体液処理方法
【課題】 正常な細胞への悪影響を回避しつつ、生体外で体液中の悪性リンパ腫細胞を死滅させる方法の提供。
【解決手段】生体外に取り出された悪性リンパ腫細胞含有の体液に下記式（Ｉ）の化合物を添加し励起光を照射する。
【解決手段】生体外に取り出された悪性リンパ腫細胞含有の体液に下記式（Ｉ）の化合物を添加し励起光を照射する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、体液処理方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体外で体液中の悪性リンパ腫細胞を死滅させる方法として、体外循環光化学療法（extracorporeal photochemotherapy又はphotopheresis）が知られている。従来の体外循環光化学療法は、体外循環回路に取り出した血液を８−メトキシソラレン（８−ＭＯＰ）で処理し、紫外線（ＵＶＡ）を照射して悪性リンパ腫細胞を死滅させた後、血液を体内に戻すというものであり、現在、皮膚Ｔ細胞リンパ腫の治療に利用されている（非特許文献１）。
【非特許文献１】Haematologica 1999; 84:237-241
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかしながら、上記の方法では、ＵＶＡ（波長：３２０ｎｍ〜４００ｎｍ）を用いるため、光の照射による正常な細胞（特に核）への悪影響を避けることができなかった。
【０００４】
そこで、本発明は、正常な細胞への悪影響を回避しつつ、生体外で体液中の悪性リンパ腫細胞を死滅させる方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記目的を達成するため、本発明は、体液中の悪性リンパ腫細胞、白血病細胞又は活性化マクロファージを生体外で選択的に死滅させるための体液処理方法であって、生体外に取り出された、悪性リンパ腫細胞、白血病細胞又は活性化マクロファージを含有する体液に、下記式（Ｉ）又は（ＩＩ）で表される化合物（以下、場合により、「ＡＴＸ−Ｓ１０・Ｎａ」という。）を添加して添加物を得る添加ステップと、前記添加物に励起光を照射して、前記式（Ｉ）又は（ＩＩ）で表される化合物を励起させる励起ステップと、を備える体液処理方法を提供する。
【０００６】
【化１】
【０００７】
【化２】
【０００８】
ＡＴＸ−Ｓ１０・Ｎａは、体液中において、悪性リンパ腫細胞、白血病細胞又は活性化マクロファージには取り込まれるが、赤血球及び血小板にはほとんど取り込まれないという性質を有する。従って、悪性リンパ腫細胞、白血病細胞又は活性化マクロファージを含有する体液にＡＴＸ−Ｓ１０・Ｎａを添加すると、ＡＴＸ−Ｓ１０・Ｎａは選択的に上記の細胞に取り込まれることになる。すなわち、上記体液処理方法は、体液中の悪性リンパ腫細胞、白血病細胞又は活性化マクロファージを生体外で選択的に死滅させるための方法である。ここで、「死滅させる」とは、体液中の悪性リンパ腫細胞、白血病細胞又は活性化マクロファージの集団の少なくとも一部を死滅させることであり、必ずしも全部を死滅させることではない。
【０００９】
ＡＴＸ−Ｓ１０・Ｎａは、波長４００ｎｍ〜４５０ｎｍ又は約６７０ｎｍ（６５０ｎｍ〜７００ｎｍ）の光を照射されることによって励起する。つまり、上記体液処理方法では、ＵＶＡよりも波長の長い可視光領域の光が用いられる。従って、光の照射により正常な細胞（特に核）や装置の材料に悪影響が及ぶことはほとんどない。また、光の物質透過性がよいので、標的細胞には十分な量の光を到達させることができる。
【００１０】
上記体液処理方法で処理した体液を生体内に戻すと、悪性リンパ腫細胞、白血病細胞又は活性化マクロファージは死滅するが、正常な細胞はほとんど死滅することなく生体内に戻されることになる。従って、悪性リンパ腫、白血病又は自己免疫疾患（潰瘍性大腸炎、クローン病、関節リウマチ等）の患者の体液を上記体液処理方法で処理して、患者の体内に戻すことにより、正常な組織・細胞にはほとんど悪影響を及ぼすことなく、上記の疾患を治療することができる。
【００１１】
上記体液処理方法では、添加ステップの前に、体液から白血球画分を分離する分離ステップを実施し、添加ステップにおいて白血球画分にＡＴＸ−Ｓ１０・Ｎａを添加するのが好ましい。こうすることにより、白血球画分以外の画分（赤血球、血小板等）を速やかに患者の体内に戻して、患者に低血圧や貧血が生じるのを確実に防ぐことが可能となる。
【００１２】
ところで、悪性リンパ腫又は白血病の患者の体液を上記体液処理方法で処理し、得られる体液処理物を患者の体内に戻すと、患者の体内の悪性リンパ腫細胞又は白血病細胞の増殖が顕著に抑制される。すなわち、上記体液処理物中に含有される死滅した悪性リンパ腫細胞又は白血病細胞は、悪性リンパ腫又は白血病のワクチンとして機能する。これは、上記体液処理物中にネクローシスを起こした細胞とアポトーシスを起こした細胞とが適度な割合で混在することにより、これらの死滅した細胞が生体内で、これと同種の細胞に特異的な免疫細胞、特にＴリンパ球を活性化するためと考えられる。
【００１３】
このように、生体外に取り出された、悪性リンパ腫細胞又は白血病細胞を含有する体液にＡＴＸ−Ｓ１０・Ｎａを添加して、励起光を照射すると、悪性リンパ腫又は白血病のワクチンを含有する体液処理物を得ることができる。上記体液処理物中に含有されるワクチンは、患者自身の悪性リンパ腫細胞又は白血病細胞に高度に特異的な免疫を誘導するオーダーメードのワクチンであり、悪性リンパ腫又は白血病の治療、及び治療後の再発・転移の予防を可能にする。
【００１４】
また、上記体液処理方法を用いれば、標的とする悪性リンパ腫細胞又は白血病細胞をホルマリン等で固定するという煩雑な操作をすることなく、簡便に、かつ短時間に悪性リンパ腫又は白血病のワクチンを製造することが可能となる。
【００１５】
なお、生体内投与を前提としたＡＴＸ−Ｓ１０・Ｎａの使用は特許第３６１３５９９号公報及び特許第３１９１２２３号公報に記載されているが、ＡＴＸ−Ｓ１０・Ｎａを体外における体液処理、特にワクチネーションを目的とした体液処理のために用いることができることは本発明者らが初めて見出した知見である。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、正常な細胞への悪影響を回避しつつ、生体外で体液中の悪性リンパ腫細胞、白血病細胞又は活性化マクロファージを選択的に死滅させる方法が提供される。また、個々の悪性リンパ腫患者又は白血病患者に最適なワクチンが提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
以下、本発明の好適な実施形態について説明する。
【００１８】
本発明の体液処理方法は、上述の添加ステップ及び励起ステップを備えるものである。
【００１９】
