動物細胞培養用の再生培地添加剤とその製造方法
【課題】抗体産生は、高価な培地添加剤を添加した培養液中で行われる。抗体を培養し、培養液中から抗体を分離した残部である精製廃液は廃棄している。これを再生して再生添加剤として利用する。
【解決手段】マウスハイブリドーマを培養してモノクローナル抗体を産生した動物細胞培養用の培地からマウス抗体を分離除去して精製廃液を得る。精製廃液を高分子区分と低分子区分とに分離して、低分子区分に含まれる老廃物を除去する。得られた高分子区分に含まれる高分子物質を新たに動物細胞培養用の再生培地添加剤として利用する。再生培地添加剤を添加した動物細胞培養用の培地においても、高い生細胞密度を示し再利用が可能である。また、再生培地添加剤を添加したした方が、かえって抗体の収量を増加させた。
【解決手段】マウスハイブリドーマを培養してモノクローナル抗体を産生した動物細胞培養用の培地からマウス抗体を分離除去して精製廃液を得る。精製廃液を高分子区分と低分子区分とに分離して、低分子区分に含まれる老廃物を除去する。得られた高分子区分に含まれる高分子物質を新たに動物細胞培養用の再生培地添加剤として利用する。再生培地添加剤を添加した動物細胞培養用の培地においても、高い生細胞密度を示し再利用が可能である。また、再生培地添加剤を添加したした方が、かえって抗体の収量を増加させた。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、モノクローナル抗体を産生する培地添加剤およびその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗体は物質選択性が非常に高い性質を持った糖タンパク質の一種である。この特徴により、抗体はリウマチなどの自己免疫疾患や各種ガンに対する薬効が高く副作用が少ない治療薬として注目されている。さらに抗体は、インフルエンザをはじめとした各種感染症への感染判定や、簡易的な妊娠判定にといった体外診断薬としても利用されている。
【０００３】
抗体は、培地添加剤を加えた動物細胞培養用の培養液中で培養される。培地添加剤としては、ウシ胎児血清や子牛血清などが使用されてきたが、非常に高価であるなど種々の理由により、最近では、魚肉由来の培地添加剤（特許文献１）や、絹由来の培地添加剤（特許文献２）など種々の培地添加剤が開発されている。そして培養後に培地から抗体と精製廃液とに分離精製している。抗体の分離精製方法としては、比較的ステップ数の少ないアフィニティーカラムを用いるのが一般的である。アフィニティーカラムに培養液を流すと、抗体が特異的に吸着され、吸着されない精製廃液とを分離することができる。
【０００４】
【特許文献１】特開２００３−３３４０６８号公報
【特許文献２】ＷＯ２００２−６８６１３３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
アフィニティーカラムなどを利用して抗体を分離精製する際に、分離された抗体以外の成分（以下、「精製廃液」という。）は従来から廃棄処分されている。
【０００６】
ここで、精製廃液中には、乳酸やアンモニアといった細胞培養障害因子が含まれている。また、培養によって消費しきれなかった成長因子、ビタミン、アミノ酸をはじめとする培地成分と、細胞が生産する抗体以外の成長因子や他の生理活性物質が含まれている。この精製廃液を再度動物細胞用の培地添加剤として利用できれば、経済的に有利となる。
【０００７】
そこで、本発明者らは、精製廃液を再度動物細胞培養用の培地添加剤に利用すべく研究した結果、再利用が可能であるばかりではなく、抗体の収量が増加することを見出した。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
請求項１の発明では、動物細胞培養用の培地からモノクローナル抗体を分離除去した精製廃液を、高分子区分と低分子区分とに分離して得られた高分子区分に含まれる高分子物質からなる動物細胞培養用の再生培地添加剤としている。
【０００９】
モノクローナル抗体は、ただ一種類のＢ細胞が作る抗体のクローンである。特に医薬品に使用されているものには、マウス抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、完全ヒト化抗体があり、本発明のモノクローナル抗体には、マウス抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体または完全ヒト化抗体が含まれる。
