本発明は、Ａｌａ Ｃｐｎ１０ポリペプチドと比較して、ＰＲＲリガンドに対する増加した親和性を有する、単離されたＣｐｎ１０ポリペプチドに関する。別の実施形態では、本発明は、修飾型シャペロニン１０ポリペプチド、およびこれをコードする核酸、このようなポリペプチドを含む組成物、ならびにそれらの使用にも関する。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、修飾型シャペロニン１０ポリペプチド、およびこれをコードする核酸に関する。また、本発明は、シャペロニン１０の突然変異体、およびこのようなポリペプチドを含む組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
熱ショックタンパク質１０（Ｈｓｐ１０）および初期妊娠因子（ＥＰＦ）としても知られる哺乳類のシャペロニン１０（Ｃｐｎ１０）は一般に、熱ショックタンパク質６０（Ｈｓｐ６０）としても知られるシャペロニン６０（Ｃｐｎ６０）と一緒に、タンパク質のフォールディングに関与するミトコンドリア「分子シャペロン」タンパク質として特徴付けられている。Ｃｐｎ１０およびＣｐｎ６０は、それぞれ細菌タンパク質ＧｒｏＥＳおよびＧｒｏＥＬのホモログである。ＧｒｏＥＳおよびＣｐｎ１０は各々オリゴマー化して、前者がＧｒｏＥＬ分子１４個、後者がＣｐｎ６０分子７個で構成されるバレル構造の上に蓋として結合する７員環になり、この複合体に変性タンパク質を繋留する（Ｂｕｋａｕ ａｎｄ Ｈｏｒｗｉｃｈ， １９９８， Ｃｅｌｌ ９２：３５１〜３６６（非特許文献１）；Ｈａｒｔｌ ａｎｄ Ｈａｙｅｒ−Ｈａｒｔｌ， ２００２， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９５：１８５２〜１８５８（非特許文献２））。
【０００３】
Ｃｐｎ１０タンパク質は、種間で高度に保存されている。ヒトＣｐｎ１０は、ウシ、イヌ、ヒツジ、ブタのＣｐｎ１０と１００％同一であり、ラットのＣｐｎ１０とはアミノ酸位置が１箇所異なるだけである。ヒトＣｐｎ１０は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）由来のＧｒｏＥＳとの配列相同性が３８％（類似性６０％）である。Ｃｐｎ１０／ＧｒｏＥＳタンパク質は、各モノマーが基本的に３種類の構造領域すなわち、コアの逆平行βバレル領域と、これに隣接する「ルーフ（ｒｏｏｆ）」βヘアピンループ領域と、「可動性（ｍｏｂｉｌｅ）ループ」領域とで構成される、ドーム形をした七量体のリングである。各モノマーの逆平行βバレル領域がドームのコアを形成し、七量体として連結されると各モノマーのβヘアピンループがドームのルーフを形成する。それぞれのモノマーにおいて、可動性ループ領域は、ルーフループとは反対側のβバレルの端にある。逆平行βバレル領域の一部が、空洞の内側に向いている下側のリム領域を形成する。この下側のリム領域には、７５位のチロシン（Ｙ７５）をはじめとして、系統発生的に保存された多数のアミノ酸が含まれる。
【０００４】
分子シャペロンとしての細胞内での役割だけでなく、Ｃｐｎ１０は細胞表面（Ｂｅｌｌｅｓら， １９９９， Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ６７：４１９１〜４２００（非特許文献３）を参照のこと）や細胞外液（Ｓｈｉｎら， ２００３， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７８：７６０７〜７６１６（非特許文献４）を参照のこと）にも頻繁に見られ、次第に炎症性疾患の治療における潜在性を持つ免疫応答制御因子として認識されるようになっている。その結果、最近になって人間の関節リウマチ患者（Ｖａｎａｇｓら Ｌａｎｃｅｔ ２００６， ３６８：８５５〜８６３（非特許文献５））および乾癬患者（Ｗｉｌｌｉａｍｓら Ａｒｃｈ． Ｄｅｒｍａｔｏｌ． ２００８， １４４：６８３〜６８５（非特許文献６））の治療におけるＣｐｎ１０の有効性と安全性が立証されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｂｕｋａｕ ａｎｄ Ｈｏｒｗｉｃｈ， １９９８， Ｃｅｌｌ ９２：３５１〜３６６
【非特許文献２】Ｈａｒｔｌ ａｎｄ Ｈａｙｅｒ−Ｈａｒｔｌ， ２００２， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９５：１８５２〜１８５８
【非特許文献３】Ｂｅｌｌｅｓら， １９９９， Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ６７：４１９１〜４２００
【非特許文献４】Ｓｈｉｎら， ２００３， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７８：７６０７〜７６１６
【非特許文献５】Ｖａｎａｇｓら Ｌａｎｃｅｔ ２００６， ３６８：８５５〜８６３
【非特許文献６】Ｗｉｌｌｉａｍｓら Ａｒｃｈ． Ｄｅｒｍａｔｏｌ． ２００８， １４４：６８３〜６８５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、この免疫調節活性を媒介しているＣｐｎ１０分子内の部位については、依然として特定しきれずにいる。本発明は、Ｃｐｎ１０の免疫調節活性、特にＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）、ヌクレオチド結合ドメインＬＲＲ含有ファミリー（ＮＬＲ）、ＲＩＧ−Ｉ様受容体（ＲＬＲ）、ＩＲＦのＤＮＡ依存性活性化因子（ＤＡＩ）、Ｃ型レクチン受容体（ＣＬＲ）またはＩＦＩ２０Ｘ／ＩＦＩ１６ファミリーのメンバー（Ｉｆｉ１６、Ａｉｍ２、ＭＮＤＡ、ＩＦＩＸなど）などのパターン認識受容体（ＰＲＲ）のリガンドを結合するにあたってそれが果たす役割に、Ｃｐｎ１０の修飾による影響がおよぶという発見に関するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の第１の態様によれば、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０ポリペプチド（配列番号３）と比較して、核酸ベースのＰＲＲリガンドに対する増加した親和性を有する、単離されたＣｐｎ１０ポリペプチドが得られる。
【０００８】
ＰＲＲは、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）、ヌクレオチド結合ドメインＬＲＲ含有ファミリー（ＮＬＲ）、ＲＩＧ−Ｉ様受容体（ＲＬＲ）、ＩＲＦのＤＮＡ依存性活性化因子（ＤＡＩ）、Ｃ型レクチン受容体（ＣＬＲ）またはＩＦＩ２０Ｘ／ＩＦＩ１６ファミリーのメンバー（Ｉｆｉ１６、Ａｉｍ２、ＭＮＤＡ、ＩＦＩＸなど）であってもよい。
【０００９】
ＴＬＲは、ＴＬＲ３、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８またはＴＬＲ９のうちの少なくとも１つからなる群より選択されるものであってもよい。一実施形態では、ＴＬＲがＴＬＲ９であってもよい。
【００１０】
リガンドは、アゴニストであってもアンタゴニストであってもよい。一実施形態では、前記ポリペプチドは、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０ポリペプチドと比較して、より大きい正味の正電荷を有する。
【００１１】
単離されたポリペプチドは、野生型Ｃｐｎ１０ポリペプチドと比較して、Ｎ末端にグリシン（Ｇ）によるアミノ酸挿入をさらに含むものであってもよい。このポリペプチドは、天然由来のものであってもよいし、組換え生成したものや合成的に生成したものであってもよい。Ｃｐｎ１０は、真核生物起源のものであってもよい。ポリペプチドは、哺乳類起源のものであってもよい。ポリペプチドは、ヒトＣｐｎ１０であってもよい。
【００１２】
もうひとつの実施形態では、単離されたポリペプチドが、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０分子の少なくとも１つの突然変異を有する。突然変異は、アミノ酸の置換、付加または欠失であってもよいし、これらの組み合わせであってもよい。置換は、１つ以上の正に荷電した残基による、１つ以上のアミノ酸残基の置き換えであってもよい。もうひとつの実施形態では、１つ以上の負に荷電した残基が、中性または正に荷電した残基で置き換えられてもよい。突然変異的な付加は、１つ以上の正に荷電した残基を含むことであってもよい。突然変異的な欠失は、１つ以上の負に荷電した残基の除去であってもよい。
【００１３】
もうひとつの実施形態では、中性の残基を正に荷電した残基で置き換えてもよい。正に荷電した残基は、アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）またはヒスチジン（Ｈ）であり得る。中性の残基は、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、プロリン（Ｐ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）、システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）またはＨであり得る。ここで、ヒスチジンはｐＫａが約６．５であるため、ｐＨ７．４（細胞外環境など）で１１％前後イオン化され、ｐＨ６．０（ＴＬＲ３、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、およびＴＬＲ９を含むリソソーム区画など）で７６％前後イオン化されることになる。
【００１４】
もうひとつの実施形態では、少なくとも１つの突然変異が、野生型Ｃｐｎ１０分子のＮ末端、βバレル、可動性ループ、ルーフループ、Ｃ末端または３つの結合ループのいずれかまたはこれらの任意の組み合わせに所在する。
【００１５】
さらに別の実施形態では、ポリペプチドが、野生型Ｃｐｎ１０分子の１〜７位、９位、１２〜１４位、１６位、１８〜４２位、４４位、４６位、５０位、５２〜６３位、６５〜６９位、７３〜７９位、８１位、８３〜８９位、９１〜９４位、９６位、９８位、１００位、１０１位からなる群より選択されるかまたはこれらの任意の組み合わせのアミノ酸位置に、突然変異を含む。
【００１６】
別の実施形態では、前記ポリペプチドが、Ａ１（Ｋ、ＲまたはＨ）、Ｇ２（Ｋ、ＲまたはＨ）、Ｑ３（Ｋ、ＲまたはＨ）、Ａ４（Ｋ、ＲまたはＨ）、Ｆ５（Ｋ、ＲまたはＨ）、Ｒ６（ＫまたはＨ）、Ｋ７（ＲまたはＨ）、Ｌ９（Ｋ、ＲまたはＨ）、Ｆ１２（Ｋ、ＲまたはＨ）、Ｄ１３（Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｃ、Ｍ、ＳまたはＴ）、Ｒ１４（ＫまたはＨ）、Ｌ１６（Ｋ、ＲまたはＨ）、Ｅ１８（Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｃ、Ｍ、ＳまたはＴ）、Ｒ１９（ＫまたはＨ）、Ｓ２０（Ｋ、ＲまたはＨ）、Ａ２１（Ｋ、ＲまたはＨ）、Ａ２２（Ｋ、ＲまたはＨ）、Ｅ２３（Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｃ、Ｍ、ＳまたはＴ）、Ｔ２４（Ｋ、ＲまたはＨ）、Ｖ２５（Ｋ、ＲまたはＨ）、Ｔ２６（Ｋ、ＲまたはＨ）、Ｒ２７（ＫまたはＨ）、Ｇ２８（Ｋ、ＲまたはＨ）、Ｇ２９（Ｋ、ＲまたはＨ）、Ｉ３０（Ｋ、ＲまたはＨ）、Ｍ３１（Ｋ、ＲまたはＨ）、Ｌ３２（Ｋ、ＲまたはＨ）、Ｐ３３（Ｋ、ＲまたはＨ）、Ｅ３４（Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｃ、Ｍ、ＳまたはＴ）、Ｋ３５（ＲまたはＨ）、Ｓ３６（Ｋ、ＲまたはＨ）、Ｑ３７（Ｋ、ＲまたはＨ）、Ｇ３８（Ｋ、ＲまたはＨ）、Ｋ３９（Ｋ、ＲまたはＨ）、Ｖ４０（Ｋ、ＲまたはＨ）、Ｌ４１（Ｋ、ＲまたはＨ）、Ｑ４２（Ｋ、ＲまたはＨ）、Ｔ４４（Ｋ、ＲまたはＨ）、Ｖ４６（Ｋ、ＲまたはＨ）、Ｓ５０（Ｋ、ＲまたはＨ）、Ｓ５２（Ｋ、ＲまたはＨ）、Ｋ５３（ＲまたはＨ）、Ｇ５４（Ｋ、ＲまたはＨ）、Ｋ５５（ＲまたはＨ）、Ｇ５６（Ｋ、ＲまたはＨ）、Ｇ５７（、Ｋ、ＲまたはＨ）、Ｅ５８（Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｃ、Ｍ、ＳまたはＴ）、Ｉ５９（Ｋ、ＲまたはＨ）、Ｑ６０（Ｋ、ＲまたはＨ）、Ｐ６１（Ｋ、ＲまたはＨ）、Ｖ６２（Ｋ、ＲまたはＨ）、Ｓ６３（Ｋ、ＲまたはＨ）、Ｋ６５（ＲまたはＨ）、Ｖ６６（Ｋ、ＲまたはＨ）、Ｇ６７（Ｋ、ＲまたはＨ）、Ｄ６８（Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｃ、Ｍ、ＳまたはＴ）、Ｋ６９（ＲまたはＨ）、Ｐ７３（Ｋ、ＲまたはＨ）、Ｅ７４（Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｃ、Ｍ、ＳまたはＴ）、Ｙ７５（Ｅ、ＧＫ、Ｋ、ＲまたはＨ）、Ｇ７６（Ｋ、ＲまたはＨ）、Ｇ７７（Ｋ、ＲまたはＨ）、Ｔ７８（Ｋ、ＲまたはＨ）、Ｋ７９（ＲまたはＨ）、Ｖ８１（Ｋ、ＲまたはＨ）、Ｄ８３（Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｃ、Ｍ、ＳまたはＴ），Ｄ８４（Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｃ、Ｍ、ＳまたはＴ）、Ｋ８５（Ｋ、ＲまたはＨ）、Ｄ８６（Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｃ、Ｍ、ＳまたはＴ）、Ｙ８７（Ｋ、ＲまたはＨ）、Ｆ８８（Ｋ、ＲまたはＨ）、Ｌ８９（Ｋ、ＲまたはＨ）、Ｒ９１（ＫまたはＨ）、Ｄ９２（Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｃ、Ｍ、ＳまたはＴ）、Ｇ９３（Ｋ、ＲまたはＨ）、Ｄ９４（Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｃ、Ｍ、ＳまたはＴ）、Ｌ９６（Ｋ、ＲまたはＨ）、Ｋ９８（ＲまたはＨ）、Ｖ１００（Ｋ、ＲまたはＨ）、Ｄ１０１（Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｃ、Ｍ、ＳまたはＴ）、ＭＨ−Ｃｐｎ１０、ＭＲ−Ｃｐｎ１０、ＭＫ−Ｃｐｎ１０、ＭＫＫ−Ｃｐｎ１０、ＭＫＫＫ−Ｃｐｎ１０、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−Ｋ２１、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−ＫＫ２１、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−Ｋ３９、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−ＫＫ３９、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−Ｋ５７、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−ＫＫ５７、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−Ｋ７６、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−ＫＫ７６、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−Ｋ８５、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−ＫＫ８５、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−Ｋ１０２、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−ＫＫ１０２、ΔＤ１３、ΔＥ１８、ΔＥ２３、ΔＥ３４、ΔＥ５８、ΔＥ６８、ΔＥ７４、ΔＤ８３、ΔＤ８４、ΔＤ８６、ΔＤ９２、ΔＤ９４、およびΔＤ１０１からなる群より選択される突然変異またはこれらの組み合わせを含む。
【００１７】
もうひとつの実施形態では、突然変異が、表２に定義するようなＮ末端に所在する。この突然変異は挿入であってもよい。たとえば、Ｎ末端での挿入が、それぞれ配列番号３０７、３１３、３１６、３１９、３１０で示すように、ＭＨ、ＭＫ、ＭＫＫ、ＭＫＫＫ、ＭＲからなる群より選択される。
【００１８】
また、Ｃｐｎ１０ポリペプチドは、それぞれ配列番号３７または１０で示すような置換Ｑ３ＫまたはＫ７Ｒを含む。
【００１９】
さらに別の実施形態では、突然変異が、表２に定義するような可動性ループに所在する。この突然変異は欠失であってもよい。欠失は、配列番号１９９および２０２に示すようなＥ２３またはＥ３４であってもよい。突然変異は挿入であってもよい。挿入は、配列番号３２２および３２５に示すようなＫ２１またはＫＫ２１であってもよい。突然変異は置換であってもよい。たとえば、この置換は、配列番号１６、６４、６７、７０、７３、７６、７９、２６５、２６８に示すようなＡ２２Ｋ、Ｅ２３Ｑ、Ｔ２４Ｋ、Ｋ２７Ｒ、Ｇ２９Ｋ、Ｍ３１Ｋ、Ｅ３４Ｋ、Ｅ３４Ｑ、Ｑ３７Ｋからなる群より選択される。
【００２０】
本明細書では、２つ以上のモノマーが互いに共有結合的に結合された７つのＣｐｎ１０モノマーを含む、単離されたＣｐｎ１０オリゴマーも得られる。Ｃｐｎ１０七量体では、１つのモノマーのＣ末端と隣接するモノマーのＮ末端との間に共有結合が形成される。共有結合の形成に用いられるＣ末端およびＮ末端については、１つ以上のアミノ酸（Ａｌａ−Ｃｐｎ１０またはＧｌｙ−Ｃｐｎ１０など）を付加して長くしてもよいし、１つ以上のアミノ酸を除去して短くしてもよい。たとえば、単離されたＣｐｎ１０ポリペプチドは、配列番号３５５に示す共有結合Ｃｐｎ１０である。
【００２１】
別の実施形態では、共有結合的に結合された七量体の各モノマーが、Ａ１（Ｋ、ＲまたはＨ）、Ｇ２（Ｋ、ＲまたはＨ）、Ｑ３（Ｋ、ＲまたはＨ）、Ａ４（Ｋ、ＲまたはＨ）、Ｆ５（Ｋ、ＲまたはＨ）、Ｒ６（ＫまたはＨ）、Ｋ７（ＲまたはＨ）、Ｌ９（Ｋ、ＲまたはＨ）、Ｆ１２（Ｋ、ＲまたはＨ）、Ｄ１３（Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｃ、Ｍ、ＳまたはＴ）、Ｒ１４（ＫまたはＨ），Ｌ１６（Ｋ、ＲまたはＨ）、Ｅ１８（Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｃ、Ｍ、ＳまたはＴ）、Ｒ１９（ＫまたはＨ）、Ｓ２０（Ｋ、ＲまたはＨ）、Ａ２１（Ｋ、ＲまたはＨ）、Ａ２２（Ｋ、ＲまたはＨ）、Ｅ２３（Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｃ、Ｍ、ＳまたはＴ）、Ｔ２４（Ｋ、ＲまたはＨ）、Ｖ２５（Ｋ、ＲまたはＨ）、Ｔ２６（Ｋ、ＲまたはＨ）、Ｒ２７（ＫまたはＨ）、Ｇ２８（Ｋ、ＲまたはＨ）、Ｇ２９（Ｋ、ＲまたはＨ）、Ｉ３０（Ｋ、ＲまたはＨ）、Ｍ３１（Ｋ、ＲまたはＨ）、Ｌ３２（Ｋ、ＲまたはＨ）、Ｐ３３（Ｋ、ＲまたはＨ）、Ｅ３４（Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｃ、Ｍ、ＳまたはＴ）、Ｋ３５（ＲまたはＨ）、Ｓ３６（Ｋ、ＲまたはＨ）、Ｑ３７（Ｋ、ＲまたはＨ）、Ｇ３８（Ｋ、ＲまたはＨ）、Ｋ３９（Ｋ、ＲまたはＨ）、Ｖ４０（Ｋ、ＲまたはＨ）、Ｌ４１（Ｋ、ＲまたはＨ）、Ｑ４２（Ｋ、ＲまたはＨ）、Ｔ４４（Ｋ、ＲまたはＨ）、Ｖ４６（Ｋ、ＲまたはＨ）、Ｓ５０（Ｋ、ＲまたはＨ）、Ｓ５２（Ｋ、ＲまたはＨ）、Ｋ５３（ＲまたはＨ）、Ｇ５４（Ｋ、ＲまたはＨ）、Ｋ５５（ＲまたはＨ）、Ｇ５６（Ｋ、ＲまたはＨ）、Ｇ５７（Ｋ、ＲまたはＨ）、Ｅ５８（Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｃ、Ｍ、ＳまたはＴ）、Ｉ５９（Ｋ、ＲまたはＨ）、Ｑ６０（Ｋ、ＲまたはＨ）、Ｐ６１（Ｋ、ＲまたはＨ）、Ｖ６２（Ｋ、ＲまたはＨ）、Ｓ６３（Ｋ、ＲまたはＨ）、Ｋ６５（ＲまたはＨ）、Ｖ６６（Ｋ、ＲまたはＨ）、Ｇ６７（Ｋ、ＲまたはＨ）、Ｄ６８（Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｃ、Ｍ、ＳまたはＴ）、Ｋ６９（ＲまたはＨ）、Ｐ７３（Ｋ、ＲまたはＨ）、Ｅ７４（Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｃ、Ｍ、ＳまたはＴ）、Ｙ７５（Ｅ、ＧＫ、Ｋ、ＲまたはＨ）、Ｇ７６（Ｋ、ＲまたはＨ）、Ｇ７７（Ｋ、ＲまたはＨ）、Ｔ７８（Ｋ、ＲまたはＨ）、Ｋ７９（ＲまたはＨ）、Ｖ８１（Ｋ、ＲまたはＨ）、Ｄ８３（Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｃ、Ｍ、ＳまたはＴ），Ｄ８４（Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｃ、Ｍ、ＳまたはＴ）、Ｋ８５（Ｋ、ＲまたはＨ）、Ｄ８６（Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｃ、Ｍ、ＳまたはＴ）、Ｙ８７（Ｋ、ＲまたはＨ）、Ｆ８８（Ｋ、ＲまたはＨ）、Ｌ８９（Ｋ、ＲまたはＨ）、Ｒ９１（ＫまたはＨ）、Ｄ９２（Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｃ、Ｍ、ＳまたはＴ）、Ｇ９３（Ｋ、ＲまたはＨ）、Ｄ９４（Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｃ、Ｍ、ＳまたはＴ）、Ｌ９６（Ｋ、ＲまたはＨ）、Ｋ９８（ＲまたはＨ）、Ｖ１００（Ｋ、ＲまたはＨ）、Ｄ１０１（Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｃ、Ｍ、ＳまたはＴ）、ＭＨ−Ｃｐｎ１０、ＭＲ−Ｃｐｎ１０、ＭＫ−Ｃｐｎ１０、ＭＫＫ−Ｃｐｎ１０、ＭＫＫＫ−Ｃｐｎ１０、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−Ｋ２１、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−ＫＫ２１、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−Ｋ３９、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−ＫＫ３９、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−Ｋ５７、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−ＫＫ５７、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−Ｋ７６、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−ＫＫ７６、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−Ｋ８５、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−ＫＫ８５、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−Ｋ１０２、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−ＫＫ１０２、ΔＤ１３、ΔＥ１８、ΔＥ２３、ΔＥ３４、ΔＥ５８、ΔＥ６８、ΔＥ７４、ΔＤ８３、ΔＤ８４、ΔＤ８６、ΔＤ９２、ΔＤ９４、およびΔＤ１０１からなる群より選択されるかまたはこれらの組み合わせの１つ以上の突然変異を含むものであってもよい。もうひとつの実施形態では、突然変異が、表２に定義するようなβバレルに所在する。少なくとも１つの突然変異が置換であってもよい。この置換は、配列番号１３、２５、２８、３１、４６、４９、５２、５５、５８、６１、５８、６１、８５、８８、９１、９４、９７、１１８、１２１、１２４、１４５、１４８、１６０、１６３、１６６、１６９、１７２、１７５、１７８、１８１、１８４、１８７、１９０、２１７、２４４、２５０、２５３、２５６、２５９、２６２、２７４、２８６、２８９、２９２、２９５、２９８、３０１に示すようなＬ９Ｋ、Ｆ１２Ｋ、Ｄ１３Ｋ、Ｄ１３Ｎ、Ｅ１８Ａ、Ｅ１８Ｋ、Ｅ１８Ｍ、Ｅ１８Ｑ、Ｅ１８Ｓ、Ｅ１８Ｒ、Ｒ１９Ｋ、Ｓ２０Ｋ、Ｌ４１Ｋ、Ｑ４２Ｋ、Ｔ４４Ｋ、Ｓ５０Ｋ、Ｓ５０Ｒ、Ｖ６６Ｋ、Ｄ６８Ｋ、Ｄ６８Ｎ、Ｋ６９Ｒ、Ｐ７３Ｋ、Ｇ７７Ｋ、Ｔ７８Ｋ、Ｋ８５Ｒ、Ｄ８６Ｋ、Ｄ８６Ｎ、Ｄ８６Ｒ、Ｙ８７Ｋ、Ｆ８８Ｋ、Ｌ８９Ｋ、Ｄ９２Ｋ、Ｄ９２Ｎ、Ｇ９３Ｋ、Ｄ９４Ａ、Ｄ９４Ｋ、Ｄ９４Ｍ、Ｄ９４Ｎ、Ｄ９４Ｒ、Ｄ９４Ｓ、Ｌ９６Ｋ、Ｋ９８ＲまたはＶ１００Ｋであってもよい。
【００２２】
もうひとつの実施形態では、突然変異が、表２に定義するようなルーフループに所在する。この突然変異は挿入であってもよい。挿入は、配列番号３３４または３３７に示すようなＫ５７またはＫＫ５７であってもよい。突然変異は欠失であってもよい。この欠失は、配列番号２０５に示すようなＥ５８であってもよい。突然変異は置換であってもよく、たとえば、単離されたＣｐｎ１０ポリペプチドが、配列番号６、２２、１００、１０３、１０６、１０９、１１２、１１５、２７１に示すようなＸ−Ｃｐｎ１０−Ｋ５３Ｅ、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−Ｓ５２Ｋ、Ｇ５４Ｋ、Ｋ５５Ｒ、Ｇ５６Ｋ、Ｅ５８Ｋ、Ｅ５８Ｑ、Ｑ６０Ｋ、Ｐ６１Ｋである。もうひとつの実施形態では、単離されたＣｐｎ１０ポリペプチドが、野生型Ｃｐｎ１０ポリペプチドのアミノ酸配列のアミノ酸残基５３位および／または５５位で、ルーフループに１つ以上のアミノ酸置換を含む。たとえば、単離されたＣｐｎ１０ポリペプチドは、配列番号８に示す配列でコードされるようなＡｌａ−Ｃｐｎ１０−Ｋ５３Ｍ、Ｋ５５Ｍであってもよい。
【００２３】
もうひとつの実施形態では、突然変異が、表２に定義するような結合ループＬ１に所在する。この突然変異は挿入であってもよい。挿入は、配列番号３２８または３３１に示すようなＫ３９またはＫＫ３９であってもよい。突然変異は置換であってもよい。たとえば、この置換は、配列番号１９または８２に示すようなＫ３９ＲまたはＶ４０Ｋからなる群より選択される。さらに別の実施形態では、突然変異が、表２に定義するような結合ループ２（下側のリム領域）に所在する。この突然変異は挿入であってもよい。この挿入は、配列番号３４０に示すようなＫ７６であってもよい。突然変異は置換であってもよい。この置換は、配列番号１３０に示すようなＸ−Ｃｐｎ１０−Ｙ７５Ｋあるいは、配列番号１２７、１３３、１３６、１３９、１４２、２３８または２７７に示すようなＡｌａ−Ｃｐｎ１０−Ｅ７４Ｋ、Ｙ７５Ｈ、Ｙ７５Ｋ、Ｙ７５Ｒ、Ｙ７５ＧＫまたはＧ７６Ｋであってもよい。突然変異は欠失であってもよい。この欠失は、配列番号２０８に示すようなＥ７４であってもよい。
【００２４】
別の実施形態では、突然変異が、表２に定義するような結合ループ３に所在する。この突然変異は挿入であってもよい。挿入は、配列番号３４３または３４６に示すようなＫ８５またはＫＫ８５であってもよい。突然変異は置換であってもよい。この置換は、配列番号１５１、１５４、１５７、２８０または２８３に示すようなＶ８１Ｋ、Ｄ８３Ｋ、Ｄ８３Ｎ、Ｄ８４ＫまたはＤ８４Ｎであってもよい。突然変異は欠失であってもよい。この欠失は、配列番号２１１に示すようなＤ８４であってもよい。
【００２５】
もうひとつの実施形態では、突然変異が、表２に定義するようなＣ末端に所在する。この突然変異は挿入であってもよい。挿入は、配列番号３４９または３５２に示すようなＫ１０２またはＫＫ１０２であってもよい。突然変異は置換であってもよい。この置換は、配列番号１９３、１９６または３０４に示すようなＤ１０１Ｋ、Ｄ１０１ＮまたはＤ１０１Ｒであってもよい。
【００２６】
もうひとつの実施形態では、ポリペプチドは、表２に定義するような野生型Ｃｐｎ１０分子のＮ末端、βバレル、可動性ループ、ルーフループ、Ｃ末端または３つの結合ループのいずれかからなる、Ｃｐｎ１０の１つ以上の領域内の任意の位置に、少なくとも２つの突然変異を含むものであってもよい。たとえば、Ｃｐｎ１０ポリペプチドは、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−Ｆ１２Ｋ，Ｄ９２Ｋ、Ｅ１８Ｋ，Ｄ１０１Ｋ；Ｅ３４Ｑ，Ｙ７５Ｋ；Ｑ４２Ｋ，Ｄ１０１Ｋ；Ｔ４４Ｋ，Ｄ１０１Ｋ；Ｓ５０Ｋ，Ｄ１０１Ｋ；Ｑ６０Ｋ，Ｔ７８Ｋ；Ｅ７４Ｋ，Ｙ７５Ｅ；Ｙ７５ＧＫ；Ｙ７５Ｇ，Ｇ７６Ｋ；Ｙ７５Ｋ，Ｄ９４Ｋ；Ｙ７５Ｋ，Ｄ９４Ｎを含むものであってもよい。ポリペプチドは、配列番号２１４、２１７、２２０、２２３、２２６、２２９、２３２、２３５、２３８、２４１、２４４、２４７に示すようなアミノ酸配列を含むものであってもよい。
【００２７】
本発明の第２の態様によれば、第１の態様によるポリペプチドをコードする単離された核酸が得られる。
【００２８】
一実施形態では、単離された核酸が、配列番号７、９、１１、１２、１４、１５、１７、１８、２０、２１、２３、２４、２６、２７、２９、３０、３２、３３、３５、３６、３８、３９、４１、４２、４４、４５、４７、４８、５０、５１、５３、５４、５６、５７、５９、６０、６２、６３、６５、６６、６８、６９、７１、７２、７４、７５、７７、７８、８０、８１、８３、８４、８６、８７、８９、９０、９２、９３、９５、９６、９８、９９、１０１、１０２、１０４、１０５、１０７、１０８、１１０、１１１、１１３、１１４、１１６、１１７、１１９、１２０、１２２、１２３、１２５、１２６、１２８、１２９、１３１、１３２、１３４、１３５、１３７、１３８、１４０、１４１、１４３、１４４、１４６、１４７、１４９、１５０、１５２、１５３、１５５、１５６、１５８、１５９、１６１、１６２、１６４、１６５、１６７、１６８、１７０、１７１、１７３、１７４、１７６、１７７、１７９、１８０、１８２、１８３、１８５、１８６、１８８、１８９、１９１、１９２、１９４、１９５、１９７、１９８、２００、２０１、２０３、２０４、２０６、２０７、２０９、２１０、２１２、２１３、２１５、２１６、２１８、２１９、２２１、２２２、２２４、２２５、２２７、２２８、２３０、２３１、２３３、２３４、２３６、２３７、２３９、２４０、２４２、２４３、２４５、２４６、２４８、２４９、２５１、２５２、２５４、２５５、２５７、２５８、２６０、２６１、２６３、２６４、２６６、２６７、２６９、２７０、２７２、２７３、２７５、２７６、２７８、２７９、２８１、２８２、２８４、２８５ ２８７、２８８、２９０、２９１、２９３、２９４、２９６、２９７、２９９、３００、３０２、３０３、３０５、３０６、３０８、３０９、３１１、３１２、３１４、３１５、３１７、３１８、３２０、３２１、３２３、３２４、３２６、３２７、３２９、３３０、３３２、３３３、３３５、３３６、３３８、３３９、３４１、３４２、３４４、３４５、３４７、３４８、３５０、３５１、３５３、３５４または３５６からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含むものであってもよい。
【００２９】
本発明の第３の態様によれば、第２の態様による核酸を含む発現構築物であって、１つ以上の制御配列に作動可能に連結された構築物が得られる。
【００３０】
核酸は、コドン最適化Ｃｐｎ１０核酸であってもよい。
【００３１】
コドン最適化核酸配列は、トランスファーＲＮＡプールの有用性を高め、一層効率的な終止コドンを開拓し、ＲＮＡ二次構造および／または不安定化要素を除去する１つ以上のヌクレオチド置換を有するものであってもよい。
【００３２】
本発明の第４の態様によれば、第１の態様によるポリペプチドを発現する宿主細胞、または第２の態様による核酸もしくは第３の態様による発現構築物を含む宿主細胞が得られる。
【００３３】
本発明の第５の態様によれば、第１の態様によるポリペプチドと選択的に結合する抗体が得られる。
【００３４】
本発明の第６の態様によれば、第１の態様によるポリペプチドと複合した炎症誘発性核酸または免疫抑制性核酸が得られる。
【００３５】
本発明の第７の態様によれば、第１の態様によるポリペプチド、第２の態様による核酸または第３の態様による発現構築物あるいは第５の態様による抗体を含む、薬学的組成物が得られる。
【００３６】
本発明の第８の態様によれば、第１の態様によるＣｐｎ１０ポリペプチドまたは第２の態様による核酸の治療有効量を前記被験体に投与するステップを含む、被験体を治療する方法が得られる。
【００３７】
治療によって、被験体における免疫応答が調節されることがある。免疫応答は、ＰＲＲシグナル伝達の制御によって調節されることがある。
【００３８】
本発明の第９の態様によれば、第１の態様によるＣｐｎ１０ポリペプチドまたは第２の態様による核酸の有効量を被験体に投与することを含む、被験体における疾患、障害または症状を治療または予防するための方法が得られる。
【００３９】
疾患、障害または症状は、インスリン依存性糖尿病、全身性エリテマトーデス、シェーグレン病（Ｓｊｏｒｇｒｅｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、グレーブス病、多発性硬化症、関節リウマチ、慢性疲労症候群、アルツハイマー病、喘息、アレルギー、ＧＶＨＤ、アテローム性動脈硬化症（ａｒｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、炎症性疼痛、乾癬、ＨＩＶ、慢性免疫活性化（Ｃｈｒｏｎｉｃ ｉｍｍｕｎｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）、慢性筋炎、強皮症などの急性または慢性の炎症性疾患；または非小細胞肺癌、腎細胞癌、メラノーマ、非ホジキンリンパ腫、結腸直腸癌、基底細胞癌などの癌；あるいは感染症から選択されるものであってもよい。感染症は、細菌感染、ウイルス感染または真菌感染に起因するものであってもよい。
【００４０】
一実施形態では、慢性免疫活性化が、胃腸管から循環系への細菌産物および／またはウイルス産物の漏出と関連するものである。たとえば、漏出は、口腔、腸または小腸から起こり得る。細菌産物またはウイルス産物の漏出は、細菌感染、ウイルス感染、炎症性腸疾患および腸疾患などの感染または疾患によって引き起こされる場合がある。ウイルス感染の一例に、ＨＩＶ感染またはＣ型肝炎感染がある。細菌産物は、ＬＰＳまたは核酸を含む場合がある。ウイルス産物は、核酸を含む場合がある。
【００４１】
別の実施形態では、慢性免疫活性化が、ＬＰＳによるＴＬＲシグナル伝達の免疫調節またはＴＬＲへの核酸結合に関与する。ＬＰＳはＴＬＲ４と結合するのに対し、核酸はＴＬＲ３、７、８または９を結合できる。
【００４２】
本発明の第１０の態様によれば、被験体において、またはその少なくとも１つの細胞、組織、もしくは臓器において、ＰＲＲシグナル伝達を調節するための方法であって、第１の態様によるＣｐｎ１０ポリペプチドまたは第２の態様による核酸の治療有効量を投与することを含む方法が得られる。
【００４３】
本発明の第１１の態様によれば、被験体において、またはその少なくとも１つの細胞、組織、もしくは臓器において、１つ以上の免疫調節物質の産生および／または分泌を調節するための方法であって、第１の態様によるＣｐｎ１０ポリペプチドまたは第２の態様による核酸の治療有効量を投与することを含む、方法が得られる。
【００４４】
ポリペプチドは、ＰＲＲリガンドを結合することによって、ＰＲＲからのシグナル伝達を調節するものであってもよい。
【００４５】
免疫調節物質は、炎症促進性サイトカインもしくはケモカインまたは抗炎症性サイトカインもしくはケモカインであってもよい。サイトカインまたはケモカインは、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＲＡＮＴＥＳ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１７、ＩＬ−２３、ＴＧＦ−βまたはＩ型インターフェロンから選択されるものであってもよい。Ｉ型インターフェロンは、ＩＦＮα、ＩＦＮβまたはＩＦＮγであってもよい。
【００４６】
本発明の第１２の態様によれば、被験体において、またはその少なくとも１つの細胞、組織、もしくは臓器において、１つ以上の免疫調節物質の産生および／または分泌を阻害するための方法であって、第１の態様によるＣｐｎ１０ポリペプチドまたは第２の態様による核酸の有効量を投与することを含む、方法が得られる。
【００４７】
ポリペプチドは、ＰＲＲリガンドを結合することによって、ＰＲＲからのシグナル伝達を調節するものであってもよい。ＰＲＲリガンドに対するポリペプチドの結合が、ＰＲＲを有する細胞に対する免疫調節作用を持つものであってもよい。この細胞は、抗原提示細胞であってもよいし、Ｔ細胞またはＢ細胞であってもよい。抗原提示細胞は、樹状細胞、マクロファージまたは単球であってもよい。
【００４８】
免疫調節物質は、炎症促進性サイトカインまたはケモカインであってもよいし、抗炎症性サイトカインまたはケモカインであってもよい。サイトカインまたはケモカインは、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＲＡＮＴＥＳ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１７、ＩＬ−２３、ＴＧＦ−βまたはＩ型インターフェロンから選択されるものであってもよい。Ｉ型インターフェロンは、ＩＦＮα、ＩＦＮβまたはＩＦＮγであってもよい。
【００４９】
本発明の第１３の態様によれば、第１の態様によるポリペプチドと結合する化合物を同定する方法であって、
（ａ）候補化合物を前記ポリペプチドと接触させるステップ、および
（ｂ）候補化合物と前記ポリペプチドとの間の複合体の形成をアッセイするステップ
を含む方法が得られる。
【００５０】
複合体の形成のアッセイは、競合的結合アッセイ、ツーハイブリッドアッセイ、ゲル濾過クロマトグラフィ、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（登録商標）ハイスループットスクリーニング、電気泳動移動度シフト（ゲルシフト）アッセイおよび／またはプレートキャプチャアッセイであってもよい。
【００５１】
アッセイは、定性的であっても定量的であってもよい。
【００５２】
本発明の第１４の態様によれば、第１の態様によるポリペプチドの活性を調節する化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）前記ポリペプチドを、前記ポリペプチドと候補化合物との相互作用を可能にするのに適した条件下で、候補化合物と接触させるステップ、および
（ｂ）前記ポリペプチドの活性をアッセイするステップ
を含む方法が得られる。
【００５３】
ポリペプチドの活性のアッセイは、標識基質を加えるステップと、標識基質の変化を測定するステップとを含むものであってもよい。
【００５４】
本発明の第１５の態様によれば、
（ａ）第１の態様によるポリペプチドを、前記ポリペプチドと候補化合物との相互作用を可能にするのに適した条件下で、候補ＰＲＲリガンド化合物と接触させるステップ、および
（ｂ）Ａｌａ−Ｃｐｎ１０と比較した、前記ポリペプチドとの前記化合物の親和性の増加をアッセイするステップ、および／または
（ｃ）候補ＰＲＲリガンド化合物および第１の態様によるポリペプチドの存在下で、ＰＲＲ活性化の増加または低下をアッセイするステップ
を含む、ＰＲＲリガンドをスクリーニングする方法が得られる。
【００５５】
また、本発明は、上記の態様および実施形態による単離されたＣｐｎ１０ポリペプチドおよびポリヌクレオチドのバリアント、誘導体、ホモログ、アナログ、フラグメントも企図する。
【００５６】
上記の態様および実施形態によれば、Ｃｐｎ１０ポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、どのような動物由来のものであってもよく、組換えＤＮＡ技術を用いて生成したものであっても、合成的に生成したものであってもよい。Ｃｐｎ１０は、真核生物のＣｐｎ１０であってもよい。たとえば、Ｃｐｎ１０はヒトＣｐｎ１０である。
【００５７】
野生型Ｃｐｎ１０分子またはポリペプチドは、アセチル−Ｃｐｎ１０またはＸ−Ｃｐｎ１０（配列番号１）であってもよい。
【００５８】
上記の態様および実施形態によれば、Ｃｐｎ１０ポリペプチドの免疫調節活性は、ポリペプチドの七量体の生成に関与することがある。この七量体は、任意の組み合わせで突然変異体を含むものであってもよいし、非突然変異体ポリペプチドであってもよい。
【００５９】
定義
本明細書の文脈において、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という表現は、「主に含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）が必ずしもそれだけとはかぎらない」ことを意味する。さらに、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」や「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」などの「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という単語の活用形についても、その形に応じて意味が変化する。
【００６０】
「野生型」という用語は、Ｃｐｎ１０分子またはポリペプチドに関して本明細書で使用する場合、天然または非天然の形態を含む。たとえば、天然のヒトＣｐｎ１０は、そのＮ末端でアセチル化される。本発明では、野生型Ｃｐｎ１０という用語の範囲内に、配列番号１に示すようなアセチル化された（Ｘ−Ｃｐｎ１０）分子またはアセチル化されていない（Ｘ−Ｃｐｎ１０）分子を企図する。
【００６１】
「Ａｌａ−Ｃｐｎ１０」という用語は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で産生されるヒトＣｐｎ１０を示す。この場合、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０はＮ末端のアラニン残基が多い状態で産生される。Ａｌａ−Ｃｐｎ１０の配列を配列番号３としてあげておく。
【００６２】
「免疫調節物質」という用語は、免疫系と相互作用し、免疫応答の活性化、阻害、調節、維持、成熟、抑制または増強において役割を果たす分子メディエータを意味する。免疫調節物質は、炎症促進性サイトカインもしくはケモカインまたは抗炎症性サイトカインもしくはケモカインであってもよい。サイトカインまたはケモカインは、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＲＡＮＴＥＳ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１７、ＩＬ−２３、ＴＧＦ−βまたはＩ型インターフェロンから選択されるものであってもよい。Ｉ型インターフェロンは、ＩＦＮα、ＩＦＮβまたはＩＦＮγであってもよい。
【００６３】
「パターン認識受容体」またはＰＲＲという用語は、本明細書で使用する場合、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）、ヌクレオチド結合ドメインＬＲＲ含有ファミリー（ＮＬＲ）、ＲＩＧ−Ｉ様受容体（ＲＬＲ）、ＩＲＦのＤＮＡ依存性活性化因子（ＤＡＩ）、Ｃ型レクチン受容体（ＣＬＲ）またはＩＦＩ２０Ｘ／ＩＦＩ１６ファミリーのメンバー（Ｉｆｉ１６、Ａｉｍ２、ＭＮＤＡ、およびＩＦＩＸなど）をはじめとするいくつかのクラスの生殖系列コードタンパク質を意味する（たとえば、審良（Ａｋｉｒａ）ら， Ｃｅｌｌ ２００６， １２４：７８３〜８０１；Ｌａｔｚ， Ｅ．およびＦｉｔｚｇｅｒａｌｄ， Ｋ．Ａ．（２００８） Ｎａｔ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｖｏｌ． ８， Ｎｏ． ４， Ｐｏｓｔｅｒを参照のこと）。通常、ＰＲＲは核酸ベースのＰＲＲ（通常は細胞内に常在）と細胞表面ＰＲＲ（通常は疎水性リガンドを認識する）の２つの群に分けられる。ＰＲＲは、抗原提示細胞（樹状細胞、単球、マクロファージなど）、Ｔ細胞、Ｂ細胞を含むがこれに限定されるものではないさまざまな細胞型に存在する。
【００６４】
「Ｔｏｌｌ様受容体」またはＴＬＲという用語は、病原体と相互作用し、感染に対する宿主免疫応答を作動させる受容体を意味する。哺乳動物では、病原体によるＴＬＲの活性化によって、病原体の散在を防止し、なおかつ樹状細胞上のＴＬＲによって、獲得免疫の発達を指示する自然免疫の炎症過程が発動される。ＴＬＲは、ヒトで知られる生殖系列１０における限られた数の遺伝子によってコードされる。これらの１０受容体は、リポ多糖などの糖脂質、フラゲリンなどのタンパク質、ｄｓＲＮＡなどの核酸をはじめとして、多岐にわたる病原体由来の分子サインを認識する。ＴＬＲは、通常は疎水性リガンドを認識する細胞表面ＴＬＲと、通常は核酸ベースのリガンドを認識する細胞内ＴＬＲ（すなわちＴＬＲ−３、ＴＬＲ−７、ＴＬＲ−８、ＴＬＲ−９）の２つの群に分けられる。
【００６５】
本明細書で使用する場合、「調節する（ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ）」、「調節する（ｍｏｄｕｌａｔｅｓ）」ならびにその活用形は、本発明の特定の調節分子または調節剤の非存在下での活性、生成、分泌のレベルまたはそれの他の機能と比較して、調節分子または調節剤の存在下における活性、生成、分泌のレベルまたは分子の機能が増大または減少することを示す。これらの用語は、増減の定量化を暗示するものではない。調節は、所望の結果を生成できればどのような大きさであってもよく、直接的であっても間接的であってもよい。
【００６６】
「正味の電荷」という用語は、本明細書で使用する場合、分子の変化を示す。タンパク質、ペプチド、ポリペプチド（Ｃｐｎ１０ポリペプチドなど）といったアミノ酸配列を含む分子は、正または負に荷電できるものである。特定ｐＨでのポリペプチドの正味の電荷については、ヘンダーソン−ハッセルバルヒ式（Ｈａｓｓｅｌｂａｌｃｈ， Ｋ．Ａ．， １９１７ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｃｈｅ Ｚｅｉｔｓｃｈｒｉｆｔ ７８： １１２〜１４４）と、ポリペプチドのイオン化可能なアミノ酸側鎖およびＮ末端およびＣ末端の周知のｐＫａ値とに基づいて計算で求めることが可能である。
【００６７】
「正味の正電荷がより大きい」という表現は、本明細書で使用する場合、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０に対する分子の正電荷の増加である。
【００６８】
「可動性ループ」という表現は、１８個のアミノ酸残基を含むＣｐｎ１０分子の柔軟な領域である。可動性ループは、残基Ａ２１〜Ｇ３８を含む（図１参照；残基の番号は、本明細書で説明するようなアセチル化されたまたはアセチル化されていないＸ−Ｃｐｎ１０（配列番号１）のいずれかに基づくものである）。
【００６９】
「ルーフループ」という用語は、１４個のアミノ酸残基を含むＣｐｎ１０分子の柔軟な領域である。ルーフループは、残基Ｓ５２〜Ｖ６２を含む（図１参照；残基の番号は、本明細書で説明するようなアセチル化されたまたはアセチル化されていないＸ−Ｃｐｎ１０（配列番号１のいずれかに基づくものである）。
【００７０】
本明細書で説明するような「βバレル」は、５つのセグメントすなわち、１番目、２番目、３番目、４番目、５番目のセグメントを含むＣｐｎ１０分子の領域である。１番目のセグメントは、残基Ｆ８〜Ｓ２０を含み、２番目のセグメントはＬ４１〜Ｇ５１を含み、３番目のセグメントはＳ６３〜Ｐ７３を含み、４番目のセグメントはＧ７７〜Ｖ８０を含み、５番目のセグメントは残基Ｋ８５〜Ｖ１００を含む（図１参照）。残基の番号は、本明細書で説明するようなＸ−Ｃｐｎ１０（配列番号１）に基づくものである。
【００７１】