添加ステップでは、生体外に取り出された体液にＡＴＸ−Ｓ１０・Ｎａを添加する。ＡＴＸ−Ｓ１０・Ｎａは、特許第３６１３５９９号公報に記載の方法により製造することができる。
【００２０】
体液としては、血液、リンパ液及び骨髄液が挙げられる。血液を処理する場合は、血液が凝固しないように、生体外に取り出したら抗凝固薬（ヘパリン、クエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）等）を添加しておくのが好ましい。
【００２１】
上記体液は、悪性リンパ腫、白血病又は自己免疫疾患の患者（ヒト又は動物）から取り出されたものであり、悪性リンパ腫細胞、白血病細胞又は活性化マクロファージを含有する。悪性リンパ腫細胞は、ホジキン病及び非ホジキンリンパ腫のいずれに由来するものでもよく、また、Ｂリンパ球性細胞及びＴリンパ球性細胞のいずれでもよい。白血病細胞は、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ球性白血病及び慢性リンパ球性白血病のいずれに由来するものでもよく、例として、骨髄芽球、前骨髄球、単球、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球等が挙げられる。
【００２２】
ＡＴＸ−Ｓ１０・Ｎａは、適当な溶媒に溶解した溶液の状態で体液に添加しても、また、固体状態で体液に添加してもよい。ＡＴＸ−Ｓ１０・Ｎａが添加された体液は、ＡＴＸ−Ｓ１０・Ｎａが悪性リンパ腫細胞、白血病細胞又は活性化マクロファージに十分取り込まれるようにするために、一定時間（例えば、２時間）以上インキュベートしておくのが好ましい。なお、ＡＴＸ−Ｓ１０・Ｎａは水溶性が高いので、溶媒としては生理食塩水、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）等が好適である。
【００２３】
体液から白血球画分を分離する場合、白血球画分の分離は、例えば、比重の違いに基づいて遠心分離により行うことができる。得られた白血球画分は、生理食塩水、ＰＢＳ等の溶媒に懸濁させておくのが好ましい。
【００２４】
白血球画分は悪性リンパ腫細胞、白血病細胞又は活性化マクロファージを含有していればよいが、これらの細胞以外の正常な細胞（好中球等）は白血球画分から分離しておくのが好ましい。正常な細胞を分離しておけば、白血球画分にＡＴＸ−Ｓ１０・Ｎａを添加した場合に、正常な細胞に対するＡＴＸ−Ｓ１０・Ｎａの影響がより確実に回避される。
【００２５】
体液から白血球画分を分離した場合は、白血球画分にＡＴＸ−Ｓ１０・Ｎａを添加する。ＡＴＸ−Ｓ１０・Ｎａは、適当な溶媒（生理食塩水、ＰＢＳ等）に溶解した溶液の状態で白血球画分に添加しても、また、適当な溶媒（生理食塩水、ＰＢＳ等）に懸濁させた白血球画分に固体状態で添加してもよい。ＡＴＸ−Ｓ１０・Ｎａが添加された白血球画分は、ＡＴＸ−Ｓ１０・Ｎａが悪性リンパ腫細胞、白血病細胞又は活性化マクロファージに十分取り込まれるようにするために、一定時間（例えば、２時間）以上インキュベートしておくのが好ましい。
【００２６】
励起ステップでは、ＡＴＸ−Ｓ１０・Ｎａが添加された体液又は白血球画分に励起光を照射する。励起光は波長４００ｎｍ〜４５０ｎｍ又は約６７０ｎｍ（６５０ｎｍ〜７００ｎｍ）の光であるが、使用する光の波長としては約６７０ｎｍが好ましい。波長が長い方がそれだけ物質透過性に優れている。また、６５０ｎｍ〜７５０ｎｍは、光の吸収による生体成分への影響が最も少ない波長域である。更に、白血球画分を分離せずに体液を処理する場合は、４００ｎｍ〜４５０ｎｍの光は体液中の赤血球（ヘモグロビン）に吸収される可能性がある。
【００２７】
照射量（照射エネルギー密度）は、体液又は白血球画分に含有される各種細胞にＡＴＸ−Ｓ１０・Ｎａがどの程度取り込まれているかによって、適宜調整すればよい。例えば、体液又は白血球画分に正常な好中球が含有されている場合、ＡＴＸ−Ｓ１０・Ｎａは正常な好中球にも取り込まれている。しかし、好中球に取り込まれるＡＴＸ−Ｓ１０・Ｎａの量は悪性リンパ腫細胞、白血病細胞又は活性化マクロファージほど多くないので、照射量を調整することにより、悪性リンパ腫細胞、白血病細胞又は活性化マクロファージを選択的に死滅させることができる。一般に、照射量は１Ｊ／ｃｍ２〜５０Ｊ／ｃｍ２が好ましい。
【００２８】
励起光源は、波長４００ｎｍ〜４５０ｎｍ又は約６７０ｎｍ（６５０ｎｍ〜７００ｎｍ）、好ましくは約６７０ｎｍの光を放出するものであればよく、例として、ランプ（キセノンランプ等）、発光ダイオード（ＬＥＤ）、レーザーダイオード等が挙げられる。光源が上記波長以外の波長の光を放出する場合は、上記波長の光を取り出すためのフィルターを組み合わせて用いればよい。
【００２９】
本発明の体液処理方法は、励起ステップの後に、ＡＴＸ−Ｓ１０・Ｎａを体液中から除去する除去ステップを備えているのが好ましい。ＡＴＸ−Ｓ１０・Ｎａが体液中から除去されていれば、処理後の体液が生体内に戻された場合に、ＡＴＸ−Ｓ１０・Ｎａが生体内で正常な組織・細胞に悪影響を及ぼすのを確実に回避することができる。ＡＴＸ−Ｓ１０・Ｎａの除去は、例えば、ＡＴＸ−Ｓ１０・Ｎａを吸着する材質（活性炭等）からなるカラムに体液を通すことにより行うことができる。
【００３０】
除去ステップでは更に、除去されていないＡＴＸ−Ｓ１０・Ｎａが一定量以上ないかどうかを検査し、ＡＴＸ−Ｓ１０・Ｎａが一定量以上残存している場合には、再度除去操作を行うのが好ましい。例えば、ＡＴＸ−Ｓ１０・Ｎａの励起光を体液又は白血球画分に照射して、蛍光検出器で一定値以上の強度の蛍光が検出される場合には、ＡＴＸ−Ｓ１０・Ｎａが一定量以上残存していると判定することができる。
【００３１】
本発明の体液処理方法は、２５℃〜３６℃の一定温度下で実施されるのが好ましい。
【００３２】
ワクチンを含有する体液処理物を得る場合は、悪性リンパ腫細胞又は白血病細胞を含有する体液を上記体液処理方法で処理する。この場合、上記体液処理方法において、励起ステップの後（除去ステップを実施する場合は除去ステップの後）に、体液又は白血球画分を遠心し、その上清を採取する遠心ステップを実施してもよい。遠心ステップを実施する場合、ワクチンは得られる上清中に含有されている。励起光の照射前には、ＡＴＸ−Ｓ１０・Ｎａが添加された培地で悪性リンパ腫細胞又は白血病細胞を培養しておくのが好ましい。
【００３３】
ワクチンを含有する体液処理物は、ワクチンを単離せずにそのまま、悪性リンパ腫又は白血病の患者（ヒト又は動物）に投与することができる。ヒトに用いる場合は、静脈注射、皮内注射等により投与することができる。投与回数は１〜４が好ましい。
【００３４】
悪性リンパ腫又は白血病のワクチンを含有する体液処理物は、例えば、次のように得ることができる。すなわち、マイクロプレートの各ウェルに悪性リンパ腫細胞又は白血病細胞を１×１０７個撒き、ＡＴＸ−Ｓ１０・Ｎａ（ＩＩ）含有培地を添加し、２４時間培養する。培養後、ＡＴＸ−Ｓ１０・Ｎａ（ＩＩ）を含有しない新鮮培地と交換し、波長６７０ｎｍ、２５Ｊ／ｃｍ２の半導体レーザーを照射する。更に、４８時間培養した後、８００×ｇで遠心し、その上清を採取する。
