内皮特異的な生体内伝達のターゲティング剤としての熱ショックタンパク質
【課題】治療薬及びシグナル伝達物質を含むがこれらに限定されない、細胞内への内在化剤として有用なＬＯＸ−１に結合するＨＳＰ又はそのフラグメントの使用。
【解決手段】本発明は、ターゲティング配位子としての熱ショックタンパク質及びそのフラグメントの使用に関する。熱ショックタンパク質は、レクチン様の酸化低密度リポタンパク質受容体（ＬＯＸ−１）を結合でき、イメージング剤で標識又は治療薬に付着できる。ペプチド配列は、シグナル伝達部分及び治療薬を内在化する手段だけでなく、疾患の診断及び監視に有用である。
【解決手段】本発明は、ターゲティング配位子としての熱ショックタンパク質及びそのフラグメントの使用に関する。熱ショックタンパク質は、レクチン様の酸化低密度リポタンパク質受容体（ＬＯＸ−１）を結合でき、イメージング剤で標識又は治療薬に付着できる。ペプチド配列は、シグナル伝達部分及び治療薬を内在化する手段だけでなく、疾患の診断及び監視に有用である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の実施形態は、シグナル伝達物質（例えば、造影剤又はイメージング剤）及び治療薬の送達及び内在化のための、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）から誘導したペプチド及びポリペプチドを用いる化合物、組成物及び方法に関する。例えば，熱ショックタンパク質７０は、酸化低密度リポタンパク質受容体（ＬＯＸ−１又はＯＬＲ−１）に結合してＬＯＸ−１受容体にＨＳＰ及び任意の結合する部分を、内皮細胞を通して伝達するようシグナル伝達する。ＨＳＰペプチドはイメージング剤又は治療薬に直接又はリンカーを介して結合し得る。また、組成物は、インビボで生体分子をマクロファージ及び他の炎症性細胞を含む、高濃度のＬＯＸ−１を有する部位に送達するのに有用である。造影剤／イメージング剤は、様々なイメージングモダリティのために選択することができ，より詳細には、前記結合する部分は、例えばアテローム性動脈硬化症等の、炎症に関連するプラークの攻撃を受けやすい部位のイメージングに有用である。組成物は、炎症及び炎症と関連する疾患、（例えばアテローム性動脈硬化症，不安定プラーク及び冠動脈疾患を含むがこれらに限定されない様々な心血管疾患、並びに関節リウマチ）を診断及び監視するのに有用である。
【背景技術】
【０００２】
ＨＳＰ（熱ショックタンパク質）は、バクテリアから哺乳類まで、全器官の細胞内に見られる高度に保存されたタンパク質のファミリーの１つである。ＨＳＰは、ストレス無負荷の細胞内でさえ細胞の代謝に要求される。ＨＳＰは、合成、構成、輸送及びタンパク質アセンブリの他の態様、例えば、新たに合成されたポリペプチドの折り畳みを支援して、他のタンパク質との早過ぎる相互作用を防止する（即ち、シャペロンとして作用する）ことを促進する。ＨＳＰの発現は、例えば温度の上昇、ｐＨの変化及び酸素欠乏等の生理的ストレスに応答して増大する。これらのストレスは、細胞のタンパク質の三次元構造の崩壊又は変成を起こす場合がある。もしこれらのストレスが野放しにされた場合、異常に折り畳まれた又は変成したタンパク質が凝集体を形成し、最終的に細胞を殺傷する場合がある。ＨＳＰは、損傷したタンパク質に結合して、適切な形状へ再び折り畳み及び／又は損傷の発生を阻止する補助をする。
【０００３】
欧州特許１０４６６５２号は、哺乳類の酸化ＬＤＬ受容体（ＬＯＸ−１）の細胞外ドメイン及びＩｇＧの一部から構成されることから、融合ポリペプチドが標識剤によって標識される融合ポリペプチドを開示している。従って、融合ポリペプチドは、酸化ＬＤＬの検出、定量、分離及び精製に使用することができる。欧州特許１０４６６５２号の融合ポリペプチドは、ＬＯＸ−１の検出又は定量に使用することができない。
【０００４】
ＴＡＴペプチド配列（ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ）及び最近報告されたＡｎｔｐ内在性配列（ＲＱＩＡＷＦＱＮＲＲＮＫＷＫＫ）は、インビトロ及びインビボの両方で、様々な基質の内在性の活性を示している。ＴＡＴペプチドは、酸化鉄ナノ粒子を非特異的に細胞内へ送達するのに使用されているが（Ｗｕｎｄｅｒｂａｌｉｎｇｅｒ，Ｐ． ｅｔ． ａｌ．， Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００２，１３，２６４−８）、診断用造影剤を内皮細胞上の疾患領域に送達する目的で、特異的受容体を標的とすることを示すものは存在しない。これらの方法の不都合は、関心細胞に造影剤を標的とするペプチドの非特異性である。造影剤の非特異的な送達は、診断する関心領域（即ち、アテローム性動脈硬化病変）を、血管系の他の機能的領域から区別する試みを阻止する。
【０００５】
心血管疾患は、米国において主要な死因となっており、年間１００万人越の死者数を占めている。アテローム性動脈硬化は、冠動脈心疾患の主な要因であり、西洋の国々にて非偶発的な死亡の主な原因となっている。アテローム性動脈硬化症には、例えば高血圧、上昇した総血清コレステロール、高い低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）コレステロール値、低い高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）コレステロール値、真性糖尿病、重症の肥満及び喫煙等の複数の危険因子が寄与することは十分裏付けられている。アテローム性動脈硬化症、並びに心筋梗塞、アンギナ、臓器不全及び卒中を含む疾患の予後及び潜在的治療法を明らかにするための、相当の取り組みが為されている。今日まで、アテローム性動脈硬化症の治療は、コレステロール値を低下させ、脂質を調整することを焦点としている。しかし、最近の研究では、冠動脈疾患に起因する死亡の４０％は、総コレステロール値が２２０ｍｇ／ｄｌ未満の男性に起こることが示されている。アテローム性動脈硬化病変がいつどのように陥りやすく、かつ致命的となるか，最良の医療行為及び病変の進行をどのように検出及び監視するかを含む、未解決の問題が多数存在している。
【０００６】
数種の侵襲的及び非侵襲的技術が、アテローム性動脈硬化症のイメージング及び該疾患の進行及び安定化の評価に使用される。これらは、冠動脈造影、血管内超音波内視鏡、血管内核磁気共鳴画像法，及び赤外線カテーテルを用いるプラークの赤外線イメージングが含まれる。これらの技術は、不安定プラークの確認に首尾よく用いられているが、一般的に侵襲性である（例えば、外科手術又はプローブ若しくはカメラの挿入を必要とする）。可溶性マーカー、例えばＰ−セレクチン、フォン・ヴィレブランド因子、アンジオテンシン変換酵素（Ｃ１４６）、Ｃ−反応性タンパク質、Ｄ−二量体（Ｉｋｅｄａ ｅｔ． ａｌ．， Ａｍ．Ｊ．Ｃａｒｄｉｏｌ．，１９９０，６５，１６９３−１６９６）及び活性化循環炎症細胞は、不安定狭心症の患者に見られるが、それらの存在を利用して関連する病変の位置を特定することができない。カテーテルに含まれる温度感知要素は、炎症過程及び細胞増殖が発熱過程であるという理論の下に、プラークの位置を特定するのに使用されており、例えば米国特許第４９８６６７１号及び同第４７５２１４１号に記載されている。血管造影図は内腔径の像を映し、狭窄の程度を優れた分解能で提供する。しかし、血管造影図は血管壁又は様々な病理組織成分をイメージングしない。
【０００７】
現在利用可能な技術は、一般的に、アテローム性動脈硬化症の形態学的及び／又は機能的パラメータのいくつかを同定して、該疾患に関連する相対的危険性を定性的に又は半定量的に評価する。しかし、これらの診断的手順は、侵襲的であるか又は例えばプラークの細胞組成物、プラーク中の各成分の分子レベルにおける生物学的特徴等の内在的な病態生理学上の情報は殆ど得られない。
【０００８】
酸化ＬＤＬ（ｏｘＬＤＬ）は、アテローム性動脈硬化症と病理生物学的に深く関わっている。動脈硬化プラーク中の脂質プールは、天然ＬＤＬではなく、ｏｘＬＤＬの摂取に起因することが疑われている。ＯｘＬＤＬは、マクロファージ上でスカベンジャー受容体により認識され、マクロファージによる大量のｏｘＬＤＬの摂取によって、動脈硬化プラークの重要な成分である泡沫細胞を生じる。ＬＯＸ−１、即ちレクチン様酸化ＬＤＬ受容体は、最近、ｏｘＬＤＬのための内皮細胞上の受容体として同定されている。内皮細胞によるｏｘＬＤＬの内在化を仲介し、例えば国際公開第０２／０６７７１号（Ｓａｗａｍｕｒａ，Ｔ． Ｎａｔｕｒｅ １９９７ ３８６：７３−７７）に記載されているマクロファージスカベンジャー受容体とは異なる。ＬＯＸ−１のアミノ酸配列を図３に示す。また、ＬＯＸ−１は、マクロファージ上において発現し、ｏｘＬＤＬ認識／内在化の役割を果たす（Ｙｏｓｈｉｄａ，Ｈ． ｅｔ． ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１９９８ ３３４：９−１３）。ＬＯＸ−１は、健康なヒトの大動脈サンプルからは殆ど検出不可能であるが、動脈硬化プラークに見られ、特に、他の手段によって検出不可能と思われる病変早期に見られる（Ｋａｔａｏｋａ，Ｈ． ｅｔ． ａｌ．， Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １９９９ ９９：３１１０−３１１７）。最近の研究は、ＬＯＸ−１によるｏｘＬＤＬの認識が、内皮細胞上の接着受容体の発現における重要な初期段階であることを示唆している。これらの受容体は、単球を早期の動脈硬化プラークに引き付ける役割を担うと考えられる。ＬＯＸ−１に対する抗体は、ｏｘＬＤＬのＬＯＸ−１に対する結合を防止することによって、アテローム性動脈硬化症の治療に有用であるものとして記載されている（国際公開第０１／６４８６２号）。
【特許文献１】欧州特許１０４６６５２号明細書
【特許文献２】米国特許第４９８６６７１号明細書
【特許文献３】米国特許第４７５２１４１号明細書
【特許文献４】国際公開第０２／０６７７１号パンフレット
【特許文献５】国際公開第０１／６４８６２号パンフレット
【非特許文献１】Ｗｕｎｄｅｒｂａｌｉｎｇｅｒ，Ｐ． ｅｔ． ａｌ．， Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００２，１３，２６４−８
【非特許文献２】Ｉｋｅｄａ ｅｔ． ａｌ．， Ａｍ．Ｊ．Ｃａｒｄｉｏｌ．，１９９０，６５，１６９３−１６９６
【非特許文献３】Ｙｏｓｈｉｄａ，Ｈ． ｅｔ． ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１９９８ ３３４：９−１３
【非特許文献４】Ｋａｔａｏｋａ，Ｈ． ｅｔ． ａｌ．， Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １９９９ ９９：３１１０−３１１７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
現在のイメージング剤及びイメージングモダリティは、主に解剖学的情報を提供する。通常、この情報は、極めて高い解像度を提供するコントラストの形態によって得られる。しかし、潜在する疾患状態は、肉体的な物理的徴候の発現前に、疾患を増殖させる生化学的プロセスに関与している。早期疾患過程において、生化学的経路又は該経路内の特定のマーカー（バイオマーカー）をイメージングする能力によって機能的情報が提供される。従って、様々な心血管疾患（例、アテローム性動脈硬化症、不安定プラーク、冠動脈疾患、腎疾患、血栓症、凝固による一過性虚血、卒中、心筋梗塞、臓器移植、臓器不全及び高コレステロール血症）を診断及び監視する非侵襲的方法が必要である。非侵襲的方法によって、プラークの潜在する病態生理学、例えばプラークの細胞組成物及びプラーク中の各成分の分子レベルにおける生物学的特徴に関する情報を得る必要がある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、治療薬及びシグナル伝達物質を含むがこれらに限定されない、細胞内への内在化剤として有用なＬＯＸ−１に結合するＨＳＰ又はそのフラグメントの使用を開示する。別の一実施形態では、ＨＳＰのＬＯＸ−１結合部分は、例えばアテローム性動脈硬化症に関連する炎症等の、身体内の炎症を確認及び位置付けする有用な手段を提供する。さらに、本発明の実施形態は、ＨＳＰ（ＬＯＸ−１ペプチド結合配列）を用いて、診断的手順を補助する方法を提供する。より詳細には、化合物及び組成物は、プラークの形成を検出する方法に使用される。本発明の実施形態は、さらに、ＬＯＸ−１ペプチド結合配列を用い、ＬＯＸ−１の過剰発現又は増大した発現に起因するヒト及び／又は他の動物の疾患治療を監視する方法を提供する。
【００１１】
さらに、本発明は、インビボでＬＯＸ−１タンパク質の発現を検出して定量することができる、ＬＯＸ−１に結合可能なイメージング剤／分子を提供する。
【００１２】
イメージングする目的に加え、化合物及び組成物を、高濃度のＬＯＸ−１を有する領域、例えばマクロファージ及び他の炎症細胞内の対象とする生体分子への送達機構としても使用してもよい。
本発明はさらに、炎症性疾患、例えばアテローム性動脈硬化症の治療効果を監視する方法も提供する。別の一実施形態では、本発明は、ＬＯＸ−１の発現に起因する疾患又は障害の罹患が疑われる哺乳類のＬＯＸ−１の発現レベルを測定する方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
第１の実施形態では、本発明は式Ｉの化合物を提供する。
【００１４】
（Ｉ）Ｙ−（Ｌ）ｎ−Ｅ
式中、ＹはＳＩＧ又はＴＡであって、ＳＩＧはインビボ又はインビトロで検出可能なシグナルを提供するシグナル伝達部分であり、ＴＡは、治療薬であり、
ＬはＹとＥとを連結するリンカー基であり、
ＥはＬＯＸ−１に結合する熱ショックタンパク質又はそのフラグメント若しくは変異体を含む結合部分であり、
ｎは０又は１である。
【００１５】
定義
結合部分（Ｅ）
「結合部分」（Ｅ）は、ＬＯＸ１に結合することができる、哺乳類、好ましくはヒトの熱ショックタンパク質又はそのフラグメント若しくは変異体である。ＬＯＸ−１に結合する周知の部分とは異なり、本発明の結合部分は、ヒト体液の存在下で（インビボ又はインビトロで）、ＬＯＸ−１が過剰発現している組織（例、動脈硬化組織）が、健康な組織から区別されるように、十分な特異性をもってＬＯＸ−１に結合するよう設計されている。本願明細書で使用される用語「ＬＯＸ−１に結合する熱ショックタンパク質又はそのフラグメント若しくは変異体」は、本願明細書全体を通して、ペプチド、ペプチド配列、ＨＳＰペプチド、ＬＯＸ−１結合ペプチド又は結合ペプチドと称される。これらの各用語は、フラグメント、融合ペプチド、誘導体、変異体及びホモログを含むことを意図する。さらに、例えばＨＳＰ−７０又は配列番号１〜５等の特定の参照は、実際には例示であり、そのフラグメント、融合ペプチド、誘導体、変異体及びホモログもその特定の参照に含まれる。
【００１６】
引用した各実施形態に関して、熱ショックタンパク質（リガンド）は、完全配列、そのフラグメント又はその完全配列、フラグメント及び変異体のいずれかのホモログであってよい。タンパク質とペプチド間の相違は寸法である。用語「ペプチド」は、通常、約１０，０００Ｄａの分子量を有する、１００個未満のアミノ酸を含むものを示すのに使用される。好ましいＨＳＰペプチドは、３０個未満のアミノ酸を含むか又は３５００Ｄａ未満の分子量を有する。抗体又はタンパク質と比較すると、これらの小さいペプチドは利点をいくつか有する。例えば、これらは、就職又はナノ粒子への結合における厳しい化学的条件を許容することができる。さらに、全体としての粒子の合成が単純化され、制御が容易となる。また、小さいペプチドは免疫原性となりにくく、さらには、基本的な生物学的過程において、分子の他のクラスと比較して広義に必要とされ、また多くの場合、小さいペプチドの受容体に対する親和性は、抗体又はそのフラグメントの親和性と比較してかなり高い。好ましくは、熱ショックタンパク質は、熱ショックタンパク質７０、そのフラグメント又はその完全配列、フラグメント及び変異体のいずれかのホモログである。ＨＳＰペプチド結合配列は、ＨＳＰ−７０フラグメントであるのがより好ましい。熱ショックタンパク質７０のフラグメントは、３０−ｍｅｒｓ又はそれより短いのがより好ましい。以下に説明するように、３０個又はそれより少ないアミノ酸を含むこれらのフラグメントは、より良好な特異性、輸送及び／又はクリアランス特性を有し、ＨＳＰ−７０の親水性部分を含むことが好ましい。３０−ｍｅｒｓは、熱ショックタンパク質７０のアミノ酸数３８３〜６４０から選択されることがより好ましい。
【００１７】
一実施形態では、ＨＳＰ−７０はその全体を使用することができるが、ＨＳＰ−７０の所定の部分は、細胞表面受容体に結合する傾向がより高い。未変換状態において、ＨＳＰ−７０は、安定な三次構造を有する。しかし短鎖オリゴマーは、安定な三次構造の状態に達しない又は代替的にＨＳＰの結合部分を表さない可能性がある。従って、本発明の一実施形態では、ＨＳＰの親水性部分は、ＬＯＸ−１との複合体に使用されるフラグメントを生成するのに利用される。親水性領域は、以下の２つの異なる利点を有する。
【００１８】
（１）本来親水性であるため、これら比較的短鎖のオリゴマーは、より安定性が高いと考えられる。
【００１９】
（２）親水性ドメインは、細胞結合の役目を担う可能性が最も高い。結合部分は、例えば、
・ＤＡＡＫＮＱＶＡＬＮＰＱＮＴＶＦＤＡＫＲＬＩＧＲＫＦＧＤＰＶＶＱＳＤＭＫＨＷＰＦ（配列番号１）
?ＱＶＩＮＤＧＤＫＰＫＶＱＶＳＹＫＧＥＴＫＡＦＹ（配列番号２）
?ＰＥＥＩＳＳＭＶＬＴＫＭＫＥＩＡＥＡＹＬＧＹＰＶＴ（配列番号３）
?ＤＳＱＲＱＡＴＫＤＡＧＶＩＡＧＬＮＶＬＲＩＩＮＥＰＴＡＡＡＩＡＹＧＬＤＲ（配列番号４）
?ＭＧＤＫＳＥＮＶＱＤＬＬＬＬＤＶＡＰＬＳＬＧＬＥＴＡＧＧＶＭ（配列番号５）
?ＫＤＮＮＬＬＧＲＦＥＬＳＧＩＰＰＡＰＧＶＰＱＩＥＶＴＦＤＩＤ（配列番号６）
を含んでもよい。
【００２０】
別の一実施形態では、配列番号１〜６のホモログ又はより大きいフラグメントであるセグメントを使用することが好ましい。
【００２１】
当業者であれば、ＨＳＰ−７０は例示であり、ＨＳＰ間において大変保護される性質により他のＨＳＰも使用できることが認識されよう。詳細には、ＨＳＰ−７０の結合領域に対して高い相同性を有する他のＨＳＰからの配列を使用することが好ましい。さらに、本発明者等は、相同構造において、Ｃ−末端の半分内よりＮ−末端の半分内に多くの親水性ドメインが存在することが示唆されるため、Ｃ−末端の相同セグメントよりもＮ−末端の相同セグメントが好ましいことを見出した。
【００２２】
二次構造解析を使用すれば、Ｎ−末端の相同セグメントは主にα−螺旋からなり、Ｃ−末端の相同セグメントは、主にβ−シートからなることが示される。他の好ましいフラグメントは、３−Ｄモデリング及び例えば静電気及び疎水性等の表面特性により同定されてもよい。
【００２３】
例えば、実験的に同定される構造を有する相同タンパク質は、共有財産、詳細にはタンパク質構造データバンク（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｄａｔａｂａｎｋ）から同定され、その配列は、ＬＯＸ−１に最も高い相同性を示した。ＰＤＢ構造データベースのｐｈｉ−ｐｓｉ ＢＬＡＳＴサーチ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）を使用して、相同性のあるテンプレートを同定した。その後に、タンパク質データバンクから結晶構造を得た。
【００２４】
また、以下の構造情報は、有用な配列及び内部のアミノ酸置換の同定を支援するのに役立つ。以下の情報は、１ＨＪＯ（ヒト）由来のＨＳＰフラグメントに基づくものであり、ｗｗｗ．ｐｄｂ．ｏｒｇ．にさらに記載されている。
【００２５】
１．β−シートＡ
アミノ酸７−ＩＬＥ〜アミノ酸２８−ＩＬＥ
アミノ酸１４１−ＡＳＮ〜アミノ酸１４６−ＶＡＬ
アミノ酸１６８−ＡＳＮ〜アミノ酸１７４−ＡＳＮ
２．β−シートＢ
アミノ酸４２−ＶＡＬ〜アミノ酸５１−ＩＬＥ
３．ヘリックス１
アミノ酸５３−ＡＳＰ〜アミノ酸６１−ＬＥＵ
４．ヘリックス２
アミノ酸６３−ＰＲＯ〜アミノ酸６５−ＡＳＮ
５．ヘリックス３
アミノ酸７０−ＡＬＡ〜アミノ酸７３−ＬＥＵ
６．ヘリックス４
アミノ酸８１−ＰＲＯ〜アミノ酸８９−ＨＩＳ
７．β−シートＣ
アミノ酸９３−ＧＬＮ〜アミノ酸１１５−ＴＹＲ
８．ヘリックス５
アミノ酸１１６−ＰＲＯ〜アミノ酸１３５−ＬＥＵ
９．ヘリックス６
アミノ酸１５２−ＡＳＰ〜アミノ酸１６４−ＩＬＥ
１０．ヘリックス７
アミノ酸１７５−ＧＬＵ〜アミノ酸１８２−ＡＬＡ
１１．ヘリックス８
アミノ酸２３０−ＧＬＹ〜アミノ酸２４８−ＬＹＳ
１２．β−シートＤ
アミノ酸１９２−ＧＬＵ〜アミノ酸３３７−ＶＡＬ
１３．ヘリックス９
アミノ酸２５７−ＬＹＳ〜アミノ酸２７５−ＳＥＲ
１４．β−シートＥ
アミノ酸２７９−ＧＬＮ〜アミノ酸２９８−ＴＨＲ
１５．ヘリックス１０
アミノ酸２９９−ＡＲＧ〜アミノ酸３２３−ＡＳＰ
１６．ヘリックス１１
アミノ酸３２８−ＬＹＳ〜アミノ酸３３０−ＧＬＮ
１７．ヘリックス１２
アミノ酸３３９−ＧＬＹ〜アミノ酸３４２−ＡＲＧ
１８．ヘリックス１３
アミノ酸３４４−ＰＲＯ〜アミノ酸３５３−ＰＨＥ
１９．ヘリックス１４
アミノ酸３６８−ＡＬＡ〜アミノ酸３８０−ＬＥＵ。
【００２６】
これらのパラメータ及び本願明細書に記載する方法を使用して、数種のＨＳＰフラグメントを合成した。他の変異体は、（１以上の）新規なグリコシル化及び／又はリン酸化部位を生成又は（１以上の）従来のグリコシル化及び／又はリン酸化部位を削除するように設計されたものを含む。変異体は、グリコシル化部位、タンパク質分解切断部位及び／又はシステイン残基において、少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。変異体は、リンカーペプチド上の対象とするアミノ酸配列の前又は後にアミノ酸残基をさらに有するペプチドも含む。例えば、システイン残基は、対象とするアミノ酸配列のアミノ及びカルボキシ末端の両方に付加され、ジスルフィド結合の形成による対象とするアミノ酸配列の環化を可能にする。また、用語「変異体」は、対象アミノ酸の３′又は５′末端のいずれかに隣接する少なくとも１つの及び２５以上のアミノ酸をさらに含む対象とするアミノ酸配列を有するポリペプチドも包含する。
【００２７】
本発明のＨＳＰタンパク質及びペプチドは、天然又は合成由来のものであってよい。天然タンパク質及びペプチドは、哺乳類由来のＨＳＰから単離されてもよい。本願明細書にて使用される「単離された」は、元の環境（例、物質が生成される天然環境）から移された物質を意味し、つまり、その天然環境から「人の手によって改変」される。さらに、単離される物質は、単離されたＨＳＰペプチド結合配列又は特定のＨＳＰ７０フラグメント結合配列を包含する。
【００２８】
用語「フラグメント」は、対象とするアミノ酸配列の連続するサブ配列からなるタンパク質又はポリペプチドを指し、天然に存在するフラグメント、例えばスプライス変異体及び天然に存在する生体内プロテアーゼ活性から得られるフラグメントを含む。そのようなフラグメントは、アミノ末端、カルボキシ末端及び／又は内部で（例えば、天然のスプライシングにより）切断されてもよい。そのようなフラグメントは、アミノ末端メチオニンを含む或いは含まずに生成されてもよい。本発明の適切なＨＳＰフラグメントは、３〜１００個のアミノ酸、好ましくは４〜５０個のアミノ酸、最も好ましくは５〜３０個のアミノ酸を含んでなる。
【００２９】
用語「変異体」は、対象とするアミノ酸配列と比較して、１以上のアミノ酸置換、欠損及び／又は挿入が見られるタンパク質又はポリペプチドを指し、天然に存在する対立遺伝子多型又は別のスプライス変異体を含む。用語「変異体」は、（１以上の）相似若しくは相同のアミノ酸又は（１以上の）異なるアミノ酸によるペプチド配列内の１以上のアミノ酸の置換を含む。アミノ酸の相似性又は相同性を順番付けする多数の尺度が存在する（Ｇｕｎｎａｒｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ，Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｐ．１２３−３９（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ１９８７）。好ましい変異体は、１以上のアミノ酸位置におけるアラニン置換を含む。他の好ましい置換は、タンパク質の全体の正味荷電、極性又は疎水性に殆ど又は全く影響を与えない保存的置換を含む。保存的置換を、下の表１に示す。
【００３０】
【表１】
表２に、アミノ酸置換の他のスキームを示す。
【００３１】
【表２】
他の変異体は、例えば（ａ）置換領域における、例えばシート若しくは螺旋状構造等のポリペプチドバックボーンの構造、（ｂ）ターゲティング部位における分子の電荷若しくは疎水性又は（ｃ）側鎖の嵩を維持する効果において、より有意に異なる残基を選択する等、より保存性の低いアミノ酸置換からなる。機能上、より有意な効果があると一般的に考えられる置換は、（ａ）グリシン及び／又はプロリンが他のアミノ酸で置換又は削除若しくは挿入（ｂ）親水性残基、例えばセリル又はスレオニルが、疎水性残基、例えばロイシルイソロイシル、フェニルアラニル、バリル、若しくはアラニルに（で）置換、（ｃ）システイン残基が、任意の他の残基に（で）置換、（ｄ）電気的陽性の側鎖を有する残基、例えばリシル、アルギニル、若しくはヒスチジルが、陰性の電荷を有する残基、例えばグルタミル若しくはアスパルチルに（で）置換又は（ｅ）嵩高い側鎖を有する残基、例えばフェニルアラニンが、そのような側鎖を持たない、例えばグリシンに（で）置換されるものである。
【００３２】
ポリペプチド及びその変異体
用語「ポリペプチド」は、ＨＳＰヌクレオチドによってコードされるタンパク質、ペプチド及びそのフラグメント（機能性又は非機能性）を包含する。用語「誘導体」は、例えばプロセシング及び他の転写後修飾等の天然プロセスだけでなく、例えば１以上のポリエチレングリコール分子、糖、ホスフェート及び／又はそのような他の分子の付加等の化学的修飾技術により化学的に修飾された化学修飾タンパク質又はポリペプチドを指す。その（１以上の）分子は、そのように誘導体化された野生型アミノ酸に天然では結合されない。誘導体は塩を含む。そのような化学的修飾は、基礎的な教科書に詳細に説明され、またモノグラフ及び膨大な研究文献により詳細に説明されており、当業者に周知である。所定のタンパク質又はポリペプチドの数個の部位に、同一の種類の修飾が同一又は様々な程度で存在してもよいことが理解されよう。
【００３３】
さらに、所定のタンパク質又はポリペプチドは、多くの種類の修飾を含んでもよい。修飾は、ペプチドバックボーン、アミノ酸側鎖及びアミノ又はカルボキシル末端を含む、タンパク質又はポリペプチドの任意の位置において行なわれてもよい。修飾は、例えば、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチド又はヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質又は脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、架橋結合、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合架橋の形成、システインの形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、γ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解過程、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、グリコシル化、脂質結合、硫酸化、グルタミン酸残基のγ−カルボキシル化、ヒドロキシル化及びＡＤＰ−リボシル化、セレノイル化、硫酸化、転移−ＲＮＡ仲介によるアミノ酸のタンパク質への付加、例えばアルギニル化及びユビキチン化を含む。ＰＲＯＴＥＩＮＳ−ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ ＡＮＤ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＰＲＯＰＥＲＴＩＥＳ、２ｎｄ Ｅｄ．，Ｔ．Ｅ． Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ， Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９３）及びＷｏｌｄ，Ｆ．，Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ，ｐｇｓ．１−１２ ｉｎ Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｖａｌｅｎｔ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ， Ｈ．Ｃ．Ｊｏｈｎｓｏｎ， Ｅｄ．， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８３）、Ｓｅｉｆｔｅｒ ｅｔ． ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８２：６２６−６４６（１９９０）及びＲａｔｔａｎ ｅｔ． ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ：Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄ Ａｇｉｎｇ， Ａｎｎ． Ｎ． Ｙ．Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．６６３：４８−６２（１９９２）。用語「誘導体」は、分岐鎖又は分岐鎖を伴う若しくは伴わない環状タンパク質又はポリペプチドにする化学的修飾も含む。環状、分岐鎖及び分岐鎖を伴う環状タンパク質又はポリペプチドは、翻訳後の天然プロセスの結果であり、完全な合成方法によっても形成されてもよい。
