低分子量コーティング試薬を含む新規な水溶性ナノ結晶、およびその調製方法
本発明は、元素周期系（PSE）の主族II、VIIA、亜族VIIA、亜族IB、亜族IIB、主族IIIまたは主族IVの元素から成る群より選択される少なくとも１つの金属M1と、PSEの主族Vまたは主族VIから選択される少なくとも１つの元素Aとを含むナノ結晶コアと、ナノ結晶のコア表面に結合されたキャッピング試薬であって、少なくとも２個のカップリング基を有するキャッピング試薬と、第２層であって、コーティング試薬と共有結合的にカップリングされた少なくとも２個のカップリング部分と、水溶性を付与するよう少なくとも１個の水溶性基を有する低分子量コーティング試薬を含む第２層とを備えた、水溶性ナノ結晶に関するものである。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
[0001]本発明は、新規な水溶性ナノ結晶およびその作製方法に関する。本発明は、これに限定されるわけではないが、生物材料またはプロセスの検出および／または描出などの各種の分析および生物医学用途において、例えばin vitroまたはin vivo内での組織または細胞画像化においてを含む、このようなナノ結晶の使用に関する。本発明は、核酸、タンパク質、または他の生体分子を含む検体の検出に使用されうる、このようなナノ結晶を含有する組成物およびキットにも関する。
【０００２】
[0002]半導体ナノ結晶（量子ドット）は、発光デバイス（ColvinらNature 370，354−357，1994；TesslerらScience 295，1506−1508，2002）、レーザ（KlimovらScience 290，314−317，2000）、太陽電池（HuynhらScience 295，2425−2427，2002）など、または細胞生物学などの生化学研究分野での蛍光生物標識などの各種の技術におけるその使用に関して大きな基礎的および技術的関心を受けてきた。例えばBruchezらScience，vol．281，pages 2013−2015，2001；Chan & Nie，Science，vol．281，pages 2016−2018，2001；米国特許第6,207,392号，summarized in Klarreich，Nature，vol．43，pages 450−452，2001を参照；またMitchell，Nature Biotechnology，pages 1013−1017，2001ならびに米国特許第6,423,551号，同第6,306,610号，及び同第6,326,144号を参照。
【０００３】
[0003]生物アッセイで使用するための高感度非同位体検出システムの開発は、多くの研究および診断分野、例えばＤＮＡ配列決定、臨床診断アッセイ、ならびに基礎細胞および分子生物学プロトコルに著しく影響を及ぼしてきた。現在の非同位体検出方法は、色変化する、または蛍光性、発光性である有機レポータ分子に主に基づいている。分子の蛍光標識付けは、生物学において標準技法である。標識は、広範なスペクトル特徴、短い寿命、光退色および細胞に対する潜在的毒性の通常の問題を引き起こす有機染料であることが多い。量子ドットの最近出現した技術は、無機錯体または粒子を使用する蛍光標識の開発に新たな時代を開いた。これらの物質は、大きなストックス（Stocks）シフト、より長い発光半減期、狭い発光ピークおよび最小限の光退色を含む、有機染料に勝る実質的な利点を与える（上で引用した参考文献を参照）。
【０００４】
[0004]過去１０年間にわたって、多種多様の半導体ナノ結晶の合成およびキャラクタリゼーションで多くの前進がなされた。最近の進歩は、相対的に単分散の量子ドットの大規模調製に至っている（MurrayらJ．Am．Chem．Soc，115，8706−15，1993；Bowen KatariらJ．Phys．Chem．98，4109−17，1994；HinesらJ．Phys．Chem．100，468−71，1996．Dabbousi，らJ．Phys．Chem．101，9463−9475，1997）。
【０００５】
[0005]発光量子ドット技術のさらなる進歩は、量子ドットの蛍光効率および安定性の向上を引き起こしている。量子ドットの顕著な発光特性は、金属および半導体コア粒子が約１〜５ｎｍの励起ボーア半径よりも小さいときに起こる、量子サイズ閉じ込めから生じる（Alivisatos，Science，271，933-37，1996；Alivisatos，J．Phys．Chem．100，13226−39，1996；Brus，Appl．Phys．A53，465−74，1991；WilsonらScience，262，1242−46，1993）。最近の研究では、改善された発光がサイズ調整可能なより低いバンドギャップのコア粒子を、より高いバンドギャップの無機材料シェルによりキャッピングすることによって達成されうることが示されている。例えばZnS層によって不動態化されたCdSe量子ドットは室温にて発光性が強く、その発光波長は粒径を変更することにより青色から赤色に調整されうる。その上、ZnSキャッピング層は表面非発光性再結合部位を不動態化して、量子ドットのより高い安定性を生じる（DabbousiらJ．Phys．Chem．B101，9463−75，1997．KortanらJ．Am．Chem．Soc．112，1327−1332，1990）。
【０００６】
[0006]発光量子ドット技術の前進にかかわらず、従来のキャップ発光量子ドットは、キャップ発光量子ドットが水溶性でないために生物用途には適切ではない。
【０００７】
[0007]この問題を克服するために、量子ドットの有機不動態化層は水溶性部分によって置換された。しかしながら得られた量子ドットは、発光性が高くない（ZhongらJ．Am．Chem．Soc．125，8589，2003）。２−メルカプトエタノールおよび１−チオ−グリセロールなどの短鎖チオールも、水溶性CdTeナノ結晶の調製で安定剤として使用されている（RogachらBer．Bunsenges．Phys．Chem．100，1772，1996；RajhらJ．Phys．Chem．97，11999，1993）。別の手法において、Cofferらは、デオキシリボ核酸（DNA）の水溶性キャッピング化合物としての使用について記載している（CofferらNanotechnology，69，1992）。このようなシステムのすべてで、コーティングナノ結晶は安定でなく、光輝性特性は時間と共に低下した。
【０００８】
[0008]さらなる研究では、SpanhelらがCd（OH）2キャップCdSゾルを開示した（Spanhel，らJ．Am．Chem．Soc．109，5649，1987）。しかしながらコロイド状ナノ結晶は非常に狭いｐＨ範囲（ｐＨ８〜１０）でのみ調製でき、１０を超えるｐＨにて狭い蛍光バンドを示した。このようなｐＨ依存性は、該材料の有用性を大幅に制限し、特に生物システムでの使用に不適切である。
【０００９】
[0009]PCT国際公開公報第00／17656号は、ナノ結晶を水溶性にするために、それぞれ式SH（CH2）n−COOH及びSH（CH2）H−SO3Hのカルボン酸またはスルホン酸化合物によってキャップされるコアシェルナノ結晶を開示する。同様にPCT出願国際公開公報第00／29617号およびイギリス特許第2342651号は、メルカプト酢酸またはメルカプト−ウンデカン酸などの有機酸がナノ結晶を水溶性にするためにナノ結晶の表面に結合され、タンパク質または核酸などの生体分子のコンジュゲーションに適していることを記載している。GB 2342651は、ナノ結晶の水溶性を与えるとされているキャッピング材料としてトリオクチルホスフィンの使用についても記載している。
【００１０】
[0010]別の手法は、水溶化剤としてのジアミノカルボン酸の使用を報告するPCT国際公開公報第00／27365号で教示されている。このPCT公報では、ジアミノ酸は１価キャッピング化合物によってナノ結晶コアに結合される。
【００１１】
[0011]PCT国際公開公報第00／17655号は、疎水性部分および親水性部分を有する可溶化剤の使用によって水溶性にされるナノ結晶を開示している。可溶化剤は疎水性基を介してナノ結晶に結合するのに対して、親水性基、例えばカルボン酸またはメタクリル酸は水溶性を供給する。
【００１２】
[0012]さらなるPCT出願（国際公開公報第02／073155号）において、各種の分子、例えばトリオクチルホスフィンオキシドヒドロキサメート、ヒドロキサム酸の誘導体または多座錯化剤、例えばエチレンジアミンがナノ結晶の表面に直接結合されてそれらを水溶性にする、水溶性半導体ナノ結晶が記載されている。これらのナノ結晶は次にＥＤＣを介してタンパク質に結合される。別の手法において、PCT出願国際公開公報第00／58731号は、血液細胞集合の分析に使用され、約3,000〜約3,000,000の分子量を有するアミノ誘導ポリサッカライドがナノ結晶に連結される、ナノ結晶を開示している。
【００１３】
[0013]米国特許第6,699,723号は、ビオチンおよびストレプトアビジンなどの生体分子の発光ナノ結晶プローブへの結合を促進するための連結剤としてのシランベース化合物の使用を開示している。米国特許出願第2004／0072373 A1号は、シランベース化合物を使用する生化学標識の方法について記載している。シラン連結ナノ粒子は、分子インプリンティングによってテンプレート分子に結合され、次に重合されてマトリクスを形成する。その後、テンプレート分子はマトリクスから除去された。テンプレート分子の除去のためにマトリクス中に生成された空洞は、標識化に使用されうる特性を有する。
【００１４】
[0014]最近、水溶性ナノ結晶を安定化させるための合成ポリマーの使用が報告されている。米国特許出願第2004／0115817 A1号は、両親媒性ジブロックポリマーの使用が疎水性相互作用を介して、表面がトリオクチルホスフィンまたはトリオクチルホスフィンオキシドなどの薬剤でコーティングされているナノ結晶に非共有的に結合されうることを記載している。同様にGaoら（Nature Biotechnology，vol．22，969−976，August 2004）は、両親媒性トリブロックコポリマーによって非共有結合性疎水性相互作用を介してカプセル化される水溶性半導体ナノ結晶を開示している。
【００１５】
[0015]これらの開発にもかかわらず、依然として、生物アッセイでの検出目的に使用することのできるナノ結晶が求められている。本報告において、生体分子の生物活性を保存する様式で生体分子に結合されうるナノ結晶を有することが望ましい。さらに、水性媒体中において安定で頑強な（ｒｏｂｕｓｔ）懸濁物または溶液として調製または貯蔵されうる水溶性半導体ナノ結晶を有することが望ましい。最後に、これらの水溶性ナノ結晶量子ドットは、高い量子効率によるエネルギー放出が可能であるべきであり、小粒径であるべきである。
【００１６】
[0016]したがって本発明の目的は、上の要求を満足するナノ結晶を提供することである。
【００１７】
[0017]本目的は、ナノ結晶およびそれぞれの独立請求項の特徴を有するナノ結晶を産生するプロセスによって解決される。
【００１８】
[0018]一態様において、本発明は、
元素周期系（PSE）の亜族Ib、亜族IIb、亜族IVb、亜族Vb、亜族VIb、亜族VIIb、亜族VIIIb、主族II、主族IIIまたは主族IVの元素から選択される少なくとも１つの金属M1を含むナノ結晶コア、を含み、さらに
ナノ結晶のコアの表面に結合されたキャッピング試薬であって、少なくとも２個のカップリング基を有するキャッピング試薬を含む第１層と、
第２層であって、コーティング試薬によって共有結合的にカップリングされた少なくとも２個のカップリング部分と、第２層に水溶性を与えるための少なくとも１個の水溶性基とを有する低分子量コーティング試薬を含む第２層と、
を含む、水溶性ナノ結晶に関するものである。
【００１９】
[0019]水溶性ナノ結晶は、
上で定義したようなナノ結晶コアをキャッピング試薬と反応させて、それによりキャッピング試薬をナノ結晶コアの表面に結合させ、ナノ結晶コアを包囲する第１層を形成するステップと、
キャッピング試薬に、キャッピング試薬の少なくとも２個のカップリング基に対して反応性である少なくとも２個のカップリング部分と、第２層に水溶性を与えるための少なくとも１個の水溶性基とを有する低分子量コーティング試薬をカップリングさせて、それにより第１層に共有結合的にカップリングされた第２層を形成して、ナノ結晶コアを包囲する水溶性シェルの形成を完了させるステップと、
を含む方法によって得られうる。
【００２０】
[0020]別の態様において、本発明は、
元素周期系（PSE）の主族II、亜族VIIA、亜族VIIIA、亜族IB、亜族IIB、主族IIIまたは主族IVの元素から選択される少なくとも１つの金属M1と、PSEの主族Vまたは主族VIから選択される少なくとも１つの元素Aとを含む、ナノ結晶コアを含み、さらに
ナノ結晶のコアの表面に結合されたキャッピング試薬であって、少なくとも２個のカップリング基を有するキャッピング試薬を含む第１層と、
第２層であって、コーティング試薬によって共有結合的にカップリングされた少なくとも２個のカップリング部分と、第２層に水溶性を与えるための少なくとも１個の水溶性基とを有する低分子量コーティング試薬を含む第２層と、
を含む、水溶性ナノ結晶に関するものである。
【００２１】
[0021]水溶性ナノ結晶は、
上で定義したようなナノ結晶コアをキャッピング試薬と反応させて、それによりキャッピング試薬をナノ結晶コアの表面に結合させ、ナノ結晶コアを包囲する第１層を形成するステップと、
キャッピング試薬に、キャッピング試薬の少なくとも２個のカップリング基に対して反応性である少なくとも２個のカップリング部分と、第２層に水溶性を与えるための少なくとも１個の水溶性基とを有する低分子量コーティング試薬をカップリングさせて、それにより第１層に共有結合的にカップリングされた第２層を形成して、ナノ結晶コアを包囲する水溶性シェルの形成を完了させるステップと、
を含む方法によって得られうる。
【００２２】
[0022]ナノ結晶をコーティングする従来の方法は通例、ナノ結晶コアを被覆する水溶性シェル間の界面に共有結合を含まない。本発明において、小型モノマーまたは低分子量オリゴマー分子を含むキャッピング試薬のどちらも、ナノ結晶表面をキャップして（たとえば金属硫黄または金属窒素結合を形成して）第１層としても既知であるキャッピング試薬層を形成するために最初に使用される。この第１層は、ナノ結晶コアに共有結合される。本ステップには、水溶性基を持つ低分子量コーティング試薬をキャッピング試薬にカップリング剤の存在下でカップリングするステップが続く。このカップリングは、ナノ結晶コア上での水溶性シェルの形成を引き起こす。シェルは、ナノ結晶コアの表面に結合および固定化される（図１も参照）。低分子量コーティング試薬はナノ結晶コアを包囲する共有結合的に架橋された層を形成するので、低分子量コーティング試薬はシェルを保全し、ナノ結晶コアに結合されるように補助して、それにより水溶性シェルがナノ結晶から剥離する可能性を低下させる。
【００２３】
[0023]別の態様において、本発明は、
上で定義したようなナノ結晶コアを提供するステップと、
ナノ結晶コアをキャッピング試薬と反応させて、それによりキャッピング試薬をナノ結晶コアの表面に結合させ、ナノ結晶コアを包囲する第１層を形成するステップと、
キャッピング試薬に、キャッピング試薬の少なくとも２個のカップリング基に対して反応性である少なくとも２個のカップリング部分と、第２層に水溶性を与えるための少なくとも１個の水溶性基とを有する低分子量コーティング試薬をカップリングさせて、それにより第１層に共有結合的にカップリングされた第２層を形成して、ナノ結晶コアを包囲する水溶性シェルの形成を完了させるステップと、
を含む、上で定義したようなコアを有する水溶性ナノ結晶を調製する方法に関するものである。
【００２４】
[0024]本発明は、水溶性ナノ結晶がナノ結晶を包囲する水溶性シェルの形成によって効果的に安定化されうるという発見に基づいている。このシェルは、ナノ結晶コアの表面に共有結合された（キャッピング試薬を含む）第１層と、第１層に共有結合的にカップリングされた、または共有結合的に架橋された低分子量コーティング試薬を含む第２層とを含む。この様式で合成された水溶性シェルが、発光の任意の実質的な消失なしにナノ結晶を水性環境にかなり長い期間にわたってとどまらせることが見出される。理論に縛られたくはないが、ナノ結晶の改善された安定性は水溶性シェルの保護機能に起因しうることが考えられる。シェルは、ナノ結晶コアと存在しうるイオン、ラジカルまたは分子などの反応性水溶性種との間の接触を減少させる密封ボックスまたは保護バリアとして挙動する。このことは、水性環境でのナノ結晶の凝集を防止するのに有用である。凝集を防止するに当たって、ナノ結晶は相互から電気的に絶縁されたままになり、それによりその光ルミネセンスを延長させることも考えられる。低分子量化合物をコーティング試薬として使用することにより、第１層と第２層との間の反応が容易に制御されうる。さらに低分子量化合物のコーティング試薬としての使用は、サイズが小さく、平滑表面形態を有するナノ結晶を生じさせる。別の利点は、そのように形成されたシェルもまた、組織および器官標的などの多様な生体物質の認識を促進しうる適切な生体分子または検体の結合を介して好都合に官能化することができることである。水溶性シェルを形成するためにキャッピング試薬と低分子量コーティング試薬の異なる組合せを実施することによって、本発明は、多岐に亘る用途に有用である改良された化学的および物理的特性を有する水溶性ナノ結晶の新たなクラスへの的確な経路を提供する。
【００２５】
[0025]本発明に従って、ナノ結晶（量子ドット）のいずれの適切な種類も、ナノ結晶の表面がキャッピング試薬と結合されうる限り、水溶性にされうる。この文脈では、「ナノ結晶」および「量子ドット」という用語は互換的に使用される。
【００２６】
[0026]一実施形態において、適切なナノ結晶は、金属のみを含むナノ結晶コアを有する。この目的のために、M1は、元素周期系（PSE）の主族II、亜族VIIA、亜族VIIIA、亜族IB、亜族IIB、主族IIIまたは主族IVの元素から成る群より選択されうる。したがってナノ結晶コアは、金属元素M1のみから成りうる。非金属元素AまたはBは、下で定義するように非存在である。本実施形態において、ナノ結晶は、PSEの上の族のいずれかからの純粋な金属、例えば金、銀、銅（亜族Ib）、チタン（亜族IVb）、テルビウム（亜族IIIb）、コバルト、プラチナ、ロジウム、ルテニウム（亜族VIIIb）、鉛（主族IV）またはその合金のみから成る。本発明は主に、対元素Aを含むナノ結晶のみに関して下で例示されるが、純粋な金属または純粋な金属の混合物より成るナノ結晶も本発明で使用されうることが理解される。
【００２７】
[0027]別の実施形態において、本発明で使用されるナノ結晶コアは、２つの元素を含みうる。したがってナノ結晶コアは、２つの金属元素M1及びM2を含む二元ナノ結晶合金、例えばZn、Cd、Hg、Mg、Mn、Ga、In、Al、Fe、Co、Ni、Cu、Ag、Au及びAuなどの金属から形成された任意の周知のコアシェルナノ結晶でありうる。本発明で適切な二元ナノ結晶の別の種類は、１つの金属元素M1と、PSEの主族Ｖまたは主族VIから選択される少なくとも１つの元素Aとを含みうる。したがって、現在、使用に適切なナノ結晶の１つの種類は、式M1Aを有する。このようなナノ結晶の例は、II−VI族半導体ナノ結晶（すなわち主族IIまたは亜族IIBからの金属と、主族VIからの元素とを含むナノ結晶）でありえて、ここでコアおよび／またはシェル（「シェル」という用語は本明細書で使用するように、ナノ結晶を封入した有機分子から生成された水溶性「シェル」とは異なり、区別される）は、CdS、CdSe、CdTe、MgTe、ZnS、ZnSe、ZnTe、HgS、HgSe、またはHgTeを含む。ナノ結晶コアは、任意のIII−V族半導体ナノ結晶（すなわち主族IIIからの金属と、主族Vからの元素とを含むナノ結晶）でもありうる。コアおよび／またはシェルは、GaN、GaP、GaAs、GaSb、InN、InP、InAs、InSb、AlN、AlP、AlAs、AlSbを含む。本発明で使用されうるコアシェルナノ結晶の具体例は、これに限定されるわけではないが、ZnSシェルを有する（CdSe）−ナノ結晶はもちろんのこと、ZnShシェルを有する（CdS）−ナノ結晶も含む。
【００２８】
[0028]本発明は、上述のコア−シェルナノ結晶の使用に限定されない。別の実施形態において、本発明のナノ結晶は、組成M11−xM2xAを有する均質三元合金より成るコアを有することができ、式中、
a) AがPSEの主族VIの元素を表すとき、M1及びM2は、元素周期系（PSE）の亜族IIb、亜族VIIa、亜族VIIIa、亜族Ibまたは主族IIから独立して選択され、または
b) AがPSEの主族（V）野元素を表すとき、M1及びM2はどちらもPSEの主族（III）の元素から選択される。
【００２９】
[0029]別の実施形態において、均質四元合金より成るナノ結晶が使用されうる。この種類の四元合金は組成M11−xM2xAｙB1−yを有し、式中、
a) A及びBの両方がPSEの主族VIの元素を表すときに、M1及びM2は、元素周期系（PSE）の亜族IIb、亜族VIIa、亜族VIIIa、亜族Ibまたは主族IIの元素から独立して選択され、または
b) A及びBの両方がPSEの主族（V）の元素を表すとき、M1及びM2はPSEの主族（III）の元素から独立して選択される。
【００３０】
[0030]均質三元または四元ナノ結晶のこの種類の例は、例えば、ZhongらJ．Am．Chem．Soc，2003 125，8598−8594，ZhongらJ．Am．Chem．Soc，2003 125，13559−13553、または国際特許出願2004／054923号に記載されている。
【００３１】
[0031]上に記載した式で使用されるような名称M1及びM2は、本明細書を通じて互換的に使用することができる。例えばCd及びHgを含む合金はそれぞれ別々に、M1またはM2によってはもちろんのこと、M2及びM2とも呼ぶことができる。同様に、PSEのVまたはVI族の元素の名称A及びBは互換的に使用される。それゆえ本発明の四元合金において、SeまたはTeはどちらも元素AまたはBと呼ぶことができる。
【００３２】
[0032]このような三元ナノ結晶は：
i) ナノ結晶の産生に適した形の元素M1を含有する反応混合物を適切な温度T1まで加熱して、この温度においてナノ結晶の産生に適した形の元素Aを添加し、反応混合物を上記二元ナノ結晶M1Aが形成するのに適した温度で十分な期間にわたって加熱して、次に反応混合物を冷却させることによって二元ナノ結晶M1Aを形成するステップと、
