候補遺伝子のアレイを用いた原発性乳がんの遺伝子発現プロファイリング
【課題】臨床例におけるｃＤＮＡアレイ試験の可能性を評価し、雑多な癌を臨床転帰がさらに一様ないくつかの腫瘍サブタイプに分類し、かつ新たな潜在的予後因子および治療標的を同定する手段を提供する。
【解決手段】ポリヌクレオチド配列またはこれらの部分配列のプールを含む、癌腫の分子キャラクタリゼーションに役立つポリヌクレオチドライブラリであって、上記の配列または部分配列が腫瘍細胞にて高発現され、この配列または特定の配列のいずれかに記載のポリヌクレオチド配列またはこれらの相補体のうちいずれかに実質的に対応する、ポリヌクレオチドライブラリ。また、選択された固定化ポリヌクレオチド配列の集合の組み合わせを含む、腫瘍細胞と正常な細胞とを見分ける上で役立つポリヌクレオチドアレイ。
【解決手段】ポリヌクレオチド配列またはこれらの部分配列のプールを含む、癌腫の分子キャラクタリゼーションに役立つポリヌクレオチドライブラリであって、上記の配列または部分配列が腫瘍細胞にて高発現され、この配列または特定の配列のいずれかに記載のポリヌクレオチド配列またはこれらの相補体のうちいずれかに実質的に対応する、ポリヌクレオチドライブラリ。また、選択された固定化ポリヌクレオチド配列の集合の組み合わせを含む、腫瘍細胞と正常な細胞とを見分ける上で役立つポリヌクレオチドアレイ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリヌクレオチドの分析に関し、特に、候補ポリヌクレオチドのアレイを用いて癌腫のポリヌクレオチド発現プロファイリングを行うことに関する。
【背景技術】
【０００２】
乳癌患者の処置に携わる病理学者および臨床医らは、この疾患の不均一性が高く、従来の組織学的・臨床的な特徴に、乳癌とその感受性が癌の治療に対してどのように発展していくかを高い信頼度で予測する因子がないという、２つの大きな問題に直面している。予後のタイプが同じに見える乳腫であっても、治療に対する応答性は患者ごとに大きく異なり、必然的に生存率も患者によって大きく異なる。患者ごとに治療を変えられるようにするには、新たな予後因子および予測因子が必要なのである。
【０００３】
上記の問題に対してグローバルに取り組む分子的研究に現在大きな期待がよせられている。細胞遺伝学、比較ゲノムハイブリダイゼーション、全ゲノムａｌｌｅｌｏｔｙｐｉｎｇなどの方法では、この問題にゲノムレベルで取り組んできている。現在、転写レベルでヒトの腫瘍に起こる修飾についても、多くの遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルを同時定量的測定できるｃＤＮＡアレイなどの新たな方法を用いて、前例のない大きな規模で研究することが可能である。したがって、臨床例におけるｃＤＮＡアレイ試験の可能性を評価し、雑多な（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ）癌を臨床転帰がさらに一様ないくつかの腫瘍サブタイプに分類し、かつ新たな潜在的予後因子および治療標的を同定する手段を提供できれば都合がよいであろう。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、ポリヌクレオチド配列またはこれらの部分配列のプールを含む、癌腫の分子キャラクタリゼーションに役立つポリヌクレオチドライブラリであって、上記の配列または部分配列が腫瘍細胞にて低発現または高発現され、この配列または部分配列が配列番号１〜４６８のいずれかに記載のポリヌクレオチド配列またはこれらの相補体のうちいずれかに実質的に対応するものである、ポリヌクレオチドライブラリに関する。
【０００５】
本願開示内容では、さまざまな専門用語を使用しなければならない。
【０００６】
「ポリヌクレオチド」という用語は、一本鎖であり、任意に、合成のヌクレオチド塩基、非天然のヌクレオチド塩基または改変されたヌクレオチド塩基を含む、ＲＮＡまたはＤＮＡのポリマーを示す。ＤＮＡのポリマーとしてのポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたは合成ＤＮＡの１つまたはそれ以上のセグメントで構成されるものであってもよい。
【０００７】
「部分配列」という用語は、これよりも長い核酸の配列の一部を含む核酸配列を示す。
【０００８】
「支持体に固定化された」とは、共有結合、水素結合、イオン性の相互作用、疎水性の相互作用またはその他の方法による付着を含む、直接的または間接的な結合を意味する。
【０００９】
乳癌には組織臨床的に重要な不均一性が認められるという特徴があるが、このような不均一性は症例ごとに最も適切な処置を選択する上での妨げとなっている。この問題については、疾患の自然史と処置に対する感受性とをさらに高い精度で予測する新たなパラメーターを確認することで解決できる可能性がある。本発明の重要な一目的は、予測、予後および癌処置の一助となり得る乳癌の大規模分子キャラクタリゼーションに関するものである。
【００１０】
本発明の重要な一態様はｃＤＮＡアレイを使用することに関するものである。これは、腫瘍試料の比較結果、従来の組織臨床的な予後の特徴と分子データとの相関性、遺伝子相関という３通りの方法で、３４の一貫した原発性乳がんにおける１８８の候補遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルを定量的に研究できるようにするものである。この実験によって、乳腫の高い不均一性が転写レベルで明らかになった。階層的クラスタリング法では、化学療法後の臨床転帰が異なることが特徴である腫瘍の分子的に異なる２つのサブグループが識別された。この転帰は一般に使用されている組織臨床的なパラメーターでは予測できなかったものである。患者の年齢、腫瘍のサイズ、組織学的なタイプおよびグレードには何ら相関性は認められなかった。しかしながら、エストロゲンレセプターの状態から判断した場合の遺伝子の発現がリンパ節転移のある腫瘍において特徴的であった。すなわち、ＥＲＢＢ２の発現はリンパ節の状態と強く相関（ｐ≦０．０００１）し、ＧＡＴＡ３の発現はエストロゲンレセプターの存在と強く相関（ｐ≦０．００１）していた。したがって、これらの実験結果から、新たな潜在的発癌ターゲットと転帰とに基づいて腫瘍をグループ化する新たな方法が得られた。これらの方法では、ｃＤＮＡアレイ試験を系統的に使用することで予後と化学受容性の点で乳癌の分類が改善され、かつ新しい潜在的な治療標的が得られる可能性が高いことが分かる。
【００１１】
固相支持体あるいは、ナイロン膜、スライドガラス、ガラスビーズ、シリコンチップなどの支持体上に規則正しくスポットされた多数のＤＮＡ分子で構成されるのがＤＮＡアレイである。ＤＮＡアレイについては、アレイ上の各ＤＮＡスポットのサイズによってマイクロアレイ（各ＤＮＡスポットの直径２５０ミクロン未満）とマクロアレイ（スポット直径が３００ミクロンを上回る）とに分類できる。使用する固体支持体のサイズが小さい場合、このアレイをＤＮＡチップと呼ぶこともある。どのようなスポッティング法を使うのかによって、ガラス製マイクロアレイのスポット数は数百から数千までの範囲となり得る。
【００１２】
ＤＮＡマイクロアレイは、遺伝子発現プロファイリング、新規遺伝子配列決定、遺伝子変異分析、遺伝子マッピングおよび遺伝子型同定をはじめとするさまざまな目的に活用されてきた。ｃＤＮＡマイクロアレイはｃＤＮＡライブラリから単離した別々のｃＤＮＡクローンでプリントされる。このため、各スポットが別々のｍＲＮＡ由来であるため、それぞれ発現された遺伝子を表すことになる。
【００１３】
一般に、遺伝子発現をモニタリングする方法では、（１）１つまたはそれ以上の標的遺伝子（単数または複数）のＲＮＡ転写物（単数または複数）またはこのＲＮＡ転写物（単数または複数）由来の核酸を含む試料ポリヌクレオチドのプールを提供し、（２）試料ポリヌクレオチドを、プローブのアレイ（たとえばポリヌクレオチドライブラリから得たポリヌクレオチドなど）（対照プローブを含む）にハイブリダイズするなど、反応させ、（３）反応した／ハイブリダイズされたポリヌクレオチドを検出する。この検出は、相対的な発現（転写）レベルの計算／定量化を伴うものであってもよい。
【００１４】
本発明は、ポリヌクレオチド配列またはこれらの部分配列のプールを含む、癌腫の分子キャラクタリゼーションに役立つポリヌクレオチドライブラリであって、前記配列または部分配列が腫瘍細胞にて低発現または高発現され、前記配列または部分配列が添付書類の配列番号１〜４６８のいずれかに記載のポリヌクレオチド配列またはこれらの相補体のうちいずれかに実質的に対応するものである、ポリヌクレオチドライブラリに関するものである。
【００１５】
当然、上記配列との相同率の高い配列を用いて、すなわち配列番号１〜４６８のいずれかひとつの配列と比較してこれらの配列が点のような変異（ｐｕｎｃｔｕａｌ ｍｕｔａｔｉｏｎ）を１つあるいは若干示す場合に、本発明の分子キャラクタリゼーションを実現することもできる。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明は、ポリヌクレオチド配列またはこれらの部分配列のプールを含む、癌腫の分子キャラクタリゼーションに役立つポリヌクレオチドライブラリであって、前記配列または部分配列が腫瘍細胞にて高発現され、前記配列または部分配列が添付書類の配列番号１〜２４９（ここで、これらの配列番号は、優先権書類での旧配列番号１〜２４９を示し、本願添付書類の配列表における対応表１０でこれらの配列を識別することができる）のいずれかに記載のポリヌクレオチド配列またはこれらの相補体のうちいずれかに実質的に対応するものである、ポリヌクレオチドライブラリに関するものである。
【００１７】
好ましくは、ポリヌクレオチド配列または部分配列のプールが、配列番号１〜２４７（ここで、これらの配列番号は、優先権書類での旧配列番号１〜２４７を示し、本願添付書類の配列表における対応表１０でこれらの配列を識別することができる）のうちいずれかのポリヌクレオチド配列に実質的に対応し、前記配列が、正常な細胞と癌細胞とを区別する際に役立つものである。
【００１８】
また、本発明は、ポリヌクレオチド配列または部分配列のプールが、配列番号１〜２４２（ここで、これらの配列番号は、優先権書類での旧配列番号１〜２４２を示し、本願添付書類の配列表における対応表１０でこれらの配列を識別することができる）のうちいずれかのポリヌクレオチド配列に実質的に対応し、前記配列が、ホルモン感受性腫瘍細胞を検出する際に役立つものである、あるいは、前記配列が、リンパ節のある腫瘍とリンパ節のない腫瘍とを区別する際に役立つものである、ポリヌクレオチドライブラリに関するものである。
【００１９】
また、本発明は、ポリヌクレオチド配列または部分配列のプールが、配列番号１〜２２４（ここで、これらの配列番号は、優先権書類での旧配列番号１〜２２４を示し、本願添付書類の配列表における対応表１０でこれらの配列を識別することができる）のうちいずれかのポリヌクレオチド配列に実質的に対応し、前記配列が、テトラサイクリン感受性腫瘍とテトラサイクリン非感受性腫瘍とを区別する際に役立つものである、ポリヌクレオチドライブラリに関するものである。
【００２０】
また、本発明は、ポリヌクレオチドアレイを形成すべく前記ポリヌクレオチドを固相支持体に固定化した、上述したようなポリヌクレオチドライブラリに関するものである。
【００２１】
好ましくは、ナイロン膜、スライドガラス、ガラスビーズまたはシリコンチップからなる群から支持体を選択する。
【００２２】
また、本発明は、
ａ）患者からポリヌクレオチド試料を得ることと、
ｂ）ステップ（ａ）で得られた前記試料ポリヌクレオチドと、上述したライブラリのポリヌクレオチド配列のうちいずれかまたは前記ライブラリのポリヌクレオチド配列のうちいずれかでコードされる発現産物を含む、固相支持体に固定化したプローブと、を反応させることと、
ｃ）ステップ（ｂ）の反応産物を検出することとを含む、癌と相関し、発現状態の異なるポリヌクレオチド配列を検出する方法に関するものである。
【００２３】
また、本発明は、ステップ（ｃ）の反応産物の量と対照試料とを比較する、本発明の差次的に発現されたポリヌクレオチド配列を検出するための方法に関するものである。
【００２４】
好ましくは、ポリヌクレオチド試料を単離し、試料はＲＮＡまたはｍＲＮＡである。
【００２５】
好ましくは、ポリヌクレオチド試料はｍＲＮＡの逆転写によって得られたｃＤＮＡである。
【００２６】
好ましい実施形態では、差次的に発現されたポリヌクレオチド配列を検出する方法、ステップ（ｂ）は試料ＲＮＡを標識したプローブにハイブリダイゼーションすることを含む。
【００２７】
この差次的に発現されたポリヌクレオチド配列を検出する方法は、癌に関連した健康状態すなわち、乳癌を検出し、診断し、病期分類し、モニタリングし、予後判定するのに使用される。
【００２８】
ポリヌクレオチド配列または部分配列のうちいずれかでコードされる産物が、検出の根拠となるレセプターリガンド反応に関与している場合に、差次的に発現されたポリヌクレオチド配列を検出する方法は特に有用である。
【００２９】
また、本発明は、上述した差次的に発現されたポリヌクレオチド配列を検出するための方法を含む、抗腫瘍薬をスクリーニングするための方法であって、スクリーニング対象となる抗腫瘍薬で試料を処置しておく方法に関するものである。
【００３０】
ポリヌクレオチド試料の標識に使用する標識は、放射性標識、比色的な標識、酵素的な標識、分子増幅による標識、生物発光標識または蛍光標識からなる群から選択される。
【００３１】
また、本発明は、配列番号：１から配列番号：２４９（ここで、これらの配列番号は、優先権書類での旧配列番号１〜２４９を示し、本願添付書類の配列表における対応表１０でこれらの配列を識別することができる）から選択される腫瘍由来の細胞およびそれぞれの相補体において高発現または低発現されたポリヌクレオチド配列からなる個体群を含む、ポリヌクレオチドのライブラリに関するものである。
【００３２】
特定の実施形態では、本発明は、配列番号：１、配列番号：５、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：２８、配列番号：２９、配列番号：３０、配列番号：３１、配列番号：３２、配列番号：４５、配列番号：４６、配列番号：５２、配列番号：５４、配列番号：６３、配列番号：６４、配列番号：８１、配列番号：８２、配列番号：８７、配列番号：８８、配列番号：１０１、配列番号：１０２、配列番号：１０３、配列番号：１０４、配列番号：１０５、配列番号：１０７、配列番号：１１３、配列番号：１１４、配列番号：１１５、配列番号：１１６、配列番号：１２７、配列番号：１２８、配列番号：１３１、配列番号：１３９、配列番号：１４０、配列番号：１４２、配列番号：１５０、配列番号：１５１、配列番号：１５４、配列番号：１５６、配列番号：１６０、配列番号：１６１、配列番号：１６２、配列番号：１７７、配列番号：１７８、配列番号：１９４、配列番号：１９５、配列番号：２２７、配列番号：２２８、配列番号：２２９、配列番号：２３１、配列番号：２３３、配列番号：２４３、配列番号：２４４、配列番号：２４５、配列番号：２４６、配列番号：２４７（ここで、これらの配列番号は、優先権書類の表５における旧配列番号を示し、本願添付書類の配列表における対応表１０でこれらの配列を識別することができる）のポリヌクレオチド配列に関するものであり、これで健常な人と癌のある人とを見分ける。
【００３３】
好ましくは、本発明は、配列番号：１、配列番号：５、配列番号：１０２、配列番号：１０３、配列番号：１０７、配列番号：２２９、配列番号：４５、配列番号：４６、配列番号：２４３、配列番号：２４４、配列番号：２４５、配列番号：２４６、配列番号：２４７（ここで、これらの配列番号は、優先権書類の表６における旧配列番号を示し、本願添付書類の配列表における対応表１０でこれらの配列を識別することができる）のポリヌクレオチド配列に関するものであり、これで健常な人と癌のある人とを見分ける。
【００３４】
別の特定の実施形態において、本発明は、ホルモン感受性腫瘍を検出する、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：１８、配列番号：１９、配列番号：２０、配列番号：２１、配列番号：２２、配列番号：２３；、配列番号：２４、配列番号：２５、配列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：２２１、配列番号：２２２、配列番号：２２３、配列番号：２４１、配列番号：２４２（ここで、これらの配列番号は、優先権書類の表７における旧配列番号を示し、本願添付書類の配列表における対応表１０でこれらの配列を識別することができる）のポリヌクレオチド配列に関するものである。
【００３５】
好ましくは、本発明は、配列番号：１、配列番号：２配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：２２１、配列番号：２２２、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：１８、配列番号：１９、配列番号：２０、配列番号：２１、配列番号：２２、配列番号：２４１、配列番号：２４２（ここで、これらの配列番号は、優先権書類の表８における旧配列番号を示し、本願添付書類の配列表における対応表１０でこれらの配列を識別することができる）のポリヌクレオチド配列に関するものであり、これでホルモン感受性腫瘍を検出する。
【００３６】
別の特定の実施形態において、本発明は、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：１９、配列番号：２０、配列番号：２１、配列番号：２２、配列番号：２３、配列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９、配列番号：３０、配列番号：３１、配列番号：３２、配列番号：３３、配列番号：３４、配列番号：３５、配列番号：３６、配列番号：３７、配列番号：３８、配列番号：３９、配列番号：４０、配列番号：４１、配列番号：４２、配列番号：４３、配列番号：４４、配列番号：２２１、配列番号：２２２、配列番号：２３３、配列番号：２４１、配列番号：２４２（ここで、これらの配列番号は、優先権書類の表８における旧配列番号を示し、本願添付書類の配列表における対応表１０でこれらの配列を識別することができる）のポリヌクレオチド配列に関するものであり、これでリンパ節のある腫瘍とリンパ節のない腫瘍とを見分ける。
【００３７】
好ましくは、本発明は、配列番号：１、配列番号：２１、配列番号：２２、配列番号：２８；、配列番号：２９、配列番号：２９、配列番号：３１、配列番号：３２、配列番号：１９、配列番号：２０、配列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：３７、配列番号：３８、配列番号：３９、配列番号：２４１、配列番号：２４１（ここで、これらの配列番号は、優先権書類の表８における旧配列番号を示し、本願添付書類の配列表における対応表１０でこれらの配列を識別することができる）のポリヌクレオチド配列に関するものであり、これでリンパ節のある腫瘍とリンパ節のない腫瘍とを見分ける。
【００３８】
別の特定の実施形態において、本発明は、アントラサイクリンに対する感受性のある腫瘍とアントラサイクリンに対する感受性のない腫瘍とを見分ける、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１９、配列番号：２０、配列番号：２１、配列番号：２２、配列番号：２３、配列番号：３５、配列番号：３６；、配列番号：３７、配列番号：５６、配列番号：５７、配列番号：７４、配列番号：７５、配列番号：１０２、配列番号：１０４、配列番号：１０７、配列番号：１０８、配列番号：１０９、配列番号：１１８、配列番号：１１９；、配列番号：１３６、配列番号：２１３、配列番号：２１４、配列番号：２１５、配列番号：２２３、配列番号：２２４（ここで、これらの配列番号は、優先権書類の表１１における旧配列番号を示し、本願添付書類の配列表における対応表１０でこれらの配列を識別することができる）のポリヌクレオチド配列に関するものである。
【００３９】
また、本発明は、癌と相関した、差次的に発現された遺伝子を検出する方法であって、患者から得た試料で、上記にて定義したようなポリヌクレオチド配列の少なくとも１つのライブラリまたは前記ライブラリでコードされる産物の少なくとも１つのライブラリを検出することを含む方法に関するものである。
【００４０】
本発明の特定の実施形態は、表４に定義するような、あらかじめ定義されたポリヌクレオチド配列の集合１から集合２１２のそれぞれに含まれるものの中から選択される少なくとも１つのポリヌクレオチド配列のいずれかの組み合わせに実質的に対応するポリヌクレオチドライブラリに関するものである。
【発明の効果】
【００４１】
本発明は明らかに、前記あらかじめ定義された集合の少なくとも５０％、好ましくは７５％、より好ましくは１００％に含まれるものの中から選択される少なくとも１つのポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドライブラリに関するものであり、これによって識別可能な遺伝子パターンが得られる、すなわち、健常な患者と腫瘍病変に羅患した患者、ホルモン感受性腫瘍を持つ患者とホルモン耐性腫瘍を持つ患者、リンパ節のある腫瘍を持つ患者とリンパ節のない腫瘍を持つ患者、アントラサイクリン感受性腫瘍を持つ患者とアントラサイクリン非感受性腫瘍を持つ患者、予後の良い原発性乳腫を持つ患者と予後の悪い原発性乳ガンを持つ患者とを見分けることができる。
【００４２】
また、関与している遺伝子を完全に検出できるように、本発明を実現するのに役立つポリヌクレオチド配列ライブラリは、表４に定義するようなポリヌクレオチド配列集合各々の３’末端と５’末端との間で構成されるあらゆる配列を含み得るものである。
【００４３】
また、本発明は、ポリヌクレオチド配列または部分配列のプールが、正常な細胞と癌細胞とを区別する際に役立つ、表５に示されるあらかじめ定義されたポリヌクレオチド配列の集合それぞれに含まれるものの中から選択される少なくとも１つのポリヌクレオチド配列のいずれかの組み合わせに実質的に対応するものである、正常な細胞と癌細胞とを区別する上で役立つポリヌクレオチドライブラリに関するものである。
【００４４】
好ましくは、正常な細胞と癌細胞とを区別する上で役立つポリヌクレオチドライブラリが、表５Ａに記載のあらかじめ定義されたポリヌクレオチド配列の集合それぞれに含まれるものの中から選択される少なくとも１つのポリヌクレオチド配列と、表５Ｂに記載のあらかじめ定義されたポリヌクレオチド配列の集合それぞれに含まれるものの中から選択される少なくとも１つのポリヌクレオチド配列とのいずれかの組み合わせに実質的に対応する。
