権利請求されているのは、一般式（Ｉ）の化合物およびその薬学的に許容される塩であり、式中、Ｍは、Ｐｄ、Ｆｅ、Ｍｎ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｚｎ、Ｍｏを含む群から独立に選択される金属原子を意味し、Ｒ^１およびＲ^２は各々独立に、水素、アミノ、ヒドロキシ、オキシ、カルボキシ、シアノ、Ｃ_１〜１２アルキル、Ｃ_２〜１２アルケニル、Ｃ_２〜１２アルキニル、Ｃ_１〜１２アルコキシ、Ｃ_１〜１２アルキルアミノ、Ｃ_１〜１２アルコキシカルボニル、Ｃ_１〜１２アルキルアミド、アリールアミドを意味し、特定置換基のアルキレン基は、以下の基すなわちヒドロキシ、オキシ、カルボキシ、アミノまたはアミドのうちの１つ以上で置換可能であり、Ｒ^３〜Ｒ^１０は各々独立に、水素を意味するか、ＮＨＲ^３Ｒ^４およびＮＨＲ^５Ｒ^６が合一しておよび／またはＮＨＲ^７Ｒ^８およびＮＨＲ^９Ｒ^１０が合一して、窒素の１つまたはいくつかの脂肪族または芳香族ドナー原子を含有し、金属原子（Ｍ）を中心としてｃｉｓ位の配位子（単数または複数）である。権利請求された化合物は、配位化合物と、配位化合物に結合していない脂肪族チオール（またはその誘導体）の遊離分子と、を含有する製剤で使用可能である。製剤中の配位化合物および脂肪族チオール（またはその誘導体）の遊離分子は、カチオン形態であってもアニオン形態であってもよく、中性粒子の形態であっても構わない。提案された物質は、薬剤に対する標的の親和性を高めるおよび／または標的の微小環境において治療的に最適な濃度の薬剤を提供するおよび／または薬剤の毒性を低減することで、薬剤の作用を一層効果的にすることができる。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は創薬分野に関し、薬理学、医学、獣医学に利用できる。
【背景技術】
【０００２】
薬剤の有効性を改善するための方法には、薬剤分子の化学修飾および／または別の化学物質（単数または複数）の併用によって、薬剤の薬物動態および／または薬力学を最適化および／または薬剤の毒性を低減することがある。
【０００３】
薬理学的解決策に用いられる化学物質（単数または複数）は、薬理学的に有意な固有の活性を持つ場合と持たない場合があるが、単にその薬理学的標的に対する作用の選択性を高めるおよび／または生物学的標的構造の微小環境において必要かつ十分な濃度を提供するおよび／または毒性を低減することによって、薬効の実現を常に保証するものでなければならない。
【０００４】
このため、アモキシシリンとクラブラン酸を含むアモキシクラブならびに、イミペネムと腎ジヒドロペプチダーゼ酵素の特異的阻害剤であるシラスタチンとの合剤であるＴｉｅｎａｍをはじめとして、多数の薬理学的解決策が周知である。クラブラン酸は細菌酵素によるアモキシシリンの分解を防止し、クラブラン酸を併用しない場合に比して少量の製剤で治療効果を達成できるようにするものである。シラスタチンは腎臓でのイミペネムの代謝を遅らせるため、実質的にすべての抗生物質分子の抗微生物活性が利用され、シラスタチンを併用しない場合に比して少量のイミペネム分子で治療効果の達成につながる［１（非特許文献１、以下同様）］。
【０００５】
薬剤作用の選択性を取り入れることは、いくつかある要因の中でも、薬剤標的間の特異的結合の性質とこの結合の強度の両方がゆえに、複雑な課題である。選択的に作用する薬剤は、その薬理学的標的との結合が弱いことが示されている［１］。この状況は、薬剤分子が確実に反応中心まで到達できる特定の構造配置の薬理学的標的を見つける必要があることを意味する。タンパク質分子の半分が本質的に多官能性であることが立証されており［２，３］、構造レベルで、生理学的に固有の機能を果たすのに適したタンパク質分子の特定のコンホメーションで発現される。何らかの生理学的機能を果たす以外に、分子は構造化されていない状態で存在する。さまざまなタイプの化学修飾−リン酸化、チオール化、グルタチオン付加、酸化など−によって、特定の構造的コンホメーションが形成され、生理学的機能が発揮される。これに関連して、いずれかの薬剤、特に選択的に作用する薬剤を用いて効果を得られる可能性を、適切なコンホメーションの標的分子を見つけることで判断している。
【０００６】
疾患の治療に対して潜在的に有用な多数の薬剤が存在するが、薬力学および／または薬物動態的な特徴がゆえに、所望の効果を得られないことも多い。製剤の用量を増やせば治療効果を達成する上での問題もいくらかは解決するが、これは概して毒性の増加と関連する。作用媒介受容体による腫瘍性疾患の標的治療用の薬剤が、典型的な一例である。
【０００７】
このため、抗腫瘍標的として積極的に研究されている対象物のひとつに上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）がある［４，５，６］。
【０００８】
ＥＧＦＲによって実現される生物学的作用を遮断することを目的とした、多数の薬理学的解決策が存在する。
１）受容体の細胞外部分に結合するモノクローナル抗体の使用：Ｅｒｂｉｔｕｘ−ＨＥＲ１に対するモノクローナル抗体、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ−ＨＥＲ２／ｎｅｕに対するモノクローナル抗体；２）細胞膜透過性細胞毒とコンジュゲートする組換えペプチド配位子ＥＧＦおよび／またはＴＧＦ−ａの使用；３）ＥＧＦＲの細胞内ドメインに作用でき、シグナル伝達タンパク質のチロシンキナーゼリン酸化のプロセスを中断できる低分子量の阻害剤であるＩｒｅｓｓａ、チルホスチン、ゲニステイン、ＳＵ６６６８、ＺＤ６４７４の使用。
【０００９】
抗体と受容体の免疫活性中心との相互作用ならびに阻害剤と触媒活性の活性中心との相互作用では、これらの中心に到達できる必要があり、これは受容体タンパク質分子のコンホメーションによって判断される。二量体ＥＧＦＲ分子のコンホメーションによって、チロシンキナーゼ阻害剤およびモノクローナル抗体は各々の結合部位と相互作用できるようになる。二量体ＥＧＦＲ分子の適切なコンホメーションが、いくつかある方法のうち、スルフヒドリル基の酸化修飾、チオール化またはグルタチオン付加によって達成される［７］。
【００１０】
これに関連して、ＥＧＦＲ分子のチオール化またはグルタチオン付加のプロセスを開始し、二量体受容体分子の形成を開始する薬剤は、ＥＧＦＲと相互作用する薬剤調製物と併用すると、上皮成長因子受容体に対する薬剤の親和性を高めることができるものである。
【００１１】
よって、今までのところ、ＥＧＦＲと相互作用可能な化合物を生成して、薬剤に対するその親和性を高めることが関心の的になっている。
【００１２】
相互作用が関心の的になっているもうひとつの標的に、Ｐ−糖タンパク質（Ｐｇｐ）がある。Ｐｇｐは、細胞質膜の膜貫通タンパク質であり、ヒトのＭＤＲ１およびＭＤＲ２遺伝子にコードされ、濃度勾配に対して細胞からのさまざまな化合物の分子（薬剤調製物分子を含む）のＡＴＰ依存性輸送体として機能する［４］。Ｐｇｐの機能的活性は、ある意味で、上皮および間葉系由来の事実上すべての哺乳類細胞において発現される［４］。Ｐ−糖タンパク質は、有毒物質の分子（薬剤分子を含む）から細胞を保護し、これらの分子を細胞からおよび細胞内標的から除去する。上皮細胞のＰｇｐ活性は、頂端膜でのみ見出され、有毒物質の分子（薬剤分子を含む）が体内または個々の臓器の組織に侵入するのを防止する。このように、腸管上皮の頂端膜側に局在するＰｇｐ活性のおかげで、有毒物質の分子（薬剤分子を含む）が体内環境に侵入するのが制限される。大脳血管叢内皮の頂端膜側に局在するＰ−糖タンパク質は、有害な物質（薬剤分子を含む）が脳組織に侵入するのを制限し、血液脳関門の一要素として機能する。Ｐｇｐ活性の低さまたは存在しないことは、脳組織への外来化合物の分子（薬剤分子を含む）の浸透増大と、胆汁への毒素を除去する能力の低下と相関している［８］。Ｐｇｐ活性は、タンパク質分子の転写、翻訳、化学修飾のレベルで調節される［９］。ＭＤＲ１遺伝子の転写／Ｐｇｐ活性は、成長因子、ホルモン、抗腫瘍製剤、特定の抗生物質、紫外線、分化誘導剤、ホルボールエステル、発癌物質ならびに、他の化学的作用剤、物理的作用剤、生物学的作用剤の影響下で増加する［４］。Ｐｇｐ活性を開始する多数の作用剤が、タンパク質ｐ２１（Ｒａｓ−タンパク質）、ホスファチジルイノシトール−キナーゼ（Ｐ１３Ｋ）、タンパク質−キナーゼＣ（ＰＫＣ）の活性化に左右されるシグナル伝達経路を含むさまざまなシグナル伝達経路で作用する［４］。Ｐｇｐ活性の阻害剤は、タンパク質分子に作用するもので、イオンチャネルブロッカーであるキニジン、ベラパミル、ニカルジピン；抗ヒスタミン薬であるテルフェナジン；抗生物質であるシクロスポリン、バリノマイシン、ケトコナゾール、ビンブラスチン；ホルモンアンタゴニストであるタモキシフェンを含む［１］。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ｂａｓｉｃ ＆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ． Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｂｅｒｔｒａｍ Ｇ． Ｋａｔｚｕｎｇ， ＭＤ， ＰｈＤ， １９９５．
【非特許文献２】Ｂｏｇａｔｙｒｅｖａ Ｎ．Ｓ．， Ｆｉｎｋｅｌｓｔｅｉｎ Ａ．Ｖ．， Ｇａｌｓｉｔｓｋａｙａ Ｏ．Ｖ． Ｔｒｅｎｄ ｏｆ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｔａｘａ ／／ Ｊ． Ｂｉｏｉｎｆ． Ｃｏｍｐｕｔ． Ｂｉｏｌ．， ２００６， Ｖｏｌ． ４， ｐｐ． ５９７−６０８
【非特許文献３】Ｊｅｆｆｒｙ Ｃ．Ｊ Ｍｏｏｎｌｉｇｈｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ／／ ＴＩＢＳ， １９９９， ｐｐ． ８−１１．
【非特許文献４】Ｓｔａｖｒｏｖｓｋａｙａ Ａ．Ａ．， Ｓｔｒｏｍｓｋａｙａ Ｔ．Ｐ． ＡＢＣ ｆａｍｉｌｙ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ ／／ Ｂｉｏｋｈｉｍｉｙａ， ２００８， Ｖｏｌ． ７３， Ｎｏ． ５， ｐｐ． ７３５−７５０．
【非特許文献５】Ｂｒｉｄｇｅｓ Ａ．Ｊ． Ｔｈｅ ｒａｔｉｏｎａｌｅ ａｎｄ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｕｓｅｄ ｔｏ ｄｅｖｅｌｏｐ ａ ｓｅｒｉｅｓ ｏｆ ｈｉｇｈｌｙ ｐｏｔｅｎｔ， ｉｒｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ， ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ ｔｈｅ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆａｍｉｌｙ ｏｆ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅｓ ／／ Ｃｕｒｒ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ．， １９９９， ６， ８２５−８４３．
【非特許文献６】Ｍｏｄｊｔａｈｅｄｉ Ｈ．， Ｄｅａｎ Ｃｈ． Ｔｈｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆｏｒ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ａｎｄ ｌｉｇａｎｄｓ： ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ， ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ ｖａｌｕｅ ａｎｄ ｔａｒｇｅｔ ｆｏｒ ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ ／／ Ｉｎｔｅｒｎ． Ｊ． Ｏｎｃｏｌ．， １９９５， Ｖｏｌ． ４， ｐｐ． ２７７-２９６．
【非特許文献７】Ｔｏｗｎｓｅｎｄ Ｄ． Ｍ．， Ｈｅ Ｌ．， Ｈｕｔｃｈｅｎｓ Ｓ．， ｅｔ ａｌ． ＮＯＶ−００２， ａ Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ Ｍｉｍｅｔｉｃ， ａｓ ａ Ｍｏｄｕｌａｔｏｒ ｏｆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｒｅｄｏｘ Ｂａｌａｎｃｅ ／／ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ２００８， Ｖｏｌ． ６８， ｐｐ． ２８７０−２８７７．
【非特許文献８】Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇ Ｔ．Ｈ． Ｃｅｌｌｕｌａｒ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｏｆ ｄｒｕｇｓ ／／ Ｃｌｉｎ． Ｉｎｆｅｃｔ． Ｄｉｓ．， １９９４， Ｖｏｌ． １９． Ｎｏ． ５， ｐｐ． ９１６−９２１．
【非特許文献９】Ｓｃｏｔｔｏ Ｋ．Ｗ． Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＡＢＣ ｄｒａｇ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｓ ／／ Ｏｎｃｏｇｅｎｅ， ２００３， Ｖｏｌ． ２２， Ｎｏ． ４７， ｐｐ． ７４９６−７５１１．
【非特許文献１０】Ａｌｂｅｒｔｓ Ｂ．， Ｊｏｈｎｓｏｎ Ａ．， Ｌｅｗｉｓ Ｊ．， Ｒａｆｆ Ｍ．， Ｒｏｂｅｒｔｓ Ｋ．， Ｗａｌｔｅｒ Ｐ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ ｃｅｌｌ， ４ｔｈ ｅｄ． Ｎ．Ｙ．， Ｇａｒｌａｎｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｔａｙｌｏｒ ａｎｄ Ｆｒａｎｃｉｓ ｇｒｏｕｐ． ２００２， １６１６ ｐｐ．
【非特許文献１１】Ｋｅｌｌｙ Ｃ．Ｐ．， Ｃｒａｍｅｒ Ｃ．Ｊ．， Ｔｒｕｈｌａｒ Ｄ．Ｇ． Ａｄｄｉｎｇ Ｅｘｐｌｉｃｉｔ Ｓｏｌｖｅｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｔｏ Ｃｏｎｔｉｎｕｕｍ Ｓｏｌｖｅｎｔ Ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｑｕｅｏｕｓ Ａｃｉｄ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｃｏｎｓｔａｎｔｓ ／／ Ｊ． Ｐｈｙｓ． Ｃｈｅｍ． Ａ．， ２００６， １１０（７）， ２４９３−２４９９．
【非特許文献１２】Ｓａｒａｃｉｎｏ Ｇ．Ａ．， Ｉｍｐｒｏｔａ Ｒ．， Ｂａｒｏｎｅ Ｖ． Ａｂｓｏｌｕｔｅ ｐＫａ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｃｉｄｓ ｕｓｉｎｇ ｄｅｎｓｉｔｙ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｔｈｅｏｒｙ ａｎｄ ｔｈｅ ｐｏｌａｒｉｚａｂｌｅ ｃｏｎｔｉｎｕｕｍ ｍｏｄｅｌ ／／ Ｃｈｅｍ． Ｐｈｙｓ． Ｌｅｔｔ．， ２００３， ３７３（３−４）， ４１１−４１５．
【非特許文献１３】Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｉｃａｌ ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｅｗ ｐｅｒｏｒａｌ ｈｙｐｏｇｌｙｃｅｍｉｃ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ． Ｉｎ： Ｌｅａｄｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｉｃａｌ ｐａｐｅｒｓ ｏｎ ｔｈｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｒｕｇｓ． Ｐａｒｔ ６． Ｍｏｓｃｏｗ， １９８６， ｐ． ２０２．
【非特許文献１４】Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ （ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ） ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｅｗ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ． Ｅｄ． Ｋｈａｂｒｉｙｅｖ Ｒ．Ｕ． ２ｎｄ ｅｄ． Ｍｏｓｃｏｗ， Ｉｚｄ． Ｍｅｄｉｔｓｉｎａ， ２００５， ８３２ ｐｐ．
【非特許文献１５】Ｙｅｌｌｏｎ Ｄ．Ｍ．， Ｄｏｗｎｅｙ Ｊ．Ｍ． Ｐｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ ｔｈｅ ｍｙｏｃａｒｄｉｕｍ： ｆｒｏｍ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ｔｏ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ ／／ Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｒｅｖ．， ２００３， Ｖｏｌ． ８３， Ｎｏ． ４， ｐｐ． １１１３-１１５１．
【非特許文献１６】Ｔｓｕｃｈｉｄａ Ａ．， Ｔｈｏｍｐｓｏｎ Ｒ．， Ｏｌｓｓｏｎ Ｒ．Ａ．， Ｄｏｗｎｅｙ Ｊ．Ｍ． Ｔｈｅ ａｎｔｉ-ｉｎｆａｒｃｔ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ａｎ ａｄｅｎｏｓｉｎｅ Ａ１-ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ａｇｏｎｉｓｔ ｉｓ ｄｉｍｉｎｉｓｈｅｄ ａｆｔｅｒ ｐｒｏｌｏｎｇｅｄ ｉｎｆｕｓｉｏｎ ａｓ ｉｓ ｔｈｅ ｃａｒｄｉｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｐｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ ｉｎ ｒａｂｂｉｔ ｈｅａｒｔ ／／ Ｊ． Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｃａｒｄｉｏｌ．， １９９４， Ｖｏｌ． ２６， Ｎｏ． ３， ｐｐ． ３０３-３１１．
【非特許文献１７】Ｄａｎａ Ａ．， Ｂａｘｔｅｒ Ｇ．， Ｗａｌｋｅｒ Ｊ．Ｍ．， Ｙｅｌｌｏｎ Ｄ．Ｍ． Ｐｒｏｌｏｎｇｉｎｇ ｔｈｅ ｄｅｌａｙｅｄ ｐｈａｓｅ ｏｆ ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ： ｒｅｐｅｔｉｔｉｖｅ ａｄｅｎｏｓｉｎｅ Ａ１ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｍａｉｎｔａｉｎｓ ｒａｂｂｉｔ ｍｙｏｃａｒｄｉｕｍ ｉｎ ａ ｐｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ ｓｔａｔｅ ／／ Ｊ． Ａｍ． Ｃｏｌｌ． Ｃａｒｄｉｏｌ．， １９９８， Ｖｏｌ． ３１， Ｎｏ． ５， ｐｐ． １１４２-１１４９．
【非特許文献１８】Ｄｏｗｎｅｙ Ｊ．Ｍ．， Ｃｏｈｅｎ Ｍ．Ｖ． Ｒｅｄｕｃｉｎｇ ｉｎｆａｒｃｔ ｓｉｚｅ ｉｎ ｔｈｅ ｓｅｔｔｉｎｇ ｏｆ ａｃｕｔｅ ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ ／／ Ｐｒｏｇ． Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ． Ｄｉｓ． ２００６， Ｖｏｌ． ４８， Ｎｏ． ５， ｐｐ． ３６３-３７１．
【非特許文献１９】Ｓｅｌｙｅ Ｈ．， Ｂａｊｕｓｚ Ｅ．， Ｇｒａｓｓｏ Ｓ．， Ｍｅｎｄｅｌｌ Ｐ． Ｓｉｍｐｌｅ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｓｕｒｇｉｃａｌ ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ ｏｆ ｃｏｒｏｎａｒｙ ｖｅｓｓｅｌｓ ｉｎ ｔｈｅ ｒａｔ ／／ Ａｎｇｉｏｌｏｇｙ， １９６０， Ｖｏｌ． １１， Ｎｏ． ５， ｐｐ． ３９８-４０７．
【非特許文献２０】Ｌｅｉｒｉｓ Ｊ．， Ｈａｒｄｉｎｇ Ｄ． Ｐ．， Ｐｅｓｔｒｅ Ｓ． Ｔｈｅ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｒａｔ ｈｅａｒｔ： ａ ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ ｓｔｕｄｙｉｎｇ ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｈｙｐｏｘｉａ ｏｒ ｉｓｃｈｅｍｉａ ／／ Ｂａｓｉｃ Ｒｅｓ． Ｃａｒｄｉｏｌ．， １９８４， Ｖｏｌ． ７９， Ｎｏ． ３． ｐｐ． ３１５-３２３．
【非特許文献２１】Ｈｉｍｏｒｙ Ｎ．， Ｍａｔｓｕｕｒａ Ａ． Ａ ｓｉｍｐｌｅ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｆｏｒ ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ ｏｆ ｃｏｒｏｎａｒｙ ａｒｔｅｒｙ ｉｎ ｃｏｎｓｃｉｏｕｓ ｒａｔｓ ／／ Ａｍ． Ｊ． Ｐｈｙｓｉｏｌ．， １９８９， Ｖｏｌ． ２５６， ｐｐ． Ｈ１７１９-Ｈ１７２５．
【非特許文献２２】Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄ Ｆ．Ｊ．， Ｈｅａｒｓｅ Ｄ．Ｊ． Ｔｈｅ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｂｌｏｏｄ ａｎｄ ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ ｆｌｕｉｄ ｐｅｒｆｕｓｅｄ ｈｅａｒｔ ／／ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｒｅｓ．， ２０００， Ｖｏｌ． ４１， Ｎｏ． ６， ｐｐ． ６１３-６２７．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
Ｐｇｐ活性の阻害剤を治療現場で用いることには、腫瘍細胞の薬剤耐性を抑制するための悪性腫瘍の治療における実用上の用途がある［１］。このような他の薬剤（その分子はＰｇｐ基質である）の作用の有効性を高める手法を限定的に用いるのは、その薬剤の作用によって生じる有益な効果よりも危険なＰｇｐ阻害剤の副作用がゆえである。悪性腫瘍は例外であるが、これは細胞分裂阻害薬を用いる場合の腫瘍細胞の耐性が、化学療法では成果がなく、大量の細胞分裂阻害薬が正常な細胞に作用し、そこに対して毒作用を有することを意味するためである。これに関連して、Ｐｇｐ阻害剤の使用が正当と認められ、化学療法剤から治療効果を安全にすることができるとともに、Ｐｇｐによる腫瘍細胞の薬剤耐性が克服される。
【００１５】
Ｐｇｐ活性を生理学的に適切に抑制し、周知のＰｇｐ阻害剤の典型的な毒作用、特に血液抑制および免疫抑制、肝細胞の解毒機能の低下、心臓血管系の機能および他の多くの作用の破壊などの回避を可能にする新規な化合物も、関心の的になっている。
【００１６】
これに関連して、本発明の目的は、薬剤の作用に対する標的の親和性を高めるおよび／または標的の微小環境において治療的に最適な濃度の薬剤を提供することで、薬剤調製物の作用の有効性を高められるおよび／または薬剤の毒性を低減できる化合物を生成することであった。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明は、薬剤調製物の一部をなす生物学的に活性な物質の作用の有効性を高めることができる、一般式Ｉで表される脂肪族チオールとのｄ−金属の二核配位化合物またはその薬学的に許容される塩（本発明による化合物）を提案するものであって、
【化１】