ii) 形成された二元ナノ結晶M1Aを沈殿または単離することなく、反応混合物を適切な温度T2まで再加熱し、この温度の反応混合物にナノ結晶の産生に適した形の元素Ｍの十分な量を添加して、次に上記三元ナノ結晶M11−xM2xAを形成するのに適した温度にて十分な期間にわたって反応混合物を加熱し、次に反応混合物を室温まで冷却して、三元ナノ結晶M11−xM2xAを単離するステップと、
を含むプロセスによって得ることができる。
【００３３】
[0033]これらの三元ナノ結晶において、指数xは、0.001＜x＜0.999の、好ましくは0.01＜x＜0.99、0.1＜0.9の、またはさらに好ましくは0.5＜x＜0.95の値を有する。なおさらに好ましい実施形態において、xは約0.3または約0.3〜約0.8または約0.9の値を有しうる。ここで利用される四元ナノ結晶において、yは、0.001＜y＜0.999の、好ましくは0．01＜y＜0.99の、あるいはさらに好ましくは0.1＜x＜0.95または約0.2〜約0.8の値を有する。
【００３４】
[0034]II−VI三元ナノ結晶において、そこに含まれる元素M1及びM2は好ましくは、Zn、Cd及びHgから成る群より独立して選択される。これらの三元合金中のPSEのVI族の元素Aは好ましくは、S、SeおよびTeから成る群より選択される。それゆえこれらの元素M1、M2及びAのすべての組合せは、本発明の範囲内である。好ましい実施形態において、使用されたナノ結晶は、組成ZnxCd1−xSe、ZnxCd1−xS、ZnxCd1−xTe、HgxCd1−xSe、HgxCd1−xTe、HgxCd1−xS、ZnxHg1−xSe、ZnxHg1−xTe、およびZnxHg1−xSを有する。
【００３５】
[0035]ある好ましい実施形態において、xは上の化学式で使用されるように、0.10＜x＜0.90または0.15＜x＜0.85の値を、さらに好ましくは0.2＜x＜0.8の値を有する。特に好ましい実施形態において、ナノ結晶は組成ZnxC1−x SおよびZnxCd1−xSeを有する。xが0.10＜x＜0.95の値を、さらに好ましくは0.2＜x＜0.8の値を有する、このようなナノ結晶が好ましい。
【００３６】
[0036]ナノ結晶コアが本発明のIII−Vナノ結晶から作製されるある実施形態において、元素M1及びM2の各々はGa及びInから独立して選択される。元素Aは好ましくはP、As及びSbから選択される。これらの元素M1、M2及びAのすべての考えられる組合せは、本発明の範囲内である。いくつかの現在好ましい実施形態において、ナノ結晶は組成GaxIn1−x P、GaxIn1−x AsおよびGaxIn1−x Asを有する。
【００３７】
[0037]発明において、ナノ結晶コアは、２つの主成分を含む水溶性シェル中に覆われている。水溶性シェルの第１の成分は、ナノ結晶コアの表面に親和性を有し、水溶性シェルの第１層を形成するキャッピング試薬である。第２の成分は、キャッピング試薬にカップリングされ、水溶性シェルの第２層を形成する低分子量コーティング試薬である。
【００３８】
[0038]ナノ結晶の表面への結合親和性を有する小型分子またはオリゴマーのすべての種類が、第１層を形成するためのキャッピング試薬として使用されうる。一実施形態において、化合物の１種類のみがキャッピング試薬として使用される。他の実施形態において、２、３、４つ以上（または少なくとも２つ）の異なる化合物の混合物がキャッピング試薬として使用される。好ましいキャッピング試薬は有機分子であり、第１にナノ結晶コアの表面上に固定化されるために付着または共有結合されうる少なくとも１個の部分を、そして第２に続いてのコーティング試薬とのカップリングに備えた少なくとも２個のカップリング基を有する。カップリング基はコーティング試薬に存在するカップリング部分と直接反応しうるか、またはカップリング基は、たとえばカップリング反応を開始するために、間接的に結合しうる、たとえばカップリング剤による活性化を必要としうる。これらの部分の各々はキャッピング試薬内で分子上の末端位置、または分子の主鎖に沿った非末端位置のどちらかに存在しうる。
【００３９】
[0039]一実施形態において、キャッピング試薬はナノ結晶のコア表面への親和性を有する１つの部分を含み、該部分はキャッピング試薬分子の末端位置に位置している。ナノ結晶コアと部分との間の相互作用は、疎水性または静電相互作用から、あるいは共有または配位結合から発生しうる。適切な末端基は、遊離（未結合）電子対を有し、それによりキャッピング試薬がナノ結晶コアの表面に結合できるようにする部分を含む。例示的な末端基は、S、N、P原子またはP＝O基を含有する部分を含む。これらの部分の具体的な例としては、例えばアミン、チオール、アミン−オキシドおよびホスフィンが挙げられる。
【００４０】
[0040]さらなる実施形態において、キャッピング試薬はさらに、末端基から疎水性領域によって離間された少なくとも１個のカップリング基を含む。各カップリング基は、任意の適切な数の主鎖炭素原子と、水溶性シェルの第２層を形成するために使用されるコーティング試薬上の相補的カップリング部分と反応しうる任意の適切な官能基を含みうる。例示的なカップリング部分は、ヒドロキシ（−OH）、アミノ（−NH2）、カルボキシル（−COOH）、カルボニル（−CHO）、シアノ基（−CN）から成る群より選択されうる。
【００４１】
[0041]好ましい実施形態において、キャッピング試薬は、次の一般式（G1）で示されるように、末端基から疎水性領域によって離間された２つのカップリング基を含む：
【化１】
式中
TG−末端基
HR−疎水性領域
CM1およびCM2−カップリング基
【００４２】
[0042]上の式G1において、カップリング基CM1およびCM2は親水性でありうる。親水性カップリング基の例としては、−NH2、−COOHまたはOH官能基が挙げられる。他の例としては、ニトリル、ニトロ、イソシアナート、無水物、エポキシドおよびハロゲン基が挙げられる。カップリング基は疎水性でありうる。疎水性および親水性基の組合せを有するキャッピング試薬が使用されうる。疎水性基の例としては、アルキル部分、芳香環、またはメトキシ基が挙げられる。各カップリング基は独立して選択され、親水性キャッピング試薬および疎水性キャッピング試薬の組合せは同時に使用されうる。
【００４３】
[0043]理論に縛られたくはないが、式（G1）で定義されたようなキャッピング試薬内の疎水性領域は、ナノ結晶コアが水性環境内に存在する荷電種を遮蔽できると考えられる。水性環境からナノ結晶コアの表面への電荷移動は、疎水性領域によって妨害されるようになり、それにより合成中の中間ナノ結晶（すなわちキャッピング試薬によってキャップされているナノ結晶）の早期反応停止を最小限に抑える。それゆえキャッピング試薬内での疎水性領域の存在は、ナノ結晶の最終量子収率を改善するのを補助しうる。この目的に適した疎水性部分の例としては、すべての脂肪族直鎖、環式、または芳香族炭化水素部分を含む、炭化水素部分が挙げられる。
【００４４】
[0044]一実施形態において、本発明のナノ結晶で使用されるキャッピング試薬は一般式（I）を有する：
【化２】
【００４５】
[0045]この式において、Xは、ナノ結晶コアの表面への親和性を有する末端基を表す。Xは、S、N、P、またはO＝Pから選択されうる。部分Hn−X−の具体例としては、次の、例えばH−S−、O＝P−、およびH2N−の１つが挙げられうる。Raは、少なくとも２個の主鎖炭素原子を含む部分であり、それゆえ疎水性特性を持つ。Raが主に疎水性特性、たとえば炭化水素である場合、Raは部分Zをナノ結晶コアから隔離する疎水性領域を提供する。部分Yは、N、C、−COO−、または−CH2O−から選択される。Zは、次の重合のために少なくとも１つのカップリング部分を含み、それゆえ親水性キャッピング試薬の部分に主に親水性特性を与える部分である。例示的な極性官能基としては、これに限定されるわけではないが、−OH、−COOH、−NH2、−CHO、−CONHR、−CN、−NCO、−COR及びハロゲン化合物を含む。式中の数字は、記号k、n、n’及びmによって表される。kは、０または１である。数字nは、０〜３の整数であり、n’は、０〜２の整数である。両方ともX及びYの価数要件をそれぞれ満足するために選択される。数字mは、１〜３の整数である。数字kは、０または１である。kが０ならば、ZがRaに結合されるという条件が適用される。k＝０の値は、カップリング部分ZがRaに直接結合される場合に対応し、ここでたとえばRaは環式部分、たとえば脂肪族シクロアルカン、芳香族炭化水素または複素環である。しかしながら、k＝１であるときに、Raが環式部分、たとえばベンゼン環に結合された３級アミノ基、または環式炭化水素であることが可能である。本式において、Zは、アミノ、ヒドロキシル、カルボニル、カルボキシル、ニトリル、ニトロ、イソシアナート、エポキシド、無水物およびハロゲン基から成る群より選択される官能基である。YまたはZのどちらかがカップリング基として機能することができる。Zがカップリング基として存在する場合、Yはカップリング基Zを結合するための構成成分として機能することができる。Zが非存在である場合、Yはカップリング基の一部を形成することができる。
【００４６】
[0046]上の式の部分Raは、数十〜数百個の主鎖原子を含んでもよい。詳細な一実施形態において、RaおよびＺの各々は独立して、２〜５０個の主鎖原子を含む。Zは、１個以上のアミドまたはエステル結合を含んでもよい。Raに使用されうる適切な部分の例としては、アルキル、アルケニル、アルコキシおよびアリール部分が挙げられる。
【００４７】
[0047]「アルキル」という用語は本明細書で使用するように、一般に２〜５０個の炭素原子を含む分岐または非分岐直鎖または環式飽和炭化水素基、例えばメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔ−ブチル、オクチル、デシル、テトラデシル、ヘキサデシル、エイコシル、テトラコシルはもちろんのこと、例えばシクロペンチル、シクロヘキシルなどのシクロアルキル基も指す。「アルケニル」という用語は本明細書で使用するように、一般に２〜５０個の炭素原子を含み、少なくとも１個の二重結合を含有する、通例１〜６個の二重結合を、より通例には１または２個の二重結合を含有する分岐または非分岐炭化水素基、例えばエテニル、ｎ−プロペニル、ｎ−ブテニル、オクテニル、デセニルはもちろんのこと、シクロアルケニル基、例えばシクロペンテニル、シクロヘキセニルなどを指す。「アルコキシ」という用語は本明細書で使用するように、Ｒが上で定義したようなアルキルである置換基−O−Rを指す。「アリール」という用語は本明細書で使用するように、そして別途規定しない限り、１個以上の芳香環を含有する芳香族部分を指す。アリール基は場合により、芳香環上で１個以上の不活性非水素置換基によって置換され、適切な置換基としては例えば、ハロ、ハロアルキル（好ましくはハロ置換低級アルキル）、アルキル（好ましくは低級アルキル）、アルケニル（好ましくは低級アルケニル）、アルキニル（好ましくは低級アルキニル）、アルコキシ（好ましくは低級アルコキシ）、アルコキシカルボニル（好ましくは低級アルコキシカルボニル）、カルボキシ、ニトロ、シアノおよびスルホニルが挙げられる。すべての実施形態において、Raは、一般に窒素、酸素または硫黄などのヘテロ原子を含むヘテロ芳香族部分を含んでもよい。
【００４８】
[0048]好ましい実施形態において、Raは、エチル、プロピル、ブチル、およびペンチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロオクチル、エトキシ、プロポキシ、ブトキシ、ベンジル、プリン、ピリジン、イミダゾール部分から成る群より選択される。
【００４９】
[0049]別の実施形態において、キャッピング試薬の少なくとも２個のカップリング基はホモ二官能性またはヘテロ二官能性であり、ホモ二官能性またはヘテロ二官能性のカップリング基は少なくとも２個の同一のカップリング基または２個の異なるカップリング基をそれぞれ含みうることを意味する。２または３個のカップリング基を備えたある適切なキャッピング試薬の例示的な例は、次のような各構造を有する。
【化３】
【００５０】
[0050]コーティング試薬がヘテロ二官能性である、すなわち２個の異なるカップリング基が存在する例示的なキャッピング試薬としては、これに限定されるわけではないが
【化４】
が挙げられる。
【００５１】
[0051]別の実施形態において、キャッピング試薬は、重合性不飽和基、例えばC＝C二重結合を介して、任意の遊離ラジカル重合機構を介してコーティング試薬をカップリングする。このようなキャッピング試薬の具体的な例としては、これに限定されるわけではないが、ω−チオール末端メチルメタクリレート、２−ブテンチオール、（Ｅ）−２−ブテン−１−チオール、Ｓ−（Ｅ）−２−ブテニルチオアセテート、Ｓ−３−メチルブテニルチオアセテート、２−キノリンメタンチオール、およびＳ−２−キノリンメチルチオアセテートが挙げられる。
【００５２】
[0052]ナノ結晶コアを包囲する水溶性シェルの第２の成分は、水溶性基を持つ低分子量コーティング試薬のキャッピング試薬へのカップリングによって形成される。カップリング剤は場合により、キャッピング試薬中に存在するカップリング基を活性化するために使用することができる。カップリング剤およびカップリング部分を持つコーティング試薬は続けて添加することができる、すなわちコーティング試薬は活性化が実施された後に添加される。あるいはコーティング試薬をカップリング剤と共に同時に添加することができる。
【００５３】
[0053]原則として、キャッピング試薬中のカップリング基を活性化するいずれのカップリング剤も、カップリング剤が第１層を形成するために使用されるキャッピング試薬および第２層を形成するために使用されるコーティング試薬と化学的に適合性である限り使用可能であり、キャッピング試薬およびポリマーと反応して、カップリング剤がキャッピング試薬およびポリマーの構造を変化させないことを意味する。理想的には、未反応カップリング剤は、カップリング剤分子がコーティング試薬分子によって完全に置換されるべきなので、ナノ結晶中に存在してはならない。しかしながら実際には、カップリング剤の未反応残基はそれにもかかわらず最終的なナノ結晶中に存在している可能性がある。
【００５４】
[0054]適切なカップリング剤の決定は、当業者の知識の範囲内である。適切なカップリング試薬の一例は、スルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）と組合せて使用される１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド（ＥＤＣ）である。これに限定されるわけではないがイミドおよびアゾールを含む、カップリング試薬の他の種類を使用することができる。使用することのできるイミドのある例は、カルボジイミド、スクシンイミドおよびフタルイミドである。イミドのある明示的な例としては、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドまたは他の任意の活性化分子と関連して使用される、１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド（ＥＤＣ）、スルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミドが挙げられる。
【００５５】
[0055]カップリング基が不飽和C＝C結合を含むキャッピング剤の場合、カップリング剤は、tert−ブチルペルアセテート、ベンゾイルペルオキシド、過流酸カリウム、および過酢酸のような開始剤を含む。カップリングを引き起こすために、カップリング基中の不飽和結合を活性化するために光開始剤も利用することができる。
【００５６】
[0056]水溶性シェルの第２層を形成するために使用されるコーティング試薬に、キャッピング試薬の活性化されたカップリング基と反応するであろうカップリング部分を有する１個以上の適切なカップリング部分を含めることができる。通例、適切なコーティング試薬は少なくとも２個のカップリング部分を有し、すなわちある実施形態において、たとえばキャッピング試薬の活性化されたカップリング基に対して反応性である２、３、または４個の官能基がある。図２に示すように、コーティング試薬の少なくとも２個のカップリング部分がキャッピング試薬と反応されたときに、コーティング試薬はたとえばエステルまたはアミド結合の形成によってキャッピング試薬に共有結合的にカップリングされる（「架橋される」）ようになり、それによりナノ結晶コアを包囲する水溶性シェルを形成する。
【００５７】
[0057]コーティング試薬のキャッピング試薬とのカップリングは、任意の適切なカップリング反応スキームによって実施することができる。適切な反応スキーム例としては、フリーラジカルカップリング、アミドカップリングまたはエステルカップリング反応が挙げられる。一実施形態において、キャッピング試薬にカップリングされるコーティング試薬は、キャッピング試薬上の露出されたカップリング基にカルボジイミド媒介カップリング反応によってカップリングされる。１つの好ましいカップリング反応は、１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミドによって供給され、スルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドによって促進されるカルボジイミドカップリング反応であり、そこではキャッピング試薬のカップリング基内のカルボキシ官能基およびアミノ官能基およびコーティング試薬上のカップリング部分が反応して、共有結合を形成する。
【００５８】
[0058]本発明の文脈において、水溶性シェルの第２層を形成するために使用されるような「低分子量コーティング試薬」という用語は、非ポリマー性（「小型」）分子を含む。コーティング試薬の分子量は、コーティング試薬分子中に存在する基の種類に応じて、低くても高くてもよい。コーティング試薬がたとえば小さい側鎖を有する場合、ここでコーティング試薬の分子量は低くなるであろう。大きい側鎖が存在するコーティング試薬の場合、ここでそのようなコーティング試薬分子の分子量は高くなるであろう。したがって、ある実施形態において、コーティング試薬の分子量の上限は、約２００、約４００、約６００ダルトンまたは約１０００とすることができる。高分子量または大きい空間体積のキャッピング試薬が使用される他の実施形態において、上限はより高く、たとえば約１２００、または約１５００、または約２０００ダルトンとすることができる。この定義に従って、「低分子量コーティング試薬」という用語も、たとえば約２０００ダルトンまでの分子量を有するオリゴマー化合物を含む。「カップリング」および「共有結合的カップリング」という用語は、単一のより大きい実体を形成するために２個の分子を共に接合する任意の種類の反応、たとえばエステルを形成するための酸およびアルコールのカップリング、またはアミドを形成するための酸およびアミンのカップリングを一般に指す。したがってキャッピング試薬およびコーティング試薬に存在するカップリング基およびカップリング部分をカップリングしうる任意の反応も、用語の意味の範囲内である。「カップリング」は、コーティング試薬をキャッピング試薬層に共有結合するために、キャッピング試薬中にカップリング基として存在する１個以上の不飽和基（たとえば−C＝C−二重結合）にコーティング試薬中の対応するカップリング部分をフリーラジカルカップリングによって反応させるステップも含む。
【００５９】
[0059]キャッピング試薬およびコーティング試薬は、重合を実施させるために相互に反応性である官能基をそれぞれ有することできる。一実施形態において、コーティング試薬は、各々がキャッピング試薬上のカップリング基と反応することができる少なくとも１個の共重合性官能基を有する少なくとも２個のカップリング部分を含む水溶性分子である。詳細な実施形態において、コーティング試薬は、式（II）：
【化５】
（式中、
Tは、溶解性を調整するための部分であり、
Rcは、少なくとも３個の主鎖炭素原子を含む部分であり、
Gは、N、またはCから選択され、
Z’は、共重合性部分であり、
nは、１または２の整数であり、および
n’は、０または１であり、ここでn’は、Gの価数要件を満足するように選択される）を有する水溶性分子でありうる。
【００６０】
[0060]所望の特性を有する水溶性シェルは、部分Rcが３０個未満の、好ましくは２０個未満の、またはさらに好ましくは１２個未満の主鎖炭素原子を有するキャッピング試薬によって得られうる。好ましい実施形態において、Rcは３から１２個の主鎖炭素原子を含む。特定の実験条件の下で、この範囲はナノ結晶の合成の間に、高いカップリング効率を提供した。部分Ｔは、ナノ結晶が配置される環境でのナノ結晶の溶解性を調整するための極性／親水性官能基でありうる。したがって部分Ｔは、シェルに親水性、または疎水性特徴を与えることができ、それゆえナノ結晶が非水性環境ではもちろんのこと、水性環境でも溶解されるようにする。Ｔは、たとえばヒドロキシル基、カルボキシル基、カルボニル基、スルホン酸基、リン酸基、アミノ基、カルボキサミド基などの極性基から選択されうる。部分Ｔは、水性環境で不溶性であるナノ結晶を得るために、疎水性、たとえば任意の脂肪族または芳香族炭化水素（たとえば脂肪酸またはベンゼン誘導体）、あるいは水に不溶性である他の任意の有機部分でもありうる。Tが疎水性である場合、Ｔはまた、コーティング試薬がキャッピング試薬と共重合された後に、親水性部分の包含によって修飾されうる。部分Z’は、キャッピング試薬上のカップリング部分と共重合しうる官能基を有する共重合性部分である。適切な官能基としては、これに限定されるわけではないが、たとえば−NH2、−COOHまたは−OH、−Br、−C＝C−が挙げられる。Ｚ’は加えて、好ましくは少なくとも２個の主鎖炭素原子を含む脂肪族または環式炭素鎖を含みうる。
【００６１】
[0061]一実施形態において、Tはシクロデキストリン分子に由来しうる。シクロデキストリン分子は、得られたコポリマーの水溶性を改善する多数のヒドロキシル基を有し、また生体標識目的で生体分子に容易にコンジュゲートしうる。適切である適切なシクロデキストリンの例としては、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリン、ジメチル−α−シクロデキストリン、トリメチル−α−シクロデキストリン、ジメチル−β−シクロデキストリン、トリメチル−β−シクロデキストリン、ジメチル−γ−シクロデキストリン、およびトリメチル−γ−シクロデキストリンが挙げられる。