【００４５】
表５Ａに定義するポリヌクレオチド配列の集合を用いて同定される遺伝子の高発現の検出と、表５Ｂに定義するポリヌクレオチド配列の集合を用いて同定される遺伝子の低発現の検出とを一緒に行うことで、正常な患者と腫瘍病変に羅患した患者とを見分けることができる。
【００４６】
また、本発明は、ポリヌクレオチド配列または部分配列のプールが、表６に記載のあらかじめ定義されたポリヌクレオチド配列の集合それぞれに含まれるものの中から選択される少なくとも１つのポリヌクレオチド配列のいずれかの組み合わせに実質的に対応するものである、ホルモン感受性腫瘍細胞を検出する上で役立つポリヌクレオチドライブラリに関するものである。
【００４７】
好ましくは、ホルモン感受性腫瘍細胞を検出する上で役立つポリヌクレオチドライブラリが、表６Ａに記載のあらかじめ定義されたポリヌクレオチド配列の集合それぞれに含まれるものの中から選択される少なくとも１つのポリヌクレオチド配列と、表６Ｂに記載のあらかじめ定義されたポリヌクレオチド配列の集合それぞれに含まれるものの中から選択される少なくとも１つのポリヌクレオチド配列と、のいずれかの組み合わせに実質的に対応する。
【００４８】
表６Ａに定義するポリヌクレオチド配列の集合を用いて同定される遺伝子の高発現の検出と、表６Ｂに定義するポリヌクレオチド配列の集合を用いて同定される遺伝子の低発現の検出とを一緒に行うことで、ホルモン感受性腫瘍を持つ患者とホルモン耐性腫瘍を持つ患者とを見分けることができる。
【００４９】
また、本発明は、ポリヌクレオチド配列または部分配列のプールが、表７に記載のあらかじめ定義されたポリヌクレオチド配列の集合それぞれに含まれるものの中から選択される少なくとも１つのポリヌクレオチド配列のいずれかの組み合わせに実質的に対応するものである、リンパ節のある腫瘍とリンパ節のない腫瘍とを区別する上で役立つポリヌクレオチドライブラリに関するものである。
【００５０】
好ましくは、リンパ節のある腫瘍とリンパ節のない腫瘍とを区別する上で役立つポリヌクレオチドライブラリが、表７Ａに記載のあらかじめ定義されたポリヌクレオチド配列の集合それぞれに含まれるものの中から選択される少なくとも１つのポリヌクレオチド配列と、表７Ｂに記載のあらかじめ定義されたポリヌクレオチド配列の集合それぞれに含まれるものの中から選択される少なくとも１つのポリヌクレオチド配列と、のいずれかの組み合わせに実質的に対応する。
【００５１】
表７Ａに定義するポリヌクレオチド配列の集合を用いて同定される遺伝子の高発現の検出と、表７Ｂに定義するポリヌクレオチド配列の集合を用いて同定される遺伝子の低発現の検出とを一緒に行うことで、リンパ節のある腫瘍を持つ患者とリンパ節のない腫瘍を持つ患者とを見分けることができる。
【００５２】
また、本発明は、ポリヌクレオチド配列または部分配列のプールが、表８に記載のあらかじめ定義されたポリヌクレオチド配列の集合それぞれに含まれるものの中から選択される少なくとも１つのポリヌクレオチド配列のいずれかの組み合わせに実質的に対応するものである、アントラサイクリン感受性腫瘍とアントラサイクリン非感受性腫瘍とを区別する上で役立つポリヌクレオチドライブラリに関するものである。
【００５３】
好ましくは、アントラサイクリン感受性腫瘍とアントラサイクリン非感受性腫瘍とを区別する上で役立つポリヌクレオチドライブラリが、表８Ａに記載のあらかじめ定義されたポリヌクレオチド配列の集合それぞれに含まれるものの中から選択される少なくとも１つのポリヌクレオチド配列と、表８Ｂに記載のあらかじめ定義されたポリヌクレオチド配列の集合それぞれに含まれるものの中から選択される少なくとも１つのポリヌクレオチド配列と、のいずれかの組み合わせに実質的に対応する。
【００５４】
表８Ａに定義するポリヌクレオチド配列の集合を用いて同定される遺伝子の高発現の検出と、表８Ｂに定義するポリヌクレオチド配列の集合を用いて同定される遺伝子の低発現の検出とを一緒に行うことで、アントラサイクリン感受性腫瘍を持つ患者とアントラサイクリン非感受性腫瘍を持つ患者とを見分けることができる。
【００５５】
また、本発明は、ポリヌクレオチド配列または部分配列のプールが、表９に記載のあらかじめ定義されたポリヌクレオチド配列の集合それぞれに含まれるものの中から選択される少なくとも１つのポリヌクレオチド配列のいずれかの組み合わせに実質的に対応するものである、予後の良い原発性乳ガンと予後の悪い原発性乳ガンとを分類する上で役立つポリヌクレオチドライブラリに関するものである。
【００５６】
好ましくは、予後の良い原発性乳ガンと予後の悪い原発性乳ガンとを分類する上で役立つポリヌクレオチドライブラリが、表９Ａに記載のあらかじめ定義されたポリヌクレオチド配列の集合それぞれに含まれるものの中から選択される少なくとも１つのポリヌクレオチド配列と、表９Ｂに記載のあらかじめ定義されたポリヌクレオチド配列の集合それぞれに含まれるものの中から選択される少なくとも１つのポリヌクレオチド配列と、のいずれかの組み合わせに実質的に対応する。
【００５７】
表９Ａに定義するポリヌクレオチド配列の集合を用いて同定される遺伝子の高発現の検出と、表９Ｂに定義するポリヌクレオチド配列の集合を用いて同定される遺伝子の低発現の検出とを一緒に行うことで、予後の良い原発性乳ガンを持つ患者と予後の悪い原発性乳ガンを持つ患者とを分類することができる。
【００５８】
好ましい実施形態では、本発明のポリヌクレオチドライブラリから低発現された配列または高発現された配列を示す腫瘍細胞が乳腫細胞である。
【００５９】
特定の実施形態では、ポリヌクレオチドアレイを形成するために本発明のポリヌクレオチドライブラリのポリヌクレオチドを固相支持体に固定化し、前記固相支持体が、ナイロン膜、ニトロセルロース膜、スライドガラス、ガラスビーズ、ガラス支持体上の膜またはシリコンチップからなる群から選択される。
【００６０】
本発明のもうひとつの目的は、上記にて定義したような固定化ポリヌクレオチドライブラリ集合を少なくとも１つ含む、腫瘍の予後または診断に役立つポリヌクレオチドアレイに関するものである。
【００６１】
次に、本発明は、正常な細胞と癌細胞とを区別する際に役立つ、表５に記載のあらかじめ定義されたポリヌクレオチド配列の集合それぞれに含まれるものの中から選択される少なくとも１つのポリヌクレオチド配列のいずれかの組み合わせを含む、正常な細胞と癌細胞とを区別する上で役立つポリヌクレオチドアレイに関するものである。
【００６２】
好ましくは、正常な細胞と癌細胞とを区別する上で役立つポリヌクレオチドアレイが、表５Ａに記載のあらかじめ定義されたポリヌクレオチド配列の集合それぞれに含まれるものの中から選択される少なくとも１つのポリヌクレオチド配列と、表５Ｂに記載のあらかじめ定義されたポリヌクレオチド配列の集合それぞれに含まれるものの中から選択される少なくとも１つのポリヌクレオチド配列と、のいずれかの組み合わせを含む。
【００６３】
また、本発明は、表６に記載のあらかじめ定義されたポリヌクレオチド配列の集合それぞれに含まれるものの中から選択される少なくとも１つのポリヌクレオチド配列のいずれかの組み合わせを含む、ホルモン感受性腫瘍細胞を検出する上で役立つポリヌクレオチドアレイに関するものである。
【００６４】
好ましくは、ホルモン感受性腫瘍細胞を検出する上で役立つポリヌクレオチドアレイが、表６Ａに記載のあらかじめ定義されたポリヌクレオチド配列の集合それぞれに含まれるものの中から選択される少なくとも１つのポリヌクレオチド配列と、表６Ｂに記載のあらかじめ定義されたポリヌクレオチド配列の集合それぞれに含まれるものの中から選択される少なくとも１つのポリヌクレオチド配列と、のいずれかの組み合わせを含む。
【００６５】
また、本発明は、表７に記載のあらかじめ定義されたポリヌクレオチド配列の集合それぞれに含まれるものの中から選択される少なくとも１つのポリヌクレオチド配列のいずれかの組み合わせを含む、リンパ節のある腫瘍とリンパ節のない腫瘍とを区別する上で役立つポリヌクレオチドアレイに関するものである。
【００６６】
好ましくは、リンパ節のある腫瘍とリンパ節のない腫瘍とを区別する上で役立つポリヌクレオチドアレイが、表７Ａに記載のあらかじめ定義されたポリヌクレオチド配列の集合それぞれに含まれるものの中から選択される少なくとも１つのポリヌクレオチド配列と、表７Ｂに記載のあらかじめ定義されたポリヌクレオチド配列の集合それぞれに含まれるものの中から選択される少なくとも１つのポリヌクレオチド配列と、のいずれかの組み合わせを含む。
【００６７】
また、本発明は、表８に記載のあらかじめ定義されたポリヌクレオチド配列の集合それぞれに含まれるものの中から選択される少なくとも１つのポリヌクレオチド配列のいずれかの組み合わせを含む、アントラサイクリン感受性腫瘍とアントラサイクリン非感受性腫瘍とを区別する上で役立つポリヌクレオチドアレイに関するものである。
【００６８】
好ましくは、アントラサイクリン感受性腫瘍とアントラサイクリン非感受性腫瘍とを区別する上で役立つポリヌクレオチドアレイが、表８Ａに記載のあらかじめ定義されたポリヌクレオチド配列の集合それぞれに含まれるものの中から選択される少なくとも１つのポリヌクレオチド配列と、表８Ｂに記載のあらかじめ定義されたポリヌクレオチド配列の集合それぞれに含まれるものの中から選択される少なくとも１つのポリヌクレオチド配列と、のいずれかの組み合わせを含む。
【００６９】
また、本発明は、表９に記載のあらかじめ定義されたポリヌクレオチド配列の集合それぞれに含まれるものの中から選択される少なくとも１つのポリヌクレオチド配列のいずれかの組み合わせを含む、予後の良い原発性乳ガンと予後の悪い原発性乳ガンとを分類する上で役立つポリヌクレオチドアレイに関するものである。
【００７０】
好ましくは、予後の良い原発性乳ガンと予後の悪い原発性乳ガンとを分類する上で役立つポリヌクレオチドアレイが、表９Ａに記載のあらかじめ定義されたポリヌクレオチド配列の集合それぞれに含まれるものの中から選択される少なくとも１つのポリヌクレオチド配列と、表９Ｂに記載のあらかじめ定義されたポリヌクレオチド配列の集合それぞれに含まれるものの中から選択される少なくとも１つのポリヌクレオチド配列と、のいずれかの組み合わせを含む。
【００７１】
また、本発明は、
ａ）患者からポリヌクレオチド試料を得、
ｂ）ステップ（ａ）で得られた前記試料ポリヌクレオチドと、上記にて定義したライブラリのポリヌクレオチド配列のうちいずれかまたは上記にて定義した前記ライブラリのポリヌクレオチド配列のうちいずれかでコードされる発現産物を含む、固相支持体に固定化したプローブと、を反応させ、
ｃ）ステップ（ｂ）の反応産物を検出することを含む、癌と相関し、発現状態の異なるポリヌクレオチド配列を検出する方法に関するものである。
【００７２】
好ましくは、ステップ（ａ）で得られたポリヌクレオチド試料を、固相支持体に固定化されたプローブとステップ（ｂ）で反応させる前に標識する。
【００７３】
ポリヌクレオチド試料の標識は、放射性標識、比色的な標識、酵素的な標識、分子増幅による標識、生物発光標識または蛍光標識からなる群から選択される。
【００７４】
特定の実施形態では、ステップ（ｃ）の反応産物を、前記反応産物と対照試料とをさらに比較することで定量化する。
【００７５】
第１の実施形態では、患者から単離され、ステップ（ａ）で得られたポリヌクレオチド試料が、ＲＮＡまたはｍＲＮＡのいずれかである。
【００７６】
もうひとつの実施形態では、患者から単離されたポリヌクレオチド試料が、ｍＲＮＡの逆転写によって得られるｃＤＮＡである。
【００７７】
好ましくは、差次的に発現されたポリヌクレオチド配列を検出する方法の反応ステップ（ｂ）が、患者から得られる試料ＲＮＡをプローブとハイブリダイゼーションすることを含む。
【００７８】
好ましくは、プローブとのハイブリダイゼーションよりも前に試料ＲＮＡを標識し、この標識が、放射性標識、比色的な標識、酵素的な標識、分子増幅による標識、生物発光標識または蛍光標識からなる群から選択される。
【００７９】
差次的に発現されたポリヌクレオチド配列を検出するこの方法は、癌に関連した健康状態、特に乳癌を検出し、診断し、病期分類し、モニタリングし、予後判定し、予防し、または治療するのに特に役立つ。
【００８０】
さらに、ポリヌクレオチド配列または部分配列の集合のうちいずれかでコードされる産物が、検出の根拠となるレセプターリガンド反応に関与している場合、差次的に発現されたポリヌクレオチド配列を検出する方法は特に有用である。
【００８１】
また、本発明は、上述した差次的に発現されたポリヌクレオチド配列を検出するための方法、方法を含む、抗腫瘍薬をスクリーニングするための方法であって、スクリーニング対象となる抗腫瘍薬で試料を処置しておく方法に関係がある。
【００８２】
特定の実施形態では、抗腫瘍薬をスクリーニングするための方法が、試料で、上記にて定義したようなポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列の集合の少なくとも１つのライブラリまたは前記ライブラリでコードされる産物の少なくとも１つのライブラリと反応するポリヌクレオチド配列を検出することを含む。
【００８３】
以下、腫瘍試料を同定し、かつ正常な試料と見分ける上で役立つポリペプチドの選択されたライブラリで得られる特定の実験結果に関連した、以下に詳細に示す実施例を用いて本発明について説明する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００８４】
腫瘍試料とＲＮＡの抽出
腫瘍のタイプとサイズに関して選択の偏りを一切なくすために、試験対象となるＲＮＡを未選択試料から調製した。Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｐａｏｌｉ−Ｃａｌｍｅｔｔｅで手術を受けている３４名の患者から侵襲性の原発性乳癌の試料を収集した。外科的切除の後に、腫瘍をマクロ解剖した（ｍａｃｒｏｄｉｓｓｅｃｔｅｄ）。病理学者による診断用に切片を取得し、隣接した断片を分子分析用に液体窒素中ですみやかに凍結させた。診断時における患者の年齢の中央値は５５歳（３９、８３の範囲）であり、彼女らの大半が閉経後であった。乳腫についてのＷＨＯの組織学的診断基準に従って腫瘍を分類したところ、乳管癌２９例、小葉癌２例、乳管癌と小葉癌との併発１例、髄様癌２例であった。これらの癌腫はサイズがまちまちであり、免疫組織化学的なアッセイで評価（２３例でＥＲ陽性、１１例でＥＲ陰性）したところ、２０ｍｍ以下（ｎ＝１３）、２０〜５０ｍｍ（ｎ＝１８）、５０ｍｍ以上（ｎ＝３）、腋窩リンパ節の状態（陰性：１９腫瘍、陽性：１５腫瘍）、ＳＢＲグレード（Ｉ：３腫瘍、ＩＩ：２０腫瘍、ＩＩＩ：１０腫瘍、評価できず：１腫瘍）、エストロゲンレセプター状態（ＥＲ）であった。ＥＲ陽性のカットオフ値は１０％であった。地元の慣行に従い、放射線療法と合わせた補助処置ならびに、必要に応じてアントラサイクリンベースの多剤併用化学療法（ｎ＝１６）を患者に対して施した。
【００８５】
常法に従い腫瘍試料から全ＲＮＡを抽出した（４３）。正常な乳房組織由来の全ＲＮＡをクロンテック（カリフォルニア州パロアルト）から入手した。年齢２３歳から４７歳の範囲のコーカソイドの女性由来の８つの組織標本からＲＮＡを単離した。２８Ｓ特異性オリゴヌクレオチドを用いてホルムアルデヒドアガロースゲル電気泳動およびノーザンブロットを変性させる（ｄｅｎａｔｕｒｅ）ことによってＲＮＡの完全性を制御した。
【００８６】
ｃＤＮＡアレイの調製
アレイを放射性プローブとハイブリダイゼーションすることで、遺伝子の発現を分析した。これらのアレイには、実用的な基準（ｍＲＮＡの３’配列、同一のクローニングベクター、宿主バクテリア、インサートサイズ）を用いて選択した１８０のＩＭＡＧＥヒトｃＤＮＡクローンと５つの対照クローンのＰＣＲ産物が含まれていた。これは１７６の遺伝子を表す（４つの遺伝子が２種類の異なるクローンで表された）もので、このうち１２１に未証明または推定ではあるが癌ではないかと思われるものが認められ、５５が免疫反応と関係していた（ｈｔｔｐ：／／ｔａｇｃ．ｕｎｉｖ−ｍｒｓ．ｆｒ／ｐｕｂ／Ｃａｎｃｅｒ／のウェブサイトで一覧を入手可能）。プラスミドＤＮＡの５’ｔａｇ配列決定ならびに、ＮＣＢＩでのＥＳＴ（ｄｂＥＳＴ）データベースおよびヌクレオチド（ＧｅｎＢａｎｋ）データベースに収録された配列との比較によって、それぞれの同一性を検証した。ＧｅｎＢａｎｋでの受入番号で照会した、有意な遺伝子同一性のない１４のクローン以外のすべてのクローンについて、同一性が確認された。シロイヌナズナシトクロムｃ５５４遺伝子（ハイブリダイゼーションシグナルの正規化に使用）、サイズの異なる３ポリ（Ａ）配列、ベクターｐＴ７Ｔ３Ｄ（負の対照）を対照クローンとした。
【００８７】
表記のプロトコールに従って、ＰＣＲ増幅、精製およびＰＣＲ産物のＨｙｂｏｎｄ−Ｎ＋膜（アマシャム）へのロボットによるスポッティングを行った（４）。すべてのＰＣＲ産物を２組ずつスポットした。正規化の目的で、膜全体にｃ５５４遺伝子を９６倍に散在させてスポットした。
【００８８】
ｃＤＮＡアレイのハイブリダイゼーション
（各スポットでハイブリダイゼーション可能な標的ＤＮＡの量を正確に判定するために）ベクターオリゴヌクレオチドを使用し、続いてベクタープローブを取り除いた後はＲＮＡから作製した複合体プローブを使用して、ハイブリダイゼーションを成功させた（４）。各複合体プローブを別々のフィルタにハイブリダイズさせた。過剰なオリゴ（ｄＴ２５）を用いて全ＲＮＡからプローブを作製し、メッセンジャーのポリ（Ａ）尾を飽和させ、逆転写された産物に長いポリ（Ｔ）配列が含まれないようにした。標識前に正確な量のｃ５５４ ｍＲＮＡを全ＲＮＡに加え、データを正常化できるようにした。
【００８９】
各標識には組織試料から得た全ＲＮＡ ５ｎｇ（ｍＲＮＡ 〜１００ｎｇ）を使用した。周知の方法（ｈｔｔｐ：／／ｔａｇｃ．ｕｎｉｖ−ｍｒｓ．ｆｒ／ｐｕｂ／Ｃａｎｃｅｒ／）でプローブ作製と膜のハイブリダイゼーションを実施した。
【００９０】
標的過剰（各スポットでのＤＮＡ 〜１５ｎｇ）でハイブリダイゼーションを実施したところ、標的に対するｃＤＮＡの結合はプローブ中のｃＤＮＡの量に正比例していた。
【００９１】
ｃＤＮＡアレイハイブリダイゼーションシグナルの検出と定量化
イメージングプレート装置を用いて定量的データを得た。すでに説明した（ｈｔｔｐ：／／ｔａｇｃ．ｕｎｉｖ−ｍｒｓ．ｆｒ／ｐｕｂ／Ｃａｎｃｅｒ／）ようにして、ＦＵＪＩ ＢＡＳ １５００装置でハイブリダイゼーションシグナルを検出し、ＨＤＧ Ａｎａｌｙｚｅｒソフトウェア（ミシガン州アンアーバーのゲノミックソリューションズ）で定量化を行った。定量化については、すべてのスポット画素強度を一緒にし、隣接するエリアで求めたスポットのバックグラウンド値を減算することで行った。ＬａＰｌａｃｉａｎ形質転換でスポットを位置付けた。スポットのバックグラウンドレベルは、そのスポットを中心とする小さなウィンドウ内にあり、任意のスポットの一部ではない、すべての画素の強度の中央値であった（４４）。既述（４）のとおり、定量化データを３ステップで正規化し、これを絶対遺伝子発現レベルとして（すなわち試料中のｍＲＮＡに対する個々のｍＲＮＡの存在量のパーセンテージで）表した。
【００９２】
アレイデータの分析
結果を分析する前に、２組のスポットを比較するか、別個の２つのアレイ上にある同一プローブで１回のハイブリダイゼーションを行うか、あるいは同一のＲＮＡから作製したプローブで２回のハイブリダイゼーションを独立して行うことにより、実験の再現性を検証した。いずれの場合も、それぞれの相関係数が０．９５、０．９８および０．９８（データ示さず）という結果となり、再現性は良好であった。さらに、ＣＤＫ４またはＥＴＶ５などのアレイ上で２種類の異なるクローンで表される遺伝子では、すべての試料でこの２種類のクローンについて同様の発現プロフィールが認められた。この再現性は、倍化発現差（ｆｏｌｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ）を著しく異なるものとみなすには十分であった。
【００９３】
グラフ表示のため、データを絶対発現レベルとして表示した（図２ａ）。クラスタリングがさらによく分かるように、結果を対数変換し、各列および各行で中央値に集めた（ｍｅｄｉａｎ−ｃｅｎｔｅｒｅｄ）相対値として表示した（図２ｂ）。Ｅｉｓｅｎが開発したクラスタプログラム（４５）（類似性の基準としてＰｅａｒｓｏｎの相関性を用いる平均結合法）を使用して、組織試料および遺伝子に階層的クラスタリングを適用した。図２および図３に示す結果はＴｒｅｅＶｉｅｗプログラム（４５）で表示したものである。
【００９４】
Ｅｘｃｅｌソフトウェア（マイクロソフト）を使用して以後の分析を行い、ＳＰＳＳソフトウェアを用いて統計分析を行った。分析から１回目の転移再発あるいは死まで、それぞれ無転移生存率と全生存率を診断結果から求めた。Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ法でこれを評価し、ログランク検定を行ってグループ同士を比較した。相関係数ｒを用いて、発現プロファイルに基づく遺伝子対の相関性を求めた。腫瘍パラメーターと相関する発現レベルの遺伝子を、連続したいくつかのステップで探索した。
【００９５】
最初に、興味の対象となるパラメーターが一致しない腫瘍で構成される２つのサブグループで遺伝子発現レベルの中央値を比較することにより、遺伝子を検出した。平均値ではなく中央値を用いたのは、発現レベルは多くの遺伝子で極めて変わりやすく、発現レベルの標準偏差が平均値に近くなるか平均値よりも優れたものとなってしまい、平均との比較が不可能になるためである。次に、これらの検出された遺伝子をグラフィックスで可視検査し、最後に、相関性を有効にすることが確認されているものに適当な統計解析を適用した。Ｍａｎｎ−Ｗｉｔｎｅｙ検定を使用して、ＥＲ陽性腫瘍とＥＲ陰性腫瘍とのＧＡＴＡ３発現の比較を有効にした。相関係数を使用し、遺伝子発現レベルを腋窩節の数と比較した。
【００９６】
ノーザンブロット分析
アレイ上で試験した３４例のうち２２例を含む、７９の乳腫のＧＡＴＡ３発現をノーザンブロットハイブリダイゼーションで分析した。腫瘍試料からのＲＮＡ抽出とノーザンブロットとを、過去に説明されているようにして実施した（４３）。ＧＡＴＡ３ ｃＤＮＡ配列（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｘ５５１２２）の３’領域（＋８４３から＋１６８９）に対応するＧＡＴＡ３プローブを、ＩＭＡＧＥ ｃＤＮＡクローン１２９７５７から作製した。このクローンをＥｃｏＲＩ酵素およびＰａｃＩ酵素で消化することにより、インサート（８４６ｂｐ）を得た。ノーザンブロットを取り除き、ａ−アクチンプローブを用いて再ハイブリダイズさせた（４６）。
