加齢による皮膚明度の低下を予測する皮膚評価方法
【課題】加齢による皮膚明度の低下を予測する皮膚評価方法を提供する。
【解決手段】加齢による皮膚明度の低下を予測するための皮膚評価方法であって、皮膚中のＮＡＤＨ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ発現量を指標にして、皮膚明度の低下が起こり易い皮膚であると判断する方法。好ましい一態様では、被験対象部位から非侵襲的に採取された角質細胞を皮膚試料とし、前記皮膚試料から抽出したＲＮＡを試料として用いる。
【解決手段】加齢による皮膚明度の低下を予測するための皮膚評価方法であって、皮膚中のＮＡＤＨ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ発現量を指標にして、皮膚明度の低下が起こり易い皮膚であると判断する方法。好ましい一態様では、被験対象部位から非侵襲的に採取された角質細胞を皮膚試料とし、前記皮膚試料から抽出したＲＮＡを試料として用いる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、加齢による皮膚明度の低下を予測するための皮膚評価方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
加齢により、皮膚明度が低下することが知られている。これは、加齢によってメラニン量が増加する、新陳代謝が低下し皮膚のターンオーバーが遅延する、血流が低下するなどが原因であると考えられる。特に、顔や首などの皮膚明度の低下は、常に他人から見られる部位であるため非常に気になり、大きな精神的ダメージを被る。また、皮膚明度の低下を隠す方法として、例えばメイク用品のファンデーションやコンシーラーなどがあるが、その効果は十分なものではなかった。このように、加齢による皮膚明度の低下は、我々にとって大きな悩みではあるが、年齢を重ねると誰にでも起こり得る現象であるため、対処は難しいとの考え方が一般的であった。
【０００３】
しかしながら、加齢による皮膚明度の低下は誰にでも起こり得るものの、その程度には大きな差があることが経験上知られている。即ち、皮膚明度の変化を同年代で比較した場合、皮膚明度が大きく低下するヒトがいる一方で、それほど低下しないヒトがいる。このように、皮膚明度の低下には極めて個人差があると考えられる。そこで、加齢による皮膚明度の低下をある程度予測することができれば、皮膚明度が低下する前から念入りにアンチエイジング対応の医薬品、医薬部外品および化粧品を使用することで、将来起こり得る皮膚明度の低下を予防・改善することができると考えられる。
【０００４】
皮膚における特定の因子を測定することにより、将来起こり得る皮膚性状の変化を予測することは既に行われている。例えば、シミに特異的な遺伝子の発現量を測定することにより、シミ形成の起こり易さを予測する方法（特許文献１、２）が知られている。また、角質細胞の微絨毛様突起を観察することにより、将来的な皮膚バリア機能の程度を予測する方法（特許文献３）が知られている。しかし、加齢による皮膚明度の低下を予測する方法については、これまで知られていない。
【０００５】
一方、ＮＡＤＨ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（ＮＡＤＨ脱水素酵素）は、ミトコンドリア電子伝達系の呼吸鎖複合体Ｉにおいて、ＮＡＤＨ（還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）を電子供与体として、酸化型電子受容体を還元型に変換する反応を触媒する酵素である。ＮＡＤＨ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅの量または活性が低下することによって引き起こされる疾患群として、例えばミトコンドリア異常症が知られており、症例部位においては、ミトコンドリアの呼吸鎖複合体Ｉの活性が低下していることが知られている（非特許文献１）。また、アルツハイマー病患者の脳組織においては、健常者の脳組織と比べてＮＡＤＨ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅの量が減少していることが知られている（特許文献４）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００７−２８９０６３号公報
【特許文献２】特開２００９−１１２２５５号公報
【特許文献３】特開２００７−３０９７２０号公報
【特許文献４】特開２００５−１３２７３８号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】本多 正和，埼玉医科大学雑誌，３５：３１−３６，２００８．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明者は、加齢による皮膚明度の低下が起こるか否かを予測できる手法について鋭意検討した。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、皮膚中のＮＡＤＨ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ発現量と皮膚明度に相関があることを見出したものである。従って、皮膚中のＮＡＤＨ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ発現量を調べることにより、加齢による皮膚明度の低下が起こり易い皮膚であると判断することが可能であることが明らかとなった。以下に列挙する皮膚評価方法を提供する。
