前立腺癌の遺伝子診断
【課題】グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴＰ１）の発現と関連する細胞増殖性疾患の検出方法および治療方法のための医薬を提供する。
【解決手段】この方法は、被検者組織サンプル中における高メチル化されたＧＳＴＰ１プロモーターの直接検出、またはＧＳＴＰ１ ｍＲＮＡまたはＧＳＴＰ１タンパク質の低下の間接検出を含む。
【解決手段】この方法は、被検者組織サンプル中における高メチル化されたＧＳＴＰ１プロモーターの直接検出、またはＧＳＴＰ１ ｍＲＮＡまたはＧＳＴＰ１タンパク質の低下の間接検出を含む。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般には癌の診断に関し、特に前立腺組織の細胞増殖性疾患の診断上の指標として、高メチル化（hypermethylated）グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴＰ１）プロモーターを同定することに関する。
【背景技術】
【０００２】
現存の癌試験は非特異的であることが多く、そのために臨床上の有用性が限定されている。例えば、癌の診断とモニターの両方で広く使われている生化学試験では癌胎児性抗原（ＣＥＡ）のレベルを測定する。ＣＥＡは胎児組織に大量に検出される癌胎児性抗原であるが、正常な成人組織にも少量存在する。ある種の消化器癌の患者の血清には高いレベルのＣＥＡが含まれており、これを免疫学的方法で測定することができる。血清中のＣＥＡ量はこれらの腫瘍の軽快または再発と関連しており、外科的に腫瘍を除去するとそのレベルは急激に減少する。ＣＥＡレベルの再度の上昇は悪性細胞が再発したことを示唆する。しかしながら、ＣＥＡはほとんど全ての成人に低レベルで存在する正常な糖タンパク質でもある。さらに、ＣＥＡタンパク質が非悪性状態でも上昇することがあり、また多くの癌で上昇しないこともあるという事実のために、ＣＥＡと癌の関連性は極めてあいまいなものとなっている。従って、ＣＥＡは癌マーカーとしては理想から程遠いものである。
【０００３】
ヒトの癌細胞は典型的には、決定的な遺伝子の突然変異、増幅または欠失によって特徴付けられる体細胞の変化したゲノムを含む。さらに、ヒト癌細胞由来のＤＮＡテンプレートはＤＮＡのメチル化において体細胞の変化を示すことが多い（E.R. Fearon, et al., Cell, 61:759, 1990; P.A. Jones, et al., Cancer Res., 46:461, 1986; R. Holliday, Science, 238:163, 1987; A. De Bustros, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 85:5693, 1988; P.A. Jones, et al., Adv. Cancer Res., 54:1, 1990; S.B. Baylin, et al., Cancer Cells, 3:383, 1991; M. Makos, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 89:1929, 1992; N. Ohtani-Fujita, et al., Oncogene, 8:1063, 1993）。しかしながら、ヒトの腫瘍形成における異常なＤＮＡメチル化の正確な役割は分かっていない。ＤＮＡメチラーゼは普遍的なメチル供与体であるＳ−アデノシルメチオニンからＤＮＡ上の特異的部位にメチル基を転移させる。いくつかの生物学的機能がＤＮＡ中のメチル化された塩基によるものであるとされている。最も確立されている生物学的機能は、同種の制限酵素による消化からＤＮＡを保護することである。制限酵素修飾現象は現在までのところ細菌のみで観察されている。しかしながら、哺乳動物細胞はグアニン（ＣｐＧ）の５’近辺にあるＤＮＡ上のシトシン残基のみをメチル化する異なるメチラーゼをもつ。このメチル化が遺伝子活性、細胞分化、腫瘍形成、Ｘ染色体不活性化、ゲノム刷り込み（imprinting）およびその他の主要な生物学的プロセスである役割を果たしていることがいくつかの証拠から示されている（Razin, A., H., and Riggs, R.D.編集、 DNA Methylation Biochemistry and Biological Significance, Springer-Verlag, New York, 1984）。
【０００４】
グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）は、化学的に反応性の親電子体をグルタチオオンと結合することによって親電子的発癌物質を不活性化させることを含む、細胞内の脱毒性化反応を触媒する（C.B. Pickett, et al., Annu.Rev. Biochem., 58:743, 1989; B. Coles, et al., CRC Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol., 25:47, 1990; T.H. Rushmore, et al., J. Biol. Chem. 268:11475, 1993）。異なる遺伝子座でいくつかの異なる遺伝子によってコードされるヒトＧＳＴは、α、μ、π、およびテータ(theta) と呼ばれる４つのファミリーに分類されている（B. Mannervik, et al., Biochem. J., 282:305, 1992）。
【０００５】
多くのヒトの癌ではそれらの元の組織と比較してＧＳＴＰ１の発現が増加していることが示されている（S. Tsuchida, et al., CRC Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol., 27:337, 1992）。癌のような細胞増殖性疾患の存在と相関する意味のあるマーカーを提供することが従来限定され、また失敗してきたために、このような障害の進展を診断しモニターするのに使用できるマーカーの必要性が生じている。本発明はこのような必要性を満足するものである。
【発明の開示】
【０００６】
本発明は、ほとんどの前立腺癌が正常な前立腺組織と比較してＧＳＴＰ１ポリペプチドのレベルが低下しているという予期せぬ発見に基づく。さらに研究を行ったところ、細胞内でのＧＳＴＰ１の翻訳の低下はＧＳＴＰ１プロモーターの高メチル化によるものであり、それによってＧＳＴＰ１の転写が低下することが示された。
【０００７】
ある態様では、本発明は、細胞成分をＧＳＴＰ１を検出する試薬と接触させることを含む、被検者の前立腺組織またはその他のサンプル中の細胞増殖性疾患を検出する方法を提供する。例えば、高メチル化されたＧＳＴＰ１プロモーターを同定するためにメチル化感受性制限酵素を用いることができる。さらに、疑われる組織由来の核酸またはタンパク質をＧＳＴＰ１−特異的核酸プローブまたは抗体とそれぞれ接触させてそのレベルを正常組織のレベルと比較することによって、低下したＧＳＴＰ１ ｍＲＮＡおよびＧＳＴＰ１タンパク質を検出することができる。
【０００８】
別の態様では、ＧＳＴＰ１の発現に付随する細胞増殖性疾患を治療する方法を提供する。この方法は、障害をもつ被検者に、治療的有効量の試薬、例えばＧＳＴＰ１の発現を調節するセンスＧＳＴＰ１プロモーターや構造遺伝子を投与することを含む。
【０００９】
発明の詳細な説明
本発明は、ヒトπ−クラスのグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ構造遺伝子ＧＳＴＰ１の高メチル化プロモーターが前立腺の癌形成と正の相関を有することを明らかにするものである。この予期せぬ発見により、制限酵素分析によって直接的に、あるいはＧＳＴＰ１ ｍＲＮＡまたはＧＳＴＰ１遺伝子産物の検出によって間接的に、高メチル化プロモーターを検出する簡単なアッセイによって前立腺組織の細胞増殖性疾患を検出することが可能となる。例えば、高メチル化プロモーターを非メチル化プロモーターで置換することに焦点をあてた治療法が今や可能となった。
【００１０】
”プロモーター”の語は、構造遺伝子の上流または５’に位置する制御領域をいう。ＧＳＴＰ１のプロモーター領域の配列分析は、ヌクレオチドの約７２％がＣＧであり、約１０％がＣｐＧジヌクレオチドであることを示す。
【００１１】
本発明は、ＧＳＴＰ１を発現することまたはＧＳＴＰ１関連の障害をもつことが疑われる標的細胞成分をこの成分と結合する試薬と接触させることを含む、被検者の組織中のＧＳＴＰ１を発現する細胞またはＧＳＴＰ１と関連する細胞増殖性疾患を検出する方法を提供する。標的細胞成分はＤＮＡまたはＲＮＡなどの核酸、あるいはタンパク質でありうる。成分が核酸であるときは、試薬は核酸プローブまたはＰＣＲプライマーである。細胞成分がタンパク質であるときは、試薬は抗体プローブである。プローブは例えば、放射性同位体、蛍光化合物、生物発光化合物、化学発光化合物、金属キレーター、または酵素で検出可能なように標識することができる。抗体に結合するための適当なその他の標識は当業者には公知であり、あるいは日常的実験を用いてこれを確認することができる。
【００１２】
本発明では、ＧＳＴＰ１転写のレベル低下がＧＳＴＰ１プロモーターの高メチル化の結果であることが多い、ということを示すので、このプロモーターが高メチル化されているか否かを決定することが望ましい。一般に、活発に転写された遺伝子はＤＮＡ中の平均数よりも少ないメチル化ＣＧを含む。高メチル化は制限酵素処理とサザンブロット分析によって検出できる。従って、本発明の方法では、検出される細胞性成分がＤＮＡであるときには、ＧＳＴＰ１プロモーターの高メチル化を検出するのに制限酵素分析が好ましい。認識部位の一部としてＣＧを含み、Ｃがメチル化されたときに阻害される制限酵素であれば何でも使用できる。好ましくは、メチル化感受性の制限酵素はＢｓｓＨＩＩ、ＭｓｐＩまたはＨｐａＩＩであり、これを単独または組み合わせて使用する。その他のメチル化感受性の制限酵素も当業者には公知である。
【００１３】
本発明の目的達成のために、ＧＳＴＰ１に特異的な抗体または核酸プローブを、生物学的流体または組織中のＧＳＴＰ１ポリペプチド（抗体を用いて）またはポリヌクレオチド（核酸プローブを用いて）の存在を検出するのに使用できる。ＧＳＴＰ１配列中の全てのコーディング配列領域に基づくオリゴヌクレオチドプライマーを、例えばＰＣＲによってＤＮＡを増幅するのに使用できる。検出できる量のポリヌクレオチドまたは抗原を含む全ての標本が使用できる。本発明の好ましいサンプルは尿性器由来の組織、特に前立腺組織である。サンプルは上皮細胞を含んでいることが好ましい。あるいは、ＧＳＴＰ１関連の細胞増殖性疾患を示す細胞を含む射精精液、尿または血液などの生物学的流体を使用することができる。好ましい被検者はヒトである。
【００１４】
高い感受性をもたらす別の方法は、抗体を低分子量のハプテンと結合することからなる。これらのハプテンは第２の反応によって特異的に検出できる。例えば、アビジンと反応するビオチン、または特異的抗ハプテン抗体と反応するジニトロフェノール、ピリドキサール、およびフルオレセインなどのハプテンを用いることが多い。
【００１５】
上述した本発明のＧＳＴＰ１を発現する細胞またはＧＳＴＰ１に関連する細胞増殖性疾患を検出する方法は、臨床上の軽快状態中にある被検者に前立腺癌またはその他の悪性物が残っているかの検出に用いることができる。さらに、細胞中のＧＳＴＰ１ポリペプチドを検出する方法は、被検者組織中でＧＳＴＰ１を発現する細胞中のＧＳＴＰ１レベルを正常細胞または組織中で発現するＧＳＴＰ１と比較して測定することによる細胞増殖性疾患の検出に使用できる。本発明の方法を用いて、細胞中のＧＳＴＰ１発現を同定し、適当な治療法（例えば、センス遺伝子治療や薬剤治療）を用いることができる。本発明によるＧＳＴＰ１の発現パターンは、例えば前立腺上皮内新生体（ＰＩＮ）で見られるように（McNeal, et al., Human Pathol., 17:64, 1986）、悪性度の段階によって変化するので、前立腺組織などのサンプルをＧＳＴＰ１−特異的試薬（すなわち、核酸プローブまたはＧＳＴＰ１に対する抗体）のパネルでスクリーニングして、ＧＳＴＰ１発現を検出し、細胞の悪性度の段階を診断する。
【００１６】
本発明の方法で用いるモノクローナル抗体は、例えば液相または固相担体に結合して用いるイムノアッセイで用いるのに適している。さらに、これらのイムノアッセイでモノクローナル抗体を各種方法で検出可能なように標識できる。本発明のモノクローナル抗体を用いるイムノアッセイのタイプの例としては、直接または間接フォーマットの競合的および非競合的イムノアッセイが挙げられる。このようなイムノアッセイの例には、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）およびサンドイッチ（イムノメトリック）アッセイがある。本発明のモノクローナル抗体を用いる抗原の検出は、生理学的サンプル上での免疫組織学的アッセイを含む、順行、逆行、または同時モードで流すイムノアッセイを用いて行うことができる。当業者であれば過度の実験を行うことなくその他のイムノアッセイフォーマットを容易に認識することができる。
【００１７】
”イムノメトリックアッセイ”または”サンドイッチイムノアッセイ”の語は、同時サンドイッチ、順行サンドイッチおよび逆行サンドイッチイムノアッセイを含む。これらの用語は当業者に公知である。当業者であれば、本発明の抗体を現在公知であるか、または将来開発されるその他の各種のアッセイフォーマットに使用できることも理解するであろう。これらも本発明の範囲に含まれる。
【００１８】
モノクローナル抗体は多くの異なる担体と結合してＧＳＴＰ１の存在を検出するのに使用できる。よく知られた担体の例には、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然および修飾セルロース、ポリアクリルアミド、アガロースおよびマグネタイトを含む。担体の性質は本発明の目的により可溶性または不溶性のいずれかでありうる。当業者にはモノクローナル抗体を結合するその他の適当な担体が公知であり、あるいは日常的実験により確認することができる。
