健康状態のアッセイ
本発明は、ウイルスの存在の検出と健康状態を示すゲノム標的またはマーカーの存在の検出との組み合わせを用いて、対象の健康状態を判定するアッセイに関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般に、対象の健康状態を判定するためのアッセイとして、サンプル中のゲノムマーカーの検出と共にウイルスの存在を検出することに関する。本発明は、予後診断的価値を有する危険性評価試験として好適である。
【背景技術】
【０００２】
特定の核酸分子の検出のために、現在、多数の方法が利用できる。これらの方法は典型的に、標的核酸と、短いオリゴヌクレオチド（２０塩基以下）から多キロ塩基（ｋｂ）配列の範囲の長さであり得る核酸プローブとの間の配列依存ハイブリダイゼーションに依存する。
【０００３】
核酸配列の集団内から特定の配列を増幅するために最も広く用いられている方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法（Dieffenbach, C. and Dveksler, G., eds. PCR Primer: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Press, Plainview NY）である。この増幅法では、相補的ＤＮＡ鎖上および増幅される領域のいずれかの端に、一般に、２０ヌクレオチドから３０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドを用いて、変性した一本鎖ＤＮＡ上でＤＮＡ合成が開始される。変性、プライマーハイブリダイゼーションおよび熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを用いたＤＮＡ鎖合成の連続的サイクルにより、プライマー間の配列の指数関数的増幅が可能になる。ＲＮＡ配列は、まず逆転写酵素を用いてコピーして相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）コピーを作製することにより、増幅できる。増幅されたＤＮＡ断片は、ゲル電気泳動、標識プローブとのハイブリダイゼーション、引き続いての同定（例えば、酵素結合アッセイによる）を可能にするタグ付きプライマーの使用、および標的ＤＮＡとハイブリダイゼーションするとシグナルを増強させる蛍光タグ付きプライマーの使用（例えば、ＢｅａｃｏｎおよびＴａｑＭａｎのシステム）など、種々の手段によって検出できる。
【０００４】
特定のヌクレオチド配列の検出および増幅のために、ＰＣＲに加えて、他の種々の技法が開発されている。一例は、リガーゼ連鎖反応である（Barany, F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 189-193, 1991）。
【０００５】
他の例は、１９９２年に最初に記載された等温増幅（Walker GT, Little MC, Nadeau JG and Shank D. Isothermal in vitro amplification of DNA by a restriction enzyme/DNA polymerase system. PNAS 89: 392-396 (1992)）であり、鎖置換増幅（ＳＤＡ）と称される。それ以来、転写媒介増幅（ＴＭＡ）および、対応するゲノムＤＮＡではなく、ＲＮＡ配列をコピーするＲＮＡポリメラーゼを用いるＮＡＳＢＡ法などの多数の他の等温増幅法が記載されている（Guatelli JC, Whitfield KM, Kwoh DY, Barringer KJ, Richmann DD and Gingeras TR. Isothermal, in vitro amplification of nucleic acids by a multienzyme reaction modeled after retroviral replication. PNAS 87: 1874-1878 (1990); Kievits T, van Gemen B, van Strijp D, Schukkink R, Dircks M, Adriaanse H, Malek L, Sooknanan R, Lens P. NASBA isothermal enzymatic in vitro nucleic acid amplification optimized for the diagnosis of HIV-1 infection. J Virol Methods. 1991 Dec; 35(3):273-86）。
【０００６】
他のＤＮＡベースの等温法としては、ＤＮＡポリメラーゼが、環状テンプレートに対するプライマーを伸長させるローリングサークル増幅（ＲＣＡ）（Fire A and Xu SQ. Rolling replication of short circles. PNAS 92: 4641-4645 (1995）、標的検出のために環状プローブを用いる分枝増幅（ＲＡＭ）（Zhang W, Cohenford M, Lentrichia B, Isenberg HD, Simson E, Li H, Yi J, Zhang DY. Detection of Chlamydia trachomatis by isothermal ramification amplification method: a feasibility study. J Clin Microbiol. 2002 Jan; 40(1):128-32）、より最近では、ＤＮＡ鎖を巻き戻すために、熱の替わりにヘリカーゼ酵素を用いるヘリカーゼ依存性等温ＤＮＡ増幅（ＨＤＡ）（Vincent M, Xu Y, Kong H. Helicase-dependent isothermal DNA amplification. EMBO Rep. 2004 Aug; 5(8):795-800）が挙げられる。
【０００７】
最近、ＤＮＡ増幅の等温法が記載された（Walker GT, Little MC, Nadeau JG and Shank D. Isothermal in vitro amplification of DNA by a restriction enzyme/DNA polymerase system. PNAS 89:392-396(1992)）。伝統的な増幅法は、増幅反応の各サイクルにおける標的分子の変性および復元のサイクルの継続に頼っている。ＤＮＡの熱処理はＤＮＡ分子のある程度の切断をもたらし、したがって、発達中の胚盤胞からの少数の細胞からＤＮＡを単離する場合や、特に、組織切片、パラフィンブロックおよび古いＤＮＡサンプルなどのようにＤＮＡがすでに断片化された形態である場合など、ＤＮＡに限りがある場合、この加熱−冷却サイクルはＤＮＡをさらに損傷させ、増幅シグナルの損失をもたらす恐れがある。等温法は、さらなる増幅のためのテンプレートとして役立つ一本鎖分子を産生させるためにテンプレートＤＮＡを継続的に変性させる工程に依存せず、一定温度における特定の制限エンドヌクレアーゼによるＤＮＡ分子の酵素的ニッキング、またはヘリカーゼ酵素の使用によるＤＮＡ二重鎖の巻き戻しに依存する。
【０００８】
鎖置換増幅（ＳＤＡ）と称される技法は、半修飾ＤＮＡの非修飾鎖にニックを入れる所定の制限酵素の能力、および下流の鎖を伸長させ置換する５’−３’エキソヌクレアーゼ欠損ポリメラーゼの能力に依存する。次いで、センス反応からの鎖置換がアンチセンス反応のテンプレートとして役立つ、センスとアンチセンスの結合反応により、指数関数的な増幅が達成される（Walker GT, Little MC Nadeau JG and Shank D. Isothermal in vitro amplification of DNA by a restriction enzyme/DNA polymerase system. PNAS 89:392-396(1992)）。このような技法は、結核菌（Walker GT, Little MC, Nadeau JG and Shank D. Isothermal in vitro amplification of DNA by a restriction enzyme/DNA polymerase system. PNAS 89:392-396(1992)）、ＨＩＶ−１、Ｃ型肝炎およびＨＰＶ−１６（Nuovo G.J., 2000）、トラコーマクラミジア（Spears PA, Linn P, Woodard DL and Walker GT. Simultaneous Strand Displacement Amplification and Fluorescence Polarization Detection of Chlamydia trachomatis. Anal. Biochem. 247:130-137(1997)）の好首尾な増幅に用いられている。
【０００９】
現在まで、ＳＤＡの使用は、修飾鎖上で酵素的開裂に耐性を有すると考えられる半ホスホロチオエートＤＮＡ二重鎖を生じさせる修飾ホスホロチオエートヌクレオチドに依存しており、置換反応を駆動させるための消化の替わりに、酵素的ニッキングをもたらしている。しかし最近、いくつかの「ニッカーゼ」酵素が操作されている。これらの酵素は、伝統的様式でＤＮＡを切断するのではなく、ＤＮＡ鎖の一本にニックを生じさせる。「ニッカーゼ」酵素としては、Ｎ．Ａｌｗ１（Xu Y, Lunnen KD and Kong H. Engineering a nicking endonuclease N.Alw1 by domain swapping. PNAS 98:12990-12995(2001)、Ｎ．ＢｓｔＮＢ１（Morgan RD, Calvet C, Demeter M, Agra R, Kong H. Characterization of the specific DNA nicking activity of restriction endonuclease N.BstNBI. Biol. Chem. 2000 Nov; 381(11):1123-5）およびＭＩｙ１（Besnier CE, Kong H. Converting MIy1 endonuclease into a nicking enzyme by changing its oligomerization state. EMBO Rep. 2001、Sep; 2(9):782-6. Epub 2001 Aug 23）が挙げられる。したがって、このような酵素の使用により、ＳＤＡ法が簡便化されると考えられる。
【００１０】
さらに、熱安定性制限酵素（Ａｖａ１）と熱安定性エキソポリメラーゼ（Ｂｓｔポリメラーゼ）の併用により、ＳＤＡは改善されている。この併用は、この反応の増幅効率を、１０８倍増幅から１０１０倍増幅、増加させることが示されているので、この技法を用いて、ユニークな単一コピー分子の増幅が可能である。熱安定性ポリメラーゼ／酵素を併用して得られた増幅倍数は、１０９の桁である（Milla M.A., Spears P.A., Pearson R.E. and Walker G.T. Use of the Restriction Enzyme Ava1 and Exo-Bst Polymerase in Strand Displacement Amplification Biotechniques, 1997 24:392-396）。
【００１１】
現在まで、全ての等温ＤＮＡ増幅法では、増幅開始前に、二本鎖ＤＮＡテンプレート分子を変性することが必要である。さらに、増幅は、各々のプライミング事象から１回のみ開始される。
【００１２】
直接的検出では、標的核酸は、最も一般的には、ゲル電気泳動によりサイズに基づいて分離され、固相担体に移された後、標的配列に相補的なプローブとのハイブリダイゼーションを行う（サザンブロッティングおよびノーザンブロッティング）。このプローブは、天然核酸、または、ペプチド核酸（ＰＮＡ）もしくはロックド核酸（ＬＮＡ）もしくは挿入核酸（ＩＮＡ）などの類縁体であり得る。このプローブは、直接標識できる（例えば、３２Ｐにより）か、間接的方法を使用できる。間接的方法は通常、このプローブ内へのビオチンまたはジゴキシゲニンなどの「タグ」の組み込みに依存し、次いで、このプローブを、酵素結合基質変換または化学発光などの手段により検出する。
【００１３】
核酸を直接検出するために広く使用されている他の方法は、「サンドイッチ」ハイブリダイゼーションである。この方法では、捕捉プローブを固相担体に結合させ、溶液中で、標的核酸を結合させた当該プローブにハイブリダイズさせる。非結合標的核酸を洗浄除去し、標的配列にハイブリダイズする第２のプローブを用いて、結合核酸を検出する。検出には、上記で概説した直接法または間接法を使用できる。このような方法の例としては、サンドイッチハイブリダイゼーションの原理を用いる一例である「分枝ＤＮＡ」シグナル検出システム（1991, Urdea, M.S., et al., Nucleic Acids Symp. Ser. 24, 197-200）が挙げられる。核酸配列の直接的検出のための核酸ハイブリダイゼーションを用いる、急成長している分野は、ＤＮＡマイクロアレイの分野である（2002, Nature Genetics, 32, [Supplement]; 2004, Cope, L.M., et al., Bioinformatics, 20, 323-331; 2004, Kendal, S.L., et al., Trends in Microbiology, 12, 537-544）。この方法では、短いオリゴヌクレオチド（典型的には、アフィメトリクスのシステムにおける２５量体）からより長いオリゴヌクレオチド（典型的には、アプライドバイオシステムおよびアジレントのプラットフォームにおける６０量体）、さらにｃＤＮＡクローンなどのより長い配列の範囲にあり得る個々の核酸種を、グリッドパターンにおける固体支持体に固定するか、または固体支持体上にフォトリソグラフィ合成する。次いで、タグをつけた、または標識化した核酸集団を、このアレイにハイブリダイズさせ、アレイにおける各スポットに対するハイブリダイゼーションのレベルを定量化する。最も一般的には、放射性または蛍光標識した核酸（例えば、ｃＲＮＡ類またはｃＤＮＡ類）をハイブリダイゼーションに用いるが、化学発光などの他の検出システムも使用できる。
【００１４】
このような新規な方法は、病原生物の高感度で特異的な検出の見込みがあるため、現在、感染性疾患の診断のための分子的方法を利用することに大きな関心が持たれている。この文脈において、ヌクレオチド配列のレベルとそれらのゲノムのサイズとの双方において違いのある個々のＨＰＶタイプを有する可変性の遺伝子プールとしての集団的レベルでそのＤＮＡゲノムが存在するヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）を、本発明は扱っている。分子的試験により、種々の臨床サンプル中の異なるＨＰＶタイプを検出し正確に同定することは、種々の分子的試験の限界によって妨げられる。さらに、ＨＰＶを規定する包括的な組分け内には、多数の「遺伝子型」、「変異体」、「サブタイプ」および「タイプ」が存在する。例えば現在、１００超のＨＰＶのタイプが認められており、そのうちのいくつかはヒトの疾患に強い関連性がある。いわゆる高リスクおよび中程度リスクのタイプは、癌への進行に関係しており、利用できる最も正確な分子的方法によるそれらの検出は緊急の臨床的優先事項である。
【００１５】
大きな問題は、ＨＰＶ単独の検出は、癌への進行について必ずしも良好な指標ではないことである。子宮頚部上皮内腫瘍形成（ＣＩＮ）は、侵襲的形態に進行する可能性はあるが、多くの病巣は、退縮するか、または癌腫に進行することなく存続する。女性の７０パーセントは、２年以内にＨＰＶ感染を除去する（1998, Journal of Pediatrics 132, 277-284; Moscicki, A.B., et al.）。しかし、ＣＩＮおよびその進行の発見はきわめて可変的であるため、無処置であっても、正常に戻り得るし、または完全ブローン癌腫になり得る。ＣＩＮＩおよびＣＩＮＩＩの症例のおよそ三分の一から二分の一が自然に退縮する（1990, Australian and New Zealand Journal of Obstetrics and Gynaecology, 30, 1-23, Channen, W et al.）。ＣＩＮＩからＣＩＮＩＩへの進行にかかる時間は、約十年であるが、一部の女性では、二十年以上であり得る（2000, Cancer Research 60, 6027-6032., Ylitalo, E et al.）。
【００１６】
エプスタインバールウイルスおよびその胃癌との関連における場合のように、細胞、組織または器官のウイルス感染により、これら対象物が変化を受けるゲノムメチル化のサインが生じ得る（2002, American J. Pathology 160, 787-794, Kang, G.H., et al）。メチル化または脱メチル化は、多くの細胞分裂にわたって、いくつかの場合は生物の世代にわたって引き継がれてきた安定な変化であるため、通常は安定なメチロームの変化は、前癌状態または癌状態を予知するものであり得る。
【００１７】
異なるＨＰＶゲノムタイプ間の交差ハイブリダイゼーションの問題があるのみならず、ＨＰＶタイプを構成する正確な分類が、生命情報科学の著しい限界を有するゲノム配列の類似性に依存するため、単一アッセイで、全ての異なるＨＰＶタイプを認識する信頼性の高いロバストなＤＮＡベースの検出システムを実行することは困難な課題であった。したがって、新規ＨＰＶタイプを、以前のＨＰＶタイプと９０％未満の配列類似性のあるものとして確定できても、より細かい分類学上の細区分は、扱う上でより問題となる。したがって、新規ＨＰＶ「サブタイプ」は、ＤＮＡ配列の類似性が以前のサブタイプに比較して９０〜９８％の範囲である場合に確定される。新規「変異体」は、配列類似性が、以前の変異体に比較して、９８〜１００％である場合に確定される（1993, Van Rast, M.A., et al., Papillomavirus Rep, 4, 61-65; 1998, Southern, S.A. and Herrington, C.S. Sex. Transm. Inf. 74, 101-109）。このスペクトルは、単一単離ウイルス粒子からの単一ゲノムの比較に基づいて変異を測定し得る点までさらに広がり得る。このような場合、「遺伝子型」は、他のいずれかの完全に配列決定されたＨＰＶゲノムと１つの塩基だけ少なくとも異なっているいずれかの完全に配列決定されたＨＰＶゲノムとなるであろう。これは、確定位置における単一塩基が、Ｇ、Ａ、ＴまたはＣの４つの状態のうちの１つである全ての場合、ならびに、所与の位置における塩基が欠失、付加、増幅または転移により、別の部位へ変化した場合を含む。
【００１８】
上記の理由で、本特許明細書出願に用いられる全てのバイオインフォマティクス上の比較は、ＨＰＶ１６ゲノム（標準的コンパレーターとしてＨＰＶ１６の１から７９０４の位置を用いて）と相対的に、また、先行技術であるＢＬＡＳＴ法（1996, Morgenstern, B., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93, 12098-12103）を用いて行われる。参照を目的として本明細書で利用される標準的なＨＰＶ「タイプ」は、７９０４塩基対のパピローマウイルスである、ＰａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｉｄａｅのＨＰＶ１６である（National Center for Biotechnology Information、ＮＣＢＩ遺伝子座ＮＣ＿００１５２６；変型ＮＣ＿００１５２６．１；ＧＩ：９６２７１００；参照、Medline, 91162763 and 85246220; PubMed 1848319 and 2990099）。
【００１９】
疾患リスク評価の文脈において既存のＨＰＶ検出システムが直面している困難はおおむね三重となっている。第１の限界は、テクノロジーシステム自体のものである。第２は、疾患細胞集団の病理学的解釈の限界である。第３は、遺伝子背景、ならびに寄与している補因子の違いに供されている異なるヒト集団における疾患の進行評価の臨床レベルにおける限界である。
【００２０】
一定のタイプのＨＰＶは、子宮頚癌に関係しており、膣、産卵口、陰茎および肛門の、確定がより困難な癌の一部に寄与している。子宮頚部悪性転換域である組織の環状部は、ＨＰＶ発癌の可能性の高い領域であり、この領域の完全な細胞正常状態から侵襲性癌腫状態の評価は、組織学的、細胞学的および分子生物学的方法論により、可視または顕微鏡の基準を用いて、ルーチン評価されている。ウイルスレベルと易感染性ヒト細胞のレベル双方におけるウイルスによって誘導された異常の早期検出は、正常組織から異常組織まで分子径路に沿って細胞集団が到達する場所の判定にそれが役立ち得るならば、臨床的に大きな関連性を有すると考えられる。しかし、半世紀の間、パップスメアの使用にも関わらず、異常子宮頚部の細胞学的診断と正常状態との間の固形早期リスク評価は、現在依然として問題がある。主要な問題は、種々の段階の子宮頚部上皮内腫瘍（ＣＩＮ１、ＣＩＮ２およびＣＩＮ３）などの「前癌」の確定、したがって、治療オプションに関する臨床的決定の分かりにくい基準をめぐるものである。前癌の確定は、ｉｎ ｓｉｔｕのＣＩＮ２、ＣＩＮ３および癌腫の使用を避けるための偽正確の方法であると考えている臨床医もいる。顕微鏡診断に、さらにＣＩＮ２の臨床的意味には、大きな不均一性が存在する（2003, Schiffman, M., J. Nat. Cancer Instit. Monog. 31, 14-19）。いくつかのＣＩＮ２病巣は顕微鏡による外観は悪いにも関わらず、免疫系によって克服されて消失するが、他の病巣は侵襲的な癌腫へと進行する。したがって、ＣＩＮ２は、多義的診断の緩衝帯域と考えている者もあるが、このような帯域の境界条件には議論の余地がある。ある臨床医は、ＣＩＮ２とＣＩＮ３とを組み合わせることは実行不良と考えているが、一方、他の者は、ＣＩＮ２またはそれより悪い病巣全てを処置している。最後に、ＣＩＮ３と特定された女性の三分の一から三分の二の間の者は侵襲的癌腫を発現するが、それでもこれは、予測不能な時間依存的様式で生じることが、文献に示されている（2003, Schiffman, M., J. Nat. Cancer. Instit. Monog. 31, 14-19; 1978, Kinlen, L.J., et al., Lancet 2, 463-465; 1956, Peterson, O. Am. J. Obstet. Gynec. 72, 1063-1071）。
【００２１】
今日、未だに医師が直面している中心的問題は、有意性が未判定の異型細胞（ＡＳＣＵＳ）などの低段階の細胞学的異常、または扁平上皮内病巣（ＳＩＬｓ）の確定が困難なことである。実際、ＡＳＣＵＳは、適切な診断ではなく、むしろ、理解に乏しい変化の「ゴミ箱」カテゴリーである（1996, Lorincz, A.T., 1996, J. Obstet. Gyncol. Res. 22, 629-636）。経口避妊薬の使用から、喫煙、トラコーマクラミジアおよび単純疱疹ウイルス２型などの、ＨＰＶ以外の病原体、抗酸化栄養物および頚部炎症の補因子作用は全て、高段階の扁平上皮内病巣（ＨＳＩＬｓ）から子宮頚癌の進行へのリスクを調節すると主張されているが、これらのために前癌病巣の範囲全体を解釈することは困難である（2003, Castellsague, X.J. Nat. Cancer Inst. Monog. 31, 20-28）。分類のベセスダシステムおよび２００１年におけるその改定版の導入は、低段階の扁平上皮内病巣（ＬＳＩＬｓ）の新たなカテゴリーにＣＩＮ１の異型性コイロサイトーシスを含めることが最初、有用でないことが分かったため、臨床医の間の混乱を減少させる上でなされたことはわずかであった。ベセスダシステム導入の結果は、多くの臨床医が異型性コイロサイトーシスに対してコルポスコピーを実行してはいないが、「ＣＩＮ１の患者にそうすることを強いられるように感じた」ことである（1995, Hatch, K.D., Am. J. Obstet. Gyn. 172, 1150-1157）。コルポスコピーの熟達には多くの年数の訓練が必要であったが、主観的細胞学的基準により依然として、一貫性がなく、また、再現性がない結果となっている（1994, Sherman, M.E., Am. J. Clin. Pathology 102, 182-187; 1988, Giles, J.A., Br. Med. J., 296, 1099-1102）。
【００２２】
継続する診断上の障害は、「異型」などの不明確な診断が、いくつかの設定において、診断の２０％以上を占め得ることである（1993, Schiffman, M. Contemporary OB/GYN, 27-40）。これは、「異型」であったスミアに対して病理学者の独立した診断一致のレベルを評価するために特に設計された試験によって示されている。同一セットのサンプルに対する５人の専門的病理学者の間での正確な一致が生じたのは、症例のわずか２９％に過ぎなかったことが分かった（1994, Sherman, M.E., et al., Am. J. Clin. Pathology 102, 182-187）。正味の結果は、子宮頚部細胞診断は、高い偽陰性（低感受性と称される）および高い偽陽性（低特異性と称される）を有し続けていることである。様々な病理学者の細胞学的解釈では、２０％位までの偽陰性の率および１５％までの偽陽性の率となっている（1993, Koss, L.G., Cancer 71, 1406-1412）。偽陽性結果は、不必要なコルポスコピー検査、生検および処置に至り、これらは全て、健康管理費用の負担を付加する。偽陰性結果は、診療過誤訴訟になり、関連経費がかかる可能性が生じる。ＨＰＶに関する試験を用いた子宮頚部異常の早期段階の分子診断により、細胞学的診断よりも主観性の少ない試験が提供される。
【００２３】
生物における健康欠如のゲノム指標は、多数のレベルでのゲノムメチル化状態における変化に密接に関連している。食事の補完は、メチル化および代謝の健康状態に対する誤った有害な帰結を有する恐れがあり（Waterland, R.A., 2003, Molecular and Cellular Biology 23, 5293-5300）、リールイン遺伝子座の領域など、一定のゲノムプロモーター領域の異常なメチル化は、精神分裂症などの種々の精神医学的条件に関係している（2002, Chen, Y., et al, Nucleic Acids Research 30, 2930-2939; Miklos, G.L.G., and Maleszka, R., 2004, Nature Biotechnology 22, 615-621）。メチル化研究の１つの大きな領域は癌研究にあり、そこでは、ゲノム領域の高メチル化と低メチル化の双方が、広範に文書化されている（French, S.W., et al., 2002, Clinical Immunology 103, 217-230; Frigola, J., et al., 2005, Human Molecular Genetics, 14, 319-326; Belinsky S.A., et al., Nature Reviews Cancer 4, 1-11）。これらの研究のいくつかは、癌の指標のための予後バイオマーカーの発見を目指している（Baker, M., 2005, Nature Biotechnology, 23, 297-304）が、バイオマーカーの分野は、一貫性のない結果で不可解である。さらに、このようなゲノム研究が、微生物およびウイルスの感染から生じる細胞および組織に対する動揺の他の出所源と結び付けられることは稀である。また、癌のゲノムは一般に、染色体の異数、セグメントの異数、欠失、増幅、反転、転座および多変異などの大量のゲノム変動を含有し（Duesberg, P., 2004, Cell Cycle, 3, 823-828; Miklos, G.L.G., 2005, Nature Biotechnology 23, 535-537）、メチル化変化の文脈における早期検出のためのこれらの重要性は、まだそれほど深く探索されていない（Vogelstein, B., et al., 2004, Nature Medicine, 10, 789-799; Lucito, R., et al., 2003, Genome Research, 13, 2291-2305）。
【００２４】
上記に概説した全ての問題および欠点に鑑みて、特に、前腫瘍形成病巣のスクリーニングで、ＤＮＡ方法論の臨床的影響に関する議論は依然として存在している。細胞異常の高感度な分子の早期兆候指標は、きわめて役立つものと考えられる。本発明者らは、個体の健康状態の判定に使用する目的で、ウイルスおよびゲノム標的を検出するための新規な方法、キットおよび統合された生命情報科学プラットフォームを開発した。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００２５】
発明の開示
一般的態様において、本発明は、ウイルスの存在の検出と、健康状態を示すゲノム標的またはマーカーの有無または状態の検出との組み合わせを用いて、対象の健康状態を判定するアッセイに関する。本発明は、必要な場合、同一の試験、容器、または反応において、ただ１つのサンプルで実施できる。
【００２６】
第１の態様において、本発明は、
（ａ）核酸中の非メチル化シトシンを修飾できる試剤により対象からのサンプルを処理する工程であって、サンプル中のウイルス核酸およびゲノム核酸を処理してウイルス核酸誘導体およびゲノム核酸誘導体を形成する工程；
（ｂ）処理されたサンプル中のウイルス核酸誘導体の存在をアッセイする工程；および
（ｃ）処理されたサンプル中のゲノム核酸誘導体中のゲノム標的の状態を判定する工程であって、１種以上のウイルス核酸誘導体の存在およびゲノム標的の状態により健康状態が示される工程、を含む、対象の健康状態を判定するアッセイを提供する。
【００２７】
好ましい一形態において、このアッセイは、
アッセイ工程および判定工程に先立って、ウイルス核酸誘導体およびゲノム核酸誘導体の少なくとも一部を増幅させる工程、をさらに含む。
【００２８】
第２の態様において、本発明は、
（ａ）ウイルス核酸およびゲノム核酸を含有する対象からのサンプルを、非メチル化シトシンを修飾する試剤により処理し、シトシン数は減少しているが、塩基の総数は対応する非処理ウイルス核酸および非処理ゲノム核酸と実質的に同じであるウイルス核酸誘導体およびゲノム核酸誘導体を形成する工程；
（ｂ）ウイルス特異的核酸分子を得る工程；
（ｃ）ゲノム標的を有する核酸分子を得る工程；
（ｄ）ウイルス特異的核酸分子の存在を試験する工程；および
（ｅ）処理され増幅されたサンプル中のゲノム標的の状態を判定する工程であって、１種以上のウイルス特異的核酸分子および標的状態の検出により対象の健康状態が示される工程、を含む対象の健康状態を判定するアッセイを提供する。
【００２９】
このウイルス特異的核酸分子およびゲノム標的を有する核酸分子は、ウイルス核酸誘導体およびゲノム核酸誘導体を増幅することによって得ることが好ましい。
【００３０】
第３の態様において、本発明は、
（ａ）非メチル化シトシンを修飾する試剤により、対象からのサンプルを処理して、核酸誘導体を形成する工程；
（ｂ）所望のウイルス核酸分子を核酸誘導体に増幅させることができるプライマーを提供する工程；
（ｃ）標的ゲノム核酸分子を核酸誘導体に増幅させることができるプライマーを提供する工程；
（ｄ）核酸誘導体に対して増幅反応を実施する工程；および
（ｅ）増幅された所望のウイルス核酸および増幅された標的ゲノム核酸の存在をアッセイする工程であって、１つ以上の増幅産物の有無により対象の健康状態が示される工程、を含む、対象の健康状態を判定するアッセイを提供する。
【００３１】
好ましい一形態において、工程（ｅ）は、所望のウイルス特異的核酸分子の検出により、サンプル中のウイルスの存在を示す、所望のウイルス特異的核酸分子を含む増幅核酸産物の存在をアッセイする工程を含む。
【００３２】
他の好ましい形態において、工程（ｅ）は、標的核酸分子を含む増幅核酸産物の存在をアッセイする工程であって、標的核酸分子を検出することにより、サンプル中のゲノムまたは遺伝子の状態が示される工程、をさらに含む。
【００３３】
第４の態様において、本発明は、
（ａ）ウイルス核酸およびゲノム核酸中の非メチル化シトシンをウラシルに変換してウイルス核酸誘導体およびゲノム核酸誘導体を形成する条件下、対象からのサンプルを重亜硫酸塩試薬で処理する工程；
（ｂ）サンプルに、ウイルス核酸誘導体における所望のウイルス特異的核酸分子を増幅させることができる、ウイルス核酸誘導体の領域に結合可能なプライマーを供給する工程；
（ｃ）サンプルに、ゲノム核酸誘導体における所望の標的ゲノム特異的核酸分子を増幅させることができる、ゲノム核酸誘導体の領域に結合可能なプライマーを供給する工程；
（ｄ）処理されたサンプルに対して増幅反応を実施する工程；および
（ｅ）増幅されたウイルス核酸産物および増幅されたゲノム核酸標的の存在をアッセイすることであって、上記産物および標的のうちの１つまたは双方の検出により対象の健康状態が示されること、を含む、対象の健康状態を判定するアッセイを提供する。
【００３４】
好ましい一形態において、このアッセイは、
（ｆ）ウイルスが存在するサンプルを、前記サンプル中のウイルスのタイプ、サブタイプ、変異体または遺伝子型を判定するために試験する工程、をさらに含む。
【００３５】
増幅は、ＰＣＲまたは等温増幅などの任意の好適な手段により実施できる。
【００３６】
このウイルスがＤＮＡゲノムを有している場合は、この試剤との処理によって核酸誘導体が生じる。しかし、このウイルスがＲＮＡゲノムを有している場合は、ゲノムは逆転写酵素方法論によってＤＮＡへ変換できる。変換は、試剤との処理の前または後に実施できる。他のＲＮＡからｃＤＮＡへの変換がないことを保証するために、ウイルス特異的プライマーを用いることが好ましい。
【００３７】
本対象は、かなりの頻度でゲノムのメチル化を有する任意の高等生物形態であり得る。典型的に本発明は、動物またはヒトに、およびウイルス感染植物種に好適である。動物は、飼育動物または家畜哺乳動物であることが好ましいが、健康状態をモニターすることが必要な野生集団であってもよい。ヒトは、健康な個人であっても病人であってもよい。
【００３８】
所望のウイルス核酸分子は、疾患を示すものであってもなくても、ウイルスファミリー自体、または、属もしくは種などのより下位の分類カテゴリー、タイプもしくはサブタイプ、またはウイルスの変異体もしくは遺伝子型に特異的であり得る。
【００３９】
いくつかのゲノム領域のメチル化は、典型的に、関連遺伝子が「オフ」になる発現を引き起こす。しかし、ある状況では、いくつかの遺伝子が関連するメチル化領域を有し得るが、遺伝子発現は「オン」のままである。したがって、好ましい形態において、メチル化または非メチル化は、遺伝子発現自体ではなく、予後の指標として使用できる。また、所望のメチル化状態を判定または標的化するために、特定の核酸領域の増幅を妨害することも可能である。
【００４０】
標的のゲノム核酸は、ゲノムの１つもしくは複数の遺伝子またはプロモーターもしくはエンハンサーなどの調節領域、あるいは任意のコード領域または非コード領域、または静止もしくは移動性領域に特異的であり得る。本標的は、診断目的または予後診断目的に有用であるメチル化特性を有することが好ましい。これには、反復ＤＮＡ配列のＬＩＮＥファミリー（ヒトゲノム内に豊富なレトロトランスポゾンファミリーであるLong Interspersed Nuclear Elementsとしても知られる長鎖散剤反復配列；1996, Smit, A.F.A., Current Opinion in Genetics and Development, 6, 743-748; 2003, Han, J.S., et al., Nature, 429, 268-274; 2004, Brouha, B., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100, 5280-5285）およびＳＩＮＥファミリー（短い散在性核要素としても知られている短い散在性要素；Batzer, M.A., et al.,）によって例証されるものなどの移動性またはかつて移動性だった要素が含まれ、これらは共に、ヒトゲノムのほぼ半分を構成している。標的ゲノム核酸は、ゲノム核酸のメチル化または非メチル化領域を示すことがより好ましい。
【００４１】
好ましくは、アッセイは、ウイルスの所与のタイプまたはタイプ群に特異的なプライマーを用いて繰り返され、増幅産物の存在がウイルスのタイプまたはタイプ群を示す。
【００４２】
典型的には、増幅後、各核酸誘導体は、対応する無処置核酸に比較して、シトシンの総数が減少した単純化核酸分子を形成し、単純化核酸分子は、好ましくは、ウイルスまたは標的に特異的な核酸配列を含む。
【００４３】
メチル化シトシンを含まない二本鎖ＤＮＡでは、この処理工程により、各々がアデニン、グアニン、チミンおよびウラシルの塩基を含有する２種の核酸誘導体がもたらされる。２種の核酸誘導体は、二本鎖ＤＮＡの２つの一本鎖から生じる。２種の核酸誘導体は、シトシンを有さないが、元の処理されていないＤＮＡ分子と同じ塩基総数および配列の長さを有したままである。重要なことに、２種の誘導体は、互いに相補的でなく、トップ鎖およびボトム鎖を形成する。単純化核酸分子を生じさせるため、増幅には標的として、１本以上の鎖を使用できる。
【００４４】
典型的には、ウイルスに特異的な単純化核酸配列は、処理されていないウイルスゲノムに自然に生じることはない。
【００４５】
ウイルス株またはウイルスタイプは、特定のヒトまたは動物の種系列における所与の組織に対して、高、中または低レベルの発癌性または他の疾患状態を与え得る。例として、高リスクのＨＰＶタイプ１６、１８、４５および５６；中リスクのＨＰＶタイプ３０、３１、３３、３５、３９、５１、５２、５８、５９および６８；および低リスクのＨＰＶタイプ６、１１、４２、４３、４４、５３、５４、および５５が挙げられる。
【００４６】
ウイルスは、ヒトウイルス（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ICTVdb/Ictv/ICD-10.htmを参照）の記載されたファミリーのいずれのものからでもあり得る。
ポックスウイルス科。牛痘ウイルス、サル痘ウイルス、ワクシニアウイルスおよび痘瘡ウイルスが含まれる。ウイルスに依って、これらは、皮膚および粘膜損傷、湿疹、および接触感染性膿疱生皮膚炎を起こし得る。種々のヒト疾患は、2003, International Statistical Classification of Diseases and Related Health Problems, (ICD), 10th revisionにまとめられている（http://www3.who.int/icd/vol1htm2003/navi.htm）。
パラミクソウイルス科。ニパー（Ｎｉｐａｈ）ウイルス、パラインフルエンザおよび流行性耳下腺炎が含まれ、種々の呼吸器疾患、流行性耳下腺炎、髄膜炎、膵炎、脳炎およびはしかに関連している。ニパー（Ｎｉｐａｈ）ウイルスは、１９９９年に初めて認められたばかりで、感染患者の７０％に致死的な脳炎を引き起こし、ヒト、イヌ、ネコ、ブタ、ウマ、ハムスター、コウモリおよびモルモットなど、きわめて広い宿主範囲を有する。これは、世界的な健康および経済にとって重大な脅威である（2005, Nature, 436, 401-405; Negrete, O.A., et al.,）；
フラビウイルス科。デング、黄熱病、Ｃ型肝炎およびＧ型肝炎が含まれ、脳炎、肝炎およびショック症候群に関連している。例えば、Ｃ型肝炎は、６つの主な遺伝子型を有するＲＮＡウイルスであり、世界で１億７０００万人超が感染し、有効なワクチンがない、慢性肝臓疾患の主要な原因である（2005, Science, 309, 623-626; Lindenbach, B.D., et al,）；
ヘルペスウイルス科。ヒトヘルペスウイルス１から８までが含まれる。これらのウイルスは、口腔感染、角膜の潰瘍、生殖器官感染、髄膜炎、水痘、肺炎、帯状疱疹、サイトメガロウイルス単核症および脳炎を引き起こす。ヒトサイトメガロウイルスは、臓器移植個体などの免疫不全個体に、重篤な致死的疾患を引き起こす。また、ＨＨＶ８は、ＡＩＤＳ関連病態のカポジ肉腫における原因物質として関係している（2003, Nature, 424, 456-461; Wang, X., et al,）；
アデノウイルス科。ヒトアデノウイルスＡからＦが含まれる。これらのウイルスは、呼吸器疾患、腎臓の感染、結膜炎および下痢を引き起こし得る；
パピローマウイルス科。上記に紹介したヒトパピローマウイルスのタイプが含まれる。これらは、ウイルス性疣及び子宮頚部、喉頭および膀胱の腫瘍の原因となる。
パルボウイルス科。Ｂ１９ウイルスが含まれ、合併症のない風疹の症状を与える；
ヘパドナウイルス科。Ｂ型肝炎が含まれ、肝硬変、および原発性肝細胞癌に関連している；
レトロウイルス科。急性感染症およびヒトＴ細胞白血病などの種々の悪性腫瘍に関連するＨＴＬＶ１および２、ＨＩＶ１および２が含まれる；
