光合成による水素の生産
水素の生産方法であって、（ｉ）光合成微生物であって、光合成「光」反応経路を介し且つ酸化的リン酸化経路を伴う呼吸電子伝達鎖を介して電子伝達を行うことができると共にヒドロゲナーゼを発現し、酸化的リン酸化経路の調節が崩壊された結果、呼吸電子伝達鎖に沿ったシトクロムオキシダーゼ（複合体ＩＶ）への電子の流れが低減された光合成微生物を提供する段階と、（ｉｉ）該微生物をマイクロオキシック条件及び照射条件下培養する段階と、（ｉｉｉ）発生した水素を回収する段階とを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は水素の生産に関し、より詳細には、天然の水素生産能を有する光合成微生物における水素生産の向上に関する。特に本発明は、ヒドロゲナーゼによって水から水素を生産できるシアノバクテリアや藻類等の光合成微生物に関する。本発明はまた、水素生産を向上させるために、これら微生物の生理機能を操作することに関する。
【背景技術】
【０００２】
未来に向けて、クリーンで持続可能であると共に経済的に実行可能なエネルギー供給の開発は、我々の世代における最も切迫した課題の一つとなっている。産油量は、今後５〜３０年程でピークを迎えると考えられており、経済的に利用しうる石油埋蔵量の大部分は２０５０年までに枯渇するとされている。しかしながら、最近の報告によれば、産油量は既に２０００年がピークであった可能性が示唆されている。水素経済の実現には、クリーンで持続可能であり経済的な水素生産方法が必要となる。現在、水素生産の殆どは非再生可能資源の利用（即ち、天然ガスの水蒸気改質や石炭ガス化、更には原子力を利用した水の電気分解）に依存している。これらのアプローチは、当初は水素経済への移行を押し進めるものと思われたが、生成した水素は、その源である非再生可能エネルギー源より高価で且つ含有エネルギーが低い。更に、化石燃料と原子力の使用は持続性に欠ける。従って、経済的に実行可能である水素生産手段を確立する必要性は明白である。
【０００３】
究極のエネルギー源が太陽エネルギーであることを考えると、光合成生物を利用した水素生産はとりわけ望ましい選択肢である。藻類生育池技術は光電池等の代替技術と比較して安価であると思われる。更に、そして製造時に最初のＣＯ２排出ペナルティーが課されることになる、他の全ての持続可能なエネルギーシステム（バイオマスを除く）とは対照的に、藻類は、その複雑な太陽光集光器を自ら組立てる一方、ＣＯ２を切り離して自らの中に取り込む（sequester）ことができるという利点を有する。従って、炭素取引が実施されるようになることを考えると、藻類の持つ固有の価値は一層注目される。
【０００４】
太陽エネルギーはデンプン、その他タンパク質等の分子の形態の中に捕捉・貯蔵される。続いて、これらの分子が燃料として用いられ、ミトコンドリアでの酸化的リン酸化プロセスによるＡＴＰ生成を駆動する（図１）。ある種の緑藻類は、嫌気的条件下、デンプンに貯蔵されたＨ＋とｅ−からＨ２生産を行う能力を進化させてきた。従って、藻類のバイオリアクタを用いた水素生産が有望視されている。光合成の第一の段階において、光化学系ＩＩ（ＰＳＩＩ）により生物学において知られた酸化反応のうち最も強力な酸化反応が駆動され、Ｈ２Ｏが酸素（Ｏ２）、プロトン（Ｈ＋）そして電子（ｅ−）に分解される（図１）。Ｏ２は大気中へ放出され、地球上の好気的生物の生命を維持する。生じたｅ−は、光合成のｅ−伝達鎖（図２）に沿って移動し、プラストキノン（ＰＱ）を介してＰＳＩＩからシトクロムｂ６ｆ（ｃｙｔｂ６ｆ）へ、次いで光化学系Ｉ（ＰＳＩ）に至り、最終的にはＮＡＤＰＨの生成に用いられる。この並行プロセス（光リン酸化）において、Ｈ＋はチラコイド内腔（図１）に放出されそこでＨ＋勾配が作られて、ＡＴＰ合成酵素によるＡＴＰ生成を駆動する。ＮＡＤＰＨとＡＴＰは続いてデンプンや他の生体分子の生成に用いられる。
【０００５】
ＡＴＰとＮＡＤＰＨ／ＮＡＤＨは、全生細胞にとって必須要素である。ＰＳＩＩを阻害(例えば、暗所におけるインキュベーションにより)すると、葉緑体での光リン酸化によるＡＴＰとＮＡＤＰＨの生成に利用されるＨ＋とｅ−の供給が阻止される。一時的には、ＰＳＩＩの阻害により引き起こされたＡＴＰとＮＡＤＰＨの不足は、ミトコンドリアのｅ−伝達鎖（図１）が媒介する好気呼吸（デンプンやタンパク質、脂質の代謝）により補われ得る。名称から分かるように、酸化的リン酸化にはＯ２が必要とされる。ミトコンドリアの複合体ＩＶの働きにより、Ｏ２はＨ＋とｅ−に結合し、Ｈ２Ｏが生成される（Ｈ２Ｏは、本質的にＨ＋とｅ−のシンク（sink；溜り場）として働く）（図１）。嫌気的条件下では、複合体ＩＶの働きが阻害され、複合体Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ及びシトクロムオキシダーゼ（複合体ＩＶとも呼ばれる）から構成されるｅ−伝達鎖の残部におけるｅ−伝達が阻止される。絶対嫌気的条件下では光合成生物の大部分が死滅する。しかしながら、緑藻類Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ等のごく一部の光合成生物は第３の機構を有し、ＡＴＰとＮＡＤＰＨ生成モードへ切替えることができる（図２）。光を照射した嫌気的条件において、これらの生物は葉緑体でＡＴＰを生成すると同時に、一時的なＨ＋／ｅ−のシンクとしてＨ２Ｏの代わりにＨ２を生成する。このプロセスには、葉緑体のストロマに存在するヒドロゲナーゼＨｙｄＡが関与している（フロリン（Florin）ら、２００１、ハッペ（Happe）とカミンスキ（Kaminski）、２００２）。ＨｙｄＡの転写及び活性は、Ｏ２によって強力に阻害される（ジラルディ（Ghirardi）ら、１９９７）。酸素感受性は、嫌気的条件になった時、そのことをＨｙｄＡに知らせる分子制御スイッチとして働くと考えられる。
【０００６】
明暗の遷移状態の光照射下におけるＡＴＰとＮＡＤＰＨ生成の最適化のため、植物や藻類はＬＨＣ状態遷移と呼ばれるレドックス制御調節機構（redox-controlled regulation mechanism）を発達させた。このプロセスは通常、集光アンテナ（ＬＨＣＩとＬＨＣＩＩ）のサイズ調節、特にこれら２個の光化学系間にＬｈｃｂタンパク質を往復させることによって、ＰＳＩとＰＳＩＩのターノーバー速度のバランスをとる（状態１：大きなＰＳＩＩアンテナ；状態２：大きなＰＳＩアンテナ）。緑藻Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉにおいては、このプロセスは線状から環状への光合成電子伝達への切替えをもたらし、その結果、ＰＳＩの還元側で、ｅ−に関しＦｅ−ヒドロゲナーゼＨｙｄＡと競合する。嫌気的条件下で状態１において阻害を受けた細胞は、Ｃｙｔｂ６ｆに電子を送り返す環状電子伝達を行わない。こうした条件では、Ｆｅ−ヒドロゲナーゼＨｙｄＡはもはやＣｙｔｂ６ｆ媒介の環状電子伝達と競合してＰＳＩ由来の電子を獲得する必要がない。
【０００７】
藻類のＨ２生産についての最初の報告は、１９３０年代にまで遡る（ステファンソン（Stephenson）とスティックランド（Stickland）、１９３１）。光照射下でＯ２による阻害にきわめて敏感な反応により、一定の緑藻類とシアノバクテリアがＨ２ガスを生産できることが発見された。光合成微生物を利用しＨ２ＯからＨ２を持続的に生産させることは極めて興味深いことであったが、２０００年になってメリス（Melis）とその共同研究者らがこの阻害を克服する方法について初めて報告した。（メリス（Melis）、２０００、米国特許出願第２００１／００５３４３号）。メリス（Melis）が記載するプロセスでは、Ｏ２を生成するＨ２Ｏスプリット反応（ＰＳＩＩにより触媒される）を、Ｏ２感受性Ｈ２生産反応（葉緑体ヒドロゲナーゼ（ＨｙｄＡ）によって触媒される）から一時的に分離することにより阻害を解消した。この分離は、まず、硫黄存在下でＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉを培養して内在性基質の貯蔵庫を構築し、次いで硫黄非存在下において培養することにより達成された。硫黄は、ＰＳＩＩの反応中心を構成するＤ１タンパク質のｄｅ ｎｏｖｏ合成に必要とされ、もちろん、その他多数の細胞構成有機成分の合成にも必要である。Ｄ１タンパク質の半減期は約３０分であり、最適でない条件では自身が駆動する強力な酸化反応により損傷を受ける。硫黄存在下では、活性型ＰＳＩＩが高レベルに維持され、Ｈ２ＯはＨ＋、ｅ−及びＯ２に分解される。硫黄欠乏培地での硫黄レベルが下がると、ＨｙｄＡによりＨ＋とｅ−は再結合されてＨ２を生産しＯ２によるヒドロゲナーゼの阻害が解消される。これにより初めて、野生型（ＷＴ）Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｔｉｉを用いた長期に亘るＨ２生産が容易に行えるようになった。
【０００８】
しかしながら、メリス（Melis）のプロセスは、実用面で大きな制約がある。実際の水素ガス蓄積率は細胞の有する光合成能のせいぜい１５〜２０％（メリス（Melis）とハッペ（Happe）、２００１）であり、またＳ欠乏下での藻類の水素生産は無期限に継続して行えないという本質的な制限がある。Ｓ除去から約４０〜７０時間後には収量が横ばいとなり減少し始め、Ｓ除去から約１００時間後には、各種の内在性基質を補充するために、藻類は通常の光合成状態に戻る必要がある。
【０００９】
国際公報ＷＯ０３／０６７２１３号には、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉを用いる水素生産プロセスが記載されており、これによると、この藻にアンチセンス配列を挿入することで遺伝的変更を加え、サルフェート透過酵素ＣｒｃｐＳｕｌＰの発現をダウンレギュレーションさせている。これは、水素生産を誘導するために必要とされる、含硫黄栄養素の成長培地からの物理的除去を不要とするもので、従来の硫黄除去技法を廃れさせたといわれている。この技法により細胞の硫黄取込み量を減少させると、葉緑体の主要タンパク質（ルビスコやＤ１、ＬＨＣＩＩ等）のレベルを実質的に低下させるだけでなく、それ以外のタンパク質の生合成に使用される硫黄も細胞から奪い取ってしまう。
【００１０】
結果として、持続性があり且つ効率のよい光合成利用水素生産プロセスであって、更に硫黄除去を解消できるプロセスを見極める必要がある。
【発明の概要】
【００１１】
本発明は、光照射下におけるミトコンドリアの酸化的リン酸化経路の調節の崩壊によって、葉緑体中のデンプンレベルの上昇、光合成循環的電子伝達の阻害、ＰＳＩＩによる酸素生産の低下という影響を細胞に与えるものの、ＰＳＩ及びＦｄへの線形電子伝達は許容されるため、ＰＳＩからの電子を受け入れるヒドロゲナーゼ（ＨｙｄＡ）は作用できると共に本来的な酸素阻害が低減するという驚くべき観察結果に基づくものである。
【００１２】
従って、本発明はその第１の様相において、水素の生産方法であって、
（ｉ）光合成微生物であって、光合成「光」反応を介し且つ酸化的リン酸化経路を伴う呼吸電子伝達鎖を介して電子伝達を行うことができると共にヒドロゲナーゼを発現し、酸化的リン酸化経路の調節が崩壊された結果、呼吸電子伝達鎖に沿ったシトクロムオキシダーゼ（複合体ＩＶ）への電子の流れが低減された光合成微生物を提供する段階と、
（ｉｉ）該微生物をマイクロオキシック条件及び照射条件下培養する段階と、
（ｉｉｉ）発生した水素を回収する段階とを含む方法を提供する。
【００１３】
種々の生物が、この方法に使用するのに生理学的に適している。とりわけ、水素生産の間接的基質として水を用いることができヒドロゲナーゼを含有する光合成微生物が用いられる。この例としては、シアノバクテリアや藻類、特に緑藻類だけでなく青緑藻類（例えばＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）や赤藻類、特にＣｈｌｏｒｏｃｏｃｃａｌｅｓやＶｏｌｖｏｃａｌｅｓ、とりわけＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｓｐｐ．（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ＭＧＡ１６１等）、Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ ｓｐｐ.（Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ ｏｂｌｉｑｕｕｓ等）、Ｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｍ ｓｐｐ．（Ｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｍ ｌｉｔｔｏｒａｌｅ等）、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｓｐｐ．（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｆｕｓｃａ等）、Ｐｌａｔｙｍｏｎａｓ ｓｐｐ．（Ｐｌａｔｙｍｏｎａｓ ｓｕｂｃｏｒｄｉｓｉｆｏｒｍｉｓ等）、Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ ｓｐｐ．（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ ｖａｇｉｎａｌｉｓ等）の藻類が挙げられる。中でも藻類Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉは、生物の遺伝操作のためのプロセスが十分開発されておりその一倍体ゲノムは既に配列解析されているため、特に好ましい。
【００１４】
酸化的リン酸化を崩壊させる任意の適切な手段を用いることができる。一実施形態においては、微生物が、ミトコンドリアの酸化的リン酸化経路の調節を崩壊させる一手段である。この場合、ｍｏｃ１ノックアウトの場合と同様、酸化的リン酸化を調節する核コードミトコンドリア転写終結因子の活性を低下させるかなくすることにより崩壊を行う。このような高い水素生産能を有する変異体はＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ Ｓｔｍ６である。Ｓｔｍ６は、試験条件下においては野生株の３．５〜７倍の速度で水素を生産することが分かった。
【００１５】
光合成電子輸送鎖からのＡＴＰシンターゼのアンカップラーを添加することにより、水素生産速度を更に上昇させることができる。アンカップラーの例としては、カルボニルシアニドｍ−クロロフェニルヒドラゾン（ＣＣＣＰ）、１，３−ジクロロ−ヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、塩化アンモニウム、ベンツリシジン（Venturicidin）、カルボニルシアニド ｐ−トリフルオロメトキシフェニルヒドラゾン（ＦＣＣＰ）、２，４−ジニトロフェノール、グラミシジン（Gramicidin）、ニゲリシン（Nigericin）が挙げられ、これらを用いることにより野生株の約１５倍の速度が達成される。このようなアンカップラーは、基本的にチラコイド内腔からストロマへのＨ＋の流れを増加させ、ストロマにおいてＨ＋はＨｙｄＡの基質として利用可能となる。
【００１６】
外部栄養源の存在下において好気性条件或いは嫌気性条件下、バイオマスを増大（expand）させるため、上述の微生物を照射条件下培養することができる。一実施形態においては、廃棄物流をこの培養の炭素源として用いると廃棄物流から炭素が除去されるため、これは例えば廃棄物流を処理して有機汚染物質を除去するのに有用であろう。更に、バイオマスを増大させるために、微生物を好気性条件下且つ照射条件下培養後、次の各段階、即ち、
ｉ）増大されたバイオマスをガス化する段階と、
ｉｉ）生産された水素を回収する段階とを行うことができる。
【００１７】
これは、嫌気性条件下で照射を行った場合に培養物から水素を直接回収する代替法を提供する。
【００１８】
本発明はその更なる様相において、光合成微生物であって、光合成「光」反応経路を介し且つ酸化的リン酸化経路を伴う呼吸電子伝達鎖を介して電子伝達を行うことができると共にヒドロゲナーゼを発現し、酸化的リン酸化経路の調節が崩壊された結果、呼吸電子伝達鎖に沿ったシトクロムオキシダーゼ（複合体ＩＶ）への電子の流れが低減された光合成微生物を提供する。
【００１９】
一実施形態においては、微生物は、藻類、例えばＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ、特にＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ Ｓｔｍ６（２００３年７月１日にＣＣＡＰ受託番号１１／１２９で藻類及び原生動物培養保存機関（Culture Collection of Algae and Protozoa）（ＣＣＡＰ）に寄託された）のＭｏｃ１ノックアウトである。
【００２０】
本明細書中では従来技術に係る多くの刊行物に言及したが、これらの文献のいずれかがオーストラリアや他の国において当分野の共通一般知識の一部を構成しているということを自認するものではないことは明確に理解されよう。
【００２１】
本明細書においては、「含む(comprising, comprises)」という単語は「含み、これらに限定されるものではない」という意味であることは明瞭に理解されるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
以下、実施例及び図面により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００２３】
光合成のレドックス制御調節にとって重要な細胞成分を特定するため、スクリーニングによって状態遷移が混乱した突然変異体を見出すというアプローチをとった。これは、光化学系Ｉと光化学系ＩＩの間の電子の流れ（ボナベンツラ（Bonaventura）とマイエルス（Myers）、１９６９；ムラタ（Murata）、１９６９）に関与する２種の光合成反応中心の励起の平衡を維持するレドックス制御機構である。プラストキノンプール（ＰＳＩＩとＰＳＩをつなぐ光合成電子伝達鎖の一成分）が極端に低減されると、移動性集光アンテナがＰＳＩＩから離れ、続いてレドックス活性化リン酸化（redox-activated phosphorylation）が起こってＰＳＩに入り、ＰＳＩの励起を増大させＰＱプールをより酸化する（いわゆる、状態２に入る）。ＰＱがより酸化されると逆のプロセスが起こる（状態１を達成するため）（アレン（Allen）ら、１９８１；ホートン（Horton）ら、１９８１）。ラピッドクロロフィル−蛍光ベーススクリーニング（rapid chlorophyll-fluorescence based screen）を用いて、状態遷移（状態１と状態２の内部転換）を阻害（クルース（Kruse）ら、１９９９；フレイヒマン（Fleichmann）ら、１９９９）したモデル生物である緑藻Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉのコロニーの同定を行い、状態遷移に重要な遺伝子を同定した。驚くべきことに、遺伝子産物は核にコードされたタンパク質のうち葉緑体ではなくミトコンドリアを標的とするタンパク質であることが分かり、ミトコンドリアの遺伝子発現の調節に関わる。
【００２４】
本明細書において「単離された(isolated)」とは、精製されたポリヌクレオチド分子或いはポリペプチド分子を意味する。本明細書に用いる場合、「精製された(purified)」とは、ネイティブな状態において通常結合している、実質的に全ての他の分子から分離されたポリヌクレオチド分子或いはポリペプチド分子を意味する。調製物の大部分を占める種が実質的に精製された分子であることがより好ましい。実質的に精製された分子とは、天然混合物の状態で（in the natural mixture）存在する他の分子種（溶媒を除く）の６０％超が除去されたものであり、好ましくは７５％除去、より好ましくは９０％除去、更に９５％除去されたものが最も好ましい。本明細書において「単離された」とはまた、天然のポリヌクレオチドに通常隣接結合（flank）している核酸を分離したポリヌクレオチド分子も意味する。よって、例えば組換え技法を用いた結果、通常は結合対象とならない調節配列或いはコード配列に結合した（fused）ポリヌクレオチドは、本明細書では単離されたとみなされる。このような分子は、例えば宿主細胞の染色体や核酸溶液中に存在していても単離されたとみなされる。本明細書において「単離された」と「精製された」という用語は、ネイティブな状態で存在する分子を包含することを意図したものではない。
【００２５】
本明細書において「野生型」とは、現在開示されている一以上の転写因子をノックアウト或いは過剰発現させる遺伝的変更を受けていない微生物を意味する。野生型生物を対照として用い、転写機能を改変した生物或いは異所的（ectopically）発現を行わせた生物（例えば、ノックアウト或いは過剰発現させた生物）と比較して、発現レベル、特性変化の程度及びその性質について知ることができる。
【００２６】
本明細書中の「配列同一性(sequence identity)」とは、最適整合された２種類のポリヌクレオチド配列或いはぺプチド配列が、各成分（例えば、ヌクレオチド或いはアミノ酸）の並びのウィンドウ（window）を通して一致する程度を意味する。試験配列と基準配列の位置あわせしたセグメントについて「同一フラクション(identity fraction)」とは、位置合わせした２つの配列が共に有する一致成分の個数を、基準配列セグメント（即ち、全基準配列或いは基準配列のより少ない特定部分）中の成分の全数によって除した数である。「一致率」とは、同一フラクション×１００である。周知の多数の方法を用いて、各配列の比較を行い一致率を求めることができる。このような方法としては例えば、数学的アルゴリズムを用いた方法（配列分析プログラムＢＬＡＳＴスイートのアルゴリズム等）を挙げることができる。
【００２７】
本明細書中、調節の「抑制(suppression)」或いは「破壊（disruption）」とは、調節タンパク質の活性低下を意味し、こうした活性の低下は各種機構、例えばアンチセンス、突然変異によるノックアウト或いはＲＮＡｉ等によって引き起こすことができる。アンチセンスＲＮＡによる場合、タンパク質の発現レベルが低下し、結果的にタンパク質活性が野生型の活性レベルよりも低いものとなる。タンパク質コード遺伝子の突然変異の場合、タンパク質の発現レベルを低下させる及び／又は発現したタンパク質の機能を妨害することによって、タンパク質の活性を低下させることができる。
【００２８】
本明細書中において「ポリペプチド」は、一方のアミノ酸のカルボキシル基と他方のアミノ酸のアミノ基がアミド結合によって共有結合的に結合された各アミノ酸残基からなる非分岐状鎖を意味する。ポリペプチドという用語は、タンパク質のフラグメントを包含し得ると共に、タンパク質全体（即ち、特定の遺伝子にコードされた機能タンパク質）を包含し得る。更に「タンパク質」は、一以上のポリペプチド鎖からなる分子をも含む。従って、本発明においてポリペプチドは、複数のポリペプチド鎖を有する機能性オリゴタンパク質の一部分のみならず、全遺伝子産物を構成することもできる。
【００２９】
本明細書に用いられる用語「ポリヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド配列」、「核酸配列」、「核酸フラグメント」及び「単離された核酸フラグメント」は相互変換可能である。これらの用語はヌクレオチド配列等を包含する。ポリヌクレオチドは、ＲＮＡ或いはＤＮＡの１本鎖或いは２本鎖のポリマーであり得、合成、非天然或いは改変したヌクレオチド塩基を含んでいてもよい。ＤＮＡポリマーの形態のポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ或いはそれらの混合物の一以上のセグメントからなり得る。各ヌクレオチド（通常、５’−１リン酸の形態）は、次の一文字表記によって表される。即ち、ＲＮＡ或いはＤＮＡの各場合において、「アデニル酸」或いは「デオキシアデニル酸」は「Ａ」、「シチジル酸」或いは「デオキシシチジル酸」は「Ｃ」、「グアニル酸」或いは「デオキシグアニル酸」は「Ｇ」、「ウリジル酸」は「Ｕ」、「デオキシチミジル酸」は「Ｔ」、プリン塩基（Ａ或いはＧ）は「Ｒ」、ピリミジン塩基（Ｃ或いはＴ）は「Ｙ」、Ｇ或いはＴは「Ｋ」、Ａ、Ｃ或いはＴは「Ｈ」、イノシンは「Ｉ」、そして、任意の一ヌクレオチドは「Ｎ」で表記する。
【００３０】
本明細書に使用する「機能的に等価であるところのサブフラグメント」と「機能的に等価であるサブフラグメント」は相互変換可能である。これらの用語は、遺伝子発現を改変する能力或いは一定の表現型を提供する能力を保持している単離された核酸フラグメントの一部分或いはそれに続く部分（subsequence）を意味し、該フラグメント或いはサブフラグメントが活性な酵素をコードしているかどうかは関係がない。例えば、該フラグメント或いは該サブフラグメントをキメラ遺伝子の設計に用いて、藻類を形質転換して所望の表現型をもたらすことができる。キメラ遺伝子は核酸フラグメント或いはそのサブフラグメントが活性な酵素をコードしているかどうかに関係なく、これと植物のプロモーター配列に対してセンス或いはアンチセンス方向に結合することによって機能抑制を行うように設計することができる。
【００３１】
本明細書に使用される「相同」、「相同な」、「実質的に同様」及び「実質的に対応している」は相互に置換え可能である。これらは、一以上のヌクレオチド塩基が異なっていても、各核酸フラグメントの有する遺伝子発現媒介能力或いは一定の表現型を提供する能力が変わらない核酸フラグメントを意味する。これらの用語はまた、本発明における核酸フラグメントの変更を意味する。これらの変更としては例えば、変更の結果生じた核酸フラグメントの機能的特性が未変更の元のフラグメントに対して実質的に変わらない一以上のヌクレオチドの欠失或いは挿入を挙げることができる。従って、本発明は例として用いた特定の配列以外の、当業者であれば想到するであろう配列も包含する。
【００３２】
更に、当業者には容易に理解されることであるが、中程度にストリンジェントな条件（例えば、０.５×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳ、６０℃）で、本明細書に例示した配列或いは本明細書に開示のヌクレオチド配列の一部とハイブリダイズし得れば、実質的に同様な核酸配列として本発明に包含され、これは本明細書に開示の核酸配列の任意のものと機能的に等価である。スクリーニング対象である或る程度似たフラグメント（例えば、遠縁生物由来の相同な配列）や高度に似たフラグメント（例えば、近縁生物からの機能的酵素の複製物を生じさせる遺伝子）等に応じて、ストリンジェントな条件を調整できる。ストリンジェントな条件はハイブリダイゼーション後の洗浄によって決まる。設定条件としては、始めに６×ＳＳＣ、０.５％ＳＤＳを用い室温で１５分間洗浄を行い、次いで２×ＳＳＣ、０.５％ＳＤＳを用い４５℃で３０分間行って、更に０.２×ＳＳＣ、０.５％ＳＤＳを用い５０℃で３０分間の洗浄を２回行う一連の洗浄を含む条件が好ましい。ストリンジェントな条件のより好ましい設定としては、より高温で洗浄を行うものであり、上述の洗浄の最終２回（３０分間、０.２×ＳＳＣ、０.５％ＳＤＳ使用）の温度を６０℃に上げる（それ以外は同様）。よりストリンジェントな条件の別の好ましい設定としては、最終２回の洗浄を０.１×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳを用いて６５℃で行う。
【００３３】
「遺伝子」とは、特定のタンパク質を発現する核酸フラグメントを意味し、コード配列前方に位置する調節配列（５’非コード配列）及び後方に位置する調節配列（３’非コード配列）を含む。「ネイティブ遺伝子」とは、天然の遺伝子で自身の調節配列を有する遺伝子を意味する。「キメラ遺伝子」とは、ネイティブ遺伝子ではない任意の遺伝子を意味し、天然には共存しない調節配列とコード配列を含む。従って、キメラ遺伝子は異なるソース由来の調節配列とコード配列を含んでいてもよいし、同一ソース由来であるが、天然のものとは異なる配置となっている調節配列とコード配列を含んでいてもよい。
【００３４】
「コード配列」とは、特定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を意味する。「調節配列」とは、コード配列上流（５’非コード配列）、コード配列内部或いはコード配列下流（３’非コード配列）に位置するヌクレオチド配列を意味し、これらの配列は、転写、ＲＮＡプロセシング、ＲＮＡの安定性、或いは関連のあるコード配列の翻訳に影響を及ぼす。
【００３５】
調節配列としては、プロモーターや翻訳リーダー配列、イントロン、ポリアデニル酸認識配列(polyadenylation recognition sequences)が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００３６】
「プロモーター」とは、コード配列或いは機能的ＲＮＡの発現を調節できるＤＮＡ配列を意味する。プロモーター配列は上流側近傍のエレメントと上流側のより遠方に位置するエレメントからなる。後者のエレメントはエンハンサーと呼ばれることが多い。従って、「エンハンサー」とは、プロモーター活性を刺激することができるＤＮＡ配列であり、エンハンサーはプロモーターの固有のエレメント或いは挿入された異種エレメントであり、プロモーターのレベル或いは組織特異性を向上させ得る。プロモーター全体がネイティブ遺伝子由来でもよいし、天然の各種プロモーターに由来する各種エレメントから構成されていてもよいし、或いは合成ＤＮＡセグメントを含んでいてもよい。各種プロモーターは、各種組織又は細胞型において、或いは各種発生段階で、或いは各種環境条件に応じて、遺伝子発現を指令し得ることは当業者に知られたところである。更に、調節配列としての正確な区分が完全には定義されていない場合が多いため、数種のバリエーションを有するＤＮＡフラグメントが同一のプロモーター活性を有することもあることが認識される。多くの細胞型においてよく(at most times)遺伝子を発現させるプロモーターは通常、「構成プロモーター（constitutive promoters）」と呼ばれる。
【００３７】
「翻訳リーダー配列」とは、遺伝子のプロモーター配列とコード配列の間に位置するポリヌクレオチド配列を意味する。翻訳リーダー配列は充分にプロセシングされたｍＲＮＡの翻訳開始配列上流に位置する。翻訳リーダー配列はｍＲＮＡの一次転写産物のプロセシング、ｍＲＮＡの安定性或いは翻訳効率に影響を与える。翻訳リーダー配列の例としては次の記載がある：ターナー（Turner），Ｒ．とフォスター（Foster），Ｇ．Ｄ．（１９９５）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３：２２５〜２３６。
【００３８】
「３’非コード配列」とは、コード配列下流に位置するＤＮＡ配列を意味し、ポリアデニル酸認識配列、及びｍＲＮＡプロセシング或いは遺伝子発現に影響を及ぼす調節シグナルをコードするその他の配列を含む。ポリアデニル酸シグナルは通常、ｍＲＮＡ前駆体３’末端へのポリアデニル酸トラクト（tracts）の付加に影響を及ぼすことを特徴とする。各種３’非コード配列の使用については、インゲルブレヒト（Ingelbrecht），Ｉ．Ｌ．ら（１９８９）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ、１：６７１〜６８０に例示されている。
【００３９】