【００１９】
本発明の目的のために、ＧＳＴＰ１が生物学的流体または組織中に存在するときはモノクローナル抗体によって検出することができる。検出しうる量でＧＳＴＰ１を含むあらゆるサンプルを用いることができる。サンプルは射精精液、尿、唾液、脳脊髄液、血液、血清などの液体、または組織、糞便などの固体または半固体、あるいは組織学的診断で通常使用されるような固体組織であってよい。
【００２０】
アッセイを実施するときには、インキュベーション媒質にある種の”ブロッカー”を含むことが望ましい（通常は標識した可溶性抗体とともに添加する）。”ブロッカー”は、実験サンプル中に存在する非特異的タンパク質、プロテアーゼ、または抗−ＧＳＴＰ１免疫グロブリンに対する抗−異好性免疫グロブリンが、固相支持体上の抗体又は、放射標識したインジケーターと交差反応したり破壊したりして誤った陽性結果や誤った陰性結果をもたらさないことを確認するために添加する。従って、”ブロッカー”の選択は本発明で記載するアッセイの特異性を実質的に高くする。
【００２１】
本アッセイで使用するのと同じクラスまたはサブクラス（イソタイプ）の多数の関連のない（すなわち非特異的）抗体（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＭなど）を”ブロッカー”として使用できる。正しい感度を維持し、なおかつ標本中の相互に交差する反応性タンパク質による好ましくない妨害を阻止するためには、”ブロッカー”の濃度（通常１−１００μｇ／μＬ）が重要である。
【００２２】
抗原のin vivo検出にモノクローナル抗体を使用するときは、診断的に有効な用量で検出可能なように標識されたモノクローナル抗体を用いる。”診断的に有効な”の語とは、検出可能なように標識されたモノクローナル抗体を、該モノクローナル抗体が特異的なＧＳＴＰ１抗原をもつ部位の検出を可能にするのに十分な量で投与することを意味する。
【００２３】
投与する検出可能なように標識されたモノクローナル抗体の濃度は、ＧＳＴＰ１をもつ細胞との結合がバックグランドと比較して検出可能であるのに十分であるべきである。さらに、最良の標的−対−バックグランドのシグナル比を得るためには、検出可能なように標識されたモノクローナル抗体が循環系から迅速に除去されることが望ましい。
【００２４】
一般に、in vivo診断のための検出可能なように標識されたモノクローナル抗体の用量は個々人の年齢、性別、および病気の程度によって変更する。モノクローナル抗体の用量は約０．００１ｍｇ／ｍ2から約５００ｍｇ／ｍ2、好ましくは０．１ｍｇ／ｍ2から約２００ｍｇ／ｍ2、最も好ましくは約０．１ｍｇ／ｍ2から約１０ｍｇ／ｍ2で変更しうる。このような用量は例えば、複数の注射をするか、腫瘍の重症度、および当業者に公知のその他の要因によって変更しうる。
【００２５】
In vivoの診断画像では、放射性同位体を選択するうえでどのタイプの検出装置が可能かが主な要因である。選択した放射性同位体は一定のタイプの装置で検出可能な崩壊型をもっていなければならない。In vivo診断のための放射性同位体の選択における別の重要な要因は、放射性同位体の半減期が、標的による最大取り込み時にも検出可能である程度に長く、しかも宿主への有害な放射が最小となる程度に短いことである。理想的には、in vivo画像で使用する放射性同位体は粒子放出を欠くが、１４０−２５０ｋｅＶの範囲で多数の光子を発生するものであり、光子は慣用のガンマカメラで容易に検出できる。
【００２６】
In vivo診断のためには、放射性同位体を中間的官能基を用いて直接的または間接的に免疫グロブリンに結合することができる。金属イオンとして存在する放射性同位体を免疫グロブリンに結合するためによく用いられる中間的官能基は、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）やエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）などの二官能性キレート剤および同様の分子である。本発明のモノクローナル抗体に結合することのできる金属イオンの典型的例には111Ｉｎ、97Ｒｕ、67Ｇａ、68Ｇａ、72Ａｓ、89Ｚｒ、および201Ｔｌが挙げられる。
【００２７】
本発明の方法で使用するモノクローナル抗体を磁気共鳴画像（ＭＲＩ）または電子スピン共鳴（ＥＳＲ）におけるように、in vivo診断目的用の常磁性同位体で標識することもできる。一般に、診断画像を可視化するあらゆる従来法を用いることができる。通常、カメラ画像やＭＲＩ用の常磁性同位体にはガンマ線および陽電子を放出する放射性同位体を用いる。このような方法に特に有用な原子は、157Ｇｄ、55Ｍｎ、162Ｄｙ、52Ｃｒ、および56Ｆｅを含む。
【００２８】
本発明の方法で使用するモノクローナル抗体を用いてＧＳＴＰ１関連の細胞増殖性疾患の回復過程をモニターすることができる。従って、ＧＳＴＰ１を発現する細胞数の増減または射精精液または尿などの各種体液中に存在するＧＳＴＰ１の変化を測定することによって、障害の回復を目的とする特定の治療法が有効であるかどうかを決定することができる。
【００２９】
本発明はまた、ＧＳＴＰ１関連の細胞増殖性疾患をもつ被検者を治療する方法を提供する。前立腺癌では、正常細胞中での発現と比較してＧＳＴＰ１ヌクレオチド配列が発現低下しているので、この配列に向けられた適当な治療または診断法を開発することが可能である。従って、細胞増殖性疾患が悪性を伴うＧＳＴＰ１の発現と関連する場合には、転写または翻訳レベルでＧＳＴＰ１の発現を調節する核酸配列を用いることができる。細胞増殖性疾患または異常細胞の表現型がＧＳＴＰ１の発現低下と関連する場合には、例えばＧＳＴＰ１をコードする核酸配列（センス）を障害をもつ被検者に投与することができる。
【００３０】
”細胞増殖性疾患”の語は、形態的および遺伝子型的に周囲の組織とは異なって現れる悪性ならびに非悪性の細胞集団を意味する。このような障害は例えばＧＳＴＰ１発現のないことと関連する。本質的に、ＧＳＴＰ１発現と病因的に関連付けられる全ての障害が、ＧＳＴＰ１発現を調節する本発明の試薬を用いる治療に感受性であると考えられる。
【００３１】
”調節する”の語は、ＧＳＴＰ１が発現低下している場合には、ＧＳＴＰ１プロモーターのメチル化の抑制またはその他のＧＳＴ遺伝子の発現増強を意味する。細胞増殖性疾患がＧＳＴＰ１発現と関連する場合には、５−アザシタジンなどのメチル化抑制剤を細胞に導入することができる。あるいは、細胞増殖性疾患がＧＳＴＰ１ポリペプチドの発現低下と関連する場合には、プロモーター領域または構造遺伝子と作動的に連結したプロモーターをコードするセンスポリヌクレオチド配列（ＤＮＡコーディング鎖）を細胞に導入する。
【００３２】
本発明はまた、ＧＳＴＰ１によって媒介される細胞増殖性疾患の治療のための遺伝子治療法を提供する。このような治療は、増殖性障害をもつ被検者の細胞中に、正常なＧＳＴＰ１プロモーター領域を単独で、あるいはＧＳＴＰ１構造遺伝子（センス）と組み合わせて含む適当なＧＳＴＰ１ポリヌクレオチドを導入することによって治療効果を達成する。あるいは、ＧＳＴＰ１構造遺伝子をＧＳＴＭ、ＧＳＴＡまたはその他のプロモーターなどの異種プロモーターと作動的に連結して導入することができる。センスＧＳＴＰプロモーターポリヌクレオチド構築体の送達は、キメラウイルスまたはコロイド分散システムなどの組換え発現ベクターを用いて行うことができる。
【００３３】
本発明の方法で用いるプロモーターポリヌクレオチド配列は天然、未メチル化配列であってよく、あるいは非メチル化可能な（nonmethylatable）類似体を配列内で置換した配列であってもよい。好ましくは、類似体は５−アザシタジンなどのシチジンの非メチル化可能な類似体である。その他の類似体も当業者には公知である。あるいは、このような非メチル化可能な類似体を単独で、あるいはＧＳＴＰ１のためのセンスプロモーターまたはＧＳＴＰ１の構造遺伝子と作動的に連結したセンスプロモーターと同時に、薬剤治療として被検者に投与することができる。
【００３４】
別の態様では、ＧＳＴＰ１構造遺伝子を組織特異的な異種プロモーターと作動的に連結して遺伝子治療に使用できる。例えば、ＧＳＴＰ１遺伝子を、前立腺組織中におけるＧＳＴＰ１の発現のための前立腺特異的プロモーターである前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）とライゲートする。あるいは、その他のＧＳＴ遺伝子のためのプロモーターをＧＳＴＰ１構造遺伝子と連結して遺伝子治療に使用できる。
【００３５】
本明細書で教示する遺伝子治療に使用できる各種ウイルスベクターには、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニア、または好ましくはレトロウイルスなどのＲＮＡウイルスを含む。レトロウイルスベクターはネズミまたはトリレトロウイルスであることが好ましい。１つの外来遺伝子を挿入できるレトロウイルスベクターの例には、モロニーネズミ白血病ウイルス（ＭｏＭｕＬＶ）、ハーベイネズミ肉腫ウイルス（ＨａＭｕＳＶ）、ネズミ乳癌ウイルス（ＭｕＭＴＶ）およびラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）を含むが、これに限定されない。さらに多数のレトロウイルスベクターには複数の遺伝子を導入することができる。これらのベクターは全て、形質導入された細胞を同定し作製できるような選択可能なマーカー遺伝子を伝達または導入できる。ウイルスベクター中に関心のあるＧＳＴＰ１配列（プロモーター領域を含む）を、例えば特異的標的細胞上の受容体に対するリガンドをコードする別の遺伝子とともに挿入することによって、ベクターは標的特異的となる。レトロウイルスベクターは例えば糖、糖脂質、またはタンパク質をコードするポリヌクレオチドを挿入することによって標的特異的にできる。レトロウイルスベクターを標的とする抗体を用いることによって標的化を行うことが好ましい。レトロウイルスゲノム中に挿入してＧＳＴＰの１センスまたはアンチセンスポリヌクレオチドを含むレトロウイルスベクターを標的特異的に送達できるような特異的ポリヌクレオチド配列は当業者に公知であり、あるいは過度の実験を行うことなくこれを容易に確認できる。
【００３６】
組換えレトロウイルスは欠損しているので、感染性のベクター粒子を作製するには補助を必要とする。この補助は例えば、ＬＴＲ内の制御配列のコントロール下にレトロウイルスの構造遺伝子の全てをコードするプラスミドを含むヘルパーセルラインを用いて提供することができる。これらのプラスミドは、キャプシド化のためのＲＮＡ転写物を認識するためのパッケージングメカニズムを可能にするヌクレオチド配列を欠く。パッケージングシグナルを欠失するヘルパーセルラインには例えばψ２、ＰＡ３１７およびＰＡ１２を含むが、これに限定されない。これらのセルラインはゲノムがパッケージングされていないので空のビリオンを生産する。パッケージングシグナルは完全であるが、構造遺伝子が別の関心のある遺伝子で置き換わったこのような細胞中にレトロウイルスベクターを導入すると、ベクターはパッケージングされベクタービリオンが生産される。
【００３７】
ＧＳＴＰ１ポリヌクレオチドを標的送達する別のシステムはコロイド分散システムである。コロイド分散システムには、巨大分子複合体、ナノカプセル、小球、ビーズ、ならびに水中油エマルジョン、ミセル、混合ミセルおよびリポソームを含む脂質をベースとした系を含む。本発明の好ましいコロイドシステムはリポソームである。リポソームはin vitroおよびin vivoでの送達担体として使用される人工膜小胞である。０．２−４．０ｕｍのサイズの大きな単ラメラ小胞（ＬＵＶ）は大きな巨大分子を含む水性バッファーの実質的部分を封入することができる。ＲＮＡ、ＤＮＡおよび完全なビリオンを水性内部に封入して生物学的活性型で細胞に送達できる（Fraley, et al., Trends Biochem. Sci., 6:77, 1981）。リポソームは哺乳動物細胞に加えて、植物、酵母および細菌細胞中にポリヌクレオチドを送達するのに使われてきた。リポソームが有効な遺伝子伝達担体であるためには、以下の性質をもっているべきである：（１）生物学的活性を損なうことなく高い効率で関心のある遺伝子を封入する；（２）非標的細胞と比較して標的細胞に優先的かつ実質的に結合する；（３）高い効率で小胞の水性内容物を標的細胞の細胞質に送達する；そして（４）遺伝子情報を正確かつ有効に発現する（Mannino, et al., Biotechniques, 6:682, 1988）。
【００３８】
リポソームの成分は、通常リン脂質、特に高い相転移温度のリン脂質と、通常ステロイド、特にコレステロールとの組み合わせである。その他のリン脂質またはその他の脂質も使用できる。リポソームの物理的性質はｐＨ、イオン強度、および二価カチオンの存在によって決まる。
【００３９】
リポソーム製造に使用する脂質の例には、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴリピッド、セレブロシド、およびガングリオシドなどのホスファチジル化合物を含む。特に有用なのは、脂質部分が１４−１８炭素原子、特に１６−１８炭素原子を含み、飽和されているジアシルホスファチジルグリセロールである。リン脂質の例としては、卵ホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリンおよびジステアロイルホスファチジルコリンを含む。
【００４０】
リポソームの標的化は解剖学的および機械的要因によって分類される。解剖学的分類は例えば器官特異的、細胞特異的、およびオルガネラ特異的な選択性のレベルに基づく。機械的標的化は受動的か能動的かで区別される。受動標的化では、洞状毛細管を含む器官にある細網内皮系（ＲＥＳ）の細胞中にリポソームが自然に分布する傾向を利用する。一方、能動標的では、自然に起きる局在部位以外の型の器官や細胞への送達を達成するために、リポソームをモノクローナル抗体、糖、糖脂質またはタンパク質などの特異的リガンドと結合するか、あるいはリポソームの成分やサイズを変えることによるリポソームの改変を含む。
【００４１】
