凍結標本の分配システム、方法及び装置
凍結された生物学的標本を保存凍結試料から抽出するための音速、線形振動運動を生み出すモータを備えたドリリングシステム、及び残存試料を解凍せずに抽出するその使用方法が提供される。固定子及びスライダ部品は、ソフトウェアを搭載したコンピュータのポートを通じて通信及びプログラム可能であるサーボ制御装置により操作される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、凍結した生物学的標本を凍結試料から、該試料を解凍せずに抽出するためのコアリングシステム、及びその使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生物保存容器に保存される生物学的標本は、病気の診断や原因の研究をする際に重要な資源である。生物学的標本は軍事施設、法医学ＤＮＡバンク、政府の研究所、診断病理学及び細胞診、営利企業及び病院等の非営利組織において保存されている。生物学的標本の保存及び分析を行うことにより、病気についての知識が増加し、これらの病気の予防、診断、及び治療のためのよりよい方法を発展させる基礎となる。
【０００３】
控えめに見積もっても、２億８千２百万の試料が現在米国の施設内に保存されている。またその試料は、１９９８年の初めから毎年２０００万ずつ増加している。（国家生命倫理諮問委員会、「ヒト由来試料を用いた研究：倫理問題及び政策指針」、第１巻、国家生命倫理諮問委員会による報告及び提言、メリーランド州ロックビル、１９９９年８月）。
【０００４】
生物学的標本は通常凍結した状態で保存される。試料はスライド、パラフィンブロック、ホルマリン固定、組織培養、抽出されたＤＮＡとして保存されている。癌、感染症、精神疾患の研究は、これらの試料に瞬時にアクセスすることで進展する。例えば、前記標本は約−２０度、−４０度、或いは約−８０度でクライオチューブ内に保存される。標本を等分する現在の工業的手法は、部分標本を取り除く度に試料の保存量を解凍及び再凍結することにより行われる。検査結果によると、凍結・解凍のサイクルを繰り返すことにより、試料が品質低下することを示している。しかしながら、凍結（クライオストレージ（冷凍貯蔵器））を行うと生物学的標本の耐用期間が延長される。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
さらに、現在の標本の入手方法及び処理方法は遅延時間を伴うものであり、またこれらの保存場所を使用するにあたって障害となるものである。標本は、標本に対して品質低下させる凍結／解凍のサイクルが繰り返される。また、一つの試料が複数の容器に冷凍前に分け入れられると、冷凍場所の非効率的使用、クライオチューブの費用、ラベル及び時間の増加を招く。そして処理時において新たなミスを引き起こすこととなる。
【０００６】
保存量の凍結された生物学的試料から標本（部分標本）を獲得する効果的な方法は、すなわち、過剰な凍結保存場所の需要の削減、試料受入の調達時間の削減、及び試料の品質低下の削減を行う方法であり、これらの方法が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明のある一部は、凍結した生物学的試料から凍結標本を採取する装置をもたらす。この装置は、容器内の試料に接触するドリルを備え、該ドリルは中空ビットコアリング針を作動させるモータを備え、また試料を掴むグリップを備え、該グリップは容器の開口端を前記針の近位に有し、前記モータは前記針を前記容器内の試料に突き刺し、凍結標本はコンテナ内の試料が解凍されていない場合、試料から取り除かれる。
【０００８】
ある実施形態において、前記装置はさらに前記容器の終端部を浸水させる冷却タンクを備える。前記冷却タンクは試料を連続的に凍結し続け、品質低下を避けるものと想定される。すなわち、沈殿した標本の連続的凍結、試料の表面に霜が降りることの防止、試料への水の添加の防止、及び使用者による試料の視認可が挙げられる。
【０００９】
前記装置の関連する実施形態において、前記容器はクライオチューブ、アレイ、成形レシピエントブロックの仕切り、或いはプラットホームより少なくとも一つ選択される。
【００１０】
前記装置のある実施形態において、前記モータは線形振動運動をもたらす。前記装置の代替可能な実施形態において、モータは回転運動をもたらす。
【００１１】
代替可能な実施形態において、前記装置はコンピュータと通信するサーボ制御装置を備え、前記コンピュータ及びソフトウェアを用いてプログラム可能である。その他の実施形態において、前記装置は手動制御される。
【００１２】
前記モータが前記ビットへ力をもたらし、これにより前記ビットは、約３０Ｎ〜約９０Ｎ、約３５Ｎ〜約８０Ｎ，或いは約４０Ｎ〜約７５Ｎ等の力で凍結試料へ衝突する力をもたらす。前記モータは前記ビットへ約４０ＭＰａ〜約８０ＭＰａ、或いは約５０ＭＰａ〜約７０ＭＰａ等の圧縮応力をもたらす。前記試料は約−９０度、或いは約−８０度、或いは約−７０度、或いは約−４０度、或いは約−２０度、或いは約−１０度の温度で保存される。すなわち、前記試料は約−９０度から−１０度等の範囲内である。この装置の冷却要素により、試料に霜が降りない。
【００１３】
ある実施形態において、試料は約０．５ｍＬ〜約５ｍＬ、或いは約１．５ｍＬ〜約１５ｍＬ、或いは約５ｍＬ〜約５０ｍＬ等の体積を有する。代替可能な実施形態において、前記試料は約１０μｌから約５０μｌ、或いは約５０μｌから約１００μｌ、或いは約１００μｌから約５００μｌ、或いは約５００μｌから約１．０ｍｌである。
【００１４】
前記装置の他の実施形態において、前記ビットの先はさらに研磨された先端部及び歯部が付された抽出部を有する遠位端を備える。前記装置のある実施形態において、前記ビットの先はセラミック或いは金属である。例えば、チタン、インコネル６２５、ステンレス鋼３０４、ステンレス鋼３１６、ステンレス鋼３１６Ｌの群より選択される少なくとも一つを含む組立式の標準の外科用の管である。
【００１５】
他の実施形態において、前記装置はさらに標本の受入装置を含む。関連する実施形態において、前記受入装置はマイクロアレイである。例えば、前記マイクロアレイは予め型どられた空洞を有するレシピエントブロックである。前記空洞はテーパ形状を有し、前記空洞は底に向かって大きくなる。例えば、空洞がテーパ形状であるため、標本が外へ飛び出すことが防がれる。ある実施形態において、前記予め型どられた空洞が有するテーパ部は、２度、或いは約５度、或いは約１０度の傾斜を有する。
【００１６】
ある実施形態において、前記装置はさらに、ばね復帰或いはその他のタイプの自動復
帰を有する突き出しピンを備える。前記突き出しピンは、前記針の内径よりも小さい及
び実質的に同一の断面直径を有する。
【００１７】
前記装置はさらに筐体を備える。前記筐体は、湿度制御、冷凍、血液により運ばれる病原菌に対する使用者への安全性、及び滅菌の群より選択される少なくとも一つの用途に用いられる。
【００１８】
ここに述べられる発明の他の態様は、凍結した生物学的試料から凍結標本を採取するための方法、及び試料を凍結した状態で維持するための方法であって、前記方法は、中空ビットコアリング針を作動させるモータを有するドリル及び試料を掴むグリップを用いて容器内の試料に接触する段階を備え、前記グリップは容器の開口端に位置し、前記容器は針の側に位置し、前記モータは前記針を試料に突き刺すよう動作させ、前記方法はさらに、前記凍結標本を含んだ針を抜く段階と、前記凍結標本を針から受入装置へ押し出す段階を備え、前記凍結標本は前記凍結された生物学的標本から得られ、前記標本は凍結状態で維持されている。
【００１９】
他の実施形態において、前記方法はさらに、容器の終端部を浸水させる冷却タンクを備える。関連する実施形態において、前記容器はクライオチューブ、アレイ内の仕切り、或いはプラットホームより少なくとも一つ選択される。
【００２０】
ある実施形態において、前記方法は、少なくとも約−９０度から約−１０度、或いは試料を凍結状態で保存するその他の温度にて行われる。他の実施形態において、前記方法はさらに、標本の複製部分標本を得るため前記段階を反復することをさらに含む。関連する実施形態において、前記方法はさらに、少なくとも一つの付加的試料より標本を得るため前記段階を反復することを含む。
【００２１】
前記方法のある実施形態において、中空ビットコアリング針を作動させる前記モータが前記試料の表面に線形振動運動を与えて破砕する。
【００２２】
前記方法の他の実施形態において、前記凍結標本を針から受入装置へ押し出すことは突き出しピンを作動させることを含む。
【００２３】
他の実施形態において、前記受入装置は分析管、クライオチューブ、病理学、組織学及び／又はマイクロアレイ分析用の平面、及びマルチウェルディッシュのくぼみからなる群より選択される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
凍結された生物学的試料の保存容器の保護及び分析することで、病気に関する知識を増加させ、またこれらの病気の予防、診断、及び治療のためのよりよい方法を発展させる基礎となる。
【００２５】
ここにもたらされる方法及び装置は、超低周波衝撃ドリリングを用いて、硬い凍結試料に穴をあけ、標本（部分標本）を抽出する。前記装置は、部分標本の凍結標本を抽出する手順を自動化することにより、標本を抽出するのに必要な時間を低減する。また前記方法は、現在の工業的手順と比較して、訓練及び操作にあまり時間を要さない。ここにもたらされる前記装置及び方法は、研究所の研究員のリードタイムを低減し、医学研究を促進する。そして最も重要なのは、前記装置及び方法が、保存された凍結試料の生物学的安定性及び完全性をもたらすことである。
【００２６】
＜工業標本処理＞
生物学的保存には、多数の凍結された生物学的組織及び液体試料が含まれる。前記生物学的組織及び液体試料は、他の研究分野と同様に、生体指標、栄養学、機能的ゲノム学の研究を支持するものとして科学者が利用可能なものである。例えば、血液バンクは将来的に利用するため２万から４万ユニットの血液を保存すると同時に、年間約１５００万ユニットの血液を集めている。注文を受けた標本のセットを配送するのに、現在の生物学的保存施設は、非常に長いリードタイムをかけている。例えば、看護師健康調査（ＮＨＳ）によると、分割操作において、研究助手は週に１５０の標本を処理する。また標準的な研究には約１０００の標本が必要となる。したがって、研究助手が一つの研究のための標本処理を完了させるために、データ管理に要する１〜２週間に加えて、６週間以上の期間が必要となる。
【００２７】
凍結・解凍のサイクルは、標本内のＲＮＡやたんぱく質などの重要な生物学的分子の品質低下につながることが知られている。このことは、品質低下の正確な程度が数値化されていないため、研究者にとって問題となっている。クライオストレージ（冷凍貯蔵器）は生物学的試料の耐用期間を延ばすために必要である。最も品質の高い標本を研究所に届けることを確実にするため、凍結・解凍のサイクルを繰り返すことは最低限化、或いは排除されなければならない。
【００２８】
ある方法は、標本を一つの容器に保存すること、及び要求された場合に必要な量を等分するのが特徴である。標本は、例えば１．８ｍＬ或いは４．５ｍＬの大きなクライオチューブ内に保存され、そして凍結される。標本がその全体を解凍、混合される必要がある場合、必要な部分標本が取り出される。残りの標本は元の容器内で再凍結される。この方法は、標本が一つの容器内に保存されるため、労働力、空間及びエネルギーを有効利用する。欠点は、標本が何度も凍結・解凍のサイクルにさらされるので、標本の品質は低下し、またその将来価値が低減することである。
【００２９】
保存及び抽出のその他の方法は、等分された大きさの容器に標本を保存することである。この方法は品質低下がわずかという利点を有する。しかし、この方法は、各標本に対して多数のクライオチューブを保存する必要があるため、労働力、凍結場所及びエネルギーは有効利用されていない。さらに、標本を識別する際に混乱を招くという別の可能性もある。
【００３０】
標本保存の第３の方法は、２つの既に述べた方法の組み合わせである。この混合した方法は、多数の試料を凍結保存することから始める。例えば１．８ｍＬ或いは４．５ｍＬのクライオチューブを用いて保存する。分析の依頼があると、試料は例えば等分に分割され、その後、使用されなかった部分標本は再凍結される。試料のこの保存方法は、凍結・解凍を２回繰り返すのみである。試料が必要とされるまで、凍結場所の利用は最小限でよい。しかしながら、この方法は試料の質を維持するが、凍結場所については問題がある。またこの方法は混乱を招き、大きな労働力を要する。
【００３１】
生物学的保存に凍結標本分割器具を導入することにより、以下の有利な点が挙げられる。すなわち、過剰な凍結保存場所に対する必要性を抑制できる点、試料の部分標本を受取るのに要するリードタイムを削減できる点、訓練の必要性を最小化できる点、及び試料の品質低下を凍結・解凍サイクルの繰り返しを低減することにより制限できる点である。この提案されている器具は、試料の解凍を行わずに凍結試料を直接取り出す。必要とされる凍結場所は、試料がより大きな体積で保存されることができるので最小化される。凍結試料をドリルの自動化により取り出したり、或いは分割する方法は、現在の標本採取作業にとって重大な進歩をもたらすものである。
【００３２】
本発明中に用いられているように、「試料」という用語は、凍結した生物学的な固形組織及び体液を保存したもののことを言う。「標本」及び「部分標本」という用語は、元の試料の一部のことを言う。
【００３３】
＜構造の目的＞
凍結された生物学的試料より１ｍｍの直径のコアを抽出するように設計することが必要とされる。前記試料は、約−９０度、−８０度、或いは−７０度、−４０度、或いは−２０度の温度、或いはそれ以下の温度で保たれている。実施例は、凍結試料が脆性材料の性質を示すことを表している。試料の劣化、また発熱の様々な状態が予想される方法が本発明において分析される。回転コアリング方法は、生物学的試料へ伝わるビット内の高い座屈応力及びねじり応力を有するため、要求を満たすものではないことがわかった。
圧電スタックを有する超音波ドリルシステムを、線形運動により駆動する超低周波システムと比較した。発熱の量は、周波数及びストロークの長さに直接比例することがわかった。また、超音波を用いた方法は、計算及び分析を経て、可能性を有する解決策として考慮されなかった。
次にリニアモータを分析した。試験した最初のモデルはLinMot社の設計のもので、設計の構想に必要な動きをもたらすために選ばれた。試験は多様なビットの形状を用いて行われ、最適なドリルビットの形態が見出された。正弦波、周波数５０Ｈｚの音波、及び２ｍｍのストロークが、破砕を開始するのに必要な力を標本内にもたらすものであることを突き止めた。図３はビットを備えたLinMotリニアモータの図である。
本発明における装置及び方法の目的は、凍結した生物学的試料より標本を抽出することである。この目的は、凍結試料の破砕システム及びシステムの温度制約に起因する重要な課題に対するものである。例において、データは凍結した生理食塩水が実際の生物学的試料の代表であること、また脆弱な性質を示すものである。調査を通じて、標本抽出時の脆弱な破砕方法は、結果として氷片を形成することがわかった。氷片を容易に除去すること、及びさらに深いコアのために、振動運動が考慮される。この種の装置の分析は、摩擦による発熱は周波数及びストロークの長さに比例することを突き止めた。したがって、実施例のさらなる目的は振動運動を突き止めることである。前記振動運動は、低い周波数及びストロークの長さを有し、破砕を起こすのに必要な力を標本内にもたらす。この運動は本発明において、これらの目的を満たす独特なビットの形態と組み合わせられる。
【００３４】
＜形態特性＞
前記装置の特性について以下の点が述べられる。すなわち、部分標本間に保存される体積の均一性、効果的な状況において利用される保存量、無駄な標本を最小限にすること、及び従来技術の方法と比較して時間及び使用者の必要量が最低限で済むことである。
臨床試験の基準に基づいた部分標本の必須条件及び工業的効率性の必須条件については以下のことが述べられる。すなわち、少なくとも約１０μＬ、５０μＬ、１００μＬ、或いは約５００μＬが分析の成功のために必要となる。あるケースにおいて、工業の標準規格は、保存量の効率的な利用のため部分標本を約１２０μＬ以下に制限している。１．８μＬ入る典型的なクライオチューブは、工業の効率的な標準規格を満たすため約１０の部分標本を有する。周辺の試料への周囲の損傷は最低限にされるべきである。そうすればさらなる標本を同じクライオチューブより抽出することが可能となる。
【００３５】
＜試料採取方法＞
回転運動を用いビットを駆動させ物質内へ入っていく回転ドリルは、米国特許出願第2002/0129975号（Barth他）に示されている。この氷用オーガシステムは、湖や川などの凍結した水から固体のコアを切り取るのに用いられる。その目的は、氷の削り屑を削減する一方、氷に穴を開け、筒状の氷のコアを大きなひびを入れずに取り出すことである。前記システムは細長いシャフトの上端部に接続されているモータ装置を使用して回転する。前記システムは、少なくとも１つの氷に係合するビットを用いて芯をくり抜く。また前記システムは継続的切断用のフライティングを利用する。このシステムは、一定の正確な量を正確に抽出するため、或いは内部のコア及び周囲の氷の完全性を維持するものとして設計されていない。このシステムは基本的な回転運動を用い、固体のコアを切り取るのに用いられる。
超音波コアラー／ドリラ装置は、米国特許第6,689,087号（Pal他）に示されている。このシステムはハンマ作用を生み出す。前記ハンマ作用は超音波及び亜音速の振動を用いることにより生じ、効果的なドリリング及びコアリングを生み出す。超音波ドリラ及びコアラーは惑星探査、地質学的調査、軍事、及び医療手術において用いられる。また前記超音波ドリラ及びコアラーは、一定の正確な量を正確に抽出するため、或いは内部のコア及び周囲の氷の完全性を維持するためのものとして設計されていない。このシステムは基本的な回転運動を用い、固体のコアを切り取るのに用いられる。
