再プログラム化多能性細胞の作製
本発明は、再プログラム化細胞を作製する方法を提供し、前記方法は、Ｓｔｒｏ−１＋多分化能細胞および／またはその子孫細胞を、細胞を再プログラムするために十分な条件下で１種または複数の能力決定因子に曝露するステップを含む。本発明は、このような方法によって作製された細胞およびその細胞のさまざまな使用に加えて、それから分化した細胞をさらに提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多能性細胞およびその作製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
胚性幹（ＥＳ）細胞は、多能性を維持している間は不確定に成長でき、３種の胚葉、すなわち中胚葉、内胚葉および外肺葉すべての細胞に分化できると信じられている（Ｅｖａｎｓ ＆ Ｋａｕｆｍａｎ、Ｎａｔｕｒｅ ２９２：１５４〜１５６（１９８１））。ヒトＥＳ細胞およびそれに由来する細胞は、パーキンソン病、脊髄損傷および糖尿病などの疾患の宿主の治療用に現在評価されている。しかし、ヒトＥＳ細胞はヒトの胚から得られるという事実が、多数の非常に議論の余地がある倫理規定を提起し、多くの国において、これらの細胞の誘導が法律によって禁止されている。さらに、ＥＳ細胞およびそれに由来する細胞は、それが由来する対象から抗原を発現するので、不適合な（例えば同じＨＬＡ型（複数可）を発現しない）対象に投与された場合、それらの細胞が拒絶される危険性がある。したがって、科学者らはＥＳ細胞の現在の作製方法を避けるための技術的解決法を探求した。これらの解決法を達成するための１つの望ましい方法は、出生後の個体、例えば、治療される対象もしくは関連する対象または他の適合する対象の体細胞から直接多能性細胞を作製することであった。
【０００３】
体細胞を再プログラミングするための一方法は、細胞の核内容物を卵母細胞に移入するステップ（Ｗｉｌｍｕｔら、Ｎａｔｕｒｅ ３８５：８１０〜８１３（１９９７年））またはＥＳ細胞と融合させるステップ（Ｃｏｗａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０９：１３６９〜１３７３（２００５年））を含み、未受精卵およびＥＳ細胞は体細胞において全能性または多能性をもたらす因子を含有することを示している。これらの方法に付随する問題は卵子および／または胚の破壊の必要性を含み、このことは一部の国において倫理規定を提起し得る。
【０００４】
多能性の転写決定は完全に理解されてはいないが、Ｏｃｔ３／４（Ｎｉｃｈｏｌｓら、Ｃｅｌｌ ９５：３７９〜３９１（１９９８年））、Ｓｏｘ２（Ａｖｉｌｉｏｎら、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１７：１２６〜１４０（２００３年））およびＮａｎｏｇ（Ｃｈａｍｂｅｒｓら、Ｃｅｌｌ １１３：６４３〜６５５（２００３年））を含むいくつかの転写因子は、ＥＳ細胞の多能性の維持に関与しており、しかし、ＥＳ細胞の特定だけでは十分でない。
【０００５】
最近、ＴａｋａｈａｓｈｉおよびＹａｍａｎａｋａは、４つの因子（すなわち、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、ｃ−ＭｙｃおよびＫｌｆ４）を、マウスのＥＳ細胞培養に適切な条件下で培養されたマウスのＥＳ細胞および成体マウスの線維芽細胞に導入した。どちらかの細胞型に形質導入後、著者らは、マウスＥＳ細胞の形態および成長特性を示し、マウスＥＳ細胞のマーカー遺伝子を発現した、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞を得た（Ｔａｋａｈａｓｈｉ＆Ｙａｍａｎａｋａ、Ｃｅｌｌ １２６：６６３〜６７６（２００６年））。ヌードマウスへのｉＰＳ細胞の皮下移植は、３種すべての胚葉に由来するさまざまな組織を含有する腫瘍をもたらした。胚盤胞への注射後、ｉＰＳ細胞はマウスの胚発生に寄与した。これらのデータは、レトロウイルス形質導入を使用して、わずか数種の確定された因子を加えることによって、多能性細胞が直接マウス線維芽細胞培養物から作製され得ることを実証している。しかし、この技術は、再プログラミングの率の低さ（処置された細胞の１％よりかなり低い）ならびにゲノムへの組み込みおよび発がん遺伝子ｃ−ＭｙｃおよびＫｌｆ４の連続発現の必要性を含む、いくつかの重要な不利益に非常に悩まされる。これらの遺伝子の発現は、細胞およびこの細胞に由来する細胞のレシピエントにおいて腫瘍の発生をもたらし得る。この点で、おそらくこれらの発がん遺伝子の連続発現の結果として、これらの方法を用いて作製されたｉＰＳ細胞を使用して作製されたキメラマウスは腫瘍を発生する。結果的に、この分野の調査の主要な目的は、これらの因子をコードする核酸のゲノムへの組み込みを必要としないか、またはこれらの再プログラミング因子もしくは他の再プログラミング因子の発現の数もしくは期間を最小化するかのいずれかの再プログラミングの方法を開発することである。
【０００６】
融合に基づく再プログラミング研究において線維芽細胞は誘導および大量使用の容易さの可能性が最も高いため、ｉＰＳ細胞に基づく研究の大部分は線維芽細胞を使用するが、繊維芽細胞以外のさまざまな細胞集団がマウスにおけるｉＰＳ細胞の誘導に使用されてきた。これらの研究からの重要な観察は、選択された体細胞の型が、ｉＰＳ細胞作製の効率および再プログラミングのレベルに有意な効果を有することである。この点において、神経幹細胞、胃細胞および肝細胞などのいくつかの細胞型は、線維芽細胞と比較して比較的高い効率で再プログラムすると思われる。しかし、ヒト由来のこれらの細胞の単離は、組織採取の侵襲性および／または利用可能なドナー試料が限られていることにより困難または実現不可能である。いくつかのより入手しやすい細胞型（例えば、筋肉細胞または分化した造血細胞）はｉＰＳ研究の基盤として使用されているが、再プログラミングの成功は限られている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、当分野において、容易に入手でき、効率的な再プログラミングが確実に可能な最適な細胞型の特定の必要がある。効率的な再プログラミング特性を有するこのような細胞型の特定は、ゲノムへの組み込みを必要とせず、かつ／または再プログラミング因子の数を最小化もしくは減少させる再プログラミング方法の使用を容易にすると思われる。このことは、腫瘍性形質転換の危険性が減少した、より安全な多能性ｉＰＳ細胞集団をもたらすであろう。再プログラミングの効率が高く、胚組織に頼らずに得られるこのような細胞型は、存在がすでに企図されている適用である多能性ＥＳ細胞への使用に適していると思われる。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明につながる研究において、本発明者は、多くの組織供給源が効率的にｉＰＳ細胞を作製するために適切な供給源ではないという従来の見識にもかかわらず、さまざまな供給源由来の細胞を使用してｉＰＳ細胞の作製を試みた。驚くべきことに、本発明者は、Ｓｔｒｏ−１＋多分化能細胞またはその子孫細胞（特に、脂肪組織または歯髄組織由来のもの）が、高い効率、例えば線維芽細胞より高い効率を有するｉＰＳ細胞作製のための有用な供給源であったことを発見した。
【０００９】
本発明者はまた、Ｓｔｒｏ−１＋多分化能細胞またはその子孫細胞が、線維芽細胞を再プログラムし、ｉＰＳ細胞を作製するために、外から(exogenously)加えられることが普通は必要とされる内因性因子、例えばＫｌｆ４および／またはｃ−ｍｙｃを発現することも決定した。このような内因性（endocgenous）遺伝子の発現は、これらのタンパク質を高レベルで導入することなく、またはこれらの非内因性型タンパク質を全く導入することなくｉＰＳ細胞を作製することを可能にできる。ｃ−ｍｙｃの内因性発現は、この発がん遺伝子の構成的発現および／または強度の発現を必要としないので、ｃ−ｍｙｃの内因性発現は、腫瘍形成の危険性が減少したｉＰＳ細胞の作製もまた容易にすると思われる。
【００１０】
本発明の一例は、再プログラム化細胞を作製する方法を提供し、前記方法は、Ｓｔｒｏ−１＋多分化能細胞および／またはその子孫細胞を、細胞を再プログラムするために十分な条件下で１種または複数の能力決定因子（potency-determining factors）に曝露するステップおよび曝露された細胞を培養し、再プログラム化細胞を得るステップを含む。この方法は、同様に、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞を作製する方法に適用される。
【００１１】
本発明の別の例は、再プログラム化細胞を作製する方法を提供し、前記方法は、Ｓｔｒｏ−１＋多分化能細胞および／またはその子孫細胞が濃縮された細胞の集団を、細胞を再プログラムするために十分な条件下で１種または複数の能力決定因子に曝露するステップを含む。
【００１２】
Ｓｔｒｏ−１＋多分化能細胞の供給源は、これらの細胞がｉｎ ｓｉｔｕで位置する任意の組織であってよい。好ましくは、Ｓｔｒｏ−１＋多分化能細胞の供給源は脂肪組織または歯髄組織である。Ｓｔｒｏ−１＋細胞の別の供給源は骨髄である。
【００１３】
一例において、Ｓｔｒｏ−１＋多分化能細胞またはその子孫細胞は、１種または複数の能力決定因子に曝露する前の脂肪組織、歯髄組織、骨髄または他の部位から濃縮される。
【００１４】
一例において、本発明の方法は、曝露された細胞を培養し、Ｓｔｒｏ−１＋多分化能細胞および／またはその子孫細胞よりも広い分化能を有する、すなわち、Ｓｔｒｏ−１＋多分化能細胞および／またはその子孫細胞よりも広範囲の細胞系列（cell lineage）および／または細胞型に分化できる、再プログラム化細胞を得るステップを含む。
【００１５】
例示的な能力決定因子は、限定するものではないが、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、ｃ−Ｍｙｃ、ｂＦＧＦ、ＳＣＦ、ＴＥＲＴ、ＳＶ４０ラージＴ抗原、ＨＰＶ１６Ｅ６、ＨＰＶ１６Ｅ７、Ｂｍｉｌ、Ｆｂｘ１５、Ｅｒａｓ、ＥＣＡＴ１５−２、Ｔｃｌ１、β−カテニン、ＥＣＡＴ１、ＥＳＧ１、Ｄｎｍｔ３Ｌ、ＥＣＡＴ８、Ｇｄｆ３、Ｓｏｘ１５、ＥＣＡＴ１５−１、Ｆｔｈｌ１７、Ｓａｌ１４、Ｒｅｘ１、ＵＴＦ１、Ｓｔｅｌｌａ、Ｓｔａｔ３、ＦｏｘＤ３、ＺＮＦ２０６、Ｍｙｂｌ２、ＤＰＰ Ａ２、Ｏｔｘ２およびＧｒｂ２または１種もしくは複数の前記因子と同一もしくは類似の活性を有する化合物、例えばその活性断片または小分子からなる群から個別にまたは集約的に選択される因子を含む。別の例示的な能力決定因子は、例えば本明細書に記載された、化学物質、ペプチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたはマイクロＲＮＡである。例えば、１種または複数の能力決定因子は、
（ｉ）Ｏｃｔ４、
（ｉｉ）Ｏｃｔ４とＳｏｘ２との組み合わせ、
（ｉｉｉ）Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２と、ＮａｎｏｇおよびＬｉｎ２８のうちの少なくとも１つとの組み合わせ、
（ｉｖ）Ｏｃｔ４、Ｋｌｆ４およびｃ−Ｍｙｃの組み合わせ、
（ｖ）Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２およびＫｌｆ４の組み合わせ、
（ｖｉ）Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４およびｃ−Ｍｙｃの組み合わせ、
（ｖｉｉ）Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、ＮａｎｏｇおよびＬｉｎ２８の組み合わせ、
（ｖｉｉｉ）Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃ、ＮａｎｏｇおよびＬｉｎ２８の組み合わせ、ならびに
（ｉｘ）（ｉ）から（ｘ）のうちのいずれか１つと、さらに化学物質、ペプチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたはマイクロＲＮＡとの組み合わせ
からなる群から個別にまたは集約的に選択される。
【００１６】
好ましくは、能力決定因子はＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４およびｃ−Ｍｙｃである。
【００１７】
本発明の方法の一例において、Ｓｔｒｏ−１＋多分化能細胞および／またはその子孫細胞は、出生後の対象から得られる。この実施形態によれば、本方法は、対照からＳｔｒｏ−１＋多分化能細胞および／または子孫細胞を得る、または単離するステップをさらに含み得る。
【００１８】
好ましくは、対象は、哺乳動物および／または哺乳動物の細胞である。例示的な哺乳動物対象は、限定するものではないが、ヒト、霊長類、家畜（例えば、ヒツジ、ウシ、ウマ、ロバ、ブタ）、コンパニオン・アニマル（例えば、イヌ、ネコ）、実験動物（例えば、マウス、ウサギ、ラット、モルモット、ハムスター）、捕らわれた野生動物（例えば、キツネ、シカ）を含む。好ましくは、哺乳動物はヒトまたは霊長類である。最も好ましい哺乳動物はヒトである。
【００１９】
本発明の一例示形態において、Ｓｔｒｏ−１＋多分化能細胞および／またはその子孫細胞を１種または複数の能力決定因子に曝露するステップは、プロモーターに作動可能に連結された１種または複数の能力決定因子をコードする配列を含む核酸をＳｔｒｏ−１＋多分化能細胞および／またはその子孫細胞に導入するステップを含む。核酸をコードする複数の能力因子は互いに異なっていても、または単一の核酸において、例えば、別々のプロモーターにそれぞれが連結した複数の核酸、もしくは単一のプロモーターにそれぞれが連結した複数の核酸を含む単一の発現ベクター、例えばマルチシストロン性ベクター中にあってもよい。好ましくは、核酸はベクター、より好ましくはウイルスベクター、例えばレトロウイルスベクターまたはアデノウイルスベクター内に含有される。
【００２０】
本発明の一例において、核酸は、Ｓｔｒｏ−１＋多分化能細胞および／またはその子孫細胞のゲノム中に組み込まれない。例えば、核酸（複数可）は、細胞（複数可）内で１つまたは複数のエピソームとして残存し、および／または最終的に細胞（複数可）から排出される。
【００２１】
好ましくは、本発明の方法は、多分化能細胞または多能性細胞または全能細胞、より好ましくは多能性細胞の作製をもたらす。一例において、再プログラム化細胞は、（ｉ）Ｏｃｔ−４、ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４、Ｔｒａ−１−６０およびＴｒａ−１−８１からなる群から選択される細胞マーカーを発現し、（ｉｉ）多能性細胞に特徴的な形態を示し、（ｉｉｉ）免疫不全動物に導入されると奇形腫を形成する。
【００２２】
別の例において、本発明の方法は、再プログラム化細胞を、所望の細胞型を含む細胞集団、または所望の細胞型が濃縮された細胞集団に分化させるステップをさらに含む。本発明の方法は、所望の細胞型を単離、濃縮または選択するステップをさらに含み得る。このような細胞は、例えば本明細書に記載された療法またはスクリーニングにおいて有用である。または、例えば多能性細胞が病態を患っている対象から作製された場合、このような分化細胞は疾患状態または病態の研究に有用である。
【００２３】
別の例において、本発明の方法は、任意の実施形態に従って本明細書に記載の方法によって作製された細胞の有効量を、薬学的に許容される担体または賦形剤を有する医薬組成物に製剤化するステップを含む。
【００２４】
別の例において、本発明は、任意の実施形態に従って本明細書に記載の方法によって作製された細胞またはその集団または再プログラム化細胞が濃縮された集団を提供する。同様に、本発明の例示形態は、任意の実施形態に従って本明細書に記載の細胞または集団から分化した細胞または細胞の集団を提供する。
【００２５】
本発明の別の例は、異種プロモーターに作動可能に連結された能力決定因子をコードする核酸を含む、Ｓｔｒｏ−１＋多分化能細胞および／またはその子孫細胞を提供する。このような細胞は、再プログラム化細胞の作製に有用である。
【００２６】
任意の実施形態に従って本明細書に記載の方法を実施することによって作製された細胞は、薬物療法、例えば疾患または障害を治療または予防する方法において有用であり、この方法は、この細胞またはその集団を、それを必要とする対象に投与するステップを含む。
【００２７】
任意の実施形態に従って本明細書に記載の方法を実施することによって作製された細胞は、スクリーニングにもまた有用である。例えば、本発明は、疾患または障害の治療または予防において有用な化合物をスクリーニングする方法を提供し、この方法は、本発明による細胞または集団を前記化合物に曝露するステップを含む。
【００２８】
例えば、本発明は、多能性細胞の分化を導く化合物を特定する方法をさらに提供し、この方法は、
ｉ）本発明に従って作製された多能性細胞またはその集団を被験化合物と接触させ、それから分化した細胞の量を決定するステップ、
ｉｉ）この化合物の不在下で、本発明に従って作製された多能性細胞またはその集団から分化した細胞の量を決定するステップ
を含み、（ｉｉ）と比較して（ｉ）において分化細胞の量が増加することが、化合物が多能性細胞の分化を導くことを示す。
【００２９】
好ましくは、本方法は、１種または複数の異なる分化細胞型の量を決定するステップを含む。このようにして、特定の細胞系列または細胞型への分化を導く化合物が決定される。
【００３０】
前述により、本発明が、多能性細胞の分化を低減し、または阻止する化合物を特定する方法をさらに提供することが、当業者には明らかであると思われる。
【００３１】
本発明はさらに、病態の治療に有用な化合物を特定または単離する方法を提供し、この方法は、
（ｉ）任意の実施形態に従って本明細書に記載の方法を実施して、病態を患う対象から多能性細胞またはその集団を作製するステップ、および
（ｉｉ）細胞または集団を被験化合物と接触させ、病態の１種または複数の症状に対するその効果を決定するステップ
を含み、病態の症状を改善または緩和する化合物が病態の治療に有用である。
【００３２】
一例において、本方法は、
（ａ）多能性細胞またはその集団を病態に侵された細胞に分化させるステップ、および
（ｂ）（ａ）の細胞を被験化合物と接触させ、病態の１種または複数の症状に対するその効果を決定するステップ
を含み、病態の症状を改善または緩和する化合物が病態の治療に有用である。
【００３３】
このような方法は、病態を治療するための新規な化合物の特定および単離に有用であるだけではなく、対象が、既存の治療化合物／予防化合物を用いた治療に応答する可能性があるかどうかを特定するためにも有用である。
【００３４】
このような方法は、化合物を、再プログラム化Ｓｔｒｏ−１＋多分化能細胞および／またはその子孫細胞から成熟および分化および由来した１種または複数の標的組織に曝露した場合、化合物の任意の特定の毒性効果を特定するためにもさらに有用である。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
概要
本明細書を通して、特に明示しない限り、または文脈上別の解釈を要する場合を除き、単一のステップ、組成物、ステップの群または組成物の群への言及は、それらのステップ、組成物、ステップの群または組成物の群の１つまたは複数（すなわち、１つ以上）を包含すると解釈されるべきである。
【００３６】
本明細書に記載の個々の実施形態は、特に明記されない限り、１つ１つの他の実施形態に変更すべきところは変更して適用される。
【００３７】
当業者は、本明細書に記載の発明が、具体的に述べられた以外の変更および改良を受け入れ可能であることが明らかであろう。本発明が、このような変更および改良をすべて含むことは理解されるべきである。本発明は、本明細書に言及された、または示されたすべてのステップ、特徴、組成物および化合物、ならびに前記ステップまたは特徴のあらゆる組み合わせまたは任意の２つ以上を個別にまたは集約的にさらに含む。
【００３８】
本発明は、本明細書に記載の具体的実施形態によって範囲を限定されるものではなく、これらは単なる例示を目的とする意図である。機能的に同等である生成物、組成物および方法が本発明の範囲内であることは、本明細書に記載のように明らかである。
【００３９】
本発明は、特に明記しない限り、分子生物学、微生物学、ウイルス学、組み換えＤＮＡ技術、溶液中のペプチド合成、固相ペプチド合成および免疫学の従来技術を使用して、必要以上の実験をせずに実施される。このような手順は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｆｒｉｔｓｃｈ ＆ Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、第２版（１９８９年）、Ｖｏｌｓ Ｉ、ＩＩおよびＤＩ全体；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｖｏｌｓ．ＩおよびＩＩ（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ編、１９８５年）、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、テキスト全体；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編、１９８４年）ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、テキスト全体および特にテキスト中のＧａｉｔによる１〜２２ページ；Ａｔｋｉｎｓｏｎら、３５〜８１ページ；Ｓｐｒｏａｔら、８３〜１１５；およびＷｕら、１３５〜１５１ページの論文；４．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編、１９８５年）ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、テキスト全体；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（１９８６年）ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、テキスト全体；Ｐｅｒｂａｌ，Ｂ．、Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４年）；Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｓ．ＣｏｌｏｗｉｃｋおよびＮ．Ｋａｐｌａｎ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）、シリーズ全体；Ｊ．Ｆ．Ｒａｍａｌｈｏ Ｏｒｔｉｇａｏ、「Ｔｈｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」：Ｋｎｏｗｌｅｄｇｅ ｄａｔａｂａｓｅ ｏｆ Ａｃｃｅｓｓ ｔｏ Ｖｉｒｔｕａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｗｅｂｓｉｔｅ （Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖａ、Ｇｅｒｍａｎｙ）；Ｓａｋａｋｉｂａｒａ，Ｄ．、Ｔｅｉｃｈｍａｎ，Ｊ．、Ｌｉｅｎ，Ｅ．Ｌａｎｄ Ｆｅｎｉｃｈｅｌ，Ｒ．Ｌ．（１９７６年）．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．７３ ３３６〜３４２ページ；Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｒ．Ｂ．（１９６３年）．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５、２１４９〜２１５４年；Ｂａｒａｎｙ，Ｇ．およびＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｒ．Ｂ．（１９７９年）、Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ（Ｇｒｏｓｓ，Ｅ．およびＭｅｉｅｎｈｏｆｅｒ，Ｊ．編）ｖｏｌ．２、１〜２８４ページ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ．１２．Ｗｕｕｎｓｃｈ，Ｅ．編（１９７４年）Ｓｙｎｔｈｅｓｅ ｖｏｎ Ｐｅｐｔｉｄｅｎ ｉｎ Ｈｏｕｂｅｎ−Ｗｅｙｌｓ Ｍｅｔｏｄｅｎ ｄｅｒ Ｏｒｇａｎｉｓｃｈｅｎ Ｃｈｅｍｉｅ（Ｍｕｌｅｒ，Ｅ．編）、ｖｏｌ．１５、第４版、パート１および２、Ｔｈｉｅｍｅ，Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ；Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ，Ｍ．（１９８４年）Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ；Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ，Ｍ．＆ Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ，Ａ．（１９８４年）Ｔｈｅ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ；Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ，Ｍ．（１９８５年）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．２５、４４９〜４７４ページ；Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｉ〜ＩＶ巻（Ｄ． Ｍ．ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編、１９８６年、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）；ならびにＡｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ： Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、第３版（Ｊｏｈｎ Ｒ．Ｗ．Ｍａｓｔｅｒｓ編、２０００年）、ＩＳＢＮ０１９９６３７９７０、テキスト全体に記載されている。
【００４０】
選択された定義
「集約的」（collectively）は、本発明が、任意の数または組み合わせの列挙されたタンパク質もしくはマーカーまたはタンパク質もしくはマーカーの群を包含することを意味し、しかも、このような数または組み合わせのタンパク質もしくはマーカーまたはタンパク質もしくはマーカーの群が本明細書に具体的に記載されていないにもかかわらず、添付の特許請求の範囲が、任意の他の組み合わせのタンパク質もしくはマーカーまたはタンパク質もしくはマーカーの群から単独におよび分割可能にこのような組み合わせまたは小型の組み合わせ(sub-combinations)を定義し得ることを意味する。
【００４１】
本明細書を通して、文脈上別の解釈を要する場合を除き、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という用語または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変形は、述べられたステップもしくは要素もしくは整数（integer）またはステップもしくは要素もしくは整数の群を包含するが、他の任意のステップもしくは要素もしくは整数またはステップもしくは要素もしくは整数の群を排除しないことを暗示すると理解されるべきであろう。
【００４２】
本明細書において使用する場合、「に由来する」という用語は、指定された整数が特定の供給源から得ることができるが、必ずしも直接その供給源からである必要はないことを示すと解釈されるべきである。
【００４３】
本明細書において使用する場合、「有効量」という用語は、投与前の同じ過程または状態と比較して、および／または細胞を投与されない対象と比較して、生理的過程もしくは疾患状態を改善するため、または対象における疾患状態の発症を予防するための、再プログラム化細胞またはそれから分化した細胞および／またはその子孫細胞の十分量を意味すると解釈されるべきである。
【００４４】
本明細書において使用する場合、細胞集団の文脈における「濃縮された」という用語は、再プログラム化細胞または多能性細胞の数またはパーセントが天然の細胞集団における数またはパーセントを超えることを意味すると解釈されるべきである。例えば、再プログラム化細胞または多能性細胞が濃縮された集団は、少なくとも約０．０２％の前記細胞または少なくとも約０．０５％の前記細胞または少なくとも約０．１％の前記細胞または少なくとも約０．２％の前記細胞または少なくとも約０．５％の前記細胞または少なくとも約０．５％の前記細胞または少なくとも約０．８％の前記細胞または少なくとも約１％の前記細胞または少なくとも約２％の前記細胞または少なくとも約３％の前記細胞または少なくとも約４％の前記細胞または少なくとも約５％の前記細胞または少なくとも約１０％の前記細胞または少なくとも約１５％の前記細胞または少なくとも約２０％の前記細胞または少なくとも約２５％の前記細胞または少なくとも約３０％の前記細胞または少なくとも約４０％の前記細胞または少なくとも約５０％の前記細胞または少なくとも約６０％の前記細胞または少なくとも約７０％の前記細胞または少なくとも約８０％の前記細胞または少なくとも約８５％の前記細胞または少なくとも約９０％の前記細胞または少なくとも約９５％の前記細胞または少なくとも約９７％の前記細胞または少なくとも約９８％の前記細胞または少なくとも約９９％の前記細胞で構成されている。
【００４５】
「曝露する（ｅｘｐｏｓｅ）」および文法的に同等の用語、例えば「曝露すること（ｅｘｐｏｓｉｎｇ）」は、能力決定因子が細胞に生物学的効果を発揮するほど、細胞を能力決定因子の十分近くに運ぶ任意の過程を意味すると解釈されるべきである。この用語は、限定するものではないが、細胞をこの因子と接触させるステップおよび／または細胞をこの因子をコードする核酸と接触させるステップおよび／または細胞においてこの因子を発現させるステップを含むと理解されるべきである。
【００４６】
「個別に」は、本発明が、列挙されたタンパク質もしくはマーカーまたはタンパク質もしくはマーカーの群を単独に包含することを意味し、しかも、個別のタンパク質もしくはマーカーまたはタンパク質もしくはマーカーの群が本明細書に単独で記載されていないとしても、添付の特許請求の範囲が、このようなタンパク質もしくはマーカーまたはタンパク質もしくはマーカーの群を、互いに単独におよび分割可能に定義し得ることを意味する。
【００４７】
本明細書において使用する場合、「ｉＰＳ細胞」という用語は、起源であるその各分化体細胞（例えば、Ｓｔｒｏ−１＋多分化能細胞またはその子孫細胞）と実質的に、遺伝学的に同一であり、ＥＳ細胞などの能力のより高い細胞と同様の特徴を示す細胞を指す。ｉＰＳ細胞は、ＥＳ細胞と類似の形態学的特性（すなわち、円形、大型の核小体およびわずかな細胞質）および成長特性（すなわち、倍加時間；ＥＳ細胞は約１７から１８時間の倍加時間を有する）を示す。さらに、ｉＰＳ細胞は、多能性細胞特異的マーカー（例えば、Ｏｃｔ−４、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ−１−６０、Ｔｒａ−１−８１、しかしＳＳＥＡ−Ｉは発現しない）を発現することが好ましい。しかし、ｉＰＳ細胞は、胚に直接由来するものではなく、少なくともそれらが多能性になるまで、選択された能力決定因子の１つまたは複数のコピーを一時的にまたは安定して発現できる。本明細書において使用する場合、「胚に直接由来しない」は、ｉＰＳ細胞を作製するための出発細胞型が、出生後の個体から得た非多能性Ｓｔｒｏ−１＋多分化能（mutilpotential）細胞またはその非多能性子孫であることを意味する。
【００４８】
本明細書において使用する場合、「多分化能」(multipotent)という用語は、細胞が、３種の胚葉（中胚葉、内胚葉および外胚葉）の１種または２種または３種、好ましくは１種または２種の胚葉の複数の異なる型の細胞に分化できることを意味すると解釈されるべきである。
【００４９】
本明細書において使用する場合、「多能性」(pluripotent)という用語は、細胞が、３種の胚葉、すなわち内胚葉、外胚葉および中胚葉のそれぞれの細胞に分化できることを意味すると解釈されるべきである。多能性細胞は、さまざまな多能性細胞特異的マーカー（例えば、以下の多能性細胞特異的マーカー：ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０またはＴＲＡ１−８１の１種または複数）を発現し、未分化細胞に特徴的な細胞形態（すなわち、コンパクトなコロニー、核細胞質比の高さおよび顕著な核小体）を有し、ＳＣＩＤマウスなどの免疫不全動物に導入された場合、奇形腫を形成する。奇形腫は、通常３種の胚葉すべての特徴を示す細胞または組織を含有する。当業者は、当分野において一般的に使用される技術を使用することによってこれらの特徴を評価でき、例えば、Ｔｈｏｍｓｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：１１４５〜１１４７（１９９８年）を参照されたい。多能性細胞は、細胞培養における増殖、および多分化能特性を示す、系列が限定されたさまざまな細胞集団への分化の両方ができる。多分化能体細胞は、多能性細胞と比較してより分化しているが、最終分化はしていない。したがって、多能性細胞は、多分化能細胞より高い能力を有している。
【００５０】
本明細書において使用する場合、「能力決定因子」という用語は、遺伝子または他の核酸、それらの機能的断片などの因子およびコードされた因子、例えばタンパク質もしくはその機能的断片、または体細胞の能力を増加し、それにより多分化能、多能性または全能になるために使用される小分子もしくは抗体を指す。能力決定因子は、場合により、再プログラム化細胞中に一時的にだけ存在し得る、または核酸の場合、再プログラム化細胞のゲノム中に転写的に活性または不活性な状態で維持され得る。同様に、核酸の能力決定因子は、再プログラム化細胞中に複数のコピーが存在でき、能力決定因子が細胞のゲノム中に組み込まれ得る場合、染色体外または両方に存在し得る。例示的能力決定因子は、Ｏｃｔ４（例示的ヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＢＣ１１７４３５．１またはＮＣＢＩ受託番号ＮＭ００２７０１で提示される）、Ｓｏｘ２（例示的ヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、ＮＣＢＩ受託番号ＮＭ＿００３１０６．２で提示される）、Ｋｌｆ４（例示的ヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、ＮＣＢＩ受託番号ＮＭ＿００４２３５．４で提示される）、Ｎａｎｏｇ（例示的ヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、ＮＣＢＩ受託番号ＮＭ＿０２４８６５．２で提示される）、Ｌｉｎ２８（例示的ヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、ＮＣＢＩ受託番号ＮＭ＿０２４６７４．４で提示される）、ｃ−Ｍｙｃ（例示的ヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｌ１６７８５．１）、ｂＦＧＦ、ＳＣＦ、ＴＥＲＴ、ＳＶ４０ラージＴ抗原、ＨＰＶ１６Ｅ６、ＨＰＶ１６Ｅ７、Ｂｍｉｌ、Ｆｂｘ１５、Ｅｒａｓ、ＥＣＡＴ１５−２、Ｔｃｌ１、β−カテニン、ＥＣＡＴ１、ＥＳＧ１、Ｄｎｍｔ３Ｌ、ＥＣＡＴ８、Ｇｄｆ３、Ｓｏｘ１５、ＥＣＡＴ１５−１、Ｆｔｈｌ１７、Ｓａｌ１４、Ｒｅｘ１（例示的配列は、ＮＣＢＩ受託番号ＮＭ１７４９００で提示される）、ＵＴＦ１（例示的配列は、ＮＣＢＩ受託番号ＮＭ００３５７７で提示される）、Ｓｔｅｌｌａ（例示的配列は、ＮＣＢＩ受託番号ＮＭ１９９２８６で提示される）、Ｓｔａｔ３、ＦｏｘＤ３（例示的配列は、ＮＣＢＩ受託番号ＮＭ０１２１８３で提示される）、ＺＮＦ２０６、Ｍｙｂｌ２、ＤＰＰ Ａ２、Ｏｔｘ２およびＧｒｂ２を含む。本明細書に提供されたすべての受託番号は、２００９年２月２０日現在のものである。当業者は、本明細書に記載の他の能力決定因子の構造を、例えばＮＣＢＩまたはＧｅｎＢａｎｋなどのデータベースを使用して容易に決定できるであろう。前記因子と同じまたは同様の活性を有する化合物もまた含まれる。このような化合物は、再プログラミングを強化または誘導できる抗体および小分子、例えば、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤またはＤＮＡメチラーゼまたはその阻害剤を含む。当業者は、適切な化合物を、例えば、１種または複数の能力決定因子が除外された本明細書に記載の方法および評価された被験化合物のパネルを使用して、ならびに／または細胞および／もしくはＭａｒｋｏｕｌａｋｉら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２７、１６９〜１７１ページ（２００９年）に記載の方法を使用して決定できるであろう。
【００５１】
本明細書において使用する場合、「能力」という用語は、複数の細胞型に分化する細胞の能力を意味すると解釈されるべきである。したがって、優れた能力を有する細胞は、能力のより低い細胞より多くの細胞型に分化できる。
【００５２】
本明細書において使用する場合、「予防有効量」という用語は、臨床症状の１種または複数の検出可能な症状を予防する、またはその発症を阻害する、または発症を遅延させるために十分な量の再プログラム化細胞またはそれから分化した細胞および／またはその子孫細胞を意味すると解釈されるべきである。
【００５３】
本明細書において使用する場合、「予防する（ｐｒｅｖｅｎｔ）」または「予防すること（ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ）」または「予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）」という用語は、予防有効量の細胞を投与し、臨床症状の少なくとも１種の症状の発生を停止する、妨げる、または遅延させるまたは減少させることを意味すると解釈されるべきである。
【００５４】
本明細書において使用する場合、「再プログラミング」という用語は、体細胞を脱分化および／または多分化能／多能性／全能細胞に転換させ、したがってそれが由来した細胞より優れた能力の可能性を有する過程を指す。好ましくは、再プログラム化細胞は多分化能、多能性または全能であり、より好ましくは多能性である。「再プログラム化」という用語は、体細胞を多分化能／多能性／全能にさせるために脱分化されている体細胞を指す。
【００５５】
本明細書において使用する場合、「ＳＴＲＯ−１＋多分化能細胞」という語句は、多分化能細胞コロニーを形成できる非造血性ＳＴＲＯ−１＋および／またはＴＮＡＰ＋の前駆細胞を意味すると解釈されるべきである。好ましいＳＴＲＯ−１＋多分化能細胞は、本明細書においてより詳細に考察される。
【００５６】
本明細書において使用する場合、「対象」という用語は、Ｓｔｒｏ−１＋細胞を含む任意の対象、好ましくは哺乳動物を意味すると解釈されるべきである。例示的対象は、限定するものではないが、ヒト、霊長類、家畜（例えば、ヒツジ、ウシ、ウマ、ロバ、ブタ）、コンパニオン・アニマル（例えば、イヌ、ネコ）、実験動物（例えば、マウス、ウサギ、ラット、モルモット、ハムスター）、捕らわれた野生動物（例えば、キツネ、シカ）を含む。好ましくは、哺乳動物はヒトまたは霊長類である。最も好ましい哺乳動物はヒトである。
【００５７】
本明細書において使用する場合、「全能」という用語は、ある細胞が、３種の胚葉のそれぞれの細胞および胚外組織に分化できることを意味すると解釈されるべきである。
【００５８】
本明細書において使用する場合、「治療有効量」という用語は、１種または複数の臨床症状を減少する、または阻害するために十分な量の再プログラム化細胞またはそれから分化した細胞および／またはその子孫細胞を意味すると解釈されるべきである。
【００５９】
本明細書において使用する場合、「治療する（ｔｒｅａｔ）」または「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」または「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」という用語は、治療有効量の細胞を投与し、臨床症状の少なくとも１種の症状を減少させる、または阻害することを意味すると理解されるべきである
【００６０】
ＳＴＲＯ−１＋多分化能細胞または子孫細胞
ＳＴＲＯ−１＋多分化能細胞は、骨髄、血液、歯髄細胞、脂肪組織、皮膚、脾臓、膵臓、脳、腎臓、肝臓、心臓、網膜、脳、毛嚢、腸、肺、リンパ節、胸腺、骨、靭帯、腱、骨格筋、真皮および骨膜において発見された細胞であり、中胚葉および／または内胚葉および／または外胚葉などの生殖細胞系に分化できる。好ましくは、ＳＴＲＯ−１＋細胞は骨髄、歯髄または脂肪組織由来であり、より好ましくは歯髄または脂肪組織由来である。したがって、ＳＴＲＯ−１＋多分化能細胞は、限定するものではないが、脂肪組織、骨組織、軟骨組織、弾性組織、筋肉組織および線維性結合組織を含む多数の細胞型に分化できる。これらの細胞が進入する特定の分化系列決定および分化経路は、機序的な影響ならびに／または内因性生物活性因子、例えば成長因子、サイトカインおよび／もしくは宿主組織によって確立された局所的微小環境条件からのさまざまな影響に依存する。したがって、ＳＴＲＯ−１＋多分化能細胞は、分裂し、時がたてば不可逆的に分化し表現型細胞をもたらすであろう、幹細胞または前駆体細胞のいずれかである娘細胞をもたらす非造血性前駆細胞である。
【００６１】
好ましい実施形態において、ＳＴＲＯ−１＋多分化能細胞は、対象、例えば治療されるべき対象または関連する対象または関連のない対象（同じ種または異なる種のどちらでも）から得られた試料から濃縮される。このような濃縮は、ｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで実施され得る。「濃縮された（ｅｎｒｉｃｈｅｄ）」、「濃縮（ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）」という用語またはそれらの変形は、本明細書において、未処理の集団と比較した場合、１種の特定の細胞型の割合または多数の特定の細胞型の割合が増加した細胞の集団を表すために使用される。
【００６２】
好ましい実施形態において、本発明において使用される細胞は、ＴＮＡＰ＋、ＶＣＡＭ−１＋、ＴＨＹ−１＋、ＳＴＲＯ−２＋、ＣＤ４５＋、ＣＤ１４６＋、３Ｇ５＋またはそれらの任意の組み合わせからなる群から個別にまたは集約的に選択される、１種または複数のマーカーを発現する。
【００６３】
好ましくは、ＳＴＲＯ−１＋細胞は、ＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔ（同義語ＳＴＲＯ−１ｂｒｉ）である。好ましくは、ＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔ細胞は、さらにＴＮＡＰ＋、ＶＣＡＭ−１＋、ＴＨＹ−１＋、ＳＴＲＯ−２＋および／またはＣＤ１４６＋の１つまたは複数である。
【００６４】