【００３５】
得られる上清に含有されるワクチンの効果は、例えば、次のように確認することができる。上記の上清３０μＬをマウスの背部皮膚に週に１回、４週間皮内投与する。最終投与から１週間後に１×１０４個の悪性リンパ腫細胞又は白血病細胞を皮下に移植し、移植後９０日にマウスを屠殺する。また、上清を投与していないマウスについても、１×１０４個の悪性リンパ腫細胞又は白血病細胞を皮下に移植し、移植後９０日にマウスを屠殺する。上清投与群及び非投与群のマウスにおける悪性リンパ腫細胞又は白血病細胞の増殖量を比較する。
【実施例】
【００３６】
以下、本発明の実施例を説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００３７】
（実施例１：各種細胞のＡＴＸ−Ｓ１０・Ｎａ取込み量の測定）
（ＡＴＸ−Ｓ１０・Ｎａ添加液の調製）
上記式（ＩＩ）で表される化合物（以下、「ＡＴＸ−Ｓ１０・Ｎａ（ＩＩ）」という。）を14Ｃで標識した後、濃度が約１×１０−３ｍｏｌ／ＬになるようにＡＴＸ−Ｓ１０・Ｎａ（ＩＩ）を生理食塩水に溶解し、これを０．２２μｍフィルターでろ過滅菌し、更に１％ＦＢＳ（fetal bovine serum）含有ＲＰＭＩ1640培地で希釈して、５×１０−５ｍｏｌ／ＬのＡＴＸ−Ｓ１０・Ｎａ（ＩＩ）添加液を調製した。
【００３８】
（各種細胞の調製）
３人の健常人（Ａ、Ｂ及びＣと表す。）から採取した血液から、赤血球、血小板、好中球及びリンパ球を調製した。
【００３９】
赤血球、好中球及びリンパ球は、ヘパリン加血液から調製した。ヘパリン加血液と６％デキストラン加生理食塩水を３：１（ｖ：ｖ）の割合で混和し、室温で３０分間放置した。上層の白血球画分を遠心チューブで遠心（９００ｒｐｍ、１０分間、４℃）し、沈渣を生理食塩水に懸濁してFicoll-Hypaque（登録商標）液の上に重層し、遠心（１６００ｒｐｍ、３０分間、室温）した。中間層をリンパ球画分（単球を含む。）とし、沈渣を好中球画分とした。好中球画分は、氷冷０．２％ＮａＣｌ溶液に懸濁して溶血させ、直ちに同量の氷冷１．６％ＮａＣｌ溶液を添加して等張に戻した。また、粗赤血球画分は、ＫＲＰ（Krebs-Ringerリン酸緩衝液）で希釈して遠心（２０００ｒｐｍ、５分間、４℃）し、buffy coat（白血球層）を除去した。同様の操作を更に４回繰り返して赤血球画分を得た。
【００４０】
血小板は、クエン酸加血液から調製した。クエン酸加血液を遠心（８００ｒｐｍ、１０分間、室温）してＲＰＲ（platelet rich plasma）を分離し、ＲＰＲに１／１００容の１ｍｏｌ／Ｌクエン酸を加えて遠心（２２００ｒｐｍ、１０分間、室温）した。その沈渣をTyrode-HEPES緩衝液（ｐＨ７．３）に懸濁して遠心（２２００ｒｐｍ、１０分間、室温）し、沈渣を血小板画分とした。
【００４１】
悪性リンパ腫細胞及び白血病細胞として、ＴＨＰ−１細胞（ヒト単球性白血病由来細胞）、ＥｏＬ−１細胞（ヒト好酸球性白血病由来細胞）、Ａ３／ＫＡＷ細胞（ヒト悪性リンパ腫由来細胞）及びＫＧ−１細胞（ヒト急性骨髄性白血病由来細胞）を用いた。いずれの細胞も、１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ1640培地を用いて培養し、培養中は週に１〜２回継代した。なお、ＴＨＰ−１細胞及びＥｏＬ−１細胞は独立行政法人理化学研究所バイオリソースセンターより、また、Ａ３／ＫＡＷ細胞及びＫＧ−１細胞は財団法人ヒューマンサイエンス振興財団より入手した。
【００４２】
（ＡＴＸ−Ｓ１０・Ｎａ取込み量の測定）
４８ウェルマイクロプレートの各ウェルに細胞懸濁液４００μＬ及びＡＴＸ−Ｓ１０・Ｎａ（ＩＩ）添加液１００μＬを添加して混和し、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）でインキュベートし、又は冷蔵室（約４℃）で静置した。添加直後（添加後０時間）、添加後１時間、３時間、２０時間及び４４時間に細胞を分離し、細胞のＡＴＸ−Ｓ１０・Ｎａ（ＩＩ）取込み量（細胞表面への結合量を含む。）を測定した。なお、４℃で静置した場合の取込み量は細胞表面への結合量に相当し、３７℃でインキュベートした場合の取込み量から４℃で静置した場合の取込み量を差し引いた値が各種細胞の実質的なＡＴＸ−Ｓ１０・Ｎａ（ＩＩ）取込み量に当たると考えられる。
【００４３】
細胞分離及び取込み量測定は次のように行った。すなわち、予め１ｍＬの１．５％ＢＳＡ（bovine serum albumin）含有ＰＢＳ溶液（氷冷）を１．５ｍＬチューブに入れておいた。分離しようとする細胞の懸濁液を軽くピペッティングして混和し、１００μＬを採取して上記１．５％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液の上に重層した。１ウェルにつき、細胞懸濁液（３００μＬ）を３本のチューブに分注した（ｎ＝３）。遠心（３２００ｒｐｍ、１０分間、４℃）後、培地及び１．５％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液を吸引除去し、沈渣をＰＢＳ（−）１００μＬで懸濁し、更に１ｍＬのＰＢＳ（−）を加えて混和した。再度遠心（３０００ｒｐｍ、１０分間、４℃）し、上清を吸引除去した後、チューブ底の沈渣をチューブごと切り取り、カウンティングバイアルに移した。液体シンチレーター４．５ｍＬを加えて混和し、液体シンチレーションカウンターを用いて５分間放射能量を計測した。計測された放射能量より、細胞のＡＴＸ−Ｓ１０・Ｎａ（ＩＩ）取込み量（ｐｍｏｌ／１０５cells）を算出した。
【００４４】
好中球の取込み量の測定は、N-formyl-L-methionyl-L-leucyl-L-phenylalanine（以下、「ｆＭＬＰ」という。）（最終濃度：１×１０−７ｍｏｌ／Ｌ又は１×１０−６ｍｏｌ／Ｌ）又はphorbol 12-myristate 13-acetate（以下、「ＰＭＡ」という。）（最終濃度：１×１０−７ｍｏｌ／Ｌ）をＡＴＸ−Ｓ１０・Ｎａ（ＩＩ）と同時に細胞懸濁液に添加した場合についても行った。
【００４５】
また、ＴＨＰ−１細胞の取込み量の測定は、細胞をＰＭＡ（２ｎｍｏｌ／Ｌ、５ｎｍｏｌ／Ｌ又は１５ｎｍｏｌ／Ｌ）で約２４時間刺激し、ＰＭＡ除去後直ちにＡＴＸ−Ｓ１０・Ｎａ（ＩＩ）を細胞懸濁液に添加した場合についても行った。なお、ＴＨＰ−１細胞は、ＰＭＡの刺激によりマクロファージに分化する。
【００４６】
測定結果を表１〜表３及び図１〜図９に示す。
【００４７】
【表１】
【００４８】
【表２】
【００４９】
【表３】
【００５０】