式中、
Ｍは、Ｐｄ、Ｆｅ、Ｍｎ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｚｎ、Ｍｏを含む群から独立に選択される金属原子を意味し、
Ｒ^１およびＲ^２は各々独立に、プロトン（−Ｈ）、アミノ（−ＮＨ_２）、ヒドロキシ（−ＯＨ）、オキシ（＝Ｏ）、カルボキシ（−ＣＯＯＨ）、シアノ（−ＣＮ）、Ｃ_１〜１２アルキル（以下、Ｒと表記する）、Ｃ_２〜１２アルケニル、Ｃ_２〜１２アルキニル、Ｃ_１〜１２アルコキシ（−ＯＲ）、Ｃ_１〜１２アルキルアミノ（−ＮＨ−Ｒ）、Ｃ_１〜１２アルコキシカルボニル（−ＣＯＯＲ）、Ｃ_１〜１２アルキルアミド（−ＣＯ−ＮＨ−Ｒ）、アリールアミドを意味し、前記置換基に含まれるアルキル基は、以下の基すなわちヒドロキシ、オキシ、カルボキシ、アミノまたはアミド（−ＣＯ−ＮＨ_２）のうちの１つまたは２つ以上で置換されていてもよい。
【００１８】
Ｒ^３〜Ｒ^１０は各々独立に、水素を意味するか、ＮＨＲ^３Ｒ^４およびＮＨＲ^５Ｒ^６が合一しておよび／またはＮＨＲ^７Ｒ^８およびＮＨＲ^９Ｒ^１０が合一して、窒素の１つまたはいくつかの脂肪族または芳香族ドナー原子を含有し、金属原子（Ｍ）を中心としてｃｉｓ位にある配位子である。
【００１９】
ＮＨＲ^３Ｒ^４およびＮＨＲ^５Ｒ^６が合一しておよび／またはＮＨＲ^７Ｒ^８およびＮＨＲ^９Ｒ^１０が合一して、２つの芳香族窒素原子を有するジアミノ化合物またはアリールであると望ましい。
【００２０】
ジアミノ化合物がＣ_２〜Ｃ_６ジアミノアルキレンであり、アリールが２つのピリジル環を含有すると望ましい。
【００２１】
Ｒ^３〜Ｒ^１０が水素を意味するか、ＮＨＲ^３Ｒ^４およびＮＨＲ^５Ｒ^６が合一しておよび／またはＮＨＲ^７Ｒ^８およびＮＨＲ^９Ｒ^１０が合一して、エチレンジアミン、２，２’−ビジピリジル（２，２’−ｂｉｐｙ）、１，１０−フェナントロリン（１，１０−ｐｈｅｎ）またはこれらの誘導体であると望ましい。
【００２２】
Ｒ^１Ｒ^２ＣＨ−ＣＨ_２−ＳＨが、２−アミノエタンチオール（ａｅｔ、システアミン）、２−アセトアミドエタンチオール、システイン（Ｃｙｓ）、システインメチルエステル、システインエチルエステル、アセチルシステイン（Ａｃｃｙｓ）、アセチルシステインメチルエステル、アセチルシステインエチルエステル、アセチルシステインニトリル、３−メルカプトプロピオン酸、γ−グルタミン−システイン−グリシン、ホモシステイン、チオグリコール酸またはこれらの誘導体であると好ましい。
【００２３】
Ｒ^３〜Ｒ^１０が水素であるか、ＮＨＲ^３Ｒ^４およびＮＨＲ^５Ｒ^６が合一しておよび／またはＮＨＲ^７Ｒ^８およびＮＨＲ^９Ｒ^１０が合一して、エチレンジアミン、２，２’−ビジピリジル（２，２’−ｂｉｐｙ）、１，１０−フェナントロリン（１，１０−ｐｈｅｎ）またはこれらの誘導体であり、Ｒ^１Ｒ^２ＣＨ−ＣＨ_２−ＳＨが、２−アミノエタンチオール（ａｅｔ、システアミン）、２−アセトアミドエタンチオール、システイン（Ｃｙｓ）、システインメチルエステル、システインエチルエステル、アセチルシステイン（Ａｃｃｙｓ）、アセチルシステインメチルエステル、アセチルシステインエチルエステル、アセチルシステインニトリル、３−メルカプトプロピオン酸、γ−グルタミン−システイン−グリシン、ホモシステイン、チオグリコール酸またはこれらの誘導体であると、なお一層好ましい。
【００２４】
本発明による化合物は、式
【化２】


で表されるものであってもよい。
【００２５】
好ましい事例では、本発明による化合物が、［Ｐｄ_２（μ−Ｓ−Ｌ−Ｃｙｓ）（μ−Ｓ−Ｌ−ＣｙｓＨ）（２，２’−ｄｉｐｙ）_２］（ＮＯ_３）_３・４．５Ｈ_２Ｏ、Ｐｄ_２（ａｅｔＨ）_２（ｐｈｅｎ）_２］（ＮＯ_３）_４・Ｈ_２Ｏ、［Ｐｄ_２（μ−Ｓ−Ａｃｃｙｓ）_２（ｄｉｐｙ）_２］Ｃｌ_２・Ｈ_２Ｏ、［Ｐｄ_２（μ−Ｓ−Ａｃｃｙｓ）_２（ＮＨ_３）_４］Ｃｌ_２、［Ｃｕ_２（μ−Ｓ−Ｃｙｓ）_２（ｄｉｐｙ）_２］Ｃｌ_２を含む群から選択される。
【００２６】
実施形態のうちの１つにおいて、本発明による化合物は、［Ｐｄ_２（μ−Ｓ−Ｌ−Ｃｙｓ）（μ−Ｓ−Ｌ−ＣｙｓＨ）（２，２’−ｄｉｐｙ）_２］（ＮＯ_３）_３・４．５Ｈ_２Ｏであって、三斜晶系、空間群Ｐ１で結晶化し、単位胞パラメータ（Å）がａ＝１３．８６、ｂ＝１３．８２、ｃ＝１２．１７、α＝１２２．１３°、β＝１０３．６１°、γ＝９１．４０°、Ｖ（Å^３）＝１８８７．０、Ｚ＝１、ＩＲスペクトル（ＫＢｒペレット）ν_ｍａｘ（ｃｍ^−１）が４１９、５４２、５９０、６４８、６８９、７２２、７６５、８０７、９７７、１０２２、１０３６、１０７２、１１０７、１１６４、１１７４、１２０４、１２２６、１２４０、１２７２、１３１２、１３５３、１３６４、１３８４、１４４７、１４６９、１５６３、１６０１、１６６６、１７２８、３０７３、３１０８、３２２１、３２８３、３４２７、３９５３であることを特徴とする。
【００２７】
実施形態のうちの１つにおいて、本発明による化合物は、Ｐｄ_２（ａｅｔＨ）_２（ｐｈｅｎ）_２］（ＮＯ_３）_４・Ｈ_２Ｏであり、単斜晶系、空間群Ｃｃで結晶化し、単位胞パラメータÅがａ＝２４．５３、ｂ＝１３．１０、ｃ＝２２．６５、β＝１０４．２６°、Ｖ（Å^３）＝７０５２．２５、Ｚ＝４である。
【００２８】
実施形態のうちの１つにおいて、本発明による化合物は、ＩＲスペクトル（ＫＢｒペレット）ν_ｍａｘ（ｃｍ^−１）が、５０７、６４０、６９２、７７４、８１５、８７９、９４６、１０５８、１０９４、１２１２、１２２９、１３４３、１３８１、１４０４、１４２７、１５７３、１７２３、２６５５、２８２０、２９７１、３３７７、３４０６、３４８０であることを特徴とする、［Ｐｄ_２（μ−Ｓ−Ａｃｃｙｓ）_２（ｄｉｐｙ）_２］Ｃｌ_２・Ｈ_２Ｏである。
【００２９】
実施形態のうちの１つにおいて、本発明による化合物は、ＩＲスペクトル（ＫＢｒペレット）ν_ｍａｘ（ｃｍ^−１）が、５１２、５９７、６９２、７７３、８３９、８７９、９４６、１０９４、１２１２、１２２９、１２５４、１３４３、１４０３、１５２１、１５７２、１５９４、１７２３、２６５５、２９２５、２９７１、３１１９、３４６０であることを特徴とする、［Ｐｄ_２（μ−Ｓ−Ａｃｃｙｓ）_２（ＮＨ_３）_４］Ｃｌ_２である。
【００３０】
実施形態のうちの１つにおいて、本発明による化合物は、ＩＲスペクトル（ＫＢｒペレット）ν_ｍａｘ（ｃｍ^−１）が、５２０、６９１、８１５、８７９、１０５８、１１３３、１２１２、１２２９、１２５４、１３４３、１４０４、１５７２、１５９４、１６２７、２６５５、２９２５、２９４０、２９７１、３１１９、３４８０であることを特徴とする、［Ｃｕ_２（μ−Ｓ−Ｃｙｓ）_２（ｄｉｐｙ）_２］Ｃｌ_２である。
【００３１】
本発明による化合物は、さまざまなシグナルの形質導入時に重要な役割を果たす二次メディエータ（酸素、窒素、他の酸化剤の内在性活性形態）の助けを借りて、単にジスルフィド結合（架橋）を形成するだけのために（少量および微量での使用を条件に）チオアミノ酸のチオール基の均一かつ選択的で「穏やかな」酸化プロセスの加速を可能にすることを特徴とする。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
本発明による提案された化合物は、組成物中に可逆性酸化還元（レドックス）修飾が可能な硫黄残基を含む、細胞表面および細胞内受容体および酵素、細胞質膜および細胞内膜のイオンチャネルおよび輸送体タンパク質、ペプチド型の細胞外調節分子および輸送体分子、細胞骨格および細胞外マトリックスのタンパク質ならびに他の構造的分子、機能的分子、調節分子に作用する能力を有する。ペプチド型分子における硫黄残基の状態のひとつが還元状態であり、その状態でこれはプロトンと結合し、チオール（スルフヒドリル）基Ｐｅｐｔ−ＳＨ（Ｐｅｐｔは任意のペプチド型分子である）を含む。ペプチド型分子における硫黄残基の状態のもうひとつは酸化状態である。酸化剤の性質と硫黄残基の酸化の度合いとに応じて、これはさまざまな化学的酸化修飾の対象となることがある。しかしながら、生理学的に重要な酸化バリアントは、一ポリペプチド配列のシステインにおける硫黄残基が、別のポリペプチド配列のシステインにおける硫黄残基と共有結合的に結合して、ジスルフィド結合−Ｐｅｐｔ−Ｓ−Ｓ−Ｐｅｐｔを形成するものである。本発明による提案された化合物を、急性および慢性のプロセスにおける標的分子の生理学的に不適切な活性をレドックス調節する医薬品の創製に使用してもよく、細胞での生理学的プロセスの機能的な一致につながる（実施例９〜１４）。
【００３３】
本発明による提案された化合物は、その主要な触媒機能が発揮され、最初の化合物が分解された後に「小さなクラスター」（ナノサイズの粒子）の形態で体内から排除される潜在的な能力を有する。
【００３４】
本発明による提案された化合物を、薬剤の組成物に添加される他の生物学的に活性な物質と組み合わせ（実施例番号１２〜１４）、これらの化合物が薬理学的標的の微小環境に侵入できるように（実施例番号１０）および／またはこれらの化合物に対する薬理学的標的の親和性を高めて（実施例番号９）もよい。
【００３５】
経腸、非経口、吸入または他の経路を用いて哺乳動物の体内で生物学的効果を達成するために、特定構造の脂肪族チオールとのｄ−元素の配位化合物を少量（１０^−３〜１０^−６モル）および微量（１０^−６〜１０^−１５モル未満）で導入してもよい。本発明による化合物が細胞にて標的の分子に対しておよぼす作用は、細胞プロセスの機能的コヒーレンスならびに、細胞が生物学的に活性な物質に対して適切に応答する能力を回復させるが、これらはどちらも内因性すなわち体内で合成されると同時に、生理学的に最適な用量で体外からも導入され、それがゆえに治療目的を達成するために高濃度の生物学的に活性な物質が薬剤調製物の一部として導入されるのを回避できるようになる。
【００３６】
本発明による化合物が細胞に対しておよぼす作用は、さまざまな理由の中でも特に多剤耐性を担うタンパク質の活性低下が原因で、薬剤の一部として細胞内の薬理学的標的に微小環境に導入される生物学的に活性な物質の濃度の上昇を引き起こす（実施例番号１０）。この時点で脂肪族チオールとのｄ−元素の二核配位化合物の構造が持つ生物活性特有の特徴に、生体異物に対する解毒の第二相の酵素の合成だけを誘導する能力がある。これは薬剤調製物の一部として導入される生物学的に活性な物質の大半の不活性化にはほとんど影響しないが、レベルの増大が病気および／または薬剤の作用である負の環境要因に対する細胞の耐性を高める（実施例１１）。
【００３７】
このように、本発明による化合物は、原因療法、病原療法、対症療法での薬剤で用いられる、周知の生物学的効果および薬理学的活性を有する化学分子と併用されるとともに、薬理学的解決策で必要な生物活性を有する新たに合成された化学分子とも併用される、外用、吸入、経腸、非経口投与での創薬向けの将来性のある化学分子である。本発明による化合物は、生物学的に活性な化学分子の薬理学的活性を生理学的に最適な用量で顕在化させやすくする。
【００３８】
特に、本発明による提案された化合物は、ＥＧＦＲに作用して、薬理学的に活性な分子に対するその親和性を高めることができる（実施例番号９）。先に示した一般式Ｉに適合する本発明による化合物は、Ｐ−糖タンパク質を阻害することで細胞における薬剤の濃度を高めることができる（実施例番号１１）。
【００３９】
また、本発明による提案された化合物は、式ＩＩでも表すことが可能なものである。
【化３】


式中、Ｍは上述した金属原子を意味し、Ｘは脂肪族チオールの残基またはこれらの誘導体であって、硫黄原子によって架橋機能（μ−Х）を果たし、Ｎは二座窒素含有配位子（Ｌ）のドナー窒素原子であって、エチレンジアミンの２つの二座配位分子またはアンモニアの４つの一座配位末端分子で置換されていてもよい。
【００４０】
本発明による架橋を、式（Ｍ−（μ−ＳＣＨ_２ＣＨＲ^１Ｒ^２）−Ｍ）で表してもよい。
【００４１】
本発明による脂肪族チオールを、式Ｒ^１Ｒ^２ＣＨ−ＣＨ_２−ＳＨで表してもよく、この場合、硫黄原子はｓｐ^３−ハイブリダイズされた炭素原子に結合されるのに対し、Ｒ^１およびＲ^２は各々独立に、プロトン（−Ｈ）、アミノ（−ＮＨ_２）、ヒドロキシ（−ＯＨ）、オキシ（＝Ｏ）、カルボキシ（−ＣＯＯＨ）、シアノ（−ＣＮ）、Ｃ_１〜１２アルキル、Ｃ_２〜１２アルケニル、Ｃ_２〜１２アルキニル、Ｃ_１〜１２アルコキシ（−ＯＲ）、Ｃ_１〜１２アルキルアミノ（−ＮＨ−Ｒ）、Ｃ_１〜１２アルコキシカルボニル（−ＣＯＯＲ）、Ｃ_１〜１２アルキルアミド（−ＣＯ−ＮＨ−Ｒ）、アリールアミドを意味し、前記置換基に含まれるアルキル基は、以下の基すなわちヒドロキシ、オキシ、カルボキシ、アミノまたはアミド（−ＣＯ−ＮＨ_２）のうちの１つまたは２つ以上で置換されていてもよく、ＲはＣ_１〜１２アルキル残基を示す。
【００４２】
【表１】

【００４３】
これらの事例では、表記のチオールは、２−アミノエタンチオール（ａｅｔ、システアミン）（１）、２−アセトアミド−エタンチオール（２）、システイン（Ｃｙｓ）（３）、システインメチルエステル（４）、システインエチルエステル（５）、アセチルシステイン（Ａｃｃｙｓ）（６）、アセチルシステインメチルエステル（７）、アセチルシステインエチルエステル（８）、アセチルシステインニトリル（９）、３−メルカプトプロピオン酸（１０）、γ−グルタミン−システイン−グリシン（１１）、ホモシステイン（１２）、チオグリコール酸（１３）である。
【００４４】
特に明記しないかぎり、以下に示す特許請求の範囲ならびに明細書一式にて使用する以下の用語は、下記のとおり定義される。
【００４５】
「ＮＨＲ^３Ｒ^４およびＮＨＲ^５Ｒ^６が合一しておよび／またはＮＨＲ^７Ｒ^８およびＮＨＲ^９Ｒ^１０が合一して、窒素の１つまたはいくつかの脂肪族または芳香族ドナー原子を含有し、金属原子（Ｍ）を中心としてｃｉｓ位にある配位子である」という表現は、Ｒ^３〜Ｒ^６が各々自己と結合した窒素原子と合一して、窒素の１つまたはいくつかの脂肪族または芳香族ドナー原子を含有する配位子を形成し、配位子が、金属原子（Ｍ）を中心としてｃｉｓ位にある、ジアミノ化合物またはアリール（ヘテロアリール）などであるおよび／またはＲ^７〜Ｒ^１０が各々自己と結合した窒素原子と合一して、窒素の１つまたはいくつかの脂肪族または芳香族ドナー原子を含有する配位子を形成し、配位子が、金属原子（Ｍ）を中心としてｃｉｓ位にある、ジアミノ化合物またはアリール（ヘテロアリール）などであることを意味する。
【００４６】
「ｃｉｓ位配位子」という用語は、表記の配位子が配位化合物の平面正方形配置の隣接する位置にある配位化合物に対応するのに対し、「ｔｒａｎｓ位配位子」とは、金属原子を中心として互いに対角の位置にある配位子の配置に対応する。
【００４７】
前記特許請求の範囲における置換基Ｒ^１およびＲ^２についての「アルキル」という用語は、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉｓｏ−プロピル、ｉｓｏ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチルなど、１〜１２個、好ましくは１〜６個、たとえば１〜４個の炭素原子を有する直鎖または分枝鎖の飽和炭化水素残基を意味する。
【００４８】
前記式Ｒ^１Ｒ^２ＣＨ−ＣＨ_２−ＳＨにおける置換基Ｒ^１およびＲ^２についての前記「アルキル」という用語は、二重結合または三重結合を含有するが、ｓｐ^３ハイブリダイズされた炭素原子（−ＣＨ_２−ＣＨ＝ＣＨ_２）またはプロパルギル（−ＣＨ_２−Ｃ≡ＣＨ）を介して一般式Ｒ^１Ｒ^２ＣＨ−ＣＨ_２−ＳＨの炭素に結合された直鎖または分枝鎖の飽和炭化水素残基として理解してもよいものである。
【００４９】
「アルケニル」という用語は、２〜１２個の炭素原子を有し、二重結合を含有する直鎖または分枝鎖の不飽和炭化水素残基であって、構造Ｒ^１Ｒ^２ＣＨ−ＣＨ_２−ＳＨにおける置換基Ｒ^１およびＲ^２の結合がｓｐ^２ハイブリダイズされた炭素原子を介して形成される不飽和炭化水素残基を意味する。Ｒ^１およびＲ^２は、好ましくは、２〜４個の炭素原子を含有する。エテニル（ビニル（−ＣＨ＝ＣＨ_２））またはプロペニル（−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ_３）が一例である。
【００５０】
「アルキニル」という用語は、２〜１２個の炭素原子を有し、三重結合を含有する直鎖または分枝鎖の不飽和炭化水素残基であって、構造Ｒ^１Ｒ^２ＣＨ−ＣＨ_２−ＳＨにおける置換基Ｒ^１およびＲ^２の結合がｓｐハイブリダイズされた炭素原子を介して形成される不飽和炭化水素残基を意味する。Ｒ^１およびＲ^２は、好ましくは、２〜４個の炭素原子を含有する。プロピニル（−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ_３）が一例である。
【００５１】
「アルコキシ」という用語は、酸素原子を介して結合された、先に示した定義の意味でのアルキル残基を意味する。アルコキシを式Ｒ−Ｏ−で表してもよく、式中、Ｒはアルキル残基を意味する。「アルコキシ」残基の例として、メトキシ（−ＯＣＨ_３）、エトキシ（−ＯＣ_２Ｈ_５）、イソプロポキシ（−Ｏ−（ｉ−Ｐｒ））などがあげられる。
【００５２】
「アルキルアミノ」という用語は、式−ＮＨ−Ｒの基を意味する。
【００５３】
「アルコキシカルボニル」という用語は、カルボキシエチル（−ＣＯＯＣ_２Ｈ_５）またはカルボキシメチル（−ＣＯＯＣＨ_３）など、式−ＣＯＯＲの基を意味する。
【００５４】
「アルキルアミド」という用語は、式−ＣＯ−ＮＨ−Ｒの基を意味する。
【００５５】
先に示した定義において、Ｒは、先に定義した意味でのアルキルを意味する。
【００５６】
「アリール」という用語は、フェニル、ナフチルまたはイミダゾリルなど、３〜７個の炭素原子を含有する芳香族ラジカルを意味する。また、アリールは、窒素、酸素、硫黄（ヘテロアリール）のヘテロ原子などのヘテロ原子を含有してもよい。特に、Ｒ^１およびＲ^２の定義におけるアリールは、３〜７個の炭素原子を含有し、場合によってはヘテロ原子を含む芳香族ラジカルを意味する。金属原子（Ｍ）を中心として１つまたはいくつかの脂肪族または芳香族のドナー窒素原子を含有する配位子の一部を形成するアリールは、単環式アリールであっても多環式アリール（ヘテロアリール）であってもよく、環は縮合環であっても架橋結合によって連結されたものであってもよい。この場合、アリールは、フェナントロリン、ピリジンまたはジピリジルであってもよい。
【００５７】
「ジアミノ化合物」という用語は、２つのアミノ基を有するＣ_２〜Ｃ_１０または好ましくはＣ_２〜Ｃ_６脂肪族またはアルキレン基など、２つのアミノ基（−ＮＨ_２）を有する脂肪族基を意味する。特に、「Ｃ_２〜Ｃ_６ジアミノアルキレン」は、エチレンジアミン（Ｈ_２Ｎ（ＣＨ_２）_２ＮＨ_２）など、２つのアミノ基を有する［（−ＣＨ_２）_２〜６］アルキレンを意味する。
【００５８】
窒素の脂肪族または芳香族ドナー原子を含有し、配位化合物にてＭ原子を中心としてｃｉｓ位にある配位子（単数または複数）は、たとえば、エチレンジアミン（Ｈ_２Ｎ（ＣＨ_２）_２ＮＨ_２）、１，１０−フェナントロリン（１，１０−ｐｈｅｎ）、２，２’−ジピリジル（２，２’−ｄｉｐｙ）またはこれらの誘導体の環状分子ならびに、アンモニアまたはピリジンの一座配位分子であってもよい。
【００５９】
配位子Ｌが金属原子と自由に配位できる脂肪族または芳香族の窒素原子を１つしか持たない場合、配位化合物のフレームワークは実験式Ｌ_２Ｍ（μ−Ｘ）_２ＭＬ_２で記述できるものであり、構造式ＩＩａで表すこともできる。
【化４】