「結合ループ」という用語は、可動性ループおよびルーフループなど、Ｃｐｎ１０分子のさまざまなループをβバレルと接続するＣｐｎ１０分子の柔軟な領域を示す。結合ループには、１番目、２番目、３番目の３つがある。１番目の結合ループは残基Ｋ３９〜Ｖ４０を含む。２番目の結合ループはＥ７４〜Ｇ７６を含み、３番目のループは残基Ｖ８１〜Ｄ８４を含む（図１参照）。残基の番号は、本明細書で説明するようなＸ−Ｃｐｎ１０（配列番号１）に基づくものである。
【００７２】
「Ｎ末端」という用語は、残基Ａ１〜Ｋ７を含むＣｐｎ１０分子のＮ末端の柔軟な領域（図１参照）である。残基の番号は、本明細書で説明するようなＸ−Ｃｐｎ１０（配列番号１）に基づくものである。
【００７３】
「Ｃ末端」という用語は、Ｃｐｎ１０分子のＤ１０１を含む（図１参照；残基の番号は、本明細書で説明するようなＸ−Ｃｐｎ１０（配列番号１）に基づくものである）。
【００７４】
「アミノ酸」という用語は、本明細書で使用する場合、アミン官能基とカルボキシル官能基の両方を含む分子を意味する。
【００７５】
「荷電した残基」という用語は、本明細書で使用する場合、正または負の電荷を持つための電位のある側鎖を有するアミノ酸残基を意味する。
【００７６】
「ポリペプチド」という用語は、ペプチド結合によって互いに結合されたアミノ酸で構成されるポリマーを意味する。「ポリペプチド」という用語は、全長タンパク質の一部を構成するものであってもよい。さらに、「ポリペプチド」という用語は、野生型Ｃｐｎ１０分子と比較してそのアミノ酸配列に少なくとも１つの修飾を呈することがあるポリペプチドを示す。この修飾は、ユビキチン化、（放射性核種またはさまざまな酵素での）標識、ペグ化（ポリエチレングリコールによる誘導体化）などの共有ポリマー結合、オルニチンなどのアミノ酸の化学合成による挿入または置換（これらはヒトタンパク質で天然に発生するものである）といった技術などの化学修飾を含むものであってもよい。
【００７７】
「ポリヌクレオチド」という用語は、本明細書で使用する場合、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド塩基あるいは、天然ヌクレオチドの周知のアナログまたはこれらの混合物の一本鎖または二本鎖ポリマーを示す。この用語には、特に明記しないかぎり、特定配列ならびにこれと相補な配列を含む。「ポリヌクレオチド」および「核酸」は、本明細書では同義に用いられる。
【００７８】
「ＣｐＧ」という用語は、本明細書で使用する場合、塩基の直鎖状配列においてその長さ方向にシトシンヌクレオチドがグアニンヌクレオチドの次に生じ、ＤＮＡで２つのヌクレオシドを連結するリン酸塩によって分離されているＤＮＡの領域内のメチル化されていない部位を示す。「ＣｐＧ」は、上記の意味と、グアニンと対をなすシトシン塩基とを区別するのに用いられる。抗原提示細胞を刺激する機能に違いのある３つの異なるタイプのＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドが同定されている。すなわち、ＣｐＧ−Ａ（ヒトＯＤＮ−２２１６）は形質細胞様樹状細胞（ＰＤＣ）において大量のインターフェロン−α（ＩＦＮ−α）およびＩＦＮ−βを誘導する。ＣｐＧ−Ｂ（ヒトＯＤＮ−２００６およびマウスＯＤＮ−１８２６）はＰＤＣ成熟を誘導し、Ｂ細胞の強力な活性化因子であるが少量のＩＦＮ−αおよびＩＦＮ−βしか刺激しない。これに対し、ＣｐＧ−Ｃ（ヒトＯＤＮ−Ｍ３６２）はＢ細胞およびＮＫ細胞を誘導し、ヒト末梢血単核細胞のＩＦＮ−α産生を誘導する。
【００７９】
「単離された」という表現は、対象となる分子が、存在する優勢な種になる（分子ベースで組成物／試料中に個々の他の種より豊富である）ような形で、対象となる分子がその天然の環境または宿主から取り出され、関連の不純物が低減または除去された状態のことを意味する。一般に、実質的に精製された画分とは、存在する全巨大分子種の少なくとも約３０パーセントを目的の種が占める組成物である。通常、実質的に純粋な組成物は、組成物中に存在する全巨大分子種の約８０〜９０パーセントを超えて含むことになる。最も一般には、目的の種を実質的に同質になる（従来の検出方法では組成物中に汚染種を検出できない）まで精製し、その組成物は実質的に単一の巨大分子種からなる。
【００８０】
本明細書で使用する場合、「実質的に」という表現は、大多数であるが必ずしもすべてとはかぎらないことを意味し、したがって、対応する野生型ポリペプチドの構成領域を「実質的に」欠いた修飾ポリペプチドといえば、その修飾ポリペプチドがその構成領域の一部を保持することがある。たとえば、対応する野生型ポリペプチドの構成領域を「実質的に」欠いた修飾ポリペプチドは、その構成領域の配列の５０パーセント前後またはそれ未満を保持することがあるが、一般に構成領域は、取り除かれる領域の配列の割合に応じて、構造的および／または機能的に不活性にされる。
【００８１】
「保存的アミノ酸置換」という用語は、本明細書で使用する場合、１つのアミノ酸を同様の構造的および／または化学的特性を持つ他のアミノ酸で置き換えることを示す。保存的アミノ酸置換は、関与する残基の極性、電荷、可溶性、疎水性、親水性および／または両親媒の性質のうちの１つ以上の類似性に基づいてなされるものであってもよい。たとえば、非極性（疎水性）アミノ酸には、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、システイン、メチオニンがある。荷電していない極性のアミノ酸には、グリシン、セリン、スレオニン、アスパラギン、グルタミンがある。正に荷電した（塩基性）極性のアミノ酸には、アルギニン、リジン、ヒスチジンがある。負に荷電した（酸性）アミノ酸には、アスパラギン酸およびグルタミン酸がある。アミノ酸の「挿入」または「欠失」は、好ましくはアミノ酸約１〜２０個、一層好ましくはアミノ酸１〜１０個の範囲である。その変形については、組換えＤＮＡ技術を用いてポリペプチド分子におけるアミノ酸の挿入、欠失または置換を体系的に実施し、得られた組換えバリアントの活性をアッセイすることで、実験で求めるようにしてもよい。
【００８２】
本明細書で使用する場合、「治療」、「治療する」という表現ならびにその活用形は、疾患状態または症候を改善し、疾患の確立を予防し、そうでなければ疾患または他の望ましくない症候の進行を何らかの形で予防、妨害、遅延または反転するあらゆる用途を示す。
【００８３】
本明細書で使用する場合、「有効量」という用語は、その意味に、無毒であるが所望の治療効果または予防効果を得られるだけの作用剤または化合物の十分な量を含む。必要とされる厳密な量は、治療対象となる種、被験体の年齢と全身症状、治療対象となる症状の重症度、投与対象となる特定の作用剤、投与モードなどの要因に応じて、被験体ごとに異なる。このため、厳密な「有効量」を指定することが可能である。しかしながら、どの事例でも、適当な「有効量」は当業者が常法の実験だけで決定できるものである。
【図面の簡単な説明】
【００８４】
【図１】Ａ．Ｃｐｎ１０のさまざまな領域を示す大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｃｐｎ１０（ＧｒｏＥＳ）の結晶構造。Ｃｐｎ１０は、１０ｋＤａの同一のサブユニット７個からなる。Ｂ．Ｃｐｎ１０とＧｒｏＥＳのアミノ酸配列を示す。ＧｒｏＥＳのリボン構造は、Ｘｕら（Ｎａｔｕｒｅ １９９７， ３８８：７４１〜７５０）によって刊行されたＸ線結晶配位から作成したものであり、この構造では、通常は無秩序な可動性ループがＧｒｏＥＬとの相互作用によって完全に整列配置されている（この図ではＧｒｏＥＬを省略した）。
【図２】多数の生物王国から得たヒトＣｐｎ１０とＣｐｎ１０ホモログの配列アライメント。ヒトＣｐｎ１０とは異なるアミノ酸に影を付けてある。可動性ループおよびβヘアピンルーフループの位置を示す。囲み（ａからｅでマーク）は、５５残基βバレルコアの予測される境界を示す（Ｈｕｎｔら， １９９７ Ｃｅｌｌ ９０： ３６１〜３７１）。ヒトＣｐｎ１０に対するさまざまなホモログの同一性および類似性のパーセンテージを示す。各タンパク質のＳｗｉｓｓＰｒｏｔの受入番号をあげておく。ヒトＣｐｎ１０に対する配列の同一性（％）と類似性（％）の計算は、ＮＣＢＩブラスト（Ａｌｔｓｃｈｕｌら， １９９７ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５：３３８９〜３４０２）を用いて実施し、ＮＳ＝有意な類似性が認められなかったことを示す。また、ＥｘＰＡＳｙプロテオミクスサーバーＰｒｏｔＰａｒａｍ Ｔｏｏｌ（ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｔｏｏｌｓ／ｐｒｏｔｐａｒａｍ．ｈｔｍｌ）を用いて等電点（ｐＩ）を計算した。
【図３】クーマシーブリリアントブルーで染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、組換えＣｐｎ１０タンパク質が＞９９％純粋であることが明らかになる。
【図４】１μｇのＴＬＲ３アゴニストポリ（Ｉ：Ｃ）（合成ｄｓＲＮＡアナログ）を、５０μｇのＣｐｎ１０バリアントと一緒に、表記の塩濃度で１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）にて２３℃で１時間インキュベートした。試料を１％ＴＡＥアガロースゲルにて分離し、臭化エチジウムで染色した。遊離Ｃｐｎ１０が負電極（ゲルの頂部）に向かって遊走するのに対し、遊離ポリ（Ｉ：Ｃ）は正電極（ゲルの底部）に向かって遊走し、Ｃｐｎ１０−ポリ（Ｉ：Ｃ）の複合体は両方の分子の移動を遅らせる。
【図５】１μｇのヒトＯＤＮ−２２１６クラスＡ（ＴＬＲ９アゴニスト；Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）を、５０μｇのＣｐｎ１０と一緒に、表記の塩濃度で１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）にて２３℃で１５分間インキュベートした。試料を１％ＴＡＥアガロースゲルにて分離し、臭化エチジウムで染色した。遊離Ｃｐｎ１０が負電極（ゲルの頂部）に向かって遊走するのに対し、遊離ＣｐＧ−ＯＤＮは正電極（ゲルの底部）に向かって遊走し、Ｃｐｎ１０−ＣｐＧ−ＯＤＮの複合体は両方の分子の移動を遅らせる。
【図６】０．５μｇの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２ ｓｓＲＮＡ（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ カタログ番号ｔｌｒｌ−ｅｃｒｎａ）（ＴＬＲ７／８アゴニスト）を、５０μｇのＣｐｎ１０バリアントと一緒に、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）中、表記の塩濃度（０、１５０および５００ｍＭ ＮａＣｌ）にて２３℃で３０分間インキュベートした。試料を１％ＴＡＥアガロースゲルにて分離し、臭化エチジウムで染色した。遊離Ｃｐｎ１０が負電極（ゲルの頂部）に向かって遊走するのに対し、遊離ｓｓＲＮＡは正電極（ゲルの底部）に向かって遊走し、Ｃｐｎ１０−ｓｓＲＮＡの複合体は両方の分子の移動を遅らせる。
【図７】ＣｐＧオリゴヌクレオチド（ＯＤＮ）に対するＣｐｎ１０結合の定量分析。調製緩衝液ｐＨ７．２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０およびＣｐｎ１０突然変異体を１μｇ／μｌで調製し、９６ウェルのプレートの三重ウェルに、４℃で１６時間、５０μｇを吸着させた。結合しなかったタンパク質をデカントした後、プレートを１％ＢＳＡおよび５％スクロースのＰＢＳ溶液（ｐＨ７．２）で２３℃で２時間ブロックした。ＰＢＳ（ｐＨ７．２）中０．０２μｇ／μｌで調製された５０μｌの３’−ビオチン標識ヒトＯＤＮ−２２１６クラス−Ａ、ヒトＯＤＮ−２００６クラス−ＢまたはヒトＯＤＮ−Ｍ３６２クラス−Ｃ（ＴＬＲ９アゴニスト）（Ｐｒｏｌｉｇｏ／Ｓｉｇｍａ）を各ウェルに加え、２３℃で２時間インキュベートした。未結合のリガンドを、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０で５回洗浄して取り除いた。結合したＣｐＧ−ＯＤＮをストレプトアビジン−ＨＲＰおよびＴＭＢ検出系でＡ４５０ｎｍにて分析した。結果は３つの複製の平均であり、各ＣｐＧに対するＡｌａ−Ｃｐｎ１０の結合のレベルに正規化したものである。
【図８】Ｃｐｎ１０がＣｐＧ−Ｂ ＯＤＮ誘発ＮＦκＢ活性を調節する。Ｇｅｎｅｊｕｉｃｅを製造業者の指示（Ｎｏｖｏｇｅｎ）どおりに使用し、ｐＮｉｆｔｙ ＮＦκＢ−ルシフェラーゼレポータープラスミド（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）をＲＡＷ２６４．７（マウスマクロファージ）細胞にトランスフェクトした。２４時間後、細胞をトリプシン処理し、カウントし、２．５×１０^５個の細胞を１ｍｌの培地にて２４ウェルのプレートの各ウェルに蒔き、一晩放置して接着させた。１００μｇのＣｐｎ１０構築物または調製緩衝液の対照を４μｇのＣｐＧ−Ｂ ＯＤＮ−１８２６（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）と混合し、遠心濾過装置ＹＭ１０（Ａｍｉｃｏｎ）に通した。流動容量分全体をＲＡＷ２６４−ｐＮＩＦｔｙ−ＬＵＣ細胞に加え、３７℃で５時間インキュベートした。細胞を洗浄した後、１ウェルあたり１００μｌのＣＣＬＲ １×溶液（Ｐｒｏｍｅｇａルシフェラーゼ溶解緩衝液）で溶解させ、製造業者の指示どおりにルシフェラーゼ基質と混合し、ルシフェラーゼカウントを測定した。図は、１００％のＡｌａ−Ｃｐｎ１０に正規化したＮＦκＢ活性化レベルを示すものである。
【図９】ポリ（Ｉ：Ｃ）刺激に対するＣｐｎ１０突然変異体による影響。ＧｅｎｅＪｕｉｃｅを製造業者の指示（Ｎｏｖｏｇｅｎ）どおりに使用し、ｐＮｉｆｔｙ ＮＦｋＢ−ルシフェラーゼ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）およびＴＬＲ３をコードするプラスミドをＨＥＫ２９３細胞に一過的にトランスフェクトした。２４時間後、トランスフェクト細胞をトリプシン処理し、カウントし、１×１０^５個の細胞を１ｍｌの培地にて２４ウェルのプレートの各ウェルに蒔き、２４時間放置して接着させた。次に、１００ｕｇのＣｐｎ１０、０．１ｕｇのポリ（Ｉ：Ｃ）（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）、１０ｕｌのＳＵＰＥＲａｓｅ ＲＮＡｓｅ阻害因子（Ａｍｂｉｏｎ）を、各ウェルに２４時間加えた。続いて上清を除去し、細胞をＰＢＳで洗浄し、１×溶解緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ）で溶解させ、ルシフェラーゼをアッセイした。ルシフェラーゼのレベルを１００％のポリ（Ｉ：Ｃ）単独に正規化した。値は３つ重複させたウェルの平均を表す。
【発明を実施するための形態】
【００８５】
Ｃｐｎ１０は、１０ｋＤａの同一のサブユニットからなるドーム形の七量体リングである（図１）。ドームの表面は親水性であり、高度に荷電されている。それぞれのＣｐｎ１０サブユニットは、いくつかのループ構造によって結合される５つのセグメントで不規則なβバレルの形態を形成する。３つの小さな結合ループと、バレルから突出する２つの大きなループ伸展部がある。第１の伸展部は、七量体の中心に向かって伸展し、ドーム様構造のルーフを形成するβヘアピンループ（「ルーフループ」）である。興味深いことに、生理的な条件下でＧｒｏＥＳ（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｃｐｎ１０）のルーフには、ルーフループの先端に負に荷電した残基のクラスターが含まれるのに対し、哺乳類Ｃｐｎ１０のルーフでは、ルーフループの先端にアミノ酸の正に荷電したクラスターが含まれる。一方、バクテリオファージのＣｐｎ１０（Ｇｐ３１）からはルーフの大部分が完全に欠けている。また、この分子は、ドームの底から伸展し、Ｃｐｎ６０との相互作用を媒介する柔軟な１８個のアミノ酸からなる可動性ループである、別の伸展部を有する。残基Ｇｌｕ−７４、Ｔｙｒ−７５、Ｇｌｙ−７６で構成される小さな接続ループのうちの１つは、ドームの底から伸展し、内側に突出して下側のリム領域を形成する。下側のリム領域のアミノ酸残基は、ほとんどの真核生物で系統発生的に保存されている。
【００８６】
どのような機序または経路にも拘泥することなく、本発明者らは、Ｃｐｎ１０ポリペプチドの電荷を変更する、主にアミノ酸の置換、欠失、付加またはこれらの組み合わせによって一連の突然変異を生成し、Ｃｐｎ１０と１つ以上のＰＲＲリガンドとの相互作用を改変する、特にＰＲＲリガンドに対するＣｐｎ１０の結合親和性（ＰＲＲシグナル伝達によって免疫系／応答を調節する機能の指標である）を高める上で、突然変異が有効であることを本明細書にて示す。ＰＲＲリガンドに対するＣｐｎ１０ポリペプチドの結合には、ＰＲＲを持つ特定の免疫細胞に対する免疫調節作用がある。細胞は、抗原提示細胞であってもよいし、Ｔ細胞またはＢ細胞であってもよい。抗原提示細胞は、樹状細胞であってもよいし、マクロファージまたは単球であってもよい。
【００８７】
Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）、ヌクレオチド結合ドメインＬＲＲ含有ファミリー（ＮＬＲ）、ＲＩＧ−Ｉ様受容体（ＲＬＲ）、ＩＲＦのＤＮＡ依存性活性化因子（ＤＡＩ）、Ｃ型レクチン受容体（ＣＬＲ）、ＩＦＩ２０Ｘ／ＩＦＩ１６ファミリー（Ｉｆｉ１６、Ａｉｍ２、ＭＮＤＡおよびＩＦＩＸ）をはじめとするパターン認識受容体（ＰＲＲ）は、免疫系の番人であり、特定の病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰＳ）を認識し、免疫応答を発動して、侵入してくる病原体に対する防御の最前線で働く。また、ＰＲＲは、自己分子が変化するとＰＲＲを過剰に活性化させ、病的な状態を発生させることにつながる敗血症、自己免疫疾患または慢性炎症性疾患をはじめとする多くの炎症性症候群で、何らかの役割を果たしているようにも思われる。
【００８８】
Ｃｐｎ１０ポリペプチド突然変異体
陽性残基の付加または陰性残基の除去による余分な正電荷の追加によって、核酸ベースのＰＲＲリガンドに対して（Ａｌａ−Ｃｐｎ１０およびＸ−Ｃｐｎ１０よりも）かなり強く結合するＣｐｎ１０分子が生成される。余分な正電荷は、（１）既存の表面／液（ｓｏｌｕｔｉｏｎ）露出中性残基または陰性残基を陽性残基で置き換える、（２）既存の表面／液露出陰性残基を中性残基で置き換える、（３）別の表面／液露出陽性残基を導入する（ループ構造またはＮ末端およびＣ末端を延長するなど）または（４）既存の表面／液露出陰性残基を取り除く（ループ構造またはＮ末端およびＣ末端を短くするなど）ことによって追加可能である。本発明者らが得た結果では、複数の正電荷を導入すると（Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−Ｙ７５Ｋ、Ｄ９４Ｋなど）、個々の突然変異よりも結合電位が有意に高まる場合があることも分かる。
【００８９】
タンパク質の正味の電荷の計算
特定ｐＨでのポリペプチドの正味の電荷を、ヘンダーソン−ハッセルバルヒ式（Ｈａｓｓｅｌｂａｌｃｈ， Ｋ．Ａ．， １９１７ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｃｈｅ Ｚｅｉｔｓｃｈｒｉｆｔ ７８： １１２〜１４４）と、ポリペプチドのイオン化可能なアミノ酸側鎖ならびにＮ末端およびＣ末端の周知のｐＫａ値とに基づいて計算する。ヘンダーソン−ハッセルバルヒ式は、弱酸／塩基およびそのコンジュゲート塩基／酸を含有する溶液のｐＨは、以下の明らかなように、これら２種類の溶質のモル濃度の比にのみ左右され、希釈率とは無関係なままであることも示している。
ヘンダーソン−ハッセルバルヒ式
酸の式：ｐＨ＝ｐＫ_ａ＋ｌｏｇ［Ａ⁻］／［ＨＡ］（Ｃ末端、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｃｙｓ、Ｔｙｒで使用）
塩基の式：ｐＨ＝ｐＫ_ａ＋ｌｏｇ［Ｂ］／［ＢＨ^＋］（Ｎ末端、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓで使用）
式中、［Ａ⁻］は関連する酸のコンジュゲート塩基のモル濃度（Ｃ末端、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｃｙｓ、Ｔｙｒ）を示し、［ＢＨ^＋］は、関連する塩基のコンジュゲート酸のモル濃度（Ｎ末端、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ）を示す。ポリペプチド内のイオン化可能な基のｐＫａ値は当該技術分野において周知であり、多数の学術雑誌やテキストに見いだすことが可能である。使用するｐＫａ値の組次第で、計算で得られるタンパク質の正味の電荷は若干変わってくるが、これは本研究で得られる結論を変えるものではない。表３で用いたｐＫａ値は、Ｎ末端８．０、Ｃ末端３．１、Ｌｙｓ １０．０、Ａｒｇ １２．０、Ｈｉｓ ６．５、Ｇｌｕ ４．４、Ａｓｐ ４．４、Ｔｙｒ １０．０、Ｃｙｓ ８．５である（Ｓｔｒｙｅｒ， Ｌ．， １９８８ 「Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」 ｔｅｘｔｂｏｏｋ 第３版， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ， ＩＳＢＮ ０７１６７１９２０７）。
【００９０】
このため、イオン化可能な基を複数有するポリペプチドでは、特定ｐＨにおけるそのポリペプチドの正味の電荷を以下のようにして計算すればよい。
１．イオン化可能な残基（Ｃｙｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｔｙｒ、カルボキシル末端、アミノ末端）をすべて列挙する。
２．イオン化可能な基のｐＫａがｐＨ値から≧２単位離れている場合、計算なしで電荷を１、０、−１と割り当てることが可能である。たとえば、ｐＨ７．３で、リジン（ｐＫａ１０．０）は１００％プロトン化され、平均電荷が＋１となる。一方、ｐＨ７．３では、グルタミン酸塩（ｐＫａ４．４）とアスパラギン酸塩（ｐＫａ４．４）がいずれも１００％脱プロトン化され、平均電荷が−１となる。
３．ヘンダーソン−ハッセルバルヒ式を使用して、特定ｐＨでの各イオン化可能な基のイオン化率を計算する。表３では、ｐＨ７．３とｐＨ７．４（生理的なｐＨとして採用）で計算を行った。
４．各イオン化可能な基のイオン化率（ｚ_ｉ）に特定のポリペプチド内に生じる個々のイオン化可能な基の総数（ｎ_ｉ）を掛け、各々のイオン化可能な基によって得られる総電荷を得る。次に、各々のイオン化可能な基によって得られるすべての電荷を総和（Ｚ＝Σｎ_ｉｚ_ｉ）して、特定ｐＨでのそのポリペプチドの正味の電荷にすることで、特定ｐＨでのポリペプチドの正味の電荷（Ｚ）を得る。
【００９１】
ポリペプチドの正味の電荷を求めるこのアプローチを使いやすいように自動化した、多数の無料で利用可能な資源が存在する。たとえば、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃａｌｃｕｌａｔｏｒ Ｖ３．３（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｃｒｉｐｐｓ．ｅｄｕ／〜ｃｄｐｕｔｎａｍ／ｐｒｏｔｃａｌｃ．ｈｔｍｌ）は、アミノ酸配列に基づいてタンパク質の正味の電荷を求めるための無料で利用できるツールである。このツールを使用し、表３に示すような生理的ｐＨ（７．３〜７．４を採用）で多数のＣｐｎ１０ポリペプチドの正味の電荷を求めた。
【００９２】
突然変異のタイプ
陽性残基を加えるか陰性残基を取り除くことで、炎症誘発性核酸に対する親和性の高いＣｐｎ１０バリアントを生成することが可能である。炎症誘発性核酸に対する親和性の高いＣｐｎ１０バリアントを生成するのに利用した突然変異は、突然変異によってｐＨ７．４での正電荷がＡｌａ−Ｃｐｎ１０よりも高いＣｐｎ１０バリアントが得られるのであれば、アミノ酸残基の挿入、欠失、置換または付加あるいはこれらの組み合わせでよい。
【００９３】
一実施形態では、図１ｂに定義するＣｐｎ１０ポリペプチドのいずれかの領域などに対して、既存の残基を正に荷電した残基で置き換えてもよいし、負に荷電した残基を中性残基で置き換えてもよく、別の正に荷電した残基を加えたり、負に荷電した残基を取り除いたりしてもよい。突然変異については、部位特異的突然変異誘発、相同的組換え、トランスポゾン突然変異誘発または配列タグ突然変異誘発などの当該技術分野において周知のどのような手段で作り出してもよい。一般に、部位特異的突然変異誘発を使用する。
【００９４】
当業者であれば、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０よりもｐＨ７．４での正電荷が高く、炎症誘発性核酸に対する親和性の高いＣｐｎ１０バリアントを生じる突然変異の数とタイプについては、いずれも本発明の範囲に包含されることを認識するであろう。
【００９５】
ポリペプチド
本明細書に開示するように、本発明は、単離されたＣｐｎ１０ポリペプチドならびに、１つ以上のアミノ酸の欠失、付加または置換を含む核酸ベースのＰＲＲリガンドに対する親和性をＡｌａ−Ｃｐｎ１０よりも高くすることを企図している。
【００９６】
Ｃｐｎ１０は、天然のものであってもよいし、天然由来、組換えまたは合成Ｃｐｎ１０であってもよい。Ｃｐｎ１０分子は、真核生物から得られるどのようなＣｐｎ１０ポリペプチドであってもよい。図２に示すような一例として、Ｃｐｎ１０は、酵母（出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）など）、線形動物（線虫（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ）など）、カエル（ゼノパス・トロピカリス（Ｘｅｎｏｐｕｓ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）など）、ニワトリ（Ｇａｌｌｕｓ ｇａｌｌｕｓなど）、ゼブラフィッシュ（ゼブラフィッシュ（Ｄａｎｉｏ ｒｅｒｉｏ）など）、ハエ（キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）などのショウジョウバエなど）、植物（シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）など）または哺乳動物由来のものであってもよい。哺乳類のＣｐｎ１０は、霊長類、マウス、ヒツジ、ウシ、イヌ、ネコ、ブタまたはウマであってもよい。あるいは、Ｃｐｎ１０は、古細菌由来のものであってもよい。特定の実施形態では、Ｃｐｎ１０がヒトＣｐｎ１０である。
【００９７】
また、本発明は、上記にて開示したようなヒトＣｐｎ１０ポリペプチドホモログの修飾にも関し、ここで１つ以上のアミノ酸残基の付加、欠失または置換によって修飾されたこれらの分子ならびに、これらの修飾がどのように核酸ベースのＰＲＲリガンドに対するこれらのＣｐｎ１０ポリペプチドの親和性を高めることができるのかということも包含する。さらに、アミノ酸付加は、Ｃｐｎ１０ポリペプチドまたはそのフラグメントと、ポリヒスチジンタグなどの第２のポリペプチドまたはペプチドとの融合、マルトース結合タンパク質融合、グルタチオンＳトランスフェラーゼ融合、緑色蛍光タンパク質融合あるいは、ＦＬＡＧ、ｃ−ｍｙｃまたはヘキサヒスチジンタグなどのエピトープタグの付加を伴うものであってもよい。Ｃｐｎ１０ポリペプチドは、Ｎ末端に開始メチオニンを含むものであってもよいし、含まないものであってもよい。たとえば、ヒトＣｐｎ１０は、Ｎ末端に別のＧＳＭトリペプチドを含むものであってもよく（たとえば、開示内容を本明細書に援用する国際特許出願公開第９５／１５３３８号パンフレットを参照のこと）、別のアラニン（Ａ；配列番号３〜５）または別のグリシンを含むものであってもよい。また、本発明は、Ｃｐｎ１０のこのような修飾形態をコードするポリヌクレオチドの使用も企図する。ヒトＣｐｎ１０に基づくまたは実質的にこれに由来する本発明のＣｐｎ１０ポリペプチドの場合、当該ポリペプチドは、Ｎ末端配列ＡＧＱＡＦＲＫＦＬ、ＭＡＧＱ、ＡＧＱまたはＡＡＧＱを含むものであってもよく、任意に上述したような１つ以上の修飾を含む。
【００９８】
「バリアント」という用語は、本明細書で使用する場合、実質的に類似の配列を示す。通常、ポリペプチド配列のバリアントは、共通して定性的な生物活性を持つ。さらに、これらのポリペプチド配列のバリアントは、配列同一性が少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％であり得る。「バリアント」という用語の意味には、本発明のポリペプチドのホモログも含まれる。ホモログは一般に、異なる種に由来するが、本明細書に開示の対応するポリペプチドと実質的に同じ生物機能または活性を持つポリペプチドである。
【００９９】
さらに、「バリアント」という用語は、本発明のポリペプチドのアナログも含み、「アナログ」という用語は、本発明のポリペプチドの誘導体であるポリペプチドを意味し、この誘導体は、ポリペプチドが実質的に同じ機能を維持するような形での１つ以上のアミノ酸の付加、欠失、置換を含む。
【０１００】
また、本発明は、本明細書に開示のポリペプチドのフラグメントも企図する。「フラグメント」という用語は、本発明のポリペプチドまたはそのバリアントの構成要素をコードするか、その構成要素であるポリペプチド分子を示す。一般に、フラグメントは、それが構成するポリペプチドと共通して定性的な生物活性を持つ。ペプチドフラグメントは、約５〜約１５０アミノ酸長、約５〜約１００アミノ酸長、約５〜約５０アミノ酸長または約５〜約２５アミノ酸長であってもよい。あるいは、ペプチドフラグメントは、約５〜約１５アミノ酸長であってもよい。
【０１０１】
上述したような１つ以上のアミノ酸残基の付加、欠失または置換によってＮ末端および／またはＣ末端で修飾されるＣｐｎ１０ポリペプチドも、本発明の範囲に包含される。
【０１０２】
Ｃｐｎ１０ ｃＤＮＡ配列の最適化
本発明では、最適化されたＣｐｎ１０ ｃＤＮＡ配列を利用して、Ｃｐｎ１０ポリペプチドを生成する上での豊富なトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）プールの利用を増やす。ｔＲＮＡプールによって、メッセンジャーＲＮＡからのタンパク質の翻訳用に特定のアミノ酸をコードする特定のコドンが得られることは、周知である。さらに、ｔＲＮＡプールによっては、他のｔＲＮＡプールよりも豊富なことがあるのも周知である。これは、大量のタンパク質が特定の発現系から産生される場合に、枯渇しているそれほど豊富でないｔＲＮＡプールの収率が落ちるおよび／またはｔＲＮＡ置換によって突然変異が生じることにつながり得る。
【０１０３】
本発明に関して、これに影響されやすい特定のＣｐｎ１０バリアントが見いだされた。たとえば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるＣｐｎ１０の過発現時、Ｇｌｙ３９に用いられるまれなグリシン（Ｇｌｙ）ＧＧＡ ｔＲＮＡを枯渇させ、極めて一般的なグルタミン酸塩／グルタミン酸（Ｇｌｕ）ＧＡＡ ｔＲＮＡで置換してもよい。
【０１０４】
このように、任意の数の位置で最適化されたコドンを用いる最適化された配列を構築してもよい。特に、グリシンおよびアルギニン残基Ｇ３、Ｇ２９、Ｇ３９、Ｇ５０、Ｇ５５、Ｇ５８、Ｇ６８、Ｇ７７、Ｇ９８、Ｒ８、Ｒ１６、Ｒ２１およびＲ９３の特定の最適化によって、野生型ｃＤＮＡの発現レベルに達したが、Ｃｐｎ１０全体としての収率が保たれたままバリアントレベルは有意に減少した。
【０１０５】
また、Ｃｐｎ１０バリアントは、細胞ＴＧＡ終止コドンによるリボソームリーディングが原因で生成されることもある。この点に関して、ＴＧＡ終止コドンをＴＡＡ終止コドンに変え、この問題を回避することでこれを最適化してもよい。
【０１０６】
Ｃｐｎ１０の生成
本発明によれば、Ｃｐｎ１０ポリペプチドを、当業者間で周知の組換えＤＮＡおよび分子生物学の標準的な手法を用いて生成してもよい。たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８９およびＡｕｓｕｂｅｌら， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌ． Ａｓｓｏｃ． ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅｓ， １９９２などの標準的なテキストから、ガイダンスを得られる。Ｍｏｒｔｏｎら， ２０００（Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ７８：６０３〜６０７）， Ｒｙａｎら， １９９５（Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７０：２２０３７〜２２０４３）およびＪｏｈｎｓｏｎら， ２００５（Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８０：４０３７〜４０４７）に記載された方法は、Ｃｐｎ１０ポリペプチドの好適な精製方法の一例であるが、本発明が使用する精製方法または生成方法によって限定されるものではなく、他の方法を用いて、本発明の方法および組成物に従って用いるＣｐｎ１０を生成してもよいことは、当業者であれば理解できるであろう。
【０１０７】
本発明に従って用いられるＣｐｎ１０ポリペプチドおよびペプチドフラグメントは、標準的な組換え核酸手法で得たものであってもよいし、従来の液体または固体相合成手法で合成されたものであってもよい。Ｃｐｎ１０ペプチドは、ｅｎｄｏＬｙｓ−Ｃ、ｅｎｄｏＡｒｇ−Ｃ、ｅｎｄｏＧｌｕ−Ｃおよびブドウ球菌Ｖ８−プロテアーゼなどの１種類以上のプロテイナーゼによるポリペプチドの消化によって生成できるものである。消化されたペプチドフラグメントは、たとえば、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）による手法などで精製可能である。
【０１０８】
本発明のＣｐｎ１０ポリペプチドの精製を、大規模製造目的でスケールアップしてもよい。たとえば、本明細書で説明するように、本発明者らは、大量（グラム単位）の高度に精製された臨床グレードのＣｐｎ１０ポリペプチドを製造するためのバイオプロセスを開発した。
【０１０９】
本発明のＣｐｎ１０ポリペプチドならびに、そのフラグメントおよびバリアントを、当業者間で周知の液体または固体相化学の標準的な方法で合成してもよい。たとえば、ＳｔｅｗａｒｄおよびＹｏｕｎｇ（Ｓｔｅｗａｒｄ， Ｊ．Ｍ． ＆ Ｙｏｕｎｇ， Ｊ．Ｄ．， Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．（第２版） Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．， Ｉｌｌｉｎｏｉｓ， ＵＳＡ（１９８４）の固体相化学手順で当該分子を合成してもよい。
【０１１０】
通常、このような合成方法は、１種類以上のアミノ酸または適宜保護したアミノ酸を成長しているペプチド鎖に逐次追加することを含む。一般に、第１のアミノ酸のアミノ基またはカルボキシル基のいずれかを、好適な保護基で保護する。次に、アミド結合の形成に適した条件下で、適宜保護した無料の（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔａｒｙ）（アミノまたはカルボキシル）基を有する配列における次のアミノ酸を加えることで、保護されたアミノ酸を不活性固体支持体に結合させるか、溶液中で使用する。次に、保護基をこの新たに加えたアミノ酸残基から除去し、次の（保護された）アミノ酸を加えるといった具合である。最終的に、所望のアミノ酸が結合され、残った保護基と、必要であれば固体支持体を、順次または同時に除去して最終的なポリペプチドを生成する。
【０１１１】
Ｃｐｎ１０ポリペプチドにおけるアミノ酸の変更は、関連業界の当業者間で周知の手法で実施すればよい。たとえば、適切な読み枠が維持される条件で、付加、欠失または置換を含むヌクレオチド交換法（保存および／または非保存）によってアミノ酸の変更を実施してもよい。代表的な手法として、ランダム突然変異誘発、部位特異的突然変異誘発、オリゴヌクレオチド仲介またはポリヌクレオチド仲介突然変異誘発、既存のまたは遺伝子工学的制限酵素部位を用いる選択した領域の欠失、ポリメラーゼ連鎖反応があげられる。
【０１１２】
本発明のＣｐｎ１０ポリペプチドによる免疫調節活性の生成は、Ｃｐｎ１０ポリペプチドの七量体の形成を伴うものであってもよい。本発明の目的での免疫調節活性の試験は、当業者間で周知の多数の手法のうち、どれを用いて実施してもよい。本明細書で例示するように、Ｃｐｎ１０ポリペプチドの免疫調節活性は、たとえばＮＦ−κＢ−ルシフェラーゼレポーター細胞株を用いて、一般にポリ（Ｉ：Ｃ）などのＴＬＲ−３アゴニストの存在下で、ポリペプチドがＴｏｌｌ様受容体ＴＬＲ−３からのシグナル伝達を調節する機能を測定することで判断できるものである。ＴＬＲ−７、８および９などの他のＴＬＲも本明細書で説明するようにして試験される。これに代えて、あるいはこれに加えて、たとえば末梢血単核細胞などの細胞におけるサイトカイン産生の測定、競合的結合アッセイ、ツーハイブリッドアッセイ、フィルタアッセイ、電気泳動移動度シフト（ゲルシフト）アッセイ、プレートキャプチャアッセイまたは免疫調節活性を測定できるようにするアッセイの任意の組み合わせによって、他のアッセイを用いてｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで免疫調節活性を判断してもよい。
【０１１３】
ポリヌクレオチド
本発明の実施形態は、上述したようなＣｐｎ１０ポリペプチドならびに、当該ポリペプチドのバリアントおよびフラグメントをコードする、単離されたポリヌクレオチドを提供するものである。本発明の範囲内で企図されるポリヌクレオチドの非限定的な例を、本明細書では配列番号７、９、１１、１２、１４、１５、１７、１８、２０、２１、２３、２４、２６、２７、２９、３０、３２、３３、３５、３６、３８、３９、４１、４２、４４、４５、４７、４８、５０、５１、５３、５４、５６、５７、５９、６０、６２、６３、６５、６６、６８、６９、７１、７２、７４、７５、７７、７８、８０、８１、８３、８４、８６、８７、８９、９０、９２、９３、９５、９６、９８、９９、１０１、１０２、１０４、１０５、１０７、１０８、１１０、１１１、１１３、１１４、１１６、１１７、１１９、１２０、１２２、１２３、１２５、１２６、１２８、１２９、１３１、１３２、１３４、１３５、１３７、１３８、１４０、１４１、１４３、１４４、１４６、１４７、１４９、１５０、１５２、１５３、１５５、１５６、１５８、１５９、１６１、１６２、１６４、１６５、１６７、１６８、１７０、１７１、１７３、１７４、１７６、１７７、１７９、１８０、１８２、１８３、１８５、１８６、１８８、１８９、１９１、１９２、１９４、１９５、１９７、１９８、２００、２０１、２０３、２０４、２０６、２０７、２０９、２１０、２１２、２１３、２１５、２１６、２１８、２１９、２２１、２２２、２２４、２２５、２２７、２２８、２３０、２３１、２３３、２３４、２３６、２３７、２３９、２４０、２４２、２４３、２４５、２４６、２４８、２４９、２５１、２５２、２５４、２５５、２５７、２５８、２６０、２６１、２６３、２６４、２６６、２６７、２６９、２７０、２７２、２７３、２７５、２７６、２７８、２７９、２８１、２８２、２８４、２８５ ２８７、２８８、２９０、２９１、２９３、２９４、２９６、２９７、２９９、３００、３０２、３０３、３０５、３０６、３０８、３０９、３１１、３１２、３１４、３１５、３１７、３１８、３２０、３２１、３２３、３２４、３２６、３２７、３２９、３３０、３３２、３３３、３３５、３３６、３３８、３３９、３４１、３４２、３４４、３４５、３４７、３４８、３５０、３５１、３５３、３５４または３５６で示す。
【０１１４】
上述したポリペプチドについて、「バリアント」という用語は、本明細書で使用する場合、実質的に類似の配列を示す。通常、ポリヌクレオチド配列のバリアントは、共通して定性的な生物活性を持つポリペプチドをコードする。さらに、これらのポリヌクレオチド配列のバリアントは、配列同一性が少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％であり得る。「バリアント」という用語の意味には、本発明のポリヌクレオチドのホモログも含まれる。ホモログは一般に、異なる種に由来するが、実質的に同じ活性を持つポリヌクレオチドである。
【０１１５】
本発明のポリヌクレオチドのフラグメントも企図される。「フラグメント」という用語は、本発明のポリヌクレオチドの構成要素をコードするか、あるいはその構成要素である核酸分子を示す。ポリヌクレオチドのフラグメントは、必ずしも生物活性を維持しているポリペプチドをコードする必要はない。むしろ、フラグメントは、たとえば、ハイブリダイゼーションプローブまたはＰＣＲプライマーとして有用なことがある。フラグメントは、本発明のポリヌクレオチド由来のものであってもよいし、あるいは、化学合成などの他の手段で合成したものであってもよい。また、当業者間で周知の手法を用いて、アンチセンス分子の生成に本発明のポリヌクレオチドおよびそのフラグメントを使用してもよい。
【０１１６】
このように、本発明は、本発明のポリヌクレオチドの配列に基づいて、プライマーおよびプローブとして用いられるオリゴヌクレオチドおよびフラグメントを企図する。オリゴヌクレオチドは、ＰＣＲなどの核酸増幅反応で使用するのに適したヌクレオチド残基の短いストレッチであり、一般に少なくとも約１０ヌクレオチド〜約５０ヌクレオチド長であり、より一般には約１５〜約３０ヌクレオチド長である。プローブは、一般にハイブリダイゼーションによって相同の配列を検出するのに用いられる、たとえば約１０ヌクレオチドから数千ヌクレオチドという可変長のヌクレオチド配列である。配列間の相同レベル（配列同一性）は、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーにかなり大きく左右される。特に、プローブとして用いられるヌクレオチド配列は、低ストリンジェンシー、中ストリンジェンシーまたは高ストリンジェンシーの条件下で、本明細書に開示のポリヌクレオチドのホモログまたは他のバリアントとハイブリダイズできるものである。低ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件は、２×ＳＳＣにて５０℃で実施されるハイブリダイゼーションに対応するものであってもよい。当業者間で周知の多数の条件および因子があり、これらを用いてハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを変更してもよい。たとえば、特定の核酸に対するハイブリダイズ対象となる核酸の長さおよび性質（ＤＮＡ、ＲＮＡ、塩基組成物）；塩および他の成分の濃度、ホルムアミド、硫酸デキストラン、ポリエチレングリコールなどの有無など；ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄ステップの温度の変更。たとえば、ハイブリダイゼーションフィルタを、２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、少なくとも５５℃（低ストリンジェンシー）、少なくとも６０℃（中ストリンジェンシー）、少なくとも６５℃（中程度の／高ストリンジェンシー）、少なくとも７０℃（高ストリンジェンシー）または少なくとも７５℃（極高ストリンジェンシー）で、３０分間２回洗浄してもよい。
【０１１７】
特定の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドをベクターにクローニングしてもよい。ベクターは、外来配列を挿入し、これを真核生物細胞に導入し、導入した配列を発現させるのに適したプラスミドベクターであってもよいし、ウイルスベクターあるいは他の好適なビヒクルであってもよい。一般に、ベクターは真核生物の発現ベクターであり、プロモーター、エンハンサー、リボソーム結合部位、ポリアデニル化シグナル、転写終結配列などの発現制御およびプロセシング配列を含むものであってもよい。
【０１１８】
抗体
本発明は、本発明のＣｐｎ１０ポリペプチドならびに、そのフラグメントおよびアナログと選択的に結合する抗体を提供するものである。好適な抗体としては、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、ヒト化、単鎖、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ発現ライブラリがあげられる。本発明の抗体は、Ｃｐｎ１０ポリペプチドあるいは、そのフラグメントまたはアナログのアゴニストまたはアンタゴニストとして作用することもある。
【０１１９】
本発明のＣｐｎ１０ポリペプチド、特に免疫調節活性および／またはパートナーまたは基質結合に関与するもの離散的な領域またはフラグメントから抗体を調製してもよい。抗原Ｃｐｎ１０ポリペプチドは、少なくとも約５、好ましくは少なくとも約１０のアミノ酸を含有する。
【０１２０】
好適な抗体を生成するための方法については、当業者であれば容易に理解できよう。たとえば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ編， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｎ．Ｙ．（１９８８）に記載のハイブリドーマ技術を用いて、一般にＦａｂ部分を含有する抗Ｃｐｎ１０モノクローナル抗体を調製すればよい。
【０１２１】
本発明のＣｐｎ１０ポリペプチド、そのフラグメントまたはアナログに向けたモノクローナル抗体の調製にあたって、培養中で連続細胞株によって抗体分子を生成できるものであれば、どのような手法を使用してもよい。これには、もともとＫｏｈｌｅｒら， Ｎａｔｕｒｅ， ２５６：４９５〜４９７（１９７５）によって開発されたハイブリドーマ手法ならびに、トリオーマ手法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ手法［Ｋｏｚｂｏｒら，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ， ４：７２（１９８３）］、ヒトモノクローナル抗体を生成するためのＥＢＶ−ハイブリドーマ手法［Ｃｏｌｅら， ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ， 第７７〜９６ページ， Ａｌａｎ Ｒ． Ｌｉｓｓ， Ｉｎｃ．，（１９８５）］が含まれる。発癌ＤＮＡでのＢリンパ球の直接形質転換またはＥｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルスの形質移入などの融合以外の手法によって、不死抗体産生細胞株を作製することが可能である。たとえば、Ｍ． Ｓｃｈｒｅｉｅｒら， 「Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」（１９８０）； Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら， 「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔ−ｃｅｌｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ」（１９８１）； Ｋｅｎｎｅｔｔら， 「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」（１９８０）を参照のこと。
【０１２２】