図１は、ＡＴＸ−Ｓ１０・Ｎａ（ＩＩ）を細胞懸濁液に添加した直後の、各種細胞のＡＴＸ−Ｓ１０・Ｎａ（ＩＩ）取込み量を示す棒グラフである。図２は、ＡＴＸ−Ｓ１０・Ｎａ（ＩＩ）を細胞懸濁液に添加した後、３７℃で１時間インキュベートした場合の、各種細胞のＡＴＸ−Ｓ１０・Ｎａ（ＩＩ）取込み量を示す棒グラフである。図３は、ＡＴＸ−Ｓ１０・Ｎａ（ＩＩ）を細胞懸濁液に添加した後、４℃で１時間静置した場合の、各種細胞のＡＴＸ−Ｓ１０・Ｎａ（ＩＩ）取込み量を示す棒グラフである。図４は、ＡＴＸ−Ｓ１０・Ｎａ（ＩＩ）を細胞懸濁液に添加した後、３７℃で３時間インキュベートした場合の、各種細胞のＡＴＸ−Ｓ１０・Ｎａ（ＩＩ）取込み量を示す棒グラフである。図５は、ＡＴＸ−Ｓ１０・Ｎａ（ＩＩ）を細胞懸濁液に添加した後、４℃で３時間静置した場合の、各種細胞のＡＴＸ−Ｓ１０・Ｎａ（ＩＩ）取込み量を示す棒グラフである。図６は、ＡＴＸ−Ｓ１０・Ｎａ（ＩＩ）を細胞懸濁液に添加した後、３７℃で２０時間インキュベートした場合の、各種細胞のＡＴＸ−Ｓ１０・Ｎａ（ＩＩ）取込み量を示す棒グラフである。図７は、ＡＴＸ−Ｓ１０・Ｎａ（ＩＩ）を細胞懸濁液に添加した後、４℃で２０時間静置した場合の、各種細胞のＡＴＸ−Ｓ１０・Ｎａ（ＩＩ）取込み量を示す棒グラフである。図８は、ＡＴＸ−Ｓ１０・Ｎａ（ＩＩ）を細胞懸濁液に添加した後、３７℃で４４時間インキュベートした場合の、各種細胞のＡＴＸ−Ｓ１０・Ｎａ（ＩＩ）取込み量を示す棒グラフである。図９は、ＡＴＸ−Ｓ１０・Ｎａ（ＩＩ）を細胞懸濁液に添加した後、４℃で４４時間静置した場合の、各種細胞のＡＴＸ−Ｓ１０・Ｎａ（ＩＩ）取込み量を示す棒グラフである。
【００５１】
表１〜表３及び図１〜図９において、（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）は、細胞が由来する被採血者がそれぞれＡ、Ｂ及びＣであることを表す。（ｆＭＬＰ１０−７）及び（ｆＭＬＰ１０−６）は、それぞれｆＭＬＰ１×１０−７ｍｏｌ／Ｌ及び１×１０−７ｍｏｌ／Ｌで刺激したものであることを表し、（ＰＭＡ）はＰＭＡ１×１０−７ｍｏｌ／Ｌで刺激したものであることを表す。（ＰＭＡ２）、（ＰＭＡ５）及び（ＰＭＡ１５）は、それぞれＰＭＡ２ｎｍｏｌ／Ｌ、５ｎｍｏｌ／Ｌ及び１５ｎｍｏｌ／Ｌで刺激したものであることを表す。表１〜表３において、１ｈｒ、３ｈｒ、２０ｈｒ及び４４ｈｒにおける上段及び下段の数値は、それぞれ３７℃でインキュベートした場合、及び４℃で静置した場合の取込み量（ｐｍｏｌ／１０５cells）を示す。
【００５２】
表１〜表３及び図１〜図９から明らかなように、実質的なＡＴＸ−Ｓ１０・Ｎａ（ＩＩ）取込み量（３７℃でインキュベートした場合の取込み量から４℃で静置した場合の取込み量を差し引いた値）は、ＴＨＰ−１細胞、ＥｏＬ−１細胞、Ａ３／ＫＡＷ細胞及びＫＧ−１細胞のいずれにおいても、インキュベーション時間に応じて増加した。取込み能は、ＴＨＰ−１細胞が最も高く、Ａ３／ＫＡＷ細胞及びＫＧ−１細胞がそれに続き、ＥｏＬ−１細胞はかなり低かった。ＰＭＡで２４時間刺激したＴＨＰ−１細胞（活性化マクロファージ）では、ＰＭＡで刺激しない場合よりも取込み量が多く、また、ＰＭＡ濃度が高いほど取込み量が増加した。
【００５３】
リンパ球及び好中球においても、実質的なＡＴＸ−Ｓ１０・Ｎａ（ＩＩ）取込み量はインキュベーション時間に応じて増加した。取込み能は、いずれもＴＨＰ−１細胞又はＡ３／ＫＡＷ細胞ほどではないが、ＥｏＬ−１細胞よりは多かった。好中球では、ｆＭＬＰ又はＰＭＡで刺激することによって取込み量が増加することはなかった。
【００５４】
赤血球及び血小板では、ＡＴＸ−Ｓ１０・Ｎａ（ＩＩ）がほとんど取り込まれなかった。なお、３７℃で４４時間インキュベートした後には、血小板の凝集が観察された。
【産業上の利用可能性】
【００５５】
本発明は、悪性リンパ腫、白血病又は自己免疫疾患の治療に利用することができる。本発明はまた、悪性リンパ腫又は白血病のワクチンの製造、及び悪性リンパ腫又は白血病の再発・転移の予防に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】ＡＴＸ−Ｓ１０・Ｎａ（ＩＩ）を細胞懸濁液に添加した直後の、各種細胞のＡＴＸ−Ｓ１０・Ｎａ（ＩＩ）取込み量を示す棒グラフである。
【図２】ＡＴＸ−Ｓ１０・Ｎａ（ＩＩ）を細胞懸濁液に添加した後、３７℃で１時間インキュベートした場合の、各種細胞のＡＴＸ−Ｓ１０・Ｎａ（ＩＩ）取込み量を示す棒グラフである。
【図３】ＡＴＸ−Ｓ１０・Ｎａ（ＩＩ）を細胞懸濁液に添加した後、４℃で１時間静置した場合の、各種細胞のＡＴＸ−Ｓ１０・Ｎａ（ＩＩ）取込み量を示す棒グラフである。
【図４】ＡＴＸ−Ｓ１０・Ｎａ（ＩＩ）を細胞懸濁液に添加した後、３７℃で３時間インキュベートした場合の、各種細胞のＡＴＸ−Ｓ１０・Ｎａ（ＩＩ）取込み量を示す棒グラフである。
【図５】ＡＴＸ−Ｓ１０・Ｎａ（ＩＩ）を細胞懸濁液に添加した後、４℃で３時間静置した場合の、各種細胞のＡＴＸ−Ｓ１０・Ｎａ（ＩＩ）取込み量を示す棒グラフである。
【図６】ＡＴＸ−Ｓ１０・Ｎａ（ＩＩ）を細胞懸濁液に添加した後、３７℃で２０時間インキュベートした場合の、各種細胞のＡＴＸ−Ｓ１０・Ｎａ（ＩＩ）取込み量を示す棒グラフである。
【図７】ＡＴＸ−Ｓ１０・Ｎａ（ＩＩ）を細胞懸濁液に添加した後、４℃で２０時間静置した場合の、各種細胞のＡＴＸ−Ｓ１０・Ｎａ（ＩＩ）取込み量を示す棒グラフである。
【図８】ＡＴＸ−Ｓ１０・Ｎａ（ＩＩ）を細胞懸濁液に添加した後、３７℃で４４時間インキュベートした場合の、各種細胞のＡＴＸ−Ｓ１０・Ｎａ（ＩＩ）取込み量を示す棒グラフである。
【図９】ＡＴＸ−Ｓ１０・Ｎａ（ＩＩ）を細胞懸濁液に添加した後、４℃で４４時間静置した場合の、各種細胞のＡＴＸ−Ｓ１０・Ｎａ（ＩＩ）取込み量を示す棒グラフである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、体液処理方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体外で体液中の悪性リンパ腫細胞を死滅させる方法として、体外循環光化学療法（extracorporeal photochemotherapy又はphotopheresis）が知られている。従来の体外循環光化学療法は、体外循環回路に取り出した血液を８−メトキシソラレン（８−ＭＯＰ）で処理し、紫外線（ＵＶＡ）を照射して悪性リンパ腫細胞を死滅させた後、血液を体内に戻すというものであり、現在、皮膚Ｔ細胞リンパ腫の治療に利用されている（非特許文献１）。
【非特許文献１】Haematologica 1999; 84:237-241
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかしながら、上記の方法では、ＵＶＡ（波長：３２０ｎｍ〜４００ｎｍ）を用いるため、光の照射による正常な細胞（特に核）への悪影響を避けることができなかった。
【０００４】