マイクロアレイ技術は、さらに小さな針という不利な点を有する。前記針は、径が縮小されたためより簡単に曲がり易く、例えば癌の生検等の組織標本をほとんど解明することができない。大きさが長さ３ｍｍから４ｍｍで、約−２０度で凍結されたドナーブロックから取り出された標本が抽出される。
いくつかの実施形態において、ダイヤモンド結晶は、極めて高い温度、また成分を切断する極めて大きい応力のもとに結合している。これは米国特許第5,437,343号（クーリー他）に示されている。耐熱性多結晶ダイヤモンド切削要素は、回転ドラッグビットを使用するために置かれる。前記回転ドラッグビットは、せん断運動で地下層に穴を開けるのに用いられる。窒化ホウ素及び窒化ケイ素もまた超硬物質であり、同様に切削要素に結合することが可能である。スパッタコーティングダイヤモンド或いは熱処理エナメル加工超硬物質を針先形状の先端部に用いることによって不具合が生じるまでのサイクルが増加し、針先の初期の接触応力を低く維持することになる。
【００３６】
＜ビットの形態＞
本発明において、「ビット」、「ドリルビット」、或いは「針」という用語は、線形振動モータに取り付けられた中空管を指す。前記線形振動モータは凍結された生物学的試料に衝撃を与えドリルで穴を開け、そして凍結標本を取り出すものである。
前記ビット（針）の形状は、ドリルで穴を開ける間、放射状の亀裂を抑制するよう最小化される。そうすることにより、各クライオチューブから最大数の標本を取り出すことができる。放射状亀裂の伝播に影響する要因として、衝撃速度、衝撃力、ビット表面積、及び第一の歯部を備えた抽出部のピッチが含まれる。
前記ビットの先端部にかかる応力を低減することは一つの特徴である。そして前記ビットにかかる応力は最小化されるので、前記ビットの疲労に起因する不具合を防ぐ。このことは、操作コスト及びシステムをより効率的にするので、各針が可能なコアの数を最大限にする。
凍結標本を貫通する際に針が結合することを最小限にするため、凍結氷片除去システムは、針の形態に組み入れられている。このシステムは不要な圧縮された凍結氷片の除去を容易にする。衝撃を受ける場所から圧縮されていない氷片を除去すると、針の衝撃面と凍結標本間の摩擦が低減される。
針の材料の選択は以下の要因により影響を受ける。その要因とはすなわち、強度、周囲及び凍結標本の周囲の温度サイクルに耐える能力、低価格、及び製品化の容易さである。
【００３７】
＜例示的モデル＞
凍結組織マイクロアレイヤの初期の形態は、中空ドリリング装置（TechnoDiamant社のダイヤモンドコアドリルビット）に基づいたものであった。前記装置は垂直方向の力および回転の組み合わせにより切断する。この切断方法の組み合わせは、垂直方向の力のみを利用した場合と比べて、前記針の応力レベルを低減する。また、この垂直方向の力のみを利用することは、すでに現在の市販の装置にて用いられている。力がより小さければ針の寿命が長持ちし、また組織の構造にかかるコアリングの衝撃を低減する。図１に示される前記針は、小さな凍結組織アレイを作製する間に２０の標本を切断することができる。
このドリリング装置はｘ−ｙミリングテーブルに組み入れられる。前記ｘ−ｙミリングテーブルは、ｘ−ｙ−ｚポジションのコンピュータ制御、及び一定であるが、選択可能な回転スピードのドリルビットのオン／オフ制御をもたらす。前記ｘ−ｙミリングテーブル或いはミニミルは、反復性を持つ0.003175ｍｍのステップ分解能を有する。該ステップ分解能は0.0127ｍｍよりもよい反復性を有するので、この発明にとって適切なものである。標本はTechnodiamant社の針およびミニミルを用いて、−７０度の凍結食塩水および組織から抽出された。
【００３８】
＜温度調整＞
凍結組織試料は組織カセット内に保存される。前記組織カセットはホルダに挿入され、そしてフライス盤上にある冷却液タンク内に配される。前記冷却液タンクはドライアイスアルコールスラリを収容する。前記ドライアイスアルコールスラリは組織を凍結状態に保持する。またある実施形態において、空気冷却材ループが、組織ブロック上方の冷たい空気の流れをもたらすものとして盛り込まれている。この空気循環は前記ブロック上部が温まらないようにし、ブロックに霜が降りることを防ぐ。この組立部は、前記ブロックを−７０度或いはさらに低い温度で、少なくとも８時間維持するのに適していることがわかった。
【００３９】
前記ビットは、凍結試料内を移動し生じる摩擦、或いはまた、試料からレシピエントブロックまでの移動で生じる対流によって熱を得る。前記ビットはあらかじめ冷やされるので、摩擦からの熱は周囲の試料へと消える。繰り返し使用される場合、前記ビットは使用される毎に冷却液で前もって冷やされる。例えば、前記ビットは試料上方の冷たい空気の流れに触れる。
【００４０】
システムの温度特性を決定するために、熱的接触をもたらすためクライオサーマルグリースで処理した熱電対が前記ビット内に挿入される。前記ビットはドライアイス／アルコールスラリと接触することにより冷やされる。そして前記ビットはスラリから離れる。また記録された温度は図２に示される通りである。データによると、標本の温度は−２０度で１００秒間維持される。この時間は、受容容器内の凍結標本の位置を決定し、そしてその位置に置くのに十分な時間である。
【００４１】
＜組織標本のレシピエントブロックへの挿入＞
凍結標本は突き出しピンを用いて針から取り除かれる。前記突き出しピンは、ドリリングの針の内径に非常にぴったり嵌合するもので、前記針から完全に及びすっかりと凍結標本を取り除く。前記ピンはさらにばね復帰を有する。そして前記ピンはテフロン（登録商標）シールを有してもよい。前記テフロン（登録商標）シールは前記プロセスの反復の前の針からのサンプル回収を最大限にする。ドリリングの針の遠位端にあるテフロン（登録商標）部品及び前記針の内径をぴったりとはめることは保持力を最小化する。また外部の要素は洗浄ステーション及び以下のステップを用いることにより取り除かれる。すなわち、ドリリングの針はブラシの床に挿入されている。ブラシは１０％濃度の漂白剤に入っていて、その中にコアリングの針が挿入されている。一度挿入すると、前記針はブラシの剛毛の周りを、軌道を描くよう動く。一方で前記針は回転し、前記突き出しピンは上下運動する。そしてテフロン（登録商標）部品は、その周囲も同様に洗浄されるように部分的に露出している。次の工程において、前記方法は、漂白が食塩溶液により行われること以外、ここに述べたものと同じである。そして、前記ステーションを乾燥し、残存食塩溶液を取り除く。そして冷却ステーションは前記針を所望の温度の範囲にする。
クリーニングアッセイは以下を用いて行われた。洗浄手順と共に本明細書中で得られた凍結したヒト組織１０個、及び洗浄手順を除いた対照群１０個をQuantiBlot Human DNA Quantitation Kit（Applied Biosystems社）、及びＤ１７Ｚ１の遺伝子座の霊長類種アルファサテライトＤＮＡ配列を用いて試験した。
【００４２】
＜組織カセット＞
凍結試料用の凍結組織アレイヤカセットは、例えば一つ、或いは多数に分割されたアルミニウムから機械加工されたものである。そのため、前記カセットは凍結、保存、或いは後に続くアレイ構成の間機能する。さらに、同じセットがドナー凍結試料及びレシピエントブロックに利用することも可能である。
【００４３】
＜組織形態の維持＞
凍結試料から標本を獲得するプロセス及びこれらの試料をレシピエントブロックに正確に配置するプロセスにおいて、従来技術における方法は、不要な力を細胞及び／又は組織へ適用するものである。ドリリングはせん断力（組織を通るコアリングビットの回転）及び圧縮力（コアリングの針が組織内へ押し込まれる時）を適用する。これらのコアリングの力は組織を「ねじる」可能性、及び組織を圧縮する可能性を有する。コアをレシピエントブロックに挿入する間、二つの力が適用される。一つは突き出し針からの力で、組織表面に対し均一に適用されるものである。もう一つは摩擦力で、コアリングの針の内径とレシピエントブロックの空洞の内径との交点において生じるものである。これら配置時の力には組織を圧縮する可能性があり、コアの周囲及び中心間の相対運動を引き起こす。
目的は、ドリリング及び配置時の力を最適化することである。この結果、組織の形態の変化が検出されない点にまで最適化される。これらの力に衝撃を与える本発明の制御に用いられる設計変数は以下を含む。ドリリングの針の形状、ドリリング間の回転速度、ドリリング間に前記針が前進する速度、ドリル外径及びレシピエントブロックの空洞の内径間の差、針の表面処理、ドリリングの針がレシピエントブロックの空洞上に配される正確さが含まれる。配置の正確さはコンピュータで制御されており、−７０度に維持された組織温度の生化学的忠実性を保つ。
アレイヤに組み込まれた圧電気力及びトルクセンサ（PCB Piezotronics社、圧電気力：PCB 1102-05A及びトルクセンサ：PCB 2308-02A）は、ドリリングのプロセスの間、適用した力のデータ及びトルクのデータ（力及びトルク対時間）を測定する。データは病理学的評価（例を参照）とともに分析され、最適な形態状態を特定する。変数の長所を評価するのに用いられる測定基準は以下のことを含む。すなわち、単一の組織切片の機能としての標本の形態はドリリングのプロセスの衝撃を査定するため評価される。評価を行うため、標本を様々な異なる組織の種類から採取し、また切片をドナー組織及び凍結組織アレイから採取する。そしてこの二つを一組にする。二重盲検評価は病理学者により行われる。
ドナー組織及び凍結アレイより採取した切片を切り、ここに同定される三つの重要な分析を進め、盲検評価をする。免疫組織科学（ＩＨＣ）／免疫蛍光（ＩＦ）は、特定の抗体を用いて細胞中の特定のたんぱく質及び抗原の存在を査定するのに用いられる技術である。前記抗体は前記たんぱく質及び抗原に結合することにより、視覚化及び顕微鏡での試験が可能となる。ＩＨＣに対するＩＦの長所として、様々な異なる蛍光性のクロモゲンが利用可能である。そしてこのようにして、同時に様々な抗原に異なる標識化をすることが可能であり、また視覚化することも可能である。
（蛍光）in-situハイブリダイゼーション法は、特定のＤＮＡ／ＲＮＡ配列（例：遺伝子）を検出する技術である。前記技術は、形態学的に保存された染色体、細胞或いは組織切片中の標識化された相補的なＤＮＡ／ＲＮＡのプローブを用いる。これは微小の位相的な情報を、ＤＮＡ或いはｍＲＮＡレベルでの遺伝子活性にもたらす。同様に、ＩＳＨに対するＦＩＳＨの長所として、様々な異なる蛍光色素が利用可能である。そしてこのようにして、同時に様々なＤＮＡ／ＲＮＡ配列に異なる標識化をすることが可能であり、また視覚化することも可能である。
【００４４】
本発明は十分に説明がされてきた。さらに本発明は以下の例や請求項によって示される。そしてこの例や請求項は実例となるものであって、より限定するものではない。繰り返し説明したり、ここに記述される特定の手順の多数の同等物を用いることなく、当業者は理解或いは解明することが可能である。そのような同等物は本発明及び請求項の範囲内にある。本出願で引用した米国特許及び米国特許出願公開を含む全ての文献を参照することによりこれに含むこととする。
【実施例】
【００４５】
＜実施例１：必要な力の決定＞
一般的な目的は、このプロセスの結果起こる発熱を最小化することである。凍結生理食塩水分析を用いた実験シミュレーションで、約−９０度、約−８０度、或いは約−７０度に維持された標本に破砕を生み出すのに必要な力は、所望のビット形態を用い約３０Ｎ及び９０Ｎ，特に４３から７２Ｎの間で変動する。この変動は、実験データに基づいた実験的凍結標本の破壊靭性において観測されたばらつきから生じたものである。
いくつかの形態の代わりとなるものが研究された。その中には回転運動或いは線形振動運動を有するドリルも含まれている。
【００４６】
＜実施例２：回転ドリル＞
コアリングの回転運動方法は、回転運動（例えばボール盤）を用いてコアリングビットを駆動することにより達成される。この方法は、標本を貫通するのにコアビットの高い軸方向の荷重と高いねじり荷重両方を必要とする。凍結した生物学的試料の回転ドリリングへの試みはいくつかの限定的な成功を見せたが、解析データにより決定されるような成功した標本を生み出すことはなかった。前記線形振動運動の分析から得られた追加的なデータをここに示す。
【００４７】
＜実施例３：線形振動運動＞
ここにもたらされる線形振動超音波ドリリングシステムは、圧電スタックを備える。該圧電スタックはホーンを共振周波数にする。典型的な超音波システムは振動数２０ＫＨｚ以上、変位は３０μｍまでで操作する。ここに示す市販の超音波ポリッシャを使用するサンプリングの実施例は、計算により確認された過剰な熱量を発見した。超音波ポリッシャ装置はドリリングビットを備え、凍結した標本へ導入された。前記装置は凍結試料を完全に溶かした。動きの変数に対する適応能力や調整もまた制限された。
したがって、ここで研究された線形振動システムの種類の他の例は、デジタル処理により線形モータシステムを制御した。この種類のモータは前記システムを亜音速のスピードで駆動させるのに用い、また必要な運動データをもたらすことができた。前記方法に適切なこの種類の例示的なモータはLin Mot社が製造している。（Delevan, WI53115）また前記モータは、円筒状固定子を用い管状線形モータをもたらし、ネオジム磁石を含む中空スライダを駆動させる。このモータの利点は、運動のパラメータを制御することに対し付加される。
【００４８】
＜実施例４：例示的装置＞
例えばLinMot社製のリニアモータは音速、線形、振動運動をサンプリング用に生み出す。固定子及びスライダ部品はサーボ制御装置により操作される。前記サーボ制御装置はその提供されたソフトウェアを備えたいずれのパーソナルコンピュータのＣＯＭポートを通じて通信したりプログラムされたりする。目的の最適適合性を決定するため解析調査が行われた。最初の計算は、前記システムでの発熱の量を決定するのに用いられた。前記システムでの発熱の起こりうる状態に、破砕、摩擦、及び粉砕が含まれる。ごくわずかな発熱量は摩擦から生じる。これは材料のもろい性質のためである。摩擦からの熱は、周波数及びストロークの長さに直接比例するよう計算された。計算によると、コアリングの超音波の方法は、LinMot社のシステムよりも２７倍以上の摩擦からの熱を生じた。標本分子の機械的粉砕から粉砕が生じる。前記機械的粉砕はビットコアが凍結標本内に入る時に起こりうる。粉砕により生じる熱はリッティンガー方程式を用いて計算される。前記リッティンガー方程式において、エネルギー法は、最初と最後の先端部の表面積を発熱量と関連させるのに利用される。リッティンガー法が実験的に発展すると、このシステムにおける粉砕による発熱を定量化することが難しい。発熱に加え、先端部の移動による熱伝導は周知のシステムの境界条件を用いて計算される。前記境界条件には先端部の大きさ及び先端部の移動速度が含まれる。粉砕から生じた熱を用いると、試験を通じ先端部熱伝導は最適に決定される。
−７９度における最初の破砕に必要な限界力は、以下の等式により決定される。
【００４９】
【数１】
これは物質の破壊靭性、ビッカース硬さ、及び推定合成放射状亀裂の長さに、破壊を生じさせる限界力を関連させるものである。
氷の破壊靱性値の範囲により、必要な力の範囲は４３Ｎから７２Ｎの間であると決定された。これを支持するため、ＡＮＳＹＳを用いた有限要素解析が計算された。上記の限界力計算から導いた下限値４３Ｎは、氷の無限板に適用された。そしてその結果生じた主応力が計算された。このＡＮＳＹＳ分析は６０ＭＰａの圧縮応力を生み出した。一軸圧縮における氷の破壊の経験的観測は４から３０ＭＰａの必要な応力を示す。この値は４３Ｎの力より生じる６０ＭＰａよりも小さい。限界力計算及びＡＮＳＹＳ分析の組み合わせは、LinMot社の駆動システムの適合性を示した。
【００５０】
＜実施例５：自由落下の力＞
自由落下の力の手段は、凍結した生理食塩水を破砕するのに必要な力を決定する追加的な手段として実施された。エネルギーの定理及びエネルギー保存を用い、実験が７３Ｎの力を凍結した生理食塩水に伝えることを予想した。ビットの約２倍の径のくぼみとともに、破砕が発生し、氷片が生じた。この試験はさらに理論解析の根拠をもたらした。
LinMot社の駆動システムの形態コンセプトの長所は動きの制御であると結論付けられた。前記制御はシステムのソフトウェアの操作を通じて達成されたものである。LinMot社のシステムは最小の発熱を持つ振動運動の一例である。加えて、LinMotは中空スライダ形態を備えている。前記中空スライダ形態は凍結標本を得た後に取り除くことを可能にする。
【００５１】
＜実施例６：改良及び同等物＞
LinMot社或いはその同等のシステムのサーボメモリはアップグレードされ、より多くのデータ点を有することができる。LinMot社の制御装置は、４０００のデータ点を有する運動軌跡を制御する。データ点における増加は、供給量をもたらす一方で、前記システムをより大きな範囲の周波数、振幅、及び力で動作させることができる。
他の有益な改善点は、ビットの材料にチタンを使用することにより、前記ビットの硬度を４５％増加させることである。ビットの形状の追加的な修正は、前記ビットが標本を採取する一方で、その標本から切片を取り除くことを可能にする。
その他の改良点は、例えばテフロン（登録商標）などのビットへの疎水性コーティングを施すことである。これは摩擦を低減し、前記ビットからより簡単に標本回収を行うことができる。
【００５２】
＜実施例７：ビット衝撃試験＞
LinMot社の超音波インパクトドリラを用い、前記システムは静止位置に取り付けられるので、LinMot社のスライダは唯一の可動部になる。LinMot社のソフトウェアは電流の力フィードバック及び前記システムの駆動力レベルを含む。
