免疫原性が抑制されたＢＭＰ−７変異体
本発明は、抑制された免疫原性を有する骨形成タンパク質に関する。特に、本発明は、野生型ＢＭＰ−７のアミノ酸配列の変化によって免疫原性を抑制するよう改変された、ヒトＢＭＰ−７に関する。本発明は、野生型ヒトＢＭＰ−７と比較して、その免疫原性を抑制するように改変したＢＭＰ−７、例えばヒト組換えＢＭＰ−７に関する。より具体的には、本発明によるＢＭＰ−７タンパク質を、潜在的な免疫原性エピトープを除去するように改変する。結果として、本発明のＢＭＰ−７タンパク質は、野生型ＢＭＰ−７と比較して、改善した生物学的性質を有する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本願は、２００９年１２月２２日に出願された米国仮特許出願第６１／２８９，２２０号の利益を主張し、この米国仮特許出願の内容は、本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
発明の技術分野
本発明は、免疫原性を抑制するように改変した骨形成タンパク質−７（ＢＭＰ−７）、および免疫原性を抑制するようにＢＭＰ−７を改変するための方法に関連する。
【背景技術】
【０００３】
背景
骨成長を誘導し得るタンパク質である、骨形成タンパク質−１（ＯＰ−１）としても公知のＢＭＰ−７は、様々な軟骨および骨の疾患および欠損を処置するために有用である。例えば、組換えヒトＢＭＰ−７は、世界中で４０，０００人以上の患者を処置するために使用されてきた。しかし、臨床結果は、組換えヒトＢＭＰ−７は、いくつかの臨床適応症において高度に免疫原性であることを明らかにした。言い換えると、上記組換えタンパク質は、患者において免疫反応を刺激し、上記患者にＢＭＰ−７に対する抗体を作らせ得る。これらの抗体はまた、上記患者によって内因性に産生されたＢＭＰ−７の機能を阻害し、患者の健康にとって潜在的な長期的結果を引き起こし得る。よって、当該分野において、患者においてその有効性を改善し、そして有害作用を抑制するために、免疫原性を抑制し、一方その生物学的活性および臨床的に関連のある骨形成の性質を維持する、組換えＢＭＰ−７を含む、ＢＭＰ−７に対するニーズが存在する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
発明の要旨
本発明は、野生型ヒトＢＭＰ−７と比較して、その免疫原性を抑制するように改変したＢＭＰ−７、例えばヒト組換えＢＭＰ−７に関する。より具体的には、本発明によるＢＭＰ−７タンパク質を、潜在的な免疫原性エピトープを除去するように改変する。結果として、本発明のＢＭＰ−７タンパク質は、野生型ＢＭＰ−７と比較して、改善した生物学的性質を有する。
【０００５】
１つの局面によって、本発明は、成熟ヒトＢＭＰ−７と少なくとも９０％の配列同一性を有する、変異体ＢＭＰ−７タンパク質を含む。上記変異体ＢＭＰ−７は、１個以上、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、または８個以上の、成熟ヒトＢＭＰ−７に対応する以下の位置で、置換を含む：Ｇ６１、Ａ６３、Ｙ６５、Ｙ６６、Ｅ６８、Ｅ７０、Ａ７２、Ｈ９２、Ｆ９３、Ｉ９４、Ｎ９５、Ｐ９６、Ｅ９７、Ｔ９８、Ｖ９９、Ｐ１００、Ｐ１０２、またはＡ１０５。さらなる実施態様において、上記変異体タンパク質は、成熟ヒトＢＭＰ−７と少なくとも９５％の同一性を有する。
【０００６】
さらなる実施態様において、上記置換は、１つ以上の以下のものである：Ｇ６１Ｅ、Ａ６３Ｅ／Ｑ／Ｈ、Ｙ６５Ｆ／Ｎ、Ｙ６６Ｅ、Ｅ６８Ｄ／Ｋ／Ｈ、Ｅ７０Ｇ／Ｄ、Ａ７２Ｓ／Ｆ／Ｐ、Ｈ９２Ｎ、Ｆ９３Ｎ／Ｌ／Ｓ、Ｉ９４Ｍ／Ｋ／Ｓ／Ｖ、Ｎ９５Ｖ／Ｆ、Ｐ９６Ｓ／Ｎ、Ｅ９７Ｓ／Ｔ／Ｄ／Ｋ、Ｔ９８Ｋ／Ｉ／Ｓ／Ｙ／Ｈ、Ｖ９９Ｉ、Ｐ１００Ｇ、Ｐ１０２Ａ、またはＡ１０５Ｖ。さらなる実施態様において、上記変異体は、ＢＭＰ−７活性を示す。
【０００７】
別の局面において、本発明は、本発明の変異体ＢＭＰ−７タンパク質をコードする核酸に関する。例えば、上記核酸はＤＮＡまたはＲＮＡである。
【０００８】
別の局面において、本発明は、本発明の変異体ＢＭＰ−７タンパク質をコードする核酸を含む、組換え発現ベクターに関する。
【０００９】
さらに別の局面において、本発明は、本発明の変異体ＢＭＰ−７タンパク質をコードする核酸を含む発現ベクターを含む細胞に関する。上記細胞は、１つの実施態様において原核生物であり得る、または別の実施態様において真核生物であり得る。
【００１０】
さらなる局面において、本発明は、本発明の変異体ＢＭＰ−７タンパク質および薬学的キャリアを含む薬学的組成物に関する。
【００１１】
さらなる局面によって、本発明は、患者における骨格障害を処置する方法に関する。上記方法は、上記患者に、治療的に有効な量の本発明の変異体ＢＭＰ−７タンパク質を投与することを必要とする。
【００１２】
またさらなる局面によって、本発明は、ヒトＢＭＰ−７タンパク質の免疫原性を抑制する方法に関する。上記方法は、ヒトＢＭＰ−７の免疫原性エピトープを同定すること、およびＢＭＰ−７のアミノ酸配列において１つ以上の置換を工学技術で作製することによって、ヒトＢＭＰ−７のアミノ酸配列においてエピトープを改変して、改変アミノ酸配列を作製することを必要とする。１つ以上の置換が、成熟ヒトＢＭＰ−７に対応する、１つ以上の位置Ｇ６１、Ａ６３、Ｙ６５、Ｙ６６、Ｅ６８、Ｅ７０、Ａ７２、Ｈ９２、Ｆ９３、Ｉ９４、Ｎ９５、Ｐ９６、Ｅ９７、Ｔ９８、Ｖ９９、Ｐ１００、Ｐ１０２、またはＡ１０５において起こる。１つの実施態様において、上記ヒトＢＭＰ−７は組換体である。さらなる実施態様において、上記１つ以上の置換は、Ｇ６１Ｅ、Ａ６３Ｅ／Ｑ／Ｈ、Ｙ６５Ｆ／Ｎ、Ｙ６６Ｅ、Ｅ６８Ｄ／Ｋ／Ｈ、Ｅ７０Ｇ／Ｄ、Ａ７２Ｓ／Ｆ／Ｐ、Ｈ９２Ｎ、Ｆ９３Ｎ／Ｌ／Ｓ、Ｉ９４Ｍ／Ｋ／Ｓ／Ｖ、Ｎ９５Ｖ／Ｆ、Ｐ９６Ｓ／Ｎ、Ｅ９７Ｓ／Ｔ／Ｄ／Ｋ、Ｔ９８Ｋ／Ｉ／Ｓ／Ｙ／Ｈ、Ｖ９９Ｉ、Ｐ１００Ｇ、Ｐ１０２Ａ、またはＡ１０５Ｖのいずれか１つ以上である。さらなる実施態様において、上記方法は、適当な発現システムにおいて、上記改変されたアミノ酸配列によってコードされるタンパク質を発現する工程、および上記タンパク質を精製する工程を含み得る。上記タンパク質を、１つの実施態様において真核細胞において発現し得る、または別の実施態様において原核細胞において発現し得る。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、それぞれ１５アミノ酸長であり、そして５または１０アミノ酸のいずれかで重複する、ヒトＢＭＰ−７の成熟領域の配列全体をカバーする、１８個のペプチドを示す。
【図２】図２は、ヒトＢＭＰ−７の成熟領域全体に関連する、これらのペプチド間の重複を示す、１８個のペプチドの概略図である。
【図３】図３は、患者血清サンプル由来の、非中和抗ＢＭＰ−７抗体に対する、図１に示した１８個のペプチドの、ＥＬＩＳＡにおける結合の結果を示す棒グラフである。（その棒は、左から右に、１１２６６−、１１１６９４＋、１１１９４５＋、１１１６６５＋、および１Ｂ１２／１２Ｇ３＋である）。
【図４】図４は、患者血清サンプル由来の、中和抗ＢＭＰ−７抗体に対する、図１に示した１８個のペプチドの、ＥＬＩＳＡにおける結合の結果を示す棒グラフである。（その棒は、左から右に、１１１３７９１−、１１３１１３＋、１１３３３１＋、１１３７５６＋、１１２９５６＋、１１３７５７＋、１１３７６６＋、１１１６９４＋、および１Ｂ１２／１２Ｇ３＋である）。
【図５】図５Ａは、ＢＭＰ−２、４、５、６、および９における対応する領域とともに、ペプチド９（図１に示すような）に対応するＢＭＰ−７の部分の整列である。図５Ｂは、ＢＭＰ−２、４、５、６、および９における対応する領域とともに、ペプチド１３（図１に示すような）に対応するＢＭＰ−７の部分の整列である。
【図６】図６は、成熟ヒトＢＭＰ−７の配列である（配列番号１）。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
発明の詳細な説明
組換えヒトＢＭＰ−７は、いくつかの臨床適応症において高度に免疫原性であることが示された。例えば、ＢＭＰ−７は、ＯＰ−１（登録商標）ＰｕｔｔｙまたはＯＰ−１（登録商標）Ｉｍｐｌａｎｔ（Ｓｔｒｙｋｅｒ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ、ＭＡ）の一部として患者に移植された場合、いくらかの患者において、組換えヒトＢＭＰ−７に対する抗体を生成することによって、免疫反応を示すようになる。これは、ＢＭＰ−７処置の有効性を減少させ、そして副作用を引き起こし得る。
【００１５】
よって、本発明は、野生型ＢＭＰ−７と比較して、抑制された免疫原性を有する変異体ＢＭＰ−７タンパク質に関する。本発明はまた、抑制された免疫原性を有するＢＭＰ−７変異体を製造および使用する方法も含む。本発明によって、潜在的な免疫原性エピトープを含むＢＭＰ−７部分のアミノ酸残基を改変することによって、免疫原性を抑制する。よって、本発明によって改変したＢＭＰ−７タンパク質は、その生物学的活性を維持するが、その野生型ＢＭＰ−７対応物より実質的に免疫原性が低い。例えば、ＢＭＰ−７の免疫原性の性質を、本発明によって除去または実質的に抑制する。よって、そのような変異体ＢＭＰ−７タンパク質は、患者、例えばヒト患者に投与した場合に、免疫原性が低いことが予期される。
【００１６】
骨形成タンパク質
骨形成タンパク質（ＢＭＰ）は、ＴＧＦ−βスーパーファミリーに属する。上記ＴＧＦ−βスーパーファミリータンパク質は、６個の保存されたシステイン残基によって特徴付けられるサイトカインである。ヒトゲノムは、ＴＧＦ−βスーパーファミリータンパク質をコードする、約４２個のオープンリーディングフレームを含む。上記ＴＧＦ−βスーパーファミリータンパク質を、配列類似性およびそれらが活性化する特異的シグナル伝達経路に基づいて、少なくともＢＭＰサブファミリーおよびＴＧＦ−βサブファミリーに分けることができる。上記ＢＭＰサブファミリーは、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３（オステオゲニン）、ＢＭＰ−３ｂ（ＧＤＦ−１０）、ＢＭＰ−４（ＢＭＰ−２ｂ）、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７（骨形成タンパク質−１またはＯＰ−１）、ＢＭＰ−８（ＯＰ−２）、ＢＭＰ−８Ｂ（ＯＰ−３）、ＢＭＰ−９（ＧＤＦ−２）、ＢＭＰ−１０、ＢＭＰ−１１（ＧＤＦ−１１）、ＢＭＰ−１２（ＧＤＦ−７）、ＢＭＰ−１３（ＧＤＦ−６、ＣＤＭＰ−２）、ＢＭＰ−１５（ＧＤＦ−９）、ＢＭＰ−１６、ＧＤＦ−１、ＧＤＦ−３、ＧＤＦ−５（ＣＤＭＰ−１、ＭＰ−５２）、およびＧＤＦ−８（ミオスタチン）を含むがこれに限らない。さらに、ヒト集団の異なるメンバーの間で、ＢＭＰ配列の対立遺伝子変異が存在し、そして現在までに発見および特徴付けされたＢＭＰの間で種の変異が存在する。本明細書中で使用される場合、「ＢＭＰサブファミリー」、「ＢＭＰ」、「ＢＭＰリガンド」およびその文法的同等物は、明確に他に示さなければ、ＢＭＰサブファミリーのメンバーを指す。
【００１７】
これらの配列、およびその化学的ならびに物理的性質を開示する出版物は、以下のものを含む：
【００１８】
【数１】
【００１９】
上記の出版物は、本明細書中で参考文献に組込まれる。
【００２０】
本明細書中で使用される場合、「ＴＧＦ−βスーパーファミリーメンバー」または「ＴＧＦ−βスーパーファミリータンパク質」は、トランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）スーパーファミリーのメンバーとして当業者に公知であるタンパク質を意味する。構造的に、そのようなタンパク質は、疎水性のシグナル配列、数百アミノ酸のＮ末端プロ領域、および可変Ｎ末端領域、および保存された６個または７個のシステイン骨格を有する特徴的なシステインモチーフを有する約１００アミノ酸を含む、高度に保存されたＣ末端領域を含む成熟ドメインを含む大きな前駆体ポリペプチド鎖として発現するホモまたはヘテロダイマーである。これらの構造的に関連するタンパク質は、様々な発生のイベントに関与するとして同定された。
【００２１】
「形態形成タンパク質」という用語は、真の形態形成活性を有する、タンパク質のＴＧＦ−βスーパーファミリーに属するタンパク質を指す。例えば、そのようなタンパク質は、前駆細胞を誘導して、増殖させ得る、および／または、局所環境の指示（ｃｕｅ）に依存して、軟骨、骨、腱、靭帯、神経または他の型の分化組織の形成に至る分化経路の一連のイベントを開始し得る。従って、本発明によって有用な形態形成タンパク質は、異なる環境において異なる挙動をし得る。ある実施態様において、本発明の形態形成タンパク質は、ホモダイマー種またはヘテロダイマー種であり得る。
【００２２】
「骨形成タンパク質（ＯＰ）」という用語は、前駆細胞を誘導して軟骨および／または骨も形成し得る、形態形成タンパク質を指す。上記骨は、膜内の骨または軟骨内の骨であり得る。ほとんどの骨形成タンパク質は、ＢＭＰサブファミリーのメンバーであり、そして従ってＢＭＰでもある。しかし、逆は真ではない。本発明によって、ＤＮＡ配列相同性またはアミノ酸配列同一性によって同定されたＢＭＰはまた、骨形成タンパク質であるために、機能的な生物検定において明白な骨形成または軟骨形成活性を有さなければならない。適当な生物検定は、当該分野で周知である；特に有用な生物検定は、異所性骨形成アッセイである（例えば、米国特許第５，０１１，６９１号；米国特許第５，２６６，６８３号を参照のこと）。
【００２３】
構造的に、ＢＭＰはダイマーのシステインノットタンパク質（ｃｙｓｔｅｉｎ ｋｎｏｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）である。ＢＭＰの各モノマーは、複数の分子内ジスルフィド結合を含む。さらなる分子間ジスルフィド結合が、ほとんどのＢＭＰにおいてダイマー化を媒介する。ＢＭＰは、ホモダイマーを形成し得る。いくつかのＢＭＰはヘテロダイマーを形成し得る。ＢＭＰは、長いプロドメイン、１つ以上の切断部位、および成熟ドメインを含む、プロタンパク質として発現する。上記プロドメインは、正しいフォールディングおよびＢＭＰのプロセシングを助けると考えられる。さらに、全てではないがいくつかのＢＭＰにおいて、上記プロドメインは上記成熟ドメインに非共有結合的に結合し得、そしてインヒビターとして作用し得る（例えばＴｈｉｅｓら、（２００１）Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ １８：２５１−２５９）。
【００２４】
