加齢黄斑変性の予防又は治療剤
【課題】 ブホルミン若しくはフェンホルミン又はそれらの塩の新たな医薬用途を探索すること。
【解決手段】 ブホルミン若しくはフェンホルミン又はそれらの塩は、脈絡膜において優れた血管新生阻害作用を発揮する一方、光障害による光受容体細胞死をも抑制するので、加齢黄斑変性の予防又は治療剤として有用である。
【解決手段】 ブホルミン若しくはフェンホルミン又はそれらの塩は、脈絡膜において優れた血管新生阻害作用を発揮する一方、光障害による光受容体細胞死をも抑制するので、加齢黄斑変性の予防又は治療剤として有用である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ブホルミン、フェンホルミン及びそれらの塩からなる群より選ばれた少なくとも１種の化合物を有効成分として含有する加齢黄斑変性の予防又は治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
加齢黄斑変性（ａｇｅ‐ｒｅｌａｔｅｄ ｍａｃｕｌａｒ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ： ＡＭＤ）は、現在、先進国における失明の主要原因疾患の一つであり、主に５０歳以上の高齢者に見られる。加齢黄斑変性は黄斑の加齢に伴う変化によっておこる疾患であり、滲出型加齢黄斑変性（ｅｘｕｄａｔｉｖｅ ＡＭＤ）、萎縮型加齢黄斑変性（ａｔｒｏｐｈｉｃ ＡＭＤ）及びこれらの前駆病変である初期加齢黄斑変性（ｅａｒｌｙ ａｇｅ−ｒｅｌａｔｅｄ ｍａｃｕｌｏｐａｔｈｙ）に大別される。ここで、滲出型加齢黄斑変性は高齢者の黄斑に脈絡膜から新生血管が発生し、網膜色素上皮下又は網膜下に出血や滲出性病変を生じ、ついには瘢痕組織を形成する疾患である。一方、萎縮型加齢黄斑変性は黄斑部の萎縮やドルーゼンの蓄積を伴う疾患である。
【０００３】
滲出型加齢黄斑変性の基本となる病態は、脈絡膜血管新生であり、黄斑の網膜色素上皮細胞、ブルッフ膜、脈絡膜血管等の加齢変化を基盤にして発症すると考えられている。しかし、脈絡膜血管新生の発症原因・メカニズムはいまだ解明されていない点が多く、今後の発展が期待される領域である。一方、初期加齢黄斑変性および萎縮型加齢黄斑変性は、脈絡膜新生血管を伴わないことが知られている。なお、萎縮型加齢黄斑変性においては、萎縮に伴う光受容体細胞の変性（細胞死）により視力低下が生じると考えられており、光受容体細胞保護が新たな治療法として注目されている（非特許文献１）。
【０００４】
一方、ビグアナイド系薬剤は、古くから経口糖尿病薬として開発および臨床使用されてきた薬剤である。ビグアナイド系薬剤としては、我が国で上市されているメトホルミンおよびブホルミンに加えて、フェンホルミン、ベンホスホルミン（Ｂｅｎｆｏｓｆｏｒｍｉｎ）、エトホルミン（Ｅｔｏｆｏｒｍｉｎ）、ティホルミン（Ｔｉｆｏｒｍｉｎ）などが知られている。
【０００５】
ビグアナイド系薬剤の血糖低下作用の作用機序については完全には明らかとなっていないが、一部のビグアナイド系薬剤がインスリン感受性を亢進すること（非特許文献２）、ＡＭＰＫ（ＡＭＰ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ）活性化作用を有すること（非特許文献３及び４）などが報告されている。また、糖尿病薬により血糖コントロールを適切に行うことは糖尿病網膜症の予防及び進行の抑制に有効であることが知られており（特許文献１、非特許文献５など）、特許文献１には、糖尿病薬の一例としてビグアナイド系薬剤が開示されている。
【０００６】
ところで、ビグアナイド系薬剤の一つであるメトホルミンについては、特許文献２において、そのＡＭＰＫ活性化作用より加齢黄斑変性の治療に有用であることが示唆されている。しかしながら、特許文献２には、メトホルミンがどのように加齢黄斑変性の治療に用いられるのか開示されておらず、また、初期加齢黄斑変性、萎縮型加齢黄斑変性または滲出型加齢黄斑変性のいずれの型の加齢黄斑変性の治療に有用であるのかも明らかではない。さらに、メトホルミン以外のビグアナイド系薬剤（例えば、ブホルミン又はフェンホルミン）が加齢黄斑変性に及ぼす影響についても、特許文献２には一切記載も示唆もされていない。
【０００７】
また、代表的なＡＭＰＫ活性化剤であるＡＩＣＡＲ（５−ａｍｉｎｏｉｍｉｄａｚｏｌｅ−４−ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ）が血管新生促進因子であるＶＥＧＦ（ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）の発現を促進するとの報告も存在し（非特許文献６）、メトホルミン以外のビグアナイド系薬剤が加齢黄斑変性を悪化させる可能性も考えられる。
【０００８】
以上のように、ブホルミン又はフェンホルミンが加齢黄斑変性に及ぼす影響については全く明らかとなっていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】国際公開２００５／０４９０１４号パンフレット
【特許文献２】国際公開２００８／０２２２５６号パンフレット
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Expert Opin. Ther. Targets, 11(5), 625-639 (2007)
【非特許文献２】Int. J. Diabetes and Metabol., 13(3), 111-134 (2005)
【非特許文献３】Mini-Rev. Med. Chem., 7(5), 521-528 (2007)
【非特許文献４】Biochem. Pharmacol., 71(11), 1637-1647 (2006)
【非特許文献５】Postgrad. Med., 116(1), 57-64 (2004)
【非特許文献６】Biochem. Biophys. Res. Commun., 342(4), 1197-1202 (2006)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
すなわち、ブホルミン又はフェンホルミンの新たな医薬用途を探索することは興味深い課題である。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本願の発明者は、ブホルミン又はフェンホルミンの新たな医薬用途を探索すべく鋭意研究したところ、レーザー誘発ラット脈絡膜血管新生モデルにおいて、ブホルミン又はフェンホルミンの経口投与により脈絡膜血管新生の阻害が認められることを見出し、本発明に至った。一方で、メトホルミンの経口投与では脈絡膜血管新生阻害がほとんど認められなかったことを考慮すれば、これは驚くべき結果である。
【００１３】
また、ブホルミン又はフェンホルミンがヒト網膜血管内皮細胞であるＨＲＥＣの細胞増殖を抑制する一方で、メトホルミンは全く細胞増殖を抑制しなかった。すなわち、ブホルミン及びフェンホルミンは、メトホルミンが有していない異質な作用により脈絡膜血管新生を阻害している可能性が考えられる。
【００１４】
さらに、本願の発明者は、マウス光障害モデルにおいて、ブホルミン又はフェンホルミンの経口投与が光受容体細胞死を抑制することも見出した。一方、驚くべきことに、メトホルミンの経口投与は光受容体細胞死を全く抑制しなかった。
【００１５】
すなわち、本発明は、ブホルミン、フェンホルミン及びそれらの塩からなる群より選択された少なくとも１種の化合物を有効成分として含有する加齢黄斑変性の予防又は治療剤である。
【発明の効果】
【００１６】