いくつかの単独の衝撃分析が行われ、最小の放射状亀裂でもって氷表面を破砕するのに必要な応力が決定された。試験の仕組みは多様な平均速度でのいくつかの操作を含んでいて、前記平均速度は１．２２から２４０ｍｍ／秒の範囲であった。３１６ステンレス鋼製の３０度のコニカルスタッド（円錐状のスタッド針）は、LinMot社のスライダに螺入される。氷表面上の圧力の増加を測定するため、スタッド針の先端部は平面になるよう細かく研磨され、衝突時に氷と接触する表面積を増加させる。平均の衝突速度は１２８ｍｍ／秒である。接触点の駆動力は、ソフトウェアの換算率及び出力の電流スパイクを用いることにより決定された。氷表面の電流は１．４７Ａであることがわかった。駆動力は２９．４８Ｎであると決定された。スライダの質量もまた、運動量を通して衝撃エネルギーの一因となるものとして考慮された。前記スライダの質量は０．５ｋｇである。前記運動量は０．０６４ｋｇ＊ｍ／秒で、これは駆動力及びスライダの質量を用いて計算された。計算で求めた衝突時間は０．００６秒であった。前記システムの衝撃力及び衝撃応力は、運動量を衝突時間長さで割って決定された。
最高慣性力は、スライダが固定子から最も遠いところに延出されている時、氷表面付近で発生する。最適な氷表面破砕データは１２０ｍｍ／秒の時であった。最大衝突部分は２．３７４ｍｍ２になるよう試験され決定される。また前記最大衝突部分は衝撃力４０．１５３Ｎ、合成応力１０ＭＰａになった。
【００５３】
＜実施例８：ビット分析＞
実験の要因計画は、表１に示すビットの形状の重要な要素がビットの応力にどのように影響したかを決定するため行われた。６つの独立因子が選択された。すなわち、Ａ：外径、Ｂ：衝突角度、Ｃ：フィレット半径、Ｄ：歯の高さ、Ｅ：衝突幅、及びＦ：歯の角度である。
２水準一部実施実験が用いられた。各因子に高水準及び低水準が割り当てられた。この結果、６つの因子に基づいた全因子計画の６４の組み合わせが半分に低減された。３２の組み合わせはＡＮＳＹＳで最大ミーゼス応力を解くため分析された。
【００５４】
【表１】
【００５５】
【表２】
【００５６】
これら６つの因子の主効果は、表２の結果を用い計算された。例えば、外径の主効果は、因子が高い値である組み合わせの平均応力を、因子が低い値である組み合わせの平均応力から差し引くことにより計算された。表２はこれらの計算結果を示しており、この計算結果はＭＰａで表された平均応力である。
外径及び衝撃角度は応力出力に大きな影響を持たないことがわかった。応力は衝撃幅が増加すると減少する。残りの因子は、因子の水準が増加すると応力も増加することを示した。歯の高さは歯の角度より影響を持たないが、フィレット半径よりは影響を持つ。衝突時に氷を破砕する最大表面積に伴うこれらの結果は、ビット形状を最適化するのに用いられた。
【００５７】
＜実施例９：製造可能性及び材料選択＞
ドリリングビットの形態は分析され、製造可能性の簡便さは以下を利用することにより最適化された。すなわち、利用可能な標準な管の大きさ、許容範囲の調整、及び一般的な寸法を用いたビットの形態である。
ビット形態は厚い壁及び薄い壁の形態を比較するのに開発された。これらの形態は２つ或いは３つの寸法においてのみ変化する。均一な測定はリードタイムを制限することによって製造化を簡便にする。ビット間の多様性は装置の動作に影響する寸法に限定される。本発明により好適な特徴が試験によって決定される。
前記ビットは既成の標準外科用管でできている。利用可能な材料として、すなわちチタン、インコネル６２５、またステンレス鋼３０４、ステンレス鋼３０４Ｌ、ステンレス鋼３１６、ステンレス鋼３１６Ｌのそれぞれが含まれる。表３は室温における４つの材料の材料特性を示している。本発明で用いられるドリリングビットは低い温度を条件とする。３００系オーステナイトステンレス鋼（高延性、低降伏応力、及び高伸張強度の性質を持つ）が重要であるのは、室温靭性の大部分を−２５２度の温度で保持するからである。
【００５８】
【表３】
【００５９】
表３の材料特性はステンレス鋼３１６が最適な材料であることを示している。ステンレス鋼３０４及び３１６は最も大きい降伏力及び疲労限度を有している。前記３１６ステンレス鋼はより硬い材料で、ここで使用するのに好都合な材料である。前記３１６ステンレス鋼は最適値を有し、また生物医学産業において広く利用されている。さらに、前記３１６ステンレス鋼は、前記３０４ステンレス鋼よりも一般腐食に対し耐久性を有する。一般的な管のサイズは、N.E．Small Tube社（ニューハンプシャー州リッチフィールド）、Micro Group社（マサチューセッツ州メドウェー）、Unimed社（ニューヨーク州ブルックリン、ソルベー）及びPopper and Sons社（ニューヨーク州ニューハイドパーク）を含む様々なところから市販されている。
前記ビットの形態は、様々な基準を満たす先端部の形状を含む。前記基準とは、半径方向の亀裂を最小化する一方、凍結試料に向かって縦方向の亀裂伝播を最大化すること、ビットの寿命、及び材料特性を最適化することである。また、前記材料特性とは、ダイヤモンドコーティングのオプション、及び要求に有益な他の追加物を含む。
【００６０】
＜実施例１０：ビット形態＞
主たる目的は、試料の１１０μＬ（１００ｍｍ３）±１０と同等の標本を得ることである。標準の長さ６０ｍｍのクライオチューブを用い、ドリリング機能に必要な針の径は約１．９ｍｍである。前記径はニードルシリンダの体積を用いて計算される。６０ｍｍのクライオチューブに利用可能な凍結材料の長さは、約３５ｍｍである。
【００６１】
【数２】
【００６２】
最初の試験に用いられるビットは４インチ長の針を備えていた。前記針は、平面のダイヤモンドコーティングされた先端部を有する、ねじ山のない真鍮の金属片に接続されている。前記針は３０３ステンレス鋼製で、内径（ＩＤ）が１．０６６８ｍｍ、外径（ＯＤ）が１．９８１２ｍｍである。この形態は前記ビットの長い繰り返し載荷寿命を有することがわかった。またこの形態は、衝撃表面の円の性質による衝突時の亀裂の長さ伝播の均一性も有する。しかしながら、この平面衝撃面はモデルシステム、凍結食塩水で標本をうまく作ることができず、効率的でないことがわかった。
さらなるビット形態はここで用いられるのと同じＩＤ及びＯＤを利用した。前記形態は、針との連結を促進するよう押圧されたねじ山を有する真鍮の金属片と、先が７５度になるよう研磨された先端部を有する。この二重先端部の形態はここに述べた形態と比較して、使用の簡便さにおいて向上した能力を示した。また採取した凍結標本は約１５．８７５ｍｍと、長さにおいても向上した能力を示している。
二重先端部の形態の改良は以下を含む。すなわち、前記ビットの応力を低減することによりビットの寿命を長くすること、システムの切断有効性を向上させサンプリング時間を短縮すること、そして不要な凍結切片を衝突部分から取り除く氷片除去システムを組み込むことである。ここにおける実施形態はさらに、これらの問題についても取り組んでいる。
【００６３】
＜実施例１１：ドリリングビットの実施例＞
本実施例におけるドリリングビットは、外形（ＯＤ）２．５ｍｍかつ内径（ＩＤ）１．８０ｍｍの壁と９０°切断による変形可能な4つの先端部を有する。この先端部は、無限小の値ではなく、約０．３ｍｍの厚さの衝撃平面を有する。この特徴により、衝撃時において、ビットにかかる最大応力を低減させることが可能となる。応力低減に加えて、切断部に０．２５ｍｍのフィレットが見つかった。
【００６４】
生理食塩水の凍結標本の抽出及び取出しは、抽出歯部を用いて行われる。この抽出歯部は、ビット全長に沿って、衝撃表面１ｍｍごとに間隔を空けて用いられる。凍結標本に対して接触するため、直径２．７ｍｍの抽出部が準備される。この抽出部は、従来の抽出部よりも０．１ｍｍ直径が大きい。この直径の変更により、緩衝帯が下方に設けられる。このことにより、除去されていない氷片が緩衝帯に再び入りこみ、針の固定が行われる。凍結標本のシリンダ壁と小さな抽出歯部の間における空隙が、針のＺ軸の振動運動により作り出された空気渦を介して、氷片の除去を促進する。第１抽出部の高さが０．１ｍｍに変更されるため、応力解析時において、抽出部及び氷界面の大きなずれを除去することが可能となる。抽出歯部とシリンダ針の壁の角度は２２°になっているため、急な斜面を形成し、抽出歯部と凍結標本のシリンダ壁部との間における氷粒子は急激な遷移をなす。
【００６５】
応力解析は、先端部が４つある形態（ドリリングビット）に対して行われ、特定の形状の選択がどのような影響を与えるのか確認した。６０ＭＰａの三軸的圧力時において、凍結生理食塩水の粉砕に要する最大応力がビット接触面に与えられると、先端部が２つのある形態はミーゼス応力の最大値１９７８ＭＰａと最大ずれ０．２５４ｍｍを示した。針による最大応力が１７９，２８１サイクルに達すると、ビットに不具合が生じる。６０ヘルツにて平均時間の１５０秒かけてコアを抽出することで、コアごとに９０００サイクルに達し、２０のコアに不具合が生じる。プロトタイプの形態に応じて、この解析は再現され、繰り返し荷重がどのように改善するのか決定した。
【００６６】
初期の衝撃テストを正確に再現するため、構造負荷として３４５ＭＰａ（表４参照）が接触ビットの衝撃表面全てに加えられた。この負荷は力の上界を再現し、力は針の先端に作用する。この圧力は、LinMot社がシステムとして採用している最大力、すなわち１２０ニュートンを用いて、計算される。そして、この計算方法は、初期接触の表面に対して用いられる。
【００６７】
【表４】
【００６８】
ビットの形状は、Ｘ、ＹそしてＺ軸の先端に拘束される。また、ビットの回転も全ての軸に拘束される。LinMot社のシステムにより、針に対して適用される物理的制約を正確に再現する。
本形状は、３５４ＭＰａのミーゼス応力の最大値をもたらす。この最大値は、従来の先端部が２つある形態と比して８２％に低減されている。本形状の最大ずれは０．００２６ｍｍで、従来の針の形態と比して９９％に低減されている。明らかなことだが、最大応力は、ビットの衝撃表面上に生じる。
【００６９】
＜実施例１２：疲労寿命＞
このビットにおけるミーゼス応力の最大値を用いることで、針に不具合が生じるサイクル数の下界（Ｎｆ）を導出する。従来の針の最大応力は、１７９，２８１サイクルに相当し、このサイクルではビットに不具合が生じる。６０ヘルツにて平均時間の１５０秒かけて標本を入手することで、サンプルごとに９０００サイクルに達し、１９．９２のコアに不具合が生じる。分析により、３５４ＭＰａの最大応力をもたらした。ビットは単独で緊張状態ではなく、圧縮状態である。従って、交互応力は最大応力の半分となる。ビットの交互応力から、バスキンの式を用い、ビットに不具合が生じるサイクルを決定した。分析の結果、ビットのＮｆは２，００３，１９７サイクルに達すると、ビットに不具合が生じることが判明した。本形態（標本ごとに５０ヘルツで１５０秒）の場合、標本ごとに７５００サイクルに達する。このサイクルは、ビットに不具合が生じるまで２６７標本に相当する。この結果は、従来の形態に比して１３３５％改善されたことを意味する。
【００７０】
＜実施例１３：自動化＞
本形態における方法及び装置は、アクチュエータ及びモータ回路スイッチ（ＭＣＳ）を介してＺ軸の動きを制御することに関する。ロードセルは装置に組み込まれ、衝撃地点の近くにおける、力測定結果を蓄積する。制御システムはＭＣＳを備え、ＭＣＳは両方のアクチュエータを作動させるとともに、ロードセルからのアウトプットを処理する。
ドリル作業中における力データは、コアシャフトに沿った摩擦力の情報を備える。蓄積されたデータは、最大衝撃力測定結果に基づき、ビット形状を調整することが可能である。LinMot社のアクチュエータの動作周波数は５０Ｈｚであるため、ロードセルは５０ＨＺの振動に耐えなければならない。２００Ｈｚよりも大きい速度で力測定を行い、衝撃についての十分な情報を提供しなければならない。スライダとコアリングビットのエネルギー運動量が結合される際、本システムによって生成される最大力は１２０Ｎである。荷重によるわずかな変形により、衝撃は分離され、ロードセルのずれを避けることが可能となる。
【００７１】
LinMot社のアクチュエータの動作は、主として増幅器内の組込みコントローラを介して制御されている。このコントローラは、スライダ質量と入力動作プロファイルに基づき、出力動作を計算し測定する。コントローラが運動を計算する際、ロードセル及びドリリングビットの付加質量は考慮に入れない。従って、コントローラの予期しない付加的な慣性が存在するため、全ての動きは反動運動量を有する。振動体質量はほぼ１１３にまで増加する。
【００７２】
ロードセルのずれは最小化されることで、小さな波形変化を測定することが可能となる。凍結標本に対して伝送されるエネルギーを最大化するためにロードする間、ロードセルはずれない。衝撃特性の予備調査は、衝撃の深さを示す。衝撃の深さ、つまりビットが氷の内側を移動した距離は約０．０４ｍｍである。これは、２ｍｍ／秒の全体的動作速度に変換される。小距離の場合、あらゆる方向への亀裂伝播距離を縮小させることで、放射状の氷の破砕を最小限にすることが可能である。
【００７３】
装置は、５０Ｈｚの振動数で２ｍｍの正弦波振幅を振動するようプログラムされている。ロードセルの周波数特性をドリリング操作の周波数特性よりも高くすることで、ロードセルの周波数特性を正確に測定することが可能となる。力データはサイクルごとに少なくとも４回蓄積される。周波数サンプルは２００ヘルツ以上である。機器の取得について、この時点で考えられなければならない。
【００７４】
初期検査の間、Lab Viewは、ロードセルからのデータを処理するのに利用され、コアリング操作時における組み合わせを特徴付けることが可能である。しかしながら、Lab Viewの利用に適するあらゆるロードセルは、他のコントロールシステムとともに利用するのに適している。多くのロードセル製造者は、設計仕様書内において装置を説明している。例えば、PCB Piezotronics社（デピュー、ニューヨーク州）の圧電式のロードセルは、リードタイムが短く、クオーツフォースセンサの能力があるため、本出願の発明において利用するのに適している。圧電式のロードセルは、動的ローディングに対する、ある特定の水晶の電気機械反応に基づいて、力を測定する。力の測定は、動的ローディング時に、水晶への供給電圧の変動を確認することで行われる。この場合、石英だが、水晶は、様々な伝導性を有する。この伝導性の違いは、電力供給装置における供給電源の変化に基づいて測定される。伝導性の違いは、直流電圧出力に変換される。例えば、PCBのような、商業的に利用可能なロードセルであれば、幅広いタイプのものが本発明で使用できる。そして、幅広い電源供給装置とロードセルは本発明の他部材とともに使用できる。統合システムは、電気的側面において増幅器による出力をLab Viewに取り込む役割を果たしている。装置は、衝撃時の力を測定する能力を有するとともに、適切にコアリングプロファイルを調整する能力を有する。PCB221B02のクオーツフォースセンサは本実施例の設計要件に適している。
【００７５】
線形アクチュエータは垂直に配向された支持構造と強固に接続されている。例としてLinMot社の線形アクチュエータは取付板と強固に接続されている。力は、取付板の前面から約５０mmの距離で与えられる。コアリング中に生じうる最大力に接近すると、３００Ｎの軸方向の力とキャリッジ全域での15Nmの力のモーメントをもたらす。軸周りに極僅かな力のモーメントとX軸あるいはY軸に極僅かな力のモーメントが存在する。
【００７６】
フォースフィードバックセンサを有する、完全統合自動システムの実験が行なわれた。LinMot社の製品である、亜音速によるインパクトドリラは５０Ｈｚの周波数に設定される。力センサを組み込むことで、氷内部で高い応力のかかった範囲に有益なフィードバックをもたらす。また、この力センサを組み込むことは最適運動プロファイルを決定するのに役立つ。完全自動システムと手動作動システムを数量化するには、ここで述べる形態を有する針（ビット）に対する試験を必要とする。試験手順は一定ではないが、５０Ｈｚの周波数に設定されたLinMot社のインパクトドリラを用い、Ｚ軸に沿った０．０５ｍｍの刻み幅による破砕が制御される。この結果は表５に示されている。
【００７７】
【表５】
【００７８】
Ｚ軸のモーションコントローラによる破砕変化の試験は、コアが２５．３ｍｍの深さに達する時、成功した。Ｚ軸上における刻み幅を増やすことで、ドリル速度を速め、LinMot社のインパクトドリラの周波数を５０Ｈｚに抑制し、Ｚ軸上における破砕時間を０．５秒にした。この結果は表６に示されている。
【００７９】
【表６】
【００８０】
最適運動プロファイルの試験結果と時間効率を示す。針ドリリングの自動化システムは凍結生体学的試料を等分化するための改善された手段である。ドリリングビットの形態は、仮設計を経て実験的試験を行い、最適化される。この結果により、コアリングビットに最大応力をもたらす際における各特徴により、主な効果が発揮される。結果が示すように、衝撃幅と歯の角度は、衝撃時にビット内の応力をもたらすのに、最も重要である。これらの結果は、氷破砕に要する衝撃領域を維持しつつ、応力を減少させることで疲労寿命に対して最適化されたビットをもたらす。最適化されたプロトタイプビットは、１５０標本の寿命を超えて十分使用できる。
【００８１】
＜実施例１４：凍結試料から採取される組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）＞
ＴＭＡs（組織マイクロアレイ）はここ数年間世界中で使われている。1ブロック内に数百のコアサンプルを設置することで、コホートの大規模試験を行なうことにおける、さらなる有効性が実証された。ヘマトキシリン・エオシン染色は、ＴＭＡの塊の上に準備されたスライドを染色する。このヘマトキシリン・エオシン染色は、数百の患者の診断情報を明確にするのに用いられる。加えて、ＴＭＡは臨床的研究以外の領域においても、よく知られている。例えば、３０００人の患者の大コホートの遺伝子、抗体及びタンパク質の研究において、ＴＭＡは生理食塩水から組織型や診断特徴を観察するのに用いられる方法である。逆に、ある特定の抗体を観察するためだけに、３０００人のスライドを染色することは、旧式の方法であるだけでなく、技術作業の人件費及び試薬にかかる費用が高額になる。ＴＭＡは研究分野において重要な地位を獲得している。また、本方法は、臨床検査室が求める高生産性及び正確性を満たすため、ＴＭＡは臨床分野においても有用である。