【００１０】
マウス抗体はマウスＢ細胞が産生する抗体であり、マウスミエローマとマウス抗体産生細胞との細胞融合によって作製されたマウスハイブリドーマで産生される。
【００１１】
キメラ抗体は、マウス抗体の内、定常領域と可変領域の一部がヒト由来の抗体に置換された抗体であり、産業上は目的の抗体遺伝子をチャイニーズハムスター卵巣細胞（以下、ＣＨＯ細胞という。）に導入して生産されている。
【００１２】
ヒト化抗体は、可変領域の一部がマウス由来であるもののその他の部分以外が全てヒト抗体に置換された抗体であり、キメラ抗体と同様に、目的の抗体遺伝子をＣＨＯ細胞に導入して生産されている。また、完全ヒト化抗体はヒトの細胞から作られる抗体である。
【００１３】
動物細胞培養用の培地には、イーグル基礎培地、ダルベッコ変法イーグル培地、ＲＰＭＩ１６４０培地、ハムF-12培地などが使用され、多くの培地には、グリシンやアルギニンといった各種アミノ酸、アスコルビン酸や葉酸をはじめとするビタミン類、塩化カルシウムや塩化カリウム、塩化ナトリウムなどの無機塩、ＡＴＰやＦＡＤといった塩基や核酸、リノレイン酸などの脂質やグルコース、ガラクトースといった糖類などを含んでいる。
【００１４】
培地添加剤は、動物細胞の生存・増殖や物質生産性を向上させるために動物細胞培養用の培地に添加される物質を指す。例えば、ウシやウマといった哺乳動物の血清、ＥＧＦ、ＦＧＦ、ＩＧＦ−１、ＮＧＦといった成長因子、ウシ血清アルブミン（以下、ＢＳＡという。）、コレステロール、インスリン、トランスフェリン等が挙げられる。特に、抗体生産においては、トランスフェリン、インスリンなどが重要である。血清を含む培地は血清入り培地と呼ばれ、血清を含まない培地は無血清培地と呼ばれる。この無血清培地には、マウスハイブリドーマやＣＨＯ細胞用に開発された無血清培地も含まれる。
【００１５】
精製廃液とは、マウスハイブリドーマあるいは目的とする抗体遺伝子が導入されたＣＨＯ細胞を動物細胞培養用の培地で培養した後、細胞を分離除去した溶液をいう。分離手段としてアフィニティーカラムを使用した場合には、アフィニティーカラムに流した際に抗体成分はカラムに吸着され、カラムに吸着されずに溶出する溶液である。
【００１６】
精製廃液には、培養によって消費されなかった培地成分および細胞の代謝によって産生された成分が含まれている。
【００１７】
培養によって消費されなかった培地成分としては、グリシンやアルギニンといった各種アミノ酸、アスコルビン酸や葉酸をはじめとするビタミン類、塩化カルシウムや塩化カリウム、塩化ナトリウムなどの無機塩、ＡＴＰやＦＡＤといった塩基や核酸、リノレイン酸などの脂質やグルコース、ガラクトースといった糖類がある。さらに、血清やＥＧＦ、ＦＧＦ、ＩＧＦ−１、ＮＧＦといった成長因子、ウシ血清アルブミン（以下ＢＳＡ）、コレステロール、インスリン、トランスフェリンも含まれる。
【００１８】
細胞の代謝によって産生された成分としては、乳酸やアンモニア、グルタミン酸などの老廃物の他に、未特定であるが成長因子などが含まれている。
【００１９】
一般に、乳酸やアンモニアといった細胞培養障害因子の多くは５００Ｄ未満の低分子量であり、他方、成長因子や生理活性物質は多くは５００Ｄ以上のオリゴペプチドやタンパク質であって高分子量である。従って、分子量の差を利用して高分子区分と低分子区分とに分離すれば、細胞培養障害因子と成長因子や生理活性物質とを分離することができる。分離法としては公知の方法を採用することができるが、特に限外濾過法が望ましい。限外濾過法は分離作業が容易であるばかりでなく、同時に高分子区分を濃縮することもできる。
【００２０】
本明細書中でいう「高分子区分」とは、オリゴペプチドやタンパク質の分子量オーダの区分をいい、例えば、分子量５００Ｄ以上の分子量を有する物質をいう。また、「低分子物質区分」とは、乳酸やアンモニアといった細胞培養障害因子が有する分子量オーダの物質をいい、例えば分子量５００Ｄ未満の物質をいう。従って、高分子区分には培地に残存する成長因子や細胞が産生した生理活性物質が回収されており、なおかつ細胞培養障害因子が取り除かれている。
【発明の効果】
【００２１】