一実施形態において、間葉前駆体細胞は、ＷＯ２００４／８５６３０に定義されるように血管周囲の間葉前駆体細胞である。
【００６５】
所与のマーカーに対して「陽性」であると称される細胞は、この用語が細胞の選別過程において使用される蛍光または他のマーカーの強度に関連する場合、マーカーが細胞表面に存在する程度に依存して、低レベル（ｌｏもしくはｄｉｍ）または高レベル（ｂｒｉｇｈｔ、ｂｒｉ）のいずれかでそのマーカーを発現できる。ｌｏ（もしくはｄｉｍもしくはｄｕｌｌ）とｂｒｉとの区別は、選別された特定の細胞集団に関して使用されるマーカーとの関連で理解されるであろう。所与のマーカーに対して「陰性」であると称される細胞は、その細胞が必ずしも完全に不在ではない。この用語は、その細胞によって発現されるマーカーが比較的非常に低いレベルであることを意味し、検出可能に標識された場合、非常に低いシグナルを発生するまたはバックグラウンドのレベルを上回って検出できないことを意味する。
【００６６】
本明細書において使用する場合、「ｂｒｉｇｈｔ」という用語は、検出可能に標識された場合、比較的高いシグナルを発生する細胞表面のマーカーを指す。理論に縛られることを好むわけではないが、「ｂｒｉｇｈｔ」細胞が、試料中の他の細胞より多くの標的マーカータンパク質（例えば、ＳＴＲＯ−１により認識される抗原）を発現することが提唱される。例えば、ＳＴＲＯ−１ｂｒｉ細胞は、ＦＩＴＣ標識ＳＴＲＯ−１抗体を用いて標識された場合、蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）分析による決定で非ｂｒｉｇｈｔ細胞（ＳＴＲＯ−１ｄｕｌｌ／ｄｉｍ）より多くの蛍光シグナルを発生する。好ましくは、「ｂｒｉｇｈｔ」細胞は出発試料中に含有される最も明るく標識された骨髄単核細胞の少なくとも約０．１％を構成する。他の実施形態において、「ｂｒｉｇｈｔ」細胞は出発試料中に含有される最も明るく標識された骨髄単核細胞の少なくとも約０．１％、少なくとも約０．５％、少なくとも約１％、少なくとも約１．５％または少なくとも約２％を構成する。好ましい実施形態において、ＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔ細胞は、「バックグラウンド」、すなわちＳＴＲＯ−１−である細胞と比較してＳＴＲＯ−１の表面発現の２ｌｏｇ量の発現増加を有する。比較すると、ＳＴＲＯ−１ｄｉｍおよび／またはＳＴＲＯ−１ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ細胞は、２ｌｏｇ量未満の発現増加、通常約１ｌｏｇまたは「バックグラウンド」より低いＳＴＲＯ−１の表面発現を有する。
【００６７】
本明細書において使用する場合、「ＴＮＡＰ」という用語は、組織非特異的アルカリホスファターゼのすべてのアイソフォームを包含することを意図する。例えばこの用語は、肝臓アイソフォーム（ＬＡＰ）、骨アイソフォーム（ＢＡＰ）および腎臓アイソフォーム（ＫＡＰ）を包含する。好ましい実施形態において、ＴＮＡＰはＢＡＰである。特に好ましい実施形態において、本明細書において使用する場合、ＴＮＡＰは、ブダペスト条約の規定の下に、２００５年１２月１９日に受託番号ＰＴＡ−７２８２でＡＴＣＣに寄託された、ハイブリドーマ細胞系によって作製されたＳＴＲＯ−３抗体に結合できる分子を指す。
【００６８】
さらに、好ましい実施形態において、ＳＴＲＯ−１＋多分化能細胞は、コロニー形成ＣＦＵ−Ｆを生じさせることができる。
【００６９】
かなりの割合の多分化能細胞が、少なくとも２種の異なる生殖細胞系に分化できることが好ましい。多分化能細胞が決定（committed）され得る系列の限定されない例は、骨前駆体細胞；胆管上皮細胞および肝細胞に関して多分化能である肝細胞前駆細胞；乏突起膠細胞および星状細胞に進行するグリア細胞前駆体を発生できる神経制限細胞；ニューロンに進行するニューロン前駆体；心筋および心筋細胞、グルコース反応性、インスリン分泌膵臓β細胞系に関する前駆体を含む。他の系列は、限定するものではないが、象牙芽細胞、象牙質産生細胞および軟骨細胞ならびに以下：細胞網膜色素上皮細胞、線維芽細胞、ケラチノサイトなどの皮膚細胞、樹状細胞、毛嚢細胞、尿細管上皮細胞、平滑筋細胞および骨格筋細胞、精巣前駆細胞、血管内皮細胞、腱、靭帯、軟骨、含脂肪細胞、線維芽細胞、骨髄基質、心筋、平滑筋、骨格筋、周皮細胞、血管、上皮、グリア、ニューロン、星状細胞および乏突起膠細胞の各細胞の前駆体細胞を含む。
【００７０】
別の実施形態において、ＳＴＲＯ−１＋多分化能細胞は、培養において造血性細胞を発生できない。
【００７１】
一実施形態において、細胞は治療される対象から採取される、または例えば、任意の実施形態に従って本明細書に記載の方法に使用する前に、標準的技術を使用してｉｎ ｖｉｔｒｏで培養される。このような細胞またはそれらから分化した細胞は、自己または同種の組成物において対象に投与するために有用である。別の実施形態において、確立されたヒト細胞系の１種または複数の細胞が使用される。本発明の別の有用な実施形態において、非ヒト動物（または対象がヒトではない場合、別の種由来）の細胞が使用される。
【００７２】
子孫細胞は、任意の適切な培地において培養することによって得ることができる。細胞培養に関して使用される場合、「培地」という用語は、細胞周囲の環境構成要素を含む。培地は、固体、液体、気体または相と材料の混合物であってよい。培地は、液体成長培地および細胞成長を維持しない液体培地を含む。培地は、ゼラチン培地、例えば寒天、アガロース、ゼラチンおよびコラーゲン基質をさらに含む。例示的ガス状培地は、ペトリ皿または他の固体もしくは半固体支持体上で成長する細胞が曝露されるガス相を含む。「培地」という用語は、たとえ細胞に接触していなくても、細胞培養において使用するための材料を指す。言い換えれば、細胞培養のために調製された栄養豊富な液体は培地である。水または他の液体と混合した場合細胞培養に適切になる粉末混合物は、「粉末培地」と呼ぶことができる。
【００７３】
ある実施形態において、本発明の方法に有用な子孫細胞は、ＳＴＲＯ−３抗体を用いて標識された磁気ビーズを使用して骨髄からＴＮＡＰ＋ＳＴＲＯ−１＋多分化能細胞を単離し、次いで培養して単離細胞を増殖させる（expand）ことによって得られる（適切な培養条件の例に関してはＧｒｏｎｔｈｏｓら、Ｂｌｏｏｄ ８５：９２９〜９４０ページ、１９９５年を参照されたい）。
【００７４】
一実施形態において、このように増殖させた細胞（子孫）（好ましくは、少なくとも５継代後）は、ＴＮＡＰ−、ＣＣ９−、ＨＬＡクラスＩ＋、ＨＬＡクラスＩＩ−、ＣＤ１４−、ＣＤ１９−、ＣＤ３−、ＣＤ１１ａ−ｃ−、ＣＤ３１−、ＣＤ８６−、ＣＤ３４−および／またはＣＤ８０−であり得る。しかし、本明細書に記載の培養条件と異なる培養条件下では、さまざまなマーカーの発現は変動し得る可能性がある。さらに、これらの表現型の細胞は増殖させた細胞集団において優勢であり得るが、この表現型（複数可）を有さない細胞の少数の集団が存在することを意味するものではない（例えば、増殖させた細胞は、少ない割合でＣＣ９−であり得る。）。好ましい一実施形態において、増殖させた細胞は、さまざまな細胞型に分化する能力を未だに有している。
【００７５】
さらなる実施形態において、増殖させた細胞は、ＬＦＡ−３、ＴＨＹ−１、ＶＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１、ＰＥＣＡＭ−１、Ｐ−セレクチン、Ｌ−セレクチン、３Ｇ５、ＣＤ４９ａ／ＣＤ４９ｂ／ＣＤ２９、ＣＤ４９ｃ／ＣＤ２９、ＣＤ４９ｄ／ＣＤ２９、ＣＤ９０、ＣＤ２９、ＣＤ１８、ＣＤ６１、インテグリンβ ６−１９、トロンボモジュリン、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＳＣＦ、ＰＤＧＦ−Ｒ、ＥＧＦ−Ｒ、ＩＧＦ１−Ｒ、ＮＧＦ−Ｒ、ＦＧＦ−Ｒ、レプチン−Ｒ（ＳＴＲＯ−２＝レプチン−Ｒ）、ＲＡＮＫＬ、ＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔおよびＣＤ１４６またはこれらのマーカーの任意の組み合わせからなる群から選択される、１種または複数のマーカーを集約的に、または個別に発現し得る。
【００７６】
一実施形態において、子孫細胞は、ＷＯ２００６／０３２０９２において定義され、および／または記載された、多分化能性増殖ＳＴＲＯ−１＋多分化能細胞子孫（Ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔｉａｌ Ｅｘｐａｎｄｅｄ ＳＴＲＯ−１＋ Ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｃｅｌｌｓ Ｐｒｏｇｅｎｙ）（ＭＥＭＰ）である。子孫が由来し得るＳＴＲＯ−１＋多分化能細胞が濃縮された集団を調製する方法は、ＷＯ０１／０４２６８およびＷＯ２００４／０８５６３０に記載される。ｉｎ ｖｉｔｒｏの関連において、ＳＴＲＯ−１＋多分化能細胞は、完全に純粋な調製品として存在することは稀であり、一般的には組織特異的分化系列決定細胞（ｔｉｓｓｕｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｏｍｍｉｔｔｅｄ ｃｅｌｌｓ）（ＴＳＣＣ）である他の細胞と一緒に存在すると思われる。ＷＯ０１／０４２６８は、約０．１％から９０％の純度レベルで骨髄からこのような細胞を収穫するステップについて言及している。子孫が由来する多分化能（mutilpotential）細胞を含む集団は、組織供給源から直接収穫でき、またはｅｘ ｖｉｖｏですでに増殖させた集団であってもよい。
【００７７】
例えば、子孫は、それが存在する集団の合計細胞の少なくとも約０．１、１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０または９５％を含む、収穫され、増殖しない実質的に精製されたＳＴＲＯ−１＋多分化能細胞の集団から得ることができる。このレベルは、例えば、ＴＮＡＰ、ＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔ、３Ｇ５＋、ＶＣＡＭ−１、ＴＨＹ−１、ＣＤ１４６およびＳＴＲＯ−２からなる群から個別にまたは集約的に選択される、少なくとも１種のマーカーに陽性である細胞を選択することによって達成され得る。
【００７８】
ＭＥＭＰは、マーカーのＳＴＲＯ−１ｂｒｉに対して陽性であり、マーカーのアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）に対して陰性であるという点から、新鮮に収穫されたＳＴＲＯ−１＋多分化能細胞とは識別され得る。対照的に、新鮮に単離されたＳＴＲＯ−１＋多分化能細胞は、ＳＴＲＯ−１ｂｒｉおよびＡＬＰの両方に対して陽性である。本発明の好ましい実施形態において、投与された細胞の少なくとも１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％はＳＴＲＯ−１ｂｒｉ、ＡＬＰ−の表現型を有する。さらなる好ましい実施形態において、ＭＥＭＰは、マーカーのＫｉ６７、ＣＤ４４および／またはＣＤ４９ｃ／ＣＤ２９、ＶＬＡ−３、α３β１の１種または複数に対して陽性である。その上さらなる好ましい実施形態において、ＭＥＭＰはＴＥＲＴ活性を示さない、および／またはマーカーのＣＤ１８に対して陰性である。
【００７９】
ＳＴＲＯ−１＋多分化能細胞出発集団は、ＷＯ０１／０４２６８またはＷＯ２００４／０８５６３０において示される任意の１種もしくは複数の組織型、すなわち骨髄、歯髄細胞、脂肪組織および皮膚に由来し、または、おそらくより広範囲には、脂肪組織、歯、歯髄、皮膚、肝臓、腎臓、心臓、網膜、脳、毛嚢、腸、肺、脾臓、リンパ節、胸腺、膵臓、骨、靭帯、骨髄、腱および骨格筋に由来し得る。
【００８０】
本発明の実施において、任意の所与の細胞表面マーカーを担持する細胞の分離は、多数のさまざまな方法によってもたらされ得るが、好ましい方法は、結合剤（例えば、抗体またはその抗原結合断片）と関与するマーカーとの結合、その後の、高レベルの結合または低レベルの結合または結合を示さないかのいずれかである、結合を示す細胞の分離に頼ると理解されると思われる。最も都合の良い結合剤は、抗体または抗体に基づく分子であり、好ましくは、これらの後者の薬剤の特異性のためモノクローナル抗体であり、またはモノクローナル抗体に基づく。抗体は、両方のステップに使用できるが、他の薬剤もまた使用でき、したがって、これらのマーカーに対するリガンドもまた、これらのマーカーを担持する細胞またはそれを欠いた細胞の濃縮に用いることができる。
【００８１】
抗体またはリガンドは固体支持体と結合し、粗分離を可能にする。分離技術は、好ましくは回収される分画の生存能力の保有を最大にする。異なる効率のさまざまな技術を用い、比較的粗い分離を得ることができる。用いる特定の技術は、分離の効率、関連する細胞毒性、実施の簡便さおよび速さならびに高性能の機器および／または技術的熟練の必要性に依存すると思われる。分離の手順は、限定するものではないが、抗体コーティング磁気ビーズを使用する磁気分離、アフィニティクロマトグラフィーおよび固体マトリックスに結合した抗体を用いた「パニング」を含み得る。正確な分離を提供する技術は、限定するものではないが、ＦＡＣＳを含む。ＦＡＣＳを実施する方法は、当業者には明らかであると思われる。
【００８２】
本明細書に記載の個々のマーカーに対する抗体は、市販されており（例えば、ＳＴＲＯ−１に対するモノクローナル抗体は、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＵＳＡから市販されている）、ＡＴＣＣまたは他の寄託組織から利用でき、および／または当分野において認識されている技術を使用して作製できる。
【００８３】
ＳＴＲＯ−１＋多分化能細胞を単離する方法は、例えば、ＳＴＲＯ−１の高レベルの発現を認識する磁気活性化細胞分取法（ＭＡＣＳ）を利用する固体相選別ステップである第１のステップを含むことが好ましい。所望であれば、次いで、特許明細書ＷＯ０１／１４２６８に記載の高レベルの前駆体細胞発現をもたらす第２の選別ステップを続けることができる。この第２の選別ステップは、複数のマーカーの使用を含み得る。
【００８４】
ＳＴＲＯ−１＋多分化能細胞を得る方法は、公知の技術を使用する第１の濃縮ステップの前に、細胞供給源の収穫をさらに含み得る。したがって、組織は外科的に摘出される。次いで、供給源組織を含む細胞は、いわゆる単一細胞懸濁液に分離されるであろう。この分離は、物理的および／または酵素的方法によって達成され得る。
【００８５】
ひとたび適切なＳＴＲＯ−１＋多分化能細胞集団が得られたら、ＳＴＲＯ−１＋多分化能細胞集団は、ＭＥＭＰを得るための任意の適切な手段によって培養または増殖させ得る。
【００８６】
本発明は、限定するものではないが、非ヒト霊長類細胞、有蹄動物、イヌ、ネコ、ウサギ、げっ歯類、鳥類および魚類の細胞を含む任意の非ヒト動物種由来の細胞を使用して実行できる。本発明を実施できる霊長類細胞は、限定するものではないが、チンパンジー、ヒヒ、カニクイザルならびに他の任意の新世界ザルおよび旧世界ザル（New or Old World monkeys）の細胞を含む。本発明を実施できる有蹄動物細胞は、限定するものではないが、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、バッファローおよびバイソンの細胞を含む。本発明を実施できるげっ歯類細胞は、限定するものではないが、マウス、ラット、モルモット、ハムスターおよびスナネズミの細胞を含む。本発明を実施できるウサギ種の例は、家畜化されたウサギ、ジャックラビット、野ウサギ、ワタオウサギ、カンジキウサギおよびナキウサギを含む。ニワトリ（Gallus gallus）は、本発明を実施できる鳥類の例である。
【００８７】
本発明の方法に有用な細胞は、使用前、または上清もしくは可溶性因子を得る前に保管できる。真核細胞および特に哺乳動物細胞の保管および保存の方法およびプロトコルは当分野において公知である（例えば、Ｐｏｌｌａｒｄ，Ｊ．Ｗ．およびＷａｌｋｅｒ，Ｊ．Ｍ．（１９９７年）Ｂａｓｉｃ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、第２版、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、Ｎ．Ｊ．；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．（２０００年）Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ、第４版、Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ、Ｈｏｂｏｋｅｎ、Ｎ．Ｊ．を参照されたい）。単離された幹細胞、例えば間葉幹細胞／前駆細胞またはその子孫の生物活性を維持する任意の方法は、本発明に関連して利用され得る。好ましい一実施形態において、細胞は、凍結保存を使用して維持および保管される。
【００８８】
能力決定因子を発現するように遺伝子改変された細胞
一実施形態において、ＳＴＲＯ−１＋多分化能細胞および／またはその子孫細胞は、例えば、能力決定因子またはその複数を発現するように遺伝子改変される。
【００８９】
細胞を遺伝子改変する方法は、当業者には明らかであると思われる。例えば、細胞において発現される核酸は、細胞、好ましくは多能性（plurlipotent）細胞における発現を誘導するためのプロモーターに作動可能に連結される。例えば、核酸は、対象のさまざまな細胞において作動可能であるプロモーター、例えば、ウイルスプロモーター、例えばＣＭＶプロモーター（例えばＣＭＶ−ＩＥプロモーター）またはＳＶ−４０プロモーターまたは延長因子プロモーターまたは誘導プロモーター、例えばｔｅｔ誘導プロモーターに作動可能に連結される。さらなる適切なプロモーターは当分野において公知であり、本発明の本実施形態に、必要な変更を加えて適用すると解釈されるべきである。本発明は、単一のプロモーター、例えばＯｃｔ４およびＳｏｘ２から複数の能力決定因子の発現を可能にする、マルチシストロン性ベクターの使用をさらに包含する。このようなベクターは、一般的に、さまざまな能力決定因子を個々にコードする２つの核酸を分離する配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を含む。
【００９０】
本明細書において使用する場合、「プロモーター」という用語は最も広い文脈で解釈されるべきであり、転写の開始に必要とされるＴＡＴＡボックスまたはイニシエーターエレメントを含むゲノム遺伝子の転写制御配列を、例えば、発生刺激および／または外部刺激に対する応答において、または組織特異的様式で遺伝子発現を改変するさらなる制御エレメント（すなわち、上流活性化配列、転写因子結合部位、エンハンサーおよびサイレンサー）と一緒に含む、またはそれを伴わずに含む。本文脈において、「プロモーター」という用語は、組み換え、合成もしくは融合分子または作動可能に連結された核酸の発現をもたらす、活性化する、または強化する、かつ好ましくはペプチドまたはタンパク質をコードする誘導体を表すためにもまた使用される。好ましいプロモーターは、１種または複数の特異的制御エレメントのさらなるコピーを含有し、前記核酸分子の発現をさらに強化する、ならびに／または空間的発現および／もしくは時間的発現を改変することができる。
【００９１】
本文脈において、核酸の発現がプロモーターによって調節されるように位置付けられる場合、核酸は、プロモーターと一緒に、またはプロモーターに「作動可能に連結される」（すなわち、プロモーターの制御管理下にある）。プロモーターは、一般的に核酸の発現５’（上流）に位置付けられ、プロモーターが核酸の発現を調節する。異種プロモーター／核酸の組み合わせを構築するために、プロモーターは、そのプロモーターと遺伝子との間の距離とおよそ同じ距離で遺伝子転写開始部位から離れて位置付けられ、プロモーターがその自然の設定、すなわちプロモーターが由来する遺伝子において調節することが、一般的に好ましい。当分野において公知であるように、この距離のいくつかの変更はプロモーター機能を失うことなく調整され得る。同様に、その調節下で配置される異種核酸に対する制御配列エレメントの好ましい位置付けは、その自然の設定、すなわちそれが由来する遺伝子において要素を位置付けることによって画定される。この場合も先と同様に、当分野において公知であるように、この距離のいくつかの変更がまた起こり得る。
【００９２】
好ましくは、核酸は発現構築体の形態で提供される。本明細書において使用する場合、「発現構築体」という用語は、細胞において作動可能に連結される核酸に発現をもたらす能力を有する核酸を指す。本発明の文脈において、発現構築体は、プラスミド、バクテリオファージ、ファージミド、コスミド、ウイルスのサブゲノムもしくはゲノム断片または異種ＤＮＡに発現をもたらすことのできる他の核酸であってもよく、それを含んでいてもよいことが理解されよう。発現構築体は、細胞のゲノム中に組み込まれても、エピソームとして残存してもよい。
【００９３】
好ましい発現構築体は、エピソーム性、例えば、プラスミドおよびファージミドのままであり得る。このような発現構築体は、例えば発現構築体がゲノムに組み込まれていない再プログラム化細胞の作製に有用である。さらに、これらの発現構築体は多くの場合細胞分裂の間に失われるので、組み換え発現構築体を含まない再プログラム化細胞の作製を可能にする（例えば、Ｏｋｉｔａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３２２：９４９〜５３ページ、２００８年を参照されたい）。
【００９４】
本発明の実施のための適切な発現構築体の構築の方法は、当業者には明らかであると思われ、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、ＩＳＢＮ ０４７ １５０３３８、１９８７年）またはＳａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、第３版、２００１年）に記載されている。例えば、発現構築体の個々の要素は、適切な鋳型核酸から、例えばＰＣＲを使用して増幅され、その後、適切な発現構築体、例えばプラスミドまたはファージミドなどの内部にクローン化される。
【００９５】
このような発現構築体に適切なベクターは、当分野において公知であり、および／または本明細書に記載される。例えば、哺乳動物細胞中の本発明の方法に適切な発現ベクターは、例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎにより供給されるｐｃＤＮＡベクタースイート（vector suite）のベクター、ｐＣＩベクタースイート（Ｐｒｏｍｅｇａ）のベクター、ｐＣＭＶベクタースイート（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のベクター、ｐＭベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、ｐＳＩベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ＶＰ１６ベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）またはｐｃＤＮＡベクタースイート（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のベクターである。
【００９６】
当業者は、さらなるベクターおよびこのようなベクターの供給源、例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ＣｌｏｎｔｅｃｈまたはＰｒｏｍｅｇａを承知しているであろう。
【００９７】
単離核酸分子またはそれを含む遺伝子構築体を細胞に導入する方法は当業者には公知である。所与の生物に使用される技術は、公知の成功する技術に依存する。組み換えＤＮＡを細胞に導入する方法は、リン酸カルシウム沈殿（ＧｒａｈａｍおよびＶａｎ Ｄｅｒ Ｅｂ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、５２：４５６〜４６７ページ、１９７３年；ＣｈｅｎおよびＯｋａｙａｍａ、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、７：２７４５〜２７５２ページ、１９８７年；Ｒｉｐｐｅら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、１０：６８９〜６９５ページ、１９９０年）、ＤＥＡＥ−デキストラン（Ｇｏｐａｌ、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、５：１１８８〜１１９０ページ、１９８５年）、エレクトロポレーション（Ｔｕｒ−Ｋａｓｐａら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、６：７１６〜７１８ページ、１９８６年；Ｐｏｔｔｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８１：７１６１〜７１６５ページ、１９８４年）、直接微量注入、ＤＮＡ負荷リポソーム（ＮｉｃｏｌａｕおよびＳｅｎｅ、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、７２１：１８５〜１９０ページ、１９８２年；Ｆｒａｌｅｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７６：３３４８〜３３５２ページ、１９７９年）、細胞の超音波処理（Ｆｅｃｈｈｅｉｍｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８４：８４６３〜８４６７ページ、１９８７年）、高速微粒子銃を使用する遺伝子ボンバードメント（Ｙａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ、８７：９５６８〜９５７２ページ、１９９０年）、レセプター媒介トランスフェクション（ＷｕおよびＷｕ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６２：４４２９〜４４３２ページ、１９８７７年；ＷｕおよびＷｕ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２７：８８７〜８９２ページ、１９８８年）を含む。他の実施形態において、核酸の細胞への移入は、ナノキャップ（nanocaps）（例えばナノ粒子ＣａＰ０４）、コロイド金、ナノ粒子合成ポリマーおよび／またはリポソームと一緒に製剤化することによって達成され得る。
【００９８】
好ましい一実施形態において、エピソーム性のままである発現構築体、または発現構築体が細胞のゲノムに組み込まれていない限り、例えば上記、またはＯｋｉｔａら、２００８年、上記に記載の方法を使用してトランスフェクトされる。好ましくは、プラスミドは、前期細胞が再プログラムされるまで、前期細胞に繰り返しトランスフェクトされる。この様式において、細胞のゲノムに組み込まれた異種ＤＮＡを有さない細胞が作製され、治療的観点からこのことはより魅力的である。
【００９９】
または、本発明の発現構築体はウイルスベクターである。適切なウイルスベクターは当分野において公知であり、市販されている。核酸の送達およびその核酸を宿主細胞のゲノムに組み込まれるための従来のウイルスに基づく系は、例えば、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクターまたはアデノ随伴ウイルスベクターを含む。または、アデノウイルスベクターはエピソーム性のままである核酸を宿主細胞に導入し、例えば、そのゲノムに組み込まれた異種ＤＮＡを含まない再プログラム化細胞を作製するために有用である。ウイルスベクターは、標的細胞および組織における有効かつ用途の広い遺伝子移入方法である。さらに、高効率の形質導入が、多数のさまざまな細胞型および標的組織において観察されている。例示的ウイルスベクターを以下に述べる。
【０１００】
ａ）アデノウイルスベクター
一例において、本発明に有用なウイルス遺伝子送達系は、アデノウイルス由来のベクターを利用する。３６ｋＢの線状および二本鎖ＤＮＡウイルスであるアデノウイルスの遺伝子構成の知見は、８ｋＢまでの外来配列を有する大きなアデノウイルスＤＮＡ片の置換を可能にする。アデノウイルスＤＮＡは、遺伝毒性の可能性なしにエピソーム性様式で複製できるので、アデノウイルスＤＮＡの宿主細胞への感染は染色体への組み込みをもたらさない。さらに、アデノウイルスは構造的に安定であり、ゲノムの再構成が、広大な増幅後に検出されている。アデノウイルスは、その細胞周期の段階にかかわらず、事実上すべての上皮細胞に感染できる。組み換えアデノウイルスは、分裂細胞および非分裂細胞の両方を形質導入できる。非分裂細胞を有効に形質導入する能力は、アデノウイルスを、遺伝子を筋肉細胞または脂肪細胞に移入するための優れた候補にさせる。
【０１０１】
アデノウイルスは、その中型のゲノム、操作の容易さ、高力価、標的細胞の範囲の広さおよび高い感染性のため、遺伝子移入ベクターとして特に適切である。ウイルスゲノムの両方の末端は、１００〜２００塩基対（ｂｐ）の逆位末端反復（ＩＴＲ）を含有し、これらはウイルスＤＮＡの複製およびパッケージングに必要なシスエレメントである。
【０１０２】
ゲノムの初期（Ｅ）領域および後期（Ｌ）領域は、ウイルスＤＮＡの複製の開始によって分裂するさまざまな転写ユニットを含有する。Ｅ１領域（Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂ）は、ウイルスゲノムおよび少数の細胞遺伝子の転写制御に関与するタンパク質をコードする。Ｅ２領域（Ｅ２ＡおよびＥ２Ｂ）の発現は、ウイルスＤＮＡ複製のためのタンパク質の合成をもたらす。これらのタンパク質は、ＤＮＡの複製、後期遺伝子発現および宿主細胞の遮断に関与する（Ｒｅｎａｎ（１９９０年）Ｒａｄｉｏｔｈｅｒａｐ．Ｏｎｃｏｌ．１９：１９７）。ウイルスカプシドタンパク質の大部分を含む後期遺伝子の生成物は、主要な後期プロモーター（ＭＬＰ）によって生じる単一の一次転写産物の重要なプロセシングの後にのみ発現される。ＭＬＰ（１６．８μに位置する）は、感染後期において特に有効であり、このプロモーターから生じたすべてのｍＲＮＡは、それを翻訳のための例示的ｍＲＮＡにさせる５’トリパータイトリーダー（ＴＬ）配列を保有する。
【０１０３】
アデノウイルスゲノムは、対象となる遺伝子産物をコードするように操作することができるが、正常なウイルスの溶菌ライフサイクルにおいて複製するその能力に関しては不活性化される（例えば、Ｂｅｒｋｎｅｒら、（１９８８年）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：６１６ページ；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、（１９９１年）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：４３１〜４３４ページおよびＲｏｓｅｎｆｅｌｄら、（１９９２年）Ｃｅｌｌ ６８：１４３〜１５５ページを参照されたい）。アデノウイルスＡｄ株５ ｄｌ３２４型またはアデノウイルスの他の株（例えば、Ａｄ２、Ａｄ３、Ａｄ７など）に由来する適切なアデノウイルスベクター−は、当業者には公知である。
【０１０４】
組み換えアデノウイルスは、組み換えアデノウイルスが非分裂細胞を感染させることができ、気道上皮（上に引用されたＲｏｓｅｎｆｅｌｄら、（１９９２年））、内皮細胞（Ｌｅｍａｒｃｈａｎｄら、（１９９２年）ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８９：６４８２〜６４８６ページ）、肝細胞（ＨｅｒｚおよびＧｅｒａｒｄ、（１９９３年）ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９０：２８１２〜２８１６ページ）および筋肉細胞（Ｑｕａｎｔｉｎら、（１９９２年）ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８９：２５８１〜２５８４ページ；Ｒａｇｏｔら、（１９９３年）Ｎａｔｕｒｅ ３６１：６４７ページ）を含む広範囲の細胞型を感染させるために使用され得る、特定の状況において有利であり得る。
【０１０５】
さらに、ウイルス粒子は比較的安定であり、精製および濃縮しやすく、感染性の範囲に影響を及ぼすように改変され得る。
【０１０６】
さらに、他の遺伝子送達ベクターと比較して、外来ＤＮＡに対するアデノウイルスゲノムの担持能力は大きい（最大８キロベースまで）（Ｂｅｒｋｎｅｒら、上記；Ｈａｊ−ＡｈｍａｎｄおよびＧｒａｈａｍ（１９８６年）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５７：２６７ページ）。現在使用され、したがって本発明によって支持される、大部分の複製欠損アデノウイルスベクターは、ウイルスのＥ１およびＥ３遺伝子の全部または一部が削除されているが、アデノウイルスの遺伝物質の８０％程度を保有している（例えば、Ｊｏｎｅｓら、（１９７９年）Ｃｅｌｌ１６：６８３ページ；Ｂｅｒｋｎｅｒら、上記およびＧｒａｈａｍら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｅ．Ｊ．Ｍｕｒｒａｙ編（Ｈｕｍａｎａ、Ｃｌｉｆｔｏｎ、ＮＪ、１９９１年）７巻、１０９〜１２７ページを参照されたい）。本発明の挿入ポリヌクレオチドの発現は、例えば、Ｅ１Ａプロモーター、主要後期プロモーター（ＭＬＰ）および関連リーダー配列、ウイルスのＥ３プロモーターまたは外から加えられたプロモーター配列の調節下であり得る。
【０１０７】
ある実施形態において、アデノウイルスベクターは複製欠損であっても、または条件付き欠損であってもよい。アデノウイルスは、４２種の公知の異なる血清型またはサブグループＡ〜Ｆのいずれであってもよい。サブグループＣのアデノウイルス５型は、本明細書に記載の方法および組成物に従った使用のための、条件付き複製欠損アデノウイルスベクターを得るための例示的出発物質である。アデノウイルス５型は、大量の生化学的情報および遺伝的情報が公知であるヒトアデノウイルスであり、アデノウイルスをベクターとして用いる大部分の構築に歴史的に使用されてきたからである。上記のように、本発明に従った典型的なベクターは複製欠損であり、アデノウイルスＥ１領域を有さないであろう。したがって、対象となる核酸を、Ｅ１をコードする配列が除去された場所に導入するために最も都合がよいと思われる。しかし、アデノウイルス配列内の領域中のポリヌクレオチドの挿入位置は、本発明にとって重要ではない。例えば、Ｋａｒｌｓｓｏｎら、（１９８６年）によって以前に記載されたように、Ｅ３置換ベクター中の欠失Ｅ３領域の代わりに、またはＥ４を欠失したヘルパー細胞系またはヘルパーウイルス補体のＥ４領域にも挿入され得る。
【０１０８】
例示的ヘルパー細胞系は２９３（ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ１５７３）である。「パッケージング細胞系」とも称されるこのヘルパー細胞系は、Ｆｒａｎｋ Ｇｒａｈａｍ（Ｇｒａｈａｍら、（１９８７年）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．３６：５９〜７２ページおよびＧｒａｈａｍ（１９７７年）Ｊ．Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６８：９３７〜９４０）によって開発され、Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂをトランスで供給する。しかし、ヘルパー細胞系は、ヒト細胞、例えばヒト胎児の腎臓細胞、筋肉細胞、造血細胞または他のヒト胎児の間葉細胞もしくは上皮細胞にもまた由来し得る。または、ヘルパー細胞は、ヒトアデノウイルスに対して許容である他の哺乳動物種の細胞にも由来し得る。このような細胞は、例えば、ベロ細胞または他のサル胎児の間葉細胞もしくは上皮細胞を含む。
【０１０９】
アデノウイルスはさらに細胞型特異的である、すなわち、限定された細胞型だけに感染する、および／または限定された細胞型においてのみ所望のヌクレオチド配列を発現することができる。例えば、ウイルスは、例えば米国特許第５，６９８，４４３号に記載のように、標的宿主細胞によって特異的に制御される転写開始領域の転写調節下で遺伝子を含み得る。したがって、複製可能なアデノウイルスからの発現は、複製に必要なタンパク質の合成を制御する細胞特異的応答エレメント、例えば、Ｅ１ＡまたはＥ１Ｂを挿入することによって、特定の細胞に制限され得る。
【０１１０】
核酸の組み込み、核酸を含有する組み換えウイルスの増殖および精製ならびに細胞および哺乳動物のトランスフェクトへのその使用のための方法および材料を含む、本発明の実施に有用であると思われるアデノウイルス技術に関するさらなる詳細なガイダンスに関しては、Ｗｉｌｓｏｎら、ＷＯ９４／２８９３８、ＷＯ９６／１３５９７およびＷＯ９６／２６２８ならびにそれらの引用された参考文献を参照されたい。
【０１１１】
ｂ）レトロウイルス
ある実施形態において、レトロウイルスベクターは、本明細書に記載の方法および組成物に従って使用され得る。このようなウイルスは、再プログラム化細胞の作製にすでに使用されているがＳｔｒｏ−１＋細胞においては使用されていない。レトロウイルスは、逆転写の過程によって感染細胞においてそれらのＲＮＡを二本鎖ＤＮＡに転換する能力を特徴とする一本鎖ＲＮＡウイルスの群である（Ｃｏｆｆｉｎ（１９９０年）「Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉａｅ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ」Ｉｎ Ｆｉｅｌｄｓ、Ｋｎｉｐｅ編Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ）。次いで、得られたＤＮＡはプロウイルスとして細胞染色体に安定に組み込まれ、ウイルスタンパク質を調節合成する。組み込まれると、レシピエント細胞およびその子孫においてウイルス遺伝子配列が保有される。レトロウイルスゲノムは、それぞれカプシドタンパク質ポリメラーゼ酵素およびエンベロープ成分をコードする３種の遺伝子、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖを含有する。ｇａｇ遺伝子の上流で発見された配列はｐｓｉと呼ばれ、ビリオンにゲノムをパッケージングするためのシグナルとして機能する。２つの長い末端反復（ＬＴＲ）配列は、ウイルスゲノムの５’末端および３’末端に存在する。これらは、強いプロモーター配列およびエンハンサー配列を含有し、宿主細胞ゲノムへの組み込みにもまた必要とされる（Ｃｏｆｆｉｎ（１９９０年）、上記）。
【０１１２】
レトロウイルスベクターを構築するために、複製欠損であるウイルスを作製するための特定のウイルス配列に代わって、対象となる核酸がウイルスゲノムに挿入される。ビリオンを作製するために、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子を含有するが、ＬＴＲおよびｐｓｉ成分を含有しないパッケージング細胞系が構築される（Ｍａｎｎら、（１９８３年）Ｃｅｌｌ ３３：１５３ページ）。本発明の核酸を含有する組み換えプラスミドと、レトロウイルスのＬＴＲおよびｐｓｉ配列とを一緒に、（例えばリン酸カルシウム沈殿によって）この細胞系に導入する場合、ｐｓｉ配列は組み換えプラスミドのＲＮＡ転写産物をウイルス粒子にパッケージング可能にし、その後培養培地に分泌する（ＮｉｃｏｌａｓおよびＲｕｂｅｎｓｔｅｉｎ（１９８８年）「Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ」、ＲｏｄｒｉｇｕｅｚおよびＤｅｎｈａｒｄｔ編 Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ Ｓｕｒｖｅｙ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ Ｕｓｅｓ．Ｓｔｏｎｅｈａｍ、ＢｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈおよびＴｅｍｉｎ（１９８６年）「Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ：Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｉｎｔｏ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ ＤＮＡ ｉｎ Ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｏｍｅ」、Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ編 Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ；Ｍａｎｎら、１９８３年、上記）。その後、組み換えレトロウイルスを含有する培地が回収され、場合により濃縮され、遺伝子移入に使用される。レトロウイルスベクターは、広範囲の細胞型に感染できる。
【０１１３】
複製欠損レトロウイルスだけを産生する特殊化した細胞系（「パッケージング細胞」と呼ばれる）の開発は、遺伝子療法のためのレトロウイルスの有用性を増加させ、欠損レトロウイルスは遺伝子療法目的のための遺伝子移入への使用を特徴とする（再考察として、Ｍｉｌｌｅｒ，Ａ．Ｄ．（１９９０年）Ｂｌｏｏｄ ７６：２７１ページを参照されたい）。したがって、レトロウイルスコーディング配列（ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ）の一部が、ペプチドまたは本発明の類似体、例えばレトロウイルスに複製欠損をもたらす転写活性化因子をコードする核酸によって置換されている組み換えレトロウイルスが構築され得る。その後、複製欠損レトロウイルスはビリオンにパッケージングされ、このビリオンは、標準的技術によってヘルパーウイルスの使用を介して標的細胞を感染させるために使用できる。組み換えレトロウイルスの作製およびこのようなウイルスをｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで細胞に感染させるためのプロトコルは、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら（編）Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、（１９８９年）、Ｓｅｃｔｉｏｎｓ９．１０〜９．１４および他の標準的実験室マニュアルにおいて見出すことができる。
【０１１４】
適切なレトロウイルスの例は、ｐＬＪ、ｐＺＩＰ、ｐＷＥおよびｐＥＭを含み、これらは当業者には公知である。例示的レトロウイルスベクターは、ｐＳＲ ＭＳＶｔｋＮｅｏ（Ｍｕｌｌｅｒら、（１９９１年）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１１：１７８５ページおよびｐＳＲ ＭＳＶ（ＸｂａＩ）（Ｓａｗｙｅｒｓら、（１９９５年）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８１：３０７ページ）およびそれらの誘導体である。例えば、これらのベクター両方中の特有のＢａｍＨＩ部位は、ＣｌａｃｋｓｏｎらによるＷＯ９６／４１８６５に記載のように、ベクターをＢａｍＨＩを用いて消化し、Ｋｌｅｎｏｗを用いて埋め、それぞれ、ｐＳＭＴＮ２およびｐＳＭＴＸ２を作製するために再接合することによって除去できる。同種指向性および両種指向性両方のレトロウイルス系を調製するための適切なパッケージングウイルス系の例は、ＣｒｉｐおよびＣｒｅを含む。