【００８２】
本方法のｐｆ ＴＭＡは、パラフィン包埋した組織を必要とするのだが、パラフィン内の固定組織を処理するのに欠点が存在する。従来技術の大部分は固定組織用に考案されているが、現在、固定物質の代わりに凍結組織を用いるニーズが増大している。パラフィン包埋した組織を用いる際、流動パラフィン内で高温にて固定作業、除去作業、浸透作業を行なわなければならない。これらの作業は、組織の抗原性を減少させる効果があるとともに、タンパク質を交差結合させ、他の組織構造を分解する効果がある。固定試料においては、多くの研究がなされていなかったことは否定的なことである。病変研究は、ホルマリンの固定試料の構造に依存するようになっているため、問題である。しかしながら、多くの不安定な抗原、タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、そしてペプチドの研究を行なうため、新鮮な凍結組織のマイクロアレイ（ｆｆ ＴＭＡｓ）に対するニーズが存在する。
【００８３】
病理検査室の最適な試料は入手しやすい新鮮な凍結組織の試料であり、この試料は、冷凍庫で−８０℃にて保存されている。凍結標本は、あらゆる研究作業において利用されている。この試料は生物学的機能を有した状態である。凍結後に、数日、数ヶ月、数年後、すぐにでも研究に用いられる。凍結部分はクライオスタットを用いて切り取られ、診断部分を入手し、試料の全表面を評価する。これは、ＤＮＡ及びＲＮＡの抽出の特殊研究、あるいは蛍光in-situハイブリデーション法（ＦＩＳＨ）やin-situハイブリデーション法（ＩＳＨ）といった蛍光抗体法に用いられる。個々に区分されたスライドは固定され、特定の作業に供される。この結果、不適切な固定により、時間をかけずにかつ好ましくない効果を得るのではなく、最適な試験結果をもたらすことができる。より少ない組織量で組織を区分するため、将来の研究に備えて、残存組織を確保することが可能である。結局のところ、常に病理学的記録を維持するため、少量の新鮮な凍結試料が固定され、処理される。従って、これから先、何年も、固定組織をパラフィンＴＭＡ内で固定することが可能である。
【００８４】
利用可能な技術は幅広い多用途性を備えるため、研究及び診断研究所にとって新鮮な凍結試料は最も価値がある。可能な場合には、最も一般的な病理検査室、特に学術研究所における病理研究室は即座に新鮮な組織標本を入手する。これらの組織は特異診断によるものであるため、特に興味深い。これらの標本例は、リンパ節、前立腺腫瘍、乳房の腫瘍、神経、そして筋肉があげられる。学術研究所には、診断及び研究用として、腫瘍そして新鮮な凍結試料の大きな保管場所が存在する。しかしながら、診断用組織を保全し、組織の有効な解釈結果を獲得しなければならないため、一貫した試料を取り扱う必要がある。
【００８５】
細胞株のアレイは本実施例において構成され、凍結細胞株のアレイは凍結標本のタンパク質リン酸化反応を決定するのに適していることが実験により示されている。タンパク質リン酸化反応は重要かつ有益なメカニズムであり、実例として明示するが、ホルマリン固定標本においては、信憑性がない結果を示す。多腫瘍アレイが構成され、該アレイにおける組織標本には、前立腺癌、良性前立腺腫瘍、結腸癌、腎癌、肝臓そして肺から採取した組織標本が含まれる。アレイ構成の過程により、ｆｆ ＴＭＡの凍結組織のマイクロアレイを生成する。この凍結組織のマイクロアレイは、最終生成物が生成されることで、有益な情報をもたらす。例えば、今まで固定組織として獲得することは不可能であった、ヘプシン造影ペプチドを用いる場合、有益な情報をもたらす。タンパク質の抗原は、しばしば固定時に破壊される、もしくは強い抗原回復を要する。
【００８６】
凍結多腫瘍アレイの構造についてだが、アレイは‐８０度の冷凍庫で保存されている組織を用いて生成される。新鮮な凍結組織と２年以上前に生成された凍結組織は同等の結果を示した。このことは、凍結組織の最も重要な点である。
【００８７】
多腫瘍アレイは、Beecher社のMTA１アレイヤと、Tissue Tek社のO.C.T.コンパウンド（Optimal Cutting Temperature：最適切削温度，ティシュー・テック社）を用いて手動で形成される。包埋媒質として用いられる水溶性の包埋剤は、凍結状態で試料を維持するのに用いられているため、‐８０度の冷凍庫において、乾燥を防止する役割を果たしている。アレイヤ周囲領域を、組織の保全可能な低温とするために、ドライアイスがアレイヤの内部及び周囲に用いられる。組織標本とアレイの温度変動が測定され、温度制御を確保することが可能となる。多腫瘍アレイは、全試料に対する解析(mapping)が行なわれるとともに、管理(filing)場所が維持されているため、パラフィンアレイと同様に準備される。標本は供給体の凍結標本の塊から取り除かれ、包埋容器のウェルに収納される。１つのスライド上でヘプシン造影ペプチドを用いて、一度で全ての組織を選択し、実験を行うことが可能となったため、この凍結多腫瘍アレイを用いると、従来技術では不可能であった実験を実施することが可能となる。従来技術では、個々の組織の多くの切片は、様々な組織型の価値及び制御可能性の分析が行なわれる必要があった。
【００８８】
凍結標本は、リサーチ・クオリティ・クライオスタット（Leica Microsystems社 ドイツ ハイデルブルグ）で切り取られる。各切片が切り取られてから、クライオジェーン・テープ・トランスファー・システム（Instrumedics社 ニュージャージー州 ハッケンサック）を用いて切片を取り上げる。テープトランスファーシステムを用いると、組織をスライドにしっかりと接着させることが可能である。なお、このスライドもまたInstrumedics社による製品である。CryoJane社のシステム及びスライドを用いることで、スライドごとに標本が増加し、組織を無駄に使うことにはならない。
【００８９】
＜凍結細胞株のアレイ＞
タンパク質リン酸化反応は細胞内シグナル伝達において、重要なメカニズムである。リン酸化タンパク質を決定する従来の方法は、しばしば信憑性がない結果を示す。細胞内のホスファターゼ及びホルマリン固定により、これらのタンパク質は数ミリ秒の血流不全の間に脱リン酸化する。なお、この血流不全は、細胞あるいは組織が採取される際に生じるものである。ホスファターゼ阻害剤を追加することで、脱リン酸化は進行しない。リン酸化状態を維持する１つの方法は、組織あるいは細胞株を採取し、ホスファターゼ阻害剤を加え、標本を氷上に置き、凍結させ、即座に温度を下げる方法である。
【００９０】
凍結細胞株のアレイを生成するため、リン酸緩衝生理食塩水の内、３０μlの細胞懸濁液は、２０μl採取できるピペット先端を用いて、流し型のウェルに移される。（図４のパネルＡを参照）現在、１６までの個々の細胞株標本を一度に配列することが可能である。図４におけるパネルＢはＨ＆Ｅ染色を行なった、アレイの中心部を示している。細胞株は単細胞クローンからなるので、固形組織コアを入手することは必ずしも必要ない。図４のパネルＣにおいて、抗体で染色した細胞コアが高倍率で示されている。この抗体は細胞外調節キナーゼ（ＥＲＫ）の特異的なリン酸化体である。強い核染色が確認された。
【００９１】
＜凍結多腫瘍組織のアレイ＞
ヘプシンの発現は、前立腺癌の場合、過剰に発現される生体指標であるが、このヘプシンを観察することは、前立腺癌の診断に非常に役立つ。ＰＳＡは前立腺癌の通常のスクリーニング試験に現在用いられているが、必ずしも適切な指示薬だとは限らない。従って、前立腺癌の診断のための非侵襲的方法を開発する必要性がある。従って、ヘプシン特定のペプチドは生体内画像で識別されている。
【００９２】
ヘプシンに結合するペプチドはファージ提示法の技術により識別される。これらのペプチドのヘプシンへの結合は、ヘプシンを過剰発現する細胞株を用いて確認される。しかしながら、造影剤を展開するために、ペプチドは、ヒトの組織のタンパク抗原を結合可能であることを示すのは重要である。患者の組織標本あるいは組織のマイクロアレイ（ＴＭＡ）上のペプチドを検査する際の大きな障害は、これらのペプチドが特定の構造であること及び最適な結合を行うインタクトな抗原を要することである。タンパク抗原は、抗原固定化及び抗原回復過程においてしばしば破壊されるので、ホルマリン固定パラフィン包埋（Formalin-Fixed Paraffin-Embedded: FFPE）組織を用いて形成されたTMAは、このようなペプチド試験には使用できない。ほとんどの抗原は、通常の免疫組織化学（ＩＨＣ）における多数の抗体により認識されている構造を保持しているのだが、ペプチドは小さな分子抗原であり、インタクトな局所的構造を要する。従って、凍結組織において局所構造はしっかりと保存されているので、このような研究の際、凍結材質が必要となる。
【００９３】
ヘプシンと結合するペプチド対象を生体内撮像試験するために、凍結した多腫瘍ＴＭＡが用いられる。凍結した多腫瘍ＴＭＡは、前立腺、肺、結腸、肝臓、腎臓、胸、そして手動で研究室において構成される良性前立腺腫瘍の組織を含む。図５はＦＩＴＣと分類される腺癌のペプチドを用いて、特定のヘプシン染色を示す。特定のヘプシンの膜質染色は腺癌の腔側に見られ、この染色は際立って良性の腺においては確認されない。
【００９４】
従って、凍結ＴＭＡを用いることで、ヘプシン造影ペプチドのもつ能力に対する試験が成功したことを示す。本研究において形成された多腫瘍凍結アレイは、様々な種類の癌の造影を行う際、様々な組織の試験マーカとしても供される。
【図面の簡単な説明】
【００９５】
【図１】ドリルビット（TechnoDiamant社）の写真を示す図である。内径（ＩＤ）０．０３９５ｍｍ、外径（ＯＤ）０．０７０ｍｍである。先端部はダイヤモンド／金属のマトリックスを有する。
【図２】中空ドリルビット内の標本の温度を時間の関数として示す図表である。ビットの予冷は、容器内の冷却液、熱平衡、及び曝気により行った。データは４回の実験の平均値である。
【図３】ドリルビットの線形振動モータを示す概略図である。符号は駆動システム（３１）、スライダ（３２）、ビット（３３）を表す。
【図４】凍結株細胞アレイを示す図である。このアレイは、本発明中の方法により抽出された標本の凍結組織を配置するための型を用い作製された。図４のパネルＡは株細胞アレイを示す。プロトタイプブロックは１２の空洞を有する。組織マイクロアレイは８個の標本を有する。また組織マイクロアレイは、最初の２列中に５個の組織（薄色）を有し、３個の染色ＯＣＴ（最適切削温度:Optimal Cutting Temperature）標本（濃色）を３列目に有する。空洞の形状を示すため、空の空洞が４つある。光の加減のため僅かに色が濃くなっている標本もある。これは標本がより深い成形穴から取り出されるためである。成形穴は２度のテーパを有し、このテーパにより標本が落下しないようにする。図４のパネルＢは染色標本を示す。図４のパネルＣは細胞の顕微鏡写真である。この細胞はリン酸化したＥＲＫに特異的な抗体を用いて染色されたものである。
【図５】ＦＩＴＣと分類されるヘプシンペプチドを用いて染色した凍結組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）の写真である。図５のパネルＡは、凍結腺腫瘍の標本の細胞の顕微鏡写真（２０倍）である。この写真は、腺癌の内腔付近の特異的な膜染色を示している。図５のパネルＢは対照凍結の大きな良性腺（２０倍）の顕微鏡写真である。特異的染色は陰性を示す。すなわち細胞間質の弱い非特異的染色を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、凍結した生物学的標本を凍結試料から、該試料を解凍せずに抽出するためのコアリングシステム、及びその使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生物保存容器に保存される生物学的標本は、病気の診断や原因の研究をする際に重要な資源である。生物学的標本は軍事施設、法医学ＤＮＡバンク、政府の研究所、診断病理学及び細胞診、営利企業及び病院等の非営利組織において保存されている。生物学的標本の保存及び分析を行うことにより、病気についての知識が増加し、これらの病気の予防、診断、及び治療のためのよりよい方法を発展させる基礎となる。
【０００３】
控えめに見積もっても、２億８千２百万の試料が現在米国の施設内に保存されている。またその試料は、１９９８年の初めから毎年２０００万ずつ増加している。（国家生命倫理諮問委員会、「ヒト由来試料を用いた研究：倫理問題及び政策指針」、第１巻、国家生命倫理諮問委員会による報告及び提言、メリーランド州ロックビル、１９９９年８月）。
【０００４】
生物学的標本は通常凍結した状態で保存される。試料はスライド、パラフィンブロック、ホルマリン固定、組織培養、抽出されたＤＮＡとして保存されている。癌、感染症、精神疾患の研究は、これらの試料に瞬時にアクセスすることで進展する。例えば、前記標本は約−２０度、−４０度、或いは約−８０度でクライオチューブ内に保存される。標本を等分する現在の工業的手法は、部分標本を取り除く度に試料の保存量を解凍及び再凍結することにより行われる。検査結果によると、凍結・解凍のサイクルを繰り返すことにより、試料が品質低下することを示している。しかしながら、凍結（クライオストレージ（冷凍貯蔵器））を行うと生物学的標本の耐用期間が延長される。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
さらに、現在の標本の入手方法及び処理方法は遅延時間を伴うものであり、またこれらの保存場所を使用するにあたって障害となるものである。標本は、標本に対して品質低下させる凍結／解凍のサイクルが繰り返される。また、一つの試料が複数の容器に冷凍前に分け入れられると、冷凍場所の非効率的使用、クライオチューブの費用、ラベル及び時間の増加を招く。そして処理時において新たなミスを引き起こすこととなる。
【０００６】
保存量の凍結された生物学的試料から標本（部分標本）を獲得する効果的な方法は、すなわち、過剰な凍結保存場所の需要の削減、試料受入の調達時間の削減、及び試料の品質低下の削減を行う方法であり、これらの方法が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明のある一部は、凍結した生物学的試料から凍結標本を採取する装置をもたらす。この装置は、容器内の試料に接触するドリルを備え、該ドリルは中空ビットコアリング針を作動させるモータを備え、また試料を掴むグリップを備え、該グリップは容器の開口端を前記針の近位に有し、前記モータは前記針を前記容器内の試料に突き刺し、凍結標本はコンテナ内の試料が解凍されていない場合、試料から取り除かれる。
【０００８】
ある実施形態において、前記装置はさらに前記容器の終端部を浸水させる冷却タンクを備える。前記冷却タンクは試料を連続的に凍結し続け、品質低下を避けるものと想定される。すなわち、沈殿した標本の連続的凍結、試料の表面に霜が降りることの防止、試料への水の添加の防止、及び使用者による試料の視認可が挙げられる。
【０００９】
前記装置の関連する実施形態において、前記容器はクライオチューブ、アレイ、成形レシピエントブロックの仕切り、或いはプラットホームより少なくとも一つ選択される。
【００１０】
前記装置のある実施形態において、前記モータは線形振動運動をもたらす。前記装置の代替可能な実施形態において、モータは回転運動をもたらす。
【００１１】
代替可能な実施形態において、前記装置はコンピュータと通信するサーボ制御装置を備え、前記コンピュータ及びソフトウェアを用いてプログラム可能である。その他の実施形態において、前記装置は手動制御される。
【００１２】
前記モータが前記ビットへ力をもたらし、これにより前記ビットは、約３０Ｎ〜約９０Ｎ、約３５Ｎ〜約８０Ｎ，或いは約４０Ｎ〜約７５Ｎ等の力で凍結試料へ衝突する力をもたらす。前記モータは前記ビットへ約４０ＭＰａ〜約８０ＭＰａ、或いは約５０ＭＰａ〜約７０ＭＰａ等の圧縮応力をもたらす。前記試料は約−９０度、或いは約−８０度、或いは約−７０度、或いは約−４０度、或いは約−２０度、或いは約−１０度の温度で保存される。すなわち、前記試料は約−９０度から−１０度等の範囲内である。この装置の冷却要素により、試料に霜が降りない。
【００１３】
ある実施形態において、試料は約０．５ｍＬ〜約５ｍＬ、或いは約１．５ｍＬ〜約１５ｍＬ、或いは約５ｍＬ〜約５０ｍＬ等の体積を有する。代替可能な実施形態において、前記試料は約１０μｌから約５０μｌ、或いは約５０μｌから約１００μｌ、或いは約１００μｌから約５００μｌ、或いは約５００μｌから約１．０ｍｌである。
【００１４】
前記装置の他の実施形態において、前記ビットの先はさらに研磨された先端部及び歯部が付された抽出部を有する遠位端を備える。前記装置のある実施形態において、前記ビットの先はセラミック或いは金属である。例えば、チタン、インコネル６２５、ステンレス鋼３０４、ステンレス鋼３１６、ステンレス鋼３１６Ｌの群より選択される少なくとも一つを含む組立式の標準の外科用の管である。
【００１５】
他の実施形態において、前記装置はさらに標本の受入装置を含む。関連する実施形態において、前記受入装置はマイクロアレイである。例えば、前記マイクロアレイは予め型どられた空洞を有するレシピエントブロックである。前記空洞はテーパ形状を有し、前記空洞は底に向かって大きくなる。例えば、空洞がテーパ形状であるため、標本が外へ飛び出すことが防がれる。ある実施形態において、前記予め型どられた空洞が有するテーパ部は、２度、或いは約５度、或いは約１０度の傾斜を有する。
【００１６】
ある実施形態において、前記装置はさらに、ばね復帰或いはその他のタイプの自動復
帰を有する突き出しピンを備える。前記突き出しピンは、前記針の内径よりも小さい及
び実質的に同一の断面直径を有する。
【００１７】
