医薬組成物、ＤＮＡ、ベクター、形質転換体、ポリペプチド、及びクローニング方法
【課題】ＥＢＶゲノムが除去され且つ疾患を充分に治療又は予防できる医薬組成物等を提供すること。
【解決手段】本発明の医薬組成物は、ＥＢＶゲノム陰性であることを指標に選抜されて得られた融合ミエローマ細胞と、ある抗原に対する抗体を産生するＥＢＶ形質転換ヒトＢ細胞と、を細胞融合して得られる完全ヒト抗体産生ハイブリドーマが産生する完全ヒト抗体のサブタイプＩｇＧ１、ＩｇＧ４の２種からなるＥＢＶゲノム陰性抗体（ＴＴ１＋ＴＴ２）を有効成分とする。
【解決手段】本発明の医薬組成物は、ＥＢＶゲノム陰性であることを指標に選抜されて得られた融合ミエローマ細胞と、ある抗原に対する抗体を産生するＥＢＶ形質転換ヒトＢ細胞と、を細胞融合して得られる完全ヒト抗体産生ハイブリドーマが産生する完全ヒト抗体のサブタイプＩｇＧ１、ＩｇＧ４の２種からなるＥＢＶゲノム陰性抗体（ＴＴ１＋ＴＴ２）を有効成分とする。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬組成物、ＤＮＡ、ベクター、形質転換体、ポリペプチド、及びクローニング方法に関し、より詳しくは、ＥＢＶウイルスが除去された抗体を用いる製薬技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
マウス等の実験動物種の抗体の一部をヒト抗体に置き換えた、キメラ抗体やヒト型化抗体が作製容易な抗体として、実用化されている。しかし、キメラ抗体やヒト型化抗体は、その一部にヒト以外の動物種の抗体が混在するため、ヒト免疫系において抗原として認識される。よって、キメラ抗体やヒト型化抗体を使用した医薬品は、重複投与できない等の欠点を有する。
【０００３】
従って、医薬品に使用する抗体としては、重複投与可能な点、更に、抗原に対する親和性が高いという点から、ヒト以外の動物種の抗体が混在しない抗体である完全ヒト抗体が好ましい。
【０００４】
従来からの完全ヒト抗体の作製方法としては、ＥＢＶ−ハイブリドーマ法が挙げられる。この方法によれば、たとえ目的の抗原が未知の場合にも、抗原決定基を有するポリペプチドの合成等を行う必要がないので、迅速に、目的の完全ヒト抗体産生ハイブリドーマを作製できる（例えば、非特許文献１参照）。従って、完全ヒト抗体を、迅速且つ容易に作製できる。
【０００５】
しかし、ＥＢＶ−ハイブリドーマ法では、ヒトＢ細胞として、ＥＢＶにより形質転換されたものを使用するから、作製された完全ヒト抗体産生ハイブリドーマにＥＢＶゲノムが残存する。ＥＢＶは、欧米では白血病、アジアでは上皮性癌（例えば、上咽頭癌）の原因の一つと考えられている。このため、抗体を製剤化する際には、安全上の観点から、ＥＢＶゲノムを除去する必要がある。
【０００６】
このような問題に対して、特許文献１は、ヒトミエローマ細胞及びマウスミエローマ細胞を細胞融合して得られたヘテロハイブリドーマに、ヒトＢ細胞が更に細胞融合され、ＥＢＶゲノム陰性であることを指標に選抜されて得られた融合ミエローマ細胞を用いる抗体作製方法を開示している。
【特許文献１】特開２００７−１４１号公報
【非特許文献１】Ｅ．Ｔｒａｇｇｉａｉら、「Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ」、２００４年発行、１０、ｐ．８７１〜８７５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかし、特許文献１に示される方法では、作製される抗体の、疾患の治療又は予防に対する効果が不充分である場合があった。
【０００８】
そこで、本発明は、ＥＢＶゲノムが除去され且つ疾患を充分に治療又は予防できる完全ヒト抗体の作製を可能にするＤＮＡ、ベクター、形質転換体、及びポリペプチドを提供することを第一の目的とする。
【０００９】
また、本発明は、ＥＢＶゲノムが除去され且つ疾患を充分に治療又は予防できる完全ヒト抗体で構成された医薬組成物を提供することを第二の目的とする。
【００１０】
更に、本発明は、ＥＢＶゲノムが除去され且つ疾患を充分に治療又は予防できる完全ヒト抗体の作製を可能にするＤＮＡのクローニング方法を提供することを第三の目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、前述した完全ヒト化抗体の複数のサブタイプを併用することで、疾病の治療又は予防の効果を飛躍的に向上できることを見出し、本発明を完成するに至った。具体的には、本発明は以下のようなものを提供する。
【００１２】
（１） 以下の（ａ）から（ｄ）のいずれかのＤＮＡ。
（ａ）ヒトミエローマ細胞及びマウスミエローマ細胞を細胞融合して得られたヘテロハイブリドーマに、ヒトＢ細胞が更に細胞融合され、ＥＢＶゲノム陰性であることを指標に選抜されて得られた融合ミエローマ細胞と、ある抗原に対する抗体を産生するＥＢＶ形質転換ヒトＢ細胞と、を細胞融合して得られる完全ヒト抗体産生ハイブリドーマに由来するＥＢＶゲノム陰性ハイブリドーマから得られ、前記抗体の重鎖又は軽鎖をコードする塩基配列を有するＤＮＡ
（ｂ）塩基配列（ａ）とストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる塩基配列を有するＤＮＡ
（ｃ）前記抗体の重鎖又は軽鎖のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ
（ｄ）塩基配列（ａ）と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなるＤＮＡ
【００１３】
（２） 前記抗体は、ＩｇＧ４サブタイプである（１）記載のＤＮＡ。
【００１４】
（３） 塩基配列（ａ）は、配列番号１又は２の塩基配列である（２）記載のＤＮＡ。
【００１５】
（４） （１）から（３）いずれか記載のＤＮＡを含むベクター。
【００１６】
（５） （４）記載のベクターが導入された形質転換体。
【００１７】
（６） 複数のサブクラスの前記完全ヒト抗体を発現する（５）記載の形質転換体。
【００１８】
（７） 前記複数のサブクラスは、前記完全ヒト抗体産生ハイブリドーマが産生する抗体群に含まれるものである（６）記載の形質転換体。
【００１９】
（８） （１）から（３）いずれか記載のＤＮＡによりコードされるポリペプチド。
【００２０】
（９） ヒトミエローマ細胞及びマウスミエローマ細胞を細胞融合して得られたヘテロハイブリドーマに、ヒトＢ細胞が更に細胞融合され、ＥＢＶゲノム陰性であることを指標に選抜されて得られた融合ミエローマ細胞と、ある抗原に対する抗体を産生するＥＢＶ形質転換ヒトＢ細胞と、を細胞融合して得られる完全ヒト抗体産生ハイブリドーマが産生する完全ヒト抗体のサブタイプの２種以上からなるＥＢＶゲノム陰性抗体を有効成分とする医薬組成物。
【００２１】
（１０） 前記ＥＢＶゲノム陰性抗体は、ヒトミエローマ細胞及びマウスミエローマ細胞を細胞融合して得られたヘテロハイブリドーマに、ヒトＢ細胞が更に細胞融合され、ＥＢＶゲノム陰性であることを指標に選抜されて得られた融合ミエローマ細胞と、ある抗原に対する抗体を産生するＥＢＶ形質転換ヒトＢ細胞と、を細胞融合して得られる完全ヒト抗体産生ハイブリドーマに由来するＥＢＶゲノム陰性細胞株から得られる抗体である（９）記載の医薬組成物。
【００２２】
（１１） 前記ＥＢＶゲノム陰性抗体は、（８）記載のポリペプチドである（９）記載の医薬組成物。
【００２３】
（１２） 前記ＥＢＶゲノム陰性抗体は、少なくともＩｇＧ４サブタイプを含む（９）から（１１）いずれか記載の医薬組成物。
【００２４】
（１３） 破傷風の治療に用いられ、
前記ＩｇＧ４サブタイプは、配列番号１の塩基配列と、配列番号２の塩基配列と、によってコードされる（１２）記載の医薬組成物。
【００２５】
（１４） 配列番号３の塩基配列と、配列番号３の塩基配列と、によってコードされるＩｇＧ１サブタイプを更に含む（１３）記載の医薬組成物。
【００２６】
（１５） ヒトミエローマ細胞及びマウスミエローマ細胞を細胞融合して得られたヘテロハイブリドーマに、ヒトＢ細胞が更に細胞融合され、ＥＢＶゲノム陰性であることを指標に選抜されて得られた融合ミエローマ細胞と、ある抗原に対する抗体を産生するＥＢＶ形質転換ヒトＢ細胞と、を細胞融合して得られる完全ヒト抗体産生ハイブリドーマが産生する完全ヒト抗体のＩｇＧ４サブタイプを有効成分とし、他のサブタイプの効用を増強する抗体増強剤。
【００２７】
（１６） 前記効用は破傷風の治療におけるものであり、
前記ＩｇＧ４サブタイプは、配列番号１の塩基配列と、配列番号２の塩基配列と、によってコードされる（１５）記載の抗体増強剤。
【００２８】
（１７） 抗体の重鎖又は軽鎖をコードする塩基配列を有するＤＮＡのクローニング方法であって、
ヒトミエローマ細胞及びマウスミエローマ細胞を細胞融合して得られたヘテロハイブリドーマに、ヒトＢ細胞が更に細胞融合され、ＥＢＶゲノム陰性であることを指標に選抜されて得られた融合ミエローマ細胞と、ある抗原に対する抗体を産生するＥＢＶ形質転換ヒトＢ細胞と、を細胞融合して得られる完全ヒト抗体産生ハイブリドーマ、又はこの完全ヒト抗体産生ハイブリドーマに由来するハイブリドーマから抽出されるｍＲＮＡを鋳型として、前記抗体の重鎖又は軽鎖をコードする塩基配列を有するＤＮＡを特異的に増幅する手順を含むクローニング方法。
【００２９】
（１８） 前記完全ヒト抗体産生ハイブリドーマからｍＲＮＡを抽出する（１７）記載のクローニング方法。
【発明の効果】
【００３０】
本発明によれば、ＥＢＶゲノムが除去され且つ疾患を充分に治療又は予防できる完全ヒト抗体の作製を可能にするＤＮＡ、ベクター、形質転換体、及びポリペプチド、並びにＥＢＶゲノムが除去され且つ疾患を充分に治療又は予防できる完全ヒト抗体で構成された医薬組成物、前述したＤＮＡのクローニング方法を提供できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３１】
以下、本発明の一実施形態について説明する。
【００３２】
＜ＤＮＡ＞
本発明のＤＮＡは、以下の（ａ）から（ｄ）のいずれかのＤＮＡである。
（ａ）ヒトミエローマ細胞及びマウスミエローマ細胞を細胞融合して得られたヘテロハイブリドーマに、ヒトＢ細胞が更に細胞融合され、ＥＢＶゲノム陰性であることを指標に選抜されて得られた融合ミエローマ細胞と、ある抗原に対する抗体を産生するＥＢＶ形質転換ヒトＢ細胞と、を細胞融合して得られる完全ヒト抗体産生ハイブリドーマに由来するＥＢＶゲノム陰性ハイブリドーマから得られ、前記抗体の重鎖又は軽鎖をコードする塩基配列を有するＤＮＡ
（ｂ）塩基配列（ａ）とストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる塩基配列を有するＤＮＡ
（ｃ）前記抗体の重鎖又は軽鎖のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ
（ｄ）塩基配列（ａ）と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなるＤＮＡ
【００３３】
本発明における「ＤＮＡ」は、センス鎖又はアンチセンス鎖（例えば、プローブとして使用できる）のいずれでもよく、その形状は一本鎖と二本鎖のいずれでもよい。また、ゲノムＤＮＡであっても、ｃＤＮＡであっても、合成されたＤＮＡであってもよい。
【００３４】
塩基配列（ａ）は、ＥＢＶ形質転換ヒトＢ細胞が産生する抗体の重鎖又は軽鎖をコードする。ＥＢＶ形質転換ヒトＢ細胞は複数のサブタイプの抗体を産生するのが通常であるところ、塩基配列（ａ）がコードするのは、いずれかのサブタイプの抗体の重鎖又は軽鎖である。
【００３５】
本発明のＤＮＡの最も好ましい態様は塩基配列（ａ）を有するＤＮＡであるが、本発明のＤＮＡには、更に、塩基配列（ａ）を有するＤＮＡの種々の変異体やホモログが含まれる。塩基配列（ａ）の詳細については後述するが、他の抗体の効用を増強できる点で、ＩｇＧ４サブタイプの重鎖又は軽鎖をコードする配列であることが好ましい。ＩｇＧ４サブタイプの軽鎖をコードする塩基配列としては配列番号１の塩基配列、ＩｇＧ４サブタイプの重鎖をコードする塩基配列としては配列番号２の塩基配列が挙げられ、これら塩基配列によってコードされるポリペプチドは破傷風の治療に有用である。
【００３６】
塩基配列（ａ）を有するＤＮＡの変異体やホモログには、例えば、塩基配列（ａ）とストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる塩基配列を有するＤＮＡが含まれる。ここで、「ストリンジェントな条件」としては、例えば、通常のハイブリダイゼーション緩衝液中、４０〜７０℃（好ましくは、６０〜６５℃）で反応を行い、塩濃度１５〜３００ｍＭ（好ましくは、１５〜６０ｍＭ）の洗浄液中で洗浄を行う条件が挙げられる。
【００３７】
また、抗体の重鎖又は軽鎖のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡも含まれる。ここで「１もしくは複数」とは、通常、５０アミノ酸以内であり、好ましくは３０アミノ酸以内であり、更に好ましくは１０アミノ酸以内（例えば、５アミノ酸以内、３アミノ酸以内、１アミノ酸）である。筋特異的チロシンキナーゼを活性化する能力を維持する場合、変異するアミノ酸残基においては、アミノ酸側鎖の性質が保存されている別のアミノ酸に変異されることが望ましい。例えばアミノ酸側鎖の性質としては、疎水性アミノ酸（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｗ、Ｙ、Ｖ）、親水性アミノ酸（Ｒ、Ｄ、Ｎ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、Ｔ）、脂肪族側鎖を有するアミノ酸（Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ）、水酸基含有側鎖を有するアミノ酸（Ｓ、Ｔ、Ｙ）、硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸（Ｃ、Ｍ）、カルボン酸及びアミド含有側鎖を有するアミノ酸（Ｄ、Ｎ、Ｅ、Ｑ）、塩基含有側鎖を有するアミノ離（Ｒ、Ｋ、Ｈ）、芳香族含有側鎖を有するアミノ酸（Ｈ、Ｆ、Ｙ、Ｗ）が挙げられる（括弧内はいずれもアミノ酸の一文字標記を表す）。