【００６０】
ｄ−金属原子を中心としてｃｉｓ位にある脂肪族または芳香族アミンの主な機能は、２つの架橋チオラート配位子との間で二核化合物を形成できる可能性である。これは、厳密には体内に存在する内在性酸化剤（酸素の活性形態）によってチオラートの酸化の同期的２電子プロセスを実行可能にする二核配位化合物における２つの架橋配位子の存在である。
【００６１】
ｄ−金属原子を中心としてｃｉｓ位にある脂肪族または芳香族アミンの存在は、配位化合物の高い生物活性を担っている。この配位化合物の構造機構の特徴次第で、薬剤分子の特定の異性体（これが生物学的分子に作用して薬剤の治療作用を左右する）と相互作用する生物学的標的の基本特性としての配位化合物の生物活性が決まる。同じ化学分子の他の異性体は、生体分子との関連で活性がわずかであるか、不活性であって、治療活性も備えていない。
【００６２】
生物活性を左右するのは、厳密には配位化合物分子の構造機構であって、その化学組成の一般性ではない。
【００６３】
金属原子を中心としてｃｉｓ位に配位される配位子（単数または複数）は、２つの架橋チオラート基を含有する二核化合物を得ることを可能にする。
【００６４】
ここに提案された化合物は、塩の形態であってもよい。
【００６５】
「薬学的に許容される塩」という用語は、無機または有機の酸または塩基を用いて調製される塩に関するものであり、この塩は、人間または動物の治療に安全に使用可能である。
【００６６】
薬学的に許容される塩は、塩への変換対象となる化合物の化学的特性を考慮しつつ、従来技術において周知の方法を用いて容易に調製可能なものである。たとえば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、クエン酸、ギ酸、フマル酸、マレイン酸、酢酸、コハク酸、酒石酸、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸などの無機酸または有機酸が、式Ｉ、ＩＩまたはＩＩａで表される基本化合物の薬学的に許容される塩を形成するのに適している。
【００６７】
本発明による化合物は、以下に示すスキームを用いて調製できるものであり、これは専門家らにとって理解可能である。
【００６８】
［脂肪族チオールとのｄ−元素の配位化合物Ｉ、ＩＩまたはＩＩａを調製するための一般スキーム］
【化５】


式中、Ｈａｌはハロゲン原子（好ましくはＣｌ、ＢｒまたはＩ）を意味し、Ｍは上述した金属原子を意味し（配位化合物の組成物中の金属は異なっていてもよい）、Ｘは、上述した脂肪族チオールの残基またはこれらの誘導体であって架橋機能を果たし、Ｎは窒素含有配位子（Ｌ）のドナー原子である。
【００６９】
本発明による化合物は、専門家には自明であろう方法、配位化合物の提案された構造からの手順、一般スキームに示す方法で調製できるものである。
【００７０】
本発明による配位化合物を、ｄ−金属のｃｉｓ−ハライド配位化合物の化合物の水溶液または懸濁液を採用し、これに配位子（脂肪族チオール）を乾燥形態または溶液または懸濁液の形態で添加して調製してもよい。架橋チオラート配位子を含有する二核配位化合物の形成は、こうして得られる系でなされる。
【００７１】
個々の化合物の希釈度合いについては、経験的に選択すればよい。二核配位化合物の形成に関する正確な判断は、物理化学研究（特にＸ線構造研究）ならびに、これらの化合物が酸化触媒として機能することを確認する高度な量子化学計算の結果に基づいて実施すればよい［１１，１２］。酸化還元反応の前記化合物によるｉｎ ｖｉｔｒｏでの触媒作用（チオラート基の硫黄が酸化されてジスルフィド結合だけが形成される）を、このような構造が存在することを示す間接的な基準として用いることが可能である。
【００７２】
チオラート配位子−ＳＣＨ_２Ｃ（Ｈ）Ｒ^１Ｒ^２のイオン化エネルギ（ＩＥ）を、そのドナー容量すなわち、ｄ−元素のイオンとの間で錯体を形成する能力の特徴として用いることが可能である。ＩＥ値が小さければ小さいほど、配位子の予測ドナー特性が大きくなる。一例として計算した−ＳＣＨ_２Ｃ（Ｈ）Ｒ^１Ｒ^２アニオンのＩＥ値を表１にあげておく。
【００７３】
【表２】

【００７４】
Ｊａｇｕａｒ ７．５ソフトウェアパッケージを使用し、ＤＦＴ Ｂ３ＬＹＰ（ＣＣ−ＰＶＴＺ（−Ｆ）＋ベース）法で化合物の電子構造を計算した。
【００７５】
同じ表に、チオール酸化の触媒サイクルでの錯体形成原子である硫黄原子について計算で求めた電荷も示す。硫黄原子での電子密度の増加すなわち負電荷が増大することによって、金属イオンとの強力な結合を形成しやすくなる。よって、ここで考慮するチオラートアニオンＳＲ⁻のシリーズにおいて、そのドナー容量もシリーズで上昇すべきである。
【化６】

【００７６】
また、量子化学計算の結果から得られる情報によって、化合物の幾何学的構造と得られる薬剤調製物の生理活性との相関を特定しやすくできる点にも注意されたい。
【００７７】
配位化合物の存在下における脂肪族チオールの酸化の一般的な触媒サイクルは、以下のとおりである。
【化７】

【００７８】
本発明による化合物は、配位化合物と、配位化合物に結合していない脂肪族チオール（またはその誘導体）の遊離分子を含む製剤の一部を形成するものであってもよい。製剤中の配位化合物および脂肪族チオール（またはその誘導体）の遊離分子は、カチオン形態であってもアニオン形態であってもよく、中性粒子の形態であってもよい。
【００７９】
製剤の薬学的に許容される形態については、配位化合物、脂肪族チオールまたはその誘導体ならびに薬学的に活性な化合物の化学的特性を考慮しつつ、従来技術において周知の方法に従って調製すればよい。製剤における配位化合物と脂肪族チオール分子とのモル比が１：５０〜１：５００００であるのが好ましい。脂肪族チオールと薬学的に活性な化合物との比は、経験的に選択される。
【００８０】
製剤は、使用するのに適しており、所望の治療効果を達成できる剤形（固体、液体、軟質、吸入など）であればよい。
【００８１】
過剰なチオールは、ｄ−金属の配位化合物を小用量および微用量で調製および製剤の一部として使用できることを保証するものである。
【００８２】
本発明による化合物は、薬物療法用の医薬品（剤形）の形態で用いられる。薬物療法および薬物療法的な作用という用語は、本発明では、薬剤を用いる治療において一般に認められている意味で用いる。本発明による化合物の医薬品は、経口的すなわち、溶液、乳液または懸濁液ならびに、錠剤、コート錠、ピル、ハードゼラチンカプセルおよびソフトゼラチンカプセルなどの剤形として投与できるものである。直腸投与すなわち、坐剤などの剤形としても有効なことがある。非経口投与は、皮下注射、筋肉内注射、血管内注射および膣内注射用ならびに吸入用の溶液の形態で有効である。本発明による化合物は、外用（軟膏、クリームなど）でも使用できるし、医薬品を患者の体内に確実に送達させる他の任意の方法で、吸入、鼻腔内および／または経口的に投与してもよいものである。
【００８３】
医薬品（剤形）を得るために、本発明による化合物を、単一剤形で治療的に不活性な無機ビヒクルまたは有機ビヒクルと組み合わせる。たとえば、ラクトース、トウモロコシデンプンまたはこれらの誘導体、タルク、ステアリン酸またはその塩などを、錠剤、コート錠、ピル、ハードゼラチンカプセル用のそのようなビヒクルとして用いることができる。ソフトゼラチンカプセルの場合は、たとえば、植物油、ワックス、脂肪、半固体ポリオールおよび液体ポリオールなどが、好適なビヒクルである。たとえば、水、ポリオール、スクロース、転化糖、グルコースなどが、溶液およびシロップを調製するのに適したビヒクルである。天然油または硬化油、ワックス、脂肪、半液体ポリオールまたは液体ポリオールなどが、坐剤用の好適なビヒクルである。
【００８４】
さらに、医薬品は、保存料、可溶化剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、甘味料、着色料、香味料、浸透圧を調節するための塩、緩衝液、マスキング剤または酸化防止剤ならびに、剤形の調製に必要な他の成分を含有するものであってもよい。
【００８５】
上記に示した補助物質は、創剤に用いられるものであり、以下、「治療的に不活性な補形剤」と呼ぶ。しかしながら、本発明による化合物の剤形は、脂肪族チオールの遊離分子および／または他の治療的に活性な物質も含有するものであってもよい。
【００８６】
本発明による化合物は、配位化合物と、配位化合物に結合していない脂肪族チオール（またはその誘導体）の遊離分子を含む製剤の一部を形成するものであってもよい。製剤中の配位化合物および脂肪族チオール（またはその誘導体）の遊離分子は、カチオン形態であってもアニオン形態であってもよく、中性粒子の形態であってもよい。
【００８７】
製剤の薬学的に許容される形態については、配位化合物、脂肪族チオール（またはその誘導体）の化学的特性を考慮しつつ、従来技術において周知の方法に従って調製すればよい。製剤における配位化合物のｄ−金属の原子と脂肪族チオール分子とのモル比が１：５０〜１：５００００であるのが好ましい。
【００８８】
製剤は、使用するのに適しており、所望の治療効果を達成できる剤形（固体、液体、ソフト、吸入など）であればよい。
【００８９】
過剰なチオールは、ｄ−金属の配位化合物を小用量および微用量で調製および製剤の一部として使用できることを保証するものである。このような製剤は、一層厳密な投薬を保証するものであり、これは本発明による化合物を少量および微量で投与する場合に重要である。
【００９０】
本発明によれば、ここに提案された手段を利用して、特定の薬理学的に活性な物質の治療活性を高めてもよい。
【００９１】
本明細書の文脈において、薬理学的に活性な物質の治療有効性を増すことは、薬剤の親和性に対する標的の親和性が向上した結果としての単一用量または反復用量の低減および／または薬理学的標的領域での薬剤濃度の増加ならびに、結果として、この薬理学的に活性な物質の通例の治療量での一般毒性の低減を含む。
【００９２】
薬理学的に活性な物質は、薬物療法的な目的で用いられる物質として理解される。
【００９３】
本発明による化合物を用いて特定の薬理学的に活性な物質の薬物療法的な有効性を高める場合、この薬理学的に活性な物質を本発明による配位化合物の内部領域に配位子として導入してもよい。また、（対イオンなどとして）外部領域に局在してもよい。薬理学的に活性な物質は、薬学的に許容される剤形で本発明による手段に対して過剰に存在してもよい。
【００９４】
製剤の薬学的に許容される形態については、配位化合物および薬学的に活性な化合物の化学的特性を考慮しつつ、従来技術において周知の方法に従って調製すればよい。脂肪族チオールと薬学的に活性な化合物との比は、経験的に選択される。
【００９５】
剤形（固体、液体、ソフト、吸入など）は、本発明による化合物に比して過剰に用いられる薬理学的に活性な物質の性質を考慮しつつ、従来技術において周知の方法に従って容易に調製可能なものである。
【００９６】
ここにあげた事例において、本発明による化合物および薬理学的に活性な物質（その有効性をそれが高める）は、単一剤形に含有される。この例では、本発明による化合物と薬理学的に活性な物質とが、そのままで同時に投与されることになる。
【００９７】
本発明による化合物および薬理学的に活性な物質（それの助けによってその有効性が高められる）を別々の剤形に含有させてもよい。
【００９８】
別々の剤形での投与は、同時に（錠剤などの固体での投与剤形を２つ同時に服用する、特に１本の注射器での同時注射）実施してもよいし、最初に第１の剤形、続いて第２の剤形を患者に与えるまたは投与させる形で順次実施してもよい。投与間隔は、好ましくは１時間以下であるが、依然として相乗効果が観察されるあいだはさらに長くしてもよい。
【００９９】
ここで提案する配位化合物の配位子は、生理学的（生物学的、薬理学的）および薬学的に許容される化合物である点に注意されたい。
【０１００】
生理学的に（生物学的に、薬理学的に）許容される化合物は、患者に投与したときに毒作用またはそれ以外の望ましくない影響を引き起こさない化合物として理解される。生理学的に許容される、生物学的に許容される、薬理学的に許容されるという表現は、本明細書の文脈では同義とみなされる。また、使用する物質はいずれも薬学的に許容される、すなわち剤形の成分として使用してもよい点も理解される。
【０１０１】
本発明の文脈では、患者とは、何らかの方法で剤形を投与する対象となる人間または他の哺乳動物、鳥類、両棲類または魚類を意味する。
【０１０２】
配位子およびｄ−金属は、内因性の薬理学的活性を持つものであってもよい。
【０１０３】
バイオメタルと呼ばれる投与対象のｄ−金属と脂肪族チオールとの配位化合物の量は、配位化合物の組成物中におけるバイオメタルの重量割合に応じて決まり、使用するバイオメタルの一日所要量に対応することもあれば、それ未満のこともある。それ以外では、配位化合物の一部として投与対象となるｄ−金属の量は、治療結果を達成するための必要性に応じて決まる。バイオメタルと呼ばれない、投与対象となるｄ−金属の配位化合物の量は、配位化合物の組成物中におけるｄ−金属の重量割合に応じて決まり、その最大許容値未満でなければならない。それ以外では、配位化合物の一部として投与対象となるｄ−金属の量は、治療結果を達成するための必要性に応じて決まる。
【０１０４】
実施形態のうちの１つにおいて、本発明は、腫瘍性疾患（癌）に羅患した哺乳動物（人間など）を治療するための方法であって、ここに開示する有効量の配位化合物（錯体）と有効量のＥＧＦＲ阻害剤（Ｉｒｅｓｓａ、チルホスチン、ゲニステイン、ＳＵ６６６８、ＺＤ６４７４）とを哺乳動物に投与する方法に関する。この方法で治療可能な腫瘍性疾患の例としては、肺、乳房、頭頸部、胃腸管、卵巣、腎臓、皮膚、神経系、脳、結合組織の癌があげられる。
【０１０５】
実施形態のうちの１つにおいて、本発明は、メタボリックシンドローム、１型または２型真性糖尿病、２型真性糖尿病患者における糖尿病網膜症、２型真性糖尿病患者における糖尿病性足病変症候群、２型真性糖尿病患者における下肢栄養障害性潰瘍または２型真性糖尿病患者における糖尿病性ニューロパチーに羅患した哺乳動物（人間など）を治療するための方法であって、ここに開示する有効量の配位化合物（錯体）と有効量のチオクト酸とを哺乳動物に投与する方法に関する。
【０１０６】
実施形態のうちの１つにおいて、本発明は、心血管疾患を予防または治療するための方法であって、ここに開示する有効量の配位化合物（錯体）と有効量のアデノシンとを哺乳動物に投与する方法に関する。急性および慢性の虚血性心疾患、心筋梗塞および狭心症が、特に、心血管疾患の例である。
【０１０７】
実施形態のうちの１つにおいて、本発明は、放射線照射後の汎血球減少症（ｈｅｍｏｄｅｐｒｅｓｓｉｏｎ）、中毒による汎血球減少症、外傷後の汎血球減少症、躁病または鬱病タイプの精神障害ならびに、さまざまな原因による関節炎を治療するための方法であって、ここに開示する有効量の配位化合物（錯体）と有効量のリチウムとを哺乳動物に投与する方法に関する。
【実施例】
【０１０８】
以下、具体的な実施例によって本発明を説明する。
【０１０９】
＜実施例番号１：Ｐｄ（ＩＩ）とシステインとの配位化合物の調製＞
水溶液中で、カチオン［Ｐｄ_２（μ−Ｓ−Ｌ−Ｃｙｓ）（μ−Ｓ−Ｌ−ＣｙｓＨ）（２，２’−ｄｉｐｙ）_２］^３＋である。
【化８】


最小量の水に溶解させた２２１ｍｇ（１．８１１ｍｍｏｌ）のＡｇＮＯ_３を、３００ｍｇ（０．９０４ｍｍｏｌ）のＰｄ（２，２’−ｄｉｐｙ）Ｃｌ_２を１５ｍｌの水に入れた懸濁液に加える。０．５ｍｌの濃ＨＮＯ_３を用いて混合物を酸性化し、超音波浴中にて１５分間均質化し、濾過する。最小量の水に溶解させた９６ｍｇ（０．９０５ｍｍｏｌ）のＬ−システイン（ｃｙｓ）を、濾液に加える。反応混合物を室温にて空気中で蒸発させる。沈殿する［Ｐｄ_２（μ−Ｓ−Ｌ−Ｃｙｓ）（μ−Ｓ−Ｌ−ＣｙｓＨ）（２，２’−ｄｉｐｙ）_２］（ＮＯ_３）_３・４．５Ｈ_２Ｏの濃いオレンジ色の結晶は水に容易に溶解され、エタノールにはそれほど溶解されず、アセトンおよびジクロロメタンには実質的に不溶である。収率７０〜７５％。
【０１１０】
元素分析：実測値％：Ｃ ２１．８５、Ｎ １１．１３、Ｐｄ ２４．０２、Ｓ ７．２３。
Ｃ_１６Ｈ_３２Ｎ_７Ｏ_１７．５Ｐｄ_２Ｓ_２（［Ｐｄ_２（μ−Ｃｙｓ）（μ−ＣｙｓＨ）（ｄｉｐｙ）_２］−（ＮＯ_３）_３・４．５Ｈ_２Ｏ、ＭＷ １０３４．１ｇ／ｍｏｌ）としたときの計算値％：Ｃ ２１．８７、Ｎ １１．１７、Ｐｄ ２４．１３、Ｓ ７．２８。
【０１１１】
三斜晶系、空間群Ｐ１で結晶化し、単位胞パラメータÅがａ＝１３．８６、ｂ＝１３．８２、ｃ＝１２．１７、α＝１２２．１３°、β＝１０３．６１°、γ＝９１．４０°、Ｖ（Å^３）＝１８８７．０、Ｚ＝１、Ｒ＝７．０２％である。
【化９】

【０１１２】
固体状態で、［Ｐｄ_２（μ−сｙｓ）（μ−ＣｙｓＨ）（ｄｉｐｙ）_２］（ＮＯ_３）_３分子は、弱い非共有結合的な相互作用がゆえに、パラジウム原子によって対で結合する。
【化１０】

【０１１３】
通常、錯体化合物分子の「構造化」は、金属イオン間のＰｄ−Ｐｄ相互作用、水素結合の系ならびに、結晶構造内での「鎖」の形成につながる配位子間π−π相互作用がゆえに発生する。
【化１１】