要するに、モノクローナル抗体、ミエローマまたは他の自己増殖性細胞株の生成元になるハイブリドーマを生成する手段を、その認識因子結合部分あるいは、認識因子、あるいはその起点特異的ＤＮＡ結合部分で過免疫化した哺乳動物の脾臓から得たリンパ球と融合させる。本発明を実施するにあたって有用なモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを、それが持つ本認識因子と免疫反応する機能ならびに、標的細胞において指定の転写活性を阻害する機能によって同定する。
【０１２３】
本発明を実施するにあたって有用なモノクローナル抗体は、適当な抗原特異性を持つ抗体分子を分泌するハイブリドーマを含有する栄養培地を含むモノクローナルハイブリドーマ培養を開始することで生成可能である。この培養を、ハイブリドーマが抗体分子を培地に分泌するのに十分な条件下で、これに十分な時間維持する。次に、抗体含有培地を回収する。その後は、周知の手法によって抗体分子をさらに単離することが可能である。
【０１２４】
同様に、本発明のＣｐｎ１０ポリペプチドあるいは、そのフラグメントまたはアナログに対するポリクローナル抗体の生成に使用できる当該技術分野において周知のさまざまな手順がある。Ｃｐｎ１０ポリクローナル抗体を生成するために、Ｃｐｎ１０ポリペプチドあるいは、そのフラグメントまたはアナログを注射することで、ウサギ、ネズミ、ラット、ヒツジ、ヤギなどを含むがこれに限定されるものではないさまざまな宿主動物を免疫することが可能である。さらに、Ｃｐｎ１０ポリペプチドあるいは、そのフラグメントまたはアナログを、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）またはキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）などの免疫原性キャリアにコンジュゲートすることも可能である。また、フロイント（完全および不完全）、水酸化アルミニウムなどのミネラルゲル、リゾレシチンなどの表面活性物質、プルロニック（ｐｌｕｒｏｎｉｃ）ポリオール、ポリアニオン、ペプチド、オイルエマルション、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノールならびに、ＢＣＧ（カルメット−ゲラン（Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）桿菌）およびコリネバクテリウム・パルバム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ）などの潜在的に有用なヒトアジュバントを含むがこれに限定されるものではない、さまざまなアジュバントを使用して、免疫学的応答を増加させてもよい。
【０１２５】
所望の抗体のスクリーニングは、当該技術分野において周知の多岐にわたる手法によっても達成可能である。抗体の免疫特異的結合のアッセイとしては、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着測定法）、サンドイッチイムノアッセイ、免疫放射定量アッセイ、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、ｉｎ ｓｉｔｕイムノアッセイ、ウェスタンブロット、沈降反応、凝集アッセイ、補体結合アッセイ、免疫蛍光アッセイ、タンパク質Ａアッセイ、免疫電気泳動アッセイなどがあげられるが、これに限定されるものではない（たとえば、Ａｕｓｕｂｅｌら編， １９９４， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第１巻， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照のこと）。抗体結合については、一次抗Ｃｐｎ１０抗体上の検出可能な標識によって検出すればよい。あるいは、二次抗体との結合あるいは、適宜標識した試薬によって抗Ｃｐｎ１０抗体を検出してもよい。イムノアッセイにおける結合を検出する多種多様な方法が当該技術分野において周知であり、本発明の範囲に包含される。
【０１２６】
本発明の抗体を、当業者間で周知の診断方法およびキットに利用して、体液または組織中のＣｐｎ１０を定性的または定量的に検出することが可能である。あるいは、さまざまな疾患、障害、症状を治療するための方法および組成物に抗体を用いてもよい。
【０１２７】
本発明のＣｐｎ１０ポリペプチドまたはそのフラグメントまたはアナログに対して産生された抗体（またはそのフラグメント）は、Ｃｐｎ１０への結合親和性を有する。好ましくは、この抗体（またはそのフラグメント）は、結合親和性または結合活性が約１０^５Ｍ^−１を上回り、一層好ましくは約１０^６Ｍ^−１を上回り、一層好ましくは約１０^７Ｍ^−１を上回り、最も好ましくは約１０^８Ｍ^−１を上回る。
【０１２８】
本発明による抗体を好適な量で得る観点から、無血清培地でのバッチ発酵を用いて抗体を創成してもよい。発酵後、クロマトグラフィおよびウイルス不活性化／除去ステップを取り入れた多段階の手順で抗体を精製してもよい。たとえば、まずは抗体をタンパク質Ａ親和性クロマトグラフィによって分離した後、溶媒／洗剤で処理し、脂質エンベロープウイルスを不活性化させる。一般にアニオンおよびカチオン交換クロマトグラフィによるさらなる精製を利用して、残っているタンパク質、溶媒／洗剤および核酸を除去してもよい。ゲル濾過カラムを用いて、精製抗体をさらに精製し、０．９％生理食塩水に配合してもよい。配合後のバルク調製物を滅菌し、ウイルスを濾過し、分注してもよい。
【０１２９】
アゴニストおよびアンタゴニスト
上述した方法を使用して、本発明のポリペプチドまたはそのバリアントまたはフラグメントのアゴニストである作用剤を同定してもよい。アゴニストである作用剤は、ポリペプチドの生物活性のうちの１つ以上を増強する。あるいは、上述した方法によって、本発明のポリペプチドまたはそのバリアントまたはフラグメントのアンタゴニストである作用剤を同定してもよい。アンタゴニストである作用剤は、ポリペプチドの生物活性のうちの１つ以上を減弱させる。アゴニストは、本明細書で説明するようなＣｐｎ１０ポリペプチドなどの分子の生物活性のうちの１つ以上を増強するのに対し、アンタゴニストはポリペプチドの生物活性のうちの１つ以上を減弱させる。一例において、本発明のポリペプチドのアゴニストは、免疫抑制性核酸であってもよい。この核酸は、複合体において本発明のポリペプチドを結合できる。別の例では、本発明のポリペプチドのアンタゴニストが炎症誘発性核酸であってもよい。この核酸も、複合体において本発明のポリペプチドを結合できる。このような本発明のポリペプチドの強力な活性調節因子を、当業者間で周知の多数の方法で、上記の方法によってスクリーニング用に生成してもよい。たとえば、Ｘ線結晶学および核磁気共鳴分析法などの方法を用いて、本発明のポリペプチドまたはそのバリアントまたはフラグメントの構造をモデル化し、これによってコンピュータベースのモデリングを用いて潜在的な調節作用剤の設計を容易にしてもよい。さまざまな形態のコンビナトリアル化学を使用して、推定上の調節因子を生成してもよい。後述するスクリーニング方法を用いて、本発明のポリペプチドまたはそのバリアントまたはフラグメントのアゴニストまたはアンタゴニストである作用剤を同定してもよい。抗体、低分子量ペプチド、核酸、非タンパク質性有機分子は、本発明のポリペプチドまたはそのバリアントまたはフラグメントのアゴニストまたはアンタゴニストとして作用できる作用剤の例である。
【０１３０】
スクリーニング
本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドと結合するか、そうでなければこれと相互作用する化合物、特にその活性を調節する化合物を、多岐にわたる好適な方法で同定することができる。非限定的な方法として、ツーハイブリッド法、免疫共沈降、アフィニティ精製、質量分析、タンデムアフィニティ精製、ファージディスプレイ、ラベル転移、ＤＮＡマイクロアレイ／遺伝子同時発現、タンパク質マイクロアレイがあげられる。
【０１３１】
本発明のＣｐｎ１０ポリペプチドおよび適切なフラグメントおよびバリアントを、高スループットスクリーンに使用して、候補化合物がＣｐｎ１０と結合するか、そうでなければこれと相互作用する機能をアッセイすることが可能である。このような候補化合物は、本明細書で説明するようなポリペプチド、当該ポリペプチドのフラグメントまたはバリアントと複合体を形成する炎症誘発性核酸または免疫抑制性核酸であり得る。候補化合物はタンパク質であってもよい。
【０１３２】
これらの候補化合物をさらに、機能的Ｃｐｎ１０に対してスクリーニングし、この化合物がＣｐｎ１０活性に対しておよぼす影響を判断することが可能である。本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドならびに、そのフラグメントおよびアナログは、これらの分子と相互作用する化合物および作用剤のスクリーニングおよび同定に有用である。特に、望ましい化合物は、これらのポリペプチドおよびポリヌクレオチドの活性を調節する化合物である。当該化合物は、ポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドの発現または活性を賦活、刺激、増加、阻害または防止することによって、調節作用を発揮することがある。好適な化合物は、直接（結合など）または間接的な相互作用によって、その作用を発揮することがある。本明細書で説明するように、本発明のＣｐｎ１０ポリペプチドの活性を調節するか、そうでなければこれと相互作用できる化合物をスクリーニングする方法がある。これらの化合物は、多岐にわたる好適な方法で同定できるものである。相互作用および／または結合については、ゲルシフトアッセイおよび内部で説明されたプレート結合アッセイあるいは、またはツーハイブリッドアッセイ系などの標準的な競合的結合アッセイを用いて判断すればよい。
【０１３３】
たとえば、ツーハイブリッドアッセイは、一般にタンパク質−タンパク質相互作用の検出に用いられる、酵母ベースの遺伝子アッセイ系（ＦｉｅｌｄｓおよびＳｏｎｇ，１９８９）である。簡単に説明すると、このアッセイでは転写活性化因子のマルチドメインの性質を利用している。たとえば、周知の転写活性化因子のＤＮＡ結合ドメインを本発明のＣｐｎ１０ポリペプチドあるいはそのフラグメントまたはバリアントと融合させ、転写活性化因子の活性化ドメインを候補タンパク質と融合させることができる。候補タンパク質とＣｐｎ１０ポリペプチドあるいはそのフラグメントまたはバリアントとの相互作用により、転写活性因子のＤＮＡ結合ドメインと活性化ドメインとが近接する。このため、転写活性因子によって活性化された特定のレポーター遺伝子の転写により、相互作用を検出することが可能である。
【０１３４】
あるいは、アフィニティクロマトグラフィを用いて、Ｃｐｎ１０の結合パートナーを同定してもよい。たとえば、本発明のＣｐｎ１０ポリペプチドあるいは、そのフラグメントまたはバリアントを支持体（セファロースなど）に固定化し、カラムに細胞可溶化物を通してもよい。その後、固定化したＣｐｎ１０ポリペプチド、フラグメントまたはバリアントに結合しているタンパク質をカラムから溶出し、同定することが可能である。最初に、当該タンパクをＮ末端アミノ酸シーケンシングなどで同定してもよい。
【０１３５】
上記の手法の改変例において、Ｃｐｎ１０ポリペプチド、フラグメントまたはバリアントを、アルカリホスファターゼなどの検出可能なタグと融合させ、ＦｌａｎａｇａｎおよびＬｅｄｅｒ（１９９０）に説明されているような免疫沈降の改変形態を用いることで、融合タンパク質を生成してもよい。
【０１３６】
Ｃｐｎ１０活性を調節する化合物を検出するための方法は、Ｃｐｎ１０ポリペプチドを候補化合物および好適な標識基質と組み合わせ、基質の変化に基づいて当該化合物がＣｐｎ１０に対しておよぼす作用を監視する（時間の関数として求めてもよい）ことを伴うものであってもよい。好適な標識物質としては、比色測定、放射測定、蛍光測定または蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）ベースの方法に合わせて標識された物質があげられる。
【０１３７】
たとえば、免疫共沈降を利用して、候補作用剤または複数の候補作用剤が、本発明のポリペプチドまたはそのバリアントまたはフラグメントと相互作用または結合するか否かを判断してもよい。この手法を用いて、タンパク質−タンパク質相互作用の保存に適した非変性条件下で、藍藻毒性生物、藍藻類および／または渦鞭毛藻類を溶解してもよい。続いて、得られる溶液を、本発明のポリペプチドまたはそのバリアントまたはフラグメントに特異な抗体と一緒にインキュベートし、固体支持体に結合された抗体結合タンパク質で捕捉するなどの方法でバルク溶液から免疫沈降させることが可能である。この方法による本発明のポリペプチドまたはそのバリアントまたはフラグメントの免疫沈降は、そのタンパク質に関連する作用剤の免疫共沈降を容易にするものである。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ウエスタンブロッティング、質量分析を含むがこれに限定されるものではない、当該技術分野において周知の多数の方法を用いて同定関連の作用剤を確立することが可能である。
【０１３８】
あるいは、ファージディスプレイ法を利用して、候補作用剤または複数の候補作用剤が、本発明のポリペプチドまたはそのバリアントまたはフラグメントと相互作用または結合するか否かを判断してもよい。ファージディスプレイは、遺伝子バンクから得た複数の遺伝子をファージに組み込むことでタンパク質相互作用をスクリーニングするための試験である。この方法では、組換えＤＮＡ手法を用いて多数の遺伝子をバクテリオファージのコートタンパク質との融合体として発現させ、各遺伝子の当該ペプチドまたはタンパク質産物をウイルス粒子の表面にディスプレイさせる。該当するファージがディスプレイしたペプチドまたはタンパク質産物のライブラリ全体を、このようにして作製することが可能である。その後、ファージがディスプレイしたペプチドまたはタンパク質産物の得られるライブラリが本発明のポリペプチドまたはそのバリアントまたはフラグメントと結合する機能をスクリーニングしてもよい。相互作用しているファージから抽出されるＤＮＡは、相互作用しているタンパク質の配列を含む。
【０１３９】
あるいは、アフィニティクロマトグラフィを用いて、候補作用剤または複数の候補作用剤が本発明のポリペプチドまたはそのバリアントまたはフラグメントと相互作用または結合するか否かを判断してもよい。たとえば、本発明のポリペプチドまたはそのバリアントまたはフラグメントを支持体（セファロースなど）に固定化し、カラムに細胞可溶化物を通してもよい。その後、固定化した本発明のポリペプチドまたはそのバリアントまたはフラグメントに結合しているタンパク質をカラムから溶出し、Ｎ末端アミノ酸シーケンシングなどによって同定してもよい。
【０１４０】
また、本発明は、ポリペプチドの発現を変化させることで本発明のポリペプチドに対してその調節作用を発揮できる化合物を企図するものである。この場合、候補化合物の存在下でのポリペプチドの発現レベルを候補化合物の非存在下での発現レベルと比較することで、当該化合物を同定してもよい。
【０１４１】
抗体との関連で、当該技術分野において周知の多種多様な手法で所望の抗体のスクリーニングを達成することも可能である。抗体の免疫特異的結合のアッセイとしては、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着測定法）、サンドイッチイムノアッセイ、免疫放射定量アッセイ、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、ｉｎ ｓｉｔｕイムノアッセイ、ウェスタンブロット、沈降反応、凝集アッセイ、補体結合アッセイ、免疫蛍光アッセイ、タンパク質Ａアッセイ、免疫電気泳動法アッセイなど（たとえば、Ａｕｓｕｂｅｌら， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， 第１巻， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９９４）を参照のこと）があげられるが、これに限定されるものではない。抗体結合については、一次抗体上の検出可能な標識によって検出すればよい。あるいは、二次抗体との結合あるいは、適宜標識した試薬によって抗体を検出してもよい。イムノアッセイにおける結合を検出する多種多様な方法が当該技術分野において周知であり、本発明の範囲に包含される。
【０１４２】
上述した方法は、本発明のポリペプチドまたはそのバリアントまたはフラグメントと相互作用またはその活性を調節できる作用剤の同定に利用できるいくつかのタイプの方法の単なる一例にすぎないことは、理解できよう。当業者であれば他の好適な方法も知るであろうし、それらも本発明の範囲に包含される。
【０１４３】
組成物と投与経路
本発明のＣｐｎ１０ポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、治療薬としても有用なことがある。これらの分子には、被験体に対して治療有効量の当該分子を投与することで、被験体の疾患または症状を治療または予防する上での用途がある。一般に、当該疾患および症状は、被験体の免疫応答を調節することで治療できるものである。一例として、このような疾患および症状は、インスリン依存性糖尿病、全身性エリテマトーデス、シェーグレン病、グレーブス病、多発性硬化症、関節リウマチ、慢性疲労症候群、アルツハイマー病、喘息、アレルギー、多発性硬化症、ＧＶＨＤ、アテローム性動脈硬化症、炎症性疼痛、乾癬、ＨＩＶ、慢性免疫活性化、慢性筋炎、強皮症などの急性または慢性炎症性疾患を含むものであってもよい。疾患が、非小細胞肺癌、腎細胞癌、メラノーマ、非ホジキンリンパ腫、結腸直腸癌、基底細胞癌などの癌であってもよい。疾患が感染症であってもよい。
【０１４４】
感染症は、細菌感染、ウイルス感染または真菌感染に起因するものであってもよい。慢性免疫活性化は、胃腸管から循環系への細菌産物（ＬＰＳなど）および／またはウイルス産物（核酸など）の漏出と関連するものである。たとえば、漏出は、口腔、腸または小腸から起こり得る。細菌産物またはウイルス産物の漏出は、細菌感染、ウイルス感染、炎症性腸疾患および腸疾患などの感染または疾患によって引き起こされる場合がある。ウイルス感染の一例に、ＨＩＶ感染またはＣ型肝炎感染がある。
【０１４５】
慢性免疫活性化は、ＬＰＳによるＴＬＲシグナル伝達の免疫調節またはＴＬＲへの核酸結合に関与する。ＬＰＳはＴＬＲ２またはＴＬＲ４と結合できるのに対し、核酸はＴＬＲ３、７、８または９を結合できる。
【０１４６】
したがって、疾患および症状の治療または予防に用いられるＣｐｎ１０ポリペプチドおよびポリヌクレオチドを含む薬学的に有用な組成物も、本明細書にて企図される。
【０１４７】
抗Ｃｐｎ１０抗体をはじめとする、本発明のＣｐｎ１０ポリペプチドのアゴニストおよびアンタゴニストは、治療薬として有用なこともある。このため、本発明は、当該アゴニストおよびアンタゴニストを用いる治療方法ならびに、これを含む薬学的組成物も企図するものである。
【０１４８】
通常、本発明の方法に従って用いられる好適な組成物については、当業者間で周知の方法および手順で調製してもよく、このため、薬学的に許容されるキャリア、希釈剤および／またはアジュバントを含むものであってもよい。
【０１４９】
組成物は、標準的な経路で投与できるものである。通常、この組成物は非経口経路（たとえば、静脈内、脊髄内、皮下または筋肉内）、経口経路または局所経路で投与される。投与は、全身投与であってもよいし、部分投与または局所投与であってもよい。特定の状況で用いられる特定の投与経路は、治療対象となる症状の性質、症状の重症度と度合い、送達される特定化合物の必要投与量、化合物によって生じ得る副作用をはじめとする多数の要因に左右されることになる。
【０１５０】
通常、好適な組成物は、当業者間で周知の方法で調製できるものであり、薬学的に許容される希釈剤、アジュバントおよび／または賦形剤を含むものであってもよい。希釈剤、アジュバントおよび賦形剤は、その組成物の他の成分と適合性があり、そのレシピエントにとって有害ではないという意味で、「許容可能な」ものでなければならない。
【０１５１】
薬学的に許容されるキャリアまたは希釈剤の例として、脱塩水または蒸留水；生理食塩水溶液；ピーナッツ油、紅花油、オリーブ油、綿実油、トウモロコシ油、ゴマ油などのピーナッツ油、紅花油、オリーブ油、綿実油、トウモロコシ油、ゴマ油、落花生油またはココナッツオイルなどの植物油；シリコーン油（メチルポリシロキサン、フェニルポリシロキサン、メチルフェニルポリシロキサンなどのポリシロキサンを含む）；揮発性シリコーン；液状パラフィン、ソフトパラフィンまたはスクアランなどの鉱油；メチルセルロース、エチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムまたはヒドロキシプロピルメチルセルロースなどのセルロース誘導体；エタノールまたはイソプロパノールなどの低級アルカノール；低級アラルカノール；ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコール、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコールまたはグリセリンなどの低級ポリアルキレングリコールまたは低級アルキレングリコール；パルミチン酸イソプロピル、ミリスチン酸イソプロピルまたはオレイン酸エチルなどの脂肪酸エステル；ポリビニルピリドン；寒天；カラギーナン；トラガントゴムまたはアカシアゴム、ワセリンがあげられる。一般に、キャリアは組成物の１０重量％〜９９．９重量％を構成することになる。
【０１５２】
本発明の組成物は、注射投与に適した形態、経口摂取に適した処方剤の形態（カプセル、錠剤、カプレット、エリキシル剤など）、局所投与に適した軟膏、クリームまたはローションの形態、点眼薬としての送達に適した形態、鼻腔内吸引または経口吸引などの吸引投与に適したエアロゾル形態、非経口投与すなわち、皮下注射、筋肉内注射または静脈注射に適した形態であってもよい。
【０１５３】
注射可能な溶液または懸濁液としての投与用では、無毒で非経口的に許容可能な希釈剤またはキャリアとして、リンゲル液、等張生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、エタノール、１，２プロピレングリコールがあげられる。
【０１５４】
経口用途での好適なキャリア、希釈剤、賦形剤、アジュバントの例としては、ピーナッツ油、液状パラフィン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、アカシアゴム、トラガントゴム、右旋糖、スクロース、ソルビトール、マンニトール、ゼラチン、レシチンがあげられる。これらに加えて、好適な香味料や着色料を経口製剤に含有させてもよい。カプセルの形態で用いる場合は、このカプセルに、崩壊を遅らせるモノステアリン酸グリセリンまたはジステアリン酸グリセリンなどの化合物をコーティングしてもよい。
【０１５５】
アジュバントは一般に、皮膚軟化剤、乳化剤、増粘剤、保存剤、殺菌剤、緩衝剤を含む。
【０１５６】
経口投与用の固体形態は、ヒトおよび獣医薬理学的な実務で許容できるバインダ、甘味料、崩壊剤、希釈剤、香料、コーティング剤、保存剤、潤滑剤および／または時間遅延剤を含むものであってもよい。好適なバインダとしては、アカシアゴム、ゼラチン、コーンスターチ、トラガントゴム、アルギン酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロースまたはポリエチレングリコールがあげられる。好適な甘味料としては、スクロース、ラクトース、グルコース、アスパルテーム（ａｓｐａｒｔａｍｅ）またはサッカリンがあげられる。好適な崩壊剤としては、コーンスターチ、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、グアーガム、キサンタンガム、ベントナイト、アルギン酸または寒天があげられる。好適な希釈剤としては、ラクトース、ソルビトール、マンニトール、右旋糖、カオリン、セルロース、炭酸カルシウム、ケイ酸カルシウムまたはリン酸二カルシウムがあげられる。好適な香味料としては、ペパーミント油、冬緑油、サクランボ、オレンジまたはラズベリー香料があげられる。好適なコーティング剤としては、アクリル酸および／またはメタクリル酸および／またはそれらのエステルのポリマーまたはコポリマー、ワックス、脂肪アルコール、ゼイン、シェラックまたはグルテンがあげられる。好適な保存剤としては、安息香酸ナトリウム、ビタミンＥ、α−トコフェロール、アスコルビン酸、メチルパラベン、プロピルパラベンまたは亜硫酸水素ナトリウムがあげられる。好適な潤滑剤としては、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、オレイン酸ナトリウム、塩化ナトリウムまたはタルクがあげられる。好適な時間遅延剤としては、モノステアリン酸グリセリンまたはジステアリン酸グリセリンがあげられる。
【０１５７】
経口投与用の液体形態は、上記の作用剤に加えて、液体キャリアを含むものであってもよい。好適な液体キャリアとしては、水、オリーブ油、ピーナッツ油、ゴマ油、ヒマワリ油、紅花油、落花生油、ココナッツオイルなどの油類、液状パラフィン、エチレングリコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、グリセロール、脂肪アルコール、トリグリセリドまたはこれらの混合物があげられる。
【０１５８】
経口投与用の懸濁液は、分散剤および／または懸濁化剤をさらに含むものであってもよい。好適な懸濁化剤としては、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、アルギン酸ナトリウムまたはアセチルアルコールがあげられる。好適な分散剤としては、レシチン、ステアリン酸などの脂肪酸のポリオキシエチレンエステル、ポリオキシエチレンソルビトールモノまたはジオレアート、ステアラートまたはラウラート、ポリオキシエチレンソルビタンモノまたはジオレアート、ステアラートまたはラウラートなどがあげられる。
【０１５９】
経口投与用のエマルションは、１種類以上の乳化剤をさらに含むものであってもよい。好適な乳化剤としては、上記に例示したような分散剤あるいは、グアーガム、アカシアゴムまたはトラガントゴムなどの天然ゴムがあげられる。
【０１６０】
非経口投与可能な組成物を調製するための方法は当業者には自明であり、たとえば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ、第１５版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．に一層詳細に記載され、これを本明細書に援用する。
【０１６１】
本発明の局所製剤は、活性成分を１種類以上の許容可能なキャリアならびに、任意に他の治療成分と一緒に含む。局所投与に適した製剤としては、リニメント剤、ローション、クリーム、軟膏またはペーストなど、治療が必要な部位への皮膚からの浸透に適した液体または半液体の調製物ならびに、眼、耳または鼻への投与に適した点薬（ｄｒｏｐ）があげられる。
【０１６２】
本発明による点薬は、滅菌された水性または油性の溶液または懸濁液を含むものであってもよい。これらは、殺菌薬および／または殺真菌薬および／または他の好適な保存剤の水溶液（任意に界面活性剤を含む）に活性成分を溶解させて、調製できるものである。次に、得られた溶液を濾過により清澄化し、好適な容器に移し、滅菌すればよい。滅菌は、９０〜１００℃で半時間ほどオートクレーブ処理または維持するか、濾過した上で無菌技術によって容器に移して達成すればよい。点薬に含有させるのに適した殺菌薬または殺真菌薬の例としては、硝酸フェニル水銀または酢酸フェニル水銀（０．００２％）、塩化ベンザルコニウム（０．０１％）、酢酸クロルヘキシジン（０．０１％）があげられる。油性溶液を調製するのに適した溶媒としては、グリセロール、希釈アルコール、プロピレングリコールがあげられる。
【０１６３】
本発明によるローションとしては、皮膚または眼への塗布に適したものがあげられる。点眼ローションは、任意に殺菌薬を含有する滅菌水溶液を含むものであってもよく、点薬の調製に関して上述したものと同様の方法で調製してもよい。皮膚への塗布用のローションまたはリニメント剤は、アルコールまたはアセトンなどの皮膚の乾燥を促進し、冷却する作用剤および／またはグリセロールなどの保湿剤あるいは、ヒマシ油または落花生油などのオイルを含有してもよい。
【０１６４】
本発明によるクリーム、軟膏またはペーストは、外用塗布用に活性成分を含む半固体製剤である。これらは、細かく砕いた形態または粉末状の活性成分を、単独で、あるいは水性または非水性流体中の溶液または懸濁液の状態で、グリース状または非グリース状の基材と混合して調製できるものである。この基材は、硬パラフィン、軟パラフィンまたは液状パラフィンなどの炭化水素、グリセロール、蜜蝋、金属石鹸；粘液；アーモンド油、トウモロコシ油、落花生油、ヒマシ油またはオリーブ油などの天然由来の油；羊毛脂またはその誘導体あるいは、ステアリン酸またはオレイン酸などの脂肪酸を、プロピレングリコールまたはマクロゴールなどのアルコールと一緒に含むものであってもよい。
【０１６５】
この組成物には、ソルビタンエステルまたはそのポリオキシエチレン誘導体などのアニオン系、カチオン系または非イオン系界面活性剤などの好適な界面活性剤を取り入れてもよい。天然ゴム、セルロース誘導体などの懸濁化剤あるいは、ケイ質シリカなどの無機材料およびラノリンなどの他の成分を含有させてもよい。
【０１６６】
この組成物を、リポソームの形態で投与してもよい。リポソームは通常、リン脂質または他の脂質物質から誘導され、水性媒質中に分散した一重膜または多重膜の水和液晶によって形成される。リポソームを形成できる、無毒で生理学的に許容され、代謝可能な脂質を使用できる。リポソーム状の組成物は、安定剤、保存剤、賦形剤などを含有するものであってもよい。好ましい脂質は、天然と合成の両方のリン脂質およびホスファチヂルコリン（レシチン）である。リポソームを形成するための方法は当該技術分野において周知であり、特にこれに関しては、その内容を本明細書に援用するＰｒｅｓｃｏｔｔ編， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ， 第ＸＩＶ巻， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ． （１９７６），第３３ページ以下を参照のこと。
【０１６７】
この組成物を、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）誘導体のアレイとコンジュゲートさせてもよい。タンパク質へのＰＥＧ付加（ＰＥＧ化）は、タンパク質の血漿クリアランス速度を落とすことで、その有効性を高めるための十分に確立された方法である（Ｎｕｃｃｉら， １９９１， Ａｄｖ． Ｄｒｕｇ Ｄｅｌ． Ｒｅｖ． ６：１３３）。ＰＥＧ化の別の利点として、タンパク質の安定性が高まり、免疫原性が低下し、溶解度が増し、タンパク質分解に対する感受性が低下することがあげられる（Ｓｈｅｆｆｉｅｌｄ Ｗ． ２００１， Ｃｕｒｒ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｓ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ Ｈａｅｍａｔｏｌ Ｄｉｓｏｒｄ． １：１〜２２）。ＰＥＧ分子は、−（ＯＣＨ_３ＣＨ_２）ｎ−ＯＨの基本繰返し構造を含み、分子量に基づいて分類される。ＰＥＧ誘導体をタンパク質とコンジュゲートさせて、その流体力学半径を大きくするが、その半減期の増加は通常、付加したＰＥＧ鎖の大きさと直接関連している（Ｓｈｅｆｆｉｅｌｄ Ｗ． ２００１， Ｃｕｒｒ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｓ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ Ｈａｅｍａｔｏｌ Ｄｉｓｏｒｄ． １：１〜２２）。
【０１６８】
この組成物を微粒子の形で投与してもよい。ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリ乳酸−コ−グリコリド（ＰＬＧＡ）、エプシロン−カプロラクトン（ε−カプロラクトン）から形成される生分解性の微粒子が、血漿中の半減期を長くすることで有効性を持続させるための薬剤キャリアとして広く用いられている（Ｒ．Ｋｕｍａｒ， Ｍ．， ２０００， Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ Ｓｃｉ． ３（２） ２３４〜２５８）。微粒子は、ワクチン、抗生物質、ＤＮＡなどのさまざまな薬剤候補の送達用に処方されている。さらに、これらの製剤は、非経口の皮下注射、静脈内注射、吸引をはじめとするさまざまな送達経路用に開発されている。
【０１６９】
この組成物に、イソ酪酸酢酸スクロース（ＳＡＩＢ）および有機溶媒または有機溶媒混合物からなる徐放マトリクスを取り入れてもよい。また、ポリマー添加物を放出調節剤としてビヒクルに添加し、粘度をさらに高めて放出速度を低下させてもよい。ＳＡＩＢは周知の食品添加物である。これは疎水性が極めて高く、公称ではイソ酪酸６対酢酸２という比で完全にエステル化されたスクロース誘導体である。混合エステルとして、ＳＡＩＢは結晶化せずに透明で粘性の液体として存在する。ＳＡＩＢを、エタノールまたはベンジルアルコールなどの薬学的に許容される有機溶媒と混合すると、混合物の粘度が、注射可能な程度まで低下する。薬学的活性成分をＳＡＩＢ送達ビヒクルに添加し、ＳＡＩＢ溶液または懸濁液の製剤を形成してもよい。この製剤を皮下注射すると、溶媒がマトリクスから拡散し、ＳＡＩＢ−薬剤またはＳＡＩＢ−薬剤−ポリマー混合物が、ｉｎ ｓｉｔｕ形成持続製剤として構成される。
【０１７０】
本発明の目的において、分子および作用剤は、被験体に対して治療的または予防的のいずれかの組成物として投与されるものであってもよい。治療用途では、すでに何らかの疾患に罹患している患者に対し、疾患およびその合併症を治癒させるまたは少なくとも部分的に抑制できるだけの十分な量の組成物を投与する。組成物は、患者を効果的に治療できるだけの十分な量の分子または作用剤を提供するものでなければならない。
【０１７１】
また、本発明の実施形態は、Ｃｐｎ１０をコードするポリヌクレオチドの投与も企図するものである。このような状況では、ポリヌクレオチドは一般に、ポリヌクレオチドを被験体に投与した後に適切なポリペプチド配列が産生されるような形で、プロモーターに対して作動可能に連結される。このポリヌクレオチドを、ベクターで被験体に投与してもよい。ベクターは、外来配列を挿入し、これを真核生物細胞に導入し、導入した配列を発現させるのに適したプラスミドベクターであってもよいし、ウイルスベクターまたは他の好適なビヒクルであってもよい。一般に、ベクターは真核生物の発現ベクターであり、プロモーター、エンハンサー、リボソーム結合部位、ポリアデニル化シグナル、転写終結配列などの発現制御およびプロセシング配列を含むものであってもよい。投与対象となる核酸構築物は、ネイキッドＤＮＡを含むものであってもよいし、あるいは、１種類以上の薬学的に許容されるキャリアと併用される組成物の形であってもよい。
【０１７２】
本発明の方法によれば、本発明のＣｐｎ１０ポリペプチドを単独で投与してもよいし、１種類以上の別の作用剤と併せて投与してもよいことは、当業者であれば理解できよう。たとえば、本発明のＣｐｎ１０ポリペプチドを、ＴＬＲ−３などのＴＬＲ受容体を刺激できる１種類以上のアゴニストと一緒に投与してもよい。また、本発明は、本発明のＣｐｎ１０ポリペプチドを他の治療アプローチと併せて使用して、疾患および障害を治療する併用療法を企図するものである。たとえば、Ｃｐｎ１０ポリペプチドは、ＩＦＮβまたはＩＦＮ１βなどのＩ型インターフェロンを用いる療法に応答するウイルス疾患の治療において有用なことがあり、多発性硬化症などの自己免疫疾患の治療にあたって本発明のＣｐｎ１０ポリペプチドをＩＦＮβと併せて使用してもよい。
【０１７３】
そのような併用療法では、所望の効果が得られるように、併用療法の各成分を同時に投与してもよいし、あるいは任意の順序または異なる時刻に逐次投与してもよい。あるいは、成分を単一の投与単位にまとめて混合生成物として処方してもよい。別々に投与するのであれば、同じ投与経路で成分を投与すると好ましいことがあるが、必ずしもそうでなければならないわけではない。
【０１７４】
投与量
特定の患者に対する治療上有効な投与レベルは、治療対象となる障害およびその障害の重症度；使用する分子または作用剤の活性；使用する組成物；年齢、体重、全体的な健康状態、患者の性別および食事；投与時間；投与経路；分子または作用剤の隔離速度；治療期間；治療と組み合わせてまたは治療と同時に用いられる薬剤ならびに、医薬分野で周知の他の関連する要因をはじめとする、多種多様な要因に左右されることになる。
【０１７５】
当業者であれば、常法での実験により、適用可能な疾患および症状の治療に必要な作用剤または化合物の有効かつ無毒の量を判断することができよう。
【０１７６】
通常、有効投与量は、隔週で（ｂｉ ｗｅｅｋｌｙ）体重１ｋｇあたり約０．０００１ｍｇ〜約１００ｍｇ、一般に隔週で体重１ｋｇあたり約０．００１ｍｇ〜約７５ｍｇ、隔週で体重１ｋｇあたり約０．０１ｍｇ〜約５０ｍｇ、隔週で体重１ｋｇあたり約０．０５ｍｇ〜約５０ｍｇ、隔週ごとに体重１ｋｇあたり約０．１ｍｇ〜約１０ｍｇ、隔週で体重１ｋｇあたり０．１ｍｇ前後の範囲にあると想定される。また、本明細書では、投与量の週に１回または３週間に１回での投与も企図される。
【０１７７】
あるいは、有効投与量が隔週で患者１人あたり約２５〜１５０ｍｇであってもよい。通常、有効投与量は、隔週で患者１人あたり約２．５〜約７５０ｍｇ、好ましくは隔週で患者１人あたり約１０〜約３５０ｍｇ、一層好ましくは隔週で患者１人あたり約２５〜１５０ｍｇ、なお一層好ましくは週に約２５〜２００ｍｇの範囲にあると想定される。
【０１７８】
一般に、治療用途では、疾患状態の期間中の治療となる。
【０１７９】
さらに、個々の投与量の最適な量および間隔は、治療対象となる疾患状態の性質と度合い、形態、投与経路および投与部位、治療対象となる特定の個体の性質に応じて判断されることになるのは、当業者であれば自明であろう。また、このような最適な条件については、従来の手法で判断可能である。
【０１８０】
また、規定の日数のあいだにおける１日あたりの投与回数についても、従来の治療過程判断試験を用いて当業者が確認可能であることは、当業者であれば自明であろう。
【０１８１】
以下、具体的な実施例を参照して本発明について説明するが、これらの実施例は、いかなる意味においても本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
【実施例】
【０１８２】
実施例１：Ｃｐｎ１０ポリペプチドの生成
本発明のＣｐｎ１０ポリペプチドの生成プロセスをさらに定義するために、以下の非限定的な実施例をあげておく。
【０１８３】
まず、ヒトＣｐｎ１０をコードする熱誘導可能な発現プラスミドを、修飾のある状態または修飾のない状態で大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＸＬ１−Ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に形質転換し、選択した単一のクローンからマスター細胞バンクを確立した。
【０１８４】
次に、基本的にＲｙａｎら（１９９５， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７０： ２２０３７〜２２０４３）に記載されているようにして、Ｃｐｎ１０を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で産生させた。また、Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ Ｈｉｇｈ Ｑ（ＢｉｏＲａｄ）を結合しない材料を、Ｓ−セファロースに続いてゲル濾過（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でさらに精製した。精製後のＣｐｎ１０を５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）および１５０ｍＭのＮａＣｌ緩衝液に入れたものを、０．２ｍｍのＭｕｓｔａｎｇ Ｅ膜のあるＡｃｒｏｄｉｓｃで製造業者の指示どおり濾過し（Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ，ＭＩ．カタログ番号ＭＳＴＧ５Ｅ３）、残っているエンドトキシンを除去して、−７０℃で保管した。たとえば図３に示すようなさまざまなＣｐｎ１０突然変異体ポリペプチドなどのＣｐｎ１０の純度を求めたところ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおけるクーマシーブリリアント染色で＞９９％であった。使用前にアリコートを１回解凍した。
【０１８５】
実施例２：Ｃｐｎ１０タンパク質の分子シャペロン活性
さまざまなアミノ酸残基の重要性、その電位電荷、シャペロン活性との関連でこれらの残基の位置について調べるために、本発明者らは、１つ以上の突然変異を含み、なおかつ余分なＮ末端アラニン（Ａｌａ）残基がある場合とない場合とで、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＧｒｏＥＬとの併用でＣｐｎ１０ポリペプチド（表１参照）が分子シャペロンとして作用してタンパク質を折り畳む機能を試験した。これについては、Ｗｅｂｅｒ Ｆ．およびＨａｙｅｒ−Ｈａｒｔｌ Ｍ．Ｋ．（Ｃｈａｐｅｒｏｎｉｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， Ｅｄ Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ Ｃ．， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．， ２０００， ｐ１１７−１２６）から適合させた方法を用いるｉｎ ｖｉｔｒｏでのロダネーゼリフォールディングのアッセイによって判断した。
【０１８６】
天然のウシロダネーゼ（３０μＭ、ＳＩＧＭＡ）を、２０ｍＭのＭＯＰＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭのＫＣｌ、２０ｍＭのＭｇＣｌ_２（緩衝液Ａ）に５ＭのグアニジンＨＣｌと８ｍＭのＤＴＴを含有させた中で変性させた後、変性剤からＧｒｏＥＬ（４００ｎＭ）を含有する緩衝液Ａに希釈（７５倍）し、ロダネーゼの最終濃度が４００ｎＭになるようにした。ＧｒｏＥＬは、すみやかに安定して変性ロダネーゼ（Ｄ−Ｒｈｏ）を結合したのに対し、緩衝液単独では、Ｄ−Ｒｈｏはミスフォールドして凝集した（すなわち、自然なリフォールディングが不十分であった）。事前に形成しておいたＧｒｏＥＬ結合ロダネーゼの安定した複合体にＣｐｎ１０およびＡＴＰ（２０．１ｍＭ）を加えると、効率的なリフォールディングが進行する。Ｃｐｎ１０の非存在下、ＡＴＰの添加によってＤ−Ｒｈｏがフォールディングできない形でＧｒｏＥＬのオンオフを繰り返し、最終的にミスフォールディングして凝集する（この反応が好適なアッセイブランクとして機能する）。各フォールディング反応物の総容量は、特定の時点（すなわち、０、１５、３０、４５、６０、７５、９０分）で２９０μＬであり、３０μＬのアリコートを取り出し、７０μＬのロダネーゼ活性アッセイ混合物（５７．１ｍＭのＫＨ_２ＰＯ_４（ｐＨ７．５）、７１．４ｍＭのＥＤＴＡ、７１．４ｍＭのチオ硫酸Ｎａ、７１．４ｍＭのＫＣＮ）と６分間一緒にする。ＡＴＰでのリフォールディング反応の開始前に、リフォールディング時点Ｔ＝０分として３０μＬのアリコートを取る。ロダネーゼ活性アッセイ混合物内のＥＤＴＡがＭｇ^２＋イオンとキレート形成し、これがＧｒｏＥＬのＡＴＰ結合を防止して、結果としてフォールディング反応が瞬時に停止する。その後、６分後に５０μＬの１５％（ｖ／ｖ）ホルムアルデヒド（最終濃度５％ｖ／ｖ）を加えてロダネーゼ活性を停止させる。
【０１８７】
ロダネーゼは、チオ硫酸塩とシアン化物からのチオシアニド（「Ｒｈｏｄａｎｉｄ」）の形成を触媒する。チオシアニドは、硝酸第二鉄の存在下で赤鉄錯体を形成することで、比色的に（吸光度４５０ｎｍ）容易に検出される。ロダネーゼ活性の測定（１５０μＬ）では、硝酸第二鉄試薬１５０μＬ（１６４．５ｍＭの硝酸第二鉄および９．２％ｖ／ｖの硝酸）を添加して発色させる。ロダネーゼ活性の測定値については、９６ウェルのマイクロプレートにて、Ａ４５０ｎｍで読み取る。
【０１８８】
一般的なロダネーゼのフォールディング反応は、フォールドされたロダネーゼの収率が最大となるまでの間、ロダネーゼ活性（すなわちフォールドされたロダネーゼ）の指数関数的勾配に沿った形となる。ＧｒｏＥＬ（４００ｎＭ）とロダネーゼ（４００ｎＭ）が一定量であれば、Ｃｐｎ１０（７量体）とＧｒｏＥＬ（１４量体）のモル濃度が等しくなる（すなわち４００ｎＭ）まで、（ロダネーゼ活性と時間との間に）Ｃｐｎ１０の増加に伴う直線的な関係が観察される。Ｃｐｎ１０の濃度が４００ｎＭを上回ると、ロダネーゼ活性の増加がすみやかに最大に達する。このアッセイを、５つの標準（二重）と試験試料（二重）で構成する。Ｃｐｎ１０標準の濃度は、０ｎＭ、１４０ｎＭ、２５０ｎＭ、２８０ｎＭ、３５０ｎＭである。３０、４５、６０、７５、９０分の時点でのロダネーゼ活性（すなわちＣｐｎ１０活性）の測定値を平均する。０ｎＭのＣｐｎ１０標準はアッセイのバックグラウンド活性の好適な測定値として役立つため、０ｎＭのＣｐｎ１０好適なについての吸光度の値を、計算で求めた他のすべての吸光度値（または活性値）から差し引く。バックグラウンド補正後、２８０ｎＭのＣｐｎ１０標準の吸光度値を１００％活性として指定し、他のすべての吸光度値を、１００％標準に対する相対活性％に変換する。二重に実施する測定を比較することで外れ値のデータ点を除外し、二重の測定値で３０％を超える偏差を許容範囲外とする。許容されるデータを使用して、５つの標準濃度すなわち０ｎＭのＣｐｎ１０（０％活性）、１４０ｎＭのＣｐｎ１０（５０％活性）、２５０ｎＭのＣｐｎ１０（８９．３％活性）、２８０ｎＭのＣｐｎ１０（１００％活性）、３５０ｎＭのＣｐｎ１０（１２５％活性）を用いて、線形較正曲線を生成する。ロダネーゼ活性（Ａｌａ−Ｃｐｎ１０活性など）をＡｌａ−Ｃｐｎ１０濃度に対してプロットする。アッセイバイアスの補正のため、被験試料からの活性値の比率を、線形較正曲線から得た式を用いて再計算する。
【０１８９】
シャペロニン（ＧｒｏＥＬおよびＣｐｎ１０）の濃度についてはタンパク質のオリゴマーの分子量（ＭＷ）を用いて計算し、一方、ロダネーゼではモノマーのＭＷから計算する。たとえば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＧｒｏＥＬの１４量体（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ Ｐ０Ａ６Ｆ５）＝８００，７６６．４ｇ／ｍｏｌ、ヒトＡｌａ−Ｃｐｎ１０の７量体（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ Ｐ６１６０４）＝７６，１００．５ｇ／ｍｏｌ、ヒトＸ−Ｃｐｎ１０−Ｙ７５Ｋの７量体＝７５，３５８．５ｇ／ｍｏｌ、ヒトＡｌａ−Ｃｐｎ１０−Ｙ７５Ｋの７量体＝７５，８５５．５ｇ／ｍｏｌ、ウシロダネーゼの単量体（ＳｗｉｓＰｒｏｔ Ｐ００５８６）＝３３，１６４．６ｇ／ｍｏｌである。
【０１９０】
以下の表１に示すように、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０標準曲線の方程式から多数のＣｐｎ１０タンパク質の活性を求めた。反応はすべて、二重に実施した。
【０１９１】
【表１】