請求項１の発明では、動物細胞培養用の培地からモノクローナル抗体を分離除去した精製廃液を、高分子区分と低分子区分とに分離して得られた高分子区分に含まれる高分子物質からなる動物細胞培養用の再生培地添加剤としている。これにより、従来廃棄されていた精製廃液を再度培地添加剤として有効利用することができるとともに、新規の培地添加剤のみによる培地培養よりも大量の抗体を得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
動物細胞培養用の培地で抗体を培養し、抗体を分離した精製廃液を高分子区分と低分子区分とに分離して得られた高分子区分に含まれる物質を動物細胞培養用の培地添加剤とすることによって実現した。
【実施例】
【００２３】
以下、本発明を臨床診断薬生産モデルとしてマウスハイブリドーマの培養系を用いた実施例により説明する。
【００２４】
＜抗体精製廃液の調製＞
マウスハイブリドーマ２E３−０を市販の抗体生産培地ＡＳＦ１０４（味の素株式会社製：商標）で３日間培養して１２０ｍｌの培養液を回収した。マウスハイブリドーマ２E３−０は、マウスミエローマとトリニトロフェニル（ＴＰＮ：ハプテン抗原の一種）に免疫されたマウスＢ細胞との細胞融合によって作成され、トリニトロフェニルと特異的に結合してマウスＩｇＧ１抗体を産生する。また、抗体生産培地ＡＳＦ１０４は、基本培地とタンパク成分を主とする培地添加剤とからなる２剤タイプである。また培地添加剤にはタンパク成分にトランスフェリン５ｍｇ／ｌとインシュリン５ｍｇ／ｌの他α―CD−リノール酸が含有されたアルブミンフリータイプである。
【００２５】
回収した培養液を遠心分離により細胞を取り除いて溶液のみ（７８．５ｍｌ）とし、当量のリン酸ナトリウム溶液を添加後、アフィニティーカラム（プロテインGカラム）に流して抗体を分離回収した。一方、プロテインGカラムに捕捉されずに流れ出てきた溶液２４０ｍｌを回収し精製廃液とした。
【００２６】
＜限外濾過による抽出液の調製＞
精製廃液１５７ｍｌを遠心式限外濾過ユニット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製 商標名：Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａー１５）を用いて４５００回転で、高分子区分（分子量５ｋD以上）の抽出液１４ｍｌと低分子区分（分子量５ｋD未満）の抽出液１４３ｍｌをそれぞれ分離して回収した。なお、高分子区分の抽出液は、本操作によって培養液の状態と比較して１２倍に濃縮されていることになる。
【００２７】
＜抽出液中の成長因子の確認＞
図１は、各生産段階で得られた溶液中のタンパクをＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＳＤＳ−ｐｏｌｙａｃｌｙｌａｍｉｄｅｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）で分離した結果である。図１（ａ）は使用前の培地（ＡＳＦ１０４）の結果を示し、トランスフェリンとインスリンの存在が確認される。図１（ｂ）は培養後、抗体精製前の溶液の結果を示し、トランスフェリンとインスリンの両方の他、種々の物質が検出された。図１（ｃ）は、高分子区分の抽出液の結果を示し、トランスフェリンの存在は確認できたが、その存在量はバンドの濃度から、使用前の３分の１程度であると推定される。
【００２８】
＜再生培地添加剤を利用した動物細胞培養＞
高分子区分の抽出液は、ＡＳＦ１０４で１２倍に希釈し再生培地添加剤として以下の試験を行った。
【００２９】
培地ＡＳＦ１０４の基本培地に、培地添加剤を表１に示す配合に調節して実施例１及び比較例１〜４の試験を行った。
【００３０】
ハイブリドーマ２Ｅ３−Ｏは、初期生細胞密度 １３５００個/mlで２４ウェルプレート（住友ベークライト社製）に１ｍｌずつ播種した。播種後６８時間培養し、細胞増殖と物質生産について評価した。
【００３１】
【表１】
【００３２】
＜細胞増殖に対する効果＞
試験結果を図２に示した。添加剤を添加しなかった比較例１では細胞は死滅した。また、再生培地添加剤のみの比較例３では、細胞は生存したものの増殖はしなかった。また、添加剤の量が通常の１／３の比較例４では、培養６８時間目における細胞数は比較例２の通常培地と比べて３割程度少なかった。一方、実施例１では、添加剤の量が１／３であるにもかかわらず、比較例２の通常培地と同等の細胞数を示した。以上の試験から、再生培地添加剤の添加により、高価な添加剤の使用量を１／３に大幅に減少できた。
【００３３】
＜物質生産＞