前記装置はさらに筐体を備える。前記筐体は、湿度制御、冷凍、血液により運ばれる病原菌に対する使用者への安全性、及び滅菌の群より選択される少なくとも一つの用途に用いられる。
【００１８】
ここに述べられる発明の他の態様は、凍結した生物学的試料から凍結標本を採取するための方法、及び試料を凍結した状態で維持するための方法であって、前記方法は、中空ビットコアリング針を作動させるモータを有するドリル及び試料を掴むグリップを用いて容器内の試料に接触する段階を備え、前記グリップは容器の開口端に位置し、前記容器は針の側に位置し、前記モータは前記針を試料に突き刺すよう動作させ、前記方法はさらに、前記凍結標本を含んだ針を抜く段階と、前記凍結標本を針から受入装置へ押し出す段階を備え、前記凍結標本は前記凍結された生物学的標本から得られ、前記標本は凍結状態で維持されている。
【００１９】
他の実施形態において、前記方法はさらに、容器の終端部を浸水させる冷却タンクを備える。関連する実施形態において、前記容器はクライオチューブ、アレイ内の仕切り、或いはプラットホームより少なくとも一つ選択される。
【００２０】
ある実施形態において、前記方法は、少なくとも約−９０度から約−１０度、或いは試料を凍結状態で保存するその他の温度にて行われる。他の実施形態において、前記方法はさらに、標本の複製部分標本を得るため前記段階を反復することをさらに含む。関連する実施形態において、前記方法はさらに、少なくとも一つの付加的試料より標本を得るため前記段階を反復することを含む。
【００２１】
前記方法のある実施形態において、中空ビットコアリング針を作動させる前記モータが前記試料の表面に線形振動運動を与えて破砕する。
【００２２】
前記方法の他の実施形態において、前記凍結標本を針から受入装置へ押し出すことは突き出しピンを作動させることを含む。
【００２３】
他の実施形態において、前記受入装置は分析管、クライオチューブ、病理学、組織学及び／又はマイクロアレイ分析用の平面、及びマルチウェルディッシュのくぼみからなる群より選択される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
凍結された生物学的試料の保存容器の保護及び分析することで、病気に関する知識を増加させ、またこれらの病気の予防、診断、及び治療のためのよりよい方法を発展させる基礎となる。
【００２５】
ここにもたらされる方法及び装置は、超低周波衝撃ドリリングを用いて、硬い凍結試料に穴をあけ、標本（部分標本）を抽出する。前記装置は、部分標本の凍結標本を抽出する手順を自動化することにより、標本を抽出するのに必要な時間を低減する。また前記方法は、現在の工業的手順と比較して、訓練及び操作にあまり時間を要さない。ここにもたらされる前記装置及び方法は、研究所の研究員のリードタイムを低減し、医学研究を促進する。そして最も重要なのは、前記装置及び方法が、保存された凍結試料の生物学的安定性及び完全性をもたらすことである。
【００２６】
＜工業標本処理＞
生物学的保存には、多数の凍結された生物学的組織及び液体試料が含まれる。前記生物学的組織及び液体試料は、他の研究分野と同様に、生体指標、栄養学、機能的ゲノム学の研究を支持するものとして科学者が利用可能なものである。例えば、血液バンクは将来的に利用するため２万から４万ユニットの血液を保存すると同時に、年間約１５００万ユニットの血液を集めている。注文を受けた標本のセットを配送するのに、現在の生物学的保存施設は、非常に長いリードタイムをかけている。例えば、看護師健康調査（ＮＨＳ）によると、分割操作において、研究助手は週に１５０の標本を処理する。また標準的な研究には約１０００の標本が必要となる。したがって、研究助手が一つの研究のための標本処理を完了させるために、データ管理に要する１〜２週間に加えて、６週間以上の期間が必要となる。
【００２７】
凍結・解凍のサイクルは、標本内のＲＮＡやたんぱく質などの重要な生物学的分子の品質低下につながることが知られている。このことは、品質低下の正確な程度が数値化されていないため、研究者にとって問題となっている。クライオストレージ（冷凍貯蔵器）は生物学的試料の耐用期間を延ばすために必要である。最も品質の高い標本を研究所に届けることを確実にするため、凍結・解凍のサイクルを繰り返すことは最低限化、或いは排除されなければならない。
【００２８】
ある方法は、標本を一つの容器に保存すること、及び要求された場合に必要な量を等分するのが特徴である。標本は、例えば１．８ｍＬ或いは４．５ｍＬの大きなクライオチューブ内に保存され、そして凍結される。標本がその全体を解凍、混合される必要がある場合、必要な部分標本が取り出される。残りの標本は元の容器内で再凍結される。この方法は、標本が一つの容器内に保存されるため、労働力、空間及びエネルギーを有効利用する。欠点は、標本が何度も凍結・解凍のサイクルにさらされるので、標本の品質は低下し、またその将来価値が低減することである。
【００２９】
保存及び抽出のその他の方法は、等分された大きさの容器に標本を保存することである。この方法は品質低下がわずかという利点を有する。しかし、この方法は、各標本に対して多数のクライオチューブを保存する必要があるため、労働力、凍結場所及びエネルギーは有効利用されていない。さらに、標本を識別する際に混乱を招くという別の可能性もある。
【００３０】
標本保存の第３の方法は、２つの既に述べた方法の組み合わせである。この混合した方法は、多数の試料を凍結保存することから始める。例えば１．８ｍＬ或いは４．５ｍＬのクライオチューブを用いて保存する。分析の依頼があると、試料は例えば等分に分割され、その後、使用されなかった部分標本は再凍結される。試料のこの保存方法は、凍結・解凍を２回繰り返すのみである。試料が必要とされるまで、凍結場所の利用は最小限でよい。しかしながら、この方法は試料の質を維持するが、凍結場所については問題がある。またこの方法は混乱を招き、大きな労働力を要する。
【００３１】
生物学的保存に凍結標本分割器具を導入することにより、以下の有利な点が挙げられる。すなわち、過剰な凍結保存場所に対する必要性を抑制できる点、試料の部分標本を受取るのに要するリードタイムを削減できる点、訓練の必要性を最小化できる点、及び試料の品質低下を凍結・解凍サイクルの繰り返しを低減することにより制限できる点である。この提案されている器具は、試料の解凍を行わずに凍結試料を直接取り出す。必要とされる凍結場所は、試料がより大きな体積で保存されることができるので最小化される。凍結試料をドリルの自動化により取り出したり、或いは分割する方法は、現在の標本採取作業にとって重大な進歩をもたらすものである。
【００３２】
本発明中に用いられているように、「試料」という用語は、凍結した生物学的な固形組織及び体液を保存したもののことを言う。「標本」及び「部分標本」という用語は、元の試料の一部のことを言う。
【００３３】
＜構造の目的＞
凍結された生物学的試料より１ｍｍの直径のコアを抽出するように設計することが必要とされる。前記試料は、約−９０度、−８０度、或いは−７０度、−４０度、或いは−２０度の温度、或いはそれ以下の温度で保たれている。実施例は、凍結試料が脆性材料の性質を示すことを表している。試料の劣化、また発熱の様々な状態が予想される方法が本発明において分析される。回転コアリング方法は、生物学的試料へ伝わるビット内の高い座屈応力及びねじり応力を有するため、要求を満たすものではないことがわかった。
圧電スタックを有する超音波ドリルシステムを、線形運動により駆動する超低周波システムと比較した。発熱の量は、周波数及びストロークの長さに直接比例することがわかった。また、超音波を用いた方法は、計算及び分析を経て、可能性を有する解決策として考慮されなかった。
次にリニアモータを分析した。試験した最初のモデルはLinMot社の設計のもので、設計の構想に必要な動きをもたらすために選ばれた。試験は多様なビットの形状を用いて行われ、最適なドリルビットの形態が見出された。正弦波、周波数５０Ｈｚの音波、及び２ｍｍのストロークが、破砕を開始するのに必要な力を標本内にもたらすものであることを突き止めた。図３はビットを備えたLinMotリニアモータの図である。
本発明における装置及び方法の目的は、凍結した生物学的試料より標本を抽出することである。この目的は、凍結試料の破砕システム及びシステムの温度制約に起因する重要な課題に対するものである。例において、データは凍結した生理食塩水が実際の生物学的試料の代表であること、また脆弱な性質を示すものである。調査を通じて、標本抽出時の脆弱な破砕方法は、結果として氷片を形成することがわかった。氷片を容易に除去すること、及びさらに深いコアのために、振動運動が考慮される。この種の装置の分析は、摩擦による発熱は周波数及びストロークの長さに比例することを突き止めた。したがって、実施例のさらなる目的は振動運動を突き止めることである。前記振動運動は、低い周波数及びストロークの長さを有し、破砕を起こすのに必要な力を標本内にもたらす。この運動は本発明において、これらの目的を満たす独特なビットの形態と組み合わせられる。
【００３４】
＜形態特性＞
前記装置の特性について以下の点が述べられる。すなわち、部分標本間に保存される体積の均一性、効果的な状況において利用される保存量、無駄な標本を最小限にすること、及び従来技術の方法と比較して時間及び使用者の必要量が最低限で済むことである。
臨床試験の基準に基づいた部分標本の必須条件及び工業的効率性の必須条件については以下のことが述べられる。すなわち、少なくとも約１０μＬ、５０μＬ、１００μＬ、或いは約５００μＬが分析の成功のために必要となる。あるケースにおいて、工業の標準規格は、保存量の効率的な利用のため部分標本を約１２０μＬ以下に制限している。１．８μＬ入る典型的なクライオチューブは、工業の効率的な標準規格を満たすため約１０の部分標本を有する。周辺の試料への周囲の損傷は最低限にされるべきである。そうすればさらなる標本を同じクライオチューブより抽出することが可能となる。
【００３５】
＜試料採取方法＞
回転運動を用いビットを駆動させ物質内へ入っていく回転ドリルは、米国特許出願第2002/0129975号（Barth他）に示されている。この氷用オーガシステムは、湖や川などの凍結した水から固体のコアを切り取るのに用いられる。その目的は、氷の削り屑を削減する一方、氷に穴を開け、筒状の氷のコアを大きなひびを入れずに取り出すことである。前記システムは細長いシャフトの上端部に接続されているモータ装置を使用して回転する。前記システムは、少なくとも１つの氷に係合するビットを用いて芯をくり抜く。また前記システムは継続的切断用のフライティングを利用する。このシステムは、一定の正確な量を正確に抽出するため、或いは内部のコア及び周囲の氷の完全性を維持するものとして設計されていない。このシステムは基本的な回転運動を用い、固体のコアを切り取るのに用いられる。
超音波コアラー／ドリラ装置は、米国特許第6,689,087号（Pal他）に示されている。このシステムはハンマ作用を生み出す。前記ハンマ作用は超音波及び亜音速の振動を用いることにより生じ、効果的なドリリング及びコアリングを生み出す。超音波ドリラ及びコアラーは惑星探査、地質学的調査、軍事、及び医療手術において用いられる。また前記超音波ドリラ及びコアラーは、一定の正確な量を正確に抽出するため、或いは内部のコア及び周囲の氷の完全性を維持するためのものとして設計されていない。このシステムは基本的な回転運動を用い、固体のコアを切り取るのに用いられる。
マイクロアレイ技術は、さらに小さな針という不利な点を有する。前記針は、径が縮小されたためより簡単に曲がり易く、例えば癌の生検等の組織標本をほとんど解明することができない。大きさが長さ３ｍｍから４ｍｍで、約−２０度で凍結されたドナーブロックから取り出された標本が抽出される。
いくつかの実施形態において、ダイヤモンド結晶は、極めて高い温度、また成分を切断する極めて大きい応力のもとに結合している。これは米国特許第5,437,343号（クーリー他）に示されている。耐熱性多結晶ダイヤモンド切削要素は、回転ドラッグビットを使用するために置かれる。前記回転ドラッグビットは、せん断運動で地下層に穴を開けるのに用いられる。窒化ホウ素及び窒化ケイ素もまた超硬物質であり、同様に切削要素に結合することが可能である。スパッタコーティングダイヤモンド或いは熱処理エナメル加工超硬物質を針先形状の先端部に用いることによって不具合が生じるまでのサイクルが増加し、針先の初期の接触応力を低く維持することになる。
【００３６】
＜ビットの形態＞
本発明において、「ビット」、「ドリルビット」、或いは「針」という用語は、線形振動モータに取り付けられた中空管を指す。前記線形振動モータは凍結された生物学的試料に衝撃を与えドリルで穴を開け、そして凍結標本を取り出すものである。
前記ビット（針）の形状は、ドリルで穴を開ける間、放射状の亀裂を抑制するよう最小化される。そうすることにより、各クライオチューブから最大数の標本を取り出すことができる。放射状亀裂の伝播に影響する要因として、衝撃速度、衝撃力、ビット表面積、及び第一の歯部を備えた抽出部のピッチが含まれる。
前記ビットの先端部にかかる応力を低減することは一つの特徴である。そして前記ビットにかかる応力は最小化されるので、前記ビットの疲労に起因する不具合を防ぐ。このことは、操作コスト及びシステムをより効率的にするので、各針が可能なコアの数を最大限にする。
凍結標本を貫通する際に針が結合することを最小限にするため、凍結氷片除去システムは、針の形態に組み入れられている。このシステムは不要な圧縮された凍結氷片の除去を容易にする。衝撃を受ける場所から圧縮されていない氷片を除去すると、針の衝撃面と凍結標本間の摩擦が低減される。
針の材料の選択は以下の要因により影響を受ける。その要因とはすなわち、強度、周囲及び凍結標本の周囲の温度サイクルに耐える能力、低価格、及び製品化の容易さである。
【００３７】
＜例示的モデル＞
凍結組織マイクロアレイヤの初期の形態は、中空ドリリング装置（TechnoDiamant社のダイヤモンドコアドリルビット）に基づいたものであった。前記装置は垂直方向の力および回転の組み合わせにより切断する。この切断方法の組み合わせは、垂直方向の力のみを利用した場合と比べて、前記針の応力レベルを低減する。また、この垂直方向の力のみを利用することは、すでに現在の市販の装置にて用いられている。力がより小さければ針の寿命が長持ちし、また組織の構造にかかるコアリングの衝撃を低減する。図１に示される前記針は、小さな凍結組織アレイを作製する間に２０の標本を切断することができる。
このドリリング装置はｘ−ｙミリングテーブルに組み入れられる。前記ｘ−ｙミリングテーブルは、ｘ−ｙ−ｚポジションのコンピュータ制御、及び一定であるが、選択可能な回転スピードのドリルビットのオン／オフ制御をもたらす。前記ｘ−ｙミリングテーブル或いはミニミルは、反復性を持つ0.003175ｍｍのステップ分解能を有する。該ステップ分解能は0.0127ｍｍよりもよい反復性を有するので、この発明にとって適切なものである。標本はTechnodiamant社の針およびミニミルを用いて、−７０度の凍結食塩水および組織から抽出された。
【００３８】
＜温度調整＞
凍結組織試料は組織カセット内に保存される。前記組織カセットはホルダに挿入され、そしてフライス盤上にある冷却液タンク内に配される。前記冷却液タンクはドライアイスアルコールスラリを収容する。前記ドライアイスアルコールスラリは組織を凍結状態に保持する。またある実施形態において、空気冷却材ループが、組織ブロック上方の冷たい空気の流れをもたらすものとして盛り込まれている。この空気循環は前記ブロック上部が温まらないようにし、ブロックに霜が降りることを防ぐ。この組立部は、前記ブロックを−７０度或いはさらに低い温度で、少なくとも８時間維持するのに適していることがわかった。
【００３９】
前記ビットは、凍結試料内を移動し生じる摩擦、或いはまた、試料からレシピエントブロックまでの移動で生じる対流によって熱を得る。前記ビットはあらかじめ冷やされるので、摩擦からの熱は周囲の試料へと消える。繰り返し使用される場合、前記ビットは使用される毎に冷却液で前もって冷やされる。例えば、前記ビットは試料上方の冷たい空気の流れに触れる。
【００４０】
システムの温度特性を決定するために、熱的接触をもたらすためクライオサーマルグリースで処理した熱電対が前記ビット内に挿入される。前記ビットはドライアイス／アルコールスラリと接触することにより冷やされる。そして前記ビットはスラリから離れる。また記録された温度は図２に示される通りである。データによると、標本の温度は−２０度で１００秒間維持される。この時間は、受容容器内の凍結標本の位置を決定し、そしてその位置に置くのに十分な時間である。
【００４１】
＜組織標本のレシピエントブロックへの挿入＞
凍結標本は突き出しピンを用いて針から取り除かれる。前記突き出しピンは、ドリリングの針の内径に非常にぴったり嵌合するもので、前記針から完全に及びすっかりと凍結標本を取り除く。前記ピンはさらにばね復帰を有する。そして前記ピンはテフロン（登録商標）シールを有してもよい。前記テフロン（登録商標）シールは前記プロセスの反復の前の針からのサンプル回収を最大限にする。ドリリングの針の遠位端にあるテフロン（登録商標）部品及び前記針の内径をぴったりとはめることは保持力を最小化する。また外部の要素は洗浄ステーション及び以下のステップを用いることにより取り除かれる。すなわち、ドリリングの針はブラシの床に挿入されている。ブラシは１０％濃度の漂白剤に入っていて、その中にコアリングの針が挿入されている。一度挿入すると、前記針はブラシの剛毛の周りを、軌道を描くよう動く。一方で前記針は回転し、前記突き出しピンは上下運動する。そしてテフロン（登録商標）部品は、その周囲も同様に洗浄されるように部分的に露出している。次の工程において、前記方法は、漂白が食塩溶液により行われること以外、ここに述べたものと同じである。そして、前記ステーションを乾燥し、残存食塩溶液を取り除く。そして冷却ステーションは前記針を所望の温度の範囲にする。