そこで、本発明は、正常な細胞への悪影響を回避しつつ、生体外で体液中の悪性リンパ腫細胞を死滅させる方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記目的を達成するため、本発明は、体液中の悪性リンパ腫細胞、白血病細胞又は活性化マクロファージを生体外で選択的に死滅させるための体液処理方法であって、生体外に取り出された、悪性リンパ腫細胞、白血病細胞又は活性化マクロファージを含有する体液に、下記式（Ｉ）又は（ＩＩ）で表される化合物（以下、場合により、「ＡＴＸ−Ｓ１０・Ｎａ」という。）を添加して添加物を得る添加ステップと、前記添加物に励起光を照射して、前記式（Ｉ）又は（ＩＩ）で表される化合物を励起させる励起ステップと、を備える体液処理方法を提供する。
【０００６】
【化１】
【０００７】
【化２】
【０００８】
ＡＴＸ−Ｓ１０・Ｎａは、体液中において、悪性リンパ腫細胞、白血病細胞又は活性化マクロファージには取り込まれるが、赤血球及び血小板にはほとんど取り込まれないという性質を有する。従って、悪性リンパ腫細胞、白血病細胞又は活性化マクロファージを含有する体液にＡＴＸ−Ｓ１０・Ｎａを添加すると、ＡＴＸ−Ｓ１０・Ｎａは選択的に上記の細胞に取り込まれることになる。すなわち、上記体液処理方法は、体液中の悪性リンパ腫細胞、白血病細胞又は活性化マクロファージを生体外で選択的に死滅させるための方法である。ここで、「死滅させる」とは、体液中の悪性リンパ腫細胞、白血病細胞又は活性化マクロファージの集団の少なくとも一部を死滅させることであり、必ずしも全部を死滅させることではない。
【０００９】
ＡＴＸ−Ｓ１０・Ｎａは、波長４００ｎｍ〜４５０ｎｍ又は約６７０ｎｍ（６５０ｎｍ〜７００ｎｍ）の光を照射されることによって励起する。つまり、上記体液処理方法では、ＵＶＡよりも波長の長い可視光領域の光が用いられる。従って、光の照射により正常な細胞（特に核）や装置の材料に悪影響が及ぶことはほとんどない。また、光の物質透過性がよいので、標的細胞には十分な量の光を到達させることができる。
【００１０】
上記体液処理方法で処理した体液を生体内に戻すと、悪性リンパ腫細胞、白血病細胞又は活性化マクロファージは死滅するが、正常な細胞はほとんど死滅することなく生体内に戻されることになる。従って、悪性リンパ腫、白血病又は自己免疫疾患（潰瘍性大腸炎、クローン病、関節リウマチ等）の患者の体液を上記体液処理方法で処理して、患者の体内に戻すことにより、正常な組織・細胞にはほとんど悪影響を及ぼすことなく、上記の疾患を治療することができる。
【００１１】
上記体液処理方法では、添加ステップの前に、体液から白血球画分を分離する分離ステップを実施し、添加ステップにおいて白血球画分にＡＴＸ−Ｓ１０・Ｎａを添加するのが好ましい。こうすることにより、白血球画分以外の画分（赤血球、血小板等）を速やかに患者の体内に戻して、患者に低血圧や貧血が生じるのを確実に防ぐことが可能となる。
【００１２】
ところで、悪性リンパ腫又は白血病の患者の体液を上記体液処理方法で処理し、得られる体液処理物を患者の体内に戻すと、患者の体内の悪性リンパ腫細胞又は白血病細胞の増殖が顕著に抑制される。すなわち、上記体液処理物中に含有される死滅した悪性リンパ腫細胞又は白血病細胞は、悪性リンパ腫又は白血病のワクチンとして機能する。これは、上記体液処理物中にネクローシスを起こした細胞とアポトーシスを起こした細胞とが適度な割合で混在することにより、これらの死滅した細胞が生体内で、これと同種の細胞に特異的な免疫細胞、特にＴリンパ球を活性化するためと考えられる。
【００１３】
このように、生体外に取り出された、悪性リンパ腫細胞又は白血病細胞を含有する体液にＡＴＸ−Ｓ１０・Ｎａを添加して、励起光を照射すると、悪性リンパ腫又は白血病のワクチンを含有する体液処理物を得ることができる。上記体液処理物中に含有されるワクチンは、患者自身の悪性リンパ腫細胞又は白血病細胞に高度に特異的な免疫を誘導するオーダーメードのワクチンであり、悪性リンパ腫又は白血病の治療、及び治療後の再発・転移の予防を可能にする。
【００１４】
また、上記体液処理方法を用いれば、標的とする悪性リンパ腫細胞又は白血病細胞をホルマリン等で固定するという煩雑な操作をすることなく、簡便に、かつ短時間に悪性リンパ腫又は白血病のワクチンを製造することが可能となる。
【００１５】
なお、生体内投与を前提としたＡＴＸ−Ｓ１０・Ｎａの使用は特許第３６１３５９９号公報及び特許第３１９１２２３号公報に記載されているが、ＡＴＸ−Ｓ１０・Ｎａを体外における体液処理、特にワクチネーションを目的とした体液処理のために用いることができることは本発明者らが初めて見出した知見である。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、正常な細胞への悪影響を回避しつつ、生体外で体液中の悪性リンパ腫細胞、白血病細胞又は活性化マクロファージを選択的に死滅させる方法が提供される。また、個々の悪性リンパ腫患者又は白血病患者に最適なワクチンが提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
以下、本発明の好適な実施形態について説明する。
【００１８】
本発明の体液処理方法は、上述の添加ステップ及び励起ステップを備えるものである。
【００１９】
添加ステップでは、生体外に取り出された体液にＡＴＸ−Ｓ１０・Ｎａを添加する。ＡＴＸ−Ｓ１０・Ｎａは、特許第３６１３５９９号公報に記載の方法により製造することができる。
【００２０】
体液としては、血液、リンパ液及び骨髄液が挙げられる。血液を処理する場合は、血液が凝固しないように、生体外に取り出したら抗凝固薬（ヘパリン、クエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）等）を添加しておくのが好ましい。
【００２１】
上記体液は、悪性リンパ腫、白血病又は自己免疫疾患の患者（ヒト又は動物）から取り出されたものであり、悪性リンパ腫細胞、白血病細胞又は活性化マクロファージを含有する。悪性リンパ腫細胞は、ホジキン病及び非ホジキンリンパ腫のいずれに由来するものでもよく、また、Ｂリンパ球性細胞及びＴリンパ球性細胞のいずれでもよい。白血病細胞は、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ球性白血病及び慢性リンパ球性白血病のいずれに由来するものでもよく、例として、骨髄芽球、前骨髄球、単球、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球等が挙げられる。
【００２２】
ＡＴＸ−Ｓ１０・Ｎａは、適当な溶媒に溶解した溶液の状態で体液に添加しても、また、固体状態で体液に添加してもよい。ＡＴＸ−Ｓ１０・Ｎａが添加された体液は、ＡＴＸ−Ｓ１０・Ｎａが悪性リンパ腫細胞、白血病細胞又は活性化マクロファージに十分取り込まれるようにするために、一定時間（例えば、２時間）以上インキュベートしておくのが好ましい。なお、ＡＴＸ−Ｓ１０・Ｎａは水溶性が高いので、溶媒としては生理食塩水、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）等が好適である。