ＢＭＰは、天然には長いプロドメイン、１つ以上の切断部位、および成熟ドメインを含むプロタンパク質として発現する。次いでこのプロタンパク質が、細胞機構によって処理されて、ダイマーの成熟ＢＭＰ分子を生じる。上記プロドメインは、正しいフォールディングおよびＢＭＰのプロセシングを助けると考えられる。さらに、全てではないがいくつかのＢＭＰにおいて、上記プロドメインは上記成熟ドメインに非共有結合的に結合し得、そしてシャペロンおよびインヒビターとして作用し得る（例えばＴｈｉｅｓら、（２００１）Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ １８：２５１−２５９）。
【００２５】
ＢＭＰシグナル伝達は、ＢＭＰダイマーが、２つのＩ型および２つのＩＩ型セリン／スレオニンキナーゼ受容体に結合したときに開始される。Ｉ型受容体は、ＡＬＫ−１、ＡＬＫ−２（ＡｃｔＲｌａまたはＡｃｔＲＩとも呼ばれる）、ＡＬＫ−３（ＢＭＰＲＩａとも呼ばれる）、およびＡＬＫ−６（ＢＭＰＲＩｂとも呼ばれる）を含むがこれに限らない。ＩＩ型受容体は、ＡｃｔＲＩＩａ（ＡｃｔＲＩＩとも呼ばれる）、ＡｃｔＲＩＩｂ、およびＢＭＰＲＩＩを含むがこれに限らない。ヒトゲノムは、７個のＩ型および５個のＩＩ型受容体を含む、受容体セリン／スレオニンキナーゼファミリーの１２個のメンバーを含み、それらは全て、ＴＧＦ−βシグナル伝達に関与する（Ｍａｎｎｉｎｇら、２００２、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９８：１９１２−１９３４、その開示は本明細書によって参考文献に組込まれる）。ＢＭＰが結合した後、上記ＩＩ型受容体は、上記Ｉ型受容体をリン酸化し、そのＩ型受容体は転写因子のＳｍａｄファミリーのメンバーをリン酸化し、そしてそのＳｍａｄは核に移動して、そして一群の遺伝子の発現を活性化する。
【００２６】
ＢＭＰはまた、ＢＡＭＢＩ（ＢＭＰおよびアクチビン膜結合インヒビター）、ＢＭＰＥＲ（ＢＭＰ結合内皮細胞前駆体由来制御因子）、セルベラス（Ｃｅｒｂｅｒｕｓ）、コルディン（ｃｏｒｄｉｎ）、コルディン様、ダン（Ｄａｎ）、ダンテ（Ｄａｎｔｅ）、フォリスタチン（ｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎ）、フォリスタチン関連タンパク質（ＦＳＲＰ）、エクトディン（ｅｃｔｏｄｉｎ）、グレムリン（ｇｒｅｍｌｉｎ）、ノギン（ｎｏｇｇｉｎ）、ダンおよびセルベラス（ｃｅｒｂｅｒｕｓ）に関連するタンパク質（ＰＲＤＣ）、スクレロスチン（ｓｃｌｅｒｏｓｔｉｎ）、スクレロスチン様、および子宮感作関連遺伝子−１（ｕｔｅｒｉｎｅ ｓｅｎｓｉｔｉｚａｔｉｏｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｇｅｎｅ−１）（ＵＳＡＧ−１）を含むがこれに限らない、インヒビター、可溶性受容体、およびデコイ受容体と相互作用する。さらに、ＢＭＰは、補助受容体と相互作用し得、例えばＢＭＰ−２およびＢＭＰ−４は、補助受容体ＤＲＡＧＯＮ（Ｓａｍａｄら、（２００５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８０：１４１２２−１４１２９）、およびヘパリン硫酸およびヘパリンのような細胞外マトリックス成分（Ｉｒｉｅら、（２００３）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３０８：８５８−８６５）に結合する。
【００２７】
本明細書中で企図されるように、「ＢＭＰ」という用語は、ＤＮＡ相同性およびアミノ酸配列同一性に基づいて規定される、ＴＧＦ−βスーパーファミリーのタンパク質の、ＢＭＰサブファミリーに属するタンパク質を指す。本発明によって、タンパク質は、上記ＢＭＰサブファミリーを特徴づける、保存されたＣ末端システインリッチドメイン内で、公知のＢＭＰサブファミリーメンバーと少なくとも５０％のアミノ酸配列同一性を有する場合、上記ＢＭＰサブファミリーに属する。ＢＭＰサブファミリーのメンバーは、全体的に５０％未満のＤＮＡ配列同一性またはアミノ酸配列同一性を有し得る。本明細書中で使用される場合、「ＢＭＰ」という用語はさらに、天然に存在する骨形成タンパク質のアミノ酸配列変異体、ドメイン交換変異体、および短縮化および活性断片であるタンパク質、およびＢＭＰ−２／７；ＢＭＰ−４／７；ＢＭＰ−２／６；ＢＭＰ−２／５；ＢＭＰ−４／７；ＢＭＰ−４／５；およびＢＭＰ−４／６ヘテロダイマーのような、２つの異なるモノマーＢＭＰペプチドから形成される、ヘテロダイマータンパク質を指す。適当なＢＭＰ変異体およびヘテロダイマーは、ＵＳ２００６／０２３５２０４；ＷＯ０７／０８７０５３；ＷＯ０５／０９７８２５；ＷＯ００／０２０６０７；ＷＯ００／０２０５９１；ＷＯ００／０２０４４９；ＷＯ０５／１１３５８５；ＷＯ９５／０１６０３４およびＷＯ９３／００９２２９において記載するものを含む。
【００２８】
１つの実施態様によって、本発明の方法によって生じた、ＢＭＰ−７変異体のようなＢＭＰ変異体は、対応する野生型ＢＭＰタンパク質配列と、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を維持する。
【００２９】
１つの実施態様によって、本発明の方法によって生じた、ＢＭＰ−７変異体のようなＢＭＰ変異体は、対応する野生型ＢＭＰタンパク質配列のＣ末端領域の保存されたシステインドメインと、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を維持する。
【００３０】
「対応する野生型タンパク質」によって、その改変ＢＭＰまたは変異体ＢＭＰの野生型バージョンを意味する。例えば、上記改変ＢＭＰまたは変異体ＢＭＰが改変ＢＭＰ−７または変異体ＢＭＰ−７であるなら、対応する野生型ＢＭＰは、野生型ＢＭＰ−７である。
【００３１】
２つのアミノ酸配列または２つの核酸の同一性パーセントを決定するために、その配列を、最適な比較の目的のために整列する（例えば、２番目のアミノ酸配列または核酸配列との最適な整列のために、最初のアミノ酸配列または核酸配列の配列中に、ギャップを導入し得る）。２つの配列間の同一性パーセントは、上記配列によって共有される同一の位置の数の関数である（すなわち、相同性％＝同一の位置の数／全部の位置の数×１００）。２つの配列間の相同性パーセントの決定を、数学的アルゴリズムを用いて達成し得る。２つの配列の比較のために利用される数学的アルゴリズムの、好ましい、制限しない例は、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３−７７におけるように改変された、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：２２６４−６８のアルゴリズムである。そのようなアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラムに組込まれている。ＢＬＡＳＴヌクレオチドサーチを、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、語長（ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ）＝１２で行い得る。ＢＬＡＳＴタンパク質サーチを、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、語長＝３で行い得る。比較の目的のためにギャップを挿入した整列を得るために、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２５（１７）：３３８９−３４０２において記載されるように、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴを利用し得る。ＢＬＡＳＴおよびＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（例えばＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメーターを使用し得る。
【００３２】
変異体ＢＭＰ−７
本発明は、ＢＭＰ−７の免疫原性を抑制するための方法を提供する。上記免疫原性を抑制または排除するために、野生型ＢＭＰ−７と異なる変異体ＢＭＰ−７タンパク質を作製する。本発明の実施態様によって、これらの変異体は、ＢＭＰ−７の免疫原性エピトープの１つ以上のアミノ酸が改変されている点で、野生型ＢＭＰ−７と異なる。本発明の実施態様によって、ＢＭＰ−７の潜在的な免疫原性エピトープを、本明細書中で記載されたように、および／または当該分野で公知の他の方法によって同定し、そして上記エピトープを改変して上記エピトープの免疫原性効果を抑制または排除する。次いで、上記エピトープの免疫原性効果を抑制または排除するために、標準的な遺伝子操作手順によって、上記エピトープ領域において置換、欠失、または挿入のようなアミノ酸の改変を行う。本発明の１つの実施態様によって、本発明のＢＭＰ−７変異体は、その生物活性を維持するが、野生型ＢＭＰ−７と比較して、免疫原性が抑制されている、または実質的に抑制されている、または排除されている。
【００３３】
本発明の１つの実施態様によって、エピトープを含むと同定されたＢＭＰ−７の領域を、上記エピトープを除去するために、別のＢＭＰの対応する領域由来のアミノ酸配列で置き換える。例えば、１つの実施態様において、成熟ヒトＢＭＰ−７の残基６１−７５の配列を、ＢＭＰ−２（ＧＹＨＡＦＹＣＨＧＥＣＰＦＰＬ（配列番号２０）−図５Ａの残基３１９−３３３）、ＢＭＰ−４（ＧＹＱＡＦＹＣＨＧＤＣＰＦＰＬ（配列番号２１）−図５Ａの残基３３１−３４５）、ＢＭＰ−５（ＧＹＡＡＦＹＣＤＧＥＣＳＦＰＬ（配列番号２２）−図５Ａの残基３７６−３９０）、ＢＭＰ−６（ＧＹＡＡＮＹＣＤＧＥＣＳＦＰＬ（配列番号２３）−図５Ａの残基４３５−４４９）、またはＢＭＰ−９（ＥＹＥＡＹＥＣＫＧＧＣＦＦＰＬ（配列番号２４）−図５Ａの残基３５０−３６４）由来の対応するアミノ酸配列で置き換える。別の実施態様において、成熟ヒトＢＭＰ−７の残基９１−１０５の配列を、ＢＭＰ−２（ＶＮＳＶＮＳＫＩＰＫＡＣＣＶ（配列番号２５）−図５Ｂの残基３４９−３６２）、ＢＭＰ−４（ＶＮＳＶＮＳＳＩＰＫＡＣＣＶ（配列番号２６）−図５Ｂの残基３６１−３７４）、ＢＭＰ−５（ＶＨＬＭＦＰＤＨＶＰＫＰＣＣＡ（配列番号２７）−図５Ｂの残基４０６−４２０）、ＢＭＰ−６（ＶＨＬＭＮＰＥＹＶＰＫＰＣＣＡ（配列番号２８）−図５Ｂの残基４６５−４７９）、またはＢＭＰ−９（ＶＨＬＫＦＰＴＫＶＧＫＡＣＣＶ（配列番号２９）−図５Ｂの残基３８０−３９４）由来の対応するアミノ酸配列で置き換える。
【００３４】
本発明の別の実施態様において、エピトープを含むＢＭＰ−７の領域中にあると同定された、ＢＭＰ−７の１つ以上のアミノ酸を、上記エピトープを除去するために、例えば別のＢＭＰのその残基に対応するアミノ酸の置換によって改変する。例えば、図５Ａおよび５Ｂにおいて示すように、２つの推定エピトープ領域（ペプチド９および１３）の、他のＢＭＰタンパク質由来の対応する領域との整列を示し、これにより、ＢＭＰ−７に対する可能性のあるアミノ酸改変が示唆される。
【００３５】
本発明の別の実施態様において、エピトープを除去するために、１つ以上の点突然変異をヒトＢＭＰ−７に導入する。例えば、１つの実施態様において、ＢＭＰ−７は、残基Ｇ６１、Ａ６３、Ｙ６５、Ｙ６６、Ｅ６８、Ｅ７０、Ａ７２、Ｈ９２、Ｆ９３、Ｉ９４、Ｎ９５、Ｐ９６、Ｅ９７、Ｔ９８、Ｖ９９、Ｐ１００、Ｐ１０２、またはＡ１０５の１個以上において、置換を有する。
【００３６】
別の実施態様において、ＢＭＰ−７は、残基Ｇ６１、Ａ６３、Ｙ６５、Ｙ６６、Ｅ６８、Ｅ７０、Ａ７２、Ｈ９２、Ｆ９３、Ｉ９４、Ｎ９５、Ｐ９６、Ｅ９７、Ｔ９８、Ｖ９９、Ｐ１００、Ｐ１０２、またはＡ１０５の２個以上において、置換を有する。
【００３７】
別の実施態様において、ＢＭＰ−７は、残基Ｇ６１、Ａ６３、Ｙ６５、Ｙ６６、Ｅ６８、Ｅ７０、Ａ７２、Ｈ９２、Ｆ９３、Ｉ９４、Ｎ９５、Ｐ９６、Ｅ９７、Ｔ９８、Ｖ９９、Ｐ１００、Ｐ１０２、またはＡ１０５の３個以上において、置換を有する。
【００３８】
別の実施態様において、ＢＭＰ−７は、残基Ｇ６１、Ａ６３、Ｙ６５、Ｙ６６、Ｅ６８、Ｅ７０、Ａ７２、Ｈ９２、Ｆ９３、Ｉ９４、Ｎ９５、Ｐ９６、Ｅ９７、Ｔ９８、Ｖ９９、Ｐ１００、Ｐ１０２、またはＡ１０５の４個以上において、置換を有する。
【００３９】
別の実施態様において、ＢＭＰ−７は、残基Ｇ６１、Ａ６３、Ｙ６５、Ｙ６６、Ｅ６８、Ｅ７０、Ａ７２、Ｈ９２、Ｆ９３、Ｉ９４、Ｎ９５、Ｐ９６、Ｅ９７、Ｔ９８、Ｖ９９、Ｐ１００、Ｐ１０２、またはＡ１０５の５個以上において、置換を有する。
【００４０】
別の実施態様において、ＢＭＰ−７は、残基Ｇ６１、Ａ６３、Ｙ６５、Ｙ６６、Ｅ６８、Ｅ７０、Ａ７２、Ｈ９２、Ｆ９３、Ｉ９４、Ｎ９５、Ｐ９６、Ｅ９７、Ｔ９８、Ｖ９９、Ｐ１００、Ｐ１０２、またはＡ１０５の６個以上において、置換を有する。
【００４１】
別の実施態様において、ＢＭＰ−７は、残基Ｇ６１、Ａ６３、Ｙ６５、Ｙ６６、Ｅ６８、Ｅ７０、Ａ７２、Ｈ９２、Ｆ９３、Ｉ９４、Ｎ９５、Ｐ９６、Ｅ９７、Ｔ９８、Ｖ９９、Ｐ１００、Ｐ１０２、またはＡ１０５の７個以上において、置換を有する。
【００４２】
別の実施態様において、ＢＭＰ−７は、残基Ｇ６１、Ａ６３、Ｙ６５、Ｙ６６、Ｅ６８、Ｅ７０、Ａ７２、Ｈ９２、Ｆ９３、Ｉ９４、Ｎ９５、Ｐ９６、Ｅ９７、Ｔ９８、Ｖ９９、Ｐ１００、Ｐ１０２、またはＡ１０５の８個以上において、置換を有する。
【００４３】
別の実施態様において、ＢＭＰ−７は、残基Ｇ６１、Ａ６３、Ｙ６５、Ｙ６６、Ｅ６８、Ｅ７０、Ａ７２、Ｈ９２、Ｆ９３、Ｉ９４、Ｎ９５、Ｐ９６、Ｅ９７、Ｔ９８、Ｖ９９、Ｐ１００、Ｐ１０２、またはＡ１０５の９個以上において、置換を有する。
【００４４】
別の実施態様において、ＢＭＰ−７は、残基Ｇ６１、Ａ６３、Ｙ６５、Ｙ６６、Ｅ６８、Ｅ７０、Ａ７２、Ｈ９２、Ｆ９３、Ｉ９４、Ｎ９５、Ｐ９６、Ｅ９７、Ｔ９８、Ｖ９９、Ｐ１００、Ｐ１０２、またはＡ１０５の１０個以上において、置換を有する。
【００４５】
さらなる実施態様において、ＢＭＰ−７は、１個以上の以下の置換を有する：Ｇ６１Ｅ、Ａ６３Ｅ／Ｑ／Ｈ、Ｙ６５Ｆ／Ｎ、Ｙ６６Ｅ、Ｅ６８Ｄ／Ｋ／Ｈ、Ｅ７０Ｄ／Ｇ、Ａ７２Ｓ／Ｆ／Ｐ、Ｈ９２Ｎ、Ｆ９３Ｎ／Ｌ／Ｓ、Ｉ９４Ｍ／Ｋ／Ｓ／Ｖ、Ｎ９５Ｖ／Ｆ、Ｐ９６Ｓ／Ｎ、Ｅ９７Ｓ／Ｔ／Ｄ／Ｋ、Ｔ９８Ｋ／Ｉ／Ｓ／Ｙ／Ｈ、Ｖ９９Ｉ、Ｐ１００Ｇ、Ｐ１０２Ａ、またはＡ１０５Ｖ。
【００４６】
さらなる実施態様において、ＢＭＰ−７は、２個以上の以下の置換を有する：Ｇ６１Ｅ、Ａ６３Ｅ／Ｑ／Ｈ、Ｙ６５Ｆ／Ｎ、Ｙ６６Ｅ、Ｅ６８Ｄ／Ｋ／Ｈ、Ｅ７０Ｄ／Ｇ、Ａ７２Ｓ／Ｆ／Ｐ、Ｈ９２Ｎ、Ｆ９３Ｎ／Ｌ／Ｓ、Ｉ９４Ｍ／Ｋ／Ｓ／Ｖ、Ｎ９５Ｖ／Ｆ、Ｐ９６Ｓ／Ｎ、Ｅ９７Ｓ／Ｔ／Ｄ／Ｋ、Ｔ９８Ｋ／Ｉ／Ｓ／Ｙ／Ｈ、Ｖ９９Ｉ、Ｐ１００Ｇ、Ｐ１０２Ａ、またはＡ１０５Ｖ。
【００４７】
さらなる実施態様において、ＢＭＰ−７は、３個以上の以下の置換を有する：Ｇ６１Ｅ、Ａ６３Ｅ／Ｑ／Ｈ、Ｙ６５Ｆ／Ｎ、Ｙ６６Ｅ、Ｅ６８Ｄ／Ｋ／Ｈ、Ｅ７０Ｄ／Ｇ、Ａ７２Ｓ／Ｆ／Ｐ、Ｈ９２Ｎ、Ｆ９３Ｎ／Ｌ／Ｓ、Ｉ９４Ｍ／Ｋ／Ｓ／Ｖ、Ｎ９５Ｖ／Ｆ、Ｐ９６Ｓ／Ｎ、Ｅ９７Ｓ／Ｔ／Ｄ／Ｋ、Ｔ９８Ｋ／Ｉ／Ｓ／Ｙ／Ｈ、Ｖ９９Ｉ、Ｐ１００Ｇ、Ｐ１０２Ａ、またはＡ１０５Ｖ。