【００３４】
用語「ホモログ」は、そのアミノ酸配列において、２つのポリペプチドのアミノ酸位置の類似性を比較するのに通常使用される標準的な方法で測定され、対象とするアミノ酸配列の少なくとも６０％の同一性を有するタンパク質を指す。２つのタンパク質間の類似性又は同一性の程度を、ＣＯＭＰＵＴＡＴＩＯＮＡＬ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ， Ｌｅｓｋ、Ａ．Ｍ．，ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，１９８８，Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ： Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９３，Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ，ＰａｒｔＩ，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，及びＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，ｅｄｓ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ，１９９４，Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８７，Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．及びＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．，Ｍ Ｓｔｏｃｋｔｏｎ ｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９１、並びにＣａｒｉｌｌｏＨ．及びＬｉｐｍａｎ，Ｄ．，ＳＩＡＭ，Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ．，４８：１０７３（１９８８）に記載されているものを含むが周知の方法に限定されない方法により容易に計算することができる。同一性を測定する好ましい方法は、試験される配列間の最大の一致を算出するよう設計される。同一性及び類似性を測定する方法は、一般に入手可能なコンピュータプログラムに体系化されている。
【００３５】
２つの配列間の同一性及び類似性を測定するのに有用な好ましいコンピュータプログラム法は、ＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ． ｅｔ． ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１２（１）：３８７（１９８４））、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ及びＦＡＳＴＡ、Ａｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ． ｅｔ． ａｌ．， Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３−４１０（１９９０）を含むが、これらに限定されない。ＢＬＡＳＴＸプログラムは、ＮＣＢＩ及び他のソース（ＢＬＡＳＴ Ｍａｎｕａｌ、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ． ｅｔ． ａｌ．，ＮＣＢＩ ＮＬＭ ＮＩＨ Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．２０８９４、Ａｌｔｓｃｈｕｌ、Ｓ． ｅｔ． ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３−４１０（１９９０）より一般に入手可能である。例として、ＧＡＰ（Ｇｅｎｅｔｉｃ ＣｏｍｐｕｔｅｒＧｒｏｕｐ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）等のコンピュータアルゴリズムを使用して、配列の同一性を表す百分率を測定しようとする２つのタンパク質又はポリペプチドを、各々のアミノ酸が最適に一致するようにアラインする（アルゴリズムにより測定される「一致の長さ」）。
【００３６】
ギャップオープニングペナルティ（平均ダイアゴナルの３倍として計算、「平均ダイアゴナル」とは、使用する比較マトリクスのダイアゴナルの平均であり、「ダイアゴナル」とは、特定の比較マトリクスにより、アミノ酸の完全一致の各々に割り当てられるスコア又は数である）及びギャップエクステンションペナルティ（通常、ギャップオープニングペナルティの１／１０倍）、並びに、例えば、ＰＡＭ２５０又はＢＬＯＳＵＭ６２等の比較マトリクスを、アルゴリズムと併せて使用する。標準的な比較マトリクス（ＰＡＭ２５０比較マトリクスに関しては、Ｄａｙｈｏｆｆ ｅｔ． ａｌ．， Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、ｖｏｌ．５、ｓｕｐｐ．３［１９７８］を参照、ＢＬＯＳＵＭ６２比較マトリクスに関しては、Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ｅｔ． ａｌ．， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ、８９：１０９１５−１０９１９［１９９２］を参照）も、アルゴリズムにより使用されてもよい。次に、同一性の百分率をアルゴリズムにより計算する。一般的に、ホモログは、比較対象のアミノ酸と比較して、場合により１以上のアミノ酸置換、欠損及び／又は挿入を有する。
【００３７】
用語「ペプチド模倣体」又は「模倣体」は、ペプチド又はタンパク質の生物学的活性を模倣するが、化学的性質においてペプチド性を持たない、即ち、ペプチド結合（即ち、アミノ酸間のアミド結合）を全く含まない、生物学的に活性な化合物を指す。用語「ペプチド模倣体」は、例えば、擬ペプチド、セミペプチド及びペプトイド等の、実際に完全なペプチド性を持たない分子を含む広義な意味で使用される。この広義な意味でのペプチド模倣体の例（ペプチドの一部が、ペプチド結合を欠いた構造で置換）について、以下に説明する。完全又は一部が非ペプチドであるかに関わらず、本発明によるペプチド模倣体は、ペプチド模倣体がベースとなる対象とするペプチドの活性基の三次元配置と大変類似の反応性のある化学部分の空間配置を提供する。この類似した活性部位の構造によって、ペプチド模倣体は、生体系に対して対象とするペプチドの生物学的活性と同様の効果がある。
【００３８】
本発明のペプチド模倣体は、三次元形状及び生物学的活性の両面において、本願明細書に記載する対象とするペプチドと実質的に類似していることが好ましい。ペプチドを構造的に修飾してペプチド模倣体を形成する当分野において周知の方法の例は、特にＮ−末端において、活性に悪い影響を与えることなくタンパク質分解による劣化に対して安定性を高めるＤ−アミノ酸残基構造を導くバックボーンのキラル中心の反転を含む。１つの例は、論文「Ｔｒｉｔｒｉａｔｅｄ Ｄ−ａｌａ１−Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｔ Ｂｉｎｄｉｎｇ」、Ｓｍｉｔｈ Ｃ．Ｓ． ｅｔ． ａｌ．， Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｒｅｓ．，１５，ｐｐ．３７１−３７９（１９８８）に記載されている。第２の方法は、例えばＮからＣへの鎖間結合イミド及びラクタムのように、環構造を安定化のために改変することである（Ｅｄｅ ｅｔ． ａｌ．， Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｒｉｖｉｅｒ（Ｅｄｓ．）「Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｅｓｃｏｍ、Ｌｅｉｄｅｎ（１９９１）、ｐｐ．２６８−２７０）。この１つの例は、例えば米国特許第４４５７４８９号（１９８５）に開示されているような、構造的に制限されたチモペンチン状化合物である。第３の方法は、対象とするペプチドのペプチド結合を、タンパク質分解に対する抵抗性を付与する擬ペプチド結合で置換することである。
【００３９】
ペプチドの構造及び生物学的活性に影響を与えない、多数の擬ペプチド結合が記載されている。このアプローチの１つでは、ｒｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｓｏ型擬ペプチド結合で置換する（Ｒｉｖｉｅｒ、Ｊ．Ｅ．ａｎｄ Ｍａｒｓｈａｌｌ、Ｇ．Ｒ．（ｅｄｓ）「Ｐｅｐｔｉｄｅｓ、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｅｓｃｏｍ、Ｌｅｉｄｅｎ（１９９０）、ｐｐ．７２２−７７３の「Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ ａｃｔｉｖｅ ｒｅｔｒｏ ｉｎｖｅｒｓｏ ａｎａｌｏｇｕｅｓ ｏｆ ｔｈｙｍｏｐｅｎｔｉｎ」、ＳｉｓｔｏＡ ｅｔ． ａｌ．及びＤａｌｐｏｚｚｏ ｅｔ． ａｌ．（１９９３）、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．，４１：５６１−５６６、参照により本願明細書に組み入れられる）。この変更によれば、ペプチドのアミノ酸配列は、１以上のペプチド結合がｒｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｓｏ型擬ペプチド結合で置換されている以外は、対象とするアミノ酸配列の配列と同一であってよい。Ｎ−末端側のペプチド結合を置換することが最も好ましく、それは、そのような置換が、Ｎ−末端上に作用するエキソペプチダーゼによるタンパク質分解に対する抵抗性を付与するためである。さらに、アミノ酸の化学基を、同様の構造の他の化学基と置換することにより修飾してもよい。生物学的活性を全く又は殆ど損なうことなく、酵素切断に対する安定性を高める他の周知の適切な擬ペプチド結合は、還元型イソスター擬ペプチド結合である（Ｃｏｕｄｅｒ ｅｔ． ａｌ．，（１９９３）、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．，４１：１８１−１８４、その全体が参照により本願明細書に組み入れられる）。
【００４０】
従って、これらのペプチドのアミノ酸配列は、１以上のペプチド結合がイソスター擬ペプチド結合で置換されていることを除いて、対象とするアミノ酸配列の配列と同一であってよい。最もＮ−末端側のペプチド結合を置換するのが好ましく、それは、そのような置換が、Ｎ−末端上に作用するエキソペプチダーゼによるタンパク質分解に対する抵抗性を付与するためである。１以上の還元型イソスター擬ペプチド結合を有するペプチドの合成は、当分野において周知である［Ｃｏｕｄｅｒ ｅｔ． ａｌ．（１９９３）、上記に引用］。他の例は、ケトメチレン又はメチルスルフィド結合を導入して、ペプチド結合を置換することを含む。
【００４１】
ペプトイド誘導体は、生物学的活性のための重要な構造的決定因子を保持するペプチド模倣体の別のクラスであるが、ペプチド結合を削除することにより、タンパク質分解に対する抵抗性が付与される（Ｓｉｍｏｎ ｅｔ． ａｌ．，１９９２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：９３６７−９３７１、その全体が参照により本願明細書に組み入れられる）。ペプトイドは、Ｎ−置換グリシンのオリゴマーである。各々天然アミノ酸の側鎖に対応する、多数のＮ−アルキル基が記載されている（Ｓｉｍｏｎ ｅｔ． ａｌ．（１９９２）、上記に引用）。対象とする分子の数個又は全部のアミノ酸が、置換アミノ酸に対応するＮ−置換グリシンで置換されてもよい。
【００４２】
用語「ペプチド模倣体」又は「模倣体」は、反転−Ｄペプチド及びエナンチオマーも含む。用語「反転−Ｄペプチド」は、対象とするペプチドのＬ−アミノ酸配列と比較して、逆順に配列されたＤ−アミノ酸からなる、生物学的に活性なタンパク質又はペプチドを指す。用語「エナンチオマー」は、１以上の対象とするペプチドのアミノ酸配列内のＬ−アミノ酸残基が、対応する（１以上の）Ｄ−アミノ酸残基で置換されている、生物学的に活性なタンパク質又はペプチドを指す。
【００４３】
ＬＯＸ−１の様々な種が単離され、配列決定されており、比較的有意な種間の相違性が明らかになっている［Ｃｈｅｎ、Ｍ ｅｔ． ａｌ．， Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，３５５：２８９−９５（２００１）］。米国特許第５９６２２６０号及び米国特許第６１９７９３７号は、ヒト及びウシＬＯＸ−１のアミノ酸配列を開示している。任意の種からＬＯＸ−１を単離するための、これら文献に開示された技術を使用して、ＨＳＰペプチド（Ｅ）のＬＯＸ−１に対する結合を容易に確立することができる。
【００４４】
このように、結合部分（Ｅ）は、周知のＬＯＸ−１ポリペプチドのアミノ酸配列が与えられる場合、周知の技術（一般的に、単離又は合成）により得ることができる。周知の及び／又は考えられる抗原決定基又はエピトープ結合部位が与えられる場合、ＬＯＸ−１の特定の部分のみに結合する部分（Ｅ）も合成することができる。
【００４５】
異なるＥ基の結合親和性のスクリーニング及び評価に、多数の方法を使用することができる。１つの方法は、例えばインビトロでの蛍光ベースの実験を含む。細胞ベースのアッセイにおいて、同時に、検出に必要なシグナルの生成する要素の量、つまり結合部分（Ｅ）のコンジュゲートに必要なシグナルの生成する要素の量に関する情報を得ることができる。このような実験において、蛍光色素は、好ましくは例えばアミノ酸配列ＫＫＧＧ（Ｋ＝リシン、Ｇ＝グリシン）等の可撓性リンカーを介してＨＳＰペプチドのＮ−末端に結合される。Ｎ−末端が色素を付着する更なる官能基末端を持たないシグナル伝達部分に結合される場合、色素は配列内（例、リンカー内）に組み込まれたＫ残基の側鎖アミンを介して結合することもできる。
【００４６】
使用するスクリーニングアッセイの種類に関わらず、（例、一般的なインビトロモデル）、基質表面上のＬＯＸ−１の量が、まず、その基質が細胞又は別の基質かに関わらず周知であると仮定する。マルチウェル透明プレート内で、ＬＯＸ−１はウェル全体にて均一に（純粋なＬＯＸ−１タンパク質として又は細胞上に発現して）存在する。次いで、標識ＨＳＰペプチドを加え、異なるウェル内で最適な時間インキュベートすることができる。次いで、例えばリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）等の緩衝剤でウェルを徹底的に洗浄し、続いてレーザーを照射して、取り付けた色素を励起させ蛍光発光を開始して、プレートをイメージングする。各ウェルからの蛍光の強度、つまり、様々なペプチド結合の程度を定量化することができる。絶対結合数を得るためには、結合アッセイの同様の条件下で、周知の量の色素コンジュゲートＨＳＰペプチドの蛍光強度を得ることにより、シグナルをさらに調整することが好ましい。ＬＯＸ−１分子の数が周知であり、また結合するペプチドの量が求められている場合、結合親和性を評価する解離定数を計算することができる。このように、様々なＨＳＰペプチドの結合親和性を定量的にスクリーニングすることができる。細胞当たりの結合ペプチドの数も、ペプチドにコンジュゲートしたシグナルを生成する要素からの検出可能なシグナルの得るのに必要なパラメータに関する情報を提供することができる。
【００４７】
アッセイにおいて、画像は、レーザー共焦点顕微鏡又は撮像装置を使用して得てもよい。例えば、細胞に結合するペプチドの画像は、以下のようにレーザー共焦点顕微鏡を使用して得ることができる。ＨＣＡＥ細胞を高品質ホウケイ酸塩８−チャンバガラススライド（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｆｏｒｔ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、ＰＡ）上で増殖させることができる。次いで、標識ペプチドの１ｍｇ／ｍｌ水溶液約１０μＬを細胞に加えて、１時間インキュベートする。その後、好ましくは細胞をＨＢＳＳ緩衝液で３回洗浄する。次いで、細胞を４％ホルムアルデヒド溶液で１０分間固定化することができる。緩衝液による最後の洗浄後、スライドをイメージングする。画像は、Ａｒイオンレーザー（４８８ｎｍ線を選択）及び５１０ｎｍロングパスフィルターを使用して、ＯＬＹＭＰＵＳレーザー走査共焦点顕微鏡、Ｆｌｕｏｖｉｅｗ ３００モデルにより得ることが好ましい。画像は、２つのチャネル、反射光及び蛍光モードチャネル又は両方のチャネルのオーバーレイを用いて獲得することができる。さらに、例えば、共焦点顕微鏡法を介して内在化のレベルを調べることが可能である。共焦点顕微鏡法は、三次元全域を走査する能力を備えることによって、細胞内部及び細胞表面全体を検査することができる。従って、蛍光剤が内在化したか否かを詳細に調べることができる。
【００４８】
より高いスループットのスクリーニングのために、上述した方法を拡張することができる。９６ウェルプレートを８ウェルスライドと交換し、共焦点顕微鏡をＢｉｏｒａｄ撮像装置、ＦＸ Ｐｒｏｐｌｕｓモデルと交換してもよい。例えば、細胞に結合するフルオレセイン標識ＨＳＰの画像は、撮像装置を使用して得ることができ、それによりＨＣＡＥ細胞を、一般に市販されている９６ウェルプレート（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）上のウェル内に置き、増殖させることができる。次いで、１ｍｇ／ｍｌ標識ＨＳＰ水溶液約１０μＬを細胞に加え、１時間インキュベートすることができる。その後、好ましくは細胞をＰＢＳ緩衝液で３回洗浄する。緩衝液による最後の洗浄後、蛍光プローブとして「フルオレセイン」を選択して、Ｂｉｏｒａｄ撮像装置を使用してスライドをイメージングすることができる。
【００４９】
シグナル伝達部分（ＳＩＧ）
「シグナル伝達部分」ＳＩＧは、インビボ又はインビトロで検出することができるシグナルを提供する。ＳＩＧは、それ自体で又は他の物質と反応することによりイメージング可能であり、検出機器を用いてインビボ又はインビトロで検出可能な構成要素を示す。適切なシグナル部分（ＳＩＧ）は、蛍光色素、放射性核種、近赤外色素、磁気的に活性な同位体、超常磁性粒子、５０を越えるＺ値を有する金属イオン、例えばミセル、リポソーム、ポリソーム及びガス封入マイクロバブル等の封入種、並びにこれらの組合せを含む。結合部分（Ｅ）のＬＯＸ−１に対する結合を損なうことなく、結合部分（Ｅ）に結合して検出可能なシグナルを生成することができる限り、任意のシグナル部分／ソースを使用することができる。
【００５０】
インビボでのイメージングに適切なＳＩＧ部分は、
・単一光子放射型コンピュータ断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）によるイメージングのためのγ放射体である放射性核種、
・陽電子放射断層撮影（ＰＥＴ）のための陽電子放射体である放射性核種、
・光学的イメージングのための蛍光又は化学発光を発することできる色素、
・Ｘ線イメージング、コンピュータ断層撮影法（ＣＴ）のための、ハイ−Ｚ元素、好ましくはヨウ素又はビスマスを含む分子、
・超音波検査法のための、ガス封入マイクロバブル、フッ化炭素充填ミセル、
・核磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）のための、例えばキレートＧｄ＋＋＋等の常磁性イオン又は例えば超常磁性酸化鉄ナノ粒子（ＳＰＩＯ）等の超常磁性粒子又は
・好ましくは酸化鉄及び元素鉄の少なくともどちらかを含むナノ粒子である超常磁性粒子、を含む。
【００５１】
ＳＩＧ基は、インビボでのイメージングに適していることが好ましい。そのようなＳＩＧ基は、哺乳類身体の外部から、即ちインビボでの使用のために設計された検出器、例えば血管内照射又は例えば内視鏡等の光学検出器又は術中使用のために設計された放射線検出器を使用して検出してもよい。好ましいインビボＳＩＧ基は、インビボで、投与後に非侵襲的方法で外部から検出可能なものである。インビボでのイメージングに適切な最も好ましいＳＩＧ基は、特にＳＰＥＣＴ又はＰＥＴを用いるイメージングに適切な、放射性、特に放射性金属イオン、γ線を放射する放射性ハロゲン及び陽電子を放出する放射性非金属である。
【００５２】
インビボでのイメージングに適したＳＩＧは、最も好ましくは、
（ｉ）放射性金属イオン、
（ｉｉ）常磁性金属イオン、
（ｉｉｉ）γ線を放射する放射性ハロゲン、
（ｉｖ）陽電子を放出する放射性非金属、
（ｖ）過分極ＮＭＲ活性核、
（ｖｉ）インビボでの光学的イメージングに適したレポーター、
（ｖｉｉ）血管内検出に適したβ−放射体、から選択される。
【００５３】
ＳＩＧが放射性金属イオン、即ち放射性金属の場合、適切な放射性金属は、例えば６４Ｃｕ、４８Ｖ、５２Ｆｅ、５５Ｃｏ、９４ｍＴｃ又は６８Ｇａ等の陽電子放射体、例えば９９ｍＴｃ、１１１Ｉｎ、１１３ｍＩｎ又は６７Ｇａ等のγ−放射体のいずれであってよい。好ましい放射性金属は、９９ｍＴｃ、６４Ｃｕ、６８Ｇａ及び１１１Ｉｎである。最も好ましい放射性金属は、γ−放射体、特に９９ｍＴｃである。
【００５４】
ＳＩＧが常磁性金属イオンの場合、適切なそのような金属イオンは、Ｇｄ（ＩＩＩ）、Ｍｎ（ＩＩ）、Ｃｕ（ＩＩ）、Ｃｒ（ＩＩＩ）、Ｆｅ（ＩＩＩ）、Ｃｏ（ＩＩ）、Ｅｒ（ＩＩ）、Ｎｉ（ＩＩ）、Ｅｕ（ＩＩＩ）又はＤｙ（ＩＩＩ）を含む。好ましい常磁性金属イオンは、Ｇｄ（ＩＩＩ）、Ｍｎ（ＩＩ）及びＦｅ（ＩＩＩ）であり、Ｇｄ（ＩＩＩ）が特に好ましい。
【００５５】
ＳＩＧがγ線を放射する放射性ハロゲンの場合、放射性ハロゲンは、適切には１２３Ｉ、１３１Ｉ及び７７Ｂｒから選択される。好ましいγ線放出放射性ハロゲンは、１２３Ｉである。
【００５６】
ＳＩＧが陽電子を放出する放射性非金属の場合、そのような適切な陽電子放射体は、１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏ、１７Ｆ、１８Ｆ、７５Ｂｒ、７６Ｂｒ又は１２４Ｉを含む。好ましい陽電子放出放射性非金属は、１１Ｃ、１３Ｎ、１８Ｆ及び１２４Ｉであり、特に１１Ｃ及び１８Ｆが好ましく、特に１８Ｆが最も好ましい。
【００５７】
ＳＩＧが過分極ＮＭＲ−活性核の場合、そのようなＮＭＲ−活性原子核は、核スピンがゼロであり、１３Ｃ、１５Ｎ、１９Ｆ、２９Ｓｉ及び３１Ｐを含む。これらのうちでは、１３Ｃが好ましい。用語「過分極」は、ＮＭＲ−活性原子核の平衡分極を越えた、分極の程度の増大を意味する。（１２Ｃに対する）１３Ｃの天然存在度は約１％であり、適切な１３Ｃ標識化合物は、過分極化される前に、少なくとも５％、好ましくは少なくとも５０％、最も好ましくは少なくとも９０％に適切に濃縮される。式（Ｉ）の化合物の少なくとも１つの炭素原子は、適切には１３Ｃで濃縮され、続いて該１３Ｃは過分極化される。
【００５８】
ＳＩＧがインビボでの光学的イメージングに適するレポーターの場合、該レポーターは、光学的イメージング法において直接的に又は間接的に検出することが可能な任意の部分である。レポーターは、光散乱体（例、着色又は非着色粒子）、光吸収体又は光放射体である可能性がある。レポーターは、発色団又は蛍光化合物等の色素であることがより好ましい。色素は、紫外線光から近赤外光までの波長を伴う電磁スペクトル内の光と相互作用する任意の色素であってよい。レポーターは、蛍光特性を有することが最も好ましい。
【００５９】
好ましい有機発色団及び蛍光団レポーターは、広範囲に非局在化した電子系を有する基、例えばシアニン、メロシアニン、インドシアニン、フタロシアニン、ナフタロシアニン、トリフェニルメチン、ポルフィリン、ピリリウム色素、チオピリリウム（ｔｈｉａｐｙｒｉｌｉｕｐ）色素、スクアリリウム色素、クロコニウム色素、アズレニウム色素、インドアニリン、ベンゾフェノキサジニウム色素、ベンゾチアフェノチアジニウム色素、アントラキノン、ナフトキノン、インダスレン、フタロイルアクリドン、トリスフェノキノン、アゾ色素、分子内及び分子間電荷移動色素及び色素錯体、トロポン、テトラジン、ビス（ジチオレン）錯体、ビス（ベンゼン−ジチオレート）錯体、ヨードアニリン色素、ビス（Ｓ、Ｏ−ジチオレン）錯体を含む。蛍光タンパク質、例えば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）及び様々な吸収／放射特性を有するＧＦＰの修飾も有用である。所定の希土類金属（例、ユーロピウム、サマリウム、テルビウム又はジスプロシウム）の錯体も、蛍光ナノ結晶（量子ドット）のように、所定の文脈において使用される。
【００６０】
使用することができる発色団の特定の例は、フルオレセイン、スルホローダミン１０１（Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ）、ローダミンＢ、ローダミン６Ｇ、ローダミン１９、インドシアニングリーンＣｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、Ｍａｒｉｎａ Ｂｌｕｅ、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ ８８、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ ５１４、テトラメチルローダミン、並びにＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ３５０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４３０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５３２、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５６８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６３３、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６６０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６８０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７００及びＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７５０を含む。
【００６１】
特に好ましくは、可視又は近赤外領域内、４００ｎｍ〜３μｍ、特に６００〜１３００ｎｍに吸収極大を有する色素である。
【００６２】
