本発明は分析物の検出のための方法、キットおよび組成物を提供する。本発明の方法では、第１ポリメラーゼに繋がれた結合分子を修飾ポリヌクレオチド鋳型と共にインキュベートして、修飾ヌクレオチドを何ら伴わない修飾ポリヌクレオチド鋳型のコピーを形成する。第２増幅／プライマー伸長反応において、修飾ポリヌクレオチド鋳型を増幅することができない第２ポリメラーゼを使用して非修飾コピーを検出する。非修飾コピーの検出は試料中の分析物の存在および／または量の指標である。第１ポリメラーゼに繋がれた結合分子の代わりに一対の分析物特異的プローブを使用することもできる。第１分析物特異的プローブは第１結合部および第１ポリメラーゼの第１部分を含み、第２分析物特異的プローブは第２結合部および第１ポリメラーゼの第２部分を含む。結合部が分析物に結合している場合、ポリメラーゼの第１および第２部分は相互作用して、修飾ヌクレオチドを何ら伴わない修飾ポリヌクレオチド鋳型のコピーを形成するために使用される機能的ポリメラーゼ複合体を形成する。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオテクノロジーの分野に関する。さらに具体的には、本発明は、ポリメラーゼまたはその一部分に繋がれた結合部を有する分析物特異的結合分子を使用して分析物を検出および定量するための便利で迅速かつ鋭敏な方法、組成物およびキットに関する。分析物の結合部への結合時に、ポリメラーゼは核酸増幅反応のための鋳型を作成するための手段を提供する。増幅生成物の存在の検出は、試料中の分析物の存在の指標である。
【背景技術】
【０００２】
イムノアッセイの開発および核酸検出における進歩は生物学的試料の検出の分野を進歩させてきた。酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）により試料中のタンパク質の存在に関して試料のハイスループットスクリーニングが可能になる。分析物の存在はアルカリ性ホスファターゼまたはセイヨウワサビペルオキシダーゼに基づく酵素的比色アッセイの使用により検出されることが頻繁である。これは酵素基質の比色変化の検出の範囲に依存して感受性およびアッセイの範囲を限定する。これは血清中の分析物のおよその量を検出するための初期スクリーニング、または使用される具体的な方法および試薬の検出範囲内で試料が試験されることを確実にするための、多数の一連の希釈の使用のいずれかを必要とする。この方法でのその他の問題には、高いバックグラウンドレベルおよび低い感受性が含まれる。例えばＥＬＩＳＡプレートに対するセイヨウワサビペルオキシダーゼの直接結合は非特異的バックグラウンドシグナルに至る。非特異的結合を低減させるために、相対的に不活性なタンパク質を含有する遮断溶液（乳または血清アルブミン）をアッセイに添加する。しかしながらバックグラウンドシグナルに至る非特異的結合は排除されないため、アッセイ感受性は低くなる。
【０００３】
これらの限定に対処するために、試料中の分析物の酵素基盤の検出と併用するための核酸基盤の検出方法が開発されている。いくつかは「免疫ＰＣＲアッセイ」と称され、当分野において公知であり、ＥＬＩＳＡアッセイの態様をＰＣＲと組み合わせる。プローブ／抗体が試料中の分析物と結合した場合にアッセイは検出可能なシグナルを生成し、標的核酸の増幅が可能になる。
【０００４】
例えば米国特許第５６６５５３９号は、検出を抗体およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）と組み合わせて特異的タンパク質の検出に関する感受性を増大させる。標準的な免疫ＰＣＲプロトコールでは、核酸配列に付着した抗体は抗原分子上のエピトープに結合する。抗体と核酸との間の付着は、核酸および抗体に関する二特異性親和性を有するリンカーを介して生じるので、特異的な抗原−抗体ＤＮＡ抱合体の形成に至る。その後、付着した核酸配列のセグメントをＰＣＲにより増幅後、ゲル電気泳動によりＰＣＲ生成物を検出する。しかしながらＤＮＡは粘着性があり、そして検出前に未結合ＤＮＡを系から洗浄するのは決して容易ではなく、アッセイにおいて非特異的結合および高いバックグラウンドを引き起こすので、ＤＮＡの抗体に対する連結には問題がある。
【０００５】
その他のこのようなアッセイは米国特許公開第２００２／０１３２２３３号、米国特許第５９８５５４８号、米国特許公開第２００５／００２６１６１号および米国特許公開第２００５／０２３９１０８号に記載される。米国特許公開第２００２／０１３２２３３号、第２００５／００２６１６１号および第２００５／０２３９１０８号は、オリゴヌクレオチドに直接的にまたは間接的に（例えば、ビオチン／アビジン結合対を使用して）繋がれた分析物特異的抗体を使用するサンドイッチ免疫ＰＣＲ法を対象とする。試料中の分析物に対する抗体の結合は分析物−抗体−ＤＮＡ複合体に至る。複合体を増幅条件に供することにより抗体結合を検出し、ここで付着したオリゴヌクレオチドを鋳型として使用して増幅生成物を作成する。しかしながらこれらの方法に、抗体またはその他の結合分子をポリメラーゼに繋ぐものはない。むしろそれらは全て直接的または間接的にオリゴヌクレオチドに繋がれた抗体の使用を必要とする。抗体／ＤＮＡ抱合体の非特異的結合は高いバックグラウンドの原因となり、そして少量の分析物を検出する能力と干渉する。加えて２つの異なるポリメラーゼ反応を使用して増幅生成物を作成し、そしてアッセイの感受性を増大させる方法はない。
【０００６】
米国特許第５９８５５４８号は別のサンドイッチ免疫ＰＣＲ法を開示し、ここで抗体のような結合分子を標的オリゴヌクレオチドと抱合させる。上記で論じられた免疫ＰＣＲ法と同様に、抗体／ＤＮＡ抱合体の非特異的結合は高いバックグラウンドの原因となり、そして少量の分析物を検出する能力と干渉する。別の実施形態では、米国特許第５９８５５４８号は、抗体のような結合分子が、標的オリゴヌクレオチド上の部分（例えば、チラミン）を活性化することができるセイヨウワサビペルオキシダーゼのような酵素に抱合される、サンドイッチ免疫ＰＣＲ法を開示する。一度チラミンが活性化されると、それは固体支持体上の受容体に結合する反応性の中間体を形成することにより、標的オリゴヌクレオチドを固定する。次いで固定された標的オリゴヌクレオチドを増幅反応に供する。この実施形態は抗体またはその他の結合部に連結されたＤＮＡを含むレポーター抱合体の使用を回避するが、レポーター抱合体に付着した酵素により活性化される部分を有する標的核酸の使用を必要とし、そして活性化時に、増幅前に固定された受容体に必ず結合する反応性中間体を形成する部分を有する標的核酸の使用を必要とする。さらに米国特許第５９８５５４８号には、２つの異なるポリメラーゼ反応を用いて増幅生成物を作成する方法はない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本開示は分析物の検出のための方法、キットおよび組成物を提供する。本方法、キットおよび組成物は、溶液中の分析物の検出および定量に特に適している。特定の方法では、第１ポリメラーゼに繋がれた結合分子は分析物に結合して、分析物、結合分子および第１ポリメラーゼを含む複合体を形成する。この複合体をプライマーおよび、特定のポリメラーゼが修飾鋳型を増幅することを防止する１つもしくはそれより多い修飾ヌクレオチドを含む修飾核酸鋳型と共にインキュベートする。プライマーが修飾核酸鋳型にアニーリングする場合、それを第１ポリメラーゼにより伸長して、修飾ヌクレオチドを何ら含有しない修飾核酸鋳型のコピーを合成する。次いで修飾核酸鋳型を増幅できないが、非修飾コピーを増幅することが可能な、別のポリメラーゼを使用して、増幅反応において非修飾コピーを検出する。非修飾コピーの検出は試料中の分析物の存在および／または量の指標である。このように、修飾ポリヌクレオチド鋳型が、結合分子に繋がれた第１ポリメラーゼによりコピーされなければ、第２ポリメラーゼは修飾ポリヌクレオチド鋳型を増幅しないので、２つの異なるポリメラーゼ反応の使用は感受性を増大し、バックグラウンドを低減し、かつ再現性を改善する。換言すれば、結合分子が試料中の分析物に結合しない場合、修飾ポリヌクレオチドは第１ポリメラーゼによりコピーされず、したがって第２ポリメラーゼが増幅するための鋳型を作成しない。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
これらの方法、組成物およびキットは、特異的結合対結合反応（例えば、免疫検出）の特異性をポリメラーゼ基盤の検出反応の感受性と組み合わせる。これによりさらに市販により入手可能な系に関して、別の結合分子に繋ぐ必要のない標的核酸を増幅するために使用することができるポリメラーゼに繋がれた抗体のような結合分子を提供することにより、感受性における増大およびバックグラウンドレベルの低減が可能になる。加えてこれらの方法、キットおよび組成物を、市販により入手可能な系において認められるバックグラウンドの種々の供給源を低減させるかまたは排除する、２つの異なるポリメラーゼ反応を伴う使用のために適合させることができる。
【０００９】
一態様においては、分析物を検出するための方法が提供される。本方法は試料を反応混合物と接触させて、抗体のような結合分子を分析物に結合することを可能にすることを伴う。１つまたはそれより多い修飾ヌクレオチドを含む修飾ポリヌクレオチド鋳型を増幅することが可能である第１ポリメラーゼに、結合分子を繋ぐ。第１プライマーは修飾ポリヌクレオチド鋳型にアニーリングし、そして第１ポリメラーゼにより伸長され、１つまたはそれより多い修飾ヌクレオチドを何ら含有しない、修飾ポリヌクレオチド鋳型のコピー（「非修飾コピー」）を合成する。次いで非修飾コピーを第２ポリメラーゼで増幅する。第２ポリメラーゼは修飾ポリヌクレオチド鋳型を増幅することが不可能であるが、非修飾ポリヌクレオチド（非修飾コピー）を増幅することは可能である。増幅された非修飾コピーの検出は、試料中の分析物の存在または量の指標である。
【００１０】
さらに別の態様においては、組成物が提供される。組成物は修飾ポリヌクレオチド鋳型を増幅することが可能である、第１ポリメラーゼに繋がれた結合分子を含む。組成物はさらに修飾ポリヌクレオチド鋳型、または非修飾ポリヌクレオチド鋳型（すなわち修飾ヌクレオチドを何ら伴わない修飾ポリヌクレオチド鋳型のコピー）を増幅することが可能であるが、修飾ポリヌクレオチド鋳型を増幅することが不可能である第２ポリメラーゼを含む。
【００１１】
修飾ポリヌクレオチド鋳型は、第２ポリメラーゼが修飾ポリヌクレオチド鋳型を増幅することを干渉／防止する、１つまたはそれより多い修飾ヌクレオチドを含む。適当な修飾にはデオキシウラシルおよび２’−Ｏ−メチル修飾が含まれる。一実施形態においては、結合分子に繋がれたポリメラーゼはクレノウまたはＴ４ポリメラーゼである。さらなる実施形態においては、第２ポリメラーゼはＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼである。当業者は、第１ポリメラーゼが修飾ポリヌクレオチドをコピーすることを許容するが、同時に第２ポリメラーゼが修飾ポリヌクレオチド鋳型を増幅することを防止する、その他のポリメラーゼ／修飾ポリヌクレオチドの組み合わせを設計することができる。
【００１２】
例えば抗体−ポリメラーゼ融合タンパク質のような、またはストレプトアビジン−ビオチンもしくはアビジン−ビオチン相互作用を経る結合を介することを含む第１ポリメラーゼに、共有結合的または非共有結合的に結合分子を繋ぐことができる。好ましい実施形態では、結合分子はビオチン化抗体であり、そして第１ポリメラーゼをストレプトアビジンまたはアビジンのようなビオチン−結合分子に、例えば融合タンパク質として繋ぐ。
【００１３】
別の態様においては、試料中の分析物を検出するための方法が提供される。本方法は、反応混合物をインキュベートして抗体のような結合分子が分析物に結合することを可能にすることを伴う。結合分子は３’エキソヌクレアーゼ活性を有する第１ポリメラーゼに繋がれ、そしてポリヌクレオチド鋳型ならびに、３’フラップおよび伸長時に新しいプライマー結合部位を導入する５’領域を含む伸長プライマーの存在下で、インキュベートされる。インキュベーションにより、プライマーのポリヌクレオチド鋳型へのアニーリング、第１ポリメラーゼによる３’フラップの切断および第１ポリメラーゼでの切断されたプライマーの伸長が可能になる。切断されたプライマーの伸長は、伸長プライマーにより導入された新しいプライマー結合部位を含む増幅のための鋳型を形成する。増幅のための鋳型を、少なくとも２つのプライマー（そのうちの１つは伸長プライマーにより導入された新しいプライマー結合部位にアニーリングする）、および３’エキソヌクレアーゼ活性を実質的に欠如する第２ポリメラーゼと共にインキュベート後、増幅反応に供する。増幅用に増幅された鋳型の検出は、試料中の分析物の存在または量の指標である。１つの実施形態においては、伸長プライマーを約４１℃以上の反応温度で標的核酸にアニーリングしないように設計する。この実施形態においては、第１ポリメラーゼとのインキュベーションを、結合分子の分析物への結合、伸長プライマーのポリヌクレオチド鋳型へのアニーリング、３’フラップの切断および切断されたプライマーの伸長を許容する第１反応温度で実施し、そして第２ポリメラーゼでの増幅反応を約４１℃以上である第２反応温度で実施する。さらにこの実施形態においては、第２ポリメラーゼが４１℃未満で不活性である限り、第２ポリメラーゼは３’エキソヌクレアーゼ活性を有し得る。別の実施形態においては、ポリヌクレオチド鋳型が１つまたはそれより多い修飾ヌクレオチドを含み、第２ポリメラーゼは修飾ポリヌクレオチド鋳型を増幅することができない。例えば抗体−ポリメラーゼ融合タンパク質のような、またはストレプトアビジン−ビオチン相互作用を経る結合を介することを含む第１ポリメラーゼに、共有結合的または非共有結合的に結合分子を繋ぐことができる。
【００１４】
さらに別の実施形態においては、前記の方法を実行するための組成物が提供される。組成物には、３’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼに繋がれた抗体のような結合分子、伸長プライマーが３’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼにより伸長される場合、３’フラップおよび増幅のための鋳型に新しいプライマー結合部位を導入する５’領域を有する伸長プライマー、ならびに場合によっては第２ポリメラーゼおよび／または増幅のための鋳型における新しいプライマー結合部位に相補的な第２プライマーが含まれる。好ましくは、第２ポリメラーゼは３’エキソヌクレアーゼ活性を実質的に欠如する。一実施形態においては、プライマーは約４１℃以上の反応温度では標的にアニーリングしない。組成物はさらに、修飾されていてもいなくてもよいポリヌクレオチド鋳型を含む。
【００１５】
加えて、前記の方法、組成物およびキットのいずれかにおいて、ポリメラーゼに繋がれた結合分子はさらに、結合分子とポリメラーゼとの間に位置するポリペプチドリンカーのようなスペーサー分子を含む。
【００１６】
別の態様では、開裂（ｓｐｌｉｔ）ポリメラーゼ系と称される複合体が、第１および第２分析物特異的プローブ（ＡＳＰ）と分析物の間で形成される。各分析物特異的プローブは、クレノウのような第１ポリメラーゼの第１または第２部分に繋がれた結合部を含む。ポリメラーゼの第１および第２部分は単離されていると本質的に不活性であるが、それらが互いに結合すると活性になるため、本質的に完全な酵素活性を再構成する。第１および第２ＡＳＰが互いに極めて近位で分析物に結合する場合、ポリメラーゼの第１および第２部分は相互作用して機能的なポリメラーゼ複合体を形成することができる。次いで機能的なポリメラーゼ複合体は、試料中の分析物の存在および／または量の指標である検出可能なシグナルを作成する。検出方法は、２つのポリメラーゼの相互関係および１つまたはそれより多い修飾ヌクレオチドを含む修飾ポリヌクレオチド鋳型に基づく。さらに具体的には、再構成された機能的なポリメラーゼ複合体は修飾ポリヌクレオチド鋳型にアニーリングしたプライマーを伸長して、１つまたはそれより多い修飾ヌクレオチドを何ら含有しない修飾ポリヌクレオチド鋳型のコピー（「非修飾コピー」）を合成する。次いで非修飾コピーを第２ポリメラーゼで増幅後、検出する。第２ポリメラーゼは修飾ポリヌクレオチド鋳型を増幅することが不可能であるが、非修飾コピーを増幅することは可能である。
【００１７】
一実施形態においては、その第１および第２部分が結合分子に繋がれた第１ポリメラーゼは、クレノウまたはＴ４ポリメラーゼである。さらなる実施形態においては、第２ポリメラーゼはＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼである。当業者は、第１ポリメラーゼが修飾ポリヌクレオチドをコピーすることを許容するが、同時に第２ポリメラーゼが修飾ポリヌクレオチド鋳型を増幅することを防止する、その他のポリメラーゼ／修飾ポリヌクレオチドの組み合わせを設計することができる。
【００１８】
開裂ポリメラーゼ系の１つの態様では、分析物を検出する方法が提供される。本方法は試料を反応混合物と接触させて、第１ＡＳＰおよび第２ＡＳＰを分析物に結合させること、１つまたはそれより多い修飾ヌクレオチドを含む修飾ポリヌクレオチド鋳型に第１プライマーをアニーリングすること、ならびに第１プライマーの伸長を許容することを必要とする。第１ＡＳＰは第１ポリメラーゼの第１部分に繋がれた第１結合部を含み、かつ第２ＡＳＰは第１ポリメラーゼの第２部分に繋がれた第２結合部を含む。第１および第２ＡＳＰが互いに極めて近位で分析物に結合する場合、第１ポリメラーゼの第１および第２部分は相互作用して機能的なポリメラーゼ複合体を形成することができる。次いで機能的なポリメラーゼ複合体は第１プライマーを伸長でき、修飾ポリヌクレオチド鋳型にアニーリングして、１つまたはそれより多い修飾ヌクレオチドを何ら含有しない修飾鋳型のコピー（「非修飾コピー」）を形成する。次に非修飾コピーを第２ポリメラーゼで増幅して検出可能なシグナルを生成する。第２ポリメラーゼは修飾ポリヌクレオチド鋳型を増幅することが不可能であるが、非修飾コピーを増幅することは可能である。増幅された非修飾コピーの検出は試料中の分析物の存在および／または量の指標である。
【００１９】
開裂ポリメラーゼ系のなお別の態様においては組成物が提供される。この実施形態においては、組成物は第１分析物特異的プローブ、第２分析物特異的プローブならびに、場合によっては修飾ポリヌクレオチド鋳型および／または第２ポリメラーゼを含む。第１ＡＳＰは第１ポリメラーゼの第１部分に繋がれた結合部を含み、かつ第２ＡＳＰは第１ポリメラーゼの第２部分に繋がれた結合部を含む。それらが互いに関連する場合、第１ポリメラーゼの第１および第２部分は機能的なポリメラーゼ複合体を形成する。１つの実施形態においては、第１ポリメラーゼはクレノウまたはＴ４である。別の実施形態においては、例えば抗体−ポリメラーゼ融合タンパク質のような、またはストレプトアビジン−ビオチン相互作用を経る結合を介することを含むクレノウまたはＴ４のようなポリメラーゼの第１および第２部分に、共有結合的または非共有結合的に第１および第２結合分子を繋ぐ。好ましい実施形態においては、第１結合分子はストレプトアビジンまたはアビジン連結によりポリメラーゼの第１部分に繋がれたビオチン化抗体であり、かつ第２結合分子はストレプトアビジンまたはアビジン連結を介してポリメラーゼの第２部分に繋がれたビオチン化抗体である。
【００２０】
開裂ポリメラーゼ系を、３’フラップおよび新しいプライマー結合部位を増幅のための鋳型に導入する５’領域を有するプライマーを使用する本明細書に記載される方法および組成物において使用し、かつこれに適合させることもできる。
【００２１】
なお別の態様においては、組成物はクレノウフラグメントを含み、ここで該クレノウフラグメントは合成活性を有し、そして配列番号：１のアミノ酸２０１−６０５に９５％以上同一であるアミノ酸配列からなる。
【００２２】
開裂ポリメラーゼ法、組成物およびキットのいずれかでは、ＡＳＰは場合によっては、結合部とポリメラーゼの第１または第２部分との間に位置するポリペプチドリンカーのようなスペーサー分子を含む。
【００２３】
その他の態様においては、本明細書に記載される組成物およびそのための包装材料のいずれかを含有するキットが提供される。
【００２４】
これらの方法の全てにおいて、非修飾コピーまたは増幅のための鋳型の検出を、リアルタイムＰＣＲ検出アッセイ（例えば、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．、アラメダ、カリフォルニア州）反応）を含む、当分野において公知の数多くの方法により実施することができる。第１および第２ポリメラーゼ反応（非修飾コピーの合成および検出反応）を一工程反応（例えば、同じ反応混合物およびインキュベーション工程）として、または逐次的に（例えば、別個の反応混合物およびインキュベーション工程）実施できる。
【００２５】
加えて、本発明の態様のいずれかを固相検出反応（例えば、プレートに結合した捕捉分子（例えば、抗体）、および場合によっては抗体またはストレプトアビジンのような結合分子に繋がれたポリヌクレオチド鋳型を利用する）、または非固相検出反応（例えば、ポリヌクレオチド鋳型に繋がれた抗体またはストレプトアビジンのような結合分子、ならびにポリメラーゼまたは第１および第２分析物特異的プローブに繋がれた抗体のような第１結合分子を使用する、溶液基盤の検出反応）として実行できる。
【００２６】
本明細書に組み込まれ、そしてその一部を構成する添付の図面は、本発明の特定の実施形態を例証し、そして書面による記載と一緒に本発明の特定の原理を説明するために提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１Ａ】図１Ａは、修飾ポリヌクレオチド鋳型を利用する固相検出アッセイの１つの実施形態を例証する。
【図１Ｂ】図１Ｂは、修飾ポリヌクレオチド鋳型を利用する非固相検出アッセイ（ポリメラーゼに繋がれた第１抗体および鋳型核酸に繋がれた第２抗体の使用）の１つの実施形態を例証する。
【図２Ａ】図２Ａは、３’フラップおよび新しいプライマー結合部位を導入する５’領域を有するプライマーを利用する固相検出アッセイの実施形態を例証する。第１ポリメラーゼの３’エキソヌクレアーゼ活性は３’フラップを切断するか、またはそうでなければ除去後、第１ポリメラーゼはプライマーを伸長してポリヌクレオチド鋳型のコピーを合成する。増幅／検出工程において使用されるプライマーに関するアニーリング温度よりも低いＴ_ｍを有するように、プライマーを設計できる。ポリヌクレオチド鋳型は修飾されていても非修飾でもよい。
【図２Ｂ】図２Ｂは、３’フラップおよび新しいプライマー結合部位を導入する５’領域を有するプライマーを利用する、非固相検出アッセイ（ポリメラーゼに繋がれた第１抗体および鋳型核酸に繋がれた第２抗体の使用）の実施形態を例証する。第１ポリメラーゼの３’エキソヌクレアーゼ活性は３’フラップを切断するかまたはそうでなければ除去し、そして第１ポリメラーゼはプライマーを伸長してポリヌクレオチド鋳型のコピーを合成する。増幅／検出工程において使用されるプライマーに関するアニーリング温度よりも低いＴ_ｍを有するように、プライマーを設計できる。ポリヌクレオチド鋳型は修飾されていても非修飾でもよい。
【図３Ａ】図３Ａは、ＥＧＦに関する捕捉抗体および修飾ポリヌクレオチド鋳型を使用する検出アッセイで得られたデータを示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、ＶＥＧＦに関する捕捉抗体および修飾ポリヌクレオチド鋳型を使用する検出アッセイで得られたデータを示す。
【図４】プレートに直接的に結合した分析物および修飾ポリヌクレオチド鋳型を使用する検出アッセイで得られたデータを示す。
【図５】ポリヌクレオチド鋳型（Ａｌｉｅｎ１鋳型）ならびに、３’フラップおよびＰＣＲプライマー結合部位を創成する５’領域を有するプライマー（Ａｌｉｅｎ２伸長プライマー）を利用する分析物検出反応において使用することができるプライマーを例証する。Ａｌｉｅｎ２伸長プライマーは相補領域をフランキングする２つのヌクレオチドミスマッチを含有して、ｅｘｏ⁻ポリメラーゼによる伸長を阻止する。Ａｌｉｅｎ２伸長プライマーは４０℃を超えてアニーリングしない。対照プライマー（図示していない）は一方の末端でのみ２つのヌクレオチドミスマッチを有する。
【図６】クレノウの第１部分に繋がれた第１抗体およびクレノウの第２部分に繋がれた第２抗体を使用する１つの実施形態を例証する。この実施形態では、極めて近位の２つのＡＳＰの結合時に、クレノウの開裂部分は相互作用して機能的なポリメラーゼ複合体を形成する。
【図７】全長クレノウ酵素および、本発明の種々の態様において有用であり得る種々の部分を例証する。
【図８】ビオチン化抗体の存在下でクレノウのＮ２およびＣ２フラグメントを使用する検出反応の結果を示す。
【図９】一定量のクレノウのＮ２およびＣ２フラグメントの存在下での抗体の変動濃度の容量応答曲線を示す。
【図１０】ＧＳＴに結合するビオチン化抗ＧＳＴ抗体の存在を検出するためにストレプトアビジン部、異なるポリペプチドリンカーおよびクレノウ部を含む、種々のロングネック（Ｌｏｎｇ Ｎｅｃｋ）融合タンパク質を使用する固相検出反応の結果を示す。
【図１１】ＧＳＴに結合するビオチン化抗ＧＳＴ抗体の存在を検出するためにストレプトアビジン部、異なるポリペプチドリンカーおよびクレノウ部を含む、種々のロングネック（Ｌｏｎｇ Ｎｅｃｋ）融合タンパク質を使用する固相検出反応の結果を示す。
【図１２】ＶＥＧＦに結合するビオチン化抗ＶＥＧＦ抗体の存在を検出するためにストレプトアビジン部、ポリペプチドリンカーおよびクレノウ部（ＳＡｖ−ＧＳ−Ｌｘ４−ＫＬ）を含む、ロングネック（Ｌｏｎｇ Ｎｅｃｋ）融合タンパク質を使用する溶液基盤（均質）検出反応の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本発明の種々の例示的な実施形態に対して詳細に参照し、その実例を添付の図面において例証する。以下の詳細な説明は特定の実施形態、特色および本発明の態様の詳細のより十分な理解を読み手に与えるために提供され、そして本発明の範囲の限定として解釈すべきでないことは理解されよう。
【００２９】
前記で論じたように、目的の物質の免疫検出のための試薬および方法は公知であり、そして市販により入手可能である。しかしながら、これらの試薬および方法は有意な欠点、最も顕著には、相対的に低い感受性、不十分なシグナル対ノイズ比（高いバックグラウンドシグナル）のいずれかまたはその双方を有する。加えて特定の様式においてのみ機能するように具体的に設計され、したがって目的の物質を検出するための幅広い使用に適合させることができないものもある。免疫ＰＣＲ技術は感受性を改善するように考案されているが、市販により入手可能なテクノロジーは依然高いシグナル対ノイズ比を有し、その有用性が限定されている。
【００３０】
本出願は、高度に鋭敏なポリメラーゼ部分に結合した高度に特異的な結合部分（例えば、抗体部分）を含む分析物特異的結合剤を使用することにより、シグナル対ノイズ比が改善されるが、同時に検出アッセイの特異性および／または感受性は保持または改善される方法、組成物およびキットを開示し、ここでポリメラーゼが増幅反応（例えば、ＰＣＲ）のための鋳型を合成することを許容する条件下で、ポリメラーゼのための修飾ポリヌクレオチド鋳型と共に薬剤をインキュベートすることができる。増幅反応のための鋳型を、修飾ポリヌクレオチド鋳型を増幅することが不可能である第２ポリメラーゼで増幅する。２つの異なるポリメラーゼを使用することにより、任意の残留する非特異的な修飾ポリヌクレオチド鋳型は第２ポリメラーゼにより増幅されることができず、したがって検出シグナルの一部になることはないので、感受性が増大し、バックグラウンドが低減し、かつ再現性が改善される。さらに検出反応を結合反応と物理的に分離でき、そして非特異的結合試薬によるバックグラウンドシグナルを低減または排除することができるが、感受性は保持または改善される。
【００３１】
定義
本明細書で使用される際には「分析物」という用語は本発明の方法により検出または検定される物質を指す。典型的な分析物は、限定するものではないがタンパク質、ペプチド、細胞表面受容体、受容体リガンド、核酸、分子、細胞、微生物およびそのフラグメント、または結合部、例えば抗体を発達させることができる任意の物質を含むことができる。
【００３２】
本明細書で使用される際には「結合分子」とは分析物に特異的に結合する分子を指す。結合分子にはモノクローナル、ポリクローナルまたはファージ由来抗体、抗体フラグメント、ペプチド、リガンド、ハプテン、核酸、核酸アプタマー、プロテインＡ、プロテインＧ、葉酸、葉酸結合タンパク質、プラスミノーゲン、ならびにマレイミドおよびスルフヒドリル反応基が含まれる。さらなる有用な結合分子が当分野において公知である。
【００３３】