レオウイルス科。ロタウイルスが含まれ、下痢、胃腸炎および上気道疾患に関連している；
フィロウイルス科。マルブルク型およびエボラ型のウイルスが含まれ、出血熱に関連している；
ラブドウイルス科。水疱性口内炎および狂犬病が含まれ、発熱および狂犬病に関連している；
オルソミクソウイルス科。インフルエンザＡ、ＢおよびＣが含まれ、感冒および肺炎に関連している；
ブニアウイルス科。クリミア−コンゴ出血熱ウイルス、ニューヨークウイルスおよびハンタウイルスが含まれ、急性発熱および肺症候群に関連している；
アレナウイルス科。ラッサウイルス、リンパ球性脈絡膜髄膜炎ウイルスが含まれ、脳炎、髄膜炎および出血熱に関連している；
コロナウイルス科。ヒトコロナウイルスが含まれ、感冒症状および胃腸症候群に関連している；
ピコルナウイルス科。ヒトエンテロウイルスＡからＤおよびポリオウイルスが含まれ、気管支炎、髄膜炎、および麻痺に関連している；
カリシウイルス科。ノーウォーク様ウイルスおよびサッポロ様ウイルスが含まれ、急性胃腸炎に関連している；
非所属「Ｅ型肝炎様ウイルス」（ＨＥＶ）急性肝炎に関連している；
アストロウイルス科。ヒトアストロウイルスが含まれ、腸炎および胃腸炎に関連している；および
トガウイルス科。ロスリバーおよび風疹が含まれ、脳炎、白血球減少症および発疹に関連している。本発明を用いて、臨床的に低リスクとして分類されているウイルスが、特定の遺伝子型または種系列の個体または動物で、実際は高リスクであり得る。
【００４７】
核酸分子は、任意の好適な検出手段により検出できる。例としては、これに限定はしないが、
核酸分子のある領域に結合できる検出リガンドを提供して、検出リガンドが領域に結合するための十分な時間を与えること；および
核酸分子に対する検出リガンドの結合を測定して、核酸分子の存在を検出すること、
が挙げられる。当然のことながら、核酸分子は、当該技術分野で公知の任意の好適な手段によって検出できる。
【００４８】
いずれかの所与のウイルスに関して、ウイルス特異的な核酸分子が得られるか、または同定された場合、増幅反応において対象となる領域の増幅を確実にするために、プローブまたはプライマーを設計することができる。処理または変換により、配列は非対称性となり（下記を参照）、したがって、同一の座位の「トップ」鎖および「ボトム」鎖（「ワトソン」鎖と「クリック」鎖としても知られている）の検出に、異なるプライマー配列が必要とされるため、処理された、したがって変換されたゲノム（以後、「誘導体」と称される）の双方の鎖を、プライマー設計のために分析できることに注意することが重要である。こうして、２つの分子集団、すなわち、変換直後に存在する変換されたゲノムと、慣例的な酵素学的手段（ＰＣＲ）または等温増幅などの方法によって誘導体が複製された後に生じる分子集団とが存在する。プライマーは典型的に、簡便性のため、変換されたトップ鎖について設計されるが、プライマーはまた、ボトム鎖について作製することもできる。したがって、所与のタイプのウイルスおよび生物のゲノムにおける標的を検出するために、サンプルに対して臨床的または科学的なアッセイを実施することが可能になる。
【００４９】
本発明は、所与のサンプル中に何らかのウイルスが存在するかどうかを判定するために使用できる、ウイルスの代表的なタイプを示すプローブまたはプライマーを使用することができる。さらに、ウイルスの所与のタイプ、サブタイプ、変異体および遺伝子型の例を実際に検出または同定するために、ウイルスタイプに特異的なプローブを使用することができる。
【００５０】
本発明は、所与のサンプル中に標的が存在するかどうかを判定するために使用できる、メチル化などの標的を示すプローブまたはプライマーを使用できる。さらに、ゲノム内の標的を実際に検出または同定するために、標的特異的プローブを使用できる。
【００５１】
本発明の実際の予想外の利点は、１つの反応管または反応容器中でそれを実施できることである。ウイルスがアッセイされるだけでなく、１つ以上のゲノム標的も同定できる。これら２つの試験パラメーターを１つのアッセイに組み合わせることにより、対象の健康状態を特定することが可能になる。健康状態は、癌などの疾患、前癌状態、疾患状態に関する高リスクなどであり得る。本発明を、さらなる進行を予防するか、または疾患を治療するために、早期の医療的または獣医学的または園芸学的介入を可能にする疾患状態または可能的な疾患状態の早期指標として使用できる。
【００５２】
本発明は、癌などの疾患状態に関係してきたウイルスの検出に特に好適である。例としては、これに限定はしないが、ヒトパピローマウイルス、肝炎、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、および上記ウイルスの種々のファミリーのメンバーが挙げられる。
【００５３】
本発明は、癌などの疾患状態に関係してきた細胞におけるゲノム標的の検出に特に好適である。疾患状態または健康状態によって、ゲノム内の任意の遺伝子、調節領域もしくは非コード領域、または核外もしくは細胞外の成分が、本発明に使用するマーカーとしての可能性を潜在的に有している。
【００５４】
本発明は、いくつかのゲノム領域のメチル化状態が癌の進行を示すこと、およびウイルスが存在する場合は、進行がはるかに信頼性の高いものになることを実証するデータを得た。
【００５５】
臨床サンプルおよび細胞系を用いて、本発明者らは、ほぼ４００個のヒト遺伝子の近辺での調節領域におけるメチル化パターンを調べ、ＨＰＶの存在と共に癌状態の場合に、メチル化の変化を有する６０超のゲノムマーカーを見出した。例としては、これに限定はしないが、以下のゲノム領域の１つ以上が挙げられる：ＣＤ１４、ＥＮＤＲＢ、ＨＩＣ、ＲＡＲＢ１、ＰＧＲ、ＳＦＲＳ８、ＴＭＳＢ１０、ＡＢＣＧ２、ＭＦＮＧ、ＬＡＭＲ１、ＲＡＧＥ、ＡＢＬ１、ＣＲＢＰ、ＧＰＲ３７、ＨＲＫ、ＲＡＲＡ、ＳＹＫ、ＥＣＥ１、ＭＭＥ、ＴＥＭ、ＮＦ２、ＸＩＡＰ、ＲＡＲＲＥＳ１、ＦＬＩ１、ＨＴＬＦ、ＬＤＨＢ、ＲＢ１、ＴＧＤ、ＣＤＫ４、ＭＭＰ１４、ＲＡＢ３２、ＢＡＲＤ１、ＮＦ１、ＬＩＭ２、ＭＭＰ２、ＤＡＢ２、ＢＭＰ６、ＣＤＫＮ１Ｃ、ＤＡＢ２ＩＰ、ＬＭＮＢ１、ＭＭＰ２８、ＨＡＩ２、ＳＯＣＳ１、ＨＩＣ２、ＭＳＨ６、ＲＩＮ２、ＨＭＧＡ１、ＪＵＮ、Ｓ１００Ｐ＊、ＳＲＦ、ＶＤＲ、ＤＫＫ３、ＫＲＡＳ２、ＰＬＡＵ、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ、ＣＤＨ１、ＭＡＣ３０、ＤＤＢ２、ＰＡＸ６、ＡＸＬ、ＥＩＦ４Ａ２、ＳＬＩＴ２、ＲＥＣＫ、ＴＥＲＣ、ＧＡＴＡ５、ＳＴＡＴ１。他の領域としては、下表８に示されたものが挙げられる。
【００５６】
ＨＰＶを用いて本発明者らにより得られたデータから、各々全ての疾患状態または健康状態は、本発明においてマーカーとして使用し得る特定のゲノム領域を有し得ることが解されよう。サンプルがＨＰＶに関して陽性であり、癌または前癌状態由来のものである場合に、試験されたゲノムマーカーで陽性（メチル化）だったのがおよそ１５％位だけだった事実は、何らかの所与の疾患状態または健康状態に関する可能性のある標的が多数存在し得ることを示している。ヒトゲノム内に約２５，０００のタンパク質コード遺伝子座があるとすれば、１５％の比率では、ただ遺伝子の調節領域を使用して、約４０００の可能性のある標的が予測されることになる。特異的ＣｐＧ領域が特定の疾患状態または健康状態においてメチル化され得るため、より多くの潜在的標的があると考えられる。したがって、本発明は、このような全ての可能性のあるマーカーを包含する。当然のことながら、本教示は、任意の疾患状態または健康状態に関する任意の有用なゲノムマーカーを判定するために、当業者により使用され得る。
【００５７】
第５の態様において、本発明は、
（ａ）ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）中の非メチル化シトシンをウラシルに変換してＨＰＶ核酸誘導体およびゲノム核酸誘導体を形成する条件下、対象からのサンプルを重亜硫酸塩試薬で処理する工程；
（ｂ）ＨＰＶ核酸誘導体の所望のＨＰＶ特異的核酸分子を増幅させることができる、ＨＰＶ核酸誘導体の領域に結合可能なプライマーを供給する工程；
（ｃ）ゲノム核酸誘導体の所望のゲノム特異的核酸分子を増幅させることができる、ゲノム核酸誘導体の領域に結合可能なプライマーを供給する工程；
（ｄ）ＨＰＶ核酸誘導体および前記ゲノム核酸誘導体に対して増幅反応を実施する工程；および
（ｅ）増幅されたＨＰＶ核酸産物および増幅されたゲノム核酸産物の存在をアッセイする工程であって、１つまたは双方の産物の検出により対象の子宮頚癌状態への進行が示される工程、を含む対象の子宮頚癌の可能性のあるものをスクリーニングするアッセイを提供する。
【００５８】
好ましい一形態において、本アッセイは、
（ｆ）ＨＰＶが存在するサンプルを、前記サンプル中のＨＰＶのタイプ、サブタイプ、変異体または遺伝子型を決定するために試験する工程、をさらに含む。
【００５９】
例えば、ＨＰＶ１６の検出では、ＨＰＶ１６ウイルス核酸誘導体に結合できるプライマーを調製することができる。当然のことながら、ＨＰＶ核酸誘導体を、他の全てのＨＰＶタイプに関して、ＨＰＶ１６で実施したとおり、それぞれのゲノム配列において、全てのシトシンをウラシルへ変化させることによって判定することができる。このような変換は、本発明によるアッセイの工程において実施されたサンプル中のウイルス核酸処理の結果を示す。
【００６０】
当然のことながら、他のＨＰＶタイプからのＨＰＶウイルス核酸誘導体に結合できる他の好適なプライマーまたはプローブを考察することができる。
【００６１】
第６の態様において、本発明は、ＰＣＲなどの増幅反応のための１種以上の試薬または成分と共に、ウイルス特異的核酸分子の関するプローブまたはプライマーおよびゲノム特異的核酸分子の関するプローブまたはプライマーを含む、対象における健康状態を判定するためのアッセイに使用されるキットを提供する。
【００６２】
サンプルとしては、これに限定はしないが、綿棒、生検、スミア、パップスミア、表面掻取り、スパチュラ、および体液サンプル、ならびに凍結材料、パラフィンブロック、ガラススライド、法医学採取系、および永久保存材料などの種々の保存媒体からのサンプルが挙げられる。
【００６３】
動物およびヒト、ならびに植物を含む生物の集団はいずれも、長期ウイルス作用に耐性の個体を有する。したがって、ウイルスの存在とゲノムのメチル化などのゲノムマーカーとの組み合わせによって、ある生物が疾患状態を有するようになる、または有する可能性が高いかどうかが識別されることになる。本発明は、ヒトへの適用、ならびに獣医学および他の生物ベースの活動に好適である。例えば、本発明は、ゲノムメチル化の生じることが十分に示されている全ての家畜に、および野生動物集団のモニタリングのための管理手段としても使用できる。
【００６４】
本質的に、本発明は、２つのレベルでのアッセイに関する：１つは、ウイルスの存在に関するものであり、他方は、特定の増幅産物または増幅の欠如から推定されたゲノムまたは核酸標的の存在、不在または状態に関するものである。標的は、メチル化状態、核酸配列、または核酸配列の欠如、または核酸配列の変化であり得る。いくつかの進行した癌では、ゲノム標的が完全に欠失していることがあり得、したがって、その存在の欠如は診断に用いることができる。これはそれ自体で優れた診断手段であり得、本発明に含まれる。また、多くの癌が、二重微小染色体と称される染色体外アンプリコンを有しており、したがって、それらは４６の染色体の１つにない点で、厳密にはゲノムでない。同様に、細胞質または核オルガネラに含有された任意の１つ以上のミトコンドリアＤＮＡが本発明に含まれる。
【００６５】
本発明者らは、併用するための技術を開発し、それを、例えば、単一のチューブで用いれば、癌性に向かって進行している細胞集団の進行リスクの評価において、それぞれの技術を単独で用いる場合よりはるかに強力となる。典型的には、ゲノム標的の１つまたは少数のゲノムメチル化は、１本のチューブ内で行われる。ウイルスゲノムと宿主ゲノムＤＮＡ（またはＲＮＡ）の双方を含有する患者サンプルが、重亜硫酸ナトリウムの使用により、ウイルスの存在と変化した宿主メチル化プロフィールとの双方の検出のために同時に使用できる単純化された形態へと変換される場合、アッセイは強力である。
【００６６】
核酸の修飾は、非メチル化シトシンから他のヌクレオチドへの変換であり得る。試剤が非メチル化シトシンをウラシルへと修飾し、次いでこれが核酸誘導体の増幅中にチミンとして置換されることが好ましい。非メチル化シトシンを修飾するために用いられる試剤は、重亜硫酸ナトリウムであることが好ましい。同様に、メチル化シトシンではなく、非メチル化シトシンを修飾する他の試剤もまた、本発明のアッセイに使用できる。例としては、これに限定はしないが、重亜硫酸塩、酢酸塩またはクエン酸塩が挙げられる。試剤は、酸性水性条件の存在下で、シトシンをウラシルへと修飾する試薬である重亜硫酸ナトリウムであることが好ましい。
【００６７】
重亜硫酸ナトリウム（ＮａＨＳＯ３）はシトシンの５，６−二重結合と容易に反応して、スルホン化シトシン反応中間体を形成し、これは脱アミノ化され易く、水の存在下で重亜硫酸ウラシルが生じる。必要ならば、重亜硫酸基は、緩和なアルカリ性条件下で除去でき、その結果、ウラシルが形成される。したがって、全てのシトシンはウラシルへと変換される可能性がある。しかし、メチル化シトシンは、メチル化による保護のため、修飾試薬によって変換することはできない。
【００６８】
本明細書を通して、文脈により別の意味が必要とされない限り、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などのバリエーションは、当然のことながら、述べられた要素、整数もしくは工程、または要素、整数もしくは工程の群の包含を意味するが、任意の他の要素、整数もしくは工程、または要素、整数もしくは工程の群の排除を意味するものではない。
【００６９】
本明細書に含まれた文書、法令、材料、装置、物品などの考察は、本発明の文脈を提供することだけを目的としている。これらの事項のいずれかまたは全てが、先行技術の基礎の一部を形成するとか、または本明細書の各請求項の優先日前にオーストラリアに存在していた、本発明に関連した分野における一般的に知られた知識だったと認めることとして考えるべきではない。
【００７０】
本発明がさらに明瞭に理解され得ることを目的として、以下の図面および実施例を参照として、好ましい実施形態を記載する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００７１】
発明を実施するための様式
定義
本明細書に用いられる用語「対象」とは、シトシンにゲノムのメチル化を有する生物を意味する。これは典型的には、動物およびヒトなどの哺乳類、ならびに多数の植物種を含む。
【００７２】
本明細書に用いられる用語「健康状態」とは、容易に確定できる疾患または病気について、ある個体が一般的集団の程度と異なっている程度を意味する。これは、ヒトに関しては、全ての一般的疫学的および健康管理上の目的のための標準的な診断的分類である、疾病の国際的分類により、世界保健機関によって規定されている。臨床的観点で、健康状態は、Harrisons; Principles of Internal Medicine, Braunwald, E et al., eds, McGraw Hill, Medical Publishing Division, 15thおよびその後の版に述べられている基準を用いてアッセイできる。
【００７３】
本明細書に用いられる用語「ゲノム標的の状態」は、標的核酸（染色体または染色体外）の存在または不在、ゲノム標的のメチル化または非メチル化を含むことができ、標的は、生物のその集団内の特定の細胞型に存在する正常または多型の核酸であるか、感染性の微生物またはウイルスにより導入された標的であるか、または外部の動揺物質（ｐｅｒｔｕｒｂｏｇｅｎ）の結果としての増幅、移動、転移または転座により応答した標的であり得る。
【００７４】
本明細書に用いられる用語「修飾する」とは、非メチル化シトシンを他のヌクレオチドに変換することを意味する。試剤が非メチル化シトシンをウラシルへと修飾し、次いでこれが修飾核酸の増幅中にチミンとして置換されることが好ましい。
【００７５】
本明細書に広い意味で用いられる用語「複雑性減少」とは、真核生物、原核生物、またはウイルス／ウイロイドの生命形態で天然に生じたものでも、合成的に製造されたものでも、（または、ＲＮＡウイルス／ウイロイドゲノムとして天然に発生し、その後ｃＤＮＡ形態へとコピーする）、４種の一般的塩基、Ｇ、Ａ、ＴおよびＣを含有するＤＮＡゲノムが、重亜硫酸修飾の結果、Ｔｓの頻度の増加およびＣｓの頻度の減少を受けることを意味する。この変換により、かつて通常のゲノムであったものが、生物学的に機能的な有意性を持たず、「ゲノムゴースト」からなる「誘導体」と称されるポリマーの配列へと変化する。
【００７６】
本明細書に用いられる用語「複雑性減少」は、ＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴである配列（配列番号：７６）対ＡＡＡＡＡＡＡＴＴＴＴＴＴＴである同じ長さの配列（配列番号：７７）の間の何らかの数学的な複雑性の違いなど、誘導体集団において塩基が生み出す順序を言うのではない。本明細書に用いられる「複雑性減少」は、元のゲノムと不変位置１からｎまでで対象となっている塩基を有するその変換誘導体との双方を有する分子プローブまたはプライマーにより評価される２つの分子（１つは、真のゲノムで他方は誘導体）において塩基の位置が変化しないことを称する。特定のヒト女性の３０億塩基対ハプロイドヒトゲノムの場合、「トップ」鎖状の不変位置は、ｎが３，０００，０００，０００位である、１からｎとして定義される。１からｎの配列で、ｉ番目の塩基が、元のゲノムの「トップ鎖」においてＣであるならば、変換されたヒト誘導体において、ｉ番目の塩基はＵである。７９０４塩基対のＨＰＶ１６ウイルスゲノムの場合、不変位置は、１から７９０４と定義され、ｎは７９０４である。配列１からｎで、ｉ番目の塩基が、元のゲノムの「トップ」鎖においてＣであるならば、変換されたＨＰＶ誘導体において、ｉ番目の塩基はＵである。アラインメントにおいて異なるタイプ、または複数のタイプのＨＰＶ誘導体が用いられ、それらのウイルス誘導体の長さが異なる場合、ｉ番目の塩基の正しい判定には、通常の複数ゲノムアラインメントに関するMorgenstern, B. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93, 12098-12103により例示されたような慎重な生命情報科学的な複数のアラインメントが必要である。
【００７７】
個々のウイルスゲノムに、またはヒト細胞とウイルスゲノム双方、またはそれらの部分を含有する臨床サンプルに見出されるウイルスゲノムの混合物に適用した場合のこのような変換処理の結果を明らかにしている一例がある。
【００７８】
５’ＧＧＧＧＡＡＡＴＴＣ３’である通常の１０塩基のゲノム配列（配列番号：７８）（「トップ」鎖）は、５’ＧＡＡＴＴＴＣＣＣＣ３’（配列番号：７９）である相補的な「ボトム」鎖を有することになる。編成処理および重亜硫酸処理の後、「トップ」鎖は、５’ＧＧＧＧＡＡＡＴＴＵ３’（配列番号：８０）となり、「ボトム」鎖は、５’ＧＡＡＴＴＴＵＵＵＵ３’（配列番号：８１）となる。シトシンはウラシルに変換しており、ｅｘ ｖｉｖｏのＤＮＡポリメラーゼ機序による認識の点で、ウラシルはチミンと等価であるため、トップ鎖誘導体は事実上、５’ＧＧＧＧＡＡＡＴＴＴ５’ＧＧＧＧＡＡＡＴＴＴ３’（配列番号：８２）であり、ボトム鎖誘導体は、５’５’ＧＡＡＴＴＴＴＴＴＴ３’（配列番号：８３）である。したがって、当初は通常のゲノムが、トップ鎖とボトム鎖内に５つのＣおよび５つのＴを有したものから、今は、トップ鎖とボトム鎖内にＣを有さず、１０のＴを有するポリマーの誘導体集団へと変換されている。通常ゲノムは、４塩基のものから３塩基の誘導体へと減少した。それは、「複雑性減少」であった。また、誘導体集団における「座位」とは、その誘導体内部の位置的な座標を言うに過ぎない。例えば、重亜硫酸変換後、座位は、いずれのネットワークレベルにおいても、機能的な生物学的特性を全て剥ぎ取られている。以前はコードし、調節しまたは構造的であったが、今では、両方の鎖において生物学的に意味のないものである。したがって、誘導体集団は以前はゲノムの相補鎖であったものの、今は情報的に無能な２つの非相補的ゴーストである無機能の化学的ポリマーの集合である。さらに、誘導体はユニークであり、統計的偶然による以外には、何らかの細胞の、（またはウイルスの、またはウイロイドの）生命形態において、通常の進化的過程によって生じた配列を表すものではない。
【００７９】
プローブおよび複雑性減少
第１のものは通常のゲノムであり、第２のものは「変換された」もの（誘導体）である、２つの同じサイズの物質において、所与の分子条件セットの下で、特定の座位に対するプローブのハイブリダイゼーションと同じ特異性とレベルを達成するために必要なプローブ長の増加（ＩＰＬ）の観点で、本発明者らは、本明細書において、分子プローブの形式的意味において、「複雑性減少」を定義している。分子の有用性を目的として、ＩＰＬは、１以上の整数である。各座位は、通常ゲノムならびに変換誘導体において、同じ位置に留まる。
【００８０】
実際に、「複雑性減少」は、プローブ長において測定できる。例えば、平均して、１１量体のオリゴヌクレオチドプローブは、それが、４種の塩基、Ｇ、Ａ、ＴおよびＣからなる４，１９４，３０４塩基（４１１は４，１９４，３０４に等しい）の通常ゲノムのセットにおいて、完全にハイブリダイズする唯一の位置を有する。しかし、このような当初４，１９４，３０４塩基のゲノムが、ＨＧＳ重亜硫酸方法論によって、いったん変換されると、その変換された誘導体は、今やＴが多く複雑性が低い。しかし、他の新たに生じた１１塩基配列の位置は、重亜硫酸変換の結果、ｄｅ ｎｏｖｏに生じたものであるため、この複雑性減少の結果は、以前の唯一の１１量体プローブが、複雑性減少誘導体の内部でそれがハイブリダイズできる唯一の部位をもはや有さないということになる。これらの新たに生じた配列は、本明細書においてデコイ座位と称される。このように、元の座位を見出しハイブリダイズするためには、およそ１４量体のプローブが必要になる。この例では、プローブ長の増加は、およそ０から３塩基である。
【００８１】
直観に反するように思われるが、今やＴの多い誘導体における元の座位を検出するためには、増加したオリゴヌクレオチドプローブ長が必要とされ得る。したがって、誘導体の複雑性減少とは、座位の「トップ」鎖および「ボトム」鎖が誘導体における元のユニークな部位を見出すためには、より長いプローブを設計する必要があり得ることを意味する。しかし、下記に示すように、挿入核酸（ＩＮＡ）プローブの使用により、従来のオリゴヌクレオチドよりもはるかに短いプローブが可能になるため、長さの増加に関するこの要件は克服される。
【００８２】
また、本明細書に用いられる「複雑性減少」は、サンプル中ＨＰＶの存在の判定において使用できるプローブ配列の種々の構造に適用される。さらに、このようなプローブは、ＰＮＡの主鎖などの非通例的主鎖を有し得るか、またはＩＮＡに記載されているような主鎖に対する修飾付加を有し得る。このように、誘導体は、プローブが挿入偽ヌクレオチド（ＩＮＡにおけるような）などの追加要素を有するかどうかに関わりなく、複雑性減少を有すると考えられる。例としては、これに限定はしないが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ＭＮＡ、アルトリトール核酸（ＡＮＡ）、ヘキシトール核酸（ＨＮＡ）、挿入核酸（ＩＮＡ）、シクロヘキサニル核酸（ＣＮＡ）およびそれらの混合物とそれらのハイブリッド、ならびにこれに限定はしないが、それらのホスホロチオエート、メチルホスホレート、ホスホルアミダイト、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホトリエステルおよびホスホボラノエート（ｐｈｏｓｐｈｏｂｏｒａｎｏａｔｅ）などのリン原子修飾体が挙げられる。非天然ヌクレオチドとしては、これに限定はしないが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＩＮＡ、ＨＮＡ、ＭＮＡ、ＡＮＡ、ＬＮＡ、ＣＮＡ、ＣｅＮＡ、ＴＮＡ、（２’−ＮＨ）−ＴＮＡ、（３’−ＮＨ）−ＴＮＡ、α−Ｌ−リボ−ＬＮＡ、α−Ｌ−キシロ−ＬＮＡ、β−Ｄ−キシロ−ＬＮＡ、α−Ｄ−リボ−ＬＮＡ、［３．２．１］−ＬＮＡ，ビシクロ−ＤＮＡ、６−アミノ−ビシクロ−ＤＮＡ、５−エピ−ビシクロ−ＤＮＡ、α−ビシクロ−ＤＮＡ、トリシクロ−ＤＮＡ、ビシクロ［４．３．０］−ＤＮＡ、ビシクロ［３．２．１］−ＤＮＡ、ビシクロ［４．３．０］アミド−ＤＮＡ、β−Ｄ−リボピラノシル−ＮＡ、α−Ｌ−リキソピラノシル−ＮＡ、２’−Ｒ−ＲＮＡ、α−Ｌ−ＲＮＡまたはα−Ｄ−ＲＮＡ、β−Ｄ−ＲＮＡの内部に含まれるヌクレオチドが挙げられる。さらに、これに限定はしないが、メチルイミノメチル、ホルムアセテート、チオホルムアセテート、およびアミドを含む結合基などの非リン含有化合物が、ヌクレオチドへの結合に使用できる。特に、核酸および核酸類縁体は、１つ以上の挿入偽ヌクレオチド（ＩＰＮ）を含み得る。ＩＰＮの存在は、核酸分子に関する複雑性描写の部分にもならず、ＰＮＡにおけるようなその複雑性の主鎖部分でもない。
【００８３】
「ＩＮＡ」とは、本明細書に参照として組み込まれているＷＯ０３／０５１９０１、ＷＯ０３／０５２１３２、ＷＯ０３／０５２１３３及びＷＯ０３／０５２１３４（Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ Ｐｔｙ Ｌｔｄ）の教示による挿入核酸を意味する。ＩＮＡは、１つ以上の挿入偽ヌクレオチド（ＩＰＮ）を含むオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類縁体である。
【００８４】
「ＨＮＡ」とは、Van Aetschot et al., 1995により記載された例のような核酸を意味する。
【００８５】
「ＭＮＡ」とは、Hossain et al, 1998により記載された核酸を意味する。
【００８６】
「ＡＮＡ」とは、Allert et al, 1999により記載された核酸を意味する。
【００８７】
「ＬＮＡ」とは、ＷＯ９９／１４２２６(Exiqon)に記載されたＬＮＡ分子であり得る。ＬＮＡは、ＷＯ９９／１４２２６の要旨に示されている分子から選択されることが好ましい。ＬＮＡは、Singh et al, 1998, Koshkin, et al, 1998またはObika et al., 1997に記載された核酸であることがより好ましい。
【００８８】
「ＰＮＡ」は、例えば、Nielsen et al, 1991に記載されたペプチド核酸を称する。
【００８９】
プローブ長および座位における「トップ」鎖および「ボトム」鎖に関する種々のプローブ配列の観点で定義された複雑性減少の原理は、種々の分子環境における種々の構造のプローブおよびプライマー、または修飾されたプローブおよびプライマーに適用できる相対的用語である。ＩＮＡの一例は、この相対性を明らかにする。標準的なオリゴヌクレオチドプローブ以上にＩＮＡが有する著しい利点は、ＩＮＡが従来のオリゴヌクレオチドよりはるかに短く作製でき、しかも等価なハイブリダイゼーション結果を達成できることである（ＩＮＡの長さ＜オリゴヌクレオチドの長さ）。これは、ＩＮＡの構造的要素である挿入偽ヌクレオチドＩＰＮ（Ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｉｎｇ Ｐｓｅｕｄｏ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ）がもたらす、相補的ＤＮＡに対するＩＮＡの高い親和性による。したがって、所与の数のＩＰＮを有するＸ塩基長のＩＮＡが、非変換ゲノムに対する特異的なハイブリダイゼーションを首尾よく達成することが要求される場合、同じ分子条件下で、重亜硫酸変換ゲノムにおける同じ座位にハイブリダイズするために、Ｘを超える長さのＩＮＡが依然として必要となる。
【００９０】
また、宿主−病原体相互作用の場合、（ウイルスゲノムと宿主ゲノムが同じ臨床サンプル中に存在するが、濃度が著しく異なる場合）、「複雑性減少」およびＩＮＡの使用によって、特に、ＩＮＡは、ＡＴの多い核酸配列に優先的にハイブリダイズするため、ハイブリダイゼーションプロトコールに新たな有利な条件が導入されることに留意することが大切である。例えば、非変換ＨＰＶ ＤＮＡの純粋溶液中、７９０４塩基のＨＰＶ１６ゲノムにおける、ある唯一の座位を見出しハイブリダイズするために必要とされるウイルスのプローブまたはプライマーのおよその長さは、およそ６量体プローブ／プライマーである（４６は４０９６塩基に等しい）。重亜硫酸処理をしてＴの多いＨＰＶ誘導体を作出した後は、同じ分子条件下、この唯一の座位を見出すためには、およそ８量体のプローブまたはプライマー（３８は６５６１塩基に等しい）が必要である。
【００９１】
しかし、７９０４塩基対のＨＰＶゲノムとおよそ３，０００，０００，０００塩基対のヒトゲノムなど、極めてサイズの異なる２つのゲノムが、当初サンプル中に存在し、双方のゲノムがそれぞれの誘導体へと「複雑性減少」している場合、あるウイルス固有の配列に対するプローブまたはプライマーは、Ｔリッチのヒト誘導体が圧倒的に優勢である溶液中で、プローブまたはプライマーの誘導体標的にハイブリダイズする。例えば、サンプル中の各ヒト誘導体につき１つのＨＰＶ誘導体があるとすると、ウイルスプローブまたはプライマーは、３，０００，００７，９０４塩基対の誘導体にハイブリダイズする。そうすると、ある固有のウイルス配列のアッセイには、ヒト配列に新たに生じたウイルスデコイ座位から発せられるハイブリダイゼーションシグナルを避けるために、およそ１４量体のプローブまたはプライマーが必要となる。
【００９２】
プローブおよびプライマーの長さに関係する「複雑性減少」問題に加えて、ＰＣＲ反応に用いられる縮重プライマーの数が多くない場合、ハイブリダイゼーションの動態およびＰＣＲ産物の検出能力にも重要な変化がある。ＨＰＶタイプ間の広範なゲノムの変動により、先行技術の増幅では、複数のＰＣＲ反応から関連増幅核酸産物またはアンプリコンを生じさせるために、多数の縮重プライマーの使用が必要であった。しかし、プローブ／プライマープール中に縮退が多くなるほど、溶液中の個々の任意の関連プローブまたはプライマーの濃度は低くなる。このような状況は、複雑な真核生物のゲノム上で実施されるドライバー−トレーサー反応におけるハイブリダイゼーションの動態と適合度に類似しており、1966 by Waring, M. & Britten R.J. Science, 154, 791-794;および1968 by Britten, R.J. and Kohne D E., Science, 161, 529-540（およびそれらの中のCarnegie Institution of Washington Yearbook reports由来の初期文献）で、初めて化学文献に紹介された。
【００９３】
また、ＨＰＶ−ＰＣＲプライマーがヒト誘導体に比較して高濃度である場合、ハイブリダイゼーション反応を支配するのは、ＨＰＶプライマーである。例えば、サンプル中のウイルス負荷が高ければ（例えば、単一ヒトゲノムにつき約１００，０００ＨＰＶゲノム）、ウイルスプライマーのハイブリダイゼーションの速度は、１つのヒト誘導体につきただ１つのＨＰＶ誘導体が存在する場合の１００，０００倍になるであろう。前者の場合、ウイルスの要素は、溶液中で、それがゲノムの高反復要素であるかのようにふるまう。しかし、単一のＰＣＲ反応によって、臨床サンプル中の異なるリスクを有する異なるＨＰＶタイプを検出するためには、各ＨＰＶタイプとは異なるプライマーが典型的に必要とされ、縮退物の使用が必要となる。従来の、混合された通常のゲノム上での多重ＰＣＲ反応では、最終的に、プライマー集団が組み合わせ上でずれることがある。ハイブリダイゼーション部位に対して競合する数千の異なるプライマーが事実上存在し得、ＰＣＲ増幅がうまく行かないか、または増幅された核酸産物の分布が、サンプル中に存在する特定のＨＰＶタイプに有利となって偏りが強くなるという最終結果となる。このことは、従来の非変換ゲノムが存在する臨床サンプルからのデータ作出に大きな問題となる。
【００９４】
本発明に係る「複雑性減少」は、ＩＮＡプローブおよびプライマーの任意使用と組み合わせて、これら先行技術の問題における困難な事項の多くを克服する。
【００９５】
プライマーおよび複雑性減少
変換された分子集団（誘導体）が、変換された状態に留まるか、それともさらなる増幅に供されるかに依って、複雑性減少は異なることに留意されたい。上記で考察した例では、誘導体集団は、臨床サンプル中に存在するとおりに非増幅のままであった。トップ鎖（５’ＧＧＧＧＡＡＡＴＴＣ３’）（配列番号：７８）およびボトム鎖（５’ＧＡＡＴＴＴＣＣＣＣ３’）（配列番号：７９）はそれぞれ、５’ＧＧＧＧＡＡＡＴＴＵ３’（配列番号：８０）および５’ＧＡＡＴＴＴＵＵＵＵ３’（配列番号：８１）に変換されたことを思い出されたい。シトシンはウラシルに変換され、ウラシルは、ｅｘ ｖｉｖｏでのＤＮＡポリメラーゼ機序による認識に関してチミンと等価であるため、トップ鎖誘導体は事実上、５’ＧＧＧＧＡＡＡＴＴＴ３’（配列番号：８２）であり、ボトム鎖誘導体は、５’ＧＡＡＴＴＴＴＴＴＴ３’（配列番号：８３）である。しかし、誘導体集団が今、酵素学的手段によってｅｘ ｖｉｖｏで複製されるならば、結果として、４つの異なる誘導体集団が生じ、これらは、［５’ＧＧＧＧＡＡＡＴＴＴ３’（配列番号：８２）］、［５’ＡＡＡＴＴＴＣＣＣＣ３’（配列番号：８４）］、［５’ＡＡＡＡＡＡＡＴＴＣ３’（配列番号：８５）］および［５’ＧＡＡＴＴＴＴＴＴＴ３’（配列番号：８６）］である。これらの誘導体は、確かに複雑性が減少しているが、変換直後に存在する元の非複製誘導体と同程度ではない。したがって、ＰＣＲプライマーが元の非複製誘導体鎖に対して作製される場合、トップ鎖またはボトム鎖いずれに対するプライマーかの選択が結果に影響するため、どちらの増幅核酸産物を調べたいかを思慮深く決定することが必要である。変換されたゲノムの結果を構成する２つの非相補的誘導体集団対複製後に存在する４つの誘導体集団の取り扱いの間の違いは直観的には明らかではないが、プライマー設計にとって重要な意味を有し得る。
【００９６】
最後に、明確化するために以前紹介されたより長いプローブまたはプライマーの問題、および定量化された「複雑性減少」は、分子の誘導体集団内のユニークな配列を探索する際に関連性を仮定するだけである。しかしながら、本発明の重要な基礎は、ウイルスタイプ間で最も類似している誘導体座位の選択であると考えられ、必要に応じて、全てのウイルスタイプを１つの最初の試験でアッセイすることが可能になる。これらの選択される座位は、トップ鎖誘導体とボトム鎖誘導体のどちらが選択されるかによって変わり、このような座位は、ボトム鎖と比較してトップ鎖では異なる領域にある。
【００９７】
誘導体集団においてより長いプローブおよびプライマーが要求されるという実用上の重要性は、ＨＧＳ重亜硫酸処理を用いた変換によって、より類似した配列の座位が生じることでウイルス検出について得られる本発明の実用的利益によって目立たなくなる。また、従来のオリゴヌクレオチドの場合よりも、より短いプローブおよびプライマー分子が可能になるＩＮＡの任意使用によって目立たなくなる。さらに、誘導体集団に対する入れ子型ＰＣＲアプローチの適用では、増幅核酸産物の生成を可能にするために、同じ近傍に結合する２つのプライマーが必要である。ＰＣＲプライマーのうちの１つが、標的近傍の外側にあるデコイ座位に配列類似性を有している場合は、そのプライマー対の他方のメンバーが、同じ非標的領域にやはり近傍のデコイ座位を有するという可能性はない。そのような入れ子ＰＣＲアプローチの内側プライマーが第１ラウンドプライマーと同じ非標的領域にデコイ座位をやはり有するという可能性はさらにない。偽性増幅の可能性はきわめて低い。
【００９８】
本明細書に用いられる用語「ウイルス特異的核酸分子」とは、ウイルスまたはウイルスタイプに特異的な１つ以上の配列を有する、判定された、または得られた分子を意味する。
【００９９】
本明細書に用いられる用語「ウイルスの分類学レベル」は、タイプ、サブタイプ、変異体および遺伝子型を含む。ウイルスゲノムの流動性は認められている。種々のウイルス集団は、それらが、通常のＤＮＡ修復がもはや機能していない一定の癌性細胞内にある場合、さらに、単一ヌクレオチド変化について多型であり得るか、高変異性または低変異性に供され得る。
【０１００】
本明細書に用いられる用語「ウイルス特異的核酸分子」とは、ウイルスまたはウイルスタイプを示し得る、処理された、または変換されたウイルスＤＮＡに存在する特異的核酸分子を意味する。
【０１０１】
本明細書に用いられる用語「ウイルスタイプ」とは、以前単離され特徴付けられたウイルスタイプと９０％未満の配列類似性がある、任意の既存のまたは新規のウイルス集団を称する。
【０１０２】
本明細書に用いられる用語「ウイルスサブタイプ」とは、以前のサブタイプに比較して、配列類似性が９０〜９８％の範囲にある、任意の既存または新規のウイルス集団を称する。
【０１０３】
本明細書に用いられる用語「ウイルス変異体」とは、配列類似性が、以前の変異体の９８〜１００％の間にある、任意の既存のまたは新規のウイルス集団を称する。
【０１０４】
本明細書に用いられる用語「ＨＰＶ遺伝子型」は、以下のとおりである。遺伝子型は、任意の他の完全に配列決定されたＨＰＶゲノムと１塩基だけ少なくとも異なる任意の完全に配列決定されたＨＰＶゲノムであり、その単一塩基がＧ、Ａ、ＴまたはＣとして存在するものも、標準的なコンパレーターにおける所与の位置（すなわち、１位から７９０４位までのＨＰＶ１６）における塩基が欠失、付加、増幅または転移によって他の部位へ変わっているものも含む。本発明者らは、先行技術のＢＬＡＳＴ法を用いて、ＨＰＶ１６標品に対して全ての他のＨＰＶゲノム型を比較した。
【０１０５】
本明細書に用いられる用語「ＨＰＶ特異的核酸分子」とは、ウイルスまたはウイルスタイプを示し得る、処理または変換されたウイルスＤＮＡに存在する特異的核酸分子を意味する。
【０１０６】
本明細書に用いられる用語「ＨＰＶタイプ」とは、以前単離され特徴付けられたＨＰＶタイプとの配列類似性が９０％未満である任意の既存のまたは新規のＨＰＶ集団を称する（1993, Van Rast, M.A., et al., Papillomavirus Rep, 4, 61-65; 1998, Southern, S.A. and Herrington, C.S., Sex. Transm. Inf. 74, 101-109）。
【０１０７】
本明細書に用いられる用語「ＨＰＶサブタイプ」とは、以前のサブタイプに対する配列類似性が９０〜９８％の範囲である任意の既存の、または新規のＨＰＶ集団を称する（1993, Van Rast, M.A. et al., Papillomavirus Rep, 4, 61-65; 1998, Southern, S.A. and Herrington, C.S., Sex. Transm. Inf. 74, 101-109）。
【０１０８】
本明細書に用いられる用語「ＨＰＶ変異体」とは、配列類似性が以前の変異体の９８〜１００％の間にある任意の既存のまたは新規のＨＰＶ集団を称する(1993, Van Rast, M.A., et al., Papillomavirus Rep, 4, 61-65; 1998, Southern, A. and Herrington, C.S. Sex. Transm. Inf. 74, 101-109）。
【０１０９】
本明細書に用いられる用語「ＨＰＶ遺伝子型」とは、以下のとおりである。遺伝子型は、任意の他の完全に配列決定されたＨＰＶゲノムと１塩基だけ少なくとも異なる任意の完全に配列決定されたＨＰＶゲノムであり、その単一塩基がＧ、Ａ、ＴまたはＣとして存在するものも、標準的なコンパレーターにおける所与の位置（すなわち、１位から７９０４位までのＨＰＶ１６）における塩基が欠失、付加、増幅または転移によって他の部位へ変わっているものも含む。本発明者らは、先行技術のＢＬＡＳＴ法を用いて、ＨＰＶ１６標品に対して全ての他のＨＰＶゲノム型を比較した。
【０１１０】
表１は、ヒト患者の液体ベースの細胞診断サンプルからＨＰＶ特異的産物を生成させたオリゴヌクレオチドプライマーのリストを提供している。プライマーは全て、種々のＨＰＶタイプのトップ鎖誘導体に特異的である。プライマーの呼称は以下のとおりである：
【０１１１】
ＨＰＶタイプ−誘導体領域−プライマー番号は以下の設計による。
【０１１２】
【表１】
【０１１３】
例えば、最上の行は、Ｅ７誘導体領域におけるＨＰＶ１６についてのプライマー＃１を示している。ＨＰＶ−ＵｎｉおよびＨＰＶ−ＨＭは、縮退オリゴヌクレオチドプライマーを表している。非標準的記号は以前に定義されたとおりである。
【０１１４】
【表２−１】
【表２−２】
【表２−３】
【０１１５】
ウイルスアッセイ
本発明によるアッセイの第１の部分として用いられるウイルス検出はまた、細胞集団内の細胞状態の変化の評価、感染細胞内の転写、プロテオミック、代謝物またはメチロミックのネットワークの攪乱により実証されたリスク評価、感染進行のモニタリングおよび抗ウイルス療法などの治療措置を評価するために、全く異なるタイプの他のアッセイと組み合わせることができる。
【０１１６】
例えば、ウイルス特異的核酸分子を測定する分子アッセイは：