光学的イメージングモダリティ及び測定技術は、発光イメージング、内視鏡検査、蛍光内視鏡検査、光干渉断層法、透過率イメージング、時間分解透過率イメージング、共焦点イメージング、非線形顕微鏡法、光音響イメージング、音響光学イメージング、分光法、反射分光法、干渉分光法、コヒーレンス干渉法、拡散光トモグラフィー及び蛍光を介した拡散光トモグラフィー（連続波、時間領域及び周波数領域系）、並びに光散乱、吸収、偏光、発光、蛍光寿命、量子収量及び消光の測定を含むが、これらに限定されない。
【００６３】
イメージング部分が、血管内検出に適したβ−放射体である場合、適切なそのようなβ−放射体は、放射性金属６７Ｃｕ、８９Ｓｒ、９０Ｙ、１５３Ｓｍ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ又は１９２Ｉｒ、並びに非金属３２Ｐ、３３Ｐ、３８Ｓ、３８Ｃｌ、３９Ｃｌ、８２Ｂｒ及び８３Ｂｒを含む。
【００６４】
特に好ましいシグナル部分は、フルオレセイン、１１Ｃ、１８Ｆ、５２Ｆｅ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、８６Ｙ、８９Ｚｒ、９４ｍＴｃ、９４Ｔｃ、９９ｍＴｃ、１１１Ｉｎ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１５４−１５８Ｇｄ及び１７５Ｌｕ、超常磁性酸化鉄ナノ粒子、重金属イオン、ガス封入マイクロバブル、光学色素、ポルフィリン、テキサフィリン、高度にヨウ化された有機化合物、そのキレート、前述した成分の１種以上を含むポリマー、前述した成分の１種以上を含むエンドエドラル（ｅｎｄｏｅｄｒａｌ）フラーレン及びそれらの混合物を含む。さらに好ましくは、シグナル部分が、ＰＥＴに関しては１８Ｆ、ＭＲＩに関しては超常磁性酸化鉄ナノ粒子（ＳＰＩＯ）又はキレートＧｄ、Ｘ線ＣＴに関してはヨウ素及びＳＰＥＣＴに関しては９９ｍＴｃである。インビボでのイメージングに特に好ましい実施形態では、ＳＩＧは、１８Ｆ、１１Ｃ、６８Ｇａ及び６４Ｃｕ（ＰＥＴに関しては）から選択された陽電子放出放射性同位体又は１２３Ｉ及び９９ｍＴｃ（ＳＰＥＣＴに関しては）から選択されたγ線放出放射性同位体である。最も好ましくは、シグナル部分は、ＰＥＴに関しては１８Ｆである。
【００６５】
ＳＩＧは、当分野において周知の方法により導入されてもよい。放射性ＳＩＧ基は、適切な前駆体の放射標識により都合よく導入することができる。「前駆体」は、結合部分Ｅの非放射性誘導体を適切に含み、該非放射性誘導体は、所望の非金属放射性同位体の都合よい化学形態との化学反応を、最小のステップ数（理想的には１ステップ）で、かつ所望の放射性生成物を得る有意な精製を必要とすることなく（理想的には更なる精製工程なしで）行なうことができるように設計されている。そのような前駆体は合成品であり、高い化学的純度で好適に得られる。「前駆体」は、ＨＳＰペプチドの所定の官能基のための保護基（ＰＧＰ）を任意に含んでもよい。適切な前駆体は、Ｂｏｌｔｏｎ、Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｏｍｐ．Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ．，４５，４８５−５２８（２００２）に記載されている。
【００６６】
用語「保護基」（ＰＧＰ）は、望ましくない化学反応を阻害又は抑制するが、分子の他の部分を変更しない十分に穏やかな条件下で、対象とする官能基から切断するのに十分な反応性を有するよう設計される基を意味する。脱保護の後、所望の生成物が得られる。保護基は、当業者に周知であり、適切には、アミン基に関しては、Ｂｏｃ（即ち、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル）、Ｆｍｏｃ（即ち、フルオレニルメチルカルボニル）、トリフルオロアセチル、アリルオキシカルボニル、Ｄｄｅ［即ち、１−（４，４−ジメチル２，６−ジオキソシクロヘキシリデン）エチル］又はＮｐｙｓ（即ち、３−ニトロ−２−ピリジンスルフェニル）、カルボキシル基に関しては、メチルエステル、ｔｅｒｔ−ブチルエステル又はベンジルエステルから選択される。ヒドロキシル基に関して、適切な保護基は、メチル、エチル若しくはｔｅｒｔ−ブチル、アルコキシメチル若しくはアルコキシエチル、ベンジル、アセチル、ベンゾイル、トリチル（Ｔｒｔ）又はトリアルキルシリル、例えばテトラブチルジメチルシリルである。チオール基に関して、適切な保護基は、トリチル及び４−メチルベンジルである。更なる保護基の使用は、「Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」、Ｔｈｅｏｒｏｄｏｒａ Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ及びＰｅｔｅｒ Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ、（Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、１９９９）に記載されている。
【００６７】
非金属放射性同位体を用いた放射標識のための好ましい前駆体は、求電子又は求核のいずれかのハロゲン化を受けるか又はアルキル若しくはフルオロアルキルハライド、トシラート、トリフレート（即ち、トリフルオロメタンスルホネート）若しくはメシラートから選択されたアルキル化剤による容易なアルキル化を受けるか、アルキレートチオール部分をアルキル化してチオエーテル結合を形成するか又は標識アルデヒド若しくはケトンとの縮合を受ける誘導体を含む。第１のカテゴリーの例は、
（ａ）例えばトリアルキルスタンナン（例、トリメチルスタンニル若しくはトリブチルスタンニル）又はトリアルキルシラン（例、トリメチルシリル）等の有機金属誘導体、
（ｂ）ハロゲン交換のための非放射性ヨウ化アルキル又は臭化アルキル及び求核ハロゲン化のためのトシル酸アルキル、メシル酸アルキル又はアルキルトリフレート、
（ｃ）求電子ハロゲン化が行なわれるように活性化した芳香環（例、フェノール）及び求核ハロゲン化が行なわれるように活性化した芳香環（例、アリールヨウドニウム、アリールジアゾニウム、アリールトリアルキルアンモニウム塩又はニトロアリール誘導体）である。
【００６８】
容易なアルキル化を受ける好ましい誘導体は、アルコール類、フェノール類又はアミン類であり、特にフェノール類及び立体障害第一級又は第２級アミン類が好ましい。チオール含有放射性同位体反応物をアルキル化する好ましい誘導体は、Ｎ−ハロアセアチル類、特にＮ−クロロアセチル及びＮ−ブロモアセチル誘導体である。
【００６９】
前駆体は、固体支持体マトリクスに共有結合する状態で任意に供給されてもよい。その場合、所望のイメージング剤生成物を溶液中で形成しながら、出発物質及び不純物を固相に結合させたまま残留する。１８Ｆ−フッ化物を用いた固相の求電子フッ素化する前駆体は、国際公開第０３／００２４８９号パンフレットに記載されている。１８Ｆ−フッ化物を用いた固相の求核フッ素化する前駆体は、国際公開第０３／００２１５７号パンフレットに記載されている。
【００７０】
ＳＩＧが例えばヨウ素等の放射性ハロゲンの場合、前駆体は、非放射性ハロゲン原子、例えばヨウ化若しくは臭化アリール（放射性ヨウ素交換を可能にする）、活性化前駆体アリール環（例、フェノール基）、有機金属化合物（例、トリアルキル錫又はトリアルキルシリル）又は有機前駆体、例えばトリアゼン又は求核置換のための良好な脱離基、例えばヨードニウム塩を適切に含む。放射性ハロゲン（１２３Ｉ及び１８Ｆを含む）を導入する方法は、Ｂｏｌｔｏｎ［Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｏｍｐ．Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ．、４５、４８５−５２８（２００２）］に記載されている。放射性ハロゲン、特にヨウ素を結合し得る適切な前駆体アリール基の例を、以下に示す。
【００７１】
【化１】
双方とも芳香環上にて放射性ヨウ素置換を可能にする置換基を含有する。これに代わる放射性ヨウ素を含有する置換基は、放射性ハロゲン交換、例えば以下の直接ヨウ素化で合成し得る。
【００７２】
【化２】
ＳＩＧがヨウ素の放射性同位体である場合、放射性ヨウ素原子は、飽和脂肪族系に結合するヨウ素元素は、インビボで代謝を受けやすく、従って放射性ヨウ素は損失されることが周知であるため、好ましくは、例えばベンゼン環等の芳香環又はビニル基に対する直接共有結合を介して付着する。
【００７３】
ＳＩＧがフッ素の放射性同位体である場合、放射性フッ素原子は、フッ化アルキルが生体内代謝に対して抵抗性を有することから、フルオロアルキル又はフルオロアルコキシ基の一部を形成することができる。また、放射性フッ素原子は、芳香環、例えばベンゼン環に対して直接共有結合により付着することができる。１８Ｆ−フッ化物と、良好な脱離基、例えば臭化アルキル、メシル酸アルキル又はトシル酸アルキルを有する適切な前駆体との反応を用いた標識を直接介して放射性フッ素化することができる。１８Ｆはまた、例えば１８Ｆ（ＣＨ２）３ＯＭｓ（Ｍｓは、メシラートである）等のアルキル化剤を用いて、アミン前駆体をＮ−アルキル化してＮ−（ＣＨ２）３１８Ｆを得るか又は１８Ｆ（ＣＨ２）３ＯＭｓ若しくは１８Ｆ（ＣＨ２）３Ｂｒを用いてヒドロキシル基をＯ−アルキル化して導入することもできる。また、１８Ｆは、１８Ｆ（ＣＨ２）３ＯＨ反応物を用いたＮ−ハロアセアチル基のアルキル化により導入され、ＮＨ（ＣＯ）ＣＨ２Ｏ（ＣＨ２）３１８Ｆ誘導体を得ることができる。アリール系について、アリールジアゾニウム塩、アリールニトロ化合物又はアリール第４級アンモニウム塩からの１８Ｆ−フッ化物の求核置換が、アリール１８Ｆ誘導体への適切な経路である。
【００７４】
第一級アミン基を含む前駆体を、Ｋａｈｎ ｅｔ． ａｌ．［Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｏｍｐ．Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ．４５、１０４５−１０５３（２００２）］及びＢｏｒｃｈ ｅｔ． ａｌ．［Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．９３、２８９７（１９７１）］に教示されているように、１８Ｆ−Ｃ６Ｈ４−ＣＨＯを用いた還元的アミノ化により１８Ｆで標識することができる。この方法は、アリール第一級アミン、例えばフェニル−ＮＨ２又はフェニル−ＣＨ２ＮＨ２基を含む化合物にも有効に適用することができる。
【００７５】
１８Ｆで標識する好ましい方法は、Ｐｏｅｔｈｋｏ ｅｔ． ａｌ．［Ｊ．Ｎｕｃ．Ｍｅｄ．，４５，８９２−９０２（２００４）］に教示されているように、前駆体としてペプチドのアミノオキシ誘導体を使用することである。次いで、その前駆体を酸性条件下（例、ｐＨ２〜４）で１８Ｆ−Ｃ６Ｈ４−ＣＨＯと縮合させて、オキシムエーテル結合を介して所望の１８Ｆ−標識イメージング剤を与える。オキシムエーテルは、加水分解に対する抵抗性が遙かに大きい点で、イミンよりも有利である。
【００７６】
アミン含有前駆体を、例えば以下の１８Ｆ−標識活性エステルとの反応によって１８Ｆで標識して、アミド結合で結合する生成物を与えてもよい。
【００７７】
【化３】
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル及びそのペプチド標識における使用は、Ｖａｉｄｙａｎａｔｈａｎ ｅｔ． ａｌ．［Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．，１９（３），２７５−２８１（１９９２）］及びＪｏｈｎｓｔｒｏ金属［Ｃｌｉｎ．Ｓｃｉ．，１０３（Ｓｕｐｐｌ．４８）、４５−８５（２００２）］に教示されている。１８Ｆ−標識誘導体へ至る合成経路の更なる詳細は、Ｂｏｌｔｏｎ、Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｏｍｐ．Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ．，４５，４８５−５２８（２００２）に記載されている。
【００７８】
ＳＩＧが金属イオンを含んでいる場合、金属イオンは金属錯体として存在する。用語「金属錯体」は、１以上の配位子を有する、金属イオンの配位錯体を意味する。金属錯体は、「トランスキレーション（ｔｒａｎｓｈｅｌａｔｉｏｎ）に対して抵抗性を有する」、即ち金属配位部位に関して競合する可能性がある他の配位子との容易な配位子交換を受けないことが極めて好ましい。競合する可能性がある配位子は、ＨＳＰペプチドそれ自体及び生体外の製剤中の他の賦形剤（例、製剤中に使用される放射性防御物質若しくは抗菌保存剤）又は生体内の内因性化合物（例、グルタチオン、トランスフェリン若しくは血漿タンパク質）を含む。
【００７９】
金属錯体は、コンジュゲートである前駆体から誘導され（即ち、コンジュゲートした金属を配位する配位子）、配位子はＥ及びリンカー基Ｌ（存在する場合）のいずれかに共有結合する。
【００８０】
トランスキレーションに対して抵抗性を有する金属錯体を形成する、本発明に使用される適切な配位子は、２〜６、好ましくは２〜４個の金属供与体原子が、（金属供与体原子に結合する炭素元素及び複素原子のいずれかの非配座バックボーンを有することにより）５員又は６員のキレート環を形成するように配置されるキレート剤又は例えばイソニトリル、ホスフィン又はジアゼニド等の、金属イオンに対して強力に結合する供与体原子を含む単座配位子を含む。キレート剤の一部として金属に良好に結合する供与体原子の例は、アミン、チオール、アミド、オキシム及びホスフィンである。ホスフィンは強力な金属錯体を形成することによって、単座又は二座のホスフィンでさえも適切な金属錯体を形成する。イソニトリル及びジアゼニドの線状構造は、キレート剤への容易な組み込みに有用ではないため、単座配位子として使用される。適切なイソニトリルの例は、例えばｔｅｒｔ−ブチルイソニトリル等の単純アルキルイソニトリル及び例えばｍｉｂｉ（即ち、１−イソシアノ−２−メチル−２−メチルプロパン）等のエーテル置換イソニトリルを含む。適切なホスフィンの例は、テトロフォスミン及び例えばトリス（３−メチルプロピル）ホスフィン等の単座ホスフィンを含む。適切なジアゼニドの例は、配位子のＨＹＮＩＣシリーズ、即ち、ヒドラジン置換ピリジン又はニコチンアミドを含む。
【００８１】
トランスキレーションに対して抵抗性を有する金属錯体を形成するテクネチウムに対する適切なキレート剤の例は、以下の（ｉ）〜（ｖ）を含むが、これに限定されない。
【００８２】
（ｉ）式のジアミンジオキシム
【００８３】
【化４】
式中、Ｅ１〜Ｅ６は各々独立にＲ′基であり、
各Ｒ′は、Ｈ若しくはＣ１−１０アルキル、Ｃ３−１０アルキルアリール、Ｃ２−１０アルコキシアルキル、Ｃ１−１０ヒドロキシアルキル、Ｃ１−１０フルオロアルキル、Ｃ２−１０カルボキシアルキル若しくはＣ１−１０アミノアルキルであるか又は２つ若しく３個以上のＲ′基は、それらが結合する元素と共炭素環、複素環、飽和若しくは不飽和環を形成し、かつ１以上のＲ′基は、式（Ｉ）の−（Ｌ）ｎＥに結合し、
Ｑは、式−（Ｊ）ｆ−の架橋基であり、
ｆは、３、４又は５であり、各Ｊは、独立に−Ｏ−、−ＮＲ′−又は−Ｃ（Ｒ′）２−であり、但し、Ｊ基は、−Ｏ−、−ＮＲ′−の少なくとも１つを含有し、
好ましいＱ基は、
Ｑ＝−（ＣＨ２）（ＣＨＲ′）（ＣＨ２）−即ち、プロピレンアミンオキシム又はＰｎＡＯ誘導体、
Ｑ＝−（ＣＨ２）２（ＣＨＲ′）（ＣＨ２）２−即ち、ペンチレンアミンオキシム又はＰｅｎｔＡＯ誘導体、
Ｑ＝−（ＣＨ２）２ＮＲ′（ＣＨ２）２−であり、
Ｅ１〜Ｅ６は、好ましくはＣ１−３アルキル、アルキルアリールアルコキシアルキル、ヒドロキシアルキル、フルオロアルキル、カルボキシアルキル及びアミノアルキルから選択される。最も好ましくは、Ｅ１〜Ｅ６基の各々は、ＣＨ３であり、
コンジュゲーションは、好ましくはＥ１若しくはＥ６Ｒ′基のいずれか又はＱ部分のＲ′基に存在する。最も好ましくは、ＨＳＰペプチドはＱ部分のＲ′基に結合する。ＨＳＰペプチドがＱ部分のＲ′基に結合する場合、Ｒ′基は橋頭位置に存在するのが好ましい。その場合、Ｑは、好ましくは−（ＣＨ２）（ＣＨＲ′）（ＣＨ２）−、−（ＣＨ２）２（ＣＨＲ′）（ＣＨ２）２−又は−（ＣＨ２）２ＮＲ′（ＣＨ２）２−であり、最も好ましくは−（ＣＨ２）２（ＣＨＲ′）（ＣＨ２）２−であり、特に好ましい二官能性ジアミンジオキシムキレート剤は、次の式のものであり、従ってＨＳＰペプチドは、橋頭−ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２基を介して結合するジアミンジオキシムである。
【００８４】
【化５】
（ｉｉ）例えばＭＡＧ３（メルカプトアセチルトリグリシン）等のチオールトリアミド供与体の組又は例えばＰｉｃａ等のジアミドピリジンチオール供与体の組を有するＮ３Ｓ配位子及び関連する配位子
（ｉｉｉ）例えばＢＡＴ又はＥＣＤ（即ち、エチルシステイナート二量体）等のジアミンジチオール供与体の組を有する又は例えばＭＡＭＡ等のアミドアミンジチオール供与体の組を有するＮ２Ｓ２配位子
（ｉｖ）例えばサイクラム、モノオキソサイクラム又はジオキソサイクラム等のテトラミン、アミドトリアミン又はジアミドジアミン供与体の組を有する鎖状又は大環状配位子であるＮ４配位子
（ｖ）ジアミンジフェノール供与体を有するＮ２Ｏ２配位子 。
【００８５】
上述した配位子は、テクネチウム例えば９４ｍＴｃ又は９９ｍＴｃを錯化するのに特に適しており、Ｊｕｒｉｓｓｏｎ ｅｔ． ａｌ．［Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．，９９，２２０５−２２１８（１９９９）］により完全に記載されている。配位子は、他の金属、例えば銅（６４Ｃｕ又は６７Ｃｕ）、バナジウム（例、４８Ｖ）、鉄（例、５２Ｆｅ）又はコバルト（例、５５Ｃｏ）にも有用である。他の適切な配位子は、Ｓａｎｄｏｚによる国際公開第９１／０１１４４号パンフレットに記載されており、インジウム、イットリウム及びガドリニウムに特に適した配位子、特に大環状アミノカルボキシラート及びアミノホスホン酸配位子を含む。ガドリニウムの非イオン性（即ち、中性）金属錯体を形成する配位子は周知であり、米国特許第４８８５３６３号に記載されている。放射性金属イオンがテクネチウムの場合、配位子は、四座であるキレート剤が好ましい。テクネチウムのための好ましいキレート剤は、ジアミンジオキシム又は上述したＮ２Ｓ２若しくはＮ３Ｓ供与体の組を有する。
【００８６】
連結剤
Ｌは、Ｙ、即ちシグナル部分ＳＩＧ又は治療薬ＴＡを結合部分（Ｅ）に接続することができる任意の部分を含む。説明した各実施形態では、Ｌは、独立に選択されてもよい。例えば、リンカーは、２以上の原子価の有機基、１種以上の金属陽イオンと結合する金属キレート剤又はその組合せであってよい。多くの場合、ＳＩＧをＥに又はＴＡをＥに付着するため、Ｌを含むことが好ましい。即ち、式（Ｉ）のｎは１である。
【００８７】
上記したように、ＳＩＧが金属の場合、Ｌは、金属を配位する配位子又はキレート剤を任意に含んでもよい。
【００８８】
２以上の原子価の有機部分は、Ｌとして有用であり、例えばベンゾエート又はプロピオネート等の小さい有機部分を含む（図４）。有機基は、共有結合的に又はイオン結合的に、Ｅ及びＹの双方に結合してもよい。連結剤として使用するに適した有機部分は、一般的に約１〜約１０，０００個の炭素元素を有し、アルキレン、アリーレン、シクロアルキレン、アミノアルキレン、アミノアリーレン、アミノシクロアルキレン、チオアルキレン、チオアリーレン、チオシクロアルキレン、オキシアルキレン、オキシアリーレン、オキシシクロアルキレン、アシルアルキレン、アシルアリーレン、アシルシクロアルキレン単位及びその組合せからなる群から選択される有機基を含んでもよい。特に好ましいアシルアリーレン単位は、以下の構造の４−アシルフェニレン基である。
【００８９】
【化６】
他の適切な連結剤は、金属キレート剤、例えばＤＴＰＡ、１，４，７−トリアザ−シクロノナン−Ｎ，Ｎ′，Ｎ″−三酢酸（ＮＯＴＡ）、ｐ−ブロモアセトアミド−ベンジル−テトラエチルアミンテトラ酢酸（ＴＥＴＡ）、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカンテトラ酢酸（ＤＯＴＡ）、ＥＤＴＡ及びＣＨＸａの１以上を含む。金属キレート剤は、５２Ｆｅ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、８６Ｙ、８９Ｚｒ、９４ｍＴｃ、９４Ｔｃ、９９ｍＴｃ、１１１Ｉｎ、１５４−１５８Ｇｄ及び１７５Ｌｕの陽イオンから選択される少なくとも一種の金属に結合できることが好ましい。
【００９０】
当業者には明らかであろうが、様々な連結剤が所定のシグナル部分と共に使用される。例えば、金属シグナル生成部分、例えば６４Ｃｕは、一般的に結合配位子を必要とするが、１８Ｆは結合配位子を必要としない。さらに、標識した人工官能基、例えば１８Ｆ−フルオロプロピオネート又は１８Ｆ−フルオロベンゾエート（図４）を一旦調製したら、活性エステルのコンジュゲーションによりペプチドにコンジュゲートすることができるように使用することもできる。
【００９１】
Ｌは、好ましくは式−（Ａ）ｚ−を有し、式中、各Ａは、独立に、
−ＣＲ２−、−ＣＲ＝ＣＲ−、−Ｃ≡Ｃ−、−ＣＲ２ＣＯ２−、−ＣＯ２ＣＲ２−、−ＮＲＣＯ−、−ＣＯＮＲ−、−ＮＲ（Ｃ＝Ｏ）ＮＲ−、−ＮＲ（Ｃ＝Ｓ）ＮＲ−、−ＳＯ２ＮＲ−、−ＮＲＳＯ２−、−ＣＲ２ＯＣＲ２−、−ＣＲ２ＳＣＲ２−、−ＣＲ２ＮＲＣＲ２−、Ｃ４−８シクロヘテロアルキレン基、Ｃ４−８シクロアルキレン基、Ｃ５−１２アリーレン基又はＣ３−１２ヘテロアリーレン基、アミノ酸、糖又は単分散のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）構成単位であり、
Ｒは、Ｈ、Ｃ１−４アルキル、Ｃ２−４アルケニル、Ｃ２−４アルキニル、Ｃ１−４アルコキシアルキル及びＣ１−４ヒドロキシアルキルから独立に選択され、
ｚは、値０〜１０の整数である。
【００９２】
式Ｉのリンカー基（Ｌ）の役割は、シグナル伝達部分をＨＳＰペプチドの活性部位から遠ざけると考えられる。このことは、阻害剤のＬＯＸ−１に対する結合が損なわれないように、ＳＩＧの嵩が比較的高い場合（例、金属錯体）特に重要である。これは、嵩高い基がそれ自身を活性部位から離れた状態である可撓性（例、単純アルキル鎖）及び／又はシクロアルキル又はアリールスペーサが、金属錯体を活性部位から遠ざけるように配向させる剛性の組合せにより達成することができる。
【００９３】
リンカー基の性質は、イメージング剤の体内分布を変更する際にも使用し得る。従って、例えばエーテル基をリンカーに導入すると、血漿タンパク質の結合を最小にする補助となるであろう。Ｌがポリエチレングリコール（ＰＥＧ）構成単位又はペプチド鎖（適切には１〜１０個のアミノ酸残基）を含む場合、リンカー基は、イメージング剤のインビボで薬物動態及び血中クリアランス速度を変更するように機能できる。そのような「生物学的変更因子」であるリンカー基は、筋肉又は肝臓等の背景組織からの及び／又は血液からのクリアランスを加速し、背景干渉がより少ないことにより、より良好な診断画像を与え得る。生物学的変更因子であるリンカー基は、特定の排泄経路、例えば肝臓に対して腎臓による排泄を選択するように使用し得る。
【００９４】
Ｌが１〜１０個のアミノ酸残基からなるペプチド鎖を含む場合、アミノ酸残基は、好ましくはグリシン、リシン、アスパラギン酸、グルタミン酸又はセリンから選択される。Ｌ−がＰＥＧ部分を含む場合、好ましくは式ＩＩＡ又はＩＩＢの単分散ＰＥＧ−様構造のオリゴマー化から誘導される単位を含む。
【００９５】
【化７】
式中、ｐは１〜１０の整数であり、Ｃ−末端単位（＊）は、シグナル伝達部分に接続されている。また、式ＩＩＢのプロピオン酸誘導体を基礎としたＰＥＧ−様構造を使用することもできる。
【００９６】
【化８】
式ＩＩＢ中、ｐは式ＩＩＡに定義した通りであり、ｑは３〜１５の整数であり、
ｐは、好ましくは１又は２であり、ｑは好ましくは５〜１２である。
【００９７】
リンカー基がＰＥＧ又はペプチド鎖を含まない場合、好ましい−（Ａ）ｎ−基は、２〜１０個の原子、最も好ましくは２〜５個の原子、特に好ましくは２個又は３個の原子からなる−（Ａ）ｎ−部分を形成する、結合する原子のバックボーン鎖を有する。２個の原子からなる最小のリンカー基のバックボーン鎖は、相互作用が最小となるようにイメージング部分をＨＳＰペプチドから十分に分離させる利点を与える。
【００９８】
非ペプチドリンカー基、例えばアルキレン基又はアリーレン基は、コンジュゲートしたＨＳＰペプチドとの水素結合による有意な相互作用が存在せず、従ってリンカーが巻き込まれない利点を有する。好ましいアルキレンスペーサ基は、−（ＣＨ２）ｄ−（ｄは２〜５）である。好ましいアリーレンスペーサは、式
【００９９】
【化９】
のアリーレンスペーサである。
式中、ａ及びｂは、独立に０、１又は２である。
【０１００】
リンカー基−（Ａ）ｎ−は、好ましくはジグリコール酸部分、マレイミド部分、グルタル酸、コハク酸、例えばＫＫＧＧ等のリシン−グリシン誘導体、ポリエチレングリコールベースの単位又は式ＩＩＡ又はＩＩＢのＰＥＧ様単位を含む。
【０１０１】
例えばシグナル伝達物質を有する場合に、シグナル伝達物質又は治療薬の結合には、例えば１８Ｆ又は１１Ｃリンカーが必要でない場合がある。同様に、放射性同位体は、共有結合を介してＥに直接付着することができる。その場合、ＨＳＰペプチドは、単に放射性同位体で標識される。用語「〜で標識される」とは、官能基がＳＩＧを含むか又はＳＩＧが更なる種として付着することを意味する。官能基がＳＩＧを含む場合、これは「シグナル伝達部分」が化学的構造の一部を形成し、放射性同位体が該同位体の天然存在度を有意に越えるレベルで存在することを意味する。そのような同位体の上昇又は濃縮レベルは、適切には少なくとも５倍、好ましくは少なくとも１０倍、最も好ましくは少なくとも２０倍であり、理想的には対象とする同位体の天然存在度の少なくとも５０倍又は対象とする同位体の濃縮レベルが９０〜１００％のレベルで存在する。そのような官能基の例は、ＳＩＧが化学的構造において同位体で標識される１１Ｃ又は１８Ｆ原子となるように、１１Ｃレベルが上昇したＣＨ３基及び１８Ｆレベルが上昇したフッ化アルキル基を含む。放射性同位体３Ｈ及び１４Ｃは、インビボでの適切なイメージング部分ではない。
【０１０２】
ＬＯＸ−１を認識する部分（Ｅ）の標識に有用なペプチド配位子リンカー（Ｌ）の合成方法及びＬＯＸ−１に結合する連結剤を直接標識する方法を、本願明細書の以下に記載する。
【０１０３】
ペプチド合成
ＨＳＰペプチドを、標準的な固相技術を使用して、２５μモルスケール上の２，４−ジメチルベンズヒドリルアミン樹脂（Ｒｉｎｋ Ａｍｉｄｅ ＡＭ）を用いて、Ｎα−Ｆｍｏｃ−保護アミノ酸により合成した（Ｆｍｏｃ＝フルオレニルメチルカルボニル）。ペプチドは、Ｒａｉｎｉｎ／Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｓｙｍｐｈｏｎｙ固相ペプチド合成機（Ｗｏｂｕｒｎ、ＭＡ）を使用して合成した。任意の化学反応に、樹脂を塩化メチレン中で１時間膨張させ、続いて３０分間又はそれ以上かけて、ＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）で交換排出した。各カップリング反応は、室温にてＤＭＦ中で、５当量のアミノ酸を用いて実施した。反応時間は、一般的に４５分、カップリングが困難と予想される残基については１時間であった（例えば、イソロイシン、ＩをＩＰＰ配列中のプロリン、Ｐへカップリング）。使用したカップリング試薬は、ＨＢＴＵ（Ｏ−ベンゾトリアゾリル−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート）であり、塩基としてＮＭＭ（Ｎ−メチルモルホリン）を有する。各ステップにつき、カップリング剤は、見積もった樹脂の容量に対して５当量供給し、反応をＤＭＦ中の０．４Ｍ ＮＭＭ溶液２．５ｍｌ中で実施した。一般的に、反応性の基が存在する場合、反応によって、酸に不安定な基で保護したアミノ酸の側鎖が変化しなかった。一般的に、チロシン、スレオニン及びセリン側鎖は、対応するｔｅｒｔ−ブチルエーテルとして保護した。グルタミン酸側鎖は、対応するｔｅｒｔ−ブチルエステルとして保護した。リシン及びオルニチン側鎖はＢｏｃ保護した。グルタミン側鎖は、γ−トリフェニルメチル誘導体として保護し、アルギニン側鎖は、２，２，５，７，８−ペンタメチル−クロマン−６−スルホニル誘導体として保護した。各カップリング反応の後、Ｎ−末端Ｆｍｏｃ保護アミンを、ＤＭＦ中２０％ピペリジンを室温で約１５分間、２回添加して脱保護した。最後の残基を付加した後、尚ペプチド合成剤に存在する樹脂を、ＤＭＦ及び塩化メチレンで徹底的に濯いだ。
