体細胞の再プログラミング
本開示は、１つまたは複数の体細胞（例えば、部分的に分化した体細胞または完全分化／最終分化した体細胞）をより低い分化状態（例えば、多能性状態または多分化能状態）に再プログラミングする方法に関する。さらなる実施形態では、本発明はまた、本発明の方法によって産生された再プログラミングされた体細胞、かかる細胞の使用、および体細胞の再プログラミングに有用な薬剤の同定方法に関する。本発明は、選択マーカーの発現が、マーカーが連結する内因性多能性遺伝子の発現と実質的に適合するような様式で１つまたは複数の内因性多能性遺伝子が選択マーカーに作動可能に連結する操作された体細胞を提供する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
体細胞をより低い分化状態に再プログラミングする薬剤を同定する方法であって、
（ａ）体細胞を候補再プログラミング薬と接触させる工程であって、前記体細胞がＤＮＡメチル化減少に感受性である、接触させる工程、および
（ｂ）前記薬剤が体細胞を再プログラミングしない場合に予想されるよりも多数の細胞がＤＮＡメチル化減少に耐性であるかどうかを決定する工程であって、前記候補再プログラミング薬が体細胞を再プログラミングしない場合に予想されるよりも多数の細胞がＤＮＡメチル化減少に耐性を示す場合、前記候補再プログラミング薬は再プログラミング薬として同定される、決定する工程
を含む、方法。
【請求項２】
ＤＮＡメチル化減少条件下で培養物中の細胞を維持する工程および前記薬剤が体細胞を再プログラミングしない場合に予想されるよりも多数の細胞が生存するかどうかを決定する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ゲノムＤＮＡのメチル化を減少させるように細胞を処理する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ＤＮＡメチルトランスフェラーゼの発現または活性を阻害する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記細胞をＤＮＡメチルトランスフェラーゼ活性を阻害する薬剤と接触させる工程を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記細胞中の干渉ＲＮＡの発現を逆に誘導する工程であって、前記干渉ＲＮＡがＤＮＡメチルトランスフェラーゼの発現を阻害する、誘導する工程を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記ＤＮＡメチルトランスフェラーゼがＤＮＡメチルトランスフェラーゼＩである、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
前記細胞のゲノムＤＮＡ中のメチル化ＣｐＧ配列の平均数を少なくとも１０％減少させるように前記細胞を処理する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記細胞中のＤＮＭＴ１タンパク質をコードするｍＲＮＡの平均レベルを少なくとも５０％減少させる工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記細胞中のＤＮＭＴ１タンパク質の平均レベルを少なくとも５０％減少させる工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記細胞中のＤＮＭＴ１メチルトランスフェラーゼ活性の平均レベルを少なくとも５０％減少させる工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
ＤＮＡメチル化減少条件下で培養物中の細胞を適切な期間維持する工程であって、前記期間後の生細胞の存在数が、薬剤が体細胞を再プログラミングしない場合に予想されるよりも多いことは、前記候補薬が体細胞をＥＳ様状態に再プログラミングすることを示す、維持する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記期間が５日間と３０日間との間である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記期間後の生細胞の存在が細胞を薬剤と接触させなかった場合の少なくとも２倍であることは、前記候補薬が体細胞をＥＳ様状態に再プログラミングすることを示す、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記候補再プログラミング薬が体細胞を再プログラミングしない場合、前記細胞の少なくとも８０％は２０日後に増殖を停止するか死滅すると予想される、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記細胞がヒト細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記細胞が有糸分裂終了していない、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
体細胞をＥＳ様状態に再プログラミングする再プログラミング薬を同定する方法であって、
（ａ）体細胞を請求項１に記載の方法にしたがって同定された再プログラミング薬と接触させる工程、および
（ｂ）前記細胞がＤＮＡ脱メチル化耐性の増加以外のＥＳ細胞の少なくとも１つの特徴を示すかかどうかを決定し、前記特徴を示す場合、候補薬を、体細胞をＥＳ様状態に再プログラミングする薬剤であると同定する工程
を含む、方法。
【請求項１９】
さらなる特徴が、（ｉ）ＳＣＩＤマウスに注射した場合に内胚葉、中胚葉、および外胚葉の特徴を有する細胞に分化する能力；（ｉｉ）内因性のＯｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、または両方の発現；（ｉｉｉ）ＥＳ細胞マーカーの発現；（ｉｖ）出産予定日（ｔｅｒｍ）まで生存するキメラの形成に関与する能力からなる群から選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＥＳ細胞マーカーが、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、ＳＳＥＡ−１、ＳＳＥＡ−３、およびＳＳＥＡ−４からなる群から選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
ＥＳ様状態に再プログラミングされた可能性が増加する体細胞を同定する方法であって、
（ａ）体細胞を準備する工程であって、前記体細胞の少なくともいくつかがＥＳ様状態に少なくとも部分的に再プログラミングされている、準備する工程、および
（ｂ）ＤＮＡ脱メチル化耐性である細胞を選択し、それにより、ＥＳ様状態に再プログラミングされた可能性が増加する細胞を同定する工程
を含む、方法。
【請求項２２】
工程（ｂ）で選択された細胞がＥＳ様状態に再プログラミングされている、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記体細胞が外因的に導入した多能性遺伝子を発現する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記方法が細胞を再プログラミング薬と接触させる工程を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
細胞を評価してＤＮＡ脱メチル化耐性以外のＥＳ細胞の１つまたは複数の特徴を示すかどうかを決定する工程をさらに含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
前記体細胞が内因性ＤＮＡメチルトランスフェラーゼにターゲティングしたＲＮＡｉ薬を可逆的に発現する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２７】
選択された体細胞中のＲＮＡｉ薬の発現を阻害し、それにより、選択された体細胞のゲノムＤＮＡがメチル化されるようになる工程をさらに含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
２つの転写活性Ｘ染色体を有する細胞を選択する工程をさらに含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２９】
ＥＳ細胞マーカーを発現する細胞を選択する工程をさらに含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項３０】
前記ＥＳ細胞マーカーが、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、ＳＳＥＡ−１、ＳＳＥＡ−３、およびＳＳＥＡ−４からなる群から選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
ＥＳ様状態に少なくとも部分的に再プログラミングされた可能性が増加する体細胞を同定する方法であって、
（ａ）ＤＮＡ脱メチル化に感受性である体細胞を準備する工程、
（ｂ）体細胞を再プログラミングすることができる１つまたは複数の処置に前記細胞を供する工程、
（ｃ）細胞を処置してゲノムＤＮＡのメチル化を減少させる工程、
（ｄ）培養物中の細胞を一定期間維持する工程、および
（ｅ）前記期間後に生存する細胞を同定し、それにより、ＥＳ様状態に少なくとも部分的に再プログラミングされた可能性が増大する細胞を同定する工程
を含む、方法。
【請求項３２】
工程（ｅ）で同定された前記細胞がＥＳ様状態に再プログラミングされている、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
工程（ｂ）の少なくとも１つの処置が、再プログラミング薬である小分子と前記細胞を接触させる工程を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
工程（ｂ）の少なくとも１つの処置が細胞を遺伝子でトランスフェクトすることを含み、前記遺伝子が任意選択的に多能性遺伝子である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】
前記処置が、Ｏｃｔ−４、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ−２、ｃ−Ｍｙｃ、およびＫｌｆ４からなる群から選択される少なくとも２つの遺伝子で前記細胞をトランスフェクトする工程を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３６】
細胞を評価してＤＮＡ脱メチル化耐性以外のＥＳ細胞の１つまたは複数の特徴を示すかどうかを決定する工程をさらに含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３７】
ＥＳ細胞マーカーを発現する細胞を選択する工程をさらに含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３８】
前記ＥＳ細胞マーカーが、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、ＳＳＥＡ−１、ＳＳＥＡ−３、およびＳＳＥＡ−４からなる群から選択される、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
２つの転写活性Ｘ染色体を有する細胞を選択する工程をさらに含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項４０】
ＥＳ様状態に再プログラミングした体細胞を同定する方法であって、
（ａ）細胞集団を準備する工程であって、前記細胞集団の少なくともいくつかがＥＳ様状態に少なくとも部分的に再プログラミングされており、前記細胞が、選択マーカーの発現が内因性多能性遺伝子の発現に実質的に適合するような様式で、内因性多能性遺伝子の発現を調節する発現調節エレメントに作動可能に連結された選択マーカーをコードするＤＮＡを含む、準備する工程、および
（ｂ）選択マーカーを発現する細胞を同定し、それにより、ＥＳ様状態に再プログラミングされた体細胞を同定する工程
を含む、方法。
【請求項４１】
前記内因性多能性遺伝子がＯｃｔ−４またはＮａｎｏｇである、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
ＥＳ細胞またはＥＳ細胞コロニーの形態学的特徴を有する細胞または細胞のコロニーを選択する工程をさらに含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
工程（ａ）の細胞が、Ｏｃｔ−４、Ｓｏｘ−２、ｃ−Ｍｙｃ、Ｋｌｆ４、およびその組み合わせからなる群から選択される１つまたは複数の外因的に導入した遺伝子を含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４４】
単離された多能性の再プログラミングされた哺乳動物体細胞の精製調製物であって、前記細胞が、（ａ）内因性のＯｃｔ４およびＮａｎｏｇを発現し、（ｂ）ＳＣＩＤマウスに注射した場合に内胚葉、中胚葉、および外胚葉の特徴を有する組織に分化し、（ｃ）少なくとも１つの遺伝子改変（ｇｅｎｅｔｉｃ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を有し、（ｄ）外因的に導入した多能性遺伝子または内因性多能性遺伝子に作動可能に連結された選択マーカーを発現しない、精製調製物。
【請求項４５】
少なくとも５０％の細胞がＤＮＡ脱メチル化耐性をである、請求項４４に記載の細胞の精製調製物。
【請求項４６】
ＤＮＡメチルトランスフェラーゼＩ発現が少なくとも５０％減少する条件下で前記細胞が生存する、請求項４４に記載の細胞の精製調製物。
【請求項４７】
前記細胞が前記体細胞のドナーまたは前記体細胞の前駆細胞のドナーと遺伝的に適合し、前記ドナーが細胞療法を必要とする個体である、請求項４４に記載の精製調製物。
【請求項４８】
再プログラミングされた体細胞を生成する方法であって、
（ａ）体細胞のＥＳ様状態への再プログラミングに寄与する少なくとも１つの外因的に導入した遺伝子を含む体細胞を準備する工程であって、前記細胞は、前記細胞が（ｉ）ＤＮＡ脱メチル化に耐性であり、（ｉｉ）内因性Ｏｃｔ４を発現し、（ｃ）ＳＣＩＤマウスに注射した場合に内胚葉、中胚葉、および外胚葉の特徴を有する組織に分化する、ＥＳ様状態に再プログラミングされている、準備する工程、および