後述するように、ブホルミン又はフェンホルミンは、レーザー誘発ラット脈絡膜血管新生モデルにおいて優れた脈絡膜血管新生阻害作用を示す一方、マウス光障害モデルにおいて光受容体細胞死を抑制した。また、ブホルミン又はフェンホルミンは、ＶＥＧＦによって誘発されるＨＲＥＣ細胞の増殖を抑制した。すなわち、ブホルミン若しくはフェンホルミン又はこれらの塩（以下、「本化合物」ともいう）は、加齢黄斑変性の予防又は治療剤として有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
ブホルミン又はフェンホルミンは、それぞれ、下記の化学構造式［I］又は［II］で示される化合物である。
【化１】
【化２】
【００１８】
また、ブホルミン又はフェンホルミンの塩としては、医薬として許容される塩であれば特に制限はなく、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸等の無機酸との塩、酢酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、クエン酸、酒石酸、アジピン酸、グルコン酸、グルコヘプト酸、グルクロン酸、テレフタル酸、メタンスルホン酸、乳酸、馬尿酸、１，２−エタンジスルホン酸、イセチオン酸、ラクトビオン酸、オレイン酸、パモ酸、ポリガラクツロン酸、ステアリン酸、タンニン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、硫酸ラウリルエステル、硫酸メチル、ナフタレンスルホン酸、スルホサリチル酸等の有機酸との塩、臭化メチル、ヨウ化メチル等との四級アンモニウム塩、臭素イオン、塩素イオン、ヨウ素イオン等のハロゲンイオンとの塩、リチウム、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属との塩、カルシウム、マグネシウム等のアルカリ土類金属との塩、鉄、亜鉛等との金属塩、アンモニアとの塩、トリエチレンジアミン、２−アミノエタノール、２，２−イミノビス（エタノール）、１−デオキシ−１−（メチルアミノ）−２−Ｄ−ソルビトール、２−アミノ−２−（ヒドロキシメチル）−１，３−プロパンジオール、プロカイン、Ｎ，Ｎ−ビス（フェニルメチル）−１，２−エタンジアミン等の有機アミンとの塩等が挙げられるが、塩酸塩が特に好ましい。また、ブホルミン若しくはフェンホルミンは水和物又は溶媒和物の形態をとっていてもよい。
【００１９】
ブホルミン若しくはフェンホルミンに幾何異性体又は光学異性体が存在する場合は、それらの異性体又はそれらの塩も本発明の範囲に含まれる。また、ブホルミン若しくはフェンホルミンにプロトン互変異性が存在する場合には、それらの互変異性体又はそれらの塩も本発明の範囲に含まれる。
【００２０】
ブホルミン、フェンホルミン若しくはそれらの幾何異性体、光学異性体及びプロトン互変異性又はそれらの塩に、結晶多形及び結晶多形群（結晶多形システム）が存在する場合には、それらの結晶多形体及び結晶多形群（結晶多形システム）も本発明の範囲に含まれる。ここで、結晶多形群（結晶多形システム）とは、それら結晶の製造、晶出、保存等の条件及び状態（なお、本状態には製剤化した状態も含む）により、結晶形が変化する場合の各段階における個々の結晶形及びその過程全体を意味する。
【００２１】
本発明において、加齢黄斑変性とは滲出型加齢黄斑変性、萎縮型加齢黄斑変性及びこれらの前駆病変である初期加齢黄斑変性を意味する。滲出型加齢黄斑変性は高齢者の黄斑に脈絡膜から新生血管が発生し、網膜色素上皮下又は網膜下に出血や滲出性病変を生じ、ついには瘢痕組織を形成する疾患である。一方、萎縮型加齢黄斑変性は黄斑部の萎縮やドルーゼンの蓄積を伴う疾患である。
【００２２】
本化合物は、必要に応じて、医薬として許容される添加剤を加え、単独製剤又は配合製剤として汎用されている技術を用いて製剤化することができる。なお、我が国では、１錠中に塩酸ブホルミン５０mgを含有し、添加物として乳糖、バレイショデンプン、アラビアゴム末、ステアリン酸マグネシウム、ヒプロメロース、酸化チタン及びカルナウバウロを含有する医薬組成物「ジベトス錠５０mg」が、経口血糖低下剤として市販されている。
【００２３】
本化合物は、前述の眼疾患の予防又は治療に使用する場合、患者に対して経口的又は非経口的に投与することができ、投与形態としては、経口投与、眼への局所投与（点眼投与、結膜嚢内投与、硝子体内投与、結膜下投与、テノン嚢下投与等）、静脈内投与、経皮投与等が挙げられるが、経口投与が特に好ましい。
【００２４】
本化合物は、必要に応じて、製薬学的に許容され得る添加剤と共に、投与に適した剤型に製剤化される。経口投与に適した剤型としては、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤等が挙げられるが、錠剤が特に好ましい。非経口投与に適した剤型としては、例えば、注射剤、点眼剤、眼軟膏、貼布剤、ゲル、挿入剤等が挙げられる。これらは当該分野で汎用されている通常の技術を用いて調製することができる。また、本化合物はこれらの製剤の他に眼内インプラント用製剤やマイクロスフェアー等のＤＤＳ（ドラッグデリバリーシステム）化された製剤にすることもできる。
【００２５】
例えば、錠剤は、乳糖、ブドウ糖、Ｄ−マンニトール、無水リン酸水素カルシウム、デンプン、ショ糖等の賦形剤；カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、クロスカルメロースナトリウム、クロスポピドン、デンプン、部分アルファー化デンプン、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース等の崩壊剤；ヒドロキシプロピルセルロース、エチルセルロース、アラビアゴム、デンプン、部分アルファー化デンプン、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール等の結合剤；ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、タルク、含水二酸化ケイ素、硬化油等の滑沢剤；精製白糖、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、ポリビニルピロリドン等のコーティング剤；クエン酸、アスパルテーム、アスコルビン酸、メントール等の矯味剤などを適宜選択して用い、調製することができる。
【００２６】
注射剤は、塩化ナトリウム等の等張化剤；リン酸ナトリウム等の緩衝化剤；ポリオキシエチレンソルビタンモノオレート等の界面活性剤；メチルセルロース等の増粘剤等から必要に応じて選択して用い、調製することができる。
【００２７】
点眼剤は、塩化ナトリウム、濃グリセリンなどの等張化剤；リン酸ナトリウム、酢酸ナトリウムなどの緩衝化剤；ポリオキシエチレンソルビタンモノオレート、ステアリン酸ポリオキシル４０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油等の界面活性剤；クエン酸ナトリウム、エデト酸ナトリウム等の安定化剤；塩化ベンザルコニウム、パラベン等の防腐剤等から必要に応じて選択して用い、調製することができ、ｐＨは眼科製剤に許容される範囲内にあればよいが、通常４〜８の範囲内が好ましい。また、眼軟膏は、白色ワセリン、流動パラフィン等の汎用される基剤を用い、調製することができる。
【００２８】
挿入剤は、生体分解性ポリマー、例えばヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシビニルポリマー、ポリアクリル酸等の生体分解性ポリマーを本化合物とともに粉砕混合し、この粉末を圧縮成型することにより、調製することができ、必要に応じて、賦形剤、結合剤、安定化剤、ｐＨ調整剤を用いることができる。眼内インプラント用製剤は、生体分解性ポリマー、例えばポリ乳酸、ポリグリコール酸、乳酸・グリコール酸共重合体、ヒドロキシプロピルセルロース等の生体分解性ポリマーを用い、調製することができる。