【００９７】
図１は、正常な乳房組織（ＮＢ）と乳腫試料との差次的遺伝子発現の一例を示す。ナイロンフィルター上の各ｃＤＮＡアレイを５μｇの全ＲＮＡで作製した複合体プローブとハイブリダイズさせた。一番上の画像は膜全体に相当する。下の２つの画像については、膜の右側部分だけを示してある。スポットの下にある数字は、ハウスキーピング遺伝子（１がＧＡＰＤＨで２はアクチン）、負の対照クローン（３、４、５）、ＮＢと乳腫との間で差次的に発現された遺伝子の例（６はストロメライシン３、７は、ＥＲＢＢ２、８はＭＹＢＬ２、９はＦＯＳ、１０はＴＧＦａＲ３、１１はデスミン）、ＥＲ−乳腫とＥＲ＋乳腫との間で差次的に発現された遺伝子の例（１２、ＧＡＴＡ３）を示す。
【００９８】
図２は、乳癌腫の３４の試料と正常な乳房組織（ＮＢ）に含まれる１７６の遺伝子の発現レベルを表したものである。各行が単一の組織に相当し、各列が単一の遺伝子に相当する。（ａ）結果を試料内の個々のｍＲＮＡの存在率で表現し、これを青のカラースケールで表す。左下に示すカラースケール（３倍の間隔の対数スケール）は、水色（発現レベル□０．００１％）から紺色（発現レベル＞３％）までの範囲である。白い正方形は、発現レベルが検出できないクローンを示し、灰色の正方形は欠損値を示す。組織試料を任意に並べ、発現レベルの中央値の増加に伴って上から下までクローンを並べる。図面右側の水平の黒い矢印は、腫瘍（上から下にストロメライシン３、ＩＧＦ２、ＧＡＴＡ３）ごとに発現レベルが大きく異なる３つのクローンをマークしたものである。（ｂ）結果を（各行および各列の中央値に対する）相対的な発現レベルとして示し、これを１／１００から１００倍までの範囲で（灰色の正方形：欠損値）左下に示すカラースケールで表してある。３４の腫瘍のうち、発現レベルの中央値が０に等しい１８のクローンについては省略する。クラスタリングプログラムを使用して、最も類似した発現プロファイルを持つもの同士が互いに隣接して配置されるように試料（ｎ＝３５）を水平軸に沿って整列させる。同様に、すべての組織でクローンの発現プロファイルに強い相関性が認められる場合、これらのクローン（ｎ＝１６２）は垂直軸に沿って互いに近い位置にくる。試料（上）とクローン（左）とをそれぞれ捕捉する樹状図の枝の長さには、関連する要素の類似性が反映されている。２つのグループの腫瘍を分離し、グループＡ（青）とグループＢ（オレンジ）にカラーコードした。図面右側の水平の黒い矢印と水平の赤い矢印はそれぞれ、腫瘍（上から下にＩＧＦ２、ＧＡＴＡ３、ストロメライシン３）ごとに発現レベルが大きく異なる３つの遺伝子と、４つの遺伝子を表す４対の異なるクローンとをマークしたものである。（ｃ）右側の２つのｏｕｔｌｙｅｒ腫瘍を除き、図２ｂからのグループＡをズーム表示したものである。クラスタリングによって、腫瘍の２つのサブグループＡ１およびＡ２を分ける。点の付いた枝は転移の再発と死に関連した腫瘍に相当する。Ａ１よりもＡ２の方が追跡期間を長くした（Ａ１の４７に対して中央値８１ヶ月）。
【００９９】
図３は遺伝子発現プロファイリングによって乳癌の予後を分類したものであり、遺伝子発現ベースの腫瘍の分類が臨床転帰と相関していることを示している。Ａ１とＡ２のサブグループ間で上位３２の差次的に発現された遺伝子を用いて、グループＡにおける１２の試料（図２ｂおよび図２ｃ参照）を再クラスタリングした。データを図２ｂと同様に表示し、同じカラーキーで示した。３２のうち、発現レベルが（１２のうち）少なくとも２つの試料で少なくとも２倍に変化した２３のクローンから得た発現データに階層的クラスタリングを適用した。腫瘍Ａ１およびＡ２の２つのサブグループと、差次的に発現されたクローンの２つのグループとを示す。腫瘍クラスタＡ１の点の付いた枝は転移の再発および死に関連した試料に相当する。図３ａは、図２ａおよび図２ｂに示す階層的クラスタリングの結果を二次元で表したものである。分析によって、腫瘍Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄの４つのグループを描写する。黒い正方形は最終追跡時に生存している患者を示し、赤い正方形は亡くなった患者を示す。遺伝子発現プロファイルに従って、統計的に臨床転帰の異なる患者を、クラスＡ（ｎ＝１６）、クラスＢ＋Ｃ（ｎ＝３４）、クラスＤ（ｎ＝５）の３つのクラスに定義した。図３ｂは、３つのクラスの患者（ｐ＜０．００５、ログランク検定）全体の生存率をＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒプロットしたものである。また、図３ｃは、３つのクラスの患者（ｐ＜０．０５、ログランク検定）における無転移生存率をＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒプロットしたものである。
【０１００】
図４は、ＧＡＴＡ３発現とＥＲ表現型との相関を示す。（ａ）ｃＤＮＡアレイ解析によってモニタリングした３４の乳癌試料におけるＧＡＴＡ３の発現レベル（ｙ軸）を、試料中のｍＲＮＡ（対数スケール）に対する個々のｍＲＮＡの存在率で示す。Ｍａｎｎ−Ｗｉｔｎｅｙ検定を用いて（ｐ＝０．０００４）、ＥＲ陰性腫瘍（ｎ＝１１）対ＥＲ陽性腫瘍（ｎ＝２３）でＧＡＴＡ３を有意に高発現させる。正常な乳房組織におけるＧＡＴＡ３の発現レベルを右側（ＮＢ）に示す。（ｂ）正常な乳房試料（ＮＢ）と９例の乳癌試料（ＡＴ：ｃＤＮＡアレイおよびノーザンブロットで分析した腫瘍、ＮＴ：ノーザンブロットで分析した腫瘍）におけるＧＡＴＡ３のノーザンブロット分析。ＧＡＴＡ３（一番上）およびａ−アクチン（一番下）からのｃＤＮＡを用いてブロットを連続的に調査した。各腫瘍試料についてＥＲの状態を示す。
【０１０１】
データ表現
図１は、正常な乳房組織と乳腫から抽出されたＲＮＡから作製したプローブでｃＤＮＡアレイをハイブリダイゼーションする一例を示す。
【０１０２】
概略図で絶対的な値または相対的な値のいずれかで示すべく、すべてのハイブリダイゼーションの生の結果を処理した。正規化法を用いることで、図２ａに示されるようにプローブ中のｍＲＮＡの存在率で絶対値を表すことができる。青いカラーラダーの各レベルは、ｍＲＮＡの絶対存在量の３倍の間隔を表している。各列は組織試料に相当し、各行は遺伝子に相当する。グラフィックの目的で、発現レベルの中央値の増加に伴って上から下まで遺伝子を並べた。腫瘍試料については並べなかった。各試料の値は、ｍＲＮＡ存在量約０．００２％から５％の範囲にわたる発現レベルに対応する広範囲の強度（対数スケールで３０年間）を示していた。多くの遺伝子（たとえばストロメライシン３、ＩＧＦ２、ＧＡＴＡ３など、矢印参照）で、すべての腫瘍試料にわたって値のダイナミックレンジ全体に散在して発現レベルが極めて大きく変化していた。相対値を図２ｂに示す。すべての組織にわたって中央値の強度が０に等しい１８のクローンを省略し、絶対値を対数変換した。その後、各試料のデータならびに、残りの１６２のクローン各々についてのデータを中央値に集め、絶対強度ではなく相対的な変化が示されるようにした。中央値よりも高い発現レベルには赤、中央値よりも低い発現レベルには緑のカラースケールを用いてデータを表示した。中央値からの偏差の大きさを色強度で表した。その後、階層的クラスタリングプログラムを適用し、遺伝子発現プロファイル全体に従って３５の試料をグループ化するとともに、すべての組織での発現レベルの類似性に基いて１６２のクローンをグループ化した。このようにすることで、相関する組織のグループと相関する遺伝子のグループを樹状図で示すように強調して示す図が得られた。
【０１０３】
乳腫の分類
図２ｂにおいて示すように、クラスタリングアルゴリズムで２つのグループの試料を識別し、これをＡ（正常な乳房を含む、ｎ＝１５、ＮＢ）とＢ（ｎ＝２０）とした。これらのグループは、患者の年齢、診断時の閉経状態、ＳＢＲグレード、腫瘍の病理学的サイズに関して類似のものとした。しかしながら、グループＡの腫瘍のうち７２％は節陽性であり、グループＢの７５％が節陰性であった。さらに、グループＢの腫瘍のうち８０％はエストロゲンレセプター（ＥＲ）陽性であり、グループＡの５０％はＥＲ陰性であった。診断後に中央値４４ヶ月で追跡を行ったところ、全体の生存率はグループＡとグループＢとで異なっていた。すなわち、Ａでは５名の女性が亡くなり（追跡期間の中央値５８ヶ月）、Ｂでは１名の女性が亡くなった（追跡期間の中央値４０ヶ月）。しかしながら、Ａでは５名、Ｂでは６名の女性に再発が認められ、２つのグループにおける転移再発の頻度は比較的近かった。Ｂでは転移の診断から最終追跡までの時間が短すぎるため、さらに長い期間をかけて追跡を行い、発現プロファイルで定義した２つの異なるグループで全体の生存率が実際に異なっているのか否かを判断しなければならない。
【０１０４】
１５の試料で構成されるグループＡでは、３つの試料（正常な乳房と２つの腫瘍）が互いに異なり、他の１２の試料とも異なっていた。後者は、腫瘍の２つのサブグループＡ１（ｎ＝６）とＡ２（ｎ＝６）とを構成していたが、これを図２ｃに示すようにクラスタリングによってさらに分けることも可能であった。表１から明らかなように、１２の腫瘍では従来の予後の特徴による転移再発の危険性が一律に高かった。このうちの大半については、Ａ１のサブグループの方が多くの女性を治療する形で、外科手術後に似たようなアントラサイクリンベースの補助化学療法を施した。興味深いことに、これらの２つのサブグループ（一般に用いられている組織臨床的な特徴では識別することができない）では、臨床転帰が極めて異なっていた。Ａ１で転移再発が４例、死亡が４（追跡期間の中央値４４ヶ月）。これとは対照的に、かつ追跡期間の中央値がさらに長い（９０ヶ月）のにもかかわらず、Ａ２では転移や死亡例は発生しなかった。このため、グループＡ１の腫瘍よりもグループＡ２の方が無転移生存率（ｐ□０．０１）と全生存率（ｐ□０．００５）が有意に高くなった。Ｂではこのようなサブグループ化を行うことはできなかった。
【０１０５】
【表１】
【０１０６】
サブグループＡ１およびＡ２の患者の特徴。図３に示すクラスタリング図の位置に基づいて左から右に１２の腫瘍に１から１２まで番号を振ってある。補助化学療法はアントラサイクリンベースとした。患者の状態に関する行で、Ａは生存を示し、Ｄは癌が進行して死亡したことを意味する。
【０１０７】
グループＡの部分構造の原因である遺伝子を探索した。これらの遺伝子は、予後や上記腫瘍の化学療法に対する感受性と関連している可能性がある。その発現レベルの中央値をＡ１とＡ２とで比較することにより、１８８のうち３２の遺伝子を識別した。続いて、図３に示すように、これらの遺伝子の発現プロファイルを使用して１２の腫瘍を再クラスタリングした。同じサブグループＡ１およびＡ２は明らかであり、これを２グループの遺伝子で分けた。予想通り、ＥＲＢＢ２、ＭＹＣおよびＥＧＦＲの発現量が多いのは予後の悪いサブグループＡ１（６〜８）と関連し、Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎおよびプロトオンコジーンＭＹＢの発現量が多いのは予後のよいサブグループＡ２（９、１０）と関連していた。他の大半の遺伝子については、これらの結果が新たな調査のきっかけとなるかもしれない。乳癌の予後を良くする要因のひとつに分化状態があるため、転帰が良好なグループでＧＡＴＡ３（１１）やＣＲＡＢＰ２（１２）などの細胞の分化に関連した遺伝子の発現レベルが高かった。予後の悪いサブグループではエフリンＡ１ ｍＲＮＡの発現量が多いことから、この成長因子が乳癌で何らかの役割を果たしているのではないかと思われ、こうした発現量の多い状態が黒色腫の進行時における上方制御と平行している可能性がある（１３）。
【０１０８】
正常な乳房と乳腫との間の差次的遺伝子発現
乳腫（Ｔ）と正常な乳房（ＮＢ）との間で差次的に発現される遺伝子を同定するために、各遺伝子のＮＢ値と各腫瘍におけるその発現レベルとを比較した。ＮＢの遺伝子の発現レベルを検出できなかったときは、腫瘍のシグナル強度が再現性の閾値（ｍＲＮＡ存在量の０．００２％）を上回った場合に、質的な情報だけを推定してｍＲＮＡを差次的に発現されたとみなすことが可能であった。その他の事例では、少なくとも２倍の発現差があれば差次的な発現と定義した。さらに、高発現または低発現された場所での腫瘍数を測定した。高発現された遺伝子および低発現された遺伝子の上位２０ずつの一覧を表２に示す。これらの遺伝子については、Ｔ／ＮＢ比を示す。ここで、Ｔは３４の腫瘍における発現値の中央値である。この比は高発現された遺伝子では、２．７０（ＡＢＣＣ５）から１７．７６（ＧＡＴＡ３）までの範囲、低発現された遺伝子では０．００（デスミン）から０．２９（ＡＰＣ）までの範囲であった。
【０１０９】
【表２】
【０１１０】
ｃＤＮＡアレイ解析によって測定した場合の３４の乳癌腫と正常な乳房組織との間の最高頻度の差次的発現を示す遺伝子のリスト。Ｎは、正常な乳房組織に対して遺伝子が無調節状態となった場合（２倍よりも増えた）の腫瘍試料数を示す。Ｔ／ＮＢは３４の乳腫での発現レベル／正常な乳房での発現レベルの中央値の比を表わす。（ａ）ＭＹＢＬ２転写物の発現レベルの中央値が乳腫で０．０２５％となり、ＮＢでは検出できなかった。
【０１１１】
ムチン１、ＮＭ２３、ＥＲＢＢ２、ＦＧＦＲ１およびＦＧＦＲ２、ＭＹＣ、ストロメライシン３、カテプシンＤの発現量の多さならびに、ＦＯＳ、ＡＰＣ、ＲＢＬ２、ＦＡＳ、ＢＣＬ２の下方制御が、それぞれの癌におけるバイオロジーについて分かっていることを反映する形で認められた。ジンクフィンガー転写因子のＧＡＴＡファミリのメンバをコードするＧＡＴＡ３と、２つの細胞レチノイン酸結合タンパク質のうち一方をコードしているＣＲＡＢＰ２とに、ｍＲＮＡの発現量の多さが認められ、ｃＤＮＡアレイで過去に得られている結果の範囲がさらに拡張された（４）。
【０１１２】
さまざまな乳腫での差次的遺伝子発現ならびに組織臨床的な予後パラメータとの相関
乳癌における潜在的な予後マーカーを探索するために、発現レベルが従来の組織臨床的な予後パラメーターすなわち、患者の年齢、腋窩節の状態、腫瘍のサイズ、組織学的グレードおよびＥＲの状態と相関した遺伝子を探した。年齢、腫瘍のサイズ、組織学的グレードとの有意な相関は認められなかった。しかしながら、発現プロファイルがＥＲの状態と腋窩節の関与とに相関する遺伝子もあった。
【０１１３】
ホルモン応答性表現型と関連している可能性のある遺伝子を同定するために、ＥＲ陽性乳癌（ｎ＝２３）の遺伝子発現プロファイルとＥＲ陰性乳癌（ｎ＝１１）の遺伝子発現プロファイルとを比較した。１６のクローンがどちらのグループでも強度の中央値が０になった。２５のクローンは２倍よりも増えた。高発現された遺伝子と低発現された遺伝子の上位１０ずつを表３ａに示す。このうち、最も差次的に発現されたのがＥＲ＋／ＥＲ−強度比の中央値２８．６のＧＡＴＡ３であり、図４ａに示すようにＥＲ陽性腫瘍の第１の四分位数の値がＥＲ陰性腫瘍の第３の四分位数の値を上回って（５倍）いた。Ｍａｎｎ−Ｗｉｔｎｅｙ検定（ｐ□０．００１）を使用すると、ＥＲ陽性腫瘍のＧＡＴＡ３の発現率の高さは統計的に有意であった。ＥＲ陽性腫瘍すべてとＥＲ陰性腫瘍の１８％のみで、ＧＡＴＡ３発現レベルが正常な乳房の値よりも極めて高く（３倍を超える）なった。さらに、ｃＤＮＡアレイで分析した腫瘍のうち２２の腫瘍を含む７９の乳癌（ＥＲ陰性腫瘍２１、ＥＲ陽性腫瘍５８）のパネルで、ノーザンブロットハイブリダイゼーション（図４ｂ）によってＧＡＴＡ３発現を分析した。これによって、上記２２の腫瘍についてのアレイ結果ならびにＥＲの状態とＧＡＴＡ３ ＲＮＡの発現（Ｍａｎｎ−Ｗｉｔｎｅｙ検定、ｐ≦０．０００１）との間の強い相関性が確認された。
【０１１４】
【表３Ａ】
【０１１５】
乳癌における予後を大きく左右する要因である腋窩リンパ節の状態と発現プロファイルが関連した遺伝子を探索するために、節陰性腫瘍（ｎ＝１９）のグループを腋窩が広範囲にわたって伸展（陽性の節１０またはそれ以上）した腫瘍のグループと比較した。さらに、腫瘍が関与するリンパ節の数が増加するにつれて生存率が低下し、かつ、発現の測定は定量的なものであったため、これらの遺伝子の発現レベルと腫瘍が関与する節との相関（定量的変数）を求めた。これらの２つのグループ間での高発現された遺伝子と低発現された遺伝子の上位１０ずつを表３ｂに示す。これらの遺伝子の大半は今までに節の状態に関連しているとされたことはないが、こうした結果の中には既存文献に見られるデータと一致するものもある。チロシンキナーゼレセプターＥＲＢＢ２をコードする遺伝子が節陽性腫瘍で最も有意に高発現された遺伝子であり、相関係数も最も大きかった（ｒ＝０．６８、ｐ≦０．０００１）。
【０１１６】
【表３Ｂ】
【０１１７】
遺伝子クラスター
図２ｂからの遺伝子クラスタリングは、複数の試料にわたって発現が相関した遺伝子のグループを示した。異なるクローンが同じ遺伝子を表す場合、これを互いに隣同士のクラスターに分けた（赤い矢印）。３４の腫瘍における遺伝子対間の相関係数は大きいことが多かった（１３，０４１の遺伝子対の１％で相関係数が０．９５よりも大きかった−図示せず）。極めて相関性の高い遺伝子発現の一例にＢＣＬ２とＲＢＬ２の遺伝子発現がある。このような相関性のある発現は、文献にこそ記載されていないが、これらの２つの遺伝子に共通の調節機序を反映しているであろうと思われる。さらに、これらの遺伝子は、ＰＰＰ２ＣＡ、ＡＫＴ２、ＰＲＫＣＳＨまたはＴＮＦＲＳＦ６／ＦＡＳなどの他の遺伝子との有意な相関性のある発現も認められた。特に、ＢＣＬ２とＦＡＳとの間に顕著な相関性のある発現を観察することが可能であった（ｒ＝０．９１、データ示さず）。この相関性の正確な意味は不明であるが、それは細胞が生存するために必要なアポトーシスと反アポトーシスとのバランスを反映している可能性がある。
【０１１８】
ヒトの癌では、ＲＮＡのレベルにどの程度の割合で変化が反映されるのかは分かっていないが、遺伝子発現パターンをモニタリングすることがこの疾患についての知識を増やすための非常に有望な方法であるように思われる。次にあげる異なるタイプの癌について、ｃＤＮＡアレイを使用した調査が行われている。子宮頚癌（１４）、肝臓癌（１５）、卵巣癌（１６）、大腸癌（１７）、腎臓癌（１８）、神経膠芽腫（１９）、黒色腫（２０）（２１）、横紋筋肉腫（２２）、急性白血病（２３）、リンパ腫（２４）。乳癌では、先駆的な研究から最初の発現パターン（４、２５−３１）が得られた。これらの研究は、特にホルモン応答性乳腫とホルモン非応答性乳腫との分子的な差という重要な問題を取り上げていた。このため、Ｙａｎｇら（２８）ならびにＨｏｃｈら（２５）は、これらの２つのカテゴリーを表すことが分かっていた乳癌腫細胞系の発現プロファイルを比較し、差次的発現が認められる若干の遺伝子を同定した。これらの遺伝子のうちの１つがＧＡＴＡ３であった。これらの研究では主に細胞系が使用され、腫瘍試料はほとんど試験対象とならず、一般に少数であった。一連の大きな乳癌の発現プロファイルを分析する最初の研究が最近になって公表された（３２）が、臨床転帰との相関性には何ら言及されていなかった。
【０１１９】
この実験に基づいていくつかの面白いポイントを得ることが可能である。まず、腫瘍ごとの発現パターンの違いが、乳癌の組織臨床的な不均一を示す分子転写の証拠となった。この多様性は、これに関連して高スループットの分析に対する関心を強調する多種多様な遺伝子と結びつけられた、多元的なものであった。発現プロファイルを統合する階層的クラスタリングプログラムを使用すれば、ほとんどの腫瘍から正常な乳房組織を分離し、かつ、２種類の異なるグループの腫瘍を識別することが可能であった。最も重要なことに、昔からの予後因子では予言することができなかった極めて異なる臨床転帰を伴う腫瘍の２つの異なるサブグループがクラスタリングによって識別されたのである。確かに、これらの腫瘍はいずれも、既存の組織臨床ツールで評価すれば理論上予後の悪いものであった。今のところ、こうした患者についてはいずれも補助化学療法で治療できるであろうが、この処置が有効である患者とそうでない患者とを識別できる医師がいないのである。
【０１２０】
遺伝子発現プロファイルを用いることで、この区別をすることが可能であった。このような予言的なツールは治療上重要な意味を持つ。悪い予後の特徴を持つ患者は、時間のロスと第一線の化学療法に関連した毒性を避け、標準的な化学療法ではなく他の処置を適用する候補となる。これらの結果から、現時点ではアントラサイクリンベースの補助化学療法で治療されている予後の悪い乳癌の組織臨床的なカテゴリーによって、異なる化学療法措置が必要になるであろう転帰の異なる腫瘍の少なくとも分子的に別個の２つのサブグループが一緒にグループ化されるのではないかと考えられる。このため、発現プロファイルから、予後の悪い乳腫を分類し、患者を管理する新しく一層正確な方法が得られることになろう。
【０１２１】
同様に、分子の不均一性にもかかわらず、遺伝子（ＧＡＴＡ３、ＥＲＢＢ２）の発現レベルと組織学的な腫瘍パラメーターとの間に有意な相関性が認められた。乳癌でＥＲが陽性になることが、腫瘍の分化、低増殖率、良好な予後、ホルモン療法に対する応答性と相関していた。乳癌のホルモン感受性とＥＲの状態との関係は完全ではなく、ホルモン感受性の表現型を特徴付ける上でＥＲよりもＥＲの発現に関連したいくつかの遺伝子の方が重要なことはあり得る。これらの遺伝子は治療を助ける予言的な因子として役立つであろう。
【０１２２】
ＧＡＴＡ３ ｍＲＮＡの発現はＥＲの状態と大きく相関していた。ＧＡＴＡ３はエストロゲン制御されず（２５）、ＥＲ陽性の表現型に関与する遺伝子の発現を制御できる転写因子のひとつである。本発明につながる実験の過程でＥＲの状態に関係していることが明らかになった他の遺伝子のうち、ＭＹＢ（１０）、ストロメライシン３（３３）、ＣＲＡＢＰ２（３４）などのいくつかの遺伝子はＥＲ陽性乳腫において高レベルで発現されることがすでに報告されている。最近の研究（２７）と一致はするが、研究対象となったＥＲ陽性腫瘍でＴＰ５３ ｍＲＮＡのレベルがさらに高かったのは驚くべきことであった。ＴＰ５３の発現に関する研究の大半がｍＲＮＡレベルではなくタンパク質レベルを分析しており、ＴＰ５３タンパク質のレベルは昔からＥＲの状態とはあまり結びついていなかった（３５）。ＣＲＡＢＰ２の発現量が多いことは、ＥＲ陽性腫瘍のさらに分化した状態と関係している可能性がある。ＩＬ２ＲＢ、ＩＬ２ＲＧ、ＣＤ３Ｇという３種類の免疫関連遺伝子の発現量が少ないのは、これらの十分に分化した腫瘍でリンパ球の浸潤が少ないことと関連している可能性がある。乳癌でＥＲＢＢ２の発現量が多いのは、予後の悪さと関連しており、さらにはホルモン療法や化学療法に対する特定の耐性と関連していた（３６）。これは、細胞の分化、接着および運動性の調節に関与している。ＥＲＢＢ２の運動性亢進活性（３７）は、転移の確率を高め、ＥＲＢＢ２を高発現する乳腫の予後を好ましくないものとする原因になり得る。節陽性腫瘍でＥ−カドヘリンとトロンボスポンジン１の発現量が少ないのは、転移が広がるときの各ステップにおけるそれらの推定上の役割と一致している。すなわち、Ｅ−カドヘリンはその攪乱が癌腫で侵襲性細胞が放出される際の条件になる上皮細胞接着分子（３８）であり、トロンボスポンジン１は血管形成を阻害する（３９）。同様に、節陽性腫瘍で分子表面抗原ムチン１の発現量が多い（４０）ため、細胞間の相互作用が小さくなり、細胞の分離と転移が促進される可能性がある。節陽性腫瘍ならびにＧＳＴＰ１（グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼπ）で細胞接着およびリンパ節ホーミングに関与する膜貫通糖タンパク質をコードするＣＤ４４（４１）が高いレベルで発現され、腫瘍サイズの増大と関連していることが最近になって報告された（２７）。