【０１１５】
レンチウイルスを含むレトロウイルスは、さまざまな遺伝子を、神経細胞、上皮細胞、網膜細胞、内皮細胞、リンパ球、筋芽細胞、肝細胞、骨髄細胞を含む多数の異なる細胞型にｉｎ ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ ｖｉｖｏで導入するために使用されてきた（例えば、Ｆｅｄｅｒｉｃｏ（１９９９年）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１０：４４８ページ；Ｅｇｌｉｔｉｓら、（１９８５年）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０：１３９５〜１３９８ページ；ＤａｎｏｓおよびＭｕｌｌｉｇａｎ、（１９８８年）ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８５：６４６０〜６４６４ページ；Ｗｉｌｓｏｎら、（１９８８年）ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８５：３０１４〜３０１８ページ；Ａｒｍｅｎｔａｎｏら、（１９９０年）ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８７：６１４１〜６１４５ページ；Ｈｕｂｅｒら、（１９９１年）ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８８：８０３９〜８０４３ページ；Ｆｅｒｒｙら、（１９９１年）ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８８：８３７７〜８３８１ページ；Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙら、（１９９１年）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４：１８０２〜１８０５ページ；Ｋａｙら、（１９９２年）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ３：６４１〜６４７ページ；Ｄａｉら、（１９９２年）ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８９：１０８９２〜１０８９５ページ；Ｈｗｕら、（１９９３年）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：４１０４〜４１１５ページ；米国特許第４，８６８，１１６号；米国特許第４，９８０，２８６号；ＰＣＴ出願ＷＯ８９／０７１３６；ＰＣＴ出願ＷＯ８９／０２４６８；ＰＣＴ出願ＷＯ８９／０５３４５；およびＰＣＴ出願ＷＯ９２／０７５７３による再考察を参照されたい）。
【０１１６】
さらに、レトロウイルスの感染範囲およびその結果としてレトロウイルスに基づくベクターの感染範囲を、ウイルス粒子の表面上のウイルスパッケージングタンパク質を改変することによって、制限できることが示されている（例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９３／２５２３４、ＷＯ９４／０６９２０およびＷＯ９４／１１５２４を参照されたい）。例えば、レトロウイルスベクターの感染範囲の改変のための戦略は、細胞表面抗原に特異的な抗体と、ウイルスｅｎｖタンパク質とのカップリング（Ｒｏｕｘら、（１９８９年）ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８６：９０７９〜９０８３ページ；Ｊｕｌａｎら、（１９９２年）Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ ７３：３２５１〜３２５５ページ；およびＧｏｕｄら、（１９８３年）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １６３：２５１〜２５４ページ）；または細胞表面リガンドと、ウイルスｅｎｖタンパク質とのカップリング（Ｎｅｄａら、（１９９１年）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１４１４３〜１４１４６ページ）を含む。カップリングは、タンパク質または他の種類との化学的架橋（例えば、ｅｎｖタンパク質をアシアロ糖タンパク質に転換するためのラクトース）の形態で、および融合タンパク質の作製（例えば、一本鎖抗体／ｅｎｖ融合タンパク質）によって可能である。
【０１１７】
ｃ）アデノ随伴ベクター
本発明の核酸の送達に有用な例示的ウイルスベクター系はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である。ヒトアデノウイルスは、受容体媒介エンドサイト−シスによって細胞に進入する二本鎖ＤＮＡウイルスである。これらのウイルスは成長および操作しやすく、ｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏで広い宿主範囲を示すので、これらのウイルスは、遺伝子移入に非常に適していると考えられている。アデノウイルスは、感染休止および標的細胞の複製ができ、宿主ゲノム中に組み込まれるのではなく染色体外で生存できる。ＡＡＶは、ディペンドウイルス属に属するヘルパー依存性ＤＮＡパルボウイルスである。ＡＡＶは、病理が公知ではなく、有効な複製および生産的なライフサイクルのために、別のウイルス、例えば、アデノウイルス、ワクチニアまたはヘルペスウイルスによって提供されるさらなるヘルパー機能がなくては複製できない。
【０１１８】
ヘルパーウイルスの不在下では、ＡＡＶはそのゲノムの宿主細胞染色体への挿入によって潜伏状態を確立する。ヘルパーウイルスによるその後の感染は、その後、感染性のウイルスの子孫を産生するために複製できる、組み込まれたコピーを救出する。野生型ＡＡＶウイルスとアデノウイルスまたはヘルペスウイルスのいずれかに由来するヘルパー機能との組み合わせは、複製可能な組み換えＡＶＶ（ｒＡＶＶ）を発生する。この系の１つの有利性は、その相対的な安全性である（再考察のために、Ｘｉａｏら、（１９９７年）Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．１４４：１１３〜１２４ページを参照されたい。
【０１１９】
ＡＡＶのゲノムは、およそ４６８１塩基を含有する線状の一本鎖ＤＮＡ分子で構成される（ＢｅｒｎｓおよびＢｏｈｅｎｚｋｙ、（１９８７年）Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．）３２：２４３〜３０７ページ）。このゲノムは、各末端に、ＤＮＡ複製の起点として、またウイルスのパッケージングシグナルとしてｃｉｓに機能する逆位末端反復（ＩＴＲ）を含む。ゲノムの内部非反復部分は、それぞれＡＡＶｒｅｐおよびｃａｐ領域として知られる、２つの大きなオープンリーディングフレームを含む。これらの領域は、複製およびビリオンのパッケージングに関与するウイルスタンパク質をコードする。ＡＡＶゲノムの詳細な説明のために、例えば、Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｎ．（１９９２年）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：９７〜１２９ページを参照されたい。
【０１２０】
３００塩基対ほどの小さなＡＡＶを含有するベクターは、パッケージングされ得、組み込まれ得る。外来ＤＮＡの空間は約４．７ｋｂに制限され、これは、本発明のペプチドまたは類似体をコードする核酸の組み込みに十分である。Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら、（１９８５年）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３２５１〜３２６０ページに記載のようなＡＡＶベクターは、ＤＮＡを細胞に導入するために使用できる。さまざまな核酸が、ＡＡＶベクターを使用して異なる細胞型に導入されてきた（例えば、Ｈｅｒｍｏｎａｔら、（１９８４年）ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８１：６４６６〜６４７０ページ；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら、（１９８５年）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：２０７２〜２０８１ページ；Ｗｏｎｄｉｓｆｏｒｄら、（１９８８年）Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．２：３２〜３９ページ；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら、（１９８４年）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５１：６１１〜６１９ページ；およびＦｌｏｔｔｅら、（１９９３年）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：３７８１〜３７９０ページを参照されたい）。
【０１２１】
ｒＡＡＶ構築体の構築および送達のための一般的方法は、当分野において公知であり、例えば、Ｂａｒｌｅｔｔ，Ｊ．Ｓ．ら、（１９９６年）、Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ； Ｔｏｗａｒｄｓ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ、１１５〜１２７ページに記載されている。
【０１２２】
通常使用されるＡＡＶに基づく発現ベクターは、利用可能な制限部位を直接使用するか、または制限酵素を用いる所望のヌクレオチド配列の除去、その後の末端の平滑化、適切なＤＮＡリンカーのライゲーション、制限消化およびＩＴＲとの間の部位へのライゲーションによるかのどちらかで所望のヌクレオチド配列のサブクローニングに使用され得る、制限部位に隣接する１４５ヌクレオチドのＡＡＶ逆位末端配列（ＩＴＲ）を含む。
【０１２３】
ヌクレオチド配列の組み込み、ヌクレオチド配列を含有する組み換えＡＡＶベクターの増殖および精製ならびに細胞および哺乳動物のトランスフェクトへのその使用のための方法および材料を含む、本発明の実施に有用であると思われるＡＡＶ技術に関するさらなる詳細なガイダンスに関しては、例えば、Ｃａｒｔｅｒら、米国特許第４，７９７，３６８号（１９８９年１月１０日）；Ｍｕｚｙｃｚｋａら、米国特許第５，１３９，９４１号（１９９２年８月１８日）；Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉら、米国特許第５，１７３，４１４号（１９９２年１２月２２日）；Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ，米国特許第５，２５２，４７９号（１９９３年１０月１２日）；Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉら、米国特許第５，３５４，６７８号（１９９４年、１０月１１日）；Ｓｈｅｎｋら、米国特許第５，４３６，１４６号（１９９５年７月２５日）；Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅら、米国特許第５，４５４，９３５号（１９９５年１２月１２日）、Ｃａｒｔｅｒら、ＷＯ９３／２４６４１（１９９３年１２月９日公開）およびＮａｔｓｏｕｌｉｓ、米国特許第５，６２２，８５６号（１９９７年４月２２日）を参照されたい。
【０１２４】
ｄ）他のウイルス系
核酸の送達に使用され得る他のウイルスベクター系は、例えばヘルペスウイルス、例えば単純ヘルペスウイルス（Ｗｏｏら、ＩＪ Ｓｔ特許第５，６３１，２３６号、１９９７年５月２０日発行およびＮｅｕｒｏｖｅｘによるＷＯ００／０８１９１）ワクチニアウイルス（Ｒｉｄｇｅｗａｙ（１９８８年）Ｒｉｄｇｅｗａｙ、「Ｍａｍｍａｌｉａｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒｓ」、Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ Ｒ Ｌ、Ｄｅｎｈａｒｄｔ Ｄ Ｔ編 Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ ｓｕｒｖｅｙ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｕｓｅｓ．Ｓｔｏｎｅｈａｍ：Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ，；ＢａｉｃｈｗａｌおよびＳｕｇｄｅｎ（１９８６年）「Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ａｎｉｍａｌ ＤＮＡ ｖｉｒｕｓｅｓ：Ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ａｎｄ ｓｔａｂｌｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ ｇｅｎｅｓ」、Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ Ｒ編 Ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ；Ｃｏｕｐａｒら、（１９８８年）Ｇｅｎｅ、６８：１〜１０ページ）およびいくつかのＲＮＡウイルスに由来し得る。例示的ウイルスは、例えば、アルファウイルス、ポックスウイルス、ワクチニアウイルス、ポリオウイルスなどを含む。それらは、さまざまな哺乳動物細胞にとって魅力的な特徴をいくつかの提示する（Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ（１９８９年）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４４：１２７５〜１２８１ページ；Ｒｉｄｇｅｗａｙ、１９８８年、上記；ＢａｉｃｈｗａｌおよびＳｕｇｄｅｎ、１９８６年、上記、；Ｃｏｕｐａｒら、１９８８年；Ｈｏｒｗｉｃｈら、（１９９０年）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６４：６４２〜６５０ページ）。
【０１２５】
ｅ）非組み込みウイルス、自己切断型／切り出し可能構築体およびプラスミドの標的体細胞への直接トランスフェクション
「自己切断型２Ａペプチド」を組み込んだ、ポリシストロン性発現カセットからのすべての遺伝的能力決定因子の同時発現は、「リボソームスキッピング」を起こし、単一プロモーターから個々の因子が同程度に発現できる（Ｓｏｍｍｅｒら、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ．２７：５４３〜５４９ページ、２００８年；Ｃａｒｅｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０６：１５７〜１６２ページ、２００９年）。因子のペアを分離する配列内リボソーム進入配列（ＩＲＥＳ）を用いて、感染細胞はすべての能力決定因子またはそのサブセットを発現できる。Ｃａｒｅｙら、（２００９年、上記）は、ＩＲＥＳ技術を用いずに、自己切断型２Ａペプチドによって分離されたドキシサイクリン誘導因子を構築した。
【０１２６】
別の実施形態において、１種または複数の能力決定因子は、ＤＮＡトランスポゾンを使用して送達される。ＤＮＡトランスポゾンは、特異的「トランスポザーゼ」酵素によって切り出され、ゲノムの至る所に再組み込みされる、転移と呼ばれる現象の遺伝要素である。ｐｉｇｇｙＢａｃは、ＴＴＡＡ配列を抱える転写ＤＮＡユニット中に優先的に挿入される、同義遺伝子ペイロードを抱えることができる、このようなトランスポゾンの１つである。個別またはポリシストロン性のドキシサイクリン誘導構築体の誘導は、トランスポザーゼを介した組み込みおよびその後の切り出しによって、ネズミおよびヒト線維芽細胞に送達され、四倍体胚補完法による妊娠中期胚への貢献を含む、多能性のすべての特質を示すｉＰＳ細胞を発生する（Ｗｏｌｔｊｅｎら、Ｎａｔｕｒｅ．４５８：７６６〜７７０ページ、２００９年）。
【０１２７】
さらに、ｌｏｘＰが導入されたプロウイルス構築体は、その後のアデノウイルスを発現する一時的Ｃｒｅリコンビナーゼの感染を介して切り出され得る（Ｋａｊｉら、Ｎａｔｕｒｅ．４５８：７７１〜７７５ページ、２００９年）。
【０１２８】
ＤＮＡに基づかないｉＰＳ作出方法
ａ）化学的取組み
一例において、能力決定因子は、ヒストンメチルトランスフェラーゼＧ９ａの阻害剤であり、Ｏｃｔ４の代わりに、またはＯｃｔ４に対する補完（例えば、Ｏｃｔ４の発現レベルを減少させる）として使用される。Ｇ９ａの化学的阻害は、例えばＥｎｚｏ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ社によるＢＩＸ−０１２９４（ＢＩＸ）を用いて達成でき、ヒストン３、リジン９のメチル化（Ｈ３Ｋ９ｍｅ）により媒介されるＯｃｔ４発現に対する拮抗作用を軽減しており、いくつかの細胞において、ｉＰＳ細胞の誘導のためにウイルスにより送達されたＯｃｔ４が完全に置換され得るＳｈｉら、Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ．２：５２５〜５２８ページ、２００８年）。
【０１２９】
または、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を使用し、Ｇ９ａの発現をノックダウンする。このようなｓｈＲＮＡは、Ｏｃｔ４プロモーターの脱メチル化およびＯｃｔ４発現の部分的再活性化をもたらすことが示されている（Ｍａら、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ．２６：２１３１〜２１４１ページ、２００８年）。
【０１３０】
別の例において、Ｌ−チャネルカルシウムアゴニスト（例えば、Ｔｏｃｒｉｓ ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅによるＢａｙｋ８６４４）は、Ｇ９ａアンタゴニスト（例えば、ＢＩＸ）と組み合わせて使用され、Ｓｏｘ２およびｃＭｙｃの代わりをする、または補完する（Ｓｈｉら、Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ．３：５６８〜５７４ページ、２００８年）。
【０１３１】
別の例において、能力決定因子はＭＥＫ阻害剤である。Ｏｃｔ４／Ｋｌｆ４感染後７から９日および数日の間（例えば５日間）連続する、体細胞周期の進行に関与するＭＥＫの化学的阻害（例えば、Ｃａｙｍａｎ ＣｈｅｍｉｃａｌによるＰＤ０３２５９０１を使用する）は、Ｏｃｔ４の発現が高い再プログラム化ｉＰＳコロニーの成長の強化をもたらす（Ｓｈｉら、２００８年、上記）。
【０１３２】
さらなる例において、能力決定因子はＷｎｔ３ａである。細胞外Ｗｎｔ３ａは標的細胞における内因性ｃＭｙｃの発現のβ−カテニン媒介誘導を刺激でき、再プログラミング効率の劇的な改善をもたらす（Ｍａｒｓｏｎら、２００８年）。
【０１３３】
別の例において、能力決定因子はオカダ酸である。オカダ酸（ＯＡ）は、タンパク質セリン／トレオニンホスファターゼ２Ａ（ＰＰ２Ａ）の強力な阻害剤である。ＰＰ２ＡはｃＭｙｃ中の特定のセリン残基を脱リン酸化し、ユビキチンにより制御された迅速な分解のためにそれを標的とし、さらにＫｌｆ４の増加を誘発し、順に、ｃＭｙｃ遺伝子発現の上方制御を誘発するｃＭｙｃプロモーター中のＯＡ応答性エレメントと結合する。ＥＩＦαの抑制を介した、翻訳に関するＯＡのさらなる阻害効果は、ｍＲＮＡ転写産物の初期蓄積およびその後のＯＡ離脱に関するボーラス量の翻訳タンパク質の送達をもたらし得る。
【０１３４】
別の例において、能力決定因子はケンパウロンである。Ｏｃｔ４／Ｓｏｘ２／ｃＭｙｃレトロウイルス発現ＭＥＦがＯｃｔ４選択可能なｉＰＳ細胞を発生するための、Ｋｌｆ４と広範囲のタンパク質キナーゼ阻害剤であるケンパウロンとの置換は、生殖細胞系コンピテントキメラに寄与できる（Ｌｙｓｓｉｏｔｉｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０６：８９１２〜８９１７ページ、２００９年）。
【０１３５】
さらなる例において、能力決定因子はヒストン（histine）脱アセチル化酵素阻害剤である。ｉＰＳ細胞に対する、ネズミ線維芽細胞のｉＰＳ再プログラミング効率が１００倍改善されることが、ヒストン脱アセチル化酵素活性の化学的阻害を介して観察されている（Ｈｕａｎｇｆｕら、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２６：７９５〜７９７ページ、２００８年；Ｈｕａｎｇｆｕら、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２６：１２６９〜１２７５ページ、２００８年）。例えば、バルプロ酸は、遺伝的再プログラミングの再プログラミング効率を改善する。
【０１３６】
さらなる例において、能力決定因子はＤＮＡメチラーゼ阻害剤である。
【０１３７】
ｂ）タンパク質の送達
低分子化合物の使用と同様に、タンパク質の送達は、その可逆性のため、ｉＰＳ細胞作製のための魅力的な取組みである。
【０１３８】
一例において、タンパク質の能力決定因子は、細胞内（好ましくは核内）進入が容易になるように、タンパク質の形質導入ドメインに接合される。タンパク質の形質導入ドメインは当分野において公知であり、例えばポリアルギニン、ＨＩＶ Ｔａｔ基本的ドメイン、アンテナペディア（antannapedia）を含む（例えば、Ｊｏｎｅｓら、Ｂｒ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、１４５：１０９３〜１０２ページ、２００５年に記載されている）。例えば、能力決定因子に連結されたポリアルギニン標的化配列を組み込む大腸菌（E .coli）により発現された組み換えタンパク質は、ＭＥＦをｉＰＳ細胞に転換できる。
【０１３９】
タンパク質を作製する方法は当分野において公知であり、および／またはＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９年）またはＡｕｓｕｂｅｌら（編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８年、現在までのすべての改定を含む）に記載されている。
【０１４０】
ｃ）遺伝子サイレンシング戦略
一例において、能力決定因子は、内因性遺伝子の発現をサイレンシングまたは減少させる核酸に基づく化合物である。
【０１４１】
一例において、能力決定因子はマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）である。ｍｉＲＮＡは、主に配列特異的様式で標的転写産物との結合を介して多数の生物学的過程を制御する、一本鎖、非コーディングＲＮＡである。ｍｉＲＮＡは、まず一次転写産物として発現され、次いでＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と複合する活性ｍｉＲＮＡを放出するめに切断され、翻訳の抑制を開始する。０日目のｍｉＲ−２９４のトランスフェクションおよび６日目のレトロウイルス感染後、ｃＭｙｃを７５％の効率まで置換できる（Ｊｕｄｓｏｎら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２７：４５９〜４６１ページ、２００９年）。
【０１４２】
Ｄｎｍｔ１のｓｉＲＮＡノックダウンは、細胞が部分的再プログラム化から完全な再プログラム化へ超える援助ができ、再プログラミング効率は４倍に増加する（Ｍｉｋｋｅｌｓｅｎら、Ｎａｔｕｒｅ．４５４：４９〜５５ページ、２００８年）。同様に、Ｇ９ａの短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）によるノックダウン、着床後の胚におけるＯｃｔ４の脱活性化に関与するヒストンメチルトランスフェラーゼは、ｖｉｖｏでのＯｃｔ４プロモーターの脱メチル化および部分的再活性化をもたらす（上記を参照されたい）。Ｏｃｔ４／Ｓｏｘ２／Ｋｌｆ４感染と呼応したｐ５３ ｓｉＲＮＡの成人包皮線維芽細胞への添加は、単独またはさらなる処置と組み合わせて、効率を増加する（Ｚｈａｏら、Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ．３：４７５〜４７９ページ、２００８年）。
【０１４３】
当業者は、適切なＲＮＡに基づく化合物を承知しているであろう。例示的化合物は、アンチセンスポリヌクレオチド、リボザイム、ＰＮＡ、干渉ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、短鎖ヘアピンＲＮＡ、マイクロＲＮＡを含む。
【０１４４】
アンチセンスポリヌクレオチド
「アンチセンスポリヌクレオチド」という用語は、任意の実施形態において本明細書に記載のポリペプチドをコードする特定のｍＲＮＡ分子の少なくとも一部に相補的であり、ｍＲＮＡ翻訳などの転写後事象に干渉できるＤＮＡもしくはＲＮＡまたはそれらの組み合わせを意味すると解釈されるべきである。アンチセンス法の使用は当分野において公知である（例えば、ＨａｒｔｍａｎｎおよびＥｎｄｒｅｓ、Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ、Ｋｌｕｗｅｒ（１９９９年）を参照されたい）。
【０１４５】
本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは、生理学的条件下で標的ポリヌクレオチドとハイブリダイズするであろう。アンチセンスポリヌクレオチドは構造遺伝子に一致する配列または遺伝子発現またはスプライシングの調節をもたらす配列を含む。例えば、アンチセンスポリヌクレオチドは、本発明の遺伝子の標的コーディング領域または５’非翻訳領域（ＵＴＲ）もしくは３’−ＵＴＲまたはこれらの組み合わせに一致し得る。アンチセンスポリヌクレオチドは、イントロン配列と一部相補的であり得、これは転写の間または転写後、好ましくは標的遺伝子のエクソン配列だけにスプライシングされ得る。アンチセンス配列の長さは、標的核酸またはそれをコードする構造遺伝子の、少なくとも１９の連続するヌクレオチド、好ましくは少なくとも５０ヌクレオチドおよびより好ましくは少なくとも１００、２００、５００または１０００ヌクレオチドでなくてはならない。全遺伝子転写産物に相補的な完全長配列を使用できる。この長さは、最も好ましくは１００〜２０００ヌクレオチドである。標的転写産物に対するアンチセンス配列の同一性の程度は、少なくとも９０％およびより好ましくは９５〜１００％でなくてはならない。
【０１４６】
触媒ポリヌクレオチド
「触媒ポリヌクレオチド／核酸」という用語は、異なる基質を特異的に認識し、この基質の化学的改変を触媒するＤＮＡ分子もしくはＤＮＡ含有分子（「デオキシリボザイム」または「ＤＮＡザイム」としても当分野において公知である）またはＲＮＡもしくはＲＮＡ含有分子（「リボザイム」または「ＲＮＡザイム」としても公知である）を指す。触媒核酸中の核酸塩基は、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ（ＲＮＡに関してはＵ）の塩基であり得る。
【０１４７】
通常、触媒核酸は、標的核酸および酵素活性を切断する核酸の特異的認識のためにアンチセンス配列（本明細書において「触媒ドメイン」とも称される）を含有する。本発明に特に有用であるリボザイムの型は、ハンマーヘッドリボザイムおよびヘアピンリボザイムである。
【０１４８】
ＲＮＡ干渉
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、特定のタンパク質の作製を特異的に阻害するために有用である。理論に縛られることを好むわけではないが、Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅら（１９９８年）は、ｄｓＲＮＡ（二本鎖ＲＮＡ）がタンパク質作製を減少させるために使用され得る機序のためのモデルを提供している。この技術は、対象となる遺伝子のｍＲＮＡと本質的に同一である配列またはその一部を含有するｄｓＲＮＡ分子の存在に頼る。好都合なことに、ｄｓＲＮＡは組み換えベクターまたは宿主細胞において単一プロモーターから作製され得、センス配列およびアンチセンス配列は、センス配列とアンチセンス配列とをハイブリダイズできる関連のない配列に隣接し、ループ構造を形成する関連のない配列とともにｄｓＲＮＡ分子を形成する。本発明にとって適切なｄｓＲＮＡ分子の設計および作製は、当業者の能力の十分範囲内であり、特にＷＯ９９／３２６１９、ＷＯ９９／５３０５０、ＷＯ９９／４９０２９およびＷＯ０１／３４８１５を考慮されたい。
【０１４９】
ハイブリダイズするセンス配列およびアンチセンス配列の長さは、個々に、少なくとも１９の連続するヌクレオチド、好ましくは少なくとも３０または５０ヌクレオチドおよびより好ましくは少なくとも１００、２００、５００または１０００ヌクレオチドでなくてはならない。全遺伝子転写産物に一致する完全長配列を使用できる。この長さは、最も好ましくは１００〜２０００ヌクレオチドである。標的転写産物に対するセンス配列およびアンチセンス配列の同一性の程度は、少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％およびより好ましくは９５〜１００％でなくてはならない。
【０１５０】
好ましい低分子干渉ＲＮＡ（「ｓｉＲＮＡ」）分子は、標的ｍＲＮＡの約１９〜２３の連続するヌクレオチドと同一であるヌクレオチド配列を含む。好ましくは、ｓｉＲＮＡ配列ジヌクレオチドＡＡで始まり、約３０〜７０％（好ましくは３０〜６０％、より好ましくは４０〜６０％およびより好ましくは約４５％〜５５％）のＧＣ含有量を含み、例えば標準的ＢＬＡＳＴ検索によって決定して、導入される哺乳動物ゲノム中の標的以外の任意のヌクレオチド配列に対して高い割合の同一性を有さない。
【０１５１】
培養条件
多能性細胞および／または再プログラム化細胞および／または再プログラミングを受けた細胞は、多能性細胞の成長を支えるのに使用される任意の培地において培養され得る。典型的な培養培地は、限定するものではないが、ＴｅＳＲ（商標）（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ．； Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、Ｃａｎａｄａ）、ｍＴｅＳＲ（商標）（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）およびＳｔｅｍＬｉｎｅ（登録商標）無血清培地（Ｓｉｇｍａ；Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）などの合成培地、ならびにマウス胎児線維芽細胞（ＭＥＦ）馴化培地などの馴化培地を含む。さらなる培地は、塩基性培地、例えば、ＫｏＳＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を補充したＤＭＥＭまたはＤＭＥＭ−Ｆ１２を含む。または、Ｓｉｌｖａら、ＰＬＯＳ Ｂｉｏｌｏｇｙ、６：ｅ２５３、２００８年は、例えば、ＭＡＰＫシグナル伝達およびグリコーゲン合成酵素キナーゼ−３のシグナル伝達の阻害剤ならびに白血病阻止因子（ＬＩＦ）を含む、再プログラム化細胞の作製および未分化状態の再プログラム化細胞の維持に有用な培地を記載している。本明細書において使用する場合、「規定培地」は、単に生物化学的構成成分だけからなる生物化学的に規定された製剤を指す。規定培地はまた、既知の化学組成を有する構成成分だけを含み得る。規定培地は、既知の供給源に由来する構成成分をさらに含み得る。本明細書において使用する場合、「馴化培地」は、この培地において培養された細胞由来の可溶性因子をさらに補充した成長培地を指す。または、細胞は培養培地においてＭＥＦ上で維持されてもよい。
【０１５２】
細胞培養は、好ましくは加湿インキュベータにおいて約３７℃でインキュベートされる。細胞培養条件は、本発明の細胞のために大幅に変動し得るが、いくつかの実施形態において、細胞は、細胞成長に適切な、例えば空気中に５％Ｏ２、１０％ＣＯ２、８５％Ｎ２を含む、または１０％ＣＯ２を含む環境において維持される。
【０１５３】
別の実施形態において、細胞は、マトリックス、例えば細胞外マトリックス、例えばＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）、ラミニン、コラーゲン、Ｃｕｌｔｕｒｅｘ（登録商標）などの上または内部で培養される。他の実施形態において、細胞は、細胞外マトリックスの存在下で培養され得る。このようなマトリックスの存在下で細胞を増殖させる適切な手順は、例えば米国特許第７，２９７，５３９号に記載されている。
【０１５４】
細胞の単離または濃縮
下記の方法は、例えば、本明細書に記載のマーカーまたは当分野において公知のマーカーを検出することによる、Ｓｔｒｏ−１＋細胞および／または再プログラム化細胞／多能性細胞の単離または濃縮にとって有用である。
【０１５５】
所望の細胞を濃縮する例示的一手法は、磁気ビーズ細胞分取法（ＭＡＣＳ）または他の任意の磁気を利用する細胞分取法、例えばＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）である。従来のＭＡＣＳ手順は、Ｍｉｌｔｅｎｙｉら（Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ１１：２３１〜２３８ページ、１９９０年）に記載されている。この手順において、細胞は抗体または細胞表面マーカーもしくはタンパク質と結合する他の化合物に結合された磁気ビーズで標識され、細胞は、常磁性分離カラムを通される、または磁場の別の形態に曝露される。分離カラムは強力な磁石内に配置され、その結果、カラム内に磁場が発生する。磁気的に標識された細胞は、カラム内に捕捉され、通過しない。捕捉された細胞は、その後カラムから溶出される。
【０１５６】
本発明の細胞は、上記のように、例えば適切な肉体的保有宿主から、適切なタンパク質を発現する細胞を分離するためのＭＡＣＳを使用して濃縮され得る。試料はタンパク質と結合する免疫磁性ビーズと一緒にインキュベートされる。インキュベーション後、試料は洗浄され、再懸濁され、磁場を通過させられ、免疫磁性ビーズに結合された細胞が取り除かれ、ビーズに結合された細胞が回収される。これらの技術は陰性選択、例えば、望ましくないマーカー、すなわち望ましくない細胞を発現する細胞の除去に同様に適用できる。このような方法は、細胞集団を、望ましくない細胞型（複数可）において検出可能なレベルで発現された細胞表面マーカーと結合する化合物で標識された磁性粒子と接触させるステップを含む。インキュベーション後、試料は洗浄され、再懸濁され、磁場を通過させられ、免疫磁性ビーズに結合された細胞が取り除かれる。ビーズに結合された細胞が回収される。望ましくない細胞型（複数可）を失った残存細胞が、その後回収される。
【０１５７】
別の実施形態において、タンパク質または細胞表面マーカーと結合する化合物は、固体表面に固定され、細胞集団をそれと接触させる。未結合細胞を除去するための洗浄後、この化合物と結合した細胞は回収、例えば溶出され得、その結果化合物が結合するタンパク質を発現する細胞が単離または濃縮される。または所望であれば、化合物と結合しない細胞を回収できる。
【０１５８】
好ましい実施形態において、細胞は、蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）を使用して単離または濃縮される。ＦＡＣＳは、粒子の蛍光特性に基づく、細胞を含む粒子を分離するための公知の方法であり、例えばＫａｍａｒｃｈ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ，１５１：１５０〜１６５ページ、１９８７年に記載されている。一般的に、この方法は、細胞集団を、１種または複数のタンパク質または細胞表面マーカーと結合できる化合物と接触させるステップを含み、異なるマーカーと結合する化合物は、さまざまな蛍光部分、例えば、蛍光色素分子を用いて標識される。細胞は、液体の狭く、速い流れの中心に同調される。この流れは、それらの直径に関連して細胞間を分離するように構成される。振動機序は、細胞の流れを引き起こし、個別の液滴に分ける。この系は、液滴中に複数の細胞が存在する可能性が低いように調節される。流れが液滴に分かれる直前に、流れは、個々の細胞の対象となる蛍光特徴、例えば、標識化合物が結合されているかどうかが測定される蛍光測定ステーションを通過する。帯電リングは、流れが液滴に分かれるポイントに配置される。蛍光強度測定の直前に基づく電荷はリング上に配置され、液滴は流れから分離するので、対立する電荷は液滴上に捕捉されている。帯電した液滴は、その後液滴を迂回させる静電偏向方式を介して、それらの電荷に基づいて容器に落とされる、例えば、標識化合物が細胞に結合されている場合１つの容器に、そうでない場合は別の容器に落とされる。いくつかの系において、電荷は、流れに直接印加され、分かれる液滴は流れと同じ符号の電荷を保有する。この流れは、その後、液滴の分離後中性に戻る。
【０１５９】
細胞の分化
本発明の再プログラム化細胞または多能性細胞は、さまざまな商業的および治療的に重要な組織型の集団を調製するために使用できる。一般に、このことは、細胞を所望の数に増殖させることによって達成される。その後、任意のさまざまな分化戦略に従って分化が引き起こされる。例えば、神経系列の細胞の高度に濃縮された集団は、細胞を、１種もしくは複数のニュートロフィン（ニュートロフィン３または脳由来の神経栄養因子など）、１種もしくは複数のマイトジェン（上皮成長因子、ｂＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＩＧＦ１およびエリスロポエチンなど）または１種もしくは複数のビタミン（レチノイン酸、アスコルビン酸など）を含有する培養培地に変えることによって作製できる。または、多分化能神経幹細胞は、胚様体段階を介して作製でき、ｂＦＧＦを含有する化学的規定培地において維持できる。培養された細胞は、場合により、それらが神経前駆体細胞マーカー、例えば、ネスチン、Ｍｕｓａｓｈｉ、ビメンチン、Ａ２Ｂ５、ｎｕｒｒ１またはＮＣＡＭを発現するかどうかに基づいて分離される。このような方法を使用して、（成熟ニューロンを含む）神経細胞および（星状細胞および乏突起膠細胞を含む）グリア細胞の両方を作製する能力を有する神経前駆細胞／幹細胞を得ることができる。または、分化細胞集団を形成する能力を有する複製ニューロン前駆体を得ることができる。
【０１６０】
肝細胞系列のマーカーが高度に濃縮された細胞は、ｎ−ブチレートなどのヒストンデアセチラーゼ阻害剤の存在下で幹細胞を培養することによって再プログラム化細胞または多能性細胞から分化され得る。培養された細胞は、場合により、ＥＧＦ、インスリンまたはＦＧＦなどの肝細胞成熟因子と一緒に同時にまたは連続して培養される。
【０１６１】
再プログラム化細胞または多能性細胞はまた、心筋細胞の特徴的マーカーおよび自然発生的周期的収縮活性を有する細胞を作製するために使用され得る。この方法における分化は、（５−アザ−デオキシ−シチジンなどの）ＤＮＡのメチル化をもたらすヌクレオチド類似体、成長因子および骨形態形成タンパク質によって容易になる。細胞は、密度に基づく細胞分離によってさらに濃縮され得、クレアチン、カルニチンおよびタウリンを含有する培地において維持され得る。
【０１６２】
再プログラム化細胞または多能性細胞は、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）、ヒトＴＧＦ−ベータ受容体に対するリガンド、またはヒトビタミンＤ受容体に対するリガンドを含有する培地において、間葉細胞または軟骨形成細胞への分化を対象とし得る。培地は、デキサメタゾン、アスコルビン酸−２−リン酸ならびにカルシウムおよびリン酸塩の供給源をさらに含み得る。好ましい実施形態において、誘導細胞は、骨芽細胞系列の細胞の表現型特徴を有する。
【０１６３】
以上から理解されるように、再プログラム化細胞または多能性細胞に由来する分化細胞は、それを必要とするヒト患者において組織再構成または再生のために使用することもできる。この細胞は、それを意図される組織部位に接合し、機能的に欠損した領域を再構成または再生できる様式で投与される。例えば、神経前駆体細胞は、治療される疾患に従って、中枢神経系の実質部位または髄腔内部位に直接移植できる。神経細胞移植の有効性は、ＭｃＤｏｎａｌｄら、（（１９９９年）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．、５巻：１４１０ページ）およびＫｉｍら、（（２００２年）Ｎａｔｕｒｅ、４１８巻：５０ページ）に記載されるように、激しく損傷した脊髄に関してラットモデルにおいて評価され得る。移植の成功により、２〜５週間後に病変に存在する、星状細胞、乏突起膠細胞および／またはニューロンに分化し病変の終わりから脊髄に沿って遊走する、移植由来細胞および歩き方、協調および体重支持における改善が示される。
【０１６４】
同様に、本出願の代理人は、骨折または軟骨損傷の治療のために間葉幹細胞を投与する有用性を実証している。
【０１６５】
同様に、心筋細胞の有効性は、心外傷または機能不全の適切な動物モデル、例えば、治療をしなければ左心室壁組織の約５５％が瘢痕組織になる心臓の低温傷害（ｃｒｙｏｉｎｊｕｒｙ）に関する動物モデルにおいて評価され得る（Ｌｉら、（１９９６年）、Ａｎｎ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｓｕｒｇ．、６２巻：６５４ページ；Ｓａｋａｉら、（１９９９年）、Ａｎｎ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｓｕｒｇ．、８巻：２０７４ページ；Ｓａｋａｉら、（１９９９年）、Ｊ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｓｕｒｇ．、１１８巻：７１５ページ）。治療の成功により、瘢痕範囲が減少し、瘢痕の拡大が制限され、収縮、拡張および発生圧力によって決定される心機能が改善されると思われる（Ｋｅｈａｔら、（２００４年））。心外傷は、例えば、左下行前動脈の遠位部において塞栓コイルを使用しても（Ｗａｔａｎａｂｅら、（１９９８年）、Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．、７巻：２３９ページ）、または左冠動脈前下行枝の結紮（Ｍｉｎら、（２００２年）、Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．、９２巻：２８８ページ）によってもまたモデル化できる。治療の有効性は、組織構造および心機能により評価し得る。本発明に具体化される心筋細胞調製品は、心筋の再生のための療法および心機能不足の治療に使用され得る。
【０１６６】