【０１１４】
［１００］に沿った１Ｄ鎖の形成ならびに（０１０）面の２Ｄ層である。矢印は隣接する１Ｄ鎖のジピリジルフラグメント間のπ−πスタッキング相互作用を示す。
【０１１５】
原子の座標および熱パラメータについては、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｄａｔａｂａｓｅ（ＣＣＤＣ）に番号７０５７４５で登録されている。
【０１１６】
ＩＲスペクトル（ＫＢｒペレット）、ν_ｍａｘ（ｃｍ^−１）：４１９、５４２、５９０、６４８、６８９、７２２、７６５、８０７、９７７、１０２２、１０３６、１０７２、１１０７、１１６４、１１７４、１２０４、１２２６、１２４０、１２７２、１３１２、１３５３、１３６４、１３８４、１４４７、１４６９、１５６３、１６０１、１６６６、１７２８、３０７３、３１０８、３２２１、３２８３、３４２７、３９５３。
【０１１７】
過剰な配位子に配位化合物を加え、その目的で、１００ｍｌの水に溶解させた９．９７ｇのＬ−システインを含有する溶液に、０．１ｇの錯体［Ｐｄ_２（μ−Ｓ−Ｌ−Ｃｙｓ）（μ−Ｓ−Ｌ−ＣｙｓＨ）（２，２’−ｄｉｐｙ）_２］（ＮＯ_３）_３・４．５Ｈ_２Ｏを加えた。これを十分に撹拌し、得られた溶液を真空下での昇華によって乾燥させ、淡黄色の物質を形成した。この物質の配位化合物／有機分子比は１／１０００であった。
【０１１８】
この物質は、真空昇華乾燥の終了時にすぐに使用できる状態であった。
【０１１９】
＜実施例番号２：Ｐｄ（ＩＩ）とシステアミンとの配位化合物の調製＞
水溶液中、配位化合物はカチオン［Ｐｄ_２（μ−ＳＣＨ_２ＣＨ_２ＮＨ_３）_２（１，１０−ｐｈｅｎ）_２］^４＋である。
【化１２】

【０１２０】
０．５０９ｇ（２．９９ｍｍｏｌ）の硝酸銀（最小量の水に入れたもの）を含有する溶液を、５７１ｍｇ（１．４９ｍｍｏｌ）のＰｄ（１，１０−ｐｈｅｎ）Ｃｌ_２を２０ｍｌの水に入れた懸濁液（１Ｍの硝酸を用いてｐＨ３に酸性化してある）に加えた。得られたカード状の塩化銀沈殿物を水浴にて慎重に加熱して凝固させ、遠心分離した。沈殿物を分離した後、１７０ｍｇの２−アミノエタンチオール（ａｅｔ、システアミン）塩酸塩を上清に溶解させた。数週間かけてオレンジ色の溶液を空気中にゆっくり蒸発させる間に層状で朱色の結晶が堆積された。収率０．２５ｇ（３５％）。
【０１２１】
元素分析：実測値％：Ｃ ３３．５、Ｎ １４．０、Ｐｄ ２１．２、Ｓ ６．６０。
【０１２２】
Ｃ_２８Ｈ_３２Ｎ_１０Ｏ_１３Ｐｄ_２Ｓ_２（［Ｐｄ_２（ａｅｔＨ）_２（ｐｈｅｎ）_２］−（ＮＯ_３）_４・Ｈ_２Ｏ、ＭＷ ９９３．５９ｇ／ｍｏｌ）としたときの計算値％：Ｃ ３３．８５、Ｎ １４．１０、Ｐｄ ２１．４２、Ｓ ６．４５。
【０１２３】
［Ｐｄ_２（μ−Ｓ−ＣｙｓｔＨ）_２（１，１０−ｐｈｅｎ）_２］（ＮＯ_３）_４・Ｈ_２Ｏは、単斜晶系、空間群Ｃｃで結晶化し、単位胞パラメータÅがａ＝２４．５３、ｂ＝１３．１０、ｃ＝２２．６５、β＝１０４．２６°、Ｖ（Å^３）＝７０５２．２５、Ｚ＝４、Ｒ＝３．１６％である。
【化１３】

【０１２４】
製剤を得るために、配位化合物を過剰な配位子に移し、この目的のために、０．１ｇの錯体［Ｐｄ_２（μ−ＳＣＨ_２ＣＨ_２ＮＨ_３）_２（１，１０−ｐｈｅｎ）_２］（ＮＯ_３）_４・Ｈ_２Ｏを、１００ｍｌの水に溶解させた１１．４３ｇのシステアミン（アミノエタンチオール）塩酸塩を含有する溶液に加えた。これを十分に撹拌し、得られた反応溶液を真空下での昇華によって乾燥させ、淡黄色の物質を形成した。この物質の配位化合物／有機分子比は１／１０００であった。
【０１２５】
この物質は、真空昇華乾燥の終了時にすぐに使用できる状態であった。
【０１２６】
＜実施例番号３：Ｐｄ（ＩＩ）とアセチルシステインとの配位化合物の調製＞
水溶液中、配位化合物はカチオン［Ｐｄ_２（μ−Ｓ−Ａｃｃｙｓ）_２（ｄｉｐｙ）_２］^２＋である。
【化１４】

【０１２７】
７７．８ｍｇのアセチルシステイン（０．４７６ｍｍｏｌ）を、０．１６０ｇのＰｄ（２，２’−ｄｉｐｙ）Ｃｌ_２（０．４７６ｍｍｏｌ）を１０ｍｌの水に入れた懸濁液に撹拌しながら加え、０．５ＭのＫＯＨ溶液をｐＨ１１になるまで加えた。この溶液を５０℃で１時間水浴中に保持した。得られた溶液に約７０ｍｌのアセトンを加え、これを撹拌した後、約８０ｍｌのジエチルエーテルをさらに加えた。反応混合物を数時間放置したところ、錯体［Ｐｄ_２（μ−Ｓ−Ａｃｃｙｓ）_２（ｄｉｐｙ）_２］Ｃｌ_２・Ｈ_２Ｏの黄色の針晶が沈殿した。
【０１２８】
元素分析：実測値％：Ｃ ３８．６、Ｎ ９．０、Ｐｄ ２２．２９、Ｓ ６．６５。
【０１２９】
Ｃ_３０Ｈ_３４Ｃｌ_２Ｎ_６Ｏ_７Ｐｄ_２Ｓ_２［Ｐｄ_２（μ−Ｓ−Ａｃｃｙｓ）_２（ｄｉｐｙ）_２］−Ｃｌ_２・Ｈ_２Ｏ、ＭＷ ９３８．５ｇ／ｍｏｌとしたときの計算値％：Ｃ ３８．３９、Ｎ ８．９５、Ｐｄ ２２．６８、Ｓ ６．８３。
【０１３０】
ＩＲスペクトル（ＫＢｒペレット）、ν_ｍａｘ（ｃｍ^−１）：５０７、６４０、６９２、７７４、８１５、８７９、９４６、１０５８、１０９４、１２１２、１２２９、１３４３、１３８１、１４０４、１４２７、１５７３、１７２３、２６５５、２８２０、２９７１、３３７７、３４０６、３４８０。
【０１３１】
製剤を得るために、配位化合物を過剰な配位子に移し、この目的のために、０．１ｇの錯体［Ｐｄ_２（μ−Ｓ−Ａｃｃｙｓ）_２（ｄｉｐｙ）_２］Ｃｌ_２・Ｈ_２Ｏを、１０００ｍｌの水に溶解させた１７．３９ｇのアセチルシステインを含有する溶液に加えた。これを十分に撹拌し、得られた溶液を真空下での昇華によって乾燥させ、淡黄色の物質を形成した。この物質の配位化合物／有機分子比は１／１０００であった。
【０１３２】
この物質は、真空昇華乾燥の終了時にすぐに使用できる状態であった。
【０１３３】
＜実施例番号４＞
リチウムイオン、アセチルシステイン、パラジウムとアセチルシステインとの二核配位化合物を含む製剤を得る。
【０１３４】
水溶液中、配位化合物はカチオン［Ｐｄ_２（μ−Ｓ−Ａｃｃｙｓ）_２（ＮＨ_３）_４］^２＋である。
【化１５】

【０１３５】
０．３８６ｇのアセチルシステイン（２．３６ｍｍｏｌ）を、ｃｉｓ−［Ｐｄ（ＮＨ_３）_２Ｃｌ_２］（０．５ｇ、２．３６ｍｍｏｌ）の冷懸濁液に撹拌しながら加え、０．５ＭのＫＯＨ溶液をｐＨ１１になるまで加えた。この溶液を５０℃で１時間水浴中に保持した。得られた溶液に約５０ｍｌのアセトンを加え、これを撹拌した後、約５０ｍｌのジエチルエーテルをさらに加えた。沈殿した錯体［Ｐｄ_２（μ−Ｓ−Ａｃｃｙｓ）_２（ＮＨ_３）_４］Ｃｌ_２の淡黄色の堆積物を濾別し、真空デシケータにて乾燥させた。
【０１３６】
元素分析：実測値％：Ｃ １７．６、Ｎ １２．２、Ｐｄ ３０．０、Ｓ １０．０。
Ｃ_１０Ｈ_２８Ｃｌ_２Ｎ_６Ｏ_６Ｐｄ_２Ｓ_２［Ｐｄ_２（μ−Ｓ−Ａｃｃｙｓ）_２（ＮＨ_３）_４］Ｃｌ_２、ＭＷ ６７６．２４ｇ／ｍｏｌとしたときの計算値％：Ｃ １７．７６、Ｎ １２．４３、Ｐｄ ３１．４７、Ｓ ９．４８。
【０１３７】
ＩＲスペクトル（ＫＢｒペレット）、ν_ｍａｘ（ｃｍ^−１）：５１２、５９７、６９２、７７３、８３９、８７９、９４６、１０９４、１２１２、１２２９、１２５４、１３４３、１４０３、１５２１、１５７２、１５９４、１７２３、２６５５、２９２５、２９７１、３１１９、３４６０。
【０１３８】
０．１ｇの錯体［Ｐｄ_２（μ−Ｓ−Ａｃｃｙｓ）_２（ＮＨ_３）_４］Ｃｌ_２を、２４．１３ｇの無水アセチルシステインを含有する１５０ｍｌの溶液に加え、撹拌し、６．２ｇの水酸化リチウム一水和物ＬｉＯＨ・Ｈ_２Ｏを少量ずつ加え、完全に溶解するまで撹拌した。得られた溶液を水酸化リチウムの飽和水溶液でｐＨ７．２〜７．４に滴定した。
【０１３９】
この製剤は、固相における配位化合物の単離の工程を使用せずに合成可能なものである。この場合、秤量したｃｉｓ−［Ｐｄ（ＮＨ_３）_２Ｃｌ_２］を、計算で求めた量のアセチルシステインに水溶液に加え、十分に溶解するまで溶液を撹拌した後、計算で求めた量の無水水酸化リチウムまたは水酸化リチウム一水和物を加える。十分に溶解後、この溶液を飽和水酸化リチウム溶液でｐＨ７．０〜７．４に滴定する。
【０１４０】
この物質は、真空下での昇華乾燥後にすぐに使用できる状態である。
【０１４１】
＜実施例番号５：銅とシステインとの配位化合物の調製＞
水溶液中、配位化合物はカチオン［（２，２’−ｄｉｐｙ）Ｃｕ（μ−Ｃｙｓ）_２Ｃｕ（２，２’−ｄｉｐｙ）］^２＋である。
【化１６】