−組織切片における蛍光シグナルの自動定量化に関してマルチ−エピトープ−リガンド−カートグラフィ（Ｍｕｌｔｉ−Ｅｐｉｔｏｐｅ−Ｌｉｇａｎｄ−Ｋａｒｔｏｇｒａｐｈｉｅ）（ＭＥＬＫ）システムなどのパターン認識およびハイスループットロボット画像テクノロジーを用いるアッセイ、
−異数性、または異常オルガネラ（数、タイプまたは形態学的外観の点で）など、細胞内の染色体妨害の全体レベルを検出する蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、細胞学的または組織学的分析に関する光、共焦点、送信または電子顕微鏡分析を用いるアッセイ、
−核酸またはポリペプチドアプタマー；スピーゲルマー（鏡像高アフィニティーオリゴヌクレオチドリガンド）；分子の超感度非同位体検出に関する多色ナノクリスタル（量子ドットバイオ複合体）、または細胞表面もしくは内部成分に関するバイオマーカー；指数濃縮度によるリガンドの系統的発生（ＳＥＬＥＸ）および種々の細胞成分に標的化された高アフィニティーアプタマーリガンドを含む組み合わせ化学的アプローチを用いるアッセイ、
−細胞または免疫磁気細胞濃縮テクノロジー、フローサイトメトリーによりインターフェースさせたマイクロスフェアベーステクノロジー、あるいは種々の核酸またはペプチド／タンパク質部分を含有するコロイド懸濁液の光学的バーコードのレーザー捕捉を用いるアッセイ、
−複製、欠失、転移、再配置およびそれらの関連ｉｎ ｓｉｔｕテクノロジーなどの全体ゲノムインバランスを検出する目的で単一細胞比較ゲノムハイブリダイゼーションを用いるアッセイ、
−遺伝子発現の連続分析（ＳＡＧＥ）、全遺伝子発現分析（ＴＯＧＡ）、順序無作為化アドレス可能高密度光ファイバーセンサアレイ、マイクロビーズ上の超並列符号配列決定（ＭＰＳＳ）を含むロボゲノムマイクロアッセイテクノロジーなどの転写調節を通知するアッセイ、
−タンパク質マイクロアレイ、マトリックス補助レーザー脱離イオン化−飛行時間（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）法、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析（ＦＴＩＣＲ）、ＬＣ ＭＳ−ＭＳおよび迅速蒸発冷却質量分析（ＲａｐＥｖａｐ ＭＳ）による細胞分析など、種々のテクノロジーを用いるプロテオミック調節を通知するアッセイ、
−検出レベルが、ゼプトモル（１０−２１）感度に近接するマルチフォトン検出（ＭＰＤ）を用いるアッセイ、
−正常から子宮頚癌への所与の経路に沿って細胞集団の位置を判定するため；好ましくは、ウイルス感染により影響を受ける細胞、または感染部位または炎症部位に動員された免疫細胞におけるゲノム遺伝子座のメチル化特性の変化を決定するため、臨床サンプルから細胞のメチロームを識別するためにメチロミックテクノロジーを用いるアッセイ、
と組み合わせることができる。
【０１１７】
上記テクノロジーの幾つかは、以前に評価されている（2001, Miklos and Maleszka, Proteomics, 1, 30-41）。
【０１１８】
データ採取、統合および管理システム
本発明に関連する開示資料に関するデータ採取およびデータ管理システムは、臨床患者データと組み合わせることができ、特殊アルゴリズム法を用いて分析できる。ロボットプラットフォーム管理およびデータ採取を自動的に保存でき、採取データは、gene ontologies, (GO)、National Library of Medicine’s Medical Subject Headings (MeSH) thesaurusにより代表されるdisease ontologies, Online Mendelian Inheritance in Man, (OMIM)またはHuman Genome Mutation Database (HGMD)またはPubMedのような知識データベースとインターフェースする情報科学基礎構造およびソフトウェアツールと組み合わせることができる。最新のヒトゲノムアセンブリとインターフェースし、ＧｅｎｂａｎｋおよびＲｅｆＳｅｑなどの供給源からの情報へアクセスし、ダウンロードするソフトウェアパイプラインは、ＨＰＶで感染するか、または体内のどこかでＨＰＶの存在による細胞により影響を受けた細胞のゲノム状態に対する通知アッセイと組み合わせることができる。
【０１１９】
ＨＰＶデータを臨床および関連生命情報科学データと共に統合するデータベース基盤では、例えば、より良好なソフトウェア操作およびデータベース管理を容易にする疎結合モジュラーアーキテクチャを利用することができる。関連データベース管理システム（ＲＤＢＭＳ）（Ｐｏｓｔｇｒｅｓｑ １ ７．３バージョンなど）は、公開供給源であってロバストであり、ＨＰＶアリーナにおける臨床成績を評価し、より良好に予測するための統合システムの一部の例として役立つ。ウェブベースのグラフィックユーザーインターフェース（ＧＵＩ）を含むさらなる機能により、極めて多種多様なフォーマットで利用できる治療および製薬データと共に分子ＨＰＶデータと組み合わせるために集積細胞学的および組織学的分析を可能にするであろう。画像解析用の増強デジタルテクノロジー、病理学者により共有されるリモート画像および自動可視化システムの統合は、自動分子キットプラットフォームの集積部分として想定されている。
【０１２０】
細胞サンプリング
ウイルス検出プロトコールは、前胚盤胞段階、胚組織、出生時材料、死体または法医学供給源からのサンプルなど、体内の任意の部分からのサンプルに対して実施できる。それらは、子宮頚部および膣などの頚膣部領域に由来することが好ましいが、皮膚源に由来し得る。それらは、子宮頚部悪性転換帯に由来することが好ましい。サンプルは、ＣｅｒｖｅｘＢｒｕｓｈ、セラパック（Ｔｈｅｒａｐａｋ）社、米国カリフォルニア州アーウィンデール；Ｄｉｇｅｎｅ Ｃｅｒｖｉｃａｌサンプラー子宮頚部ブラシ、ダイジーン（Ｄｉｇｅｎｅ）社、米国メリーランド州ガイサーバーグ；プラスチックスパチュラ／ブラシの組み合わせ、クーパー・インスツルメンツ（Ｃｏｏｐｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）、米国フロリダ州ハリウッドを用いるか；または男性または女性患者双方の会陰領域からのサンプルを得るためにはダクロン綿棒または任意の好適な材料を用いて、もしくは針生検などの任意の標準的生検手法により採取できる。サンプルは、ＰｒｅｓｅｒｖｅＣｙｔｅ、サイティク（Ｃｙｔｙｃ）社、米国マサチューセッツ州またはトリパス・イメージングバーリントン（ＴｒｉＰａｔｈ ｉｍａｇｉｎｇ Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ）米国ノースカロライナ州からのＡｕｔｏＣｙｔｅ ＰＲＥＰなどの種々の媒体に入れることができる。最初の試験は、液体ベースの細胞学的診断に対して実施されるが、パラフィン切片およびスライドなどの平面プラットフォームもまた好適である。
【０１２１】
キット
本発明は、種々のキットまたはキットの組合せで実施でき、マニュアル、半自動または完全ロボットプラットフォームにより例示することができる。好ましい形態において、ＭｅｔｈｙＥａｓｙ（商標）またはＨｉｇｈＴｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ＭｅｔｈｙＥａｓｙ（商標）キット（ヒューマンジェネティック・シグナチュアズ・プティ）（Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ Ｐｔｙ）社、オーストラリア）は、ＥｐＭｏｔｉｏｎなどのロボットプラットフォームを用いて９６または３８４プレート中、核酸の変換を可能にする。
【０１２２】
ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）
成熟ヒトパピローマウイルスＤＮＡは、２種のウイルス性コードタンパク質からなる正二十面体カプシドコート内にカプセル化される。二本鎖循環式ＤＮＡゲノムは、ＨＰＶ１６に関して長さが７９０４の塩基対であるが、共通の媒体リスクタイプの間で、ＨＰＶ５１の７８０８の塩基対からＨＰＶ５２の７９４２の塩基対まで変わる。ウイルスゲノムの領域は、循環式分子上で生じる順序で下記に提供される。ウイルスは、ＵＲＲと称される非コード領域を有し、Ｅ６、Ｅ７、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ４、Ｅ５、Ｌ２およびＬ１と表されるコード領域数を有する。幾つかのウイルスタイプは、機能性Ｅ５領域を欠くことができる。Ｅ４領域は、細胞質ケラチンネットワークの混乱を生じる複数のタンパク質産物を産生し、コイロサイトーシスと称される細胞質「ハロ効果」に導く。種々のＨＰＶタイプは、エピテリオトピックであり、感染後、コイロサイトーシス、異常角化症、多核形成、核拡大などの異常状態、および複数扁平上皮内病巣（ＳＩＬ）になり得、これら全ての変化は子宮頚部にのみに適用される。ウイルス性感染および染色体異常は、子宮頚部癌に相関し得るが、マルチパラメトリック変化は新生物病巣に見られ、ウイルス感染、ウイルス遺伝子発現、ウイルス組込み、細胞分化およびゲノム異常性との関連に対する理解は極めて乏しい（1998, Southern, S.A. et al., Sex Transm Inf., 74, 101-109）。この理由は、種々の遺伝子背景において種々のウイルスタイプおよびそれらの異なる効果を検出することが、このように極めて重要であるからである。
【０１２３】
また、ＨＰＶタイプを皮膚および粘膜カテゴリーならびに高リスク、中等度リスクおよび低リスクカテゴリーに割り振ることは先行技術に受入れられているが、これらのカテゴリーは、幾つかほころびを示しており、ＨＰＶの皮膚および粘膜のサブカテゴリーの間でさえも重複がある。例えば、ＨＰＶ７は、口腔病巣と同様に皮膚疣にも関連している。ＨＰＶ２６は、会陰病巣と同様に全身性疣症との関連でも単離されている。さらに、ＨＰＶ６およびＨＰＶ１１は、低リスクタイプとして分類されているが、それらは、喉頭部および外陰部癌およびコンジローム尖圭と同様にＢｕｓｃｈｋｅ−Ｌｏｗｅｎｓｔｅｉｎ腫瘍から単離されている（1986, Boshart, M. et al., J. Virology, 58, 963-966; 1992, Rubben, A., et al., J Gen Virol., 73, 3147-3153）。
【０１２４】
宿主ゲノムへのウイルス組込みは、Ｅ１とＬ１遺伝子領域との間の線形化に至り、ＵＲＲ、Ｅ６およびＥ７領域は保持されるが、Ｅ１、Ｌ１およびＬ２などの遺伝子領域は欠失し、Ｅ２は不活化または欠失する。Ｅ６およびＥ７領域は一般に、子宮頚部癌では保持されるが、一方、Ｅ２タンパク質発現を欠く。Ｅ２損傷は、予後の不良と生存の短縮化とに関連している。
【０１２５】
患者のサンプル
細胞サンプルは、米国サイティック（Ｃｙｔｙｃ）社により供給された子宮頚部サンプリングデバイスを用いて子宮頚部の表面から家庭医により採取された。患者からは、サンプルをルーチンの癌スクリーニングプログラムの一部として、または先の子宮頚部疾患のモニタリング試験として採取されるサンプルに対して患者から同意を得た。医師は、採取デバイスからの細胞を細胞の保存用メタノール／水溶液に移し、試験するために実験室に輸送する。この細胞サンプルは、ルーチンの形態学的調製を用いて前癌またはウイルス感染による変化に関して評価した。細胞サンプルの個別の分割量を、本明細書に概説されたＤＮＡ試験用に用いた。
【０１２６】
ＤＮＡの抽出
ウイルスＤＮＡは、好適な供給源から得ることができる。例としては、これに限定はしないが、細胞培養物、ブロス培養物、環境サンプル、臨床サンプル、体液、液体サンプル、組織などの固体サンプルが挙げられる。サンプルからのウイルスＤＮＡは、標準的な手法により得ることができる。パラフィン固定材料に関する好適な抽出物の例は、以下のとおりである。対象のサンプルを、４００μｌの７Ｍ塩酸グアニジニウム、５ｍＭ ＥＤＴＡ、１００ｍＭトリス／ＨＣｌのｐＨ６．４、１％トリトン−Ｘ−１００、５０ｍＭプロテイナーゼＫ（シグマ（Ｓｉｇｍａ））、１００μｇ／ｍｌ酵母ｔＲＮＡに入れる。このサンプルを、使い捨て１．５ｍｌの内筒で完全にホモジナイズし、６０℃で４８時間放置する。インキュベーション後、サンプルは５分間／９５℃、５分間ドライアイスの５回の凍結／解凍サイクルに供される。次いでサンプルをボルテックスし、細胞片をペレットにするために微量遠心管中で２分間スピンさせる。上澄液を、正常なチューブに取り出し、塩濃度を減らすために希釈し、次いでフェノール対クロロホルムで抽出し、エタノール沈殿させ、５０μｌの１０ｍＭトリス／０．１ｍＭ ＥＤＴＡに再懸濁させる。
【０１２７】
驚くべきことに、核酸の他の供給源からウイルスＤＮＡを分離する必要がないことが、本発明者らにより見出されている。この処理工程を、異なるＤＮＡタイプの広範な混合物に対して使用でき、しかもウイルス特異的核酸を、本発明により同定することができる。複合ＤＮＡ混合物の検出限界は、標的ウイルス核酸分子の単一コピーに至り得る標準的なＰＣＲ検出限界のものであると推定される。
【０１２８】
ハイスループットＨＰＶアッセイ
本発明は、多数のサンプルが、ＨＰＶに関して同時に試験される９６ウェルプレートを用いてハイスループット様式で工程毎に使用できる。これは、以下のとおり、可能な市販キットに関する取扱い説明書によって示される。
【０１２９】
【表３】
注：対照サンプル／プライマー１、２、３Ａおよび３Ｂは、受領したら−２０℃で保存する必要がある。
【０１３０】
必要な材料および装置（供給されず）
・真空分岐管または遠心分離が以下のとおり用いられる：
Ｈｇで少なくとも−１０（４．９ｐｓｉ）圧を適用するポンプを備えた９６ウェルプレート真空分岐管（社内試験は、Ｂｉｏｒａｄ Ａｕｒｕｍ Ｍａｎｉｆｏｌｄを使用して実施されたが、他の分岐管も使用に適合化できる）または
クリアランス９６ウェルフォーマットプレートと適合するローターを備えた遠心分離機（社内試験は、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ５８１０を用いて実施された）。
・９６ウェルフォーマットの０．２ｍｌ低プロフィールプレートに適合性の加熱蓋付ＰＣＲサーマルサイクラー
・３８４ウェルフォーマット（ＨＰＶタイピング用）に適合性の加熱蓋付ＰＣＲサーマルサイクラー
・高クリアランス９６ウェルフォーマット（ＨＰＶタイピング用）の０．２ｍｌ低プロフィールプレートに適合性の加熱蓋付ＰＣＲサーマルサイクラー
・８０％イソプロパノール（分子生物学グレード）
・水（分子生物学グレード）
・ＮａＯＨ（分析グレード）
・２×ＰＣＲマスター混合物（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）カタログ番号Ｍ７５０５ １０００ｒｘｎ）
・Ｅ−Ｇｅｌ Ｓｙｓｔｅｍ Ｍｏｔｈｅｒ Ｅ−Ｂａｓｅ（商標）デバイス（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ＥＢ−Ｍ０３）
・Ｅ−ゲル９６ハイスループット２％寒天（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）カタログ番号Ｇ７００８−０２）
・Ｅ−ゲル低範囲マーカー（インビトロゲンカタログ番号１２３７３０３１）
・試薬貯蔵器×５
標準的実験室装置（供給されず）
・１ｍｌ容量（２００μｌ〜１０００μｌ）までの多チャネルピペット
・２００μｌ容量（２０μｌ〜２００μｌ）までの多チャネルピペット
・１０μｌ容量（１μｌ〜１０μｌ）までの多チャネルピペット
・リントフリー組織
・タイマー
・エアロゾルバリヤーチップ（１０μｌ〜１０００μｌ）
・ライトボックス
・ゲル文書化システム
・Ｇｌｉｓｏｎ Ｐ１０００
・Ｇｌｉｓｏｎ Ｐ２００
・Ｇｌｉｓｏｎ Ｐ２０
【０１３１】
方法
ＨＰＶハイスループットＤＮＡ重亜硫酸塩修飾キットを初めて使用する場合、そのユーザーガイドの詳細な方法を、重亜硫酸塩変換法を実施する前に読むことが強く推奨される。
【０１３２】
ＨＰＶハイスループットＤＮＡ重亜硫酸塩修飾キットを使用することで、変換前のゲノムＤＮＡの前消化は必要ない。このキットは、１ｎｇから４μｇのゲノムＤＮＡの出発ＤＮＡ濃度のために最適化される。
【０１３３】
サンプル調製
・試薬１の全容量を試薬２のボトルに組み合わせ、静かに転倒させて混合する。組み合わせた試薬を７２℃で１０分間または完全に溶解されるまで放置する。注：一旦混合した試薬１および試薬２は、４℃の暗所で１ヵ月間まで安定である。全ての試薬は、製造日から１年間室温で安定である。
・プロトコールの開始前に、７２℃のオーブンまたはインキュベーター内に１時間まで結合用緩衝液を入れる。
・新鮮な０．３Ｍ ＮａＯＨ溶液（例えば、５０．０ｍｌの水中０．６ｇのＮａＯＨ）を各回に作製する。
・５μＬの対照サンプル１を４９５μＬの水（分子生物学グレード）に加え、試験サンプルと平行して処理する。対照サンプル１は、処理対照として、および感度対照として作用する未変換ＨＰＶテンプレートを含有する。これは、ウェルＨ１０に入れる必要がある。
・５００μＬの水を残りの試験サンプルと処理する「ＤＮＡ無しの対照」を常時実施する。これは、ウェルＨ１１に入れる必要がある。
・液体ベースサンプル（ＰｒｅｓｅｒｖＣｙｔ（登録商標））バイアルを手で激しく振って、沈殿細胞を再懸濁させ、サンプルの十分な混合を確実にする。
・３００μｌの再懸濁細胞を、精製プレート／洗浄プレートの組み合わせの適切なウェルに移す（ウェルＨ１０、Ｈ１１またはＨ１２は用いない）。サンプルがどのウェルに入れられているかを詳細に記録する。
【０１３４】
プロトコール
・精製プレート／洗浄プレートの組み合わせを、２０００×ｒｃｆで１分間遠心分離し、流出液を捨てる。ＮＢは洗浄プレートを捨てない。
・基材密封用マットにより精製プレートの流し口を密閉し、全ての流し口が十分に密閉されていることを確認する。密封マットのカットコーナーが精製プレートのカットコーナーとそろうように常に確認する。
・２ｍｌのプロテイナーゼＫを細胞溶解緩衝液に加え、逆さにして混合する。
・１００μｌの細胞溶解緩衝液を、精製プレートの各ウェルに加える（１２チャネルピペットを用いる）。
・１０．５ｍｌの結合用緩衝液を新たなチューブに取り、１００μｌの担体ＤＮＡを加える。逆さにして混合し、精製プレートの各ウェルに１００μｌの結合用緩衝液を加え（１２チャネルピペットを用いる）、次いで用意されたプレート密封用フィルムにより精製プレートの上部を密封する。
・５５℃で６０分間インキュベートする。
・精製プレートから基材密封用マットを注意深く取り除き、洗浄プレートの上部に精製プレートを速やかに乗せる。精製プレートから密封用フィルムを取り除き、次に２０００×ｒｃｆで１分間遠心分離し、流出液を捨てる。ＮＢは洗浄プレートを捨てない。
・基材密封用マットを精製プレート上に置き換える。
・５０μｌの新鮮な０．３Ｍ ＮａＯＨ溶液を、変換プレートの各ウェルに加え、精製プレートの上部を新鮮な密封用フィルム（用意された）で密封する。
・５５℃で１５分間インキュベートする。
・密封用フィルムを取り除き、組試薬１と試薬２を合わせた２２０μｌを、多チャネルピペットを用いて変換プレートの各ウェルに加え、精製プレートの上部を新鮮な密封用フィルム（用意された）で密封する。
・この変換プレートを５５℃で３時間インキュベートする。
・インキュベーション後、密封用フィルムを取り除き、２４０μｌの結合用緩衝液（重要なプロトコール調製を参照）を変換プレートの各ウェルに加え、精製プレートの上部を新鮮な密封用フィルム（用意された）で密封する。
・精製プレートから基材密封用マットを注意深く取り除き、洗浄プレートの上部に精製プレートを素早く乗せる。
・密封用フィルムを取り除き、次に２０００×ｒｃｆで１分間遠心分離し、流出液を捨てる。
・５００μｌの８０％イソプロパノールを各ウェルに加え、室温で２０００×ｒｃｆで１分間遠心分離する。
・洗浄プレートを取出し、流出液を捨ててから置き換え、室温で２０００×ｒｃｆで１分間遠心分離する。
・洗浄プレートを捨て、溶出プレートの上部に精製プレートを置き、精製プレートの先端が溶出プレート内に正しくそろっていることを確認する。プレートを室温で５分間放置する。
・多チャネルピペットを用い、ピペットチップを接触させることなく、膜表面に近接させて置きながら、３０μｌの溶出用緩衝液を精製プレートの各サンプルウェルに加える。
・室温／１分でインキュベートする。
・全溶出容量を６０μｌにするために再度上記の工程を反復する。
・精製プレート／溶出プレートの組み合わせを、１０００×ｒｃｆの室温／１分で遠心分離する。
・溶出プレートを取り除き、用意された密閉用キャップで密封する。
・このプレートを、加熱蓋付サーモサイクラー中、９５℃／３０分で加熱蓋付ＰＣＲ器械中でインキュベートする。キャップを取外す前に短時間スピンさせる。
・液体ベースサンプル（ＰｒｅｓｅｒｖＣｙｔ（登録商標））バイアルを手で激しく振って、沈殿細胞を再懸濁させ、溶液を確実に均一にする。
・４ｍｌの再懸濁細胞を１５ｍｌのＣｏｓｔａｒ遠心管に移す。４ｍｌ未満の媒体である場合、全ての物質を１５ｍｌのＣｏｓｔａｒ遠心管に移し、滅菌蒸留水で容量を４ｍｌにする。正確な試験のために必要なサンプルの最低容量は１ｍｌである。
・スイングアウトバケットロータ内のチューブを、３０００×ｇ／１５分で遠心分離する。
・注意深くデカントし、ペレット化細胞材料を乱すことなく上澄液を捨てる。
・ペレット化細胞を、２００μｌの細胞溶解用緩衝液に再懸濁させ、溶液が均質になるまで十分に混合する。
・２０μｌのプロテイナーゼＫを加え、インキュベーションプレートの各ウェルをインキュベートする。
・８０μｌのサンプルをインキュベーションプレート（プレート１）に移し、密封用キャップで蓋をし、５５℃／１時間インキュベートする。
【０１３５】
プロトコール調製
・試薬１からの全容量を試薬２のボトルに組み合わせ、静かに逆さにして混合する。注：混合した試薬１および試薬２は、４℃の暗所で１ヵ月間まで安定である。試薬１、２、３および４は、製造日から１年間室温で安定である。
・新鮮なＮａＯＨ溶液（例えば、８．３ｍｌの水中１ｇのＮａＯＨ）を各回に作製し、５μｌを変換プレート（プレート２）の各ウェルに加える。
・５μＬの対照サンプル１を１５μＬの水（分子生物学グレード）に加え、試験サンプルと平行して処理する。
・２０μｌの細胞溶解液を変換プレート（プレート２）に移し、静かに混合する。
・変換プレート（プレート２）を用意された密封用フィルムで密封し、オーブン中３７℃／１５分インキュベートする。インキュベーション後、フィルム上の濃縮物を沈殿させるためにフィルムを取外す前に短時間でプレートを遠心分離する。
・インキュベーションプレート（プレート１）を用意された密封用キャップで密封し、−２０℃で保存する。
・試薬３は固体沈殿が形成されていないことを確認し、形成されていれば、溶液を温めて（８０℃以下で）、混合する。
【０１３６】
遠心分離プロトコール
・多チャネルピペットを用いて、試薬１と試薬２とを合わせた２２０μｌを変換プレート（プレート２）の各ウェルに加え、静かなピペット操作により混合し、用意された８ストリップ密封用キャップによりプレートを密封する。
・変換プレート（プレート２）をオーブン中、５５℃／３時間でインキュベートする。
重亜硫酸塩処理は、１時間ほどの短時間で実施できるが、インキュベーション時間の減少により、アンプリコン内の局所的非変換が生じ得る。したがって、３時間未満のインキュベーション時間は推奨されない。
・インキュベーション後、２４０μｌの試薬３（重要なプロトコール調製を参照）を、変換プレート（プレート２）の各ウェルに加える。
・精製プレート（プレート３）を、洗浄プレート（プレート４）の上部に乗せる。
・変換プレート（プレート２）からのサンプルを対応する精製プレート（プレート３）のウェル移し、用意された密封用フィルムで覆う。
・精製プレート（プレート３）／洗浄プレート（プレート４）の組み合わせを遠心分離機に入れ、室温／４〜５分の１０００ｒｃｆでスピンさせる。
・洗浄プレート（プレート４）からの流出液を捨て、次いで精製プレート（プレート３）で置き換える。０．８ｍｌの８０％イソプロパノール（分子生物学グレード）を精製プレート（プレート３）の各ウェルに加える。
・室温で１０００×ｒｃｆ／１分で遠心分離する。
・洗浄プレート（プレート４）を取出し、流出液を捨ててから置き換え、室温で１０００×ｒｃｆ／２分で遠心分離する。
・溶出プレート（プレート５）の上部に精製プレート（プレート３）を置き、精製プレート（プレート３）のチップが、溶出プレート（プレート５）の適切なウェル内に配置されていることを確認する。
・ピペットチップを接触させることなく、膜表面に近接させて置きながら多チャネルピペットを用いて、５０μｌの試薬４を精製プレート（プレート３）の各サンプルウェルに加える。
・室温／１〜２分でインキュベートする。
・精製プレート（プレート３）／溶出プレート（プレート５）の組み合わせを、１０００×ｒｃｆの室温／１分で遠心分離する。
・溶出プレート（プレート５）を取り除き、用意された密閉用キャップで密封する。
・このプレートを、９５℃／３０分で加熱蓋付ＰＣＲ器械中でインキュベートする。
これでＤＮＡサンプルが変換され、ＰＣＲ増幅の用意ができる。インキュベーション後、密封キャップからの濃縮物を除去するためにプレートを短時間遠心分離する。
【０１３７】
内部対照ＰＣＲ反応
問題処理を容易にするために、ゲノムＤＮＡおよび対照ＰＣＲプライマーが提供されている。対照サンプル１（紫色）および２（緑色）は、処理対照として提供される。対照サンプル１は、８つの変換反応のために提供された十分な物質を有する未処理ＤＮＡである。対照サンプル２は、２０のＰＣＲ増幅のために提供された十分な物質を有する重亜硫酸塩処理のＤＮＡである。対照プライマー３Ａ（黄色）および３Ｂ（赤色）はＰＣＲプライマーであり、回収ＤＮＡ（２０回のＰＣＲ増幅に十分なものが提供される）の統合性をチェックするために使用できる。
【０１３８】
「入れ子」ＰＣＲプライマーは、ＨＰＶハイスループットＤＮＡ重亜硫酸塩修飾キットにより達成される検出感度をさらに改善するために用いられる。対照プライマーは、従来の重亜硫酸塩ＰＣＲプライマーであり、２ラウンドのＰＣＲ増幅に関して最適化されている。単一ラウンドでこれらのＰＣＲプライマーを使用することは、多くの場合、アガロースゲル電気泳動後、可視アンプリコンバンドは見られないため推奨されない。
注：このプロトコールは、加熱蓋付サーマルサイクラーの使用に基づく。加熱蓋付サーマルサイクラーが入手できない場合、鉱油との反応にオーバーレイする。
【０１３９】
対照反応：
・対照サンプル１（紫色）は、未処理ＨＰＶゲノムＤＮＡ（５０ｎｇ／μｌ）を含有する
・対照サンプル２（緑色）は、重亜硫酸処理ＨＰＶヒトＤＮＡ（２０ｎｇ／μｌ）を含有する
・対照プライマー３Ａ（黄色）は、第１ラウンドのＰＣＲプライマーを含有する
・対照プライマー３Ｂ（赤色）は、第２ラウンドのＰＣＲプライマーを含有する
【０１４０】
対照ＰＣＲ
対照プライマー３Ａ（第１ラウンドのＰＣＲプライマー）および対照プライマー３Ｂ（第２ラウンドのＰＣＲプライマー）は、２０回の対照ＰＣＲ反応までにとって十分な容量が供給された検証済みの「入れ子」プライマーである。これらのプライマーサンプルは、必要な場合、問題処理過程を助けるために供給されており、また、修飾ＤＮＡの品質を評価するためにも使用できる。
注：第２ラウンドのＰＣＲ反応は、第１ラウンドのＰＣＲ反応と平行して調製でき、必要になるまで凍結できる。
【０１４１】
高リスクＰＣＲ増幅
第１ラウンドの増幅
・各反応に関して、用意された高リスクＰＣＲプレート中、１２．５μｌのＰＣＲマスターミックス（例えば、プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）マスターミックス）および９．５μｌの水（分子生物学グレード）を加える。９６のサンプルと１．２５ｍｌのマスターミックスとを組み合わせて設定する場合、８５０μｌの水および２００μｌのプライマーを、適切なチューブ中で混合し、十分に混合する。次いで多チャネルピペットを用いて、２３μｌの反応混合物を用意された高リスクＨＰＶプレート（プレート６）の各ウェルに加える。
・２μｌの対照プライマー３Ａを、ウェルＨ１０およびＨ１１を調節する適切なウェルに加える。
・溶出プレート（プレート５）からの必要な修飾ＤＮＡ２μｌを、用意された高リスクＨＰＶプレート（プレート６）に加え、ならびに２μｌの対照サンプル２をウェルＨ１１に加え、次いで、残りを引き続くＨＰＶタイピングのために−２０℃で保存する（高リスクプレートレイアウトに関しては下記を参照）。
・以下のＰＣＲプログラムを実行する。
【０１４２】
【表４】
【０１４３】
第２ラウンドの増幅
・第１ラウンドの増幅ＤＮＡ２μｌを、第１ラウンドの増幅と全く同じに調製された第２ラウンドの混合物に加える。
・以下のＰＣＲプログラムを実行する。
【０１４４】
【表５】
【０１４５】
電気泳動
・フォイルラッパーから９６ウェル２％Ｅ−ゲルを取出し、赤色９６ウェルコームを取出す。
・１０μｌの滅菌水を、多チャネルピペットを用いてゲルの各ウェルに加える。
・１０μｌのＤＮＡマーカーをマーカーウェルに加える。
・１０μｌの増幅産物を、多チャネルピペットを用いてＥ−ゲルの各ウェルに移す。
・Ｅ−ベースを５〜７分間設定し、ｐｗｒ／ｐｒｇをプレスする。
・ＵＶライトボックスおよびゲル文書化ソフトウェアを用いて結果を記録する。
【０１４６】
ＨＰＶタイピング
第１ラウンドの増幅
ハイリスクタイピングプレート（プレート８）は、以下の高リスクＨＰＶタイプ：１６、１８、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９および６８に対して方向付けられた株特異的プライマーを含有する。全ての高リスク株に関して各サンプルをタイピングする上で、十分なＤＮＡが溶出プレート（プレート５）に残っている。
・−２０℃のフリーザーから溶出プレート（プレート５）を取出す。
・高リスクユニバーサル増幅により陽性のサンプルは、ここで株特異的プライマーを用いてタイピングできる（タイピングプレート設定に関して下記を参照）。
・各反応に関して、用意されたＰＣＲプレートの各ウェルに、１２．５μｌのＰＣＲマスターミックス（例えば、プロメガマスターミックス）および８．５μｌの水を加える。タイピングする６つのサンプルを有する場合、１１８７．５μｌのマスターミックスおよび８０７．５μｌの水を、適切なチューブに加え、十分に混合してから、下記に示すとおり、２１μｌをＨＰＶタイピングプレート（プレート７）の各ウェルに加える。
・下記に示すとおり、２μｌの適切なプライマーセットを各ウェルに加える。
・タイピングが、３８４のウェルフォーマットで実施され、２４のサンプルがタイピングに利用できる場合、４．５ｍｌのマスターミックスおよび３．４２ｍｌの水を適切なチューブに入れ、十分に混合し、次いで下記に示すとおり、２１μｌを３８４のウェルプレートの各ウェルに加える。次に下記に示すとおり、２μｌの適切なプライマーセットを各ウェルに加える。
・２μｌの高リスク陽性サンプル（溶出プレートから、プレート５）をタイピングプレートの適切なウェルに加える。
・各サンプルおよび「テンプレート無し」（陰性）対照に対して十分なチューブを備える。
・以下のＰＣＲプログラムを操作する。
【０１４７】
【表６】
【０１４８】
第２ラウンドの増幅
・２μｌの第１ラウンドの増幅ＤＮＡを、第１ラウンドの増幅と全く同じに調製された第２ラウンドの混合物に加える。
・以下のＰＣＲプログラムを操作する。
【０１４９】
【表７】
【０１５０】
電気泳動
・フォイルラッパーから９６ウェルの２％Ｅ−ゲルを取出し、赤色９６ウェルコームを取出す。
・１０μｌの滅菌水を、多チャネルピペットを用いてゲルの各ウェルに加える。
・１０μｌのＤＮＡマーカーをマーカーウェルに加える。
・１０μｌの増幅産物を、多チャネルピペットを用いてＥ−ゲルの各ウェルに移す。
・Ｅ−ベースを５〜７分間設定し、プレス操作をする。
・ＵＶライトボックスおよびゲル文書化ソフトウェアを用いて結果を記録する。
・これでサンプルがタイピングされた。
【０１５１】
【表８】
【０１５２】
供給源からの重亜硫酸塩処理ＨＰＶ ＤＮＡはゲノム的に単純化したプライマーを用いて増幅される場合、オリゴヌクレオチド類であろうとＩＮＡ類などの修飾核酸であろうとヒト臨床材料であろうと別の極度端では環境源からのサンプルであろうとサンプル内の任意のタイプのＨＰＶを見出すため卓絶した検出システムを提供する。本発明は、ヒト癌の原因であると考えられている臨床関連ウイルス（ＨＰＶ）に関して開発された。
【０１５３】
本発明による検出アッセイの実用的な含みは変わり得る。詳細に上述された原理は、増幅のためにＰＣＲを用いて示されたが、読み出し情報は、当該技術分野で公知の任意の方法と係合させることができる。マイクロアレイ検出システムが現在強調されており、重亜硫酸処理が、ゲノムの複雑性を減少させ、それゆえ、より少数の検出器（機能）によりマイクロアレイ上でより多くのタイプのＨＰＶを試験できることから、ゲノム的に単純化したプライマーを用いて多種多様なＨＰＶを検出できるであろう。
【０１５４】
要約すると、ＨＧＳのゲノム的に単純化したプライマーの方法により、多くの患者の臨床的表現型と相関している一貫したデータセットが得られる。
【０１５５】
重亜硫酸塩処理
核酸の効果的な重亜硫酸塩処理の代表的なプロトコールが下記に示される。このプロトコールにより、処理された全てのＤＮＡの実質的な保持がもたらされる。この方法は、本明細書においてヒューマンジェネティックシグネチャーズ（ＨＧＳ）法とも称される。サンプルまたは試薬の容量もしくは量は変わり得ることが認識されるであろう。
【０１５６】
重亜硫酸塩処理の好ましい方法は、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｉｇｎａｔｕｒｅ Ｐｔｙ社の名称で、参照として本明細書に組み込まれているＵＳ１０／４２８３１０またはＷＯ２００４／０９６８２５（ＰＣＴ／ＡＵ２００４／０００５４９）に見ることができる。
【０１５７】
所望の場合、好適な制限酵素により予め消化してもよい２μｇのＤＮＡに、３Ｍ ＮａＯＨ（新鮮に作製された５０ｍｌの水中６ｇ）の２μｌ（１／１０容量）を２０μｌの最終容量で加えた。重亜硫酸塩試薬が一本鎖分子と反応することが好ましいことから、この工程で、二本鎖ＤＮＡ分子を一本鎖形態に変性させる。この混合物を３７℃で１５分間インキュベートした。室温より高い温度でのインキュベーションは、変性効率を改善するために使用できる。
【０１５８】
インキュベーション後、２０８μｌの２Ｍメタ重亜硫酸ナトリウム（２０ｍｌ水中、４１６ｍｌの１０Ｎ ＮａＯＨと共に７．６ｇ；ＢＤＨ ＡｎａｌａＲ番号１０３５６、４Ｄ；新鮮に作製）および１２μｌの１０ｍＭキノール（５０ｍｌの水中０．０５５ｇ、ＢＤＨ ＡｎａｌａＲ番号１０３１２２Ｅ；新鮮に作製）を連続して加えた。キノールは還元剤であり、試薬の酸化還元を促進する。他の還元剤、例えば、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、メルカプトエタノール、キノン（ヒドロキノン）、または他の好適な還元剤も使用できる。サンプルを、２００μｌの鉱油によりオーバーレイした。鉱油のオーバーレイは、必須ではないが、試薬の蒸発および酸化を防止する。次いでサンプルを５５℃で一晩インキュベートした。あるいはサンプルを、以下のとおりサーマルサイクラー中でサイクルでき：以下のとおり約４時間または一晩インキュベートする；工程１、ＰＣＲ機械内で５５℃／２時間サイクルし；９５℃／２分サイクルする。工程１は、約３７℃から約９０℃の任意の温度で実施でき、５分から８時間までの長さで変わり得る。工程２は、約７０℃から約９９℃の任意の温度で実施でき、約１秒から６０分までの長さ、またはそれ以上の長さに変わり得る。
【０１５９】
メタ重亜硫酸ナトリウムによる処理後、油分を除去し、ＤＮＡ濃度が低い場合１μｌのｔＲＮＡ（２０ｍｇ／ｍｌ）または２μｌのグリコーゲンを加えた。これらの添加物は任意選択であり、ＤＮＡが低濃度で存在する場合は特に、標的ＤＮＡとの共沈殿させることにより得られるＤＮＡの収率を改善するために使用できる。核酸のより効率的な沈殿のための担体としての添加物の使用は、一般に核酸量が＜０．５μｇである場合に望ましい。
【０１６０】
イソプロパノールのクリーンアップ処理は、以下のとおり実施した：８００μｌの水をサンプルに加え、混合してから１ｍｌのイソプロパノールを加えた。水または緩衝液は、重亜硫酸塩が、対象の標的核酸と共に沈殿しない濃度まで反応容器中のこの塩の濃度を減少させる。塩濃度が本明細書に開示された所望の範囲未満に希釈される限り、この希釈は一般に、約１／４から１／１０００である。
【０１６１】
サンプルを再度混合し、４℃で少なくとも５分間放置した。サンプルを微量遠心管中で１０〜１５分間スピンさせて、各回ボルテックスしながら７０％ＥＴＯＨによりこのペレットを２回洗浄した。この洗浄処理により、核酸と共に沈殿した残留塩が除去される。
【０１６２】
このペレットを乾燥させてから、ｐＨ７．０〜１２．５のＴ／Ｅ（１０ｍＭのトリス／０．１ｍＭのＥＤＴＡ）の５０μｌなど、適切な容量で再懸濁させた。ｐＨ１０．５での緩衝液は、特に有効であることが分かっている。サンプルは、核酸を懸濁させるのに必要である３７℃から９５℃で１分から９６時間インキュベートした。
【０１６３】
増幅
ＰＣＲ増幅は、Ｐｒｏｍｅｇａ ＰＣＲマスターミックスを用いる２μｌの重亜硫酸塩処理ゲノムＤＮＡ、６ｎｇ／μｇの各プライマーを含有する２５μｌの反応混合物中で実施された。鎖特異的入れ子プライマーを増幅に用いる。第１ラウンドのＰＣＲ増幅は、ＰＣＲプライマー１および４を用いて実施された（下記参照）。第１ラウンドのＰＣＲ増幅後、１μｌの増幅物質を、ＰＣＲプライマー２および３を含有する第２ラウンドのＰＣＲプレミックスに移し、先に記載されたように増幅を行った。ＰＣＲ産物のサンプルを、以下の条件下でＴｈｅｒｍｏＨｙｂａｉｄ ＰＸ２サーマルサイクラー中で増幅した：９５℃４分間の１サイクル、次いで９５℃１分間、５０℃２分間および７２℃２分間の３０サイクル、７２℃１０分間の１サイクル。
【０１６４】
【表９】
【０１６５】
多重増幅
１μｌの重亜硫酸塩処理ＤＮＡを、以下の成分、すなわち２５μｌの２０反応容量、×１Ｑｉａｇｅｎ多重マスターミックス、５〜１００ｎｇの各第１ラウンドＩＮＡまたはオリゴヌクレオチドプライマー１．５〜４．０ｍＭのＭｇＳＯ４、４００μＭの各ｄＮＴＰおよび０．５〜２単位のポリメラーゼ混合物中に加える。次いでこの成分を、以下のとおり熱蓋サーマルサイクラー中でサイクルさせる。典型的に、各増幅反応において２００以下の個々のプライマー配列まであり得る：
工程１；９４℃１５分間 １サイクル
工程２；９４℃１分間、５０℃３分間 ３５サイクル；６８℃３分間
工程３；６８℃１０分間 １サイクル
【０１６６】
次に第２ラウンドの増幅を第１ラウンド増幅の１μｌの分割量に対して実施し、これを酵素反応混合物および適切な第２ラウンドプライマーを含有する第２ラウンド反応チューブに移す。次いでサイクリングを上記のとおり実施する。
【０１６７】
ＨＧＳ「複雑性減少」プライマーおよびプローブ
任意の好適なＰＣＲプライマーまたはプローブが、本発明ならびに等温性増幅方法論を含む非ＰＣＲ増幅に関して特に設計されたプライマーおよびプローブに使用できる。プライマーまたはプローブは、典型的に増幅される配列に相補的な配列を有する。プライマーまたはプローブは、典型的にオリゴヌクレオチドであるが、ＩＮＡ類などのヌクレオチド類縁体であり得る。「トップ」および「ボトム」鎖に対するプライマーは、配列が異なる。
【０１６８】
プローブおよびプライマー
プローブまたはプライマーは、任意の好適な核酸分子または核酸類縁体であり得る。例としては、これに限定はしないが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、固定化核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ＭＮＡ、アルトリトール核酸（ＡＮＡ）、ヘキシトール核酸（ＨＮＡ）、挿入核酸（ＩＮＡ）、シクロヘキサニル核酸（ＣＮＡ）およびそれらの混合物ならびにそれらのハイブリッド、ならびにこれに限定はしないが、ホスホロチオエート類、メチルホスホレート類、ホスホラミダイト類、ホスホロジチオエート類、ホスホロセレノエート類、ホスホトリエステル類およびホスホボラノエート類などのそれらのリン原子修飾が挙げられる。非天然ヌクレオチド類としては、これに限定はしないが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＩＮＡ、ＨＮＡ、ＭＮＡ、ＡＮＡ、ＬＮＡ、ＣＮＡ、ＣｅＮＡ、ＴＮＡ、（２’−ＮＨ）−ＴＮＡ、（３’−ＮＨ）−ＴＮＡ、α−Ｌ−リボ−ＬＮＡ、α−Ｌ−キシロ−ＬＮＡ、β−Ｄ−キシロ−ＬＮＡ、α−Ｄ−リボ−ＬＮＡ、［３．２．１］−ＬＮＡ、ビシクロ−ＤＮＡ、６−アミノ−ビシクロ−ＤＮＡ、５−エピ−ビシクロ−ＤＮＡ、α−ビシクロ−ＤＮＡ、トリシクロ−ＤＮＡ、ビシクロ［４．３．０］−ＤＮＡ、ビシクロ［３．２．１］−ＤＮＡ、ビシクロ［４．３．０］アミド−ＤＮＡ、β−Ｄ−リボピラノシル−ＮＡ、α−Ｌ−リキソピラノシル−ＮＡ、２’−Ｒ−ＲＮＡ、α−Ｌ−ＲＮＡまたはα−Ｄ−ＲＮＡ、β−Ｄ−ＲＮＡ内に含まれるヌクレオチド類が挙げられる。さらに、非リン含有化合物は、これに限定はしないが、メチルイミノメチル、ホルムアセテート、チオホルムアセテートおよびアミドを含む結合基などのヌクレオチドへの結合に使用できる。特に核酸および核酸類縁体は、１種以上の挿入体擬似ヌクレオチドを含むことができる。