「ＲＮＡ転写物」とは、ＲＮＡポリメラーゼの触媒作用によるＤＮＡ配列の転写によって生じた産物を意味する。ＲＮＡ転写物が対応のＤＮＡ配列と完全に相補的なコピーである場合、これは一次転写物と呼ばれる。ＲＮＡ転写物が、転写後のプロセシングを受けた一次転写物に由来するＲＮＡ配列である場合、これを成熟ＲＮＡと呼ぶ。「メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）」とは、イントロンが除かれ、細胞でタンパク質に翻訳され得るＲＮＡを意味する。「ｃＤＮＡ」とは、ｍＲＮＡと相補的で、ｍＲＮＡテンプレートから逆転写酵素により合成したＤＮＡを意味する。ｃＤＮＡは１本鎖であることもできるし、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノーフラグメントにより２本鎖とすることもできる。「センス」ＲＮＡとは、ｍＲＮＡを含み、細胞内或いはｉｎ ｖｉｔｒｏでタンパク質に翻訳され得るＲＮＡ転写物を意味する。「アンチセンスＲＮＡ」とは、標的とする一次転写物或いはｍＲＮＡの全部或いは一部に相補的であり、標的遺伝子の発現を阻害するＲＮＡ転写物を意味する（米国特許第５１０７０６５号）。アンチセンスＲＮＡは、特定の遺伝子転写物の任意の部分（即ち、５’非コード配列、３’非コード配列、イントロン或いはコード配列）と相補的であってもよい。「機能的ＲＮＡ」とは、アンチセンスＲＮＡ、リボザイムＲＮＡ、或いは細胞内プロセスに影響を及ぼすが翻訳されないことがあるその他のＲＮＡを意味する。本明細書中、ｍＲＮＡ転写物について使用される用語「相補」と「逆相補」は相互変換可能であり、その情報のアンチセンスＲＮＡを示す。
【００４０】
「操作可能に結合(operably linked)」とは、単一の核酸フラグメントに核酸配列を結合させ、一方の機能を他方により調節させる結合を意味する。例えば、プロモーターがコード配列に結合しそのコード配列の発現を調節できる場合（即ち、該コード配列はプロモーターによる転写制御を受けている）、プロモーターはコード配列と操作可能に結合している。コード配列は調節配列に、センス方向或いはアンチセンス方向に操作可能に結合させることができる。別の例では、本発明における相補的なＲＮＡ領域は、標的のｍＲＮＡの５’、標的のｍＲＮＡの３’或いは標的のｍＲＮＡ内部に操作可能に結合させることができる（直接或いは間接的に）。ここで、最初の相補性領域が５’である場合、その相補物は標的とするｍＲＮＡの３’である。
【００４１】
本明細書中で用いる標準的な組換えＤＮＡ技法と分子クローニング技法は、本技術分野において周知であり、サムロック（Sambrook），Ｊ．、フリッチ（Fritsch），Ｅ．Ｆ．及びマニアティス（Maniatis），Ｔ．によるＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，１９８９に詳細な記載がある。形質転換法については当業者に周知であり、次に説明する。
【００４２】
「組換え」とは、異なる方法で分離された２種類の配列セグメントの人工的な組合せ（例えば、化学合成による、或いは単離した核酸セグメントの遺伝子工学技法を用いた操作による）を意味する。
【００４３】
本明細書中に使用する用語「組換え構築物」、「発現構築物」、「キメラ構築物」、「構築物」及び「組換えＤＮＡ構築物」は相互変換可能である。組換え構築物は核酸フラグメントの人工的な組合せ（例えば、天然にはない調節配列とコード配列の組合せ）を含む。例えば、キメラ構築物は異なるソース由来の調節配列とコード配列を含んでいてもよいし、同一ソース由来の調節配列とコード配列を含んでいてもよいが、天然のものとは異なる配置となっている。このような構築物はそれ自体で使用することもできるし、ベクターと共に用いることもできる。当業者に周知のように、ベクターを使用する場合には、宿主細胞を形質転換させる方法に応じてベクターを選択する。例えば、プラスミドベクターを用いることができる。宿主細胞の形質転換を首尾よく行い、本発明における単離した核酸フラグメントを含む宿主細胞を選択し増殖させるために、当業者はベクターに存在させるべき遺伝的エレメントを熟知している。当業者はまた、個々の独立した形質転換イベントに応じて、発現レベルや発現パターンが異なるということを認識し（ジョーンズ（Jones）ら（１９８５）ＥＭＢＯ Ｊ．４：２４１１〜２４１８；デ アルメイダ（De Almeida）ら（１９８９）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２１８：７８〜８６）、これにより、所望の発現レベル及び発現パターンを示す株を得るためには多数のイベントをスクリーニングする必要があることを認識する。このようなスクリーニングは、ＤＮＡを対象としたサザン分析、ｍＲＮＡの発現を対象としたノザン分析、タンパク質発現を対象としたイムノブロッティング分析、或いは表現型分析等を用いて行うことができる。本明細書中において「発現」とは、機能的な最終産物（ｍＲＮＡ或いはタンパク質（前駆体或いは成熟体）等）の産生を意味する。
【００４４】
「成熟した」タンパク質とは、翻訳後にプロセシングされたポリペプチドを意味する。即ち、一次翻訳産物に存在するプレペプチド或いはプロぺプチドが除去されたタンパク質である。「前駆体」タンパク質とは、ｍＲＮＡが翻訳された一次産物を意味する。即ち、プレペプチドとプロペプチドが存在している状態のタンパク質である。プレペプチド及びプロペプチドは細胞内局在化シグナルであり得るが、これらに限定されない。
【００４５】
「安定性形質転換」とは、宿主生物のゲノム（核ゲノムとオルガネラゲノムのいずれも含む）への核酸フラグメントの伝達を意味し、これにより遺伝学的に安定な形質を獲得する。一方、「一過性形質転換」とは、宿主生物の核或いはＤＮＡ含有オルガネラへの核酸の伝達を意味し、組込まれずに遺伝子発現が行われ、従って安定な遺伝形質の獲得には至らない。核酸フラグメントを含有する形質転換された宿主生物は「トランスジェニック」生物と呼ばれる。
【００４６】
「アンチセンス阻害」とは、標的タンパク質の発現を抑制することが可能なアンチセンスＲＮＡ転写物の産生を意味する。「共抑制」とは、同一或いは実質的に同様な外来遺伝子或いは内在性遺伝子（endogenous genes）の発現を抑制することが可能なセンスＲＮＡ転写物の産生を意味する（米国特許第５２３１０２０号）。植物においては、内在性ｍＲＮＡと相同性を有する核酸配列（センス方向）の過剰発現に着目して、既に共抑制構築物が設計されており、過剰発現した配列と相同性を有するＲＮＡがいずれも減少した（バウチェレト（Vaucheret）ら（１９９８）Ｐｌａｎｔ Ｊ. １６：６５１〜６５９；グラ（Gura）（２０００）Ｎａｔｕｒｅ ４０４：８０４〜８０８参照）。この現象の全体的な効率は低く、ＲＮＡ減少の程度は様々に変化する。最近の研究によれば、ｍＲＮＡコード配列の全部或いは一部を相補的方向に組入れた「ヘアピン」構造（発現ＲＮＡが「ステムループ」構造になり得る）の使用についての記載がある。これにより、再生した（recovered）トランスジェニック植物における共抑制の頻度が上昇する。ヘアピン構造には、ヘアピンのステム或いはループを形成する標的ＲＮＡが含まれていてもよい。他に、植物ウィルスの配列を用いて、近傍のｍＲＮＡコード配列を抑制（すなわち「サイレンシング」）させる例も記載されている（国際公開ＷＯ９８／３６０８３）。いずれの共抑制現象もその機構については未だ明らかでないとはいえ、遺伝学的証拠によりこの複雑な現象が解明されつつある（エルマヤン（Elmayan）ら（１９９８）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １０：１７４７〜１７５７）。
【００４７】
抑制に使用するポリヌクレオチド配列は、抑制対象となる遺伝子中のポリヌクレオチド配列と必ずしも１００％相補的である必要はない。抑制対象のポリヌクレオチドと少なくとも７５％同一であるポリヌクレオチドは、所望の標的物に対し効果的な抑制作用を示した。該ポリヌクレオチドは所望の標的物に対し、少なくとも８０％同一、好ましくは少なくとも９０％同一、より好ましくは少なくとも９５％同一である必要があり、１００％同一であってもよい。
【００４８】
一実施形態においては、アンチセンス分子を用いて核遺伝子の発現のダウンレギュレーションを行い、ｍｏｃ１等の細胞のミトコンドリア活性を調節する。アンチセンス試薬としては、アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）やネイティブな核酸に化学修飾を施し特別に合成したＯＤＮ、ＲＮＡのようなアンチセンス分子を発現する核酸構築物を挙げることができる。アンチセンス配列は標的遺伝子のｍＲＮＡと相補的であり、標的とする遺伝子産物の発現を抑制する。アンチセンス分子は種々の機構を介して、例えば、翻訳に用いられるｍＲＮＡ量を低減させたり、ＲＮＡｓｅ Ｈを活性化させたり、或いは立体障害をもたらして遺伝子発現を阻害する。各アンチセンス分子は単独或いは組み合わせて用いることができ、組合せた場合は２以上の異なる配列を含んでいてよい。
【００４９】
アンチセンス分子は、標的とする遺伝子配列の全部或いは一部を好適なベクターに組込んで発現させ生成できる。ベクター中、転写開始はアンチセンス鎖がＲＮＡ分子として生成されるように方向付ける。或いは、アンチセンス分子は合成オリゴヌクレオチドである。配列長としては１０〜３０００ヌクレオチドが好ましく、より好ましくは１００〜２０００ヌクレオチド、更に好ましくは６００〜１２００ヌクレオチド、最も好ましくは８００〜１０００ヌクレオチドである。この長さは、阻害効率や特異性（例えば、交差反応が生じない）等に応じて決定する。しかしながら、７〜８塩基長の短オリゴヌクレオチドが遺伝子発現を強力且つ選択的に阻害する例も知られている（ワグナー（Wagner）ら（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：８４０〜８４４参照）。
【００５０】
内在性センス鎖ｍＲＮＡ配列の領域のうち、既述遺伝子配列（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＦ５３１４２のｍｏｃ１の遺伝子配列）に基づいて作製したアンチセンス配列と相補的である特定の一領域或いは複数の領域が選択される。オリゴヌクレオチドの特定配列は、いくつかの候補配列についてアッセイを行い、ｉｎ ｖｉｖｏモデルにおける標的遺伝子の発現阻害を調べる経験的方法を用いて選択することができる。各配列は組み合わせて用いてもよく、この場合アンチセンス配列と相補性を有するｍＲＮＡ配列の数領域が選ばれる。
【００５１】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは本技術分野において公知の方法により化学的に合成できる（ワグナー（Wagner）ら（１９９３）上掲、参照）。細胞内安定性と結合親和性を向上させるために、ネイティブなホスホジエステル構造に化学修飾を施したオリゴヌクレオチドが好ましい。
【００５２】
本発明の核酸組成物は、標的とするポリペプチドの全部或いは一部をコードし得る。ＤＮＡ配列の２本鎖或いは１本鎖フラグメントは、従来法（制限酵素による消化、ＰＣＲ増幅法等）に従って化学的にオリゴヌクレオチドを合成することにより得られ得る。大部分の場合、ＤＮＡフラグメントは少なくとも２５ｎｔであり、通常は少なくとも５０ｎｔ、７５ｎｔ或いは１００ｎｔであるが、２００ｎｔ、２４０ｎｔ、２７０ｎｔ、３００ｎｔ、更には４００ｎｔであってもよい。小さなＤＮＡフラグメントはＰＣＲ用プライマー、ハイブリダイゼーション用スクリーニングプローブ等として有用である。ＰＣＲ等の増幅反応に用いる場合、一対のプライマーが使用される。プライマー配列の正確な組成は本発明にとって重要ではないが、本技術分野で知られているように、大抵の場合、プライマーはストリンジェントな条件で本発明における配列にハイブリダイズする。少なくとも約５０ｎｔ、好ましくは少なくとも約１００ｎｔの増幅産物を産生する一対のプライマーを選択するのが好ましい。プライマー配列の選択に用いるアルゴリズムは一般に知られており、市販のソフトウェアパッケージとなっているものを利用できる。増幅用プライマーはＤＮＡ相補鎖にハイブリダイズし、互いに反対方向へと合成を進める。
【００５３】
核酸或いは遺伝子の配列（フランキングプロモーター領域やコード領域等）は本技術分野において公知の種々の方法を用いて変異させ、プロモーター強度やタンパク質のコード配列等に所望の変更を加えることができる。このような変異の結果生成されたＤＮＡ配列或いはタンパク質は、通常、本明細書に示した各配列と実質的に同様である。即ち、異なっているとしても少なくとも１アミノ酸残基であり、１或いは２残基異なっている場合もあるが約１０残基は超えない。配列に変化をもたらすものとしては、置換、挿入或いは欠失を挙げることができる。欠失は更に、ドメインやエキソンの欠失等の大きな変化を含む。
【００５４】
クローニングした遺伝子にｉｎ ｖｉｔｒｏで変異を誘発させる技法が知られている。部位特異的な変異誘発のためのプロトコルの例については、ガスティン（Gustin）ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １４：２２（１９９３）；バラニー（Barany）、Ｇｅｎｅ ３７：１１１〜２３（１９８５）；コリセリ（Colicelli）ら、Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ １９９：５３７〜５３９（１９８５）；プレンキ（Prentki）ら、Ｇｅｎｅ ２９：３０３〜３１３（１９８４）に記載されている。部位特異的な変異誘発方法については、サムロック（Sambrook）ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、ＣＳＨ Ｐｒｅｓｓ １９８９、ｐｐ．１５．３〜１５．１０８；ワイナー（Weiner）ら、Ｇｅｎｅ １２６：３５〜４１（１９９３）；サイヤーズ（Sayers）ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １３：５９２〜５９６（１９９２）；ジョーンズ（Jones）とウィニストーファー（Winistorfer）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １２：５２８〜５３０（１９９２）；バートン（Barton）ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８：７３４９〜７３５５（１９９０）；マロッティ（Marotti）とトミチ（Tomich）、Ｇｅｎｅ Ａｎａｌ Ｔｅｃｈ ６：６７〜７０（１９８９）；ツ（Zhu）、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１７７：１２０〜１２４（１９８９）に記載されている。これらの方法により、ミトコンドリアの調節タンパク質を不活性な形態で発現させることができる。更に、ミトコンドリアのレギュレーターを発現する遺伝子を米国特許第５４６４７６４号と同第５４８７９９２号に記載の「ノックアウト」技術によって除去できる。また、これらの開示の全内容を本明細書の一部を構成するものとしてここに援用する。特に、内在性遺伝子の除去方法の開示及び記載のために援用する。
【００５５】
遺伝子からのタンパク質発現の抑制に用いられる周知の方法としては、センス抑制やアンチセンス抑制、ＲＮＡｉ抑制を挙げることができる。ｄｓＲＮＡの転写によるＲＮＡｉ遺伝子抑制については、米国特許第６５０６５５９号、米国特許出願公開２００２／０１６８７０７ Ａ１、ＷＯ９８／５３０８３、ＷＯ９９／５３０５０及びＷＯ９９／６１６３１に記載されており、これらの開示の全内容を本明細書の一部を構成するものとしてここに援用する。ＲＮＡｉによる遺伝子抑制は、その遺伝子のゲノムＤＮＡのセグメントのセンス及びアンチセンス要素を含むＤＮＡ要素に操作可能に結合するプロモーターを有する組換えＤＮＡ構築物を用いて行うことができる。遺伝子のゲノムＤＮＡのセグメントは例えば少なくとも約２３のヌクレオチドからなるセグメント、より好ましくは約５０〜２００のヌクレオチドからなるセグメントであり、そのセグメントにおいては、転写されたＲＮＡがハイブリダイズしてヘアピン構造を形成するときにループを形成できる人工ＤＮＡセグメント或いはイントロンによって、センス及びアンチセンスＤＮＡ成分は直接的に結合或いは接合することができる。
【００５６】
好適な微生物の培養方法及び発生した水素の回収方法は当業者に公知であり、例えば、メリス（Melis）による米国特許出願第２００１／００５３４３号（メリス（Melis）、２０００）及びＷＯ０３／０６７２１３に記載されている。また、これらの開示の全内容を本明細書の一部を構成するものとしてここに援用する。
【００５７】
水素生産は光照射条件下で行われる。光は連続的に照射するのが好ましく、光源として日中は太陽光を、夜間或いは曇りの場合には人工照明を用いる。また、夜間に照明を用いずに太陽光のみを用いることもできるが、この場合、水素の収量が低下する。
【００５８】
水素生産は「マイクロオキシック（microoxic）条件」で行われる。「マイクロオキシック（microoxic）条件」とは、酸素濃度を最小限に維持しヒドロゲナーゼの不活性化を防ぐ条件であり、一般には実質的嫌気的環境を意味する。ヘリウムガス等の添加によりシステムから強制的に酸素を排除できる。或いは、そしてより好ましくは、酸素除去を行わないで最初にシステムを外部環境から遮断してもよい。藻類の光合成量が乏しい場合、時間と共にシステム内の酸素量が自然減少し、システムの環境は実質的に嫌気的となり、効率的な水素生産を行うことができる。
【００５９】
本明細書において「光照射条件」とは、光合成を行うのに充分な強度の光が存在することを意味する。光としては、人工光源或いは天然の太陽光を用いることができる。一実施形態において、光の強度は１５〜３１００μｍｏｌ ｍ−２ ｓｅｃ−１であり（更にこの範囲に収まる全範囲、例えば、１００〜３０００や１０００〜２０００等）、連続照射時間は最大で１２０時間であるが、より短時間であってもよい（例えば、２４時間、４８時間、６４時間、９６時間）。
【００６０】
本発明に用いる培地としては、藻類の培養に使用され、更に硫黄を含有する標準的な市販調製物でよい。好ましくは、ＴＡＰ培地を用いる。藻類の培養は液体培地或いは固形培地で行うことができ、液体培地がより好ましい。
【００６１】
実施例１：変異株の単離
株及び培養条件
Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ株ＷＴ１３及びＣＣ１６１８（ａｒｇ７ ｃｗ１５、ｍｔ−）をクラミドモナス・ジェネティックス・センター・コレクション（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｅｎｔｅｒ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（米国デューク大学（Duke University））から得た。使用する株は全て、混合栄養状態（mixotrophically）でＴＡＰ培地（Ｔｒｉｓ−酢酸−リン酸、ｐＨ７．０）中、４０μｍｏｌ ｍ−２ ｓｅｃ−１の白色光を照射し、２０℃で培養した（Ｈａｒｒｉｓ １９８９）。培養は、１２時間の明暗サイクルで細胞密度が２×１０６個／ｍＬになるまで行った。
【００６２】
（アルギニン要求性の株ＣＣ１６１８に対して）必要な場合は、培地にアルギニン１１０μｇ／ｍＬを添加した。
【００６３】
変異株の構成及び遺伝子分析
核形質転換をＫｉｎｄｌｅら、１９８９及びＰｕｒｔｏｎとＲｏｃｈａｉｘ、１９９５に記載の方法で次の通り行った。
【００６４】
Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉアルギノコハク酸分解酵素遺伝子（Ｄｅｂｕｃｈｙら １９８９）の７．８ｋｂゲノムＤＮＡフラグメント及びバクテリオファージφＸ１７４ ＤＮＡ（ＧｕｍｐｅｌとＰｕｒｔｏｎ １９９４）の０．４ｋｂフラグメントを含むプラスミドｐＡｒｇ７．８を形質転換実験に用いた。ｐＡｒｇ７．８は、ＢａｍＨＩで消化して線状にしてから用いた。
【００６５】
遺伝子交差（Genetic crosses）を、ＷＴ１３とその変異体を用いてＨａｒｒｉｓ（１９８９）に記載の方法で行った。
【００６６】
タグのフランキングＤＮＡ配列を、ライゲーション・メディエーティッド・サプレッションＰＣＲ（ligation mediated suppression ＰＣＲ）（ＬＭＳ−ＰＣＲ）（Ｓｔｒａｕｓｓら、２００１）とプラスミドレスキュー（plasmid rescue）（ＴａｍとＬｅｆｅｂｖｒｅ、１９９３）とによりクローニングした。
【００６７】
状態遷移変異体の単離
Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ内の状態遷移に関与する遺伝子を特定するために、アルギニン無添加ＴＡＰ培地で増殖できる変異体のライブラリーをスクリーニングした。この変異体は、アルギニン要求性の株ＣＣ１６１８の核遺伝子にＡｒｇ７遺伝子を導入したプラスミドｐＡｒｇ７．８のランダム挿入後に生成されたものである（Ｄｅｂｕｃｈｙら、１９８９；ＧｕｍｐｅｌとＰｕｒｔｏｎ、１９９４）。ＷＴ内の状態遷移を誘起する光照射前後に個々のコロニーが発するクロロフィルの蛍光を記録するプレートベース蛍光ビデオ画像化スクリーニング（Ｋｒｕｓｅら、１９９９）を用いて潜在的な状態遷移変異株（ｓｔｍ）を特定した。スクリーニング対象の２×１０４個のコロニーの内、可能性のある４種のｓｔｍ変異体を特定した。そのうち変異体Ｓｔｍ６は、水素生産が増加していることが示された。
【００６８】
蛍光ビデオ画像化と７７Ｋ蛍光分光測定
状態遷移欠陥について変異体のスクリーニングを前述の通りビデオ画像化により行った（Ｋｒｕｓｅら、１９９９）。画像化は、室温ではＦｌｕｏｒＣａｍ７００ＭＦ装置（フォトン・システム・インスツルメンツ（Photon System Instruments））を用い、７７Ｋでは蛍光／発光分光分析計（パーキン・エルマー ＬＳ５０Ｂ）を用いて行った。試料の測定は、４０μｍｏｌ ｍ−２ｓ−１白色光（状態２）の照射後或いは２０分間の７１０ｎｍ（ドイツ国スコット・フィルター（Schott filter））ＰＳＩ光（状態１）の照射後に行った。或いは、Ｂｕｌｔｅら（１９９０）に従い、窒素雰囲気下、暗所で３０分間インキュベートすることにより細胞が状態２となるように調整した。
【００６９】
藻類の培養
ＷＴ及びＳｔｍ６の細胞培養物を増殖させた。増殖は、暗所で或いは照射（６０μｍｏｌ／ｍ２．ｓ−１白色光）下、ＴＡＰ寒天プレート上或いはＴＡＰ培地中、細胞密度が約２×１０６個／ｍＬに達するまで行った。
【００７０】
実施例２：水素放出測定
ＷＴ及びＳｔｍ６培養物の両方について、液相及びその上方の気体ヘッド空間のＨ２濃度を測定した（ＯＤ７５０ｎｍ＝０．８の細胞密度）。溶解Ｈ２濃度の測定は、硫黄飽和ＴＡＰ培地中或いは硫黄除去ＴＡＰ培地中の暗所細胞培養物（１Ｌ）を用い、クラーク型（Clark type）水素電極（デンマーク国、ユニセンス（Unisense）ＰＡ２０００）を用いて白色光照射により行った。５μＭ カルボニルシアニド ｍ−クロロフェニルヒドラゾン（ＣＣＣＰ）の存在下及び非存在下のＨ２濃度を、暗所培養物を用い照射（白色光、３００μｍｏｌ ｍ−２．s−１）前後（１ｈ）に測定した。気体ヘッド空間のＨ２濃度の測定は質量分析計（Ｄｅｌｔａ Ｆｉｎｎｉｇａｎ ＭＡＴ）を用いて行った。細胞培養物は低真空下、３０分間暗所に置き、培地及びヘッド空間のＯ２及びＨ２を除去してから、連続或いはパルス化した白色光に照射した（周波数３．３Ｈｚ、５μsフラッシュ；光強度範囲１５〜３０００μｍｏｌ．ｍ−２．ｓ−１）。
【００７１】
図３を参照すると、硫黄の非存在下においては、Ｓｔｍ６はＷＴの３．５倍のＨ２を生成したことが分かる（即ち、面積積分値１４６／４１＝３．５）。
【００７２】
野生株及びＳｔｍ６ Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ培養物の水素生産に対する光強度の影響をガス質量分析により推定した。これは、（暗所に３０分間置いた）ＷＴ細胞及びＳｔｍ６細胞に種々の照射レベルで連続照射を１分間行い、Ｈ２発生（相対速度）を測定して行った。Ｓｔｍ６は常に、野生株に比べて（ピークの表示で示すように）５００〜７００％高い速度で水素を生産した。
【００７３】
アンカップラーであるＣＣＣＰは、ＷＴよりも約１５００％高いレベルでＨ２生産速度を安定化させる。これは、水素クラーク電極測定（ユニセンス（UniSense））により算定した。このことから、ＨｙｄＡ活性は基質供給速度により限定され得ることが分かる。
【００７４】
実施例３：光合成によるＨ２生産中のガス発生量の測定
目的：光合成によるＨ２生産中にＳｔｍ６が発生させるガスの量及び組成を測定する。
方法：実験は白色光下で行った（８０μｍｏｌ．ｍ−２．ｓ−１）。硫黄除去条件下、培養物を暗所で４０時間インキュベートした。細胞は、追加の炭素源としてアセテートを添加したＴＡＰ培地中で、ＯＤ７５０（７５０ｎｍにおける光学密度）が約１．０になるまで増殖させた。培養量は３００ｍＬとし、発生ガスのデータは培養物１Ｌに標準化した。水素測定はＡｇｉｌｅｎｔ Ｍｉｃｒｏガスクロマトグラフを用いて行った。
【００７５】
【表１】
【００７６】
実施例４：ＷＴ培養物及びＳｔｍ６培養物における酸素濃度測定
目的：高Ｈ２表現型のＳｔｍ６は培養物中の低Ｏ２濃度を維持する能力と関連付けられるかを確認する。
方法：溶解酸素濃度測定をクラーク型酸素電極（ユニセンス）を用いて行い、図１２に示すデータを得た（パネルＡ及びＢ）。
【００７７】
パネルＡ：細胞培養物を密度０．１μg Ｃｈｌ／ｍＬになるまで硫黄飽和ＴＡＰ培地中で一定の照射条件（３００μｍｏｌｍ−２ｓ−１）下で増殖させた。硫黄除去ＴＡＰ培地に細胞を移した時を時間０とした。
【００７８】
パネルＢ：暗所で光培養細胞調製物（３０μg Ｃｈｌ／ｍＬ）±５ｍＭ ＫＣＮを用いて細胞呼吸測定を行った。
【００７９】
ＷＴ及びＳｔｍ６中の細胞酸素濃度の測定結果を図１２に示す。
【００８０】
時間＝０は、培養物を硫黄除去培地に移した時間を示す。時間＝０においては、ＰＳＩＩはまだ阻害されていない。しかしながら、Ｓｔｍ６培養物の溶解酸素濃度は野生型の４０％しかなかった。その後、野生型及びＳｔｍ６培養物のいずれにおいても溶解酸素濃度は同程度に減少し、最終的にはＰＳＩＩは完全に阻害された。これは硫黄非存在下では損傷したＤ１タンパク質の修復が不可能であるからである。
【００８１】
呼吸速度：Ｓｔｍ６における呼吸レベルの増加もパネルＡに示すＳｔｍ６の溶解酸素濃度の低下の一要因であるかを確認するために、ＰＳＩＩ活性低下に加え、呼吸レベルも暗所（ＰＳＩＩ不活性）±５ｍＭ ＫＣＮ（複合体ＩＶの阻害剤）条件にて測定した。Ｓｔｍ６の呼吸速度は、ＫＣＮの存在下においても非存在下においても野生株よりも６０％高いことが分かった。この結果から、Ｓｔｍ６の呼吸レベルが高いことが分かるだけでなく、酸素の取り込みは通常の酸化的リン酸化を介してではなく、恐らく代替的酸化（oxidate）経路を介して行われることも分かる。
【００８２】
低レベル光条件下における増殖速度
図１６は、低レベル光下におけるＳｔｍ６及び野生株の増殖速度の比較を示す。バイオマス生成においては、バイオリアクタ条件では、光レベルが制限要因となることが多い。Ｓｔｍ６及び野生株の増殖速度をアセテート添加ＴＡＰ培地中で低レベル光（２４℃において１０μｍ ｍ−２ｓ−１、２４時間光照射）で比較したところ、Ｓｔｍ６の増殖速度は野生株よりも大きかった。このことは、Ｓｔｍ６はバイオリアクタ増殖条件下におけるバイオマス生成に有利であり得ることを示唆している。
【００８３】
実施例５：Ｓｔｍ６変異体の特性
（ｉ）Ｓｔｍ６は状態１においてブロックされＰＳＩＩ-ＬＨＣＩＩリン酸化が低下する
クロロフィル蛍光アッセイを蛍光発光分光分析により７７Ｋで行い（図５）、クロロフィルビデオ画像化を化学線６２０ｎｍ光で室温にて行った（図５）ところ、Ｓｔｍ６は状態１においてブロックされることが分った。ＷＴと対照的に、ＰＳＩＩに優先的に吸収される光は細胞を状態２に遷移させることができなかった。これは、ＰＳＩからの７２０ｎｍの蛍光の増加により監視した（図５）。暗所における嫌気生活（anaerobiosis）によりＰＱプールを還元させた場合にも状態２への遷移はブロックされた（データは示さず）。
【００８４】
状態２は、ＰＳＩＩの集光（ＬＨＣ）アンテナタンパク質のスレオニン残基のリン酸化に関与しているため（Ａｌｌｅｎら、１９８１）、イムノブロットにおけるリン酸化レベルを評価するのに抗ホスホスレオニン抗体を用いた。ＷＴにおけるＣＰ２９（Ｐ９）及びＬＨＣ−Ｐ１１タンパク質のリン酸化を促進する照射条件において、Ｓｔｍ６はこれらタンパク質のリン酸化レベルを著しく減少させた（図５）。対照のイムノブロットにより、Ｓｔｍ６はＷＴレベルのＬＨＣタンパク質を含有したままであることが確認された（図５）。
【００８５】
Ｓｔｍ６においてＰＱプールを更に還元できるかを試験するため、クロロフィル蛍光測定を行い、光化学消光（photochemical quenching）パラメータｑＰ（ＰＱプールの還元状態の指標）を求めた（Ｌｕｎｄｅら、２０００）。生育光条件下、Ｓｔｍ６についてはＷＴよりも更に還元された状態にＰＱプールを置いた（１−ｑＰはＳｔｍ６では０．７７、ＷＴでは０．５９）（表１）。Ｓｔｍ６におけるＰＳＩ及びＰＳＩＩの活性レベルは、ＷＴと同等であった（表１）。
【００８６】
（ｉｉ）Ｓｔｍ６は高レベル光に対する感受性が強い
Ｓｔｍ６変異体の顕著な表現型は、状態遷移に対する影響に加え、その光ストレスに対する感受性であった。１０００μｍｏｌ ｍ−２s−１の高レベル光を４時間照射後、変異体の細胞は生残性の著しい低下を示したが、ＷＴ及び相補株Ｂ１３は殆ど影響されなかった（図６）。Ｓｔｍ６は、照射により細胞内の一重項酸素の著しい増加を示した。これは脂質ヒドロペルオキシドの蓄積により評価した（表１）。
【００８７】
【表２】
【００８８】
（ｉｉｉ）Ｓｔｍ６における単一のｍｔｅｒｆ型遺伝子の崩壊が状態遷移欠陥と光感受性の原因である
プラスミドｐＡｒｇ７．８が担持するａｒｇマーカーがＳｔｍ６と緊密に関連しているかを試験するため、ＷＴ１３とＳｔｍ６の間の遺伝子交差を行い、アルギニン非含有培地で増殖し状態遷移を行う能力についてその子孫をビデオ画像化により評価し記録した。調査した全５０個の子孫においては、アルギニン非含有ＴＡＰ培地で増殖できるクローンは正常な状態遷移を示したが、アルギニン要求性を示すクローンも程度は弱いが状態遷移を示した（データは示さず）。これらデータから、Ｓｔｍ６はａｒｇタグ化変異体であることが示唆された。
【００８９】
プラスミドレスキューとライゲーション・メディエイティッド・サプレッション（ＬＭＳ）−ＰＣＲ（Ｓｔｒａｕｓｓら、２００１）を組み合わせることにより、Ｓｔｍ６におけるａｒｇマーカーの挿入位置を特定することができた。より詳細な分析の結果、２個のｐＡｒｇ７．８プラスミドが縦列にＳｔｍ６に挿入されていることが分かった（図７）。
【００９０】
続いて行った配列解析及び相同性検索の結果、ｐＡｒｇ７．８プラスミドのランダム組込みによって２個遺伝子が影響を受けていることが分かった。その内の一方は核トランスポソン（ｔｏｃ１）として既に記述されており（Ｄａｙら、１９８８）、他方は未知のものであったため、その配列はＧｅｎＢａｎｋデータベースにｍｏｃ１（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＦ５３１４２１）として提出した。Ｓｔｍ６ＤＮＡにおいて影響を受けたゲノム挿入部位の正確な位置は、最終的には配列解析及びＰＣＲ解析により確認した（図７）。
【００９１】
非相同組換えによるランダム挿入により約２ｋｂのゲノムＤＮＡの欠失が生じた。欠失したものの中には、ｍｏｃ１遺伝子の３’領域の６１０ｂｐｓとｔｏｃ１遺伝子の５’末端の８８０ｂｐｓとが含まれていた（図７）。
【００９２】
Ｓｔｍ６及びＷＴにおいて５’特異的ｍｏｃ１プライマーとその核挿入配列由来の第２のプライマーを用いてＰＣＲ解析を行ったところ、Ｓｔｍ６においては１００５ｂｐのＰＣＲ産物が増幅された。このことから、挿入によって生じた欠失はｍｏｃ１の一部のみであり、この遺伝子の５’領域は何ら影響を受けていないことが確認された。Ｓｔｍ６における核挿入の５’領域に存在するｍｏｃ１の残りの５１２ｂｐｓと核挿入の３’領域に存在するｔｏｃ１の残りの４７８２ｂｐｓとを特定したところ、この変異は３’−ｍｏｃ１／５’−ｔｏｃ１遺伝子領域に完全に限定され、可能性のある他の全ての隣接コード領域には影響を及ぼさないことが分かった。