【００２３】
体液から白血球画分を分離する場合、白血球画分の分離は、例えば、比重の違いに基づいて遠心分離により行うことができる。得られた白血球画分は、生理食塩水、ＰＢＳ等の溶媒に懸濁させておくのが好ましい。
【００２４】
白血球画分は悪性リンパ腫細胞、白血病細胞又は活性化マクロファージを含有していればよいが、これらの細胞以外の正常な細胞（好中球等）は白血球画分から分離しておくのが好ましい。正常な細胞を分離しておけば、白血球画分にＡＴＸ−Ｓ１０・Ｎａを添加した場合に、正常な細胞に対するＡＴＸ−Ｓ１０・Ｎａの影響がより確実に回避される。
【００２５】
体液から白血球画分を分離した場合は、白血球画分にＡＴＸ−Ｓ１０・Ｎａを添加する。ＡＴＸ−Ｓ１０・Ｎａは、適当な溶媒（生理食塩水、ＰＢＳ等）に溶解した溶液の状態で白血球画分に添加しても、また、適当な溶媒（生理食塩水、ＰＢＳ等）に懸濁させた白血球画分に固体状態で添加してもよい。ＡＴＸ−Ｓ１０・Ｎａが添加された白血球画分は、ＡＴＸ−Ｓ１０・Ｎａが悪性リンパ腫細胞、白血病細胞又は活性化マクロファージに十分取り込まれるようにするために、一定時間（例えば、２時間）以上インキュベートしておくのが好ましい。
【００２６】
励起ステップでは、ＡＴＸ−Ｓ１０・Ｎａが添加された体液又は白血球画分に励起光を照射する。励起光は波長４００ｎｍ〜４５０ｎｍ又は約６７０ｎｍ（６５０ｎｍ〜７００ｎｍ）の光であるが、使用する光の波長としては約６７０ｎｍが好ましい。波長が長い方がそれだけ物質透過性に優れている。また、６５０ｎｍ〜７５０ｎｍは、光の吸収による生体成分への影響が最も少ない波長域である。更に、白血球画分を分離せずに体液を処理する場合は、４００ｎｍ〜４５０ｎｍの光は体液中の赤血球（ヘモグロビン）に吸収される可能性がある。
【００２７】
照射量（照射エネルギー密度）は、体液又は白血球画分に含有される各種細胞にＡＴＸ−Ｓ１０・Ｎａがどの程度取り込まれているかによって、適宜調整すればよい。例えば、体液又は白血球画分に正常な好中球が含有されている場合、ＡＴＸ−Ｓ１０・Ｎａは正常な好中球にも取り込まれている。しかし、好中球に取り込まれるＡＴＸ−Ｓ１０・Ｎａの量は悪性リンパ腫細胞、白血病細胞又は活性化マクロファージほど多くないので、照射量を調整することにより、悪性リンパ腫細胞、白血病細胞又は活性化マクロファージを選択的に死滅させることができる。一般に、照射量は１Ｊ／ｃｍ２〜５０Ｊ／ｃｍ２が好ましい。
【００２８】
励起光源は、波長４００ｎｍ〜４５０ｎｍ又は約６７０ｎｍ（６５０ｎｍ〜７００ｎｍ）、好ましくは約６７０ｎｍの光を放出するものであればよく、例として、ランプ（キセノンランプ等）、発光ダイオード（ＬＥＤ）、レーザーダイオード等が挙げられる。光源が上記波長以外の波長の光を放出する場合は、上記波長の光を取り出すためのフィルターを組み合わせて用いればよい。
【００２９】
本発明の体液処理方法は、励起ステップの後に、ＡＴＸ−Ｓ１０・Ｎａを体液中から除去する除去ステップを備えているのが好ましい。ＡＴＸ−Ｓ１０・Ｎａが体液中から除去されていれば、処理後の体液が生体内に戻された場合に、ＡＴＸ−Ｓ１０・Ｎａが生体内で正常な組織・細胞に悪影響を及ぼすのを確実に回避することができる。ＡＴＸ−Ｓ１０・Ｎａの除去は、例えば、ＡＴＸ−Ｓ１０・Ｎａを吸着する材質（活性炭等）からなるカラムに体液を通すことにより行うことができる。
【００３０】
除去ステップでは更に、除去されていないＡＴＸ−Ｓ１０・Ｎａが一定量以上ないかどうかを検査し、ＡＴＸ−Ｓ１０・Ｎａが一定量以上残存している場合には、再度除去操作を行うのが好ましい。例えば、ＡＴＸ−Ｓ１０・Ｎａの励起光を体液又は白血球画分に照射して、蛍光検出器で一定値以上の強度の蛍光が検出される場合には、ＡＴＸ−Ｓ１０・Ｎａが一定量以上残存していると判定することができる。
【００３１】
本発明の体液処理方法は、２５℃〜３６℃の一定温度下で実施されるのが好ましい。
【００３２】
ワクチンを含有する体液処理物を得る場合は、悪性リンパ腫細胞又は白血病細胞を含有する体液を上記体液処理方法で処理する。この場合、上記体液処理方法において、励起ステップの後（除去ステップを実施する場合は除去ステップの後）に、体液又は白血球画分を遠心し、その上清を採取する遠心ステップを実施してもよい。遠心ステップを実施する場合、ワクチンは得られる上清中に含有されている。励起光の照射前には、ＡＴＸ−Ｓ１０・Ｎａが添加された培地で悪性リンパ腫細胞又は白血病細胞を培養しておくのが好ましい。
【００３３】
ワクチンを含有する体液処理物は、ワクチンを単離せずにそのまま、悪性リンパ腫又は白血病の患者（ヒト又は動物）に投与することができる。ヒトに用いる場合は、静脈注射、皮内注射等により投与することができる。投与回数は１〜４が好ましい。
【００３４】
悪性リンパ腫又は白血病のワクチンを含有する体液処理物は、例えば、次のように得ることができる。すなわち、マイクロプレートの各ウェルに悪性リンパ腫細胞又は白血病細胞を１×１０７個撒き、ＡＴＸ−Ｓ１０・Ｎａ（ＩＩ）含有培地を添加し、２４時間培養する。培養後、ＡＴＸ−Ｓ１０・Ｎａ（ＩＩ）を含有しない新鮮培地と交換し、波長６７０ｎｍ、２５Ｊ／ｃｍ２の半導体レーザーを照射する。更に、４８時間培養した後、８００×ｇで遠心し、その上清を採取する。
【００３５】
得られる上清に含有されるワクチンの効果は、例えば、次のように確認することができる。上記の上清３０μＬをマウスの背部皮膚に週に１回、４週間皮内投与する。最終投与から１週間後に１×１０４個の悪性リンパ腫細胞又は白血病細胞を皮下に移植し、移植後９０日にマウスを屠殺する。また、上清を投与していないマウスについても、１×１０４個の悪性リンパ腫細胞又は白血病細胞を皮下に移植し、移植後９０日にマウスを屠殺する。上清投与群及び非投与群のマウスにおける悪性リンパ腫細胞又は白血病細胞の増殖量を比較する。
【実施例】
【００３６】
以下、本発明の実施例を説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００３７】
（実施例１：各種細胞のＡＴＸ−Ｓ１０・Ｎａ取込み量の測定）
（ＡＴＸ−Ｓ１０・Ｎａ添加液の調製）
上記式（ＩＩ）で表される化合物（以下、「ＡＴＸ−Ｓ１０・Ｎａ（ＩＩ）」という。）を14Ｃで標識した後、濃度が約１×１０−３ｍｏｌ／ＬになるようにＡＴＸ−Ｓ１０・Ｎａ（ＩＩ）を生理食塩水に溶解し、これを０．２２μｍフィルターでろ過滅菌し、更に１％ＦＢＳ（fetal bovine serum）含有ＲＰＭＩ1640培地で希釈して、５×１０−５ｍｏｌ／ＬのＡＴＸ−Ｓ１０・Ｎａ（ＩＩ）添加液を調製した。
【００３８】
（各種細胞の調製）
３人の健常人（Ａ、Ｂ及びＣと表す。）から採取した血液から、赤血球、血小板、好中球及びリンパ球を調製した。