（ｂ）少なくとも１つの前記外因的に導入した遺伝子を機能的に不活化する工程
を含む、方法。
【請求項４９】
前記細胞が、Ｏｃｔ−４、Ｓｏｘ−２、ｃ−Ｍｙｃ、およびＫｌｆ４をコードする外因的に導入した遺伝子を含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
工程（ｂ）が、前記細胞中への部位特異的リコンビナーゼの導入または前記細胞中の部位特異的リコンビナーゼの発現によって前記外因的に導入した遺伝子の少なくとも一部を切り出す工程を含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５１】
体細胞をより低い分化状態に再プログラミングする薬剤を同定する方法であって、
（ａ）２つのＸ染色体を含む体細胞を準備する工程であって、そのうちの１つが不活性である、準備する工程、
（ｂ）体細胞を候補再プログラミング薬と接触させる工程、
（ｃ）培養物中で前記細胞を維持する工程、
（ｄ）前記培養物中で前記候補薬が体細胞を再プログラミングしない場合に予想されるよりも多数の細胞がその不活性Ｘ染色体を再活性化するかどうかを決定する工程であって、前記候補再プログラミング薬が体細胞を再プログラミングしない場合に予想されるよりも多数の細胞がその不活性Ｘ染色体を再活性化する場合に前記候補薬を再プログラミング薬として同定する、決定する工程
を含む、方法。
【請求項５２】
前記方法が、
（ａ）２つのＸ染色体を含む体細胞を準備する工程であって、そのうちの１つが不活性であり、前記Ｘ染色体の一方が選択マーカー遺伝子の機能的対立遺伝子を含み、前記Ｘ染色体の他方が選択マーカー遺伝子の機能的対立遺伝子を含まない、準備する工程、
（ｂ）選択マーカーを発現しない細胞を選択し、それにより、選択マーカー遺伝子を含むＸ染色体が不活性である細胞を選択する工程、
（ｃ）工程（ｂ）で選択した体細胞を候補再プログラミング薬と接触させる工程、
（ｄ）選択マーカー遺伝子の機能的対立遺伝子を含むＸ染色体が不活性なままである場合に予想されるよりも多数の細胞が選択マーカーを発現するかどうかを決定し、それにより、候補再プログラミング薬が体細胞を再プログラミングしない場合に予想されるよりも多数の細胞がその不活性Ｘ染色体を再活性化するかどうかを決定する工程、および
（ｅ）候補再プログラミング薬が体細胞を再プログラミングしない場合に予想されるよりも多数の細胞がその不活性Ｘ染色体を再活性化する場合、前記候補薬を再プログラミング薬と同定する工程
を含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記方法が、細胞を候補再プログラミング薬と接触させた後に選択マーカーの機能的形態を発現する細胞を選択し、それにより、その不活性Ｘ染色体が再活性化された細胞を選択する工程を含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記選択マーカーが正の選択および負の選択に適切である、請求項５２に記載の方法。
【請求項５５】
工程（ｂ）が選択マーカーの機能的形態を発現する細胞が実質的に生存しない条件下で細胞を維持することを含み、工程（ｄ）が選択マーカーの機能的形態を発現しない細胞が実質的に生存しない条件下で細胞を維持することを含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５６】
前記遺伝子が、Ｘ染色体上に存在する内因性遺伝子である、請求項５２に記載の方法。
【請求項５７】
前記遺伝子がヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）をコードする、請求項５２に記載の方法。
【請求項５８】
前記遺伝子の機能的対立遺伝子を欠くＸ染色体が前記遺伝子を不活化する操作された遺伝子の変化を含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５９】
前記方法が、
（ａ）２つのＸ染色体を含む体細胞を準備する工程であって、そのうちの１つが不活性であり、前記Ｘ染色体の一方が、その発現を選択することができる第１の選択マーカー遺伝子の機能的対立遺伝子およびその発現を選択することができる第２の選択マーカー遺伝子の機能的形態を含み、前記Ｘ染色体の他方が各前記遺伝子の機能的対立遺伝子を欠く、準備する工程、
（ｂ）前記第１の選択マーカーの機能的形態を発現しない細胞を選択し、それにより、機能的対立遺伝子を含むＸ染色体が不活性である細胞を選択する工程、
（ｃ）体細胞を候補再プログラミング薬と接触させる工程、
（ｄ）前記第２の選択マーカーの機能的形態を発現する細胞を選択し、それにより、その不活性なＸ染色体を再活性化した細胞を選択する工程、
（ｅ）前記候補再プログラミング薬が体細胞を再プログラミングしない場合に予想されるよりも多数の細胞が不活性なＸ染色体を再活性化するかどうかを決定する工程、および
（ｆ）前記候補再プログラミング薬が細胞を再プログラミングしない場合に予想されるよりも多数の細胞がその不活性Ｘ染色体を再活性化する場合に前記候補薬を再プログラミング薬として同定する工程
を含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項６０】
体細胞のＥＳ様状態への再プログラミングに適切な再プログラミング薬を同定する方法であって、
（ａ）体細胞を請求項５１に記載の方法にしたがって同定した再プログラミング薬と接触させる工程、および
（ｂ）前記細胞が２つの転写活性Ｘ染色体を有すること以外のＥＳ細胞の少なくとも１つの特徴を示すかどうかを決定して、前記特徴を示す場合、前記候補薬を、体細胞をＥＳ様状態に再プログラミングする薬剤であると同定する工程
を含む、方法。
【請求項６１】
さらなる特徴が、（ｉ）ＳＣＩＤマウスに注射した場合に内胚葉、中胚葉、および外胚葉の特徴を有する細胞に分化する能力、（ｉｉ）内因性のＯｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、または両方の発現；（ｉｉｉ）ＥＳ細胞マーカーの発現；（ｉｖ）出産予定日まで生存するキメラの形成に関与する細胞の能力からなる群から選択される、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
ＥＳ様状態に再プログラミングされた可能性が増加する体細胞を同定する方法であって、
（ａ）２つのＸ染色体を含む体細胞を準備する工程であって、その一方が不活性である、準備する工程、
（ｂ）前記細胞を体細胞を再プログラミングすることができる１つまたは複数の処理に供する工程、および
（ｃ）不活性なＸ染色体が活性になった細胞を同定し、それにより、ＥＳ様状態に再プログラミングされた可能性が増加する細胞を同定する工程
を含む、方法。
【請求項６３】
前記方法が、前記細胞を評価して前記細胞が２つの転写活性Ｘ染色体を有すること以外のＥＳ細胞の１つまたは複数の特徴を示すかどうかを決定する工程をさらに含む、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
工程（ｂ）が、再プログラミング薬である小分子と前記細胞を接触させる工程を含む、請求項６２に記載の方法。
【請求項６５】
工程（ｂ）が、前記細胞を多能性遺伝子でトランスフェクトする工程を含む、請求項６２に記載の方法。
【請求項６６】
前記体細胞が２つのＸ染色体を含み、そのうちの１つが不活性であり、前記Ｘ染色体の一方が選択マーカー遺伝子の機能的対立遺伝子を含み、前記Ｘ染色体の他方が選択マーカー遺伝子の機能的対立遺伝子を含まない、請求項６２に記載の方法。
【請求項６７】
前記選択マーカー遺伝子が内因性遺伝子である、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記体細胞が２つのＸ染色体を含み、そのうちの１つが不活性であり、前記Ｘ染色体の両方が選択マーカー遺伝子の機能的対立遺伝子を含む、請求項６２に記載の方法。
【請求項６９】
ＥＳ様状態に再プログラミングされた可能性が増加する体細胞を同定する方法であって、
（ａ）２つのＸ染色体を含む体細胞を準備する工程であって、そのうちの１つが不活性であり、前記細胞の不活性なＸ染色体が正の選択および負の選択の両方に有用な選択マーカー遺伝子の機能的対立遺伝子を含み、前記活性なＸ染色体が前記マーカー遺伝子の機能的対立遺伝子を含まない、準備する工程、
（ｂ）前記細胞を、体細胞を再プログラミングすることができる１つまたは複数の処理に供する工程、および
（ｃ）選択マーカー遺伝子を発現する細胞を選択し、それにより、不活性なＸ染色体が転写的に活性になり、ＥＳ様状態に再プログラミングされた可能性が増加する細胞を選択する工程
を含む、方法。
【請求項７０】
前記選択マーカー遺伝子が、前記Ｘ染色体上に通常存在する内因性遺伝子である、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記選択マーカー遺伝子がＨＰＲＴをコードする、請求項６９に記載の方法。
【請求項７２】
前記活性なＸ染色体が選択マーカー遺伝子の非機能的対立遺伝子を含み、前記非機能的対立遺伝子が前記対立遺伝子を不活化する変異または操作された変化を有する、請求項６９に記載の方法。
【請求項７３】
（ｉ）２つのＸ染色体を含む体細胞を準備する工程であって、そのうちの１つが不活性であり、前記Ｘ染色体の一方が選択マーカー遺伝子の機能的対立遺伝子を含み、前記Ｘ染色体の他方が選択マーカー遺伝子の機能的対立遺伝子を含まない、準備する工程、
（ｉｉ）選択マーカー遺伝子を発現しない細胞を選択し、それにより、不活性なＸ染色体が選択マーカー遺伝子の機能的対立遺伝子を含む細胞を選択する工程、
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）の細胞を体細胞を再プログラミングすることができる１つまたは複数の処理に供する工程、および
（ｉｖ）選択マーカー遺伝子を発現する細胞を選択し、それにより、不活性なＸ染色体が転写的に活性になった細胞を選択する工程
を含む、請求項６９に記載の方法。
【請求項７４】
前記体細胞が２つのＸ染色体を含み、そのうちの１つが不活性であり、前記Ｘ染色体の両方が正の選択および負の選択の両方に有用な選択マーカー遺伝子の機能的対立遺伝子を含み、前記方法が、
（ａ）選択マーカー遺伝子を発現しない細胞を選択し、それにより、第１のＸ染色体が転写的に不活性である細胞集団を得る工程、
（ｂ）前記細胞を、体細胞を再プログラミングすることができる１つまたは複数の処理に供する工程、
（ｃ）前記第１のＸ染色体上の選択マーカー遺伝子を機能的に不活化する工程、および
（ｄ）選択マーカー遺伝子を発現する細胞を選択し、それにより、前記第２のＸ染色体が転写的に活性である細胞を選択する工程
を含む、請求項６２に記載の方法。
【請求項７５】
前記選択マーカー遺伝子が前記Ｘ染色体上に通常存在する内因性遺伝子である、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
工程（ｃ）が部位特異的リコンビナーゼを使用して選択マーカー遺伝子を機能的に不活化する工程を含む、請求項７４に記載の方法。
【請求項７７】
体細胞をより低い分化状態に再プログラミングする薬剤を同定する方法であって、
（ａ）体細胞を候補再プログラミング薬と接触させる工程であって、前記体細胞がＤＮＡメチル化減少に感受性である、接触させる工程、および
（ｂ）ＤＮＡメチル化減少に耐性である細胞の量を決定する工程であって、コントロールと比較した場合、ＤＮＡメチル化減少に耐性である細胞の量の増加が、候補薬が再プログラミング薬であることを示す、決定する工程
を含む、方法。
【請求項７８】
ＥＳ様状態に再プログラミングした可能性が増加する体細胞を誘導する方法であって、
（ａ）細胞の化学的選択に有用な遺伝子改変を含まない体細胞を準備する工程であって、前記細胞の少なくともいくつかが、ＥＳ様状態に少なくとも部分的に再プログラミングされている、準備する工程、および
（ｂ）ＥＳ細胞またはＥＳ細胞コロニーの形態的特徴を有する細胞または細胞のコロニーを選択する工程
を含む、方法。
【請求項７９】
前記体細胞が遺伝的に改変されていない、請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
準備した前記体細胞が、前記細胞の化学的選択に有用なＤＮＡ構築物を含まない、請求項７８に記載の方法。
【請求項８１】
準備した前記体細胞が、前記細胞の遺伝的または化学的選択に有用なＤＮＡ構築物を含まない、請求項７８に記載の方法。
【請求項８２】
前記体細胞が、少なくとも１つの外因的に導入した再プログラミング薬を含む、請求項７８に記載の方法。
【請求項８３】
前記外因的に導入した再プログラミング薬が、タンパク質形質導入または前記タンパク質をコードする構築物の一過性トランスフェクションによって導入されたタンパク質である、請求項８２に記載の方法。
【請求項８４】
工程（ａ）の体細胞が、１つまたは複数の外因的に導入した多能性遺伝子またはかかる遺伝子によってコードされるタンパク質を含む、請求項７８に記載の方法。
【請求項８５】
前記体細胞がＯｃｔ−４、Ｓｏｘ−２、ｃ−Ｍｙｃ、およびＫｌｆ４からなる群から選択される少なくとも２つの非内因性タンパク質を含むか発現する、請求項７８に記載の方法。
【請求項８６】
工程（ａ）の体細胞が、Ｏｃｔ−４、Ｓｏｘ−２、ｃ−Ｍｙｃ、Ｋｌｆ４、およびその組み合わせからなる群から選択される１つまたは複数の外因的に導入した遺伝子を含む、請求項７８に記載の方法。
【請求項８７】
工程（ａ）の少なくともいくつかの細胞がＥＳ様状態に再プログラミングされている、請求項７８に記載の方法。
【請求項８８】
選択された前記細胞が、以下の特徴：（ｉ）ＳＣＩＤマウスに注射した場合に内胚葉、中胚葉、および外胚葉の特徴を有する細胞に分化する能力、（ｉｉ）内因性のＯｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、または両方の発現、（ｉｉｉ）ＥＳ細胞マーカーの発現、および（ｉｖ）出産予定日まで生存するキメラの形成に関与する能力の少なくとも３つを示す、請求項７８に記載の方法。
【請求項８９】
前記ＥＳ細胞マーカーが、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、ＳＳＥＡ−１、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、およびＴＲＡＦ−６０からなる群から選択される、請求項８８に記載の方法。
