再生医療骨組成物
【課題】本発明は、新規な再生医療骨組成物の提供を目的とする。
【解決手段】前記目的を達成するために、本発明の再生医療骨組成物は、自己組織化能を有する両親媒性ペプチドを含む。前記両親媒性ペプチドは、適当な電解質存在下において、自己組織化的にナノファイバーを形成してペプチドハイドロゲルとなる。このペプチドハイドロゲルが、生体内において骨形成スカフォールドとして機能する。本発明の再生医療骨組成物は、生体適合性に優れ、また、流動性、付形性に優れるから、例えば、生体内における骨組織又は歯周組織の欠損・損傷部位の修復、復元、再生が可能である。
【解決手段】前記目的を達成するために、本発明の再生医療骨組成物は、自己組織化能を有する両親媒性ペプチドを含む。前記両親媒性ペプチドは、適当な電解質存在下において、自己組織化的にナノファイバーを形成してペプチドハイドロゲルとなる。このペプチドハイドロゲルが、生体内において骨形成スカフォールドとして機能する。本発明の再生医療骨組成物は、生体適合性に優れ、また、流動性、付形性に優れるから、例えば、生体内における骨組織又は歯周組織の欠損・損傷部位の修復、復元、再生が可能である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、再生医療骨組成物（ｔｉｓｓｕｅ−ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｂｏｎｅ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）及び骨組織又は歯周組織の修復、復元、再生医療に関する。
【背景技術】
【０００２】
頭蓋、顎、顔面の復元外科、美容外科、形成外科、整形外科、口腔外科、耳鼻咽喉科、歯科等の分野において、骨組織や歯周組織の欠損・損傷部位の修復、復元、再生のための多くの方法が研究されている。最も一般的な方法は、自己の組織、例えば、脂肪、筋膜、軟骨、骨片等を移植に用いる自家移植である。しかしながら、自家移植は、欠損・損傷部位に対して十分な供給量が得られない場合があるという問題点や、患者に対する負担が大きいという問題点がある。また、同種移植（アロ移植）や異種移植が研究されているが、供給量、免疫反応、感染源の問題が指摘されている。これらの問題を回避するべく、様々な移植材料、例えば、無機系生体吸収材料からなる代用骨材料等についても研究され、β−ＴＣＰ（β−リン酸三カルシウム）やヒドロキシアパタイト（ＨＡ）等のセラミックス材料を使用した移植材料が提案されている（例えば、特許文献１及び２参照）。しかし、これらのセラミックス材料は、吸収に長時間かかり、また、異物反応化されるという問題や、ブロック形状等のため付形性や操作性の問題が指摘されている。
【０００３】
一方、近年、組織工学（ｔｉｓｓｕｅ−ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）を取り入れた再生医療骨（ｔｉｓｓｕｅ−ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｂｏｎｅ）による骨再生方法の開発も盛んである。例えば、多血小板血漿（ＰＲＰ）と間葉系幹細胞（ＭＳＣ）との組合せからなる再生医療骨組成物は、自家移植の侵襲性を回避しつつ、自家移植と同等な成果が得られることが開示されている（例えば、特許文献１及び非特許文献１〜３参照）。
【０００４】
しかしながら、前記ＭＳＣが得られない場合などを考慮すれば、完全な人工合成物であって、生体吸収性、非免疫原性、非感染源性等の生体適合性を満たし、かつ、付形性や操作性に優れた再生医療骨組成物が望まれている。
【特許文献１】特再表ＷＯ２００２／０４００７１号公報
【特許文献２】特表２００５−５２１４４０号公報
【非特許文献１】Ｙａｍａｄａ ｅｔ ａｌ．（２００４） ＴＩＳＳＵＥ ＥＮＧＩＮＥＥＥＲＩＮＧ、Ｖｏｌ．１０、Ｎｏ．５／６、９５５−９６３
【非特許文献２】Ｙａｍａｄａ ｅｔ ａｌ．（２００４） Ｃｌｉｎ．Ｏｒａｌ Ｉｍｐｌ．Ｒｅｓ．、Ｖｏｌ．１５、５８９−５９７
【非特許文献３】Ｉｔｏ ｅｔ ａｌ．（２００５） Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．Ａ．、Ｖｏｌ．７３、Ｎｏ．１、６３−７２
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
そこで、本発明は新規な再生医療骨組成物の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
前記目的を達成するために、本発明の再生医療骨組成物は、自己組織化能を有する両親媒性ペプチドを含むことを特徴とする再生医療骨組成物である。
【発明の効果】
【０００７】
本発明の再生医療骨組成物は、生体適合性に優れ、また、流動性、付形性に優れるから、例えば、生体内の骨組織又は歯周組織の欠損・損傷部位の修復、復元、再生が可能である。したがって、本発明の再生医療骨組成物によれば、自家移植に比べて侵襲性が軽減された骨・歯周組織の再生医療が可能となる。さらに、従来の再生医療骨組成物である前記ＰＲＰや前記ＭＳＣ等と組合せが可能であり、それにより、例えば、骨形成における骨の形成量や骨の成熟速度をよりいっそう向上でき、また、治癒時間もよりいっそう短縮できる。なお、本発明において、骨形成とは、骨組織又は歯周組織の欠損・損傷部位の修復、復元又は再生を含む。また、本発明の再生医療骨組成物が適用される分野は特に制限されず、例えば、頭蓋、顎、顔面の復元外科、美容外科、形成外科、整形外科、口腔外科、耳鼻咽喉科、歯科等の分野に適用でき、ヒト及び非ヒト動物に適用できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明の再生医療骨組成物は、前記両親媒性ペプチドが、ペプチドハイドロゲルを形成していることが好ましい。
【０００９】
本発明の再生医療骨組成物は、さらに、多血小板血漿（ＰＲＰ）又は様々な成長因子と組合せることが好ましい。また、本発明の再生医療骨組成物は、さらに、骨形成能を有する細胞又は間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を含むことが好ましい。本発明に再生医療骨組成物は、さらに、細胞外マトリクス（ＥＣＭ）タンパク質を含んでもよい。
【００１０】
本発明の再生医療骨組成物は、骨組織又は歯周組織の欠損・損傷部位の修復、復元又は再生の用途に使用することが好ましい。前記歯周組織の修復、復元又は再生は、デンタルインプラントの挿入に必要な修復、復元又は再生であってもよい。
【００１１】
本発明の再生医療骨組成物は、使用時に流動性を有することが好ましく、また、本発明の再生医療骨組成物の、骨組織又は歯周組織の欠損・損傷部位への配置は、注射器又はカテーテルによる注入で行われることが好ましい。
【００１２】
以下に、本発明の再生医療骨組成物について説明する。
【００１３】
（自己組織化能を有する両親媒性ペプチド）
本発明の再生医療骨組成物に含まれる組織化能を有する両親媒性ペプチド（Ｓｅｌｆ−Ａｓｓｅｍｂｌｉｎｇ Ａｍｐｈｉｐｈａｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅ）は、疎水性アミノ酸残基と親水性アミノ酸残基とが一定周期で交互に配置されて疎水性側鎖の非極性の面と親水性側鎖の極性の面とを備える。そして、前記両親媒性ペプチドは、適当な電解質存在下において、自己組織化的にナノファイバーを形成し、その結果、ペプチドナノファイバーからなるペプチドハイドロゲルを形成する。
【００１４】