【００３９】
赤血球、好中球及びリンパ球は、ヘパリン加血液から調製した。ヘパリン加血液と６％デキストラン加生理食塩水を３：１（ｖ：ｖ）の割合で混和し、室温で３０分間放置した。上層の白血球画分を遠心チューブで遠心（９００ｒｐｍ、１０分間、４℃）し、沈渣を生理食塩水に懸濁してFicoll-Hypaque（登録商標）液の上に重層し、遠心（１６００ｒｐｍ、３０分間、室温）した。中間層をリンパ球画分（単球を含む。）とし、沈渣を好中球画分とした。好中球画分は、氷冷０．２％ＮａＣｌ溶液に懸濁して溶血させ、直ちに同量の氷冷１．６％ＮａＣｌ溶液を添加して等張に戻した。また、粗赤血球画分は、ＫＲＰ（Krebs-Ringerリン酸緩衝液）で希釈して遠心（２０００ｒｐｍ、５分間、４℃）し、buffy coat（白血球層）を除去した。同様の操作を更に４回繰り返して赤血球画分を得た。
【００４０】
血小板は、クエン酸加血液から調製した。クエン酸加血液を遠心（８００ｒｐｍ、１０分間、室温）してＲＰＲ（platelet rich plasma）を分離し、ＲＰＲに１／１００容の１ｍｏｌ／Ｌクエン酸を加えて遠心（２２００ｒｐｍ、１０分間、室温）した。その沈渣をTyrode-HEPES緩衝液（ｐＨ７．３）に懸濁して遠心（２２００ｒｐｍ、１０分間、室温）し、沈渣を血小板画分とした。
【００４１】
悪性リンパ腫細胞及び白血病細胞として、ＴＨＰ−１細胞（ヒト単球性白血病由来細胞）、ＥｏＬ−１細胞（ヒト好酸球性白血病由来細胞）、Ａ３／ＫＡＷ細胞（ヒト悪性リンパ腫由来細胞）及びＫＧ−１細胞（ヒト急性骨髄性白血病由来細胞）を用いた。いずれの細胞も、１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ1640培地を用いて培養し、培養中は週に１〜２回継代した。なお、ＴＨＰ−１細胞及びＥｏＬ−１細胞は独立行政法人理化学研究所バイオリソースセンターより、また、Ａ３／ＫＡＷ細胞及びＫＧ−１細胞は財団法人ヒューマンサイエンス振興財団より入手した。
【００４２】
（ＡＴＸ−Ｓ１０・Ｎａ取込み量の測定）
４８ウェルマイクロプレートの各ウェルに細胞懸濁液４００μＬ及びＡＴＸ−Ｓ１０・Ｎａ（ＩＩ）添加液１００μＬを添加して混和し、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）でインキュベートし、又は冷蔵室（約４℃）で静置した。添加直後（添加後０時間）、添加後１時間、３時間、２０時間及び４４時間に細胞を分離し、細胞のＡＴＸ−Ｓ１０・Ｎａ（ＩＩ）取込み量（細胞表面への結合量を含む。）を測定した。なお、４℃で静置した場合の取込み量は細胞表面への結合量に相当し、３７℃でインキュベートした場合の取込み量から４℃で静置した場合の取込み量を差し引いた値が各種細胞の実質的なＡＴＸ−Ｓ１０・Ｎａ（ＩＩ）取込み量に当たると考えられる。
【００４３】
細胞分離及び取込み量測定は次のように行った。すなわち、予め１ｍＬの１．５％ＢＳＡ（bovine serum albumin）含有ＰＢＳ溶液（氷冷）を１．５ｍＬチューブに入れておいた。分離しようとする細胞の懸濁液を軽くピペッティングして混和し、１００μＬを採取して上記１．５％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液の上に重層した。１ウェルにつき、細胞懸濁液（３００μＬ）を３本のチューブに分注した（ｎ＝３）。遠心（３２００ｒｐｍ、１０分間、４℃）後、培地及び１．５％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液を吸引除去し、沈渣をＰＢＳ（−）１００μＬで懸濁し、更に１ｍＬのＰＢＳ（−）を加えて混和した。再度遠心（３０００ｒｐｍ、１０分間、４℃）し、上清を吸引除去した後、チューブ底の沈渣をチューブごと切り取り、カウンティングバイアルに移した。液体シンチレーター４．５ｍＬを加えて混和し、液体シンチレーションカウンターを用いて５分間放射能量を計測した。計測された放射能量より、細胞のＡＴＸ−Ｓ１０・Ｎａ（ＩＩ）取込み量（ｐｍｏｌ／１０５cells）を算出した。
【００４４】
好中球の取込み量の測定は、N-formyl-L-methionyl-L-leucyl-L-phenylalanine（以下、「ｆＭＬＰ」という。）（最終濃度：１×１０−７ｍｏｌ／Ｌ又は１×１０−６ｍｏｌ／Ｌ）又はphorbol 12-myristate 13-acetate（以下、「ＰＭＡ」という。）（最終濃度：１×１０−７ｍｏｌ／Ｌ）をＡＴＸ−Ｓ１０・Ｎａ（ＩＩ）と同時に細胞懸濁液に添加した場合についても行った。
【００４５】
また、ＴＨＰ−１細胞の取込み量の測定は、細胞をＰＭＡ（２ｎｍｏｌ／Ｌ、５ｎｍｏｌ／Ｌ又は１５ｎｍｏｌ／Ｌ）で約２４時間刺激し、ＰＭＡ除去後直ちにＡＴＸ−Ｓ１０・Ｎａ（ＩＩ）を細胞懸濁液に添加した場合についても行った。なお、ＴＨＰ−１細胞は、ＰＭＡの刺激によりマクロファージに分化する。
【００４６】
測定結果を表１〜表３及び図１〜図９に示す。
【００４７】
【表１】
【００４８】
【表２】
【００４９】
【表３】
【００５０】
図１は、ＡＴＸ−Ｓ１０・Ｎａ（ＩＩ）を細胞懸濁液に添加した直後の、各種細胞のＡＴＸ−Ｓ１０・Ｎａ（ＩＩ）取込み量を示す棒グラフである。図２は、ＡＴＸ−Ｓ１０・Ｎａ（ＩＩ）を細胞懸濁液に添加した後、３７℃で１時間インキュベートした場合の、各種細胞のＡＴＸ−Ｓ１０・Ｎａ（ＩＩ）取込み量を示す棒グラフである。図３は、ＡＴＸ−Ｓ１０・Ｎａ（ＩＩ）を細胞懸濁液に添加した後、４℃で１時間静置した場合の、各種細胞のＡＴＸ−Ｓ１０・Ｎａ（ＩＩ）取込み量を示す棒グラフである。図４は、ＡＴＸ−Ｓ１０・Ｎａ（ＩＩ）を細胞懸濁液に添加した後、３７℃で３時間インキュベートした場合の、各種細胞のＡＴＸ−Ｓ１０・Ｎａ（ＩＩ）取込み量を示す棒グラフである。図５は、ＡＴＸ−Ｓ１０・Ｎａ（ＩＩ）を細胞懸濁液に添加した後、４℃で３時間静置した場合の、各種細胞のＡＴＸ−Ｓ１０・Ｎａ（ＩＩ）取込み量を示す棒グラフである。図６は、ＡＴＸ−Ｓ１０・Ｎａ（ＩＩ）を細胞懸濁液に添加した後、３７℃で２０時間インキュベートした場合の、各種細胞のＡＴＸ−Ｓ１０・Ｎａ（ＩＩ）取込み量を示す棒グラフである。図７は、ＡＴＸ−Ｓ１０・Ｎａ（ＩＩ）を細胞懸濁液に添加した後、４℃で２０時間静置した場合の、各種細胞のＡＴＸ−Ｓ１０・Ｎａ（ＩＩ）取込み量を示す棒グラフである。図８は、ＡＴＸ−Ｓ１０・Ｎａ（ＩＩ）を細胞懸濁液に添加した後、３７℃で４４時間インキュベートした場合の、各種細胞のＡＴＸ−Ｓ１０・Ｎａ（ＩＩ）取込み量を示す棒グラフである。図９は、ＡＴＸ−Ｓ１０・Ｎａ（ＩＩ）を細胞懸濁液に添加した後、４℃で４４時間静置した場合の、各種細胞のＡＴＸ−Ｓ１０・Ｎａ（ＩＩ）取込み量を示す棒グラフである。
【００５１】