システイン（０．９４ｇ、７．７ｍｍｏｌ）のエタノール溶液をＣｕ（２，２’−ｄｉｐｙ）Ｃｌ_２（１ｇ、３．４４ｍｍｏｌ、Ｃｕ：Ｃｙｓモル比１：２．２５）のエタノール溶液に加える。反応混合物を数分間加熱した後、混合物をゆっくりと冷却すると錯体の微結晶性の堆積物が沈殿され、これを濾過によって溶液から分離し、ジエチルエーテルで洗浄し、真空デシケータで乾燥させる。
【０１４２】
元素分析：実測値％：Ｃ ４１．５、Ｎ １１．０、Ｃｕ １６．５、Ｓ ８．３。
【０１４３】
Ｃ_２６Ｈ_２８Ｃｌ_２Ｃｕ_２Ｎ_６Ｏ_４Ｓ_２［Ｃｕ_２（μ−Ｓ−Ｃｙｓ）_２（ｄｉｐｙ）_２］Ｃｌ_２、ＭＷ ７５０．６７ｇ／ｍｏｌとしたときの計算値％：Ｃ ４１．６０、Ｎ １１．１９、Ｃｕ １６．９３、Ｓ ８．５４。
【０１４４】
ＩＲスペクトル（ＫＢｒペレット）、ν_ｍａｘ（ｃｍ^−１）：５２０、６９１、８１５、８７９、１０５８、１１３３、１２１２、１２２９、１２５４、１３４３、１４０４、１５７２、１５９４、１６２７、２６５５、２９２５、２９４０、２９７１、３１１９、３４８０。
【０１４５】
この製剤は、固相における配位化合物の単離の工程を使用せずに合成可能なものである。計算で求めた量のＣｕ（２，２’−ｄｉｐｙ）Ｃｌ_２を、二倍以上の過剰量のシステインを含有する水溶液に加える。得られる溶液を使用して、製剤を得ることが可能である。
【０１４６】
＜実施例番号６＞
リチウムイオンおよび銅とシステインとの二核配位化合物を含む製剤を得る。
【０１４７】
０．１ｇの［Ｃｕ_２（μ−Ｓ−Ｃｙｓ）_２（ｄｉｐｙ）_２］Ｃｌ_２（実施例番号５）を、１６．１４ｇのシステイン（配位化合物とチオールとのモル比１：１０００）を含有する水溶液（約１５０ｍｌ）に加え、十分に撹拌した。次に、得られた溶液に水酸化リチウム一水和物ＬｉＯＨ・Ｈ_２Ｏを少量ずつ加え、これが十分に溶解されるまで撹拌を継続した後、得られた溶液のｐＨを飽和ＬｉＯＨ溶液で７．２〜７．４に調節した。
【０１４８】
この物質は、真空下での昇華乾燥後にすぐに使用できる状態であった。
【０１４９】
＜実施例番号７＞
チオクト酸およびパラジウムとアセチルシステインとの二核配位化合物を含む製剤を得る。
【０１５０】
計算で求めた量の［Ｐｄ_２（μ−Ｓ−Ａｃｃｙｓ）_２（ｄｉｐｙ）_２］Ｃｌ_２・Ｈ_２Ｏ（実施例番号３）およびリポ（チオクト）酸をモル比１：１０００で含有する水溶液を混合することで、製剤を得る。
【０１５１】
この物質は、真空下での溶液の昇華乾燥後にすぐに使用できる状態である。
【０１５２】
＜実施例番号８＞
アデノシンおよびパラジウムとアセチルシステインとの二核配位化合物を含む製剤を得る。
【０１５３】
計算で求めた量の［Ｐｄ_２（μ−Ｓ−Ａｃｃｙｓ）_２（ｄｉｐｙ）_２］Ｃｌ_２・Ｈ_２Ｏ（実施例番号３）、アセチルシステイン、アデノシンをモル比１：１０００：１で含有する水溶液を混合することで、製剤を得る。
【０１５４】
この物質は、溶液の真空昇華乾燥後にすぐに使用できる状態である。
【０１５５】
＜実施例番号９＞
配位化合物によってチロシンキナーゼ活性阻害剤の作用に対する薬理学的標的−上皮成長因子受容体−の親和性を高める。
【０１５６】
増加したＨＥＲ１およびＨＥＲ２／ｎｅｕ活性と乳房、肺、卵巣、骨、食道での癌における腫瘍細胞の悪性増殖との間で、原因となる関連性を臨床的に示した。これに関連して、抗腫瘍標的として積極的に研究されている対象物のひとつに上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）がある［５，７］。
【０１５７】
ＥＧＦＲによって実現される生物学的作用を遮断することを目的とした、多数の薬理学的解決策が存在する。
１）受容体の細胞外部分に結合するモノクローナル抗体の使用：Ｅｒｂｉｔｕｘ−ＨＥＲ１に対するモノクローナル抗体、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ−ＨＥＲ２／ｎｅｕに対するモノクローナル抗体；２）細胞膜透過性細胞毒とコンジュゲートする組換えペプチド配位子ＥＧＦおよび／またはＴＧＦ−ａの使用；３）ＥＧＦＲの細胞内ドメインに作用でき、シグナル伝達タンパク質のチロシンキナーゼリン酸化のプロセスを中断できる低分子量の阻害剤であるＩｒｅｓｓａ、チルホスチン、ゲニステイン、ＳＵ６６６８、ＺＤ６４７４の使用。
【０１５８】
抗体と受容体の免疫活性中心との相互作用ならびに阻害剤と触媒活性の活性中心との相互作用では、これらの中心に到達できる必要があり、これはタンパク質分子のコンホメーションによって判断される。二量体ＥＧＦＲ分子のコンホメーションによって、チロシンキナーゼ阻害剤およびモノクローナル抗体は各々の結合部位と相互作用できるようになる。
【０１５９】
［作業の目的］
配位化合物が、薬理学的標的−上皮成長因子受容体−のチロシンキナーゼ活性阻害剤の作用に対する親和性におよぼす影響について研究すること。
【０１６０】
使用した被検化合物は、システインとパラジウム（Ｃ−Ｐｄ）の配位化合物、システイン（Ｃ）、システインが過剰な配位化合物Ｃ−Ｐｄ（Ｃ−Ｐｄ：Ｃ、配位化合物：システイン比１：１０００）、ＥＧＦ受容体−上皮成長因子の生理学的高親和性配位子、チルホスチンＡＧ１４７８（Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）、ＥＧＦチロシンキナーゼ受容体阻害剤であった。
【０１６１】
研究実施用の製剤を得る。
【０１６２】
被検化合物を＋４℃で保管した。物質を実験開始の直前に脱イオン水（ｓｕｐｅｒ Ｑ）に溶解させた。初期溶液の濃度は実験で用いる濃度の１０００倍以上とする。調製した濃溶液を＋４℃にて５時間以内で保管する。
【０１６３】
［投与経路］
最終試験濃度になるようにして細胞培地に化合物を加えた。
【０１６４】
［用量数］
表記の時間で細胞に一用量で製剤を加える。
【０１６５】
［濃度］
システイン（Ｃ）０．０１５および０．１５μｍｏｌ／ｍｌ；
システイン配位化合物−Ｃ−Ｐｄ ０．０１５および０．１５ｎｍｏｌ／ｍｌ；
システイン配位化合物：システイン（Ｃ−Ｐｄ：Ｃ）１：１０００ ０．０１５および０．１５μｍｏｌ／ｍｌ（配位子濃度をμｍｏｌ／ｍｌで示す）。
上皮成長因子２００ｎｇ／ｍｌ。
ＥＧＦチロシンキナーゼ受容体阻害剤−濃度０．１μｇ／ｍｌ、０．２５μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌ、０．７５μｇ／ｍｌ、１．０μｇ／ｍｌ、２．５μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、７．５μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌでのチルホスチンＡＧ１４７８。
【０１６６】
製剤を一用量で加えた。
【０１６７】
上皮成長因子受容体のチロシンキナーゼ活性の判定時間：０分間、５分間、１０分間、３０分間、１時間、２時間、４時間、８時間。
【０１６８】
２４時間後および４８時間後に、培養にて生細胞と死細胞の数を求めた。
【０１６９】
［使用した細胞系］
Ａｌｌ−Ｒｕｓｓｉａｎ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ （Ｒｕｓｓｉａｎ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｃｙｔｏｌｏｇｙ， Ｓｔ． Ｐｅｔｅｒｓｂｕｒｇ）から入手した、Ａ４３１系統のヒト類表皮癌細胞。
【０１７０】
［細胞培養条件］
細胞をＣＯ_２インキュベータ（Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にて＋３７℃かつＣＯ_２含有量５％で培養する。これらの条件下で単層培養まで細胞を成長させ、被検化合物の作用に曝露する。
【０１７１】
［細胞培地］
ＤＭＥＭ培地（ＯＯＯ ＰａｎＥｋｏ、モスクワ）にゲンタマイシンＫ（８０ｍｇ／ｌ）、Ｌ−グルタミン（３００ｍｇ／ｌ）、血清（ＰＡＡ、オーストリア）を加えて最終濃度１０％としたものを、細胞の培養に使用する。実験開始の２４時間前に、血清含有量を０．５％まで落とした培地に細胞を移す。
【０１７２】
［細胞成長動力学］
Ａ４３１細胞をプラスチック製のペトリ皿（Ｎｕｎｃ）に濃度１００００／ｃｍ^２で蒔き、２４時間後に１０〜１５％の単層形成時の被検製剤の作用に曝露した。
【０１７３】
［染色用細胞の調製］
Ａ４３１細胞の培地を、剥離した死細胞の完全分析用に試験管（Ｆａｌｋｏｎ）に回収する一方で、ペトリ皿の細胞を（回収した培地と合わせた）ＰＢＳで洗浄し、Ｖｅｒｓｅｎｅ（Ｐａｎｅｋｏ）にて室温で約１０分間、０．２５％トリプシン溶液で細胞が剥離するまで処理した。次に、細胞を自動ピペットでピペット滴下して懸濁させ、先に回収した培地と合わせた。試料を室温にて５分間、４００ｇで遠心処理し、上清を取り除き、堆積物をｐＨ７．４のＰＢＳホスフェート塩緩衝液に再懸濁させた。
【０１７４】
［細胞をヨウ化プロピジウムで染色］
Ｂｒｕｋｅｒ ＡＣＲ １０００蛍光フローサイトメータで測定する５〜１０分前に、細胞の懸濁液に濃度５０μｇ／ｍｌまでヨウ化プロピジウムを加えた。この染色は破損した細胞膜を通り抜けることができ、染色された細胞は死滅する。
【０１７５】
［細胞溶解方法］
刺激完了後、細胞を氷中にてホスフェート塩緩衝液（ｐＨ７．４）で洗浄する。トータルライセートを得るために、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ Ｎａ_３ＶＯ_４、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＥＧＴＡ、０．５ｍＭ ＰＭＳＦ、さらに各々１μｇ／ｍｌのロイペプチン、アプロチニン、ペプスタチン、０．５％Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含有する緩衝液中で細胞を掻爬し、４℃で１０分間インキュベートする。得られた材料を２６Ｇの注射針に５回通し、１００００ｇで５分間遠心処理する。電気泳動試料（４０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ６．８、１０％ＳＤＳ、２０％２−メルカプトエタノール、４０％グリセロール、０．０５％ブロモフェノールブルー）用の１／４容量の緩衝液を上清に加え、撹拌し、１００℃で５分間加熱する。
【０１７６】
［タンパク質濃度の判定］
ＲＣ−ＤＣタンパク質アッセイ（ＢｉｏＲａｄ）試薬を用いて、ＢｉｏＭａｔｅ ３（Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）分光光度計で、電気泳動前の試料中におけるタンパク質の濃度を求める。
【０１７７】
［電気泳動およびエレクトロトランスファ］
上皮成長因子受容体の分析用に７．５％ポリアクリルアミドゲル中にて、ＭＡＰキナーゼＥＲＫ １，２の分析用には１２％ゲルにて、標準的な方法を用いてタンパク質を電気泳動で分離する。等量のタンパク質を含有する試料をゲルに適用する。その後、０．５８％Ｔｒｉｓ、０．２９％グリシン、０．０３５％ドデシル硫酸Ｎａ、２０％メタノールを含有する緩衝液中で、分離したタンパク質をニトロセルロース膜（Ｈｙｂｏｎｄ ＥＣＬ， Ａｍｅｒｓｈａｍ）に移すエレクトロトランスファを実施する。Ｐｏｎｃｅａｕ Ｓ（Ｓｉｇｍａ）を用いてタンパク質バンドを可視化する。
【０１７８】
［イムノブロッティング］
ウェスタンブロッティングプロトコールのＥＣＬ法（Ａｍｅｒｓｈａｍ）でイムノブロッティングを実施する。すべての手順を室温にて実施する。１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．６）、１００ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ ２０（ＴＢＳ−Ｔ）を含有する溶液中で、ニトロセルロース膜を１０分間洗浄する。次に、この膜をＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）の１％溶液または脱脂粉乳（Ｖａｌｉｏ）をＴＢＳ−Ｔ緩衝液に加えた５％溶液中で１時間インキュベートした後、一次抗体をＴＢＳ−Ｔ緩衝液に加えた溶液中で１〜１．５時間インキュベートする。さらに、膜をＴＢＳ−Ｔ中で５分ずつ５回洗浄し、二次抗体をＴＢＳ−Ｔ緩衝液に加えた５％脱脂粉乳含有溶液に入れ、１時間インキュベートする。膜を洗浄（ＴＢＳ−Ｔ、５分ずつ５回）した後、高感度化学ルミネッセンス法を用いて、抗体に結合したタンパク質を明らかにする。ニトロセルロース膜をＥＣＬ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）溶液中で０．１２５ｍｌ／ｃｍ^２の速度で１分間インキュベートし、Ｋｏｄａｋ Ｘ−ＯＭＡＴ ＡＲ Ｘ線フィルムに曝露することで、化学ルミネッセンス光を記録する。
【０１７９】
［抗体］
ホスホチロシンに対する一次モノクローナル抗体（ＰＹ２０， Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＵＳＡ）と、チロシンリン酸化ＥＲＫ １，２に対するウサギポリクローナル抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＵＳＡ）を、膜でのタンパク質の特異的検出に使用する。ＥＧＦ受容体に対するウサギポリクローナル抗体と、ＥＲＫ１，２に対するウサギポリクローナル抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＵＳＡ）を、作業の過程で被検タンパク質の検出された活性形態をさらに特定するのに使用する。マウス免疫グロブリンに対して得られ、ペルオキシダーゼとコンジュゲートしたヤギ抗体（ＧＡＭ−ＨＲＰ）（Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）、ウサギ免疫グロブリンに対して開発され、西洋ワサビペルオキシダーゼとコンジュゲートしたヤギ抗体（ＧＡＲ−ＨＲＰ， Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＵＳＡ）を、イムノブロッティングの二次抗体として使用する。ヘムオキシゲナーゼ１に対する一次ウサギポリクローナル抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、ＵＳＡ）を、ヘムオキシゲナーゼの特異的検出に使用する。ウサギ免疫グロブリンに対して得られ、ペルオキシダーゼとコンジュゲートした抗体（ＧＡＲ−ＨＲＰ）（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、ＵＳＡ）を、イムノブロッティングの二次抗体として使用する。
【０１８０】
［膜から抗体を除去するための方法（ストリッピング）］
ニトロセルロース膜に抗体を除去し、これを他の抗体で再染色するために、６０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、２％ＳＤＳ、１００ｍＭ ２−メルカプトエタノールを含有する溶液中で、５０℃にて３０分間、揺動しながら膜をインキュベートする。
【０１８１】
［デンシトメトリーおよび結果の統計処理のための方法］
Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ ６．０のプログラムを用いて結果を含むＸ線フィルムをスキャンし、Ｓｃｉｏｎ Ｉｍａｇｅ ４．０．２．のプログラムを用いてバンドのデンシトメトリーを実施して、得られた値を対照値で割って３回の類似した実験（繰り返し）の平均を得た。Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ ２０００ ９．０のプログラムを用いて、Ｘ軸に時間、実験値と対照値との比をＹ軸にとってグラフを描いた。
【０１８２】
［被検化合物が細胞の増殖活性および死に対しておよぼす影響についての結果］
得られた結果によれば、使用した濃度で、対照シリーズでの値と比較して１時間から４〜８時間の長い作用時間にわたってシステインがＥＧＦ受容体を８〜１０倍活性化する。
【０１８３】
使用した濃度で、配位化合物Ｃ−Ｐｄは、上皮成長因子受容体のチロシンキナーゼ活性に影響し、これは対照シリーズでの値と比較して最初の時間で５〜８倍強く、１時間から４〜８時間の長い作用時間では１５〜２０倍強い。
【０１８４】
使用した濃度および分析した時間で、システインとシステインの配位化合物であるＣ−Ｐｄ：Ｃ（１：１０００）との作用を組み合わせて用いると、上皮成長因子受容体のチロシンキナーゼ活性の特性は、配位化合物の影響下でＥＧＦ受容体のチロシンキナーゼ活性の特性と類似していた。Ｃ−Ｐｄ：Ｃの影響下でのＥＧＦ受容体のチロシンキナーゼ活性のレベルには、配位化合物単独の受容体に対する活性化の影響レベルと比較して、１時間から４〜８時間の長い作用時間にわたって平均約２０％のわずかな増加が認められた。
【０１８５】
最初のうち（最長１時間まで）は配位化合物の影響下でＥＧＦ受容体のチロシンキナーゼ活性の２〜３倍、１時間から４〜８時間ではこれが４〜５倍のときに、飽和濃度でＥＧＦ受容体−上皮成長因子−の高親和性配位子の影響下で生じるＥＧＦ受容体のチロシンキナーゼ活性が最も増加した。
【０１８６】
ＥＧＦ受容体チロシンキナーゼ阻害剤であるチルホスチンＡＧ１４７８は、高親和性配位子上皮成長因子の作用の１０〜２５分前に導入すると、３〜７μｇ／ｍｌの濃度で、Ａ４３１細胞の培養にてＥＧＦ受容体のチロシンキナーゼ活性を完全に阻害する。阻害剤を導入するのに最適なタイミングを求める場合、これを７．５μｇ／ｍｌの濃度で使用した。上皮成長因子（２００ｎｇ／ｍｌ）をインキュベーション培地に加える１分前、５分前、１０分前、１５分前、２０分前、２５分前、３０分前に、阻害剤を導入した。阻害剤は、すべてのシリーズの実験で、上皮受容体配位子の作用の１５分前、２０分前、２５分前、３０分前に作用させた場合に、最初のうちと後半の時点で上皮成長因子によってＥＧＦ受容体のチロシンキナーゼ活性の刺激を完全に排除した。上皮成長因子への曝露１０分前にＡＧ１４７８阻害剤を作用させると、受容体は後半の判定時刻（１時間、４時間、８時間）の時点でチロシンキナーゼ活性の１０〜１５％を保持した。このため、上皮成長因子への曝露前のチルホスチンＡＧ１４７８阻害剤の作用の最小時間として１５分を選択した。チルホスチンＡＧ１４７８のＥＧＦ受容体のチロシンキナーゼ活性に対して影響する用量と影響しない用量を求める場合、０．１μｇ／ｍｌ、０．２５μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌ、０．７５μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、２．５μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、７．５μｇ／ｍｌの濃度でこれを使用した。ＡＧ１４７８は、２．５μｇ／ｍｌの濃度でＥＧＦ受容体のチロシンキナーゼ活性を３０％減少させたのに対し、５μｇ／ｍｌおよび７．５μｇ／ｍｌの濃度で作用させると、ＥＧＦ受容体チロシンキナーゼ活性は検出されなかった。ＥＧＦ受容体チロシンキナーゼ活性のＡＧ１４７８阻害剤を、０．１μｇ／ｍｌ、０．２５μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌ、０．７５μｇ／ｍｌの濃度で使用すると、高親和性配位子上皮成長因子によって開始されるＥＧＦ受容体チロシンキナーゼ活性の顕在化に影響しなかった。ＥＧＦ受容体チロシンキナーゼ活性のＡＧ１４７８阻害剤を１μｇ／ｍｌの濃度で用いると、インキュベーションの後半の段階（１時間、４時間、８時間）で、ＥＧＦ受容体のチロシンキナーゼ活性に統計的には信頼できない増加が検出された。
【０１８７】
得られた実験結果は、配位化合物の影響下にて使用した濃度でＥＧＦ受容体の二量体が形成され、過剰な配位子と組み合わせると配位化合物の影響が強まることを実証するものである。これは、ＥＧＦ受容体の二量体だけがチロシンキナーゼ活性を持つことが知られているためである。過剰な配位子と組み合わせた場合の配位化合物の活性増大は、大量の配位化合物がインキュベーション培地に侵入することによる場合がある。低濃度で作業をするのは、容器やピペットの壁面に吸収されることで物質の一部が失われてしまう可能性があるため、危険である。このような損失は極めてわずかであるが、物質を微量で用いる場合は、細胞インキュベーション培地に物質を導入する前にそれが事実上完全に失われてしまうことにもなりかねない。このような場合の過剰な有機分子は、予定された濃度の被検物質をインキュベーション培地に添加しやすくする。この論拠は、システインがＥＧＦ受容体のチロシンキナーゼ活性に対しておよぼす固有の影響について得られた実験による事実を無効にするものではないが、このような細胞反応の活性の変化（ＥＧＦ受容体に対する作用によって制御される）が細胞にとって有意であるのか否か、あるいはこれがＥＧＦ受容体のトランス活性化（多くの物質が細胞に作用するときに発生し、その直接的な生理学的機能とは関連していない）の結果であるのか否かという疑問に答えてもいない。増殖活性の変化が、ＥＧＦ受容体に対する阻害作用または活性化作用の特異性の反映であることは知られている。これに関連して、被検化合物作用時の増殖活性の変化を評価した（表２）。
【０１８８】
【表３】

【０１８９】
実験の結果、対照とシステインの影響下で事実上同一の細胞の増殖活性が認められたことから、システインは増殖活性の刺激に影響しないことがわかる。これとは対照的に、システインとパラジウムの配位化合物は、どの方法を用いても、独立にまたは過剰な配位子でＡ４３１細胞の増殖活性を刺激する。得られた結果から、ｄ−金属と硫黄含有有機分子の配位化合物が、配位子の固有の影響とは同じになり得ない固有の生物学的効果を持つことがわかる。このような差異は、配位子にとっては内因性ではない配位化合物の新規な特性（単数または複数）の顕在化によるものである。上皮成長因子は、Ａ４３１細胞の増殖活性に対して最大の刺激作用を持つ。チロシンキナーゼ活性阻害剤を併用した結果、その阻害活性が不十分になる濃度を明らかにすることが可能になった。結合部位に対する阻害剤の親和性がＥＧＦ受容体分子の二量体の形態で最大になることは周知であり、阻害剤とのプレインキュベーションによって、ＡＧ１４７８は二量体の形態にあるＥＧＦ受容体の分子と結合するが、受容体の二量体化時、残りの阻害剤分子は、上皮成長因子の作用がゆえに、リン酸化前にこの特定のチロシンによってチロシンキナーゼ活性中心と結合するには不十分であると仮定できる。これに関連して、受容体の二量体化が配位化合物の作用によって開始される場合に、ＡＧ１４７８阻害剤の無効な濃度（１．０μｇ／ｍｌ、２．５μｇ／ｍｌ）の作用の結果を確認するのが当然である（過剰な配位子は増殖活性に影響せず、このような組み合わせでは配位化合物の正確な投薬が可能であるということを考慮して、配位化合物を過剰な配位子で使用した）。この場合、阻害剤分子は、二量体化した受容体と最大限に結合し、上皮成長因子の作用時にＥＧＦ受容体の以後のチロシンキナーゼ活性を排除できるようになる。阻害剤導入前の３０分間のプレインキュベーション時間を選択し、最初のうちのＥＧＦ受容体のチロシンキナーゼ活性に対する過剰な配位子での配位化合物の最大の刺激作用を可能にし、ＡＧ１４７８阻害剤濃度１．０μｇ／ｍｌおよび２．５μｇ／ｍｌでのインキュベーションは上皮成長因子の作用の１５分前であった。実験の結果を表３にあげておく。
【０１９０】
【表４】