前記両親媒性ペプチドにおいて、前記親水性アミノ酸残基は、その側鎖のチャージが正のものと負のものとが一定周期で交互に配置され、前記極性の面が、イオン的に相補的であることが好ましい。前記両親媒性ペプチドの自己組織化能に関与するペプチド間の相互作用の一例を図１に示す。図１は、ＫＬＤＬＫＬＤＬＫＬＤＬ（配列番号１）というアミノ酸配列からなる３本の両親媒性ペプチドの相互作用を示す模式図である。前記両親媒性ペプチドは、電解質が存在する水溶液中で、多数の相互作用によって自己組織化する。前記相互作用には、例えば、隣接しているペプチドにおける正チャージのアミノ酸（リジン：Ｋ）側鎖と負チャージのアミノ酸（アスパラギン酸：Ｄ）側鎖とが形成する相補的なイオン対が含まれる。また、図示していないが、例えば、アスパラギンやグルタミン等の親水性アミノ酸残基の非チャージ側鎖であれば、水素結合総合作用に関与する。隣接しているペプチドにおける疎水性側鎖は、ファンデルワールス相互作用に関与する。ペプチド骨格上のアミノ基及びカルボニル基もまた分子間水素結合相互作用に関与しうる。前記正チャージ側鎖のアミノ酸残基としては、アルギニン：Ｒ、リジン：Ｋ、ヒスチジン：Ｈがあげられ、前記負チャージ側鎖のアミノ酸残基としては、アスパラギン酸：Ｄ、グルタミン酸：Ｅがあげられ、非チャージ親水性側鎖のアミノ酸残基としては、アスパラギン：Ｎ、グルタミン：Ｑ、セリン：Ｓ、トレオニン：Ｔ、チロシン：Ｙがあげられ、疎水性側鎖のアミノ酸残基としては、アラニン：Ａ、グリシン：Ｇ、バリン：Ｖ、ロイシン：Ｌ、イソロイシン：Ｉ、プロリン：Ｐ、フェニルアラニン：Ｆ、メチオニン：Ｍ、トリプトファン：Ｗ、システイン：Ｃがあげられる。
【００１５】
前記両親媒性ペプチドにおいて、疎水性アミノ酸残基と親水性アミノ酸残基との配置の一定周期は、例えば、１残基、２残基、３残基、４残基の交互配置であってよく、好ましくは、１個のアミノ酸残基の交互配置である。
【００１６】
前記両親媒性ペプチドにおいて、親水性アミノ酸残基の側鎖が、イオン的に相補的である場合、その正負のチャージの配列に応じてモジュールＩ〜ＩＶ等にクラス分けできる。すなわち、正チャージアミノ酸残基と負チャージアミノ酸残基の交互配置の一定周期が、１残基（−＋−＋−＋−＋）、２残基（−−＋＋−−＋＋）、３残基（−−−＋＋＋）及び４残基（−−−−＋＋＋＋）である場合を、それぞれ、モジュールＩ、モジュールＩＩ、モジュールＩＩＩ及びモジュールＩＶという。なお、各モジュールにおいて、正負チャージの順番は逆でもよい。
【００１７】
両親媒性ペプチドの長さは、例えば、８〜２００アミノ酸残基であって、好ましくは、８〜３６アミノ酸残基であり、より好ましくは、８〜１６アミノ酸残基である。また、前記両親媒性ペプチドのＮ末端側は、アセチル化されていてもよい。前記両親媒性ペプチドの製造方法は、特に制限されず、例えば、従来公知の化学合成方法により合成する方法があげられる。
【００１８】
本発明の再生医療骨組成物に含まれる前記両親媒性ペプチドは、一種類でもよく、複数種類でもよい。複数種類の場合、β−シート状の構造に自己組織化する両親媒性ペプチドを少なくとも一種類含むことが好ましい。そのようなβ−シート状の構造に自己組織化する両親媒性ペプチドは、例えば、米国特許ＵＳ５，９５５，３４３、米国特許ＵＳ５，６７０，４８３、特表２００５−５１５７９６号公報（国際公開ＷＯ２００２／０６２９６１号パンフレット）に開示されており、その一例を下記表１に示す。
【００１９】
【表１】
【００２０】
（ペプチドハイドロゲル）
本発明において、ペプチドハイドロゲルは、前記両親媒性ペプチドが自己組織化によりナノファイバーを形成した結果として得らるものである。このペプチドハイドロゲルは、ｉｎ ｖｉｖｏで、骨形成のスカフォールド（足場）として機能しうる。前記ナノファイバーとは、前記両親媒性ペプチドが、例えば、らせん状のβ−シート構造をとったものである。前記ナノファイバーの直径は、例えば、５００ｎｍ以下、１００ｎｍ未満、５０ｎｍ未満、２０ｎｍ未満、１０ｎｍ〜２０ｎｍ、５ｎｍ〜１０ｎｍ、５ｎｍ未満である。
【００２１】
前記ペプチドハイドロゲルを形成する方法としては、例えば、水溶液中の前記両親媒性ペプチドの最終濃度を、０．５ｗｔ％〜５．０ｗｔ％、好ましくは、０．５ｗｔ％〜３．０％、より好ましくは、０．５ｗｔ％〜１．０ｗｔ％とし、前記水溶液の塩濃度（例えば、ＮａＣｌ）を、５ｍＭ〜５Ｍとする方法があげられる。前記水溶液の好ましいバッファーとしては、例えば、生理食塩水、ＰＢＳ等があげられる。
【００２２】
前記ペプチドハイドロゲルを形成するための前記水溶液は、さらに、等浸透圧性溶質を含むことが好ましい。前記等浸透圧性溶質とは、前記水溶液中に溶解された非イオン性化合物をいう。前記等浸透圧性溶質としては、例えば、単糖類や二糖類等の糖類があげられ、そのなかでも、スクロース、グルコース、ガラクトース、フルクトース、リボース、マンノース、アラビノース、キシロース等が好ましい。前記等浸透圧性溶質の濃度は、例えば、５０ｍＭ、１５０ｍＭ、３００ｍＭ、２００〜２５０ｍＭ、２５０〜２７０ｍＭ、２７０〜３００ｍＭ、３００〜４００ｍＭ、４００〜５００ｍＭ、５００〜６００ｍＭ、６００〜７００ｍＭ、７００〜８００ｍＭ、８００〜９００ｍＭである。その他の等浸透圧性溶質としては、例えば、５〜２０％（ｖ／ｖ）のグリセロールがあげられる。前記水溶液のｐＨは、例えば、７．０である。
【００２３】
前記ペプチドハイドロゲルは、注射器やカテーテルで注入可能な程度の流動性を備えることが好ましい。
【００２４】
前記ペプチドハイドロゲルの水分含有量は、例えば、９９％を超え、好ましくは、９９．５％〜９９．９％である。また、前記ペプチドハイドロゲルは、優れた生体適合性を示すことが好ましい。すなわち、哺乳類動物においては、検出可能な免疫応答や炎症応答を誘発せず、また、生理食塩水条件下では、検出可能な膨張性を示さないことが好ましい。前記ペプチドハイドロゲルの孔サイズは、例えば、５０ｎｍ〜４００ｎｍである。前記ペプチドハイドロゲルは、生体内分解性があり、骨形成とともに吸収される。その分解期間は、例えば、２〜８週間である。前記分解期間は、前記両親媒性ペプチドに、例えば、プロテアーゼによる切断部位を導入するなどして調整可能である。また、完全人工合成が可能であるから、他の動物由来材料と異なり病原菌の感染のおそれを排除できる。
【００２５】
前記両親媒性ペプチドとしては、市販製品である商品商標「ＰｕｒａＭａｔｒｉｘTM」（３−Ｄ Ｍａｔｒｉｘ Ｊａｐａｎ社製）を使用でき、前記ペプチドハイドロゲルとしては、市販製品である商品商標「ＰｕｒａＭａｔｒｉｘTM Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｈｙｄｒｏｇｅｌ」（同社製）を使用できる。
【００２６】
（ＰＲＰ：多血小板血漿）
本発明の再生医療骨組成物は、その他の態様として、前記両親媒性ペプチドに加え、さらに、ＰＲＰ（多血小板血漿）を含んでもよい。ＰＲＰは、血小板を豊富に含む血漿であり、換言すれば、血小板が濃縮された血漿をいう。ＰＲＰは、例えば、商品名：濃厚血小板「日赤」（日本赤十字社製）に準じるものであり、採取した血液を遠心分離処理するなどして調製できる。具体的には、例えば、まず、採取した血液にクエン酸ナトリウム等の凝固防止剤を添加し、室温で所定時間放置する。その後、血球及びバフィーコートが分離する条件（例えば、約１，１００ｒｐｍ）で遠心処理する。これにより、２層（上層を、Ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｐｏｏｒ Ｐｌａｓｍａ：ＰＰＰともいう。下層には、血球及びバフィーコートが含まれる）に分離される。前記上層のＰＰＰを取り除いた後、更に、赤血球が分離される条件（例えば、約２，５００ｒｐｍ）で遠心処理する。その結果得られた赤血球を実質的に含まない画分（Ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｒｉｃｈ Ｐｌａｓｍａ：ＰＲＰ）を採取する。ＰＲＰの調製方法は、この方法に限定されず、必要に応じて修正を加えた方法により調製することができる。ＰＲＰに含まれる血小板の量についての一般的な定義はないが、採取した血液に比較して約２倍〜約２０倍の血小板を含有することが好ましい。なお、その調製が可能であり、かつ調製に際して非現実的な負担のない限りにおいて、血小板の含有量は、できるだけ豊富なものを用いることが好ましい。ＰＲＰは、自己由来のＰＲＰであることが好ましい。毒性ないし免疫拒絶反応を回避できるからである。
【００２７】