【０１６９】
プローブまたはプライマーは、ＩＮＡを形成する１つ以上の内部ＩＰＮ類を含有するＤＮＡまたはＤＮＡオリゴヌクレオチド類であり得る。
【０１７０】
検出方法
所望のサンプルの状態を判定するために多数の可能な検出システムが存在する。検出システムとしては、これに限定はしないが、以下のものが挙げられる：
Ｉ．適切に標識されたＤＮＡの、１０から＞２００，０００の個々の成分に関して選択し得るミクロアレイタイプのデバイスへのハイブリダイゼーション。このアレイは、ガラス、プラスチック、雲母、ナイロン、ビーズ、磁気ビーズ、蛍光ビーズまたは膜などの任意の好適な固体表面上のＩＮＡ類、ＰＮＡ類またはヌクレオチドもしくは修飾ヌクレオチドアレイを含むことができるであろう；
ＩＩ．サザンブロットタイプの検出システム；
ＩＩＩ．アガロースゲルなどの標準的ＰＣＲ検出システム、Ｇｅｎｅｓｃａｎ分析などの蛍光読取り。サンドイッチハイブリダイゼーションアッセイ、臭化エチジウムなどのＤＮＡ染色試薬、Ｓｙｂｒグリーン、抗体検出、ＥＬＩＳＡプレートリーダータイプデバイス、蛍光計デバイス；
ＩＶ；特定または複数ゲノム増幅断片もしくはそれに対する任意の変体のリアルタイプＰＣＲ定量化；
Ｖ；WO 2004/065625に概説された蛍光ビーズ、酵素複合体、放射活性ビーズなどの任意の検出システム；
ＶＩ；鎖置換増幅（ＳＤＡ）などのリガーゼ鎖反応または等温ＤＮＡ増幅テクノロジーなどの増幅工程を利用する任意の他の検出システム；
ＶＩＩ．参照として本明細書に組み込まれている、Ｔｅｘａｓ Ａ＆Ｍ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｙｓｔｅｍ名義のＵＳ６４２６２３１およびＵＳ６９１６６６５、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ名義のＵＳ６８２４６５９などのバイオセンサーテクノロジーは、本発明に好適となるであろう。
【０１７１】
挿入核酸
挿入核酸（ＩＮＡ）は、配列特異的に核酸（ＤＮＡおよびＲＮＡ）にハイブリダイズできる非天然ポリヌクレオチドである。幾つかの所望の性質を示すことから、ＩＮＡは、プローブまたはプライマーベースのハイブリダイゼーションアッセイに対する代替物／置換物としての候補物質である。ＩＮＡ類は、対応する天然核酸／核酸複合体よりも熱力学的に安定であるハイブリッドを形成するために核酸にハイブリダイズするポリマー類である。それらは、ペプチドまたは核酸を分解することが知られている酵素の基質ではない。したがって、ＩＮＡ類は、生体サンプルにおいてより安定であるはずであり、ならびに天然核酸断片よりも長い保存寿命を有する。イオン強度に極めて依存する核酸ハイブリダイゼーションとは異なり、ＩＮＡと核酸とのハイブリダイゼーションは、イオン強度からかなり独立しており、核酸に対する天然核酸のハイブリダイゼーションを非常に不利とする条件下である低イオン強度が好都合である。ＩＮＡの結合強度は、分子に操作される挿入基数ならびに二本鎖構造において特定の様式で積み重ねられる塩基間の水素結合による通常の相互作用に依存する。配列識別能は、ＤＮＡ認識ＤＮＡよりもＩＮＡ認識ＤＮＡの方が有効である。
【０１７２】
ＩＮＡは、（Ｓ）−１−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリフェニルメチル）−３−Ｏ−（１−ピレニルメチル）−グリセロールのホスホラミダイトであることが好ましい。
【０１７３】
ＩＮＡ類は、市販のフォーマットで標準的なオリゴヌクレオチド合成手法の適応により合成される。ＩＮＡ類の完全定義およびそれらの合成は、参照として本明細書に組み込まれているＷＯ０３／０５１９０１、ＷＯ０３／０５２１３２、ＷＯ０３／０５２１３３及びＷＯ０３／０５２１３４（Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ Ｐｔｙ社）に見ることができる。
【０１７４】
実際、ＩＮＡプローブとプライマーおよび標準的な核酸プローブとプライマーとの間には多くの相違がある。これらの相違は、都合よく生物学的、構造的、および物理化学的な相違に分類することができる。上記および下記に考察されるように、これらの生物学的、構造的、および物理化学的な相違は、典型的に核酸が使用される適用においてＩＮＡプローブおよびプライマーを使用しようする場合、予測できない結果となり得る。異なる組成物のこの不等価性は、しばしば化学技術において見られる。
【０１７５】
生物学的相違に関して、核酸は、遺伝子伝達および発現の作用物質として生物種の生命において中心的な役割を果たす生物学的物質である。それらのｉｎ ｖｉｖｏ特性はかなりよく理解されている。しかしながら、ＩＮＡは、化学者が思いつき、合成有機化学を用いて作製され、最近開発された全く人工的な分子である。その生物学的機能は知られていない。
【０１７６】
ＩＮＡ類は、構造的に核酸類とは劇的に異なる。双方とも共通の核酸塩基（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、およびＵ）を用いることができるが、これらの分子の組成は、構造的に多様である。ＲＮＡ、ＤＮＡおよびＩＮＡの主鎖は、反復ホスホジエステルリボース単位および２−デオキシリボース単位を含む。ＩＮＡは、リンカー分子（１つまたは複数）を介してポリマーに結合された１つ以上の大型フラット分子を有する上でＤＮＡまたはＲＮＡとは異なる。このフラット分子は、二本鎖構造におけるＩＮＡの反対位置の相補的ＤＮＡにおける塩基間に挿入する。
【０１７７】
ＩＮＡとＤＮＡまたはＲＮＡとの間の物理化学的な相違もまた相当にある。ＩＮＡは、核酸プローブまたはプライマーが同じ標的配列に結合するよりも速く相補的ＤＮＡに結合する。ＤＮＡ断片またはＲＮＡ断片とは異なり、ＩＮＡは、挿入基が末端位置に配置されない限り、ＲＮＡへうまく結合しない。挿入基と相補的ＤＮＡ鎖の塩基との間の強い相互作用のため、ＩＮＡ／ＤＮＡ複合体の安定性は、類縁体ＤＮＡ／ＤＮＡまたはＲＮＡ／ＤＮＡ複合体よりも高い。
【０１７８】
ＤＮＡ断片またはＲＮＡ断片またはＰＮＡなどの他の核酸とは異なり、ＩＮＡ類は、自己凝集または結合性を示さない。
【０１７９】
要約すると、ＩＮＡ類は、配列特異性を有して核酸にハイブリダイズし、ＩＮＡ類は、プローブベースアッセイまたはプライマーベースアッセイを開発するための有用な候補であり、特にキットおよびスクリーニングアッセイに採用される。しかしながら、ＩＮＡプローブおよびプライマーは、核酸プローブおよびプライマーの等価体ではない。その結果、特異性、感度およびプローブベースアッセイまたはプライマーベースアッセイの信頼性を改善し得る任意の方法、キットまたは組成物は、ＤＮＡ含有サンプルの検出、分析および定量化に有用となるであろう。ＩＮＡ類は、この目的のために必要な性質を有する。
【０１８０】
ＨＰＶおよび癌ゲノムマーカー
臨床サンプルおよび細胞系を用いて、本発明者らは、ほぼ４００の遺伝子の調節領域におけるメチル化パターンを調べ、ＨＰＶの存在と共に癌の状態にある場合にメチル化の変化を有する６０を超えるゲノムマーカーを見出している。例としては、これに限定はしないが、転写単位（遺伝子）内、またはそれらの近くの１つ以上の以下のゲノム領域、ＣＤ１４、ＥＮＤＲＢ、ＨＩＣ、ＲＡＲＢ１、ＰＧＲ、ＳＦＲＳ８、ＴＭＳＢ１０、ＡＢＣＧ２、ＭＦＮＧ、ＬＡＭＲ１、ＲＡＧＥ、ＡＢＬ１、ＣＲＢＰ、ＧＰＲ３７、ＨＲＫ、ＲＡＲＡ、ＳＹＫ、ＥＣＥ１、ＭＭＥ、ＴＥＭ、ＮＦ２、ＸＩＡＰＨＳＸ１１、ＲＡＲＲＥＳ１、ＦＬＩ１、ＨＴＬＦ、ＬＤＨＢ、ＲＢ１、ＴＧＤ、ＣＤＫ４、ＭＭＰ１４、ＲＡＢ３２、ＢＡＲＤ１、ＮＦ１、ＬＩＭ２、ＭＭＰ２、ＤＡＢ２、ＢＭＰ６、ＣＤＫＮ１Ｃ、ＤＡＢ２ＩＰ、ＬＭＮＢ１、ＭＭＰ２８、ＨＡＩ２、ＳＯＣＳ１、ＨＩＣ２、ＭＳＨ６、ＲＩＮ２、ＨＭＧＡ１、ＪＵＮ、Ｓ１００Ｐ＊、ＳＲＦ、ＶＤＲ、ＤＫＫ３、ＫＲＡＳ２、ＰＬＡＵ、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ、ＣＤＨ１、ＭＡＣ３０、ＤＤＢ２、ＰＡＸ６、ＡＸＬ、ＥＩＦ４Ａ２、ＳＬＩＴ２、ＲＥＣＫ、ＴＥＲＣ、ＧＡＴＡ５、およびＳＴＡＴ１と表されるものが挙げられる。
【０１８１】
疾患状態
本発明は、ＨＰＶおよび本発明を説明する例として子宮頚部癌の選択されたヒトゲノム領域のメチル化を用いている。種々の形態の認知症（アルツハイマー）などの他の状態は、単純ヘルペスウイルス１型などの感染性成分（2004, Neurobiology of Aging, 25, 619-627; Itzhaki, R.F., et al.）；コロナウイルス関連ＳＡＲＳ肺炎に関連する臨床進行およびウイルス負荷（2003, The Lancet, 361, 1767-1772, Peiris, J.S.M.m et al.,）；ヒト免疫不全ウイルスＨＩＶ、および免疫系不全および幾つかのウイルスベース出血性熱（2004, Nature Medicine, 10, 570-576, Weiss, R.A. et al.,）を有する可能性があり；ニッパウイルス、パラインフルエンザおよびおたふくかぜを含むファミリーパラミクソウイルス科のウイルスは、種々の呼吸器疾病、おたふくかぜ、髄膜炎、膵炎、脳炎および麻疹に関連することがわかるであろう。ニッパウイルスは、１９９９年に最初に認められたばかりのものであり、感染患者の７０％が致命的な脳炎を引き起こし、ヒト、イヌ、ネコ、ブタ、ウマ、ハムスター、コウモリおよびモルモットなどの非常に幅広い宿主範囲を有する。それは、世界の健康および経済に対して重大な脅威となり（2005, Nature, 436, 401-405; Negrete, O.A., et al,）；デング熱、黄熱病、Ｃ型およびＧ型肝炎を含むフラビウイルス科のウイルスは、脳炎、肝炎およびショック症候群に関連する。Ｃ型肝炎は、例えば、世界中の感染者が１億７千万人を超える慢性肝臓疾患の主要原因であり、ワクチンを利用できず（2005, Science, 309, 623-626; Lindenbach, B.D., et al,）；最後にファミリーヘルペスウイルス科のウイルスは、１型から８型までのヘルペスウイルスを含む。これらのウイルスは、口腔感染症、角膜の潰瘍、生殖器官の感染症、髄膜炎、水痘、肺炎、帯状疱疹、サイトメガロウイルス単核細胞症および脳炎を引き起こし得る。ヒトサイトメガロウイルスは、臓器移植者など、免疫不全者において重症で致命的な疾患を引き起こし（2003, Nature, 424, 456-461; Wang, X., et al）、これらもまた、健康状態の進行が、ウイルス存在および宿主のＤＮＡのメチル化状態の組み合わせによりモニターできるので、ヒトならびに種々の動物において本発明の候補になるであろう。同様の例は、植物ウイルスおよびウイロイドに対して利用できる。
【実施例】
【０１８２】
実施例
ＨＰＶ
本発明を説明するために、ＨＰＶおよび子宮頚部癌が以下の実施例に使用される。上記に概説された他のウイルスおよび疾患状態もまた、本発明によりアッセイできることがわかるであろう。
【０１８３】
本発明者らが、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏのバイオインフォマティクス分析で基礎としたものを反復すると、参照目的のために本明細書に利用された標準的なＨＰＶタイプは、元はｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ Ｔａｘｏｎｏｍｙ ｏｆ Ｖｉｒｕｓｅｓ、ＩＣＴＶによりそのように称されたファミリーパポバウイルス科パピローマウイルス属のＨＰＶ１６であるが（1993, Van Rast, M.A., et al., Papillomavirus Rep, 4, 61-65;また1998, Southern, S.A. and Herrington, C.S. Sex. Transm. Inf. 74, 101-109も参照のこと）パピローマウイルス科に対する分類学的改善により、先行技術において時には交互に使用される。不明瞭な点を避けるために、本発明者らは、標準的なコンパレーターとして、ＨＰＶ１６の完全配列決定された７９０４塩基対のゲノムを用いた（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ、ＮＣＢＩ座ＮＣ＿００１５２６；ＮＣ＿００１５２６．１版；ＧＩ：９６２７１００；参照文献、Medline, 91162763 および 85246220; PubMed 1848319および2990099）。
【０１８４】
さらに、本発明者らは、それぞれＮＣＢＩ登録番号のＮＣ−００１５２６、ＮＣ−００１３５７、ＮＣ−００１５９０およびＮＣ−００１５９４を有するいわゆる高リスクＨＰＶタイプの１６、１８、４５および５６の完全配列決定されたゲノムを用いた。
【０１８５】
本発明者らは、それぞれＮＣＢＩ登録番号のＮＣ−００１５８５、ＮＣ−００１５２７、ＮＣ−００１５２８、ＮＣ−００１５２９、ＮＣ−００１５３５、ＮＣ−００１５３３、ＮＣ−００１５９２、ＮＣ−００１４４３およびＮＣ−００１６９５を有するいわゆる中等度リスクＨＰＶタイプの３０、３１、３３、３５、３９、５１、５２、５８および６６の完全配列決定されたゲノムを用いた。
【０１８６】
本発明者らは、それぞれＮＣＢＩ登録番号のＮＣ−０００９０４、ＮＣ−００１５２５、ＮＣ−００１５３４、ＮＣ−００５３４９、ＮＣ−００１６８９、ＮＣ−００１５９３、ＮＣ−００１６７６およびＮＣ−００１６９２を有するいわゆる低リスクＨＰＶタイプの６、１１、４２、４３、４４、５３、５４および５５の完全配列決定されたゲノムを用いた。
【０１８７】
本発明者らが説明したように、種々の臨床サンプルのヒトパピローマウイルスの従来のＤＮＡ試験による検出は、多くの技術的、方法論的および臨床的問題により妨害されている。ＨＰＶ ＤＮＡの重亜硫酸塩の変換により、ＨＰＶ誘導体配列プールの複雑性を減少させるため、本発明は、先行技術に遭遇した多くの困難に対する解決を提供する。この複雑性が減少したことにより、サンプル中の種々のＨＰＶタイプのより効率的な開始スクリーニングを可能にし、それゆえ臨床データとのより適切で正確なインターフェースを可能にする。
【０１８８】
出願人により開発された方法を用いるサンプル中のＨＰＶ検出例は、参照として本明細書に組み込まれているＨｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｉｇｎｔｕｒｅｓ Ｐｔｙ社の名称でＷＯ２００６／０６６３５３（ＰＣＴ／ＡＵ２００５／００１９６３）に見ることができる。
【０１８９】
図１は、種々の正常な個体、ならびに高グレード扁平上皮内病巣部、およびある細胞系の、ＨＰＶの存在に関する試験結果を示す。提供されたデータは、ＨＰＶならびに４００のヒトゲノム領域のメチル化状態に関して試験された患者からの図１のデータを補足する。
【０１９０】
【表１０】
【０１９１】
ＨＰＶの二重存在および種々のヒトゲノム領域のメチル化状態
ＨＰＶとＨＰＶ特定のゲノム領域のメチル化状態とを合わせると、いずれか単独の特徴よりも強力な予知指標となることを立証するために実験を工夫した。この様式で、多数のゲノム領域は、子宮頚部細胞学的現象が正常である個体；子宮頚部細胞学的現象が、高グレード扁平上皮内病巣部に特徴的である個体、および子宮頚部細胞学的現象が細胞形態学の癌性指標に関して正常であるが、細胞学的特徴に基づいてＨＰＶに陽性であることが推測される個体からのサンプルにおけるメチル化状態についてアッセイされた。
【０１９２】
図１Ａは、ＨｅＬａ細胞系および病理学者により判定されたＨＳＩＬを示す２人の患者（ＨＳＩＬ−１およびＨＳＩＬ−２と表される）、および子宮頚部形態学上正常であるが、病理学的表現型からＨＰＶが存在すると推測される１人の患者（ＨＰＶ＋Ｎｏｒと表される）が、適切なＰＣＲ増幅テクノロジーにより判定されＨＰＶの存在が陽性であったことを示す。正常な子宮頚部形態学を有する２人の患者（正常１および正常２と表わされる）は、高リスクＨＰＶタイプの存在に関して分子的に陰性であった。
【０１９３】
図１Ｂは、ＨｅＬａ細胞系におけるバンド（アンプリコン）の存在を示し、これにはＨＰＶ１８タイプのＤＮＡ配列を含む。２つのＨＳＩＬサンプル（２つのパネル番号）は、分子的にアッセイされたＨＰＶ１６を含有する。病理学者により形態学的に正常であると判定されたが、その幾つかの細胞がＨＰＶ感染を示す特徴的な細胞質機能を有した子宮頚部組織は、ＨＰＶタイプ８２に陽性であることが判明した（パネル４）。
【０１９４】
次にこれらの臨床サンプルを、メチル化の存在（ｐｏｓと表される）、または非メチル化（ｎｅｇと表される）に関して、各ゲノム座において試験した。重要な予後指標は、例えば、通常の病状を有する患者が非メチル化遺伝子座を有する場合であり、一方、高グレード扁平上皮内病巣部は同じ領域にメチル化を有し；端的に言うと、関連遺伝子領域は、癌性状態に進行すると沈黙させられる（逆の過程が適用される。正常な細胞学的現象を有する個体は、特定の細胞型においてメチル化される遺伝子座を有することができ、その遺伝子座は、癌性状態において非メチル化となる）。
【０１９５】
所与のゲノム領域のメチル化は細胞型により変わることから、幾つかのゲノム領域は、その特定の細胞型の癌性状態への進行に関して必要な情報を得ないであろう。これらの領域は、全てのサンプルにおいて完全に非メチル化であるか、または全ての臨床サンプルにおいて完全にメチル化されているであろう。
【０１９６】
表３Ａおよび３Ｂは、多くの臨床サンプルのＨＰＶ状態、ならびにＨｅＬａ細胞系、および５３の個々のヒトゲノム領域のメチル化状態を示す。
【０１９７】
表３Ａおよび３Ｂから見ることができるように、ＨｅＬａ子宮頚部細胞系および高グレード扁平上皮間病巣部（ＨＳＩＬ）の双方は、分子的に判定されたとおりＨＰＶ ＤＮＡの存在に関して陽性であった。病理学的に推測されたＨＰＶ感染を有するが、非癌性の１つの子宮頚部組織サンプル（ＨＰＶ＋Ｎｏｒと表される）は、ＨＰＶの存在に関して陽性であることも判明した。異なる個体からの２つの正常な子宮頚部組織サンプルは、分子的に判定されたようにＨＰＶ ＤＮＡ配列の存在に関して陰性であることが判明した。
【０１９８】
上記領域の各々は、ＰＣＲ増幅されており、生じたアンプリコンを適切な制限酵素により消化して（および／または配列決定して）、その特定のゲノム領域のメチル化状態を判定する（表３Ａおよび３Ｂ）。
【０１９９】
最初に、予後指標に関する情報が得られないゲノム領域が存在する。これらは、全てのサンプルにおいて非メチル化（１３のゲノム領域ＡＢＣＧ２からＶＨＬ）であるか、または全てのサンプルにおいてメチル化（４つのゲノム領域、ＣＤ３４、ＭＡＧＥＡ２、ＭＡＧＥＡ３およびＭＩＮＴ３１）される。表３Ａおよび３Ｂの結果から特に興味深いのは、ＣＤ１４、ＥＮＤＲＢ、ＨＩＣおよびＲＡＲＢと表されるゲノム領域である。これら領域の全ては、ＨｅＬａ子宮頚部癌細胞系および両ＨＳＩＬサンプルにおいてメチル化された。興味深いことに、これらの領域のいずれも、試験された正常な子宮頚部組織またはＨＰＶにより感染された非癌性子宮頚部組織サンプルにおいてメチル化されなかった。
【０２００】
最後に、ＡＮＡＸ７からＴＮＦＲＳ１０Ｂまでの３２のゲノム領域は、正常な個体とＨＳＩＬを有する個体との間で可変性のメチル化パターンを示す。この可変性は、個々の患者の遺伝子背景およびヒトゲノムの個々の座でメチル化状態の異なる安定性の混合に極めて反映し易い。
【０２０１】
この結果は、ＨＰＶの存在が、ほとんど全てのＨＳＩＬおよび子宮頚部癌に検出されているが、ＨＰＶ単独の存在は、子宮頚部の高グレード異常性について信頼できる指標ではない。しかしながら、ＨＰＶの存在が、子宮頚部ＤＮＡサンプルのメチル化プロフィールの変化と関連する場合、これは、疾患状態の極めてより良好な予後指標を与える。
【０２０２】
【表１１】
【０２０３】
【表１２−１】
【表１２−２】
【表１２−３】
【０２０４】
ゲノム領域ＣＤ１４、ＥＮＤＲＢ、ＨＩＣおよびＲＡＲＢのメチル化に加えて、本発明はまた、正常な子宮頚部組織または３８４の候補遺伝子のパネルからＨＰＶにより感染した正常な子宮頚部組織ではなくて、ＨＳＩＬサンプル中のＣＤ１４、ＥＮＤＲＢ、ＨＩＣおよびＲＡＲＢと同様のメチル化プロフィール示す、さらに６２のＤＮＡゲノム領域を同定している。これらのマーカーは表４に掲げている。
【０２０５】
【表１３】
【０２０６】
図２は、ＨＧＳ ＨＲ−ＨＰＶ ＤＮＡ精製キットおよび検出キットを用いてヒトゲノムＤＮＡおよびＨＰＶ ＤＮＡの双方に関して３６のＬＢＣサンプルに対するＰＣＲ増幅の結果を示す。この方法を用いた結果からわかるように、ヒトゲノム変化の存在および同時にウイルスの有無双方に関してアッセイすることは可能である。
【０２０７】
図３は、ＢｓｔＵ１およびＴａｑαｌ制限エンドヌクレアーゼの組み合わせにより消化され、アガロースゲル上で電気泳動された１６の異なるゲノム遺伝子座で増幅された正常な子宮頚部サンプルの代表的なゲルを示す。ＤＮＡを、液体ベースの細胞種から抽出し（ここでは番号２８と２９）、重亜硫酸ナトリウムで修飾し、入れ子状態のプライマーにより、さらなる分析のために同定された遺伝子に増幅した。これらの遺伝子は、左から右に１）ＴＥＭ ２）ＭＭＥ ３）ＥＣＥ１ ４）ＳＹＫ ５）ＲＡＲＡ ６）ＨＲＫ ７）ＧＰＲ３７ ８）ＣＲＢＰ ９）ＡＢＬ１ １０）ＲＡＧＥ １１）ＬＡＭＲ１ １２）ＭＦＮＧ １３）ＡＢＣＧ２ １４）ＴＭＳＢＩＯ １５）ＳＦＲＳ８および１６）ＰＧＲであった。
【０２０８】
サンプルの病理学およびＨＰＶ感染プロフィールは、専門病理学者により評価された。アンプリコン内のＣｐＧジヌクレオチドが、メチル化されていない場合、チミン塩基への増幅後、重亜硫酸塩の修飾により非メチル化シトシンがウラシル塩基に変換する。非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドおよび制限部位は、保持されず、したがって、ＢｓｔＵ１（サンプルがメチル化されない場合に増幅後ＴＧＴＧに変換するＣＧＣＧがわかるが、サンプルがメチル化配列を含有する場合にＣＧＣＧを存続する）、またはＴａｑαｌ（サンプルがメチル化されない場合に増幅後ＴＴＧＡに変換するＴＣＧＡがわかるが、サンプルがメチル化配列を含有する場合にＴＣＧＡを存続する）エンドヌクレアーゼにより認識されない。したがって、未消化ＰＣＲ産物を表す単一バンドの検出は、アンプリコン内のＣｐＧジヌクレオチドがメチル化されていないことを意味する。メチル化ＣｐＧジヌクレオチドは、重亜流酸塩修飾に抵抗性であることから、制限エンドヌクレアーゼにより認識された制限部位は保持される。その結果、ＰＣＲ産物は、アンプリコンに利用できるＣｐＧ部位数に依って複数断片（星印により示される）に消化される。空のレーンの検出は、ＰＣＲ反応が不成功に終わったことを示唆している。
【０２０９】
２、３の複数バンドは、これら１６の座位に検出された。このアッセイからの代表的な結果を表５に作表する。
【０２１０】
【表１４−１】
【表１４−２】
【０２１１】
病理学的に正常な子宮頚部サンプル（ＮＯＲＭ）の代表的な番号のメチル化プロフィールの中のいくつかは、ＨＰＶ感染（ＮＯＲＭ ＨＰＶ）を有しているようであった。ＤＮＡは、液体ベースの細胞サンプルから抽出し、重亜硫酸ナトリウムで修飾し、３８４の異なる遺伝子に増幅した。アンプリコンは、制限酵素により消化し、アガロースゲル上で電気泳動した。単一産物（未消化産物）の検出は、サンプルが、調べられる遺伝子のプロモーター領域において非メチル化（Ｕ）されていることを示している。複数バンド（消化産物）の検出は、サンプルが、調べられる遺伝子のプロモーターにおいてメチル化（Ｍ）されていることを示している。特定の遺伝子座におけるバンドの欠如（「Ｆ」により表される）により、ＰＣＲ反応は不成功に終わったことが推測される。
【０２１２】
高リスクおよび中等度リスクパピローマウイルスＤＮＡの存在（＋）または不在（−）も掲載された。ヒトおよびマウス双方のＧＳＴ−Ｐ１遺伝子（ＨｍＧＳＴ）を増幅したプライマーは、ＰＣＲ反応に対する対照として含まれた。バンドの検出は、ＤＮＡが変換され、増幅に利用できることを意味する。
【０２１３】
図４は、ＢｓｔＵ１およびＴａｑαｌ制限エンドヌクレアーゼの組み合わせにより消化された１６の異なるゲノム座位で増幅され、アガロースゲル上で電気泳動された腫瘍サンプルの代表的なゲルを示す。ＤＮＡは、液体ベースの細胞種から抽出し（ここでは番号８２、８３、８４、９４、９５および９６）、重亜硫酸ナトリウムで修飾し、入れ子プライマーにより、さらなる分析のために同定された遺伝子に増幅した。これらの遺伝子は、左から右に１）ＰＧＲ ２）ＳＦＲＳ８ ３）ＴＭＳＢＩＯ ４）ＡＢＣＧ２ ５）ＭＦＮＧ ６）ＬＡＭＲ１ ７）ＲＡＧＥ ８）ＡＢＬ１ ９）ＣＲＢＰ １０）ＧＰＲ３７ １１）ＨＲＫ １２）ＲＡＲＡ １３）ＳＹＫ １４）ＥＣＥ１ １５）ＭＭＥおよび１６）ＴＥＭであった。
【０２１４】
サンプルの病理学およびＨＰＶ感染プロフィールは、専門病理学者により評価された。アンプリコン内のＣｐＧジヌクレオチドが、メチル化されていない場合、重亜硫酸塩の修飾により非メチル化シトシンがウラシル塩基に変換する。非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドおよび制限部位は、保持されず、したがって、ＢｓｔＵ１またはＴａｑαｌエンドヌクレアーゼにより認識されない。したがって、未消化ＰＣＲ産物を表す単一バンドの検出は、アンプリコン内のＣｐＧジヌクレオチドがメチル化されていないことを意味する。メチル化ＣｐＧジヌクレオチドは、重亜流酸塩修飾に抵抗性であることから、制限エンドヌクレアーゼにより認識された制限部位は保持される。その結果、ＰＣＲ産物は、アンプリコンに利用できるＣｐＧ部位数によって複数断片（星印により示される）に消化される。空のレーンの検出は、ＰＣＲ反応が不成功に終わったことを示唆している。
【０２１５】
正常なサンプルと比較して、腫瘍サンプルでは、遺伝子のより大きな割合がメチル化される（図４を参照）。このアッセイからの代表的な結果を表６に示す。
【０２１６】
表６において、病理学的に異常な子宮頚部サンプルの代表的な番号に関するメチル化プロフィール（専門病理学者に評価された）を示す。サンプルは、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）の存在および病巣タイプに基づいて分類された（低グレードＬＧ、パピローマウイルス ＬＧ ＨＰＶを有する低グレードＬＧ、前高グレードＰｒ ＨＧ、高グレードＨＧ、癌ｉｎ ｓｉｔｕ３つの成分を有する高グレード、および癌ｉｎ ｓｉｔｕ３つの病巣ＣＩＮ３）。
【０２１７】
ＤＮＡは、液体ベースの細胞サンプルから抽出し、重亜硫酸ナトリウムで修飾し、３８４の異なる遺伝子に増幅した。アンプリコンは、制限酵素により消化し、アガロースゲル上で電気泳動した。単一産物（未消化産物）の検出は、調べられる遺伝子のプロモーター領域において非メチル化（Ｕ）されているサンプルであることを示している。複数産物（消化産物）の検出は、識別される遺伝子のプロモーターにおいてメチル化（Ｍ）されているサンプルであることを示している。特定の遺伝子座におけるバンドの欠如（「Ｆ」により表される）により、ＰＣＲ反応は不成功に終わったことが推測される。
【０２１８】
【表１５−１】
【表１５−２】
【０２１９】
【表１６−１】
【表１６−２】
【０２２０】
表７は、ＤＮＡメチル化プロフィールに関して６４の異なるゲノム座位で調査されたサンプルの病理学を示す。
【０２２１】
予め判定された病状を有する９６人の患者に関する液体ベース細胞サンプルから、ＤＮＡを抽出した。病状タイプに関係するサンプルの関連病状、ヒトパピローマウイルス感染の侵襲度およびこのウイルスの有無は、専門病理学者により評価された。
【０２２２】
サンプルは、細胞学的に正常（ＮＯＲＭ）、ＨＰＶに感染している可能性が高い（ＨＰＶ）、ＨＰＶに感染している可能性が高いが細胞学的に正常（ＨＰＶ ＮＯＲＭ）、低グレード病巣（ＬＧ）、ＨＰＶ感染した低グレード病巣（ＬＧ ＨＰＶ）、高グレード病巣（ＨＧ）、高グレード病巣の増加（ＩＮＣ ＨＧ）、前高グレード病巣（Ｐｒ ＨＧ）として、ＨＰＶに感染し易い癌腫ｉｎ ｓｉｔｕ１の病巣、高グレード癌腫ｉｎ ｓｉｔｕ３の病巣（ＨＧ ＣＩＮ３）、高グレード癌腫（ＨＧ Ｃｘ）、扁平上皮細胞癌腫（ＳＣＣ）、扁平上皮細胞癌腫／癌（ＳＣＣ Ｃｘ）、腺癌（ＡＣ Ｃｘ）、子宮体癌（Ｃａ Ｅｎｄｏｍｅｔ）、腺癌／ｉｎ ｓｉｔｕ腺癌（ＡＣ／ＡＩＳ）としてラベルが貼られた。
【０２２３】
表８は、本発明による疾患状態の好適な指標である本発明により判明した遺伝子またはゲノム領域を示す。当業者は、ウイルス核酸の存在の検出と関連する１つ以上のこれらの遺伝子またはゲノム領域における変化を検出するために、好適なプライマーまたはプローブを工夫し得ることを理解できるであろう。
【０２２４】
【表１７−１】
【表１７−２】
【０２２５】
多数の変型および／または修飾が、幅広く記載された本発明の精神または範囲から逸脱することなく具体的な実施形態で示したように本発明になされ得ることを当業者は認識するであろう。したがって全ての点で、本実施形態は、例示であって限定するものでないと考慮されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【０２２６】
図面の簡単な説明
【図１】ＨｅＬａ細胞系；高グレード扁平上皮内病巣と表示される（ＨＳＩＬ−１およびＨＳＩＬ−２と表示される）２個体（１および２）からのサンプル；正常な細胞診断を有する２個体（正常１および正常２と表示される）；癌性状態の細胞診断指標を有しないにも関わらず、専門病理学者の判定により、細胞表現型に基づいてＨＰＶ感染を有していると推定された１個体（ＨＰＶ＋Ｎｏｒと称される）を含む種々のヒトサンプルの高リスクＨＰＶ試験およびＨＰＶタイピングを示す図であり、Ａは、高〜中等度リスクＨＰＶタイプに対するユニバーサルプライマーを用いた６つの異なるサンプルにおける高リスクＨＰＶタイプの判定を示し；Ｂは、ＨＰＶタイプ１６、１８、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８および５９に特異的な複雑性減少プライマーセット、ならびに正常組織サンプルの場合、プライマーセット４２、４３、４４、５３、５４、５５、６６、６８、７３、８２、８３および８４を用いたＨＰＶに関する試験を示す図である。
【図２】同一のＬＢＣサンプルにおけるヒトゲノムＤＮＡおよびＨＰＶ ＤＮＡの同時検出を示す図である。
【図３】１６の異なるゲノム遺伝子座で増幅し、ＢｓｔＵ１およびＴａｑαｌ制限エンドヌクレアーゼの組み合わせによって消化し、アガロースゲル上で電気泳動した正常な子宮頚部サンプルの代表的なゲルを示す図である。ＤＮＡは、液体ベースの細胞診断検体（本明細書で番号２８および２９）から抽出し、重亜硫酸ナトリウム修飾し、入れ子プライマーによって、さらなる分析のために同定される遺伝子へ増幅した。これらの遺伝子は、左から右へ、１）ＴＥＭ、２）ＭＭＥ、３）ＥＣＥ１、４）ＳＹＫ、５）ＲＡＲＡ、６）ＨＲＫ、７）ＧＰＲ３７、８）ＣＲＢＰ、９）ＡＢＬ１、１０）ＲＡＧＥ、１１）ＬＡＭＲ１、１２）ＭＦＮＧ、１３）ＡＢＣＧ２、１４）ＴＭＳＢＩＯ、１５）ＳＦＲＳ８および１６）ＰＧＲであった。
【図４】１６の異なるゲノム遺伝子座で増幅し、ＢｓｔＵ１およびＴａｑαｌ制限エンドヌクレアーゼの組み合わせによって消化し、アガロースゲル上で電気泳動した腫瘍サンプルの代表的なゲルを示す図である。ＤＮＡは、液体ベースの細胞診断検体（本明細書で番号８２、８３、８４、９４、９５および９６）から抽出し、重亜硫酸ナトリウム修飾し、入れ子プライマーによって、さらなる分析のために同定される遺伝子へ増幅した。これらの遺伝子は、左から右へ、１）ＰＧＲ、２）ＳＦＲＳ８、３）ＴＭＳＢＩＯ、４）ＡＢＣＧ２、５）ＭＦＮＧ、６）ＬＡＭＲ１、７）ＲＡＧＥ、８）ＡＢＬ１、９）ＣＲＢＰ、１０）ＧＰＲ３７、１１）ＨＲＫ、１２）ＲＡＲＡ、１３）ＳＹＫ、１４）ＥＣＥ１、１５）ＭＭＥおよび１６）ＴＥＭであった。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般に、対象の健康状態を判定するためのアッセイとして、サンプル中のゲノムマーカーの検出と共にウイルスの存在を検出することに関する。本発明は、予後診断的価値を有する危険性評価試験として好適である。
【背景技術】
【０００２】
特定の核酸分子の検出のために、現在、多数の方法が利用できる。これらの方法は典型的に、標的核酸と、短いオリゴヌクレオチド（２０塩基以下）から多キロ塩基（ｋｂ）配列の範囲の長さであり得る核酸プローブとの間の配列依存ハイブリダイゼーションに依存する。
【０００３】
核酸配列の集団内から特定の配列を増幅するために最も広く用いられている方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法（Dieffenbach, C. and Dveksler, G., eds. PCR Primer: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Press, Plainview NY）である。この増幅法では、相補的ＤＮＡ鎖上および増幅される領域のいずれかの端に、一般に、２０ヌクレオチドから３０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドを用いて、変性した一本鎖ＤＮＡ上でＤＮＡ合成が開始される。変性、プライマーハイブリダイゼーションおよび熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを用いたＤＮＡ鎖合成の連続的サイクルにより、プライマー間の配列の指数関数的増幅が可能になる。ＲＮＡ配列は、まず逆転写酵素を用いてコピーして相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）コピーを作製することにより、増幅できる。増幅されたＤＮＡ断片は、ゲル電気泳動、標識プローブとのハイブリダイゼーション、引き続いての同定（例えば、酵素結合アッセイによる）を可能にするタグ付きプライマーの使用、および標的ＤＮＡとハイブリダイゼーションするとシグナルを増強させる蛍光タグ付きプライマーの使用（例えば、ＢｅａｃｏｎおよびＴａｑＭａｎのシステム）など、種々の手段によって検出できる。
【０００４】
特定のヌクレオチド配列の検出および増幅のために、ＰＣＲに加えて、他の種々の技法が開発されている。一例は、リガーゼ連鎖反応である（Barany, F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 189-193, 1991）。
【０００５】
他の例は、１９９２年に最初に記載された等温増幅（Walker GT, Little MC, Nadeau JG and Shank D. Isothermal in vitro amplification of DNA by a restriction enzyme/DNA polymerase system. PNAS 89: 392-396 (1992)）であり、鎖置換増幅（ＳＤＡ）と称される。それ以来、転写媒介増幅（ＴＭＡ）および、対応するゲノムＤＮＡではなく、ＲＮＡ配列をコピーするＲＮＡポリメラーゼを用いるＮＡＳＢＡ法などの多数の他の等温増幅法が記載されている（Guatelli JC, Whitfield KM, Kwoh DY, Barringer KJ, Richmann DD and Gingeras TR. Isothermal, in vitro amplification of nucleic acids by a multienzyme reaction modeled after retroviral replication. PNAS 87: 1874-1878 (1990); Kievits T, van Gemen B, van Strijp D, Schukkink R, Dircks M, Adriaanse H, Malek L, Sooknanan R, Lens P. NASBA isothermal enzymatic in vitro nucleic acid amplification optimized for the diagnosis of HIV-1 infection. J Virol Methods. 1991 Dec; 35(3):273-86）。
【０００６】
他のＤＮＡベースの等温法としては、ＤＮＡポリメラーゼが、環状テンプレートに対するプライマーを伸長させるローリングサークル増幅（ＲＣＡ）（Fire A and Xu SQ. Rolling replication of short circles. PNAS 92: 4641-4645 (1995）、標的検出のために環状プローブを用いる分枝増幅（ＲＡＭ）（Zhang W, Cohenford M, Lentrichia B, Isenberg HD, Simson E, Li H, Yi J, Zhang DY. Detection of Chlamydia trachomatis by isothermal ramification amplification method: a feasibility study. J Clin Microbiol. 2002 Jan; 40(1):128-32）、より最近では、ＤＮＡ鎖を巻き戻すために、熱の替わりにヘリカーゼ酵素を用いるヘリカーゼ依存性等温ＤＮＡ増幅（ＨＤＡ）（Vincent M, Xu Y, Kong H. Helicase-dependent isothermal DNA amplification. EMBO Rep. 2004 Aug; 5(8):795-800）が挙げられる。
【０００７】
最近、ＤＮＡ増幅の等温法が記載された（Walker GT, Little MC, Nadeau JG and Shank D. Isothermal in vitro amplification of DNA by a restriction enzyme/DNA polymerase system. PNAS 89:392-396(1992)）。伝統的な増幅法は、増幅反応の各サイクルにおける標的分子の変性および復元のサイクルの継続に頼っている。ＤＮＡの熱処理はＤＮＡ分子のある程度の切断をもたらし、したがって、発達中の胚盤胞からの少数の細胞からＤＮＡを単離する場合や、特に、組織切片、パラフィンブロックおよび古いＤＮＡサンプルなどのようにＤＮＡがすでに断片化された形態である場合など、ＤＮＡに限りがある場合、この加熱−冷却サイクルはＤＮＡをさらに損傷させ、増幅シグナルの損失をもたらす恐れがある。等温法は、さらなる増幅のためのテンプレートとして役立つ一本鎖分子を産生させるためにテンプレートＤＮＡを継続的に変性させる工程に依存せず、一定温度における特定の制限エンドヌクレアーゼによるＤＮＡ分子の酵素的ニッキング、またはヘリカーゼ酵素の使用によるＤＮＡ二重鎖の巻き戻しに依存する。
【０００８】
鎖置換増幅（ＳＤＡ）と称される技法は、半修飾ＤＮＡの非修飾鎖にニックを入れる所定の制限酵素の能力、および下流の鎖を伸長させ置換する５’−３’エキソヌクレアーゼ欠損ポリメラーゼの能力に依存する。次いで、センス反応からの鎖置換がアンチセンス反応のテンプレートとして役立つ、センスとアンチセンスの結合反応により、指数関数的な増幅が達成される（Walker GT, Little MC Nadeau JG and Shank D. Isothermal in vitro amplification of DNA by a restriction enzyme/DNA polymerase system. PNAS 89:392-396(1992)）。このような技法は、結核菌（Walker GT, Little MC, Nadeau JG and Shank D. Isothermal in vitro amplification of DNA by a restriction enzyme/DNA polymerase system. PNAS 89:392-396(1992)）、ＨＩＶ−１、Ｃ型肝炎およびＨＰＶ−１６（Nuovo G.J., 2000）、トラコーマクラミジア（Spears PA, Linn P, Woodard DL and Walker GT. Simultaneous Strand Displacement Amplification and Fluorescence Polarization Detection of Chlamydia trachomatis. Anal. Biochem. 247:130-137(1997)）の好首尾な増幅に用いられている。
【０００９】