【００３８】
あるアミノ酸配列に対する１又は複数個のアミノ酸残基の欠失、付加及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有するタンパク質がその生物学的活性を維持することはすでに知られている（Ｍａｒｋ，Ｄ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８４）８１，５６６２−５６６６、Ｚｏｌｌｅｒ，Ｍ．Ｊ．＆ Ｓｍｉｔｈ，Ｍ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９８２）１０，６４８７−６５００、Ｗａｎｇ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２４，１４３１−１４３３、Ｄａｌｂａｄｉｅ−ＭｃＦａｒｌａｎｄ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８２）７９，６４０９−６４１３）。
【００３９】
更に、塩基配列（ａ）を有するＤＮＡの変異体やホモログには、塩基配列（ａ）と高い相同性を有する塩基配列からなるＤＮＡが含まれる。このようなＤＮＡは、好ましくは、塩基配列（ａ）と９０％以上、更に好ましくは９５％以上（９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上）の相同性を有する。アミノ酸配列や塩基配列の相同性は、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ ＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３−５８７７，１９９３）によって決定することができる。このアルゴリズムに基づいて、ＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸと呼ばれるプログラムが開発されている（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． ２１５：４０３−４１０，１９９０）。ＢＬＡＳＴに基づいてＢＬＡＳＴＮによって塩基配列を解析する場合には、パラメータは例えばｓｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２とする。また、ＢＬＡＳＴに基づいてＢＬＡＳＴＸによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメータは例えばｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３とする。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメータを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．）。
【００４０】
本発明のＤＮＡを取得する方法としては、特に限定されないが、ｍＲＮＡから逆転写することでｃＤＮＡを得る方法（例えば、ＲＴ−ＰＣＲ法）、ゲノムＤＮＡから調製する方法、化学合成により合成する方法、ゲノムＤＮＡライブラリーやｃＤＮＡライブラリーから単離する方法等の公知の方法（例えば、特開平１１−２９５９９号公報参照）が挙げられる。
【００４１】
〔完全ヒト抗体産生ハイブリドーマ〕
塩基配列（ａ）の決定には、完全ヒト抗体産生ハイブリドーマ、又はこの完全ヒト抗体産生ハイブリドーマに由来するハイブリドーマが用いられる。これらのハイブリドーマの作製方法の手順について、図１を参照しながら説明する。
【００４２】
本発明の完全ヒト抗体産生ハイブリドーマの作製方法は、融合ミエローマ細胞と、完全ヒト抗体を産生するＥＢＶ形質転換ヒトＢ細胞と、を細胞融合して完全ヒト抗体産生ハイブリドーマを得る融合工程（Ｓ１００）と、この完全ヒト抗体産生ハイブリドーマを所定回数クローニングするクローニング工程（Ｓ２００）と、前記クローニングされた完全抗体産生ハイブリドーマからＥＢＶゲノム陰性細胞株を選抜する選抜工程（Ｓ３００）と、を含む。
【００４３】
次に、図２及び図３を参照して、Ｓ１００で用いられる、融合ミエローマ細胞と、完全ヒト抗体を産生するＥＢＶ形質転換ヒトＢ細胞と、の調製手順について説明する。
【００４４】
＜融合工程＞
［ヘテロハイブリドーマの作製］
まず、ヒトミエローマ細胞と、マウスミエローマ細胞と、を細胞融合し、ヘテロハイブリドーマを作製する（Ｓ１０）。
【００４５】
Ｓ１０においては、ヒトミエローマ細胞、マウスミエローマ細胞としては、自己抗体産生能のない細胞を用いる。更に、ヒトミエローマ細胞、マウスミエローマ細胞のいずれか一方として、例えば、ヒポキサンチン・グアニン・ホスホリボシルトランスフェラーゼ（以下、「ＨＧＰＲＴ」と表記する。）を欠損した６―チオグアニン耐性株を用いることができる。
【００４６】
６―チオグアニンを含有する培地において、生存できることを利用して、後述するＳ１４において、目的のヘテロハイブリドーマを選別できるからである。また、ＨＧＰＲＴは、サルベージ回路経由のヌクレオチド合成に必須な酵素であるため、ＨＧＰＲＴ欠損株はヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジンを含む培地（ＨＡＴ培地）で生存できないことを利用して、後述するＳ１５０において、完全ヒト抗体産生ハイブリドーマを選出できるからである。
【００４７】
このようなヒトミエローマ細胞としては、特に限定されないが、通常、例えば、Ｕ−２６６株を挙げることができる。また、このようなマウスミエローマ細胞としては、特に限定されないが、通常、例えばＰ３Ｘ６３．Ａｇ８．６５３株を挙げることができる。
【００４８】
これらの細胞株は各々、適当な培地、例えばイスコフ改変ダルベッコ培地（以下、「ＩＭＤＭ培地」と表記する。）に、グルタミン、２−メルカプトエタノール、及びウシ胎児血清を加えた培地（ＩＭＤＭ改良培地）に６―チオグアニンを加えた培地、ＩＭＤＭ改良培地を用いて、継代培養する。そして、後述するＳ１２を行う当日に２×１０７以上の細胞数を確保しておく。
【００４９】
このヒトミエローマ細胞と、マウスミエローマ細胞と、を細胞融合する（Ｓ１２）。細胞融合の方法としては、特に限定されないが、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）法、センダイウイルスを用いる方法、電気融合法等の常法を挙げることができ、細胞毒性が比較的少なく融合操作も簡単な点からは、ＰＥＧ法が好ましい。
【００５０】
例えば、ＰＥＧ法によれば以下の手順となる（Ｓ１２’［図示はしていない］）。
即ち、ヒトミエローマ細胞と、マウスミエローマ細胞と、を、無血清培地（例えば、ＤＭＥＭ）又はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）でよく洗浄した後、ヒトミエローマ細胞とマウスミエローマ細胞との細胞数の比が１：４〜１：５程度になるように混合し、遠心分離する。遠心後の上清を除去し、沈殿した細胞群を十分にほぐした後、撹拌しながら０．６ｇ／ｍＬのＰＥＧ（分子量１０００〜４０００）を含む無血清培地１ｍＬを滴下する。
【００５１】
次いで、１０ｍＬの無血清培地をゆっくりと加えた後、遠心分離する。再び上清を捨て、沈殿した細胞を、ＩＭＤＭ培地に６―チオグアニンを加えた培地中に懸濁する。この懸濁物を培養用プレート（以下「プレート」という）の各ウェルに分注し、７％炭酸ガスの存在下、適宜６―チオグアニンを含有するＩＭＤＭ培地を補いながら、３７℃で２週間程度培養する。
【００５２】
次に、Ｓ１０を経て得られるヘテロハイブリドーマをクローニングする（Ｓ１４）。
クローニングの方法としては、プレートの１ウェルに１個のハイブリドーマが含まれるように希釈して培養する限界希釈法、軟寒天培地中で培養しコロニーを回収する軟寒天法、マイクロマニュピレーターによって１個ずつの細胞を取り出し培養する方法、セルソーターによって１個の細胞を分離する方法等を挙げることができる。このうち、操作が簡便な点から、限界希釈法がよく用いられる。
【００５３】
そして、抗体を産生していないことを確認できたものを選出する（Ｓ１６）。これにより、Ｓ１００において用いることができるヘテロハイブリドーマを、選択的に得ることができる。
【００５４】
選出の方法としては、特に限定されないが、ＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、蛍光抗体法、受身血球凝縮反応法等の公知の方法を挙げることができる。このうち、検出感度、迅速性、正確性等の点からは、ＥＬＩＳＡ法が好ましい。このＥＬＩＳＡ法は、一般的な競合法、サンドイッチ法等の手法に従って行うことができ、液相系でも、固相系でも行うことができる。
【００５５】
［融合ミエローマ細胞の作製］
このヘテロハイブリドーマと、ヒトＢ細胞と、を細胞融合し、融合ミエローマ細胞を作製する（Ｓ２０）。
【００５６】
ここで用いるヒトＢ細胞は、形質細胞又はその前駆細胞（リンパ球）であり、個体のいずれの部位から得てもよく、脾細胞、リンパ節、骨髄、扁桃、末梢血、又はこれらを適宜組み合わせたもの等から得ることができる。このうち、採取が容易な点から、末梢血が最も一般的に用いられる。ここで用いるヒトＢ細胞は、自己抗体産生能のない細胞である。
【００５７】
ヘテロハイブリドーマは、例えば、６―チオグアニンを含有するＩＭＤＭ改良培地等を用いて継代培養し、後述するＳ２２を行う当日に２×１０７以上の細胞数を確保しておく。
【００５８】
ヘテロハイブリドーマがＨＧＰＲＴを欠損した６―チオグアニン耐性株であった場合、６―チオグアニンを含有するＩＭＤＭ改良培地を用いることで、目的の融合ミエローマ細胞を選別できる。即ち、融合しなかったヒトＢ細胞、及びヒトＢ細胞同士の融合細胞は、培地に６―チオグアニンが含まれているため、生存できないからである。
【００５９】
このヘテロハイブリドーマと、ヒトＢ細胞と、を細胞融合する（Ｓ２２）。細胞融合は、例えばＰＥＧ法によれば、以下の手順となる（Ｓ２２’［図示はしていない］）。
このヘテロハイブリドーマと、ヒトＢ細胞と、を、無血清培地（例えば、ＤＭＥＭ）又はＰＢＳでよく洗浄し、ヘテロハイブリドーマとヒトＢ細胞との細胞数の比が１：４〜１：５程度になるように混合し、遠心分離する。遠心後の上清を除去し、沈殿した細胞群を十分にほぐした後、撹拌しながら０．６ｇ／ｍＬのＰＥＧ（分子量１０００〜４０００）を含む無血清培地１ｍＬを滴下する。
【００６０】
次いで、１０ｍＬの無血清培地をゆっくりと加えた後、遠心分離する。再び上清を捨て、沈殿した細胞を、適量のヒトインターロイキン−６（ヒトＩＬ−６）を更に含むウアバインを含有するＩＭＤＭ改良培地中に懸濁する。この懸濁物をプレートの各ウェルに分注し、７％炭酸ガスの存在下、適宜ウアバインを含有するＩＭＤＭ改良培地を補いながら、３７℃で２週間程度培養する。
【００６１】
Ｓ２２を経て得られる融合ミエローマ細胞をクローニングする（Ｓ２４）。Ｓ２４は、Ｓ１４と同様の手順で行うことができる。
【００６２】
そして、抗体を産生していないことを確認できたものを選出する（Ｓ２６）。これにより、Ｓ１００において用いることができる融合ミエローマ細胞を、選択的に得ることができる。Ｓ２６は、Ｓ１６と同様の手順で行うことができる。
【００６３】
このようにして、Ｓ１００において用いられる融合ミエローマ細胞を得ることができる。この融合ミエローマ細胞の一例として、受託番号がＦＥＲＭ Ａ−２０５９０である融合ミエローマ細胞が寄託されている。
【００６４】
［完全ヒト抗体を産生するＥＢＶ形質転換ヒトＢ細胞の調製］
完全ヒト抗体を産生するＥＢＶ形質転換ヒトＢ細胞を調製する（Ｓ３０）。
【００６５】
完全ヒト抗体を産生するヒトＢ細胞は、ワクチン接種を受けた又は疾患から回復したボランティア（ヒト）の形質細胞又はその前駆細胞（リンパ球）である。完全ヒト抗体を産生するヒトＢ細胞は、ボランティアのいずれの部位から得てもよく、一般には脾細胞、リンパ節、骨髄、扁桃、末梢血、又はこれらを適宜組み合わせたもの等から得る（Ｓ３２）ことができる。なお、採取が容易な点から、末梢血から完全ヒト抗体を産生するヒトＢ細胞を得ることが、最も一般的である。
【００６６】
このヒトＢ細胞にＥＢＶを感染させることで、形質転換を行う（Ｓ３４）。
形質転換の方法としては、特に限定されないが、例えば以下の手順を挙げることができる。即ち、放射線照射したフィーダー細胞上で、ヒトＢ細胞の培養を行う。このヒトＢ細胞に、ＥＢＶ陽性マーモセット細胞株Ｂ９５−８の培養上清中のウイルスを添加し、更にヒトＢ細胞を培養することで、ＥＢＶに感染させる。
【００６７】
次いで、ＥＢＶ形質転換ヒトＢ細胞をクローニングする（Ｓ３６）。Ｓ３６は、図２のＳ１４と同様の手順で行うことができるが、形質転換されたＢ細胞の増殖を促進するため、ヒトＩＬ−６等の増殖因子を適量添加しつつ、行うことが好ましい。
【００６８】
更に、Ｓ３６を経て得られるクローニングされたＥＢＶ形質転換ヒトＢ細胞から、完全ヒト抗体を産生するヒトＢ細胞を選出する（Ｓ３８）。これにより、完全ヒト抗体を産生するＥＢＶ形質転換ヒトＢ細胞を、選択的に得ることができる。Ｓ３８は、図２のＳ１６と同様の手順で行うことができる。
【００６９】
Ｓ３８は、例えばＥＬＩＳＡ法によれば、以下のような手順により行うことができる（Ｓ３８’［図示はしていない］）。