【００４８】
さらなる実施態様において、ＢＭＰ−７は、４個以上の以下の置換を有する：Ｇ６１Ｅ、Ａ６３Ｅ／Ｑ／Ｈ、Ｙ６５Ｆ／Ｎ、Ｙ６６Ｅ、Ｅ６８Ｄ／Ｋ／Ｈ、Ｅ７０Ｄ／Ｇ、Ａ７２Ｓ／Ｆ／Ｐ、Ｈ９２Ｎ、Ｆ９３Ｎ／Ｌ／Ｓ、Ｉ９４Ｍ／Ｋ／Ｓ／Ｖ、Ｎ９５Ｖ／Ｆ、Ｐ９６Ｓ／Ｎ、Ｅ９７Ｓ／Ｔ／Ｄ／Ｋ、Ｔ９８Ｋ／Ｉ／Ｓ／Ｙ／Ｈ、Ｖ９９Ｉ、Ｐ１００Ｇ、Ｐ１０２Ａ、またはＡ１０５Ｖ。
【００４９】
さらなる実施態様において、ＢＭＰ−７は、５個以上の以下の置換を有する：Ｇ６１Ｅ、Ａ６３Ｅ／Ｑ／Ｈ、Ｙ６５Ｆ／Ｎ、Ｙ６６Ｅ、Ｅ６８Ｄ／Ｋ／Ｈ、Ｅ７０Ｄ／Ｇ、Ａ７２Ｓ／Ｆ／Ｐ、Ｈ９２Ｎ、Ｆ９３Ｎ／Ｌ／Ｓ、Ｉ９４Ｍ／Ｋ／Ｓ／Ｖ、Ｎ９５Ｖ／Ｆ、Ｐ９６Ｓ／Ｎ、Ｅ９７Ｓ／Ｔ／Ｄ／Ｋ、Ｔ９８Ｋ／Ｉ／Ｓ／Ｙ／Ｈ、Ｖ９９Ｉ、Ｐ１００Ｇ、Ｐ１０２Ａ、またはＡ１０５Ｖ。
【００５０】
さらなる実施態様において、ＢＭＰ−７は、６個以上の以下の置換を有する：Ｇ６１Ｅ、Ａ６３Ｅ／Ｑ／Ｈ、Ｙ６５Ｆ／Ｎ、Ｙ６６Ｅ、Ｅ６８Ｄ／Ｋ／Ｈ、Ｅ７０Ｄ／Ｇ、Ａ７２Ｓ／Ｆ／Ｐ、Ｈ９２Ｎ、Ｆ９３Ｎ／Ｌ／Ｓ、Ｉ９４Ｍ／Ｋ／Ｓ／Ｖ、Ｎ９５Ｖ／Ｆ、Ｐ９６Ｓ／Ｎ、Ｅ９７Ｓ／Ｔ／Ｄ／Ｋ、Ｔ９８Ｋ／Ｉ／Ｓ／Ｙ／Ｈ、Ｖ９９Ｉ、Ｐ１００Ｇ、Ｐ１０２Ａ、またはＡ１０５Ｖ。
【００５１】
さらなる実施態様において、ＢＭＰ−７は、７個以上の以下の置換を有する：Ｇ６１Ｅ、Ａ６３Ｅ／Ｑ／Ｈ、Ｙ６５Ｆ／Ｎ、Ｙ６６Ｅ、Ｅ６８Ｄ／Ｋ／Ｈ、Ｅ７０Ｄ／Ｇ、Ａ７２Ｓ／Ｆ／Ｐ、Ｈ９２Ｎ、Ｆ９３Ｎ／Ｌ／Ｓ、Ｉ９４Ｍ／Ｋ／Ｓ／Ｖ、Ｎ９５Ｖ／Ｆ、Ｐ９６Ｓ／Ｎ、Ｅ９７Ｓ／Ｔ／Ｄ／Ｋ、Ｔ９８Ｋ／Ｉ／Ｓ／Ｙ／Ｈ、Ｖ９９Ｉ、Ｐ１００Ｇ、Ｐ１０２Ａ、またはＡ１０５Ｖ。
【００５２】
さらなる実施態様において、ＢＭＰ−７は、８個以上の以下の置換を有する：Ｇ６１Ｅ、Ａ６３Ｅ／Ｑ／Ｈ、Ｙ６５Ｆ／Ｎ、Ｙ６６Ｅ、Ｅ６８Ｄ／Ｋ／Ｈ、Ｅ７０Ｄ／Ｇ、Ａ７２Ｓ／Ｆ／Ｐ、Ｈ９２Ｎ、Ｆ９３Ｎ／Ｌ／Ｓ、Ｉ９４Ｍ／Ｋ／Ｓ／Ｖ、Ｎ９５Ｖ／Ｆ、Ｐ９６Ｓ／Ｎ、Ｅ９７Ｓ／Ｔ／Ｄ／Ｋ、Ｔ９８Ｋ／Ｉ／Ｓ／Ｙ／Ｈ、Ｖ９９Ｉ、Ｐ１００Ｇ、Ｐ１０２Ａ、またはＡ１０５Ｖ。
【００５３】
さらなる実施態様において、ＢＭＰ−７は、９個以上の以下の置換を有する：Ｇ６１Ｅ、Ａ６３Ｅ／Ｑ／Ｈ、Ｙ６５Ｆ／Ｎ、Ｙ６６Ｅ、Ｅ６８Ｄ／Ｋ／Ｈ、Ｅ７０Ｄ／Ｇ、Ａ７２Ｓ／Ｆ／Ｐ、Ｈ９２Ｎ、Ｆ９３Ｎ／Ｌ／Ｓ、Ｉ９４Ｍ／Ｋ／Ｓ／Ｖ、Ｎ９５Ｖ／Ｆ、Ｐ９６Ｓ／Ｎ、Ｅ９７Ｓ／Ｔ／Ｄ／Ｋ、Ｔ９８Ｋ／Ｉ／Ｓ／Ｙ／Ｈ、Ｖ９９Ｉ、Ｐ１００Ｇ、Ｐ１０２Ａ、またはＡ１０５Ｖ。
【００５４】
さらなる実施態様において、ＢＭＰ−７は、１０個以上の以下の置換を有する：Ｇ６１Ｅ、Ａ６３Ｅ／Ｑ／Ｈ、Ｙ６５Ｆ／Ｎ、Ｙ６６Ｅ、Ｅ６８Ｄ／Ｋ／Ｈ、Ｅ７０Ｄ／Ｇ、Ａ７２Ｓ／Ｆ／Ｐ、Ｈ９２Ｎ、Ｆ９３Ｎ／Ｌ／Ｓ、Ｉ９４Ｍ／Ｋ／Ｓ／Ｖ、Ｎ９５Ｖ／Ｆ、Ｐ９６Ｓ／Ｎ、Ｅ９７Ｓ／Ｔ／Ｄ／Ｋ、Ｔ９８Ｋ／Ｉ／Ｓ／Ｙ／Ｈ、Ｖ９９Ｉ、Ｐ１００Ｇ、Ｐ１０２Ａ、またはＡ１０５Ｖ。
【００５５】
本発明の別の局面によって、本発明によるＢＭＰ−７変異体は、ＢＭＰ−７の生物学的活性を維持する。本明細書中で使用される場合、「生物学的活性」という用語は、インビボまたはインビトロで、あらゆる測定可能なＢＭＰの機能を指す。ＢＭＰの生物学的活性を測定し得るいくつかの方法を、下記の「実施例」の項で列挙する。１つの実施態様において、本発明のＢＭＰ−７変異体は、野生型ＢＭＰ−７と比較して、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の生物学的活性を有する。例えば、１つの実施態様において、本発明のＢＭＰ−７変異体は、ヒト野生型ＢＭＰ−７または組換えヒト野生型ＢＭＰ−７と比較して、少なくとも前述の％の生物学的活性の１つを有する。
【００５６】
ＢＭＰ−７変異体の治療的使用
本発明によるＢＭＰ−７変異体を、広く様々な状態を処置するために、哺乳類患者、例えばヒトに移植または投与し得る。本発明のＢＭＰ−７変異体を、単独でまたは適当なキャリアまたは他の処方剤と組み合わせて、固体、ゲル、またはペースト形態で移植し得る、または上記患者にゲル、ペースト、または液体形態で注射し得る。本発明のＢＭＰ−７変異体は、広く様々な状態を処置するために有用である。例えば、本発明のＢＭＰ−７変異体を、外傷または炎症性疾患のいずれによって引き起こされたかに関わらず、軟骨の変性を含む骨格障害を処置するために使用し得る。例えば、本発明のＢＭＰ−７変異体によって処置可能な疾患は、関節リウマチ（ＲＡ）および変形性関節症（ＯＡ）、および全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）および強皮症のような自己免疫疾患を包含する。
【００５７】
本発明のＢＭＰ−７変異体を、骨格疾患または損傷を処置するために、有効に使用し得る。例えば、上記ＢＭＰ−７変異体を、開放骨折または閉鎖骨折のような、骨折を処置するために使用し得る。閉鎖骨折の処置のために、上記ＢＭＰ−７変異体を好ましくはその骨折部位に注入する。開放骨折、重大なサイズの欠損、または持続する偽関節に関して、上記ＢＭＰ−７変異体を、その骨折部位における外科的移植によって投与し得る。どちらの場合においても、上記ＢＭＰ−７変異体を、単独で、または骨セメント、リン酸カルシウム材料、ゲル材料またはコラーゲンマトリックスのような、適当なキャリア、マトリックス、または足場（ｓｃａｆｆｏｌｄ）と組み合わせて投与し得る。適当なキャリア、マトリックス、および足場は、米国特許第６，９１９，３０８；６，９４９，２５１；および７，０４１，６４１号において開示されるものを含む。
【００５８】
好ましい実施態様において、本発明のＢＭＰ−７変異体を、軟骨の分解または軟骨の欠損を引き起こす疾患または損傷を処置するために使用し得る。例えば、本発明のＢＭＰ−７変異体を、変性椎間円板のような軟骨欠損部位、または腱、靭帯、または半月板を含む他の線維軟骨組織に適用し得る。そのような方法を、米国特許第６，９５８，１４９号において述べる。公開されたＰＣＴ出願ＷＯ０５／１１５４３８において詳述したように、本発明のＢＭＰ−７変異体をまた、膝、肘、臀部、または肩を含む、滑膜性の連結（ｓｙｎｏｖｉａｌ ｊｏｉｎｔ）のような、関節の軟骨内層（ｃａｒｔｉｌａｇｅ ｌｉｎｉｎｇ）のような、関節軟骨の欠損または変性を処置するために使用し得る。この実施態様において、上記ＢＭＰ−７変異体を、好ましくは、上記関節の滑膜腔に注入する。別の実施態様において、本発明のＢＭＰ−７変異体を、関節における軟骨の欠損または骨軟骨の欠損のような、関節軟骨の欠損部位を処置するために使用する。そのような関節軟骨の欠損は、変形性関節症または関節リウマチのような疾患の進行の結果、または上記関節の損傷のためであり得る。この実施態様において、上記ＢＭＰ−７変異体を、関節腔に注入し得る、またはそれを外科的に移植し得る。例えば、上記ＢＭＰ−７変異体を、単独で、または１つ以上のさらなる活性薬剤、支持マトリックスまたは足場、または骨髄間質細胞と組み合わせて、上記欠損内に置くことができる。上記欠損内においたＢＭＰ−７変異体を、必要に応じて適当な被膜、例えば筋皮弁またはコラーゲン膜のような生体吸収性膜で覆い得る。
【００５９】
当業者によって認識されるように、患者に投与するＢＭＰ−７変異体の濃度は、制限無しに、投与する薬剤の投与量および投与経路を含む多くの因子に依存して変動する。投与する薬剤の好ましい投与量はまた、おそらく、疾患の型および程度、組織の喪失または欠損の型および程度、特定の患者の全体的な健康状態、選択した化合物の相対的な生物学的有効性、上記化合物の処方、上記処方における賦形剤の存在および型、および投与経路を含むがこれに限らない、可変物（ｖａｒｉａｂｌｅ）に依存する。本発明のＢＭＰ−７変異体を、個人に提供し得、ここで典型的な用量の範囲は１日あたり体重１ｋｇあたり約１０ｎｇから約１ｇであり、好ましい用量の範囲は体重１ｋｇあたり約０．１ｍｇから１００ｍｇであり、そしてより特に好ましい投与量の範囲は、１０−１０００μｇ／用量である。特定の好ましい実施態様において、１０−１０００μｇの用量のＢＭＰ−７を、変形性関節症に苦しむ個人に投与する。
【００６０】
さらに、下記で記載するように、本発明のＢＭＰ−７変異体を、非骨格組織の疾患または損傷を処置するために使用し得る。本発明によってさらに企図されるように、ＢＭＰは、骨または軟骨とは異なる、哺乳類の様々な組織に関して、骨形態形成および組織形態形成の発生のカスケードを誘導し得る。この形態形成活性は、前駆細胞の増殖および分化を誘導する能力、および骨、軟骨、非ミネラル化骨格または結合組織および他の成人組織の形成をもたらすイベントの進行によって、その分化した表現型を支持および維持する能力を含む。
【００６１】
例えば、本発明のＢＭＰ−７変異体を、代謝性骨疾患において骨量の喪失を予防する、および／または骨量を増加させる処置のために使用し得る。骨形成タンパク質を用いて、代謝性骨疾患における骨量の喪失を予防する、および／または骨量を増加させる処置のための一般的な方法が、米国特許第５，６７４，８４４号において開示され、その開示は、本明細書によって参考文献に組込まれる。本発明のＢＭＰ−７変異体を、歯周組織の再生のために使用し得る。骨形成タンパク質を用いた、歯周組織再生のための一般的な方法は、米国特許第５，７３３，８７８号において開示され、その開示は本明細書によって参考文献に組込まれる。ＢＭＰ−７変異体を、肝臓の再生のために使用し得る。骨形成タンパク質を用いた肝臓再生のための一般的な方法は、米国特許第５，８４９，６８６号において開示され、その開示は本明細書によって参考文献に組込まれる。ＢＭＰ−７変異体を、慢性腎不全の処置のために使用し得る。骨形成タンパク質を用いた、慢性腎不全の処置のための一般的な方法は、米国特許第６，８６１，４０４号において開示され、その開示は本明細書によって参考文献に組込まれる。本発明のＢＭＰ−７を、中枢神経系の虚血または外傷後の機能回復を増強するために使用し得る。骨形成タンパク質を用いた、中枢神経系の虚血または外傷後の機能回復を増強するための一般的な方法は、米国特許第６，４０７，０６０号において開示され、その開示は本明細書によって参考文献に組込まれる。本発明のＢＭＰ−７変異体を、樹状突起の成長を誘導するために使用し得る。骨形成タンパク質を用いた、樹状突起の成長を誘導するための一般的な方法は、米国特許第６，９４９，５０５号において開示され、その開示は本明細書によって参考文献に組込まれる。ＢＭＰ−７変異体を、神経細胞接着を誘導するために使用し得る。骨形成タンパク質を用いた、神経細胞接着を誘導するための一般的な方法は、米国特許第６，８００，６０３号において開示され、その開示は本明細書によって参考文献に組込まれる。ＢＭＰ−７変異体を、パーキンソン病の処置および予防のために使用し得る。骨形成タンパク質を用いた、パーキンソン病の処置および予防のための一般的な方法は、米国特許第６，５０６，７２９号において開示され、その開示は本明細書によって参考文献に組込まれる。
【００６２】
別の例として、ＢＭＰ−７変異体をまた、象牙質形成を誘導するために使用し得る。現在まで、損傷に対する歯髄組織の予測不能な反応が、歯科医学における基本的な臨床的問題である。さらに別の例として、ＢＭＰ−７変異体は、中枢神経系（ＣＮＳ）の修復に対して再生効果を誘導し得、それを、ラット脳穿刺モデルを用いて評価し得る。
【実施例】
【００６３】
実施例１：ＥＬＩＳＡによる免疫原性エピトープの同定
ＢＭＰ−７の潜在的な線状Ｔ細胞エピトープを同定するために、野生型ヒトＢＭＰ−７の成熟領域の配列全体をカバーするペプチドを合成した（Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）。それぞれ１５アミノ酸の１８個のペプチドを構築した。各ペプチドは、ＢＭＰ−７のうちの近接する領域（ｃｏｎｔｉｇｕｏｕｓ ｒｅｇｉｏｎ）をカバーするペプチドと比較して、５から１０アミノ酸の重複を有していた。上記１８個のペプチドそれぞれの配列を、図１に示し、その様々なペプチド間の重複を、図２に示す。
【００６４】
上記１８個のペプチドを、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて試験して、その抗ＢＭＰ−７抗体に対する結合を決定した。上記１８個のペプチドそれぞれを、９６穴高結合マイクロタイタープレートの個々の列に、５μｇ／ｍＬの濃度で個々にコーティングした。３枚のプレートを使用し、プレート１はペプチド１〜６、プレート２はペプチド７〜１２、およびプレート３はペプチド１３〜１８を有していた。合成的に作製した陰性コントロールペプチドを、各プレートの列７にコーティングし、陰性コントロールとした。ＢＭＰ−７を、各プレートの列８にコーティングし、陽性コントロールとした。
【００６５】
コーティングしたプレートを、室温で一晩インキュベートした。次の日、そのプレートをＢＢＳ／Ｔで６回洗浄した。次いで上記プレートを、２００μｌ／ウェルのＢＢＳ／Ｔミルクでブロッキングし、そして３７℃で２時間インキュベートした。そのプレートを再びＢＢＳ／Ｔで６回洗浄した。
【００６６】
ＢＭＰ−７に対する中和抗体に関して陽性である７人の患者の血清サンプルおよびＢＭＰ−７に対する非中和抗体に関して陽性である３人の患者の血清サンプルを、ＢＢＳ／Ｔミルク中で１：８０に希釈し、そして３枚のプレート全ての２つの隣接する行（ｃｏｌｕｍｎ）に加えた（１００μｌ／ウェルで２組試験した）。上記患者の血清サンプルを、ＯＰ−１ Ｐｕｔｔｙ（Ｓｔｒｙｋｅｒ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ、ＭＡ）で処置した患者から得た。例えば、患者１の血清を、全てのプレートの行１〜２に加え、患者２の血清を、全てのプレートの行３〜４に加える等した。抗ＢＭＰ−７抗体に関して陰性である１人の患者の血清サンプルを、陰性コントロールとして使用した。モノクローナル抗ＢＭＰ−７抗体、１Ｂ１２および１２Ｇ３の組み合わせを、陽性コントロールとして使用した。
【００６７】
患者の血清サンプルを、ペプチドをコーティングしたプレートに加え、そして３７℃で１時間インキュベートした。上記プレートを、ＢＢＳ／Ｔで６回洗浄した。１００μｌのヤギ抗ヒトＩｇＨＲＰ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を、ＢＢＳ／Ｔミルク中１：４０，０００の希釈で、各ウェルに加えた。上記プレートを、続いて３７℃で１時間インキュベートし、そして次いでＢＢＳ／Ｔミルクで６回洗浄した。１００μｌのＴＭＢ基質（ＢｉｏＦＸ）を、顕色のために各ウェルに加えた。
【００６８】
１００μｌの０．１８Ｍ Ｈ２ＳＯ４硫酸停止溶液を、各プレートに加えた。上記プレートを、次いでＭ５ ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）に置き、そして４５０ｎｍで吸光度を測定した。
