乳酸の製造方法
【課題】高い収率でしかも安価に乳酸を製造できる方法を提供すること
【解決手段】乳酸菌の培養における培地が窒素源として乾燥酵母を含むことを特徴とする、乳酸菌による乳酸の製造方法を提供する。
【解決手段】乳酸菌の培養における培地が窒素源として乾燥酵母を含むことを特徴とする、乳酸菌による乳酸の製造方法を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、乳酸の製造方法に関するものである。特に、本発明は、乳酸菌を用いて高い発酵効率で乳酸を製造する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、乳酸のポリマーであるポリ乳酸は、生分解性ポリマーとして、用途が拡大することが期待されている。中でも、光学活性乳酸のポリマーである、ポリＬ−乳酸とポリＤ−乳酸との混合物は、ステレオコンプレックスポリ乳酸と呼ばれ、ポリＤ−乳酸やポリＬ−乳酸と較べて耐熱性等において優位な効果を有するため、最近特に注目されている。ステレオコンプレックスポリ乳酸の原料であるポリＤ−乳酸はＤ−乳酸から、またポリＬ−乳酸は、Ｌ−乳酸から製造されるため、Ｄ−、およびＬ−乳酸の需要も高まっている。
【０００３】
今日得られる乳酸としては、石油化学製品から化学合成によって製造される乳酸と発酵により製造される乳酸とがある。このうち、石油化学製品から化学合成によって製造される乳酸は、一般に乳酸エステルの形で精製されるため高純度であるが、ラセミ体であり、光学活性を有しない。一方、発酵により製造される乳酸は、Ｌ体またはＤ体の光学活性体およびラセミ体が存在し、発酵に使用する微生物の種類により自由に必要とする光学活性体を調製できる。このように、光学活性を持つ乳酸は、特に医薬や農薬分野において強く求められているものの、現在のところ発酵法でしか生産することができないのが現状である。
【０００４】
一般的に乳酸菌による発酵法により乳酸を得る場合、その生産効率を上げるために、酵母エキスやポリペプトン、肉エキスなどの窒素源が培地中に添加される。しかしながら、酵母エキスやポリペプトンなどは非常に高価である故、最終的な乳酸の生産コストは高価なものとなる。そのため、その問題を解決するために現在までに様々な試みがなされてきた。例えば、特許文献１では、ピルビン酸を発酵培地に添加して乳酸を生成させる技術が開示されている。また、特許文献２では、発酵に用いられる炭素源としての澱粉を培地中に含み、さらにアミロース加水分解糖化酵素を付加的に存在させる技術が開示されている。さらに異なる技術としては、バシラス属に属する微生物を用いて、酵母エキス濃度が低い培地中においてＤ−乳酸を生産する方法がある（特許文献３参照）。
【特許文献１】特開２００３−１５９０９１号公報
【特許文献２】特開平２−７６５９２号公報
【特許文献３】特開２００３−８８３９２公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、上記いずれの技術を用いても、いまだ満足のいく生産効率で乳酸を製造することができず、依然高価なポリペプトンや酵母エキスなどが相当量培地中に添加されているのが現状である。よって、安価でかつより高い発酵効率で乳酸菌を培養できる方法の確立が依然として要求されている。
【０００６】
本発明は、上記事情を鑑みてなされたものであり、高い収率でしかも安価に乳酸を製造できる方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記の問題を解決すべく、乳酸を発酵により生産する際に、コストのうち最も大きな部分を占めているポリペプトンや酵母エキスの代替となる窒素源について鋭意研究を行った結果、乳酸菌の培養における培地に窒素源として乾燥酵母を含ませた場合、従来より高い発酵効率でしかも安価に乳酸を生産できることを知得し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
さらに、別の手段として、乳酸菌の培養における培地に窒素源として麦芽根、ポリペプトンおよび酵母エキスを含ませた場合、従来より高い発酵効率でしかも安価に乳酸を生産できることを知得し、本発明を完成するに至った。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の方法によれば、培地中に特定の窒素源を添加するという簡便な方法にもかかわらず、乳酸を高効率で生産できる。この方法は、特に特別な操作や装置を必要とするものではないので、乳酸を工業的に生産する場合に特に有利である。また、窒素源として用いる材料が安価であるため、工業的に生産した場合、最終生成物である乳酸の生産コストの低減を図ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下、本発明の実施の形態を説明する。
【００１１】
本発明では、乳酸を製造する際の発酵培地が、窒素源として乾燥酵母を含むことが主な特徴である。窒素源として、乾燥酵母を含むことにより、安価でしかも高い生産効率で乳酸を製造することが可能となる。
【００１２】
乾燥酵母は、栄養要求性の高い乳酸菌が資化できる有用な窒素源である。また、乳酸を生産するためのコストがポリペプトンや酵母エキスは非常に高価であるのに対し、それと比較して乾燥酵母は安価であるという利点がある。このため、窒素源として乾燥酵母を使用することによって、乳酸菌による窒素源の利用効率は維持したまま、従来、窒素源としてしばしば使用されていた高価な酵母エキスやポリペプトンの使用量を減らすことができ、ゆえに、製造される乳酸のコストを有意に軽減することができる。
【００１３】
本発明に必須の成分である「乾燥酵母」とは、酵母を乾燥し、粉末状にしたものである。使用される酵母としては、ビール酵母、パン酵母、清酒酵母などが好適であるが、とりわけビールの醸造の際に副産物として得られるビール酵母は安価かつ安定的に入手できるのでより好ましい。乾燥酵母はこれらの酵母を常法により乾燥したものを用いることができる。
【００１４】
本発明に使用される乾燥酵母の培地中への添加量は、乳酸菌が良好に生育でき、かつ効率よく乳酸を生産できる量であれば、特に制限されないが、好ましくは全培地中３〜３０ｇ／Ｌであり、より好ましくは全培地中４〜２５ｇ／Ｌ、特に好ましくは５〜１５ｇ／Ｌである。
【００１５】
本発明において、乳酸菌の培養における培地に窒素源としてさらに麦芽根を含むことが好ましい。麦芽根の添加により、乳酸の産生量がさらに増加し、乳酸の生産効率を上昇させることができる。さらに、麦芽根は、大麦を製麦して麦芽を製造する際の副生物であるため、乾燥酵母と比べても非常に安価であり、また本来廃棄されるべき麦芽根を利用するため、環境負荷軽減の意味でも有意である。
【００１６】
本発明において、「麦芽根」は、麦芽が発芽した直後の幼根である。麦芽根の製造方法は、公知であり、本発明においても同様の方法が適用でき、原料である、大麦、小麦、ライ麦等の製麦副生物である穀皮、穂軸等を含む麦芽根は、大麦、小麦、ライ麦等を製麦して麦芽を製造する際に副生物として生ずるものであれば何れも使用することができる。この副生物は製麦時に生じた麦芽根の他、大麦、小麦、ライ麦等の外皮である穀皮、穂軸、護頴、芒等の不要物を含んでいてもよい。この際、麦芽根は、上記したようなそのままの形態で使用されても、麦芽根を粉砕して使用しても、麦芽根を乾燥した後、粉砕して使用しても、熱水などによって麦芽根から所望の窒素成分を抽出した液体の形態で使用しても、いずれの形態でもよいが、麦芽根を粉砕する、または麦芽根を乾燥した後、粉砕することによって、粉末の形態で使用することが好ましい。このような形態であれば、乳酸菌による窒素源の利用効率を上げることができるからである。
