本発明により、硫化ジメチル（ＤＭＳ）および／もしくはその前駆体であるＳ−メチル−Ｌ−メチオニン（ＳＭＭ）の両方のレベルが顕著に低いこと、または前記化合物を欠くことを特徴とするオオムギ由来の飲料が提供される。加えて、本発明は、上述の飲料を生産する方法に関し、また、このような飲料を調製するのに有用なオオムギ植物体の他、前記植物体から調製される他の植物生成物にも関する。本発明を用いることにより、風味プロファイルが改善された飲料の生産手順を改善する方法が明確に示され、また、ビールを生産するための熱エネルギー投入量の顕著な削減も約束される。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願において引用されるすべての特許および非特許参考文献は、参照により、それらの全体において、本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、硫化ジメチル（ＤＭＳ）および／もしくはその前駆体であるＳ−メチル−Ｌ−メチオニン（ＳＭＭ）の両方のレベルが顕著に低いこと、または前記化合物のうちの一方、もしくは好ましくは両方を欠くことを特徴とするオオムギ由来の飲料に関する。加えて、本発明は、上述の飲料を生産する方法に関し、また、このような飲料を調製するのに有用なオオムギ植物体の他、前記植物体から調製される他の植物生成物にも関する。本発明は、風味プロファイルの改善を特徴とする飲料の生産を可能とする一方で、また、熱エネルギー投入量（特に、ウォートの煮沸に関する）を顕著に削減する生産法のための新規の枠組みも支援する。
【背景技術】
【０００３】
飲料、とりわけ、ビールは、世界の多くの地域で栽培されている単子葉植物であるオオムギ（Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ， Ｌ．）に基づいて生産することができる。オオムギは、ビールを含めた産業製品の原料として、また、動物試料の供給源としての両面で、経済的に重要である。
【０００４】
茶、ココア、ミルク、ワイン、蒸留酒（ラム酒など）、スイートコーン、および多数の調理野菜を含めた、多くの野菜および食物において、加えて、ビールにおいても、ＤＭＳは、生成物に顕著な、一般には有益なにおいと風味の調子を付加する。しかし、高レベルのＤＭＳは、通常、「煮たトウモロコシ」、または場合によって「クロスグリ様」と描写される、望ましくない風味を与える。
【０００５】
ビールの種類によって、ＤＭＳレベルは、典型的には最大で１４４μｇ／Ｌとなる可能性があり、場合によっては、最大で１５０ｐｐｂ（１５０μｇ／Ｌ）に達する可能性もあり、前記化合物は、「煮た野菜」または「キャベツ様」の望ましくない風味に寄与することが多い。しかし、低レベルの該化合物は、濃厚な風味および全体的なビールの香ばしさに寄与し得るため、ラガービールでは、場合によって望ましいこともある：感覚閾値は約２５〜５０ｐｐｂ、例えば、３０〜４５μｇ／Ｌである（Ｍｅｉｌｇａａｒｄ、１９８２年）。そのレベルが＜１０ｐｐｂであるとき、ＤＭＳの風味は、一般に感知されない。
【０００６】
本明細書ではまたＤＭＳ前駆体（ＤＭＳＰ）としても称するＳＭＭは、ＳＭＭサイクルの機能的成分の作用により、発芽しつつあるオオムギ穀粒内において合成される（図１Ａ）。ここで、メチオニン（Ｍｅｔ）−Ｓ−メチルトランスフェラーゼ（ＭＭＴ）酵素は、Ｓ−アデノシル−メチオニン（ＡｄｏＭｅｔ）からＭｅｔへのメチル基の移動を触媒して、ＳＭＭを形成させる。後者の化合物は、酵素であるホモシステイン（Ｈｃｙ）−Ｓ−メチルトランスフェラーゼ（ＨＭＴ）により触媒される反応である、ＨｃｙからのＭｅｔの合成のためのメチルドナーとして用いられ得る。ＭＭＴの決定的な役割については論じられているが、当初それは、ＡｄｏＭｅｔ合成が超過することによりタンパク質合成のためのＭｅｔプールが枯渇することを防止することであると仮定された（ＭｕｄｄおよびＤａｔｋｏ、１９９０年）。ＳＭＭサイクルはまた、葉中におけるＭｅｔからＳＭＭへの主要なフラックス、ＳＭＭの師部輸送、ならびに穀粒または他のシンク組織の発生におけるＳＭＭからＭｅｔへの再転換を伴う、植物内における長距離の硫黄輸送において機能することも示唆されている（Ｂｏｕｒｇｉｓら、１９９９年）。しかし、その後の放射性トレーサーによる実験では、前記サイクルが、Ｍｅｔの枯渇を防止するのではなく、ＡｄｏＭｅｔレベルの制御を管理していることが明らかになった（Ｒａｎｏｃｈａら、２００１年）。植物におけるＳＭＭの生理学的役割についての代替的な説明は、エチレン合成の制御（Ｋｏら、２００４年）に関し、これは、主に、Ｐｉｃｈｉａ属の酵母に由来する、組換え１−アミノシクロプロパン−１−カルボキシレートシンターゼに関する研究を介して示される考えによる。
【０００７】
ＭｃＥｌｒｏｙおよびＪａｃｏｂｓｅｎ（１９９５年）は、例えば、アンチセンス法を用いることにより、ＳＭＭの合成を制御することが可能であり得ると推測している。しかし、アンチセンスの対象となる標的遺伝子についての指針は示されず、ＳＭＭレベルが大幅に低下すれば、オオムギの成長および発育にとって有害であり得るため、結果が肯定的となる可能性は疑問視されると予測された。ＭｃＥｌｒｏｙおよびＪａｃｏｂｓｅｎ（前出）は、ＳＭＭレベルを低下させるための代替的な解決策については論じなかった。加えて、下記で詳細に論じる通り、オオムギにおいてアンチセンス法を適用して、遺伝子発現を完全に消失させるのに成功したことはない。
【０００８】
残念ながら、所与のタンパク質の発現を完全に欠くトランスジェニックのオオムギ植物体を調製する方法は与えられていない。オオムギの場合一般に、アンチセンス法を適用しても、問題となるタンパク質の一部をやはり発現するトランスジェニック植物がもたらされる（例えば、Ｒｏｂｂｉｎｓら、１９９８年； Ｓｔａｈｌら、２００４年； Ｈａｎｓｅｎら、２００７年を参照されたい）。また、キメラＲＮＡ／ＤＮＡまたは部位指向変異誘発を用いて特異的な変異を調製するのに有効な、オオムギ植物体で用いられる方法も開発されていない。本公開の発明者らが努力を結集したにもかかわらず、オオムギにおいて、オリゴヌクレオチド指向の遺伝子標的化の成功について公表例が知られないことも、このことと符合する。オオムギにおいては追及されていないが、ＩｉｄａおよびＴｅｒａｄａ（２００５年）は、トウモロコシ、タバコ、およびコメにおいて、オリゴヌクレオチド指向の遺伝子標的化が試みられている（しかし、すべての場合において、除草剤耐性遺伝子であるアセト乳酸シンターゼ（ＡＬＳ）が標的とされている）ことに言及している。ＩｉｄａおよびＴｅｒａｄａ（前出）が下す結論によれば、上述の戦略に適切な改変を加えて、これが、ＡＬＳ遺伝子など、直接的に選択可能な遺伝子以外の遺伝子に適用可能であるかどうかは、いまだに確立されていない。ジンクフィンガーヌクレアーゼを用いる標的化変異誘発は、将来の基礎的な植物生物学における研究または作物植物における改変を潜在的には可能とし得る別のツールを表す（Ｄｕｒａｉら、２００５年； ＴｚｆｉｒａおよびＷｈｉｔｅ、２００５年； Ｋｕｍａｒら、２００６年）。この場合もまた、オオムギでは、変異誘発が追及されていないか、または有効に適用されていない。
【０００９】
にもかかわらず、照射、またはアジドナトリウム（ＮａＮ_３）で処理することによるなど、化学的処理を用いる無作為的な変異誘発により、オオムギの変異体を調製することができる。例は、低フィチン酸の変異体を求めたスクリーニングの試みにおいて、ＮａＮ_３を用いることによりオオムギ穀粒を変異誘発させた後における、高レベルの遊離リン酸を有するものを求めたそれらのスクリーニングに関する（ＲａｓｍｕｓｓｅｎおよびＨａｔｚａｃｋ、１９９８年；スクリーニングされた２，０００個の穀粒から、計１０個の変異体が同定された）。常に可能であることからは遠いが、ＮａＮ_３処理後において特定の変異体を見出すことは、持続的で有効なスクリーニング法に依存し、したがって、常に成功することからは遠い。
【００１０】
従来の植物育種における有望な分子標的の同定に関する困難な部分は、所与の生化学系の出力を所望の形で変化させるには、該経路のうちのどの構成要素（複数可）を撹乱させるべきかを確証することの困難に関し、したがって、有用なスクリーニング法を確立する能力に関する。
【００１１】
ビール生産に関する高温でのインキュベーション（モルトのキルン乾燥、またはウォートの加熱および煮沸）は、ＳＭＭからＤＭＳへの化学的転換を誘導し得る。ＤＭＳの固有の特性、特に、その沸点がわずかに３７℃〜３８℃であるという特性により、キルニング時およびウォート煮沸時において形成されるＤＭＳの主要部分は、大気中へと失われ得る。約７０℃を超える温度では、ＤＭＳの揮発性が極めて低レベルへと低下する（ＳｃｈｅｕｒｅｎおよびＳｏｍｍｅｒ、２００８年）一方で、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）へのさらなる酸化のための条件が顕在化する。ウォート煮沸の維持時間または強度が、残留ＳＮＭを転換するのに不十分である場合、ＤＭＳは、ウォートが冷却される際に形成され続ける可能性がある（その後、ビール中へと移送される）。
【００１２】
ビール中におけるＤＭＳレベルを低下させる技法が開発されている。したがって、ＡＵ３８５７８／９３では、モルト中におけるＤＭＳレベルを低下させる方法であって、前記モルトの蒸気による処理を含む方法が説明されている。Ｂｉｓｇａａｒｄ−Ｆｒａｎｔｚｅｎ， Ｈ．らによるＵＳ２００６／００５７６８４では、７０℃以上の温度におけるマッシュの加熱処理を含む醸造法が説明されていた。そして、Ｒｅｕｔｈｅｒ， Ｈ．による米国特許第５，２４２，６９４号では、低炭水化物のビールを調製する方法であって、長時間にわたりウォートを煮沸する工程の後で、前記ウォートを二酸化炭素で洗浄する工程を含む方法が説明されていた。しかし、前述の処理はすべて、高レベルのエネルギーを消費し、さらに、モルトまたはウォートの特徴を変化させる可能性がある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、オオムギまたはその一部から調製される飲料、特に、風味の改善されたビールを開示する。本明細書で開示される飲料は、ＤＭＳレベルが極めて低いか、さらにまたはＤＭＳを全く示さない（特に、ＤＭＳレベルが風味閾値未満であり、したがって、ＤＭＳ風味の不在を特徴とする飲料である）。
【００１４】
さらに、本発明の飲料は、優れた風味特性を有する。したがって、本発明の飲料は、特にバランスが良くて飲みやすく、高度の新鮮さ、香ばしい風味、および花の風味を有する飲料として特徴付けられる。
【００１５】
したがって、本発明は、ＤＭＳの不在または低ＤＭＳレベルに基づく、注目すべき風味特性を有する飲料を提供する。ここで、ＤＭＳが、ビール中におけるエステル化合物に対する人間の知覚に顕著な影響を及ぼすことが見出される（図１Ｂを参照されたい）が、これは、本発明により提供される、ＤＭＳが前記化合物の風味を遮蔽するというモデルと符合する。
【００１６】
本発明が、ＤＭＳ前駆体の形成を特異的に遮断する欠損を有するオオムギまたはモルト穀粒を提供することは、極めて重要であると考えられる。この方法により、上記で説明した、ＤＭＳによるエステル風味の遮蔽を回避することができ、これにより、オオムギおよびモルトの産業的利用の新たな機会が可能となる。加えて、ＤＭＳ前駆体の形成を特異的に遮断する欠損を有するオオムギまたはモルト穀粒はまた、ＤＭＳ自体の不在により引き起こされる風味特性も示す。とりわけ、前記のオオムギまたはモルトの種類は、現行の能力をはるかに超えて調整された生産環境の確立を支援する、有効な産業適用における原材料として利用し得るであろう。特に、改善は、ビールの品質、ならびにビール生産における環境持続性の問題に関し、とりわけ、
（ｉ）ＤＭＳ特異的な風味が低レベルであるビールと；
（ｉｉ）エステル風味のプロファイルが改善されたビールと；
（ｉｉｉ）ビール生産に投入されるエネルギーの削減と；
（ｉｖ）ウォート生成におけるエネルギー消費の削減と
の問題に関する。
【００１７】
本発明は、前記改善を達成するオオムギ植物体および穀粒を提供する。
【００１８】
こうして、ＳＭＭの代謝が、他の生物学的過程といかにして絡み合い得るかについての理論的な考察に拘束されずに述べると、本出願は、ＳＭＭ合成が欠損するオオムギ植物体の育種およびその産業的使用を利用および探索するための、いまだもたらされていない機会を提供する。
【００１９】
本発明は、ＭＭＴをコードする遺伝子における変異を保有する、ＭＭＴ活性の完全な喪失を引き起こす、オオムギ植物体またはその一部から、ＤＭＳ特異的な風味が低レベルであり、エステル風味のプロファイルが改善されていることを特徴とする飲料、および／または特にバランスが良く飲みやすい飲料（すなわち、高度の新鮮さ、香ばしい風味、および花の風味を有する）を調製し得ることを開示する。本明細書では、このような植物体を、「ＭＭＴヌルの」オオムギと称する。
【００２０】
したがって、一態様では、本発明が、オオムギ植物体またはその一部から調製される飲料であって、前記飲料が３０ｐｐｂを下回るＤＭＳ（３０ｐｐｂ未満のＤＭＳなど）を含有し、前記オオムギ植物体が、ＭＭＴをコードする遺伝子における、ＭＭＴ活性の完全な喪失を引き起こす変異を保有する飲料に関する。
【００２１】
別の態様では、本発明が、前記飲料を調製するのに有用なオオムギ植物体を提供する。したがって、ＭＭＴをコードする遺伝子における、機能的ＭＭＴ酵素の完全な喪失を引き起こす変異を保有するオオムギ植物体またはその一部を提供することもまた、本発明の目的である。
【００２２】
加えて、本発明は、例えば、モルト組成物およびウォート組成物、またはオオムギベースのシロップもしくは抽出物、またはモルトベースのシロップもしくは抽出物、あるいは添加物を含めた、前記ＭＭＴヌルのオオムギ植物体から生成された植物生成物に関する。この文脈における添加物は、モルト化させていないオオムギの場合があり、これは、単独で用いることもでき、ウォートを調製するためのモルト化させたオオムギと組み合わせて用いることもできる。本発明はまた、前記オオムギ植物体を調製する方法の他、飲料および他の植物生成物を調製する方法も提供する。
【００２３】
さらに、異常気象が国際問題となっている世界にあって、社会および産業は、温室効果ガス排出の削減、および環境利益に寄与すべきである。したがって、本発明の目的は、エネルギー消費の低い方法を用いるビール生産に有用なオオムギ植物体を提供することである。したがって、本発明のオオムギ植物体は、標準的な醸造法と比較して、加熱する工程の時間経過が短いか、または加熱する工程における温度が低い方法を用いるビールの生産に有用である。根本的に重要なのは、キルンを乾燥させる工程およびウォートを煮沸させる手順における利益であり、これらは、標準的な醸造レジメおよびビール生産レジメと比べて顕著に短縮することもでき、より低温で実施することもでき、これによりエネルギー消費が削減され、ビールを生産するのにより持続可能な方法がもたらされる。
【００２４】
配列表
本発明は、以下の詳細な説明と、本出願の一部をなす添付の配列表（表１０にまとめられる）から、より完全に理解することができる。前記表は、本明細書で説明される核酸およびポリペプチド、オリゴヌクレオチドプライマーの他、これらのポリペプチドの全部または実質的部分を表すポリペプチドをコードする核酸断片を含むｃＤＮＡクローンおよびｇＤＮＡクローンの呼称、ならびに対応する識別子（配列番号）を列挙する。配列の説明と、本明細書に添付される配列表とは、特許出願におけるヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列の開示を律する規則に準拠している。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１Ａ】図１は、ＳＭＭサイクルの選択された構成成分および平均風味スコアを示す図である。（Ａ）酵素Ｍｅｔ−Ｓ−メチルトランスフェラーゼ（ＭＭＴ）によって触媒される、Ｓ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）からメチオニン（Ｍｅｔ）へのメチル基転移によってＳＭＭが合成されるＳＭＭサイクルの選択された構成成分である。ＳＭＭは、今度は、酵素Ｈｃｙ−Ｓ−メチルトランスフェラーゼ（ＨＭＴ）によって触媒される反応において、ホモシステイン（Ｈｃｙ）からのＭｅｔ合成のためのメチル基供与体として機能することができる。図は、基本的に不可逆的な反応がどのようにつながっているかを示している。サイクルの各回転は、ＡＴＰがアデノシン、ＰＰｉおよびＰｉに転換する間に２つのＭｅｔを消費し、その後再生するので（示していない）、無益である。（Ｂ）ビール試料の列挙した性質−ボディ感、エステル風およびＤＭＳについて専門家のビールの試飲パネル（ｓｐｅｃｉａｌｉｓｔ ｂｅｅｒ ｔａｓｔｅ ｐａｎｅｌ）によってもたらされた平均風味スコア±標準偏差を例示している。対照試料である標準のビールに、ビールのみ（「０」のしるしの棒）をスパイクした、またはビール中の濃度が以下になるエステルの混合物：酢酸エチル５ｐｐｍ、酢酸イソアミル１．５ｐｐｍ、ヘキサン酸エチル０．０５ｐｐｍ、オクタン酸エチル０．１３ｐｐｍ（「１」のしるしの棒）、およびＤＭＳ１００ｐｐｂを含めた上述のエステル混合物（「２」のしるしの棒）をスパイクした。
【図１Ｂ】図１は、ＳＭＭサイクルの選択された構成成分および平均風味スコアを示す図である。（Ａ）酵素Ｍｅｔ−Ｓ−メチルトランスフェラーゼ（ＭＭＴ）によって触媒される、Ｓ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）からメチオニン（Ｍｅｔ）へのメチル基転移によってＳＭＭが合成されるＳＭＭサイクルの選択された構成成分である。ＳＭＭは、今度は、酵素Ｈｃｙ−Ｓ−メチルトランスフェラーゼ（ＨＭＴ）によって触媒される反応において、ホモシステイン（Ｈｃｙ）からのＭｅｔ合成のためのメチル基供与体として機能することができる。図は、基本的に不可逆的な反応がどのようにつながっているかを示している。サイクルの各回転は、ＡＴＰがアデノシン、ＰＰｉおよびＰｉに転換する間に２つのＭｅｔを消費し、その後再生するので（示していない）、無益である。（Ｂ）ビール試料の列挙した性質−ボディ感、エステル風およびＤＭＳについて専門家のビールの試飲パネル（ｓｐｅｃｉａｌｉｓｔ ｂｅｅｒ ｔａｓｔｅ ｐａｎｅｌ）によってもたらされた平均風味スコア±標準偏差を例示している。対照試料である標準のビールに、ビールのみ（「０」のしるしの棒）をスパイクした、またはビール中の濃度が以下になるエステルの混合物：酢酸エチル５ｐｐｍ、酢酸イソアミル１．５ｐｐｍ、ヘキサン酸エチル０．０５ｐｐｍ、オクタン酸エチル０．１３ｐｐｍ（「１」のしるしの棒）、およびＤＭＳ１００ｐｐｂを含めた上述のエステル混合物（「２」のしるしの棒）をスパイクした。
【図２】図２は、蛍光化合物ＳＭＭ−ＯＰＡのアルカリ形成に関与する分子を示す図である。
【図３Ａ】図３は、変異体８０６３および変異体１４０１８のヌルＭＭＴ表現型を立証するためのＨＰＬＣ実験およびウェスタンブロット実験の結果を示す図である。（Ａ）栽培品種Ｐｒｅｓｔｉｇｅの苗条からの抽出物のＨＰＬＣに基づく分離の例であり、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、セリン（Ｓｅｒ）およびＳＭＭの溶出を示している。オオムギ苗条のＯＰＡ誘導体抽出物の蛍光については、３４０ｎｍで励起し４５０ｎｍで放射が測定された。（Ｂ）示した変異体および野生型の、栽培品種Ｓｅｂａｓｔｉａｎからの抽出物のＨＰＬＣに基づく分離である。変異体の抽出物中の構成成分の分離では、ＳＭＭ特異的なピークがないクロマトグラムがもたらされた。（Ｃ）野生型Ｐｒｅｓｔｉｇｅ（レーン２）、変異体８０６３（レーン３）、野生型Ｓｅｂａｓｔｉａｎ（レーン５）、および変異体１４０１８（レーン６）の苗条抽出物からサイズによって分離したタンパク質のウェスタンブロットの結果。ｋＤａで示した質量の参照タンパク質を、レーン１、４および７で分離すると同時に、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞からの組換えＭＭＴを対照として用い、レーン８で分離した。実施例１２において説明している通り、１２０ｋＤａの染色されたタンパク質バンドがＭＭＴを表し、一方Ｅ．ｃｏｌｉ抽出物における８０ｋＤａのバンドは、ベクターｐＥＴ１９ｂで形質転換した陰性対照の細胞の抽出物においても現れたので（図１４Ｂ、Ｃ参照）、ＭＭＴ由来ではない。
【図３Ｂ】図３は、変異体８０６３および変異体１４０１８のヌルＭＭＴ表現型を立証するためのＨＰＬＣ実験およびウェスタンブロット実験の結果を示す図である。（Ａ）栽培品種Ｐｒｅｓｔｉｇｅの苗条からの抽出物のＨＰＬＣに基づく分離の例であり、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、セリン（Ｓｅｒ）およびＳＭＭの溶出を示している。オオムギ苗条のＯＰＡ誘導体抽出物の蛍光については、３４０ｎｍで励起し４５０ｎｍで放射が測定された。（Ｂ）示した変異体および野生型の、栽培品種Ｓｅｂａｓｔｉａｎからの抽出物のＨＰＬＣに基づく分離である。変異体の抽出物中の構成成分の分離では、ＳＭＭ特異的なピークがないクロマトグラムがもたらされた。（Ｃ）野生型Ｐｒｅｓｔｉｇｅ（レーン２）、変異体８０６３（レーン３）、野生型Ｓｅｂａｓｔｉａｎ（レーン５）、および変異体１４０１８（レーン６）の苗条抽出物からサイズによって分離したタンパク質のウェスタンブロットの結果。ｋＤａで示した質量の参照タンパク質を、レーン１、４および７で分離すると同時に、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞からの組換えＭＭＴを対照として用い、レーン８で分離した。実施例１２において説明している通り、１２０ｋＤａの染色されたタンパク質バンドがＭＭＴを表し、一方Ｅ．ｃｏｌｉ抽出物における８０ｋＤａのバンドは、ベクターｐＥＴ１９ｂで形質転換した陰性対照の細胞の抽出物においても現れたので（図１４Ｂ、Ｃ参照）、ＭＭＴ由来ではない。
【図３Ｃ】図３は、変異体８０６３および変異体１４０１８のヌルＭＭＴ表現型を立証するためのＨＰＬＣ実験およびウェスタンブロット実験の結果を示す図である。（Ａ）栽培品種Ｐｒｅｓｔｉｇｅの苗条からの抽出物のＨＰＬＣに基づく分離の例であり、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、セリン（Ｓｅｒ）およびＳＭＭの溶出を示している。オオムギ苗条のＯＰＡ誘導体抽出物の蛍光については、３４０ｎｍで励起し４５０ｎｍで放射が測定された。（Ｂ）示した変異体および野生型の、栽培品種Ｓｅｂａｓｔｉａｎからの抽出物のＨＰＬＣに基づく分離である。変異体の抽出物中の構成成分の分離では、ＳＭＭ特異的なピークがないクロマトグラムがもたらされた。（Ｃ）野生型Ｐｒｅｓｔｉｇｅ（レーン２）、変異体８０６３（レーン３）、野生型Ｓｅｂａｓｔｉａｎ（レーン５）、および変異体１４０１８（レーン６）の苗条抽出物からサイズによって分離したタンパク質のウェスタンブロットの結果。ｋＤａで示した質量の参照タンパク質を、レーン１、４および７で分離すると同時に、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞からの組換えＭＭＴを対照として用い、レーン８で分離した。実施例１２において説明している通り、１２０ｋＤａの染色されたタンパク質バンドがＭＭＴを表し、一方Ｅ．ｃｏｌｉ抽出物における８０ｋＤａのバンドは、ベクターｐＥＴ１９ｂで形質転換した陰性対照の細胞の抽出物においても現れたので（図１４Ｂ、Ｃ参照）、ＭＭＴ由来ではない。
【図４】図４は、変異体８０６３の４日齢の苗条においてはＭＭＴ活性が存在しないが、発芽の長さが同様の野生型苗条においては活性が明白であることを示す図である。ＭＭＴ活性を、［^３Ｈ］ＳＡＭを基質として使用して決定した。ＭＭＴに触媒される、ＳＭＭを形成する［^３Ｈ］ＳＡＭからＭｅｔへのメチル基の移動を、活性炭によって残りの［^３Ｈ］ＳＡＭを除去した後、シンチレーション計数することによってモニターした。活性炭は基質に結合するが、新たに合成された、標識されたＳＭＭ生成物には結合しない。この図は、ＳＭＭが、変異体の苗条に存在しなかったが、野生型の苗条に存在したことも示している。変異体および野生型の植物体それぞれから１５、計３０の変異体および野生型の植物体両方の苗条を分析した。
【図５Ａ】図５は、野生型およびヌルＭＭＴのモルト、ウォート、およびビールにおける遊離のＤＭＳＰと遊離のＤＭＳの含有量の比較を示す図である。（Ａ）変異体８０６３のグリーンモルトおよびキルン乾燥モルトのどちらも、ＤＭＳＰおよび遊離のＤＭＳのレベルが著しく低下した。（Ｂ）変異体８０６３のスイートウォートおよび煮沸ウォートでは、ＤＭＳＰおよび遊離のＤＭＳがほとんど喪失し、変異体８０６３のモルトを使用して作製したビールでも、遊離のＤＭＳが極度に少なかった。
【図５Ｂ】図５は、野生型およびヌルＭＭＴのモルト、ウォート、およびビールにおける遊離のＤＭＳＰと遊離のＤＭＳの含有量の比較を示す図である。（Ａ）変異体８０６３のグリーンモルトおよびキルン乾燥モルトのどちらも、ＤＭＳＰおよび遊離のＤＭＳのレベルが著しく低下した。（Ｂ）変異体８０６３のスイートウォートおよび煮沸ウォートでは、ＤＭＳＰおよび遊離のＤＭＳがほとんど喪失し、変異体８０６３のモルトを使用して作製したビールでも、遊離のＤＭＳが極度に少なかった。
【図６Ａ】図６は、１０名の規模のビール試飲パネルによって確立された風味プロファイルの比較を示す図である。検査は、野生型の、栽培品種Ｐｏｗｅｒおよび変異体８０６３（ヌルＭＭＴ）のモルトを用いて醸造したビールで構成された。この種の分析では、グラフに示しているように、０〜５の尺度に定量化できるいくつもの所定の風味特質を利用する。風味は、分析されているビールの種類に対してその性質が最大であるとみなされるときにのみ、スコア５に対応する「極度」と判定される。（Ａ）エステルおよびアルコールをスパイクしたビールのビールの試飲パネルの評価の要約が表１に列挙されている。（Ｂ）スパイクしていないビールの試飲パネルの評価を列挙する要約。
【図６Ｂ】図６は、１０名の規模のビール試飲パネルによって確立された風味プロファイルの比較を示す図である。検査は、野生型の、栽培品種Ｐｏｗｅｒおよび変異体８０６３（ヌルＭＭＴ）のモルトを用いて醸造したビールで構成された。この種の分析では、グラフに示しているように、０〜５の尺度に定量化できるいくつもの所定の風味特質を利用する。風味は、分析されているビールの種類に対してその性質が最大であるとみなされるときにのみ、スコア５に対応する「極度」と判定される。（Ａ）エステルおよびアルコールをスパイクしたビールのビールの試飲パネルの評価の要約が表１に列挙されている。（Ｂ）スパイクしていないビールの試飲パネルの評価を列挙する要約。
【図７】図７は、ＮａＮ_３変異誘発されたオオムギ穀粒を繁殖させる様式の図を示す図である。Ｍ０世代の穀粒は、Ｍ１世代の穀粒を実らせる植物体に発達する。これらの種子をまき、Ｍ２世代の新しい穀粒を生成するＭ１植物体に発達させることができる。次に、Ｍ２植物体が成長し、Ｍ３世代の穀粒を実らせる。Ｍ３世代の穀粒を発芽させることができ、その試料、例えば、子葉鞘を分析に使用することができる。Ｍ３の種子も、種子まきし、対応する植物体の花を交配に用いてＭ４世代の植物体を得ることができる。
【図８】図８は、好ましいビール生成プロセスの簡略化した図による概説を示す図である。生成プロセスは、オオムギ子実をスティーピングする工程（１）と、発芽させる工程（２）と、キルン乾燥する工程（３）と、乾燥モルトを粉砕する工程（４）と、マッシングする工程（５）と、濾過する工程（６）と、添加されたホップの存在下でウォートを煮沸する工程（７）と、酵母の存在下で発酵させる工程（８）と、ビールを成熟させる工程（９）と、ビールを濾過する工程（１０）と、例えば、瓶、缶などに詰める工程（１１）と、ラベルを貼る工程（１２）とを含む。個々のプロセスは、モルト生成（１−３）と、ウォート生成（４−７）と、発酵（８−９）と、完成したビールの調製（１０−１２）とで構成されるセクションに分類することができる。好ましい方法を例示したが、示した工程の一部を省略する（例えば、濾過を省略してよく、またはホップを添加しなくてよい）代替的な様式を想定することができ、あるいは、付加的な工程を加えることができる（例えば、補助剤または炭酸の添加）。ビールは、モルト製造したオオムギとモルト製造していないオオムギの混合物、またはモルト製造していないオオムギのみを使用して生成することもでき、その場合は、マッシングプロセスの間に外部の酵素を頻繁に加える。
【図９】図９は、オオムギのＭＭＴをコードする遺伝子の構成を概略の形式で示す図である。翻訳開始コドンから翻訳終止コドンにわたる６３６８ｂｐ長のゲノム配列（配列番号３）を例示している。エクソンおよびイントロンを、それぞれ、番号をつけた枠および番号をつけていない線として示している。エクソン１２は、転写および翻訳の全体的な方向を示すために矢じりとして図示している。ヌクレオチドの番号は、翻訳開始コドンの一番目の塩基を基準として、示したエクソンの５’末端および３’末端を指す。表２に列挙されているプライマーセットを使用した増幅に対応するＰＣＲによるひと続きの配列のおよその位置も図示している。
【図１０】図１０は、栽培品種ＰｒｅｓｔｉｇｅのオオムギのＭＭＴの、翻訳開始コドンから翻訳終止コドンにわたるｃＤＮＡ配列、すなわちコード領域（配列番号４）を、アミノ酸の一文字コードを使用した、翻訳された配列（配列番号６）と整列させて示す図である。
【図１１−１】図１１は、ほとんど同一であるオオムギの栽培品種Ｈａｒｕｎａ Ｎｉｊｏ（配列番号２）と栽培品種Ｐｒｅｓｔｉｇｅ（配列番号６）のＭＭＴ酵素の配列のアラインメントを示す図である。２つの別々のアミノ酸残基の相違を黒枠に白文字で強調している。
【図１１−２】図１１は、ほとんど同一であるオオムギの栽培品種Ｈａｒｕｎａ Ｎｉｊｏ（配列番号２）と栽培品種Ｐｒｅｓｔｉｇｅ（配列番号６）のＭＭＴ酵素の配列のアラインメントを示す図である。２つの別々のアミノ酸残基の相違を黒枠に白文字で強調している。
【図１２−１】図１２は、オオムギの変異体８０６３がどのようにＭＭＴ遺伝子の潜在的なスプライス部位を活性化するかを示す図である。（Ａ）ＭＭＴ遺伝子のゲノム構造図の下の水平方向の小さな矢印は、プライマーセット１５（表４参照）のおよそのアニーリング位置を示している。（Ｂ）野生型の、栽培品種Ｐｒｅｓｔｉｇｅまたは変異体８０６３のいずれかからのＲＮＡ鋳型を使用した生成物の逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）分析のアガロースゲル電気泳動後のＤＮＡバンドを視覚化した図である。（Ｃ）Ａと同じグラフ要素を用いてパネルＢのＰＣＲ生成物のイントロン−エクソン構造を示している図である。生成物４のエクソン５は、野生型のエクソン５と比較して短い。垂直方向の矢じりは中途翻訳終止コドンのおよその位置を指している。プライマーの選択に起因して、生成物はエクソン１および２を含まない。しかし、ｍＲＮＡはエクソン１および２も含むことが予想される。（Ｄ）変異した（Ｍｕｔ．）イントロン５の５’スプライス部位および野生型（ＷＴ）のイントロン５の５’スプライス部位から生じた転写物を、下線を付した塩基によって変異部位を示して詳細に図示している。３および４と標識された実線でつながった矢印は、それぞれ、生成物３および生成物４のスプライシングの間に利用される供与部位および受容部位を示している（パネルＣ参照）。２^＊としるしが付いた破線は、野生型の転写物（パネルＣにおける生成物１）のスプライシングおよびスプライシングされていない生成物２（パネルＣ参照）を指している。エクソンおよびイントロン５の塩基は、それぞれ、小文字および大文字にしてある。ｎｔはヌクレオチドである。（Ｅ）単子葉植物における５’スプライス部位および３’スプライス部位の組成（ＳｉｎｉｂａｌｄｉおよびＭｅｔｔｌｅｒ、１９９２年）を変異体８０６３のＭＭＴ遺伝子におけるイントロン５の配列と比較した概要である。
【図１２−２】図１２は、オオムギの変異体８０６３がどのようにＭＭＴ遺伝子の潜在的なスプライス部位を活性化するかを示す図である。（Ａ）ＭＭＴ遺伝子のゲノム構造図の下の水平方向の小さな矢印は、プライマーセット１５（表４参照）のおよそのアニーリング位置を示している。（Ｂ）野生型の、栽培品種Ｐｒｅｓｔｉｇｅまたは変異体８０６３のいずれかからのＲＮＡ鋳型を使用した生成物の逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）分析のアガロースゲル電気泳動後のＤＮＡバンドを視覚化した図である。（Ｃ）Ａと同じグラフ要素を用いてパネルＢのＰＣＲ生成物のイントロン−エクソン構造を示している図である。生成物４のエクソン５は、野生型のエクソン５と比較して短い。垂直方向の矢じりは中途翻訳終止コドンのおよその位置を指している。プライマーの選択に起因して、生成物はエクソン１および２を含まない。しかし、ｍＲＮＡはエクソン１および２も含むことが予想される。（Ｄ）変異した（Ｍｕｔ．）イントロン５の５’スプライス部位および野生型（ＷＴ）のイントロン５の５’スプライス部位から生じた転写物を、下線を付した塩基によって変異部位を示して詳細に図示している。３および４と標識された実線でつながった矢印は、それぞれ、生成物３および生成物４のスプライシングの間に利用される供与部位および受容部位を示している（パネルＣ参照）。２＊としるしが付いた破線は、野生型の転写物（パネルＣにおける生成物１）のスプライシングおよびスプライシングされていない生成物２（パネルＣ参照）を指している。エクソンおよびイントロン５の塩基は、それぞれ、小文字および大文字にしてある。ｎｔはヌクレオチドである。（Ｅ）単子葉植物における５’スプライス部位および３’スプライス部位の組成（ＳｉｎｉｂａｌｄｉおよびＭｅｔｔｌｅｒ、１９９２年）を変異体８０６３のＭＭＴ遺伝子におけるイントロン５の配列と比較した概要である。
【図１３−１】図１３は、変異体８０６３の異常性のＭＭＴを異種発現させるための発現プラスミド、およびコードされているタンパク質のアラインメントを示す図である。（Ａ）エンテロキナーゼ部位（＊＊；配列ＳＳＧＨＩＤＤＤＤＫＨ；配列番号７０）を伴うＨｉｓタグ（＊；配列ＭＧＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨ；配列番号６９）を特定している配列にインフレームで融合した野生型ＭＭＴをコードするｐＥＴ１９ｂ−ＭＭＴの、選択された制限部位を含むＮｃｏＩ−ＢａｍＨＩ断片の図である。（Ｂ）、（Ｃ）および（Ｄ）に、欠失構築物を例示している。（Ｅ）コードされているＭＭＴ配列（Ａ、Ｂ、ＣおよびＤに示している構築物に対して、それぞれ、配列番号６、１１、１３、１５）のアラインメントである。アスタリスクでしるしをつけたひと続きの配列に対応する合成ペプチドは、オオムギのＭＭＴに対するポリクローナル抗体を生成するために使用した。野生型酵素（配列番号６）の残基番号３３３から１０８４にわたる配列は示していない。
【図１３−２】図１３は、変異体８０６３の異常性のＭＭＴを異種発現させるための発現プラスミド、およびコードされているタンパク質のアラインメントを示す図である。（Ａ）エンテロキナーゼ部位（＊＊；配列ＳＳＧＨＩＤＤＤＤＫＨ；配列番号７０）を伴うＨｉｓタグ（＊；配列ＭＧＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨ；配列番号６９）を特定している配列にインフレームで融合した野生型ＭＭＴをコードするｐＥＴ１９ｂ−ＭＭＴの、選択された制限部位を含むＮｃｏＩ−ＢａｍＨＩ断片の図である。（Ｂ）、（Ｃ）および（Ｄ）に、欠失構築物を例示している。（Ｅ）コードされているＭＭＴ配列（Ａ、Ｂ、ＣおよびＤに示している構築物に対して、それぞれ、配列番号６、１１、１３、１５）のアラインメントである。アスタリスクでしるしをつけたひと続きの配列に対応する合成ペプチドは、オオムギのＭＭＴに対するポリクローナル抗体を生成するために使用した。野生型酵素（配列番号６）の残基番号３３３から１０８４にわたる配列は示していない。
【図１４−１】図１４は、実験の詳細を実施例１２に記載している、それぞれ、栽培品種Ｐｒｅｓｔｉｇｅおよび変異体８０６３からの、野生型ＭＴＴおよび変異体型ＭＴＴをＥ．ｃｏｌｉにおいて異種発現させた結果を示す図である。ベクターｐＥＴ１９ｂで形質転換したＥ．ｃｏｌｉ細胞の抽出物ならびに純粋なＳＭＭの一定分量が実験の対照試料として機能した。ブロットがどちらも当該適用に関連性がないデータを含むレーン４と５の間のゲル領域は、スキャンした後に電子的に消去した。（Ａ）純粋なＳＭＭならびに示したプラスミドで形質転換したＥ．ｃｏｌｉからの抽出物のＨＰＬＣプロファイルである。比較のために、このプロファイルも図１８の不可欠な部分である。（Ｂ）プラスミドｐＥＴ−ＭＭＴ（レーン２）、ｐＥＴ１９ｂ−Ｌｉｎｅ８０６３−Ｐｒｏｄ３（レーン３）、ｐＥＴ１９ｂ−Ｌｉｎｅ８０６３−Ｐｒｏｄ４（レーン４）、およびｐＥＴ１９ｂ（レーン５）で形質転換したＥ．ｃｏｌｉ細胞の可溶性の細胞抽出物からサイズによって分離したタンパク質のウェスタンブロットの結果である。ｋＤａで示した質量の参照タンパク質を、レーン１で分離した。（Ｃ）上記の図Ｂ部分の説明において示したプラスミドで形質転換したＥ．ｃｏｌｉ細胞の封入体の抽出物からサイズによって分離したタンパク質のウェスタンブロットの結果である。主要な、ウェスタン分析に使用したポリクローナル抗体は、図１３においてアスタリスクでしるしをつけたひと続きのアミノ酸に対応する、オオムギのＭＭＴの１５残基長の合成ペプチドに対して生じた。
【図１４−２】図１４は、実験の詳細を実施例１２に記載している、それぞれ、栽培品種Ｐｒｅｓｔｉｇｅおよび変異体８０６３からの、野生型ＭＴＴおよび変異体型ＭＴＴをＥ．ｃｏｌｉにおいて異種発現させた結果を示す図である。ベクターｐＥＴ１９ｂで形質転換したＥ．ｃｏｌｉ細胞の抽出物ならびに純粋なＳＭＭの一定分量が実験の対照試料として機能した。ブロットがどちらも当該適用に関連性がないデータを含むレーン４と５の間のゲル領域は、スキャンした後に電子的に消去した。（Ａ）純粋なＳＭＭならびに示したプラスミドで形質転換したＥ．ｃｏｌｉからの抽出物のＨＰＬＣプロファイルである。比較のために、このプロファイルも図１８の不可欠な部分である。（Ｂ）プラスミドｐＥＴ−ＭＭＴ（レーン２）、ｐＥＴ１９ｂ−Ｌｉｎｅ８０６３−Ｐｒｏｄ３（レーン３）、ｐＥＴ１９ｂ−Ｌｉｎｅ８０６３−Ｐｒｏｄ４（レーン４）、およびｐＥＴ１９ｂ（レーン５）で形質転換したＥ．ｃｏｌｉ細胞の可溶性の細胞抽出物からサイズによって分離したタンパク質のウェスタンブロットの結果である。ｋＤａで示した質量の参照タンパク質を、レーン１で分離した。（Ｃ）上記の図Ｂ部分の説明において示したプラスミドで形質転換したＥ．ｃｏｌｉ細胞の封入体の抽出物からサイズによって分離したタンパク質のウェスタンブロットの結果である。主要な、ウェスタン分析に使用したポリクローナル抗体は、図１３においてアスタリスクでしるしをつけたひと続きのアミノ酸に対応する、オオムギのＭＭＴの１５残基長の合成ペプチドに対して生じた。
【図１５−１】図１５は、変異体８０６３のＭＭＴ遺伝子におけるＧ３０７６→Ａ変異を特徴とする子実を同定するための手法についての図を示す図である。（Ａ）対応する反応のアガロースゲル電気泳動後のエチジウムブロマイド染色されたバンドによって模式図的に示されるように（Ｃ）、プライマーセット２０（表７参照）により、仮定的な反応１では２７１−ｂｐのＰＣＲ断片がもたらされ、仮定的な反応２では断片がもたらされない。仮定的な反応３および４では（Ｂ）、反応４のみでＰＣＲ断片が生成する。水平方向の矢印は鋳型ＤＮＡに対して完全に配列が適合することを示し、鋭く曲がった矢印はミスマッチを示す。（Ｄ）栽培品種Ｐｒｅｓｔｉｇｅの野生型穀粒（レーン２）の１２０ｋＤａのＭＭＴ酵素を認識するが、変異体８０６３のＭＭＴ酵素は認識しない抗ＭＭＴ抗体を用いたウェスタンブロット分析である。標準のタンパク質をレーン１で分離し、対応する質量をｋＤａで示した。
【図１５−２】図１５は、変異体８０６３のＭＭＴ遺伝子におけるＧ３０７６→Ａ変異を特徴とする子実を同定するための手法についての図を示す図である。（Ａ）対応する反応のアガロースゲル電気泳動後のエチジウムブロマイド染色されたバンドによって模式図的に示されるように（Ｃ）、プライマーセット２０（表７参照）により、仮定的な反応１では２７１−ｂｐのＰＣＲ断片がもたらされ、仮定的な反応２では断片がもたらされない。仮定的な反応３および４では（Ｂ）、反応４のみでＰＣＲ断片が生成する。水平方向の矢印は鋳型ＤＮＡに対して完全に配列が適合することを示し、鋭く曲がった矢印はミスマッチを示す。（Ｄ）栽培品種Ｐｒｅｓｔｉｇｅの野生型穀粒（レーン２）の１２０ｋＤａのＭＭＴ酵素を認識するが、変異体８０６３のＭＭＴ酵素は認識しない抗ＭＭＴ抗体を用いたウェスタンブロット分析である。標準のタンパク質をレーン１で分離し、対応する質量をｋＤａで示した。
【図１６−１】図１６は、オオムギの変異体１４０１８がどのようにＭＭＴ遺伝子の潜在的なスプライス部位を活性化するかを示す図である。（Ａ）ＭＭＴ遺伝子のゲノム構造図の下の水平方向の小さな矢印は、プライマーセット１６（表４参照）のおよそのアニーリング位置を示している。（Ｂ）野生型（栽培品種Ｓｅｂａｓｔｉａｎ）または変異体１４０１８のいずれかからのＲＮＡ鋳型を使用したＲＴ−ＰＣＲ分析の生成物をアガロースゲル電気泳動した後のＤＮＡバンドを視覚化した図である。（Ｃ）Ａと同じグラフ要素を用いてパネルＢのＰＣＲ生成物のイントロン−エクソン構造を示している図である。生成物８のエクソン２は、野生型のエクソン２と比較して切断されている。垂直方向の矢じりは中途翻訳終止コドンのおよその位置を指している。プライマーの選択に起因して、生成物はエクソン１を含まない。しかし、ｍＲＮＡはエクソン１も含むことが予想される。（Ｄ）変異した（Ｍｕｔ．）イントロン２の５’スプライス部位および野生型（ＷＴ）のイントロン２の５’スプライス部位から生じた転写物を、下線を付した塩基によって変異部位を示して詳細に図示している。７および８と標識された実線でつながった矢印は、それぞれ、生成物７および生成物８のスプライシングの間に利用される供与部位および受容部位を示している（パネルＣ参照）。６＊としるしが付いた破線は、野生型の転写物（パネルＣにおける生成物５）のスプライシングおよびスプライシングされていない生成物６（パネルＣ参照）を指している。エクソンおよびイントロン２の塩基は、それぞれ、小文字および大文字にしてある。ｎｔはヌクレオチドである。（Ｅ）単子葉植物における５’スプライス部位および３’スプライス部位の組成（ＳｉｎｉｂａｌｄｉおよびＭｅｔｔｌｅｒ、上記）を変異体１４０１８のＭＭＴ遺伝子におけるイントロン２の配列と比較した概要である。
【図１６−２】図１６は、オオムギの変異体１４０１８がどのようにＭＭＴ遺伝子の潜在的なスプライス部位を活性化するかを示す図である。（Ａ）ＭＭＴ遺伝子のゲノム構造図の下の水平方向の小さな矢印は、プライマーセット１６（表４参照）のおよそのアニーリング位置を示している。（Ｂ）野生型（栽培品種Ｓｅｂａｓｔｉａｎ）または変異体１４０１８のいずれかからのＲＮＡ鋳型を使用したＲＴ−ＰＣＲ分析の生成物をアガロースゲル電気泳動した後のＤＮＡバンドを視覚化した図である。（Ｃ）Ａと同じグラフ要素を用いてパネルＢのＰＣＲ生成物のイントロン−エクソン構造を示している図である。生成物８のエクソン２は、野生型のエクソン２と比較して切断されている。垂直方向の矢じりは中途翻訳終止コドンのおよその位置を指している。プライマーの選択に起因して、生成物はエクソン１を含まない。しかし、ｍＲＮＡはエクソン１も含むことが予想される。（Ｄ）変異した（Ｍｕｔ．）イントロン２の５’スプライス部位および野生型（ＷＴ）のイントロン２の５’スプライス部位から生じた転写物を、下線を付した塩基によって変異部位を示して詳細に図示している。７および８と標識された実線でつながった矢印は、それぞれ、生成物７および生成物８のスプライシングの間に利用される供与部位および受容部位を示している（パネルＣ参照）。６＊としるしが付いた破線は、野生型の転写物（パネルＣにおける生成物５）のスプライシングおよびスプライシングされていない生成物６（パネルＣ参照）を指している。エクソンおよびイントロン２の塩基は、それぞれ、小文字および大文字にしてある。ｎｔはヌクレオチドである。（Ｅ）単子葉植物における５’スプライス部位および３’スプライス部位の組成（ＳｉｎｉｂａｌｄｉおよびＭｅｔｔｌｅｒ、上記）を変異体１４０１８のＭＭＴ遺伝子におけるイントロン２の配列と比較した概要である。
【図１７−１】図１７は、変異体１４０１８の異常性のＭＭＴを異種発現させるための発現プラスミド、およびコードされているタンパク質のアラインメントを示す図である。（Ａ）エンテロキナーゼ部位（＊＊；配列ＳＳＧＨＩＤＤＤＤＫＨ；配列番号７０）を伴うＨｉｓタグ（＊；配列ＭＧＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨ；配列番号６９）を特定している配列にインフレームで融合した野生型ＭＭＴをコードするｐＥＴ１９ｂ−ＭＭＴの、選択された制限部位を含むＮｃｏＩ−ＢａｍＨＩ断片の図である。（Ｂ）、（Ｃ）および（Ｄ）に、欠失構築物を例示している。（Ｅ）コードされているＭＭＴ配列（Ａ、Ｂ、ＣおよびＤに示している構築物に対して、それぞれ、配列番号１８、２２、２４、２６）のアラインメントである。野生型酵素（配列番号１８）の残基番号２１３から１０８４にわたる配列は示していない。
【図１７−２】図１７は、変異体１４０１８の異常性のＭＭＴを異種発現させるための発現プラスミド、およびコードされているタンパク質のアラインメントを示す図である。（Ａ）エンテロキナーゼ部位（＊＊；配列ＳＳＧＨＩＤＤＤＤＫＨ；配列番号７０）を伴うＨｉｓタグ（＊；配列ＭＧＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨ；配列番号６９）を特定している配列にインフレームで融合した野生型ＭＭＴをコードするｐＥＴ１９ｂ−ＭＭＴの、選択された制限部位を含むＮｃｏＩ−ＢａｍＨＩ断片の図である。（Ｂ）、（Ｃ）および（Ｄ）に、欠失構築物を例示している。（Ｅ）コードされているＭＭＴ配列（Ａ、Ｂ、ＣおよびＤに示している構築物に対して、それぞれ、配列番号１８、２２、２４、２６）のアラインメントである。野生型酵素（配列番号１８）の残基番号２１３から１０８４にわたる配列は示していない。
【図１８】図１８は、実験の詳細を実施例１５に記載している、それぞれ、栽培品種Ｐｒｅｓｔｉｇｅおよび変異体１４０１８からの野生型ＭＭＴおよび変異体型ＭＭＴをＥ．ｃｏｌｉにおいて異種発現させた、ＨＰＬＣに基づく実験結果を示す図である。純粋なＳＭＭおよびベクターｐＥＴ１９ｂで形質転換したＥ．ｃｏｌｉ細胞が、実験の対照試料として機能した。比較のために、アスタリスクでしるしをつけたクロマトグラムも図１４Ａの不可欠な部分である。
【図１９−１】図１９は、変異体１４０１８のＭＭＴ遺伝子におけるＧ１４６２→Ａ変異を特徴とする子実を同定するための遺伝学的手法に対する図を示す図である。（Ａ）対応する反応のアガロースゲル電気泳動後のエチジウムブロマイド染色されたバンドによって模式図的に示されるように（Ｃ）、プライマーセット２９（表９参照）により、仮定的な反応１では１２１ｂｐのＰＣＲ断片がもたらされ、仮定的な反応２では断片がもたらされない。仮定的な反応３および４では（Ｂ）、反応４のみでＰＣＲ断片が生成する（１２３ｂｐ）。水平方向の矢印は鋳型ＤＮＡに対して完全に配列が適合することを示し、鋭く曲がった矢印はミスマッチを示す。（Ｄ）栽培品種Ｓｅｂａｓｔｉａｎの野生型穀粒（レーン２）の１２０ｋＤａのＭＭＴ酵素を認識するが、変異体１４０１８のＭＭＴ酵素は認識しない抗ＭＭＴ抗体を用いたウェスタンブロット分析である。標準のタンパク質をレーン１で分離し、対応する質量をｋＤａで示した。
【図１９−２】図１９は、変異体１４０１８のＭＭＴ遺伝子におけるＧ１４６２→Ａ変異を特徴とする子実を同定するための遺伝学的手法に対する図を示す図である。（Ａ）対応する反応のアガロースゲル電気泳動後のエチジウムブロマイド染色されたバンドによって模式図的に示されるように（Ｃ）、プライマーセット２９（表９参照）により、仮定的な反応１では１２１ｂｐのＰＣＲ断片がもたらされ、仮定的な反応２では断片がもたらされない。仮定的な反応３および４では（Ｂ）、反応４のみでＰＣＲ断片が生成する（１２３ｂｐ）。水平方向の矢印は鋳型ＤＮＡに対して完全に配列が適合することを示し、鋭く曲がった矢印はミスマッチを示す。（Ｄ）栽培品種Ｓｅｂａｓｔｉａｎの野生型穀粒（レーン２）の１２０ｋＤａのＭＭＴ酵素を認識するが、変異体１４０１８のＭＭＴ酵素は認識しない抗ＭＭＴ抗体を用いたウェスタンブロット分析である。標準のタンパク質をレーン１で分離し、対応する質量をｋＤａで示した。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
定義
以下の説明、図、および表では、多くの用語が用いられる。このような用語に所与の範囲を含め、本明細書および特許請求の範囲を記載する目的で、以下の定義を与える。
【００２７】
本明細書で用いられる「ある」とは、それが用いられる文脈に応じて、１または複数を意味し得る。
【００２８】
「農業形質」という用語は、その効力または経済的価値に寄与する、植物体の表現型形質または遺伝形質について説明する。このような形質には、病害耐性、虫害耐性、ウイルス耐性、線虫耐性、干ばつ忍容性、高塩分忍容性、収量、草高、成熟日数、穀粒の粒ぞろい（すなわち、穀粒サイズの画分）、穀粒の窒素含量などが含まれる。
【００２９】
特に、ビール製造工程に関して、特に、モルト化工程を説明するのに用いる場合の「オオムギ」という用語は、オオムギの穀粒を意味する。別段に指定しない限り、他のすべての場合、「オオムギ」が任意の品種を含めたオオムギ植物体（Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ， Ｌ．）を意味するのに対し、オオムギ植物体の一部とは、オオムギ植物体の任意の部分、例えば、任意の組織または細胞であり得る。
【００３０】
本明細書で定義される「穀類」植物とは、主にそれらのデンプン含有種子のために栽培される、Ｇｒａｍｉｎｅａｅ（Ｇｒａｍｉｎａｅ）科植物のメンバーである。穀類植物には、オオムギ（Ｈｏｒｄｅｕｍ属）、コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ属）、コメ（Ｏｒｙｚａ属）、トウモロコシ（Ｚｅａ属）、ライムギ（Ｓｅｃａｌｅ属）、オートムギ（Ａｖｅｎａ属）、ソルガム（Ｓｏｒｇｈｕｍ属）、ならびにライムギとコムギとの交配種であるライコムギが含まれるが、これらに限定されない。
【００３１】
本明細書で用いられる「ＤＭＳＰ」とは、ＤＭＳ前駆体またはＤＭＳ潜在体、すなわち、飲料の作製時においてＤＭＳへと転換され得る分子の略号である。ＳＭＭが、ＤＭＳＰの全部ではないにせよ、その主要部分を占める。本明細書では、特定の植物物質またはその生成物中において、アルカリ性の条件で１時間にわたり煮沸することによりＤＭＳＰから生成され得るＤＭＳの量として、ＤＭＳＰレベルを定義する。本明細書で定義される１ｐｐｂのＤＭＳＰは、１ｐｐｂのＤＭＳに転換され得る。
【００３２】
特定の核酸との関連における「コードする」または「コードされる」とは、特定のタンパク質へと翻訳される情報を含むことを意味する。タンパク質をコードする核酸は、その翻訳領域内において非翻訳配列（例えば、イントロン）を含む場合もあり、このように介在する非翻訳配列を欠く（例えば、ｃＤＮＡにおいて）場合もある。タンパク質をコードする情報は、コドンを用いることにより指定される。
【００３３】
核酸と関連して本明細書で用いられる「発現」とは、核酸断片に由来するセンスｍＲＮＡまたはアンチセンスＲＮＡの転写および蓄積として理解されるものとする。タンパク質との関連で用いられる「発現」とは、ｍＲＮＡがポリペプチドへと翻訳されることを指す。
【００３４】
「遺伝子」という用語は、ポリペプチド鎖の生成に関与するＤＮＡ断片を意味し、該コード領域に先行および後続する領域（プロモーター領域およびターミネーター領域）を包含する。さらに、植物の遺伝子は、それらがコードするタンパク質について不連続であり、イントロンを介在させるエクソンからなる。ＲＮＡへと転写されると、スプライシングによりイントロンが除去されて、成熟メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）が生成される。エクソン間の「スプライス部位」は、一次ＲＮＡ転写物からのイントロンの欠失と、切除されたイントロンの両側において残存するＲＮＡ端の接合または融合とからなる、スプライシング過程のスプライスシグナルとして作用するコンセンサス配列により決定されることが典型的である。
【００３５】
本明細書で用いられる「発芽」という用語は、天然で見出される通常の土壌など、各種の組成物中において、オオムギ穀粒の成長が開始または再開されることを意味する。発芽はまた、成長チャンバーなどの中に置いたポットの土壌中で生じる場合もあり、例えば、標準的な実験室用ペトリディッシュ内に置いて湿らせた濾紙上で生じる場合もあり、モルト化時において（例えば、モルト化工場のスティープタンクまたは発芽箱内において）生じる場合もある。発芽は一般に、穀粒の水和、穀粒の膨潤、および胚芽の成長の誘導を包含すると理解される。発芽に影響する環境因子には、水分、温度、および酸素レベルが含まれる。根および芽の発育が観察される。
【００３６】
本明細書で用いられる「単離」という用語は、物質を、その元の環境から取り出すことを意味する。例えば、生体内に存在する天然のポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されていないが、天然系において共存する物質の一部または全部から分離された同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、単離されている。このようなポリヌクレオチドはベクターの一部の場合もあろうし、かつ／またはこのようなポリヌクレオチドもしくはポリペプチドは組成物の一部の場合もあろうが、このようなベクターまたは組成物はその天然環境の一部ではないので、これらはやはり単離されている。
【００３７】
「穀粒」という用語は、また、内種子とも称する穀類の頴果、外頴、および内頴を含むものと定義される。大半のオオムギ品種では、外頴および内頴が頴果に付着し、脱穀後における穀粒の一部をなす。しかし、裸性のオオムギ品種もまた生じる。これらにおいては、頴果が、外頴および内頴から遊離しており、コムギの場合と同様に、脱穀により完全に遊離する。本明細書では、「穀粒（ｋｅｒｎｅｌ）」および「穀粒（ｇｒａｉｎ）」という用語を互換的に用いる。
【００３８】
「穀粒の発生」とは、受精と共に始まり、代謝による貯蔵物質、例えば、糖、オリゴ糖、デンプン、フェノール性物質、アミノ酸、およびタンパク質が、液胞の標的化を伴い、また、これを伴わずに、穀粒内の各種の組織、例えば、内胚乳、種皮、糊粉、および胚盤へと蓄積され、これにより穀粒の拡大、穀粒の充実がもたらされ、穀粒の成熟および乾燥により終わる、オオムギの生活環を指す。
【００３９】
「機能的ＭＭＴの完全な喪失」および「ＭＭＴ活性の完全な喪失」という用語は、ＭＭＴ酵素活性の欠如、すなわち、本明細書下記の実施例２で説明されるアッセイを用いるとき、検出可能なＭＭＴ活性を伴わないオオムギ植物体を指す。代替的に、オオムギ植物体のＭＭＴ活性は、前記オオムギのＭＭＴ ｃＤＮＡを単離し、前記ｃＤＮＡによりコードされるタンパク質が、ＳＡＭからＭｅｔへのメチル基の移動を触媒し、これにより、ＳＭＭを形成することが可能であるかどうかを判定することにより決定される。
【００４０】
「モルト飲料」という用語は、モルト化させたオオムギとモルト化させていないオオムギとの混合物など、場合によって、他の成分と混合したモルトを用いて調製される飲料、好ましくは、モルトを熱湯と共にインキュベートする工程を包含する方法により調製される飲料を指す。モルト飲料は、例えば、ビールまたはモルティナであり得る。
【００４１】
「発酵モルト飲料」という用語は、例えば、酵母と共にインキュベートして発酵させたモルト飲料を指す。
【００４２】
「ＭＭＴ活性」という用語は、オオムギのメチオニン−Ｓ−メチルトランスフェラーゼ酵素の酵素活性を指す。本発明の文脈における「ＭＭＴ活性」とは、ＳＭＭをもたらす、Ｍｅｔの硫黄原子におけるＭＭＴ触媒のメチル化である。ＭＭＴ酵素は、他の反応も触媒することが可能であり得るが、本発明によるＭＭＴ活性を決定する目的では、ＳＭＭ形成活性だけを考慮すべきである。図１Ｂは、メチル化により、ＭｅｔがＳＭＭへと転換される生化学反応を概観する。
【００４３】
「モルト化」とは、モルト化工場のスティープタンクおよび発芽箱内であるが、これらに限定されない、制御された環境条件下で生じる、オオムギ穀粒発芽の特殊な形態である。本発明の工程によれば、モルト化は、オオムギ穀粒がスティーピングされる間および／またはスティーピングされた後で生じ始める。モルト化工程は、例えば、キルン乾燥工程においてオオムギ穀粒を乾燥させることにより、停止させることができる。モルトがキルン乾燥されていない場合は、「グリーンモルト」と称する。ＭＭＴヌルのオオムギから調製されたモルト組成物は、純粋のＭＭＴヌルのモルト、またはＭＭＴヌルのモルトを含む任意のモルトブレンドなど、ＭＭＴヌルのモルトを含むものと理解される。モルトは、例えば、破砕することにより加工することができ、この場合、モルトはまた、「粉砕モルト」または「粉末モルト」とも称し得る。
【００４４】
「マッシング」とは、水中における粉砕モルトのインキュベーションである。マッシングは、所望の形で基質を酵素的に脱重合化することを可能とする特定の温度および特定の水量で実施することが好ましい。温度および水量は、モルトに由来する酵素活性の低下率に影響を及ぼし、このため、とりわけ、生じ得るデンプンの加水分解量に影響を及ぼすので重要である。プロテアーゼ作用もまた重要であり得る。マッシングは、全穀粒として、またはすべてが主に抽出物のさらなる供給源として用いられる粗引き穀物もしくはデンプンなどの加工生成物（ウォート煮沸時にはシロップを投与することが典型的である）としてのオオムギ（ＭＭＴヌルのオオムギを含めた）、またはトウモロコシ、またはコメなどであるがこれらに限定されない、モルト以外の任意の炭水化物供給源を含むものと理解される添加物の存在下で行い得る。醸造における添加物を加工するための要件は、用いられる添加物の状態および種類、ならびに、特に、デンプンのゼラチン化温度または液化温度に依存する。該ゼラチン化温度が通常のモルトの糖化温度のためのゼラチン化温度より高温である場合は、マッシュに添加する前に、該デンプンをゼラチン化および液化させる。
【００４５】
所与の変異が、例えば、≧Ｍ３の世代において、ホモ接合型の遺伝子特徴として固定される場合、本明細書では、対応するオオムギ植物体を、「変異体」または「変異系統」または「系統」と互換的に称する。
【００４６】
「変異」には、遺伝子のコード領域および非コード領域内における欠失、挿入、置換、トランスバージョン、および点変異が含まれ、この場合、該非コード領域は、プロモーター領域またはイントロンであることが好ましい。欠失は、全遺伝子の欠失の場合もあり、該遺伝子の一部だけの欠失の場合もある。点変異は、１塩基または１塩基対の変化に関し、その結果として、終止コドン、フレームシフト変異、またはアミノ酸置換をもたらし得る。体細胞変異は、植物体の特定の細胞または組織内だけにおいて生じ、次世代には遺伝しない変異である。生殖細胞系列変異は、植物体の任意の細胞内において見出すことができ、遺伝する。本明細書の図７（この図は、変異したオオムギの穀粒が、育種プログラムにおいて、どのようにして繁殖し得るかについての概要を提示する）を参照すると、Ｍ３世代の穀粒、ならびにこれらから直接的に繁殖した穀粒、またはそれらの植物体を含めた、任意の後続世代の穀粒を、「生の変異体」と称することができる。さらに、なおも本明細書の図７を参照すると、「育種系統」という用語は、栽培品種の植物体との異種交配の結果の場合もあり、別個の特異的な形質を有する別の育種系統との異種交配の結果の場合もある、Ｍ４世代の穀粒、ならびにこれらの植物体を含めた任意の後続世代を指す。
【００４７】
本明細書で用いられる「ＭＭＴヌル」という用語は、機能的なメチオニン−Ｓ−メチルトランスフェラーゼ酵素の完全な喪失を指す。したがって、「ＭＭＴヌルのオオムギ植物体」とは、ＭＭＴをコードする遺伝子における、その結果として機能的ＭＭＴの完全な喪失をもたらす変異を含むオオムギ植物である。同様に、「ＭＭＴヌルの穀粒」とは、ＭＭＴをコードする遺伝子における、その結果として機能的ＭＭＴの完全な喪失をもたらす変異を含む穀粒である、などという。
【００４８】
例えば、「オオムギ植物体またはその一部」という語句の意味の範囲内に含まれる、「オオムギ植物体の一部」という用語は、オオムギ植物体の細胞、オオムギ植物体のプロトプラスト、そこからオオムギ植物体が再生され得る植物細胞組織の培養物、オオムギ植物体のカルス、ならびに、胚芽、花粉、胚珠、花、穀粒、葉、根、根端、葯、または植物体の任意の部分など、植物体またはオオムギ植物体の大部分において完全なオオムギ植物体の細胞を包含する。
【００４９】
「ＰＣＲ」または「ポリメラーゼ連鎖反応」は、特定のＤＮＡ断片を増幅するのに用いられる技法として、当業者により周知である（Ｍｕｌｌｉｓ， Ｋ．Ｂ．らによる米国特許第４，６８３，１９５号および同第４，８００，１５９号）。また、逆転写（ＲＴ−）ＰＣＲも、当業者により周知である。生物学的試料に対するＲＴ−ＰＣＲの実施は、特定の遺伝子について、発現したｍＲＮＡを検出することを目的とする。ＭＭＴとの関連において、ＲＴ−ＰＣＲは一般に、ＭＭＴについてのｍＲＮＡを含有することが疑われる試料を得る工程と、逆転写酵素、ポリメラーゼ、および特定のプライマー対により、該試料に対してＲＴ−ＰＣＲを実施して、それが存在する場合の該ＲＮＡを増幅する工程と、該試料中における、ＭＭＴをコードするＲＮＡが存在することの指標としての増幅産物を検出する工程とを包含する。プライマーは、対になって作用する（「フォワードプライマー」（または「アッパーストランドプライマー」もしくは「順方向プライマー」）と、「リバースプライマー」（または「ローワーストランドプライマー」）との対）。本明細書では、プライマー配列を、５’から３’への方向で示す。
【００５０】
「植物生成物」という用語は、植物体または植物体の一部を加工する結果として得られる生成物を意味する。例えば、前記植物生成物は、モルト、ウォート、発酵飲料もしくは非発酵飲料、食物生成物、または飼料生成物であり得る。
【００５１】
本出願の意味の範囲内における「専門家によるビール試飲パネル」とは、エステル、高度数アルコール、脂肪酸、硫黄成分、およびこくに特別の焦点を当てて、ビールの風味を味わい、説明することにおいて高度に熟練した専門家によるパネルである。風味成分を評価するための分析ツールは多数存在するが、風味活性成分の相対的重要性を分析的に評価することは難しい。しかし、風味の専門家によれば、このような複雑な特性を評価することができる。彼らの持続的な訓練には、特定濃度のビール成分（例えば、酢酸イソアミル、酢酸エチル、ヘキサン酸エチル（ｅｔｈｙｌ ｈｅｘａｎｏｔｅ）、およびイソアミルアルコール）をスパイクした標準的なビール試料の試飲および評価が含まれる。
【００５２】
「スプライス部位」という用語は、遺伝子のエクソンとイントロンとの間の境界部位を意味する。したがって、スプライス部位は、エクソンからイントロンへと移行する境界部位（また、「ドナー部位」とも呼ばれる）の場合もあり、イントロンをエクソンから隔てる境界部位（また、「アクセプター部位」とも呼ばれる）の場合もある。植物体におけるスプライス部位は、コンセンサス配列を含むことが典型的である。イントロンの５’端は、一般に、保存的なＧＴジヌクレオチド（ｍＲＮＡではＧＵ）からなり、イントロンの３’端は、通常、保存的なＡＧジヌクレオチドからなる。したがって、イントロンの５’側スプライス部位は、イントロンの５’端を含み、該３’側スプライス部位は、イントロンの３’端を含む。本発明の文脈の範囲内では、イントロンのスプライス部位は、
（ｉ）一般にＧＴである、該イントロンの大半の５’側ジヌクレオチドからなる、５’側スプライス部位；または
（ｉｉ）一般にＡＧである、該イントロンの大半の３’側ジヌクレオチドからなる、３’側スプライス部位
であることが好ましい。
【００５３】
「クリプトスプライス部位」は、通常の条件下では認識されず、したがって、通常はスプライシングを引き起こさない。しかし、天然のエレメント内に点変異を保有する転写物内では、このような部位が活性化されて、スプライシングイベントを引き起こし得る。
【００５４】
「組織培養物」とは、種類が同じであるかもしくは異なる単離細胞、または植物体の一部、例えば、プロトプラスト、カルス、胚芽、花粉、葯などへと組織化されたこのような細胞の集合を含む組成物を指す。
【００５５】
「野生オオムギ」（Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ ｓｓｐ． ｓｐｏｎｔａｎｅｕｍ）は、今日におけるオオムギの栽培形態の前駆体であると考えられる。野生状態から栽培状態へのオオムギの移行は、「オオムギ在来種」への該植物体の栽培化と符合したと考えられている。これらは、野生オオムギより、新型栽培品種との遺伝子的類縁性がより密接である。
【００５６】
「野生型」オオムギという用語は、従来の方法で生成されたオオムギ植物体を指し、該用語は、本発明のオオムギ植物体が由来するオオムギ植物体、すなわち、親植物体を指すことが好ましい。野生型オオムギ穀粒は、一般に、例えば、種子メーカーから、「栽培品種」（「ｃｖｓ．」と略記することが多い）、すなわち、米国国立の植物育種機関により列挙される遺伝子的に類似の穀粒として市販されている。本明細書では、「栽培品種」および「品種」という用語は、互換的に用いられる。
【００５７】
「ウォート」という用語は、モルト、例えば、粉砕モルトもしくはグリーンモルト、または破砕グリーンモルトの液体抽出物を意味する。前記モルトに加えて、該液体抽出物は、モルトと、発酵性の糖へと部分的に転換されるさらなるデンプン含有物質など、さらなる成分とから調製することができる。ウォートは、一般に、マッシングにより得られるが、場合によって、「スパージング」、すなわち、マッシング後において、ビール粕から、残存する糖および他の化合物を熱湯により抽出する工程をその後で実施する。スパージングは、ロイタータン、マッシュフィルター、またはビール粕から抽出される液体の分離を可能とする別の装置内で実施することが典型的である。マッシング後において得られるウォートを、一般に、「一番ウォート」と称するのに対し、スパージング後において得られるウォートを、一般に、「二番ウォート」と称する。指定しない限り、ウォートという用語は、一番ウォートの場合もあり、二番ウォートの場合もあり、両者の組合せの場合もある。ビール生産時には、一般に、ウォートをホップと共に煮沸する。ホップを伴うが煮沸せずに調製したウォートをまた、「スイートウォート」とも称し得るのに対し、ホップを伴うかまたは伴わずに煮沸したウォートは、「煮沸ウォート」と称し得る。
【００５８】
オオムギ植物体
オオムギとは、植物の科である。野生オオムギ（Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ ｓｓｐ． ｓｐｏｎｔａｎｅｕｍ）は、今日におけるオオムギの栽培形態の前駆体であると考えられる。野生状態から栽培状態へのオオムギの移行は、多数の遺伝子座における対立遺伝子の根本的な変化の頻度と符合したと考えられている。希少な対立遺伝子、および新規の変異イベントは、「オオムギ在来種」と称する栽培化された植物体集団内において新規の形質を迅速に確立した農耕民により、肯定的に選択された。これらは、野生オオムギより、新型栽培品種との遺伝子的類縁性がより密接である。１９世紀後半まで、オオムギ在来種は、早期世代における無作為的な異種交配に由来する少数の植物体を含めた、近交系と交配分離種との高度にヘテロ接合型の混合体として存在した。該在来種の大半は、先進農業において、純粋系統の栽培品種により置き換えられている。中等レベルまたは高レベルの遺伝子的多様性が、残りの在来種を特徴付けている。当初、「新型オオムギ」栽培品種は、在来種からの選択を表していた。これらは後に、地理的起源が多様な純粋系統など、確立された純粋系統間における異種交配の継起的サイクルに由来した。最終的な結果は、多くの、おそらくはすべての先進農業における遺伝的基盤の顕著な狭小化であった。在来種と比較して、新型オオムギ栽培品種は、例えば、
（ｉ）穀粒が皮裸性であること；
（ｉｉ）種子の休眠；
（ｉｉｉ）病害耐性；
（ｉｖ）環境忍容性（例えば、干ばつまたは土壌ｐＨに対する耐性）；
（ｖ）リシンおよび他のアミノ酸の比率；
（ｖｉ）タンパク質含量；
（ｖｉｉ）窒素含量；
（ｖｉｉｉ）炭水化物組成；
（ｉｘ）ホルデイン組成
などであるがこれらに限定されない多くの特性が改善されている（Ｎｅｖｏ、１９９２年； ｖｏｎ Ｂｏｔｈｍｅｒ、１９９２年）。
【００５９】
本発明の範囲内において、「オオムギ」という用語は、任意のオオムギ植物体を含む。したがって、本発明は、ＭＭＴをコードする遺伝子における、その結果として機能的ＭＭＴの完全な喪失をもたらす変異を保有する、任意のオオムギ植物体に関する。
【００６０】
しかし、本発明により用いるのに好ましいオオムギ植物体は、新型オオムギ栽培品種または純粋系統である。本発明により用いられるオオムギ栽培品種は、例えば、Ｓｅｂａｓｔｉａｎ、Ｃｅｌｅｓｔｅ、Ｔａｎｇｅｎｔ、Ｌｕｘ、Ｐｒｅｓｔｉｇｅ、Ｓａｌｏｏｎ、Ｎｅｒｕｄａ、Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ、Ｋｌａｇｅｓ、Ｍａｎｌｅｙ、Ｓｃｈｏｏｎｅｒ、Ｓｔｉｒｌｉｎｇ、Ｃｌｉｐｐｅｒ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ、Ａｌｅｘｉｓ、Ｂｌｅｎｈｅｉｍ、Ａｒｉｅｌ、Ｌｅｎｋａ、Ｍａｒｅｓｉ、Ｓｔｅｆｆｉ、Ｇｉｍｐｅｌ、Ｃｈｅｒｉ、Ｋｒｏｎａ、Ｃａｍａｒｇｕｅ、Ｃｈａｒｉｏｔ、Ｄｅｒｋａｄｏ、Ｐｒｉｓｍａ、Ｕｎｉｏｎ、Ｂｅｋａ、Ｋｙｍ、アサヒ５号、ＫＯＵ Ａ、Ｓｗａｎ Ｈａｌｓ、カントウナカテゴールド、ハカタ２号、キリン直１号、関東後期品種ゴールド、フジニジョウ、ニューゴールデン、サツキオニジョウ、セイジョウ１７号、アカギニジョウ、アズマゴールデン、アマギニジョウ（Ａｍａｇｉ Ｎｉｊｐｏ）、ニシノゴールド、ミサトゴールデン、ハルナニジョウ、Ｓｃａｒｌｅｔｔ、Ｑｕｅｎｃｈ、ＮＦＣ Ｔｉｐｐｌｅ、およびＪｅｒｓｅｙからなる群から、好ましくは、ハルナニジョウ、Ｓｅｂａｓｔｉａｎ、Ｔａｎｇｅｎｔ、Ｌｕｘ、Ｐｒｅｓｔｉｇｅ、Ｓａｌｏｏｎ、Ｎｅｒｕｄａ、Ｐｏｗｅｒ、Ｑｕｅｎｃｈ、およびＮＦＣ Ｔｉｐｐｌｅからなる群から選択することができる。
【００６１】
したがって、本発明の一実施形態では、前記植物体が、ＭＭＴをコードする遺伝子における、その結果として機能的ＭＭＴの完全な喪失をもたらす変異を保有し新型オオムギ栽培品種であり、本明細書の前記で説明したオオムギ栽培品種の群から選択される栽培品種のうちの１つであることが好ましい。したがって、この実施形態では、オオムギ植物体が、オオムギ在来種ではないことが好ましい。
【００６２】
オオムギ植物体は、任意の適切な形態であり得る。例えば、本発明によるオオムギ植物体は、生存オオムギ植物体、乾燥植物体、ホモジナイズされた植物体、または破砕オオムギ穀粒であり得る。植物体は、成熟植物体、胚芽、発芽穀粒、モルト化穀粒、粉砕モルト化穀粒などであり得る。
【００６３】
オオムギ植物体の一部は、穀粒、胚芽、葉、茎、根、花、またはこれらの断片など、該植物体の任意の適切な部分であり得る。断片は、例えば、穀粒、胚芽、葉、茎、根、または花の切片であり得る。オオムギ植物体の一部はまた、ホモジネートの断片、抽出物の断片、または破砕オオムギ植物体もしくは破砕穀粒の断片でもあり得る。
【００６４】
本発明の一実施形態では、オオムギ植物体の一部が、前記オオムギ植物体の細胞、好ましくは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、例えば、細胞培養物または組織培養物中で増殖させ得る生細胞であり得る。特に、一実施形態では、前記細胞が、全オオムギ植物体へと成熟することが不可能な細胞、すなわち、生殖材料ではない細胞であり得る。
【００６５】
機能的ＭＭＴ酵素の喪失
本発明は、オオムギ植物体またはその一部から調製される飲料などの植物生成物であって、前記オオムギ植物体が、ＭＭＴ遺伝子における、その結果として機能的ＭＭＴ酵素の喪失、例えば、野生型オオムギにおける対応するレベルと比較して、好ましくは、本明細書の上記で説明した野生型オオムギ栽培品種のうちのいずれかと比較して、より好ましくは、野生型オオムギ栽培品種であるＰｒｅｓｔｉｇｅと比較して、ＭＭＴ活性の少なくとも９０％の喪失、好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９９％、さらにより好ましくは少なくとも９９．５％の喪失をもたらす変異を保有する植物生成物に関する。前記オオムギ植物体は、ＭＭＴをコードする遺伝子における、その結果としてＭＭＴ機能の完全な喪失をもたらす変異を有する最も好ましい。
【００６６】
機能的ＭＭＴ酵素の完全な喪失は、異なる機構に基づき得る。例えば、機能的ＭＭＴ酵素の完全な喪失は、前記植物体内において機能不全のタンパク質、すなわち、検出可能な活性を伴わない変異体のＭＭＴタンパク質など、機能不全のＭＭＴ酵素から結果としてもたらされ得る。例えば、該変異体のＭＭＴタンパク質は、切断型タンパク質であり得る。ＭＭＴ活性の喪失は、異なる機構、例えば、機能不全のＭＭＴタンパク質にも同様に基づき得る。
【００６７】
変異したＭＭＴタンパク質の活性は、それが、ＳＡＭからＭｅｔへのメチル基の移動を触媒し、これにより、ＳＭＭを形成する能力により決定される。これは、例えば、本明細書下記の実施例４で説明する通りに試みることができる。好ましくは、変異したＭＭＴのアミノ酸配列は、対応する、単離オオムギｃＤＮＡの翻訳配列を決定することにより得られる。これは、本質的に、本明細書下記の実施例８で説明する通りに行うことができる。代替的に、本発明のオオムギ植物体の変異したＭＭＴは、本明細書下記の実施例１１および実施例１２で説明する通り、細菌細胞培養物中における異種発現の後、該組換えタンパク質が、ＭＭＴ酵素として不活性であることを検証することにより得られる。
【００６８】
機能的ＭＭＴの完全な喪失は、ＭＭＴタンパク質の欠如により実現することができる。ＭＭＴタンパク質の欠如は、ＭＭＴ機能の喪失をもたらす。したがって、オオムギ植物体は、ＭＭＴタンパク質を含まない場合もあり、ごくわずかだけ含む場合もあるが、検出可能なＭＭＴタンパク質を含まない場合が好ましい。ＭＭＴタンパク質の存在または不在は、当業者に公知の任意の適切な手段により検出することができる。しかし、該タンパク質（複数可）は、ＭＭＴタンパク質が、ＭＭＴを認識する特異的抗体により検出される技法により解析されることが好ましい。前記技法は、例えば、ウェスタンブロットアッセイの場合もあり、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫測定）アッセイの場合もあり、前記特異的抗体は、モノクローナル抗体の場合もあり、ポリクローナル抗体の場合もあり得る。しかし、前記抗体は、ＭＭＴタンパク質内における複数の異なるエピトープを認識するポリクローナル抗体であることが好ましい。これはまた、例えば、ＭＭＴ活性を決定する方法によって間接的に検出することもできる。したがって、本発明の好ましい一実施形態では、オオムギ植物体内においてＭＭＴタンパク質が検出可能でない場合、前記植物体が、ＭＭＴをコードする遺伝子における変異を保有し、このため、ＭＭＴ活性の完全な喪失を引き起こすという。特に、これは、質量が約１２０ｋＤ（±１０％）であるＭＭＴが、前記オオムギ植物体内において検出されない場合（好ましくは、ウェスタンブロット法による解析で、前記オオムギ植物体の穀粒内において検出されない場合）である。
【００６９】
機能的ＭＭＴの完全な喪失はまた、ＭＭＴ ｍＲＮＡの転写が見られない結果の場合もあり、これがごくわずかしか見られない結果の場合もあるが、ＭＭＴ ｍＲＮＡの転写が見られない結果であることが好ましい。当業者は、ＭＭＴ転写物の不在もまた、その結果としてＭＭＴタンパク質の不在をもたらすことを認めるであろう。
【００７０】
しかし、機能的ＭＭＴの完全な喪失は、異常なＭＭＴ転写物が発現する結果であることが好ましい。前記転写物は、例えば、スプライス部位における変異に起因する、好ましくは、一次転写物のスプライスイベントの異常により引き起こされ得る。ＭＭＴをコードする転写物の発現は、例えば、ノーザンブロット法により検出することもでき、ＲＴ−ＰＣＲ法により検出することもできる。
【００７１】
本発明のオオムギ植物体における機能的ＭＭＴの完全な喪失は、１または複数の変異により引き起こされる。したがって、本発明のオオムギ植物体は、一般に、ＭＭＴ遺伝子における少なくとも１つの変異を保有する。前記変異（複数可）は、制御領域内、例えば、プロモーター内またはイントロン内の場合もあり、タンパク質コード領域内の場合もある。したがって、機能的ＭＭＴの喪失はまた、ＭＭＴをコードする遺伝子内の変異について解析することによっても検出することができる。ＭＭＴをコードする遺伝子内の変異は、例えば、前記遺伝子を配列決定した後で、それを野生型配列、好ましくは、本明細書で配列番号３として与えられる栽培品種Ｐｒｅｓｔｉｇｅの野生型配列、または栽培品種Ｓｅｂａｓｔｉａｎ（配列番号１６）の野生型配列と比較することにより検出することができる。変異を同定した後で、例えば、実施例２または実施例４で説明する通り、ＭＭＴ活性について調べることにより、機能の喪失を確認することが好ましい。
【００７２】
ＭＭＴタンパク質という用語は、配列番号６で示されるオオムギの全長ＭＭＴタンパク質またはその機能的相同体を対象とすることを意図する。この文脈で、機能的相同体とは、配列番号６で示されるオオムギのＭＭＴタンパク質のＭＭＴ活性と同じレベルのＭＭＴ活性（±２５％）を有するＭＭＴタンパク質であり、該ＭＭＴ活性は、本明細書下記の実施例２または実施例４で説明する通りに決定される。
【００７３】
９５％など、少なくとも９０％、９９．５％など、例えば、９９％のＭＭＴ活性を喪失したか、またはＭＭＴ活性を完全に喪失したオオムギ植物体は、Ｎ末端切断形態またはＣ末端切断形態など、部分的に機能的であるか、または好ましくは非機能的なＭＭＴの切断形態を含み得る。オオムギ植物体は、異常な形でスプライスされた転写物から結果として得られる、ＭＭＴの２つの、または例えば３つの、または３つを超える異なる切断形態など、ＭＭＴの複数の切断形態を含み得る。前記切断形態は、ＭＭＴのＮ末端断片だけを含む。野生型ＭＭＴのＮ末端断片に加えて、前記ＭＭＴの切断形態は、野生型ＭＭＴには見出されない、さらなるＣ末端配列も含み得る。前記さらなるＣ末端配列は、例えば、スプライシングの異常に起因する、変異体のｍＲＮＡ内に含まれるイントロン配列などの翻訳されたイントロン配列であり得る。前記切断ＭＭＴ形態は、配列番号６の最大で５００、より好ましくは最大で４５０、なおより好ましくは最大で４００、さらにより好ましくは最大で３５０、なおより好ましくは最大で３２０、さらにより好ましくは最大で３１１、または最大で２８８のＮ末端アミノ酸残基を含むことが好ましい。これは、特に、前記オオムギ植物体が、ＭＭＴ活性を完全に喪失している場合である。しかし、ＭＭＴはまた、配列番号６の３００以下、例えば、２５０以下など、２００以下、例えば、最大で１５０、例えば、１４７以下、または１３３以下など、より少ないＮ末端アミノ酸も含み得る。
【００７４】
極めて好ましい一実施形態では、切断ＭＭＴ形態が、配列番号６のアミノ酸１〜３１１、またはアミノ酸１〜２８８と、場合によって、野生型ＭＭＴには存在しないさらなるＣ末端配列とからなる場合がある。前記さらなるＣ末端配列は、最大で５０アミノ酸からなることが好ましく、より好ましくは最大で３０アミノ酸、なおより好ましくは最大で１０アミノ酸、さらにより好ましくは最大で４アミノ酸、または最大で１アミノ酸からなる。極めて好ましい実施形態では、ＭＭＴの切断形態が、配列番号１１によるタンパク質の場合もあり、配列番号１３によるタンパク質の場合もあり、配列番号１５によるタンパク質の場合もある。配列番号１１、または配列番号１３、または配列番号１５のタンパク質のうちのいずれもが、機能的なＭＭＴ酵素ではない。
【００７５】