標的化された送達システムの表面は様々な方法で修飾できる。リポソームで標的化する送達システムの場合、標的化リガンドをリポソームの二重層と安定に会合させて維持するために、リポソームの脂質二重層に脂質基を導入できる。様々な連結基が脂質鎖と標的リガンドとの結合に用い得る。
【００４２】
一般に、標的化された送達システムの表面に結合する化合物は、標的化された送達システムが所望の細胞を見つけて”居着く”ことができるようなリガンドおよび受容体でありうる。リガンドは受容体などの別の化合物と結合する関心のあるあらゆる化合物であってよい。
【００４３】
一般に、特異的エフェクター分子と結合する表面膜タンパク質を受容体と呼ぶ。本発明では、抗体が好ましい受容体である。リポソームが特異的細胞表面リガンドを標的とするために抗体を用いることができる。例えば、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）と呼ばれる腫瘍細胞上で特異的に発現するある種の抗原を、ＧＳＴＰ１抗体含有リポソームが悪性腫瘍を直接標的とする目的に使用できる。ＧＳＴＰ１遺伝子産物はその作用において細胞型に関して無差別であるので、標的化された送達システムは無差別に注射される非特異的リポソームよりもかなり改良されたものになる。好ましくは、標的組織は尿性器、特に前立腺組織である。腎臓および膀胱組織も使用できる。リポソーム二重層にポリクローナルまたはモノクローナル抗体を共有結合するには多数の方法を使用できる。抗体標的化されたリポソームには、それが標的細胞上の抗原エピトープと効率よく結合する限り、モノクローナルまたはポリクローナル抗体、またはＦａｂやＦ（ａｂ’）2などのその断片を含む。リポソームはホルモンまたはその他の血清因子のための受容体を発現する細胞を標的とすることもできる。
【００４４】
さらに別の態様では、本発明は低レベルのＧＳＴＰ１発現をもつ被検者をグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ誘導剤で治療することを含む。その他のクラスのＧＳＴの刺激はＧＳＴＰ１の不足を補う。このような誘導剤には、スルホフライン（sulfofurain）、オルティプラッツ（oltipraz）、ならびにその他の当業界で公知の物質を含む（Prochaska, et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci., USA, 89:2394, 1992; Zhang, et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci., USA, 89:2399, 1992; Prestera, et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci., USA, 90:2965, 1993）。
【００４５】
本発明はまた、ＧＳＴＰ１プロモーターポリヌクレオチドまたはＧＳＴＰ１構造遺伝子と作動的に連結したＧＳＴＰ１またはその他のＧＳＴプロモーターポリヌクレオチドを薬剤的に許容できる賦形剤または媒質中に含む医薬または薬剤組成物に関し、ここで上記医薬はＧＳＴＰ１に付随する細胞増殖性疾患の治療に用いられる。
【００４６】
米国において男性で最も多く診断される癌であるヒト前立腺癌（C.C. Boring, et al., Cancer J. Clin., 44:7, 1994）に関して、本発明はグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ遺伝子座におけるＤＮＡメチル化において均一な体細胞の変化があることを示す。ヒトπ−クラスＧＳＴをコードするＧＳＴＰ１遺伝子は、前立腺癌形成の過程におけるプロモーター高メチル化の結果として一般に不活性化されているようであり、驚くべきことに、ほとんどの前立腺癌では正常な前立腺組織と比較して検出可能なＧＳＴＰ１ポリペプチドのレベルが減少していた。
【００４７】
癌細胞に付随し、正常細胞に付随しないＧＳＴＰ１遺伝子と遺伝子の発現における変化を同定することは、細胞増殖性疾患を同定する理想的マーカーを提供する。より有効な診断と治療法を可能にする新規な癌マーカーが求められている。
【００４８】
以下の実施例は本発明を説明するものであって、限定するものではない。実施例は使用の典型例であって、当業者に公知のその他の方法をこれに代えて用いることができる。
【実施例】
【００４９】
実施例１：正常および新生物性ヒト前立腺組織中におけるπ−クラスグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼの発現
正常および新生物性前立腺細胞におけるＧＳＴＰ１発現をin vivoで評価するために、組織標本をα−ＧＳＴＰ１抗体を用いる免疫組織学的染色に付した。ホルマリン固定しパラフィン中に包理した前立腺組織切片を、イムノパーオキシダーゼ法（Vectastain）によってα−ＧＳＴＰ１抗血清（Oncor）を用いる免疫組織学的染色によりＧＳＴＰ１発現を評価した。図１は、ＧＳＴＰ１抗体で免疫染色した前立腺組織の結果を示す。
【００５０】
正常な前立腺組織では、ほとんどの全ての基底上皮細胞でＧＳＴＰ１の強い染色が見られた（図１、パネルＡ参照）。いくつかの正常な腺上皮細胞も免疫反応性ＧＳＴＰ１を含むように見えるが、ほとんどのものは検出しうる酵素を含まなかった（図１、パネルＢ）。ＧＳＴＰ１陽性またはＧＳＴＰ１陰性の腺上皮細胞をもつ小葉は、組織学的外観または解剖学的分布に差がなかった。それとは違って、ＧＳＴＰ１陽性の上皮細胞は、精丘、小室、前立腺管、射精管、および尿道を含む前立腺組織内にある全ての正常な上皮構造で検出された。ＧＳＴＰ１の陽性の免疫組織学的染色は、移行性細胞の異形成、鱗屑細胞の異形成、および良性の前立腺肥大（ＢＰＨ）に付随する過形成の病巣でも見られた。ほとんどの正常な前立腺上皮細胞ならびに良性の増殖性前立腺集団を含む細胞中には大量のＧＳＴＰ１が存在するにもかかわらず、前立腺癌の標本９１のうち８８は検出しうる免疫反応性のＧＳＴＰ１を含まなかった（図１、パネルＤ、ＥおよびＦ）。前立腺上皮内新形成（ＰＩＮ）が前悪性集団を表すものとして提案されている。おもしろいことに、ＰＩＮ集団の画分でも多くの上皮細胞でＧＳＴＰ１がなかった（図１、パネルＣ）。
【００５１】
実施例２：ヒト前立腺癌セルラインにおけるＧＳＴＰ１発現
ヒト前立腺癌におけるＧＳＴＰ１制御の分子メカニズムを研究するために、５つの十分樹立されたヒト前立腺癌セルライン（K. R. Stone, et al., Int. J. Cancer, 21:274, 1978）のＧＳＴＰ１発現を、ＧＳＴＰ１についてはイムノブロット分析、ＧＳＴＰ１ ｍＲＮＡについてはノーザンブロット分析によって評価した。5’-meＣ−感受性制限酵素認識部位を示すＧＳＴＰ１プロモーターの制限酵素地図を図３Ａに示す。図３Ｂは、5’-meＣ−感受性制限酵素ＢｓｓＨＩＩで切断し、ＧＳＴＰ１ ｃＤＮＡプローブとハイブリダイズしたヒト前立腺癌セルラインＤＮＡのサザン分析を示す。ヒト前立腺癌セルラインそれぞれの増殖する培養物から、ドデシル硫酸ナトリウム／プロテイナーゼＫによる除タンパクとそれに続くフェノール／クロロホルム抽出によって単離したＤＮＡをまずＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩで、次にＢｓｓＨＩＩで消化し、次いでアガロースゲルで電気泳動し、Ｚｅｔａｐｒｏｂｅ（BioRad）膜に移し、32Ｐ−標識したＧＳＴＰ１ ｃＤＮＡ（American Type Culture Collection）とハイブリダイズした。図３Ｃは、ＭｓｐＩおよびＨｐａＩＩの認識部位（垂直の矢印で示す）を示すＧＳＴＰ１遺伝子の制限酵素地図である。図３Ｄは、ＭｓｐＩまたはＨｐａＩＩで切断したヒト前立腺癌セルラインＤＮＡのサザン分析を示す（William C. Earnshaw, Johns Hopkins University School of Medicine, Baltimore, MD; Robert Wood Johnson-University of Medicine and Dentistry of New Jersey, Piscataway, NJ ）。
【００５２】
セルラインをイムノブロット分析およびノーザンブロット分析によっても試験した。イムノブロットでは、食塩水で洗浄した培養前立腺癌細胞を室温中、１０分、１４，０００ｘｇで遠心することにより回収し、タンパク質抽出バッファー（６２ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．８中の２％ドデシル硫酸ナトリウム、１０％グリセロールおよび１０ｍＭジチオスレイトール）中、９５℃に１０分加熱することにより溶解した。各細胞抽出物のＤＮＡ含量をジフェニルアミンアッセイを用いて評価した（Burton, Methods Enzymol., 123:163, 1968）。培養セルラインそれぞれから調製した等量の全タンパク質抽出物をポリアクリルアミドゲルの電気泳動にかけ、セミドライエレクトロブロッター（Millipore）を用いてニトロセルロース膜（Hybond-ECL; Amersham）に移し、文献記載の方法（Nelson, et al., Mol. Cell. Biol., 14:1815, 1994）で特異的抗血清を用いてＧＳＴＰ１とＤＮＡトポイソメラーゼＩポリペプチドのレベルを測定するイムノブロット分析に付した。ウサギα−ＧＳＴＰ１抗血清はOncorから入手し；ヒトα−トポイソメラーゼＩはWilliam C. Earnshaw (Johns Hopkins University School of Medicine, Baltimore, MD）から恵与された。
【００５３】
ノーザンブロット分析では、Chomczynski と Scacchiの方法（Anal. Biochem., 162:156, 1987）によって培養細胞から抽出した全ＲＮＡを用い、これをオルシノールアッセイ（Schneider, Methods Enzymol., 3:680, 1957）で定量し、ＭＯＰＳ−ホルムアルデヒドアガロースゲルの電気泳動にかけ、Ｚｅｔａｐｒｏｂｅ（BioRad）フィルターに移し、特異的ｃＤＮＡプローブとハイブリダイズすることによってＧＳＴＰ１およびＴＯＰ１ ｍＲＮＡのレベルを評価した。ＧＳＴＰ１ ｃＤＮＡはAmerican Type Culture Collectionから入手し；ＴＯＰ１ ｃＤＮＡは Leroy F. Liu (Robert Wood Johnson-University of Medicine and Dentitry of New Jersey, Piscataway, NJ）から恵与された。
【００５４】
ヒト前立腺癌ではin vivoでＧＳＴＰ１発現がなかったという観察と一致して、α−ＧＳＴＰ１抗血清を用いるイムノブロット分析ではＬＮＣａＰ細胞から調製したタンパク質抽出物中にＧＳＴＰ１ポリペプチドを検出できず（図２Ａ、レーン１）、また全ＲＮＡのノーザンブロット分析ではＬＮＣａＰセルラインから回収した全ＲＮＡ中にＧＳＴＰ１ ｍＲＮＡを検出できなかった（図２Ｂ、レーン１）。これとは対照的に、Ｄｕ−１４５細胞、ＰＣ−３細胞、ＰＰＣ細胞、およびＴＳＵ−Ｐｒ１細胞は大量のＧＳＴＰ１ポリペプチドとＧＳＴＰ１ ｍＲＮＡを含んでいるように思われた（図２Ａおよび２Ｂ、レーン２−５）。
【００５５】
実施例３：前立腺癌セルライン中のＧＳＴＰ１遺伝子座における５’制御配列のメチル化
ＧＳＴＰ１遺伝子の上流の潜在的５’制御領域の配列分析によって、ＴＡＴＡＡ−ボックス、２つの潜在的ＳＰ１結合部位、およびコンセンサスＡＰ−１部位のあることが明らかとなった（I.G. Cowell, et al., Biochem. J., 255:79, 1988; C.S. Morrow, et al., Gene, 75:3, 1989）。機能性プロモーターの研究により、転写開始部位の５’に位置する７２ヌクレオチド配列（ヌクレオチド−８０から−８）が、プロモーターのないクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）レポーター遺伝子とライゲートすると、一過性トランスフェクションアッセイ（C.S. Morrow, et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 176:233, 1991）で基底プロモーター活性を示すことが確認された。転写開始部位のすぐ５’側にある４００ヌクレオチドは約７２％のＣＧヌクレオチドを含み、４１がＣｐＧジヌクレオチドであることに注意を喚起する。哺乳動物遺伝子の制御領域中にあるＣｐＧジヌクレオチドのメチル化により転写活性が落ちることがよくある（I. Keshet, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 82:2560, 1985; I. Keshet, et al., Cell, 44:535, 1986; H. Cedar, Cell, 53:3, 1988; J. Boyes, et al., Cell, 64:1123, 1991; J.D. Lewis, et al., Cell, 69:905, 1992）。ＧＳＴＰ１プロモーターのメチル化における差異がヒト前立腺癌セルライン中で検出されるＧＳＴＰ１発現の差異と相関するかを決定するために、各セルラインから精製したＤＮＡを5’meＣ−感受性制限酵素ＢｓｓＨＩＩで消化し、ＧＳＴＰ１プローブを用いるサザンブロット分析に付した。
【００５６】
ＬＮＣａＰ細胞から単離し、この方法で研究したＤＮＡは、ＢｓｓＨＩＩ切断しなかった（図３Ｂ、レーン６）。ＬＮＣａＰ ＧＳＴＰ１プロモーターＤＮＡがＢｓｓＨＩＩ消化をしないことは、一般にＢｓｓＨＩＩによるＬＮＣａＰ ＤＮＡの消化が不十分なための結果であるとは考えられていない。サザンブロットをＴＰＩ（リン酸トリオースイソメラーゼ）遺伝子プローブ（L.E. Maquat, et al., J. Biol. Chem., 260:3748, 1985; J.R. Brown, et al., Mol. Cell. Biol., 5:1694, 1985）とハイブリダイズすると、ＢｓｓＨＩＩ部位での完全な消化が見られた（図３Ｂ）。