［１］皮膚中のＮＡＤＨ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ発現量を指標とする、加齢による皮膚明度の低下を予測する皮膚評価方法。
［２］前記ＮＡＤＨ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅが、ＮＤＵＦＡ１、ＮＤＵＦＢ７およびＮＤＵＦＳ２である、［１］に記載の皮膚評価方法。
［３］角質細胞中のＮＡＤＨ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ発現量を測定することにより決定される、［１］および［２］に記載の皮膚評価方法。
［４］加齢による皮膚明度の低下抑制因子をスクリーニングする方法であって、候補化合物のＮＡＤＨ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅの発現および／または活性を促進させる能力について評価し、当該促進能力を有するＮＡＤＨ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ促進因子を皮膚明度の低下抑制因子として選定することを特徴とするスクリーニング方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、被験対象部位の皮膚中のＮＡＤＨ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ発現量を測定することによって、加齢による皮膚明度の低下が起こり易い皮膚であると判断することを特徴とする皮膚評価方法を提供することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明の第一の局面は、加齢による皮膚明度の低下を予測するための検査方法を提供する。この方法は、皮膚中のＮＡＤＨ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ発現量が基準発現量よりも低値を示す場合、加齢による皮膚明度の低下が起こり易い皮膚であると判断することを特徴とする。
【００１２】
本発明の加齢による皮膚明度の低下を予測するための皮膚評価方法は、好ましくは以下の一連のステップ（１）〜（３）によって実施される。
（１）被験対象部位の皮膚試料を用意するステップ
（２）前記皮膚試料中のＮＡＤＨ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ発現量を測定するステップ
（３）前記発現量から皮膚明度の低下の起こり易さを評価するステップ
【００１３】
本発明の「加齢による皮膚明度の低下を予測する」とは、将来的に生じると考えられる皮膚明度の低下を、現在の皮膚状態から科学的根拠に基づいて推測することである。
【００１４】
「ＮＡＤＨ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ」は、ミトコンドリア電子伝達系の呼吸鎖複合体Ｉにおいて、ＮＡＤＨ（還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）を電子供与体として、酸化型電子受容体を還元型に変換する反応を触媒する酵素であり、いくつかのサブユニットが存在する。本発明における皮膚評価方法としては、皮膚試料中のＮＤＵＦＡ１〜ＮＤＵＦＡ１３、ＮＤＵＦＢ１〜ＮＤＵＦＢ１１、ＮＤＵＦＣ１〜ＮＤＵＦＣ２、ＮＤＵＦＳ１〜ＮＤＵＦＳ８、およびＮＤＵＦＶ１〜ＮＤＵＦＶ３を測定することによって、加齢による皮膚明度の低下を予測することが可能となる。好ましくは、ＮＤＵＦＡ１〜ＮＤＵＦＡ１３、ＮＤＵＦＢ１〜ＮＤＵＦＢ１１およびＮＤＵＦＳ１〜ＮＤＵＦＳ８を測定することによって、皮膚明度の低下を予測することが可能となる。より好ましくは、ＮＤＵＦＡ１、ＮＤＵＦＢ７およびＮＤＵＦＳ２を測定することによって、皮膚明度の低下を予測することが可能となる。
【００１５】
検査すべき皮膚は、例えば顔、首、腕、肢など、加齢による皮膚明度の低下が気になるあらゆる部位の皮膚であってよい。また、これらの試料（組織もしくは細胞）の培養物であってもよい。
【００１６】
本発明中の「角質細胞」とは、皮膚の中で最外層に存在する角質層における細胞を示す。本発明における、皮膚中のＮＡＤＨ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ発現量の測定は、皮膚中のどの細胞を用いても行うことができる。好ましくは、容易に採取でき、かつ非侵襲的な方法による採取が可能な、角質細胞中のＮＡＤＨ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ発現量を測定するのがよい。
【００１７】
皮膚からの試料の採取方法は特に限定されない。例えば、外科的手段などの侵襲的な方法により採取されたものでよい。好ましくは非侵襲的な採取方法を採用することが望ましい。非侵襲的な方法としては、当該技術分野で使用されているテープストリッピングや擦過法などを挙げることができる。
【００１８】
皮膚中のＮＡＤＨ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ発現量の測定方法は特に限定されない。例えば、ＮＡＤＨ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅをコードするｍＲＮＡ発現量を測定する方法が挙げられる。
【００１９】