【００９３】
相補性実験を行ったところ、Ｓｔｍ６において状態遷移がない原因はｍｏｃ１のシングルコピーであることが分かった（図５、図６、図９参照）。相補株B１３は同時形質転換（co-transformation）アプローチより単離した。このアプローチには、ｍｏｃ１含有コスミドを、主要な選択可能なマーカーとしてエメチン耐性を与えるｃｒｙ１遺伝子（Ｎｅｌｓｏｎら、１９９４）を含有する第２のベクターと組み合わせて用いた。３７ｋｂのコスミドはコスミドライブラリーから単離した（英国ＵＣＬのＳａｕｌ Ｐｕｒｔｏｎ博士からご提供頂いた）。挿入領域の配列解析の結果、ｍｏｃ１はこのコスミドに挿入された唯一の遺伝子であることが分かった。
【００９４】
評価を行ったエメチン耐性を有する約５０００のコロニーの内、正常な状態遷移を行うものが４個あることが分かり（蛍光ビデオ画像化により評価）、これら４個は全てｍｏｃ１遺伝子を含んでいた。
【００９５】
ｍｏｃ１遺伝子は３５ｋＤａタンパク質をコードしているが、その中には幾分驚くべきことであるが、ミトコンドリアトランジット配列と推定される配列と、ＤＮＡ結合タンパク質に特徴的なロイシンジッパーモチーフを有する２個のミトコンドリア転写終結因子ドメイン（ｍｔｅｒｆ）（Ｄａｇａら、１９９３）とが含まれている。総じて、顕著な類似性が、３５ｋＤａヒトｍＴＥＲＦタンパク質（図８）に対して（配列全長に亘るアライメントに基づいて３４％）、更にＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ（ＤｍＴＴＦ、Ｒｏｂｅｒｔｉら、２００３）及びｓｅａ ｕｒｃｈｉｎ（ｍｔＤＢＰ、Ｌｏｇｕｅｒｉｃｉｏら、１９９９）中の相同体に対して見られた。ヒトｍＴＥＲＦはｔＲＮＡ遺伝子の下流に結合し、ミトコンドリア内でのｔＲＮＡ及びｒＲＮＡの合成量の制御と、他のミトコンドリア遺伝子の発現と、延いてはミトコンドリア呼吸鎖の機能性に関与していると考えられる（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｓｉｌｖａら、１９９７；Ｓｅｌｗｏｏｄ、２０００；Ｈｅｓｓら、１９９１）。興味深いことに、ｍｔｅｒｆドメインを有するＭＯＣ１の９個の相同体がＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａのゲノムにおいて特定されており、その内の４個（Ａｔ１ｇ６１９８０、Ａｔ２ｇ４４０２０、Ａｔ４ｇ０２９９０、Ａｔ２ｇ０３０５０）がミトコンドリアをターゲットとし、１個（Ａｔ５ｇ５５５８０）が葉緑体をターゲットとしていると予想される。最近開放されたＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ核ゲノムデータベースの解析に加えＤＮＡハイブリダイゼーション実験を行ったところ、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉにはｍｏｃ１のコピーが１個だけ存在することが示唆された。
【００９６】
（ｉｖ）ＭＯＣ１はミトコンドリアタンパク質であり、ＭＯＣ１が存在しないことによりシトクロムオキシダーゼの発現が影響を受ける
ＭＯＣ１は実際には葉緑体ではなくミトコンドリアをターゲットとしたものであること（図９）と、ＭＯＣ１はＳｔｍ６変異体には存在しないこととを確認するため、ＭＯＣ１に対する抗ペプチド抗体を用いた。重要なことであるが、ＭＯＣ１の発現は、暗い状態から明るくするとＲＮＡ及びタンパク質レベルにおいてアップレギュレートされた（図１０）。
【００９７】
ＭＯＣ１が存在しないことがミトコンドリアの呼吸複合体の発現に影響を与えるか否かを評価するために各種実験を行った。イムノブロットの結果、シトクロムオキシダーゼのサブユニット９０の蓄積（Ｌｏｗｎら、２００１）（ＣＯＸ９０）はＳｔｍ６では減少したものの（図９）、溶解性のシトクロムＣのレベルは影響を受けず、代替的オキシダーゼ１（Alternative oxidase 1）(ＡＯＸ１）のレベルは変異によって増加した（図９）。相補的な株Ｂ１３においては、シトクロムオキシダーゼのサブユニット９０はほぼＷＴのレベル迄回復した。イムノブロットのデータは、暗所増殖させたＷＴ細胞及びＳｔｍ６細胞から単離したミトコンドリアにおけるシトクロムオキシダーゼの活性測定の結果と良く一致した（図１０）。光処理に伴い、Ｓｔｍ６におけるシトクロムオキシダーゼ活性は著しく低下した。光照射下増殖させたＳｔｍ６細胞におけるＡＴＰレベルはＷＴ及びＢ１３の約５０％であり（図１０）、この結果は、光合成由来還元体（photosynthetically derived reductant）からのＡＴＰの生成におけるシトクロムオキシダーゼの役割と一致しており、先の示唆（ＫｒｏｅｍｅｒとＨｅｌｄｔ、１９９１）と合っている。
【００９８】
（ｖ）ＭＯＣ１は光曝露によるミトコンドリアゲノムの転写の変化に関与している
ＭＯＣ１がヒトｍＴＥＲＦと共通の転写因子をコードしていると仮定し、ミトコンドリアゲノムの転写産物プロファイルに対して可能性のある変動要因（perturbations）を検出することを目的とした各種実験を行った。Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉの場合は、ミトコンドリアゲノムは１５．８ｋｂの線形ゲノムから構成される（ＧｒａｙとＢｏｅｒ、１９８８）。このゲノムは複数の呼吸サブユニットをコードしており、その中にはシトクロムオキシダーゼのサブユニット１（ｃｏｘ１遺伝子産物）、複合体Ｉの５個のサブユニット（ｎａｄ１−２、ｎａｄ４−６遺伝子産物）、及びアポシトクロムｂ（ｃｏｂ遺伝子産物が含まれている。
【００９９】
ｎａｄ２遺伝子及びｃｏｘ１遺伝子の半定量的ＲＴ−ＰＣＲ解析を行った結果、暗所増殖細胞の光曝露後にはＷＴとＳｔｍ６の転写産物レベルに大きな差があることが分かった。ＷＴに比べてＳｔｍ６は常に、ｃｏｘ１転写産物レベルが低く、ｃｏｘ１の直ぐ下流に位置するｎａｄ２遺伝子由来の転写産物レベルは高かった（図１０）。
【０１００】
これらの結果をまとめると、ＭＯＣ１は、シトクロムオキシダーゼ活性レベルをｃｏｘ１の転写レベルに制御することにおいて重要な役割を担っていることが示唆される。ＣＯＸ１はシトクロムオキシダーゼ複合体に組み立てられる最初のサブユニットであるため、ＣＯＸ１発現レベルは酵素合成量の重要な決定要素である可能性がある（Ｎｉｊｔｍａｎｓら、１９９８）。
【０１０１】
（ｖｉ）光ストレス中のミトコンドリア呼吸鎖の調節におけるＭＯＣ１の役割のモデル
ミトコンドリア機能におけるＭＯＣ１の役割モデルを図１１に示す。ミトコンドリアゲノムは二方向に転写されて２個の一次転写産物を作成し、これらは処理されてより小さな転写産物となる（ＧｒａｙとＢｏｅｒ、１９８８）。本発明者らの結果から分かるように、ＭＯＣ１は、ｃｏｘ１ｍＲＮＡのレベルを下流のｎａｄ２転写産物のレベルよりも高く維持するのに重要である。従って、可能性のあるＭＯＣ１結合部位は、転写終結因子である可能性が高く、ｃｏｘ１とｎａｄ２の間に存在するであろう。このクラスの転写因子の結合部位の多様性が、この段階においては、可能性のあるＭＯＣ１結合部位を予想することを困難にしている（Ｒｏｂｅｒｔｉら、２００３）。
【０１０２】
本発明者らのモデルにおいては、ＭＯＣ１の作用を受けてミトコンドリアは、ｃｏｘ１の転写を下流のｎａｄ遺伝子と切り離し、更なるシトクロムオキシダーゼ複合体の合成に必要なＣＯＸ１の相対的な発現量を増加させることができる。これは、複合体Ｉに無関係であるロテノン非感受性ミトコンドリアＮＡＤＨデヒドロゲナーゼが光によって誘起され（ＳｖｅｎｓｓｏｎとＲａｓｍｕｓｓｅｎ、２００１）より多くのシトクロムオキシダーゼを合成する必要がある場合に特に適している。ゲノムあたり一を超えるＭＯＣ１結合部位が存在し（Ｒｏｂｅｒｔｉら、２００３）ＤＮＡだけでなくＲＮＡに結合する可能性があるとするならば、ミトコンドリア遺伝子発現に対するＭＯＣ１作用の効果はむしろ複雑であろう。
【０１０３】
（ｖｉｉ）循環的電子輸送の測定
目的：循環的電子輸送は、Ｓｔｍ６において好気的条件下或いは嫌気的条件下阻害されるか否かを決定する。
【０１０４】
方法：循環的電子輸送速度（図１４）を分光分析により測定した。測定は、２０μＭジクロロフェニルジメチル尿素（ＤＣＭＵ：ＰＳＩＩからｃｙｔｂ６ｆへのｅ−の輸送を阻害する）又は５μＭ ２，５−ジブロモ−６−イソプロピル−３−メチル−１，４−ベンゾキノン（ＤＢＭＩＢ：ｃｙｔｂ６ｆからプラストシアニンへのｅ−の輸送を阻害する）の存在下、ｃｙｔ ｆの光誘起レドックス変化を測定することにより行った。ＰＳＩ活性及びＰＳＩＩ活性は、シングルターンオーバーフラッシュ励起後の電荷分離測定から分光分析により推定した。これを行うため、測定前に細胞を暗所に２時間置くか、２００μｍｏｌ／ｍ２．ｓ−１白色光を１０分間照射した（Ｔｒｅｂｓｔら（１９８０））。
【０１０５】
このようにしてＣｙｔｆレドックス状態の変化を伴う循環的電子輸送測定を行った結果、循環的ｅ−輸送は、Ｓｔｍ６において好気的条件と嫌気的条件の両方において阻害された。
【０１０６】
（ｖｉｉｉ）ＰＳＩＩ活性レベル
目的：ＰＳＩＩ活性レベルは、状態１におけるＰＳＩＩの大きなアンテナサイズのために光照射下ダウンレギュレートされるか否かを決定する。
方法：ＰＳＩ活性及びＰＳＩＩ活性（図１４）をシングルターンオーバーフラッシュ励起後の電荷分離測定から分光分析により推定した。これを行うために測定前に細胞を暗所に２時間置くか、２００μｍｏｌ／ｍ２．ｓ−１の白色光を１０分間照射した。
【０１０７】
暗所での培養物においては、ＷＴ細胞とＳｔｍ６細胞のＰＳＩＩ（ＰＳＩＩ−Ｄ）及びＰＳＩ（ＰＳＩ−Ｄ）活性は同等であった。予想通り、ＰＳＩ活性レベルは１０分間のプレ照射時は一定のままであった（ＰＳＩ−Ｌ）。これに対し、１０分間のプレ照射段階によって、ＷＴとＳｔｍ６の双方においてＰＳＩＩ（ＰＳＩＩ−Ｌ）の光阻害が生じた。このことから、ＰＳＩＩは光阻害を受けやすいことが分かる。しかしながら、Ｓｔｍ６の場合は不活性化が更に顕著に現れた（ＰＳＩＩ−Ｌ）。これは、状態１遷移中であるためＳｔｍ６のＰＳＩＩアンテナサイズが大きいからである（Ｆｉｎｎａｚｚｉら（２００３））。
【０１０８】
（ｉｘ）リンゴ酸デヒドロゲナーゼのダウンレギュレーション
葉緑体からミトコンドリアへのＨ＋及びｅ−の移動に関与するリンゴ酸ＮＡＤＰＨデヒドロゲナーゼの活性がＳｔｍ６においてダウンレギュレートされるかを確認するため鋭意検討した。ダウンレギュレーションがあれば、Ｈ＋及びｅ−はミトコンドリアに供給されるよりもＨｙｄＡを介したＨ２生産のため葉緑体に残るということを示している。図１５に示すように、ＷＴ及びＳｔｍ６細胞培養物におけるリンゴ酸ＮＡＤＰＨ−デヒドロゲナーゼ活性測定の結果、この酵素の活性はＳｔｍ６においてダウンレギュレートされていることが分かる（Ｌｅｍａｉｒｅら（２００３））。
【０１０９】
考察
Ｈ２生産を達成するには次の三条件を満たさなければならない。第１に、ＨｙｄＡの酸素誘起阻害を高めなければならない。第２に、ストロマに位置するＨｙｄＡは高い基質（Ｈ＋とｅ−）供給速度を有さなければならない。第３に、ストロマへのｅ−輸送にＰＳＩを伴うため、ＨｙｄＡを介した光学的なＨ２生産には光が必要である。要約すると、ＨｙｄＡを介したバイオ水素生産は「嫌気性光合成」の状態において生じる（図２）。
【０１１０】
Ｈ２生産能力が改善された変位体を迅速に特定するため、まずＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉノックアウトを状態遷移プロセスの崩壊に関してスクリーニングした（図２）。このプロセスのＰＳＩ及びＰＳＩＩのターンオーバー速度は通常、バランスを保持されている（図１）。これは、光集光アンテナ（それぞれＬＨＣＩ及びＬＨＣＩＩ）のサイズを調節することにより、具体的には二種の光化学系（状態１：大きなＰＳＩＩアンテナ；状態２：大きなＰＳＩアンテナ）の間にＬｈｃｂタンパク質を往復させることにより行う。Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉの場合、このプロセスによって線形光合成電子輸送から循環的光合成電子輸送に切り替わり、これはＰＳＩの還元側においてｅ−に関してＨｙｄＡと競合する（図２）。嫌気的条件下状態１においてブロックされた細胞は循環的電子伝達を行わない。これらの条件下では、ＨｙｄＡはもはやＰＳＩ由来の電子に関してＣｙｔｂ６ｆ仲介循環的電子輸送と競合する必要はなく（図２）、光誘導性（light-driven）Ｈ２生産の効率向上が期待できる。選択された変異体の内、ｍｏｃ１の核ノックアウト変異体であるＳｔｍ６（Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号ＡＦ５３１４２１）は、状態１においてブロックされＨ２生産能力が向上すること（図３）、循環的電子輸送において阻害されること（図１４）、葉緑体内に多量のデンプンを蓄積させること（ＨｙｄＡのためのＨ＋／ｅ−の貯蔵）（図４）、及び常にＰＳＩＩ−ＬＨＣＩＩアンテナ複合体が大きいことによって光阻害に対する感受性が高いためＰＳＩＩ活性が低いことが分かった。更に、Ｓｔｍ６の細胞酸素濃度は約６０％減少しており、これは恐らく代替的オキシダーゼの活性が高いためであろう。このように多岐に亘り複雑な表現型の特性によって、Ｓｔｍ６は本質的に、捕捉した太陽エネルギーを主にＰＳＩによって動かされる「嫌気性光合成経路」を介して化学エネルギー（Ｈ２の形）へ変換するように仕向けられる。
【０１１１】
Ｍｏｃ１は核にコードされたミトコンドリアＤＮＡ結合タンパク質であり、その欠失は光照射によるミトコンドリア電子輸送経路のデレギュレーションを生じさせる。特に、Ｍｏｃ１欠失は複合体ＩＶの著しいダウンレギュレーションを惹き起こす。この変異は更に、ミトコンドリアＨ＋勾配を維持しミトコンドリアＦ０Ｆ１ＡＴＰａｓｅを介してＡＴＰを合成する能力において、ミトコンドリア電子輸送（複合体Ｉ→複合体ＩＶ）の低下を惹き起こす。従って、光合成による生成物のシンク（sink；溜り場）として作用するミトコンドリアの能力を著しく減退させてしまう（図２）。このようなミトコンドリアと葉緑体の間の相互作用の減少により、Ｓｔｍ６は、一時的なＨ＋／ｅ−のシンクとして、生成されたＨ２を用いてＰＳＩＩ由来のＨ＋／ｅ−をヒドロゲナーゼＨｙｄＡに供給する。Ｓｔｍ６において観察された葉緑体の準自律機能及びそれに伴う光合成循環的電子流の阻害の全体的な効果として、この株において観察されたＨ２生産増加という価値ある性質が提供される。
【０１１２】
長期間（６日間）のＨ２生産実験（図３）により、バイオ水素生産に対しＳｔｍ６が有益である点を幾つか見出した。第１に、（ＰＳＩＩ修復を阻害するための）硫黄非存在下において、野生株（ＷＴ）よりも早く水素生産が開始された。第２に、Ｓｔｍ６は、より高いＨ２生産速度を達成した。第３に、水素生産時間が約４５時間（ＷＴ）から約１２０時間（Ｓｔｍ６）まで延びた。これら観測された３点の改良点を合わせると、ＷＴよりもＨ２生産が約３５０％増加した。尚、照射に先立ち、培養物を２時間暗所に置いておいた。照射フェーズ開始後、Ｓｔｍ６において直ぐにＨ２生産が観察されたことも注目される。この知見は、Ｓｔｍ６の呼吸速度がＨｙｄＡ発現の酸素誘起阻害を防止するのに十分高いということを示唆するので重要である。
【０１１３】
Ｓｔｍ６には、更に収量を増加させる可能性がある。より短期間の実験の結果、ＷＴに対して水素生成量が約５００〜７００％増加した。この増加は、１５〜３１００μｍｏｌ／ｍ２．s−１の照射範囲に亘って見られた。これは、水素バイオリアクタにおける使用に関してもＳｔｍ６は有益であることを示しており重要である。即ち、バイオリアクタ内では、細胞が曝露される光の照射強度は光源からの距離によって広範囲に亘るからである。
【０１１４】
ＷＴに比べると、Ｓｔｍ６を用いた場合には、ＨｙｄＡへの基質（Ｈ＋／ｅ−）供給速度を高めることにより更に高いＨ２収量を達成できる。光合成時のストロマのアルカリ化のため、ストロマに位置するＨｙｄＡへのＨ＋供給はＨ２生産速度、特に、循環的流れの阻害によってＨｙｄＡへの電子搬送速度がＷＴよりも高いＳｔｍ６におけるＨ２生産速度を制限するであろう（図２）。この仮説を調べるため、Ｈ＋の迅速なチラコイド膜通過輸送を助けると考えられているプロトノフォアであるＣＣＣＰをＳｔｍ６及びＷＴ培養物に添加した。ＣＣＣＰはＷＴには殆ど影響しなかった（恐らく、ｅ−輸送がＨ２生産を制限しているため）が、Ｓｔｍ６は少なくとも３０分間の間に約１５００％のＨ２生産の増加を示した。この結果から、内腔からストロマへのＨ＋輸送がＳｔｍ６におけるＨ２生産の改善における律速段階であることは明らかである。
【０１１５】
要約すると、Ｓｔｍ６は、Ｈ２Ｏを基質として使用できる将来の太陽光利用Ｈ２生産システムの開発に価値ある複数の性質を有している。第１に、Ｓｔｍ６の葉緑体は準自律的に機能して、Ｈ２Ｏ由来のＨ＋及びｅ−をミトコンドリア電子輸送鎖にではなくＨ２生産のためのＨｙｄＡに供給する。第２に、Ｓｔｍ６においては循環的電子輸送がオフにされるため、この変異体は、ＨｙｄＡへのｅ−供給の恒久的且つ高速のルートとなる。第３に、Ｓｔｍ６の細胞Ｏ２濃度は低く維持されるため、ＨｙｄＡ活性が顕著に高い。最後に本発明者らは、Ｓｔｍ６は、ＣＣＣＰの存在下においてＷＴよりも１５倍速い速度でＨ２を生産できることを示した。この１５倍の増加は、経済的に実行可能なＨ２生産システムの開発に向けた重要な第一歩である。
【０１１６】
明確さと理解のため本発明を幾分詳細に説明したが、本明細書に開示した本発明の概念から逸脱することなく本明細書に記載した実施形態や方法に対して各種の変更や変形を行うことができることは当業者には明らかであろう。
【０１１７】
参考文献
次の文献の開示内容を、本明細書の一部を構成するものとしてここに援用する。
Abraham, S. National Hydrogen Energy Roadmap. United States Department of Energy (2002)。
Allen, J.F., Bennett, J., Steinback, K.E. and Arntzen, C.J. (1981) Chloroplast protein phosphorylation couples plastoquinone redox state to distribution of excitation energy between photosystems. Nature 291, 21-25。
Armstead, H.C.H. Geothermal Energy: Its Past, Present, and Future Contribution to the Energy Needs of Man (E. & F. N. Spon, London, 1983)。
Bonaventura, C. and Myers, J. (1969) Fluorescence and oxygen evolution from Chlorella pyrenoidosa. Biochim. Biophys. Acta 189, 366-386。
Bulte, L., Gans, P., Rebeille, F. and Wollman, F.-A. (1990) ATP control on state transitions in vivo in Chlamydomonas reinhardtii. Biochim. Biophys. Acta 1020, 72-80。
【０１１８】
Daga, A., Micol, V., Hess, D., Aebersold, R. and Attardi, G. (1993) Molecular characterization of the transcription termination factor from human mitochondria. J. Biol. Chem. 268(11), 8124-8130。
Day, A., Schirmer-Rahire, M., Kuchka, M.R., Mayfield, S.P. and Rochaix, J.D. (1988) A transposon with an unusual arrangement of long terminal repeats in the green alga Chlamydomonas rheinhardtii. EMBO J. 7 (7), 1917-1927。
Debuchy, R., Purton, S. and Rochaix, J.-D. (1989) The argininosuccinate lyase gene of Chlamydomonas reinhardtii: an important tool for nuclear transformation and for correlating the genetic and molecular maps of the ARG7 locus. EMBO J. 8, 2803-2809。
De Vitry, C., Finazzi, G., Baymann, F. and Kallas, T. (1999) Analysis of the nucleus-encoded and chloroplast-targeted rieske protein by classic and site-directed mutagenesis of Chlamydomonas. Plant Cell 11(10), 2031-2044。
Depege, N., Bellafiore, S. and Rochaix, J.-D. (2003) Role of chloroplast protein kinase Stt7 in LHCII phosphorylation and state transition in Chlamydomonas. Science 299, 1572-1575。
【０１１９】
Duby, F. and Matagne, R.F. (1999) Alteration of dark respiration and reduction of phototrophic growth in a mitochondrial DNA deletion mutant of Chlamydomonaslacking cob, nd4, and the 3’ end of nd5. Plant Cell 11, 115-125。
Dutilleul, C., Driscoll, S., Cornic, G., DePaepe, R., Foyer, C.H. and Noctor, G. (2003) Functional mitochondrial complex I is required by tobacco leaves for optimal photosynthetic performance in photorespiratory conditions and during transients. Plant Physiol. 131, 264-275。
Fernandez-Silva, P., Martinez-Azorin, F., Micol, V. and Attardi, G. (1997) The human mitochondrial transcription termination factor (mTERF) is a multizipper protein but binds to DNA as a monomer, with evidence pointing to intramolecular leucine zipper interactions. EMBO J. 16(5), 1066-1079。
Finazzi, G., Rappaport, F., Furia, A., Fleischmann, M., Rochaix, J.-D., Zito, F. and Forti, G. (2002) Involvement of state transitions in the switch between linear and cyclic electron flow in Chlamydomonas reinhardtii. EMBO Rep. 3(3), 280-285。
Finazzi, G., Chasen, C., Wollman, F.A. & de Vitry, C. Thylakoid targeting of Tat passenger proteins shows no delta pH dependence in vivo. EMBO J. 22:807-15 (2003)。
【０１２０】
Fleischmann, M.M., Ravanel, S., Delosme, R., Olive, J., Zito, F., Wollman, F.A. and Rochaix, J.-D. (1999) Isolation and characterization of photoautotrophic mutants of Chlamydomonas reinhardtii deficient in state transition. J. Biol. Chem. 274(43), 30987-30994。
Florin, L., Tsokoglou, A., and Happe, T. (2001) J Biol Chem 276, 6125-6132。
Flugge, U.-I. (1998) Metabolite transporters in plastids. Curr. Opin. Plant Biol. 1, 201-206。
Gans, P. and Wollman, F.-A. (1995) The effect of cyanide on state transitions in Chlamydomonas reinhardtii. Biochim. Biophys. Acta 1228, 51-57。
Ghirardi, M. L., Togasaki, R. K., and Seibert, M. (1997) Applied Biochemistry and Biotechnology 63-5, 141-151。
【０１２１】
Gray, M.W. and Boer, P.H. (1988) Organization and expression of algal (Chlamydomonas reinhardtii) mitochondrial DNA. Phil. Trans. R. Soc. Lond. B 319, 135-147。
Gu, D.M. and Newton, K.J. (1993)Analysis of Leaf Sectors in the NCS6 Mitochondrial Mutant of Maize.Plant Cell 5, 963-971。
Gumpel, N.J. and Purton, S. (1994) Playing tag with Chlamydomonas. Trends Cell Biol 4, 299-301。
Happe, T., and Kaminski, A. (2002) Eur J Biochem269, 1022-1032。
Harris, E. (1989) The Chlamydomonas Sourcebook: A Comprehensive Guide to Biology and Laboratory Use. Academic Press, San Diego, USA。
【０１２２】
Heldt, W. H., Werdan, K., Milovancev, M. & Geller, G. Alkalization of the chloroplast stroma caused by light-dependent proton flux into the thylakoid space. Biochim Biophys Acta 314, 224-41 (1973)。
Hess, J.F., Parasi, M.A., Bennett, J.L. and Clayton, D.A. (1991) Impairment of mitochondrial transcription termination by a point mutation associated with the MELAS subgroup of mitochondrial encephalomyopathies. Nature 351, 236-239。
Hoefnagel, M.H.N., Atkin, O.K. and Wiskich, J.T. (1998) Interdependence between chloroplasts and mitochondria in the light and the dark. Biochim Biophys. Acta1366, 235-255。
Hoffert, M. I. et al. Energy implications of future stabilization of atmospheric CO2 content. Nature 395, 881-884 (1998)。
Horton, P., Allen, J.F., Black, M.T. and Bennett, J. (1981) Regulation of phosphorylation of chloroplast membrane polypeptides by the redox state of plastoquinone. FEBS Lett. 125, 193-196。
【０１２３】
Husic, D.W. and Tolbert, N.E. (1987) Inhibition of glycolate and D-lactate metabolism in a Chlamydomonas reinhardtii mutant deficient in mitochondrial respiration. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 1555-1559。
Kindle, K.L., Schnell, R.A. Fernandez, E. and Levebvre, P.A. (1989) Stable nuclear transformation of Chlamydomonas using the Chlamydomonasgene for nitrate reductase. J.Cell Biol. 109, 2589-2601。
Kromer, S. and Heldt, H.W. (1991) On the role of mitochondrial oxidative phosphorylation in photosynthesis metabolism as studied by the effect of oligomycin on photosynthesis in protoplasts and leaves of barley. Plant Physiol. 95, 1270-1276。
Kromer, S., Stitt, M. and Heldt, H.W. (1988) Mitochondrial oxidative phosphorylation participating in photosynthetic metabolism of a leaf cell. FEBS Lett.226, 352-356。
Kruse, B., Narasimhan, N. and Atardi, G. (1989) Termination of transcription inhuman mitochondria: identification and purification of a DNA binding protein factor that promotes termination. Cell 58, 391-397。
【０１２４】