【００１７】
本発明において、麦芽根が用いられる場合は、乾燥酵母との合計で、全培地中３〜３０ｇ／Ｌであることが好ましく、より好ましくは４〜２５ｇ／Ｌ、特に好ましくは５〜１５ｇ／Ｌである。この範囲であれば、さらに乳酸の生産効率が上昇するので、好ましい。また、乾燥酵母と麦芽根との比率が、乾燥酵母：麦芽根＝１００：１〜1：１００であることが好ましく、より好ましくは、１０：１〜１：１０、さらに好ましくは、１０：１〜１：２である。この範囲であると、さらに乳酸の生産効率が上昇するので、好ましい。
【００１８】
本発明において、使用される乳酸菌は、乳酸を生産できる微生物であれば特に制限されず、得られる乳酸の所望の形態（ＤあるいはＬ−体）によって適宜選択される。所望の形態がＤ−体である場合には、使用できる乳酸菌は、Ｄ−乳酸を生産できる微生物であれば特に制限されないが、例えば、ラクトバチラス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ロイコノストック属（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）、及びスポロラクトバチラス属（Ｓｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）に属する微生物などが好ましく使用できる。これらのうち、Ｄ−乳酸の生産能を考慮すると、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｉｆｉｄｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｉｆｉｄｕｓ Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｃｈｎｅｒｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｕｃａｓｉｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｉｌｇａｒｄｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｃｔｉａ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｅｉｃｈｍａｎｎｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、及びＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｒｉｃｈｏｄｅｓ等の、ラクトバチラス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）に属する微生物がより好ましく、特にラクトバチラス・デブルキイー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）、最も好ましくはラクトバチラス・デブルキイー ＩＦＯ３２０２株（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ＩＦＯ３２０２）が使用できる。また、所望の形態がＬ−体である場合には、使用できる乳酸菌は、Ｌ−乳酸を生産できる微生物であれば特に制限されないが、例えば、ラクトバチラス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ロイコノストック属（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）、及びスポロラクトバチラス属（Ｓｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）に属する微生物などが好ましく使用できる。これらのうち、Ｌ−乳酸の生産能を考慮すると、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ等の、ラクトバチラス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）に属する微生物がより好ましく、特にラクトバチラス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、最も好ましくはラクトバチラス・ラムノサス ＩＦＯ３８６３（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ ＩＦＯ３８６３）が使用できる。
【００１９】
また、本発明で使用される乳酸菌は、上記したような野生株に加えて、ＵＶ照射、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）処理などの、当該分野において既知の変異処理によって得られる変異株、細胞融合や遺伝子組換技術などの遺伝学的手法により誘導される組換株などを使用してもよい。なお、上記変異処理や遺伝学的手法は、当該分野において既知の方法と同様の方法が使用できる。また、上記遺伝子組換株の宿主としては、所望の遺伝子を形質転換してタンパク質を発現できるものであれば特に制限されず、親株と同じ属種であってもあるいは属種の異なるものを宿主として使用してもよいが、上述したような乳酸菌と同じ属種のものを宿主として使用することが好ましい。
【００２０】
本発明は、また、乳酸の製造する際の発酵培地が、窒素源として麦芽根、ポリペプトンおよび酵母エキスを含むことも主な特徴である。麦芽根は、上述したように安価な窒素源として有用であり、窒素源の一部を麦芽根に置換することにより、高価なポリペプトンおよび酵母エキスの使用量を減らすことができ、結果として安価でかつ大量に乳酸を生産することが可能となる。
【００２１】
本発明で用いられるポリペプトンおよび酵母エキスは従来公知のものを使用できる。麦芽根、ポリペプトンおよび酵母エキスは、合計で好ましくは全培地中３〜３０ｇ／Ｌであり、より好ましくは全培地中４〜２５ｇ／Ｌ、特に好ましくは５〜１５ｇ／Ｌである。また、麦芽根、ポリペプトンおよび酵母エキスは、質量比で、麦芽根：（ポリペプトン＋酵母エキス）＝１：２０〜２０：１であることが好ましく、より好ましくは１：１０〜１０：１、特に好ましくは１：５〜５：１である。さらに、ポリペプトン：酵母エキス＝１：２０〜２０：１であることが好ましく、より好ましくは１：１０〜１０：１、特に好ましくは１：５〜５：１である。この範囲であれば、乳酸の生産効率が高く、乳酸の製造において非常に有用である。
【００２２】
本発明の乳酸菌の培養をするにあたって、寒天培地等の固体培地に斜面培養したものを直接培養用の培地に植菌して、本発明の方法による培養を行なってもよい（場合によっては、種培養と区別するために「本培養」とも記載する）が、乳酸菌を予め液体培地で培養（種培養）したものを、本発明の方法にかかる培養（本培養）に使用することが好ましい。このような方法によると、乳酸菌の成長をより向上できるからである。
【００２３】