皮膚中のＮＡＤＨ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｍＲＮＡ発現量は、皮膚試料からＲＮＡを抽出し、逆転写反応を行った後にＰＣＲ法を行うことにより決定することができる。ＲＮＡの抽出方法、ＰＣＲ法は当業者にとって周知であり、常法のプロトコール、または常法のプロトコールを適宜修正・変更したプロトコールによって適切な測定系を構築し、そして実施することができる。
【００２０】
皮膚明度の低下の起こり易さの評価は、例えば、算出した発現量を、予め設定した基準発現量と比較して、その比率を計算する。そして、その比率が、複数の区分の中のいずれに該当するのかを調べる。区分の設定に関する具体例を以下に示す。
（例１）皮膚明度の低下の起こり易さ（低い）：比率＜ａ、（中程度）：ａ≦比率＜ｂ、（高い）：ｂ≦比率
【００２１】
（例１）では区分数を３としているが、区分数は特に限定されるものではない。例えば、区分数を２〜１０のいずれかにすることができる。区分数、および各区分に関連付けられる基準発現量の値の範囲は、予備実験の結果を基に任意に設定可能である。
【００２２】
本発明の第二の局面は、皮膚明度の低下抑制因子をスクリーニングする方法を提供する。この方法は、候補化合物をＮＡＤＨ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅの発現および／または活性を促進する能力について評価し、当該促進能力を有するＮＡＤＨ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ促進因子を皮膚明度の低下抑制因子として選定することを特徴とする。
【００２３】
例えば、被験対象部位の皮膚に候補化合物、または候補化合物を含む製剤を適用し、適用前後のＮＡＤＨ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ発現量を測定することにより、当該促進能力の評価をすることができる。被験対象部位への候補化合物の適用方法は、塗布や接種など、皮膚への直接的な適用に限定されることはなく、例えば、経口や経鼻などの間接的な適用であってもよい。また、被験対象部位の皮膚試料（組織もしくは細胞）の培養物に候補化合物を適用し、適用の有無によるＮＡＤＨ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ発現量を測定することにより、当該促進能力の評価を行うこともできる。
【実施例】
【００２４】
以下、本発明を効果的に説明するために、実験例を挙げる。なお、本発明はこれにより限定されるものではない。
【００２５】
実験例１ 老化によるＮＡＤＨ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｍＲＮＡ発現量の減少
正常ヒトケラチノサイト（ＫＫ−４００９、クラボウ）を解凍後、直径６０ｍｍ ｄｉｓｈ（ＦＡＬＣＯＮ）でコンフルエントになるまで培養した。この細胞を継代回数０（Ｐ０）とし、ＲＮＡ抽出キット（ＴＲＩｚｏｌ Ｒｅａｇｅｎｔ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にて総ＲＮＡを抽出した。また、繰り返し継代培養を行うことにより、細胞の老化モデルを作製した。継代培養を１回行った細胞をＰ１、２回行った細胞をＰ２、３回行った細胞をＰ３とし、それぞれコンフルエントになった後、ＲＮＡ抽出キットにて総ＲＮＡを抽出した。得られたＲＮＡを、ＲＴ−ＰＣＲキット（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ Ｐｌａｔｉｎｕｍ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｔｗｏ−ｓｔｅｐ ｑＲＴ−ＰＣＲ ｋｉｔ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いた定量ＰＣＲ反応に供し、ＮＡＤＨ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅのサブユニットのうち、ＮＤＵＦＡ１、ＮＤＵＦＢ７およびＮＤＵＦＳ２遺伝子の発現量を定量した。これらの遺伝子発現量は、ＧＡＰＤＨ遺伝子の発現量で規格化（ノーマライズ）した。なお、ＮＤＵＦＡ１、ＮＤＵＦＢ７、ＮＤＵＦＳ２およびＧＡＰＤＨ遺伝子発現量の測定に使用したプライマーは次の通りである。
【００２６】
ＮＤＵＦＡ１用のプライマーセット
ＴＧＧＧＣＧＴＧＴＧＣＴＴＧＴＴＧＡＴ（配列番号１）
ＣＣＧＴＴＡＧＴＧＡＡＣＣＴＧＴＧＧＡＴＧＴＡＣ（配列番号２）
ＮＤＵＦＢ７用のプライマーセット
ＡＧＣＡＣＣＧＣＧＡＣＴＡＴＧＴＧＡＴＧ（配列番号３）
ＣＡＡＣＴＣＴＧＣＣＧＣＣＴＴＣＴＴＣＴ（配列番号４）
ＮＤＵＦＳ２用のプライマーセット
ＴＴＧＡＴＣＣＣＣＣＣＴＧＣＣＴＡＴＣ（配列番号５）
ＡＣＡＧＡＧＧＣＣＡＡＴＴＴＣＣＡＧＴＧＡ（配列番号６）
ＧＡＰＤＨ用のプライマーセット
ＴＧＣＡＣＣＡＣＣＡＡＣＴＧＣＴＴＡＧＣ（配列番号７）
ＴＣＴＴＣＴＧＧＧＴＧＧＣＡＧＴＧＡＴＧ（配列番号８）
【００２７】
上記の遺伝子発現量の定量化はΔΔＣｔ法にて行い、Ｐ０におけるＮＤＵＦＡ１、ＮＤＵＦＢ７およびＮＤＵＦＳ２ ｍＲＮＡ発現量に対するＰ１、Ｐ２およびＰ３における発現量を算出した。その結果を表１に示す。正常ヒトケラチノサイトの継代数が増加するに伴い、ＮＤＵＦＡ１、ＮＤＵＦＢ７およびＮＤＵＦＳ２ ｍＲＮＡ発現量が減少することが明らかとなった。以上より、加齢によって、ＮＡＤＨ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｍＲＮＡ発現量が減少することが示された。