【００５７】
さらに、ＢｓｓＨＩＩがＬＮＣａＰ ＧＳＴＰ１プロモーターＤＮＡを切断しなかったことは、シトシンメチル化によるものであって、ＢｓｓＨＩＩ認識部位における突然変異によるものでないと思われた。なぜなら、ポリメラーゼチェインリアクション（ＰＣＲ）によってＬＮＣａＰ ＤＮＡから増幅されたＧＳＴＰ１プロモーター配列はＢｓｓＨＩＩによって容易に消化されるからである。さらに、近位ＧＳＴＰ１プロモーターの−１３２と−１０２の部位をぞれぞれ認識する5’meＣ−感受性の制限酵素であるＮｏｔＩとＳａｃＩＩを用いてもＬＮＣａＰ ＧＳＴＰ１制御配列は切断されない。これとは対照的に、Ｄｕ−１４５細胞、ＰＣ−３細胞、ＰＰＣ細胞およびＴｓｕ−Ｐｒ１細胞中に存在する大部分のＧＳＴＰ１対立遺伝子ではプロモーター配列の低メチル化（hypomethylation）が観察された（図３Ｂ）。これらのセルラインのそれぞれは大量のＧＳＴＰ１ ｍＲＮＡを発現しており（図２参照）、これはＧＳＴＰ１転写活性の上昇がＧＳＴＰ１プロモーターの低メチル化と関連することを示唆する。
【００５８】
さらに、ＧＳＴＰ１遺伝子に分布するいくつかの認識部位をもつアイソシゾマー(isoschizomers) であるＭｓｐＩとＨｐａＩＩで消化した前立腺癌セルラインＤＮＡのサザンブロット分析から、シトシン低メチル化とＧＳＴＰ１増加の相関は５’制御配列に存在するシトシン残基に限定されるようであった（図３、ＣおよびＤ）。その他の遺伝子に関していくつかのＣＧに富む５’制御配列で提案されたように、ＧＳＴＰ１プロモーター配列はメチル化−感受性の“ＣｐＧアイランド（island）”を構成するのかも知れない（A.P. Bird, Nature, 321:209, 1986）。
【００５９】
ＤＮＡのメチル化パターンは、in vitroで増殖させた細胞中では変化することが見いだされている（F. Antequera, et al., Cell, 62:503, 1990）。この点で興味深いことに、Ｄｕ−１４５細胞、ＰＣ−３細胞およびＰＰＣ細胞は低メチル化と高メチル化された両方のＧＳＴＰ１プロモーター配列を含むと思われた。これらのセルラインそれぞれの研究は、ＤＮＡの二倍体含量／細胞よりも多く含むことが知られている（K.R. Stone, et al., 前出）。Ｄｕ−１４５、ＰＣ−３およびＰＰＣセルラインではＧＳＴＰ１プロモーター配列の大部分が低メチル化されているが、サザンブロット分析では、各セルラインが5’-meＣ−感受性制限酵素ＢｓｓＨＩＩ切断をしないＧＳＴＰ１プロモーター配列をいくらか含むことを示しており（図３参照）、これは少なくとも１つのＧＳＴＰ１対立遺伝子を含むプロモーターの高メチル化と一致する。ＬＮＣａＰセルラインの場合と同様に、これらの細胞からのＤＮＡ中のＧＳＴＰ１プロモーター配列をＢｓｓＨＩＩで切断できないことは、ＴＰＩ遺伝子中のＢｓｓＨＩＩ部位を完全に消化しても生じる（図３）。Ｔｓｕ−Ｐｒ１細胞から単離したＤＮＡはＧＳＴＰ１プロモーターメチル化の証拠を何も示さなかった（図３）。合計すると、メチル化されたＧＳＴＰ１プロモーター配列は、５つのヒト前立腺癌セルライン中の４つで存在した。もしもセルラインに用いた親腫瘍中でＧＳＴＰ１遺伝子がプロモーターの高メチル化によって不活性化されていると、Ｄｕ−１４５、ＰＣ−３、ＰＰＣおよびＴｓｕ−Ｐｒ１セルラインは、ＧＳＴＰ１対立遺伝子のいくつかにおけるプロモーター脱メチル化の結果として、in vitroでの連続増殖中にＧＳＴＰ１発現が再度活性化したのかも知れない。
【００６０】
実施例４：正常な成人組織中におけるin vivoでのＧＳＴＰ１プロモーターメチル化の状態
ＧＳＴＰ１プロモーターのメチル化は今まで文献に記載されていない（V. Daniel, CRC Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol., 28:173, 1993）。ＧＳＴＰ１プロモーターの高メチル化が正常な生理学的細胞分化の過程で起きるのか否かを決定するために、異なるＧＳＴＰ１発現パターンをもつ正常なヒト組織から単離したＤＮＡを、5’-meＣ−感受性制限酵素ＢｓｓＨＩＩで消化しサザンブロット分析に付した。剖検で回収した正常なヒト組織標本から単離したＤＮＡのＧＳＴＰ１ ｃＤＮＡプローブを用いたサザンブロット分析を図３で上述したようにして実施した。図４Ａは、ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩでまず消化し、次にＢｓｓＨＩＩの存在下または不在下に消化した正常な組織を示す。図４Ｂは、前立腺疾患にかかっていない種々の年齢の男性から剖検で回収した正常な前立腺組織から調製し、ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢｓｓＨＩＩで消化したＤＮＡを示す。
【００６１】
正常な前立腺、貯精嚢、食道、腎臓、肝臓、肺または脾臓から単離したＤＮＡ中にはメチル化されたＧＳＴＰ１プロモーター配列を示す証拠は検出されなかった（図４Ａ）。
【００６２】
ＧＳＴＰ１プロモーター配列の高メチル化が正常な前立腺細胞で加齢の過程で起きるのかどうかを評価するために、種々の年齢の男性から回収した正常な前立腺組織標本から調製したＤＮＡも分析した（図４Ｂ参照）。ここでも、正常な前立腺組織のいずれにもＧＳＴＰ１プロモーターの高メチル化を示す証拠はなかった。
【００６３】
実施例５：前立腺癌におけるＧＳＴＰ１プロモーターの高メチル化
研究したほとんどのヒト前立腺癌セルライン由来のＤＮＡ中で高メチル化されたＧＳＴＰ１プロモーターを検出したが、正常なヒト組織から調製したＤＮＡ中ではほとんど見られなかった。さらに、α−ＧＳＴＰ１抗体を用いる免疫組織学的染色で試験したヒト前立腺癌標本の大部分でＧＳＴＰ１発現がなかった。ＧＳＴＰ１プロモーターの高メチル化が前立腺の癌形成中にin vivoで起こるのかどうかを決定するために、ヒト前立腺癌標本から単離したＤＮＡを5’-meＣ−感受性制限酵素ＢｓｓＨＩＩで消化し、次にＧＳＴＰ１プローブを用いるサザンブロット分析に付した（図５）。外科的切除で回収した前立腺癌（ＣＡ）からＤＮＡを単離した。さらに、前記外科的切除標本に付随する、癌組織に隣接するおおむね正常な前立腺組織（ＰＲＯＳ）、良性の前立腺過形成（ＢＰＨ）、および正常な貯精嚢（ＳＶ）からＤＮＡを調製した。次にＤＮＡをＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢｓｓＨＩＩで消化し、図３で上述したようにしてＧＳＴＰ１ ｃＤＮＡを用いるサザンブロット分析に付した。図５Ａは、貯精嚢（ＳＶ）と前立腺癌（ＣＡ）ＤＮＡの対を示す。図５Ｂは、おおむね正常な前立腺（ＰＲＯＳ）と前立腺癌（ＣＡ）ＤＮＡの対を示す。図５Ｃは、同じ外科的切除標本からのおおむね正常な前立腺（ＰＲＯＳ）、良性の前立腺過形成（ＢＰＨ）、および前立腺癌（ＣＡ）を示す。矢印はＢｓｓＨＩＩで切断されないＧＳＴＰ１制限酵素断片の移動位置を示す。
【００６４】
研究に用いた前立腺癌のそれぞれは、正常な組織から調製した対になった対照ＤＮＡと比較して、ＧＳＴＰ１プロモーターの高メチル化が増加している証拠を示した（図５）。前立腺上皮細胞にとって、ＧＳＴＰ１プロモーター配列のメチル化の増加は悪性癌形成の過程に特有であるかも知れない。根治的前立腺切除術によって外科的に除去した前立腺癌の５つのケースでは、正常な前立腺、良性の前立腺過形成（ＢＰＨ）、または前立腺癌を含む、同じ前立腺組織切除標本の異なる領域からＤＮＡを選択的に調製した（図５Ｃ）。ＢｓｓＨＩＩ−消化したＤＮＡサンプルを含むサザンブロットをＧＳＴＰ１プローブとハイブリダイズすると、各癌標本中でＧＳＴＰ１プロモーター配列の明らかな高メチル化が検出された（図５Ｃ、レーン３、６、９、１９および１５）が、ＢＰＨ標本では全く検出されなかった（図５Ｃ、レーン２、５、８、１１および１４）。あるケースでは、おおむね正常な前立腺組織から調製したＤＮＡも、いくらかメチル化されたプロモーター配列をもつＧＳＴＰ１対立遺伝子を含むように思われた（図５、レーン１０）。これは、メチル化されたＧＳＴＰ１プロモーターを含む顕微的癌によるおおむね正常な前立腺組織の侵潤によるためなのか、おおむね正常な前立腺組織中の前立腺上皮内新形成（ＰＩＮ）病変内のＧＳＴＰ１プロモーターの高メチル化によるためなのか、あるいは組織学的には正常な前立腺上皮細胞中のＧＳＴＰ１プロモーターの高メチル化によるためなのか、はまだ確認されていない。しかしながら、それでもＧＳＴＰ１プロモーターＤＮＡの高メチル化は、前立腺での新生物のトランスフォーメーション（悪性転換）に特異的であるように思われ、前立腺癌をもたない男性からの正常な前立腺組織は、検出しうるＧＳＴＰ１制御配列のメチル化を含まなかった（図４Ｂ）。
【００６５】
この研究で集められた全てのデータは、ＧＳＴＰ１発現の低下およびＧＳＴＰ１プロモーターの高メチル化が前立腺上皮細胞の悪性トランスフォーメーションで普通に起こることを示す。ＣｐＧアイランド配列の高メチル化としてしばしば明示される局所的メチル化の変化が癌形成で重要な役割を果たすことが提案されている（L.E. Maquat, et al., J. Biol. Chem. 260:3748, 1985; J.R. Brown,
et al., Mol. Cell. Biol., 5:1694, 1985）。ヒト前立腺癌には高メチル化された５’ＧＳＴＰ１制御配列があるが、正常組織にはないという優勢な知見がこの一般的な提案を支持している。残念なことに、特異的常染色体対立遺伝子のde novo での局所的高メチル化が癌細胞で起きるメカニズムはまだよくわかっていない。異常なＤＮＡメチル化が新生物細胞で付随する。ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ活性の増加（T.L. Kautainien, et al., J. Biol. Chem., 261:1594, 1986）、ならびにＤＮＡ−ＭＴ ｍＲＮＡレベルの上昇（W.S. El-Deiry, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:3470, 1991）の両方が新生物細胞で検出されてきた。おもしろいことに、ＤＮＡ−ＭＴ ｍＲＮＡの増加が結腸癌形成過程の初期に観察され、これはいくつかの組織学的に正常な結腸粘膜標本においても観察される。
【００６６】
上述の記載は説明のためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。実際、当業者であればここに記載の技術に基づいて過度の実験を行うことなく、さらに別の態様を容易に考え、生み出すことができる。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】正常前立腺組織（パネルＡ、Ｂ）、前立腺上皮内新形成（ＰＩＮ）（パネルＣ）および前立腺癌組織（パネルＤ−Ｆ）の、抗−ＧＳＴＰ１抗血清による免疫組織学的染色を示す。
【図２】ヒト前立腺癌セルラインにおけるＧＳＴＰ１発現のイムノブロット（パネルＡ）およびノーザンブロット（パネルＢ）分析を示す。
【図３】ＧＳＴＰ１プロモーターの制限酵素地図（パネルＡ）、ＢｓｓＨＩＩで切断したヒト前立腺癌セルラインＤＮＡのサザンブロット（パネルＢ）、ＧＳＴＰ１遺伝子の制限酵素地図（パネルＣ）、およびＭｓｐＩまたはＨｐａＩＩで切断したヒト前立腺癌セルラインＤＮＡのサザンブロット（パネルＤ）を示す。
【図４】ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、次にＢｓｓＨＩＩの存在下または不在下に消化した正常成人組織（パネルＡ）；ならびにＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢｓｓＨＩＩで消化した前立腺組織ＤＮＡ（パネルＢ）のサザンブロット分析を示す。
【図５】前立腺癌由来のＤＮＡにおけるＧＳＴＰ１プロモーターの高メチル化を示す。同じ手術で摘出した標本から由来する、パネルＡは貯精嚢（ＳＶ）および前立腺癌（ＣＡ）ＤＮＡを示し；パネルＢはおおむね正常な前立腺（ＰＲＯＳ）およびＣＡを示し；そしてパネルＣはＰＲＯＳ、ＣＡおよび良性の前立腺過形成（ＢＰＨ）を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般には癌の診断に関し、特に前立腺組織の細胞増殖性疾患の診断上の指標として、高メチル化（hypermethylated）グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴＰ１）プロモーターを同定することに関する。
【背景技術】
【０００２】
現存の癌試験は非特異的であることが多く、そのために臨床上の有用性が限定されている。例えば、癌の診断とモニターの両方で広く使われている生化学試験では癌胎児性抗原（ＣＥＡ）のレベルを測定する。ＣＥＡは胎児組織に大量に検出される癌胎児性抗原であるが、正常な成人組織にも少量存在する。ある種の消化器癌の患者の血清には高いレベルのＣＥＡが含まれており、これを免疫学的方法で測定することができる。血清中のＣＥＡ量はこれらの腫瘍の軽快または再発と関連しており、外科的に腫瘍を除去するとそのレベルは急激に減少する。ＣＥＡレベルの再度の上昇は悪性細胞が再発したことを示唆する。しかしながら、ＣＥＡはほとんど全ての成人に低レベルで存在する正常な糖タンパク質でもある。さらに、ＣＥＡタンパク質が非悪性状態でも上昇することがあり、また多くの癌で上昇しないこともあるという事実のために、ＣＥＡと癌の関連性は極めてあいまいなものとなっている。従って、ＣＥＡは癌マーカーとしては理想から程遠いものである。
【０００３】