【０１９２】
実施例３：Ｃｐｎ１０突然変異体がポリ（Ｉ：Ｃ）、ＣｐＧ−ＯＤＮ、ＲＮＡと結合する
ＴＬＲは細胞外と細胞内のどちらでも発現され、細胞表面（ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ１０、ＴＬＲ１１）で発現されると通常は疎水性リガンドを認識するのに対し、細胞内区画にあると（ＴＬＲ３、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９）通常は負に荷電した核酸ベースのリガンドを認識する（審良ら ２００６， １２４： ７８３〜８０１）。
【０１９３】
本明細書で説明するように、本発明者らは、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０が負に荷電した核酸ベースのＴＬＲリガンドを結合し、これが、図４に示すようなポリ（Ｉ：Ｃ）（ＴＬＲ３アゴニスト）、図５および図７に示すようなメチル化されていない一本鎖ＣｐＧ−オリゴヌクレオチド（ＯＤＮ）のいくつかのクラス（ヒトＯＤＮ−２２１６クラスＡ、ヒトＯＤＮ−２００６クラスＢ、ヒトＯＤＮ−Ｍ３６２クラスＣ；すべてのＴＬＲ９アゴニスト）および図６に示すような大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２ ｓｓＲＮＡ（ＴＬＲ７／８リガンド）を含むことを示している。
【０１９４】
後述するように、本発明者らはさらに、多数の突然変異体が、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０よりもしっかりとポリ（Ｉ：Ｃ）（図４）、ＣｐＧ−ＯＤＮ（図５）およびｓｓＲＮＡ（図６）に結合することも示している。
【０１９５】
図４に関して、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−Ｅ１８Ａ、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−Ｅ３４Ｑ、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−Ｄ６８Ｎ、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−Ｄ８３Ｎ、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−Ｄ９４Ｎ、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−Ｙ７５Ｒ、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−Ｅ１８Ｋ，Ｄ１０１Ｋ、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−Ｅ３４Ｑ，Ｙ７５Ｋ、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−Ｑ４２，Ｄ１０１Ｋ、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−Ｔ４４Ｋ，Ｄ１０１Ｋ、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−Ｓ５０Ｋ，Ｄ１０１Ｋ、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−Ｅ７４Ｋ，Ｙ７５Ｅ、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−Ｙ７５Ｇ，Ｇ７６Ｋ、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−Ｙ７５ＧＫ、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−Ｙ７５Ｋ，Ｄ９４Ｋ、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−Ｑ３Ｋ、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−Ｓ５０Ｋ、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−Ｄ６８Ｋ、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−Ｄ９４Ｋ、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−Ｄ１０１Ｋ、共有結合−Ｃｐｎ１０、ＭＲ−Ｃｐｎ１０、ＭＫＫＫ−Ｃｐｎ１０などの突然変異体は、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０よりもしっかりとポリＩ：Ｃを結合する。さらに、Ｘ−Ｃｐｎ１０−Ｙ７５Ｋ、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−Ｙ７５Ｋなどのいくつかの突然変異体は、ＴＬＲ３アゴニストポリ（Ｉ：Ｃ）に非常にしっかりと結合するため、１５０ｍＭのＮａＣｌで解離するＡｌａ−Ｃｐｎ１０とは異なり、５００ｍＭのＮａＣｌでは完全には放出できない（図４）。興味深いことに、低ＮａＣｌ濃度では、多くのＣｐｎ１０バリアントが、臭化エチジウムによるインターカレーションからこれを隔離するような形でポリ（Ｉ：Ｃ）の長いポリマーと結合することから、おそらくいくつかのＣｐｎ１０七量体が単一のポリ（Ｉ：Ｃ）鎖と結合していると思われる（図４）。Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−Ｙ７５Ｋ、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−ＫＫ２１、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−Ｄ９４Ｎ、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−Ｙ７５Ｋ，Ｄ９４Ｋをはじめとするいくつかの突然変異体も、低塩濃度で結合ポリ（Ｉ：Ｃ）を臭化エチジウムによるインターカレーションから隔離するが、≧１５０ｍＭでは、結合ポリ（Ｉ：Ｃ）が逃げることなく臭化エチジウムによるインターカレーションに十分なほど結合部位が開く。
【０１９６】
ポリ（Ｉ：Ｃ）との相互作用と同様に、Ｘ−Ｃｐｎ１０およびＡｌａ−Ｃｐｎ１０とＴＬＲ９アゴニストＣｐＧ−クラスＡとの不安定な複合体が、生理的塩濃度（約１５０ｍＭ）で観察された（図５）。これとは対照的に、本発明者らは、ポリ（Ｉ：Ｃ）との相互作用と同様に、いくつかのＣｐｎ１０バリアントとＣｐＧ−クラスＡとの間に有意に強い会合が形成された（図４および５）ことを観察した。実際、ＣｐＧ−クラスＡとの複合体は、５００ｍＭのＮａＣｌ（図５）では解離に対してほとんど耐性であった。ＴＬＲ７およびＴＬＲ８アゴニスト大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２ ｓｓＲＮＡに関して、実験から、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０よりもＡｌａ−Ｃｐｎ１０−Ｙ７５Ｋ、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−ＫＫ２１、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−Ｄ９４ＮおよびＡｌａ−Ｃｐｎ１０−Ｙ７５Ｋ，Ｄ９４Ｋなどの多くのＣｐｎ１０バリアントとの間で強い会合が形成されているということが分かる（図６）。１５０ｍＭのＮａＣｌでは、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０とＸ−Ｃｐｎ１０がｓｓＲＮＡから完全に解離する。しかしながら、いくつかの突然変異体は、５００ｍＭのＮａＣｌの存在下にてしっかりと結合したままである。
【０１９７】
実施例４：ＣｐＧオリゴヌクレオチド（ＯＤＮ）に対するＣｐｎ１０結合の定量的分析
ＯＤＮに対するＣｐｎ１０突然変異体の結合量を判断するために、ｐＨ７．２のＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にて１０μｇ／μｌで突然変異体を調製し、９６ウェルのプレートの三重ウェルに、４℃で１６時間、５０μｇを吸着させた。結合しなかったタンパク質をデカントした後、プレートを１％ＢＳＡおよび５％スクロースのＰＢＳ溶液（ｐＨ７．２）で２３℃で２時間ブロックした。ＰＢＳ（ｐＨ７．２）中０．０１μｇ／μｌで調製された５０μｌの３’−ビオチン標識ヒトＯＤＮ−２２１６クラス−Ａ、ヒトＯＤＮ−２００６クラス−ＢまたはヒトＯＤＮ−Ｍ３６２クラス−Ｃ（ＴＬＲ９アゴニスト）（Ｐｒｏｌｉｇｏ／Ｓｉｇｍａ）を各ウェルに加え、２３℃で２時間インキュベートした。未結合のリガンドを、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０で５回洗浄して取り除いた。結合したＣｐＧ−ＯＤＮをストレプトアビジン−ＨＲＰおよびＴＭＢ検出系でＡ４５０ｎｍにて分析した。
【０１９８】
図７において、生理的塩濃度（約１５０ｍＭ）での定量分析では、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０に比して多数の突然変異体に対するＣｐＧ−クラスＡ、ＢおよびＣの有意に強い相互作用が強調される。
【０１９９】
陽性置換（Ｑ３Ｋ、Ｅ１８Ｋ、Ｑ４２Ｋ、Ｔ４４Ｋ、Ｓ５０Ｋ、Ｄ８６Ｋ、Ｄ１０１Ｋ）を含むＣｐｎ１０突然変異体を作製し、試験したところ、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０に比してＣｐＧ−ＯＤＮクラス−Ａ／Ｂ／Ｃに対する親和性が有意に改善された。
【０２００】
研究対象とした陰性から中性のすべての置換（Ｅ１８Ｑ、Ｅ１８Ａ、Ｅ１８Ｓ、Ｅ１８Ｍ、Ｄ６８Ｎ、Ｄ８３ＮおよびＤ１０１Ｎ）では、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０に比してＣｐＧ−ＯＤＮクラス−Ａ／Ｂ／Ｃに対する親和性が有意に改善された。
【０２０１】
複数の陽性置換Ｃｐｎ１０突然変異体に関して、ＣｐＧ−ＯＤＮクラス−Ａ／Ｂ／Ｃへの結合の定量分析によって、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０に比して、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−Ｙ７５Ｋ，Ｄ９４ＫおよびＡｌａ−Ｃｐｎ１０−Ｅ３４Ｑ，Ｙ７５Ｋなど、いずれも親和性が有意に改善されたことが確認された（図７）。
【０２０２】
ＭＫ−Ｃｐｎ１０およびＡｌａ−Ｃｐｎ１０−Ｋ８５など、研究した陽性挿入（延長）のＣｐｎ１０突然変異体はいずれも、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０に比して／ＣｐＧ−ＯＤＮクラス−Ａ／Ｂ／Ｃに対する親和性が有意に改善された。
【０２０３】
実施例５：Ｃｐｎ１０がＣｐＧ−Ｂ ＯＤＮ誘発ＮＦκＢ活性を調節する
ＰＲＲリガンドの高親和性結合を免疫調節活性の増大と相関させることができるか否かを判断するために、いくつかの細胞ベースのアッセイを開発し、さまざまなＣｐｎ１０突然変異体が炎症誘発性核酸を隔離することでＰＲＲシグナル伝達のレベルを下げる機能を評価した。第１に、ＣｐＧ−ＯＤＮクラスＢおよび未結合のＰＲＲリガンドとともにインキュベートした場合にＡｌａ−Ｃｐｎ１０およびＸ−Ｃｐｎ１０に比して高親和性のバインダを使用して、マウスマクロファージ（ＲＡＷ２６４細胞）にてＮＦκＢを刺激した。
【０２０４】
ＮＦκＢ−ルシフェラーゼレポータープラスミド（ｐＮＩＦｔｙ２−ＬＵＣ；Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）をＲＡＷ２６４．７（マウスマクロファージ）細胞に安定的にトランスフェクトした。ＲＡＷ２６４−ｐＮＩＦｔｙ２−ＬＵＣ細胞を蒔き、一晩放置して接着させた。１００μｇのＣｐｎ１０構築物または調製緩衝液の対照を４μｇのＣｐＧ−Ｂ ＯＤＮ−１８２６（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）と混合し、遠心濾過装置ＹＭ１０（Ａｍｉｃｏｎ）に通した。流動容量分全体をＲＡＷ２６４−ｐＮＩＦｔｙ２−ＬＵＣ細胞に加え、３７℃で５時間インキュベートした。細胞を洗浄した後、１ウェルあたり１００μｌのＣＣＬＲ １×溶液（Ｐｒｏｍｅｇａルシフェラーゼ溶解緩衝液）で溶解させ、製造業者の指示どおりにルシフェラーゼ基質と混合し、ルシフェラーゼカウントを測定した。Ａｌａ−Ｃｐｎ１０でのＴＬＲ９の活性化レベルに、１００％の値を割り当てた。
【０２０５】
図８は、高親和性バインダと、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０に比して低減されたＮＦκＢレベルとのしっかりとした相関を示す。図８から、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−Ｙ７５Ｋ、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−Ｅ１８Ａ、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−Ｙ７５Ｋ，Ｄ９４Ｋ、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−Ｅ３４Ｑ，Ｙ７５Ｋ、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−Ｑ３Ｋ、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−Ｅ１８Ｋ，Ｄ１０１Ｋ、ＭＫＫ−Ｃｐｎ１０などの１つ以上のアミノ酸置換、欠失および／または付加を含む単離されたＣｐｎ１０ポリペプチドが、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０の場合よりもＴＬＲ９の低いレベルの活性化につながることが分かる。
【０２０６】
実施例６：ＨＥＫ２９３細胞においてＣｐｎ１０突然変異体がＴＬＲ−３によりポリ（Ｉ：Ｃ）誘発ＮＦκＢ産生を阻害する
ＴＬＲ３およびｐＮＩＦＴＹ−ＮＦκＢルシフェラーゼレポーター遺伝子をＨＥＫ２９３細胞に一過的にトランスフェクトした。２４時間後、トランスフェクト細胞を２４ウェルのプレートに１×１０^５で蒔き、一晩放置して接着させた。次に、０．１ｕｇのポリ（Ｉ：Ｃ）で、１００ｕｇのＣｐｎ１０突然変異体、１０ｕｌのＳＵＰＥＲａｓｅ ＲＮＡｓｅ阻害因子（Ａｍｂｉｏｎ）の存在下または非存在下で、競合アッセイとして細胞を１８時間刺激した（図９）。ポリ（Ｉ：Ｃ）およびＣｐｎ１０を所望の濃度にて３０分間一緒に混合した後、細胞に加えた。条件ごとに３重に試験した。刺激の１８時間後、細胞を溶解させ、ルシフェラーゼカウントを測定した。
【０２０７】
ルシフェラーゼカウントをポリ（Ｉ：Ｃ）単独に対して正規化し、これを１００％の値とした。ポリ（Ｉ：Ｃ）で細胞を刺激すると、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０はルシフェラーゼ（すなわちＮＦκＢ）のレベルを２２％下げることができた。突然変異体、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−Ｙ７５Ｋ、Ｘ−Ｃｐｎ１０−Ｙ７５Ｋ、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−Ｄ９４Ｋ，Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−Ｙ７５ＧＫ、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−Ｅ１８Ｋ，Ｄ１０１ＫおよびＡｌａ−Ｃｐｎ１０−Ｅ３４Ｑ，Ｙ７５Ｋのうちのいくつかが、ポリ（Ｉ：Ｃ）誘発ＴＬＲ３の有意な調節を示し、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−Ｙ７５Ｋがシグナル伝達を５３％低下させ、Ｘ−Ｃｐｎ１０−Ｙ７５Ｋはシグナル伝達を７１％低下させ、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−Ｄ９４Ｋはシグナル伝達を８２％低下させるといった具合である（図９）。このことから、Ｃｐｎ１０突然変異体のほとんどに、特にＴＬＲ３シグナル伝達に関与する場合に免疫系を調節する機能があることが分かる。
【０２０８】
実施例７：突然変異体のパネル
上記の方法および試験を適用するにあたり、本発明者らは、さまざまな突然変異のある多数のＣｐｎ１０ポリペプチドを生成し、Ｘ−Ｃｐｎ１０およびＡｌａ−Ｃｐｎ１０などのＣｐｎ１０分子と比較して、ポリ（Ｉ：Ｃ）およびいくつかのクラスのＯＤＮなどのＰＲＲリガンドに対する結合性を増加させる機能におけるさまざまなアミノ酸残基の重要性（Ｃｐｎ１０分子における電荷および位置など）を評価した。
【０２０９】
本発明者らは、表１に示すように、Ｃｐｎ１０分子のＮ末端、βバレル、可動性ループ、ルーフループ、Ｃ末端および結合ループの各々におけるアミノ酸残基のうちの少なくとも１つを置換した。本発明者らは、中性のアミノ酸残基を正に荷電した残基と置き換えるか、負に荷電したアミノ酸残基を中性または正に荷電した残基と置き換えるか、正に荷電した残基を別の正に荷電した残基と置き換えるか、正に荷電した残基を挿入または負に荷電した残基を欠失させるかのいずれかを実施した。
【０２１０】
【表２】