【００６２】
[0062]さらに別の実施形態において、コーティング試薬は、アミノ酸、好ましくはジアミノ酸またはジカルボキシルアミノ酸から選択される水溶性分子である。現在考慮されるジアミノ酸の具体例としては、２、３例のみ挙げると、２，４−ジアミノ酪酸、２，３−ジアミノプロピオン酸または２，５−ジアミノペンタン酸が挙げられる。本発明で考慮されるジカルボン酸としては、これに限定されるわけではないが、アスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられる。
【００６３】
[0063]他の実施形態において、コーティング試薬は
【化６】
から成る群より選択される水溶性分子であり、
式中、CDはシクロデキストリン、および
【化７】
である。
【００６４】
[0064]キャッピング試薬が不飽和基（たとえばC＝C二重結合）を含む別の実施形態において、カップリングに使用されうる適切なコーティング試薬としては、１，４−ブタジエン、１，５−ペンタジエン、および１，６−ヘキサジエンなどのジエンおよびトリエンが挙げられる。
【００６５】
[0065]ナノ結晶を官能化することによって、本発明のナノ結晶が多様な用途で使用されることが可能となる。さらなる実施形態において、水溶性シェルは水溶性シェルに親和性リガンドを結合することによって官能化される。このようなナノ結晶は、親和性リガンドが結合特異性を有する基質の存在または非存在を検出することができる。サンプル中に存在する場合、官能化ナノ結晶の親和性リガンドと標的化基質との間の接触と、続いての結合は、多様な目的を果たすことができる。例えば、量子化、描出のための検出可能な信号、または検出の他の形を放出することができる、官能化ナノ結晶−基質を含む複合体を形成させることができる。考慮される親和性リガンドとしては、キメラまたは遺伝子修飾モノクローナル抗体を含むモノクローナル抗体、ペプチド、アパタマー、核酸分子、ストレプトアビジン、アビジン、レクチンなどが含まれる。
【００６６】
[0066]上の開示に従って、本発明の別の態様は、水溶性ナノ結晶を調製する方法に関する。
【００６７】
[0067]水溶性シェルの合成は、最初にキャッピング試薬にナノ結晶を接触させて、それによりキャッピング試薬にナノ結晶を反応させることによって実施することができる。接触は直接または間接的のどちらかで実施することができる。直接接触は、いずれの配位リガンドの使用も含まない、ナノ結晶コアのキャッピング試薬を含有する溶液への浸漬を指す。間接接触は、キャッピング試薬を接触させる前に、ナノ結晶コアを初回刺激するための配位リガンドの使用を指す。間接接触は通例、２つのステップを含む。接触のどちらの方法も本発明で実行可能である。しかしながら間接接触の後者の方法は、配位リガンドのキャッピング試薬のナノ結晶コア表面への結合の高速化を助けるので好ましい。
【００６８】
[0068]間接接触は次のように詳説されるであろう。間接接触の第１のステップにおいて、配位リガンドは好ましくは有機溶媒に溶解させることによって調製される。次にナノ結晶コアは有機溶媒中に規定の期間にわたって浸漬されて、ナノ結晶コアの表面に十分に安定な不動態化層を形成させる（以下、「不動態化ナノ結晶」と呼ばれる）。不動態化層は、ナノ結晶コアに接触しうるいずれの親水性種もはじく役割を果たし、それによりナノ結晶のいずれの劣化も防止する。受動態化ナノ結晶を単離されて、所望ならばいずれの好ましい期間にわたっても、配位リガンドを含有する有機溶媒中に貯蔵してもよい。所望ならば、適切な中性有機溶媒、例えばクロロホルム、メチレンクロライド、またはテトラヒドロフランを添加することができる。
【００６９】
[0069]間接接触の第２のステップにおいて、有機溶媒の存在下または水溶液中でリガンド交換が実施される。リガンド交換（置換）は、受動態化ナノ結晶とキャッピング試薬との接触を促進するために、キャッピング試薬の過剰量を受動態化ナノ結晶に添加することによって実施される。高レベルの置換を達成するために必要な接触時間は、反応混合物を必要な期間にわたって撹拌または超音波処理することによって短縮されうる。十分な長さの時間の後、キャッピング試薬は受動態化層を置換して、それ自体がナノ結晶に結合されるようになり、それゆえ続くコーティング試薬のカップリングのためにナノ結晶コアの表面をキャッピングする。
【００７０】
[0070]間接接触で使用される配位リガンドは、ナノ結晶コアの表面への親和性を有する部分を含むいずれの分子でもよい。この親和性は、例えば静電相互作用、共有結合または配位結合の形で現れることがある。適切な配位リガンドとしては、これに限定されるわけではないが、疎水性分子、または親水性部分に結合された疎水性鎖を含む両親媒性分子、例えば極性官能基を含む。このような分子の例としては、トリオクチルホスフィン、トリオクチルホスフィンオキシド、またはメルカプトウンデカン酸が挙げられる。使用されうる配位リガンドの他の種類としては、チオール、アミンまたはシランを挙げることができる。
【００７１】
[0071]キャッピング試薬とコーティング試薬との間接接触経路によるカップリングを実施するためのスキームを図４に示す。最初に、ナノ結晶コアはトリオクチルホスフィンオキシド（ＴＯＰＯ）などの配位溶媒中で調製でき、ナノ結晶コア表面上に不動態化層の形成を生じさせる。次にＴＯＰＯ層はキャッピング試薬によって置換される。置換は、高濃度のキャッピング試薬を含有する媒体中でのＴＯＰＯ層状化ナノ結晶の分散によって起こりうる。このステップは通例、有機溶媒または水溶液のどちらかで実施することができる。好ましい有機溶媒としては、極性有機溶媒、例えばピリジン、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ＤＭＳＯ、ジクロロメタン、エーテル、クロロホルム、またはテトラヒドロフランが挙げられる。その後、キャッピング試薬にカップリングされるキャッピング試薬が調製されて、キャップされたナノ結晶コアに添加される。
【００７２】
[0072]本発明の方法は、一旦、水溶性シェルの第１層が形成し、キャッピング試薬によってキャッピングされたナノ結晶を、水溶性基を有するコーティング試薬とカップリングするさらなるステップの実施を含む。カップリングは、所望ならばカップリング剤の存在下で実施することができる。カップリング剤は、キャッピング試薬を初回刺激して、コーティング試薬に対して反応性にするために使用してもよいし、またはカップリング剤は、コーティング試薬のカップリング部分を初回刺激して、キャッピング試薬に対して反応性にするために使用してもよい。好ましい実施形態において、ＥＤＣ（１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド）は、場合によりスルホＮＨＳ（スルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）によって補助されるカップリング剤として使用することができる。架橋剤を含む、カップリング試薬の他の種類も使用することができる。例としては、これに限定されるわけではないが、カルボジイミド、たとえばジイソプロピルカルボジイミド、カルボジシクロヘキシルイミド、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ；Pierce），Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチル−チオアセテート（ＳＡＴＡ）、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオナート（ＳＰＤＰ）、オルトフェニレンジマレイミド（ｏ−ＰＤＭ）、およびスルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシラート（スルホ−ＳＭＣＣ）およびアゾールが挙げられる。カップリング剤は、Ｏ−尿素誘導体を形成するためにカルボキシル基を活性化して、カルボン酸とアミンとの間のアミド結合の形成を触媒する。この誘導体は、求核性アミン基とただちに反応して、それによりカップリング反応を加速する。
【００７３】
[0073]例示のために、カップリング基xモルを有するキャッピング試薬xモルが、ナノ結晶コア各１モルに結合することができると仮定する。（キャッピング試薬xモルに結合された）ナノ結晶コア１モルと完全に反応するためにコーティング試薬yモルがカップリング部分xモルを含有する場合、ここでコーティング試薬対ナノ結晶の混合比は、ナノ結晶コア１モルあたり少なくともコーティング試薬yモルである。実際にキャッピング試薬は、ナノ結晶上での完全なキャッピングを確保するために、通常過剰で反応させられる。未反応キャッピング試薬は、たとえば遠心分離によって除去されうる。キャッピングされたナノ結晶とカップリングするために添加されたコーティング試薬の量も同様に過剰に、キャッピングされたナノ結晶１モル当たり通例、コーティング試薬約１０、または約２０、または約３０〜１０００モルの領域で添加することができる。
【００７４】
[0074]コーティング試薬をナノ結晶コアの表面にキャップされているキャッピング試薬にカップリングするために、コーティング試薬をカップリング剤の存在下でキャッピング試薬と混合する。カップリング剤およびコーティング試薬は、第１層を含むナノ結晶を含有する溶液に同時に添加することができる（実施例１および２を参照）か、またはカップリング剤およびコーティング試薬は連続して添加でき、コーティング試薬はカップリング剤の後に添加される。カップリング剤は、キャッピング試薬およびコーティング試薬中にそれぞれ存在するカップリング剤およびカップリング部分を活性化するための開始剤として作用する。その後、コーティング試薬はキャッピング試薬とカップリングされ、ナノ結晶コアを包囲する第２層が形成される。
【００７５】
[0075]カップリング反応は、水溶液中または有機溶媒中で実施されうる。例えばカップリング反応は、水溶液中で、例えば開始剤、安定剤または重合の動態を改善するための相間移動試薬を含む、適切な添加剤を含む水中で実施されうる。カップリング反応は、緩衝溶液、例えばリン酸またはアンモニウム緩衝溶液中でも実施することができる。加えて重合は、適切な添加剤、例えばカップリング試薬および触媒を含む無水有機溶媒中で実施することができる。一般に使用される有機溶媒としては、ＤＭＦ、ＤＭＳＯ、クロロホルム、ジクロロメタン、およびＴＨＦが挙げられる。
【００７６】
[0076]最後に、水溶性シェルのコーティング試薬層が一旦キャッピング試薬にカップリングされると、第２層中に含まれるコーティング試薬に、第２層中に存在する水溶性基を露出させるのに適した試薬への反応を含む最終ステップを実施することができる。たとえば使用されるコーティング試薬が（そうでなければ第２層の形成を妨害しうるカルボキシル基を防御するために）エステル結合を含む場合、エステルはナノ結晶にアルカリ性溶液（たとえば水酸化ナトリウム）を添加することによって加水分解させることができる。ナノ結晶にアルカリ性溶液を添加することで、第２層中のカルボキシル基を溶液中に放出させることができ、それによりナノ結晶に水溶性を付与する。
【００７７】
[0077]本発明はさらに、所与の検体への結合親和性を有する分子にコンジュゲートされている、本明細書で開示するようなナノ結晶に関する。所与の検体への結合親和性を有する分子をナノ結晶へコンジュゲートすることによって、マーカー化合物またはプローブが形成される。このようなプローブでは、本発明のナノ結晶は、所与の検体の検出に使用することができる、例えば電磁スペクトルの可視または近赤外範囲の放射線を放出する標識またはタグとして作用する。
【００７８】
[0078]原則として、検体に少なくとも多少特異的に結合できる特異的な結合パートナーが存在する各検体を検出することができる。検体は、薬物（例えばアスピリン（登録商標）またはリバビリン）などの化学化合物、あるいはタンパク質（例えばトロポニンに特異性の抗体または細胞表面タンパク質）または核酸分子などの生化学分子でありうる。興味のある検体、例えばリバビリンのための結合親和性を備えた適切な分子（検体結合パートナーとも呼ばれる）にカップリングされたとき、得られたプローブは例えば、患者の血漿中の薬物レベルを監視するための蛍光免疫測定法に使用することができる。心筋の損傷の、それゆえ一般に心臓発作のマーカータンパク質であるトロポニンの場合、抗トロポニン抗体および本発明のナノ結晶を含有するコンジュゲートを、心臓発作の診断に使用することができる。本発明のナノ結晶と腫瘍関連細胞表面タンパク質に特異性である抗体とのコンジュゲートの場合、このコンジュゲートを腫瘍診断または撮像に使用することができる。別の例は、ナノ結晶とストレプトアビジンとのコンジュゲートである。
【００７９】
[0079]検体は、これに限定されるわけではないが、ウィルス粒子、染色体または全細胞を含む複合生物構造であってもよい。例えば検体結合パートナーが細胞膜に結合する脂質である場合、このような脂質に結合された本発明のナノ結晶を含むコンジュゲートが、全細胞の検出および描出に使用することができる。細胞染色または細胞撮像などの目的のために、可視光を放出するナノ結晶を使用することが好ましい。この開示に従って、検体結合パートナーにコンジュゲートされた本発明のナノ粒子を含むマーカー化合物の使用によって検出される検体は、好ましくは生体分子である。
【００８０】
[0080]したがってさらに好ましい実施形態において、検体に対して結合親和性を有する分子は、タンパク質、ペプチド、免疫原性ハプテンの特徴を有する化合物、核酸、炭水化物または有機分子である。検体結合パートナーとして利用されるタンパク質は例えば、抗体、抗体断片、リガンド、アビジン、ストレプトアビジンまたは酵素でありうる。有機分子の例は、ビオチン、ジゴキシゲニン、セロトロニン、葉酸誘導体、抗原、ペプチド、タンパク質、核酸および酵素などである。核酸は、これに限定されるわけではないが、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＰＮＡ分子、１０〜５０ｂｐを持つ短オリゴヌクレオチドはもちろんのこと、より長い核酸からも選択されうる。
【００８１】
[0081]生体分子の検出に使用される場合、本発明のナノ結晶は、宿主分子の表面露出基を介して結合活性を有する分子にコンジュゲートさせることができる。この目的では、アミン、ヒドロキシルまたはカルボキシラート基などのコーティング試薬の表面露出官能基は、連結剤と反応させることができる。連結剤は本明細書で使用するように、本発明のナノ結晶を、任意の生物標的への結合親和性を有する分子へ連結することができる任意の化合物を意味する。ナノ結晶を検体結合パートナーにコンジュゲートするために使用されうる連結剤の種類の例は、エチル−３−ジメチルアミノカルボジイミドなどの（２官能性）連結剤または当業者に既知である他の適切なカップリング化合物である。適切な連結剤の例は、Ｎ−（３−アミノプロピル）３−メルカプト−ベンズアミド、３−アミノプロピル−トリメトキシシラン、３−メルカプトプロピル−トリメトキシシラン、３−（トリメトキシシリル）プロピル−マレイミド、および３−（トリメトキシシリル）プロピル−ヒドラジドである。コーティング試薬も、所期の結合親和性を有する選択された分子また検体結合パートナーに連結されている適切な連結剤とコンジュゲートされせることができる。例えばコーティング試薬がシクロデキストリン部分を含む場合、そこでこれに限定されるわけではないが、そのすべてが興味のある分子との共有結合を形成するための適切な反応性基を有する、フェロセン誘導体、アダマンタン化合物、ポリオキシエチレン化合物、芳香族化合物を含む適切な連結剤を使用することができる。
【００８２】
[0082]さらに本発明は、ここで定義されるようなナノ結晶の少なくとも１種類を含有する組成物にも関する。ナノ結晶をプラスチックビーズ、磁気ビーズまたはラテックスビーズに包含してもよい。さらにここで定義されるようなナノ結晶を含有する検出キットも本発明の一部である。
【００８３】
[0083]本発明は、次の非制限的な実施例および添付図面によってさらに説明される。
【００８４】
［実施例１］
水溶液中での架橋シェルを持つ水溶性ナノ結晶の調製
[0088]TOPOキャップナノ結晶は、次の手順に従って最初に調製された。
【００８５】
[0089]トリオクチルホスフィンオキシド（ＴＯＰＯ）（３０ｇ）をフラスコに入れて、真空下（〜１トール）で１８０℃にて１時間乾燥させた。次いでフラスコに窒素を充填して、３５０℃まで加熱した。不活性雰囲気ドライボックス中で、次の注射溶液を調製した。CdMe2（０．３５ｍｌ）、１Ｍトリオクチルホスフィン−Se（ＴＯＰＳＥ）溶液（４．０ｍｌ）、およびトリオクチルホスフィン（ＴＯＰ）（１６ｍｌ）。注射溶液は完全に混合され、注射器に装填されて、ドライボックスから取り出された。
【００８６】
[0090]反応から熱を除去して、反応混合物は１回の連続注射によって激しく撹拌されているＴＯＰＯ中に移された。反応フラスコに加熱が使用され、温度を２６０〜２８０℃まで徐々に上昇させた。反応後、反応フラスコは約６０℃まで冷却され、ＴＯＰＯの固化を防止するためにブタノール２０ｍｌが添加された。大量のメタノールの添加は、粒子を綿状塊にさせた。綿状塊は遠心分離によって上清から分離された。得られた粉末は、光学的に透明な溶液を生成するために、各種の有機溶媒中に分散させることができる。
【００８７】
[0091]ＴＯＰＯ５ｇを含有するフラスコは１９０℃にて真空下で数時間加熱され、次に６０℃まで冷却され、その後トリオクチルホスフィン（ＴＯＰ）０．５ｍｌが添加された。ヘキサン中に分散されたCdSeドット約０．１〜０．４μｍｏｌは注射器で反応容器に移され、溶媒はポンプで除去された。ジエチル亜鉛（ZnEt2）およびヘキサメチルジシラチアン（（TMS）2S）は、ZnおよびＳ前駆物質としてそれぞれ使用された。前駆物質等モル量を不活性雰囲気のグローブボックス内でＴＯＰ２〜４ｍｌに溶解させた。前駆物質溶液は注射器に装填され、反応フラスコに取り付けられた添加漏斗に移された。添加が完了した後、混合物は９０℃まで冷却され、数時間撹拌されたままであった。室温への冷却時にＴＯＰＯが固化するのを防止するために、混合物にブタノールが添加された。
【００８８】
[0092]このように形成された（CdSe）−ZnSコアシェルナノ結晶は、２、３滴のピリジンと共にきわめて過剰量の３−メルカプトプロピオン酸を含むクロロホルム中に溶解された。混合物は超超音波処理（ultrasonication）を約２時間受けさせされて、室温にて一晩撹拌させておいた。形成された沈殿は遠心分離によって収集され、過剰の酸を除去するためにアセトンで洗浄された。残渣はアルゴン蒸気によって短時間乾燥させた。ナノ結晶コアを被覆／包囲する第１層を形成するカルボン酸の分子によってコーティングされた、得られたナノ結晶は次に水または緩衝溶液に溶解された（図２、ステップ１を参照）。水溶液中のナノ結晶はもう１回遠心分離され、０．２μｍフィルタで濾過させられて、アルゴンによって脱気され、使用前に２５℃で貯蔵された。
【００８９】
[0093]架橋界面の形成および続いての第２層に含まれるコーティング試薬層との重合のために、カルボン酸キャップナノ結晶は水性緩衝系に溶解された。ＥＤＣ（１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド）およびスルホＮＨＳ（スルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）は架橋剤としてナノ結晶溶液に、５００〜１０００倍の過剰量で添加された。得られた溶液は、架橋界面の形成に関与する官能基の活性化のために、室温にて３０分間撹拌された（図２、ステップ２を参照）。カルボン酸キャップナノ結晶、ＥＤＣおよびスルホＮＨＳを含有する混合物は、同じ緩衝器内でジアミノカルボキシルメチルエステル溶液に撹拌しながら滴加された。混合物は室温にて２時間撹拌され、次に、架橋界面の形成および第２層に含まれているコーティング試薬の第１層への共有結合のために４℃にて一晩放置された（図２、ステップ３を参照）。ジアミノカルボキシルエステルの水溶性カルボキシル基を放出させて（すなわちメチルエステル結合の加水分解）、それゆえ第２の水溶性層を形成するために、次に０．１Ｎ NaOHおよびエタノールが添加され、溶液は室温にてさらに６時間撹拌を続けられた（図２、ステップ４）を参照。溶液は任意の固体も除去するために遠心分離され、ストック溶液として水溶液中に４℃にて貯蔵された。
【００９０】
[0094]得られた量子ドットは有機溶媒抽出によっても精製されうる。反応（架橋界面の形成および第２層に含まれているコーティング試薬の第１層への共有結合）が完了した後、エステル表面を備えたポリマーシェルを持つ量子ドットを有機溶媒から抽出するために、溶液はエチルアセテートによって抽出された。そのように得られた有機溶媒は合せられて乾燥され、次に回転蒸発機によって除去されて、エステル結合の加水分解および水溶性ナノ結晶の形成のために、エタノールおよび０．１Ｎ ＮａＯＨに溶解された。溶液は室温にて４時間にわたり絶えず撹拌され、次に中和された。得られた透明溶液は、任意の微量の固体を除去するために遠心分離され、脱気後に室温にて水溶液中に貯蔵された。
【００９１】
[0095]本発明の得られた架橋水溶性シェルを持つナノ結晶の物理化学的特性は、メルカプトプロピオン酸（ＭＣＡ）またはアミノエタンチオール（ＡＥＴ）のみでキャッピングされた（CdSe）−ZnSコアシェルナノ結晶の物理化学的特性と次のように比較された。ナノ結晶の水溶液に、H2O2が最終濃度０．１５ｍｏｌ／ｌで添加され、化学挙動が分光写真器によって追跡された。ＭＣＡまたはＡＥＴによってのみコーティングされたナノ結晶では、ナノ結晶の酸化がただちに検出され、ナノ結晶は３０分以内に沈殿した。これに対して本発明のシェル化ナノ結晶は、ごく低速で発生する化学的酸化に対して著しくさらに安定であった。
【００９２】
[0096]さらなる実験において（データは示さず）、０．１Ｍ CdSO4溶液がＭＣＡのみでキャッピングされた（CdSe）−ZnSコアシェルナノ結晶または本発明のシェルを持つナノ結晶のどちらかに添加されたとき、ＭＣＡキャップナノ結晶は溶液から迅速に沈殿した。これに対して、本発明のナノ結晶は溶液中で安定を維持し、カドミウムイオンの添加がその安定性に有意な効果を持たないことを示している。
【００９３】
[0097]同様に、シェルを持つナノ結晶の光化学安定性も、ＭＣＡキャップナノ結晶と比較して有意に改善された（データは示さず）。波長２５４ｎｍのUV光に露出されたときに、ＭＣＡキャップナノ結晶は４８時間内に溶液から沈殿するのが見出されたのに対して、本発明のシェルを持つナノ結晶は４日間安定であった。蛍光強度も長時間にわたって安定であることが見出された。