ヒトの癌細胞は典型的には、決定的な遺伝子の突然変異、増幅または欠失によって特徴付けられる体細胞の変化したゲノムを含む。さらに、ヒト癌細胞由来のＤＮＡテンプレートはＤＮＡのメチル化において体細胞の変化を示すことが多い（E.R. Fearon, et al., Cell, 61:759, 1990; P.A. Jones, et al., Cancer Res., 46:461, 1986; R. Holliday, Science, 238:163, 1987; A. De Bustros, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 85:5693, 1988; P.A. Jones, et al., Adv. Cancer Res., 54:1, 1990; S.B. Baylin, et al., Cancer Cells, 3:383, 1991; M. Makos, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 89:1929, 1992; N. Ohtani-Fujita, et al., Oncogene, 8:1063, 1993）。しかしながら、ヒトの腫瘍形成における異常なＤＮＡメチル化の正確な役割は分かっていない。ＤＮＡメチラーゼは普遍的なメチル供与体であるＳ−アデノシルメチオニンからＤＮＡ上の特異的部位にメチル基を転移させる。いくつかの生物学的機能がＤＮＡ中のメチル化された塩基によるものであるとされている。最も確立されている生物学的機能は、同種の制限酵素による消化からＤＮＡを保護することである。制限酵素修飾現象は現在までのところ細菌のみで観察されている。しかしながら、哺乳動物細胞はグアニン（ＣｐＧ）の５’近辺にあるＤＮＡ上のシトシン残基のみをメチル化する異なるメチラーゼをもつ。このメチル化が遺伝子活性、細胞分化、腫瘍形成、Ｘ染色体不活性化、ゲノム刷り込み（imprinting）およびその他の主要な生物学的プロセスである役割を果たしていることがいくつかの証拠から示されている（Razin, A., H., and Riggs, R.D.編集、 DNA Methylation Biochemistry and Biological Significance, Springer-Verlag, New York, 1984）。
【０００４】
グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）は、化学的に反応性の親電子体をグルタチオオンと結合することによって親電子的発癌物質を不活性化させることを含む、細胞内の脱毒性化反応を触媒する（C.B. Pickett, et al., Annu.Rev. Biochem., 58:743, 1989; B. Coles, et al., CRC Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol., 25:47, 1990; T.H. Rushmore, et al., J. Biol. Chem. 268:11475, 1993）。異なる遺伝子座でいくつかの異なる遺伝子によってコードされるヒトＧＳＴは、α、μ、π、およびテータ(theta) と呼ばれる４つのファミリーに分類されている（B. Mannervik, et al., Biochem. J., 282:305, 1992）。
【０００５】
多くのヒトの癌ではそれらの元の組織と比較してＧＳＴＰ１の発現が増加していることが示されている（S. Tsuchida, et al., CRC Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol., 27:337, 1992）。癌のような細胞増殖性疾患の存在と相関する意味のあるマーカーを提供することが従来限定され、また失敗してきたために、このような障害の進展を診断しモニターするのに使用できるマーカーの必要性が生じている。本発明はこのような必要性を満足するものである。
【発明の開示】
【０００６】
本発明は、ほとんどの前立腺癌が正常な前立腺組織と比較してＧＳＴＰ１ポリペプチドのレベルが低下しているという予期せぬ発見に基づく。さらに研究を行ったところ、細胞内でのＧＳＴＰ１の翻訳の低下はＧＳＴＰ１プロモーターの高メチル化によるものであり、それによってＧＳＴＰ１の転写が低下することが示された。
【０００７】
ある態様では、本発明は、細胞成分をＧＳＴＰ１を検出する試薬と接触させることを含む、被検者の前立腺組織またはその他のサンプル中の細胞増殖性疾患を検出する方法を提供する。例えば、高メチル化されたＧＳＴＰ１プロモーターを同定するためにメチル化感受性制限酵素を用いることができる。さらに、疑われる組織由来の核酸またはタンパク質をＧＳＴＰ１−特異的核酸プローブまたは抗体とそれぞれ接触させてそのレベルを正常組織のレベルと比較することによって、低下したＧＳＴＰ１ ｍＲＮＡおよびＧＳＴＰ１タンパク質を検出することができる。
【０００８】
別の態様では、ＧＳＴＰ１の発現に付随する細胞増殖性疾患を治療する方法を提供する。この方法は、障害をもつ被検者に、治療的有効量の試薬、例えばＧＳＴＰ１の発現を調節するセンスＧＳＴＰ１プロモーターや構造遺伝子を投与することを含む。
【０００９】
発明の詳細な説明
本発明は、ヒトπ−クラスのグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ構造遺伝子ＧＳＴＰ１の高メチル化プロモーターが前立腺の癌形成と正の相関を有することを明らかにするものである。この予期せぬ発見により、制限酵素分析によって直接的に、あるいはＧＳＴＰ１ ｍＲＮＡまたはＧＳＴＰ１遺伝子産物の検出によって間接的に、高メチル化プロモーターを検出する簡単なアッセイによって前立腺組織の細胞増殖性疾患を検出することが可能となる。例えば、高メチル化プロモーターを非メチル化プロモーターで置換することに焦点をあてた治療法が今や可能となった。
【００１０】
”プロモーター”の語は、構造遺伝子の上流または５’に位置する制御領域をいう。ＧＳＴＰ１のプロモーター領域の配列分析は、ヌクレオチドの約７２％がＣＧであり、約１０％がＣｐＧジヌクレオチドであることを示す。
【００１１】
本発明は、ＧＳＴＰ１を発現することまたはＧＳＴＰ１関連の障害をもつことが疑われる標的細胞成分をこの成分と結合する試薬と接触させることを含む、被検者の組織中のＧＳＴＰ１を発現する細胞またはＧＳＴＰ１と関連する細胞増殖性疾患を検出する方法を提供する。標的細胞成分はＤＮＡまたはＲＮＡなどの核酸、あるいはタンパク質でありうる。成分が核酸であるときは、試薬は核酸プローブまたはＰＣＲプライマーである。細胞成分がタンパク質であるときは、試薬は抗体プローブである。プローブは例えば、放射性同位体、蛍光化合物、生物発光化合物、化学発光化合物、金属キレーター、または酵素で検出可能なように標識することができる。抗体に結合するための適当なその他の標識は当業者には公知であり、あるいは日常的実験を用いてこれを確認することができる。
【００１２】
本発明では、ＧＳＴＰ１転写のレベル低下がＧＳＴＰ１プロモーターの高メチル化の結果であることが多い、ということを示すので、このプロモーターが高メチル化されているか否かを決定することが望ましい。一般に、活発に転写された遺伝子はＤＮＡ中の平均数よりも少ないメチル化ＣＧを含む。高メチル化は制限酵素処理とサザンブロット分析によって検出できる。従って、本発明の方法では、検出される細胞性成分がＤＮＡであるときには、ＧＳＴＰ１プロモーターの高メチル化を検出するのに制限酵素分析が好ましい。認識部位の一部としてＣＧを含み、Ｃがメチル化されたときに阻害される制限酵素であれば何でも使用できる。好ましくは、メチル化感受性の制限酵素はＢｓｓＨＩＩ、ＭｓｐＩまたはＨｐａＩＩであり、これを単独または組み合わせて使用する。その他のメチル化感受性の制限酵素も当業者には公知である。
【００１３】
本発明の目的達成のために、ＧＳＴＰ１に特異的な抗体または核酸プローブを、生物学的流体または組織中のＧＳＴＰ１ポリペプチド（抗体を用いて）またはポリヌクレオチド（核酸プローブを用いて）の存在を検出するのに使用できる。ＧＳＴＰ１配列中の全てのコーディング配列領域に基づくオリゴヌクレオチドプライマーを、例えばＰＣＲによってＤＮＡを増幅するのに使用できる。検出できる量のポリヌクレオチドまたは抗原を含む全ての標本が使用できる。本発明の好ましいサンプルは尿性器由来の組織、特に前立腺組織である。サンプルは上皮細胞を含んでいることが好ましい。あるいは、ＧＳＴＰ１関連の細胞増殖性疾患を示す細胞を含む射精精液、尿または血液などの生物学的流体を使用することができる。好ましい被検者はヒトである。
【００１４】
高い感受性をもたらす別の方法は、抗体を低分子量のハプテンと結合することからなる。これらのハプテンは第２の反応によって特異的に検出できる。例えば、アビジンと反応するビオチン、または特異的抗ハプテン抗体と反応するジニトロフェノール、ピリドキサール、およびフルオレセインなどのハプテンを用いることが多い。
【００１５】
上述した本発明のＧＳＴＰ１を発現する細胞またはＧＳＴＰ１に関連する細胞増殖性疾患を検出する方法は、臨床上の軽快状態中にある被検者に前立腺癌またはその他の悪性物が残っているかの検出に用いることができる。さらに、細胞中のＧＳＴＰ１ポリペプチドを検出する方法は、被検者組織中でＧＳＴＰ１を発現する細胞中のＧＳＴＰ１レベルを正常細胞または組織中で発現するＧＳＴＰ１と比較して測定することによる細胞増殖性疾患の検出に使用できる。本発明の方法を用いて、細胞中のＧＳＴＰ１発現を同定し、適当な治療法（例えば、センス遺伝子治療や薬剤治療）を用いることができる。本発明によるＧＳＴＰ１の発現パターンは、例えば前立腺上皮内新生体（ＰＩＮ）で見られるように（McNeal, et al., Human Pathol., 17:64, 1986）、悪性度の段階によって変化するので、前立腺組織などのサンプルをＧＳＴＰ１−特異的試薬（すなわち、核酸プローブまたはＧＳＴＰ１に対する抗体）のパネルでスクリーニングして、ＧＳＴＰ１発現を検出し、細胞の悪性度の段階を診断する。
【００１６】
本発明の方法で用いるモノクローナル抗体は、例えば液相または固相担体に結合して用いるイムノアッセイで用いるのに適している。さらに、これらのイムノアッセイでモノクローナル抗体を各種方法で検出可能なように標識できる。本発明のモノクローナル抗体を用いるイムノアッセイのタイプの例としては、直接または間接フォーマットの競合的および非競合的イムノアッセイが挙げられる。このようなイムノアッセイの例には、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）およびサンドイッチ（イムノメトリック）アッセイがある。本発明のモノクローナル抗体を用いる抗原の検出は、生理学的サンプル上での免疫組織学的アッセイを含む、順行、逆行、または同時モードで流すイムノアッセイを用いて行うことができる。当業者であれば過度の実験を行うことなくその他のイムノアッセイフォーマットを容易に認識することができる。
【００１７】
”イムノメトリックアッセイ”または”サンドイッチイムノアッセイ”の語は、同時サンドイッチ、順行サンドイッチおよび逆行サンドイッチイムノアッセイを含む。これらの用語は当業者に公知である。当業者であれば、本発明の抗体を現在公知であるか、または将来開発されるその他の各種のアッセイフォーマットに使用できることも理解するであろう。これらも本発明の範囲に含まれる。
【００１８】
モノクローナル抗体は多くの異なる担体と結合してＧＳＴＰ１の存在を検出するのに使用できる。よく知られた担体の例には、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然および修飾セルロース、ポリアクリルアミド、アガロースおよびマグネタイトを含む。担体の性質は本発明の目的により可溶性または不溶性のいずれかでありうる。当業者にはモノクローナル抗体を結合するその他の適当な担体が公知であり、あるいは日常的実験により確認することができる。
【００１９】
本発明の目的のために、ＧＳＴＰ１が生物学的流体または組織中に存在するときはモノクローナル抗体によって検出することができる。検出しうる量でＧＳＴＰ１を含むあらゆるサンプルを用いることができる。サンプルは射精精液、尿、唾液、脳脊髄液、血液、血清などの液体、または組織、糞便などの固体または半固体、あるいは組織学的診断で通常使用されるような固体組織であってよい。
【００２０】
アッセイを実施するときには、インキュベーション媒質にある種の”ブロッカー”を含むことが望ましい（通常は標識した可溶性抗体とともに添加する）。”ブロッカー”は、実験サンプル中に存在する非特異的タンパク質、プロテアーゼ、または抗−ＧＳＴＰ１免疫グロブリンに対する抗−異好性免疫グロブリンが、固相支持体上の抗体又は、放射標識したインジケーターと交差反応したり破壊したりして誤った陽性結果や誤った陰性結果をもたらさないことを確認するために添加する。従って、”ブロッカー”の選択は本発明で記載するアッセイの特異性を実質的に高くする。
【００２１】
本アッセイで使用するのと同じクラスまたはサブクラス（イソタイプ）の多数の関連のない（すなわち非特異的）抗体（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＭなど）を”ブロッカー”として使用できる。正しい感度を維持し、なおかつ標本中の相互に交差する反応性タンパク質による好ましくない妨害を阻止するためには、”ブロッカー”の濃度（通常１−１００μｇ／μＬ）が重要である。
【００２２】
抗原のin vivo検出にモノクローナル抗体を使用するときは、診断的に有効な用量で検出可能なように標識されたモノクローナル抗体を用いる。”診断的に有効な”の語とは、検出可能なように標識されたモノクローナル抗体を、該モノクローナル抗体が特異的なＧＳＴＰ１抗原をもつ部位の検出を可能にするのに十分な量で投与することを意味する。
【００２３】
投与する検出可能なように標識されたモノクローナル抗体の濃度は、ＧＳＴＰ１をもつ細胞との結合がバックグランドと比較して検出可能であるのに十分であるべきである。さらに、最良の標的−対−バックグランドのシグナル比を得るためには、検出可能なように標識されたモノクローナル抗体が循環系から迅速に除去されることが望ましい。
【００２４】