肝機能もまた、例えば本発明に従って成長させた霊長類多能性幹細胞から分化した、肝細胞および肝細胞前駆体を投与することによって回復できる。これらの分化細胞は、肝損傷の修復能力に関して動物モデルにおいて評価され得る。このような一例は、Ｄ−ガラクトサミンの腹腔内注射によって引き起こされる損傷である（Ｄａｂｅｖａら、（１９９３年）、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．、１４３巻：１６０６ページ）。治療の有効性は、肝細胞マーカーに関する免疫組織化学的染色、細管構造が成長組織において形成されるかどうかの顕微鏡的決定および肝臓特異的タンパク質の合成を回復するための治療能力によって決定され得る。肝細胞は、直接投与によって、または例えば劇症肝不全の後に対象の肝組織がそれ自体を再生する間に一時的に肝機能を提供する生物補助（bioassist）デバイスの一部として、療法に使用され得る。
【０１６７】
細胞組成物
本発明の一例において、再プログラム化細胞または多能性細胞および／またはそれから分化した細胞は、組成物の形態で投与され、またはこのような組成物に製剤化される。好ましくは、このような組成物は、薬学的に許容される担体および／または賦形剤を含む。
【０１６８】
「担体」および「賦形剤」という用語は、保管、投与および／または活性化合物の生物活性を容易にするために当分野において従来から使用される組成物を指す（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１６版、Ｍａｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ（１９８０年を参照されたい）。担体は、活性化合物の任意の望ましくない副作用を減少することもできる。適切な担体は安定である、例えば担体中の他の原料と反応できない。一例において、担体は、治療に用いた投与量および濃度で、レシピエントにおいて有意な局所的または全身性の有害な影響を起こさない。
【０１６９】
本発明にとって適切な担体は、従来から使用されている担体を含み、例えば、水、生理食塩水、水性デキストロース、ラクトース、リンガー液、緩衝化溶液、ヒアルロン酸およびグリコールが、（等張の場合）特に溶液のために好ましい液体担体である。適切な医薬担体および賦形剤は、デンプン、セルロース、ブドウ糖、乳糖、ショ糖、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、白亜、シリカゲル、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート（glycerol monostearate）、塩化ナトリウム、グリセロール、プロピレングリコール、水、エタノールなどを含む。
【０１７０】
別の例において、担体は、例えば、細胞が成長する、または懸濁される培地組成物である。好ましくは、このような培地組成物は投与された対象において任意の有害な影響を誘導しない。
【０１７１】
好ましい担体および賦形剤は、細胞の生存能力および／または生物学的効果および好ましくは有利な影響を発揮する細胞の能力に有害に影響を及ぼさない。
【０１７２】
一例において、担体または賦形剤は緩衝活性を提供し、細胞および／または可溶性因子を適切なｐＨで維持し、その結果生物活性を発揮する、例えば、担体または賦形剤はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）である。ＰＢＳは細胞および因子との相互作用が最小であり、細胞および因子の迅速な放出を可能にし、このような場合本発明の組成物は、血流または組織または組織周囲の領域もしくは組織に隣接する領域に、例えば、注射により直接適用するための液体として作製できるので、ＰＢＳは魅力的な担体および賦形剤を代表する。
【０１７３】
再プログラム化細胞または多能性細胞および／またはそれから分化した細胞は、レシピエント適合性であり、レシピエントに対して害がない生成物に分解する足場内に組み込む、または埋め込むこともできる。これらの足場は、レシピエント対象に移植された細胞に支持および保護を提供する。天然および／または合成の生分解性足場はこのような足場の例である。
【０１７４】
さまざまな異なる足場が本発明の実施に成功して使用され得る。好ましい足場は、限定するものではないが、生物学的に分解可能な足場である。天然の生分解性足場は、コラーゲン、フィブロネクチンおよびラミニンの足場を含む。細胞移植の足場に適切な合成材料は、大規模な細胞成長および細胞機能を支持できなければならない。このような足場は、さらに再吸収され得る。適切な足場は、例えば、Ｖａｃａｎｔｉら、Ｊ．Ｐｅｄ．Ｓｕｒｇ．２３：３〜９ページ １９８８年；Ｃｉｍａら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．３８：１４５ページ１９９１年；Ｖａｃａｎｔｉら、Ｐｌａｓｔ．Ｒｅｃｏｎｓｔｒ．Ｓｕｒｇ．８８：７５３〜９ページ １９９１年により記載されたポリグリコール酸足場またはポリ酸無水物、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸などの合成ポリマーを含む。
【０１７５】
別の例において、細胞は、（Ｕｐｊｏｈｎ ＣｏｍｐａｎｙによるＧｅｌｆｏａｍなどの）ゲル足場において投与され得る。
【０１７６】
本発明に有用な細胞組成物は、単独または他の細胞との混合物として投与され得る。本発明の組成物と併せて投与され得る細胞は、限定するものではないが、他の多分化能細胞もしくは多能性細胞または幹細胞または骨髄細胞を含む。異なる型の細胞は、投与直前または少し前に本発明の組成物と混合され得る、または投与前の期間一緒に共培養され得る。
【０１７７】
好ましくは、組成物は、有効量または治療もしくは予防有効量の細胞を含む。例えば、組成物は、約１×１０５の再プログラム化細胞または多能性細胞および／またはそれから分化した細胞／ｋｇから約１×１０７の再プログラム化細胞または多能性細胞および／またはそれから分化した細胞／ｋｇ、あるいは、約１×１０６再プログラム化細胞または多能性細胞および／またはそれから分化した細胞／ｋｇから約５×１０６の再プログラム化細胞または多能性細胞および／またはそれから分化した細胞／ｋｇを含む。投与される細胞の正確な量は、患者の年齢、体重および性別を含むさまざまな因子および治療される障害の程度および重症度に依存する。
【０１７８】
いくつかの実施形態において、細胞は、細胞が対象の循環に出ることができないが、細胞によって分泌される因子は循環に進入できるチャンバー内に含有される。この様式において、細胞が、対象の循環内に因子を分泌可能にすることによって可溶性因子は対象に投与され得る。このようなチャンバーは、可溶性因子の局所レベルを増加するために対象中の部位に同様に埋め込まれ得る。
【０１７９】
本発明のいくつかの実施形態において、細胞組成物による療法の開始前に、必ずしも患者を免疫抑制する必要はなく、または望ましいとも思われない。したがって、同種間または異種間の移植であっても、再プログラム化細胞または多能性細胞および／またはそれから分化した細胞は、ある場合においては容認され得る。
【０１８０】
しかし、他の場合において、細胞療法の開始前に患者を薬理学的に免疫抑制することが望ましいまたは適切であると思われる。このことは、免疫抑制剤の全身性または局所的使用を介して達成され得る、または細胞をカプセル化デバイスにおいて送達することによって達成され得る。細胞は、細胞および治療因子によって必要とされる栄養および酸素に対して浸透性であるカプセルにカプセル化され得るが、細胞は、免疫液性の因子および細胞に対して未だ不浸透性である。好ましくは、カプセルの材料は低アレルギー性であり、標的組織中に容易かつ安定に位置し、埋め込み構造に追加の保護を提供する。移植細胞に対する免疫反応を減少させる、または除去するこれらおよび他の手段は、当分野において公知である。別の方法として、細胞は、その免疫原性を減少するように遺伝子改変され得る。
【０１８１】
スクリーニング方法
本発明は、Ｓｔｒｏ−１＋多分化能細胞および／またはその子孫細胞の再プログラミングを誘導または強化する化合物を特定または単離する方法をさらに提供し、前記方法は、Ｓｔｒｏ−１＋多分化能細胞および／またはその子孫細胞と化合物とを、一時の間、および化合物が再プログラミングを誘導または強化する場合に再プログラミングが起こるために十分な条件下で接触させるステップ、および細胞が再プログラム化されるかどうかを決定するステップを含む。
【０１８２】
一例において、本方法は、
（ｉ）Ｓｔｒｏ−１＋多分化能細胞および／またはその子孫細胞が濃縮された集団と化合物とを、一時の間、および化合物が再プログラミングを誘導または強化する場合に再プログラミングが起こるために十分な条件下で接触させ、再プログラム化細胞の数を決定するステップ；ならびに
（ｉｉ）化合物と接触させられたことのないＳｔｒｏ−１＋多分化能細胞および／またはその子孫細胞が濃縮された集団中の再プログラム化細胞の数を決定するステップ
を含み、
（ｉｉ）と比較して（ｉ）において再プログラム化細胞の数が増加することが、化合物がＳｔｒｏ−１＋多分化能細胞および／またはその子孫細胞の再プログラミングを誘導または強化したことを示す。
【０１８３】
一例において、本方法は、例えば本明細書に記載された１種または複数の能力決定因子の存在下で実施される。
【０１８４】
本発明は、再プログラム化細胞または多能性細胞の所望の細胞型への分化を誘導または強化する化合物を特定または単離する方法をさらに提供し、前記方法は、任意の実施形態に従って本明細書に記載の方法を実施することによって作製された再プログラム化細胞または多能性細胞を接触させるステップ、および細胞が所望の細胞型に分化しているかどうかを決定するステップを含む。
【０１８５】
好ましくは、本方法は、
（ｉ）任意の実施形態に従って本明細書に記載の方法を実施することによって作製された再プログラム化細胞または多能性細胞が濃縮された集団と化合物とを、一時の間、および細胞の分化が起こるために十分な条件下で接触させ、所望の細胞型の細胞数を決定するステップ、ならびに
（ｉｉ）同じ条件であるが化合物が不在の下で、任意の実施形態に従って本明細書に記載の方法を実施することによって作製された再プログラム化細胞または多能性細胞を培養することによって作製された所望の細胞型の数を決定するステップ
を含み、
（ｉｉ）と比較して（ｉ）において所望の細胞型の細胞数が増加することが、化合物が所望の細胞型への分化を誘導または強化したことを示す。
【０１８６】
本発明は、病態を治療するために有用な化合物を特定または単離する方法をさらに提供し、本方法は、
（ｉ）任意の実施形態に従って本明細書に記載の方法を実施し、病態を患う対象から多能性細胞またはその集団を作製するステップ、
（ｉｉ）細胞または集団を被験化合物と接触させ、病態の１種または複数の症状に関するその効果を決定するステップ
を含み、
病態の症状を改善または緩和する化合物が病態の治療に有用である。
【０１８７】
一例において、本方法は、
（ａ）多能性細胞またはその集団を、病態の影響を受ける細胞に分化させるステップ、および
（ｂ）（ａ）細胞と被験化合物を接触させ、病態の１種または複数の症状に関するその効果を決定するステップ
を含み、病態の症状を改善または緩和する化合物が病態の治療に有用である。
【０１８８】
このような方法は、病態の治療のための新規な化合物を特定または単離するためだけに有用ではなく、さらに、対象が既存の治療用／予防用化合物を用いた治療に応答する可能性があるかないかを特定するためにも有用である。
【０１８９】
当業者は、例えば、本明細書の開示および／または適切な病態および／またはその病態の症状に基づく、細胞を分化させる適切な方法を承知していると思われる。例えば、病態は、嚢胞性線維症であり、症状は肺細胞からの分泌であるか、または神経変性病態（例えば、アルツハイマー病またはハンチントン病）および症状は神経変性またはプラーク／細胞内凝集体の形成であるか、または心臓の病態および症状は心筋細胞の収縮である。
【０１９０】
本発明は、細胞または組織型に対して毒性が減少した化合物を特定する方法、例えば、毒性の危険性が減少した治療用化合物を決定する方法をさらに企図する。例えば、本発明は、
（ｉ）任意の実施形態に従って本明細書に記載の方法を実施し、多能性細胞またはその集団を作製するステップ、
（ｉｉ）多能性細胞またはその集団を、１種または複数の特定の系列の細胞および／または組織に分化させるステップ、
（ｉｉｉ）この細胞と被験化合物とを接触させるステップ、ならびに
（ｉｖ）細胞の生存能力および／または増殖に対する化合物の効果を決定するステップ
を含み、
細胞または細胞集団の有意な割合を殺さない、または増殖を減少させない化合物が、毒性が減少していると考えられる方法を提供する。
【０１９１】
例示的分化細胞は、血液細胞、肝細胞、腎細胞および心臓細胞である。
【０１９２】
細胞の生存能力および／または増殖に対する化合物の効果を決定する方法は、当分野において公知であり、ターミナル・デオキシヌクレオチジル・トランスフェラーゼ媒介ビオチン化ＵＴＰニック末端標識（ＴＵＮＥＬ）アッセイ、トリパンブルー色素排除アッセイ、ＭＴＴアッセイ、チミジン取り込みアッセイまたはＢｒｄＵ取り込みアッセイを含む。
【０１９３】
当業者は、本発明が、任意の実施形態に従って本明細書に記載の細胞を使用して化合物を特定および／または単離するさまざまな方法を包含することを、前述より承知していると思われる。スクリーニングに適切な化合物は、例えば、抗体、ペプチドまたは小分子を含む。
【０１９４】
本発明は、特定または単離された化合物に関する情報の供給を、さらに提供する。したがって、スクリーニング方法は、
（ｉ）場合により、化合物の構造を決定するステップ、ならびに
（ｉｉ）化合物または化合物の名称もしくは構造を、例えば文書の形態、機械による読み込み可能な形態またはコンピューターに読み込み可能な形態などで提供するステップ
によりさらに改変される。
【０１９５】
必然的に、公知であるが本発明により提供されたスクリーニングを使用してその機能をいままでに試験されていない化合物については、化合物の構造の決定は黙示的（implicit）である。当業者は、スクリーニングの実施時に、化合物の名称および／または構造を承知していると思われるからである。
【０１９６】
本明細書において使用する場合、「化合物を提供する」という用語は、前記化合物を作製するための任意の化学的または組み換えの合成手段、または任意の人または手段により今までに合成されている化合物の供給を含むと解釈されるべきである。これは、化合物の単離を明らかに含む。
【０１９７】
好ましい実施形態において、化合物または化合物の名称もしくは構造は、例えば、本明細書に記載のスクリーニングにより決定されたその使用に関する指示と一緒に提供される。
【０１９８】
スクリーニングアッセイは、
（ｉ）場合により、化合物の構造を決定するステップ、
（ｉｉ）場合により、化合物の名称もしくは構造を、例えば文書の形態、機械による読み込み可能な形態またはコンピューターに読み込み可能な形態などで提供するステップ、ならびに
（ｉｉｉ）化合物を提供するステップ
によりさらに改変され得る。
【０１９９】
好ましい実施形態において、合成化合物またはこの化合物の名称もしくは構造は、例えば、本明細書に記載のスクリーニングにより決定されたその使用に関する指示と一緒に提供される。
【０２００】
一実施形態において、化合物は化合物のライブラリーで提供され、ライブラリーの１つ１つ、またはライブラリーのサブセットは他のメンバーから分離され得る（すなわち、物理的に単離される）。このような場合、化合物はその同定によりライブラリーから単離され、その同定により、その後、例えばライブラリーの他のメンバーの不在下で、当業者が、例えばその化合物を単離して作製することが可能になる。
【０２０１】
本発明を、以下の限定されない実施例においてさらに説明する。
【実施例１】
【０２０２】
Ｓｔｒｏ−１＋多分化能前駆細胞からの再プログラム化細胞の作製
１．１ Ｓｔｒｏ−１＋多分化能前駆細胞を濃縮した集団
Ｓｔｒｏ−１＋多分化能前駆細胞は、骨髄、脂肪組織および歯髄組織を含むさまざまな組織から得られる。異なる部位に由来するＳｔｒｏ−１＋多分化能前駆細胞の再プログラミング効率を比較するために、本質的にＧｒｏｎｔｈｏｓおよびＺａｎｎｅｔｔｉｎｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．４４９：４５〜５７ページ（２００８年）に記載のように、これらの組織それぞれに由来する細胞を、ＳＴＲＯ３ ｍＡｂを使用する免疫選択によってＳｔｒｏ−１Ｂｒｉｇｈｔ細胞を濃縮し、その後、培養により増殖し、ＰｒｏＦｒｅｅｚｅＴＭ−ＣＤＭ（Ｌｏｎｚａ、ＵＳＡ）において凍結保存する。異なる免疫選択法を使用して、同じ部位に由来するＳｔｒｏ−１＋多分化能前駆細胞の再プログラミング効率を比較するために、同じドナー由来の対を成す骨髄試料を、ＳＴＲＯ３またはＳＴＲＯ１ｍＡｂのいずれかを使用する免疫選択によってＳｔｒｏ−１Ｂｒｉｇｈｔ細胞を濃縮し、培養により増殖し、ＰｒｏＦｒｅｅｚｅＴＭ−ＣＤＭ（Ｌｏｎｚａ、ＵＳＡ）において凍結保存する。すべての研究に関して、第４継代の細胞を解凍し、即時使用のためにビヒクルにおいて構成する。
【０２０３】
１．２ レンチウイルスベクターのパッケージングおよび作製
導入遺伝子発現レンチウイルスベクターを、２９３ＦＴ細胞系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）において作製する。２９３Ｔは、形質転換された２９３胎児腎細胞に由来する、成長が速く、高度に移入可能なクローンの変異体であり、より高いウイルス価に寄与するパッケージングタンパク質の高レベル発現のために、ラージＴ抗原を含有する。常法としての維持および増殖のために、これらの細胞を、２９３ＦＴ培地（ＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ、２ｍＭのＬ−グルタミンおよび０．１ｍＭのＭＥＭ非必須アミノ酸）において５００μｇ／ｍｌのジェネテシンの存在下で培養する。パッケージングのために、２９３ＦＴ細胞を、トリプシン処理によって収集する。遠心分離によりトリプシンを除去後、これらの細胞を、ジェネテシンを含まない２９３ＦＴ培地において、Ｔ７５フラスコにアリコートに分ける（１５×１０６細胞／フラスコおよび６フラスコ／構築物）。
【０２０４】
レンチウイルスベクターおよび２つのヘルパープラスミドの共トランスフェクションを、細胞をアリコートに分けた直後にＳｕｐｅｒｆｅｃｔ（登録商標）トランスフェクション試薬（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて実施する。翌日、トランスフェクション混合物を含有する培養培地を、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（８ｍｌ／フラスコ）を補充した新鮮な２９３ＦＴ培地に取り換える。レンチウイルス含有上清を形質導入の約４８から７２時間後に収集する。２９３ＦＴ細胞の残渣（debris）を、４℃において１５分間の遠心分離によって上清から除去する。レンチウイルスを濃縮するために、０．４μＭの酢酸セルロース（ＣＡ）膜（Ｃｏｒｎｉｎｇｔｏｎ、１１５ｍｌ 低タンパク質結合）を通して上清をろ過し、７０ｍｌの滅菌ボトル（Ｂｅｃｋｍａｎ、カタログ番号３５５６２２、４５Ｔｉローターだけのためのポリカーボネート）において、４０℃において２．５時間超遠心分離にかける。上清の除去後、ＰＢＳ（各構築物に関して約３００μｌ）を加え、４０℃において８から１４時間、または室温において２時間、遠心管を振動させることによってペレットを再懸濁する。残存する細胞残渣を遠心分離により除去し、再懸濁したレンチウイルスをアリコートに分け、−８０℃において保管した。レンチウイルスは、１種または複数の能力決定因子をコードする配列を担持する。
【０２０５】
１．３ レンチウイルス形質導入後の細胞の再プログラミングおよび能力決定因子の発現
１種または複数の能力決定因子（例えば、Ｏｃｔ４；またはＯｃｔ４とＳｏｘ２の組み合わせ；またはＯｃｔ４、Ｓｏｘ２と、ＮａｎｏｇおよびＬｉｎ２８のうちの少なくとも１つとの組み合わせ；またはＯｃｔ４、Ｋｌｆ４およびｃ−Ｍｙｃの組み合わせ；またはＯｃｔ４、Ｓｏｘ２およびＫｌｆ４の組み合わせ；またはＯＣＴ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４およびｃ−Ｍｙｃの組み合わせ；またはＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、ＮａｎｏｇおよびＬｉｎ２８の組み合わせ；またはＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃ、ＮａｎｏｇおよびＬｉｎ２８の組み合わせ）をコードするレンチウイルスを、最終濃度約６μｇ／ｍｌ（Ｓｉｇｍａ）でポリブレン担体を加えた後、細胞培養液に加える。
【０２０６】
翌日レンチウイルス含有培地を新鮮な培地に取り換え、細胞を適切な培地においてさらに培養する。必要に応じて、形質導入の３日後に薬剤選択を開始する。
【０２０７】
体細胞を因子に曝露した前後に、細胞分取法を使用して細胞を分析する。接着細胞を、トリプシン処理（０．０５％のトリプシン／０．５ｍＭのＥＤＴＡ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により解離させ、２％のパラホルムアルデヒド中で室温において２０分間固定する。細胞を、４０μｍのメッシュを通してろ過し、ＦＡＣＳ緩衝液（２％のＦＢＳおよび０．１％のアジ化ナトリウムを含有するＰＢＳ）に再懸濁する。懸濁液において成長した細胞を、１ｍＭのＥＤＴＡおよび１％の正常マウス血清（Ｓｉｇｍａ）を補充したＦＡＣＳ緩衝液において染色した。細胞内ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）染色を、Ｆｉｘ ＆ Ｐｅｒｍ（登録商標）試薬（Ｃａｌｔａｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）を使用して実施する。５×１０５細胞を含有する約１００μｌの細胞懸濁液を、個々の標識に使用する。（必要に応じて）一次抗体および二次抗体の両方のインキュベーションを室温において約３０分間実施する。対照試料を、アイソタイプ一致対照抗体を用いて染色する。洗浄後、細胞を約３００〜５００μｌのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（ＢＤＩＳ；Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）において、Ｃｅｌｌ Ｑｕｅｓｔ（商標）ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎおよび分析ソフトウェア（ＢＤＩＳ）を使用して分析する。合計で２０，０００事象（event）が得られる。検出されたマーカーは、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ−１−６０、Ｔｒａ−１−８１、ＣＤ２９、Ｔｒａ−１−８５、ＣＤ５６、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ３１またはＣＤ３４から選択される。
【０２０８】
いくつかの形質導入およびその後の培養において、細胞はバルプロ酸の存在下（in the presence or valproic acid）で維持する。
【０２０９】
ＥＢおよび奇形腫の形成をさらに使用して、再プログラム化細胞が３種すべての一次胚葉の分化誘導体を生じるための発生能を有することを実証する。
【実施例２】
【０２１０】
Ｓｔｒｏ−１＋多分化能前駆細胞からの再プログラム化細胞の作製
２．１ 材料および方法
Ｓｔｒｏ−１＋多分化能細胞を濃縮した集団
Ｓｔｒｏ−１＋多分化能前駆細胞が濃縮された細胞集団を、骨髄、脂肪組織および歯髄組織から得た。異なる部位に由来するＳｔｒｏ−１＋多分化能前駆細胞の再プログラミング効率を比較するために、本質的にＧｒｏｎｔｈｏｓおよびＺａｎｎｅｔｔｉｎｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．４４９：４５〜５７ページ（２００８年）に記載のように、これらの組織それぞれに由来する細胞を、ＳＴＲＯ３ ｍＡｂを使用する免疫選択によってＳｔｒｏ−１Ｂｒｉｇｈｔ細胞を濃縮し、その後、培養により増殖し、ＰｒｏＦｒｅｅｚｅＴＭ−ＣＤＭ（Ｌｏｎｚａ、ＵＳＡ）において凍結保存した。異なる免疫選択法を使用して、同じ部位に由来するＳｔｒｏ−１＋多分化能前駆細胞の再プログラミング効率を比較するために、同じドナー由来の対を成す骨髄試料を、ＳＴＲＯ３またはＳＴＲＯ１ｍＡｂのいずれかを使用する免疫選択によってＳｔｒｏ−１Ｂｒｉｇｈｔ細胞を濃縮し、培養により増殖し、ＰｒｏＦｒｅｅｚｅＴＭ−ＣＤＭ（Ｌｏｎｚａ、ＵＳＡ）において凍結保存した。すべての研究に関して、第４継代の細胞を解凍し、即時使用のためにビヒクルにおいて構成した。
【０２１１】
細胞系
ウイルスパッケージング細胞である、プラチナ−Ａ（Ｐｌａｔ−Ａ）細胞を、Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．Ｄｅｔｒｏｉｔ ５５１から得、線維芽細胞は実験のための陽性対照であった。
【０２１２】
レトロウイルスの作製およびｉＰＳ細胞の発生
ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４およびｃＭＹＣのヒトｃＤＮＡを含有する、モロニーに基づくレトロウイルスベクター（ｐＭＸ）を、Ａｄｄｇｅｎｅから得た。９μｇの各プラスミドを、Ｆｕｇｅｎｅ６（Ｒｏｃｈｅ）を使用して、ウイルスパッケージングＰｌａｔ−Ａ細胞にトランスフェクトした。ウイルス含有上清を、トランスフェクトの４８時間後及び７２時間後に収集し、孔径０．４５μｍのフィルターを通してろ過し、４μｇ／ｍｌのポリブレン（Ｓｉｇｍａ）を補充した。標的細胞を、感染２４時間前に１×１０３から５×１０３細胞／ｃｍ２の密度で播種した。４種の転写因子のレトロウイルス上清を等量で混合し、二重感染を２４時間および４８時間において標的細胞に加えた。感染細胞のための培養培地を、感染後４日目にｈＥＳ細胞培地に変えた。細胞は培地において維持し、培地は、３週間まで、または細胞が集密に達するまで毎日新しくした。
【０２１３】
ｉＰＳ細胞の増殖
ｉＰＳ細胞系を確立するために、感染後約３週間目にｈＥＳ細胞様コロニー形態に基づいてｉＰＳ細胞のコロニーを取り上げた。取り上げたコロニーを、ｈＥＳ細胞培地において新鮮な、有糸分裂的に不活性化されたＭＥＦ上で増殖した。
【０２１４】
ｉＰＳ細胞の維持
ヒトｉＰＳ細胞を、２０％のＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１ｍＭのＬ−Ｇｌｕｔａｍａｘ、０．１ｍＭの非必須アミノ酸、０．１ｍＭのβ−メルカプトエタノール、１％のＩＴＳおよび１０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ（すべてＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから）を補充したＤＭＥＭにおいて培養した。ヒトｉＰＳ細胞を、培養培地で毎日再生（refresh）した。機械的解離を、２９Ｇの針を付けた１ｍｌのインスリン注射器を使用して、ｉＰＳ細胞コロニーをより小さい細胞の塊に解体することによって実施した。感染後８から１０日後に、新鮮な有糸分裂的に不活性化したＭＥＦ上にコロニーを移した。ｉＰＳコロニーを、７から１０日ごとに継代し、その後機械的解離を実施した。
【０２１５】
ＦＡＣＳ分析
細胞のトランスフェクション効率を推定するために、上記と同じ方法を使用して、ｐＭＸｓ−ＧＦＰレトロウイルスベクターをＰｌａｔ−Ａ細胞にさらにトランスフェクトした。ＧＦＰ ｃＤＮＡを含有するｐＭＸレトロウイルスは、追加の細胞であった。ＧＦＰを発現する細胞の数を、フローサイトメトリーによって感染４８時間後に評価した。細胞を、０．２５％のトリプシン−ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて５分間解離させ、フローサイトメーター（ＭｏＦＬＯ）を使用して分析した。
【０２１６】
再プログラミング効率のアッセイ
脂肪細胞、歯髄細胞およびＭＰＣを、上記の「Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｉＰＳ Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ」に記載の４種の因子に感染させた。細胞を、１７日間維持し、毎日培地を変えた。次いで細胞を、トリプシンを用いて解離させ、４％のパラホルムアルデヒドを用いて固定した。細胞を、２．５％（ｗ／ｖ）のスキムミルクパウダー、ＰＢＳ中２％（ｖ／ｖ）のヤギ血清を用いてブロックした。細胞を、一次抗体を用いて４℃において一晩標識し、次いで、一次抗体（マウス抗Ｏｃｔ４、抗Ｎａｎｏｇまたは抗ＳＳＥＡ４）を用いて４℃において一晩標識し、その後、ヤギ抗マウスＡｌｅｘａ４８８二次抗体を用いて室温において１時間標識した。試料を、上記のＦＡＣＳによって分析し、陽性に染色された細胞の数を決定した。
【０２１７】
２．２ 結果
すべてのＳｔｒｏ−１＋多分化能前駆細胞が濃縮された集団は、それが歯髄、脂肪組織または骨髄から供給されたかどうかにかかわらず、また、ＳＴＲＯ−３またはＳＴＲＯ−１ｍＡｂｓを用いて免疫選択されたかどうかにかかわらず、再プログラムでき、ｉＰＳ細胞系を作製できる。
【０２１８】
さまざまな細胞の再プログラミングのための結果の要約を、表１に示す。
【０２１９】
【表１】
【０２２０】
ＧＦＰレポーター構築体によって決定したすべての細胞型のトランスフェクション効率は同様であり、７１．２〜９８．３％の範囲であった。プレート当たりに成長するｉＰＳコロニーの数を測定する研究の結果は、Ｄ５５１胎児線維芽細胞に由来する系と比較して、歯髄および脂肪組織を起源とするＳｔｒｏ−１＋多分化能前駆細胞が濃縮された細胞集団に由来する系に関する有意により高い推定ｉＰＳ細胞コロニーの形成を示す。さらに、歯髄および脂肪組織を起源とするＳｔｒｏ−１＋多分化能前駆細胞が濃縮された細胞集団に由来する系に関するｉＰＳ細胞のコロニー形成は、骨髄由来のＳｔｒｏ−１＋多分化能前駆細胞に由来する系より有意に高かった。歯髄および脂肪組織（それぞれ５６および２２）に関する平均コロニー数（／播種された５０，０００細胞）は、Ｄ５５１線維芽細胞（７）または骨髄（０．５）に関して観察されるより優位に高かった（ｐ＜０．０５、カイ二乗検定）。
【０２２１】
Ｄ５５１線維芽細胞と比較してＳｔｒｏ−１＋多分化能前駆細胞からのｉＰＳ発生の効率の増加が、外からトランスフェクトされた遺伝子または誘導性外来遺伝子の持続発現と関係があったかどうかを調べるために、本発明者らは、次にすべての培養されたトランスフェクト細胞集団においてＯｃｔ４およびＮａｎｏｇの発現を測定した。表１に示すように、トランスフェクトされたＤ５５１線維芽細胞は、最も高いレベルのＯｃｔ４の持続発現（６９％）を明示し、歯髄または脂肪組織を起源とするトランスフェクトされたＳｔｒｏ−１＋多分化能前駆細胞は中間レベルのＯｃｔ４発現（それぞれ５７％および５６％）を有し、トランスフェクトされた骨髄Ｓｔｒｏ−１＋多分化能前駆細胞は最も低いレベルのＯｃｔ４発現（３６％）を有した。
【０２２２】
歯髄または脂肪組織を起源とするＳｔｒｏ−１＋多分化能前駆細胞のトランスフェクトされた集団は、Ｎａｎｏｇを発現する細胞の合計数がトランスフェクトされたＤ５５１線維芽細胞（２８％）より低い（それぞれ、５％および１０％）。骨髄Ｓｔｒｏ−１＋多分化能前駆細胞に関しては、対を成す同じ骨髄試料からＳＴＲＯ−３またはＳＴＲＯ−１ｍＡｂを用いて免疫選択されたかどうかにかかわらず、同様のパターンのＯｃｔ４およびＮａｎｏｇの発現が一貫して見られる（Ｏｃｔ４に関してはそれぞれ３０％および３７％ならびにＮａｎｏｇに関してはそれぞれ１７％および２１％）。
【０２２３】
Ｎａｎｏｇ発現の誘導が、中間段階にあるが、必ずしも決定的なｉＰＳ段階には進まないｉＰＳ様コロニーと関連し得ることを示す以前に公開されたデータ（Ｃｈａｎら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２７（１１）：１０３３〜１０３７ページ（２００９年））と併せて、歯髄または脂肪組織を起源とするトランスフェクトされたＳｔｒｏ−１＋多分化能前駆細胞が、Ｄ５５１線維芽細胞より低いＮａｎｏｇ発現を有するが、有意に高いｉＰＳコロニー数を有するという本発明者らの発見は、Ｓｔｒｏ−１＋多分化能前駆細胞が、能力因子への曝露後の決定的なｉＰＳコロニー形成へ進行するためのより許容状態の細胞型を代表することを示す。
【０２２４】
総合して、これらの結果は、
１）トランスフェクション後の同様のＯｃｔ４発現にもかかわらず、歯髄および脂肪組織を起源とするＳｔｒｏ−１＋多分化能前駆細胞が濃縮された細胞集団は、ｉＰＳ細胞コロニーを、対照の線維芽細胞より、より効率的にかつより多数作製し、
２）トランスフェクション後にＮａｎｏｇ発現の誘導が低下したにもかかわらず、歯髄および脂肪組織を起源とするＳｔｒｏ−１＋多分化能前駆細胞が濃縮された細胞集団は、決定的なｉＰＳ細胞コロニーを、対照の線維芽細胞より、より効率的にかつより多数作製し、
３）歯髄および脂肪組織を起源とするＳｔｒｏ−１＋多分化能前駆細胞が濃縮された細胞集団は、骨髄由来のＳｔｒｏ−１＋多分化能前駆細胞が濃縮された細胞集団より、ｉＰＳ細胞コロニーをより効率的に作製したので、組織の起源は、ｉＰＳ細胞コロニーの形成の効率に影響を及ぼし得る、
ことを示す。
【０２２５】
免疫蛍光
歯髄由来のｉＰＳ細胞コロニーは、Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ１−６０およびＴＲＡ１−８１を発現することが免疫蛍光により示された。これらの細胞は、アルカリホスファターゼを発現することがさらに示された。
【０２２６】
脂肪組織由来のｉＰＳ細胞コロニーは、Ｏｃｔ４を発現することが免疫蛍光により示され、アルカリホスファターゼを発現することが示された。
【０２２７】
ｉＰＳ細胞系の遺伝子発現
遺伝子発現研究の結果を表２に提示する。
【０２２８】
要約として、Ｓｔｒｏ−１＋多分化能前駆細胞濃縮細胞集団が歯髄、脂肪組織，または骨髄から得られたかどうかにかかわらず、すべてのＳｔｒｏ−１＋多分化能前駆細胞濃縮細胞集団が、感染前にＫＬＦ４およびｃ−ｍｙｃを内因性に発現した。理論および作用機序に縛られることを好むものではないが、Ｓｔｒｏ−１＋多分化能前駆細胞によるこれらの能力因子の内因性発現は、Ｓｔｒｏ−１＋多分化能前駆細胞を使用したｉＰＳ作製の、線維芽細胞より高い効率を一部説明できる。しかし、さらなる因子は、歯髄又は脂肪組織を起源とするＳｔｒｏ−１＋多分化能前駆細胞において観察されたｉＰＳ系を作製する効率が、骨髄を起源とするものより高いことを説明できる。
【０２２９】
確立された歯のｉＰＳ細胞系は、すべての内因性遺伝子、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、ｃ−ｍｙｃおよびＫｌｆ４を発現した。外因性Ｏｃｔ４およびｃ−ｍｙｃは、第３継代および第８継代で発現停止されたが、Ｓｏｘ２およびＫｌｆ４は発現されたままである。
【０２３０】
第２継代の脂肪ＩＰＳＣは内因性Ｋｌｆ４だけを発現した。外因性Ｏｃｔ４およびｃ−ｍｙｃは発現停止されないままであった。
【０２３１】
第２継代骨髄−ＭＰＣは、いずれの内因性遺伝子の発現も示さなかった。これらの細胞におい発現停止された唯一の外因性遺伝子はＳｏｘ２であった。
【０２３２】
【表２】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多能性細胞およびその作製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
胚性幹（ＥＳ）細胞は、多能性を維持している間は不確定に成長でき、３種の胚葉、すなわち中胚葉、内胚葉および外肺葉すべての細胞に分化できると信じられている（Ｅｖａｎｓ ＆ Ｋａｕｆｍａｎ、Ｎａｔｕｒｅ ２９２：１５４〜１５６（１９８１））。ヒトＥＳ細胞およびそれに由来する細胞は、パーキンソン病、脊髄損傷および糖尿病などの疾患の宿主の治療用に現在評価されている。しかし、ヒトＥＳ細胞はヒトの胚から得られるという事実が、多数の非常に議論の余地がある倫理規定を提起し、多くの国において、これらの細胞の誘導が法律によって禁止されている。さらに、ＥＳ細胞およびそれに由来する細胞は、それが由来する対象から抗原を発現するので、不適合な（例えば同じＨＬＡ型（複数可）を発現しない）対象に投与された場合、それらの細胞が拒絶される危険性がある。したがって、科学者らはＥＳ細胞の現在の作製方法を避けるための技術的解決法を探求した。これらの解決法を達成するための１つの望ましい方法は、出生後の個体、例えば、治療される対象もしくは関連する対象または他の適合する対象の体細胞から直接多能性細胞を作製することであった。
【０００３】
体細胞を再プログラミングするための一方法は、細胞の核内容物を卵母細胞に移入するステップ（Ｗｉｌｍｕｔら、Ｎａｔｕｒｅ ３８５：８１０〜８１３（１９９７年））またはＥＳ細胞と融合させるステップ（Ｃｏｗａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０９：１３６９〜１３７３（２００５年））を含み、未受精卵およびＥＳ細胞は体細胞において全能性または多能性をもたらす因子を含有することを示している。これらの方法に付随する問題は卵子および／または胚の破壊の必要性を含み、このことは一部の国において倫理規定を提起し得る。
【０００４】
多能性の転写決定は完全に理解されてはいないが、Ｏｃｔ３／４（Ｎｉｃｈｏｌｓら、Ｃｅｌｌ ９５：３７９〜３９１（１９９８年））、Ｓｏｘ２（Ａｖｉｌｉｏｎら、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１７：１２６〜１４０（２００３年））およびＮａｎｏｇ（Ｃｈａｍｂｅｒｓら、Ｃｅｌｌ １１３：６４３〜６５５（２００３年））を含むいくつかの転写因子は、ＥＳ細胞の多能性の維持に関与しており、しかし、ＥＳ細胞の特定だけでは十分でない。
【０００５】
最近、ＴａｋａｈａｓｈｉおよびＹａｍａｎａｋａは、４つの因子（すなわち、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、ｃ−ＭｙｃおよびＫｌｆ４）を、マウスのＥＳ細胞培養に適切な条件下で培養されたマウスのＥＳ細胞および成体マウスの線維芽細胞に導入した。どちらかの細胞型に形質導入後、著者らは、マウスＥＳ細胞の形態および成長特性を示し、マウスＥＳ細胞のマーカー遺伝子を発現した、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞を得た（Ｔａｋａｈａｓｈｉ＆Ｙａｍａｎａｋａ、Ｃｅｌｌ １２６：６６３〜６７６（２００６年））。ヌードマウスへのｉＰＳ細胞の皮下移植は、３種すべての胚葉に由来するさまざまな組織を含有する腫瘍をもたらした。胚盤胞への注射後、ｉＰＳ細胞はマウスの胚発生に寄与した。これらのデータは、レトロウイルス形質導入を使用して、わずか数種の確定された因子を加えることによって、多能性細胞が直接マウス線維芽細胞培養物から作製され得ることを実証している。しかし、この技術は、再プログラミングの率の低さ（処置された細胞の１％よりかなり低い）ならびにゲノムへの組み込みおよび発がん遺伝子ｃ−ＭｙｃおよびＫｌｆ４の連続発現の必要性を含む、いくつかの重要な不利益に非常に悩まされる。これらの遺伝子の発現は、細胞およびこの細胞に由来する細胞のレシピエントにおいて腫瘍の発生をもたらし得る。この点で、おそらくこれらの発がん遺伝子の連続発現の結果として、これらの方法を用いて作製されたｉＰＳ細胞を使用して作製されたキメラマウスは腫瘍を発生する。結果的に、この分野の調査の主要な目的は、これらの因子をコードする核酸のゲノムへの組み込みを必要としないか、またはこれらの再プログラミング因子もしくは他の再プログラミング因子の発現の数もしくは期間を最小化するかのいずれかの再プログラミングの方法を開発することである。
【０００６】
融合に基づく再プログラミング研究において線維芽細胞は誘導および大量使用の容易さの可能性が最も高いため、ｉＰＳ細胞に基づく研究の大部分は線維芽細胞を使用するが、繊維芽細胞以外のさまざまな細胞集団がマウスにおけるｉＰＳ細胞の誘導に使用されてきた。これらの研究からの重要な観察は、選択された体細胞の型が、ｉＰＳ細胞作製の効率および再プログラミングのレベルに有意な効果を有することである。この点において、神経幹細胞、胃細胞および肝細胞などのいくつかの細胞型は、線維芽細胞と比較して比較的高い効率で再プログラムすると思われる。しかし、ヒト由来のこれらの細胞の単離は、組織採取の侵襲性および／または利用可能なドナー試料が限られていることにより困難または実現不可能である。いくつかのより入手しやすい細胞型（例えば、筋肉細胞または分化した造血細胞）はｉＰＳ研究の基盤として使用されているが、再プログラミングの成功は限られている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、当分野において、容易に入手でき、効率的な再プログラミングが確実に可能な最適な細胞型の特定の必要がある。効率的な再プログラミング特性を有するこのような細胞型の特定は、ゲノムへの組み込みを必要とせず、かつ／または再プログラミング因子の数を最小化もしくは減少させる再プログラミング方法の使用を容易にすると思われる。このことは、腫瘍性形質転換の危険性が減少した、より安全な多能性ｉＰＳ細胞集団をもたらすであろう。再プログラミングの効率が高く、胚組織に頼らずに得られるこのような細胞型は、存在がすでに企図されている適用である多能性ＥＳ細胞への使用に適していると思われる。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明につながる研究において、本発明者は、多くの組織供給源が効率的にｉＰＳ細胞を作製するために適切な供給源ではないという従来の見識にもかかわらず、さまざまな供給源由来の細胞を使用してｉＰＳ細胞の作製を試みた。驚くべきことに、本発明者は、Ｓｔｒｏ−１＋多分化能細胞またはその子孫細胞（特に、脂肪組織または歯髄組織由来のもの）が、高い効率、例えば線維芽細胞より高い効率を有するｉＰＳ細胞作製のための有用な供給源であったことを発見した。
【０００９】
本発明者はまた、Ｓｔｒｏ−１＋多分化能細胞またはその子孫細胞が、線維芽細胞を再プログラムし、ｉＰＳ細胞を作製するために、外から(exogenously)加えられることが普通は必要とされる内因性因子、例えばＫｌｆ４および／またはｃ−ｍｙｃを発現することも決定した。このような内因性（endocgenous）遺伝子の発現は、これらのタンパク質を高レベルで導入することなく、またはこれらの非内因性型タンパク質を全く導入することなくｉＰＳ細胞を作製することを可能にできる。ｃ−ｍｙｃの内因性発現は、この発がん遺伝子の構成的発現および／または強度の発現を必要としないので、ｃ−ｍｙｃの内因性発現は、腫瘍形成の危険性が減少したｉＰＳ細胞の作製もまた容易にすると思われる。
【００１０】
本発明の一例は、再プログラム化細胞を作製する方法を提供し、前記方法は、Ｓｔｒｏ−１＋多分化能細胞および／またはその子孫細胞を、細胞を再プログラムするために十分な条件下で１種または複数の能力決定因子（potency-determining factors）に曝露するステップおよび曝露された細胞を培養し、再プログラム化細胞を得るステップを含む。この方法は、同様に、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞を作製する方法に適用される。