【請求項９０】
同定された前記細胞を１つまたは複数の選択工程に供して、ＥＳ様細胞をＥＳ様状態に再プログラミングされない細胞から分離する工程をさらに含む、請求項７８に記載の方法。
【請求項９１】
前記１つまたは複数の選択工程が、
（ａ）ＥＳ様状態に再プログラミングされない細胞を溶解するのに十分な補体成分の存在下での細胞の補体媒介溶解に耐性を示す細胞を選択する工程、
（ｂ）体細胞ではなくＥＳ細胞に特徴的な細胞表面マーカーの発現に基づいた細胞選別工程、
（ｃ）ＤＮＡ脱メチル化に耐性である細胞を選択する工程、
（ｄ）２つの活性なＸ染色体を有する細胞を選択する工程、および
（ｅ）前記コロニーを継代またはサブクローニングする工程、および前記コロニーの細胞の子孫からＥＳ様形態を有する細胞または細胞コロニーを同定する工程から選択される、請求項９０に記載の方法。
【請求項９２】
ＥＳ様状態に再プログラミングされた体細胞を同定する方法であって、
（ａ）細胞集団を準備する工程であって、その少なくともいくつかがＥＳ様状態に再プログラミングされており、前記細胞が内因性多能性遺伝子の発現を調節する発現調節エレメントに作動可能に連結された選択マーカーをコードするＤＮＡを含まない、準備する工程、および
（ｂ）ＥＳ細胞またはＥＳ細胞コロニーに特徴的な形態を有する細胞または細胞コロニーを同定する工程
を含む、方法。
【請求項９３】
前記細胞のコロニー由来の細胞または少なくともいくつかの細胞を、かかる形態を欠く集団中の他の細胞と区別する工程をさらに含む、請求項９２に記載の方法。
【請求項９４】
工程（ａ）の細胞が、Ｏｃｔ−４、Ｓｏｘ−２、ｃ−Ｍｙｃ、Ｋｌｆ４、およびその組み合わせからなる群から選択される１つまたは複数の外因的に導入した遺伝子を含む、請求項９２に記載の方法。
【請求項９５】
ＥＳ様状態に再プログラミングされた体細胞を同定する方法であって、
（ａ）１つまたは複数の再プログラミング薬を細胞に導入する工程であって、前記再プログラミング薬が前記細胞の少なくともいくつかをＥＳ様状態に再プログラミングするのに十分である、導入する工程、
（ｂ）前記細胞を、ＥＳ様細胞を含むコロニーが発生するのに適切な期間培養物中で維持する工程、および
（ｃ）化学的選択または遺伝的選択を使用せずにＥＳ様細胞の少なくとも１つのかかるコロニーを同定する工程
を含む方法。
【請求項９６】
工程（ａ）が、Ｏｃｔ−４、Ｓｏｘ−２、ｃ−Ｍｙｃ、Ｋｌｆ４、およびその組み合わせからなる群から選択される１つまたは複数の遺伝子を細胞に導入することを含む、請求項９５に記載の方法。
【請求項９７】
ＥＳ様状態に再プログラミングされた体細胞を同定する方法であって、
（ａ）体細胞集団を準備する工程であって、その少なくともいくつかがＥＳ様状態に再プログラミングされており、前記細胞が、内因性多能性遺伝子の発現を調節する発現調節エレメントに作動可能に連結された選択マーカーをコードするＤＮＡを含まない、準備する工程、
（ｂ）（ｉ）細胞溶解に十分な補体成分および（ｉｉ）ＥＳ様状態に再プログラミングしない体細胞の細胞表面に存在するが、ＥＳ細胞によって存在しないか有意でないレベルで発現するマーカーに特異的に結合する補体結合抗体の存在下にて培養物中で前記細胞を維持する工程、および
（ｃ）工程（ｂ）を生存する細胞を単離する工程
を含む、方法。
【請求項９８】
前記マーカーがＭＨＣクラスＩ抗原である、請求項９７に記載の方法。
【請求項９９】
前記有意でないレベルが、体細胞の型と同型の生物由来の線維芽細胞によって発現される平均レベルの１０倍より小さい、請求項９７に記載の方法。
【請求項１００】
単離された多能性の再プログラミングされた哺乳動物体細胞の精製調製物であって、前記細胞が、（ａ）内因性のＯｃｔ４およびＮａｎｏｇを発現し、（ｂ）ＳＣＩＤマウスに注射した場合に内胚葉、中胚葉、および外胚葉の特徴を有する組織に分化し、（ｃ）内因性多能性遺伝子に作動可能に連結された選択マーカーをコードするＤＮＡを含まない、精製調製物。
【請求項１０１】
前記細胞が遺伝的に改変されていない、請求項１００に記載の細胞の精製調製物。
【請求項１０２】
前記細胞が前記体細胞のドナーまたは前記体細胞の前駆細胞のドナーと遺伝的に適合し、前記ドナーが細胞療法を必要とする個体である、請求項１００に記載の細胞の精製調製物。
【請求項１０３】
再プログラミングされた体細胞を誘導する方法であって、
（ａ）前記細胞のＥＳ様状態への再プログラミングに寄与する少なくとも１つの外因的に導入した遺伝子またはタンパク質を含む体細胞を準備する工程であって、前記細胞が、（ｉ）ＤＮＡ脱メチル化に耐性を示し、（ｉｉ）内因性Ｏｃｔ４を発現し、（ｃ）ＳＣＩＤマウスに注射した場合に内胚葉、中胚葉、および外胚葉の特徴を有する組織に分化するＥＳ様状態に前記細胞が再プログラミングされている、準備する工程、
（ｂ）遺伝的選択または化学的選択を使用せずにＥＳ様細胞を単離する工程、および
（ｃ）少なくとも１つの前記外因的に導入した遺伝子を機能的に不活化する工程
を含む、方法。
【請求項１０４】
前記細胞が、Ｏｃｔ−４、Ｓｏｘ−２、ｃ−Ｍｙｃ、およびＫｌｆ４をコードする外因的に導入した遺伝子またはこれらのタンパク質を含む、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０５】
工程（ｂ）が、前記細胞における部位特異的リコンビナーゼの導入または前記細胞における部位特異的リコンビナーゼの発現によって前記外因的に導入した遺伝子の少なくとも一部を切り出す工程を含む、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０６】
再プログラミングされた細胞を誘導する方法であって、（ｉ）遺伝的に改変されていない細胞集団を準備する工程であって、その少なくともいくつかがＥＳ様状態に部分的または完全に再プログラミングされている、準備する工程、（ｉｉ）補体媒介溶解を使用して部分的または完全に再プログラミングされた細胞を富化して、少なくともいくつかの非再プログラミング細胞を排除する工程、および（ｉｉｉ）形態的基準を使用して、再プログラミングされた細胞またはかかる細胞を含むコロニーを同定する工程を含む、方法。
【請求項１０７】
体細胞が、化学的選択または遺伝的選択に有用なマーカーをコードする核酸構築物で遺伝的に改変されない、ＥＳ様状態に再プログラミングされた単離体細胞。
【請求項１０８】
前記細胞が遺伝的に改変されない、請求項１０７に記載の単離体細胞。
【請求項１０９】
少なくとも９０％の細胞がＥＳ様状態に再プログラミングされており、化学的選択または遺伝的選択に有用なマーカーをコードする核酸構築物で遺伝的に改変されない、精製体細胞集団。
【請求項１１０】
前記細胞が遺伝的に改変されていない、請求項３２に記載の精製体細胞集団。
【請求項１１１】
準備した前記体細胞を、マウス、ラット、ウサギ、家畜、ペット（ｃｏｍｐａｎｉｏｎ ａｎｉｍａｌ）、霊長類、またはヒトから得る、請求項７８に記載の方法。
【請求項１１２】
前記体細胞を、マウス、ラット、ウサギ、家畜、ペット、霊長類、またはヒトから得る、請求項１０９に記載の精製体細胞集団。
【請求項１１３】
分化した体細胞を多能性状態に再プログラミングする方法であって、
（ａ）分化した体細胞を前記細胞の多能性状態への再プログラミングに寄与する少なくとも１つの再プログラミング薬と接触させる工程、
（ｂ）前記細胞を、前記細胞の増殖および前記少なくとも１つの再プログラミング薬の活性に適切な条件下で前記細胞の再プログラミングの開始に十分な期間維持する工程、および
（ｃ）前記少なくとも１つの再プログラミング薬を機能的に不活化する工程
を含む、方法。
【請求項１１４】
分化した体細胞を多能性状態に再プログラミングする方法であって、
（ａ）分化した体細胞の多能性状態への再プログラミングに寄与する少なくとも１つの外因的に導入した因子を含む分化した体細胞を準備する工程、
（ｂ）前記細胞を、前記細胞の増殖および前記少なくとも１つの外因的に導入した因子の活性に適切な条件下で少なくとも１つの内因性多能性遺伝子の活性化に十分な期間維持する工程、および
（ｃ）前記少なくとも１つの外因的に導入した因子を機能的に不活化する工程
を含む、方法。
【請求項１１５】
多能性状態に再プログラミングされた分化した体細胞を選択する方法であって、
（ａ）分化した体細胞の多能性状態への再プログラミングに寄与する少なくとも１つの外因的に導入した因子を含む分化した体細胞を準備する工程、
（ｂ）前記細胞を、前記細胞の増殖および前記少なくとも１つの外因的に導入した因子の活性に適切な条件下で少なくとも１つの内因性多能性遺伝子の活性化に十分な期間維持する工程、
（ｃ）前記少なくとも１つの外因的に導入した因子を機能的に不活化する工程、および
（ｄ）１つまたは複数の多能性のマーカーを示す細胞と示さない細胞とを区別する工程
を含む、方法。
【請求項１１６】
前記分化した体細胞が部分的に分化している、請求項１１３、１１４、または１１５に記載の方法。
【請求項１１７】
前記分化した体細胞が完全に分化している、請求項１１３、１１４、または１１５に記載の方法。
【請求項１１８】
前記分化した体細胞が造血性系列細胞である、請求項１１３、１１４、または１１５に記載の方法。
【請求項１１９】
前記分化した体細胞を末梢血から得る、請求項１１３、１１４、または１１５に記載の方法。
【請求項１２０】
前記分化した体細胞が免疫系細胞である、請求項１１３、１１４、または１１５に記載の方法。
【請求項１２１】
前記分化した体細胞がマクロファージである、請求項１１３、１１４、または１１５に記載の方法。
【請求項１２２】
前記分化した体細胞がリンパ球系細胞である、請求項１１３、１１４、または１１５に記載の方法。
【請求項１２３】
前記分化した体細胞がＢ細胞である、請求項１１３、１１４、または１１５に記載の方法。
【請求項１２４】
前記部分的に分化した細胞が未熟Ｂ細胞である、請求項１１６に記載の方法。
【請求項１２５】
前記未熟Ｂ細胞がプレＢ細胞またはプロＢ細胞である、請求項１１６に記載の方法。
【請求項１２６】
前記完全に分化した細胞が成熟Ｂ細胞である、請求項１１７に記載の方法。
【請求項１２７】
前記完全に分化した細胞が非ナイーブ成熟Ｂ細胞である、請求項１１７に記載の方法。
【請求項１２８】
前記少なくとも１つの外因的に導入した因子がポリヌクレオチドである、請求項１１４または請求項１１５に記載の方法。
【請求項１２９】
前記少なくとも１つの外因的に導入した因子がポリペプチドである、請求項１１４または請求項１１５に記載の方法。
【請求項１３０】
前記少なくとも１つの外因的に導入した因子が、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ−４、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、ｃ−Ｍｙｃ、およびその組み合わせからなる群から選択される、請求項１１４または請求項１１５に記載の方法。
【請求項１３１】
前記分化した体細胞が、外因的に導入したＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、およびＫｌｆ−４を含む、請求項１１４または請求項１１５に記載の方法。
【請求項１３２】
前記分化した体細胞が、外因的に導入したＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ−４、およびｃ−Ｍｙｃを含む、請求項１１４または請求項１１５に記載の方法。
【請求項１３３】
前記少なくとも１つの外因的に導入した因子が、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ−４、ｃ−Ｍｙｃ、およびその組み合わせからなる群から選択され、前記分化した体細胞が、前記分化した体細胞の脱分化を誘導することができる少なくとも１つの外因的に導入した因子をさらに含む、請求項１２３に記載の方法。
【請求項１３４】
前記分化した体細胞の脱分化を誘導することができる少なくとも１つの外因的に導入した因子がポリヌクレオチドである、請求項１３３に記載の方法。
【請求項１３５】
前記分化した体細胞の脱分化を誘導することができる少なくとも１つの外因的に導入した因子がポリペプチドである、請求項１３３に記載の方法。
【請求項１３６】
前記分化した体細胞が外因的に導入した遺伝子であるＯｃｔ４、Ｓｏｘ２ およびＫｌｆ−４を含み、前記分化した体細胞の脱分化を誘導することができる少なくとも１つの外因的に導入した因子をさらに含む、請求項１２３に記載の方法。
【請求項１３７】
前記分化した体細胞の脱分化を誘導することができる少なくとも１つの外因的に導入した因子がポリヌクレオチドである、請求項１３６に記載の方法。
【請求項１３８】
前記分化した体細胞の脱分化を誘導することができる少なくとも１つの外因的に導入した因子がポリペプチドである、請求項１３６に記載の方法。
【請求項１３９】
前記分化した体細胞が、外因的に導入した遺伝子であるＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ−４、およびｃ−Ｍｙｃを含み、前記分化した体細胞の脱分化を誘導することができる少なくとも１つの外因的に導入した因子をさらに含む、請求項１２３に記載の方法。
【請求項１４０】
前記分化した体細胞の脱分化を誘導することができる少なくとも１つの外因的に導入した因子がポリヌクレオチドである、請求項１３９に記載の方法。
【請求項１４１】
前記分化した体細胞の脱分化を誘導することができる少なくとも１つの外因的に導入した因子がポリペプチドである、請求項１３９に記載の方法。
【請求項１４２】
前記分化した体細胞の脱分化を誘導することができる因子が、Ｂ細胞後期特異的マーカーを下方制御する少なくとも１つのポリヌクレオチド、Ｐａｘ５発現を阻害する少なくとも１つのポリヌクレオチド、Ｂ細胞後期特異的マーカーを下方制御する少なくとも１つのポリペプチド、Ｐａｘ５発現を阻害する少なくとも１つのポリペプチド、およびその組み合わせからなる群から選択される、請求項１３３に記載の方法。
【請求項１４３】
前記分化した体細胞の脱分化を誘導することができる因子が、Ｂ細胞後期特異的マーカーを下方制御する少なくとも１つのポリヌクレオチド、Ｐａｘ５発現を阻害する少なくとも１つのポリヌクレオチド、Ｂ細胞後期特異的マーカーを下方制御する少なくとも１つのポリペプチド、Ｐａｘ５発現を阻害する少なくとも１つのポリペプチド、およびその組み合わせからなる群から選択される、請求項１３６に記載の方法。