【０２１１】
単一置換の突然変異に加えて、本発明者らは、二重突然変異体など、上記の突然変異のうちの２つ以上の組み合わせを含むＣｐｎ１０ポリペプチドを生成した（たとえばＡｌａ−Ｃｐｎ１０−Ｆ１２Ｋ，Ｄ９２Ｋ、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−Ｅ１８Ｋ，Ｄ１０１Ｋ、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−Ｅ３４Ｑ，Ｙ７５Ｋ、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−Ｑ４２Ｋ，Ｄ１０１Ｋ、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−Ｔ４４Ｋ，Ｄ１０１Ｋ、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−Ｓ５０Ｋ，Ｄ１０１Ｋ、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−Ｑ６０Ｋ，Ｔ７８Ｋ、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−Ｅ７４Ｋ，Ｙ７５Ｅ、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−Ｙ７５ＧＫ、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−Ｙ７５Ｇ，Ｇ７６Ｋ、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−Ｙ７５Ｋ，Ｄ９４ＫおよびＡｌａ−Ｃｐｎ１０−Ｙ７５Ｋ，Ｄ９４Ｎ。さらに、本発明者らは、陽性挿入（延長）および陰性欠失（除去）Ｃｐｎ１０バリアント（ＭＨ−Ｃｐｎ１０、ＭＲ−Ｃｐｎ１０、ＭＫ−Ｃｐｎ１０、ＭＫＫ−Ｃｐｎ１０、ＭＫＫＫ−Ｃｐｎ１０、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−Ｋ２１、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−ＫＫ２１、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−Ｋ３９、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−ＫＫ３９、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−Ｋ５７、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−ＫＫ５７、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−Ｋ７６、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−ＫＫ７６、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−Ｋ８５、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−ＫＫ８５、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−Ｋ１０２、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−ＫＫ１０２、ΔＤ１３、ΔＥ１８、ΔＥ２３、ΔＥ３４、ΔＥ５８、ΔＥ６８、ΔＥ７４、ΔＤ８３、ΔＤ８４、ΔＤ８６、ΔＤ９２、ΔＤ９４、ΔＤ１０１など）を生成した。
【０２１２】
本明細書では、別の二重突然変異体、三重突然変異体などの生成につながる上記の突然変異の任意の組み合わせも、本発明の範囲に包含されることが企図される。
【０２１３】
実施例８：Ｃｐｎ１０ポリペプチドの正味の電荷の計算
タンパク質の正味の電荷の計算
上述したように、特定ｐＨでのポリペプチドの正味の電荷を、ヘンダーソン−ハッセルバルヒ式（Ｈａｓｓｅｌｂａｌｃｈ， Ｋ．Ａ．， １９１７ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｃｈｅ Ｚｅｉｔｓｃｈｒｉｆｔ ７８： １１２〜１４４）ならびに、ポリペプチドのイオン化可能なアミノ酸側鎖およびＮ末端およびＣ末端の周知のｐＫａ値に基づいて計算する。表３で利用するｐＫａ値は、Ｎ末端８．０、Ｃ末端３．１、Ｌｙｓ １０．０、Ａｒｇ １２．０、Ｈｉｓ ６．５、Ｇｌｕ ４．４、Ａｓｐ ４．４、Ｔｙｒ １０．０、Ｃｙｓ ８．５である（Ｓｔｒｙｅｒ， Ｌ．， １９８８ 「Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」 ｔｅｘｔｂｏｏｋ 第３版， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ， ＩＳＢＮ ０７１６７１９２０７）。上述した方法を利用して、表３に示すようなＣｐｎ１０バリアントの正味の電荷をｐＨ７．３とｐＨ７．４（生理的なｐＨとして採用）で計算した。
【０２１４】
【表３】