Kruse, O. Light-induced short-term adaptation mechanisms under redox control in the PS II-LHCII supercomplex: LHC II state transitions and PS II repair cycle. Naturwissenschaften 88, 284-92 (2001)。
Kruse, O., Nixon, P.J., Schmid, G.H. and Mullineaux, C.W. (1999) Isolation of state transition mutants of Chlamydomonas reinhardtii by fluorescence video imaging. Photosynth. Res. 61, 43-51。
Lee, J. W., Greenbaum, E. A new oxygen sensitivity and its potential application in photosynthetic H2 production. Applied Biochemistry and Biotechnology Vol. 105-108 (2003) 303-313。
Lemaire, S.D., Collin, V., Keryer, E., Quesada, A. & Miginiac-Maslow, M. Characterization of thioredoxin, a new type of thioredoxin identified in the genome of Chlamydomonas reinhardtii. FEBS Lett 543, 87-92 (2003)。
Loguericio, P.P., Roberti, M., Musicco, C., Gadaleta, M.N., Quagliariello, E. and Cantatore, P. (1999) Cloning and characterisation of mtDBP, a DNA-binding protein which binds two distinct regions of sea urchin mitochondrial DNA. Nucleic Acids Res. 27, 1890-1899。
【０１２５】
Lown, F.J., Watson, A.T. and Purton, S. (2001) Chlamydomonas nuclear mutants that fail to assemble respiratory or photosynthetic electron transfer complexes. Biochem. Soc. Trans. 29(4), 452-455。
Melis, A., Zhang, L. P., Forestier, M., Ghirardi, M. L., and Seibert, M. (2000) Plant Physiology 122, 127-135。
Melis, A., and Happe, T. (2001) Plant Physiol 127, 740-748。
Michel, K.-P., Kruger, F., Puhler, A. and Pistorius, E.K. (1999) Molecular characterisation of idiA and adjacent genes in the cyanobacteria Synechococcussp. strains PCC6301 and PCC 7942. Microbiology 145, 1473-1484. Millenaar,F.F. and Lambers,H. (2003) The alternative oxidase: In vivo regulation and function. Plant Biol. 5, 2-15。
Miyamoto, K. in FAO Agricultural Services Bulletin (ed. Miyamoto, K.) (FAO - Food and Agriculture Organization of the United Nations, Osaka University, Osaka, Japan, 1997)。
【０１２６】
Murata, N. (1969) Control of excitation transfer in photosynthesis. I. Light-induced change of chlorophyll a fluorescence in Porphyridium cruentum. Biochim. Biophys. Acta 172, 242-251。
Nelson, J.A.E., Savereide, P.B. and Lefebvre, P.A. (1994) The CRY1 Gene in Chlamydomonas reinhardtii: Structure and use as a dominant selectable marker for nuclear transformation. Mol. Cell. Biol. 14(6), 4011-4019。
Nijtmans, L.G.J., Taanman, J.-W., Muijsers, A.O., Speijer, D. and Van Den Bogert, C. (1998) Assembly of cytochrome-c oxidase in cultured human cells. Eur. J. Biochem. 254, 389-394。
Nurani, G., Erikson, M., Knorpp, C., Glaser, E. and Franzen, L.-G. (1997) Homologous and heterologous import into mitochondria isolated from the green alga Chlamydomonas reinhardtii. Plant Mol. Biol. 35, 973-980。
Petit, J. R. et al. Climate and atmospheric history of the past 420,000 years from the Vostok ice core, Antarctica. Nature 399, 429-436 (1999)。
【０１２７】
Pfannschmidt, T., Nilsson, A. and Allen, J. (1999) Photosynthetic control of chloroplast gene expression. Nature 397(6720), 625-628。
Purton, S. and Rochaix, J.D. (1995) Characterisation of the Arg7 gene of Chlamydomonas reinhardtii and its application to nuclear transformation. Eur.J. Phycol. 30, 141-148。
Rasmusson, A.G. and Moller, I.M. (1991) NAD(P)H dehydrogenases on the inner surface of the inner mitochondrial membrane studied using inside-out submitochondrial particles. Physiol. Plant. 83, 357-365。
Rebeille, F. and Gans, P. (1988) Interaction between chloroplasts and mitochondria in microalgae. Plant Physiol. 88, 973-975。
Rifkin, J. The Hydrogen Economy (Penguin Putnam Inc., New York, 2002)。
【０１２８】
Rintamaki, E., Martinsuo, P., Pursiheimo, S. and Aro, E.M. (2000) Cooperative regulation of lightharvesting complex II phosphorylation via the plastoquinol and ferredoxin-thioredoxin system in chloroplasts. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97(21), 11644-11649。
Roberti, M., Polosa, P.L., Bruni, F., Musicco, C., Gadaleta, M.N. and Cantatore, P. (2003) DmTTF, a novel mitochondrial transcription termination factor that recognises two sequences of Drosophila melanogaster mitochondrial DNA. Nucl. Acids Res. 31, 1597-1604。
Rupprecht, J., Kruse, O. & Hankamer, B. Evaluating the feasibility of implementing a global zero-CO2 emission energy strategy. Energy(submitted) (2004)。
Schonfeld, C. et al. MOC1, a transcription factor essential for mitochondrial light acclimation in C. reinhardtii. J Biol Chem (submitted) (2004)。
Selwood, S.P., Chrzanowska-Lightowlers, Z.M.A. and Lightowlers, R.N. (2000) Does the mitochondrial trancription termination complex play an essential role in controlling differential transcription of mitochondrial DNA? Biochem. Soc. Trans.28(2), 154-159。
【０１２９】
Singh, D.P. and Varna, K. (1995) Response of the wild-type and high light-tolerant mutant of Anacystis nidulans against photooxidative damage: Differential mechanism of high light tolerance. Photochem. Photobiol. 62(2), 314-319。
Stephenson, M., and Stickland, L. H. (1931) Biochem J. 25, 205-214。
Strauss, C., Mussgnug, J. and Kruse, O. (2001) Ligation-mediated suppression-PCR as a powerful tool to analyse nuclear gene sequences in the green alga Chlamydomonas reinhardtii. Photosynth. Res. 70, 311-320。
Svensson, A.S. and Rasmusson, A.G. (2001) Light-dependent gene expression for proteins in the respiratory chain of potato leaves. Plant J. 28, 73-82。
Tam, L.W. and Lefebvre, P.A. (1993) The use of DNA insertional mutagenesis to clone genes in Chlamydomonas. Genetics 135, 375-384。
【０１３０】
Thomas, C.D. et al. Extinction risk from climate change. Nature 427, 145-148 (2004)。
Trebst, A. (1980) Inhibitors in electron flow: tools for the functional and structural localization of carriers and energy conversion sites. Methods Enzymol. 69, 675-715。
Vener, A.V., van Kann, P.J., Rich, P.R., Andersson, B. and Ohad, I.(1997) Plastoquinol at the Qo-site of reduced cytochrome b6/f mediates signal transduction between light and thylakoid phosphorylation. Thylakoid protein kinase deactivation by a single turnover flash. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94,1585-1590。
Vener, A.V., Rokka, A., Fulgosi, H., Andersson, B. and Herrmann, R.G. (1999) A clophilin-regulated PP2A-like protein phosphatase in thylakoid membranes of plant chloroplasts. Biochemistry 38(45), 14955-14965。
Wollman, F. A. State transitions reveal the dynamics and flexibility of the photosynthetic apparatus. EMBO J 20, 3623-3630 (2001)。
【０１３１】
Zerges, W. and Rochaix, J.-D. (1998) Low density membranes are associated with RNA-binding proteins and thylakoids in the chloroplast of Chlamydomonas reinhardtii. J Cell Biol. 140(1), 101-10。
Zito, F., Finazzi, G., Delosme, R., Nitschke, W., Picot, D. and Wollman, F.-A. (1999) The Qo site of cytochrome b6f complexes controls the activation of the LHCII kinase. EMBO J. 18(11), 2961-2969。
【図面の簡単な説明】
【０１３２】
【図１】好気的条件或いは嫌気的条件下でのＳｔｍ６或いはＷＴにおける光合成Ｈ２生産に関連する各生化学的経路を示す図である。各区分は、葉緑体（ＣＨＬ）、サイトゾル及びミトコンドリア（ＭＩＴ）を示す。濃い矢印及び薄い矢印はそれぞれ電子及びプロトンの流れを示し、濃い線及び薄い線は同時のプロトン及び電子の流れを示す。○で囲った黒の×は阻害された経路を示す。○で囲った黒の矢印はダウンレギュレートされた経路を示す。
【図２】好気的条件或いは嫌気的条件下でのＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉの葉緑体におけるＨ＋／ｅ−の流れを示す。 ａ：好気的条件下、ＰＳＩＩの水分解（water splitting）反応由来の電子を光合成電子輸送鎖に沿って通過させる（黒実線矢印）。これは、ＮＡＤＰＨ及びデンプンの生成に使用する前に、プラストキノン（ＰＱ）、シトクロムｂ６ｆ（Ｃｙｔ ｂ６ｆ）、光化学系Ｉ（ＰＳＩ）、及びフェロドキシン（ferrodoxin）（Ｆｄ）経由で行う。ＰＳＩＩ及びＰＱ／ＰＱＨ２サイクルがチラコイド内腔に放出したＨ＋（プロトンの流れを薄灰色実線矢印で示す）はプロトン勾配を形成し、この勾配によってＡＴＰシンターゼによるＡＴＰ生成が駆動される。破線は、Ｓｔｍ６において阻害されたＨ＋（薄灰色）及びｅ−（黒）の移動経路を示す。 ｂ：嫌気的条件下、デンプン及びＮＡＤＰＨに貯蔵されたＨ＋／ｅ−をＨ２生産のためのＨｙｄＡに供給する。Ｓｔｍ６においては循環的電子輸送（ＦｄとＣｙｔ ｂ６ｆとを結ぶ黒破線）が阻害される。
【図３】野生株（ＷＴ）と変異体（Ｍ）Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉのＨ２生産特性を示す。 Ａ：ＷＴ及びＳｔｍ６ Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ培養物の長期間水素生産。溶解Ｈ２濃度の測定は、クラーク型水素センサシステム（デンマーク国、ユニセンス（UniSense））と暗所増殖させた１リットルのＷＴ及びＳｔｍ６細胞培養物（照射あたりの細胞密度ＯＤ７５０ｎｍ＝０．８は等しい）を用いて行った。硫黄非存在下においては、Ｓｔｍ６の生産するＨ２量はＷＴの３．５倍多かった（即ち、面積積分値１４６／４１＝３．５）。 Ｂ：ガス質量分析により推定した、野生株及びＳｔｍ６ Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ培養物の水素生産に対する光強度の影響。様々な照射レベルで１分間連続照射したときの（暗所で３０分置いた）ＷＴ及びＳｔｍ６細胞による水素発生（相対速度）。Ｓｔｍ６は常に、野生株に比べて（ピークの表示で示すように）５００〜７００％高い速度で水素を生産した。 Ｃ：水素クラーク電極測定値（ユニセンス（UniSense））により推定されるように、アンカップラーであるＣＣＣＰは、ＷＴに比べて約１５００％高いレベルでＨ２生産速度を安定させる。これは、ＨｙｄＡ活性は基質供給速度により限定され得ることを示している。
【図４】ＷＴ及び高Ｈ２生産変異体Ｃ．ｒｈｅｉｎｈａｒｄｔｉｉの染色切片の電子顕微鏡写真である。Ｃ−葉緑体、Ｇ−ゴルジ、Ｍ−ミトコンドリア、Ｎ−核、Ｓ−デンプン。尚、１）変異体のグラナはＷＴに比べて層数が少ない。これは変異体の光捕捉特性を示唆している。変異体には、デンプンの形の炭水化物が多く貯蔵されているように見られる。水由来のＨ＋及びｅ−は、ＨｙｄＡによってＨ２に変換される前はデンプンに貯蔵されている。
【図５】葉緑体における光誘起短時間適応機構の分析結果を示す。 ａ）ＷＴ、Ｂ１３及びＳｔｍ６において７７Ｋ蛍光分光分析によって分析した状態遷移 ｂ）状態２及び状態１においてＴＡＰ寒天プレート上で行ったＷＴ、Ｂ１３及びＳｔｍ６の蛍光ビデオ画像（化学線６２０ｎｍ光照射±１５分 ７１０ｎｍＰＳＩ光照射） ｃ）状態２適用ＷＴ及びＳｔｍ６細胞から単離したチラコイド膜のインビボリン酸化タンパク質パターン
【図６】Ｓｔｍ６は光ストレスに対して感受性を有することを示す。 ａ）ＷＴ、Ｂ１３及びＳｔｍ６株。ＴＡＰ培地中、対数増殖期中期まで培養し、１０００μｍｏｌ ｍ−２ｓ−１の白色光に４時間曝露した後、ＴＡＰ寒天プレート上に接種し４０μｍｏｌ ｍ−２ｓ−１の白色光下７日間増殖させた。 ｂ）高レベル光細胞生残率。ＷＴ、Ｂ１３及びＳｔｍ６株に対し４時間に亘って高レベル光処理を行った。細胞は、光処理に先立ち、１×１０４個／ｍＬに希釈した。
【図７】２個のｐＡｒｇ７．８プラスミドの縦列核挿入によって影響を受けたＳｔｍ６のゲノムＤＮＡ部位を示す。 −染色体歩行（ＬＭＳ−ＰＣＲ）後の配列解析による、及び： −特異的ｍｏｃ１、ｔｏｃ１、ｐＡｒｇ７．８の各プライマーを用いたＰＣＲ解析による。 ２本の黒矢印の組は、ＰＣＲに用いた各プライマーを示す。 ２本の灰色矢印は、ＷＴにおける核挿入の組込み部位を示す。
【図８】ＭＯＣ１のタンパク質配列、及びヒト転写終結因子ｍＴＥＲＦとのアライメントを示す。この模式図及び黒枠は、ＭＯＣ１におけるミトコンドリアトランジット配列及び特定されたｍＴＥＲＦドメイン構造の位置を示す。
【図９】ＷＴ、Ｓｔｍ６及びＢ１３のウェスタン解析及びＡＴＰ測定値レベルを示す。 ａ）シトクロムオキシダーゼサブユニットＣＯＸ９０に特異的な抗体を用いた光増殖細胞のイムノブロット。 ｂ）抗ペプチド抗体を用いたイムノブロット。ＭＯＣ１が葉緑体ではなくミトコンドリアに局在化していることを示すため（葉緑体及びミトコンドリアに対する対照としてそれぞれ抗Ｄ２及び抗Ｃｙｔ c ブロットを行った）、及びＳｔｍ６におけるＡＯＸ１のアップレギュレーションを示すために行った。濃度計で測定した交差反応の相対強度を示す。 ｃ）光増殖或いは暗所増殖させたＷＴ、Ｓｔｍ６及びＢ１３細胞のＡＴＰレベル。
【図１０】光誘起ミトコンドリア転写調節におけるＭＯＣ１の役割を示す。 ａ）暗所増殖培養物、及び暗所増殖後に光照射（３時間、２００μｍｏｌ ｍ−２ｓ−１）した培養物のｎａｄ２及びｃｏｘ１の半定量的ＲＴ−ＰＣＲ；ｍＲＮＡレベルはアクチンに標準化した。 ｂ）暗所増殖ＷＴ及び光照射増殖ＷＴから単離した全ＲＮＡのｍｏｃ１ノーザンブロット。 ｃ）高レベル光（８００μｍｏｌ ｍ−２ｓ−１）に０〜１８０分曝露したＷＴ細胞から単離したミトコンドリアの抗ＭＯＣ１及び抗シトクロムイムノブロット。対照としてＳｔｍ６ブロットを行った。 ｄ）ＷＴ及びＳｔｍ６から単離したミトコンドリアにおけるシトクロムオキシダーゼ活性測定値（３時間、２００μｍｏｌ ｍ−２ｓ−１）。
【図１１】高光ストレス時のミトコンドリア呼吸電子輸送調節におけるＭＯＣ１の役割と、葉緑体における光誘起レドックス対照プロセスに対するその影響とを説明するモデルを示す。灰色の枠は細胞小器官を示す。
【図１２】溶解酸素濃度測定値を示す。 パネルＡ：一定照射下、硫黄飽和ＴＡＰ培地中細胞培養を行い、時間＝０において硫黄除去ＴＡＰ培地に移した。 パネルＢ：光培養細胞調製物（３０μｇ Ｃｈｌ／ｍＬ）±５ｍＭ ＫＣＮを用いて暗所で細胞呼吸測定を行った。
【図１３】循環的電子輸送の分光分析測定を示すグラフである。測定は、２０μＭジクロロフェニルジメチル尿素（ＤＣＭＵ：ＰＳＩＩからｃｙｔｂ６ｆへのｅ−の輸送を阻害する）又は５μＭ ２，５−ジブロモ−６−イソプロピル−３−メチル−１，４−ベンゾキノンの存在下、ｃｙｔ ｆの光誘起レドックス変化を測定することにより行った。上向き矢印：光オン、下向き矢印：光オフ。吸光度は、ｃｙｔ ｆの酸化に対応して減少する。
【図１４】ＷＴ Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ及びＳｔｍ６におけるＰＳＩＩ及びＰＳＩ活性レベルを示すグラフである。
【図１５】ＷＴ Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ及びＳｔｍ６細胞培養物におけるリンゴ酸ＮＡＤＰＨ−デヒドロゲナーゼ活性測定値を示すグラフである。
【図１６】低光レベルにおけるＳｔｍ６及び野生株Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉの増殖速度の比較を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は水素の生産に関し、より詳細には、天然の水素生産能を有する光合成微生物における水素生産の向上に関する。特に本発明は、ヒドロゲナーゼによって水から水素を生産できるシアノバクテリアや藻類等の光合成微生物に関する。本発明はまた、水素生産を向上させるために、これら微生物の生理機能を操作することに関する。
【背景技術】
【０００２】
未来に向けて、クリーンで持続可能であると共に経済的に実行可能なエネルギー供給の開発は、我々の世代における最も切迫した課題の一つとなっている。産油量は、今後５〜３０年程でピークを迎えると考えられており、経済的に利用しうる石油埋蔵量の大部分は２０５０年までに枯渇するとされている。しかしながら、最近の報告によれば、産油量は既に２０００年がピークであった可能性が示唆されている。水素経済の実現には、クリーンで持続可能であり経済的な水素生産方法が必要となる。現在、水素生産の殆どは非再生可能資源の利用（即ち、天然ガスの水蒸気改質や石炭ガス化、更には原子力を利用した水の電気分解）に依存している。これらのアプローチは、当初は水素経済への移行を押し進めるものと思われたが、生成した水素は、その源である非再生可能エネルギー源より高価で且つ含有エネルギーが低い。更に、化石燃料と原子力の使用は持続性に欠ける。従って、経済的に実行可能である水素生産手段を確立する必要性は明白である。
【０００３】
究極のエネルギー源が太陽エネルギーであることを考えると、光合成生物を利用した水素生産はとりわけ望ましい選択肢である。藻類生育池技術は光電池等の代替技術と比較して安価であると思われる。更に、そして製造時に最初のＣＯ２排出ペナルティーが課されることになる、他の全ての持続可能なエネルギーシステム（バイオマスを除く）とは対照的に、藻類は、その複雑な太陽光集光器を自ら組立てる一方、ＣＯ２を切り離して自らの中に取り込む（sequester）ことができるという利点を有する。従って、炭素取引が実施されるようになることを考えると、藻類の持つ固有の価値は一層注目される。
【０００４】
太陽エネルギーはデンプン、その他タンパク質等の分子の形態の中に捕捉・貯蔵される。続いて、これらの分子が燃料として用いられ、ミトコンドリアでの酸化的リン酸化プロセスによるＡＴＰ生成を駆動する（図１）。ある種の緑藻類は、嫌気的条件下、デンプンに貯蔵されたＨ＋とｅ−からＨ２生産を行う能力を進化させてきた。従って、藻類のバイオリアクタを用いた水素生産が有望視されている。光合成の第一の段階において、光化学系ＩＩ（ＰＳＩＩ）により生物学において知られた酸化反応のうち最も強力な酸化反応が駆動され、Ｈ２Ｏが酸素（Ｏ２）、プロトン（Ｈ＋）そして電子（ｅ−）に分解される（図１）。Ｏ２は大気中へ放出され、地球上の好気的生物の生命を維持する。生じたｅ−は、光合成のｅ−伝達鎖（図２）に沿って移動し、プラストキノン（ＰＱ）を介してＰＳＩＩからシトクロムｂ６ｆ（ｃｙｔｂ６ｆ）へ、次いで光化学系Ｉ（ＰＳＩ）に至り、最終的にはＮＡＤＰＨの生成に用いられる。この並行プロセス（光リン酸化）において、Ｈ＋はチラコイド内腔（図１）に放出されそこでＨ＋勾配が作られて、ＡＴＰ合成酵素によるＡＴＰ生成を駆動する。ＮＡＤＰＨとＡＴＰは続いてデンプンや他の生体分子の生成に用いられる。
【０００５】
ＡＴＰとＮＡＤＰＨ／ＮＡＤＨは、全生細胞にとって必須要素である。ＰＳＩＩを阻害(例えば、暗所におけるインキュベーションにより)すると、葉緑体での光リン酸化によるＡＴＰとＮＡＤＰＨの生成に利用されるＨ＋とｅ−の供給が阻止される。一時的には、ＰＳＩＩの阻害により引き起こされたＡＴＰとＮＡＤＰＨの不足は、ミトコンドリアのｅ−伝達鎖（図１）が媒介する好気呼吸（デンプンやタンパク質、脂質の代謝）により補われ得る。名称から分かるように、酸化的リン酸化にはＯ２が必要とされる。ミトコンドリアの複合体ＩＶの働きにより、Ｏ２はＨ＋とｅ−に結合し、Ｈ２Ｏが生成される（Ｈ２Ｏは、本質的にＨ＋とｅ−のシンク（sink；溜り場）として働く）（図１）。嫌気的条件下では、複合体ＩＶの働きが阻害され、複合体Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ及びシトクロムオキシダーゼ（複合体ＩＶとも呼ばれる）から構成されるｅ−伝達鎖の残部におけるｅ−伝達が阻止される。絶対嫌気的条件下では光合成生物の大部分が死滅する。しかしながら、緑藻類Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ等のごく一部の光合成生物は第３の機構を有し、ＡＴＰとＮＡＤＰＨ生成モードへ切替えることができる（図２）。光を照射した嫌気的条件において、これらの生物は葉緑体でＡＴＰを生成すると同時に、一時的なＨ＋／ｅ−のシンクとしてＨ２Ｏの代わりにＨ２を生成する。このプロセスには、葉緑体のストロマに存在するヒドロゲナーゼＨｙｄＡが関与している（フロリン（Florin）ら、２００１、ハッペ（Happe）とカミンスキ（Kaminski）、２００２）。ＨｙｄＡの転写及び活性は、Ｏ２によって強力に阻害される（ジラルディ（Ghirardi）ら、１９９７）。酸素感受性は、嫌気的条件になった時、そのことをＨｙｄＡに知らせる分子制御スイッチとして働くと考えられる。
【０００６】
明暗の遷移状態の光照射下におけるＡＴＰとＮＡＤＰＨ生成の最適化のため、植物や藻類はＬＨＣ状態遷移と呼ばれるレドックス制御調節機構（redox-controlled regulation mechanism）を発達させた。このプロセスは通常、集光アンテナ（ＬＨＣＩとＬＨＣＩＩ）のサイズ調節、特にこれら２個の光化学系間にＬｈｃｂタンパク質を往復させることによって、ＰＳＩとＰＳＩＩのターノーバー速度のバランスをとる（状態１：大きなＰＳＩＩアンテナ；状態２：大きなＰＳＩアンテナ）。緑藻Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉにおいては、このプロセスは線状から環状への光合成電子伝達への切替えをもたらし、その結果、ＰＳＩの還元側で、ｅ−に関しＦｅ−ヒドロゲナーゼＨｙｄＡと競合する。嫌気的条件下で状態１において阻害を受けた細胞は、Ｃｙｔｂ６ｆに電子を送り返す環状電子伝達を行わない。こうした条件では、Ｆｅ−ヒドロゲナーゼＨｙｄＡはもはやＣｙｔｂ６ｆ媒介の環状電子伝達と競合してＰＳＩ由来の電子を獲得する必要がない。
【０００７】
藻類のＨ２生産についての最初の報告は、１９３０年代にまで遡る（ステファンソン（Stephenson）とスティックランド（Stickland）、１９３１）。光照射下でＯ２による阻害にきわめて敏感な反応により、一定の緑藻類とシアノバクテリアがＨ２ガスを生産できることが発見された。光合成微生物を利用しＨ２ＯからＨ２を持続的に生産させることは極めて興味深いことであったが、２０００年になってメリス（Melis）とその共同研究者らがこの阻害を克服する方法について初めて報告した。（メリス（Melis）、２０００、米国特許出願第２００１／００５３４３号）。メリス（Melis）が記載するプロセスでは、Ｏ２を生成するＨ２Ｏスプリット反応（ＰＳＩＩにより触媒される）を、Ｏ２感受性Ｈ２生産反応（葉緑体ヒドロゲナーゼ（ＨｙｄＡ）によって触媒される）から一時的に分離することにより阻害を解消した。この分離は、まず、硫黄存在下でＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉを培養して内在性基質の貯蔵庫を構築し、次いで硫黄非存在下において培養することにより達成された。硫黄は、ＰＳＩＩの反応中心を構成するＤ１タンパク質のｄｅ ｎｏｖｏ合成に必要とされ、もちろん、その他多数の細胞構成有機成分の合成にも必要である。Ｄ１タンパク質の半減期は約３０分であり、最適でない条件では自身が駆動する強力な酸化反応により損傷を受ける。硫黄存在下では、活性型ＰＳＩＩが高レベルに維持され、Ｈ２ＯはＨ＋、ｅ−及びＯ２に分解される。硫黄欠乏培地での硫黄レベルが下がると、ＨｙｄＡによりＨ＋とｅ−は再結合されてＨ２を生産しＯ２によるヒドロゲナーゼの阻害が解消される。これにより初めて、野生型（ＷＴ）Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｔｉｉを用いた長期に亘るＨ２生産が容易に行えるようになった。
【０００８】
しかしながら、メリス（Melis）のプロセスは、実用面で大きな制約がある。実際の水素ガス蓄積率は細胞の有する光合成能のせいぜい１５〜２０％（メリス（Melis）とハッペ（Happe）、２００１）であり、またＳ欠乏下での藻類の水素生産は無期限に継続して行えないという本質的な制限がある。Ｓ除去から約４０〜７０時間後には収量が横ばいとなり減少し始め、Ｓ除去から約１００時間後には、各種の内在性基質を補充するために、藻類は通常の光合成状態に戻る必要がある。