【００１１】
本発明の別の例は、再プログラム化細胞を作製する方法を提供し、前記方法は、Ｓｔｒｏ−１＋多分化能細胞および／またはその子孫細胞が濃縮された細胞の集団を、細胞を再プログラムするために十分な条件下で１種または複数の能力決定因子に曝露するステップを含む。
【００１２】
Ｓｔｒｏ−１＋多分化能細胞の供給源は、これらの細胞がｉｎ ｓｉｔｕで位置する任意の組織であってよい。好ましくは、Ｓｔｒｏ−１＋多分化能細胞の供給源は脂肪組織または歯髄組織である。Ｓｔｒｏ−１＋細胞の別の供給源は骨髄である。
【００１３】
一例において、Ｓｔｒｏ−１＋多分化能細胞またはその子孫細胞は、１種または複数の能力決定因子に曝露する前の脂肪組織、歯髄組織、骨髄または他の部位から濃縮される。
【００１４】
一例において、本発明の方法は、曝露された細胞を培養し、Ｓｔｒｏ−１＋多分化能細胞および／またはその子孫細胞よりも広い分化能を有する、すなわち、Ｓｔｒｏ−１＋多分化能細胞および／またはその子孫細胞よりも広範囲の細胞系列（cell lineage）および／または細胞型に分化できる、再プログラム化細胞を得るステップを含む。
【００１５】
例示的な能力決定因子は、限定するものではないが、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、ｃ−Ｍｙｃ、ｂＦＧＦ、ＳＣＦ、ＴＥＲＴ、ＳＶ４０ラージＴ抗原、ＨＰＶ１６Ｅ６、ＨＰＶ１６Ｅ７、Ｂｍｉｌ、Ｆｂｘ１５、Ｅｒａｓ、ＥＣＡＴ１５−２、Ｔｃｌ１、β−カテニン、ＥＣＡＴ１、ＥＳＧ１、Ｄｎｍｔ３Ｌ、ＥＣＡＴ８、Ｇｄｆ３、Ｓｏｘ１５、ＥＣＡＴ１５−１、Ｆｔｈｌ１７、Ｓａｌ１４、Ｒｅｘ１、ＵＴＦ１、Ｓｔｅｌｌａ、Ｓｔａｔ３、ＦｏｘＤ３、ＺＮＦ２０６、Ｍｙｂｌ２、ＤＰＰ Ａ２、Ｏｔｘ２およびＧｒｂ２または１種もしくは複数の前記因子と同一もしくは類似の活性を有する化合物、例えばその活性断片または小分子からなる群から個別にまたは集約的に選択される因子を含む。別の例示的な能力決定因子は、例えば本明細書に記載された、化学物質、ペプチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたはマイクロＲＮＡである。例えば、１種または複数の能力決定因子は、
（ｉ）Ｏｃｔ４、
（ｉｉ）Ｏｃｔ４とＳｏｘ２との組み合わせ、
（ｉｉｉ）Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２と、ＮａｎｏｇおよびＬｉｎ２８のうちの少なくとも１つとの組み合わせ、
（ｉｖ）Ｏｃｔ４、Ｋｌｆ４およびｃ−Ｍｙｃの組み合わせ、
（ｖ）Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２およびＫｌｆ４の組み合わせ、
（ｖｉ）Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４およびｃ−Ｍｙｃの組み合わせ、
（ｖｉｉ）Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、ＮａｎｏｇおよびＬｉｎ２８の組み合わせ、
（ｖｉｉｉ）Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃ、ＮａｎｏｇおよびＬｉｎ２８の組み合わせ、ならびに
（ｉｘ）（ｉ）から（ｘ）のうちのいずれか１つと、さらに化学物質、ペプチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたはマイクロＲＮＡとの組み合わせ
からなる群から個別にまたは集約的に選択される。
【００１６】
好ましくは、能力決定因子はＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４およびｃ−Ｍｙｃである。
【００１７】
本発明の方法の一例において、Ｓｔｒｏ−１＋多分化能細胞および／またはその子孫細胞は、出生後の対象から得られる。この実施形態によれば、本方法は、対照からＳｔｒｏ−１＋多分化能細胞および／または子孫細胞を得る、または単離するステップをさらに含み得る。
【００１８】
好ましくは、対象は、哺乳動物および／または哺乳動物の細胞である。例示的な哺乳動物対象は、限定するものではないが、ヒト、霊長類、家畜（例えば、ヒツジ、ウシ、ウマ、ロバ、ブタ）、コンパニオン・アニマル（例えば、イヌ、ネコ）、実験動物（例えば、マウス、ウサギ、ラット、モルモット、ハムスター）、捕らわれた野生動物（例えば、キツネ、シカ）を含む。好ましくは、哺乳動物はヒトまたは霊長類である。最も好ましい哺乳動物はヒトである。
【００１９】
本発明の一例示形態において、Ｓｔｒｏ−１＋多分化能細胞および／またはその子孫細胞を１種または複数の能力決定因子に曝露するステップは、プロモーターに作動可能に連結された１種または複数の能力決定因子をコードする配列を含む核酸をＳｔｒｏ−１＋多分化能細胞および／またはその子孫細胞に導入するステップを含む。核酸をコードする複数の能力因子は互いに異なっていても、または単一の核酸において、例えば、別々のプロモーターにそれぞれが連結した複数の核酸、もしくは単一のプロモーターにそれぞれが連結した複数の核酸を含む単一の発現ベクター、例えばマルチシストロン性ベクター中にあってもよい。好ましくは、核酸はベクター、より好ましくはウイルスベクター、例えばレトロウイルスベクターまたはアデノウイルスベクター内に含有される。
【００２０】
本発明の一例において、核酸は、Ｓｔｒｏ−１＋多分化能細胞および／またはその子孫細胞のゲノム中に組み込まれない。例えば、核酸（複数可）は、細胞（複数可）内で１つまたは複数のエピソームとして残存し、および／または最終的に細胞（複数可）から排出される。
【００２１】
好ましくは、本発明の方法は、多分化能細胞または多能性細胞または全能細胞、より好ましくは多能性細胞の作製をもたらす。一例において、再プログラム化細胞は、（ｉ）Ｏｃｔ−４、ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４、Ｔｒａ−１−６０およびＴｒａ−１−８１からなる群から選択される細胞マーカーを発現し、（ｉｉ）多能性細胞に特徴的な形態を示し、（ｉｉｉ）免疫不全動物に導入されると奇形腫を形成する。
【００２２】
別の例において、本発明の方法は、再プログラム化細胞を、所望の細胞型を含む細胞集団、または所望の細胞型が濃縮された細胞集団に分化させるステップをさらに含む。本発明の方法は、所望の細胞型を単離、濃縮または選択するステップをさらに含み得る。このような細胞は、例えば本明細書に記載された療法またはスクリーニングにおいて有用である。または、例えば多能性細胞が病態を患っている対象から作製された場合、このような分化細胞は疾患状態または病態の研究に有用である。
【００２３】
別の例において、本発明の方法は、任意の実施形態に従って本明細書に記載の方法によって作製された細胞の有効量を、薬学的に許容される担体または賦形剤を有する医薬組成物に製剤化するステップを含む。
【００２４】
別の例において、本発明は、任意の実施形態に従って本明細書に記載の方法によって作製された細胞またはその集団または再プログラム化細胞が濃縮された集団を提供する。同様に、本発明の例示形態は、任意の実施形態に従って本明細書に記載の細胞または集団から分化した細胞または細胞の集団を提供する。
【００２５】
本発明の別の例は、異種プロモーターに作動可能に連結された能力決定因子をコードする核酸を含む、Ｓｔｒｏ−１＋多分化能細胞および／またはその子孫細胞を提供する。このような細胞は、再プログラム化細胞の作製に有用である。
【００２６】
任意の実施形態に従って本明細書に記載の方法を実施することによって作製された細胞は、薬物療法、例えば疾患または障害を治療または予防する方法において有用であり、この方法は、この細胞またはその集団を、それを必要とする対象に投与するステップを含む。
【００２７】
任意の実施形態に従って本明細書に記載の方法を実施することによって作製された細胞は、スクリーニングにもまた有用である。例えば、本発明は、疾患または障害の治療または予防において有用な化合物をスクリーニングする方法を提供し、この方法は、本発明による細胞または集団を前記化合物に曝露するステップを含む。
【００２８】
例えば、本発明は、多能性細胞の分化を導く化合物を特定する方法をさらに提供し、この方法は、
ｉ）本発明に従って作製された多能性細胞またはその集団を被験化合物と接触させ、それから分化した細胞の量を決定するステップ、
ｉｉ）この化合物の不在下で、本発明に従って作製された多能性細胞またはその集団から分化した細胞の量を決定するステップ
を含み、（ｉｉ）と比較して（ｉ）において分化細胞の量が増加することが、化合物が多能性細胞の分化を導くことを示す。
【００２９】
好ましくは、本方法は、１種または複数の異なる分化細胞型の量を決定するステップを含む。このようにして、特定の細胞系列または細胞型への分化を導く化合物が決定される。
【００３０】
前述により、本発明が、多能性細胞の分化を低減し、または阻止する化合物を特定する方法をさらに提供することが、当業者には明らかであると思われる。
【００３１】
本発明はさらに、病態の治療に有用な化合物を特定または単離する方法を提供し、この方法は、
（ｉ）任意の実施形態に従って本明細書に記載の方法を実施して、病態を患う対象から多能性細胞またはその集団を作製するステップ、および
（ｉｉ）細胞または集団を被験化合物と接触させ、病態の１種または複数の症状に対するその効果を決定するステップ
を含み、病態の症状を改善または緩和する化合物が病態の治療に有用である。
【００３２】
一例において、本方法は、
（ａ）多能性細胞またはその集団を病態に侵された細胞に分化させるステップ、および
（ｂ）（ａ）の細胞を被験化合物と接触させ、病態の１種または複数の症状に対するその効果を決定するステップ
を含み、病態の症状を改善または緩和する化合物が病態の治療に有用である。
【００３３】
このような方法は、病態を治療するための新規な化合物の特定および単離に有用であるだけではなく、対象が、既存の治療化合物／予防化合物を用いた治療に応答する可能性があるかどうかを特定するためにも有用である。
【００３４】
このような方法は、化合物を、再プログラム化Ｓｔｒｏ−１＋多分化能細胞および／またはその子孫細胞から成熟および分化および由来した１種または複数の標的組織に曝露した場合、化合物の任意の特定の毒性効果を特定するためにもさらに有用である。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
概要
本明細書を通して、特に明示しない限り、または文脈上別の解釈を要する場合を除き、単一のステップ、組成物、ステップの群または組成物の群への言及は、それらのステップ、組成物、ステップの群または組成物の群の１つまたは複数（すなわち、１つ以上）を包含すると解釈されるべきである。
【００３６】
本明細書に記載の個々の実施形態は、特に明記されない限り、１つ１つの他の実施形態に変更すべきところは変更して適用される。
【００３７】
当業者は、本明細書に記載の発明が、具体的に述べられた以外の変更および改良を受け入れ可能であることが明らかであろう。本発明が、このような変更および改良をすべて含むことは理解されるべきである。本発明は、本明細書に言及された、または示されたすべてのステップ、特徴、組成物および化合物、ならびに前記ステップまたは特徴のあらゆる組み合わせまたは任意の２つ以上を個別にまたは集約的にさらに含む。
【００３８】
本発明は、本明細書に記載の具体的実施形態によって範囲を限定されるものではなく、これらは単なる例示を目的とする意図である。機能的に同等である生成物、組成物および方法が本発明の範囲内であることは、本明細書に記載のように明らかである。
【００３９】
本発明は、特に明記しない限り、分子生物学、微生物学、ウイルス学、組み換えＤＮＡ技術、溶液中のペプチド合成、固相ペプチド合成および免疫学の従来技術を使用して、必要以上の実験をせずに実施される。このような手順は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｆｒｉｔｓｃｈ ＆ Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、第２版（１９８９年）、Ｖｏｌｓ Ｉ、ＩＩおよびＤＩ全体；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｖｏｌｓ．ＩおよびＩＩ（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ編、１９８５年）、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、テキスト全体；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編、１９８４年）ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、テキスト全体および特にテキスト中のＧａｉｔによる１〜２２ページ；Ａｔｋｉｎｓｏｎら、３５〜８１ページ；Ｓｐｒｏａｔら、８３〜１１５；およびＷｕら、１３５〜１５１ページの論文；４．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編、１９８５年）ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、テキスト全体；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（１９８６年）ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、テキスト全体；Ｐｅｒｂａｌ，Ｂ．、Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４年）；Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｓ．ＣｏｌｏｗｉｃｋおよびＮ．Ｋａｐｌａｎ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）、シリーズ全体；Ｊ．Ｆ．Ｒａｍａｌｈｏ Ｏｒｔｉｇａｏ、「Ｔｈｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」：Ｋｎｏｗｌｅｄｇｅ ｄａｔａｂａｓｅ ｏｆ Ａｃｃｅｓｓ ｔｏ Ｖｉｒｔｕａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｗｅｂｓｉｔｅ （Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖａ、Ｇｅｒｍａｎｙ）；Ｓａｋａｋｉｂａｒａ，Ｄ．、Ｔｅｉｃｈｍａｎ，Ｊ．、Ｌｉｅｎ，Ｅ．Ｌａｎｄ Ｆｅｎｉｃｈｅｌ，Ｒ．Ｌ．（１９７６年）．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．７３ ３３６〜３４２ページ；Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｒ．Ｂ．（１９６３年）．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５、２１４９〜２１５４年；Ｂａｒａｎｙ，Ｇ．およびＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｒ．Ｂ．（１９７９年）、Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ（Ｇｒｏｓｓ，Ｅ．およびＭｅｉｅｎｈｏｆｅｒ，Ｊ．編）ｖｏｌ．２、１〜２８４ページ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ．１２．Ｗｕｕｎｓｃｈ，Ｅ．編（１９７４年）Ｓｙｎｔｈｅｓｅ ｖｏｎ Ｐｅｐｔｉｄｅｎ ｉｎ Ｈｏｕｂｅｎ−Ｗｅｙｌｓ Ｍｅｔｏｄｅｎ ｄｅｒ Ｏｒｇａｎｉｓｃｈｅｎ Ｃｈｅｍｉｅ（Ｍｕｌｅｒ，Ｅ．編）、ｖｏｌ．１５、第４版、パート１および２、Ｔｈｉｅｍｅ，Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ；Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ，Ｍ．（１９８４年）Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ；Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ，Ｍ．＆ Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ，Ａ．（１９８４年）Ｔｈｅ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ；Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ，Ｍ．（１９８５年）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．２５、４４９〜４７４ページ；Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｉ〜ＩＶ巻（Ｄ． Ｍ．ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編、１９８６年、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）；ならびにＡｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ： Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、第３版（Ｊｏｈｎ Ｒ．Ｗ．Ｍａｓｔｅｒｓ編、２０００年）、ＩＳＢＮ０１９９６３７９７０、テキスト全体に記載されている。
【００４０】
選択された定義
「集約的」（collectively）は、本発明が、任意の数または組み合わせの列挙されたタンパク質もしくはマーカーまたはタンパク質もしくはマーカーの群を包含することを意味し、しかも、このような数または組み合わせのタンパク質もしくはマーカーまたはタンパク質もしくはマーカーの群が本明細書に具体的に記載されていないにもかかわらず、添付の特許請求の範囲が、任意の他の組み合わせのタンパク質もしくはマーカーまたはタンパク質もしくはマーカーの群から単独におよび分割可能にこのような組み合わせまたは小型の組み合わせ(sub-combinations)を定義し得ることを意味する。
【００４１】
本明細書を通して、文脈上別の解釈を要する場合を除き、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という用語または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変形は、述べられたステップもしくは要素もしくは整数（integer）またはステップもしくは要素もしくは整数の群を包含するが、他の任意のステップもしくは要素もしくは整数またはステップもしくは要素もしくは整数の群を排除しないことを暗示すると理解されるべきであろう。
【００４２】
本明細書において使用する場合、「に由来する」という用語は、指定された整数が特定の供給源から得ることができるが、必ずしも直接その供給源からである必要はないことを示すと解釈されるべきである。
【００４３】
本明細書において使用する場合、「有効量」という用語は、投与前の同じ過程または状態と比較して、および／または細胞を投与されない対象と比較して、生理的過程もしくは疾患状態を改善するため、または対象における疾患状態の発症を予防するための、再プログラム化細胞またはそれから分化した細胞および／またはその子孫細胞の十分量を意味すると解釈されるべきである。
【００４４】
本明細書において使用する場合、細胞集団の文脈における「濃縮された」という用語は、再プログラム化細胞または多能性細胞の数またはパーセントが天然の細胞集団における数またはパーセントを超えることを意味すると解釈されるべきである。例えば、再プログラム化細胞または多能性細胞が濃縮された集団は、少なくとも約０．０２％の前記細胞または少なくとも約０．０５％の前記細胞または少なくとも約０．１％の前記細胞または少なくとも約０．２％の前記細胞または少なくとも約０．５％の前記細胞または少なくとも約０．５％の前記細胞または少なくとも約０．８％の前記細胞または少なくとも約１％の前記細胞または少なくとも約２％の前記細胞または少なくとも約３％の前記細胞または少なくとも約４％の前記細胞または少なくとも約５％の前記細胞または少なくとも約１０％の前記細胞または少なくとも約１５％の前記細胞または少なくとも約２０％の前記細胞または少なくとも約２５％の前記細胞または少なくとも約３０％の前記細胞または少なくとも約４０％の前記細胞または少なくとも約５０％の前記細胞または少なくとも約６０％の前記細胞または少なくとも約７０％の前記細胞または少なくとも約８０％の前記細胞または少なくとも約８５％の前記細胞または少なくとも約９０％の前記細胞または少なくとも約９５％の前記細胞または少なくとも約９７％の前記細胞または少なくとも約９８％の前記細胞または少なくとも約９９％の前記細胞で構成されている。
【００４５】
「曝露する（ｅｘｐｏｓｅ）」および文法的に同等の用語、例えば「曝露すること（ｅｘｐｏｓｉｎｇ）」は、能力決定因子が細胞に生物学的効果を発揮するほど、細胞を能力決定因子の十分近くに運ぶ任意の過程を意味すると解釈されるべきである。この用語は、限定するものではないが、細胞をこの因子と接触させるステップおよび／または細胞をこの因子をコードする核酸と接触させるステップおよび／または細胞においてこの因子を発現させるステップを含むと理解されるべきである。
【００４６】
「個別に」は、本発明が、列挙されたタンパク質もしくはマーカーまたはタンパク質もしくはマーカーの群を単独に包含することを意味し、しかも、個別のタンパク質もしくはマーカーまたはタンパク質もしくはマーカーの群が本明細書に単独で記載されていないとしても、添付の特許請求の範囲が、このようなタンパク質もしくはマーカーまたはタンパク質もしくはマーカーの群を、互いに単独におよび分割可能に定義し得ることを意味する。
【００４７】
本明細書において使用する場合、「ｉＰＳ細胞」という用語は、起源であるその各分化体細胞（例えば、Ｓｔｒｏ−１＋多分化能細胞またはその子孫細胞）と実質的に、遺伝学的に同一であり、ＥＳ細胞などの能力のより高い細胞と同様の特徴を示す細胞を指す。ｉＰＳ細胞は、ＥＳ細胞と類似の形態学的特性（すなわち、円形、大型の核小体およびわずかな細胞質）および成長特性（すなわち、倍加時間；ＥＳ細胞は約１７から１８時間の倍加時間を有する）を示す。さらに、ｉＰＳ細胞は、多能性細胞特異的マーカー（例えば、Ｏｃｔ−４、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ−１−６０、Ｔｒａ−１−８１、しかしＳＳＥＡ−Ｉは発現しない）を発現することが好ましい。しかし、ｉＰＳ細胞は、胚に直接由来するものではなく、少なくともそれらが多能性になるまで、選択された能力決定因子の１つまたは複数のコピーを一時的にまたは安定して発現できる。本明細書において使用する場合、「胚に直接由来しない」は、ｉＰＳ細胞を作製するための出発細胞型が、出生後の個体から得た非多能性Ｓｔｒｏ−１＋多分化能（mutilpotential）細胞またはその非多能性子孫であることを意味する。
【００４８】
本明細書において使用する場合、「多分化能」(multipotent)という用語は、細胞が、３種の胚葉（中胚葉、内胚葉および外胚葉）の１種または２種または３種、好ましくは１種または２種の胚葉の複数の異なる型の細胞に分化できることを意味すると解釈されるべきである。
【００４９】
本明細書において使用する場合、「多能性」(pluripotent)という用語は、細胞が、３種の胚葉、すなわち内胚葉、外胚葉および中胚葉のそれぞれの細胞に分化できることを意味すると解釈されるべきである。多能性細胞は、さまざまな多能性細胞特異的マーカー（例えば、以下の多能性細胞特異的マーカー：ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０またはＴＲＡ１−８１の１種または複数）を発現し、未分化細胞に特徴的な細胞形態（すなわち、コンパクトなコロニー、核細胞質比の高さおよび顕著な核小体）を有し、ＳＣＩＤマウスなどの免疫不全動物に導入された場合、奇形腫を形成する。奇形腫は、通常３種の胚葉すべての特徴を示す細胞または組織を含有する。当業者は、当分野において一般的に使用される技術を使用することによってこれらの特徴を評価でき、例えば、Ｔｈｏｍｓｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：１１４５〜１１４７（１９９８年）を参照されたい。多能性細胞は、細胞培養における増殖、および多分化能特性を示す、系列が限定されたさまざまな細胞集団への分化の両方ができる。多分化能体細胞は、多能性細胞と比較してより分化しているが、最終分化はしていない。したがって、多能性細胞は、多分化能細胞より高い能力を有している。
【００５０】
本明細書において使用する場合、「能力決定因子」という用語は、遺伝子または他の核酸、それらの機能的断片などの因子およびコードされた因子、例えばタンパク質もしくはその機能的断片、または体細胞の能力を増加し、それにより多分化能、多能性または全能になるために使用される小分子もしくは抗体を指す。能力決定因子は、場合により、再プログラム化細胞中に一時的にだけ存在し得る、または核酸の場合、再プログラム化細胞のゲノム中に転写的に活性または不活性な状態で維持され得る。同様に、核酸の能力決定因子は、再プログラム化細胞中に複数のコピーが存在でき、能力決定因子が細胞のゲノム中に組み込まれ得る場合、染色体外または両方に存在し得る。例示的能力決定因子は、Ｏｃｔ４（例示的ヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＢＣ１１７４３５．１またはＮＣＢＩ受託番号ＮＭ００２７０１で提示される）、Ｓｏｘ２（例示的ヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、ＮＣＢＩ受託番号ＮＭ＿００３１０６．２で提示される）、Ｋｌｆ４（例示的ヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、ＮＣＢＩ受託番号ＮＭ＿００４２３５．４で提示される）、Ｎａｎｏｇ（例示的ヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、ＮＣＢＩ受託番号ＮＭ＿０２４８６５．２で提示される）、Ｌｉｎ２８（例示的ヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、ＮＣＢＩ受託番号ＮＭ＿０２４６７４．４で提示される）、ｃ−Ｍｙｃ（例示的ヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｌ１６７８５．１）、ｂＦＧＦ、ＳＣＦ、ＴＥＲＴ、ＳＶ４０ラージＴ抗原、ＨＰＶ１６Ｅ６、ＨＰＶ１６Ｅ７、Ｂｍｉｌ、Ｆｂｘ１５、Ｅｒａｓ、ＥＣＡＴ１５−２、Ｔｃｌ１、β−カテニン、ＥＣＡＴ１、ＥＳＧ１、Ｄｎｍｔ３Ｌ、ＥＣＡＴ８、Ｇｄｆ３、Ｓｏｘ１５、ＥＣＡＴ１５−１、Ｆｔｈｌ１７、Ｓａｌ１４、Ｒｅｘ１（例示的配列は、ＮＣＢＩ受託番号ＮＭ１７４９００で提示される）、ＵＴＦ１（例示的配列は、ＮＣＢＩ受託番号ＮＭ００３５７７で提示される）、Ｓｔｅｌｌａ（例示的配列は、ＮＣＢＩ受託番号ＮＭ１９９２８６で提示される）、Ｓｔａｔ３、ＦｏｘＤ３（例示的配列は、ＮＣＢＩ受託番号ＮＭ０１２１８３で提示される）、ＺＮＦ２０６、Ｍｙｂｌ２、ＤＰＰ Ａ２、Ｏｔｘ２およびＧｒｂ２を含む。本明細書に提供されたすべての受託番号は、２００９年２月２０日現在のものである。当業者は、本明細書に記載の他の能力決定因子の構造を、例えばＮＣＢＩまたはＧｅｎＢａｎｋなどのデータベースを使用して容易に決定できるであろう。前記因子と同じまたは同様の活性を有する化合物もまた含まれる。このような化合物は、再プログラミングを強化または誘導できる抗体および小分子、例えば、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤またはＤＮＡメチラーゼまたはその阻害剤を含む。当業者は、適切な化合物を、例えば、１種または複数の能力決定因子が除外された本明細書に記載の方法および評価された被験化合物のパネルを使用して、ならびに／または細胞および／もしくはＭａｒｋｏｕｌａｋｉら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２７、１６９〜１７１ページ（２００９年）に記載の方法を使用して決定できるであろう。
【００５１】
本明細書において使用する場合、「能力」という用語は、複数の細胞型に分化する細胞の能力を意味すると解釈されるべきである。したがって、優れた能力を有する細胞は、能力のより低い細胞より多くの細胞型に分化できる。
【００５２】
本明細書において使用する場合、「予防有効量」という用語は、臨床症状の１種または複数の検出可能な症状を予防する、またはその発症を阻害する、または発症を遅延させるために十分な量の再プログラム化細胞またはそれから分化した細胞および／またはその子孫細胞を意味すると解釈されるべきである。
【００５３】
本明細書において使用する場合、「予防する（ｐｒｅｖｅｎｔ）」または「予防すること（ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ）」または「予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）」という用語は、予防有効量の細胞を投与し、臨床症状の少なくとも１種の症状の発生を停止する、妨げる、または遅延させるまたは減少させることを意味すると解釈されるべきである。
【００５４】
本明細書において使用する場合、「再プログラミング」という用語は、体細胞を脱分化および／または多分化能／多能性／全能細胞に転換させ、したがってそれが由来した細胞より優れた能力の可能性を有する過程を指す。好ましくは、再プログラム化細胞は多分化能、多能性または全能であり、より好ましくは多能性である。「再プログラム化」という用語は、体細胞を多分化能／多能性／全能にさせるために脱分化されている体細胞を指す。
【００５５】
本明細書において使用する場合、「ＳＴＲＯ−１＋多分化能細胞」という語句は、多分化能細胞コロニーを形成できる非造血性ＳＴＲＯ−１＋および／またはＴＮＡＰ＋の前駆細胞を意味すると解釈されるべきである。好ましいＳＴＲＯ−１＋多分化能細胞は、本明細書においてより詳細に考察される。
【００５６】
本明細書において使用する場合、「対象」という用語は、Ｓｔｒｏ−１＋細胞を含む任意の対象、好ましくは哺乳動物を意味すると解釈されるべきである。例示的対象は、限定するものではないが、ヒト、霊長類、家畜（例えば、ヒツジ、ウシ、ウマ、ロバ、ブタ）、コンパニオン・アニマル（例えば、イヌ、ネコ）、実験動物（例えば、マウス、ウサギ、ラット、モルモット、ハムスター）、捕らわれた野生動物（例えば、キツネ、シカ）を含む。好ましくは、哺乳動物はヒトまたは霊長類である。最も好ましい哺乳動物はヒトである。
【００５７】
本明細書において使用する場合、「全能」という用語は、ある細胞が、３種の胚葉のそれぞれの細胞および胚外組織に分化できることを意味すると解釈されるべきである。
【００５８】
本明細書において使用する場合、「治療有効量」という用語は、１種または複数の臨床症状を減少する、または阻害するために十分な量の再プログラム化細胞またはそれから分化した細胞および／またはその子孫細胞を意味すると解釈されるべきである。
【００５９】
本明細書において使用する場合、「治療する（ｔｒｅａｔ）」または「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」または「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」という用語は、治療有効量の細胞を投与し、臨床症状の少なくとも１種の症状を減少させる、または阻害することを意味すると理解されるべきである
【００６０】
ＳＴＲＯ−１＋多分化能細胞または子孫細胞
ＳＴＲＯ−１＋多分化能細胞は、骨髄、血液、歯髄細胞、脂肪組織、皮膚、脾臓、膵臓、脳、腎臓、肝臓、心臓、網膜、脳、毛嚢、腸、肺、リンパ節、胸腺、骨、靭帯、腱、骨格筋、真皮および骨膜において発見された細胞であり、中胚葉および／または内胚葉および／または外胚葉などの生殖細胞系に分化できる。好ましくは、ＳＴＲＯ−１＋細胞は骨髄、歯髄または脂肪組織由来であり、より好ましくは歯髄または脂肪組織由来である。したがって、ＳＴＲＯ−１＋多分化能細胞は、限定するものではないが、脂肪組織、骨組織、軟骨組織、弾性組織、筋肉組織および線維性結合組織を含む多数の細胞型に分化できる。これらの細胞が進入する特定の分化系列決定および分化経路は、機序的な影響ならびに／または内因性生物活性因子、例えば成長因子、サイトカインおよび／もしくは宿主組織によって確立された局所的微小環境条件からのさまざまな影響に依存する。したがって、ＳＴＲＯ−１＋多分化能細胞は、分裂し、時がたてば不可逆的に分化し表現型細胞をもたらすであろう、幹細胞または前駆体細胞のいずれかである娘細胞をもたらす非造血性前駆細胞である。
【００６１】
好ましい実施形態において、ＳＴＲＯ−１＋多分化能細胞は、対象、例えば治療されるべき対象または関連する対象または関連のない対象（同じ種または異なる種のどちらでも）から得られた試料から濃縮される。このような濃縮は、ｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで実施され得る。「濃縮された（ｅｎｒｉｃｈｅｄ）」、「濃縮（ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）」という用語またはそれらの変形は、本明細書において、未処理の集団と比較した場合、１種の特定の細胞型の割合または多数の特定の細胞型の割合が増加した細胞の集団を表すために使用される。
【００６２】
好ましい実施形態において、本発明において使用される細胞は、ＴＮＡＰ＋、ＶＣＡＭ−１＋、ＴＨＹ−１＋、ＳＴＲＯ−２＋、ＣＤ４５＋、ＣＤ１４６＋、３Ｇ５＋またはそれらの任意の組み合わせからなる群から個別にまたは集約的に選択される、１種または複数のマーカーを発現する。
【００６３】
好ましくは、ＳＴＲＯ−１＋細胞は、ＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔ（同義語ＳＴＲＯ−１ｂｒｉ）である。好ましくは、ＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔ細胞は、さらにＴＮＡＰ＋、ＶＣＡＭ−１＋、ＴＨＹ−１＋、ＳＴＲＯ−２＋および／またはＣＤ１４６＋の１つまたは複数である。
【００６４】
一実施形態において、間葉前駆体細胞は、ＷＯ２００４／８５６３０に定義されるように血管周囲の間葉前駆体細胞である。
【００６５】
所与のマーカーに対して「陽性」であると称される細胞は、この用語が細胞の選別過程において使用される蛍光または他のマーカーの強度に関連する場合、マーカーが細胞表面に存在する程度に依存して、低レベル（ｌｏもしくはｄｉｍ）または高レベル（ｂｒｉｇｈｔ、ｂｒｉ）のいずれかでそのマーカーを発現できる。ｌｏ（もしくはｄｉｍもしくはｄｕｌｌ）とｂｒｉとの区別は、選別された特定の細胞集団に関して使用されるマーカーとの関連で理解されるであろう。所与のマーカーに対して「陰性」であると称される細胞は、その細胞が必ずしも完全に不在ではない。この用語は、その細胞によって発現されるマーカーが比較的非常に低いレベルであることを意味し、検出可能に標識された場合、非常に低いシグナルを発生するまたはバックグラウンドのレベルを上回って検出できないことを意味する。
【００６６】
本明細書において使用する場合、「ｂｒｉｇｈｔ」という用語は、検出可能に標識された場合、比較的高いシグナルを発生する細胞表面のマーカーを指す。理論に縛られることを好むわけではないが、「ｂｒｉｇｈｔ」細胞が、試料中の他の細胞より多くの標的マーカータンパク質（例えば、ＳＴＲＯ−１により認識される抗原）を発現することが提唱される。例えば、ＳＴＲＯ−１ｂｒｉ細胞は、ＦＩＴＣ標識ＳＴＲＯ−１抗体を用いて標識された場合、蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）分析による決定で非ｂｒｉｇｈｔ細胞（ＳＴＲＯ−１ｄｕｌｌ／ｄｉｍ）より多くの蛍光シグナルを発生する。好ましくは、「ｂｒｉｇｈｔ」細胞は出発試料中に含有される最も明るく標識された骨髄単核細胞の少なくとも約０．１％を構成する。他の実施形態において、「ｂｒｉｇｈｔ」細胞は出発試料中に含有される最も明るく標識された骨髄単核細胞の少なくとも約０．１％、少なくとも約０．５％、少なくとも約１％、少なくとも約１．５％または少なくとも約２％を構成する。好ましい実施形態において、ＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔ細胞は、「バックグラウンド」、すなわちＳＴＲＯ−１−である細胞と比較してＳＴＲＯ−１の表面発現の２ｌｏｇ量の発現増加を有する。比較すると、ＳＴＲＯ−１ｄｉｍおよび／またはＳＴＲＯ−１ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ細胞は、２ｌｏｇ量未満の発現増加、通常約１ｌｏｇまたは「バックグラウンド」より低いＳＴＲＯ−１の表面発現を有する。
【００６７】
本明細書において使用する場合、「ＴＮＡＰ」という用語は、組織非特異的アルカリホスファターゼのすべてのアイソフォームを包含することを意図する。例えばこの用語は、肝臓アイソフォーム（ＬＡＰ）、骨アイソフォーム（ＢＡＰ）および腎臓アイソフォーム（ＫＡＰ）を包含する。好ましい実施形態において、ＴＮＡＰはＢＡＰである。特に好ましい実施形態において、本明細書において使用する場合、ＴＮＡＰは、ブダペスト条約の規定の下に、２００５年１２月１９日に受託番号ＰＴＡ−７２８２でＡＴＣＣに寄託された、ハイブリドーマ細胞系によって作製されたＳＴＲＯ−３抗体に結合できる分子を指す。
【００６８】
さらに、好ましい実施形態において、ＳＴＲＯ−１＋多分化能細胞は、コロニー形成ＣＦＵ−Ｆを生じさせることができる。
【００６９】
かなりの割合の多分化能細胞が、少なくとも２種の異なる生殖細胞系に分化できることが好ましい。多分化能細胞が決定（committed）され得る系列の限定されない例は、骨前駆体細胞；胆管上皮細胞および肝細胞に関して多分化能である肝細胞前駆細胞；乏突起膠細胞および星状細胞に進行するグリア細胞前駆体を発生できる神経制限細胞；ニューロンに進行するニューロン前駆体；心筋および心筋細胞、グルコース反応性、インスリン分泌膵臓β細胞系に関する前駆体を含む。他の系列は、限定するものではないが、象牙芽細胞、象牙質産生細胞および軟骨細胞ならびに以下：細胞網膜色素上皮細胞、線維芽細胞、ケラチノサイトなどの皮膚細胞、樹状細胞、毛嚢細胞、尿細管上皮細胞、平滑筋細胞および骨格筋細胞、精巣前駆細胞、血管内皮細胞、腱、靭帯、軟骨、含脂肪細胞、線維芽細胞、骨髄基質、心筋、平滑筋、骨格筋、周皮細胞、血管、上皮、グリア、ニューロン、星状細胞および乏突起膠細胞の各細胞の前駆体細胞を含む。
【００７０】
別の実施形態において、ＳＴＲＯ−１＋多分化能細胞は、培養において造血性細胞を発生できない。
【００７１】
一実施形態において、細胞は治療される対象から採取される、または例えば、任意の実施形態に従って本明細書に記載の方法に使用する前に、標準的技術を使用してｉｎ ｖｉｔｒｏで培養される。このような細胞またはそれらから分化した細胞は、自己または同種の組成物において対象に投与するために有用である。別の実施形態において、確立されたヒト細胞系の１種または複数の細胞が使用される。本発明の別の有用な実施形態において、非ヒト動物（または対象がヒトではない場合、別の種由来）の細胞が使用される。
【００７２】
子孫細胞は、任意の適切な培地において培養することによって得ることができる。細胞培養に関して使用される場合、「培地」という用語は、細胞周囲の環境構成要素を含む。培地は、固体、液体、気体または相と材料の混合物であってよい。培地は、液体成長培地および細胞成長を維持しない液体培地を含む。培地は、ゼラチン培地、例えば寒天、アガロース、ゼラチンおよびコラーゲン基質をさらに含む。例示的ガス状培地は、ペトリ皿または他の固体もしくは半固体支持体上で成長する細胞が曝露されるガス相を含む。「培地」という用語は、たとえ細胞に接触していなくても、細胞培養において使用するための材料を指す。言い換えれば、細胞培養のために調製された栄養豊富な液体は培地である。水または他の液体と混合した場合細胞培養に適切になる粉末混合物は、「粉末培地」と呼ぶことができる。
【００７３】
ある実施形態において、本発明の方法に有用な子孫細胞は、ＳＴＲＯ−３抗体を用いて標識された磁気ビーズを使用して骨髄からＴＮＡＰ＋ＳＴＲＯ−１＋多分化能細胞を単離し、次いで培養して単離細胞を増殖させる（expand）ことによって得られる（適切な培養条件の例に関してはＧｒｏｎｔｈｏｓら、Ｂｌｏｏｄ ８５：９２９〜９４０ページ、１９９５年を参照されたい）。
【００７４】
一実施形態において、このように増殖させた細胞（子孫）（好ましくは、少なくとも５継代後）は、ＴＮＡＰ−、ＣＣ９−、ＨＬＡクラスＩ＋、ＨＬＡクラスＩＩ−、ＣＤ１４−、ＣＤ１９−、ＣＤ３−、ＣＤ１１ａ−ｃ−、ＣＤ３１−、ＣＤ８６−、ＣＤ３４−および／またはＣＤ８０−であり得る。しかし、本明細書に記載の培養条件と異なる培養条件下では、さまざまなマーカーの発現は変動し得る可能性がある。さらに、これらの表現型の細胞は増殖させた細胞集団において優勢であり得るが、この表現型（複数可）を有さない細胞の少数の集団が存在することを意味するものではない（例えば、増殖させた細胞は、少ない割合でＣＣ９−であり得る。）。好ましい一実施形態において、増殖させた細胞は、さまざまな細胞型に分化する能力を未だに有している。
【００７５】
さらなる実施形態において、増殖させた細胞は、ＬＦＡ−３、ＴＨＹ−１、ＶＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１、ＰＥＣＡＭ−１、Ｐ−セレクチン、Ｌ−セレクチン、３Ｇ５、ＣＤ４９ａ／ＣＤ４９ｂ／ＣＤ２９、ＣＤ４９ｃ／ＣＤ２９、ＣＤ４９ｄ／ＣＤ２９、ＣＤ９０、ＣＤ２９、ＣＤ１８、ＣＤ６１、インテグリンβ ６−１９、トロンボモジュリン、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＳＣＦ、ＰＤＧＦ−Ｒ、ＥＧＦ−Ｒ、ＩＧＦ１−Ｒ、ＮＧＦ−Ｒ、ＦＧＦ−Ｒ、レプチン−Ｒ（ＳＴＲＯ−２＝レプチン−Ｒ）、ＲＡＮＫＬ、ＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔおよびＣＤ１４６またはこれらのマーカーの任意の組み合わせからなる群から選択される、１種または複数のマーカーを集約的に、または個別に発現し得る。
【００７６】