本明細書で使用される際には「結合部」という用語は、分析物に安定して結合する分子を指す。結合部には、限定するものではないがモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、アプタマー、細胞表面受容体、受容体リガンド、ビオチン、ストレプトアビジン、アビジン、プロテインＡおよびプロテインＧならびにその結合フラグメント、例えばＦａｂが含まれる。結合部を直接的または間接的に反応分子に繋ぐ。
【００３４】
本明細書で使用される際には「分析物特異的プローブ」または「ＡＳＰ」という用語は結合部および反応部（例えば、ポリメラーゼの第１または第２部分）を有する分子を指す。結合部を反応部に作動可能なように繋ぐ。２つまたはそれより多いプローブが互いに極めて近位で結合する場合、反応部は効果的に相互作用する。２つのプローブが分析物上のその各々の結合部位に結合し、そしてその活性部が相互作用する場合、分析物特異的プローブは互いに極めて近位にある。結合分子を直接的または間接的に反応部に繋ぐ。
【００３５】
本明細書で使用される際には「相互作用する」という用語はＡＳＰの反応部に適用されるように、２つまたはそれより多い反応部（例えば、ポリメラーゼの第１および第２部分）を互いに極めて近位にして反応部が物理的に会合するのを可能にすることを指す。例えばポリメラーゼの第１および第２部分を有する一対の分析物特異的プローブが分析物に結合する場合、ポリメラーゼの第１および第２部分は極めて近位になり、相互作用し、そして機能的なポリメラーゼ複合体を形成するようになる。この機能的なポリメラーゼ複合体は次いで、ポリヌクレオチド鋳型にハイブリダイズしたプライマーの３’末端を伸長して増幅鋳型を形成するようになる。ポリメラーゼの第１および第２部分が分離されている（相互作用しない）場合、部分は合成活性を実質的に欠如する。
【００３６】
本明細書で使用される際には「合成活性を実質的に欠如する」という用語は、機能的なポリメラーゼ複合体の合成活性の５０％、４０％、３０％、２０％または１０％以下、および好ましくは１％未満しか有さないポリメラーゼの第１または第２部分を指す。
【００３７】
本明細書で使用される際には第１ポリメラーゼに関する「部分」という用語は、単離された場合に核酸合成活性を実質的に欠如するが、核酸ポリメラーゼの第２部分と相互作用する場合に核酸合成活性を有する核酸ポリメラーゼのフラグメントを指す。本明細書で使用される際には第１ポリメラーゼに関する「部分」とは５０−１０００個のアミノ酸のフラグメントを指すが、それは全長ポリメラーゼに満たない。一実施形態においては、部分は核酸ポリメラーゼの少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０もしくは６００個またはそれより多いアミノ酸を有するが、全長ポリメラーゼに満たない。例えばクレノウの第１部分は配列番号：２のアミノ酸配列を有することができ、クレノウの第２部分は配列番号：３のアミノ酸配列を有することができるが、全長クレノウは配列番号：１のアミノ酸配列を含む。
【００３８】
本明細書で使用される際には「機能的なポリメラーゼ複合体」という用語は、本明細書で定義されたようなポリメラーゼの２つまたはそれより多い部分を指し、それは相互作用していずれかの部分単独（例えば、複合体でない）の合成活性の少なくとも２倍である合成活性（ポリメラーゼ活性）を有するポリペプチド複合体を形成する。
【００３９】
好ましい実施形態では、ＡＳＰの結合部は抗体である。
【００４０】
本明細書で使用される際には「抗体」という用語は抗原、例えば分析物を結合することが可能である免疫グロブリンタンパク質を指す。抗体は一般的には、「エピトープ結合フラグメント」と称される全長抗体により認識されるエピトープに結合する能力を保持する抗体の任意の部分を含む。抗体フラグメントの例としては、好ましくは、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）_２、Ｆｄ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、一本鎖抗体、ジスルフィド連結Ｆｖ（ｓｄＦｖ）ならびにＶ_ＬまたはＶ_Ｈドメインのいずれかを含むフラグメントが含まれるが、これらに限定されない。一本鎖抗体を含むエピトープ結合フラグメントは（複数の）可変領域を単独で、または以下：ヒンジ領域、Ｃ_Ｈ１、Ｃ_Ｈ２およびＣ_Ｈ３ドメイン；の全体または一部分との組み合わせで含むことができる。
【００４１】
本明細書で使用される際には、「核酸ポリメラーゼ」または「ポリメラーゼ」とはヌクレオチドの重合化を触媒する酵素を指す。一般的には、酵素は核酸鋳型配列にアニーリングしたプライマーの３’末端で合成を開始後、鋳型鎖の５’末端に向かって進む。「ＤＮＡポリメラーゼ」はデオキシリボヌクレオチドの重合化を触媒する。公知のＤＮＡポリメラーゼには、例えばパイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ）（Ｐｆｕ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｌｕｎｄｂｅｒｇら、Ｇｅｎｅ １０８：１（１９９１））大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ（ＬｅｃｏｍｔｅおよびＤｏｕｂｌｅｄａｙ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１１：７５０５（１９８３））、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｏｒｄｓｔｒｏｍら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５６：３１１２（１９８１））、サーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（Ｔｔｈ）ＤＮＡポリメラーゼ（ＭｙｅｒｓおよびＧｅｌｆａｎｄ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３０：７６６１（１９９１））、バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼ（ＳｔｅｎｅｓｈおよびＭｃＧｏｗａｎ、Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ ４７５：３２（１９７７））、サーモコッカス・リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）（Ｔｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｖｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼとも称される、Ｃａｒｉｅｌｌｏら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １９：４１９３（１９９１））、９°Ｎｍ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓの製造中止になった製品）、サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ）（Ｔｍａ）ＤＮＡポリメラーゼ（ＤｉａｚおよびＳａｂｉｎｏ、Ｂｒａｚ Ｊ．Ｍｅｄ．Ｒｅｓ ３１：１２３９（１９９８））、サーマス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）（Ｔａｑ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｃｈｉｅｎら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｏｒｉｏｌ １２７：１５５０（１９７６））、パイロコッカス・コダカラエンシス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ）ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｋａｇｉら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６３：４５０４（１９９７））、ＪＤＦ−３ ＤＮＡポリメラーゼ（特許出願第ＷＯ０１３２８８７号）、パイロコッカスＧＢ−Ｄ（ＰＧＢ−Ｄ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｊｕｎｃｏｓａ−Ｇｉｎｅｓｔａら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １６：８２０（１９９４））、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼおよび大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメント（「クレノウ」）が含まれる。前記の酵素のいずれかのポリメラーゼ活性を当分野において周知の方法により決定することができる。一実施形態においては、本発明の方法は３’ヌクレアーゼ活性を保有するポリメラーゼおよび３’ヌクレアーゼ活性を実質的に欠如する第２ポリメラーゼを利用する。３’ヌクレアーゼ活性を保有するまたは３’ヌクレアーゼ活性を実質的に欠如するポリメラーゼは当分野において公知であり、かつ本明細書に記載される。別の実施形態においては、本方法は修飾ポリヌクレオチド鋳型を増幅することが可能である第１核酸ポリメラーゼ、および修飾ポリヌクレオチド鋳型を増幅することが不可能であるか、または実質的に不可能である第２核酸ポリメラーゼを利用する。修飾ポリヌクレオチド鋳型を増幅することが可能なポリメラーゼ、および修飾ポリヌクレオチド鋳型を増幅することが不可能であるか、または実質的に不可能であるポリメラーゼは当分野において公知であり、かつ本明細書に記載される。本明細書に開示される方法、組成物およびキットの関連では、修飾ポリヌクレオチド鋳型を増幅することが「不可能である」かまたは増幅もしくはコピー「できない」第２ポリメラーゼは、第２ポリメラーゼが特定の条件下で修飾ポリヌクレオチド鋳型を増幅または複製できないことを意味するのではなく、むしろ例えば第１ポリメラーゼと比較して、修飾ポリヌクレオチド鋳型を増幅するときに少なくとも１００倍、少なくとも１０００倍、少なくとも１００００倍、少なくとも１０００００倍または少なくとも１００００００倍効果が低いことを含む、修飾ポリヌクレオチド鋳型を増幅またはコピーする場合に、第２ポリメラーゼが第１ポリメラーゼよりも実質的に効果が低いことを意味する。開裂ポリメラーゼ系では、本方法は第１および第２部分に開裂する第１ポリメラーゼを利用する。一実施形態においては、第１ポリメラーゼはファミリーＡポリメラーゼである。別の実施形態においては、第１および第２部分に開裂するポリメラーゼはクレノウである。
【００４２】
本明細書で使用される際には「繋がれた」とは共有結合的および非共有結合的な相互作用により、例えば水素、イオンまたはファンデルワールス結合による２つの分子の会合を指す。このような結合は少なくとも２つの同じまたは異なる原子またはイオンの間で、これらの原子またはイオンの電子密度の再分布の結果として形成され得る。例えば酵素を、ストレプトアビジン−ビオチン相互作用を経る結合を介して、またはＦｃプロテインＡ／Ｇ相互作用を介する結合を経て、抗体−酵素融合タンパク質として抗体に繋ぐことができる（例えば、ポリメラーゼをプロテインＡ／Ｇに繋ぎ、それを次に抗体のＦｃ領域に結合する）。
【００４３】
本明細書に記載されるような「抗体結合分子」は抗体に結合するリガンドである。一般的には、リガンドは抗原結合部位を経て抗体に結合しない。非限定的な例には、プロテインＡ、プロテインＬおよびプロテインＧが含まれる。
【００４４】
本明細書で使用される際には「融合ポリペプチド」とは、互いにインフレームで連結された２つまたはそれより多いポリペプチドを含むポリペプチドを指す。本明細書で使用される際には「連結された」または「融合された」という用語は、互いにインフレームで連結された２つまたはそれより多いポリペプチドをコードする融合分子を形成するためのポリペプチドまたは核酸の２つまたはそれより多いセグメントを一緒に連結することを意味する。２つまたはそれより多いポリペプチドを、直接的にまたはリンカーを介して連結できる。
【００４５】
本明細書で使用される際には、用語「オリゴヌクレオチド」または「ポリヌクレオチド」は、ポリデオキシリボヌクレオチド（２−デオキシ−Ｄ−リボースを含有する）、ポリリボヌクレオチド（Ｄ−リボースを含有する）およびプリンもしくはピリミジン塩基、または修飾プリンもしくはピリミジン塩基のＮ−グリコシドである任意のポリヌクレオチドを指す。オリゴヌクレオチドはその他のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズできるか、または自己ハイブリダイズ（例えば、ヘアピン構造）できる。オリゴヌクレオチドには、限定するものではないが一本および二本鎖オリゴヌクレオチドが含まれる。
【００４６】
本明細書で使用される際には「ポリヌクレオチド鋳型」という用語は、プライマーがハイブリダイズし、かつ例えばＰＣＲまたはプライマー伸長反応において核酸ポリメラーゼにより複製される核酸配列を指す。一実施形態においては、第１ポリメラーゼの第１および第２部分が相互作用して機能的なポリメラーゼ複合体を形成する場合、ポリヌクレオチド鋳型は複製される。本明細書で使用される際には「非修飾コピー」は、第１ポリメラーゼまたは修飾ポリヌクレオチド鋳型に存在する修飾ヌクレオチドを何ら含有しない機能的なポリメラーゼ複合体により合成される修飾ポリヌクレオチド鋳型のコピーである。非修飾コピーは、修飾ポリヌクレオチド鋳型を増幅することが不可能である第２ポリメラーゼにより増幅される。
【００４７】
本明細書で使用される際には「修飾ポリヌクレオチド鋳型」または「修飾核酸鋳型」とは、鋳型が第２ポリメラーゼ（例えば、Ｐｆｕポリメラーゼ）によりコピーされることを防止するが、第１ポリメラーゼ（例えば、クレノウまたはＴ４ポリメラーゼ）によりコピーされることを防止しない１つまたはそれより多い非天然ヌクレオチドを伴うポリヌクレオチド鋳型を指す。このような非天然修飾には、チミンをウラシルで置換すること、および２’ヒドロキシルを２’−Ｏ−メチルで置換することが含まれる。その他の適当な修飾には３’−５’逆デオキシリボヌクレオチド（Ｑｉａｎｇ Ｌｉｕら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．３３：１２９−１３８（２００２年７月））、ヒポキサンチン、およびその他の当分野において公知のおよび本明細書に記載される非伝統的なヌクレオチドが含まれ得る。「修飾核酸鋳型」を本明細書に記載される反応条件下（例えば、１倍Ｐｆｕバッファー、６０−７２℃）でＰｆｕポリメラーゼ（パイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ）（Ｐｆｕ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｌｕｎｄｂｅｒｇら、Ｇｅｎｅ １０８：１（１９９１）））によりコピー（例えば、増幅）することはできないが、クレノウに適当な条件下（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、７．５ｍＭ ＤＴＴ、室温）でクレノウにより複製することができる。鋳型が修飾ポリヌクレオチド鋳型であるかどうかを決定するためのアッセイは本明細書に記載され、かつ当分野において公知である。
【００４８】
本明細書で使用される際には、用語「相補的」は、２つのポリヌクレオチド／オリゴヌクレオチド鎖の領域の間の配列相補性の概念を指す。塩基がチミンまたはウラシルである場合、第１ポリヌクレオチド領域のアデニン塩基が、第１領域に対して逆平行である第２ポリヌクレオチド領域の塩基と特異的水素結合（「塩基対形成」）を形成することが可能であることは公知である。同様に、塩基がグアニンである場合、第１ポリヌクレオチド鎖のシトシン塩基が第１鎖に対して逆平行である第２ポリヌクレオチド鎖の塩基と塩基対形成することが可能であることは公知である。２つの領域を逆平行の様式で整列させたときに、第１領域の少なくとも１つのヌクレオチドが第２領域の塩基と塩基対形成することが可能である場合、ポリヌクレオチドの第１の領域は異なるポリヌクレオチドの第２領域に対して相補的である。したがって、ヌクレオチド位置毎に２つの相補的ポリヌクレオチドが塩基対形成することは要求されない。「相補的」とは第２ポリヌクレオチドに対して１００％または「十分に」相補的であり、したがってヌクレオチド位置毎に塩基対を形成する第１ポリヌクレオチドを指すことができる。「相補的」とはまた、１００％相補的でない（例えば、９０％、８０％、７０％、６０％相補的）、１つまたはそれより多いヌクレオチド位置でミスマッチしたヌクレオチドを含有する第１ポリヌクレオチドを指すこともできる。
【００４９】
本明細書で使用される際には「ハイブリダイゼーション」または「アニーリング」という用語は、相補的（部分的な相補的を含む）ポリヌクレオチド／オリゴヌクレオチド鎖、例えばプライマーおよび鋳型の対形成を記載するために用いられる。ハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションの強度（すなわちポリヌクレオチド鎖間の会合の強度）は、ポリヌクレオチド間の相補性の程度、関与する条件のストリンジェンシー、形成されたハイブリッドの融解温度（Ｔ_ｍ）、他の成分の存在（例えば、ポリエチレングリコールの存在または不在）、ハイブリダイズする鎖のモル濃度、およびポリヌクレオチド鎖のＧ：Ｃ含量を含む、当分野において周知の多くの因子の影響を受ける。
【００５０】
本明細書で使用される際には、１つのポリヌクレオチドが別のポリヌクレオチドに「ハイブリダイズ」または「アニーリング」すると称される場合、それは２つのポリヌクレオチド間で何らかの相補性が存在するか、または２つのポリヌクレオチドが高ストリンジェンシー条件下でハイブリッドを形成することを意味する。１つのポリヌクレオチドが別のポリヌクレオチドにハイブリダイズしないと称される場合、それは２つのポリヌクレオチド間で配列相補性が存在しないか、または高ストリンジェンシー条件下で２つのポリヌクレオチドの間でハイブリッドが形成されないことを意味する。
【００５１】
「ヌクレアーゼ」という用語は、５’−３’エンドヌクレアーゼ活性および／または５’−３’エキソヌクレアーゼ活性（５’エキソヌクレアーゼ）を保有する酵素を指す。５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を保有する酵素には、ＤＮＡポリメラーゼ、例えば大腸菌由来のＤＮＡポリメラーゼＩならびにサーマス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）（Ｔａｑ）、サーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（Ｔｔｈ）およびサーマス・フラバス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｌａｖｕｓ）（Ｔｆｌ）由来のＤＮＡポリメラーゼが含まれる。「ヌクレアーゼ」という用語はまたＦＥＮヌクレアーゼをも包含する。ＦＥＮ酵素は５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を保有し、そして一本鎖および二本鎖ＤＮＡの接合部でホスホジエステル結合の加水分解切断を経て５’核酸フラップを切断する。ＦＥＮヌクレアーゼ酵素には、アーケオグロブス・フルギダス（Ａｒｃｈａｅｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓ）、メタノコッカス・ヤナシ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）、パイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ）、ヒト、マウスまたはアフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ）由来のＦＥＮ酵素が含まれる。ヌクレアーゼにはまた出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＲＡＤ２７および分裂酵母（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）ＲＡＤ２、Ｐｏｌ Ｉ ＤＮＡポリメラーゼ随伴５’−３’エキソヌクレアーゼドメイン（例えば、大腸菌、サーマス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）（Ｔａｑ）、サーマス・フラバス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｌａｖｕｓ）（Ｔｆｌ）、バシラス・カルドテナクス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｌｄｏｔｅｎａｘ）（Ｂｃａ）、肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ））ならびに限定するものではないがＴ５ ５’−３’エキソヌクレアーゼ、Ｔ７遺伝子６エキソヌクレアーゼおよびＴ３遺伝子６エキソヌクレアーゼを含む、ＦＥＮのファージ機能的相同体もまた含まれる。
【００５２】
「３’ヌクレアーゼ」または「３’エキソヌクレアーゼ」という用語は、３’−５’エンドヌクレアーゼ活性（３’エンドヌクレアーゼ）および／または３’−５’エキソヌクレアーゼ活性（３’エキソヌクレアーゼ）を保有する酵素（例えば、ポリメラーゼ）を指す。３’ヌクレアーゼ活性を保有する酵素は本明細書に記載されるか、または当分野において公知である。
【００５３】
用語「３’ヌクレアーゼ活性を実質的に欠如する」は、酵素がＴ４、Ｔ７、ＰｆｕまたはクレノウＤＮＡポリメラーゼのような野生型ポリメラーゼの３’ヌクレアーゼ活性の５％または１０％以下、および好ましくは０．１％、０．５％または１％未満を保有することを意味する。
【００５４】
本明細書で使用される際には「３’フラップ」とは標的核酸にハイブリダイズした場合に３’一本鎖として突出する一本鎖核酸フラップを指す。３’フラップは標的核酸に対して非相補的であり、かつ３’ヌクレアーゼにより切断される。
【００５５】
本明細書で使用される際には「切断反応」とは、オリゴヌクレオチドをオリゴヌクレオチドから放出されるフラグメントまたはヌクレオチドおよびフラグメントに酵素的に分離する（すなわちホスホジエステル結合によりその他のフラグメントまたは核酸に物理的に連結されない）ことを指す。切断反応をエキソヌクレアーゼ活性、エンドヌクレアーゼ活性または制限酵素活性により実施する。エンドヌクレアーゼ活性を利用する切断反応にはＩＮＶＡＤＥＲ（登録商標）検出アッセイ（Ｔｈｉｒｄ Ｗａｖｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；マディソン、ウィスコンシン州）が含まれ、これは米国特許第６３４８３１４号に記載され、そしてその全てが参照により本明細書に組み込まれる。本方法に包含される切断反応アッセイには分子ビーコン検出アッセイ（種々の商業的供給源から供給される）およびＴＡＱＭＡＮ（登録商標）（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．、アラメダ、カリフォルニア州）検出アッセイもまた含まれ、これらは米国特許第５７２３５９１号；第５９２５５１７号および第５８０４３７５号に記載され、その各々はその全てが参照により本明細書に組み込まれる。本発明に有用な切断反応はまた米国特許第６５４８２５０号に記載され、参照により本明細書に組み込まれる。本発明の方法におけるヌクレアーゼによりこのような切断反応を実行できる。
【００５６】
本明細書で使用される際には、用語「切断生成物」は、ヌクレアーゼによる切断反応において切断され、かつ溶液に放出されるオリゴヌクレオチドフラグメントである。
【００５７】
本明細書で使用される際には「増幅」という用語は核酸配列に適用される場合、それにより特定の核酸配列の１つまたはそれより多いコピーが鋳型核酸から作成される過程を指す。一般的には当分野において周知のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）またはリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）テクノロジー（Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ，Ｃ．Ｗ．およびＧ．Ｓ．Ｄｖｅｋｓｌｅｒ（１９９５）ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ，ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、プレーンビュー、ニューヨーク州）を用いて増幅を実施する。しかしながら本明細書で使用される際には、増幅はまた核酸配列の一工程複製／コピー（例えば、プライマー伸長反応）を含むと意図される。
【００５８】
本明細書に記載されるいずれかの方法では、増幅鋳型の合成および検出反応を一工程反応（例えば、同じ反応混合物およびインキュベーション工程）として、または逐次的に（例えば、別個の反応混合物およびインキュベーション工程）実施できる。第２ポリメラーゼは、例えば第１プライマー伸長反応条件（例えば、Ｐｆｕポリメラーゼ）下で、非修飾ポリヌクレオチド鋳型を増幅することが可能であるが、修飾ポリヌクレオチド鋳型を増幅することが不可能である任意のポリメラーゼでよい。
【００５９】
別の実施形態では、第２ポリメラーゼは化学的処理されたホットスタート用のＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、ＳＵＲＥＳＴＡＲＴ（登録商標）Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ラ・ホーヤ、カリフォルニア州）のようなＴａｑポリメラーゼである。この実施形態においては、特にＴａｑポリメラーゼはウラシル塩基を認識するので、第２ポリメラーゼでの増幅の前に修飾ポリヌクレオチド鋳型を除去するのが好ましい。修飾ポリヌクレオチド鋳型の除去に適当な薬剤および方法は当分野において公知であり、かつ第１プライマー伸長反応後、第２ポリメラーゼでの増幅前に、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）で試料を処理することを含む。ＵＤＧはＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（ビバリー、マサチューセッツ州）から入手可能である。ＵＤＧはウラシル含有ＤＮＡのホスホジエステルバックボーンからウラシル塩基を切断するが、天然の（すなわちチミン含有）ＤＮＡには影響を及ぼさない。得られた脱ピリミジン部位はＤＮＡポリメラーゼによる複製を遮断し、そして酸／塩基加水分解に対して非常に不安定である。したがって第１プライマー伸長反応の後であるが、Ｔａｑポリメラーゼでの増幅の前に試料をＵＤＧで処理することは、任意の残留する修飾ポリヌクレオチド鋳型を除去し、したがって任意のバックグラウンドシグナルの最小化を支援する。
【００６０】
好ましい実施形態では、第１ポリメラーゼはクレノウまたはＴ４ポリメラーゼである。第１ポリメラーゼおよび結合分子、例えば抗体は、融合タンパク質として互いに会合することができるか、または化学的リンカーを介して連結できる。適当な化学的リンカーにはビオチン−ストレプトアビジン相互作用が含まれる。さらに別の実施形態では、第１ポリメラーゼを抗体結合分子（例えば、プロテインＡもしくはプロテインＧもしくはビオチン、アビジンまたはストレプトアビジン）を介して抗体に繋ぐ。好ましい実施形態では、結合分子はビオチン化抗体であり、そして第１ポリメラーゼをストレプトアビジンまたはアビジンに融合する。
【００６１】
好ましい実施形態では、試料中の分析物を検出する方法が提供される。本方法は、
ビオチン化抗体を分析物に結合させるステップと、ここで分析物は表面に固定されている；
表面を洗浄して未結合抗体を除去するステップと；
抗体上のビオチンと融合タンパク質におけるストレプトアビジンとの間を繋ぐステップと、および固定された分析物／ビオチン化抗体／融合タンパク質複合体の形成を許容する条件下で、ストレプトアビジンに融合した第１ポリメラーゼを含む融合タンパク質と共に表面をインキュベートするステップと；
表面を洗浄して未結合融合タンパク質を除去するステップと；