ＰＲＰに豊富に含まれる血小板及びフィブリノーゲンをトロンビン等を用いてゲル化させたＰＲＰゲルは、前記ペプチドハイドロゲルと共役して骨形成のスカフォールドとして機能しうる。ＰＲＰは、また、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）等の成長因子を豊富に含み、これらの成長因子もまた、骨形成に寄与すると考えられる。本発明の再生骨組成物は、さらにその他の態様として、ＰＲＰに代えて、ＰＤＧＦやＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、骨誘導因子（ＢＭＰ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）−Ｉ、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）等の成長因子と組合せたものあってもよい。
【００２８】
（骨形成能を有する細胞）
本発明の再生医療骨組成物は、その他の態様として、前記両親媒性ペプチドに加え、さらに、骨形成能を有する細胞を含むことが好ましい。より好ましくは、本発明の再生医療骨組成物は、その他の態様として、前記両親媒性ペプチドに加え、ＰＲＰ及び骨形成能を有する細胞を含む。なお、この態様において、前述のとおり、前記ＰＲＰに代えて、各種成長因子を使用してもよい。
【００２９】
骨形成能を有する細胞とは、骨組織を形成しうる細胞をいい、骨芽細胞、前骨芽細胞、並びに、骨系細胞への分化能を獲得した間葉系幹細胞（ＭＳＣ）及び胚性幹細胞（ＥＳ細胞）等があげられる。本発明の再生医療骨組成物に含まれる前記骨形成能を有する細胞は、前記いずれかの細胞を使用してもよく、前記細胞を任意に組合せたものを使用してもよい。これらの中でも、骨系細胞への分化能を獲得したＭＳＣを使用することが好ましい。ここで、「骨系細胞への分化能を獲得した」とは、未分化状態のＭＳＣが、骨系細胞へ分化すべく方向付けされた状態をいう。骨系細胞への分化能を獲得したＭＳＣは、自家細胞であることが好ましいが、同種他家細胞であってもよく、ヒトＭＳＣ由来の細胞を利用できる。
【００３０】
骨系細胞への分化能を獲得したＭＳＣは、例えば、体内から採取した未分化ＭＳＣを、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、骨系細胞への分化を誘導する条件下で培養することで調製できる。前記骨系細胞への分化を誘導する培地としては、例えば、β−グリセロリン酸、デキサメタゾン及びＬ−アスコルビン酸を含む培地があげられる。但し、培養条件としては、これに限定されず、従来公知の骨系細胞への分化を誘導する条件を適用できる。前記未分化ＭＳＣの供給源としては、例えば、骨髄、骨膜、歯髄、さい帯血、脂肪、末梢血等があげられる。これらの従来公知の方法で採取した後、ＭＳＣをその接着性の有無に基づき選択する。すなわち、骨髄等に含まれる細胞の中で、接着性を有するもの等を選択することにより未分化ＭＳＣを得ることができる。
【００３１】
骨系細胞への分化能を獲得したＭＳＣは、前記ペプチドハイドロゲルをスカフォールドとして生体内で骨形成をすることができる。未分化ＭＳＣの骨系細胞への分化誘導は、前記ペプチドハイドロゲル内でｉｎ ｖｉｔｒｏで行って本発明の再生医療骨組成物としてもよく、または、別途ｉｎ ｖｉｔｒｏで誘導した骨系細胞への分化能を獲得したＭＳＣを、前記両親媒性ペプチド若しくは前記ペプチドハイドロゲルと混合して本発明の再生医療骨組成物としてもよい。また、前記骨系細胞への分化能を獲得したＭＳＣは、凍結乾燥処理をしたものであってもよい。本発明の再生医療骨組成物における前記ＭＳＣの細胞数としては、例えば、組成物１ｍＬあたり１×１０5細胞以上であって、好ましくは、１×１０6〜１×１０7細胞である。
【００３２】
本発明の再生医療骨組成物は、少なくとも使用時において流動性を有しておればよく、使用前においては粉状ないし固形状であっても良い。したがって、凍結した状態をもって本発明の再生医療骨組成物とすることができる。また、凍結乾燥した状態をもって本発明の再生医療骨組成物とすることもできる。使用前において凍結状態又は凍結乾燥状態とすることにより長期の保存が可能となり、また、使用前の取扱いも容易となる。さらには、凍結処理又は凍結乾燥処理により抗原性の低下が期待できるため、自家のＰＲＰではなく同種の他家のＰＲＰを用いた場合の安全性向上される。前記流動性は、例えば、本発明の再生医療骨組成物を、注射器やカテーテルにて注入可能な程度であることが好ましい。
【００３３】
本発明の再生医療骨組成物は、その他の態様として、細胞外マトリクス（ＥＣＭ）タンパク質を含んでもよい。前記ＥＣＭは、自家であることが好ましいが、同種他家であってよい。また、本発明の再生医療骨組成物は、ゲル化材料、例えば、トロンビンや塩化カルシウムを含んでもよい。これらを含むことにより、トロンビンがＰＲＰ中のフィブリノーゲンに作用し、フィブリンが生ずる。そして、フィブリンの凝集作用により粘性が増加する。前記ゲル化剤の種類は特に限定されず、上記のようにＰＲＰ中の成分に作用して粘性を増加させるもの、又はそれ自身により増粘効果を奏するものを適宜選択して用いることができる。また、前記ゲル化材料に加えて、適用後（移植後）に作用して本発明の再生医療骨組成物の流動性（粘度）を変化させる第２のゲル化材料を併用することもできる。使用時には適度な流動性を有するために移植が容易であり、かつ、適用後にはより粘度が増すことにより適用部位における定着性が向上し、骨形成が効果的となる。前記ゲル化材料としては、その他に、コラーゲンやフィブリン糊等があげられる。さらに、本発明の再生医療骨組成物は、アルギン酸ナトリウム等の増粘多糖類、グリセリン、ワセリン等の増粘剤を含んでもよい。
【００３４】
本発明の再生医療骨組成物は、骨組織又は歯周組織における欠損部位や損傷部位の、修復、復元又は再生の用途に使用できる。また、デンタルインプラント治療においても、デンタルインプラントを挿入するための骨移植が必要になる場合あり、そのような場合にも、本発明の再生医療骨組成物を使用して、骨移植の治癒時間の短縮をすることができる。なお、本発明の再生医療骨組成物の適用分野は、特に制限されず、例えば、頭蓋、顎、顔面の復元外科、美容外科、形成外科、整形外科、口腔外科、耳鼻咽喉科、歯科等の分野に適用できる。
【００３５】
したがって、本発明は、その他の態様として、骨組織又は歯周組織の再生医療方法若しくは再生法であって、本発明の再生医療骨組成物を使用して、例えば、ヒト及び非ヒト動物の骨形成することを含む方法である。さらに、本発明は、その他の態様として、デンタルインプラント治療方法であって、本発明の再生医療骨組成物を使用して、例えば、ヒト及び非ヒト動物の骨組織又は歯周組織の形成又は再生をする工程を含む治療方法である。また、本発明は、その他の態様として、骨組織又は歯周組織の再生医療方法若しくは再生法、又は、デンタルインプラント治療方法における本発明の再生医療骨組成物の使用である。
【００３６】
さらに、本発明は、その他の態様として、骨組織又は歯周組織の再生医療方法若しくは再生法、又は、デンタルインプラント治療方法のためのキットであって、前記両親媒性ペプチドを含むキットである。前記キットは、さらに、凍結乾燥又は凍結した前記ＭＳＣ、ＰＲＰ等や、試薬等を含んでもよい。
【００３７】
以下に、本発明を実施例により説明する。
【実施例１】
【００３８】
イヌを使用した実験系をデザインして、本発明の再生医療骨組成物が生体内の骨形成に使用できることを確認した。前記実験系の説明図を図２に示す。イヌの下顎に、直径１０ｍｍ、深さ１０ｍｍの骨欠損を形成し、この欠損部位に本発明の再生医療骨組成物を含む様々な移植材料を注入して骨形成能力を確認した。
【００３９】
（イヌ実験動物モデル）
実験動物の取扱いは、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅで承認されたプロトコールにしたがった。一定期間飼育後、平均２歳の４体の成体ハイブリッドイヌを全身麻酔して、第一大臼歯、小臼歯、第２及び第３小臼歯を抜歯し、２ヶ月の治癒期間を与えた。次に、下顎の両側の歯槽骨に直径１０ｍｍのトリファンバーを用いて骨欠損を作成した。この欠損部位は、外側皮質に垂直になるように作成した。前記欠損部位は、自然には骨が再生することが困難な骨欠損である。
【００４０】
（自己組織化能を有する両親媒性ペプチド）
自己組織化能を有する両親媒性ペプチドとして、市販製品である商品商標「ＰｕｒａＭａｔｒｉｘTM」（３−Ｄ Ｍａｔｒｉｘ Ｊａｐａｎ社製）を使用した。このペプチドは、Ｎ末端がアセチル化された１６アミノ酸残基のアミノ酸配列（ＲＡＤＡＲＡＤＡＲＡＤＡＲＡＤＡ：配列表の配列番号２）からなるモジュールＩ型の両親媒性ペプチドである。以下、このペプチドをＰＭという。