クリーニングアッセイは以下を用いて行われた。洗浄手順と共に本明細書中で得られた凍結したヒト組織１０個、及び洗浄手順を除いた対照群１０個をQuantiBlot Human DNA Quantitation Kit（Applied Biosystems社）、及びＤ１７Ｚ１の遺伝子座の霊長類種アルファサテライトＤＮＡ配列を用いて試験した。
【００４２】
＜組織カセット＞
凍結試料用の凍結組織アレイヤカセットは、例えば一つ、或いは多数に分割されたアルミニウムから機械加工されたものである。そのため、前記カセットは凍結、保存、或いは後に続くアレイ構成の間機能する。さらに、同じセットがドナー凍結試料及びレシピエントブロックに利用することも可能である。
【００４３】
＜組織形態の維持＞
凍結試料から標本を獲得するプロセス及びこれらの試料をレシピエントブロックに正確に配置するプロセスにおいて、従来技術における方法は、不要な力を細胞及び／又は組織へ適用するものである。ドリリングはせん断力（組織を通るコアリングビットの回転）及び圧縮力（コアリングの針が組織内へ押し込まれる時）を適用する。これらのコアリングの力は組織を「ねじる」可能性、及び組織を圧縮する可能性を有する。コアをレシピエントブロックに挿入する間、二つの力が適用される。一つは突き出し針からの力で、組織表面に対し均一に適用されるものである。もう一つは摩擦力で、コアリングの針の内径とレシピエントブロックの空洞の内径との交点において生じるものである。これら配置時の力には組織を圧縮する可能性があり、コアの周囲及び中心間の相対運動を引き起こす。
目的は、ドリリング及び配置時の力を最適化することである。この結果、組織の形態の変化が検出されない点にまで最適化される。これらの力に衝撃を与える本発明の制御に用いられる設計変数は以下を含む。ドリリングの針の形状、ドリリング間の回転速度、ドリリング間に前記針が前進する速度、ドリル外径及びレシピエントブロックの空洞の内径間の差、針の表面処理、ドリリングの針がレシピエントブロックの空洞上に配される正確さが含まれる。配置の正確さはコンピュータで制御されており、−７０度に維持された組織温度の生化学的忠実性を保つ。
アレイヤに組み込まれた圧電気力及びトルクセンサ（PCB Piezotronics社、圧電気力：PCB 1102-05A及びトルクセンサ：PCB 2308-02A）は、ドリリングのプロセスの間、適用した力のデータ及びトルクのデータ（力及びトルク対時間）を測定する。データは病理学的評価（例を参照）とともに分析され、最適な形態状態を特定する。変数の長所を評価するのに用いられる測定基準は以下のことを含む。すなわち、単一の組織切片の機能としての標本の形態はドリリングのプロセスの衝撃を査定するため評価される。評価を行うため、標本を様々な異なる組織の種類から採取し、また切片をドナー組織及び凍結組織アレイから採取する。そしてこの二つを一組にする。二重盲検評価は病理学者により行われる。
ドナー組織及び凍結アレイより採取した切片を切り、ここに同定される三つの重要な分析を進め、盲検評価をする。免疫組織科学（ＩＨＣ）／免疫蛍光（ＩＦ）は、特定の抗体を用いて細胞中の特定のたんぱく質及び抗原の存在を査定するのに用いられる技術である。前記抗体は前記たんぱく質及び抗原に結合することにより、視覚化及び顕微鏡での試験が可能となる。ＩＨＣに対するＩＦの長所として、様々な異なる蛍光性のクロモゲンが利用可能である。そしてこのようにして、同時に様々な抗原に異なる標識化をすることが可能であり、また視覚化することも可能である。
（蛍光）in-situハイブリダイゼーション法は、特定のＤＮＡ／ＲＮＡ配列（例：遺伝子）を検出する技術である。前記技術は、形態学的に保存された染色体、細胞或いは組織切片中の標識化された相補的なＤＮＡ／ＲＮＡのプローブを用いる。これは微小の位相的な情報を、ＤＮＡ或いはｍＲＮＡレベルでの遺伝子活性にもたらす。同様に、ＩＳＨに対するＦＩＳＨの長所として、様々な異なる蛍光色素が利用可能である。そしてこのようにして、同時に様々なＤＮＡ／ＲＮＡ配列に異なる標識化をすることが可能であり、また視覚化することも可能である。
【００４４】
本発明は十分に説明がされてきた。さらに本発明は以下の例や請求項によって示される。そしてこの例や請求項は実例となるものであって、より限定するものではない。繰り返し説明したり、ここに記述される特定の手順の多数の同等物を用いることなく、当業者は理解或いは解明することが可能である。そのような同等物は本発明及び請求項の範囲内にある。本出願で引用した米国特許及び米国特許出願公開を含む全ての文献を参照することによりこれに含むこととする。
【実施例】
【００４５】
＜実施例１：必要な力の決定＞
一般的な目的は、このプロセスの結果起こる発熱を最小化することである。凍結生理食塩水分析を用いた実験シミュレーションで、約−９０度、約−８０度、或いは約−７０度に維持された標本に破砕を生み出すのに必要な力は、所望のビット形態を用い約３０Ｎ及び９０Ｎ，特に４３から７２Ｎの間で変動する。この変動は、実験データに基づいた実験的凍結標本の破壊靭性において観測されたばらつきから生じたものである。
いくつかの形態の代わりとなるものが研究された。その中には回転運動或いは線形振動運動を有するドリルも含まれている。
【００４６】
＜実施例２：回転ドリル＞
コアリングの回転運動方法は、回転運動（例えばボール盤）を用いてコアリングビットを駆動することにより達成される。この方法は、標本を貫通するのにコアビットの高い軸方向の荷重と高いねじり荷重両方を必要とする。凍結した生物学的試料の回転ドリリングへの試みはいくつかの限定的な成功を見せたが、解析データにより決定されるような成功した標本を生み出すことはなかった。前記線形振動運動の分析から得られた追加的なデータをここに示す。
【００４７】
＜実施例３：線形振動運動＞
ここにもたらされる線形振動超音波ドリリングシステムは、圧電スタックを備える。該圧電スタックはホーンを共振周波数にする。典型的な超音波システムは振動数２０ＫＨｚ以上、変位は３０μｍまでで操作する。ここに示す市販の超音波ポリッシャを使用するサンプリングの実施例は、計算により確認された過剰な熱量を発見した。超音波ポリッシャ装置はドリリングビットを備え、凍結した標本へ導入された。前記装置は凍結試料を完全に溶かした。動きの変数に対する適応能力や調整もまた制限された。
したがって、ここで研究された線形振動システムの種類の他の例は、デジタル処理により線形モータシステムを制御した。この種類のモータは前記システムを亜音速のスピードで駆動させるのに用い、また必要な運動データをもたらすことができた。前記方法に適切なこの種類の例示的なモータはLin Mot社が製造している。（Delevan, WI53115）また前記モータは、円筒状固定子を用い管状線形モータをもたらし、ネオジム磁石を含む中空スライダを駆動させる。このモータの利点は、運動のパラメータを制御することに対し付加される。
【００４８】
＜実施例４：例示的装置＞
例えばLinMot社製のリニアモータは音速、線形、振動運動をサンプリング用に生み出す。固定子及びスライダ部品はサーボ制御装置により操作される。前記サーボ制御装置はその提供されたソフトウェアを備えたいずれのパーソナルコンピュータのＣＯＭポートを通じて通信したりプログラムされたりする。目的の最適適合性を決定するため解析調査が行われた。最初の計算は、前記システムでの発熱の量を決定するのに用いられた。前記システムでの発熱の起こりうる状態に、破砕、摩擦、及び粉砕が含まれる。ごくわずかな発熱量は摩擦から生じる。これは材料のもろい性質のためである。摩擦からの熱は、周波数及びストロークの長さに直接比例するよう計算された。計算によると、コアリングの超音波の方法は、LinMot社のシステムよりも２７倍以上の摩擦からの熱を生じた。標本分子の機械的粉砕から粉砕が生じる。前記機械的粉砕はビットコアが凍結標本内に入る時に起こりうる。粉砕により生じる熱はリッティンガー方程式を用いて計算される。前記リッティンガー方程式において、エネルギー法は、最初と最後の先端部の表面積を発熱量と関連させるのに利用される。リッティンガー法が実験的に発展すると、このシステムにおける粉砕による発熱を定量化することが難しい。発熱に加え、先端部の移動による熱伝導は周知のシステムの境界条件を用いて計算される。前記境界条件には先端部の大きさ及び先端部の移動速度が含まれる。粉砕から生じた熱を用いると、試験を通じ先端部熱伝導は最適に決定される。
−７９度における最初の破砕に必要な限界力は、以下の等式により決定される。
【００４９】
【数１】
これは物質の破壊靭性、ビッカース硬さ、及び推定合成放射状亀裂の長さに、破壊を生じさせる限界力を関連させるものである。
氷の破壊靱性値の範囲により、必要な力の範囲は４３Ｎから７２Ｎの間であると決定された。これを支持するため、ＡＮＳＹＳを用いた有限要素解析が計算された。上記の限界力計算から導いた下限値４３Ｎは、氷の無限板に適用された。そしてその結果生じた主応力が計算された。このＡＮＳＹＳ分析は６０ＭＰａの圧縮応力を生み出した。一軸圧縮における氷の破壊の経験的観測は４から３０ＭＰａの必要な応力を示す。この値は４３Ｎの力より生じる６０ＭＰａよりも小さい。限界力計算及びＡＮＳＹＳ分析の組み合わせは、LinMot社の駆動システムの適合性を示した。
【００５０】
＜実施例５：自由落下の力＞
自由落下の力の手段は、凍結した生理食塩水を破砕するのに必要な力を決定する追加的な手段として実施された。エネルギーの定理及びエネルギー保存を用い、実験が７３Ｎの力を凍結した生理食塩水に伝えることを予想した。ビットの約２倍の径のくぼみとともに、破砕が発生し、氷片が生じた。この試験はさらに理論解析の根拠をもたらした。
LinMot社の駆動システムの形態コンセプトの長所は動きの制御であると結論付けられた。前記制御はシステムのソフトウェアの操作を通じて達成されたものである。LinMot社のシステムは最小の発熱を持つ振動運動の一例である。加えて、LinMotは中空スライダ形態を備えている。前記中空スライダ形態は凍結標本を得た後に取り除くことを可能にする。
【００５１】
＜実施例６：改良及び同等物＞
LinMot社或いはその同等のシステムのサーボメモリはアップグレードされ、より多くのデータ点を有することができる。LinMot社の制御装置は、４０００のデータ点を有する運動軌跡を制御する。データ点における増加は、供給量をもたらす一方で、前記システムをより大きな範囲の周波数、振幅、及び力で動作させることができる。
他の有益な改善点は、ビットの材料にチタンを使用することにより、前記ビットの硬度を４５％増加させることである。ビットの形状の追加的な修正は、前記ビットが標本を採取する一方で、その標本から切片を取り除くことを可能にする。
その他の改良点は、例えばテフロン（登録商標）などのビットへの疎水性コーティングを施すことである。これは摩擦を低減し、前記ビットからより簡単に標本回収を行うことができる。
【００５２】
＜実施例７：ビット衝撃試験＞
LinMot社の超音波インパクトドリラを用い、前記システムは静止位置に取り付けられるので、LinMot社のスライダは唯一の可動部になる。LinMot社のソフトウェアは電流の力フィードバック及び前記システムの駆動力レベルを含む。
いくつかの単独の衝撃分析が行われ、最小の放射状亀裂でもって氷表面を破砕するのに必要な応力が決定された。試験の仕組みは多様な平均速度でのいくつかの操作を含んでいて、前記平均速度は１．２２から２４０ｍｍ／秒の範囲であった。３１６ステンレス鋼製の３０度のコニカルスタッド（円錐状のスタッド針）は、LinMot社のスライダに螺入される。氷表面上の圧力の増加を測定するため、スタッド針の先端部は平面になるよう細かく研磨され、衝突時に氷と接触する表面積を増加させる。平均の衝突速度は１２８ｍｍ／秒である。接触点の駆動力は、ソフトウェアの換算率及び出力の電流スパイクを用いることにより決定された。氷表面の電流は１．４７Ａであることがわかった。駆動力は２９．４８Ｎであると決定された。スライダの質量もまた、運動量を通して衝撃エネルギーの一因となるものとして考慮された。前記スライダの質量は０．５ｋｇである。前記運動量は０．０６４ｋｇ＊ｍ／秒で、これは駆動力及びスライダの質量を用いて計算された。計算で求めた衝突時間は０．００６秒であった。前記システムの衝撃力及び衝撃応力は、運動量を衝突時間長さで割って決定された。
最高慣性力は、スライダが固定子から最も遠いところに延出されている時、氷表面付近で発生する。最適な氷表面破砕データは１２０ｍｍ／秒の時であった。最大衝突部分は２．３７４ｍｍ２になるよう試験され決定される。また前記最大衝突部分は衝撃力４０．１５３Ｎ、合成応力１０ＭＰａになった。
【００５３】
＜実施例８：ビット分析＞
実験の要因計画は、表１に示すビットの形状の重要な要素がビットの応力にどのように影響したかを決定するため行われた。６つの独立因子が選択された。すなわち、Ａ：外径、Ｂ：衝突角度、Ｃ：フィレット半径、Ｄ：歯の高さ、Ｅ：衝突幅、及びＦ：歯の角度である。
２水準一部実施実験が用いられた。各因子に高水準及び低水準が割り当てられた。この結果、６つの因子に基づいた全因子計画の６４の組み合わせが半分に低減された。３２の組み合わせはＡＮＳＹＳで最大ミーゼス応力を解くため分析された。
【００５４】
【表１】
【００５５】
【表２】
【００５６】
これら６つの因子の主効果は、表２の結果を用い計算された。例えば、外径の主効果は、因子が高い値である組み合わせの平均応力を、因子が低い値である組み合わせの平均応力から差し引くことにより計算された。表２はこれらの計算結果を示しており、この計算結果はＭＰａで表された平均応力である。
外径及び衝撃角度は応力出力に大きな影響を持たないことがわかった。応力は衝撃幅が増加すると減少する。残りの因子は、因子の水準が増加すると応力も増加することを示した。歯の高さは歯の角度より影響を持たないが、フィレット半径よりは影響を持つ。衝突時に氷を破砕する最大表面積に伴うこれらの結果は、ビット形状を最適化するのに用いられた。
【００５７】
＜実施例９：製造可能性及び材料選択＞
ドリリングビットの形態は分析され、製造可能性の簡便さは以下を利用することにより最適化された。すなわち、利用可能な標準な管の大きさ、許容範囲の調整、及び一般的な寸法を用いたビットの形態である。
ビット形態は厚い壁及び薄い壁の形態を比較するのに開発された。これらの形態は２つ或いは３つの寸法においてのみ変化する。均一な測定はリードタイムを制限することによって製造化を簡便にする。ビット間の多様性は装置の動作に影響する寸法に限定される。本発明により好適な特徴が試験によって決定される。
前記ビットは既成の標準外科用管でできている。利用可能な材料として、すなわちチタン、インコネル６２５、またステンレス鋼３０４、ステンレス鋼３０４Ｌ、ステンレス鋼３１６、ステンレス鋼３１６Ｌのそれぞれが含まれる。表３は室温における４つの材料の材料特性を示している。本発明で用いられるドリリングビットは低い温度を条件とする。３００系オーステナイトステンレス鋼（高延性、低降伏応力、及び高伸張強度の性質を持つ）が重要であるのは、室温靭性の大部分を−２５２度の温度で保持するからである。
【００５８】
【表３】
【００５９】
表３の材料特性はステンレス鋼３１６が最適な材料であることを示している。ステンレス鋼３０４及び３１６は最も大きい降伏力及び疲労限度を有している。前記３１６ステンレス鋼はより硬い材料で、ここで使用するのに好都合な材料である。前記３１６ステンレス鋼は最適値を有し、また生物医学産業において広く利用されている。さらに、前記３１６ステンレス鋼は、前記３０４ステンレス鋼よりも一般腐食に対し耐久性を有する。一般的な管のサイズは、N.E．Small Tube社（ニューハンプシャー州リッチフィールド）、Micro Group社（マサチューセッツ州メドウェー）、Unimed社（ニューヨーク州ブルックリン、ソルベー）及びPopper and Sons社（ニューヨーク州ニューハイドパーク）を含む様々なところから市販されている。
前記ビットの形態は、様々な基準を満たす先端部の形状を含む。前記基準とは、半径方向の亀裂を最小化する一方、凍結試料に向かって縦方向の亀裂伝播を最大化すること、ビットの寿命、及び材料特性を最適化することである。また、前記材料特性とは、ダイヤモンドコーティングのオプション、及び要求に有益な他の追加物を含む。
【００６０】
＜実施例１０：ビット形態＞
主たる目的は、試料の１１０μＬ（１００ｍｍ３）±１０と同等の標本を得ることである。標準の長さ６０ｍｍのクライオチューブを用い、ドリリング機能に必要な針の径は約１．９ｍｍである。前記径はニードルシリンダの体積を用いて計算される。６０ｍｍのクライオチューブに利用可能な凍結材料の長さは、約３５ｍｍである。
【００６１】
【数２】
【００６２】
最初の試験に用いられるビットは４インチ長の針を備えていた。前記針は、平面のダイヤモンドコーティングされた先端部を有する、ねじ山のない真鍮の金属片に接続されている。前記針は３０３ステンレス鋼製で、内径（ＩＤ）が１．０６６８ｍｍ、外径（ＯＤ）が１．９８１２ｍｍである。この形態は前記ビットの長い繰り返し載荷寿命を有することがわかった。またこの形態は、衝撃表面の円の性質による衝突時の亀裂の長さ伝播の均一性も有する。しかしながら、この平面衝撃面はモデルシステム、凍結食塩水で標本をうまく作ることができず、効率的でないことがわかった。
さらなるビット形態はここで用いられるのと同じＩＤ及びＯＤを利用した。前記形態は、針との連結を促進するよう押圧されたねじ山を有する真鍮の金属片と、先が７５度になるよう研磨された先端部を有する。この二重先端部の形態はここに述べた形態と比較して、使用の簡便さにおいて向上した能力を示した。また採取した凍結標本は約１５．８７５ｍｍと、長さにおいても向上した能力を示している。
二重先端部の形態の改良は以下を含む。すなわち、前記ビットの応力を低減することによりビットの寿命を長くすること、システムの切断有効性を向上させサンプリング時間を短縮すること、そして不要な凍結切片を衝突部分から取り除く氷片除去システムを組み込むことである。ここにおける実施形態はさらに、これらの問題についても取り組んでいる。
【００６３】
＜実施例１１：ドリリングビットの実施例＞