【００９４】
［実施例２］
有機溶液中での架橋シェルを持つ水溶性ナノ結晶の調製
[0098]ＴＯＰＯキャップナノ結晶は実施例１に従って調製され、第１層の形成のために過剰量のペンタン−（３−Ｎ−エチルチオール）−１，５−ジアミンの過剰量と共にクロロホルムに溶解された（図３、ステップ１を参照）。混合物は室温にて一晩放置された。形成された沈殿は遠心分離によって収集され、次にメタノールで洗浄され、アルゴンガスによって短時間乾燥された。得られたナノ結晶は無水ＤＭＦ（５０ｍｌ）に溶解された。
【００９５】
[0099]別のフラスコに、ペンタン−３，３−ジエチル−カルボン酸エステル−１，５−ジカルボン酸（第２層に含まれるコーティング剤として）をＤＭＦにＥＤＣおよびＮＨＳ ５当量と共に溶解され、窒素保護の下で室温にて２０分間撹拌された（図３、ステップ２を参照）。コーティング剤との共有結合的カップリングのために、ナノ結晶溶液に溶液がゆっくり添加された（図３、ステップ３を参照）。得られた溶液を室温にて２時間撹拌した後に、ＤＭＦ溶媒は減圧下でロータベーパーシステムを使用することによって蒸発された。得られたスラリーは水５ｍｌに溶解され、次に第２層に溶媒露出水溶性結合を形成するために、１Ｍ EtONa／EtOH溶液５ｍｌが添加され、室温にてさらに２時間撹拌された。得られた溶液は、任意の微量の添加剤または未反応開始物質を除去するために、エーテルで２回洗浄された（５ｍｌ×２）。溶液は次に、貯蔵のために０．１Ｎ HCl水溶液で中和された。さらなる精製は、ポリマーコートナノ結晶の酸性溶液中での遠心分離および溶液のｐＨ値の調整によるナノ結晶の水への再溶解によって実施された。
【図面の簡単な説明】
【００９６】
【図１Ａ】本発明の水溶性ナノ結晶の一般化された図を示す。
【図１Ｂ】キャッピング試薬ヘプタン−（４−Ｎ−エチルチオール）−１，７−ジカルボン酸（第１層を形成するために使用される）と第２層を形成するためのコーティング試薬として使用されるジ−（３−アミノプロピル）−６−Ｎ−ヘキサン酸メチルエステル）との間に形成された架橋界面の拡大概略図を示す（図２も参照）。図１ｂよりわかるように、コーティング試薬分子がキャッピング試薬分子を共に連結する橋として作用するように、ナノ結晶は、キャッピング試薬の少なくとも２個の（隣接する）分子とコーティング試薬の１個の分子との間の共有結合から形成された界面領域を含む。
【図２Ａ】コーティング試薬としてのジアミンカルボキシルエステル（ジ−（３−アミノプロピル）−６−Ｎ−ヘキサン酸メチルエステル）、およびキャッピング試薬としてのヘプタン−（４−Ｎ−エチルチオール）−１，７−ジカルボン酸を使用する架橋によって形成された、ポリアミドシェル内にカプセル化された水溶性ナノ結晶を合成するための方法の概略図を示す。本実施例では、形成された第２層は露出されたカルボン酸基を含有する。
【図２Ｂ】コーティング試薬としてのジアミンカルボキシルエステル（ジ−（３−アミノプロピル）−６−Ｎ−ヘキサン酸メチルエステル）、およびキャッピング試薬としてのヘプタン−（４−Ｎ−エチルチオール）−１，７−ジカルボン酸を使用する架橋によって形成された、ポリアミドシェル内にカプセル化された水溶性ナノ結晶を合成するための方法の概略図を示す。本実施例では、形成された第２層は露出されたカルボン酸基を含有する。
【図３Ａ】第１層を形成するためのキャッピング試薬としてのペンタン−（３−Ｎ−エチルチオール）−１，５−ジアミン、および第２層を形成するためのコーティング試薬としてのペンタン−３，３−ジエチルカルボン酸エステル−１，５−ジカルボン酸を使用する架橋によって形成された、ポリアミド水溶性シェル内にカプセル化された水溶性ナノ結晶を合成するための方法の概略図を示す。
【図３Ｂ】第１層を形成するためのキャッピング試薬としてのペンタン−（３−Ｎ−エチルチオール）−１，５−ジアミン、および第２層を形成するためのコーティング試薬としてのペンタン−３，３−ジエチルカルボン酸エステル−１，５−ジカルボン酸を使用する架橋によって形成された、ポリアミド水溶性シェル内にカプセル化された水溶性ナノ結晶を合成するための方法の概略図を示す。
【図４】メルカプトプロピオン酸（ＭＣＡ）またはアミノエタンチオール（ＡＥＴ）のみでキャッピングされた（CdSe）−ZnSコアシェルナノ結晶の一方と比較した、本発明のシェルを持つナノ結晶の化学的酸化に対する安定性を示す。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
[0001]本発明は、新規な水溶性ナノ結晶およびその作製方法に関する。本発明は、これに限定されるわけではないが、生物材料またはプロセスの検出および／または描出などの各種の分析および生物医学用途において、例えばin vitroまたはin vivo内での組織または細胞画像化においてを含む、このようなナノ結晶の使用に関する。本発明は、核酸、タンパク質、または他の生体分子を含む検体の検出に使用されうる、このようなナノ結晶を含有する組成物およびキットにも関する。
【０００２】
[0002]半導体ナノ結晶（量子ドット）は、発光デバイス（ColvinらNature 370，354−357，1994；TesslerらScience 295，1506−1508，2002）、レーザ（KlimovらScience 290，314−317，2000）、太陽電池（HuynhらScience 295，2425−2427，2002）など、または細胞生物学などの生化学研究分野での蛍光生物標識などの各種の技術におけるその使用に関して大きな基礎的および技術的関心を受けてきた。例えばBruchezらScience，vol．281，pages 2013−2015，2001；Chan & Nie，Science，vol．281，pages 2016−2018，2001；米国特許第6,207,392号，summarized in Klarreich，Nature，vol．43，pages 450−452，2001を参照；またMitchell，Nature Biotechnology，pages 1013−1017，2001ならびに米国特許第6,423,551号，同第6,306,610号，及び同第6,326,144号を参照。
【０００３】
[0003]生物アッセイで使用するための高感度非同位体検出システムの開発は、多くの研究および診断分野、例えばＤＮＡ配列決定、臨床診断アッセイ、ならびに基礎細胞および分子生物学プロトコルに著しく影響を及ぼしてきた。現在の非同位体検出方法は、色変化する、または蛍光性、発光性である有機レポータ分子に主に基づいている。分子の蛍光標識付けは、生物学において標準技法である。標識は、広範なスペクトル特徴、短い寿命、光退色および細胞に対する潜在的毒性の通常の問題を引き起こす有機染料であることが多い。量子ドットの最近出現した技術は、無機錯体または粒子を使用する蛍光標識の開発に新たな時代を開いた。これらの物質は、大きなストックス（Stocks）シフト、より長い発光半減期、狭い発光ピークおよび最小限の光退色を含む、有機染料に勝る実質的な利点を与える（上で引用した参考文献を参照）。
【０００４】
[0004]過去１０年間にわたって、多種多様の半導体ナノ結晶の合成およびキャラクタリゼーションで多くの前進がなされた。最近の進歩は、相対的に単分散の量子ドットの大規模調製に至っている（MurrayらJ．Am．Chem．Soc，115，8706−15，1993；Bowen KatariらJ．Phys．Chem．98，4109−17，1994；HinesらJ．Phys．Chem．100，468−71，1996．Dabbousi，らJ．Phys．Chem．101，9463−9475，1997）。
【０００５】
[0005]発光量子ドット技術のさらなる進歩は、量子ドットの蛍光効率および安定性の向上を引き起こしている。量子ドットの顕著な発光特性は、金属および半導体コア粒子が約１〜５ｎｍの励起ボーア半径よりも小さいときに起こる、量子サイズ閉じ込めから生じる（Alivisatos，Science，271，933-37，1996；Alivisatos，J．Phys．Chem．100，13226−39，1996；Brus，Appl．Phys．A53，465−74，1991；WilsonらScience，262，1242−46，1993）。最近の研究では、改善された発光がサイズ調整可能なより低いバンドギャップのコア粒子を、より高いバンドギャップの無機材料シェルによりキャッピングすることによって達成されうることが示されている。例えばZnS層によって不動態化されたCdSe量子ドットは室温にて発光性が強く、その発光波長は粒径を変更することにより青色から赤色に調整されうる。その上、ZnSキャッピング層は表面非発光性再結合部位を不動態化して、量子ドットのより高い安定性を生じる（DabbousiらJ．Phys．Chem．B101，9463−75，1997．KortanらJ．Am．Chem．Soc．112，1327−1332，1990）。
【０００６】
[0006]発光量子ドット技術の前進にかかわらず、従来のキャップ発光量子ドットは、キャップ発光量子ドットが水溶性でないために生物用途には適切ではない。
【０００７】
[0007]この問題を克服するために、量子ドットの有機不動態化層は水溶性部分によって置換された。しかしながら得られた量子ドットは、発光性が高くない（ZhongらJ．Am．Chem．Soc．125，8589，2003）。２−メルカプトエタノールおよび１−チオ−グリセロールなどの短鎖チオールも、水溶性CdTeナノ結晶の調製で安定剤として使用されている（RogachらBer．Bunsenges．Phys．Chem．100，1772，1996；RajhらJ．Phys．Chem．97，11999，1993）。別の手法において、Cofferらは、デオキシリボ核酸（DNA）の水溶性キャッピング化合物としての使用について記載している（CofferらNanotechnology，69，1992）。このようなシステムのすべてで、コーティングナノ結晶は安定でなく、光輝性特性は時間と共に低下した。
【０００８】
[0008]さらなる研究では、SpanhelらがCd（OH）2キャップCdSゾルを開示した（Spanhel，らJ．Am．Chem．Soc．109，5649，1987）。しかしながらコロイド状ナノ結晶は非常に狭いｐＨ範囲（ｐＨ８〜１０）でのみ調製でき、１０を超えるｐＨにて狭い蛍光バンドを示した。このようなｐＨ依存性は、該材料の有用性を大幅に制限し、特に生物システムでの使用に不適切である。
【０００９】
[0009]PCT国際公開公報第00／17656号は、ナノ結晶を水溶性にするために、それぞれ式SH（CH2）n−COOH及びSH（CH2）H−SO3Hのカルボン酸またはスルホン酸化合物によってキャップされるコアシェルナノ結晶を開示する。同様にPCT出願国際公開公報第00／29617号およびイギリス特許第2342651号は、メルカプト酢酸またはメルカプト−ウンデカン酸などの有機酸がナノ結晶を水溶性にするためにナノ結晶の表面に結合され、タンパク質または核酸などの生体分子のコンジュゲーションに適していることを記載している。GB 2342651は、ナノ結晶の水溶性を与えるとされているキャッピング材料としてトリオクチルホスフィンの使用についても記載している。
【００１０】
[0010]別の手法は、水溶化剤としてのジアミノカルボン酸の使用を報告するPCT国際公開公報第00／27365号で教示されている。このPCT公報では、ジアミノ酸は１価キャッピング化合物によってナノ結晶コアに結合される。
【００１１】
[0011]PCT国際公開公報第00／17655号は、疎水性部分および親水性部分を有する可溶化剤の使用によって水溶性にされるナノ結晶を開示している。可溶化剤は疎水性基を介してナノ結晶に結合するのに対して、親水性基、例えばカルボン酸またはメタクリル酸は水溶性を供給する。
【００１２】
[0012]さらなるPCT出願（国際公開公報第02／073155号）において、各種の分子、例えばトリオクチルホスフィンオキシドヒドロキサメート、ヒドロキサム酸の誘導体または多座錯化剤、例えばエチレンジアミンがナノ結晶の表面に直接結合されてそれらを水溶性にする、水溶性半導体ナノ結晶が記載されている。これらのナノ結晶は次にＥＤＣを介してタンパク質に結合される。別の手法において、PCT出願国際公開公報第00／58731号は、血液細胞集合の分析に使用され、約3,000〜約3,000,000の分子量を有するアミノ誘導ポリサッカライドがナノ結晶に連結される、ナノ結晶を開示している。
【００１３】
[0013]米国特許第6,699,723号は、ビオチンおよびストレプトアビジンなどの生体分子の発光ナノ結晶プローブへの結合を促進するための連結剤としてのシランベース化合物の使用を開示している。米国特許出願第2004／0072373 A1号は、シランベース化合物を使用する生化学標識の方法について記載している。シラン連結ナノ粒子は、分子インプリンティングによってテンプレート分子に結合され、次に重合されてマトリクスを形成する。その後、テンプレート分子はマトリクスから除去された。テンプレート分子の除去のためにマトリクス中に生成された空洞は、標識化に使用されうる特性を有する。
【００１４】
[0014]最近、水溶性ナノ結晶を安定化させるための合成ポリマーの使用が報告されている。米国特許出願第2004／0115817 A1号は、両親媒性ジブロックポリマーの使用が疎水性相互作用を介して、表面がトリオクチルホスフィンまたはトリオクチルホスフィンオキシドなどの薬剤でコーティングされているナノ結晶に非共有的に結合されうることを記載している。同様にGaoら（Nature Biotechnology，vol．22，969−976，August 2004）は、両親媒性トリブロックコポリマーによって非共有結合性疎水性相互作用を介してカプセル化される水溶性半導体ナノ結晶を開示している。
【００１５】
[0015]これらの開発にもかかわらず、依然として、生物アッセイでの検出目的に使用することのできるナノ結晶が求められている。本報告において、生体分子の生物活性を保存する様式で生体分子に結合されうるナノ結晶を有することが望ましい。さらに、水性媒体中において安定で頑強な（ｒｏｂｕｓｔ）懸濁物または溶液として調製または貯蔵されうる水溶性半導体ナノ結晶を有することが望ましい。最後に、これらの水溶性ナノ結晶量子ドットは、高い量子効率によるエネルギー放出が可能であるべきであり、小粒径であるべきである。
【００１６】
[0016]したがって本発明の目的は、上の要求を満足するナノ結晶を提供することである。
【００１７】
[0017]本目的は、ナノ結晶およびそれぞれの独立請求項の特徴を有するナノ結晶を産生するプロセスによって解決される。
【００１８】
[0018]一態様において、本発明は、
元素周期系（PSE）の亜族Ib、亜族IIb、亜族IVb、亜族Vb、亜族VIb、亜族VIIb、亜族VIIIb、主族II、主族IIIまたは主族IVの元素から選択される少なくとも１つの金属M1を含むナノ結晶コア、を含み、さらに
ナノ結晶のコアの表面に結合されたキャッピング試薬であって、少なくとも２個のカップリング基を有するキャッピング試薬を含む第１層と、
第２層であって、コーティング試薬によって共有結合的にカップリングされた少なくとも２個のカップリング部分と、第２層に水溶性を与えるための少なくとも１個の水溶性基とを有する低分子量コーティング試薬を含む第２層と、
を含む、水溶性ナノ結晶に関するものである。
【００１９】
[0019]水溶性ナノ結晶は、
上で定義したようなナノ結晶コアをキャッピング試薬と反応させて、それによりキャッピング試薬をナノ結晶コアの表面に結合させ、ナノ結晶コアを包囲する第１層を形成するステップと、
キャッピング試薬に、キャッピング試薬の少なくとも２個のカップリング基に対して反応性である少なくとも２個のカップリング部分と、第２層に水溶性を与えるための少なくとも１個の水溶性基とを有する低分子量コーティング試薬をカップリングさせて、それにより第１層に共有結合的にカップリングされた第２層を形成して、ナノ結晶コアを包囲する水溶性シェルの形成を完了させるステップと、
を含む方法によって得られうる。
【００２０】
[0020]別の態様において、本発明は、
元素周期系（PSE）の主族II、亜族VIIA、亜族VIIIA、亜族IB、亜族IIB、主族IIIまたは主族IVの元素から選択される少なくとも１つの金属M1と、PSEの主族Vまたは主族VIから選択される少なくとも１つの元素Aとを含む、ナノ結晶コアを含み、さらに
ナノ結晶のコアの表面に結合されたキャッピング試薬であって、少なくとも２個のカップリング基を有するキャッピング試薬を含む第１層と、
第２層であって、コーティング試薬によって共有結合的にカップリングされた少なくとも２個のカップリング部分と、第２層に水溶性を与えるための少なくとも１個の水溶性基とを有する低分子量コーティング試薬を含む第２層と、
を含む、水溶性ナノ結晶に関するものである。
【００２１】
[0021]水溶性ナノ結晶は、
上で定義したようなナノ結晶コアをキャッピング試薬と反応させて、それによりキャッピング試薬をナノ結晶コアの表面に結合させ、ナノ結晶コアを包囲する第１層を形成するステップと、
キャッピング試薬に、キャッピング試薬の少なくとも２個のカップリング基に対して反応性である少なくとも２個のカップリング部分と、第２層に水溶性を与えるための少なくとも１個の水溶性基とを有する低分子量コーティング試薬をカップリングさせて、それにより第１層に共有結合的にカップリングされた第２層を形成して、ナノ結晶コアを包囲する水溶性シェルの形成を完了させるステップと、
を含む方法によって得られうる。
【００２２】
[0022]ナノ結晶をコーティングする従来の方法は通例、ナノ結晶コアを被覆する水溶性シェル間の界面に共有結合を含まない。本発明において、小型モノマーまたは低分子量オリゴマー分子を含むキャッピング試薬のどちらも、ナノ結晶表面をキャップして（たとえば金属硫黄または金属窒素結合を形成して）第１層としても既知であるキャッピング試薬層を形成するために最初に使用される。この第１層は、ナノ結晶コアに共有結合される。本ステップには、水溶性基を持つ低分子量コーティング試薬をキャッピング試薬にカップリング剤の存在下でカップリングするステップが続く。このカップリングは、ナノ結晶コア上での水溶性シェルの形成を引き起こす。シェルは、ナノ結晶コアの表面に結合および固定化される（図１も参照）。低分子量コーティング試薬はナノ結晶コアを包囲する共有結合的に架橋された層を形成するので、低分子量コーティング試薬はシェルを保全し、ナノ結晶コアに結合されるように補助して、それにより水溶性シェルがナノ結晶から剥離する可能性を低下させる。
【００２３】
[0023]別の態様において、本発明は、
上で定義したようなナノ結晶コアを提供するステップと、
ナノ結晶コアをキャッピング試薬と反応させて、それによりキャッピング試薬をナノ結晶コアの表面に結合させ、ナノ結晶コアを包囲する第１層を形成するステップと、
キャッピング試薬に、キャッピング試薬の少なくとも２個のカップリング基に対して反応性である少なくとも２個のカップリング部分と、第２層に水溶性を与えるための少なくとも１個の水溶性基とを有する低分子量コーティング試薬をカップリングさせて、それにより第１層に共有結合的にカップリングされた第２層を形成して、ナノ結晶コアを包囲する水溶性シェルの形成を完了させるステップと、
を含む、上で定義したようなコアを有する水溶性ナノ結晶を調製する方法に関するものである。
【００２４】
[0024]本発明は、水溶性ナノ結晶がナノ結晶を包囲する水溶性シェルの形成によって効果的に安定化されうるという発見に基づいている。このシェルは、ナノ結晶コアの表面に共有結合された（キャッピング試薬を含む）第１層と、第１層に共有結合的にカップリングされた、または共有結合的に架橋された低分子量コーティング試薬を含む第２層とを含む。この様式で合成された水溶性シェルが、発光の任意の実質的な消失なしにナノ結晶を水性環境にかなり長い期間にわたってとどまらせることが見出される。理論に縛られたくはないが、ナノ結晶の改善された安定性は水溶性シェルの保護機能に起因しうることが考えられる。シェルは、ナノ結晶コアと存在しうるイオン、ラジカルまたは分子などの反応性水溶性種との間の接触を減少させる密封ボックスまたは保護バリアとして挙動する。このことは、水性環境でのナノ結晶の凝集を防止するのに有用である。凝集を防止するに当たって、ナノ結晶は相互から電気的に絶縁されたままになり、それによりその光ルミネセンスを延長させることも考えられる。低分子量化合物をコーティング試薬として使用することにより、第１層と第２層との間の反応が容易に制御されうる。さらに低分子量化合物のコーティング試薬としての使用は、サイズが小さく、平滑表面形態を有するナノ結晶を生じさせる。別の利点は、そのように形成されたシェルもまた、組織および器官標的などの多様な生体物質の認識を促進しうる適切な生体分子または検体の結合を介して好都合に官能化することができることである。水溶性シェルを形成するためにキャッピング試薬と低分子量コーティング試薬の異なる組合せを実施することによって、本発明は、多岐に亘る用途に有用である改良された化学的および物理的特性を有する水溶性ナノ結晶の新たなクラスへの的確な経路を提供する。
【００２５】
[0025]本発明に従って、ナノ結晶（量子ドット）のいずれの適切な種類も、ナノ結晶の表面がキャッピング試薬と結合されうる限り、水溶性にされうる。この文脈では、「ナノ結晶」および「量子ドット」という用語は互換的に使用される。
【００２６】
[0026]一実施形態において、適切なナノ結晶は、金属のみを含むナノ結晶コアを有する。この目的のために、M1は、元素周期系（PSE）の主族II、亜族VIIA、亜族VIIIA、亜族IB、亜族IIB、主族IIIまたは主族IVの元素から成る群より選択されうる。したがってナノ結晶コアは、金属元素M1のみから成りうる。非金属元素AまたはBは、下で定義するように非存在である。本実施形態において、ナノ結晶は、PSEの上の族のいずれかからの純粋な金属、例えば金、銀、銅（亜族Ib）、チタン（亜族IVb）、テルビウム（亜族IIIb）、コバルト、プラチナ、ロジウム、ルテニウム（亜族VIIIb）、鉛（主族IV）またはその合金のみから成る。本発明は主に、対元素Aを含むナノ結晶のみに関して下で例示されるが、純粋な金属または純粋な金属の混合物より成るナノ結晶も本発明で使用されうることが理解される。
【００２７】