【請求項１４４】
前記分化した体細胞の脱分化を誘導することができる因子が、Ｂ細胞後期特異的マーカーを下方制御する少なくとも１つのポリヌクレオチド、Ｐａｘ５発現を阻害する少なくとも１つのポリヌクレオチド、Ｂ細胞後期特異的マーカーを下方制御する少なくとも１つのポリペプチド、Ｐａｘ５発現を阻害する少なくとも１つのポリペプチド、およびその組み合わせからなる群から選択される、請求項１３９に記載の方法。
【請求項１４５】
前記分化した体細胞の脱分化を誘導することができる因子が、Ｃ／ＥＢＰαまたはＣ／ＥＢＰαのヒトホモログである、請求項１３３に記載の方法。
【請求項１４６】
前記分化した体細胞の脱分化を誘導することができる因子が、Ｃ／ＥＢＰαまたはＣ／ＥＢＰαのヒトホモログである、請求項１３６に記載の方法。
【請求項１４７】
前記分化した体細胞の脱分化を誘導することができる因子が、Ｃ／ＥＢＰαまたはＣ／ＥＢＰαのヒトホモログである、請求項１３９に記載の方法。
【請求項１４８】
前記少なくとも１つの外因的に導入した因子を、ベクターを使用して導入する、請求項１１４または請求項１１５に記載の方法。
【請求項１４９】
前記少なくとも１つの外因的に導入した因子を、誘導ベクターまたは条件的に発現されるベクターを使用して導入する、請求項１１４または請求項１１５に記載の方法。
【請求項１５０】
前記少なくとも１つの外因的に導入した因子を、メチル化媒介サイレンシングに供さないベクターを使用して導入する、請求項１１４または請求項１１５に記載の方法。
【請求項１５１】
前記少なくとも１つの外因的に導入した因子を、ウイルスベクターを使用して導入する、請求項１１４または請求項１１５に記載の方法。
【請求項１５２】
前記少なくとも１つの外因的に導入した因子を、レトロウイルスベクターを使用して導入する、請求項１１４または請求項１１５に記載の方法。
【請求項１５３】
前記少なくとも１つの外因的に導入した因子を、レンチウイルスベクターを使用して導入する、請求項１１４または請求項１１５に記載の方法。
【請求項１５４】
前記分化した体細胞を、造血性サイトカインおよび成長因子の存在下で維持する、請求項１１８に記載の方法。
【請求項１５５】
前記分化した体細胞を、造血性サイトカインおよび成長因子の存在下で維持する、請求項１２３に記載の方法。
【請求項１５６】
前記分化した体細胞を、骨髄間質細胞を含む培地上で培養する、請求項１１８に記載の方法。
【請求項１５７】
前記分化した体細胞を、骨髄間質細胞を含む培地上で培養する、請求項１２３に記載の方法。
【請求項１５８】
前記内因性多能性遺伝子が、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、およびその組み合わせからなる群から選択される、請求項１１４または請求項１１５に記載の方法。
【請求項１５９】
前記内因性多能性遺伝子が、選択マーカーと同時発現する、請求項１１４または請求項１１５に記載の方法。
【請求項１６０】
前記選択マーカーが、抗生物質耐性遺伝子または発光マーカーである、請求項１５９に記載の方法。
【請求項１６１】
前記分化した体細胞が、前記少なくとも１つの内因性多能性遺伝子の発現を調節する発現調節エレメントに作動可能に連結された選択マーカーをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドをさらに含む、１１３、１１４、または１１５に記載の方法。
【請求項１６２】
前記分化した体細胞が、Ｏｃｔ４遺伝子座中、Ｎａｎｏｇ遺伝子座中、またはＯｃｔ４遺伝子座中およびＮａｎｏｇ遺伝子座中の両方に選択遺伝子を含む、請求項１１３、１１４、または１１５に記載の方法。
【請求項１６３】
前記少なくとも１つの外因的に導入した因子を誘導ベクターを使用して導入し、前記少なくとも１つの外因的に導入した因子を機能的に不活化する工程が、前記細胞が維持される条件を前記ベクターの誘導発現に不適切にすることを含む、請求項１１３、１１４、または１１５に記載の方法。
【請求項１６４】
前記少なくとも１つの多能性のマーカーが、多能性遺伝子の発現、その発現が多能性遺伝子の発現の直接または間接的な結果である遺伝子の発現、アルカリホスファターゼの発現、ＳＳＥＡ１の発現、ＳＳＥＡ３の発現、ＳＳＥＡ４の発現、ＴＲＡＦ−６０の発現、Ｎａｎｏｇの発現、Ｏｃｔ４の発現、Ｆｘｂ１５の発現、ＥＳ細胞またはＥＳ細胞コロニーに特徴的な形態、出産予定日まで生存するキメラの形成に関与する能力、ＳＣＩＤマウスに注射した場合に内胚葉、中胚葉、および外胚葉の特徴を有する細胞に分化する能力、２つの活性なＸ染色体の存在、ＤＮＡメチル化に対する耐性、およびその組み合わせからなる群から選択される、請求項１１５に記載の方法。
【請求項１６５】
再プログラミングされた分化した体細胞に由来する単離多能性細胞。
【請求項１６６】
再プログラミングされた分化した体細胞に由来する少なくとも７０％の多能性細胞を含む精製体細胞集団。
【請求項１６７】
（ａ）分化した体細胞の多能性状態への再プログラミングに寄与する少なくとも１つの外因的に導入した因子を含む分化した体細胞を準備する工程、
（ｂ）前記細胞を、前記細胞の増殖および前記少なくとも１つの外因的に導入した因子の活性に適切な条件下で少なくとも１つの内因性多能性遺伝子の活性化に十分な期間維持する工程、
（ｃ）前記少なくとも１つの外因的に導入した因子を機能的に不活化する工程、および
（ｄ）１つまたは複数の多能性のマーカーを示す細胞を示さない細胞と区別する工程
を含む方法によって産生された単離多能性細胞。
【請求項１６８】
（ａ）分化した体細胞の多能性状態への再プログラミングに寄与する少なくとも１つの外因的に導入した因子を含む分化した体細胞を準備する工程、
（ｂ）前記細胞を、前記細胞の増殖および前記少なくとも１つの外因的に導入した因子の活性に適切な条件下で少なくとも１つの内因性多能性遺伝子の活性化に十分な期間維持する工程、
（ｃ）前記少なくとも１つの外因的に導入した因子を機能的に不活化する工程、および
（ｄ）１つまたは複数の多能性のマーカーを示す細胞と示さない細胞とを区別する工程
を含む方法によって産生された、再プログラミングされた分化した体細胞に由来する少なくとも７０％の多能性細胞を含む精製体細胞集団。
【請求項１６９】
体細胞から多能性細胞を産生する方法であって、
（ａ）１つまたは複数の体細胞の多能性状態への再プログラミングに寄与する少なくとも１つの外因的に導入した因子をそれぞれ含む１つまたは複数の体細胞を準備する工程であって、前記外因的に導入した因子を、メチル化誘導サイレンシングに供さない誘導ベクターを使用して導入する、準備する工程、
（ｂ）前記１つまたは複数の細胞を、前記細胞の増殖および前記少なくとも１つの外因的に導入した因子の活性に適切な条件下で少なくとも１つの内因性多能性遺伝子の活性化に十分な期間維持する工程、
（ｃ）前記少なくとも１つの外因的に導入した因子を機能的に不活化する工程、
（ｄ）多能性のマーカーを示す１つまたは複数の細胞を選択する工程、
（ｅ）前記多能性のマーカーを示す１つまたは複数の細胞を使用してキメラ胚を生成する工程、
（ｆ）前記キメラ胚から１つまたは複数の体細胞を得る工程、
（ｇ）前記１つまたは複数の体細胞を、前記細胞の増殖および前記少なくとも１つの外因的に導入した因子の活性に適切な条件下で少なくとも１つの内因性多能性遺伝子の活性化に十分な期間維持する工程、および
（ｈ）１つまたは複数の多能性のマーカーを示す細胞と示さない細胞との間で区別する工程
を含む、方法。
【請求項１７０】
（ａ）１つまたは複数の体細胞の多能性状態への再プログラミングに寄与する少なくとも１つの外因的に導入した因子をそれぞれ含む１つまたは複数の体細胞を準備する工程であって、前記外因的に導入した因子を、メチル化誘導サイレンシングに供さない誘導ベクターを使用して導入する、準備する工程、
（ｂ）前記１つまたは複数の細胞を、前記細胞の増殖および前記少なくとも１つの外因的に導入した因子の活性に適切な条件下で少なくとも１つの内因性多能性遺伝子の活性化に十分な期間維持する工程、
（ｃ）前記少なくとも１つの外因的に導入した因子を機能的に不活化する工程、
（ｄ）多能性のマーカーを示す１つまたは複数の細胞を選択する工程、
（ｅ）前記多能性のマーカーを示す１つまたは複数の細胞を使用してキメラ胚を生成する工程、
（ｆ）前記キメラ胚から１つまたは複数の分化した体細胞を得る工程、
（ｇ）前記１つまたは複数の分化した体細胞を、前記細胞の増殖および前記少なくとも１つの外因的に導入した因子の活性に適切な条件下で少なくとも１つの内因性多能性遺伝子の活性化に十分な期間維持する工程、および
（ｈ）１つまたは複数の多能性のマーカーを示す細胞と示さない細胞とを区別する工程
を含む方法によって産生された単離多能性細胞。
【請求項１７１】
（ａ）１つまたは複数の体細胞の多能性状態への再プログラミングに寄与する少なくとも１つの外因的に導入した因子をそれぞれ含む１つまたは複数の体細胞を準備する工程であって、前記外因的に導入した因子を、メチル化誘導サイレンシングに供さない誘導ベクターを使用して導入する、準備する工程、
（ｂ）前記１つまたは複数の細胞を、前記細胞の増殖および前記少なくとも１つの外因的に導入した因子の活性に適切な条件下で少なくとも１つの内因性多能性遺伝子の活性化に十分な期間維持する工程、
（ｃ）前記少なくとも１つの外因的に導入した因子を機能的に不活化する工程、
（ｄ）多能性のマーカーを示す１つまたは複数の細胞を選択する工程、
（ｅ）前記多能性のマーカーを示す１つまたは複数の細胞を使用してキメラ胚を生成する工程、
（ｆ）前記キメラ胚から１つまたは複数の分化した体細胞を得る工程、
（ｇ）前記１つまたは複数の分化した体細胞を、前記細胞の増殖および前記少なくとも１つの外因的に導入した因子の活性に適切な条件下で少なくとも１つの内因性多能性遺伝子の活性化に十分な期間維持する工程、および
（ｈ）１つまたは複数の多能性のマーカーを示す細胞と示さない細胞とを区別する工程
を含む方法によって産生された、再プログラミングされた分化した体細胞に由来する少なくとも７０％の多能性細胞を含む精製体細胞集団。
【請求項１７２】
分化した免疫細胞を多能性状態に再プログラミングする方法であって、
（ａ）それぞれ誘導ベクターの調節下で、外因的に導入したＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ−４、およびｃ−Ｍｙｃを含み、外因的に導入したＣ／ＥＢＰαをさらに含む分化した免疫細胞を準備する工程、
（ｂ）前記細胞を、前記細胞の増殖およびＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ−４、ｃ−Ｍｙｃ、およびＣ／ＥＢＰαの活性に適切な条件下で内因性のＮａｎｏｇおよび／またはＯｃｔ４の活性化に十分な期間維持する工程、および
（ｃ）外因的に導入したＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ−４、およびｃ−Ｍｙｃを機能的に不活化する工程
を含む、方法。
【請求項１７３】
前記誘導ベクターがメチル化誘導サイレンシングに供されない、請求項１７２に記載の方法。
【請求項１７４】
（ａ）それぞれ誘導ベクターの調節下で、外因的に導入したＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ−４、およびｃ−Ｍｙｃを含み、外因的に導入したＣ／ＥＢＰαをさらに含む分化した免疫細胞を準備する工程、
（ｂ）前記細胞を、前記細胞の増殖およびＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ−４、ｃ−Ｍｙｃ、およびＣ／ＥＢＰαの活性に適切な条件下で内因性のＮａｎｏｇおよび／またはＯｃｔ４の活性化に十分な期間維持する工程、および
（ｃ）外因的に導入したＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ−４、およびｃ−Ｍｙｃを機能的に不活化する工程
を含む方法によって産生された、再プログラミングされた分化した免疫細胞に由来する少なくとも７０％の多能性細胞を含む精製免疫細胞集団。
【請求項１７５】
再プログラミング薬を同定する方法であって、
（ａ）１つまたは複数の体細胞の多能性状態への再プログラミングに寄与する少なくとも１つの外因的に導入した因子をそれぞれ含む１つまたは複数の体細胞を準備する工程であって、前記外因的に導入した各因子を、メチル化誘導サイレンシングに供さない誘導ベクターを使用して導入し、その発現を異なるインデューサーによって誘導される調節エレメントによって調節する、準備する工程、
（ｂ）前記１つまたは複数の細胞を、前記細胞の増殖および前記少なくとも１つの外因的に導入した因子の活性に適切な条件下で前記細胞を再プログラミングするか少なくとも１つの内因性多能性遺伝子の活性化に十分な期間維持する工程、
（ｃ）前記少なくとも１つの外因的に導入した因子を機能的に不活化する工程、
（ｄ）多能性のマーカーを示す１つまたは複数の細胞を選択する工程、
（ｅ）前記多能性のマーカーを示す１つまたは複数の細胞を使用してキメラ胚を生成する工程、
（ｆ）前記キメラ胚から１つまたは複数の体細胞を得る工程、
（ｇ）前記１つまたは複数の体細胞を、前記細胞の増殖および前記少なくとも１つの外因的に導入した因子の活性に適切な条件下で維持する工程であって、前記少なくとも１つの外因的に導入した因子の活性のみでは少なくとも１つの内因性多能性遺伝子の活性化に不十分である、維持する工程、
（ｈ）（ｇ）の体細胞を１つまたは複数の候補再プログラミング薬と接触させる工程、および
（ｉ）１つまたは複数の多能性のマーカーを示す前記１つまたは複数の候補再プログラミング薬と接触した細胞を同定する工程であって、（ｇ）の体細胞を１つまたは複数の多能性のマーカーを示すように誘導する候補再プログラミング薬を再プログラミング薬と同定する、同定する工程
を含む、方法。
【請求項１】
体細胞をより低い分化状態に再プログラミングする薬剤を同定する方法であって、
（ａ）体細胞を候補再プログラミング薬と接触させる工程であって、前記体細胞がＤＮＡメチル化減少に感受性である、接触させる工程、および
（ｂ）前記薬剤が体細胞を再プログラミングしない場合に予想されるよりも多数の細胞がＤＮＡメチル化減少に耐性であるかどうかを決定する工程であって、前記候補再プログラミング薬が体細胞を再プログラミングしない場合に予想されるよりも多数の細胞がＤＮＡメチル化減少に耐性を示す場合、前記候補再プログラミング薬は再プログラミング薬として同定される、決定する工程