【０１９１】
得られた結果から、配位化合物がＥＧＦ受容体に対しておよぼす影響によって、ＡＧ１４７８チロシンキナーゼ活性阻害剤の作用の有効性を高められ、併用すると後者を低濃度で使用可能になることになる。
【０１９２】
ＥＧＦ受容体が薬理学的作用の標的であると知り、なおかつ脂肪族チオールとのｄ−元素の二核配位化合物が薬理学的作用の手段であるチロシンキナーゼ活性阻害剤に対するＥＧＦ受容体の親和性を高める能力を考慮して、脂肪族チオールとのｄ−元素の二核配位化合物が、生理学的に適切な用量で後者を用いるための薬剤の作用に対する薬理学的標的の感受性を高めることが重要である疾患の治療に入ることを可能にすると仮定できる。
【０１９３】
＜実施例番号１０：配位化合物の作用によって多剤耐性因子−Ｐ−糖タンパク質−を阻害することで薬理学的標的の微小環境における薬剤の濃度を高めること＞
【０１９４】
Ｐ−糖タンパク質（Ｐｇｐ）は、薬剤分子をはじめとする有毒物質の分子から細胞を保護し、これらの分子を細胞および細胞内標的から除去する。多くのタイプの腫瘍が、これらの腫瘍を形成する細胞でのＰｇｐの顕著な活性の結果として細胞分裂阻害薬の作用に対する顕著な耐性を特徴とする。これに関連して、化学療法の実務におけるＰｇｐ活性阻害剤の使用には、悪性腫瘍の治療で腫瘍細胞の薬剤耐性を抑制する実用的な用途がある。Ｐｇｐ阻害剤の副作用がゆえに、Ｐｇｐ阻害剤の使用は主に悪性腫瘍に制限される。この副作用は、薬剤の作用によって生じる有益な効果よりも危険なものである。悪性腫瘍は例外であるが、これは細胞分裂阻害薬を用いる場合の腫瘍細胞の耐性が、化学療法では成果がなく、大量の細胞分裂阻害薬が正常な細胞に作用し、そこに対して毒作用を有することを示すためである。これに関連して、化学療法的な手段から治療効果を達成可能にするＰｇｐ阻害剤を使用し、Ｐｇｐによる腫瘍細胞の薬剤耐性を克服するのは当然である。低毒性ではあるが有効なＰ−糖タンパク質の新たな阻害剤を探すことは急務であり、これに対する解決策は、悪性腫瘍をはじめとするさまざまな疾患での医薬品の有効性を高められるようにする。
【０１９５】
［作業の目的］
配位化合物がＰ−糖タンパク質の活性を阻害することで標的の微小環境で薬剤の量を増やす能力について研究すること。
【０１９６】
使用した被検化合物は、システアミンとパラジウム（Ｔｓ−Ｐｄ）の配位化合物（実施例番号２）；システアミン（Ｔｓ）；過剰なシステアミンとの配位化合物Ｔｓ−Ｐｄ（Ｔｓ−Ｐｄ：Ｔｓ；配位化合物：システアミン比１：１０００）、ドキソルビシンであり、３通りの濃度で使用した。最大−５×１０^−７Ｍ、また、その５分の１および１０分の１。
【０１９７】
［研究実施用の製剤を得る］
被検化合物を＋４℃で保管した。物質を実験開始の直前に脱イオン水（ｓｕｐｅｒ Ｑ）に溶解させた。初期溶液の濃度は実験で用いる濃度の１０００倍以上とする。調製した濃溶液を＋４℃にて５時間以内で保管する。
【０１９８】
［投与経路］
最終試験濃度になるようにして細胞培地に化合物を加えた。
【０１９９】
［用量数］
表記の時間で細胞に一用量で製剤を加える。
【０２００】
［濃度］
システアミン（Ｔｓ）０．０１５および０．１５μｍｏｌ／ｍｌ。
システアミン配位化合物−Ｔｓ−Ｐｄ０．０１５および０．１５ｎｍｏｌ／ｍｌ。
システアミン配位化合物：システアミン（Ｔｓ−Ｐｄ：Ｔｓ）１：１０００−０．０１５および０．１５μｍｏｌ／ｍｌ（配位子濃度をμｍｏｌ／ｍｌで示す）。
【０２０１】
製剤を一用量で加えた。
【０２０２】
［使用した細胞系］
ジャーカット系統のヒトＴ−リンパ芽球性白血病細胞の培養物。
【０２０３】
［細胞培養条件］
細胞をＣＯ_２インキュベータ（Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にて＋３７℃かつＣＯ_２含有量５％で培養する。これらの条件下で単層培養まで細胞を成長させ、被検化合物の作用に曝露する。
【０２０４】
［細胞培養条件、被検化合物がＰｇｐ活性に対しておよぼす影響を判断するための手順］
１０％仔ウシ胚血清を含有するＲＰＭＩ−１６４０培地にて、細胞を培養した。実験日に、細胞の懸濁液を１５００回転／分で１０分間遠心処理し、堆積物をｐＨ７．４のリン酸緩衝液に再懸濁させた。得られた懸濁液中の細胞数をＧｏｒｙａｙｅｖチャンバで計数し、必要があれば、遠心処理して最終細胞濃度の１００万／ｍｌに達するまで適量のリン酸緩衝液に再懸濁させた。
【０２０５】
モノクローナル抗体と多剤耐性のマーカとの相互作用に対して被検化合物がおよぼす影響を研究するための実験開始の直前に、ｐＨ７．４のリン酸緩衝液を用いて市販の抗体の所望の希釈物を調製した。抗体の適切な希釈物を蛍光フローサイトメータ用のプラスチック管にて特定濃度で被検細胞の１００μｌの懸濁液に加えた後、４℃で３０分間、冷インキュベートした。インキュベーション完了後に遊離（Ｐｇｐに結合していない）抗体を洗い流すために、ｐＨ７．４のリン酸緩衝液２ｍｌを各管に加えた後、これを１５００回転／分で１０分間遠心処理した。上清の液体を真空ポンプで取り除き、洗浄手順を繰り返した。堆積物をｐＨ７．４のリン酸緩衝液３００μｌに再懸濁させた。
【０２０６】
ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎから入手したＦＩＴＣ標識クローン１７Ｆ９マウスモノクローナル抗体を作業に使用した。これらの抗体は、ヒト膜貫通タンパク質Ｐｇｐの外部エピトープに対する特異性が特徴である。この研究では９通りの濃度の抗体を使用した。これを希釈していない市販溶液の体積単位で表すと次のとおりである。細胞懸濁液１００μｌあたり４０；２０；１０；５；２．５；１；０．５；０．２５；０．１μｌ。濃度４０μｌを最大として使用した。これは、さらに抗体の量を増やしても蛍光および染色細胞比率がわずかしか増加しなかったためである。
【０２０７】
特異的抗体と等しい濃度のＦＩＴＣ標識ｌｇＧ_２ｂ，ｋマウスモノクローナル抗体をアイソタイプ対照として使用した。
【０２０８】
［蛍光フローサイトメトリを用いた細胞培養懸濁液におけるＰｇｐの機能的活性の評価］
２０００回転で遠心処理することで栄養塩培地なしで細胞を洗浄し、グルコースを含有してフェノールレッドを含まないハンクス溶液に堆積物を再懸濁させ、試験管に細胞懸濁液を加える。次に、輸送体（単数または複数）阻害剤を細胞懸濁液に加え、管を２０分間インキュベート（５ｍＭのグルコースを対照試料に加えたハンクス溶液）する。続いてドキソルビシンとともに３７℃で５分間のインキュベーションを実施し、その後、１０％ホルマリンで細胞を固定する。その次の段階で、調製済みの試料を蛍光フローサイトメトリで分析する。
【０２０９】
［蛍光フローサイトメトリ法］
励起波長４８８ｎｍ、放出波長５７６ｎｍ、シャッター値１００、細胞２００個／ｓの速度で、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）蛍光フローサイトメータを用いて蛍光を測定した。分析したイベント数は５０００〜１００００であった。蛍光強度に基づいた細胞分布のヒストグラムを、細胞懸濁液全体に対する累積的な平均蛍光指数と、別途アイソタイプ対照の蛍光フィールド（マーカＭ２）およびＰｇｐに対する抗体の特異的結合（マーカＭ１）を用いて、Ｋｏｌｍｏｇｏｒｏｖ−Ｓｍｉｒｎｏｖ法で求めたモノクローナル抗体フィールドの特異的結合におけるマーカＭ１細胞の数にも従って、ＷｉｎＭＤＩプログラムで分析した。
【０２１０】
［被検化合物が細胞の増殖活性および死に対しておよぼす影響についての結果］
研究のメイン段階を開始する前に、本発明者らは、ジャーカット系統ヒトＴ−リンパ芽球性白血病細胞の培養にて、抗体濃度範囲０．１；０．２５；０．５；１．０；２．５；５．０；１０．０；２０．０、４０．０μｌでＰｇｐの細胞外エピトープに対する特異的抗体で細胞を染色して、多剤耐性マーカＰｇｐの発現をキャラクタライズした。使用した濃度で、被検化合物は、抗体濃度範囲０．１；０．２５；０．５；１．０；２．５；５．０；１０．０；２０．０、４０．０μｌでＰｇｐの染色に用いたアイソタイプ抗体の細胞との相互作用に影響しなかった。
【０２１１】
配位化合物ならびに、配位子が過剰な配位化合物との細胞のプレインキュベーションでは、使用した濃度で、Ｐｇｐに対する特異的抗体によって、それぞれ濃度０．１５ｎｍｏｌ／ｍｌおよび０．１５μｍｏｌ／ｍｌで、Ｐｇｐに対する特異的抗体の濃度２．５−５．０−１０．０μｌで、１．４−１．７−２．０倍、第２の実験では濃度０．０１５ｎｍｏｌ／ｍｌおよび０．０１５μｍｏｌ／ｍｌで１．８−１．７−１．９倍だけ、細胞の平均蛍光が顕著に低下した。システアミンは、使用したどの濃度でも細胞の平均蛍光に影響しなかった。
【０２１２】
このように、Ｐｇｐ活性は、個々に用いるか配位子過剰で用いる配位化合物の影響下でのみ抑制された。
【０２１３】
濃度０．０１５および０．１５μｍｏｌ／ｍｌの配位化合物が、３通りの濃度（最大−５×１０^−７Ｍ、また、５分の１および１０分の１）でのモデル製剤およびドキソルビシン蛍光プローブの細胞質と核との間の分布ならびに細胞内蓄積に対しておよぼす作用がゆえに、両方の試験濃度で配位化合物を用いる細胞のプレインキュベーション後にドキソルビシンの細胞内蓄積が顕著に増加した。これをドキソルビシンのさまざまな濃度比でのドキソルビシンの細胞内蛍光の増加として記録した。配位化合物０．１５μｍｏｌ／ｍｌ：ドキソルビシンの比１／１０で１．３倍、配位化合物０．０１５μｍｏｌ／ｍｌ：ドキソルビシンの比１、１／５および１／０でそれぞれ１．４−２．０−２．２倍。
【０２１４】
さらに、ドキソルビシンの核蓄積ならびにそのＤＮＡとの結合の増加が、濃度０．１５μｍｏｌ／ｍｌの配位化合物の影響下でドキソルビシン濃度１および１／５で留意され、その結果はドキソルビシンの細胞内蛍光の相当な（それぞれ１．４倍および１．７倍）減少であった。
【０２１５】
このように、薬理学的標的の微小環境における薬剤濃度の増加は、多剤耐性因子Ｐ−糖タンパク質に対する配位化合物の作用によって達成されるため、この配位化合物を、薬剤の治療有効性を改善し、治療的に最適な用量での使用するための将来性のある手段とみなすことができる。
【０２１６】
＜実施例１１：銅配位化合物が動物の肝細胞で生体異物を解毒する第二相の酵素の活性に対しておよぼす影響＞
【０２１７】
［作業の目的］
配位化合物が動物の肝細胞で生体異物を解毒する第二相の酵素の活性に対しておよぼす影響を研究すること。
【０２１８】
システイン（Ｃ）ならびに、過剰なシステインを有するシステインと銅との配位化合物（Ｃ−Ｃｕ）（実施例５参照）を被検化合物として使用した。
【０２１９】
ＲＡＭＮ Ｒａｐｐｏｌｏｖｏ繁殖センタから入手し、シクロホスファン（ＣＰ）を２０ｍｇ／ｋｇの用量で生理食塩液に加えたものを１０日間にわたって毎日皮下注射して肝毒性を起こした体重１４０〜１６０ｇのオスの任意交配白ネズミで、研究を実施した。
【０２２０】
４つの実験動物群を形成した。
【０２２１】
Ｎｏ．１−被検化合物の溶媒（生理食塩液）を注射した無傷の動物（溶媒対照）；
Ｎｏ．２−ＣＰを与えた後、治療手段として生理食塩液を注射した無傷の動物（対照）；
【０２２２】
［実験群］
Ｎｏ．３−中毒物質ＣＰの投与３０分後に、被検化合物のシステイン（Ｃ）を生理食塩液に加えたものを腹腔内に用量１０ｍｇ／ｋｇで１０日間与えた動物。
Ｎｏ．４−中毒物質ＣＰの投与３０分後に、システイン（Ｃ）をシステインと銅の配位化合物（Ｃ−Ｃｕ：Ｃ、システイン：配位化合物比１０００：１）との組み合わせで生理食塩液に加えたものを腹腔内に用量１０ｍｇ／ｋｇ（配位化合物の量８．３×１０^−８Ｍ／ｋｇ）で１０日間与えた動物。
【０２２３】
肝細胞のサイトゾル画分で生体異物を解毒する第二相の酵素について研究した：グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＥＣ ２．５．１．１８）、グルタチオンペルオキシダーゼ（ＥＣ １．１１．１．９）、グルタチオンレダクターゼ（ＥＣ １．６．４．２）、グルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．１．１．４９）。
【０２２４】
［被検材料］
肝細胞のサイトゾル画分。
【０２２５】
［被検酵素］
グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＥＣ ２．５．１．１８）、グルタチオンペルオキシダーゼ（ＥＣ １．１１．１．９）、グルタチオンレダクターゼ（ＥＣ １．６．４．２）、グルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．１．１．４９）。
【０２２６】
［肝細胞のサイトゾル画分を得るための方法］
研究用の材料を得るために、エーテルで麻酔した実験動物を断頭した。冷却した０．１５Ｍ ＫＣｌ溶液（ｐＨ７．８）を上大静脈に灌流して血液を完全に除去した後に肝臓を抽出した。肝細胞を間質から分離し、テフロン内筒を用いたＤｏｗｎｓタイプのホモジナイザで、組織重量と溶液（０．１５Ｍ ＫＣｌ、ｐＨ７．８）容量との比１：１０で均質化した。ホモジネートを、１２×１０^３ｇおよび温度４℃で２５分間遠心処理した。ミトコンドリア後上清を、Ｔｙｐｅ ５０ ３．Ｔｉロータを用いてＬ８−Ｍ超遠心機（Ｂｅｃｋｍａｎ、ＵＳＡ）にて１０５×１０^３ｇおよび温度４℃で６０分間遠心処理した。サイトゾル画分を用いて、酵素の活性を判断した。
【０２２７】
５，５’−ジ−チオ−ビス（−２−ニトロ安息香）酸（ＤＴＮＢ）を用いて、試料中でタンパク質を沈殿させるのにスルホサリチル酸の溶液を使用するＧ．Ｌ． Ｅｌｌｍａｎの方法（この方法はメタリン酸またはトリクロロ酢酸を使う場合とは対照的に、グルタチオンの還元形態から酸化形態への自然な変換をなくす）で、肝細胞ホモジネートにおける還元グルタチオンの濃度を求めた。
【０２２８】
この方法の原理は、波長４１２ｎｍで吸収が最大になる着色産物である５−チオ−２−ニトロ安息香酸（ＴＮＢ）の酸可溶性チオール基とのＤＴＮＢ（Ｅｌｌｍａｎ作用剤）の反応に基づくものである。
【０２２９】
０．２ｍｌの２０％スルホサリチル酸溶液を０．６ｍｌの肝細胞ホモジネートに加えた。試料を３０００回転／分および温度＋２℃で１０分間遠心処理した。得られた上清０．２ｍｌを、２．５５ｍｌの０．１Ｍ ＴＲＩＳ−ＨＣｌ緩衝液を０．０１％エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ｐＨ８．５と一緒に入れた試験管に移した。２５μｌのＤＴＮＢ溶液（４ｍｇの市販ＤＴＮＢ調製物（Ｂｏｅｈｒｉｎｇ Ｍａｎｎｈｅｉｍ、ドイツ）を１ｍｌの無水メタノールに入れたもの）を、得られた混合物に加えた。発色後、ＤＵ ６５０分光光度計（Ｂｅｃｋｍａｎ、ＵＳＡ）で基準溶液に対して波長４１２ｎｍで光路長１０ｍｍのセルにて試料を測定した。較正曲線を用いて還元グルタチオンの含有量を計算した。この目的のために、市販のＲＧ調製物（Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）を用いて濃度０．０２〜２．０ｍｍｏｌ／ｌのＲＧ溶液を調製し、上述した方法によって還元グルタチオンの含有量を求めるためにそこから試料を得て、得られた消光値から較正曲線を引いた。較正曲線を用いて還元グルタチオンの濃度を計算した。
【０２３０】
［酵素活性の判断］
（グルタチオンペルオキシダーゼ（ＥＣ １．１１．１．９）の活性の判断）
ｔｅｒｔ−ブチルヒドロペルオキシド（ＴＢＨＰ）を基質として用いて、グルタチオンペルオキシダーゼの活性を求めた。
【０２３１】
この方法の原理は、ＴＢＨＰとの細胞サイトゾルのインキュベーション時にグルタチオンペルオキシダーゼによって還元グルタチオンを利用することを含む。Ｇ．Ｌ． Ｅｌｌｍａｎの方法で、５，５’−ジ−チオ−ビス（−２−ニトロ安息香）酸（ＤＲＮＢ）を用いる色反応によって、インキュベーション前後の試料中における還元グルタチオン（ＲＧ）の含有量を求めた。
【０２３２】
酵素反応を実施するために、肝細胞のサイトゾル画分を０．１Ｍカリウム−リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）でさらに４０倍に希釈した。０．２ｍｌの希釈サイトゾルを実験試料および対照試料に入れ、０．７３ｍｌの０．１Ｍ ＴＲＩＳ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．５）を加えた（１ｍｌの緩衝液に０．１ｍｇのＥＤＴＡ、０．７８ｍｇのＮａＮ_３（Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）、１ｍｇのＲＧ（Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）を含有）。試料をサーモスタットにて＋３７℃で１０分間インキュベートした。７０％市販調製物（ＩＣＮ、ＵＳＡ）を蒸留水で５００倍に希釈して調製した７０μｌのＴＢＨＰを導入することで、反応を開始した。ＴＢＨＰ溶液の代わりに７０μｌのＨ_２Ｏを対照試料に加えた。５分間＋３７℃でインキュベーションを実施した後、０．２ｍｌの２０％トリクロロ酢酸溶液を各試験管に加えて反応を停止させた。上述の方法と同様にして、試料を３０００ｇで１０分間遠心処理し、上清を用いて還元グルタチオンの量を求めた。実験試料および対照試料のＲＧの量の差に基づいて、較正曲線を用いて酵素活性を計算し、ｍｍｏｌ／（分・ｇタンパク質）で表した。
【０２３３】
（グルタチオンレダクターゼ（ＥＣ １．６．４．２）の活性の判断）
強度をＮＡＤＰ−Ｈ溶液の吸光が最大になる波長３４０ｎｍで試料の消光時の還元率から評価可能である、グルタチオンの酸化形態を還元形態に還元する触媒ＮＡＤＰ−Ｈ依存性反応に基づく方法で、グルタチオンレダクターゼの活性を求めた。
グルタチオンレダクターゼ
ＮＡＤＰ−Ｈ＋Ｈ^＋＋ＯＧ → → → ＮＡＤＰ^＋＋２ＲＧ
【０２３４】
酵素反応を実施するために、０．１Ｍカリウム−リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を用いて、１：９の比で肝細胞のサイトゾル画分をさらに希釈した。サーモスタット付きのセルで、温度＋３７℃にて反応を実施した。１．８ｍｌの０．１Ｍカリウム−リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．１ｍｌの酸化型グルタチオン２０ｍＭ水溶液（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ、ドイツ）、１００μｌの希釈サイトゾル画分と一緒に、セルに入れた。３〜５分間の温度平衡後、０．１ｍｌのＮＡＤＰ−Ｈ（Ｆ．Ｈｏｆｆｍａｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ、スイス）２ｍＭ溶液を１０ｍＭのＴＲＩＳ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解させたものを加えて反応を開始した。ＤＵ ６５０分光光度計の光路長１０ｍｍのセルにて内容物を５分間撹拌した直後に、被検溶液の光学密度を波長３４０ｎｍで対照試料に対して測定した。サイトゾルに代えて同容量の０．１Ｍカリウム−リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を加えておいた反応混合物の光学密度の測定を対照として利用した。ＮＡＤＰ−Ｈの波長３４０ｎｍでのモル吸光係数ε＝６２００Ｍ^−１・ｃｍ^−１を用いて、グルタチオンレダクターゼ活性を計算した。活性をμｍｏｌ／（分・ｇタンパク質）で表した。
【０２３５】
（グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＥＣ ２．５．１．１８．）の活性の判断）
Ｗ．Ｈ． ＨａｂｉｇおよびＷ．Ｂ． Ｊａｋｏｂｙの方法を用いて、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼの活性を求めた。
【０２３６】
この方法は、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼの存在下、還元グルタチオンが１−クロロ−２，４−ジニトロベンゼンと反応して、波長３４０ｎｍで吸光が最大になる生成物を形成する能力に基づくものである。
【０２３７】
酵素反応を実施するために、０．１Ｍカリウム−リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を用いて、１：９の比で肝細胞のサイトゾル画分をさらに希釈した。サーモスタット付きのセルで、温度＋３７℃にて反応を実施した。１．２ｍｌの還元グルタチオン（Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）２ｍＭ溶液を０．１Ｍカリウム−リン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に入れたものと０．１ｍｌの希釈サイトゾル画分をセルに加えた。温度平衡後、培地に１．２ｍｌの１−クロロ−２，４−ジニトロベンゼン（市販調製物（ＩＣＮ、ＵＳＡ）１０ｍｇを１ｍｌの無水メタノールに溶解させ、得られたアルコール溶液に２３ｍｌの０．１Ｍカリウム−リン酸緩衝液（ｐＨ６．５）を加えた）２ｍＭ溶液を加えて反応を開始した。ＤＵ ６５０分光光度計の光路長１０ｍｍのセルにて内容物を混合し、５分後に、被検溶液の光学密度を波長３４０ｎｍで水に対して測定した。サイトゾルに代えて同容量の０．１Ｍカリウム−リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を加えておいた混合物の光学密度の測定を対照として利用した。形成された生成物の波長３４０ｎｍでのモル吸光係数ε＝９６００Ｍ^−１・ｃｍ^−１を用いて、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ活性を計算した。活性をμｍｏｌ／（分・ｇタンパク質）で表した。
【０２３８】
（グルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．１．１．４９．）の活性の判断）
Ａ．Ｋｏｒｎｂｅｒｇらの方法を用いて、グルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼの活性を求めた。
【０２３９】
この方法は、グルコース−６−ホスフェートの酸化時にグルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼがＮＡＤＰ^＋をＮＡＤＰ−Ｈに還元する能力に基づくものである。形成されるＮＡＤＰ−Ｈの量は、酵素活性に比例する。
【０２４０】
サーモスタット付きのセルで、温度＋３７℃にて酵素反応を実施した。３．０ｍｌの５０ｍＭ ＴＲＩＳ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．６）を、５ｍＭのＥＤＴＡ、０．１ｍｌのＮＡＤＰ（Ｍｅｒｃｋ、ドイツ）１０ｍＭ溶液、５０μｌの肝臓サイトゾル画分と一緒に、セルに入れた。温度平衡後、０．１ｍｌのグルコース−６−ホスフェートナトリウム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ、ドイツ）５ｍＭ溶液を試験培地に加えて反応を開始した。ＤＵ ６５０分光光度計の光路長１０ｍｍのセルで５分間経過後に、基質のない対照に対して波長３４０ｎｍの測光法で試料を測定した。形成されたＮＡＤＰ−Ｈの波長３４０ｎｍでのモル吸光係数ε＝６２００Ｍ^−１・ｃｍ^−１を用いて活性を計算した。活性をμｍｏｌ／（分・ｇタンパク質）で表した。
【０２４１】
（タンパク質濃度の判断）
Ｇ．Ｌ．Ｐｅｔｅｒｓｏｎの改変で、Ｌｏｗｒｙ法でタンパク質含有量を求めた。
【０２４２】
この方法の原理は、アルカリ培地でペプチド結合と反応する銅酒石酸塩−炭酸塩を用いる反応と、芳香族アミノ酸と反応するＦｏｌｉｎ−Ｃｉｏｃａｌｔｅｕ試薬を用いる反応という、タンパク質の判断に特有の２つの連続した反応を実施することを含む。これによって、波長７５０ｎｍで最大吸光となる着色錯体が形成され、色の強度は試料のタンパク質含有量に比例する。
【０２４３】
１０μｌの肝臓サイトゾル画分と０．１ｍｌのデオキシコール酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）０．１５％溶液とを、０．９９ｍｌの蒸留水に順次加えた。試料を室温にて１０分間インキュベートした後、試料中のタンパク質を０．１ｍｌの７２％トリクロロ酢酸溶液で沈殿させた。次に、試料を３０００回転／分で１５分間遠心処理した。上清を除去し、１ｍｌの水と、同容量の１０％ドデシル硫酸ナトリウム溶液、０．８Ｍ ＮａＯＨ溶液、蒸留水、銅酒石酸塩−炭素塩の溶液（０．１％硫酸銅、０．２％酒石酸カリウム−ナトリウム、１０％炭酸ナトリウム）から調製した試薬１ｍｌとを堆積物に加えた。堆積物に試薬を加えると、堆積物が溶解された。得られた溶液を温度＋３０℃で１０分間インキュベートした。次に、０．５ｍｌの０．３３Ｍ Ｆｏｌｉｎ−Ｃｉｏｃａｌｔｅｕ試薬（Ｓｅｒｖａ、ドイツ）を溶液に加え、振盪後、試料を暗所にて３０分間放置した。次に、ＤＵ ６５０分光光度計で、蒸留水に対して波長７５０ｎｍで、光路長１０ｍｍのセルにて試料を測光法で測定した。タンパク質の含有量を求めるために、較正曲線を作成し、その目的でウシ血清アルブミンの水溶液を濃度０．１〜１０．０ｇ／ｌで調製し、そこから上述した方法でタンパク質含有量を求めるための試料を取得して、特定の濃度に対応する消光値を得た。サイトゾル画分におけるタンパク質の含有量を、較正曲線を用いて計算し、ｇ／ｌ単位で表した。
【０２４４】
［結果の統計処理］
得られた結果を、パーソナルコンピュータでＳＴＡＴＩＳＴＩＣＡ ６．０ソフトウェアスイートを用いて統計的に処理した。各群で平均値および平均誤差を計算した。対応する対照群との差異の信頼性をｔ検定で評価した。本文ならびに表に示す値は、Ｘ_ａｖ±ｍ_ｘの形で表してある。
【０２４５】
［研究の結果］
有毒物質の作用に対する許容度を提供する分子反応の複雑さについて研究した結果は、システイン（Ｃ）およびその配位化合物（Ｃ−Ｃｕ）が生体異物を解毒する第二相の酵素の活性を誘導する能力−グルタチオンレダクターゼ（ＥＣ １．６．４．２）、グルタチオンペルオキシダーゼ（ＥＣ １．１１．１．９）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＥＣ ２．５．１．１８）ならびに、これに関連した還元グルタチオンの代謝を実証するものである（表４）。
【０２４６】
【表５】