現在まで、ＳＤＡの使用は、修飾鎖上で酵素的開裂に耐性を有すると考えられる半ホスホロチオエートＤＮＡ二重鎖を生じさせる修飾ホスホロチオエートヌクレオチドに依存しており、置換反応を駆動させるための消化の替わりに、酵素的ニッキングをもたらしている。しかし最近、いくつかの「ニッカーゼ」酵素が操作されている。これらの酵素は、伝統的様式でＤＮＡを切断するのではなく、ＤＮＡ鎖の一本にニックを生じさせる。「ニッカーゼ」酵素としては、Ｎ．Ａｌｗ１（Xu Y, Lunnen KD and Kong H. Engineering a nicking endonuclease N.Alw1 by domain swapping. PNAS 98:12990-12995(2001)、Ｎ．ＢｓｔＮＢ１（Morgan RD, Calvet C, Demeter M, Agra R, Kong H. Characterization of the specific DNA nicking activity of restriction endonuclease N.BstNBI. Biol. Chem. 2000 Nov; 381(11):1123-5）およびＭＩｙ１（Besnier CE, Kong H. Converting MIy1 endonuclease into a nicking enzyme by changing its oligomerization state. EMBO Rep. 2001、Sep; 2(9):782-6. Epub 2001 Aug 23）が挙げられる。したがって、このような酵素の使用により、ＳＤＡ法が簡便化されると考えられる。
【００１０】
さらに、熱安定性制限酵素（Ａｖａ１）と熱安定性エキソポリメラーゼ（Ｂｓｔポリメラーゼ）の併用により、ＳＤＡは改善されている。この併用は、この反応の増幅効率を、１０８倍増幅から１０１０倍増幅、増加させることが示されているので、この技法を用いて、ユニークな単一コピー分子の増幅が可能である。熱安定性ポリメラーゼ／酵素を併用して得られた増幅倍数は、１０９の桁である（Milla M.A., Spears P.A., Pearson R.E. and Walker G.T. Use of the Restriction Enzyme Ava1 and Exo-Bst Polymerase in Strand Displacement Amplification Biotechniques, 1997 24:392-396）。
【００１１】
現在まで、全ての等温ＤＮＡ増幅法では、増幅開始前に、二本鎖ＤＮＡテンプレート分子を変性することが必要である。さらに、増幅は、各々のプライミング事象から１回のみ開始される。
【００１２】
直接的検出では、標的核酸は、最も一般的には、ゲル電気泳動によりサイズに基づいて分離され、固相担体に移された後、標的配列に相補的なプローブとのハイブリダイゼーションを行う（サザンブロッティングおよびノーザンブロッティング）。このプローブは、天然核酸、または、ペプチド核酸（ＰＮＡ）もしくはロックド核酸（ＬＮＡ）もしくは挿入核酸（ＩＮＡ）などの類縁体であり得る。このプローブは、直接標識できる（例えば、３２Ｐにより）か、間接的方法を使用できる。間接的方法は通常、このプローブ内へのビオチンまたはジゴキシゲニンなどの「タグ」の組み込みに依存し、次いで、このプローブを、酵素結合基質変換または化学発光などの手段により検出する。
【００１３】
核酸を直接検出するために広く使用されている他の方法は、「サンドイッチ」ハイブリダイゼーションである。この方法では、捕捉プローブを固相担体に結合させ、溶液中で、標的核酸を結合させた当該プローブにハイブリダイズさせる。非結合標的核酸を洗浄除去し、標的配列にハイブリダイズする第２のプローブを用いて、結合核酸を検出する。検出には、上記で概説した直接法または間接法を使用できる。このような方法の例としては、サンドイッチハイブリダイゼーションの原理を用いる一例である「分枝ＤＮＡ」シグナル検出システム（1991, Urdea, M.S., et al., Nucleic Acids Symp. Ser. 24, 197-200）が挙げられる。核酸配列の直接的検出のための核酸ハイブリダイゼーションを用いる、急成長している分野は、ＤＮＡマイクロアレイの分野である（2002, Nature Genetics, 32, [Supplement]; 2004, Cope, L.M., et al., Bioinformatics, 20, 323-331; 2004, Kendal, S.L., et al., Trends in Microbiology, 12, 537-544）。この方法では、短いオリゴヌクレオチド（典型的には、アフィメトリクスのシステムにおける２５量体）からより長いオリゴヌクレオチド（典型的には、アプライドバイオシステムおよびアジレントのプラットフォームにおける６０量体）、さらにｃＤＮＡクローンなどのより長い配列の範囲にあり得る個々の核酸種を、グリッドパターンにおける固体支持体に固定するか、または固体支持体上にフォトリソグラフィ合成する。次いで、タグをつけた、または標識化した核酸集団を、このアレイにハイブリダイズさせ、アレイにおける各スポットに対するハイブリダイゼーションのレベルを定量化する。最も一般的には、放射性または蛍光標識した核酸（例えば、ｃＲＮＡ類またはｃＤＮＡ類）をハイブリダイゼーションに用いるが、化学発光などの他の検出システムも使用できる。
【００１４】
このような新規な方法は、病原生物の高感度で特異的な検出の見込みがあるため、現在、感染性疾患の診断のための分子的方法を利用することに大きな関心が持たれている。この文脈において、ヌクレオチド配列のレベルとそれらのゲノムのサイズとの双方において違いのある個々のＨＰＶタイプを有する可変性の遺伝子プールとしての集団的レベルでそのＤＮＡゲノムが存在するヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）を、本発明は扱っている。分子的試験により、種々の臨床サンプル中の異なるＨＰＶタイプを検出し正確に同定することは、種々の分子的試験の限界によって妨げられる。さらに、ＨＰＶを規定する包括的な組分け内には、多数の「遺伝子型」、「変異体」、「サブタイプ」および「タイプ」が存在する。例えば現在、１００超のＨＰＶのタイプが認められており、そのうちのいくつかはヒトの疾患に強い関連性がある。いわゆる高リスクおよび中程度リスクのタイプは、癌への進行に関係しており、利用できる最も正確な分子的方法によるそれらの検出は緊急の臨床的優先事項である。
【００１５】
大きな問題は、ＨＰＶ単独の検出は、癌への進行について必ずしも良好な指標ではないことである。子宮頚部上皮内腫瘍形成（ＣＩＮ）は、侵襲的形態に進行する可能性はあるが、多くの病巣は、退縮するか、または癌腫に進行することなく存続する。女性の７０パーセントは、２年以内にＨＰＶ感染を除去する（1998, Journal of Pediatrics 132, 277-284; Moscicki, A.B., et al.）。しかし、ＣＩＮおよびその進行の発見はきわめて可変的であるため、無処置であっても、正常に戻り得るし、または完全ブローン癌腫になり得る。ＣＩＮＩおよびＣＩＮＩＩの症例のおよそ三分の一から二分の一が自然に退縮する（1990, Australian and New Zealand Journal of Obstetrics and Gynaecology, 30, 1-23, Channen, W et al.）。ＣＩＮＩからＣＩＮＩＩへの進行にかかる時間は、約十年であるが、一部の女性では、二十年以上であり得る（2000, Cancer Research 60, 6027-6032., Ylitalo, E et al.）。
【００１６】
エプスタインバールウイルスおよびその胃癌との関連における場合のように、細胞、組織または器官のウイルス感染により、これら対象物が変化を受けるゲノムメチル化のサインが生じ得る（2002, American J. Pathology 160, 787-794, Kang, G.H., et al）。メチル化または脱メチル化は、多くの細胞分裂にわたって、いくつかの場合は生物の世代にわたって引き継がれてきた安定な変化であるため、通常は安定なメチロームの変化は、前癌状態または癌状態を予知するものであり得る。
【００１７】
異なるＨＰＶゲノムタイプ間の交差ハイブリダイゼーションの問題があるのみならず、ＨＰＶタイプを構成する正確な分類が、生命情報科学の著しい限界を有するゲノム配列の類似性に依存するため、単一アッセイで、全ての異なるＨＰＶタイプを認識する信頼性の高いロバストなＤＮＡベースの検出システムを実行することは困難な課題であった。したがって、新規ＨＰＶタイプを、以前のＨＰＶタイプと９０％未満の配列類似性のあるものとして確定できても、より細かい分類学上の細区分は、扱う上でより問題となる。したがって、新規ＨＰＶ「サブタイプ」は、ＤＮＡ配列の類似性が以前のサブタイプに比較して９０〜９８％の範囲である場合に確定される。新規「変異体」は、配列類似性が、以前の変異体に比較して、９８〜１００％である場合に確定される（1993, Van Rast, M.A., et al., Papillomavirus Rep, 4, 61-65; 1998, Southern, S.A. and Herrington, C.S. Sex. Transm. Inf. 74, 101-109）。このスペクトルは、単一単離ウイルス粒子からの単一ゲノムの比較に基づいて変異を測定し得る点までさらに広がり得る。このような場合、「遺伝子型」は、他のいずれかの完全に配列決定されたＨＰＶゲノムと１つの塩基だけ少なくとも異なっているいずれかの完全に配列決定されたＨＰＶゲノムとなるであろう。これは、確定位置における単一塩基が、Ｇ、Ａ、ＴまたはＣの４つの状態のうちの１つである全ての場合、ならびに、所与の位置における塩基が欠失、付加、増幅または転移により、別の部位へ変化した場合を含む。
【００１８】
上記の理由で、本特許明細書出願に用いられる全てのバイオインフォマティクス上の比較は、ＨＰＶ１６ゲノム（標準的コンパレーターとしてＨＰＶ１６の１から７９０４の位置を用いて）と相対的に、また、先行技術であるＢＬＡＳＴ法（1996, Morgenstern, B., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93, 12098-12103）を用いて行われる。参照を目的として本明細書で利用される標準的なＨＰＶ「タイプ」は、７９０４塩基対のパピローマウイルスである、ＰａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｉｄａｅのＨＰＶ１６である（National Center for Biotechnology Information、ＮＣＢＩ遺伝子座ＮＣ＿００１５２６；変型ＮＣ＿００１５２６．１；ＧＩ：９６２７１００；参照、Medline, 91162763 and 85246220; PubMed 1848319 and 2990099）。
【００１９】
疾患リスク評価の文脈において既存のＨＰＶ検出システムが直面している困難はおおむね三重となっている。第１の限界は、テクノロジーシステム自体のものである。第２は、疾患細胞集団の病理学的解釈の限界である。第３は、遺伝子背景、ならびに寄与している補因子の違いに供されている異なるヒト集団における疾患の進行評価の臨床レベルにおける限界である。
【００２０】
一定のタイプのＨＰＶは、子宮頚癌に関係しており、膣、産卵口、陰茎および肛門の、確定がより困難な癌の一部に寄与している。子宮頚部悪性転換域である組織の環状部は、ＨＰＶ発癌の可能性の高い領域であり、この領域の完全な細胞正常状態から侵襲性癌腫状態の評価は、組織学的、細胞学的および分子生物学的方法論により、可視または顕微鏡の基準を用いて、ルーチン評価されている。ウイルスレベルと易感染性ヒト細胞のレベル双方におけるウイルスによって誘導された異常の早期検出は、正常組織から異常組織まで分子径路に沿って細胞集団が到達する場所の判定にそれが役立ち得るならば、臨床的に大きな関連性を有すると考えられる。しかし、半世紀の間、パップスメアの使用にも関わらず、異常子宮頚部の細胞学的診断と正常状態との間の固形早期リスク評価は、現在依然として問題がある。主要な問題は、種々の段階の子宮頚部上皮内腫瘍（ＣＩＮ１、ＣＩＮ２およびＣＩＮ３）などの「前癌」の確定、したがって、治療オプションに関する臨床的決定の分かりにくい基準をめぐるものである。前癌の確定は、ｉｎ ｓｉｔｕのＣＩＮ２、ＣＩＮ３および癌腫の使用を避けるための偽正確の方法であると考えている臨床医もいる。顕微鏡診断に、さらにＣＩＮ２の臨床的意味には、大きな不均一性が存在する（2003, Schiffman, M., J. Nat. Cancer Instit. Monog. 31, 14-19）。いくつかのＣＩＮ２病巣は顕微鏡による外観は悪いにも関わらず、免疫系によって克服されて消失するが、他の病巣は侵襲的な癌腫へと進行する。したがって、ＣＩＮ２は、多義的診断の緩衝帯域と考えている者もあるが、このような帯域の境界条件には議論の余地がある。ある臨床医は、ＣＩＮ２とＣＩＮ３とを組み合わせることは実行不良と考えているが、一方、他の者は、ＣＩＮ２またはそれより悪い病巣全てを処置している。最後に、ＣＩＮ３と特定された女性の三分の一から三分の二の間の者は侵襲的癌腫を発現するが、それでもこれは、予測不能な時間依存的様式で生じることが、文献に示されている（2003, Schiffman, M., J. Nat. Cancer. Instit. Monog. 31, 14-19; 1978, Kinlen, L.J., et al., Lancet 2, 463-465; 1956, Peterson, O. Am. J. Obstet. Gynec. 72, 1063-1071）。
【００２１】
今日、未だに医師が直面している中心的問題は、有意性が未判定の異型細胞（ＡＳＣＵＳ）などの低段階の細胞学的異常、または扁平上皮内病巣（ＳＩＬｓ）の確定が困難なことである。実際、ＡＳＣＵＳは、適切な診断ではなく、むしろ、理解に乏しい変化の「ゴミ箱」カテゴリーである（1996, Lorincz, A.T., 1996, J. Obstet. Gyncol. Res. 22, 629-636）。経口避妊薬の使用から、喫煙、トラコーマクラミジアおよび単純疱疹ウイルス２型などの、ＨＰＶ以外の病原体、抗酸化栄養物および頚部炎症の補因子作用は全て、高段階の扁平上皮内病巣（ＨＳＩＬｓ）から子宮頚癌の進行へのリスクを調節すると主張されているが、これらのために前癌病巣の範囲全体を解釈することは困難である（2003, Castellsague, X.J. Nat. Cancer Inst. Monog. 31, 20-28）。分類のベセスダシステムおよび２００１年におけるその改定版の導入は、低段階の扁平上皮内病巣（ＬＳＩＬｓ）の新たなカテゴリーにＣＩＮ１の異型性コイロサイトーシスを含めることが最初、有用でないことが分かったため、臨床医の間の混乱を減少させる上でなされたことはわずかであった。ベセスダシステム導入の結果は、多くの臨床医が異型性コイロサイトーシスに対してコルポスコピーを実行してはいないが、「ＣＩＮ１の患者にそうすることを強いられるように感じた」ことである（1995, Hatch, K.D., Am. J. Obstet. Gyn. 172, 1150-1157）。コルポスコピーの熟達には多くの年数の訓練が必要であったが、主観的細胞学的基準により依然として、一貫性がなく、また、再現性がない結果となっている（1994, Sherman, M.E., Am. J. Clin. Pathology 102, 182-187; 1988, Giles, J.A., Br. Med. J., 296, 1099-1102）。
【００２２】
継続する診断上の障害は、「異型」などの不明確な診断が、いくつかの設定において、診断の２０％以上を占め得ることである（1993, Schiffman, M. Contemporary OB/GYN, 27-40）。これは、「異型」であったスミアに対して病理学者の独立した診断一致のレベルを評価するために特に設計された試験によって示されている。同一セットのサンプルに対する５人の専門的病理学者の間での正確な一致が生じたのは、症例のわずか２９％に過ぎなかったことが分かった（1994, Sherman, M.E., et al., Am. J. Clin. Pathology 102, 182-187）。正味の結果は、子宮頚部細胞診断は、高い偽陰性（低感受性と称される）および高い偽陽性（低特異性と称される）を有し続けていることである。様々な病理学者の細胞学的解釈では、２０％位までの偽陰性の率および１５％までの偽陽性の率となっている（1993, Koss, L.G., Cancer 71, 1406-1412）。偽陽性結果は、不必要なコルポスコピー検査、生検および処置に至り、これらは全て、健康管理費用の負担を付加する。偽陰性結果は、診療過誤訴訟になり、関連経費がかかる可能性が生じる。ＨＰＶに関する試験を用いた子宮頚部異常の早期段階の分子診断により、細胞学的診断よりも主観性の少ない試験が提供される。
【００２３】
生物における健康欠如のゲノム指標は、多数のレベルでのゲノムメチル化状態における変化に密接に関連している。食事の補完は、メチル化および代謝の健康状態に対する誤った有害な帰結を有する恐れがあり（Waterland, R.A., 2003, Molecular and Cellular Biology 23, 5293-5300）、リールイン遺伝子座の領域など、一定のゲノムプロモーター領域の異常なメチル化は、精神分裂症などの種々の精神医学的条件に関係している（2002, Chen, Y., et al, Nucleic Acids Research 30, 2930-2939; Miklos, G.L.G., and Maleszka, R., 2004, Nature Biotechnology 22, 615-621）。メチル化研究の１つの大きな領域は癌研究にあり、そこでは、ゲノム領域の高メチル化と低メチル化の双方が、広範に文書化されている（French, S.W., et al., 2002, Clinical Immunology 103, 217-230; Frigola, J., et al., 2005, Human Molecular Genetics, 14, 319-326; Belinsky S.A., et al., Nature Reviews Cancer 4, 1-11）。これらの研究のいくつかは、癌の指標のための予後バイオマーカーの発見を目指している（Baker, M., 2005, Nature Biotechnology, 23, 297-304）が、バイオマーカーの分野は、一貫性のない結果で不可解である。さらに、このようなゲノム研究が、微生物およびウイルスの感染から生じる細胞および組織に対する動揺の他の出所源と結び付けられることは稀である。また、癌のゲノムは一般に、染色体の異数、セグメントの異数、欠失、増幅、反転、転座および多変異などの大量のゲノム変動を含有し（Duesberg, P., 2004, Cell Cycle, 3, 823-828; Miklos, G.L.G., 2005, Nature Biotechnology 23, 535-537）、メチル化変化の文脈における早期検出のためのこれらの重要性は、まだそれほど深く探索されていない（Vogelstein, B., et al., 2004, Nature Medicine, 10, 789-799; Lucito, R., et al., 2003, Genome Research, 13, 2291-2305）。
【００２４】
上記に概説した全ての問題および欠点に鑑みて、特に、前腫瘍形成病巣のスクリーニングで、ＤＮＡ方法論の臨床的影響に関する議論は依然として存在している。細胞異常の高感度な分子の早期兆候指標は、きわめて役立つものと考えられる。本発明者らは、個体の健康状態の判定に使用する目的で、ウイルスおよびゲノム標的を検出するための新規な方法、キットおよび統合された生命情報科学プラットフォームを開発した。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００２５】
発明の開示
一般的態様において、本発明は、ウイルスの存在の検出と、健康状態を示すゲノム標的またはマーカーの有無または状態の検出との組み合わせを用いて、対象の健康状態を判定するアッセイに関する。本発明は、必要な場合、同一の試験、容器、または反応において、ただ１つのサンプルで実施できる。
【００２６】
第１の態様において、本発明は、
（ａ）核酸中の非メチル化シトシンを修飾できる試剤により対象からのサンプルを処理する工程であって、サンプル中のウイルス核酸およびゲノム核酸を処理してウイルス核酸誘導体およびゲノム核酸誘導体を形成する工程；
（ｂ）処理されたサンプル中のウイルス核酸誘導体の存在をアッセイする工程；および
（ｃ）処理されたサンプル中のゲノム核酸誘導体中のゲノム標的の状態を判定する工程であって、１種以上のウイルス核酸誘導体の存在およびゲノム標的の状態により健康状態が示される工程、を含む、対象の健康状態を判定するアッセイを提供する。
【００２７】
好ましい一形態において、このアッセイは、
アッセイ工程および判定工程に先立って、ウイルス核酸誘導体およびゲノム核酸誘導体の少なくとも一部を増幅させる工程、をさらに含む。
【００２８】
第２の態様において、本発明は、
（ａ）ウイルス核酸およびゲノム核酸を含有する対象からのサンプルを、非メチル化シトシンを修飾する試剤により処理し、シトシン数は減少しているが、塩基の総数は対応する非処理ウイルス核酸および非処理ゲノム核酸と実質的に同じであるウイルス核酸誘導体およびゲノム核酸誘導体を形成する工程；
（ｂ）ウイルス特異的核酸分子を得る工程；
（ｃ）ゲノム標的を有する核酸分子を得る工程；
（ｄ）ウイルス特異的核酸分子の存在を試験する工程；および
（ｅ）処理され増幅されたサンプル中のゲノム標的の状態を判定する工程であって、１種以上のウイルス特異的核酸分子および標的状態の検出により対象の健康状態が示される工程、を含む対象の健康状態を判定するアッセイを提供する。
【００２９】
このウイルス特異的核酸分子およびゲノム標的を有する核酸分子は、ウイルス核酸誘導体およびゲノム核酸誘導体を増幅することによって得ることが好ましい。
【００３０】
第３の態様において、本発明は、
（ａ）非メチル化シトシンを修飾する試剤により、対象からのサンプルを処理して、核酸誘導体を形成する工程；
（ｂ）所望のウイルス核酸分子を核酸誘導体に増幅させることができるプライマーを提供する工程；
（ｃ）標的ゲノム核酸分子を核酸誘導体に増幅させることができるプライマーを提供する工程；
（ｄ）核酸誘導体に対して増幅反応を実施する工程；および
（ｅ）増幅された所望のウイルス核酸および増幅された標的ゲノム核酸の存在をアッセイする工程であって、１つ以上の増幅産物の有無により対象の健康状態が示される工程、を含む、対象の健康状態を判定するアッセイを提供する。
【００３１】
好ましい一形態において、工程（ｅ）は、所望のウイルス特異的核酸分子の検出により、サンプル中のウイルスの存在を示す、所望のウイルス特異的核酸分子を含む増幅核酸産物の存在をアッセイする工程を含む。
【００３２】
他の好ましい形態において、工程（ｅ）は、標的核酸分子を含む増幅核酸産物の存在をアッセイする工程であって、標的核酸分子を検出することにより、サンプル中のゲノムまたは遺伝子の状態が示される工程、をさらに含む。
【００３３】
第４の態様において、本発明は、
（ａ）ウイルス核酸およびゲノム核酸中の非メチル化シトシンをウラシルに変換してウイルス核酸誘導体およびゲノム核酸誘導体を形成する条件下、対象からのサンプルを重亜硫酸塩試薬で処理する工程；
（ｂ）サンプルに、ウイルス核酸誘導体における所望のウイルス特異的核酸分子を増幅させることができる、ウイルス核酸誘導体の領域に結合可能なプライマーを供給する工程；
（ｃ）サンプルに、ゲノム核酸誘導体における所望の標的ゲノム特異的核酸分子を増幅させることができる、ゲノム核酸誘導体の領域に結合可能なプライマーを供給する工程；
（ｄ）処理されたサンプルに対して増幅反応を実施する工程；および
（ｅ）増幅されたウイルス核酸産物および増幅されたゲノム核酸標的の存在をアッセイすることであって、上記産物および標的のうちの１つまたは双方の検出により対象の健康状態が示されること、を含む、対象の健康状態を判定するアッセイを提供する。
【００３４】
好ましい一形態において、このアッセイは、
（ｆ）ウイルスが存在するサンプルを、前記サンプル中のウイルスのタイプ、サブタイプ、変異体または遺伝子型を判定するために試験する工程、をさらに含む。
【００３５】
増幅は、ＰＣＲまたは等温増幅などの任意の好適な手段により実施できる。
【００３６】
このウイルスがＤＮＡゲノムを有している場合は、この試剤との処理によって核酸誘導体が生じる。しかし、このウイルスがＲＮＡゲノムを有している場合は、ゲノムは逆転写酵素方法論によってＤＮＡへ変換できる。変換は、試剤との処理の前または後に実施できる。他のＲＮＡからｃＤＮＡへの変換がないことを保証するために、ウイルス特異的プライマーを用いることが好ましい。
【００３７】
本対象は、かなりの頻度でゲノムのメチル化を有する任意の高等生物形態であり得る。典型的に本発明は、動物またはヒトに、およびウイルス感染植物種に好適である。動物は、飼育動物または家畜哺乳動物であることが好ましいが、健康状態をモニターすることが必要な野生集団であってもよい。ヒトは、健康な個人であっても病人であってもよい。
【００３８】
所望のウイルス核酸分子は、疾患を示すものであってもなくても、ウイルスファミリー自体、または、属もしくは種などのより下位の分類カテゴリー、タイプもしくはサブタイプ、またはウイルスの変異体もしくは遺伝子型に特異的であり得る。
【００３９】
いくつかのゲノム領域のメチル化は、典型的に、関連遺伝子が「オフ」になる発現を引き起こす。しかし、ある状況では、いくつかの遺伝子が関連するメチル化領域を有し得るが、遺伝子発現は「オン」のままである。したがって、好ましい形態において、メチル化または非メチル化は、遺伝子発現自体ではなく、予後の指標として使用できる。また、所望のメチル化状態を判定または標的化するために、特定の核酸領域の増幅を妨害することも可能である。
【００４０】
標的のゲノム核酸は、ゲノムの１つもしくは複数の遺伝子またはプロモーターもしくはエンハンサーなどの調節領域、あるいは任意のコード領域または非コード領域、または静止もしくは移動性領域に特異的であり得る。本標的は、診断目的または予後診断目的に有用であるメチル化特性を有することが好ましい。これには、反復ＤＮＡ配列のＬＩＮＥファミリー（ヒトゲノム内に豊富なレトロトランスポゾンファミリーであるLong Interspersed Nuclear Elementsとしても知られる長鎖散剤反復配列；1996, Smit, A.F.A., Current Opinion in Genetics and Development, 6, 743-748; 2003, Han, J.S., et al., Nature, 429, 268-274; 2004, Brouha, B., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100, 5280-5285）およびＳＩＮＥファミリー（短い散在性核要素としても知られている短い散在性要素；Batzer, M.A., et al.,）によって例証されるものなどの移動性またはかつて移動性だった要素が含まれ、これらは共に、ヒトゲノムのほぼ半分を構成している。標的ゲノム核酸は、ゲノム核酸のメチル化または非メチル化領域を示すことがより好ましい。
【００４１】
好ましくは、アッセイは、ウイルスの所与のタイプまたはタイプ群に特異的なプライマーを用いて繰り返され、増幅産物の存在がウイルスのタイプまたはタイプ群を示す。
【００４２】
典型的には、増幅後、各核酸誘導体は、対応する無処置核酸に比較して、シトシンの総数が減少した単純化核酸分子を形成し、単純化核酸分子は、好ましくは、ウイルスまたは標的に特異的な核酸配列を含む。
【００４３】
メチル化シトシンを含まない二本鎖ＤＮＡでは、この処理工程により、各々がアデニン、グアニン、チミンおよびウラシルの塩基を含有する２種の核酸誘導体がもたらされる。２種の核酸誘導体は、二本鎖ＤＮＡの２つの一本鎖から生じる。２種の核酸誘導体は、シトシンを有さないが、元の処理されていないＤＮＡ分子と同じ塩基総数および配列の長さを有したままである。重要なことに、２種の誘導体は、互いに相補的でなく、トップ鎖およびボトム鎖を形成する。単純化核酸分子を生じさせるため、増幅には標的として、１本以上の鎖を使用できる。
【００４４】
典型的には、ウイルスに特異的な単純化核酸配列は、処理されていないウイルスゲノムに自然に生じることはない。
【００４５】
ウイルス株またはウイルスタイプは、特定のヒトまたは動物の種系列における所与の組織に対して、高、中または低レベルの発癌性または他の疾患状態を与え得る。例として、高リスクのＨＰＶタイプ１６、１８、４５および５６；中リスクのＨＰＶタイプ３０、３１、３３、３５、３９、５１、５２、５８、５９および６８；および低リスクのＨＰＶタイプ６、１１、４２、４３、４４、５３、５４、および５５が挙げられる。
【００４６】
ウイルスは、ヒトウイルス（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ICTVdb/Ictv/ICD-10.htmを参照）の記載されたファミリーのいずれのものからでもあり得る。
ポックスウイルス科。牛痘ウイルス、サル痘ウイルス、ワクシニアウイルスおよび痘瘡ウイルスが含まれる。ウイルスに依って、これらは、皮膚および粘膜損傷、湿疹、および接触感染性膿疱生皮膚炎を起こし得る。種々のヒト疾患は、2003, International Statistical Classification of Diseases and Related Health Problems, (ICD), 10th revisionにまとめられている（http://www3.who.int/icd/vol1htm2003/navi.htm）。
パラミクソウイルス科。ニパー（Ｎｉｐａｈ）ウイルス、パラインフルエンザおよび流行性耳下腺炎が含まれ、種々の呼吸器疾患、流行性耳下腺炎、髄膜炎、膵炎、脳炎およびはしかに関連している。ニパー（Ｎｉｐａｈ）ウイルスは、１９９９年に初めて認められたばかりで、感染患者の７０％に致死的な脳炎を引き起こし、ヒト、イヌ、ネコ、ブタ、ウマ、ハムスター、コウモリおよびモルモットなど、きわめて広い宿主範囲を有する。これは、世界的な健康および経済にとって重大な脅威である（2005, Nature, 436, 401-405; Negrete, O.A., et al.,）；
フラビウイルス科。デング、黄熱病、Ｃ型肝炎およびＧ型肝炎が含まれ、脳炎、肝炎およびショック症候群に関連している。例えば、Ｃ型肝炎は、６つの主な遺伝子型を有するＲＮＡウイルスであり、世界で１億７０００万人超が感染し、有効なワクチンがない、慢性肝臓疾患の主要な原因である（2005, Science, 309, 623-626; Lindenbach, B.D., et al,）；
ヘルペスウイルス科。ヒトヘルペスウイルス１から８までが含まれる。これらのウイルスは、口腔感染、角膜の潰瘍、生殖器官感染、髄膜炎、水痘、肺炎、帯状疱疹、サイトメガロウイルス単核症および脳炎を引き起こす。ヒトサイトメガロウイルスは、臓器移植個体などの免疫不全個体に、重篤な致死的疾患を引き起こす。また、ＨＨＶ８は、ＡＩＤＳ関連病態のカポジ肉腫における原因物質として関係している（2003, Nature, 424, 456-461; Wang, X., et al,）；
アデノウイルス科。ヒトアデノウイルスＡからＦが含まれる。これらのウイルスは、呼吸器疾患、腎臓の感染、結膜炎および下痢を引き起こし得る；
パピローマウイルス科。上記に紹介したヒトパピローマウイルスのタイプが含まれる。これらは、ウイルス性疣及び子宮頚部、喉頭および膀胱の腫瘍の原因となる。
パルボウイルス科。Ｂ１９ウイルスが含まれ、合併症のない風疹の症状を与える；
ヘパドナウイルス科。Ｂ型肝炎が含まれ、肝硬変、および原発性肝細胞癌に関連している；
レトロウイルス科。急性感染症およびヒトＴ細胞白血病などの種々の悪性腫瘍に関連するＨＴＬＶ１および２、ＨＩＶ１および２が含まれる；
レオウイルス科。ロタウイルスが含まれ、下痢、胃腸炎および上気道疾患に関連している；
フィロウイルス科。マルブルク型およびエボラ型のウイルスが含まれ、出血熱に関連している；
ラブドウイルス科。水疱性口内炎および狂犬病が含まれ、発熱および狂犬病に関連している；
オルソミクソウイルス科。インフルエンザＡ、ＢおよびＣが含まれ、感冒および肺炎に関連している；
ブニアウイルス科。クリミア−コンゴ出血熱ウイルス、ニューヨークウイルスおよびハンタウイルスが含まれ、急性発熱および肺症候群に関連している；
アレナウイルス科。ラッサウイルス、リンパ球性脈絡膜髄膜炎ウイルスが含まれ、脳炎、髄膜炎および出血熱に関連している；
コロナウイルス科。ヒトコロナウイルスが含まれ、感冒症状および胃腸症候群に関連している；
ピコルナウイルス科。ヒトエンテロウイルスＡからＤおよびポリオウイルスが含まれ、気管支炎、髄膜炎、および麻痺に関連している；
カリシウイルス科。ノーウォーク様ウイルスおよびサッポロ様ウイルスが含まれ、急性胃腸炎に関連している；
非所属「Ｅ型肝炎様ウイルス」（ＨＥＶ）急性肝炎に関連している；
アストロウイルス科。ヒトアストロウイルスが含まれ、腸炎および胃腸炎に関連している；および
トガウイルス科。ロスリバーおよび風疹が含まれ、脳炎、白血球減少症および発疹に関連している。本発明を用いて、臨床的に低リスクとして分類されているウイルスが、特定の遺伝子型または種系列の個体または動物で、実際は高リスクであり得る。
【００４７】
核酸分子は、任意の好適な検出手段により検出できる。例としては、これに限定はしないが、
核酸分子のある領域に結合できる検出リガンドを提供して、検出リガンドが領域に結合するための十分な時間を与えること；および
核酸分子に対する検出リガンドの結合を測定して、核酸分子の存在を検出すること、
が挙げられる。当然のことながら、核酸分子は、当該技術分野で公知の任意の好適な手段によって検出できる。
【００４８】
いずれかの所与のウイルスに関して、ウイルス特異的な核酸分子が得られるか、または同定された場合、増幅反応において対象となる領域の増幅を確実にするために、プローブまたはプライマーを設計することができる。処理または変換により、配列は非対称性となり（下記を参照）、したがって、同一の座位の「トップ」鎖および「ボトム」鎖（「ワトソン」鎖と「クリック」鎖としても知られている）の検出に、異なるプライマー配列が必要とされるため、処理された、したがって変換されたゲノム（以後、「誘導体」と称される）の双方の鎖を、プライマー設計のために分析できることに注意することが重要である。こうして、２つの分子集団、すなわち、変換直後に存在する変換されたゲノムと、慣例的な酵素学的手段（ＰＣＲ）または等温増幅などの方法によって誘導体が複製された後に生じる分子集団とが存在する。プライマーは典型的に、簡便性のため、変換されたトップ鎖について設計されるが、プライマーはまた、ボトム鎖について作製することもできる。したがって、所与のタイプのウイルスおよび生物のゲノムにおける標的を検出するために、サンプルに対して臨床的または科学的なアッセイを実施することが可能になる。
【００４９】
本発明は、所与のサンプル中に何らかのウイルスが存在するかどうかを判定するために使用できる、ウイルスの代表的なタイプを示すプローブまたはプライマーを使用することができる。さらに、ウイルスの所与のタイプ、サブタイプ、変異体および遺伝子型の例を実際に検出または同定するために、ウイルスタイプに特異的なプローブを使用することができる。
【００５０】
本発明は、所与のサンプル中に標的が存在するかどうかを判定するために使用できる、メチル化などの標的を示すプローブまたはプライマーを使用できる。さらに、ゲノム内の標的を実際に検出または同定するために、標的特異的プローブを使用できる。
【００５１】
本発明の実際の予想外の利点は、１つの反応管または反応容器中でそれを実施できることである。ウイルスがアッセイされるだけでなく、１つ以上のゲノム標的も同定できる。これら２つの試験パラメーターを１つのアッセイに組み合わせることにより、対象の健康状態を特定することが可能になる。健康状態は、癌などの疾患、前癌状態、疾患状態に関する高リスクなどであり得る。本発明を、さらなる進行を予防するか、または疾患を治療するために、早期の医療的または獣医学的または園芸学的介入を可能にする疾患状態または可能的な疾患状態の早期指標として使用できる。
【００５２】
本発明は、癌などの疾患状態に関係してきたウイルスの検出に特に好適である。例としては、これに限定はしないが、ヒトパピローマウイルス、肝炎、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、および上記ウイルスの種々のファミリーのメンバーが挙げられる。
【００５３】
本発明は、癌などの疾患状態に関係してきた細胞におけるゲノム標的の検出に特に好適である。疾患状態または健康状態によって、ゲノム内の任意の遺伝子、調節領域もしくは非コード領域、または核外もしくは細胞外の成分が、本発明に使用するマーカーとしての可能性を潜在的に有している。
【００５４】
本発明は、いくつかのゲノム領域のメチル化状態が癌の進行を示すこと、およびウイルスが存在する場合は、進行がはるかに信頼性の高いものになることを実証するデータを得た。
【００５５】
臨床サンプルおよび細胞系を用いて、本発明者らは、ほぼ４００個のヒト遺伝子の近辺での調節領域におけるメチル化パターンを調べ、ＨＰＶの存在と共に癌状態の場合に、メチル化の変化を有する６０超のゲノムマーカーを見出した。例としては、これに限定はしないが、以下のゲノム領域の１つ以上が挙げられる：ＣＤ１４、ＥＮＤＲＢ、ＨＩＣ、ＲＡＲＢ１、ＰＧＲ、ＳＦＲＳ８、ＴＭＳＢ１０、ＡＢＣＧ２、ＭＦＮＧ、ＬＡＭＲ１、ＲＡＧＥ、ＡＢＬ１、ＣＲＢＰ、ＧＰＲ３７、ＨＲＫ、ＲＡＲＡ、ＳＹＫ、ＥＣＥ１、ＭＭＥ、ＴＥＭ、ＮＦ２、ＸＩＡＰ、ＲＡＲＲＥＳ１、ＦＬＩ１、ＨＴＬＦ、ＬＤＨＢ、ＲＢ１、ＴＧＤ、ＣＤＫ４、ＭＭＰ１４、ＲＡＢ３２、ＢＡＲＤ１、ＮＦ１、ＬＩＭ２、ＭＭＰ２、ＤＡＢ２、ＢＭＰ６、ＣＤＫＮ１Ｃ、ＤＡＢ２ＩＰ、ＬＭＮＢ１、ＭＭＰ２８、ＨＡＩ２、ＳＯＣＳ１、ＨＩＣ２、ＭＳＨ６、ＲＩＮ２、ＨＭＧＡ１、ＪＵＮ、Ｓ１００Ｐ＊、ＳＲＦ、ＶＤＲ、ＤＫＫ３、ＫＲＡＳ２、ＰＬＡＵ、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ、ＣＤＨ１、ＭＡＣ３０、ＤＤＢ２、ＰＡＸ６、ＡＸＬ、ＥＩＦ４Ａ２、ＳＬＩＴ２、ＲＥＣＫ、ＴＥＲＣ、ＧＡＴＡ５、ＳＴＡＴ１。他の領域としては、下表８に示されたものが挙げられる。
【００５６】
ＨＰＶを用いて本発明者らにより得られたデータから、各々全ての疾患状態または健康状態は、本発明においてマーカーとして使用し得る特定のゲノム領域を有し得ることが解されよう。サンプルがＨＰＶに関して陽性であり、癌または前癌状態由来のものである場合に、試験されたゲノムマーカーで陽性（メチル化）だったのがおよそ１５％位だけだった事実は、何らかの所与の疾患状態または健康状態に関する可能性のある標的が多数存在し得ることを示している。ヒトゲノム内に約２５，０００のタンパク質コード遺伝子座があるとすれば、１５％の比率では、ただ遺伝子の調節領域を使用して、約４０００の可能性のある標的が予測されることになる。特異的ＣｐＧ領域が特定の疾患状態または健康状態においてメチル化され得るため、より多くの潜在的標的があると考えられる。したがって、本発明は、このような全ての可能性のあるマーカーを包含する。当然のことながら、本教示は、任意の疾患状態または健康状態に関する任意の有用なゲノムマーカーを判定するために、当業者により使用され得る。
【００５７】
第５の態様において、本発明は、
（ａ）ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）中の非メチル化シトシンをウラシルに変換してＨＰＶ核酸誘導体およびゲノム核酸誘導体を形成する条件下、対象からのサンプルを重亜硫酸塩試薬で処理する工程；
（ｂ）ＨＰＶ核酸誘導体の所望のＨＰＶ特異的核酸分子を増幅させることができる、ＨＰＶ核酸誘導体の領域に結合可能なプライマーを供給する工程；
（ｃ）ゲノム核酸誘導体の所望のゲノム特異的核酸分子を増幅させることができる、ゲノム核酸誘導体の領域に結合可能なプライマーを供給する工程；
（ｄ）ＨＰＶ核酸誘導体および前記ゲノム核酸誘導体に対して増幅反応を実施する工程；および
（ｅ）増幅されたＨＰＶ核酸産物および増幅されたゲノム核酸産物の存在をアッセイする工程であって、１つまたは双方の産物の検出により対象の子宮頚癌状態への進行が示される工程、を含む対象の子宮頚癌の可能性のあるものをスクリーニングするアッセイを提供する。
【００５８】
好ましい一形態において、本アッセイは、
（ｆ）ＨＰＶが存在するサンプルを、前記サンプル中のＨＰＶのタイプ、サブタイプ、変異体または遺伝子型を決定するために試験する工程、をさらに含む。
【００５９】
例えば、ＨＰＶ１６の検出では、ＨＰＶ１６ウイルス核酸誘導体に結合できるプライマーを調製することができる。当然のことながら、ＨＰＶ核酸誘導体を、他の全てのＨＰＶタイプに関して、ＨＰＶ１６で実施したとおり、それぞれのゲノム配列において、全てのシトシンをウラシルへ変化させることによって判定することができる。このような変換は、本発明によるアッセイの工程において実施されたサンプル中のウイルス核酸処理の結果を示す。
【００６０】
当然のことながら、他のＨＰＶタイプからのＨＰＶウイルス核酸誘導体に結合できる他の好適なプライマーまたはプローブを考察することができる。
【００６１】