【０１０４】
本発明において、１ｍＬＴＦＡ、２．５％ＴＳＰ（トリイソプロピルシラン）及び２．５％水からなるカクテルを使用して、ペプチドを樹脂から切断した。樹脂及びカクテルを、室温で約３〜４時間撹拌した。樹脂ビーズをグラスウールで濾過除去し、次いでｆＴＦＡ２〜３ｍｌで濯いだ。ペプチドを氷冷エーテル４０ｍｌで沈殿させ、沈殿が遠心分離管の底でペレットを形成するまで、３０００〜４０００ｒｐｍで遠心分離した。エーテルをデカントし、ペレットを冷エーテル（４０ｍＬ）中に再懸濁させ、再度遠心分離した。この工程を２〜３回繰り返した。最後の洗浄中、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ水１０ｍｌを冷エーテル３０ｍｌに加え、混合物を再度遠心分離した。エーテルをデカントした。粗ペプチドを含む水層を、凍結乾燥のため丸底フラスコに移した。
【０１０５】
ペプチドの合成は、飛行時間型マトリクス補助レーザー脱離スペクトロスコピー（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）を用いた質量分析により確認した。さらに粗合成混合物中の純粋な生成物の特性を調べるために、予備ＬＣ／ＭＳ技術も用いた。
【０１０６】
結合の合成
フルオレセイン色素、５（６）−カルボキシフルオレセインと合成ペプチドのＮ−末端との結合は、好ましくは色素、ＨＢＴＵ及びＮＭＭを添加して、上記のアミノ酸と同じ方法で樹脂に含めることが好ましい。反応後、樹脂を、好ましくはＤＭＦ及び塩化メチレンで徹底的に洗浄し、窒素流下で乾燥する。１ｍＬＴＦＡ、２．５％ＴＳＰ（トリイソプロピルシラン）及び２．５％水を含む混合物を用いて、ペプチドを樹脂から切断することができる。樹脂及び混合物を、好ましくは室温で約３〜４時間撹拌する。次いで、ガラスウールを用いて樹脂ビーズを濾過して除去し、次いでＴＦＡ２〜３ｍｌで濯ぐ。さらに、ペプチドを、好ましくは氷冷エーテル（４０ｍＬ）で沈殿させ、沈殿物が遠心分離管の底でペレットを形成するまで遠心分離する（例、３０００〜４０００ｒｐｍ）。エーテルをデカントしてもよく、ペレットを冷エーテル（４０ｍＬ）中に再懸濁し、再び遠分離した。このプロセスを２〜３回繰り返してもよい。最後の洗浄中、好ましくはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ水１０ｍｌを冷エーテル３０ｍｌに加え、混合物を再度遠心分離した。次に、エーテルをデカントしてもよく、粗ペプチドを含有する水層を、凍結乾燥のために丸底フラスコに移してもよい。ペプチド合成に関する粗収率は、通常約９０％であった。非標識ペプチドは、一般的に観察されなかった。
【０１０７】
好ましくは１００ペプチドを、Ｃ４−シリカカラム（Ｖｙｄａｃ、Ｈｅｓｐｅｒｉａ、ＣＡ）を用いた逆相セミ分取又は分取ＨＰＬＣにより精製した。ペプチドのクロマトグラムを、アミド発色団の吸収に対応する２２０ｎｍにおいて測定することができる。４９５ｎｍにおける測定も監視し、ペプチド上のフルオレセイン色素の存在を確認することができる。セミ分取及び分取に、各々流速３ｍｌ／分及び１０ｍｌ／分のＣＨ３ＣＮ／ＴＦＡ（アセトニトリル／トリフルオロ酢酸、１００：０．０１）及びＨ２Ｏ／ＴＦＡ（水／トリフルオロ酢酸、１００：０．０１）溶離液を含む溶媒系を使用することが好ましい。Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ水に溶解した粗ペプチドを、セミ分取及び分取のために、各々１．５ｍｇ及び５〜１０ｍｇペプチドの範囲で注入することができる。クロマトグラム形を分析して、良好な分解能及びピークの形状を確認した。全ペプチドに関する傾斜条件は、一般的に３０分でＣＨ３ＣＮ／ＴＦＡ（１００：０．０１）５〜５０％であった。精製したペプチドの同一性を、マトリクス補助レーザー脱離飛行時間（Ｔｉｍｅ−ｏｆ−Ｆｌｉｇｈｔ）質量分析により確認した。
【０１０８】
治療薬
本発明の治療薬（ＴＡ）は、例えば抗ウイルス及び抗癌剤、ＨＩＶプロテアーゼ阻害剤、ウイルス及びステロイドとして有用な、例えば抗生物質、鎮痛薬、ワクチン、抗炎症薬、抗うつ薬、抗ウイルス薬、抗癌剤、酵素阻害剤、ジドブジンを含有する製剤、高分子ポリペプチド、芳香族ニトロ及びニトロソ化合物、並びにそれらの代謝産物等の医薬化合物又は組成物及び生物学的に活性な組成物、例えばホルモン又は他の増殖刺激剤、その混合物、並びに同様物等の増殖を促進する組成物を含むが、これらに限定されない。
【０１０９】
生物学的に活性な成分は、例えば抗癌剤等の細胞内に内在化した場合、有効性を改善することが可能である、任意の周知の活性物質から選択されてもよい。活性成分は、例えば５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、シトシンアラビノシド（ＡＲＡｃ）、６−メルカプトプリン、メトトレキサート等の代謝拮抗薬、例えばナイトロジェンマスタード、シクロホスファミド、ニトロソウレア、シスプラチン等のアルキル化、例えばビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド（ＶＰ１６）等の植物性アルカロイド、例えばマイトマイシンＣ、ブレオマイシン、ドキソルビシン等の抗生物質又は例えばタモキシフェン若しくはフルタミド等のホルモンを含んでもよい。
【０１１０】
第２の実施形態では、本発明は、哺乳類への投与に適した形態における式Ｉの化合物と生体適合性の担体とを含む医薬組成物を提供する。医薬組成物のために、式（Ｉ）の本質的な特徴及びその好ましい実施形態は、第１の実施形態（上記）に記載した通りである。
【０１１１】
「生体適合性担体」は体液であり、特に、組成物が生理学的許容性を有するように、即ち有毒性又は過度の不快感なしで哺乳類の身体へ投与できるように、薬剤が懸濁又は溶解することができる液体である。生体適合性担体は、注入可能な担体液体であることが適切であり、例えば滅菌された、非発熱性の注射用水、水溶液、例えばエタノール水溶液又は生理食塩水（注射用の最終生成物が等張となるように、好適に平衡にすることができる）、１以上の等張性調整物質（例、血漿陽イオンと生体適合性対イオンとの塩）、糖（例、ブドウ糖又はショ糖）、糖アルコール（例、ソルビトール又はマンニトール）、グリコール（例、グリセロール）又は他の非イオン性ポリオール材料（例、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール等）の水溶液である。生体適合性担体は、非発熱性の注射用水又は等張生理食塩水が好ましい。
【０１１２】
そのような医薬組成物は、皮下注射用針による１以上回の穿孔に適切であるが、完全な無菌状態を保持する密閉容器（例、襞付き隔壁（ｃｒｉｍｐｅｄ−ｏｎ ｓｅｐｔｕｍ）密閉容器）内に適切に供給される。そのような容器は、患者の１以上回の用量を収容し得る。好ましい複数回用量の容器は、１バルクのバイアルを含む（例、１０〜３０ｃｍ３容量）。この容器は、複数回の患者線量を収容するため、１回の患者線量を、製剤の利用可能な期間、臨床状態に適するように様々な時間間隔において臨床グレードの注射器内に引き入れることができる。プレフィルド注射器は、ヒトの１回の用量又は「単位用量」を収容するよう構成されており、従って臨床用途に適した使い捨て注射器又は他の注射器であることが好ましい。ＳＩＧが放射性の場合、プレフィルド注射器は、操作者を放射性線量から保護する注射器遮蔽物を任意にて備えてもよい。そのような放射性医薬品注射器の適切な遮蔽物は、当分野にて周知であり、鉛及びタングステンのいずれかを含むことが好ましい。
【０１１３】
ＳＩＧがインビボにおけるイメージングのための放射性核種（即ち、放射性医薬品）の場合、放射性医薬品を、以下の第３の実施形態に説明するように、キットから調製することができる。また、放射性医薬品を無菌製造条件下で調製して所望の滅菌生成物を得てもよい。放射性医薬品を非滅菌条件下で調製する後、例えばγ−照射、高圧蒸気滅菌法、乾熱又は化学的処理（例、酸化エチレンを用いた）により最終的に滅菌してもよい。本発明の放射性医薬品は、キットから調製することが好ましい。
【０１１４】
第３の実施形態では、本発明は、第２の実施形態の医薬組成物の調製用キットを提供する。ＳＩＧは放射性同位体又は放射性核種を含む。そのようなキットは、放射性同位体の滅菌原料との反応によって、最小数の操作により所望の放射性医薬品が得られるように、好ましくは滅菌型非発熱性の形態の上記「前駆体」を含む。そのような考慮は、放射性同位体が比較的短い半減期である放射性医薬品及び取り扱いを容易にして放射性物質を扱う薬剤師の放射線量を低減させるのに特に重要である。従って、そのようなキットを再構成するための反応媒体は、好ましくは上記に定義した「生体適合性担体」であり、最も好ましくは水性担体である。
【０１１５】
適切なキット容器は、完全な滅菌状態及び／又は放射能に対する安全性及び容器の上部空間の不活性気体（例、窒素又はアルゴン）を任意に保持しながら、注射器による溶液の添加する及び引き入れることができる密閉容器を含む。好ましいそのような容器は、隔壁で密封されたバイアルであり、気密容器には、（一般的にアルミニウムの）上部シールが襞で止められている。そのような容器は、所望であれば、例えば上部空間の気体の交換又は溶液の脱気のための真空に耐える密閉容器であるという更なる利点を有する。
【０１１６】
非放射性キットは、さらに例えば放射性保護剤、抗菌保存剤、ｐＨ−調整剤又はフィラー等の追加の成分を任意に含んでもよい。
【０１１７】
用語「放射性保護剤」は、水の放射線分解により生じた例えば酸素含有フリーラジカル等の高い反応性を有するフリーラジカルをトラップすることによって、例えば酸化還元工程等の劣化反応を抑制する化合物を意味する。本発明の放射性保護剤は、適切にはアスコルビン酸、パラ−アミノ安息香酸（即ち、４−アミノ安息香酸）、ゲンチシン酸（即ち、２，５−ジヒドロキシ安息香酸）及びその生体適合性陽イオンとの塩から選択される。用語「生体適合性陽イオン」は、イオン化した、負荷電を有する基と塩を形成する、正電荷の対イオンを意味する。また、前記正電荷の対イオンは無毒であるため、哺乳類、特にヒトの身体に投与するに適している。適切な生体適合性陽イオンの例は、アルカリ金属ナトリウム又はカリウム、アルカリ土類金属カルシウム及びマグネシウム、並びにアンモニウムイオンを含む。好ましい生体適合性陽イオンは、ナトリウム及びカリウム、最も好ましくはナトリウムである。
【０１１８】
用語「抗菌保存剤」は、例えばバクテリア、酵母又はカビ等の有害である恐れのある微生物の増殖を阻害する薬剤を意味する。抗菌保存剤は、用量に応じていくつかの殺菌特性も示す。本発明の（１種以上の）抗菌保存剤の主な役割は、再構成後の放射性医薬組成物、即ち放射性診断生成物それ自体においてそのような微生物の増殖を阻害することである。しかし、抗菌保存剤を、再構成前の本発明の非放射性キットの１種以上の成分中の有害である恐れのある微生物の増殖の阻害にも任意に使用することができる。適切な（１種以上の）抗菌保存剤は、パラベン、即ちメチル、エチル、プロピル若しくはブチルパラベン又はその混合物、ベンジルアルコール、フェノール、クレゾール、セトリミド及びチオマーサルを含む。好ましい（１種以上の）抗菌保存剤は、パラベンである。
【０１１９】
用語「ｐＨ調整剤」は、ヒト又は哺乳類への投与のために、再構成されたキットのｐＨが許容可能な範囲（約ｐＨ４．０〜１０．５）内にあることを確実にする有用な化合物又は化合物の混合物を意味する。そのような適切なｐＨ調整剤は、薬理学的に許容できる緩衝剤、例えばトリシン、ホスフェート又はＴＲＩＳ［即ち、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン］及び薬理学的に許容できる塩基、例えば炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム又はその混合物を含む。コンジュゲートが酸の塩の態で用いられる場合、ｐＨ調整剤は、別個のバイアル又は容器内に任意に提供されるため、キットの使用者は、複数ステップからなる手順の一部としてｐＨを調整することができる。
【０１２０】
用語「フィラー」は、製造及び凍結乾燥中の材料の取り扱いを容易にすることができる薬理学的に許容できる充填剤を意味する。適切なフィラーは、無機塩、例えば塩化ナトリウム及び水溶性の糖又は糖アルコール、例えばショ糖、麦芽糖、マンニトール又はトレハロースを含む。
【０１２１】
キット中に用いられる場合、「前駆体」の好ましい態様は上述した通りである。キット中で使用される前駆体を無菌製造条件下で使用して、所望の滅菌型非発熱性材料を得ることができる。前駆体は、非滅菌条件下で使用した後、例えばγ−照射、高圧蒸気滅菌法、乾熱又は（例、酸化エチレンで）化学的処理により最終的に滅菌されてもよい。好ましくは、前駆体は滅菌、非発熱形態で使用される。最も好ましくは滅菌、非発熱性前駆体は、上述した密閉容器内で使用される。
【０１２２】
キットの「前駆体」は、任意にて、上述したように固体支持体のマトリクスに共有結合させて任意に供給することができる。従ってＰＥＴ放射性医薬品の調製において、キットは、適合させた自動合成機内に差し込み可能なカートリッジを含んでもよい。カートリッジは、固体支持体に結合する前駆体とは別に、望ましくないフッ化物イオンを除去するカラム及び必要に応じて、反応混合物を蒸発させ、生成物を製剤化するよう接続される適切な容器を含んでもよい。合成に必要な試薬及び溶媒、並びに他の消耗品を、放射性濃度、容積、送達時間等に関する消費者の要求に合わせるように合成機を作動させるソフトウエアを携えたコンパクトディスクを含んでもよい。稼働間の汚染率を最小にし、滅菌状態及び品質を保証するために、キットの全成分が使い捨てのものであれば都合がよい。
【０１２３】
第４の実施形態では、本発明は、組織をイメージングしてＬＯＸ−１の存在及び／又は量を検出する方法を提供する。該方法は、
式（Ｉ）（式中、ＹはＳＩＧである）の化合物を哺乳類に投与し、
ＬＯＸ−１に結合していない式（Ｉ）の化合物を除去する排除剤を適宜投与し、
哺乳類をＳＩＧで生成されるシグナルを検出するのに有効なイメージングに付してＬＯＸ−１の存在及び／又は量の検出することを含む。
【０１２４】
イメージング方法に関して、ＹはＳＩＧであり、そうでない場合、式（Ｉ）の本質的な性質及びその好ましい実施形態は第１の実施形態（上記）に記載した通りである。
【０１２５】
用語「排除剤」は、血流中を循環する任意の式（Ｉ）の化合物に結合して、肝臓又は腎臓により容易に排泄させて哺乳類の身体から除去される種を形成する、生体適合性を有する無毒の化合物を意味する。
【０１２６】
結合部分Ｅに付着する特定のＳＩＧに応じて、適当なイメージング技術を使用して標的組織をイメージングする。例えば、１８Ｆが標識剤として使用される場合、ＰＥＴイメージングを実施する。好ましい実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、第２の実施形態の医薬組成物として投与される。
【０１２７】
標識される配位子を診断として使用し、ＬＯＸ−１の過剰発現が疑われる標的組織のイメージングを支援することができる。イメージング方法は、診断として使用され、インビトロ又はインビボで、好ましくはインビボでヒト組織内のＬＯＸ−１の存在を検出することができる。さらに、イメージング方法を何日間も繰り返してＬＯＸ−１の増殖又は発現の程度を定量的に評価することができる。このように、インビトロでのイメージングは、組織又は細胞培養をイメージングしてＬＯＸ−１の存在及び／又は量を検出することを含むことができる。
【０１２８】
好ましい態様において、哺乳類は、以前にアテローム性動脈硬化症を罹患していると診断され、アテローム性動脈硬化症の治療用の治療薬で既に治療されており、該方法はさらに、
投与及びイメージング法を、ある期間にわたって１回以上繰り返し、ＬＯＸ−１の量の差を検出することを含んでなる。
【０１２９】
これは、ＬＯＸ−１の発現に起因する疾患又は障害を治療する治療の有効性を監視する方法を提供する。
【０１３０】
ＬＯＸ−１の発現に起因する疾患又は障害は、高濃度のＬＯＸ−１が存在する炎症部位、並びに例えばマクロファージ及び他の炎症細胞が蓄積する領域を含む。より好ましくは、組織は、動脈硬化性プラークを含む動脈硬化組織である。
【０１３１】
第５の実施形態では、本発明は、ＬＯＸ−１の発現に起因する疾患又は障害が疑われる哺乳類の診断方法における、式（Ｉ）（式中、ＹはＳＩＧである）の化合物の使用を提供する。そのような疾患は、上記の第４の実施形態に記載した通りである。この使用に関して、ＹはＳＩＧであり、ＳＩＧはインビボにおけるイメージングに適切であることが好ましい。そうでない場合、式（Ｉ）の本質的な特徴及びその好ましい実施形態は、第１の実施形態（上記）に記載した通りである。
【０１３２】
この使用において、哺乳類は、以前に第３の実施形態の放射性医薬組成物を投与される。用語「以前に投与した」は、臨床医が薬剤を患者に例えば静脈注射による投与に関するステップが、既に行なわれていることを意味する。ＳＩＧがインビボでのイメージングにおいて適切である場合、この実施形態は、本発明の第１の態様に記載される前記イメージング剤の好ましい実施形態を含む。また、好ましい実施形態では、この使用はＬＯＸ−１が関与する哺乳類の身体の疾患状態を、インビボで診断的イメージングするための診断薬の製造における式（Ｉ）の化合物（式中、ＹはＳＩＧである）の使用も含む。
【実施例】
【０１３３】
本発明を、以下の非限定的な例にて説明する。
【０１３４】
全ての実施例は、机上の実施例である。
【０１３５】
実施例１
熱ショックタンパク質Ｅ基を、当分野にて周知の標準的な技術を用いて、４−アシルフェニレン基（Ｌ）を介してフルオレセイン（ＳＩＧ）に共有結合させる。細胞株を用いて、細胞に対する錯体の結合能を試験する。錯体を細胞と共にインキュベートし、続いて洗浄する。その後、次いで標準的な技術を用いて細胞をイメージングする。さらに、ＨＳＰフラグメントのシグナルを内在化する能力を、細胞内に内在化させた色素を介し、蛍光像を介して示された細胞表面上のものと対比させて示す。フラグメントを、細胞中に内在化すると蛍光を発するｐＨ感受性色素、例えばＣｙｐＨｅｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）で標識する。
【０１３６】
実施例２
当分野にて周知の標準的な技術を用いて、Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（Ｌ）を介してＥを１８Ｆ（ＳＩＧ）に共有結合させる。次いで錯体を、インビボによる注射によって、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手可能な５匹の対照及び５匹の疾患ＡｐｏＥ−／−マウスへ送達する。送達後、標準的なＰＥＴ技術を用いてマウスを走査する。疾患マウスは、患部動脈壁に沿って特異的結合を示す。
【０１３７】
第２段階にて、錯体による処理を繰り返し、患部領域の分解能を増大させるイメージング剤の蓄積を示す。
【０１３８】
実施例３
当分野にて周知の標準的な技術を用いて、ＤＴＰＡ（Ｌ）を介してＥをタキソール（Ｔ）に共有結合させる。細胞株を用いて、錯体の細胞に対する結合能を試験する。錯体を細胞と共にインキュベートし、続いて洗浄する。ＨＳＰフラグメントのシグナルを内在化する能力を、細胞内に内在化させた色素の認識を介して、蛍光像を介して示された細胞表面上のものと対比させて示す。
【０１３９】
実施例４
当分野にて周知の標準的な技術を用いて、６８Ｇａ（Ｌ）を介してＥを共有結合させる。錯体を、インビボにおける注射により、５匹の対照及び５匹の疾患ＡｐｏＥ−／−マウスへ送達する。送達後、標準的なＰＥＴ技術を用いてマウスを走査する。疾患マウスは、患部動脈壁に沿って特異的結合を示す。
【０１４０】
第２段階にて、錯体による処理を繰り返してイメージング剤の蓄積を示し、患部領域の分解能を増大させる。
【０１４１】
実施例５
当分野にて周知の標準的な技術を用いて、Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（Ｌ）を介してＥを１８Ｆ（ＳＩＧ）に共有結合させ、さらにタキソール（ＴＡ）に共有結合させる。熱ショックＨｅＬａ細胞株及びストレス無負荷の正常ＨｅＬａ細胞を用いて、細胞に対する錯体の結合能を検査する。さらに、錯体を細胞と共にインキュベートし、続いて洗浄する。ＬＯＸ−１を発現する細胞は、選択的細胞死がより多くなることを示す。さらに、細胞死の選択性を、細胞のイメージング及びシグナルの内在化を介して示す。
【０１４２】
実施例６
リンカーを持たない錯体の例として、当分野にて周知の標準的な技術を用い、６８Ｇａ（ＳＩＧ）を介してＥを共有結合させる。次いで錯体を、インビボにおける注射によって、５匹の対照及び５匹の疾患ＡｐｏＥ−／−マウスへ送達する。送達後、標準的なＰＥＴ技術を用いてマウスを走査する。疾患マウスは、患部動脈壁に沿って特異的結合を示す。
【０１４３】
第２段階にて、錯体による処理を繰り返してイメージング剤の蓄積を示し、患部領域の分解能を増大させる。
【図面の簡単な説明】
【０１４４】
【図１】ＨＳＰ−７０のＮ−末端に関するアミノ酸配列。
【図２】ＨＳＰ−７０のＣ−端末に関するアミノ酸配列。
【図３】ヒトＬＯＸ−１に関するアミノ酸配列。
【図４】式（Ｉ）の化合物におけるＬ及びＳＩＧの変形を示す図。
【図５】ＨＳＰ−７０のＮ−末端に関する三次元構造図。
【図６】ＨＳＰ−７０のＣ−端末に関する三次元構造図。
【技術分野】
【０００１】
本発明の実施形態は、シグナル伝達物質（例えば、造影剤又はイメージング剤）及び治療薬の送達及び内在化のための、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）から誘導したペプチド及びポリペプチドを用いる化合物、組成物及び方法に関する。例えば，熱ショックタンパク質７０は、酸化低密度リポタンパク質受容体（ＬＯＸ−１又はＯＬＲ−１）に結合してＬＯＸ−１受容体にＨＳＰ及び任意の結合する部分を、内皮細胞を通して伝達するようシグナル伝達する。ＨＳＰペプチドはイメージング剤又は治療薬に直接又はリンカーを介して結合し得る。また、組成物は、インビボで生体分子をマクロファージ及び他の炎症性細胞を含む、高濃度のＬＯＸ−１を有する部位に送達するのに有用である。造影剤／イメージング剤は、様々なイメージングモダリティのために選択することができ，より詳細には、前記結合する部分は、例えばアテローム性動脈硬化症等の、炎症に関連するプラークの攻撃を受けやすい部位のイメージングに有用である。組成物は、炎症及び炎症と関連する疾患、（例えばアテローム性動脈硬化症，不安定プラーク及び冠動脈疾患を含むがこれらに限定されない様々な心血管疾患、並びに関節リウマチ）を診断及び監視するのに有用である。
【背景技術】
【０００２】
ＨＳＰ（熱ショックタンパク質）は、バクテリアから哺乳類まで、全器官の細胞内に見られる高度に保存されたタンパク質のファミリーの１つである。ＨＳＰは、ストレス無負荷の細胞内でさえ細胞の代謝に要求される。ＨＳＰは、合成、構成、輸送及びタンパク質アセンブリの他の態様、例えば、新たに合成されたポリペプチドの折り畳みを支援して、他のタンパク質との早過ぎる相互作用を防止する（即ち、シャペロンとして作用する）ことを促進する。ＨＳＰの発現は、例えば温度の上昇、ｐＨの変化及び酸素欠乏等の生理的ストレスに応答して増大する。これらのストレスは、細胞のタンパク質の三次元構造の崩壊又は変成を起こす場合がある。もしこれらのストレスが野放しにされた場合、異常に折り畳まれた又は変成したタンパク質が凝集体を形成し、最終的に細胞を殺傷する場合がある。ＨＳＰは、損傷したタンパク質に結合して、適切な形状へ再び折り畳み及び／又は損傷の発生を阻止する補助をする。
【０００３】
欧州特許１０４６６５２号は、哺乳類の酸化ＬＤＬ受容体（ＬＯＸ−１）の細胞外ドメイン及びＩｇＧの一部から構成されることから、融合ポリペプチドが標識剤によって標識される融合ポリペプチドを開示している。従って、融合ポリペプチドは、酸化ＬＤＬの検出、定量、分離及び精製に使用することができる。欧州特許１０４６６５２号の融合ポリペプチドは、ＬＯＸ−１の検出又は定量に使用することができない。
【０００４】
ＴＡＴペプチド配列（ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ）及び最近報告されたＡｎｔｐ内在性配列（ＲＱＩＡＷＦＱＮＲＲＮＫＷＫＫ）は、インビトロ及びインビボの両方で、様々な基質の内在性の活性を示している。ＴＡＴペプチドは、酸化鉄ナノ粒子を非特異的に細胞内へ送達するのに使用されているが（Ｗｕｎｄｅｒｂａｌｉｎｇｅｒ，Ｐ． ｅｔ． ａｌ．， Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００２，１３，２６４−８）、診断用造影剤を内皮細胞上の疾患領域に送達する目的で、特異的受容体を標的とすることを示すものは存在しない。これらの方法の不都合は、関心細胞に造影剤を標的とするペプチドの非特異性である。造影剤の非特異的な送達は、診断する関心領域（即ち、アテローム性動脈硬化病変）を、血管系の他の機能的領域から区別する試みを阻止する。
【０００５】
心血管疾患は、米国において主要な死因となっており、年間１００万人越の死者数を占めている。アテローム性動脈硬化は、冠動脈心疾患の主な要因であり、西洋の国々にて非偶発的な死亡の主な原因となっている。アテローム性動脈硬化症には、例えば高血圧、上昇した総血清コレステロール、高い低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）コレステロール値、低い高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）コレステロール値、真性糖尿病、重症の肥満及び喫煙等の複数の危険因子が寄与することは十分裏付けられている。アテローム性動脈硬化症、並びに心筋梗塞、アンギナ、臓器不全及び卒中を含む疾患の予後及び潜在的治療法を明らかにするための、相当の取り組みが為されている。今日まで、アテローム性動脈硬化症の治療は、コレステロール値を低下させ、脂質を調整することを焦点としている。しかし、最近の研究では、冠動脈疾患に起因する死亡の４０％は、総コレステロール値が２２０ｍｇ／ｄｌ未満の男性に起こることが示されている。アテローム性動脈硬化病変がいつどのように陥りやすく、かつ致命的となるか，最良の医療行為及び病変の進行をどのように検出及び監視するかを含む、未解決の問題が多数存在している。
【０００６】
数種の侵襲的及び非侵襲的技術が、アテローム性動脈硬化症のイメージング及び該疾患の進行及び安定化の評価に使用される。これらは、冠動脈造影、血管内超音波内視鏡、血管内核磁気共鳴画像法，及び赤外線カテーテルを用いるプラークの赤外線イメージングが含まれる。これらの技術は、不安定プラークの確認に首尾よく用いられているが、一般的に侵襲性である（例えば、外科手術又はプローブ若しくはカメラの挿入を必要とする）。可溶性マーカー、例えばＰ−セレクチン、フォン・ヴィレブランド因子、アンジオテンシン変換酵素（Ｃ１４６）、Ｃ−反応性タンパク質、Ｄ−二量体（Ｉｋｅｄａ ｅｔ． ａｌ．， Ａｍ．Ｊ．Ｃａｒｄｉｏｌ．，１９９０，６５，１６９３−１６９６）及び活性化循環炎症細胞は、不安定狭心症の患者に見られるが、それらの存在を利用して関連する病変の位置を特定することができない。カテーテルに含まれる温度感知要素は、炎症過程及び細胞増殖が発熱過程であるという理論の下に、プラークの位置を特定するのに使用されており、例えば米国特許第４９８６６７１号及び同第４７５２１４１号に記載されている。血管造影図は内腔径の像を映し、狭窄の程度を優れた分解能で提供する。しかし、血管造影図は血管壁又は様々な病理組織成分をイメージングしない。
【０００７】
現在利用可能な技術は、一般的に、アテローム性動脈硬化症の形態学的及び／又は機能的パラメータのいくつかを同定して、該疾患に関連する相対的危険性を定性的に又は半定量的に評価する。しかし、これらの診断的手順は、侵襲的であるか又は例えばプラークの細胞組成物、プラーク中の各成分の分子レベルにおける生物学的特徴等の内在的な病態生理学上の情報は殆ど得られない。
【０００８】