を含む、方法。
【請求項２】
ＤＮＡメチル化減少条件下で培養物中の細胞を維持する工程および前記薬剤が体細胞を再プログラミングしない場合に予想されるよりも多数の細胞が生存するかどうかを決定する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ゲノムＤＮＡのメチル化を減少させるように細胞を処理する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ＤＮＡメチルトランスフェラーゼの発現または活性を阻害する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記細胞をＤＮＡメチルトランスフェラーゼ活性を阻害する薬剤と接触させる工程を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記細胞中の干渉ＲＮＡの発現を逆に誘導する工程であって、前記干渉ＲＮＡがＤＮＡメチルトランスフェラーゼの発現を阻害する、誘導する工程を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記ＤＮＡメチルトランスフェラーゼがＤＮＡメチルトランスフェラーゼＩである、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
前記細胞のゲノムＤＮＡ中のメチル化ＣｐＧ配列の平均数を少なくとも１０％減少させるように前記細胞を処理する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記細胞中のＤＮＭＴ１タンパク質をコードするｍＲＮＡの平均レベルを少なくとも５０％減少させる工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記細胞中のＤＮＭＴ１タンパク質の平均レベルを少なくとも５０％減少させる工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記細胞中のＤＮＭＴ１メチルトランスフェラーゼ活性の平均レベルを少なくとも５０％減少させる工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
ＤＮＡメチル化減少条件下で培養物中の細胞を適切な期間維持する工程であって、前記期間後の生細胞の存在数が、薬剤が体細胞を再プログラミングしない場合に予想されるよりも多いことは、前記候補薬が体細胞をＥＳ様状態に再プログラミングすることを示す、維持する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記期間が５日間と３０日間との間である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記期間後の生細胞の存在が細胞を薬剤と接触させなかった場合の少なくとも２倍であることは、前記候補薬が体細胞をＥＳ様状態に再プログラミングすることを示す、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記候補再プログラミング薬が体細胞を再プログラミングしない場合、前記細胞の少なくとも８０％は２０日後に増殖を停止するか死滅すると予想される、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記細胞がヒト細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記細胞が有糸分裂終了していない、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
体細胞をＥＳ様状態に再プログラミングする再プログラミング薬を同定する方法であって、
（ａ）体細胞を請求項１に記載の方法にしたがって同定された再プログラミング薬と接触させる工程、および
（ｂ）前記細胞がＤＮＡ脱メチル化耐性の増加以外のＥＳ細胞の少なくとも１つの特徴を示すかかどうかを決定し、前記特徴を示す場合、候補薬を、体細胞をＥＳ様状態に再プログラミングする薬剤であると同定する工程
を含む、方法。
【請求項１９】
さらなる特徴が、（ｉ）ＳＣＩＤマウスに注射した場合に内胚葉、中胚葉、および外胚葉の特徴を有する細胞に分化する能力；（ｉｉ）内因性のＯｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、または両方の発現；（ｉｉｉ）ＥＳ細胞マーカーの発現；（ｉｖ）出産予定日（ｔｅｒｍ）まで生存するキメラの形成に関与する能力からなる群から選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＥＳ細胞マーカーが、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、ＳＳＥＡ−１、ＳＳＥＡ−３、およびＳＳＥＡ−４からなる群から選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
ＥＳ様状態に再プログラミングされた可能性が増加する体細胞を同定する方法であって、
（ａ）体細胞を準備する工程であって、前記体細胞の少なくともいくつかがＥＳ様状態に少なくとも部分的に再プログラミングされている、準備する工程、および
（ｂ）ＤＮＡ脱メチル化耐性である細胞を選択し、それにより、ＥＳ様状態に再プログラミングされた可能性が増加する細胞を同定する工程
を含む、方法。
【請求項２２】
工程（ｂ）で選択された細胞がＥＳ様状態に再プログラミングされている、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記体細胞が外因的に導入した多能性遺伝子を発現する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記方法が細胞を再プログラミング薬と接触させる工程を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
細胞を評価してＤＮＡ脱メチル化耐性以外のＥＳ細胞の１つまたは複数の特徴を示すかどうかを決定する工程をさらに含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
前記体細胞が内因性ＤＮＡメチルトランスフェラーゼにターゲティングしたＲＮＡｉ薬を可逆的に発現する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２７】
選択された体細胞中のＲＮＡｉ薬の発現を阻害し、それにより、選択された体細胞のゲノムＤＮＡがメチル化されるようになる工程をさらに含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
２つの転写活性Ｘ染色体を有する細胞を選択する工程をさらに含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２９】
ＥＳ細胞マーカーを発現する細胞を選択する工程をさらに含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項３０】
前記ＥＳ細胞マーカーが、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、ＳＳＥＡ−１、ＳＳＥＡ−３、およびＳＳＥＡ−４からなる群から選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
ＥＳ様状態に少なくとも部分的に再プログラミングされた可能性が増加する体細胞を同定する方法であって、
（ａ）ＤＮＡ脱メチル化に感受性である体細胞を準備する工程、
（ｂ）体細胞を再プログラミングすることができる１つまたは複数の処置に前記細胞を供する工程、
（ｃ）細胞を処置してゲノムＤＮＡのメチル化を減少させる工程、
（ｄ）培養物中の細胞を一定期間維持する工程、および
（ｅ）前記期間後に生存する細胞を同定し、それにより、ＥＳ様状態に少なくとも部分的に再プログラミングされた可能性が増大する細胞を同定する工程
を含む、方法。
【請求項３２】
工程（ｅ）で同定された前記細胞がＥＳ様状態に再プログラミングされている、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
工程（ｂ）の少なくとも１つの処置が、再プログラミング薬である小分子と前記細胞を接触させる工程を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
工程（ｂ）の少なくとも１つの処置が細胞を遺伝子でトランスフェクトすることを含み、前記遺伝子が任意選択的に多能性遺伝子である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】
前記処置が、Ｏｃｔ−４、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ−２、ｃ−Ｍｙｃ、およびＫｌｆ４からなる群から選択される少なくとも２つの遺伝子で前記細胞をトランスフェクトする工程を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３６】
細胞を評価してＤＮＡ脱メチル化耐性以外のＥＳ細胞の１つまたは複数の特徴を示すかどうかを決定する工程をさらに含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３７】
ＥＳ細胞マーカーを発現する細胞を選択する工程をさらに含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３８】
前記ＥＳ細胞マーカーが、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、ＳＳＥＡ−１、ＳＳＥＡ−３、およびＳＳＥＡ−４からなる群から選択される、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
２つの転写活性Ｘ染色体を有する細胞を選択する工程をさらに含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項４０】
ＥＳ様状態に再プログラミングした体細胞を同定する方法であって、
（ａ）細胞集団を準備する工程であって、前記細胞集団の少なくともいくつかがＥＳ様状態に少なくとも部分的に再プログラミングされており、前記細胞が、選択マーカーの発現が内因性多能性遺伝子の発現に実質的に適合するような様式で、内因性多能性遺伝子の発現を調節する発現調節エレメントに作動可能に連結された選択マーカーをコードするＤＮＡを含む、準備する工程、および
（ｂ）選択マーカーを発現する細胞を同定し、それにより、ＥＳ様状態に再プログラミングされた体細胞を同定する工程
を含む、方法。
【請求項４１】
前記内因性多能性遺伝子がＯｃｔ−４またはＮａｎｏｇである、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
ＥＳ細胞またはＥＳ細胞コロニーの形態学的特徴を有する細胞または細胞のコロニーを選択する工程をさらに含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
工程（ａ）の細胞が、Ｏｃｔ−４、Ｓｏｘ−２、ｃ−Ｍｙｃ、Ｋｌｆ４、およびその組み合わせからなる群から選択される１つまたは複数の外因的に導入した遺伝子を含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４４】
単離された多能性の再プログラミングされた哺乳動物体細胞の精製調製物であって、前記細胞が、（ａ）内因性のＯｃｔ４およびＮａｎｏｇを発現し、（ｂ）ＳＣＩＤマウスに注射した場合に内胚葉、中胚葉、および外胚葉の特徴を有する組織に分化し、（ｃ）少なくとも１つの遺伝子改変（ｇｅｎｅｔｉｃ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を有し、（ｄ）外因的に導入した多能性遺伝子または内因性多能性遺伝子に作動可能に連結された選択マーカーを発現しない、精製調製物。
【請求項４５】
少なくとも５０％の細胞がＤＮＡ脱メチル化耐性をである、請求項４４に記載の細胞の精製調製物。
【請求項４６】
ＤＮＡメチルトランスフェラーゼＩ発現が少なくとも５０％減少する条件下で前記細胞が生存する、請求項４４に記載の細胞の精製調製物。
【請求項４７】
前記細胞が前記体細胞のドナーまたは前記体細胞の前駆細胞のドナーと遺伝的に適合し、前記ドナーが細胞療法を必要とする個体である、請求項４４に記載の精製調製物。
【請求項４８】
再プログラミングされた体細胞を生成する方法であって、
（ａ）体細胞のＥＳ様状態への再プログラミングに寄与する少なくとも１つの外因的に導入した遺伝子を含む体細胞を準備する工程であって、前記細胞は、前記細胞が（ｉ）ＤＮＡ脱メチル化に耐性であり、（ｉｉ）内因性Ｏｃｔ４を発現し、（ｃ）ＳＣＩＤマウスに注射した場合に内胚葉、中胚葉、および外胚葉の特徴を有する組織に分化する、ＥＳ様状態に再プログラミングされている、準備する工程、および
（ｂ）少なくとも１つの前記外因的に導入した遺伝子を機能的に不活化する工程
を含む、方法。
【請求項４９】
前記細胞が、Ｏｃｔ−４、Ｓｏｘ−２、ｃ−Ｍｙｃ、およびＫｌｆ４をコードする外因的に導入した遺伝子を含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
工程（ｂ）が、前記細胞中への部位特異的リコンビナーゼの導入または前記細胞中の部位特異的リコンビナーゼの発現によって前記外因的に導入した遺伝子の少なくとも一部を切り出す工程を含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５１】
体細胞をより低い分化状態に再プログラミングする薬剤を同定する方法であって、
（ａ）２つのＸ染色体を含む体細胞を準備する工程であって、そのうちの１つが不活性である、準備する工程、
（ｂ）体細胞を候補再プログラミング薬と接触させる工程、
（ｃ）培養物中で前記細胞を維持する工程、
（ｄ）前記培養物中で前記候補薬が体細胞を再プログラミングしない場合に予想されるよりも多数の細胞がその不活性Ｘ染色体を再活性化するかどうかを決定する工程であって、前記候補再プログラミング薬が体細胞を再プログラミングしない場合に予想されるよりも多数の細胞がその不活性Ｘ染色体を再活性化する場合に前記候補薬を再プログラミング薬として同定する、決定する工程