【０００９】
国際公報ＷＯ０３／０６７２１３号には、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉを用いる水素生産プロセスが記載されており、これによると、この藻にアンチセンス配列を挿入することで遺伝的変更を加え、サルフェート透過酵素ＣｒｃｐＳｕｌＰの発現をダウンレギュレーションさせている。これは、水素生産を誘導するために必要とされる、含硫黄栄養素の成長培地からの物理的除去を不要とするもので、従来の硫黄除去技法を廃れさせたといわれている。この技法により細胞の硫黄取込み量を減少させると、葉緑体の主要タンパク質（ルビスコやＤ１、ＬＨＣＩＩ等）のレベルを実質的に低下させるだけでなく、それ以外のタンパク質の生合成に使用される硫黄も細胞から奪い取ってしまう。
【００１０】
結果として、持続性があり且つ効率のよい光合成利用水素生産プロセスであって、更に硫黄除去を解消できるプロセスを見極める必要がある。
【発明の概要】
【００１１】
本発明は、光照射下におけるミトコンドリアの酸化的リン酸化経路の調節の崩壊によって、葉緑体中のデンプンレベルの上昇、光合成循環的電子伝達の阻害、ＰＳＩＩによる酸素生産の低下という影響を細胞に与えるものの、ＰＳＩ及びＦｄへの線形電子伝達は許容されるため、ＰＳＩからの電子を受け入れるヒドロゲナーゼ（ＨｙｄＡ）は作用できると共に本来的な酸素阻害が低減するという驚くべき観察結果に基づくものである。
【００１２】
従って、本発明はその第１の様相において、水素の生産方法であって、
（ｉ）光合成微生物であって、光合成「光」反応を介し且つ酸化的リン酸化経路を伴う呼吸電子伝達鎖を介して電子伝達を行うことができると共にヒドロゲナーゼを発現し、酸化的リン酸化経路の調節が崩壊された結果、呼吸電子伝達鎖に沿ったシトクロムオキシダーゼ（複合体ＩＶ）への電子の流れが低減された光合成微生物を提供する段階と、
（ｉｉ）該微生物をマイクロオキシック条件及び照射条件下培養する段階と、
（ｉｉｉ）発生した水素を回収する段階とを含む方法を提供する。
【００１３】
種々の生物が、この方法に使用するのに生理学的に適している。とりわけ、水素生産の間接的基質として水を用いることができヒドロゲナーゼを含有する光合成微生物が用いられる。この例としては、シアノバクテリアや藻類、特に緑藻類だけでなく青緑藻類（例えばＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）や赤藻類、特にＣｈｌｏｒｏｃｏｃｃａｌｅｓやＶｏｌｖｏｃａｌｅｓ、とりわけＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｓｐｐ．（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ＭＧＡ１６１等）、Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ ｓｐｐ.（Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ ｏｂｌｉｑｕｕｓ等）、Ｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｍ ｓｐｐ．（Ｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｍ ｌｉｔｔｏｒａｌｅ等）、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｓｐｐ．（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｆｕｓｃａ等）、Ｐｌａｔｙｍｏｎａｓ ｓｐｐ．（Ｐｌａｔｙｍｏｎａｓ ｓｕｂｃｏｒｄｉｓｉｆｏｒｍｉｓ等）、Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ ｓｐｐ．（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ ｖａｇｉｎａｌｉｓ等）の藻類が挙げられる。中でも藻類Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉは、生物の遺伝操作のためのプロセスが十分開発されておりその一倍体ゲノムは既に配列解析されているため、特に好ましい。
【００１４】
酸化的リン酸化を崩壊させる任意の適切な手段を用いることができる。一実施形態においては、微生物が、ミトコンドリアの酸化的リン酸化経路の調節を崩壊させる一手段である。この場合、ｍｏｃ１ノックアウトの場合と同様、酸化的リン酸化を調節する核コードミトコンドリア転写終結因子の活性を低下させるかなくすることにより崩壊を行う。このような高い水素生産能を有する変異体はＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ Ｓｔｍ６である。Ｓｔｍ６は、試験条件下においては野生株の３．５〜７倍の速度で水素を生産することが分かった。
【００１５】
光合成電子輸送鎖からのＡＴＰシンターゼのアンカップラーを添加することにより、水素生産速度を更に上昇させることができる。アンカップラーの例としては、カルボニルシアニドｍ−クロロフェニルヒドラゾン（ＣＣＣＰ）、１，３−ジクロロ−ヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、塩化アンモニウム、ベンツリシジン（Venturicidin）、カルボニルシアニド ｐ−トリフルオロメトキシフェニルヒドラゾン（ＦＣＣＰ）、２，４−ジニトロフェノール、グラミシジン（Gramicidin）、ニゲリシン（Nigericin）が挙げられ、これらを用いることにより野生株の約１５倍の速度が達成される。このようなアンカップラーは、基本的にチラコイド内腔からストロマへのＨ＋の流れを増加させ、ストロマにおいてＨ＋はＨｙｄＡの基質として利用可能となる。
【００１６】
外部栄養源の存在下において好気性条件或いは嫌気性条件下、バイオマスを増大（expand）させるため、上述の微生物を照射条件下培養することができる。一実施形態においては、廃棄物流をこの培養の炭素源として用いると廃棄物流から炭素が除去されるため、これは例えば廃棄物流を処理して有機汚染物質を除去するのに有用であろう。更に、バイオマスを増大させるために、微生物を好気性条件下且つ照射条件下培養後、次の各段階、即ち、
ｉ）増大されたバイオマスをガス化する段階と、
ｉｉ）生産された水素を回収する段階とを行うことができる。
【００１７】
これは、嫌気性条件下で照射を行った場合に培養物から水素を直接回収する代替法を提供する。
【００１８】
本発明はその更なる様相において、光合成微生物であって、光合成「光」反応経路を介し且つ酸化的リン酸化経路を伴う呼吸電子伝達鎖を介して電子伝達を行うことができると共にヒドロゲナーゼを発現し、酸化的リン酸化経路の調節が崩壊された結果、呼吸電子伝達鎖に沿ったシトクロムオキシダーゼ（複合体ＩＶ）への電子の流れが低減された光合成微生物を提供する。
【００１９】
一実施形態においては、微生物は、藻類、例えばＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ、特にＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ Ｓｔｍ６（２００３年７月１日にＣＣＡＰ受託番号１１／１２９で藻類及び原生動物培養保存機関（Culture Collection of Algae and Protozoa）（ＣＣＡＰ）に寄託された）のＭｏｃ１ノックアウトである。
【００２０】
本明細書中では従来技術に係る多くの刊行物に言及したが、これらの文献のいずれかがオーストラリアや他の国において当分野の共通一般知識の一部を構成しているということを自認するものではないことは明確に理解されよう。
【００２１】
本明細書においては、「含む(comprising, comprises)」という単語は「含み、これらに限定されるものではない」という意味であることは明瞭に理解されるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
以下、実施例及び図面により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００２３】
光合成のレドックス制御調節にとって重要な細胞成分を特定するため、スクリーニングによって状態遷移が混乱した突然変異体を見出すというアプローチをとった。これは、光化学系Ｉと光化学系ＩＩの間の電子の流れ（ボナベンツラ（Bonaventura）とマイエルス（Myers）、１９６９；ムラタ（Murata）、１９６９）に関与する２種の光合成反応中心の励起の平衡を維持するレドックス制御機構である。プラストキノンプール（ＰＳＩＩとＰＳＩをつなぐ光合成電子伝達鎖の一成分）が極端に低減されると、移動性集光アンテナがＰＳＩＩから離れ、続いてレドックス活性化リン酸化（redox-activated phosphorylation）が起こってＰＳＩに入り、ＰＳＩの励起を増大させＰＱプールをより酸化する（いわゆる、状態２に入る）。ＰＱがより酸化されると逆のプロセスが起こる（状態１を達成するため）（アレン（Allen）ら、１９８１；ホートン（Horton）ら、１９８１）。ラピッドクロロフィル−蛍光ベーススクリーニング（rapid chlorophyll-fluorescence based screen）を用いて、状態遷移（状態１と状態２の内部転換）を阻害（クルース（Kruse）ら、１９９９；フレイヒマン（Fleichmann）ら、１９９９）したモデル生物である緑藻Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉのコロニーの同定を行い、状態遷移に重要な遺伝子を同定した。驚くべきことに、遺伝子産物は核にコードされたタンパク質のうち葉緑体ではなくミトコンドリアを標的とするタンパク質であることが分かり、ミトコンドリアの遺伝子発現の調節に関わる。
【００２４】
本明細書において「単離された(isolated)」とは、精製されたポリヌクレオチド分子或いはポリペプチド分子を意味する。本明細書に用いる場合、「精製された(purified)」とは、ネイティブな状態において通常結合している、実質的に全ての他の分子から分離されたポリヌクレオチド分子或いはポリペプチド分子を意味する。調製物の大部分を占める種が実質的に精製された分子であることがより好ましい。実質的に精製された分子とは、天然混合物の状態で（in the natural mixture）存在する他の分子種（溶媒を除く）の６０％超が除去されたものであり、好ましくは７５％除去、より好ましくは９０％除去、更に９５％除去されたものが最も好ましい。本明細書において「単離された」とはまた、天然のポリヌクレオチドに通常隣接結合（flank）している核酸を分離したポリヌクレオチド分子も意味する。よって、例えば組換え技法を用いた結果、通常は結合対象とならない調節配列或いはコード配列に結合した（fused）ポリヌクレオチドは、本明細書では単離されたとみなされる。このような分子は、例えば宿主細胞の染色体や核酸溶液中に存在していても単離されたとみなされる。本明細書において「単離された」と「精製された」という用語は、ネイティブな状態で存在する分子を包含することを意図したものではない。
【００２５】
本明細書において「野生型」とは、現在開示されている一以上の転写因子をノックアウト或いは過剰発現させる遺伝的変更を受けていない微生物を意味する。野生型生物を対照として用い、転写機能を改変した生物或いは異所的（ectopically）発現を行わせた生物（例えば、ノックアウト或いは過剰発現させた生物）と比較して、発現レベル、特性変化の程度及びその性質について知ることができる。
【００２６】
本明細書中の「配列同一性(sequence identity)」とは、最適整合された２種類のポリヌクレオチド配列或いはぺプチド配列が、各成分（例えば、ヌクレオチド或いはアミノ酸）の並びのウィンドウ（window）を通して一致する程度を意味する。試験配列と基準配列の位置あわせしたセグメントについて「同一フラクション(identity fraction)」とは、位置合わせした２つの配列が共に有する一致成分の個数を、基準配列セグメント（即ち、全基準配列或いは基準配列のより少ない特定部分）中の成分の全数によって除した数である。「一致率」とは、同一フラクション×１００である。周知の多数の方法を用いて、各配列の比較を行い一致率を求めることができる。このような方法としては例えば、数学的アルゴリズムを用いた方法（配列分析プログラムＢＬＡＳＴスイートのアルゴリズム等）を挙げることができる。
【００２７】
本明細書中、調節の「抑制(suppression)」或いは「破壊（disruption）」とは、調節タンパク質の活性低下を意味し、こうした活性の低下は各種機構、例えばアンチセンス、突然変異によるノックアウト或いはＲＮＡｉ等によって引き起こすことができる。アンチセンスＲＮＡによる場合、タンパク質の発現レベルが低下し、結果的にタンパク質活性が野生型の活性レベルよりも低いものとなる。タンパク質コード遺伝子の突然変異の場合、タンパク質の発現レベルを低下させる及び／又は発現したタンパク質の機能を妨害することによって、タンパク質の活性を低下させることができる。
【００２８】
本明細書中において「ポリペプチド」は、一方のアミノ酸のカルボキシル基と他方のアミノ酸のアミノ基がアミド結合によって共有結合的に結合された各アミノ酸残基からなる非分岐状鎖を意味する。ポリペプチドという用語は、タンパク質のフラグメントを包含し得ると共に、タンパク質全体（即ち、特定の遺伝子にコードされた機能タンパク質）を包含し得る。更に「タンパク質」は、一以上のポリペプチド鎖からなる分子をも含む。従って、本発明においてポリペプチドは、複数のポリペプチド鎖を有する機能性オリゴタンパク質の一部分のみならず、全遺伝子産物を構成することもできる。
【００２９】
本明細書に用いられる用語「ポリヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド配列」、「核酸配列」、「核酸フラグメント」及び「単離された核酸フラグメント」は相互変換可能である。これらの用語はヌクレオチド配列等を包含する。ポリヌクレオチドは、ＲＮＡ或いはＤＮＡの１本鎖或いは２本鎖のポリマーであり得、合成、非天然或いは改変したヌクレオチド塩基を含んでいてもよい。ＤＮＡポリマーの形態のポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ或いはそれらの混合物の一以上のセグメントからなり得る。各ヌクレオチド（通常、５’−１リン酸の形態）は、次の一文字表記によって表される。即ち、ＲＮＡ或いはＤＮＡの各場合において、「アデニル酸」或いは「デオキシアデニル酸」は「Ａ」、「シチジル酸」或いは「デオキシシチジル酸」は「Ｃ」、「グアニル酸」或いは「デオキシグアニル酸」は「Ｇ」、「ウリジル酸」は「Ｕ」、「デオキシチミジル酸」は「Ｔ」、プリン塩基（Ａ或いはＧ）は「Ｒ」、ピリミジン塩基（Ｃ或いはＴ）は「Ｙ」、Ｇ或いはＴは「Ｋ」、Ａ、Ｃ或いはＴは「Ｈ」、イノシンは「Ｉ」、そして、任意の一ヌクレオチドは「Ｎ」で表記する。
【００３０】
本明細書に使用する「機能的に等価であるところのサブフラグメント」と「機能的に等価であるサブフラグメント」は相互変換可能である。これらの用語は、遺伝子発現を改変する能力或いは一定の表現型を提供する能力を保持している単離された核酸フラグメントの一部分或いはそれに続く部分（subsequence）を意味し、該フラグメント或いはサブフラグメントが活性な酵素をコードしているかどうかは関係がない。例えば、該フラグメント或いは該サブフラグメントをキメラ遺伝子の設計に用いて、藻類を形質転換して所望の表現型をもたらすことができる。キメラ遺伝子は核酸フラグメント或いはそのサブフラグメントが活性な酵素をコードしているかどうかに関係なく、これと植物のプロモーター配列に対してセンス或いはアンチセンス方向に結合することによって機能抑制を行うように設計することができる。
【００３１】
本明細書に使用される「相同」、「相同な」、「実質的に同様」及び「実質的に対応している」は相互に置換え可能である。これらは、一以上のヌクレオチド塩基が異なっていても、各核酸フラグメントの有する遺伝子発現媒介能力或いは一定の表現型を提供する能力が変わらない核酸フラグメントを意味する。これらの用語はまた、本発明における核酸フラグメントの変更を意味する。これらの変更としては例えば、変更の結果生じた核酸フラグメントの機能的特性が未変更の元のフラグメントに対して実質的に変わらない一以上のヌクレオチドの欠失或いは挿入を挙げることができる。従って、本発明は例として用いた特定の配列以外の、当業者であれば想到するであろう配列も包含する。
【００３２】
更に、当業者には容易に理解されることであるが、中程度にストリンジェントな条件（例えば、０.５×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳ、６０℃）で、本明細書に例示した配列或いは本明細書に開示のヌクレオチド配列の一部とハイブリダイズし得れば、実質的に同様な核酸配列として本発明に包含され、これは本明細書に開示の核酸配列の任意のものと機能的に等価である。スクリーニング対象である或る程度似たフラグメント（例えば、遠縁生物由来の相同な配列）や高度に似たフラグメント（例えば、近縁生物からの機能的酵素の複製物を生じさせる遺伝子）等に応じて、ストリンジェントな条件を調整できる。ストリンジェントな条件はハイブリダイゼーション後の洗浄によって決まる。設定条件としては、始めに６×ＳＳＣ、０.５％ＳＤＳを用い室温で１５分間洗浄を行い、次いで２×ＳＳＣ、０.５％ＳＤＳを用い４５℃で３０分間行って、更に０.２×ＳＳＣ、０.５％ＳＤＳを用い５０℃で３０分間の洗浄を２回行う一連の洗浄を含む条件が好ましい。ストリンジェントな条件のより好ましい設定としては、より高温で洗浄を行うものであり、上述の洗浄の最終２回（３０分間、０.２×ＳＳＣ、０.５％ＳＤＳ使用）の温度を６０℃に上げる（それ以外は同様）。よりストリンジェントな条件の別の好ましい設定としては、最終２回の洗浄を０.１×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳを用いて６５℃で行う。
【００３３】
「遺伝子」とは、特定のタンパク質を発現する核酸フラグメントを意味し、コード配列前方に位置する調節配列（５’非コード配列）及び後方に位置する調節配列（３’非コード配列）を含む。「ネイティブ遺伝子」とは、天然の遺伝子で自身の調節配列を有する遺伝子を意味する。「キメラ遺伝子」とは、ネイティブ遺伝子ではない任意の遺伝子を意味し、天然には共存しない調節配列とコード配列を含む。従って、キメラ遺伝子は異なるソース由来の調節配列とコード配列を含んでいてもよいし、同一ソース由来であるが、天然のものとは異なる配置となっている調節配列とコード配列を含んでいてもよい。
【００３４】
「コード配列」とは、特定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を意味する。「調節配列」とは、コード配列上流（５’非コード配列）、コード配列内部或いはコード配列下流（３’非コード配列）に位置するヌクレオチド配列を意味し、これらの配列は、転写、ＲＮＡプロセシング、ＲＮＡの安定性、或いは関連のあるコード配列の翻訳に影響を及ぼす。
【００３５】
調節配列としては、プロモーターや翻訳リーダー配列、イントロン、ポリアデニル酸認識配列(polyadenylation recognition sequences)が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００３６】
「プロモーター」とは、コード配列或いは機能的ＲＮＡの発現を調節できるＤＮＡ配列を意味する。プロモーター配列は上流側近傍のエレメントと上流側のより遠方に位置するエレメントからなる。後者のエレメントはエンハンサーと呼ばれることが多い。従って、「エンハンサー」とは、プロモーター活性を刺激することができるＤＮＡ配列であり、エンハンサーはプロモーターの固有のエレメント或いは挿入された異種エレメントであり、プロモーターのレベル或いは組織特異性を向上させ得る。プロモーター全体がネイティブ遺伝子由来でもよいし、天然の各種プロモーターに由来する各種エレメントから構成されていてもよいし、或いは合成ＤＮＡセグメントを含んでいてもよい。各種プロモーターは、各種組織又は細胞型において、或いは各種発生段階で、或いは各種環境条件に応じて、遺伝子発現を指令し得ることは当業者に知られたところである。更に、調節配列としての正確な区分が完全には定義されていない場合が多いため、数種のバリエーションを有するＤＮＡフラグメントが同一のプロモーター活性を有することもあることが認識される。多くの細胞型においてよく(at most times)遺伝子を発現させるプロモーターは通常、「構成プロモーター（constitutive promoters）」と呼ばれる。
【００３７】
「翻訳リーダー配列」とは、遺伝子のプロモーター配列とコード配列の間に位置するポリヌクレオチド配列を意味する。翻訳リーダー配列は充分にプロセシングされたｍＲＮＡの翻訳開始配列上流に位置する。翻訳リーダー配列はｍＲＮＡの一次転写産物のプロセシング、ｍＲＮＡの安定性或いは翻訳効率に影響を与える。翻訳リーダー配列の例としては次の記載がある：ターナー（Turner），Ｒ．とフォスター（Foster），Ｇ．Ｄ．（１９９５）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３：２２５〜２３６。
【００３８】
「３’非コード配列」とは、コード配列下流に位置するＤＮＡ配列を意味し、ポリアデニル酸認識配列、及びｍＲＮＡプロセシング或いは遺伝子発現に影響を及ぼす調節シグナルをコードするその他の配列を含む。ポリアデニル酸シグナルは通常、ｍＲＮＡ前駆体３’末端へのポリアデニル酸トラクト（tracts）の付加に影響を及ぼすことを特徴とする。各種３’非コード配列の使用については、インゲルブレヒト（Ingelbrecht），Ｉ．Ｌ．ら（１９８９）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ、１：６７１〜６８０に例示されている。
【００３９】
「ＲＮＡ転写物」とは、ＲＮＡポリメラーゼの触媒作用によるＤＮＡ配列の転写によって生じた産物を意味する。ＲＮＡ転写物が対応のＤＮＡ配列と完全に相補的なコピーである場合、これは一次転写物と呼ばれる。ＲＮＡ転写物が、転写後のプロセシングを受けた一次転写物に由来するＲＮＡ配列である場合、これを成熟ＲＮＡと呼ぶ。「メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）」とは、イントロンが除かれ、細胞でタンパク質に翻訳され得るＲＮＡを意味する。「ｃＤＮＡ」とは、ｍＲＮＡと相補的で、ｍＲＮＡテンプレートから逆転写酵素により合成したＤＮＡを意味する。ｃＤＮＡは１本鎖であることもできるし、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノーフラグメントにより２本鎖とすることもできる。「センス」ＲＮＡとは、ｍＲＮＡを含み、細胞内或いはｉｎ ｖｉｔｒｏでタンパク質に翻訳され得るＲＮＡ転写物を意味する。「アンチセンスＲＮＡ」とは、標的とする一次転写物或いはｍＲＮＡの全部或いは一部に相補的であり、標的遺伝子の発現を阻害するＲＮＡ転写物を意味する（米国特許第５１０７０６５号）。アンチセンスＲＮＡは、特定の遺伝子転写物の任意の部分（即ち、５’非コード配列、３’非コード配列、イントロン或いはコード配列）と相補的であってもよい。「機能的ＲＮＡ」とは、アンチセンスＲＮＡ、リボザイムＲＮＡ、或いは細胞内プロセスに影響を及ぼすが翻訳されないことがあるその他のＲＮＡを意味する。本明細書中、ｍＲＮＡ転写物について使用される用語「相補」と「逆相補」は相互変換可能であり、その情報のアンチセンスＲＮＡを示す。
【００４０】
「操作可能に結合(operably linked)」とは、単一の核酸フラグメントに核酸配列を結合させ、一方の機能を他方により調節させる結合を意味する。例えば、プロモーターがコード配列に結合しそのコード配列の発現を調節できる場合（即ち、該コード配列はプロモーターによる転写制御を受けている）、プロモーターはコード配列と操作可能に結合している。コード配列は調節配列に、センス方向或いはアンチセンス方向に操作可能に結合させることができる。別の例では、本発明における相補的なＲＮＡ領域は、標的のｍＲＮＡの５’、標的のｍＲＮＡの３’或いは標的のｍＲＮＡ内部に操作可能に結合させることができる（直接或いは間接的に）。ここで、最初の相補性領域が５’である場合、その相補物は標的とするｍＲＮＡの３’である。
【００４１】
本明細書中で用いる標準的な組換えＤＮＡ技法と分子クローニング技法は、本技術分野において周知であり、サムロック（Sambrook），Ｊ．、フリッチ（Fritsch），Ｅ．Ｆ．及びマニアティス（Maniatis），Ｔ．によるＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，１９８９に詳細な記載がある。形質転換法については当業者に周知であり、次に説明する。
【００４２】
「組換え」とは、異なる方法で分離された２種類の配列セグメントの人工的な組合せ（例えば、化学合成による、或いは単離した核酸セグメントの遺伝子工学技法を用いた操作による）を意味する。
【００４３】
本明細書中に使用する用語「組換え構築物」、「発現構築物」、「キメラ構築物」、「構築物」及び「組換えＤＮＡ構築物」は相互変換可能である。組換え構築物は核酸フラグメントの人工的な組合せ（例えば、天然にはない調節配列とコード配列の組合せ）を含む。例えば、キメラ構築物は異なるソース由来の調節配列とコード配列を含んでいてもよいし、同一ソース由来の調節配列とコード配列を含んでいてもよいが、天然のものとは異なる配置となっている。このような構築物はそれ自体で使用することもできるし、ベクターと共に用いることもできる。当業者に周知のように、ベクターを使用する場合には、宿主細胞を形質転換させる方法に応じてベクターを選択する。例えば、プラスミドベクターを用いることができる。宿主細胞の形質転換を首尾よく行い、本発明における単離した核酸フラグメントを含む宿主細胞を選択し増殖させるために、当業者はベクターに存在させるべき遺伝的エレメントを熟知している。当業者はまた、個々の独立した形質転換イベントに応じて、発現レベルや発現パターンが異なるということを認識し（ジョーンズ（Jones）ら（１９８５）ＥＭＢＯ Ｊ．４：２４１１〜２４１８；デ アルメイダ（De Almeida）ら（１９８９）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２１８：７８〜８６）、これにより、所望の発現レベル及び発現パターンを示す株を得るためには多数のイベントをスクリーニングする必要があることを認識する。このようなスクリーニングは、ＤＮＡを対象としたサザン分析、ｍＲＮＡの発現を対象としたノザン分析、タンパク質発現を対象としたイムノブロッティング分析、或いは表現型分析等を用いて行うことができる。本明細書中において「発現」とは、機能的な最終産物（ｍＲＮＡ或いはタンパク質（前駆体或いは成熟体）等）の産生を意味する。
【００４４】
「成熟した」タンパク質とは、翻訳後にプロセシングされたポリペプチドを意味する。即ち、一次翻訳産物に存在するプレペプチド或いはプロぺプチドが除去されたタンパク質である。「前駆体」タンパク質とは、ｍＲＮＡが翻訳された一次産物を意味する。即ち、プレペプチドとプロペプチドが存在している状態のタンパク質である。プレペプチド及びプロペプチドは細胞内局在化シグナルであり得るが、これらに限定されない。
【００４５】
「安定性形質転換」とは、宿主生物のゲノム（核ゲノムとオルガネラゲノムのいずれも含む）への核酸フラグメントの伝達を意味し、これにより遺伝学的に安定な形質を獲得する。一方、「一過性形質転換」とは、宿主生物の核或いはＤＮＡ含有オルガネラへの核酸の伝達を意味し、組込まれずに遺伝子発現が行われ、従って安定な遺伝形質の獲得には至らない。核酸フラグメントを含有する形質転換された宿主生物は「トランスジェニック」生物と呼ばれる。
【００４６】
「アンチセンス阻害」とは、標的タンパク質の発現を抑制することが可能なアンチセンスＲＮＡ転写物の産生を意味する。「共抑制」とは、同一或いは実質的に同様な外来遺伝子或いは内在性遺伝子（endogenous genes）の発現を抑制することが可能なセンスＲＮＡ転写物の産生を意味する（米国特許第５２３１０２０号）。植物においては、内在性ｍＲＮＡと相同性を有する核酸配列（センス方向）の過剰発現に着目して、既に共抑制構築物が設計されており、過剰発現した配列と相同性を有するＲＮＡがいずれも減少した（バウチェレト（Vaucheret）ら（１９９８）Ｐｌａｎｔ Ｊ. １６：６５１〜６５９；グラ（Gura）（２０００）Ｎａｔｕｒｅ ４０４：８０４〜８０８参照）。この現象の全体的な効率は低く、ＲＮＡ減少の程度は様々に変化する。最近の研究によれば、ｍＲＮＡコード配列の全部或いは一部を相補的方向に組入れた「ヘアピン」構造（発現ＲＮＡが「ステムループ」構造になり得る）の使用についての記載がある。これにより、再生した（recovered）トランスジェニック植物における共抑制の頻度が上昇する。ヘアピン構造には、ヘアピンのステム或いはループを形成する標的ＲＮＡが含まれていてもよい。他に、植物ウィルスの配列を用いて、近傍のｍＲＮＡコード配列を抑制（すなわち「サイレンシング」）させる例も記載されている（国際公開ＷＯ９８／３６０８３）。いずれの共抑制現象もその機構については未だ明らかでないとはいえ、遺伝学的証拠によりこの複雑な現象が解明されつつある（エルマヤン（Elmayan）ら（１９９８）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １０：１７４７〜１７５７）。
【００４７】
抑制に使用するポリヌクレオチド配列は、抑制対象となる遺伝子中のポリヌクレオチド配列と必ずしも１００％相補的である必要はない。抑制対象のポリヌクレオチドと少なくとも７５％同一であるポリヌクレオチドは、所望の標的物に対し効果的な抑制作用を示した。該ポリヌクレオチドは所望の標的物に対し、少なくとも８０％同一、好ましくは少なくとも９０％同一、より好ましくは少なくとも９５％同一である必要があり、１００％同一であってもよい。
【００４８】
一実施形態においては、アンチセンス分子を用いて核遺伝子の発現のダウンレギュレーションを行い、ｍｏｃ１等の細胞のミトコンドリア活性を調節する。アンチセンス試薬としては、アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）やネイティブな核酸に化学修飾を施し特別に合成したＯＤＮ、ＲＮＡのようなアンチセンス分子を発現する核酸構築物を挙げることができる。アンチセンス配列は標的遺伝子のｍＲＮＡと相補的であり、標的とする遺伝子産物の発現を抑制する。アンチセンス分子は種々の機構を介して、例えば、翻訳に用いられるｍＲＮＡ量を低減させたり、ＲＮＡｓｅ Ｈを活性化させたり、或いは立体障害をもたらして遺伝子発現を阻害する。各アンチセンス分子は単独或いは組み合わせて用いることができ、組合せた場合は２以上の異なる配列を含んでいてよい。
【００４９】
アンチセンス分子は、標的とする遺伝子配列の全部或いは一部を好適なベクターに組込んで発現させ生成できる。ベクター中、転写開始はアンチセンス鎖がＲＮＡ分子として生成されるように方向付ける。或いは、アンチセンス分子は合成オリゴヌクレオチドである。配列長としては１０〜３０００ヌクレオチドが好ましく、より好ましくは１００〜２０００ヌクレオチド、更に好ましくは６００〜１２００ヌクレオチド、最も好ましくは８００〜１０００ヌクレオチドである。この長さは、阻害効率や特異性（例えば、交差反応が生じない）等に応じて決定する。しかしながら、７〜８塩基長の短オリゴヌクレオチドが遺伝子発現を強力且つ選択的に阻害する例も知られている（ワグナー（Wagner）ら（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：８４０〜８４４参照）。