【０２４７】
微量の配位化合物によって、システインが生体異物を解毒する第二相の酵素の活性を誘導する能力が高められ、これに関連した重要な代謝物である還元グルタチオンの代謝強度が高くなった。
【０２４８】
このため、脂肪族チオールとのｄ−金属の二核配位化合物を、他の原因治療、病原治療、対照治療手段と一緒に併用すると、関連する薬剤調製物の副作用を回避できるようになり、治療が生理学的に一層適切なものになる。
【０２４９】
＜実施例番号１２：銅とアセチルシステインの配位化合物がアセチルシステインのリチウム塩の血液刺激活性（ｈｅｍｏｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ）に対しておよぼす影響＞
アセチルシステインのリチウム塩（ａＣ−Ｌｉ）および銅の配位化合物（実施例番号６を参照）を含有する製剤について研究した。
【０２５０】
［研究を実施するための被検化合物溶液の調製］
結晶物質を４℃で保管した。物質を実験開始の直前に生理食塩液に溶解させた。滅菌層流キャビネットにて０．２２μｍのＭｉｌｌｅｘ−ＧＳ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）フィルタに通すことで、溶液を滅菌した。
【０２５１】
［研究モデル］
シクロホスファンを１００ｍｇ／ｋｇの用量で生理食塩液に加えたものを単回皮下注射した体重１４０〜１６０ｇのオスの任意交配白ネズミで、研究を実施した。
【０２５２】
４つの実験動物群を形成した。
【０２５３】
Ｎｏ．１−被検化合物の溶媒（生理食塩液）を注射した無傷の動物（溶媒対照）；
Ｎｏ．２−ＣＰを与えた後、治療手段として生理食塩液を注射した無傷の動物（対照）；
（実験群）
Ｎｏ．３−シクロホスファンを注射した後、Ｃｕ−ａＣ−Ｌｉ：ａＣ−Ｌｉを生理食塩液に入れたものを用量１０ｍｇ／ｋｇで治療手段として投与した動物（配位化合物の量７．８×１０^−８Ｍ／ｋｇ）；
Ｎｏ．４−シクロホスファンを注射し、ａＣ−Ｌｉを生理食塩液に入れたものを用量１０ｍｇ／ｋｇで治療手段として投与した動物；
Ｎｏ．５−シクロホスファンを注射し、炭酸リチウムを生理食塩液に入れたものを用量３ｍｇ／ｋｇで治療手段として投与した動物（炭酸リチウムの量については、システインのリチウム塩１０ｍｇ中におけるリチウムイオン（０．５５）の重量比をもとに計算し、３ｍｇの炭酸リチウムに同じ量のリチウムが含まれる）；
Ｎｏ．６−シクロホスファンを注射し、アセチルシステインを生理食塩液に入れたものを用量９．５ｍｇ／ｋｇで治療手段として投与した動物（アセチルシステインの量については、アセチルシステイン１０ｍｇ中におけるアセチルシステイン（約０．９５）の重量比をもとに計算したもので、これはアセチルシステインの水素化形態９．５ｍｇに相当する）。
【０２５４】
シクロホスファンの投与後３日目に、被検製剤を投与した。
【０２５５】
［被検材料］
ＣＰを投与した３日後、７日後、１４日後に、尾静脈から、血液学的調査用の血液を採取した。それぞれのシリーズの終了時（３日目、７日目、１４日目）、実験動物を過剰量のエーテルで安楽死させ、尾静脈および大腿骨の骨髄から血液を得た。
【０２５６】
［分析した特徴］
この研究では、血液抑制した（ｈｅｍｏｄｅｐｒｅｓｓｅｄ）動物に対する被検化合物の投与７日目に血液の細胞充実性（赤血球、血小板、白血球、リンパ球、好中球、ＥＳＲ）および骨髄を評価した。
【０２５７】
［研究の結果］
血液の細胞充実性について実施した研究の結果を表１〜３にあげておく。
【０２５８】
用量１００ｇ／ｋｇで、シクロホスファンは、絶対的リンパ球減少症および相対的リンパ球減少症を伴う血液の形成された全要素に関してかなり明らかな血球減少症を引き起こし、１４日目に最大限に出現した（１〜３）。
【０２５９】
配位化合物Ｃｉ−ａＣ−Ｌｉ：ａＣ−Ｌｉは、顕著な血液刺激作用を呈し、これは血液の細胞充実性が事実上完全に回復する形で顕在化された。アセチルシステインのリチウム塩過剰で導入されたアセチルシステインのリチウム塩と銅との配位化合物とは対照的に、アセチルシステイン、アセチルシステインのリチウム塩、炭酸リチウムの作用が、好ましい傾向の形で顕在化し、これは全体として血液刺激作用として評価可能である（表５〜７）。
【０２６０】
【表６】

【０２６１】
【表７】

【０２６２】
【表８】

【０２６３】
このように、ｄ−金属と脂肪族チオールとの二核配位化合物と、血液刺激手段とを併用することによって、生理学的に一層適切な用量で後者の治療効果を確保することが可能になる。
【０２６４】
＜実施例番号１３：パラジウムとアセチルシステインの配位化合物がアセチルシステインを有するチオクト酸製剤の血糖降下作用（ｈｙｐｏｇｌｙｃｅｍｉｚｉｎｇ ａｃｔｉｏｎ）に対しておよぼす影響（実施例番号７を参照）＞
【０２６５】
アセチルシステイン−チオクト酸組成物（実施例番号７を参照）を被検製剤として使用した。
【０２６６】
［研究実施のための被検化合物溶液の調製］
白色結晶物質を４℃で保管した。物質を実験開始の直前に生理食塩液に溶解させた。滅菌層流キャビネットにて０．２２μｍのＭｉｌｌｅｘ−ＧＳ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）フィルタに通すことで、溶液を滅菌した。血糖降下作用を判断するために、生理食塩液、用量１００ｍｇ／ｋｇおよび２００ｍｇ／ｋｇのチオクト酸、用量１０および２０ｍｇ／ｋｇで配位子過剰な配位化合物と併用したチオクト酸（チオクト酸と過剰な配位子が等モル比）で、飢餓状態のマウスに被検物質を静脈内投与した。
【０２６７】
［研究の実施］
公式に推奨された試験［１３，１４］を用いて、製剤の糖低減活性を評価した。
−低血糖試験（無傷の動物における血糖含有量の低減）；
−グルコース負荷試験（飢餓状態のときにグルコースを投与することで引き起こされる高血糖症の動物における糖含有量の低減）；
−アロキサン糖尿病モデル（実験の慢性インスリン不足の状態における糖含有量の低減）。
【０２６８】
尾静脈穿刺の１時間後に血液を取得し、オルト−トルイジン法で血清グルコースレベルを求めた。
【０２６９】
体重１７〜１８ｇの白マウスで、被検物質が血中グルコースレベルに対しておよぼす影響について研究するための実験を実施した。実験の前夜から動物を断食させた。朝に、飢餓状態のマウスに１０％グルコース溶液を１ｇ／ｋｇ（０．１ｍｌ／体重１０ｇ）の速度で皮下注射した［４］。グルコース注射の直後、実験動物に基準製剤（用量０．３単位／ｋｇのインスリン）を皮下注射した。被検物質を筋肉内注射した。５．５、１１、１００および２００ｍｇ／ｋｇのチオクト酸（最初の２種類の用量は配位化合物との複合材料におけるチオクト酸の含有量に対応）；チオクト酸と配位子過剰な配位化合物−チオクト酸＋ＣＣ−１０および２０ｍｇ／ｋｇとの組み合わせ。１時間の間隔で４時間にわたって血中グルコースレベルを求めた。
【０２７０】
別のシリーズの実験ではアロキサン糖尿病モデルを使用した。アロキサン水和物（Ｃｈｅｍａｐｏｌ、チェコ共和国）を用量１００ｍｇ／ｋｇで体重１８０〜２００ｇのラット（２４時間絶食させた）に１回皮下注射して、アロキサン糖尿病を誘導した。以下の群の動物を研究した。無傷のラット、糖尿病のある未処置のラット、糖尿病があり、１か月間にわたって用量１００ｍｇ／ｋｇでチオクト酸を毎日与えた動物、チオクト酸を配位化合物との組み合わせで用量１０ｍｇ／ｋｇで１日１回胃内に与えた動物。血中グルコースレベルが対照と比較してほぼ２倍になった７日後に、製剤の投与を開始した。各群にはオスとメスで２０匹の動物を含めた。動物の全身症状、食餌および水の要求量、体重、血清グルコースレベル、総脂質、トリグリセリド、リポタンパク質、コレステロールを実験の過程で記録した。
【０２７１】
［研究の結果］
グルコース負荷後に被検化合物が動物の血中グルコースレベルに対しておよぼす影響を表８に示す。
【０２７２】
【表９】

【０２７３】
研究の結果には、用量１００および２００ｍｇ／ｋｇでのチオクト酸および用量５．５および１１ｍｇ／ｋｇでの複合材料の一部としてのチオクト酸が血糖レベルに対しておよぼす影響の比較が示される。配位化合物を使用しないと、チオクト酸は用量５．５および１１ｍｇ／ｋｇで血糖降下効果を呈さなかった。
【０２７４】
ラットに外挿し、有効一用量はチオクト酸と配位化合物の複合材料で２０ｍｇ／ｋｇ、チオクト酸の単独投与で２００ｍｇ／ｋｇであると仮定できよう。よって、ラットにおける実験での糖尿病の治療には、これらの用量を選択した。その結果を表９にあげておく。
【０２７５】
【表１０】

【０２７６】
【表１１】

【０２７７】
得られた結果は、チオクト酸と配位化合物の複合材料が中程度の重篤度の糖尿病において良好な治療効果を発揮し、製剤の効果は複合材料中でのその量と比較して２０倍の用量で独立に投与したチオクト酸の効果に匹敵することを実証するものである。チオクト酸複合材料を与えたすべての動物で、血中グルコースレベルの減少と脂質代謝指数の正常化が観察された。これらの動物は正常に太り、水の消費量も対照群と差がなかった。
【０２７８】
このように、チオクト酸と配位化合物との複合材料は妥当な抗糖尿病活性を有し、炭水化物および脂質代謝指数を正常化する。これは、実験動物の血中コレステロールレベルの統計的に信頼できる低減という形で顕在化する。
【０２７９】
アセチルシステイン過剰なパラジウムとアセチルシステインとの配位化合物（実施例番号７）に、チオクト酸を組み合わせて使用すると、パラジウムとアセチルシステインとの配位化合物を微量で用いた場合に、有意な血糖降下効果のない用量で用いるチオクト酸の血糖降下効果を発揮しやすくなった。
【０２８０】
このように、ｄ−金属と脂肪族チオールの二核配位化合物と、血糖降下手段とを併用すると、生理学的に適切な用量で後者の治療効果を保証することが可能になる。
【０２８１】
＜実施例番号１４：パラジウムとアセチルシステインとの配位化合物がアデノシンの心保護活性に対しておよぼす影響＞
アセチルシステインおよびアデノシン過剰（アセチルシステイン−アデノシン（等モル比）（実施例番号８を参照）のパラジウムの配位化合物の組成物を被検製剤として使用した。
【０２８２】
アデノシンは、心筋虚血において顕著な心保護効果を発揮する化合物のひとつであり、これはさまざまな実験モデルで示されている。体内の自然な代謝物であるアデノシンは、内在性プリンヌクレオシドである。アデノシンは、特に心臓および冠血管において多くの生理学的プロセスを調節するが、いくつかのタイプの不整脈を治療するための治療用製剤として用いられる［１］。いくつかある理由の中でも特に、効果の不安定さと物質の作用に対する寛容形成が速いがゆえに、心筋虚血のある心臓疾患の治療におけるアデノシンを広く用いることができずにいる［１５］。心筋虚血では、アデノシンの投与によって、アデノシンの心保護効果に関するタキフィラキシーの発生すなわち治療効果の迅速かつ進行性の減少が誘発される［１６］。しかしながら、アデノシンの心保護効果が存在する場合は虚血に対する耐性が数週間維持された。アデノシンの制御可能で安定した長期間にわたる効果を達成するための試みは今までのところ成功に輝いておらず、それがゆえに、アデノシンは慢性虚血における心筋障害の予防および治療のための手段としての広い用途が制限され、適切な薬理学的解決策を待つプロスペクティブな薬剤の群に残ったままになっている［１７，１８］。
【０２８３】
［研究実施のための被検化合物溶液の調製］
白色結晶物質を４℃で保管した。物質を実験開始の直前に生理食塩液に溶解させた。滅菌層流キャビネットにて０．２２μｍのＭｉｌｌｅｘ−ＧＳ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）フィルタに通すことで、溶液を滅菌した。心保護効果を研究するために、実験の過程で確立した心保護効果を誘発しない用量の生理食塩液：アデノシン；配位子過剰な配位化合物と組み合わせたアデノシン（等モル比：アデノシン過剰な配位子）に被検物質を入れてラットに投与し、アデノシンの量は実験の過程で経験的に得られた値に相当した。
【０２８４】
［麻酔した動物における心筋の局所虚血−再灌流をｉｎ ｖｉｖｏにてモデリング］
体重２００〜３００ｇのオスのＷｉｓｔａｒラット（ＲＡＭＮ Ｒａｐｐｏｌｏｖｏ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ Ｃｅｎｔｒｅ， Ｓｔ． Ｐｅｔｅｒｓｂｕｒｇ）および体重２５〜３０ｇのオスのＣ５７Ｂマウス（Ｂ＆Ｋ， Ｓｏｌｌｅｎｔｕｎａ、スウェーデン）で実験を実施した。動物を１２／１２時間の光照射レジメに維持し、標準的な食餌と飲料水を自由に与えた。すべての実験を「Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｎ ｔｈｅ ｃａｒｅ ａｎｄ ｕｓｅ ｏｆ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ａｎｉｍａｌｓ」（ＵＳＡ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ． ８５−２３）および「Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｎ ｔｈｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ （ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ） ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｎｅｗ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ」に基づいて実施した。
【０２８５】
ペントバルビタールナトリウム（Ｎｅｍｂｕｔａｌ）を７ｍｇ／１００ｇの一用量で腹腔内投与して、ラットの初期麻酔を実施した。気管切開術による肺ＡＶＬ）の人工呼吸で実験を実施した（呼吸速度−６０／分、呼吸容量−３ｍｌ／体重１００ｇ）。Ｖｉｔａ−１ユニット（ＰＯ Ｋｒａｓｎｏｇｖａｒｄｅｙｅｔｓ， Ｓｔ．Ｐｅｔｅｒｓｂｕｒｇ）を用いて室内空気でＡＶＬを実施した。実験小動物用の呼吸弁を使用し、装置の死腔量を減らすと同時に、装置のフローシステムでの二酸化炭素の蓄積を制限できるようにする。小型の圧力センサ（Ｂａｘｔｅｒ、ＵＳＡ）を用いて、左総頸動脈に挿入したヘパリン化カテーテル経由で実験時に動脈圧（ＡＰ）を測定した。首に正中の皮膚切開を作った後、組織を鉗子で鈍的に分けて、気管および頸動脈にアクセスできるようにした。実験の過程で、直径２ｍｍ、長さ２５ｍｍの皮下針電極を用いて、標準的なリードで心電図（ＥＣＧ）を記録した（Ｋａｒｄｉｏｔｅｋｈｎｉｋａ−ＥＫＧ−８， ＺＡＯ Ｉｎｋａｒｔ， Ｓｔ．Ｐｅｔｅｒｓｂｕｒｇ）。実験開始時に、麻酔を維持して被検製剤を投与する目的、実験終了時にはエバンスブルーを投与する目的で、左大腿静脈にＮｅｍｂｕｔａｌの静脈点滴用のカテーテルを通した。
【０２８６】
過去に説明された方法［１９］を用いて、心筋の虚血−再灌流をモデル化した。左第四肋間を開胸して心臓にアクセスした。最初にＬ字形の皮膚切開を作り、続いて電気凝固装置で大胸筋および小胸筋を層ごとにわけた後、肋間筋を分離して胸膜を露出させた。次に、鈍的な方法で心嚢を開いて、左の左心房の心耳の内側縁を使用し、ＬＣＡ共通幹の場所を案内するために右肺動脈の錐体部を判断し、そのためのポリプロピレン結紮糸を無傷針（６−０、Ｃａｒｄｉｏｐｏｉｎｔ， ＣＶ−３０１）の助けを借りて配置した。創傷から心臓を取り出すことは避けた。心臓に機械的外傷を引き起こすことは別にして、このような操作が必然的に重篤な血行動態の乱れにつながるためである。
【０２８７】
心筋に可逆性の虚血を作り出すために、閉塞部を形成し、冠動脈を囲んでいる結紮糸の両端を、直径１ｍｍ、長さ５〜６ｃｍのポリエチレン管（ＰＥ ４０）の内側に導いた後、管を心臓の方に向かって動かして左冠動脈（ＬＣＡ）の閉塞を、逆方向に動かして再灌流を達成した。閉塞を３０分間維持する目的で、管にクランプを適用した。実験時にはサーモスタットを付けた手術台に動物を載せておいた。この間、動物の体温を３７．５±０．５℃の範囲に維持した。
【０２８８】
動脈圧（ＡＰ）の一時的な低下、また、局所的チアノーゼの発生、ＥＣＧ上の虚血の変化（ＳＴセグメントの上昇）ならびに、ときには左心室（ＬＶ）壁の収縮期における突出が存在することで心筋虚血の発症を確認した。
【０２８９】
３０分間のＬＣＡ閉塞に続いて９０分間の再灌流を用いて、心筋に不可逆的な虚血−再灌流損傷を作り出した。これは、心保護効果を評価するための試験である。
【０２９０】
［実験による心筋梗塞のサイズを判断するための方法］
虚血を起こした心臓領域の範囲内で不可逆的に損傷された（壊死した）心筋組織と生存能を保った組織とを区別できるようにする、一般に許容された差動指示器による方法を使用し、ｉｎ ｖｉｖｏにて局所的虚血のある実験でのＭＩのサイズを求めた。この方法での物質は以下のとおりである。実験の生理学的部分を終えた後に染色する第１段階では、結紮糸を再び冠動脈の周囲に締め付け、０．５ｍｌの５％エバンスブルー溶液（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ、ＵＳＡ）をボーラス静注射した。右冠動脈によって血液が供給されて血管が新生される心臓の部分に入ると、染料がこれを濃い青に染めたのに対し、閉塞ＬＣＡの部分は染色されずに残った。血液供給部分と虚血部分との境界を可視化した後、心臓をすみやかに切断し、生理食塩液で十分に洗浄し、主要血管と心房を取り除いた後に、同じ厚さ（２ｍｍ）の５つの断片（切片）に横切開した。心臓切片の基底面を、顕微鏡写真装置（ＭＰＤ）によって、Ｏｌｙｍｐｕｓ ２０２０デジタルカメラに実体顕微鏡（ＭＢＳ−１０、ＬＯＭＯ， Ｓｔ． Ｐｅｔｅｒｓｂｕｒｇ）を組み合わせたもので撮影した。光のスポットが形成されないようにするために、切片の基底面を液体が覆うような形で、写真用に生理食塩液を満たした背の低い瓶に切片を入れた。
【０２９１】
特別に開発されたソフトウェア（「医学分野での顕微鏡分析の自動化（ＬｉｔｔｌｅＭｅｄ）」、コンピュータプログラムの正式登録証明書Ｎｏ．２００３６１１５９９）を用いて画像のコンピュータ処理を実施した。５つの切片各々についてコンピュータで求めた値の算術平均を計算することで、特定の心臓に対する解剖学的リスク領域の相対サイズを得た。各切片について、エバンス陰性セクターの面積を切片の総面積で割って１００を掛けることで、リスク領域のサイズをパーセンテージで表した。リスク領域の相対体積が心臓の全体積の１５％未満の実験については、シリーズから除外した。
【０２９２】
染色の第２段階では、心筋の切片を１，２，３−トリフェニルテトラゾリウムクロリド（ＴＴＣ， ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ、ＵＳＡ）の１％溶液に入れた。これは、ＮＡＤ依存性酵素の活性を呈する生存組織を明るい赤（煉瓦色）に染色するものである。切片を温度３７℃およびｐＨ７．４で１５分間インキュベートした。切片をＴＴＣとともに解剖学的リスク領域の境界内でインキュベーションを実施した後、煉瓦色に染まったセクターと心筋の自然色のセクターを求めた。切片の基底面を再度撮影し、得られた画像を上述した方法で処理し、梗塞巣の相対サイズをリスク領域のサイズ対梗塞域のサイズの比として（パーセントで）計算した。多くの場合、切片をＴＴＣで染色した後に梗塞域と生存能を保った組織との境界を一層明確にするために、１０％中性ホルマリン溶液中で切片をさらにインキュベーションを実施してから撮影を実施した。
【０２９３】
［データのコンピュータ処理および統計分析方法］
ＳＰＳＳソフトウェアパッケージ（ＡＮＯＶＡ、シェッフェ法）を用いて、解剖学的リスク領域および梗塞域のサイズに関する差異の統計的な信頼性を評価した。結果を「平均±標準偏差」の形で示した。Ｐ値０．０５未満で信頼できるとみなした。
【０２９４】
［被検製剤を用いて壊死から心筋を保護する有効性を求めた結果］
パラジウムと脂肪族チオール−アセチルシステインとの配位化合物（配位化合物−アセチルシステイン比１：１０００）を含有するアセチルシステイン（ａＣ）−アデノシン（等モル比）組成物を用いて、壊死に対して心筋を薬理学的に保護した。
【０２９５】
被検組成物の最小有効濃度を求めるために、短時間の虚血とその後の再灌流という対応するレジメで、心保護効果が発揮されないか、あるいはこれが不十分な度合いで顕在化したアデノシン濃度（壊死に対する心筋保護の最小レベルに相当）を求められるようにして実験を設定した。パラジウムの配位化合物を含有するアセチルシステインの心保護効果を、別のシリーズの実験で求めた。動物に投与したアセチルシステインの濃度は、心保護効果が発揮されないアデノシンの濃度と等モルであった。以後の実験では、パラジウムの配位化合物を含むアセチルシステイン（ａＣ）−アデノシン（等モル比）組成物を、これを形成する物質が心保護効果を発揮しない濃度ならびにそれが顕在化する濃度で使用した。
【０２９６】
心保護効果が発揮されない、すなわち虚血とその後の再灌流を実施したときに壊死から心筋を保護しないアデノシンの用量を求めるために、以下の群を用いた。
１．対照（ｎ＝１２）。この群では、ＬＣＡを３０分間閉塞した後、９０分間再灌流し、他の介入は行わなかった。冠動脈閉塞の３０分前に、生理食塩液（塩化ナトリウムを蒸留水に入れた０．９％溶液）を２ｍｌの容量で速度０．５ｍｌ／分にて静脈内注射した。
２．群番号１（ｎ＝１０）。心筋梗塞のモデリングに先行して用量０．１μｍｏｌ／ｋｇでのアデノシンの静脈点滴をした（群１〜９では、点滴容量平均２ｍｌ、点滴速度を０．５ｍｌ／分とし、冠動脈閉塞の３０分前に投与を実施した）。
３．群２（ｎ＝１４）。心筋梗塞のモデリングに先行して用量０．２５μｍｏｌ／ｋｇでのアデノシンの静脈点滴をした。
４．群３（ｎ＝９）。心筋梗塞のモデリングに先行して用量０．５μｍｏｌ／ｋｇでのアデノシンの静脈点滴をした。
５．群４（ｎ＝８）。心筋梗塞のモデリングに先行して用量１．０μｍｏｌ／ｋｇでアデノシンの静脈点滴をした。
６．群５（ｎ＝８）。心筋梗塞のモデリングに先行して用量２．５μｍｏｌ／ｋｇでアデノシンの静脈点滴をした。
７．群６（ｎ＝１０）。心筋梗塞のモデリングに先行して用量５．０μｍｏｌ／ｋｇでアデノシンの静脈点滴をした。
８．群７（ｎ＝１１）。心筋梗塞のモデリングに先行して用量１０．０μｍｏｌ／ｋｇでアデノシンの静脈点滴をした。
９．群８（ｎ＝１１）。心筋梗塞のモデリングに先行して用量２５．０μｍｏｌ／ｋｇでアデノシンの静脈点滴をした。
１０．群９（ｎ＝１０）。心筋梗塞のモデリングに先行して用量５０．０μｍｏｌ／ｋｇでアデノシンの静脈点滴をした。
【０２９７】
群番号１（対照）における梗塞域のサイズは、解剖学的リスク領域のサイズの６３．８±３．３２％であった。対照すなわち、群番号順に６４．７±３．４７％、６３．１±４．３１％、６２．７±４．１１％、６５．１±４．８４％、６０．９±５．１０％と比較して群番号１〜５の梗塞域のサイズに差異は認められなかったが、群６〜９では、梗塞域のサイズが対照と比較して約１．５〜２．５分の１に小さくなり、それぞれ３５．９±３．５９％、３２．７±３．２１％、２８．２±３．４３％、２６．５±２．８７％であった。こうして、実施した実験の過程で虚血に対する心筋保護につながらなかったアデノシンの用量ならびに壊死のゾーンが１．５〜２．５分の１に低減された用量を特定した。アデノシン濃度の上昇に伴って効果が高まったことから、製剤の心保護効果が存在することがわかる。全体としての心保護効果は、個々の細胞に対するアデノシンの受容体依存性作用で構成される。各細胞における特定強度および期間の細胞シグナルを開始できる適切な数の受容体が存在することで、アデノシンが複雑な細胞保護反応を開始する能力が決まる。投与したアデノシンの濃度が倍増する際にアデノシンの心保護効果が比較的小さな増加を示す、得られた結果から、アデノシン受容体が細胞の大部分をその配位子と反応させることはできない旨が示される場合がある。配位化合物が細胞受容体を表面上は配位子と反応できるコンホメーションに変換する能力を考慮して、アデノシンと配位化合物との併用投与によってアデノシンの心保護効果が高まる可能性を予測しなければならない。実験を実施するにあたって、好ましくない状況で同じく細胞保護効果を持つ内在性アデノシンの存在を考慮した。この場合も、その心保護効果の可能性は、細胞に存在して相互作用する受容体の数によって制限される。これに関連して、心保護効果を欠いている配位化合物の濃度を求めた。
【０２９８】
アセチルシステイン過剰なパラジウムの配位化合物（配位化合物対アセチルシステイン比１：１０００）が心保護効果を発揮する能力を、一連の実験で判断した。この実験でのアセチルシステインの濃度は、後者が心保護効果を欠いたアデノシンの濃度に対応していた。
【０２９９】
この研究では、以下の群を使用した。
１．対照（ｎ＝１４）。この群では、ＬＣＡを３０分間閉塞した後、９０分間再灌流し、他の介入は行わなかった。冠動脈閉塞の３０分前に、生理食塩液（塩化ナトリウムを蒸留水に入れた０．９％溶液）を２ｍｌの容量で速度０．５ｍｌ／分にて静脈内注射した。
２．群番号１（ｎ＝９）。心筋梗塞のモデリングに先行して、パラジウムとアセチルシステインとの配位化合物を配位化合物：アセチルシステイン比１：１０００で含有するアセチルシステインを静脈点滴した（本明細書では、以下、作用剤）。作用剤を０．１μｍｏｌ／ｋｇの量で投与した（群１〜５では、点滴容量平均２ｍｌ、点滴速度を０．５ｍｌ／分とし、冠動脈閉塞の３０分前に投与を実施した）。
３．群２（ｎ＝１０）。心筋梗塞のモデリングに先行して、０．２５μｍｏｌ／ｋｇの量で投与する作用剤を静脈点滴した。
４．群３（ｎ＝９）。心筋梗塞のモデリングに先行して、０．５μｍｏｌ／ｋｇの量で投与する作用剤を静脈点滴した。
５．群４（ｎ＝１１）。心筋梗塞のモデリングに先行して、１．０μｍｏｌ／ｋｇの量で投与する作用剤を静脈点滴した。
６．群５（ｎ＝７）。心筋梗塞のモデリングに先行して、２．５μｍｏｌ／ｋｇの量で投与する作用剤を静脈点滴した。
７．群６（ｎ＝１０）。心筋梗塞のモデリングに先行して、５．０μｍｏｌ／ｋｇの量で投与する作用剤を静脈点滴した。
【０３００】
対照における梗塞域のサイズは、解剖学的リスク領域のサイズの７１．８±６．１７％であった。群番号１〜４では、対照と比較して梗塞域のサイズにはどのような差異も認められなかった−７４．２±６．９４％、７４．２±６．６１％、７２．６±７．０１％、７０．１±６．３４％。群番号５および６では、対照と比較して梗塞域が約２．０分の１に小さくなるという形で、投与した作用剤の心保護効果が顕在化した−群番号順にそれぞれ４１．７±３．１２％および３４．４±４．６５％。
【０３０１】
このように、心保護効果が発揮されて梗塞域が２分の１に小さくなる作用剤の量ならびに、逆に心筋を虚血から保護しない作用剤の量を、実施した実験の過程で求めた。
【０３０２】
アデノシンおよびアセチルシステインを等モル比で含み、パラジウムとアセチルシステインとの配位化合物（配位化合物とアセチルシステインとの比を１：１０００とした）を含む製剤が、心保護効果を発揮する能力を、以後の一連の実験で評価した。前の実験での結果によれば、アデノシンおよびアセチルシステイン＋パラジウムとアセチルシステインとの配位化合物（配位化合物とアセチルシステインとの比を１：１０００とした）を含有する製剤で研究を構成し、心保護効果が顕在化しない量で投与した−アデノシンおよびアセチルシステイン＋パラジウムとアセチルシステインの配位化合物（配位化合物とアセチルシステインとの比を１：１０００とした）の投与量が各々０．５μｍｏｌ／ｋｇであった製剤番号１と、アデノシンおよびアセチルシステイン＋パラジウムとアセチルシステインとの配位化合物（配位化合物とアセチルシステインとの比を１：１０００とした）の投与量が各々１．０μｍｏｌ／ｋｇであった製剤番号２。アデノシンおよびアセチルシステイン＋パラジウムとアセチルシステインとの配位化合物（配位化合物とアセチルシステインとの比を１：１０００とした）の投与量が各々２．５μｍｏｌ／ｋｇであった製剤番号３。アデノシンおよびアセチルシステイン＋パラジウムとアセチルシステインとの配位化合物（配位化合物とアセチルシステインとの比を１：１０００とした）の投与量が各々５．０μｍｏｌ／ｋｇであった製剤番号４。
【０３０３】
１．対照（ｎ＝１４）。この群では、ＬＣＡを３０分間閉塞した後、９０分間再灌流し、他の介入は行わなかった。冠動脈閉塞の３０分前に、生理食塩液（塩化ナトリウムを蒸留水に入れた０．９％溶液）を２ｍｌの容量で速度０．５ｍｌ／分にて静脈内注射した。
２．群１（ｎ＝１４）。心筋梗塞のモデリングに先行して製剤番号１の静脈点滴をした（群１〜４では、点滴容量平均２ｍｌ、点滴速度を０．５ｍｌ／分とし、冠動脈閉塞の３０分前に投与を実施した）。
３．群２（ｎ＝１１）。心筋梗塞のモデリングに先行して、製剤番号２を静脈点滴した。
４．群３（ｎ＝１５）。心筋梗塞のモデリングに先行して、製剤番号３を静脈点滴した。
５．群４（ｎ＝１２）。心筋梗塞のモデリングに先行して、製剤番号４を静脈点滴した。
【０３０４】
対照における梗塞域のサイズは、解剖学的リスク領域のサイズの７９．３±６．２２％であった。群番号１では、対照と比較して梗塞域のサイズに信頼できる差異は認められなかった−７５．６±６．８５％。群番号２、３、４では、対照と比較して梗塞域のサイズがそれぞれ４６．３±４．７１％、２９．７６±２．９７％、１１．８±３．１２％であった（Ｐ＜０．０５）。製剤番号２の一部としてパラジウムとアセチルシステインとの配位化合物を併用投与すると、アデノシンの心保護効果を顕在化でき、これは事実上、対照と比較して虚血時に梗塞域が２分の１に小さくなることにつながった。アデノシンおよびパラジウムとアセチルシステインとの配位化合物の投与量を増やすと、心保護効果を発現させやすくなった。製剤番号３では、対照と比較して梗塞域が２．５分の１に小さくなった。製剤番号４では、最も顕著な心保護効果が得られ、対照と比較して梗塞域が６．５分の１に小さくなった。製剤番号４は、単独で使用するとそれほど大きな心保護効果が得られない量のアデノシンおよびパラジウムとアセチルシステインとの配位化合物を含んでいた。個々の心筋細胞それぞれでの虚血に対する耐性の発生機序は同一であり、あらかじめ定められた強度および長さの調節シグナルの生成後に開始される［１５，１６］。これに関連して、梗塞域の縮小は、長期にわたる虚血に対して耐性のある細胞数の増加を証明するものである。アデノシンを相当多量に単独使用すると、長期間にわたる虚血でそれほど顕著な心保護効果は認められなかった。特に、この結果は、アデノシンの量が一層顕著な心保護効果を得るには十分であったが、アデノシン受容体がそれと相互作用する能力は何らかの理由で制限され、得られた結果につながったことを示している。アデノシンと、パラジウムとアセチルシステインとの配位化合物とを併用投与すると、製剤の治療有効性が高まることで、少量の製剤での心保護効果の実現が容易になった。製剤を使っての作業で最も望ましくない合併症である、心臓の鼓動の乱れまたは心臓停止は、アデノシンを投与する実験の過程ではまったく観察されなかった。アデノシンの投与量が、虚血と再灌流の短時間のエピソードによる長期にわたる虚血に対する心筋の保護時に見られ、生理学的であるとみなされる値に近かった点に注意されたい［１５，１６］。
【０３０５】
このように、配位子過剰な脂肪族チオールの微小濃度の配位化合物と、生理学的に許容可能な濃度の薬理学的に活性な物質−アデノシンとを併用すると、生理学的に適切な用量のアデノシンの治療効果が示された。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式
【化１】