第１ポリメラーゼが第１プライマーを伸長し、そして１つまたはそれより多い修飾ヌクレオチド（「非修飾コピー」）を含まない修飾ポリヌクレオチド鋳型のコピーを合成することを許容する条件下で、固定された分析物／ビオチン化抗体／融合タンパク質複合体を、デオキシウラシルまたは２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドのような１つまたはそれより多い修飾ヌクレオチド、４つのデオキシ三リン酸および修飾ポリヌクレオチド鋳型に結合する第１プライマーを含む修飾ポリヌクレオチド鋳型と共に、インキュベートすること；
非修飾コピーを含むインキュベーション反応物のアリコートを新しい反応容器に移すステップと；
修飾ポリヌクレオチド鋳型を増幅することができないＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼのような第２ポリメラーゼで非修飾コピーを増幅するステップと；ならびに
増幅生成物を検出するステップと、ここで増幅生成物の検出は試料中の分析物の存在または量の指標である；
を含む。
【００６２】
別の態様においては、本発明はクレノウまたはＴ４ポリメラーゼのような第１ポリメラーゼに繋がれた抗体のような結合分子、修飾ポリヌクレオチド鋳型、修飾ポリヌクレオチド鋳型に相補的な第１プライマー、Ｐｆｕポリメラーゼのような第２ポリメラーゼ、および修飾ポリヌクレオチド鋳型の非修飾コピーに相補的な第２プライマーを含む反応混合物を形成することにより、試料中の分析物を検出する方法を対象とする。修飾ポリヌクレオチド鋳型には、デオキシウラシルまたは２’−Ｏ−メチル修飾のような１つまたはそれより多い修飾ヌクレオチドが含まれる。反応混合物をインキュベートして、結合分子の分析物への結合、第１プライマーの修飾ポリヌクレオチド鋳型へのアニーリングおよび第１ポリメラーゼによる第１プライマーの伸長を許容する。第１プライマーの伸長により、修飾ヌクレオチドを何ら含有しない修飾ポリヌクレオチド鋳型のコピー（「非修飾コピー」）を生成する。第２プライマーの非修飾コピーへのアニーリングおよび第２ポリメラーゼでのプライマーの伸長により、非修飾コピーを検出する。第２ポリメラーゼは修飾ポリヌクレオチド鋳型を増幅することができないが、第１ポリメラーゼにより作成された非修飾コピーを増幅することができる。非修飾コピーの検出は試料中の分析物の存在または量の指標である。
【００６３】
ポリヌクレオチド鋳型を伸長するために使用されるプライマーが３’フラップを有する特定の態様では、抗体のような結合分子は、３’エキソヌクレアーゼ活性を有する第１ポリメラーゼに繋がれる。第１ポリメラーゼはクレノウ（ｅｘｏ^＋）のような３’ヌクレアーゼ活性を有する任意のポリメラーゼでよい。第２ポリメラーゼはＰｆｕ（ｅｘｏ⁻）ＤＮＡポリメラーゼのような３’ヌクレアーゼ活性を有さない任意のポリメラーゼでよい。第１ポリメラーゼおよび抗体は融合タンパク質の形態で互いに会合することができるか、または化学的リンカーを介してそれらを連結できる。適当な化学的リンカーにはビオチン−ストレプトアビジン相互作用が含まれる。さらに別の実施形態では、抗体結合分子（例えば、プロテインＡまたはプロテインＧ）を介して第１ポリメラーゼを抗体に繋ぐ。
【００６４】
ポリヌクレオチド鋳型（修飾または非修飾）は好ましくは溶液中で遊離しているが、しかしながら固相および溶液基盤の実施形態の双方を含むいくつかの実施形態においては、ポリヌクレオチド鋳型はさらなる抗体または、抗体のようなビオチン化検出分子と相互作用することができるストレプトアビジンのようなその他の部分に繋がれることが企図される。この実施形態においてはポリヌクレオチド鋳型のコピーは、第１および第２抗体（またはその他の部分）が互いに極めて近位内で結合し（例えば、同じ分析物）、したがって第１ポリメラーゼおよびポリヌクレオチド鋳型が相互作用するのが可能になる場合にのみ合成される。
【００６５】
ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．、アラメダ、カリフォルニア州）プローブまたはＳＹＢＲ（登録商標）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、ユージン、オレゴン州）グリーン色素のような当分野で利用可能な検出試薬を使用して、リアルタイムＰＣＲ検出アッセイ（例えば、ＳｔｒａｔａｇｅｎｅのＭＸ３００５ＰリアルタイムＰＣＲ）を含む当分野において公知の数多くの方法により、複製されたポリヌクレオチド鋳型の検出を実施することができる。適当な検出アッセイには切断反応もまた含まれる。例えば検出反応はさらに、第２プライマーの下流でアニーリングする標識プローブを含むことができる。この実施形態において、第２プライマーは伸長されて、核酸切断反応（例えば、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．、アラメダ、カリフォルニア州）検出アッセイ）において下流の標識プローブを切断するようになる。あるいは検出工程は第２プライマーからの伸長生成物の直接検出を用いることができる。この実施形態では、伸長された第２プライマーの増幅生成物をゲル電気泳動により検出し、そして可視化することができる。増幅生成物の存在は試料中の分析物の存在の指標である。
【００６６】
本明細書にて開示される方法およびキットで使用するための組成物が提供される。１つの態様においては、組成物は第１ポリメラーゼまたはその部分に繋がれた抗体を含む。一実施形態においては、抗体は第１ポリメラーゼまたはその部分に融合される。好ましい実施形態においては、抗体はビオチン／アビジン相互作用によりポリメラーゼまたはその部分に繋がれる。例えば、ストレプトアビジンまたはアビジンに連結された第１ポリメラーゼまたはその部分を含む融合タンパク質と共に、ビオチン化抗体を使用できる。組成物を本明細書に記載される方法の実行と併せて使用するのに適当である少なくとも１つのその他の物質と組み合わせることができる。適当な物質には、本明細書に開示される方法にて望まれるように実施するその能力に有害な影響を及ぼすことなく、結合分子または第１ポリメラーゼとの接触を引き起こすことができるものが含まれる。これに代えて、または加えて、組成物は結合分子および、分子が特異的に結合する１つもしくはそれより多い物質（例えば、検出されるべき抗原）、またはポリメラーゼ部と相互作用する１つもしくはそれより多い物質（例えば、修飾ポリヌクレオチド鋳型）を含むことができる。別の態様においては、組成物は、ポリメラーゼ部に繋がれたプロテインＡ、ＧもしくはＬ、またはビオチン、アビジンもしくはストレプトアビジンのような抗体以外の結合分子を含み、それを本明細書に記載される方法の実行と併せて使用するのに適当である少なくとも１つのその他の物質と組み合わせることができる。例えば凍結乾燥された乾燥粉末、または水性混合物のような液体または固体形態で、組成物を見出すことができる。したがって結合および検出アッセイにおける組成物の使用が提供される。
【００６７】
開裂ポリメラーゼ系の１つの態様では、ポリメラーゼはクレノウであり、そして第１ポリメラーゼの第１部分は配列番号：２のアミノ酸配列を有し、そして第１ポリメラーゼの第２部分は配列番号：３のアミノ酸配列を有する。Ｅｎｔｒｅｚ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅデータベース（米国立生物工学情報センター（「ＮＣＢＩ」）のウェブサイトから利用可能）にて開示されるように、クレノウはＤＮＡポリメラーゼＡスーパーファミリーに属し、そして配列番号：１の約アミノ酸２２５からアミノ酸６０５にわたる保存されたポリメラーゼドメインを共有する；Ｖｉｌｌｂｒａｎｄｔら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．１３（９）：６４５−５４（２０００）（その開示は参照により本明細書に組み込まれる）もまた参照のこと。公知のドメイン構造を使用して、当業者は例えば図７にて例証されるようなその他の型の開裂クレノウポリメラーゼを容易に構築できるであろう。クレノウのポリメラーゼドメインは当分野において公知であるので、当業者は２つの部分が会合した場合に形成されるポリメラーゼ複合体のポリメラーゼ活性に影響を及ぼすことなく、配列番号２および配列番号３の配列（または図７に描かれるもののようなその他のクレノウフラグメント）に置換または欠失を容易に作成できるであろう。したがって別の態様においては、第１ポリメラーゼの第１および第２部分が相互作用したときに機能的なポリメラーゼ複合体を形成する限り、第１ポリメラーゼの第１部分は配列番号２（またはその他のクレノウフラグメントが何でも使用される）のアミノ酸配列と少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の同一性を有し、そして第１ポリメラーゼの第２部分は配列番号３（またはその他のクレノウフラグメントが何でも使用される）のアミノ酸配列と少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の同一性を有する。当業者はクレノウ以外の開裂ポリメラーゼを構築することができる。クレノウおよびその他のポリメラーゼの三次元構造はＮＣＢＩウェブサイトのＳｔｒｕｃｔｕｒｅデータベースのような公のデータベースから利用可能である。構造ドメインを分離する非構造化領域に開裂点を位置決定することが好ましい。ポリメラーゼの部分を極めて近位にする任意の研究法によりポリメラーゼ活性の再構成を促進することができる。結合部はモノクローナルまたはポリクローナル抗体、レクチン、細胞表面受容体、受容体リガンド、ペプチド、炭水化物、アプタマー、ビオチン、ストレプトアビジン、アビジン、プロテインＡまたはプロテインＧでよい。好ましい実施形態では、クレノウの２つの相補的部分を、同じ抗体上のビオチンに、または分析物上で互いに近位にある、異なる抗体上のビオチンに結合することができる、ストレプトアビジンタグと共に提供する。
【００６８】
別の態様においては、スペーサー分子は結合分子を第１ポリメラーゼから、または第１および第２結合部を各々第１ポリメラーゼの第１および第２部分から分離する。スペーサー分子は任意の物質または物質の組み合わせからなってよい。しかしながら典型的には、スペーサー分子はポリペプチドまたはポリヌクレオチドからなる。一実施形態においては、スペーサー分子はグリシン、セリン、アラニンおよびスレオニンのような小型アミノ酸を含むポリペプチドリンカーである。別の実施形態においては、自然発生の可動性非構造化領域を使用することができる。このような領域を豊富に発現されるタンパク質から、例えばＬ７／Ｌ１２リボソームタンパク質から選択することができる（Ｂｏｃｈａｒｏｖら、「タンパク質Ｌ７／Ｌ１２の構造および動態からリボソームにおける分子スイッチまで」Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９（１７）：１７６９７−７０６（２００４））。多くの非構造化領域は当業者に公知であり、そしてデータベースのタンパク質構造から、例えばＥｎｔｒｅｚ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ＮＣＢＩデータベースから利用可能である。さらにバイオインフォーマティクス法により、例えばＳｃｏｏｂｙ−Ｄｏｍａｉｎ法（Ｐａｎｇ ＣＮら、「疎水性シグナルからタンパク質配列におけるフォールディング可能な領域を同定する」Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３６（２）：５７８−８８（２００８））を用いて、タンパク質における非構造化領域を予測することができる。
【００６９】
スペーサー分子を使用することにより結合分子をポリメラーゼから分離することは、例えば融合タンパク質にさらなる可動性を提供し、そして結合およびポリメラーゼドメインが妨害されずに機能することを促進するのに有用である。
【００７０】
スペーサー分子はまた、開裂ポリメラーゼ部（例えば、Ｎ−およびＣ−末端部分）の相互作用および機能的ポリメラーゼ複合体の再構成を促進するのを支援する。実施例６〜９にて示されるように、ポリメラーゼ活性の再構成は、ストレプトアビジン−開裂ポリメラーゼ部のビオチン化抗体への結合により促進される。ビオチン化抗体への結合によりポリメラーゼのＮ−およびＣ−末端部分が極めて近位になることで、ポリメラーゼ活性の再構成が促進される。
【００７１】
ビオチン化抗体におけるビオチン分子の無作為な位置のために、全てのストレプトアビジン−ビオチン結合事象は必ずしもポリメラーゼ活性の再構成には至らない。例えばいくつかのビオチン分子は、互いに遠すぎている可能性がある。あるいはビオチン分子は互いに離れたストレプトアビジン−ポリメラーゼＮ−およびストレプトアビジン−ポリメラーゼＣ−部分に結合し得る。特にストレプトアビジン−開裂ポリメラーゼ融合タンパク質が互いに向かい合わないか、またはそれほど近位ではないビオチン分子に結合している場合、スペーサー分子の使用により、例えば開裂ポリメラーゼ部分の間の立体障害を低減することによりポリメラーゼ活性の再構成を促進することを支援する。
【００７２】
本明細書に記載されるいずれかの検出方法を単一の反応容器中で、または２つもしくはそれより多い反応容器中で実施できる（例えば、第１反応容器中での分析物への抗体結合および非修飾コピーまたは増幅のための鋳型の合成、ならびに第２反応容器中での増幅された非修飾コピーまたは鋳型の検出）。
【００７３】
本明細書に記載されるいずれかの検出方法を、溶液基盤のアッセイ（例えば、捕捉抗体および固体支持体を伴わない）において実施されるように適合させることができる。これらの実施形態においては、方法は一般的には２つの検出抗体を利用し、第１はポリヌクレオチド鋳型に作動可能なように繋がれ、そして第２は第１核酸ポリメラーゼに繋がれている。同様に開裂ポリメラーゼ系では、方法は一般的には、各々独立して第１ポリメラーゼの第１および第２部分に繋がれた２つの検出抗体ならびに溶液中で提供される修飾ポリヌクレオチド鋳型を使用する。修飾ポリヌクレオチド鋳型を検出抗体に、またはビオチン化検出抗体と相互作用することができるストレプトアビジンのような異なる結合部に繋ぐことができる。抗体を互いに極めて近位内で結合するように設計して、ポリヌクレオチド鋳型および第１核酸ポリメラーゼが相互作用して増幅のための鋳型を形成するか、または開裂ポリメラーゼ系ではポリメラーゼ活性の再構成を促進することを可能にする。このようなアッセイは２００６年１０月１１日出願の米国特許出願第１１／５４６６９５号（その全てにおいて参照により本明細書に組み込まれる）に記載される。
【００７４】
本明細書に開示される組成物および方法はバイオテクノロジーおよび医学分野で幅広い適用性を有する。これらは研究目的で有用であるのみならず、診断試薬およびアッセイとして医学、獣医、法医学、環境および食品検査の分野への適用に有利である。したがって実施形態においては、本発明は試料から目的の物質を検出するための診断方法を提供し、ここで物質の検出は特定の疾患または障害の指標である。例えば方法は患者における癌を診断するための診断方法でよく、ここでその方法には癌特異的抗原の検出が含まれる。同様に例えば方法は障害の公知のマーカーの検出により、糖尿病のような代謝障害を診断するための診断方法でよい。ヒトおよびその他の動物における疾患および障害のための多くのマーカーが公知であり、そして任意のこのようなマーカーを本明細書に開示される方法による診断アッセイの局面内で使用することができる。マーカーは特定の疾患または障害と１００％相関するものである必要はないが、むしろ疾患または障害により影響を受ける一部のヒトまたは動物において、疾患または障害と関連するとして単に公知であり得ることに留意されたい。さらにマーカーは疾患または障害の原因物質である必要はないが、むしろ疾患または障害と関連する（その存在、不在またはレベルにより）として公知である任意のマーカーでよいことを理解されたい。
【００７５】
本明細書に開示される方法はまた、疾患もしくは障害の結果を予後診断するか、または疾患または障害のための処置計画を追随するために使用することもできる。さらに具体的には、組成物および方法を用いて経時的に採取された複数の試料に関して検出アッセイを繰り返すことにより、疾患および障害に関するマーカーの存在およびレベルを経時的に追跡することができる。マーカーの存在、不在またはレベルが疾患または障害からの回復（または疾患または障害の重篤度等）の可能性の指標である場合、本発明のアッセイを用いて疾患または障害の結果を予測するか、または発達を追跡することができる。
【００７６】
前記で論じられた使用に鑑みて、さらなる態様では、本発明の組成物を含むキットが提供される。一般的に、キットは、入れ物の貯蔵および出荷のための包装材料と組み合わされた少なくとも１つの入れ物中に抗体のような結合分子または結合部に繋がれた、ポリメラーゼまたはその第１および第２部分を含む。あるいはキットは、入れ物の貯蔵および出荷のための包装材料と組み合わされた少なくとも１つの入れ物中にストレプトアビジンまたはアビジンに繋がれた、ポリメラーゼまたはその第１および第２部分を含む。ポリメラーゼまたはその部分を純粋な物質として、または組成物の一部として供給できる。限定するものではないが、ポリヌクレオチド鋳型（修飾または非修飾）、１つまたはそれより多いプライマー、および／または修飾ポリヌクレオチド鋳型を増幅できないか、もしくは３’エキソヌクレアーゼ活性を実質的に欠如するかのいずれかである第２ポリメラーゼを含む、本発明の方法を実行するためのその他の試薬および供給物を含むさらなる構成成分をキットで供給できる。当業者は、目的の物質を検出するためのキットにおいて典型的に含まれる種々の供給物および物質を認識しており、そしてこれらの供給物および物質のいずれかを本発明によるキットに含むことができる。例えばキットは本発明の方法を実施するための１つまたはそれより多い固体基質を含むことができ、実施形態では目的の分析物および／または触媒反応のための検出反応容器（例えば、ＰＣＲ反応チューブ）に特異的に結合することができる捕捉分子（例えば、抗体）にそれを予め結合させることができる。キットはまた、または代替として、結合溶液または洗浄溶液が入った１つまたはそれより多い入れ物（例えば、ビン）を含有できる。
【００７７】
修飾ポリヌクレオチド鋳型を利用する検出アッセイ
図１Ａは修飾ポリヌクレオチド鋳型および、修飾ポリヌクレオチド鋳型のコピーが可能である第１ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、クレノウ）を利用する、固相実施形態を例証する。この実施形態では、分析物を含有する被験試料を最初に固定された捕捉抗体と共に、次に第１核酸ポリメラーゼに繋がれた検出抗体と共にインキュベートする。あるいは分析物をウェルに直接的に結合させ、そして捕捉抗体を必要としない。
【００７８】
インキュベーションに続いて、捕捉抗体を利用する固相アッセイではウェルを洗浄バッファーで洗浄する。
【００７９】
次いで捕捉抗体−分析物−検出抗体−ポリメラーゼ複合体を含有するウェルに伸長反応混合物を添加し、そしてインキュベートする（例えば、室温で３０分間）。伸長反応混合物には、本明細書に記載されるような修飾ポリヌクレオチド鋳型、および修飾ポリヌクレオチド鋳型の一部分に相補的である逆方向プライマーが含まれる。インキュベーションの間、プライマーは修飾ポリヌクレオチド鋳型にアニーリングし、そして第１核酸ポリメラーゼにより伸長されて、修飾ポリヌクレオチド鋳型の非修飾コピーを形成するようになる。次いで非修飾コピーを検出反応において利用する。
【００８０】
結合／伸長反応と同じか、または好ましくは異なる反応容器中で検出反応を実施できる。例えば、非修飾コピーを有する反応混合物のアリコートを９６ウェルＰＣＲプレートの対応するウェルに移すことができる。この工程では、非修飾コピーは検出試薬（例えば、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．、アラメダ、カリフォルニア州）プローブ、ＳＹＢＲ（登録商標）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、ユージン、オレゴン州）グリーン色素、分子ビーコンプローブ）、修飾ポリヌクレオチド鋳型を複製することが不可能である第２核酸ポリメラーゼ、および逆方向および順方向プライマーのような１つまたはそれより多いプライマーと反応する。検出反応混合物を、プライマーのアニーリング、非修飾コピーの増幅および増幅した非修飾コピーの検出を可能にする反応条件に供する。例えば１つの実施形態では、増幅および検出に必要な適切な時間および温度でプログラムされているリアルタイムＰＣＲ装置において検出反応を行う。例えばＳＹＢＲ（登録商標）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、ユージン、オレゴン州）グリーンを利用する検出反応では、解離曲線ならびに９５℃１０分間、続いて９５℃１５秒間および６３℃４５秒間の４０サイクルの２工程循環パラメーターで、ＳＹＢＲ（登録商標）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、ユージン、オレゴン州）グリーン検出アッセイに対応するプログラムを用いてＭＸ３００５ＰリアルタイムＰＣＲ装置を利用できる。リアルタイムＰＣＲ検出のその他の手段は当分野において周知であり（例えば、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．、アラメダ、カリフォルニア州）検出アッセイおよび分子ビーコン検出アッセイ）、そして本発明の実施形態における使用に適合させることができる。次いで検出されたシグナルを用いて試料中の分析物の濃度を決定することができる。
【００８１】
別の実施形態においては、分析物、第１ポリメラーゼに繋がれた検出抗体、および修飾ポリヌクレオチド鋳型に繋がれた別の抗体は、溶液中で遊離している（図１Ｂ）。検出抗体を第１核酸ポリメラーゼに繋ぎ、その後それらを反応混合物に添加するか、または分析物とのインキュベーションの間に繋ぐことができる（例えば、ビオチン標識された検出抗体および添加されたストレプトアビジン−クレノウ）。あるいは第１核酸ポリメラーゼに繋がれ、そして検出抗体に結合する中間体（例えば、第２抗体）を介して、第１核酸ポリメラーゼを検出抗体に結合させることができる。分析物が溶液中で遊離している場合、修飾ポリヌクレオチド鋳型を抗体に繋ぐことにより、抗体の分析物への結合時に修飾ポリヌクレオチド鋳型および第１ポリメラーゼを極めて近位にすることが支援される。これは次に第１ポリメラーゼと修飾ポリヌクレオチド鋳型との間の相互作用を促進し、第１ポリメラーゼが修飾ポリヌクレオチド鋳型の非修飾コピーを合成する速度を速めることを支援する。溶液基盤の実施形態においては、伸長および検出反応は固相実施形態に関して記載されたものと同じである。
【００８２】
３’フラップを伴うプライマーを利用する検出アッセイ
図２Ａはポリヌクレオチド鋳型および３’エキソヌクレアーゼ活性を有する第１ＤＮＡポリメラーゼ（クレノウ（ｅｘｏ^＋））を利用する１つの実施形態を例証する。いくつかの実施形態では、３’ヌクレアーゼ活性は別個の酵素（例えば、異なるポリメラーゼまたは必ずしもポリメラーゼ活性を有するとは限らないヌクレアーゼ）により供給されるので、第１ポリメラーゼは３’ヌクレアーゼ活性を有さない。
【００８３】
分析物を含有する被験試料は最初に固定された捕捉抗体と、次に第１核酸ポリメラーゼに繋がれた検出抗体と反応する。あるいは分析物をウェルに直接的に結合させ、そして捕捉抗体を利用しない。別の実施形態においては、分析物、第１ポリメラーゼに繋がれた検出抗体およびポリヌクレオチド鋳型に繋がれた別の抗体は溶液中で遊離しており、かつ固体支持体に結合していない（例えば、溶液基盤のアッセイ、図２Ｂ）。検出抗体を反応混合物に添加する前に第１核酸ポリメラーゼに繋ぐことができるか、または分析物とのインキュベーションの間に繋ぐことができる（例えば、ビオチン標識された検出抗体および添加されたストレプトアビジン−クレノウ）。あるいは第１核酸ポリメラーゼに繋がれ、そして検出抗体に結合する中間体（例えば、第２抗体）を介して、第１核酸ポリメラーゼを検出抗体に結合させることができる。反応混合物を適切な温度で十分な時間インキュベートさせて（例えば、室温で３０分間）、捕捉抗体および／または検出抗体の分析物への結合を可能にする。インキュベーションの後、固相アッセイではウェルを洗浄バッファーで洗浄する。
【００８４】
次いでウェルに伸長反応混合物を添加し、そしてインキュベートする（例えば、室温で３０分間）。伸長反応混合物には本明細書に記載されるようなポリヌクレオチド鋳型、ならびに３’フラップおよび伸長時に新しいプライマー結合部位を導入する５’領域を伴う伸長プライマーが含まれる。インキュベーション工程の間に、プライマーはポリヌクレオチド鋳型にアニーリングして３’非相補的フラップを形成するようになる。次いで３’フラップは第１核酸ポリメラーゼにより切断され、かつ伸長されて、伸長プライマーにより導入された新しいプライマー結合部位を含む増幅のための鋳型を形成するようになる。いくつかの実施形態においては、第１ポリメラーゼは３’ヌクレアーゼ活性を有さず、そして３’フラップは異なる酵素（例えば、異なるポリメラーゼまたは必ずしもポリメラーゼ活性を有するとは限らないヌクレアーゼ）により切断される。次いで増幅のための鋳型を、Ｐｆｕ（ｅｘｏ⁻）ＤＮＡポリメラーゼのような３’エキソヌクレアーゼ活性を実質的に欠如する第２ＤＮＡポリメラーゼと共に検出反応において利用する。
【００８５】
結合／伸長反応と同じか、または好ましくは別個の反応容器中で検出反応を実施できる。例えば、増幅のための鋳型を有する反応混合物のアリコートを９６ウェルＰＣＲプレートの対応するウェルに移すことができる。この工程では、増幅のための鋳型は検出試薬（例えば、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．、アラメダ、カリフォルニア州）プローブ、ＳＹＢＲ（登録商標）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、ユージン、オレゴン州）グリーン色素）、第１および第２プライマー（そのうちの１つは伸長プライマーにより導入された新しいプライマー結合部位にアニーリングする）ならびに３’エキソヌクレアーゼ活性を実質的に欠如する第２核酸ポリメラーゼと反応する。検出反応混合物を、プライマーのアニーリング、増幅のための鋳型の増幅および増幅された鋳型の検出を可能にする反応条件に供する。例えば１つの実施形態では、増幅および検出に必要な適切な時間および温度でプログラムされているリアルタイムＰＣＲ装置において検出反応を行う。例えば解離曲線ならびに９５℃１０分間、続いて９５℃１５秒間および６３℃４５秒間の４０サイクルの２工程循環パラメーターで、ＳＹＢＲ（登録商標）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、ユージン、オレゴン州）グリーン検出アッセイに対応するプログラムを用いて、ＭＸ３００５ＰリアルタイムＰＣＲ装置を利用できる。リアルタイムＰＣＲ検出のその他の手段は当分野において周知であり（例えば、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．、アラメダ、カリフォルニア州）および分子ビーコン検出アッセイ）、そして本実施形態における使用に適合させることができる。次いで検出されたシグナルを用いて試料中の分析物の濃度を決定することができる。
【００８６】
開裂ポリメラーゼおよび修飾ポリヌクレオチド鋳型を使用する検出アッセイ
図６は修飾ポリヌクレオチド鋳型、第１結合部および第１ポリメラーゼの第１部分を有する第１分析物特異的プローブ、ならびに第２結合部および第１ポリメラーゼ（例えば、クレノウ）の第２部分を有する第２分析物特異的プローブを利用する１つの実施形態を例証する。
【００８７】
この実施形態では、分析物を含有する被験試料は最初に結合反応において第１および第２分析物特異的プローブと反応する。いくつかの実施形態では、固体支持体に結合した捕捉抗体もまた存在する。第１および第２結合部を各々第１および第２ポリメラーゼ部分に繋ぐ。限定するものではないが抗体／ポリメラーゼ融合タンパク質として直接連結すること、ストレプトアビジン−ビオチン相互作用またはプロテインＡもしくはプロテインＧを介して連結されることを含む多くの異なる方式で、結合部をポリメラーゼ部分に繋ぐことができる。第１ポリメラーゼの第１および第２部分が分離されている場合、これらは合成活性を実質的に欠如する。しかしながら第１ポリメラーゼの第１および第２部分が互いに極めて近位になる場合、それらは相互作用して合成活性を有する機能的な第１ポリメラーゼ複合体を形成するようになる。
【００８８】