一般に、in vivo診断のための検出可能なように標識されたモノクローナル抗体の用量は個々人の年齢、性別、および病気の程度によって変更する。モノクローナル抗体の用量は約０．００１ｍｇ／ｍ2から約５００ｍｇ／ｍ2、好ましくは０．１ｍｇ／ｍ2から約２００ｍｇ／ｍ2、最も好ましくは約０．１ｍｇ／ｍ2から約１０ｍｇ／ｍ2で変更しうる。このような用量は例えば、複数の注射をするか、腫瘍の重症度、および当業者に公知のその他の要因によって変更しうる。
【００２５】
In vivoの診断画像では、放射性同位体を選択するうえでどのタイプの検出装置が可能かが主な要因である。選択した放射性同位体は一定のタイプの装置で検出可能な崩壊型をもっていなければならない。In vivo診断のための放射性同位体の選択における別の重要な要因は、放射性同位体の半減期が、標的による最大取り込み時にも検出可能である程度に長く、しかも宿主への有害な放射が最小となる程度に短いことである。理想的には、in vivo画像で使用する放射性同位体は粒子放出を欠くが、１４０−２５０ｋｅＶの範囲で多数の光子を発生するものであり、光子は慣用のガンマカメラで容易に検出できる。
【００２６】
In vivo診断のためには、放射性同位体を中間的官能基を用いて直接的または間接的に免疫グロブリンに結合することができる。金属イオンとして存在する放射性同位体を免疫グロブリンに結合するためによく用いられる中間的官能基は、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）やエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）などの二官能性キレート剤および同様の分子である。本発明のモノクローナル抗体に結合することのできる金属イオンの典型的例には111Ｉｎ、97Ｒｕ、67Ｇａ、68Ｇａ、72Ａｓ、89Ｚｒ、および201Ｔｌが挙げられる。
【００２７】
本発明の方法で使用するモノクローナル抗体を磁気共鳴画像（ＭＲＩ）または電子スピン共鳴（ＥＳＲ）におけるように、in vivo診断目的用の常磁性同位体で標識することもできる。一般に、診断画像を可視化するあらゆる従来法を用いることができる。通常、カメラ画像やＭＲＩ用の常磁性同位体にはガンマ線および陽電子を放出する放射性同位体を用いる。このような方法に特に有用な原子は、157Ｇｄ、55Ｍｎ、162Ｄｙ、52Ｃｒ、および56Ｆｅを含む。
【００２８】
本発明の方法で使用するモノクローナル抗体を用いてＧＳＴＰ１関連の細胞増殖性疾患の回復過程をモニターすることができる。従って、ＧＳＴＰ１を発現する細胞数の増減または射精精液または尿などの各種体液中に存在するＧＳＴＰ１の変化を測定することによって、障害の回復を目的とする特定の治療法が有効であるかどうかを決定することができる。
【００２９】
本発明はまた、ＧＳＴＰ１関連の細胞増殖性疾患をもつ被検者を治療する方法を提供する。前立腺癌では、正常細胞中での発現と比較してＧＳＴＰ１ヌクレオチド配列が発現低下しているので、この配列に向けられた適当な治療または診断法を開発することが可能である。従って、細胞増殖性疾患が悪性を伴うＧＳＴＰ１の発現と関連する場合には、転写または翻訳レベルでＧＳＴＰ１の発現を調節する核酸配列を用いることができる。細胞増殖性疾患または異常細胞の表現型がＧＳＴＰ１の発現低下と関連する場合には、例えばＧＳＴＰ１をコードする核酸配列（センス）を障害をもつ被検者に投与することができる。
【００３０】
”細胞増殖性疾患”の語は、形態的および遺伝子型的に周囲の組織とは異なって現れる悪性ならびに非悪性の細胞集団を意味する。このような障害は例えばＧＳＴＰ１発現のないことと関連する。本質的に、ＧＳＴＰ１発現と病因的に関連付けられる全ての障害が、ＧＳＴＰ１発現を調節する本発明の試薬を用いる治療に感受性であると考えられる。
【００３１】
”調節する”の語は、ＧＳＴＰ１が発現低下している場合には、ＧＳＴＰ１プロモーターのメチル化の抑制またはその他のＧＳＴ遺伝子の発現増強を意味する。細胞増殖性疾患がＧＳＴＰ１発現と関連する場合には、５−アザシタジンなどのメチル化抑制剤を細胞に導入することができる。あるいは、細胞増殖性疾患がＧＳＴＰ１ポリペプチドの発現低下と関連する場合には、プロモーター領域または構造遺伝子と作動的に連結したプロモーターをコードするセンスポリヌクレオチド配列（ＤＮＡコーディング鎖）を細胞に導入する。
【００３２】
本発明はまた、ＧＳＴＰ１によって媒介される細胞増殖性疾患の治療のための遺伝子治療法を提供する。このような治療は、増殖性障害をもつ被検者の細胞中に、正常なＧＳＴＰ１プロモーター領域を単独で、あるいはＧＳＴＰ１構造遺伝子（センス）と組み合わせて含む適当なＧＳＴＰ１ポリヌクレオチドを導入することによって治療効果を達成する。あるいは、ＧＳＴＰ１構造遺伝子をＧＳＴＭ、ＧＳＴＡまたはその他のプロモーターなどの異種プロモーターと作動的に連結して導入することができる。センスＧＳＴＰプロモーターポリヌクレオチド構築体の送達は、キメラウイルスまたはコロイド分散システムなどの組換え発現ベクターを用いて行うことができる。
【００３３】
本発明の方法で用いるプロモーターポリヌクレオチド配列は天然、未メチル化配列であってよく、あるいは非メチル化可能な（nonmethylatable）類似体を配列内で置換した配列であってもよい。好ましくは、類似体は５−アザシタジンなどのシチジンの非メチル化可能な類似体である。その他の類似体も当業者には公知である。あるいは、このような非メチル化可能な類似体を単独で、あるいはＧＳＴＰ１のためのセンスプロモーターまたはＧＳＴＰ１の構造遺伝子と作動的に連結したセンスプロモーターと同時に、薬剤治療として被検者に投与することができる。
【００３４】
別の態様では、ＧＳＴＰ１構造遺伝子を組織特異的な異種プロモーターと作動的に連結して遺伝子治療に使用できる。例えば、ＧＳＴＰ１遺伝子を、前立腺組織中におけるＧＳＴＰ１の発現のための前立腺特異的プロモーターである前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）とライゲートする。あるいは、その他のＧＳＴ遺伝子のためのプロモーターをＧＳＴＰ１構造遺伝子と連結して遺伝子治療に使用できる。
【００３５】
本明細書で教示する遺伝子治療に使用できる各種ウイルスベクターには、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニア、または好ましくはレトロウイルスなどのＲＮＡウイルスを含む。レトロウイルスベクターはネズミまたはトリレトロウイルスであることが好ましい。１つの外来遺伝子を挿入できるレトロウイルスベクターの例には、モロニーネズミ白血病ウイルス（ＭｏＭｕＬＶ）、ハーベイネズミ肉腫ウイルス（ＨａＭｕＳＶ）、ネズミ乳癌ウイルス（ＭｕＭＴＶ）およびラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）を含むが、これに限定されない。さらに多数のレトロウイルスベクターには複数の遺伝子を導入することができる。これらのベクターは全て、形質導入された細胞を同定し作製できるような選択可能なマーカー遺伝子を伝達または導入できる。ウイルスベクター中に関心のあるＧＳＴＰ１配列（プロモーター領域を含む）を、例えば特異的標的細胞上の受容体に対するリガンドをコードする別の遺伝子とともに挿入することによって、ベクターは標的特異的となる。レトロウイルスベクターは例えば糖、糖脂質、またはタンパク質をコードするポリヌクレオチドを挿入することによって標的特異的にできる。レトロウイルスベクターを標的とする抗体を用いることによって標的化を行うことが好ましい。レトロウイルスゲノム中に挿入してＧＳＴＰの１センスまたはアンチセンスポリヌクレオチドを含むレトロウイルスベクターを標的特異的に送達できるような特異的ポリヌクレオチド配列は当業者に公知であり、あるいは過度の実験を行うことなくこれを容易に確認できる。
【００３６】
組換えレトロウイルスは欠損しているので、感染性のベクター粒子を作製するには補助を必要とする。この補助は例えば、ＬＴＲ内の制御配列のコントロール下にレトロウイルスの構造遺伝子の全てをコードするプラスミドを含むヘルパーセルラインを用いて提供することができる。これらのプラスミドは、キャプシド化のためのＲＮＡ転写物を認識するためのパッケージングメカニズムを可能にするヌクレオチド配列を欠く。パッケージングシグナルを欠失するヘルパーセルラインには例えばψ２、ＰＡ３１７およびＰＡ１２を含むが、これに限定されない。これらのセルラインはゲノムがパッケージングされていないので空のビリオンを生産する。パッケージングシグナルは完全であるが、構造遺伝子が別の関心のある遺伝子で置き換わったこのような細胞中にレトロウイルスベクターを導入すると、ベクターはパッケージングされベクタービリオンが生産される。
【００３７】
ＧＳＴＰ１ポリヌクレオチドを標的送達する別のシステムはコロイド分散システムである。コロイド分散システムには、巨大分子複合体、ナノカプセル、小球、ビーズ、ならびに水中油エマルジョン、ミセル、混合ミセルおよびリポソームを含む脂質をベースとした系を含む。本発明の好ましいコロイドシステムはリポソームである。リポソームはin vitroおよびin vivoでの送達担体として使用される人工膜小胞である。０．２−４．０ｕｍのサイズの大きな単ラメラ小胞（ＬＵＶ）は大きな巨大分子を含む水性バッファーの実質的部分を封入することができる。ＲＮＡ、ＤＮＡおよび完全なビリオンを水性内部に封入して生物学的活性型で細胞に送達できる（Fraley, et al., Trends Biochem. Sci., 6:77, 1981）。リポソームは哺乳動物細胞に加えて、植物、酵母および細菌細胞中にポリヌクレオチドを送達するのに使われてきた。リポソームが有効な遺伝子伝達担体であるためには、以下の性質をもっているべきである：（１）生物学的活性を損なうことなく高い効率で関心のある遺伝子を封入する；（２）非標的細胞と比較して標的細胞に優先的かつ実質的に結合する；（３）高い効率で小胞の水性内容物を標的細胞の細胞質に送達する；そして（４）遺伝子情報を正確かつ有効に発現する（Mannino, et al., Biotechniques, 6:682, 1988）。
【００３８】
リポソームの成分は、通常リン脂質、特に高い相転移温度のリン脂質と、通常ステロイド、特にコレステロールとの組み合わせである。その他のリン脂質またはその他の脂質も使用できる。リポソームの物理的性質はｐＨ、イオン強度、および二価カチオンの存在によって決まる。
【００３９】
リポソーム製造に使用する脂質の例には、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴリピッド、セレブロシド、およびガングリオシドなどのホスファチジル化合物を含む。特に有用なのは、脂質部分が１４−１８炭素原子、特に１６−１８炭素原子を含み、飽和されているジアシルホスファチジルグリセロールである。リン脂質の例としては、卵ホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリンおよびジステアロイルホスファチジルコリンを含む。
【００４０】
リポソームの標的化は解剖学的および機械的要因によって分類される。解剖学的分類は例えば器官特異的、細胞特異的、およびオルガネラ特異的な選択性のレベルに基づく。機械的標的化は受動的か能動的かで区別される。受動標的化では、洞状毛細管を含む器官にある細網内皮系（ＲＥＳ）の細胞中にリポソームが自然に分布する傾向を利用する。一方、能動標的では、自然に起きる局在部位以外の型の器官や細胞への送達を達成するために、リポソームをモノクローナル抗体、糖、糖脂質またはタンパク質などの特異的リガンドと結合するか、あるいはリポソームの成分やサイズを変えることによるリポソームの改変を含む。
【００４１】
標的化された送達システムの表面は様々な方法で修飾できる。リポソームで標的化する送達システムの場合、標的化リガンドをリポソームの二重層と安定に会合させて維持するために、リポソームの脂質二重層に脂質基を導入できる。様々な連結基が脂質鎖と標的リガンドとの結合に用い得る。
【００４２】
一般に、標的化された送達システムの表面に結合する化合物は、標的化された送達システムが所望の細胞を見つけて”居着く”ことができるようなリガンドおよび受容体でありうる。リガンドは受容体などの別の化合物と結合する関心のあるあらゆる化合物であってよい。
【００４３】
一般に、特異的エフェクター分子と結合する表面膜タンパク質を受容体と呼ぶ。本発明では、抗体が好ましい受容体である。リポソームが特異的細胞表面リガンドを標的とするために抗体を用いることができる。例えば、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）と呼ばれる腫瘍細胞上で特異的に発現するある種の抗原を、ＧＳＴＰ１抗体含有リポソームが悪性腫瘍を直接標的とする目的に使用できる。ＧＳＴＰ１遺伝子産物はその作用において細胞型に関して無差別であるので、標的化された送達システムは無差別に注射される非特異的リポソームよりもかなり改良されたものになる。好ましくは、標的組織は尿性器、特に前立腺組織である。腎臓および膀胱組織も使用できる。リポソーム二重層にポリクローナルまたはモノクローナル抗体を共有結合するには多数の方法を使用できる。抗体標的化されたリポソームには、それが標的細胞上の抗原エピトープと効率よく結合する限り、モノクローナルまたはポリクローナル抗体、またはＦａｂやＦ（ａｂ’）2などのその断片を含む。リポソームはホルモンまたはその他の血清因子のための受容体を発現する細胞を標的とすることもできる。
【００４４】
さらに別の態様では、本発明は低レベルのＧＳＴＰ１発現をもつ被検者をグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ誘導剤で治療することを含む。その他のクラスのＧＳＴの刺激はＧＳＴＰ１の不足を補う。このような誘導剤には、スルホフライン（sulfofurain）、オルティプラッツ（oltipraz）、ならびにその他の当業界で公知の物質を含む（Prochaska, et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci., USA, 89:2394, 1992; Zhang, et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci., USA, 89:2399, 1992; Prestera, et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci., USA, 90:2965, 1993）。