即ち、まず、抗原をＥＬＩＳＡ法用９６穴プレート等の固相表面に吸着させ、抗原が吸着していない固相表面を抗原と無関係なタンパク質、例えばウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）により覆う。次いで、この表面を洗浄した後、一次抗体として、段階希釈した試料に接触させ、上記抗原に試料中の完全ヒト抗体を結合させる。更に、二次抗体として、酵素標識されたヒト抗体に対する抗体を加えて、ヒト抗体に結合させる。洗浄した後、この酵素の基質を加え、基質分解に基づく発色による吸光度の変化等を測定することにより、抗体価を算出する。
【００７０】
＜完全ヒト抗体産生ハイブリドーマへの細胞融合＞
次に、Ｓ２０を経て得られる融合ミエローマ細胞と、Ｓ３０を経て得られる完全ヒト抗体を産生するＥＢＶ形質転換ヒトＢ細胞と、を細胞融合して完全ヒト抗体産生ハイブリドーマを得る（Ｓ１００）。
【００７１】
融合ミエローマ細胞は、例えば、６―チオグアニン及びウアバインを含有するＩＭＤＭ改良培地を用いて継代培養する。完全ヒト抗体を産生するＥＢＶ形質転換ヒトＢ細胞は、例えば、ＩＬ−６、２−メルカプトエタノール、ウシインスリン、ヒトトランスフェリンを含有するＩＭＤＭ改良培地を用いて継代培養する。いずれの細胞も、後述するＳ１１０を行う当日に２×１０７以上の細胞数を確保しておく。
【００７２】
上記融合ミエローマ細胞がＨＧＰＲＴを欠損した６―チオグアニン耐性及びウアバイン耐性株であった場合、６―チオグアニン及びウアバインを含有するＨＡＴ培地を用いることで、目的のハイブリドーマを選別できる。即ち、融合しなかった完全ヒト抗体を産生するＥＢＶ形質転換ヒトＢ細胞、及び完全ヒト抗体を産生するＥＢＶ形質転換ヒトＢ細胞同士の融合細胞は、培地に６―チオグアニン及びウアバインが含有されているため、生存できない。一方、融合しなかった融合ミエローマ細胞、及び融合ミエローマ細胞同士の融合細胞は、培地にＨＡＴが含まれているため、生存できないからである。
【００７３】
この融合ミエローマ細胞と、完全ヒト抗体を産生するＥＢＶ形質転換ヒトＢ細胞と、を細胞融合する（Ｓ１１０）。Ｓ１１０は、図２のＳ１２と同様の手順で行うことができる。
【００７４】
細胞融合は、例えばＰＥＧ法によれば、以下の手順（Ｓ１１０’［図示はしていない］）となる。
即ち、融合ミエローマ細胞と、完全ヒト抗体を産生するＥＢＶ形質転換ヒトＢ細胞と、を、無血清培地（例えば、ＤＭＥＭ）又はＰＢＳでよく洗浄し、融合ミエローマ細胞と完全ヒト抗体を産生するＥＢＶ形質転換ヒトＢ細胞との細胞数の比が１：４〜１：５程度になるように混合し、遠心分離する。遠心後の上清を除去し、沈殿した細胞群を十分にほぐした後、撹拌しながら０．６ｇ／ｍＬのＰＥＧ（分子量１０００〜４０００）を含む無血清培地１ｍＬを滴下する。
【００７５】
次いで、１０ｍＬの無血清培地をゆっくりと加えた後、遠心分離する。再び上清を捨て、沈殿した細胞を、適量のヒトＩＬ−６を更に含み、６―チオグアニン及びウアバインを含有するＨＡＴ培地中に懸濁する。この懸濁物をプレートの各ウェルに分注し、５％炭酸ガスの存在下、適宜６―チオグアニン及びウアバインを含有するＨＡＴ培地を補いながら、３７℃で２週間程度培養する。
【００７６】
次に、Ｓ１１０を経て得られる完全ヒト抗体産生ハイブリドーマをクローニングする（Ｓ１３０）。Ｓ１３０は、図２のＳ１４と同様の手順で行うことができる。
【００７７】
次に、Ｓ１３０を経て得られる完全ヒト抗体産生ハイブリドーマの中から、抗体産生能及び細胞増殖能が高いものを選出する（Ｓ１５０）。
選出の方法としては、特に限定されないが、ＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、蛍光抗体法、受身血球凝縮反応法等の公知の方法により抗体産生能が高いものを選出できる。
【００７８】
＜クローニング工程＞
次に、Ｓ１５０を経て選出された完全ヒト抗体産生ハイブリドーマに、後述するＳ２１０及びＳ２３０を所定回数施す（Ｓ２００）。
【００７９】
Ｓ１５０を経て選出された完全ヒト抗体産生ハイブリドーマを、別のプレートに移しクローニングを行う（Ｓ２１０［図示はしていない］）。Ｓ２１０は、図２のＳ１４と同様の手順で行うことができる。
【００８０】
Ｓ２１０を経て得られる株（サブクローン）の中から、Ｓ１５０と同様の手順で、抗体産生能及び細胞増殖能が高いことを指標に、次にクローニングを施す株を選出する（Ｓ２３０［図示はしていない］）。
【００８１】
このようなＳ２１０及びＳ２３０を所定回数行うことにより、ＥＢＶゲノムが除去された完全ヒト抗体産生ハイブリドーマを得ることができる。
【００８２】
＜選抜工程＞
得られた完全ヒト抗体産生ハイブリドーマの中から、ＥＢＶゲノムが除去された完全ヒト抗体産生ハイブリドーマを選抜する（Ｓ３００）。選抜の方法としては、特に限定されないが、例えば、定性的ＰＣＲ法、定量的ＰＣＲ法を挙げることができ、これらを併せて行うこともできる。
【００８３】
（定性的ＰＣＲ法）
定性的ＰＣＲ法によれば、完全ヒト抗体産生ハイブリドーマ内におけるＥＢＶゲノムの存否を確認する（Ｓ３１０［図示はしていない］）ことができる。
【００８４】
ＰＣＲにおいて鋳型となるＤＮＡは、培養された完全ヒト抗体産生ハイブリドーマから、常法に従って、「ＱＩＡ ａｍｐ ＤＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ」（キアゲン社製）等を用いて精製できる（Ｓ３１１［図示はしていない］）。
【００８５】
増幅させて検出する対象としては、特に限定されないが、検出感度を高めるという点で、例えば、ＢａｍＨＩ Ｗ領域等の繰り返し配列を有する領域が好ましい。例えば、ＢａｍＨＩ Ｗ領域は、ＥＢＶゲノム中、約１２回の繰り返し配列となっており、他の領域に比べて、より多量に増幅することができるからである。
【００８６】
定性的ＰＣＲ法においてＢａｍＨＩ Ｗ領域を増幅させるためのプライマーとしては、特に限定されないが、例えば、配列表の配列番号１及び２記載のプライマーを挙げることができる。
【００８７】
（定量的ＰＣＲ法）
定量的ＰＣＲ法によれば、ハイブリドーマ内におけるＥＢＶゲノムの存否及びコピー数を確認する（Ｓ３２０［図示はしていない］）ことができる。Ｓ３１１と同様の手順で、ＰＣＲにおいて鋳型となるＤＮＡを精製できる（Ｓ３２１［図示はしてない］）。増幅させて検出する対象としては、特に限定されないが、例えば、ＢＡＬＦ５（ＤＮＡポリメラーゼの遺伝子領域）等の構造遺伝子領域が挙げられる。
【００８８】
定量的ＰＣＲ法においてＢＡＬＦ５領域を増幅させるためのプライマーとしては、特に限定されないが、例えば、配列表の配列番号３及び４記載のプライマーを挙げることができ、プローブとしては配列表の配列番号５記載のプローブを挙げることができる。
【００８９】
また、単位細胞当たりのコピー数を定量化するための内部標準としては、特に限定されないが、ヒトグリセルアルデヒド―３―リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）やマウスβ―アクチン等の構造遺伝子領域を挙げることができる。
【００９０】
なお、定量的ＰＣＲを簡便に行うため、「ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ（登録商標） ７０００」（アプライドバイオシステムズ社製）等によるＲｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ法を用いることもできる。
【００９１】
〔クローニング方法〕
このようにして作製される、ＥＢＶゲノムが除去された完全ヒト抗体産生ハイブリドーマ又はこの完全ヒト抗体産生ハイブリドーマに由来するハイブリドーマは、通常の培地で継代培養することができ、また液体窒素中で長期間保存できる。このため、これら完全ヒト抗体産生ハイブリドーマ又はその由来ハイブリドーマを用いることで、塩基配列（ａ）を有するＤＮＡのクローニング、及び塩基配列（ａ）の決定を行うことができる。ただし、由来ハイブリドーマの作製は長時間を要することから、迅速にクローニングできる点で、完全ヒト抗体産生ハイブリドーマを用いることが好ましい。
【００９２】
その手順を次に示す。まず、完全ヒト抗体産生ハイブリドーマ又はその由来ハイブリドーマからｍＲＮＡを抽出し、逆転写することでｃＤＮＡを調製する。このｃＤＮＡを鋳型とし、重鎖又は軽鎖をコードする塩基配列を挟む既知の保存領域に特異的に結合するプライマーを用いることで、ＰＣＲ法にて重鎖又は軽鎖の塩基配列を増幅することで、塩基配列（ａ）を有するＤＮＡが得られ、単離してＤＮＡをクローニングする。また、公知の手順で、塩基配列（ａ）を決定すれば、この決定された配列に基づいて、塩基配列（ｂ）〜（ｄ）を得ることができる。ここで使用できるプライマーは、既知の保存領域に特異的に結合できる限りにおいて、後述の実施例で使用されるものに限定されない。
【００９３】
＜ベクター＞
本発明のベクターは、前述したＤＮＡを含むものであり、適当なベクターに上述のＤＮＡを挿入することにより作製できる。
【００９４】
「適当なベクター」とは、原核生物及び／又は真核生物の各種の宿主内で複製保持又は自己増殖できるものであればよく、使用の目的に応じて適宜選択できるものである。例えば、ＤＮＡを大量に取得したい場合には高コピーベクターを選択でき、ポリペプチドを取得したい場合には発現ベクターを選択できる。その具体例としては、特に限定されず、例えば、特開平１１−２９５９９号公報に記載された公知のベクターが挙げられる。
【００９５】
＜形質転換体＞
本発明の形質転換体は、前述したベクターを宿主に導入することで作製できる。ここで、形質転換体は、後述する医薬組成物を１種の形質転換体を用いて調製できる点で、複数のサブクラスの完全ヒト抗体を発現することが好ましい。また、複数のサブクラスは、治療効果の向上を保証できる点で、完全ヒト抗体産生ハイブリドーマが産生する抗体群に含まれるものであることが好ましい。なお、このような形質転換体は、複数のベクターを導入することで作製できる。
【００９６】
このような宿主は、本発明のベクターに適合し形質転換され得るものであればよく、その具体例としては、特に限定されないが、細菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞等の、公知の天然細胞もしくは人工的に樹立された細胞（特開平１１−２９５９９号公報参照）が挙げられる。しかし、発現ベクターを導入しヒトへの使用を目指す限りにおいて、安全性の観点から、動物細胞、特にＣＯＳ細胞が好ましく使用される。
【００９７】
ベクターの導入方法は、ベクターや宿主の種類等に応じて適宜選択できるものである。その具体例としては、特に限定されないが、プロトプラスト法、コンピテント法等の公知の方法（例えば、特開平１１−２９５９９号公報参照）が挙げられる。
【００９８】
＜ポリペプチド＞
本発明のポリペプチドは、前述したＤＮＡによりコードされるものであり、例えば、前述のＤＮＡを含む発現ベクターが導入された形質転換体を使用することで作製できる。まず、形質転換体を適宜の条件で培養し、ＤＮＡがコードするタンパク質（ポリペプチド）を合成させる。そして、合成されたタンパク質を形質転換体又は培養液から回収することにより、本発明のポリペプチドが得られる。
【００９９】
形質転換体の培養は、ポリペプチドが大量に且つ容易に取得できるように、形質転換体の種類等に応じて、公知の栄養培地から適宜選択し、温度、栄養培地のｐＨ、培養時間等を適宜調整して行うことができる（例えば、特開平１１−２９５９９号公報参照）。
【０１００】
ポリペプチドの単離方法及び精製方法としては、特に限定されず、溶解度を利用する方法、分子量の差を利用する方法、荷電を利用する方法等の公知の方法（例えば、特開平１１−２９５９９号公報参照）が挙げられる。
【０１０１】
＜医薬組成物・抗体増強剤＞
本発明の医薬組成物は、前述した完全ヒト抗体産生ハイブリドーマが産生する完全ヒト抗体であって、前述の融合ミエローマ細胞が産生する抗体のサブタイプの２種以上からなるＥＢＶゲノム陰性抗体を有効成分とする。
【０１０２】
ＥＢＶゲノム陰性抗体は、抗体の効用を増強できる点で、ＩｇＧ４サブタイプを少なくとも含むことが好ましい。特に、破傷風毒素に対するＩｇＧ４サブタイプの軽鎖は配列番号１の塩基配列によってコードされ、重鎖は配列番号２の塩基配列によってコードされる。また、これら塩基配列によってコードされるＩｇＧ４サブタイプは、配列番号３の塩基配列によってコードされるＩｇＧ１軽鎖と、配列番号３の塩基配列によってコードされるＩｇＧ１重鎖によって構成されるＩｇＧ１サブタイプの効用を特に増強する。このように、本発明で使用される完全ヒト抗体産生ハイブリドーマが産生する完全ヒト抗体のＩｇＧ４サブタイプは、他のサブタイプ（例えば、ＩｇＧ１）の効用を増強する抗体増強剤として作用する。
【０１０３】
前述の融合ミエローマ細胞が産生する抗体のサブタイプは、抗原抗体反応等を用いて、公知の方法で決定できる。医薬組成物は、決定されたすべてのサブタイプを含有することが好ましいが、製造コスト等を考慮して所望の治療効果が得られる最小の組合せを含有すればよい。なお、各サブタイプの含有量や含有比率は、適宜設定されてよい。
【０１０４】
ＥＢＶゲノム陰性抗体は、例えば、Ｓ３００を経て選抜された、ＥＢＶゲノムが除去された完全ヒト抗体産生ハイブリドーマによって産生されてよい。産生の手順は、特に限定されないが、例えば、以下の通りである。まず、Ｓ３００を経て選抜された、ＥＢＶゲノムが除去された完全ヒト抗体産生ハイブリドーマを、ＨＡＴを除いたＨＹ培地又はＩＭＤＭ改良培地に接種し、培養する。次いで、培養後の培養上清を回収する。大量培養をするときは、大型培養瓶を用いた回転培養、スピナー培養、あるいはホローファイバーシステムを用いた培養を行うことができる。比較的高純度の目的抗体を培養上清として得ることができる点で、大量培養は有利である。