【００２８】
【表１】
【００２９】
実験例２ 皮膚中ＮＡＤＨ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｍＲＮＡ発現量と皮膚明度の相関
同年代の被験者６名（平均年齢４４歳）の顔面頬部にそれぞれ半径１ｃｍの円状のテープ（Ｂｌｅｎｄｅｒｍ、３Ｍ）を一枚貼り付け、十分に接着していることを確認した後、テープを剥がし取り、角質を含むテープを得た。得られた角質に含まれるＲＮＡをＲＮＡ抽出キット（ＲＮＡｑｕｅｏｕｓ−４ＰＣＲ Ｋｉｔ、Ａｍｂｉｏｎ）を用いて抽出した。すなわち、角質の付着したテープをテープごと３５０μＬのＬｙｓｉｓ／Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎに入れ、ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加し、５６℃で１時間インキュベートした。その後、超音波破砕機を用いて分散させた後、３５０μＬの６４％エタノールを加えて攪拌し、テープを取り除き、角質抽出液を得た。付属のＦｉｌｔｅｒ ＣａｒｔｒｉｇｅにＲＮＡを吸着させた後に、１００μＬの抽出液でＲＮＡを溶出した。得られた溶出液にＤＮａｓｅＩを加え、残存しているＤＮＡを完全に除去した後、エタノールを用いてＲＮＡを沈殿させてＲＮＡを濃縮した。得られたＲＮＡのペレットを必要量の水に溶解して、角質に含まれる残存ＲＮＡを得た。得られたＲＮＡは、実験例１と同様の方法にて定量ＰＣＲ反応に供し、ＮＡＤＨ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅのサブユニットの一つであるＮＤＵＦＡ１遺伝子発現量を定量した。ＮＤＵＦＡ１遺伝子の発現量はβ−アクチン遺伝子の発現量で規格化した。なお、β−アクチン遺伝子発現量の測定に使用したプライマーを以下に示した。
また、皮膚明度は、上記同一被験者６名の顔面頬部を、分光測色計（ＣＭ−２６００ｄ、コニカミノルタ）にて同一箇所を５回測定し、その平均から皮膚明度（Ｌ値）を算出した。
【００３０】
β−アクチン用のプライマーセット
ＣＡＣＴＣＴＴＣＣＡＧＣＣＴＴＣＣＴＴＣＣ（配列番号９）
ＧＴＧＴＴＧＧＣＧＴＡＣＡＧＧＴＣＴＴＴＧ（配列番号１０）
【００３１】
上記の遺伝子発現量の定量化はΔΔＣｔ法で行い、ＮＤＵＦＡ１ ｍＲＮＡの発現量は、標準品の発現量に対する顔面頬部の発現量の比率として算出した。標準品のＮＤＵＦＡ１ ｍＲＮＡ発現量は、ＢｉｏＣｈａｉｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ社から購入したＴｏｔａｌ ＲＮＡ（Ｃａｔａｌｏｇ Ｎｏ．Ｒ１２３４２１８−Ｐ）を用いて算出した。遺伝子発現比率が１以上となった場合は、顔面頬部角質中のＮＤＵＦＡ１ ｍＲＮＡ発現量が、標準品のＮＤＵＦＡ１ ｍＲＮＡ発現量よりも高いことを示している。
ΔΔＣｔ＝（顔面頬部のＮＤＵＦＡ１ ｍＲＮＡのＣｔ値―顔面頬部のβ−アクチンｍＲＮＡのＣｔ値）―（標準品のＮＤＵＦＡ１ ｍＲＮＡのＣｔ値―標準品のβ−アクチンｍＲＮＡのＣｔ値）
遺伝子発現比率＝２−ΔΔＣｔ
【００３２】
その結果を表２に示す。皮膚中ＮＤＵＦＡ１ ｍＲＮＡ発現量が高値を示す被験者（被験者１〜３）においては、高いＬ値を示し、ＮＤＵＦＡ１ ｍＲＮＡ発現量が低値を示す被験者（被験者４〜６）においては、低いＬ値を示すことが明らかとなった。従って、皮膚中ＮＤＵＦＡ１ ｍＲＮＡ発現量と皮膚明度に相関があることが示された。以上より、皮膚におけるＮＡＤＨ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｍＲＮＡ発現量を測定することにより、従来技術では評価することができなかった、加齢による皮膚明度の低下について予測することが可能となった。
【００３３】
【表２】
【産業上の利用可能性】
【００３４】
本発明の加齢による皮膚明度の低下を予測する皮膚評価方法によれば、加齢による皮膚明度の低下が起こり易いか否かを判断することができる。また、皮膚明度の低下が起こる前から皮膚明度の低下に対する手入れを行うことで、今まで以上の効果が期待できる。さらに、皮膚明度の低下抑制因子を適切に選定することができる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、加齢による皮膚明度の低下を予測するための皮膚評価方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
加齢により、皮膚明度が低下することが知られている。これは、加齢によってメラニン量が増加する、新陳代謝が低下し皮膚のターンオーバーが遅延する、血流が低下するなどが原因であると考えられる。特に、顔や首などの皮膚明度の低下は、常に他人から見られる部位であるため非常に気になり、大きな精神的ダメージを被る。また、皮膚明度の低下を隠す方法として、例えばメイク用品のファンデーションやコンシーラーなどがあるが、その効果は十分なものではなかった。このように、加齢による皮膚明度の低下は、我々にとって大きな悩みではあるが、年齢を重ねると誰にでも起こり得る現象であるため、対処は難しいとの考え方が一般的であった。
【０００３】
しかしながら、加齢による皮膚明度の低下は誰にでも起こり得るものの、その程度には大きな差があることが経験上知られている。即ち、皮膚明度の変化を同年代で比較した場合、皮膚明度が大きく低下するヒトがいる一方で、それほど低下しないヒトがいる。このように、皮膚明度の低下には極めて個人差があると考えられる。そこで、加齢による皮膚明度の低下をある程度予測することができれば、皮膚明度が低下する前から念入りにアンチエイジング対応の医薬品、医薬部外品および化粧品を使用することで、将来起こり得る皮膚明度の低下を予防・改善することができると考えられる。