【００２９】
本化合物の投与量は、剤型、投与すべき患者の症状の軽重、年令、体重、医師の判断等に応じて適宜変えることができるが、経口投与の場合、一般には、成人に対し１日あたり０．０１〜５０００ｍｇ、好ましくは０．１〜２５００ｍｇ、より好ましくは０．５〜１０００ｍｇを１回又は数回に分けて投与することができ、注射剤の場合、一般には、成人に対し０．０００１〜２０００ｍｇを１回又は数回に分けて投与することができる。また、点眼剤又は挿入剤の場合には、０．０００００１〜１０％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．００００１〜１％（ｗ／ｖ）、より好ましくは０．０００１〜０．１％（ｗ／ｖ）の有効成分濃度のものを１日１回又は数回投与することができる。さらに、貼布剤の場合は、成人に対し０．０００１〜２０００ｍｇを含有する貼布剤を貼布することができ、眼内インプラント用製剤の場合は、成人に対し０．０００１〜２０００ｍｇ含有する眼内インプラント用製剤を眼内にインプラントすることができる。
【００３０】
以下に、薬理試験及び製剤例の結果を示すが、これらの例は本発明をよりよく理解する
ためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【００３１】
［薬理試験１］
滲出型加齢黄斑変性のモデルとして汎用されているレーザー誘発ラット脈絡膜血管新生モデル（Ｉｎｖｅｓｔ． Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ． Ｖｉｓ． Ｓｃｉ．， ４０（２）， ４５９−４６６ （１９９９））を用いて、本化合物の有用性を評価した。
【００３２】
（クリプトンレーザー誘発ラット脈絡膜血管新生モデルの作製方法）
ラットに５％（Ｗ／Ｖ）塩酸ケタミン注射液および２％塩酸キシラジン注射液の混合液（７：１）１ｍｌ／ｋｇを筋肉内投与してこれを全身麻酔し、０．５％（Ｗ／Ｖ）トロピカミド−０．５％塩酸フェニレフリン点眼液を点眼して散瞳させた後、クリプトンレーザー光凝固装置（ニデック社製 マルチカラーレーザー光凝固装置 ＭＣ−７０００）により光凝固を行った。光凝固は、眼底後局部において、太い網膜血管を避け、焦点を網膜深層に合わせて１眼につき８ヶ所散在状に実施した（凝固条件：スポットサイズ１００μｍ、出力１００Ｗｍ、凝固時間０．１秒）。光凝固後、眼底撮影を行い、レーザー照射部位を確認した。
【００３３】
（薬物投与方法）
塩酸ブホルミン（以下、「化合物Ａ」ともいう）又は塩酸フェンホルミン（以下、「化合物Ｂ」ともいう）を１％（Ｗ／Ｖ）メチルセルロース液（メチルセルロースを精製水に溶解させて調製）に６ｍｇ／ｍｌ又は２０ｍｇ／ｍｌになるように懸濁させ、それぞれ１回あたり５ｍｌ／ｋｇの投与液量で、光凝固手術日より、手術日を含め７日間１日１回経口投与した（１日あたり３０ｍｇ／ｋｇ又は１００ｍｇ／ｋｇ）。また、塩酸メトホルミン（以下、「化合物Ｃ」ともいう）に関しては、１％（Ｗ／Ｖ）メチルセルロース液に２０ｍｇ／ｍｌ又は６０ｍｇ／ｍｌになるように懸濁させ、それぞれ１回あたり５ｍｌ／ｋｇの投与液量で、光凝固手術日より、手術日を含め７日間１日１回経口投与した（１日あたり１００ｍｇ／ｋｇ又は３００ｍｇ／ｋｇ）。なお、化合物Ａ、Ｂ及びＣは、それぞれ、和光純薬社より購入した「Ｂｕｆｏｒｍｉｎ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ」（カタログ番号：０２８−１００５２）、Ｓｉｇｍａ社より購入した「Ｐｈｅｎｆｏｒｍｉｎ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ」（カタログ番号：Ｐ７０４５）及びＳｉｇｍａ社より購入した「Ｍｅｔｆｏｒｍｉｎ（１，１−Ｄｉｍｅｔｈｙｌｂｉｇｕａｎｉｄｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）」（カタログ番号：Ｄ１５０９５９）を用いた。
【００３４】
（評価方法）
光凝固後７日目、ラットに５％（Ｗ／Ｖ）ペントバルビタール１ｍｌ／ｋｇを腹腔内投与してこれを全身麻酔し、０．５％（Ｗ／Ｖ）トロピカミド−０．５％塩酸フェニレフリン点眼液を点眼して散瞳させた後、１０％フルオレセイン溶液０．１ｍｌを陰茎静脈から注入して、蛍光眼底造影を行った。蛍光眼底造影で、蛍光露出が認められなかったスポットを陰性（血管新生なし）、蛍光露出が認められたスポットを陽性（血管新生あり）と判断した。また、若干の蛍光露出が認められる光凝固部位は、それが２箇所存在した時に陽性と判定した。その後、式１に従い、レーザー照射８ヶ所のスポットに対する陽性スポット数から脈絡膜血管新生発生率（％）を算出し、式２に従い、評価薬物の抑制率（％）を算出した。化合物Ａ、Ｂ及びＣの評価結果を表１に示す。なお、各投与群の例数は８である。
【００３５】
［式１］
脈絡膜血管新生発生率（％）＝（陽性スポット数／全光凝固部位数）×１００
［式２］
抑制率（％）＝（Ａ０−ＡＸ）／Ａ０×１００
Ａ０：基剤投与群の脈絡膜血管新生発生率
ＡＸ：薬物投与群の脈絡膜血管新生発生率
【表１】
【００３６】
（結果）
表１から明らかなように、化合物Ａまたは化合物Ｂの経口投与は、レーザー誘発ラット脈絡膜血管新生モデルにおいて脈絡膜血管新生を阻害することが示された。一方で、化合物Ｃについては、投与量を３００ｍｇ／ｋｇまで増加させても、脈絡膜血管新生をほとんど阻害しなかった。
【００３７】
（考察）
ブホルミン又はフェンホルミンの経口投与は脈絡膜血管新生阻害作用を示すことから、本化合物は滲出型加齢黄斑変性等の加齢黄斑変性を予防又は治療しうることが示された。一方、驚くべきことに、同じビグアナイド系薬剤の中でも、メトホルミンの経口投与では該作用はほとんど認められなかった。また、加齢黄斑変性治療の予防又は治療剤については、一般に結膜下投与または硝子体内投与といった侵襲性の高い投与形態が選択されることが多い。したがって、ブホルミン又はフェンホルミンが経口投与により脈絡膜血管新生を阻害することは、予想外かつ臨床上極めて有用な知見である。すなわち、本化合物は、非侵襲性である経口型の加齢黄斑変性の予防又は治療剤となることが期待される。
【００３８】
［薬理試験２］
ＶＥＧＦは血管新生を促進する因子であり、加齢黄斑変性の発症や進行原因の１つであると考えられている（Ｐｒｏｇ． Ｒｅｔｉｎａｌ Ｅｙｅ Ｒｅｓ．， ２２（１）, １−２９ （２００３））。そこで、ヒト網膜血管内皮細胞であるＨＲＥＣを用いて、ＶＥＧＦ誘発の細胞増殖に対する化合物Ａおよび化合物Ｂの抑制効果を評価した。加えて、化合物Ｃの効果も同時に評価し、これらを比較検討した。
【００３９】
（実験方法）
ＨＲＥＣ（Ｃｅｌｌ ｓｙｓｔｅｍｓ社製 カタログ番号：ＡＢＩ−１８１）を１．５×１０３個／ウェルで９６ウェルプレートに播種し、３７℃、５％ＣＯ２／９５％空気の条件下で一晩培養した。ＨＲＥＣの培養液は、１０％ウシ胎児血清を含有するＣＳＣ培地を用いた。次に培養液を除去し、基剤培養液又は１ｍＭの化合物Ａ、ＢまたはＣを含有する実験用培養液に交換した。なお、基剤培養液として、ＣＳＣ培地にヘパリン溶液を５０ＩＵ／ｍｌになるように添加したものを使用した。また、実験用培養液として、基剤培養液にＶＥＧＦ溶液を１０ｎｇ／ｍｌになるように添加したものを使用した。培養液交換後、３７℃、５％ＣＯ２／９５％空気の条件下で２日間培養した。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６（登録商標） Ａｑｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を添加し、２時間培養した後に吸光度（ＯＤ４９０）を測定した。なお、化合物Ａ、Ｂ及びＣは、薬理試験１と同じものを使用した。