【００４１】
（ＰＭのペプチドハイドロゲル化）
ＰＭのペプチドハイドロゲル化は、超音波処理後、スクロース溶液に溶解したＰＭに、ＰＢＳを添加することで行った。最終スクロース濃度は、１０％であり、最終ＰＭ濃度は、１．０６％であり、最終塩濃度は、１．１８％であった。
【００４２】
（骨系細胞への分化能を獲得したＭＳＣの調製）
イヌ腸骨稜の骨髄穿刺（１０ｍｌ）により未分化ＭＳＣを含むイヌの骨髄を採取した。次に、骨髄細胞を、基本培地、低グルコースＤＭＥＭ、増殖サプリメント（Ｃａｍｂｒｅｘ社製）で培養し、３つのサプリメント（デキサメタゾン、β−グリセロリン酸ナトリウム、及びＬ−アスコルビン酸２リン酸）によって、ＭＳＣの骨系細胞への分化を誘導した。骨系細胞への分化能を獲得したＭＳＣは、ｐ−ニトロフェニルホスファターゼを基質として使用したアルカリホスファターゼ活性を検出することで確認した。ＭＳＣは、移植に使用する前にトリプシン処理を施した。
【００４３】
（ＰＲＰの調製）
イヌ末梢血から、約５０ｍＬの全血を採取し、２５０Ｕ／ｍＬの防腐剤フリーのヘパリン及び１０ｍＬの培地を含む遠心管に回収した。５分間、１１００ｒｐｍの遠心分離の後、イエロープラズマ（血小板及び白血球とともにバフィーコートを含む）を長いカニューレで中性のモノベットに回収し、１０分間、２５００ｒｐｍの遠心分離で血小板を単一ペレットとした。この上清がＰＰＰであり、前記ペレットがＰＲＰである。前記ＰＲＰは、５ｍＬの残存血漿にリサスペンドし、ＰＲＰのゲル化に使用した。
【００４４】
（ＰＲＰのゲル化）
ＰＲＰのゲル化は、３．５ｍＬの前記ＰＲＰに、５００μＬのトロンビン／塩化カルシウム溶液を添加し、気泡を含ませながら混合することで行った。前記トロンビン／塩化カルシウム溶液は、１０ｍＬの１０％塩化カルシウム溶液に、１０，０００Ｕのウシトロンビンを溶解して調製した。ＰＲＰのゲル化は、必要に応じて、骨系細胞への分化能を獲得した前記ＭＳＣ（１．０×１０7細胞／ｍＬ）、及び／又は、前記ＰＭハイドロゲルを混合して行った。
【００４５】
（移植材料の移植）
ＰＭハイドロゲル単独、ＰＭハイドロゲル／ＭＳＣ、及び、ＰＭハイドロゲル／ＭＳＣ／ＰＲＰゲルの組合せの移植材料をそれぞれ調製し、これらの移植片を、欠損をコントロールとして、前記欠損部位に移植して、歯肉を縫合し、２週後、４週後、８週後の組織を採取し、組織学的に評価した。各組織のＨＥ（ヘマトキシリン−エオシン）染色による顕微鏡観察写真を図３Ａ〜３Ｄに示す。
【００４６】
（結果）
コントロールは、図３Ａに示すとおり、２週、４週、８週ともに、新生骨の形成は認められず、結合組織の増生のみが認められた。
【００４７】
ＰＭハイドロゲルを移植した場合、図３Ｂに示すとおり、２週目において新生骨の形成が認められた。ＰＭハイドロゲルのスカフォールドは、４週目まで残留していた。また、８週目においても、骨は未成熟であった。
【００４８】
ＰＭハイドロゲル／ＭＳＣを移植した場合、図３Ｃに示すとおり、２週目において新生骨の形成が認められた。ＰＭハイドロゲルのスカフォールドは、２週目まで残留していた。しかし、新生骨の形成量、及び、骨の成熟速度は、前記２例を超え、８週目において、成熟骨特有の層板構造が観察された。
【００４９】
ＰＭハイドロゲル／ＭＳＣ／ＰＲＰゲルを移植した場合、図３Ｄに示すとおり、２週目において新生骨の形成が認められた。ＰＭハイドロゲルのスカフォールドは、２週目まで残留していたがその男残存は前記例よりも少なかった。新生骨の形成量、及び、骨の成熟速度は、前記３例を超え、８週目において、成熟骨特有の層板構造が観察された。
【００５０】
以上のことから、ＰＭハイドロゲルは、骨形成スカフォールドとして機能しうることが確認された。
【００５１】
（比較例）
移植材料として、天然ウシ骨ミネラルからなる市販の代替骨である登録商標Ｂｉｏ−Ｏｓｓ（Ｏｓｔｅｏｈｅａｌｔｈ社製）を使用した他は、実施例１と同様に、欠損をコントロールとして、登録商標Ｂｉｏ−Ｏｓｓを前記欠損部位に移植して、歯肉を縫合し、２週後、４週後、８週後の組織を採取し、組織学的に評価した。各組織のＨＥ（ヘマトキシリン−エオシン）染色による顕微鏡観察写真を図４Ａ及び４Ｂに示す。
【００５２】
コントロールは、図４Ａに示すとおり、２週、４週、８週ともに、新生骨の形成は認められず、結合組織の増生のみが認められた。また、登録商標Ｂｉｏ−Ｏｓｓを移植した場合も同様に、図４Ｂに示すとおり、２週、４週、８週ともに、登録商標Ｂｉｏ−Ｏｓｓが残留しており、新生骨の形成は認められなかった。登録商標Ｂｉｏ−Ｏｓｓの場合、新生骨の形成が認められたのは、移植後１２週からであった（データ示さず）。
【００５３】
したがって、本発明の再生医療骨組成物は、前記ＰＭハイドロゲル単独であっても、従来の代替骨に比べて骨形成における骨の形成量や骨の成熟速度をよりいっそう向上でき、また、治癒時間もよりいっそう短縮できることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００５４】
以上、説明したとおり、本発明の再生医療骨組成物は、例えば、頭蓋、顎、顔面の復元外科、美容外科、形成外科、整形外科、口腔外科、耳鼻咽喉科、歯科等の分野において、骨組織や歯周組織の欠損・損傷部位の修復、復元、再生のための使用に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】図１は、自己組織化能を有する両親媒性ペプチド間の相互作用を説明する模式図である。
【図２】図２は、実施例における実験系を説明する模式図である。
【図３Ａ】図３Ａは、実施例において骨の欠損部位（コントロール）の顕微鏡観察写真の一例である。
【図３Ｂ】図３Ｂは、実施例においてＰＭハイドロゲルを移植した場合の顕微鏡観察写真の一例である。
【図３Ｃ】図３Ｃは、実施例においてＰＭハイドロゲル／ＭＳＣを移植した場合を移植した場合の顕微鏡観察写真の一例である。
【図３Ｄ】図３Ｄは、実施例においてＰＭハイドロゲル／ＭＳＣ／ＰＲＰゲルを移植した場合を移植した場合の顕微鏡観察写真の一例である。
【図４Ａ】図４Ａは、比較例において骨の欠損部位（コントロール）の顕微鏡観察写真の一例である。
【図４Ｂ】図４Ｂは、比較例において代替骨である登録商標Ｂｉｏ−Ｏｓｓを移植した場合の顕微鏡観察写真の一例である。
【配列表フリーテキスト】
【００５６】
配列番号１〜１８ 自己組織化能を有する両親媒性ペプチド
【技術分野】
【０００１】
本発明は、再生医療骨組成物（ｔｉｓｓｕｅ−ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｂｏｎｅ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）及び骨組織又は歯周組織の修復、復元、再生医療に関する。
【背景技術】
【０００２】
頭蓋、顎、顔面の復元外科、美容外科、形成外科、整形外科、口腔外科、耳鼻咽喉科、歯科等の分野において、骨組織や歯周組織の欠損・損傷部位の修復、復元、再生のための多くの方法が研究されている。最も一般的な方法は、自己の組織、例えば、脂肪、筋膜、軟骨、骨片等を移植に用いる自家移植である。しかしながら、自家移植は、欠損・損傷部位に対して十分な供給量が得られない場合があるという問題点や、患者に対する負担が大きいという問題点がある。また、同種移植（アロ移植）や異種移植が研究されているが、供給量、免疫反応、感染源の問題が指摘されている。これらの問題を回避するべく、様々な移植材料、例えば、無機系生体吸収材料からなる代用骨材料等についても研究され、β−ＴＣＰ（β−リン酸三カルシウム）やヒドロキシアパタイト（ＨＡ）等のセラミックス材料を使用した移植材料が提案されている（例えば、特許文献１及び２参照）。しかし、これらのセラミックス材料は、吸収に長時間かかり、また、異物反応化されるという問題や、ブロック形状等のため付形性や操作性の問題が指摘されている。
【０００３】