一実施形態において、子孫細胞は、ＷＯ２００６／０３２０９２において定義され、および／または記載された、多分化能性増殖ＳＴＲＯ−１＋多分化能細胞子孫（Ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔｉａｌ Ｅｘｐａｎｄｅｄ ＳＴＲＯ−１＋ Ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｃｅｌｌｓ Ｐｒｏｇｅｎｙ）（ＭＥＭＰ）である。子孫が由来し得るＳＴＲＯ−１＋多分化能細胞が濃縮された集団を調製する方法は、ＷＯ０１／０４２６８およびＷＯ２００４／０８５６３０に記載される。ｉｎ ｖｉｔｒｏの関連において、ＳＴＲＯ−１＋多分化能細胞は、完全に純粋な調製品として存在することは稀であり、一般的には組織特異的分化系列決定細胞（ｔｉｓｓｕｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｏｍｍｉｔｔｅｄ ｃｅｌｌｓ）（ＴＳＣＣ）である他の細胞と一緒に存在すると思われる。ＷＯ０１／０４２６８は、約０．１％から９０％の純度レベルで骨髄からこのような細胞を収穫するステップについて言及している。子孫が由来する多分化能（mutilpotential）細胞を含む集団は、組織供給源から直接収穫でき、またはｅｘ ｖｉｖｏですでに増殖させた集団であってもよい。
【００７７】
例えば、子孫は、それが存在する集団の合計細胞の少なくとも約０．１、１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０または９５％を含む、収穫され、増殖しない実質的に精製されたＳＴＲＯ−１＋多分化能細胞の集団から得ることができる。このレベルは、例えば、ＴＮＡＰ、ＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔ、３Ｇ５＋、ＶＣＡＭ−１、ＴＨＹ−１、ＣＤ１４６およびＳＴＲＯ−２からなる群から個別にまたは集約的に選択される、少なくとも１種のマーカーに陽性である細胞を選択することによって達成され得る。
【００７８】
ＭＥＭＰは、マーカーのＳＴＲＯ−１ｂｒｉに対して陽性であり、マーカーのアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）に対して陰性であるという点から、新鮮に収穫されたＳＴＲＯ−１＋多分化能細胞とは識別され得る。対照的に、新鮮に単離されたＳＴＲＯ−１＋多分化能細胞は、ＳＴＲＯ−１ｂｒｉおよびＡＬＰの両方に対して陽性である。本発明の好ましい実施形態において、投与された細胞の少なくとも１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％はＳＴＲＯ−１ｂｒｉ、ＡＬＰ−の表現型を有する。さらなる好ましい実施形態において、ＭＥＭＰは、マーカーのＫｉ６７、ＣＤ４４および／またはＣＤ４９ｃ／ＣＤ２９、ＶＬＡ−３、α３β１の１種または複数に対して陽性である。その上さらなる好ましい実施形態において、ＭＥＭＰはＴＥＲＴ活性を示さない、および／またはマーカーのＣＤ１８に対して陰性である。
【００７９】
ＳＴＲＯ−１＋多分化能細胞出発集団は、ＷＯ０１／０４２６８またはＷＯ２００４／０８５６３０において示される任意の１種もしくは複数の組織型、すなわち骨髄、歯髄細胞、脂肪組織および皮膚に由来し、または、おそらくより広範囲には、脂肪組織、歯、歯髄、皮膚、肝臓、腎臓、心臓、網膜、脳、毛嚢、腸、肺、脾臓、リンパ節、胸腺、膵臓、骨、靭帯、骨髄、腱および骨格筋に由来し得る。
【００８０】
本発明の実施において、任意の所与の細胞表面マーカーを担持する細胞の分離は、多数のさまざまな方法によってもたらされ得るが、好ましい方法は、結合剤（例えば、抗体またはその抗原結合断片）と関与するマーカーとの結合、その後の、高レベルの結合または低レベルの結合または結合を示さないかのいずれかである、結合を示す細胞の分離に頼ると理解されると思われる。最も都合の良い結合剤は、抗体または抗体に基づく分子であり、好ましくは、これらの後者の薬剤の特異性のためモノクローナル抗体であり、またはモノクローナル抗体に基づく。抗体は、両方のステップに使用できるが、他の薬剤もまた使用でき、したがって、これらのマーカーに対するリガンドもまた、これらのマーカーを担持する細胞またはそれを欠いた細胞の濃縮に用いることができる。
【００８１】
抗体またはリガンドは固体支持体と結合し、粗分離を可能にする。分離技術は、好ましくは回収される分画の生存能力の保有を最大にする。異なる効率のさまざまな技術を用い、比較的粗い分離を得ることができる。用いる特定の技術は、分離の効率、関連する細胞毒性、実施の簡便さおよび速さならびに高性能の機器および／または技術的熟練の必要性に依存すると思われる。分離の手順は、限定するものではないが、抗体コーティング磁気ビーズを使用する磁気分離、アフィニティクロマトグラフィーおよび固体マトリックスに結合した抗体を用いた「パニング」を含み得る。正確な分離を提供する技術は、限定するものではないが、ＦＡＣＳを含む。ＦＡＣＳを実施する方法は、当業者には明らかであると思われる。
【００８２】
本明細書に記載の個々のマーカーに対する抗体は、市販されており（例えば、ＳＴＲＯ−１に対するモノクローナル抗体は、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＵＳＡから市販されている）、ＡＴＣＣまたは他の寄託組織から利用でき、および／または当分野において認識されている技術を使用して作製できる。
【００８３】
ＳＴＲＯ−１＋多分化能細胞を単離する方法は、例えば、ＳＴＲＯ−１の高レベルの発現を認識する磁気活性化細胞分取法（ＭＡＣＳ）を利用する固体相選別ステップである第１のステップを含むことが好ましい。所望であれば、次いで、特許明細書ＷＯ０１／１４２６８に記載の高レベルの前駆体細胞発現をもたらす第２の選別ステップを続けることができる。この第２の選別ステップは、複数のマーカーの使用を含み得る。
【００８４】
ＳＴＲＯ−１＋多分化能細胞を得る方法は、公知の技術を使用する第１の濃縮ステップの前に、細胞供給源の収穫をさらに含み得る。したがって、組織は外科的に摘出される。次いで、供給源組織を含む細胞は、いわゆる単一細胞懸濁液に分離されるであろう。この分離は、物理的および／または酵素的方法によって達成され得る。
【００８５】
ひとたび適切なＳＴＲＯ−１＋多分化能細胞集団が得られたら、ＳＴＲＯ−１＋多分化能細胞集団は、ＭＥＭＰを得るための任意の適切な手段によって培養または増殖させ得る。
【００８６】
本発明は、限定するものではないが、非ヒト霊長類細胞、有蹄動物、イヌ、ネコ、ウサギ、げっ歯類、鳥類および魚類の細胞を含む任意の非ヒト動物種由来の細胞を使用して実行できる。本発明を実施できる霊長類細胞は、限定するものではないが、チンパンジー、ヒヒ、カニクイザルならびに他の任意の新世界ザルおよび旧世界ザル（New or Old World monkeys）の細胞を含む。本発明を実施できる有蹄動物細胞は、限定するものではないが、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、バッファローおよびバイソンの細胞を含む。本発明を実施できるげっ歯類細胞は、限定するものではないが、マウス、ラット、モルモット、ハムスターおよびスナネズミの細胞を含む。本発明を実施できるウサギ種の例は、家畜化されたウサギ、ジャックラビット、野ウサギ、ワタオウサギ、カンジキウサギおよびナキウサギを含む。ニワトリ（Gallus gallus）は、本発明を実施できる鳥類の例である。
【００８７】
本発明の方法に有用な細胞は、使用前、または上清もしくは可溶性因子を得る前に保管できる。真核細胞および特に哺乳動物細胞の保管および保存の方法およびプロトコルは当分野において公知である（例えば、Ｐｏｌｌａｒｄ，Ｊ．Ｗ．およびＷａｌｋｅｒ，Ｊ．Ｍ．（１９９７年）Ｂａｓｉｃ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、第２版、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、Ｎ．Ｊ．；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．（２０００年）Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ、第４版、Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ、Ｈｏｂｏｋｅｎ、Ｎ．Ｊ．を参照されたい）。単離された幹細胞、例えば間葉幹細胞／前駆細胞またはその子孫の生物活性を維持する任意の方法は、本発明に関連して利用され得る。好ましい一実施形態において、細胞は、凍結保存を使用して維持および保管される。
【００８８】
能力決定因子を発現するように遺伝子改変された細胞
一実施形態において、ＳＴＲＯ−１＋多分化能細胞および／またはその子孫細胞は、例えば、能力決定因子またはその複数を発現するように遺伝子改変される。
【００８９】
細胞を遺伝子改変する方法は、当業者には明らかであると思われる。例えば、細胞において発現される核酸は、細胞、好ましくは多能性（plurlipotent）細胞における発現を誘導するためのプロモーターに作動可能に連結される。例えば、核酸は、対象のさまざまな細胞において作動可能であるプロモーター、例えば、ウイルスプロモーター、例えばＣＭＶプロモーター（例えばＣＭＶ−ＩＥプロモーター）またはＳＶ−４０プロモーターまたは延長因子プロモーターまたは誘導プロモーター、例えばｔｅｔ誘導プロモーターに作動可能に連結される。さらなる適切なプロモーターは当分野において公知であり、本発明の本実施形態に、必要な変更を加えて適用すると解釈されるべきである。本発明は、単一のプロモーター、例えばＯｃｔ４およびＳｏｘ２から複数の能力決定因子の発現を可能にする、マルチシストロン性ベクターの使用をさらに包含する。このようなベクターは、一般的に、さまざまな能力決定因子を個々にコードする２つの核酸を分離する配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を含む。
【００９０】
本明細書において使用する場合、「プロモーター」という用語は最も広い文脈で解釈されるべきであり、転写の開始に必要とされるＴＡＴＡボックスまたはイニシエーターエレメントを含むゲノム遺伝子の転写制御配列を、例えば、発生刺激および／または外部刺激に対する応答において、または組織特異的様式で遺伝子発現を改変するさらなる制御エレメント（すなわち、上流活性化配列、転写因子結合部位、エンハンサーおよびサイレンサー）と一緒に含む、またはそれを伴わずに含む。本文脈において、「プロモーター」という用語は、組み換え、合成もしくは融合分子または作動可能に連結された核酸の発現をもたらす、活性化する、または強化する、かつ好ましくはペプチドまたはタンパク質をコードする誘導体を表すためにもまた使用される。好ましいプロモーターは、１種または複数の特異的制御エレメントのさらなるコピーを含有し、前記核酸分子の発現をさらに強化する、ならびに／または空間的発現および／もしくは時間的発現を改変することができる。
【００９１】
本文脈において、核酸の発現がプロモーターによって調節されるように位置付けられる場合、核酸は、プロモーターと一緒に、またはプロモーターに「作動可能に連結される」（すなわち、プロモーターの制御管理下にある）。プロモーターは、一般的に核酸の発現５’（上流）に位置付けられ、プロモーターが核酸の発現を調節する。異種プロモーター／核酸の組み合わせを構築するために、プロモーターは、そのプロモーターと遺伝子との間の距離とおよそ同じ距離で遺伝子転写開始部位から離れて位置付けられ、プロモーターがその自然の設定、すなわちプロモーターが由来する遺伝子において調節することが、一般的に好ましい。当分野において公知であるように、この距離のいくつかの変更はプロモーター機能を失うことなく調整され得る。同様に、その調節下で配置される異種核酸に対する制御配列エレメントの好ましい位置付けは、その自然の設定、すなわちそれが由来する遺伝子において要素を位置付けることによって画定される。この場合も先と同様に、当分野において公知であるように、この距離のいくつかの変更がまた起こり得る。
【００９２】
好ましくは、核酸は発現構築体の形態で提供される。本明細書において使用する場合、「発現構築体」という用語は、細胞において作動可能に連結される核酸に発現をもたらす能力を有する核酸を指す。本発明の文脈において、発現構築体は、プラスミド、バクテリオファージ、ファージミド、コスミド、ウイルスのサブゲノムもしくはゲノム断片または異種ＤＮＡに発現をもたらすことのできる他の核酸であってもよく、それを含んでいてもよいことが理解されよう。発現構築体は、細胞のゲノム中に組み込まれても、エピソームとして残存してもよい。
【００９３】
好ましい発現構築体は、エピソーム性、例えば、プラスミドおよびファージミドのままであり得る。このような発現構築体は、例えば発現構築体がゲノムに組み込まれていない再プログラム化細胞の作製に有用である。さらに、これらの発現構築体は多くの場合細胞分裂の間に失われるので、組み換え発現構築体を含まない再プログラム化細胞の作製を可能にする（例えば、Ｏｋｉｔａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３２２：９４９〜５３ページ、２００８年を参照されたい）。
【００９４】
本発明の実施のための適切な発現構築体の構築の方法は、当業者には明らかであると思われ、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、ＩＳＢＮ ０４７ １５０３３８、１９８７年）またはＳａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、第３版、２００１年）に記載されている。例えば、発現構築体の個々の要素は、適切な鋳型核酸から、例えばＰＣＲを使用して増幅され、その後、適切な発現構築体、例えばプラスミドまたはファージミドなどの内部にクローン化される。
【００９５】
このような発現構築体に適切なベクターは、当分野において公知であり、および／または本明細書に記載される。例えば、哺乳動物細胞中の本発明の方法に適切な発現ベクターは、例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎにより供給されるｐｃＤＮＡベクタースイート（vector suite）のベクター、ｐＣＩベクタースイート（Ｐｒｏｍｅｇａ）のベクター、ｐＣＭＶベクタースイート（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のベクター、ｐＭベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、ｐＳＩベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ＶＰ１６ベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）またはｐｃＤＮＡベクタースイート（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のベクターである。
【００９６】
当業者は、さらなるベクターおよびこのようなベクターの供給源、例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ＣｌｏｎｔｅｃｈまたはＰｒｏｍｅｇａを承知しているであろう。
【００９７】
単離核酸分子またはそれを含む遺伝子構築体を細胞に導入する方法は当業者には公知である。所与の生物に使用される技術は、公知の成功する技術に依存する。組み換えＤＮＡを細胞に導入する方法は、リン酸カルシウム沈殿（ＧｒａｈａｍおよびＶａｎ Ｄｅｒ Ｅｂ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、５２：４５６〜４６７ページ、１９７３年；ＣｈｅｎおよびＯｋａｙａｍａ、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、７：２７４５〜２７５２ページ、１９８７年；Ｒｉｐｐｅら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、１０：６８９〜６９５ページ、１９９０年）、ＤＥＡＥ−デキストラン（Ｇｏｐａｌ、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、５：１１８８〜１１９０ページ、１９８５年）、エレクトロポレーション（Ｔｕｒ−Ｋａｓｐａら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、６：７１６〜７１８ページ、１９８６年；Ｐｏｔｔｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８１：７１６１〜７１６５ページ、１９８４年）、直接微量注入、ＤＮＡ負荷リポソーム（ＮｉｃｏｌａｕおよびＳｅｎｅ、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、７２１：１８５〜１９０ページ、１９８２年；Ｆｒａｌｅｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７６：３３４８〜３３５２ページ、１９７９年）、細胞の超音波処理（Ｆｅｃｈｈｅｉｍｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８４：８４６３〜８４６７ページ、１９８７年）、高速微粒子銃を使用する遺伝子ボンバードメント（Ｙａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ、８７：９５６８〜９５７２ページ、１９９０年）、レセプター媒介トランスフェクション（ＷｕおよびＷｕ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６２：４４２９〜４４３２ページ、１９８７７年；ＷｕおよびＷｕ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２７：８８７〜８９２ページ、１９８８年）を含む。他の実施形態において、核酸の細胞への移入は、ナノキャップ（nanocaps）（例えばナノ粒子ＣａＰ０４）、コロイド金、ナノ粒子合成ポリマーおよび／またはリポソームと一緒に製剤化することによって達成され得る。
【００９８】
好ましい一実施形態において、エピソーム性のままである発現構築体、または発現構築体が細胞のゲノムに組み込まれていない限り、例えば上記、またはＯｋｉｔａら、２００８年、上記に記載の方法を使用してトランスフェクトされる。好ましくは、プラスミドは、前期細胞が再プログラムされるまで、前期細胞に繰り返しトランスフェクトされる。この様式において、細胞のゲノムに組み込まれた異種ＤＮＡを有さない細胞が作製され、治療的観点からこのことはより魅力的である。
【００９９】
または、本発明の発現構築体はウイルスベクターである。適切なウイルスベクターは当分野において公知であり、市販されている。核酸の送達およびその核酸を宿主細胞のゲノムに組み込まれるための従来のウイルスに基づく系は、例えば、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクターまたはアデノ随伴ウイルスベクターを含む。または、アデノウイルスベクターはエピソーム性のままである核酸を宿主細胞に導入し、例えば、そのゲノムに組み込まれた異種ＤＮＡを含まない再プログラム化細胞を作製するために有用である。ウイルスベクターは、標的細胞および組織における有効かつ用途の広い遺伝子移入方法である。さらに、高効率の形質導入が、多数のさまざまな細胞型および標的組織において観察されている。例示的ウイルスベクターを以下に述べる。
【０１００】
ａ）アデノウイルスベクター
一例において、本発明に有用なウイルス遺伝子送達系は、アデノウイルス由来のベクターを利用する。３６ｋＢの線状および二本鎖ＤＮＡウイルスであるアデノウイルスの遺伝子構成の知見は、８ｋＢまでの外来配列を有する大きなアデノウイルスＤＮＡ片の置換を可能にする。アデノウイルスＤＮＡは、遺伝毒性の可能性なしにエピソーム性様式で複製できるので、アデノウイルスＤＮＡの宿主細胞への感染は染色体への組み込みをもたらさない。さらに、アデノウイルスは構造的に安定であり、ゲノムの再構成が、広大な増幅後に検出されている。アデノウイルスは、その細胞周期の段階にかかわらず、事実上すべての上皮細胞に感染できる。組み換えアデノウイルスは、分裂細胞および非分裂細胞の両方を形質導入できる。非分裂細胞を有効に形質導入する能力は、アデノウイルスを、遺伝子を筋肉細胞または脂肪細胞に移入するための優れた候補にさせる。
【０１０１】
アデノウイルスは、その中型のゲノム、操作の容易さ、高力価、標的細胞の範囲の広さおよび高い感染性のため、遺伝子移入ベクターとして特に適切である。ウイルスゲノムの両方の末端は、１００〜２００塩基対（ｂｐ）の逆位末端反復（ＩＴＲ）を含有し、これらはウイルスＤＮＡの複製およびパッケージングに必要なシスエレメントである。
【０１０２】
ゲノムの初期（Ｅ）領域および後期（Ｌ）領域は、ウイルスＤＮＡの複製の開始によって分裂するさまざまな転写ユニットを含有する。Ｅ１領域（Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂ）は、ウイルスゲノムおよび少数の細胞遺伝子の転写制御に関与するタンパク質をコードする。Ｅ２領域（Ｅ２ＡおよびＥ２Ｂ）の発現は、ウイルスＤＮＡ複製のためのタンパク質の合成をもたらす。これらのタンパク質は、ＤＮＡの複製、後期遺伝子発現および宿主細胞の遮断に関与する（Ｒｅｎａｎ（１９９０年）Ｒａｄｉｏｔｈｅｒａｐ．Ｏｎｃｏｌ．１９：１９７）。ウイルスカプシドタンパク質の大部分を含む後期遺伝子の生成物は、主要な後期プロモーター（ＭＬＰ）によって生じる単一の一次転写産物の重要なプロセシングの後にのみ発現される。ＭＬＰ（１６．８μに位置する）は、感染後期において特に有効であり、このプロモーターから生じたすべてのｍＲＮＡは、それを翻訳のための例示的ｍＲＮＡにさせる５’トリパータイトリーダー（ＴＬ）配列を保有する。
【０１０３】
アデノウイルスゲノムは、対象となる遺伝子産物をコードするように操作することができるが、正常なウイルスの溶菌ライフサイクルにおいて複製するその能力に関しては不活性化される（例えば、Ｂｅｒｋｎｅｒら、（１９８８年）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：６１６ページ；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、（１９９１年）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：４３１〜４３４ページおよびＲｏｓｅｎｆｅｌｄら、（１９９２年）Ｃｅｌｌ ６８：１４３〜１５５ページを参照されたい）。アデノウイルスＡｄ株５ ｄｌ３２４型またはアデノウイルスの他の株（例えば、Ａｄ２、Ａｄ３、Ａｄ７など）に由来する適切なアデノウイルスベクター−は、当業者には公知である。
【０１０４】
組み換えアデノウイルスは、組み換えアデノウイルスが非分裂細胞を感染させることができ、気道上皮（上に引用されたＲｏｓｅｎｆｅｌｄら、（１９９２年））、内皮細胞（Ｌｅｍａｒｃｈａｎｄら、（１９９２年）ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８９：６４８２〜６４８６ページ）、肝細胞（ＨｅｒｚおよびＧｅｒａｒｄ、（１９９３年）ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９０：２８１２〜２８１６ページ）および筋肉細胞（Ｑｕａｎｔｉｎら、（１９９２年）ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８９：２５８１〜２５８４ページ；Ｒａｇｏｔら、（１９９３年）Ｎａｔｕｒｅ ３６１：６４７ページ）を含む広範囲の細胞型を感染させるために使用され得る、特定の状況において有利であり得る。
【０１０５】
さらに、ウイルス粒子は比較的安定であり、精製および濃縮しやすく、感染性の範囲に影響を及ぼすように改変され得る。
【０１０６】
さらに、他の遺伝子送達ベクターと比較して、外来ＤＮＡに対するアデノウイルスゲノムの担持能力は大きい（最大８キロベースまで）（Ｂｅｒｋｎｅｒら、上記；Ｈａｊ−ＡｈｍａｎｄおよびＧｒａｈａｍ（１９８６年）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５７：２６７ページ）。現在使用され、したがって本発明によって支持される、大部分の複製欠損アデノウイルスベクターは、ウイルスのＥ１およびＥ３遺伝子の全部または一部が削除されているが、アデノウイルスの遺伝物質の８０％程度を保有している（例えば、Ｊｏｎｅｓら、（１９７９年）Ｃｅｌｌ１６：６８３ページ；Ｂｅｒｋｎｅｒら、上記およびＧｒａｈａｍら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｅ．Ｊ．Ｍｕｒｒａｙ編（Ｈｕｍａｎａ、Ｃｌｉｆｔｏｎ、ＮＪ、１９９１年）７巻、１０９〜１２７ページを参照されたい）。本発明の挿入ポリヌクレオチドの発現は、例えば、Ｅ１Ａプロモーター、主要後期プロモーター（ＭＬＰ）および関連リーダー配列、ウイルスのＥ３プロモーターまたは外から加えられたプロモーター配列の調節下であり得る。
【０１０７】
ある実施形態において、アデノウイルスベクターは複製欠損であっても、または条件付き欠損であってもよい。アデノウイルスは、４２種の公知の異なる血清型またはサブグループＡ〜Ｆのいずれであってもよい。サブグループＣのアデノウイルス５型は、本明細書に記載の方法および組成物に従った使用のための、条件付き複製欠損アデノウイルスベクターを得るための例示的出発物質である。アデノウイルス５型は、大量の生化学的情報および遺伝的情報が公知であるヒトアデノウイルスであり、アデノウイルスをベクターとして用いる大部分の構築に歴史的に使用されてきたからである。上記のように、本発明に従った典型的なベクターは複製欠損であり、アデノウイルスＥ１領域を有さないであろう。したがって、対象となる核酸を、Ｅ１をコードする配列が除去された場所に導入するために最も都合がよいと思われる。しかし、アデノウイルス配列内の領域中のポリヌクレオチドの挿入位置は、本発明にとって重要ではない。例えば、Ｋａｒｌｓｓｏｎら、（１９８６年）によって以前に記載されたように、Ｅ３置換ベクター中の欠失Ｅ３領域の代わりに、またはＥ４を欠失したヘルパー細胞系またはヘルパーウイルス補体のＥ４領域にも挿入され得る。
【０１０８】
例示的ヘルパー細胞系は２９３（ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ１５７３）である。「パッケージング細胞系」とも称されるこのヘルパー細胞系は、Ｆｒａｎｋ Ｇｒａｈａｍ（Ｇｒａｈａｍら、（１９８７年）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．３６：５９〜７２ページおよびＧｒａｈａｍ（１９７７年）Ｊ．Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６８：９３７〜９４０）によって開発され、Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂをトランスで供給する。しかし、ヘルパー細胞系は、ヒト細胞、例えばヒト胎児の腎臓細胞、筋肉細胞、造血細胞または他のヒト胎児の間葉細胞もしくは上皮細胞にもまた由来し得る。または、ヘルパー細胞は、ヒトアデノウイルスに対して許容である他の哺乳動物種の細胞にも由来し得る。このような細胞は、例えば、ベロ細胞または他のサル胎児の間葉細胞もしくは上皮細胞を含む。
【０１０９】
アデノウイルスはさらに細胞型特異的である、すなわち、限定された細胞型だけに感染する、および／または限定された細胞型においてのみ所望のヌクレオチド配列を発現することができる。例えば、ウイルスは、例えば米国特許第５，６９８，４４３号に記載のように、標的宿主細胞によって特異的に制御される転写開始領域の転写調節下で遺伝子を含み得る。したがって、複製可能なアデノウイルスからの発現は、複製に必要なタンパク質の合成を制御する細胞特異的応答エレメント、例えば、Ｅ１ＡまたはＥ１Ｂを挿入することによって、特定の細胞に制限され得る。
【０１１０】
核酸の組み込み、核酸を含有する組み換えウイルスの増殖および精製ならびに細胞および哺乳動物のトランスフェクトへのその使用のための方法および材料を含む、本発明の実施に有用であると思われるアデノウイルス技術に関するさらなる詳細なガイダンスに関しては、Ｗｉｌｓｏｎら、ＷＯ９４／２８９３８、ＷＯ９６／１３５９７およびＷＯ９６／２６２８ならびにそれらの引用された参考文献を参照されたい。
【０１１１】
ｂ）レトロウイルス
ある実施形態において、レトロウイルスベクターは、本明細書に記載の方法および組成物に従って使用され得る。このようなウイルスは、再プログラム化細胞の作製にすでに使用されているがＳｔｒｏ−１＋細胞においては使用されていない。レトロウイルスは、逆転写の過程によって感染細胞においてそれらのＲＮＡを二本鎖ＤＮＡに転換する能力を特徴とする一本鎖ＲＮＡウイルスの群である（Ｃｏｆｆｉｎ（１９９０年）「Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉａｅ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ」Ｉｎ Ｆｉｅｌｄｓ、Ｋｎｉｐｅ編Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ）。次いで、得られたＤＮＡはプロウイルスとして細胞染色体に安定に組み込まれ、ウイルスタンパク質を調節合成する。組み込まれると、レシピエント細胞およびその子孫においてウイルス遺伝子配列が保有される。レトロウイルスゲノムは、それぞれカプシドタンパク質ポリメラーゼ酵素およびエンベロープ成分をコードする３種の遺伝子、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖを含有する。ｇａｇ遺伝子の上流で発見された配列はｐｓｉと呼ばれ、ビリオンにゲノムをパッケージングするためのシグナルとして機能する。２つの長い末端反復（ＬＴＲ）配列は、ウイルスゲノムの５’末端および３’末端に存在する。これらは、強いプロモーター配列およびエンハンサー配列を含有し、宿主細胞ゲノムへの組み込みにもまた必要とされる（Ｃｏｆｆｉｎ（１９９０年）、上記）。
【０１１２】
レトロウイルスベクターを構築するために、複製欠損であるウイルスを作製するための特定のウイルス配列に代わって、対象となる核酸がウイルスゲノムに挿入される。ビリオンを作製するために、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子を含有するが、ＬＴＲおよびｐｓｉ成分を含有しないパッケージング細胞系が構築される（Ｍａｎｎら、（１９８３年）Ｃｅｌｌ ３３：１５３ページ）。本発明の核酸を含有する組み換えプラスミドと、レトロウイルスのＬＴＲおよびｐｓｉ配列とを一緒に、（例えばリン酸カルシウム沈殿によって）この細胞系に導入する場合、ｐｓｉ配列は組み換えプラスミドのＲＮＡ転写産物をウイルス粒子にパッケージング可能にし、その後培養培地に分泌する（ＮｉｃｏｌａｓおよびＲｕｂｅｎｓｔｅｉｎ（１９８８年）「Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ」、ＲｏｄｒｉｇｕｅｚおよびＤｅｎｈａｒｄｔ編 Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ Ｓｕｒｖｅｙ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ Ｕｓｅｓ．Ｓｔｏｎｅｈａｍ、ＢｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈおよびＴｅｍｉｎ（１９８６年）「Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ：Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｉｎｔｏ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ ＤＮＡ ｉｎ Ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｏｍｅ」、Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ編 Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ；Ｍａｎｎら、１９８３年、上記）。その後、組み換えレトロウイルスを含有する培地が回収され、場合により濃縮され、遺伝子移入に使用される。レトロウイルスベクターは、広範囲の細胞型に感染できる。
【０１１３】
複製欠損レトロウイルスだけを産生する特殊化した細胞系（「パッケージング細胞」と呼ばれる）の開発は、遺伝子療法のためのレトロウイルスの有用性を増加させ、欠損レトロウイルスは遺伝子療法目的のための遺伝子移入への使用を特徴とする（再考察として、Ｍｉｌｌｅｒ，Ａ．Ｄ．（１９９０年）Ｂｌｏｏｄ ７６：２７１ページを参照されたい）。したがって、レトロウイルスコーディング配列（ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ）の一部が、ペプチドまたは本発明の類似体、例えばレトロウイルスに複製欠損をもたらす転写活性化因子をコードする核酸によって置換されている組み換えレトロウイルスが構築され得る。その後、複製欠損レトロウイルスはビリオンにパッケージングされ、このビリオンは、標準的技術によってヘルパーウイルスの使用を介して標的細胞を感染させるために使用できる。組み換えレトロウイルスの作製およびこのようなウイルスをｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで細胞に感染させるためのプロトコルは、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら（編）Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、（１９８９年）、Ｓｅｃｔｉｏｎｓ９．１０〜９．１４および他の標準的実験室マニュアルにおいて見出すことができる。
【０１１４】
適切なレトロウイルスの例は、ｐＬＪ、ｐＺＩＰ、ｐＷＥおよびｐＥＭを含み、これらは当業者には公知である。例示的レトロウイルスベクターは、ｐＳＲ ＭＳＶｔｋＮｅｏ（Ｍｕｌｌｅｒら、（１９９１年）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１１：１７８５ページおよびｐＳＲ ＭＳＶ（ＸｂａＩ）（Ｓａｗｙｅｒｓら、（１９９５年）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８１：３０７ページ）およびそれらの誘導体である。例えば、これらのベクター両方中の特有のＢａｍＨＩ部位は、ＣｌａｃｋｓｏｎらによるＷＯ９６／４１８６５に記載のように、ベクターをＢａｍＨＩを用いて消化し、Ｋｌｅｎｏｗを用いて埋め、それぞれ、ｐＳＭＴＮ２およびｐＳＭＴＸ２を作製するために再接合することによって除去できる。同種指向性および両種指向性両方のレトロウイルス系を調製するための適切なパッケージングウイルス系の例は、ＣｒｉｐおよびＣｒｅを含む。
【０１１５】
レンチウイルスを含むレトロウイルスは、さまざまな遺伝子を、神経細胞、上皮細胞、網膜細胞、内皮細胞、リンパ球、筋芽細胞、肝細胞、骨髄細胞を含む多数の異なる細胞型にｉｎ ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ ｖｉｖｏで導入するために使用されてきた（例えば、Ｆｅｄｅｒｉｃｏ（１９９９年）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１０：４４８ページ；Ｅｇｌｉｔｉｓら、（１９８５年）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０：１３９５〜１３９８ページ；ＤａｎｏｓおよびＭｕｌｌｉｇａｎ、（１９８８年）ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８５：６４６０〜６４６４ページ；Ｗｉｌｓｏｎら、（１９８８年）ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８５：３０１４〜３０１８ページ；Ａｒｍｅｎｔａｎｏら、（１９９０年）ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８７：６１４１〜６１４５ページ；Ｈｕｂｅｒら、（１９９１年）ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８８：８０３９〜８０４３ページ；Ｆｅｒｒｙら、（１９９１年）ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８８：８３７７〜８３８１ページ；Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙら、（１９９１年）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４：１８０２〜１８０５ページ；Ｋａｙら、（１９９２年）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ３：６４１〜６４７ページ；Ｄａｉら、（１９９２年）ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８９：１０８９２〜１０８９５ページ；Ｈｗｕら、（１９９３年）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：４１０４〜４１１５ページ；米国特許第４，８６８，１１６号；米国特許第４，９８０，２８６号；ＰＣＴ出願ＷＯ８９／０７１３６；ＰＣＴ出願ＷＯ８９／０２４６８；ＰＣＴ出願ＷＯ８９／０５３４５；およびＰＣＴ出願ＷＯ９２／０７５７３による再考察を参照されたい）。
【０１１６】
さらに、レトロウイルスの感染範囲およびその結果としてレトロウイルスに基づくベクターの感染範囲を、ウイルス粒子の表面上のウイルスパッケージングタンパク質を改変することによって、制限できることが示されている（例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９３／２５２３４、ＷＯ９４／０６９２０およびＷＯ９４／１１５２４を参照されたい）。例えば、レトロウイルスベクターの感染範囲の改変のための戦略は、細胞表面抗原に特異的な抗体と、ウイルスｅｎｖタンパク質とのカップリング（Ｒｏｕｘら、（１９８９年）ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８６：９０７９〜９０８３ページ；Ｊｕｌａｎら、（１９９２年）Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ ７３：３２５１〜３２５５ページ；およびＧｏｕｄら、（１９８３年）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １６３：２５１〜２５４ページ）；または細胞表面リガンドと、ウイルスｅｎｖタンパク質とのカップリング（Ｎｅｄａら、（１９９１年）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１４１４３〜１４１４６ページ）を含む。カップリングは、タンパク質または他の種類との化学的架橋（例えば、ｅｎｖタンパク質をアシアロ糖タンパク質に転換するためのラクトース）の形態で、および融合タンパク質の作製（例えば、一本鎖抗体／ｅｎｖ融合タンパク質）によって可能である。
【０１１７】
ｃ）アデノ随伴ベクター
本発明の核酸の送達に有用な例示的ウイルスベクター系はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である。ヒトアデノウイルスは、受容体媒介エンドサイト−シスによって細胞に進入する二本鎖ＤＮＡウイルスである。これらのウイルスは成長および操作しやすく、ｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏで広い宿主範囲を示すので、これらのウイルスは、遺伝子移入に非常に適していると考えられている。アデノウイルスは、感染休止および標的細胞の複製ができ、宿主ゲノム中に組み込まれるのではなく染色体外で生存できる。ＡＡＶは、ディペンドウイルス属に属するヘルパー依存性ＤＮＡパルボウイルスである。ＡＡＶは、病理が公知ではなく、有効な複製および生産的なライフサイクルのために、別のウイルス、例えば、アデノウイルス、ワクチニアまたはヘルペスウイルスによって提供されるさらなるヘルパー機能がなくては複製できない。
【０１１８】
ヘルパーウイルスの不在下では、ＡＡＶはそのゲノムの宿主細胞染色体への挿入によって潜伏状態を確立する。ヘルパーウイルスによるその後の感染は、その後、感染性のウイルスの子孫を産生するために複製できる、組み込まれたコピーを救出する。野生型ＡＡＶウイルスとアデノウイルスまたはヘルペスウイルスのいずれかに由来するヘルパー機能との組み合わせは、複製可能な組み換えＡＶＶ（ｒＡＶＶ）を発生する。この系の１つの有利性は、その相対的な安全性である（再考察のために、Ｘｉａｏら、（１９９７年）Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．１４４：１１３〜１２４ページを参照されたい。
【０１１９】
ＡＡＶのゲノムは、およそ４６８１塩基を含有する線状の一本鎖ＤＮＡ分子で構成される（ＢｅｒｎｓおよびＢｏｈｅｎｚｋｙ、（１９８７年）Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．）３２：２４３〜３０７ページ）。このゲノムは、各末端に、ＤＮＡ複製の起点として、またウイルスのパッケージングシグナルとしてｃｉｓに機能する逆位末端反復（ＩＴＲ）を含む。ゲノムの内部非反復部分は、それぞれＡＡＶｒｅｐおよびｃａｐ領域として知られる、２つの大きなオープンリーディングフレームを含む。これらの領域は、複製およびビリオンのパッケージングに関与するウイルスタンパク質をコードする。ＡＡＶゲノムの詳細な説明のために、例えば、Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｎ．（１９９２年）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：９７〜１２９ページを参照されたい。
【０１２０】