酸化ＬＤＬ（ｏｘＬＤＬ）は、アテローム性動脈硬化症と病理生物学的に深く関わっている。動脈硬化プラーク中の脂質プールは、天然ＬＤＬではなく、ｏｘＬＤＬの摂取に起因することが疑われている。ＯｘＬＤＬは、マクロファージ上でスカベンジャー受容体により認識され、マクロファージによる大量のｏｘＬＤＬの摂取によって、動脈硬化プラークの重要な成分である泡沫細胞を生じる。ＬＯＸ−１、即ちレクチン様酸化ＬＤＬ受容体は、最近、ｏｘＬＤＬのための内皮細胞上の受容体として同定されている。内皮細胞によるｏｘＬＤＬの内在化を仲介し、例えば国際公開第０２／０６７７１号（Ｓａｗａｍｕｒａ，Ｔ． Ｎａｔｕｒｅ １９９７ ３８６：７３−７７）に記載されているマクロファージスカベンジャー受容体とは異なる。ＬＯＸ−１のアミノ酸配列を図３に示す。また、ＬＯＸ−１は、マクロファージ上において発現し、ｏｘＬＤＬ認識／内在化の役割を果たす（Ｙｏｓｈｉｄａ，Ｈ． ｅｔ． ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１９９８ ３３４：９−１３）。ＬＯＸ−１は、健康なヒトの大動脈サンプルからは殆ど検出不可能であるが、動脈硬化プラークに見られ、特に、他の手段によって検出不可能と思われる病変早期に見られる（Ｋａｔａｏｋａ，Ｈ． ｅｔ． ａｌ．， Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １９９９ ９９：３１１０−３１１７）。最近の研究は、ＬＯＸ−１によるｏｘＬＤＬの認識が、内皮細胞上の接着受容体の発現における重要な初期段階であることを示唆している。これらの受容体は、単球を早期の動脈硬化プラークに引き付ける役割を担うと考えられる。ＬＯＸ−１に対する抗体は、ｏｘＬＤＬのＬＯＸ−１に対する結合を防止することによって、アテローム性動脈硬化症の治療に有用であるものとして記載されている（国際公開第０１／６４８６２号）。
【特許文献１】欧州特許１０４６６５２号明細書
【特許文献２】米国特許第４９８６６７１号明細書
【特許文献３】米国特許第４７５２１４１号明細書
【特許文献４】国際公開第０２／０６７７１号パンフレット
【特許文献５】国際公開第０１／６４８６２号パンフレット
【非特許文献１】Ｗｕｎｄｅｒｂａｌｉｎｇｅｒ，Ｐ． ｅｔ． ａｌ．， Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００２，１３，２６４−８
【非特許文献２】Ｉｋｅｄａ ｅｔ． ａｌ．， Ａｍ．Ｊ．Ｃａｒｄｉｏｌ．，１９９０，６５，１６９３−１６９６
【非特許文献３】Ｙｏｓｈｉｄａ，Ｈ． ｅｔ． ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１９９８ ３３４：９−１３
【非特許文献４】Ｋａｔａｏｋａ，Ｈ． ｅｔ． ａｌ．， Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １９９９ ９９：３１１０−３１１７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
現在のイメージング剤及びイメージングモダリティは、主に解剖学的情報を提供する。通常、この情報は、極めて高い解像度を提供するコントラストの形態によって得られる。しかし、潜在する疾患状態は、肉体的な物理的徴候の発現前に、疾患を増殖させる生化学的プロセスに関与している。早期疾患過程において、生化学的経路又は該経路内の特定のマーカー（バイオマーカー）をイメージングする能力によって機能的情報が提供される。従って、様々な心血管疾患（例、アテローム性動脈硬化症、不安定プラーク、冠動脈疾患、腎疾患、血栓症、凝固による一過性虚血、卒中、心筋梗塞、臓器移植、臓器不全及び高コレステロール血症）を診断及び監視する非侵襲的方法が必要である。非侵襲的方法によって、プラークの潜在する病態生理学、例えばプラークの細胞組成物及びプラーク中の各成分の分子レベルにおける生物学的特徴に関する情報を得る必要がある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、治療薬及びシグナル伝達物質を含むがこれらに限定されない、細胞内への内在化剤として有用なＬＯＸ−１に結合するＨＳＰ又はそのフラグメントの使用を開示する。別の一実施形態では、ＨＳＰのＬＯＸ−１結合部分は、例えばアテローム性動脈硬化症に関連する炎症等の、身体内の炎症を確認及び位置付けする有用な手段を提供する。さらに、本発明の実施形態は、ＨＳＰ（ＬＯＸ−１ペプチド結合配列）を用いて、診断的手順を補助する方法を提供する。より詳細には、化合物及び組成物は、プラークの形成を検出する方法に使用される。本発明の実施形態は、さらに、ＬＯＸ−１ペプチド結合配列を用い、ＬＯＸ−１の過剰発現又は増大した発現に起因するヒト及び／又は他の動物の疾患治療を監視する方法を提供する。
【００１１】
さらに、本発明は、インビボでＬＯＸ−１タンパク質の発現を検出して定量することができる、ＬＯＸ−１に結合可能なイメージング剤／分子を提供する。
【００１２】
イメージングする目的に加え、化合物及び組成物を、高濃度のＬＯＸ−１を有する領域、例えばマクロファージ及び他の炎症細胞内の対象とする生体分子への送達機構としても使用してもよい。
本発明はさらに、炎症性疾患、例えばアテローム性動脈硬化症の治療効果を監視する方法も提供する。別の一実施形態では、本発明は、ＬＯＸ−１の発現に起因する疾患又は障害の罹患が疑われる哺乳類のＬＯＸ−１の発現レベルを測定する方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
第１の実施形態では、本発明は式Ｉの化合物を提供する。
【００１４】
（Ｉ）Ｙ−（Ｌ）ｎ−Ｅ
式中、ＹはＳＩＧ又はＴＡであって、ＳＩＧはインビボ又はインビトロで検出可能なシグナルを提供するシグナル伝達部分であり、ＴＡは、治療薬であり、
ＬはＹとＥとを連結するリンカー基であり、
ＥはＬＯＸ−１に結合する熱ショックタンパク質又はそのフラグメント若しくは変異体を含む結合部分であり、
ｎは０又は１である。
【００１５】
定義
結合部分（Ｅ）
「結合部分」（Ｅ）は、ＬＯＸ１に結合することができる、哺乳類、好ましくはヒトの熱ショックタンパク質又はそのフラグメント若しくは変異体である。ＬＯＸ−１に結合する周知の部分とは異なり、本発明の結合部分は、ヒト体液の存在下で（インビボ又はインビトロで）、ＬＯＸ−１が過剰発現している組織（例、動脈硬化組織）が、健康な組織から区別されるように、十分な特異性をもってＬＯＸ−１に結合するよう設計されている。本願明細書で使用される用語「ＬＯＸ−１に結合する熱ショックタンパク質又はそのフラグメント若しくは変異体」は、本願明細書全体を通して、ペプチド、ペプチド配列、ＨＳＰペプチド、ＬＯＸ−１結合ペプチド又は結合ペプチドと称される。これらの各用語は、フラグメント、融合ペプチド、誘導体、変異体及びホモログを含むことを意図する。さらに、例えばＨＳＰ−７０又は配列番号１〜５等の特定の参照は、実際には例示であり、そのフラグメント、融合ペプチド、誘導体、変異体及びホモログもその特定の参照に含まれる。
【００１６】
引用した各実施形態に関して、熱ショックタンパク質（リガンド）は、完全配列、そのフラグメント又はその完全配列、フラグメント及び変異体のいずれかのホモログであってよい。タンパク質とペプチド間の相違は寸法である。用語「ペプチド」は、通常、約１０，０００Ｄａの分子量を有する、１００個未満のアミノ酸を含むものを示すのに使用される。好ましいＨＳＰペプチドは、３０個未満のアミノ酸を含むか又は３５００Ｄａ未満の分子量を有する。抗体又はタンパク質と比較すると、これらの小さいペプチドは利点をいくつか有する。例えば、これらは、就職又はナノ粒子への結合における厳しい化学的条件を許容することができる。さらに、全体としての粒子の合成が単純化され、制御が容易となる。また、小さいペプチドは免疫原性となりにくく、さらには、基本的な生物学的過程において、分子の他のクラスと比較して広義に必要とされ、また多くの場合、小さいペプチドの受容体に対する親和性は、抗体又はそのフラグメントの親和性と比較してかなり高い。好ましくは、熱ショックタンパク質は、熱ショックタンパク質７０、そのフラグメント又はその完全配列、フラグメント及び変異体のいずれかのホモログである。ＨＳＰペプチド結合配列は、ＨＳＰ−７０フラグメントであるのがより好ましい。熱ショックタンパク質７０のフラグメントは、３０−ｍｅｒｓ又はそれより短いのがより好ましい。以下に説明するように、３０個又はそれより少ないアミノ酸を含むこれらのフラグメントは、より良好な特異性、輸送及び／又はクリアランス特性を有し、ＨＳＰ−７０の親水性部分を含むことが好ましい。３０−ｍｅｒｓは、熱ショックタンパク質７０のアミノ酸数３８３〜６４０から選択されることがより好ましい。
【００１７】
一実施形態では、ＨＳＰ−７０はその全体を使用することができるが、ＨＳＰ−７０の所定の部分は、細胞表面受容体に結合する傾向がより高い。未変換状態において、ＨＳＰ−７０は、安定な三次構造を有する。しかし短鎖オリゴマーは、安定な三次構造の状態に達しない又は代替的にＨＳＰの結合部分を表さない可能性がある。従って、本発明の一実施形態では、ＨＳＰの親水性部分は、ＬＯＸ−１との複合体に使用されるフラグメントを生成するのに利用される。親水性領域は、以下の２つの異なる利点を有する。
【００１８】
（１）本来親水性であるため、これら比較的短鎖のオリゴマーは、より安定性が高いと考えられる。
【００１９】
（２）親水性ドメインは、細胞結合の役目を担う可能性が最も高い。結合部分は、例えば、
・ＤＡＡＫＮＱＶＡＬＮＰＱＮＴＶＦＤＡＫＲＬＩＧＲＫＦＧＤＰＶＶＱＳＤＭＫＨＷＰＦ（配列番号１）
?ＱＶＩＮＤＧＤＫＰＫＶＱＶＳＹＫＧＥＴＫＡＦＹ（配列番号２）
?ＰＥＥＩＳＳＭＶＬＴＫＭＫＥＩＡＥＡＹＬＧＹＰＶＴ（配列番号３）
?ＤＳＱＲＱＡＴＫＤＡＧＶＩＡＧＬＮＶＬＲＩＩＮＥＰＴＡＡＡＩＡＹＧＬＤＲ（配列番号４）
?ＭＧＤＫＳＥＮＶＱＤＬＬＬＬＤＶＡＰＬＳＬＧＬＥＴＡＧＧＶＭ（配列番号５）
?ＫＤＮＮＬＬＧＲＦＥＬＳＧＩＰＰＡＰＧＶＰＱＩＥＶＴＦＤＩＤ（配列番号６）
を含んでもよい。
【００２０】
別の一実施形態では、配列番号１〜６のホモログ又はより大きいフラグメントであるセグメントを使用することが好ましい。
【００２１】
当業者であれば、ＨＳＰ−７０は例示であり、ＨＳＰ間において大変保護される性質により他のＨＳＰも使用できることが認識されよう。詳細には、ＨＳＰ−７０の結合領域に対して高い相同性を有する他のＨＳＰからの配列を使用することが好ましい。さらに、本発明者等は、相同構造において、Ｃ−末端の半分内よりＮ−末端の半分内に多くの親水性ドメインが存在することが示唆されるため、Ｃ−末端の相同セグメントよりもＮ−末端の相同セグメントが好ましいことを見出した。
【００２２】
二次構造解析を使用すれば、Ｎ−末端の相同セグメントは主にα−螺旋からなり、Ｃ−末端の相同セグメントは、主にβ−シートからなることが示される。他の好ましいフラグメントは、３−Ｄモデリング及び例えば静電気及び疎水性等の表面特性により同定されてもよい。
【００２３】
例えば、実験的に同定される構造を有する相同タンパク質は、共有財産、詳細にはタンパク質構造データバンク（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｄａｔａｂａｎｋ）から同定され、その配列は、ＬＯＸ−１に最も高い相同性を示した。ＰＤＢ構造データベースのｐｈｉ−ｐｓｉ ＢＬＡＳＴサーチ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）を使用して、相同性のあるテンプレートを同定した。その後に、タンパク質データバンクから結晶構造を得た。
【００２４】
また、以下の構造情報は、有用な配列及び内部のアミノ酸置換の同定を支援するのに役立つ。以下の情報は、１ＨＪＯ（ヒト）由来のＨＳＰフラグメントに基づくものであり、ｗｗｗ．ｐｄｂ．ｏｒｇ．にさらに記載されている。
【００２５】
１．β−シートＡ
アミノ酸７−ＩＬＥ〜アミノ酸２８−ＩＬＥ
アミノ酸１４１−ＡＳＮ〜アミノ酸１４６−ＶＡＬ
アミノ酸１６８−ＡＳＮ〜アミノ酸１７４−ＡＳＮ
２．β−シートＢ
アミノ酸４２−ＶＡＬ〜アミノ酸５１−ＩＬＥ
３．ヘリックス１
アミノ酸５３−ＡＳＰ〜アミノ酸６１−ＬＥＵ
４．ヘリックス２
アミノ酸６３−ＰＲＯ〜アミノ酸６５−ＡＳＮ
５．ヘリックス３
アミノ酸７０−ＡＬＡ〜アミノ酸７３−ＬＥＵ
６．ヘリックス４
アミノ酸８１−ＰＲＯ〜アミノ酸８９−ＨＩＳ
７．β−シートＣ
アミノ酸９３−ＧＬＮ〜アミノ酸１１５−ＴＹＲ
８．ヘリックス５
アミノ酸１１６−ＰＲＯ〜アミノ酸１３５−ＬＥＵ
９．ヘリックス６
アミノ酸１５２−ＡＳＰ〜アミノ酸１６４−ＩＬＥ
１０．ヘリックス７
アミノ酸１７５−ＧＬＵ〜アミノ酸１８２−ＡＬＡ
１１．ヘリックス８
アミノ酸２３０−ＧＬＹ〜アミノ酸２４８−ＬＹＳ
１２．β−シートＤ
アミノ酸１９２−ＧＬＵ〜アミノ酸３３７−ＶＡＬ
１３．ヘリックス９
アミノ酸２５７−ＬＹＳ〜アミノ酸２７５−ＳＥＲ
１４．β−シートＥ
アミノ酸２７９−ＧＬＮ〜アミノ酸２９８−ＴＨＲ
１５．ヘリックス１０
アミノ酸２９９−ＡＲＧ〜アミノ酸３２３−ＡＳＰ
１６．ヘリックス１１
アミノ酸３２８−ＬＹＳ〜アミノ酸３３０−ＧＬＮ
１７．ヘリックス１２
アミノ酸３３９−ＧＬＹ〜アミノ酸３４２−ＡＲＧ
１８．ヘリックス１３
アミノ酸３４４−ＰＲＯ〜アミノ酸３５３−ＰＨＥ
１９．ヘリックス１４
アミノ酸３６８−ＡＬＡ〜アミノ酸３８０−ＬＥＵ。
【００２６】
これらのパラメータ及び本願明細書に記載する方法を使用して、数種のＨＳＰフラグメントを合成した。他の変異体は、（１以上の）新規なグリコシル化及び／又はリン酸化部位を生成又は（１以上の）従来のグリコシル化及び／又はリン酸化部位を削除するように設計されたものを含む。変異体は、グリコシル化部位、タンパク質分解切断部位及び／又はシステイン残基において、少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。変異体は、リンカーペプチド上の対象とするアミノ酸配列の前又は後にアミノ酸残基をさらに有するペプチドも含む。例えば、システイン残基は、対象とするアミノ酸配列のアミノ及びカルボキシ末端の両方に付加され、ジスルフィド結合の形成による対象とするアミノ酸配列の環化を可能にする。また、用語「変異体」は、対象アミノ酸の３′又は５′末端のいずれかに隣接する少なくとも１つの及び２５以上のアミノ酸をさらに含む対象とするアミノ酸配列を有するポリペプチドも包含する。
【００２７】
本発明のＨＳＰタンパク質及びペプチドは、天然又は合成由来のものであってよい。天然タンパク質及びペプチドは、哺乳類由来のＨＳＰから単離されてもよい。本願明細書にて使用される「単離された」は、元の環境（例、物質が生成される天然環境）から移された物質を意味し、つまり、その天然環境から「人の手によって改変」される。さらに、単離される物質は、単離されたＨＳＰペプチド結合配列又は特定のＨＳＰ７０フラグメント結合配列を包含する。
【００２８】
用語「フラグメント」は、対象とするアミノ酸配列の連続するサブ配列からなるタンパク質又はポリペプチドを指し、天然に存在するフラグメント、例えばスプライス変異体及び天然に存在する生体内プロテアーゼ活性から得られるフラグメントを含む。そのようなフラグメントは、アミノ末端、カルボキシ末端及び／又は内部で（例えば、天然のスプライシングにより）切断されてもよい。そのようなフラグメントは、アミノ末端メチオニンを含む或いは含まずに生成されてもよい。本発明の適切なＨＳＰフラグメントは、３〜１００個のアミノ酸、好ましくは４〜５０個のアミノ酸、最も好ましくは５〜３０個のアミノ酸を含んでなる。
【００２９】
用語「変異体」は、対象とするアミノ酸配列と比較して、１以上のアミノ酸置換、欠損及び／又は挿入が見られるタンパク質又はポリペプチドを指し、天然に存在する対立遺伝子多型又は別のスプライス変異体を含む。用語「変異体」は、（１以上の）相似若しくは相同のアミノ酸又は（１以上の）異なるアミノ酸によるペプチド配列内の１以上のアミノ酸の置換を含む。アミノ酸の相似性又は相同性を順番付けする多数の尺度が存在する（Ｇｕｎｎａｒｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ，Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｐ．１２３−３９（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ１９８７）。好ましい変異体は、１以上のアミノ酸位置におけるアラニン置換を含む。他の好ましい置換は、タンパク質の全体の正味荷電、極性又は疎水性に殆ど又は全く影響を与えない保存的置換を含む。保存的置換を、下の表１に示す。
【００３０】
【表１】
表２に、アミノ酸置換の他のスキームを示す。
【００３１】
【表２】
他の変異体は、例えば（ａ）置換領域における、例えばシート若しくは螺旋状構造等のポリペプチドバックボーンの構造、（ｂ）ターゲティング部位における分子の電荷若しくは疎水性又は（ｃ）側鎖の嵩を維持する効果において、より有意に異なる残基を選択する等、より保存性の低いアミノ酸置換からなる。機能上、より有意な効果があると一般的に考えられる置換は、（ａ）グリシン及び／又はプロリンが他のアミノ酸で置換又は削除若しくは挿入（ｂ）親水性残基、例えばセリル又はスレオニルが、疎水性残基、例えばロイシルイソロイシル、フェニルアラニル、バリル、若しくはアラニルに（で）置換、（ｃ）システイン残基が、任意の他の残基に（で）置換、（ｄ）電気的陽性の側鎖を有する残基、例えばリシル、アルギニル、若しくはヒスチジルが、陰性の電荷を有する残基、例えばグルタミル若しくはアスパルチルに（で）置換又は（ｅ）嵩高い側鎖を有する残基、例えばフェニルアラニンが、そのような側鎖を持たない、例えばグリシンに（で）置換されるものである。
【００３２】
ポリペプチド及びその変異体
用語「ポリペプチド」は、ＨＳＰヌクレオチドによってコードされるタンパク質、ペプチド及びそのフラグメント（機能性又は非機能性）を包含する。用語「誘導体」は、例えばプロセシング及び他の転写後修飾等の天然プロセスだけでなく、例えば１以上のポリエチレングリコール分子、糖、ホスフェート及び／又はそのような他の分子の付加等の化学的修飾技術により化学的に修飾された化学修飾タンパク質又はポリペプチドを指す。その（１以上の）分子は、そのように誘導体化された野生型アミノ酸に天然では結合されない。誘導体は塩を含む。そのような化学的修飾は、基礎的な教科書に詳細に説明され、またモノグラフ及び膨大な研究文献により詳細に説明されており、当業者に周知である。所定のタンパク質又はポリペプチドの数個の部位に、同一の種類の修飾が同一又は様々な程度で存在してもよいことが理解されよう。
【００３３】
さらに、所定のタンパク質又はポリペプチドは、多くの種類の修飾を含んでもよい。修飾は、ペプチドバックボーン、アミノ酸側鎖及びアミノ又はカルボキシル末端を含む、タンパク質又はポリペプチドの任意の位置において行なわれてもよい。修飾は、例えば、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチド又はヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質又は脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、架橋結合、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合架橋の形成、システインの形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、γ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解過程、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、グリコシル化、脂質結合、硫酸化、グルタミン酸残基のγ−カルボキシル化、ヒドロキシル化及びＡＤＰ−リボシル化、セレノイル化、硫酸化、転移−ＲＮＡ仲介によるアミノ酸のタンパク質への付加、例えばアルギニル化及びユビキチン化を含む。ＰＲＯＴＥＩＮＳ−ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ ＡＮＤ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＰＲＯＰＥＲＴＩＥＳ、２ｎｄ Ｅｄ．，Ｔ．Ｅ． Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ， Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９３）及びＷｏｌｄ，Ｆ．，Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ，ｐｇｓ．１−１２ ｉｎ Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｖａｌｅｎｔ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ， Ｈ．Ｃ．Ｊｏｈｎｓｏｎ， Ｅｄ．， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８３）、Ｓｅｉｆｔｅｒ ｅｔ． ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８２：６２６−６４６（１９９０）及びＲａｔｔａｎ ｅｔ． ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ：Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄ Ａｇｉｎｇ， Ａｎｎ． Ｎ． Ｙ．Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．６６３：４８−６２（１９９２）。用語「誘導体」は、分岐鎖又は分岐鎖を伴う若しくは伴わない環状タンパク質又はポリペプチドにする化学的修飾も含む。環状、分岐鎖及び分岐鎖を伴う環状タンパク質又はポリペプチドは、翻訳後の天然プロセスの結果であり、完全な合成方法によっても形成されてもよい。
【００３４】
用語「ホモログ」は、そのアミノ酸配列において、２つのポリペプチドのアミノ酸位置の類似性を比較するのに通常使用される標準的な方法で測定され、対象とするアミノ酸配列の少なくとも６０％の同一性を有するタンパク質を指す。２つのタンパク質間の類似性又は同一性の程度を、ＣＯＭＰＵＴＡＴＩＯＮＡＬ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ， Ｌｅｓｋ、Ａ．Ｍ．，ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，１９８８，Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ： Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９３，Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ，ＰａｒｔＩ，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，及びＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，ｅｄｓ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ，１９９４，Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８７，Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．及びＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．，Ｍ Ｓｔｏｃｋｔｏｎ ｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９１、並びにＣａｒｉｌｌｏＨ．及びＬｉｐｍａｎ，Ｄ．，ＳＩＡＭ，Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ．，４８：１０７３（１９８８）に記載されているものを含むが周知の方法に限定されない方法により容易に計算することができる。同一性を測定する好ましい方法は、試験される配列間の最大の一致を算出するよう設計される。同一性及び類似性を測定する方法は、一般に入手可能なコンピュータプログラムに体系化されている。
【００３５】
２つの配列間の同一性及び類似性を測定するのに有用な好ましいコンピュータプログラム法は、ＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ． ｅｔ． ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１２（１）：３８７（１９８４））、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ及びＦＡＳＴＡ、Ａｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ． ｅｔ． ａｌ．， Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３−４１０（１９９０）を含むが、これらに限定されない。ＢＬＡＳＴＸプログラムは、ＮＣＢＩ及び他のソース（ＢＬＡＳＴ Ｍａｎｕａｌ、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ． ｅｔ． ａｌ．，ＮＣＢＩ ＮＬＭ ＮＩＨ Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．２０８９４、Ａｌｔｓｃｈｕｌ、Ｓ． ｅｔ． ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３−４１０（１９９０）より一般に入手可能である。例として、ＧＡＰ（Ｇｅｎｅｔｉｃ ＣｏｍｐｕｔｅｒＧｒｏｕｐ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）等のコンピュータアルゴリズムを使用して、配列の同一性を表す百分率を測定しようとする２つのタンパク質又はポリペプチドを、各々のアミノ酸が最適に一致するようにアラインする（アルゴリズムにより測定される「一致の長さ」）。
【００３６】
ギャップオープニングペナルティ（平均ダイアゴナルの３倍として計算、「平均ダイアゴナル」とは、使用する比較マトリクスのダイアゴナルの平均であり、「ダイアゴナル」とは、特定の比較マトリクスにより、アミノ酸の完全一致の各々に割り当てられるスコア又は数である）及びギャップエクステンションペナルティ（通常、ギャップオープニングペナルティの１／１０倍）、並びに、例えば、ＰＡＭ２５０又はＢＬＯＳＵＭ６２等の比較マトリクスを、アルゴリズムと併せて使用する。標準的な比較マトリクス（ＰＡＭ２５０比較マトリクスに関しては、Ｄａｙｈｏｆｆ ｅｔ． ａｌ．， Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、ｖｏｌ．５、ｓｕｐｐ．３［１９７８］を参照、ＢＬＯＳＵＭ６２比較マトリクスに関しては、Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ｅｔ． ａｌ．， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ、８９：１０９１５−１０９１９［１９９２］を参照）も、アルゴリズムにより使用されてもよい。次に、同一性の百分率をアルゴリズムにより計算する。一般的に、ホモログは、比較対象のアミノ酸と比較して、場合により１以上のアミノ酸置換、欠損及び／又は挿入を有する。
【００３７】
用語「ペプチド模倣体」又は「模倣体」は、ペプチド又はタンパク質の生物学的活性を模倣するが、化学的性質においてペプチド性を持たない、即ち、ペプチド結合（即ち、アミノ酸間のアミド結合）を全く含まない、生物学的に活性な化合物を指す。用語「ペプチド模倣体」は、例えば、擬ペプチド、セミペプチド及びペプトイド等の、実際に完全なペプチド性を持たない分子を含む広義な意味で使用される。この広義な意味でのペプチド模倣体の例（ペプチドの一部が、ペプチド結合を欠いた構造で置換）について、以下に説明する。完全又は一部が非ペプチドであるかに関わらず、本発明によるペプチド模倣体は、ペプチド模倣体がベースとなる対象とするペプチドの活性基の三次元配置と大変類似の反応性のある化学部分の空間配置を提供する。この類似した活性部位の構造によって、ペプチド模倣体は、生体系に対して対象とするペプチドの生物学的活性と同様の効果がある。