ＡＳＰの結合ならびに第１ポリメラーゼの第１および第２部分の相互作用の後、伸長反応が進行する。前記で列挙された試薬に加えて、伸長反応にはさらに修飾ポリヌクレオチド鋳型および修飾ポリヌクレオチド鋳型の一部分に相補的である１つまたはそれより多いさらなるプライマーが含まれる。反応混合物をインキュベート（例えば、室温で３０分間）して、プライマーアニーリングおよび第１ポリメラーゼ複合体によるプライマーの伸長を許容して、修飾ポリヌクレオチド鋳型の非修飾コピーを形成するようになる。次いで非修飾コピーを、図１Ａに関連する固相実施形態を参照して前記で論じられたような修飾ポリヌクレオチド鋳型を複製することが不可能である第２ポリメラーゼと共に検出反応において利用する。
【００８９】
分析物
方法、組成物およびキットを使用して多岐にわたる分析物を検出できる。結合分子または各ＡＳＰに関する結合部位は同じかまたは異なっていてよい。分析物は単一分子、分子複合体、複数の試薬結合部位を含有する生物またはウイルスでよい。変動する分子距離に及ぶために結合分子またはＡＳＰをコードするオリゴヌクレオチドの長さを構築することができるので、結合部位は同じ分子上にある必要はない。しかしながら、それらは別個であるが近接した位置の分子上にあり得る。例えばウイルス、細菌または細胞のような有機体の複数の結合エピトープを本明細書に開示される方法によりターゲティングすることができる。１つの態様においては、分析物はタンパク質、オリゴヌクレオチド、細胞表面受容体または受容体リガンドである。
【００９０】
結合分子および結合部
利用される捕捉および検出分子が、方法が用いられている分析物を特異的に認識および結合するように、方法（例えば、固体支持体に付着した捕捉抗体およびポリメラーゼまたはその一部分に繋がれた検出抗体）において使用される結合分子または結合部（捕捉分子および／または検出分子とも称される）を単純に改変することにより、本明細書に開示される方法を任意の分析物の検出のために適合させることができる。いくつかの実施形態においては、分析物を固体支持体に直接結合させて、捕捉抗体が必要ではないようにできる。その他の実施形態においては、捕捉抗体は分析物に結合し、未標識中間抗体は分析物に結合し、そして検出抗体は中間抗体に結合する。
【００９１】
その他の実施形態では、溶液相反応において（例えば、捕捉抗体および固体支持体を伴わずに）アッセイを実施する。これらの実施形態においては、方法は一般的に修飾ポリヌクレオチド鋳型に作動可能なように繋がれた第１検出抗体および第１核酸ポリメラーゼに繋がれた第２検出抗体、または代替として第１核酸ポリメラーゼの第１および第２部分に繋がれた第２および第３検出抗体を利用する。抗体を互いに極めて近位内に結合して、ポリヌクレオチド鋳型および第１核酸ポリメラーゼが相互作用して、増幅のための鋳型（例えば、修飾ポリヌクレオチド鋳型の非修飾コピー）を形成することを可能にするように設計する。このようなアッセイは２００６年１０月１１日出願の米国特許出願第１１／５４６６９５号（その全が参照により本明細書に組み込まれる）に記載される。
【００９２】
捕捉分子および検出分子は調査中の分析物（例えば、多価分析物）の同じ部分またはエピトープを認識および結合できる。あるいは捕捉分子および検出分子は分析物の異なる部分またはエピトープを認識および結合する。いくつかの実施形態においては、捕捉分子および検出分子は同じ分析物ではなく、相互作用して複合体を形成する２つの異なる分析物に結合できる。例えば捕捉抗体は受容体タンパク質に特異的でよく、かつそれに結合でき、そして検出抗体は受容体のリガンドに特異的でよく、かつそれに結合でき、捕捉分子、受容体タンパク質、リガンドおよび検出抗体は複合体を形成するようになる。
【００９３】
結合部を互いに極めて近位内に結合して、第１核酸ポリメラーゼの第１および第２部分が相互作用して、増幅のための鋳型を形成することを可能にするように設計する。
【００９４】
好ましくは捕捉および分析物結合検出分子または結合部は、モノクローナル、ポリクローナルもしくはファージ由来抗体または抗体フラグメントである。さらに好ましくは、捕捉および検出分子または結合部は、モノクローナル抗体である。
【００９５】
抗体がポリクローナル、モノクローナルまたは免疫反応性のそのフラグメントのいずれでも、当業者によく知られた慣習的な方法により生成することができる。従来のモノクローナルおよびポリクローナル抗体は有用であり、そして好ましい型の結合分子を示す。したがって抗体調製の確立された方法を用いて、免疫型結合分子を調製することができる。抗体調製および免疫型結合部に関する精製の適当な方法は、Ｈａｒｌｏｗ，ＥｄおよびＬａｎｅ，Ｄ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク州（１９８８）に記載される。さらに本明細書に記載されるアッセイを現在利用可能な市販により入手可能である抗体と共に使用することができる。
【００９６】
「ポリクローナル抗体」は抗原またはその抗原性機能的誘導体で免疫された動物の血清から誘導された抗体分子の異種性集団である。ポリクローナル抗体の生成のために、ウサギ、マウスおよびヤギのような宿主動物を、場合によってはアジュバントを補充された、抗原またはハプテンキャリア抱合体の注射により免疫できる。
【００９７】
モノクローナル抗体を作成するための当分野において公知の任意の方法は、例えばファージディスプレイテクノロジーでのインビトロ作成、およびマウスのような動物を免疫することによるインビボ作成により企図される。これらの方法にはＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９７（１９７５））およびＣａｍｐｂｅｌｌ（Ｂｕｒｄｏｎら編、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第１３巻、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、アムステルダム（１９９５）における「モノクローナル抗体テクノロジー、げっ歯類およびヒトハイブリドーマの生成および特徴付け」）に記載される免疫学的方法；ならびにＨｕｓｅら、（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５−１２８１（１９８９））により記載される組換えＤＮＡ法が含まれる。標準的な組換えＤＮＡ技術はＳａｍｂｒｏｏｋら（「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ」第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８７））およびＡｕｓｕｂｅｌ（「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ／Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、ニューヨーク（１９９０））において記載される。これらの方法の各々は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００９８】
捕捉分子および検出分子はインタクトな抗体に限定されず、抗体フラグメントおよび抗体フラグメントを含む組換え融合タンパク質のようなその他の結合分子を包含する。
【００９９】
キメラ化、ヒト化および一本鎖抗体ならびにそのフラグメントを生成する方法はＰＣＴ出願第ＷＯ９３／２１３１９号、欧州特許出願第２３９４００号；ＰＣＴ出願第ＷＯ８９／０９６２２号；欧州特許出願第３３８７４５号；および欧州特許出願第ＥＰ３３２４２４号において開示される。これらの出願の各々は参照により本明細書に組み込まれる。
【０１００】
加えて、適切な抗原特異性のマウス抗体分子からの遺伝子を、適切な生物学的活性のヒト抗体分子からの遺伝子と一緒にスプライシングすることによる、「キメラ抗体」の生成のための開発された技術（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１：６８５１−６８５５（１９８４）；Ｔａｋｅｄａら、Ｎａｔｕｒｅ ３１４：４５２−５４（１９８５））を使用することができる。キメラ抗体は、ネズミｍＡｂから誘導される可変領域およびヒト免疫グロブリン定常領域を有するもののような、異なる部分が異なる動物種から誘導される分子である。あるいは、一本鎖抗体の生成のために記載される技術（米国特許第４，９４６，７７８号；Ｂｉｒｄ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−２６（１９８８）；Ｈｕｓｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９−８３（１９８８）；およびＷａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ ３３４：５４４−４６（１９８９））を遺伝子−一本鎖抗体を生成するために適合させることができる。典型的には一本鎖抗体は、アミノ酸橋を介してＦｖ領域の重および軽鎖フラグメントを連結することにより形成され、結果的に一本鎖ポリペプチドに至る。
【０１０１】
非免疫結合分子もまた捕捉または検出分子としての使用に関して企図される。これらの分子には、２つの構成要素がお互いに関して天然の親和性を共有するが、抗原／抗体様の対ではない系が含まれる。非免疫結合部の実例にはビオチン／アビジンまたはビオチン／ストレプトアビジン、葉酸−葉酸結合タンパク質、ビタミンＢ１２／内因子、相補的プローブ核酸、プロテインＡ、Ｇ、免疫グロブリン、ヘテロおよびホモ二量体ポリペプチド複合体等が含まれる。互いに共有結合を形成する非免疫結合対もまた含まれる。
【０１０２】
ポリ核酸アプタマーのような非抗体タンパク質受容体または非タンパク質受容体を使用することもできる。ポリ核酸アプタマーは典型的には、受容体または抗体とほぼ同じ様式でタンパク質に選択的に結合するように作用し得るＲＮＡオリゴヌクレオチドである（Ｃｏｎｒａｄら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６７（Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）３３６−３６７（１９９６））。これらのアプタマーは結合分子または結合部として適当であろう。
【０１０３】
「特異的に結合する」および「特異的な結合」という用語は本明細書で使用される際には、本発明の明記された条件下で抗体またはその他の結合分子もしくは結合部が、抗原、リガンドまたは分析物のような標的に、その他の分子に結合するよりも大きな親和性で結合することを意味する。当分野において公知であるように抗体または抗体フラグメントは、抗原のようなその他の分子に結合することができる領域を含有するポリペプチド分子である。種々の実施形態においては「特異的に結合する」とは、抗体またはその他の生物学的分子が標的分子に少なくとも約１０^−６−１０^−１０／Ｍの親和性で結合し、さらに好ましくはそれらは少なくとも１０^−８／Ｍの親和性を有し、最も好ましくは少なくとも１０^−９／Ｍの親和性を有することを意味する。
【０１０４】
ポリメラーゼ
ＤＮＡポリメラーゼは当業者に周知である。これにはＤＮＡ依存性ポリメラーゼおよび逆転写酵素のようなＲＮＡ依存性ポリメラーゼの双方が含まれる。ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼの少なくとも５つのファミリーが公知であるが、たいていがファミリーＡ、ＢおよびＣに入る。種々のファミリー間で構造または配列類似性はほとんどまたは全くない。たいていのファミリーＡポリメラーゼは、ポリメラーゼ、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性および５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を含む複数の酵素的機能を含有することができる一本鎖タンパク質である。ファミリーＢポリメラーゼは典型的には、ポリメラーゼとの単一の触媒ドメインおよび３’−５’エキソヌクレアーゼ活性、ならびにアクセサリー因子を有する。ファミリーＣポリメラーゼは典型的には、重合化および３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を伴うマルチサブユニットタンパク質である。大腸菌では、ＤＮＡポリメラーゼの３つの型：ＤＮＡポリメラーゼＩ（ファミリーＡ）、ＩＩ（ファミリーＢ）およびＩＩＩ（ファミリーＣ）が見出されている。真核細胞では、３つの異なるファミリーＢポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼα、δおよびεは核複製に関わり、そしてファミリーＡポリメラーゼ、ポリメラーゼｙはミトコンドリア１ＤＮＡ複製に使用される。その他の型のＤＮＡポリメラーゼにはファージポリメラーゼが含まれる。
【０１０５】
同様にＲＮＡポリメラーゼには、典型的には真核生物ＲＮＡポリメラーゼＩ、ＩＩおよびＩＩＩ、および細菌性ＲＮＡポリメラーゼ、ならびにファージおよびウイルスポリメラーゼが含まれる。ＲＮＡポリメラーゼはＤＮＡ依存性およびＲＮＡ依存性でよい。
【０１０６】
本明細書に記載される方法、組成物およびキットは少なくとも４つのクラスのポリメラーゼ：（１）３’ヌクレアーゼ活性を欠如するポリメラーゼ；（２）３’ヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼ；（３）修飾ポリヌクレオチド鋳型を複製することが可能なポリメラーゼ；および（４）修飾ポリヌクレオチド鋳型を複製することが不可能なポリメラーゼ；を利用することができる。特定の実施形態において有用な核酸ポリメラーゼは３’−５’ヌクレアーゼ活性を実質的に欠如し、ｅｘｏ⁻Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を実質的に欠如するＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼの変異形態、Ｃｌｉｎｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２４：３５４６（１９９６）；米国特許第５，５５６，７７２号；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（ラ・ホーヤ、カリフォルニア州）から市販により入手可能、カタログ番号６００１６３）、ｅｘｏ⁻Ｔｍａ ＤＮＡポリメラーゼ（３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を実質的に欠如するＴｍａ ＤＮＡポリメラーゼの変異形態）、ｅｘｏ⁻Ｔｌｉ ＤＮＡポリメラーゼ（３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を実質的に欠如するＴｌｉ ＤＮＡポリメラーゼの変異形態、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（カタログ番号２５７））、ｅｘｏ⁻大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ（３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を実質的に欠如する大腸菌ＤＮＡポリメラーゼの変異形態）、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのｅｘｏ⁻クレノウフラグメント（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カタログ番号６０００６９）、ｅｘｏ⁻Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ（３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を実質的に欠如するＴ７ ＤＮＡポリメラーゼの変異形態）、ｅｘｏ⁻ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ（３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を実質的に欠如するＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼの変異形態）、ｅｘｏ⁻ＪＤＦ−３ ＤＮＡポリメラーゼ（３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を実質的に欠如するＪＤＦ−３ ＤＮＡポリメラーゼの変異形態）、ｅｘｏ⁻ＰＧＢ−Ｄ ＤＮＡポリメラーゼ（３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を実質的に欠如するＰＧＢ−Ｄ ＤＮＡポリメラーゼの変異形態）Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、カタログ番号２５９、Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、カタログ番号６００１３１、６００１３２、６００１３９、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）；Ｕ１Ｔｍａ（Ｎ−トランケート体）サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍａｔｏｇａ ｍａｒｔｉｍａ）ＤＮＡポリメラーゼ；ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメント、９°Ｎｍ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（ビバリー、マサチューセッツ州）の製造中止になった製品）、「３’−５’エキソレデュースト（ｅｘｏ ｒｅｄｕｃｅｄ）」変異体（Ｓｏｕｔｈｗｏｒｔｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ９３５２８１（１９９６））およびＳｅｑｕｅｎａｓｅ（ＵＳＢ、クリーブランド、オハイオ州）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１０７】
具体的な実施形態においては、第１ポリメラーゼは抗体のような結合分子に繋がれた、または２部に開裂したクレノウであり、その各々は抗体のような結合部に繋がれている。クレノウに類似して作用するその他のファミリーＡポリメラーゼ、例えば完全大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ、サーマス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼＩ、肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｔ５ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｓｐｏ２ ＤＮＡポリメラーゼまたはその部分を使用することもできる。伸長工程は典型的には同じ混合物中に存在し得るその他の中温性タンパク質（抗原、抗体）の生物学的活性に適合する温度で実施されるので（例えば、約室温から約３７℃にわたる温度）、クレノウのような中温性ポリメラーゼは第１ポリメラーゼとして好ましい。しかしながらＴａｑのような好熱性ポリメラーゼは中温性の温度で活性であるので、それらを使用することもできる。具体的な実施形態では、Ｔａｑポリメラーゼは、その各々が結合部（例えば、抗体）に連結された第１および第２部分に開裂する。加えて第１ポリメラーゼを用いる伸長工程を分析物結合工程から分離することができ、そして第１ポリメラーゼ反応に最適である任意の温度で実施することができる。Ｔａｑポリメラーゼに約９０％類似するサーマス・ブロキアヌス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｂｒｏｃｋｉａｎｕｓ）ポリメラーゼ、ならびにサーマス・フラバス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｌａｖｕｓ）ポリメラーゼ、および逆転写酵素活性を有するサーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ポリメラーゼもまた使用できる。加えてバチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）に由来するファミリーＡポリメラーゼのような極端な好熱性ではないポリメラーゼを使用することができる。
【０１０８】
パイロコッカスポリメラーゼのようなファミリーＢポリメラーゼ、例えばＰｆｕポリメラーゼは第２ポリメラーゼとして有用である。
【０１０９】
当業者に周知のアッセイを用いてポリメラーゼの活性を測定することができる。例えばポリメラーゼ連鎖反応のような反応において合成された核酸の量を決定することにより、ポリメラーゼ活性のような前進型酵素活性を測定することができる。酵素の相対的有効性を決定するときに、次いで配列非特異的二本鎖ＤＮＡ結合ドメインを含有するポリメラーゼで得られた生成物の量を、通常のポリメラーゼ酵素で得られた生成物の量と比較することができる。
【０１１０】
本明細書に開示される方法、組成物およびキットにおける使用に適当なポリメラーゼドメインは、酵素自体または触媒ドメイン、例えば大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメント（「クレノウ」）、またはポリメラーゼ活性を有するクレノウの一部分でよい。触媒ドメインはさらなるアミノ酸を含むことができ、および／またはアミノ酸置換、欠失もしくは付加を含有するが、依然として酵素活性を保持するバリアントでよい。
【０１１１】
一実施形態においては、分離された場合には実質的な合成活性を有さないが、それらが相互作用して複合体を形成する場合には実質的な合成活性を有する２つの部分にポリメラーゼを分ける。第１ポリメラーゼを、その各々が別個の抗体に繋がれている２つの部分に開裂できる。一実施形態においては、第１ポリメラーゼはクレノウである。好ましい実施形態においては、第１ポリメラーゼの第１部分は配列番号１のアミノ酸残基１〜２２４を含み、そして第１ポリメラーゼの第２部分は配列番号１のアミノ酸残基２２５〜６０５を含む。
【０１１２】
「クレノウ」という用語は、好ましくは少なくとも約２５個、３５個、５０個またはそれを超えるアミノ酸の１つの領域にわたって、配列番号１のクレノウ配列に対して約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％より大きい、好ましくは９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％、またはそれより大きいアミノ酸配列同一性を有し、そして合成活性を表示するアミノ酸配列を有する、ポリペプチド多型バリアント、対立遺伝子、変異体、および種間相同体を指す。一実施形態においては、クレノウは配列番号１と少なくとも９５％アミノ酸同一性を共有するポリペプチドを指す。配列番号１は、Ｅｘｏ⁻クレノウ（ここで１位置のアミノ酸はメチオニンであり、そして３２および３４位置のアミノ酸はアラニン残基である）およびＥｘｏ^＋クレノウ（ここで１位置のアミノ酸はバリンであり、そして３２および３４位置のアミノ酸は各々アスパラギン酸およびグルタミン酸である）の双方を包含する。Ｅｘｏ⁻クレノウおよびＥｘｏ^＋クレノウに関する野生型配列は、例えば各々受け入れ番号１Ｄ８Ｙ＿Ａおよび１ＫＦＤ＿Ａで本出願の出願日として公に利用可能である。
【０１１３】
クレノウ以外の第１ポリメラーゼの第１および第２部分を構築するための適当な切断部位を、クレノウに対するその配列相同性に基づいて同定することができる。比較ウインドウにわたって最大一致するようにクレノウ配列と、または下記の配列比較アルゴリズムもしくは手動アラインメントおよび肉眼検査のうちの１つを使用して測定されるような指定された領域と、被験配列とを比較し、そしてアラインすることができる。ＢＬＡＳＴのデフォルトパラメーターによりアミノ酸同一性パーセントを決定することができる。例えばその他のファミリーＡポリメラーゼを配列番号１のアミノ酸残基１〜２２４に対応する第１部分に、および配列番号１のアミノ酸残基２２５〜６０５に対応する第２部分に切断することができる。なお別の実施形態においては、被験ポリメラーゼを配列番号１のアミノ酸１９９〜３１０のいずれか１つに対応するアミノ酸で２つの部分に切断する。
【０１１４】
本明細書で使用される際には「に対応する」という用語は、第１ポリペプチドおよび参照ポリペプチド配列をアラインする場合、参照ポリペプチド配列（例えば、クレノウ、配列番号１）における所定の（複数の）アミノ酸とアラインする被験ポリペプチド配列（ファミリーＡポリメラーゼ）における、１つまたはそれより多いアミノ酸を指す。当業者はこの目的のために設計されたソフトウェア、例えばＢＬＡＳＴＰバージョン２．２．２をそのバージョン用のデフォルトパラメーターで用いて、アラインメントを実施する。
【０１１５】
配列比較のために、典型的には１つの配列が、被験配列と比較される参照配列として働く。配列比較アルゴリズムを用いる場合、被験および参照配列をコンピューターに入力し、必要に応じて部分配列座標を指定し、そして配列アルゴリズムプログラムパラメーターを指定する。デフォルトのプログラムパラメーターを使用することができるか、または代替のパラメーターを指定することができる。次いで配列比較アルゴリズムがプログラムパラメーターに基づいて、参照配列に相対した被験配列に関する配列同一性パーセントを計算する。
【０１１６】
比較ウインドウは２０から６００、通常的には約５０から約２００、さらに通常的には約１００から約１５０からなる群から選択される隣接位置の数のいずれか１つのセグメントに対する参照を含み、ここで２つの配列を最適にアラインした後に、配列を同数の隣接位置の参照配列と比較できる。比較のための配列アラインメントの方法は、当分野において周知である。比較のための配列の最適なアラインメントを、例えばＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所相同性アルゴリズムにより、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ，Ｊ．、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性アラインメントアルゴリズムにより、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４（１９８８）の類似法に関する検索により、これらのアルゴリズム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（５７５サイエンス通り、マディソン、ウィスコンシン州）におけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ）のコンピューターによる実行により、または手動アラインメントおよび肉眼検査（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９９５年補冊）参照）により行うことができる。
【０１１７】
配列同一性パーセントおよび配列類似性を決定するのに適当であるアルゴリズムの実例はＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムであり、それらは各々Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２（１９７７）およびＡｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０）に記載される。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは米国立生物工学情報センターのウェブサイトを経て公に入手可能である。このアルゴリズムは、データベース配列における同じ長さのワードでアラインした場合、いくつかの正の値の閾値スコアＴに合致するかまたは満足するかのいずれかである、クエリー配列における長さＷのショートワードを同定することにより、最初に高いスコアの配列対（ＨＳＰ）を同定することを伴う。Ｔは近隣ワードスコア閾値と称される（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、前出）。これらの初期近隣ワードヒットは、それらを含有するより長いＨＳＰを見出すための検索を開始するためのシードとして働く。ワードヒットは、累積アラインメントスコアが増大し得る限り、各々の配列に沿って双方向に伸長する。ヌクレオチド配列に関してパラメーターＭ（マッチする残基の対に関するリワードスコア（ｒｅｗａｒｄ ｓｃｏｒｅ）；常に＞０）およびＮ（ミスマッチする残基に関するペナルティースコア；常に＜０）を用いて累積スコアを計算する。アミノ酸配列に関して、スコアマトリクスを用いて累積スコアを計算する。各方向でのワードヒットの伸長は：累積アラインメントスコアがその最大達成値から量Ｘだけ下落する；１つまたはそれより多い負のスコアの残基アラインメントの蓄積のために、累積スコアがゼロに達するかまたはそれを下回る；またはいずれかの配列の末端に到達する；場合に停止する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、ＴおよびＸはアラインメントの感受性および速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列用）はデフォルトとしてワード長（Ｗ）１１、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および双方の鎖の比較を使用する。アミノ酸配列用にＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとしてワード長３、期待値（Ｅ）１０、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアマトリクス（ＨｅｎｉｋｏｆｆおよびＨｅｎｉｋｏｆｆ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５（１９８９））アラインメント（Ｂ）５０、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および双方の鎖の比較を使用する。