を含む、方法。
【請求項５２】
前記方法が、
（ａ）２つのＸ染色体を含む体細胞を準備する工程であって、そのうちの１つが不活性であり、前記Ｘ染色体の一方が選択マーカー遺伝子の機能的対立遺伝子を含み、前記Ｘ染色体の他方が選択マーカー遺伝子の機能的対立遺伝子を含まない、準備する工程、
（ｂ）選択マーカーを発現しない細胞を選択し、それにより、選択マーカー遺伝子を含むＸ染色体が不活性である細胞を選択する工程、
（ｃ）工程（ｂ）で選択した体細胞を候補再プログラミング薬と接触させる工程、
（ｄ）選択マーカー遺伝子の機能的対立遺伝子を含むＸ染色体が不活性なままである場合に予想されるよりも多数の細胞が選択マーカーを発現するかどうかを決定し、それにより、候補再プログラミング薬が体細胞を再プログラミングしない場合に予想されるよりも多数の細胞がその不活性Ｘ染色体を再活性化するかどうかを決定する工程、および
（ｅ）候補再プログラミング薬が体細胞を再プログラミングしない場合に予想されるよりも多数の細胞がその不活性Ｘ染色体を再活性化する場合、前記候補薬を再プログラミング薬と同定する工程
を含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記方法が、細胞を候補再プログラミング薬と接触させた後に選択マーカーの機能的形態を発現する細胞を選択し、それにより、その不活性Ｘ染色体が再活性化された細胞を選択する工程を含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記選択マーカーが正の選択および負の選択に適切である、請求項５２に記載の方法。
【請求項５５】
工程（ｂ）が選択マーカーの機能的形態を発現する細胞が実質的に生存しない条件下で細胞を維持することを含み、工程（ｄ）が選択マーカーの機能的形態を発現しない細胞が実質的に生存しない条件下で細胞を維持することを含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５６】
前記遺伝子が、Ｘ染色体上に存在する内因性遺伝子である、請求項５２に記載の方法。
【請求項５７】
前記遺伝子がヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）をコードする、請求項５２に記載の方法。
【請求項５８】
前記遺伝子の機能的対立遺伝子を欠くＸ染色体が前記遺伝子を不活化する操作された遺伝子の変化を含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５９】
前記方法が、
（ａ）２つのＸ染色体を含む体細胞を準備する工程であって、そのうちの１つが不活性であり、前記Ｘ染色体の一方が、その発現を選択することができる第１の選択マーカー遺伝子の機能的対立遺伝子およびその発現を選択することができる第２の選択マーカー遺伝子の機能的形態を含み、前記Ｘ染色体の他方が各前記遺伝子の機能的対立遺伝子を欠く、準備する工程、
（ｂ）前記第１の選択マーカーの機能的形態を発現しない細胞を選択し、それにより、機能的対立遺伝子を含むＸ染色体が不活性である細胞を選択する工程、
（ｃ）体細胞を候補再プログラミング薬と接触させる工程、
（ｄ）前記第２の選択マーカーの機能的形態を発現する細胞を選択し、それにより、その不活性なＸ染色体を再活性化した細胞を選択する工程、
（ｅ）前記候補再プログラミング薬が体細胞を再プログラミングしない場合に予想されるよりも多数の細胞が不活性なＸ染色体を再活性化するかどうかを決定する工程、および
（ｆ）前記候補再プログラミング薬が細胞を再プログラミングしない場合に予想されるよりも多数の細胞がその不活性Ｘ染色体を再活性化する場合に前記候補薬を再プログラミング薬として同定する工程
を含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項６０】
体細胞のＥＳ様状態への再プログラミングに適切な再プログラミング薬を同定する方法であって、
（ａ）体細胞を請求項５１に記載の方法にしたがって同定した再プログラミング薬と接触させる工程、および
（ｂ）前記細胞が２つの転写活性Ｘ染色体を有すること以外のＥＳ細胞の少なくとも１つの特徴を示すかどうかを決定して、前記特徴を示す場合、前記候補薬を、体細胞をＥＳ様状態に再プログラミングする薬剤であると同定する工程
を含む、方法。
【請求項６１】
さらなる特徴が、（ｉ）ＳＣＩＤマウスに注射した場合に内胚葉、中胚葉、および外胚葉の特徴を有する細胞に分化する能力、（ｉｉ）内因性のＯｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、または両方の発現；（ｉｉｉ）ＥＳ細胞マーカーの発現；（ｉｖ）出産予定日まで生存するキメラの形成に関与する細胞の能力からなる群から選択される、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
ＥＳ様状態に再プログラミングされた可能性が増加する体細胞を同定する方法であって、
（ａ）２つのＸ染色体を含む体細胞を準備する工程であって、その一方が不活性である、準備する工程、
（ｂ）前記細胞を体細胞を再プログラミングすることができる１つまたは複数の処理に供する工程、および
（ｃ）不活性なＸ染色体が活性になった細胞を同定し、それにより、ＥＳ様状態に再プログラミングされた可能性が増加する細胞を同定する工程
を含む、方法。
【請求項６３】
前記方法が、前記細胞を評価して前記細胞が２つの転写活性Ｘ染色体を有すること以外のＥＳ細胞の１つまたは複数の特徴を示すかどうかを決定する工程をさらに含む、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
工程（ｂ）が、再プログラミング薬である小分子と前記細胞を接触させる工程を含む、請求項６２に記載の方法。
【請求項６５】
工程（ｂ）が、前記細胞を多能性遺伝子でトランスフェクトする工程を含む、請求項６２に記載の方法。
【請求項６６】
前記体細胞が２つのＸ染色体を含み、そのうちの１つが不活性であり、前記Ｘ染色体の一方が選択マーカー遺伝子の機能的対立遺伝子を含み、前記Ｘ染色体の他方が選択マーカー遺伝子の機能的対立遺伝子を含まない、請求項６２に記載の方法。
【請求項６７】
前記選択マーカー遺伝子が内因性遺伝子である、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記体細胞が２つのＸ染色体を含み、そのうちの１つが不活性であり、前記Ｘ染色体の両方が選択マーカー遺伝子の機能的対立遺伝子を含む、請求項６２に記載の方法。
【請求項６９】
ＥＳ様状態に再プログラミングされた可能性が増加する体細胞を同定する方法であって、
（ａ）２つのＸ染色体を含む体細胞を準備する工程であって、そのうちの１つが不活性であり、前記細胞の不活性なＸ染色体が正の選択および負の選択の両方に有用な選択マーカー遺伝子の機能的対立遺伝子を含み、前記活性なＸ染色体が前記マーカー遺伝子の機能的対立遺伝子を含まない、準備する工程、
（ｂ）前記細胞を、体細胞を再プログラミングすることができる１つまたは複数の処理に供する工程、および
（ｃ）選択マーカー遺伝子を発現する細胞を選択し、それにより、不活性なＸ染色体が転写的に活性になり、ＥＳ様状態に再プログラミングされた可能性が増加する細胞を選択する工程
を含む、方法。
【請求項７０】
前記選択マーカー遺伝子が、前記Ｘ染色体上に通常存在する内因性遺伝子である、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記選択マーカー遺伝子がＨＰＲＴをコードする、請求項６９に記載の方法。
【請求項７２】
前記活性なＸ染色体が選択マーカー遺伝子の非機能的対立遺伝子を含み、前記非機能的対立遺伝子が前記対立遺伝子を不活化する変異または操作された変化を有する、請求項６９に記載の方法。
【請求項７３】
（ｉ）２つのＸ染色体を含む体細胞を準備する工程であって、そのうちの１つが不活性であり、前記Ｘ染色体の一方が選択マーカー遺伝子の機能的対立遺伝子を含み、前記Ｘ染色体の他方が選択マーカー遺伝子の機能的対立遺伝子を含まない、準備する工程、
（ｉｉ）選択マーカー遺伝子を発現しない細胞を選択し、それにより、不活性なＸ染色体が選択マーカー遺伝子の機能的対立遺伝子を含む細胞を選択する工程、
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）の細胞を体細胞を再プログラミングすることができる１つまたは複数の処理に供する工程、および
（ｉｖ）選択マーカー遺伝子を発現する細胞を選択し、それにより、不活性なＸ染色体が転写的に活性になった細胞を選択する工程
を含む、請求項６９に記載の方法。
【請求項７４】
前記体細胞が２つのＸ染色体を含み、そのうちの１つが不活性であり、前記Ｘ染色体の両方が正の選択および負の選択の両方に有用な選択マーカー遺伝子の機能的対立遺伝子を含み、前記方法が、
（ａ）選択マーカー遺伝子を発現しない細胞を選択し、それにより、第１のＸ染色体が転写的に不活性である細胞集団を得る工程、
（ｂ）前記細胞を、体細胞を再プログラミングすることができる１つまたは複数の処理に供する工程、
（ｃ）前記第１のＸ染色体上の選択マーカー遺伝子を機能的に不活化する工程、および
（ｄ）選択マーカー遺伝子を発現する細胞を選択し、それにより、前記第２のＸ染色体が転写的に活性である細胞を選択する工程
を含む、請求項６２に記載の方法。
【請求項７５】
前記選択マーカー遺伝子が前記Ｘ染色体上に通常存在する内因性遺伝子である、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
工程（ｃ）が部位特異的リコンビナーゼを使用して選択マーカー遺伝子を機能的に不活化する工程を含む、請求項７４に記載の方法。
【請求項７７】
体細胞をより低い分化状態に再プログラミングする薬剤を同定する方法であって、
（ａ）体細胞を候補再プログラミング薬と接触させる工程であって、前記体細胞がＤＮＡメチル化減少に感受性である、接触させる工程、および
（ｂ）ＤＮＡメチル化減少に耐性である細胞の量を決定する工程であって、コントロールと比較した場合、ＤＮＡメチル化減少に耐性である細胞の量の増加が、候補薬が再プログラミング薬であることを示す、決定する工程
を含む、方法。
【請求項７８】
ＥＳ様状態に再プログラミングした可能性が増加する体細胞を誘導する方法であって、
（ａ）細胞の化学的選択に有用な遺伝子改変を含まない体細胞を準備する工程であって、前記細胞の少なくともいくつかが、ＥＳ様状態に少なくとも部分的に再プログラミングされている、準備する工程、および
（ｂ）ＥＳ細胞またはＥＳ細胞コロニーの形態的特徴を有する細胞または細胞のコロニーを選択する工程
を含む、方法。
【請求項７９】
前記体細胞が遺伝的に改変されていない、請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
準備した前記体細胞が、前記細胞の化学的選択に有用なＤＮＡ構築物を含まない、請求項７８に記載の方法。
【請求項８１】
準備した前記体細胞が、前記細胞の遺伝的または化学的選択に有用なＤＮＡ構築物を含まない、請求項７８に記載の方法。
【請求項８２】
前記体細胞が、少なくとも１つの外因的に導入した再プログラミング薬を含む、請求項７８に記載の方法。
【請求項８３】
前記外因的に導入した再プログラミング薬が、タンパク質形質導入または前記タンパク質をコードする構築物の一過性トランスフェクションによって導入されたタンパク質である、請求項８２に記載の方法。
【請求項８４】
工程（ａ）の体細胞が、１つまたは複数の外因的に導入した多能性遺伝子またはかかる遺伝子によってコードされるタンパク質を含む、請求項７８に記載の方法。
【請求項８５】
前記体細胞がＯｃｔ−４、Ｓｏｘ−２、ｃ−Ｍｙｃ、およびＫｌｆ４からなる群から選択される少なくとも２つの非内因性タンパク質を含むか発現する、請求項７８に記載の方法。
【請求項８６】
工程（ａ）の体細胞が、Ｏｃｔ−４、Ｓｏｘ−２、ｃ−Ｍｙｃ、Ｋｌｆ４、およびその組み合わせからなる群から選択される１つまたは複数の外因的に導入した遺伝子を含む、請求項７８に記載の方法。
【請求項８７】
工程（ａ）の少なくともいくつかの細胞がＥＳ様状態に再プログラミングされている、請求項７８に記載の方法。
【請求項８８】
選択された前記細胞が、以下の特徴：（ｉ）ＳＣＩＤマウスに注射した場合に内胚葉、中胚葉、および外胚葉の特徴を有する細胞に分化する能力、（ｉｉ）内因性のＯｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、または両方の発現、（ｉｉｉ）ＥＳ細胞マーカーの発現、および（ｉｖ）出産予定日まで生存するキメラの形成に関与する能力の少なくとも３つを示す、請求項７８に記載の方法。
【請求項８９】
前記ＥＳ細胞マーカーが、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、ＳＳＥＡ−１、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、およびＴＲＡＦ−６０からなる群から選択される、請求項８８に記載の方法。
【請求項９０】
同定された前記細胞を１つまたは複数の選択工程に供して、ＥＳ様細胞をＥＳ様状態に再プログラミングされない細胞から分離する工程をさらに含む、請求項７８に記載の方法。
【請求項９１】
前記１つまたは複数の選択工程が、
（ａ）ＥＳ様状態に再プログラミングされない細胞を溶解するのに十分な補体成分の存在下での細胞の補体媒介溶解に耐性を示す細胞を選択する工程、
（ｂ）体細胞ではなくＥＳ細胞に特徴的な細胞表面マーカーの発現に基づいた細胞選別工程、
（ｃ）ＤＮＡ脱メチル化に耐性である細胞を選択する工程、
（ｄ）２つの活性なＸ染色体を有する細胞を選択する工程、および
（ｅ）前記コロニーを継代またはサブクローニングする工程、および前記コロニーの細胞の子孫からＥＳ様形態を有する細胞または細胞コロニーを同定する工程から選択される、請求項９０に記載の方法。
【請求項９２】
ＥＳ様状態に再プログラミングされた体細胞を同定する方法であって、
（ａ）細胞集団を準備する工程であって、その少なくともいくつかがＥＳ様状態に再プログラミングされており、前記細胞が内因性多能性遺伝子の発現を調節する発現調節エレメントに作動可能に連結された選択マーカーをコードするＤＮＡを含まない、準備する工程、および