本実施例におけるドリリングビットは、外形（ＯＤ）２．５ｍｍかつ内径（ＩＤ）１．８０ｍｍの壁と９０°切断による変形可能な4つの先端部を有する。この先端部は、無限小の値ではなく、約０．３ｍｍの厚さの衝撃平面を有する。この特徴により、衝撃時において、ビットにかかる最大応力を低減させることが可能となる。応力低減に加えて、切断部に０．２５ｍｍのフィレットが見つかった。
【００６４】
生理食塩水の凍結標本の抽出及び取出しは、抽出歯部を用いて行われる。この抽出歯部は、ビット全長に沿って、衝撃表面１ｍｍごとに間隔を空けて用いられる。凍結標本に対して接触するため、直径２．７ｍｍの抽出部が準備される。この抽出部は、従来の抽出部よりも０．１ｍｍ直径が大きい。この直径の変更により、緩衝帯が下方に設けられる。このことにより、除去されていない氷片が緩衝帯に再び入りこみ、針の固定が行われる。凍結標本のシリンダ壁と小さな抽出歯部の間における空隙が、針のＺ軸の振動運動により作り出された空気渦を介して、氷片の除去を促進する。第１抽出部の高さが０．１ｍｍに変更されるため、応力解析時において、抽出部及び氷界面の大きなずれを除去することが可能となる。抽出歯部とシリンダ針の壁の角度は２２°になっているため、急な斜面を形成し、抽出歯部と凍結標本のシリンダ壁部との間における氷粒子は急激な遷移をなす。
【００６５】
応力解析は、先端部が４つある形態（ドリリングビット）に対して行われ、特定の形状の選択がどのような影響を与えるのか確認した。６０ＭＰａの三軸的圧力時において、凍結生理食塩水の粉砕に要する最大応力がビット接触面に与えられると、先端部が２つのある形態はミーゼス応力の最大値１９７８ＭＰａと最大ずれ０．２５４ｍｍを示した。針による最大応力が１７９，２８１サイクルに達すると、ビットに不具合が生じる。６０ヘルツにて平均時間の１５０秒かけてコアを抽出することで、コアごとに９０００サイクルに達し、２０のコアに不具合が生じる。プロトタイプの形態に応じて、この解析は再現され、繰り返し荷重がどのように改善するのか決定した。
【００６６】
初期の衝撃テストを正確に再現するため、構造負荷として３４５ＭＰａ（表４参照）が接触ビットの衝撃表面全てに加えられた。この負荷は力の上界を再現し、力は針の先端に作用する。この圧力は、LinMot社がシステムとして採用している最大力、すなわち１２０ニュートンを用いて、計算される。そして、この計算方法は、初期接触の表面に対して用いられる。
【００６７】
【表４】
【００６８】
ビットの形状は、Ｘ、ＹそしてＺ軸の先端に拘束される。また、ビットの回転も全ての軸に拘束される。LinMot社のシステムにより、針に対して適用される物理的制約を正確に再現する。
本形状は、３５４ＭＰａのミーゼス応力の最大値をもたらす。この最大値は、従来の先端部が２つある形態と比して８２％に低減されている。本形状の最大ずれは０．００２６ｍｍで、従来の針の形態と比して９９％に低減されている。明らかなことだが、最大応力は、ビットの衝撃表面上に生じる。
【００６９】
＜実施例１２：疲労寿命＞
このビットにおけるミーゼス応力の最大値を用いることで、針に不具合が生じるサイクル数の下界（Ｎｆ）を導出する。従来の針の最大応力は、１７９，２８１サイクルに相当し、このサイクルではビットに不具合が生じる。６０ヘルツにて平均時間の１５０秒かけて標本を入手することで、サンプルごとに９０００サイクルに達し、１９．９２のコアに不具合が生じる。分析により、３５４ＭＰａの最大応力をもたらした。ビットは単独で緊張状態ではなく、圧縮状態である。従って、交互応力は最大応力の半分となる。ビットの交互応力から、バスキンの式を用い、ビットに不具合が生じるサイクルを決定した。分析の結果、ビットのＮｆは２，００３，１９７サイクルに達すると、ビットに不具合が生じることが判明した。本形態（標本ごとに５０ヘルツで１５０秒）の場合、標本ごとに７５００サイクルに達する。このサイクルは、ビットに不具合が生じるまで２６７標本に相当する。この結果は、従来の形態に比して１３３５％改善されたことを意味する。
【００７０】
＜実施例１３：自動化＞
本形態における方法及び装置は、アクチュエータ及びモータ回路スイッチ（ＭＣＳ）を介してＺ軸の動きを制御することに関する。ロードセルは装置に組み込まれ、衝撃地点の近くにおける、力測定結果を蓄積する。制御システムはＭＣＳを備え、ＭＣＳは両方のアクチュエータを作動させるとともに、ロードセルからのアウトプットを処理する。
ドリル作業中における力データは、コアシャフトに沿った摩擦力の情報を備える。蓄積されたデータは、最大衝撃力測定結果に基づき、ビット形状を調整することが可能である。LinMot社のアクチュエータの動作周波数は５０Ｈｚであるため、ロードセルは５０ＨＺの振動に耐えなければならない。２００Ｈｚよりも大きい速度で力測定を行い、衝撃についての十分な情報を提供しなければならない。スライダとコアリングビットのエネルギー運動量が結合される際、本システムによって生成される最大力は１２０Ｎである。荷重によるわずかな変形により、衝撃は分離され、ロードセルのずれを避けることが可能となる。
【００７１】
LinMot社のアクチュエータの動作は、主として増幅器内の組込みコントローラを介して制御されている。このコントローラは、スライダ質量と入力動作プロファイルに基づき、出力動作を計算し測定する。コントローラが運動を計算する際、ロードセル及びドリリングビットの付加質量は考慮に入れない。従って、コントローラの予期しない付加的な慣性が存在するため、全ての動きは反動運動量を有する。振動体質量はほぼ１１３にまで増加する。
【００７２】
ロードセルのずれは最小化されることで、小さな波形変化を測定することが可能となる。凍結標本に対して伝送されるエネルギーを最大化するためにロードする間、ロードセルはずれない。衝撃特性の予備調査は、衝撃の深さを示す。衝撃の深さ、つまりビットが氷の内側を移動した距離は約０．０４ｍｍである。これは、２ｍｍ／秒の全体的動作速度に変換される。小距離の場合、あらゆる方向への亀裂伝播距離を縮小させることで、放射状の氷の破砕を最小限にすることが可能である。
【００７３】
装置は、５０Ｈｚの振動数で２ｍｍの正弦波振幅を振動するようプログラムされている。ロードセルの周波数特性をドリリング操作の周波数特性よりも高くすることで、ロードセルの周波数特性を正確に測定することが可能となる。力データはサイクルごとに少なくとも４回蓄積される。周波数サンプルは２００ヘルツ以上である。機器の取得について、この時点で考えられなければならない。
【００７４】
初期検査の間、Lab Viewは、ロードセルからのデータを処理するのに利用され、コアリング操作時における組み合わせを特徴付けることが可能である。しかしながら、Lab Viewの利用に適するあらゆるロードセルは、他のコントロールシステムとともに利用するのに適している。多くのロードセル製造者は、設計仕様書内において装置を説明している。例えば、PCB Piezotronics社（デピュー、ニューヨーク州）の圧電式のロードセルは、リードタイムが短く、クオーツフォースセンサの能力があるため、本出願の発明において利用するのに適している。圧電式のロードセルは、動的ローディングに対する、ある特定の水晶の電気機械反応に基づいて、力を測定する。力の測定は、動的ローディング時に、水晶への供給電圧の変動を確認することで行われる。この場合、石英だが、水晶は、様々な伝導性を有する。この伝導性の違いは、電力供給装置における供給電源の変化に基づいて測定される。伝導性の違いは、直流電圧出力に変換される。例えば、PCBのような、商業的に利用可能なロードセルであれば、幅広いタイプのものが本発明で使用できる。そして、幅広い電源供給装置とロードセルは本発明の他部材とともに使用できる。統合システムは、電気的側面において増幅器による出力をLab Viewに取り込む役割を果たしている。装置は、衝撃時の力を測定する能力を有するとともに、適切にコアリングプロファイルを調整する能力を有する。PCB221B02のクオーツフォースセンサは本実施例の設計要件に適している。
【００７５】
線形アクチュエータは垂直に配向された支持構造と強固に接続されている。例としてLinMot社の線形アクチュエータは取付板と強固に接続されている。力は、取付板の前面から約５０mmの距離で与えられる。コアリング中に生じうる最大力に接近すると、３００Ｎの軸方向の力とキャリッジ全域での15Nmの力のモーメントをもたらす。軸周りに極僅かな力のモーメントとX軸あるいはY軸に極僅かな力のモーメントが存在する。
【００７６】
フォースフィードバックセンサを有する、完全統合自動システムの実験が行なわれた。LinMot社の製品である、亜音速によるインパクトドリラは５０Ｈｚの周波数に設定される。力センサを組み込むことで、氷内部で高い応力のかかった範囲に有益なフィードバックをもたらす。また、この力センサを組み込むことは最適運動プロファイルを決定するのに役立つ。完全自動システムと手動作動システムを数量化するには、ここで述べる形態を有する針（ビット）に対する試験を必要とする。試験手順は一定ではないが、５０Ｈｚの周波数に設定されたLinMot社のインパクトドリラを用い、Ｚ軸に沿った０．０５ｍｍの刻み幅による破砕が制御される。この結果は表５に示されている。
【００７７】
【表５】
【００７８】
Ｚ軸のモーションコントローラによる破砕変化の試験は、コアが２５．３ｍｍの深さに達する時、成功した。Ｚ軸上における刻み幅を増やすことで、ドリル速度を速め、LinMot社のインパクトドリラの周波数を５０Ｈｚに抑制し、Ｚ軸上における破砕時間を０．５秒にした。この結果は表６に示されている。
【００７９】
【表６】
【００８０】
最適運動プロファイルの試験結果と時間効率を示す。針ドリリングの自動化システムは凍結生体学的試料を等分化するための改善された手段である。ドリリングビットの形態は、仮設計を経て実験的試験を行い、最適化される。この結果により、コアリングビットに最大応力をもたらす際における各特徴により、主な効果が発揮される。結果が示すように、衝撃幅と歯の角度は、衝撃時にビット内の応力をもたらすのに、最も重要である。これらの結果は、氷破砕に要する衝撃領域を維持しつつ、応力を減少させることで疲労寿命に対して最適化されたビットをもたらす。最適化されたプロトタイプビットは、１５０標本の寿命を超えて十分使用できる。
【００８１】
＜実施例１４：凍結試料から採取される組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）＞
ＴＭＡs（組織マイクロアレイ）はここ数年間世界中で使われている。1ブロック内に数百のコアサンプルを設置することで、コホートの大規模試験を行なうことにおける、さらなる有効性が実証された。ヘマトキシリン・エオシン染色は、ＴＭＡの塊の上に準備されたスライドを染色する。このヘマトキシリン・エオシン染色は、数百の患者の診断情報を明確にするのに用いられる。加えて、ＴＭＡは臨床的研究以外の領域においても、よく知られている。例えば、３０００人の患者の大コホートの遺伝子、抗体及びタンパク質の研究において、ＴＭＡは生理食塩水から組織型や診断特徴を観察するのに用いられる方法である。逆に、ある特定の抗体を観察するためだけに、３０００人のスライドを染色することは、旧式の方法であるだけでなく、技術作業の人件費及び試薬にかかる費用が高額になる。ＴＭＡは研究分野において重要な地位を獲得している。また、本方法は、臨床検査室が求める高生産性及び正確性を満たすため、ＴＭＡは臨床分野においても有用である。
【００８２】
本方法のｐｆ ＴＭＡは、パラフィン包埋した組織を必要とするのだが、パラフィン内の固定組織を処理するのに欠点が存在する。従来技術の大部分は固定組織用に考案されているが、現在、固定物質の代わりに凍結組織を用いるニーズが増大している。パラフィン包埋した組織を用いる際、流動パラフィン内で高温にて固定作業、除去作業、浸透作業を行なわなければならない。これらの作業は、組織の抗原性を減少させる効果があるとともに、タンパク質を交差結合させ、他の組織構造を分解する効果がある。固定試料においては、多くの研究がなされていなかったことは否定的なことである。病変研究は、ホルマリンの固定試料の構造に依存するようになっているため、問題である。しかしながら、多くの不安定な抗原、タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、そしてペプチドの研究を行なうため、新鮮な凍結組織のマイクロアレイ（ｆｆ ＴＭＡｓ）に対するニーズが存在する。
【００８３】
病理検査室の最適な試料は入手しやすい新鮮な凍結組織の試料であり、この試料は、冷凍庫で−８０℃にて保存されている。凍結標本は、あらゆる研究作業において利用されている。この試料は生物学的機能を有した状態である。凍結後に、数日、数ヶ月、数年後、すぐにでも研究に用いられる。凍結部分はクライオスタットを用いて切り取られ、診断部分を入手し、試料の全表面を評価する。これは、ＤＮＡ及びＲＮＡの抽出の特殊研究、あるいは蛍光in-situハイブリデーション法（ＦＩＳＨ）やin-situハイブリデーション法（ＩＳＨ）といった蛍光抗体法に用いられる。個々に区分されたスライドは固定され、特定の作業に供される。この結果、不適切な固定により、時間をかけずにかつ好ましくない効果を得るのではなく、最適な試験結果をもたらすことができる。より少ない組織量で組織を区分するため、将来の研究に備えて、残存組織を確保することが可能である。結局のところ、常に病理学的記録を維持するため、少量の新鮮な凍結試料が固定され、処理される。従って、これから先、何年も、固定組織をパラフィンＴＭＡ内で固定することが可能である。
【００８４】
利用可能な技術は幅広い多用途性を備えるため、研究及び診断研究所にとって新鮮な凍結試料は最も価値がある。可能な場合には、最も一般的な病理検査室、特に学術研究所における病理研究室は即座に新鮮な組織標本を入手する。これらの組織は特異診断によるものであるため、特に興味深い。これらの標本例は、リンパ節、前立腺腫瘍、乳房の腫瘍、神経、そして筋肉があげられる。学術研究所には、診断及び研究用として、腫瘍そして新鮮な凍結試料の大きな保管場所が存在する。しかしながら、診断用組織を保全し、組織の有効な解釈結果を獲得しなければならないため、一貫した試料を取り扱う必要がある。
【００８５】
細胞株のアレイは本実施例において構成され、凍結細胞株のアレイは凍結標本のタンパク質リン酸化反応を決定するのに適していることが実験により示されている。タンパク質リン酸化反応は重要かつ有益なメカニズムであり、実例として明示するが、ホルマリン固定標本においては、信憑性がない結果を示す。多腫瘍アレイが構成され、該アレイにおける組織標本には、前立腺癌、良性前立腺腫瘍、結腸癌、腎癌、肝臓そして肺から採取した組織標本が含まれる。アレイ構成の過程により、ｆｆ ＴＭＡの凍結組織のマイクロアレイを生成する。この凍結組織のマイクロアレイは、最終生成物が生成されることで、有益な情報をもたらす。例えば、今まで固定組織として獲得することは不可能であった、ヘプシン造影ペプチドを用いる場合、有益な情報をもたらす。タンパク質の抗原は、しばしば固定時に破壊される、もしくは強い抗原回復を要する。
【００８６】
凍結多腫瘍アレイの構造についてだが、アレイは‐８０度の冷凍庫で保存されている組織を用いて生成される。新鮮な凍結組織と２年以上前に生成された凍結組織は同等の結果を示した。このことは、凍結組織の最も重要な点である。
【００８７】
多腫瘍アレイは、Beecher社のMTA１アレイヤと、Tissue Tek社のO.C.T.コンパウンド（Optimal Cutting Temperature：最適切削温度，ティシュー・テック社）を用いて手動で形成される。包埋媒質として用いられる水溶性の包埋剤は、凍結状態で試料を維持するのに用いられているため、‐８０度の冷凍庫において、乾燥を防止する役割を果たしている。アレイヤ周囲領域を、組織の保全可能な低温とするために、ドライアイスがアレイヤの内部及び周囲に用いられる。組織標本とアレイの温度変動が測定され、温度制御を確保することが可能となる。多腫瘍アレイは、全試料に対する解析(mapping)が行なわれるとともに、管理(filing)場所が維持されているため、パラフィンアレイと同様に準備される。標本は供給体の凍結標本の塊から取り除かれ、包埋容器のウェルに収納される。１つのスライド上でヘプシン造影ペプチドを用いて、一度で全ての組織を選択し、実験を行うことが可能となったため、この凍結多腫瘍アレイを用いると、従来技術では不可能であった実験を実施することが可能となる。従来技術では、個々の組織の多くの切片は、様々な組織型の価値及び制御可能性の分析が行なわれる必要があった。
【００８８】
凍結標本は、リサーチ・クオリティ・クライオスタット（Leica Microsystems社 ドイツ ハイデルブルグ）で切り取られる。各切片が切り取られてから、クライオジェーン・テープ・トランスファー・システム（Instrumedics社 ニュージャージー州 ハッケンサック）を用いて切片を取り上げる。テープトランスファーシステムを用いると、組織をスライドにしっかりと接着させることが可能である。なお、このスライドもまたInstrumedics社による製品である。CryoJane社のシステム及びスライドを用いることで、スライドごとに標本が増加し、組織を無駄に使うことにはならない。
【００８９】
＜凍結細胞株のアレイ＞
タンパク質リン酸化反応は細胞内シグナル伝達において、重要なメカニズムである。リン酸化タンパク質を決定する従来の方法は、しばしば信憑性がない結果を示す。細胞内のホスファターゼ及びホルマリン固定により、これらのタンパク質は数ミリ秒の血流不全の間に脱リン酸化する。なお、この血流不全は、細胞あるいは組織が採取される際に生じるものである。ホスファターゼ阻害剤を追加することで、脱リン酸化は進行しない。リン酸化状態を維持する１つの方法は、組織あるいは細胞株を採取し、ホスファターゼ阻害剤を加え、標本を氷上に置き、凍結させ、即座に温度を下げる方法である。
【００９０】