【０００４】
皮膚における特定の因子を測定することにより、将来起こり得る皮膚性状の変化を予測することは既に行われている。例えば、シミに特異的な遺伝子の発現量を測定することにより、シミ形成の起こり易さを予測する方法（特許文献１、２）が知られている。また、角質細胞の微絨毛様突起を観察することにより、将来的な皮膚バリア機能の程度を予測する方法（特許文献３）が知られている。しかし、加齢による皮膚明度の低下を予測する方法については、これまで知られていない。
【０００５】
一方、ＮＡＤＨ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（ＮＡＤＨ脱水素酵素）は、ミトコンドリア電子伝達系の呼吸鎖複合体Ｉにおいて、ＮＡＤＨ（還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）を電子供与体として、酸化型電子受容体を還元型に変換する反応を触媒する酵素である。ＮＡＤＨ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅの量または活性が低下することによって引き起こされる疾患群として、例えばミトコンドリア異常症が知られており、症例部位においては、ミトコンドリアの呼吸鎖複合体Ｉの活性が低下していることが知られている（非特許文献１）。また、アルツハイマー病患者の脳組織においては、健常者の脳組織と比べてＮＡＤＨ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅの量が減少していることが知られている（特許文献４）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００７−２８９０６３号公報
【特許文献２】特開２００９−１１２２５５号公報
【特許文献３】特開２００７−３０９７２０号公報
【特許文献４】特開２００５−１３２７３８号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】本多 正和，埼玉医科大学雑誌，３５：３１−３６，２００８．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明者は、加齢による皮膚明度の低下が起こるか否かを予測できる手法について鋭意検討した。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、皮膚中のＮＡＤＨ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ発現量と皮膚明度に相関があることを見出したものである。従って、皮膚中のＮＡＤＨ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ発現量を調べることにより、加齢による皮膚明度の低下が起こり易い皮膚であると判断することが可能であることが明らかとなった。以下に列挙する皮膚評価方法を提供する。
［１］皮膚中のＮＡＤＨ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ発現量を指標とする、加齢による皮膚明度の低下を予測する皮膚評価方法。
［２］前記ＮＡＤＨ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅが、ＮＤＵＦＡ１、ＮＤＵＦＢ７およびＮＤＵＦＳ２である、［１］に記載の皮膚評価方法。
［３］角質細胞中のＮＡＤＨ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ発現量を測定することにより決定される、［１］および［２］に記載の皮膚評価方法。
［４］加齢による皮膚明度の低下抑制因子をスクリーニングする方法であって、候補化合物のＮＡＤＨ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅの発現および／または活性を促進させる能力について評価し、当該促進能力を有するＮＡＤＨ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ促進因子を皮膚明度の低下抑制因子として選定することを特徴とするスクリーニング方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、被験対象部位の皮膚中のＮＡＤＨ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ発現量を測定することによって、加齢による皮膚明度の低下が起こり易い皮膚であると判断することを特徴とする皮膚評価方法を提供することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明の第一の局面は、加齢による皮膚明度の低下を予測するための検査方法を提供する。この方法は、皮膚中のＮＡＤＨ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ発現量が基準発現量よりも低値を示す場合、加齢による皮膚明度の低下が起こり易い皮膚であると判断することを特徴とする。
【００１２】
本発明の加齢による皮膚明度の低下を予測するための皮膚評価方法は、好ましくは以下の一連のステップ（１）〜（３）によって実施される。