第６の態様において、本発明は、ＰＣＲなどの増幅反応のための１種以上の試薬または成分と共に、ウイルス特異的核酸分子の関するプローブまたはプライマーおよびゲノム特異的核酸分子の関するプローブまたはプライマーを含む、対象における健康状態を判定するためのアッセイに使用されるキットを提供する。
【００６２】
サンプルとしては、これに限定はしないが、綿棒、生検、スミア、パップスミア、表面掻取り、スパチュラ、および体液サンプル、ならびに凍結材料、パラフィンブロック、ガラススライド、法医学採取系、および永久保存材料などの種々の保存媒体からのサンプルが挙げられる。
【００６３】
動物およびヒト、ならびに植物を含む生物の集団はいずれも、長期ウイルス作用に耐性の個体を有する。したがって、ウイルスの存在とゲノムのメチル化などのゲノムマーカーとの組み合わせによって、ある生物が疾患状態を有するようになる、または有する可能性が高いかどうかが識別されることになる。本発明は、ヒトへの適用、ならびに獣医学および他の生物ベースの活動に好適である。例えば、本発明は、ゲノムメチル化の生じることが十分に示されている全ての家畜に、および野生動物集団のモニタリングのための管理手段としても使用できる。
【００６４】
本質的に、本発明は、２つのレベルでのアッセイに関する：１つは、ウイルスの存在に関するものであり、他方は、特定の増幅産物または増幅の欠如から推定されたゲノムまたは核酸標的の存在、不在または状態に関するものである。標的は、メチル化状態、核酸配列、または核酸配列の欠如、または核酸配列の変化であり得る。いくつかの進行した癌では、ゲノム標的が完全に欠失していることがあり得、したがって、その存在の欠如は診断に用いることができる。これはそれ自体で優れた診断手段であり得、本発明に含まれる。また、多くの癌が、二重微小染色体と称される染色体外アンプリコンを有しており、したがって、それらは４６の染色体の１つにない点で、厳密にはゲノムでない。同様に、細胞質または核オルガネラに含有された任意の１つ以上のミトコンドリアＤＮＡが本発明に含まれる。
【００６５】
本発明者らは、併用するための技術を開発し、それを、例えば、単一のチューブで用いれば、癌性に向かって進行している細胞集団の進行リスクの評価において、それぞれの技術を単独で用いる場合よりはるかに強力となる。典型的には、ゲノム標的の１つまたは少数のゲノムメチル化は、１本のチューブ内で行われる。ウイルスゲノムと宿主ゲノムＤＮＡ（またはＲＮＡ）の双方を含有する患者サンプルが、重亜硫酸ナトリウムの使用により、ウイルスの存在と変化した宿主メチル化プロフィールとの双方の検出のために同時に使用できる単純化された形態へと変換される場合、アッセイは強力である。
【００６６】
核酸の修飾は、非メチル化シトシンから他のヌクレオチドへの変換であり得る。試剤が非メチル化シトシンをウラシルへと修飾し、次いでこれが核酸誘導体の増幅中にチミンとして置換されることが好ましい。非メチル化シトシンを修飾するために用いられる試剤は、重亜硫酸ナトリウムであることが好ましい。同様に、メチル化シトシンではなく、非メチル化シトシンを修飾する他の試剤もまた、本発明のアッセイに使用できる。例としては、これに限定はしないが、重亜硫酸塩、酢酸塩またはクエン酸塩が挙げられる。試剤は、酸性水性条件の存在下で、シトシンをウラシルへと修飾する試薬である重亜硫酸ナトリウムであることが好ましい。
【００６７】
重亜硫酸ナトリウム（ＮａＨＳＯ３）はシトシンの５，６−二重結合と容易に反応して、スルホン化シトシン反応中間体を形成し、これは脱アミノ化され易く、水の存在下で重亜硫酸ウラシルが生じる。必要ならば、重亜硫酸基は、緩和なアルカリ性条件下で除去でき、その結果、ウラシルが形成される。したがって、全てのシトシンはウラシルへと変換される可能性がある。しかし、メチル化シトシンは、メチル化による保護のため、修飾試薬によって変換することはできない。
【００６８】
本明細書を通して、文脈により別の意味が必要とされない限り、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などのバリエーションは、当然のことながら、述べられた要素、整数もしくは工程、または要素、整数もしくは工程の群の包含を意味するが、任意の他の要素、整数もしくは工程、または要素、整数もしくは工程の群の排除を意味するものではない。
【００６９】
本明細書に含まれた文書、法令、材料、装置、物品などの考察は、本発明の文脈を提供することだけを目的としている。これらの事項のいずれかまたは全てが、先行技術の基礎の一部を形成するとか、または本明細書の各請求項の優先日前にオーストラリアに存在していた、本発明に関連した分野における一般的に知られた知識だったと認めることとして考えるべきではない。
【００７０】
本発明がさらに明瞭に理解され得ることを目的として、以下の図面および実施例を参照として、好ましい実施形態を記載する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００７１】
発明を実施するための様式
定義
本明細書に用いられる用語「対象」とは、シトシンにゲノムのメチル化を有する生物を意味する。これは典型的には、動物およびヒトなどの哺乳類、ならびに多数の植物種を含む。
【００７２】
本明細書に用いられる用語「健康状態」とは、容易に確定できる疾患または病気について、ある個体が一般的集団の程度と異なっている程度を意味する。これは、ヒトに関しては、全ての一般的疫学的および健康管理上の目的のための標準的な診断的分類である、疾病の国際的分類により、世界保健機関によって規定されている。臨床的観点で、健康状態は、Harrisons; Principles of Internal Medicine, Braunwald, E et al., eds, McGraw Hill, Medical Publishing Division, 15thおよびその後の版に述べられている基準を用いてアッセイできる。
【００７３】
本明細書に用いられる用語「ゲノム標的の状態」は、標的核酸（染色体または染色体外）の存在または不在、ゲノム標的のメチル化または非メチル化を含むことができ、標的は、生物のその集団内の特定の細胞型に存在する正常または多型の核酸であるか、感染性の微生物またはウイルスにより導入された標的であるか、または外部の動揺物質（ｐｅｒｔｕｒｂｏｇｅｎ）の結果としての増幅、移動、転移または転座により応答した標的であり得る。
【００７４】
本明細書に用いられる用語「修飾する」とは、非メチル化シトシンを他のヌクレオチドに変換することを意味する。試剤が非メチル化シトシンをウラシルへと修飾し、次いでこれが修飾核酸の増幅中にチミンとして置換されることが好ましい。
【００７５】
本明細書に広い意味で用いられる用語「複雑性減少」とは、真核生物、原核生物、またはウイルス／ウイロイドの生命形態で天然に生じたものでも、合成的に製造されたものでも、（または、ＲＮＡウイルス／ウイロイドゲノムとして天然に発生し、その後ｃＤＮＡ形態へとコピーする）、４種の一般的塩基、Ｇ、Ａ、ＴおよびＣを含有するＤＮＡゲノムが、重亜硫酸修飾の結果、Ｔｓの頻度の増加およびＣｓの頻度の減少を受けることを意味する。この変換により、かつて通常のゲノムであったものが、生物学的に機能的な有意性を持たず、「ゲノムゴースト」からなる「誘導体」と称されるポリマーの配列へと変化する。
【００７６】
本明細書に用いられる用語「複雑性減少」は、ＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴである配列（配列番号：７６）対ＡＡＡＡＡＡＡＴＴＴＴＴＴＴである同じ長さの配列（配列番号：７７）の間の何らかの数学的な複雑性の違いなど、誘導体集団において塩基が生み出す順序を言うのではない。本明細書に用いられる「複雑性減少」は、元のゲノムと不変位置１からｎまでで対象となっている塩基を有するその変換誘導体との双方を有する分子プローブまたはプライマーにより評価される２つの分子（１つは、真のゲノムで他方は誘導体）において塩基の位置が変化しないことを称する。特定のヒト女性の３０億塩基対ハプロイドヒトゲノムの場合、「トップ」鎖状の不変位置は、ｎが３，０００，０００，０００位である、１からｎとして定義される。１からｎの配列で、ｉ番目の塩基が、元のゲノムの「トップ鎖」においてＣであるならば、変換されたヒト誘導体において、ｉ番目の塩基はＵである。７９０４塩基対のＨＰＶ１６ウイルスゲノムの場合、不変位置は、１から７９０４と定義され、ｎは７９０４である。配列１からｎで、ｉ番目の塩基が、元のゲノムの「トップ」鎖においてＣであるならば、変換されたＨＰＶ誘導体において、ｉ番目の塩基はＵである。アラインメントにおいて異なるタイプ、または複数のタイプのＨＰＶ誘導体が用いられ、それらのウイルス誘導体の長さが異なる場合、ｉ番目の塩基の正しい判定には、通常の複数ゲノムアラインメントに関するMorgenstern, B. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93, 12098-12103により例示されたような慎重な生命情報科学的な複数のアラインメントが必要である。
【００７７】
個々のウイルスゲノムに、またはヒト細胞とウイルスゲノム双方、またはそれらの部分を含有する臨床サンプルに見出されるウイルスゲノムの混合物に適用した場合のこのような変換処理の結果を明らかにしている一例がある。
【００７８】
５’ＧＧＧＧＡＡＡＴＴＣ３’である通常の１０塩基のゲノム配列（配列番号：７８）（「トップ」鎖）は、５’ＧＡＡＴＴＴＣＣＣＣ３’（配列番号：７９）である相補的な「ボトム」鎖を有することになる。編成処理および重亜硫酸処理の後、「トップ」鎖は、５’ＧＧＧＧＡＡＡＴＴＵ３’（配列番号：８０）となり、「ボトム」鎖は、５’ＧＡＡＴＴＴＵＵＵＵ３’（配列番号：８１）となる。シトシンはウラシルに変換しており、ｅｘ ｖｉｖｏのＤＮＡポリメラーゼ機序による認識の点で、ウラシルはチミンと等価であるため、トップ鎖誘導体は事実上、５’ＧＧＧＧＡＡＡＴＴＴ５’ＧＧＧＧＡＡＡＴＴＴ３’（配列番号：８２）であり、ボトム鎖誘導体は、５’５’ＧＡＡＴＴＴＴＴＴＴ３’（配列番号：８３）である。したがって、当初は通常のゲノムが、トップ鎖とボトム鎖内に５つのＣおよび５つのＴを有したものから、今は、トップ鎖とボトム鎖内にＣを有さず、１０のＴを有するポリマーの誘導体集団へと変換されている。通常ゲノムは、４塩基のものから３塩基の誘導体へと減少した。それは、「複雑性減少」であった。また、誘導体集団における「座位」とは、その誘導体内部の位置的な座標を言うに過ぎない。例えば、重亜硫酸変換後、座位は、いずれのネットワークレベルにおいても、機能的な生物学的特性を全て剥ぎ取られている。以前はコードし、調節しまたは構造的であったが、今では、両方の鎖において生物学的に意味のないものである。したがって、誘導体集団は以前はゲノムの相補鎖であったものの、今は情報的に無能な２つの非相補的ゴーストである無機能の化学的ポリマーの集合である。さらに、誘導体はユニークであり、統計的偶然による以外には、何らかの細胞の、（またはウイルスの、またはウイロイドの）生命形態において、通常の進化的過程によって生じた配列を表すものではない。
【００７９】
プローブおよび複雑性減少
第１のものは通常のゲノムであり、第２のものは「変換された」もの（誘導体）である、２つの同じサイズの物質において、所与の分子条件セットの下で、特定の座位に対するプローブのハイブリダイゼーションと同じ特異性とレベルを達成するために必要なプローブ長の増加（ＩＰＬ）の観点で、本発明者らは、本明細書において、分子プローブの形式的意味において、「複雑性減少」を定義している。分子の有用性を目的として、ＩＰＬは、１以上の整数である。各座位は、通常ゲノムならびに変換誘導体において、同じ位置に留まる。
【００８０】
実際に、「複雑性減少」は、プローブ長において測定できる。例えば、平均して、１１量体のオリゴヌクレオチドプローブは、それが、４種の塩基、Ｇ、Ａ、ＴおよびＣからなる４，１９４，３０４塩基（４１１は４，１９４，３０４に等しい）の通常ゲノムのセットにおいて、完全にハイブリダイズする唯一の位置を有する。しかし、このような当初４，１９４，３０４塩基のゲノムが、ＨＧＳ重亜硫酸方法論によって、いったん変換されると、その変換された誘導体は、今やＴが多く複雑性が低い。しかし、他の新たに生じた１１塩基配列の位置は、重亜硫酸変換の結果、ｄｅ ｎｏｖｏに生じたものであるため、この複雑性減少の結果は、以前の唯一の１１量体プローブが、複雑性減少誘導体の内部でそれがハイブリダイズできる唯一の部位をもはや有さないということになる。これらの新たに生じた配列は、本明細書においてデコイ座位と称される。このように、元の座位を見出しハイブリダイズするためには、およそ１４量体のプローブが必要になる。この例では、プローブ長の増加は、およそ０から３塩基である。
【００８１】
直観に反するように思われるが、今やＴの多い誘導体における元の座位を検出するためには、増加したオリゴヌクレオチドプローブ長が必要とされ得る。したがって、誘導体の複雑性減少とは、座位の「トップ」鎖および「ボトム」鎖が誘導体における元のユニークな部位を見出すためには、より長いプローブを設計する必要があり得ることを意味する。しかし、下記に示すように、挿入核酸（ＩＮＡ）プローブの使用により、従来のオリゴヌクレオチドよりもはるかに短いプローブが可能になるため、長さの増加に関するこの要件は克服される。
【００８２】
また、本明細書に用いられる「複雑性減少」は、サンプル中ＨＰＶの存在の判定において使用できるプローブ配列の種々の構造に適用される。さらに、このようなプローブは、ＰＮＡの主鎖などの非通例的主鎖を有し得るか、またはＩＮＡに記載されているような主鎖に対する修飾付加を有し得る。このように、誘導体は、プローブが挿入偽ヌクレオチド（ＩＮＡにおけるような）などの追加要素を有するかどうかに関わりなく、複雑性減少を有すると考えられる。例としては、これに限定はしないが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ＭＮＡ、アルトリトール核酸（ＡＮＡ）、ヘキシトール核酸（ＨＮＡ）、挿入核酸（ＩＮＡ）、シクロヘキサニル核酸（ＣＮＡ）およびそれらの混合物とそれらのハイブリッド、ならびにこれに限定はしないが、それらのホスホロチオエート、メチルホスホレート、ホスホルアミダイト、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホトリエステルおよびホスホボラノエート（ｐｈｏｓｐｈｏｂｏｒａｎｏａｔｅ）などのリン原子修飾体が挙げられる。非天然ヌクレオチドとしては、これに限定はしないが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＩＮＡ、ＨＮＡ、ＭＮＡ、ＡＮＡ、ＬＮＡ、ＣＮＡ、ＣｅＮＡ、ＴＮＡ、（２’−ＮＨ）−ＴＮＡ、（３’−ＮＨ）−ＴＮＡ、α−Ｌ−リボ−ＬＮＡ、α−Ｌ−キシロ−ＬＮＡ、β−Ｄ−キシロ−ＬＮＡ、α−Ｄ−リボ−ＬＮＡ、［３．２．１］−ＬＮＡ，ビシクロ−ＤＮＡ、６−アミノ−ビシクロ−ＤＮＡ、５−エピ−ビシクロ−ＤＮＡ、α−ビシクロ−ＤＮＡ、トリシクロ−ＤＮＡ、ビシクロ［４．３．０］−ＤＮＡ、ビシクロ［３．２．１］−ＤＮＡ、ビシクロ［４．３．０］アミド−ＤＮＡ、β−Ｄ−リボピラノシル−ＮＡ、α−Ｌ−リキソピラノシル−ＮＡ、２’−Ｒ−ＲＮＡ、α−Ｌ−ＲＮＡまたはα−Ｄ−ＲＮＡ、β−Ｄ−ＲＮＡの内部に含まれるヌクレオチドが挙げられる。さらに、これに限定はしないが、メチルイミノメチル、ホルムアセテート、チオホルムアセテート、およびアミドを含む結合基などの非リン含有化合物が、ヌクレオチドへの結合に使用できる。特に、核酸および核酸類縁体は、１つ以上の挿入偽ヌクレオチド（ＩＰＮ）を含み得る。ＩＰＮの存在は、核酸分子に関する複雑性描写の部分にもならず、ＰＮＡにおけるようなその複雑性の主鎖部分でもない。
【００８３】
「ＩＮＡ」とは、本明細書に参照として組み込まれているＷＯ０３／０５１９０１、ＷＯ０３／０５２１３２、ＷＯ０３／０５２１３３及びＷＯ０３／０５２１３４（Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ Ｐｔｙ Ｌｔｄ）の教示による挿入核酸を意味する。ＩＮＡは、１つ以上の挿入偽ヌクレオチド（ＩＰＮ）を含むオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類縁体である。
【００８４】
「ＨＮＡ」とは、Van Aetschot et al., 1995により記載された例のような核酸を意味する。
【００８５】
「ＭＮＡ」とは、Hossain et al, 1998により記載された核酸を意味する。
【００８６】
「ＡＮＡ」とは、Allert et al, 1999により記載された核酸を意味する。
【００８７】
「ＬＮＡ」とは、ＷＯ９９／１４２２６(Exiqon)に記載されたＬＮＡ分子であり得る。ＬＮＡは、ＷＯ９９／１４２２６の要旨に示されている分子から選択されることが好ましい。ＬＮＡは、Singh et al, 1998, Koshkin, et al, 1998またはObika et al., 1997に記載された核酸であることがより好ましい。
【００８８】
「ＰＮＡ」は、例えば、Nielsen et al, 1991に記載されたペプチド核酸を称する。
【００８９】
プローブ長および座位における「トップ」鎖および「ボトム」鎖に関する種々のプローブ配列の観点で定義された複雑性減少の原理は、種々の分子環境における種々の構造のプローブおよびプライマー、または修飾されたプローブおよびプライマーに適用できる相対的用語である。ＩＮＡの一例は、この相対性を明らかにする。標準的なオリゴヌクレオチドプローブ以上にＩＮＡが有する著しい利点は、ＩＮＡが従来のオリゴヌクレオチドよりはるかに短く作製でき、しかも等価なハイブリダイゼーション結果を達成できることである（ＩＮＡの長さ＜オリゴヌクレオチドの長さ）。これは、ＩＮＡの構造的要素である挿入偽ヌクレオチドＩＰＮ（Ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｉｎｇ Ｐｓｅｕｄｏ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ）がもたらす、相補的ＤＮＡに対するＩＮＡの高い親和性による。したがって、所与の数のＩＰＮを有するＸ塩基長のＩＮＡが、非変換ゲノムに対する特異的なハイブリダイゼーションを首尾よく達成することが要求される場合、同じ分子条件下で、重亜硫酸変換ゲノムにおける同じ座位にハイブリダイズするために、Ｘを超える長さのＩＮＡが依然として必要となる。
【００９０】
また、宿主−病原体相互作用の場合、（ウイルスゲノムと宿主ゲノムが同じ臨床サンプル中に存在するが、濃度が著しく異なる場合）、「複雑性減少」およびＩＮＡの使用によって、特に、ＩＮＡは、ＡＴの多い核酸配列に優先的にハイブリダイズするため、ハイブリダイゼーションプロトコールに新たな有利な条件が導入されることに留意することが大切である。例えば、非変換ＨＰＶ ＤＮＡの純粋溶液中、７９０４塩基のＨＰＶ１６ゲノムにおける、ある唯一の座位を見出しハイブリダイズするために必要とされるウイルスのプローブまたはプライマーのおよその長さは、およそ６量体プローブ／プライマーである（４６は４０９６塩基に等しい）。重亜硫酸処理をしてＴの多いＨＰＶ誘導体を作出した後は、同じ分子条件下、この唯一の座位を見出すためには、およそ８量体のプローブまたはプライマー（３８は６５６１塩基に等しい）が必要である。
【００９１】
しかし、７９０４塩基対のＨＰＶゲノムとおよそ３，０００，０００，０００塩基対のヒトゲノムなど、極めてサイズの異なる２つのゲノムが、当初サンプル中に存在し、双方のゲノムがそれぞれの誘導体へと「複雑性減少」している場合、あるウイルス固有の配列に対するプローブまたはプライマーは、Ｔリッチのヒト誘導体が圧倒的に優勢である溶液中で、プローブまたはプライマーの誘導体標的にハイブリダイズする。例えば、サンプル中の各ヒト誘導体につき１つのＨＰＶ誘導体があるとすると、ウイルスプローブまたはプライマーは、３，０００，００７，９０４塩基対の誘導体にハイブリダイズする。そうすると、ある固有のウイルス配列のアッセイには、ヒト配列に新たに生じたウイルスデコイ座位から発せられるハイブリダイゼーションシグナルを避けるために、およそ１４量体のプローブまたはプライマーが必要となる。
【００９２】
プローブおよびプライマーの長さに関係する「複雑性減少」問題に加えて、ＰＣＲ反応に用いられる縮重プライマーの数が多くない場合、ハイブリダイゼーションの動態およびＰＣＲ産物の検出能力にも重要な変化がある。ＨＰＶタイプ間の広範なゲノムの変動により、先行技術の増幅では、複数のＰＣＲ反応から関連増幅核酸産物またはアンプリコンを生じさせるために、多数の縮重プライマーの使用が必要であった。しかし、プローブ／プライマープール中に縮退が多くなるほど、溶液中の個々の任意の関連プローブまたはプライマーの濃度は低くなる。このような状況は、複雑な真核生物のゲノム上で実施されるドライバー−トレーサー反応におけるハイブリダイゼーションの動態と適合度に類似しており、1966 by Waring, M. & Britten R.J. Science, 154, 791-794;および1968 by Britten, R.J. and Kohne D E., Science, 161, 529-540（およびそれらの中のCarnegie Institution of Washington Yearbook reports由来の初期文献）で、初めて化学文献に紹介された。
【００９３】
また、ＨＰＶ−ＰＣＲプライマーがヒト誘導体に比較して高濃度である場合、ハイブリダイゼーション反応を支配するのは、ＨＰＶプライマーである。例えば、サンプル中のウイルス負荷が高ければ（例えば、単一ヒトゲノムにつき約１００，０００ＨＰＶゲノム）、ウイルスプライマーのハイブリダイゼーションの速度は、１つのヒト誘導体につきただ１つのＨＰＶ誘導体が存在する場合の１００，０００倍になるであろう。前者の場合、ウイルスの要素は、溶液中で、それがゲノムの高反復要素であるかのようにふるまう。しかし、単一のＰＣＲ反応によって、臨床サンプル中の異なるリスクを有する異なるＨＰＶタイプを検出するためには、各ＨＰＶタイプとは異なるプライマーが典型的に必要とされ、縮退物の使用が必要となる。従来の、混合された通常のゲノム上での多重ＰＣＲ反応では、最終的に、プライマー集団が組み合わせ上でずれることがある。ハイブリダイゼーション部位に対して競合する数千の異なるプライマーが事実上存在し得、ＰＣＲ増幅がうまく行かないか、または増幅された核酸産物の分布が、サンプル中に存在する特定のＨＰＶタイプに有利となって偏りが強くなるという最終結果となる。このことは、従来の非変換ゲノムが存在する臨床サンプルからのデータ作出に大きな問題となる。
【００９４】
本発明に係る「複雑性減少」は、ＩＮＡプローブおよびプライマーの任意使用と組み合わせて、これら先行技術の問題における困難な事項の多くを克服する。
【００９５】
プライマーおよび複雑性減少
変換された分子集団（誘導体）が、変換された状態に留まるか、それともさらなる増幅に供されるかに依って、複雑性減少は異なることに留意されたい。上記で考察した例では、誘導体集団は、臨床サンプル中に存在するとおりに非増幅のままであった。トップ鎖（５’ＧＧＧＧＡＡＡＴＴＣ３’）（配列番号：７８）およびボトム鎖（５’ＧＡＡＴＴＴＣＣＣＣ３’）（配列番号：７９）はそれぞれ、５’ＧＧＧＧＡＡＡＴＴＵ３’（配列番号：８０）および５’ＧＡＡＴＴＴＵＵＵＵ３’（配列番号：８１）に変換されたことを思い出されたい。シトシンはウラシルに変換され、ウラシルは、ｅｘ ｖｉｖｏでのＤＮＡポリメラーゼ機序による認識に関してチミンと等価であるため、トップ鎖誘導体は事実上、５’ＧＧＧＧＡＡＡＴＴＴ３’（配列番号：８２）であり、ボトム鎖誘導体は、５’ＧＡＡＴＴＴＴＴＴＴ３’（配列番号：８３）である。しかし、誘導体集団が今、酵素学的手段によってｅｘ ｖｉｖｏで複製されるならば、結果として、４つの異なる誘導体集団が生じ、これらは、［５’ＧＧＧＧＡＡＡＴＴＴ３’（配列番号：８２）］、［５’ＡＡＡＴＴＴＣＣＣＣ３’（配列番号：８４）］、［５’ＡＡＡＡＡＡＡＴＴＣ３’（配列番号：８５）］および［５’ＧＡＡＴＴＴＴＴＴＴ３’（配列番号：８６）］である。これらの誘導体は、確かに複雑性が減少しているが、変換直後に存在する元の非複製誘導体と同程度ではない。したがって、ＰＣＲプライマーが元の非複製誘導体鎖に対して作製される場合、トップ鎖またはボトム鎖いずれに対するプライマーかの選択が結果に影響するため、どちらの増幅核酸産物を調べたいかを思慮深く決定することが必要である。変換されたゲノムの結果を構成する２つの非相補的誘導体集団対複製後に存在する４つの誘導体集団の取り扱いの間の違いは直観的には明らかではないが、プライマー設計にとって重要な意味を有し得る。
【００９６】
最後に、明確化するために以前紹介されたより長いプローブまたはプライマーの問題、および定量化された「複雑性減少」は、分子の誘導体集団内のユニークな配列を探索する際に関連性を仮定するだけである。しかしながら、本発明の重要な基礎は、ウイルスタイプ間で最も類似している誘導体座位の選択であると考えられ、必要に応じて、全てのウイルスタイプを１つの最初の試験でアッセイすることが可能になる。これらの選択される座位は、トップ鎖誘導体とボトム鎖誘導体のどちらが選択されるかによって変わり、このような座位は、ボトム鎖と比較してトップ鎖では異なる領域にある。
【００９７】
誘導体集団においてより長いプローブおよびプライマーが要求されるという実用上の重要性は、ＨＧＳ重亜硫酸処理を用いた変換によって、より類似した配列の座位が生じることでウイルス検出について得られる本発明の実用的利益によって目立たなくなる。また、従来のオリゴヌクレオチドの場合よりも、より短いプローブおよびプライマー分子が可能になるＩＮＡの任意使用によって目立たなくなる。さらに、誘導体集団に対する入れ子型ＰＣＲアプローチの適用では、増幅核酸産物の生成を可能にするために、同じ近傍に結合する２つのプライマーが必要である。ＰＣＲプライマーのうちの１つが、標的近傍の外側にあるデコイ座位に配列類似性を有している場合は、そのプライマー対の他方のメンバーが、同じ非標的領域にやはり近傍のデコイ座位を有するという可能性はない。そのような入れ子ＰＣＲアプローチの内側プライマーが第１ラウンドプライマーと同じ非標的領域にデコイ座位をやはり有するという可能性はさらにない。偽性増幅の可能性はきわめて低い。
【００９８】
本明細書に用いられる用語「ウイルス特異的核酸分子」とは、ウイルスまたはウイルスタイプに特異的な１つ以上の配列を有する、判定された、または得られた分子を意味する。
【００９９】
本明細書に用いられる用語「ウイルスの分類学レベル」は、タイプ、サブタイプ、変異体および遺伝子型を含む。ウイルスゲノムの流動性は認められている。種々のウイルス集団は、それらが、通常のＤＮＡ修復がもはや機能していない一定の癌性細胞内にある場合、さらに、単一ヌクレオチド変化について多型であり得るか、高変異性または低変異性に供され得る。
【０１００】
本明細書に用いられる用語「ウイルス特異的核酸分子」とは、ウイルスまたはウイルスタイプを示し得る、処理された、または変換されたウイルスＤＮＡに存在する特異的核酸分子を意味する。
【０１０１】
本明細書に用いられる用語「ウイルスタイプ」とは、以前単離され特徴付けられたウイルスタイプと９０％未満の配列類似性がある、任意の既存のまたは新規のウイルス集団を称する。
【０１０２】
本明細書に用いられる用語「ウイルスサブタイプ」とは、以前のサブタイプに比較して、配列類似性が９０〜９８％の範囲にある、任意の既存または新規のウイルス集団を称する。
【０１０３】
本明細書に用いられる用語「ウイルス変異体」とは、配列類似性が、以前の変異体の９８〜１００％の間にある、任意の既存のまたは新規のウイルス集団を称する。
【０１０４】
本明細書に用いられる用語「ＨＰＶ遺伝子型」は、以下のとおりである。遺伝子型は、任意の他の完全に配列決定されたＨＰＶゲノムと１塩基だけ少なくとも異なる任意の完全に配列決定されたＨＰＶゲノムであり、その単一塩基がＧ、Ａ、ＴまたはＣとして存在するものも、標準的なコンパレーターにおける所与の位置（すなわち、１位から７９０４位までのＨＰＶ１６）における塩基が欠失、付加、増幅または転移によって他の部位へ変わっているものも含む。本発明者らは、先行技術のＢＬＡＳＴ法を用いて、ＨＰＶ１６標品に対して全ての他のＨＰＶゲノム型を比較した。
【０１０５】
本明細書に用いられる用語「ＨＰＶ特異的核酸分子」とは、ウイルスまたはウイルスタイプを示し得る、処理または変換されたウイルスＤＮＡに存在する特異的核酸分子を意味する。
【０１０６】
本明細書に用いられる用語「ＨＰＶタイプ」とは、以前単離され特徴付けられたＨＰＶタイプとの配列類似性が９０％未満である任意の既存のまたは新規のＨＰＶ集団を称する（1993, Van Rast, M.A., et al., Papillomavirus Rep, 4, 61-65; 1998, Southern, S.A. and Herrington, C.S., Sex. Transm. Inf. 74, 101-109）。
【０１０７】
本明細書に用いられる用語「ＨＰＶサブタイプ」とは、以前のサブタイプに対する配列類似性が９０〜９８％の範囲である任意の既存の、または新規のＨＰＶ集団を称する（1993, Van Rast, M.A. et al., Papillomavirus Rep, 4, 61-65; 1998, Southern, S.A. and Herrington, C.S., Sex. Transm. Inf. 74, 101-109）。
【０１０８】
本明細書に用いられる用語「ＨＰＶ変異体」とは、配列類似性が以前の変異体の９８〜１００％の間にある任意の既存のまたは新規のＨＰＶ集団を称する(1993, Van Rast, M.A., et al., Papillomavirus Rep, 4, 61-65; 1998, Southern, A. and Herrington, C.S. Sex. Transm. Inf. 74, 101-109）。
【０１０９】
本明細書に用いられる用語「ＨＰＶ遺伝子型」とは、以下のとおりである。遺伝子型は、任意の他の完全に配列決定されたＨＰＶゲノムと１塩基だけ少なくとも異なる任意の完全に配列決定されたＨＰＶゲノムであり、その単一塩基がＧ、Ａ、ＴまたはＣとして存在するものも、標準的なコンパレーターにおける所与の位置（すなわち、１位から７９０４位までのＨＰＶ１６）における塩基が欠失、付加、増幅または転移によって他の部位へ変わっているものも含む。本発明者らは、先行技術のＢＬＡＳＴ法を用いて、ＨＰＶ１６標品に対して全ての他のＨＰＶゲノム型を比較した。
【０１１０】
表１は、ヒト患者の液体ベースの細胞診断サンプルからＨＰＶ特異的産物を生成させたオリゴヌクレオチドプライマーのリストを提供している。プライマーは全て、種々のＨＰＶタイプのトップ鎖誘導体に特異的である。プライマーの呼称は以下のとおりである：
【０１１１】
ＨＰＶタイプ−誘導体領域−プライマー番号は以下の設計による。
【０１１２】
【表１】
【０１１３】
例えば、最上の行は、Ｅ７誘導体領域におけるＨＰＶ１６についてのプライマー＃１を示している。ＨＰＶ−ＵｎｉおよびＨＰＶ−ＨＭは、縮退オリゴヌクレオチドプライマーを表している。非標準的記号は以前に定義されたとおりである。
【０１１４】
【表２−１】
【表２−２】
【表２−３】
【０１１５】
ウイルスアッセイ
本発明によるアッセイの第１の部分として用いられるウイルス検出はまた、細胞集団内の細胞状態の変化の評価、感染細胞内の転写、プロテオミック、代謝物またはメチロミックのネットワークの攪乱により実証されたリスク評価、感染進行のモニタリングおよび抗ウイルス療法などの治療措置を評価するために、全く異なるタイプの他のアッセイと組み合わせることができる。
【０１１６】
例えば、ウイルス特異的核酸分子を測定する分子アッセイは：
−組織切片における蛍光シグナルの自動定量化に関してマルチ−エピトープ−リガンド−カートグラフィ（Ｍｕｌｔｉ−Ｅｐｉｔｏｐｅ−Ｌｉｇａｎｄ−Ｋａｒｔｏｇｒａｐｈｉｅ）（ＭＥＬＫ）システムなどのパターン認識およびハイスループットロボット画像テクノロジーを用いるアッセイ、
−異数性、または異常オルガネラ（数、タイプまたは形態学的外観の点で）など、細胞内の染色体妨害の全体レベルを検出する蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、細胞学的または組織学的分析に関する光、共焦点、送信または電子顕微鏡分析を用いるアッセイ、
−核酸またはポリペプチドアプタマー；スピーゲルマー（鏡像高アフィニティーオリゴヌクレオチドリガンド）；分子の超感度非同位体検出に関する多色ナノクリスタル（量子ドットバイオ複合体）、または細胞表面もしくは内部成分に関するバイオマーカー；指数濃縮度によるリガンドの系統的発生（ＳＥＬＥＸ）および種々の細胞成分に標的化された高アフィニティーアプタマーリガンドを含む組み合わせ化学的アプローチを用いるアッセイ、
−細胞または免疫磁気細胞濃縮テクノロジー、フローサイトメトリーによりインターフェースさせたマイクロスフェアベーステクノロジー、あるいは種々の核酸またはペプチド／タンパク質部分を含有するコロイド懸濁液の光学的バーコードのレーザー捕捉を用いるアッセイ、
−複製、欠失、転移、再配置およびそれらの関連ｉｎ ｓｉｔｕテクノロジーなどの全体ゲノムインバランスを検出する目的で単一細胞比較ゲノムハイブリダイゼーションを用いるアッセイ、
−遺伝子発現の連続分析（ＳＡＧＥ）、全遺伝子発現分析（ＴＯＧＡ）、順序無作為化アドレス可能高密度光ファイバーセンサアレイ、マイクロビーズ上の超並列符号配列決定（ＭＰＳＳ）を含むロボゲノムマイクロアッセイテクノロジーなどの転写調節を通知するアッセイ、
−タンパク質マイクロアレイ、マトリックス補助レーザー脱離イオン化−飛行時間（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）法、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析（ＦＴＩＣＲ）、ＬＣ ＭＳ−ＭＳおよび迅速蒸発冷却質量分析（ＲａｐＥｖａｐ ＭＳ）による細胞分析など、種々のテクノロジーを用いるプロテオミック調節を通知するアッセイ、
−検出レベルが、ゼプトモル（１０−２１）感度に近接するマルチフォトン検出（ＭＰＤ）を用いるアッセイ、
−正常から子宮頚癌への所与の経路に沿って細胞集団の位置を判定するため；好ましくは、ウイルス感染により影響を受ける細胞、または感染部位または炎症部位に動員された免疫細胞におけるゲノム遺伝子座のメチル化特性の変化を決定するため、臨床サンプルから細胞のメチロームを識別するためにメチロミックテクノロジーを用いるアッセイ、
と組み合わせることができる。
【０１１７】
上記テクノロジーの幾つかは、以前に評価されている（2001, Miklos and Maleszka, Proteomics, 1, 30-41）。
【０１１８】
データ採取、統合および管理システム
本発明に関連する開示資料に関するデータ採取およびデータ管理システムは、臨床患者データと組み合わせることができ、特殊アルゴリズム法を用いて分析できる。ロボットプラットフォーム管理およびデータ採取を自動的に保存でき、採取データは、gene ontologies, (GO)、National Library of Medicine’s Medical Subject Headings (MeSH) thesaurusにより代表されるdisease ontologies, Online Mendelian Inheritance in Man, (OMIM)またはHuman Genome Mutation Database (HGMD)またはPubMedのような知識データベースとインターフェースする情報科学基礎構造およびソフトウェアツールと組み合わせることができる。最新のヒトゲノムアセンブリとインターフェースし、ＧｅｎｂａｎｋおよびＲｅｆＳｅｑなどの供給源からの情報へアクセスし、ダウンロードするソフトウェアパイプラインは、ＨＰＶで感染するか、または体内のどこかでＨＰＶの存在による細胞により影響を受けた細胞のゲノム状態に対する通知アッセイと組み合わせることができる。
【０１１９】
ＨＰＶデータを臨床および関連生命情報科学データと共に統合するデータベース基盤では、例えば、より良好なソフトウェア操作およびデータベース管理を容易にする疎結合モジュラーアーキテクチャを利用することができる。関連データベース管理システム（ＲＤＢＭＳ）（Ｐｏｓｔｇｒｅｓｑ １ ７．３バージョンなど）は、公開供給源であってロバストであり、ＨＰＶアリーナにおける臨床成績を評価し、より良好に予測するための統合システムの一部の例として役立つ。ウェブベースのグラフィックユーザーインターフェース（ＧＵＩ）を含むさらなる機能により、極めて多種多様なフォーマットで利用できる治療および製薬データと共に分子ＨＰＶデータと組み合わせるために集積細胞学的および組織学的分析を可能にするであろう。画像解析用の増強デジタルテクノロジー、病理学者により共有されるリモート画像および自動可視化システムの統合は、自動分子キットプラットフォームの集積部分として想定されている。
【０１２０】
細胞サンプリング
ウイルス検出プロトコールは、前胚盤胞段階、胚組織、出生時材料、死体または法医学供給源からのサンプルなど、体内の任意の部分からのサンプルに対して実施できる。それらは、子宮頚部および膣などの頚膣部領域に由来することが好ましいが、皮膚源に由来し得る。それらは、子宮頚部悪性転換帯に由来することが好ましい。サンプルは、ＣｅｒｖｅｘＢｒｕｓｈ、セラパック（Ｔｈｅｒａｐａｋ）社、米国カリフォルニア州アーウィンデール；Ｄｉｇｅｎｅ Ｃｅｒｖｉｃａｌサンプラー子宮頚部ブラシ、ダイジーン（Ｄｉｇｅｎｅ）社、米国メリーランド州ガイサーバーグ；プラスチックスパチュラ／ブラシの組み合わせ、クーパー・インスツルメンツ（Ｃｏｏｐｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）、米国フロリダ州ハリウッドを用いるか；または男性または女性患者双方の会陰領域からのサンプルを得るためにはダクロン綿棒または任意の好適な材料を用いて、もしくは針生検などの任意の標準的生検手法により採取できる。サンプルは、ＰｒｅｓｅｒｖｅＣｙｔｅ、サイティク（Ｃｙｔｙｃ）社、米国マサチューセッツ州またはトリパス・イメージングバーリントン（ＴｒｉＰａｔｈ ｉｍａｇｉｎｇ Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ）米国ノースカロライナ州からのＡｕｔｏＣｙｔｅ ＰＲＥＰなどの種々の媒体に入れることができる。最初の試験は、液体ベースの細胞学的診断に対して実施されるが、パラフィン切片およびスライドなどの平面プラットフォームもまた好適である。
【０１２１】
キット
本発明は、種々のキットまたはキットの組合せで実施でき、マニュアル、半自動または完全ロボットプラットフォームにより例示することができる。好ましい形態において、ＭｅｔｈｙＥａｓｙ（商標）またはＨｉｇｈＴｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ＭｅｔｈｙＥａｓｙ（商標）キット（ヒューマンジェネティック・シグナチュアズ・プティ）（Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ Ｐｔｙ）社、オーストラリア）は、ＥｐＭｏｔｉｏｎなどのロボットプラットフォームを用いて９６または３８４プレート中、核酸の変換を可能にする。
【０１２２】
ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）
成熟ヒトパピローマウイルスＤＮＡは、２種のウイルス性コードタンパク質からなる正二十面体カプシドコート内にカプセル化される。二本鎖循環式ＤＮＡゲノムは、ＨＰＶ１６に関して長さが７９０４の塩基対であるが、共通の媒体リスクタイプの間で、ＨＰＶ５１の７８０８の塩基対からＨＰＶ５２の７９４２の塩基対まで変わる。ウイルスゲノムの領域は、循環式分子上で生じる順序で下記に提供される。ウイルスは、ＵＲＲと称される非コード領域を有し、Ｅ６、Ｅ７、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ４、Ｅ５、Ｌ２およびＬ１と表されるコード領域数を有する。幾つかのウイルスタイプは、機能性Ｅ５領域を欠くことができる。Ｅ４領域は、細胞質ケラチンネットワークの混乱を生じる複数のタンパク質産物を産生し、コイロサイトーシスと称される細胞質「ハロ効果」に導く。種々のＨＰＶタイプは、エピテリオトピックであり、感染後、コイロサイトーシス、異常角化症、多核形成、核拡大などの異常状態、および複数扁平上皮内病巣（ＳＩＬ）になり得、これら全ての変化は子宮頚部にのみに適用される。ウイルス性感染および染色体異常は、子宮頚部癌に相関し得るが、マルチパラメトリック変化は新生物病巣に見られ、ウイルス感染、ウイルス遺伝子発現、ウイルス組込み、細胞分化およびゲノム異常性との関連に対する理解は極めて乏しい（1998, Southern, S.A. et al., Sex Transm Inf., 74, 101-109）。この理由は、種々の遺伝子背景において種々のウイルスタイプおよびそれらの異なる効果を検出することが、このように極めて重要であるからである。
【０１２３】