[0027]別の実施形態において、本発明で使用されるナノ結晶コアは、２つの元素を含みうる。したがってナノ結晶コアは、２つの金属元素M1及びM2を含む二元ナノ結晶合金、例えばZn、Cd、Hg、Mg、Mn、Ga、In、Al、Fe、Co、Ni、Cu、Ag、Au及びAuなどの金属から形成された任意の周知のコアシェルナノ結晶でありうる。本発明で適切な二元ナノ結晶の別の種類は、１つの金属元素M1と、PSEの主族Ｖまたは主族VIから選択される少なくとも１つの元素Aとを含みうる。したがって、現在、使用に適切なナノ結晶の１つの種類は、式M1Aを有する。このようなナノ結晶の例は、II−VI族半導体ナノ結晶（すなわち主族IIまたは亜族IIBからの金属と、主族VIからの元素とを含むナノ結晶）でありえて、ここでコアおよび／またはシェル（「シェル」という用語は本明細書で使用するように、ナノ結晶を封入した有機分子から生成された水溶性「シェル」とは異なり、区別される）は、CdS、CdSe、CdTe、MgTe、ZnS、ZnSe、ZnTe、HgS、HgSe、またはHgTeを含む。ナノ結晶コアは、任意のIII−V族半導体ナノ結晶（すなわち主族IIIからの金属と、主族Vからの元素とを含むナノ結晶）でもありうる。コアおよび／またはシェルは、GaN、GaP、GaAs、GaSb、InN、InP、InAs、InSb、AlN、AlP、AlAs、AlSbを含む。本発明で使用されうるコアシェルナノ結晶の具体例は、これに限定されるわけではないが、ZnSシェルを有する（CdSe）−ナノ結晶はもちろんのこと、ZnShシェルを有する（CdS）−ナノ結晶も含む。
【００２８】
[0028]本発明は、上述のコア−シェルナノ結晶の使用に限定されない。別の実施形態において、本発明のナノ結晶は、組成M11−xM2xAを有する均質三元合金より成るコアを有することができ、式中、
a) AがPSEの主族VIの元素を表すとき、M1及びM2は、元素周期系（PSE）の亜族IIb、亜族VIIa、亜族VIIIa、亜族Ibまたは主族IIから独立して選択され、または
b) AがPSEの主族（V）野元素を表すとき、M1及びM2はどちらもPSEの主族（III）の元素から選択される。
【００２９】
[0029]別の実施形態において、均質四元合金より成るナノ結晶が使用されうる。この種類の四元合金は組成M11−xM2xAｙB1−yを有し、式中、
a) A及びBの両方がPSEの主族VIの元素を表すときに、M1及びM2は、元素周期系（PSE）の亜族IIb、亜族VIIa、亜族VIIIa、亜族Ibまたは主族IIの元素から独立して選択され、または
b) A及びBの両方がPSEの主族（V）の元素を表すとき、M1及びM2はPSEの主族（III）の元素から独立して選択される。
【００３０】
[0030]均質三元または四元ナノ結晶のこの種類の例は、例えば、ZhongらJ．Am．Chem．Soc，2003 125，8598−8594，ZhongらJ．Am．Chem．Soc，2003 125，13559−13553、または国際特許出願2004／054923号に記載されている。
【００３１】
[0031]上に記載した式で使用されるような名称M1及びM2は、本明細書を通じて互換的に使用することができる。例えばCd及びHgを含む合金はそれぞれ別々に、M1またはM2によってはもちろんのこと、M2及びM2とも呼ぶことができる。同様に、PSEのVまたはVI族の元素の名称A及びBは互換的に使用される。それゆえ本発明の四元合金において、SeまたはTeはどちらも元素AまたはBと呼ぶことができる。
【００３２】
[0032]このような三元ナノ結晶は：
i) ナノ結晶の産生に適した形の元素M1を含有する反応混合物を適切な温度T1まで加熱して、この温度においてナノ結晶の産生に適した形の元素Aを添加し、反応混合物を上記二元ナノ結晶M1Aが形成するのに適した温度で十分な期間にわたって加熱して、次に反応混合物を冷却させることによって二元ナノ結晶M1Aを形成するステップと、
ii) 形成された二元ナノ結晶M1Aを沈殿または単離することなく、反応混合物を適切な温度T2まで再加熱し、この温度の反応混合物にナノ結晶の産生に適した形の元素Ｍの十分な量を添加して、次に上記三元ナノ結晶M11−xM2xAを形成するのに適した温度にて十分な期間にわたって反応混合物を加熱し、次に反応混合物を室温まで冷却して、三元ナノ結晶M11−xM2xAを単離するステップと、
を含むプロセスによって得ることができる。
【００３３】
[0033]これらの三元ナノ結晶において、指数xは、0.001＜x＜0.999の、好ましくは0.01＜x＜0.99、0.1＜0.9の、またはさらに好ましくは0.5＜x＜0.95の値を有する。なおさらに好ましい実施形態において、xは約0.3または約0.3〜約0.8または約0.9の値を有しうる。ここで利用される四元ナノ結晶において、yは、0.001＜y＜0.999の、好ましくは0．01＜y＜0.99の、あるいはさらに好ましくは0.1＜x＜0.95または約0.2〜約0.8の値を有する。
【００３４】
[0034]II−VI三元ナノ結晶において、そこに含まれる元素M1及びM2は好ましくは、Zn、Cd及びHgから成る群より独立して選択される。これらの三元合金中のPSEのVI族の元素Aは好ましくは、S、SeおよびTeから成る群より選択される。それゆえこれらの元素M1、M2及びAのすべての組合せは、本発明の範囲内である。好ましい実施形態において、使用されたナノ結晶は、組成ZnxCd1−xSe、ZnxCd1−xS、ZnxCd1−xTe、HgxCd1−xSe、HgxCd1−xTe、HgxCd1−xS、ZnxHg1−xSe、ZnxHg1−xTe、およびZnxHg1−xSを有する。
【００３５】
[0035]ある好ましい実施形態において、xは上の化学式で使用されるように、0.10＜x＜0.90または0.15＜x＜0.85の値を、さらに好ましくは0.2＜x＜0.8の値を有する。特に好ましい実施形態において、ナノ結晶は組成ZnxC1−x SおよびZnxCd1−xSeを有する。xが0.10＜x＜0.95の値を、さらに好ましくは0.2＜x＜0.8の値を有する、このようなナノ結晶が好ましい。
【００３６】
[0036]ナノ結晶コアが本発明のIII−Vナノ結晶から作製されるある実施形態において、元素M1及びM2の各々はGa及びInから独立して選択される。元素Aは好ましくはP、As及びSbから選択される。これらの元素M1、M2及びAのすべての考えられる組合せは、本発明の範囲内である。いくつかの現在好ましい実施形態において、ナノ結晶は組成GaxIn1−x P、GaxIn1−x AsおよびGaxIn1−x Asを有する。
【００３７】
[0037]発明において、ナノ結晶コアは、２つの主成分を含む水溶性シェル中に覆われている。水溶性シェルの第１の成分は、ナノ結晶コアの表面に親和性を有し、水溶性シェルの第１層を形成するキャッピング試薬である。第２の成分は、キャッピング試薬にカップリングされ、水溶性シェルの第２層を形成する低分子量コーティング試薬である。
【００３８】
[0038]ナノ結晶の表面への結合親和性を有する小型分子またはオリゴマーのすべての種類が、第１層を形成するためのキャッピング試薬として使用されうる。一実施形態において、化合物の１種類のみがキャッピング試薬として使用される。他の実施形態において、２、３、４つ以上（または少なくとも２つ）の異なる化合物の混合物がキャッピング試薬として使用される。好ましいキャッピング試薬は有機分子であり、第１にナノ結晶コアの表面上に固定化されるために付着または共有結合されうる少なくとも１個の部分を、そして第２に続いてのコーティング試薬とのカップリングに備えた少なくとも２個のカップリング基を有する。カップリング基はコーティング試薬に存在するカップリング部分と直接反応しうるか、またはカップリング基は、たとえばカップリング反応を開始するために、間接的に結合しうる、たとえばカップリング剤による活性化を必要としうる。これらの部分の各々はキャッピング試薬内で分子上の末端位置、または分子の主鎖に沿った非末端位置のどちらかに存在しうる。
【００３９】
[0039]一実施形態において、キャッピング試薬はナノ結晶のコア表面への親和性を有する１つの部分を含み、該部分はキャッピング試薬分子の末端位置に位置している。ナノ結晶コアと部分との間の相互作用は、疎水性または静電相互作用から、あるいは共有または配位結合から発生しうる。適切な末端基は、遊離（未結合）電子対を有し、それによりキャッピング試薬がナノ結晶コアの表面に結合できるようにする部分を含む。例示的な末端基は、S、N、P原子またはP＝O基を含有する部分を含む。これらの部分の具体的な例としては、例えばアミン、チオール、アミン−オキシドおよびホスフィンが挙げられる。
【００４０】
[0040]さらなる実施形態において、キャッピング試薬はさらに、末端基から疎水性領域によって離間された少なくとも１個のカップリング基を含む。各カップリング基は、任意の適切な数の主鎖炭素原子と、水溶性シェルの第２層を形成するために使用されるコーティング試薬上の相補的カップリング部分と反応しうる任意の適切な官能基を含みうる。例示的なカップリング部分は、ヒドロキシ（−OH）、アミノ（−NH2）、カルボキシル（−COOH）、カルボニル（−CHO）、シアノ基（−CN）から成る群より選択されうる。
【００４１】
[0041]好ましい実施形態において、キャッピング試薬は、次の一般式（G1）で示されるように、末端基から疎水性領域によって離間された２つのカップリング基を含む：
【化１】
式中
TG−末端基
HR−疎水性領域
CM1およびCM2−カップリング基
【００４２】
[0042]上の式G1において、カップリング基CM1およびCM2は親水性でありうる。親水性カップリング基の例としては、−NH2、−COOHまたはOH官能基が挙げられる。他の例としては、ニトリル、ニトロ、イソシアナート、無水物、エポキシドおよびハロゲン基が挙げられる。カップリング基は疎水性でありうる。疎水性および親水性基の組合せを有するキャッピング試薬が使用されうる。疎水性基の例としては、アルキル部分、芳香環、またはメトキシ基が挙げられる。各カップリング基は独立して選択され、親水性キャッピング試薬および疎水性キャッピング試薬の組合せは同時に使用されうる。
【００４３】
[0043]理論に縛られたくはないが、式（G1）で定義されたようなキャッピング試薬内の疎水性領域は、ナノ結晶コアが水性環境内に存在する荷電種を遮蔽できると考えられる。水性環境からナノ結晶コアの表面への電荷移動は、疎水性領域によって妨害されるようになり、それにより合成中の中間ナノ結晶（すなわちキャッピング試薬によってキャップされているナノ結晶）の早期反応停止を最小限に抑える。それゆえキャッピング試薬内での疎水性領域の存在は、ナノ結晶の最終量子収率を改善するのを補助しうる。この目的に適した疎水性部分の例としては、すべての脂肪族直鎖、環式、または芳香族炭化水素部分を含む、炭化水素部分が挙げられる。
【００４４】
[0044]一実施形態において、本発明のナノ結晶で使用されるキャッピング試薬は一般式（I）を有する：
【化２】
【００４５】
[0045]この式において、Xは、ナノ結晶コアの表面への親和性を有する末端基を表す。Xは、S、N、P、またはO＝Pから選択されうる。部分Hn−X−の具体例としては、次の、例えばH−S−、O＝P−、およびH2N−の１つが挙げられうる。Raは、少なくとも２個の主鎖炭素原子を含む部分であり、それゆえ疎水性特性を持つ。Raが主に疎水性特性、たとえば炭化水素である場合、Raは部分Zをナノ結晶コアから隔離する疎水性領域を提供する。部分Yは、N、C、−COO−、または−CH2O−から選択される。Zは、次の重合のために少なくとも１つのカップリング部分を含み、それゆえ親水性キャッピング試薬の部分に主に親水性特性を与える部分である。例示的な極性官能基としては、これに限定されるわけではないが、−OH、−COOH、−NH2、−CHO、−CONHR、−CN、−NCO、−COR及びハロゲン化合物を含む。式中の数字は、記号k、n、n’及びmによって表される。kは、０または１である。数字nは、０〜３の整数であり、n’は、０〜２の整数である。両方ともX及びYの価数要件をそれぞれ満足するために選択される。数字mは、１〜３の整数である。数字kは、０または１である。kが０ならば、ZがRaに結合されるという条件が適用される。k＝０の値は、カップリング部分ZがRaに直接結合される場合に対応し、ここでたとえばRaは環式部分、たとえば脂肪族シクロアルカン、芳香族炭化水素または複素環である。しかしながら、k＝１であるときに、Raが環式部分、たとえばベンゼン環に結合された３級アミノ基、または環式炭化水素であることが可能である。本式において、Zは、アミノ、ヒドロキシル、カルボニル、カルボキシル、ニトリル、ニトロ、イソシアナート、エポキシド、無水物およびハロゲン基から成る群より選択される官能基である。YまたはZのどちらかがカップリング基として機能することができる。Zがカップリング基として存在する場合、Yはカップリング基Zを結合するための構成成分として機能することができる。Zが非存在である場合、Yはカップリング基の一部を形成することができる。
【００４６】
[0046]上の式の部分Raは、数十〜数百個の主鎖原子を含んでもよい。詳細な一実施形態において、RaおよびＺの各々は独立して、２〜５０個の主鎖原子を含む。Zは、１個以上のアミドまたはエステル結合を含んでもよい。Raに使用されうる適切な部分の例としては、アルキル、アルケニル、アルコキシおよびアリール部分が挙げられる。
【００４７】
[0047]「アルキル」という用語は本明細書で使用するように、一般に２〜５０個の炭素原子を含む分岐または非分岐直鎖または環式飽和炭化水素基、例えばメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔ−ブチル、オクチル、デシル、テトラデシル、ヘキサデシル、エイコシル、テトラコシルはもちろんのこと、例えばシクロペンチル、シクロヘキシルなどのシクロアルキル基も指す。「アルケニル」という用語は本明細書で使用するように、一般に２〜５０個の炭素原子を含み、少なくとも１個の二重結合を含有する、通例１〜６個の二重結合を、より通例には１または２個の二重結合を含有する分岐または非分岐炭化水素基、例えばエテニル、ｎ−プロペニル、ｎ−ブテニル、オクテニル、デセニルはもちろんのこと、シクロアルケニル基、例えばシクロペンテニル、シクロヘキセニルなどを指す。「アルコキシ」という用語は本明細書で使用するように、Ｒが上で定義したようなアルキルである置換基−O−Rを指す。「アリール」という用語は本明細書で使用するように、そして別途規定しない限り、１個以上の芳香環を含有する芳香族部分を指す。アリール基は場合により、芳香環上で１個以上の不活性非水素置換基によって置換され、適切な置換基としては例えば、ハロ、ハロアルキル（好ましくはハロ置換低級アルキル）、アルキル（好ましくは低級アルキル）、アルケニル（好ましくは低級アルケニル）、アルキニル（好ましくは低級アルキニル）、アルコキシ（好ましくは低級アルコキシ）、アルコキシカルボニル（好ましくは低級アルコキシカルボニル）、カルボキシ、ニトロ、シアノおよびスルホニルが挙げられる。すべての実施形態において、Raは、一般に窒素、酸素または硫黄などのヘテロ原子を含むヘテロ芳香族部分を含んでもよい。
【００４８】
[0048]好ましい実施形態において、Raは、エチル、プロピル、ブチル、およびペンチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロオクチル、エトキシ、プロポキシ、ブトキシ、ベンジル、プリン、ピリジン、イミダゾール部分から成る群より選択される。
【００４９】
[0049]別の実施形態において、キャッピング試薬の少なくとも２個のカップリング基はホモ二官能性またはヘテロ二官能性であり、ホモ二官能性またはヘテロ二官能性のカップリング基は少なくとも２個の同一のカップリング基または２個の異なるカップリング基をそれぞれ含みうることを意味する。２または３個のカップリング基を備えたある適切なキャッピング試薬の例示的な例は、次のような各構造を有する。
【化３】
【００５０】
[0050]コーティング試薬がヘテロ二官能性である、すなわち２個の異なるカップリング基が存在する例示的なキャッピング試薬としては、これに限定されるわけではないが
【化４】
が挙げられる。
【００５１】
[0051]別の実施形態において、キャッピング試薬は、重合性不飽和基、例えばC＝C二重結合を介して、任意の遊離ラジカル重合機構を介してコーティング試薬をカップリングする。このようなキャッピング試薬の具体的な例としては、これに限定されるわけではないが、ω−チオール末端メチルメタクリレート、２−ブテンチオール、（Ｅ）−２−ブテン−１−チオール、Ｓ−（Ｅ）−２−ブテニルチオアセテート、Ｓ−３−メチルブテニルチオアセテート、２−キノリンメタンチオール、およびＳ−２−キノリンメチルチオアセテートが挙げられる。
【００５２】
[0052]ナノ結晶コアを包囲する水溶性シェルの第２の成分は、水溶性基を持つ低分子量コーティング試薬のキャッピング試薬へのカップリングによって形成される。カップリング剤は場合により、キャッピング試薬中に存在するカップリング基を活性化するために使用することができる。カップリング剤およびカップリング部分を持つコーティング試薬は続けて添加することができる、すなわちコーティング試薬は活性化が実施された後に添加される。あるいはコーティング試薬をカップリング剤と共に同時に添加することができる。
【００５３】
[0053]原則として、キャッピング試薬中のカップリング基を活性化するいずれのカップリング剤も、カップリング剤が第１層を形成するために使用されるキャッピング試薬および第２層を形成するために使用されるコーティング試薬と化学的に適合性である限り使用可能であり、キャッピング試薬およびポリマーと反応して、カップリング剤がキャッピング試薬およびポリマーの構造を変化させないことを意味する。理想的には、未反応カップリング剤は、カップリング剤分子がコーティング試薬分子によって完全に置換されるべきなので、ナノ結晶中に存在してはならない。しかしながら実際には、カップリング剤の未反応残基はそれにもかかわらず最終的なナノ結晶中に存在している可能性がある。
【００５４】
[0054]適切なカップリング剤の決定は、当業者の知識の範囲内である。適切なカップリング試薬の一例は、スルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）と組合せて使用される１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド（ＥＤＣ）である。これに限定されるわけではないがイミドおよびアゾールを含む、カップリング試薬の他の種類を使用することができる。使用することのできるイミドのある例は、カルボジイミド、スクシンイミドおよびフタルイミドである。イミドのある明示的な例としては、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドまたは他の任意の活性化分子と関連して使用される、１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド（ＥＤＣ）、スルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミドが挙げられる。
【００５５】
[0055]カップリング基が不飽和C＝C結合を含むキャッピング剤の場合、カップリング剤は、tert−ブチルペルアセテート、ベンゾイルペルオキシド、過流酸カリウム、および過酢酸のような開始剤を含む。カップリングを引き起こすために、カップリング基中の不飽和結合を活性化するために光開始剤も利用することができる。
【００５６】
[0056]水溶性シェルの第２層を形成するために使用されるコーティング試薬に、キャッピング試薬の活性化されたカップリング基と反応するであろうカップリング部分を有する１個以上の適切なカップリング部分を含めることができる。通例、適切なコーティング試薬は少なくとも２個のカップリング部分を有し、すなわちある実施形態において、たとえばキャッピング試薬の活性化されたカップリング基に対して反応性である２、３、または４個の官能基がある。図２に示すように、コーティング試薬の少なくとも２個のカップリング部分がキャッピング試薬と反応されたときに、コーティング試薬はたとえばエステルまたはアミド結合の形成によってキャッピング試薬に共有結合的にカップリングされる（「架橋される」）ようになり、それによりナノ結晶コアを包囲する水溶性シェルを形成する。
【００５７】
[0057]コーティング試薬のキャッピング試薬とのカップリングは、任意の適切なカップリング反応スキームによって実施することができる。適切な反応スキーム例としては、フリーラジカルカップリング、アミドカップリングまたはエステルカップリング反応が挙げられる。一実施形態において、キャッピング試薬にカップリングされるコーティング試薬は、キャッピング試薬上の露出されたカップリング基にカルボジイミド媒介カップリング反応によってカップリングされる。１つの好ましいカップリング反応は、１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミドによって供給され、スルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドによって促進されるカルボジイミドカップリング反応であり、そこではキャッピング試薬のカップリング基内のカルボキシ官能基およびアミノ官能基およびコーティング試薬上のカップリング部分が反応して、共有結合を形成する。
【００５８】
[0058]本発明の文脈において、水溶性シェルの第２層を形成するために使用されるような「低分子量コーティング試薬」という用語は、非ポリマー性（「小型」）分子を含む。コーティング試薬の分子量は、コーティング試薬分子中に存在する基の種類に応じて、低くても高くてもよい。コーティング試薬がたとえば小さい側鎖を有する場合、ここでコーティング試薬の分子量は低くなるであろう。大きい側鎖が存在するコーティング試薬の場合、ここでそのようなコーティング試薬分子の分子量は高くなるであろう。したがって、ある実施形態において、コーティング試薬の分子量の上限は、約２００、約４００、約６００ダルトンまたは約１０００とすることができる。高分子量または大きい空間体積のキャッピング試薬が使用される他の実施形態において、上限はより高く、たとえば約１２００、または約１５００、または約２０００ダルトンとすることができる。この定義に従って、「低分子量コーティング試薬」という用語も、たとえば約２０００ダルトンまでの分子量を有するオリゴマー化合物を含む。「カップリング」および「共有結合的カップリング」という用語は、単一のより大きい実体を形成するために２個の分子を共に接合する任意の種類の反応、たとえばエステルを形成するための酸およびアルコールのカップリング、またはアミドを形成するための酸およびアミンのカップリングを一般に指す。したがってキャッピング試薬およびコーティング試薬に存在するカップリング基およびカップリング部分をカップリングしうる任意の反応も、用語の意味の範囲内である。「カップリング」は、コーティング試薬をキャッピング試薬層に共有結合するために、キャッピング試薬中にカップリング基として存在する１個以上の不飽和基（たとえば−C＝C−二重結合）にコーティング試薬中の対応するカップリング部分をフリーラジカルカップリングによって反応させるステップも含む。