【００４５】
本発明はまた、ＧＳＴＰ１プロモーターポリヌクレオチドまたはＧＳＴＰ１構造遺伝子と作動的に連結したＧＳＴＰ１またはその他のＧＳＴプロモーターポリヌクレオチドを薬剤的に許容できる賦形剤または媒質中に含む医薬または薬剤組成物に関し、ここで上記医薬はＧＳＴＰ１に付随する細胞増殖性疾患の治療に用いられる。
【００４６】
米国において男性で最も多く診断される癌であるヒト前立腺癌（C.C. Boring, et al., Cancer J. Clin., 44:7, 1994）に関して、本発明はグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ遺伝子座におけるＤＮＡメチル化において均一な体細胞の変化があることを示す。ヒトπ−クラスＧＳＴをコードするＧＳＴＰ１遺伝子は、前立腺癌形成の過程におけるプロモーター高メチル化の結果として一般に不活性化されているようであり、驚くべきことに、ほとんどの前立腺癌では正常な前立腺組織と比較して検出可能なＧＳＴＰ１ポリペプチドのレベルが減少していた。
【００４７】
癌細胞に付随し、正常細胞に付随しないＧＳＴＰ１遺伝子と遺伝子の発現における変化を同定することは、細胞増殖性疾患を同定する理想的マーカーを提供する。より有効な診断と治療法を可能にする新規な癌マーカーが求められている。
【００４８】
以下の実施例は本発明を説明するものであって、限定するものではない。実施例は使用の典型例であって、当業者に公知のその他の方法をこれに代えて用いることができる。
【実施例】
【００４９】
実施例１：正常および新生物性ヒト前立腺組織中におけるπ−クラスグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼの発現
正常および新生物性前立腺細胞におけるＧＳＴＰ１発現をin vivoで評価するために、組織標本をα−ＧＳＴＰ１抗体を用いる免疫組織学的染色に付した。ホルマリン固定しパラフィン中に包理した前立腺組織切片を、イムノパーオキシダーゼ法（Vectastain）によってα−ＧＳＴＰ１抗血清（Oncor）を用いる免疫組織学的染色によりＧＳＴＰ１発現を評価した。図１は、ＧＳＴＰ１抗体で免疫染色した前立腺組織の結果を示す。
【００５０】
正常な前立腺組織では、ほとんどの全ての基底上皮細胞でＧＳＴＰ１の強い染色が見られた（図１、パネルＡ参照）。いくつかの正常な腺上皮細胞も免疫反応性ＧＳＴＰ１を含むように見えるが、ほとんどのものは検出しうる酵素を含まなかった（図１、パネルＢ）。ＧＳＴＰ１陽性またはＧＳＴＰ１陰性の腺上皮細胞をもつ小葉は、組織学的外観または解剖学的分布に差がなかった。それとは違って、ＧＳＴＰ１陽性の上皮細胞は、精丘、小室、前立腺管、射精管、および尿道を含む前立腺組織内にある全ての正常な上皮構造で検出された。ＧＳＴＰ１の陽性の免疫組織学的染色は、移行性細胞の異形成、鱗屑細胞の異形成、および良性の前立腺肥大（ＢＰＨ）に付随する過形成の病巣でも見られた。ほとんどの正常な前立腺上皮細胞ならびに良性の増殖性前立腺集団を含む細胞中には大量のＧＳＴＰ１が存在するにもかかわらず、前立腺癌の標本９１のうち８８は検出しうる免疫反応性のＧＳＴＰ１を含まなかった（図１、パネルＤ、ＥおよびＦ）。前立腺上皮内新形成（ＰＩＮ）が前悪性集団を表すものとして提案されている。おもしろいことに、ＰＩＮ集団の画分でも多くの上皮細胞でＧＳＴＰ１がなかった（図１、パネルＣ）。
【００５１】
実施例２：ヒト前立腺癌セルラインにおけるＧＳＴＰ１発現
ヒト前立腺癌におけるＧＳＴＰ１制御の分子メカニズムを研究するために、５つの十分樹立されたヒト前立腺癌セルライン（K. R. Stone, et al., Int. J. Cancer, 21:274, 1978）のＧＳＴＰ１発現を、ＧＳＴＰ１についてはイムノブロット分析、ＧＳＴＰ１ ｍＲＮＡについてはノーザンブロット分析によって評価した。5’-meＣ−感受性制限酵素認識部位を示すＧＳＴＰ１プロモーターの制限酵素地図を図３Ａに示す。図３Ｂは、5’-meＣ−感受性制限酵素ＢｓｓＨＩＩで切断し、ＧＳＴＰ１ ｃＤＮＡプローブとハイブリダイズしたヒト前立腺癌セルラインＤＮＡのサザン分析を示す。ヒト前立腺癌セルラインそれぞれの増殖する培養物から、ドデシル硫酸ナトリウム／プロテイナーゼＫによる除タンパクとそれに続くフェノール／クロロホルム抽出によって単離したＤＮＡをまずＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩで、次にＢｓｓＨＩＩで消化し、次いでアガロースゲルで電気泳動し、Ｚｅｔａｐｒｏｂｅ（BioRad）膜に移し、32Ｐ−標識したＧＳＴＰ１ ｃＤＮＡ（American Type Culture Collection）とハイブリダイズした。図３Ｃは、ＭｓｐＩおよびＨｐａＩＩの認識部位（垂直の矢印で示す）を示すＧＳＴＰ１遺伝子の制限酵素地図である。図３Ｄは、ＭｓｐＩまたはＨｐａＩＩで切断したヒト前立腺癌セルラインＤＮＡのサザン分析を示す（William C. Earnshaw, Johns Hopkins University School of Medicine, Baltimore, MD; Robert Wood Johnson-University of Medicine and Dentistry of New Jersey, Piscataway, NJ ）。
【００５２】
セルラインをイムノブロット分析およびノーザンブロット分析によっても試験した。イムノブロットでは、食塩水で洗浄した培養前立腺癌細胞を室温中、１０分、１４，０００ｘｇで遠心することにより回収し、タンパク質抽出バッファー（６２ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．８中の２％ドデシル硫酸ナトリウム、１０％グリセロールおよび１０ｍＭジチオスレイトール）中、９５℃に１０分加熱することにより溶解した。各細胞抽出物のＤＮＡ含量をジフェニルアミンアッセイを用いて評価した（Burton, Methods Enzymol., 123:163, 1968）。培養セルラインそれぞれから調製した等量の全タンパク質抽出物をポリアクリルアミドゲルの電気泳動にかけ、セミドライエレクトロブロッター（Millipore）を用いてニトロセルロース膜（Hybond-ECL; Amersham）に移し、文献記載の方法（Nelson, et al., Mol. Cell. Biol., 14:1815, 1994）で特異的抗血清を用いてＧＳＴＰ１とＤＮＡトポイソメラーゼＩポリペプチドのレベルを測定するイムノブロット分析に付した。ウサギα−ＧＳＴＰ１抗血清はOncorから入手し；ヒトα−トポイソメラーゼＩはWilliam C. Earnshaw (Johns Hopkins University School of Medicine, Baltimore, MD）から恵与された。
【００５３】
ノーザンブロット分析では、Chomczynski と Scacchiの方法（Anal. Biochem., 162:156, 1987）によって培養細胞から抽出した全ＲＮＡを用い、これをオルシノールアッセイ（Schneider, Methods Enzymol., 3:680, 1957）で定量し、ＭＯＰＳ−ホルムアルデヒドアガロースゲルの電気泳動にかけ、Ｚｅｔａｐｒｏｂｅ（BioRad）フィルターに移し、特異的ｃＤＮＡプローブとハイブリダイズすることによってＧＳＴＰ１およびＴＯＰ１ ｍＲＮＡのレベルを評価した。ＧＳＴＰ１ ｃＤＮＡはAmerican Type Culture Collectionから入手し；ＴＯＰ１ ｃＤＮＡは Leroy F. Liu (Robert Wood Johnson-University of Medicine and Dentitry of New Jersey, Piscataway, NJ）から恵与された。
【００５４】
ヒト前立腺癌ではin vivoでＧＳＴＰ１発現がなかったという観察と一致して、α−ＧＳＴＰ１抗血清を用いるイムノブロット分析ではＬＮＣａＰ細胞から調製したタンパク質抽出物中にＧＳＴＰ１ポリペプチドを検出できず（図２Ａ、レーン１）、また全ＲＮＡのノーザンブロット分析ではＬＮＣａＰセルラインから回収した全ＲＮＡ中にＧＳＴＰ１ ｍＲＮＡを検出できなかった（図２Ｂ、レーン１）。これとは対照的に、Ｄｕ−１４５細胞、ＰＣ−３細胞、ＰＰＣ細胞、およびＴＳＵ−Ｐｒ１細胞は大量のＧＳＴＰ１ポリペプチドとＧＳＴＰ１ ｍＲＮＡを含んでいるように思われた（図２Ａおよび２Ｂ、レーン２−５）。
【００５５】
実施例３：前立腺癌セルライン中のＧＳＴＰ１遺伝子座における５’制御配列のメチル化
ＧＳＴＰ１遺伝子の上流の潜在的５’制御領域の配列分析によって、ＴＡＴＡＡ−ボックス、２つの潜在的ＳＰ１結合部位、およびコンセンサスＡＰ−１部位のあることが明らかとなった（I.G. Cowell, et al., Biochem. J., 255:79, 1988; C.S. Morrow, et al., Gene, 75:3, 1989）。機能性プロモーターの研究により、転写開始部位の５’に位置する７２ヌクレオチド配列（ヌクレオチド−８０から−８）が、プロモーターのないクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）レポーター遺伝子とライゲートすると、一過性トランスフェクションアッセイ（C.S. Morrow, et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 176:233, 1991）で基底プロモーター活性を示すことが確認された。転写開始部位のすぐ５’側にある４００ヌクレオチドは約７２％のＣＧヌクレオチドを含み、４１がＣｐＧジヌクレオチドであることに注意を喚起する。哺乳動物遺伝子の制御領域中にあるＣｐＧジヌクレオチドのメチル化により転写活性が落ちることがよくある（I. Keshet, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 82:2560, 1985; I. Keshet, et al., Cell, 44:535, 1986; H. Cedar, Cell, 53:3, 1988; J. Boyes, et al., Cell, 64:1123, 1991; J.D. Lewis, et al., Cell, 69:905, 1992）。ＧＳＴＰ１プロモーターのメチル化における差異がヒト前立腺癌セルライン中で検出されるＧＳＴＰ１発現の差異と相関するかを決定するために、各セルラインから精製したＤＮＡを5’meＣ−感受性制限酵素ＢｓｓＨＩＩで消化し、ＧＳＴＰ１プローブを用いるサザンブロット分析に付した。
【００５６】
ＬＮＣａＰ細胞から単離し、この方法で研究したＤＮＡは、ＢｓｓＨＩＩ切断しなかった（図３Ｂ、レーン６）。ＬＮＣａＰ ＧＳＴＰ１プロモーターＤＮＡがＢｓｓＨＩＩ消化をしないことは、一般にＢｓｓＨＩＩによるＬＮＣａＰ ＤＮＡの消化が不十分なための結果であるとは考えられていない。サザンブロットをＴＰＩ（リン酸トリオースイソメラーゼ）遺伝子プローブ（L.E. Maquat, et al., J. Biol. Chem., 260:3748, 1985; J.R. Brown, et al., Mol. Cell. Biol., 5:1694, 1985）とハイブリダイズすると、ＢｓｓＨＩＩ部位での完全な消化が見られた（図３Ｂ）。
【００５７】
さらに、ＢｓｓＨＩＩがＬＮＣａＰ ＧＳＴＰ１プロモーターＤＮＡを切断しなかったことは、シトシンメチル化によるものであって、ＢｓｓＨＩＩ認識部位における突然変異によるものでないと思われた。なぜなら、ポリメラーゼチェインリアクション（ＰＣＲ）によってＬＮＣａＰ ＤＮＡから増幅されたＧＳＴＰ１プロモーター配列はＢｓｓＨＩＩによって容易に消化されるからである。さらに、近位ＧＳＴＰ１プロモーターの−１３２と−１０２の部位をぞれぞれ認識する5’meＣ−感受性の制限酵素であるＮｏｔＩとＳａｃＩＩを用いてもＬＮＣａＰ ＧＳＴＰ１制御配列は切断されない。これとは対照的に、Ｄｕ−１４５細胞、ＰＣ−３細胞、ＰＰＣ細胞およびＴｓｕ−Ｐｒ１細胞中に存在する大部分のＧＳＴＰ１対立遺伝子ではプロモーター配列の低メチル化（hypomethylation）が観察された（図３Ｂ）。これらのセルラインのそれぞれは大量のＧＳＴＰ１ ｍＲＮＡを発現しており（図２参照）、これはＧＳＴＰ１転写活性の上昇がＧＳＴＰ１プロモーターの低メチル化と関連することを示唆する。
【００５８】
さらに、ＧＳＴＰ１遺伝子に分布するいくつかの認識部位をもつアイソシゾマー(isoschizomers) であるＭｓｐＩとＨｐａＩＩで消化した前立腺癌セルラインＤＮＡのサザンブロット分析から、シトシン低メチル化とＧＳＴＰ１増加の相関は５’制御配列に存在するシトシン残基に限定されるようであった（図３、ＣおよびＤ）。その他の遺伝子に関していくつかのＣＧに富む５’制御配列で提案されたように、ＧＳＴＰ１プロモーター配列はメチル化−感受性の“ＣｐＧアイランド（island）”を構成するのかも知れない（A.P. Bird, Nature, 321:209, 1986）。
【００５９】