【００４０】
（評価方法）
式３に従い、各化合物処置群の細胞増殖抑制率（％）を算出した。化合物Ａ、Ｂ及びＣの評価結果を表２に示す。なお、各群の例数は３である。
【００４１】
［式３］
細胞増殖抑制率（％）＝（（ＢＸ−ＢＮ）／（Ｂ０−ＢＮ））×１００
Ｂ０：基剤処置群の細胞の吸光度
ＢＸ：薬物処置群の細胞の吸光度
ＢＮ：無処置群の細胞の吸光度
【表２】
【００４２】
（結果）
表２から明らかなように、化合物Ａまたは化合物ＢはＶＥＧＦによって誘発されるＨＲＥＣ細胞の増殖を強力に抑制した。一方で、化合物Ｃは、全くＨＲＥＣ細胞増殖抑制作用を示さなかった。
【００４３】
（考察）
同じビグアナイド系薬剤の中でも、ブホルミン又はフェンホルミンがＶＥＧＦにより誘発される細胞増殖を抑制するのに対し、メトホルミンは全く細胞増殖を抑制しなかった。これは驚くべき結果である。また、前述したように、ブホルミン及びフェンホルミンは、メトホルミンとは異なり、経口投与により脈絡膜血管新生を阻害する。すなわち、本化合物は、メトホルミンが有していない異質な作用を介して、脈絡膜血管新生を阻害している可能性が考えられる。
【００４４】
［薬理試験３］
マウス光障害モデルは、光照射により網膜光受容細胞の細胞死を誘発させたモデル動物であり、網膜変性のモデル動物として汎用されている（Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ．， ４６（３）， ９７９−９８７ （２００５））。また、背景技術の項で説明したように、光受容体細胞保護は萎縮型加齢黄斑変性の新たな治療法として注目されている。そこで、本モデルを用いて、化合物Ａおよび化合物Ｂの薬理効果を評価した。加えて、化合物Ｃの効果も同時に評価し、比較検討した。
【００４５】
（マウス光障害モデルの作製方法および評価方法）
９週齢のＢＡＬＢ／ｃ雄性マウスに、暗室にて暗順応を２４時間施した後、白色蛍光灯で５０００ｌｕｘ、２時間光照射を実施して、光障害を誘発した。その後、暗室にて暗順応を一晩施し、ｅｌｅｃｔｒｏｒｅｔｉｎｏｇｒａｍ（ＥＲＧ）を測定した。得られた波形からｂ波の振幅（μＶ）を算出した。なお、正常対照群は、光照射を行わず、暗室にて暗順応を一晩施したあと、ＥＲＧを測定した。式４に従い、ｂ波について振幅減弱抑制率（％）を算出した。なお、各群の例数は７又は８である。
【００４６】
［式４］
振幅減弱抑制率（％）＝（ＶＸ−Ｖ０）／（Ｖｎ−Ｖ０）×１００
Ｖ０：基剤投与群の振幅（μＶ）
Ｖｎ：正常対照群の振幅（μＶ）
ＶＸ：薬物投与群の振幅（μＶ）
【００４７】
（薬物投与方法）
化合物Ａ、Ｂ及びＣ投与群については、それぞれ１％（Ｗ／Ｖ）メチルセルロース水溶液に２０ｍｇ/ｍｌになるように懸濁した化合物Ａ溶液、Ｂ溶液又はＣ溶液を５ｍＬ／ｋｇの用量で、光照射１時間前の１回、経口投与した。一方、正常対照群及び基剤投与群については、１％（Ｗ／Ｖ）メチルセルロース水溶液を、光照射１時間前の１回、経口投与した。なお、化合物Ａ、Ｂ及びＣは、薬理試験１と同じものを使用した。
【００４８】
【表３】
【００４９】
（結果）
表３から明らかなように、化合物Ａまたは化合物Ｂの経口投与は、光照射によるＥＲＧのｂ波の減弱を顕著に抑制した。一方で、化合物Ｃについては、光照射によるＥＲＧのｂ波の減弱を全く抑制しなかった。
【００５０】
（考察）
ＥＲＧのｂ波減弱は光受容体細胞死を反映することから、本化合物が光障害による光受容体細胞死を抑制することが示された。すなわち、ブホルミン及びフェンホルミンは、脈絡膜新生血管を伴わない萎縮型加齢黄斑変性及び初期加齢黄斑変性をも予防又は治療しうることが示唆された。同じビグアナイド系薬剤であるメトホルミンで該作用が全く認められないことを勘案すれば、これは驚くべき結果である。以上より、本化合物は全ての型の加齢黄斑変性（初期加齢黄斑変性、萎縮型加齢黄斑変性及び滲出型加齢黄斑変性）に対して顕著な予防または治療効果を有しており、極めて有用な経口型の加齢黄斑変性の予防又は治療剤となることが期待される。
【００５１】
［製剤例］
製剤例を挙げて本発明の薬剤をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの製剤例にのみ限定されるものではない。
【００５２】
処方例１ 錠剤
１００ｍｇ中
化合物Ａ １ｍｇ
乳糖 ６６．４ｍｇ
トウモロコシデンプン ２０ｍｇ
カルボキシメチルセルロースカルシウム ６ｍｇ
ヒドロキシプロピルセルロース ６ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム ０．６ｍｇ
本化合物、乳糖を混合機中で混合し、その混合物にカルボキシメチルセルロースカルシウム及びヒドロキシプロピルセルロースを加えて造粒し、得られた顆粒を乾燥後整粒し、その整粒顆粒にステアリン酸マグネシウムを加えて混合し、打錠機で打錠する。また、本化合物の添加量を変えることにより、１００ｍｇ中の含有量が０．１ｍｇ、１０ｍｇ又は５０ｍｇの錠剤を調製できる。
【００５３】
処方例２ 点眼剤
１００ｍｌ中
化合物Ａ １０ｍｇ
塩化ナトリウム ９００ｍｇ
ポリソルベート８０ 適量
リン酸水素二ナトリウム 適量
リン酸二水素ナトリウム 適量
滅菌精製水 適量
滅菌精製水に本化合物及びそれ以外の上記成分を加え、これらを十分に混合して点眼液を調製する。本化合物の添加量を変えることにより、濃度が０．０５％（ｗ／ｖ）、０．１％（ｗ／ｖ）、０．５％（ｗ／ｖ）又は１％（ｗ／ｖ）の点眼剤を調製できる。
【００５４】
処方例３ 眼軟膏
１００ｇ中
化合物Ｂ ０．３ｇ
流動パラフィン １０．０ｇ
白色ワセリン 適量
均一に溶融した白色ワセリン及び流動パラフィンに、本化合物を加え、これらを十分に混合して後に徐々に冷却することで眼軟膏を調製する。本化合物の添加量を変えることにより、濃度が０．０５％（ｗ／ｗ）、０．１％（ｗ／ｗ）、０．５％（ｗ／ｗ）、１％（ｗ／ｗ）又は３％（ｗ／ｗ）の眼軟膏を調製できる。
【００５５】
処方例４ 注射剤
１０ｍｌ中
化合物Ｂ １０ｍｇ
塩化ナトリウム ９０ｍｇ
ポリソルベート８０ 適量
滅菌精製水 適量
本化合物及び塩化ナトリウムを滅菌精製水に溶解して注射剤を調製する。本化合物の添加量を変えることにより、１０ｍｌ中の含有量が０．１ｍｇ、１ｍｇ又は５０ｍｇの注射剤を調製できる。
【産業上の利用可能性】
【００５６】
ブホルミン又はフェンホルミンの経口投与は、レーザー誘発ラット脈絡膜血管新生モデルにおいて、優れた脈絡膜血管新生阻害作用を示す一方、マウス光障害モデルにおいて光受容体細胞死を抑制した。また、ブホルミン又はフェンホルミンは、ＶＥＧＦによって誘発されるＨＲＥＣ細胞の増殖を抑制した。したがって、ブホルミン若しくはフェンホルミン又はそれらの塩は加齢黄斑変性の予防又は治療剤として有用である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ブホルミン、フェンホルミン及びそれらの塩からなる群より選ばれた少なくとも１種の化合物を有効成分として含有する加齢黄斑変性の予防又は治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
加齢黄斑変性（ａｇｅ‐ｒｅｌａｔｅｄ ｍａｃｕｌａｒ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ： ＡＭＤ）は、現在、先進国における失明の主要原因疾患の一つであり、主に５０歳以上の高齢者に見られる。加齢黄斑変性は黄斑の加齢に伴う変化によっておこる疾患であり、滲出型加齢黄斑変性（ｅｘｕｄａｔｉｖｅ ＡＭＤ）、萎縮型加齢黄斑変性（ａｔｒｏｐｈｉｃ ＡＭＤ）及びこれらの前駆病変である初期加齢黄斑変性（ｅａｒｌｙ ａｇｅ−ｒｅｌａｔｅｄ ｍａｃｕｌｏｐａｔｈｙ）に大別される。ここで、滲出型加齢黄斑変性は高齢者の黄斑に脈絡膜から新生血管が発生し、網膜色素上皮下又は網膜下に出血や滲出性病変を生じ、ついには瘢痕組織を形成する疾患である。一方、萎縮型加齢黄斑変性は黄斑部の萎縮やドルーゼンの蓄積を伴う疾患である。