（１）被験対象部位の皮膚試料を用意するステップ
（２）前記皮膚試料中のＮＡＤＨ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ発現量を測定するステップ
（３）前記発現量から皮膚明度の低下の起こり易さを評価するステップ
【００１３】
本発明の「加齢による皮膚明度の低下を予測する」とは、将来的に生じると考えられる皮膚明度の低下を、現在の皮膚状態から科学的根拠に基づいて推測することである。
【００１４】
「ＮＡＤＨ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ」は、ミトコンドリア電子伝達系の呼吸鎖複合体Ｉにおいて、ＮＡＤＨ（還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）を電子供与体として、酸化型電子受容体を還元型に変換する反応を触媒する酵素であり、いくつかのサブユニットが存在する。本発明における皮膚評価方法としては、皮膚試料中のＮＤＵＦＡ１〜ＮＤＵＦＡ１３、ＮＤＵＦＢ１〜ＮＤＵＦＢ１１、ＮＤＵＦＣ１〜ＮＤＵＦＣ２、ＮＤＵＦＳ１〜ＮＤＵＦＳ８、およびＮＤＵＦＶ１〜ＮＤＵＦＶ３を測定することによって、加齢による皮膚明度の低下を予測することが可能となる。好ましくは、ＮＤＵＦＡ１〜ＮＤＵＦＡ１３、ＮＤＵＦＢ１〜ＮＤＵＦＢ１１およびＮＤＵＦＳ１〜ＮＤＵＦＳ８を測定することによって、皮膚明度の低下を予測することが可能となる。より好ましくは、ＮＤＵＦＡ１、ＮＤＵＦＢ７およびＮＤＵＦＳ２を測定することによって、皮膚明度の低下を予測することが可能となる。
【００１５】
検査すべき皮膚は、例えば顔、首、腕、肢など、加齢による皮膚明度の低下が気になるあらゆる部位の皮膚であってよい。また、これらの試料（組織もしくは細胞）の培養物であってもよい。
【００１６】
本発明中の「角質細胞」とは、皮膚の中で最外層に存在する角質層における細胞を示す。本発明における、皮膚中のＮＡＤＨ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ発現量の測定は、皮膚中のどの細胞を用いても行うことができる。好ましくは、容易に採取でき、かつ非侵襲的な方法による採取が可能な、角質細胞中のＮＡＤＨ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ発現量を測定するのがよい。
【００１７】
皮膚からの試料の採取方法は特に限定されない。例えば、外科的手段などの侵襲的な方法により採取されたものでよい。好ましくは非侵襲的な採取方法を採用することが望ましい。非侵襲的な方法としては、当該技術分野で使用されているテープストリッピングや擦過法などを挙げることができる。
【００１８】
皮膚中のＮＡＤＨ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ発現量の測定方法は特に限定されない。例えば、ＮＡＤＨ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅをコードするｍＲＮＡ発現量を測定する方法が挙げられる。
【００１９】
皮膚中のＮＡＤＨ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｍＲＮＡ発現量は、皮膚試料からＲＮＡを抽出し、逆転写反応を行った後にＰＣＲ法を行うことにより決定することができる。ＲＮＡの抽出方法、ＰＣＲ法は当業者にとって周知であり、常法のプロトコール、または常法のプロトコールを適宜修正・変更したプロトコールによって適切な測定系を構築し、そして実施することができる。
【００２０】
皮膚明度の低下の起こり易さの評価は、例えば、算出した発現量を、予め設定した基準発現量と比較して、その比率を計算する。そして、その比率が、複数の区分の中のいずれに該当するのかを調べる。区分の設定に関する具体例を以下に示す。
（例１）皮膚明度の低下の起こり易さ（低い）：比率＜ａ、（中程度）：ａ≦比率＜ｂ、（高い）：ｂ≦比率
【００２１】
（例１）では区分数を３としているが、区分数は特に限定されるものではない。例えば、区分数を２〜１０のいずれかにすることができる。区分数、および各区分に関連付けられる基準発現量の値の範囲は、予備実験の結果を基に任意に設定可能である。
【００２２】
本発明の第二の局面は、皮膚明度の低下抑制因子をスクリーニングする方法を提供する。この方法は、候補化合物をＮＡＤＨ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅの発現および／または活性を促進する能力について評価し、当該促進能力を有するＮＡＤＨ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ促進因子を皮膚明度の低下抑制因子として選定することを特徴とする。
【００２３】
例えば、被験対象部位の皮膚に候補化合物、または候補化合物を含む製剤を適用し、適用前後のＮＡＤＨ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ発現量を測定することにより、当該促進能力の評価をすることができる。被験対象部位への候補化合物の適用方法は、塗布や接種など、皮膚への直接的な適用に限定されることはなく、例えば、経口や経鼻などの間接的な適用であってもよい。また、被験対象部位の皮膚試料（組織もしくは細胞）の培養物に候補化合物を適用し、適用の有無によるＮＡＤＨ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ発現量を測定することにより、当該促進能力の評価を行うこともできる。