極めて好ましい別の実施形態では、切断ＭＭＴ形態が、配列番号１８のアミノ酸１〜１４７、またはアミノ酸１〜１３３と、場合によって、野生型ＭＭＴには存在しないさらなるＣ末端配列とからなる場合がある。前記さらなるＣ末端配列は、最大で５０アミノ酸からなることが好ましく、より好ましくは最大で４０アミノ酸、なおより好ましくは最大で３９アミノ酸、または最大で３３アミノ酸、または最大で３０アミノ酸からなる。極めて好ましい実施形態では、ＭＭＴの切断形態が、配列番号２２によるタンパク質の場合もあり、配列番号２４によるタンパク質の場合もあり、配列番号２６によるタンパク質の場合もある。配列番号２２、または配列番号２４、または配列番号２６のタンパク質のうちのいずれもが、機能的なＭＭＴ酵素ではない。
【００７６】
上述のＭＭＴの切断形態は、例えば、ＭＭＴをコードする遺伝子における変異を保有するオオムギ植物体内に存在し、前記変異により未熟終止コドンが導入され、その結果、上述のＭＭＴの切断形態をコードする遺伝子がもたらされ得る。
【００７７】
本発明の好ましい実施形態では、オオムギ植物体が、介在配列なしに併せてスプライスされる野生型ＭＭＴ遺伝子（オオムギの野生型ＭＭＴのイントロン−エクソン構造を図９に示す）のうちの全部ではないが一部を含むｍＲＮＡへと転写される遺伝子を含む。したがって、一実施形態では、本発明によるオオムギ植物体のＭＭＴ ｍＲＮＡが、介在配列なしに併せてスプライスされるエクソン１、２、３、４、および５を最大で含むか、または例えば、介在配列なしで併せてスプライスされるエクソン１および２を最大で含む。前記併せてスプライスされるエクソンに加え、本発明によるオオムギ植物体のＭＭＴ ｍＲＮＡは、野生型のイントロンおよび／またはエクソンに由来する、さらなる３’末端配列を含む場合があり、ここで、エクソン配列はイントロンにより隔てられている。本発明によるオオムギ植物体の異常なＭＭＴ ｍＲＮＡの好ましい例（ＲＴ−ＰＣＲにより決定され、したがって、ｂｐ単位の断片長を有する）を、図１２および図１６に示す。本発明によるオオムギ植物体の異常な ｍＲＮＡは、５’端においてエクソン１および２をさらに含む、図１２で示されるｍＲＮＡ、または５’端においてエクソン１をさらに含む、図１６で示されるｍＲＮＡであることがより好ましい。
【００７８】
本発明の極めて好ましい実施形態では、ＭＭＴ遺伝子における変異を保有するオオムギ植物体が、ＭＭＴ遺伝子内のスプライス部位において変異を含み、その結果異常な形でスプライスされるｍＲＮＡをもたらす。前記変異は、ＭＭＴ遺伝子のイントロン内に位置することがより好ましく、イントロン１（該イントロンは、エクソン１および２を隔てる）上における５’側のスプライス部位など、イントロン２（該イントロンは、エクソン２および３を隔てる）上における５’側のスプライス部位など、イントロン３（該イントロンは、エクソン３および４を隔てる）上における５’側のスプライス部位など、イントロン４（該イントロンは、エクソン４および５を隔てる）上における５’側のスプライス部位など、イントロン５（該イントロンは、エクソン５および６を隔てる）上における５’側のスプライス部位など、イントロン６（該イントロンは、エクソン６および７を隔てる）上における５’側のスプライス部位など、イントロンの５’側のスプライス部位内に位置することがなおより好ましく、イントロン２またはイントロン５の５’側のスプライス部位内に位置することが最も好ましい。
【００７９】
前記変異は、前述のイントロンの５’末端塩基のＧ→Ａ変異であることが好ましい。したがって、極めて好ましい変異は、イントロン２の５’末端塩基のＧ→Ａ変異、またはイントロン５の最も５’側の塩基のＧ→Ａ変異である。
【００８０】
本発明によるオオムギ植物体は、当業者に公知の任意の適切な方法により、好ましくは、本明細書下記の節「機能的ＭＭＴを完全に喪失させたオオムギ植物体の調製」で概観される方法により調製することができる。
【００８１】
本発明の一実施形態では、本発明による、ＭＭＴ活性を完全に喪失させたオオムギ植物体が、野生型オオムギと同等の、生理学的および発生学的な穀粒特徴および植物体特徴を有することが好ましい。よって、本明細書では、ＭＭＴヌルのオオムギ植物体が、草高、植物体１体当たりのひこばえ数、開花の開始、および／または１穂当たりの穀粒数など、農業的に重要な特徴に関して、野生型オオムギと同様であることが好ましい。
【００８２】
極めて好ましい実施形態では、本発明によるオオムギ植物体のＭＭＴをコードする遺伝子が、配列番号８に示される配列を有する。したがって、本発明によるオオムギ植物体は、配列番号３（ここで、配列番号３とは、栽培品種ＰｒｅｓｔｉｇｅであるオオムギのＭＭＴの野生型ゲノム配列である）の塩基番号３０７６のＧ→Ａ変異を保有することが好ましい。
【００８３】
ＭＭＴ活性を完全に喪失させたオオムギ植物体の好ましい一例は、２００８年１０月１３日にＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ （ＡＴＣＣ）， Ｐａｔｅｎｔ Ｄｅｐｏｓｉｔｏｒｙ， １０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｌｖｄ．， Ｍａｎａｓｓａｓ， ＶＡ ２０１１０， Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓに寄託され、「オオムギ（Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ）：８０６３系統」と称するオオムギ植物体である。したがって、本発明のオオムギ植物体は、２００８年１０月１３日にＡＴＣＣに寄託されたオオムギ８０６３系統（ＡＴＣＣ特許受託番号：ＰＴＡ−９５４３）、またはその任意の前駆体であるオオムギ植物体であり、本発明によるオオムギ植物体のＭＭＴをコードする遺伝子は、配列番号８に示される配列を有する。
【００８４】
極めて好ましい実施形態では、本発明によるオオムギ植物体のＭＭＴをコードする遺伝子が、配列番号１９に示される配列を有する。したがって、本発明によるオオムギ植物体は、配列番号１６（ここで、配列番号１６とは、栽培品種ＳｅｂａｓｔｉａｎであるオオムギのＭＭＴの野生型ゲノム配列である）の塩基番号１４６２のＧ→Ａ変異を保有することが好ましい。
【００８５】
機能的ＭＭＴを完全に喪失させたオオムギ植物体の調製
本発明による機能的ＭＭＴを完全に喪失させたオオムギ植物体は、当業者に公知の任意の適切な方法により調製することができる。本発明のオオムギ植物体は、オオムギ植物体（またはその一部、例えば、オオムギ穀粒）を変異させる工程の後で、オオムギ植物体を、ＭＭＴ活性を完全に喪失させた個体についてスクリーニングおよび選択する工程を含む方法により調製する。興味深いことに、一態様では、本発明が、前記オオムギ植物体の同定を可能とする、新規で極めて有効なスクリーニング法に関する。
【００８６】
したがって、ＭＭＴ遺伝子における、ＭＭＴ活性の完全な喪失を引き起こす変異を保有するオオムギ植物体を調製する方法を提供することが本発明の目的である。前記方法は、
（ｉ）オオムギ植物体、および／またはオオムギ細胞、および／またはオオムギ組織、および／またはオオムギ穀粒、および／またはオオムギ胚芽を変異誘発し、これにより、Ｍ０世代のオオムギを得る工程と；
（ｉｉ）前記変異誘発されたオオムギ植物体、オオムギ穀粒、および／またはオオムギ胚芽を、少なくとも２世代にわたり繁殖させ、これにより、Ｍｘ（ここで、ｘは、≧２の整数である）世代のオオムギ植物体を得る工程と；
（ｉｉｉ）前記Ｍｘ世代のオオムギ植物体から試料を得る工程と；
（ｉｖ）前記試料中におけるＳＭＭレベルを決定する工程と；
（ｖ）試料が１０ｐｐｂ未満のＳＭＭ、好ましくは５ｐｐｂ未満のＳＭＭを含み、より好ましくは検出可能なＳＭＭを含まない植物体を選択する工程と；
（ｖｉ）ＭＭＴ遺伝子の少なくとも一部を配列決定する工程と；
（ｖｉｉ）ＭＭＴ遺伝子における変異を保有する植物体を選択する工程と
を含み、これらにより、ＭＭＴ遺伝子における、機能的ＭＭＴの完全な喪失を引き起こす変異を保有するオオムギ植物体を得る。
【００８７】
上記列挙における工程（ｉ）は、オオムギ植物体、オオムギ細胞、オオムギ組織、オオムギ穀粒、およびオオムギ胚芽からなる群から選択され、好ましくは、オオムギ植物体、オオムギ穀粒、およびオオムギ胚芽からなる群から選択される生存オオムギ物質、より好ましくは、オオムギ穀粒を変異誘発する工程を伴い得る。変異誘発は、任意の適切な方法により実施することができる。一実施形態では、オオムギ植物体またはその一部（例えば、オオムギ穀粒またはオオムギに由来する個々の細胞）を、変異誘発剤と共にインキュベートすることにより、変異誘発を実施する。このような薬剤は当業者に公知であり、例えば、アジドナトリウム（ＮａＮ_３）、メタンスルホン酸エチル（ＥＭＳ）、アジドグリセロール（ＡＧ）、メチルニトロソウレア（ＭＮＵ）、およびマレインヒドラジド（ＭＨ）からなる群から選択することができる。
【００８８】
別の実施形態では、例えば、オオムギ植物体または穀粒などその一部を紫外線で照射することにより、変異誘発を実施する。本発明の好ましい実施形態では、本明細書下記の節「化学的変異誘発」において概観される方法のうちのいずれかにより、変異誘発を実施する。適切な変異誘発プロトコールの非限定的な例は、Ｂｒｅｄｄａｍ， Ｋ．らによる米国特許第７，４２０，１０５号の他、本明細書下記の実施例２においても与えられている。
【００８９】
変異誘発は、Ｍ３世代のオオムギをスクリーニングするとき、所望の変異体の予測頻度が、穀粒１０，０００個当たり０．５〜５個の範囲内など、少なくとも０．５個、例えば、０．９〜２．３個の範囲内であるように実施することが好ましい。
【００９０】
好ましい実施形態では、オオムギ穀粒を変異誘発する。これらを、Ｍ０世代と称する（また、図７も参照されたい）。
【００９１】
変異誘発の後、検出可能なＭＭＴ活性を示さないオオムギ植物体またはその一部を選択する。選択は、試料をオオムギ植物体から、好ましくは、発芽しつつあるオオムギ植物体から、なおより好ましくは、発芽以来４日間が経過したオオムギ植物体から得る工程を含む。試料は、子葉鞘および／または初生葉に由来することが好ましく、好ましくは葉に由来する。したがって、試料は、例えば、葉組織の１ｃｍ〜３ｃｍの範囲内であり得る。
【００９２】
試料は、異なる溶媒および結合物質の継起的な使用を伴う、本明細書で説明される、新規に開発されたマルチ工程のプロトコールに従い、抽出および解析することができる。一般に、試料は、例えば、溶媒または溶媒の混合物、好ましくは、水および／または有機溶媒により抽出することができる。有機溶媒は、例えば、アルコール、好ましくはメタノールであり得る（または、有機溶媒は、例えば、ハロゲン化アルキル、好ましくはクロロホルムであり得る）。好ましい一実施形態では、溶媒が、水、メタノール、およびクロロホルムの混合物である。前記抽出は、例えば、シェーカーまたはミキサーを用いて混合しながら実施すると有利であり得る。該溶媒／試料混合物には、固体支持体（例えば、ガラスビーズなどのビーズ）を添加することができる。
【００９３】
好ましい実施形態では、前述の葉試料を、Ｍｘ（ここで、ｘは、≧２の整数、好ましくは、２〜１０の範囲内の整数、より好ましくは、３〜８の範囲内の整数である）世代の穀粒から採取する。極めて好ましい実施形態では、Ｍ３世代の発芽植物体またはその試料（葉など）中において、ＳＭＭレベルを決定する。前記実施形態では、変異誘発したＭ０世代のオオムギ穀粒を成長させてオオムギ植物体を得、その後、これを異種交配させてＭ１世代の穀粒を得ることが好ましい。Ｍ３世代の穀粒が得られるまで、この手順を反復する（図７を参照されたい）。
【００９４】
ＳＭＭレベルの決定は、下記で説明される新規の手順に基づくことが好ましい。興味深いことに、この方法は、ハイスループットのスクリーニングを可能とし、これにより、機能的ＭＭＴの完全な喪失を特徴とするオオムギ植物体の同定が実行可能となる。
【００９５】
一般的に述べると、該方法は、試料、または好ましくは、上記で説明された通りに調製された前記試料の抽出物を、ＳＭＭに結合することが可能な化合物と反応させる工程を伴う。本明細書の下記ではＯＰＡとだけ称するＯＰＡ試薬（Ｓｉｇｍａ社製、型番Ｐ７９１４；図２を参照されたい）が、ＳＭＭレベルを決定するのに特に有用であることが判明した。ＯＰＡは、とりわけ、ＳＭＭと反応して、ＳＭＭ−ＯＰＡと称する分子を形成する（図２を参照されたい）。反応は、ＯＰＡを、上記で説明した通りに調製された試料の抽出物と共にインキュベートする工程を伴うことが好ましい。加えて、該反応混合物に、３−メルカプト−プロピオン酸を添加することが好ましい。混合物は、アルカリ性のｐＨ、好ましくはｐＨ８〜ｐＨ１１の範囲内、より好ましくはｐＨ９〜ｐＨ１１の範囲内、なおより好ましくは、ｐＨ１０など、ｐＨ９．５〜ｐＨ１０．５の範囲内に保つことが好ましい。インキュベーションは、０℃〜１０℃の範囲内、好ましくは１℃〜８℃の範囲内、なおより好ましくは２℃〜６℃の範囲内、さらにより好ましくは、４℃など、３℃〜５℃の範囲内にある温度で実施することが好ましい。インキュベーション時間は、≧１０分間であることが好ましい。
【００９６】
ＳＭＭ−ＯＰＡが、それぞれ、３４０ｎｍおよび４５０ｎｍの光を吸光および発光するという観察に基づき、蛍光分光分析を用いることにより、その検出が可能となった。検出の初期過程は、カラムにより、好ましくは、３０×２ｍｍのＧｅｍｉｎｉ ３μ Ｃ１８カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社製、型番００Ａ−４４３９−８０； Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社、２００６年）上において抽出物を分離した後で、ハイスループットの液体クロマトグラフィーシステム、好ましくは、３４０ｎｍの励起波長および４５０ｎｍの発光波長を有する分子の蛍光レベルを同定および測定するようにデザインされた、Ｕｌｔｒａ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ液体クロマトグラフィー（Ｗａｔｅｒｓ社製、ＵＰＬＣシステム）を用いる蛍光の検出を伴うことが好ましい。この方法を用いる場合、「検出可能なＳＭＭは見られない」とは、ＳＭＭと共に共溶出する検出可能な化合物が不在であることを意味する。この文脈において、クロマトグラムピークにおける小さな「肩」は、アーチファクトのピークであること考えられる。したがって、Ａｓｎ／Ｓｅｒピークの右側における小さな肩（図３を参照されたい）は、ＳＭＭピークを表すとは考えられない。したがって、例を目的として述べると、図３Ｂに示される上方の２つのクロマトグラムが、「検出可能なＳＭＭは見られない」を示すと考えられるのに対し、前記図中下方のクロマトグラムは、ＳＭＭを含む試料の分離を表す。
【００９７】
ＳＭＭの検出は、実施例２で説明する通りに行うことが好ましい。本発明によるオオムギ植物体、発芽しつつあるオオムギ植物体、なおより好ましくは、発芽以来４日間が経過したオオムギ植物体を選択するのに好ましい方法は、本明細書下記の実施例２で説明する。上述のスクリーニング法が特に有用であることは、注目に値する。何よりもまず、該解析法は新規である。さらに、それが、発芽しつつあるオオムギ植物体の葉など、発芽しつつあるオオムギ植物体内におけるＳＭＭレベルを決定するために確立されていることは、上記の方法の顕著な利点である。発芽しつつあるオオムギから試料採取するタイミングにより、ＵＰＬＣベースでＳＭＭを検出するための、予測外に清明な調製物が作製される。他の試料、例えば、上記で説明した同様の穀粒によるウォート試料は、組成が複雑に過ぎ、一般に、ＳＭＭレベルを決定するための、言及されたクロマトグラフィー法で用いることはできない。
【００９８】
ＳＭＭが１０ｐｐｂ未満であり、好ましくは、検出可能なＳＭＭを有さないオオムギ植物体を同定した後で、対応するＭＭＴ遺伝子またはその一部を配列決定して、問題のオオムギ植物体が、該ＭＭＴ遺伝子における変異を有するものとして分類され得るかどうかを決定することが典型的である。次いで、検出可能なＳＭＭを有さないことを特徴とし、ＭＭＴをコードする遺伝子のうちの１または複数の塩基が野生型配列と比較して異なるオオムギ植物体を選択する。この文脈で、野生型配列とは、対応する野生型オオムギ栽培種内で見出される配列であることが好ましく、本明細書で配列番号３として示される配列であることが好ましい。好ましい変異は、本明細書の上記で説明されている。
【００９９】
選択されたオオムギの変異体をさらに繁殖させ、後続世代の植物体を、ＳＭＭ含量について再スクリーニングすることができる。有用なオオムギ植物体を選択した後で、これらを、本明細書下記の節「植物体の育種」で説明される従来の方法を用いる育種プログラムに組み入れることができる。
【０１００】
植物生成物
一態様では本発明が、オオムギ植物体またはその一部から調製される、ＤＭＳレベルの低い飲料または他の植物生成物であって、ＭＭＴ遺伝子における、ＭＭＴ機能の完全な喪失を引き起こす変異を保有する飲料または他の植物生成物に関する。興味深いことに、このような植物生成物は、一般に、含むＤＭＳレベルが極めて低い。さらに、このような植物生成物はまた、一般に、含むＳＭＭレベルも極めて低く、また、好ましくは、ＤＭＳＯレベルも極めて低い。理論に拘束されることなく述べると、本出願者らは、オオムギおよびモルトに由来するＳＭＭが不在である結果として、飲料中おいて、また、機能的ＭＭＴ酵素の喪失を特徴とする前記オオムギから調製された他の植物生成物中においても、ＤＭＳレベルが極めて低くなることを認識する。ＭＭＴ活性を完全に喪失させたオオムギ植物体から調製した飲料など、有用な植物生成物の例については、本明細書の下記で説明する。
【０１０１】
前記飲料、または前記植物生成物は、それぞれ野生型オオムギ植物体から調製された同様の飲料または植物生成物のＤＭＳ含量およびＳＭＭ含量の
（ｉ）３０％未満、好ましくは２０％未満、より好ましくは１５％未満、なおより好ましくは１０％未満のＤＭＳ；および／または
（ｉｉ）３０％未満、好ましくは２０％未満、より好ましくは１５％未満、なおより好ましくは、５％未満、例えば、２％未満など、１０％未満のＳＭＭ
を含有することが好ましい。
【０１０２】
前記飲料、または前記植物生成物は、
（ｉ）３０ｐｐｂ未満、好ましくは２５ｐｐｂ未満、より好ましくは２０ｐｐｂ未満、なおより好ましくは１５ｐｐｂ未満、さらにより好ましくは１０ｐｐｂ未満、なおより好ましくは５ｐｐｂ未満のＤＭＳを含有し、さらにより好ましくは、検出可能なＤＭＳを含有せず；かつ／または
（ｉｉ）５０ｐｐｂ未満、好ましくは４０ｐｐｂ未満、より好ましくは３０ｐｐｂ未満、なおより好ましくは２０ｐｐｂ未満、さらにより好ましくは１０ｐｐｂ未満、なおより好ましくは５ｐｐｂ未満のＳＭＭを含有し、さらにより好ましくは検出可能なＳＭＭを含有しない
ことが好ましい。
【０１０３】
加えて、植物生成物は、野生型オオムギ植物体から調製された同様の飲料または植物生成物のＤＭＳＯ含量の３０％未満、好ましくは２０％未満、より好ましくは１５％未満、なおより好ましくは１０％未満のＤＭＳＯ含量を含むことが好ましい。
【０１０４】
一態様では、本発明による植物生成物が、機能的ＭＭＴの完全な喪失を結果としてもたらす変異を保有するオオムギ穀粒であり得る。植物生成物はまた、前記穀粒を含む組成物、ならびに前記穀粒から調製される組成物の他、前記穀粒から調製される他の植物生成物でもあり得る。
【０１０５】
一態様では、本発明による植物生成物は、ＭＭＴをコードする遺伝子における、ＭＭＴ活性の完全な喪失を引き起こす変異を保有するオオムギ植物体の穀粒をモルト化することにより調製されるモルト組成物である。「モルト化」という用語により、制御された環境条件下で生じる、スティーピングされたオオムギ穀粒の発芽（例えば、図８に示す）が理解されるものとする。
【０１０６】
モルト化とは、オオムギ穀粒を制御された形でスティーピングし、発芽させた後で、これを乾燥させる（好ましくは、キルン乾燥させる）工程である。乾燥させる前の、スティーピングされて発芽したオオムギ穀粒を「グリーンモルト」と称するが、これもまた、本発明による植物生成物であり得る。このイベントの連鎖は、主に、死滅した内胚乳細胞壁を脱重合化させ、穀粒の栄養物質を移動させるのに用いられる過程において、穀粒の改変を引き起こす多数の酵素を合成するのに重要である。乾燥させる工程では、化学反応の結果として、風味および色（例えば、褐色）が生成される。モルトは主に、飲料を生産するのに用いられるが、それはまた、例えば、製パン業における酵素供給源として、またはモルトもしくは粉末モルトなど、食物産業における芳香剤および着色剤として、あるいは間接的に、モルトシロップなどとして、他の産業工程でも用いることができる。
【０１０７】
一態様では、本発明が、前記モルト組成物を生成させる方法に関する。該方法は、
（ｉ）ＭＭＴをコードする遺伝子における、ＭＭＴ活性の完全な喪失を引き起こす変異を保有するオオムギ植物体に由来するオオムギ穀粒を供給する工程と；
（ｉｉ）前記穀粒をスティーピングする工程と；
（ｉｉｉ）該スティーピングされた穀粒を、所定の条件下で発芽させる工程と；
（ｉｖ）前記発芽した穀粒を乾燥させる工程と
を含み、これらにより、ＳＭＭおよび／またはＤＭＳレベルの低いモルト組成物を生成させる。例えば、モルトは、Ｂｒｉｇｇｓら（１９８１年）およびＨｏｕｇｈら（１９８２年）により説明される方法のうちのいずれかにより生成させることができる。
【０１０８】
しかし、モルトを焙煎する方法などが含まれるがこれらに限定されない、特殊モルトを生成させるための方法など、モルトを生成させるのに適する他の任意の方法もまた用いることができる。
【０１０９】
興味深いことに、ＤＭＳは、沸点が３７℃〜３８℃のかなり揮発性の化合物であり（Ｉｍａｓｈｕｋｕ、前出）、モルト生成時、例えば、キルン乾燥時において、該組成物は、一般に、実質量のＤＭＳが蒸発してしまうような熱にかけられる。しかし、通常のモルト組成物の冷却時には、ＤＭＳ前駆体（ＤＭＳＰ）からより多くのＤＭＳが生成される可能性がある。本発明の主要な１つの利点は、モルト組成物中において、ＤＭＳが生成されないか、または生成されるＤＭＳが極めてわずかであるに過ぎないことである（実施例６；図５Ａを参照されたい）。
【０１１０】
モルト中におけるＤＭＳ濃度を低下させる方法が説明されている。これらの方法の多くは、モルトの熱処理に依拠する。前記熱処理は、単に、例えば、キルン乾燥時においてモルトを加熱して、蒸気を適用することにより遊離ＤＭＳを蒸発させることであり得る。こうして、モルトの蒸気処理は、モルト中における遊離ＤＭＳレベルを低下させ得る。しかし、これらの方法は、主に、モルト中における遊離ＤＭＳレベルは低下させるが、ＳＭＭレベルに及ぼす影響は、より低い程度であるに過ぎない。上記で言及した通り、モルト組成物など、本発明の植物生成物は、それが含むＤＭＳおよびＳＭＭがいずれも低レベルであることが好ましい。本発明の一実施形態では、本発明のモルト組成物を、蒸気により遊離ＤＭＳを蒸発させて除去することを伴う処理にかける程度が限定的であるに過ぎないか、または代替的に、キルン乾燥時において蒸気を用いて遊離ＤＭＳを蒸発させて除去することを伴う処理にかけることがない。
【０１１１】
本発明の一実施形態では、本発明によるモルトが、臭素酸カリウムまたは臭素酸カルシウムなどの臭素酸塩により処理されていないことが好ましい。
【０１１２】
モルトは、例えば、破砕し、これにより粉砕モルトを得ることにより、さらに加工することができる。したがって、本発明による植物生成物は、未加工モルト、または粉砕モルト、もしくはその粉末など、任意の種類のモルトであり得る。粉砕モルトおよびその粉末は、再発芽する能力を欠く死滅細胞を含めた、モルトの化学成分を含む。
【０１１３】
本発明のモルト組成物は、最大で３μｇ／ｇ、好ましくは最大で２μｇ／ｇ、より好ましくは最大で１μｇ／ｇ、なおより好ましくは、最大で０．２μｇ／ｇなど、最大で０．５μｇ／ｇの遊離ＤＭＳを含むことが好ましい。加えて、本発明のモルト組成物は、最大で２μｇ／ｇ、好ましくは最大で１μｇ／ｇ、より好ましくは最大で０．５μｇ／ｇのＳＭＭを含むことが好ましい。
【０１１４】
好ましい態様では、本発明は、最大で２００ｐｐｂ、好ましくは最大で１５０ｐｐｂ、より好ましくは最大で１００ｐｐｂ、なおより好ましくは、最大で２５ｐｐｂなど、最大で５０ｐｐｂの遊離ＤＭＳを含むモルト組成物を提供する。加えて、好ましくは、本発明のモルト組成物は、最大で１０００ｐｐｂ、好ましくは最大で５００ｐｐｂ、より好ましくは最大で２５０ｐｐｂ、なおより好ましくは最大で１００ｐｐｂ、さらにより好ましくは最大で５０ｐｐｂのＳＭＭを含むことが好ましい。また、本発明のモルト組成物は、最大で１０００ｐｐｂ、好ましくは最大で５００ｐｐｂ、より好ましくは最大で１００ｐｐｂ、さらにより好ましくは最大で５０ｐｐｂのＤＭＳＰを含むことも好ましい。
【０１１５】
別の態様では、本発明は、最大で５０００ｐｐｂ、より好ましくは最大で２５００ｐｐｂ、さらにより好ましくは最大で１０００ｐｐｂ、なおより好ましくは最大で５００ｐｐｂ、さらにより好ましくは最大で２５０ｐｐｂ、例えば、最大で１５０ｐｐｂのＤＭＳＰを含むグリーンモルト組成物に関する。また、前記グリーンモルト組成物は、最大で２００ｐｐｂ、好ましくは最大で１５０ｐｐｂ、より好ましくは最大で１００ｐｐｂ、なおより好ましくは、最大で２５ｐｐｂなど、最大で５０ｐｐｂの遊離ＤＭＳを含むことも好ましい。
【０１１６】
別の態様では、本発明による植物生成物が、オオムギシロップまたはオオムギモルトシロップなどのシロップである。植物生成物はまた、オオオムギまたはモルトの抽出物でもあり得る。
【０１１７】
別の態様では、本発明による植物生成物が、ＭＭＴ遺伝子における、ＭＭＴ活性の完全な喪失を引き起こす変異を保有するオオムギ穀粒に由来するモルト組成物から調製されるウォート組成物である（実施例６；図５Ｂを参照されたい）。前記ウォートは、ＭＭＴヌルの穀粒だけから調製することもでき、他の穀粒も含む混合物から調製することもできる。本発明はまた、単独で、または他の成分と混合されたＭＭＴヌルのオオムギまたはその一部を用いて調製されるウォート組成物にも関する。前記ウォート組成物は、一番ウォート、および／または二番ウォート、および／またはさらなるウォートであり得る。ウォート組成物は、スイートウォートの場合もあり、煮沸ウォートの場合もあり、これらの混合物の場合もある。一般に、ウォート組成物は、高レベルのアミノ窒素と、発酵性炭水化物とを含有し、後者は主にマルトースである。図８に、モルトからウォートを調製する一般的な方法を示す。一般に、ウォートは、マッシング工程において、モルトを水と共にインキュベートすることにより調製する。マッシング時において、モルト／水組成物には、炭水化物に富むさらなる組成物、例えば、オオムギ添加物、トウモロコシ添加物、またはコメ添加物を補充することができる。モルト化していない穀類添加物は一般に、含有する酵素レベルが極めて低いことが公知であり、このため、糖転換および／または遊離アミノ窒素の生成を含めた抽出物の生成には、モルトまたは外因性酵素の補充が必要となる。
【０１１８】
本発明の一実施形態では、植物生成物が、モルト化させていないオオムギであり、これは、例えば、マッシング時における添加物として有用であり得る。
【０１１９】
一般に、ウォート生成工程における最初の工程は、水が、マッシング相にある穀粒粒子に到達し得るように、モルトを破砕する工程である（これは、酵素により基質を脱重合化するモルト化工程の拡張であると考えることができる）。マッシング時には、粉砕モルトを、水などの液体と共にインキュベートする。インキュベーション温度は、一定に保つ（等温マッシング）か、または段階的に上昇させる。好ましい実施形態では、初期のマッシング温度が７０℃を超えず、好ましくは６９℃を超えず、したがって、例えば、初期のマッシング温度が、５５℃〜６９℃の範囲内、例えば、５５℃〜６５℃の範囲内など、５０℃〜６９℃の範囲内であり得る。初期のマッシング温度が高すぎると、マッシュ中における酵素活性に影響が及び、所望の酵素活性を低下させるか、さらにまたは無化する可能性があり、この結果、ウォートの品質が変化する。いずれの場合も、モルト化およびマッシングにおいて生成される可溶性物質は、前記液体画分中に放出される。その後の濾過により、ウォートの液体と、残留する固体粒子との分離がなされ、後者を、ビール粕と称する。前記ウォートはまた、「一番ウォート」とも称する。濾過後、熱湯でスパージングすることにより、「二番ウォート」を得ることができる。ウォートを調製するのに適する手順の非限定的な例は、Ｂｒｉｇｇｓら（１９８１年）およびＨｏｕｇｈら（１９８２年）により説明されている。
【０１２０】
一番ウォート、二番ウォート、およびさらなるウォートを混合し、その後、煮沸にかけることができる。純粋の一番ウォートであれ、混合ウォートであれ、煮沸されていないウォートをまた「スイートウォート」とも称するのに対し、煮沸後のウォートは、「煮沸ウォート」と称する。ウォートをビールの生産に用いる場合、煮沸前にホップを添加することが多い。
【０１２１】
ウォート組成物はまた、モルト化させていないＭＭＴヌルの植物体またはその一部など、ＭＭＴヌルのオオムギ植物体またはその一部を、酵素組成物または酵素混合物による組成物、例えば、ＵｌｔｒａｆｌｏまたはＣｅｒｅｆｌｏ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ社製）など、１または複数の適切な酵素と共にインキュベートすることによっても調製することができる。ウォート組成物はまた、モルトと、モルト化させていないオオムギ植物体またはその一部との混合物、またはモルト化させていないオオムギだけを用いて調製することもでき、場合によって、前記調製時において、１または複数の適切な酵素、特に、アミラーゼ、グルカナーゼ（好ましくは、（１−４）−グルカナーゼおよび／または（１−３，１−４）−β−グルカナーゼ）、および／もしくはキシラナーゼ（アラビノキシラナーゼなど）、および／もしくはプロテアーゼ、または前述の酵素のうちの１または複数を含む酵素混合物を添加して、例えば、酵素混合物であるＯｎｄｅａ Ｐｒｏ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ社製）を添加して調製することもできる。
【０１２２】
本発明のオオムギは、モルトマッシュに添加して、添加物として用いることができる。より具体的に述べると、本発明のオオムギは、オオムギ：モルト＝１００：０、または７５：２５、または５０：５０、または２５：７５などであるがこれらに限定されない、外部の醸造用酵素を伴うかまたは伴わずに、モルトと併せた任意の組合せでマッシングに用いることができる。
【０１２３】
従来の醸造法では、ウォートを長時間にわたり、一般には、６０分間〜１２０分間の範囲で煮沸するが、その１つの理由は、長時間の煮沸により、揮発性であるＤＭＳの量が低減されることである。しかし、長時間の煮沸は、他の多くの理由のため、例えば、それが顕著なエネルギー供給を必要とするために望ましくない。加えて、前記煮沸は、ストレッカーアルデヒドの望ましくない異臭を生成させ得る。本発明により、長時間の煮沸を行わなくても、ＭＭＴヌルのオオムギから、ＤＭＳレベルの低いウォートを生成させることができる。したがって、本発明の好ましい実施形態によるウォートの煮沸時間は、最長で４５分間、なおより好ましくは最長で３０分間、例えば、最長で１５分間である。ウォートを長時間にわたり煮沸しても、時間が経過すると、ＤＭＳがＤＭＳＰからやはり生成され得ることは注目に値する。興味深いことに、本発明によるウォートは、通常のウォートを煮沸させた後で得られるＤＭＳレベルより実質的に低い、低ＤＭＳレベルを維持する。
【０１２４】
本発明のさらなる実施形態では、ウォートの煮沸後で、かつ発酵前において、ウォートを二酸化炭素による洗浄にかけないことが好ましい。
【０１２５】
本発明のウォート組成物は、３０ｐｐｂ未満、好ましくは２５ｐｐｂ未満、より好ましくは２０ｐｐｂ未満、なおより好ましくは、１５ｐｐｂ未満、さらにより好ましくは１０ｐｐｂ未満、なおより好ましくは５ｐｐｂ未満のＤＭＳを含み、さらにより好ましくは検出可能なＤＭＳを含まない、かつ／または５０ｐｐｂ未満、好ましくは４０ｐｐｂ未満、より好ましくは３０ｐｐｂ未満、なおより好ましくは２０ｐｐｂ未満、さらにより好ましくは１０ｐｐｂ未満の、なおより好ましくは５ｐｐｂ未満のＳＭＭを含み、なおより好ましくは検出可能なＳＭＭを含まないことが好ましい。
【０１２６】
本発明の植物生成物またはその一部はまた、ＭＭＴをコードする遺伝子における、ＭＭＴ活性の完全な喪失を引き起こす変異を保有するオオムギ植物体を含む、食物組成物、飼料組成物、および香料の原料組成物でもあり得る。食物組成物は、例えば、モルト化させたオオムギ穀粒およびモルト化させていないオオムギ穀粒、オオムギ粉末、パン、ポリッジ、オオムギを含む穀類混合物、オオムギを含む飲料などの健康製品、オオムギシロップ、およびフレーク状オオムギ組成物、破砕オオムギ組成物、または押出し成形したオオムギ組成物であり得るがこれらに限定されない。飼料組成物には、例えば、オオムギ穀粒および／またはオオムギ粉末を含む組成物が含まれる。香料の原料組成物については、本明細書の下記で説明する。
【０１２７】
本発明はまた、本明細書で説明される植物生成物の混合物にも関する。例えば、一態様では本発明が、
（ｉ）ＭＭＴをコードする遺伝子における、ＭＭＴ活性の完全な喪失を引き起こす変異を保有するオオムギ植物体またはその一部を含む組成物と；
（ｉｉ）ＭＭＴヌルの穀粒から調製されるモルト組成物と
の混合物により調製される組成物に関する。
【０１２８】
好ましい態様では、本発明が、飲料、より好ましくはモルト由来の飲料、なおより好ましくは、含有するＤＭＳレベルが低いビールなどのアルコール飲料に関し、前記飲料は、ＭＭＴヌルのオオムギまたはその一部を用いて調製される。
【０１２９】
したがって、好ましい態様では、本発明は、飲料、より好ましくはモルト由来の飲料、なおより好ましくは、ビールなどのアルコール飲料に関し、前記飲料またはビールは、
（ｉ）３０ｐｐｂ未満、好ましくは２５ｐｐｂ未満、より好ましくは２０ｐｐｂ未満、なおより好ましくは１５ｐｐｂ未満、さらにより好ましくは１０ｐｐｂ未満、なおより好ましくは５ｐｐｂ未満のＤＳＭを含有し、さらにより好ましくは、検出可能なＤＳＭを含有せず；かつ／または
（ｉｉ）５０ｐｐｂ未満、好ましくは４０ｐｐｂ未満、より好ましくは３０ｐｐｂ未満、なおより好ましくは２０ｐｐｂ未満、さらにより好ましくは１０ｐｐｂ未満、なおより好ましくは５ｐｐｂ未満のＳＭＭを含有し、さらにより好ましくは検出可能なＳＭＭを含有しない。
【０１３０】
飲料は、ＭＭＴヌルのオオムギ（またはその一部、またはその抽出物）を発酵させることにより、例えば、ＭＭＴヌルのオオムギから生成させたモルトを、単独で、または他の成分と組み合わせて用いて生成させたウォートを発酵させることにより調製することが好ましい。
【０１３１】
しかし、本発明の他の実施形態では、飲料が、非発酵飲料、例えば、ウォート、好ましくは、ＭＭＴヌルのモルトから調製したウォートである。前記飲料を、モルト化させていないオオムギ植物体またはその一部から、好ましくは、モルト化させていないＭＭＴヌルのオオムギ植物体またはその一部から調製し得ることもまた、本発明の範囲内に含まれる。
【０１３２】
飲料は、非アルコール性ビール、またはモルティナなどの非アルコール性モルト飲料など、他の種類の非アルコール性飲料などの非アルコール性飲料であり得る。
【０１３３】
しかし、前記飲料は、ＭＭＴヌルのオオムギ穀粒を含むモルト組成物から調製することが好ましい。前記飲料は、ビールであることがより好ましい。これは、当業者に公知の任意の種類のビールであり得る。一実施形態では、ビールが、例えば、ラガービールである。ビールは、発芽したＭＭＴヌルのオオムギを含むモルト組成物を用いて醸造することが好ましい。しかし、モルト組成物はまた、例えば、野生型オオムギ、コムギ、および／もしくはライムギ、または、シロップ組成物を含め、モルト化させた原料もしくはモルト化させていない原料に由来する糖もしくは組成物を含む、発芽させていない原料も含み得る。
【０１３４】
時間が経過すると、ＳＭＭを含めたＤＭＳＰから、ＤＭＳが発生し得ると一般に考えられる。したがって、飲料中に当初ＤＭＳが存在しないか、または存在するＤＭＳが極めて少量であっても、時間が経過するにつれてＤＭＳは蓄積し得る。しかし、（保存後であっても）含有するＤＭＳが少量であるか、またはＤＭＳを含有しない飲料を提供することが、本発明の目的である。
【０１３５】
したがって、本発明の目的は、少なくとも１週間、好ましくは少なくとも２週間、より好ましくは少なくとも３週間、なおより好ましくは、１カ月〜３カ月の範囲内、例えば、６カ月〜１２カ月の範囲内など、３カ月〜６カ月の範囲内など、少なくとも４週間にわたる保存の後に、３０ｐｐｂ未満、好ましくは２５ｐｐｂ未満、より好ましくは２０ｐｐｂ未満、なおより好ましくは、１５ｐｐｂ未満、さらにより好ましくは１０ｐｐｂ未満、なおより好ましくは５ｐｐｂ未満のＤＳＭを含有し、さらにより好ましくは検出可能なＤＳＭを含有しないビールなど、オオムギ植物体に由来する飲料を提供することである。保存は、１５℃〜４０℃の範囲内など、５℃〜４０℃の範囲内にある温度で実施する。
【０１３６】
さらに、本発明による飲料は、優れた風味特性を特徴とすることが好ましい。特に、本発明による飲料は、対応する「通常の」ビールより香ばしい（ａｒｏｍａｔｉｃおよびｆｒａｇｒａｎｔ）ものとして特徴付けられる（実施例７；図６を参照されたい）。理論により拘束されずに述べると、本発明は、ＤＭＳおよびＳＭＭのレベルが低いか、さらにまたはこれらが不在であることにより、香ばしい（ａｒｏｍａｔｉｃおよびｆｒａｇｒａｎｔ）風味の知覚が増強されるという理論を提示する。
【０１３７】
香ばしい（ａｒｏｍａｔｉｃおよびｆｒａｇｒａｎｔ）風味は、専門家による試飲パネルが判定する。飲料がビールである実施形態では、試飲パネルが、ビール試飲の専門家からなることが好ましい。本明細書では、「専門家によるビール試飲パネル（ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ ｂｅｅｒ ｔａｓｔｅ ｐａｎｅｌ）」を、「熟練試飲パネル」または「専門家によるビール試飲パネル（ｓｐｅｃｉａｌｉｓｔ ｂｅｅｒ ｔａｓｔｅ ｐａｎｅｌ）」とも称する。ＤＭＳ自体が、ビールの風味特性に対して重大な影響を及ぼすことは公知であるが、試飲パネルによっては、多面的な硫黄様の風味に対して不正確な評価をもたらす傾向を示し得る。その理由は単純に、パネリストが、依然として、彼らの風味知覚が異なることの結果として、不正確に「較正」された状態にとどまるということである。この複雑な障害は、本明細書で説明する通り、ビールのエステルの風味特性、高度数アルコールの風味特性、硫黄成分の風味特性、およびこくの風味特性を批判的に評価するスキルを身に付けた、少なくとも９名のビール試飲家による、高度に熟練した専門家によるパネルを確立することにより解決された。
【０１３８】
したがって、試飲パネルは、少なくとも９名、好ましくは、９〜１２名、例えば、１０名など、９〜２０名の範囲内からなるべきである。試飲パネルの各メンバーは、高度に熟練していることが好ましいものとし、特に、ビールのエステルの風味特性、高度数アルコールの風味特性、硫黄成分の風味特性、およびこくの風味特性を評価するスキルを身に付けているべきである。次いで、試飲パネルの各メンバーは、０〜５段階で、異なる風味の調子を評価する。風味の属性は、苦味の強さ、苦味の質、こく、バランスの良さ、新鮮さ、飲みやすさ、香ばしい風味、エステル風味、アルコール／溶媒の風味、花の風味、ホップ風味、樹脂の風味、モルト風味、穀粒の風味、キャラメル風味、焦げた風味、フェノール風味、硫黄の風味、酸性、および甘味からなる群から選択されることが好ましい。
【０１３９】
上述の手法を用いると、本発明の飲料は、いずれの飲料のエステル／アルコールプロファイルも同様となるように調整し、いずれの飲料も同じ方法で調製する場合、同様のエタノール含量を有し、野生型オオムギ、好ましくは栽培品種Ｐｏｗｅｒから調製した飲料と比較して、香ばしさの特性、エステルの特性、アルコール／溶媒の特性、花の特性、ホップの特性からなる群から選択される香ばしさの（ａｒｏｍａｔｉｃ／ｆｒａｇｒａｎｔ）特性のうち、少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、なおより好ましくは少なくとも３つ、さらにより好ましくは少なくとも４つ、なおより好ましくはすべてについて、より高いスコアを示すことが好ましい。
【０１４０】
さらに、上述の手法を用いると、本発明の飲料は、いずれの飲料のエステル／アルコールプロファイルも同様となるように調整する場合、同様のエタノール含量を有し、野生型オオムギ、好ましくは栽培品種Ｐｏｗｅｒから調製した飲料と比較して、バランスの良さ、新鮮さ、飲みやすさからなる群から選択される３つの一般的特性のうち、少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、なおより好ましくはすべてについて、より高いスコアを示すことが好ましい。
【０１４１】
上述の手法を用いると、本発明の飲料は、いずれの飲料のエステルプロファイルも同様となるように調整する場合、同様のエタノール含量を有し、野生型オオムギ、好ましくは栽培品種Ｐｏｗｅｒから調製した飲料と比較して、新鮮さおよび／またはエステルの特性について、少なくとも０．１、より好ましくは少なくとも０．２高いスコアを示すことが好ましい。
【０１４２】
本出願の文脈において、表１で言及される１２の化合物を同様のレベルに調整する（また、実施例７も参照されたい）場合、すなわち、飲料が、表１で言及される１２の化合物を同量（±２０％）含有する場合、エステル／アルコールプロファイルは、同様であると考えられる。エタノール含量は、同量（±２０％）、好ましくは同量（±１０％）である場合、同様であると考えられる。
【０１４３】
したがって、本発明の飲料は、１２の化合物の含量（表１および実施例７における一覧を参照されたい）を以下：
（ｉ）アセトアルデヒド １．２０ｐｐｍ±２０％；
（ｉｉ）ギ酸エチル（Ｅｔｈｙｌｆｏｒｍｉａｔｅ） ０．２４ｐｐｍ±２０％；
（ｉｉｉ）酢酸エチル ２３．４０ｐｐｍ±２０％；
（ｉｖ）酢酸イソブチル ０．０５ｐｐｍ±２０％；
（ｖ）１−プロパノール １３．８０ｐｐｍ±２０％；
（ｖｉ）イソブタノール ９．６０ｐｐｍ±２０％；
（ｖｉｉ）酢酸イソアミル ３．４３ｐｐｍ±２０％；
（ｖｉｉｉ）１−ブタノール ０．２３ｐｐｍ±２０％；
（ｉｘ）イソアミルアルコール ５２．００ｐｐｍ±２０％；
（ｘ）ヘキサン酸エチル ０．１３ｐｐｍ±２０％；
（ｘｉ）ｎ−酢酸ヘキシル ０．０１ｐｐｍ±２０％；
（ｘｉｉ）オクタン酸エチル ０．３３ ｐｐｍ±２０％
に調整した場合、以下の特性（実施例７で説明する通りに判定される）：
（ｉ）「バランスの良さ」の特性（少なくとも２．５、好ましくは少なくとも２．７のスコア）；
（ｉｉ）「新鮮さ」の特性（少なくとも２．５、好ましくは少なくとも２．７、より好ましくは少なくとも２．９、さらにより好ましくは少なくとも３．１のスコア）；
（ｉｉｉ）「飲みやすさ」の特性（少なくとも２．５、好ましくは少なくとも２．７、より好ましくは少なくとも２．９、さらにより好ましくは少なくとも３．０のスコア）；
（ｉｖ）「香ばしさ」の特性（少なくとも２．５、好ましくは少なくとも２．７、より好ましくは少なくとも２．９のスコア）；
（ｖ）「エステル」の特性（少なくとも２．５、好ましくは少なくとも２．７、より好ましくは少なくとも２．９、さらにより好ましくは少なくとも３．０のスコア）；
（ｖｉ）「アルコール／溶媒」の特性（少なくとも１．５のスコア）；
（ｖｉｉ）「花」の特性（少なくとも１．７，好ましくは少なくとも１．９のスコア）；
（ｖｉｉｉ）「ホップ」の特性（少なくとも１．８のスコア）；
より好ましくは、以下の特性（実施例７で説明する通りに判定される）：
（ｉ）「新鮮さ」の特性（少なくとも２．５、好ましくは少なくとも２．７、より好ましくは少なくとも２．９、さらにより好ましくは少なくとも３．１のスコア）；
（ｉｉ）「飲みやすさ」の特性（少なくとも２．５、好ましくは少なくとも２．７、より好ましくは少なくとも２．９、さらにより好ましくは少なくとも３．０のスコア）；
（ｉｉｉ）「香ばしさ」の特性（少なくとも２．５、好ましくは少なくとも２．７、より好ましくは少なくとも２．９のスコア）；
（ｉｖ）「エステル」の特性（少なくとも２．５、好ましくは少なくとも２．７、より好ましくは少なくとも２．９、さらにより好ましくは少なくとも３．０のスコア）
のうち、少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、より好ましくは少なくとも３つ、なおより好ましくは少なくとも４つ、さらにより好ましくは少なくとも５つ、なおより好ましくはすべてのスコア値を示すことを特徴とすることが好ましい。
【０１４４】
したがって、そのエステル／アルコールプロファイルが、実施例７、表１の「ＭＭＴヌル」欄で示される通り（これに混合物１および混合物２を添加する）であると仮定すれば、本発明による飲料は、
（ｉ）専門家による試飲パネルが評価する場合、０〜５段階で少なくとも２．５の「新鮮さ」のスコア；および／または
（ｉｉ）専門家による試飲パネルが評価する場合、０〜５段階で少なくとも２．５の「飲みやすさ」のスコア；および／または
（ｉｉｉ） 専門家による試飲パネルが評価する場合、０〜５段階で少なくとも２．５の「香ばしい風味」のスコア；および／または
（ｉｖ）専門家による試飲パネルが評価する場合、０〜５段階で少なくとも２．５の「エステル風味」のスコア
を示すことが好ましい。
【０１４５】
特に、本発明は、飲料中におけるＤＭＳの存在が、エステル風味を遮蔽し得ることを開示する。したがって、同じ方法で調製されるが、含むＤＭＳが１００〜２００ｐｐｂの範囲にあるなど、含むＤＭＳが少なくとも１００ｐｐｂである飲料と比較して、または同じ方法で調製されるが、含むＤＭＳが５０〜１００ｐｐｂの範囲内にあるなど、少なくとも５０ｐｐｂである飲料と比較して、熟練試飲パネル（好ましくは、少なくとも９名のメンバーによる熟練試飲パネル）が評価するエステル風味についてより高いスコアを示す飲料を提供することが、本発明の目的である。上記で説明した通り、エステル風味を０〜５段階で判定する場合、前記エステル風味についてのより高いスコアは、少なくとも０．５ポイント、好ましくは少なくとも０．７ポイント、例えば、少なくとも０．９ポイント高い。
【０１４６】
本発明はまた、上述の飲料を作製する方法であって、好ましくは、
（ｉ）発芽したＭＭＴヌルの穀粒を含むモルト組成物を供給する工程と；
（ｉｉ）前記モルト組成物を飲料へと加工する工程と
を含み、これらにより、３０ｐｐｂ未満、好ましくは２５ｐｐｂ未満、より好ましくは２０ｐｐｂ未満、なおより好ましくは１５ｐｐｂ未満、さらにより好ましくは１０ｐｐｂ未満、なおより好ましくは５ｐｐｂ未満のＤＭＳを含有し、さらにより好ましくは、検出可能なＤＭＳを含有しない飲料を得る方法にも関する。
【０１４７】
好ましい一実施形態では、飲料はビールである。この場合は、加工する工程が、例えば、本明細書の上記で説明した方法のうちのいずれかにより、前記モルト組成物からウォートを調製する工程と、前記ウォートを発酵させる工程とを含むことが好ましい。
【０１４８】
一般的に述べると、アルコール飲料（ビールなど）は、モルト化させたオオムギ穀粒および／またはモルト化させていないオオムギ穀粒から製造することができる。ホップおよび酵母に加えて、モルトが、ビールの風味および色に寄与する。さらに、モルトは、発酵性糖の供給源として機能し、また、酵素の供給源としても機能する。ビール生産の一般的な工程についての図式的表示を図８に示すが、モルト化および醸造の方法についての詳細な説明は、例えば、Ｂｒｉｇｇｓら（１９８１年）およびＨｏｕｇｈら（１９８２年）による刊行物中において見出すことができる。オオムギ生成物、モルト生成物、ビール製品の解析については、定期的に更新される多数の方法を用いることができる。これらには、例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｒｅａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｓ（１９９５年）、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｂｒｅｗｉｎｇ Ｃｈｅｍｉｓｔｓ（１９９２年）、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｂｒｅｗｅｒｙ Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ（１９９８年）、およびＩｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂｒｅｗｉｎｇ（１９９７年）が含まれるが、これらに限定されない。所与のビール醸造業者毎に、多くの特殊な手順が用いられており、その最も顕著な多様性は、各地の消費者選好に関するものであると理解される。本発明と共に、ビールを生産する任意のこのような方法を用いることができる。
【０１４９】
前述した飲料（例えば、ビール、モルト飲料、または非発酵ウォートを含めた）のモルト組成物は、例えば、本明細書の上記で説明した方法のうちのいずれかにより得ることができる。ウォートは、前記モルト組成物から調製することができる。
【０１５０】
ウォートからビールを生産する最初の工程は、前記ウォートを煮沸する工程を伴うことが好ましい。煮沸時には、穀類シロップまたはホップなど他の成分を添加することができ、後者の成分により、ビールに典型的な苦味および香ばしさの特徴がもたらされ得る。ウォートの煮沸はまた、ポリフェノールと変性したタンパク質との凝集物ももたらし、これは、ビール生産の後続の段階において沈殿し得る。ウォートの煮沸はまた、ＤＭＳを含めた揮発性化合物の蒸発も引き起こし得る。しかし、上記で言及した通り、ＭＭＴヌルのオオムギから調製したウォートは、含有するＤＭＳが少量であるか、またはＤＭＳを含有せず、したがって、このようなウォートを煮沸する時間を実質的に短縮することが可能となる。冷却後、ウォートを、酵母、好ましくは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ種であるビール酵母を含有する発酵タンクへと移送する。ウォートは、任意の適切な時間、一般には１〜１００日間の範囲内で発酵させる。数日間にわたる発酵工程において、糖はアルコールおよびＣＯ_２へと転換され、これと同時に一部の風味物質が生成される。
【０１５１】
その後、ビールはさらに加工され、例えば、冷却される。それはまた、濾過および／またはラガーリング（快い芳香を生成させ、酵母風味を軽減する工程）を経る場合もある。また、添加物を添加することもできる。さらに、ＣＯ_２を添加することもできる。最後に、ビールを殺菌および濾過して、ボトルまたは缶に封入する。
【０１５２】
オオムギ植物体または植物生成物が、ＭＭＴ遺伝子における、ＭＭＴ機能の完全な喪失を引き起こす変異を保有するオオムギ植物体から調製されるかどうかを判定するには、各種の方法を用いることができる。植物生成物は、一般に、その生成に用いられる植物体に由来する少なくとも一部のゲノムＤＮＡを含む。したがって、モルトは、大量のゲノムＤＮＡを含有するが、ウォートなど、オオムギまたはモルトの抽出物であっても、前記オオムギまたはモルトに由来するゲノムＤＮＡを含み得る。ビールなど、オオムギベースの飲料もまた、前記植物体に由来するゲノムＤＮＡを含み得る。植物生成物中のＤＮＡを解析することにより、そこから植物生成物が調製される植物体が、ＭＭＴ遺伝子における、ＭＭＴ機能の完全な喪失を引き起こす変異を保有するかどうかを確立することができる。前記変異は、例えば、本明細書上記の節「機能的ＭＭＴ酵素の喪失」で説明した、ＭＭＴ遺伝子内の変異のうちのいずれかであり得るであろう。ゲノムＤＮＡは、配列決定などの任意の有用な方法により、またはＰＣＲベースの方法を含めた増幅ベースの方法により解析することができる。ＭＭＴ遺伝子における特定の変異が推定される場合は、例えば、ＳＮＰ解析などの多型解析を用いることができる。このような解析は、本明細書下記の実施例１３および１７で説明する通りに実施することができる。当業者は、これらの実施例で説明される特定のＳＮＰ解析を、他の変異または他の出発物質と共に用いるのに適合させることができるであろう。
【０１５３】
上述の植物生成物が、ＭＭＴ遺伝子における、ＭＭＴ機能の完全な喪失を引き起こす変異を保有するオオムギ植物体だけから調製される場合は、オオムギのＭＭＴ ｍＲＮＡおよび／またはＭＭＴタンパク質の存在対不在もまた、前記植物生成物が、ＭＭＴヌルのオオムギから調製されているかどうかを示し得る。したがって、ウェスタンブロット解析または他のタンパク質解析により植物生成物を検討することもでき、ＲＴ−ＰＣＲにより、またはノーザンブロット解析により、または他のｍＲＮＡ解析により植物生成物を検討することもできる。このような解析は、植物生成物がモルトである場合、特に有用である。
【０１５４】
ＳＭＭおよびＤＭＳ
植物生成物中におけるＳＭＭおよびＤＭＳの量は、任意の適切な方法により決定することができる。ＳＭＭは、本質的に、本明細書上記の節「機能的ＭＭＴを完全に喪失させたオオムギ植物体の調製」（この節では、オオムギ試料中におけるＳＭＭレベルの決定について説明される）において説明した通りに決定することができる。したがって、ＳＭＭは、それをＯＰＡなどの化合物へと連結し、例えば、ＵＰＬＣシステムを用いることを介して、蛍光発光を決定することにより決定することができる。定量的な測定を行う場合は、ＳＭＭピークに対応するクロマトグラムの面積を決定することができる。
【０１５５】
より正確な測定を行う場合は、ＤＭＳおよびＤＭＳＰ（ＳＭＭなど）（活性化後、後者の化合物は、ＤＭＳとして測定される）のいずれの量も、高解像度キャピラリーガスクロマトグラフィーを用いて決定することが好ましい。本明細書では、ウォート試料中またはビール試料中における全ＤＭＳを、遊離ＤＭＳと、ＤＭＳＰと称するその前駆形態との定量的な和として定義する。この定義を用いると、ウォート試料中またはビール試料中におけるＤＭＳＰの量を、全ＤＭＳ（煮沸試料中、好ましくは、アルカリ性条件下で１時間にわたり煮沸した試料中において測定された）と、遊離ＤＭＳ（煮沸していない試料中で測定された）との差として決定することができる。実施例６では、全ＤＭＳレベルおよび遊離ＤＭＳレベルを測定するのに好ましい方法について詳述する。
【０１５６】
化学的変異誘発
本発明によるＭＭＴをコードする遺伝子における、ＭＭＴ機能の完全な喪失を引き起こす変異を保有するオオムギ植物体を作製するには、任意の適切な変異誘発法により、例えば、オオムギ穀粒の化学的変異誘発（無作為的に変異を誘導することが公知である方法）を用いることにより、極めて多数のオオムギ変異体を調製することができる。オオムギの変異誘発は、任意の変異誘発化学物質を用いて実施することができる。しかし、オオムギの変異誘発は、穀粒をＮａＮ_３で処理し（図７を参照されたい）、生存する穀粒を発芽させた後、子孫植物体を解析することにより実施することが好ましい。Ｍ０世代と称する、変異誘発させた穀粒から成長する植物体世代は、任意の所与の変異について、ヘテロ接合体のキメラを含有する。自己授粉後に回収された子孫植物体を、Ｍ１世代と称するが、ここでは、所与の変異が、対応するヘテロ接合体およびホモ接合体へと分離する。
【０１５７】
処理後における穀粒は、一部の非変異体細胞と、ＤＮＡの変異を有する各種の細胞とを含有するので、オオムギ穀粒をＮａＮ_３で処理することは、単一のオオムギ細胞を処理することと等価ではない。生殖細胞系列をもたらさない細胞系統では変異が失われるが、これは、生殖組織へと生育し、Ｍ１世代の発生に寄与する少数の細胞を、変異誘発物質の標的とすることが目的であることを意味する。
【０１５８】
全体的な変異効率を評価するため、Ｍ０世代およびＭ１世代のそれぞれにおいて、アルビノキメラおよびアルビノ植物体をカウントすることができる。変異体の数を生存植物体数の関数として評価することにより、変異の効率についての推定値が得られる一方、変異体数を、処理した種子数の関数として評価することにより、変異の効率と、穀粒死滅との両方についての組合せ測定値が得られる。
【０１５９】
細胞が、遺伝子発現のほとんどどの段階でも、変異の損傷的効果をおそらく緩和する、品質保証機構を有することは注目に値する。真核生物において十分に研究されている一例は、ＮＭＤと称し、潜在的に有害な、未熟の切断型タンパク質の合成を防止する、ナンセンス変異依存ｍＲＮＡ分解機構（ＭａｑｕａｔおよびＣａｒｍｉｃｈａｅｌ、２００１年； Ｗｕ ら、２００７年）である。ＮＭＤでは、終止コドンが、下流の不安定化エレメントに対するその位置により未熟であると同定される。ＰＴＣと称する、未熟終止（ナンセンス変異）コドンを発生させる変異は、場合によって、原因変異をスキップし、これにより、タンパク質機能を潜在的に保全する、代替的なスプライス転写物のレベルを上昇させることがある（ＭｅｎｄｅｌｌおよびＤｉｅｔｚ、２００１年）。
【０１６０】
植物体の育種
作物の育成は、新規の形質の導入と共に始まる、長期間にわたる過程として見ることができる。植物育種家の視点からすると、この工程は、農業形質の全体的プロファイルの所望の程度が、市販される現行の品種より劣る植物体を結果としてもたらす場合が多い。したがって、本発明の好ましい一実施形態では、ＭＭＴ遺伝子における、機能的ＭＭＴの完全な喪失を引き起こす変異を保有する、農業的に有用なオオムギ植物体を提供することが目的である。
【０１６１】
ＭＭＴヌルの形質に加えて、穀粒の収量、穀粒のサイズ、ならびにモルト化の効力または醸造の効力に関するパラメータが含まれるがこれらに限定されない、市販のモルト化オオムギ品種を生成させる技術分野でもまた考慮し得る他の因子も存在する。このような形質の多く（すべてではないにせよ）は、遺伝子の制御下にあるため、本発明はまた、ＭＭＴヌルのオオムギ植物体との異種交配から調製され得る、最新で、ホモ接合型の、高収量をもたらすオオムギ栽培品種も提供する。このようなオオムギ植物体の穀粒は、機能的なＭＭＴ酵素を有さない新規の原料を提供する。オオムギ育種の当業者は、本発明によるＭＭＴヌルのオオムギ植物体を、他のオオムギ植物体と異種交配させ、その後、優れた栽培品種を結果としてもたらす形質を有する子孫植物体を選択および育成することができるであろう。このような子孫植物体もまた、本発明の一部と考えられる。代替的に、オオムギの育種家は、本発明の植物体を用いて、さらなる変異誘発をもたらし、ＭＭＴヌルのオオムギに由来する新規の栽培品種を生成させることができる。
【０１６２】
本発明によるオオムギ植物体は、任意の適切なスキームによる育種の試みにおいて用いることができる。
【０１６３】
本発明の別の目的は、ＭＭＴヌルの形質を含む、農業的に優良のオオムギ植物体を提供することである。したがって、本発明はまた、第１の親オオムギ植物体を、第２の親オオムギ植物体と異種交配させることにより、新規のＭＭＴヌルのオオムギ植物体を作製する方法であって、該第１および第２の植物体が、ＭＭＴヌルのオオムギである方法も対象とする。加えて、第１および第２の親オオムギ植物体はいずれも、ＭＭＴヌルのオオムギ品種を表す。したがって、ＭＭＴヌルのオオムギ品種を用いる以下：自家受粉、戻し交配、品種集団との異種交配などのうちのいずれかのこのような方法は、本発明の一部である。ＭＭＴヌルのオオムギ品種に由来する品種から発生した植物体を含め、ＭＭＴヌルのオオムギ品種を親世代として用いて作製されるすべての植物体は、本発明の範囲内にある。ＭＭＴヌルのオオムギはまた、ＭＭＴヌルの植物体または植物体組織に外因性のＤＮＡを導入し、これを発現させる場合における遺伝子形質転換にも用いることができる。
【０１６４】
本発明と共に戻し交配法を用いて、変異したオオムギ植物体のＭＭＴヌル形質を、別の品種、例えば、栽培品種Ｓｃａｒｌｅｔｔまたは栽培品種Ｊｅｒｓｅｙ（これらのいずれもが、高収量をもたらす新型のモルト化オオムギ栽培品種である）など、別の栽培品種へと導入することができる。標準的な戻し交配のプロトコールでは、対象の元の品種、すなわち、対象の反復親植物体を、形質導入される対象の単一遺伝子を保有する第２の品種（すなわち、一回親植物体）と異種交配させる。この異種交配から結果として得られるＭＭＴヌルの子孫植物体を、その後、該反復親へと異種交配させ、該一回親植物体の該ＭＭＴヌルの形質を遺伝子配置に形質導入することに加えて、該反復親植物体により指定される本質的にすべての特徴が、生成される植物体内で復帰するオオムギ植物体が得られるまで、該過程を反復する。最終的に、該戻し交配により最後に生成された植物体を自家受粉させて、純粋な、ＭＭＴヌルの育種用子孫植物体を得る。
【０１６５】
その目的に、ＭＭＴヌルの形質を元の品種へと導入することを包含する戻し交配手順を成功させるには、適切な反復親を有することが好ましい。これを達成するには、元の品種に由来する本質的にすべての遺伝子特性を保持させながら、一回親植物体に由来するＭＭＴヌル形質の遺伝子配置により、該反復親品種の遺伝子配置を改変する。形質導入される遺伝子特性が、優性の対立遺伝子により指定される場合は、戻し交配法が単純化されるが、劣性のＭＭＴヌル形質の遺伝子特性を戻し交配することも可能である。
【０１６６】
植物体の育種過程を加速化させる方法は、組織培養物法および組織再生法を適用することにより、生成された変異体を初期繁殖させることを含む。したがって、本発明の別の態様は、（増殖および分化すると）ＭＭＴヌルの形質を有するオオムギ植物体を生成させる細胞を提供することである。例えば、育種は、従来の異種交配、葯に由来する造精植物体の調製、または小胞子培養法の使用を伴い得る。
【０１６７】
ＭＭＴをコードする遺伝子における、ＭＭＴ活性の完全な喪失を引き起こす変異を保有するだけでなく、１または複数のさらなる有用な変異も保有するオオムギ植物体を提供することもまた、本発明の実施形態である。このようなさらなる変異には、例えば、リポキシゲナーゼ１（ＬＯＸ−１）の活性レベルを低下させる変異（例えば、Ｄｏｕｍａ， Ａ．Ｃ．らによる米国特許第６，６６０，９１５号において説明される変異体）、またはＢｒｅｄｄａｍ， Ｋ．らによる米国特許第７，４２０，１０５号またはＰＣＴ特許出願第ＷＯ２００５／０８７９３４号において開示される変異体のうちのいずれか、特に、Ｂｒｅｄｄａｍ， Ｋ．らによる米国特許第７，４２０，１０５号の配列番号２または配列番号６による、ＬＯＸ−１をコードする遺伝子のゲノム配列を含む変異体など、ＬＯＸ−１機能の完全な喪失を引き起こす変異など、ＬＯＸ−１をコードするオオムギ遺伝子内の変異が含まれ得る。
【０１６８】
上述の特許および特許出願において説明されるＬＯＸ−１ヌルのモルトであれば、それ自体、オオムギのモルト化工程における低温キルン乾燥の原料をもたらし得るであろう。しかし、ＬＯＸ−１活性およびＭＭＴ活性のいずれもが不活化されるので、ＬＯＸ−１ヌルとＭＭＴヌルとを組み合わせた二重変異体であれば、醸造業において優れた、高度に有用な植物体となるであろう。このようなオオムギ植物体は、本発明によるオオムギ植物体を、Ｂｒｅｄｄａｍ， Ｋ．らによる米国特許第７，４２０，１０５号またはＰＣＴ特許出願第ＷＯ２００５／０８７９３４号で説明される植物体と異種交配することにより得ることができる。
【実施例】
【０１６９】
本明細書の実施例は、本発明の好ましい実施形態を例示しており、本発明を限定するものとみなされるべきではない。
【０１７０】
他に指定がない限り、核酸、タンパク質および細菌を取り扱うために、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌ（２００１年）に記載の基本的な分子生物学的技法を行った。
【０１７１】
（実施例１）
ＤＭＳはビールのエステル風味を隠す
硫黄に似た風味の調子を特徴付けることは、一般のビールのパネル試飲家の中でさえも、一般に難しいと考えられている。多くの場合、ビールの試飲パネリストは、硫黄の調子を特徴付けるために、専門的な硫黄の調子、例えば「メルカプタン」、「硫化水素」および「ＤＭＳ」よりも、「硫黄の」という一般用語を使用する。
【０１７２】
９名の試飲家規模のパネルを設けた後、硫黄含有成分の香ばしさを追跡することに関してメンバーを広範囲にわたって訓練し、驚いたことに、硫黄成分を添加することが、他の香ばしさ構成成分の知覚に強く影響を及ぼすこと、例えばビールのエステル風味およびボディ感についての低スコアにつながる性質が明らかになった。
【０１７３】
別の一連の実験では、パネルを訓練するためにＤＭＳを選択した。高濃度の前記硫黄含有構成成分をスパイクしたビール試料をパネルに提示し、パネルは試飲し、「ボディ感」、「エステル風」および「ＤＭＳ」という特性を、０（なし）から５（極度）までの尺度で順位付けするように要求された。検査の各シリーズは、標準の、市販のビールおよび２種の、パネリストに対して未知の試料を含んだ。
【０１７４】
図１Ｂにおいて、それぞれ、エステルおよびエステル／ＤＭＳをスパイクしたビール試料を含む検査シリーズからの平均スコアの結果を例示している。ＤＭＳを添加することが、エステルと組み合わせた場合、エステルのみをスパイクすることによって得られたそのスコアと比較して、知覚されるエステル風のスコアに負の影響を及ぼしたことは予想外の結果であった。同様に、ビールのボディ感の調子が減少した。驚くことではないが、ＤＭＳをスパイクすると、その性質に対するスコアが増大した。
【０１７５】
上記の結果は、専門化した試飲パネルの、単一の風味構成成分の風味を感じる能力は、他の香ばしさ構成成分によって決定された「風味バックグラウンド」に大いに左右されると思われることを実証している。
【０１７６】
図１Ｂに要約されている、風味の検査からの驚くべき知見により、対応する原料を飲料生成において利用することにより、ＤＭＳが少ないまたはＤＭＳを含まない製品を生成することが可能になり得るだけでなく、エステル調子についての改良も約束されるような、ＤＭＳレベルが低い飲料、およびそのような飲料を調製するために有用なオオムギの変異体、すなわちＳＭＭを合成する能力を喪失したオオムギの変異体を提供することによって本発明の基礎ももたらされた。
【０１７７】
（実施例２）
スクリーニングの準備、手法１
栽培品種Ｐｒｅｓｔｉｇｅおよび栽培品種Ｓｅｂａｓｔｉａｎのオオムギ植物体から採取した穀粒を、別々に、Ｋｌｅｉｎｈｏｆｓら（１９７８年）によって提供された実験の詳細に従って、変異原ＮａＮ_３と一緒にインキュベートした。この手順を選択したのは、オオムギのゲノムＤＮＡにおいて点変異を誘発する可能性が公知であるからである。
【０１７８】
本実験では、Ｍ１世代の変異した子実を、畑の小区画において次の２世代を通して繁殖させ、最終的に、スクリーニングするために、高比率のホモ接合性のＭ３世代の植物体を得た。Ｍ３世代の変異した子実は、子実１０，０００個当たり０．９〜２．３の頻度で遺伝子変異を含有することが予想された（Ｋｌｅｉｎｈｏｆｓら、上記）。Ｍ２子実がスクリーニングされなかったことは注目に値する。
【０１７９】
興味深いことに、本発明は、モルト製造の間の検出可能なＳＭＭ合成の喪失をもたらす、ＭＭＴ活性を喪失したＭ３変異オオムギ子実を検出するための高速ハイスループットスクリーニング手順を記載している。したがって、出願人らは、ＳＭＭが、発芽しているオオムギの子葉鞘および初生葉に主に蓄積したこと、および４日齢の発芽した子実の破砕した葉組織からアミノ酸を抽出し、続いて抽出したアミノ酸をＯＰＡと反応させて高度に蛍光性の生成物を形成することによって、ＳＭＭの検出を行うことができることを見出した（図２参照）。
【０１８０】
実際的に述べると、各アッセイは、閉じたプラスチックの箱の中で、Ｗｈａｔｍａｎ＃１濾紙（２９６×２０．９ｍｍ）１枚を用いて９４種の可能性のある変異体のそれぞれからの２つの子実および２つの野生型植物体を発芽させることによって行った。多数の、可能性のある変異子実に対してアッセイを繰り返した（下記を参照されたい）。発芽の開始時に水道水２５ｍＬ、続いて発芽の２日目に付加的な水道水１５ｍＬを前記プラスチックの箱に加えた。発芽の４日後に、１〜３ｃｍの葉組織を、１．２ｍＬの９６ウェルのそれぞれが直径５ｍｍのガラスビーズおよび水：メタノール：クロロホルムの１２：５：６（ｖ／ｖ／ｖ）混合物５００μＬを含む、貯蔵プレート（ＡＢｇｅｎｅ）に移した。次いで、プレートを、ＭＭ３００ラボ用粉砕器（Ｒｅｔｓｃｈ）内で３０Ｈｚの頻度で４５秒間振とうした。その後、プレートを遠心分離機（Ｒｏｔａｎｔａ４６０Ｒ、Ｈｅｔｔｉｃｈ）に移し、４，０００ｒｐｍで１５分、室温で、不溶性物質が沈殿するまで回転させた。上清１０μＬを９６ウェル貯蔵プレート（Ｗａｔｅｒｓ、カタログ番号１８６００２４８１）に移し、２００μＬのＨ_２ＯおよびＯＰＡ試薬（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｐ７９１４）：３−メルカプトプロピオン酸（Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｍ５８０１）の１５，０００：４５（ｖ／ｖ）混合物を含有する反応溶液６０μＬと混合した。混合物を４℃で少なくとも１０分間インキュベートしてＯＰＡによる試料アミノ酸の定量的誘導体化を得る。蛍光検出器を備えたＷａｔｅｒｓに基づくＵＰＬＣシステムを使用して、誘導体化された混合物２μＬを２．１×３０ｍｍの、３μｍの粒子のＣ１８ Ｇｅｍｉｎｉカラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、カタログ番号００Ａ−４４３９−８０）において、移動相Ａ（４０ｍＭのＮａＨ_２ＰＯ_４緩衝液、ｐＨ７．８に調整）と移動相Ｂ［記載されている通り（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、２００６年）、アセトニトリル：メタノール：水の４５：４５：１０（ｖ：ｖ：ｖ）溶液］を混合することによる勾配溶出を使用して分離した。溶出されたＯＰＡ誘導体の励起は３４０ｎｍであったと同時に、光の放射は４５０ｎｍにおいて測定された。クロマトグラムの例を図３Ａに示して、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、セリン（Ｓｅｒ）およびＳＭＭの溶出プロファイルを例示している。ＳＭＭは、全体的なプロジェクトの目的が、ＳＭＭを合成する能力を喪失したオオムギ植物体、すなわち、対応するクロマトグラムのピークが非常に小さいまたは好ましくはピークが存在しない植物体を同定することであったので、それを含めた。
【０１８１】
スクリーニングの準備、手法２
当該実施例では、上記の実験と平行して、活性なＭＭＴ酵素を喪失したオオムギの実生を同定するための非常に高速のスクリーニング方法を確立するために試みを行った。植物体が、亜セレン酸Ｎａを転換するための活性なＭＭＴを含有すれば、前記実生が２５０μＭの亜セレン酸Ｎａの存在下で成長することができるという事実に基づいて、スクリーニングを設計して、前記濃度の亜セレン酸Ｎａの存在下で成長が減少した実生を視覚的にスコア化した。実際的に述べると、ＮａＮ_３変異誘発されたオオムギの栽培品種ＰｒｅｓｔｉｇｅのＭ３世代の、それぞれが２０〜３０の穀粒からなる２２，７０４の穂を、２５０μＭの亜セレン酸Ｎａを補充し標準のＶｅｒｍｅｃｕｌｉｔｅ成長培地で満たしたプラスチックトレイ内においた。穂の穀粒を発芽させ、長さ約１５ｃｍの実生にまで発達させた。成長が減少したことを特徴とする、すなわち、実生の長さが＜１５ｃｍである計８１２の植物体を、新しい土に移し、さらに発達させた。しかし、野生型レベルのＳＭＭと比較することによって決定すると、ＭＭＴ活性が低下したことが分かった前記植物体はなかった。したがって、上記のスクリーニング手法では変異体が得られず、したがって終了させた。
【０１８２】
（実施例３）
可能性のある変異体
それぞれ、計１０，２４８および計３，８５８の、オオムギの栽培品種Ｐｒｅｓｔｉｇｅおよび栽培品種ＳｅｂａｓｔｉａｎのＮａＮ_３変異した穀粒を、野生型子実と比較するとＳＭＭ含有量が大いに減少したものを同定するために、ＳＭＭ含有量についてスクリーニングした（実施例２の手法１を参照されたい）。Ｍ３世代の、可能性のある変異体が２つのみ同定された、すなわち、試料番号８，０６３の子実（栽培品種Ｐｒｅｓｔｉｇｅに由来し、以下変異体８０６３と表示され、呼称は次の世代の子実に対しても使用される；図３Ｂ）、および試料番号１４，０１８の子実（栽培品種Ｓｅｂａｓｔｉａｎに由来し、以下変異体１４０１８と表示され、呼称は、次の世代の子実に対しても使用される；図３Ｂに例示している）。各変異体の子実をＭ４世代まで繁殖させ、次いで収穫し、最終的に再分析した。その結果、変異体８０６３および変異体１４０１８の子実が、極度に低いＳＭＭ含有量を有し、ＳＭＭを完全に喪失している可能性もあることが立証された。
【０１８３】
別々の実験において、ウェスタンブロット分析を用いて変異体８０６３および変異体１４０１８がＭＭＴ酵素を喪失していることを立証した。変異体および対応する野生型植物体の子実を、暗闇の中で４日間、水に浸した濾紙上で発芽させた。各試料の子実を１つずつ２５０μＬのＨ_２Ｏを含有するエッペンドルフチューブに移し、雌ずいを使用することによってホモジナイズした。１０分間の長さ、１３，０００ｒｐｍで遠心分離した後、液体抽出物１５μＬを標準の４倍濃縮したＳＤＳ試料緩衝液５μＬと混合した。実施例１２に記載されているものと同じ免疫学的な方法体系および前記実施例において説明しているものと同じ抗ＭＭＴ抗体の一定分量を使用することによって、上述の、発芽した穀粒の試料抽出物のタンパク質をサイズによって電気泳動的に分離し、ウェスタンブロット分析に適用した。サイズによって分離した変異体８０６３および変異体１４０１８の抽出物について、ＭＭＴに対応する、染色された１２０ｋＤａのタンパク質バンドが存在しないことが示された。しかし、発芽した野生型穀粒の抽出物において、１２０ｋＤａのタンパク質バンドが明瞭に目に見えた（図３Ｃ）。ウェスタン分析の結果と、変異体８０６３および変異体１４０１８の抽出物にＳＭＭが存在しないが野生型穀粒の抽出物にＳＭＭが存在すること（図３Ｂ参照）を併せて、変異体８０６３および変異体１４０１８が、ＭＭＴ形質に関してヌル変異体を表していることが実証されている。
【０１８４】
（実施例４）
変異体８０６３のＭＭＴ活性の測定
ＭＭＴ酵素は、メチル基がＳＡＭからＭｅｔへ移動し、ＳＭＭが形成されることを触媒する（図１Ｂ参照）。メチル基をトリチウムで標識した［^３Ｈ］ＳＡＭを基質として使用して、活性炭によって残りの［^３Ｈ］ＳＡＭを除去した後にシンチレーション計数することによって、前記メチル基の移動をモニターすることができる。活性炭は基質に結合するが、新たに合成された、標識されたＳＭＭ生成物には結合しない（Ｐｉｍｅｎｔａら、１９９５年）。これによって、変異体８０６３および栽培品種Ｐｒｅｓｔｉｇｅそれぞれの苗条１５ずつの抽出物における、ＭＭＴの活性、および実施例２に記載の通り決定したＳＭＭ含有量を検出することが可能になった。（図４）。データを検討することにより、野生型の穀粒において、変異体８０６３の子実にはない性質、ＭＭＴがＳＭＭの形成を触媒したことが立証された。
【０１８５】
（実施例５）
変異体８０６３のヌルＭＭＴ穀粒のパイロット規模でのモルト製造および醸造
変異体８０６３のモルトおよび栽培品種Ｐｏｗｅｒの参照モルトを用いたモルト製造および醸造分析は、
（ｉ）スティーピングすること、グリーンモルトを生成すること、時には続いて
キルン乾燥してキルン乾燥モルトを得ることを含めた発芽させる工程と；
（ｉｉ）ウォートを調製する工程と；
（ｉｉｉ）ウォートを分離する工程と；
（ｉｖ）ウォートを煮沸する工程と；
（ｖ）酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓを用いてウォートを発酵させる工程と；
（ｖｉ）ビールをラガーリングする工程と；
（ｖｉｉ）澄んだビールを濾過する工程と；
（ｖｉｉｉ）ビールを瓶詰めする工程
とを伴う。
【０１８６】
変異体８０６３および栽培品種Ｐｏｗｅｒ（参照試料）のどちらについても、醸造するためにモルト３０ｋｇを使用した。モルト試料を粉砕し、次いで各試料について、１５０Ｌまで水道水を加えた。マッシングインを６０℃で２０分間行い、続いて５分間で６５℃まで徐々に上げ、その温度で５５分インキュベートを続けた。次いで、マッシュを１５分間、７８℃までの勾配にかけ、５分間インキュベートした後にマッシングを終わらせた。
【０１８７】
その後の醸造作業は、ウォートの濾過、１時間の長さの煮沸工程、およびワールプールにおける分離を含んだ。７日間の長さの発酵、ラガーリング、および完成したビールの緑色のガラス瓶への充填は、例えば、Ｂｒｉｇｇｓら（１９８１年）およびＨｏｕｇｈら（１９８２年）によって記載されている標準の醸造の実施の規格に従った。野生型のモルトおよび変異体のモルト由来のビールで、全部で１００本の３３ｃＬ瓶を作製した。
【０１８８】
（実施例６）
ヌルＭＭＴモルトで作られたビールのＤＭＳおよびＤＭＳＰのレベル
ヌルＭＭＴおよび栽培品種Ｐｏｗｅｒのモルトから、実施例５に記載の通りビールを醸造した。モルト製造および醸造のプロセスの間、遊離のＤＭＳおよびＤＭＳＰのレベルを、グリーンモルトおよびキルン乾燥モルトにおいて（図５Ａ）、ならびに対応するスイートウォートおよび煮沸ウォート、さらには完成したビールにおいて決定した（図５Ｂ）。
【０１８９】
ＤＭＳおよびＤＭＳＰのレベルを、基本的にＨｙｓｅｒｔら（１９８０年）によって記載されている通り、３５０Ｂ Ｓｕｌｆｕｒ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ（Ｓｉｅｖｅｒｓ）で静的ヘッドスペースガスクロマトグラフィーを使用した硫黄特異的な検出を用いて決定した。自動装置（ＨＳ−４０ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｈｅａｄｓｐａｃｅ Ｓａｍｐｌｅｒ、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用してサンプリングを行った。ＤＭＳの総レベル、すなわち、ウォートならびにグリーンモルトおよびキルン乾燥モルトの抽出物中の遊離のＤＭＳおよびＤＭＳＰの合計を、それぞれの試料をアルカリ性条件下で１時間煮沸することによって得た。次いで、試料を、ＤＭＳレベルを検出するためにヘッドスペース分析に供した。以前に記載の通り、煮沸した試料中の総ＤＭＳレベルと、対応する煮沸していない試料中の遊離のＤＭＳの間の差異は、試料ＤＭＳＰの量と等しいと定義された。ビール中の遊離のＤＭＳの量は、基本的にウォート中のＤＭＳの量と同様に決定した（Ｈｙｓｅｒｔら、上記）。
【０１９０】
（実施例７）
ヌルＭＭＴモルトを用いて醸造したビールの試飲
パイロット規模で生成した、ヌルＭＭＴモルトを用いて醸造したビールを、プロのビールの試飲パネルがどのように評価するかを確立するために、ＤＭＳを４ｐｐｂ含有することが測定されたビールについて、プロファイル試飲を行った。参照として、栽培品種Ｐｏｗｅｒのモルトを使用して生成した、ＤＭＳが７６ｐｐｂの通常のビールを使用した。
【０１９１】
風味の分析に先だって、ビールのエステルおよび高級アルコールのプロファイルをガスクロマトグラフィー分析によって得た。ヌルＭＭＴモルトのビールは、分析された化合物１２種の内３種に関してレベルが低かった（表１）。第１の風味の検査では、酢酸エチル、酢酸イソアミルおよびオクタン酸エチルからなる混合物１を、ヌルＭＭＴモルトを用いて醸造したビールにスパイクして、２種のラガービールが、標準のエステルプロファイルに寄与するこれらの風味が活性な化合物を同様のレベルで有することを確実にした。（表１参照）。第２の検査の目的は、風味の調子が増大した高エステルビールを作製することであった。したがって、酢酸イソアミル、ヘキサン酸エチル（ｅｔｈｙｌｈｅｘａｎｏｔｅ）およびオクタン酸エチルからなる混合物２を、栽培品種Ｐｏｗｅｒのモルトのビールにスパイクし（表１）、一方、ヌルＭＭＴモルトのビールには、混合物１および混合物２の両方をスパイクした。
【０１９２】
次いで、上記のビールを１０名の規模の訓練されたビールの試飲パネルが検査し、２０種の特異的な風味特質を、それぞれ０〜５の尺度またはスコアで評価した（図６）。
【０１９３】
図６Ａにおいて高エステルビールについて説明している通り、同じレベルにスパイクした標準のビールと比較して、ヌルＭＭＴモルトで醸造した「非常に低ＤＭＳのビール」における、香ばしい（ａｒｏｍａｔｉｃ−ｆｒａｇｒａｎｔ）風味の知覚に対する注目すべき影響があった。評価されたすべての香ばしい風味について高いスコアが示された。通常のエステルプロファイルをスパイクしたヌルＭＭＴモルトのビールにおいてさえ（図６Ｂ）、香ばしい風味の知覚が増大したことが示され、これはＤＭＳのレベルが低いことが、香ばしいビール化合物の知覚に関して正の影響を与えることを重ねて示している。この現象に対する解釈は、単純に、ビール中のＤＭＳが、飲料の鮮度を評価する際に重要な因子を表す、心地よい香ばしい風味の風味を隠すということである。
【０１９４】
【表１】