【００５０】
内在性センス鎖ｍＲＮＡ配列の領域のうち、既述遺伝子配列（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＦ５３１４２のｍｏｃ１の遺伝子配列）に基づいて作製したアンチセンス配列と相補的である特定の一領域或いは複数の領域が選択される。オリゴヌクレオチドの特定配列は、いくつかの候補配列についてアッセイを行い、ｉｎ ｖｉｖｏモデルにおける標的遺伝子の発現阻害を調べる経験的方法を用いて選択することができる。各配列は組み合わせて用いてもよく、この場合アンチセンス配列と相補性を有するｍＲＮＡ配列の数領域が選ばれる。
【００５１】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは本技術分野において公知の方法により化学的に合成できる（ワグナー（Wagner）ら（１９９３）上掲、参照）。細胞内安定性と結合親和性を向上させるために、ネイティブなホスホジエステル構造に化学修飾を施したオリゴヌクレオチドが好ましい。
【００５２】
本発明の核酸組成物は、標的とするポリペプチドの全部或いは一部をコードし得る。ＤＮＡ配列の２本鎖或いは１本鎖フラグメントは、従来法（制限酵素による消化、ＰＣＲ増幅法等）に従って化学的にオリゴヌクレオチドを合成することにより得られ得る。大部分の場合、ＤＮＡフラグメントは少なくとも２５ｎｔであり、通常は少なくとも５０ｎｔ、７５ｎｔ或いは１００ｎｔであるが、２００ｎｔ、２４０ｎｔ、２７０ｎｔ、３００ｎｔ、更には４００ｎｔであってもよい。小さなＤＮＡフラグメントはＰＣＲ用プライマー、ハイブリダイゼーション用スクリーニングプローブ等として有用である。ＰＣＲ等の増幅反応に用いる場合、一対のプライマーが使用される。プライマー配列の正確な組成は本発明にとって重要ではないが、本技術分野で知られているように、大抵の場合、プライマーはストリンジェントな条件で本発明における配列にハイブリダイズする。少なくとも約５０ｎｔ、好ましくは少なくとも約１００ｎｔの増幅産物を産生する一対のプライマーを選択するのが好ましい。プライマー配列の選択に用いるアルゴリズムは一般に知られており、市販のソフトウェアパッケージとなっているものを利用できる。増幅用プライマーはＤＮＡ相補鎖にハイブリダイズし、互いに反対方向へと合成を進める。
【００５３】
核酸或いは遺伝子の配列（フランキングプロモーター領域やコード領域等）は本技術分野において公知の種々の方法を用いて変異させ、プロモーター強度やタンパク質のコード配列等に所望の変更を加えることができる。このような変異の結果生成されたＤＮＡ配列或いはタンパク質は、通常、本明細書に示した各配列と実質的に同様である。即ち、異なっているとしても少なくとも１アミノ酸残基であり、１或いは２残基異なっている場合もあるが約１０残基は超えない。配列に変化をもたらすものとしては、置換、挿入或いは欠失を挙げることができる。欠失は更に、ドメインやエキソンの欠失等の大きな変化を含む。
【００５４】
クローニングした遺伝子にｉｎ ｖｉｔｒｏで変異を誘発させる技法が知られている。部位特異的な変異誘発のためのプロトコルの例については、ガスティン（Gustin）ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １４：２２（１９９３）；バラニー（Barany）、Ｇｅｎｅ ３７：１１１〜２３（１９８５）；コリセリ（Colicelli）ら、Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ １９９：５３７〜５３９（１９８５）；プレンキ（Prentki）ら、Ｇｅｎｅ ２９：３０３〜３１３（１９８４）に記載されている。部位特異的な変異誘発方法については、サムロック（Sambrook）ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、ＣＳＨ Ｐｒｅｓｓ １９８９、ｐｐ．１５．３〜１５．１０８；ワイナー（Weiner）ら、Ｇｅｎｅ １２６：３５〜４１（１９９３）；サイヤーズ（Sayers）ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １３：５９２〜５９６（１９９２）；ジョーンズ（Jones）とウィニストーファー（Winistorfer）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １２：５２８〜５３０（１９９２）；バートン（Barton）ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８：７３４９〜７３５５（１９９０）；マロッティ（Marotti）とトミチ（Tomich）、Ｇｅｎｅ Ａｎａｌ Ｔｅｃｈ ６：６７〜７０（１９８９）；ツ（Zhu）、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１７７：１２０〜１２４（１９８９）に記載されている。これらの方法により、ミトコンドリアの調節タンパク質を不活性な形態で発現させることができる。更に、ミトコンドリアのレギュレーターを発現する遺伝子を米国特許第５４６４７６４号と同第５４８７９９２号に記載の「ノックアウト」技術によって除去できる。また、これらの開示の全内容を本明細書の一部を構成するものとしてここに援用する。特に、内在性遺伝子の除去方法の開示及び記載のために援用する。
【００５５】
遺伝子からのタンパク質発現の抑制に用いられる周知の方法としては、センス抑制やアンチセンス抑制、ＲＮＡｉ抑制を挙げることができる。ｄｓＲＮＡの転写によるＲＮＡｉ遺伝子抑制については、米国特許第６５０６５５９号、米国特許出願公開２００２／０１６８７０７ Ａ１、ＷＯ９８／５３０８３、ＷＯ９９／５３０５０及びＷＯ９９／６１６３１に記載されており、これらの開示の全内容を本明細書の一部を構成するものとしてここに援用する。ＲＮＡｉによる遺伝子抑制は、その遺伝子のゲノムＤＮＡのセグメントのセンス及びアンチセンス要素を含むＤＮＡ要素に操作可能に結合するプロモーターを有する組換えＤＮＡ構築物を用いて行うことができる。遺伝子のゲノムＤＮＡのセグメントは例えば少なくとも約２３のヌクレオチドからなるセグメント、より好ましくは約５０〜２００のヌクレオチドからなるセグメントであり、そのセグメントにおいては、転写されたＲＮＡがハイブリダイズしてヘアピン構造を形成するときにループを形成できる人工ＤＮＡセグメント或いはイントロンによって、センス及びアンチセンスＤＮＡ成分は直接的に結合或いは接合することができる。
【００５６】
好適な微生物の培養方法及び発生した水素の回収方法は当業者に公知であり、例えば、メリス（Melis）による米国特許出願第２００１／００５３４３号（メリス（Melis）、２０００）及びＷＯ０３／０６７２１３に記載されている。また、これらの開示の全内容を本明細書の一部を構成するものとしてここに援用する。
【００５７】
水素生産は光照射条件下で行われる。光は連続的に照射するのが好ましく、光源として日中は太陽光を、夜間或いは曇りの場合には人工照明を用いる。また、夜間に照明を用いずに太陽光のみを用いることもできるが、この場合、水素の収量が低下する。
【００５８】
水素生産は「マイクロオキシック（microoxic）条件」で行われる。「マイクロオキシック（microoxic）条件」とは、酸素濃度を最小限に維持しヒドロゲナーゼの不活性化を防ぐ条件であり、一般には実質的嫌気的環境を意味する。ヘリウムガス等の添加によりシステムから強制的に酸素を排除できる。或いは、そしてより好ましくは、酸素除去を行わないで最初にシステムを外部環境から遮断してもよい。藻類の光合成量が乏しい場合、時間と共にシステム内の酸素量が自然減少し、システムの環境は実質的に嫌気的となり、効率的な水素生産を行うことができる。
【００５９】
本明細書において「光照射条件」とは、光合成を行うのに充分な強度の光が存在することを意味する。光としては、人工光源或いは天然の太陽光を用いることができる。一実施形態において、光の強度は１５〜３１００μｍｏｌ ｍ−２ ｓｅｃ−１であり（更にこの範囲に収まる全範囲、例えば、１００〜３０００や１０００〜２０００等）、連続照射時間は最大で１２０時間であるが、より短時間であってもよい（例えば、２４時間、４８時間、６４時間、９６時間）。
【００６０】
本発明に用いる培地としては、藻類の培養に使用され、更に硫黄を含有する標準的な市販調製物でよい。好ましくは、ＴＡＰ培地を用いる。藻類の培養は液体培地或いは固形培地で行うことができ、液体培地がより好ましい。
【００６１】
実施例１：変異株の単離
株及び培養条件
Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ株ＷＴ１３及びＣＣ１６１８（ａｒｇ７ ｃｗ１５、ｍｔ−）をクラミドモナス・ジェネティックス・センター・コレクション（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｅｎｔｅｒ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（米国デューク大学（Duke University））から得た。使用する株は全て、混合栄養状態（mixotrophically）でＴＡＰ培地（Ｔｒｉｓ−酢酸−リン酸、ｐＨ７．０）中、４０μｍｏｌ ｍ−２ ｓｅｃ−１の白色光を照射し、２０℃で培養した（Ｈａｒｒｉｓ １９８９）。培養は、１２時間の明暗サイクルで細胞密度が２×１０６個／ｍＬになるまで行った。
【００６２】
（アルギニン要求性の株ＣＣ１６１８に対して）必要な場合は、培地にアルギニン１１０μｇ／ｍＬを添加した。
【００６３】
変異株の構成及び遺伝子分析
核形質転換をＫｉｎｄｌｅら、１９８９及びＰｕｒｔｏｎとＲｏｃｈａｉｘ、１９９５に記載の方法で次の通り行った。
【００６４】
Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉアルギノコハク酸分解酵素遺伝子（Ｄｅｂｕｃｈｙら １９８９）の７．８ｋｂゲノムＤＮＡフラグメント及びバクテリオファージφＸ１７４ ＤＮＡ（ＧｕｍｐｅｌとＰｕｒｔｏｎ １９９４）の０．４ｋｂフラグメントを含むプラスミドｐＡｒｇ７．８を形質転換実験に用いた。ｐＡｒｇ７．８は、ＢａｍＨＩで消化して線状にしてから用いた。
【００６５】
遺伝子交差（Genetic crosses）を、ＷＴ１３とその変異体を用いてＨａｒｒｉｓ（１９８９）に記載の方法で行った。
【００６６】
タグのフランキングＤＮＡ配列を、ライゲーション・メディエーティッド・サプレッションＰＣＲ（ligation mediated suppression ＰＣＲ）（ＬＭＳ−ＰＣＲ）（Ｓｔｒａｕｓｓら、２００１）とプラスミドレスキュー（plasmid rescue）（ＴａｍとＬｅｆｅｂｖｒｅ、１９９３）とによりクローニングした。
【００６７】
状態遷移変異体の単離
Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ内の状態遷移に関与する遺伝子を特定するために、アルギニン無添加ＴＡＰ培地で増殖できる変異体のライブラリーをスクリーニングした。この変異体は、アルギニン要求性の株ＣＣ１６１８の核遺伝子にＡｒｇ７遺伝子を導入したプラスミドｐＡｒｇ７．８のランダム挿入後に生成されたものである（Ｄｅｂｕｃｈｙら、１９８９；ＧｕｍｐｅｌとＰｕｒｔｏｎ、１９９４）。ＷＴ内の状態遷移を誘起する光照射前後に個々のコロニーが発するクロロフィルの蛍光を記録するプレートベース蛍光ビデオ画像化スクリーニング（Ｋｒｕｓｅら、１９９９）を用いて潜在的な状態遷移変異株（ｓｔｍ）を特定した。スクリーニング対象の２×１０４個のコロニーの内、可能性のある４種のｓｔｍ変異体を特定した。そのうち変異体Ｓｔｍ６は、水素生産が増加していることが示された。
【００６８】
蛍光ビデオ画像化と７７Ｋ蛍光分光測定
状態遷移欠陥について変異体のスクリーニングを前述の通りビデオ画像化により行った（Ｋｒｕｓｅら、１９９９）。画像化は、室温ではＦｌｕｏｒＣａｍ７００ＭＦ装置（フォトン・システム・インスツルメンツ（Photon System Instruments））を用い、７７Ｋでは蛍光／発光分光分析計（パーキン・エルマー ＬＳ５０Ｂ）を用いて行った。試料の測定は、４０μｍｏｌ ｍ−２ｓ−１白色光（状態２）の照射後或いは２０分間の７１０ｎｍ（ドイツ国スコット・フィルター（Schott filter））ＰＳＩ光（状態１）の照射後に行った。或いは、Ｂｕｌｔｅら（１９９０）に従い、窒素雰囲気下、暗所で３０分間インキュベートすることにより細胞が状態２となるように調整した。
【００６９】
藻類の培養
ＷＴ及びＳｔｍ６の細胞培養物を増殖させた。増殖は、暗所で或いは照射（６０μｍｏｌ／ｍ２．ｓ−１白色光）下、ＴＡＰ寒天プレート上或いはＴＡＰ培地中、細胞密度が約２×１０６個／ｍＬに達するまで行った。
【００７０】
実施例２：水素放出測定
ＷＴ及びＳｔｍ６培養物の両方について、液相及びその上方の気体ヘッド空間のＨ２濃度を測定した（ＯＤ７５０ｎｍ＝０．８の細胞密度）。溶解Ｈ２濃度の測定は、硫黄飽和ＴＡＰ培地中或いは硫黄除去ＴＡＰ培地中の暗所細胞培養物（１Ｌ）を用い、クラーク型（Clark type）水素電極（デンマーク国、ユニセンス（Unisense）ＰＡ２０００）を用いて白色光照射により行った。５μＭ カルボニルシアニド ｍ−クロロフェニルヒドラゾン（ＣＣＣＰ）の存在下及び非存在下のＨ２濃度を、暗所培養物を用い照射（白色光、３００μｍｏｌ ｍ−２．s−１）前後（１ｈ）に測定した。気体ヘッド空間のＨ２濃度の測定は質量分析計（Ｄｅｌｔａ Ｆｉｎｎｉｇａｎ ＭＡＴ）を用いて行った。細胞培養物は低真空下、３０分間暗所に置き、培地及びヘッド空間のＯ２及びＨ２を除去してから、連続或いはパルス化した白色光に照射した（周波数３．３Ｈｚ、５μsフラッシュ；光強度範囲１５〜３０００μｍｏｌ．ｍ−２．ｓ−１）。
【００７１】
図３を参照すると、硫黄の非存在下においては、Ｓｔｍ６はＷＴの３．５倍のＨ２を生成したことが分かる（即ち、面積積分値１４６／４１＝３．５）。
【００７２】
野生株及びＳｔｍ６ Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ培養物の水素生産に対する光強度の影響をガス質量分析により推定した。これは、（暗所に３０分間置いた）ＷＴ細胞及びＳｔｍ６細胞に種々の照射レベルで連続照射を１分間行い、Ｈ２発生（相対速度）を測定して行った。Ｓｔｍ６は常に、野生株に比べて（ピークの表示で示すように）５００〜７００％高い速度で水素を生産した。
【００７３】
アンカップラーであるＣＣＣＰは、ＷＴよりも約１５００％高いレベルでＨ２生産速度を安定化させる。これは、水素クラーク電極測定（ユニセンス（UniSense））により算定した。このことから、ＨｙｄＡ活性は基質供給速度により限定され得ることが分かる。
【００７４】
実施例３：光合成によるＨ２生産中のガス発生量の測定
目的：光合成によるＨ２生産中にＳｔｍ６が発生させるガスの量及び組成を測定する。
方法：実験は白色光下で行った（８０μｍｏｌ．ｍ−２．ｓ−１）。硫黄除去条件下、培養物を暗所で４０時間インキュベートした。細胞は、追加の炭素源としてアセテートを添加したＴＡＰ培地中で、ＯＤ７５０（７５０ｎｍにおける光学密度）が約１．０になるまで増殖させた。培養量は３００ｍＬとし、発生ガスのデータは培養物１Ｌに標準化した。水素測定はＡｇｉｌｅｎｔ Ｍｉｃｒｏガスクロマトグラフを用いて行った。
【００７５】
【表１】
【００７６】
実施例４：ＷＴ培養物及びＳｔｍ６培養物における酸素濃度測定
目的：高Ｈ２表現型のＳｔｍ６は培養物中の低Ｏ２濃度を維持する能力と関連付けられるかを確認する。
方法：溶解酸素濃度測定をクラーク型酸素電極（ユニセンス）を用いて行い、図１２に示すデータを得た（パネルＡ及びＢ）。
【００７７】
パネルＡ：細胞培養物を密度０．１μg Ｃｈｌ／ｍＬになるまで硫黄飽和ＴＡＰ培地中で一定の照射条件（３００μｍｏｌｍ−２ｓ−１）下で増殖させた。硫黄除去ＴＡＰ培地に細胞を移した時を時間０とした。
【００７８】
パネルＢ：暗所で光培養細胞調製物（３０μg Ｃｈｌ／ｍＬ）±５ｍＭ ＫＣＮを用いて細胞呼吸測定を行った。
【００７９】
ＷＴ及びＳｔｍ６中の細胞酸素濃度の測定結果を図１２に示す。
【００８０】
時間＝０は、培養物を硫黄除去培地に移した時間を示す。時間＝０においては、ＰＳＩＩはまだ阻害されていない。しかしながら、Ｓｔｍ６培養物の溶解酸素濃度は野生型の４０％しかなかった。その後、野生型及びＳｔｍ６培養物のいずれにおいても溶解酸素濃度は同程度に減少し、最終的にはＰＳＩＩは完全に阻害された。これは硫黄非存在下では損傷したＤ１タンパク質の修復が不可能であるからである。
【００８１】
呼吸速度：Ｓｔｍ６における呼吸レベルの増加もパネルＡに示すＳｔｍ６の溶解酸素濃度の低下の一要因であるかを確認するために、ＰＳＩＩ活性低下に加え、呼吸レベルも暗所（ＰＳＩＩ不活性）±５ｍＭ ＫＣＮ（複合体ＩＶの阻害剤）条件にて測定した。Ｓｔｍ６の呼吸速度は、ＫＣＮの存在下においても非存在下においても野生株よりも６０％高いことが分かった。この結果から、Ｓｔｍ６の呼吸レベルが高いことが分かるだけでなく、酸素の取り込みは通常の酸化的リン酸化を介してではなく、恐らく代替的酸化（oxidate）経路を介して行われることも分かる。
【００８２】
低レベル光条件下における増殖速度
図１６は、低レベル光下におけるＳｔｍ６及び野生株の増殖速度の比較を示す。バイオマス生成においては、バイオリアクタ条件では、光レベルが制限要因となることが多い。Ｓｔｍ６及び野生株の増殖速度をアセテート添加ＴＡＰ培地中で低レベル光（２４℃において１０μｍ ｍ−２ｓ−１、２４時間光照射）で比較したところ、Ｓｔｍ６の増殖速度は野生株よりも大きかった。このことは、Ｓｔｍ６はバイオリアクタ増殖条件下におけるバイオマス生成に有利であり得ることを示唆している。
【００８３】
実施例５：Ｓｔｍ６変異体の特性
（ｉ）Ｓｔｍ６は状態１においてブロックされＰＳＩＩ-ＬＨＣＩＩリン酸化が低下する
クロロフィル蛍光アッセイを蛍光発光分光分析により７７Ｋで行い（図５）、クロロフィルビデオ画像化を化学線６２０ｎｍ光で室温にて行った（図５）ところ、Ｓｔｍ６は状態１においてブロックされることが分った。ＷＴと対照的に、ＰＳＩＩに優先的に吸収される光は細胞を状態２に遷移させることができなかった。これは、ＰＳＩからの７２０ｎｍの蛍光の増加により監視した（図５）。暗所における嫌気生活（anaerobiosis）によりＰＱプールを還元させた場合にも状態２への遷移はブロックされた（データは示さず）。
【００８４】
状態２は、ＰＳＩＩの集光（ＬＨＣ）アンテナタンパク質のスレオニン残基のリン酸化に関与しているため（Ａｌｌｅｎら、１９８１）、イムノブロットにおけるリン酸化レベルを評価するのに抗ホスホスレオニン抗体を用いた。ＷＴにおけるＣＰ２９（Ｐ９）及びＬＨＣ−Ｐ１１タンパク質のリン酸化を促進する照射条件において、Ｓｔｍ６はこれらタンパク質のリン酸化レベルを著しく減少させた（図５）。対照のイムノブロットにより、Ｓｔｍ６はＷＴレベルのＬＨＣタンパク質を含有したままであることが確認された（図５）。
【００８５】
Ｓｔｍ６においてＰＱプールを更に還元できるかを試験するため、クロロフィル蛍光測定を行い、光化学消光（photochemical quenching）パラメータｑＰ（ＰＱプールの還元状態の指標）を求めた（Ｌｕｎｄｅら、２０００）。生育光条件下、Ｓｔｍ６についてはＷＴよりも更に還元された状態にＰＱプールを置いた（１−ｑＰはＳｔｍ６では０．７７、ＷＴでは０．５９）（表１）。Ｓｔｍ６におけるＰＳＩ及びＰＳＩＩの活性レベルは、ＷＴと同等であった（表１）。
【００８６】
（ｉｉ）Ｓｔｍ６は高レベル光に対する感受性が強い
Ｓｔｍ６変異体の顕著な表現型は、状態遷移に対する影響に加え、その光ストレスに対する感受性であった。１０００μｍｏｌ ｍ−２s−１の高レベル光を４時間照射後、変異体の細胞は生残性の著しい低下を示したが、ＷＴ及び相補株Ｂ１３は殆ど影響されなかった（図６）。Ｓｔｍ６は、照射により細胞内の一重項酸素の著しい増加を示した。これは脂質ヒドロペルオキシドの蓄積により評価した（表１）。
【００８７】
【表２】
【００８８】
（ｉｉｉ）Ｓｔｍ６における単一のｍｔｅｒｆ型遺伝子の崩壊が状態遷移欠陥と光感受性の原因である
プラスミドｐＡｒｇ７．８が担持するａｒｇマーカーがＳｔｍ６と緊密に関連しているかを試験するため、ＷＴ１３とＳｔｍ６の間の遺伝子交差を行い、アルギニン非含有培地で増殖し状態遷移を行う能力についてその子孫をビデオ画像化により評価し記録した。調査した全５０個の子孫においては、アルギニン非含有ＴＡＰ培地で増殖できるクローンは正常な状態遷移を示したが、アルギニン要求性を示すクローンも程度は弱いが状態遷移を示した（データは示さず）。これらデータから、Ｓｔｍ６はａｒｇタグ化変異体であることが示唆された。
【００８９】
プラスミドレスキューとライゲーション・メディエイティッド・サプレッション（ＬＭＳ）−ＰＣＲ（Ｓｔｒａｕｓｓら、２００１）を組み合わせることにより、Ｓｔｍ６におけるａｒｇマーカーの挿入位置を特定することができた。より詳細な分析の結果、２個のｐＡｒｇ７．８プラスミドが縦列にＳｔｍ６に挿入されていることが分かった（図７）。
【００９０】
続いて行った配列解析及び相同性検索の結果、ｐＡｒｇ７．８プラスミドのランダム組込みによって２個遺伝子が影響を受けていることが分かった。その内の一方は核トランスポソン（ｔｏｃ１）として既に記述されており（Ｄａｙら、１９８８）、他方は未知のものであったため、その配列はＧｅｎＢａｎｋデータベースにｍｏｃ１（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＦ５３１４２１）として提出した。Ｓｔｍ６ＤＮＡにおいて影響を受けたゲノム挿入部位の正確な位置は、最終的には配列解析及びＰＣＲ解析により確認した（図７）。
【００９１】
非相同組換えによるランダム挿入により約２ｋｂのゲノムＤＮＡの欠失が生じた。欠失したものの中には、ｍｏｃ１遺伝子の３’領域の６１０ｂｐｓとｔｏｃ１遺伝子の５’末端の８８０ｂｐｓとが含まれていた（図７）。
【００９２】
Ｓｔｍ６及びＷＴにおいて５’特異的ｍｏｃ１プライマーとその核挿入配列由来の第２のプライマーを用いてＰＣＲ解析を行ったところ、Ｓｔｍ６においては１００５ｂｐのＰＣＲ産物が増幅された。このことから、挿入によって生じた欠失はｍｏｃ１の一部のみであり、この遺伝子の５’領域は何ら影響を受けていないことが確認された。Ｓｔｍ６における核挿入の５’領域に存在するｍｏｃ１の残りの５１２ｂｐｓと核挿入の３’領域に存在するｔｏｃ１の残りの４７８２ｂｐｓとを特定したところ、この変異は３’−ｍｏｃ１／５’−ｔｏｃ１遺伝子領域に完全に限定され、可能性のある他の全ての隣接コード領域には影響を及ぼさないことが分かった。
【００９３】
相補性実験を行ったところ、Ｓｔｍ６において状態遷移がない原因はｍｏｃ１のシングルコピーであることが分かった（図５、図６、図９参照）。相補株B１３は同時形質転換（co-transformation）アプローチより単離した。このアプローチには、ｍｏｃ１含有コスミドを、主要な選択可能なマーカーとしてエメチン耐性を与えるｃｒｙ１遺伝子（Ｎｅｌｓｏｎら、１９９４）を含有する第２のベクターと組み合わせて用いた。３７ｋｂのコスミドはコスミドライブラリーから単離した（英国ＵＣＬのＳａｕｌ Ｐｕｒｔｏｎ博士からご提供頂いた）。挿入領域の配列解析の結果、ｍｏｃ１はこのコスミドに挿入された唯一の遺伝子であることが分かった。
【００９４】
評価を行ったエメチン耐性を有する約５０００のコロニーの内、正常な状態遷移を行うものが４個あることが分かり（蛍光ビデオ画像化により評価）、これら４個は全てｍｏｃ１遺伝子を含んでいた。
【００９５】
ｍｏｃ１遺伝子は３５ｋＤａタンパク質をコードしているが、その中には幾分驚くべきことであるが、ミトコンドリアトランジット配列と推定される配列と、ＤＮＡ結合タンパク質に特徴的なロイシンジッパーモチーフを有する２個のミトコンドリア転写終結因子ドメイン（ｍｔｅｒｆ）（Ｄａｇａら、１９９３）とが含まれている。総じて、顕著な類似性が、３５ｋＤａヒトｍＴＥＲＦタンパク質（図８）に対して（配列全長に亘るアライメントに基づいて３４％）、更にＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ（ＤｍＴＴＦ、Ｒｏｂｅｒｔｉら、２００３）及びｓｅａ ｕｒｃｈｉｎ（ｍｔＤＢＰ、Ｌｏｇｕｅｒｉｃｉｏら、１９９９）中の相同体に対して見られた。ヒトｍＴＥＲＦはｔＲＮＡ遺伝子の下流に結合し、ミトコンドリア内でのｔＲＮＡ及びｒＲＮＡの合成量の制御と、他のミトコンドリア遺伝子の発現と、延いてはミトコンドリア呼吸鎖の機能性に関与していると考えられる（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｓｉｌｖａら、１９９７；Ｓｅｌｗｏｏｄ、２０００；Ｈｅｓｓら、１９９１）。興味深いことに、ｍｔｅｒｆドメインを有するＭＯＣ１の９個の相同体がＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａのゲノムにおいて特定されており、その内の４個（Ａｔ１ｇ６１９８０、Ａｔ２ｇ４４０２０、Ａｔ４ｇ０２９９０、Ａｔ２ｇ０３０５０）がミトコンドリアをターゲットとし、１個（Ａｔ５ｇ５５５８０）が葉緑体をターゲットとしていると予想される。最近開放されたＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ核ゲノムデータベースの解析に加えＤＮＡハイブリダイゼーション実験を行ったところ、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉにはｍｏｃ１のコピーが１個だけ存在することが示唆された。
【００９６】
（ｉｖ）ＭＯＣ１はミトコンドリアタンパク質であり、ＭＯＣ１が存在しないことによりシトクロムオキシダーゼの発現が影響を受ける
ＭＯＣ１は実際には葉緑体ではなくミトコンドリアをターゲットとしたものであること（図９）と、ＭＯＣ１はＳｔｍ６変異体には存在しないこととを確認するため、ＭＯＣ１に対する抗ペプチド抗体を用いた。重要なことであるが、ＭＯＣ１の発現は、暗い状態から明るくするとＲＮＡ及びタンパク質レベルにおいてアップレギュレートされた（図１０）。
【００９７】
ＭＯＣ１が存在しないことがミトコンドリアの呼吸複合体の発現に影響を与えるか否かを評価するために各種実験を行った。イムノブロットの結果、シトクロムオキシダーゼのサブユニット９０の蓄積（Ｌｏｗｎら、２００１）（ＣＯＸ９０）はＳｔｍ６では減少したものの（図９）、溶解性のシトクロムＣのレベルは影響を受けず、代替的オキシダーゼ１（Alternative oxidase 1）(ＡＯＸ１）のレベルは変異によって増加した（図９）。相補的な株Ｂ１３においては、シトクロムオキシダーゼのサブユニット９０はほぼＷＴのレベル迄回復した。イムノブロットのデータは、暗所増殖させたＷＴ細胞及びＳｔｍ６細胞から単離したミトコンドリアにおけるシトクロムオキシダーゼの活性測定の結果と良く一致した（図１０）。光処理に伴い、Ｓｔｍ６におけるシトクロムオキシダーゼ活性は著しく低下した。光照射下増殖させたＳｔｍ６細胞におけるＡＴＰレベルはＷＴ及びＢ１３の約５０％であり（図１０）、この結果は、光合成由来還元体（photosynthetically derived reductant）からのＡＴＰの生成におけるシトクロムオキシダーゼの役割と一致しており、先の示唆（ＫｒｏｅｍｅｒとＨｅｌｄｔ、１９９１）と合っている。
【００９８】
（ｖ）ＭＯＣ１は光曝露によるミトコンドリアゲノムの転写の変化に関与している
ＭＯＣ１がヒトｍＴＥＲＦと共通の転写因子をコードしていると仮定し、ミトコンドリアゲノムの転写産物プロファイルに対して可能性のある変動要因（perturbations）を検出することを目的とした各種実験を行った。Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉの場合は、ミトコンドリアゲノムは１５．８ｋｂの線形ゲノムから構成される（ＧｒａｙとＢｏｅｒ、１９８８）。このゲノムは複数の呼吸サブユニットをコードしており、その中にはシトクロムオキシダーゼのサブユニット１（ｃｏｘ１遺伝子産物）、複合体Ｉの５個のサブユニット（ｎａｄ１−２、ｎａｄ４−６遺伝子産物）、及びアポシトクロムｂ（ｃｏｂ遺伝子産物が含まれている。
【００９９】
ｎａｄ２遺伝子及びｃｏｘ１遺伝子の半定量的ＲＴ−ＰＣＲ解析を行った結果、暗所増殖細胞の光曝露後にはＷＴとＳｔｍ６の転写産物レベルに大きな差があることが分かった。ＷＴに比べてＳｔｍ６は常に、ｃｏｘ１転写産物レベルが低く、ｃｏｘ１の直ぐ下流に位置するｎａｄ２遺伝子由来の転写産物レベルは高かった（図１０）。
【０１００】
これらの結果をまとめると、ＭＯＣ１は、シトクロムオキシダーゼ活性レベルをｃｏｘ１の転写レベルに制御することにおいて重要な役割を担っていることが示唆される。ＣＯＸ１はシトクロムオキシダーゼ複合体に組み立てられる最初のサブユニットであるため、ＣＯＸ１発現レベルは酵素合成量の重要な決定要素である可能性がある（Ｎｉｊｔｍａｎｓら、１９９８）。
【０１０１】
（ｖｉ）光ストレス中のミトコンドリア呼吸鎖の調節におけるＭＯＣ１の役割のモデル
ミトコンドリア機能におけるＭＯＣ１の役割モデルを図１１に示す。ミトコンドリアゲノムは二方向に転写されて２個の一次転写産物を作成し、これらは処理されてより小さな転写産物となる（ＧｒａｙとＢｏｅｒ、１９８８）。本発明者らの結果から分かるように、ＭＯＣ１は、ｃｏｘ１ｍＲＮＡのレベルを下流のｎａｄ２転写産物のレベルよりも高く維持するのに重要である。従って、可能性のあるＭＯＣ１結合部位は、転写終結因子である可能性が高く、ｃｏｘ１とｎａｄ２の間に存在するであろう。このクラスの転写因子の結合部位の多様性が、この段階においては、可能性のあるＭＯＣ１結合部位を予想することを困難にしている（Ｒｏｂｅｒｔｉら、２００３）。
【０１０２】
本発明者らのモデルにおいては、ＭＯＣ１の作用を受けてミトコンドリアは、ｃｏｘ１の転写を下流のｎａｄ遺伝子と切り離し、更なるシトクロムオキシダーゼ複合体の合成に必要なＣＯＸ１の相対的な発現量を増加させることができる。これは、複合体Ｉに無関係であるロテノン非感受性ミトコンドリアＮＡＤＨデヒドロゲナーゼが光によって誘起され（ＳｖｅｎｓｓｏｎとＲａｓｍｕｓｓｅｎ、２００１）より多くのシトクロムオキシダーゼを合成する必要がある場合に特に適している。ゲノムあたり一を超えるＭＯＣ１結合部位が存在し（Ｒｏｂｅｒｔｉら、２００３）ＤＮＡだけでなくＲＮＡに結合する可能性があるとするならば、ミトコンドリア遺伝子発現に対するＭＯＣ１作用の効果はむしろ複雑であろう。
【０１０３】
（ｖｉｉ）循環的電子輸送の測定
目的：循環的電子輸送は、Ｓｔｍ６において好気的条件下或いは嫌気的条件下阻害されるか否かを決定する。
【０１０４】
方法：循環的電子輸送速度（図１４）を分光分析により測定した。測定は、２０μＭジクロロフェニルジメチル尿素（ＤＣＭＵ：ＰＳＩＩからｃｙｔｂ６ｆへのｅ−の輸送を阻害する）又は５μＭ ２，５−ジブロモ−６−イソプロピル−３−メチル−１，４−ベンゾキノン（ＤＢＭＩＢ：ｃｙｔｂ６ｆからプラストシアニンへのｅ−の輸送を阻害する）の存在下、ｃｙｔ ｆの光誘起レドックス変化を測定することにより行った。ＰＳＩ活性及びＰＳＩＩ活性は、シングルターンオーバーフラッシュ励起後の電荷分離測定から分光分析により推定した。これを行うため、測定前に細胞を暗所に２時間置くか、２００μｍｏｌ／ｍ２．ｓ−１白色光を１０分間照射した（Ｔｒｅｂｓｔら（１９８０））。
【０１０５】
このようにしてＣｙｔｆレドックス状態の変化を伴う循環的電子輸送測定を行った結果、循環的ｅ−輸送は、Ｓｔｍ６において好気的条件と嫌気的条件の両方において阻害された。
【０１０６】
（ｖｉｉｉ）ＰＳＩＩ活性レベル
目的：ＰＳＩＩ活性レベルは、状態１におけるＰＳＩＩの大きなアンテナサイズのために光照射下ダウンレギュレートされるか否かを決定する。