一方、近年、組織工学（ｔｉｓｓｕｅ−ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）を取り入れた再生医療骨（ｔｉｓｓｕｅ−ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｂｏｎｅ）による骨再生方法の開発も盛んである。例えば、多血小板血漿（ＰＲＰ）と間葉系幹細胞（ＭＳＣ）との組合せからなる再生医療骨組成物は、自家移植の侵襲性を回避しつつ、自家移植と同等な成果が得られることが開示されている（例えば、特許文献１及び非特許文献１〜３参照）。
【０００４】
しかしながら、前記ＭＳＣが得られない場合などを考慮すれば、完全な人工合成物であって、生体吸収性、非免疫原性、非感染源性等の生体適合性を満たし、かつ、付形性や操作性に優れた再生医療骨組成物が望まれている。
【特許文献１】特再表ＷＯ２００２／０４００７１号公報
【特許文献２】特表２００５−５２１４４０号公報
【非特許文献１】Ｙａｍａｄａ ｅｔ ａｌ．（２００４） ＴＩＳＳＵＥ ＥＮＧＩＮＥＥＥＲＩＮＧ、Ｖｏｌ．１０、Ｎｏ．５／６、９５５−９６３
【非特許文献２】Ｙａｍａｄａ ｅｔ ａｌ．（２００４） Ｃｌｉｎ．Ｏｒａｌ Ｉｍｐｌ．Ｒｅｓ．、Ｖｏｌ．１５、５８９−５９７
【非特許文献３】Ｉｔｏ ｅｔ ａｌ．（２００５） Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．Ａ．、Ｖｏｌ．７３、Ｎｏ．１、６３−７２
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
そこで、本発明は新規な再生医療骨組成物の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
前記目的を達成するために、本発明の再生医療骨組成物は、自己組織化能を有する両親媒性ペプチドを含むことを特徴とする再生医療骨組成物である。
【発明の効果】
【０００７】
本発明の再生医療骨組成物は、生体適合性に優れ、また、流動性、付形性に優れるから、例えば、生体内の骨組織又は歯周組織の欠損・損傷部位の修復、復元、再生が可能である。したがって、本発明の再生医療骨組成物によれば、自家移植に比べて侵襲性が軽減された骨・歯周組織の再生医療が可能となる。さらに、従来の再生医療骨組成物である前記ＰＲＰや前記ＭＳＣ等と組合せが可能であり、それにより、例えば、骨形成における骨の形成量や骨の成熟速度をよりいっそう向上でき、また、治癒時間もよりいっそう短縮できる。なお、本発明において、骨形成とは、骨組織又は歯周組織の欠損・損傷部位の修復、復元又は再生を含む。また、本発明の再生医療骨組成物が適用される分野は特に制限されず、例えば、頭蓋、顎、顔面の復元外科、美容外科、形成外科、整形外科、口腔外科、耳鼻咽喉科、歯科等の分野に適用でき、ヒト及び非ヒト動物に適用できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明の再生医療骨組成物は、前記両親媒性ペプチドが、ペプチドハイドロゲルを形成していることが好ましい。
【０００９】
本発明の再生医療骨組成物は、さらに、多血小板血漿（ＰＲＰ）又は様々な成長因子と組合せることが好ましい。また、本発明の再生医療骨組成物は、さらに、骨形成能を有する細胞又は間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を含むことが好ましい。本発明に再生医療骨組成物は、さらに、細胞外マトリクス（ＥＣＭ）タンパク質を含んでもよい。
【００１０】
本発明の再生医療骨組成物は、骨組織又は歯周組織の欠損・損傷部位の修復、復元又は再生の用途に使用することが好ましい。前記歯周組織の修復、復元又は再生は、デンタルインプラントの挿入に必要な修復、復元又は再生であってもよい。
【００１１】
本発明の再生医療骨組成物は、使用時に流動性を有することが好ましく、また、本発明の再生医療骨組成物の、骨組織又は歯周組織の欠損・損傷部位への配置は、注射器又はカテーテルによる注入で行われることが好ましい。
【００１２】
以下に、本発明の再生医療骨組成物について説明する。
【００１３】
（自己組織化能を有する両親媒性ペプチド）
本発明の再生医療骨組成物に含まれる組織化能を有する両親媒性ペプチド（Ｓｅｌｆ−Ａｓｓｅｍｂｌｉｎｇ Ａｍｐｈｉｐｈａｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅ）は、疎水性アミノ酸残基と親水性アミノ酸残基とが一定周期で交互に配置されて疎水性側鎖の非極性の面と親水性側鎖の極性の面とを備える。そして、前記両親媒性ペプチドは、適当な電解質存在下において、自己組織化的にナノファイバーを形成し、その結果、ペプチドナノファイバーからなるペプチドハイドロゲルを形成する。
【００１４】
前記両親媒性ペプチドにおいて、前記親水性アミノ酸残基は、その側鎖のチャージが正のものと負のものとが一定周期で交互に配置され、前記極性の面が、イオン的に相補的であることが好ましい。前記両親媒性ペプチドの自己組織化能に関与するペプチド間の相互作用の一例を図１に示す。図１は、ＫＬＤＬＫＬＤＬＫＬＤＬ（配列番号１）というアミノ酸配列からなる３本の両親媒性ペプチドの相互作用を示す模式図である。前記両親媒性ペプチドは、電解質が存在する水溶液中で、多数の相互作用によって自己組織化する。前記相互作用には、例えば、隣接しているペプチドにおける正チャージのアミノ酸（リジン：Ｋ）側鎖と負チャージのアミノ酸（アスパラギン酸：Ｄ）側鎖とが形成する相補的なイオン対が含まれる。また、図示していないが、例えば、アスパラギンやグルタミン等の親水性アミノ酸残基の非チャージ側鎖であれば、水素結合総合作用に関与する。隣接しているペプチドにおける疎水性側鎖は、ファンデルワールス相互作用に関与する。ペプチド骨格上のアミノ基及びカルボニル基もまた分子間水素結合相互作用に関与しうる。前記正チャージ側鎖のアミノ酸残基としては、アルギニン：Ｒ、リジン：Ｋ、ヒスチジン：Ｈがあげられ、前記負チャージ側鎖のアミノ酸残基としては、アスパラギン酸：Ｄ、グルタミン酸：Ｅがあげられ、非チャージ親水性側鎖のアミノ酸残基としては、アスパラギン：Ｎ、グルタミン：Ｑ、セリン：Ｓ、トレオニン：Ｔ、チロシン：Ｙがあげられ、疎水性側鎖のアミノ酸残基としては、アラニン：Ａ、グリシン：Ｇ、バリン：Ｖ、ロイシン：Ｌ、イソロイシン：Ｉ、プロリン：Ｐ、フェニルアラニン：Ｆ、メチオニン：Ｍ、トリプトファン：Ｗ、システイン：Ｃがあげられる。
【００１５】
前記両親媒性ペプチドにおいて、疎水性アミノ酸残基と親水性アミノ酸残基との配置の一定周期は、例えば、１残基、２残基、３残基、４残基の交互配置であってよく、好ましくは、１個のアミノ酸残基の交互配置である。
【００１６】
前記両親媒性ペプチドにおいて、親水性アミノ酸残基の側鎖が、イオン的に相補的である場合、その正負のチャージの配列に応じてモジュールＩ〜ＩＶ等にクラス分けできる。すなわち、正チャージアミノ酸残基と負チャージアミノ酸残基の交互配置の一定周期が、１残基（−＋−＋−＋−＋）、２残基（−−＋＋−−＋＋）、３残基（−−−＋＋＋）及び４残基（−−−−＋＋＋＋）である場合を、それぞれ、モジュールＩ、モジュールＩＩ、モジュールＩＩＩ及びモジュールＩＶという。なお、各モジュールにおいて、正負チャージの順番は逆でもよい。
【００１７】
両親媒性ペプチドの長さは、例えば、８〜２００アミノ酸残基であって、好ましくは、８〜３６アミノ酸残基であり、より好ましくは、８〜１６アミノ酸残基である。また、前記両親媒性ペプチドのＮ末端側は、アセチル化されていてもよい。前記両親媒性ペプチドの製造方法は、特に制限されず、例えば、従来公知の化学合成方法により合成する方法があげられる。
【００１８】
本発明の再生医療骨組成物に含まれる前記両親媒性ペプチドは、一種類でもよく、複数種類でもよい。複数種類の場合、β−シート状の構造に自己組織化する両親媒性ペプチドを少なくとも一種類含むことが好ましい。そのようなβ−シート状の構造に自己組織化する両親媒性ペプチドは、例えば、米国特許ＵＳ５，９５５，３４３、米国特許ＵＳ５，６７０，４８３、特表２００５−５１５７９６号公報（国際公開ＷＯ２００２／０６２９６１号パンフレット）に開示されており、その一例を下記表１に示す。
【００１９】
【表１】
【００２０】
（ペプチドハイドロゲル）