【０２１５】
実施例９：概要
本発明者らは、Ｃｐｎ１０がいくつかの病原体認識受容体（ＰＲＲ）を調節することを以前に発見し、最近になって、人間の関節リウマチ患者（Ｖａｎａｇｓら Ｌａｎｃｅｔ ２００６； ３６８：８５５〜８６３）および乾癬患者（Ｗｉｌｌｉａｍｓら Ａｒｃｈ． Ｄｅｒｍａｔｏｌ． ２００８； １４４：６８３〜６８５）の治療におけるその有効性と安全性を示した。今、本発明者らは、Ｃｐｎ１０のバリアントがいくつかの核酸ベースのＰＲＲリガンドと特異的に結合されることを示す。
【０２１６】
陽性残基を加えるか陰性残基を取り除いて余分な正電荷を加えると、（Ａｌａ−Ｃｐｎ１０およびＸ−Ｃｐｎ１０に比して）核酸ベースのＰＲＲリガンドと有意に強く結合するＣｐｎ１０分子が生成される。余分な正電荷については、（１）既存の表面／液露出中性残基または陰性残基を陽性残基で置き換える、（２）既存の表面／液露出陰性残基を中性残基で置き換える、（３）別の表面／液露出陽性残基を導入する（ループ構造またはＮ末端およびＣ末端を延長するなど）または（４）既存の表面／液露出陰性残基を取り除く（ループ構造またはＮ末端およびＣ末端を短くするなど）ことによって加えることができる。また、本発明者らの結果から、複数の正電荷を導入すると（Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−Ｆ１２Ｋ，Ｄ９２Ｎ；Ｅ１８Ｋ，Ｄ１０１Ｋ；Ｅ３４Ｑ，Ｙ７５Ｋ；Ｑ４２Ｋ，Ｄ１０１Ｋ；Ｔ４４Ｋ，Ｄ１０１Ｋ；Ｓ５０Ｋ，Ｄ１０１Ｋ；Ｑ６０Ｋ，Ｔ７８Ｋ；Ｅ７４Ｋ，Ｙ７５Ｅ；Ｙ７５ＧＫ；Ｙ７５Ｇ，Ｇ７６Ｋ；Ｙ７５Ｋ，Ｄ９４Ｋ；Ｙ７５Ｋ，Ｄ９４Ｎなど）すると、個々の突然変異よりも結合電位が有意に高まる場合があることも分かる。
【０２１７】
事前に存在する中性および陰性残基をリジン（Ｋ）またはアルギニン（Ｒ）残基で置き換えることによる効果を調べた。陽性置換研究（Ａ１Ｋ、Ｑ３Ｋ、Ｑ３Ｒ、Ｆ５Ｋ、Ｄ１３Ｋ、Ｅ１８Ｋ、Ｅ１８Ｒ、Ｓ２０Ｋ、Ａ２２Ｋ、Ｔ２４Ｋ、Ｇ２９Ｋ、Ｍ３１Ｋ、Ｅ３４Ｋ、Ｑ３７Ｋ、Ｖ４０Ｋ、Ｌ４１Ｋ、Ｑ４２Ｋ、Ｔ４４Ｋ、Ｓ５０Ｋ、Ｓ５０Ｒ、Ｓ５２Ｋ、Ｇ５４Ｋ、Ｇ５６Ｋ、Ｅ５８Ｋ、Ｑ６０Ｋ、Ｐ６１Ｋ、Ｖ６６Ｋ、Ｄ６８Ｋ、Ｐ７３Ｋ、Ｅ７４Ｋ、Ｙ７５Ｋ、Ｙ７５Ｈ、Ｙ７５Ｒ、Ｇ７６Ｋ、Ｇ７７Ｋ、Ｔ７８Ｋ、Ｖ８１Ｋ、Ｄ８３Ｋ、Ｄ８４Ｌ、Ｄ８６Ｋ、Ｄ８６Ｒ、Ｙ８７Ｋ、Ｆ８８Ｋ、Ｌ８９Ｋ、Ｄ９２Ｋ、Ｇ９３Ｋ、Ｄ９４Ｋ、Ｄ９４Ｒ、Ｌ９６Ｋ、Ｖ１００Ｋ、Ｄ１０１ＫおよびＤ１０１Ｒ；配列番号３４−４５および５２−１９８）ではいずれも、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０に比してポリ（Ｉ：Ｃ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２ ｓｓＲＮＡおよびいくつかのＣｐＧ−ＯＤＮクラス−Ａ／Ｂ／Ｃに対する親和性が有意に改善された（図４〜図９）。
【０２１８】
事前に存在する陰性残基（すなわちＥおよびＤ）を中性残基（たとえば、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｃ、Ｍ、Ｓ、Ｔ、Ｈ）で置き換えることによる効果についても調べた。ここでも、陰性から中性のすべての置換研究（Ｄ１３Ｎ、Ｅ１８Ａ、Ｅ１８Ｍ、Ｅ１８Ｑ、Ｅ１８Ｓ、Ｅ２３Ｑ、Ｅ３４Ｑ、Ｅ５８Ｑ、Ｄ６８Ｎ、Ｅ７４Ｑ、Ｄ８３Ｎ、Ｄ８４Ｎ、Ｄ８６Ｎ、Ｄ９２Ｎ、Ｄ９４Ａ、Ｄ９４Ｍ、Ｄ９４Ｎ、Ｄ９４ＳおよびＤ１０１Ｎ；配列番号２５０−３０６）で、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０に比してポリ（Ｉ：Ｃ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２ ｓｓＲＮＡおよびいくつかのＣｐＧ−ＯＤＮクラス−Ａ／Ｂ／Ｃに対する親和性が有意に改善された（図４〜図９）。
【０２１９】
複数の正電荷を付加することで、結合がさらにしっかりとしたものになるかどうかを調べるために、いくつかのバリアントを調製した（ｉｅｇ Ｅ１８Ｋ／Ｄ１０１Ｋ、Ｑ４２Ｋ／Ｄ１０１Ｋ、Ｔ４４Ｋ／Ｄ１０１ＫおよびＳ５０Ｋ／Ｄ１０１Ｋ；配列番号２１７−２３１）。予想どおり、すべての核酸ベースのＰＲＲリガンドに対して高親和性の結合が観察された（図４〜図９）。上記にて概説したように、既存の中性または陰性残基を陽性残基（Ｋ，Ｒ，Ｈ）で置き換えたり、陰性残基を中性残基で置き換えたりすることで、Ｃｐｎ１０に正電荷を加えることが可能である。正電荷を別の方法として、このような構造変化に耐えられるＣｐｎ１０の位置での陽性残基（Ｋ，Ｒ，Ｈ）の挿入がある。各Ｃｐｎ１０サブユニットを、３つの小さなループと２つの大きなβヘアピン折り返しループで接続される不連続なβバレル構造にフォールドされる１０１のアミノ酸から形成する（図１）。βバレル構造によって、すべてのサブユニット−サブユニット相互作用およびＣｐｎ１０七量体の安定性が得られる。βバレルのセグメントを延長すると、構造的な不安定さが生じる可能性がある。これに対し、Ｎ末端、Ｃ末端またはいくつかの結合ループを延長しても、このような構造変化に一層よく耐えられると思われる。この予測と一致する形で、いくつかのＣｐｎ１０ホモログは、自然に伸展するセグメントを有する（図２）。たとえば、バクテリオファージＴ４ Ｃｐｎ１０（Ｇｐ３１）は、有意に延長された可動性ループおよびＬ−３ループを有する。蚊、ハエ、マイコバクテリアのＣｐｎ１０は、延長されたルーフループを持つのに対し、多数のＣｐｎ１０が長めのＮ末端およびＣ末端を含む。表４に示すように、５つの結合ループ（すなわちＬ−１、Ｌ−２、Ｌ−３、可動性ループおよびルーフループ）、Ｎ末端およびＣ末端の各々への陽性残基の挿入に成功した。
【０２２０】
【表４】