【００５９】
[0059]キャッピング試薬およびコーティング試薬は、重合を実施させるために相互に反応性である官能基をそれぞれ有することできる。一実施形態において、コーティング試薬は、各々がキャッピング試薬上のカップリング基と反応することができる少なくとも１個の共重合性官能基を有する少なくとも２個のカップリング部分を含む水溶性分子である。詳細な実施形態において、コーティング試薬は、式（II）：
【化５】
（式中、
Tは、溶解性を調整するための部分であり、
Rcは、少なくとも３個の主鎖炭素原子を含む部分であり、
Gは、N、またはCから選択され、
Z’は、共重合性部分であり、
nは、１または２の整数であり、および
n’は、０または１であり、ここでn’は、Gの価数要件を満足するように選択される）を有する水溶性分子でありうる。
【００６０】
[0060]所望の特性を有する水溶性シェルは、部分Rcが３０個未満の、好ましくは２０個未満の、またはさらに好ましくは１２個未満の主鎖炭素原子を有するキャッピング試薬によって得られうる。好ましい実施形態において、Rcは３から１２個の主鎖炭素原子を含む。特定の実験条件の下で、この範囲はナノ結晶の合成の間に、高いカップリング効率を提供した。部分Ｔは、ナノ結晶が配置される環境でのナノ結晶の溶解性を調整するための極性／親水性官能基でありうる。したがって部分Ｔは、シェルに親水性、または疎水性特徴を与えることができ、それゆえナノ結晶が非水性環境ではもちろんのこと、水性環境でも溶解されるようにする。Ｔは、たとえばヒドロキシル基、カルボキシル基、カルボニル基、スルホン酸基、リン酸基、アミノ基、カルボキサミド基などの極性基から選択されうる。部分Ｔは、水性環境で不溶性であるナノ結晶を得るために、疎水性、たとえば任意の脂肪族または芳香族炭化水素（たとえば脂肪酸またはベンゼン誘導体）、あるいは水に不溶性である他の任意の有機部分でもありうる。Tが疎水性である場合、Ｔはまた、コーティング試薬がキャッピング試薬と共重合された後に、親水性部分の包含によって修飾されうる。部分Z’は、キャッピング試薬上のカップリング部分と共重合しうる官能基を有する共重合性部分である。適切な官能基としては、これに限定されるわけではないが、たとえば−NH2、−COOHまたは−OH、−Br、−C＝C−が挙げられる。Ｚ’は加えて、好ましくは少なくとも２個の主鎖炭素原子を含む脂肪族または環式炭素鎖を含みうる。
【００６１】
[0061]一実施形態において、Tはシクロデキストリン分子に由来しうる。シクロデキストリン分子は、得られたコポリマーの水溶性を改善する多数のヒドロキシル基を有し、また生体標識目的で生体分子に容易にコンジュゲートしうる。適切である適切なシクロデキストリンの例としては、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリン、ジメチル−α−シクロデキストリン、トリメチル−α−シクロデキストリン、ジメチル−β−シクロデキストリン、トリメチル−β−シクロデキストリン、ジメチル−γ−シクロデキストリン、およびトリメチル−γ−シクロデキストリンが挙げられる。
【００６２】
[0062]さらに別の実施形態において、コーティング試薬は、アミノ酸、好ましくはジアミノ酸またはジカルボキシルアミノ酸から選択される水溶性分子である。現在考慮されるジアミノ酸の具体例としては、２、３例のみ挙げると、２，４−ジアミノ酪酸、２，３−ジアミノプロピオン酸または２，５−ジアミノペンタン酸が挙げられる。本発明で考慮されるジカルボン酸としては、これに限定されるわけではないが、アスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられる。
【００６３】
[0063]他の実施形態において、コーティング試薬は
【化６】
から成る群より選択される水溶性分子であり、
式中、CDはシクロデキストリン、および
【化７】
である。
【００６４】
[0064]キャッピング試薬が不飽和基（たとえばC＝C二重結合）を含む別の実施形態において、カップリングに使用されうる適切なコーティング試薬としては、１，４−ブタジエン、１，５−ペンタジエン、および１，６−ヘキサジエンなどのジエンおよびトリエンが挙げられる。
【００６５】
[0065]ナノ結晶を官能化することによって、本発明のナノ結晶が多様な用途で使用されることが可能となる。さらなる実施形態において、水溶性シェルは水溶性シェルに親和性リガンドを結合することによって官能化される。このようなナノ結晶は、親和性リガンドが結合特異性を有する基質の存在または非存在を検出することができる。サンプル中に存在する場合、官能化ナノ結晶の親和性リガンドと標的化基質との間の接触と、続いての結合は、多様な目的を果たすことができる。例えば、量子化、描出のための検出可能な信号、または検出の他の形を放出することができる、官能化ナノ結晶−基質を含む複合体を形成させることができる。考慮される親和性リガンドとしては、キメラまたは遺伝子修飾モノクローナル抗体を含むモノクローナル抗体、ペプチド、アパタマー、核酸分子、ストレプトアビジン、アビジン、レクチンなどが含まれる。
【００６６】
[0066]上の開示に従って、本発明の別の態様は、水溶性ナノ結晶を調製する方法に関する。
【００６７】
[0067]水溶性シェルの合成は、最初にキャッピング試薬にナノ結晶を接触させて、それによりキャッピング試薬にナノ結晶を反応させることによって実施することができる。接触は直接または間接的のどちらかで実施することができる。直接接触は、いずれの配位リガンドの使用も含まない、ナノ結晶コアのキャッピング試薬を含有する溶液への浸漬を指す。間接接触は、キャッピング試薬を接触させる前に、ナノ結晶コアを初回刺激するための配位リガンドの使用を指す。間接接触は通例、２つのステップを含む。接触のどちらの方法も本発明で実行可能である。しかしながら間接接触の後者の方法は、配位リガンドのキャッピング試薬のナノ結晶コア表面への結合の高速化を助けるので好ましい。
【００６８】
[0068]間接接触は次のように詳説されるであろう。間接接触の第１のステップにおいて、配位リガンドは好ましくは有機溶媒に溶解させることによって調製される。次にナノ結晶コアは有機溶媒中に規定の期間にわたって浸漬されて、ナノ結晶コアの表面に十分に安定な不動態化層を形成させる（以下、「不動態化ナノ結晶」と呼ばれる）。不動態化層は、ナノ結晶コアに接触しうるいずれの親水性種もはじく役割を果たし、それによりナノ結晶のいずれの劣化も防止する。受動態化ナノ結晶を単離されて、所望ならばいずれの好ましい期間にわたっても、配位リガンドを含有する有機溶媒中に貯蔵してもよい。所望ならば、適切な中性有機溶媒、例えばクロロホルム、メチレンクロライド、またはテトラヒドロフランを添加することができる。
【００６９】
[0069]間接接触の第２のステップにおいて、有機溶媒の存在下または水溶液中でリガンド交換が実施される。リガンド交換（置換）は、受動態化ナノ結晶とキャッピング試薬との接触を促進するために、キャッピング試薬の過剰量を受動態化ナノ結晶に添加することによって実施される。高レベルの置換を達成するために必要な接触時間は、反応混合物を必要な期間にわたって撹拌または超音波処理することによって短縮されうる。十分な長さの時間の後、キャッピング試薬は受動態化層を置換して、それ自体がナノ結晶に結合されるようになり、それゆえ続くコーティング試薬のカップリングのためにナノ結晶コアの表面をキャッピングする。
【００７０】
[0070]間接接触で使用される配位リガンドは、ナノ結晶コアの表面への親和性を有する部分を含むいずれの分子でもよい。この親和性は、例えば静電相互作用、共有結合または配位結合の形で現れることがある。適切な配位リガンドとしては、これに限定されるわけではないが、疎水性分子、または親水性部分に結合された疎水性鎖を含む両親媒性分子、例えば極性官能基を含む。このような分子の例としては、トリオクチルホスフィン、トリオクチルホスフィンオキシド、またはメルカプトウンデカン酸が挙げられる。使用されうる配位リガンドの他の種類としては、チオール、アミンまたはシランを挙げることができる。
【００７１】
[0071]キャッピング試薬とコーティング試薬との間接接触経路によるカップリングを実施するためのスキームを図４に示す。最初に、ナノ結晶コアはトリオクチルホスフィンオキシド（ＴＯＰＯ）などの配位溶媒中で調製でき、ナノ結晶コア表面上に不動態化層の形成を生じさせる。次にＴＯＰＯ層はキャッピング試薬によって置換される。置換は、高濃度のキャッピング試薬を含有する媒体中でのＴＯＰＯ層状化ナノ結晶の分散によって起こりうる。このステップは通例、有機溶媒または水溶液のどちらかで実施することができる。好ましい有機溶媒としては、極性有機溶媒、例えばピリジン、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ＤＭＳＯ、ジクロロメタン、エーテル、クロロホルム、またはテトラヒドロフランが挙げられる。その後、キャッピング試薬にカップリングされるキャッピング試薬が調製されて、キャップされたナノ結晶コアに添加される。
【００７２】
[0072]本発明の方法は、一旦、水溶性シェルの第１層が形成し、キャッピング試薬によってキャッピングされたナノ結晶を、水溶性基を有するコーティング試薬とカップリングするさらなるステップの実施を含む。カップリングは、所望ならばカップリング剤の存在下で実施することができる。カップリング剤は、キャッピング試薬を初回刺激して、コーティング試薬に対して反応性にするために使用してもよいし、またはカップリング剤は、コーティング試薬のカップリング部分を初回刺激して、キャッピング試薬に対して反応性にするために使用してもよい。好ましい実施形態において、ＥＤＣ（１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド）は、場合によりスルホＮＨＳ（スルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）によって補助されるカップリング剤として使用することができる。架橋剤を含む、カップリング試薬の他の種類も使用することができる。例としては、これに限定されるわけではないが、カルボジイミド、たとえばジイソプロピルカルボジイミド、カルボジシクロヘキシルイミド、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ；Pierce），Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチル−チオアセテート（ＳＡＴＡ）、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオナート（ＳＰＤＰ）、オルトフェニレンジマレイミド（ｏ−ＰＤＭ）、およびスルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシラート（スルホ−ＳＭＣＣ）およびアゾールが挙げられる。カップリング剤は、Ｏ−尿素誘導体を形成するためにカルボキシル基を活性化して、カルボン酸とアミンとの間のアミド結合の形成を触媒する。この誘導体は、求核性アミン基とただちに反応して、それによりカップリング反応を加速する。
【００７３】
[0073]例示のために、カップリング基xモルを有するキャッピング試薬xモルが、ナノ結晶コア各１モルに結合することができると仮定する。（キャッピング試薬xモルに結合された）ナノ結晶コア１モルと完全に反応するためにコーティング試薬yモルがカップリング部分xモルを含有する場合、ここでコーティング試薬対ナノ結晶の混合比は、ナノ結晶コア１モルあたり少なくともコーティング試薬yモルである。実際にキャッピング試薬は、ナノ結晶上での完全なキャッピングを確保するために、通常過剰で反応させられる。未反応キャッピング試薬は、たとえば遠心分離によって除去されうる。キャッピングされたナノ結晶とカップリングするために添加されたコーティング試薬の量も同様に過剰に、キャッピングされたナノ結晶１モル当たり通例、コーティング試薬約１０、または約２０、または約３０〜１０００モルの領域で添加することができる。
【００７４】
[0074]コーティング試薬をナノ結晶コアの表面にキャップされているキャッピング試薬にカップリングするために、コーティング試薬をカップリング剤の存在下でキャッピング試薬と混合する。カップリング剤およびコーティング試薬は、第１層を含むナノ結晶を含有する溶液に同時に添加することができる（実施例１および２を参照）か、またはカップリング剤およびコーティング試薬は連続して添加でき、コーティング試薬はカップリング剤の後に添加される。カップリング剤は、キャッピング試薬およびコーティング試薬中にそれぞれ存在するカップリング剤およびカップリング部分を活性化するための開始剤として作用する。その後、コーティング試薬はキャッピング試薬とカップリングされ、ナノ結晶コアを包囲する第２層が形成される。
【００７５】
[0075]カップリング反応は、水溶液中または有機溶媒中で実施されうる。例えばカップリング反応は、水溶液中で、例えば開始剤、安定剤または重合の動態を改善するための相間移動試薬を含む、適切な添加剤を含む水中で実施されうる。カップリング反応は、緩衝溶液、例えばリン酸またはアンモニウム緩衝溶液中でも実施することができる。加えて重合は、適切な添加剤、例えばカップリング試薬および触媒を含む無水有機溶媒中で実施することができる。一般に使用される有機溶媒としては、ＤＭＦ、ＤＭＳＯ、クロロホルム、ジクロロメタン、およびＴＨＦが挙げられる。
【００７６】
[0076]最後に、水溶性シェルのコーティング試薬層が一旦キャッピング試薬にカップリングされると、第２層中に含まれるコーティング試薬に、第２層中に存在する水溶性基を露出させるのに適した試薬への反応を含む最終ステップを実施することができる。たとえば使用されるコーティング試薬が（そうでなければ第２層の形成を妨害しうるカルボキシル基を防御するために）エステル結合を含む場合、エステルはナノ結晶にアルカリ性溶液（たとえば水酸化ナトリウム）を添加することによって加水分解させることができる。ナノ結晶にアルカリ性溶液を添加することで、第２層中のカルボキシル基を溶液中に放出させることができ、それによりナノ結晶に水溶性を付与する。
【００７７】
[0077]本発明はさらに、所与の検体への結合親和性を有する分子にコンジュゲートされている、本明細書で開示するようなナノ結晶に関する。所与の検体への結合親和性を有する分子をナノ結晶へコンジュゲートすることによって、マーカー化合物またはプローブが形成される。このようなプローブでは、本発明のナノ結晶は、所与の検体の検出に使用することができる、例えば電磁スペクトルの可視または近赤外範囲の放射線を放出する標識またはタグとして作用する。
【００７８】
[0078]原則として、検体に少なくとも多少特異的に結合できる特異的な結合パートナーが存在する各検体を検出することができる。検体は、薬物（例えばアスピリン（登録商標）またはリバビリン）などの化学化合物、あるいはタンパク質（例えばトロポニンに特異性の抗体または細胞表面タンパク質）または核酸分子などの生化学分子でありうる。興味のある検体、例えばリバビリンのための結合親和性を備えた適切な分子（検体結合パートナーとも呼ばれる）にカップリングされたとき、得られたプローブは例えば、患者の血漿中の薬物レベルを監視するための蛍光免疫測定法に使用することができる。心筋の損傷の、それゆえ一般に心臓発作のマーカータンパク質であるトロポニンの場合、抗トロポニン抗体および本発明のナノ結晶を含有するコンジュゲートを、心臓発作の診断に使用することができる。本発明のナノ結晶と腫瘍関連細胞表面タンパク質に特異性である抗体とのコンジュゲートの場合、このコンジュゲートを腫瘍診断または撮像に使用することができる。別の例は、ナノ結晶とストレプトアビジンとのコンジュゲートである。
【００７９】
[0079]検体は、これに限定されるわけではないが、ウィルス粒子、染色体または全細胞を含む複合生物構造であってもよい。例えば検体結合パートナーが細胞膜に結合する脂質である場合、このような脂質に結合された本発明のナノ結晶を含むコンジュゲートが、全細胞の検出および描出に使用することができる。細胞染色または細胞撮像などの目的のために、可視光を放出するナノ結晶を使用することが好ましい。この開示に従って、検体結合パートナーにコンジュゲートされた本発明のナノ粒子を含むマーカー化合物の使用によって検出される検体は、好ましくは生体分子である。
【００８０】
[0080]したがってさらに好ましい実施形態において、検体に対して結合親和性を有する分子は、タンパク質、ペプチド、免疫原性ハプテンの特徴を有する化合物、核酸、炭水化物または有機分子である。検体結合パートナーとして利用されるタンパク質は例えば、抗体、抗体断片、リガンド、アビジン、ストレプトアビジンまたは酵素でありうる。有機分子の例は、ビオチン、ジゴキシゲニン、セロトロニン、葉酸誘導体、抗原、ペプチド、タンパク質、核酸および酵素などである。核酸は、これに限定されるわけではないが、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＰＮＡ分子、１０〜５０ｂｐを持つ短オリゴヌクレオチドはもちろんのこと、より長い核酸からも選択されうる。
【００８１】
[0081]生体分子の検出に使用される場合、本発明のナノ結晶は、宿主分子の表面露出基を介して結合活性を有する分子にコンジュゲートさせることができる。この目的では、アミン、ヒドロキシルまたはカルボキシラート基などのコーティング試薬の表面露出官能基は、連結剤と反応させることができる。連結剤は本明細書で使用するように、本発明のナノ結晶を、任意の生物標的への結合親和性を有する分子へ連結することができる任意の化合物を意味する。ナノ結晶を検体結合パートナーにコンジュゲートするために使用されうる連結剤の種類の例は、エチル−３−ジメチルアミノカルボジイミドなどの（２官能性）連結剤または当業者に既知である他の適切なカップリング化合物である。適切な連結剤の例は、Ｎ−（３−アミノプロピル）３−メルカプト−ベンズアミド、３−アミノプロピル−トリメトキシシラン、３−メルカプトプロピル−トリメトキシシラン、３−（トリメトキシシリル）プロピル−マレイミド、および３−（トリメトキシシリル）プロピル−ヒドラジドである。コーティング試薬も、所期の結合親和性を有する選択された分子また検体結合パートナーに連結されている適切な連結剤とコンジュゲートされせることができる。例えばコーティング試薬がシクロデキストリン部分を含む場合、そこでこれに限定されるわけではないが、そのすべてが興味のある分子との共有結合を形成するための適切な反応性基を有する、フェロセン誘導体、アダマンタン化合物、ポリオキシエチレン化合物、芳香族化合物を含む適切な連結剤を使用することができる。
【００８２】
[0082]さらに本発明は、ここで定義されるようなナノ結晶の少なくとも１種類を含有する組成物にも関する。ナノ結晶をプラスチックビーズ、磁気ビーズまたはラテックスビーズに包含してもよい。さらにここで定義されるようなナノ結晶を含有する検出キットも本発明の一部である。
【００８３】
[0083]本発明は、次の非制限的な実施例および添付図面によってさらに説明される。
【００８４】
［実施例１］
水溶液中での架橋シェルを持つ水溶性ナノ結晶の調製
[0088]TOPOキャップナノ結晶は、次の手順に従って最初に調製された。
【００８５】
[0089]トリオクチルホスフィンオキシド（ＴＯＰＯ）（３０ｇ）をフラスコに入れて、真空下（〜１トール）で１８０℃にて１時間乾燥させた。次いでフラスコに窒素を充填して、３５０℃まで加熱した。不活性雰囲気ドライボックス中で、次の注射溶液を調製した。CdMe2（０．３５ｍｌ）、１Ｍトリオクチルホスフィン−Se（ＴＯＰＳＥ）溶液（４．０ｍｌ）、およびトリオクチルホスフィン（ＴＯＰ）（１６ｍｌ）。注射溶液は完全に混合され、注射器に装填されて、ドライボックスから取り出された。
【００８６】
[0090]反応から熱を除去して、反応混合物は１回の連続注射によって激しく撹拌されているＴＯＰＯ中に移された。反応フラスコに加熱が使用され、温度を２６０〜２８０℃まで徐々に上昇させた。反応後、反応フラスコは約６０℃まで冷却され、ＴＯＰＯの固化を防止するためにブタノール２０ｍｌが添加された。大量のメタノールの添加は、粒子を綿状塊にさせた。綿状塊は遠心分離によって上清から分離された。得られた粉末は、光学的に透明な溶液を生成するために、各種の有機溶媒中に分散させることができる。
【００８７】
[0091]ＴＯＰＯ５ｇを含有するフラスコは１９０℃にて真空下で数時間加熱され、次に６０℃まで冷却され、その後トリオクチルホスフィン（ＴＯＰ）０．５ｍｌが添加された。ヘキサン中に分散されたCdSeドット約０．１〜０．４μｍｏｌは注射器で反応容器に移され、溶媒はポンプで除去された。ジエチル亜鉛（ZnEt2）およびヘキサメチルジシラチアン（（TMS）2S）は、ZnおよびＳ前駆物質としてそれぞれ使用された。前駆物質等モル量を不活性雰囲気のグローブボックス内でＴＯＰ２〜４ｍｌに溶解させた。前駆物質溶液は注射器に装填され、反応フラスコに取り付けられた添加漏斗に移された。添加が完了した後、混合物は９０℃まで冷却され、数時間撹拌されたままであった。室温への冷却時にＴＯＰＯが固化するのを防止するために、混合物にブタノールが添加された。
【００８８】
[0092]このように形成された（CdSe）−ZnSコアシェルナノ結晶は、２、３滴のピリジンと共にきわめて過剰量の３−メルカプトプロピオン酸を含むクロロホルム中に溶解された。混合物は超超音波処理（ultrasonication）を約２時間受けさせされて、室温にて一晩撹拌させておいた。形成された沈殿は遠心分離によって収集され、過剰の酸を除去するためにアセトンで洗浄された。残渣はアルゴン蒸気によって短時間乾燥させた。ナノ結晶コアを被覆／包囲する第１層を形成するカルボン酸の分子によってコーティングされた、得られたナノ結晶は次に水または緩衝溶液に溶解された（図２、ステップ１を参照）。水溶液中のナノ結晶はもう１回遠心分離され、０．２μｍフィルタで濾過させられて、アルゴンによって脱気され、使用前に２５℃で貯蔵された。