【０１１８】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムはまた２つの配列間の類似性の統計分析をも実施する（例えば、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３５７８７（１９９３）参照）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより提供される類似性の１つの測定値は最小合計確率（ｓｍａｌｌｅｓｔ ｓｕｍ ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ）（Ｐ（Ｎ））であり、これは２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間のマッチが偶然に生じる確率の指標である。例えば被験核酸の参照核酸に対する比較における最小合計確率が約０．２未満、さらに好ましくは約０．０１未満、そして最も好ましくは約０．００１未満である場合、核酸は参照配列に類似すると考えられる。
【０１１９】
ファミリーＡおよびファミリーＢ ＤＮＡポリメラーゼに関するポリメラーゼアラインメントはＢｒａｉｔｈｗａｉｔｅおよびＩｔｏ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２１（４）；７８７−８０２（１９９３）（参照により本明細書に組み込まれる）の図１に見出される。
【０１２０】
３’−５’エキソヌクレアーゼ（３’ヌクレアーゼ）活性を有するポリメラーゼが本明細書に開示される方法のいくつかの実施形態を実行するのに好ましい。３’ヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼには、例えば大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ、サーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（Ｔｔｈ）ＤＮＡポリメラーゼ、バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｖｅｎｔ、Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ、Ｔ７、クレノウ（ｅｘｏ^＋）およびＴ４が含まれる。その全てが当分野において公知であり、そして市販により入手可能である（例えば、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）。
【０１２１】
修飾ポリヌクレオチド鋳型を複製することが可能なポリメラーゼが、本明細書に開示される方法のいくつかの実施形態を実行するのに好ましい。修飾ポリヌクレオチド鋳型を複製することが可能なポリメラーゼにはクレノウ（ｅｘｏ⁻）および（ｅｘｏ^＋）ならびにＴ４が含まれる。修飾ポリヌクレオチド鋳型を複製するのに適当であり得るその他のポリメラーゼには、ＴａｑおよびＴ７を含む、ＢｒａｉｔｈｗａｉｔｅおよびＩｔｏ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２１（４）；７８７−８０２（１９９３）（参照により本明細書に組み込まれる）に開示されるもののようなファミリーＡ ＤＮＡポリメラーゼが含まれる。このようなポリメラーゼは当分野において周知であり、そして本明細書に記載される方法における使用に関してその適合性を決定するために、本明細書に記載されるアッセイにおいて試験され得る。例えば修飾ポリヌクレオチド鋳型の非修飾コピーを合成するに適当な条件下で、被験ポリメラーゼを修飾ポリヌクレオチド鋳型と共にインキュベートすることにより、特定の被験ポリメラーゼが修飾ポリヌクレオチド鋳型を複製することが可能であるか、または不可能であるかを決定できる。このような条件は当分野において公知であり、そして市販により入手可能であるポリメラーゼを容易に利用できる。例えば適当な反応条件には以下が含まれる（全て混合後の最終濃度である）：
１５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．４
５０ｍＭ ＫＣｌ
２．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２
３％ ＤＭＳＯ
０．０１％ Ｔｗｅｅｎ−２０
８００ｎＭ ｄＮＴＰ（ＡＣＧＴ）
０．４４４倍ＳＹＢＲ（登録商標）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、ユージン、オレゴン州）グリーン（１００００倍として提供）
３０ｎＭ Ｒｏｘ参照色素（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅカタログ番号６００５３０）
種々の濃度の酵素、例えば５０単位／ｍｌ
１００ｎＭ 順方向プライマー
１００ｎＭ 逆方向プライマー
４０ｐＭ 修飾Ｏｌｉｇｏ１およびその相補的配列。
５’−ＴＴＴＴＴＴＴＧＣＴＣＧＡＣＧＧＴＧＡＡＵＧＡＵＧＴＡＧＧＵＡＣＣＡＧＣＡＧＵＡＡＣＵＣＧＡＧＣＡＣＧＵＣＵＵ２’ＯＭｅ（ＣＧ）Ａ２’ＯＭｅ（ＣＣ）ＡＡＡＴＣＵＧＧＡＵＡＴＴＧＣＡＧＣＣＴＣＧＴ−３’（配列番号：４）
８３塩基長ホスホジエステルＤＮＡ／２’ＯＭｅ、ここで２’ＯＭｅは２’−Ｏ−メトキシ修飾ヌクレオチドを示す；Ｕは２’デオキシウリジンを示す。
【０１２２】
次いでＭＸ３００５ＰにおいてＳＹＢＲ（登録商標）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、ユージン、オレゴン州）グリーンのためのプログラムを用いて、試験されているポリメラーゼに適当な反応条件下でＱＰＣＲを実施することができる。増幅生成物の検出は、ポリメラーゼが修飾ポリヌクレオチド鋳型を複製することが可能であることを示すが、増幅なしはポリメラーゼが修飾ポリヌクレオチド鋳型を複製することが不可能であることを示す。
【０１２３】
修飾ポリヌクレオチド鋳型を複製することが不可能であるポリメラーゼが、本明細書に開示される方法のいくつかの実施形態を実行するのに好ましい。修飾ポリヌクレオチド鋳型を複製することが不可能なポリメラーゼにはＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼが含まれる。その他のファミリーＢ ＤＮＡポリメラーゼもまた、修飾ポリヌクレオチド鋳型を複製することが不可能であるポリメラーゼが必要とされる実施形態を実行するのに有用であることが企図される。このようなポリメラーゼには、ヒトα、δおよびεＤＮＡポリメラーゼ、ＲＢ６９およびＰｈｉ２９バクテリオファージＤＮＡポリメラーゼならびに、ＢｒａｉｔｈｗａｉｔｅおよびＩｔｏ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２１（４）；７８７−８０２（１９９３）（参照により本明細書に組み込まれる）に開示されるその他のファミリーＢ ＤＮＡポリメラーゼが含まれる。
【０１２４】
ポリメラーゼまたはその部分をストレプトアビジンまたはプロテインＧもしくはＡに繋ぐことができる。例えばクレノウまたはＴ４をストレプトアビジンまたはプロテインＧに融合させることができる。ポリメラーゼ融合タンパク質を作成する方法は当分野において公知であり、そして本明細書に記載される。
【０１２５】
前記で言及されたカテゴリーの１つに入るさらなるポリメラーゼは当分野において公知である。加えて、当分野において公知であり本明細書に記載されるアッセイにより、前記の活性のいずれかに関してポリメラーゼを試験することができる。特定のポリメラーゼによる最適な活性を可能にするようにバッファーおよび伸長温度を選択する。ポリメラーゼに有用なバッファーおよび伸長温度は当分野において公知であり、そして製造供給元の仕様書から決定することもできる。
【０１２６】
オリゴヌクレオチド／ポリヌクレオチド
用語「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸（分子）」は、互換的に使用されて任意の長さのヌクレオチドの多量体形態を指す。ポリヌクレオチドはデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチドおよび／またはその類似体を含有できる。ヌクレオチドは三次元構造を有することができ、そして公知の、または未知の任意の機能を実施し得る。「ポリヌクレオチド」という用語には一本鎖、二本鎖および三重らせん分子が含まれる。ポリヌクレオチドを遺伝子から単離するか、または当分野において公知の方法により化学的に合成できる。
【０１２７】
核酸を検出または測定するために、鋳型核酸配列を増幅するために、および本明細書に開示される方法にしたがって切断構造を形成するために有用な、オリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブもまた提供される。
【０１２８】
用語「プライマー」は１を超えるプライマーを指すことができ、そして精製された制限消化におけるような自然発生でも、または合成的に生成されても、核酸鎖に対して相補的であるプライマー伸長生成物の合成が触媒される条件下に置かれた場合、相補鎖に沿って合成の開始点として作用することが可能であるオリゴヌクレオチドを指す。このような条件には、適当なバッファー（「バッファー」にはコファクターである、またはｐＨ、イオン強度等に影響を及ぼす置換成分が含まれる）中および適当な温度で、４つの異なるデオキシリボヌクレオシド三リン酸およびＤＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素のような重合化誘導剤の存在が含まれる。プライマーは好ましくは増幅において有効性が最大になるために一本鎖である。いくつかの実施形態においては、プライマーは３’ヌクレアーゼにより切断される３’フラップを有し得る。
【０１２９】
オリゴヌクレオチドプライマーは、鋳型核酸配列にハイブリダイズ可能であり、かつ第２核酸鎖の酵素的合成を予備刺激する一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ分子でよい。プライマーは標的分子の一部分に相補的である。化学的または酵素的のいずれかの合成方法によりオリゴヌクレオチドプライマーを調製することができることが企図される。あるいは、このような分子またはそのフラグメントは自然発生であり、かつその天然の供給源から単離されるかまたは商業的供給者から購入される。オリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブは５から１００ヌクレオチド長、理想的には１７から４０ヌクレオチドであるが、様々な長さのプライマーおよびプローブが有用である。増幅のためのプライマーは好ましくは約１７−２５ヌクレオチドである。融解温度（Ｔ_ｍ）推定の方法により特定の融解温度を有するようにプライマーを設計することができる。いくつかの実施形態においては、検出／ＰＣＲ反応と干渉しないように、検出／ＰＣＲ反応において使用されるプライマーの有効Ｔ_ｍのＴ_ｍよりも低いＴ_ｍ（例えば、４０℃）を有するように、ポリヌクレオチド鋳型に相補的なプライマーを設計することができる。ＯＬＩＧＯ（商標）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｉｎｓｉｇｈｔｓ，Ｉｎｃ．、カスケード、カナダ）を含む市販のプログラム、Ｐｒｉｍｅｒ３およびＯｌｉｇｏ Ｃａｌｃｕｌａｔｏｒを含むインターネットで利用可能なプライマーデザインおよびプログラムを用いて、核酸配列のＴ_ｍを計算することができる。好ましいＴ_ｍのプライマーは実行されている特定の実施形態に依存するであろう。例えば一実施形態においては、プライマーは４１℃以上の温度で標的から解離するであろう。一方その他の実施形態においては、好ましいのは約４５から６５℃の間、そしてさらに好ましくは約５０から６０℃の間のＴ_ｍを有することである。オリゴヌクレオチドにはポリヌクレオチド鋳型（修飾または非修飾）およびプライマーが含まれる。ポリヌクレオチド鋳型を少なくとも１０塩基長、典型的には少なくとも２０塩基長、例えば少なくとも３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００塩基長からの長さの範囲の長さで調製することができる。オリゴヌクレオチドは大きな核酸フラグメントでよいが、一般的にはそれは５００塩基以下の核酸に限定される。
【０１３０】
オリゴヌクレオチドは溶液中で遊離するかまたは結合分子に抱合されてよい。結合部に抱合されているオリゴヌクレオチドは一般的に、核酸のそのストレッチにおける任意の位置で、抱合されることを可能にする化学的に活性な基（例えば、第一級アミン基）を有するであろう。
【０１３１】
本明細書で使用される際には、「修飾」または「修飾された」とは、具体的なクラスのポリメラーゼ（例えば、Ｐｆｕ（ｅｘｏ⁻））により増幅できないが、その他のポリメラーゼ（例えば、クレノウ）により増幅できる核酸を付与するポリヌクレオチド鋳型における、任意の変化（例えば、従来型でないヌクレオチドの付加）を指す。このような修飾には核酸のリン酸をチオリン酸と置換すること、および２’ヒドロキシルを２’−Ｏ−メチルと置換することが含まれる。その他の適当な修飾には１つまたはそれより多い以下のものが含まれる：２’−デオキシ−２’−フルオロ−β−Ｄ−アラビノ核酸（ａｒａｂｉｎｏｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）（２’Ｆ−ＡＮＡ）ヌクレオチド、ロックド核酸（ＬＮＡ）およびＥＮＡ：２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレン架橋核酸、逆（ｒｅｖｅｒｓｅｄ）デオキシリボヌクレオチド、ｄＵ、ヒポキサンチン、８−オキソグアニン、８−オキソアデニン、エテノアデニン、脱プリン部位、コレステロール付加物ならびに、例えばＴｒｉＬｉｎｋ ＢｉｏＴｅｃｈ（サンディエゴ、カリフォルニア州）、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ａｎｄ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．（ウォルサム、マサチューセッツ州）およびＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（セントルイス、ミズーリ州）から入手可能なもののような、その他の非従来型ヌクレオチド。
【０１３２】
「非従来型ヌクレオチド」または「非天然ヌクレオチド」とは、ａ）ＤＮＡポリメラーゼにより認識および組み込みされる４つの従来型デオキシヌクレオチド、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰのうちの１つではないヌクレオチド構造；ｂ）（ａ）における４つの従来型デオキシヌクレオチドのうちの１つではない合成ヌクレオチド；ｃ）修飾された従来型ヌクレオチド；またはｄ）リボヌクレオチド（それらは通常ＤＮＡポリメラーゼにより認識または組み込みされないため）およびリボヌクレオチドの修飾形態；を指す。これらの修飾ヌクレオチドを、修飾ポリヌクレオチド鋳型を利用する実施形態におけるその有用性に関して、本明細書に記載される方法を介して試験することができる。
【０１３３】
したがって修飾ポリヌクレオチドは結果的に、非修飾ポリヌクレオチド鋳型および同じポリメラーゼ（例えば、Ｐｆｕ）で生成されるような増幅生成物の量の１０％、５％、１％、０．５％、０．１％および最も好ましくは０％を超えるべきではない。当業者はポリメラーゼが、当分野において公知のアッセイにおいて修飾ポリヌクレオチド鋳型をコピーすることが可能であるかどうかを決定することができる。例えば特定のポリメラーゼが修飾ポリヌクレオチド鋳型を増幅することが可能であるかどうかを決定するために、プライマー伸長反応においてポリメラーゼを本明細書に記載される修飾ポリヌクレオチド鋳型と共にインキュベートし、そして得られた生成物を検出することができる。増幅生成物の存在は、ポリメラーゼが修飾ポリヌクレオチド鋳型をコピーすることが可能であることを示すが、増幅生成物の不在は、ポリメラーゼが修飾ポリヌクレオチド鋳型をコピーすることが不可能であることを示す。
【０１３４】
前記で記したように、ポリヌクレオチド鋳型は複製されて、増幅のための鋳型、通常は修飾ポリヌクレオチド鋳型の非修飾コピーを生成する。複製は適当な（複数の）相補的プライマーを必要とするので；およびまたポリヌクレオチド鋳型は様々な検出の手段および反応条件における柔軟性を提供することができるので、ポリヌクレオチド鋳型の設計は重要である。例えばいくつかの実施形態においては、ポリヌクレオチド鋳型を修飾する。
【０１３５】
ポリヌクレオチド鋳型は２つの相補的核酸鎖のハイブリッド二重鎖を含む二本鎖（ｄｓ）でよいか、または代替として一本鎖（ｓｓ）でよい。いずれかまたは双方の鎖は修飾塩基を担持することができる。
【０１３６】
一実施形態においては、一本鎖ポリヌクレオチド鋳型および単一のプライマーを使用して対数的複製を達成することができる。ｓｓ標的の１つの末端でプライマー結合配列、および標的鎖の反対の末端でプライマー結合部位の相補配列を含有するようにポリヌクレオチド鋳型配列を設計することにより、これを達成する。プライマーのアニーリングおよび伸長は、結果的に同一のプライマー結合部位を含有する相補的標的鎖の形成に至るであろう。この方式で、得られたｄｓ標的の（＋）および（−）鎖の双方は標的二重鎖の反対の末端で同一のプライマー部位を含有し、かつポリメラーゼおよび標的核酸の組み合わせで使用される同じプライマーは、＋および−標的鎖の双方の複製を促進する。
【０１３７】
その他の好ましい実施形態においては、ポリヌクレオチド鋳型配列の塩基の組成および配列を異なるアッセイ要件に適応させるために変更することができる。例えばポリヌクレオチド鋳型は本明細書に記載されるような１つまたはそれより多い修飾ヌクレオチドを含有して、特定のクラスのポリメラーゼ（例えば、Ｐｆｕポリメラーゼ）による複製を防止することができる。
【０１３８】
例えば５’末端で検出分子および３’末端でプライマー結合部位を、間に挿入された可変領域と共に付着するための繋ぎ連結を含有するように、ポリヌクレオチド鋳型配列を設計できることが企図される。あるいは繋ぎ連結はポリヌクレオチドの３’末端でよい。可変領域はポリヌクレオチド鋳型増幅法の要件によってのみ限定される任意の長さまたは組成にできる。例えばオリゴヌクレオチドを５’末端で化学的に繋ぎ連結を経て抗体に抱合させることができる。ポリヌクレオチド鋳型は複製プライマーの１つに相補的な５’結合領域およびその他の複製されたプライマーを結合するための３’部位を含有できる。ポリヌクレオチド鋳型は核酸塩基可変領域を有することができ、かつ長さまたは配列において可変でよく、検出増幅反応の間に特異的プライマーおよび／またはプローブで検出される様々な配列を含み、それにより大きさまたはその他の因子に基づいて複製された標的の検出の代替手段を提供する。
【０１３９】
別の実施形態では、一連の様々なポリヌクレオチド鋳型をマルチプレックスアッセイにおいて使用するために様々な分析物に利用する。例えばプライマー結合部位および／または内部ポリヌクレオチド鋳型領域のいずれかが異なる一連のポリヌクレオチド鋳型を調製し、そして様々な分析物に結合することが可能である様々な結合分子に繋ぐことができる。これらの受容体抱合体（例えば、増幅生成物）の各々の複製生成物を次いで検出反応において、大きさまたは配列に基づいて容易に区別できる。例えば様々なレポーター分子を伴う増幅鋳型特異的プライマーおよび／またはプローブを使用して、マルチプレックス反応において存在し得る種々の様々な増幅生成物を区別することができる。したがって複数の分析物をリアルタイムＰＣＲ反応において検出することができる。
【０１４０】
ポリメラーゼおよびポリヌクレオチドを結合分子または結合部に繋ぐ
本明細書に開示される方法を実行する場合、２つの異なる型の連結が企図される。第１の連結型は、例えば抗体−ポリメラーゼ融合タンパク質のような、またはストレプトアビジン−ビオチン相互作用を経る結合を介することを含む抗体またはその他の結合分子もしくは結合部に、共有結合的にまたは非共有結合的に繋がれたポリメラーゼまたはその一部分を含む。好ましい実施形態においては、結合分子または結合部は、ストレプトアビジンまたはアビジンに融合した第１ポリメラーゼまたはその一部分を含む融合タンパク質に間接的に繋がれた抗体である。当業者に周知の方法を用いてこれらを調製できる（Ｄ．Ｇ．Ｗｉｌｌｉａｍｓ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ７９：２６１（１９８４））。あるいは組換えＤＮＡおよび遺伝子操作技術を用いて酵素結合抱合体を作成することができる（Ｉ．ＰａｓｔａｎおよびＤ．Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４：１１７３（１９９１））。抗体接合体における使用に適当な酵素には限定するものではないが、ポリメラーゼ（例えば、３’ヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼおよび修飾ポリヌクレオチド鋳型を複製することが可能なポリメラーゼ）が含まれる。ポリメラーゼ接合体の選択は、実行される実施形態に依存する。
【０１４１】
タンパク質を抗体のような結合化合物に共有結合的に連結するための詳しい手引きを文献、例えばＨｅｒｍａｎｓｏｎ、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク、１９９６年）等に見出すことができる。１つの態様においては、１つまたはそれより多いタンパク質を結合分子または結合部上の共通する反応基に直接的または間接的に付着させる。共通する反応基はアミン、チオール、カルボン酸、ヒドロキシル、アルデヒド、ケトン等を含み、そして市販により入手可能である架橋剤、例えばＨｅｒｍａｎｓｏｎ（前記で引用）；Ｈａｕｇｌａｎｄ、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、第９版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、ユージン、オレゴン州、２００２年）によりタンパク質に繋がれ得る。一実施形態においては、分子タグのＮＨＳ−エステルは結合分子上の遊離アミンと反応する。
【０１４２】
第２の連結型は、分析物を認識する抗体またはその他の結合分子に繋がれたポリヌクレオチド鋳型配列からなる。タンパク質をアミノ−オリゴヌクレオチドに連結するための当業者に公知の方法の変法を用いてこれらを調製することができる。例えばアミノ修飾された窪みを核酸の３’末端に付加する酵素テーリング法を用いてこれを達成できる（Ａ．Ｋｕｍａｒ，Ａｎａｌ．Ｂｒｉｏｃｈｅ．１６９：３７６（１９８８））。あるいはアミノ修飾塩基を核酸塩基配列に合成的に導入することができる（Ｐ．Ｌｉら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５：５２７５（１９８７））。次いでＵｒｅａの方法における酵素を抗体に置換することにより、抗体をアミノ修飾核酸に付着させることができる（Ｍ．Ｓ，Ｕｒｅａ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：４９３７（１９８８））。
【０１４３】
いくつかの実施形態においては、核酸／抗体抱合体はヘテロ二機能性クロスリンカーをＤＮＡオリゴヌクレオチド標的に繋ぐことを伴い、次にそれをＴｓｅｎｇら、米国特許第５３２４６５０号により記載される化学を用いて抗体に繋ぐ。
【０１４４】
オリゴヌクレオチドの抗体への化学的付着を促進するために、シアノエチルホスホラミダイト化学を用いて合成の間にその５’末端に第一級アミン基を導入することによりオリゴヌクレオチドをアミノ修飾できる。アミノ修飾オリゴヌクレオチドをスルフヒドリル基を導入するヘテロ二機能性試薬でさらに修飾できる。試薬、Ｎ−スクシンイミジルＳ−アセチルチオアセタート（ＳＡＴＡ）は、第一級アミン反応基Ｎ−ヒドロキシルスクシンイミド（ＮＨＳ）を用いてアミノ修飾オリゴヌクレオチドに繋ぎ、アセチル保護スルフヒドリル基を導入するヘテロ二機能性クロスリンカーである。抗体は別のＮＨＳクロスリンク剤、スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシラート（ＳＭＣＣ）で修飾される。ＳＭＣＣは抗体のペプチド内の第一級アミン基（例えば、リジン上の．イプシロン．−基）と反応し、マレイミド基（遊離スルフヒドリル反応基）を抗体に導入する。マレイミド修飾抗体をＳＡＴＡ修飾抗体と混合する。ＳＡＴＡ修飾オリゴヌクレオチド上のアセチル保護スルフヒドリル基はヒドロキシルアミンの添加で活性化されて反応性の遊離スルフヒドリル基を生成する（米国特許出願第０７／９４６２４７号）。遊離スルフヒドリル含有オリゴヌクレオチドはマレイミド修飾抗体と即座に反応してＤＮＡ−抗体抱合体を形成する。
【０１４５】
オリゴヌクレオチドをオリゴヌクレオチドの５’ヌクレオチド、３’ヌクレオチドまたは内部ヌクレオチドで結合分子に付着させることができる。あるいはオリゴヌクレオチドを、ストレプトアビジン、プロテインＡまたはプロテインＧを介して結合分子に間接的に付着させる。例えばビオチン−ストレプトアビジンを介してオリゴヌクレオチドを抗体に抱合させることができる。
【０１４６】
ＡＳＰは反応部に繋がれた結合部を含む。１つの実施形態においては、結合部は抗体であり、かつ反応部はポリメラーゼの第１または第２部分である。なおさらなる実施形態においては、抗体およびポリメラーゼの第１または第２部分は融合ポリペプチドである。好ましい実施形態においては、結合部は、ストレプトアビジンまたはアビジンに融合した第１ポリメラーゼの第１または第２部分を含む融合タンパク質に間接的に繋がれた抗体である。
【０１４７】
ポリメラーゼ／抗体融合タンパク質は、目的の抗体またはその活性フラグメントの第１ポリペプチド配列、およびポリメラーゼまたはその第１もしくは第２部分の第２ポリペプチド配列を含むポリペプチド鎖を含む。当分野において公知の方法を用いて本明細書に記載される抗体融合ポリペプチドを作成することができる。例えば融合タンパク質を米国特許第６１９４１７７号に記載されるように構築できる。
【０１４８】
一般的に、目的の抗体をコードする核酸分子をＰＣＲによりクローン化し、そしてポリメラーゼまたはその第１もしくは第２部分をコードする核酸分子と共にインフレームでライゲートする。融合／ハイブリッドタンパク質をコードする核酸分子を、続いて発現のために宿主細胞にトランスフェクトする。最終構築物の配列をシークエンシングにより確認することができる。
【０１４９】
組換え遺伝学の分野における日常的な技術を用いて、抗体−ポリメラーゼハイブリッドに組み込まれるべきポリメラーゼまたはポリメラーゼ部分をコードする核酸を得ることができる。使用の一般法を開示する基礎的な教科書にはＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第３版、２００１年）；Ｋｒｉｅｇｌｅｒ、Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９９０年）；およびＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９９４−１９９９年）が含まれる。
【０１５０】