（ｂ）ＥＳ細胞またはＥＳ細胞コロニーに特徴的な形態を有する細胞または細胞コロニーを同定する工程
を含む、方法。
【請求項９３】
前記細胞のコロニー由来の細胞または少なくともいくつかの細胞を、かかる形態を欠く集団中の他の細胞と区別する工程をさらに含む、請求項９２に記載の方法。
【請求項９４】
工程（ａ）の細胞が、Ｏｃｔ−４、Ｓｏｘ−２、ｃ−Ｍｙｃ、Ｋｌｆ４、およびその組み合わせからなる群から選択される１つまたは複数の外因的に導入した遺伝子を含む、請求項９２に記載の方法。
【請求項９５】
ＥＳ様状態に再プログラミングされた体細胞を同定する方法であって、
（ａ）１つまたは複数の再プログラミング薬を細胞に導入する工程であって、前記再プログラミング薬が前記細胞の少なくともいくつかをＥＳ様状態に再プログラミングするのに十分である、導入する工程、
（ｂ）前記細胞を、ＥＳ様細胞を含むコロニーが発生するのに適切な期間培養物中で維持する工程、および
（ｃ）化学的選択または遺伝的選択を使用せずにＥＳ様細胞の少なくとも１つのかかるコロニーを同定する工程
を含む方法。
【請求項９６】
工程（ａ）が、Ｏｃｔ−４、Ｓｏｘ−２、ｃ−Ｍｙｃ、Ｋｌｆ４、およびその組み合わせからなる群から選択される１つまたは複数の遺伝子を細胞に導入することを含む、請求項９５に記載の方法。
【請求項９７】
ＥＳ様状態に再プログラミングされた体細胞を同定する方法であって、
（ａ）体細胞集団を準備する工程であって、その少なくともいくつかがＥＳ様状態に再プログラミングされており、前記細胞が、内因性多能性遺伝子の発現を調節する発現調節エレメントに作動可能に連結された選択マーカーをコードするＤＮＡを含まない、準備する工程、
（ｂ）（ｉ）細胞溶解に十分な補体成分および（ｉｉ）ＥＳ様状態に再プログラミングしない体細胞の細胞表面に存在するが、ＥＳ細胞によって存在しないか有意でないレベルで発現するマーカーに特異的に結合する補体結合抗体の存在下にて培養物中で前記細胞を維持する工程、および
（ｃ）工程（ｂ）を生存する細胞を単離する工程
を含む、方法。
【請求項９８】
前記マーカーがＭＨＣクラスＩ抗原である、請求項９７に記載の方法。
【請求項９９】
前記有意でないレベルが、体細胞の型と同型の生物由来の線維芽細胞によって発現される平均レベルの１０倍より小さい、請求項９７に記載の方法。
【請求項１００】
単離された多能性の再プログラミングされた哺乳動物体細胞の精製調製物であって、前記細胞が、（ａ）内因性のＯｃｔ４およびＮａｎｏｇを発現し、（ｂ）ＳＣＩＤマウスに注射した場合に内胚葉、中胚葉、および外胚葉の特徴を有する組織に分化し、（ｃ）内因性多能性遺伝子に作動可能に連結された選択マーカーをコードするＤＮＡを含まない、精製調製物。
【請求項１０１】
前記細胞が遺伝的に改変されていない、請求項１００に記載の細胞の精製調製物。
【請求項１０２】
前記細胞が前記体細胞のドナーまたは前記体細胞の前駆細胞のドナーと遺伝的に適合し、前記ドナーが細胞療法を必要とする個体である、請求項１００に記載の細胞の精製調製物。
【請求項１０３】
再プログラミングされた体細胞を誘導する方法であって、
（ａ）前記細胞のＥＳ様状態への再プログラミングに寄与する少なくとも１つの外因的に導入した遺伝子またはタンパク質を含む体細胞を準備する工程であって、前記細胞が、（ｉ）ＤＮＡ脱メチル化に耐性を示し、（ｉｉ）内因性Ｏｃｔ４を発現し、（ｃ）ＳＣＩＤマウスに注射した場合に内胚葉、中胚葉、および外胚葉の特徴を有する組織に分化するＥＳ様状態に前記細胞が再プログラミングされている、準備する工程、
（ｂ）遺伝的選択または化学的選択を使用せずにＥＳ様細胞を単離する工程、および
（ｃ）少なくとも１つの前記外因的に導入した遺伝子を機能的に不活化する工程
を含む、方法。
【請求項１０４】
前記細胞が、Ｏｃｔ−４、Ｓｏｘ−２、ｃ−Ｍｙｃ、およびＫｌｆ４をコードする外因的に導入した遺伝子またはこれらのタンパク質を含む、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０５】
工程（ｂ）が、前記細胞における部位特異的リコンビナーゼの導入または前記細胞における部位特異的リコンビナーゼの発現によって前記外因的に導入した遺伝子の少なくとも一部を切り出す工程を含む、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０６】
再プログラミングされた細胞を誘導する方法であって、（ｉ）遺伝的に改変されていない細胞集団を準備する工程であって、その少なくともいくつかがＥＳ様状態に部分的または完全に再プログラミングされている、準備する工程、（ｉｉ）補体媒介溶解を使用して部分的または完全に再プログラミングされた細胞を富化して、少なくともいくつかの非再プログラミング細胞を排除する工程、および（ｉｉｉ）形態的基準を使用して、再プログラミングされた細胞またはかかる細胞を含むコロニーを同定する工程を含む、方法。
【請求項１０７】
体細胞が、化学的選択または遺伝的選択に有用なマーカーをコードする核酸構築物で遺伝的に改変されない、ＥＳ様状態に再プログラミングされた単離体細胞。
【請求項１０８】
前記細胞が遺伝的に改変されない、請求項１０７に記載の単離体細胞。
【請求項１０９】
少なくとも９０％の細胞がＥＳ様状態に再プログラミングされており、化学的選択または遺伝的選択に有用なマーカーをコードする核酸構築物で遺伝的に改変されない、精製体細胞集団。
【請求項１１０】
前記細胞が遺伝的に改変されていない、請求項３２に記載の精製体細胞集団。
【請求項１１１】
準備した前記体細胞を、マウス、ラット、ウサギ、家畜、ペット（ｃｏｍｐａｎｉｏｎ ａｎｉｍａｌ）、霊長類、またはヒトから得る、請求項７８に記載の方法。
【請求項１１２】
前記体細胞を、マウス、ラット、ウサギ、家畜、ペット、霊長類、またはヒトから得る、請求項１０９に記載の精製体細胞集団。
【請求項１１３】
分化した体細胞を多能性状態に再プログラミングする方法であって、
（ａ）分化した体細胞を前記細胞の多能性状態への再プログラミングに寄与する少なくとも１つの再プログラミング薬と接触させる工程、
（ｂ）前記細胞を、前記細胞の増殖および前記少なくとも１つの再プログラミング薬の活性に適切な条件下で前記細胞の再プログラミングの開始に十分な期間維持する工程、および
（ｃ）前記少なくとも１つの再プログラミング薬を機能的に不活化する工程
を含む、方法。
【請求項１１４】
分化した体細胞を多能性状態に再プログラミングする方法であって、
（ａ）分化した体細胞の多能性状態への再プログラミングに寄与する少なくとも１つの外因的に導入した因子を含む分化した体細胞を準備する工程、
（ｂ）前記細胞を、前記細胞の増殖および前記少なくとも１つの外因的に導入した因子の活性に適切な条件下で少なくとも１つの内因性多能性遺伝子の活性化に十分な期間維持する工程、および
（ｃ）前記少なくとも１つの外因的に導入した因子を機能的に不活化する工程
を含む、方法。
【請求項１１５】
多能性状態に再プログラミングされた分化した体細胞を選択する方法であって、
（ａ）分化した体細胞の多能性状態への再プログラミングに寄与する少なくとも１つの外因的に導入した因子を含む分化した体細胞を準備する工程、
（ｂ）前記細胞を、前記細胞の増殖および前記少なくとも１つの外因的に導入した因子の活性に適切な条件下で少なくとも１つの内因性多能性遺伝子の活性化に十分な期間維持する工程、
（ｃ）前記少なくとも１つの外因的に導入した因子を機能的に不活化する工程、および
（ｄ）１つまたは複数の多能性のマーカーを示す細胞と示さない細胞とを区別する工程
を含む、方法。
【請求項１１６】
前記分化した体細胞が部分的に分化している、請求項１１３、１１４、または１１５に記載の方法。
【請求項１１７】
前記分化した体細胞が完全に分化している、請求項１１３、１１４、または１１５に記載の方法。
【請求項１１８】
前記分化した体細胞が造血性系列細胞である、請求項１１３、１１４、または１１５に記載の方法。
【請求項１１９】
前記分化した体細胞を末梢血から得る、請求項１１３、１１４、または１１５に記載の方法。
【請求項１２０】
前記分化した体細胞が免疫系細胞である、請求項１１３、１１４、または１１５に記載の方法。
【請求項１２１】
前記分化した体細胞がマクロファージである、請求項１１３、１１４、または１１５に記載の方法。
【請求項１２２】
前記分化した体細胞がリンパ球系細胞である、請求項１１３、１１４、または１１５に記載の方法。
【請求項１２３】
前記分化した体細胞がＢ細胞である、請求項１１３、１１４、または１１５に記載の方法。
【請求項１２４】
前記部分的に分化した細胞が未熟Ｂ細胞である、請求項１１６に記載の方法。
【請求項１２５】
前記未熟Ｂ細胞がプレＢ細胞またはプロＢ細胞である、請求項１１６に記載の方法。
【請求項１２６】
前記完全に分化した細胞が成熟Ｂ細胞である、請求項１１７に記載の方法。
【請求項１２７】
前記完全に分化した細胞が非ナイーブ成熟Ｂ細胞である、請求項１１７に記載の方法。
【請求項１２８】
前記少なくとも１つの外因的に導入した因子がポリヌクレオチドである、請求項１１４または請求項１１５に記載の方法。
【請求項１２９】
前記少なくとも１つの外因的に導入した因子がポリペプチドである、請求項１１４または請求項１１５に記載の方法。
【請求項１３０】
前記少なくとも１つの外因的に導入した因子が、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ−４、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、ｃ−Ｍｙｃ、およびその組み合わせからなる群から選択される、請求項１１４または請求項１１５に記載の方法。
【請求項１３１】
前記分化した体細胞が、外因的に導入したＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、およびＫｌｆ−４を含む、請求項１１４または請求項１１５に記載の方法。
【請求項１３２】
前記分化した体細胞が、外因的に導入したＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ−４、およびｃ−Ｍｙｃを含む、請求項１１４または請求項１１５に記載の方法。
【請求項１３３】
前記少なくとも１つの外因的に導入した因子が、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ−４、ｃ−Ｍｙｃ、およびその組み合わせからなる群から選択され、前記分化した体細胞が、前記分化した体細胞の脱分化を誘導することができる少なくとも１つの外因的に導入した因子をさらに含む、請求項１２３に記載の方法。
【請求項１３４】
前記分化した体細胞の脱分化を誘導することができる少なくとも１つの外因的に導入した因子がポリヌクレオチドである、請求項１３３に記載の方法。
【請求項１３５】
前記分化した体細胞の脱分化を誘導することができる少なくとも１つの外因的に導入した因子がポリペプチドである、請求項１３３に記載の方法。
【請求項１３６】
前記分化した体細胞が外因的に導入した遺伝子であるＯｃｔ４、Ｓｏｘ２ およびＫｌｆ−４を含み、前記分化した体細胞の脱分化を誘導することができる少なくとも１つの外因的に導入した因子をさらに含む、請求項１２３に記載の方法。
【請求項１３７】
前記分化した体細胞の脱分化を誘導することができる少なくとも１つの外因的に導入した因子がポリヌクレオチドである、請求項１３６に記載の方法。
【請求項１３８】
前記分化した体細胞の脱分化を誘導することができる少なくとも１つの外因的に導入した因子がポリペプチドである、請求項１３６に記載の方法。
【請求項１３９】
前記分化した体細胞が、外因的に導入した遺伝子であるＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ−４、およびｃ−Ｍｙｃを含み、前記分化した体細胞の脱分化を誘導することができる少なくとも１つの外因的に導入した因子をさらに含む、請求項１２３に記載の方法。
【請求項１４０】
前記分化した体細胞の脱分化を誘導することができる少なくとも１つの外因的に導入した因子がポリヌクレオチドである、請求項１３９に記載の方法。
【請求項１４１】
前記分化した体細胞の脱分化を誘導することができる少なくとも１つの外因的に導入した因子がポリペプチドである、請求項１３９に記載の方法。
【請求項１４２】
前記分化した体細胞の脱分化を誘導することができる因子が、Ｂ細胞後期特異的マーカーを下方制御する少なくとも１つのポリヌクレオチド、Ｐａｘ５発現を阻害する少なくとも１つのポリヌクレオチド、Ｂ細胞後期特異的マーカーを下方制御する少なくとも１つのポリペプチド、Ｐａｘ５発現を阻害する少なくとも１つのポリペプチド、およびその組み合わせからなる群から選択される、請求項１３３に記載の方法。
【請求項１４３】
前記分化した体細胞の脱分化を誘導することができる因子が、Ｂ細胞後期特異的マーカーを下方制御する少なくとも１つのポリヌクレオチド、Ｐａｘ５発現を阻害する少なくとも１つのポリヌクレオチド、Ｂ細胞後期特異的マーカーを下方制御する少なくとも１つのポリペプチド、Ｐａｘ５発現を阻害する少なくとも１つのポリペプチド、およびその組み合わせからなる群から選択される、請求項１３６に記載の方法。
【請求項１４４】
前記分化した体細胞の脱分化を誘導することができる因子が、Ｂ細胞後期特異的マーカーを下方制御する少なくとも１つのポリヌクレオチド、Ｐａｘ５発現を阻害する少なくとも１つのポリヌクレオチド、Ｂ細胞後期特異的マーカーを下方制御する少なくとも１つのポリペプチド、Ｐａｘ５発現を阻害する少なくとも１つのポリペプチド、およびその組み合わせからなる群から選択される、請求項１３９に記載の方法。
【請求項１４５】
前記分化した体細胞の脱分化を誘導することができる因子が、Ｃ／ＥＢＰαまたはＣ／ＥＢＰαのヒトホモログである、請求項１３３に記載の方法。
【請求項１４６】
前記分化した体細胞の脱分化を誘導することができる因子が、Ｃ／ＥＢＰαまたはＣ／ＥＢＰαのヒトホモログである、請求項１３６に記載の方法。
【請求項１４７】
前記分化した体細胞の脱分化を誘導することができる因子が、Ｃ／ＥＢＰαまたはＣ／ＥＢＰαのヒトホモログである、請求項１３９に記載の方法。
【請求項１４８】
前記少なくとも１つの外因的に導入した因子を、ベクターを使用して導入する、請求項１１４または請求項１１５に記載の方法。
【請求項１４９】