【００６９】
患者血清由来の非中和抗ＢＭＰ−７抗体の、上記１８個のペプチドに対する結合の結果を、図３に示し、そして患者血清由来の中和抗ＢＭＰ−７抗体の、その１８個のペプチドに対する結合を図４に示す。図３に示すように、ペプチド１３は、上記３つの陽性患者の血清サンプル（１１１６９４、１１１９４５、および１１１６６５）由来の非中和抗ＢＭＰ−７抗体に高い結合親和性を示し、一方陰性の患者血清（１１１２６６）は、予測されたように、結合親和性を示さなかった。これは、ペプチド１３はこれらの非中和抗ＢＭＰ−７抗体に対する線状結合エピトープを含むことを示す。
【００７０】
図４に示すように、ペプチド１３は、再びいくつかの上記陽性患者サンプル由来の中和抗ＢＭＰ−７抗体に対して高い結合親和性を示し、このことは、ペプチド１３は中和抗ＢＭＰ−７抗体の線状結合エピトープを含むことを示唆する。さらに、図４のデータは、抗ＢＭＰ−７抗体の、ペプチド１３に含まれる線状エピトープへの結合を確認するだけでなく、中和抗体は、ペプチド１および９に含まれる線状エピトープにもいくらか結合親和性を有し得ることも示唆する。ペプチド５に関してもいくらかの結合が観察された。
【００７１】
実施例２．エピトープを変化させることによって、抑制された免疫原性を有するＢＭＰ−７タンパク質を工学技術で作製する（ｅｎｇｉｎｅｅｒ）
ペプチド９は、アミノ酸配列ＧＹＡＡＹＹＣＥＧＥＣＡＦＰＬ（配列番号１０）を有し、一方ペプチド１３は、アミノ酸配列ＶＨＦＩＮＰＥＴＶＰＫＰＡＣＣＡ（配列番号１４）を有する。しかし、実施例１において示すように、エピトープはペプチド９およびペプチド１３に対応するＢＭＰ−７の領域に存在する。よって、これらの配列の免疫原性を抑制または排除するために、ペプチド９およびペプチド１３の残基に対応する残基において、ＢＭＰ−７のアミノ酸を変化させる。
【００７２】
ペプチド９および１３の免疫原性に関与する特定の残基を決定するために、２つの連続するアミノ酸を、それぞれアラニン残基に改変した、いくつかのペプチドアナログを生成する。２つの連続するアラニン残基による、ペプチド９および１３の全ての並べ替え（ｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎ）が生じるように十分なペプチドを生成する。次いでそのペプチドアナログを、ペプチド９および１３の抗ＢＭＰ−７抗体に結合する能力と比較して、抗ＢＭＰ−７抗体に結合するそれらの能力に関してアッセイする。抗ＢＭＰ−７抗体への結合が減少したペプチドアナログを同定し、そして、ペプチド９の残基１、３、５、６、８、１０、または１２（成熟ヒトＢＭＰ−７（配列番号１）の残基６１、６３、６５、６６、６８、７０、および７２に対応する）の１つ以上、および／またはペプチド１３の残基２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、または１５（成熟ヒトＢＭＰ−７（配列番号１）の残基９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０２、または１０５に対応する）の１つ以上が、上記抗ＢＭＰ−７抗体への結合に関与し、そしてそれによって組換えヒトＢＭＰ−７の免疫原性を引き起こすことが決定される。よって、ＢＭＰ−７の免疫原性を引き起こすと決定されたそれらの残基を、例えば置換によって改変して、抑制された免役原性を有するＢＭＰ−７変異体を作製する。
【００７３】
本明細書中で教示されるアミノ酸置換のような、本発明による変化を、標準的な組換え遺伝子操作技術によって、ＢＭＰ−７の遺伝子配列に導入する。次いでその変異体ＢＭＰ−７を、標準的なプロトコールによって、原核生物または真核生物発現システムにおいて発現する。次いでその発現した変異体ＢＭＰ−７を、標準的なプロトコールによって精製する。
【００７４】
実施例３．ＢＭＰ−７変異体は、アルカリホスファターゼ活性を誘導する
本発明のＢＭＰ−７変異体の、ラット骨肉腫細胞系統ＲＯＳ１７／２．８におけるアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性を誘導する能力をアッセイする。本発明の変異体ＢＭＰ−７を、野生型ＢＭＰ−７を陽性コントロールとして使用して、３組で９点における用量反応性を試験する。特に、ＲＯＳ１７／２．８細胞を、９６穴組織培養プレートにまく。ＢＭＰ−７変異体を、６０００、２０００、６６６、２２２、７４、２４、８、２、および０．９ｎｇ／ｍｌの投与量で上記細胞に加え、そして４８時間の期間インキュベートする。続いて細胞を溶解し、そしてその増殖因子のＡＬＰ活性を誘導する効力を、上記サンプルの平均吸光度（ＯＤ）の非線形回帰から得られるＥＣ５０に基づいて評価する。試験した全てのＢＭＰ−７変異体が、明確なアルカリホスファターゼ活性を示し、このことは、上記変異体がその生物学的活性を維持していることを示す。
【００７５】
実施例４．ＢＭＰ−７変異体は、野生型と比較して、抑制されたまたは排除された免役原性を有する
本発明の実施態様によるＢＭＰ−７変異体を、その免疫原性を決定するために霊長類において試験する。真核生物で産生したＢＭＰ−７変異体を、コントロールとして投与した野生型ヒトＢＭＰ−７（真核生物で産生した）と共に試験する。典型的な実験において、アカゲザルに、４０μｇ／ｋｇの上記タンパク質サンプルを、１日１回、皮下に４週間注射する。規則的な間隔で、血清をその動物から得て、そしてＢＭＰ−７に対する抗体の血清濃度を、ヒトＩＬ−７コーティング９６穴プレートを用いて、ＥＬＩＳＡによって測定する。典型的には、各血清サンプルの段階希釈物を、３組で各ウェルに２時間加え、ＰＢＳ中０．０５％のＴｗｅｅｎ（Ｔｗｅｅｎ２０）で洗浄し、そしてＰＢＳ中１％のＢＳＡ／１％のヤギ血清でブロックする。各サンプルに、西洋ワサビペルオキシダーゼ−結合抗アカゲザルＩｇＧを加え（サンプル緩衝液中１：６０，０００）、３７℃で２時間インキュベートし、そして上記プレートをＰＢＳ中０．０５％のＴｗｅｅｎで８回洗浄する。次いでサンプルを、比色定量基質溶液ＯＰＤ（ｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩）を用いて、４９０ｎｍにおけるＯＤを測定し、６５０ｎｍにおけるバックグラウンドの測定値を引くことによって、アッセイする。
【００７６】
真核生物で産生した野生型ヒトＢＭＰ−７は、高い抗ＢＭＰ−７抗体力価を生じることが見出される。対照的に、真核生物で産生された変異体ヒトＢＭＰ−７の抗体力価は、有意に低い抗ＢＭＰ−７抗体の力価を生じる。
【００７７】
実施例６．変異体ＢＭＰ−７は、ヒト患者において、低い濃度で骨および軟骨の増殖を誘導するのに有効である。
【００７８】
２人のヒト患者が、それぞれ腰椎（ｌａｍｂａｒ ｓｐｉｎｅ）において後外側の癒合（ｆｕｓｉｏｎ）をもたらす処置を必要とする。１人の患者において、ウシ骨コラーゲンおよびカルボキシメチルセルロースナトリウムのマトリックス（ＯＰ−１（登録商標）Ｐｕｔｔｙ、Ｓｔｒｙｋｅｒ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ、ＭＡと類似の）中１．５ｍｇの変異体ＢＭＰ−７を、癒合が必要な部位の上記腰椎（ｔｈｅ ｓｐｉｎｅ）の各側に、外科的に移植する。そのマトリックスを、移植の前に、滅菌食塩水（０．９％）溶液で再構成する。他方の患者において、ウシ骨コラーゲンおよびカルボキシメチルセルロースナトリウムのマトリックス（ＯＰ−１（登録商標）Ｐｕｔｔｙ、Ｓｔｒｙｋｅｒ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ、ＭＡと類似の）中３．５ｍｇの野生型ＢＭＰ−７を、癒合が必要な部位の上記腰椎の各側に、外科的に移植する。
【００７９】
数ヶ月の最初の期間の後、各患者の脊椎を、例えばＸ線によって、Ｘ線撮影で検査して、上記癒合における骨増殖の存在を決定する。変異体ＢＭＰ−７を投与された上記患者において、骨の増殖が、癒合部位において検出される。しかし、癒合は完全ではない。野生型ＢＭＰ−７を投与された上記患者において、変異体ＢＭＰ−７を投与された上記患者と同じレベルの骨増殖が検出される。再び、椎骨の癒合は完全ではない。
【００８０】
数ヶ月の最初の期間と同じ、数ヶ月の２番目の期間の後、各患者の脊椎を再び、例えばＸ線によってＸ線撮影で検査する。各患者において、移植部位における椎骨の癒合は完全である。
【００８１】
よって、変異体ＢＭＰ−７を、同じ速度の骨増殖を促進しながら、対応する野生型ＢＭＰよりも低い濃度で投与し得る。これは、ＢＭＰ−７変異体に対する免疫反応の減少に起因し得、それによって、ＢＭＰ−７が免疫系の反応に対して失われないので、同じレベルの骨増殖を達成するために、野生型ＢＭＰ−７と比較して、より低い濃度の変異体ＢＭＰ−７を投与することを可能にする。
【００８２】
別の例において、２人のヒト患者がそれぞれ、腰椎の後外側癒合をもたらすための処置を必要とする。１人の患者において、ウシ骨コラーゲンおよびカルボキシメチルセルロースナトリウムのマトリックス（ＯＰ−１（登録商標）Ｐｕｔｔｙ、Ｓｔｒｙｋｅｒ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ、ＭＡと類似の）中３．５ｍｇの変異体ＢＭＰ−７を、癒合が必要な部位において、上記腰椎の各側に、外科的に移植する。そのマトリックスを、移植の前に、滅菌食塩水（０．９％）溶液で再構成する。他方の患者において、ウシ骨コラーゲンおよびカルボキシメチルセルロースナトリウムのマトリックス（ＯＰ−１（登録商標）Ｐｕｔｔｙ、Ｓｔｒｙｋｅｒ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ、ＭＡと類似の）中３．５ｍｇの野生型ＢＭＰ−７を、癒合が必要な部位において、上記腰椎の各側に、外科的に移植する。
【００８３】
数ヶ月の最初の期間の後、各患者の脊椎を、例えばＸ線によって、Ｘ線撮影で検査して、癒合における骨増殖の存在を決定する。変異体ＢＭＰ−７を投与された上記患者において、骨の増殖が、その癒合部位において検出され、そしてその椎骨の癒合は完全である。対照的に、野生型ＢＭＰ−７を投与された上記患者において、移植部位において骨の増殖が検出される。しかし、上記椎骨の癒合は不完全である。
【００８４】
数ヶ月の最初の期間と同じ、数ヶ月の２番目の期間の後、野生型ＢＭＰ−７を投与された患者の脊椎を再び、例えばＸ線によってＸ線撮影で検査する。移植部位における椎骨の癒合は完全である。
【００８５】
よって、変異体ＢＭＰ−７を、加速した速度の骨増殖を達成するために、対応する野生型ＢＭＰと同じ濃度で投与し得る。これは、ＢＭＰ−７変異体に対して開始される免疫反応の低減に起因し得、それによって、野生型よりも一層多くの変異体ＢＭＰ−７が骨増殖を促進することを可能にする。
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本願は、２００９年１２月２２日に出願された米国仮特許出願第６１／２８９，２２０号の利益を主張し、この米国仮特許出願の内容は、本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
発明の技術分野
本発明は、免疫原性を抑制するように改変した骨形成タンパク質−７（ＢＭＰ−７）、および免疫原性を抑制するようにＢＭＰ−７を改変するための方法に関連する。
【背景技術】
【０００３】
背景
骨成長を誘導し得るタンパク質である、骨形成タンパク質−１（ＯＰ−１）としても公知のＢＭＰ−７は、様々な軟骨および骨の疾患および欠損を処置するために有用である。例えば、組換えヒトＢＭＰ−７は、世界中で４０，０００人以上の患者を処置するために使用されてきた。しかし、臨床結果は、組換えヒトＢＭＰ−７は、いくつかの臨床適応症において高度に免疫原性であることを明らかにした。言い換えると、上記組換えタンパク質は、患者において免疫反応を刺激し、上記患者にＢＭＰ−７に対する抗体を作らせ得る。これらの抗体はまた、上記患者によって内因性に産生されたＢＭＰ−７の機能を阻害し、患者の健康にとって潜在的な長期的結果を引き起こし得る。よって、当該分野において、患者においてその有効性を改善し、そして有害作用を抑制するために、免疫原性を抑制し、一方その生物学的活性および臨床的に関連のある骨形成の性質を維持する、組換えＢＭＰ−７を含む、ＢＭＰ−７に対するニーズが存在する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
発明の要旨
本発明は、野生型ヒトＢＭＰ−７と比較して、その免疫原性を抑制するように改変したＢＭＰ−７、例えばヒト組換えＢＭＰ−７に関する。より具体的には、本発明によるＢＭＰ−７タンパク質を、潜在的な免疫原性エピトープを除去するように改変する。結果として、本発明のＢＭＰ−７タンパク質は、野生型ＢＭＰ−７と比較して、改善した生物学的性質を有する。
【０００５】
１つの局面によって、本発明は、成熟ヒトＢＭＰ−７と少なくとも９０％の配列同一性を有する、変異体ＢＭＰ−７タンパク質を含む。上記変異体ＢＭＰ−７は、１個以上、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、または８個以上の、成熟ヒトＢＭＰ−７に対応する以下の位置で、置換を含む：Ｇ６１、Ａ６３、Ｙ６５、Ｙ６６、Ｅ６８、Ｅ７０、Ａ７２、Ｈ９２、Ｆ９３、Ｉ９４、Ｎ９５、Ｐ９６、Ｅ９７、Ｔ９８、Ｖ９９、Ｐ１００、Ｐ１０２、またはＡ１０５。さらなる実施態様において、上記変異体タンパク質は、成熟ヒトＢＭＰ−７と少なくとも９５％の同一性を有する。
【０００６】
さらなる実施態様において、上記置換は、１つ以上の以下のものである：Ｇ６１Ｅ、Ａ６３Ｅ／Ｑ／Ｈ、Ｙ６５Ｆ／Ｎ、Ｙ６６Ｅ、Ｅ６８Ｄ／Ｋ／Ｈ、Ｅ７０Ｇ／Ｄ、Ａ７２Ｓ／Ｆ／Ｐ、Ｈ９２Ｎ、Ｆ９３Ｎ／Ｌ／Ｓ、Ｉ９４Ｍ／Ｋ／Ｓ／Ｖ、Ｎ９５Ｖ／Ｆ、Ｐ９６Ｓ／Ｎ、Ｅ９７Ｓ／Ｔ／Ｄ／Ｋ、Ｔ９８Ｋ／Ｉ／Ｓ／Ｙ／Ｈ、Ｖ９９Ｉ、Ｐ１００Ｇ、Ｐ１０２Ａ、またはＡ１０５Ｖ。さらなる実施態様において、上記変異体は、ＢＭＰ−７活性を示す。
【０００７】
別の局面において、本発明は、本発明の変異体ＢＭＰ−７タンパク質をコードする核酸に関する。例えば、上記核酸はＤＮＡまたはＲＮＡである。
【０００８】
別の局面において、本発明は、本発明の変異体ＢＭＰ−７タンパク質をコードする核酸を含む、組換え発現ベクターに関する。
【０００９】
さらに別の局面において、本発明は、本発明の変異体ＢＭＰ−７タンパク質をコードする核酸を含む発現ベクターを含む細胞に関する。上記細胞は、１つの実施態様において原核生物であり得る、または別の実施態様において真核生物であり得る。
【００１０】
さらなる局面において、本発明は、本発明の変異体ＢＭＰ−７タンパク質および薬学的キャリアを含む薬学的組成物に関する。
【００１１】