本発明の方法において、種培養に使用される培地の組成は、本培養に使用される培地の組成と、同一であってもあるいは異なるものであってもよく、使用される乳酸菌の種類に応じて適宜選択され、一般的に乳酸菌を接種／培養するために市販されている培地が使用できる。例えば、本発明において特に好ましく使用されるラクトバチラス・デブルキー ＩＦＯ３２０２株（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ＩＦＯ３２０２）を用いる場合には、一般乳酸菌接種用培地「ニッスイ」などが種培養用の培地として好ましく使用され、その培地組成は下記実施例の表１に示される。なお、上記種培養に使用される培地は、乳酸菌の本培養に使用するのに十分な量の菌体量が得られれば上記に制限されるものではなく、他の乳酸菌を培養するに適することが知られている組成の培地、上記組成を変えたもの、上記組成における成分を変えたものなど、様々な組成が使用できる。
【００２４】
本発明の方法において、本培養に使用される培地の組成は、本発明の要素を具備する限り、特に制限されるものではないが、好ましくは一般的な炭素源、無機塩を含む。
【００２５】
本発明による乳酸菌の培養において使用できる炭素源としては、上記菌株が良好に生育し、乳酸を順調に産生できうるものであれば特に制限されず、公知の炭素源が使用できる。例えば、ガラクトース、ラクトース、グルコース、フルクトース、グリセロール、シュークロース、サッカロース、セルロース、デンプンまたはその組成画分、焙焼デキストリン、加工デンプン、デンプン誘導体、物理処理デンプン及びα−デンプン等の炭水化物；グリセリン、マンイトル、キシリトール、リビトール等のポリアルコールなどの発酵性糖質などが使用できる。または、具体例としては、上記発酵性糖質を含むデンプン糖化液、トウモロコシやコメの加水分解物、糖蜜、農業廃棄物の加水分解液、可溶性デンプン、アミロース、アミロペクチン、マルトオリゴ糖、シクロデキストリン、プルラン、トウモロコシデンプン、馬鈴薯デンプン、甘藷デンプン及びデキストリン等の炭水化物を使用してもよい。これらの炭素源のうち、乳酸菌の産生及び乳酸の生産性の観点から、グルコース、フルクトース及びグリセロールが好ましく使用され、特にグルコースが好ましい。これらの炭素源は、単独あるいは２種以上の混合物の形態で使用できる。
【００２６】
上記炭素源の培地における使用濃度は、特に制限されず従来と同様の濃度で使用できるが、有機酸の生成を阻害しない範囲で可能な限り高い濃度であることが好ましい。通常、炭素源の濃度は、培地中、好ましくは５〜３０（ｗ／ｖ）％、より好ましくは５〜２０（ｗ／ｖ）％である。
【００２７】
本発明による培養に使用できる無機塩としては、マグネシウム、マンガン、カルシウム、ナトリウム、カリウム、銅、鉄及び亜鉛などのリン酸塩、塩酸塩、硫酸塩、炭酸塩及び酢酸塩等から選ばれた１種または２種以上を使用することができる。この際、無機塩の培地における使用濃度は、特に制限されず従来と同様の濃度で使用できるが、有機酸の生成を阻害しない範囲で可能な限り高い濃度であることが好ましい。通常、無機塩の濃度は、培地中、好ましくは０〜０．５（ｗ／ｖ）％、より好ましくは０〜０．４（ｗ／ｖ）％である。
【００２８】
乳酸菌の生育を促進する目的で、上記培地に、ビオチン、パントテン酸、イノシトール、ニコチン酸等のビタミン類、ヌクレオチド、アミノ酸などの生育促進因子をさらに添加してもよい。なお、上記生育促進因子は、上記に限定されるものではなく、当該分野において使用される他の生育促進因子もまた同様に使用でき、また、添加する場合の生育促進因子の培地への添加量もまた、特に制限されるものではなく、当該分野において通常使用される量と同様の量が使用できるが、好ましくは、生育促進因子の培地中の濃度が、０．１（ｗ／ｖ）％以下、より好ましくは０．０００１〜０．０１（ｗ／ｖ）％となるような量である。なお、上記生育促進因子は、単独で使用されてもあるいは２種以上の混合物の形態で使用されてもよい。
【００２９】
また、培養時の発泡を抑えるために、消泡剤を培地に添加してもよい。この際、消泡剤は、公知の消泡剤が同様にして使用でき、市販の消泡剤を使用してもよい。また、消泡剤を使用する場合の培地への添加量もまた、特に制限されず、当該分野において使用される通常の量が同様にして使用でき、適宜選択される。なお、上記消泡剤は、単独で使用されてもあるいは２種以上の混合物の形態で使用されてもよい。
【００３０】
また、本発明では、上記必須の窒素源に加えて、他の窒素源を使用してもよい。本発明による乳酸菌の培養において使用できるその他の窒素源としては、例えば、アンモニア、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム及び塩化アンモニウム等のアンモニウム塩、硝酸ナトリウム等の硝酸塩、尿素、大豆加水分解物、大豆粉末、カゼイン、ミルクカゼイン、カゼイン分解物、カザミノ酸等の無機窒素化合物、肉エキス、ペプトン、各種アミノ酸及びコーンスティープリカー等の有機窒素化合物などが使用できる。これらの他の窒素源は、特に制限されるものではないが、本発明の効果を有意に得るためには、０〜０．１（ｗ／ｖ）％であることが好ましい。
【００３１】
また、本発明の方法の培養において使用される培地のｐＨは、乳酸菌が乳酸を生成できる環境であれば特に制限されないが、通常約２〜９程度である。
【００３２】
本発明において、乳酸菌の培養は、通常嫌気的条件下で行われ、その際の培養条件は、培地の組成や培養法によって適宜選択され、本菌株が増殖し、所望の乳酸が効率よく産生できる条件であれば特に制限されない。具体的には、培養温度は、乳酸菌が速やかに生育できる条件であれば特に制限されないが、通常は、２０〜４０℃、より好ましくは３０〜４０℃の温度で培養される。
【００３３】
上記したように、乳酸菌によって生成した乳酸は、培養液中に蓄積されるので、培養液から乳酸を分離・精製することによって、所望の乳酸が回収できる。この際、乳酸の培地からの回収方法は、特に制限されず、公知の方法が単独であるいは適宜組合わせて同様にして適用できる。具体的には、培地を、遠心分離や濾過等によって不溶な物質（菌体、添加される場合には麦芽根などを含む）を除去した後、イオン交換樹脂などで脱塩し、その溶液から、結晶化やカラムクロマトグラフィー等の常法に従って所望の乳酸を分離・精製することができる。
【実施例】
【００３４】
本発明の効果を、以下の実施例および比較例を用いて説明する。ただし、本発明の技術的範囲が以下の実施例のみに制限されるわけではない。
【００３５】
（実施例１〜３）
オートクレーブにより滅菌した一般乳酸菌接種用培地「ニッスイ」（培地組成は、下記表１参照）に、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｉｂｒｕｅｃｋｉｉ ＩＦＯ３２０２を一白金耳植菌する。これを３７℃、２４時間静置培養を行ない、種培養液を調製した。
【００３６】
【表１】
【００３７】
次に、下記表２に示す発酵培地Ａ２．０Ｌを５Ｌ容の通気攪拌型バイオリアクターに入れてオートクレーブ滅菌した後、これに上記種培養液を１００ｍＬ接種し、３７℃にて窒素ガスを通気しながら１４４時間静置培養を行なった。
【００３８】
【表２】
【００３９】
ここで、発酵培地中の窒素源として、下記表３に示した量で乾燥酵母（実施例１〜３）、ポリペプトン：酵母エキス＝１：１（質量比）（比較例１〜３）、麦芽根（比較例４〜６）を使用した。表３および図１に各実施例、比較例のＤ−乳酸の生産量を示した。
【００４０】
【表３】
【００４１】
なお、本実施例において、Ｄ−乳酸の生成量は、下記条件によるＨＰＬＣによる分析によって測定した。