【０２２１】
研究した陽性挿入（延長）Ｃｐｎ１０バリアントはいずれも、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０に比してポリ（Ｉ：Ｃ）およびいくつかのＣｐＧ−ＯＤＮクラス−Ａ／Ｂ／Ｃに対する親和性が有意に改善された（図４〜図９；配列番号３０７〜３５４）。
【０２２２】
１つの陽性付加を有するＣｐｎ１０バリアントはいずれも、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２ ｓｓＲＮＡと相互作用し、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０よりも高い親和性を呈する。同様に、複数の陽性付加を有するＣｐｎ１０バリアント（Ｅ１８Ｋ／Ｄ１０１Ｋ、Ｑ４２Ｋ／Ｄ１０１Ｋ、Ｔ４４Ｋ／Ｄ１０１Ｋ、Ｓ５０Ｋ／Ｄ１０１Ｋ、ＭＫＫ−Ｃｐｎ１０、ＭＫＫＫ−Ｃｐｎ１０、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−ＫＫ３９、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−ＫＫ８５およびＡｌａ−Ｃｐｎ１０−ＫＫ１０２）では、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０に比して大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２ ｓｓＲＮＡに対する親和性が改善されている（図６）。正味の正電荷を高めるには、陰性残基を中性または陽性残基と置換すればよい。もうひとつの可能性として、陰性残基を完全に取り除くことがある。上述したように、多数のＣｐｎ１０ホモログが自然に伸展され、また短縮された結合ループ（すなわちＬ−１、Ｌ−２、Ｌ−３、可動性ループおよびルーフループ）を有する。２３位、３４位、５８位、７４位および８４位で陰性残基を除去すると（配列番号１９９〜２１３）、これらのＣｐｎ１０バリアントで核酸ベースのＰＲＲリガンドに対する親和性が高まることが示された。陰性残基Ｄ６８、Ｄ８４、Ｄ１０１も、Ｃｐｎ１０の構造の完全性を犠牲にすることなく欠失可能であり、これらのバリアントも高親和性バインダであると想定される。
【０２２３】
ＰＲＲリガンドの高親和性結合を免疫調節活性の増大と相関させることができるか否かを判断するために、いくつかの細胞ベースのアッセイを開発し、さまざまなＣｐｎ１０突然変異体が炎症誘発性核酸を隔離することでＰＲＲシグナル伝達のレベルを下げる機能を評価した。第１に、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０に比して高親和性のバインダをＣｐＧ−ＯＤＮクラスＢと一緒にインキュベートし、未結合のＰＲＲリガンドを用いてＮＦκＢをマウスマクロファージ（ＲＡＷ２６４細胞）にて刺激した。図８は、高親和性バインダとＡｌａ−Ｃｐｎ１０に比して低減されたＮＦκＢレベルとのしっかりとした相関を示す。同様に、Ｘ−Ｃｐｎ１０−Ｋ５３ＥおよびＡｌａ−Ｃｐｎ１０−Ｋ５３Ｍ，Ｋ５５Ｍなど、ＰＲＲリガンドに対する親和性を妥協した突然変異体では、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０に比してＮＦκＢ活性化のレベルが増加した。細胞での高親和性バインダの生物活性を試験するために、次にポリ（Ｉ：Ｃ）で刺激した場合に炎症誘発性ＮＦκＢ活性化（ＴＬＲ３を発現しているＨＥＫ細胞から）を抑える機能についてＣｐｎ１０バリアントを評価した。この系では、高親和性のバインダ（Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−Ｄ１０１Ｋなど）は通常、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０に比してＮＦκＢ活性化を阻害する有意に改善された機能を示した（図７＋図９）。正に荷電した残基を他の正に荷電した残基で置き換え（Ｋ７Ｒ、Ｒ１９Ｋ、Ｋ２７Ｒ、Ｋ３９Ｒ、Ｋ５５Ｒ、Ｋ６９Ｒ、Ｋ８５ＲおよびＫ９８Ｒ；配列番号１０〜３３など）ても、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０に比して当該Ｃｐｎ１０バリアントが炎症促進性核酸を結合する機能に有意な影響はなかった（図８）。
【０２２４】
本明細書では、上記ならびに本明細書全体をとおして述べる突然変異のある単離されたＣｐｎ１０ポリペプチドで、核酸ベースのＰＲＲリガンド、特にＴＬＲ−３アゴニストポリ（Ｉ：Ｃ）、ＴＬＲ７およびＴＬＲ８アゴニスト大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ） ｓｓＲＮＡおよびＴＬＲ９アゴニスト非メチル化ＣｐＧ−オリゴヌクレオチド（ＯＤＮ）（ＯＤＮ−２２１６クラスＡ、ＯＤＮ−２００６クラスＢおよびＯＤＮ−Ｍ３６２クラスＣ）に対する親和性が高まることが示される。また、本明細書では、これらのＣｐｎ１０ポリペプチドがポリ（Ｉ：Ｃ）およびＣｐＧ誘発ＮＦｋＢ活性化を阻害することもことも示される。
【０２２５】
結論
本明細書に含むデータから、Ｃｐｎ１０分子内にて、正に荷電した残基を加えるまたは負に荷電した残基を取り除く、負に荷電した残基を中性または正に荷電した残基で置き換える、中性残基を正に荷電した残基で置き換えることで、ＰＲＲの核酸ベースのリガンドに対する親和性が高められた、実施例８で列挙したようなＣｐｎ１０突然変異体を生成することが可能であることが明らかになっている。たとえば、本発明者らは、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−Ｙ７５Ｋならびに、多くの他のＣｐｎ１０突然変異体が、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０に比してポリ（Ｉ：Ｃ）、ＣｐＧ−ＯＤＮクラス−Ａ／Ｂ／Ｃおよび大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２ ｓｓＲＮＡに対して有意に改善された親和性を持つことを確認した（図４〜図７）が、これはアミノ酸の置換、欠失および／または挿入によってＣｐｎ１０分子の正味の正電荷を増したことによる可能性がある。
【０２２６】
さらに、本発明者らは、Ｃｐｎ１０分子内のいくつかの位置において正電荷を導入することで、ＰＲＲの核酸ベースのリガンドに対する高親和性の結合を達成可能であることも見いだした。核酸ベースのＰＲＲリガンドに対する本発明のポリペプチドの親和性が高められたことは、免疫調節活性が高められたことを示す。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ａｌａ−Ｃｐｎ１０ポリペプチドと比較して、ＰＲＲリガンドに対する増加した親和性を有する、単離されたＣｐｎ１０ポリペプチド。
【請求項２】
前記ＰＲＲリガンドが、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）、ヌクレオチド結合ドメインＬＲＲ含有ファミリー（ＮＬＲ）、ＲＩＧ−Ｉ様受容体（ＲＬＲ）、ＩＲＦのＤＮＡ依存性活性化因子（ＤＡＩ）、Ｃ型レクチン受容体（ＣＬＲ）、またはＩＦＩ２０Ｘ／ＩＦＩ１６ファミリーのメンバー（Ｉｆｉ１６、Ａｉｍ２、ＭＮＤＡ、およびＩＦＩＸなど）からなる群より選択されるＰＲＲのシグナル伝達を調節する、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
前記ＴＬＲが、ＴＬＲ３、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、またはＴＬＲ９のうちの少なくとも１つからなる群より選択される、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
Ａｌａ−Ｃｐｎ１０ポリペプチドと比較して、より大きい正味の正電荷を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項５】
Ａｌａ−Ｃｐｎ１０分子の少なくとも１つの突然変異を有するポリペプチドであって、前記突然変異が、アミノ酸の置換、付加、または欠失である、請求項４に記載のポリペプチド。
【請求項６】
前記突然変異が、１つ以上の正に荷電した残基または中性残基による、１つ以上のアミノ酸残基の置き換えである、請求項５に記載のポリペプチド。
【請求項７】
前記突然変異が、１つ以上の中性残基による、１つ以上のアミノ酸残基の置き換えである、請求項５に記載のポリペプチド。
【請求項８】
前記正に荷電した残基が、アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）、およびヒスチジン（Ｈ）からなる群より選択される、請求項６に記載のポリペプチド。
【請求項９】
前記中性残基が、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、プロリン（Ｐ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）、システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）、およびヒスチジン（Ｈ）からなる群より選択される、請求項７に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
前記突然変異が、可動性（ｍｏｂｉｌｅ）ループ内もしくはルーフ（ｒｏｏｆ）ループ内のいずれかにおける突然変異であるか、またはＣｐｎ１０分子の内面もしくは外面のいずれかの範囲内の、露出した遊離側鎖を残基が有する位置における突然変異であるか、またはこれらの組み合わせにおける突然変異である、請求項６〜９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
野生型Ｃｐｎ１０分子の１〜７位、９位、１２〜１４位、１６位、１８〜４２位、４４位、４６位、５０位、５２〜６３位、６５〜６９位、７３〜７９位、８１位、８３〜８９位、９１〜９４位、および９６位、９８位、１００位、１０１位からなる群より選択されるかまたはこれらの組み合わせのアミノ酸位置において、突然変異を含む、請求項５〜１０のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
Ａ１（Ｋ、ＲまたはＨ）、Ｇ２（Ｋ、ＲまたはＨ）、Ｑ３（Ｋ、ＲまたはＨ）、Ａ４（Ｋ、ＲまたはＨ）、Ｆ５（Ｋ、ＲまたはＨ）、Ｒ６（ＫまたはＨ）、Ｋ７（ＲまたはＨ）、Ｌ９（Ｋ、ＲまたはＨ）、Ｆ１２（Ｋ、ＲまたはＨ）、Ｄ１３（Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｃ、Ｍ、ＳまたはＴ）、Ｒ１４（ＫまたはＨ）、Ｌ１６（Ｋ、ＲまたはＨ）、Ｅ１８（Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｃ、Ｍ、ＳまたはＴ）、Ｒ１９（ＫまたはＨ）、Ｓ２０（Ｋ、ＲまたはＨ）、Ａ２１（Ｋ、ＲまたはＨ）、Ａ２２（Ｋ、ＲまたはＨ）、Ｅ２３（Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｃ、Ｍ、ＳまたはＴ）、Ｔ２４（Ｋ、ＲまたはＨ）、Ｖ２５（Ｋ、ＲまたはＨ）、Ｔ２６（Ｋ、ＲまたはＨ）、Ｒ２７（ＫまたはＨ）、Ｇ２８（Ｋ、ＲまたはＨ）、Ｇ２９（Ｋ、ＲまたはＨ）、Ｉ３０（Ｋ、ＲまたはＨ）、Ｍ３１（Ｋ、ＲまたはＨ）、Ｌ３２（Ｋ、ＲまたはＨ）、Ｐ３３（Ｋ、ＲまたはＨ）、Ｅ３４（Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｃ、Ｍ、ＳまたはＴ）、Ｋ３５（ＲまたはＨ）、Ｓ３６（Ｋ、ＲまたはＨ）、Ｑ３７（Ｋ、ＲまたはＨ）、Ｇ３８（Ｋ、ＲまたはＨ）、Ｋ３９（Ｋ、ＲまたはＨ）、Ｖ４０（Ｋ、ＲまたはＨ）、Ｌ４１（Ｋ、ＲまたはＨ）、Ｑ４２（Ｋ、ＲまたはＨ）、Ｔ４４（Ｋ、ＲまたはＨ）、Ｖ４６（Ｋ、ＲまたはＨ）、Ｓ５０（Ｋ、ＲまたはＨ）、Ｓ５２（Ｋ、ＲまたはＨ）、Ｋ５３（ＲまたはＨ）、Ｇ５４（Ｋ、ＲまたはＨ）、Ｋ５５（ＲまたはＨ）、Ｇ５６（Ｋ、ＲまたはＨ）、Ｇ５７（Ｋ、ＲまたはＨ）、Ｅ５８（Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｃ、Ｍ、ＳまたはＴ）、Ｉ５９（Ｋ、ＲまたはＨ）、Ｑ６０（Ｋ、ＲまたはＨ）、Ｐ６１（Ｋ、ＲまたはＨ）、Ｖ６２（Ｋ、ＲまたはＨ）、Ｓ６３（Ｋ、ＲまたはＨ）、Ｋ６５（ＲまたはＨ）、Ｖ６６（Ｋ、ＲまたはＨ）、Ｇ６７（Ｋ、ＲまたはＨ）、Ｄ６８（Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｃ、Ｍ、ＳまたはＴ）、Ｋ６９（ＲまたはＨ）、Ｐ７３（Ｋ、ＲまたはＨ）、Ｅ７４（Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｃ、Ｍ、ＳまたはＴ）、Ｙ７５（ＧＫ、Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｅ）、Ｇ７６（Ｋ、ＲまたはＨ）、Ｇ７７（Ｋ、ＲまたはＨ）、Ｔ７８（Ｋ、ＲまたはＨ）、Ｋ７９（ＲまたはＨ）、Ｖ８１（Ｋ、ＲまたはＨ）、Ｄ８３（Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｃ、Ｍ、ＳまたはＴ）、Ｄ８４（Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｃ、Ｍ、ＳまたはＴ）、Ｋ８５（Ｋ、ＲまたはＨ）、Ｄ８６（Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｃ、Ｍ、ＳまたはＴ）、Ｙ８７（Ｋ、ＲまたはＨ）、Ｆ８８（Ｋ、ＲまたはＨ）、Ｌ８９（Ｋ、ＲまたはＨ）、Ｒ９１（ＫまたはＨ）、Ｄ９２（Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｃ、Ｍ、ＳまたはＴ）、Ｇ９３（Ｋ、ＲまたはＨ）、Ｄ９４（Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｃ、Ｍ、ＳまたはＴ）、Ｌ９６（Ｋ、ＲまたはＨ）、Ｋ９８（ＲまたはＨ）、Ｖ１００（Ｋ、ＲまたはＨ）、Ｄ１０１（Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｃ、Ｍ、ＳまたはＴ）、ＭＨ−Ｃｐｎ１０、ＭＲ−Ｃｐｎ１０、ＭＫ−Ｃｐｎ１０、ＭＫＫ−Ｃｐｎ１０、ＭＫＫＫ−Ｃｐｎ１０、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−Ｋ２１、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−ＫＫ２１、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−Ｋ３９、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−ＫＫ３９、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−Ｋ５７、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−ＫＫ５７、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−Ｋ７６、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−ＫＫ７６、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−Ｋ８５、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−ＫＫ８５、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−Ｋ１０２、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−ＫＫ１０２、ΔＤ１３、ΔＥ１８、ΔＥ２３、ΔＥ３４、ΔＥ５８、ΔＥ６８、ΔＥ７４、ΔＤ８３、ΔＤ８４、ΔＤ８６、ΔＤ９２、ΔＤ９４、およびΔＤ１０１からなる群より選択されるかまたはこれらの組み合わせの突然変異を含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１３】
２つ以上の前記突然変異の組み合わせを含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１４】
Ｆ１２Ｋ，Ｄ９２Ｋ；Ｅ１８Ｋ，Ｄ１０１Ｋ；Ｅ３４Ｑ，Ｙ７５Ｋ；Ｑ４２Ｋ，Ｄ１０１Ｋ；Ｔ４４Ｋ，Ｄ１０１Ｋ；Ｓ５０Ｋ，Ｄ１０１Ｋ；Ｑ６０Ｋ，Ｔ７８Ｋ；Ｅ７４Ｋ，Ｙ７５Ｅ；Ｙ７５ＧＫ；Ｙ７５Ｇ，Ｇ７６Ｋ；Ｙ７５Ｋ，Ｄ９４Ｋ；およびＹ７５Ｋ，Ｄ９４Ｎからなる群より選択される突然変異を含む、請求項１３に記載のポリペプチド。
【請求項１５】
Ｎ末端、可動性ループ、ヘアピンルーフループ、またはこれらの組み合わせを欠いているかまたは実質的に欠いている、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１６】
配列番号３４、３７、４０、４３、４６、４９、５２、５５、５８、６１、６４、６７、７０、７３、７６、７９、８２、８５、８８、９１、９４、９７、１００、１０３、１０６、１０９、１１２、１１５、１１８、１２１、１２４、１２７、１３０、１３３、１３６、１３９、１４２、１４５、１４８、１５１、１５４、１５７、１６０、１６３、１６６、１６９、１７２、１７５、１７８、１８１、１８４、１８７、１９０、１９３、１９６、１９９、２０２、２０５、２０８、２１１、２１７、２２０、２２３、２２６、２２９、２３２、２３５、２３８、２４１、２４４、２４７、２５０、２５３、２５６、２５９、２６２、２７１、２７４、２７７、２８０、２８３、２８６、２８９、２９２、２９５、２９８、３０１、３０４、３０７、３１０、３１３、３１６、３１９、３２２、３２５、３２８、３３１、３３４、３３７、３４０、３４３、３４６、３４９、３５２、または３５５からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１７】
ヒトＣｐｎ１０である、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１８】
請求項１〜１７のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする、単離された核酸。
【請求項１９】
請求項１８に記載の核酸を含む発現構築物であって、１つ以上の制御配列に作動可能に連結された発現構築物。
【請求項２０】
請求項１〜１７のいずれか一項に記載のポリペプチドを発現するか、または請求項１８に記載の核酸もしくは請求項１９に記載の発現構築物を含む、宿主細胞。
【請求項２１】
請求項１〜１７のいずれか一項に記載のポリペプチドと選択的に結合する抗体。
【請求項２２】
請求項１〜１７のいずれか一項に記載のポリペプチドを、単独で、あるいは核酸ベースのＰＲＲリガンド、請求項１８に記載の核酸、請求項１９に記載の発現構築物、もしくは請求項２１に記載の抗体のうちの少なくとも１つ、またはこれらの任意の組み合わせと併せてのいずれかで含む、薬学的組成物。
【請求項２３】
請求項１〜１７のいずれか一項に記載のポリペプチドの治療有効量を、単独で、あるいは核酸ベースのＰＲＲリガンドもしくは請求項１８に記載の核酸のうちの少なくとも１つまたはこれらの任意の組み合わせと併せてのいずれかで、被験体に投与するステップを含む、被験体を治療する方法。
【請求項２４】
前記治療が被験体における免疫応答を調節し、前記免疫応答が、ＰＲＲシグナル伝達の制御によって調節される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
被験体における疾患、障害、または症状を治療または予防するための方法であって、請求項１〜１７のいずれか一項に記載のポリペプチドの有効量を、単独で、あるいは核酸ベースのＰＲＲリガンドもしくは請求項１８に記載の核酸のうちの少なくとも１つまたはこれらの任意の組み合わせと併せてのいずれかで、被験体に投与するステップを含む、方法。
【請求項２６】
前記疾患、障害、または症状が、インスリン依存性糖尿病、全身性エリテマトーデス、シェーグレン病（Ｓｊｏｒｇｒｅｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、グレーブス病、多発性硬化症、関節リウマチ、慢性疲労症候群、アルツハイマー病、喘息、アレルギー、ＧＶＨＤ、アテローム性動脈硬化症（ａｒｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、炎症性疼痛、乾癬、ＨＩＶ、慢性免疫活性化（Ｃｈｒｏｎｉｃ ｉｍｍｕｎｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）、慢性筋炎、強皮症などの急性もしくは慢性炎症性疾患；または非小細胞肺癌、腎細胞癌、メラノーマ、非ホジキンリンパ腫、結腸直腸癌、基底細胞癌などの癌；または細菌感染、ウイルス感染もしくは真菌感染に起因しうる感染症からなる群より選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
被験体において、またはその少なくとも１つの細胞、組織、もしくは臓器において、ＰＲＲシグナル伝達を調節するための方法であって、治療有効量の、請求項１〜１７のいずれか一項に記載のポリペプチドもしくは請求項１８に記載の核酸またはこれらの任意の組み合わせを投与するステップを含む、方法。
【請求項２８】
被験体において、またはその少なくとも１つの細胞、組織、もしくは臓器において、１つ以上の免疫調節物質の生成および／または分泌を調節するための方法であって、治療有効量の、請求項１〜１７のいずれか一項に記載のポリペプチドもしくは請求項１８に記載の核酸またはこれらの任意の組み合わせを投与するステップを含む、方法。
【請求項２９】
被験体において、またはその少なくとも１つの細胞、組織、もしくは臓器において、１つ以上の免疫調節物質の生成および／または分泌を阻害するための方法であって、有効量の、請求項１〜１７のいずれか一項に記載のポリペプチドもしくは請求項１８に記載の核酸またはこれらの任意の組み合わせを投与するステップを含む、方法。
【請求項３０】
前記免疫調節物質が、炎症促進性サイトカインもしくはケモカインまたは抗炎症性サイトカインもしくはケモカインであって、前記サイトカインまたはケモカインが、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１α／β、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−２３、ＲＡＮＴＥＳ、ＴＧＦ−β、またはＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、もしくはＩＦＮ−γでありうるＩ型インターフェロンから選択される、請求項２８または２９に記載の方法。
【請求項３１】
請求項１〜１７のいずれか一項に記載のポリペプチドと結合する化合物を同定する方法であって、
（ａ）候補化合物を前記ポリペプチドと接触させるステップ、および
（ｂ）前記候補化合物と前記ポリペプチドとの間の複合体の形成をアッセイするステップ
を含む、方法。
【請求項３２】
前記アッセイが、競合的結合アッセイ、ゲル濾過クロマトグラフィ、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（登録商標）ハイスループットスクリーニング、ツーハイブリッドアッセイ、電気泳動移動度シフト（ゲルシフト）アッセイ、およびプレートキャプチャアッセイからなる群より選択される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
請求項１〜１７のいずれか一項に記載のポリペプチドの活性を調節する化合物のスクリーニング方法であって、
（ａ）前記ポリペプチドを、前記ポリペプチドと候補化合物との相互作用を可能にするのに適した条件下で、候補化合物と接触させるステップ、および
（ｂ）前記ポリペプチドの活性をアッセイするステップ
を含む、方法。
【請求項３４】
ＰＲＲリガンドのスクリーニング方法であって、
（ａ）請求項１〜１７のいずれか一項に記載のポリペプチドを、前記ポリペプチドと候補化合物との相互作用を可能にするのに適した条件下で、候補ＰＲＲリガンド化合物と接触させるステップ、および
（ｂ）野生型Ｃｐｎ１０と比較した、前記ポリペプチドとの前記化合物の親和性の増加をアッセイするステップ、および／または
（ｃ）候補ＰＲＲリガンド化合物および前記ポリペプチドの存在下で、ＰＲＲ活性化の増加または低下をアッセイするステップ
を含む、方法。
【請求項３５】
機能的バリアント、誘導体、ホモログ、アナログ、またはフラグメントである、請求項１〜１７のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【図１】