＊酢酸２−メチルブチル濃度と酢酸イソアミル濃度の和
＊＊２−メチル−１−ブタノール濃度とイソアミルアルコール濃度の和
（実施例８）
オオムギの栽培品種ＰｒｅｓｔｉｇｅにおいてＭＭＴをコードする遺伝子の配列決定
野生型のオオムギ植物体と変異したオオムギ植物体の間のＭＭＴ活性の差異の根底にあるゲノム多様性を確立することを目的として、主な試みは、対応するオオムギ遺伝子の開始コドンから終止コドンにわたるＤＮＡ配列を決定することであった。オオムギのＭＭＴ遺伝子の、以前に知られていないゲノム配列を確立するために、最初の工程は、６日齢の、栽培品種Ｐｒｅｓｔｉｇｅのオオムギの実生の葉からのゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を、Ｐｌａｎｔ ＤＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ、カタログ番号１６６７３１９）の供給業者によって提供された説明書に従って精製することであった。
【０１９５】
次に、ＭＭＴをコードするｃＤＮＡ配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＢ０２８８７０；配列番号１）に結合させるためにオリゴヌクレオチドプライマーを設計した。オオムギのｇＤＮＡを鋳型として使用して、そのＤＮＡ配列が表２に列挙されている６つの異なるプライマーセットを用いて標準のＰＣＲ増幅を行った。対で、プライマーは、エクソン１（翻訳開始コドンを含み、かつその下流）および２、エクソン２および４、エクソン４および５、エクソン５および９、エクソン９および１１、ならびにエクソン１１および１２（翻訳終止コドンを含み、かつその上流）にアニーリングすることが見出された。上述の６つの反応の内５つで、エクソン２〜４にわたるＤＮＡ断片、エクソン４〜５にわたるＤＮＡ断片、エクソン５〜９にわたるＤＮＡ断片、エクソン９〜１１にわたるＤＮＡ断片、およびエクソン１１〜１２にわたるＤＮＡ断片が生成した（図９参照）。１つの反応も、翻訳開始コドンからエクソン２にわたるＤＮＡ断片を生成すると仮定されたが（すなわち、表２および図９に列挙されているプライマーセット番号１を用いた反応）、反応の人為結果のみが観察された。この難しさの理由は分かりにくいままであるが、対象の遺伝子セグメントにおけるＧ塩基およびＣ塩基の含有量が著しく高いことが、正しい配列の増幅ができない原因である可能性がある。したがって、Ｇ−Ｃが豊富な遺伝子領域の増幅を容易にすることが主張されている多数の市販のＰＣＲ反応補充剤を、ＭＭＴをコードするオオムギ遺伝子の開始コドンの下流であるが、なおそれを含有するＤＮＡ断片を増幅するために試みに使用した。多数試みたにもかかわらず、表２に列挙されている反応１におけるプライマーによって指定される断片を増幅することに関しては、ｇＤＮＡ鋳型を利用したすべての取組みが失敗した。
【０１９６】
ｇＤＮＡの増幅を用いた実験と並んで、オオムギ実生の葉のＲＮＡ由来のｃＤＮＡが、ＭＭＴに対する遺伝子の厄介なエクソン１配列を増幅するための機能的な鋳型を構成し得るかどうかも試験した。したがって、４日齢の栽培品種Ｐｒｅｓｔｉｇｅのオオムギ実生の小葉から、ＦａｓｔＲＮＡ ＰｒｏＧｒｅｅｎ Ｋｉｔ （Ｑ−ＢＩＯｇｅｎｅ、カタログ番号６０４５−０５０）の構成成分および説明書を使用して全ＲＮＡを抽出し、精製した。これの一定分量を、ＯｎｅＳｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲキット（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号２１０２１２）の説明書において説明されている通り、８×２の標準のＲＴ−ＰＣＲ反応［すなわち、それぞれ２つの反応緩衝液を用いたプライマー対８つの組合せ（表３）］において使用した。断片を１％アガロースゲルで分離し、その後の分析によって、前記キットの緩衝液１を使用することによってのみ反応生成物が得られ得ることが明らかになった。次いで対象のＤＮＡバンドを、ＱｉａｅｘＩＩゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号２００５１）を使用して精製した。上述のＲＴ−ＰＣＲキットのＱ溶液の存在下で、プライマーセット番号７、１０、および１１（表３参照）を用いてＲＴ−ＰＣＲ増幅物を分離する。この場合、対象のＤＮＡ断片も精製した。個々のＤＮＡ断片をベクターｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ｋ４５００−０１）に挿入し、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞をこの構築物でトランスフェクションした後、プラスミド挿入物の、対応するＤＮＡ配列を決定した。
【０１９７】
総合すると、組み合わせた、上記の取組みは、栽培品種ＰｒｅｓｔｉｇｅのオオムギのＭＭＴ遺伝子の翻訳開始コドンから翻訳終止コドンにわたるゲノム配列（配列番号３）の組み立てに結晶化された。ｃＤＮＡおよびゲノム配列のアラインメント、すなわち配列番号３と配列番号１のアラインメントによって、図９に例示しているオオムギのＭＭＴ遺伝子が、１１のイントロン（全部で３１９２ｂｐ）によって分離された１２のエクソン（全部で３２６７ｂｐ）を含むことが決定された。栽培品種ＰｒｅｓｔｉｇｅのＭＭＴに対して導かれたアミノ酸配列を図１０に示し、配列番号６として列挙されている。上述の栽培品種ＰｒｅｓｔｉｇｅのＭＭＴに対して導かれたアミノ酸配列において、Ｐｒｏ１５７→ＡｌａおよびＭｅｔ９８５→Ｔｙｒを除けば、栽培品種Ｈａｒｕｎａ Ｎｉｊｏ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＢ０２８８７０；配列番号２）との比較により、完全に同一であることが明らかになった（図１１）。
【０１９８】
【表２】