【００４２】
＜ＨＰＬＣ分析条件＞
カラム：東ソー製 ＴＳＫｇｅｌ ＯＡＰａｋ−Ａ
（内径：７．８ｍｍ、カラム長：３０．０ｃｍ）
溶媒： ０．７５ｍＭ 硫酸水溶液
流速： １ｍｌ／ｍｉｎ
検出器：ＲＩ（屈折率測定）
カラム温度：４０℃
また、本実施例において、生産した乳酸の形態（Ｄ体またはＬ体）は、下記条件に従って光学純度を測定することによって、確認した。
【００４３】
＜光学純度測定条件＞
カラム：住化分析センター製 Ｓｕｍｉｃｈｉｒａｌ ＯＡ−５０００
（内径：４．６ｍｍ、カラム長：１５．０ｃｍ）
溶媒： １ｍＭ 硫酸銅水溶液
流速： １ｍｌ／ｍｉｎ
検出器：ＵＶ（紫外線吸収、波長：２５４ｎｍ）
カラム温度：４０℃
上記実施例１〜３及び比較例１〜６の結果を比較すると、本発明の方法、すなわち乾燥酵母を含む培地で乳酸を製造する方法によると、Ｄ−乳酸が高い収率で得られることが分かった。なお、実施例１〜３で得られた乳酸の光学純度は、各実施例とも９９％以上であった。
【００４４】
（実施例４〜７）
上記実施例１〜３と同じ種培養液、発酵培地、発酵条件を用い、実施例１〜３と同様にＤ−乳酸の生産量を測定した。本実施例では、窒素源として、乾燥酵母（実施例４）、乾燥酵母と麦芽根（実施例５〜７）、麦芽根（比較例７）を下記表４の量で用いた。図２および表４に各実施例、比較例のＤ−乳酸の生産量を示した。
【００４５】
【表４】
【００４６】
上記実施例１〜３及び比較例１〜６の結果を比較すると、本発明の方法、すなわち乾燥酵母を含む培地で乳酸を製造する方法によると、Ｄ−乳酸が高い収率で得られることが分かった。さらに乾燥酵母に加えて、麦芽根を培地中に添加すると、Ｄ−乳酸がより高い収率で得られることが分かった。なお、実施例４〜７で得られた乳酸の光学純度は、各実施例とも９９％以上であった。
【００４７】
（実施例８〜１０）
上記実施例１と同じ種培養液、発酵培地、発酵条件を用い、実施例１〜７と同様にＤ−乳酸の生産量を測定した。本実施例では、麦芽根、ポリペプトンおよび乾燥酵母を下記表５の量で用いた。図３および表５に各実施例、比較例のＤ−乳酸の生産量を示した。
【００４８】
【表５】
【００４９】
上記実施例８〜１０と比較例８、９の結果を比較すると、本発明の方法、すなわち麦芽根、酵母エキスおよびポリペプトンを含む培地で乳酸を製造する方法によると、Ｄ−乳酸が高い収率で得られることが分かった。なお、実施例８〜１０で得られた乳酸の光学純度は、各実施例とも９９％以上であった。
【００５０】
（実施例１１、１２）
上記実施例１〜１０と同じ種培養液、発酵培地を用い、発酵培地２．０Ｌをオートクレーブ滅菌した後、５Ｌ容のジャーファーメンターに上記種培養液を１００ｍＬ接種し、３７℃にて窒素ガスは通気しないで、１４４時間静置培養を行い、２４時間毎にＤ−およびＬ−乳酸の生産量を測定した。実施例１１では実施例１〜１０で用いたＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｃｋｉｉ ＩＦＯ３２０２を、実施例１２では、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ ＩＦＯ３８６３を用いた。また、本実施例では、窒素源として、乾燥酵母５．５ｇ／Ｌ、麦芽根４．５ｇ／Ｌを培地中に添加したものを用いた。なお、Ｌ−乳酸の生産量および光学純度の測定は、前記Ｄ−乳酸の生産量および光学純度測定で用いた方法を使用した。図４に２４時間毎のＤ−乳酸の生産量を、図５に２４時間毎のＬ−乳酸の生産量を示した。
【００５１】
図４，５に示されるようにＤ−乳酸、Ｌ−乳酸ともに本発明の方法により、高い収率で生産できることが分かった。なお、実施例１１，１２で得られた乳酸の光学純度は、９９％以上であった。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】培地中の各窒素源量に対する、Ｄ−乳酸の生産量を示すグラフである。
【図２】培地中の乾燥酵母および麦芽根量に対する、Ｄ−乳酸の生産量を示すグラフである。
【図３】培地中の麦芽根、ポリペプトンおよび酵母エキス量に対する、Ｄ−乳酸の生産量を示すグラフである。
【図４】培養時間に対する、Ｄ−乳酸の生産量を示すグラフである。
【図５】培養時間に対する、Ｌ−乳酸の生産量を示すグラフである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、乳酸の製造方法に関するものである。特に、本発明は、乳酸菌を用いて高い発酵効率で乳酸を製造する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、乳酸のポリマーであるポリ乳酸は、生分解性ポリマーとして、用途が拡大することが期待されている。中でも、光学活性乳酸のポリマーである、ポリＬ−乳酸とポリＤ−乳酸との混合物は、ステレオコンプレックスポリ乳酸と呼ばれ、ポリＤ−乳酸やポリＬ−乳酸と較べて耐熱性等において優位な効果を有するため、最近特に注目されている。ステレオコンプレックスポリ乳酸の原料であるポリＤ−乳酸はＤ−乳酸から、またポリＬ−乳酸は、Ｌ−乳酸から製造されるため、Ｄ−、およびＬ−乳酸の需要も高まっている。
【０００３】
今日得られる乳酸としては、石油化学製品から化学合成によって製造される乳酸と発酵により製造される乳酸とがある。このうち、石油化学製品から化学合成によって製造される乳酸は、一般に乳酸エステルの形で精製されるため高純度であるが、ラセミ体であり、光学活性を有しない。一方、発酵により製造される乳酸は、Ｌ体またはＤ体の光学活性体およびラセミ体が存在し、発酵に使用する微生物の種類により自由に必要とする光学活性体を調製できる。このように、光学活性を持つ乳酸は、特に医薬や農薬分野において強く求められているものの、現在のところ発酵法でしか生産することができないのが現状である。
【０００４】
一般的に乳酸菌による発酵法により乳酸を得る場合、その生産効率を上げるために、酵母エキスやポリペプトン、肉エキスなどの窒素源が培地中に添加される。しかしながら、酵母エキスやポリペプトンなどは非常に高価である故、最終的な乳酸の生産コストは高価なものとなる。そのため、その問題を解決するために現在までに様々な試みがなされてきた。例えば、特許文献１では、ピルビン酸を発酵培地に添加して乳酸を生成させる技術が開示されている。また、特許文献２では、発酵に用いられる炭素源としての澱粉を培地中に含み、さらにアミロース加水分解糖化酵素を付加的に存在させる技術が開示されている。さらに異なる技術としては、バシラス属に属する微生物を用いて、酵母エキス濃度が低い培地中においてＤ−乳酸を生産する方法がある（特許文献３参照）。
【特許文献１】特開２００３−１５９０９１号公報
【特許文献２】特開平２−７６５９２号公報
【特許文献３】特開２００３−８８３９２公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、上記いずれの技術を用いても、いまだ満足のいく生産効率で乳酸を製造することができず、依然高価なポリペプトンや酵母エキスなどが相当量培地中に添加されているのが現状である。よって、安価でかつより高い発酵効率で乳酸菌を培養できる方法の確立が依然として要求されている。
【０００６】