【０１２３】
次に、発現パターンが大きく相関した多くの遺伝子があった。基本的には動的な実験条件下で（４２）、最近では定常状態（１７）でも、さらに大きな一連の遺伝子との遺伝子相関がすでに報告されている。ここで、相関性は、比較的小さいが選択された一連の遺伝子の発現プロファイルに基づくものであり、定常状態では異なる乳腫によって表された。遺伝子の相関性は、ｉ）癌細胞の一般的な調節回路に関する情報を提供し、発現ネットワークを制御する調節要素を識別することができ、ｉｉ）たとえば遺伝子クラスターに含まれる大量の遺伝子の強度とそれぞれの中間強度とを入れ替えることで分析される系の複雑さを抑えられる可能性があるという２つの側面で、癌研究に役立つ可能性を秘めたツールである。
【０１２４】
最後に、これらの結果は、癌研究におけるｃＤＮＡアレイの大きな可能性を浮き彫りにするものである。遺伝子発現プロファイルを用いることで、乳癌の不均一性が確認され、最も重要なことに、通常の組織臨床的なパラメーターではまだ認識されていないが、補助化学療法後の臨床転帰の異なる、この疾患の２つのサブタイプを、一連の予後の悪い乳腫で識別できるようになった。さらに、本発明を用いることで、発現が昔からの予後の条件と相関した遺伝子を検出できるようになる。
【０１２５】
腫瘍由来の細胞、特に乳腫由来の細胞で低発現または高発現されたポリヌクレオチド配列の個体群に対応するポリヌクレオチドの配列番号：１から配列番号：４６８ならびにそれぞれの相補体のライブラリを表４に示す。
【０１２６】
【表４】
【０１２７】
特に健常な人と癌患者とを区別することに注意しつつ、高発現されたポリヌクレオチド配列および低発現されたポリヌクレオチド配列の上位５ずつに対応する２つの部分個体群を以下の表５Ａおよび表５Ｂに示す。
【０１２８】
【表５Ａ】
【０１２９】
【表５Ｂ】
【０１３０】
以下の表６は、ＥＲ＋の試料とＥＲ−の試料とを区別できるようにするホルモン感受性腫瘍を検出することに注目した、ポリヌクレオチド配列の部分個体群に関するものである。
【０１３１】
【表６】
【０１３２】
以下の表６Ａおよび表６Ｂは、ＥＲ＋の試料とＥＲ−の試料とを区別できるようにするホルモン感受性腫瘍を検出することに特に注目した、ポリヌクレオチド配列の２つの部分個体群に関するものである。
【０１３３】
【表６Ａ】
【０１３４】
【表６Ｂ】
【０１３５】
以下の表７は、リンパ節のある腫瘍とリンパ節のない腫瘍とを区別することに注目した、ポリヌクレオチド配列の部分個体群に関するものである。
【０１３６】
【表７】
【０１３７】
以下の表７Ａおよび表７Ｂは、リンパ節のある腫瘍とリンパ節のない腫瘍とを区別することに特に注目した、ポリヌクレオチド配列の２つの部分個体群に関するものである。
【０１３８】
【表７Ａ】
【０１３９】
【表７Ｂ】
【０１４０】
以下の表８、表８Ａおよび表８Ｂは、アントラサイクリン感受性の腫瘍とアントラサイクリン非感受性の腫瘍とを区別することに特に注目した、ポリヌクレオチド配列の部分個体群に関するものである。
【０１４１】
【表８】
【０１４２】
以下の表８Ａおよび表８Ｂは、アントラサイクリン感受性の腫瘍とアントラサイクリン非感受性の腫瘍とを区別することに特に注目した、ポリヌクレオチド配列の２つの部分個体群に関するものである。
【０１４３】
【表８Ａ】
【０１４４】
【表８Ｂ】
【０１４５】
以下の表９、表９Ａおよび表９Ｂは、予後の良い原発性乳ガンと予後の悪い原発性乳ガンとを分類することに特に注目した、ポリヌクレオチド配列の部分個体群に関するものである。
【０１４６】
【表９】
【０１４７】
【表９Ａ】
【０１４８】
【表９Ｂ】
【０１４９】
表９Ａに記載のあらかじめ定義されたポリヌクレオチド配列のそれぞれに含まれるものの中から選択される少なくとも１つのポリヌクレオチド配列を用いて検出される遺伝子の高発現と、表９Ｂに記載のあらかじめ定義されたポリヌクレオチド配列のそれぞれに含まれるものの中から選択される少なくとも１つのポリヌクレオチド配列を用いて検出される遺伝子の低発現とを組み合わせることで、良好な転帰が得られる。
【０１５０】
したがって、本発明による好ましいＤＮＡアレイは、表９Ａに記載のあらかじめ定義されたポリヌクレオチド配列のそれぞれに含まれるものの中から選択される少なくとも１つのポリヌクレオチド配列と、表９Ｂに記載のあらかじめ定義されたポリヌクレオチド配列のそれぞれに含まれるものの中から選択される少なくとも１つのポリヌクレオチド配列とを含む。
【０１５１】
このようなＤＮＡアレイは、リスクの高い（転帰の悪い）患者と予後の良好な（転帰の良い）患者とを区別する上で特に役立つものである。
【０１５２】
【表１０】
【図面の簡単な説明】
【０１５３】
【図１】正常な乳房組織（ＮＢ）と乳腫試料との間の差次的遺伝子発現の一例を示す図である。
【図２】正常な乳房組織（ＮＢ）と乳癌腫の３４の試料における１７６の遺伝子の発現レベルを示す図である。
【図３】遺伝子発現プロファイリングによる乳癌の予後の分類を示す図である。
【図４】ＧＡＴＡ３の発現とＥＲ表現型との相関を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリヌクレオチドの分析に関し、特に、候補ポリヌクレオチドのアレイを用いて癌腫のポリヌクレオチド発現プロファイリングを行うことに関する。
【背景技術】
【０００２】
乳癌患者の処置に携わる病理学者および臨床医らは、この疾患の不均一性が高く、従来の組織学的・臨床的な特徴に、乳癌とその感受性が癌の治療に対してどのように発展していくかを高い信頼度で予測する因子がないという、２つの大きな問題に直面している。予後のタイプが同じに見える乳腫であっても、治療に対する応答性は患者ごとに大きく異なり、必然的に生存率も患者によって大きく異なる。患者ごとに治療を変えられるようにするには、新たな予後因子および予測因子が必要なのである。
【０００３】
上記の問題に対してグローバルに取り組む分子的研究に現在大きな期待がよせられている。細胞遺伝学、比較ゲノムハイブリダイゼーション、全ゲノムａｌｌｅｌｏｔｙｐｉｎｇなどの方法では、この問題にゲノムレベルで取り組んできている。現在、転写レベルでヒトの腫瘍に起こる修飾についても、多くの遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルを同時定量的測定できるｃＤＮＡアレイなどの新たな方法を用いて、前例のない大きな規模で研究することが可能である。したがって、臨床例におけるｃＤＮＡアレイ試験の可能性を評価し、雑多な（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ）癌を臨床転帰がさらに一様ないくつかの腫瘍サブタイプに分類し、かつ新たな潜在的予後因子および治療標的を同定する手段を提供できれば都合がよいであろう。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、ポリヌクレオチド配列またはこれらの部分配列のプールを含む、癌腫の分子キャラクタリゼーションに役立つポリヌクレオチドライブラリであって、上記の配列または部分配列が腫瘍細胞にて低発現または高発現され、この配列または部分配列が配列番号１〜４６８のいずれかに記載のポリヌクレオチド配列またはこれらの相補体のうちいずれかに実質的に対応するものである、ポリヌクレオチドライブラリに関する。
【０００５】
本願開示内容では、さまざまな専門用語を使用しなければならない。
【０００６】
「ポリヌクレオチド」という用語は、一本鎖であり、任意に、合成のヌクレオチド塩基、非天然のヌクレオチド塩基または改変されたヌクレオチド塩基を含む、ＲＮＡまたはＤＮＡのポリマーを示す。ＤＮＡのポリマーとしてのポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたは合成ＤＮＡの１つまたはそれ以上のセグメントで構成されるものであってもよい。
【０００７】
「部分配列」という用語は、これよりも長い核酸の配列の一部を含む核酸配列を示す。
【０００８】
「支持体に固定化された」とは、共有結合、水素結合、イオン性の相互作用、疎水性の相互作用またはその他の方法による付着を含む、直接的または間接的な結合を意味する。
【０００９】
乳癌には組織臨床的に重要な不均一性が認められるという特徴があるが、このような不均一性は症例ごとに最も適切な処置を選択する上での妨げとなっている。この問題については、疾患の自然史と処置に対する感受性とをさらに高い精度で予測する新たなパラメーターを確認することで解決できる可能性がある。本発明の重要な一目的は、予測、予後および癌処置の一助となり得る乳癌の大規模分子キャラクタリゼーションに関するものである。
【００１０】
本発明の重要な一態様はｃＤＮＡアレイを使用することに関するものである。これは、腫瘍試料の比較結果、従来の組織臨床的な予後の特徴と分子データとの相関性、遺伝子相関という３通りの方法で、３４の一貫した原発性乳がんにおける１８８の候補遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルを定量的に研究できるようにするものである。この実験によって、乳腫の高い不均一性が転写レベルで明らかになった。階層的クラスタリング法では、化学療法後の臨床転帰が異なることが特徴である腫瘍の分子的に異なる２つのサブグループが識別された。この転帰は一般に使用されている組織臨床的なパラメーターでは予測できなかったものである。患者の年齢、腫瘍のサイズ、組織学的なタイプおよびグレードには何ら相関性は認められなかった。しかしながら、エストロゲンレセプターの状態から判断した場合の遺伝子の発現がリンパ節転移のある腫瘍において特徴的であった。すなわち、ＥＲＢＢ２の発現はリンパ節の状態と強く相関（ｐ≦０．０００１）し、ＧＡＴＡ３の発現はエストロゲンレセプターの存在と強く相関（ｐ≦０．００１）していた。したがって、これらの実験結果から、新たな潜在的発癌ターゲットと転帰とに基づいて腫瘍をグループ化する新たな方法が得られた。これらの方法では、ｃＤＮＡアレイ試験を系統的に使用することで予後と化学受容性の点で乳癌の分類が改善され、かつ新しい潜在的な治療標的が得られる可能性が高いことが分かる。
【００１１】
固相支持体あるいは、ナイロン膜、スライドガラス、ガラスビーズ、シリコンチップなどの支持体上に規則正しくスポットされた多数のＤＮＡ分子で構成されるのがＤＮＡアレイである。ＤＮＡアレイについては、アレイ上の各ＤＮＡスポットのサイズによってマイクロアレイ（各ＤＮＡスポットの直径２５０ミクロン未満）とマクロアレイ（スポット直径が３００ミクロンを上回る）とに分類できる。使用する固体支持体のサイズが小さい場合、このアレイをＤＮＡチップと呼ぶこともある。どのようなスポッティング法を使うのかによって、ガラス製マイクロアレイのスポット数は数百から数千までの範囲となり得る。
【００１２】
ＤＮＡマイクロアレイは、遺伝子発現プロファイリング、新規遺伝子配列決定、遺伝子変異分析、遺伝子マッピングおよび遺伝子型同定をはじめとするさまざまな目的に活用されてきた。ｃＤＮＡマイクロアレイはｃＤＮＡライブラリから単離した別々のｃＤＮＡクローンでプリントされる。このため、各スポットが別々のｍＲＮＡ由来であるため、それぞれ発現された遺伝子を表すことになる。
【００１３】
一般に、遺伝子発現をモニタリングする方法では、（１）１つまたはそれ以上の標的遺伝子（単数または複数）のＲＮＡ転写物（単数または複数）またはこのＲＮＡ転写物（単数または複数）由来の核酸を含む試料ポリヌクレオチドのプールを提供し、（２）試料ポリヌクレオチドを、プローブのアレイ（たとえばポリヌクレオチドライブラリから得たポリヌクレオチドなど）（対照プローブを含む）にハイブリダイズするなど、反応させ、（３）反応した／ハイブリダイズされたポリヌクレオチドを検出する。この検出は、相対的な発現（転写）レベルの計算／定量化を伴うものであってもよい。
【００１４】
本発明は、ポリヌクレオチド配列またはこれらの部分配列のプールを含む、癌腫の分子キャラクタリゼーションに役立つポリヌクレオチドライブラリであって、前記配列または部分配列が腫瘍細胞にて低発現または高発現され、前記配列または部分配列が添付書類の配列番号１〜４６８のいずれかに記載のポリヌクレオチド配列またはこれらの相補体のうちいずれかに実質的に対応するものである、ポリヌクレオチドライブラリに関するものである。
【００１５】
当然、上記配列との相同率の高い配列を用いて、すなわち配列番号１〜４６８のいずれかひとつの配列と比較してこれらの配列が点のような変異（ｐｕｎｃｔｕａｌ ｍｕｔａｔｉｏｎ）を１つあるいは若干示す場合に、本発明の分子キャラクタリゼーションを実現することもできる。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明は、ポリヌクレオチド配列またはこれらの部分配列のプールを含む、癌腫の分子キャラクタリゼーションに役立つポリヌクレオチドライブラリであって、前記配列または部分配列が腫瘍細胞にて高発現され、前記配列または部分配列が添付書類の配列番号１〜２４９（ここで、これらの配列番号は、優先権書類での旧配列番号１〜２４９を示し、本願添付書類の配列表における対応表１０でこれらの配列を識別することができる）のいずれかに記載のポリヌクレオチド配列またはこれらの相補体のうちいずれかに実質的に対応するものである、ポリヌクレオチドライブラリに関するものである。
【００１７】
好ましくは、ポリヌクレオチド配列または部分配列のプールが、配列番号１〜２４７（ここで、これらの配列番号は、優先権書類での旧配列番号１〜２４７を示し、本願添付書類の配列表における対応表１０でこれらの配列を識別することができる）のうちいずれかのポリヌクレオチド配列に実質的に対応し、前記配列が、正常な細胞と癌細胞とを区別する際に役立つものである。
【００１８】
また、本発明は、ポリヌクレオチド配列または部分配列のプールが、配列番号１〜２４２（ここで、これらの配列番号は、優先権書類での旧配列番号１〜２４２を示し、本願添付書類の配列表における対応表１０でこれらの配列を識別することができる）のうちいずれかのポリヌクレオチド配列に実質的に対応し、前記配列が、ホルモン感受性腫瘍細胞を検出する際に役立つものである、あるいは、前記配列が、リンパ節のある腫瘍とリンパ節のない腫瘍とを区別する際に役立つものである、ポリヌクレオチドライブラリに関するものである。
【００１９】
また、本発明は、ポリヌクレオチド配列または部分配列のプールが、配列番号１〜２２４（ここで、これらの配列番号は、優先権書類での旧配列番号１〜２２４を示し、本願添付書類の配列表における対応表１０でこれらの配列を識別することができる）のうちいずれかのポリヌクレオチド配列に実質的に対応し、前記配列が、テトラサイクリン感受性腫瘍とテトラサイクリン非感受性腫瘍とを区別する際に役立つものである、ポリヌクレオチドライブラリに関するものである。
【００２０】
また、本発明は、ポリヌクレオチドアレイを形成すべく前記ポリヌクレオチドを固相支持体に固定化した、上述したようなポリヌクレオチドライブラリに関するものである。
【００２１】
好ましくは、ナイロン膜、スライドガラス、ガラスビーズまたはシリコンチップからなる群から支持体を選択する。
【００２２】
また、本発明は、
ａ）患者からポリヌクレオチド試料を得ることと、
ｂ）ステップ（ａ）で得られた前記試料ポリヌクレオチドと、上述したライブラリのポリヌクレオチド配列のうちいずれかまたは前記ライブラリのポリヌクレオチド配列のうちいずれかでコードされる発現産物を含む、固相支持体に固定化したプローブと、を反応させることと、
ｃ）ステップ（ｂ）の反応産物を検出することとを含む、癌と相関し、発現状態の異なるポリヌクレオチド配列を検出する方法に関するものである。
【００２３】
また、本発明は、ステップ（ｃ）の反応産物の量と対照試料とを比較する、本発明の差次的に発現されたポリヌクレオチド配列を検出するための方法に関するものである。
【００２４】
好ましくは、ポリヌクレオチド試料を単離し、試料はＲＮＡまたはｍＲＮＡである。
【００２５】
好ましくは、ポリヌクレオチド試料はｍＲＮＡの逆転写によって得られたｃＤＮＡである。
【００２６】
好ましい実施形態では、差次的に発現されたポリヌクレオチド配列を検出する方法、ステップ（ｂ）は試料ＲＮＡを標識したプローブにハイブリダイゼーションすることを含む。
【００２７】
この差次的に発現されたポリヌクレオチド配列を検出する方法は、癌に関連した健康状態すなわち、乳癌を検出し、診断し、病期分類し、モニタリングし、予後判定するのに使用される。
【００２８】
ポリヌクレオチド配列または部分配列のうちいずれかでコードされる産物が、検出の根拠となるレセプターリガンド反応に関与している場合に、差次的に発現されたポリヌクレオチド配列を検出する方法は特に有用である。
【００２９】
また、本発明は、上述した差次的に発現されたポリヌクレオチド配列を検出するための方法を含む、抗腫瘍薬をスクリーニングするための方法であって、スクリーニング対象となる抗腫瘍薬で試料を処置しておく方法に関するものである。
【００３０】
ポリヌクレオチド試料の標識に使用する標識は、放射性標識、比色的な標識、酵素的な標識、分子増幅による標識、生物発光標識または蛍光標識からなる群から選択される。
【００３１】
また、本発明は、配列番号：１から配列番号：２４９（ここで、これらの配列番号は、優先権書類での旧配列番号１〜２４９を示し、本願添付書類の配列表における対応表１０でこれらの配列を識別することができる）から選択される腫瘍由来の細胞およびそれぞれの相補体において高発現または低発現されたポリヌクレオチド配列からなる個体群を含む、ポリヌクレオチドのライブラリに関するものである。
【００３２】
特定の実施形態では、本発明は、配列番号：１、配列番号：５、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：２８、配列番号：２９、配列番号：３０、配列番号：３１、配列番号：３２、配列番号：４５、配列番号：４６、配列番号：５２、配列番号：５４、配列番号：６３、配列番号：６４、配列番号：８１、配列番号：８２、配列番号：８７、配列番号：８８、配列番号：１０１、配列番号：１０２、配列番号：１０３、配列番号：１０４、配列番号：１０５、配列番号：１０７、配列番号：１１３、配列番号：１１４、配列番号：１１５、配列番号：１１６、配列番号：１２７、配列番号：１２８、配列番号：１３１、配列番号：１３９、配列番号：１４０、配列番号：１４２、配列番号：１５０、配列番号：１５１、配列番号：１５４、配列番号：１５６、配列番号：１６０、配列番号：１６１、配列番号：１６２、配列番号：１７７、配列番号：１７８、配列番号：１９４、配列番号：１９５、配列番号：２２７、配列番号：２２８、配列番号：２２９、配列番号：２３１、配列番号：２３３、配列番号：２４３、配列番号：２４４、配列番号：２４５、配列番号：２４６、配列番号：２４７（ここで、これらの配列番号は、優先権書類の表５における旧配列番号を示し、本願添付書類の配列表における対応表１０でこれらの配列を識別することができる）のポリヌクレオチド配列に関するものであり、これで健常な人と癌のある人とを見分ける。
【００３３】
好ましくは、本発明は、配列番号：１、配列番号：５、配列番号：１０２、配列番号：１０３、配列番号：１０７、配列番号：２２９、配列番号：４５、配列番号：４６、配列番号：２４３、配列番号：２４４、配列番号：２４５、配列番号：２４６、配列番号：２４７（ここで、これらの配列番号は、優先権書類の表６における旧配列番号を示し、本願添付書類の配列表における対応表１０でこれらの配列を識別することができる）のポリヌクレオチド配列に関するものであり、これで健常な人と癌のある人とを見分ける。
【００３４】
別の特定の実施形態において、本発明は、ホルモン感受性腫瘍を検出する、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：１８、配列番号：１９、配列番号：２０、配列番号：２１、配列番号：２２、配列番号：２３；、配列番号：２４、配列番号：２５、配列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：２２１、配列番号：２２２、配列番号：２２３、配列番号：２４１、配列番号：２４２（ここで、これらの配列番号は、優先権書類の表７における旧配列番号を示し、本願添付書類の配列表における対応表１０でこれらの配列を識別することができる）のポリヌクレオチド配列に関するものである。
【００３５】
好ましくは、本発明は、配列番号：１、配列番号：２配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：２２１、配列番号：２２２、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：１８、配列番号：１９、配列番号：２０、配列番号：２１、配列番号：２２、配列番号：２４１、配列番号：２４２（ここで、これらの配列番号は、優先権書類の表８における旧配列番号を示し、本願添付書類の配列表における対応表１０でこれらの配列を識別することができる）のポリヌクレオチド配列に関するものであり、これでホルモン感受性腫瘍を検出する。
【００３６】