方法：ＰＳＩ活性及びＰＳＩＩ活性（図１４）をシングルターンオーバーフラッシュ励起後の電荷分離測定から分光分析により推定した。これを行うために測定前に細胞を暗所に２時間置くか、２００μｍｏｌ／ｍ２．ｓ−１の白色光を１０分間照射した。
【０１０７】
暗所での培養物においては、ＷＴ細胞とＳｔｍ６細胞のＰＳＩＩ（ＰＳＩＩ−Ｄ）及びＰＳＩ（ＰＳＩ−Ｄ）活性は同等であった。予想通り、ＰＳＩ活性レベルは１０分間のプレ照射時は一定のままであった（ＰＳＩ−Ｌ）。これに対し、１０分間のプレ照射段階によって、ＷＴとＳｔｍ６の双方においてＰＳＩＩ（ＰＳＩＩ−Ｌ）の光阻害が生じた。このことから、ＰＳＩＩは光阻害を受けやすいことが分かる。しかしながら、Ｓｔｍ６の場合は不活性化が更に顕著に現れた（ＰＳＩＩ−Ｌ）。これは、状態１遷移中であるためＳｔｍ６のＰＳＩＩアンテナサイズが大きいからである（Ｆｉｎｎａｚｚｉら（２００３））。
【０１０８】
（ｉｘ）リンゴ酸デヒドロゲナーゼのダウンレギュレーション
葉緑体からミトコンドリアへのＨ＋及びｅ−の移動に関与するリンゴ酸ＮＡＤＰＨデヒドロゲナーゼの活性がＳｔｍ６においてダウンレギュレートされるかを確認するため鋭意検討した。ダウンレギュレーションがあれば、Ｈ＋及びｅ−はミトコンドリアに供給されるよりもＨｙｄＡを介したＨ２生産のため葉緑体に残るということを示している。図１５に示すように、ＷＴ及びＳｔｍ６細胞培養物におけるリンゴ酸ＮＡＤＰＨ−デヒドロゲナーゼ活性測定の結果、この酵素の活性はＳｔｍ６においてダウンレギュレートされていることが分かる（Ｌｅｍａｉｒｅら（２００３））。
【０１０９】
考察
Ｈ２生産を達成するには次の三条件を満たさなければならない。第１に、ＨｙｄＡの酸素誘起阻害を高めなければならない。第２に、ストロマに位置するＨｙｄＡは高い基質（Ｈ＋とｅ−）供給速度を有さなければならない。第３に、ストロマへのｅ−輸送にＰＳＩを伴うため、ＨｙｄＡを介した光学的なＨ２生産には光が必要である。要約すると、ＨｙｄＡを介したバイオ水素生産は「嫌気性光合成」の状態において生じる（図２）。
【０１１０】
Ｈ２生産能力が改善された変位体を迅速に特定するため、まずＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉノックアウトを状態遷移プロセスの崩壊に関してスクリーニングした（図２）。このプロセスのＰＳＩ及びＰＳＩＩのターンオーバー速度は通常、バランスを保持されている（図１）。これは、光集光アンテナ（それぞれＬＨＣＩ及びＬＨＣＩＩ）のサイズを調節することにより、具体的には二種の光化学系（状態１：大きなＰＳＩＩアンテナ；状態２：大きなＰＳＩアンテナ）の間にＬｈｃｂタンパク質を往復させることにより行う。Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉの場合、このプロセスによって線形光合成電子輸送から循環的光合成電子輸送に切り替わり、これはＰＳＩの還元側においてｅ−に関してＨｙｄＡと競合する（図２）。嫌気的条件下状態１においてブロックされた細胞は循環的電子伝達を行わない。これらの条件下では、ＨｙｄＡはもはやＰＳＩ由来の電子に関してＣｙｔｂ６ｆ仲介循環的電子輸送と競合する必要はなく（図２）、光誘導性（light-driven）Ｈ２生産の効率向上が期待できる。選択された変異体の内、ｍｏｃ１の核ノックアウト変異体であるＳｔｍ６（Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号ＡＦ５３１４２１）は、状態１においてブロックされＨ２生産能力が向上すること（図３）、循環的電子輸送において阻害されること（図１４）、葉緑体内に多量のデンプンを蓄積させること（ＨｙｄＡのためのＨ＋／ｅ−の貯蔵）（図４）、及び常にＰＳＩＩ−ＬＨＣＩＩアンテナ複合体が大きいことによって光阻害に対する感受性が高いためＰＳＩＩ活性が低いことが分かった。更に、Ｓｔｍ６の細胞酸素濃度は約６０％減少しており、これは恐らく代替的オキシダーゼの活性が高いためであろう。このように多岐に亘り複雑な表現型の特性によって、Ｓｔｍ６は本質的に、捕捉した太陽エネルギーを主にＰＳＩによって動かされる「嫌気性光合成経路」を介して化学エネルギー（Ｈ２の形）へ変換するように仕向けられる。
【０１１１】
Ｍｏｃ１は核にコードされたミトコンドリアＤＮＡ結合タンパク質であり、その欠失は光照射によるミトコンドリア電子輸送経路のデレギュレーションを生じさせる。特に、Ｍｏｃ１欠失は複合体ＩＶの著しいダウンレギュレーションを惹き起こす。この変異は更に、ミトコンドリアＨ＋勾配を維持しミトコンドリアＦ０Ｆ１ＡＴＰａｓｅを介してＡＴＰを合成する能力において、ミトコンドリア電子輸送（複合体Ｉ→複合体ＩＶ）の低下を惹き起こす。従って、光合成による生成物のシンク（sink；溜り場）として作用するミトコンドリアの能力を著しく減退させてしまう（図２）。このようなミトコンドリアと葉緑体の間の相互作用の減少により、Ｓｔｍ６は、一時的なＨ＋／ｅ−のシンクとして、生成されたＨ２を用いてＰＳＩＩ由来のＨ＋／ｅ−をヒドロゲナーゼＨｙｄＡに供給する。Ｓｔｍ６において観察された葉緑体の準自律機能及びそれに伴う光合成循環的電子流の阻害の全体的な効果として、この株において観察されたＨ２生産増加という価値ある性質が提供される。
【０１１２】
長期間（６日間）のＨ２生産実験（図３）により、バイオ水素生産に対しＳｔｍ６が有益である点を幾つか見出した。第１に、（ＰＳＩＩ修復を阻害するための）硫黄非存在下において、野生株（ＷＴ）よりも早く水素生産が開始された。第２に、Ｓｔｍ６は、より高いＨ２生産速度を達成した。第３に、水素生産時間が約４５時間（ＷＴ）から約１２０時間（Ｓｔｍ６）まで延びた。これら観測された３点の改良点を合わせると、ＷＴよりもＨ２生産が約３５０％増加した。尚、照射に先立ち、培養物を２時間暗所に置いておいた。照射フェーズ開始後、Ｓｔｍ６において直ぐにＨ２生産が観察されたことも注目される。この知見は、Ｓｔｍ６の呼吸速度がＨｙｄＡ発現の酸素誘起阻害を防止するのに十分高いということを示唆するので重要である。
【０１１３】
Ｓｔｍ６には、更に収量を増加させる可能性がある。より短期間の実験の結果、ＷＴに対して水素生成量が約５００〜７００％増加した。この増加は、１５〜３１００μｍｏｌ／ｍ２．s−１の照射範囲に亘って見られた。これは、水素バイオリアクタにおける使用に関してもＳｔｍ６は有益であることを示しており重要である。即ち、バイオリアクタ内では、細胞が曝露される光の照射強度は光源からの距離によって広範囲に亘るからである。
【０１１４】
ＷＴに比べると、Ｓｔｍ６を用いた場合には、ＨｙｄＡへの基質（Ｈ＋／ｅ−）供給速度を高めることにより更に高いＨ２収量を達成できる。光合成時のストロマのアルカリ化のため、ストロマに位置するＨｙｄＡへのＨ＋供給はＨ２生産速度、特に、循環的流れの阻害によってＨｙｄＡへの電子搬送速度がＷＴよりも高いＳｔｍ６におけるＨ２生産速度を制限するであろう（図２）。この仮説を調べるため、Ｈ＋の迅速なチラコイド膜通過輸送を助けると考えられているプロトノフォアであるＣＣＣＰをＳｔｍ６及びＷＴ培養物に添加した。ＣＣＣＰはＷＴには殆ど影響しなかった（恐らく、ｅ−輸送がＨ２生産を制限しているため）が、Ｓｔｍ６は少なくとも３０分間の間に約１５００％のＨ２生産の増加を示した。この結果から、内腔からストロマへのＨ＋輸送がＳｔｍ６におけるＨ２生産の改善における律速段階であることは明らかである。
【０１１５】
要約すると、Ｓｔｍ６は、Ｈ２Ｏを基質として使用できる将来の太陽光利用Ｈ２生産システムの開発に価値ある複数の性質を有している。第１に、Ｓｔｍ６の葉緑体は準自律的に機能して、Ｈ２Ｏ由来のＨ＋及びｅ−をミトコンドリア電子輸送鎖にではなくＨ２生産のためのＨｙｄＡに供給する。第２に、Ｓｔｍ６においては循環的電子輸送がオフにされるため、この変異体は、ＨｙｄＡへのｅ−供給の恒久的且つ高速のルートとなる。第３に、Ｓｔｍ６の細胞Ｏ２濃度は低く維持されるため、ＨｙｄＡ活性が顕著に高い。最後に本発明者らは、Ｓｔｍ６は、ＣＣＣＰの存在下においてＷＴよりも１５倍速い速度でＨ２を生産できることを示した。この１５倍の増加は、経済的に実行可能なＨ２生産システムの開発に向けた重要な第一歩である。
【０１１６】
明確さと理解のため本発明を幾分詳細に説明したが、本明細書に開示した本発明の概念から逸脱することなく本明細書に記載した実施形態や方法に対して各種の変更や変形を行うことができることは当業者には明らかであろう。
【０１１７】
参考文献
次の文献の開示内容を、本明細書の一部を構成するものとしてここに援用する。
Abraham, S. National Hydrogen Energy Roadmap. United States Department of Energy (2002)。
Allen, J.F., Bennett, J., Steinback, K.E. and Arntzen, C.J. (1981) Chloroplast protein phosphorylation couples plastoquinone redox state to distribution of excitation energy between photosystems. Nature 291, 21-25。
Armstead, H.C.H. Geothermal Energy: Its Past, Present, and Future Contribution to the Energy Needs of Man (E. & F. N. Spon, London, 1983)。
Bonaventura, C. and Myers, J. (1969) Fluorescence and oxygen evolution from Chlorella pyrenoidosa. Biochim. Biophys. Acta 189, 366-386。
Bulte, L., Gans, P., Rebeille, F. and Wollman, F.-A. (1990) ATP control on state transitions in vivo in Chlamydomonas reinhardtii. Biochim. Biophys. Acta 1020, 72-80。
【０１１８】
Daga, A., Micol, V., Hess, D., Aebersold, R. and Attardi, G. (1993) Molecular characterization of the transcription termination factor from human mitochondria. J. Biol. Chem. 268(11), 8124-8130。
Day, A., Schirmer-Rahire, M., Kuchka, M.R., Mayfield, S.P. and Rochaix, J.D. (1988) A transposon with an unusual arrangement of long terminal repeats in the green alga Chlamydomonas rheinhardtii. EMBO J. 7 (7), 1917-1927。
Debuchy, R., Purton, S. and Rochaix, J.-D. (1989) The argininosuccinate lyase gene of Chlamydomonas reinhardtii: an important tool for nuclear transformation and for correlating the genetic and molecular maps of the ARG7 locus. EMBO J. 8, 2803-2809。
De Vitry, C., Finazzi, G., Baymann, F. and Kallas, T. (1999) Analysis of the nucleus-encoded and chloroplast-targeted rieske protein by classic and site-directed mutagenesis of Chlamydomonas. Plant Cell 11(10), 2031-2044。
Depege, N., Bellafiore, S. and Rochaix, J.-D. (2003) Role of chloroplast protein kinase Stt7 in LHCII phosphorylation and state transition in Chlamydomonas. Science 299, 1572-1575。
【０１１９】
Duby, F. and Matagne, R.F. (1999) Alteration of dark respiration and reduction of phototrophic growth in a mitochondrial DNA deletion mutant of Chlamydomonaslacking cob, nd4, and the 3’ end of nd5. Plant Cell 11, 115-125。
Dutilleul, C., Driscoll, S., Cornic, G., DePaepe, R., Foyer, C.H. and Noctor, G. (2003) Functional mitochondrial complex I is required by tobacco leaves for optimal photosynthetic performance in photorespiratory conditions and during transients. Plant Physiol. 131, 264-275。
Fernandez-Silva, P., Martinez-Azorin, F., Micol, V. and Attardi, G. (1997) The human mitochondrial transcription termination factor (mTERF) is a multizipper protein but binds to DNA as a monomer, with evidence pointing to intramolecular leucine zipper interactions. EMBO J. 16(5), 1066-1079。
Finazzi, G., Rappaport, F., Furia, A., Fleischmann, M., Rochaix, J.-D., Zito, F. and Forti, G. (2002) Involvement of state transitions in the switch between linear and cyclic electron flow in Chlamydomonas reinhardtii. EMBO Rep. 3(3), 280-285。
Finazzi, G., Chasen, C., Wollman, F.A. & de Vitry, C. Thylakoid targeting of Tat passenger proteins shows no delta pH dependence in vivo. EMBO J. 22:807-15 (2003)。
【０１２０】
Fleischmann, M.M., Ravanel, S., Delosme, R., Olive, J., Zito, F., Wollman, F.A. and Rochaix, J.-D. (1999) Isolation and characterization of photoautotrophic mutants of Chlamydomonas reinhardtii deficient in state transition. J. Biol. Chem. 274(43), 30987-30994。
Florin, L., Tsokoglou, A., and Happe, T. (2001) J Biol Chem 276, 6125-6132。
Flugge, U.-I. (1998) Metabolite transporters in plastids. Curr. Opin. Plant Biol. 1, 201-206。
Gans, P. and Wollman, F.-A. (1995) The effect of cyanide on state transitions in Chlamydomonas reinhardtii. Biochim. Biophys. Acta 1228, 51-57。
Ghirardi, M. L., Togasaki, R. K., and Seibert, M. (1997) Applied Biochemistry and Biotechnology 63-5, 141-151。
【０１２１】
Gray, M.W. and Boer, P.H. (1988) Organization and expression of algal (Chlamydomonas reinhardtii) mitochondrial DNA. Phil. Trans. R. Soc. Lond. B 319, 135-147。
Gu, D.M. and Newton, K.J. (1993)Analysis of Leaf Sectors in the NCS6 Mitochondrial Mutant of Maize.Plant Cell 5, 963-971。
Gumpel, N.J. and Purton, S. (1994) Playing tag with Chlamydomonas. Trends Cell Biol 4, 299-301。
Happe, T., and Kaminski, A. (2002) Eur J Biochem269, 1022-1032。
Harris, E. (1989) The Chlamydomonas Sourcebook: A Comprehensive Guide to Biology and Laboratory Use. Academic Press, San Diego, USA。
【０１２２】
Heldt, W. H., Werdan, K., Milovancev, M. & Geller, G. Alkalization of the chloroplast stroma caused by light-dependent proton flux into the thylakoid space. Biochim Biophys Acta 314, 224-41 (1973)。
Hess, J.F., Parasi, M.A., Bennett, J.L. and Clayton, D.A. (1991) Impairment of mitochondrial transcription termination by a point mutation associated with the MELAS subgroup of mitochondrial encephalomyopathies. Nature 351, 236-239。
Hoefnagel, M.H.N., Atkin, O.K. and Wiskich, J.T. (1998) Interdependence between chloroplasts and mitochondria in the light and the dark. Biochim Biophys. Acta1366, 235-255。
Hoffert, M. I. et al. Energy implications of future stabilization of atmospheric CO2 content. Nature 395, 881-884 (1998)。
Horton, P., Allen, J.F., Black, M.T. and Bennett, J. (1981) Regulation of phosphorylation of chloroplast membrane polypeptides by the redox state of plastoquinone. FEBS Lett. 125, 193-196。
【０１２３】
Husic, D.W. and Tolbert, N.E. (1987) Inhibition of glycolate and D-lactate metabolism in a Chlamydomonas reinhardtii mutant deficient in mitochondrial respiration. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 1555-1559。
Kindle, K.L., Schnell, R.A. Fernandez, E. and Levebvre, P.A. (1989) Stable nuclear transformation of Chlamydomonas using the Chlamydomonasgene for nitrate reductase. J.Cell Biol. 109, 2589-2601。
Kromer, S. and Heldt, H.W. (1991) On the role of mitochondrial oxidative phosphorylation in photosynthesis metabolism as studied by the effect of oligomycin on photosynthesis in protoplasts and leaves of barley. Plant Physiol. 95, 1270-1276。
Kromer, S., Stitt, M. and Heldt, H.W. (1988) Mitochondrial oxidative phosphorylation participating in photosynthetic metabolism of a leaf cell. FEBS Lett.226, 352-356。
Kruse, B., Narasimhan, N. and Atardi, G. (1989) Termination of transcription inhuman mitochondria: identification and purification of a DNA binding protein factor that promotes termination. Cell 58, 391-397。
【０１２４】
Kruse, O. Light-induced short-term adaptation mechanisms under redox control in the PS II-LHCII supercomplex: LHC II state transitions and PS II repair cycle. Naturwissenschaften 88, 284-92 (2001)。
Kruse, O., Nixon, P.J., Schmid, G.H. and Mullineaux, C.W. (1999) Isolation of state transition mutants of Chlamydomonas reinhardtii by fluorescence video imaging. Photosynth. Res. 61, 43-51。
Lee, J. W., Greenbaum, E. A new oxygen sensitivity and its potential application in photosynthetic H2 production. Applied Biochemistry and Biotechnology Vol. 105-108 (2003) 303-313。
Lemaire, S.D., Collin, V., Keryer, E., Quesada, A. & Miginiac-Maslow, M. Characterization of thioredoxin, a new type of thioredoxin identified in the genome of Chlamydomonas reinhardtii. FEBS Lett 543, 87-92 (2003)。
Loguericio, P.P., Roberti, M., Musicco, C., Gadaleta, M.N., Quagliariello, E. and Cantatore, P. (1999) Cloning and characterisation of mtDBP, a DNA-binding protein which binds two distinct regions of sea urchin mitochondrial DNA. Nucleic Acids Res. 27, 1890-1899。
【０１２５】
Lown, F.J., Watson, A.T. and Purton, S. (2001) Chlamydomonas nuclear mutants that fail to assemble respiratory or photosynthetic electron transfer complexes. Biochem. Soc. Trans. 29(4), 452-455。
Melis, A., Zhang, L. P., Forestier, M., Ghirardi, M. L., and Seibert, M. (2000) Plant Physiology 122, 127-135。
Melis, A., and Happe, T. (2001) Plant Physiol 127, 740-748。
Michel, K.-P., Kruger, F., Puhler, A. and Pistorius, E.K. (1999) Molecular characterisation of idiA and adjacent genes in the cyanobacteria Synechococcussp. strains PCC6301 and PCC 7942. Microbiology 145, 1473-1484. Millenaar,F.F. and Lambers,H. (2003) The alternative oxidase: In vivo regulation and function. Plant Biol. 5, 2-15。
Miyamoto, K. in FAO Agricultural Services Bulletin (ed. Miyamoto, K.) (FAO - Food and Agriculture Organization of the United Nations, Osaka University, Osaka, Japan, 1997)。
【０１２６】
Murata, N. (1969) Control of excitation transfer in photosynthesis. I. Light-induced change of chlorophyll a fluorescence in Porphyridium cruentum. Biochim. Biophys. Acta 172, 242-251。
Nelson, J.A.E., Savereide, P.B. and Lefebvre, P.A. (1994) The CRY1 Gene in Chlamydomonas reinhardtii: Structure and use as a dominant selectable marker for nuclear transformation. Mol. Cell. Biol. 14(6), 4011-4019。
Nijtmans, L.G.J., Taanman, J.-W., Muijsers, A.O., Speijer, D. and Van Den Bogert, C. (1998) Assembly of cytochrome-c oxidase in cultured human cells. Eur. J. Biochem. 254, 389-394。
Nurani, G., Erikson, M., Knorpp, C., Glaser, E. and Franzen, L.-G. (1997) Homologous and heterologous import into mitochondria isolated from the green alga Chlamydomonas reinhardtii. Plant Mol. Biol. 35, 973-980。
Petit, J. R. et al. Climate and atmospheric history of the past 420,000 years from the Vostok ice core, Antarctica. Nature 399, 429-436 (1999)。
【０１２７】
Pfannschmidt, T., Nilsson, A. and Allen, J. (1999) Photosynthetic control of chloroplast gene expression. Nature 397(6720), 625-628。
Purton, S. and Rochaix, J.D. (1995) Characterisation of the Arg7 gene of Chlamydomonas reinhardtii and its application to nuclear transformation. Eur.J. Phycol. 30, 141-148。
Rasmusson, A.G. and Moller, I.M. (1991) NAD(P)H dehydrogenases on the inner surface of the inner mitochondrial membrane studied using inside-out submitochondrial particles. Physiol. Plant. 83, 357-365。
Rebeille, F. and Gans, P. (1988) Interaction between chloroplasts and mitochondria in microalgae. Plant Physiol. 88, 973-975。
Rifkin, J. The Hydrogen Economy (Penguin Putnam Inc., New York, 2002)。
【０１２８】
Rintamaki, E., Martinsuo, P., Pursiheimo, S. and Aro, E.M. (2000) Cooperative regulation of lightharvesting complex II phosphorylation via the plastoquinol and ferredoxin-thioredoxin system in chloroplasts. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97(21), 11644-11649。
Roberti, M., Polosa, P.L., Bruni, F., Musicco, C., Gadaleta, M.N. and Cantatore, P. (2003) DmTTF, a novel mitochondrial transcription termination factor that recognises two sequences of Drosophila melanogaster mitochondrial DNA. Nucl. Acids Res. 31, 1597-1604。