実施例１及び比較例１〜４による試験（６８時間培養）から抗体生産を評価した。その結果を表２に示す。モノクロナール抗体量は、実施例では通常培地の比較例２とほぼ同等の細胞増殖を示した。一方、培養によって生産されたモノクロナール抗体量は、比較例２よりも４０％多い生産量を示した。なお、抗体比生産速度は次式で算出している。
【００３４】
抗体比生産速度＝（培養６８時間後のマウスモノクローナル抗体量）/（培養４３−６８時間の対数平均細胞数）
【００３５】
【表２】
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】溶液中のトランスフェリンとインスリンの存在を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥの写真であって、図１（ａ）は未使用の生産培地、 図１（ｂ）は抗体精製前 図１（ｃ）は高分子区分の抽出液を表す。
【図２】生細胞密度の経時変化を示すグラフ
【技術分野】
【０００１】
本発明は、モノクローナル抗体を産生する培地添加剤およびその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗体は物質選択性が非常に高い性質を持った糖タンパク質の一種である。この特徴により、抗体はリウマチなどの自己免疫疾患や各種ガンに対する薬効が高く副作用が少ない治療薬として注目されている。さらに抗体は、インフルエンザをはじめとした各種感染症への感染判定や、簡易的な妊娠判定にといった体外診断薬としても利用されている。
【０００３】
抗体は、培地添加剤を加えた動物細胞培養用の培養液中で培養される。培地添加剤としては、ウシ胎児血清や子牛血清などが使用されてきたが、非常に高価であるなど種々の理由により、最近では、魚肉由来の培地添加剤（特許文献１）や、絹由来の培地添加剤（特許文献２）など種々の培地添加剤が開発されている。そして培養後に培地から抗体と精製廃液とに分離精製している。抗体の分離精製方法としては、比較的ステップ数の少ないアフィニティーカラムを用いるのが一般的である。アフィニティーカラムに培養液を流すと、抗体が特異的に吸着され、吸着されない精製廃液とを分離することができる。
【０００４】
【特許文献１】特開２００３−３３４０６８号公報
【特許文献２】ＷＯ２００２−６８６１３３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
アフィニティーカラムなどを利用して抗体を分離精製する際に、分離された抗体以外の成分（以下、「精製廃液」という。）は従来から廃棄処分されている。
【０００６】
ここで、精製廃液中には、乳酸やアンモニアといった細胞培養障害因子が含まれている。また、培養によって消費しきれなかった成長因子、ビタミン、アミノ酸をはじめとする培地成分と、細胞が生産する抗体以外の成長因子や他の生理活性物質が含まれている。この精製廃液を再度動物細胞用の培地添加剤として利用できれば、経済的に有利となる。
【０００７】
そこで、本発明者らは、精製廃液を再度動物細胞培養用の培地添加剤に利用すべく研究した結果、再利用が可能であるばかりではなく、抗体の収量が増加することを見出した。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
請求項１の発明では、動物細胞培養用の培地からモノクローナル抗体を分離除去した精製廃液を、高分子区分と低分子区分とに分離して得られた高分子区分に含まれる高分子物質からなる動物細胞培養用の再生培地添加剤としている。
【０００９】
モノクローナル抗体は、ただ一種類のＢ細胞が作る抗体のクローンである。特に医薬品に使用されているものには、マウス抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、完全ヒト化抗体があり、本発明のモノクローナル抗体には、マウス抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体または完全ヒト化抗体が含まれる。
【００１０】
マウス抗体はマウスＢ細胞が産生する抗体であり、マウスミエローマとマウス抗体産生細胞との細胞融合によって作製されたマウスハイブリドーマで産生される。
【００１１】
キメラ抗体は、マウス抗体の内、定常領域と可変領域の一部がヒト由来の抗体に置換された抗体であり、産業上は目的の抗体遺伝子をチャイニーズハムスター卵巣細胞（以下、ＣＨＯ細胞という。）に導入して生産されている。