本発明において、ペプチドハイドロゲルは、前記両親媒性ペプチドが自己組織化によりナノファイバーを形成した結果として得らるものである。このペプチドハイドロゲルは、ｉｎ ｖｉｖｏで、骨形成のスカフォールド（足場）として機能しうる。前記ナノファイバーとは、前記両親媒性ペプチドが、例えば、らせん状のβ−シート構造をとったものである。前記ナノファイバーの直径は、例えば、５００ｎｍ以下、１００ｎｍ未満、５０ｎｍ未満、２０ｎｍ未満、１０ｎｍ〜２０ｎｍ、５ｎｍ〜１０ｎｍ、５ｎｍ未満である。
【００２１】
前記ペプチドハイドロゲルを形成する方法としては、例えば、水溶液中の前記両親媒性ペプチドの最終濃度を、０．５ｗｔ％〜５．０ｗｔ％、好ましくは、０．５ｗｔ％〜３．０％、より好ましくは、０．５ｗｔ％〜１．０ｗｔ％とし、前記水溶液の塩濃度（例えば、ＮａＣｌ）を、５ｍＭ〜５Ｍとする方法があげられる。前記水溶液の好ましいバッファーとしては、例えば、生理食塩水、ＰＢＳ等があげられる。
【００２２】
前記ペプチドハイドロゲルを形成するための前記水溶液は、さらに、等浸透圧性溶質を含むことが好ましい。前記等浸透圧性溶質とは、前記水溶液中に溶解された非イオン性化合物をいう。前記等浸透圧性溶質としては、例えば、単糖類や二糖類等の糖類があげられ、そのなかでも、スクロース、グルコース、ガラクトース、フルクトース、リボース、マンノース、アラビノース、キシロース等が好ましい。前記等浸透圧性溶質の濃度は、例えば、５０ｍＭ、１５０ｍＭ、３００ｍＭ、２００〜２５０ｍＭ、２５０〜２７０ｍＭ、２７０〜３００ｍＭ、３００〜４００ｍＭ、４００〜５００ｍＭ、５００〜６００ｍＭ、６００〜７００ｍＭ、７００〜８００ｍＭ、８００〜９００ｍＭである。その他の等浸透圧性溶質としては、例えば、５〜２０％（ｖ／ｖ）のグリセロールがあげられる。前記水溶液のｐＨは、例えば、７．０である。
【００２３】
前記ペプチドハイドロゲルは、注射器やカテーテルで注入可能な程度の流動性を備えることが好ましい。
【００２４】
前記ペプチドハイドロゲルの水分含有量は、例えば、９９％を超え、好ましくは、９９．５％〜９９．９％である。また、前記ペプチドハイドロゲルは、優れた生体適合性を示すことが好ましい。すなわち、哺乳類動物においては、検出可能な免疫応答や炎症応答を誘発せず、また、生理食塩水条件下では、検出可能な膨張性を示さないことが好ましい。前記ペプチドハイドロゲルの孔サイズは、例えば、５０ｎｍ〜４００ｎｍである。前記ペプチドハイドロゲルは、生体内分解性があり、骨形成とともに吸収される。その分解期間は、例えば、２〜８週間である。前記分解期間は、前記両親媒性ペプチドに、例えば、プロテアーゼによる切断部位を導入するなどして調整可能である。また、完全人工合成が可能であるから、他の動物由来材料と異なり病原菌の感染のおそれを排除できる。
【００２５】
前記両親媒性ペプチドとしては、市販製品である商品商標「ＰｕｒａＭａｔｒｉｘTM」（３−Ｄ Ｍａｔｒｉｘ Ｊａｐａｎ社製）を使用でき、前記ペプチドハイドロゲルとしては、市販製品である商品商標「ＰｕｒａＭａｔｒｉｘTM Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｈｙｄｒｏｇｅｌ」（同社製）を使用できる。
【００２６】
（ＰＲＰ：多血小板血漿）
本発明の再生医療骨組成物は、その他の態様として、前記両親媒性ペプチドに加え、さらに、ＰＲＰ（多血小板血漿）を含んでもよい。ＰＲＰは、血小板を豊富に含む血漿であり、換言すれば、血小板が濃縮された血漿をいう。ＰＲＰは、例えば、商品名：濃厚血小板「日赤」（日本赤十字社製）に準じるものであり、採取した血液を遠心分離処理するなどして調製できる。具体的には、例えば、まず、採取した血液にクエン酸ナトリウム等の凝固防止剤を添加し、室温で所定時間放置する。その後、血球及びバフィーコートが分離する条件（例えば、約１，１００ｒｐｍ）で遠心処理する。これにより、２層（上層を、Ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｐｏｏｒ Ｐｌａｓｍａ：ＰＰＰともいう。下層には、血球及びバフィーコートが含まれる）に分離される。前記上層のＰＰＰを取り除いた後、更に、赤血球が分離される条件（例えば、約２，５００ｒｐｍ）で遠心処理する。その結果得られた赤血球を実質的に含まない画分（Ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｒｉｃｈ Ｐｌａｓｍａ：ＰＲＰ）を採取する。ＰＲＰの調製方法は、この方法に限定されず、必要に応じて修正を加えた方法により調製することができる。ＰＲＰに含まれる血小板の量についての一般的な定義はないが、採取した血液に比較して約２倍〜約２０倍の血小板を含有することが好ましい。なお、その調製が可能であり、かつ調製に際して非現実的な負担のない限りにおいて、血小板の含有量は、できるだけ豊富なものを用いることが好ましい。ＰＲＰは、自己由来のＰＲＰであることが好ましい。毒性ないし免疫拒絶反応を回避できるからである。
【００２７】
ＰＲＰに豊富に含まれる血小板及びフィブリノーゲンをトロンビン等を用いてゲル化させたＰＲＰゲルは、前記ペプチドハイドロゲルと共役して骨形成のスカフォールドとして機能しうる。ＰＲＰは、また、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）等の成長因子を豊富に含み、これらの成長因子もまた、骨形成に寄与すると考えられる。本発明の再生骨組成物は、さらにその他の態様として、ＰＲＰに代えて、ＰＤＧＦやＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、骨誘導因子（ＢＭＰ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）−Ｉ、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）等の成長因子と組合せたものあってもよい。
【００２８】
（骨形成能を有する細胞）
本発明の再生医療骨組成物は、その他の態様として、前記両親媒性ペプチドに加え、さらに、骨形成能を有する細胞を含むことが好ましい。より好ましくは、本発明の再生医療骨組成物は、その他の態様として、前記両親媒性ペプチドに加え、ＰＲＰ及び骨形成能を有する細胞を含む。なお、この態様において、前述のとおり、前記ＰＲＰに代えて、各種成長因子を使用してもよい。
【００２９】
骨形成能を有する細胞とは、骨組織を形成しうる細胞をいい、骨芽細胞、前骨芽細胞、並びに、骨系細胞への分化能を獲得した間葉系幹細胞（ＭＳＣ）及び胚性幹細胞（ＥＳ細胞）等があげられる。本発明の再生医療骨組成物に含まれる前記骨形成能を有する細胞は、前記いずれかの細胞を使用してもよく、前記細胞を任意に組合せたものを使用してもよい。これらの中でも、骨系細胞への分化能を獲得したＭＳＣを使用することが好ましい。ここで、「骨系細胞への分化能を獲得した」とは、未分化状態のＭＳＣが、骨系細胞へ分化すべく方向付けされた状態をいう。骨系細胞への分化能を獲得したＭＳＣは、自家細胞であることが好ましいが、同種他家細胞であってもよく、ヒトＭＳＣ由来の細胞を利用できる。
【００３０】
骨系細胞への分化能を獲得したＭＳＣは、例えば、体内から採取した未分化ＭＳＣを、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、骨系細胞への分化を誘導する条件下で培養することで調製できる。前記骨系細胞への分化を誘導する培地としては、例えば、β−グリセロリン酸、デキサメタゾン及びＬ−アスコルビン酸を含む培地があげられる。但し、培養条件としては、これに限定されず、従来公知の骨系細胞への分化を誘導する条件を適用できる。前記未分化ＭＳＣの供給源としては、例えば、骨髄、骨膜、歯髄、さい帯血、脂肪、末梢血等があげられる。これらの従来公知の方法で採取した後、ＭＳＣをその接着性の有無に基づき選択する。すなわち、骨髄等に含まれる細胞の中で、接着性を有するもの等を選択することにより未分化ＭＳＣを得ることができる。
【００３１】