【０００３】
滲出型加齢黄斑変性の基本となる病態は、脈絡膜血管新生であり、黄斑の網膜色素上皮細胞、ブルッフ膜、脈絡膜血管等の加齢変化を基盤にして発症すると考えられている。しかし、脈絡膜血管新生の発症原因・メカニズムはいまだ解明されていない点が多く、今後の発展が期待される領域である。一方、初期加齢黄斑変性および萎縮型加齢黄斑変性は、脈絡膜新生血管を伴わないことが知られている。なお、萎縮型加齢黄斑変性においては、萎縮に伴う光受容体細胞の変性（細胞死）により視力低下が生じると考えられており、光受容体細胞保護が新たな治療法として注目されている（非特許文献１）。
【０００４】
一方、ビグアナイド系薬剤は、古くから経口糖尿病薬として開発および臨床使用されてきた薬剤である。ビグアナイド系薬剤としては、我が国で上市されているメトホルミンおよびブホルミンに加えて、フェンホルミン、ベンホスホルミン（Ｂｅｎｆｏｓｆｏｒｍｉｎ）、エトホルミン（Ｅｔｏｆｏｒｍｉｎ）、ティホルミン（Ｔｉｆｏｒｍｉｎ）などが知られている。
【０００５】
ビグアナイド系薬剤の血糖低下作用の作用機序については完全には明らかとなっていないが、一部のビグアナイド系薬剤がインスリン感受性を亢進すること（非特許文献２）、ＡＭＰＫ（ＡＭＰ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ）活性化作用を有すること（非特許文献３及び４）などが報告されている。また、糖尿病薬により血糖コントロールを適切に行うことは糖尿病網膜症の予防及び進行の抑制に有効であることが知られており（特許文献１、非特許文献５など）、特許文献１には、糖尿病薬の一例としてビグアナイド系薬剤が開示されている。
【０００６】
ところで、ビグアナイド系薬剤の一つであるメトホルミンについては、特許文献２において、そのＡＭＰＫ活性化作用より加齢黄斑変性の治療に有用であることが示唆されている。しかしながら、特許文献２には、メトホルミンがどのように加齢黄斑変性の治療に用いられるのか開示されておらず、また、初期加齢黄斑変性、萎縮型加齢黄斑変性または滲出型加齢黄斑変性のいずれの型の加齢黄斑変性の治療に有用であるのかも明らかではない。さらに、メトホルミン以外のビグアナイド系薬剤（例えば、ブホルミン又はフェンホルミン）が加齢黄斑変性に及ぼす影響についても、特許文献２には一切記載も示唆もされていない。
【０００７】
また、代表的なＡＭＰＫ活性化剤であるＡＩＣＡＲ（５−ａｍｉｎｏｉｍｉｄａｚｏｌｅ−４−ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ）が血管新生促進因子であるＶＥＧＦ（ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）の発現を促進するとの報告も存在し（非特許文献６）、メトホルミン以外のビグアナイド系薬剤が加齢黄斑変性を悪化させる可能性も考えられる。
【０００８】
以上のように、ブホルミン又はフェンホルミンが加齢黄斑変性に及ぼす影響については全く明らかとなっていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】国際公開２００５／０４９０１４号パンフレット
【特許文献２】国際公開２００８／０２２２５６号パンフレット
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Expert Opin. Ther. Targets, 11(5), 625-639 (2007)
【非特許文献２】Int. J. Diabetes and Metabol., 13(3), 111-134 (2005)
【非特許文献３】Mini-Rev. Med. Chem., 7(5), 521-528 (2007)
【非特許文献４】Biochem. Pharmacol., 71(11), 1637-1647 (2006)
【非特許文献５】Postgrad. Med., 116(1), 57-64 (2004)
【非特許文献６】Biochem. Biophys. Res. Commun., 342(4), 1197-1202 (2006)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
すなわち、ブホルミン又はフェンホルミンの新たな医薬用途を探索することは興味深い課題である。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本願の発明者は、ブホルミン又はフェンホルミンの新たな医薬用途を探索すべく鋭意研究したところ、レーザー誘発ラット脈絡膜血管新生モデルにおいて、ブホルミン又はフェンホルミンの経口投与により脈絡膜血管新生の阻害が認められることを見出し、本発明に至った。一方で、メトホルミンの経口投与では脈絡膜血管新生阻害がほとんど認められなかったことを考慮すれば、これは驚くべき結果である。
【００１３】
また、ブホルミン又はフェンホルミンがヒト網膜血管内皮細胞であるＨＲＥＣの細胞増殖を抑制する一方で、メトホルミンは全く細胞増殖を抑制しなかった。すなわち、ブホルミン及びフェンホルミンは、メトホルミンが有していない異質な作用により脈絡膜血管新生を阻害している可能性が考えられる。
【００１４】
さらに、本願の発明者は、マウス光障害モデルにおいて、ブホルミン又はフェンホルミンの経口投与が光受容体細胞死を抑制することも見出した。一方、驚くべきことに、メトホルミンの経口投与は光受容体細胞死を全く抑制しなかった。
【００１５】
すなわち、本発明は、ブホルミン、フェンホルミン及びそれらの塩からなる群より選択された少なくとも１種の化合物を有効成分として含有する加齢黄斑変性の予防又は治療剤である。
【発明の効果】
【００１６】
後述するように、ブホルミン又はフェンホルミンは、レーザー誘発ラット脈絡膜血管新生モデルにおいて優れた脈絡膜血管新生阻害作用を示す一方、マウス光障害モデルにおいて光受容体細胞死を抑制した。また、ブホルミン又はフェンホルミンは、ＶＥＧＦによって誘発されるＨＲＥＣ細胞の増殖を抑制した。すなわち、ブホルミン若しくはフェンホルミン又はこれらの塩（以下、「本化合物」ともいう）は、加齢黄斑変性の予防又は治療剤として有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
ブホルミン又はフェンホルミンは、それぞれ、下記の化学構造式［I］又は［II］で示される化合物である。
【化１】
【化２】
【００１８】
また、ブホルミン又はフェンホルミンの塩としては、医薬として許容される塩であれば特に制限はなく、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸等の無機酸との塩、酢酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、クエン酸、酒石酸、アジピン酸、グルコン酸、グルコヘプト酸、グルクロン酸、テレフタル酸、メタンスルホン酸、乳酸、馬尿酸、１，２−エタンジスルホン酸、イセチオン酸、ラクトビオン酸、オレイン酸、パモ酸、ポリガラクツロン酸、ステアリン酸、タンニン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、硫酸ラウリルエステル、硫酸メチル、ナフタレンスルホン酸、スルホサリチル酸等の有機酸との塩、臭化メチル、ヨウ化メチル等との四級アンモニウム塩、臭素イオン、塩素イオン、ヨウ素イオン等のハロゲンイオンとの塩、リチウム、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属との塩、カルシウム、マグネシウム等のアルカリ土類金属との塩、鉄、亜鉛等との金属塩、アンモニアとの塩、トリエチレンジアミン、２−アミノエタノール、２，２−イミノビス（エタノール）、１−デオキシ−１−（メチルアミノ）−２−Ｄ−ソルビトール、２−アミノ−２−（ヒドロキシメチル）−１，３−プロパンジオール、プロカイン、Ｎ，Ｎ−ビス（フェニルメチル）−１，２−エタンジアミン等の有機アミンとの塩等が挙げられるが、塩酸塩が特に好ましい。また、ブホルミン若しくはフェンホルミンは水和物又は溶媒和物の形態をとっていてもよい。