【００１２】
ヒト化抗体は、可変領域の一部がマウス由来であるもののその他の部分以外が全てヒト抗体に置換された抗体であり、キメラ抗体と同様に、目的の抗体遺伝子をＣＨＯ細胞に導入して生産されている。また、完全ヒト化抗体はヒトの細胞から作られる抗体である。
【００１３】
動物細胞培養用の培地には、イーグル基礎培地、ダルベッコ変法イーグル培地、ＲＰＭＩ１６４０培地、ハムF-12培地などが使用され、多くの培地には、グリシンやアルギニンといった各種アミノ酸、アスコルビン酸や葉酸をはじめとするビタミン類、塩化カルシウムや塩化カリウム、塩化ナトリウムなどの無機塩、ＡＴＰやＦＡＤといった塩基や核酸、リノレイン酸などの脂質やグルコース、ガラクトースといった糖類などを含んでいる。
【００１４】
培地添加剤は、動物細胞の生存・増殖や物質生産性を向上させるために動物細胞培養用の培地に添加される物質を指す。例えば、ウシやウマといった哺乳動物の血清、ＥＧＦ、ＦＧＦ、ＩＧＦ−１、ＮＧＦといった成長因子、ウシ血清アルブミン（以下、ＢＳＡという。）、コレステロール、インスリン、トランスフェリン等が挙げられる。特に、抗体生産においては、トランスフェリン、インスリンなどが重要である。血清を含む培地は血清入り培地と呼ばれ、血清を含まない培地は無血清培地と呼ばれる。この無血清培地には、マウスハイブリドーマやＣＨＯ細胞用に開発された無血清培地も含まれる。
【００１５】
精製廃液とは、マウスハイブリドーマあるいは目的とする抗体遺伝子が導入されたＣＨＯ細胞を動物細胞培養用の培地で培養した後、細胞を分離除去した溶液をいう。分離手段としてアフィニティーカラムを使用した場合には、アフィニティーカラムに流した際に抗体成分はカラムに吸着され、カラムに吸着されずに溶出する溶液である。
【００１６】
精製廃液には、培養によって消費されなかった培地成分および細胞の代謝によって産生された成分が含まれている。
【００１７】
培養によって消費されなかった培地成分としては、グリシンやアルギニンといった各種アミノ酸、アスコルビン酸や葉酸をはじめとするビタミン類、塩化カルシウムや塩化カリウム、塩化ナトリウムなどの無機塩、ＡＴＰやＦＡＤといった塩基や核酸、リノレイン酸などの脂質やグルコース、ガラクトースといった糖類がある。さらに、血清やＥＧＦ、ＦＧＦ、ＩＧＦ−１、ＮＧＦといった成長因子、ウシ血清アルブミン（以下ＢＳＡ）、コレステロール、インスリン、トランスフェリンも含まれる。
【００１８】
細胞の代謝によって産生された成分としては、乳酸やアンモニア、グルタミン酸などの老廃物の他に、未特定であるが成長因子などが含まれている。
【００１９】
一般に、乳酸やアンモニアといった細胞培養障害因子の多くは５００Ｄ未満の低分子量であり、他方、成長因子や生理活性物質は多くは５００Ｄ以上のオリゴペプチドやタンパク質であって高分子量である。従って、分子量の差を利用して高分子区分と低分子区分とに分離すれば、細胞培養障害因子と成長因子や生理活性物質とを分離することができる。分離法としては公知の方法を採用することができるが、特に限外濾過法が望ましい。限外濾過法は分離作業が容易であるばかりでなく、同時に高分子区分を濃縮することもできる。
【００２０】
本明細書中でいう「高分子区分」とは、オリゴペプチドやタンパク質の分子量オーダの区分をいい、例えば、分子量５００Ｄ以上の分子量を有する物質をいう。また、「低分子物質区分」とは、乳酸やアンモニアといった細胞培養障害因子が有する分子量オーダの物質をいい、例えば分子量５００Ｄ未満の物質をいう。従って、高分子区分には培地に残存する成長因子や細胞が産生した生理活性物質が回収されており、なおかつ細胞培養障害因子が取り除かれている。
【発明の効果】
【００２１】
請求項１の発明では、動物細胞培養用の培地からモノクローナル抗体を分離除去した精製廃液を、高分子区分と低分子区分とに分離して得られた高分子区分に含まれる高分子物質からなる動物細胞培養用の再生培地添加剤としている。これにより、従来廃棄されていた精製廃液を再度培地添加剤として有効利用することができるとともに、新規の培地添加剤のみによる培地培養よりも大量の抗体を得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
動物細胞培養用の培地で抗体を培養し、抗体を分離した精製廃液を高分子区分と低分子区分とに分離して得られた高分子区分に含まれる物質を動物細胞培養用の培地添加剤とすることによって実現した。