種々の方法のいずれかを用いてポリメラーゼをコードする核酸配列を得ることができる。いくつかの実施形態においては、ポリペプチドをコードする核酸配列を、ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡライブラリーからプローブでのハイブリダイゼーションによりクローン化するか、またはオリゴヌクレオチドプライマーでの増幅技術を用いて単離する。さらに一般的には、増幅技術を用いて、ＤＮＡまたはＲＮＡ鋳型（例えば、ＤｉｅｆｆｅｎｆａｃｈおよびＤｖｅｋｓｌｅｒ、ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９９５）参照）を用いてポリメラーゼ配列を増幅および単離する。あるいは重複オリゴヌクレオチドを合成的に生成し、そして結合させて１つまたはそれより多いドメインを生成することができる。プローブとして抗体を用いて、ポリメラーゼをコードする核酸を発現ライブラリーから単離することもできる。
【０１５１】
抗体およびポリメラーゼまたはポリメラーゼ部分を直接的に、または共有結合リンカー、例えばポリグリシンリンカーのようなアミノ酸リンカー、もしくは別の型の化学的リンカー、例えば炭水化物リンカー、脂質リンカー、脂肪酸リンカー、ポリエーテルリンカー、例えばＰＥＧ等を介してのいずれかで連結することができる（例えば、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９９６）参照）。融合タンパク質を形成するポリペプチドをＣ末端からＮ末端に連結できるが、それらをＣ末端からＣ末端に連結することもできる。融合タンパク質におけるアミノ酸の様々な鎖を一緒に直接的にスプライシングできるか、または化学的連結基もしくはアミノ酸連結基を介して一緒に間接的にスプライシングでき、それは約２００以上のアミノ酸長でよく、典型的には１から１００アミノ酸である。いくつかの実施形態においては、プロリン残基をリンカーに組み込んでリンカーによる有意な二次構造エレメントの形成を防止する。リンカーはしばしば組換え融合タンパク質の一部として合成される可動性アミノ酸部分配列でよい。このような可動性リンカーは当業者に公知である。
【０１５２】
いくつかの実施形態では、抗体またはその結合フラグメントのアミノ酸配列をペプチドリンカーを介してポリメラーゼの一部分に連結する。ペプチドリンカーの実例は当分野において周知であり、かつ一般的には、例えばＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒＧｌｙ（配列番号２６）のようないくつかのＧｌｙおよびいくつかのＳｅｒ残基を含む。一実施形態においては、融合タンパク質において使用するためのペプチドリンカーは可動性ヒンジとして作用する。
【０１５３】
一実施形態においては、ポリメラーゼまたはポリメラーゼの第１もしくは第２部分を抗体の非抗原結合部分に連結する。別の実施形態においては、ポリメラーゼまたはポリメラーゼの第１もしくは第２部分を結合部のＣ末端に連結する。
【０１５４】
別の実施形態は配列番号１のアミノ酸配列に９５％以上同一であるクレノウに繋がれた抗体のような結合分子または結合部を対象とし、ここでクレノウはポリメラーゼ活性を保持する。
【０１５５】
別の実施形態は、第１ポリメラーゼの第１部分が第１ポリメラーゼの第２部分と相互作用する場合に、それが機能的なポリメラーゼ複合体を形成する限り、配列番号２のアミノ酸配列に少なくとも９５％、９８％または９９％同一である第１ポリメラーゼの第１部分を対象とする。
【０１５６】
別の実施形態は、第１ポリメラーゼの第２部分が第１ポリメラーゼの第１部分と相互作用する場合に、それが機能的なポリメラーゼ複合体を形成する限り、配列番号３のアミノ酸配列に少なくとも９５％、９８％または９９％同一である第１ポリメラーゼの第２部分を対象とする。
【０１５７】
ＡＳＰの発現
特定の実施形態においては、本明細書に記載されるいずれかの方法または当分野において公知である方法により得られる、当分野において周知の技術により適切な発現ベクターに挿入することができるＤＮＡ分子を使用して、ＡＳＰを発現することができる。例えばホモ多量体のテーリング、合成ＤＮＡリンカーの使用を伴う制限酵素連結、またはブラント末端ライゲーションにより、二本鎖ｃＤＮＡを適当なベクターにクローン化することができる。通常ＤＮＡリガーゼを使用してＤＮＡ分子を連結後、アルカリ性ホスファターゼでの処理により、望ましくない結合を回避することができる。
【０１５８】
したがって本発明は、本明細書に記載されるような核酸分子（例えば、遺伝子または遺伝子を含む組換え核酸分子）を含むベクター（例えば、組換えプラスミドおよびバクテリオファージ）を含む。「組換えベクター」という用語には、組換えベクターが誘導された元来のまたは天然の核酸分子に含まれるものよりも大きな、小さなまたは異なる核酸配列を含有するように改変、修飾または操作されているベクター（例えば、プラスミド、ファージ、ファスミド、ウイルス、コスミド、フォスミドまたはその他の精製された核酸ベクター）が含まれる。
【０１５９】
真核生物宿主のために、宿主の性質に依存して様々な転写および翻訳調節配列を用いることができる。これらはアデノウイルス、ウシパピローマウイルス、サルウイルス等のようなウイルス供給源から誘導でき、ここで調節シグナルは高レベルで発現する特定の遺伝子に関連する。実施例には、ヘルペスウイルスのＴＫプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、酵母ｇａｌ４遺伝子プロモーター等が含まれるが、これらに限定されない。遺伝子の発現を調整できるように抑制または活性化を可能にする転写開始調節シグナルを選択できる。
【０１６０】
いくつかの実施形態においては、ハイブリッドタンパク質の１つまたはそれより多いポリペプチド鎖をコードするヌクレオチド配列を含む１つまたはそれより多いＤＮＡ分子を、望ましいＤＮＡ分子を宿主細胞に組み入れることが可能である１つまたはそれより多い調節配列に作動可能なように連結する。例えば発現ベクターを含有する宿主細胞の選択を可能にする１つまたはそれより多いマーカーを導入することにより、導入されたＤＮＡにより安定して形質転換されている細胞を選択することができる。選択可能マーカー遺伝子を発現されるべき核酸配列に直接連結するか、または同時トランスフェクションにより同じ細胞に導入することができるかのいずれかである。本明細書に記載されるタンパク質の最適な合成のためにさらなるエレメントもまた必要とされ得る。必要に応じて使用するさらなるエレメントは当業者には明白であろう。
【０１６１】
特定のプラスミドまたはウイルスベクターを選択するのに重要な因子には、限定するものではないが；ベクターを含有するレシピエント細胞が、ベクターを含有しないこれらのレシピエント細胞から認識および選択される容易さ；特定の宿主において望まれるベクターのコピー数；および異なる種の宿主細胞間でベクターを「シャトル」できることが望ましいかどうか；が含まれる。
【０１６２】
一度（複数の）ベクターが発現のためのＤＮＡ配列を含むように構築されると、例えば形質転換、トランスフェクション、抱合、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈降、直接マイクロインジェクション等を含むがこれらに限定されない、当分野において公知である種々の適当な方法の１つまたはそれより多くにより、それを適切な宿主細胞に導入できる。
【０１６３】
宿主細胞は原核生物性または真核生物性のいずれかでよい。真核生物宿主細胞の実施例には、例えばヒト、サル、マウスおよびチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞のような哺乳動物細胞が含まれる。このような細胞は、例えば正確なフォールディングまたはグリコシル化を含むタンパク質の翻訳後修飾を促進する。加えて、酵母細胞を用いてハイブリッドタンパク質を発現することもできる。たいていの哺乳動物細胞と同様に、酵母細胞もまた例えばグリコシル化を含むタンパク質の翻訳後修飾を可能にする。酵母におけるタンパク質の生成に利用することができる強力なプロモーター配列および高コピー数のプラスミドを利用する、多くの組換えＤＮＡ計画が存在する。酵母の転写および翻訳の機構はクローン化された哺乳動物遺伝子生成物上のリーダー配列を認識することができ、それによりリーダー配列を担持するペプチドの分泌を可能にする（すなわちプレペプチド）。ハイブリッドタンパク質の高収率生成の特に好ましい方法は、米国特許第４８８９８０３号に記載されるような連続的な漸増レベルのメトトレキサートの使用による、ＤＨＦＲ−欠損ＣＨＯ細胞におけるジヒドロ葉酸リダクターゼ（ＤＨＦＲ）増幅の使用による。得られたポリペプチドはグリコシル化形態でよい。
【０１６４】
１つまたはそれより多いベクターの導入の後、宿主細胞を通常ベクター含有細胞の成長に関して選択する選択培地中で成長させる。当分野において公知の、または本明細書に記載される方法のいずれか、例えば抽出、沈降、クロマトグラフィーおよび電気泳動を伴う任意の従来の手順により、組換えタンパク質の精製を実施することができる。タンパク質を精製するために使用できるさらなる精製手順は、標的タンパク質に結合するモノクローナル抗体を使用するアフィニティークロマトグラフィーである。一般的には、組換えタンパク質を含有する粗製調製物を、適当なモノクローナル抗体が固定されているカラムに通過させる。タンパク質は通常、特異的抗体を介してカラムに結合するが、不純物は通過する。カラムを洗浄した後、例えばｐＨまたはイオン強度を変化させることによりタンパク質をゲルから溶出する。
【０１６５】
固体表面に付着した結合分子または結合部
一実施形態においては、固体支持体の存在下で方法を実行する。本明細書で使用される際には「固体支持体」または「固体表面」とは、捕捉分子（例えば、抗体）として使用される結合分子または結合部のための支持体を提供する任意の構造を指す。適当な固体支持体にはポリスチレン、ポリスチレン誘導体、ニトロセルロース、ＰＶＤＦもしくはナイロンのような膜、ラテックスビーズ、ガラスビーズ、シリカビーズ、常磁性もしくはラテックスマイクロスフェア、またはマイクロタイターウェルが含まれる。さらなる実施例として、固体支持体は抗体のような捕捉分子のプレートへの共有結合的付着を可能にする、Ｔｏｐ Ｙｉｅｌｄプレートのような修飾されたマイクロタイタープレートでよい。固体支持体がビーズ、常磁性マイクロスフェアまたはラテックスマイクロスフェアのような材料である場合、固体支持体はマルチウェル組織培養皿のような開口した入れ物、またはスクリュートップチューブのような密閉された入れ物に入れることができ、双方共に研究室で一般的に使用される。
【０１６６】
一実施形態においては、捕捉抗体は固体支持体に結合している。別の実施形態においては、分析物は固体支持体に直接的に結合する。
【０１６７】
表面をポリＬ−リジンでコーティングすることによるような、支持体の表面への捕捉分子の結合を促進するために固体支持体を修飾するか、またはアミノアルデヒドサイレージもしくはエポキシシランでシリコン化することができる。方法を実施する環境が、どの固体支持体が最も好ましいか、および入れ物を使用するかどうかを左右するであろうということは当業者には理解されよう。
【０１６８】
被験試料中の量を擬似することが予期される分析物の様々な量での交差力価測定により、固体支持体に付着すべき捕捉分子の量を実験的に決定できる。一般的には被験試料中の分析物の量は、アトグラムからミリグラムの範囲であると予期される。被験試料中の未知の濃度の分析物を明記された容量で添加することは試験の感受性に影響を及ぼすであろう。大容量の被験試料（例えば、２００−４００μｌ）を使用する場合、より大容量の試料を可能にするために試験形式の修飾が必要な可能性がある。しかしながら一般的には捕捉分子の濃度はｍｌあたり約１から約１０μｇであろう。
【０１６９】
分析物のプラスチックまたはその他の固体支持体系（例えば、膜またはマイクロスフェア）への付着に関して記載されている日常的な方法により、捕捉分子を固体支持体に付着させることができる。このような方法の実施例を、米国特許第４０４５３８４号および米国特許第４０４６７２３号（双方共に参照により本明細書に組み込まれる）に見出すことができる。
【０１７０】
膜、マイクロスフェアまたはマイクロタイターウェルのような表面への捕捉分子の付着を、ＰＢＳまたは規定のｐＨのその他のバッファー中での直接添加により実施し、続いて対流式オーブン中で乾燥させることができる。
【０１７１】
吸着、共有結合的連結、アビジン−ビオチン連結、ストレプトアビジン−ビオチン連結、ヘテロ二機能性クロスリンカー、プロテインＡ連結またはプロテインＧ連結を介するような付着手段により、捕捉分子を固体支持体に付着させることができる。各々の付着手段は、固体支持体の表面からの捕捉分子の喪失が最小であるストリンジェント洗浄条件の使用を許容すべきである。実施例としては、吸着は親水性吸着でよい。さらなる実施例としては、ヘテロ二機能性クロスリンカーはマレイン酸無水物、３−アミノプロピルトリメトキシシラン（ＡＰＳ）、Ｎ−５アジド、２−ニトロベンゾイルオキシスクシンイミド（ＡＮＢ−ＮＯＳ）またはメルカプトシランでよい。
【０１７２】
アミノ酸残基、好ましくはリジンもしくはアルギニン残基、チオール基または炭水化物残基のような捕捉分子の一部分を経て、捕捉分子を固体支持体に付着させることができる。捕捉分子が抗体である場合、チオール基は抗体ヒンジ領域のチオール基でよい。
【０１７３】
固体支持体をアビジンまたはストレプトアビジンで誘導体化でき、かつ捕捉分子の固体支持体への付着に役立つように、捕捉分子を修飾して少なくとも１つのビオチン部を含有できる。あるいは固体支持体をビオチンで誘導体化でき、そして捕捉分子を修飾して少なくとも１つのアビジンまたは少なくとも１つのストレプトアビジン部を含有できる。
【０１７４】
被験試料および分析物結合
本明細書に開示される方法を実行するときに、調査中の選択された分析物を含有することが疑われる被験試料を、捕捉分子を含有する支持体に適用することができる。あるいは溶液基盤のアッセイでは、被験試料を反応混合物または固体支持体を含まない容器に直接添加する。支持体の同一性に依存して、支持体をいくつかの型の培養装置内に含有できる。支持体が膜である場合、例えば膜の長さおよび幅よりもわずかに大きい浅いガラス皿を使用できる。支持体がマイクロスフェアである場合、マイクロスフェアをポリプロピレンまたはポリスチレンスクリュートップチューブのようなチューブ中に含有できる。反応容器または入れ物の同一性は重大ではないが、方法で使用される試薬が接着しない材料から構成されるべきである。
【０１７５】
使用される被験試料の量は重大ではないが、容易に取り扱うことができ、かつ本明細書に開示される方法の限界内で検出可能である分析物の濃度を有する量であるべきである。被験試料はまた支持体を適確に覆うために十分であるべきであり、かつこの点で必要に応じて希釈され得る。例えば被験試料の量は０．２μｌから２ｍｌの間でよい。好ましくは、被験試料の量は０．２μｌから１ｍｌの間でよい。最も好ましくは被験試料の量は０．２μｌから２００μｌの間でよい。
【０１７６】
被験試料中の分析物の濃度は重大ではないが、本明細書に開示される方法の検出限界内であるべきである。濃度は被験試料の容量に依存して異なり得るため、分析物を検出できる濃度範囲を提供することは困難であることは当業者には理解されるであろう。好ましくは方法において使用される被験試料は約１×１０^−６と約１×１０^−１８ｇの間の分析物、さらに好ましくは約１×１０^−６ｇと約１×１０^−１５ｇの間の分析物、最も好ましくは約１×１０^−６ｇと約１×１０^−１８ｇの間の分析物を含有する。
【０１７７】
したがって本明細書にて教示される方法およびキットを使用して、例えば約１０ｐｇ／ｍｌ以下、約１ｎｇ／ｍｌ以下、約０．７ｎｇ／ｍｌ以下、約０．５ｎｇ／ｍｌ以下、約０．１ｎｇ／ｍｌ以下、約０．０１ｎｇ／ｍｌ以下、約１ｐｇ／ｍｌ以下、約０．１ｐｇ／ｍｌ以下、約０．０１ｐｇ／ｍｌ以下、約１ｆｇ／ｍｌ以下の濃度で試料中に存在する分析物を検出することができる。
【０１７８】
いくつかの実施形態においては、固体支持体および捕捉抗体を使用する。この実施形態においては、捕捉分子が固体支持体に結合するのを可能にするのに十分な時間、捕捉分子を固体支持体と共にインキュベートする。あるいは分析物が固体支持体に結合するのを可能にするのに十分な時間、分析物を固体支持体と共にインキュベートする。好ましくはインキュベーションを約１０分から約６０分の間続行するが、適切な場合、一晩を含む、より長時間続行できる。
【０１７９】
方法の各々のインキュベーション工程を実施する温度もまた重大ではない。好ましくはインキュベーションを行う温度は約１８℃から約３７℃の間である。さらに好ましくはインキュベーション温度は約１８℃から約３０℃の間である。最も好ましくはインキュベーション温度は周囲温度（２０℃）である。分析物および捕捉抗体の添加後、一般的には洗浄、続いて検出分子結合反応を実施する。
【０１８０】
検出抗体結合および伸長反応
特定の実施形態においては、第１核酸ポリメラーゼおよび抗体のような検出分子を適当なバッファーに添加する。第１核酸ポリメラーゼを検出抗体（例えば、融合タンパク質またはビオチン−ストレプトアビジン相互作用）に繋ぐ。一実施形態においては、反応のこの工程は修飾ポリヌクレオチド鋳型および修飾ポリヌクレオチド鋳型を増幅することが可能である第１ポリメラーゼを利用する。別の実施形態においては、反応のこの工程は、３’ヌクレアーゼ活性を有する第１ポリメラーゼ、およびポリヌクレオチド鋳型に相補的であり、かつ３’フラップおよび伸長時に新しいプライマー結合部位を導入する５’領域を有するプライマーを利用する。検出抗体を反応混合物に添加する前に第１核酸ポリメラーゼに繋ぐことができるか、または分析物とのインキュベーションの間に繋ぐことができる（例えば、ビオチン標識された検出抗体および添加されたストレプトアビジン−クレノウ）。別の実施形態においては、第１分析物特異的プローブおよび第２分析物特異的プローブを適当なバッファー中で添加する。第１分析物特異的プローブは第１ポリメラーゼの第１部分に繋がれた抗体のような検出分子を有するが、第２分析物特異的プローブは第１ポリメラーゼの第２部分に繋がれた抗体のような検出分子を有する。核酸ポリメラーゼの第１および第２部分を反応混合物に添加する前に検出抗体に繋ぐことができるか、またはそれらを分析物とのインキュベーションの間に繋ぐことができる（例えば、ビオチン標識された抗体ならびに添加されたストレプトアビジン−クレノウの第１および第２部分）。
【０１８１】
反応混合物は、検出抗体が分析物に結合するのを可能にするのに十分な時間インキュベートされる。好ましくは、インキュベーションを約５分と約６０分との間続行するが、適切な場合、一晩を含む、より長時間続行できる。
【０１８２】
方法の各々のインキュベーション工程が実施される温度もまた重大ではない。好ましくはインキュベーションを行う温度は約１８℃から約３７℃の間である。さらに好ましくはインキュベーション温度は約１８℃から約３０℃の間である。最も好ましくはインキュベーション温度は周囲温度（２０℃）である。インキュベーションの後、ウェルを洗浄バッファーで洗浄する。
【０１８３】
一実施形態においては、分析物−検出抗体インキュベーション反応および伸長反応を同じ反応条件下で同時に実施する。好ましい実施形態においては、分析物−検出抗体インキュベーション反応および伸長反応を逐次的に実施する。
【０１８４】
次いで伸長反応混合物をウェルに添加する。伸長反応混合物には本明細書に記載されるような修飾ポリヌクレオチド鋳型、および修飾ポリヌクレオチド鋳型の一部分に相補的である１つまたはそれより多い逆方向プライマーが含まれる。一般的には反応混合物を室温で３０分から一晩インキュベートする。一実施形態においては、ポリヌクレオチド鋳型を１つまたはそれより多い非従来型ヌクレオチドを有するように修飾する。インキュベーション工程の間、プライマーは修飾ポリヌクレオチド鋳型にアニーリングし、そして第１核酸ポリメラーゼまたは、第１ポリメラーゼの第１および第２部分の相互作用により形成されるポリメラーゼ複合体により伸長されて、修飾ポリヌクレオチド鋳型の非修飾コピーを形成する。次いで非修飾コピーを検出反応において利用する。
【０１８５】
検出分子結合／プライマー伸長条件が、ポリヌクレオチド分子の性質および同一性、ならびに（１つまたは複数の）プライマーの性質および同一性に依存して異なり得ることは、当業者には理解されよう。本明細書にて論じられるような基準を有する多くのその他のＤＮＡポリメラーゼ（例えば、３’ヌクレアーゼ活性を有する）が利用可能であり、本明細書に開示される方法において使用できることは当業者には理解されよう。条件の実例を実施例にて記載する。
【０１８６】
検出アッセイ
結合／伸長反応の後、検出反応を実施する。この反応を、伸長反応を行った同一の反応容器中で、または別個の反応容器中で行うことができる。好ましくは検出反応は、伸長反応の間に生成された増幅のための鋳型（および／またはその相補体）（例えば、修飾ポリヌクレオチド鋳型の非修飾コピー）に特異的である、（１つまたは複数の）オリゴヌクレオチドプライマーを使用して実施されるポリメラーゼ連鎖（ＰＣＲ）である。ＰＣＲをマイクロウェルプレート中の、またはいくつかのその他の適切な入れ物中の（例えば、マイクロビーズを支持体として使用する場合）アッセイ系で直接実施できる。
【０１８７】
ＰＣＲ増幅バッファー、増幅のための鋳型（および／またはその相補体）に特異的である（１つまたは複数の）オリゴヌクレオチドプライマー、および第２ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、３’ヌクレアーゼ活性を欠如するポリメラーゼまたはＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ）をインキュベートする。ＰＣＲで使用される増幅バッファーおよびＤＮＡポリメラーゼは、増幅分子のポリヌクレオチド分子部分の性質および同一性、ならびに（１つまたは複数の）プライマーの性質および同一性に依存して異なり得ることは、当業者には理解されよう。一実施形態においては、反応物に添加される第２ポリメラーゼ（例えば、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ）は修飾ポリヌクレオチド鋳型を増幅することができない。ＰＣＲ増幅バッファー／プライマー／ＤＮＡポリメラーゼ組成物の実施例は、反応混合物２５μｌ中１５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．４）、５０ｍＭ ＫＣｌ、２．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、３％ ＤＭＳＯ、０．０１％ Ｔｗｅｅｎ−２０、８００μＭ ｄＮＴＰ（ＡＣＧＴ）、Ｐｆｕ（ｅｘｏ⁻）５０単位／ｍｌ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅカタログ番号６００１６３−８１）および１００ｎＭプライマーである。本明細書にて論じられるような基準を有する多くのその他のＤＮＡポリメラーゼ（例えば、３’ヌクレアーゼ活性を実質的に欠如する）が利用可能であり、本明細書に開示される方法において使用できることは当業者には理解されよう。
【０１８８】
一実施形態においては、反応混合物に添加される第２ポリメラーゼは３’ヌクレアーゼ活性を実質的に欠如する。別の実施形態においては、反応物に添加される第２ポリメラーゼは修飾ポリヌクレオチド鋳型を増幅することができない。この後者の実施形態においては、第２ポリメラーゼは３’ヌクレアーゼ活性を呈しても、呈しなくてもよい。
【０１８９】
第２ポリメラーゼが本明細書にて論じられる基準内に入る限り（例えば、修飾ポリヌクレオチド鋳型を増幅することができないか、または３’ヌクレアーゼ活性を実質的に欠如する）、ＰＣＲを実施するためのいずれかの市販により入手可能な系においてＰＣＲ増幅を実施できる。ＰＣＲの時間および温度は増幅分子のポリヌクレオチド分子部分の性質および同一性、ならびに（１つまたは複数の）プライマーの性質および同一性に依存するであろう。条件の実例には９５℃（１５秒）および６３℃（４５秒）で４０サイクルが含まれる。
【０１９０】
ＰＣＲ増幅に加えて、本明細書で開示される方法を鎖置換増幅（ＳＤＡ）、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、転写媒介増幅（ＴＭＡ）またはリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）を用いて実行できる。リアルタイム増幅を用いて均一な閉管環境においてシグナルの増幅を作成できる。リアルタイム増幅に適当な計器装備には、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．、フォスターシティー、カリフォルニア州）、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．、アラメダ、カリフォルニア州）システム、ＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲ（登録商標）（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ＧｍｂＨ、マンハイム、ドイツ）、ＲＡＰＩＤＣＹＣＬＥＲ（登録商標）（Ｉｄａｈｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ソルトレークシティー、ユタ州）、Ｂｉｏ−ＲａｄのサーマルサイクラーおよびＳＭＡＲＴＣＹＣＬＥＲ（登録商標）（Ｃｅｐｈｅｉｄ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、サニーベール、カリフォルニア州）が含まれる。
【０１９１】
ＰＣＲ反応の間に、当分野において公知の種々の方法により非修飾コピーまたは増幅のための鋳型を検出できる。（ａ）ゲル上で放出された切断生成物の直接検出；（ｂ）核酸切断反応（ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．、アラメダ、カリフォルニア州）反応）の間に作成されたシグナルの間接的または直接的な検出；（ｃ）標的にプローブ結合したときの蛍光変化（分子ビーコン）；またはＳＹＢＲ（登録商標）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、ユージン、オレゴン州）グリーン検出アッセイ（例えば、実施例参照）を含むいくつかの手段により、増幅された生成物の検出を検出できるが、これらに限定されない。エンドヌクレアーゼ活性を利用する切断反応には、ＩＮＶＡＤＥＲ（登録商標）検出アッセイ（Ｔｈｉｒｄ Ｗａｖｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；マディソン、ウィスコンシン州）（米国特許第６３４８３１４号に記載され、その全が参照により本明細書に組み込まれる）が含まれる。本方法により包含される切断反応アッセイには、分子ビーコン検出アッセイ（種々の商業用供給源により供給される）およびＴＡＱＭＡＮ（登録商標）（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．、アラメダ、カリフォルニア州）検出アッセイ（Ｒｏｃｈｅを含む種々の商業用供給源により供給される）（米国特許第５７２３５９１号；第５９２５５１７号および第５８０４３７５号に記載され、その各々はその全てが参照により本明細書に組み込まれる）もまた含まれる。特定の実施形態において有用な切断反応はまた米国特許第６５４８２５０号に記載され、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に開示される方法においてこのような切断反応はヌクレアーゼにより実行される。
【０１９２】
とりわけ固体支持体および捕捉抗体を使用するこれらの方法を含む本明細書に開示される方法における試薬の添加の間に、アッセイ系を洗浄に供して非特異的結合の発生を低減させるのが好ましい。インタクトなポリメラーゼ（非開裂）または開裂ポリメラーゼ系では、結合分子、第１ポリメラーゼおよび分析物またはＡＳＰ−分析物を含む複合体ならびに第１ポリメラーゼ複合体の解離を引き起こさないストリンジェント洗浄条件を用いることができる。例えば加熱、ｐＨ変化または（ならびに）ホルムアミド、界面活性剤および塩の添加を用いて、洗浄工程の効率を増大させることができる。あまりにストリンジェントな条件では、結合分子、第１ポリメラーゼおよび分析物もしくはＡＳＰ−分析物を含む複合体ならびに第１ポリメラーゼ複合体の解離、またはレポーターの破壊に至り得る。ストリンジェント洗浄条件に対する耐性は、使用される分析物、結合メンバー、反応部、ポリメラーゼおよび特異的レポーターの性質で異なるであろう。したがって、ストリンジェント条件は各アッセイに関して実験的に最適化されるべきである。しかしながら、非特異的結合を低減させるための洗浄において、結合分子、第１ポリメラーゼおよび分析物またはＡＳＰ−分析物を含む複合体ならびにポリメラーゼ複合体のいくつかを喪失する場合、温度リサイクル工程の数の増大、またはプライマー伸長工程の時間の増大により実現されるさらなる標的複製により、これを代償することができる。