また、ＨＰＶタイプを皮膚および粘膜カテゴリーならびに高リスク、中等度リスクおよび低リスクカテゴリーに割り振ることは先行技術に受入れられているが、これらのカテゴリーは、幾つかほころびを示しており、ＨＰＶの皮膚および粘膜のサブカテゴリーの間でさえも重複がある。例えば、ＨＰＶ７は、口腔病巣と同様に皮膚疣にも関連している。ＨＰＶ２６は、会陰病巣と同様に全身性疣症との関連でも単離されている。さらに、ＨＰＶ６およびＨＰＶ１１は、低リスクタイプとして分類されているが、それらは、喉頭部および外陰部癌およびコンジローム尖圭と同様にＢｕｓｃｈｋｅ−Ｌｏｗｅｎｓｔｅｉｎ腫瘍から単離されている（1986, Boshart, M. et al., J. Virology, 58, 963-966; 1992, Rubben, A., et al., J Gen Virol., 73, 3147-3153）。
【０１２４】
宿主ゲノムへのウイルス組込みは、Ｅ１とＬ１遺伝子領域との間の線形化に至り、ＵＲＲ、Ｅ６およびＥ７領域は保持されるが、Ｅ１、Ｌ１およびＬ２などの遺伝子領域は欠失し、Ｅ２は不活化または欠失する。Ｅ６およびＥ７領域は一般に、子宮頚部癌では保持されるが、一方、Ｅ２タンパク質発現を欠く。Ｅ２損傷は、予後の不良と生存の短縮化とに関連している。
【０１２５】
患者のサンプル
細胞サンプルは、米国サイティック（Ｃｙｔｙｃ）社により供給された子宮頚部サンプリングデバイスを用いて子宮頚部の表面から家庭医により採取された。患者からは、サンプルをルーチンの癌スクリーニングプログラムの一部として、または先の子宮頚部疾患のモニタリング試験として採取されるサンプルに対して患者から同意を得た。医師は、採取デバイスからの細胞を細胞の保存用メタノール／水溶液に移し、試験するために実験室に輸送する。この細胞サンプルは、ルーチンの形態学的調製を用いて前癌またはウイルス感染による変化に関して評価した。細胞サンプルの個別の分割量を、本明細書に概説されたＤＮＡ試験用に用いた。
【０１２６】
ＤＮＡの抽出
ウイルスＤＮＡは、好適な供給源から得ることができる。例としては、これに限定はしないが、細胞培養物、ブロス培養物、環境サンプル、臨床サンプル、体液、液体サンプル、組織などの固体サンプルが挙げられる。サンプルからのウイルスＤＮＡは、標準的な手法により得ることができる。パラフィン固定材料に関する好適な抽出物の例は、以下のとおりである。対象のサンプルを、４００μｌの７Ｍ塩酸グアニジニウム、５ｍＭ ＥＤＴＡ、１００ｍＭトリス／ＨＣｌのｐＨ６．４、１％トリトン−Ｘ−１００、５０ｍＭプロテイナーゼＫ（シグマ（Ｓｉｇｍａ））、１００μｇ／ｍｌ酵母ｔＲＮＡに入れる。このサンプルを、使い捨て１．５ｍｌの内筒で完全にホモジナイズし、６０℃で４８時間放置する。インキュベーション後、サンプルは５分間／９５℃、５分間ドライアイスの５回の凍結／解凍サイクルに供される。次いでサンプルをボルテックスし、細胞片をペレットにするために微量遠心管中で２分間スピンさせる。上澄液を、正常なチューブに取り出し、塩濃度を減らすために希釈し、次いでフェノール対クロロホルムで抽出し、エタノール沈殿させ、５０μｌの１０ｍＭトリス／０．１ｍＭ ＥＤＴＡに再懸濁させる。
【０１２７】
驚くべきことに、核酸の他の供給源からウイルスＤＮＡを分離する必要がないことが、本発明者らにより見出されている。この処理工程を、異なるＤＮＡタイプの広範な混合物に対して使用でき、しかもウイルス特異的核酸を、本発明により同定することができる。複合ＤＮＡ混合物の検出限界は、標的ウイルス核酸分子の単一コピーに至り得る標準的なＰＣＲ検出限界のものであると推定される。
【０１２８】
ハイスループットＨＰＶアッセイ
本発明は、多数のサンプルが、ＨＰＶに関して同時に試験される９６ウェルプレートを用いてハイスループット様式で工程毎に使用できる。これは、以下のとおり、可能な市販キットに関する取扱い説明書によって示される。
【０１２９】
【表３】
注：対照サンプル／プライマー１、２、３Ａおよび３Ｂは、受領したら−２０℃で保存する必要がある。
【０１３０】
必要な材料および装置（供給されず）
・真空分岐管または遠心分離が以下のとおり用いられる：
Ｈｇで少なくとも−１０（４．９ｐｓｉ）圧を適用するポンプを備えた９６ウェルプレート真空分岐管（社内試験は、Ｂｉｏｒａｄ Ａｕｒｕｍ Ｍａｎｉｆｏｌｄを使用して実施されたが、他の分岐管も使用に適合化できる）または
クリアランス９６ウェルフォーマットプレートと適合するローターを備えた遠心分離機（社内試験は、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ５８１０を用いて実施された）。
・９６ウェルフォーマットの０．２ｍｌ低プロフィールプレートに適合性の加熱蓋付ＰＣＲサーマルサイクラー
・３８４ウェルフォーマット（ＨＰＶタイピング用）に適合性の加熱蓋付ＰＣＲサーマルサイクラー
・高クリアランス９６ウェルフォーマット（ＨＰＶタイピング用）の０．２ｍｌ低プロフィールプレートに適合性の加熱蓋付ＰＣＲサーマルサイクラー
・８０％イソプロパノール（分子生物学グレード）
・水（分子生物学グレード）
・ＮａＯＨ（分析グレード）
・２×ＰＣＲマスター混合物（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）カタログ番号Ｍ７５０５ １０００ｒｘｎ）
・Ｅ−Ｇｅｌ Ｓｙｓｔｅｍ Ｍｏｔｈｅｒ Ｅ−Ｂａｓｅ（商標）デバイス（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ＥＢ−Ｍ０３）
・Ｅ−ゲル９６ハイスループット２％寒天（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）カタログ番号Ｇ７００８−０２）
・Ｅ−ゲル低範囲マーカー（インビトロゲンカタログ番号１２３７３０３１）
・試薬貯蔵器×５
標準的実験室装置（供給されず）
・１ｍｌ容量（２００μｌ〜１０００μｌ）までの多チャネルピペット
・２００μｌ容量（２０μｌ〜２００μｌ）までの多チャネルピペット
・１０μｌ容量（１μｌ〜１０μｌ）までの多チャネルピペット
・リントフリー組織
・タイマー
・エアロゾルバリヤーチップ（１０μｌ〜１０００μｌ）
・ライトボックス
・ゲル文書化システム
・Ｇｌｉｓｏｎ Ｐ１０００
・Ｇｌｉｓｏｎ Ｐ２００
・Ｇｌｉｓｏｎ Ｐ２０
【０１３１】
方法
ＨＰＶハイスループットＤＮＡ重亜硫酸塩修飾キットを初めて使用する場合、そのユーザーガイドの詳細な方法を、重亜硫酸塩変換法を実施する前に読むことが強く推奨される。
【０１３２】
ＨＰＶハイスループットＤＮＡ重亜硫酸塩修飾キットを使用することで、変換前のゲノムＤＮＡの前消化は必要ない。このキットは、１ｎｇから４μｇのゲノムＤＮＡの出発ＤＮＡ濃度のために最適化される。
【０１３３】
サンプル調製
・試薬１の全容量を試薬２のボトルに組み合わせ、静かに転倒させて混合する。組み合わせた試薬を７２℃で１０分間または完全に溶解されるまで放置する。注：一旦混合した試薬１および試薬２は、４℃の暗所で１ヵ月間まで安定である。全ての試薬は、製造日から１年間室温で安定である。
・プロトコールの開始前に、７２℃のオーブンまたはインキュベーター内に１時間まで結合用緩衝液を入れる。
・新鮮な０．３Ｍ ＮａＯＨ溶液（例えば、５０．０ｍｌの水中０．６ｇのＮａＯＨ）を各回に作製する。
・５μＬの対照サンプル１を４９５μＬの水（分子生物学グレード）に加え、試験サンプルと平行して処理する。対照サンプル１は、処理対照として、および感度対照として作用する未変換ＨＰＶテンプレートを含有する。これは、ウェルＨ１０に入れる必要がある。
・５００μＬの水を残りの試験サンプルと処理する「ＤＮＡ無しの対照」を常時実施する。これは、ウェルＨ１１に入れる必要がある。
・液体ベースサンプル（ＰｒｅｓｅｒｖＣｙｔ（登録商標））バイアルを手で激しく振って、沈殿細胞を再懸濁させ、サンプルの十分な混合を確実にする。
・３００μｌの再懸濁細胞を、精製プレート／洗浄プレートの組み合わせの適切なウェルに移す（ウェルＨ１０、Ｈ１１またはＨ１２は用いない）。サンプルがどのウェルに入れられているかを詳細に記録する。
【０１３４】
プロトコール
・精製プレート／洗浄プレートの組み合わせを、２０００×ｒｃｆで１分間遠心分離し、流出液を捨てる。ＮＢは洗浄プレートを捨てない。
・基材密封用マットにより精製プレートの流し口を密閉し、全ての流し口が十分に密閉されていることを確認する。密封マットのカットコーナーが精製プレートのカットコーナーとそろうように常に確認する。
・２ｍｌのプロテイナーゼＫを細胞溶解緩衝液に加え、逆さにして混合する。
・１００μｌの細胞溶解緩衝液を、精製プレートの各ウェルに加える（１２チャネルピペットを用いる）。
・１０．５ｍｌの結合用緩衝液を新たなチューブに取り、１００μｌの担体ＤＮＡを加える。逆さにして混合し、精製プレートの各ウェルに１００μｌの結合用緩衝液を加え（１２チャネルピペットを用いる）、次いで用意されたプレート密封用フィルムにより精製プレートの上部を密封する。
・５５℃で６０分間インキュベートする。
・精製プレートから基材密封用マットを注意深く取り除き、洗浄プレートの上部に精製プレートを速やかに乗せる。精製プレートから密封用フィルムを取り除き、次に２０００×ｒｃｆで１分間遠心分離し、流出液を捨てる。ＮＢは洗浄プレートを捨てない。
・基材密封用マットを精製プレート上に置き換える。
・５０μｌの新鮮な０．３Ｍ ＮａＯＨ溶液を、変換プレートの各ウェルに加え、精製プレートの上部を新鮮な密封用フィルム（用意された）で密封する。
・５５℃で１５分間インキュベートする。
・密封用フィルムを取り除き、組試薬１と試薬２を合わせた２２０μｌを、多チャネルピペットを用いて変換プレートの各ウェルに加え、精製プレートの上部を新鮮な密封用フィルム（用意された）で密封する。
・この変換プレートを５５℃で３時間インキュベートする。
・インキュベーション後、密封用フィルムを取り除き、２４０μｌの結合用緩衝液（重要なプロトコール調製を参照）を変換プレートの各ウェルに加え、精製プレートの上部を新鮮な密封用フィルム（用意された）で密封する。
・精製プレートから基材密封用マットを注意深く取り除き、洗浄プレートの上部に精製プレートを素早く乗せる。
・密封用フィルムを取り除き、次に２０００×ｒｃｆで１分間遠心分離し、流出液を捨てる。
・５００μｌの８０％イソプロパノールを各ウェルに加え、室温で２０００×ｒｃｆで１分間遠心分離する。
・洗浄プレートを取出し、流出液を捨ててから置き換え、室温で２０００×ｒｃｆで１分間遠心分離する。
・洗浄プレートを捨て、溶出プレートの上部に精製プレートを置き、精製プレートの先端が溶出プレート内に正しくそろっていることを確認する。プレートを室温で５分間放置する。
・多チャネルピペットを用い、ピペットチップを接触させることなく、膜表面に近接させて置きながら、３０μｌの溶出用緩衝液を精製プレートの各サンプルウェルに加える。
・室温／１分でインキュベートする。
・全溶出容量を６０μｌにするために再度上記の工程を反復する。
・精製プレート／溶出プレートの組み合わせを、１０００×ｒｃｆの室温／１分で遠心分離する。
・溶出プレートを取り除き、用意された密閉用キャップで密封する。
・このプレートを、加熱蓋付サーモサイクラー中、９５℃／３０分で加熱蓋付ＰＣＲ器械中でインキュベートする。キャップを取外す前に短時間スピンさせる。
・液体ベースサンプル（ＰｒｅｓｅｒｖＣｙｔ（登録商標））バイアルを手で激しく振って、沈殿細胞を再懸濁させ、溶液を確実に均一にする。
・４ｍｌの再懸濁細胞を１５ｍｌのＣｏｓｔａｒ遠心管に移す。４ｍｌ未満の媒体である場合、全ての物質を１５ｍｌのＣｏｓｔａｒ遠心管に移し、滅菌蒸留水で容量を４ｍｌにする。正確な試験のために必要なサンプルの最低容量は１ｍｌである。
・スイングアウトバケットロータ内のチューブを、３０００×ｇ／１５分で遠心分離する。
・注意深くデカントし、ペレット化細胞材料を乱すことなく上澄液を捨てる。
・ペレット化細胞を、２００μｌの細胞溶解用緩衝液に再懸濁させ、溶液が均質になるまで十分に混合する。
・２０μｌのプロテイナーゼＫを加え、インキュベーションプレートの各ウェルをインキュベートする。
・８０μｌのサンプルをインキュベーションプレート（プレート１）に移し、密封用キャップで蓋をし、５５℃／１時間インキュベートする。
【０１３５】
プロトコール調製
・試薬１からの全容量を試薬２のボトルに組み合わせ、静かに逆さにして混合する。注：混合した試薬１および試薬２は、４℃の暗所で１ヵ月間まで安定である。試薬１、２、３および４は、製造日から１年間室温で安定である。
・新鮮なＮａＯＨ溶液（例えば、８．３ｍｌの水中１ｇのＮａＯＨ）を各回に作製し、５μｌを変換プレート（プレート２）の各ウェルに加える。
・５μＬの対照サンプル１を１５μＬの水（分子生物学グレード）に加え、試験サンプルと平行して処理する。
・２０μｌの細胞溶解液を変換プレート（プレート２）に移し、静かに混合する。
・変換プレート（プレート２）を用意された密封用フィルムで密封し、オーブン中３７℃／１５分インキュベートする。インキュベーション後、フィルム上の濃縮物を沈殿させるためにフィルムを取外す前に短時間でプレートを遠心分離する。
・インキュベーションプレート（プレート１）を用意された密封用キャップで密封し、−２０℃で保存する。
・試薬３は固体沈殿が形成されていないことを確認し、形成されていれば、溶液を温めて（８０℃以下で）、混合する。
【０１３６】
遠心分離プロトコール
・多チャネルピペットを用いて、試薬１と試薬２とを合わせた２２０μｌを変換プレート（プレート２）の各ウェルに加え、静かなピペット操作により混合し、用意された８ストリップ密封用キャップによりプレートを密封する。
・変換プレート（プレート２）をオーブン中、５５℃／３時間でインキュベートする。
重亜硫酸塩処理は、１時間ほどの短時間で実施できるが、インキュベーション時間の減少により、アンプリコン内の局所的非変換が生じ得る。したがって、３時間未満のインキュベーション時間は推奨されない。
・インキュベーション後、２４０μｌの試薬３（重要なプロトコール調製を参照）を、変換プレート（プレート２）の各ウェルに加える。
・精製プレート（プレート３）を、洗浄プレート（プレート４）の上部に乗せる。
・変換プレート（プレート２）からのサンプルを対応する精製プレート（プレート３）のウェル移し、用意された密封用フィルムで覆う。
・精製プレート（プレート３）／洗浄プレート（プレート４）の組み合わせを遠心分離機に入れ、室温／４〜５分の１０００ｒｃｆでスピンさせる。
・洗浄プレート（プレート４）からの流出液を捨て、次いで精製プレート（プレート３）で置き換える。０．８ｍｌの８０％イソプロパノール（分子生物学グレード）を精製プレート（プレート３）の各ウェルに加える。
・室温で１０００×ｒｃｆ／１分で遠心分離する。
・洗浄プレート（プレート４）を取出し、流出液を捨ててから置き換え、室温で１０００×ｒｃｆ／２分で遠心分離する。
・溶出プレート（プレート５）の上部に精製プレート（プレート３）を置き、精製プレート（プレート３）のチップが、溶出プレート（プレート５）の適切なウェル内に配置されていることを確認する。
・ピペットチップを接触させることなく、膜表面に近接させて置きながら多チャネルピペットを用いて、５０μｌの試薬４を精製プレート（プレート３）の各サンプルウェルに加える。
・室温／１〜２分でインキュベートする。
・精製プレート（プレート３）／溶出プレート（プレート５）の組み合わせを、１０００×ｒｃｆの室温／１分で遠心分離する。
・溶出プレート（プレート５）を取り除き、用意された密閉用キャップで密封する。
・このプレートを、９５℃／３０分で加熱蓋付ＰＣＲ器械中でインキュベートする。
これでＤＮＡサンプルが変換され、ＰＣＲ増幅の用意ができる。インキュベーション後、密封キャップからの濃縮物を除去するためにプレートを短時間遠心分離する。
【０１３７】
内部対照ＰＣＲ反応
問題処理を容易にするために、ゲノムＤＮＡおよび対照ＰＣＲプライマーが提供されている。対照サンプル１（紫色）および２（緑色）は、処理対照として提供される。対照サンプル１は、８つの変換反応のために提供された十分な物質を有する未処理ＤＮＡである。対照サンプル２は、２０のＰＣＲ増幅のために提供された十分な物質を有する重亜硫酸塩処理のＤＮＡである。対照プライマー３Ａ（黄色）および３Ｂ（赤色）はＰＣＲプライマーであり、回収ＤＮＡ（２０回のＰＣＲ増幅に十分なものが提供される）の統合性をチェックするために使用できる。
【０１３８】
「入れ子」ＰＣＲプライマーは、ＨＰＶハイスループットＤＮＡ重亜硫酸塩修飾キットにより達成される検出感度をさらに改善するために用いられる。対照プライマーは、従来の重亜硫酸塩ＰＣＲプライマーであり、２ラウンドのＰＣＲ増幅に関して最適化されている。単一ラウンドでこれらのＰＣＲプライマーを使用することは、多くの場合、アガロースゲル電気泳動後、可視アンプリコンバンドは見られないため推奨されない。
注：このプロトコールは、加熱蓋付サーマルサイクラーの使用に基づく。加熱蓋付サーマルサイクラーが入手できない場合、鉱油との反応にオーバーレイする。
【０１３９】
対照反応：
・対照サンプル１（紫色）は、未処理ＨＰＶゲノムＤＮＡ（５０ｎｇ／μｌ）を含有する
・対照サンプル２（緑色）は、重亜硫酸処理ＨＰＶヒトＤＮＡ（２０ｎｇ／μｌ）を含有する
・対照プライマー３Ａ（黄色）は、第１ラウンドのＰＣＲプライマーを含有する
・対照プライマー３Ｂ（赤色）は、第２ラウンドのＰＣＲプライマーを含有する
【０１４０】
対照ＰＣＲ
対照プライマー３Ａ（第１ラウンドのＰＣＲプライマー）および対照プライマー３Ｂ（第２ラウンドのＰＣＲプライマー）は、２０回の対照ＰＣＲ反応までにとって十分な容量が供給された検証済みの「入れ子」プライマーである。これらのプライマーサンプルは、必要な場合、問題処理過程を助けるために供給されており、また、修飾ＤＮＡの品質を評価するためにも使用できる。
注：第２ラウンドのＰＣＲ反応は、第１ラウンドのＰＣＲ反応と平行して調製でき、必要になるまで凍結できる。
【０１４１】
高リスクＰＣＲ増幅
第１ラウンドの増幅
・各反応に関して、用意された高リスクＰＣＲプレート中、１２．５μｌのＰＣＲマスターミックス（例えば、プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）マスターミックス）および９．５μｌの水（分子生物学グレード）を加える。９６のサンプルと１．２５ｍｌのマスターミックスとを組み合わせて設定する場合、８５０μｌの水および２００μｌのプライマーを、適切なチューブ中で混合し、十分に混合する。次いで多チャネルピペットを用いて、２３μｌの反応混合物を用意された高リスクＨＰＶプレート（プレート６）の各ウェルに加える。
・２μｌの対照プライマー３Ａを、ウェルＨ１０およびＨ１１を調節する適切なウェルに加える。
・溶出プレート（プレート５）からの必要な修飾ＤＮＡ２μｌを、用意された高リスクＨＰＶプレート（プレート６）に加え、ならびに２μｌの対照サンプル２をウェルＨ１１に加え、次いで、残りを引き続くＨＰＶタイピングのために−２０℃で保存する（高リスクプレートレイアウトに関しては下記を参照）。
・以下のＰＣＲプログラムを実行する。
【０１４２】
【表４】
【０１４３】
第２ラウンドの増幅
・第１ラウンドの増幅ＤＮＡ２μｌを、第１ラウンドの増幅と全く同じに調製された第２ラウンドの混合物に加える。
・以下のＰＣＲプログラムを実行する。
【０１４４】
【表５】
【０１４５】
電気泳動
・フォイルラッパーから９６ウェル２％Ｅ−ゲルを取出し、赤色９６ウェルコームを取出す。
・１０μｌの滅菌水を、多チャネルピペットを用いてゲルの各ウェルに加える。
・１０μｌのＤＮＡマーカーをマーカーウェルに加える。
・１０μｌの増幅産物を、多チャネルピペットを用いてＥ−ゲルの各ウェルに移す。
・Ｅ−ベースを５〜７分間設定し、ｐｗｒ／ｐｒｇをプレスする。
・ＵＶライトボックスおよびゲル文書化ソフトウェアを用いて結果を記録する。
【０１４６】
ＨＰＶタイピング
第１ラウンドの増幅
ハイリスクタイピングプレート（プレート８）は、以下の高リスクＨＰＶタイプ：１６、１８、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９および６８に対して方向付けられた株特異的プライマーを含有する。全ての高リスク株に関して各サンプルをタイピングする上で、十分なＤＮＡが溶出プレート（プレート５）に残っている。
・−２０℃のフリーザーから溶出プレート（プレート５）を取出す。
・高リスクユニバーサル増幅により陽性のサンプルは、ここで株特異的プライマーを用いてタイピングできる（タイピングプレート設定に関して下記を参照）。
・各反応に関して、用意されたＰＣＲプレートの各ウェルに、１２．５μｌのＰＣＲマスターミックス（例えば、プロメガマスターミックス）および８．５μｌの水を加える。タイピングする６つのサンプルを有する場合、１１８７．５μｌのマスターミックスおよび８０７．５μｌの水を、適切なチューブに加え、十分に混合してから、下記に示すとおり、２１μｌをＨＰＶタイピングプレート（プレート７）の各ウェルに加える。
・下記に示すとおり、２μｌの適切なプライマーセットを各ウェルに加える。
・タイピングが、３８４のウェルフォーマットで実施され、２４のサンプルがタイピングに利用できる場合、４．５ｍｌのマスターミックスおよび３．４２ｍｌの水を適切なチューブに入れ、十分に混合し、次いで下記に示すとおり、２１μｌを３８４のウェルプレートの各ウェルに加える。次に下記に示すとおり、２μｌの適切なプライマーセットを各ウェルに加える。
・２μｌの高リスク陽性サンプル（溶出プレートから、プレート５）をタイピングプレートの適切なウェルに加える。
・各サンプルおよび「テンプレート無し」（陰性）対照に対して十分なチューブを備える。
・以下のＰＣＲプログラムを操作する。
【０１４７】
【表６】
【０１４８】
第２ラウンドの増幅
・２μｌの第１ラウンドの増幅ＤＮＡを、第１ラウンドの増幅と全く同じに調製された第２ラウンドの混合物に加える。
・以下のＰＣＲプログラムを操作する。
【０１４９】
【表７】
【０１５０】
電気泳動
・フォイルラッパーから９６ウェルの２％Ｅ−ゲルを取出し、赤色９６ウェルコームを取出す。
・１０μｌの滅菌水を、多チャネルピペットを用いてゲルの各ウェルに加える。
・１０μｌのＤＮＡマーカーをマーカーウェルに加える。
・１０μｌの増幅産物を、多チャネルピペットを用いてＥ−ゲルの各ウェルに移す。
・Ｅ−ベースを５〜７分間設定し、プレス操作をする。
・ＵＶライトボックスおよびゲル文書化ソフトウェアを用いて結果を記録する。
・これでサンプルがタイピングされた。
【０１５１】
【表８】
【０１５２】
供給源からの重亜硫酸塩処理ＨＰＶ ＤＮＡはゲノム的に単純化したプライマーを用いて増幅される場合、オリゴヌクレオチド類であろうとＩＮＡ類などの修飾核酸であろうとヒト臨床材料であろうと別の極度端では環境源からのサンプルであろうとサンプル内の任意のタイプのＨＰＶを見出すため卓絶した検出システムを提供する。本発明は、ヒト癌の原因であると考えられている臨床関連ウイルス（ＨＰＶ）に関して開発された。
【０１５３】
本発明による検出アッセイの実用的な含みは変わり得る。詳細に上述された原理は、増幅のためにＰＣＲを用いて示されたが、読み出し情報は、当該技術分野で公知の任意の方法と係合させることができる。マイクロアレイ検出システムが現在強調されており、重亜硫酸処理が、ゲノムの複雑性を減少させ、それゆえ、より少数の検出器（機能）によりマイクロアレイ上でより多くのタイプのＨＰＶを試験できることから、ゲノム的に単純化したプライマーを用いて多種多様なＨＰＶを検出できるであろう。
【０１５４】
要約すると、ＨＧＳのゲノム的に単純化したプライマーの方法により、多くの患者の臨床的表現型と相関している一貫したデータセットが得られる。
【０１５５】
重亜硫酸塩処理
核酸の効果的な重亜硫酸塩処理の代表的なプロトコールが下記に示される。このプロトコールにより、処理された全てのＤＮＡの実質的な保持がもたらされる。この方法は、本明細書においてヒューマンジェネティックシグネチャーズ（ＨＧＳ）法とも称される。サンプルまたは試薬の容量もしくは量は変わり得ることが認識されるであろう。
【０１５６】
重亜硫酸塩処理の好ましい方法は、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｉｇｎａｔｕｒｅ Ｐｔｙ社の名称で、参照として本明細書に組み込まれているＵＳ１０／４２８３１０またはＷＯ２００４／０９６８２５（ＰＣＴ／ＡＵ２００４／０００５４９）に見ることができる。
【０１５７】
所望の場合、好適な制限酵素により予め消化してもよい２μｇのＤＮＡに、３Ｍ ＮａＯＨ（新鮮に作製された５０ｍｌの水中６ｇ）の２μｌ（１／１０容量）を２０μｌの最終容量で加えた。重亜硫酸塩試薬が一本鎖分子と反応することが好ましいことから、この工程で、二本鎖ＤＮＡ分子を一本鎖形態に変性させる。この混合物を３７℃で１５分間インキュベートした。室温より高い温度でのインキュベーションは、変性効率を改善するために使用できる。
【０１５８】
インキュベーション後、２０８μｌの２Ｍメタ重亜硫酸ナトリウム（２０ｍｌ水中、４１６ｍｌの１０Ｎ ＮａＯＨと共に７．６ｇ；ＢＤＨ ＡｎａｌａＲ番号１０３５６、４Ｄ；新鮮に作製）および１２μｌの１０ｍＭキノール（５０ｍｌの水中０．０５５ｇ、ＢＤＨ ＡｎａｌａＲ番号１０３１２２Ｅ；新鮮に作製）を連続して加えた。キノールは還元剤であり、試薬の酸化還元を促進する。他の還元剤、例えば、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、メルカプトエタノール、キノン（ヒドロキノン）、または他の好適な還元剤も使用できる。サンプルを、２００μｌの鉱油によりオーバーレイした。鉱油のオーバーレイは、必須ではないが、試薬の蒸発および酸化を防止する。次いでサンプルを５５℃で一晩インキュベートした。あるいはサンプルを、以下のとおりサーマルサイクラー中でサイクルでき：以下のとおり約４時間または一晩インキュベートする；工程１、ＰＣＲ機械内で５５℃／２時間サイクルし；９５℃／２分サイクルする。工程１は、約３７℃から約９０℃の任意の温度で実施でき、５分から８時間までの長さで変わり得る。工程２は、約７０℃から約９９℃の任意の温度で実施でき、約１秒から６０分までの長さ、またはそれ以上の長さに変わり得る。
【０１５９】
メタ重亜硫酸ナトリウムによる処理後、油分を除去し、ＤＮＡ濃度が低い場合１μｌのｔＲＮＡ（２０ｍｇ／ｍｌ）または２μｌのグリコーゲンを加えた。これらの添加物は任意選択であり、ＤＮＡが低濃度で存在する場合は特に、標的ＤＮＡとの共沈殿させることにより得られるＤＮＡの収率を改善するために使用できる。核酸のより効率的な沈殿のための担体としての添加物の使用は、一般に核酸量が＜０．５μｇである場合に望ましい。
【０１６０】
イソプロパノールのクリーンアップ処理は、以下のとおり実施した：８００μｌの水をサンプルに加え、混合してから１ｍｌのイソプロパノールを加えた。水または緩衝液は、重亜硫酸塩が、対象の標的核酸と共に沈殿しない濃度まで反応容器中のこの塩の濃度を減少させる。塩濃度が本明細書に開示された所望の範囲未満に希釈される限り、この希釈は一般に、約１／４から１／１０００である。
【０１６１】
サンプルを再度混合し、４℃で少なくとも５分間放置した。サンプルを微量遠心管中で１０〜１５分間スピンさせて、各回ボルテックスしながら７０％ＥＴＯＨによりこのペレットを２回洗浄した。この洗浄処理により、核酸と共に沈殿した残留塩が除去される。
【０１６２】
このペレットを乾燥させてから、ｐＨ７．０〜１２．５のＴ／Ｅ（１０ｍＭのトリス／０．１ｍＭのＥＤＴＡ）の５０μｌなど、適切な容量で再懸濁させた。ｐＨ１０．５での緩衝液は、特に有効であることが分かっている。サンプルは、核酸を懸濁させるのに必要である３７℃から９５℃で１分から９６時間インキュベートした。
【０１６３】
増幅
ＰＣＲ増幅は、Ｐｒｏｍｅｇａ ＰＣＲマスターミックスを用いる２μｌの重亜硫酸塩処理ゲノムＤＮＡ、６ｎｇ／μｇの各プライマーを含有する２５μｌの反応混合物中で実施された。鎖特異的入れ子プライマーを増幅に用いる。第１ラウンドのＰＣＲ増幅は、ＰＣＲプライマー１および４を用いて実施された（下記参照）。第１ラウンドのＰＣＲ増幅後、１μｌの増幅物質を、ＰＣＲプライマー２および３を含有する第２ラウンドのＰＣＲプレミックスに移し、先に記載されたように増幅を行った。ＰＣＲ産物のサンプルを、以下の条件下でＴｈｅｒｍｏＨｙｂａｉｄ ＰＸ２サーマルサイクラー中で増幅した：９５℃４分間の１サイクル、次いで９５℃１分間、５０℃２分間および７２℃２分間の３０サイクル、７２℃１０分間の１サイクル。
【０１６４】
【表９】
【０１６５】
多重増幅
１μｌの重亜硫酸塩処理ＤＮＡを、以下の成分、すなわち２５μｌの２０反応容量、×１Ｑｉａｇｅｎ多重マスターミックス、５〜１００ｎｇの各第１ラウンドＩＮＡまたはオリゴヌクレオチドプライマー１．５〜４．０ｍＭのＭｇＳＯ４、４００μＭの各ｄＮＴＰおよび０．５〜２単位のポリメラーゼ混合物中に加える。次いでこの成分を、以下のとおり熱蓋サーマルサイクラー中でサイクルさせる。典型的に、各増幅反応において２００以下の個々のプライマー配列まであり得る：
工程１；９４℃１５分間 １サイクル
工程２；９４℃１分間、５０℃３分間 ３５サイクル；６８℃３分間
工程３；６８℃１０分間 １サイクル
【０１６６】
次に第２ラウンドの増幅を第１ラウンド増幅の１μｌの分割量に対して実施し、これを酵素反応混合物および適切な第２ラウンドプライマーを含有する第２ラウンド反応チューブに移す。次いでサイクリングを上記のとおり実施する。
【０１６７】
ＨＧＳ「複雑性減少」プライマーおよびプローブ
任意の好適なＰＣＲプライマーまたはプローブが、本発明ならびに等温性増幅方法論を含む非ＰＣＲ増幅に関して特に設計されたプライマーおよびプローブに使用できる。プライマーまたはプローブは、典型的に増幅される配列に相補的な配列を有する。プライマーまたはプローブは、典型的にオリゴヌクレオチドであるが、ＩＮＡ類などのヌクレオチド類縁体であり得る。「トップ」および「ボトム」鎖に対するプライマーは、配列が異なる。
【０１６８】
プローブおよびプライマー
プローブまたはプライマーは、任意の好適な核酸分子または核酸類縁体であり得る。例としては、これに限定はしないが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、固定化核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ＭＮＡ、アルトリトール核酸（ＡＮＡ）、ヘキシトール核酸（ＨＮＡ）、挿入核酸（ＩＮＡ）、シクロヘキサニル核酸（ＣＮＡ）およびそれらの混合物ならびにそれらのハイブリッド、ならびにこれに限定はしないが、ホスホロチオエート類、メチルホスホレート類、ホスホラミダイト類、ホスホロジチオエート類、ホスホロセレノエート類、ホスホトリエステル類およびホスホボラノエート類などのそれらのリン原子修飾が挙げられる。非天然ヌクレオチド類としては、これに限定はしないが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＩＮＡ、ＨＮＡ、ＭＮＡ、ＡＮＡ、ＬＮＡ、ＣＮＡ、ＣｅＮＡ、ＴＮＡ、（２’−ＮＨ）−ＴＮＡ、（３’−ＮＨ）−ＴＮＡ、α−Ｌ−リボ−ＬＮＡ、α−Ｌ−キシロ−ＬＮＡ、β−Ｄ−キシロ−ＬＮＡ、α−Ｄ−リボ−ＬＮＡ、［３．２．１］−ＬＮＡ、ビシクロ−ＤＮＡ、６−アミノ−ビシクロ−ＤＮＡ、５−エピ−ビシクロ−ＤＮＡ、α−ビシクロ−ＤＮＡ、トリシクロ−ＤＮＡ、ビシクロ［４．３．０］−ＤＮＡ、ビシクロ［３．２．１］−ＤＮＡ、ビシクロ［４．３．０］アミド−ＤＮＡ、β−Ｄ−リボピラノシル−ＮＡ、α−Ｌ−リキソピラノシル−ＮＡ、２’−Ｒ−ＲＮＡ、α−Ｌ−ＲＮＡまたはα−Ｄ−ＲＮＡ、β−Ｄ−ＲＮＡ内に含まれるヌクレオチド類が挙げられる。さらに、非リン含有化合物は、これに限定はしないが、メチルイミノメチル、ホルムアセテート、チオホルムアセテートおよびアミドを含む結合基などのヌクレオチドへの結合に使用できる。特に核酸および核酸類縁体は、１種以上の挿入体擬似ヌクレオチドを含むことができる。
【０１６９】
プローブまたはプライマーは、ＩＮＡを形成する１つ以上の内部ＩＰＮ類を含有するＤＮＡまたはＤＮＡオリゴヌクレオチド類であり得る。
【０１７０】
検出方法
所望のサンプルの状態を判定するために多数の可能な検出システムが存在する。検出システムとしては、これに限定はしないが、以下のものが挙げられる：
Ｉ．適切に標識されたＤＮＡの、１０から＞２００，０００の個々の成分に関して選択し得るミクロアレイタイプのデバイスへのハイブリダイゼーション。このアレイは、ガラス、プラスチック、雲母、ナイロン、ビーズ、磁気ビーズ、蛍光ビーズまたは膜などの任意の好適な固体表面上のＩＮＡ類、ＰＮＡ類またはヌクレオチドもしくは修飾ヌクレオチドアレイを含むことができるであろう；
ＩＩ．サザンブロットタイプの検出システム；
ＩＩＩ．アガロースゲルなどの標準的ＰＣＲ検出システム、Ｇｅｎｅｓｃａｎ分析などの蛍光読取り。サンドイッチハイブリダイゼーションアッセイ、臭化エチジウムなどのＤＮＡ染色試薬、Ｓｙｂｒグリーン、抗体検出、ＥＬＩＳＡプレートリーダータイプデバイス、蛍光計デバイス；
ＩＶ；特定または複数ゲノム増幅断片もしくはそれに対する任意の変体のリアルタイプＰＣＲ定量化；
Ｖ；WO 2004/065625に概説された蛍光ビーズ、酵素複合体、放射活性ビーズなどの任意の検出システム；
ＶＩ；鎖置換増幅（ＳＤＡ）などのリガーゼ鎖反応または等温ＤＮＡ増幅テクノロジーなどの増幅工程を利用する任意の他の検出システム；
ＶＩＩ．参照として本明細書に組み込まれている、Ｔｅｘａｓ Ａ＆Ｍ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｙｓｔｅｍ名義のＵＳ６４２６２３１およびＵＳ６９１６６６５、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ名義のＵＳ６８２４６５９などのバイオセンサーテクノロジーは、本発明に好適となるであろう。
【０１７１】
挿入核酸
挿入核酸（ＩＮＡ）は、配列特異的に核酸（ＤＮＡおよびＲＮＡ）にハイブリダイズできる非天然ポリヌクレオチドである。幾つかの所望の性質を示すことから、ＩＮＡは、プローブまたはプライマーベースのハイブリダイゼーションアッセイに対する代替物／置換物としての候補物質である。ＩＮＡ類は、対応する天然核酸／核酸複合体よりも熱力学的に安定であるハイブリッドを形成するために核酸にハイブリダイズするポリマー類である。それらは、ペプチドまたは核酸を分解することが知られている酵素の基質ではない。したがって、ＩＮＡ類は、生体サンプルにおいてより安定であるはずであり、ならびに天然核酸断片よりも長い保存寿命を有する。イオン強度に極めて依存する核酸ハイブリダイゼーションとは異なり、ＩＮＡと核酸とのハイブリダイゼーションは、イオン強度からかなり独立しており、核酸に対する天然核酸のハイブリダイゼーションを非常に不利とする条件下である低イオン強度が好都合である。ＩＮＡの結合強度は、分子に操作される挿入基数ならびに二本鎖構造において特定の様式で積み重ねられる塩基間の水素結合による通常の相互作用に依存する。配列識別能は、ＤＮＡ認識ＤＮＡよりもＩＮＡ認識ＤＮＡの方が有効である。
【０１７２】
ＩＮＡは、（Ｓ）−１−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリフェニルメチル）−３−Ｏ−（１−ピレニルメチル）−グリセロールのホスホラミダイトであることが好ましい。
【０１７３】
ＩＮＡ類は、市販のフォーマットで標準的なオリゴヌクレオチド合成手法の適応により合成される。ＩＮＡ類の完全定義およびそれらの合成は、参照として本明細書に組み込まれているＷＯ０３／０５１９０１、ＷＯ０３／０５２１３２、ＷＯ０３／０５２１３３及びＷＯ０３／０５２１３４（Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ Ｐｔｙ社）に見ることができる。
【０１７４】
実際、ＩＮＡプローブとプライマーおよび標準的な核酸プローブとプライマーとの間には多くの相違がある。これらの相違は、都合よく生物学的、構造的、および物理化学的な相違に分類することができる。上記および下記に考察されるように、これらの生物学的、構造的、および物理化学的な相違は、典型的に核酸が使用される適用においてＩＮＡプローブおよびプライマーを使用しようする場合、予測できない結果となり得る。異なる組成物のこの不等価性は、しばしば化学技術において見られる。
【０１７５】
生物学的相違に関して、核酸は、遺伝子伝達および発現の作用物質として生物種の生命において中心的な役割を果たす生物学的物質である。それらのｉｎ ｖｉｖｏ特性はかなりよく理解されている。しかしながら、ＩＮＡは、化学者が思いつき、合成有機化学を用いて作製され、最近開発された全く人工的な分子である。その生物学的機能は知られていない。
【０１７６】
ＩＮＡ類は、構造的に核酸類とは劇的に異なる。双方とも共通の核酸塩基（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、およびＵ）を用いることができるが、これらの分子の組成は、構造的に多様である。ＲＮＡ、ＤＮＡおよびＩＮＡの主鎖は、反復ホスホジエステルリボース単位および２−デオキシリボース単位を含む。ＩＮＡは、リンカー分子（１つまたは複数）を介してポリマーに結合された１つ以上の大型フラット分子を有する上でＤＮＡまたはＲＮＡとは異なる。このフラット分子は、二本鎖構造におけるＩＮＡの反対位置の相補的ＤＮＡにおける塩基間に挿入する。
【０１７７】
ＩＮＡとＤＮＡまたはＲＮＡとの間の物理化学的な相違もまた相当にある。ＩＮＡは、核酸プローブまたはプライマーが同じ標的配列に結合するよりも速く相補的ＤＮＡに結合する。ＤＮＡ断片またはＲＮＡ断片とは異なり、ＩＮＡは、挿入基が末端位置に配置されない限り、ＲＮＡへうまく結合しない。挿入基と相補的ＤＮＡ鎖の塩基との間の強い相互作用のため、ＩＮＡ／ＤＮＡ複合体の安定性は、類縁体ＤＮＡ／ＤＮＡまたはＲＮＡ／ＤＮＡ複合体よりも高い。
【０１７８】
ＤＮＡ断片またはＲＮＡ断片またはＰＮＡなどの他の核酸とは異なり、ＩＮＡ類は、自己凝集または結合性を示さない。
【０１７９】
要約すると、ＩＮＡ類は、配列特異性を有して核酸にハイブリダイズし、ＩＮＡ類は、プローブベースアッセイまたはプライマーベースアッセイを開発するための有用な候補であり、特にキットおよびスクリーニングアッセイに採用される。しかしながら、ＩＮＡプローブおよびプライマーは、核酸プローブおよびプライマーの等価体ではない。その結果、特異性、感度およびプローブベースアッセイまたはプライマーベースアッセイの信頼性を改善し得る任意の方法、キットまたは組成物は、ＤＮＡ含有サンプルの検出、分析および定量化に有用となるであろう。ＩＮＡ類は、この目的のために必要な性質を有する。
【０１８０】
ＨＰＶおよび癌ゲノムマーカー
臨床サンプルおよび細胞系を用いて、本発明者らは、ほぼ４００の遺伝子の調節領域におけるメチル化パターンを調べ、ＨＰＶの存在と共に癌の状態にある場合にメチル化の変化を有する６０を超えるゲノムマーカーを見出している。例としては、これに限定はしないが、転写単位（遺伝子）内、またはそれらの近くの１つ以上の以下のゲノム領域、ＣＤ１４、ＥＮＤＲＢ、ＨＩＣ、ＲＡＲＢ１、ＰＧＲ、ＳＦＲＳ８、ＴＭＳＢ１０、ＡＢＣＧ２、ＭＦＮＧ、ＬＡＭＲ１、ＲＡＧＥ、ＡＢＬ１、ＣＲＢＰ、ＧＰＲ３７、ＨＲＫ、ＲＡＲＡ、ＳＹＫ、ＥＣＥ１、ＭＭＥ、ＴＥＭ、ＮＦ２、ＸＩＡＰＨＳＸ１１、ＲＡＲＲＥＳ１、ＦＬＩ１、ＨＴＬＦ、ＬＤＨＢ、ＲＢ１、ＴＧＤ、ＣＤＫ４、ＭＭＰ１４、ＲＡＢ３２、ＢＡＲＤ１、ＮＦ１、ＬＩＭ２、ＭＭＰ２、ＤＡＢ２、ＢＭＰ６、ＣＤＫＮ１Ｃ、ＤＡＢ２ＩＰ、ＬＭＮＢ１、ＭＭＰ２８、ＨＡＩ２、ＳＯＣＳ１、ＨＩＣ２、ＭＳＨ６、ＲＩＮ２、ＨＭＧＡ１、ＪＵＮ、Ｓ１００Ｐ＊、ＳＲＦ、ＶＤＲ、ＤＫＫ３、ＫＲＡＳ２、ＰＬＡＵ、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ、ＣＤＨ１、ＭＡＣ３０、ＤＤＢ２、ＰＡＸ６、ＡＸＬ、ＥＩＦ４Ａ２、ＳＬＩＴ２、ＲＥＣＫ、ＴＥＲＣ、ＧＡＴＡ５、およびＳＴＡＴ１と表されるものが挙げられる。
【０１８１】
疾患状態