本発明は、上記事情を鑑みてなされたものであり、高い収率でしかも安価に乳酸を製造できる方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記の問題を解決すべく、乳酸を発酵により生産する際に、コストのうち最も大きな部分を占めているポリペプトンや酵母エキスの代替となる窒素源について鋭意研究を行った結果、乳酸菌の培養における培地に窒素源として乾燥酵母を含ませた場合、従来より高い発酵効率でしかも安価に乳酸を生産できることを知得し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
さらに、別の手段として、乳酸菌の培養における培地に窒素源として麦芽根、ポリペプトンおよび酵母エキスを含ませた場合、従来より高い発酵効率でしかも安価に乳酸を生産できることを知得し、本発明を完成するに至った。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の方法によれば、培地中に特定の窒素源を添加するという簡便な方法にもかかわらず、乳酸を高効率で生産できる。この方法は、特に特別な操作や装置を必要とするものではないので、乳酸を工業的に生産する場合に特に有利である。また、窒素源として用いる材料が安価であるため、工業的に生産した場合、最終生成物である乳酸の生産コストの低減を図ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下、本発明の実施の形態を説明する。
【００１１】
本発明では、乳酸を製造する際の発酵培地が、窒素源として乾燥酵母を含むことが主な特徴である。窒素源として、乾燥酵母を含むことにより、安価でしかも高い生産効率で乳酸を製造することが可能となる。
【００１２】
乾燥酵母は、栄養要求性の高い乳酸菌が資化できる有用な窒素源である。また、乳酸を生産するためのコストがポリペプトンや酵母エキスは非常に高価であるのに対し、それと比較して乾燥酵母は安価であるという利点がある。このため、窒素源として乾燥酵母を使用することによって、乳酸菌による窒素源の利用効率は維持したまま、従来、窒素源としてしばしば使用されていた高価な酵母エキスやポリペプトンの使用量を減らすことができ、ゆえに、製造される乳酸のコストを有意に軽減することができる。
【００１３】
本発明に必須の成分である「乾燥酵母」とは、酵母を乾燥し、粉末状にしたものである。使用される酵母としては、ビール酵母、パン酵母、清酒酵母などが好適であるが、とりわけビールの醸造の際に副産物として得られるビール酵母は安価かつ安定的に入手できるのでより好ましい。乾燥酵母はこれらの酵母を常法により乾燥したものを用いることができる。
【００１４】
本発明に使用される乾燥酵母の培地中への添加量は、乳酸菌が良好に生育でき、かつ効率よく乳酸を生産できる量であれば、特に制限されないが、好ましくは全培地中３〜３０ｇ／Ｌであり、より好ましくは全培地中４〜２５ｇ／Ｌ、特に好ましくは５〜１５ｇ／Ｌである。
【００１５】
本発明において、乳酸菌の培養における培地に窒素源としてさらに麦芽根を含むことが好ましい。麦芽根の添加により、乳酸の産生量がさらに増加し、乳酸の生産効率を上昇させることができる。さらに、麦芽根は、大麦を製麦して麦芽を製造する際の副生物であるため、乾燥酵母と比べても非常に安価であり、また本来廃棄されるべき麦芽根を利用するため、環境負荷軽減の意味でも有意である。
【００１６】
本発明において、「麦芽根」は、麦芽が発芽した直後の幼根である。麦芽根の製造方法は、公知であり、本発明においても同様の方法が適用でき、原料である、大麦、小麦、ライ麦等の製麦副生物である穀皮、穂軸等を含む麦芽根は、大麦、小麦、ライ麦等を製麦して麦芽を製造する際に副生物として生ずるものであれば何れも使用することができる。この副生物は製麦時に生じた麦芽根の他、大麦、小麦、ライ麦等の外皮である穀皮、穂軸、護頴、芒等の不要物を含んでいてもよい。この際、麦芽根は、上記したようなそのままの形態で使用されても、麦芽根を粉砕して使用しても、麦芽根を乾燥した後、粉砕して使用しても、熱水などによって麦芽根から所望の窒素成分を抽出した液体の形態で使用しても、いずれの形態でもよいが、麦芽根を粉砕する、または麦芽根を乾燥した後、粉砕することによって、粉末の形態で使用することが好ましい。このような形態であれば、乳酸菌による窒素源の利用効率を上げることができるからである。
【００１７】
本発明において、麦芽根が用いられる場合は、乾燥酵母との合計で、全培地中３〜３０ｇ／Ｌであることが好ましく、より好ましくは４〜２５ｇ／Ｌ、特に好ましくは５〜１５ｇ／Ｌである。この範囲であれば、さらに乳酸の生産効率が上昇するので、好ましい。また、乾燥酵母と麦芽根との比率が、乾燥酵母：麦芽根＝１００：１〜1：１００であることが好ましく、より好ましくは、１０：１〜１：１０、さらに好ましくは、１０：１〜１：２である。この範囲であると、さらに乳酸の生産効率が上昇するので、好ましい。
【００１８】
本発明において、使用される乳酸菌は、乳酸を生産できる微生物であれば特に制限されず、得られる乳酸の所望の形態（ＤあるいはＬ−体）によって適宜選択される。所望の形態がＤ−体である場合には、使用できる乳酸菌は、Ｄ−乳酸を生産できる微生物であれば特に制限されないが、例えば、ラクトバチラス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ロイコノストック属（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）、及びスポロラクトバチラス属（Ｓｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）に属する微生物などが好ましく使用できる。これらのうち、Ｄ−乳酸の生産能を考慮すると、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｉｆｉｄｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｉｆｉｄｕｓ Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｃｈｎｅｒｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｕｃａｓｉｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｉｌｇａｒｄｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｃｔｉａ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｅｉｃｈｍａｎｎｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、及びＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｒｉｃｈｏｄｅｓ等の、ラクトバチラス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）に属する微生物がより好ましく、特にラクトバチラス・デブルキイー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）、最も好ましくはラクトバチラス・デブルキイー ＩＦＯ３２０２株（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ＩＦＯ３２０２）が使用できる。