さらなる局面によって、本発明は、患者における骨格障害を処置する方法に関する。上記方法は、上記患者に、治療的に有効な量の本発明の変異体ＢＭＰ−７タンパク質を投与することを必要とする。
【００１２】
またさらなる局面によって、本発明は、ヒトＢＭＰ−７タンパク質の免疫原性を抑制する方法に関する。上記方法は、ヒトＢＭＰ−７の免疫原性エピトープを同定すること、およびＢＭＰ−７のアミノ酸配列において１つ以上の置換を工学技術で作製することによって、ヒトＢＭＰ−７のアミノ酸配列においてエピトープを改変して、改変アミノ酸配列を作製することを必要とする。１つ以上の置換が、成熟ヒトＢＭＰ−７に対応する、１つ以上の位置Ｇ６１、Ａ６３、Ｙ６５、Ｙ６６、Ｅ６８、Ｅ７０、Ａ７２、Ｈ９２、Ｆ９３、Ｉ９４、Ｎ９５、Ｐ９６、Ｅ９７、Ｔ９８、Ｖ９９、Ｐ１００、Ｐ１０２、またはＡ１０５において起こる。１つの実施態様において、上記ヒトＢＭＰ−７は組換体である。さらなる実施態様において、上記１つ以上の置換は、Ｇ６１Ｅ、Ａ６３Ｅ／Ｑ／Ｈ、Ｙ６５Ｆ／Ｎ、Ｙ６６Ｅ、Ｅ６８Ｄ／Ｋ／Ｈ、Ｅ７０Ｇ／Ｄ、Ａ７２Ｓ／Ｆ／Ｐ、Ｈ９２Ｎ、Ｆ９３Ｎ／Ｌ／Ｓ、Ｉ９４Ｍ／Ｋ／Ｓ／Ｖ、Ｎ９５Ｖ／Ｆ、Ｐ９６Ｓ／Ｎ、Ｅ９７Ｓ／Ｔ／Ｄ／Ｋ、Ｔ９８Ｋ／Ｉ／Ｓ／Ｙ／Ｈ、Ｖ９９Ｉ、Ｐ１００Ｇ、Ｐ１０２Ａ、またはＡ１０５Ｖのいずれか１つ以上である。さらなる実施態様において、上記方法は、適当な発現システムにおいて、上記改変されたアミノ酸配列によってコードされるタンパク質を発現する工程、および上記タンパク質を精製する工程を含み得る。上記タンパク質を、１つの実施態様において真核細胞において発現し得る、または別の実施態様において原核細胞において発現し得る。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、それぞれ１５アミノ酸長であり、そして５または１０アミノ酸のいずれかで重複する、ヒトＢＭＰ−７の成熟領域の配列全体をカバーする、１８個のペプチドを示す。
【図２】図２は、ヒトＢＭＰ−７の成熟領域全体に関連する、これらのペプチド間の重複を示す、１８個のペプチドの概略図である。
【図３】図３は、患者血清サンプル由来の、非中和抗ＢＭＰ−７抗体に対する、図１に示した１８個のペプチドの、ＥＬＩＳＡにおける結合の結果を示す棒グラフである。（その棒は、左から右に、１１２６６−、１１１６９４＋、１１１９４５＋、１１１６６５＋、および１Ｂ１２／１２Ｇ３＋である）。
【図４】図４は、患者血清サンプル由来の、中和抗ＢＭＰ−７抗体に対する、図１に示した１８個のペプチドの、ＥＬＩＳＡにおける結合の結果を示す棒グラフである。（その棒は、左から右に、１１１３７９１−、１１３１１３＋、１１３３３１＋、１１３７５６＋、１１２９５６＋、１１３７５７＋、１１３７６６＋、１１１６９４＋、および１Ｂ１２／１２Ｇ３＋である）。
【図５】図５Ａは、ＢＭＰ−２、４、５、６、および９における対応する領域とともに、ペプチド９（図１に示すような）に対応するＢＭＰ−７の部分の整列である。図５Ｂは、ＢＭＰ−２、４、５、６、および９における対応する領域とともに、ペプチド１３（図１に示すような）に対応するＢＭＰ−７の部分の整列である。
【図６】図６は、成熟ヒトＢＭＰ−７の配列である（配列番号１）。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
発明の詳細な説明
組換えヒトＢＭＰ−７は、いくつかの臨床適応症において高度に免疫原性であることが示された。例えば、ＢＭＰ−７は、ＯＰ−１（登録商標）ＰｕｔｔｙまたはＯＰ−１（登録商標）Ｉｍｐｌａｎｔ（Ｓｔｒｙｋｅｒ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ、ＭＡ）の一部として患者に移植された場合、いくらかの患者において、組換えヒトＢＭＰ−７に対する抗体を生成することによって、免疫反応を示すようになる。これは、ＢＭＰ−７処置の有効性を減少させ、そして副作用を引き起こし得る。
【００１５】
よって、本発明は、野生型ＢＭＰ−７と比較して、抑制された免疫原性を有する変異体ＢＭＰ−７タンパク質に関する。本発明はまた、抑制された免疫原性を有するＢＭＰ−７変異体を製造および使用する方法も含む。本発明によって、潜在的な免疫原性エピトープを含むＢＭＰ−７部分のアミノ酸残基を改変することによって、免疫原性を抑制する。よって、本発明によって改変したＢＭＰ−７タンパク質は、その生物学的活性を維持するが、その野生型ＢＭＰ−７対応物より実質的に免疫原性が低い。例えば、ＢＭＰ−７の免疫原性の性質を、本発明によって除去または実質的に抑制する。よって、そのような変異体ＢＭＰ−７タンパク質は、患者、例えばヒト患者に投与した場合に、免疫原性が低いことが予期される。
【００１６】
骨形成タンパク質
骨形成タンパク質（ＢＭＰ）は、ＴＧＦ−βスーパーファミリーに属する。上記ＴＧＦ−βスーパーファミリータンパク質は、６個の保存されたシステイン残基によって特徴付けられるサイトカインである。ヒトゲノムは、ＴＧＦ−βスーパーファミリータンパク質をコードする、約４２個のオープンリーディングフレームを含む。上記ＴＧＦ−βスーパーファミリータンパク質を、配列類似性およびそれらが活性化する特異的シグナル伝達経路に基づいて、少なくともＢＭＰサブファミリーおよびＴＧＦ−βサブファミリーに分けることができる。上記ＢＭＰサブファミリーは、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３（オステオゲニン）、ＢＭＰ−３ｂ（ＧＤＦ−１０）、ＢＭＰ−４（ＢＭＰ−２ｂ）、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７（骨形成タンパク質−１またはＯＰ−１）、ＢＭＰ−８（ＯＰ−２）、ＢＭＰ−８Ｂ（ＯＰ−３）、ＢＭＰ−９（ＧＤＦ−２）、ＢＭＰ−１０、ＢＭＰ−１１（ＧＤＦ−１１）、ＢＭＰ−１２（ＧＤＦ−７）、ＢＭＰ−１３（ＧＤＦ−６、ＣＤＭＰ−２）、ＢＭＰ−１５（ＧＤＦ−９）、ＢＭＰ−１６、ＧＤＦ−１、ＧＤＦ−３、ＧＤＦ−５（ＣＤＭＰ−１、ＭＰ−５２）、およびＧＤＦ−８（ミオスタチン）を含むがこれに限らない。さらに、ヒト集団の異なるメンバーの間で、ＢＭＰ配列の対立遺伝子変異が存在し、そして現在までに発見および特徴付けされたＢＭＰの間で種の変異が存在する。本明細書中で使用される場合、「ＢＭＰサブファミリー」、「ＢＭＰ」、「ＢＭＰリガンド」およびその文法的同等物は、明確に他に示さなければ、ＢＭＰサブファミリーのメンバーを指す。
【００１７】
これらの配列、およびその化学的ならびに物理的性質を開示する出版物は、以下のものを含む：
【００１８】
【数１】
【００１９】
上記の出版物は、本明細書中で参考文献に組込まれる。
【００２０】
本明細書中で使用される場合、「ＴＧＦ−βスーパーファミリーメンバー」または「ＴＧＦ−βスーパーファミリータンパク質」は、トランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）スーパーファミリーのメンバーとして当業者に公知であるタンパク質を意味する。構造的に、そのようなタンパク質は、疎水性のシグナル配列、数百アミノ酸のＮ末端プロ領域、および可変Ｎ末端領域、および保存された６個または７個のシステイン骨格を有する特徴的なシステインモチーフを有する約１００アミノ酸を含む、高度に保存されたＣ末端領域を含む成熟ドメインを含む大きな前駆体ポリペプチド鎖として発現するホモまたはヘテロダイマーである。これらの構造的に関連するタンパク質は、様々な発生のイベントに関与するとして同定された。
【００２１】
「形態形成タンパク質」という用語は、真の形態形成活性を有する、タンパク質のＴＧＦ−βスーパーファミリーに属するタンパク質を指す。例えば、そのようなタンパク質は、前駆細胞を誘導して、増殖させ得る、および／または、局所環境の指示（ｃｕｅ）に依存して、軟骨、骨、腱、靭帯、神経または他の型の分化組織の形成に至る分化経路の一連のイベントを開始し得る。従って、本発明によって有用な形態形成タンパク質は、異なる環境において異なる挙動をし得る。ある実施態様において、本発明の形態形成タンパク質は、ホモダイマー種またはヘテロダイマー種であり得る。
【００２２】
「骨形成タンパク質（ＯＰ）」という用語は、前駆細胞を誘導して軟骨および／または骨も形成し得る、形態形成タンパク質を指す。上記骨は、膜内の骨または軟骨内の骨であり得る。ほとんどの骨形成タンパク質は、ＢＭＰサブファミリーのメンバーであり、そして従ってＢＭＰでもある。しかし、逆は真ではない。本発明によって、ＤＮＡ配列相同性またはアミノ酸配列同一性によって同定されたＢＭＰはまた、骨形成タンパク質であるために、機能的な生物検定において明白な骨形成または軟骨形成活性を有さなければならない。適当な生物検定は、当該分野で周知である；特に有用な生物検定は、異所性骨形成アッセイである（例えば、米国特許第５，０１１，６９１号；米国特許第５，２６６，６８３号を参照のこと）。
【００２３】
構造的に、ＢＭＰはダイマーのシステインノットタンパク質（ｃｙｓｔｅｉｎ ｋｎｏｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）である。ＢＭＰの各モノマーは、複数の分子内ジスルフィド結合を含む。さらなる分子間ジスルフィド結合が、ほとんどのＢＭＰにおいてダイマー化を媒介する。ＢＭＰは、ホモダイマーを形成し得る。いくつかのＢＭＰはヘテロダイマーを形成し得る。ＢＭＰは、長いプロドメイン、１つ以上の切断部位、および成熟ドメインを含む、プロタンパク質として発現する。上記プロドメインは、正しいフォールディングおよびＢＭＰのプロセシングを助けると考えられる。さらに、全てではないがいくつかのＢＭＰにおいて、上記プロドメインは上記成熟ドメインに非共有結合的に結合し得、そしてインヒビターとして作用し得る（例えばＴｈｉｅｓら、（２００１）Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ １８：２５１−２５９）。
【００２４】
ＢＭＰは、天然には長いプロドメイン、１つ以上の切断部位、および成熟ドメインを含むプロタンパク質として発現する。次いでこのプロタンパク質が、細胞機構によって処理されて、ダイマーの成熟ＢＭＰ分子を生じる。上記プロドメインは、正しいフォールディングおよびＢＭＰのプロセシングを助けると考えられる。さらに、全てではないがいくつかのＢＭＰにおいて、上記プロドメインは上記成熟ドメインに非共有結合的に結合し得、そしてシャペロンおよびインヒビターとして作用し得る（例えばＴｈｉｅｓら、（２００１）Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ １８：２５１−２５９）。
【００２５】
ＢＭＰシグナル伝達は、ＢＭＰダイマーが、２つのＩ型および２つのＩＩ型セリン／スレオニンキナーゼ受容体に結合したときに開始される。Ｉ型受容体は、ＡＬＫ−１、ＡＬＫ−２（ＡｃｔＲｌａまたはＡｃｔＲＩとも呼ばれる）、ＡＬＫ−３（ＢＭＰＲＩａとも呼ばれる）、およびＡＬＫ−６（ＢＭＰＲＩｂとも呼ばれる）を含むがこれに限らない。ＩＩ型受容体は、ＡｃｔＲＩＩａ（ＡｃｔＲＩＩとも呼ばれる）、ＡｃｔＲＩＩｂ、およびＢＭＰＲＩＩを含むがこれに限らない。ヒトゲノムは、７個のＩ型および５個のＩＩ型受容体を含む、受容体セリン／スレオニンキナーゼファミリーの１２個のメンバーを含み、それらは全て、ＴＧＦ−βシグナル伝達に関与する（Ｍａｎｎｉｎｇら、２００２、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９８：１９１２−１９３４、その開示は本明細書によって参考文献に組込まれる）。ＢＭＰが結合した後、上記ＩＩ型受容体は、上記Ｉ型受容体をリン酸化し、そのＩ型受容体は転写因子のＳｍａｄファミリーのメンバーをリン酸化し、そしてそのＳｍａｄは核に移動して、そして一群の遺伝子の発現を活性化する。
【００２６】
ＢＭＰはまた、ＢＡＭＢＩ（ＢＭＰおよびアクチビン膜結合インヒビター）、ＢＭＰＥＲ（ＢＭＰ結合内皮細胞前駆体由来制御因子）、セルベラス（Ｃｅｒｂｅｒｕｓ）、コルディン（ｃｏｒｄｉｎ）、コルディン様、ダン（Ｄａｎ）、ダンテ（Ｄａｎｔｅ）、フォリスタチン（ｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎ）、フォリスタチン関連タンパク質（ＦＳＲＰ）、エクトディン（ｅｃｔｏｄｉｎ）、グレムリン（ｇｒｅｍｌｉｎ）、ノギン（ｎｏｇｇｉｎ）、ダンおよびセルベラス（ｃｅｒｂｅｒｕｓ）に関連するタンパク質（ＰＲＤＣ）、スクレロスチン（ｓｃｌｅｒｏｓｔｉｎ）、スクレロスチン様、および子宮感作関連遺伝子−１（ｕｔｅｒｉｎｅ ｓｅｎｓｉｔｉｚａｔｉｏｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｇｅｎｅ−１）（ＵＳＡＧ−１）を含むがこれに限らない、インヒビター、可溶性受容体、およびデコイ受容体と相互作用する。さらに、ＢＭＰは、補助受容体と相互作用し得、例えばＢＭＰ−２およびＢＭＰ−４は、補助受容体ＤＲＡＧＯＮ（Ｓａｍａｄら、（２００５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８０：１４１２２−１４１２９）、およびヘパリン硫酸およびヘパリンのような細胞外マトリックス成分（Ｉｒｉｅら、（２００３）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３０８：８５８−８６５）に結合する。
【００２７】
本明細書中で企図されるように、「ＢＭＰ」という用語は、ＤＮＡ相同性およびアミノ酸配列同一性に基づいて規定される、ＴＧＦ−βスーパーファミリーのタンパク質の、ＢＭＰサブファミリーに属するタンパク質を指す。本発明によって、タンパク質は、上記ＢＭＰサブファミリーを特徴づける、保存されたＣ末端システインリッチドメイン内で、公知のＢＭＰサブファミリーメンバーと少なくとも５０％のアミノ酸配列同一性を有する場合、上記ＢＭＰサブファミリーに属する。ＢＭＰサブファミリーのメンバーは、全体的に５０％未満のＤＮＡ配列同一性またはアミノ酸配列同一性を有し得る。本明細書中で使用される場合、「ＢＭＰ」という用語はさらに、天然に存在する骨形成タンパク質のアミノ酸配列変異体、ドメイン交換変異体、および短縮化および活性断片であるタンパク質、およびＢＭＰ−２／７；ＢＭＰ−４／７；ＢＭＰ−２／６；ＢＭＰ−２／５；ＢＭＰ−４／７；ＢＭＰ−４／５；およびＢＭＰ−４／６ヘテロダイマーのような、２つの異なるモノマーＢＭＰペプチドから形成される、ヘテロダイマータンパク質を指す。適当なＢＭＰ変異体およびヘテロダイマーは、ＵＳ２００６／０２３５２０４；ＷＯ０７／０８７０５３；ＷＯ０５／０９７８２５；ＷＯ００／０２０６０７；ＷＯ００／０２０５９１；ＷＯ００／０２０４４９；ＷＯ０５／１１３５８５；ＷＯ９５／０１６０３４およびＷＯ９３／００９２２９において記載するものを含む。
【００２８】