【実施例】
【００２３】
以下、本発明を臨床診断薬生産モデルとしてマウスハイブリドーマの培養系を用いた実施例により説明する。
【００２４】
＜抗体精製廃液の調製＞
マウスハイブリドーマ２E３−０を市販の抗体生産培地ＡＳＦ１０４（味の素株式会社製：商標）で３日間培養して１２０ｍｌの培養液を回収した。マウスハイブリドーマ２E３−０は、マウスミエローマとトリニトロフェニル（ＴＰＮ：ハプテン抗原の一種）に免疫されたマウスＢ細胞との細胞融合によって作成され、トリニトロフェニルと特異的に結合してマウスＩｇＧ１抗体を産生する。また、抗体生産培地ＡＳＦ１０４は、基本培地とタンパク成分を主とする培地添加剤とからなる２剤タイプである。また培地添加剤にはタンパク成分にトランスフェリン５ｍｇ／ｌとインシュリン５ｍｇ／ｌの他α―CD−リノール酸が含有されたアルブミンフリータイプである。
【００２５】
回収した培養液を遠心分離により細胞を取り除いて溶液のみ（７８．５ｍｌ）とし、当量のリン酸ナトリウム溶液を添加後、アフィニティーカラム（プロテインGカラム）に流して抗体を分離回収した。一方、プロテインGカラムに捕捉されずに流れ出てきた溶液２４０ｍｌを回収し精製廃液とした。
【００２６】
＜限外濾過による抽出液の調製＞
精製廃液１５７ｍｌを遠心式限外濾過ユニット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製 商標名：Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａー１５）を用いて４５００回転で、高分子区分（分子量５ｋD以上）の抽出液１４ｍｌと低分子区分（分子量５ｋD未満）の抽出液１４３ｍｌをそれぞれ分離して回収した。なお、高分子区分の抽出液は、本操作によって培養液の状態と比較して１２倍に濃縮されていることになる。
【００２７】
＜抽出液中の成長因子の確認＞
図１は、各生産段階で得られた溶液中のタンパクをＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＳＤＳ−ｐｏｌｙａｃｌｙｌａｍｉｄｅｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）で分離した結果である。図１（ａ）は使用前の培地（ＡＳＦ１０４）の結果を示し、トランスフェリンとインスリンの存在が確認される。図１（ｂ）は培養後、抗体精製前の溶液の結果を示し、トランスフェリンとインスリンの両方の他、種々の物質が検出された。図１（ｃ）は、高分子区分の抽出液の結果を示し、トランスフェリンの存在は確認できたが、その存在量はバンドの濃度から、使用前の３分の１程度であると推定される。
【００２８】
＜再生培地添加剤を利用した動物細胞培養＞
高分子区分の抽出液は、ＡＳＦ１０４で１２倍に希釈し再生培地添加剤として以下の試験を行った。
【００２９】
培地ＡＳＦ１０４の基本培地に、培地添加剤を表１に示す配合に調節して実施例１及び比較例１〜４の試験を行った。
【００３０】
ハイブリドーマ２Ｅ３−Ｏは、初期生細胞密度 １３５００個/mlで２４ウェルプレート（住友ベークライト社製）に１ｍｌずつ播種した。播種後６８時間培養し、細胞増殖と物質生産について評価した。
【００３１】
【表１】
【００３２】
＜細胞増殖に対する効果＞
試験結果を図２に示した。添加剤を添加しなかった比較例１では細胞は死滅した。また、再生培地添加剤のみの比較例３では、細胞は生存したものの増殖はしなかった。また、添加剤の量が通常の１／３の比較例４では、培養６８時間目における細胞数は比較例２の通常培地と比べて３割程度少なかった。一方、実施例１では、添加剤の量が１／３であるにもかかわらず、比較例２の通常培地と同等の細胞数を示した。以上の試験から、再生培地添加剤の添加により、高価な添加剤の使用量を１／３に大幅に減少できた。
【００３３】
＜物質生産＞
実施例１及び比較例１〜４による試験（６８時間培養）から抗体生産を評価した。その結果を表２に示す。モノクロナール抗体量は、実施例では通常培地の比較例２とほぼ同等の細胞増殖を示した。一方、培養によって生産されたモノクロナール抗体量は、比較例２よりも４０％多い生産量を示した。なお、抗体比生産速度は次式で算出している。
【００３４】
抗体比生産速度＝（培養６８時間後のマウスモノクローナル抗体量）/（培養４３−６８時間の対数平均細胞数）