また、所望の形態がＬ−体である場合には、使用できる乳酸菌は、Ｌ−乳酸を生産できる微生物であれば特に制限されないが、例えば、ラクトバチラス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ロイコノストック属（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）、及びスポロラクトバチラス属（Ｓｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）に属する微生物などが好ましく使用できる。これらのうち、Ｌ−乳酸の生産能を考慮すると、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ等の、ラクトバチラス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）に属する微生物がより好ましく、特にラクトバチラス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、最も好ましくはラクトバチラス・ラムノサス ＩＦＯ３８６３（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ ＩＦＯ３８６３）が使用できる。
【００１９】
また、本発明で使用される乳酸菌は、上記したような野生株に加えて、ＵＶ照射、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）処理などの、当該分野において既知の変異処理によって得られる変異株、細胞融合や遺伝子組換技術などの遺伝学的手法により誘導される組換株などを使用してもよい。なお、上記変異処理や遺伝学的手法は、当該分野において既知の方法と同様の方法が使用できる。また、上記遺伝子組換株の宿主としては、所望の遺伝子を形質転換してタンパク質を発現できるものであれば特に制限されず、親株と同じ属種であってもあるいは属種の異なるものを宿主として使用してもよいが、上述したような乳酸菌と同じ属種のものを宿主として使用することが好ましい。
【００２０】
本発明は、また、乳酸の製造する際の発酵培地が、窒素源として麦芽根、ポリペプトンおよび酵母エキスを含むことも主な特徴である。麦芽根は、上述したように安価な窒素源として有用であり、窒素源の一部を麦芽根に置換することにより、高価なポリペプトンおよび酵母エキスの使用量を減らすことができ、結果として安価でかつ大量に乳酸を生産することが可能となる。
【００２１】
本発明で用いられるポリペプトンおよび酵母エキスは従来公知のものを使用できる。麦芽根、ポリペプトンおよび酵母エキスは、合計で好ましくは全培地中３〜３０ｇ／Ｌであり、より好ましくは全培地中４〜２５ｇ／Ｌ、特に好ましくは５〜１５ｇ／Ｌである。また、麦芽根、ポリペプトンおよび酵母エキスは、質量比で、麦芽根：（ポリペプトン＋酵母エキス）＝１：２０〜２０：１であることが好ましく、より好ましくは１：１０〜１０：１、特に好ましくは１：５〜５：１である。さらに、ポリペプトン：酵母エキス＝１：２０〜２０：１であることが好ましく、より好ましくは１：１０〜１０：１、特に好ましくは１：５〜５：１である。この範囲であれば、乳酸の生産効率が高く、乳酸の製造において非常に有用である。
【００２２】
本発明の乳酸菌の培養をするにあたって、寒天培地等の固体培地に斜面培養したものを直接培養用の培地に植菌して、本発明の方法による培養を行なってもよい（場合によっては、種培養と区別するために「本培養」とも記載する）が、乳酸菌を予め液体培地で培養（種培養）したものを、本発明の方法にかかる培養（本培養）に使用することが好ましい。このような方法によると、乳酸菌の成長をより向上できるからである。
【００２３】
本発明の方法において、種培養に使用される培地の組成は、本培養に使用される培地の組成と、同一であってもあるいは異なるものであってもよく、使用される乳酸菌の種類に応じて適宜選択され、一般的に乳酸菌を接種／培養するために市販されている培地が使用できる。例えば、本発明において特に好ましく使用されるラクトバチラス・デブルキー ＩＦＯ３２０２株（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ＩＦＯ３２０２）を用いる場合には、一般乳酸菌接種用培地「ニッスイ」などが種培養用の培地として好ましく使用され、その培地組成は下記実施例の表１に示される。なお、上記種培養に使用される培地は、乳酸菌の本培養に使用するのに十分な量の菌体量が得られれば上記に制限されるものではなく、他の乳酸菌を培養するに適することが知られている組成の培地、上記組成を変えたもの、上記組成における成分を変えたものなど、様々な組成が使用できる。
【００２４】
本発明の方法において、本培養に使用される培地の組成は、本発明の要素を具備する限り、特に制限されるものではないが、好ましくは一般的な炭素源、無機塩を含む。
【００２５】
本発明による乳酸菌の培養において使用できる炭素源としては、上記菌株が良好に生育し、乳酸を順調に産生できうるものであれば特に制限されず、公知の炭素源が使用できる。例えば、ガラクトース、ラクトース、グルコース、フルクトース、グリセロール、シュークロース、サッカロース、セルロース、デンプンまたはその組成画分、焙焼デキストリン、加工デンプン、デンプン誘導体、物理処理デンプン及びα−デンプン等の炭水化物；グリセリン、マンイトル、キシリトール、リビトール等のポリアルコールなどの発酵性糖質などが使用できる。または、具体例としては、上記発酵性糖質を含むデンプン糖化液、トウモロコシやコメの加水分解物、糖蜜、農業廃棄物の加水分解液、可溶性デンプン、アミロース、アミロペクチン、マルトオリゴ糖、シクロデキストリン、プルラン、トウモロコシデンプン、馬鈴薯デンプン、甘藷デンプン及びデキストリン等の炭水化物を使用してもよい。これらの炭素源のうち、乳酸菌の産生及び乳酸の生産性の観点から、グルコース、フルクトース及びグリセロールが好ましく使用され、特にグルコースが好ましい。これらの炭素源は、単独あるいは２種以上の混合物の形態で使用できる。
【００２６】
上記炭素源の培地における使用濃度は、特に制限されず従来と同様の濃度で使用できるが、有機酸の生成を阻害しない範囲で可能な限り高い濃度であることが好ましい。通常、炭素源の濃度は、培地中、好ましくは５〜３０（ｗ／ｖ）％、より好ましくは５〜２０（ｗ／ｖ）％である。
【００２７】
本発明による培養に使用できる無機塩としては、マグネシウム、マンガン、カルシウム、ナトリウム、カリウム、銅、鉄及び亜鉛などのリン酸塩、塩酸塩、硫酸塩、炭酸塩及び酢酸塩等から選ばれた１種または２種以上を使用することができる。この際、無機塩の培地における使用濃度は、特に制限されず従来と同様の濃度で使用できるが、有機酸の生成を阻害しない範囲で可能な限り高い濃度であることが好ましい。通常、無機塩の濃度は、培地中、好ましくは０〜０．５（ｗ／ｖ）％、より好ましくは０〜０．４（ｗ／ｖ）％である。
【００２８】
乳酸菌の生育を促進する目的で、上記培地に、ビオチン、パントテン酸、イノシトール、ニコチン酸等のビタミン類、ヌクレオチド、アミノ酸などの生育促進因子をさらに添加してもよい。なお、上記生育促進因子は、上記に限定されるものではなく、当該分野において使用される他の生育促進因子もまた同様に使用でき、また、添加する場合の生育促進因子の培地への添加量もまた、特に制限されるものではなく、当該分野において通常使用される量と同様の量が使用できるが、好ましくは、生育促進因子の培地中の濃度が、０．１（ｗ／ｖ）％以下、より好ましくは０．０００１〜０．０１（ｗ／ｖ）％となるような量である。なお、上記生育促進因子は、単独で使用されてもあるいは２種以上の混合物の形態で使用されてもよい。