前記少なくとも１つの外因的に導入した因子を、誘導ベクターまたは条件的に発現されるベクターを使用して導入する、請求項１１４または請求項１１５に記載の方法。
【請求項１５０】
前記少なくとも１つの外因的に導入した因子を、メチル化媒介サイレンシングに供さないベクターを使用して導入する、請求項１１４または請求項１１５に記載の方法。
【請求項１５１】
前記少なくとも１つの外因的に導入した因子を、ウイルスベクターを使用して導入する、請求項１１４または請求項１１５に記載の方法。
【請求項１５２】
前記少なくとも１つの外因的に導入した因子を、レトロウイルスベクターを使用して導入する、請求項１１４または請求項１１５に記載の方法。
【請求項１５３】
前記少なくとも１つの外因的に導入した因子を、レンチウイルスベクターを使用して導入する、請求項１１４または請求項１１５に記載の方法。
【請求項１５４】
前記分化した体細胞を、造血性サイトカインおよび成長因子の存在下で維持する、請求項１１８に記載の方法。
【請求項１５５】
前記分化した体細胞を、造血性サイトカインおよび成長因子の存在下で維持する、請求項１２３に記載の方法。
【請求項１５６】
前記分化した体細胞を、骨髄間質細胞を含む培地上で培養する、請求項１１８に記載の方法。
【請求項１５７】
前記分化した体細胞を、骨髄間質細胞を含む培地上で培養する、請求項１２３に記載の方法。
【請求項１５８】
前記内因性多能性遺伝子が、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、およびその組み合わせからなる群から選択される、請求項１１４または請求項１１５に記載の方法。
【請求項１５９】
前記内因性多能性遺伝子が、選択マーカーと同時発現する、請求項１１４または請求項１１５に記載の方法。
【請求項１６０】
前記選択マーカーが、抗生物質耐性遺伝子または発光マーカーである、請求項１５９に記載の方法。
【請求項１６１】
前記分化した体細胞が、前記少なくとも１つの内因性多能性遺伝子の発現を調節する発現調節エレメントに作動可能に連結された選択マーカーをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドをさらに含む、１１３、１１４、または１１５に記載の方法。
【請求項１６２】
前記分化した体細胞が、Ｏｃｔ４遺伝子座中、Ｎａｎｏｇ遺伝子座中、またはＯｃｔ４遺伝子座中およびＮａｎｏｇ遺伝子座中の両方に選択遺伝子を含む、請求項１１３、１１４、または１１５に記載の方法。
【請求項１６３】
前記少なくとも１つの外因的に導入した因子を誘導ベクターを使用して導入し、前記少なくとも１つの外因的に導入した因子を機能的に不活化する工程が、前記細胞が維持される条件を前記ベクターの誘導発現に不適切にすることを含む、請求項１１３、１１４、または１１５に記載の方法。
【請求項１６４】
前記少なくとも１つの多能性のマーカーが、多能性遺伝子の発現、その発現が多能性遺伝子の発現の直接または間接的な結果である遺伝子の発現、アルカリホスファターゼの発現、ＳＳＥＡ１の発現、ＳＳＥＡ３の発現、ＳＳＥＡ４の発現、ＴＲＡＦ−６０の発現、Ｎａｎｏｇの発現、Ｏｃｔ４の発現、Ｆｘｂ１５の発現、ＥＳ細胞またはＥＳ細胞コロニーに特徴的な形態、出産予定日まで生存するキメラの形成に関与する能力、ＳＣＩＤマウスに注射した場合に内胚葉、中胚葉、および外胚葉の特徴を有する細胞に分化する能力、２つの活性なＸ染色体の存在、ＤＮＡメチル化に対する耐性、およびその組み合わせからなる群から選択される、請求項１１５に記載の方法。
【請求項１６５】
再プログラミングされた分化した体細胞に由来する単離多能性細胞。
【請求項１６６】
再プログラミングされた分化した体細胞に由来する少なくとも７０％の多能性細胞を含む精製体細胞集団。
【請求項１６７】
（ａ）分化した体細胞の多能性状態への再プログラミングに寄与する少なくとも１つの外因的に導入した因子を含む分化した体細胞を準備する工程、
（ｂ）前記細胞を、前記細胞の増殖および前記少なくとも１つの外因的に導入した因子の活性に適切な条件下で少なくとも１つの内因性多能性遺伝子の活性化に十分な期間維持する工程、
（ｃ）前記少なくとも１つの外因的に導入した因子を機能的に不活化する工程、および
（ｄ）１つまたは複数の多能性のマーカーを示す細胞を示さない細胞と区別する工程
を含む方法によって産生された単離多能性細胞。
【請求項１６８】
（ａ）分化した体細胞の多能性状態への再プログラミングに寄与する少なくとも１つの外因的に導入した因子を含む分化した体細胞を準備する工程、
（ｂ）前記細胞を、前記細胞の増殖および前記少なくとも１つの外因的に導入した因子の活性に適切な条件下で少なくとも１つの内因性多能性遺伝子の活性化に十分な期間維持する工程、
（ｃ）前記少なくとも１つの外因的に導入した因子を機能的に不活化する工程、および
（ｄ）１つまたは複数の多能性のマーカーを示す細胞と示さない細胞とを区別する工程
を含む方法によって産生された、再プログラミングされた分化した体細胞に由来する少なくとも７０％の多能性細胞を含む精製体細胞集団。
【請求項１６９】
体細胞から多能性細胞を産生する方法であって、
（ａ）１つまたは複数の体細胞の多能性状態への再プログラミングに寄与する少なくとも１つの外因的に導入した因子をそれぞれ含む１つまたは複数の体細胞を準備する工程であって、前記外因的に導入した因子を、メチル化誘導サイレンシングに供さない誘導ベクターを使用して導入する、準備する工程、
（ｂ）前記１つまたは複数の細胞を、前記細胞の増殖および前記少なくとも１つの外因的に導入した因子の活性に適切な条件下で少なくとも１つの内因性多能性遺伝子の活性化に十分な期間維持する工程、
（ｃ）前記少なくとも１つの外因的に導入した因子を機能的に不活化する工程、
（ｄ）多能性のマーカーを示す１つまたは複数の細胞を選択する工程、
（ｅ）前記多能性のマーカーを示す１つまたは複数の細胞を使用してキメラ胚を生成する工程、
（ｆ）前記キメラ胚から１つまたは複数の体細胞を得る工程、
（ｇ）前記１つまたは複数の体細胞を、前記細胞の増殖および前記少なくとも１つの外因的に導入した因子の活性に適切な条件下で少なくとも１つの内因性多能性遺伝子の活性化に十分な期間維持する工程、および
（ｈ）１つまたは複数の多能性のマーカーを示す細胞と示さない細胞との間で区別する工程
を含む、方法。
【請求項１７０】
（ａ）１つまたは複数の体細胞の多能性状態への再プログラミングに寄与する少なくとも１つの外因的に導入した因子をそれぞれ含む１つまたは複数の体細胞を準備する工程であって、前記外因的に導入した因子を、メチル化誘導サイレンシングに供さない誘導ベクターを使用して導入する、準備する工程、
（ｂ）前記１つまたは複数の細胞を、前記細胞の増殖および前記少なくとも１つの外因的に導入した因子の活性に適切な条件下で少なくとも１つの内因性多能性遺伝子の活性化に十分な期間維持する工程、
（ｃ）前記少なくとも１つの外因的に導入した因子を機能的に不活化する工程、
（ｄ）多能性のマーカーを示す１つまたは複数の細胞を選択する工程、
（ｅ）前記多能性のマーカーを示す１つまたは複数の細胞を使用してキメラ胚を生成する工程、
（ｆ）前記キメラ胚から１つまたは複数の分化した体細胞を得る工程、
（ｇ）前記１つまたは複数の分化した体細胞を、前記細胞の増殖および前記少なくとも１つの外因的に導入した因子の活性に適切な条件下で少なくとも１つの内因性多能性遺伝子の活性化に十分な期間維持する工程、および
（ｈ）１つまたは複数の多能性のマーカーを示す細胞と示さない細胞とを区別する工程
を含む方法によって産生された単離多能性細胞。
【請求項１７１】
（ａ）１つまたは複数の体細胞の多能性状態への再プログラミングに寄与する少なくとも１つの外因的に導入した因子をそれぞれ含む１つまたは複数の体細胞を準備する工程であって、前記外因的に導入した因子を、メチル化誘導サイレンシングに供さない誘導ベクターを使用して導入する、準備する工程、
（ｂ）前記１つまたは複数の細胞を、前記細胞の増殖および前記少なくとも１つの外因的に導入した因子の活性に適切な条件下で少なくとも１つの内因性多能性遺伝子の活性化に十分な期間維持する工程、
（ｃ）前記少なくとも１つの外因的に導入した因子を機能的に不活化する工程、
（ｄ）多能性のマーカーを示す１つまたは複数の細胞を選択する工程、
（ｅ）前記多能性のマーカーを示す１つまたは複数の細胞を使用してキメラ胚を生成する工程、
（ｆ）前記キメラ胚から１つまたは複数の分化した体細胞を得る工程、
（ｇ）前記１つまたは複数の分化した体細胞を、前記細胞の増殖および前記少なくとも１つの外因的に導入した因子の活性に適切な条件下で少なくとも１つの内因性多能性遺伝子の活性化に十分な期間維持する工程、および
（ｈ）１つまたは複数の多能性のマーカーを示す細胞と示さない細胞とを区別する工程
を含む方法によって産生された、再プログラミングされた分化した体細胞に由来する少なくとも７０％の多能性細胞を含む精製体細胞集団。
【請求項１７２】
分化した免疫細胞を多能性状態に再プログラミングする方法であって、
（ａ）それぞれ誘導ベクターの調節下で、外因的に導入したＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ−４、およびｃ−Ｍｙｃを含み、外因的に導入したＣ／ＥＢＰαをさらに含む分化した免疫細胞を準備する工程、
（ｂ）前記細胞を、前記細胞の増殖およびＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ−４、ｃ−Ｍｙｃ、およびＣ／ＥＢＰαの活性に適切な条件下で内因性のＮａｎｏｇおよび／またはＯｃｔ４の活性化に十分な期間維持する工程、および
（ｃ）外因的に導入したＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ−４、およびｃ−Ｍｙｃを機能的に不活化する工程
を含む、方法。
【請求項１７３】
前記誘導ベクターがメチル化誘導サイレンシングに供されない、請求項１７２に記載の方法。
【請求項１７４】
（ａ）それぞれ誘導ベクターの調節下で、外因的に導入したＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ−４、およびｃ−Ｍｙｃを含み、外因的に導入したＣ／ＥＢＰαをさらに含む分化した免疫細胞を準備する工程、
（ｂ）前記細胞を、前記細胞の増殖およびＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ−４、ｃ−Ｍｙｃ、およびＣ／ＥＢＰαの活性に適切な条件下で内因性のＮａｎｏｇおよび／またはＯｃｔ４の活性化に十分な期間維持する工程、および
（ｃ）外因的に導入したＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ−４、およびｃ−Ｍｙｃを機能的に不活化する工程
を含む方法によって産生された、再プログラミングされた分化した免疫細胞に由来する少なくとも７０％の多能性細胞を含む精製免疫細胞集団。
【請求項１７５】
再プログラミング薬を同定する方法であって、
（ａ）１つまたは複数の体細胞の多能性状態への再プログラミングに寄与する少なくとも１つの外因的に導入した因子をそれぞれ含む１つまたは複数の体細胞を準備する工程であって、前記外因的に導入した各因子を、メチル化誘導サイレンシングに供さない誘導ベクターを使用して導入し、その発現を異なるインデューサーによって誘導される調節エレメントによって調節する、準備する工程、
（ｂ）前記１つまたは複数の細胞を、前記細胞の増殖および前記少なくとも１つの外因的に導入した因子の活性に適切な条件下で前記細胞を再プログラミングするか少なくとも１つの内因性多能性遺伝子の活性化に十分な期間維持する工程、
（ｃ）前記少なくとも１つの外因的に導入した因子を機能的に不活化する工程、
（ｄ）多能性のマーカーを示す１つまたは複数の細胞を選択する工程、
（ｅ）前記多能性のマーカーを示す１つまたは複数の細胞を使用してキメラ胚を生成する工程、
（ｆ）前記キメラ胚から１つまたは複数の体細胞を得る工程、
（ｇ）前記１つまたは複数の体細胞を、前記細胞の増殖および前記少なくとも１つの外因的に導入した因子の活性に適切な条件下で維持する工程であって、前記少なくとも１つの外因的に導入した因子の活性のみでは少なくとも１つの内因性多能性遺伝子の活性化に不十分である、維持する工程、
（ｈ）（ｇ）の体細胞を１つまたは複数の候補再プログラミング薬と接触させる工程、および
（ｉ）１つまたは複数の多能性のマーカーを示す前記１つまたは複数の候補再プログラミング薬と接触した細胞を同定する工程であって、（ｇ）の体細胞を１つまたは複数の多能性のマーカーを示すように誘導する候補再プログラミング薬を再プログラミング薬と同定する、同定する工程
を含む、方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公表番号】特表２０１０−５２３１１７（Ｐ２０１０−５２３１１７Ａ）
【公表日】平成２２年７月１５日（２０１０．７．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５０２１５８（Ｐ２０１０−５０２１５８）
【出願日】平成２０年４月７日（２００８．４．７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／００４５１６
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１２４１３３
【国際公開日】平成２０年１０月１６日（２００８．１０．１６）
【出願人】（５００４８２８１０）ホワイトヘッド・インスティテュート・フォー・バイオメディカル・リサーチ (7)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年７月１５日（２０１０．７．１５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年４月７日（２００８．４．７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／００４５１６
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１２４１３３
【国際公開日】平成２０年１０月１６日（２００８．１０．１６）
【出願人】（５００４８２８１０）ホワイトヘッド・インスティテュート・フォー・バイオメディカル・リサーチ (7)
【Ｆターム（参考）】
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