＊）ＭＭＴのゲノム配列（配列番号３；図９も参照されたい）についてと同様の塩基対の番号付け
＊＊）「ＰＣＲ生成物の末端」と表示された列に列挙されている断片の５’末端の配列
＊＊＊）「ＰＣＲ生成物の末端」と表示された列に示されている断片の３’末端の相補配列
【０１９９】
【表３】

＊）ＭＭＴのゲノム配列（配列番号３）についてと同様の塩基対の番号付け
＊＊）「ＰＣＲ生成物の末端」と表示された列に列挙されている断片の５’末端の配列
＊＊＊）「ＲＴ−ＰＣＲ生成物の末端」と表示された列に示されている断片の３’末端の相補配列
（実施例９）
オオムギの変異体８０６３のＭＭＴをコードする遺伝子は、イントロン５
の５’スプライス部位において変異している
変異体８０６３のオオムギの実生では、ＭＭＴ活性が存在しないこと（実施例４）と一致して、ＳＭＭの含有量が極度に少ない、またはＳＭＭが含有されない（実施例３）。この知見に基づいて、ＭＭＴをコードする遺伝子における塩基置換が、オオムギ穀粒の最初のＮａＮ_３変異原処理によって引き起こされたかどうかを調査した。したがって、変異体８０６３のヌルＭＭＴ表現型についての分子基礎を確立するために、変異体８０６３の前記遺伝子を増幅し、クローニングし、配列決定するための試みを行った。
【０２００】
６つのプライマーセットを用いて栽培品種ＰｒｅｓｔｉｇｅのＭＭＴ野生型遺伝子のヌクレオチド配列を増幅し（表２；実施例８において説明している）、オオムギの変異体８０６３に対して同様の手法に従った。手短に、ゲノムＤＮＡを変異体から抽出し、ＭＭＴ遺伝子特異的な、それらの増幅断片をベクターｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ｋ４５００−０１）に挿入し、クローニングし、配列決定し、つなぎ合わせ（配列番号８）、そして最後に野生型オオムギの配列と比較した。ＭＭＴ遺伝子のタンパク質をコードする部分に変異は同定されなかった。しかし、変異体の遺伝子と野生型遺伝子のイントロン配列を比較することにより、イントロン５の一番目の塩基（配列番号８のヌクレオチド番号３０７６）におけるＧ→Ａ塩基転移が明らかになった。前記塩基は、イントロン５の５’スプライス部位の一部分であり、遺伝子の主要なＲＮＡプロセシング、すなわちＲＮＡスプライシングに影響を及ぼす（ＳｉｎｉｂａｌｄｉおよびＭｅｔｔｌｅｒ、１９９２年；図１２も参照されたい）。
【０２０１】
変異体８０６３のＭＭＴをコードする遺伝子における正常な遺伝子スプライシングの摂動に関して塩基変異が果たし得る役割を評価するために、スプライシング中間体を検出するために変異体由来のＲＮＡの詳細な分析を行った。イントロンの５’ＧＴジヌクレオチドの変化が、スプライシング中間体の蓄積につながる可能性があるので、この手法を選択した（Ｌａｌら、１９９９年）。
【０２０２】
対象の断片を増幅するために、分析はＲＴ−ＰＣＲキット（ＱｉａｇｅｎのＯｎｅＳｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲ、カタログ番号２１０２１２）を使用するために提供された推奨に従った。鋳型として、栽培品種Ｐｒｅｓｔｉｇｅおよび変異体８０６３の４日齢の実生の小葉から、実施例８に記載の通り精製した全ＲＮＡを１μｇ使用した。プライマーセット１５（表４）を使用してＲＴ−ＰＣＲ反応を設計して、野生型Ｐｒｅｓｔｉｇｅおよび変異体８０６３のＭＭＴの転写物のエクソン３からエクソン７にわたる遺伝子領域を増幅した（図１２Ａ）。増幅した後、反応生成物を１％アガロースゲルで電気泳動によって分離した（図１２Ｂ）。
【０２０３】
増幅生成物を検討することにより、野生型ＲＮＡを用いた反応からの単一のバンドのみが明らかになった（図１２Ｂ）。これをゲルから切り出し、ＱｉａｅｘＩＩキット（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号２００５１）の構成成分を使用して精製し、ベクターｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ｋ４５００−０１）に挿入し、クローニングし、配列決定した。分析により、野生型オオムギのＭＭＴの全長ｃＤＮＡ（配列番号４）の４４２〜１３２３にわたる塩基と同一の配列を特徴とする８８２ｂｐの断片（図１２Ｂ、Ｃの生成物１；配列番号９）が存在することが実証された。この知見に基づいて、選択的スプライシングは野生型遺伝子発現に無関係であると考えられる。
【０２０４】
変異体８０６３から精製した鋳型ＲＮＡを適用することを除いて、以前の段落で記載したものと同様のＲＴ−ＰＣＲ反応により、それぞれ、野生型ＲＮＡを使用して増幅した生成物１（図１２Ｂ）と長さが異なる３つの特異的なＤＮＡ断片−図１２Ｂの生成物２、生成物３、生成物４を指す−が生成した。したがって、ｍＲＮＡ前駆体のプロセシングは、変異体８０６３のＭＭＴ遺伝子のイントロン５の５’スプライス部位における単一の塩基変異によって妨害される。この筋書では、前記５’スプライス部位の使用が完全に無効になるが、潜在的な、付加的なスプライス部位の使用が活性化される。
【０２０５】
変異体８０６３において、上述の３つのＰＣＲ断片が得られたことの根底にある分子的原因に取り組む試みにおいて、それぞれを、ＤＮＡ配列を決定するために、実施例８において栽培品種ＰｒｅｓｔｉｇｅのＰＣＲ由来のＤＮＡバンドについて上記した手順を使用して調製した。最大の断片は１０８９ｂｐ長であり（図１２Ｃの生成物２；配列番号１０）、イントロン５の全体を含むことが見出され、一方、生成物３（図１２Ｃ；配列番号１２）および生成物４（図１２Ｃ；配列番号１４）は、それぞれ、９５５ｂｐ長および８１０ｂｐ長であり、したがって野生型ＲＮＡからの８８２ｂｐの断片よりも短かった（上記の説明を参照されたい）。生成物３のＤＮＡ配列を分析することにより、イントロン５の中央の潜在的なスプライス部位が明らかになり、一方生成物４の潜在的なスプライス部位はエクソン５にあった（図１２Ｄ）。
【０２０６】
それぞれ３１５アミノ酸長、３１５アミノ酸長、および２８９アミノ酸長の翻訳されたタンパク質をもたらす中途翻訳終止コドンを、生成物２［オオムギの栽培品種ＰｒｅｓｔｉｇｅからのゲノムＤＮＡ（配列番号３）の塩基番号付けによる３０８８〜３０９０位におけるＴＧＡ］、生成物３［オオムギの栽培品種ＰｒｅｓｔｉｇｅからのゲノムＤＮＡ（配列番号３）の塩基番号付けによる３０８８〜３０９０位におけるＴＧＡ］、および生成物４［オオムギの栽培品種ＰｒｅｓｔｉｇｅからのゲノムＤＮＡ（配列番号３）の塩基番号付けによる３２８９〜３２９１位におけるＴＧＡ］において発見したことも、ＤＮＡ配列の分析の重要な発見であった。図１２Ｃは生成物１、生成物２、生成物３、および生成物４の配列決定の結果の、図による比較および要約を提供し、一方、図１２Ｄおよび図１２Ｅにおける図は、選択的スプライシング事象に関与する特異的な塩基に対する特異的なデータを提供している。
【０２０７】
【表４】