【００１９】
ブホルミン若しくはフェンホルミンに幾何異性体又は光学異性体が存在する場合は、それらの異性体又はそれらの塩も本発明の範囲に含まれる。また、ブホルミン若しくはフェンホルミンにプロトン互変異性が存在する場合には、それらの互変異性体又はそれらの塩も本発明の範囲に含まれる。
【００２０】
ブホルミン、フェンホルミン若しくはそれらの幾何異性体、光学異性体及びプロトン互変異性又はそれらの塩に、結晶多形及び結晶多形群（結晶多形システム）が存在する場合には、それらの結晶多形体及び結晶多形群（結晶多形システム）も本発明の範囲に含まれる。ここで、結晶多形群（結晶多形システム）とは、それら結晶の製造、晶出、保存等の条件及び状態（なお、本状態には製剤化した状態も含む）により、結晶形が変化する場合の各段階における個々の結晶形及びその過程全体を意味する。
【００２１】
本発明において、加齢黄斑変性とは滲出型加齢黄斑変性、萎縮型加齢黄斑変性及びこれらの前駆病変である初期加齢黄斑変性を意味する。滲出型加齢黄斑変性は高齢者の黄斑に脈絡膜から新生血管が発生し、網膜色素上皮下又は網膜下に出血や滲出性病変を生じ、ついには瘢痕組織を形成する疾患である。一方、萎縮型加齢黄斑変性は黄斑部の萎縮やドルーゼンの蓄積を伴う疾患である。
【００２２】
本化合物は、必要に応じて、医薬として許容される添加剤を加え、単独製剤又は配合製剤として汎用されている技術を用いて製剤化することができる。なお、我が国では、１錠中に塩酸ブホルミン５０mgを含有し、添加物として乳糖、バレイショデンプン、アラビアゴム末、ステアリン酸マグネシウム、ヒプロメロース、酸化チタン及びカルナウバウロを含有する医薬組成物「ジベトス錠５０mg」が、経口血糖低下剤として市販されている。
【００２３】
本化合物は、前述の眼疾患の予防又は治療に使用する場合、患者に対して経口的又は非経口的に投与することができ、投与形態としては、経口投与、眼への局所投与（点眼投与、結膜嚢内投与、硝子体内投与、結膜下投与、テノン嚢下投与等）、静脈内投与、経皮投与等が挙げられるが、経口投与が特に好ましい。
【００２４】
本化合物は、必要に応じて、製薬学的に許容され得る添加剤と共に、投与に適した剤型に製剤化される。経口投与に適した剤型としては、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤等が挙げられるが、錠剤が特に好ましい。非経口投与に適した剤型としては、例えば、注射剤、点眼剤、眼軟膏、貼布剤、ゲル、挿入剤等が挙げられる。これらは当該分野で汎用されている通常の技術を用いて調製することができる。また、本化合物はこれらの製剤の他に眼内インプラント用製剤やマイクロスフェアー等のＤＤＳ（ドラッグデリバリーシステム）化された製剤にすることもできる。
【００２５】
例えば、錠剤は、乳糖、ブドウ糖、Ｄ−マンニトール、無水リン酸水素カルシウム、デンプン、ショ糖等の賦形剤；カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、クロスカルメロースナトリウム、クロスポピドン、デンプン、部分アルファー化デンプン、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース等の崩壊剤；ヒドロキシプロピルセルロース、エチルセルロース、アラビアゴム、デンプン、部分アルファー化デンプン、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール等の結合剤；ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、タルク、含水二酸化ケイ素、硬化油等の滑沢剤；精製白糖、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、ポリビニルピロリドン等のコーティング剤；クエン酸、アスパルテーム、アスコルビン酸、メントール等の矯味剤などを適宜選択して用い、調製することができる。
【００２６】
注射剤は、塩化ナトリウム等の等張化剤；リン酸ナトリウム等の緩衝化剤；ポリオキシエチレンソルビタンモノオレート等の界面活性剤；メチルセルロース等の増粘剤等から必要に応じて選択して用い、調製することができる。
【００２７】
点眼剤は、塩化ナトリウム、濃グリセリンなどの等張化剤；リン酸ナトリウム、酢酸ナトリウムなどの緩衝化剤；ポリオキシエチレンソルビタンモノオレート、ステアリン酸ポリオキシル４０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油等の界面活性剤；クエン酸ナトリウム、エデト酸ナトリウム等の安定化剤；塩化ベンザルコニウム、パラベン等の防腐剤等から必要に応じて選択して用い、調製することができ、ｐＨは眼科製剤に許容される範囲内にあればよいが、通常４〜８の範囲内が好ましい。また、眼軟膏は、白色ワセリン、流動パラフィン等の汎用される基剤を用い、調製することができる。
【００２８】
挿入剤は、生体分解性ポリマー、例えばヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシビニルポリマー、ポリアクリル酸等の生体分解性ポリマーを本化合物とともに粉砕混合し、この粉末を圧縮成型することにより、調製することができ、必要に応じて、賦形剤、結合剤、安定化剤、ｐＨ調整剤を用いることができる。眼内インプラント用製剤は、生体分解性ポリマー、例えばポリ乳酸、ポリグリコール酸、乳酸・グリコール酸共重合体、ヒドロキシプロピルセルロース等の生体分解性ポリマーを用い、調製することができる。
【００２９】
本化合物の投与量は、剤型、投与すべき患者の症状の軽重、年令、体重、医師の判断等に応じて適宜変えることができるが、経口投与の場合、一般には、成人に対し１日あたり０．０１〜５０００ｍｇ、好ましくは０．１〜２５００ｍｇ、より好ましくは０．５〜１０００ｍｇを１回又は数回に分けて投与することができ、注射剤の場合、一般には、成人に対し０．０００１〜２０００ｍｇを１回又は数回に分けて投与することができる。また、点眼剤又は挿入剤の場合には、０．０００００１〜１０％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．００００１〜１％（ｗ／ｖ）、より好ましくは０．０００１〜０．１％（ｗ／ｖ）の有効成分濃度のものを１日１回又は数回投与することができる。さらに、貼布剤の場合は、成人に対し０．０００１〜２０００ｍｇを含有する貼布剤を貼布することができ、眼内インプラント用製剤の場合は、成人に対し０．０００１〜２０００ｍｇ含有する眼内インプラント用製剤を眼内にインプラントすることができる。
【００３０】
以下に、薬理試験及び製剤例の結果を示すが、これらの例は本発明をよりよく理解する
ためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【００３１】
［薬理試験１］