３００塩基対ほどの小さなＡＡＶを含有するベクターは、パッケージングされ得、組み込まれ得る。外来ＤＮＡの空間は約４．７ｋｂに制限され、これは、本発明のペプチドまたは類似体をコードする核酸の組み込みに十分である。Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら、（１９８５年）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３２５１〜３２６０ページに記載のようなＡＡＶベクターは、ＤＮＡを細胞に導入するために使用できる。さまざまな核酸が、ＡＡＶベクターを使用して異なる細胞型に導入されてきた（例えば、Ｈｅｒｍｏｎａｔら、（１９８４年）ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８１：６４６６〜６４７０ページ；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら、（１９８５年）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：２０７２〜２０８１ページ；Ｗｏｎｄｉｓｆｏｒｄら、（１９８８年）Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．２：３２〜３９ページ；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら、（１９８４年）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５１：６１１〜６１９ページ；およびＦｌｏｔｔｅら、（１９９３年）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：３７８１〜３７９０ページを参照されたい）。
【０１２１】
ｒＡＡＶ構築体の構築および送達のための一般的方法は、当分野において公知であり、例えば、Ｂａｒｌｅｔｔ，Ｊ．Ｓ．ら、（１９９６年）、Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ； Ｔｏｗａｒｄｓ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ、１１５〜１２７ページに記載されている。
【０１２２】
通常使用されるＡＡＶに基づく発現ベクターは、利用可能な制限部位を直接使用するか、または制限酵素を用いる所望のヌクレオチド配列の除去、その後の末端の平滑化、適切なＤＮＡリンカーのライゲーション、制限消化およびＩＴＲとの間の部位へのライゲーションによるかのどちらかで所望のヌクレオチド配列のサブクローニングに使用され得る、制限部位に隣接する１４５ヌクレオチドのＡＡＶ逆位末端配列（ＩＴＲ）を含む。
【０１２３】
ヌクレオチド配列の組み込み、ヌクレオチド配列を含有する組み換えＡＡＶベクターの増殖および精製ならびに細胞および哺乳動物のトランスフェクトへのその使用のための方法および材料を含む、本発明の実施に有用であると思われるＡＡＶ技術に関するさらなる詳細なガイダンスに関しては、例えば、Ｃａｒｔｅｒら、米国特許第４，７９７，３６８号（１９８９年１月１０日）；Ｍｕｚｙｃｚｋａら、米国特許第５，１３９，９４１号（１９９２年８月１８日）；Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉら、米国特許第５，１７３，４１４号（１９９２年１２月２２日）；Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ，米国特許第５，２５２，４７９号（１９９３年１０月１２日）；Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉら、米国特許第５，３５４，６７８号（１９９４年、１０月１１日）；Ｓｈｅｎｋら、米国特許第５，４３６，１４６号（１９９５年７月２５日）；Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅら、米国特許第５，４５４，９３５号（１９９５年１２月１２日）、Ｃａｒｔｅｒら、ＷＯ９３／２４６４１（１９９３年１２月９日公開）およびＮａｔｓｏｕｌｉｓ、米国特許第５，６２２，８５６号（１９９７年４月２２日）を参照されたい。
【０１２４】
ｄ）他のウイルス系
核酸の送達に使用され得る他のウイルスベクター系は、例えばヘルペスウイルス、例えば単純ヘルペスウイルス（Ｗｏｏら、ＩＪ Ｓｔ特許第５，６３１，２３６号、１９９７年５月２０日発行およびＮｅｕｒｏｖｅｘによるＷＯ００／０８１９１）ワクチニアウイルス（Ｒｉｄｇｅｗａｙ（１９８８年）Ｒｉｄｇｅｗａｙ、「Ｍａｍｍａｌｉａｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒｓ」、Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ Ｒ Ｌ、Ｄｅｎｈａｒｄｔ Ｄ Ｔ編 Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ ｓｕｒｖｅｙ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｕｓｅｓ．Ｓｔｏｎｅｈａｍ：Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ，；ＢａｉｃｈｗａｌおよびＳｕｇｄｅｎ（１９８６年）「Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ａｎｉｍａｌ ＤＮＡ ｖｉｒｕｓｅｓ：Ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ａｎｄ ｓｔａｂｌｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ ｇｅｎｅｓ」、Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ Ｒ編 Ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ；Ｃｏｕｐａｒら、（１９８８年）Ｇｅｎｅ、６８：１〜１０ページ）およびいくつかのＲＮＡウイルスに由来し得る。例示的ウイルスは、例えば、アルファウイルス、ポックスウイルス、ワクチニアウイルス、ポリオウイルスなどを含む。それらは、さまざまな哺乳動物細胞にとって魅力的な特徴をいくつかの提示する（Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ（１９８９年）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４４：１２７５〜１２８１ページ；Ｒｉｄｇｅｗａｙ、１９８８年、上記；ＢａｉｃｈｗａｌおよびＳｕｇｄｅｎ、１９８６年、上記、；Ｃｏｕｐａｒら、１９８８年；Ｈｏｒｗｉｃｈら、（１９９０年）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６４：６４２〜６５０ページ）。
【０１２５】
ｅ）非組み込みウイルス、自己切断型／切り出し可能構築体およびプラスミドの標的体細胞への直接トランスフェクション
「自己切断型２Ａペプチド」を組み込んだ、ポリシストロン性発現カセットからのすべての遺伝的能力決定因子の同時発現は、「リボソームスキッピング」を起こし、単一プロモーターから個々の因子が同程度に発現できる（Ｓｏｍｍｅｒら、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ．２７：５４３〜５４９ページ、２００８年；Ｃａｒｅｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０６：１５７〜１６２ページ、２００９年）。因子のペアを分離する配列内リボソーム進入配列（ＩＲＥＳ）を用いて、感染細胞はすべての能力決定因子またはそのサブセットを発現できる。Ｃａｒｅｙら、（２００９年、上記）は、ＩＲＥＳ技術を用いずに、自己切断型２Ａペプチドによって分離されたドキシサイクリン誘導因子を構築した。
【０１２６】
別の実施形態において、１種または複数の能力決定因子は、ＤＮＡトランスポゾンを使用して送達される。ＤＮＡトランスポゾンは、特異的「トランスポザーゼ」酵素によって切り出され、ゲノムの至る所に再組み込みされる、転移と呼ばれる現象の遺伝要素である。ｐｉｇｇｙＢａｃは、ＴＴＡＡ配列を抱える転写ＤＮＡユニット中に優先的に挿入される、同義遺伝子ペイロードを抱えることができる、このようなトランスポゾンの１つである。個別またはポリシストロン性のドキシサイクリン誘導構築体の誘導は、トランスポザーゼを介した組み込みおよびその後の切り出しによって、ネズミおよびヒト線維芽細胞に送達され、四倍体胚補完法による妊娠中期胚への貢献を含む、多能性のすべての特質を示すｉＰＳ細胞を発生する（Ｗｏｌｔｊｅｎら、Ｎａｔｕｒｅ．４５８：７６６〜７７０ページ、２００９年）。
【０１２７】
さらに、ｌｏｘＰが導入されたプロウイルス構築体は、その後のアデノウイルスを発現する一時的Ｃｒｅリコンビナーゼの感染を介して切り出され得る（Ｋａｊｉら、Ｎａｔｕｒｅ．４５８：７７１〜７７５ページ、２００９年）。
【０１２８】
ＤＮＡに基づかないｉＰＳ作出方法
ａ）化学的取組み
一例において、能力決定因子は、ヒストンメチルトランスフェラーゼＧ９ａの阻害剤であり、Ｏｃｔ４の代わりに、またはＯｃｔ４に対する補完（例えば、Ｏｃｔ４の発現レベルを減少させる）として使用される。Ｇ９ａの化学的阻害は、例えばＥｎｚｏ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ社によるＢＩＸ−０１２９４（ＢＩＸ）を用いて達成でき、ヒストン３、リジン９のメチル化（Ｈ３Ｋ９ｍｅ）により媒介されるＯｃｔ４発現に対する拮抗作用を軽減しており、いくつかの細胞において、ｉＰＳ細胞の誘導のためにウイルスにより送達されたＯｃｔ４が完全に置換され得るＳｈｉら、Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ．２：５２５〜５２８ページ、２００８年）。
【０１２９】
または、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を使用し、Ｇ９ａの発現をノックダウンする。このようなｓｈＲＮＡは、Ｏｃｔ４プロモーターの脱メチル化およびＯｃｔ４発現の部分的再活性化をもたらすことが示されている（Ｍａら、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ．２６：２１３１〜２１４１ページ、２００８年）。
【０１３０】
別の例において、Ｌ−チャネルカルシウムアゴニスト（例えば、Ｔｏｃｒｉｓ ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅによるＢａｙｋ８６４４）は、Ｇ９ａアンタゴニスト（例えば、ＢＩＸ）と組み合わせて使用され、Ｓｏｘ２およびｃＭｙｃの代わりをする、または補完する（Ｓｈｉら、Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ．３：５６８〜５７４ページ、２００８年）。
【０１３１】
別の例において、能力決定因子はＭＥＫ阻害剤である。Ｏｃｔ４／Ｋｌｆ４感染後７から９日および数日の間（例えば５日間）連続する、体細胞周期の進行に関与するＭＥＫの化学的阻害（例えば、Ｃａｙｍａｎ ＣｈｅｍｉｃａｌによるＰＤ０３２５９０１を使用する）は、Ｏｃｔ４の発現が高い再プログラム化ｉＰＳコロニーの成長の強化をもたらす（Ｓｈｉら、２００８年、上記）。
【０１３２】
さらなる例において、能力決定因子はＷｎｔ３ａである。細胞外Ｗｎｔ３ａは標的細胞における内因性ｃＭｙｃの発現のβ−カテニン媒介誘導を刺激でき、再プログラミング効率の劇的な改善をもたらす（Ｍａｒｓｏｎら、２００８年）。
【０１３３】
別の例において、能力決定因子はオカダ酸である。オカダ酸（ＯＡ）は、タンパク質セリン／トレオニンホスファターゼ２Ａ（ＰＰ２Ａ）の強力な阻害剤である。ＰＰ２ＡはｃＭｙｃ中の特定のセリン残基を脱リン酸化し、ユビキチンにより制御された迅速な分解のためにそれを標的とし、さらにＫｌｆ４の増加を誘発し、順に、ｃＭｙｃ遺伝子発現の上方制御を誘発するｃＭｙｃプロモーター中のＯＡ応答性エレメントと結合する。ＥＩＦαの抑制を介した、翻訳に関するＯＡのさらなる阻害効果は、ｍＲＮＡ転写産物の初期蓄積およびその後のＯＡ離脱に関するボーラス量の翻訳タンパク質の送達をもたらし得る。
【０１３４】
別の例において、能力決定因子はケンパウロンである。Ｏｃｔ４／Ｓｏｘ２／ｃＭｙｃレトロウイルス発現ＭＥＦがＯｃｔ４選択可能なｉＰＳ細胞を発生するための、Ｋｌｆ４と広範囲のタンパク質キナーゼ阻害剤であるケンパウロンとの置換は、生殖細胞系コンピテントキメラに寄与できる（Ｌｙｓｓｉｏｔｉｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０６：８９１２〜８９１７ページ、２００９年）。
【０１３５】
さらなる例において、能力決定因子はヒストン（histine）脱アセチル化酵素阻害剤である。ｉＰＳ細胞に対する、ネズミ線維芽細胞のｉＰＳ再プログラミング効率が１００倍改善されることが、ヒストン脱アセチル化酵素活性の化学的阻害を介して観察されている（Ｈｕａｎｇｆｕら、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２６：７９５〜７９７ページ、２００８年；Ｈｕａｎｇｆｕら、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２６：１２６９〜１２７５ページ、２００８年）。例えば、バルプロ酸は、遺伝的再プログラミングの再プログラミング効率を改善する。
【０１３６】
さらなる例において、能力決定因子はＤＮＡメチラーゼ阻害剤である。
【０１３７】
ｂ）タンパク質の送達
低分子化合物の使用と同様に、タンパク質の送達は、その可逆性のため、ｉＰＳ細胞作製のための魅力的な取組みである。
【０１３８】
一例において、タンパク質の能力決定因子は、細胞内（好ましくは核内）進入が容易になるように、タンパク質の形質導入ドメインに接合される。タンパク質の形質導入ドメインは当分野において公知であり、例えばポリアルギニン、ＨＩＶ Ｔａｔ基本的ドメイン、アンテナペディア（antannapedia）を含む（例えば、Ｊｏｎｅｓら、Ｂｒ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、１４５：１０９３〜１０２ページ、２００５年に記載されている）。例えば、能力決定因子に連結されたポリアルギニン標的化配列を組み込む大腸菌（E .coli）により発現された組み換えタンパク質は、ＭＥＦをｉＰＳ細胞に転換できる。
【０１３９】
タンパク質を作製する方法は当分野において公知であり、および／またはＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９年）またはＡｕｓｕｂｅｌら（編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８年、現在までのすべての改定を含む）に記載されている。
【０１４０】
ｃ）遺伝子サイレンシング戦略
一例において、能力決定因子は、内因性遺伝子の発現をサイレンシングまたは減少させる核酸に基づく化合物である。
【０１４１】
一例において、能力決定因子はマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）である。ｍｉＲＮＡは、主に配列特異的様式で標的転写産物との結合を介して多数の生物学的過程を制御する、一本鎖、非コーディングＲＮＡである。ｍｉＲＮＡは、まず一次転写産物として発現され、次いでＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と複合する活性ｍｉＲＮＡを放出するめに切断され、翻訳の抑制を開始する。０日目のｍｉＲ−２９４のトランスフェクションおよび６日目のレトロウイルス感染後、ｃＭｙｃを７５％の効率まで置換できる（Ｊｕｄｓｏｎら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２７：４５９〜４６１ページ、２００９年）。
【０１４２】
Ｄｎｍｔ１のｓｉＲＮＡノックダウンは、細胞が部分的再プログラム化から完全な再プログラム化へ超える援助ができ、再プログラミング効率は４倍に増加する（Ｍｉｋｋｅｌｓｅｎら、Ｎａｔｕｒｅ．４５４：４９〜５５ページ、２００８年）。同様に、Ｇ９ａの短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）によるノックダウン、着床後の胚におけるＯｃｔ４の脱活性化に関与するヒストンメチルトランスフェラーゼは、ｖｉｖｏでのＯｃｔ４プロモーターの脱メチル化および部分的再活性化をもたらす（上記を参照されたい）。Ｏｃｔ４／Ｓｏｘ２／Ｋｌｆ４感染と呼応したｐ５３ ｓｉＲＮＡの成人包皮線維芽細胞への添加は、単独またはさらなる処置と組み合わせて、効率を増加する（Ｚｈａｏら、Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ．３：４７５〜４７９ページ、２００８年）。
【０１４３】
当業者は、適切なＲＮＡに基づく化合物を承知しているであろう。例示的化合物は、アンチセンスポリヌクレオチド、リボザイム、ＰＮＡ、干渉ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、短鎖ヘアピンＲＮＡ、マイクロＲＮＡを含む。
【０１４４】
アンチセンスポリヌクレオチド
「アンチセンスポリヌクレオチド」という用語は、任意の実施形態において本明細書に記載のポリペプチドをコードする特定のｍＲＮＡ分子の少なくとも一部に相補的であり、ｍＲＮＡ翻訳などの転写後事象に干渉できるＤＮＡもしくはＲＮＡまたはそれらの組み合わせを意味すると解釈されるべきである。アンチセンス法の使用は当分野において公知である（例えば、ＨａｒｔｍａｎｎおよびＥｎｄｒｅｓ、Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ、Ｋｌｕｗｅｒ（１９９９年）を参照されたい）。
【０１４５】
本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは、生理学的条件下で標的ポリヌクレオチドとハイブリダイズするであろう。アンチセンスポリヌクレオチドは構造遺伝子に一致する配列または遺伝子発現またはスプライシングの調節をもたらす配列を含む。例えば、アンチセンスポリヌクレオチドは、本発明の遺伝子の標的コーディング領域または５’非翻訳領域（ＵＴＲ）もしくは３’−ＵＴＲまたはこれらの組み合わせに一致し得る。アンチセンスポリヌクレオチドは、イントロン配列と一部相補的であり得、これは転写の間または転写後、好ましくは標的遺伝子のエクソン配列だけにスプライシングされ得る。アンチセンス配列の長さは、標的核酸またはそれをコードする構造遺伝子の、少なくとも１９の連続するヌクレオチド、好ましくは少なくとも５０ヌクレオチドおよびより好ましくは少なくとも１００、２００、５００または１０００ヌクレオチドでなくてはならない。全遺伝子転写産物に相補的な完全長配列を使用できる。この長さは、最も好ましくは１００〜２０００ヌクレオチドである。標的転写産物に対するアンチセンス配列の同一性の程度は、少なくとも９０％およびより好ましくは９５〜１００％でなくてはならない。
【０１４６】
触媒ポリヌクレオチド
「触媒ポリヌクレオチド／核酸」という用語は、異なる基質を特異的に認識し、この基質の化学的改変を触媒するＤＮＡ分子もしくはＤＮＡ含有分子（「デオキシリボザイム」または「ＤＮＡザイム」としても当分野において公知である）またはＲＮＡもしくはＲＮＡ含有分子（「リボザイム」または「ＲＮＡザイム」としても公知である）を指す。触媒核酸中の核酸塩基は、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ（ＲＮＡに関してはＵ）の塩基であり得る。
【０１４７】
通常、触媒核酸は、標的核酸および酵素活性を切断する核酸の特異的認識のためにアンチセンス配列（本明細書において「触媒ドメイン」とも称される）を含有する。本発明に特に有用であるリボザイムの型は、ハンマーヘッドリボザイムおよびヘアピンリボザイムである。
【０１４８】
ＲＮＡ干渉
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、特定のタンパク質の作製を特異的に阻害するために有用である。理論に縛られることを好むわけではないが、Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅら（１９９８年）は、ｄｓＲＮＡ（二本鎖ＲＮＡ）がタンパク質作製を減少させるために使用され得る機序のためのモデルを提供している。この技術は、対象となる遺伝子のｍＲＮＡと本質的に同一である配列またはその一部を含有するｄｓＲＮＡ分子の存在に頼る。好都合なことに、ｄｓＲＮＡは組み換えベクターまたは宿主細胞において単一プロモーターから作製され得、センス配列およびアンチセンス配列は、センス配列とアンチセンス配列とをハイブリダイズできる関連のない配列に隣接し、ループ構造を形成する関連のない配列とともにｄｓＲＮＡ分子を形成する。本発明にとって適切なｄｓＲＮＡ分子の設計および作製は、当業者の能力の十分範囲内であり、特にＷＯ９９／３２６１９、ＷＯ９９／５３０５０、ＷＯ９９／４９０２９およびＷＯ０１／３４８１５を考慮されたい。
【０１４９】
ハイブリダイズするセンス配列およびアンチセンス配列の長さは、個々に、少なくとも１９の連続するヌクレオチド、好ましくは少なくとも３０または５０ヌクレオチドおよびより好ましくは少なくとも１００、２００、５００または１０００ヌクレオチドでなくてはならない。全遺伝子転写産物に一致する完全長配列を使用できる。この長さは、最も好ましくは１００〜２０００ヌクレオチドである。標的転写産物に対するセンス配列およびアンチセンス配列の同一性の程度は、少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％およびより好ましくは９５〜１００％でなくてはならない。
【０１５０】
好ましい低分子干渉ＲＮＡ（「ｓｉＲＮＡ」）分子は、標的ｍＲＮＡの約１９〜２３の連続するヌクレオチドと同一であるヌクレオチド配列を含む。好ましくは、ｓｉＲＮＡ配列ジヌクレオチドＡＡで始まり、約３０〜７０％（好ましくは３０〜６０％、より好ましくは４０〜６０％およびより好ましくは約４５％〜５５％）のＧＣ含有量を含み、例えば標準的ＢＬＡＳＴ検索によって決定して、導入される哺乳動物ゲノム中の標的以外の任意のヌクレオチド配列に対して高い割合の同一性を有さない。
【０１５１】
培養条件
多能性細胞および／または再プログラム化細胞および／または再プログラミングを受けた細胞は、多能性細胞の成長を支えるのに使用される任意の培地において培養され得る。典型的な培養培地は、限定するものではないが、ＴｅＳＲ（商標）（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ．； Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、Ｃａｎａｄａ）、ｍＴｅＳＲ（商標）（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）およびＳｔｅｍＬｉｎｅ（登録商標）無血清培地（Ｓｉｇｍａ；Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）などの合成培地、ならびにマウス胎児線維芽細胞（ＭＥＦ）馴化培地などの馴化培地を含む。さらなる培地は、塩基性培地、例えば、ＫｏＳＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を補充したＤＭＥＭまたはＤＭＥＭ−Ｆ１２を含む。または、Ｓｉｌｖａら、ＰＬＯＳ Ｂｉｏｌｏｇｙ、６：ｅ２５３、２００８年は、例えば、ＭＡＰＫシグナル伝達およびグリコーゲン合成酵素キナーゼ−３のシグナル伝達の阻害剤ならびに白血病阻止因子（ＬＩＦ）を含む、再プログラム化細胞の作製および未分化状態の再プログラム化細胞の維持に有用な培地を記載している。本明細書において使用する場合、「規定培地」は、単に生物化学的構成成分だけからなる生物化学的に規定された製剤を指す。規定培地はまた、既知の化学組成を有する構成成分だけを含み得る。規定培地は、既知の供給源に由来する構成成分をさらに含み得る。本明細書において使用する場合、「馴化培地」は、この培地において培養された細胞由来の可溶性因子をさらに補充した成長培地を指す。または、細胞は培養培地においてＭＥＦ上で維持されてもよい。
【０１５２】
細胞培養は、好ましくは加湿インキュベータにおいて約３７℃でインキュベートされる。細胞培養条件は、本発明の細胞のために大幅に変動し得るが、いくつかの実施形態において、細胞は、細胞成長に適切な、例えば空気中に５％Ｏ２、１０％ＣＯ２、８５％Ｎ２を含む、または１０％ＣＯ２を含む環境において維持される。
【０１５３】
別の実施形態において、細胞は、マトリックス、例えば細胞外マトリックス、例えばＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）、ラミニン、コラーゲン、Ｃｕｌｔｕｒｅｘ（登録商標）などの上または内部で培養される。他の実施形態において、細胞は、細胞外マトリックスの存在下で培養され得る。このようなマトリックスの存在下で細胞を増殖させる適切な手順は、例えば米国特許第７，２９７，５３９号に記載されている。
【０１５４】
細胞の単離または濃縮
下記の方法は、例えば、本明細書に記載のマーカーまたは当分野において公知のマーカーを検出することによる、Ｓｔｒｏ−１＋細胞および／または再プログラム化細胞／多能性細胞の単離または濃縮にとって有用である。
【０１５５】
所望の細胞を濃縮する例示的一手法は、磁気ビーズ細胞分取法（ＭＡＣＳ）または他の任意の磁気を利用する細胞分取法、例えばＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）である。従来のＭＡＣＳ手順は、Ｍｉｌｔｅｎｙｉら（Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ１１：２３１〜２３８ページ、１９９０年）に記載されている。この手順において、細胞は抗体または細胞表面マーカーもしくはタンパク質と結合する他の化合物に結合された磁気ビーズで標識され、細胞は、常磁性分離カラムを通される、または磁場の別の形態に曝露される。分離カラムは強力な磁石内に配置され、その結果、カラム内に磁場が発生する。磁気的に標識された細胞は、カラム内に捕捉され、通過しない。捕捉された細胞は、その後カラムから溶出される。
【０１５６】
本発明の細胞は、上記のように、例えば適切な肉体的保有宿主から、適切なタンパク質を発現する細胞を分離するためのＭＡＣＳを使用して濃縮され得る。試料はタンパク質と結合する免疫磁性ビーズと一緒にインキュベートされる。インキュベーション後、試料は洗浄され、再懸濁され、磁場を通過させられ、免疫磁性ビーズに結合された細胞が取り除かれ、ビーズに結合された細胞が回収される。これらの技術は陰性選択、例えば、望ましくないマーカー、すなわち望ましくない細胞を発現する細胞の除去に同様に適用できる。このような方法は、細胞集団を、望ましくない細胞型（複数可）において検出可能なレベルで発現された細胞表面マーカーと結合する化合物で標識された磁性粒子と接触させるステップを含む。インキュベーション後、試料は洗浄され、再懸濁され、磁場を通過させられ、免疫磁性ビーズに結合された細胞が取り除かれる。ビーズに結合された細胞が回収される。望ましくない細胞型（複数可）を失った残存細胞が、その後回収される。
【０１５７】
別の実施形態において、タンパク質または細胞表面マーカーと結合する化合物は、固体表面に固定され、細胞集団をそれと接触させる。未結合細胞を除去するための洗浄後、この化合物と結合した細胞は回収、例えば溶出され得、その結果化合物が結合するタンパク質を発現する細胞が単離または濃縮される。または所望であれば、化合物と結合しない細胞を回収できる。
【０１５８】
好ましい実施形態において、細胞は、蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）を使用して単離または濃縮される。ＦＡＣＳは、粒子の蛍光特性に基づく、細胞を含む粒子を分離するための公知の方法であり、例えばＫａｍａｒｃｈ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ，１５１：１５０〜１６５ページ、１９８７年に記載されている。一般的に、この方法は、細胞集団を、１種または複数のタンパク質または細胞表面マーカーと結合できる化合物と接触させるステップを含み、異なるマーカーと結合する化合物は、さまざまな蛍光部分、例えば、蛍光色素分子を用いて標識される。細胞は、液体の狭く、速い流れの中心に同調される。この流れは、それらの直径に関連して細胞間を分離するように構成される。振動機序は、細胞の流れを引き起こし、個別の液滴に分ける。この系は、液滴中に複数の細胞が存在する可能性が低いように調節される。流れが液滴に分かれる直前に、流れは、個々の細胞の対象となる蛍光特徴、例えば、標識化合物が結合されているかどうかが測定される蛍光測定ステーションを通過する。帯電リングは、流れが液滴に分かれるポイントに配置される。蛍光強度測定の直前に基づく電荷はリング上に配置され、液滴は流れから分離するので、対立する電荷は液滴上に捕捉されている。帯電した液滴は、その後液滴を迂回させる静電偏向方式を介して、それらの電荷に基づいて容器に落とされる、例えば、標識化合物が細胞に結合されている場合１つの容器に、そうでない場合は別の容器に落とされる。いくつかの系において、電荷は、流れに直接印加され、分かれる液滴は流れと同じ符号の電荷を保有する。この流れは、その後、液滴の分離後中性に戻る。
【０１５９】
細胞の分化
本発明の再プログラム化細胞または多能性細胞は、さまざまな商業的および治療的に重要な組織型の集団を調製するために使用できる。一般に、このことは、細胞を所望の数に増殖させることによって達成される。その後、任意のさまざまな分化戦略に従って分化が引き起こされる。例えば、神経系列の細胞の高度に濃縮された集団は、細胞を、１種もしくは複数のニュートロフィン（ニュートロフィン３または脳由来の神経栄養因子など）、１種もしくは複数のマイトジェン（上皮成長因子、ｂＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＩＧＦ１およびエリスロポエチンなど）または１種もしくは複数のビタミン（レチノイン酸、アスコルビン酸など）を含有する培養培地に変えることによって作製できる。または、多分化能神経幹細胞は、胚様体段階を介して作製でき、ｂＦＧＦを含有する化学的規定培地において維持できる。培養された細胞は、場合により、それらが神経前駆体細胞マーカー、例えば、ネスチン、Ｍｕｓａｓｈｉ、ビメンチン、Ａ２Ｂ５、ｎｕｒｒ１またはＮＣＡＭを発現するかどうかに基づいて分離される。このような方法を使用して、（成熟ニューロンを含む）神経細胞および（星状細胞および乏突起膠細胞を含む）グリア細胞の両方を作製する能力を有する神経前駆細胞／幹細胞を得ることができる。または、分化細胞集団を形成する能力を有する複製ニューロン前駆体を得ることができる。
【０１６０】
肝細胞系列のマーカーが高度に濃縮された細胞は、ｎ−ブチレートなどのヒストンデアセチラーゼ阻害剤の存在下で幹細胞を培養することによって再プログラム化細胞または多能性細胞から分化され得る。培養された細胞は、場合により、ＥＧＦ、インスリンまたはＦＧＦなどの肝細胞成熟因子と一緒に同時にまたは連続して培養される。
【０１６１】
再プログラム化細胞または多能性細胞はまた、心筋細胞の特徴的マーカーおよび自然発生的周期的収縮活性を有する細胞を作製するために使用され得る。この方法における分化は、（５−アザ−デオキシ−シチジンなどの）ＤＮＡのメチル化をもたらすヌクレオチド類似体、成長因子および骨形態形成タンパク質によって容易になる。細胞は、密度に基づく細胞分離によってさらに濃縮され得、クレアチン、カルニチンおよびタウリンを含有する培地において維持され得る。
【０１６２】
再プログラム化細胞または多能性細胞は、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）、ヒトＴＧＦ−ベータ受容体に対するリガンド、またはヒトビタミンＤ受容体に対するリガンドを含有する培地において、間葉細胞または軟骨形成細胞への分化を対象とし得る。培地は、デキサメタゾン、アスコルビン酸−２−リン酸ならびにカルシウムおよびリン酸塩の供給源をさらに含み得る。好ましい実施形態において、誘導細胞は、骨芽細胞系列の細胞の表現型特徴を有する。
【０１６３】
以上から理解されるように、再プログラム化細胞または多能性細胞に由来する分化細胞は、それを必要とするヒト患者において組織再構成または再生のために使用することもできる。この細胞は、それを意図される組織部位に接合し、機能的に欠損した領域を再構成または再生できる様式で投与される。例えば、神経前駆体細胞は、治療される疾患に従って、中枢神経系の実質部位または髄腔内部位に直接移植できる。神経細胞移植の有効性は、ＭｃＤｏｎａｌｄら、（（１９９９年）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．、５巻：１４１０ページ）およびＫｉｍら、（（２００２年）Ｎａｔｕｒｅ、４１８巻：５０ページ）に記載されるように、激しく損傷した脊髄に関してラットモデルにおいて評価され得る。移植の成功により、２〜５週間後に病変に存在する、星状細胞、乏突起膠細胞および／またはニューロンに分化し病変の終わりから脊髄に沿って遊走する、移植由来細胞および歩き方、協調および体重支持における改善が示される。
【０１６４】
同様に、本出願の代理人は、骨折または軟骨損傷の治療のために間葉幹細胞を投与する有用性を実証している。
【０１６５】
同様に、心筋細胞の有効性は、心外傷または機能不全の適切な動物モデル、例えば、治療をしなければ左心室壁組織の約５５％が瘢痕組織になる心臓の低温傷害（ｃｒｙｏｉｎｊｕｒｙ）に関する動物モデルにおいて評価され得る（Ｌｉら、（１９９６年）、Ａｎｎ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｓｕｒｇ．、６２巻：６５４ページ；Ｓａｋａｉら、（１９９９年）、Ａｎｎ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｓｕｒｇ．、８巻：２０７４ページ；Ｓａｋａｉら、（１９９９年）、Ｊ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｓｕｒｇ．、１１８巻：７１５ページ）。治療の成功により、瘢痕範囲が減少し、瘢痕の拡大が制限され、収縮、拡張および発生圧力によって決定される心機能が改善されると思われる（Ｋｅｈａｔら、（２００４年））。心外傷は、例えば、左下行前動脈の遠位部において塞栓コイルを使用しても（Ｗａｔａｎａｂｅら、（１９９８年）、Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．、７巻：２３９ページ）、または左冠動脈前下行枝の結紮（Ｍｉｎら、（２００２年）、Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．、９２巻：２８８ページ）によってもまたモデル化できる。治療の有効性は、組織構造および心機能により評価し得る。本発明に具体化される心筋細胞調製品は、心筋の再生のための療法および心機能不足の治療に使用され得る。
【０１６６】
肝機能もまた、例えば本発明に従って成長させた霊長類多能性幹細胞から分化した、肝細胞および肝細胞前駆体を投与することによって回復できる。これらの分化細胞は、肝損傷の修復能力に関して動物モデルにおいて評価され得る。このような一例は、Ｄ−ガラクトサミンの腹腔内注射によって引き起こされる損傷である（Ｄａｂｅｖａら、（１９９３年）、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．、１４３巻：１６０６ページ）。治療の有効性は、肝細胞マーカーに関する免疫組織化学的染色、細管構造が成長組織において形成されるかどうかの顕微鏡的決定および肝臓特異的タンパク質の合成を回復するための治療能力によって決定され得る。肝細胞は、直接投与によって、または例えば劇症肝不全の後に対象の肝組織がそれ自体を再生する間に一時的に肝機能を提供する生物補助（bioassist）デバイスの一部として、療法に使用され得る。
【０１６７】
細胞組成物
本発明の一例において、再プログラム化細胞または多能性細胞および／またはそれから分化した細胞は、組成物の形態で投与され、またはこのような組成物に製剤化される。好ましくは、このような組成物は、薬学的に許容される担体および／または賦形剤を含む。
【０１６８】
「担体」および「賦形剤」という用語は、保管、投与および／または活性化合物の生物活性を容易にするために当分野において従来から使用される組成物を指す（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１６版、Ｍａｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ（１９８０年を参照されたい）。担体は、活性化合物の任意の望ましくない副作用を減少することもできる。適切な担体は安定である、例えば担体中の他の原料と反応できない。一例において、担体は、治療に用いた投与量および濃度で、レシピエントにおいて有意な局所的または全身性の有害な影響を起こさない。
【０１６９】
本発明にとって適切な担体は、従来から使用されている担体を含み、例えば、水、生理食塩水、水性デキストロース、ラクトース、リンガー液、緩衝化溶液、ヒアルロン酸およびグリコールが、（等張の場合）特に溶液のために好ましい液体担体である。適切な医薬担体および賦形剤は、デンプン、セルロース、ブドウ糖、乳糖、ショ糖、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、白亜、シリカゲル、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート（glycerol monostearate）、塩化ナトリウム、グリセロール、プロピレングリコール、水、エタノールなどを含む。
【０１７０】
別の例において、担体は、例えば、細胞が成長する、または懸濁される培地組成物である。好ましくは、このような培地組成物は投与された対象において任意の有害な影響を誘導しない。
【０１７１】
好ましい担体および賦形剤は、細胞の生存能力および／または生物学的効果および好ましくは有利な影響を発揮する細胞の能力に有害に影響を及ぼさない。
【０１７２】
一例において、担体または賦形剤は緩衝活性を提供し、細胞および／または可溶性因子を適切なｐＨで維持し、その結果生物活性を発揮する、例えば、担体または賦形剤はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）である。ＰＢＳは細胞および因子との相互作用が最小であり、細胞および因子の迅速な放出を可能にし、このような場合本発明の組成物は、血流または組織または組織周囲の領域もしくは組織に隣接する領域に、例えば、注射により直接適用するための液体として作製できるので、ＰＢＳは魅力的な担体および賦形剤を代表する。
【０１７３】
再プログラム化細胞または多能性細胞および／またはそれから分化した細胞は、レシピエント適合性であり、レシピエントに対して害がない生成物に分解する足場内に組み込む、または埋め込むこともできる。これらの足場は、レシピエント対象に移植された細胞に支持および保護を提供する。天然および／または合成の生分解性足場はこのような足場の例である。
【０１７４】
さまざまな異なる足場が本発明の実施に成功して使用され得る。好ましい足場は、限定するものではないが、生物学的に分解可能な足場である。天然の生分解性足場は、コラーゲン、フィブロネクチンおよびラミニンの足場を含む。細胞移植の足場に適切な合成材料は、大規模な細胞成長および細胞機能を支持できなければならない。このような足場は、さらに再吸収され得る。適切な足場は、例えば、Ｖａｃａｎｔｉら、Ｊ．Ｐｅｄ．Ｓｕｒｇ．２３：３〜９ページ １９８８年；Ｃｉｍａら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．３８：１４５ページ１９９１年；Ｖａｃａｎｔｉら、Ｐｌａｓｔ．Ｒｅｃｏｎｓｔｒ．Ｓｕｒｇ．８８：７５３〜９ページ １９９１年により記載されたポリグリコール酸足場またはポリ酸無水物、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸などの合成ポリマーを含む。
【０１７５】
別の例において、細胞は、（Ｕｐｊｏｈｎ ＣｏｍｐａｎｙによるＧｅｌｆｏａｍなどの）ゲル足場において投与され得る。
【０１７６】
本発明に有用な細胞組成物は、単独または他の細胞との混合物として投与され得る。本発明の組成物と併せて投与され得る細胞は、限定するものではないが、他の多分化能細胞もしくは多能性細胞または幹細胞または骨髄細胞を含む。異なる型の細胞は、投与直前または少し前に本発明の組成物と混合され得る、または投与前の期間一緒に共培養され得る。
【０１７７】
好ましくは、組成物は、有効量または治療もしくは予防有効量の細胞を含む。例えば、組成物は、約１×１０５の再プログラム化細胞または多能性細胞および／またはそれから分化した細胞／ｋｇから約１×１０７の再プログラム化細胞または多能性細胞および／またはそれから分化した細胞／ｋｇ、あるいは、約１×１０６再プログラム化細胞または多能性細胞および／またはそれから分化した細胞／ｋｇから約５×１０６の再プログラム化細胞または多能性細胞および／またはそれから分化した細胞／ｋｇを含む。投与される細胞の正確な量は、患者の年齢、体重および性別を含むさまざまな因子および治療される障害の程度および重症度に依存する。
【０１７８】
いくつかの実施形態において、細胞は、細胞が対象の循環に出ることができないが、細胞によって分泌される因子は循環に進入できるチャンバー内に含有される。この様式において、細胞が、対象の循環内に因子を分泌可能にすることによって可溶性因子は対象に投与され得る。このようなチャンバーは、可溶性因子の局所レベルを増加するために対象中の部位に同様に埋め込まれ得る。
【０１７９】
本発明のいくつかの実施形態において、細胞組成物による療法の開始前に、必ずしも患者を免疫抑制する必要はなく、または望ましいとも思われない。したがって、同種間または異種間の移植であっても、再プログラム化細胞または多能性細胞および／またはそれから分化した細胞は、ある場合においては容認され得る。
【０１８０】
しかし、他の場合において、細胞療法の開始前に患者を薬理学的に免疫抑制することが望ましいまたは適切であると思われる。このことは、免疫抑制剤の全身性または局所的使用を介して達成され得る、または細胞をカプセル化デバイスにおいて送達することによって達成され得る。細胞は、細胞および治療因子によって必要とされる栄養および酸素に対して浸透性であるカプセルにカプセル化され得るが、細胞は、免疫液性の因子および細胞に対して未だ不浸透性である。好ましくは、カプセルの材料は低アレルギー性であり、標的組織中に容易かつ安定に位置し、埋め込み構造に追加の保護を提供する。移植細胞に対する免疫反応を減少させる、または除去するこれらおよび他の手段は、当分野において公知である。別の方法として、細胞は、その免疫原性を減少するように遺伝子改変され得る。
【０１８１】
スクリーニング方法
本発明は、Ｓｔｒｏ−１＋多分化能細胞および／またはその子孫細胞の再プログラミングを誘導または強化する化合物を特定または単離する方法をさらに提供し、前記方法は、Ｓｔｒｏ−１＋多分化能細胞および／またはその子孫細胞と化合物とを、一時の間、および化合物が再プログラミングを誘導または強化する場合に再プログラミングが起こるために十分な条件下で接触させるステップ、および細胞が再プログラム化されるかどうかを決定するステップを含む。
【０１８２】
一例において、本方法は、
（ｉ）Ｓｔｒｏ−１＋多分化能細胞および／またはその子孫細胞が濃縮された集団と化合物とを、一時の間、および化合物が再プログラミングを誘導または強化する場合に再プログラミングが起こるために十分な条件下で接触させ、再プログラム化細胞の数を決定するステップ；ならびに