†）変異体８０６３のＲＮＡ鋳型を使用するＲＴ−ＰＣＲ用
‡）変異体１４０１８のＲＮＡ鋳型を使用するＲＴ−ＰＣＲ用
＊）ＭＭＴのｃＤＮＡ（配列番号４）についてと同様の塩基対の番号付け
＊＊）「ＰＣＲ生成物の末端」と表示された列に示されている断片の５’末端の配列
＊＊＊）「ＰＣＲ生成物の末端」と表示された列に示されている断片の３’末端の相補配列
（実施例１０）
野生型ＭＭＴをコードする発現プラスミド
以下の２つの所見
（ｉ）Ｅ．ｃｏｌｉ細胞はＭＭＴおよびＳＭＭを合成する能力を喪失している（Ｔｈａｎｂｉｃｈｅｒら、１９９８年）：
（ｉｉ）植物のＭＭＴをＥ．ｃｏｌｉにおいて合成することができる（Ｔａｇａｍｏｕｎｔら、２００２年）
により、
上述の細菌において変異したオオムギのＭＭＴまたは切断型のオオムギのＭＭＴを異種発現させることにより、それらのＭＭＴが酵素活性を喪失していることを模擬実験または確認する新しい様式が可能になる。組換えと同様に、Ｅ．ｃｏｌｉからの野生型オオムギのＭＭＴは、そのような実験において陽性対照として機能すると思われ、課題は、オオムギのＭＭＴを異種発現させるためのＥ．ｃｏｌｉ発現プラスミドを設計し、構築することであった。
【０２０８】
関連性のある配列を増幅するために、まず全ＲＮＡを栽培品種Ｐｒｅｓｔｉｇｅの４日齢の実生の小葉から抽出し（実施例９において説明している通り）、その１μｇを、プライマーセット１７を反応混合物に加えた（表５）ことを除いて標準のＲＴ−ＰＣＲ反応において、鋳型として使用した。増幅生成物を、ベクターｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に挿入し、プラスミドｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ−ＭＭＴを得た。プラスミドをクローニングした後、全挿入物を配列決定し（配列番号５）、栽培品種Ｐｒｅｓｔｉｇｅの配列（配列番号４）と比較した。クローニングされた生成物において、ＭＭＴのアミノ酸置換、Ｌｅｕ４３７→Ｈｉｓ、Ｔｙｒ９８５→Ｍｅｔ、およびＧｌｙ１０１１→Ｓｅｒをもたらす（配列番号６および配列番号７を比較することによって決定された通り）、ＰＣＲに誘導されたヌクレオチドの相違が３つ同定された（Ｔ１３１０→Ａ、Ｔ２９５４→Ｃ、およびＧ３０３１→Ａ）。当該適用に関連性があり得るという意味で、組換えＭＭＴの作用を損なうと予想されたアミノ酸の変化はなかった。この結論は、発現されたタンパク質は活性であり、抗ＭＭＴ抗体によって認識され得るという知見に基づいた（実施例１２参照）。
【０２０９】
次に、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ−ＭＭＴをＮｄｅＩ−ＥｃｏＲＩを用いて切断し、５６９ｂｐのＮｄｅＩ−ＥｃｏＲＩ ５’断片および２６９９ｂｐの３’ＥｃｏＲＩ断片を得た。５’断片をＮｄｅＩ−ＥｃｏＲＩで直線化された発現ベクターｐＥＴ１９ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ、カタログ番号６９６７７−３）に挿入し、生じたプラスミドのＥｃｏＲＩ部位に上記の２６９９ｂｐの３’断片を挿入し、このようにして発現プラスミドｐＥＴ１９ｂ−ＭＭＴ（図１３Ａ）を生成させた。このＭＭＴをコードする発現プラスミドを、Ｎ末端Ｈｉｓタグ（ＭＧＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨ；配列番号６９）およびエンテロキナーゼ部位（ＳＳＧＨＩＤＤＤＤＫＨ；配列番号７０）に連結させた。
【０２１０】
【表５】