【実施例】
【００２４】
以下、本発明を効果的に説明するために、実験例を挙げる。なお、本発明はこれにより限定されるものではない。
【００２５】
実験例１ 老化によるＮＡＤＨ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｍＲＮＡ発現量の減少
正常ヒトケラチノサイト（ＫＫ−４００９、クラボウ）を解凍後、直径６０ｍｍ ｄｉｓｈ（ＦＡＬＣＯＮ）でコンフルエントになるまで培養した。この細胞を継代回数０（Ｐ０）とし、ＲＮＡ抽出キット（ＴＲＩｚｏｌ Ｒｅａｇｅｎｔ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にて総ＲＮＡを抽出した。また、繰り返し継代培養を行うことにより、細胞の老化モデルを作製した。継代培養を１回行った細胞をＰ１、２回行った細胞をＰ２、３回行った細胞をＰ３とし、それぞれコンフルエントになった後、ＲＮＡ抽出キットにて総ＲＮＡを抽出した。得られたＲＮＡを、ＲＴ−ＰＣＲキット（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ Ｐｌａｔｉｎｕｍ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｔｗｏ−ｓｔｅｐ ｑＲＴ−ＰＣＲ ｋｉｔ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いた定量ＰＣＲ反応に供し、ＮＡＤＨ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅのサブユニットのうち、ＮＤＵＦＡ１、ＮＤＵＦＢ７およびＮＤＵＦＳ２遺伝子の発現量を定量した。これらの遺伝子発現量は、ＧＡＰＤＨ遺伝子の発現量で規格化（ノーマライズ）した。なお、ＮＤＵＦＡ１、ＮＤＵＦＢ７、ＮＤＵＦＳ２およびＧＡＰＤＨ遺伝子発現量の測定に使用したプライマーは次の通りである。
【００２６】
ＮＤＵＦＡ１用のプライマーセット
ＴＧＧＧＣＧＴＧＴＧＣＴＴＧＴＴＧＡＴ（配列番号１）
ＣＣＧＴＴＡＧＴＧＡＡＣＣＴＧＴＧＧＡＴＧＴＡＣ（配列番号２）
ＮＤＵＦＢ７用のプライマーセット
ＡＧＣＡＣＣＧＣＧＡＣＴＡＴＧＴＧＡＴＧ（配列番号３）
ＣＡＡＣＴＣＴＧＣＣＧＣＣＴＴＣＴＴＣＴ（配列番号４）
ＮＤＵＦＳ２用のプライマーセット
ＴＴＧＡＴＣＣＣＣＣＣＴＧＣＣＴＡＴＣ（配列番号５）
ＡＣＡＧＡＧＧＣＣＡＡＴＴＴＣＣＡＧＴＧＡ（配列番号６）
ＧＡＰＤＨ用のプライマーセット
ＴＧＣＡＣＣＡＣＣＡＡＣＴＧＣＴＴＡＧＣ（配列番号７）
ＴＣＴＴＣＴＧＧＧＴＧＧＣＡＧＴＧＡＴＧ（配列番号８）
【００２７】
上記の遺伝子発現量の定量化はΔΔＣｔ法にて行い、Ｐ０におけるＮＤＵＦＡ１、ＮＤＵＦＢ７およびＮＤＵＦＳ２ ｍＲＮＡ発現量に対するＰ１、Ｐ２およびＰ３における発現量を算出した。その結果を表１に示す。正常ヒトケラチノサイトの継代数が増加するに伴い、ＮＤＵＦＡ１、ＮＤＵＦＢ７およびＮＤＵＦＳ２ ｍＲＮＡ発現量が減少することが明らかとなった。以上より、加齢によって、ＮＡＤＨ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｍＲＮＡ発現量が減少することが示された。
【００２８】
【表１】
【００２９】
実験例２ 皮膚中ＮＡＤＨ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｍＲＮＡ発現量と皮膚明度の相関
同年代の被験者６名（平均年齢４４歳）の顔面頬部にそれぞれ半径１ｃｍの円状のテープ（Ｂｌｅｎｄｅｒｍ、３Ｍ）を一枚貼り付け、十分に接着していることを確認した後、テープを剥がし取り、角質を含むテープを得た。得られた角質に含まれるＲＮＡをＲＮＡ抽出キット（ＲＮＡｑｕｅｏｕｓ−４ＰＣＲ Ｋｉｔ、Ａｍｂｉｏｎ）を用いて抽出した。すなわち、角質の付着したテープをテープごと３５０μＬのＬｙｓｉｓ／Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎに入れ、ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加し、５６℃で１時間インキュベートした。その後、超音波破砕機を用いて分散させた後、３５０μＬの６４％エタノールを加えて攪拌し、テープを取り除き、角質抽出液を得た。付属のＦｉｌｔｅｒ ＣａｒｔｒｉｇｅにＲＮＡを吸着させた後に、１００μＬの抽出液でＲＮＡを溶出した。得られた溶出液にＤＮａｓｅＩを加え、残存しているＤＮＡを完全に除去した後、エタノールを用いてＲＮＡを沈殿させてＲＮＡを濃縮した。得られたＲＮＡのペレットを必要量の水に溶解して、角質に含まれる残存ＲＮＡを得た。得られたＲＮＡは、実験例１と同様の方法にて定量ＰＣＲ反応に供し、ＮＡＤＨ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅのサブユニットの一つであるＮＤＵＦＡ１遺伝子発現量を定量した。ＮＤＵＦＡ１遺伝子の発現量はβ−アクチン遺伝子の発現量で規格化した。なお、β−アクチン遺伝子発現量の測定に使用したプライマーを以下に示した。
また、皮膚明度は、上記同一被験者６名の顔面頬部を、分光測色計（ＣＭ−２６００ｄ、コニカミノルタ）にて同一箇所を５回測定し、その平均から皮膚明度（Ｌ値）を算出した。
【００３０】
β−アクチン用のプライマーセット
ＣＡＣＴＣＴＴＣＣＡＧＣＣＴＴＣＣＴＴＣＣ（配列番号９）
ＧＴＧＴＴＧＧＣＧＴＡＣＡＧＧＴＣＴＴＴＧ（配列番号１０）
【００３１】