【００２９】
また、培養時の発泡を抑えるために、消泡剤を培地に添加してもよい。この際、消泡剤は、公知の消泡剤が同様にして使用でき、市販の消泡剤を使用してもよい。また、消泡剤を使用する場合の培地への添加量もまた、特に制限されず、当該分野において使用される通常の量が同様にして使用でき、適宜選択される。なお、上記消泡剤は、単独で使用されてもあるいは２種以上の混合物の形態で使用されてもよい。
【００３０】
また、本発明では、上記必須の窒素源に加えて、他の窒素源を使用してもよい。本発明による乳酸菌の培養において使用できるその他の窒素源としては、例えば、アンモニア、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム及び塩化アンモニウム等のアンモニウム塩、硝酸ナトリウム等の硝酸塩、尿素、大豆加水分解物、大豆粉末、カゼイン、ミルクカゼイン、カゼイン分解物、カザミノ酸等の無機窒素化合物、肉エキス、ペプトン、各種アミノ酸及びコーンスティープリカー等の有機窒素化合物などが使用できる。これらの他の窒素源は、特に制限されるものではないが、本発明の効果を有意に得るためには、０〜０．１（ｗ／ｖ）％であることが好ましい。
【００３１】
また、本発明の方法の培養において使用される培地のｐＨは、乳酸菌が乳酸を生成できる環境であれば特に制限されないが、通常約２〜９程度である。
【００３２】
本発明において、乳酸菌の培養は、通常嫌気的条件下で行われ、その際の培養条件は、培地の組成や培養法によって適宜選択され、本菌株が増殖し、所望の乳酸が効率よく産生できる条件であれば特に制限されない。具体的には、培養温度は、乳酸菌が速やかに生育できる条件であれば特に制限されないが、通常は、２０〜４０℃、より好ましくは３０〜４０℃の温度で培養される。
【００３３】
上記したように、乳酸菌によって生成した乳酸は、培養液中に蓄積されるので、培養液から乳酸を分離・精製することによって、所望の乳酸が回収できる。この際、乳酸の培地からの回収方法は、特に制限されず、公知の方法が単独であるいは適宜組合わせて同様にして適用できる。具体的には、培地を、遠心分離や濾過等によって不溶な物質（菌体、添加される場合には麦芽根などを含む）を除去した後、イオン交換樹脂などで脱塩し、その溶液から、結晶化やカラムクロマトグラフィー等の常法に従って所望の乳酸を分離・精製することができる。
【実施例】
【００３４】
本発明の効果を、以下の実施例および比較例を用いて説明する。ただし、本発明の技術的範囲が以下の実施例のみに制限されるわけではない。
【００３５】
（実施例１〜３）
オートクレーブにより滅菌した一般乳酸菌接種用培地「ニッスイ」（培地組成は、下記表１参照）に、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｉｂｒｕｅｃｋｉｉ ＩＦＯ３２０２を一白金耳植菌する。これを３７℃、２４時間静置培養を行ない、種培養液を調製した。
【００３６】
【表１】
【００３７】
次に、下記表２に示す発酵培地Ａ２．０Ｌを５Ｌ容の通気攪拌型バイオリアクターに入れてオートクレーブ滅菌した後、これに上記種培養液を１００ｍＬ接種し、３７℃にて窒素ガスを通気しながら１４４時間静置培養を行なった。
【００３８】
【表２】
【００３９】
ここで、発酵培地中の窒素源として、下記表３に示した量で乾燥酵母（実施例１〜３）、ポリペプトン：酵母エキス＝１：１（質量比）（比較例１〜３）、麦芽根（比較例４〜６）を使用した。表３および図１に各実施例、比較例のＤ−乳酸の生産量を示した。
【００４０】
【表３】
【００４１】
なお、本実施例において、Ｄ−乳酸の生成量は、下記条件によるＨＰＬＣによる分析によって測定した。
【００４２】
＜ＨＰＬＣ分析条件＞
カラム：東ソー製 ＴＳＫｇｅｌ ＯＡＰａｋ−Ａ
（内径：７．８ｍｍ、カラム長：３０．０ｃｍ）
溶媒： ０．７５ｍＭ 硫酸水溶液
流速： １ｍｌ／ｍｉｎ
検出器：ＲＩ（屈折率測定）
カラム温度：４０℃
また、本実施例において、生産した乳酸の形態（Ｄ体またはＬ体）は、下記条件に従って光学純度を測定することによって、確認した。
【００４３】
＜光学純度測定条件＞
カラム：住化分析センター製 Ｓｕｍｉｃｈｉｒａｌ ＯＡ−５０００
（内径：４．６ｍｍ、カラム長：１５．０ｃｍ）
溶媒： １ｍＭ 硫酸銅水溶液
流速： １ｍｌ／ｍｉｎ
検出器：ＵＶ（紫外線吸収、波長：２５４ｎｍ）
カラム温度：４０℃
上記実施例１〜３及び比較例１〜６の結果を比較すると、本発明の方法、すなわち乾燥酵母を含む培地で乳酸を製造する方法によると、Ｄ−乳酸が高い収率で得られることが分かった。なお、実施例１〜３で得られた乳酸の光学純度は、各実施例とも９９％以上であった。
【００４４】
（実施例４〜７）
上記実施例１〜３と同じ種培養液、発酵培地、発酵条件を用い、実施例１〜３と同様にＤ−乳酸の生産量を測定した。本実施例では、窒素源として、乾燥酵母（実施例４）、乾燥酵母と麦芽根（実施例５〜７）、麦芽根（比較例７）を下記表４の量で用いた。図２および表４に各実施例、比較例のＤ−乳酸の生産量を示した。
【００４５】
【表４】
【００４６】
上記実施例１〜３及び比較例１〜６の結果を比較すると、本発明の方法、すなわち乾燥酵母を含む培地で乳酸を製造する方法によると、Ｄ−乳酸が高い収率で得られることが分かった。さらに乾燥酵母に加えて、麦芽根を培地中に添加すると、Ｄ−乳酸がより高い収率で得られることが分かった。なお、実施例４〜７で得られた乳酸の光学純度は、各実施例とも９９％以上であった。
【００４７】
（実施例８〜１０）
上記実施例１と同じ種培養液、発酵培地、発酵条件を用い、実施例１〜７と同様にＤ−乳酸の生産量を測定した。本実施例では、麦芽根、ポリペプトンおよび乾燥酵母を下記表５の量で用いた。図３および表５に各実施例、比較例のＤ−乳酸の生産量を示した。
【００４８】
【表５】
【００４９】
上記実施例８〜１０と比較例８、９の結果を比較すると、本発明の方法、すなわち麦芽根、酵母エキスおよびポリペプトンを含む培地で乳酸を製造する方法によると、Ｄ−乳酸が高い収率で得られることが分かった。なお、実施例８〜１０で得られた乳酸の光学純度は、各実施例とも９９％以上であった。
【００５０】
（実施例１１、１２）
上記実施例１〜１０と同じ種培養液、発酵培地を用い、発酵培地２．０Ｌをオートクレーブ滅菌した後、５Ｌ容のジャーファーメンターに上記種培養液を１００ｍＬ接種し、３７℃にて窒素ガスは通気しないで、１４４時間静置培養を行い、２４時間毎にＤ−およびＬ−乳酸の生産量を測定した。実施例１１では実施例１〜１０で用いたＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｃｋｉｉ ＩＦＯ３２０２を、実施例１２では、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ ＩＦＯ３８６３を用いた。また、本実施例では、窒素源として、乾燥酵母５．５ｇ／Ｌ、麦芽根４．５ｇ／Ｌを培地中に添加したものを用いた。なお、Ｌ−乳酸の生産量および光学純度の測定は、前記Ｄ−乳酸の生産量および光学純度測定で用いた方法を使用した。図４に２４時間毎のＤ−乳酸の生産量を、図５に２４時間毎のＬ−乳酸の生産量を示した。