＊）ＭＭＴのｃＤＮＡ（配列番号５）についてと同様の塩基対の番号付け、すなわち、開始コドンの上流のＣＡＴおよび終止コドン下流のＡＡＴＴＣの配列の伸長を除外している。
＊＊）プライマーセットによって定義されたように「ＲＴ−ＰＣＲ生成物の末端」と表示された列に示されている断片の５’末端の配列。ＮｄｅＩ部位に下線を付した；翻訳開始コドンに二重下線を付した。
＊＊＊）「ＲＴ−ＰＣＲ生成物の末端」と表示された列に示されている断片の３’末端の相補配列。ＥｃｏＲＩ部位に下線を付した。ＥｃｏＲＩ部位を含む翻訳終止コドンをイタリック体で示している。
【０２１１】
（実施例１１）
変異体８０６３の切断型ＭＭＴをコードする発現プラスミド
変異体８０６３のＭＭＴをコードする遺伝子は、実施例９において、イントロン５の５’スプライス部位にＧ→Ａ塩基転移を含有し、それによって２つの潜在的なスプライス部位が活性化され、その結果、それぞれが中途終止コドンを含有する３つの異常な転写物が発現する（図１２Ｂ、Ｃ参照）ことが示された。
【０２１２】
変異体の転写物が非機能的ＭＭＴをコードすることを確認するために、下記の通りそれぞれの対応するオープンリーディングフレームを増幅し、Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターに挿入した。選択的にスプライシングされた転写物のうち２つ、詳細には生成物２および生成物３をもたらす転写物（図１２Ｂ）が、同一のタンパク質をコードすることは注目に値する。したがって、オオムギの変異体８０６３の異常にスプライシングされた遺伝子が機能的ＭＭＴ酵素をコードするかどうかを決定するためには、２つの発現プラスミドのみで十分であった。
【０２１３】
変異体８０６３における潜在的なスプライシング生成物の配列が分かったことにより（図１２Ｄ参照）、その構築について実施例１０において説明している発現プラスミドｐＥＴ１９ｂ−ＭＭＴからの関連性のある遺伝子部分を増幅することが可能になった。表６に列挙されているプライマーセット１８を使用して、生成物２（配列番号２７）および生成物３（配列番号２８）のＳａｃＩＩ−ＢａｍＨＩ断片として遺伝子の３’部分を増幅した。その後、これらをｐＥＴ１９ｂ−ＭＭＴの対応する断片と交換し（図１３Ａ参照）、発現プラスミドｐＥＴ１９ｂ−Ｌｉｎｅ８０６３−Ｐｒｏｄ２（図１３Ｂ）およびｐＥＴ１９ｂ−Ｌｉｎｅ８０６３−Ｐｒｏｄ３（図１３Ｃ）を生じさせた。平行して実行する反応では、生成物４（図１２Ｂ参照）に関連するＭＭＴに対応する切断型ＭＭＴを合成するために設計した発現プラスミドｐＥＴ１９ｂ−Ｌｉｎｅ８０６３−Ｐｒｏｄ４（図１３Ｄ；クローニングするための生成物４の配列を示す配列番号２９）を生成するために、プライマーセット１９（表６）を利用した。
【０２１４】
図１３Ｅは、野生型ＭＭＴと変異体８０６３によってコードされる切断型生成物の詳細なアミノ酸配列の比較を提供する。
【０２１５】
【表６】