表１〜表３及び図１〜図９において、（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）は、細胞が由来する被採血者がそれぞれＡ、Ｂ及びＣであることを表す。（ｆＭＬＰ１０−７）及び（ｆＭＬＰ１０−６）は、それぞれｆＭＬＰ１×１０−７ｍｏｌ／Ｌ及び１×１０−７ｍｏｌ／Ｌで刺激したものであることを表し、（ＰＭＡ）はＰＭＡ１×１０−７ｍｏｌ／Ｌで刺激したものであることを表す。（ＰＭＡ２）、（ＰＭＡ５）及び（ＰＭＡ１５）は、それぞれＰＭＡ２ｎｍｏｌ／Ｌ、５ｎｍｏｌ／Ｌ及び１５ｎｍｏｌ／Ｌで刺激したものであることを表す。表１〜表３において、１ｈｒ、３ｈｒ、２０ｈｒ及び４４ｈｒにおける上段及び下段の数値は、それぞれ３７℃でインキュベートした場合、及び４℃で静置した場合の取込み量（ｐｍｏｌ／１０５cells）を示す。
【００５２】
表１〜表３及び図１〜図９から明らかなように、実質的なＡＴＸ−Ｓ１０・Ｎａ（ＩＩ）取込み量（３７℃でインキュベートした場合の取込み量から４℃で静置した場合の取込み量を差し引いた値）は、ＴＨＰ−１細胞、ＥｏＬ−１細胞、Ａ３／ＫＡＷ細胞及びＫＧ−１細胞のいずれにおいても、インキュベーション時間に応じて増加した。取込み能は、ＴＨＰ−１細胞が最も高く、Ａ３／ＫＡＷ細胞及びＫＧ−１細胞がそれに続き、ＥｏＬ−１細胞はかなり低かった。ＰＭＡで２４時間刺激したＴＨＰ−１細胞（活性化マクロファージ）では、ＰＭＡで刺激しない場合よりも取込み量が多く、また、ＰＭＡ濃度が高いほど取込み量が増加した。
【００５３】
リンパ球及び好中球においても、実質的なＡＴＸ−Ｓ１０・Ｎａ（ＩＩ）取込み量はインキュベーション時間に応じて増加した。取込み能は、いずれもＴＨＰ−１細胞又はＡ３／ＫＡＷ細胞ほどではないが、ＥｏＬ−１細胞よりは多かった。好中球では、ｆＭＬＰ又はＰＭＡで刺激することによって取込み量が増加することはなかった。
【００５４】
赤血球及び血小板では、ＡＴＸ−Ｓ１０・Ｎａ（ＩＩ）がほとんど取り込まれなかった。なお、３７℃で４４時間インキュベートした後には、血小板の凝集が観察された。
【産業上の利用可能性】
【００５５】
本発明は、悪性リンパ腫、白血病又は自己免疫疾患の治療に利用することができる。本発明はまた、悪性リンパ腫又は白血病のワクチンの製造、及び悪性リンパ腫又は白血病の再発・転移の予防に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】ＡＴＸ−Ｓ１０・Ｎａ（ＩＩ）を細胞懸濁液に添加した直後の、各種細胞のＡＴＸ−Ｓ１０・Ｎａ（ＩＩ）取込み量を示す棒グラフである。
【図２】ＡＴＸ−Ｓ１０・Ｎａ（ＩＩ）を細胞懸濁液に添加した後、３７℃で１時間インキュベートした場合の、各種細胞のＡＴＸ−Ｓ１０・Ｎａ（ＩＩ）取込み量を示す棒グラフである。
【図３】ＡＴＸ−Ｓ１０・Ｎａ（ＩＩ）を細胞懸濁液に添加した後、４℃で１時間静置した場合の、各種細胞のＡＴＸ−Ｓ１０・Ｎａ（ＩＩ）取込み量を示す棒グラフである。
【図４】ＡＴＸ−Ｓ１０・Ｎａ（ＩＩ）を細胞懸濁液に添加した後、３７℃で３時間インキュベートした場合の、各種細胞のＡＴＸ−Ｓ１０・Ｎａ（ＩＩ）取込み量を示す棒グラフである。
【図５】ＡＴＸ−Ｓ１０・Ｎａ（ＩＩ）を細胞懸濁液に添加した後、４℃で３時間静置した場合の、各種細胞のＡＴＸ−Ｓ１０・Ｎａ（ＩＩ）取込み量を示す棒グラフである。
【図６】ＡＴＸ−Ｓ１０・Ｎａ（ＩＩ）を細胞懸濁液に添加した後、３７℃で２０時間インキュベートした場合の、各種細胞のＡＴＸ−Ｓ１０・Ｎａ（ＩＩ）取込み量を示す棒グラフである。
【図７】ＡＴＸ−Ｓ１０・Ｎａ（ＩＩ）を細胞懸濁液に添加した後、４℃で２０時間静置した場合の、各種細胞のＡＴＸ−Ｓ１０・Ｎａ（ＩＩ）取込み量を示す棒グラフである。
【図８】ＡＴＸ−Ｓ１０・Ｎａ（ＩＩ）を細胞懸濁液に添加した後、３７℃で４４時間インキュベートした場合の、各種細胞のＡＴＸ−Ｓ１０・Ｎａ（ＩＩ）取込み量を示す棒グラフである。
【図９】ＡＴＸ−Ｓ１０・Ｎａ（ＩＩ）を細胞懸濁液に添加した後、４℃で４４時間静置した場合の、各種細胞のＡＴＸ−Ｓ１０・Ｎａ（ＩＩ）取込み量を示す棒グラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
体液中の悪性リンパ腫細胞、白血病細胞又は活性化マクロファージを生体外で選択的に死滅させるための体液処理方法であって、
生体外に取り出された、悪性リンパ腫細胞、白血病細胞又は活性化マクロファージを含有する体液に、下記式（Ｉ）又は（ＩＩ）で表される化合物を添加して添加物を得る添加ステップと、
前記添加物に励起光を照射して、前記式（Ｉ）又は（ＩＩ）で表される化合物を励起させる励起ステップと、を備える体液処理方法。
【化１】
【化２】
【請求項２】
前記添加ステップの前に、生体外に取り出された、悪性リンパ腫細胞、白血病細胞又は活性化マクロファージを含有する体液から白血球画分を分離する分離ステップを実施し、
前記添加ステップにおいて、前記白血球画分に、前記式（Ｉ）又は（ＩＩ）で表される化合物を添加する請求項１記載の体液処理方法。
【請求項１】
体液中の悪性リンパ腫細胞、白血病細胞又は活性化マクロファージを生体外で選択的に死滅させるための体液処理方法であって、
生体外に取り出された、悪性リンパ腫細胞、白血病細胞又は活性化マクロファージを含有する体液に、下記式（Ｉ）又は（ＩＩ）で表される化合物を添加して添加物を得る添加ステップと、
前記添加物に励起光を照射して、前記式（Ｉ）又は（ＩＩ）で表される化合物を励起させる励起ステップと、を備える体液処理方法。
【化１】
【化２】
【請求項２】
前記添加ステップの前に、生体外に取り出された、悪性リンパ腫細胞、白血病細胞又は活性化マクロファージを含有する体液から白血球画分を分離する分離ステップを実施し、
前記添加ステップにおいて、前記白血球画分に、前記式（Ｉ）又は（ＩＩ）で表される化合物を添加する請求項１記載の体液処理方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【公開番号】特開２００６−３０６７４３（Ｐ２００６−３０６７４３Ａ）
【公開日】平成１８年１１月９日（２００６．１１．９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−１２８４５７（Ｐ２００５−１２８４５７）
【出願日】平成１７年４月２６日（２００５．４．２６）
【出願人】（０００２３６４３６）浜松ホトニクス株式会社 (1,479)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年１１月９日（２００６．１１．９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年４月２６日（２００５．４．２６）
【出願人】（０００２３６４３６）浜松ホトニクス株式会社 (1,479)
【Ｆターム（参考）】
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