（式中、
Ｍは、Ｐｄ、Ｆｅ、Ｍｎ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｚｎ、Ｍｏを含む群から独立に選択される金属原子を意味し、
Ｒ^１およびＲ^２は各々独立に、水素、アミノ、ヒドロキシ、オキシ、カルボキシ、シアノ、Ｃ_１〜１２アルキル、Ｃ_２〜１２アルケニル、Ｃ_２〜１２アルキニル、Ｃ_１〜１２アルコキシ、Ｃ_１〜１２アルキルアミノ、Ｃ_１〜１２アルコキシカルボニル、Ｃ_１〜１２アルキルアミド、アリールアミドを意味し、前記置換基に含まれるアルキル基は、以下のヒドロキシ、オキシ、カルボキシ、アミノまたはアミド基のうちの１つまたは２つ以上で置換されていてもよく、
Ｒ^３〜Ｒ^１０は各々独立に、水素を意味するか、
ＮＨＲ^３Ｒ^４およびＮＨＲ^５Ｒ^６が合一しておよび／またはＮＨＲ^７Ｒ^８およびＮＨＲ^９Ｒ^１０が合一して、窒素の１つまたはいくつかの脂肪族または芳香族ドナー原子を含有し、前記金属原子（Ｍ）を中心としてｃｉｓ位にある１つまたは複数の配位子である）で表される化合物およびその薬学的に許容される塩。
【請求項２】
ＮＨＲ^３Ｒ^４およびＮＨＲ^５Ｒ^６が合一しておよび／またはＮＨＲ^７Ｒ^８およびＮＨＲ^９Ｒ^１０が合一して、２つの芳香族窒素原子を有するジアミノ化合物またはアリールである、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
ジアミノ化合物がＣ_２〜Ｃ_６ジアミノアルキレンであり、アリールが２つのピリジル環を含有する、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
さまざまなシグナルの形質導入時に重要な役割を果たす、酸素、窒素、他の酸化剤の内在性活性形態である二次メディエータの助けを借りて、単にジスルフィド結合または架橋を形成するだけのために少量および微量での使用を条件にチオアミノ酸のチオール基の均一かつ選択的で穏やかな酸化プロセスの加速を可能にすることを特徴とする、請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
ＮＨＲ^３Ｒ^４およびＮＨＲ^５Ｒ^６が合一しておよび／またはＮＨＲ^７Ｒ^８およびＮＨＲ^９Ｒ^１０が合一して、エチレンジアミン、２，２’−ビジピリジル（２，２’−ｂｉｐｙ）、１，１０−フェナントロリン（１，１０−ｐｈｅｎ）またはこれらの誘導体である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項６】
Ｒ^１Ｒ^２ＣＨ−ＣＨ_２−ＳＨが、２−アミノエタンチオール（ａｅｔ、システアミン）、２−アセトアミドエタンチオール、システイン（Ｃｙｓ）、システインメチルエステル、システインエチルエステル、アセチルシステイン（Ａｃｃｙｓ）、アセチルシステインメチルエステル、アセチルシステインエチルエステル、アセチルシステインニトリル、３−メルカプトプロピオン酸、γ−グルタミン−システイン−グリシン、ホモシステイン、チオグリコール酸またはこれらの誘導体である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項７】
ＮＨＲ^３Ｒ^４およびＮＨＲ^５Ｒ^６が合一しておよび／またはＮＨＲ^７Ｒ^８およびＮＨＲ^９Ｒ^１０が合一して、エチレンジアミン、２，２’−ビジピリジル（２，２’−ｂｉｐｙ）、１，１０−フェナントロリン（１，１０−ｐｈｅｎ）またはこれらの誘導体であり、Ｒ^１Ｒ^２ＣＨ−ＣＨ_２−ＳＨが、２−アミノエタンチオール（ａｅｔ、システアミン）、２−アセトアミドエタンチオール、システイン（Ｃｙｓ）、システインメチルエステル、システインエチルエステル、アセチルシステイン（Ａｃｃｙｓ）、アセチルシステインメチルエステル、アセチルシステインエチルエステル、アセチルシステインニトリル、３−メルカプトプロピオン酸、γ−グルタミン−システイン−グリシン、ホモシステイン、チオグリコール酸またはこれらの誘導体である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項８】
式
【化２】


（式中、Ｍ、Ｒ^１およびＲ^２は請求項１で定義したとおりである）で表される、請求項１に記載の化合物。
【請求項９】
［Ｐｄ_２（μ−Ｓ−Ｌ−Ｃｙｓ）（μ−Ｓ−Ｌ−ＣｙｓＨ）（２，２’−ｄｉｐｙ）_２］（ＮＯ_３）_３・４．５Ｈ_２Ｏ、Ｐｄ_２（ａｅｔＨ）_２（ｐｈｅｎ）_２］（ＮＯ_３）_４・Ｈ_２Ｏ、［Ｐｄ_２（μ−Ｓ−Ａｃｃｙｓ）_２（ｄｉｐｙ）_２］Ｃｌ_２・Ｈ_２Ｏ、［Ｐｄ_２（μ−Ｓ−Ａｃｃｙｓ）_２（ＮＨ_３）_４］Ｃｌ_２、［Ｃｕ_２（μ−Ｓ−Ｃｙｓ）_２（ｄｉｐｙ）_２］Ｃｌ_２を含む群から選択される化合物である、請求項１に記載の化合物。
【請求項１０】
［Ｐｄ_２（μ−Ｓ−Ｌ−Ｃｙｓ）（μ−Ｓ−Ｌ−ＣｙｓＨ）（２，２’−ｄｉｐｙ）_２］（ＮＯ_３）_３・４．５Ｈ_２Ｏであって、三斜晶系、空間群Ｐ１で結晶化し、単位胞パラメータ（Å）がａ＝１３．８６、ｂ＝１３．８２、ｃ＝１２．１７、α＝１２２．１３°、β＝１０３．６１°、γ＝９１．４０°、Ｖ（Å^３）＝１８８７．０、Ｚ＝１、ＩＲスペクトル（ＫＢｒペレット）ν_ｍａｘ（ｃｍ^−１）が４１９、５４２、５９０、６４８、６８９、７２２、７６５、８０７、９７７、１０２２、１０３６、１０７２、１１０７、１１６４、１１７４、１２０４、１２２６、１２４０、１２７２、１３１２、１３５３、１３６４、１３８４、１４４７、１４６９、１５６３、１６０１、１６６６、１７２８、３０７３、３１０８、３２２１、３２８３、３４２７、３９５３であることを特徴とする、請求項９に記載の化合物。
【請求項１１】
Ｐｄ_２（ａｅｔＨ）_２（ｐｈｅｎ）_２］（ＮＯ_３）_４・Ｈ_２Ｏであり、単斜晶系、空間群Ｃｃで結晶化し、単位胞パラメータÅがａ＝２４．５３、ｂ＝１３．１０、ｃ＝２２．６５、β＝１０４．２６°、Ｖ（Å^３）＝７０５２．２５、Ｚ＝４である、請求項９に記載の化合物。
【請求項１２】
ＩＲスペクトル（ＫＢｒペレット）ν_ｍａｘ（ｃｍ^−１）が、５０７、６４０、６９２、７７４、８１５、８７９、９４６、１０５８、１０９４、１２１２、１２２９、１３４３、１３８１、１４０４、１４２７、１５７３、１７２３、２６５５、２８２０、２９７１、３３７７、３４０６、３４８０であることを特徴とする、［Ｐｄ_２（μ−Ｓ−Ａｃｃｙｓ）_２（ｄｉｐｙ）_２］Ｃｌ_２・Ｈ_２Ｏである、請求項９に記載の化合物。
【請求項１３】
ＩＲスペクトル（ＫＢｒペレット）ν_ｍａｘ（ｃｍ^−１）が、５１２、５９７、６９２、７７３、８３９、８７９、９４６、１０９４、１２１２、１２２９、１２５４、１３４３、１４０３、１５２１、１５７２、１５９４、１７２３、２６５５、２９２５、２９７１、３１１９、３４６０であることを特徴とする、［Ｐｄ_２（μ−Ｓ−Ａｃｃｙｓ）_２（ＮＨ_３）_４］Ｃｌ_２である、請求項９に記載の化合物。
【請求項１４】
ＩＲスペクトル（ＫＢｒペレット）ν_ｍａｘ（ｃｍ^−１）が、５２０、６９１、８１５、８７９、１０５８、１１３３、１２１２、１２２９、１２５４、１３４３、１４０４、１５７２、１５９４、１６２７、２６５５、２９２５、２９４０、２９７１、３１１９、３４８０であることを特徴とする、［Ｃｕ_２（μ−Ｓ−Ｃｙｓ）_２（ｄｉｐｙ）_２］Ｃｌ_２である、請求項９に記載の化合物。
【請求項１５】
薬理学で用いられる、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１６】
細胞外、細胞表面および細胞内受容体、酵素、イオンチャネル、細胞質膜および細胞内膜の輸送体タンパク質、ペプチド型細胞外調節および輸送体分子の活性を調節することで、細胞の生物活性に対して効果を発揮する、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１７】
外用、吸入、経腸および非経口投与での薬剤の調製に使用する、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１８】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の化合物少なくとも１種類を有効量で、薬学的に許容される補形剤と一緒に含む、医薬組成物。
【請求項１９】
遊離ＣＨＲ^１Ｒ^２−ＣＨ_２ＳＨをさらに含有し、式中、Ｒ^１およびＲ^２は請求項１に定義されたとおりである、請求項１８に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
チオクト酸をさらに含有する、請求項１８または１９に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
リチウムイオンをさらに含有する、請求項１８または１９に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
アデノシンをさらに含有する、請求項１８または１９に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
基質およびその配位子に対するＥＧＦＲの親和性を高める薬剤の製造に、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の化合物を用いる使用法。
【請求項２４】
Ｐｇｐ阻害剤である薬剤の製造に請求項１〜１４のいずれか１項に記載の化合物を用いる使用法。
【請求項２５】
有効量の請求項１〜１４のいずれか１項に記載の化合物を、これを必要とする患者に投与する、患者の身体に対する薬物療法的な作用の方法。
【請求項２６】
患者に投与されるｄ−金属の配位化合物の量が、１０^−３〜１０^−１５ｍｏｌ／体重ｋｇである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
配位化合物の一部として投与されるｄ−金属の量が、特定の金属の生理学的に許容可能な値を超えない、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
有効量の薬剤を、これを必要とする患者に、吸入、経腸または非経口経路で投与するか、外用で使用する、請求項２５に記載の方法。

【公表番号】特表２０１２−５３２９２８（Ｐ２０１２−５３２９２８Ａ）
【公表日】平成２４年１２月２０日（２０１２．１２．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５２０５６２（Ｐ２０１２−５２０５６２）
【出願日】平成２２年７月１２日（２０１０．７．１２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＲＵ２０１０／０００３９１
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／００８１３２
【国際公開日】平成２３年１月２０日（２０１１．１．２０）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＰＨＯＴＯＳＨＯＰ
２．テフロン
【出願人】（５１２００９７７９）アイビー　ファーム　エルエルシー (1)
【Ｆターム（参考）】