【０１０５】
また、ＥＢＶゲノム陰性抗体は、増殖速度が早い形質転換体を用いて迅速且つ大量に製造できる点で、前述したポリペプチドであることが好ましい。
【０１０６】
抗体産生ハイブリドーマの培養上清及びマウス等の腹水は、そのまま粗製抗体液として用いることができる。また、これらは常法に従って、硫酸アンミモニウム分画、塩析、ゲル濾過法、イオン交換クロマトグラフィー、プロテインＡカラムクロマトグラフィー等のアフィニテイクロマトグラフィー等により精製して、精製抗体とすることもできる。
【０１０７】
本発明の医薬組成物は、経口あるいは非経口（例えば、注射による筋肉への直接投与）で投与できる。投与量は、患者の年齢、性別、体重、症状、治療効果、投与方法、処理時間等により異なるため、適宜選択すべきものである。
【０１０８】
「有効成分」とは、神経筋伝達障害の治療用医薬品もしくは予防用医薬品として有効である程度に含まれる成分という意味であって、他の任意成分を含むことを除外するものではない。
【０１０９】
他の任意成分としては、特に限定されないが、賦形剤、希釈剤、増粘剤、崩壊剤、安定剤、保存剤、緩衝材、乳化剤、芳香剤、着色剤、甘味剤、粘調剤、溶解補助剤等の担体等が挙げられる。これらの任意成分によれば、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、注射剤、液剤、カプセル剤、トロー剤、エリキシル剤等の様々な形態の医薬組成物を容易に調整できる。
【０１１０】
＜その他＞
［記録媒体］
前述したＤＮＡの塩基配列、及び、ポリペプチドのアミノ酸配列は、コンピュータ読み取り可能記録媒体に保存されてよい。この記録媒体によれば、保存されている本発明のポリペプチドのアミノ酸配列、及び、ＤＮＡの塩基配列を、コンピュータを用いてデータベース化することができる。このため、このアミノ酸配列や塩基配列を配列情報としても活用できる。
【０１１１】
記録媒体としては、コンピュータ読み取り可能であれば、特に限定されず、フレキシブルディスク、ハードディスク、磁気テープ等の磁気媒体、ＣＤ−ＲＯＭ、ＭＯ、ＣＤ−Ｒ、ＣＤ−ＲＷ、ＤＶＤ−Ｒ、ＤＶＤ−ＲＡＭ等の光ディスク、半導体メモリ等が挙げられる。
【０１１２】
［網羅的解析用ツール］
本発明のＤＮＡ及びポリペプチド、並びに、これらの部分断片は、基盤上に、担体として結合させた状態で、使用することもできる。本発明のポリペプチドやＤＮＡ以外に、更に、他のポリペプチドやＤＮＡを結合させた基盤は、本発明のポリペプチドやＤＮＡを含めた網羅的な解析に使用できる。
【０１１３】
基盤としては、特に限定されないが、ナイロン膜、ポリプロピレン膜等の樹脂基板、ニトロセルロース膜、ガラスプレート、シリコンプレート等が挙げられる。また、ハイブリダイゼーションの検出を、例えば蛍光物質といった非放射性同位体物質を用いて行う場合、基盤として、蛍光物質を含まないガラスプレート、シリコンプレート等を好ましく使用できる。
【実施例】
【０１１４】
次に、本発明を実施例及び比較例を挙げて説明する。具体的には、破傷風毒素に対する抗体の作製を行った。
【０１１５】
＜ヒト完全抗体の作製＞
破傷風毒素のワクチン接種をしたボランティア（ヒト）から末梢血を採取し、破傷風毒素に対する抗体を産生するヒトＢ細胞を得た。このヒトＢ細胞に、Ｂ９５−８を添加することによりＥＢＶを感染させ、形質転換した。
【０１１６】
次いで、このＥＢＶ形質転換ヒトＢ細胞を、１Ｕ／ｍＬのＩＬ−６を添加しつつ、常法に従って限界希釈法により、クローニングした。そして、クローニングされたＥＢＶ形質転換ヒトＢ細胞から、常法に従ってＥＬＩＳＡ法により、破傷風毒素に対する完全ヒト抗体の産生が確認されたヒトＢ細胞を選出した。このようにして、破傷風毒素に対する完全ヒト抗体を産生するＥＢＶ形質転換Ｂ細胞（５−１１Ｆ Ｄ１１）を得た。
【０１１７】
受託番号がＦＥＲＭ Ａ−２０５９０として寄託されている融合ミエローマ細胞と、５−１１Ｆ Ｄ１１と、を各々、ウアバインを含有するＩＭＤＭ改良培地、ＢＳＡ、Ｌ−グルタミン、及び２−メルカプトエタノールを含有するＩＭＤＭ改良培地を用いて、融合当日に２×１０７以上の細胞数を確保した。
【０１１８】
この融合ミエローマ細胞と、完全ヒト抗体を産生するＥＢＶ形質転換ヒトＢ細胞と、を、ＤＭＥＭでよく洗浄し、ＦＥＲＭ Ａ−２０５９０と５−１１Ｆ Ｄ１１との細胞数の比が１：５程度になるように混合し、遠心分離した。遠心後の上清を除去し、沈殿した細胞群を十分にほぐした後、撹拌しながら０．６ｇ／ｍＬのＰＥＧ（分子量４０００）を含む無血清培地１ｍＬを滴下した。次いで、１０ｍＬの無血清培地をゆっくりと加えた後、遠心分離した。再び上清を捨て、沈殿した細胞を、ウアバインを含有するＨＡＴ培地中に懸濁した。この懸濁物をプレートの各ウェルに分注し、７％炭酸ガスの存在下、適宜６―チオグアニン及びウアバインを含有するＨＡＴ培地を補いながら、３７℃で２週間程度培養した。
【０１１９】
このようにして得られた破傷風毒素に対する完全ヒト抗体産生ハイブリドーマの中から、ＥＬＩＳＡ法により抗体産生能が高いもの（１Ｃ１１、２Ｂ５、３Ｃ７、４Ｆ８、３Ｂ７、２Ｇ１１）を選出し、吸光度が比較的高いもの（１Ｃ１１、２Ｇ１１）を細胞増殖能が高いものとして選出した。
【０１２０】
［クローニング工程］
（第１回目クローニング）
１Ｃ１１を、別のプレートに移し、プレートの１ウェルに１個のハイブリドーマが含まれるように希釈して培養する限界希釈法によりクローニングを行った。クローニングされた株の中から、上述と同様の手順で、抗体産生能が高いもの（１Ｄ３、１Ｆ１０、２Ｅ３、２Ｅ７）を選出し、更に、細胞増殖能が高いもの（２Ｅ７）を選出した。同様に、２Ｇ１１から１Ｄ５及び１Ｃ６を選出した。
【０１２１】
（第２回目クローニング）
２Ｅ７を用いて第１回目クローニングと同じ手順でクローニングを行い、クローニングされた株の中から、上述と同様の手順で、抗体産生能が高いもの（１Ｆ５、２Ｄ４、１Ｂ４、１Ｇ７）を選出し、更に、細胞増殖能が高いもの（１Ｂ４、１Ｇ７）を選出し、次のクローニングを施すこととした。
【０１２２】
同様に、１Ｄ５から３Ｃ９、１Ｃ６から１Ｂ６及び２Ｇ１０を、それぞれ破傷風毒素に対する特異的抗体を持続的に産生し、且つ、安定に増殖するハイブリドーマとして得た。
【０１２３】
（第３回目クローニング）
１Ｂ４、１Ｇ７を用いて第１回目クローニングと同じ手順でクローニングを行い、破傷風毒素に対する特異的抗体を持続的に産生し、且つ、安定に増殖する６株のハイブリドーマ（１Ｃ４、１Ｆ８、２Ｄ３、２Ｆ１１、１Ｂ３、２Ｄ２）を得た。
【０１２４】
なお、以上説明した各細胞株の関係は、図４に示す通りである。
【０１２５】
［選抜工程］
選出したハイブリドーマの中から、定量的ＰＣＲ法を用いて、ＥＢＶゲノムが除去された完全ヒト抗体産生ハイブリドーマを選抜した。具体的には、これらの６株各々を、１０ｍｌのＨＹ培地に接種し、３７℃で３日間培養して得られたハイブリドーマ（細胞数５×１０６）から「ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ ｍｉｎｉ Ｋｉｔ」（キアゲン社製）を用いて精製したＤＮＡを鋳型とし、ＥＢＶゲノム内のＢＡＬＦ５領域を増幅可能なプライマー（配列表の配列番号３及び４記載のプライマー）を用いて、「ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ（登録商標） ７０００」（アプライドバイオシステムズ社製）等によるＲｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲを行った。また、プローブとして「ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ（登録商標） Ｐｒｏｂｅ ＰＣＲ Ｋｉｔ」（キアゲン社製）を使用し、内部標準としてヒトグリセルアルデヒド―３―リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）及びマウスβ―アクチンを用いた。その結果、前述した９株はいずれもＥＢＶゲノムの単位細胞あたりのコピー数が０又は０に限りなく近く、ＥＢＶゲノムが除去されていることが分かった（図５参照）。
【０１２６】
［完全ヒト抗体の調製］
選抜された９株を、各々、５００ｍｌのＨＹ培地に接種し、スピナーフラスコ内、３７℃で培養した（大量培養）。この培養上清から、常法に従って、プロテインＡカラムクロマトグラフィーにより各々の抗体を精製することにより、破傷風毒素に対する完全ヒト抗体を得た。
【０１２７】
［アイソタイプ及びサブタイプの決定］
この完全ヒト抗体のアイソタイプはサンドウィッチＥＬＩＳＡにて決定し、コーティング緩衝液で５０００倍希釈したヤギ抗ヒト抗体（ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、重鎖、及び軽鎖）（０３０１−０２３１，Ｃａｐｐｅｌ社製）をＥＩＡプレート（ｃｏｓｔｅｒ社製）に各ウェル５０μｌで加え４℃にて一晩コーティングした。破傷風菌毒素特異的抗体の内訳は抗原特異的ＥＬＩＳＡを利用し、破傷風トキソイドを０．５μｇ／ｍｌにコーティング緩衝液で希釈しＥＩＡプレートに各ウェル５０μｌで加え４℃にて一晩コーティングした。その後、コーティング液を除き、２５％ブロックエース添加ＰＢＳ（−）を各ウェルに１００μｌずつ加え４℃にて一晩ブロッキングした。「ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ」（登録商標）１５０μｌで２回洗浄後に一次反応としてハイブリドーマあるいは不死化Ｂ細胞集団の１０倍希釈培養液を５０μｌで加え室温にて１時間静置し、その後４回洗浄した。
【０１２８】
二次抗体としては、それぞれ以下のものを使用した。
ＩｇＡ；マウス抗ヒトIgA Common Specificity腹水 (BRL, 9458SA)
ＩｇＭ；マウス抗ヒトIgM (Fab) 腹水 (BRL, 9480SA)
ＩｇＧ１；ビオチン化マウス抗ヒトIgG1 (クローン: HP6069) (ICN, 63472)
ＩｇＧ２；ビオチン化マウス抗ヒトIgG2 (クローン: HP6002) (ICN, 63473)
ＩｇＧ３；ビオチン化マウス抗ヒトIgG3 (クローン: HP6047) (ICN, 63474)
ＩｇＧ４；ビオチン化マウス抗ヒトIgG4 (クローン: HP6025) (ICN, 63475)
κ鎖；マウス抗ヒト軽鎖-κ腹水 (BRL, 9470SA)
λ鎖；マウス抗ヒト軽鎖-λ 腹水 (BRL, 9490SA)
【０１２９】
二次抗体がマウス腹水である場合は、二次反応として５０００倍希釈した上記抗体を５０μｌ／ウェルで加え室温で１時間静置した。４回洗浄し、三次反応として５０００倍希釈のＡＬＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ＋ＩｇＭ（ＡＭＩ３７０５，Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ社製）を５０μｌ／ウェルで加え室温で１時間静置した。その後４回洗浄し、終濃度１ｍｇ／ｍｌのｐＮＰＰを１００μｌずつ加え発色させた。二次抗体がビオチン化抗体である場合は、二次反応として１０００倍希釈した上記抗体を５０μｌ／ウェルで加え室温で１時間静置した。４回洗浄し、三次反応として５０００倍希釈のＡＬＰ標識アビジン（９５４２ＳＡ， Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ社製）を５０μｌ／ウェルで加え室温で１時間静置した。その後、４回洗浄し、基質ｐＮＰＰを１００μｌずつ加え発色させた。
【０１３０】
陽性対照として、一次反応は同上、二次反応は「ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ」、三次反応抗体として５０００倍希釈したＡＬＰ標識ヤギ抗ヒトＩｇＡ、ＩｇＭ，ＩｇＧ＋Ｌ（ＡＨＩ１７０５，ＢＩＯＳＯＵＲＣＥ社製）及び５０００倍希釈したＡＬＰ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ（４６００，ＴＡＧＯ社製）を使用した。また、各反応系において一次反応を培地で行ったものを陰性対照とした。
【０１３１】
その結果、図４に示されるように、１Ｃ４、１Ｆ８、２Ｄ３、２Ｆ１１、１Ｂ３、及び２Ｄ２の６株は、ＩｇＧ１を産生する細胞株群ＴＴ１に属する一方、３Ｃ９、１Ｂ６、及び２Ｇ１０の３株は、ＩｇＧ４を産生する細胞株群ＴＴ２に属することが分かった。
【０１３２】
〔ＥＢＶゲノムの除去についての評価〕
（定性的ＰＣＲ法）
１Ｃ４、１Ｆ８、２Ｄ３、２Ｆ１１、１Ｂ３、２Ｄ２、３Ｃ９、１Ｂ６、２Ｇ１０及びその作製過程で得られたハイブリドーマ各々について、前述した手順と同じ手順の定性的ＰＣＲ法により、ＥＢＶゲノムの存否を確認した。その結果は、図１０の通りであった。
【０１３３】
図１０から、１Ｃ１１及び２Ｅ３を除き、ＥＢＶゲノムが、少なくとも検出限界以下にまで、除去されていることが分かった。
【０１３４】
（定量的ＰＣＲ法）
１Ｃ４、１Ｆ８、２Ｄ３、２Ｆ１１、１Ｂ３、２Ｄ２、３Ｃ９、１Ｂ６、２Ｇ１０及びその作製過程で得られたハイブリドーマ各々について、前述した手順と同じ手順の定性的ＰＣＲ法により、ＥＢＶゲノムの存否を確認した。その結果は、図５の通りであった。
【０１３５】
図５から、１Ｃ１１、２Ｅ３、１Ｆ８、２Ｇ１１、３Ｂ７を除き、単位細胞当たりのＥＢＶゲノムコピー数が、０もしくは０とほぼ近似できる程度にまで、除去されていることが分かった。
【０１３６】
〔完全ヒト抗体についての評価〕