ＤＮＡのメチル化パターンは、in vitroで増殖させた細胞中では変化することが見いだされている（F. Antequera, et al., Cell, 62:503, 1990）。この点で興味深いことに、Ｄｕ−１４５細胞、ＰＣ−３細胞およびＰＰＣ細胞は低メチル化と高メチル化された両方のＧＳＴＰ１プロモーター配列を含むと思われた。これらのセルラインそれぞれの研究は、ＤＮＡの二倍体含量／細胞よりも多く含むことが知られている（K.R. Stone, et al., 前出）。Ｄｕ−１４５、ＰＣ−３およびＰＰＣセルラインではＧＳＴＰ１プロモーター配列の大部分が低メチル化されているが、サザンブロット分析では、各セルラインが5’-meＣ−感受性制限酵素ＢｓｓＨＩＩ切断をしないＧＳＴＰ１プロモーター配列をいくらか含むことを示しており（図３参照）、これは少なくとも１つのＧＳＴＰ１対立遺伝子を含むプロモーターの高メチル化と一致する。ＬＮＣａＰセルラインの場合と同様に、これらの細胞からのＤＮＡ中のＧＳＴＰ１プロモーター配列をＢｓｓＨＩＩで切断できないことは、ＴＰＩ遺伝子中のＢｓｓＨＩＩ部位を完全に消化しても生じる（図３）。Ｔｓｕ−Ｐｒ１細胞から単離したＤＮＡはＧＳＴＰ１プロモーターメチル化の証拠を何も示さなかった（図３）。合計すると、メチル化されたＧＳＴＰ１プロモーター配列は、５つのヒト前立腺癌セルライン中の４つで存在した。もしもセルラインに用いた親腫瘍中でＧＳＴＰ１遺伝子がプロモーターの高メチル化によって不活性化されていると、Ｄｕ−１４５、ＰＣ−３、ＰＰＣおよびＴｓｕ−Ｐｒ１セルラインは、ＧＳＴＰ１対立遺伝子のいくつかにおけるプロモーター脱メチル化の結果として、in vitroでの連続増殖中にＧＳＴＰ１発現が再度活性化したのかも知れない。
【００６０】
実施例４：正常な成人組織中におけるin vivoでのＧＳＴＰ１プロモーターメチル化の状態
ＧＳＴＰ１プロモーターのメチル化は今まで文献に記載されていない（V. Daniel, CRC Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol., 28:173, 1993）。ＧＳＴＰ１プロモーターの高メチル化が正常な生理学的細胞分化の過程で起きるのか否かを決定するために、異なるＧＳＴＰ１発現パターンをもつ正常なヒト組織から単離したＤＮＡを、5’-meＣ−感受性制限酵素ＢｓｓＨＩＩで消化しサザンブロット分析に付した。剖検で回収した正常なヒト組織標本から単離したＤＮＡのＧＳＴＰ１ ｃＤＮＡプローブを用いたサザンブロット分析を図３で上述したようにして実施した。図４Ａは、ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩでまず消化し、次にＢｓｓＨＩＩの存在下または不在下に消化した正常な組織を示す。図４Ｂは、前立腺疾患にかかっていない種々の年齢の男性から剖検で回収した正常な前立腺組織から調製し、ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢｓｓＨＩＩで消化したＤＮＡを示す。
【００６１】
正常な前立腺、貯精嚢、食道、腎臓、肝臓、肺または脾臓から単離したＤＮＡ中にはメチル化されたＧＳＴＰ１プロモーター配列を示す証拠は検出されなかった（図４Ａ）。
【００６２】
ＧＳＴＰ１プロモーター配列の高メチル化が正常な前立腺細胞で加齢の過程で起きるのかどうかを評価するために、種々の年齢の男性から回収した正常な前立腺組織標本から調製したＤＮＡも分析した（図４Ｂ参照）。ここでも、正常な前立腺組織のいずれにもＧＳＴＰ１プロモーターの高メチル化を示す証拠はなかった。
【００６３】
実施例５：前立腺癌におけるＧＳＴＰ１プロモーターの高メチル化
研究したほとんどのヒト前立腺癌セルライン由来のＤＮＡ中で高メチル化されたＧＳＴＰ１プロモーターを検出したが、正常なヒト組織から調製したＤＮＡ中ではほとんど見られなかった。さらに、α−ＧＳＴＰ１抗体を用いる免疫組織学的染色で試験したヒト前立腺癌標本の大部分でＧＳＴＰ１発現がなかった。ＧＳＴＰ１プロモーターの高メチル化が前立腺の癌形成中にin vivoで起こるのかどうかを決定するために、ヒト前立腺癌標本から単離したＤＮＡを5’-meＣ−感受性制限酵素ＢｓｓＨＩＩで消化し、次にＧＳＴＰ１プローブを用いるサザンブロット分析に付した（図５）。外科的切除で回収した前立腺癌（ＣＡ）からＤＮＡを単離した。さらに、前記外科的切除標本に付随する、癌組織に隣接するおおむね正常な前立腺組織（ＰＲＯＳ）、良性の前立腺過形成（ＢＰＨ）、および正常な貯精嚢（ＳＶ）からＤＮＡを調製した。次にＤＮＡをＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢｓｓＨＩＩで消化し、図３で上述したようにしてＧＳＴＰ１ ｃＤＮＡを用いるサザンブロット分析に付した。図５Ａは、貯精嚢（ＳＶ）と前立腺癌（ＣＡ）ＤＮＡの対を示す。図５Ｂは、おおむね正常な前立腺（ＰＲＯＳ）と前立腺癌（ＣＡ）ＤＮＡの対を示す。図５Ｃは、同じ外科的切除標本からのおおむね正常な前立腺（ＰＲＯＳ）、良性の前立腺過形成（ＢＰＨ）、および前立腺癌（ＣＡ）を示す。矢印はＢｓｓＨＩＩで切断されないＧＳＴＰ１制限酵素断片の移動位置を示す。
【００６４】
研究に用いた前立腺癌のそれぞれは、正常な組織から調製した対になった対照ＤＮＡと比較して、ＧＳＴＰ１プロモーターの高メチル化が増加している証拠を示した（図５）。前立腺上皮細胞にとって、ＧＳＴＰ１プロモーター配列のメチル化の増加は悪性癌形成の過程に特有であるかも知れない。根治的前立腺切除術によって外科的に除去した前立腺癌の５つのケースでは、正常な前立腺、良性の前立腺過形成（ＢＰＨ）、または前立腺癌を含む、同じ前立腺組織切除標本の異なる領域からＤＮＡを選択的に調製した（図５Ｃ）。ＢｓｓＨＩＩ−消化したＤＮＡサンプルを含むサザンブロットをＧＳＴＰ１プローブとハイブリダイズすると、各癌標本中でＧＳＴＰ１プロモーター配列の明らかな高メチル化が検出された（図５Ｃ、レーン３、６、９、１９および１５）が、ＢＰＨ標本では全く検出されなかった（図５Ｃ、レーン２、５、８、１１および１４）。あるケースでは、おおむね正常な前立腺組織から調製したＤＮＡも、いくらかメチル化されたプロモーター配列をもつＧＳＴＰ１対立遺伝子を含むように思われた（図５、レーン１０）。これは、メチル化されたＧＳＴＰ１プロモーターを含む顕微的癌によるおおむね正常な前立腺組織の侵潤によるためなのか、おおむね正常な前立腺組織中の前立腺上皮内新形成（ＰＩＮ）病変内のＧＳＴＰ１プロモーターの高メチル化によるためなのか、あるいは組織学的には正常な前立腺上皮細胞中のＧＳＴＰ１プロモーターの高メチル化によるためなのか、はまだ確認されていない。しかしながら、それでもＧＳＴＰ１プロモーターＤＮＡの高メチル化は、前立腺での新生物のトランスフォーメーション（悪性転換）に特異的であるように思われ、前立腺癌をもたない男性からの正常な前立腺組織は、検出しうるＧＳＴＰ１制御配列のメチル化を含まなかった（図４Ｂ）。
【００６５】
この研究で集められた全てのデータは、ＧＳＴＰ１発現の低下およびＧＳＴＰ１プロモーターの高メチル化が前立腺上皮細胞の悪性トランスフォーメーションで普通に起こることを示す。ＣｐＧアイランド配列の高メチル化としてしばしば明示される局所的メチル化の変化が癌形成で重要な役割を果たすことが提案されている（L.E. Maquat, et al., J. Biol. Chem. 260:3748, 1985; J.R. Brown,
et al., Mol. Cell. Biol., 5:1694, 1985）。ヒト前立腺癌には高メチル化された５’ＧＳＴＰ１制御配列があるが、正常組織にはないという優勢な知見がこの一般的な提案を支持している。残念なことに、特異的常染色体対立遺伝子のde novo での局所的高メチル化が癌細胞で起きるメカニズムはまだよくわかっていない。異常なＤＮＡメチル化が新生物細胞で付随する。ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ活性の増加（T.L. Kautainien, et al., J. Biol. Chem., 261:1594, 1986）、ならびにＤＮＡ−ＭＴ ｍＲＮＡレベルの上昇（W.S. El-Deiry, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:3470, 1991）の両方が新生物細胞で検出されてきた。おもしろいことに、ＤＮＡ−ＭＴ ｍＲＮＡの増加が結腸癌形成過程の初期に観察され、これはいくつかの組織学的に正常な結腸粘膜標本においても観察される。
【００６６】
上述の記載は説明のためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。実際、当業者であればここに記載の技術に基づいて過度の実験を行うことなく、さらに別の態様を容易に考え、生み出すことができる。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】正常前立腺組織（パネルＡ、Ｂ）、前立腺上皮内新形成（ＰＩＮ）（パネルＣ）および前立腺癌組織（パネルＤ−Ｆ）の、抗−ＧＳＴＰ１抗血清による免疫組織学的染色を示す。
【図２】ヒト前立腺癌セルラインにおけるＧＳＴＰ１発現のイムノブロット（パネルＡ）およびノーザンブロット（パネルＢ）分析を示す。
【図３】ＧＳＴＰ１プロモーターの制限酵素地図（パネルＡ）、ＢｓｓＨＩＩで切断したヒト前立腺癌セルラインＤＮＡのサザンブロット（パネルＢ）、ＧＳＴＰ１遺伝子の制限酵素地図（パネルＣ）、およびＭｓｐＩまたはＨｐａＩＩで切断したヒト前立腺癌セルラインＤＮＡのサザンブロット（パネルＤ）を示す。
【図４】ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、次にＢｓｓＨＩＩの存在下または不在下に消化した正常成人組織（パネルＡ）；ならびにＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢｓｓＨＩＩで消化した前立腺組織ＤＮＡ（パネルＢ）のサザンブロット分析を示す。
【図５】前立腺癌由来のＤＮＡにおけるＧＳＴＰ１プロモーターの高メチル化を示す。同じ手術で摘出した標本から由来する、パネルＡは貯精嚢（ＳＶ）および前立腺癌（ＣＡ）ＤＮＡを示し；パネルＢはおおむね正常な前立腺（ＰＲＯＳ）およびＣＡを示し；そしてパネルＣはＰＲＯＳ、ＣＡおよび良性の前立腺過形成（ＢＰＨ）を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＧＳＴＰ１発現の低下に関連する細胞増殖性疾患をもつ被検者に治療的有効量で投与して該細胞増殖性疾患を治療する医薬を製造するための、ＧＳＴＰ１発現を調節する試薬の使用。
【請求項２】
細胞増殖性疾患が尿性器組織にある、請求項１記載の使用。
【請求項３】
尿性器組織が前立腺である、請求項２記載の使用。
【請求項４】
試薬がプロモーターのセンスポリヌクレオチド配列を含む、請求項１記載の使用。
【請求項５】
試薬がＧＳＴＰ１をコードする構造ポリヌクレオチド配列を含む、請求項４記載の使用。
【請求項６】
ＧＳＴＰ１発現の低下に関連する細胞増殖性疾患を治療する遺伝子治療に用いる医薬を製造するための、ＧＳＴＰ１をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターの使用。
【請求項７】
発現ベクターがプロモーターのセンスポリヌクレオチド配列を含む、請求項６記載の使用。
【請求項８】
発現ベクターがＧＳＴＰ１をコードする構造ポリヌクレオチド配列を含む、請求項７記載の使用。
【請求項９】
遺伝子治療が、発現ベクターを宿主被検者の細胞中にin vitroで導入し、次に形質転換細胞を被検者中に再導入することを含む、請求項６記載の使用。
【請求項１０】
発現ベクターがＲＮＡウイルスである、請求項６記載の使用。
【請求項１１】
ＲＮＡウイルスがレトロウイルスである、請求項１０記載の使用。
【請求項１２】
被検者がヒトである、請求項６記載の使用。
【請求項１】
ＧＳＴＰ１発現の低下に関連する細胞増殖性疾患をもつ被検者に治療的有効量で投与して該細胞増殖性疾患を治療する医薬を製造するための、ＧＳＴＰ１発現を調節する試薬の使用。
【請求項２】
細胞増殖性疾患が尿性器組織にある、請求項１記載の使用。
【請求項３】
尿性器組織が前立腺である、請求項２記載の使用。
【請求項４】
試薬がプロモーターのセンスポリヌクレオチド配列を含む、請求項１記載の使用。
【請求項５】
試薬がＧＳＴＰ１をコードする構造ポリヌクレオチド配列を含む、請求項４記載の使用。
【請求項６】
ＧＳＴＰ１発現の低下に関連する細胞増殖性疾患を治療する遺伝子治療に用いる医薬を製造するための、ＧＳＴＰ１をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターの使用。
【請求項７】
発現ベクターがプロモーターのセンスポリヌクレオチド配列を含む、請求項６記載の使用。
【請求項８】
発現ベクターがＧＳＴＰ１をコードする構造ポリヌクレオチド配列を含む、請求項７記載の使用。
【請求項９】
遺伝子治療が、発現ベクターを宿主被検者の細胞中にin vitroで導入し、次に形質転換細胞を被検者中に再導入することを含む、請求項６記載の使用。
【請求項１０】
発現ベクターがＲＮＡウイルスである、請求項６記載の使用。
【請求項１１】
ＲＮＡウイルスがレトロウイルスである、請求項１０記載の使用。
【請求項１２】
被検者がヒトである、請求項６記載の使用。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２００６−８９５００（Ｐ２００６−８９５００Ａ）
【公開日】平成１８年４月６日（２００６．４．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−３４５９５５（Ｐ２００５−３４５９５５）
【出願日】平成１７年１１月３０日（２００５．１１．３０）
【分割の表示】特願平８−５０５２３８の分割
【原出願日】平成７年７月１８日（１９９５．７．１８）
【出願人】（５００１４８９５０）ザ ジョンズ ホプキンス ユニバーシティー スクール オブ メディシン (3)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年４月６日（２００６．４．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年１１月３０日（２００５．１１．３０）
【分割の表示】特願平８−５０５２３８の分割
【原出願日】平成７年７月１８日（１９９５．７．１８）
【出願人】（５００１４８９５０）ザ ジョンズ ホプキンス ユニバーシティー スクール オブ メディシン (3)
【Ｆターム（参考）】
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