【００３８】
本発明のペプチド模倣体は、三次元形状及び生物学的活性の両面において、本願明細書に記載する対象とするペプチドと実質的に類似していることが好ましい。ペプチドを構造的に修飾してペプチド模倣体を形成する当分野において周知の方法の例は、特にＮ−末端において、活性に悪い影響を与えることなくタンパク質分解による劣化に対して安定性を高めるＤ−アミノ酸残基構造を導くバックボーンのキラル中心の反転を含む。１つの例は、論文「Ｔｒｉｔｒｉａｔｅｄ Ｄ−ａｌａ１−Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｔ Ｂｉｎｄｉｎｇ」、Ｓｍｉｔｈ Ｃ．Ｓ． ｅｔ． ａｌ．， Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｒｅｓ．，１５，ｐｐ．３７１−３７９（１９８８）に記載されている。第２の方法は、例えばＮからＣへの鎖間結合イミド及びラクタムのように、環構造を安定化のために改変することである（Ｅｄｅ ｅｔ． ａｌ．， Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｒｉｖｉｅｒ（Ｅｄｓ．）「Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｅｓｃｏｍ、Ｌｅｉｄｅｎ（１９９１）、ｐｐ．２６８−２７０）。この１つの例は、例えば米国特許第４４５７４８９号（１９８５）に開示されているような、構造的に制限されたチモペンチン状化合物である。第３の方法は、対象とするペプチドのペプチド結合を、タンパク質分解に対する抵抗性を付与する擬ペプチド結合で置換することである。
【００３９】
ペプチドの構造及び生物学的活性に影響を与えない、多数の擬ペプチド結合が記載されている。このアプローチの１つでは、ｒｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｓｏ型擬ペプチド結合で置換する（Ｒｉｖｉｅｒ、Ｊ．Ｅ．ａｎｄ Ｍａｒｓｈａｌｌ、Ｇ．Ｒ．（ｅｄｓ）「Ｐｅｐｔｉｄｅｓ、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｅｓｃｏｍ、Ｌｅｉｄｅｎ（１９９０）、ｐｐ．７２２−７７３の「Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ ａｃｔｉｖｅ ｒｅｔｒｏ ｉｎｖｅｒｓｏ ａｎａｌｏｇｕｅｓ ｏｆ ｔｈｙｍｏｐｅｎｔｉｎ」、ＳｉｓｔｏＡ ｅｔ． ａｌ．及びＤａｌｐｏｚｚｏ ｅｔ． ａｌ．（１９９３）、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．，４１：５６１−５６６、参照により本願明細書に組み入れられる）。この変更によれば、ペプチドのアミノ酸配列は、１以上のペプチド結合がｒｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｓｏ型擬ペプチド結合で置換されている以外は、対象とするアミノ酸配列の配列と同一であってよい。Ｎ−末端側のペプチド結合を置換することが最も好ましく、それは、そのような置換が、Ｎ−末端上に作用するエキソペプチダーゼによるタンパク質分解に対する抵抗性を付与するためである。さらに、アミノ酸の化学基を、同様の構造の他の化学基と置換することにより修飾してもよい。生物学的活性を全く又は殆ど損なうことなく、酵素切断に対する安定性を高める他の周知の適切な擬ペプチド結合は、還元型イソスター擬ペプチド結合である（Ｃｏｕｄｅｒ ｅｔ． ａｌ．，（１９９３）、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．，４１：１８１−１８４、その全体が参照により本願明細書に組み入れられる）。
【００４０】
従って、これらのペプチドのアミノ酸配列は、１以上のペプチド結合がイソスター擬ペプチド結合で置換されていることを除いて、対象とするアミノ酸配列の配列と同一であってよい。最もＮ−末端側のペプチド結合を置換するのが好ましく、それは、そのような置換が、Ｎ−末端上に作用するエキソペプチダーゼによるタンパク質分解に対する抵抗性を付与するためである。１以上の還元型イソスター擬ペプチド結合を有するペプチドの合成は、当分野において周知である［Ｃｏｕｄｅｒ ｅｔ． ａｌ．（１９９３）、上記に引用］。他の例は、ケトメチレン又はメチルスルフィド結合を導入して、ペプチド結合を置換することを含む。
【００４１】
ペプトイド誘導体は、生物学的活性のための重要な構造的決定因子を保持するペプチド模倣体の別のクラスであるが、ペプチド結合を削除することにより、タンパク質分解に対する抵抗性が付与される（Ｓｉｍｏｎ ｅｔ． ａｌ．，１９９２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：９３６７−９３７１、その全体が参照により本願明細書に組み入れられる）。ペプトイドは、Ｎ−置換グリシンのオリゴマーである。各々天然アミノ酸の側鎖に対応する、多数のＮ−アルキル基が記載されている（Ｓｉｍｏｎ ｅｔ． ａｌ．（１９９２）、上記に引用）。対象とする分子の数個又は全部のアミノ酸が、置換アミノ酸に対応するＮ−置換グリシンで置換されてもよい。
【００４２】
用語「ペプチド模倣体」又は「模倣体」は、反転−Ｄペプチド及びエナンチオマーも含む。用語「反転−Ｄペプチド」は、対象とするペプチドのＬ−アミノ酸配列と比較して、逆順に配列されたＤ−アミノ酸からなる、生物学的に活性なタンパク質又はペプチドを指す。用語「エナンチオマー」は、１以上の対象とするペプチドのアミノ酸配列内のＬ−アミノ酸残基が、対応する（１以上の）Ｄ−アミノ酸残基で置換されている、生物学的に活性なタンパク質又はペプチドを指す。
【００４３】
ＬＯＸ−１の様々な種が単離され、配列決定されており、比較的有意な種間の相違性が明らかになっている［Ｃｈｅｎ、Ｍ ｅｔ． ａｌ．， Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，３５５：２８９−９５（２００１）］。米国特許第５９６２２６０号及び米国特許第６１９７９３７号は、ヒト及びウシＬＯＸ−１のアミノ酸配列を開示している。任意の種からＬＯＸ−１を単離するための、これら文献に開示された技術を使用して、ＨＳＰペプチド（Ｅ）のＬＯＸ−１に対する結合を容易に確立することができる。
【００４４】
このように、結合部分（Ｅ）は、周知のＬＯＸ−１ポリペプチドのアミノ酸配列が与えられる場合、周知の技術（一般的に、単離又は合成）により得ることができる。周知の及び／又は考えられる抗原決定基又はエピトープ結合部位が与えられる場合、ＬＯＸ−１の特定の部分のみに結合する部分（Ｅ）も合成することができる。
【００４５】
異なるＥ基の結合親和性のスクリーニング及び評価に、多数の方法を使用することができる。１つの方法は、例えばインビトロでの蛍光ベースの実験を含む。細胞ベースのアッセイにおいて、同時に、検出に必要なシグナルの生成する要素の量、つまり結合部分（Ｅ）のコンジュゲートに必要なシグナルの生成する要素の量に関する情報を得ることができる。このような実験において、蛍光色素は、好ましくは例えばアミノ酸配列ＫＫＧＧ（Ｋ＝リシン、Ｇ＝グリシン）等の可撓性リンカーを介してＨＳＰペプチドのＮ−末端に結合される。Ｎ−末端が色素を付着する更なる官能基末端を持たないシグナル伝達部分に結合される場合、色素は配列内（例、リンカー内）に組み込まれたＫ残基の側鎖アミンを介して結合することもできる。
【００４６】
使用するスクリーニングアッセイの種類に関わらず、（例、一般的なインビトロモデル）、基質表面上のＬＯＸ−１の量が、まず、その基質が細胞又は別の基質かに関わらず周知であると仮定する。マルチウェル透明プレート内で、ＬＯＸ−１はウェル全体にて均一に（純粋なＬＯＸ−１タンパク質として又は細胞上に発現して）存在する。次いで、標識ＨＳＰペプチドを加え、異なるウェル内で最適な時間インキュベートすることができる。次いで、例えばリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）等の緩衝剤でウェルを徹底的に洗浄し、続いてレーザーを照射して、取り付けた色素を励起させ蛍光発光を開始して、プレートをイメージングする。各ウェルからの蛍光の強度、つまり、様々なペプチド結合の程度を定量化することができる。絶対結合数を得るためには、結合アッセイの同様の条件下で、周知の量の色素コンジュゲートＨＳＰペプチドの蛍光強度を得ることにより、シグナルをさらに調整することが好ましい。ＬＯＸ−１分子の数が周知であり、また結合するペプチドの量が求められている場合、結合親和性を評価する解離定数を計算することができる。このように、様々なＨＳＰペプチドの結合親和性を定量的にスクリーニングすることができる。細胞当たりの結合ペプチドの数も、ペプチドにコンジュゲートしたシグナルを生成する要素からの検出可能なシグナルの得るのに必要なパラメータに関する情報を提供することができる。
【００４７】
アッセイにおいて、画像は、レーザー共焦点顕微鏡又は撮像装置を使用して得てもよい。例えば、細胞に結合するペプチドの画像は、以下のようにレーザー共焦点顕微鏡を使用して得ることができる。ＨＣＡＥ細胞を高品質ホウケイ酸塩８−チャンバガラススライド（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｆｏｒｔ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、ＰＡ）上で増殖させることができる。次いで、標識ペプチドの１ｍｇ／ｍｌ水溶液約１０μＬを細胞に加えて、１時間インキュベートする。その後、好ましくは細胞をＨＢＳＳ緩衝液で３回洗浄する。次いで、細胞を４％ホルムアルデヒド溶液で１０分間固定化することができる。緩衝液による最後の洗浄後、スライドをイメージングする。画像は、Ａｒイオンレーザー（４８８ｎｍ線を選択）及び５１０ｎｍロングパスフィルターを使用して、ＯＬＹＭＰＵＳレーザー走査共焦点顕微鏡、Ｆｌｕｏｖｉｅｗ ３００モデルにより得ることが好ましい。画像は、２つのチャネル、反射光及び蛍光モードチャネル又は両方のチャネルのオーバーレイを用いて獲得することができる。さらに、例えば、共焦点顕微鏡法を介して内在化のレベルを調べることが可能である。共焦点顕微鏡法は、三次元全域を走査する能力を備えることによって、細胞内部及び細胞表面全体を検査することができる。従って、蛍光剤が内在化したか否かを詳細に調べることができる。
【００４８】
より高いスループットのスクリーニングのために、上述した方法を拡張することができる。９６ウェルプレートを８ウェルスライドと交換し、共焦点顕微鏡をＢｉｏｒａｄ撮像装置、ＦＸ Ｐｒｏｐｌｕｓモデルと交換してもよい。例えば、細胞に結合するフルオレセイン標識ＨＳＰの画像は、撮像装置を使用して得ることができ、それによりＨＣＡＥ細胞を、一般に市販されている９６ウェルプレート（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）上のウェル内に置き、増殖させることができる。次いで、１ｍｇ／ｍｌ標識ＨＳＰ水溶液約１０μＬを細胞に加え、１時間インキュベートすることができる。その後、好ましくは細胞をＰＢＳ緩衝液で３回洗浄する。緩衝液による最後の洗浄後、蛍光プローブとして「フルオレセイン」を選択して、Ｂｉｏｒａｄ撮像装置を使用してスライドをイメージングすることができる。
【００４９】
シグナル伝達部分（ＳＩＧ）
「シグナル伝達部分」ＳＩＧは、インビボ又はインビトロで検出することができるシグナルを提供する。ＳＩＧは、それ自体で又は他の物質と反応することによりイメージング可能であり、検出機器を用いてインビボ又はインビトロで検出可能な構成要素を示す。適切なシグナル部分（ＳＩＧ）は、蛍光色素、放射性核種、近赤外色素、磁気的に活性な同位体、超常磁性粒子、５０を越えるＺ値を有する金属イオン、例えばミセル、リポソーム、ポリソーム及びガス封入マイクロバブル等の封入種、並びにこれらの組合せを含む。結合部分（Ｅ）のＬＯＸ−１に対する結合を損なうことなく、結合部分（Ｅ）に結合して検出可能なシグナルを生成することができる限り、任意のシグナル部分／ソースを使用することができる。
【００５０】
インビボでのイメージングに適切なＳＩＧ部分は、
・単一光子放射型コンピュータ断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）によるイメージングのためのγ放射体である放射性核種、
・陽電子放射断層撮影（ＰＥＴ）のための陽電子放射体である放射性核種、
・光学的イメージングのための蛍光又は化学発光を発することできる色素、
・Ｘ線イメージング、コンピュータ断層撮影法（ＣＴ）のための、ハイ−Ｚ元素、好ましくはヨウ素又はビスマスを含む分子、
・超音波検査法のための、ガス封入マイクロバブル、フッ化炭素充填ミセル、
・核磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）のための、例えばキレートＧｄ＋＋＋等の常磁性イオン又は例えば超常磁性酸化鉄ナノ粒子（ＳＰＩＯ）等の超常磁性粒子又は
・好ましくは酸化鉄及び元素鉄の少なくともどちらかを含むナノ粒子である超常磁性粒子、を含む。
【００５１】
ＳＩＧ基は、インビボでのイメージングに適していることが好ましい。そのようなＳＩＧ基は、哺乳類身体の外部から、即ちインビボでの使用のために設計された検出器、例えば血管内照射又は例えば内視鏡等の光学検出器又は術中使用のために設計された放射線検出器を使用して検出してもよい。好ましいインビボＳＩＧ基は、インビボで、投与後に非侵襲的方法で外部から検出可能なものである。インビボでのイメージングに適切な最も好ましいＳＩＧ基は、特にＳＰＥＣＴ又はＰＥＴを用いるイメージングに適切な、放射性、特に放射性金属イオン、γ線を放射する放射性ハロゲン及び陽電子を放出する放射性非金属である。
【００５２】
インビボでのイメージングに適したＳＩＧは、最も好ましくは、
（ｉ）放射性金属イオン、
（ｉｉ）常磁性金属イオン、
（ｉｉｉ）γ線を放射する放射性ハロゲン、
（ｉｖ）陽電子を放出する放射性非金属、
（ｖ）過分極ＮＭＲ活性核、
（ｖｉ）インビボでの光学的イメージングに適したレポーター、
（ｖｉｉ）血管内検出に適したβ−放射体、から選択される。
【００５３】
ＳＩＧが放射性金属イオン、即ち放射性金属の場合、適切な放射性金属は、例えば６４Ｃｕ、４８Ｖ、５２Ｆｅ、５５Ｃｏ、９４ｍＴｃ又は６８Ｇａ等の陽電子放射体、例えば９９ｍＴｃ、１１１Ｉｎ、１１３ｍＩｎ又は６７Ｇａ等のγ−放射体のいずれであってよい。好ましい放射性金属は、９９ｍＴｃ、６４Ｃｕ、６８Ｇａ及び１１１Ｉｎである。最も好ましい放射性金属は、γ−放射体、特に９９ｍＴｃである。
【００５４】
ＳＩＧが常磁性金属イオンの場合、適切なそのような金属イオンは、Ｇｄ（ＩＩＩ）、Ｍｎ（ＩＩ）、Ｃｕ（ＩＩ）、Ｃｒ（ＩＩＩ）、Ｆｅ（ＩＩＩ）、Ｃｏ（ＩＩ）、Ｅｒ（ＩＩ）、Ｎｉ（ＩＩ）、Ｅｕ（ＩＩＩ）又はＤｙ（ＩＩＩ）を含む。好ましい常磁性金属イオンは、Ｇｄ（ＩＩＩ）、Ｍｎ（ＩＩ）及びＦｅ（ＩＩＩ）であり、Ｇｄ（ＩＩＩ）が特に好ましい。
【００５５】
ＳＩＧがγ線を放射する放射性ハロゲンの場合、放射性ハロゲンは、適切には１２３Ｉ、１３１Ｉ及び７７Ｂｒから選択される。好ましいγ線放出放射性ハロゲンは、１２３Ｉである。
【００５６】
ＳＩＧが陽電子を放出する放射性非金属の場合、そのような適切な陽電子放射体は、１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏ、１７Ｆ、１８Ｆ、７５Ｂｒ、７６Ｂｒ又は１２４Ｉを含む。好ましい陽電子放出放射性非金属は、１１Ｃ、１３Ｎ、１８Ｆ及び１２４Ｉであり、特に１１Ｃ及び１８Ｆが好ましく、特に１８Ｆが最も好ましい。
【００５７】
ＳＩＧが過分極ＮＭＲ−活性核の場合、そのようなＮＭＲ−活性原子核は、核スピンがゼロであり、１３Ｃ、１５Ｎ、１９Ｆ、２９Ｓｉ及び３１Ｐを含む。これらのうちでは、１３Ｃが好ましい。用語「過分極」は、ＮＭＲ−活性原子核の平衡分極を越えた、分極の程度の増大を意味する。（１２Ｃに対する）１３Ｃの天然存在度は約１％であり、適切な１３Ｃ標識化合物は、過分極化される前に、少なくとも５％、好ましくは少なくとも５０％、最も好ましくは少なくとも９０％に適切に濃縮される。式（Ｉ）の化合物の少なくとも１つの炭素原子は、適切には１３Ｃで濃縮され、続いて該１３Ｃは過分極化される。
【００５８】
ＳＩＧがインビボでの光学的イメージングに適するレポーターの場合、該レポーターは、光学的イメージング法において直接的に又は間接的に検出することが可能な任意の部分である。レポーターは、光散乱体（例、着色又は非着色粒子）、光吸収体又は光放射体である可能性がある。レポーターは、発色団又は蛍光化合物等の色素であることがより好ましい。色素は、紫外線光から近赤外光までの波長を伴う電磁スペクトル内の光と相互作用する任意の色素であってよい。レポーターは、蛍光特性を有することが最も好ましい。
【００５９】
好ましい有機発色団及び蛍光団レポーターは、広範囲に非局在化した電子系を有する基、例えばシアニン、メロシアニン、インドシアニン、フタロシアニン、ナフタロシアニン、トリフェニルメチン、ポルフィリン、ピリリウム色素、チオピリリウム（ｔｈｉａｐｙｒｉｌｉｕｐ）色素、スクアリリウム色素、クロコニウム色素、アズレニウム色素、インドアニリン、ベンゾフェノキサジニウム色素、ベンゾチアフェノチアジニウム色素、アントラキノン、ナフトキノン、インダスレン、フタロイルアクリドン、トリスフェノキノン、アゾ色素、分子内及び分子間電荷移動色素及び色素錯体、トロポン、テトラジン、ビス（ジチオレン）錯体、ビス（ベンゼン−ジチオレート）錯体、ヨードアニリン色素、ビス（Ｓ、Ｏ−ジチオレン）錯体を含む。蛍光タンパク質、例えば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）及び様々な吸収／放射特性を有するＧＦＰの修飾も有用である。所定の希土類金属（例、ユーロピウム、サマリウム、テルビウム又はジスプロシウム）の錯体も、蛍光ナノ結晶（量子ドット）のように、所定の文脈において使用される。
【００６０】
使用することができる発色団の特定の例は、フルオレセイン、スルホローダミン１０１（Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ）、ローダミンＢ、ローダミン６Ｇ、ローダミン１９、インドシアニングリーンＣｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、Ｍａｒｉｎａ Ｂｌｕｅ、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ ８８、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ ５１４、テトラメチルローダミン、並びにＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ３５０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４３０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５３２、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５６８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６３３、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６６０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６８０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７００及びＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７５０を含む。
【００６１】
特に好ましくは、可視又は近赤外領域内、４００ｎｍ〜３μｍ、特に６００〜１３００ｎｍに吸収極大を有する色素である。
【００６２】
光学的イメージングモダリティ及び測定技術は、発光イメージング、内視鏡検査、蛍光内視鏡検査、光干渉断層法、透過率イメージング、時間分解透過率イメージング、共焦点イメージング、非線形顕微鏡法、光音響イメージング、音響光学イメージング、分光法、反射分光法、干渉分光法、コヒーレンス干渉法、拡散光トモグラフィー及び蛍光を介した拡散光トモグラフィー（連続波、時間領域及び周波数領域系）、並びに光散乱、吸収、偏光、発光、蛍光寿命、量子収量及び消光の測定を含むが、これらに限定されない。
【００６３】
イメージング部分が、血管内検出に適したβ−放射体である場合、適切なそのようなβ−放射体は、放射性金属６７Ｃｕ、８９Ｓｒ、９０Ｙ、１５３Ｓｍ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ又は１９２Ｉｒ、並びに非金属３２Ｐ、３３Ｐ、３８Ｓ、３８Ｃｌ、３９Ｃｌ、８２Ｂｒ及び８３Ｂｒを含む。
【００６４】
特に好ましいシグナル部分は、フルオレセイン、１１Ｃ、１８Ｆ、５２Ｆｅ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、８６Ｙ、８９Ｚｒ、９４ｍＴｃ、９４Ｔｃ、９９ｍＴｃ、１１１Ｉｎ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１５４−１５８Ｇｄ及び１７５Ｌｕ、超常磁性酸化鉄ナノ粒子、重金属イオン、ガス封入マイクロバブル、光学色素、ポルフィリン、テキサフィリン、高度にヨウ化された有機化合物、そのキレート、前述した成分の１種以上を含むポリマー、前述した成分の１種以上を含むエンドエドラル（ｅｎｄｏｅｄｒａｌ）フラーレン及びそれらの混合物を含む。さらに好ましくは、シグナル部分が、ＰＥＴに関しては１８Ｆ、ＭＲＩに関しては超常磁性酸化鉄ナノ粒子（ＳＰＩＯ）又はキレートＧｄ、Ｘ線ＣＴに関してはヨウ素及びＳＰＥＣＴに関しては９９ｍＴｃである。インビボでのイメージングに特に好ましい実施形態では、ＳＩＧは、１８Ｆ、１１Ｃ、６８Ｇａ及び６４Ｃｕ（ＰＥＴに関しては）から選択された陽電子放出放射性同位体又は１２３Ｉ及び９９ｍＴｃ（ＳＰＥＣＴに関しては）から選択されたγ線放出放射性同位体である。最も好ましくは、シグナル部分は、ＰＥＴに関しては１８Ｆである。
【００６５】
ＳＩＧは、当分野において周知の方法により導入されてもよい。放射性ＳＩＧ基は、適切な前駆体の放射標識により都合よく導入することができる。「前駆体」は、結合部分Ｅの非放射性誘導体を適切に含み、該非放射性誘導体は、所望の非金属放射性同位体の都合よい化学形態との化学反応を、最小のステップ数（理想的には１ステップ）で、かつ所望の放射性生成物を得る有意な精製を必要とすることなく（理想的には更なる精製工程なしで）行なうことができるように設計されている。そのような前駆体は合成品であり、高い化学的純度で好適に得られる。「前駆体」は、ＨＳＰペプチドの所定の官能基のための保護基（ＰＧＰ）を任意に含んでもよい。適切な前駆体は、Ｂｏｌｔｏｎ、Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｏｍｐ．Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ．，４５，４８５−５２８（２００２）に記載されている。
【００６６】
用語「保護基」（ＰＧＰ）は、望ましくない化学反応を阻害又は抑制するが、分子の他の部分を変更しない十分に穏やかな条件下で、対象とする官能基から切断するのに十分な反応性を有するよう設計される基を意味する。脱保護の後、所望の生成物が得られる。保護基は、当業者に周知であり、適切には、アミン基に関しては、Ｂｏｃ（即ち、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル）、Ｆｍｏｃ（即ち、フルオレニルメチルカルボニル）、トリフルオロアセチル、アリルオキシカルボニル、Ｄｄｅ［即ち、１−（４，４−ジメチル２，６−ジオキソシクロヘキシリデン）エチル］又はＮｐｙｓ（即ち、３−ニトロ−２−ピリジンスルフェニル）、カルボキシル基に関しては、メチルエステル、ｔｅｒｔ−ブチルエステル又はベンジルエステルから選択される。ヒドロキシル基に関して、適切な保護基は、メチル、エチル若しくはｔｅｒｔ−ブチル、アルコキシメチル若しくはアルコキシエチル、ベンジル、アセチル、ベンゾイル、トリチル（Ｔｒｔ）又はトリアルキルシリル、例えばテトラブチルジメチルシリルである。チオール基に関して、適切な保護基は、トリチル及び４−メチルベンジルである。更なる保護基の使用は、「Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」、Ｔｈｅｏｒｏｄｏｒａ Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ及びＰｅｔｅｒ Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ、（Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、１９９９）に記載されている。
【００６７】
非金属放射性同位体を用いた放射標識のための好ましい前駆体は、求電子又は求核のいずれかのハロゲン化を受けるか又はアルキル若しくはフルオロアルキルハライド、トシラート、トリフレート（即ち、トリフルオロメタンスルホネート）若しくはメシラートから選択されたアルキル化剤による容易なアルキル化を受けるか、アルキレートチオール部分をアルキル化してチオエーテル結合を形成するか又は標識アルデヒド若しくはケトンとの縮合を受ける誘導体を含む。第１のカテゴリーの例は、
（ａ）例えばトリアルキルスタンナン（例、トリメチルスタンニル若しくはトリブチルスタンニル）又はトリアルキルシラン（例、トリメチルシリル）等の有機金属誘導体、
（ｂ）ハロゲン交換のための非放射性ヨウ化アルキル又は臭化アルキル及び求核ハロゲン化のためのトシル酸アルキル、メシル酸アルキル又はアルキルトリフレート、
（ｃ）求電子ハロゲン化が行なわれるように活性化した芳香環（例、フェノール）及び求核ハロゲン化が行なわれるように活性化した芳香環（例、アリールヨウドニウム、アリールジアゾニウム、アリールトリアルキルアンモニウム塩又はニトロアリール誘導体）である。
【００６８】
容易なアルキル化を受ける好ましい誘導体は、アルコール類、フェノール類又はアミン類であり、特にフェノール類及び立体障害第一級又は第２級アミン類が好ましい。チオール含有放射性同位体反応物をアルキル化する好ましい誘導体は、Ｎ−ハロアセアチル類、特にＮ−クロロアセチル及びＮ−ブロモアセチル誘導体である。
【００６９】
前駆体は、固体支持体マトリクスに共有結合する状態で任意に供給されてもよい。その場合、所望のイメージング剤生成物を溶液中で形成しながら、出発物質及び不純物を固相に結合させたまま残留する。１８Ｆ−フッ化物を用いた固相の求電子フッ素化する前駆体は、国際公開第０３／００２４８９号パンフレットに記載されている。１８Ｆ−フッ化物を用いた固相の求核フッ素化する前駆体は、国際公開第０３／００２１５７号パンフレットに記載されている。
【００７０】
ＳＩＧが例えばヨウ素等の放射性ハロゲンの場合、前駆体は、非放射性ハロゲン原子、例えばヨウ化若しくは臭化アリール（放射性ヨウ素交換を可能にする）、活性化前駆体アリール環（例、フェノール基）、有機金属化合物（例、トリアルキル錫又はトリアルキルシリル）又は有機前駆体、例えばトリアゼン又は求核置換のための良好な脱離基、例えばヨードニウム塩を適切に含む。放射性ハロゲン（１２３Ｉ及び１８Ｆを含む）を導入する方法は、Ｂｏｌｔｏｎ［Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｏｍｐ．Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ．、４５、４８５−５２８（２００２）］に記載されている。放射性ハロゲン、特にヨウ素を結合し得る適切な前駆体アリール基の例を、以下に示す。
【００７１】
【化１】
双方とも芳香環上にて放射性ヨウ素置換を可能にする置換基を含有する。これに代わる放射性ヨウ素を含有する置換基は、放射性ハロゲン交換、例えば以下の直接ヨウ素化で合成し得る。