別の特定の実施形態において、本発明は、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：１９、配列番号：２０、配列番号：２１、配列番号：２２、配列番号：２３、配列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９、配列番号：３０、配列番号：３１、配列番号：３２、配列番号：３３、配列番号：３４、配列番号：３５、配列番号：３６、配列番号：３７、配列番号：３８、配列番号：３９、配列番号：４０、配列番号：４１、配列番号：４２、配列番号：４３、配列番号：４４、配列番号：２２１、配列番号：２２２、配列番号：２３３、配列番号：２４１、配列番号：２４２（ここで、これらの配列番号は、優先権書類の表８における旧配列番号を示し、本願添付書類の配列表における対応表１０でこれらの配列を識別することができる）のポリヌクレオチド配列に関するものであり、これでリンパ節のある腫瘍とリンパ節のない腫瘍とを見分ける。
【００３７】
好ましくは、本発明は、配列番号：１、配列番号：２１、配列番号：２２、配列番号：２８；、配列番号：２９、配列番号：２９、配列番号：３１、配列番号：３２、配列番号：１９、配列番号：２０、配列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：３７、配列番号：３８、配列番号：３９、配列番号：２４１、配列番号：２４１（ここで、これらの配列番号は、優先権書類の表８における旧配列番号を示し、本願添付書類の配列表における対応表１０でこれらの配列を識別することができる）のポリヌクレオチド配列に関するものであり、これでリンパ節のある腫瘍とリンパ節のない腫瘍とを見分ける。
【００３８】
別の特定の実施形態において、本発明は、アントラサイクリンに対する感受性のある腫瘍とアントラサイクリンに対する感受性のない腫瘍とを見分ける、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１９、配列番号：２０、配列番号：２１、配列番号：２２、配列番号：２３、配列番号：３５、配列番号：３６；、配列番号：３７、配列番号：５６、配列番号：５７、配列番号：７４、配列番号：７５、配列番号：１０２、配列番号：１０４、配列番号：１０７、配列番号：１０８、配列番号：１０９、配列番号：１１８、配列番号：１１９；、配列番号：１３６、配列番号：２１３、配列番号：２１４、配列番号：２１５、配列番号：２２３、配列番号：２２４（ここで、これらの配列番号は、優先権書類の表１１における旧配列番号を示し、本願添付書類の配列表における対応表１０でこれらの配列を識別することができる）のポリヌクレオチド配列に関するものである。
【００３９】
また、本発明は、癌と相関した、差次的に発現された遺伝子を検出する方法であって、患者から得た試料で、上記にて定義したようなポリヌクレオチド配列の少なくとも１つのライブラリまたは前記ライブラリでコードされる産物の少なくとも１つのライブラリを検出することを含む方法に関するものである。
【００４０】
本発明の特定の実施形態は、表４に定義するような、あらかじめ定義されたポリヌクレオチド配列の集合１から集合２１２のそれぞれに含まれるものの中から選択される少なくとも１つのポリヌクレオチド配列のいずれかの組み合わせに実質的に対応するポリヌクレオチドライブラリに関するものである。
【発明の効果】
【００４１】
本発明は明らかに、前記あらかじめ定義された集合の少なくとも５０％、好ましくは７５％、より好ましくは１００％に含まれるものの中から選択される少なくとも１つのポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドライブラリに関するものであり、これによって識別可能な遺伝子パターンが得られる、すなわち、健常な患者と腫瘍病変に羅患した患者、ホルモン感受性腫瘍を持つ患者とホルモン耐性腫瘍を持つ患者、リンパ節のある腫瘍を持つ患者とリンパ節のない腫瘍を持つ患者、アントラサイクリン感受性腫瘍を持つ患者とアントラサイクリン非感受性腫瘍を持つ患者、予後の良い原発性乳腫を持つ患者と予後の悪い原発性乳ガンを持つ患者とを見分けることができる。
【００４２】
また、関与している遺伝子を完全に検出できるように、本発明を実現するのに役立つポリヌクレオチド配列ライブラリは、表４に定義するようなポリヌクレオチド配列集合各々の３’末端と５’末端との間で構成されるあらゆる配列を含み得るものである。
【００４３】
また、本発明は、ポリヌクレオチド配列または部分配列のプールが、正常な細胞と癌細胞とを区別する際に役立つ、表５に示されるあらかじめ定義されたポリヌクレオチド配列の集合それぞれに含まれるものの中から選択される少なくとも１つのポリヌクレオチド配列のいずれかの組み合わせに実質的に対応するものである、正常な細胞と癌細胞とを区別する上で役立つポリヌクレオチドライブラリに関するものである。
【００４４】
好ましくは、正常な細胞と癌細胞とを区別する上で役立つポリヌクレオチドライブラリが、表５Ａに記載のあらかじめ定義されたポリヌクレオチド配列の集合それぞれに含まれるものの中から選択される少なくとも１つのポリヌクレオチド配列と、表５Ｂに記載のあらかじめ定義されたポリヌクレオチド配列の集合それぞれに含まれるものの中から選択される少なくとも１つのポリヌクレオチド配列とのいずれかの組み合わせに実質的に対応する。
【００４５】
表５Ａに定義するポリヌクレオチド配列の集合を用いて同定される遺伝子の高発現の検出と、表５Ｂに定義するポリヌクレオチド配列の集合を用いて同定される遺伝子の低発現の検出とを一緒に行うことで、正常な患者と腫瘍病変に羅患した患者とを見分けることができる。
【００４６】
また、本発明は、ポリヌクレオチド配列または部分配列のプールが、表６に記載のあらかじめ定義されたポリヌクレオチド配列の集合それぞれに含まれるものの中から選択される少なくとも１つのポリヌクレオチド配列のいずれかの組み合わせに実質的に対応するものである、ホルモン感受性腫瘍細胞を検出する上で役立つポリヌクレオチドライブラリに関するものである。
【００４７】
好ましくは、ホルモン感受性腫瘍細胞を検出する上で役立つポリヌクレオチドライブラリが、表６Ａに記載のあらかじめ定義されたポリヌクレオチド配列の集合それぞれに含まれるものの中から選択される少なくとも１つのポリヌクレオチド配列と、表６Ｂに記載のあらかじめ定義されたポリヌクレオチド配列の集合それぞれに含まれるものの中から選択される少なくとも１つのポリヌクレオチド配列と、のいずれかの組み合わせに実質的に対応する。
【００４８】
表６Ａに定義するポリヌクレオチド配列の集合を用いて同定される遺伝子の高発現の検出と、表６Ｂに定義するポリヌクレオチド配列の集合を用いて同定される遺伝子の低発現の検出とを一緒に行うことで、ホルモン感受性腫瘍を持つ患者とホルモン耐性腫瘍を持つ患者とを見分けることができる。
【００４９】
また、本発明は、ポリヌクレオチド配列または部分配列のプールが、表７に記載のあらかじめ定義されたポリヌクレオチド配列の集合それぞれに含まれるものの中から選択される少なくとも１つのポリヌクレオチド配列のいずれかの組み合わせに実質的に対応するものである、リンパ節のある腫瘍とリンパ節のない腫瘍とを区別する上で役立つポリヌクレオチドライブラリに関するものである。
【００５０】
好ましくは、リンパ節のある腫瘍とリンパ節のない腫瘍とを区別する上で役立つポリヌクレオチドライブラリが、表７Ａに記載のあらかじめ定義されたポリヌクレオチド配列の集合それぞれに含まれるものの中から選択される少なくとも１つのポリヌクレオチド配列と、表７Ｂに記載のあらかじめ定義されたポリヌクレオチド配列の集合それぞれに含まれるものの中から選択される少なくとも１つのポリヌクレオチド配列と、のいずれかの組み合わせに実質的に対応する。
【００５１】
表７Ａに定義するポリヌクレオチド配列の集合を用いて同定される遺伝子の高発現の検出と、表７Ｂに定義するポリヌクレオチド配列の集合を用いて同定される遺伝子の低発現の検出とを一緒に行うことで、リンパ節のある腫瘍を持つ患者とリンパ節のない腫瘍を持つ患者とを見分けることができる。
【００５２】
また、本発明は、ポリヌクレオチド配列または部分配列のプールが、表８に記載のあらかじめ定義されたポリヌクレオチド配列の集合それぞれに含まれるものの中から選択される少なくとも１つのポリヌクレオチド配列のいずれかの組み合わせに実質的に対応するものである、アントラサイクリン感受性腫瘍とアントラサイクリン非感受性腫瘍とを区別する上で役立つポリヌクレオチドライブラリに関するものである。
【００５３】
好ましくは、アントラサイクリン感受性腫瘍とアントラサイクリン非感受性腫瘍とを区別する上で役立つポリヌクレオチドライブラリが、表８Ａに記載のあらかじめ定義されたポリヌクレオチド配列の集合それぞれに含まれるものの中から選択される少なくとも１つのポリヌクレオチド配列と、表８Ｂに記載のあらかじめ定義されたポリヌクレオチド配列の集合それぞれに含まれるものの中から選択される少なくとも１つのポリヌクレオチド配列と、のいずれかの組み合わせに実質的に対応する。
【００５４】
表８Ａに定義するポリヌクレオチド配列の集合を用いて同定される遺伝子の高発現の検出と、表８Ｂに定義するポリヌクレオチド配列の集合を用いて同定される遺伝子の低発現の検出とを一緒に行うことで、アントラサイクリン感受性腫瘍を持つ患者とアントラサイクリン非感受性腫瘍を持つ患者とを見分けることができる。
【００５５】
また、本発明は、ポリヌクレオチド配列または部分配列のプールが、表９に記載のあらかじめ定義されたポリヌクレオチド配列の集合それぞれに含まれるものの中から選択される少なくとも１つのポリヌクレオチド配列のいずれかの組み合わせに実質的に対応するものである、予後の良い原発性乳ガンと予後の悪い原発性乳ガンとを分類する上で役立つポリヌクレオチドライブラリに関するものである。
【００５６】
好ましくは、予後の良い原発性乳ガンと予後の悪い原発性乳ガンとを分類する上で役立つポリヌクレオチドライブラリが、表９Ａに記載のあらかじめ定義されたポリヌクレオチド配列の集合それぞれに含まれるものの中から選択される少なくとも１つのポリヌクレオチド配列と、表９Ｂに記載のあらかじめ定義されたポリヌクレオチド配列の集合それぞれに含まれるものの中から選択される少なくとも１つのポリヌクレオチド配列と、のいずれかの組み合わせに実質的に対応する。
【００５７】
表９Ａに定義するポリヌクレオチド配列の集合を用いて同定される遺伝子の高発現の検出と、表９Ｂに定義するポリヌクレオチド配列の集合を用いて同定される遺伝子の低発現の検出とを一緒に行うことで、予後の良い原発性乳ガンを持つ患者と予後の悪い原発性乳ガンを持つ患者とを分類することができる。
【００５８】
好ましい実施形態では、本発明のポリヌクレオチドライブラリから低発現された配列または高発現された配列を示す腫瘍細胞が乳腫細胞である。
【００５９】
特定の実施形態では、ポリヌクレオチドアレイを形成するために本発明のポリヌクレオチドライブラリのポリヌクレオチドを固相支持体に固定化し、前記固相支持体が、ナイロン膜、ニトロセルロース膜、スライドガラス、ガラスビーズ、ガラス支持体上の膜またはシリコンチップからなる群から選択される。
【００６０】
本発明のもうひとつの目的は、上記にて定義したような固定化ポリヌクレオチドライブラリ集合を少なくとも１つ含む、腫瘍の予後または診断に役立つポリヌクレオチドアレイに関するものである。
【００６１】
次に、本発明は、正常な細胞と癌細胞とを区別する際に役立つ、表５に記載のあらかじめ定義されたポリヌクレオチド配列の集合それぞれに含まれるものの中から選択される少なくとも１つのポリヌクレオチド配列のいずれかの組み合わせを含む、正常な細胞と癌細胞とを区別する上で役立つポリヌクレオチドアレイに関するものである。
【００６２】
好ましくは、正常な細胞と癌細胞とを区別する上で役立つポリヌクレオチドアレイが、表５Ａに記載のあらかじめ定義されたポリヌクレオチド配列の集合それぞれに含まれるものの中から選択される少なくとも１つのポリヌクレオチド配列と、表５Ｂに記載のあらかじめ定義されたポリヌクレオチド配列の集合それぞれに含まれるものの中から選択される少なくとも１つのポリヌクレオチド配列と、のいずれかの組み合わせを含む。
【００６３】
また、本発明は、表６に記載のあらかじめ定義されたポリヌクレオチド配列の集合それぞれに含まれるものの中から選択される少なくとも１つのポリヌクレオチド配列のいずれかの組み合わせを含む、ホルモン感受性腫瘍細胞を検出する上で役立つポリヌクレオチドアレイに関するものである。
【００６４】
好ましくは、ホルモン感受性腫瘍細胞を検出する上で役立つポリヌクレオチドアレイが、表６Ａに記載のあらかじめ定義されたポリヌクレオチド配列の集合それぞれに含まれるものの中から選択される少なくとも１つのポリヌクレオチド配列と、表６Ｂに記載のあらかじめ定義されたポリヌクレオチド配列の集合それぞれに含まれるものの中から選択される少なくとも１つのポリヌクレオチド配列と、のいずれかの組み合わせを含む。
【００６５】
また、本発明は、表７に記載のあらかじめ定義されたポリヌクレオチド配列の集合それぞれに含まれるものの中から選択される少なくとも１つのポリヌクレオチド配列のいずれかの組み合わせを含む、リンパ節のある腫瘍とリンパ節のない腫瘍とを区別する上で役立つポリヌクレオチドアレイに関するものである。
【００６６】
好ましくは、リンパ節のある腫瘍とリンパ節のない腫瘍とを区別する上で役立つポリヌクレオチドアレイが、表７Ａに記載のあらかじめ定義されたポリヌクレオチド配列の集合それぞれに含まれるものの中から選択される少なくとも１つのポリヌクレオチド配列と、表７Ｂに記載のあらかじめ定義されたポリヌクレオチド配列の集合それぞれに含まれるものの中から選択される少なくとも１つのポリヌクレオチド配列と、のいずれかの組み合わせを含む。
【００６７】
また、本発明は、表８に記載のあらかじめ定義されたポリヌクレオチド配列の集合それぞれに含まれるものの中から選択される少なくとも１つのポリヌクレオチド配列のいずれかの組み合わせを含む、アントラサイクリン感受性腫瘍とアントラサイクリン非感受性腫瘍とを区別する上で役立つポリヌクレオチドアレイに関するものである。
【００６８】
好ましくは、アントラサイクリン感受性腫瘍とアントラサイクリン非感受性腫瘍とを区別する上で役立つポリヌクレオチドアレイが、表８Ａに記載のあらかじめ定義されたポリヌクレオチド配列の集合それぞれに含まれるものの中から選択される少なくとも１つのポリヌクレオチド配列と、表８Ｂに記載のあらかじめ定義されたポリヌクレオチド配列の集合それぞれに含まれるものの中から選択される少なくとも１つのポリヌクレオチド配列と、のいずれかの組み合わせを含む。
【００６９】
また、本発明は、表９に記載のあらかじめ定義されたポリヌクレオチド配列の集合それぞれに含まれるものの中から選択される少なくとも１つのポリヌクレオチド配列のいずれかの組み合わせを含む、予後の良い原発性乳ガンと予後の悪い原発性乳ガンとを分類する上で役立つポリヌクレオチドアレイに関するものである。
【００７０】
好ましくは、予後の良い原発性乳ガンと予後の悪い原発性乳ガンとを分類する上で役立つポリヌクレオチドアレイが、表９Ａに記載のあらかじめ定義されたポリヌクレオチド配列の集合それぞれに含まれるものの中から選択される少なくとも１つのポリヌクレオチド配列と、表９Ｂに記載のあらかじめ定義されたポリヌクレオチド配列の集合それぞれに含まれるものの中から選択される少なくとも１つのポリヌクレオチド配列と、のいずれかの組み合わせを含む。
【００７１】
また、本発明は、
ａ）患者からポリヌクレオチド試料を得、
ｂ）ステップ（ａ）で得られた前記試料ポリヌクレオチドと、上記にて定義したライブラリのポリヌクレオチド配列のうちいずれかまたは上記にて定義した前記ライブラリのポリヌクレオチド配列のうちいずれかでコードされる発現産物を含む、固相支持体に固定化したプローブと、を反応させ、
ｃ）ステップ（ｂ）の反応産物を検出することを含む、癌と相関し、発現状態の異なるポリヌクレオチド配列を検出する方法に関するものである。
【００７２】
好ましくは、ステップ（ａ）で得られたポリヌクレオチド試料を、固相支持体に固定化されたプローブとステップ（ｂ）で反応させる前に標識する。
【００７３】
ポリヌクレオチド試料の標識は、放射性標識、比色的な標識、酵素的な標識、分子増幅による標識、生物発光標識または蛍光標識からなる群から選択される。
【００７４】
特定の実施形態では、ステップ（ｃ）の反応産物を、前記反応産物と対照試料とをさらに比較することで定量化する。
【００７５】
第１の実施形態では、患者から単離され、ステップ（ａ）で得られたポリヌクレオチド試料が、ＲＮＡまたはｍＲＮＡのいずれかである。
【００７６】
もうひとつの実施形態では、患者から単離されたポリヌクレオチド試料が、ｍＲＮＡの逆転写によって得られるｃＤＮＡである。
【００７７】
好ましくは、差次的に発現されたポリヌクレオチド配列を検出する方法の反応ステップ（ｂ）が、患者から得られる試料ＲＮＡをプローブとハイブリダイゼーションすることを含む。
【００７８】
好ましくは、プローブとのハイブリダイゼーションよりも前に試料ＲＮＡを標識し、この標識が、放射性標識、比色的な標識、酵素的な標識、分子増幅による標識、生物発光標識または蛍光標識からなる群から選択される。
【００７９】
差次的に発現されたポリヌクレオチド配列を検出するこの方法は、癌に関連した健康状態、特に乳癌を検出し、診断し、病期分類し、モニタリングし、予後判定し、予防し、または治療するのに特に役立つ。
【００８０】
さらに、ポリヌクレオチド配列または部分配列の集合のうちいずれかでコードされる産物が、検出の根拠となるレセプターリガンド反応に関与している場合、差次的に発現されたポリヌクレオチド配列を検出する方法は特に有用である。
【００８１】
また、本発明は、上述した差次的に発現されたポリヌクレオチド配列を検出するための方法、方法を含む、抗腫瘍薬をスクリーニングするための方法であって、スクリーニング対象となる抗腫瘍薬で試料を処置しておく方法に関係がある。
【００８２】
特定の実施形態では、抗腫瘍薬をスクリーニングするための方法が、試料で、上記にて定義したようなポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列の集合の少なくとも１つのライブラリまたは前記ライブラリでコードされる産物の少なくとも１つのライブラリと反応するポリヌクレオチド配列を検出することを含む。
【００８３】
以下、腫瘍試料を同定し、かつ正常な試料と見分ける上で役立つポリペプチドの選択されたライブラリで得られる特定の実験結果に関連した、以下に詳細に示す実施例を用いて本発明について説明する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００８４】
腫瘍試料とＲＮＡの抽出
腫瘍のタイプとサイズに関して選択の偏りを一切なくすために、試験対象となるＲＮＡを未選択試料から調製した。Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｐａｏｌｉ−Ｃａｌｍｅｔｔｅで手術を受けている３４名の患者から侵襲性の原発性乳癌の試料を収集した。外科的切除の後に、腫瘍をマクロ解剖した（ｍａｃｒｏｄｉｓｓｅｃｔｅｄ）。病理学者による診断用に切片を取得し、隣接した断片を分子分析用に液体窒素中ですみやかに凍結させた。診断時における患者の年齢の中央値は５５歳（３９、８３の範囲）であり、彼女らの大半が閉経後であった。乳腫についてのＷＨＯの組織学的診断基準に従って腫瘍を分類したところ、乳管癌２９例、小葉癌２例、乳管癌と小葉癌との併発１例、髄様癌２例であった。これらの癌腫はサイズがまちまちであり、免疫組織化学的なアッセイで評価（２３例でＥＲ陽性、１１例でＥＲ陰性）したところ、２０ｍｍ以下（ｎ＝１３）、２０〜５０ｍｍ（ｎ＝１８）、５０ｍｍ以上（ｎ＝３）、腋窩リンパ節の状態（陰性：１９腫瘍、陽性：１５腫瘍）、ＳＢＲグレード（Ｉ：３腫瘍、ＩＩ：２０腫瘍、ＩＩＩ：１０腫瘍、評価できず：１腫瘍）、エストロゲンレセプター状態（ＥＲ）であった。ＥＲ陽性のカットオフ値は１０％であった。地元の慣行に従い、放射線療法と合わせた補助処置ならびに、必要に応じてアントラサイクリンベースの多剤併用化学療法（ｎ＝１６）を患者に対して施した。
【００８５】
常法に従い腫瘍試料から全ＲＮＡを抽出した（４３）。正常な乳房組織由来の全ＲＮＡをクロンテック（カリフォルニア州パロアルト）から入手した。年齢２３歳から４７歳の範囲のコーカソイドの女性由来の８つの組織標本からＲＮＡを単離した。２８Ｓ特異性オリゴヌクレオチドを用いてホルムアルデヒドアガロースゲル電気泳動およびノーザンブロットを変性させる（ｄｅｎａｔｕｒｅ）ことによってＲＮＡの完全性を制御した。
【００８６】
ｃＤＮＡアレイの調製
アレイを放射性プローブとハイブリダイゼーションすることで、遺伝子の発現を分析した。これらのアレイには、実用的な基準（ｍＲＮＡの３’配列、同一のクローニングベクター、宿主バクテリア、インサートサイズ）を用いて選択した１８０のＩＭＡＧＥヒトｃＤＮＡクローンと５つの対照クローンのＰＣＲ産物が含まれていた。これは１７６の遺伝子を表す（４つの遺伝子が２種類の異なるクローンで表された）もので、このうち１２１に未証明または推定ではあるが癌ではないかと思われるものが認められ、５５が免疫反応と関係していた（ｈｔｔｐ：／／ｔａｇｃ．ｕｎｉｖ−ｍｒｓ．ｆｒ／ｐｕｂ／Ｃａｎｃｅｒ／のウェブサイトで一覧を入手可能）。プラスミドＤＮＡの５’ｔａｇ配列決定ならびに、ＮＣＢＩでのＥＳＴ（ｄｂＥＳＴ）データベースおよびヌクレオチド（ＧｅｎＢａｎｋ）データベースに収録された配列との比較によって、それぞれの同一性を検証した。ＧｅｎＢａｎｋでの受入番号で照会した、有意な遺伝子同一性のない１４のクローン以外のすべてのクローンについて、同一性が確認された。シロイヌナズナシトクロムｃ５５４遺伝子（ハイブリダイゼーションシグナルの正規化に使用）、サイズの異なる３ポリ（Ａ）配列、ベクターｐＴ７Ｔ３Ｄ（負の対照）を対照クローンとした。
【００８７】
表記のプロトコールに従って、ＰＣＲ増幅、精製およびＰＣＲ産物のＨｙｂｏｎｄ−Ｎ＋膜（アマシャム）へのロボットによるスポッティングを行った（４）。すべてのＰＣＲ産物を２組ずつスポットした。正規化の目的で、膜全体にｃ５５４遺伝子を９６倍に散在させてスポットした。
【００８８】
ｃＤＮＡアレイのハイブリダイゼーション
（各スポットでハイブリダイゼーション可能な標的ＤＮＡの量を正確に判定するために）ベクターオリゴヌクレオチドを使用し、続いてベクタープローブを取り除いた後はＲＮＡから作製した複合体プローブを使用して、ハイブリダイゼーションを成功させた（４）。各複合体プローブを別々のフィルタにハイブリダイズさせた。過剰なオリゴ（ｄＴ２５）を用いて全ＲＮＡからプローブを作製し、メッセンジャーのポリ（Ａ）尾を飽和させ、逆転写された産物に長いポリ（Ｔ）配列が含まれないようにした。標識前に正確な量のｃ５５４ ｍＲＮＡを全ＲＮＡに加え、データを正常化できるようにした。
【００８９】