＊）数字は、隣の列に列挙されている対応する配列番号のヌクレオチド番号を指す。
＊＊）一本の下線は、それぞれ、順方向プライマーのＳａｃＩＩ部位および逆方向プライマーのＢａｍＨＩ部位にしるしをつけるために使用した。二重下線は終止コドンを示す。
【０２１６】
（実施例１２）
変異体８０６３の組換えＭＭＴ型は不活性である
ＭＭＴ欠失型の変異体８０６３が酵素的に不活性であることを立証するために、ＢＬ２１株のＥ．ｃｏｌｉ細胞を、プラスミドｐＥＴ１９ｂ、ｐＥＴ１９ｂ−ＭＭＴ、ｐＥＴ１９ｂ−Ｌｉｎｅ８０６３−Ｐｒｏｄ３、およびｐＥＴ１９ｂ−Ｌｉｎｅ８０６３−Ｐｒｏｄ４で別々に形質転換し（図１３参照）、その後、アンピシリンを含有する標準のＬｕｒｉａ Ｂｒｏｔｈ（ＬＢ）培地５ｍＬ中で一晩繁殖させた。各培養物の１．２５ｍＬの一定分量を、新鮮なＬＢ１００ｍＬに加え、細胞密度がＯＤ_６００＝０．６に達するまで３７℃でインキュベートした。この時点で、異種タンパク質の発現を誘導するために、１ＭのＩＰＴＧを４０μＬ加えた。２０℃で一晩インキュベートした後、個々の培養物の細胞を、４℃、４，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離することによって沈殿させた。細胞ペレットのそれぞれを、５ｍＬのＨ_２Ｏに再懸濁させ、次いで何回かの凍結と融解のサイクルにかけ、最終的に、約７５０ユニット／Ｌのヌクレアーゼ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｅ８２６３−２５ＫＵ）の存在下、３７℃で３０分間インキュベートして試料の粘度を低下させた。４℃、４，０００ｒｐｍ、３０分間の長さで遠心分離した後、細胞溶解性タンパク質（液相中のタンパク質と定義される）を不溶性タンパク質（ペレット中のタンパク質と定義される）から分離するために、ペレットを、リゾチーム１ｍｇを含有する２ｍＬのＨ_２Ｏに再懸濁させることによってさらに洗浄した。外界温度で５分間インキュベートした後、１５ｍＬのＨ_２Ｏを添加することによって試料を希釈した。同様の洗浄−沈殿のサイクルを３回行った後、７Ｍの尿素、２ｍＭのβ−メルカプトエタノールを含有する５０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ緩衝液、ｐＨ８．０を１ｍＬ用いてペレット中の封入体タンパク質を抽出した。
【０２１７】
ＭＭＴ活性についてアッセイするために、細胞溶解性タンパク質（上述のように定義される）を含有する試料５０μＬを、０．４ｍＭのＡｄｏＭｅｔ、１０ｍＭのＭｅｔ、１ｍＭのＤＴＴ、０．１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡを含有する２５ｍＭのリン酸Ｋ緩衝液、ｐＨ６．０、２５０μＬに移した。５０℃で１時間インキュベートした後、試料を濾過し、１０μＬの一定分量を、実施例２において説明している通りＯＰＡと反応させた。次いで、ＳＭＭレベルについて前記実施例に記載の通りの分析が続き、結果は図１４Ａに要約されている。ｐＥＴ１９ｂ−ＭＭＴで形質転換した細胞からの抽出物のみが、ＳＭＭ標準物質と同じ保持時間でクロマトグラムのピークを生じた。したがって、ｐＥＴ１９ｂ−Ｌｉｎｅ８０６３−Ｐｒｏｄ３およびｐＥＴ１９ｂ−Ｌｉｎｅ８０６３−Ｐｒｏｄ４で形質転換した細胞からのクロマトグラムに同様のピークが存在しないことは、変異体８０６３が活性なＭＭＴを生成する能力を喪失していることを示している。
【０２１８】
変異体８０６３が全長の活性なＭＭＴを生成する能力を喪失していることを立証するために、別々の実験が計画された。上記のＥ．ｃｏｌｉ抽出物の、細胞溶解性のタンパク質試料５μＬおよびペレット由来のタンパク質試料１０μＬを、標準の電気泳動によって分離し、オオムギのＭＭＴの１５残基長のペプチド抗原を標的とするウサギポリクローナル抗ＭＭＴ抗体を用いて探索した［図１３Ｅ（アスタリスクでしるしをつけたひと続きの配列）参照；ポリクローナル抗ＭＭＴ抗体の、親和性精製した１２ｍＬスケールの調製物はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入し（プロジェクト番号Ｌ０４０２８０１Ｋ；動物番号Ｃ７５１１）、標準のウェスタンブロット分析において１：１０００希釈して使用した（図１４Ｂ、Ｃ）］。
【０２１９】
詳細には、上述のタンパク質を１０％ＳＤＳポリアクリルアミドゲルにローディングし、１５０Ｖで７５分間、電気泳動することによって分離し、その後タンパク質を、電気ブロッティング装置（Ｔｒａｎｓ−Ｂｌｏｔ ＳＤ Ｓｅｍｉ−Ｄｒｙ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｃｅｌｌ、ＢｉｏＲａｄ）を１ｃｍ^２当たり２．５ｍＡｍｐ（最大２５Ｖ）で実行することによってフッ化ポリビニリデン膜（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に移した。トランスブロットを、２５℃で１時間、ブロッキング緩衝液［１×リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、１％ＢＳＡ］中に置いた。ブロッキング溶液を除去し、膜を抗ＭＭＴ抗体の溶液中に１時間置いた。その後、膜を１×ＰＢＳですすぎ、ヤギ抗ウサギＩｇＧアルカリホスファターゼ溶液（Ｓｉｇｍａ）中で１時間インキュベートした。上述のインキュベートの後、膜を１×ＴＢＳ中ですすぎ、続いて、ニトロブルーテトラゾリウムおよび５−ブロモ−４−クロロ−３−インドールリン酸（Ｓｉｇｍａ）を使用してインキュベートした後、タンパク質バンドを視覚化した。ゲルを、最後に水中ですすいでホスファターゼ反応を停止させた。
【０２２０】
上記の抗ＭＭＴ抗体の調製物を使用して、ｐＥＴ１９ｂ−ＭＭＴ（図１４Ｂ、Ｃ；「２」としるしが付いたレーン）、ｐＥＴ１９ｂ−Ｌｉｎｅ８０６３−Ｐｒｏｄ３（図１４Ｂ、Ｃ；「３」としるしが付いたレーン）、ｐＥＴ１９ｂ−Ｌｉｎｅ８０６３−Ｐｒｏｄ４（図１４Ｂ、Ｃ；「４」としるしが付いたレーン）およびｐＥＴ１９ｂ（図１４Ｂ、Ｃ；「５」としるしが付いたレーン）で形質転換したＥ．ｃｏｌｉ細胞の細胞溶解性のタンパク質およびペレット由来のタンパク質のブロットを探索した。細胞溶解性のタンパク質およびペレット由来のタンパク質の全体的なバンドのパターンが異なるにもかかわらず（ペレット由来のタンパク質のバンドは、一般に、ゲルの上端で開始し、ゲルの下端まで下に広がるタンパク質バンドのスメアとして現れる）、ｐＥＴ１９ｂ−ＭＭＴで形質転換した細胞の抽出物において、全長のＭＭＴが、１２０ｋＤａのマーカータンパク質（「１」としるしが付いたレーン）と共に移動するタンパク質バンドとして認識された。ｐＥＴ１９ｂ−Ｌｉｎｅ８０６３−Ｐｒｏｄ３およびｐＥＴ１９ｂ−Ｌｉｎｅ８０６３−Ｐｒｏｄ４で形質転換した細胞の不活性型ＭＭＴタンパク質は、３０ｋＤａから４０ｋＤａの間のブロット領域において強く染色されたバンドに対応すると予想された。染色された８０ｋＤａのタンパク質バンドは、ベクターｐＥＴ１９ｂで形質転換した陰性対照の細胞の抽出物においても現れたので、ＭＭＴ由来ではないことは注目に値する。
【０２２１】
上記の、野生型オオムギおよび変異体８０６３の組換えＭＭＴ型を生成するために設計した、ＭＭＴ型の異種発現の実験結果に基づいて、前記変異体におけるＭＭＴ型ではなく野生型ＭＭＴのみが活性であると結論付けられる。したがって、ＭｅｔをＤＭＳ前駆物質のＳＭＭに転換することを触媒する能力は、変異体８０６３とは対照的に、野生型オオムギに限定される。
【０２２２】
（実施例１３）
オオムギの変異体８０６３についてのモニタリングシステム
変異体８０６３のオオムギ穀粒を検出するための生化学的アッセイ（実施例２参照）に加えて、本実施例は、変異体の穀粒またはその生成物を同定するために設計した遺伝学的方法を記載する。当業者に公知の適切な改変と共に、この方法は、所与の植物生成物がオオムギの変異体８０６３を使用して調製されるかどうかを検出するためにも適用することができる。アッセイは、図１５に例示した通りの、表７に列挙されているオリゴヌクレオチドプライマーセットの特性を持つ、変異体８０６３のＭＴＴ遺伝子の一塩基多型（ＳＮＰ）、詳細には３０７６位におけるＧ→Ａ変異を検出するための分析に基づいている。
【０２２３】
オオムギの栽培品種ＰｒｅｓｔｉｇｅのゲノムＤＮＡを用いた反応において、プライマーセット番号２０を鋳型として適用した場合、２７１ｂｐの、配列番号３３で示される配列のＰＣＲ生成物が生成し、一方、鋳型として変異体８０６３のゲノムＤＮＡが機能した場合、生成物は増幅されなかった。後者の場合は、単純に、逆方向プライマーの３’末端と鋳型の間に塩基対合がなかったことによる（図１９Ａ）。しかし、変異体８０６３のゲノムＤＮＡ（配列番号３４；図１９Ａ）を用いたＰＣＲ増幅において、プライマーセット番号２１を用いると、逆方向プライマーが鋳型と完全な配列一致を有するので、２７１ｂｐのＰＣＲ生成物が得られる。変異体８０６３のＭＭＴ遺伝子におけるＧ３０７６→Ａ変異を含有する断片を増幅するための２つ、および変異体１４０１８のＭＭＴ遺伝子（配列番号３６、実施例１７参照）におけるＧ１４６２→Ａ変異のための２つであるプライマーセット番号２０および２１として列挙された４つの上述のプライマーからなるプライマーセット番号２２を設計して、上述のヌクレオチド変異をどちらも含有するＭＭＴの変異遺伝子が存在することをモニターする。
【０２２４】
上記のＰＣＲ増幅それぞれを、ゲノムＤＮＡ２００ｎｇおよび特異的なプライマーセット（表７）の各プライマー５０〜１００ｐｍｏｌからなるＲｅｄＴａｑポリメラーゼ反応物５０μＬ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｄ６０６３）として、実験的に行う。標準のＰＣＲサイクラーにおいて増幅した後（９５℃で１分；次いで９４℃、６０秒−６４℃、３０秒−７２℃、３０秒を３０サイクル；終わりに７２℃で１０分）、試料の一定分量２５μＬを２％アガロースゲルで標準の電気泳動にかける。図１５Ｃに例示している通り、栽培品種ＰｒｅｓｔｉｇｅのゲノムＤＮＡを用いたＰＣＲにより、プライマーセット番号２０の存在下では、２７１ｂｐのＤＮＡ断片が得られ、プライマーセット番号２１の存在下では断片が得られなかった。そして、変異体８０６３のゲノムＤＮＡを用いたＰＣＲにより、プライマーセット番号２０の存在下では断片が得られず、プライマーセット番号２１の存在下では２７１ｂｐのＤＮＡ断片が得られた。後者の結果が、アイデンティティが未知のオオムギ子実のゲノムＤＮＡを用いたＰＣＲのアウトカムである場合、鋳型ＤＮＡが、変異体８０６３のＤＮＡと同一である可能性が高い。この結論を支持するためのさらなる取組みは、ＳＭＭのレベルについて（実施例２参照）およびＭＭＴ活性について（実施例４参照）試験するための分析を含む。
【０２２５】
変異体８０６３がＭＭＴを喪失していることを立証するための別の方法は、実施例３において説明している通り、技術的な手順および抗ＭＭＴ抗体を使用するウェスタンブロット分析を伴う。実際的に述べると、栽培品種Ｐｒｅｓｔｉｇｅの穀粒および変異体８０６３の穀粒を、２０℃で４日間、発芽させ、続いて野生型の穀粒１つおよび変異体の穀粒１つを、それぞれ２５０μＬのＨ_２Ｏ中で別々にホモジナイズした。１３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後、それぞれの上清１５μＬをＳＤＳローディング緩衝液５μＬと混合し、５分間煮沸し、１２％ＳＤＳポリアクリルアミドゲルにローディングし、電気泳動によって分離し、電気ブロッティングし、そして最終的にポリクローナル抗ＭＭＴ抗体を用いて探索した（図１５Ｄ）。１２０ｋＤａの明瞭なＭＭＴタンパク質バンドが、栽培品種Ｐｒｅｓｔｉｇｅの抽出物において容易に認識でき、一方、１２０ｋＤａのマーカータンパク質と共に移動した変異体８０６３の免疫反応性タンパク質はなかった。したがって、上述のウェスタンブロット分析法は、発芽しているオオムギ穀粒がＭＭＴを生成するか、またはその能力を喪失しているかを調査するために有用である。所与の子実が変異体８０６３由来であるかどうかを確認するために別の分子的検査および生化学検査を使用することができる。
【０２２６】
【表７】