完全ヒト抗体の破傷風毒素に対する中和能に関し、マウスを用いたｉｎ ｖｉｖｏ試験法で評価を行った。試験の手順は、抗血清等の国家検定等で利用される試験法に則り、Ｌ＋／１００レベルで試験を行った。破傷風毒素５００μｌ及び精製抗体溶液５００μｌを混合し、室温で３０分間静置した。得られた抗体抗原複合体を、４週齢のｄｄＹマウス雌（三協ラボサービス社より入手）の左大腿部皮下に、１匹あたり４００μｌ投与した。抗体としては、２Ｄ３から精製したもの（ＴＴ１のみ）、１Ｂ６から精製したもの（ＴＴ２のみ）、これらを等量ずつ混合したもの（ＴＴ１＋ＴＴ２）の３種を採用した。
【０１３７】
マウス１匹あたり投与される毒素量は一律４００ＬＤ５０（ＬＤ５０とは、母集団の半分が死亡する５０％致死量である）とし、マウス１匹あたり投与される抗体溶液を、抗体量が５００μｇ及び１２５μｇとなるように希釈した。検体数は、一群あたり５匹とした。
【０１３８】
その後２４時間おきに記録を採取することで、投与後のマウスの生存率の経時的変化を調べた。図１０（ａ）は抗体量５００μｇのとき、（ｂ）は抗体量１２５μｇのときの結果をそれぞれ示す。
【０１３９】
図１０に示されるように、ＴＴ１群から精製したもの（ＩｇＧ１）のみ、ＴＴ２群から精製したもの（ＩｇＧ４）のみの投与では、マウス生存率の改善の程度は不充分であった。これに対して、複数のサブタイプ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ４）を併用した場合には、マウス生存率が長期間に亘って高く維持された。この結果は、ＥＢＶ形質転換ヒトＢ細胞が産生する抗体のサブタイプの２種以上からなるＥＢＶゲノム陰性抗体を有効量投与することで、疾患を充分に治療又は予防できることを強く示唆するものである。
【０１４０】
また、この結果を異なる側面から見れば、細胞群ＴＴ２から精製した抗体（ＩｇＧ４）は、他のサブタイプであり細胞群ＴＴ１から精製した抗体（ＴＴ１）の効用を増強できることになる。
【０１４１】
＜ＤＮＡのクローニング＞
〔完全ヒト抗体産生ハイブリドーマに由来するハイブリドーマの使用〕
完全ヒト抗体産生ハイブリドーマに由来する２Ｄ３及び１Ｂ６を用い、抗体の重鎖及び軽鎖をコードする塩基配列を有するＤＮＡのクローニングを行った。まず、ハイブリドーマから「ＱｕｉｃｋＰｒｅｐ ｍｉｃｒｏ ｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ」（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いてｍＲＮＡを抽出し、このｍＲＮＡを鋳型にして、「Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ 」（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いてｃＤＮＡを調製した。実際の調製法は、添付説明書の記載に従った。
【０１４２】
クローニング及びポリペプチド発現は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社の「ＧＡＴＥＷＡＹ」（登録商標）システムを利用した。まず、調製した完全長ｃＤＮＡをｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯベクターに挿入し、クローニングした。重鎖をコードする塩基配列を有するＤＮＡのクローニングは、「Ｐｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ」（Ｔａｋａｒａ社製）を使用し、９４℃にて１分静置した後、９４℃にて１５秒、５６℃にて９０秒、６８℃にて９０秒のサイクルを２５回繰り返し、最後に６８℃にて５分の伸長反応を行った。プライマーとしては、分泌シグナルの違いにより５’末端側に５種類、３’末端側に共通で１種類の計５種類の組合せを準備した。各プライマーの配列は、以下に示す通りとした。
【０１４３】
【表１】
【０１４４】
λ鎖及びκ鎖の伸長は、「ＫＯＤプラスＤＮＡポリメラーゼ」（Ｔｏｙｏｂｏ社製）を使用し、９４℃にて１分静置した後、９４℃にて１５秒、５６℃にて３０秒、６８℃にて４５秒のサイクルを３５回繰り返し、最後に６８℃にて５分の伸長反応を行った。プライマーとしては、分泌シグナルの違いにより５’末端側にκ鎖について２種類、λ鎖について３種類、３’末端側にそれぞれ１種類準備した。プライマーの組合せとしては、κ鎖で２種類、λ鎖で３種類を準備した。各プライマーの配列は、以下に示す通りとした。
【０１４５】
【表２】
【０１４６】
クローニングした抗体遺伝子のＤＮＡの塩基配列について、Ｍ１３フォワードプライマー（５’−Ｇ ＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧ ３’）及びＭ１３リバースプライマー（５’−ＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡ Ｃ−３’）を用い、「ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１００ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ」（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）により決定した。この結果、２Ｄ３（ＩｇＧ１）の軽鎖の塩基配列は配列番号３、重鎖の塩基配列は配列番号４の通り、また、１Ｂ６（ＩｇＧ４）の軽鎖の塩基配列は配列番号１、重鎖の塩基配列は配列番号２の通りであることが分かった。
【０１４７】
ＴＴ１群である２Ｄ３に由来するＤＮＡは、重鎖５’−４（センス）プライマー及びラムダ５’−３（センス）プライマーの組合せ、ＴＴ２群である１Ｂ６に由来するＤＮＡは、重鎖５’−５（センス）プライマー及びカッパ５’−１（センス）の組合せ、をそれぞれ使用した場合にのみ増幅が確認された。また、決定した塩基配列に基づき、Ｋａｂａｔデータベースを使用して可変領域のアミノ酸配列を解析した。これにより、２Ｄ３に由来する抗体と、１Ｂ６に由来するＤＮＡとでは、抗原への結合に重要な相補性決定領域（ＣＤ１、ＣＤ２、ＣＤ３）が大きく異なることが確認された。この結果は、前述のタンパク質レベルで行った試験の結果と一致するものである。
【０１４８】
〔完全ヒト抗体産生ハイブリドーマの使用〕
次に、完全ヒト抗体産生ハイブリドーマ１Ｃ１１及び２Ｇ１１を用いても、ＤＮＡをクローニングできるか否かを確認する試験を行った。まず、クローン１Ｃ１１及び２Ｇ１１に関して１０６細胞から１０細胞まで段階的に希釈した細胞懸濁液からｍＲＮＡを調製し、このｍＲＮＡからｃＤＮＡを逆転写した。このｃＤＮＡを鋳型としたところ、前述したプライマーの組合せにおいてのみ、ＤＮＡの増幅が確認され、完全ヒト抗体産生ハイブリドーマを用いてもＤＮＡをクローニングできることが分かった。また、最小１０細胞から調製されるｃＤＮＡの量であっても、充分量にまで増幅でき、クローニングできることが分かった（図８（ａ）参照）。
【０１４９】
更に、１Ｃ１１及び２Ｇ１１の単クローン１〜３を用いて、同様の手順でＤＮＡのクローニングを試みた。この結果を図８（ｂ）に示す。１Ｃ１１の単クローン２の重鎖ＤＮＡのように、ｍＲＮＡの発現量の低下によると考えられる低増幅効率のクローンも存在したが、単クローンからでも容易にＤＮＡをクローニングできることが明らかになった。
【０１５０】
〔親和性〕
ハイブリドーマ２Ｄ３及び１Ｂ６が産生する天然完全ヒト抗体（細胞群ＴＴ１又はＴＴ２から精製）、及び同様のアミノ酸配列を有する合成ポリペプチドの、破傷風毒素（ＴＴ）及び不活化トキソイド（Ｔｔｄ）に対する親和性の評価を行った。破傷風毒素としては国立感染症研究所より入手した「Ｔ１４０３−Ｋ」を使用し、この毒素を０．５％ホルマリンで処理した毒素を不活化破傷風毒素として使用した。
【０１５１】
破傷風毒素及び不活化破傷風毒素をコーティング緩衝液にて０．５μｇ／ｍｌに希釈してコーティング液を調製した。このコーティング液をＥＩＡプレートに各ウェル５０μｌで加え、４℃で一晩コーティングを行った。コーティング液を除去し、０．５％（ｗ／ｖ）ゼラチン添加ＰＢＳ（−）を、各ウェルに１００μｌずつ加え、４℃で一晩ブロッキングを行った。「ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ」で２回洗浄した後、一次反応として、「ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ」で抗体又はポリペプチドを１μｇ／ｍｌから段階的に１０倍希釈した希釈液を５０μｌで加え、室温で１時間静置した。「ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ」で４回洗浄し、５０００倍希釈したＡＬＰ標識ヤギ抗ヒト抗体（ＡＨＩ１７０５，Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ社製）を加え、更に１時間静置した。４回洗浄した後、基質ｐＮＰＰを１００μｌずつ加えて発色させ、ＥＬＩＳＡリーダにより吸光度を測定した。この結果を図９に示す。なお、測定は３点で行い、その測定値を平均値±標準偏差で表示する。
【０１５２】
図９（ａ）に示されるように、細胞群ＴＴ１及びＴＴ２から精製した抗体は、破傷風毒素及び不活化トキソイドに対する親和性に優れることが分かった。一方、破傷風毒素に対する親和性は、細胞群ＴＴ１から精製した抗体において非常に高い一方、ＴＴ２から精製した抗体において低いことも分かった。また、図９（ｂ）に示されるように、合成ポリペプチドは、天然抗体と同様の親和性を有することが分かった。
【０１５３】
以上より、細胞群ＴＴ２から精製した抗体（ＩｇＧ４）は、他のサブタイプであり細胞群ＴＴ１から精製した抗体（ＴＴ１）の効用を増強できることが確認された。
【図面の簡単な説明】
【０１５４】
【図１】本発明に係るＤＮＡの作製に使用される完全ヒト抗体産生ハイブリドーマの作製手順のフローチャート。
【図２】本発明で用いられる融合ミエローマ細胞の調整手順のフローチャート。
【図３】本発明で用いられる完全ヒト抗体を産生するＥＢＶ形質転換ヒトＢ細胞の調整手順のフローチャート。
【図４】本発明の実施例で得た各細胞株の関係を示す図。
【図５】本発明の実施例における定量的ＰＣＲ法による解析の結果を示す図。
【図６】本発明の実施例における完全ヒト抗体をマウスに投与したときの、マウス生存率の経時的変化を示すグラフ。
【図７】本発明の実施例における完全ヒト抗体の可変領域アミノ酸配列を示す図。
【図８】本発明の実施例におけるＤＮＡクローニングの結果を示す図。
【図９】本発明の実施例における完全ヒト抗体又はポリペプチドの、破傷風毒素に対する親和性を示すグラフ。
【図１０】本発明の実施例における定性的ＰＣＲ法による解析結果を示す電気泳動図。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬組成物、ＤＮＡ、ベクター、形質転換体、ポリペプチド、及びクローニング方法に関し、より詳しくは、ＥＢＶウイルスが除去された抗体を用いる製薬技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
マウス等の実験動物種の抗体の一部をヒト抗体に置き換えた、キメラ抗体やヒト型化抗体が作製容易な抗体として、実用化されている。しかし、キメラ抗体やヒト型化抗体は、その一部にヒト以外の動物種の抗体が混在するため、ヒト免疫系において抗原として認識される。よって、キメラ抗体やヒト型化抗体を使用した医薬品は、重複投与できない等の欠点を有する。
【０００３】
従って、医薬品に使用する抗体としては、重複投与可能な点、更に、抗原に対する親和性が高いという点から、ヒト以外の動物種の抗体が混在しない抗体である完全ヒト抗体が好ましい。
【０００４】
従来からの完全ヒト抗体の作製方法としては、ＥＢＶ−ハイブリドーマ法が挙げられる。この方法によれば、たとえ目的の抗原が未知の場合にも、抗原決定基を有するポリペプチドの合成等を行う必要がないので、迅速に、目的の完全ヒト抗体産生ハイブリドーマを作製できる（例えば、非特許文献１参照）。従って、完全ヒト抗体を、迅速且つ容易に作製できる。
【０００５】
しかし、ＥＢＶ−ハイブリドーマ法では、ヒトＢ細胞として、ＥＢＶにより形質転換されたものを使用するから、作製された完全ヒト抗体産生ハイブリドーマにＥＢＶゲノムが残存する。ＥＢＶは、欧米では白血病、アジアでは上皮性癌（例えば、上咽頭癌）の原因の一つと考えられている。このため、抗体を製剤化する際には、安全上の観点から、ＥＢＶゲノムを除去する必要がある。
【０００６】
このような問題に対して、特許文献１は、ヒトミエローマ細胞及びマウスミエローマ細胞を細胞融合して得られたヘテロハイブリドーマに、ヒトＢ細胞が更に細胞融合され、ＥＢＶゲノム陰性であることを指標に選抜されて得られた融合ミエローマ細胞を用いる抗体作製方法を開示している。
【特許文献１】特開２００７−１４１号公報
【非特許文献１】Ｅ．Ｔｒａｇｇｉａｉら、「Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ」、２００４年発行、１０、ｐ．８７１〜８７５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかし、特許文献１に示される方法では、作製される抗体の、疾患の治療又は予防に対する効果が不充分である場合があった。
【０００８】
そこで、本発明は、ＥＢＶゲノムが除去され且つ疾患を充分に治療又は予防できる完全ヒト抗体の作製を可能にするＤＮＡ、ベクター、形質転換体、及びポリペプチドを提供することを第一の目的とする。
【０００９】
また、本発明は、ＥＢＶゲノムが除去され且つ疾患を充分に治療又は予防できる完全ヒト抗体で構成された医薬組成物を提供することを第二の目的とする。
【００１０】