各標識には組織試料から得た全ＲＮＡ ５ｎｇ（ｍＲＮＡ 〜１００ｎｇ）を使用した。周知の方法（ｈｔｔｐ：／／ｔａｇｃ．ｕｎｉｖ−ｍｒｓ．ｆｒ／ｐｕｂ／Ｃａｎｃｅｒ／）でプローブ作製と膜のハイブリダイゼーションを実施した。
【００９０】
標的過剰（各スポットでのＤＮＡ 〜１５ｎｇ）でハイブリダイゼーションを実施したところ、標的に対するｃＤＮＡの結合はプローブ中のｃＤＮＡの量に正比例していた。
【００９１】
ｃＤＮＡアレイハイブリダイゼーションシグナルの検出と定量化
イメージングプレート装置を用いて定量的データを得た。すでに説明した（ｈｔｔｐ：／／ｔａｇｃ．ｕｎｉｖ−ｍｒｓ．ｆｒ／ｐｕｂ／Ｃａｎｃｅｒ／）ようにして、ＦＵＪＩ ＢＡＳ １５００装置でハイブリダイゼーションシグナルを検出し、ＨＤＧ Ａｎａｌｙｚｅｒソフトウェア（ミシガン州アンアーバーのゲノミックソリューションズ）で定量化を行った。定量化については、すべてのスポット画素強度を一緒にし、隣接するエリアで求めたスポットのバックグラウンド値を減算することで行った。ＬａＰｌａｃｉａｎ形質転換でスポットを位置付けた。スポットのバックグラウンドレベルは、そのスポットを中心とする小さなウィンドウ内にあり、任意のスポットの一部ではない、すべての画素の強度の中央値であった（４４）。既述（４）のとおり、定量化データを３ステップで正規化し、これを絶対遺伝子発現レベルとして（すなわち試料中のｍＲＮＡに対する個々のｍＲＮＡの存在量のパーセンテージで）表した。
【００９２】
アレイデータの分析
結果を分析する前に、２組のスポットを比較するか、別個の２つのアレイ上にある同一プローブで１回のハイブリダイゼーションを行うか、あるいは同一のＲＮＡから作製したプローブで２回のハイブリダイゼーションを独立して行うことにより、実験の再現性を検証した。いずれの場合も、それぞれの相関係数が０．９５、０．９８および０．９８（データ示さず）という結果となり、再現性は良好であった。さらに、ＣＤＫ４またはＥＴＶ５などのアレイ上で２種類の異なるクローンで表される遺伝子では、すべての試料でこの２種類のクローンについて同様の発現プロフィールが認められた。この再現性は、倍化発現差（ｆｏｌｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ）を著しく異なるものとみなすには十分であった。
【００９３】
グラフ表示のため、データを絶対発現レベルとして表示した（図２ａ）。クラスタリングがさらによく分かるように、結果を対数変換し、各列および各行で中央値に集めた（ｍｅｄｉａｎ−ｃｅｎｔｅｒｅｄ）相対値として表示した（図２ｂ）。Ｅｉｓｅｎが開発したクラスタプログラム（４５）（類似性の基準としてＰｅａｒｓｏｎの相関性を用いる平均結合法）を使用して、組織試料および遺伝子に階層的クラスタリングを適用した。図２および図３に示す結果はＴｒｅｅＶｉｅｗプログラム（４５）で表示したものである。
【００９４】
Ｅｘｃｅｌソフトウェア（マイクロソフト）を使用して以後の分析を行い、ＳＰＳＳソフトウェアを用いて統計分析を行った。分析から１回目の転移再発あるいは死まで、それぞれ無転移生存率と全生存率を診断結果から求めた。Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ法でこれを評価し、ログランク検定を行ってグループ同士を比較した。相関係数ｒを用いて、発現プロファイルに基づく遺伝子対の相関性を求めた。腫瘍パラメーターと相関する発現レベルの遺伝子を、連続したいくつかのステップで探索した。
【００９５】
最初に、興味の対象となるパラメーターが一致しない腫瘍で構成される２つのサブグループで遺伝子発現レベルの中央値を比較することにより、遺伝子を検出した。平均値ではなく中央値を用いたのは、発現レベルは多くの遺伝子で極めて変わりやすく、発現レベルの標準偏差が平均値に近くなるか平均値よりも優れたものとなってしまい、平均との比較が不可能になるためである。次に、これらの検出された遺伝子をグラフィックスで可視検査し、最後に、相関性を有効にすることが確認されているものに適当な統計解析を適用した。Ｍａｎｎ−Ｗｉｔｎｅｙ検定を使用して、ＥＲ陽性腫瘍とＥＲ陰性腫瘍とのＧＡＴＡ３発現の比較を有効にした。相関係数を使用し、遺伝子発現レベルを腋窩節の数と比較した。
【００９６】
ノーザンブロット分析
アレイ上で試験した３４例のうち２２例を含む、７９の乳腫のＧＡＴＡ３発現をノーザンブロットハイブリダイゼーションで分析した。腫瘍試料からのＲＮＡ抽出とノーザンブロットとを、過去に説明されているようにして実施した（４３）。ＧＡＴＡ３ ｃＤＮＡ配列（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｘ５５１２２）の３’領域（＋８４３から＋１６８９）に対応するＧＡＴＡ３プローブを、ＩＭＡＧＥ ｃＤＮＡクローン１２９７５７から作製した。このクローンをＥｃｏＲＩ酵素およびＰａｃＩ酵素で消化することにより、インサート（８４６ｂｐ）を得た。ノーザンブロットを取り除き、ａ−アクチンプローブを用いて再ハイブリダイズさせた（４６）。
【００９７】
図１は、正常な乳房組織（ＮＢ）と乳腫試料との差次的遺伝子発現の一例を示す。ナイロンフィルター上の各ｃＤＮＡアレイを５μｇの全ＲＮＡで作製した複合体プローブとハイブリダイズさせた。一番上の画像は膜全体に相当する。下の２つの画像については、膜の右側部分だけを示してある。スポットの下にある数字は、ハウスキーピング遺伝子（１がＧＡＰＤＨで２はアクチン）、負の対照クローン（３、４、５）、ＮＢと乳腫との間で差次的に発現された遺伝子の例（６はストロメライシン３、７は、ＥＲＢＢ２、８はＭＹＢＬ２、９はＦＯＳ、１０はＴＧＦａＲ３、１１はデスミン）、ＥＲ−乳腫とＥＲ＋乳腫との間で差次的に発現された遺伝子の例（１２、ＧＡＴＡ３）を示す。
【００９８】
図２は、乳癌腫の３４の試料と正常な乳房組織（ＮＢ）に含まれる１７６の遺伝子の発現レベルを表したものである。各行が単一の組織に相当し、各列が単一の遺伝子に相当する。（ａ）結果を試料内の個々のｍＲＮＡの存在率で表現し、これを青のカラースケールで表す。左下に示すカラースケール（３倍の間隔の対数スケール）は、水色（発現レベル□０．００１％）から紺色（発現レベル＞３％）までの範囲である。白い正方形は、発現レベルが検出できないクローンを示し、灰色の正方形は欠損値を示す。組織試料を任意に並べ、発現レベルの中央値の増加に伴って上から下までクローンを並べる。図面右側の水平の黒い矢印は、腫瘍（上から下にストロメライシン３、ＩＧＦ２、ＧＡＴＡ３）ごとに発現レベルが大きく異なる３つのクローンをマークしたものである。（ｂ）結果を（各行および各列の中央値に対する）相対的な発現レベルとして示し、これを１／１００から１００倍までの範囲で（灰色の正方形：欠損値）左下に示すカラースケールで表してある。３４の腫瘍のうち、発現レベルの中央値が０に等しい１８のクローンについては省略する。クラスタリングプログラムを使用して、最も類似した発現プロファイルを持つもの同士が互いに隣接して配置されるように試料（ｎ＝３５）を水平軸に沿って整列させる。同様に、すべての組織でクローンの発現プロファイルに強い相関性が認められる場合、これらのクローン（ｎ＝１６２）は垂直軸に沿って互いに近い位置にくる。試料（上）とクローン（左）とをそれぞれ捕捉する樹状図の枝の長さには、関連する要素の類似性が反映されている。２つのグループの腫瘍を分離し、グループＡ（青）とグループＢ（オレンジ）にカラーコードした。図面右側の水平の黒い矢印と水平の赤い矢印はそれぞれ、腫瘍（上から下にＩＧＦ２、ＧＡＴＡ３、ストロメライシン３）ごとに発現レベルが大きく異なる３つの遺伝子と、４つの遺伝子を表す４対の異なるクローンとをマークしたものである。（ｃ）右側の２つのｏｕｔｌｙｅｒ腫瘍を除き、図２ｂからのグループＡをズーム表示したものである。クラスタリングによって、腫瘍の２つのサブグループＡ１およびＡ２を分ける。点の付いた枝は転移の再発と死に関連した腫瘍に相当する。Ａ１よりもＡ２の方が追跡期間を長くした（Ａ１の４７に対して中央値８１ヶ月）。
【００９９】
図３は遺伝子発現プロファイリングによって乳癌の予後を分類したものであり、遺伝子発現ベースの腫瘍の分類が臨床転帰と相関していることを示している。Ａ１とＡ２のサブグループ間で上位３２の差次的に発現された遺伝子を用いて、グループＡにおける１２の試料（図２ｂおよび図２ｃ参照）を再クラスタリングした。データを図２ｂと同様に表示し、同じカラーキーで示した。３２のうち、発現レベルが（１２のうち）少なくとも２つの試料で少なくとも２倍に変化した２３のクローンから得た発現データに階層的クラスタリングを適用した。腫瘍Ａ１およびＡ２の２つのサブグループと、差次的に発現されたクローンの２つのグループとを示す。腫瘍クラスタＡ１の点の付いた枝は転移の再発および死に関連した試料に相当する。図３ａは、図２ａおよび図２ｂに示す階層的クラスタリングの結果を二次元で表したものである。分析によって、腫瘍Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄの４つのグループを描写する。黒い正方形は最終追跡時に生存している患者を示し、赤い正方形は亡くなった患者を示す。遺伝子発現プロファイルに従って、統計的に臨床転帰の異なる患者を、クラスＡ（ｎ＝１６）、クラスＢ＋Ｃ（ｎ＝３４）、クラスＤ（ｎ＝５）の３つのクラスに定義した。図３ｂは、３つのクラスの患者（ｐ＜０．００５、ログランク検定）全体の生存率をＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒプロットしたものである。また、図３ｃは、３つのクラスの患者（ｐ＜０．０５、ログランク検定）における無転移生存率をＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒプロットしたものである。
【０１００】
図４は、ＧＡＴＡ３発現とＥＲ表現型との相関を示す。（ａ）ｃＤＮＡアレイ解析によってモニタリングした３４の乳癌試料におけるＧＡＴＡ３の発現レベル（ｙ軸）を、試料中のｍＲＮＡ（対数スケール）に対する個々のｍＲＮＡの存在率で示す。Ｍａｎｎ−Ｗｉｔｎｅｙ検定を用いて（ｐ＝０．０００４）、ＥＲ陰性腫瘍（ｎ＝１１）対ＥＲ陽性腫瘍（ｎ＝２３）でＧＡＴＡ３を有意に高発現させる。正常な乳房組織におけるＧＡＴＡ３の発現レベルを右側（ＮＢ）に示す。（ｂ）正常な乳房試料（ＮＢ）と９例の乳癌試料（ＡＴ：ｃＤＮＡアレイおよびノーザンブロットで分析した腫瘍、ＮＴ：ノーザンブロットで分析した腫瘍）におけるＧＡＴＡ３のノーザンブロット分析。ＧＡＴＡ３（一番上）およびａ−アクチン（一番下）からのｃＤＮＡを用いてブロットを連続的に調査した。各腫瘍試料についてＥＲの状態を示す。
【０１０１】
データ表現
図１は、正常な乳房組織と乳腫から抽出されたＲＮＡから作製したプローブでｃＤＮＡアレイをハイブリダイゼーションする一例を示す。
【０１０２】
概略図で絶対的な値または相対的な値のいずれかで示すべく、すべてのハイブリダイゼーションの生の結果を処理した。正規化法を用いることで、図２ａに示されるようにプローブ中のｍＲＮＡの存在率で絶対値を表すことができる。青いカラーラダーの各レベルは、ｍＲＮＡの絶対存在量の３倍の間隔を表している。各列は組織試料に相当し、各行は遺伝子に相当する。グラフィックの目的で、発現レベルの中央値の増加に伴って上から下まで遺伝子を並べた。腫瘍試料については並べなかった。各試料の値は、ｍＲＮＡ存在量約０．００２％から５％の範囲にわたる発現レベルに対応する広範囲の強度（対数スケールで３０年間）を示していた。多くの遺伝子（たとえばストロメライシン３、ＩＧＦ２、ＧＡＴＡ３など、矢印参照）で、すべての腫瘍試料にわたって値のダイナミックレンジ全体に散在して発現レベルが極めて大きく変化していた。相対値を図２ｂに示す。すべての組織にわたって中央値の強度が０に等しい１８のクローンを省略し、絶対値を対数変換した。その後、各試料のデータならびに、残りの１６２のクローン各々についてのデータを中央値に集め、絶対強度ではなく相対的な変化が示されるようにした。中央値よりも高い発現レベルには赤、中央値よりも低い発現レベルには緑のカラースケールを用いてデータを表示した。中央値からの偏差の大きさを色強度で表した。その後、階層的クラスタリングプログラムを適用し、遺伝子発現プロファイル全体に従って３５の試料をグループ化するとともに、すべての組織での発現レベルの類似性に基いて１６２のクローンをグループ化した。このようにすることで、相関する組織のグループと相関する遺伝子のグループを樹状図で示すように強調して示す図が得られた。
【０１０３】
乳腫の分類
図２ｂにおいて示すように、クラスタリングアルゴリズムで２つのグループの試料を識別し、これをＡ（正常な乳房を含む、ｎ＝１５、ＮＢ）とＢ（ｎ＝２０）とした。これらのグループは、患者の年齢、診断時の閉経状態、ＳＢＲグレード、腫瘍の病理学的サイズに関して類似のものとした。しかしながら、グループＡの腫瘍のうち７２％は節陽性であり、グループＢの７５％が節陰性であった。さらに、グループＢの腫瘍のうち８０％はエストロゲンレセプター（ＥＲ）陽性であり、グループＡの５０％はＥＲ陰性であった。診断後に中央値４４ヶ月で追跡を行ったところ、全体の生存率はグループＡとグループＢとで異なっていた。すなわち、Ａでは５名の女性が亡くなり（追跡期間の中央値５８ヶ月）、Ｂでは１名の女性が亡くなった（追跡期間の中央値４０ヶ月）。しかしながら、Ａでは５名、Ｂでは６名の女性に再発が認められ、２つのグループにおける転移再発の頻度は比較的近かった。Ｂでは転移の診断から最終追跡までの時間が短すぎるため、さらに長い期間をかけて追跡を行い、発現プロファイルで定義した２つの異なるグループで全体の生存率が実際に異なっているのか否かを判断しなければならない。
【０１０４】
１５の試料で構成されるグループＡでは、３つの試料（正常な乳房と２つの腫瘍）が互いに異なり、他の１２の試料とも異なっていた。後者は、腫瘍の２つのサブグループＡ１（ｎ＝６）とＡ２（ｎ＝６）とを構成していたが、これを図２ｃに示すようにクラスタリングによってさらに分けることも可能であった。表１から明らかなように、１２の腫瘍では従来の予後の特徴による転移再発の危険性が一律に高かった。このうちの大半については、Ａ１のサブグループの方が多くの女性を治療する形で、外科手術後に似たようなアントラサイクリンベースの補助化学療法を施した。興味深いことに、これらの２つのサブグループ（一般に用いられている組織臨床的な特徴では識別することができない）では、臨床転帰が極めて異なっていた。Ａ１で転移再発が４例、死亡が４（追跡期間の中央値４４ヶ月）。これとは対照的に、かつ追跡期間の中央値がさらに長い（９０ヶ月）のにもかかわらず、Ａ２では転移や死亡例は発生しなかった。このため、グループＡ１の腫瘍よりもグループＡ２の方が無転移生存率（ｐ□０．０１）と全生存率（ｐ□０．００５）が有意に高くなった。Ｂではこのようなサブグループ化を行うことはできなかった。
【０１０５】
【表１】
【０１０６】
サブグループＡ１およびＡ２の患者の特徴。図３に示すクラスタリング図の位置に基づいて左から右に１２の腫瘍に１から１２まで番号を振ってある。補助化学療法はアントラサイクリンベースとした。患者の状態に関する行で、Ａは生存を示し、Ｄは癌が進行して死亡したことを意味する。
【０１０７】
グループＡの部分構造の原因である遺伝子を探索した。これらの遺伝子は、予後や上記腫瘍の化学療法に対する感受性と関連している可能性がある。その発現レベルの中央値をＡ１とＡ２とで比較することにより、１８８のうち３２の遺伝子を識別した。続いて、図３に示すように、これらの遺伝子の発現プロファイルを使用して１２の腫瘍を再クラスタリングした。同じサブグループＡ１およびＡ２は明らかであり、これを２グループの遺伝子で分けた。予想通り、ＥＲＢＢ２、ＭＹＣおよびＥＧＦＲの発現量が多いのは予後の悪いサブグループＡ１（６〜８）と関連し、Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎおよびプロトオンコジーンＭＹＢの発現量が多いのは予後のよいサブグループＡ２（９、１０）と関連していた。他の大半の遺伝子については、これらの結果が新たな調査のきっかけとなるかもしれない。乳癌の予後を良くする要因のひとつに分化状態があるため、転帰が良好なグループでＧＡＴＡ３（１１）やＣＲＡＢＰ２（１２）などの細胞の分化に関連した遺伝子の発現レベルが高かった。予後の悪いサブグループではエフリンＡ１ ｍＲＮＡの発現量が多いことから、この成長因子が乳癌で何らかの役割を果たしているのではないかと思われ、こうした発現量の多い状態が黒色腫の進行時における上方制御と平行している可能性がある（１３）。
【０１０８】
正常な乳房と乳腫との間の差次的遺伝子発現
乳腫（Ｔ）と正常な乳房（ＮＢ）との間で差次的に発現される遺伝子を同定するために、各遺伝子のＮＢ値と各腫瘍におけるその発現レベルとを比較した。ＮＢの遺伝子の発現レベルを検出できなかったときは、腫瘍のシグナル強度が再現性の閾値（ｍＲＮＡ存在量の０．００２％）を上回った場合に、質的な情報だけを推定してｍＲＮＡを差次的に発現されたとみなすことが可能であった。その他の事例では、少なくとも２倍の発現差があれば差次的な発現と定義した。さらに、高発現または低発現された場所での腫瘍数を測定した。高発現された遺伝子および低発現された遺伝子の上位２０ずつの一覧を表２に示す。これらの遺伝子については、Ｔ／ＮＢ比を示す。ここで、Ｔは３４の腫瘍における発現値の中央値である。この比は高発現された遺伝子では、２．７０（ＡＢＣＣ５）から１７．７６（ＧＡＴＡ３）までの範囲、低発現された遺伝子では０．００（デスミン）から０．２９（ＡＰＣ）までの範囲であった。
【０１０９】
【表２】
【０１１０】
ｃＤＮＡアレイ解析によって測定した場合の３４の乳癌腫と正常な乳房組織との間の最高頻度の差次的発現を示す遺伝子のリスト。Ｎは、正常な乳房組織に対して遺伝子が無調節状態となった場合（２倍よりも増えた）の腫瘍試料数を示す。Ｔ／ＮＢは３４の乳腫での発現レベル／正常な乳房での発現レベルの中央値の比を表わす。（ａ）ＭＹＢＬ２転写物の発現レベルの中央値が乳腫で０．０２５％となり、ＮＢでは検出できなかった。
【０１１１】
ムチン１、ＮＭ２３、ＥＲＢＢ２、ＦＧＦＲ１およびＦＧＦＲ２、ＭＹＣ、ストロメライシン３、カテプシンＤの発現量の多さならびに、ＦＯＳ、ＡＰＣ、ＲＢＬ２、ＦＡＳ、ＢＣＬ２の下方制御が、それぞれの癌におけるバイオロジーについて分かっていることを反映する形で認められた。ジンクフィンガー転写因子のＧＡＴＡファミリのメンバをコードするＧＡＴＡ３と、２つの細胞レチノイン酸結合タンパク質のうち一方をコードしているＣＲＡＢＰ２とに、ｍＲＮＡの発現量の多さが認められ、ｃＤＮＡアレイで過去に得られている結果の範囲がさらに拡張された（４）。
【０１１２】
さまざまな乳腫での差次的遺伝子発現ならびに組織臨床的な予後パラメータとの相関
乳癌における潜在的な予後マーカーを探索するために、発現レベルが従来の組織臨床的な予後パラメーターすなわち、患者の年齢、腋窩節の状態、腫瘍のサイズ、組織学的グレードおよびＥＲの状態と相関した遺伝子を探した。年齢、腫瘍のサイズ、組織学的グレードとの有意な相関は認められなかった。しかしながら、発現プロファイルがＥＲの状態と腋窩節の関与とに相関する遺伝子もあった。
【０１１３】
ホルモン応答性表現型と関連している可能性のある遺伝子を同定するために、ＥＲ陽性乳癌（ｎ＝２３）の遺伝子発現プロファイルとＥＲ陰性乳癌（ｎ＝１１）の遺伝子発現プロファイルとを比較した。１６のクローンがどちらのグループでも強度の中央値が０になった。２５のクローンは２倍よりも増えた。高発現された遺伝子と低発現された遺伝子の上位１０ずつを表３ａに示す。このうち、最も差次的に発現されたのがＥＲ＋／ＥＲ−強度比の中央値２８．６のＧＡＴＡ３であり、図４ａに示すようにＥＲ陽性腫瘍の第１の四分位数の値がＥＲ陰性腫瘍の第３の四分位数の値を上回って（５倍）いた。Ｍａｎｎ−Ｗｉｔｎｅｙ検定（ｐ□０．００１）を使用すると、ＥＲ陽性腫瘍のＧＡＴＡ３の発現率の高さは統計的に有意であった。ＥＲ陽性腫瘍すべてとＥＲ陰性腫瘍の１８％のみで、ＧＡＴＡ３発現レベルが正常な乳房の値よりも極めて高く（３倍を超える）なった。さらに、ｃＤＮＡアレイで分析した腫瘍のうち２２の腫瘍を含む７９の乳癌（ＥＲ陰性腫瘍２１、ＥＲ陽性腫瘍５８）のパネルで、ノーザンブロットハイブリダイゼーション（図４ｂ）によってＧＡＴＡ３発現を分析した。これによって、上記２２の腫瘍についてのアレイ結果ならびにＥＲの状態とＧＡＴＡ３ ＲＮＡの発現（Ｍａｎｎ−Ｗｉｔｎｅｙ検定、ｐ≦０．０００１）との間の強い相関性が確認された。
【０１１４】
【表３Ａ】
【０１１５】
乳癌における予後を大きく左右する要因である腋窩リンパ節の状態と発現プロファイルが関連した遺伝子を探索するために、節陰性腫瘍（ｎ＝１９）のグループを腋窩が広範囲にわたって伸展（陽性の節１０またはそれ以上）した腫瘍のグループと比較した。さらに、腫瘍が関与するリンパ節の数が増加するにつれて生存率が低下し、かつ、発現の測定は定量的なものであったため、これらの遺伝子の発現レベルと腫瘍が関与する節との相関（定量的変数）を求めた。これらの２つのグループ間での高発現された遺伝子と低発現された遺伝子の上位１０ずつを表３ｂに示す。これらの遺伝子の大半は今までに節の状態に関連しているとされたことはないが、こうした結果の中には既存文献に見られるデータと一致するものもある。チロシンキナーゼレセプターＥＲＢＢ２をコードする遺伝子が節陽性腫瘍で最も有意に高発現された遺伝子であり、相関係数も最も大きかった（ｒ＝０．６８、ｐ≦０．０００１）。
【０１１６】
【表３Ｂ】
【０１１７】
遺伝子クラスター
図２ｂからの遺伝子クラスタリングは、複数の試料にわたって発現が相関した遺伝子のグループを示した。異なるクローンが同じ遺伝子を表す場合、これを互いに隣同士のクラスターに分けた（赤い矢印）。３４の腫瘍における遺伝子対間の相関係数は大きいことが多かった（１３，０４１の遺伝子対の１％で相関係数が０．９５よりも大きかった−図示せず）。極めて相関性の高い遺伝子発現の一例にＢＣＬ２とＲＢＬ２の遺伝子発現がある。このような相関性のある発現は、文献にこそ記載されていないが、これらの２つの遺伝子に共通の調節機序を反映しているであろうと思われる。さらに、これらの遺伝子は、ＰＰＰ２ＣＡ、ＡＫＴ２、ＰＲＫＣＳＨまたはＴＮＦＲＳＦ６／ＦＡＳなどの他の遺伝子との有意な相関性のある発現も認められた。特に、ＢＣＬ２とＦＡＳとの間に顕著な相関性のある発現を観察することが可能であった（ｒ＝０．９１、データ示さず）。この相関性の正確な意味は不明であるが、それは細胞が生存するために必要なアポトーシスと反アポトーシスとのバランスを反映している可能性がある。