【図２】

【図３Ａ】

【図３Ｂ】

【図３Ｃ】

【図３Ｄ】

【図３Ｅ】

【図３Ｆ】

【図３Ｇ】

【図４ａ】

【図４ｂ】

【図４ｃ−１】

【図４ｃ−２】

【図４ｃ−３】

【図４ｄ】

【図４ｅ】

【図４ｆ】

【図４ｇ】

【図５ａ】

【図５ｂ】

【図５ｃ−１】

【図５ｃ−２】

【図５ｃ−３】

【図５ｃ−４】

【図５ｃ−５】

【図５ｃ−６】

【図５ｃ−７】

【図５ｄ−１】

【図５ｄ−２】

【図５ｄ−３】

【図５ｄ−４】

【図５ｅ−１】

【図５ｅ−２】

【図５ｅ−３】

【図５ｅ−４】

【図５ｆ】

【図５ｇ−１】

【図５ｇ−２】

【図５ｇ−３】

【図６ａ】

【図６ｂ】

【図６ｃ−１】

【図６ｃ−２】

【図６ｃ−３】

【図６ｄ】

【図６ｅ】

【図６ｆ】

【図６ｇ】

【図７ａ】

【図７ｂ】

【図７ｃ】

【図７ｄ】

【図７ｅ】

【図７ｆ】

【図７ｇ】

【図８ａ】

【図８ｂ】

【図８ｃ】

【図８ｄ】

【図８ｅ】

【図８ｆ】

【図８ｇ】

【図９ａ】

【図９ｂ】

【図９ｃ】

【図９ｅ】

【図９ｆ−１】

【図９ｆ−２】

【公表番号】特表２０１１−５１９５４８（Ｐ２０１１−５１９５４８Ａ）
【公表日】平成２３年７月１４日（２０１１．７．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５０３３１０（Ｐ２０１１−５０３３１０）
【出願日】平成２１年４月９日（２００９．４．９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＡＵ２００９／０００４４４
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１２４３５３
【国際公開日】平成２１年１０月１５日（２００９．１０．１５）
【出願人】（５０８００８７８４）シーバイオ　リミテッド (2)
【Ｆターム（参考）】