Rupprecht, J., Kruse, O. & Hankamer, B. Evaluating the feasibility of implementing a global zero-CO2 emission energy strategy. Energy(submitted) (2004)。
Schonfeld, C. et al. MOC1, a transcription factor essential for mitochondrial light acclimation in C. reinhardtii. J Biol Chem (submitted) (2004)。
Selwood, S.P., Chrzanowska-Lightowlers, Z.M.A. and Lightowlers, R.N. (2000) Does the mitochondrial trancription termination complex play an essential role in controlling differential transcription of mitochondrial DNA? Biochem. Soc. Trans.28(2), 154-159。
【０１２９】
Singh, D.P. and Varna, K. (1995) Response of the wild-type and high light-tolerant mutant of Anacystis nidulans against photooxidative damage: Differential mechanism of high light tolerance. Photochem. Photobiol. 62(2), 314-319。
Stephenson, M., and Stickland, L. H. (1931) Biochem J. 25, 205-214。
Strauss, C., Mussgnug, J. and Kruse, O. (2001) Ligation-mediated suppression-PCR as a powerful tool to analyse nuclear gene sequences in the green alga Chlamydomonas reinhardtii. Photosynth. Res. 70, 311-320。
Svensson, A.S. and Rasmusson, A.G. (2001) Light-dependent gene expression for proteins in the respiratory chain of potato leaves. Plant J. 28, 73-82。
Tam, L.W. and Lefebvre, P.A. (1993) The use of DNA insertional mutagenesis to clone genes in Chlamydomonas. Genetics 135, 375-384。
【０１３０】
Thomas, C.D. et al. Extinction risk from climate change. Nature 427, 145-148 (2004)。
Trebst, A. (1980) Inhibitors in electron flow: tools for the functional and structural localization of carriers and energy conversion sites. Methods Enzymol. 69, 675-715。
Vener, A.V., van Kann, P.J., Rich, P.R., Andersson, B. and Ohad, I.(1997) Plastoquinol at the Qo-site of reduced cytochrome b6/f mediates signal transduction between light and thylakoid phosphorylation. Thylakoid protein kinase deactivation by a single turnover flash. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94,1585-1590。
Vener, A.V., Rokka, A., Fulgosi, H., Andersson, B. and Herrmann, R.G. (1999) A clophilin-regulated PP2A-like protein phosphatase in thylakoid membranes of plant chloroplasts. Biochemistry 38(45), 14955-14965。
Wollman, F. A. State transitions reveal the dynamics and flexibility of the photosynthetic apparatus. EMBO J 20, 3623-3630 (2001)。
【０１３１】
Zerges, W. and Rochaix, J.-D. (1998) Low density membranes are associated with RNA-binding proteins and thylakoids in the chloroplast of Chlamydomonas reinhardtii. J Cell Biol. 140(1), 101-10。
Zito, F., Finazzi, G., Delosme, R., Nitschke, W., Picot, D. and Wollman, F.-A. (1999) The Qo site of cytochrome b6f complexes controls the activation of the LHCII kinase. EMBO J. 18(11), 2961-2969。
【図面の簡単な説明】
【０１３２】
【図１】好気的条件或いは嫌気的条件下でのＳｔｍ６或いはＷＴにおける光合成Ｈ２生産に関連する各生化学的経路を示す図である。各区分は、葉緑体（ＣＨＬ）、サイトゾル及びミトコンドリア（ＭＩＴ）を示す。濃い矢印及び薄い矢印はそれぞれ電子及びプロトンの流れを示し、濃い線及び薄い線は同時のプロトン及び電子の流れを示す。○で囲った黒の×は阻害された経路を示す。○で囲った黒の矢印はダウンレギュレートされた経路を示す。
【図２】好気的条件或いは嫌気的条件下でのＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉの葉緑体におけるＨ＋／ｅ−の流れを示す。 ａ：好気的条件下、ＰＳＩＩの水分解（water splitting）反応由来の電子を光合成電子輸送鎖に沿って通過させる（黒実線矢印）。これは、ＮＡＤＰＨ及びデンプンの生成に使用する前に、プラストキノン（ＰＱ）、シトクロムｂ６ｆ（Ｃｙｔ ｂ６ｆ）、光化学系Ｉ（ＰＳＩ）、及びフェロドキシン（ferrodoxin）（Ｆｄ）経由で行う。ＰＳＩＩ及びＰＱ／ＰＱＨ２サイクルがチラコイド内腔に放出したＨ＋（プロトンの流れを薄灰色実線矢印で示す）はプロトン勾配を形成し、この勾配によってＡＴＰシンターゼによるＡＴＰ生成が駆動される。破線は、Ｓｔｍ６において阻害されたＨ＋（薄灰色）及びｅ−（黒）の移動経路を示す。 ｂ：嫌気的条件下、デンプン及びＮＡＤＰＨに貯蔵されたＨ＋／ｅ−をＨ２生産のためのＨｙｄＡに供給する。Ｓｔｍ６においては循環的電子輸送（ＦｄとＣｙｔ ｂ６ｆとを結ぶ黒破線）が阻害される。
【図３】野生株（ＷＴ）と変異体（Ｍ）Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉのＨ２生産特性を示す。 Ａ：ＷＴ及びＳｔｍ６ Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ培養物の長期間水素生産。溶解Ｈ２濃度の測定は、クラーク型水素センサシステム（デンマーク国、ユニセンス（UniSense））と暗所増殖させた１リットルのＷＴ及びＳｔｍ６細胞培養物（照射あたりの細胞密度ＯＤ７５０ｎｍ＝０．８は等しい）を用いて行った。硫黄非存在下においては、Ｓｔｍ６の生産するＨ２量はＷＴの３．５倍多かった（即ち、面積積分値１４６／４１＝３．５）。 Ｂ：ガス質量分析により推定した、野生株及びＳｔｍ６ Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ培養物の水素生産に対する光強度の影響。様々な照射レベルで１分間連続照射したときの（暗所で３０分置いた）ＷＴ及びＳｔｍ６細胞による水素発生（相対速度）。Ｓｔｍ６は常に、野生株に比べて（ピークの表示で示すように）５００〜７００％高い速度で水素を生産した。 Ｃ：水素クラーク電極測定値（ユニセンス（UniSense））により推定されるように、アンカップラーであるＣＣＣＰは、ＷＴに比べて約１５００％高いレベルでＨ２生産速度を安定させる。これは、ＨｙｄＡ活性は基質供給速度により限定され得ることを示している。
【図４】ＷＴ及び高Ｈ２生産変異体Ｃ．ｒｈｅｉｎｈａｒｄｔｉｉの染色切片の電子顕微鏡写真である。Ｃ−葉緑体、Ｇ−ゴルジ、Ｍ−ミトコンドリア、Ｎ−核、Ｓ−デンプン。尚、１）変異体のグラナはＷＴに比べて層数が少ない。これは変異体の光捕捉特性を示唆している。変異体には、デンプンの形の炭水化物が多く貯蔵されているように見られる。水由来のＨ＋及びｅ−は、ＨｙｄＡによってＨ２に変換される前はデンプンに貯蔵されている。
【図５】葉緑体における光誘起短時間適応機構の分析結果を示す。 ａ）ＷＴ、Ｂ１３及びＳｔｍ６において７７Ｋ蛍光分光分析によって分析した状態遷移 ｂ）状態２及び状態１においてＴＡＰ寒天プレート上で行ったＷＴ、Ｂ１３及びＳｔｍ６の蛍光ビデオ画像（化学線６２０ｎｍ光照射±１５分 ７１０ｎｍＰＳＩ光照射） ｃ）状態２適用ＷＴ及びＳｔｍ６細胞から単離したチラコイド膜のインビボリン酸化タンパク質パターン
【図６】Ｓｔｍ６は光ストレスに対して感受性を有することを示す。 ａ）ＷＴ、Ｂ１３及びＳｔｍ６株。ＴＡＰ培地中、対数増殖期中期まで培養し、１０００μｍｏｌ ｍ−２ｓ−１の白色光に４時間曝露した後、ＴＡＰ寒天プレート上に接種し４０μｍｏｌ ｍ−２ｓ−１の白色光下７日間増殖させた。 ｂ）高レベル光細胞生残率。ＷＴ、Ｂ１３及びＳｔｍ６株に対し４時間に亘って高レベル光処理を行った。細胞は、光処理に先立ち、１×１０４個／ｍＬに希釈した。
【図７】２個のｐＡｒｇ７．８プラスミドの縦列核挿入によって影響を受けたＳｔｍ６のゲノムＤＮＡ部位を示す。 −染色体歩行（ＬＭＳ−ＰＣＲ）後の配列解析による、及び： −特異的ｍｏｃ１、ｔｏｃ１、ｐＡｒｇ７．８の各プライマーを用いたＰＣＲ解析による。 ２本の黒矢印の組は、ＰＣＲに用いた各プライマーを示す。 ２本の灰色矢印は、ＷＴにおける核挿入の組込み部位を示す。
【図８】ＭＯＣ１のタンパク質配列、及びヒト転写終結因子ｍＴＥＲＦとのアライメントを示す。この模式図及び黒枠は、ＭＯＣ１におけるミトコンドリアトランジット配列及び特定されたｍＴＥＲＦドメイン構造の位置を示す。
【図９】ＷＴ、Ｓｔｍ６及びＢ１３のウェスタン解析及びＡＴＰ測定値レベルを示す。 ａ）シトクロムオキシダーゼサブユニットＣＯＸ９０に特異的な抗体を用いた光増殖細胞のイムノブロット。 ｂ）抗ペプチド抗体を用いたイムノブロット。ＭＯＣ１が葉緑体ではなくミトコンドリアに局在化していることを示すため（葉緑体及びミトコンドリアに対する対照としてそれぞれ抗Ｄ２及び抗Ｃｙｔ c ブロットを行った）、及びＳｔｍ６におけるＡＯＸ１のアップレギュレーションを示すために行った。濃度計で測定した交差反応の相対強度を示す。 ｃ）光増殖或いは暗所増殖させたＷＴ、Ｓｔｍ６及びＢ１３細胞のＡＴＰレベル。
【図１０】光誘起ミトコンドリア転写調節におけるＭＯＣ１の役割を示す。 ａ）暗所増殖培養物、及び暗所増殖後に光照射（３時間、２００μｍｏｌ ｍ−２ｓ−１）した培養物のｎａｄ２及びｃｏｘ１の半定量的ＲＴ−ＰＣＲ；ｍＲＮＡレベルはアクチンに標準化した。 ｂ）暗所増殖ＷＴ及び光照射増殖ＷＴから単離した全ＲＮＡのｍｏｃ１ノーザンブロット。 ｃ）高レベル光（８００μｍｏｌ ｍ−２ｓ−１）に０〜１８０分曝露したＷＴ細胞から単離したミトコンドリアの抗ＭＯＣ１及び抗シトクロムイムノブロット。対照としてＳｔｍ６ブロットを行った。 ｄ）ＷＴ及びＳｔｍ６から単離したミトコンドリアにおけるシトクロムオキシダーゼ活性測定値（３時間、２００μｍｏｌ ｍ−２ｓ−１）。
【図１１】高光ストレス時のミトコンドリア呼吸電子輸送調節におけるＭＯＣ１の役割と、葉緑体における光誘起レドックス対照プロセスに対するその影響とを説明するモデルを示す。灰色の枠は細胞小器官を示す。
【図１２】溶解酸素濃度測定値を示す。 パネルＡ：一定照射下、硫黄飽和ＴＡＰ培地中細胞培養を行い、時間＝０において硫黄除去ＴＡＰ培地に移した。 パネルＢ：光培養細胞調製物（３０μｇ Ｃｈｌ／ｍＬ）±５ｍＭ ＫＣＮを用いて暗所で細胞呼吸測定を行った。
【図１３】循環的電子輸送の分光分析測定を示すグラフである。測定は、２０μＭジクロロフェニルジメチル尿素（ＤＣＭＵ：ＰＳＩＩからｃｙｔｂ６ｆへのｅ−の輸送を阻害する）又は５μＭ ２，５−ジブロモ−６−イソプロピル−３−メチル−１，４−ベンゾキノンの存在下、ｃｙｔ ｆの光誘起レドックス変化を測定することにより行った。上向き矢印：光オン、下向き矢印：光オフ。吸光度は、ｃｙｔ ｆの酸化に対応して減少する。
【図１４】ＷＴ Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ及びＳｔｍ６におけるＰＳＩＩ及びＰＳＩ活性レベルを示すグラフである。
【図１５】ＷＴ Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ及びＳｔｍ６細胞培養物におけるリンゴ酸ＮＡＤＰＨ−デヒドロゲナーゼ活性測定値を示すグラフである。
【図１６】低光レベルにおけるＳｔｍ６及び野生株Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉの増殖速度の比較を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
水素の生産方法であって、該方法は、
（ｉ）光合成微生物であって、光合成「光」反応経路を介し且つ酸化的リン酸化経路を伴う呼吸電子伝達鎖を介して電子伝達を行うことができると共にヒドロゲナーゼを発現し、酸化的リン酸化経路の調節が崩壊された結果、呼吸電子伝達鎖に沿ったシトクロムオキシダーゼ（複合体ＩＶ）への電子の流れが低減された光合成微生物を提供する段階と、
（ｉｉ）該微生物をマイクロオキシック条件及び照射条件下培養する段階と、
（ｉｉｉ）発生した水素を回収する段階とを含む方法。
【請求項２】
該微生物がアセテート含有培地において培養される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
二酸化炭素が炭素源である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
照射を最大１２０時間継続する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
照射を太陽光の照射により行う、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
照射を人工光源により行う、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
照射光の強度が１５〜３１００μｍｏｌ ｍ−２ｓ−１である、請求項５又は６に記載の方法。
【請求項８】
光合成電子輸送鎖からのＡＴＰシンターゼのアンカップラーを添加する段階をさらに含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
アンカップラーは、カルボニルシアニド ３−クロロ−フェニルヒドラゾン（ＣＣＣＰ）、１，３−ジクロロ−ヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、塩化アンモニウム、ベンツリシジン、カルボニルシアニド ｐ−トリフルオロメトキシフェニルヒドラゾン（ＦＣＣＰ）、２，４−ジニトロフェノール、グラミシジン及びニゲリシンからなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
呼吸電子伝達鎖を調節するミトコンドリア転写因子の活性が低減されるかなくされる、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
ミトコンドリア転写因子はＭＯＣ１である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ミトコンドリア転写因子の活性は、ＲＮＡｉを用いてアンチセンス分子を導入することにより、不活性化変異を導入することにより、或いはミトコンドリア転写因子の阻害剤を導入することにより低減されるかなくされる、請求項１０又は１１に記載の方法。
【請求項１３】
シトクロムオキシダーゼ（複合体ＩＶ）がダウンレギュレートされる、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
ｃｏｘ１転写産物のレベルがｎａｄ２より低減される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
葉緑体における循環的電子輸送が阻害される、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
微生物は藻類或いはシアノバクテリアである、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
藻類は緑藻類の内の一種である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
藻類は、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、Ｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃａｌｅｓ及びＶｏｌｖｏｃａｌｅｓ、とりわけＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｓｐｐ．、Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ ｓｐｐ．、Ｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｍ ｓｐｐ．、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｓｐｐ．、Ｐｌａｔｙｍｏｎａｓ ｓｐｐ．及びＴｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ ｓｐｐ．の藻類からなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
藻類がＶｏｌｖｏｃａｌｅｓ目に属する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
藻類がＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｓｐｐ．に属する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
藻類がＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
藻類が、２００３年７月１日に受託番号１１／１２９で藻類及び原生動物培養保存機関（Culture Collection of Algae and Protozoa）（ＣＣＡＰ）に寄託されたＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ Ｓｔｍ６である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
バイオマス生産を向上させる方法であって、該方法は、
（ｉ）光合成微生物であって、光合成「光」反応経路を介し且つ酸化的リン酸化経路を伴う呼吸電子伝達鎖を介して電子伝達を行うことができると共にヒドロゲナーゼを発現し、酸化的リン酸化経路の調節が崩壊された結果、呼吸電子伝達鎖に沿ったシトクロムオキシダーゼ（複合体ＩＶ）への電子の流れが低減された光合成微生物を提供する段階と、
（ｉｉ）照射条件下且つ炭素源の存在下、該微生物を培養してバイオマスを増大させる段階とを含む方法。
【請求項２４】
増大されたバイオマスをガス化して水素を生産する段階を更に含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
外部の栄養源から炭素を切り離す（sequestering）方法であって、該方法は、
（ｉ）光合成微生物であって、光化学系Ｉ及びＩＩ（ＰＳ Ｉ及びＰＳ ＩＩ）を伴う光合成「光」反応経路を介して電子伝達を行うことができると共にヒドロゲナーゼを発現し、ヒドロゲナーゼの固有の酸素阻害を低減するかなくするように酸化的リン酸化経路の調節が崩壊される光合成微生物を提供する段階と、
（ｉｉ）照射条件下、該微生物を培養してバイオマスを増大させる段階とを含み、
外部の栄養源を前記培養の炭素源として用い、そのためにその栄養源から炭素がなくなる方法。
【請求項２６】
外部の栄養源が廃棄物流である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
光合成微生物の実質的に純粋な培養物であって、光合成「光」反応経路を介し且つ酸化的リン酸化経路を伴う呼吸電子伝達鎖を介して電子伝達を行うことができると共にヒドロゲナーゼを発現し、酸化的リン酸化経路の調節が崩壊された結果、呼吸電子伝達鎖に沿ったシトクロムオキシダーゼ（複合体ＩＶ）への電子の流れが低減された光合成微生物の実質的に純粋な培養物。
【請求項２８】
２００３年７月１日に受託番号ＣＣＡＰ１１／１２９で藻類及び原生動物培養保存機関（Culture Collection of Algae and Protozoa）（ＣＣＡＰ）に寄託されたＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ Ｓｔｍ６。
【請求項１】
水素の生産方法であって、該方法は、
（ｉ）光合成微生物であって、光合成「光」反応経路を介し且つ酸化的リン酸化経路を伴う呼吸電子伝達鎖を介して電子伝達を行うことができると共にヒドロゲナーゼを発現し、酸化的リン酸化経路の調節が崩壊された結果、呼吸電子伝達鎖に沿ったシトクロムオキシダーゼ（複合体ＩＶ）への電子の流れが低減された光合成微生物を提供する段階と、
（ｉｉ）該微生物をマイクロオキシック条件及び照射条件下培養する段階と、
（ｉｉｉ）発生した水素を回収する段階とを含む方法。
【請求項２】
該微生物がアセテート含有培地において培養される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
二酸化炭素が炭素源である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
照射を最大１２０時間継続する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
照射を太陽光の照射により行う、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
照射を人工光源により行う、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
照射光の強度が１５〜３１００μｍｏｌ ｍ−２ｓ−１である、請求項５又は６に記載の方法。
【請求項８】
光合成電子輸送鎖からのＡＴＰシンターゼのアンカップラーを添加する段階をさらに含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
アンカップラーは、カルボニルシアニド ３−クロロ−フェニルヒドラゾン（ＣＣＣＰ）、１，３−ジクロロ−ヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、塩化アンモニウム、ベンツリシジン、カルボニルシアニド ｐ−トリフルオロメトキシフェニルヒドラゾン（ＦＣＣＰ）、２，４−ジニトロフェノール、グラミシジン及びニゲリシンからなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
呼吸電子伝達鎖を調節するミトコンドリア転写因子の活性が低減されるかなくされる、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
ミトコンドリア転写因子はＭＯＣ１である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ミトコンドリア転写因子の活性は、ＲＮＡｉを用いてアンチセンス分子を導入することにより、不活性化変異を導入することにより、或いはミトコンドリア転写因子の阻害剤を導入することにより低減されるかなくされる、請求項１０又は１１に記載の方法。
【請求項１３】
シトクロムオキシダーゼ（複合体ＩＶ）がダウンレギュレートされる、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
ｃｏｘ１転写産物のレベルがｎａｄ２より低減される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
葉緑体における循環的電子輸送が阻害される、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
微生物は藻類或いはシアノバクテリアである、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
藻類は緑藻類の内の一種である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
藻類は、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、Ｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃａｌｅｓ及びＶｏｌｖｏｃａｌｅｓ、とりわけＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｓｐｐ．、Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ ｓｐｐ．、Ｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｍ ｓｐｐ．、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｓｐｐ．、Ｐｌａｔｙｍｏｎａｓ ｓｐｐ．及びＴｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ ｓｐｐ．の藻類からなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
藻類がＶｏｌｖｏｃａｌｅｓ目に属する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
藻類がＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｓｐｐ．に属する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
藻類がＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
藻類が、２００３年７月１日に受託番号１１／１２９で藻類及び原生動物培養保存機関（Culture Collection of Algae and Protozoa）（ＣＣＡＰ）に寄託されたＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ Ｓｔｍ６である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
バイオマス生産を向上させる方法であって、該方法は、
（ｉ）光合成微生物であって、光合成「光」反応経路を介し且つ酸化的リン酸化経路を伴う呼吸電子伝達鎖を介して電子伝達を行うことができると共にヒドロゲナーゼを発現し、酸化的リン酸化経路の調節が崩壊された結果、呼吸電子伝達鎖に沿ったシトクロムオキシダーゼ（複合体ＩＶ）への電子の流れが低減された光合成微生物を提供する段階と、
（ｉｉ）照射条件下且つ炭素源の存在下、該微生物を培養してバイオマスを増大させる段階とを含む方法。
【請求項２４】
増大されたバイオマスをガス化して水素を生産する段階を更に含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
外部の栄養源から炭素を切り離す（sequestering）方法であって、該方法は、
（ｉ）光合成微生物であって、光化学系Ｉ及びＩＩ（ＰＳ Ｉ及びＰＳ ＩＩ）を伴う光合成「光」反応経路を介して電子伝達を行うことができると共にヒドロゲナーゼを発現し、ヒドロゲナーゼの固有の酸素阻害を低減するかなくするように酸化的リン酸化経路の調節が崩壊される光合成微生物を提供する段階と、
（ｉｉ）照射条件下、該微生物を培養してバイオマスを増大させる段階とを含み、
外部の栄養源を前記培養の炭素源として用い、そのためにその栄養源から炭素がなくなる方法。
【請求項２６】
外部の栄養源が廃棄物流である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
光合成微生物の実質的に純粋な培養物であって、光合成「光」反応経路を介し且つ酸化的リン酸化経路を伴う呼吸電子伝達鎖を介して電子伝達を行うことができると共にヒドロゲナーゼを発現し、酸化的リン酸化経路の調節が崩壊された結果、呼吸電子伝達鎖に沿ったシトクロムオキシダーゼ（複合体ＩＶ）への電子の流れが低減された光合成微生物の実質的に純粋な培養物。
【請求項２８】
２００３年７月１日に受託番号ＣＣＡＰ１１／１２９で藻類及び原生動物培養保存機関（Culture Collection of Algae and Protozoa）（ＣＣＡＰ）に寄託されたＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ Ｓｔｍ６。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【公表番号】特表２００７−５２５１９９（Ｐ２００７−５２５１９９Ａ）
【公表日】平成１９年９月６日（２００７．９．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５１７９０２（Ｐ２００６−５１７９０２）
【出願日】平成１６年７月７日（２００４．７．７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＡＵ２００４／０００９１３
【国際公開番号】ＷＯ２００５／００３０２４
【国際公開日】平成１７年１月１３日（２００５．１．１３）
【出願人】（５０６００８７００）ユニバーシティ オブ クイーンズランド (3)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年９月６日（２００７．９．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年７月７日（２００４．７．７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＡＵ２００４／０００９１３
【国際公開番号】ＷＯ２００５／００３０２４
【国際公開日】平成１７年１月１３日（２００５．１．１３）
【出願人】（５０６００８７００）ユニバーシティ オブ クイーンズランド (3)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]