【０１１８】
ヒトの癌では、ＲＮＡのレベルにどの程度の割合で変化が反映されるのかは分かっていないが、遺伝子発現パターンをモニタリングすることがこの疾患についての知識を増やすための非常に有望な方法であるように思われる。次にあげる異なるタイプの癌について、ｃＤＮＡアレイを使用した調査が行われている。子宮頚癌（１４）、肝臓癌（１５）、卵巣癌（１６）、大腸癌（１７）、腎臓癌（１８）、神経膠芽腫（１９）、黒色腫（２０）（２１）、横紋筋肉腫（２２）、急性白血病（２３）、リンパ腫（２４）。乳癌では、先駆的な研究から最初の発現パターン（４、２５−３１）が得られた。これらの研究は、特にホルモン応答性乳腫とホルモン非応答性乳腫との分子的な差という重要な問題を取り上げていた。このため、Ｙａｎｇら（２８）ならびにＨｏｃｈら（２５）は、これらの２つのカテゴリーを表すことが分かっていた乳癌腫細胞系の発現プロファイルを比較し、差次的発現が認められる若干の遺伝子を同定した。これらの遺伝子のうちの１つがＧＡＴＡ３であった。これらの研究では主に細胞系が使用され、腫瘍試料はほとんど試験対象とならず、一般に少数であった。一連の大きな乳癌の発現プロファイルを分析する最初の研究が最近になって公表された（３２）が、臨床転帰との相関性には何ら言及されていなかった。
【０１１９】
この実験に基づいていくつかの面白いポイントを得ることが可能である。まず、腫瘍ごとの発現パターンの違いが、乳癌の組織臨床的な不均一を示す分子転写の証拠となった。この多様性は、これに関連して高スループットの分析に対する関心を強調する多種多様な遺伝子と結びつけられた、多元的なものであった。発現プロファイルを統合する階層的クラスタリングプログラムを使用すれば、ほとんどの腫瘍から正常な乳房組織を分離し、かつ、２種類の異なるグループの腫瘍を識別することが可能であった。最も重要なことに、昔からの予後因子では予言することができなかった極めて異なる臨床転帰を伴う腫瘍の２つの異なるサブグループがクラスタリングによって識別されたのである。確かに、これらの腫瘍はいずれも、既存の組織臨床ツールで評価すれば理論上予後の悪いものであった。今のところ、こうした患者についてはいずれも補助化学療法で治療できるであろうが、この処置が有効である患者とそうでない患者とを識別できる医師がいないのである。
【０１２０】
遺伝子発現プロファイルを用いることで、この区別をすることが可能であった。このような予言的なツールは治療上重要な意味を持つ。悪い予後の特徴を持つ患者は、時間のロスと第一線の化学療法に関連した毒性を避け、標準的な化学療法ではなく他の処置を適用する候補となる。これらの結果から、現時点ではアントラサイクリンベースの補助化学療法で治療されている予後の悪い乳癌の組織臨床的なカテゴリーによって、異なる化学療法措置が必要になるであろう転帰の異なる腫瘍の少なくとも分子的に別個の２つのサブグループが一緒にグループ化されるのではないかと考えられる。このため、発現プロファイルから、予後の悪い乳腫を分類し、患者を管理する新しく一層正確な方法が得られることになろう。
【０１２１】
同様に、分子の不均一性にもかかわらず、遺伝子（ＧＡＴＡ３、ＥＲＢＢ２）の発現レベルと組織学的な腫瘍パラメーターとの間に有意な相関性が認められた。乳癌でＥＲが陽性になることが、腫瘍の分化、低増殖率、良好な予後、ホルモン療法に対する応答性と相関していた。乳癌のホルモン感受性とＥＲの状態との関係は完全ではなく、ホルモン感受性の表現型を特徴付ける上でＥＲよりもＥＲの発現に関連したいくつかの遺伝子の方が重要なことはあり得る。これらの遺伝子は治療を助ける予言的な因子として役立つであろう。
【０１２２】
ＧＡＴＡ３ ｍＲＮＡの発現はＥＲの状態と大きく相関していた。ＧＡＴＡ３はエストロゲン制御されず（２５）、ＥＲ陽性の表現型に関与する遺伝子の発現を制御できる転写因子のひとつである。本発明につながる実験の過程でＥＲの状態に関係していることが明らかになった他の遺伝子のうち、ＭＹＢ（１０）、ストロメライシン３（３３）、ＣＲＡＢＰ２（３４）などのいくつかの遺伝子はＥＲ陽性乳腫において高レベルで発現されることがすでに報告されている。最近の研究（２７）と一致はするが、研究対象となったＥＲ陽性腫瘍でＴＰ５３ ｍＲＮＡのレベルがさらに高かったのは驚くべきことであった。ＴＰ５３の発現に関する研究の大半がｍＲＮＡレベルではなくタンパク質レベルを分析しており、ＴＰ５３タンパク質のレベルは昔からＥＲの状態とはあまり結びついていなかった（３５）。ＣＲＡＢＰ２の発現量が多いことは、ＥＲ陽性腫瘍のさらに分化した状態と関係している可能性がある。ＩＬ２ＲＢ、ＩＬ２ＲＧ、ＣＤ３Ｇという３種類の免疫関連遺伝子の発現量が少ないのは、これらの十分に分化した腫瘍でリンパ球の浸潤が少ないことと関連している可能性がある。乳癌でＥＲＢＢ２の発現量が多いのは、予後の悪さと関連しており、さらにはホルモン療法や化学療法に対する特定の耐性と関連していた（３６）。これは、細胞の分化、接着および運動性の調節に関与している。ＥＲＢＢ２の運動性亢進活性（３７）は、転移の確率を高め、ＥＲＢＢ２を高発現する乳腫の予後を好ましくないものとする原因になり得る。節陽性腫瘍でＥ−カドヘリンとトロンボスポンジン１の発現量が少ないのは、転移が広がるときの各ステップにおけるそれらの推定上の役割と一致している。すなわち、Ｅ−カドヘリンはその攪乱が癌腫で侵襲性細胞が放出される際の条件になる上皮細胞接着分子（３８）であり、トロンボスポンジン１は血管形成を阻害する（３９）。同様に、節陽性腫瘍で分子表面抗原ムチン１の発現量が多い（４０）ため、細胞間の相互作用が小さくなり、細胞の分離と転移が促進される可能性がある。節陽性腫瘍ならびにＧＳＴＰ１（グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼπ）で細胞接着およびリンパ節ホーミングに関与する膜貫通糖タンパク質をコードするＣＤ４４（４１）が高いレベルで発現され、腫瘍サイズの増大と関連していることが最近になって報告された（２７）。
【０１２３】
次に、発現パターンが大きく相関した多くの遺伝子があった。基本的には動的な実験条件下で（４２）、最近では定常状態（１７）でも、さらに大きな一連の遺伝子との遺伝子相関がすでに報告されている。ここで、相関性は、比較的小さいが選択された一連の遺伝子の発現プロファイルに基づくものであり、定常状態では異なる乳腫によって表された。遺伝子の相関性は、ｉ）癌細胞の一般的な調節回路に関する情報を提供し、発現ネットワークを制御する調節要素を識別することができ、ｉｉ）たとえば遺伝子クラスターに含まれる大量の遺伝子の強度とそれぞれの中間強度とを入れ替えることで分析される系の複雑さを抑えられる可能性があるという２つの側面で、癌研究に役立つ可能性を秘めたツールである。
【０１２４】
最後に、これらの結果は、癌研究におけるｃＤＮＡアレイの大きな可能性を浮き彫りにするものである。遺伝子発現プロファイルを用いることで、乳癌の不均一性が確認され、最も重要なことに、通常の組織臨床的なパラメーターではまだ認識されていないが、補助化学療法後の臨床転帰の異なる、この疾患の２つのサブタイプを、一連の予後の悪い乳腫で識別できるようになった。さらに、本発明を用いることで、発現が昔からの予後の条件と相関した遺伝子を検出できるようになる。
【０１２５】
腫瘍由来の細胞、特に乳腫由来の細胞で低発現または高発現されたポリヌクレオチド配列の個体群に対応するポリヌクレオチドの配列番号：１から配列番号：４６８ならびにそれぞれの相補体のライブラリを表４に示す。
【０１２６】
【表４】
【０１２７】
特に健常な人と癌患者とを区別することに注意しつつ、高発現されたポリヌクレオチド配列および低発現されたポリヌクレオチド配列の上位５ずつに対応する２つの部分個体群を以下の表５Ａおよび表５Ｂに示す。
【０１２８】
【表５Ａ】
【０１２９】
【表５Ｂ】
【０１３０】
以下の表６は、ＥＲ＋の試料とＥＲ−の試料とを区別できるようにするホルモン感受性腫瘍を検出することに注目した、ポリヌクレオチド配列の部分個体群に関するものである。
【０１３１】
【表６】
【０１３２】
以下の表６Ａおよび表６Ｂは、ＥＲ＋の試料とＥＲ−の試料とを区別できるようにするホルモン感受性腫瘍を検出することに特に注目した、ポリヌクレオチド配列の２つの部分個体群に関するものである。
【０１３３】
【表６Ａ】
【０１３４】
【表６Ｂ】
【０１３５】
以下の表７は、リンパ節のある腫瘍とリンパ節のない腫瘍とを区別することに注目した、ポリヌクレオチド配列の部分個体群に関するものである。
【０１３６】
【表７】
【０１３７】
以下の表７Ａおよび表７Ｂは、リンパ節のある腫瘍とリンパ節のない腫瘍とを区別することに特に注目した、ポリヌクレオチド配列の２つの部分個体群に関するものである。
【０１３８】
【表７Ａ】
【０１３９】
【表７Ｂ】
【０１４０】
以下の表８、表８Ａおよび表８Ｂは、アントラサイクリン感受性の腫瘍とアントラサイクリン非感受性の腫瘍とを区別することに特に注目した、ポリヌクレオチド配列の部分個体群に関するものである。
【０１４１】
【表８】
【０１４２】
以下の表８Ａおよび表８Ｂは、アントラサイクリン感受性の腫瘍とアントラサイクリン非感受性の腫瘍とを区別することに特に注目した、ポリヌクレオチド配列の２つの部分個体群に関するものである。
【０１４３】
【表８Ａ】
【０１４４】
【表８Ｂ】
【０１４５】
以下の表９、表９Ａおよび表９Ｂは、予後の良い原発性乳ガンと予後の悪い原発性乳ガンとを分類することに特に注目した、ポリヌクレオチド配列の部分個体群に関するものである。
【０１４６】
【表９】
【０１４７】
【表９Ａ】
【０１４８】
【表９Ｂ】
【０１４９】
表９Ａに記載のあらかじめ定義されたポリヌクレオチド配列のそれぞれに含まれるものの中から選択される少なくとも１つのポリヌクレオチド配列を用いて検出される遺伝子の高発現と、表９Ｂに記載のあらかじめ定義されたポリヌクレオチド配列のそれぞれに含まれるものの中から選択される少なくとも１つのポリヌクレオチド配列を用いて検出される遺伝子の低発現とを組み合わせることで、良好な転帰が得られる。
【０１５０】
したがって、本発明による好ましいＤＮＡアレイは、表９Ａに記載のあらかじめ定義されたポリヌクレオチド配列のそれぞれに含まれるものの中から選択される少なくとも１つのポリヌクレオチド配列と、表９Ｂに記載のあらかじめ定義されたポリヌクレオチド配列のそれぞれに含まれるものの中から選択される少なくとも１つのポリヌクレオチド配列とを含む。
【０１５１】
このようなＤＮＡアレイは、リスクの高い（転帰の悪い）患者と予後の良好な（転帰の良い）患者とを区別する上で特に役立つものである。
【０１５２】
【表１０】
【図面の簡単な説明】
【０１５３】
【図１】正常な乳房組織（ＮＢ）と乳腫試料との間の差次的遺伝子発現の一例を示す図である。
【図２】正常な乳房組織（ＮＢ）と乳癌腫の３４の試料における１７６の遺伝子の発現レベルを示す図である。
【図３】遺伝子発現プロファイリングによる乳癌の予後の分類を示す図である。
【図４】ＧＡＴＡ３の発現とＥＲ表現型との相関を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリヌクレオチド配列またはこれらの部分配列のプールを含む、癌腫の分子キャラクタリゼーションに役立つポリヌクレオチドライブラリであって、前記配列または部分配列が腫瘍細胞にて低発現または高発現され、前記配列または部分配列が配列番号１〜４６８のいずれかに記載のポリヌクレオチド配列またはこれらの相補体のうちいずれかに実質的に対応するものであり、
前記ポリヌクレオチド配列または部分配列のプールが、ＳＥＴ １：（配列番号：１、配列番号：２）と、ＳＥＴ ４：（配列番号：７、配列番号：８）と、ＳＥＴ １８：（配列番号：３９、配列番号：４０、配列番号：４１）と、ＳＥＴ ２１：（配列番号：４６、配列番号：４７）と、ＳＥＴ ２４：（配列番号：５４、配列番号：５５、配列番号：５６）と、ＳＥＴ ３２：（配列番号：７６、配列番号：７７、配列番号：７８）と、ＳＥＴ ３８：（配列番号：９１、配列番号：９２、配列番号：９３）と、ＳＥＴ ４８：（配列番号：１１５、配列番号：１１６、配列番号：１１７）と、ＳＥＴ ５３：（配列番号：１２６、配列番号：１２７、配列番号：１２８）と、ＳＥＴ ５８：（配列番号：１３８、配列番号：１３９、配列番号：１４０）と、ＳＥＴ ５９：（配列番号：１４１、配列番号：１４２、配列番号：１４３）と、ＳＥＴ ６１：（配列番号：１４７、配列番号：１４８、配列番号：１４９）と、ＳＥＴ ６４：（配列番号：１５６、配列番号：１５７、配列番号：１５８）と、ＳＥＴ ６６：（配列番号：１６２、配列番号：１６３）と、ＳＥＴ ６９：（配列番号：１６８、配列番号：１６９、配列番号：１７０）と、ＳＥＴ ７３：（配列番号：１７８、配列番号：１７９）と、ＳＥＴ ８５：（配列番号：２０４、配列番号：２０５）と、ＳＥＴ ８８：（配列番号：２１０、配列番号：２１１）と、ＳＥＴ ９１：（配列番号：２１６、配列番号：２１７）と、ＳＥＴ ９７：（配列番号：２３０、配列番号：２３１、配列番号：２３２）と、ＳＥＴ １０４：（配列番号：２４８、配列番号：２４９）と、ＳＥＴ １０５：（配列番号：２５０、配列番号：２５１、配列番号：２５２）と、ＳＥＴ １１２：（配列番号：２６５、配列番号：２６６）と、ＳＥＴ １１３：（配列番号：２６７、配列番号：２６８）と、ＳＥＴ １１５と、（配列番号：２７１、配列番号：２７２）と、ＳＥＴ １３１：（配列番号：３０８、配列番号：３０９、配列番号：３１０）と、ＳＥＴ １３２：（配列番号：３１１、配列番号：３１２、配列番号：３１３）と、ＳＥＴ １３４：（配列番号：３１７、配列番号：３１８）と、ＳＥＴ １３７：（配列番号：３２４、配列番号：３２５）と、ＳＥＴ １４５：（配列番号：３４５、配列番号：３４６）と、ＳＥＴ １４７：（配列番号：３５０、配列番号：３５１）と、ＳＥＴ １５５：（配列番号：３６８、配列番号：３６９、配列番号：３００）と、ＳＥＴ １７５：（配列番号：４１７、配列番号：４１８、配列番号：４１９）と、ＳＥＴ １８０：（配列番号：４３０）と、ＳＥＴ １８１：（配列番号：４３１）と、ＳＥＴ １８２：（配列番号：４３２）と、ＳＥＴ １８５：（配列番号：４３７）と、ＳＥＴ １８７：（配列番号：４４０、配列番号：４４１とを含む、あらかじめ定義されたポリヌクレオチド配列の集合それぞれに含まれるものの中から選択される少なくとも１つのポリヌクレオチド配列のいずれかの組み合わせに実質的に対応するものであり、
前記配列が、正常な細胞と癌細胞とを区別する際に役立つものである、ポリヌクレオチドライブラリ。
【請求項２】
ポリヌクレオチド配列またはこれらの部分配列のプールを含む、癌腫の分子キャラクタリゼーションに役立つポリヌクレオチドライブラリであって、前記配列または部分配列が腫瘍細胞にて低発現または高発現され、前記配列または部分配列が配列番号１〜４６８のいずれかに記載のポリヌクレオチド配列またはこれらの相補体のうちいずれかに実質的に対応するものであり、
前記ポリヌクレオチド配列または部分配列のプールが、ＳＥＴ １１：（配列番号：２２、配列番号：２３、配列番号：２４）と、ＳＥＴ ２６：（配列番号：５９、配列番号：６０、配列番号：６１）と、ＳＥＴ ３２：（配列番号：７６、配列番号：７７、配列番号：７８）と、ＳＥＴ ３４：（配列番号：８２、配列番号：８３）と、ＳＥＴ ４０：（配列番号：９７、配列番号：９８、配列番号：９９）と、ＳＥＴ ５７：（配列番号：１３５、配列番号：１３６、配列番号：１３７）と、ＳＥＴ ６４：（配列番号：１５６、配列番号：１５７、配列番号：１５８）と、ＳＥＴ １０７：（配列番号：２５５、配列番号：２５６）と、ＳＥＴ １１９：（配列番号：２７９、配列番号：２８０、配列番号：２８１）と、ＳＥＴ １３６：（配列番号：３２２、配列番号：３２３）と、ＳＥＴ １４０：（配列番号：３３１、配列番号：３３２、配列番号：３３３）と、ＳＥＴ １４１：（配列番号：３３４、配列番号：３３５、配列番号：３３６）と、ＳＥＴ １４５：（配列番号：３４５、配列番号：３４６）と、ＳＥＴ １４８：（配列番号：３５２、配列番号：３５３）と、ＳＥＴ １４９：（配列番号：３５４、配列番号：３５５）と、ＳＥＴ １６２：（配列番号：３８５、配列番号：３８６、配列番号：３８７）と、ＳＥＴ １６５：（配列番号：３９４、配列番号：３９５）と、ＳＥＴ １６９：（配列番号：４０２、配列番号：４０３）と、ＳＥＴ １７４：（配列番号：４１４、配列番号：４１５、配列番号：４１６）と、ＳＥＴ １８８：（配列番号：４４２）とを含む、あらかじめ定義されたポリヌクレオチド配列の集合それぞれに含まれるものの中から選択される少なくとも１つのポリヌクレオチド配列のいずれかの組み合わせに実質的に対応するものであり、
前記配列が、ホルモン感受性腫瘍細胞を検出する際に役立つものである、ポリヌクレオチドライブラリ。
【請求項３】
ポリヌクレオチド配列またはこれらの部分配列のプールを含む、癌腫の分子キャラクタリゼーションに役立つポリヌクレオチドライブラリであって、前記配列または部分配列が腫瘍細胞にて低発現または高発現され、前記配列または部分配列が配列番号１〜４６８のいずれかに記載のポリヌクレオチド配列またはこれらの相補体のうちいずれかに実質的に対応するものであり、
前記ポリヌクレオチド配列または部分配列のプールが、ＳＥＴ ８：（配列番号：１６）と、ＳＥＴ １１：（配列番号：２２、配列番号：２３、配列番号：２４）と、ＳＥＴ １８：（配列番号：３９、配列番号：４０、配列番号：４１）と、ＳＥＴ ２５：（配列番号：５７、配列番号：５８）と、ＳＥＴ ３２：（配列番号：７６、配列番号：７７、配列番号：７８）と、ＳＥＴ ３４：（配列番号：８２、配列番号：８３）と、ＳＥＴ ４０：（配列番号：９７、配列番号：９８、配列番号：９９）と、ＳＥＴ ４９：（配列番号：１１８、配列番号：１１９）と、ＳＥＴ ５７：（配列番号：１３５、配列番号：１３６、配列番号：１３７）と、ＳＥＴ ９１：（配列番号：２１６、配列番号：２１７）と、ＳＥＴ １００：（配列番号：２３８、配列番号：２３９）と、ＳＥＴ １０５：（配列番号：２５０、配列番号：２５１、配列番号：２５２）と、ＳＥＴ １３６：（配列番号：３２２、配列番号：３２３）と、ＳＥＴ １３８：（配列番号：３２６、配列番号：３２７、配列番号：３２８）と、ＳＥＴ １３９：（配列番号：３２９、配列番号：３３０）と、ＳＥＴ １４１：（配列番号：３３４、配列番号：３３５、配列番号：３３６）と、ＳＥＴ １５８：（配列番号：３７４、配列番号：３７５、配列番号：３７６）と、ＳＥＴ １６９：（配列番号：４０２、配列番号：４０３）と、ＳＥＴ １８０：（配列番号：４３０）と、ＳＥＴ １８６：（配列番号：４３８、配列番号：４３９）とを含む、あらかじめ定義されたポリヌクレオチド配列の集合それぞれに含まれるものの中から選択される少なくとも１つのポリヌクレオチド配列のいずれかの組み合わせに実質的に対応するものであり、
前記配列が、リンパ節のある腫瘍とリンパ節のない腫瘍とを区別する際に役立つものである、ポリヌクレオチドライブラリ。
【請求項４】
ポリヌクレオチド配列またはこれらの部分配列のプールを含む、癌腫の分子キャラクタリゼーションに役立つポリヌクレオチドライブラリであって、前記配列または部分配列が腫瘍細胞にて低発現または高発現され、前記配列または部分配列が配列番号１〜４６８のいずれかに記載のポリヌクレオチド配列またはこれらの相補体のうちいずれかに実質的に対応するものであり、
前記ポリヌクレオチド配列または部分配列のプールが、ＳＥＴ １１：（配列番号：２２、配列番号：２３、配列番号：２４）と、ＳＥＴ ２２：（配列番号：４８、配列番号：４９、配列番号：５０）と、ＳＥＴ ２３：（配列番号：５１、配列番号：５２、配列番号：５３）と、ＳＥＴ ２６：（配列番号：５９、配列番号：６０、配列番号：６１）と、ＳＥＴ ２８：（配列番号：６５、配列番号：６６、配列番号：６７）と、ＳＥＴ ３１：（配列番号：７３、配列番号：７４、配列番号：７５）と、ＳＥＴ ３２：（配列番号：７６、配列番号：７７、配列番号：７８）と、ＳＥＴ ３４：（配列番号：８２、配列番号：８３）と、ＳＥＴ ４９：（配列番号：１１８、配列番号：１１９）と、ＳＥＴ ５７：（配列番号：１３５、配列番号：１３６、配列番号：１３７）と、ＳＥＴ ６４：（配列番号：１５６、配列番号：１５７、配列番号：１５８）と、ＳＥＴ ７３：（配列番号：１７８、配列番号：１７９）と、ＳＥＴ ７７：（配列番号：１８６）と、ＳＥＴ ８１：（配列番号：１９４、配列番号：１９５）と、ＳＥＴ ９５：（配列番号：２２６、配列番号：２２７）と、ＳＥＴ １３１：（配列番号：３０８、配列番号：３０９、配列番号：３１０）と、ＳＥＴ １３８：（配列番号：３２６、配列番号：３２７、配列番号：３２８）と、ＳＥＴ １４０：（配列番号：３３１、配列番号：３３２、配列番号：３３３）と、ＳＥＴ １４９：（配列番号：３５４、配列番号：３５５）と、ＳＥＴ １６２：（配列番号：３８５、配列番号：３８６、配列番号：３８７）と、ＳＥＴ １６４：（配列番号：３９１、配列番号：３９２、配列番号：３９３）と、ＳＥＴ １６５：（配列番号：３９４、配列番号：３９５）と、ＳＥＴ １８３：（配列番号：４３３、配列番号：４３４）とを含む、あらかじめ定義されたポリヌクレオチド配列の集合それぞれに含まれるものの中から選択される少なくとも１つのポリヌクレオチド配列のいずれかの組み合わせに実質的に対応するものであり、
前記配列が、アントラサイクリン感受性腫瘍とアントラサイクリン非感受性腫瘍とを区別する際に役立つものである、ポリヌクレオチドライブラリ。
【請求項５】
ポリヌクレオチド配列またはこれらの部分配列のプールを含む、癌腫の分子キャラクタリゼーションに役立つポリヌクレオチドライブラリであって、前記配列または部分配列が腫瘍細胞にて低発現または高発現され、前記配列または部分配列が配列番号１〜４６８のいずれかに記載のポリヌクレオチド配列またはこれらの相補体のうちいずれかに実質的に対応するものであり、