更に、本発明は、ＥＢＶゲノムが除去され且つ疾患を充分に治療又は予防できる完全ヒト抗体の作製を可能にするＤＮＡのクローニング方法を提供することを第三の目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、前述した完全ヒト化抗体の複数のサブタイプを併用することで、疾病の治療又は予防の効果を飛躍的に向上できることを見出し、本発明を完成するに至った。具体的には、本発明は以下のようなものを提供する。
【００１２】
（１） 以下の（ａ）から（ｄ）のいずれかのＤＮＡ。
（ａ）ヒトミエローマ細胞及びマウスミエローマ細胞を細胞融合して得られたヘテロハイブリドーマに、ヒトＢ細胞が更に細胞融合され、ＥＢＶゲノム陰性であることを指標に選抜されて得られた融合ミエローマ細胞と、ある抗原に対する抗体を産生するＥＢＶ形質転換ヒトＢ細胞と、を細胞融合して得られる完全ヒト抗体産生ハイブリドーマに由来するＥＢＶゲノム陰性ハイブリドーマから得られ、前記抗体の重鎖又は軽鎖をコードする塩基配列を有するＤＮＡ
（ｂ）塩基配列（ａ）とストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる塩基配列を有するＤＮＡ
（ｃ）前記抗体の重鎖又は軽鎖のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ
（ｄ）塩基配列（ａ）と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなるＤＮＡ
【００１３】
（２） 前記抗体は、ＩｇＧ４サブタイプである（１）記載のＤＮＡ。
【００１４】
（３） 塩基配列（ａ）は、配列番号１又は２の塩基配列である（２）記載のＤＮＡ。
【００１５】
（４） （１）から（３）いずれか記載のＤＮＡを含むベクター。
【００１６】
（５） （４）記載のベクターが導入された形質転換体。
【００１７】
（６） 複数のサブクラスの前記完全ヒト抗体を発現する（５）記載の形質転換体。
【００１８】
（７） 前記複数のサブクラスは、前記完全ヒト抗体産生ハイブリドーマが産生する抗体群に含まれるものである（６）記載の形質転換体。
【００１９】
（８） （１）から（３）いずれか記載のＤＮＡによりコードされるポリペプチド。
【００２０】
（９） ヒトミエローマ細胞及びマウスミエローマ細胞を細胞融合して得られたヘテロハイブリドーマに、ヒトＢ細胞が更に細胞融合され、ＥＢＶゲノム陰性であることを指標に選抜されて得られた融合ミエローマ細胞と、ある抗原に対する抗体を産生するＥＢＶ形質転換ヒトＢ細胞と、を細胞融合して得られる完全ヒト抗体産生ハイブリドーマが産生する完全ヒト抗体のサブタイプの２種以上からなるＥＢＶゲノム陰性抗体を有効成分とする医薬組成物。
【００２１】
（１０） 前記ＥＢＶゲノム陰性抗体は、ヒトミエローマ細胞及びマウスミエローマ細胞を細胞融合して得られたヘテロハイブリドーマに、ヒトＢ細胞が更に細胞融合され、ＥＢＶゲノム陰性であることを指標に選抜されて得られた融合ミエローマ細胞と、ある抗原に対する抗体を産生するＥＢＶ形質転換ヒトＢ細胞と、を細胞融合して得られる完全ヒト抗体産生ハイブリドーマに由来するＥＢＶゲノム陰性細胞株から得られる抗体である（９）記載の医薬組成物。
【００２２】
（１１） 前記ＥＢＶゲノム陰性抗体は、（８）記載のポリペプチドである（９）記載の医薬組成物。
【００２３】
（１２） 前記ＥＢＶゲノム陰性抗体は、少なくともＩｇＧ４サブタイプを含む（９）から（１１）いずれか記載の医薬組成物。
【００２４】
（１３） 破傷風の治療に用いられ、
前記ＩｇＧ４サブタイプは、配列番号１の塩基配列と、配列番号２の塩基配列と、によってコードされる（１２）記載の医薬組成物。
【００２５】
（１４） 配列番号３の塩基配列と、配列番号３の塩基配列と、によってコードされるＩｇＧ１サブタイプを更に含む（１３）記載の医薬組成物。
【００２６】
（１５） ヒトミエローマ細胞及びマウスミエローマ細胞を細胞融合して得られたヘテロハイブリドーマに、ヒトＢ細胞が更に細胞融合され、ＥＢＶゲノム陰性であることを指標に選抜されて得られた融合ミエローマ細胞と、ある抗原に対する抗体を産生するＥＢＶ形質転換ヒトＢ細胞と、を細胞融合して得られる完全ヒト抗体産生ハイブリドーマが産生する完全ヒト抗体のＩｇＧ４サブタイプを有効成分とし、他のサブタイプの効用を増強する抗体増強剤。
【００２７】
（１６） 前記効用は破傷風の治療におけるものであり、
前記ＩｇＧ４サブタイプは、配列番号１の塩基配列と、配列番号２の塩基配列と、によってコードされる（１５）記載の抗体増強剤。
【００２８】
（１７） 抗体の重鎖又は軽鎖をコードする塩基配列を有するＤＮＡのクローニング方法であって、
ヒトミエローマ細胞及びマウスミエローマ細胞を細胞融合して得られたヘテロハイブリドーマに、ヒトＢ細胞が更に細胞融合され、ＥＢＶゲノム陰性であることを指標に選抜されて得られた融合ミエローマ細胞と、ある抗原に対する抗体を産生するＥＢＶ形質転換ヒトＢ細胞と、を細胞融合して得られる完全ヒト抗体産生ハイブリドーマ、又はこの完全ヒト抗体産生ハイブリドーマに由来するハイブリドーマから抽出されるｍＲＮＡを鋳型として、前記抗体の重鎖又は軽鎖をコードする塩基配列を有するＤＮＡを特異的に増幅する手順を含むクローニング方法。
【００２９】
（１８） 前記完全ヒト抗体産生ハイブリドーマからｍＲＮＡを抽出する（１７）記載のクローニング方法。
【発明の効果】
【００３０】
本発明によれば、ＥＢＶゲノムが除去され且つ疾患を充分に治療又は予防できる完全ヒト抗体の作製を可能にするＤＮＡ、ベクター、形質転換体、及びポリペプチド、並びにＥＢＶゲノムが除去され且つ疾患を充分に治療又は予防できる完全ヒト抗体で構成された医薬組成物、前述したＤＮＡのクローニング方法を提供できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３１】
以下、本発明の一実施形態について説明する。
【００３２】
＜ＤＮＡ＞
本発明のＤＮＡは、以下の（ａ）から（ｄ）のいずれかのＤＮＡである。
（ａ）ヒトミエローマ細胞及びマウスミエローマ細胞を細胞融合して得られたヘテロハイブリドーマに、ヒトＢ細胞が更に細胞融合され、ＥＢＶゲノム陰性であることを指標に選抜されて得られた融合ミエローマ細胞と、ある抗原に対する抗体を産生するＥＢＶ形質転換ヒトＢ細胞と、を細胞融合して得られる完全ヒト抗体産生ハイブリドーマに由来するＥＢＶゲノム陰性ハイブリドーマから得られ、前記抗体の重鎖又は軽鎖をコードする塩基配列を有するＤＮＡ
（ｂ）塩基配列（ａ）とストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる塩基配列を有するＤＮＡ
（ｃ）前記抗体の重鎖又は軽鎖のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ
（ｄ）塩基配列（ａ）と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなるＤＮＡ
【００３３】
本発明における「ＤＮＡ」は、センス鎖又はアンチセンス鎖（例えば、プローブとして使用できる）のいずれでもよく、その形状は一本鎖と二本鎖のいずれでもよい。また、ゲノムＤＮＡであっても、ｃＤＮＡであっても、合成されたＤＮＡであってもよい。
【００３４】
塩基配列（ａ）は、ＥＢＶ形質転換ヒトＢ細胞が産生する抗体の重鎖又は軽鎖をコードする。ＥＢＶ形質転換ヒトＢ細胞は複数のサブタイプの抗体を産生するのが通常であるところ、塩基配列（ａ）がコードするのは、いずれかのサブタイプの抗体の重鎖又は軽鎖である。
【００３５】
本発明のＤＮＡの最も好ましい態様は塩基配列（ａ）を有するＤＮＡであるが、本発明のＤＮＡには、更に、塩基配列（ａ）を有するＤＮＡの種々の変異体やホモログが含まれる。塩基配列（ａ）の詳細については後述するが、他の抗体の効用を増強できる点で、ＩｇＧ４サブタイプの重鎖又は軽鎖をコードする配列であることが好ましい。ＩｇＧ４サブタイプの軽鎖をコードする塩基配列としては配列番号１の塩基配列、ＩｇＧ４サブタイプの重鎖をコードする塩基配列としては配列番号２の塩基配列が挙げられ、これら塩基配列によってコードされるポリペプチドは破傷風の治療に有用である。
【００３６】
塩基配列（ａ）を有するＤＮＡの変異体やホモログには、例えば、塩基配列（ａ）とストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる塩基配列を有するＤＮＡが含まれる。ここで、「ストリンジェントな条件」としては、例えば、通常のハイブリダイゼーション緩衝液中、４０〜７０℃（好ましくは、６０〜６５℃）で反応を行い、塩濃度１５〜３００ｍＭ（好ましくは、１５〜６０ｍＭ）の洗浄液中で洗浄を行う条件が挙げられる。
【００３７】
また、抗体の重鎖又は軽鎖のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡも含まれる。ここで「１もしくは複数」とは、通常、５０アミノ酸以内であり、好ましくは３０アミノ酸以内であり、更に好ましくは１０アミノ酸以内（例えば、５アミノ酸以内、３アミノ酸以内、１アミノ酸）である。筋特異的チロシンキナーゼを活性化する能力を維持する場合、変異するアミノ酸残基においては、アミノ酸側鎖の性質が保存されている別のアミノ酸に変異されることが望ましい。例えばアミノ酸側鎖の性質としては、疎水性アミノ酸（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｗ、Ｙ、Ｖ）、親水性アミノ酸（Ｒ、Ｄ、Ｎ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、Ｔ）、脂肪族側鎖を有するアミノ酸（Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ）、水酸基含有側鎖を有するアミノ酸（Ｓ、Ｔ、Ｙ）、硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸（Ｃ、Ｍ）、カルボン酸及びアミド含有側鎖を有するアミノ酸（Ｄ、Ｎ、Ｅ、Ｑ）、塩基含有側鎖を有するアミノ離（Ｒ、Ｋ、Ｈ）、芳香族含有側鎖を有するアミノ酸（Ｈ、Ｆ、Ｙ、Ｗ）が挙げられる（括弧内はいずれもアミノ酸の一文字標記を表す）。
【００３８】
あるアミノ酸配列に対する１又は複数個のアミノ酸残基の欠失、付加及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有するタンパク質がその生物学的活性を維持することはすでに知られている（Ｍａｒｋ，Ｄ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８４）８１，５６６２−５６６６、Ｚｏｌｌｅｒ，Ｍ．Ｊ．＆ Ｓｍｉｔｈ，Ｍ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９８２）１０，６４８７−６５００、Ｗａｎｇ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２４，１４３１−１４３３、Ｄａｌｂａｄｉｅ−ＭｃＦａｒｌａｎｄ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８２）７９，６４０９−６４１３）。
【００３９】
更に、塩基配列（ａ）を有するＤＮＡの変異体やホモログには、塩基配列（ａ）と高い相同性を有する塩基配列からなるＤＮＡが含まれる。このようなＤＮＡは、好ましくは、塩基配列（ａ）と９０％以上、更に好ましくは９５％以上（９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上）の相同性を有する。アミノ酸配列や塩基配列の相同性は、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ ＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３−５８７７，１９９３）によって決定することができる。このアルゴリズムに基づいて、ＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸと呼ばれるプログラムが開発されている（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． ２１５：４０３−４１０，１９９０）。ＢＬＡＳＴに基づいてＢＬＡＳＴＮによって塩基配列を解析する場合には、パラメータは例えばｓｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２とする。また、ＢＬＡＳＴに基づいてＢＬＡＳＴＸによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメータは例えばｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３とする。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメータを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．）。
【００４０】
本発明のＤＮＡを取得する方法としては、特に限定されないが、ｍＲＮＡから逆転写することでｃＤＮＡを得る方法（例えば、ＲＴ−ＰＣＲ法）、ゲノムＤＮＡから調製する方法、化学合成により合成する方法、ゲノムＤＮＡライブラリーやｃＤＮＡライブラリーから単離する方法等の公知の方法（例えば、特開平１１−２９５９９号公報参照）が挙げられる。
【００４１】
〔完全ヒト抗体産生ハイブリドーマ〕
塩基配列（ａ）の決定には、完全ヒト抗体産生ハイブリドーマ、又はこの完全ヒト抗体産生ハイブリドーマに由来するハイブリドーマが用いられる。これらのハイブリドーマの作製方法の手順について、図１を参照しながら説明する。