【００３５】
【表２】
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】溶液中のトランスフェリンとインスリンの存在を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥの写真であって、図１（ａ）は未使用の生産培地、 図１（ｂ）は抗体精製前 図１（ｃ）は高分子区分の抽出液を表す。
【図２】生細胞密度の経時変化を示すグラフ
【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物細胞培養用の培地からモノクローナル抗体を分離除去した精製廃液を、高分子区分と低分子区分とに分離して得られた該高分子区分に含まれる高分子物質からなる動物細胞培養用の再生培地添加剤。
【請求項２】
モノクローナル抗体がマウス抗体であることを特徴とする請求項１記載の動物細胞培養用の再生培地添加剤。
【請求項３】
高分子物質が分子量５００Ｄ以上の分子量を有する物質であることを特徴とする請求項１，２記載の動物細胞培養用の再生培地添加剤。
【請求項４】
動物細胞培養用の培地によりモノクローナル抗体を産生し、該培地からモノクローナル抗体を分離除去して得られた精製廃液を、高分子区分と低分子区分とに分離し、得られた該高分子区分に含まれる高分子物質により動物細胞培養用の再生培地添加剤を製造する動物細胞培養用の再生培地添加剤の製造方法。
【請求項５】
限外濾過法により精製廃液を高分子区分と低分子区分とに分離する請求項４記載の動物細胞培養用の再生培地添加剤の製造方法。
【請求項１】
動物細胞培養用の培地からモノクローナル抗体を分離除去した精製廃液を、高分子区分と低分子区分とに分離して得られた該高分子区分に含まれる高分子物質からなる動物細胞培養用の再生培地添加剤。
【請求項２】
モノクローナル抗体がマウス抗体であることを特徴とする請求項１記載の動物細胞培養用の再生培地添加剤。
【請求項３】
高分子物質が分子量５００Ｄ以上の分子量を有する物質であることを特徴とする請求項１，２記載の動物細胞培養用の再生培地添加剤。
【請求項４】
動物細胞培養用の培地によりモノクローナル抗体を産生し、該培地からモノクローナル抗体を分離除去して得られた精製廃液を、高分子区分と低分子区分とに分離し、得られた該高分子区分に含まれる高分子物質により動物細胞培養用の再生培地添加剤を製造する動物細胞培養用の再生培地添加剤の製造方法。
【請求項５】
限外濾過法により精製廃液を高分子区分と低分子区分とに分離する請求項４記載の動物細胞培養用の再生培地添加剤の製造方法。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２０１０−５１１７３（Ｐ２０１０−５１１７３Ａ）
【公開日】平成２２年３月１１日（２０１０．３．１１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−２１６２９３（Ｐ２００８−２１６２９３）
【出願日】平成２０年８月２６日（２００８．８．２６）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 発行者名 社団法人日本農芸化学会 刊行物名 日本農業化学学会２００８年度大会講演要旨集 発行日 平成２０年３月５日
【出願人】（５０４１４５３２０）国立大学法人福井大学 (287)
【出願人】（５０４２３７０５０）独立行政法人国立高等専門学校機構 (656)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年３月１１日（２０１０．３．１１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年８月２６日（２００８．８．２６）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 発行者名 社団法人日本農芸化学会 刊行物名 日本農業化学学会２００８年度大会講演要旨集 発行日 平成２０年３月５日
【出願人】（５０４１４５３２０）国立大学法人福井大学 (287)
【出願人】（５０４２３７０５０）独立行政法人国立高等専門学校機構 (656)
【Ｆターム（参考）】
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