【００７２】
【化２】
ＳＩＧがヨウ素の放射性同位体である場合、放射性ヨウ素原子は、飽和脂肪族系に結合するヨウ素元素は、インビボで代謝を受けやすく、従って放射性ヨウ素は損失されることが周知であるため、好ましくは、例えばベンゼン環等の芳香環又はビニル基に対する直接共有結合を介して付着する。
【００７３】
ＳＩＧがフッ素の放射性同位体である場合、放射性フッ素原子は、フッ化アルキルが生体内代謝に対して抵抗性を有することから、フルオロアルキル又はフルオロアルコキシ基の一部を形成することができる。また、放射性フッ素原子は、芳香環、例えばベンゼン環に対して直接共有結合により付着することができる。１８Ｆ−フッ化物と、良好な脱離基、例えば臭化アルキル、メシル酸アルキル又はトシル酸アルキルを有する適切な前駆体との反応を用いた標識を直接介して放射性フッ素化することができる。１８Ｆはまた、例えば１８Ｆ（ＣＨ２）３ＯＭｓ（Ｍｓは、メシラートである）等のアルキル化剤を用いて、アミン前駆体をＮ−アルキル化してＮ−（ＣＨ２）３１８Ｆを得るか又は１８Ｆ（ＣＨ２）３ＯＭｓ若しくは１８Ｆ（ＣＨ２）３Ｂｒを用いてヒドロキシル基をＯ−アルキル化して導入することもできる。また、１８Ｆは、１８Ｆ（ＣＨ２）３ＯＨ反応物を用いたＮ−ハロアセアチル基のアルキル化により導入され、ＮＨ（ＣＯ）ＣＨ２Ｏ（ＣＨ２）３１８Ｆ誘導体を得ることができる。アリール系について、アリールジアゾニウム塩、アリールニトロ化合物又はアリール第４級アンモニウム塩からの１８Ｆ−フッ化物の求核置換が、アリール１８Ｆ誘導体への適切な経路である。
【００７４】
第一級アミン基を含む前駆体を、Ｋａｈｎ ｅｔ． ａｌ．［Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｏｍｐ．Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ．４５、１０４５−１０５３（２００２）］及びＢｏｒｃｈ ｅｔ． ａｌ．［Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．９３、２８９７（１９７１）］に教示されているように、１８Ｆ−Ｃ６Ｈ４−ＣＨＯを用いた還元的アミノ化により１８Ｆで標識することができる。この方法は、アリール第一級アミン、例えばフェニル−ＮＨ２又はフェニル−ＣＨ２ＮＨ２基を含む化合物にも有効に適用することができる。
【００７５】
１８Ｆで標識する好ましい方法は、Ｐｏｅｔｈｋｏ ｅｔ． ａｌ．［Ｊ．Ｎｕｃ．Ｍｅｄ．，４５，８９２−９０２（２００４）］に教示されているように、前駆体としてペプチドのアミノオキシ誘導体を使用することである。次いで、その前駆体を酸性条件下（例、ｐＨ２〜４）で１８Ｆ−Ｃ６Ｈ４−ＣＨＯと縮合させて、オキシムエーテル結合を介して所望の１８Ｆ−標識イメージング剤を与える。オキシムエーテルは、加水分解に対する抵抗性が遙かに大きい点で、イミンよりも有利である。
【００７６】
アミン含有前駆体を、例えば以下の１８Ｆ−標識活性エステルとの反応によって１８Ｆで標識して、アミド結合で結合する生成物を与えてもよい。
【００７７】
【化３】
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル及びそのペプチド標識における使用は、Ｖａｉｄｙａｎａｔｈａｎ ｅｔ． ａｌ．［Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．，１９（３），２７５−２８１（１９９２）］及びＪｏｈｎｓｔｒｏ金属［Ｃｌｉｎ．Ｓｃｉ．，１０３（Ｓｕｐｐｌ．４８）、４５−８５（２００２）］に教示されている。１８Ｆ−標識誘導体へ至る合成経路の更なる詳細は、Ｂｏｌｔｏｎ、Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｏｍｐ．Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ．，４５，４８５−５２８（２００２）に記載されている。
【００７８】
ＳＩＧが金属イオンを含んでいる場合、金属イオンは金属錯体として存在する。用語「金属錯体」は、１以上の配位子を有する、金属イオンの配位錯体を意味する。金属錯体は、「トランスキレーション（ｔｒａｎｓｈｅｌａｔｉｏｎ）に対して抵抗性を有する」、即ち金属配位部位に関して競合する可能性がある他の配位子との容易な配位子交換を受けないことが極めて好ましい。競合する可能性がある配位子は、ＨＳＰペプチドそれ自体及び生体外の製剤中の他の賦形剤（例、製剤中に使用される放射性防御物質若しくは抗菌保存剤）又は生体内の内因性化合物（例、グルタチオン、トランスフェリン若しくは血漿タンパク質）を含む。
【００７９】
金属錯体は、コンジュゲートである前駆体から誘導され（即ち、コンジュゲートした金属を配位する配位子）、配位子はＥ及びリンカー基Ｌ（存在する場合）のいずれかに共有結合する。
【００８０】
トランスキレーションに対して抵抗性を有する金属錯体を形成する、本発明に使用される適切な配位子は、２〜６、好ましくは２〜４個の金属供与体原子が、（金属供与体原子に結合する炭素元素及び複素原子のいずれかの非配座バックボーンを有することにより）５員又は６員のキレート環を形成するように配置されるキレート剤又は例えばイソニトリル、ホスフィン又はジアゼニド等の、金属イオンに対して強力に結合する供与体原子を含む単座配位子を含む。キレート剤の一部として金属に良好に結合する供与体原子の例は、アミン、チオール、アミド、オキシム及びホスフィンである。ホスフィンは強力な金属錯体を形成することによって、単座又は二座のホスフィンでさえも適切な金属錯体を形成する。イソニトリル及びジアゼニドの線状構造は、キレート剤への容易な組み込みに有用ではないため、単座配位子として使用される。適切なイソニトリルの例は、例えばｔｅｒｔ−ブチルイソニトリル等の単純アルキルイソニトリル及び例えばｍｉｂｉ（即ち、１−イソシアノ−２−メチル−２−メチルプロパン）等のエーテル置換イソニトリルを含む。適切なホスフィンの例は、テトロフォスミン及び例えばトリス（３−メチルプロピル）ホスフィン等の単座ホスフィンを含む。適切なジアゼニドの例は、配位子のＨＹＮＩＣシリーズ、即ち、ヒドラジン置換ピリジン又はニコチンアミドを含む。
【００８１】
トランスキレーションに対して抵抗性を有する金属錯体を形成するテクネチウムに対する適切なキレート剤の例は、以下の（ｉ）〜（ｖ）を含むが、これに限定されない。
【００８２】
（ｉ）式のジアミンジオキシム
【００８３】
【化４】
式中、Ｅ１〜Ｅ６は各々独立にＲ′基であり、
各Ｒ′は、Ｈ若しくはＣ１−１０アルキル、Ｃ３−１０アルキルアリール、Ｃ２−１０アルコキシアルキル、Ｃ１−１０ヒドロキシアルキル、Ｃ１−１０フルオロアルキル、Ｃ２−１０カルボキシアルキル若しくはＣ１−１０アミノアルキルであるか又は２つ若しく３個以上のＲ′基は、それらが結合する元素と共炭素環、複素環、飽和若しくは不飽和環を形成し、かつ１以上のＲ′基は、式（Ｉ）の−（Ｌ）ｎＥに結合し、
Ｑは、式−（Ｊ）ｆ−の架橋基であり、
ｆは、３、４又は５であり、各Ｊは、独立に−Ｏ−、−ＮＲ′−又は−Ｃ（Ｒ′）２−であり、但し、Ｊ基は、−Ｏ−、−ＮＲ′−の少なくとも１つを含有し、
好ましいＱ基は、
Ｑ＝−（ＣＨ２）（ＣＨＲ′）（ＣＨ２）−即ち、プロピレンアミンオキシム又はＰｎＡＯ誘導体、
Ｑ＝−（ＣＨ２）２（ＣＨＲ′）（ＣＨ２）２−即ち、ペンチレンアミンオキシム又はＰｅｎｔＡＯ誘導体、
Ｑ＝−（ＣＨ２）２ＮＲ′（ＣＨ２）２−であり、
Ｅ１〜Ｅ６は、好ましくはＣ１−３アルキル、アルキルアリールアルコキシアルキル、ヒドロキシアルキル、フルオロアルキル、カルボキシアルキル及びアミノアルキルから選択される。最も好ましくは、Ｅ１〜Ｅ６基の各々は、ＣＨ３であり、
コンジュゲーションは、好ましくはＥ１若しくはＥ６Ｒ′基のいずれか又はＱ部分のＲ′基に存在する。最も好ましくは、ＨＳＰペプチドはＱ部分のＲ′基に結合する。ＨＳＰペプチドがＱ部分のＲ′基に結合する場合、Ｒ′基は橋頭位置に存在するのが好ましい。その場合、Ｑは、好ましくは−（ＣＨ２）（ＣＨＲ′）（ＣＨ２）−、−（ＣＨ２）２（ＣＨＲ′）（ＣＨ２）２−又は−（ＣＨ２）２ＮＲ′（ＣＨ２）２−であり、最も好ましくは−（ＣＨ２）２（ＣＨＲ′）（ＣＨ２）２−であり、特に好ましい二官能性ジアミンジオキシムキレート剤は、次の式のものであり、従ってＨＳＰペプチドは、橋頭−ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２基を介して結合するジアミンジオキシムである。
【００８４】
【化５】
（ｉｉ）例えばＭＡＧ３（メルカプトアセチルトリグリシン）等のチオールトリアミド供与体の組又は例えばＰｉｃａ等のジアミドピリジンチオール供与体の組を有するＮ３Ｓ配位子及び関連する配位子
（ｉｉｉ）例えばＢＡＴ又はＥＣＤ（即ち、エチルシステイナート二量体）等のジアミンジチオール供与体の組を有する又は例えばＭＡＭＡ等のアミドアミンジチオール供与体の組を有するＮ２Ｓ２配位子
（ｉｖ）例えばサイクラム、モノオキソサイクラム又はジオキソサイクラム等のテトラミン、アミドトリアミン又はジアミドジアミン供与体の組を有する鎖状又は大環状配位子であるＮ４配位子
（ｖ）ジアミンジフェノール供与体を有するＮ２Ｏ２配位子 。
【００８５】
上述した配位子は、テクネチウム例えば９４ｍＴｃ又は９９ｍＴｃを錯化するのに特に適しており、Ｊｕｒｉｓｓｏｎ ｅｔ． ａｌ．［Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．，９９，２２０５−２２１８（１９９９）］により完全に記載されている。配位子は、他の金属、例えば銅（６４Ｃｕ又は６７Ｃｕ）、バナジウム（例、４８Ｖ）、鉄（例、５２Ｆｅ）又はコバルト（例、５５Ｃｏ）にも有用である。他の適切な配位子は、Ｓａｎｄｏｚによる国際公開第９１／０１１４４号パンフレットに記載されており、インジウム、イットリウム及びガドリニウムに特に適した配位子、特に大環状アミノカルボキシラート及びアミノホスホン酸配位子を含む。ガドリニウムの非イオン性（即ち、中性）金属錯体を形成する配位子は周知であり、米国特許第４８８５３６３号に記載されている。放射性金属イオンがテクネチウムの場合、配位子は、四座であるキレート剤が好ましい。テクネチウムのための好ましいキレート剤は、ジアミンジオキシム又は上述したＮ２Ｓ２若しくはＮ３Ｓ供与体の組を有する。
【００８６】
連結剤
Ｌは、Ｙ、即ちシグナル部分ＳＩＧ又は治療薬ＴＡを結合部分（Ｅ）に接続することができる任意の部分を含む。説明した各実施形態では、Ｌは、独立に選択されてもよい。例えば、リンカーは、２以上の原子価の有機基、１種以上の金属陽イオンと結合する金属キレート剤又はその組合せであってよい。多くの場合、ＳＩＧをＥに又はＴＡをＥに付着するため、Ｌを含むことが好ましい。即ち、式（Ｉ）のｎは１である。
【００８７】
上記したように、ＳＩＧが金属の場合、Ｌは、金属を配位する配位子又はキレート剤を任意に含んでもよい。
【００８８】
２以上の原子価の有機部分は、Ｌとして有用であり、例えばベンゾエート又はプロピオネート等の小さい有機部分を含む（図４）。有機基は、共有結合的に又はイオン結合的に、Ｅ及びＹの双方に結合してもよい。連結剤として使用するに適した有機部分は、一般的に約１〜約１０，０００個の炭素元素を有し、アルキレン、アリーレン、シクロアルキレン、アミノアルキレン、アミノアリーレン、アミノシクロアルキレン、チオアルキレン、チオアリーレン、チオシクロアルキレン、オキシアルキレン、オキシアリーレン、オキシシクロアルキレン、アシルアルキレン、アシルアリーレン、アシルシクロアルキレン単位及びその組合せからなる群から選択される有機基を含んでもよい。特に好ましいアシルアリーレン単位は、以下の構造の４−アシルフェニレン基である。
【００８９】
【化６】
他の適切な連結剤は、金属キレート剤、例えばＤＴＰＡ、１，４，７−トリアザ−シクロノナン−Ｎ，Ｎ′，Ｎ″−三酢酸（ＮＯＴＡ）、ｐ−ブロモアセトアミド−ベンジル−テトラエチルアミンテトラ酢酸（ＴＥＴＡ）、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカンテトラ酢酸（ＤＯＴＡ）、ＥＤＴＡ及びＣＨＸａの１以上を含む。金属キレート剤は、５２Ｆｅ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、８６Ｙ、８９Ｚｒ、９４ｍＴｃ、９４Ｔｃ、９９ｍＴｃ、１１１Ｉｎ、１５４−１５８Ｇｄ及び１７５Ｌｕの陽イオンから選択される少なくとも一種の金属に結合できることが好ましい。
【００９０】
当業者には明らかであろうが、様々な連結剤が所定のシグナル部分と共に使用される。例えば、金属シグナル生成部分、例えば６４Ｃｕは、一般的に結合配位子を必要とするが、１８Ｆは結合配位子を必要としない。さらに、標識した人工官能基、例えば１８Ｆ−フルオロプロピオネート又は１８Ｆ−フルオロベンゾエート（図４）を一旦調製したら、活性エステルのコンジュゲーションによりペプチドにコンジュゲートすることができるように使用することもできる。
【００９１】
Ｌは、好ましくは式−（Ａ）ｚ−を有し、式中、各Ａは、独立に、
−ＣＲ２−、−ＣＲ＝ＣＲ−、−Ｃ≡Ｃ−、−ＣＲ２ＣＯ２−、−ＣＯ２ＣＲ２−、−ＮＲＣＯ−、−ＣＯＮＲ−、−ＮＲ（Ｃ＝Ｏ）ＮＲ−、−ＮＲ（Ｃ＝Ｓ）ＮＲ−、−ＳＯ２ＮＲ−、−ＮＲＳＯ２−、−ＣＲ２ＯＣＲ２−、−ＣＲ２ＳＣＲ２−、−ＣＲ２ＮＲＣＲ２−、Ｃ４−８シクロヘテロアルキレン基、Ｃ４−８シクロアルキレン基、Ｃ５−１２アリーレン基又はＣ３−１２ヘテロアリーレン基、アミノ酸、糖又は単分散のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）構成単位であり、
Ｒは、Ｈ、Ｃ１−４アルキル、Ｃ２−４アルケニル、Ｃ２−４アルキニル、Ｃ１−４アルコキシアルキル及びＣ１−４ヒドロキシアルキルから独立に選択され、
ｚは、値０〜１０の整数である。
【００９２】
式Ｉのリンカー基（Ｌ）の役割は、シグナル伝達部分をＨＳＰペプチドの活性部位から遠ざけると考えられる。このことは、阻害剤のＬＯＸ−１に対する結合が損なわれないように、ＳＩＧの嵩が比較的高い場合（例、金属錯体）特に重要である。これは、嵩高い基がそれ自身を活性部位から離れた状態である可撓性（例、単純アルキル鎖）及び／又はシクロアルキル又はアリールスペーサが、金属錯体を活性部位から遠ざけるように配向させる剛性の組合せにより達成することができる。
【００９３】
リンカー基の性質は、イメージング剤の体内分布を変更する際にも使用し得る。従って、例えばエーテル基をリンカーに導入すると、血漿タンパク質の結合を最小にする補助となるであろう。Ｌがポリエチレングリコール（ＰＥＧ）構成単位又はペプチド鎖（適切には１〜１０個のアミノ酸残基）を含む場合、リンカー基は、イメージング剤のインビボで薬物動態及び血中クリアランス速度を変更するように機能できる。そのような「生物学的変更因子」であるリンカー基は、筋肉又は肝臓等の背景組織からの及び／又は血液からのクリアランスを加速し、背景干渉がより少ないことにより、より良好な診断画像を与え得る。生物学的変更因子であるリンカー基は、特定の排泄経路、例えば肝臓に対して腎臓による排泄を選択するように使用し得る。
【００９４】
Ｌが１〜１０個のアミノ酸残基からなるペプチド鎖を含む場合、アミノ酸残基は、好ましくはグリシン、リシン、アスパラギン酸、グルタミン酸又はセリンから選択される。Ｌ−がＰＥＧ部分を含む場合、好ましくは式ＩＩＡ又はＩＩＢの単分散ＰＥＧ−様構造のオリゴマー化から誘導される単位を含む。
【００９５】
【化７】
式中、ｐは１〜１０の整数であり、Ｃ−末端単位（＊）は、シグナル伝達部分に接続されている。また、式ＩＩＢのプロピオン酸誘導体を基礎としたＰＥＧ−様構造を使用することもできる。
【００９６】
【化８】
式ＩＩＢ中、ｐは式ＩＩＡに定義した通りであり、ｑは３〜１５の整数であり、
ｐは、好ましくは１又は２であり、ｑは好ましくは５〜１２である。
【００９７】
リンカー基がＰＥＧ又はペプチド鎖を含まない場合、好ましい−（Ａ）ｎ−基は、２〜１０個の原子、最も好ましくは２〜５個の原子、特に好ましくは２個又は３個の原子からなる−（Ａ）ｎ−部分を形成する、結合する原子のバックボーン鎖を有する。２個の原子からなる最小のリンカー基のバックボーン鎖は、相互作用が最小となるようにイメージング部分をＨＳＰペプチドから十分に分離させる利点を与える。
【００９８】
非ペプチドリンカー基、例えばアルキレン基又はアリーレン基は、コンジュゲートしたＨＳＰペプチドとの水素結合による有意な相互作用が存在せず、従ってリンカーが巻き込まれない利点を有する。好ましいアルキレンスペーサ基は、−（ＣＨ２）ｄ−（ｄは２〜５）である。好ましいアリーレンスペーサは、式
【００９９】
【化９】
のアリーレンスペーサである。
式中、ａ及びｂは、独立に０、１又は２である。
【０１００】
リンカー基−（Ａ）ｎ−は、好ましくはジグリコール酸部分、マレイミド部分、グルタル酸、コハク酸、例えばＫＫＧＧ等のリシン−グリシン誘導体、ポリエチレングリコールベースの単位又は式ＩＩＡ又はＩＩＢのＰＥＧ様単位を含む。
【０１０１】
例えばシグナル伝達物質を有する場合に、シグナル伝達物質又は治療薬の結合には、例えば１８Ｆ又は１１Ｃリンカーが必要でない場合がある。同様に、放射性同位体は、共有結合を介してＥに直接付着することができる。その場合、ＨＳＰペプチドは、単に放射性同位体で標識される。用語「〜で標識される」とは、官能基がＳＩＧを含むか又はＳＩＧが更なる種として付着することを意味する。官能基がＳＩＧを含む場合、これは「シグナル伝達部分」が化学的構造の一部を形成し、放射性同位体が該同位体の天然存在度を有意に越えるレベルで存在することを意味する。そのような同位体の上昇又は濃縮レベルは、適切には少なくとも５倍、好ましくは少なくとも１０倍、最も好ましくは少なくとも２０倍であり、理想的には対象とする同位体の天然存在度の少なくとも５０倍又は対象とする同位体の濃縮レベルが９０〜１００％のレベルで存在する。そのような官能基の例は、ＳＩＧが化学的構造において同位体で標識される１１Ｃ又は１８Ｆ原子となるように、１１Ｃレベルが上昇したＣＨ３基及び１８Ｆレベルが上昇したフッ化アルキル基を含む。放射性同位体３Ｈ及び１４Ｃは、インビボでの適切なイメージング部分ではない。
【０１０２】
ＬＯＸ−１を認識する部分（Ｅ）の標識に有用なペプチド配位子リンカー（Ｌ）の合成方法及びＬＯＸ−１に結合する連結剤を直接標識する方法を、本願明細書の以下に記載する。
【０１０３】
ペプチド合成
ＨＳＰペプチドを、標準的な固相技術を使用して、２５μモルスケール上の２，４−ジメチルベンズヒドリルアミン樹脂（Ｒｉｎｋ Ａｍｉｄｅ ＡＭ）を用いて、Ｎα−Ｆｍｏｃ−保護アミノ酸により合成した（Ｆｍｏｃ＝フルオレニルメチルカルボニル）。ペプチドは、Ｒａｉｎｉｎ／Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｓｙｍｐｈｏｎｙ固相ペプチド合成機（Ｗｏｂｕｒｎ、ＭＡ）を使用して合成した。任意の化学反応に、樹脂を塩化メチレン中で１時間膨張させ、続いて３０分間又はそれ以上かけて、ＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）で交換排出した。各カップリング反応は、室温にてＤＭＦ中で、５当量のアミノ酸を用いて実施した。反応時間は、一般的に４５分、カップリングが困難と予想される残基については１時間であった（例えば、イソロイシン、ＩをＩＰＰ配列中のプロリン、Ｐへカップリング）。使用したカップリング試薬は、ＨＢＴＵ（Ｏ−ベンゾトリアゾリル−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート）であり、塩基としてＮＭＭ（Ｎ−メチルモルホリン）を有する。各ステップにつき、カップリング剤は、見積もった樹脂の容量に対して５当量供給し、反応をＤＭＦ中の０．４Ｍ ＮＭＭ溶液２．５ｍｌ中で実施した。一般的に、反応性の基が存在する場合、反応によって、酸に不安定な基で保護したアミノ酸の側鎖が変化しなかった。一般的に、チロシン、スレオニン及びセリン側鎖は、対応するｔｅｒｔ−ブチルエーテルとして保護した。グルタミン酸側鎖は、対応するｔｅｒｔ−ブチルエステルとして保護した。リシン及びオルニチン側鎖はＢｏｃ保護した。グルタミン側鎖は、γ−トリフェニルメチル誘導体として保護し、アルギニン側鎖は、２，２，５，７，８−ペンタメチル−クロマン−６−スルホニル誘導体として保護した。各カップリング反応の後、Ｎ−末端Ｆｍｏｃ保護アミンを、ＤＭＦ中２０％ピペリジンを室温で約１５分間、２回添加して脱保護した。最後の残基を付加した後、尚ペプチド合成剤に存在する樹脂を、ＤＭＦ及び塩化メチレンで徹底的に濯いだ。
【０１０４】
本発明において、１ｍＬＴＦＡ、２．５％ＴＳＰ（トリイソプロピルシラン）及び２．５％水からなるカクテルを使用して、ペプチドを樹脂から切断した。樹脂及びカクテルを、室温で約３〜４時間撹拌した。樹脂ビーズをグラスウールで濾過除去し、次いでｆＴＦＡ２〜３ｍｌで濯いだ。ペプチドを氷冷エーテル４０ｍｌで沈殿させ、沈殿が遠心分離管の底でペレットを形成するまで、３０００〜４０００ｒｐｍで遠心分離した。エーテルをデカントし、ペレットを冷エーテル（４０ｍＬ）中に再懸濁させ、再度遠心分離した。この工程を２〜３回繰り返した。最後の洗浄中、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ水１０ｍｌを冷エーテル３０ｍｌに加え、混合物を再度遠心分離した。エーテルをデカントした。粗ペプチドを含む水層を、凍結乾燥のため丸底フラスコに移した。
【０１０５】
ペプチドの合成は、飛行時間型マトリクス補助レーザー脱離スペクトロスコピー（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）を用いた質量分析により確認した。さらに粗合成混合物中の純粋な生成物の特性を調べるために、予備ＬＣ／ＭＳ技術も用いた。
【０１０６】
結合の合成
フルオレセイン色素、５（６）−カルボキシフルオレセインと合成ペプチドのＮ−末端との結合は、好ましくは色素、ＨＢＴＵ及びＮＭＭを添加して、上記のアミノ酸と同じ方法で樹脂に含めることが好ましい。反応後、樹脂を、好ましくはＤＭＦ及び塩化メチレンで徹底的に洗浄し、窒素流下で乾燥する。１ｍＬＴＦＡ、２．５％ＴＳＰ（トリイソプロピルシラン）及び２．５％水を含む混合物を用いて、ペプチドを樹脂から切断することができる。樹脂及び混合物を、好ましくは室温で約３〜４時間撹拌する。次いで、ガラスウールを用いて樹脂ビーズを濾過して除去し、次いでＴＦＡ２〜３ｍｌで濯ぐ。さらに、ペプチドを、好ましくは氷冷エーテル（４０ｍＬ）で沈殿させ、沈殿物が遠心分離管の底でペレットを形成するまで遠心分離する（例、３０００〜４０００ｒｐｍ）。エーテルをデカントしてもよく、ペレットを冷エーテル（４０ｍＬ）中に再懸濁し、再び遠分離した。このプロセスを２〜３回繰り返してもよい。最後の洗浄中、好ましくはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ水１０ｍｌを冷エーテル３０ｍｌに加え、混合物を再度遠心分離した。次に、エーテルをデカントしてもよく、粗ペプチドを含有する水層を、凍結乾燥のために丸底フラスコに移してもよい。ペプチド合成に関する粗収率は、通常約９０％であった。非標識ペプチドは、一般的に観察されなかった。
【０１０７】
好ましくは１００ペプチドを、Ｃ４−シリカカラム（Ｖｙｄａｃ、Ｈｅｓｐｅｒｉａ、ＣＡ）を用いた逆相セミ分取又は分取ＨＰＬＣにより精製した。ペプチドのクロマトグラムを、アミド発色団の吸収に対応する２２０ｎｍにおいて測定することができる。４９５ｎｍにおける測定も監視し、ペプチド上のフルオレセイン色素の存在を確認することができる。セミ分取及び分取に、各々流速３ｍｌ／分及び１０ｍｌ／分のＣＨ３ＣＮ／ＴＦＡ（アセトニトリル／トリフルオロ酢酸、１００：０．０１）及びＨ２Ｏ／ＴＦＡ（水／トリフルオロ酢酸、１００：０．０１）溶離液を含む溶媒系を使用することが好ましい。Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ水に溶解した粗ペプチドを、セミ分取及び分取のために、各々１．５ｍｇ及び５〜１０ｍｇペプチドの範囲で注入することができる。クロマトグラム形を分析して、良好な分解能及びピークの形状を確認した。全ペプチドに関する傾斜条件は、一般的に３０分でＣＨ３ＣＮ／ＴＦＡ（１００：０．０１）５〜５０％であった。精製したペプチドの同一性を、マトリクス補助レーザー脱離飛行時間（Ｔｉｍｅ−ｏｆ−Ｆｌｉｇｈｔ）質量分析により確認した。
【０１０８】
治療薬
本発明の治療薬（ＴＡ）は、例えば抗ウイルス及び抗癌剤、ＨＩＶプロテアーゼ阻害剤、ウイルス及びステロイドとして有用な、例えば抗生物質、鎮痛薬、ワクチン、抗炎症薬、抗うつ薬、抗ウイルス薬、抗癌剤、酵素阻害剤、ジドブジンを含有する製剤、高分子ポリペプチド、芳香族ニトロ及びニトロソ化合物、並びにそれらの代謝産物等の医薬化合物又は組成物及び生物学的に活性な組成物、例えばホルモン又は他の増殖刺激剤、その混合物、並びに同様物等の増殖を促進する組成物を含むが、これらに限定されない。
【０１０９】
生物学的に活性な成分は、例えば抗癌剤等の細胞内に内在化した場合、有効性を改善することが可能である、任意の周知の活性物質から選択されてもよい。活性成分は、例えば５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、シトシンアラビノシド（ＡＲＡｃ）、６−メルカプトプリン、メトトレキサート等の代謝拮抗薬、例えばナイトロジェンマスタード、シクロホスファミド、ニトロソウレア、シスプラチン等のアルキル化、例えばビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド（ＶＰ１６）等の植物性アルカロイド、例えばマイトマイシンＣ、ブレオマイシン、ドキソルビシン等の抗生物質又は例えばタモキシフェン若しくはフルタミド等のホルモンを含んでもよい。
【０１１０】
第２の実施形態では、本発明は、哺乳類への投与に適した形態における式Ｉの化合物と生体適合性の担体とを含む医薬組成物を提供する。医薬組成物のために、式（Ｉ）の本質的な特徴及びその好ましい実施形態は、第１の実施形態（上記）に記載した通りである。
【０１１１】
「生体適合性担体」は体液であり、特に、組成物が生理学的許容性を有するように、即ち有毒性又は過度の不快感なしで哺乳類の身体へ投与できるように、薬剤が懸濁又は溶解することができる液体である。生体適合性担体は、注入可能な担体液体であることが適切であり、例えば滅菌された、非発熱性の注射用水、水溶液、例えばエタノール水溶液又は生理食塩水（注射用の最終生成物が等張となるように、好適に平衡にすることができる）、１以上の等張性調整物質（例、血漿陽イオンと生体適合性対イオンとの塩）、糖（例、ブドウ糖又はショ糖）、糖アルコール（例、ソルビトール又はマンニトール）、グリコール（例、グリセロール）又は他の非イオン性ポリオール材料（例、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール等）の水溶液である。生体適合性担体は、非発熱性の注射用水又は等張生理食塩水が好ましい。
【０１１２】
そのような医薬組成物は、皮下注射用針による１以上回の穿孔に適切であるが、完全な無菌状態を保持する密閉容器（例、襞付き隔壁（ｃｒｉｍｐｅｄ−ｏｎ ｓｅｐｔｕｍ）密閉容器）内に適切に供給される。そのような容器は、患者の１以上回の用量を収容し得る。好ましい複数回用量の容器は、１バルクのバイアルを含む（例、１０〜３０ｃｍ３容量）。この容器は、複数回の患者線量を収容するため、１回の患者線量を、製剤の利用可能な期間、臨床状態に適するように様々な時間間隔において臨床グレードの注射器内に引き入れることができる。プレフィルド注射器は、ヒトの１回の用量又は「単位用量」を収容するよう構成されており、従って臨床用途に適した使い捨て注射器又は他の注射器であることが好ましい。ＳＩＧが放射性の場合、プレフィルド注射器は、操作者を放射性線量から保護する注射器遮蔽物を任意にて備えてもよい。そのような放射性医薬品注射器の適切な遮蔽物は、当分野にて周知であり、鉛及びタングステンのいずれかを含むことが好ましい。
【０１１３】
ＳＩＧがインビボにおけるイメージングのための放射性核種（即ち、放射性医薬品）の場合、放射性医薬品を、以下の第３の実施形態に説明するように、キットから調製することができる。また、放射性医薬品を無菌製造条件下で調製して所望の滅菌生成物を得てもよい。放射性医薬品を非滅菌条件下で調製する後、例えばγ−照射、高圧蒸気滅菌法、乾熱又は化学的処理（例、酸化エチレンを用いた）により最終的に滅菌してもよい。本発明の放射性医薬品は、キットから調製することが好ましい。