本発明は、ＨＰＶおよび本発明を説明する例として子宮頚部癌の選択されたヒトゲノム領域のメチル化を用いている。種々の形態の認知症（アルツハイマー）などの他の状態は、単純ヘルペスウイルス１型などの感染性成分（2004, Neurobiology of Aging, 25, 619-627; Itzhaki, R.F., et al.）；コロナウイルス関連ＳＡＲＳ肺炎に関連する臨床進行およびウイルス負荷（2003, The Lancet, 361, 1767-1772, Peiris, J.S.M.m et al.,）；ヒト免疫不全ウイルスＨＩＶ、および免疫系不全および幾つかのウイルスベース出血性熱（2004, Nature Medicine, 10, 570-576, Weiss, R.A. et al.,）を有する可能性があり；ニッパウイルス、パラインフルエンザおよびおたふくかぜを含むファミリーパラミクソウイルス科のウイルスは、種々の呼吸器疾病、おたふくかぜ、髄膜炎、膵炎、脳炎および麻疹に関連することがわかるであろう。ニッパウイルスは、１９９９年に最初に認められたばかりのものであり、感染患者の７０％が致命的な脳炎を引き起こし、ヒト、イヌ、ネコ、ブタ、ウマ、ハムスター、コウモリおよびモルモットなどの非常に幅広い宿主範囲を有する。それは、世界の健康および経済に対して重大な脅威となり（2005, Nature, 436, 401-405; Negrete, O.A., et al,）；デング熱、黄熱病、Ｃ型およびＧ型肝炎を含むフラビウイルス科のウイルスは、脳炎、肝炎およびショック症候群に関連する。Ｃ型肝炎は、例えば、世界中の感染者が１億７千万人を超える慢性肝臓疾患の主要原因であり、ワクチンを利用できず（2005, Science, 309, 623-626; Lindenbach, B.D., et al,）；最後にファミリーヘルペスウイルス科のウイルスは、１型から８型までのヘルペスウイルスを含む。これらのウイルスは、口腔感染症、角膜の潰瘍、生殖器官の感染症、髄膜炎、水痘、肺炎、帯状疱疹、サイトメガロウイルス単核細胞症および脳炎を引き起こし得る。ヒトサイトメガロウイルスは、臓器移植者など、免疫不全者において重症で致命的な疾患を引き起こし（2003, Nature, 424, 456-461; Wang, X., et al）、これらもまた、健康状態の進行が、ウイルス存在および宿主のＤＮＡのメチル化状態の組み合わせによりモニターできるので、ヒトならびに種々の動物において本発明の候補になるであろう。同様の例は、植物ウイルスおよびウイロイドに対して利用できる。
【実施例】
【０１８２】
実施例
ＨＰＶ
本発明を説明するために、ＨＰＶおよび子宮頚部癌が以下の実施例に使用される。上記に概説された他のウイルスおよび疾患状態もまた、本発明によりアッセイできることがわかるであろう。
【０１８３】
本発明者らが、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏのバイオインフォマティクス分析で基礎としたものを反復すると、参照目的のために本明細書に利用された標準的なＨＰＶタイプは、元はｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ Ｔａｘｏｎｏｍｙ ｏｆ Ｖｉｒｕｓｅｓ、ＩＣＴＶによりそのように称されたファミリーパポバウイルス科パピローマウイルス属のＨＰＶ１６であるが（1993, Van Rast, M.A., et al., Papillomavirus Rep, 4, 61-65;また1998, Southern, S.A. and Herrington, C.S. Sex. Transm. Inf. 74, 101-109も参照のこと）パピローマウイルス科に対する分類学的改善により、先行技術において時には交互に使用される。不明瞭な点を避けるために、本発明者らは、標準的なコンパレーターとして、ＨＰＶ１６の完全配列決定された７９０４塩基対のゲノムを用いた（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ、ＮＣＢＩ座ＮＣ＿００１５２６；ＮＣ＿００１５２６．１版；ＧＩ：９６２７１００；参照文献、Medline, 91162763 および 85246220; PubMed 1848319および2990099）。
【０１８４】
さらに、本発明者らは、それぞれＮＣＢＩ登録番号のＮＣ−００１５２６、ＮＣ−００１３５７、ＮＣ−００１５９０およびＮＣ−００１５９４を有するいわゆる高リスクＨＰＶタイプの１６、１８、４５および５６の完全配列決定されたゲノムを用いた。
【０１８５】
本発明者らは、それぞれＮＣＢＩ登録番号のＮＣ−００１５８５、ＮＣ−００１５２７、ＮＣ−００１５２８、ＮＣ−００１５２９、ＮＣ−００１５３５、ＮＣ−００１５３３、ＮＣ−００１５９２、ＮＣ−００１４４３およびＮＣ−００１６９５を有するいわゆる中等度リスクＨＰＶタイプの３０、３１、３３、３５、３９、５１、５２、５８および６６の完全配列決定されたゲノムを用いた。
【０１８６】
本発明者らは、それぞれＮＣＢＩ登録番号のＮＣ−０００９０４、ＮＣ−００１５２５、ＮＣ−００１５３４、ＮＣ−００５３４９、ＮＣ−００１６８９、ＮＣ−００１５９３、ＮＣ−００１６７６およびＮＣ−００１６９２を有するいわゆる低リスクＨＰＶタイプの６、１１、４２、４３、４４、５３、５４および５５の完全配列決定されたゲノムを用いた。
【０１８７】
本発明者らが説明したように、種々の臨床サンプルのヒトパピローマウイルスの従来のＤＮＡ試験による検出は、多くの技術的、方法論的および臨床的問題により妨害されている。ＨＰＶ ＤＮＡの重亜硫酸塩の変換により、ＨＰＶ誘導体配列プールの複雑性を減少させるため、本発明は、先行技術に遭遇した多くの困難に対する解決を提供する。この複雑性が減少したことにより、サンプル中の種々のＨＰＶタイプのより効率的な開始スクリーニングを可能にし、それゆえ臨床データとのより適切で正確なインターフェースを可能にする。
【０１８８】
出願人により開発された方法を用いるサンプル中のＨＰＶ検出例は、参照として本明細書に組み込まれているＨｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｉｇｎｔｕｒｅｓ Ｐｔｙ社の名称でＷＯ２００６／０６６３５３（ＰＣＴ／ＡＵ２００５／００１９６３）に見ることができる。
【０１８９】
図１は、種々の正常な個体、ならびに高グレード扁平上皮内病巣部、およびある細胞系の、ＨＰＶの存在に関する試験結果を示す。提供されたデータは、ＨＰＶならびに４００のヒトゲノム領域のメチル化状態に関して試験された患者からの図１のデータを補足する。
【０１９０】
【表１０】
【０１９１】
ＨＰＶの二重存在および種々のヒトゲノム領域のメチル化状態
ＨＰＶとＨＰＶ特定のゲノム領域のメチル化状態とを合わせると、いずれか単独の特徴よりも強力な予知指標となることを立証するために実験を工夫した。この様式で、多数のゲノム領域は、子宮頚部細胞学的現象が正常である個体；子宮頚部細胞学的現象が、高グレード扁平上皮内病巣部に特徴的である個体、および子宮頚部細胞学的現象が細胞形態学の癌性指標に関して正常であるが、細胞学的特徴に基づいてＨＰＶに陽性であることが推測される個体からのサンプルにおけるメチル化状態についてアッセイされた。
【０１９２】
図１Ａは、ＨｅＬａ細胞系および病理学者により判定されたＨＳＩＬを示す２人の患者（ＨＳＩＬ−１およびＨＳＩＬ−２と表される）、および子宮頚部形態学上正常であるが、病理学的表現型からＨＰＶが存在すると推測される１人の患者（ＨＰＶ＋Ｎｏｒと表される）が、適切なＰＣＲ増幅テクノロジーにより判定されＨＰＶの存在が陽性であったことを示す。正常な子宮頚部形態学を有する２人の患者（正常１および正常２と表わされる）は、高リスクＨＰＶタイプの存在に関して分子的に陰性であった。
【０１９３】
図１Ｂは、ＨｅＬａ細胞系におけるバンド（アンプリコン）の存在を示し、これにはＨＰＶ１８タイプのＤＮＡ配列を含む。２つのＨＳＩＬサンプル（２つのパネル番号）は、分子的にアッセイされたＨＰＶ１６を含有する。病理学者により形態学的に正常であると判定されたが、その幾つかの細胞がＨＰＶ感染を示す特徴的な細胞質機能を有した子宮頚部組織は、ＨＰＶタイプ８２に陽性であることが判明した（パネル４）。
【０１９４】
次にこれらの臨床サンプルを、メチル化の存在（ｐｏｓと表される）、または非メチル化（ｎｅｇと表される）に関して、各ゲノム座において試験した。重要な予後指標は、例えば、通常の病状を有する患者が非メチル化遺伝子座を有する場合であり、一方、高グレード扁平上皮内病巣部は同じ領域にメチル化を有し；端的に言うと、関連遺伝子領域は、癌性状態に進行すると沈黙させられる（逆の過程が適用される。正常な細胞学的現象を有する個体は、特定の細胞型においてメチル化される遺伝子座を有することができ、その遺伝子座は、癌性状態において非メチル化となる）。
【０１９５】
所与のゲノム領域のメチル化は細胞型により変わることから、幾つかのゲノム領域は、その特定の細胞型の癌性状態への進行に関して必要な情報を得ないであろう。これらの領域は、全てのサンプルにおいて完全に非メチル化であるか、または全ての臨床サンプルにおいて完全にメチル化されているであろう。
【０１９６】
表３Ａおよび３Ｂは、多くの臨床サンプルのＨＰＶ状態、ならびにＨｅＬａ細胞系、および５３の個々のヒトゲノム領域のメチル化状態を示す。
【０１９７】
表３Ａおよび３Ｂから見ることができるように、ＨｅＬａ子宮頚部細胞系および高グレード扁平上皮間病巣部（ＨＳＩＬ）の双方は、分子的に判定されたとおりＨＰＶ ＤＮＡの存在に関して陽性であった。病理学的に推測されたＨＰＶ感染を有するが、非癌性の１つの子宮頚部組織サンプル（ＨＰＶ＋Ｎｏｒと表される）は、ＨＰＶの存在に関して陽性であることも判明した。異なる個体からの２つの正常な子宮頚部組織サンプルは、分子的に判定されたようにＨＰＶ ＤＮＡ配列の存在に関して陰性であることが判明した。
【０１９８】
上記領域の各々は、ＰＣＲ増幅されており、生じたアンプリコンを適切な制限酵素により消化して（および／または配列決定して）、その特定のゲノム領域のメチル化状態を判定する（表３Ａおよび３Ｂ）。
【０１９９】
最初に、予後指標に関する情報が得られないゲノム領域が存在する。これらは、全てのサンプルにおいて非メチル化（１３のゲノム領域ＡＢＣＧ２からＶＨＬ）であるか、または全てのサンプルにおいてメチル化（４つのゲノム領域、ＣＤ３４、ＭＡＧＥＡ２、ＭＡＧＥＡ３およびＭＩＮＴ３１）される。表３Ａおよび３Ｂの結果から特に興味深いのは、ＣＤ１４、ＥＮＤＲＢ、ＨＩＣおよびＲＡＲＢと表されるゲノム領域である。これら領域の全ては、ＨｅＬａ子宮頚部癌細胞系および両ＨＳＩＬサンプルにおいてメチル化された。興味深いことに、これらの領域のいずれも、試験された正常な子宮頚部組織またはＨＰＶにより感染された非癌性子宮頚部組織サンプルにおいてメチル化されなかった。
【０２００】
最後に、ＡＮＡＸ７からＴＮＦＲＳ１０Ｂまでの３２のゲノム領域は、正常な個体とＨＳＩＬを有する個体との間で可変性のメチル化パターンを示す。この可変性は、個々の患者の遺伝子背景およびヒトゲノムの個々の座でメチル化状態の異なる安定性の混合に極めて反映し易い。
【０２０１】
この結果は、ＨＰＶの存在が、ほとんど全てのＨＳＩＬおよび子宮頚部癌に検出されているが、ＨＰＶ単独の存在は、子宮頚部の高グレード異常性について信頼できる指標ではない。しかしながら、ＨＰＶの存在が、子宮頚部ＤＮＡサンプルのメチル化プロフィールの変化と関連する場合、これは、疾患状態の極めてより良好な予後指標を与える。
【０２０２】
【表１１】
【０２０３】
【表１２−１】
【表１２−２】
【表１２−３】
【０２０４】
ゲノム領域ＣＤ１４、ＥＮＤＲＢ、ＨＩＣおよびＲＡＲＢのメチル化に加えて、本発明はまた、正常な子宮頚部組織または３８４の候補遺伝子のパネルからＨＰＶにより感染した正常な子宮頚部組織ではなくて、ＨＳＩＬサンプル中のＣＤ１４、ＥＮＤＲＢ、ＨＩＣおよびＲＡＲＢと同様のメチル化プロフィール示す、さらに６２のＤＮＡゲノム領域を同定している。これらのマーカーは表４に掲げている。
【０２０５】
【表１３】
【０２０６】
図２は、ＨＧＳ ＨＲ−ＨＰＶ ＤＮＡ精製キットおよび検出キットを用いてヒトゲノムＤＮＡおよびＨＰＶ ＤＮＡの双方に関して３６のＬＢＣサンプルに対するＰＣＲ増幅の結果を示す。この方法を用いた結果からわかるように、ヒトゲノム変化の存在および同時にウイルスの有無双方に関してアッセイすることは可能である。
【０２０７】
図３は、ＢｓｔＵ１およびＴａｑαｌ制限エンドヌクレアーゼの組み合わせにより消化され、アガロースゲル上で電気泳動された１６の異なるゲノム遺伝子座で増幅された正常な子宮頚部サンプルの代表的なゲルを示す。ＤＮＡを、液体ベースの細胞種から抽出し（ここでは番号２８と２９）、重亜硫酸ナトリウムで修飾し、入れ子状態のプライマーにより、さらなる分析のために同定された遺伝子に増幅した。これらの遺伝子は、左から右に１）ＴＥＭ ２）ＭＭＥ ３）ＥＣＥ１ ４）ＳＹＫ ５）ＲＡＲＡ ６）ＨＲＫ ７）ＧＰＲ３７ ８）ＣＲＢＰ ９）ＡＢＬ１ １０）ＲＡＧＥ １１）ＬＡＭＲ１ １２）ＭＦＮＧ １３）ＡＢＣＧ２ １４）ＴＭＳＢＩＯ １５）ＳＦＲＳ８および１６）ＰＧＲであった。
【０２０８】
サンプルの病理学およびＨＰＶ感染プロフィールは、専門病理学者により評価された。アンプリコン内のＣｐＧジヌクレオチドが、メチル化されていない場合、チミン塩基への増幅後、重亜硫酸塩の修飾により非メチル化シトシンがウラシル塩基に変換する。非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドおよび制限部位は、保持されず、したがって、ＢｓｔＵ１（サンプルがメチル化されない場合に増幅後ＴＧＴＧに変換するＣＧＣＧがわかるが、サンプルがメチル化配列を含有する場合にＣＧＣＧを存続する）、またはＴａｑαｌ（サンプルがメチル化されない場合に増幅後ＴＴＧＡに変換するＴＣＧＡがわかるが、サンプルがメチル化配列を含有する場合にＴＣＧＡを存続する）エンドヌクレアーゼにより認識されない。したがって、未消化ＰＣＲ産物を表す単一バンドの検出は、アンプリコン内のＣｐＧジヌクレオチドがメチル化されていないことを意味する。メチル化ＣｐＧジヌクレオチドは、重亜流酸塩修飾に抵抗性であることから、制限エンドヌクレアーゼにより認識された制限部位は保持される。その結果、ＰＣＲ産物は、アンプリコンに利用できるＣｐＧ部位数に依って複数断片（星印により示される）に消化される。空のレーンの検出は、ＰＣＲ反応が不成功に終わったことを示唆している。
【０２０９】
２、３の複数バンドは、これら１６の座位に検出された。このアッセイからの代表的な結果を表５に作表する。
【０２１０】
【表１４−１】
【表１４−２】
【０２１１】
病理学的に正常な子宮頚部サンプル（ＮＯＲＭ）の代表的な番号のメチル化プロフィールの中のいくつかは、ＨＰＶ感染（ＮＯＲＭ ＨＰＶ）を有しているようであった。ＤＮＡは、液体ベースの細胞サンプルから抽出し、重亜硫酸ナトリウムで修飾し、３８４の異なる遺伝子に増幅した。アンプリコンは、制限酵素により消化し、アガロースゲル上で電気泳動した。単一産物（未消化産物）の検出は、サンプルが、調べられる遺伝子のプロモーター領域において非メチル化（Ｕ）されていることを示している。複数バンド（消化産物）の検出は、サンプルが、調べられる遺伝子のプロモーターにおいてメチル化（Ｍ）されていることを示している。特定の遺伝子座におけるバンドの欠如（「Ｆ」により表される）により、ＰＣＲ反応は不成功に終わったことが推測される。
【０２１２】
高リスクおよび中等度リスクパピローマウイルスＤＮＡの存在（＋）または不在（−）も掲載された。ヒトおよびマウス双方のＧＳＴ−Ｐ１遺伝子（ＨｍＧＳＴ）を増幅したプライマーは、ＰＣＲ反応に対する対照として含まれた。バンドの検出は、ＤＮＡが変換され、増幅に利用できることを意味する。
【０２１３】
図４は、ＢｓｔＵ１およびＴａｑαｌ制限エンドヌクレアーゼの組み合わせにより消化された１６の異なるゲノム座位で増幅され、アガロースゲル上で電気泳動された腫瘍サンプルの代表的なゲルを示す。ＤＮＡは、液体ベースの細胞種から抽出し（ここでは番号８２、８３、８４、９４、９５および９６）、重亜硫酸ナトリウムで修飾し、入れ子プライマーにより、さらなる分析のために同定された遺伝子に増幅した。これらの遺伝子は、左から右に１）ＰＧＲ ２）ＳＦＲＳ８ ３）ＴＭＳＢＩＯ ４）ＡＢＣＧ２ ５）ＭＦＮＧ ６）ＬＡＭＲ１ ７）ＲＡＧＥ ８）ＡＢＬ１ ９）ＣＲＢＰ １０）ＧＰＲ３７ １１）ＨＲＫ １２）ＲＡＲＡ １３）ＳＹＫ １４）ＥＣＥ１ １５）ＭＭＥおよび１６）ＴＥＭであった。
【０２１４】
サンプルの病理学およびＨＰＶ感染プロフィールは、専門病理学者により評価された。アンプリコン内のＣｐＧジヌクレオチドが、メチル化されていない場合、重亜硫酸塩の修飾により非メチル化シトシンがウラシル塩基に変換する。非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドおよび制限部位は、保持されず、したがって、ＢｓｔＵ１またはＴａｑαｌエンドヌクレアーゼにより認識されない。したがって、未消化ＰＣＲ産物を表す単一バンドの検出は、アンプリコン内のＣｐＧジヌクレオチドがメチル化されていないことを意味する。メチル化ＣｐＧジヌクレオチドは、重亜流酸塩修飾に抵抗性であることから、制限エンドヌクレアーゼにより認識された制限部位は保持される。その結果、ＰＣＲ産物は、アンプリコンに利用できるＣｐＧ部位数によって複数断片（星印により示される）に消化される。空のレーンの検出は、ＰＣＲ反応が不成功に終わったことを示唆している。
【０２１５】
正常なサンプルと比較して、腫瘍サンプルでは、遺伝子のより大きな割合がメチル化される（図４を参照）。このアッセイからの代表的な結果を表６に示す。
【０２１６】
表６において、病理学的に異常な子宮頚部サンプルの代表的な番号に関するメチル化プロフィール（専門病理学者に評価された）を示す。サンプルは、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）の存在および病巣タイプに基づいて分類された（低グレードＬＧ、パピローマウイルス ＬＧ ＨＰＶを有する低グレードＬＧ、前高グレードＰｒ ＨＧ、高グレードＨＧ、癌ｉｎ ｓｉｔｕ３つの成分を有する高グレード、および癌ｉｎ ｓｉｔｕ３つの病巣ＣＩＮ３）。
【０２１７】
ＤＮＡは、液体ベースの細胞サンプルから抽出し、重亜硫酸ナトリウムで修飾し、３８４の異なる遺伝子に増幅した。アンプリコンは、制限酵素により消化し、アガロースゲル上で電気泳動した。単一産物（未消化産物）の検出は、調べられる遺伝子のプロモーター領域において非メチル化（Ｕ）されているサンプルであることを示している。複数産物（消化産物）の検出は、識別される遺伝子のプロモーターにおいてメチル化（Ｍ）されているサンプルであることを示している。特定の遺伝子座におけるバンドの欠如（「Ｆ」により表される）により、ＰＣＲ反応は不成功に終わったことが推測される。
【０２１８】
【表１５−１】
【表１５−２】
【０２１９】
【表１６−１】
【表１６−２】
【０２２０】
表７は、ＤＮＡメチル化プロフィールに関して６４の異なるゲノム座位で調査されたサンプルの病理学を示す。
【０２２１】
予め判定された病状を有する９６人の患者に関する液体ベース細胞サンプルから、ＤＮＡを抽出した。病状タイプに関係するサンプルの関連病状、ヒトパピローマウイルス感染の侵襲度およびこのウイルスの有無は、専門病理学者により評価された。
【０２２２】
サンプルは、細胞学的に正常（ＮＯＲＭ）、ＨＰＶに感染している可能性が高い（ＨＰＶ）、ＨＰＶに感染している可能性が高いが細胞学的に正常（ＨＰＶ ＮＯＲＭ）、低グレード病巣（ＬＧ）、ＨＰＶ感染した低グレード病巣（ＬＧ ＨＰＶ）、高グレード病巣（ＨＧ）、高グレード病巣の増加（ＩＮＣ ＨＧ）、前高グレード病巣（Ｐｒ ＨＧ）として、ＨＰＶに感染し易い癌腫ｉｎ ｓｉｔｕ１の病巣、高グレード癌腫ｉｎ ｓｉｔｕ３の病巣（ＨＧ ＣＩＮ３）、高グレード癌腫（ＨＧ Ｃｘ）、扁平上皮細胞癌腫（ＳＣＣ）、扁平上皮細胞癌腫／癌（ＳＣＣ Ｃｘ）、腺癌（ＡＣ Ｃｘ）、子宮体癌（Ｃａ Ｅｎｄｏｍｅｔ）、腺癌／ｉｎ ｓｉｔｕ腺癌（ＡＣ／ＡＩＳ）としてラベルが貼られた。
【０２２３】
表８は、本発明による疾患状態の好適な指標である本発明により判明した遺伝子またはゲノム領域を示す。当業者は、ウイルス核酸の存在の検出と関連する１つ以上のこれらの遺伝子またはゲノム領域における変化を検出するために、好適なプライマーまたはプローブを工夫し得ることを理解できるであろう。
【０２２４】
【表１７−１】
【表１７−２】
【０２２５】
多数の変型および／または修飾が、幅広く記載された本発明の精神または範囲から逸脱することなく具体的な実施形態で示したように本発明になされ得ることを当業者は認識するであろう。したがって全ての点で、本実施形態は、例示であって限定するものでないと考慮されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【０２２６】
図面の簡単な説明
【図１】ＨｅＬａ細胞系；高グレード扁平上皮内病巣と表示される（ＨＳＩＬ−１およびＨＳＩＬ−２と表示される）２個体（１および２）からのサンプル；正常な細胞診断を有する２個体（正常１および正常２と表示される）；癌性状態の細胞診断指標を有しないにも関わらず、専門病理学者の判定により、細胞表現型に基づいてＨＰＶ感染を有していると推定された１個体（ＨＰＶ＋Ｎｏｒと称される）を含む種々のヒトサンプルの高リスクＨＰＶ試験およびＨＰＶタイピングを示す図であり、Ａは、高〜中等度リスクＨＰＶタイプに対するユニバーサルプライマーを用いた６つの異なるサンプルにおける高リスクＨＰＶタイプの判定を示し；Ｂは、ＨＰＶタイプ１６、１８、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８および５９に特異的な複雑性減少プライマーセット、ならびに正常組織サンプルの場合、プライマーセット４２、４３、４４、５３、５４、５５、６６、６８、７３、８２、８３および８４を用いたＨＰＶに関する試験を示す図である。
【図２】同一のＬＢＣサンプルにおけるヒトゲノムＤＮＡおよびＨＰＶ ＤＮＡの同時検出を示す図である。
【図３】１６の異なるゲノム遺伝子座で増幅し、ＢｓｔＵ１およびＴａｑαｌ制限エンドヌクレアーゼの組み合わせによって消化し、アガロースゲル上で電気泳動した正常な子宮頚部サンプルの代表的なゲルを示す図である。ＤＮＡは、液体ベースの細胞診断検体（本明細書で番号２８および２９）から抽出し、重亜硫酸ナトリウム修飾し、入れ子プライマーによって、さらなる分析のために同定される遺伝子へ増幅した。これらの遺伝子は、左から右へ、１）ＴＥＭ、２）ＭＭＥ、３）ＥＣＥ１、４）ＳＹＫ、５）ＲＡＲＡ、６）ＨＲＫ、７）ＧＰＲ３７、８）ＣＲＢＰ、９）ＡＢＬ１、１０）ＲＡＧＥ、１１）ＬＡＭＲ１、１２）ＭＦＮＧ、１３）ＡＢＣＧ２、１４）ＴＭＳＢＩＯ、１５）ＳＦＲＳ８および１６）ＰＧＲであった。
【図４】１６の異なるゲノム遺伝子座で増幅し、ＢｓｔＵ１およびＴａｑαｌ制限エンドヌクレアーゼの組み合わせによって消化し、アガロースゲル上で電気泳動した腫瘍サンプルの代表的なゲルを示す図である。ＤＮＡは、液体ベースの細胞診断検体（本明細書で番号８２、８３、８４、９４、９５および９６）から抽出し、重亜硫酸ナトリウム修飾し、入れ子プライマーによって、さらなる分析のために同定される遺伝子へ増幅した。これらの遺伝子は、左から右へ、１）ＰＧＲ、２）ＳＦＲＳ８、３）ＴＭＳＢＩＯ、４）ＡＢＣＧ２、５）ＭＦＮＧ、６）ＬＡＭＲ１、７）ＲＡＧＥ、８）ＡＢＬ１、９）ＣＲＢＰ、１０）ＧＰＲ３７、１１）ＨＲＫ、１２）ＲＡＲＡ、１３）ＳＹＫ、１４）ＥＣＥ１、１５）ＭＭＥおよび１６）ＴＥＭであった。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象の健康状態を判定するアッセイであって、
核酸中の非メチル化シトシンを修飾できる試剤により前記対象からのサンプルを処理する工程であって、前記サンプル中のウイルス核酸およびゲノム核酸を処理してウイルス核酸誘導体およびゲノム核酸誘導体を形成する工程；
処理された前記サンプル中の前記ウイルス核酸誘導体の存在をアッセイする工程；および
処理された前記サンプル中の前記ゲノム核酸誘導体におけるゲノム標的の状態を判定する工程であって、１種以上の前記ウイルス核酸誘導体の存在および前記ゲノム標的の状態により健康状態が示される工程、を含むアッセイ。
【請求項２】
アッセイ工程および判定工程に先立って、前記ウイルス核酸誘導体および前記ゲノム核酸誘導体の少なくとも一部を増幅させる工程をさらに含む、請求項１に記載のアッセイ。
【請求項３】
対象の健康状態を判定するアッセイであって、
ウイルス核酸およびゲノム核酸を含有する前記対象からのサンプルを、非メチル化シトシンを修飾する試剤により処理し、シトシン数は減少しているが、塩基の総数は対応する非処理ウイルス核酸および非処理ゲノム核酸と実質的に同じであるウイルス核酸誘導体およびゲノム核酸誘導体を形成する工程；
ウイルス特異的核酸分子を得る工程；
ゲノム標的を有する核酸分子を得る工程；
ウイルス特異的核酸分子の存在を試験する工程；および
処理され増幅された前記サンプル中のゲノム標的の状態を判定する工程であって、１種以上の前記ウイルス特異的核酸分子および前記標的状態の検出により前記対象の健康状態が示される工程、を含むアッセイ。
【請求項４】
前記ウイルス特異的核酸分子および前記ゲノム標的を有する核酸分子が、前記ウイルス核酸誘導体および前記ゲノム核酸誘導体を増幅させることにより得られる、請求項３に記載のアッセイ。
【請求項５】
対象の健康状態を判定するアッセイであって、
非メチル化シトシンを修飾する試剤により、前記対象からのサンプルを処理して、核酸誘導体を形成する工程；
所望のウイルス核酸分子を核酸誘導体に増幅させることができるプライマーを提供する工程；
標的ゲノム核酸分子を核酸誘導体に増幅させることができるプライマーを提供する工程；
核酸誘導体に対して増幅反応を実施する工程；および
増幅された所望のウイルス核酸および増幅された標的ゲノム核酸の存在をアッセイする工程であって、１つ以上の増幅産物の有無により対象の健康状態が示される工程、を含むアッセイ。
【請求項６】
前記所望のウイルス特異的核酸分子を含む増幅核酸産物の存在をアッセイする工程を含む請求項５に記載のアッセイであって、前記所望のウイルス特異的核酸分子を検出することにより、前記サンプル中のウイルスの存在が示されるアッセイ。
【請求項７】
前記標的核酸分子を含む増幅核酸産物の存在をアッセイする工程を含む請求項５または６に記載のアッセイであって、前記標的核酸分子を検出することにより、前記サンプル中のゲノムまたは遺伝子の状態が示されるアッセイ。
【請求項８】
前記試剤が、非メチル化シトシンをウラシルに修飾する、請求項１〜７のいずれか一項に記載のアッセイ。
【請求項９】
前記試剤が、重亜硫酸塩、酢酸塩またはクエン酸塩から選択される、請求項８に記載のアッセイ。
【請求項１０】
前記試剤が、重亜硫酸ナトリウムである、請求項９に記載のアッセイ。
【請求項１１】
前記標的ゲノム核酸が、１つの遺伝子もしくは複数の遺伝子またはプロモーターもしくはエンハンサーなどの調節領域、あるいは、ゲノムの任意のコードもしくは非コード領域または静止もしくは移動性領域に特異的である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のアッセイ。
【請求項１２】
前記標的がメチル化特性を有する、請求項１１に記載のアッセイ。
【請求項１３】
前記メチル化特性が、ゲノム核酸のメチル化または非メチル化領域である、請求項１２に記載のアッセイ。
【請求項１４】
前記ウイルスが、癌などの疾患状態に関係する、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のアッセイ。
【請求項１５】
前記ウイルスが、ヒトパピローマウイルス、肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２）、ヒトヘルペスウイルス（ＨＨＶ）、レトロウイルス、ポリオーマウイルス、およびアデノウイルスからなる群から選択される、請求項１４に記載のアッセイ。
【請求項１６】
前記ゲノム標的が、癌などの疾患状態に関係する、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のアッセイ。
【請求項１７】
ゲノム標的が、ＣＤ１４、ＥＮＤＲＢ、ＨＩＣ、ＲＡＲＢ１、ＰＧＲ、ＳＦＲＳ８、ＴＭＳＢ１０、ＡＢＣＧ２、ＭＦＮＧ、ＬＡＭＲ１、ＲＡＧＥ、ＡＢＬ１、ＣＲＢＰ、ＧＰＲ３７、ＨＲＫ、ＲＡＲＡ、ＳＹＫ、ＥＣＥ１、ＭＭＥ、ＴＥＭ、ＮＦ２、ＸＩＡＰＨＳＸ１１、ＲＡＲＲＥＳ１、ＦＬＩ１、ＨＴＬＦ、ＬＤＨＢ、ＲＢ１、ＴＧＤ、ＣＤＫ４、ＭＭＰ１４、ＲＡＢ３２、ＢＡＲＤ１、ＮＦ１、ＬＩＭ２、ＭＭＰ２、ＤＡＢ２、ＢＭＰ６、ＣＤＫＮ１Ｃ、ＤＡＢ２ＩＰ、ＬＭＮＢ１、ＭＭＰ２８、ＨＡＩ２、ＳＯＣＳ１、ＨＩＣ２、ＭＳＨ６、ＲＩＮ２、ＨＭＧＡ１、ＪＵＮ、Ｓ１００Ｐ＊、ＳＲＦ、ＶＤＲ、ＤＫＫ３、ＫＲＡＳ２、ＰＬＡＵ、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ、ＣＤＨ１、ＭＡＣ３０、ＤＤＢ２、ＰＡＸ６、ＡＸＬ、ＥＩＦ４Ａ２、ＳＬＩＴ２、ＲＥＣＫ、ＴＥＲＣ、ＧＡＴＡ５、およびＳＴＡＴ１の領域からなる群より選択される、請求項１６に記載のアッセイ。
【請求項１８】
対象の健康状態を判定するアッセイであって、
ウイルス核酸およびゲノム核酸中の非メチル化シトシンをウラシルに変換してウイルス核酸誘導体およびゲノム核酸誘導体を形成する条件下、前記対象からのサンプルを重亜硫酸塩試薬で処理する工程；
前記サンプルに、前記ウイルス核酸誘導体における所望のウイルス特異的核酸分子を増幅させることができる、前記ウイルス核酸誘導体の領域に結合可能なプライマーを供給する工程；
前記サンプルに、前記ゲノム核酸誘導体における所望の標的ゲノム特異的核酸分子を増幅させることができる、前記ゲノム核酸誘導体の領域に結合可能なプライマーを供給する工程；
処理された前記サンプルに対して増幅反応を実施する工程；および
増幅されたウイルス核酸産物および増幅されたゲノム核酸標的の存在をアッセイする工程であって、前記産物および前記標的のうちの１つまたは双方の検出により前記対象の健康状態が示される工程、を含むアッセイ。
【請求項１９】
ウイルスが存在するサンプルを、前記サンプル中のウイルスのタイプ、サブタイプ、変異体または遺伝子型を判定するために試験する工程をさらに含む、請求項１８に記載のアッセイ。
【請求項２０】
前記増幅が、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または等温増幅により実施される、請求項１８または１９に記載のアッセイ。
【請求項２１】
対象における子宮頸癌の可能性をスクリーニングするアッセイであって、
ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）中の非メチル化シトシンをウラシルに変換してＨＰＶ核酸誘導体およびゲノム核酸誘導体を形成する条件下、前記対象からのサンプルを重亜硫酸塩試薬で処理する工程；
前記ＨＰＶ核酸誘導体の所望のＨＰＶ特異的核酸分子を増幅させることができる、前記ＨＰＶ核酸誘導体の領域に結合可能なプライマーを供給する工程；
前記ゲノム核酸誘導体の所望のゲノム特異的核酸分子を増幅させることができる、前記ゲノム核酸誘導体の領域に結合可能なプライマーを供給する工程；
前記ＨＰＶ核酸誘導体および前記ゲノム核酸誘導体に対して増幅反応を実施する工程；および
増幅されたＨＰＶ核酸産物および増幅されたゲノム核酸産物の存在をアッセイする工程であって、１つまたは双方の産物の検出により前記対象の子宮頚癌状態への進行が示される工程、を含むアッセイ。
【請求項２２】
ＨＰＶが存在するサンプルを、前記サンプル中のＨＰＶのタイプ、サブタイプ、変異体または遺伝子型を決定するために試験する工程をさらに含む、請求項２１に記載のアッセイ。
【請求項２３】
前記サンプルが、綿棒、生検、スミア、パップスミア、表面掻取り、スパチュラ、および体液サンプル、ならびに凍結材料、パラフィンブロック、スライドガラス、法医学採取システム、および永久保存材料などの種々の保存媒体からのサンプルからなる群から選択される、請求項２２に記載のアッセイ。
【請求項１】
対象の健康状態を判定するアッセイであって、
核酸中の非メチル化シトシンを修飾できる試剤により前記対象からのサンプルを処理する工程であって、前記サンプル中のウイルス核酸およびゲノム核酸を処理してウイルス核酸誘導体およびゲノム核酸誘導体を形成する工程；
処理された前記サンプル中の前記ウイルス核酸誘導体の存在をアッセイする工程；および
処理された前記サンプル中の前記ゲノム核酸誘導体におけるゲノム標的の状態を判定する工程であって、１種以上の前記ウイルス核酸誘導体の存在および前記ゲノム標的の状態により健康状態が示される工程、を含むアッセイ。
【請求項２】
アッセイ工程および判定工程に先立って、前記ウイルス核酸誘導体および前記ゲノム核酸誘導体の少なくとも一部を増幅させる工程をさらに含む、請求項１に記載のアッセイ。
【請求項３】
対象の健康状態を判定するアッセイであって、
ウイルス核酸およびゲノム核酸を含有する前記対象からのサンプルを、非メチル化シトシンを修飾する試剤により処理し、シトシン数は減少しているが、塩基の総数は対応する非処理ウイルス核酸および非処理ゲノム核酸と実質的に同じであるウイルス核酸誘導体およびゲノム核酸誘導体を形成する工程；
ウイルス特異的核酸分子を得る工程；
ゲノム標的を有する核酸分子を得る工程；
ウイルス特異的核酸分子の存在を試験する工程；および
処理され増幅された前記サンプル中のゲノム標的の状態を判定する工程であって、１種以上の前記ウイルス特異的核酸分子および前記標的状態の検出により前記対象の健康状態が示される工程、を含むアッセイ。
【請求項４】
前記ウイルス特異的核酸分子および前記ゲノム標的を有する核酸分子が、前記ウイルス核酸誘導体および前記ゲノム核酸誘導体を増幅させることにより得られる、請求項３に記載のアッセイ。
【請求項５】
対象の健康状態を判定するアッセイであって、
非メチル化シトシンを修飾する試剤により、前記対象からのサンプルを処理して、核酸誘導体を形成する工程；
所望のウイルス核酸分子を核酸誘導体に増幅させることができるプライマーを提供する工程；
標的ゲノム核酸分子を核酸誘導体に増幅させることができるプライマーを提供する工程；
核酸誘導体に対して増幅反応を実施する工程；および
増幅された所望のウイルス核酸および増幅された標的ゲノム核酸の存在をアッセイする工程であって、１つ以上の増幅産物の有無により対象の健康状態が示される工程、を含むアッセイ。
【請求項６】
前記所望のウイルス特異的核酸分子を含む増幅核酸産物の存在をアッセイする工程を含む請求項５に記載のアッセイであって、前記所望のウイルス特異的核酸分子を検出することにより、前記サンプル中のウイルスの存在が示されるアッセイ。
【請求項７】
前記標的核酸分子を含む増幅核酸産物の存在をアッセイする工程を含む請求項５または６に記載のアッセイであって、前記標的核酸分子を検出することにより、前記サンプル中のゲノムまたは遺伝子の状態が示されるアッセイ。
【請求項８】
前記試剤が、非メチル化シトシンをウラシルに修飾する、請求項１〜７のいずれか一項に記載のアッセイ。
【請求項９】
前記試剤が、重亜硫酸塩、酢酸塩またはクエン酸塩から選択される、請求項８に記載のアッセイ。
【請求項１０】
前記試剤が、重亜硫酸ナトリウムである、請求項９に記載のアッセイ。
【請求項１１】
前記標的ゲノム核酸が、１つの遺伝子もしくは複数の遺伝子またはプロモーターもしくはエンハンサーなどの調節領域、あるいは、ゲノムの任意のコードもしくは非コード領域または静止もしくは移動性領域に特異的である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のアッセイ。
【請求項１２】
前記標的がメチル化特性を有する、請求項１１に記載のアッセイ。
【請求項１３】
前記メチル化特性が、ゲノム核酸のメチル化または非メチル化領域である、請求項１２に記載のアッセイ。
【請求項１４】
前記ウイルスが、癌などの疾患状態に関係する、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のアッセイ。
【請求項１５】
前記ウイルスが、ヒトパピローマウイルス、肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２）、ヒトヘルペスウイルス（ＨＨＶ）、レトロウイルス、ポリオーマウイルス、およびアデノウイルスからなる群から選択される、請求項１４に記載のアッセイ。
【請求項１６】
前記ゲノム標的が、癌などの疾患状態に関係する、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のアッセイ。
【請求項１７】
ゲノム標的が、ＣＤ１４、ＥＮＤＲＢ、ＨＩＣ、ＲＡＲＢ１、ＰＧＲ、ＳＦＲＳ８、ＴＭＳＢ１０、ＡＢＣＧ２、ＭＦＮＧ、ＬＡＭＲ１、ＲＡＧＥ、ＡＢＬ１、ＣＲＢＰ、ＧＰＲ３７、ＨＲＫ、ＲＡＲＡ、ＳＹＫ、ＥＣＥ１、ＭＭＥ、ＴＥＭ、ＮＦ２、ＸＩＡＰＨＳＸ１１、ＲＡＲＲＥＳ１、ＦＬＩ１、ＨＴＬＦ、ＬＤＨＢ、ＲＢ１、ＴＧＤ、ＣＤＫ４、ＭＭＰ１４、ＲＡＢ３２、ＢＡＲＤ１、ＮＦ１、ＬＩＭ２、ＭＭＰ２、ＤＡＢ２、ＢＭＰ６、ＣＤＫＮ１Ｃ、ＤＡＢ２ＩＰ、ＬＭＮＢ１、ＭＭＰ２８、ＨＡＩ２、ＳＯＣＳ１、ＨＩＣ２、ＭＳＨ６、ＲＩＮ２、ＨＭＧＡ１、ＪＵＮ、Ｓ１００Ｐ＊、ＳＲＦ、ＶＤＲ、ＤＫＫ３、ＫＲＡＳ２、ＰＬＡＵ、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ、ＣＤＨ１、ＭＡＣ３０、ＤＤＢ２、ＰＡＸ６、ＡＸＬ、ＥＩＦ４Ａ２、ＳＬＩＴ２、ＲＥＣＫ、ＴＥＲＣ、ＧＡＴＡ５、およびＳＴＡＴ１の領域からなる群より選択される、請求項１６に記載のアッセイ。
【請求項１８】
対象の健康状態を判定するアッセイであって、
ウイルス核酸およびゲノム核酸中の非メチル化シトシンをウラシルに変換してウイルス核酸誘導体およびゲノム核酸誘導体を形成する条件下、前記対象からのサンプルを重亜硫酸塩試薬で処理する工程；
前記サンプルに、前記ウイルス核酸誘導体における所望のウイルス特異的核酸分子を増幅させることができる、前記ウイルス核酸誘導体の領域に結合可能なプライマーを供給する工程；
前記サンプルに、前記ゲノム核酸誘導体における所望の標的ゲノム特異的核酸分子を増幅させることができる、前記ゲノム核酸誘導体の領域に結合可能なプライマーを供給する工程；
処理された前記サンプルに対して増幅反応を実施する工程；および
増幅されたウイルス核酸産物および増幅されたゲノム核酸標的の存在をアッセイする工程であって、前記産物および前記標的のうちの１つまたは双方の検出により前記対象の健康状態が示される工程、を含むアッセイ。
【請求項１９】
ウイルスが存在するサンプルを、前記サンプル中のウイルスのタイプ、サブタイプ、変異体または遺伝子型を判定するために試験する工程をさらに含む、請求項１８に記載のアッセイ。
【請求項２０】
前記増幅が、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または等温増幅により実施される、請求項１８または１９に記載のアッセイ。
【請求項２１】
対象における子宮頸癌の可能性をスクリーニングするアッセイであって、
ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）中の非メチル化シトシンをウラシルに変換してＨＰＶ核酸誘導体およびゲノム核酸誘導体を形成する条件下、前記対象からのサンプルを重亜硫酸塩試薬で処理する工程；
前記ＨＰＶ核酸誘導体の所望のＨＰＶ特異的核酸分子を増幅させることができる、前記ＨＰＶ核酸誘導体の領域に結合可能なプライマーを供給する工程；
前記ゲノム核酸誘導体の所望のゲノム特異的核酸分子を増幅させることができる、前記ゲノム核酸誘導体の領域に結合可能なプライマーを供給する工程；
前記ＨＰＶ核酸誘導体および前記ゲノム核酸誘導体に対して増幅反応を実施する工程；および
増幅されたＨＰＶ核酸産物および増幅されたゲノム核酸産物の存在をアッセイする工程であって、１つまたは双方の産物の検出により前記対象の子宮頚癌状態への進行が示される工程、を含むアッセイ。
【請求項２２】
ＨＰＶが存在するサンプルを、前記サンプル中のＨＰＶのタイプ、サブタイプ、変異体または遺伝子型を決定するために試験する工程をさらに含む、請求項２１に記載のアッセイ。
【請求項２３】
前記サンプルが、綿棒、生検、スミア、パップスミア、表面掻取り、スパチュラ、および体液サンプル、ならびに凍結材料、パラフィンブロック、スライドガラス、法医学採取システム、および永久保存材料などの種々の保存媒体からのサンプルからなる群から選択される、請求項２２に記載のアッセイ。
【図２】
【図３】
【図４】
【図３】
【図４】
【公表番号】特表２００９−５０７４９８（Ｐ２００９−５０７４９８Ａ）
【公表日】平成２１年２月２６日（２００９．２．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５３０２７５（Ｐ２００８−５３０２７５）
【出願日】平成１８年９月１４日（２００６．９．１４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＡＵ２００６／００１３４９
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０３０８８２
【国際公開日】平成１９年３月２２日（２００７．３．２２）
【出願人】（５０５１８８９０６）ヒューマン ジェネティック シグネチャーズ ピーティーワイ リミテッド (15)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年２月２６日（２００９．２．２６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年９月１４日（２００６．９．１４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＡＵ２００６／００１３４９
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０３０８８２
【国際公開日】平成１９年３月２２日（２００７．３．２２）
【出願人】（５０５１８８９０６）ヒューマン ジェネティック シグネチャーズ ピーティーワイ リミテッド (15)
【Ｆターム（参考）】
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