【００４２】
本発明の完全ヒト抗体産生ハイブリドーマの作製方法は、融合ミエローマ細胞と、完全ヒト抗体を産生するＥＢＶ形質転換ヒトＢ細胞と、を細胞融合して完全ヒト抗体産生ハイブリドーマを得る融合工程（Ｓ１００）と、この完全ヒト抗体産生ハイブリドーマを所定回数クローニングするクローニング工程（Ｓ２００）と、前記クローニングされた完全抗体産生ハイブリドーマからＥＢＶゲノム陰性細胞株を選抜する選抜工程（Ｓ３００）と、を含む。
【００４３】
次に、図２及び図３を参照して、Ｓ１００で用いられる、融合ミエローマ細胞と、完全ヒト抗体を産生するＥＢＶ形質転換ヒトＢ細胞と、の調製手順について説明する。
【００４４】
＜融合工程＞
［ヘテロハイブリドーマの作製］
まず、ヒトミエローマ細胞と、マウスミエローマ細胞と、を細胞融合し、ヘテロハイブリドーマを作製する（Ｓ１０）。
【００４５】
Ｓ１０においては、ヒトミエローマ細胞、マウスミエローマ細胞としては、自己抗体産生能のない細胞を用いる。更に、ヒトミエローマ細胞、マウスミエローマ細胞のいずれか一方として、例えば、ヒポキサンチン・グアニン・ホスホリボシルトランスフェラーゼ（以下、「ＨＧＰＲＴ」と表記する。）を欠損した６―チオグアニン耐性株を用いることができる。
【００４６】
６―チオグアニンを含有する培地において、生存できることを利用して、後述するＳ１４において、目的のヘテロハイブリドーマを選別できるからである。また、ＨＧＰＲＴは、サルベージ回路経由のヌクレオチド合成に必須な酵素であるため、ＨＧＰＲＴ欠損株はヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジンを含む培地（ＨＡＴ培地）で生存できないことを利用して、後述するＳ１５０において、完全ヒト抗体産生ハイブリドーマを選出できるからである。
【００４７】
このようなヒトミエローマ細胞としては、特に限定されないが、通常、例えば、Ｕ−２６６株を挙げることができる。また、このようなマウスミエローマ細胞としては、特に限定されないが、通常、例えばＰ３Ｘ６３．Ａｇ８．６５３株を挙げることができる。
【００４８】
これらの細胞株は各々、適当な培地、例えばイスコフ改変ダルベッコ培地（以下、「ＩＭＤＭ培地」と表記する。）に、グルタミン、２−メルカプトエタノール、及びウシ胎児血清を加えた培地（ＩＭＤＭ改良培地）に６―チオグアニンを加えた培地、ＩＭＤＭ改良培地を用いて、継代培養する。そして、後述するＳ１２を行う当日に２×１０７以上の細胞数を確保しておく。
【００４９】
このヒトミエローマ細胞と、マウスミエローマ細胞と、を細胞融合する（Ｓ１２）。細胞融合の方法としては、特に限定されないが、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）法、センダイウイルスを用いる方法、電気融合法等の常法を挙げることができ、細胞毒性が比較的少なく融合操作も簡単な点からは、ＰＥＧ法が好ましい。
【００５０】
例えば、ＰＥＧ法によれば以下の手順となる（Ｓ１２’［図示はしていない］）。
即ち、ヒトミエローマ細胞と、マウスミエローマ細胞と、を、無血清培地（例えば、ＤＭＥＭ）又はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）でよく洗浄した後、ヒトミエローマ細胞とマウスミエローマ細胞との細胞数の比が１：４〜１：５程度になるように混合し、遠心分離する。遠心後の上清を除去し、沈殿した細胞群を十分にほぐした後、撹拌しながら０．６ｇ／ｍＬのＰＥＧ（分子量１０００〜４０００）を含む無血清培地１ｍＬを滴下する。
【００５１】
次いで、１０ｍＬの無血清培地をゆっくりと加えた後、遠心分離する。再び上清を捨て、沈殿した細胞を、ＩＭＤＭ培地に６―チオグアニンを加えた培地中に懸濁する。この懸濁物を培養用プレート（以下「プレート」という）の各ウェルに分注し、７％炭酸ガスの存在下、適宜６―チオグアニンを含有するＩＭＤＭ培地を補いながら、３７℃で２週間程度培養する。
【００５２】
次に、Ｓ１０を経て得られるヘテロハイブリドーマをクローニングする（Ｓ１４）。
クローニングの方法としては、プレートの１ウェルに１個のハイブリドーマが含まれるように希釈して培養する限界希釈法、軟寒天培地中で培養しコロニーを回収する軟寒天法、マイクロマニュピレーターによって１個ずつの細胞を取り出し培養する方法、セルソーターによって１個の細胞を分離する方法等を挙げることができる。このうち、操作が簡便な点から、限界希釈法がよく用いられる。
【００５３】
そして、抗体を産生していないことを確認できたものを選出する（Ｓ１６）。これにより、Ｓ１００において用いることができるヘテロハイブリドーマを、選択的に得ることができる。
【００５４】
選出の方法としては、特に限定されないが、ＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、蛍光抗体法、受身血球凝縮反応法等の公知の方法を挙げることができる。このうち、検出感度、迅速性、正確性等の点からは、ＥＬＩＳＡ法が好ましい。このＥＬＩＳＡ法は、一般的な競合法、サンドイッチ法等の手法に従って行うことができ、液相系でも、固相系でも行うことができる。
【００５５】
［融合ミエローマ細胞の作製］
このヘテロハイブリドーマと、ヒトＢ細胞と、を細胞融合し、融合ミエローマ細胞を作製する（Ｓ２０）。
【００５６】
ここで用いるヒトＢ細胞は、形質細胞又はその前駆細胞（リンパ球）であり、個体のいずれの部位から得てもよく、脾細胞、リンパ節、骨髄、扁桃、末梢血、又はこれらを適宜組み合わせたもの等から得ることができる。このうち、採取が容易な点から、末梢血が最も一般的に用いられる。ここで用いるヒトＢ細胞は、自己抗体産生能のない細胞である。
【００５７】
ヘテロハイブリドーマは、例えば、６―チオグアニンを含有するＩＭＤＭ改良培地等を用いて継代培養し、後述するＳ２２を行う当日に２×１０７以上の細胞数を確保しておく。
【００５８】
ヘテロハイブリドーマがＨＧＰＲＴを欠損した６―チオグアニン耐性株であった場合、６―チオグアニンを含有するＩＭＤＭ改良培地を用いることで、目的の融合ミエローマ細胞を選別できる。即ち、融合しなかったヒトＢ細胞、及びヒトＢ細胞同士の融合細胞は、培地に６―チオグアニンが含まれているため、生存できないからである。
【００５９】
このヘテロハイブリドーマと、ヒトＢ細胞と、を細胞融合する（Ｓ２２）。細胞融合は、例えばＰＥＧ法によれば、以下の手順となる（Ｓ２２’［図示はしていない］）。
このヘテロハイブリドーマと、ヒトＢ細胞と、を、無血清培地（例えば、ＤＭＥＭ）又はＰＢＳでよく洗浄し、ヘテロハイブリドーマとヒトＢ細胞との細胞数の比が１：４〜１：５程度になるように混合し、遠心分離する。遠心後の上清を除去し、沈殿した細胞群を十分にほぐした後、撹拌しながら０．６ｇ／ｍＬのＰＥＧ（分子量１０００〜４０００）を含む無血清培地１ｍＬを滴下する。
【００６０】
次いで、１０ｍＬの無血清培地をゆっくりと加えた後、遠心分離する。再び上清を捨て、沈殿した細胞を、適量のヒトインターロイキン−６（ヒトＩＬ−６）を更に含むウアバインを含有するＩＭＤＭ改良培地中に懸濁する。この懸濁物をプレートの各ウェルに分注し、７％炭酸ガスの存在下、適宜ウアバインを含有するＩＭＤＭ改良培地を補いながら、３７℃で２週間程度培養する。
【００６１】
Ｓ２２を経て得られる融合ミエローマ細胞をクローニングする（Ｓ２４）。Ｓ２４は、Ｓ１４と同様の手順で行うことができる。
【００６２】
そして、抗体を産生していないことを確認できたものを選出する（Ｓ２６）。これにより、Ｓ１００において用いることができる融合ミエローマ細胞を、選択的に得ることができる。Ｓ２６は、Ｓ１６と同様の手順で行うことができる。
【００６３】
このようにして、Ｓ１００において用いられる融合ミエローマ細胞を得ることができる。この融合ミエローマ細胞の一例として、受託番号がＦＥＲＭ Ａ−２０５９０である融合ミエローマ細胞が寄託されている。
【００６４】
［完全ヒト抗体を産生するＥＢＶ形質転換ヒトＢ細胞の調製］
完全ヒト抗体を産生するＥＢＶ形質転換ヒトＢ細胞を調製する（Ｓ３０）。
【００６５】
完全ヒト抗体を産生するヒトＢ細胞は、ワクチン接種を受けた又は疾患から回復したボランティア（ヒト）の形質細胞又はその前駆細胞（リンパ球）である。完全ヒト抗体を産生するヒトＢ細胞は、ボランティアのいずれの部位から得てもよく、一般には脾細胞、リンパ節、骨髄、扁桃、末梢血、又はこれらを適宜組み合わせたもの等から得る（Ｓ３２）ことができる。なお、採取が容易な点から、末梢血から完全ヒト抗体を産生するヒトＢ細胞を得ることが、最も一般的である。
【００６６】
このヒトＢ細胞にＥＢＶを感染させることで、形質転換を行う（Ｓ３４）。
形質転換の方法としては、特に限定されないが、例えば以下の手順を挙げることができる。即ち、放射線照射したフィーダー細胞上で、ヒトＢ細胞の培養を行う。このヒトＢ細胞に、ＥＢＶ陽性マーモセット細胞株Ｂ９５−８の培養上清中のウイルスを添加し、更にヒトＢ細胞を培養することで、ＥＢＶに感染させる。
【００６７】
次いで、ＥＢＶ形質転換ヒトＢ細胞をクローニングする（Ｓ３６）。Ｓ３６は、図２のＳ１４と同様の手順で行うことができるが、形質転換されたＢ細胞の増殖を促進するため、ヒトＩＬ−６等の増殖因子を適量添加しつつ、行うことが好ましい。
【００６８】
更に、Ｓ３６を経て得られるクローニングされたＥＢＶ形質転換ヒトＢ細胞から、完全ヒト抗体を産生するヒトＢ細胞を選出する（Ｓ３８）。これにより、完全ヒト抗体を産生するＥＢＶ形質転換ヒトＢ細胞を、選択的に得ることができる。Ｓ３８は、図２のＳ１６と同様の手順で行うことができる。
【００６９】
Ｓ３８は、例えばＥＬＩＳＡ法によれば、以下のような手順により行うことができる（Ｓ３８’［図示はしていない］）。
即ち、まず、抗原をＥＬＩＳＡ法用９６穴プレート等の固相表面に吸着させ、抗原が吸着していない固相表面を抗原と無関係なタンパク質、例えばウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）により覆う。次いで、この表面を洗浄した後、一次抗体として、段階希釈した試料に接触させ、上記抗原に試料中の完全ヒト抗体を結合させる。更に、二次抗体として、酵素標識されたヒト抗体に対する抗体を加えて、ヒト抗体に結合させる。洗浄した後、この酵素の基質を加え、基質分解に基づく発色による吸光度の変化等を測定することにより、抗体価を算出する。
【００７０】
＜完全ヒト抗体産生ハイブリドーマへの細胞融合＞
次に、Ｓ２０を経て得られる融合ミエローマ細胞と、Ｓ３０を経て得られる完全ヒト抗体を産生するＥＢＶ形質転換ヒトＢ細胞と、を細胞融合して完全ヒト抗体産生ハイブリドーマを得る（Ｓ１００）。
【００７１】
融合ミエローマ細胞は、例えば、６―チオグアニン及びウアバインを含有するＩＭＤＭ改良培地を用いて継代培養する。完全ヒト抗体を産生するＥＢＶ形質転換ヒトＢ細胞は、例えば、ＩＬ−６、２−メルカプトエタノール、ウシインスリン、ヒトトランスフェリンを含有するＩＭＤＭ改良培地を用いて継代培養する。いずれの細胞も、後述するＳ１１０を行う当日に２×１０７以上の細胞数を確保しておく。
【００７２】
上記融合ミエローマ細胞がＨＧＰＲＴを欠損した６―チオグアニン耐性及びウアバイン耐性株であった場合、６―チオグアニン及びウアバインを含有するＨＡＴ培地を用いることで、目的のハイブリドーマを選別できる。即ち、融合しなかった完全ヒト抗体を産生するＥＢＶ形質転換ヒトＢ細胞、及び完全ヒト抗体を産生するＥＢＶ形質転換ヒトＢ細胞同士の融合細胞は、培地に６―チオグアニン及びウアバインが含有されているため、生存できない。一方、融合しなかった融合ミエローマ細胞、及び融合ミエローマ細胞同士の融合細胞は、培地にＨＡＴが含まれているため、生存できないからである。
【００７３】
この融合ミエローマ細胞と、完全ヒト抗体を産生するＥＢＶ形質転換ヒトＢ細胞と、を細胞融合する（Ｓ１１０）。Ｓ１１０は、図２のＳ１２と同様の手順で行うことができる。
【００７４】
細胞融合は、例えばＰＥＧ法によれば、以下の手順（Ｓ１１０’［図示はしていない］）となる。
即ち、融合ミエローマ細胞と、完全ヒト抗体を産生するＥＢＶ形質転換ヒトＢ細胞と、を、無血清培地（例えば、ＤＭＥＭ）又はＰＢＳでよく洗浄し、融合ミエローマ細胞と完全ヒト抗体を産生するＥＢＶ形質転換ヒトＢ細胞との細胞数の比が１：４〜１：５程度になるように混合し、遠心分離する。遠心後の上清を除去し、沈殿した細胞群を十分にほぐした後、撹拌しながら０．６ｇ／ｍＬのＰＥＧ（分子量１０００〜４０００）を含む無血清培地１ｍＬを滴下する。
【００７５】
次いで、１０ｍＬの無血清培地をゆっくりと加えた後、遠心分離する。再び上清を捨て、沈殿した細胞を、適量のヒトＩＬ−６を更に含み、６―チオグアニン及びウアバインを含有するＨＡＴ培地中に懸濁する。この懸濁物をプレートの各ウェルに分注し、５％炭酸ガスの存在下、適宜６―チオグアニン及びウアバインを含有するＨＡＴ培地を補いながら、３７℃で２週間程度培養する。
【００７６】
次に、Ｓ１１０を経て得られる完全ヒト抗体産生ハイブリドーマをクローニングする（Ｓ１３０）。Ｓ１３０は、図２のＳ１４と同様の手順で行うことができる。
【００７７】
次に、Ｓ１３０を経て得られる完全ヒト抗体産生ハイブリドーマの中から、抗体産生能及び細胞増殖能が高いものを選出する（Ｓ１５０）。
選出の方法としては、特に限定されないが、ＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、蛍光抗体法、受身血球凝縮反応法等の公知の方法により抗体産生能が高いものを選出できる。
【００７８】
＜クローニング工程＞
次に、Ｓ１５０を経て選出された完全ヒト抗体産生ハイブリドーマに、後述するＳ２１０及びＳ２３０を所定回数施す（Ｓ２００）。