【００８９】
[0093]架橋界面の形成および続いての第２層に含まれるコーティング試薬層との重合のために、カルボン酸キャップナノ結晶は水性緩衝系に溶解された。ＥＤＣ（１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド）およびスルホＮＨＳ（スルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）は架橋剤としてナノ結晶溶液に、５００〜１０００倍の過剰量で添加された。得られた溶液は、架橋界面の形成に関与する官能基の活性化のために、室温にて３０分間撹拌された（図２、ステップ２を参照）。カルボン酸キャップナノ結晶、ＥＤＣおよびスルホＮＨＳを含有する混合物は、同じ緩衝器内でジアミノカルボキシルメチルエステル溶液に撹拌しながら滴加された。混合物は室温にて２時間撹拌され、次に、架橋界面の形成および第２層に含まれているコーティング試薬の第１層への共有結合のために４℃にて一晩放置された（図２、ステップ３を参照）。ジアミノカルボキシルエステルの水溶性カルボキシル基を放出させて（すなわちメチルエステル結合の加水分解）、それゆえ第２の水溶性層を形成するために、次に０．１Ｎ NaOHおよびエタノールが添加され、溶液は室温にてさらに６時間撹拌を続けられた（図２、ステップ４）を参照。溶液は任意の固体も除去するために遠心分離され、ストック溶液として水溶液中に４℃にて貯蔵された。
【００９０】
[0094]得られた量子ドットは有機溶媒抽出によっても精製されうる。反応（架橋界面の形成および第２層に含まれているコーティング試薬の第１層への共有結合）が完了した後、エステル表面を備えたポリマーシェルを持つ量子ドットを有機溶媒から抽出するために、溶液はエチルアセテートによって抽出された。そのように得られた有機溶媒は合せられて乾燥され、次に回転蒸発機によって除去されて、エステル結合の加水分解および水溶性ナノ結晶の形成のために、エタノールおよび０．１Ｎ ＮａＯＨに溶解された。溶液は室温にて４時間にわたり絶えず撹拌され、次に中和された。得られた透明溶液は、任意の微量の固体を除去するために遠心分離され、脱気後に室温にて水溶液中に貯蔵された。
【００９１】
[0095]本発明の得られた架橋水溶性シェルを持つナノ結晶の物理化学的特性は、メルカプトプロピオン酸（ＭＣＡ）またはアミノエタンチオール（ＡＥＴ）のみでキャッピングされた（CdSe）−ZnSコアシェルナノ結晶の物理化学的特性と次のように比較された。ナノ結晶の水溶液に、H2O2が最終濃度０．１５ｍｏｌ／ｌで添加され、化学挙動が分光写真器によって追跡された。ＭＣＡまたはＡＥＴによってのみコーティングされたナノ結晶では、ナノ結晶の酸化がただちに検出され、ナノ結晶は３０分以内に沈殿した。これに対して本発明のシェル化ナノ結晶は、ごく低速で発生する化学的酸化に対して著しくさらに安定であった。
【００９２】
[0096]さらなる実験において（データは示さず）、０．１Ｍ CdSO4溶液がＭＣＡのみでキャッピングされた（CdSe）−ZnSコアシェルナノ結晶または本発明のシェルを持つナノ結晶のどちらかに添加されたとき、ＭＣＡキャップナノ結晶は溶液から迅速に沈殿した。これに対して、本発明のナノ結晶は溶液中で安定を維持し、カドミウムイオンの添加がその安定性に有意な効果を持たないことを示している。
【００９３】
[0097]同様に、シェルを持つナノ結晶の光化学安定性も、ＭＣＡキャップナノ結晶と比較して有意に改善された（データは示さず）。波長２５４ｎｍのUV光に露出されたときに、ＭＣＡキャップナノ結晶は４８時間内に溶液から沈殿するのが見出されたのに対して、本発明のシェルを持つナノ結晶は４日間安定であった。蛍光強度も長時間にわたって安定であることが見出された。
【００９４】
［実施例２］
有機溶液中での架橋シェルを持つ水溶性ナノ結晶の調製
[0098]ＴＯＰＯキャップナノ結晶は実施例１に従って調製され、第１層の形成のために過剰量のペンタン−（３−Ｎ−エチルチオール）−１，５−ジアミンの過剰量と共にクロロホルムに溶解された（図３、ステップ１を参照）。混合物は室温にて一晩放置された。形成された沈殿は遠心分離によって収集され、次にメタノールで洗浄され、アルゴンガスによって短時間乾燥された。得られたナノ結晶は無水ＤＭＦ（５０ｍｌ）に溶解された。
【００９５】
[0099]別のフラスコに、ペンタン−３，３−ジエチル−カルボン酸エステル−１，５−ジカルボン酸（第２層に含まれるコーティング剤として）をＤＭＦにＥＤＣおよびＮＨＳ ５当量と共に溶解され、窒素保護の下で室温にて２０分間撹拌された（図３、ステップ２を参照）。コーティング剤との共有結合的カップリングのために、ナノ結晶溶液に溶液がゆっくり添加された（図３、ステップ３を参照）。得られた溶液を室温にて２時間撹拌した後に、ＤＭＦ溶媒は減圧下でロータベーパーシステムを使用することによって蒸発された。得られたスラリーは水５ｍｌに溶解され、次に第２層に溶媒露出水溶性結合を形成するために、１Ｍ EtONa／EtOH溶液５ｍｌが添加され、室温にてさらに２時間撹拌された。得られた溶液は、任意の微量の添加剤または未反応開始物質を除去するために、エーテルで２回洗浄された（５ｍｌ×２）。溶液は次に、貯蔵のために０．１Ｎ HCl水溶液で中和された。さらなる精製は、ポリマーコートナノ結晶の酸性溶液中での遠心分離および溶液のｐＨ値の調整によるナノ結晶の水への再溶解によって実施された。
【図面の簡単な説明】
【００９６】
【図１Ａ】本発明の水溶性ナノ結晶の一般化された図を示す。
【図１Ｂ】キャッピング試薬ヘプタン−（４−Ｎ−エチルチオール）−１，７−ジカルボン酸（第１層を形成するために使用される）と第２層を形成するためのコーティング試薬として使用されるジ−（３−アミノプロピル）−６−Ｎ−ヘキサン酸メチルエステル）との間に形成された架橋界面の拡大概略図を示す（図２も参照）。図１ｂよりわかるように、コーティング試薬分子がキャッピング試薬分子を共に連結する橋として作用するように、ナノ結晶は、キャッピング試薬の少なくとも２個の（隣接する）分子とコーティング試薬の１個の分子との間の共有結合から形成された界面領域を含む。
【図２Ａ】コーティング試薬としてのジアミンカルボキシルエステル（ジ−（３−アミノプロピル）−６−Ｎ−ヘキサン酸メチルエステル）、およびキャッピング試薬としてのヘプタン−（４−Ｎ−エチルチオール）−１，７−ジカルボン酸を使用する架橋によって形成された、ポリアミドシェル内にカプセル化された水溶性ナノ結晶を合成するための方法の概略図を示す。本実施例では、形成された第２層は露出されたカルボン酸基を含有する。
【図２Ｂ】コーティング試薬としてのジアミンカルボキシルエステル（ジ−（３−アミノプロピル）−６−Ｎ−ヘキサン酸メチルエステル）、およびキャッピング試薬としてのヘプタン−（４−Ｎ−エチルチオール）−１，７−ジカルボン酸を使用する架橋によって形成された、ポリアミドシェル内にカプセル化された水溶性ナノ結晶を合成するための方法の概略図を示す。本実施例では、形成された第２層は露出されたカルボン酸基を含有する。
【図３Ａ】第１層を形成するためのキャッピング試薬としてのペンタン−（３−Ｎ−エチルチオール）−１，５−ジアミン、および第２層を形成するためのコーティング試薬としてのペンタン−３，３−ジエチルカルボン酸エステル−１，５−ジカルボン酸を使用する架橋によって形成された、ポリアミド水溶性シェル内にカプセル化された水溶性ナノ結晶を合成するための方法の概略図を示す。
【図３Ｂ】第１層を形成するためのキャッピング試薬としてのペンタン−（３−Ｎ−エチルチオール）−１，５−ジアミン、および第２層を形成するためのコーティング試薬としてのペンタン−３，３−ジエチルカルボン酸エステル−１，５−ジカルボン酸を使用する架橋によって形成された、ポリアミド水溶性シェル内にカプセル化された水溶性ナノ結晶を合成するための方法の概略図を示す。
【図４】メルカプトプロピオン酸（ＭＣＡ）またはアミノエタンチオール（ＡＥＴ）のみでキャッピングされた（CdSe）−ZnSコアシェルナノ結晶の一方と比較した、本発明のシェルを持つナノ結晶の化学的酸化に対する安定性を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
元素周期系（PSE）の亜族Ib、亜族IIb、亜族IVb、亜族Vb、亜族VIb、亜族VIIb、亜族VIIIb、主族II、主族IIIまたは主族IVの元素から選択される少なくとも１つの金属M1を含むナノ結晶コアを含む水溶性ナノ結晶であって、
前記ナノ結晶コアが、さらに、
前記コアの表面に結合したキャッピング試薬であり、少なくとも２個のカップリング基を有するキャッピング試薬を含む第１層と、
コーティング試薬によって共有結合的にカップリングした少なくとも２個のカップリング部分と、水溶性が付与されるよう少なくとも１個の水溶性基とを有する低分子量コーティング試薬を含む第２層と、
を含む、水溶性ナノ結晶。
【請求項２】
元素周期系（PSE）の主族II、亜族VIIA、亜族VIIIA、亜族IB、亜族IIB、亜族IIIまたは主族IVの元素から選択される少なくとも１つの金属M1と、PSEの主族Vまたは主族VIから選択される少なくとも１つの元素Aとを含む、ナノ結晶コアとを含む水溶性ナノ結晶であって、
前記ナノ結晶コアが、さらに、
前記ナノ結晶コアの表面に結合したキャッピング試薬であり、少なくとも２個のカップリング基を有するキャッピング試薬を含む第１層と、
コーティング試薬によって共有結合的にカップリングした少なくとも２個のカップリング部分と、水溶性が付与されるよう少なくとも１個の水溶性基とを有する低分子量コーティング試薬を含む第２層と、
を含む、水溶性ナノ結晶。
【請求項３】
前記キャッピング試薬が前記ナノ結晶の前記コア表面への親和性を有する末端基を含む、請求項１または２に記載のナノ結晶。
【請求項４】
前記末端基がスルフヒドリル、アミノ、アミン−オキシドおよびホスフィノ基から成る群より選択される、請求項３に記載のナノ結晶。
【請求項５】
前記キャッピング試薬の少なくとも２個のカップリング基が疎水性領域によって前記末端基から離間されている、請求項１〜３のいずれか一項に記載のナノ結晶。
【請求項６】
前記少なくとも２個のカップリング基の各々がアミノ、ヒドロキシル、カルボニル、カルボキシル、ニトリル、イソシアナート、エポキシド、無水物およびハロゲン基から独立して選択される官能基を含む、請求項４に記載のナノ結晶。
【請求項７】
前記キャッピング試薬が式（I）：
【化１】
（式中、
Xは、S、N、P、またはO＝Pから選択される末端基であり、
Raは、少なくとも２個の主鎖炭素原子を含む部分であり、
Yは、N、C、−COO−、または−CH2O−から選択され、
Zは、極性官能基を含む部分であり、
kは、０または１であり、
mは、１〜３の整数であり、
nは、０〜３の整数であり、
n’は、０〜２の整数であり、ここでn’は、Yの価数要件を満足するように選択される）
を有する分子である、請求項１〜６のいずれか一項に記載のナノ結晶。
【請求項８】
前記部分Raが２〜５０個の主鎖原子を含む、請求項７に記載のナノ結晶。
【請求項９】
Raがアルキル、アルケニル、アルコキシルおよびアリール部分から成る群より選択される、請求項７または８に記載のナノ結晶。
【請求項１０】
Raの各々がエチル、プロピル、ブチル、ペンチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロオクチル、エトキシ、およびベンジルから成る群より独立して選択される部分である、請求項９に記載のナノ結晶。
【請求項１１】
Zがアミノ、ヒドロキシル、カルボニル、カルボキシル、ニトリル、ニトロ、イソシアナートおよびハロゲン基から成る群より選択される官能基である、請求項７〜１０のいずれか一項に記載のナノ結晶。
【請求項１２】
Zが２〜５０個の主鎖原子を含む、請求項１１に記載のナノ結晶。
【請求項１３】
Zがさらにアミドまたはエステル結合を含む、請求項１２に記載のナノ結晶。
【請求項１４】
前記キャッピング試薬が２個の同一カップリング基を含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のナノ結晶。
【請求項１５】
前記キャッピング試薬が、
【化２】
から成る群より選択される化合物である、請求項１４のいずれかに記載のナノ結晶。
【請求項１６】
前記キャッピング試薬が２個の異なるカップリング基を含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のナノ結晶。
【請求項１７】
前記キャッピング試薬が、
【化３】
から成る群より選択される、請求項１６に記載のナノ結晶。
【請求項１８】
前記キャッピング試薬の前記カップリング基が重合性不飽和炭素間結合を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載のナノ結晶。
【請求項１９】
前記キャッピング試薬が、ω−チオール末端メチルメタクリレート、２−ブテンチオール、（Ｅ）−２−ブテン−１−チオール、Ｓ−（Ｅ）−２−ブテニルチオアセテート、Ｓ−３−メチルブテニルチオアセテート、２−キノリンメタンチオール、およびＳ−２−キノリンメチルチオアセテートから成る群より選択される、請求項１８に記載のナノ結晶。
【請求項２０】
前記第２層に含まれる前記コーティング試薬が一般式（II）：
【化４】
（式中、
Tは、親水性部分であり、
Rcは、少なくとも２個の主鎖炭素原子を含む部分であり、
Gは、N、PまたはC、またはSiから選択され、
Z’は、カップリング部分であり、
m’は、２または３であり、
nは、１または２であり、および
n’は、０または１であり、ここでn’は、Gの価数要件を満足するように選択される）を有する水溶性分子を含む、請求項１〜１９のいずれか一項に記載のナノ結晶。
【請求項２１】
Tが、カルボキシル、アミノ、ニトロ、ヒドロキシル、カルボニル基およびその誘導体から成る群より選択される官能基を含む、請求項２０に記載のナノ結晶。
【請求項２２】
Rcが３〜６個の主鎖炭素原子を含む、請求項２０または２１に記載のナノ結晶。
【請求項２３】
Z’が少なくとも６個の主鎖炭素原子を含む、請求項２０〜２２のいずれか一項に記載のナノ結晶。
【請求項２４】
Z’が、アミノ、ヒドロキシル、カルボニル、カルボキシル、ニトリル、ニトロ、イソシアナート、エポキシド、無水物およびハロゲン基から成る群より選択される少なくとも１個の官能基をさらに含む、請求項２３に記載のナノ結晶。
【請求項２５】
前記カップリング部分Z’の各々が同一である、請求項２４に記載のナノ結晶。
【請求項２６】
前記コーティング試薬がジアミン、ジカルボン酸、およびジオールから成る群より選択される、請求項２５に記載のナノ結晶。
【請求項２７】
前記ジアミンが２，４−ジアミノ酪酸または２，３−ジアミノプロピオン酸から選択される、請求項２６に記載のナノ結晶。
【請求項２８】
前記コーティング試薬が、
【化５】
から成る群より選択され、
式中、CDはシクロデキストリン、および
【化６】
である、請求項２６のいずれか一項に記載のナノ結晶。
【請求項２９】
前記カップリング部分Ｚ’の各々が異なる、請求項２４に記載のナノ結晶。
【請求項３０】
前記コーティング試薬が、
【化７】
から成る群より選択される、請求項２９に記載のナノ結晶。
【請求項３１】
前記コーティング試薬がジエンを含む、請求項１８または１９に記載のナノ結晶。
【請求項３２】
前記ジエンが１，４−ブタジエン、１，５−ペンタジエンおよび１，６−ヘキサジエンから成る群より選択される、請求項３１に記載のナノ結晶。
【請求項３３】
前記ナノ結晶がコアシェルナノ結晶である、請求項２〜３２のいずれか一項に記載のナノ結晶。
【請求項３４】
前記金属がZn、Cd、Hg、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、Ag、及びAuから成る群より選択される、請求項３３に記載のナノ結晶。
【請求項３５】
前記元素AがS、Se、及びTeから成る群より選択される、請求項３３または３４に記載のナノ結晶。
【請求項３６】
前記ナノ結晶がCdS、CdSe、MgTe、CdTe、ZnS、ZnSe、ZnTe、HgS、HgSe、およびHgTeから成る群より選択されるコアシェルナノ結晶である、請求項３５に記載のナノ結晶。
【請求項３７】
前記ナノ結晶が組成M11−xM2xAを有する均質三元合金を含み、式中、
a) AがPSEの主族VIの元素を表すとき、M1及びM2は、元素周期系（PSE）の亜族IIb−VIB、IIIB−VBまたはIVB、主族IIまたは主族IIIの元素から独立して選択され、または
b) AがPSEの主族（V）の元素を表すとき、M1及びM2はどちらもPSEの主族（III）の元素から選択され、
i) ナノ結晶の産生に適した形の元素M1を含有する反応混合物を適切な温度T1まで加熱する工程と、この温度においてナノ結晶の産生に適した形の元素Aを添加する工程と、反応混合物が前記二元ナノ結晶M1Aを形成するのに適した温度で十分な期間にわたって加熱する工程、次に反応混合物を冷却させる工程とによって二元ナノ結晶M1Aを形成するステップと、
ii) 形成された二元ナノ結晶M1Aを沈殿または単離することなく、反応混合物を適切な温度T2まで再加熱し、この温度の反応混合物にナノ結晶の産生に適した形の元素Mの十分な量を添加して、次に前記三元ナノ結晶M11−xM2xAを形成するのに適した温度にて十分な期間にわたって反応混合物を加熱し、次に反応混合物を室温まで冷却して、三元ナノ結晶M11−xM2xAを単離するステップと、
を含むプロセスによって得ることができる、請求項２〜３６のいずれか一項に記載のナノ結晶。
【請求項３８】
0.001＜x＜0.999の、請求項３７に記載のナノ結晶。
【請求項３９】
0.01＜x＜0.99の、請求項３７または３８に記載のナノ結晶。
【請求項４０】
0.5＜x＜0.95の、請求項３７〜３９のいずれか一項に記載のナノ結晶。
【請求項４１】
前記元素M1およびM2がZn、Cd、Hg、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、Ag、及びAuから成る群より独立して選択される、請求項３７〜４０のいずれか一項に記載のナノ結晶。
【請求項４２】
前記元素AがS、Se、及びTeから成る群より選択される、請求項３７〜４１のいずれかに記載のナノ結晶。
【請求項４３】
前記ナノ結晶が組成ZnxCd1−xSeまたはZnxCd1−xSを有する、請求項４２に記載のナノ結晶。
【請求項４４】
前記ポリマーシェルの前記第２層にコンジュゲートされている所与の検体に対して結合親和性を有する分子をさらに含む、請求項１〜４３のいずれか一項に記載のナノ結晶。
【請求項４５】
前記検体に対して結合親和性を有する分子が、タンパク質、ペプチド、免疫原性ハプテンの特徴を有する化合物、核酸、炭水化物または有機分子である、請求項４４に記載のナノ結晶。
【請求項４６】
前記ナノ結晶が検体に対して結合親和性を有する前記分子に共有結合連結剤によってコンジュゲートされる、請求項４４または４５に記載のナノ結晶。
【請求項４７】
検体の検出のための、請求項１〜４６のいずれか一項に記載のナノ結晶の使用。
【請求項４８】
元素周期系（PSE）の亜族Ib、亜族IIb、亜族IVb、亜族Vb、亜族VIb、亜族VIIb、亜族VIIIb、主族II、主族IIIまたは主族IVの元素から選択される少なくとも１つの金属M1を含むナノ結晶コアを提供するステップと、
前記ナノ結晶コアをキャッピング試薬と反応させて、それにより前記キャッピング試薬を前記ナノ結晶の表面に結合させ、前記ナノ結晶コアを包囲する第１層を形成するステップと、
前記キャッピング試薬に、前記キャッピング試薬の少なくとも２個のカップリング基に対して反応性である少なくとも２個のカップリング部分と、第２層に水溶性を付与するよう少なくとも１個の水溶性基とを有する低分子量コーティング試薬をカップリングさせて、それにより前記第１層に共有結合的にカップリングされた第２層を形成して、前記ナノ結晶コアを包囲する水溶性シェルの形成を完了させるステップと、
を含む、水溶性ナノ結晶を調製する方法。
【請求項４９】
元素周期系（PSE）の亜族IIB−VIB、IIIB−VBまたはIVB、主族IIまたは主族IIIの元素から独立して選択される少なくとも１つの金属M1と、周期系の主族Vまたは主族VIから選択される少なくとも１つの元素Aとを含む、ナノ結晶コアを提供するステップと、
前記ナノ結晶コアをキャッピング試薬と反応させて、それにより前記キャッピング試薬をナノ結晶の表面に結合させ、ナノ結晶コアを包囲する第１層を形成するステップと、
前記キャッピング試薬に、前記キャッピング試薬の少なくとも２個のカップリング基に対して反応性である少なくとも２個のカップリング部分と、第２層に水溶性を与えるための少なくとも１個の水溶性基とを有する低分子量コーティング試薬をカップリングさせて、それにより前記第１層に共有結合的にカップリングされた第２層を形成して、前記ナノ結晶コアを包囲する水溶性シェルの形成を完了させるステップと、
を含む、水溶性ナノ結晶を調製する方法。
【請求項５０】
前記キャッピング試薬が親水性である、請求項４８または４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記キャッピング試薬が疎水性である、請求項４８または４９に記載の方法。
【請求項５２】
前記キャッピング試薬中に存在する各カップリング基がアミノ、ヒドロキシル、カルボニル、カルボキシル、ニトリル、ニトロ、イソシアナート、エポキシド、無水物およびハロゲン基から選択される官能基を含む、請求項４８〜５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
前記キャッピング試薬が式（I）：
【化８】
（式中、
Xは、S、N、P、またはO＝Pから選択される末端基であり、
Raは、少なくとも２個の主鎖炭素原子を含む部分であり、
Yは、N、C、−COO−、または−CH2O−から選択され、
Zは、極性官能基を含む部分であり、
kは、０または１であり、
nは、０〜３の整数であり、
n’は、０〜２の整数であり、ここでn’は、Yの価数要件を満足するように選択され、
mは、１〜３の整数である）
を有する、請求項４８〜５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
前記キャッピング試薬が、
【化９】