【０１１４】
第３の実施形態では、本発明は、第２の実施形態の医薬組成物の調製用キットを提供する。ＳＩＧは放射性同位体又は放射性核種を含む。そのようなキットは、放射性同位体の滅菌原料との反応によって、最小数の操作により所望の放射性医薬品が得られるように、好ましくは滅菌型非発熱性の形態の上記「前駆体」を含む。そのような考慮は、放射性同位体が比較的短い半減期である放射性医薬品及び取り扱いを容易にして放射性物質を扱う薬剤師の放射線量を低減させるのに特に重要である。従って、そのようなキットを再構成するための反応媒体は、好ましくは上記に定義した「生体適合性担体」であり、最も好ましくは水性担体である。
【０１１５】
適切なキット容器は、完全な滅菌状態及び／又は放射能に対する安全性及び容器の上部空間の不活性気体（例、窒素又はアルゴン）を任意に保持しながら、注射器による溶液の添加する及び引き入れることができる密閉容器を含む。好ましいそのような容器は、隔壁で密封されたバイアルであり、気密容器には、（一般的にアルミニウムの）上部シールが襞で止められている。そのような容器は、所望であれば、例えば上部空間の気体の交換又は溶液の脱気のための真空に耐える密閉容器であるという更なる利点を有する。
【０１１６】
非放射性キットは、さらに例えば放射性保護剤、抗菌保存剤、ｐＨ−調整剤又はフィラー等の追加の成分を任意に含んでもよい。
【０１１７】
用語「放射性保護剤」は、水の放射線分解により生じた例えば酸素含有フリーラジカル等の高い反応性を有するフリーラジカルをトラップすることによって、例えば酸化還元工程等の劣化反応を抑制する化合物を意味する。本発明の放射性保護剤は、適切にはアスコルビン酸、パラ−アミノ安息香酸（即ち、４−アミノ安息香酸）、ゲンチシン酸（即ち、２，５−ジヒドロキシ安息香酸）及びその生体適合性陽イオンとの塩から選択される。用語「生体適合性陽イオン」は、イオン化した、負荷電を有する基と塩を形成する、正電荷の対イオンを意味する。また、前記正電荷の対イオンは無毒であるため、哺乳類、特にヒトの身体に投与するに適している。適切な生体適合性陽イオンの例は、アルカリ金属ナトリウム又はカリウム、アルカリ土類金属カルシウム及びマグネシウム、並びにアンモニウムイオンを含む。好ましい生体適合性陽イオンは、ナトリウム及びカリウム、最も好ましくはナトリウムである。
【０１１８】
用語「抗菌保存剤」は、例えばバクテリア、酵母又はカビ等の有害である恐れのある微生物の増殖を阻害する薬剤を意味する。抗菌保存剤は、用量に応じていくつかの殺菌特性も示す。本発明の（１種以上の）抗菌保存剤の主な役割は、再構成後の放射性医薬組成物、即ち放射性診断生成物それ自体においてそのような微生物の増殖を阻害することである。しかし、抗菌保存剤を、再構成前の本発明の非放射性キットの１種以上の成分中の有害である恐れのある微生物の増殖の阻害にも任意に使用することができる。適切な（１種以上の）抗菌保存剤は、パラベン、即ちメチル、エチル、プロピル若しくはブチルパラベン又はその混合物、ベンジルアルコール、フェノール、クレゾール、セトリミド及びチオマーサルを含む。好ましい（１種以上の）抗菌保存剤は、パラベンである。
【０１１９】
用語「ｐＨ調整剤」は、ヒト又は哺乳類への投与のために、再構成されたキットのｐＨが許容可能な範囲（約ｐＨ４．０〜１０．５）内にあることを確実にする有用な化合物又は化合物の混合物を意味する。そのような適切なｐＨ調整剤は、薬理学的に許容できる緩衝剤、例えばトリシン、ホスフェート又はＴＲＩＳ［即ち、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン］及び薬理学的に許容できる塩基、例えば炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム又はその混合物を含む。コンジュゲートが酸の塩の態で用いられる場合、ｐＨ調整剤は、別個のバイアル又は容器内に任意に提供されるため、キットの使用者は、複数ステップからなる手順の一部としてｐＨを調整することができる。
【０１２０】
用語「フィラー」は、製造及び凍結乾燥中の材料の取り扱いを容易にすることができる薬理学的に許容できる充填剤を意味する。適切なフィラーは、無機塩、例えば塩化ナトリウム及び水溶性の糖又は糖アルコール、例えばショ糖、麦芽糖、マンニトール又はトレハロースを含む。
【０１２１】
キット中に用いられる場合、「前駆体」の好ましい態様は上述した通りである。キット中で使用される前駆体を無菌製造条件下で使用して、所望の滅菌型非発熱性材料を得ることができる。前駆体は、非滅菌条件下で使用した後、例えばγ−照射、高圧蒸気滅菌法、乾熱又は（例、酸化エチレンで）化学的処理により最終的に滅菌されてもよい。好ましくは、前駆体は滅菌、非発熱形態で使用される。最も好ましくは滅菌、非発熱性前駆体は、上述した密閉容器内で使用される。
【０１２２】
キットの「前駆体」は、任意にて、上述したように固体支持体のマトリクスに共有結合させて任意に供給することができる。従ってＰＥＴ放射性医薬品の調製において、キットは、適合させた自動合成機内に差し込み可能なカートリッジを含んでもよい。カートリッジは、固体支持体に結合する前駆体とは別に、望ましくないフッ化物イオンを除去するカラム及び必要に応じて、反応混合物を蒸発させ、生成物を製剤化するよう接続される適切な容器を含んでもよい。合成に必要な試薬及び溶媒、並びに他の消耗品を、放射性濃度、容積、送達時間等に関する消費者の要求に合わせるように合成機を作動させるソフトウエアを携えたコンパクトディスクを含んでもよい。稼働間の汚染率を最小にし、滅菌状態及び品質を保証するために、キットの全成分が使い捨てのものであれば都合がよい。
【０１２３】
第４の実施形態では、本発明は、組織をイメージングしてＬＯＸ−１の存在及び／又は量を検出する方法を提供する。該方法は、
式（Ｉ）（式中、ＹはＳＩＧである）の化合物を哺乳類に投与し、
ＬＯＸ−１に結合していない式（Ｉ）の化合物を除去する排除剤を適宜投与し、
哺乳類をＳＩＧで生成されるシグナルを検出するのに有効なイメージングに付してＬＯＸ−１の存在及び／又は量の検出することを含む。
【０１２４】
イメージング方法に関して、ＹはＳＩＧであり、そうでない場合、式（Ｉ）の本質的な性質及びその好ましい実施形態は第１の実施形態（上記）に記載した通りである。
【０１２５】
用語「排除剤」は、血流中を循環する任意の式（Ｉ）の化合物に結合して、肝臓又は腎臓により容易に排泄させて哺乳類の身体から除去される種を形成する、生体適合性を有する無毒の化合物を意味する。
【０１２６】
結合部分Ｅに付着する特定のＳＩＧに応じて、適当なイメージング技術を使用して標的組織をイメージングする。例えば、１８Ｆが標識剤として使用される場合、ＰＥＴイメージングを実施する。好ましい実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、第２の実施形態の医薬組成物として投与される。
【０１２７】
標識される配位子を診断として使用し、ＬＯＸ−１の過剰発現が疑われる標的組織のイメージングを支援することができる。イメージング方法は、診断として使用され、インビトロ又はインビボで、好ましくはインビボでヒト組織内のＬＯＸ−１の存在を検出することができる。さらに、イメージング方法を何日間も繰り返してＬＯＸ−１の増殖又は発現の程度を定量的に評価することができる。このように、インビトロでのイメージングは、組織又は細胞培養をイメージングしてＬＯＸ−１の存在及び／又は量を検出することを含むことができる。
【０１２８】
好ましい態様において、哺乳類は、以前にアテローム性動脈硬化症を罹患していると診断され、アテローム性動脈硬化症の治療用の治療薬で既に治療されており、該方法はさらに、
投与及びイメージング法を、ある期間にわたって１回以上繰り返し、ＬＯＸ−１の量の差を検出することを含んでなる。
【０１２９】
これは、ＬＯＸ−１の発現に起因する疾患又は障害を治療する治療の有効性を監視する方法を提供する。
【０１３０】
ＬＯＸ−１の発現に起因する疾患又は障害は、高濃度のＬＯＸ−１が存在する炎症部位、並びに例えばマクロファージ及び他の炎症細胞が蓄積する領域を含む。より好ましくは、組織は、動脈硬化性プラークを含む動脈硬化組織である。
【０１３１】
第５の実施形態では、本発明は、ＬＯＸ−１の発現に起因する疾患又は障害が疑われる哺乳類の診断方法における、式（Ｉ）（式中、ＹはＳＩＧである）の化合物の使用を提供する。そのような疾患は、上記の第４の実施形態に記載した通りである。この使用に関して、ＹはＳＩＧであり、ＳＩＧはインビボにおけるイメージングに適切であることが好ましい。そうでない場合、式（Ｉ）の本質的な特徴及びその好ましい実施形態は、第１の実施形態（上記）に記載した通りである。
【０１３２】
この使用において、哺乳類は、以前に第３の実施形態の放射性医薬組成物を投与される。用語「以前に投与した」は、臨床医が薬剤を患者に例えば静脈注射による投与に関するステップが、既に行なわれていることを意味する。ＳＩＧがインビボでのイメージングにおいて適切である場合、この実施形態は、本発明の第１の態様に記載される前記イメージング剤の好ましい実施形態を含む。また、好ましい実施形態では、この使用はＬＯＸ−１が関与する哺乳類の身体の疾患状態を、インビボで診断的イメージングするための診断薬の製造における式（Ｉ）の化合物（式中、ＹはＳＩＧである）の使用も含む。
【実施例】
【０１３３】
本発明を、以下の非限定的な例にて説明する。
【０１３４】
全ての実施例は、机上の実施例である。
【０１３５】
実施例１
熱ショックタンパク質Ｅ基を、当分野にて周知の標準的な技術を用いて、４−アシルフェニレン基（Ｌ）を介してフルオレセイン（ＳＩＧ）に共有結合させる。細胞株を用いて、細胞に対する錯体の結合能を試験する。錯体を細胞と共にインキュベートし、続いて洗浄する。その後、次いで標準的な技術を用いて細胞をイメージングする。さらに、ＨＳＰフラグメントのシグナルを内在化する能力を、細胞内に内在化させた色素を介し、蛍光像を介して示された細胞表面上のものと対比させて示す。フラグメントを、細胞中に内在化すると蛍光を発するｐＨ感受性色素、例えばＣｙｐＨｅｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）で標識する。
【０１３６】
実施例２
当分野にて周知の標準的な技術を用いて、Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（Ｌ）を介してＥを１８Ｆ（ＳＩＧ）に共有結合させる。次いで錯体を、インビボによる注射によって、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手可能な５匹の対照及び５匹の疾患ＡｐｏＥ−／−マウスへ送達する。送達後、標準的なＰＥＴ技術を用いてマウスを走査する。疾患マウスは、患部動脈壁に沿って特異的結合を示す。
【０１３７】
第２段階にて、錯体による処理を繰り返し、患部領域の分解能を増大させるイメージング剤の蓄積を示す。
【０１３８】
実施例３
当分野にて周知の標準的な技術を用いて、ＤＴＰＡ（Ｌ）を介してＥをタキソール（Ｔ）に共有結合させる。細胞株を用いて、錯体の細胞に対する結合能を試験する。錯体を細胞と共にインキュベートし、続いて洗浄する。ＨＳＰフラグメントのシグナルを内在化する能力を、細胞内に内在化させた色素の認識を介して、蛍光像を介して示された細胞表面上のものと対比させて示す。
【０１３９】
実施例４
当分野にて周知の標準的な技術を用いて、６８Ｇａ（Ｌ）を介してＥを共有結合させる。錯体を、インビボにおける注射により、５匹の対照及び５匹の疾患ＡｐｏＥ−／−マウスへ送達する。送達後、標準的なＰＥＴ技術を用いてマウスを走査する。疾患マウスは、患部動脈壁に沿って特異的結合を示す。
【０１４０】
第２段階にて、錯体による処理を繰り返してイメージング剤の蓄積を示し、患部領域の分解能を増大させる。
【０１４１】
実施例５
当分野にて周知の標準的な技術を用いて、Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（Ｌ）を介してＥを１８Ｆ（ＳＩＧ）に共有結合させ、さらにタキソール（ＴＡ）に共有結合させる。熱ショックＨｅＬａ細胞株及びストレス無負荷の正常ＨｅＬａ細胞を用いて、細胞に対する錯体の結合能を検査する。さらに、錯体を細胞と共にインキュベートし、続いて洗浄する。ＬＯＸ−１を発現する細胞は、選択的細胞死がより多くなることを示す。さらに、細胞死の選択性を、細胞のイメージング及びシグナルの内在化を介して示す。
【０１４２】
実施例６
リンカーを持たない錯体の例として、当分野にて周知の標準的な技術を用い、６８Ｇａ（ＳＩＧ）を介してＥを共有結合させる。次いで錯体を、インビボにおける注射によって、５匹の対照及び５匹の疾患ＡｐｏＥ−／−マウスへ送達する。送達後、標準的なＰＥＴ技術を用いてマウスを走査する。疾患マウスは、患部動脈壁に沿って特異的結合を示す。
【０１４３】
第２段階にて、錯体による処理を繰り返してイメージング剤の蓄積を示し、患部領域の分解能を増大させる。
【図面の簡単な説明】
【０１４４】
【図１】ＨＳＰ−７０のＮ−末端に関するアミノ酸配列。
【図２】ＨＳＰ−７０のＣ−端末に関するアミノ酸配列。
【図３】ヒトＬＯＸ−１に関するアミノ酸配列。
【図４】式（Ｉ）の化合物におけるＬ及びＳＩＧの変形を示す図。
【図５】ＨＳＰ−７０のＮ−末端に関する三次元構造図。
【図６】ＨＳＰ−７０のＣ−端末に関する三次元構造図。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の式（Ｉ）の化合物。
（Ｉ）Ｙ−（Ｌ）ｎ−Ｅ
式中、ＹはＳＩＧ又はＴＡであって、ＳＩＧはインビボ又はインビトロで検出可能なシグナルを与えるシグナル伝達部分であり、ＴＡは治療薬であり、
ＬはＹとＥとを連結するリンカー基であり、
ＥはＬＯＸ−１に結合する熱ショックタンパク質又はそのフラグメント若しくは変異体を含む結合部分であり、
ｎは０又は１である。
【請求項２】
ＹがＳＩＧである、請求項１記載の化合物。
【請求項３】
ＳＩＧが蛍光色素、放射性核種、近赤外色素、磁気的に活性な同位体、超常磁性粒子、放射線不透過性ヨウ素化有機化合物、Ｚ値が５０を超える放射線不透過性金属イオン、ガス封入マイクロバブル又はこれらの組合せからなる群から選択される、請求項１又は請求項２記載の化合物。
【請求項４】
ＳＩＧが放射性核種である、請求項３記載の化合物。
【請求項５】
前記放射性核種が１１Ｃ、１８Ｆ、５２Ｆｅ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、８６Ｙ、８９Ｚｒ、９４ｍＴｃ、９４Ｔｃ、９９ｍＴｃ、１１１Ｉｎ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１５４−１５８Ｇｄ及び１７５Ｌｕからなる群から選択される、請求項４記載の化合物。
【請求項６】
前記放射性核種が陽電子放射体である、請求項４又は請求項５記載の化合物。
【請求項７】
前記陽電子放射体が１８Ｆ及び１１Ｃから選択される、請求項６記載の化合物。
【請求項８】
前記放射性核種がγ放射体である、請求項４又は請求項５記載の化合物。
【請求項９】
ＳＩＧが近赤外色素である、請求項３記載の化合物。
【請求項１０】
Ｌが２以上の原子価の有機基である、請求項１乃至請求項９のいずれか１項記載の化合物。
【請求項１１】
前記有機基がＹ基及びＥ基の双方と共有結合している、請求項１０記載の化合物。
【請求項１２】
前記有機基がＹ基及びＥ基の双方とイオン結合している、請求項１０記載の化合物。
【請求項１３】
前記有機基がアルキレン、アリーレン、シクロアルキレン、アミノアルキレン、アミノアリーレン、アミノシクロアルキレン、チオアルキレン、チオアリーレン、チオシクロアルキレン、オキシアルキレン、オキシアリーレン、オキシシクロアルキレン、アシルアルキレン、アシルアリーレン、アシルシクロアルキレン単位及びこれらの組合せからなる群から選択される、請求項１０記載の化合物。
【請求項１４】
前記アシルアリーレン単位が以下の構造の４−アシルフェニレン基である、請求項１３記載の化合物。
【化１】
【請求項１５】
Ｌがポリエチレングリコール（ＰＥＧ）構成単位又はペプチド鎖を含んでいて、Ｌが式Ｉの化合物の生体内での薬物動態及び血中クリアランス速度を変えるように機能し得る、請求項１乃至請求項１０のいずれか１項記載の化合物。
【請求項１６】
前記ペプチド鎖が１〜１０のアミノ酸残基からなる、請求項１４記載の化合物。
【請求項１７】
ＳＩＧが金属イオンを含んでおり、ＳＩＧ又は有機基のいずれかが金属キレート剤を含む、請求項１乃至請求項１６のいずれか１項記載の化合物。
【請求項１８】
前記金属キレート剤が５２Ｆｅ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、８６Ｙ、８９Ｚｒ、９４ｍＴｃ、９４Ｔｃ、９９ｍＴｃ、１１１Ｉｎ、１５４−１５８Ｇｄ及び１７５Ｌｕの陽イオンからなる群から選択される１種以上の金属陽イオンと結合する、請求項１６記載の化合物。
【請求項１９】
前記金属キレート剤がＤＴＰＡ、１，４，７−トリアザシクロノナン−Ｎ，Ｎ′，Ｎ″−三酢酸（ＮＯＴＡ）、ｐ−ブロモアセトアミド−ベンジル−テトラエチルアミンテトラ酢酸（ＴＥＴＡ）、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカンテトラ酢酸（ＤＯＴＡ）、ＥＤＴＡ及びＣＨＸａからなる群から選択される、請求項１７又は請求項１８記載の化合物。
【請求項２０】
ＥがＬＯＸ−１に結合する熱ショックタンパク質７０又はそのフラグメントである、請求項１乃至請求項１９のいずれか１項記載の化合物。
【請求項２１】
前記フラグメントが熱ショックタンパク質７０のＮ−末端フラグメントである、請求項２０記載の化合物。
【請求項２２】
前記フラグメントが３０個以下のアミノ酸からなる、請求項２０又は請求項２１記載の化合物。
【請求項２３】
請求項１乃至請求項２２のいずれか１項記載の式（Ｉ）の化合物を生体適合性担体と共に哺乳類への投与に適した形態で含む医薬組成物。
【請求項２４】
Ｙが請求項２乃至請求項９のいずれか１項記載のＳＩＧである、請求項２３記載の医薬組成物。
【請求項２５】
ＳＩＧが放射性核種である、請求項２４記載の医薬組成物。
【請求項２６】
請求項２５記載の組成物の調製用キット。
【請求項２７】
哺乳類におけるＬＯＸ−１の存在及び／又は量を検出するために組織をイメージングする方法であって、
ＹがＳＩＧである請求項１乃至請求項２２のいずれか１項記載の式（Ｉ）の化合物を哺乳類に投与すること、
ＬＯＸ−１に結合していない式（Ｉ）の化合物を除去する排除剤を適宜投与すること、及び
ＳＩＧで生成されるシグナルを検出するのに有効なイメージングに哺乳類を付してＬＯＸ−１の存在及び／又は量を検出すること
を含んでなる方法。
【請求項２８】
哺乳類が以前にアテローム性動脈硬化症を罹患していると診断され、アテローム性動脈硬化症の治療用の治療薬で治療されており、投与及びイメージング法をある期間にわたって１回以上繰り返し、ＬＯＸ−１の量の差を検出することをさらに含んでなる、請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
式（Ｉ）の化合物が請求項２３乃至請求項２５のいずれか１項記載の医薬組成物の一部である、請求項２７又は請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
ＳＩＧを検出するのに有効なイメージングが陽電子放射断層撮影である、請求項２７乃至請求項２９のいずれか１項記載の方法。
【請求項３１】
ＳＩＧが１８Ｆ及び１１Ｃから選択される、請求項３０記載の方法。
【請求項３２】
ＬＯＸ−１の発現に起因する疾患又は障害が疑われる哺乳類を診断する方法における、Ｙが請求項３乃至請求項１０のいずれか１項に規定される請求項１乃至請求項２２のいずれか１項記載の式（Ｉ）の化合物の使用。
【請求項３３】
前記方法が請求項２７乃至請求項３１のいずれか１項記載の方法を含んでなる、請求項３２記載の使用。
【請求項１】
次の式（Ｉ）の化合物。
（Ｉ）Ｙ−（Ｌ）ｎ−Ｅ
式中、ＹはＳＩＧ又はＴＡであって、ＳＩＧはインビボ又はインビトロで検出可能なシグナルを与えるシグナル伝達部分であり、ＴＡは治療薬であり、
ＬはＹとＥとを連結するリンカー基であり、
ＥはＬＯＸ−１に結合する熱ショックタンパク質又はそのフラグメント若しくは変異体を含む結合部分であり、
ｎは０又は１である。
【請求項２】
ＹがＳＩＧである、請求項１記載の化合物。
【請求項３】
ＳＩＧが蛍光色素、放射性核種、近赤外色素、磁気的に活性な同位体、超常磁性粒子、放射線不透過性ヨウ素化有機化合物、Ｚ値が５０を超える放射線不透過性金属イオン、ガス封入マイクロバブル又はこれらの組合せからなる群から選択される、請求項１又は請求項２記載の化合物。
【請求項４】
ＳＩＧが放射性核種である、請求項３記載の化合物。
【請求項５】
前記放射性核種が１１Ｃ、１８Ｆ、５２Ｆｅ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、８６Ｙ、８９Ｚｒ、９４ｍＴｃ、９４Ｔｃ、９９ｍＴｃ、１１１Ｉｎ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１５４−１５８Ｇｄ及び１７５Ｌｕからなる群から選択される、請求項４記載の化合物。
【請求項６】
前記放射性核種が陽電子放射体である、請求項４又は請求項５記載の化合物。
【請求項７】
前記陽電子放射体が１８Ｆ及び１１Ｃから選択される、請求項６記載の化合物。
【請求項８】
前記放射性核種がγ放射体である、請求項４又は請求項５記載の化合物。
【請求項９】
ＳＩＧが近赤外色素である、請求項３記載の化合物。
【請求項１０】
Ｌが２以上の原子価の有機基である、請求項１乃至請求項９のいずれか１項記載の化合物。
【請求項１１】
前記有機基がＹ基及びＥ基の双方と共有結合している、請求項１０記載の化合物。
【請求項１２】
前記有機基がＹ基及びＥ基の双方とイオン結合している、請求項１０記載の化合物。
【請求項１３】
前記有機基がアルキレン、アリーレン、シクロアルキレン、アミノアルキレン、アミノアリーレン、アミノシクロアルキレン、チオアルキレン、チオアリーレン、チオシクロアルキレン、オキシアルキレン、オキシアリーレン、オキシシクロアルキレン、アシルアルキレン、アシルアリーレン、アシルシクロアルキレン単位及びこれらの組合せからなる群から選択される、請求項１０記載の化合物。
【請求項１４】
前記アシルアリーレン単位が以下の構造の４−アシルフェニレン基である、請求項１３記載の化合物。
【化１】
【請求項１５】
Ｌがポリエチレングリコール（ＰＥＧ）構成単位又はペプチド鎖を含んでいて、Ｌが式Ｉの化合物の生体内での薬物動態及び血中クリアランス速度を変えるように機能し得る、請求項１乃至請求項１０のいずれか１項記載の化合物。
【請求項１６】
前記ペプチド鎖が１〜１０のアミノ酸残基からなる、請求項１４記載の化合物。
【請求項１７】
ＳＩＧが金属イオンを含んでおり、ＳＩＧ又は有機基のいずれかが金属キレート剤を含む、請求項１乃至請求項１６のいずれか１項記載の化合物。
【請求項１８】
前記金属キレート剤が５２Ｆｅ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、８６Ｙ、８９Ｚｒ、９４ｍＴｃ、９４Ｔｃ、９９ｍＴｃ、１１１Ｉｎ、１５４−１５８Ｇｄ及び１７５Ｌｕの陽イオンからなる群から選択される１種以上の金属陽イオンと結合する、請求項１６記載の化合物。
【請求項１９】
前記金属キレート剤がＤＴＰＡ、１，４，７−トリアザシクロノナン−Ｎ，Ｎ′，Ｎ″−三酢酸（ＮＯＴＡ）、ｐ−ブロモアセトアミド−ベンジル−テトラエチルアミンテトラ酢酸（ＴＥＴＡ）、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカンテトラ酢酸（ＤＯＴＡ）、ＥＤＴＡ及びＣＨＸａからなる群から選択される、請求項１７又は請求項１８記載の化合物。
【請求項２０】
ＥがＬＯＸ−１に結合する熱ショックタンパク質７０又はそのフラグメントである、請求項１乃至請求項１９のいずれか１項記載の化合物。
【請求項２１】
前記フラグメントが熱ショックタンパク質７０のＮ−末端フラグメントである、請求項２０記載の化合物。
【請求項２２】
前記フラグメントが３０個以下のアミノ酸からなる、請求項２０又は請求項２１記載の化合物。
【請求項２３】
請求項１乃至請求項２２のいずれか１項記載の式（Ｉ）の化合物を生体適合性担体と共に哺乳類への投与に適した形態で含む医薬組成物。
【請求項２４】
Ｙが請求項２乃至請求項９のいずれか１項記載のＳＩＧである、請求項２３記載の医薬組成物。
【請求項２５】
ＳＩＧが放射性核種である、請求項２４記載の医薬組成物。
【請求項２６】
請求項２５記載の組成物の調製用キット。
【請求項２７】
哺乳類におけるＬＯＸ−１の存在及び／又は量を検出するために組織をイメージングする方法であって、
ＹがＳＩＧである請求項１乃至請求項２２のいずれか１項記載の式（Ｉ）の化合物を哺乳類に投与すること、
ＬＯＸ−１に結合していない式（Ｉ）の化合物を除去する排除剤を適宜投与すること、及び
ＳＩＧで生成されるシグナルを検出するのに有効なイメージングに哺乳類を付してＬＯＸ−１の存在及び／又は量を検出すること
を含んでなる方法。
【請求項２８】
哺乳類が以前にアテローム性動脈硬化症を罹患していると診断され、アテローム性動脈硬化症の治療用の治療薬で治療されており、投与及びイメージング法をある期間にわたって１回以上繰り返し、ＬＯＸ−１の量の差を検出することをさらに含んでなる、請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
式（Ｉ）の化合物が請求項２３乃至請求項２５のいずれか１項記載の医薬組成物の一部である、請求項２７又は請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
ＳＩＧを検出するのに有効なイメージングが陽電子放射断層撮影である、請求項２７乃至請求項２９のいずれか１項記載の方法。
【請求項３１】
ＳＩＧが１８Ｆ及び１１Ｃから選択される、請求項３０記載の方法。
【請求項３２】
ＬＯＸ−１の発現に起因する疾患又は障害が疑われる哺乳類を診断する方法における、Ｙが請求項３乃至請求項１０のいずれか１項に規定される請求項１乃至請求項２２のいずれか１項記載の式（Ｉ）の化合物の使用。
【請求項３３】
前記方法が請求項２７乃至請求項３１のいずれか１項記載の方法を含んでなる、請求項３２記載の使用。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公表番号】特表２００８−５０９９２１（Ｐ２００８−５０９９２１Ａ）
【公表日】平成２０年４月３日（２００８．４．３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５２５７７９（Ｐ２００７−５２５７７９）
【出願日】平成１７年８月１１日（２００５．８．１１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０２８４９１
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０２０７４３
【国際公開日】平成１８年２月２３日（２００６．２．２３）
【出願人】（３０７０３５７９０）ゼネラル・エレクトリック・カンパニイ (1)
【氏名又は名称原語表記】ＧＥＮＥＲＡＬ ＥＬＥＣＴＲＩＣ ＣＯＭＰＡＮＹ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年４月３日（２００８．４．３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年８月１１日（２００５．８．１１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０２８４９１
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０２０７４３
【国際公開日】平成１８年２月２３日（２００６．２．２３）
【出願人】（３０７０３５７９０）ゼネラル・エレクトリック・カンパニイ (1)
【氏名又は名称原語表記】ＧＥＮＥＲＡＬ ＥＬＥＣＴＲＩＣ ＣＯＭＰＡＮＹ
【Ｆターム（参考）】
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