１つの実施態様によって、本発明の方法によって生じた、ＢＭＰ−７変異体のようなＢＭＰ変異体は、対応する野生型ＢＭＰタンパク質配列と、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を維持する。
【００２９】
１つの実施態様によって、本発明の方法によって生じた、ＢＭＰ−７変異体のようなＢＭＰ変異体は、対応する野生型ＢＭＰタンパク質配列のＣ末端領域の保存されたシステインドメインと、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を維持する。
【００３０】
「対応する野生型タンパク質」によって、その改変ＢＭＰまたは変異体ＢＭＰの野生型バージョンを意味する。例えば、上記改変ＢＭＰまたは変異体ＢＭＰが改変ＢＭＰ−７または変異体ＢＭＰ−７であるなら、対応する野生型ＢＭＰは、野生型ＢＭＰ−７である。
【００３１】
２つのアミノ酸配列または２つの核酸の同一性パーセントを決定するために、その配列を、最適な比較の目的のために整列する（例えば、２番目のアミノ酸配列または核酸配列との最適な整列のために、最初のアミノ酸配列または核酸配列の配列中に、ギャップを導入し得る）。２つの配列間の同一性パーセントは、上記配列によって共有される同一の位置の数の関数である（すなわち、相同性％＝同一の位置の数／全部の位置の数×１００）。２つの配列間の相同性パーセントの決定を、数学的アルゴリズムを用いて達成し得る。２つの配列の比較のために利用される数学的アルゴリズムの、好ましい、制限しない例は、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３−７７におけるように改変された、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：２２６４−６８のアルゴリズムである。そのようなアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラムに組込まれている。ＢＬＡＳＴヌクレオチドサーチを、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、語長（ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ）＝１２で行い得る。ＢＬＡＳＴタンパク質サーチを、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、語長＝３で行い得る。比較の目的のためにギャップを挿入した整列を得るために、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２５（１７）：３３８９−３４０２において記載されるように、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴを利用し得る。ＢＬＡＳＴおよびＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（例えばＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメーターを使用し得る。
【００３２】
変異体ＢＭＰ−７
本発明は、ＢＭＰ−７の免疫原性を抑制するための方法を提供する。上記免疫原性を抑制または排除するために、野生型ＢＭＰ−７と異なる変異体ＢＭＰ−７タンパク質を作製する。本発明の実施態様によって、これらの変異体は、ＢＭＰ−７の免疫原性エピトープの１つ以上のアミノ酸が改変されている点で、野生型ＢＭＰ−７と異なる。本発明の実施態様によって、ＢＭＰ−７の潜在的な免疫原性エピトープを、本明細書中で記載されたように、および／または当該分野で公知の他の方法によって同定し、そして上記エピトープを改変して上記エピトープの免疫原性効果を抑制または排除する。次いで、上記エピトープの免疫原性効果を抑制または排除するために、標準的な遺伝子操作手順によって、上記エピトープ領域において置換、欠失、または挿入のようなアミノ酸の改変を行う。本発明の１つの実施態様によって、本発明のＢＭＰ−７変異体は、その生物活性を維持するが、野生型ＢＭＰ−７と比較して、免疫原性が抑制されている、または実質的に抑制されている、または排除されている。
【００３３】
本発明の１つの実施態様によって、エピトープを含むと同定されたＢＭＰ−７の領域を、上記エピトープを除去するために、別のＢＭＰの対応する領域由来のアミノ酸配列で置き換える。例えば、１つの実施態様において、成熟ヒトＢＭＰ−７の残基６１−７５の配列を、ＢＭＰ−２（ＧＹＨＡＦＹＣＨＧＥＣＰＦＰＬ（配列番号２０）−図５Ａの残基３１９−３３３）、ＢＭＰ−４（ＧＹＱＡＦＹＣＨＧＤＣＰＦＰＬ（配列番号２１）−図５Ａの残基３３１−３４５）、ＢＭＰ−５（ＧＹＡＡＦＹＣＤＧＥＣＳＦＰＬ（配列番号２２）−図５Ａの残基３７６−３９０）、ＢＭＰ−６（ＧＹＡＡＮＹＣＤＧＥＣＳＦＰＬ（配列番号２３）−図５Ａの残基４３５−４４９）、またはＢＭＰ−９（ＥＹＥＡＹＥＣＫＧＧＣＦＦＰＬ（配列番号２４）−図５Ａの残基３５０−３６４）由来の対応するアミノ酸配列で置き換える。別の実施態様において、成熟ヒトＢＭＰ−７の残基９１−１０５の配列を、ＢＭＰ−２（ＶＮＳＶＮＳＫＩＰＫＡＣＣＶ（配列番号２５）−図５Ｂの残基３４９−３６２）、ＢＭＰ−４（ＶＮＳＶＮＳＳＩＰＫＡＣＣＶ（配列番号２６）−図５Ｂの残基３６１−３７４）、ＢＭＰ−５（ＶＨＬＭＦＰＤＨＶＰＫＰＣＣＡ（配列番号２７）−図５Ｂの残基４０６−４２０）、ＢＭＰ−６（ＶＨＬＭＮＰＥＹＶＰＫＰＣＣＡ（配列番号２８）−図５Ｂの残基４６５−４７９）、またはＢＭＰ−９（ＶＨＬＫＦＰＴＫＶＧＫＡＣＣＶ（配列番号２９）−図５Ｂの残基３８０−３９４）由来の対応するアミノ酸配列で置き換える。
【００３４】
本発明の別の実施態様において、エピトープを含むＢＭＰ−７の領域中にあると同定された、ＢＭＰ−７の１つ以上のアミノ酸を、上記エピトープを除去するために、例えば別のＢＭＰのその残基に対応するアミノ酸の置換によって改変する。例えば、図５Ａおよび５Ｂにおいて示すように、２つの推定エピトープ領域（ペプチド９および１３）の、他のＢＭＰタンパク質由来の対応する領域との整列を示し、これにより、ＢＭＰ−７に対する可能性のあるアミノ酸改変が示唆される。
【００３５】
本発明の別の実施態様において、エピトープを除去するために、１つ以上の点突然変異をヒトＢＭＰ−７に導入する。例えば、１つの実施態様において、ＢＭＰ−７は、残基Ｇ６１、Ａ６３、Ｙ６５、Ｙ６６、Ｅ６８、Ｅ７０、Ａ７２、Ｈ９２、Ｆ９３、Ｉ９４、Ｎ９５、Ｐ９６、Ｅ９７、Ｔ９８、Ｖ９９、Ｐ１００、Ｐ１０２、またはＡ１０５の１個以上において、置換を有する。
【００３６】
別の実施態様において、ＢＭＰ−７は、残基Ｇ６１、Ａ６３、Ｙ６５、Ｙ６６、Ｅ６８、Ｅ７０、Ａ７２、Ｈ９２、Ｆ９３、Ｉ９４、Ｎ９５、Ｐ９６、Ｅ９７、Ｔ９８、Ｖ９９、Ｐ１００、Ｐ１０２、またはＡ１０５の２個以上において、置換を有する。
【００３７】
別の実施態様において、ＢＭＰ−７は、残基Ｇ６１、Ａ６３、Ｙ６５、Ｙ６６、Ｅ６８、Ｅ７０、Ａ７２、Ｈ９２、Ｆ９３、Ｉ９４、Ｎ９５、Ｐ９６、Ｅ９７、Ｔ９８、Ｖ９９、Ｐ１００、Ｐ１０２、またはＡ１０５の３個以上において、置換を有する。
【００３８】
別の実施態様において、ＢＭＰ−７は、残基Ｇ６１、Ａ６３、Ｙ６５、Ｙ６６、Ｅ６８、Ｅ７０、Ａ７２、Ｈ９２、Ｆ９３、Ｉ９４、Ｎ９５、Ｐ９６、Ｅ９７、Ｔ９８、Ｖ９９、Ｐ１００、Ｐ１０２、またはＡ１０５の４個以上において、置換を有する。
【００３９】
別の実施態様において、ＢＭＰ−７は、残基Ｇ６１、Ａ６３、Ｙ６５、Ｙ６６、Ｅ６８、Ｅ７０、Ａ７２、Ｈ９２、Ｆ９３、Ｉ９４、Ｎ９５、Ｐ９６、Ｅ９７、Ｔ９８、Ｖ９９、Ｐ１００、Ｐ１０２、またはＡ１０５の５個以上において、置換を有する。
【００４０】
別の実施態様において、ＢＭＰ−７は、残基Ｇ６１、Ａ６３、Ｙ６５、Ｙ６６、Ｅ６８、Ｅ７０、Ａ７２、Ｈ９２、Ｆ９３、Ｉ９４、Ｎ９５、Ｐ９６、Ｅ９７、Ｔ９８、Ｖ９９、Ｐ１００、Ｐ１０２、またはＡ１０５の６個以上において、置換を有する。
【００４１】
別の実施態様において、ＢＭＰ−７は、残基Ｇ６１、Ａ６３、Ｙ６５、Ｙ６６、Ｅ６８、Ｅ７０、Ａ７２、Ｈ９２、Ｆ９３、Ｉ９４、Ｎ９５、Ｐ９６、Ｅ９７、Ｔ９８、Ｖ９９、Ｐ１００、Ｐ１０２、またはＡ１０５の７個以上において、置換を有する。
【００４２】
別の実施態様において、ＢＭＰ−７は、残基Ｇ６１、Ａ６３、Ｙ６５、Ｙ６６、Ｅ６８、Ｅ７０、Ａ７２、Ｈ９２、Ｆ９３、Ｉ９４、Ｎ９５、Ｐ９６、Ｅ９７、Ｔ９８、Ｖ９９、Ｐ１００、Ｐ１０２、またはＡ１０５の８個以上において、置換を有する。
【００４３】
別の実施態様において、ＢＭＰ−７は、残基Ｇ６１、Ａ６３、Ｙ６５、Ｙ６６、Ｅ６８、Ｅ７０、Ａ７２、Ｈ９２、Ｆ９３、Ｉ９４、Ｎ９５、Ｐ９６、Ｅ９７、Ｔ９８、Ｖ９９、Ｐ１００、Ｐ１０２、またはＡ１０５の９個以上において、置換を有する。
【００４４】
別の実施態様において、ＢＭＰ−７は、残基Ｇ６１、Ａ６３、Ｙ６５、Ｙ６６、Ｅ６８、Ｅ７０、Ａ７２、Ｈ９２、Ｆ９３、Ｉ９４、Ｎ９５、Ｐ９６、Ｅ９７、Ｔ９８、Ｖ９９、Ｐ１００、Ｐ１０２、またはＡ１０５の１０個以上において、置換を有する。
【００４５】
さらなる実施態様において、ＢＭＰ−７は、１個以上の以下の置換を有する：Ｇ６１Ｅ、Ａ６３Ｅ／Ｑ／Ｈ、Ｙ６５Ｆ／Ｎ、Ｙ６６Ｅ、Ｅ６８Ｄ／Ｋ／Ｈ、Ｅ７０Ｄ／Ｇ、Ａ７２Ｓ／Ｆ／Ｐ、Ｈ９２Ｎ、Ｆ９３Ｎ／Ｌ／Ｓ、Ｉ９４Ｍ／Ｋ／Ｓ／Ｖ、Ｎ９５Ｖ／Ｆ、Ｐ９６Ｓ／Ｎ、Ｅ９７Ｓ／Ｔ／Ｄ／Ｋ、Ｔ９８Ｋ／Ｉ／Ｓ／Ｙ／Ｈ、Ｖ９９Ｉ、Ｐ１００Ｇ、Ｐ１０２Ａ、またはＡ１０５Ｖ。
【００４６】
さらなる実施態様において、ＢＭＰ−７は、２個以上の以下の置換を有する：Ｇ６１Ｅ、Ａ６３Ｅ／Ｑ／Ｈ、Ｙ６５Ｆ／Ｎ、Ｙ６６Ｅ、Ｅ６８Ｄ／Ｋ／Ｈ、Ｅ７０Ｄ／Ｇ、Ａ７２Ｓ／Ｆ／Ｐ、Ｈ９２Ｎ、Ｆ９３Ｎ／Ｌ／Ｓ、Ｉ９４Ｍ／Ｋ／Ｓ／Ｖ、Ｎ９５Ｖ／Ｆ、Ｐ９６Ｓ／Ｎ、Ｅ９７Ｓ／Ｔ／Ｄ／Ｋ、Ｔ９８Ｋ／Ｉ／Ｓ／Ｙ／Ｈ、Ｖ９９Ｉ、Ｐ１００Ｇ、Ｐ１０２Ａ、またはＡ１０５Ｖ。
【００４７】
さらなる実施態様において、ＢＭＰ−７は、３個以上の以下の置換を有する：Ｇ６１Ｅ、Ａ６３Ｅ／Ｑ／Ｈ、Ｙ６５Ｆ／Ｎ、Ｙ６６Ｅ、Ｅ６８Ｄ／Ｋ／Ｈ、Ｅ７０Ｄ／Ｇ、Ａ７２Ｓ／Ｆ／Ｐ、Ｈ９２Ｎ、Ｆ９３Ｎ／Ｌ／Ｓ、Ｉ９４Ｍ／Ｋ／Ｓ／Ｖ、Ｎ９５Ｖ／Ｆ、Ｐ９６Ｓ／Ｎ、Ｅ９７Ｓ／Ｔ／Ｄ／Ｋ、Ｔ９８Ｋ／Ｉ／Ｓ／Ｙ／Ｈ、Ｖ９９Ｉ、Ｐ１００Ｇ、Ｐ１０２Ａ、またはＡ１０５Ｖ。
【００４８】
さらなる実施態様において、ＢＭＰ−７は、４個以上の以下の置換を有する：Ｇ６１Ｅ、Ａ６３Ｅ／Ｑ／Ｈ、Ｙ６５Ｆ／Ｎ、Ｙ６６Ｅ、Ｅ６８Ｄ／Ｋ／Ｈ、Ｅ７０Ｄ／Ｇ、Ａ７２Ｓ／Ｆ／Ｐ、Ｈ９２Ｎ、Ｆ９３Ｎ／Ｌ／Ｓ、Ｉ９４Ｍ／Ｋ／Ｓ／Ｖ、Ｎ９５Ｖ／Ｆ、Ｐ９６Ｓ／Ｎ、Ｅ９７Ｓ／Ｔ／Ｄ／Ｋ、Ｔ９８Ｋ／Ｉ／Ｓ／Ｙ／Ｈ、Ｖ９９Ｉ、Ｐ１００Ｇ、Ｐ１０２Ａ、またはＡ１０５Ｖ。
【００４９】
さらなる実施態様において、ＢＭＰ−７は、５個以上の以下の置換を有する：Ｇ６１Ｅ、Ａ６３Ｅ／Ｑ／Ｈ、Ｙ６５Ｆ／Ｎ、Ｙ６６Ｅ、Ｅ６８Ｄ／Ｋ／Ｈ、Ｅ７０Ｄ／Ｇ、Ａ７２Ｓ／Ｆ／Ｐ、Ｈ９２Ｎ、Ｆ９３Ｎ／Ｌ／Ｓ、Ｉ９４Ｍ／Ｋ／Ｓ／Ｖ、Ｎ９５Ｖ／Ｆ、Ｐ９６Ｓ／Ｎ、Ｅ９７Ｓ／Ｔ／Ｄ／Ｋ、Ｔ９８Ｋ／Ｉ／Ｓ／Ｙ／Ｈ、Ｖ９９Ｉ、Ｐ１００Ｇ、Ｐ１０２Ａ、またはＡ１０５Ｖ。
【００５０】
さらなる実施態様において、ＢＭＰ−７は、６個以上の以下の置換を有する：Ｇ６１Ｅ、Ａ６３Ｅ／Ｑ／Ｈ、Ｙ６５Ｆ／Ｎ、Ｙ６６Ｅ、Ｅ６８Ｄ／Ｋ／Ｈ、Ｅ７０Ｄ／Ｇ、Ａ７２Ｓ／Ｆ／Ｐ、Ｈ９２Ｎ、Ｆ９３Ｎ／Ｌ／Ｓ、Ｉ９４Ｍ／Ｋ／Ｓ／Ｖ、Ｎ９５Ｖ／Ｆ、Ｐ９６Ｓ／Ｎ、Ｅ９７Ｓ／Ｔ／Ｄ／Ｋ、Ｔ９８Ｋ／Ｉ／Ｓ／Ｙ／Ｈ、Ｖ９９Ｉ、Ｐ１００Ｇ、Ｐ１０２Ａ、またはＡ１０５Ｖ。
【００５１】
さらなる実施態様において、ＢＭＰ−７は、７個以上の以下の置換を有する：Ｇ６１Ｅ、Ａ６３Ｅ／Ｑ／Ｈ、Ｙ６５Ｆ／Ｎ、Ｙ６６Ｅ、Ｅ６８Ｄ／Ｋ／Ｈ、Ｅ７０Ｄ／Ｇ、Ａ７２Ｓ／Ｆ／Ｐ、Ｈ９２Ｎ、Ｆ９３Ｎ／Ｌ／Ｓ、Ｉ９４Ｍ／Ｋ／Ｓ／Ｖ、Ｎ９５Ｖ／Ｆ、Ｐ９６Ｓ／Ｎ、Ｅ９７Ｓ／Ｔ／Ｄ／Ｋ、Ｔ９８Ｋ／Ｉ／Ｓ／Ｙ／Ｈ、Ｖ９９Ｉ、Ｐ１００Ｇ、Ｐ１０２Ａ、またはＡ１０５Ｖ。
【００５２】
さらなる実施態様において、ＢＭＰ−７は、８個以上の以下の置換を有する：Ｇ６１Ｅ、Ａ６３Ｅ／Ｑ／Ｈ、Ｙ６５Ｆ／Ｎ、Ｙ６６Ｅ、Ｅ６８Ｄ／Ｋ／Ｈ、Ｅ７０Ｄ／Ｇ、Ａ７２Ｓ／Ｆ／Ｐ、Ｈ９２Ｎ、Ｆ９３Ｎ／Ｌ／Ｓ、Ｉ９４Ｍ／Ｋ／Ｓ／Ｖ、Ｎ９５Ｖ／Ｆ、Ｐ９６Ｓ／Ｎ、Ｅ９７Ｓ／Ｔ／Ｄ／Ｋ、Ｔ９８Ｋ／Ｉ／Ｓ／Ｙ／Ｈ、Ｖ９９Ｉ、Ｐ１００Ｇ、Ｐ１０２Ａ、またはＡ１０５Ｖ。
【００５３】
さらなる実施態様において、ＢＭＰ−７は、９個以上の以下の置換を有する：Ｇ６１Ｅ、Ａ６３Ｅ／Ｑ／Ｈ、Ｙ６５Ｆ／Ｎ、Ｙ６６Ｅ、Ｅ６８Ｄ／Ｋ／Ｈ、Ｅ７０Ｄ／Ｇ、Ａ７２Ｓ／Ｆ／Ｐ、Ｈ９２Ｎ、Ｆ９３Ｎ／Ｌ／Ｓ、Ｉ９４Ｍ／Ｋ／Ｓ／Ｖ、Ｎ９５Ｖ／Ｆ、Ｐ９６Ｓ／Ｎ、Ｅ９７Ｓ／Ｔ／Ｄ／Ｋ、Ｔ９８Ｋ／Ｉ／Ｓ／Ｙ／Ｈ、Ｖ９９Ｉ、Ｐ１００Ｇ、Ｐ１０２Ａ、またはＡ１０５Ｖ。
【００５４】
さらなる実施態様において、ＢＭＰ−７は、１０個以上の以下の置換を有する：Ｇ６１Ｅ、Ａ６３Ｅ／Ｑ／Ｈ、Ｙ６５Ｆ／Ｎ、Ｙ６６Ｅ、Ｅ６８Ｄ／Ｋ／Ｈ、Ｅ７０Ｄ／Ｇ、Ａ７２Ｓ／Ｆ／Ｐ、Ｈ９２Ｎ、Ｆ９３Ｎ／Ｌ／Ｓ、Ｉ９４Ｍ／Ｋ／Ｓ／Ｖ、Ｎ９５Ｖ／Ｆ、Ｐ９６Ｓ／Ｎ、Ｅ９７Ｓ／Ｔ／Ｄ／Ｋ、Ｔ９８Ｋ／Ｉ／Ｓ／Ｙ／Ｈ、Ｖ９９Ｉ、Ｐ１００Ｇ、Ｐ１０２Ａ、またはＡ１０５Ｖ。
【００５５】
本発明の別の局面によって、本発明によるＢＭＰ−７変異体は、ＢＭＰ−７の生物学的活性を維持する。本明細書中で使用される場合、「生物学的活性」という用語は、インビボまたはインビトロで、あらゆる測定可能なＢＭＰの機能を指す。ＢＭＰの生物学的活性を測定し得るいくつかの方法を、下記の「実施例」の項で列挙する。１つの実施態様において、本発明のＢＭＰ−７変異体は、野生型ＢＭＰ−７と比較して、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の生物学的活性を有する。例えば、１つの実施態様において、本発明のＢＭＰ−７変異体は、ヒト野生型ＢＭＰ−７または組換えヒト野生型ＢＭＰ−７と比較して、少なくとも前述の％の生物学的活性の１つを有する。
【００５６】
ＢＭＰ−７変異体の治療的使用
本発明によるＢＭＰ−７変異体を、広く様々な状態を処置するために、哺乳類患者、例えばヒトに移植または投与し得る。本発明のＢＭＰ−７変異体を、単独でまたは適当なキャリアまたは他の処方剤と組み合わせて、固体、ゲル、またはペースト形態で移植し得る、または上記患者にゲル、ペースト、または液体形態で注射し得る。本発明のＢＭＰ−７変異体は、広く様々な状態を処置するために有用である。例えば、本発明のＢＭＰ−７変異体を、外傷または炎症性疾患のいずれによって引き起こされたかに関わらず、軟骨の変性を含む骨格障害を処置するために使用し得る。例えば、本発明のＢＭＰ−７変異体によって処置可能な疾患は、関節リウマチ（ＲＡ）および変形性関節症（ＯＡ）、および全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）および強皮症のような自己免疫疾患を包含する。