から成る群より選択される化合物である、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記コーティング試薬を前記キャッピング試薬にカップリングする前に、前記キャッピング試薬の前記カップリング基を活性化するステップをさらに含む、請求項４８〜５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
前記活性化ステップが前記キャッピング試薬の前記第１層を含む前記ナノ結晶にカップリング剤を反応させることを含む、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記カップリング剤が１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド（ＥＤＣ）、スルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド、およびＮ−ヒドロキシスクシンイミドから成る群より選択される、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記キャッピング試薬にコーティング試薬をカップリングさせるステップが、前記コーティング試薬および前記カップリング剤を共に、第１層を含むナノ結晶コアを含有する溶液に添加することを含む、請求項４８〜５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
前記カップリングが水性緩衝溶液中で実施される、請求項４８〜５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６０】
前記水性緩衝溶液がリン酸またはアンモニウム緩衝溶液を含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記カップリングが極性有機溶媒中で実施される、請求項４８〜６０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６２】
前記有機溶媒がピリジン、ＤＭＦ、およびクロロホルムから成る群より選択される、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記第２層に含まれる前記コーティング試薬が一般式（II）：
【化１０】
（式中、
Tは、親水性部分であり、
Rcは、少なくとも２個の主鎖炭素原子を含む部分であり、
Gは、N、PまたはC、またはSiから選択され、
Z’は、カップリング部分であり、
m’は、２または３であり、
nは、１または２であり、
n’は、０または１であり、ここでn’は、Gの価数要件を満足するように選択される）を有する水溶性分子を含む、請求項４８〜６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６４】
前記コーティング試薬が、
【化１１】
から成る群より選択され、
式中、CDはシクロデキストリン、および
【化１２】
である、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記第２層に含まれる前記ポリマーに、前記第２層中に存在する水溶性基を露出させるのに適した試薬を反応させるステップをさらに含む、請求項４８〜６４のいずれかに記載の方法。
【請求項１】
元素周期系（PSE）の亜族Ib、亜族IIb、亜族IVb、亜族Vb、亜族VIb、亜族VIIb、亜族VIIIb、主族II、主族IIIまたは主族IVの元素から選択される少なくとも１つの金属M1を含むナノ結晶コアを含む水溶性ナノ結晶であって、
前記ナノ結晶コアが、さらに、
前記コアの表面に結合したキャッピング試薬であり、少なくとも２個のカップリング基を有するキャッピング試薬を含む第１層と、
コーティング試薬によって共有結合的にカップリングした少なくとも２個のカップリング部分と、水溶性が付与されるよう少なくとも１個の水溶性基とを有する低分子量コーティング試薬を含む第２層と、
を含む、水溶性ナノ結晶。
【請求項２】
元素周期系（PSE）の主族II、亜族VIIA、亜族VIIIA、亜族IB、亜族IIB、亜族IIIまたは主族IVの元素から選択される少なくとも１つの金属M1と、PSEの主族Vまたは主族VIから選択される少なくとも１つの元素Aとを含む、ナノ結晶コアとを含む水溶性ナノ結晶であって、
前記ナノ結晶コアが、さらに、
前記ナノ結晶コアの表面に結合したキャッピング試薬であり、少なくとも２個のカップリング基を有するキャッピング試薬を含む第１層と、
コーティング試薬によって共有結合的にカップリングした少なくとも２個のカップリング部分と、水溶性が付与されるよう少なくとも１個の水溶性基とを有する低分子量コーティング試薬を含む第２層と、
を含む、水溶性ナノ結晶。
【請求項３】
前記キャッピング試薬が前記ナノ結晶の前記コア表面への親和性を有する末端基を含む、請求項１または２に記載のナノ結晶。
【請求項４】
前記末端基がスルフヒドリル、アミノ、アミン−オキシドおよびホスフィノ基から成る群より選択される、請求項３に記載のナノ結晶。
【請求項５】
前記キャッピング試薬の少なくとも２個のカップリング基が疎水性領域によって前記末端基から離間されている、請求項１〜３のいずれか一項に記載のナノ結晶。
【請求項６】
前記少なくとも２個のカップリング基の各々がアミノ、ヒドロキシル、カルボニル、カルボキシル、ニトリル、イソシアナート、エポキシド、無水物およびハロゲン基から独立して選択される官能基を含む、請求項４に記載のナノ結晶。
【請求項７】
前記キャッピング試薬が式（I）：
【化１】
（式中、
Xは、S、N、P、またはO＝Pから選択される末端基であり、
Raは、少なくとも２個の主鎖炭素原子を含む部分であり、
Yは、N、C、−COO−、または−CH2O−から選択され、
Zは、極性官能基を含む部分であり、
kは、０または１であり、
mは、１〜３の整数であり、
nは、０〜３の整数であり、
n’は、０〜２の整数であり、ここでn’は、Yの価数要件を満足するように選択される）
を有する分子である、請求項１〜６のいずれか一項に記載のナノ結晶。
【請求項８】
前記部分Raが２〜５０個の主鎖原子を含む、請求項７に記載のナノ結晶。
【請求項９】
Raがアルキル、アルケニル、アルコキシルおよびアリール部分から成る群より選択される、請求項７または８に記載のナノ結晶。
【請求項１０】
Raの各々がエチル、プロピル、ブチル、ペンチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロオクチル、エトキシ、およびベンジルから成る群より独立して選択される部分である、請求項９に記載のナノ結晶。
【請求項１１】
Zがアミノ、ヒドロキシル、カルボニル、カルボキシル、ニトリル、ニトロ、イソシアナートおよびハロゲン基から成る群より選択される官能基である、請求項７〜１０のいずれか一項に記載のナノ結晶。
【請求項１２】
Zが２〜５０個の主鎖原子を含む、請求項１１に記載のナノ結晶。
【請求項１３】
Zがさらにアミドまたはエステル結合を含む、請求項１２に記載のナノ結晶。
【請求項１４】
前記キャッピング試薬が２個の同一カップリング基を含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のナノ結晶。
【請求項１５】
前記キャッピング試薬が、
【化２】
から成る群より選択される化合物である、請求項１４のいずれかに記載のナノ結晶。
【請求項１６】
前記キャッピング試薬が２個の異なるカップリング基を含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のナノ結晶。
【請求項１７】
前記キャッピング試薬が、
【化３】
から成る群より選択される、請求項１６に記載のナノ結晶。
【請求項１８】
前記キャッピング試薬の前記カップリング基が重合性不飽和炭素間結合を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載のナノ結晶。
【請求項１９】
前記キャッピング試薬が、ω−チオール末端メチルメタクリレート、２−ブテンチオール、（Ｅ）−２−ブテン−１−チオール、Ｓ−（Ｅ）−２−ブテニルチオアセテート、Ｓ−３−メチルブテニルチオアセテート、２−キノリンメタンチオール、およびＳ−２−キノリンメチルチオアセテートから成る群より選択される、請求項１８に記載のナノ結晶。
【請求項２０】
前記第２層に含まれる前記コーティング試薬が一般式（II）：
【化４】
（式中、
Tは、親水性部分であり、
Rcは、少なくとも２個の主鎖炭素原子を含む部分であり、
Gは、N、PまたはC、またはSiから選択され、
Z’は、カップリング部分であり、
m’は、２または３であり、
nは、１または２であり、および
n’は、０または１であり、ここでn’は、Gの価数要件を満足するように選択される）を有する水溶性分子を含む、請求項１〜１９のいずれか一項に記載のナノ結晶。
【請求項２１】
Tが、カルボキシル、アミノ、ニトロ、ヒドロキシル、カルボニル基およびその誘導体から成る群より選択される官能基を含む、請求項２０に記載のナノ結晶。
【請求項２２】
Rcが３〜６個の主鎖炭素原子を含む、請求項２０または２１に記載のナノ結晶。
【請求項２３】
Z’が少なくとも６個の主鎖炭素原子を含む、請求項２０〜２２のいずれか一項に記載のナノ結晶。
【請求項２４】
Z’が、アミノ、ヒドロキシル、カルボニル、カルボキシル、ニトリル、ニトロ、イソシアナート、エポキシド、無水物およびハロゲン基から成る群より選択される少なくとも１個の官能基をさらに含む、請求項２３に記載のナノ結晶。
【請求項２５】
前記カップリング部分Z’の各々が同一である、請求項２４に記載のナノ結晶。
【請求項２６】
前記コーティング試薬がジアミン、ジカルボン酸、およびジオールから成る群より選択される、請求項２５に記載のナノ結晶。
【請求項２７】
前記ジアミンが２，４−ジアミノ酪酸または２，３−ジアミノプロピオン酸から選択される、請求項２６に記載のナノ結晶。
【請求項２８】
前記コーティング試薬が、
【化５】
から成る群より選択され、
式中、CDはシクロデキストリン、および
【化６】
である、請求項２６のいずれか一項に記載のナノ結晶。
【請求項２９】
前記カップリング部分Ｚ’の各々が異なる、請求項２４に記載のナノ結晶。
【請求項３０】
前記コーティング試薬が、
【化７】
から成る群より選択される、請求項２９に記載のナノ結晶。
【請求項３１】
前記コーティング試薬がジエンを含む、請求項１８または１９に記載のナノ結晶。
【請求項３２】
前記ジエンが１，４−ブタジエン、１，５−ペンタジエンおよび１，６−ヘキサジエンから成る群より選択される、請求項３１に記載のナノ結晶。
【請求項３３】
前記ナノ結晶がコアシェルナノ結晶である、請求項２〜３２のいずれか一項に記載のナノ結晶。
【請求項３４】
前記金属がZn、Cd、Hg、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、Ag、及びAuから成る群より選択される、請求項３３に記載のナノ結晶。
【請求項３５】
前記元素AがS、Se、及びTeから成る群より選択される、請求項３３または３４に記載のナノ結晶。
【請求項３６】
前記ナノ結晶がCdS、CdSe、MgTe、CdTe、ZnS、ZnSe、ZnTe、HgS、HgSe、およびHgTeから成る群より選択されるコアシェルナノ結晶である、請求項３５に記載のナノ結晶。
【請求項３７】
前記ナノ結晶が組成M11−xM2xAを有する均質三元合金を含み、式中、
a) AがPSEの主族VIの元素を表すとき、M1及びM2は、元素周期系（PSE）の亜族IIb−VIB、IIIB−VBまたはIVB、主族IIまたは主族IIIの元素から独立して選択され、または
b) AがPSEの主族（V）の元素を表すとき、M1及びM2はどちらもPSEの主族（III）の元素から選択され、
i) ナノ結晶の産生に適した形の元素M1を含有する反応混合物を適切な温度T1まで加熱する工程と、この温度においてナノ結晶の産生に適した形の元素Aを添加する工程と、反応混合物が前記二元ナノ結晶M1Aを形成するのに適した温度で十分な期間にわたって加熱する工程、次に反応混合物を冷却させる工程とによって二元ナノ結晶M1Aを形成するステップと、
ii) 形成された二元ナノ結晶M1Aを沈殿または単離することなく、反応混合物を適切な温度T2まで再加熱し、この温度の反応混合物にナノ結晶の産生に適した形の元素Mの十分な量を添加して、次に前記三元ナノ結晶M11−xM2xAを形成するのに適した温度にて十分な期間にわたって反応混合物を加熱し、次に反応混合物を室温まで冷却して、三元ナノ結晶M11−xM2xAを単離するステップと、
を含むプロセスによって得ることができる、請求項２〜３６のいずれか一項に記載のナノ結晶。
【請求項３８】
0.001＜x＜0.999の、請求項３７に記載のナノ結晶。
【請求項３９】
0.01＜x＜0.99の、請求項３７または３８に記載のナノ結晶。
【請求項４０】
0.5＜x＜0.95の、請求項３７〜３９のいずれか一項に記載のナノ結晶。
【請求項４１】
前記元素M1およびM2がZn、Cd、Hg、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、Ag、及びAuから成る群より独立して選択される、請求項３７〜４０のいずれか一項に記載のナノ結晶。
【請求項４２】
前記元素AがS、Se、及びTeから成る群より選択される、請求項３７〜４１のいずれかに記載のナノ結晶。
【請求項４３】
前記ナノ結晶が組成ZnxCd1−xSeまたはZnxCd1−xSを有する、請求項４２に記載のナノ結晶。
【請求項４４】
前記ポリマーシェルの前記第２層にコンジュゲートされている所与の検体に対して結合親和性を有する分子をさらに含む、請求項１〜４３のいずれか一項に記載のナノ結晶。
【請求項４５】
前記検体に対して結合親和性を有する分子が、タンパク質、ペプチド、免疫原性ハプテンの特徴を有する化合物、核酸、炭水化物または有機分子である、請求項４４に記載のナノ結晶。
【請求項４６】
前記ナノ結晶が検体に対して結合親和性を有する前記分子に共有結合連結剤によってコンジュゲートされる、請求項４４または４５に記載のナノ結晶。
【請求項４７】
検体の検出のための、請求項１〜４６のいずれか一項に記載のナノ結晶の使用。
【請求項４８】
元素周期系（PSE）の亜族Ib、亜族IIb、亜族IVb、亜族Vb、亜族VIb、亜族VIIb、亜族VIIIb、主族II、主族IIIまたは主族IVの元素から選択される少なくとも１つの金属M1を含むナノ結晶コアを提供するステップと、
前記ナノ結晶コアをキャッピング試薬と反応させて、それにより前記キャッピング試薬を前記ナノ結晶の表面に結合させ、前記ナノ結晶コアを包囲する第１層を形成するステップと、
前記キャッピング試薬に、前記キャッピング試薬の少なくとも２個のカップリング基に対して反応性である少なくとも２個のカップリング部分と、第２層に水溶性を付与するよう少なくとも１個の水溶性基とを有する低分子量コーティング試薬をカップリングさせて、それにより前記第１層に共有結合的にカップリングされた第２層を形成して、前記ナノ結晶コアを包囲する水溶性シェルの形成を完了させるステップと、
を含む、水溶性ナノ結晶を調製する方法。
【請求項４９】
元素周期系（PSE）の亜族IIB−VIB、IIIB−VBまたはIVB、主族IIまたは主族IIIの元素から独立して選択される少なくとも１つの金属M1と、周期系の主族Vまたは主族VIから選択される少なくとも１つの元素Aとを含む、ナノ結晶コアを提供するステップと、
前記ナノ結晶コアをキャッピング試薬と反応させて、それにより前記キャッピング試薬をナノ結晶の表面に結合させ、ナノ結晶コアを包囲する第１層を形成するステップと、
前記キャッピング試薬に、前記キャッピング試薬の少なくとも２個のカップリング基に対して反応性である少なくとも２個のカップリング部分と、第２層に水溶性を与えるための少なくとも１個の水溶性基とを有する低分子量コーティング試薬をカップリングさせて、それにより前記第１層に共有結合的にカップリングされた第２層を形成して、前記ナノ結晶コアを包囲する水溶性シェルの形成を完了させるステップと、
を含む、水溶性ナノ結晶を調製する方法。
【請求項５０】
前記キャッピング試薬が親水性である、請求項４８または４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記キャッピング試薬が疎水性である、請求項４８または４９に記載の方法。
【請求項５２】
前記キャッピング試薬中に存在する各カップリング基がアミノ、ヒドロキシル、カルボニル、カルボキシル、ニトリル、ニトロ、イソシアナート、エポキシド、無水物およびハロゲン基から選択される官能基を含む、請求項４８〜５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
前記キャッピング試薬が式（I）：
【化８】
（式中、
Xは、S、N、P、またはO＝Pから選択される末端基であり、
Raは、少なくとも２個の主鎖炭素原子を含む部分であり、
Yは、N、C、−COO−、または−CH2O−から選択され、
Zは、極性官能基を含む部分であり、
kは、０または１であり、
nは、０〜３の整数であり、
n’は、０〜２の整数であり、ここでn’は、Yの価数要件を満足するように選択され、
mは、１〜３の整数である）
を有する、請求項４８〜５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
前記キャッピング試薬が、
【化９】
から成る群より選択される化合物である、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記コーティング試薬を前記キャッピング試薬にカップリングする前に、前記キャッピング試薬の前記カップリング基を活性化するステップをさらに含む、請求項４８〜５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
前記活性化ステップが前記キャッピング試薬の前記第１層を含む前記ナノ結晶にカップリング剤を反応させることを含む、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記カップリング剤が１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド（ＥＤＣ）、スルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド、およびＮ−ヒドロキシスクシンイミドから成る群より選択される、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記キャッピング試薬にコーティング試薬をカップリングさせるステップが、前記コーティング試薬および前記カップリング剤を共に、第１層を含むナノ結晶コアを含有する溶液に添加することを含む、請求項４８〜５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
前記カップリングが水性緩衝溶液中で実施される、請求項４８〜５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６０】
前記水性緩衝溶液がリン酸またはアンモニウム緩衝溶液を含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記カップリングが極性有機溶媒中で実施される、請求項４８〜６０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６２】
前記有機溶媒がピリジン、ＤＭＦ、およびクロロホルムから成る群より選択される、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記第２層に含まれる前記コーティング試薬が一般式（II）：
【化１０】
（式中、
Tは、親水性部分であり、
Rcは、少なくとも２個の主鎖炭素原子を含む部分であり、
Gは、N、PまたはC、またはSiから選択され、
Z’は、カップリング部分であり、
m’は、２または３であり、
nは、１または２であり、
n’は、０または１であり、ここでn’は、Gの価数要件を満足するように選択される）を有する水溶性分子を含む、請求項４８〜６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６４】
前記コーティング試薬が、
【化１１】
から成る群より選択され、
式中、CDはシクロデキストリン、および
【化１２】
である、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記第２層に含まれる前記ポリマーに、前記第２層中に存在する水溶性基を露出させるのに適した試薬を反応させるステップをさらに含む、請求項４８〜６４のいずれかに記載の方法。
【図１Ｂ】
【図１Ａ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４】
【図１Ａ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４】
【公表番号】特表２００８−５４０１４２（Ｐ２００８−５４０１４２Ａ）
【公表日】平成２０年１１月２０日（２００８．１１．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５０９９８２（Ｐ２００８−５０９９８２）
【出願日】平成１７年５月４日（２００５．５．４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＳＧ２００５／０００１３８
【国際公開番号】ＷＯ２００６／１１８５４３
【国際公開日】平成１８年１１月９日（２００６．１１．９）
【出願人】（５０３２３１８８２）エージェンシー フォー サイエンス，テクノロジー アンド リサーチ (179)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年１１月２０日（２００８．１１．２０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年５月４日（２００５．５．４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＳＧ２００５／０００１３８
【国際公開番号】ＷＯ２００６／１１８５４３
【国際公開日】平成１８年１１月９日（２００６．１１．９）
【出願人】（５０３２３１８８２）エージェンシー フォー サイエンス，テクノロジー アンド リサーチ (179)
【Ｆターム（参考）】
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