＊）ＭＭＴゲノム野生型配列（配列番号３）についてと同様の塩基対の番号付け
＊＊）変異体８０６３のＭＭＴゲノム配列（配列番号８）についてと同様の塩基対の番号付け
＊＊＊）変異体１４０１８のＭＭＴゲノム配列（配列番号１９）についてと同様の塩基対の番号付け
＊＊＊＊）「ＰＣＲ生成物の末端」と表示された列に列挙された断片の５’末端の配列
＊＊＊＊＊）「ＰＣＲ生成物の末端」と表示された列に示された断片の３’末端の相補配列
（実施例１４）
オオムギの変異体１４０１８のＭＭＴをコードする遺伝子はイントロン２の５’スプライス部位において変異している
オオムギの変異体１４０１８の発芽した穀粒の抽出物において極度に少ないレベルのＳＭＭが発見された、またはＳＭＭが全く発見されなかったことに従って、その植物体を、上記の実施例９において変異体８０６３について説明したのと同じ実験条件下で分析した。しかし、この場合は、野生型植物材料は、変異体１４０１８を含む穀粒のバッチにおいてＮａＮ_３を用いて変異誘発するために栽培品種Ｓｅｂａｓｔｉａｎが利用されたので、栽培品種Ｓｅｂａｓｔｉａｎからのものであった。ヌルＭＭＴ表現型を引き起こす変異を同定するための実験を設計し、下記のように実施した。
【０２２７】
第１に、栽培品種Ｓｅｂａｓｔｉａｎ（ゲノムＤＮＡ配列に対して配列番号１６；ｃＤＮＡ配列に対して配列番号１７；翻訳されたｃＤＮＡ配列に対して配列番号１８；すべての場合において、本明細書の実施例８記載の栽培品種Ｐｒｅｓｔｉｇｅと同一の配列を伴う）と、変異体１４０１８（ゲノム配列に対して配列番号１９、およびｃＤＮＡ配列に対して配列番号２０、２１、２３、２５）のＭＭＴをコードする遺伝子の別個のゲノムＤＮＡ配列の比較を、翻訳開始コドンから翻訳終止コドンにわたる領域に焦点を合わせて行った。変異体１４０１８の配列決定された遺伝子部分、詳細にはエクソン２のすぐ下流のイントロン２の一番目の塩基における供与体スプライシング供与部位、より詳細にはヌクレオチド番号１４６２においてＧ→Ａ塩基転移が同定され、したがって、遺伝子転写物の主要なＲＮＡプロセシングに影響を及ぼすことが予測される（図１６）。
【０２２８】
第２に、プライマーセット１６（表４）を使用してＲＴ−ＰＣＲ反応を設計し、栽培品種Ｓｅｂａｓｔｉａｎおよび変異体１４０１８のＭＭＴをコードする遺伝子のエクソン２からエクソン５にわたる遺伝子領域を増幅するために調整した（図１６Ａ）。ＤＮＡを増幅した後、反応生成物をアガロースゲル電気泳動にかけ、図１６Ｂに示した結果が伴った。実施例９において変異体８０６３について説明したのと同様に、栽培品種Ｓｅｂａｓｔｉａｎからの野生型ＲＮＡにより、１つのＰＣＲ断片、図１６Ｂの生成物５がもたらされ、その長さおよびＤＮＡ配列は（配列番号２０参照）、野生型オオムギのＭＭＴの全長ｃＤＮＡ（配列番号１７）の２４６〜９３３にわたる塩基と同一であった。この結果は、選択的スプライシングが野生型遺伝子発現の特徴ではないことを重ねて強調している。
【０２２９】
第３に、変異体１４０１８から精製された鋳型ＲＮＡをＰＣＲ反応に利用し、野生型鋳型の増幅生成物と長さおよび配列が異なる３つの特異的な断片−図１６Ｂ、Ｃにおける生成物６（配列番号２１）、生成物７（配列番号２３）および生成物８（配列番号２５）を指す−が生成した。この所見は、変異体１４０１８のＭＭＴ遺伝子のイントロン２の５’スプライス部位における単一の変異により、通常のスプライス部位が削除され、その代わりに潜在的な、付加的なスプライス部位の使用が活性化されることによって、ｍＲＮＡ前駆体のプロセシングが妨害されることを示唆している。この点において、生成物６および生成物７の両方に対して、イントロン２において潜在的なスプライス部位が同定され、一方、生成物８の潜在的なスプライス部位はエクソン２にあった。上述の配列決定結果の図による比較を図１６Ｃに提供している。
【０２３０】
さらに、ＤＮＡ配列の分析により、それぞれ、配列番号２２、配列番号２４、および配列番号２６として列挙されており、１８６アミノ酸長、１８０アミノ酸長および１６３アミノ酸長の翻訳されたタンパク質をもたらす、生成物６における中途翻訳終止コドン［オオムギの栽培品種ＳｅｂａｓｔｉａｎからのゲノムＤＮＡ（配列番号１６）の塩基番号付けによる、塩基１５７９〜１５８１におけるＴＡＧ］、生成物７における中途翻訳終止コドン［オオムギの栽培品種ＳｅｂａｓｔｉａｎからのゲノムＤＮＡ（配列番号１６）の塩基番号付けによる、塩基１８４０〜１８４２におけるＴＡＡ］、および生成物８における中途翻訳終止コドン［オオムギの栽培品種ＳｅｂａｓｔｉａｎからのゲノムＤＮＡ（配列番号１６）の塩基番号付けによる、塩基１９１６〜１９１８におけるＴＧＡ］が明らかになった。変異体８０６３について上記した結果（図１２Ｄ、Ｅ）と平行して、図１６Ｄ、Ｅにおける図は、選択的スプライシング事象に関与する特異的な塩基の性質による特異的なデータを提供している。
【０２３１】
（実施例１５）
変異体１４０１８の切断型ＭＭＴを合成するためのプラスミドの発現
変異体１４０１８由来の、３つの、切断型の組換えバージョンのＭＭＴの合成を導く発現プラスミドを構築するための原理および戦略は、実施例１１において変異体８０６３について説明したものと同様であった。簡潔に述べると、実験目的は、変異体１４０８６の異常性のスプライシング事象により、不活性なＭＭＴをコードする転写物が生成することを立証することであった。したがって、組換え型のひと続きの遺伝子は、生成物６、生成物７および生成物８（図１６Ｂ、Ｃ参照）につながる異常性のスプライシング事象を反映している配列のタンパク質をコードするはずであり、その配列は、配列番号２２、配列番号２４および配列番号２６に列挙されている。
【０２３２】
プライマーセット番号２３、２４および２５（表８）を用いた３回の標準の連続ＰＣＲにおける鋳型としてプラスミドｐＥＴ１９ｂ−ＭＭＴ（実施例１０参照）を使用し、３９４ｂｐの増幅断片（配列番号３０）が生じた。この増幅断片をＳａｃＩＩ−ＢａｍＨＩを用いて消化し、ｐＥＴ１９ｂ−ＭＭＴの大きなＳａｃＩＩ−ＢａｍＨＩ断片とライゲーションし（図１７Ａ）、図１６Ｂに示した生成物６に対応する切断型ＭＭＴを合成するために設計した発現プラスミドｐＥＴ１９ｂ−Ｌｉｎｅ１４０８６−Ｐｒｏｄ６を生じさせた（図１７Ｂ）。
【０２３３】
３９４ｂｐの断片について上記したものと同じ手順を利用して、しかし今度は３回の連続ＰＣＲ増幅（表８）においてプライマーセット番号２３、２４および２６を用いて、３７６ｂｐの断片を生成し（配列番号３１）、それをＳａｃＩＩ−ＢａｍＨＩを用いて消化したら、ｐＥＴ１９ｂ−ＭＭＴ（図１７Ａ）の大きなＳａｃＩＩ−ＢａｍＨＩ断片とライゲーションし、発現プラスミドｐＥＴ１９ｂ−Ｌｉｎｅ１４０８６−Ｐｒｏｄ７（図１７Ｃ）を生じさせた。この発現プラスミドは、図１６Ｂに示した生成物７を示しているものに対応する切断型ＭＭＴを合成するために設計した。
【０２３４】
ｐＥＴ１９ｂ−ＭＭＴについて記載したのと同様の方法だが、プライマーセット番号２７および２８（表８）を用いて行った平行して実行する実験では、３２５ｂｐの断片（配列番号３２）を増幅し、それをＳａｃＩＩ−ＢａｍＨＩを用いて消化したら、ｐＥＴ１９ｂ−ＭＭＴ（図１７Ａ）の大きなＳａｃＩＩ−ＢａｍＨＩ断片とライゲーションし、生成物８（図１６Ｂ参照）に対応する切断型ＭＭＴを合成するための発現プラスミドｐＥＴ１９ｂ−Ｌｉｎｅ１４０８６−Ｐｒｏｄ８（図１７Ｄ）を生じさせた。
【０２３５】
【表８】

＊）下線を付したＳａｃＩＩ部位を持つ同じ順方向プライマーをすべての反応に利用したことに留意されたい。逆方向プライマーについて、鋳型ＤＮＡにアニーリングしない５’伸長を波形の下線で示している；ＢａｍＨＩ部位をイタリックで示し、相補翻訳終止コドンを太字文字で示している。
＊＊）数字は、隣の列に列挙されている対応する配列番号のヌクレオチド番号を指す。
【０２３６】
（実施例１６）
変異体１４０１８の組換えＭＭＴ型は不活性である
実施例１２の手順に従い、変異体８０６３由来の構築物を変異体１４０１８由来の構築物と置き換えた。Ｅ．ｃｏｌｉ細菌を、ｐＥＴ１９ｂ−Ｌｉｎｅ１４０１８−Ｐｒｏｄ６、ｐＥＴ１９ｂ−Ｌｉｎｅ１４０１８−Ｐｒｏｄ７およびｐＥＴ１９ｂ−Ｌｉｎｅ１４０１８−Ｐｒｏｄ８（図１７Ａ〜Ｄ、図１７Ｅに示している対応するアミノ酸のアラインメントを持つ）で形質転換したが、実施例１２に記載の抗ＭＭＴ抗体はＭＭＴの変異体１４０１８特異的な部分にはないひと続きの配列に対して生じたので、この実験では、ウェスタンブロット分析を除いた。
【０２３７】
形質転換した細菌の抽出物でＳＭＭを生成できることが明らかになったものはなかったので（図１８）、上記の実施例１２でもたらされたのと同じ論証により、オオムギの変異体１４０１８が、ＤＭＳ前駆物質であるＳＭＭの形成を触媒する能力を喪失している、非機能的ＭＭＴ酵素を生成するという結論のための基礎がもたらされる。
【０２３８】
（実施例１７）
オオムギの変異体１４０１８についてのモニタリングシステム
変異体１４０１８のオオムギ穀粒を検出するための生化学的アッセイ（実施例２参照）に加えて、本実施例は、オオムギ変異体１４０１８から調製された変異穀粒または植物生成物を同定するために設計した遺伝学的方法を記載する。この方法は、図１９に例示した通りの、表９に列挙されているオリゴヌクレオチドプライマーセットの特性を持つ、変異体１４０１８のＭＴＴ遺伝子の一塩基多型（ＳＮＰ）、詳細には、１４６２位におけるＧ→Ａ変異を検出するための分析に基づいている。
【０２３９】
オオムギの栽培品種ＳｅｂａｓｔｉａｎのゲノムＤＮＡを用いた反応において、プライマーセット番号２９を鋳型として適用した場合、１２１ｂｐの、配列番号３５で示される配列のＰＣＲ生成物が生成し、一方、変異体１４０１８のゲノムＤＮＡが鋳型として機能した場合、生成物は増幅されなかった。後者の場合は、単純に、逆方向プライマーの３’末端と鋳型の間に塩基対合がなかったことによる（図１９Ｂ）。しかし、変異体１４０１８のゲノムＤＮＡ（配列番号３６）を用いたＰＣＲ増幅において、プライマーセット番号３０を用いると、逆方向プライマーが鋳型と完全な配列一致を有するので（図１９Ｂ）、１２１ｂｐのＰＣＲ生成物が得られる。変異体１４０１８のＭＭＴ遺伝子（すなわち、配列番号３６）におけるＧ１４６２→Ａ変異を含有する断片を増幅するための２つ、および変異体８０６３のＭＭＴ遺伝子（配列番号３４、実施例９参照）におけるＧ３０７６→Ａ変異のための２つであるプライマーセット番号２９および３０として列挙された４つの上述のプライマーからなるプライマーセット番号３１を設計して、上述のヌクレオチド変異をどちらも含有するＭＭＴの変異遺伝子が存在することをモニターする。
【０２４０】
上記のＰＣＲ増幅それぞれを、ゲノムＤＮＡ２００ｎｇおよび特異的なプライマーセット（表７）の各プライマー５０〜１００ｐｍｏｌからなるＲｅｄＴａｑポリメラーゼ反応物５０μｌ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｄ６０６３）として、実験的に行う。標準のＰＣＲサイクラーにおいて増幅した後（９５℃で１分；次いで９４℃、６０秒−６４℃、３０秒−７２℃、３０秒を３０サイクル；終わりに７２℃で１０分）、試料の一定分量２５μｌを２％アガロースゲルで標準の電気泳動にかける。図１９Ｃに例示している通り、栽培品種ＳｅｂａｓｔｉａｎのゲノムＤＮＡを用いたＰＣＲにより、プライマーセット番号２９の存在下では、１２１ｂｐのＤＮＡ断片が得られ、プライマーセット番号３０の存在下では断片が得られなかった。そして、変異体１４０１８のゲノムＤＮＡを用いたＰＣＲにより、プライマーセット番号２９の存在下では断片が得られず、プライマーセット番号３０の存在下では１２３ｂｐのＤＮＡ断片が得られた。後者の結果が、アイデンティティが未知のオオムギ子実のゲノムＤＮＡを用いたＰＣＲのアウトカムである場合、鋳型ＤＮＡが、変異体１４０１８のＤＮＡと同一である可能性が高い。この結論を支持するためのさらなる取組みは、ＳＭＭのレベルについて（実施例２参照）およびＭＭＴ活性について（実施例４参照）試験するための分析を含む。
【０２４１】
変異体１４０１８がＭＭＴを喪失していることを立証するための別の方法は、実施例３において説明している通り、技術的な手順および抗ＭＭＴ抗体を使用するウェスタンブロット分析を伴う。実際的に述べると、栽培品種Ｓｅｂａｓｔｉａｎの穀粒および変異体１４０１８の穀粒を、２０℃で４日間、発芽させ、続いて野生型の穀粒１つおよび変異体の穀粒１つを、それぞれ１００μＬのＨ_２Ｏ中で別々にホモジナイズした。１３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後、それぞれの上清１５μＬをＳＤＳローディング緩衝液５μＬと混合し、５分間煮沸し、１２％ＳＤＳポリアクリルアミドゲルにローディングし、電気泳動によって分離し、電気ブロッティングし、そして最終的にポリクローナル抗ＭＭＴ抗体を用いて探索した（図１５Ｄ）。１２０ｋＤａの明瞭なＭＭＴタンパク質バンドが、栽培品種Ｓｅｂａｓｔｉａｎの抽出物において容易に認識でき、一方、１２０ｋＤａのマーカータンパク質と共に移動した変異体１４０１８の免疫反応性タンパク質はなかった。したがって、上述のウェスタンブロット分析法は、発芽しているオオムギ穀粒がＭＭＴを生成するか、またはその能力を喪失しているかを調査するために有用である。所与の子実が変異体１４０１８由来であるかどうかを確認するために別の分子的検査および生化学検査を使用することができる。
【０２４２】
【表９】

＊）ＭＭＴゲノム野生型配列（配列番号１６）についてと同様の塩基対の番号付け
＊＊）変異体１４０１８のＭＭＴゲノム配列（配列番号１９）についてと同様の塩基対の番号付け
＊＊＊）変異体８０６３のＭＭＴゲノム配列（配列番号８）についてと同様の塩基対の番号付け
＊＊＊＊）「ＰＣＲ生成物の末端」と表示された列に列挙された断片の５’末端の配列
＊＊＊＊＊）「ＰＣＲ生成物の末端」と表示された列に示された断片の３’末端の相補配列
【０２４３】
【数１】

【０２４４】
【数２】

【０２４５】
【数３】

【０２４６】
【数４】

【０２４７】
【数５】

【０２４８】
【表１０−１】

【０２４９】
【表１０−２】

【０２５０】
【表１０−３】

【０２５１】
【表１０−４】

【０２５２】
【表１０−５】

【０２５３】
【表１０−６】

【０２５４】
【表１０−７】

【特許請求の範囲】
【請求項１】
オオムギ植物体またはその一部から調製される飲料であって、前記飲料が３０ｐｐｂ未満のレベルの硫化ジメチル（ＤＭＳ）を含有し、前記オオムギ植物体またはその一部が、メチオニン−Ｓ−メチルトランスフェラーゼ（ＭＭＴ）をコードする遺伝子において、機能的ＭＭＴの完全な喪失を引き起こす変異を保有する、飲料。
【請求項２】
モルト飲料である、請求項１に記載の飲料。
【請求項３】
発酵モルト飲料である、請求項１および２のいずれか一項に記載の飲料。
【請求項４】
ビールである、請求項１から３のいずれか一項に記載の飲料。
【請求項５】
前記飲料が、２５ｐｐｂ未満、より好ましくは２０ｐｐｂ未満、なおより好ましくは１５ｐｐｂ未満、さらにより好ましくは１０ｐｐｂ未満、なおより好ましくは５ｐｐｂ未満のＤＭＳを含有し、例えば、検出可能なＤＭＳを含有しない、請求項１から４のいずれか一項に記載の飲料。
【請求項６】
前記飲料が、２０ｐｐｂ未満のＤＭＳを含有する、請求項１から５のいずれか一項に記載の飲料。
【請求項７】
前記飲料が、５０ｐｐｂ未満、好ましくは４０ｐｐｂ未満、より好ましくは３０ｐｐｂ未満、なおより好ましくは２０ｐｐｂ未満、さらにより好ましくは１０ｐｐｂ未満、なおより好ましくは５ｐｐｂ未満のＳ−メチル−ｌ−メチオニン（ＳＭＭ）を含有し、なおより好ましくは検出可能なＳＭＭを含有しない、請求項１から６のいずれか一項に記載の飲料。
【請求項８】
前記飲料が、３０ｐｐｂ未満、好ましくは２５ｐｐｂ未満、より好ましくは２０ｐｐｂ未満、なおより好ましくは１５ｐｐｂ未満、さらにより好ましくは１０ｐｐｂ未満、なおより好ましくは５ｐｐｂ未満のＤＭＳを含有し、なおより好ましくは検出可能なＤＭＳを含有せず、および、５０ｐｐｂ未満、好ましくは４０ｐｐｂ未満、より好ましくは３０ｐｐｂ未満、なおより好ましくは２０ｐｐｂ未満、さらにより好ましくは１０ｐｐｂ未満、なおより好ましくは５ｐｐｂ未満のＳＭＭを含有し、なおより好ましくは検出可能なＳＭＭを含有しない、請求項１から７のいずれか一項に記載の飲料。
【請求項９】
前記飲料が、２０ｐｐｂ未満のＤＭＳおよび２０ｐｐｂ未満のＳＭＭを含有し、好ましくは、５ｐｐｂ未満のＤＭＳおよび５ｐｐｂ未満のＳＭＭを含有する、請求項１から８のいずれか一項に記載の飲料。
【請求項１０】
野生型のオオムギから、好ましくは栽培品種Ｐｏｗｅｒから同じ方法で調製した飲料との比較において、いずれの飲料のエステルプロファイルも同様となるように調整した場合、熟練の試飲パネルが評価する新鮮さおよび／またはエステル風味についてより高いスコアを示す、請求項１から９のいずれか一項に記載の飲料。
【請求項１１】
野生型のオオムギから、好ましくは栽培品種Ｐｏｗｅｒから同じ方法で調製した飲料との比較において、熟練の試飲パネルが評価するエステル風味についてより高いスコアを示す、請求項１から１０のいずれか一項に記載の飲料。
【請求項１２】
メチオニン−Ｓ−メチルトランスフェラーゼ（ＭＭＴ）機能の完全な喪失を引き起こす、ＭＭＴをコードする遺伝子における変異を保有する、オオムギ植物体またはその一部。
【請求項１３】
前記変異が、前記ＭＭＴをコードする遺伝子のスプライス部位内にある、請求項１２に記載のオオムギ植物体またはその一部。
【請求項１４】
前記ＭＭＴをコードする遺伝子における前記変異が、イントロンのスプライス部位内にある、請求項１２から１３のいずれか一項に記載のオオムギ植物体またはその一部。
【請求項１５】
前記ＭＭＴをコードする遺伝子における前記変異が、イントロンの５’末端塩基のＧ→Ａ変異など、イントロンの５’側スプライス部位における変異である、請求項１２から１４のいずれか一項に記載のオオムギ植物体またはその一部。
【請求項１６】
前記ＭＭＴをコードする遺伝子における前記変異が、イントロン２および５からなる群から選択されるイントロンの５’側スプライス部位における変異である、請求項１２から１５のいずれか一項に記載のオオムギ植物体またはその一部。
【請求項１７】
前記ＭＭＴをコードする遺伝子における前記変異が、配列番号３の塩基番号３０７６のＧ→Ａ変異である、請求項１２から１６のいずれか一項に記載のオオムギ植物体またはその一部。
【請求項１８】
前記ＭＭＴをコードする遺伝子における前記変異が、配列番号１６の塩基番号１４６２のＧ→Ａ変異である、請求項１２から１６のいずれか一項に記載のオオムギ植物体またはその一部。
【請求項１９】
前記変異の結果として、野生型ＭＭＴのＮ末端断片と、場合によって、野生型ＭＭＴには見出されないさらなるＣ末端配列とを含むＭＭＴの切断形態をコードする遺伝子をもたらし、前記Ｎ末端断片が、配列番号６の最大で５００、より好ましくは最大で４５０、なおより好ましくは最大で４００、さらにより好ましくは最大で３５０、なおより好ましくは最大で３２０、さらにより好ましくは最大で３１１、または最大で２８８のＮ末端アミノ酸残基を含む、請求項１２から１８のいずれか一項に記載のオオムギ植物体またはその一部。
【請求項２０】
前記変異が、前記ＭＭＴをコードする遺伝子内に未熟終止コドン、好ましくは、請求項１９に記載のＭＭＴの切断形態のうちのいずれかをコードする遺伝子を結果としてもたらす終止コドンを導入する、請求項１２から１９のいずれか一項に記載のオオムギ植物体またはその一部。
【請求項２１】
「オオムギ（Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ）：８０６３系統」と称し、ＰＴＡ−９５４３の表記で２００８年１０月１３日にＡＴＣＣへと寄託された植物体と、それらの子孫植物体とからなる群から選択される、請求項１２から１７のいずれか一項に記載のオオムギ植物体またはその一部。
【請求項２２】
前記オオムギ植物体の前記一部が、穀粒（複数可）である、請求項１２から２１のいずれか一項に記載のオオムギ植物体またはその一部。
【請求項２３】
（ｉ）オオムギ植物体、および／またはオオムギ穀粒、および／またはオオムギ胚芽、および／またはオオムギ細胞、および／またはオオムギ組織を変異誘発し、これにより、Ｍ０世代のオオムギを得る工程と；
（ｉｉ）前記変異誘発されたオオムギ植物体、オオムギ穀粒、オオムギ細胞、オオムギ組織、および／またはオオムギ胚芽を、少なくとも２世代にわたり繁殖させ、これにより、Ｍｘ（ここで、ｘは、≧２の整数である）世代のオオムギ植物体を得る工程と；
（ｉｉｉ）前記Ｍｘ世代のオオムギ穀粒から葉組織を得る工程と；
（ｉｖ）前記穀粒またはそれらの一部におけるＳＭＭレベルを決定する工程と；
（ｖ）検出可能なＳＭＭを欠く植物体を選択する工程と；
（ｖｉ）前記ＭＭＴ遺伝子の少なくとも一部を配列決定する工程と；
（ｖｉｉ）前記ＭＭＴをコードする遺伝子における変異を保有する植物体を選択する工程と
を含む方法により作製されるか、またはこれらの工程を含む方法により作製される植物体の子孫である、請求項１２から２２のうちのいずれかに記載のオオムギ植物体またはその一部。
【請求項２４】
請求項１２から２３のいずれか一項に記載のオオムギ植物体またはその一部から調製される、請求項１から１１のいずれか一項に記載の飲料。
【請求項２５】
請求項１２から２３のいずれかに記載のオオムギ植物体またはその一部を含む組成物。
【請求項２６】
請求項１２から２３のいずれかに記載のオオムギ植物体である加工オオムギ植物体またはその一部を含む植物生成物。
【請求項２７】
請求項１２から２３のいずれかに記載のオオムギ植物体である加工オオムギ植物体またはその一部を含むモルト組成物である、請求項２６に記載の植物生成物。
【請求項２８】
前記オオムギ植物体の前記一部が、穀粒（複数可）である、請求項２７に記載のモルト組成物。
【請求項２９】
グリーンモルトおよびキルン乾燥モルトからなる群から選択される、請求項２７から２８のいずれか一項に記載のモルト組成物。
【請求項３０】
粉砕モルトである、請求項２７から２８のいずれか一項に記載のモルト組成物。
【請求項３１】
最大で２００ｐｐｂ、好ましくは最大で１５０ｐｐｂ、より好ましくは最大で１００ｐｐｂ、なおより好ましくは最大で５０ｐｐｂ、例えば最大で２５ｐｐｂの遊離ＤＭＳを含む、請求項２７から３０のいずれかに記載のモルト組成物。
【請求項３２】
最大で１０００ｐｐｂ、好ましくは最大で５００ｐｐｂ、より好ましくは最大で１５０ｐｐｂのＳＭＭを含む、請求項２７から３１のいずれかに記載のモルト組成物。
【請求項３３】
最大で２００ｐｐｂの遊離ＤＭＳおよび最大で１０００ｐｐｂのＳＭＭを含む、例えば最大で２５ｐｐｂの遊離ＤＭＳおよび最大で１５０ｐｐｂのＳＭＭを含む、請求項２７から３２のいずれかに記載のモルト組成物。
【請求項３４】
請求項１２から２３のいずれかに記載のオオムギ植物体またはその一部を用いるか、前記オオムギ植物体もしくはその一部、またはこれらの混合物から調製されたモルト組成物を用いて調製されたウォート組成物である、請求項２６に記載の植物生成物。
【請求項３５】
７０℃を超えない温度、好ましくは６９℃を超えない温度におけるマッシングを用いて生成させる、請求項３４に記載のウォート組成物。
【請求項３６】
最長で４５分間、なおより好ましくは最長で３０分間煮沸される、請求項３４から３５のいずれか一項に記載のウォート組成物。
【請求項３７】
前記植物体の前記一部が、穀粒（複数可）である、請求項３４から３６のいずれか一項に記載のウォート組成物。
【請求項３８】
前記モルト組成物が、請求項２７から３３のいずれかに記載のモルト組成物である、請求項３４から３７のいずれか一項に記載のウォート組成物。
【請求項３９】
請求項３４から３８のいずれか一項に記載のウォート組成物であるか、または前記組成物から調製した飲料である、請求項２６に記載の植物生成物。
【請求項４０】
（ｉ）請求項１２から２３のいずれかに記載のオオムギ植物体またはその一部を含む組成物と；
（ｉｉ）請求項２７から３３のいずれかに記載のモルト組成物と
の混合物から調製される組成物。
【請求項４１】
請求項２７から３３のいずれか一項に記載のモルト組成物、または請求項３４から３８のいずれか一項に記載のウォート組成物から調製される、請求項１から１１のいずれかに記載の飲料。
【請求項４２】
オオムギシロップ、モルトシロップ、オオムギ抽出物、およびモルト抽出物からなる群から選択される、請求項２６に記載の植物生成物。
【請求項４３】
３０ｐｐｂ未満のＤＭＳを含有する飲料を作製する方法であって、
（ｉ）請求項１２から２３のいずれかに記載のオオムギ植物体またはその一部を含む組成物を調製する工程と；
（ｉｉ）（ｉ）の組成物を飲料へと加工する工程と
を含み、これらにより、３０ｐｐｂ未満のＤＭＳを含有する飲料を得る方法。
【請求項４４】
２０ｐｐｂ未満のＤＭＳ、なおより好ましくは５ｐｐｂ未満のＤＭＳを含有する飲料を作製する方法である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
工程（ｉ）が、前記オオムギ植物体の穀粒またはその一部からモルト組成物を調製する工程を含む、請求項４３から４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
前記組成物を飲料へと加工する工程が、マッシング工程を含み、これによりウォート組成物を生成させる、請求項４３から４５のいずれかに記載の方法。
【請求項４７】
前記マッシング工程が、７０℃を超えない温度、好ましくは６９℃を超えない温度におけるマッシングを用いて実施される、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記組成物を飲料へと加工する工程が、マッシング工程、ウォート濾過工程、およびスパージング工程を含み、これらによりウォート組成物を生成させる、請求項４３から４７のいずれかに記載の方法。
【請求項４９】
前記組成物を飲料へと加工する工程が、前記ウォートを煮沸する工程を含み、前記ウォートが最長で４５分間、なおより好ましくは最長で３０分間煮沸される、請求項４６から４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
前記組成物を飲料へと加工する工程が、前記ウォートの発酵を含む、請求項４６から４９のいずれかに記載の方法。
【請求項５１】
最大で２００ｐｐｂの遊離ＤＭＳを含むモルト組成物を生成させる方法であって、
（ｉ）請求項２２に記載の穀粒を供給する工程と；
（ｉｉ）前記穀粒をスティーピングする工程と；
（ｉｉｉ）前記スティーピングされた穀粒を、所定の条件下で発芽させる工程と；
（ｉｖ）発芽した穀粒を加熱処理する工程と
を含み、これらにより、最大で２００ｐｐｂの遊離ＤＭＳを含むモルト組成物を生成させる方法。
【請求項５２】
ＭＭＴ活性の完全な喪失を引き起こす、ＭＭＴをコードする遺伝子における変異を保有するオオムギ植物体を調製する方法であって、
（ｉ）オオムギ植物体、および／またはオオムギ穀粒、および／またはオオムギ胚芽、および／またはオオムギ細胞、および／またはオオムギ組織を変異誘発し、これにより、Ｍ０世代のオオムギを得る工程と；
（ｉｉ）前記変異誘発されたオオムギ植物体、オオムギ穀粒、オオムギ細胞、オオムギ組織、および／またはオオムギ胚芽を、少なくとも２世代にわたり繁殖させ、これにより、Ｍｘ（ここで、ｘは、≧２の整数である）世代のオオムギ植物体を得る工程と；
（ｉｉｉ）前記Ｍｘ世代のオオムギ植物体から試料を得る工程と；
（ｉｖ）前記試料中におけるＳＭＭレベルを決定する工程と；
（ｖ）検出可能なＳＭＭ活性を欠く植物体を選択する工程と；
（ｖｉ）前記ＭＭＴ遺伝子の少なくとも一部を配列決定する工程と；
（ｖｉｉ）前記ＭＭＴ遺伝子における変異を保有する植物体を選択する工程と
を含み、これらにより、ＭＭＴ活性の完全な喪失を引き起こす、前記ＭＭＴをコードする遺伝子における変異を保有するオオムギ植物体を得る方法。
【請求項５３】
（ｉ）ＭＭＴ活性の完全な喪失を引き起こす、ＭＭＴをコードする遺伝子における変異；および
（ｉｉ）リポキシゲナーゼ１活性の完全な喪失を引き起こす、リポキシゲナーゼ１をコードする遺伝子における変異
を保有するオオムギ植物体またはその一部。
【請求項５４】
前記ＭＭＴをコードする遺伝子における前記変異が、請求項１３から２０のいずれか一項に記載の変異である、請求項５３に記載のオオムギ植物体またはその一部。
【請求項５５】
請求項５３から５４のいずれか一項に記載のオオムギ植物体またはその一部から調製される植物生成物。
【請求項５６】
飲料、好ましくはビールである、請求項５５に記載の植物生成物。

【図１Ａ】

【図１Ｂ】

【図２】

【図３Ａ】

【図３Ｂ】

【図３Ｃ】

【図４】

【図５Ａ】

【図５Ｂ】

【図６Ａ】

【図６Ｂ】

【図７】

【図８】

【図９】

【図１０−１】

【図１０−２】

【図１０−３】

【図１１−１】

【図１１−２】

【図１２−２】

【図１３−１】

【図１３−２】

【図１４−１】

【図１５−１】

【図１６−２】

【図１７−１】

【図１７−２】

【図１８】

【図１９−１】

【図１２−１】

【図１４−２】

【図１５−２】

【図１６−１】

【図１９−２】

【公表番号】特表２０１２−５１０２７７（Ｐ２０１２−５１０２７７Ａ）
【公表日】平成２４年５月１０日（２０１２．５．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５３８８３６（Ｐ２０１１−５３８８３６）
【出願日】平成２１年１２月１日（２００９．１２．１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＤＫ２００９／０５０３１５
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０６３２８８
【国際公開日】平成２２年６月１０日（２０１０．６．１０）
【出願人】（５１１１３３７９４）
【出願人】（５１１１３３１２９）
【Ｆターム（参考）】