【０１９３】
洗浄サイクルの数および浸漬時間は実験的に決定されるが、一般的にＴｗｅｅｎ２０、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００またはＮＰ−４０のような界面活性剤を伴って、水または低もしくは高モル濃度の塩溶液のいずれかを洗浄溶液として使用できる。方法において使用される試薬の各々のインキュベーションの後、５または１５秒間から１０分間持続する１−５または１−８回の洗浄を実施できる。デタージェント濃度は典型的には０から１％であり、塩濃度（例えば、ＮａＣｌ）は０から１０００ｍＭである。好ましくは、例えば固体支持体への捕捉分子の添加の後、被験試料の添加の後、および検出分子の添加の後に各インキュベーション工程との間に洗浄を行う。洗浄条件の例を実施例に記載する。
【０１９４】
特記しない場合、本明細書にて使用される全ての技術的および科学的用語は、当業者により一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものに類似するかまたは均等な方法および材料を本発明の実行または試験において使用することができるが、適当な方法および材料を以下に記載する。全ての出版物、特許出願、特許および本明細書にて言及されるその他の参考文献は、その全てが参照により本明細書に組み込まれる。矛盾する事例では、定義を含む本明細書が統制する。加えて材料、方法および実例は例証となるものであり、そして限定することを意図するものではない。
【実施例】
【０１９５】
実施例１：修飾ポリヌクレオチド鋳型を利用する分析物検出反応
これらの反応を用いて、固相（例えば、ＥＬＩＳＡプレート）に直接的または間接的に取り付けた分析物を測定することができる。
【０１９６】
試料中の分析物の量を測定するために、ヒトＥＧＦおよびヒトＶＥＧＦに関するＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＤＵＯ ＳＥＴ ＥＬＩＳＡディベロップメントキット（カタログ番号ＤＹ２３６およびＤＹ２９３Ｂ；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネアポリス、ミネソタ州）で以下のアッセイを実施した。
【０１９７】
捕捉抗体の一晩コーティング、遮断、分析物希釈および捕捉、洗浄ならびにビオチン化検出抗体の適用のために、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓのキットを製造者の説明書にしたがって使用した。しかしながら検出抗体の添加後、市販のキットからのストレプトアビジン（「ＳＡｖ」）−セイヨウワサビペルオキシダーゼをＳＡｖ−クレノウ（ｅｘｏ⁻）で置換した。ＳＡｖ−クレノウ（ｅｘｏ⁻）を遮断／希釈バッファー中１００ｎｇ／ｍｌまで希釈した。
【０１９８】
ＳＡｖ−クレノウ（ｅｘｏ⁻）をＥＬＩＳＡプレートに７５μｌ／ウェルで添加し、そして室温で３０分間インキュベートして、ＳＡｖがビオチン化抗体に結合するのを可能にした。溶液をウェルから吸引し、そしてウェルをＴＢＳＴ ４００μｌで４回洗浄し、続いて水で２回洗浄した。クレノウ伸長混合物をウェルに７５μｌ／ウェルで添加し、そして室温で３０分間、修飾ポリヌクレオチド鋳型の非修飾コピーが形成されるのを可能にした。クレノウ伸長混合物には以下が含まれる（全て混合後の最終濃度である）：
１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）
５ｍＭ ＭｇＣｌ_２
７．５ｍＭ ＤＴＴ
１００μｇ／ｍｌ ＢＳＡ
５００μＭ ｄＮＴＰ（ＡＣＧＴ）
１００ｎＭ Ａｌｉｅｎ１−逆方向プライマー
４０ｐＭ Ｏｌｉｇｏ１
【０１９９】
以下のオリゴヌクレオチドもまた使用した：
Ａｌｉｅｎ１（修飾ポリヌクレオチド鋳型）＝Ｏｌｉｇｏ１：
５’−ＴＴＴＴＴＴＴＧＣＴＣＧＡＣＧＧＴＧＡＡＵＧＡＵＧＴＡＧＧＵＡＣＣＡＧＣＡＧＵＡＡＣＵＣＧＡＧＣＡＣＧＵＣＵＵ２’ＯＭｅ（ＣＧ）Ａ２’ＯＭｅ（ＣＣ）ＡＡＡＴＣＵＧＧＡＵＡＴＴＧＣＡＧＣＣＴＣＧＴ−３’（配列番号：４）
８３塩基長ホスホジエステルＤＮＡ／２’ＯＭｅ（ここで２’ＯＭｅは２’−Ｏ−メトキシ修飾ヌクレオチドを示し；Ｕは２’デオキシウリジンを示す）
【０２００】
Ａｌｉｅｎ１−逆方向プライマー（Ｏｌｉｇｏ１の３’末端にアニーリングしてＱＰＣＲの適当な鎖を予備刺激する）：
ＡＣＧＡＧＧＣＴＧＣＡＡＴＡＴＣＣＡＧＡ（配列番号：５）
ＰＣＲプライマー：
Ａｌｉｅｎ１−逆方向：ＡＣＧＡＧＧＣＴＧＣＡＡＴＡＴＣＣＡＧＡ（配列番号：５）
Ａｌｉｅｎ１−順方向：ＴＧＣＴＣＧＡＣＧＧＴＧＡＡＴＧＡＴＧＴ（配列番号：６）
【０２０１】
修飾ポリヌクレオチド鋳型の非修飾コピーを含有する伸長反応のアリコートを、２倍ＱＰＣＲマスターミックス（試料での１回希釈で１倍ＭＭになる）および抗Ｐｆｕ（ホットスタート増幅を促進するために使用された抗体）を含有する９６ウェルＰＣＲプレートの対応するウェルに移した。ＱＰＣＲ増幅マスターミックスには以下が含まれる（全て試料との混合後の最終濃度である）：
１５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．４）
５０ｍＭ ＫＣｌ
２．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２
３％ ＤＭＳＯ
０．０１％ Ｔｗｅｅｎ−２０
８００μＭ ｄＮＴＰ（ＡＣＧＴ）
０．４４４倍ＳＹＢＲ（登録商標）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、ユージン、オレゴン州）グリーン（１０，０００倍として提供される）
３０ｎＭ Ｒｏｘ参照色素（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅカタログ番号６００５３０）
Ｐｆｕ（ｅｘｏ⁻）５０単位／ｍｌ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅカタログ番号６００１６３−８１）
１００ｎＭ Ａｌｉｅｎ１−順方向プライマー
１００ｎＭ Ａｌｉｅｎ１−逆方向プライマー
【０２０２】
試料を混合し、そして解離曲線および２工程循環パラメーター［９５℃１０分間］（１サイクル）、［９５℃１５秒間、６３℃４５秒間］（４０サイクル）で、ＳＹＢＲ（登録商標）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、ユージン、オレゴン州）グリーンに関するプログラムを用いてＭＸ３００５ＰリアルタイムＰＣＲ装置に流す。
【０２０３】
分析物濃度＝０ｐｇ／ｍｌのＣｔと分析物濃度＝Ｘｐｇ／ｍｌのＣｔとの間のＣｔにおける変化を計算することにより、相対ＱＰＣＲシグナルをコンピューター計算した。これを「０からのｄＣｔ」と称した。効率１００％のアッセイでは、１つのＣｔの変化は初期の使用可能なＱＰＣＲ鋳型の量の２倍に均等である。この対数的シグナルを直線的な量に変換するために、以下の式：「相対ＱＰＣＲシグナル」＝２＾（０からのｄＣｔ）−１を使用した。図３Ａおよび３Ｂは試料中で使用される分析物の濃度（ｐｇ／ｍｌ）に対してプロットされたＱＰＣＲシグナルを示す。
【０２０４】
実施例２：修飾ポリヌクレオチド鋳型を利用し、そして捕捉抗体なしの分析物検出反応
実施例１と同一であるが、本明細書に記載される修飾を伴って以下のアッセイを実施した。
【０２０５】
イエダニ抽出物を炭酸塩バッファー（ｐＨ９．６）中４０μｇ／ｍｌ、７５μｌ容量でＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ８ウェルストリップチューブ（カタログ番号ＤＹ９９０；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネアポリス、ミネソタ州）に４℃で１６時間コーティングした。ウェルをＴＢＳＴで２回洗浄し、そして遮断／希釈バッファーで、３７℃で２時間遮断した。
【０２０６】
次いでウェルを、イエダニアレルゲンに関してアレルギーであるかまたはアレルギーでないかのいずれかであることが分かっている患者からの血清７５μｌと共に、室温で１−２時間インキュベートした。正常なヤギ血清で血清の希釈を実施した。ウェルをＴＢＳＴで４回洗浄し、続いて遮断／希釈バッファー中１：１０，０００に希釈されたビオチン標識されたアフィニティー精製ヤギ抗ヒトＩｇＥ（Ｆｃ）（カタログ番号１１６ＢＮ；Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｑｕａｌｅｘ；サンクレメンテ、カリフォルニア州）（０．０１Ｍ ＰＢＳ（ｐＨ７．６）、１％ ＢＳＡ中０．５ ｍｇ／ｍｌでストック）７５μｌと共に室温で１時間インキュベートした。次いでウェルをＴＢＳＴで３回および水で１回洗浄した。
【０２０７】
ＳＡｖ−クレノウ（ｅｘｏ⁻）をＥＬＩＳＡプレートに７５μｌ／ウェルで添加し、そして室温で３０分間インキュベートして、ＳＡｖがビオチン化抗体に結合するのを可能にした。ウェルから溶液を吸引し、そしてウェルをＴＢＳＴ ４００μｌで４回、続いて水で２回洗浄した。クレノウ伸長混合物をウェルに７５μｌ／ウェルで添加し、そして室温で３０分間、修飾ポリヌクレオチド鋳型の非修飾コピーを形成させた。
【０２０８】
修飾ポリヌクレオチド鋳型の非修飾コピーを含有する伸長反応物のアリコートを、２倍ＱＰＣＲマスターミックス（試料での１回希釈で１倍ＭＭになる）を含有する９６ウェルＰＣＲプレートの対応するウェルに移した。ホットスタート増幅を促進するために抗Ｐｆｕ抗体もまた含まれた。
【０２０９】
試料を混合し、次いで解離曲線および２工程循環パラメーター［９５℃１０分間］（１サイクル）、［９５℃１５秒間、６３℃４５秒間］（４０サイクル）で、ＳＹＢＲ（登録商標）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、ユージン、オレゴン州）グリーンに関するプログラムを用いてＭＸ３００５ＰリアルタイムＰＣＲ装置に流した。
【０２１０】
得られた結果により、アッセイはアレルギー患者の血清を陰性対照から区別するのに非常に有効であることが示される（図４）。
【０２１１】
実施例３：３’フラップを伴うプライマーを利用する分析物検出反応
この実施例では、３’フラップおよび伸長時に新しいプライマー結合部位を導入する５’領域を伴うプライマー、３’ヌクレアーゼ活性を有する第１ポリメラーゼ、ならびに３’ヌクレアーゼ活性を実質的に欠如する第２ポリメラーゼを使用した。以下に列挙されるプロトコールは溶液相アッセイ（分析物または捕捉抗体の固体支持体への結合がない）であるが、当業者はそれを固相アッセイにおける使用に容易に適合させることができる。この実施例において利用されるオリゴヌクレオチドを図５において例証する。
【０２１２】
以下の反応構成要素を調製した（全て混合後の最終濃度である）：
１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）
５ｍＭ ＭｇＣｌ_２
７．５ｍＭ ＤＴＴ
１００μｇ／ｍｌ ＢＳＡ
５００μＭ ｄＮＴＰ（ＡＣＧＴ）
４０ｐＭ Ａｌｉｅｎ２−伸長プライマー
４０ｐＭ Ｏｌｉｇｏ１（修飾ポリヌクレオチド鋳型）
種々の量のＳＡｖ−クレノウ（４ｍｇ／ｍｌストック（ｅｘｏ^＋）から希釈した）
【０２１３】
０から１×１０^９個の間の分子のＳＡｖ−クレノウ（ｅｘｏ^＋）を含有する反応物をＰＣＲチューブ中２５μｌ容量で室温で３０分間インキュベートして、ポリメラーゼがＯｌｉｇｏ１鋳型の非修飾コピーを創成することを可能にした。Ａｌｉｅｎ２−伸長プライマーはＡｌｉｅｎ２−逆方向ＰＣＲプライマーに関するプライマー結合部位をＯｌｉｇｏ１鋳型の非修飾コピーに組み込んだ。
【０２１４】
伸長反応が完了後、１２．１μｌを：
１５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．４）
５０ｍＭ ＫＣｌ
２．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２
３％ ＤＭＳＯ
０．０１％ Ｔｗｅｅｎ−２０
８００μＭ ｄＮＴＰ（ＡＣＧＴ）
０．４４４倍ＳＹＢＲ（登録商標）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、ユージン、オレゴン州）グリーン（１０，０００倍として提供される）
３０ｎＭ Ｒｏｘ参照色素（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅカタログ番号６００５３０）
Ｐｆｕ（ｅｘｏ⁻）５０単位／ｍｌ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅカタログ番号６００１６３−８１）
ホットスタート抗体
１００ｎＭ Ａｌｉｅｎ１−順方向プライマー
１００ｎＭ Ａｌｉｅｎ２−逆方向プライマー
（全て試料との混合後の最終濃度である）を含有するＱＰＣＲ増幅マスターミックス１２．９μｌを含有する新しいチューブに移した。
【０２１５】
試料を混合し、そして解離曲線および２工程循環パラメーター［９５℃１０分間］（１サイクル）、［９５℃１５秒間、６３℃４５秒間］（５０サイクル）で、ＳＹＢＲ（登録商標）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、ユージン、オレゴン州）グリーンに関するプログラムを用いてＭＸ３００５ＰリアルタイムＰＣＲ装置に流した。
【０２１６】
得られた結果により、アッセイを分析物の検出に使用できることが示される。
【０２１７】
実施例４：ビオチン化抗体の存在下でのクレノウ活性の再構成
本発明を実行するときに使用するための最適な構築物を同定するために、図７に示されるＮ末端／Ｃ末端クレノウ開裂実施形態の各々に関して、以下のアッセイを実施した。Ｎ２／Ｃ２開裂に関する結果および条件を以下に記載する。
【０２１８】
簡単には、クレノウＮ２およびＣ２ストレプトアビジン融合タンパク質（図７参照）を、３０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．２）、５０ｍＭ ＮａＣｌ、４ｍＭ ＤＴＴ、５０％グリセロールで、各々０．１９ｍｇ／ｍｌおよび０．２７ｍｇ／ｍｌの濃度に希釈した。
【０２１９】
次いで以下の反応混合物を調製した：
クレノウＮ２およびＣ２融合ポリペプチドの各々２μｌ
１６ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、８ｍＭ ＭｇＣｌ_２、４ｍＭ ＤＴＴを含有する反応混合物６μｌ
０．５ｍＭ ｄＮＴＰ
０．２ｍＭ 逆方向プライマー：
５’−ＡＣＧＡＧＧＣＴＧＣＡＡＴＡＴＣＣＡＧＡ−３’（配列番号：５）
０．１ｍＭ Ｏｌｉｇｏ１鋳型（修飾ポリヌクレオチド鋳型）：
５’−ＴＴＴＴＴＴＴＧＣＴＣＧＡＣＧＧＴＧＡＡＵＧＡＵＧＴＡＧＧＵＡＣＣＡＧＣＡＧＵＡＡＣＵＣＧＡＧＣＡＣＧＵＣＵＵ２’ＯＭｅ（ＣＧ）Ａ２’ＯＭｅ（ＣＣ）ＡＡＡＴＣＵＧＧＡＵＡＴＴＧＣＡＧＣＣＴＣＧＴ−３’（配列番号：４）
８３塩基長ホスホジエステルＤＮＡ／２’ＯＭｅ（Ｕは２’デオキシウリジンを示す）
２５μｇ／ｍｌビオチン標識ヤギ抗ウサギＩＧＧ、２５μｇ／ｍｌの濃度で（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｑｕｉａｌｅｘ、サンクレメンテ、カリフォルニア州）。
【０２２０】
反応混合物を室温で一晩インキュベートして、開裂ポリメラーゼ融合ポリペプチドがビオチン化抗体に結合して、機能的クレノウ複合体を形成し、そしてｏｌｉｇｏ１鋳型の非修飾コピーを合成することを可能にした。
【０２２１】
翌日に反応混合物を水で１：２５０に希釈した。各希釈された反応混合物１２．１μｌをＱＰＣＲマスターミックス１２．９μｌと組み合わせた。ＱＰＣＲ増幅マスターミックスには以下が含まれた（全て試料との混合後の最終濃度である）：
１５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．４）
５０ｍＭ ＫＣｌ
２．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２
３％ ＤＭＳＯ
０．０１％ Ｔｗｅｅｎ−２０
８００μＭ ｄＮＴＰ（ＡＣＧＴ）
０．４４４倍ＳＹＢＲ（登録商標）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、ユージン、オレゴン州）グリーン（１０，０００倍として提供される）
３０ｎＭ Ｒｏｘ参照色素（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅカタログ番号６００５３０）
Ｐｆｕ（ｅｘｏ⁻）５０単位／ｍｌ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅカタログ番号６００１６３−８１）
１００ｎＭ Ａｌｉｅｎ１−順方向プライマー：
５’−ＴＧＣＴＣＧＡＣＧＧＴＧＡＡＴＧＡＴＧＴ−３（配列番号：６）
１００ｎＭ Ａｌｉｅｎ１−逆方向プライマー：
５’−ＡＣＧＡＧＧＣＴＧＣＡＡＴＡＴＣＣＡＧＡ−３’（配列番号：５）
【０２２２】
試料を混合し、そして解離曲線および２工程循環パラメーター［９５℃１０分間］（１サイクル）、［９５℃１５秒間、６３℃４５秒間］（４０サイクル）で、ＳＹＢＲ（登録商標）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、ユージン、オレゴン州）グリーンに関するプログラムを用いてＭＸ３００５ＰリアルタイムＰＣＲ装置に流した。
【０２２３】
ＱＰＣＲデータを図８に表す。ビオチン化抗体を伴う開裂クレノウの半分（Ｎ２Ｃ２＋ＡＢ）の双方の組み合わせは、結果的に抗体を伴わない半分（Ｎ２Ｃ２）の双方の組み合わせよりも実質的に良好なシグナルに至る。これは開裂クレノウの２つの部分の間での近位相互作用が、抗体に対するその結合およびポリメラーゼ部分の相互作用により促進されることを示している。
【０２２４】
実施例５：作動範囲の最適化（分析物の力価測定）
開裂クレノウ融合ポリペプチドと共に使用するための最適抗体濃度を決定するために、反応混合物を調製し、そして開裂クレノウ部分、逆方向プライマーおよび鋳型の濃度が１００倍低く、そして反応物に０．０１％ ＢＳＡ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、ビバリー、マサチューセッツ州）を補充した以外は、実施例４のように処理した。
【０２２５】
用量応答性を研究するために、抗体濃度を実施例４のクレノウ分子１あたりビオチン分子１（１：１比率）から変更した。ビオチン化抗体濃度を調整してビオチン−対−クレノウ比率１：１００、１：１０、１：３．３３、１：１、３．３３：１、１０：１および１００：１を用いた。
【０２２６】
ＱＰＣＲデータを図９に示す。ｘ軸は分析物（ビオチン）−対−クレノウの比率を示し、そしてｙ軸は「相対ＱＰＣＲシグナル」を示す。予期されるように、ビオチン−対−クレノウの比率およそ１：１０で最大に到達するまで、さらなる分析物（ビオチン化抗体）が添加されるので、２成分結合からのシグナルが上昇する。等モル比率を超えた分析物のさらなる添加により、半分の双方により同時に結合する分析物の数が低減され、そしてシグナルが低下する。
【０２２７】
実施例６：ロングネック融合タンパク質の構築
この実施例は、ストレプトアビジン（「ＳＡｖ」）およびクレノウ部（成熟酵素またはそのＮ末端もしくはＣ末端部分）を含む融合タンパク質の構築について記載し、ここでストレプトアビジン部およびクレノウ部はスペーサー領域により分離される。これらの構築物もまた本明細書ではロングネック融合タンパク質と称する。
【０２２８】
鋳型としてストレプトマイセス・アビジニ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｖｉｄｉｎｉｉ）ＤＮＡならびに１対のプライマーＳＦ１およびＳＲ：
ＳＦ１ ＧＡＴＣＣＧＡＣＣＣＣＴＣＣＡＡＧＧＡＣＴ（配列番号：７）
ＳＲ１ ＧＣＧＣＡＧＡＴＣＴＣＧＡＧＣＴＧＣＴＧＡＡＣＧＧＣＧＴＣＧＡ（配列番号：８）
を使用して、成熟ストレプトアビジンをコードするＤＮＡフラグメントをＰＣＲにより得る。
【０２２９】
得られたＰＣＲフラグメントは、ＳＦ１プライマー配列の少し下流に独特なＢｓａＩ部位、ならびにＳＲ１プライマーにコードされる独特なＸｈｏＩおよびＢｇｌＩＩ部位を有する。ＰＣＲフラグメントは、成熟ストレプトアビジンをコードするヌクレオチド配列の始めに位置するＢｓａＩ制限エンドヌクレアーゼ部位で切断される。以下の配列を有する二本鎖リンカーをＢｓａＩ部位にライゲートする：
５’−ＣＡＴＧＧＧＣＡＧＣＡＧＣＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＣ−３’（配列番号：９）
３’−ＣＣＧＴＣＧＴＣＧＧＴＡＧＴＡＧＴＡＧＴＡＧＴＡＧＴＧＣＧＧＣ−５’（配列番号：１０）
【０２３０】
リンカーはポリヒスチジンタグをコードし、そして一方の末端にＮｃｏＩ粘着末端および他方の末端に５’−ＣＧＧＣ粘着末端を含有する。後者はＢｓａＩでＰＣＲフラグメントを切断した後に作成された粘着末端５’−ＧＣＣＧに適合する。リンカーはＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、ビバリー、マサチューセッツ州）を使用して５’突出末端でリン酸化され、そしてＴ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、ビバリー、マサチューセッツ州）を使用して、そのＢｓａＩにより作成された粘着末端でＰＣＲフラグメントに接続される。ＰＣＲフラグメントの大部分が付着したリンカーを有することを確実にするために、ＰＣＲフラグメントよりも約１０−１００倍過剰のリンカーが推奨される。ライゲーション生成物をＮｃｏＩおよびＢｇｌＩＩ制限エンドヌクレアーゼで切断し、リンカー−ＰＣＲフラグメントを１．５％アガロースゲル中でリンカーから分離後、リンカー−ＰＣＲフラグメントライゲーション生成物を、例えばＱＩＡＥＸ ＩＩキット（ＱＩＡＧＥＮ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ジャーマンタウン、メリーランド州）を製造者の説明書にしたがって使用してアガロースゲルから精製する。
【０２３１】
精製されたＤＮＡフラグメントを、ＮｃｏＩおよびＢａｍＩ制限エンドヌクレアーゼで切断されたｐＥＴ−１５ｂベクターにライゲートする。ライゲーション生成物をＸＬ１０ Ｇｏｌｄコンピテント細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ラ・ホーヤ、カリフォルニア州）に形質転換し、そして１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含有する寒天プレート上に播種した。プレートを３７℃で一晩インキュベートした後、アンピシリン抵抗性コロニーが出現する。水１ｍｌ中でコロニーからの材料を３分間煮沸することによりプラスミドＤＮＡを抽出後、放出されたプラスミドをＳＦ１およびＳＲ１プライマーを使用してＰＣＲにおけるインサートの存在に関して分析する。１００μｇ／ｍｌアンピシリンを補充したＬ−ブロスのような液体培地中でインサート陽性コロニーを一晩成長させた後、ＳＴＲＡＴＡＰＲＥＰ（登録商標）プラスミドミニプレップキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ラ・ホーヤ、カリフォルニア州）を使用してプラスミドＤＮＡを精製する。インサートの上流のＴ７プロモーターＤＮＡ配列に相補的であるＴ７プロモータープライマー５’−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧ−３’（配列番号：１１）を使用して、得られたプラスミドのＤＮＡ配列をＳａｎｇｅｒ法により検証する。
【０２３２】
得られたｐＥＴ−ＳＡＶプラスミドはＴ７プロモーターの制御下でＨｉｓタグ化ストレプトアビジンをコードする。ＳＲ１プライマーにおいてコードされる独特なＸｈｏＩ部位をストレプトアビジンオープンリーディグフレームの末端に導入して、スペーサーおよびポリメラーゼをコードするＤＮＡ配列のｐＥＴ−ＳＡＶプラスミドへのクローニングを促進する。
【０２３３】
グリシン、セリン、アラニンおよびスレオニンのような小型アミノ酸に富む合成可動性スペーサー領域をプラスミドに導入する。小型アミノ酸グリシンおよびセリンをコードする以下の二本鎖オリゴヌクレオチド「ＧＳ」を合成する：
５’−ＴＣＧＡＣＧＧＡＴＣＧＧＧＣＧＧＴＧＧＣＴＣＣＧＧＴＧＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＣＣ−３’（配列番号：１２）
３’−ＧＣＣＴＡＧＣＣＣＧＣＣＡＣＣＧＡＧＧＣＣＡＣＣＧＣＣＧＴＣＧＣＣＧＧＡＧＣＴ−５’（配列番号：１３）
【０２３４】
ｐＥＴ−ＳＡＶプラスミドを、ストレプトアビジンオープンリーディグフレームをコードするヌクレオチド配列の末端で、ＸｈｏＩエンドヌクレアーゼで切断後、ＸｈｏＩ粘着末端（５’−ＴＣＧＡ）によりフランキングされるＧＳオリゴヌクレオチドをその部位にライゲートする。Ｔ７プロモータープライマーを使用して得られたクローンをシークエンシングし、そして正確な配向で（ＳＡｖオープンリーディグフレームとのイン・ヒュージョン（ｉｎ−ｆｕｓｉｏｎ））ＧＳオリゴヌクレオチドを有するクローンをさらなる作業のために選択する。選択されたクローンをｐＥＴ−ＳＡＶ−ＧＳと称した。ＧＳの始めでのＸｈｏＩ粘着末端はプラスミドにライゲートされた場合に、完全なＸｈｏＩ部位に至らないので、このクローンはＧＳ配列の末端で独特なＸｈｏＩ部位を有する。独特なＸｈｏＩ部位を使用してＳＡｖ−ＧＳ融合遺伝子の下流にさらなる部分を付加することができる。この研究法、すなわち挿入された配列の末端で独特なＸｈｏＩ部位に至るポリヌクレオチド配列を挿入することにより、目的の部分をコードするその他のポリヌクレオチド配列の反復した付加が許容される。
【０２３５】
ＧＳスペーサーオリゴヌクレオチドの代わりに、またはそれに加えて、自然発生の可動性非構造化領域を使用することができる。このような領域を豊富に発現されるタンパク質から、例えばＬ７／Ｌ１２リボソームタンパク質から選択することができる（Ｂｏｃｈａｒｏｖら、「タンパク質Ｌ７／Ｌ１２の構造および動態からリボソームにおける分子スイッチまで」Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９（１７）：１７６９７−７０６（２００４））。
【０２３６】
鋳型として大腸菌Ｋ１２ ＤＮＡならびにプライマーのＬ７３ＦおよびＬ７１Ｒ対を使用して、タンパク質の可動性非構造化領域をコードするＰＣＲフラグメントが得られる：
Ｌ７３Ｆ ＧＣＧＣＧＴＣＧＡＣＧＡＡＧＡＡＡＡＡＴＴＣＧＧＴＧＴＴＴＣＣ（配列番号：１４）
Ｌ７１Ｒ ＧＣＧＣＣＴＣＧＡＧＣＴＴＴＴＣＴＴＣＡＧＣＡＧＣＴＴＣＡＡＣＣ（配列番号：１５）
【０２３７】
Ｌ７３ＦプライマーはＳａｌＩ制限部位をコードし、かつＬ７１ＲプライマーはＸｈｏＩ制限エンドヌクレアーゼ部位をコードする。得られたＬ７ ＰＣＲフラグメントは始めにＳａｌＩ部位および、フラグメントにおいてコードされる部分的Ｌ７／Ｌ１２オープンリーディグフレームの末端にＸｈｏＩ部位を有する。フラグメントをＸｈｏＩおよびＳａｌＩ制限エンドヌクレアーゼで切断後、ＸｈｏＩで切断されるｐＥＴ−ＳＡＶ−ＧＳプラスミドにライゲートする。正確な配向のインサートを伴うプラスミドを前記のようなＤＮＡシークエンシングを用いて選択する。得られたプラスミドをｐＥＴ−ＳＡＶ−ＧＳ−Ｌと称する。この研究法を用いてＬ７フラグメントのいくつかのタンデムコピーをスペーサー領域に挿入することができる。得られた２、３、４、５、６、７または８個のＬ７コピーを伴うプラスミドを、ｐＥＴ−ＳＡＶ−ＧＳ−Ｌｘ２、ｐＥＴ−ＳＡＶ−ＧＳ−Ｌｘ３、ｐＥＴ−ＳＡＶ−ＧＳ−Ｌｘ４、ｐＥＴ−ＳＡＶ−ＧＳ−Ｌｘ５、ｐＥＴ−ＳＡＶ−ＧＳ−Ｌｘ６、ｐＥＴ−ＳＡＶ−ＧＳ−Ｌｘ７およびｐＥＴ−ＳＡＶ−ＧＳ−Ｌｘ８と称した。得られた１つまたはそれより多いＬ７インサートを伴うプラスミドは、ＳＡＶ−ＧＳ−Ｌ７ｘ（ｎ）オープンリーディグフレームの末端で独特なＸｈｏＩ部位を有する。この独特なＸｈｏＩ部位を用いて融合遺伝子の下流にクレノウ部を付加する。これらのプラスミドをｐＥＴ−ＳＡＶ−ＧＳ−Ｌｘ（ｎ）（ここでｎはＬ７フラグメントのタンデムコピーの数である）と総称する。
【０２３８】
ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントを前記で記載された融合遺伝子の末端にクローン化する。鋳型として大腸菌ＤＮＡおよび以下のプライマー対を使用して、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントをコードするＰＣＲフラグメントを作成した：
ＫｌｉｎＦ
ＧＣＧＣＧＴＣＧＡＣＧＧＴＧＧＣＧＧＴＧＧＣＴＣＧＧＴＧＡＴＴＴＣＴＴＡＴＧＡＣＡＡＣＴＡＣＧＴＣＡ−３’（配列番号：１６）
ＫＷＲ ５’−ＧＣＧＣＡＡＧＣＴＴＡＧＴＧＣＧＣＣＴＧＡＴＣＣＣＡＧＴＴＴＴＣ−３’（配列番号：１７）
【０２３９】
得られたＰＣＲフラグメントはＫＬと称され、そしてさらなるスペーサー距離を提供するためにＫｌｉｎＦプライマーにおいて設計されたグリシンおよびセリンをコードするいくつかのコドンにより先行される、クレノウオープンリーディグフレーム全体をコードする。フラグメントを双方の末端で、プライマーで提供されたＳａｌＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位で切断後、スペーサー配列に続いて、前記で記載されたプラスミドのいずれかにクローン化する。得られたプラスミドをｐＥＴ−ＳＡＶ−ＧＳ−ＫＬおよびｐＥＴ−ＳＡＶ−ＧＳ−Ｌｘ（ｎ）−ＫＬと称する。
【０２４０】
加えて、クレノウのＮ末端またはＣ末端部分をコードするＰＣＲフラグメントを、前記で記載されたＳＡｖ−スペーサー融合構築物のうちの１つにクローン化する。ＫｌｉｎＦプライマーおよび以下の逆方向プライマーＳＮ２Ｒを使用してクレノウのＮ末端部分をコードするＰＣＲフラグメントを得る：
ＳＮ２Ｒ ５’−ＧＣＧＣＡＡＧＣＴＴＡＡＴＣＧＡＴＣＴＴＣＡＣＡＣＣＧＴＴＡＣ−３’（配列番号：１８）
【０２４１】
得られたＰＣＲフラグメントをＮ２と称する。
【０２４２】
クレノウのＣ末端部分をコードするＰＣＲフラグメントは逆方向プライマーＫＷＲおよび以下の順方向プライマーＳＣ２Ｆを使用して得られる：
ＳＣ２Ｆ ５’−ＧＣＧＣＧＴＣＧＡＣＧＧＴＧＧＣＡＧＣＧＡＴＣＣＧＡＡＡＧＴＣＣＴＧＣＡＣＡＡ−３’（配列番号：１９）
【０２４３】
得られたＰＣＲフラグメントをＣ２と称する。
【０２４４】
Ｎ２およびＣ２フラグメントをＳａｌＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限エンドヌクレアーゼで切断後、ＳＡｖ−スペーサー融合タンパク質をコードするＸｈｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ消化プラスミドにクローン化する。得られたプラスミドをｐＥＴ−ＳＡＶ−ＧＳ−Ｌｘ（ｎ）−Ｎ２およびｐＥＴ−ＳＡＶ−ＧＳ−Ｌｘ（ｎ）−Ｃ２（ここでｎはＬ７フラグメントのタンデムコピーの数である）と称する。
【０２４５】
アフィニティー精製タグを融合遺伝子の末端に付加することもできる。Ｃ末端タグはストレプトアビジンのＮ末端に導入されたＨｉｓタグと組み合わされてタンデムアフィニティー精製（ＴＡＰ）に備える。１）その天然の、もしくは修飾された小型リガンドまたはタンパク質結合パートナーに対する結合；または２）固定されたタグ特異的抗体に対する結合；に基づくものを含む、ＴＡＰに使用することができる当業者に公知の多くのタグがある。例としてＦＬＡＧ、Ｈｉｓ、ＣＢＰ、ＣＹＤ（共有結合的であるが、解離可能なＮｏｒｐＤペプチド）、ＳｔｒｅｐＩＩ、ＨＰＣ（プロテインＣの重鎖）ペプチドタグならびにＧＳＴおよびＭＢＰをＴＡＰに組み合わせることができる。
【０２４６】
クレノウ部のＣ末端にＦＬＡＧタグを提供するために、２つのＦＬＡＧタグ、続いて停止コドンをコードする以下の二本鎖オリゴヌクレオチドＦを合成する：
５’−ＡＣＴＡＧＴＧＡＴＴＡＴＡＡＧＧＡＴＧＡＣＧＡＴＧＡＣＡＡＡＧＡＴＴＡＣＡＡＡＧＡＴＧＡＴＧＡＣＧＡＴＡＡＧＴＡＧ−３’（配列番号：２０）
３’−ＣＡＣＴＡＡＴＡＴＴＣＣＴＡＣＴＧＣＴＡＣＴＧＴＴＴＣＴＡＡＴＧＴＴＴＣＴＡＣＴＡＣＴＧＣＴＡＴＴＣＡＴＣＴＴＡＡ−５’（配列番号：２１）
【０２４７】
２未満または２を超えるＦＬＡＧタグをコードするオリゴヌクレオチドを使用することもできる。クレノウオープンリーディグフレームの末端の停止コドンを除去するために、クレノウＤＮＡ鋳型を以下のプライマー対で増幅する：
ＸｈｏＦ ＣＧＴＧＣＡＣＴＣＧＡＧＴＴＧＣＴＡＡＡ（配列番号：２２）
ＳｐＲ ＧＣＧＣＡＣＴＡＧＴＡＴＧＣＧＣＣＴＧＡＴＣＣＣＡＧＴＴＴＴＣ（配列番号：２３）
【０２４８】
このように得られたＰＣＲフラグメントは、クレノウポリヌクレオチド配列内に存在する独特な内部ＸｈｏＩ部位、および停止コドンの前にＳｐＲプライマーを使用してクレノウオープンリーディグフレームの末端に導入された独特なＳｐｅＩ部位を有する。フラグメントをＸｈｏＩで切断後、同じ内部部位でＸｈｏＩで切断されたｐＥＴ−ＳＡＶ−ＧＳ−ＫＬ、ｐＥＴ−ＳＡＶ−ＧＳ−Ｌｘ（ｎ）−ＫＬ、ｐＥＴ−ＳＡＶ−ＧＳ−Ｌｘ（ｎ）−Ｃ２およびｐＥＴ−ＳＡＶ−ＧＳ−Ｌｘ（ｎ）−Ｎ２プラスミドのいずれかにライゲートする。次に６５℃で２０分間のインキュベーションによりＴ４ ＤＮＡリガーゼを不活化する。ライゲーション生成物をＳｐｅＩおよびＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼで、製造者の説明書にしたがって切断し、１％アガロースゲル中で分離後、ＮｃｏＩとＥｃｏＲＩ部位との間にｐＥＴ−１５ｂ ＤＮＡ配列全体、およびＮｃｏＩ部位でプラスミドに接続され、それの末端でＳｐｅＩ部位までクレノウ遺伝子を含む融合遺伝子を含有する最も大きいＤＮＡフラグメントを、例えばＱＩＡＥＸ ＩＩキット（ＱＩＡＧＥＮ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ジャーマンタウン、メリーランド州）を製造者の説明書にしたがって使用して精製した。
【０２４９】
ＳｐｅＩおよびＥｃｏＲＩ粘着末端によりフランキングされるオリゴヌクレオチドＦを同じ粘着末端を有する精製されたフラグメントと共にライゲートする。ライゲーション生成物をＸＬ１０ Ｇｏｌｄコンピテント細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ラ・ホーヤ、カリフォルニア州）に形質転換後、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含有する寒天プレート上に播種する。プレートを３７℃で一晩インキュベートした後、アンピシリン抵抗性コロニーが出現する。水１ｍｌ中でコロニーからの材料を３分間煮沸することによりプラスミドＤＮＡを抽出し、そして放出されたプラスミドをＸｈｏＦおよびＦＲ（ＣＴＡＣＴＴＧＴＣＡＴＣＧＴＣＡＴＣＣＴＴＡＴ）（配列番号：２４）プライマーを使用してＰＣＲにおいてインサートの存在に関して分析する。
【０２５０】
１００μｇ／ｍｌアンピシリンを補充したＬ−ブロスのような液体培地中でインサート陽性コロニーを一晩成長させた後、ＳＴＲＡＴＡＰＲＥＰ（登録商標）プラスミドミニプレップキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ラ・ホーヤ、カリフォルニア州）を使用してプラスミドＤＮＡを精製する。融合遺伝子の末端での二重ＦＬＡＧタグの存在をＭｆｅＦ（ＣＧＧＣＡＧＡＡＧＴＧＴＴＴＧＧＴＴＴＧ）（配列番号：２５）プライマーを使用してＳａｎｇｅｒ法により検証する。
【０２５１】
実施例７：ロングネック融合タンパク質の生成および精製
実施例６に記載されるＳＡｖ−ポリメラーゼ融合タンパク質をコードするプラスミドのいずれかを宿す大腸菌株を使用して、プラスミドによりコードされるＳＡｖ−スペーサー−クレノウ融合タンパク質を生成することができる。日常的には大腸菌ＢＬ２１ ＤＥ３株（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ラ・ホーヤ、カリフォルニア州）を使用するが、融合タンパク質の発現はｐＥＴ−１５ｂベクター中に存在するＴ７プロモーターにより駆動されるので、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを発現する任意の大腸菌株がこの目的に適当である。もちろんその他のベクターおよびその他のプロモーター、例えばｔａｃプロモーターを使用してこれらの融合タンパク質を生成できることは当業者により認識されよう。Ｔ７プロモーターの制御下でタンパク質を発現するために、本質的に米国特許第４９５２４９６号（Ｓｔｕｄｉｅｒ）に開示されるように組換え大腸菌の培養を実施する。ＪＡ−１０ローター中Ｊ２−２１遠心器（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、フラートン、カリフォルニア州）を用いて５０００ｒｐｍで、４℃で１５分間遠心することにより細胞を収集する。培養物２５０ｍｌからの細胞を１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００およびプロテアーゼ阻害剤のセットＣｏｍｐｌｅｔｅ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ、マンハイム、ドイツ）を補充したバッファーＡ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭジチオスレイトール）１０ｍｌに再懸濁し、そしてＳｏｎｉｆｉｅｒ２５０（Ｂｒａｎｓｏｎ Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ダンベリー、コネチカット州）をアウトプット３設定で用いて１．５分間の一定の超音波処理により破壊する。
【０２５２】
破壊された細胞をＪＡ−２０ローター中Ｊ２−２１遠心器（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、フラートン、カリフォルニア州）を用いて２００００ｒｐｍ、４℃で１５分間遠心する。ストレプトアビジン融合タンパク質は封入体を形成し、そして主にペレット中に見出される。しかしながら、特にストレプトアビジンおよび酵素が長い可動性非構造化領域により分離される場合、有意な量の可溶性タンパク質を回収できる。それにもかかわらず、ペレットは上澄みと比較して融合タンパク質に富み、ペレット中の融合タンパク質はタンパク質分解の傾向が少なく、そして最も重要なことに、それらは内因性ビオチンを除去するためにとにかく変性される必要があるので、不溶性分画からの精製が好ましい。前記されたような超音波処理によりペレットをバッファーＡ１０ｍｌに再懸濁し、バッファーＡで４０ｍｌに希釈し、そしてＪＡ−２０ローター中Ｊ２−２１遠心器で２００００ｒｐｍ、４℃で１５分間再び遠心する。
【０２５３】
ペレットをバッファーＡ７．５ｍｌに再懸濁後、再懸濁液の３００μｌアリコートを使用して融合タンパク質を精製する。残りの再懸濁されたペレットをさらなる使用のために−８０℃で保存する。再懸濁された封入体の３００μｌアリコートを１４０００ｒｐｍ／分で１５分間遠心し、上澄みを捨てた後、ペレットを６Ｍ ＧｄＨＣｌ（ｐＨ１．５）２．８ｍｌに再懸濁し、そして２つの１．５ｍｌチューブに移す。チューブを４℃で１時間回転させ、そして次に１４０００ｒｐｍ／分で１５分間遠心する。
【０２５４】
上澄みを収集し、そして６Ｍ ＧｄＨＣｌ（ｐＨ１．５）３００ｍｌに対して室温で一晩透析して、ストレプトアビジン部に結合していた内因性ビオチンを除去する。さらなる透析工程を４℃で実施する。
【０２５５】
次に、試料を６Ｍ ＧｄＨＣｌ、０．５Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ Ｎａ−Ｐ（ｐＨ７．４）３００ｍｌに対して４時間透析し、そして次に同じ容量のバッファーＢ（２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ８）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭジチオスレイトール）の３回交換（各交換に少なくとも２時間）に対してさらに透析する。
【０２５６】
透析バッグから試料を除去し、１４０００ｒｐｍ／分で１５分間遠心し、そして上澄みを１．５ｍｌマイクロチューブに収集する。上澄みにイミダゾールを１０ｍＭ濃度で添加し、その後バッファーＢで平衡にしたＮｉ−ＮＴＡアガロースビーズ（ＱＩＡＧＥＮ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ジャーマンタウン、メリーランド州）の５０％スラリー１００μｌを上澄各１．４ｍｌに添加する。
【０２５７】
上澄みをビーズと共に４℃で１５分間回転させ、その後２０００ｒｐｍ／分で２分間の遠心によりビーズをペレット化し、１０ｍＭイミダゾールを補充したバッファーＢ１．５ｍｌで３回洗浄し、前記したようにペレット化し、そして上澄みを完全に除去する。吸着した融合タンパク質をバッファーＢ中２５０ｍＭイミダゾールで溶出し、そして３０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．２）、５０ｍＭ ＮａＣｌ、４ｍＭ ＤＴＴ、５０％グリセロールを含有するバッファー少なくとも１００容量に対して一晩透析する。精製された融合タンパク質を−２０℃で保存する。
【０２５８】
実施例８：固相アッセイにおけるロングネック融合タンパク質を使用する分析物の検出
ＥＬＩＳＡを使用して、ロングネック融合タンパク質が固相検出反応においてＧＳＴに結合するビオチン化抗ＧＳＴ抗体の存在を検出する能力を試験した。吸着、遮断、洗浄およびインキュベーション工程は全て典型的なＥＬＩＳＡに標準的であった。ビオチン化抗ＧＳＴ検出抗体の添加の後、実施例６のストレプトアビジン−スペーサー−クレノウタンパク質を添加する。
【０２５９】
最初に０．２％魚皮ゼラチン、２％熱不活化正常ヤギ血清、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２００ｍＭ ＮａＣｌ、０．０２％ Ｔｗｅｅｎ−２０を含有する遮断／希釈バッファー中、融合タンパク質を１００ｎｇ／ｍｌまで希釈する。希釈された融合タンパク質をＥＬＩＳＡプレートに７５μｌ／ウェルで添加後、室温で３０分間インキュベートして、ＳＡｖ部がビオチン化抗体に結合するのを可能にする。溶液をウェルから吸引し、そしてウェルをＴＢＳＴバッファー（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１２５ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０）４００μｌで４回、続いて脱イオン水で２回洗浄した。
【０２６０】
次いでクレノウ伸長混合物をウェルに添加して、修飾ポリヌクレオチド鋳型の非修飾コピーの形成を促進する。
【０２６１】
クレノウ伸長混合物（全て混合後の最終濃度である）：
１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）
５ｍＭ ＭｇＣｌ_２
７．５ｍＭ ＤＴＴ
５００μＭ ｄＮＴＰ（ＡＣＧＴ）
１００μｇ／ｍｌ ＢＳＡ
１００ｎＭ Ａｌｉｅｎ１−逆方向プライマー
４０ｐＭ Ｏｌｉｇｏ１（修飾オリゴヌクレオチド鋳型）
【０２６２】
Ｏｌｉｇｏ１は以下の配列を有する（ここで２’ＯＭｅは２’−Ｏ−メトキシ修飾ヌクレオチドを示し、そしてＵは２’−デオキシウリジンを示す）：
５’−ＴＴＴＴＴＴＴＧＣＴＣＧＡＣＧＧＴＧＡＡＵＧＡＵＧＴＡＧＧＵＡＣＣＡＧＣＡＧＵＡＡＣＵＣＧＡＧＣＡＣＧＵＣＵＵ２’ＯＭｅ（ＣＧ）Ａ２’ＯＭｅ（ＣＣ）ＡＡＡＴＣＵＧＧＡＵＡＴＴＧＣＡＧＣＣＴＣＧＴ−３’（配列番号：４）
【０２６３】
Ａｌｉｅｎ１−逆方向プライマーはＯｌｉｇｏ１の３’末端にアニーリングして、クレノウ反応を予備刺激し、そして以下の配列を有する：
５’−ＡＣＧＡＧＧＣＴＧＣＡＡＴＡＴＣＣＡＧＡ−３’（配列番号：５）
【０２６４】
反応を室温で０．５−１６時間進行させる。反応の間、クレノウポリメラーゼは２’−Ｍｅまたは２’−デオキシウリジン修飾を有さないＯｌｉｇｏ１鋳型のコピーを生成する。
【０２６５】
次に２倍ＱＰＣＲマスターミックスをウェルに添加して、ＰＣＲ反応の構成要素の以下の濃度を提供する：
１５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．４）
５０ｍＭ ＫＣｌ
２．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２
３％ ＤＭＳＯ
０．０１％ Ｔｗｅｅｎ−２０
８００μＭ ｄＮＴＰ（ＡＣＧＴ）
０．４４４倍ＳＹＢＲ（登録商標）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、ユージン、オレゴン州）グリーン（１０，０００倍として提供される）
３０ｎＭ Ｒｏｘ参照色素（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅカタログ番号６００５３０）
Ｐｆｕ（ｅｘｏ⁻）５０単位／ｍｌ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅカタログ番号６００１６３−８１）
１００ｎＭ Ａｌｉｅｎ１−順方向プライマー（５’−ＴＧＣＴＣＧＡＣＧＧＴＧＡＡＴＧＡＴＧＴ−３’）（配列番号：６）
１００ｎＭ Ａｌｉｅｎ１−逆方向プライマー（５’−ＡＣＧＡＧＧＣＴＧＣＡＡＴＡＴＣＣＡＧＡ−３’）（配列番号：５）
【０２６６】
試料を混合した後、それらを解離曲線および９５℃１０分間（１サイクル）、９５℃１５秒間、６３℃３０秒間（４０サイクル）の２工程循環パラメーターで、ＳＹＢＲ（登録商標）グリーンに関するプログラムを用いてＭＸ３００５Ｐに流す。分析物濃度＝０ｐｇ／ｍｌのＣｔと分析物濃度＝Ｘｐｇ／ｍｌのＣｔとの間のＣｔにおける変化を計算することにより、相対ＱＰＣＲシグナルをコンピューター計算する。これを「０からのｄＣｔ」と称する。効率１００％のアッセイでは、１つのＣｔの変化は初期の使用可能なＱＰＣＲ鋳型の量の２倍に均等である。この対数的シグナルを直線的な量に変換するために、以下の式：「相対ＱＰＣＲシグナル」＝２＾（０からのｄＣｔ）−１を使用する。最後に相対ＱＰＣＲシグナルを、試料中で使用される分析物の濃度（ｐｇ／ｍｌ）に対してプロットする。
【０２６７】
ＳＡｖ−ＫＬ、ＳＡｖ−ＫＬ、ＳＡｖ−ＧＳ−Ｌｘ２−ＫＬ、ＳＡｖ−ＧＳ−Ｌｘ３−ＫＬ、ＳＡｖ−ＧＳ−Ｌｘ４−ＫＬおよびＳＡｖ−ＧＳ−Ｌｘ５−ＫＬを含むいくつかの種類のＳＡｖ−スペーサー−クレノウ融合タンパク質を、このアッセイにおいて活性に関して試験した。図１０および１１はこのアッセイの結果を示す。全ての融合タンパク質は活性であり、そして全て分析物（ビオチン化抗ＧＳＴ抗体）の力価測定において有用であった。図１０および１１に示されるように、スペーサー領域をこれらの融合タンパク質構築物に付加することは、一般的にこのアッセイにおける相対ＱＰＣＲシグナルを強化する。
【０２６８】
実施例９：溶液基盤のアッセイにおけるロングネック融合タンパク質を使用する分析物の検出
【０２６９】
ポリクローナルビオチン化抗ＶＥＧＦ抗体を２つのプールに分けた。１つのプールを実施例６のＳＡｖ−ＧＳ−Ｌｘ４−ＫＬ融合タンパク質で標識した。その他のプールを、ｄＵＴＰおよび２’−Ｏ−メトキシ修飾ヌクレオチドを含有する修飾ポリヌクレオチド鋳型に化学的に繋がれているストレプトアビジンで標識した。１ｍＭ Ｄ−ビオチンの添加により標識反応をクエンチした。等量で組み合わされたプローブの１００ｐＭ溶液を調製後、４μｌをＱＰＣＲ反応チューブに分配した。組換えヒトＶＥＧＦの３倍希釈系列の各々１μｌをプローブ混合物４μｌに添加後、室温で１時間インキュベートした。次いでクレノウ伸長バッファー４５μｌを各試料に添加後、３７℃で１０分間インキュベートした。次いでクレノウを７５℃で２０分間加熱して死滅させた。Ｐｆｕ（ｅｘｏ⁻）ポリメラーゼ含有ＳＹＢＲ（登録商標）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、ユージン、オレゴン州）グリーンＱＰＣＲマスターミックスを含有する新しいチューブに、加熱により死滅した伸長反応物５μｌを移た後、次にＱＰＣＲにより分析した。結果を図１２に示し、それはＱＰＣＲシグナルが各反応物に添加されたＶＥＧＦ分析物の量に比例したことを示す。
【０２７０】
本明細書に引用された全ての特許、特許出願および出版された参考文献は、その全てにおいて参照により本明細書に組み込まれる。本発明を特にその好ましい実施形態を参照して示し、そして記載してきたが、添付の請求の範囲により包含される本発明の範囲から逸脱することなく、形態および詳細における種々の変更を行うことができることは当業者には理解されよう。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）
（ｉ）分析物に対する第１ポリメラーゼに繋がれた結合分子、または
（ｉｉ）分析物に対する第１分析物特異的プローブおよび第２分析物特異的プローブ
の結合ステップであって、前記第１分析物特異的プローブは第１ポリメラーゼの第１部分に繋がれた第１結合部を含み、前記第２分析物特異的プローブは第１ポリメラーゼの第２部分に繋がれた第２結合部を含む、機能的なポリメラーゼ複合体を形成するためのステップと、
１つまたはそれより多い修飾ヌクレオチドを含む修飾ポリヌクレオチド鋳型に対する第１プライマーのアニーリングステップと、
第１ポリメラーゼまたはポリメラーゼ複合体でのプライマーの伸長ステップであって、これにより修飾ポリヌクレオチド鋳型のコピーを合成し、前記コピーは１つまたはそれ以上の修飾ヌクレオチドを何ら有さない（「非修飾コピー」）ステップと、
を許容するように、試料を反応物混合物と接触させるステップと、
ｂ）非修飾コピーを第２ポリメラーゼで増幅するステップであって、前記第２ポリメラーゼは修飾ポリヌクレオチド鋳型を増幅することができないステップと、
ｃ）増幅された非修飾コピーを検出するステップであって、前記増幅された非修飾コピーの検出は試料中の分析物の存在または量の指標であるステップ
とを含む、試料中の分析物を検出するための方法。
【請求項２】
ａ）３’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼに繋がれた結合分子の分析物に対する結合ステップと、
３’フラップおよび伸長時にプライマー結合部位を導入する５’領域を含む第１プライマーのポリヌクレオチド鋳型に対するアニーリングステップと、
３’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼでの第１プライマーの３’フラップの切断ステップと、
３’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼで切断された第１プライマーの伸長；それによりプライマー結合部位を含む増幅のための鋳型を合成するステップと
を許容するように、反応物混合物をインキュベートするステップと、
ｂ）３’エキソヌクレアーゼ活性を欠如するポリメラーゼ、およびそのうちの１つは増幅のための鋳型におけるプライマー結合部位にアニーリングする少なくとも２つのプライマーを用いて、増幅のための鋳型を増幅するステップと、
ｃ）増幅のための増幅された鋳型を検出するステップであって、前記増幅のための増幅された鋳型の検出は試料中の分析物の存在または量の指標であるステップ
とを含む、試料中の分析物を検出するための方法。
【請求項３】
前記第１プライマーが約４１℃以上の反応温度で前記ポリヌクレオチド鋳型にアニーリングせず、前記第１プライマーのポリヌクレオチド鋳型に対するアニーリングを許容する第１反応温度で前記インキュベーとするステップを実施し、かつ前記増幅するステップにおける前記第２プライマーのアニーリングおよび伸長を約４１℃以上の反応温度で実施する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記結合分子または第１および第２結合部が抗体である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記第１ポリメラーゼまたはポリメラーゼ複合体がクレノウまたはＴ４である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記抗体が、ビオチン−ストレプトアビジン相互作用により前記第１ポリメラーゼまたは前記第１ポリメラーゼの第１および第２部分に繋がれている、請求項４または５に記載の方法。
【請求項７】
前記抗体がビオチン化され、かつ前記第１ポリメラーゼまたは前記第１ポリメラーゼの前記第１および第２部分がストレプトアビジンまたはアビジンに繋がれている、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記修飾ポリヌクレオチド鋳型が、１つもしくはそれより多いデオキシウラシルおよび／または１つもしくはそれより多い２’Ｏ−メチル修飾を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記第２ポリメラーゼが熱安定性ポリメラーゼである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記熱安定性ポリメラーゼがＰｆｕまたはＴａｑポリメラーゼである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ストレプトアビジンもしくはアビジンと前記第１ポリメラーゼとの間、または前記ストレプトアビジンもしくはアビジンと前記第１ポリメラーゼの前記第１もしくは第２部分との間にポリペプチドリンカーをさらに含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
前記修飾ポリヌクレオチド鋳型が第２抗体に繋がれている、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
第１の分析物特異的プローブおよび第２の分析物特異的プローブを含む組成物であって、前記第１の分析物特異的プローブは分析物に特異的な第１結合部および第１ポリメラーゼの第１部分を含み、ならびに前記第２の分析物特異的プローブは分析物に特異的な第２結合部および第１ポリメラーゼの第２部分を含み、前記第１ポリメラーゼの前記第１および第２部分は互いに関連する場合に機能的なポリメラーゼ複合体を形成する、組成物。
【請求項１４】
１つまたはそれより多い修飾ヌクレオチドを有する修飾ポリヌクレオチド鋳型をさらに含む、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
１つまたはそれより多い修飾ヌクレオチドを有する修飾ポリヌクレオチド鋳型を増幅する第１ポリメラーゼに繋がれた結合分子と、
修飾ポリヌクレオチド鋳型と
とを含む、組成物。
【請求項１６】
前記修飾ポリヌクレオチド鋳型を増幅することができないが、前記修飾ポリヌクレオチド鋳型の非修飾コピーを増幅することができる第２ポリメラーゼをさらに含む、請求項１４または１５に記載の組成物。
【請求項１７】
前記第１および第２結合部または前記結合分子が抗体であり、かつ前記第１ポリメラーゼまたはポリメラーゼ複合体がクレノウまたはＴ４ポリメラーゼである、請求項１３から１６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１８】
前記修飾ポリヌクレオチド鋳型が１つまたはそれより多いデオキシウラシルおよび／または２’Ｏ−メチル修飾を含む、請求項１３〜１７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１９】
前記抗体が、ビオチン−ストレプトアビジン相互作用により前記第１ポリメラーゼまたは前記第１ポリメラーゼの前記第１もしくは第２部分に繋がれている、請求項１７に記載の組成物。
【請求項２０】
前記抗体がビオチン化され、前記第１ポリメラーゼまたは前記第１ポリメラーゼの第１および第２部分がストレプトアビジンまたはアビジンに繋がれている、請求項１７に記載の組成物。

【図１Ａ】

【図１Ｂ】

【図２Ａ】

【図２Ｂ】

【図３Ａ】

【図３Ｂ】

【図４】

【図５】

【図６】

【図７】

【図８】

【図９】

【図１０】

【図１１】

【図１２】

【公表番号】特表２０１０−５３３８６７（Ｐ２０１０−５３３８６７Ａ）
【公表日】平成２２年１０月２８日（２０１０．１０．２８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５１７０９９（Ｐ２０１０−５１７０９９）
【出願日】平成２０年７月１４日（２００８．７．１４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０６９９７５
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０１２２２０
【国際公開日】平成２１年１月２２日（２００９．１．２２）
【出願人】（５０９３３１２８３）アジレント　テクノロジーズ　インコーポレイテッド (4)
【Ｆターム（参考）】