【００５７】
本発明のＢＭＰ−７変異体を、骨格疾患または損傷を処置するために、有効に使用し得る。例えば、上記ＢＭＰ−７変異体を、開放骨折または閉鎖骨折のような、骨折を処置するために使用し得る。閉鎖骨折の処置のために、上記ＢＭＰ−７変異体を好ましくはその骨折部位に注入する。開放骨折、重大なサイズの欠損、または持続する偽関節に関して、上記ＢＭＰ−７変異体を、その骨折部位における外科的移植によって投与し得る。どちらの場合においても、上記ＢＭＰ−７変異体を、単独で、または骨セメント、リン酸カルシウム材料、ゲル材料またはコラーゲンマトリックスのような、適当なキャリア、マトリックス、または足場（ｓｃａｆｆｏｌｄ）と組み合わせて投与し得る。適当なキャリア、マトリックス、および足場は、米国特許第６，９１９，３０８；６，９４９，２５１；および７，０４１，６４１号において開示されるものを含む。
【００５８】
好ましい実施態様において、本発明のＢＭＰ−７変異体を、軟骨の分解または軟骨の欠損を引き起こす疾患または損傷を処置するために使用し得る。例えば、本発明のＢＭＰ−７変異体を、変性椎間円板のような軟骨欠損部位、または腱、靭帯、または半月板を含む他の線維軟骨組織に適用し得る。そのような方法を、米国特許第６，９５８，１４９号において述べる。公開されたＰＣＴ出願ＷＯ０５／１１５４３８において詳述したように、本発明のＢＭＰ−７変異体をまた、膝、肘、臀部、または肩を含む、滑膜性の連結（ｓｙｎｏｖｉａｌ ｊｏｉｎｔ）のような、関節の軟骨内層（ｃａｒｔｉｌａｇｅ ｌｉｎｉｎｇ）のような、関節軟骨の欠損または変性を処置するために使用し得る。この実施態様において、上記ＢＭＰ−７変異体を、好ましくは、上記関節の滑膜腔に注入する。別の実施態様において、本発明のＢＭＰ−７変異体を、関節における軟骨の欠損または骨軟骨の欠損のような、関節軟骨の欠損部位を処置するために使用する。そのような関節軟骨の欠損は、変形性関節症または関節リウマチのような疾患の進行の結果、または上記関節の損傷のためであり得る。この実施態様において、上記ＢＭＰ−７変異体を、関節腔に注入し得る、またはそれを外科的に移植し得る。例えば、上記ＢＭＰ−７変異体を、単独で、または１つ以上のさらなる活性薬剤、支持マトリックスまたは足場、または骨髄間質細胞と組み合わせて、上記欠損内に置くことができる。上記欠損内においたＢＭＰ−７変異体を、必要に応じて適当な被膜、例えば筋皮弁またはコラーゲン膜のような生体吸収性膜で覆い得る。
【００５９】
当業者によって認識されるように、患者に投与するＢＭＰ−７変異体の濃度は、制限無しに、投与する薬剤の投与量および投与経路を含む多くの因子に依存して変動する。投与する薬剤の好ましい投与量はまた、おそらく、疾患の型および程度、組織の喪失または欠損の型および程度、特定の患者の全体的な健康状態、選択した化合物の相対的な生物学的有効性、上記化合物の処方、上記処方における賦形剤の存在および型、および投与経路を含むがこれに限らない、可変物（ｖａｒｉａｂｌｅ）に依存する。本発明のＢＭＰ−７変異体を、個人に提供し得、ここで典型的な用量の範囲は１日あたり体重１ｋｇあたり約１０ｎｇから約１ｇであり、好ましい用量の範囲は体重１ｋｇあたり約０．１ｍｇから１００ｍｇであり、そしてより特に好ましい投与量の範囲は、１０−１０００μｇ／用量である。特定の好ましい実施態様において、１０−１０００μｇの用量のＢＭＰ−７を、変形性関節症に苦しむ個人に投与する。
【００６０】
さらに、下記で記載するように、本発明のＢＭＰ−７変異体を、非骨格組織の疾患または損傷を処置するために使用し得る。本発明によってさらに企図されるように、ＢＭＰは、骨または軟骨とは異なる、哺乳類の様々な組織に関して、骨形態形成および組織形態形成の発生のカスケードを誘導し得る。この形態形成活性は、前駆細胞の増殖および分化を誘導する能力、および骨、軟骨、非ミネラル化骨格または結合組織および他の成人組織の形成をもたらすイベントの進行によって、その分化した表現型を支持および維持する能力を含む。
【００６１】
例えば、本発明のＢＭＰ−７変異体を、代謝性骨疾患において骨量の喪失を予防する、および／または骨量を増加させる処置のために使用し得る。骨形成タンパク質を用いて、代謝性骨疾患における骨量の喪失を予防する、および／または骨量を増加させる処置のための一般的な方法が、米国特許第５，６７４，８４４号において開示され、その開示は、本明細書によって参考文献に組込まれる。本発明のＢＭＰ−７変異体を、歯周組織の再生のために使用し得る。骨形成タンパク質を用いた、歯周組織再生のための一般的な方法は、米国特許第５，７３３，８７８号において開示され、その開示は本明細書によって参考文献に組込まれる。ＢＭＰ−７変異体を、肝臓の再生のために使用し得る。骨形成タンパク質を用いた肝臓再生のための一般的な方法は、米国特許第５，８４９，６８６号において開示され、その開示は本明細書によって参考文献に組込まれる。ＢＭＰ−７変異体を、慢性腎不全の処置のために使用し得る。骨形成タンパク質を用いた、慢性腎不全の処置のための一般的な方法は、米国特許第６，８６１，４０４号において開示され、その開示は本明細書によって参考文献に組込まれる。本発明のＢＭＰ−７を、中枢神経系の虚血または外傷後の機能回復を増強するために使用し得る。骨形成タンパク質を用いた、中枢神経系の虚血または外傷後の機能回復を増強するための一般的な方法は、米国特許第６，４０７，０６０号において開示され、その開示は本明細書によって参考文献に組込まれる。本発明のＢＭＰ−７変異体を、樹状突起の成長を誘導するために使用し得る。骨形成タンパク質を用いた、樹状突起の成長を誘導するための一般的な方法は、米国特許第６，９４９，５０５号において開示され、その開示は本明細書によって参考文献に組込まれる。ＢＭＰ−７変異体を、神経細胞接着を誘導するために使用し得る。骨形成タンパク質を用いた、神経細胞接着を誘導するための一般的な方法は、米国特許第６，８００，６０３号において開示され、その開示は本明細書によって参考文献に組込まれる。ＢＭＰ−７変異体を、パーキンソン病の処置および予防のために使用し得る。骨形成タンパク質を用いた、パーキンソン病の処置および予防のための一般的な方法は、米国特許第６，５０６，７２９号において開示され、その開示は本明細書によって参考文献に組込まれる。
【００６２】
別の例として、ＢＭＰ−７変異体をまた、象牙質形成を誘導するために使用し得る。現在まで、損傷に対する歯髄組織の予測不能な反応が、歯科医学における基本的な臨床的問題である。さらに別の例として、ＢＭＰ−７変異体は、中枢神経系（ＣＮＳ）の修復に対して再生効果を誘導し得、それを、ラット脳穿刺モデルを用いて評価し得る。
【実施例】
【００６３】
実施例１：ＥＬＩＳＡによる免疫原性エピトープの同定
ＢＭＰ−７の潜在的な線状Ｔ細胞エピトープを同定するために、野生型ヒトＢＭＰ−７の成熟領域の配列全体をカバーするペプチドを合成した（Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）。それぞれ１５アミノ酸の１８個のペプチドを構築した。各ペプチドは、ＢＭＰ−７のうちの近接する領域（ｃｏｎｔｉｇｕｏｕｓ ｒｅｇｉｏｎ）をカバーするペプチドと比較して、５から１０アミノ酸の重複を有していた。上記１８個のペプチドそれぞれの配列を、図１に示し、その様々なペプチド間の重複を、図２に示す。
【００６４】
上記１８個のペプチドを、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて試験して、その抗ＢＭＰ−７抗体に対する結合を決定した。上記１８個のペプチドそれぞれを、９６穴高結合マイクロタイタープレートの個々の列に、５μｇ／ｍＬの濃度で個々にコーティングした。３枚のプレートを使用し、プレート１はペプチド１〜６、プレート２はペプチド７〜１２、およびプレート３はペプチド１３〜１８を有していた。合成的に作製した陰性コントロールペプチドを、各プレートの列７にコーティングし、陰性コントロールとした。ＢＭＰ−７を、各プレートの列８にコーティングし、陽性コントロールとした。
【００６５】
コーティングしたプレートを、室温で一晩インキュベートした。次の日、そのプレートをＢＢＳ／Ｔで６回洗浄した。次いで上記プレートを、２００μｌ／ウェルのＢＢＳ／Ｔミルクでブロッキングし、そして３７℃で２時間インキュベートした。そのプレートを再びＢＢＳ／Ｔで６回洗浄した。
【００６６】
ＢＭＰ−７に対する中和抗体に関して陽性である７人の患者の血清サンプルおよびＢＭＰ−７に対する非中和抗体に関して陽性である３人の患者の血清サンプルを、ＢＢＳ／Ｔミルク中で１：８０に希釈し、そして３枚のプレート全ての２つの隣接する行（ｃｏｌｕｍｎ）に加えた（１００μｌ／ウェルで２組試験した）。上記患者の血清サンプルを、ＯＰ−１ Ｐｕｔｔｙ（Ｓｔｒｙｋｅｒ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ、ＭＡ）で処置した患者から得た。例えば、患者１の血清を、全てのプレートの行１〜２に加え、患者２の血清を、全てのプレートの行３〜４に加える等した。抗ＢＭＰ−７抗体に関して陰性である１人の患者の血清サンプルを、陰性コントロールとして使用した。モノクローナル抗ＢＭＰ−７抗体、１Ｂ１２および１２Ｇ３の組み合わせを、陽性コントロールとして使用した。
【００６７】
患者の血清サンプルを、ペプチドをコーティングしたプレートに加え、そして３７℃で１時間インキュベートした。上記プレートを、ＢＢＳ／Ｔで６回洗浄した。１００μｌのヤギ抗ヒトＩｇＨＲＰ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を、ＢＢＳ／Ｔミルク中１：４０，０００の希釈で、各ウェルに加えた。上記プレートを、続いて３７℃で１時間インキュベートし、そして次いでＢＢＳ／Ｔミルクで６回洗浄した。１００μｌのＴＭＢ基質（ＢｉｏＦＸ）を、顕色のために各ウェルに加えた。
【００６８】
１００μｌの０．１８Ｍ Ｈ２ＳＯ４硫酸停止溶液を、各プレートに加えた。上記プレートを、次いでＭ５ ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）に置き、そして４５０ｎｍで吸光度を測定した。
【００６９】
患者血清由来の非中和抗ＢＭＰ−７抗体の、上記１８個のペプチドに対する結合の結果を、図３に示し、そして患者血清由来の中和抗ＢＭＰ−７抗体の、その１８個のペプチドに対する結合を図４に示す。図３に示すように、ペプチド１３は、上記３つの陽性患者の血清サンプル（１１１６９４、１１１９４５、および１１１６６５）由来の非中和抗ＢＭＰ−７抗体に高い結合親和性を示し、一方陰性の患者血清（１１１２６６）は、予測されたように、結合親和性を示さなかった。これは、ペプチド１３はこれらの非中和抗ＢＭＰ−７抗体に対する線状結合エピトープを含むことを示す。
【００７０】
図４に示すように、ペプチド１３は、再びいくつかの上記陽性患者サンプル由来の中和抗ＢＭＰ−７抗体に対して高い結合親和性を示し、このことは、ペプチド１３は中和抗ＢＭＰ−７抗体の線状結合エピトープを含むことを示唆する。さらに、図４のデータは、抗ＢＭＰ−７抗体の、ペプチド１３に含まれる線状エピトープへの結合を確認するだけでなく、中和抗体は、ペプチド１および９に含まれる線状エピトープにもいくらか結合親和性を有し得ることも示唆する。ペプチド５に関してもいくらかの結合が観察された。
【００７１】
実施例２．エピトープを変化させることによって、抑制された免疫原性を有するＢＭＰ−７タンパク質を工学技術で作製する（ｅｎｇｉｎｅｅｒ）
ペプチド９は、アミノ酸配列ＧＹＡＡＹＹＣＥＧＥＣＡＦＰＬ（配列番号１０）を有し、一方ペプチド１３は、アミノ酸配列ＶＨＦＩＮＰＥＴＶＰＫＰＡＣＣＡ（配列番号１４）を有する。しかし、実施例１において示すように、エピトープはペプチド９およびペプチド１３に対応するＢＭＰ−７の領域に存在する。よって、これらの配列の免疫原性を抑制または排除するために、ペプチド９およびペプチド１３の残基に対応する残基において、ＢＭＰ−７のアミノ酸を変化させる。
【００７２】
ペプチド９および１３の免疫原性に関与する特定の残基を決定するために、２つの連続するアミノ酸を、それぞれアラニン残基に改変した、いくつかのペプチドアナログを生成する。２つの連続するアラニン残基による、ペプチド９および１３の全ての並べ替え（ｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎ）が生じるように十分なペプチドを生成する。次いでそのペプチドアナログを、ペプチド９および１３の抗ＢＭＰ−７抗体に結合する能力と比較して、抗ＢＭＰ−７抗体に結合するそれらの能力に関してアッセイする。抗ＢＭＰ−７抗体への結合が減少したペプチドアナログを同定し、そして、ペプチド９の残基１、３、５、６、８、１０、または１２（成熟ヒトＢＭＰ−７（配列番号１）の残基６１、６３、６５、６６、６８、７０、および７２に対応する）の１つ以上、および／またはペプチド１３の残基２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、または１５（成熟ヒトＢＭＰ−７（配列番号１）の残基９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０２、または１０５に対応する）の１つ以上が、上記抗ＢＭＰ−７抗体への結合に関与し、そしてそれによって組換えヒトＢＭＰ−７の免疫原性を引き起こすことが決定される。よって、ＢＭＰ−７の免疫原性を引き起こすと決定されたそれらの残基を、例えば置換によって改変して、抑制された免役原性を有するＢＭＰ−７変異体を作製する。
【００７３】
本明細書中で教示されるアミノ酸置換のような、本発明による変化を、標準的な組換え遺伝子操作技術によって、ＢＭＰ−７の遺伝子配列に導入する。次いでその変異体ＢＭＰ−７を、標準的なプロトコールによって、原核生物または真核生物発現システムにおいて発現する。次いでその発現した変異体ＢＭＰ−７を、標準的なプロトコールによって精製する。
【００７４】
実施例３．ＢＭＰ−７変異体は、アルカリホスファターゼ活性を誘導する
本発明のＢＭＰ−７変異体の、ラット骨肉腫細胞系統ＲＯＳ１７／２．８におけるアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性を誘導する能力をアッセイする。本発明の変異体ＢＭＰ−７を、野生型ＢＭＰ−７を陽性コントロールとして使用して、３組で９点における用量反応性を試験する。特に、ＲＯＳ１７／２．８細胞を、９６穴組織培養プレートにまく。ＢＭＰ−７変異体を、６０００、２０００、６６６、２２２、７４、２４、８、２、および０．９ｎｇ／ｍｌの投与量で上記細胞に加え、そして４８時間の期間インキュベートする。続いて細胞を溶解し、そしてその増殖因子のＡＬＰ活性を誘導する効力を、上記サンプルの平均吸光度（ＯＤ）の非線形回帰から得られるＥＣ５０に基づいて評価する。試験した全てのＢＭＰ−７変異体が、明確なアルカリホスファターゼ活性を示し、このことは、上記変異体がその生物学的活性を維持していることを示す。