（ｉｉ）化合物と接触させられたことのないＳｔｒｏ−１＋多分化能細胞および／またはその子孫細胞が濃縮された集団中の再プログラム化細胞の数を決定するステップ
を含み、
（ｉｉ）と比較して（ｉ）において再プログラム化細胞の数が増加することが、化合物がＳｔｒｏ−１＋多分化能細胞および／またはその子孫細胞の再プログラミングを誘導または強化したことを示す。
【０１８３】
一例において、本方法は、例えば本明細書に記載された１種または複数の能力決定因子の存在下で実施される。
【０１８４】
本発明は、再プログラム化細胞または多能性細胞の所望の細胞型への分化を誘導または強化する化合物を特定または単離する方法をさらに提供し、前記方法は、任意の実施形態に従って本明細書に記載の方法を実施することによって作製された再プログラム化細胞または多能性細胞を接触させるステップ、および細胞が所望の細胞型に分化しているかどうかを決定するステップを含む。
【０１８５】
好ましくは、本方法は、
（ｉ）任意の実施形態に従って本明細書に記載の方法を実施することによって作製された再プログラム化細胞または多能性細胞が濃縮された集団と化合物とを、一時の間、および細胞の分化が起こるために十分な条件下で接触させ、所望の細胞型の細胞数を決定するステップ、ならびに
（ｉｉ）同じ条件であるが化合物が不在の下で、任意の実施形態に従って本明細書に記載の方法を実施することによって作製された再プログラム化細胞または多能性細胞を培養することによって作製された所望の細胞型の数を決定するステップ
を含み、
（ｉｉ）と比較して（ｉ）において所望の細胞型の細胞数が増加することが、化合物が所望の細胞型への分化を誘導または強化したことを示す。
【０１８６】
本発明は、病態を治療するために有用な化合物を特定または単離する方法をさらに提供し、本方法は、
（ｉ）任意の実施形態に従って本明細書に記載の方法を実施し、病態を患う対象から多能性細胞またはその集団を作製するステップ、
（ｉｉ）細胞または集団を被験化合物と接触させ、病態の１種または複数の症状に関するその効果を決定するステップ
を含み、
病態の症状を改善または緩和する化合物が病態の治療に有用である。
【０１８７】
一例において、本方法は、
（ａ）多能性細胞またはその集団を、病態の影響を受ける細胞に分化させるステップ、および
（ｂ）（ａ）細胞と被験化合物を接触させ、病態の１種または複数の症状に関するその効果を決定するステップ
を含み、病態の症状を改善または緩和する化合物が病態の治療に有用である。
【０１８８】
このような方法は、病態の治療のための新規な化合物を特定または単離するためだけに有用ではなく、さらに、対象が既存の治療用／予防用化合物を用いた治療に応答する可能性があるかないかを特定するためにも有用である。
【０１８９】
当業者は、例えば、本明細書の開示および／または適切な病態および／またはその病態の症状に基づく、細胞を分化させる適切な方法を承知していると思われる。例えば、病態は、嚢胞性線維症であり、症状は肺細胞からの分泌であるか、または神経変性病態（例えば、アルツハイマー病またはハンチントン病）および症状は神経変性またはプラーク／細胞内凝集体の形成であるか、または心臓の病態および症状は心筋細胞の収縮である。
【０１９０】
本発明は、細胞または組織型に対して毒性が減少した化合物を特定する方法、例えば、毒性の危険性が減少した治療用化合物を決定する方法をさらに企図する。例えば、本発明は、
（ｉ）任意の実施形態に従って本明細書に記載の方法を実施し、多能性細胞またはその集団を作製するステップ、
（ｉｉ）多能性細胞またはその集団を、１種または複数の特定の系列の細胞および／または組織に分化させるステップ、
（ｉｉｉ）この細胞と被験化合物とを接触させるステップ、ならびに
（ｉｖ）細胞の生存能力および／または増殖に対する化合物の効果を決定するステップ
を含み、
細胞または細胞集団の有意な割合を殺さない、または増殖を減少させない化合物が、毒性が減少していると考えられる方法を提供する。
【０１９１】
例示的分化細胞は、血液細胞、肝細胞、腎細胞および心臓細胞である。
【０１９２】
細胞の生存能力および／または増殖に対する化合物の効果を決定する方法は、当分野において公知であり、ターミナル・デオキシヌクレオチジル・トランスフェラーゼ媒介ビオチン化ＵＴＰニック末端標識（ＴＵＮＥＬ）アッセイ、トリパンブルー色素排除アッセイ、ＭＴＴアッセイ、チミジン取り込みアッセイまたはＢｒｄＵ取り込みアッセイを含む。
【０１９３】
当業者は、本発明が、任意の実施形態に従って本明細書に記載の細胞を使用して化合物を特定および／または単離するさまざまな方法を包含することを、前述より承知していると思われる。スクリーニングに適切な化合物は、例えば、抗体、ペプチドまたは小分子を含む。
【０１９４】
本発明は、特定または単離された化合物に関する情報の供給を、さらに提供する。したがって、スクリーニング方法は、
（ｉ）場合により、化合物の構造を決定するステップ、ならびに
（ｉｉ）化合物または化合物の名称もしくは構造を、例えば文書の形態、機械による読み込み可能な形態またはコンピューターに読み込み可能な形態などで提供するステップ
によりさらに改変される。
【０１９５】
必然的に、公知であるが本発明により提供されたスクリーニングを使用してその機能をいままでに試験されていない化合物については、化合物の構造の決定は黙示的（implicit）である。当業者は、スクリーニングの実施時に、化合物の名称および／または構造を承知していると思われるからである。
【０１９６】
本明細書において使用する場合、「化合物を提供する」という用語は、前記化合物を作製するための任意の化学的または組み換えの合成手段、または任意の人または手段により今までに合成されている化合物の供給を含むと解釈されるべきである。これは、化合物の単離を明らかに含む。
【０１９７】
好ましい実施形態において、化合物または化合物の名称もしくは構造は、例えば、本明細書に記載のスクリーニングにより決定されたその使用に関する指示と一緒に提供される。
【０１９８】
スクリーニングアッセイは、
（ｉ）場合により、化合物の構造を決定するステップ、
（ｉｉ）場合により、化合物の名称もしくは構造を、例えば文書の形態、機械による読み込み可能な形態またはコンピューターに読み込み可能な形態などで提供するステップ、ならびに
（ｉｉｉ）化合物を提供するステップ
によりさらに改変され得る。
【０１９９】
好ましい実施形態において、合成化合物またはこの化合物の名称もしくは構造は、例えば、本明細書に記載のスクリーニングにより決定されたその使用に関する指示と一緒に提供される。
【０２００】
一実施形態において、化合物は化合物のライブラリーで提供され、ライブラリーの１つ１つ、またはライブラリーのサブセットは他のメンバーから分離され得る（すなわち、物理的に単離される）。このような場合、化合物はその同定によりライブラリーから単離され、その同定により、その後、例えばライブラリーの他のメンバーの不在下で、当業者が、例えばその化合物を単離して作製することが可能になる。
【０２０１】
本発明を、以下の限定されない実施例においてさらに説明する。
【実施例１】
【０２０２】
Ｓｔｒｏ−１＋多分化能前駆細胞からの再プログラム化細胞の作製
１．１ Ｓｔｒｏ−１＋多分化能前駆細胞を濃縮した集団
Ｓｔｒｏ−１＋多分化能前駆細胞は、骨髄、脂肪組織および歯髄組織を含むさまざまな組織から得られる。異なる部位に由来するＳｔｒｏ−１＋多分化能前駆細胞の再プログラミング効率を比較するために、本質的にＧｒｏｎｔｈｏｓおよびＺａｎｎｅｔｔｉｎｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．４４９：４５〜５７ページ（２００８年）に記載のように、これらの組織それぞれに由来する細胞を、ＳＴＲＯ３ ｍＡｂを使用する免疫選択によってＳｔｒｏ−１Ｂｒｉｇｈｔ細胞を濃縮し、その後、培養により増殖し、ＰｒｏＦｒｅｅｚｅＴＭ−ＣＤＭ（Ｌｏｎｚａ、ＵＳＡ）において凍結保存する。異なる免疫選択法を使用して、同じ部位に由来するＳｔｒｏ−１＋多分化能前駆細胞の再プログラミング効率を比較するために、同じドナー由来の対を成す骨髄試料を、ＳＴＲＯ３またはＳＴＲＯ１ｍＡｂのいずれかを使用する免疫選択によってＳｔｒｏ−１Ｂｒｉｇｈｔ細胞を濃縮し、培養により増殖し、ＰｒｏＦｒｅｅｚｅＴＭ−ＣＤＭ（Ｌｏｎｚａ、ＵＳＡ）において凍結保存する。すべての研究に関して、第４継代の細胞を解凍し、即時使用のためにビヒクルにおいて構成する。
【０２０３】
１．２ レンチウイルスベクターのパッケージングおよび作製
導入遺伝子発現レンチウイルスベクターを、２９３ＦＴ細胞系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）において作製する。２９３Ｔは、形質転換された２９３胎児腎細胞に由来する、成長が速く、高度に移入可能なクローンの変異体であり、より高いウイルス価に寄与するパッケージングタンパク質の高レベル発現のために、ラージＴ抗原を含有する。常法としての維持および増殖のために、これらの細胞を、２９３ＦＴ培地（ＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ、２ｍＭのＬ−グルタミンおよび０．１ｍＭのＭＥＭ非必須アミノ酸）において５００μｇ／ｍｌのジェネテシンの存在下で培養する。パッケージングのために、２９３ＦＴ細胞を、トリプシン処理によって収集する。遠心分離によりトリプシンを除去後、これらの細胞を、ジェネテシンを含まない２９３ＦＴ培地において、Ｔ７５フラスコにアリコートに分ける（１５×１０６細胞／フラスコおよび６フラスコ／構築物）。
【０２０４】
レンチウイルスベクターおよび２つのヘルパープラスミドの共トランスフェクションを、細胞をアリコートに分けた直後にＳｕｐｅｒｆｅｃｔ（登録商標）トランスフェクション試薬（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて実施する。翌日、トランスフェクション混合物を含有する培養培地を、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（８ｍｌ／フラスコ）を補充した新鮮な２９３ＦＴ培地に取り換える。レンチウイルス含有上清を形質導入の約４８から７２時間後に収集する。２９３ＦＴ細胞の残渣（debris）を、４℃において１５分間の遠心分離によって上清から除去する。レンチウイルスを濃縮するために、０．４μＭの酢酸セルロース（ＣＡ）膜（Ｃｏｒｎｉｎｇｔｏｎ、１１５ｍｌ 低タンパク質結合）を通して上清をろ過し、７０ｍｌの滅菌ボトル（Ｂｅｃｋｍａｎ、カタログ番号３５５６２２、４５Ｔｉローターだけのためのポリカーボネート）において、４０℃において２．５時間超遠心分離にかける。上清の除去後、ＰＢＳ（各構築物に関して約３００μｌ）を加え、４０℃において８から１４時間、または室温において２時間、遠心管を振動させることによってペレットを再懸濁する。残存する細胞残渣を遠心分離により除去し、再懸濁したレンチウイルスをアリコートに分け、−８０℃において保管した。レンチウイルスは、１種または複数の能力決定因子をコードする配列を担持する。
【０２０５】
１．３ レンチウイルス形質導入後の細胞の再プログラミングおよび能力決定因子の発現
１種または複数の能力決定因子（例えば、Ｏｃｔ４；またはＯｃｔ４とＳｏｘ２の組み合わせ；またはＯｃｔ４、Ｓｏｘ２と、ＮａｎｏｇおよびＬｉｎ２８のうちの少なくとも１つとの組み合わせ；またはＯｃｔ４、Ｋｌｆ４およびｃ−Ｍｙｃの組み合わせ；またはＯｃｔ４、Ｓｏｘ２およびＫｌｆ４の組み合わせ；またはＯＣＴ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４およびｃ−Ｍｙｃの組み合わせ；またはＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、ＮａｎｏｇおよびＬｉｎ２８の組み合わせ；またはＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃ、ＮａｎｏｇおよびＬｉｎ２８の組み合わせ）をコードするレンチウイルスを、最終濃度約６μｇ／ｍｌ（Ｓｉｇｍａ）でポリブレン担体を加えた後、細胞培養液に加える。
【０２０６】
翌日レンチウイルス含有培地を新鮮な培地に取り換え、細胞を適切な培地においてさらに培養する。必要に応じて、形質導入の３日後に薬剤選択を開始する。
【０２０７】
体細胞を因子に曝露した前後に、細胞分取法を使用して細胞を分析する。接着細胞を、トリプシン処理（０．０５％のトリプシン／０．５ｍＭのＥＤＴＡ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により解離させ、２％のパラホルムアルデヒド中で室温において２０分間固定する。細胞を、４０μｍのメッシュを通してろ過し、ＦＡＣＳ緩衝液（２％のＦＢＳおよび０．１％のアジ化ナトリウムを含有するＰＢＳ）に再懸濁する。懸濁液において成長した細胞を、１ｍＭのＥＤＴＡおよび１％の正常マウス血清（Ｓｉｇｍａ）を補充したＦＡＣＳ緩衝液において染色した。細胞内ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）染色を、Ｆｉｘ ＆ Ｐｅｒｍ（登録商標）試薬（Ｃａｌｔａｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）を使用して実施する。５×１０５細胞を含有する約１００μｌの細胞懸濁液を、個々の標識に使用する。（必要に応じて）一次抗体および二次抗体の両方のインキュベーションを室温において約３０分間実施する。対照試料を、アイソタイプ一致対照抗体を用いて染色する。洗浄後、細胞を約３００〜５００μｌのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（ＢＤＩＳ；Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）において、Ｃｅｌｌ Ｑｕｅｓｔ（商標）ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎおよび分析ソフトウェア（ＢＤＩＳ）を使用して分析する。合計で２０，０００事象（event）が得られる。検出されたマーカーは、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ−１−６０、Ｔｒａ−１−８１、ＣＤ２９、Ｔｒａ−１−８５、ＣＤ５６、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ３１またはＣＤ３４から選択される。
【０２０８】
いくつかの形質導入およびその後の培養において、細胞はバルプロ酸の存在下（in the presence or valproic acid）で維持する。
【０２０９】
ＥＢおよび奇形腫の形成をさらに使用して、再プログラム化細胞が３種すべての一次胚葉の分化誘導体を生じるための発生能を有することを実証する。
【実施例２】
【０２１０】
Ｓｔｒｏ−１＋多分化能前駆細胞からの再プログラム化細胞の作製
２．１ 材料および方法
Ｓｔｒｏ−１＋多分化能細胞を濃縮した集団
Ｓｔｒｏ−１＋多分化能前駆細胞が濃縮された細胞集団を、骨髄、脂肪組織および歯髄組織から得た。異なる部位に由来するＳｔｒｏ−１＋多分化能前駆細胞の再プログラミング効率を比較するために、本質的にＧｒｏｎｔｈｏｓおよびＺａｎｎｅｔｔｉｎｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．４４９：４５〜５７ページ（２００８年）に記載のように、これらの組織それぞれに由来する細胞を、ＳＴＲＯ３ ｍＡｂを使用する免疫選択によってＳｔｒｏ−１Ｂｒｉｇｈｔ細胞を濃縮し、その後、培養により増殖し、ＰｒｏＦｒｅｅｚｅＴＭ−ＣＤＭ（Ｌｏｎｚａ、ＵＳＡ）において凍結保存した。異なる免疫選択法を使用して、同じ部位に由来するＳｔｒｏ−１＋多分化能前駆細胞の再プログラミング効率を比較するために、同じドナー由来の対を成す骨髄試料を、ＳＴＲＯ３またはＳＴＲＯ１ｍＡｂのいずれかを使用する免疫選択によってＳｔｒｏ−１Ｂｒｉｇｈｔ細胞を濃縮し、培養により増殖し、ＰｒｏＦｒｅｅｚｅＴＭ−ＣＤＭ（Ｌｏｎｚａ、ＵＳＡ）において凍結保存した。すべての研究に関して、第４継代の細胞を解凍し、即時使用のためにビヒクルにおいて構成した。
【０２１１】
細胞系
ウイルスパッケージング細胞である、プラチナ−Ａ（Ｐｌａｔ−Ａ）細胞を、Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．Ｄｅｔｒｏｉｔ ５５１から得、線維芽細胞は実験のための陽性対照であった。
【０２１２】
レトロウイルスの作製およびｉＰＳ細胞の発生
ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４およびｃＭＹＣのヒトｃＤＮＡを含有する、モロニーに基づくレトロウイルスベクター（ｐＭＸ）を、Ａｄｄｇｅｎｅから得た。９μｇの各プラスミドを、Ｆｕｇｅｎｅ６（Ｒｏｃｈｅ）を使用して、ウイルスパッケージングＰｌａｔ−Ａ細胞にトランスフェクトした。ウイルス含有上清を、トランスフェクトの４８時間後及び７２時間後に収集し、孔径０．４５μｍのフィルターを通してろ過し、４μｇ／ｍｌのポリブレン（Ｓｉｇｍａ）を補充した。標的細胞を、感染２４時間前に１×１０３から５×１０３細胞／ｃｍ２の密度で播種した。４種の転写因子のレトロウイルス上清を等量で混合し、二重感染を２４時間および４８時間において標的細胞に加えた。感染細胞のための培養培地を、感染後４日目にｈＥＳ細胞培地に変えた。細胞は培地において維持し、培地は、３週間まで、または細胞が集密に達するまで毎日新しくした。
【０２１３】
ｉＰＳ細胞の増殖
ｉＰＳ細胞系を確立するために、感染後約３週間目にｈＥＳ細胞様コロニー形態に基づいてｉＰＳ細胞のコロニーを取り上げた。取り上げたコロニーを、ｈＥＳ細胞培地において新鮮な、有糸分裂的に不活性化されたＭＥＦ上で増殖した。
【０２１４】
ｉＰＳ細胞の維持
ヒトｉＰＳ細胞を、２０％のＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１ｍＭのＬ−Ｇｌｕｔａｍａｘ、０．１ｍＭの非必須アミノ酸、０．１ｍＭのβ−メルカプトエタノール、１％のＩＴＳおよび１０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ（すべてＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから）を補充したＤＭＥＭにおいて培養した。ヒトｉＰＳ細胞を、培養培地で毎日再生（refresh）した。機械的解離を、２９Ｇの針を付けた１ｍｌのインスリン注射器を使用して、ｉＰＳ細胞コロニーをより小さい細胞の塊に解体することによって実施した。感染後８から１０日後に、新鮮な有糸分裂的に不活性化したＭＥＦ上にコロニーを移した。ｉＰＳコロニーを、７から１０日ごとに継代し、その後機械的解離を実施した。
【０２１５】
ＦＡＣＳ分析
細胞のトランスフェクション効率を推定するために、上記と同じ方法を使用して、ｐＭＸｓ−ＧＦＰレトロウイルスベクターをＰｌａｔ−Ａ細胞にさらにトランスフェクトした。ＧＦＰ ｃＤＮＡを含有するｐＭＸレトロウイルスは、追加の細胞であった。ＧＦＰを発現する細胞の数を、フローサイトメトリーによって感染４８時間後に評価した。細胞を、０．２５％のトリプシン−ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて５分間解離させ、フローサイトメーター（ＭｏＦＬＯ）を使用して分析した。
【０２１６】
再プログラミング効率のアッセイ
脂肪細胞、歯髄細胞およびＭＰＣを、上記の「Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｉＰＳ Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ」に記載の４種の因子に感染させた。細胞を、１７日間維持し、毎日培地を変えた。次いで細胞を、トリプシンを用いて解離させ、４％のパラホルムアルデヒドを用いて固定した。細胞を、２．５％（ｗ／ｖ）のスキムミルクパウダー、ＰＢＳ中２％（ｖ／ｖ）のヤギ血清を用いてブロックした。細胞を、一次抗体を用いて４℃において一晩標識し、次いで、一次抗体（マウス抗Ｏｃｔ４、抗Ｎａｎｏｇまたは抗ＳＳＥＡ４）を用いて４℃において一晩標識し、その後、ヤギ抗マウスＡｌｅｘａ４８８二次抗体を用いて室温において１時間標識した。試料を、上記のＦＡＣＳによって分析し、陽性に染色された細胞の数を決定した。
【０２１７】
２．２ 結果
すべてのＳｔｒｏ−１＋多分化能前駆細胞が濃縮された集団は、それが歯髄、脂肪組織または骨髄から供給されたかどうかにかかわらず、また、ＳＴＲＯ−３またはＳＴＲＯ−１ｍＡｂｓを用いて免疫選択されたかどうかにかかわらず、再プログラムでき、ｉＰＳ細胞系を作製できる。
【０２１８】
さまざまな細胞の再プログラミングのための結果の要約を、表１に示す。
【０２１９】
【表１】
【０２２０】
ＧＦＰレポーター構築体によって決定したすべての細胞型のトランスフェクション効率は同様であり、７１．２〜９８．３％の範囲であった。プレート当たりに成長するｉＰＳコロニーの数を測定する研究の結果は、Ｄ５５１胎児線維芽細胞に由来する系と比較して、歯髄および脂肪組織を起源とするＳｔｒｏ−１＋多分化能前駆細胞が濃縮された細胞集団に由来する系に関する有意により高い推定ｉＰＳ細胞コロニーの形成を示す。さらに、歯髄および脂肪組織を起源とするＳｔｒｏ−１＋多分化能前駆細胞が濃縮された細胞集団に由来する系に関するｉＰＳ細胞のコロニー形成は、骨髄由来のＳｔｒｏ−１＋多分化能前駆細胞に由来する系より有意に高かった。歯髄および脂肪組織（それぞれ５６および２２）に関する平均コロニー数（／播種された５０，０００細胞）は、Ｄ５５１線維芽細胞（７）または骨髄（０．５）に関して観察されるより優位に高かった（ｐ＜０．０５、カイ二乗検定）。
【０２２１】
Ｄ５５１線維芽細胞と比較してＳｔｒｏ−１＋多分化能前駆細胞からのｉＰＳ発生の効率の増加が、外からトランスフェクトされた遺伝子または誘導性外来遺伝子の持続発現と関係があったかどうかを調べるために、本発明者らは、次にすべての培養されたトランスフェクト細胞集団においてＯｃｔ４およびＮａｎｏｇの発現を測定した。表１に示すように、トランスフェクトされたＤ５５１線維芽細胞は、最も高いレベルのＯｃｔ４の持続発現（６９％）を明示し、歯髄または脂肪組織を起源とするトランスフェクトされたＳｔｒｏ−１＋多分化能前駆細胞は中間レベルのＯｃｔ４発現（それぞれ５７％および５６％）を有し、トランスフェクトされた骨髄Ｓｔｒｏ−１＋多分化能前駆細胞は最も低いレベルのＯｃｔ４発現（３６％）を有した。
【０２２２】
歯髄または脂肪組織を起源とするＳｔｒｏ−１＋多分化能前駆細胞のトランスフェクトされた集団は、Ｎａｎｏｇを発現する細胞の合計数がトランスフェクトされたＤ５５１線維芽細胞（２８％）より低い（それぞれ、５％および１０％）。骨髄Ｓｔｒｏ−１＋多分化能前駆細胞に関しては、対を成す同じ骨髄試料からＳＴＲＯ−３またはＳＴＲＯ−１ｍＡｂを用いて免疫選択されたかどうかにかかわらず、同様のパターンのＯｃｔ４およびＮａｎｏｇの発現が一貫して見られる（Ｏｃｔ４に関してはそれぞれ３０％および３７％ならびにＮａｎｏｇに関してはそれぞれ１７％および２１％）。
【０２２３】
Ｎａｎｏｇ発現の誘導が、中間段階にあるが、必ずしも決定的なｉＰＳ段階には進まないｉＰＳ様コロニーと関連し得ることを示す以前に公開されたデータ（Ｃｈａｎら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２７（１１）：１０３３〜１０３７ページ（２００９年））と併せて、歯髄または脂肪組織を起源とするトランスフェクトされたＳｔｒｏ−１＋多分化能前駆細胞が、Ｄ５５１線維芽細胞より低いＮａｎｏｇ発現を有するが、有意に高いｉＰＳコロニー数を有するという本発明者らの発見は、Ｓｔｒｏ−１＋多分化能前駆細胞が、能力因子への曝露後の決定的なｉＰＳコロニー形成へ進行するためのより許容状態の細胞型を代表することを示す。
【０２２４】
総合して、これらの結果は、
１）トランスフェクション後の同様のＯｃｔ４発現にもかかわらず、歯髄および脂肪組織を起源とするＳｔｒｏ−１＋多分化能前駆細胞が濃縮された細胞集団は、ｉＰＳ細胞コロニーを、対照の線維芽細胞より、より効率的にかつより多数作製し、
２）トランスフェクション後にＮａｎｏｇ発現の誘導が低下したにもかかわらず、歯髄および脂肪組織を起源とするＳｔｒｏ−１＋多分化能前駆細胞が濃縮された細胞集団は、決定的なｉＰＳ細胞コロニーを、対照の線維芽細胞より、より効率的にかつより多数作製し、
３）歯髄および脂肪組織を起源とするＳｔｒｏ−１＋多分化能前駆細胞が濃縮された細胞集団は、骨髄由来のＳｔｒｏ−１＋多分化能前駆細胞が濃縮された細胞集団より、ｉＰＳ細胞コロニーをより効率的に作製したので、組織の起源は、ｉＰＳ細胞コロニーの形成の効率に影響を及ぼし得る、
ことを示す。
【０２２５】
免疫蛍光
歯髄由来のｉＰＳ細胞コロニーは、Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ１−６０およびＴＲＡ１−８１を発現することが免疫蛍光により示された。これらの細胞は、アルカリホスファターゼを発現することがさらに示された。
【０２２６】
脂肪組織由来のｉＰＳ細胞コロニーは、Ｏｃｔ４を発現することが免疫蛍光により示され、アルカリホスファターゼを発現することが示された。
【０２２７】
ｉＰＳ細胞系の遺伝子発現
遺伝子発現研究の結果を表２に提示する。
【０２２８】
要約として、Ｓｔｒｏ−１＋多分化能前駆細胞濃縮細胞集団が歯髄、脂肪組織，または骨髄から得られたかどうかにかかわらず、すべてのＳｔｒｏ−１＋多分化能前駆細胞濃縮細胞集団が、感染前にＫＬＦ４およびｃ−ｍｙｃを内因性に発現した。理論および作用機序に縛られることを好むものではないが、Ｓｔｒｏ−１＋多分化能前駆細胞によるこれらの能力因子の内因性発現は、Ｓｔｒｏ−１＋多分化能前駆細胞を使用したｉＰＳ作製の、線維芽細胞より高い効率を一部説明できる。しかし、さらなる因子は、歯髄又は脂肪組織を起源とするＳｔｒｏ−１＋多分化能前駆細胞において観察されたｉＰＳ系を作製する効率が、骨髄を起源とするものより高いことを説明できる。
【０２２９】
確立された歯のｉＰＳ細胞系は、すべての内因性遺伝子、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、ｃ−ｍｙｃおよびＫｌｆ４を発現した。外因性Ｏｃｔ４およびｃ−ｍｙｃは、第３継代および第８継代で発現停止されたが、Ｓｏｘ２およびＫｌｆ４は発現されたままである。
【０２３０】
第２継代の脂肪ＩＰＳＣは内因性Ｋｌｆ４だけを発現した。外因性Ｏｃｔ４およびｃ−ｍｙｃは発現停止されないままであった。
【０２３１】
第２継代骨髄−ＭＰＣは、いずれの内因性遺伝子の発現も示さなかった。これらの細胞におい発現停止された唯一の外因性遺伝子はＳｏｘ２であった。
【０２３２】
【表２】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
再プログラム化細胞を作製する方法であって、Ｓｔｒｏ−１＋多分化能細胞および／またはその子孫細胞を、細胞を再プログラムするために十分な条件下で１種または複数の能力決定因子に曝露するステップを含む方法。
【請求項２】
再プログラム化細胞を作製する方法であって、Ｓｔｒｏ−１＋多分化能細胞および／またはその子孫細胞が濃縮された細胞の集団を、細胞を再プログラムするために十分な条件下で１種または複数の能力決定因子に曝露するステップを含む方法。
【請求項３】
Ｓｔｒｏ−１＋多分化能細胞および／もしくはその子孫細胞、またはＳｔｒｏ−１＋多分化能細胞および／もしくはその子孫細胞が濃縮された細胞集団が脂肪組織、歯髄組織または骨髄に由来するものである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
再プログラム化細胞を作製するために、曝露された細胞を培養するステップをさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
再プログラム化細胞を単離するステップをさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項６】
Ｓｔｒｏ−１＋多分化能細胞および／またはその子孫細胞よりも広い分化能を有する再プログラム化細胞を得るために、曝露された細胞を培養するステップを含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
１種または複数の能力決定因子が、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、ｃ−Ｍｙｃ、ｂＦＧＦ、ＳＣＦ、ＴＥＲＴ、ＳＶ４０ラージＴ抗原、ＨＰＶ１６Ｅ６、ＨＰＶ１６Ｅ７、Ｂｍｉｌ、Ｆｂｘ１５、Ｅｒａｓ、ＥＣＡＴ１５−２、Ｔｃｌ１、β−カテニン、ＥＣＡＴ１、ＥＳＧ１、Ｄｎｍｔ３Ｌ、ＥＣＡＴ８、Ｇｄｆ３、Ｓｏｘ１５、ＥＣＡＴ１５−１、Ｆｔｈｌ１７、Ｓａｌ１４、Ｒｅｘ１、ＵＴＦ１、Ｓｔｅｌｌａ、Ｓｔａｔ３、およびＧｒｂ２または１種もしくは複数の前記因子と同一もしくは類似の活性を有する化合物からなる群から個別にまたは集約的に選択される、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
１種または複数の能力決定因子が化学物質、ペプチド、ｓｉＲＮＡ、短鎖ヘアピンＲＮＡまたはマイクロＲＮＡである、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
１種または複数の能力決定因子が、
（ｉ）Ｏｃｔ４、
（ｉｉ）Ｏｃｔ４とＳｏｘ２との組み合わせ、
（ｉｉｉ）Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２と、ＮａｎｏｇおよびＬｉｎ２８のうちの少なくとも１つとの組み合わせ、
（ｉｖ）Ｏｃｔ４、Ｋｌｆ４およびｃ−Ｍｙｃの組み合わせ、
（ｖ）Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２およびＫｌｆ４の組み合わせ、
（ｖｉ）Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４およびｃ−Ｍｙｃの組み合わせ、
（ｖｉｉ）Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、ＮａｎｏｇおよびＬｉｎ２８の組み合わせ、
（ｖｉｉｉ）Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃ、ＮａｎｏｇおよびＬｉｎ２８の組み合わせ、ならびに
（ｉｘ）（ｉ）から（ｘ）のうちのいずれか１つと、さらに化学物質、ペプチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたはマイクロＲＮＡとの組み合わせ
からなる群から個別にまたは集約的に選択される、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
Ｓｔｒｏ−１＋多分化能細胞および／またはその子孫細胞が、出生後の哺乳動物から得られる、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
哺乳動物がヒトである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
Ｓｔｒｏ−１＋多分化能細胞および／またはその子孫細胞を１種または複数の能力決定因子に曝露するステップが、プロモーターに作動可能に連結された１種または複数の能力決定因子をコードする配列を含む核酸をＳｔｒｏ−１＋多分化能細胞および／またはその子孫細胞に導入するステップを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１３】
プロモーターに作動可能に連結した異なる能力決定因子をコードする配列をそれぞれが含む複数の核酸を投与するステップを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
核酸が１種または複数のベクターの内部にある、請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１５】
ベクターがウイルスベクターである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
核酸が、Ｓｔｒｏ−１＋多分化能細胞および／またはその子孫細胞のゲノム中に組み込まれない、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
再プログラム化細胞が多能性である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１８】
再プログラム化細胞が、（ｉ）Ｏｃｔ−４、Ｎａｎｏｇ、ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４、Ｔｒａ−１−６０およびＴｒａ−１−８１からなる群から選択される細胞マーカーを発現し、（ｉｉ）多能性細胞に特徴的な形態を示し、および／または（ｉｉｉ）免疫不全動物に導入されると奇形腫を形成する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１９】
請求項１から１８のいずれか一項に記載の方法を実施することによって作製される細胞。
【請求項２０】
請求項１から１８のいずれか一項に記載の方法を実施することによって作製される、多能性細胞が濃縮された細胞集団。
【請求項２１】
多能性細胞が集団の少なくとも６０％を占める、請求項２０に記載の細胞の濃縮集団。
【請求項２２】
請求項１８から２１のいずれか一項に記載の細胞または集団から分化した細胞または細胞集団。
【請求項２３】
異種プロモーターに作動可能に連結された能力決定因子をコードする核酸を含む、Ｓｔｒｏ−１＋多分化能細胞および／またはその子孫細胞。
【請求項２４】
医薬における請求項１９から２３のいずれか一項に記載の細胞または集団の使用。
【請求項２５】
疾患または障害を治療または予防する方法であって、請求項１９から２３のいずれか一項に記載の細胞または集団を、それを必要とする対象に投与するステップを含む方法。
【請求項２６】
疾患または障害の治療または予防において有用な化合物をスクリーニングする方法であって、請求項１９から２３のいずれか一項に記載の細胞または集団を前記化合物に曝露するステップを含む方法。
【請求項１】
再プログラム化細胞を作製する方法であって、Ｓｔｒｏ−１＋多分化能細胞および／またはその子孫細胞を、細胞を再プログラムするために十分な条件下で１種または複数の能力決定因子に曝露するステップを含む方法。
【請求項２】
再プログラム化細胞を作製する方法であって、Ｓｔｒｏ−１＋多分化能細胞および／またはその子孫細胞が濃縮された細胞の集団を、細胞を再プログラムするために十分な条件下で１種または複数の能力決定因子に曝露するステップを含む方法。
【請求項３】
Ｓｔｒｏ−１＋多分化能細胞および／もしくはその子孫細胞、またはＳｔｒｏ−１＋多分化能細胞および／もしくはその子孫細胞が濃縮された細胞集団が脂肪組織、歯髄組織または骨髄に由来するものである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
再プログラム化細胞を作製するために、曝露された細胞を培養するステップをさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
再プログラム化細胞を単離するステップをさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項６】
Ｓｔｒｏ−１＋多分化能細胞および／またはその子孫細胞よりも広い分化能を有する再プログラム化細胞を得るために、曝露された細胞を培養するステップを含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
１種または複数の能力決定因子が、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、ｃ−Ｍｙｃ、ｂＦＧＦ、ＳＣＦ、ＴＥＲＴ、ＳＶ４０ラージＴ抗原、ＨＰＶ１６Ｅ６、ＨＰＶ１６Ｅ７、Ｂｍｉｌ、Ｆｂｘ１５、Ｅｒａｓ、ＥＣＡＴ１５−２、Ｔｃｌ１、β−カテニン、ＥＣＡＴ１、ＥＳＧ１、Ｄｎｍｔ３Ｌ、ＥＣＡＴ８、Ｇｄｆ３、Ｓｏｘ１５、ＥＣＡＴ１５−１、Ｆｔｈｌ１７、Ｓａｌ１４、Ｒｅｘ１、ＵＴＦ１、Ｓｔｅｌｌａ、Ｓｔａｔ３、およびＧｒｂ２または１種もしくは複数の前記因子と同一もしくは類似の活性を有する化合物からなる群から個別にまたは集約的に選択される、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
１種または複数の能力決定因子が化学物質、ペプチド、ｓｉＲＮＡ、短鎖ヘアピンＲＮＡまたはマイクロＲＮＡである、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
１種または複数の能力決定因子が、
（ｉ）Ｏｃｔ４、
（ｉｉ）Ｏｃｔ４とＳｏｘ２との組み合わせ、
（ｉｉｉ）Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２と、ＮａｎｏｇおよびＬｉｎ２８のうちの少なくとも１つとの組み合わせ、
（ｉｖ）Ｏｃｔ４、Ｋｌｆ４およびｃ−Ｍｙｃの組み合わせ、
（ｖ）Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２およびＫｌｆ４の組み合わせ、
（ｖｉ）Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４およびｃ−Ｍｙｃの組み合わせ、
（ｖｉｉ）Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、ＮａｎｏｇおよびＬｉｎ２８の組み合わせ、
（ｖｉｉｉ）Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃ、ＮａｎｏｇおよびＬｉｎ２８の組み合わせ、ならびに
（ｉｘ）（ｉ）から（ｘ）のうちのいずれか１つと、さらに化学物質、ペプチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたはマイクロＲＮＡとの組み合わせ
からなる群から個別にまたは集約的に選択される、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
Ｓｔｒｏ−１＋多分化能細胞および／またはその子孫細胞が、出生後の哺乳動物から得られる、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
哺乳動物がヒトである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
Ｓｔｒｏ−１＋多分化能細胞および／またはその子孫細胞を１種または複数の能力決定因子に曝露するステップが、プロモーターに作動可能に連結された１種または複数の能力決定因子をコードする配列を含む核酸をＳｔｒｏ−１＋多分化能細胞および／またはその子孫細胞に導入するステップを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１３】
プロモーターに作動可能に連結した異なる能力決定因子をコードする配列をそれぞれが含む複数の核酸を投与するステップを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
核酸が１種または複数のベクターの内部にある、請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１５】
ベクターがウイルスベクターである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
核酸が、Ｓｔｒｏ−１＋多分化能細胞および／またはその子孫細胞のゲノム中に組み込まれない、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
再プログラム化細胞が多能性である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１８】
再プログラム化細胞が、（ｉ）Ｏｃｔ−４、Ｎａｎｏｇ、ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４、Ｔｒａ−１−６０およびＴｒａ−１−８１からなる群から選択される細胞マーカーを発現し、（ｉｉ）多能性細胞に特徴的な形態を示し、および／または（ｉｉｉ）免疫不全動物に導入されると奇形腫を形成する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１９】
請求項１から１８のいずれか一項に記載の方法を実施することによって作製される細胞。
【請求項２０】
請求項１から１８のいずれか一項に記載の方法を実施することによって作製される、多能性細胞が濃縮された細胞集団。
【請求項２１】
多能性細胞が集団の少なくとも６０％を占める、請求項２０に記載の細胞の濃縮集団。
【請求項２２】
請求項１８から２１のいずれか一項に記載の細胞または集団から分化した細胞または細胞集団。
【請求項２３】
異種プロモーターに作動可能に連結された能力決定因子をコードする核酸を含む、Ｓｔｒｏ−１＋多分化能細胞および／またはその子孫細胞。
【請求項２４】
医薬における請求項１９から２３のいずれか一項に記載の細胞または集団の使用。
【請求項２５】
疾患または障害を治療または予防する方法であって、請求項１９から２３のいずれか一項に記載の細胞または集団を、それを必要とする対象に投与するステップを含む方法。
【請求項２６】
疾患または障害の治療または予防において有用な化合物をスクリーニングする方法であって、請求項１９から２３のいずれか一項に記載の細胞または集団を前記化合物に曝露するステップを含む方法。
【公表番号】特表２０１２−５２０６６０（Ｐ２０１２−５２０６６０Ａ）
【公表日】平成２４年９月１０日（２０１２．９．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５００００９（Ｐ２０１２−５００００９）
【出願日】平成２２年３月２２日（２０１０．３．２２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＡＵ２０１０／０００３２９
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１０５３１１
【国際公開日】平成２２年９月２３日（２０１０．９．２３）
【出願人】（５０５３６２０８９）メゾブラスト，インコーポレーテッド (9)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年９月１０日（２０１２．９．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年３月２２日（２０１０．３．２２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＡＵ２０１０／０００３２９
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１０５３１１
【国際公開日】平成２２年９月２３日（２０１０．９．２３）
【出願人】（５０５３６２０８９）メゾブラスト，インコーポレーテッド (9)
【Ｆターム（参考）】
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