骨系細胞への分化能を獲得したＭＳＣは、前記ペプチドハイドロゲルをスカフォールドとして生体内で骨形成をすることができる。未分化ＭＳＣの骨系細胞への分化誘導は、前記ペプチドハイドロゲル内でｉｎ ｖｉｔｒｏで行って本発明の再生医療骨組成物としてもよく、または、別途ｉｎ ｖｉｔｒｏで誘導した骨系細胞への分化能を獲得したＭＳＣを、前記両親媒性ペプチド若しくは前記ペプチドハイドロゲルと混合して本発明の再生医療骨組成物としてもよい。また、前記骨系細胞への分化能を獲得したＭＳＣは、凍結乾燥処理をしたものであってもよい。本発明の再生医療骨組成物における前記ＭＳＣの細胞数としては、例えば、組成物１ｍＬあたり１×１０5細胞以上であって、好ましくは、１×１０6〜１×１０7細胞である。
【００３２】
本発明の再生医療骨組成物は、少なくとも使用時において流動性を有しておればよく、使用前においては粉状ないし固形状であっても良い。したがって、凍結した状態をもって本発明の再生医療骨組成物とすることができる。また、凍結乾燥した状態をもって本発明の再生医療骨組成物とすることもできる。使用前において凍結状態又は凍結乾燥状態とすることにより長期の保存が可能となり、また、使用前の取扱いも容易となる。さらには、凍結処理又は凍結乾燥処理により抗原性の低下が期待できるため、自家のＰＲＰではなく同種の他家のＰＲＰを用いた場合の安全性向上される。前記流動性は、例えば、本発明の再生医療骨組成物を、注射器やカテーテルにて注入可能な程度であることが好ましい。
【００３３】
本発明の再生医療骨組成物は、その他の態様として、細胞外マトリクス（ＥＣＭ）タンパク質を含んでもよい。前記ＥＣＭは、自家であることが好ましいが、同種他家であってよい。また、本発明の再生医療骨組成物は、ゲル化材料、例えば、トロンビンや塩化カルシウムを含んでもよい。これらを含むことにより、トロンビンがＰＲＰ中のフィブリノーゲンに作用し、フィブリンが生ずる。そして、フィブリンの凝集作用により粘性が増加する。前記ゲル化剤の種類は特に限定されず、上記のようにＰＲＰ中の成分に作用して粘性を増加させるもの、又はそれ自身により増粘効果を奏するものを適宜選択して用いることができる。また、前記ゲル化材料に加えて、適用後（移植後）に作用して本発明の再生医療骨組成物の流動性（粘度）を変化させる第２のゲル化材料を併用することもできる。使用時には適度な流動性を有するために移植が容易であり、かつ、適用後にはより粘度が増すことにより適用部位における定着性が向上し、骨形成が効果的となる。前記ゲル化材料としては、その他に、コラーゲンやフィブリン糊等があげられる。さらに、本発明の再生医療骨組成物は、アルギン酸ナトリウム等の増粘多糖類、グリセリン、ワセリン等の増粘剤を含んでもよい。
【００３４】
本発明の再生医療骨組成物は、骨組織又は歯周組織における欠損部位や損傷部位の、修復、復元又は再生の用途に使用できる。また、デンタルインプラント治療においても、デンタルインプラントを挿入するための骨移植が必要になる場合あり、そのような場合にも、本発明の再生医療骨組成物を使用して、骨移植の治癒時間の短縮をすることができる。なお、本発明の再生医療骨組成物の適用分野は、特に制限されず、例えば、頭蓋、顎、顔面の復元外科、美容外科、形成外科、整形外科、口腔外科、耳鼻咽喉科、歯科等の分野に適用できる。
【００３５】
したがって、本発明は、その他の態様として、骨組織又は歯周組織の再生医療方法若しくは再生法であって、本発明の再生医療骨組成物を使用して、例えば、ヒト及び非ヒト動物の骨形成することを含む方法である。さらに、本発明は、その他の態様として、デンタルインプラント治療方法であって、本発明の再生医療骨組成物を使用して、例えば、ヒト及び非ヒト動物の骨組織又は歯周組織の形成又は再生をする工程を含む治療方法である。また、本発明は、その他の態様として、骨組織又は歯周組織の再生医療方法若しくは再生法、又は、デンタルインプラント治療方法における本発明の再生医療骨組成物の使用である。
【００３６】
さらに、本発明は、その他の態様として、骨組織又は歯周組織の再生医療方法若しくは再生法、又は、デンタルインプラント治療方法のためのキットであって、前記両親媒性ペプチドを含むキットである。前記キットは、さらに、凍結乾燥又は凍結した前記ＭＳＣ、ＰＲＰ等や、試薬等を含んでもよい。
【００３７】
以下に、本発明を実施例により説明する。
【実施例１】
【００３８】
イヌを使用した実験系をデザインして、本発明の再生医療骨組成物が生体内の骨形成に使用できることを確認した。前記実験系の説明図を図２に示す。イヌの下顎に、直径１０ｍｍ、深さ１０ｍｍの骨欠損を形成し、この欠損部位に本発明の再生医療骨組成物を含む様々な移植材料を注入して骨形成能力を確認した。
【００３９】
（イヌ実験動物モデル）
実験動物の取扱いは、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅで承認されたプロトコールにしたがった。一定期間飼育後、平均２歳の４体の成体ハイブリッドイヌを全身麻酔して、第一大臼歯、小臼歯、第２及び第３小臼歯を抜歯し、２ヶ月の治癒期間を与えた。次に、下顎の両側の歯槽骨に直径１０ｍｍのトリファンバーを用いて骨欠損を作成した。この欠損部位は、外側皮質に垂直になるように作成した。前記欠損部位は、自然には骨が再生することが困難な骨欠損である。
【００４０】
（自己組織化能を有する両親媒性ペプチド）
自己組織化能を有する両親媒性ペプチドとして、市販製品である商品商標「ＰｕｒａＭａｔｒｉｘTM」（３−Ｄ Ｍａｔｒｉｘ Ｊａｐａｎ社製）を使用した。このペプチドは、Ｎ末端がアセチル化された１６アミノ酸残基のアミノ酸配列（ＲＡＤＡＲＡＤＡＲＡＤＡＲＡＤＡ：配列表の配列番号２）からなるモジュールＩ型の両親媒性ペプチドである。以下、このペプチドをＰＭという。
【００４１】
（ＰＭのペプチドハイドロゲル化）
ＰＭのペプチドハイドロゲル化は、超音波処理後、スクロース溶液に溶解したＰＭに、ＰＢＳを添加することで行った。最終スクロース濃度は、１０％であり、最終ＰＭ濃度は、１．０６％であり、最終塩濃度は、１．１８％であった。
【００４２】
（骨系細胞への分化能を獲得したＭＳＣの調製）
イヌ腸骨稜の骨髄穿刺（１０ｍｌ）により未分化ＭＳＣを含むイヌの骨髄を採取した。次に、骨髄細胞を、基本培地、低グルコースＤＭＥＭ、増殖サプリメント（Ｃａｍｂｒｅｘ社製）で培養し、３つのサプリメント（デキサメタゾン、β−グリセロリン酸ナトリウム、及びＬ−アスコルビン酸２リン酸）によって、ＭＳＣの骨系細胞への分化を誘導した。骨系細胞への分化能を獲得したＭＳＣは、ｐ−ニトロフェニルホスファターゼを基質として使用したアルカリホスファターゼ活性を検出することで確認した。ＭＳＣは、移植に使用する前にトリプシン処理を施した。
【００４３】
（ＰＲＰの調製）
イヌ末梢血から、約５０ｍＬの全血を採取し、２５０Ｕ／ｍＬの防腐剤フリーのヘパリン及び１０ｍＬの培地を含む遠心管に回収した。５分間、１１００ｒｐｍの遠心分離の後、イエロープラズマ（血小板及び白血球とともにバフィーコートを含む）を長いカニューレで中性のモノベットに回収し、１０分間、２５００ｒｐｍの遠心分離で血小板を単一ペレットとした。この上清がＰＰＰであり、前記ペレットがＰＲＰである。前記ＰＲＰは、５ｍＬの残存血漿にリサスペンドし、ＰＲＰのゲル化に使用した。
【００４４】
（ＰＲＰのゲル化）
ＰＲＰのゲル化は、３．５ｍＬの前記ＰＲＰに、５００μＬのトロンビン／塩化カルシウム溶液を添加し、気泡を含ませながら混合することで行った。前記トロンビン／塩化カルシウム溶液は、１０ｍＬの１０％塩化カルシウム溶液に、１０，０００Ｕのウシトロンビンを溶解して調製した。ＰＲＰのゲル化は、必要に応じて、骨系細胞への分化能を獲得した前記ＭＳＣ（１．０×１０7細胞／ｍＬ）、及び／又は、前記ＰＭハイドロゲルを混合して行った。
【００４５】
（移植材料の移植）
ＰＭハイドロゲル単独、ＰＭハイドロゲル／ＭＳＣ、及び、ＰＭハイドロゲル／ＭＳＣ／ＰＲＰゲルの組合せの移植材料をそれぞれ調製し、これらの移植片を、欠損をコントロールとして、前記欠損部位に移植して、歯肉を縫合し、２週後、４週後、８週後の組織を採取し、組織学的に評価した。各組織のＨＥ（ヘマトキシリン−エオシン）染色による顕微鏡観察写真を図３Ａ〜３Ｄに示す。
【００４６】
（結果）
コントロールは、図３Ａに示すとおり、２週、４週、８週ともに、新生骨の形成は認められず、結合組織の増生のみが認められた。
【００４７】
ＰＭハイドロゲルを移植した場合、図３Ｂに示すとおり、２週目において新生骨の形成が認められた。ＰＭハイドロゲルのスカフォールドは、４週目まで残留していた。また、８週目においても、骨は未成熟であった。