凍結細胞株のアレイを生成するため、リン酸緩衝生理食塩水の内、３０μlの細胞懸濁液は、２０μl採取できるピペット先端を用いて、流し型のウェルに移される。（図４のパネルＡを参照）現在、１６までの個々の細胞株標本を一度に配列することが可能である。図４におけるパネルＢはＨ＆Ｅ染色を行なった、アレイの中心部を示している。細胞株は単細胞クローンからなるので、固形組織コアを入手することは必ずしも必要ない。図４のパネルＣにおいて、抗体で染色した細胞コアが高倍率で示されている。この抗体は細胞外調節キナーゼ（ＥＲＫ）の特異的なリン酸化体である。強い核染色が確認された。
【００９１】
＜凍結多腫瘍組織のアレイ＞
ヘプシンの発現は、前立腺癌の場合、過剰に発現される生体指標であるが、このヘプシンを観察することは、前立腺癌の診断に非常に役立つ。ＰＳＡは前立腺癌の通常のスクリーニング試験に現在用いられているが、必ずしも適切な指示薬だとは限らない。従って、前立腺癌の診断のための非侵襲的方法を開発する必要性がある。従って、ヘプシン特定のペプチドは生体内画像で識別されている。
【００９２】
ヘプシンに結合するペプチドはファージ提示法の技術により識別される。これらのペプチドのヘプシンへの結合は、ヘプシンを過剰発現する細胞株を用いて確認される。しかしながら、造影剤を展開するために、ペプチドは、ヒトの組織のタンパク抗原を結合可能であることを示すのは重要である。患者の組織標本あるいは組織のマイクロアレイ（ＴＭＡ）上のペプチドを検査する際の大きな障害は、これらのペプチドが特定の構造であること及び最適な結合を行うインタクトな抗原を要することである。タンパク抗原は、抗原固定化及び抗原回復過程においてしばしば破壊されるので、ホルマリン固定パラフィン包埋（Formalin-Fixed Paraffin-Embedded: FFPE）組織を用いて形成されたTMAは、このようなペプチド試験には使用できない。ほとんどの抗原は、通常の免疫組織化学（ＩＨＣ）における多数の抗体により認識されている構造を保持しているのだが、ペプチドは小さな分子抗原であり、インタクトな局所的構造を要する。従って、凍結組織において局所構造はしっかりと保存されているので、このような研究の際、凍結材質が必要となる。
【００９３】
ヘプシンと結合するペプチド対象を生体内撮像試験するために、凍結した多腫瘍ＴＭＡが用いられる。凍結した多腫瘍ＴＭＡは、前立腺、肺、結腸、肝臓、腎臓、胸、そして手動で研究室において構成される良性前立腺腫瘍の組織を含む。図５はＦＩＴＣと分類される腺癌のペプチドを用いて、特定のヘプシン染色を示す。特定のヘプシンの膜質染色は腺癌の腔側に見られ、この染色は際立って良性の腺においては確認されない。
【００９４】
従って、凍結ＴＭＡを用いることで、ヘプシン造影ペプチドのもつ能力に対する試験が成功したことを示す。本研究において形成された多腫瘍凍結アレイは、様々な種類の癌の造影を行う際、様々な組織の試験マーカとしても供される。
【図面の簡単な説明】
【００９５】
【図１】ドリルビット（TechnoDiamant社）の写真を示す図である。内径（ＩＤ）０．０３９５ｍｍ、外径（ＯＤ）０．０７０ｍｍである。先端部はダイヤモンド／金属のマトリックスを有する。
【図２】中空ドリルビット内の標本の温度を時間の関数として示す図表である。ビットの予冷は、容器内の冷却液、熱平衡、及び曝気により行った。データは４回の実験の平均値である。
【図３】ドリルビットの線形振動モータを示す概略図である。符号は駆動システム（３１）、スライダ（３２）、ビット（３３）を表す。
【図４】凍結株細胞アレイを示す図である。このアレイは、本発明中の方法により抽出された標本の凍結組織を配置するための型を用い作製された。図４のパネルＡは株細胞アレイを示す。プロトタイプブロックは１２の空洞を有する。組織マイクロアレイは８個の標本を有する。また組織マイクロアレイは、最初の２列中に５個の組織（薄色）を有し、３個の染色ＯＣＴ（最適切削温度:Optimal Cutting Temperature）標本（濃色）を３列目に有する。空洞の形状を示すため、空の空洞が４つある。光の加減のため僅かに色が濃くなっている標本もある。これは標本がより深い成形穴から取り出されるためである。成形穴は２度のテーパを有し、このテーパにより標本が落下しないようにする。図４のパネルＢは染色標本を示す。図４のパネルＣは細胞の顕微鏡写真である。この細胞はリン酸化したＥＲＫに特異的な抗体を用いて染色されたものである。
【図５】ＦＩＴＣと分類されるヘプシンペプチドを用いて染色した凍結組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）の写真である。図５のパネルＡは、凍結腺腫瘍の標本の細胞の顕微鏡写真（２０倍）である。この写真は、腺癌の内腔付近の特異的な膜染色を示している。図５のパネルＢは対照凍結の大きな良性腺（２０倍）の顕微鏡写真である。特異的染色は陰性を示す。すなわち細胞間質の弱い非特異的染色を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
凍結した生物学的試料から凍結標本を摂取するための装置であって、
容器内の試料に接触するドリルを備え、該ドリルは先端部が中空ビットコアリング針を作動させるモータを備え、
また前記装置はさらに、前記試料を掴むグリップを備え、該グリップは容器の開口端を前記針の近位に有し、
前記モータは前記針を容器内の試料に突き刺し、
前記凍結標本はコンテナ内の試料が解凍していない場合、試料から取り除かれることを特徴とする装置。
【請求項２】
前記容器の終端部を浸水させる冷却タンクをさらに備えることを特徴とする請求項１記載の装置。
【請求項３】
前記容器がクライオチューブ、アレイ或いはプラットホームより少なくとも一つ選択されることを特徴とする請求項１もしくは２いずれかに記載の装置。
【請求項４】
前記モータが線形振動運動をもたらすことを特徴とする請求項１もしくは２いずれかに記載の装置。
【請求項５】
前記モータが回転運動をもたらすことを特徴とする請求項１もしくは２いずれかに記載の装置。
【請求項６】
コンピュータと通信するサーボ制御装置をさらに備え、前記コンピュータ及びソフトウェアを用いてプログラム可能であることを特徴とする請求項１から５いずれかに記載の装置。
【請求項７】
前記装置は手動制御されることを特徴とする請求項１から５いずれかに記載の装置。
【請求項８】
前記モータが前記ビットへ力をもたらし、これにより前記ビットは約３０Ｎ〜約９０Ｎ、約３５Ｎ〜約８０Ｎ，或いは約４０Ｎ〜約７５Ｎ等の力で凍結試料に衝突する力をもたらし、
前記モータが前記ビットへ約４０ＭＰａ〜約８０ＭＰａ、或いは約５０ＭＰａ〜約７０ＭＰａ等の力の圧縮応力をもたらし、
前記試料は約マイナス９０度からマイナス１０度或いは同程度の温度で保存されていることを特徴とする請求項１から７いずれかに記載の装置。
【請求項９】
前記試料は約０．５ｍＬ〜約５ｍＬ、或いは約１．５ｍＬ〜約１５ｍＬ、或いは約５ｍＬ〜約５０ｍＬ等の体積を有することを特徴とする請求項１から８いずれかに記載の装置。
【請求項１０】
前記ドリルビットの針はさらに研磨された先端部及び歯部が賦された抽出部を有する遠位端を備えることを特徴とする請求項１から９いずれかに記載の装置。
【請求項１１】
ドリルビットの針が金属或いはセラミックであることを特徴とする請求項１から１０いずれかに記載の装置。
【請求項１２】
前記金属により組立式の標準の外科用管であって、該管は少なくともチタン、インコネル６２５、ステンレス鋼３０４、ステンレス鋼３１６、ステンレス鋼３１６Ｌの群より少なくとも一つの金属を備えることを特徴とする請求項１１記載の装置。
【請求項１３】
前記標本の受入装置をさらに備えることを特徴とする請求項１から１２いずれかに記載の装置。
【請求項１４】
前記受入装置がマイクロアレイであることを特徴とする請求項１３に記載の装置。
【請求項１５】
前記マイクロアレイがレシピエントブロックであって、該レシピエントブロックが型どられた空洞を有することを特徴とする請求項１４記載の装置。
【請求項１６】
ばね復帰或いはその他のタイプの自動復帰を有する突き出しピンをさらに備え、該突き出しピンは、前記針の内径よりも小さい及びほぼ同一の断面直径を有することを特徴とする請求項１から１５いずれかに記載の装置。
【請求項１７】
前記装置はさらに筐体を備え、該筐体は、湿度制御、冷凍、血液により運ばれる病原菌に対する使用者への安全性、及び滅菌の群より選択される少なくとも一つの用途に用いられることを特徴とする請求項１から１６いずれかに記載の装置。
【請求項１８】
凍結した生物学的試料から凍結標本を採取及び試料を凍結した状態で維持するための方法であって、
中空ビットコアリング針を作動させるモータを有するドリル及び試料を掴むグリップと、容器内の試料に接触する段階を備え、
前記グリップは容器の開口端に位置し前記容器は針の側に位置し、
前記モータは前記針を試料に突き刺すよう動作させ、
前記方法はさらに、凍結標本を含んだ針を抜く段階と、
前記凍結標本を針から受入装置へ押し出す段階を備え、前記凍結標本は前記凍結された生物学的標本から得られ、前記標本は凍結状態で維持されていることを特徴とする方法。
【請求項１９】
容器の終端部を浸水させる冷却タンクをさらに備えることを特徴とする請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
容器がクライオチューブ、アレイ或いはプラットホームより少なくとも一つ選択されることを特徴とする請求項１８もしくは１９いずれかに記載の方法。
【請求項２１】
前記方法が少なくとも約マイナス９０度から約マイナス１０度等の気温の局所環境にて行われることを特徴とする請求項１８記載の方法。
【請求項２２】
標本の複製分割量を得るための前記段階を反復する段階をさらに含むことを特徴とする請求項１８記載の方法。
【請求項２３】
少なくとも一つの付け加えた試料より標本を得るため前記段階を反復する段階をさらに含むことを特徴とする請求項１８記載の方法。
【請求項２４】
中空ビットコアリング針を作動させる前記モータが線形振動運動を与えて前記標本の表面を破砕することを特徴とする請求項１８から２３いずれかに記載の方法。
【請求項２５】
前記凍結標本を針から受入装置へ押し出す段階が突き出しピンを作動させる段階を備えることを特徴とする請求項１８から２４いずれかに記載の方法。
【請求項２６】
前記受入装置は分析管、クライオチューブ、病理学、組織学及び／又はマイクロアレイ分析用の平面、及びマルチウェルディッシュのくぼみからなる群より選択されることを特徴とする請求項１８から２５いずれかに記載の方法。
【請求項１】
凍結した生物学的試料から凍結標本を摂取するための装置であって、
容器内の試料に接触するドリルを備え、該ドリルは先端部が中空ビットコアリング針を作動させるモータを備え、
また前記装置はさらに、前記試料を掴むグリップを備え、該グリップは容器の開口端を前記針の近位に有し、
前記モータは前記針を容器内の試料に突き刺し、
前記凍結標本はコンテナ内の試料が解凍していない場合、試料から取り除かれることを特徴とする装置。
【請求項２】
前記容器の終端部を浸水させる冷却タンクをさらに備えることを特徴とする請求項１記載の装置。
【請求項３】
前記容器がクライオチューブ、アレイ或いはプラットホームより少なくとも一つ選択されることを特徴とする請求項１もしくは２いずれかに記載の装置。
【請求項４】
前記モータが線形振動運動をもたらすことを特徴とする請求項１もしくは２いずれかに記載の装置。
【請求項５】
前記モータが回転運動をもたらすことを特徴とする請求項１もしくは２いずれかに記載の装置。
【請求項６】
コンピュータと通信するサーボ制御装置をさらに備え、前記コンピュータ及びソフトウェアを用いてプログラム可能であることを特徴とする請求項１から５いずれかに記載の装置。
【請求項７】
前記装置は手動制御されることを特徴とする請求項１から５いずれかに記載の装置。
【請求項８】
前記モータが前記ビットへ力をもたらし、これにより前記ビットは約３０Ｎ〜約９０Ｎ、約３５Ｎ〜約８０Ｎ，或いは約４０Ｎ〜約７５Ｎ等の力で凍結試料に衝突する力をもたらし、
前記モータが前記ビットへ約４０ＭＰａ〜約８０ＭＰａ、或いは約５０ＭＰａ〜約７０ＭＰａ等の力の圧縮応力をもたらし、
前記試料は約マイナス９０度からマイナス１０度或いは同程度の温度で保存されていることを特徴とする請求項１から７いずれかに記載の装置。
【請求項９】
前記試料は約０．５ｍＬ〜約５ｍＬ、或いは約１．５ｍＬ〜約１５ｍＬ、或いは約５ｍＬ〜約５０ｍＬ等の体積を有することを特徴とする請求項１から８いずれかに記載の装置。
【請求項１０】
前記ドリルビットの針はさらに研磨された先端部及び歯部が賦された抽出部を有する遠位端を備えることを特徴とする請求項１から９いずれかに記載の装置。
【請求項１１】
ドリルビットの針が金属或いはセラミックであることを特徴とする請求項１から１０いずれかに記載の装置。
【請求項１２】
前記金属により組立式の標準の外科用管であって、該管は少なくともチタン、インコネル６２５、ステンレス鋼３０４、ステンレス鋼３１６、ステンレス鋼３１６Ｌの群より少なくとも一つの金属を備えることを特徴とする請求項１１記載の装置。
【請求項１３】
前記標本の受入装置をさらに備えることを特徴とする請求項１から１２いずれかに記載の装置。
【請求項１４】
前記受入装置がマイクロアレイであることを特徴とする請求項１３に記載の装置。
【請求項１５】
前記マイクロアレイがレシピエントブロックであって、該レシピエントブロックが型どられた空洞を有することを特徴とする請求項１４記載の装置。
【請求項１６】
ばね復帰或いはその他のタイプの自動復帰を有する突き出しピンをさらに備え、該突き出しピンは、前記針の内径よりも小さい及びほぼ同一の断面直径を有することを特徴とする請求項１から１５いずれかに記載の装置。
【請求項１７】
前記装置はさらに筐体を備え、該筐体は、湿度制御、冷凍、血液により運ばれる病原菌に対する使用者への安全性、及び滅菌の群より選択される少なくとも一つの用途に用いられることを特徴とする請求項１から１６いずれかに記載の装置。
【請求項１８】
凍結した生物学的試料から凍結標本を採取及び試料を凍結した状態で維持するための方法であって、
中空ビットコアリング針を作動させるモータを有するドリル及び試料を掴むグリップと、容器内の試料に接触する段階を備え、
前記グリップは容器の開口端に位置し前記容器は針の側に位置し、
前記モータは前記針を試料に突き刺すよう動作させ、
前記方法はさらに、凍結標本を含んだ針を抜く段階と、
前記凍結標本を針から受入装置へ押し出す段階を備え、前記凍結標本は前記凍結された生物学的標本から得られ、前記標本は凍結状態で維持されていることを特徴とする方法。
【請求項１９】
容器の終端部を浸水させる冷却タンクをさらに備えることを特徴とする請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
容器がクライオチューブ、アレイ或いはプラットホームより少なくとも一つ選択されることを特徴とする請求項１８もしくは１９いずれかに記載の方法。
【請求項２１】
前記方法が少なくとも約マイナス９０度から約マイナス１０度等の気温の局所環境にて行われることを特徴とする請求項１８記載の方法。
【請求項２２】
標本の複製分割量を得るための前記段階を反復する段階をさらに含むことを特徴とする請求項１８記載の方法。
【請求項２３】
少なくとも一つの付け加えた試料より標本を得るため前記段階を反復する段階をさらに含むことを特徴とする請求項１８記載の方法。
【請求項２４】
中空ビットコアリング針を作動させる前記モータが線形振動運動を与えて前記標本の表面を破砕することを特徴とする請求項１８から２３いずれかに記載の方法。
【請求項２５】
前記凍結標本を針から受入装置へ押し出す段階が突き出しピンを作動させる段階を備えることを特徴とする請求項１８から２４いずれかに記載の方法。
【請求項２６】
前記受入装置は分析管、クライオチューブ、病理学、組織学及び／又はマイクロアレイ分析用の平面、及びマルチウェルディッシュのくぼみからなる群より選択されることを特徴とする請求項１８から２５いずれかに記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公表番号】特表２００９−５２４０２１（Ｐ２００９−５２４０２１Ａ）
【公表日】平成２１年６月２５日（２００９．６．２５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５５０４６１（Ｐ２００８−５５０４６１）
【出願日】平成１９年１月１６日（２００７．１．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／００１０９４
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０８４４８３
【国際公開日】平成１９年７月２６日（２００７．７．２６）
【出願人】（５０２３３３８６２）プレジデント・アンド・フエローズ・オブ・ハーバード・カレツジ (18)
【出願人】（５９２２３３７５０）ノースイースタン ユニバーシティ (7)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年６月２５日（２００９．６．２５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１月１６日（２００７．１．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／００１０９４
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０８４４８３
【国際公開日】平成１９年７月２６日（２００７．７．２６）
【出願人】（５０２３３３８６２）プレジデント・アンド・フエローズ・オブ・ハーバード・カレツジ (18)
【出願人】（５９２２３３７５０）ノースイースタン ユニバーシティ (7)
【Ｆターム（参考）】
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