【００７５】
実施例４．ＢＭＰ−７変異体は、野生型と比較して、抑制されたまたは排除された免役原性を有する
本発明の実施態様によるＢＭＰ−７変異体を、その免疫原性を決定するために霊長類において試験する。真核生物で産生したＢＭＰ−７変異体を、コントロールとして投与した野生型ヒトＢＭＰ−７（真核生物で産生した）と共に試験する。典型的な実験において、アカゲザルに、４０μｇ／ｋｇの上記タンパク質サンプルを、１日１回、皮下に４週間注射する。規則的な間隔で、血清をその動物から得て、そしてＢＭＰ−７に対する抗体の血清濃度を、ヒトＩＬ−７コーティング９６穴プレートを用いて、ＥＬＩＳＡによって測定する。典型的には、各血清サンプルの段階希釈物を、３組で各ウェルに２時間加え、ＰＢＳ中０．０５％のＴｗｅｅｎ（Ｔｗｅｅｎ２０）で洗浄し、そしてＰＢＳ中１％のＢＳＡ／１％のヤギ血清でブロックする。各サンプルに、西洋ワサビペルオキシダーゼ−結合抗アカゲザルＩｇＧを加え（サンプル緩衝液中１：６０，０００）、３７℃で２時間インキュベートし、そして上記プレートをＰＢＳ中０．０５％のＴｗｅｅｎで８回洗浄する。次いでサンプルを、比色定量基質溶液ＯＰＤ（ｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩）を用いて、４９０ｎｍにおけるＯＤを測定し、６５０ｎｍにおけるバックグラウンドの測定値を引くことによって、アッセイする。
【００７６】
真核生物で産生した野生型ヒトＢＭＰ−７は、高い抗ＢＭＰ−７抗体力価を生じることが見出される。対照的に、真核生物で産生された変異体ヒトＢＭＰ−７の抗体力価は、有意に低い抗ＢＭＰ−７抗体の力価を生じる。
【００７７】
実施例６．変異体ＢＭＰ−７は、ヒト患者において、低い濃度で骨および軟骨の増殖を誘導するのに有効である。
【００７８】
２人のヒト患者が、それぞれ腰椎（ｌａｍｂａｒ ｓｐｉｎｅ）において後外側の癒合（ｆｕｓｉｏｎ）をもたらす処置を必要とする。１人の患者において、ウシ骨コラーゲンおよびカルボキシメチルセルロースナトリウムのマトリックス（ＯＰ−１（登録商標）Ｐｕｔｔｙ、Ｓｔｒｙｋｅｒ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ、ＭＡと類似の）中１．５ｍｇの変異体ＢＭＰ−７を、癒合が必要な部位の上記腰椎（ｔｈｅ ｓｐｉｎｅ）の各側に、外科的に移植する。そのマトリックスを、移植の前に、滅菌食塩水（０．９％）溶液で再構成する。他方の患者において、ウシ骨コラーゲンおよびカルボキシメチルセルロースナトリウムのマトリックス（ＯＰ−１（登録商標）Ｐｕｔｔｙ、Ｓｔｒｙｋｅｒ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ、ＭＡと類似の）中３．５ｍｇの野生型ＢＭＰ−７を、癒合が必要な部位の上記腰椎の各側に、外科的に移植する。
【００７９】
数ヶ月の最初の期間の後、各患者の脊椎を、例えばＸ線によって、Ｘ線撮影で検査して、上記癒合における骨増殖の存在を決定する。変異体ＢＭＰ−７を投与された上記患者において、骨の増殖が、癒合部位において検出される。しかし、癒合は完全ではない。野生型ＢＭＰ−７を投与された上記患者において、変異体ＢＭＰ−７を投与された上記患者と同じレベルの骨増殖が検出される。再び、椎骨の癒合は完全ではない。
【００８０】
数ヶ月の最初の期間と同じ、数ヶ月の２番目の期間の後、各患者の脊椎を再び、例えばＸ線によってＸ線撮影で検査する。各患者において、移植部位における椎骨の癒合は完全である。
【００８１】
よって、変異体ＢＭＰ−７を、同じ速度の骨増殖を促進しながら、対応する野生型ＢＭＰよりも低い濃度で投与し得る。これは、ＢＭＰ−７変異体に対する免疫反応の減少に起因し得、それによって、ＢＭＰ−７が免疫系の反応に対して失われないので、同じレベルの骨増殖を達成するために、野生型ＢＭＰ−７と比較して、より低い濃度の変異体ＢＭＰ−７を投与することを可能にする。
【００８２】
別の例において、２人のヒト患者がそれぞれ、腰椎の後外側癒合をもたらすための処置を必要とする。１人の患者において、ウシ骨コラーゲンおよびカルボキシメチルセルロースナトリウムのマトリックス（ＯＰ−１（登録商標）Ｐｕｔｔｙ、Ｓｔｒｙｋｅｒ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ、ＭＡと類似の）中３．５ｍｇの変異体ＢＭＰ−７を、癒合が必要な部位において、上記腰椎の各側に、外科的に移植する。そのマトリックスを、移植の前に、滅菌食塩水（０．９％）溶液で再構成する。他方の患者において、ウシ骨コラーゲンおよびカルボキシメチルセルロースナトリウムのマトリックス（ＯＰ−１（登録商標）Ｐｕｔｔｙ、Ｓｔｒｙｋｅｒ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ、ＭＡと類似の）中３．５ｍｇの野生型ＢＭＰ−７を、癒合が必要な部位において、上記腰椎の各側に、外科的に移植する。
【００８３】
数ヶ月の最初の期間の後、各患者の脊椎を、例えばＸ線によって、Ｘ線撮影で検査して、癒合における骨増殖の存在を決定する。変異体ＢＭＰ−７を投与された上記患者において、骨の増殖が、その癒合部位において検出され、そしてその椎骨の癒合は完全である。対照的に、野生型ＢＭＰ−７を投与された上記患者において、移植部位において骨の増殖が検出される。しかし、上記椎骨の癒合は不完全である。
【００８４】
数ヶ月の最初の期間と同じ、数ヶ月の２番目の期間の後、野生型ＢＭＰ−７を投与された患者の脊椎を再び、例えばＸ線によってＸ線撮影で検査する。移植部位における椎骨の癒合は完全である。
【００８５】
よって、変異体ＢＭＰ−７を、加速した速度の骨増殖を達成するために、対応する野生型ＢＭＰと同じ濃度で投与し得る。これは、ＢＭＰ−７変異体に対して開始される免疫反応の低減に起因し得、それによって、野生型よりも一層多くの変異体ＢＭＰ−７が骨増殖を促進することを可能にする。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
成熟ヒトＢＭＰ−７（配列番号１）と少なくとも９０％の配列同一性を含む、ＢＭＰ−７変異体であって、該ＢＭＰ−７変異体は、成熟ヒトＢＭＰ−７に対応する、以下：
Ｇ６１、Ａ６３、Ｙ６５、Ｙ６６、Ｅ６８、Ｅ７０、Ａ７２、Ｈ９２、Ｆ９３、Ｉ９４、Ｎ９５、Ｐ９６、Ｅ９７、Ｔ９８、Ｖ９９、Ｐ１００、Ｐ１０２、またはＡ１０５のうちの１つ以上の位置において置換を含む、ＢＭＰ−７変異体。
【請求項２】
前記置換は、以下：
Ｇ６１Ｅ、Ａ６３Ｅ／Ｑ／Ｈ、Ｙ６５Ｆ／Ｎ、Ｙ６６Ｅ、Ｅ６８Ｄ／Ｋ／Ｈ、Ｅ７０Ｇ／Ｄ、Ａ７２Ｓ／Ｆ／Ｐ、Ｈ９２Ｎ、Ｆ９３Ｎ／Ｌ／Ｓ、Ｉ９４Ｍ／Ｋ／Ｓ／Ｖ、Ｎ９５Ｖ／Ｆ、Ｐ９６Ｓ／Ｎ、Ｅ９７Ｓ／Ｔ／Ｄ／Ｋ、Ｔ９８Ｋ／Ｉ／Ｓ／Ｙ／Ｈ、Ｖ９９Ｉ、Ｐ１００Ｇ、Ｐ１０２Ａ、またはＡ１０５Ｖ、のうちの一つ以上である、請求項１に記載のＢＭＰ−７変異体。
【請求項３】
前記変異体は、ＢＭＰ−７活性を示す、請求項１に記載のＢＭＰ−７変異体。
【請求項４】
前記変異体は、成熟ヒトＢＭＰ−７と少なくとも９５％の配列同一性を含む、請求項１に記載のＢＭＰ−７変異体。
【請求項５】
請求項１に記載のＢＭＰ−７変異体をコードする核酸。
【請求項６】
請求項１に記載の核酸を含む、組換え発現ベクター。
【請求項７】
請求項６に記載の発現ベクターを含む、細胞。
【請求項８】
前記細胞は、原核生物細胞である、請求項７に記載の細胞。
【請求項９】
前記細胞は、真核生物細胞である、請求項７に記載の細胞。
【請求項１０】
請求項１に記載のＢＭＰ−７変異体および薬学的キャリアを含む、組成物。
【請求項１１】
患者における骨格障害を処置する方法であって、治療的に有効な量の請求項１に記載のＢＭＰ−７変異体を該患者に投与する工程を含む、方法。
【請求項１２】
ヒトＢＭＰ−７タンパク質の免疫原性を抑制する方法であって、
ヒトＢＭＰ−７のアミノ酸配列において免疫原性エピトープを同定する工程；および
ＢＭＰ−７のアミノ酸配列において１つ以上の置換を工学技術で作製する工程であって、ここで、該１つ以上の置換が、成熟ヒトＢＭＰ−７に対応する、Ｇ６１、Ａ６３、Ｙ６５、Ｙ６６、Ｅ６８、Ｅ７０、Ａ７２、Ｈ９２、Ｆ９３、Ｉ９４、Ｎ９５、Ｐ９６、Ｅ９７、Ｔ９８、Ｖ９９、Ｐ１００、Ｐ１０２、またはＡ１０５のうちの１つ以上の位置に起こって、改変されたアミノ酸配列を生じる工程、を含む、方法。
【請求項１３】
前記１つ以上の置換が、以下：
Ｇ６１Ｅ、Ａ６３Ｅ／Ｑ／Ｈ、Ｙ６５Ｆ／Ｎ、Ｙ６６Ｅ、Ｅ６８Ｄ／Ｋ／Ｈ、Ｅ７０Ｇ／Ｄ、Ａ７２Ｓ／Ｆ／Ｐ、Ｈ９２Ｎ、Ｆ９３Ｎ／Ｌ／Ｓ、Ｉ９４Ｍ／Ｋ／Ｓ／Ｖ、Ｎ９５Ｖ／Ｆ、Ｐ９６Ｓ／Ｎ、Ｅ９７Ｓ／Ｔ／Ｄ／Ｋ、Ｔ９８Ｋ／Ｉ／Ｓ／Ｙ／Ｈ、Ｖ９９Ｉ、Ｐ１００Ｇ、Ｐ１０２Ａ、またはＡ１０５Ｖのうちのいずれか１つ以上である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
適切な発現システムにおいて前記改変されたアミノ酸配列によってコードされるタンパク質を発現する工程、および該タンパク質を精製する工程をさらに含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記タンパク質を発現する工程が、真核生物細胞中で起こる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記タンパク質を発現する工程が、原核生物細胞中で起こる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１】
成熟ヒトＢＭＰ−７（配列番号１）と少なくとも９０％の配列同一性を含む、ＢＭＰ−７変異体であって、該ＢＭＰ−７変異体は、成熟ヒトＢＭＰ−７に対応する、以下：
Ｇ６１、Ａ６３、Ｙ６５、Ｙ６６、Ｅ６８、Ｅ７０、Ａ７２、Ｈ９２、Ｆ９３、Ｉ９４、Ｎ９５、Ｐ９６、Ｅ９７、Ｔ９８、Ｖ９９、Ｐ１００、Ｐ１０２、またはＡ１０５のうちの１つ以上の位置において置換を含む、ＢＭＰ−７変異体。
【請求項２】
前記置換は、以下：
Ｇ６１Ｅ、Ａ６３Ｅ／Ｑ／Ｈ、Ｙ６５Ｆ／Ｎ、Ｙ６６Ｅ、Ｅ６８Ｄ／Ｋ／Ｈ、Ｅ７０Ｇ／Ｄ、Ａ７２Ｓ／Ｆ／Ｐ、Ｈ９２Ｎ、Ｆ９３Ｎ／Ｌ／Ｓ、Ｉ９４Ｍ／Ｋ／Ｓ／Ｖ、Ｎ９５Ｖ／Ｆ、Ｐ９６Ｓ／Ｎ、Ｅ９７Ｓ／Ｔ／Ｄ／Ｋ、Ｔ９８Ｋ／Ｉ／Ｓ／Ｙ／Ｈ、Ｖ９９Ｉ、Ｐ１００Ｇ、Ｐ１０２Ａ、またはＡ１０５Ｖ、のうちの一つ以上である、請求項１に記載のＢＭＰ−７変異体。
【請求項３】
前記変異体は、ＢＭＰ−７活性を示す、請求項１に記載のＢＭＰ−７変異体。
【請求項４】
前記変異体は、成熟ヒトＢＭＰ−７と少なくとも９５％の配列同一性を含む、請求項１に記載のＢＭＰ−７変異体。
【請求項５】
請求項１に記載のＢＭＰ−７変異体をコードする核酸。
【請求項６】
請求項１に記載の核酸を含む、組換え発現ベクター。
【請求項７】
請求項６に記載の発現ベクターを含む、細胞。
【請求項８】
前記細胞は、原核生物細胞である、請求項７に記載の細胞。
【請求項９】
前記細胞は、真核生物細胞である、請求項７に記載の細胞。
【請求項１０】
請求項１に記載のＢＭＰ−７変異体および薬学的キャリアを含む、組成物。
【請求項１１】
患者における骨格障害を処置する方法であって、治療的に有効な量の請求項１に記載のＢＭＰ−７変異体を該患者に投与する工程を含む、方法。
【請求項１２】
ヒトＢＭＰ−７タンパク質の免疫原性を抑制する方法であって、
ヒトＢＭＰ−７のアミノ酸配列において免疫原性エピトープを同定する工程；および
ＢＭＰ−７のアミノ酸配列において１つ以上の置換を工学技術で作製する工程であって、ここで、該１つ以上の置換が、成熟ヒトＢＭＰ−７に対応する、Ｇ６１、Ａ６３、Ｙ６５、Ｙ６６、Ｅ６８、Ｅ７０、Ａ７２、Ｈ９２、Ｆ９３、Ｉ９４、Ｎ９５、Ｐ９６、Ｅ９７、Ｔ９８、Ｖ９９、Ｐ１００、Ｐ１０２、またはＡ１０５のうちの１つ以上の位置に起こって、改変されたアミノ酸配列を生じる工程、を含む、方法。
【請求項１３】
前記１つ以上の置換が、以下：
Ｇ６１Ｅ、Ａ６３Ｅ／Ｑ／Ｈ、Ｙ６５Ｆ／Ｎ、Ｙ６６Ｅ、Ｅ６８Ｄ／Ｋ／Ｈ、Ｅ７０Ｇ／Ｄ、Ａ７２Ｓ／Ｆ／Ｐ、Ｈ９２Ｎ、Ｆ９３Ｎ／Ｌ／Ｓ、Ｉ９４Ｍ／Ｋ／Ｓ／Ｖ、Ｎ９５Ｖ／Ｆ、Ｐ９６Ｓ／Ｎ、Ｅ９７Ｓ／Ｔ／Ｄ／Ｋ、Ｔ９８Ｋ／Ｉ／Ｓ／Ｙ／Ｈ、Ｖ９９Ｉ、Ｐ１００Ｇ、Ｐ１０２Ａ、またはＡ１０５Ｖのうちのいずれか１つ以上である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
適切な発現システムにおいて前記改変されたアミノ酸配列によってコードされるタンパク質を発現する工程、および該タンパク質を精製する工程をさらに含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記タンパク質を発現する工程が、真核生物細胞中で起こる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記タンパク質を発現する工程が、原核生物細胞中で起こる、請求項１２に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公表番号】特表２０１３−５１４８１１（Ｐ２０１３−５１４８１１Ａ）
【公表日】平成２５年５月２日（２０１３．５．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５４６１３１（Ｐ２０１２−５４６１３１）
【出願日】平成２２年１２月２１日（２０１０．１２．２１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０６１４３７
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０８７７６８
【国際公開日】平成２３年７月２１日（２０１１．７．２１）
【出願人】（５９５１４８８８８）ストライカー コーポレイション (52)
【氏名又は名称原語表記】ＳＴＲＹＫＥＲ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年５月２日（２０１３．５．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１２月２１日（２０１０．１２．２１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０６１４３７
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０８７７６８
【国際公開日】平成２３年７月２１日（２０１１．７．２１）
【出願人】（５９５１４８８８８）ストライカー コーポレイション (52)
【氏名又は名称原語表記】ＳＴＲＹＫＥＲ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]