上記の遺伝子発現量の定量化はΔΔＣｔ法で行い、ＮＤＵＦＡ１ ｍＲＮＡの発現量は、標準品の発現量に対する顔面頬部の発現量の比率として算出した。標準品のＮＤＵＦＡ１ ｍＲＮＡ発現量は、ＢｉｏＣｈａｉｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ社から購入したＴｏｔａｌ ＲＮＡ（Ｃａｔａｌｏｇ Ｎｏ．Ｒ１２３４２１８−Ｐ）を用いて算出した。遺伝子発現比率が１以上となった場合は、顔面頬部角質中のＮＤＵＦＡ１ ｍＲＮＡ発現量が、標準品のＮＤＵＦＡ１ ｍＲＮＡ発現量よりも高いことを示している。
ΔΔＣｔ＝（顔面頬部のＮＤＵＦＡ１ ｍＲＮＡのＣｔ値―顔面頬部のβ−アクチンｍＲＮＡのＣｔ値）―（標準品のＮＤＵＦＡ１ ｍＲＮＡのＣｔ値―標準品のβ−アクチンｍＲＮＡのＣｔ値）
遺伝子発現比率＝２−ΔΔＣｔ
【００３２】
その結果を表２に示す。皮膚中ＮＤＵＦＡ１ ｍＲＮＡ発現量が高値を示す被験者（被験者１〜３）においては、高いＬ値を示し、ＮＤＵＦＡ１ ｍＲＮＡ発現量が低値を示す被験者（被験者４〜６）においては、低いＬ値を示すことが明らかとなった。従って、皮膚中ＮＤＵＦＡ１ ｍＲＮＡ発現量と皮膚明度に相関があることが示された。以上より、皮膚におけるＮＡＤＨ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｍＲＮＡ発現量を測定することにより、従来技術では評価することができなかった、加齢による皮膚明度の低下について予測することが可能となった。
【００３３】
【表２】
【産業上の利用可能性】
【００３４】
本発明の加齢による皮膚明度の低下を予測する皮膚評価方法によれば、加齢による皮膚明度の低下が起こり易いか否かを判断することができる。また、皮膚明度の低下が起こる前から皮膚明度の低下に対する手入れを行うことで、今まで以上の効果が期待できる。さらに、皮膚明度の低下抑制因子を適切に選定することができる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
皮膚中のＮＡＤＨ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ発現量を指標とする、加齢による皮膚明度の低下を予測する皮膚評価方法。
【請求項２】
前記ＮＡＤＨ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅが、ＮＤＵＦＡ１、ＮＤＵＦＢ７およびＮＤＵＦＳ２である、請求項１に記載の皮膚評価方法。
【請求項３】
角質細胞中のＮＡＤＨ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ発現量を測定することにより決定される、請求項１および２に記載の皮膚評価方法。
【請求項４】
加齢による皮膚明度の低下抑制因子をスクリーニングする方法であって、候補化合物のＮＡＤＨ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅの発現および／または活性を促進させる能力について評価し、当該促進能力を有するＮＡＤＨ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ促進因子を皮膚明度の低下抑制因子として選定することを特徴とするスクリーニング方法。
【請求項１】
皮膚中のＮＡＤＨ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ発現量を指標とする、加齢による皮膚明度の低下を予測する皮膚評価方法。
【請求項２】
前記ＮＡＤＨ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅが、ＮＤＵＦＡ１、ＮＤＵＦＢ７およびＮＤＵＦＳ２である、請求項１に記載の皮膚評価方法。
【請求項３】
角質細胞中のＮＡＤＨ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ発現量を測定することにより決定される、請求項１および２に記載の皮膚評価方法。
【請求項４】
加齢による皮膚明度の低下抑制因子をスクリーニングする方法であって、候補化合物のＮＡＤＨ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅの発現および／または活性を促進させる能力について評価し、当該促進能力を有するＮＡＤＨ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ促進因子を皮膚明度の低下抑制因子として選定することを特徴とするスクリーニング方法。
【公開番号】特開２０１１−１１５０９８（Ｐ２０１１−１１５０９８Ａ）
【公開日】平成２３年６月１６日（２０１１．６．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−２７５９８９（Ｐ２００９−２７５９８９）
【出願日】平成２１年１２月４日（２００９．１２．４）
【出願人】（５９２２６２５４３）日本メナード化粧品株式会社 (223)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年６月１６日（２０１１．６．１６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１２月４日（２００９．１２．４）
【出願人】（５９２２６２５４３）日本メナード化粧品株式会社 (223)
【Ｆターム（参考）】
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