滲出型加齢黄斑変性のモデルとして汎用されているレーザー誘発ラット脈絡膜血管新生モデル（Ｉｎｖｅｓｔ． Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ． Ｖｉｓ． Ｓｃｉ．， ４０（２）， ４５９−４６６ （１９９９））を用いて、本化合物の有用性を評価した。
【００３２】
（クリプトンレーザー誘発ラット脈絡膜血管新生モデルの作製方法）
ラットに５％（Ｗ／Ｖ）塩酸ケタミン注射液および２％塩酸キシラジン注射液の混合液（７：１）１ｍｌ／ｋｇを筋肉内投与してこれを全身麻酔し、０．５％（Ｗ／Ｖ）トロピカミド−０．５％塩酸フェニレフリン点眼液を点眼して散瞳させた後、クリプトンレーザー光凝固装置（ニデック社製 マルチカラーレーザー光凝固装置 ＭＣ−７０００）により光凝固を行った。光凝固は、眼底後局部において、太い網膜血管を避け、焦点を網膜深層に合わせて１眼につき８ヶ所散在状に実施した（凝固条件：スポットサイズ１００μｍ、出力１００Ｗｍ、凝固時間０．１秒）。光凝固後、眼底撮影を行い、レーザー照射部位を確認した。
【００３３】
（薬物投与方法）
塩酸ブホルミン（以下、「化合物Ａ」ともいう）又は塩酸フェンホルミン（以下、「化合物Ｂ」ともいう）を１％（Ｗ／Ｖ）メチルセルロース液（メチルセルロースを精製水に溶解させて調製）に６ｍｇ／ｍｌ又は２０ｍｇ／ｍｌになるように懸濁させ、それぞれ１回あたり５ｍｌ／ｋｇの投与液量で、光凝固手術日より、手術日を含め７日間１日１回経口投与した（１日あたり３０ｍｇ／ｋｇ又は１００ｍｇ／ｋｇ）。また、塩酸メトホルミン（以下、「化合物Ｃ」ともいう）に関しては、１％（Ｗ／Ｖ）メチルセルロース液に２０ｍｇ／ｍｌ又は６０ｍｇ／ｍｌになるように懸濁させ、それぞれ１回あたり５ｍｌ／ｋｇの投与液量で、光凝固手術日より、手術日を含め７日間１日１回経口投与した（１日あたり１００ｍｇ／ｋｇ又は３００ｍｇ／ｋｇ）。なお、化合物Ａ、Ｂ及びＣは、それぞれ、和光純薬社より購入した「Ｂｕｆｏｒｍｉｎ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ」（カタログ番号：０２８−１００５２）、Ｓｉｇｍａ社より購入した「Ｐｈｅｎｆｏｒｍｉｎ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ」（カタログ番号：Ｐ７０４５）及びＳｉｇｍａ社より購入した「Ｍｅｔｆｏｒｍｉｎ（１，１−Ｄｉｍｅｔｈｙｌｂｉｇｕａｎｉｄｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）」（カタログ番号：Ｄ１５０９５９）を用いた。
【００３４】
（評価方法）
光凝固後７日目、ラットに５％（Ｗ／Ｖ）ペントバルビタール１ｍｌ／ｋｇを腹腔内投与してこれを全身麻酔し、０．５％（Ｗ／Ｖ）トロピカミド−０．５％塩酸フェニレフリン点眼液を点眼して散瞳させた後、１０％フルオレセイン溶液０．１ｍｌを陰茎静脈から注入して、蛍光眼底造影を行った。蛍光眼底造影で、蛍光露出が認められなかったスポットを陰性（血管新生なし）、蛍光露出が認められたスポットを陽性（血管新生あり）と判断した。また、若干の蛍光露出が認められる光凝固部位は、それが２箇所存在した時に陽性と判定した。その後、式１に従い、レーザー照射８ヶ所のスポットに対する陽性スポット数から脈絡膜血管新生発生率（％）を算出し、式２に従い、評価薬物の抑制率（％）を算出した。化合物Ａ、Ｂ及びＣの評価結果を表１に示す。なお、各投与群の例数は８である。
【００３５】
［式１］
脈絡膜血管新生発生率（％）＝（陽性スポット数／全光凝固部位数）×１００
［式２］
抑制率（％）＝（Ａ０−ＡＸ）／Ａ０×１００
Ａ０：基剤投与群の脈絡膜血管新生発生率
ＡＸ：薬物投与群の脈絡膜血管新生発生率
【表１】
【００３６】
（結果）
表１から明らかなように、化合物Ａまたは化合物Ｂの経口投与は、レーザー誘発ラット脈絡膜血管新生モデルにおいて脈絡膜血管新生を阻害することが示された。一方で、化合物Ｃについては、投与量を３００ｍｇ／ｋｇまで増加させても、脈絡膜血管新生をほとんど阻害しなかった。
【００３７】
（考察）
ブホルミン又はフェンホルミンの経口投与は脈絡膜血管新生阻害作用を示すことから、本化合物は滲出型加齢黄斑変性等の加齢黄斑変性を予防又は治療しうることが示された。一方、驚くべきことに、同じビグアナイド系薬剤の中でも、メトホルミンの経口投与では該作用はほとんど認められなかった。また、加齢黄斑変性治療の予防又は治療剤については、一般に結膜下投与または硝子体内投与といった侵襲性の高い投与形態が選択されることが多い。したがって、ブホルミン又はフェンホルミンが経口投与により脈絡膜血管新生を阻害することは、予想外かつ臨床上極めて有用な知見である。すなわち、本化合物は、非侵襲性である経口型の加齢黄斑変性の予防又は治療剤となることが期待される。
【００３８】
［薬理試験２］
ＶＥＧＦは血管新生を促進する因子であり、加齢黄斑変性の発症や進行原因の１つであると考えられている（Ｐｒｏｇ． Ｒｅｔｉｎａｌ Ｅｙｅ Ｒｅｓ．， ２２（１）, １−２９ （２００３））。そこで、ヒト網膜血管内皮細胞であるＨＲＥＣを用いて、ＶＥＧＦ誘発の細胞増殖に対する化合物Ａおよび化合物Ｂの抑制効果を評価した。加えて、化合物Ｃの効果も同時に評価し、これらを比較検討した。
【００３９】
（実験方法）
ＨＲＥＣ（Ｃｅｌｌ ｓｙｓｔｅｍｓ社製 カタログ番号：ＡＢＩ−１８１）を１．５×１０３個／ウェルで９６ウェルプレートに播種し、３７℃、５％ＣＯ２／９５％空気の条件下で一晩培養した。ＨＲＥＣの培養液は、１０％ウシ胎児血清を含有するＣＳＣ培地を用いた。次に培養液を除去し、基剤培養液又は１ｍＭの化合物Ａ、ＢまたはＣを含有する実験用培養液に交換した。なお、基剤培養液として、ＣＳＣ培地にヘパリン溶液を５０ＩＵ／ｍｌになるように添加したものを使用した。また、実験用培養液として、基剤培養液にＶＥＧＦ溶液を１０ｎｇ／ｍｌになるように添加したものを使用した。培養液交換後、３７℃、５％ＣＯ２／９５％空気の条件下で２日間培養した。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６（登録商標） Ａｑｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を添加し、２時間培養した後に吸光度（ＯＤ４９０）を測定した。なお、化合物Ａ、Ｂ及びＣは、薬理試験１と同じものを使用した。
【００４０】
（評価方法）
式３に従い、各化合物処置群の細胞増殖抑制率（％）を算出した。化合物Ａ、Ｂ及びＣの評価結果を表２に示す。なお、各群の例数は３である。
【００４１】
［式３］
細胞増殖抑制率（％）＝（（ＢＸ−ＢＮ）／（Ｂ０−ＢＮ））×１００
Ｂ０：基剤処置群の細胞の吸光度
ＢＸ：薬物処置群の細胞の吸光度
ＢＮ：無処置群の細胞の吸光度
【表２】
【００４２】
（結果）
表２から明らかなように、化合物Ａまたは化合物ＢはＶＥＧＦによって誘発されるＨＲＥＣ細胞の増殖を強力に抑制した。一方で、化合物Ｃは、全くＨＲＥＣ細胞増殖抑制作用を示さなかった。
【００４３】
（考察）
同じビグアナイド系薬剤の中でも、ブホルミン又はフェンホルミンがＶＥＧＦにより誘発される細胞増殖を抑制するのに対し、メトホルミンは全く細胞増殖を抑制しなかった。これは驚くべき結果である。また、前述したように、ブホルミン及びフェンホルミンは、メトホルミンとは異なり、経口投与により脈絡膜血管新生を阻害する。すなわち、本化合物は、メトホルミンが有していない異質な作用を介して、脈絡膜血管新生を阻害している可能性が考えられる。
【００４４】
［薬理試験３］