【００４８】
ＰＭハイドロゲル／ＭＳＣを移植した場合、図３Ｃに示すとおり、２週目において新生骨の形成が認められた。ＰＭハイドロゲルのスカフォールドは、２週目まで残留していた。しかし、新生骨の形成量、及び、骨の成熟速度は、前記２例を超え、８週目において、成熟骨特有の層板構造が観察された。
【００４９】
ＰＭハイドロゲル／ＭＳＣ／ＰＲＰゲルを移植した場合、図３Ｄに示すとおり、２週目において新生骨の形成が認められた。ＰＭハイドロゲルのスカフォールドは、２週目まで残留していたがその男残存は前記例よりも少なかった。新生骨の形成量、及び、骨の成熟速度は、前記３例を超え、８週目において、成熟骨特有の層板構造が観察された。
【００５０】
以上のことから、ＰＭハイドロゲルは、骨形成スカフォールドとして機能しうることが確認された。
【００５１】
（比較例）
移植材料として、天然ウシ骨ミネラルからなる市販の代替骨である登録商標Ｂｉｏ−Ｏｓｓ（Ｏｓｔｅｏｈｅａｌｔｈ社製）を使用した他は、実施例１と同様に、欠損をコントロールとして、登録商標Ｂｉｏ−Ｏｓｓを前記欠損部位に移植して、歯肉を縫合し、２週後、４週後、８週後の組織を採取し、組織学的に評価した。各組織のＨＥ（ヘマトキシリン−エオシン）染色による顕微鏡観察写真を図４Ａ及び４Ｂに示す。
【００５２】
コントロールは、図４Ａに示すとおり、２週、４週、８週ともに、新生骨の形成は認められず、結合組織の増生のみが認められた。また、登録商標Ｂｉｏ−Ｏｓｓを移植した場合も同様に、図４Ｂに示すとおり、２週、４週、８週ともに、登録商標Ｂｉｏ−Ｏｓｓが残留しており、新生骨の形成は認められなかった。登録商標Ｂｉｏ−Ｏｓｓの場合、新生骨の形成が認められたのは、移植後１２週からであった（データ示さず）。
【００５３】
したがって、本発明の再生医療骨組成物は、前記ＰＭハイドロゲル単独であっても、従来の代替骨に比べて骨形成における骨の形成量や骨の成熟速度をよりいっそう向上でき、また、治癒時間もよりいっそう短縮できることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００５４】
以上、説明したとおり、本発明の再生医療骨組成物は、例えば、頭蓋、顎、顔面の復元外科、美容外科、形成外科、整形外科、口腔外科、耳鼻咽喉科、歯科等の分野において、骨組織や歯周組織の欠損・損傷部位の修復、復元、再生のための使用に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】図１は、自己組織化能を有する両親媒性ペプチド間の相互作用を説明する模式図である。
【図２】図２は、実施例における実験系を説明する模式図である。
【図３Ａ】図３Ａは、実施例において骨の欠損部位（コントロール）の顕微鏡観察写真の一例である。
【図３Ｂ】図３Ｂは、実施例においてＰＭハイドロゲルを移植した場合の顕微鏡観察写真の一例である。
【図３Ｃ】図３Ｃは、実施例においてＰＭハイドロゲル／ＭＳＣを移植した場合を移植した場合の顕微鏡観察写真の一例である。
【図３Ｄ】図３Ｄは、実施例においてＰＭハイドロゲル／ＭＳＣ／ＰＲＰゲルを移植した場合を移植した場合の顕微鏡観察写真の一例である。
【図４Ａ】図４Ａは、比較例において骨の欠損部位（コントロール）の顕微鏡観察写真の一例である。
【図４Ｂ】図４Ｂは、比較例において代替骨である登録商標Ｂｉｏ−Ｏｓｓを移植した場合の顕微鏡観察写真の一例である。
【配列表フリーテキスト】
【００５６】
配列番号１〜１８ 自己組織化能を有する両親媒性ペプチド
【特許請求の範囲】
【請求項１】
再生医療骨組成物（ｔｉｓｓｕｅ−ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｂｏｎｅ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）であって、自己組織化能を有する両親媒性ペプチドを含むことを特徴とする再生医療骨組成物。
【請求項２】
前記両親媒性ペプチドが、ペプチドハイドロゲルを形成している請求項１記載の再生医療骨組成物。
【請求項３】
さらに、多血小板血漿（ＰＲＰ）又は成長因子を含む請求項１又は２記載の再生医療骨組成物。
【請求項４】
さらに、骨形成能を有する細胞又は間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を含む請求項１から３のいずれかに記載の再生医療骨組成物。
【請求項５】
さらに、細胞外マトリクス（ＥＣＭ）タンパク質を含む請求項１から４のいずれか一項に記載の再生医療骨組成物。
【請求項６】
骨組織又は歯周組織の修復、復元又は再生の用途に使用する請求項１から５のいずれか一項に記載の再生医療骨組成物。
【請求項７】
前記歯周組織の修復、復元又は再生が、デンタルインプラントの挿入に必要な修復、復元又は再生である請求項６記載の再生医療骨組成物。
【請求項８】
使用時において流動性を有する請求項１から７のいずれか一項に記載の再生医療骨組成物。
【請求項９】
修復、復元又は再生が必要な骨組織又は歯周組織の欠損、損傷部位への配置が、注射器又はカテーテルによる注入により行われる請求項１から８のいずれか一項に記載の再生医療骨組成物。
【請求項１】
再生医療骨組成物（ｔｉｓｓｕｅ−ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｂｏｎｅ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）であって、自己組織化能を有する両親媒性ペプチドを含むことを特徴とする再生医療骨組成物。
【請求項２】
前記両親媒性ペプチドが、ペプチドハイドロゲルを形成している請求項１記載の再生医療骨組成物。
【請求項３】
さらに、多血小板血漿（ＰＲＰ）又は成長因子を含む請求項１又は２記載の再生医療骨組成物。
【請求項４】
さらに、骨形成能を有する細胞又は間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を含む請求項１から３のいずれかに記載の再生医療骨組成物。
【請求項５】
さらに、細胞外マトリクス（ＥＣＭ）タンパク質を含む請求項１から４のいずれか一項に記載の再生医療骨組成物。
【請求項６】
骨組織又は歯周組織の修復、復元又は再生の用途に使用する請求項１から５のいずれか一項に記載の再生医療骨組成物。
【請求項７】
前記歯周組織の修復、復元又は再生が、デンタルインプラントの挿入に必要な修復、復元又は再生である請求項６記載の再生医療骨組成物。
【請求項８】
使用時において流動性を有する請求項１から７のいずれか一項に記載の再生医療骨組成物。
【請求項９】
修復、復元又は再生が必要な骨組織又は歯周組織の欠損、損傷部位への配置が、注射器又はカテーテルによる注入により行われる請求項１から８のいずれか一項に記載の再生医療骨組成物。
【図１】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図３Ｄ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図３Ｄ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【公開番号】特開２００７−１０５１８６（Ｐ２００７−１０５１８６Ａ）
【公開日】平成１９年４月２６日（２００７．４．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−２９８１６０（Ｐ２００５−２９８１６０）
【出願日】平成１７年１０月１２日（２００５．１０．１２）
【出願人】（５０４１３９６６２）国立大学法人名古屋大学 (996)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年４月２６日（２００７．４．２６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年１０月１２日（２００５．１０．１２）
【出願人】（５０４１３９６６２）国立大学法人名古屋大学 (996)
【Ｆターム（参考）】
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