【００５１】
図４，５に示されるようにＤ−乳酸、Ｌ−乳酸ともに本発明の方法により、高い収率で生産できることが分かった。なお、実施例１１，１２で得られた乳酸の光学純度は、９９％以上であった。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】培地中の各窒素源量に対する、Ｄ−乳酸の生産量を示すグラフである。
【図２】培地中の乾燥酵母および麦芽根量に対する、Ｄ−乳酸の生産量を示すグラフである。
【図３】培地中の麦芽根、ポリペプトンおよび酵母エキス量に対する、Ｄ−乳酸の生産量を示すグラフである。
【図４】培養時間に対する、Ｄ−乳酸の生産量を示すグラフである。
【図５】培養時間に対する、Ｌ−乳酸の生産量を示すグラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
窒素源として乾燥酵母を含む培地中で乳酸菌を培養する段階を有することを特徴とする、乳酸菌による乳酸の製造方法。
【請求項２】
乳酸菌の培養における培地が窒素源としてさらに麦芽根を含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記培地に含まれる乾燥酵母と麦芽根とが、合計で全培地中３〜３０ｇ／Ｌであることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記乳酸菌は、Ｄ−乳酸を生産するラクトバチラス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）に属することを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記乳酸菌は、Ｌ−乳酸を生産するラクトバチラス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）に属することを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
窒素源として乾燥酵母を含むことを特徴とする、乳酸菌が乳酸を製造するための培地。
【請求項７】
窒素源として麦芽根、ポリペプトンおよび酵母エキスを含む培地中で乳酸菌を培養する段階を有することを特徴とする、乳酸菌による乳酸の製造方法。
【請求項８】
前記培地に含まれる麦芽根、ポリペプトンおよび酵母エキスが、合計で全培地中３〜３０ｇ／Ｌであることを特徴とする特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記乳酸菌は、Ｄ−乳酸を生産するラクトバチラス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）に属することを特徴とする請求項７または８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記乳酸菌は、Ｌ−乳酸を生産するラクトバチラス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）に属することを特徴とする請求項７または８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
窒素源として麦芽根、ポリペプトン、および酵母エキスを含むことを特徴とする、乳酸菌が乳酸を製造するための培地。
【請求項１】
窒素源として乾燥酵母を含む培地中で乳酸菌を培養する段階を有することを特徴とする、乳酸菌による乳酸の製造方法。
【請求項２】
乳酸菌の培養における培地が窒素源としてさらに麦芽根を含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記培地に含まれる乾燥酵母と麦芽根とが、合計で全培地中３〜３０ｇ／Ｌであることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記乳酸菌は、Ｄ−乳酸を生産するラクトバチラス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）に属することを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記乳酸菌は、Ｌ−乳酸を生産するラクトバチラス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）に属することを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
窒素源として乾燥酵母を含むことを特徴とする、乳酸菌が乳酸を製造するための培地。
【請求項７】
窒素源として麦芽根、ポリペプトンおよび酵母エキスを含む培地中で乳酸菌を培養する段階を有することを特徴とする、乳酸菌による乳酸の製造方法。
【請求項８】
前記培地に含まれる麦芽根、ポリペプトンおよび酵母エキスが、合計で全培地中３〜３０ｇ／Ｌであることを特徴とする特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記乳酸菌は、Ｄ−乳酸を生産するラクトバチラス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）に属することを特徴とする請求項７または８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記乳酸菌は、Ｌ−乳酸を生産するラクトバチラス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）に属することを特徴とする請求項７または８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
窒素源として麦芽根、ポリペプトン、および酵母エキスを含むことを特徴とする、乳酸菌が乳酸を製造するための培地。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２００７−２１５４２８（Ｐ２００７−２１５４２８Ａ）
【公開日】平成１９年８月３０日（２００７．８．３０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−３７２１３（Ｐ２００６−３７２１３）
【出願日】平成１８年２月１４日（２００６．２．１４）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成１７年９月２５日 社団法人日本生物工学会発行の「日本生物工学会大会講演要旨集」に発表
【出願人】（３９００２２３０１）株式会社武蔵野化学研究所 (63)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年８月３０日（２００７．８．３０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年２月１４日（２００６．２．１４）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成１７年９月２５日 社団法人日本生物工学会発行の「日本生物工学会大会講演要旨集」に発表
【出願人】（３９００２２３０１）株式会社武蔵野化学研究所 (63)
【Ｆターム（参考）】
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