前記ポリヌクレオチド配列または部分配列のプールが、ＳＥＴ番号１４（配列番号：３０、配列番号：３１）と、ＳＥＴ番号２３（配列番号：５１、配列番号：５２、配列番号：５３）と、ＳＥＴ番号２５（配列番号：５７、配列番号：５８）と、ＳＥＴ番号２７（配列番号：６２、配列番号：６３、配列番号：６４）と、ＳＥＴ番号２８（配列番号：６５、配列番号：６６、配列番号：６７）と、ＳＥＴ番号３２（配列番号：７６、配列番号：７７、配列番号：７８）と、ＳＥＴ番号３９（配列番号：９４、配列番号：９５、配列番号：９６）と、ＳＥＴ番号４１（配列番号：１００、配列番号：１０１、配列番号：７８）と、ＳＥＴ番号４４（配列番号：１０６、配列番号：１０７、配列番号：１０８）と、ＳＥＴ番号４８（配列番号：１１５、配列番号：１１６、配列番号：１１７）と、ＳＥＴ番号５１（配列番号：１２２、配列番号：７８）と、ＳＥＴ番号６４（配列番号：１５６、配列番号：１５７、配列番号：１５８）と、ＳＥＴ番号８１（配列番号：１９４、配列番号：１９５）と、ＳＥＴ番号８３（配列番号：１９９、配列番号：２００）と、ＳＥＴ番号９１（配列番号：２１６、配列番号：２１７）と、ＳＥＴ番号９６（配列番号：２２８、配列番号：２２９）と、ＳＥＴ番号９９（配列番号：２３５、配列番号：２３６、配列番号：２３７）と、ＳＥＴ番号１０８（配列番号：２５７、配列番号：２５８）と、ＳＥＴ番号１１０（配列番号：２６２、配列番号：２００）と、ＳＥＴ番号１１６（配列番号：２７３、配列番号：２７４）と、ＳＥＴ番号１１７（配列番号：２７５、配列番号：２７６）と、ＳＥＴ番号１１８（配列番号：２７７、配列番号：２７８）と、ＳＥＴ番号１２０（配列番号：２８２、配列番号：２８３、配列番号：２７６）と、ＳＥＴ番号１２６（配列番号：２９６、配列番号：２９７と、）と、ＳＥＴ番号１４２（配列番号：３３７、配列番号：３３８、配列番号：１１７）と、ＳＥＴ番号１４４（配列番号：３４２、配列番号：３４３、配列番号：３４４）と、ＳＥＴ番号１４９（配列番号：３５４、配列番号：３５５）と、ＳＥＴ番号１５２（配列番号：３６１、配列番号：３１）と、ＳＥＴ番号１５３（配列番号：３６２、配列番号：３６３、配列番号：３６４）と、ＳＥＴ番号１５４（配列番号：３６５、配列番号：３６６、配列番号：３６７）と、ＳＥＴ番号１５７（配列番号：３７２、配列番号：３７３、配列番号：１０８）と、ＳＥＴ番号１５９（配列番号：３７７、配列番号：３７８、配列番号：３７９）と、ＳＥＴ番号１６２（配列番号：３８５、配列番号：３８６、配列番号：３８７）と、ＳＥＴ番号１６６（配列番号：３９６、配列番号：３９７、配列番号：３９８）と、ＳＥＴ番号１６７（配列番号：３９９、配列番号：４００、配列番号：１１７）と、ＳＥＴ番号１６８（配列番号：４０１）と、ＳＥＴ番号１７１（配列番号：４０６、配列番号：４０７、配列番号：４０８）と、ＳＥＴ番号１７２（配列番号：４０９、配列番号：４１０、配列番号：４１１）と、ＳＥＴ番号１７３（配列番号：４１２、配列番号：４１３）と、ＳＥＴ番号１７６（配列番号：４２０、配列番号：４２１、配列番号：４２２）と、ＳＥＴ番号１７７（配列番号：４２３、配列番号：４２４、配列番号：４２５）と、ＳＥＴ番号１７８（配列番号：４２６、配列番号：４２７、配列番号：４２８）と、ＳＥＴ番号１７９（配列番号：４２９、配列番号：４０８）と、ＳＥＴ番号１８４（配列番号：４３５、配列番号：４３６）と、ＳＥＴ番号１８５（配列番号：４３７）とを含む、あらかじめ定義されたポリヌクレオチド配列の集合それぞれに含まれるものの中から選択される少なくとも１つのポリヌクレオチド配列のいずれかの組み合わせに実質的に対応するものであり、
前記配列が、予後の良い原発性乳ガンと予後の悪い原発性乳ガンとを分類する際に役立つものである、ポリヌクレオチドライブラリ。
【請求項６】
請求項１ないし５のいずれか１項に記載の固定化ポリヌクレオチドライブラリを含むポリヌクレオチドアレイ。
【請求項７】
ａ）患者からポリヌクレオチド試料を得ることと、
ｂ）ステップ（ａ）で得られた前記ポリヌクレオチド試料と、請求項１ないし６に記載のポリヌクレオチドライブラリのポリヌクレオチド配列のいずれかの組み合わせまたは請求項１ないし６に記載のライブラリのポリヌクレオチド配列のうちいずれかにコードされる発現産物のいずれかの組み合わせを含む、固相支持体に固定化したプローブと、を反応させることと、
ｃ）ステップ（ｂ）の反応産物を検出することとを含む、癌と相関し、発現状態の異なるポリヌクレオチド配列を検出する方法。
【請求項８】
請求項７に記載の方法を含む、抗腫瘍薬をスクリーニングするための方法であって、スクリーニング対象となる抗腫瘍薬で処置した患者から前記ポリヌクレオチド試料を得る、方法。
【請求項１】
ポリヌクレオチド配列またはこれらの部分配列のプールを含む、癌腫の分子キャラクタリゼーションに役立つポリヌクレオチドライブラリであって、前記配列または部分配列が腫瘍細胞にて低発現または高発現され、前記配列または部分配列が配列番号１〜４６８のいずれかに記載のポリヌクレオチド配列またはこれらの相補体のうちいずれかに実質的に対応するものであり、
前記ポリヌクレオチド配列または部分配列のプールが、ＳＥＴ １：（配列番号：１、配列番号：２）と、ＳＥＴ ４：（配列番号：７、配列番号：８）と、ＳＥＴ １８：（配列番号：３９、配列番号：４０、配列番号：４１）と、ＳＥＴ ２１：（配列番号：４６、配列番号：４７）と、ＳＥＴ ２４：（配列番号：５４、配列番号：５５、配列番号：５６）と、ＳＥＴ ３２：（配列番号：７６、配列番号：７７、配列番号：７８）と、ＳＥＴ ３８：（配列番号：９１、配列番号：９２、配列番号：９３）と、ＳＥＴ ４８：（配列番号：１１５、配列番号：１１６、配列番号：１１７）と、ＳＥＴ ５３：（配列番号：１２６、配列番号：１２７、配列番号：１２８）と、ＳＥＴ ５８：（配列番号：１３８、配列番号：１３９、配列番号：１４０）と、ＳＥＴ ５９：（配列番号：１４１、配列番号：１４２、配列番号：１４３）と、ＳＥＴ ６１：（配列番号：１４７、配列番号：１４８、配列番号：１４９）と、ＳＥＴ ６４：（配列番号：１５６、配列番号：１５７、配列番号：１５８）と、ＳＥＴ ６６：（配列番号：１６２、配列番号：１６３）と、ＳＥＴ ６９：（配列番号：１６８、配列番号：１６９、配列番号：１７０）と、ＳＥＴ ７３：（配列番号：１７８、配列番号：１７９）と、ＳＥＴ ８５：（配列番号：２０４、配列番号：２０５）と、ＳＥＴ ８８：（配列番号：２１０、配列番号：２１１）と、ＳＥＴ ９１：（配列番号：２１６、配列番号：２１７）と、ＳＥＴ ９７：（配列番号：２３０、配列番号：２３１、配列番号：２３２）と、ＳＥＴ １０４：（配列番号：２４８、配列番号：２４９）と、ＳＥＴ １０５：（配列番号：２５０、配列番号：２５１、配列番号：２５２）と、ＳＥＴ １１２：（配列番号：２６５、配列番号：２６６）と、ＳＥＴ １１３：（配列番号：２６７、配列番号：２６８）と、ＳＥＴ １１５と、（配列番号：２７１、配列番号：２７２）と、ＳＥＴ １３１：（配列番号：３０８、配列番号：３０９、配列番号：３１０）と、ＳＥＴ １３２：（配列番号：３１１、配列番号：３１２、配列番号：３１３）と、ＳＥＴ １３４：（配列番号：３１７、配列番号：３１８）と、ＳＥＴ １３７：（配列番号：３２４、配列番号：３２５）と、ＳＥＴ １４５：（配列番号：３４５、配列番号：３４６）と、ＳＥＴ １４７：（配列番号：３５０、配列番号：３５１）と、ＳＥＴ １５５：（配列番号：３６８、配列番号：３６９、配列番号：３００）と、ＳＥＴ １７５：（配列番号：４１７、配列番号：４１８、配列番号：４１９）と、ＳＥＴ １８０：（配列番号：４３０）と、ＳＥＴ １８１：（配列番号：４３１）と、ＳＥＴ １８２：（配列番号：４３２）と、ＳＥＴ １８５：（配列番号：４３７）と、ＳＥＴ １８７：（配列番号：４４０、配列番号：４４１とを含む、あらかじめ定義されたポリヌクレオチド配列の集合それぞれに含まれるものの中から選択される少なくとも１つのポリヌクレオチド配列のいずれかの組み合わせに実質的に対応するものであり、
前記配列が、正常な細胞と癌細胞とを区別する際に役立つものである、ポリヌクレオチドライブラリ。
【請求項２】
ポリヌクレオチド配列またはこれらの部分配列のプールを含む、癌腫の分子キャラクタリゼーションに役立つポリヌクレオチドライブラリであって、前記配列または部分配列が腫瘍細胞にて低発現または高発現され、前記配列または部分配列が配列番号１〜４６８のいずれかに記載のポリヌクレオチド配列またはこれらの相補体のうちいずれかに実質的に対応するものであり、
前記ポリヌクレオチド配列または部分配列のプールが、ＳＥＴ １１：（配列番号：２２、配列番号：２３、配列番号：２４）と、ＳＥＴ ２６：（配列番号：５９、配列番号：６０、配列番号：６１）と、ＳＥＴ ３２：（配列番号：７６、配列番号：７７、配列番号：７８）と、ＳＥＴ ３４：（配列番号：８２、配列番号：８３）と、ＳＥＴ ４０：（配列番号：９７、配列番号：９８、配列番号：９９）と、ＳＥＴ ５７：（配列番号：１３５、配列番号：１３６、配列番号：１３７）と、ＳＥＴ ６４：（配列番号：１５６、配列番号：１５７、配列番号：１５８）と、ＳＥＴ １０７：（配列番号：２５５、配列番号：２５６）と、ＳＥＴ １１９：（配列番号：２７９、配列番号：２８０、配列番号：２８１）と、ＳＥＴ １３６：（配列番号：３２２、配列番号：３２３）と、ＳＥＴ １４０：（配列番号：３３１、配列番号：３３２、配列番号：３３３）と、ＳＥＴ １４１：（配列番号：３３４、配列番号：３３５、配列番号：３３６）と、ＳＥＴ １４５：（配列番号：３４５、配列番号：３４６）と、ＳＥＴ １４８：（配列番号：３５２、配列番号：３５３）と、ＳＥＴ １４９：（配列番号：３５４、配列番号：３５５）と、ＳＥＴ １６２：（配列番号：３８５、配列番号：３８６、配列番号：３８７）と、ＳＥＴ １６５：（配列番号：３９４、配列番号：３９５）と、ＳＥＴ １６９：（配列番号：４０２、配列番号：４０３）と、ＳＥＴ １７４：（配列番号：４１４、配列番号：４１５、配列番号：４１６）と、ＳＥＴ １８８：（配列番号：４４２）とを含む、あらかじめ定義されたポリヌクレオチド配列の集合それぞれに含まれるものの中から選択される少なくとも１つのポリヌクレオチド配列のいずれかの組み合わせに実質的に対応するものであり、
前記配列が、ホルモン感受性腫瘍細胞を検出する際に役立つものである、ポリヌクレオチドライブラリ。
【請求項３】
ポリヌクレオチド配列またはこれらの部分配列のプールを含む、癌腫の分子キャラクタリゼーションに役立つポリヌクレオチドライブラリであって、前記配列または部分配列が腫瘍細胞にて低発現または高発現され、前記配列または部分配列が配列番号１〜４６８のいずれかに記載のポリヌクレオチド配列またはこれらの相補体のうちいずれかに実質的に対応するものであり、
前記ポリヌクレオチド配列または部分配列のプールが、ＳＥＴ ８：（配列番号：１６）と、ＳＥＴ １１：（配列番号：２２、配列番号：２３、配列番号：２４）と、ＳＥＴ １８：（配列番号：３９、配列番号：４０、配列番号：４１）と、ＳＥＴ ２５：（配列番号：５７、配列番号：５８）と、ＳＥＴ ３２：（配列番号：７６、配列番号：７７、配列番号：７８）と、ＳＥＴ ３４：（配列番号：８２、配列番号：８３）と、ＳＥＴ ４０：（配列番号：９７、配列番号：９８、配列番号：９９）と、ＳＥＴ ４９：（配列番号：１１８、配列番号：１１９）と、ＳＥＴ ５７：（配列番号：１３５、配列番号：１３６、配列番号：１３７）と、ＳＥＴ ９１：（配列番号：２１６、配列番号：２１７）と、ＳＥＴ １００：（配列番号：２３８、配列番号：２３９）と、ＳＥＴ １０５：（配列番号：２５０、配列番号：２５１、配列番号：２５２）と、ＳＥＴ １３６：（配列番号：３２２、配列番号：３２３）と、ＳＥＴ １３８：（配列番号：３２６、配列番号：３２７、配列番号：３２８）と、ＳＥＴ １３９：（配列番号：３２９、配列番号：３３０）と、ＳＥＴ １４１：（配列番号：３３４、配列番号：３３５、配列番号：３３６）と、ＳＥＴ １５８：（配列番号：３７４、配列番号：３７５、配列番号：３７６）と、ＳＥＴ １６９：（配列番号：４０２、配列番号：４０３）と、ＳＥＴ １８０：（配列番号：４３０）と、ＳＥＴ １８６：（配列番号：４３８、配列番号：４３９）とを含む、あらかじめ定義されたポリヌクレオチド配列の集合それぞれに含まれるものの中から選択される少なくとも１つのポリヌクレオチド配列のいずれかの組み合わせに実質的に対応するものであり、
前記配列が、リンパ節のある腫瘍とリンパ節のない腫瘍とを区別する際に役立つものである、ポリヌクレオチドライブラリ。
【請求項４】
ポリヌクレオチド配列またはこれらの部分配列のプールを含む、癌腫の分子キャラクタリゼーションに役立つポリヌクレオチドライブラリであって、前記配列または部分配列が腫瘍細胞にて低発現または高発現され、前記配列または部分配列が配列番号１〜４６８のいずれかに記載のポリヌクレオチド配列またはこれらの相補体のうちいずれかに実質的に対応するものであり、
前記ポリヌクレオチド配列または部分配列のプールが、ＳＥＴ １１：（配列番号：２２、配列番号：２３、配列番号：２４）と、ＳＥＴ ２２：（配列番号：４８、配列番号：４９、配列番号：５０）と、ＳＥＴ ２３：（配列番号：５１、配列番号：５２、配列番号：５３）と、ＳＥＴ ２６：（配列番号：５９、配列番号：６０、配列番号：６１）と、ＳＥＴ ２８：（配列番号：６５、配列番号：６６、配列番号：６７）と、ＳＥＴ ３１：（配列番号：７３、配列番号：７４、配列番号：７５）と、ＳＥＴ ３２：（配列番号：７６、配列番号：７７、配列番号：７８）と、ＳＥＴ ３４：（配列番号：８２、配列番号：８３）と、ＳＥＴ ４９：（配列番号：１１８、配列番号：１１９）と、ＳＥＴ ５７：（配列番号：１３５、配列番号：１３６、配列番号：１３７）と、ＳＥＴ ６４：（配列番号：１５６、配列番号：１５７、配列番号：１５８）と、ＳＥＴ ７３：（配列番号：１７８、配列番号：１７９）と、ＳＥＴ ７７：（配列番号：１８６）と、ＳＥＴ ８１：（配列番号：１９４、配列番号：１９５）と、ＳＥＴ ９５：（配列番号：２２６、配列番号：２２７）と、ＳＥＴ １３１：（配列番号：３０８、配列番号：３０９、配列番号：３１０）と、ＳＥＴ １３８：（配列番号：３２６、配列番号：３２７、配列番号：３２８）と、ＳＥＴ １４０：（配列番号：３３１、配列番号：３３２、配列番号：３３３）と、ＳＥＴ １４９：（配列番号：３５４、配列番号：３５５）と、ＳＥＴ １６２：（配列番号：３８５、配列番号：３８６、配列番号：３８７）と、ＳＥＴ １６４：（配列番号：３９１、配列番号：３９２、配列番号：３９３）と、ＳＥＴ １６５：（配列番号：３９４、配列番号：３９５）と、ＳＥＴ １８３：（配列番号：４３３、配列番号：４３４）とを含む、あらかじめ定義されたポリヌクレオチド配列の集合それぞれに含まれるものの中から選択される少なくとも１つのポリヌクレオチド配列のいずれかの組み合わせに実質的に対応するものであり、
前記配列が、アントラサイクリン感受性腫瘍とアントラサイクリン非感受性腫瘍とを区別する際に役立つものである、ポリヌクレオチドライブラリ。
【請求項５】
ポリヌクレオチド配列またはこれらの部分配列のプールを含む、癌腫の分子キャラクタリゼーションに役立つポリヌクレオチドライブラリであって、前記配列または部分配列が腫瘍細胞にて低発現または高発現され、前記配列または部分配列が配列番号１〜４６８のいずれかに記載のポリヌクレオチド配列またはこれらの相補体のうちいずれかに実質的に対応するものであり、
前記ポリヌクレオチド配列または部分配列のプールが、ＳＥＴ番号１４（配列番号：３０、配列番号：３１）と、ＳＥＴ番号２３（配列番号：５１、配列番号：５２、配列番号：５３）と、ＳＥＴ番号２５（配列番号：５７、配列番号：５８）と、ＳＥＴ番号２７（配列番号：６２、配列番号：６３、配列番号：６４）と、ＳＥＴ番号２８（配列番号：６５、配列番号：６６、配列番号：６７）と、ＳＥＴ番号３２（配列番号：７６、配列番号：７７、配列番号：７８）と、ＳＥＴ番号３９（配列番号：９４、配列番号：９５、配列番号：９６）と、ＳＥＴ番号４１（配列番号：１００、配列番号：１０１、配列番号：７８）と、ＳＥＴ番号４４（配列番号：１０６、配列番号：１０７、配列番号：１０８）と、ＳＥＴ番号４８（配列番号：１１５、配列番号：１１６、配列番号：１１７）と、ＳＥＴ番号５１（配列番号：１２２、配列番号：７８）と、ＳＥＴ番号６４（配列番号：１５６、配列番号：１５７、配列番号：１５８）と、ＳＥＴ番号８１（配列番号：１９４、配列番号：１９５）と、ＳＥＴ番号８３（配列番号：１９９、配列番号：２００）と、ＳＥＴ番号９１（配列番号：２１６、配列番号：２１７）と、ＳＥＴ番号９６（配列番号：２２８、配列番号：２２９）と、ＳＥＴ番号９９（配列番号：２３５、配列番号：２３６、配列番号：２３７）と、ＳＥＴ番号１０８（配列番号：２５７、配列番号：２５８）と、ＳＥＴ番号１１０（配列番号：２６２、配列番号：２００）と、ＳＥＴ番号１１６（配列番号：２７３、配列番号：２７４）と、ＳＥＴ番号１１７（配列番号：２７５、配列番号：２７６）と、ＳＥＴ番号１１８（配列番号：２７７、配列番号：２７８）と、ＳＥＴ番号１２０（配列番号：２８２、配列番号：２８３、配列番号：２７６）と、ＳＥＴ番号１２６（配列番号：２９６、配列番号：２９７と、）と、ＳＥＴ番号１４２（配列番号：３３７、配列番号：３３８、配列番号：１１７）と、ＳＥＴ番号１４４（配列番号：３４２、配列番号：３４３、配列番号：３４４）と、ＳＥＴ番号１４９（配列番号：３５４、配列番号：３５５）と、ＳＥＴ番号１５２（配列番号：３６１、配列番号：３１）と、ＳＥＴ番号１５３（配列番号：３６２、配列番号：３６３、配列番号：３６４）と、ＳＥＴ番号１５４（配列番号：３６５、配列番号：３６６、配列番号：３６７）と、ＳＥＴ番号１５７（配列番号：３７２、配列番号：３７３、配列番号：１０８）と、ＳＥＴ番号１５９（配列番号：３７７、配列番号：３７８、配列番号：３７９）と、ＳＥＴ番号１６２（配列番号：３８５、配列番号：３８６、配列番号：３８７）と、ＳＥＴ番号１６６（配列番号：３９６、配列番号：３９７、配列番号：３９８）と、ＳＥＴ番号１６７（配列番号：３９９、配列番号：４００、配列番号：１１７）と、ＳＥＴ番号１６８（配列番号：４０１）と、ＳＥＴ番号１７１（配列番号：４０６、配列番号：４０７、配列番号：４０８）と、ＳＥＴ番号１７２（配列番号：４０９、配列番号：４１０、配列番号：４１１）と、ＳＥＴ番号１７３（配列番号：４１２、配列番号：４１３）と、ＳＥＴ番号１７６（配列番号：４２０、配列番号：４２１、配列番号：４２２）と、ＳＥＴ番号１７７（配列番号：４２３、配列番号：４２４、配列番号：４２５）と、ＳＥＴ番号１７８（配列番号：４２６、配列番号：４２７、配列番号：４２８）と、ＳＥＴ番号１７９（配列番号：４２９、配列番号：４０８）と、ＳＥＴ番号１８４（配列番号：４３５、配列番号：４３６）と、ＳＥＴ番号１８５（配列番号：４３７）とを含む、あらかじめ定義されたポリヌクレオチド配列の集合それぞれに含まれるものの中から選択される少なくとも１つのポリヌクレオチド配列のいずれかの組み合わせに実質的に対応するものであり、
前記配列が、予後の良い原発性乳ガンと予後の悪い原発性乳ガンとを分類する際に役立つものである、ポリヌクレオチドライブラリ。
【請求項６】
請求項１ないし５のいずれか１項に記載の固定化ポリヌクレオチドライブラリを含むポリヌクレオチドアレイ。
【請求項７】
ａ）患者からポリヌクレオチド試料を得ることと、
ｂ）ステップ（ａ）で得られた前記ポリヌクレオチド試料と、請求項１ないし６に記載のポリヌクレオチドライブラリのポリヌクレオチド配列のいずれかの組み合わせまたは請求項１ないし６に記載のライブラリのポリヌクレオチド配列のうちいずれかにコードされる発現産物のいずれかの組み合わせを含む、固相支持体に固定化したプローブと、を反応させることと、
ｃ）ステップ（ｂ）の反応産物を検出することとを含む、癌と相関し、発現状態の異なるポリヌクレオチド配列を検出する方法。
【請求項８】
請求項７に記載の方法を含む、抗腫瘍薬をスクリーニングするための方法であって、スクリーニング対象となる抗腫瘍薬で処置した患者から前記ポリヌクレオチド試料を得る、方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２００８−１７８４１１（Ｐ２００８−１７８４１１Ａ）
【公開日】平成２０年８月７日（２００８．８．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−１４７５２（Ｐ２００８−１４７５２）
【出願日】平成２０年１月２５日（２００８．１．２５）
【分割の表示】特願２００２−５４８１８４（Ｐ２００２−５４８１８４）の分割
【原出願日】平成１３年１２月７日（２００１．１２．７）
【出願人】（５０３１９６８４６）
【氏名又は名称原語表記】ＩＰＳＯＧＥＮ
【住所又は居所原語表記】２３２ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ Ｓａｉｎｔｅ−Ｍａｒｇｕｅｒｉｔｅ，Ｆ−１３２７３ Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ Ｃａｄｅｘ ０９，Ｆｒａｎｃｅ
【出願人】（５０２３４３４２５）
【氏名又は名称原語表記】ＩＮＳＥＲＭ
【住所又は居所原語表記】１０１，ｒｕｅ ｄｅ Ｔｏｌｂｉａｃ，Ｆ−７５６５４ Ｐａｒｉｓ Ｃｅｄｅｘ １３，Ｆｒａｎｃｅ
【出願人】（５０３１９６８５７）
【氏名又は名称原語表記】Ｉｎｓｔｉｔｕｔ Ｐａｏｌｉ Ｃａｌｍｅｔｔｅｓ
【住所又は居所原語表記】２３２ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ Ｓａｉｎｔｅ−Ｍａｒｇｕｅｒｉｔｅ，Ｆ−１３００９ Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ，Ｆｒａｎｃｅ
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年８月７日（２００８．８．７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１月２５日（２００８．１．２５）
【分割の表示】特願２００２−５４８１８４（Ｐ２００２−５４８１８４）の分割
【原出願日】平成１３年１２月７日（２００１．１２．７）
【出願人】（５０３１９６８４６）
【氏名又は名称原語表記】ＩＰＳＯＧＥＮ
【住所又は居所原語表記】２３２ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ Ｓａｉｎｔｅ−Ｍａｒｇｕｅｒｉｔｅ，Ｆ−１３２７３ Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ Ｃａｄｅｘ ０９，Ｆｒａｎｃｅ
【出願人】（５０２３４３４２５）
【氏名又は名称原語表記】ＩＮＳＥＲＭ
【住所又は居所原語表記】１０１，ｒｕｅ ｄｅ Ｔｏｌｂｉａｃ，Ｆ−７５６５４ Ｐａｒｉｓ Ｃｅｄｅｘ １３，Ｆｒａｎｃｅ
【出願人】（５０３１９６８５７）
【氏名又は名称原語表記】Ｉｎｓｔｉｔｕｔ Ｐａｏｌｉ Ｃａｌｍｅｔｔｅｓ
【住所又は居所原語表記】２３２ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ Ｓａｉｎｔｅ−Ｍａｒｇｕｅｒｉｔｅ，Ｆ−１３００９ Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ，Ｆｒａｎｃｅ
【Ｆターム（参考）】
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