マウス光障害モデルは、光照射により網膜光受容細胞の細胞死を誘発させたモデル動物であり、網膜変性のモデル動物として汎用されている（Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ．， ４６（３）， ９７９−９８７ （２００５））。また、背景技術の項で説明したように、光受容体細胞保護は萎縮型加齢黄斑変性の新たな治療法として注目されている。そこで、本モデルを用いて、化合物Ａおよび化合物Ｂの薬理効果を評価した。加えて、化合物Ｃの効果も同時に評価し、比較検討した。
【００４５】
（マウス光障害モデルの作製方法および評価方法）
９週齢のＢＡＬＢ／ｃ雄性マウスに、暗室にて暗順応を２４時間施した後、白色蛍光灯で５０００ｌｕｘ、２時間光照射を実施して、光障害を誘発した。その後、暗室にて暗順応を一晩施し、ｅｌｅｃｔｒｏｒｅｔｉｎｏｇｒａｍ（ＥＲＧ）を測定した。得られた波形からｂ波の振幅（μＶ）を算出した。なお、正常対照群は、光照射を行わず、暗室にて暗順応を一晩施したあと、ＥＲＧを測定した。式４に従い、ｂ波について振幅減弱抑制率（％）を算出した。なお、各群の例数は７又は８である。
【００４６】
［式４］
振幅減弱抑制率（％）＝（ＶＸ−Ｖ０）／（Ｖｎ−Ｖ０）×１００
Ｖ０：基剤投与群の振幅（μＶ）
Ｖｎ：正常対照群の振幅（μＶ）
ＶＸ：薬物投与群の振幅（μＶ）
【００４７】
（薬物投与方法）
化合物Ａ、Ｂ及びＣ投与群については、それぞれ１％（Ｗ／Ｖ）メチルセルロース水溶液に２０ｍｇ/ｍｌになるように懸濁した化合物Ａ溶液、Ｂ溶液又はＣ溶液を５ｍＬ／ｋｇの用量で、光照射１時間前の１回、経口投与した。一方、正常対照群及び基剤投与群については、１％（Ｗ／Ｖ）メチルセルロース水溶液を、光照射１時間前の１回、経口投与した。なお、化合物Ａ、Ｂ及びＣは、薬理試験１と同じものを使用した。
【００４８】
【表３】
【００４９】
（結果）
表３から明らかなように、化合物Ａまたは化合物Ｂの経口投与は、光照射によるＥＲＧのｂ波の減弱を顕著に抑制した。一方で、化合物Ｃについては、光照射によるＥＲＧのｂ波の減弱を全く抑制しなかった。
【００５０】
（考察）
ＥＲＧのｂ波減弱は光受容体細胞死を反映することから、本化合物が光障害による光受容体細胞死を抑制することが示された。すなわち、ブホルミン及びフェンホルミンは、脈絡膜新生血管を伴わない萎縮型加齢黄斑変性及び初期加齢黄斑変性をも予防又は治療しうることが示唆された。同じビグアナイド系薬剤であるメトホルミンで該作用が全く認められないことを勘案すれば、これは驚くべき結果である。以上より、本化合物は全ての型の加齢黄斑変性（初期加齢黄斑変性、萎縮型加齢黄斑変性及び滲出型加齢黄斑変性）に対して顕著な予防または治療効果を有しており、極めて有用な経口型の加齢黄斑変性の予防又は治療剤となることが期待される。
【００５１】
［製剤例］
製剤例を挙げて本発明の薬剤をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの製剤例にのみ限定されるものではない。
【００５２】
処方例１ 錠剤
１００ｍｇ中
化合物Ａ １ｍｇ
乳糖 ６６．４ｍｇ
トウモロコシデンプン ２０ｍｇ
カルボキシメチルセルロースカルシウム ６ｍｇ
ヒドロキシプロピルセルロース ６ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム ０．６ｍｇ
本化合物、乳糖を混合機中で混合し、その混合物にカルボキシメチルセルロースカルシウム及びヒドロキシプロピルセルロースを加えて造粒し、得られた顆粒を乾燥後整粒し、その整粒顆粒にステアリン酸マグネシウムを加えて混合し、打錠機で打錠する。また、本化合物の添加量を変えることにより、１００ｍｇ中の含有量が０．１ｍｇ、１０ｍｇ又は５０ｍｇの錠剤を調製できる。
【００５３】
処方例２ 点眼剤
１００ｍｌ中
化合物Ａ １０ｍｇ
塩化ナトリウム ９００ｍｇ
ポリソルベート８０ 適量
リン酸水素二ナトリウム 適量
リン酸二水素ナトリウム 適量
滅菌精製水 適量
滅菌精製水に本化合物及びそれ以外の上記成分を加え、これらを十分に混合して点眼液を調製する。本化合物の添加量を変えることにより、濃度が０．０５％（ｗ／ｖ）、０．１％（ｗ／ｖ）、０．５％（ｗ／ｖ）又は１％（ｗ／ｖ）の点眼剤を調製できる。
【００５４】
処方例３ 眼軟膏
１００ｇ中
化合物Ｂ ０．３ｇ
流動パラフィン １０．０ｇ
白色ワセリン 適量
均一に溶融した白色ワセリン及び流動パラフィンに、本化合物を加え、これらを十分に混合して後に徐々に冷却することで眼軟膏を調製する。本化合物の添加量を変えることにより、濃度が０．０５％（ｗ／ｗ）、０．１％（ｗ／ｗ）、０．５％（ｗ／ｗ）、１％（ｗ／ｗ）又は３％（ｗ／ｗ）の眼軟膏を調製できる。
【００５５】
処方例４ 注射剤
１０ｍｌ中
化合物Ｂ １０ｍｇ
塩化ナトリウム ９０ｍｇ
ポリソルベート８０ 適量
滅菌精製水 適量
本化合物及び塩化ナトリウムを滅菌精製水に溶解して注射剤を調製する。本化合物の添加量を変えることにより、１０ｍｌ中の含有量が０．１ｍｇ、１ｍｇ又は５０ｍｇの注射剤を調製できる。
【産業上の利用可能性】
【００５６】
ブホルミン又はフェンホルミンの経口投与は、レーザー誘発ラット脈絡膜血管新生モデルにおいて、優れた脈絡膜血管新生阻害作用を示す一方、マウス光障害モデルにおいて光受容体細胞死を抑制した。また、ブホルミン又はフェンホルミンは、ＶＥＧＦによって誘発されるＨＲＥＣ細胞の増殖を抑制した。したがって、ブホルミン若しくはフェンホルミン又はそれらの塩は加齢黄斑変性の予防又は治療剤として有用である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ブホルミン、フェンホルミン及びそれらの塩からなる群より選ばれた少なくとも１種の化合物を有効成分として含有する加齢黄斑変性の予防又は治療剤。
【請求項２】
投与形態が点眼投与、硝子体内投与、結膜下投与、結膜嚢内投与、テノン嚢下投与、静脈
内投与、経皮投与又は経口投与である請求項１記載の予防又は治療剤。
【請求項３】
投与形態が経口投与である請求項１記載の予防又は治療剤。
【請求項４】
剤型が点眼剤、眼軟膏、挿入剤、貼布剤、注射剤、ゲル、錠剤、顆粒剤又はカプセル剤で
ある請求項１記載の予防又は治療剤。
【請求項５】
剤型が錠剤である請求項１記載の予防又は治療剤。
【請求項１】
ブホルミン、フェンホルミン及びそれらの塩からなる群より選ばれた少なくとも１種の化合物を有効成分として含有する加齢黄斑変性の予防又は治療剤。
【請求項２】
投与形態が点眼投与、硝子体内投与、結膜下投与、結膜嚢内投与、テノン嚢下投与、静脈
内投与、経皮投与又は経口投与である請求項１記載の予防又は治療剤。
【請求項３】
投与形態が経口投与である請求項１記載の予防又は治療剤。
【請求項４】
剤型が点眼剤、眼軟膏、挿入剤、貼布剤、注射剤、ゲル、錠剤、顆粒剤又はカプセル剤で
ある請求項１記載の予防又は治療剤。
【請求項５】
剤型が錠剤である請求項１記載の予防又は治療剤。
【公開番号】特開２０１０−４７５６７（Ｐ２０１０−４７５６７Ａ）
【公開日】平成２２年３月４日（２０１０．３．４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−１７２６０６（Ｐ２００９−１７２６０６）
【出願日】平成２１年７月２４日（２００９．７．２４）
【出願人】（０００１７７６３４）参天製薬株式会社 (177)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年３月４日（２０１０．３．４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年７月２４日（２００９．７．２４）
【出願人】（０００１７７６３４）参天製薬株式会社 (177)
【Ｆターム（参考）】
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