【００７９】
Ｓ１５０を経て選出された完全ヒト抗体産生ハイブリドーマを、別のプレートに移しクローニングを行う（Ｓ２１０［図示はしていない］）。Ｓ２１０は、図２のＳ１４と同様の手順で行うことができる。
【００８０】
Ｓ２１０を経て得られる株（サブクローン）の中から、Ｓ１５０と同様の手順で、抗体産生能及び細胞増殖能が高いことを指標に、次にクローニングを施す株を選出する（Ｓ２３０［図示はしていない］）。
【００８１】
このようなＳ２１０及びＳ２３０を所定回数行うことにより、ＥＢＶゲノムが除去された完全ヒト抗体産生ハイブリドーマを得ることができる。
【００８２】
＜選抜工程＞
得られた完全ヒト抗体産生ハイブリドーマの中から、ＥＢＶゲノムが除去された完全ヒト抗体産生ハイブリドーマを選抜する（Ｓ３００）。選抜の方法としては、特に限定されないが、例えば、定性的ＰＣＲ法、定量的ＰＣＲ法を挙げることができ、これらを併せて行うこともできる。
【００８３】
（定性的ＰＣＲ法）
定性的ＰＣＲ法によれば、完全ヒト抗体産生ハイブリドーマ内におけるＥＢＶゲノムの存否を確認する（Ｓ３１０［図示はしていない］）ことができる。
【００８４】
ＰＣＲにおいて鋳型となるＤＮＡは、培養された完全ヒト抗体産生ハイブリドーマから、常法に従って、「ＱＩＡ ａｍｐ ＤＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ」（キアゲン社製）等を用いて精製できる（Ｓ３１１［図示はしていない］）。
【００８５】
増幅させて検出する対象としては、特に限定されないが、検出感度を高めるという点で、例えば、ＢａｍＨＩ Ｗ領域等の繰り返し配列を有する領域が好ましい。例えば、ＢａｍＨＩ Ｗ領域は、ＥＢＶゲノム中、約１２回の繰り返し配列となっており、他の領域に比べて、より多量に増幅することができるからである。
【００８６】
定性的ＰＣＲ法においてＢａｍＨＩ Ｗ領域を増幅させるためのプライマーとしては、特に限定されないが、例えば、配列表の配列番号１及び２記載のプライマーを挙げることができる。
【００８７】
（定量的ＰＣＲ法）
定量的ＰＣＲ法によれば、ハイブリドーマ内におけるＥＢＶゲノムの存否及びコピー数を確認する（Ｓ３２０［図示はしていない］）ことができる。Ｓ３１１と同様の手順で、ＰＣＲにおいて鋳型となるＤＮＡを精製できる（Ｓ３２１［図示はしてない］）。増幅させて検出する対象としては、特に限定されないが、例えば、ＢＡＬＦ５（ＤＮＡポリメラーゼの遺伝子領域）等の構造遺伝子領域が挙げられる。
【００８８】
定量的ＰＣＲ法においてＢＡＬＦ５領域を増幅させるためのプライマーとしては、特に限定されないが、例えば、配列表の配列番号３及び４記載のプライマーを挙げることができ、プローブとしては配列表の配列番号５記載のプローブを挙げることができる。
【００８９】
また、単位細胞当たりのコピー数を定量化するための内部標準としては、特に限定されないが、ヒトグリセルアルデヒド―３―リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）やマウスβ―アクチン等の構造遺伝子領域を挙げることができる。
【００９０】
なお、定量的ＰＣＲを簡便に行うため、「ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ（登録商標） ７０００」（アプライドバイオシステムズ社製）等によるＲｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ法を用いることもできる。
【００９１】
〔クローニング方法〕
このようにして作製される、ＥＢＶゲノムが除去された完全ヒト抗体産生ハイブリドーマ又はこの完全ヒト抗体産生ハイブリドーマに由来するハイブリドーマは、通常の培地で継代培養することができ、また液体窒素中で長期間保存できる。このため、これら完全ヒト抗体産生ハイブリドーマ又はその由来ハイブリドーマを用いることで、塩基配列（ａ）を有するＤＮＡのクローニング、及び塩基配列（ａ）の決定を行うことができる。ただし、由来ハイブリドーマの作製は長時間を要することから、迅速にクローニングできる点で、完全ヒト抗体産生ハイブリドーマを用いることが好ましい。
【００９２】
その手順を次に示す。まず、完全ヒト抗体産生ハイブリドーマ又はその由来ハイブリドーマからｍＲＮＡを抽出し、逆転写することでｃＤＮＡを調製する。このｃＤＮＡを鋳型とし、重鎖又は軽鎖をコードする塩基配列を挟む既知の保存領域に特異的に結合するプライマーを用いることで、ＰＣＲ法にて重鎖又は軽鎖の塩基配列を増幅することで、塩基配列（ａ）を有するＤＮＡが得られ、単離してＤＮＡをクローニングする。また、公知の手順で、塩基配列（ａ）を決定すれば、この決定された配列に基づいて、塩基配列（ｂ）〜（ｄ）を得ることができる。ここで使用できるプライマーは、既知の保存領域に特異的に結合できる限りにおいて、後述の実施例で使用されるものに限定されない。
【００９３】
＜ベクター＞
本発明のベクターは、前述したＤＮＡを含むものであり、適当なベクターに上述のＤＮＡを挿入することにより作製できる。
【００９４】
「適当なベクター」とは、原核生物及び／又は真核生物の各種の宿主内で複製保持又は自己増殖できるものであればよく、使用の目的に応じて適宜選択できるものである。例えば、ＤＮＡを大量に取得したい場合には高コピーベクターを選択でき、ポリペプチドを取得したい場合には発現ベクターを選択できる。その具体例としては、特に限定されず、例えば、特開平１１−２９５９９号公報に記載された公知のベクターが挙げられる。
【００９５】
＜形質転換体＞
本発明の形質転換体は、前述したベクターを宿主に導入することで作製できる。ここで、形質転換体は、後述する医薬組成物を１種の形質転換体を用いて調製できる点で、複数のサブクラスの完全ヒト抗体を発現することが好ましい。また、複数のサブクラスは、治療効果の向上を保証できる点で、完全ヒト抗体産生ハイブリドーマが産生する抗体群に含まれるものであることが好ましい。なお、このような形質転換体は、複数のベクターを導入することで作製できる。
【００９６】
このような宿主は、本発明のベクターに適合し形質転換され得るものであればよく、その具体例としては、特に限定されないが、細菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞等の、公知の天然細胞もしくは人工的に樹立された細胞（特開平１１−２９５９９号公報参照）が挙げられる。しかし、発現ベクターを導入しヒトへの使用を目指す限りにおいて、安全性の観点から、動物細胞、特にＣＯＳ細胞が好ましく使用される。
【００９７】
ベクターの導入方法は、ベクターや宿主の種類等に応じて適宜選択できるものである。その具体例としては、特に限定されないが、プロトプラスト法、コンピテント法等の公知の方法（例えば、特開平１１−２９５９９号公報参照）が挙げられる。
【００９８】
＜ポリペプチド＞
本発明のポリペプチドは、前述したＤＮＡによりコードされるものであり、例えば、前述のＤＮＡを含む発現ベクターが導入された形質転換体を使用することで作製できる。まず、形質転換体を適宜の条件で培養し、ＤＮＡがコードするタンパク質（ポリペプチド）を合成させる。そして、合成されたタンパク質を形質転換体又は培養液から回収することにより、本発明のポリペプチドが得られる。
【００９９】
形質転換体の培養は、ポリペプチドが大量に且つ容易に取得できるように、形質転換体の種類等に応じて、公知の栄養培地から適宜選択し、温度、栄養培地のｐＨ、培養時間等を適宜調整して行うことができる（例えば、特開平１１−２９５９９号公報参照）。
【０１００】
ポリペプチドの単離方法及び精製方法としては、特に限定されず、溶解度を利用する方法、分子量の差を利用する方法、荷電を利用する方法等の公知の方法（例えば、特開平１１−２９５９９号公報参照）が挙げられる。
【０１０１】
＜医薬組成物・抗体増強剤＞
本発明の医薬組成物は、前述した完全ヒト抗体産生ハイブリドーマが産生する完全ヒト抗体であって、前述の融合ミエローマ細胞が産生する抗体のサブタイプの２種以上からなるＥＢＶゲノム陰性抗体を有効成分とする。
【０１０２】
ＥＢＶゲノム陰性抗体は、抗体の効用を増強できる点で、ＩｇＧ４サブタイプを少なくとも含むことが好ましい。特に、破傷風毒素に対するＩｇＧ４サブタイプの軽鎖は配列番号１の塩基配列によってコードされ、重鎖は配列番号２の塩基配列によってコードされる。また、これら塩基配列によってコードされるＩｇＧ４サブタイプは、配列番号３の塩基配列によってコードされるＩｇＧ１軽鎖と、配列番号３の塩基配列によってコードされるＩｇＧ１重鎖によって構成されるＩｇＧ１サブタイプの効用を特に増強する。このように、本発明で使用される完全ヒト抗体産生ハイブリドーマが産生する完全ヒト抗体のＩｇＧ４サブタイプは、他のサブタイプ（例えば、ＩｇＧ１）の効用を増強する抗体増強剤として作用する。
【０１０３】
前述の融合ミエローマ細胞が産生する抗体のサブタイプは、抗原抗体反応等を用いて、公知の方法で決定できる。医薬組成物は、決定されたすべてのサブタイプを含有することが好ましいが、製造コスト等を考慮して所望の治療効果が得られる最小の組合せを含有すればよい。なお、各サブタイプの含有量や含有比率は、適宜設定されてよい。
【０１０４】
ＥＢＶゲノム陰性抗体は、例えば、Ｓ３００を経て選抜された、ＥＢＶゲノムが除去された完全ヒト抗体産生ハイブリドーマによって産生されてよい。産生の手順は、特に限定されないが、例えば、以下の通りである。まず、Ｓ３００を経て選抜された、ＥＢＶゲノムが除去された完全ヒト抗体産生ハイブリドーマを、ＨＡＴを除いたＨＹ培地又はＩＭＤＭ改良培地に接種し、培養する。次いで、培養後の培養上清を回収する。大量培養をするときは、大型培養瓶を用いた回転培養、スピナー培養、あるいはホローファイバーシステムを用いた培養を行うことができる。比較的高純度の目的抗体を培養上清として得ることができる点で、大量培養は有利である。
【０１０５】
また、ＥＢＶゲノム陰性抗体は、増殖速度が早い形質転換体を用いて迅速且つ大量に製造できる点で、前述したポリペプチドであることが好ましい。
【０１０６】
抗体産生ハイブリドーマの培養上清及びマウス等の腹水は、そのまま粗製抗体液として用いることができる。また、これらは常法に従って、硫酸アンミモニウム分画、塩析、ゲル濾過法、イオン交換クロマトグラフィー、プロテインＡカラムクロマトグラフィー等のアフィニテイクロマトグラフィー等により精製して、精製抗体とすることもできる。
【０１０７】
本発明の医薬組成物は、経口あるいは非経口（例えば、注射による筋肉への直接投与）で投与できる。投与量は、患者の年齢、性別、体重、症状、治療効果、投与方法、処理時間等により異なるため、適宜選択すべきものである。
【０１０８】
「有効成分」とは、神経筋伝達障害の治療用医薬品もしくは予防用医薬品として有効である程度に含まれる成分という意味であって、他の任意成分を含むことを除外するものではない。
【０１０９】
他の任意成分としては、特に限定されないが、賦形剤、希釈剤、増粘剤、崩壊剤、安定剤、保存剤、緩衝材、乳化剤、芳香剤、着色剤、甘味剤、粘調剤、溶解補助剤等の担体等が挙げられる。これらの任意成分によれば、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、注射剤、液剤、カプセル剤、トロー剤、エリキシル剤等の様々な形態の医薬組成物を容易に調整できる。
【０１１０】
＜その他＞
［記録媒体］
前述したＤＮＡの塩基配列、及び、ポリペプチドのアミノ酸配列は、コンピュータ読み取り可能記録媒体に保存されてよい。この記録媒体によれば、保存されている本発明のポリペプチドのアミノ酸配列、及び、ＤＮＡの塩基配列を、コンピュータを用いてデータベース化することができる。このため、このアミノ酸配列や塩基配列を配列情報としても活用できる。
【０１１１】
記録媒体としては、コンピュータ読み取り可能であれば、特に限定されず、フレキシブルディスク、ハードディスク、磁気テープ等の磁気媒体、ＣＤ−ＲＯＭ、ＭＯ、ＣＤ−Ｒ、ＣＤ−ＲＷ、ＤＶＤ−Ｒ、ＤＶＤ−ＲＡＭ等の光ディスク、半導体メモリ等が挙げられる。
【０１１２】
［網羅的解析用ツール］
本発明のＤＮＡ及びポリペプチド、並びに、これらの部分断片は、基盤上に、担体として結合させた状態で、使用することもできる。本発明のポリペプチドやＤＮＡ以外に、更に、他のポリペプチドやＤＮＡを結合させた基盤は、本発明のポリペプチドやＤＮＡを含めた網羅的な解析に使用できる。
【０１１３】
基盤としては、特に限定されないが、ナイロン膜、ポリプロピレン膜等の樹脂基板、ニトロセルロース膜、ガラスプレート、シリコンプレート等が挙げられる。また、ハイブリダイゼーションの検出を、例えば蛍光物質といった非放射性同位体物質を用いて行う場合、基盤として、蛍光物質を含まないガラスプレート、シリコンプレート等を好ましく使用できる。
【実施例】
【０１１４】
次に、本発明を実施例及び比較例を挙げて説明する。具体的には、破傷風毒素に対する抗体の作製を行った。
【０１１５】
＜ヒト完全抗体の作製＞
破傷風毒素のワクチン接種をしたボランティア（ヒト）から末梢血を採取し、破傷風毒素に対する抗体を産生するヒトＢ細胞を得た。このヒトＢ細胞に、Ｂ９５−８を添加することによりＥＢＶを感染させ、形質転換した。
【０１１６】
次いで、このＥＢＶ形質転換ヒトＢ細胞を、１Ｕ／ｍＬのＩＬ−６を添加しつつ、常法に従って限界希釈法により、クローニングした。そして、クローニングされたＥＢＶ形質転換ヒトＢ細胞から、常法に従ってＥＬＩＳＡ法により、破傷風毒素に対する完全ヒト抗体の産生が確認されたヒトＢ細胞を選出した。このようにして、破傷風毒素に対する完全ヒト抗体を産生するＥＢＶ形質転換Ｂ細胞（５−１１Ｆ Ｄ１１）を得た。
【０１１７】
受託番号がＦＥＲＭ Ａ−２０５９０として寄託されている融合ミエローマ細胞と、５−１１Ｆ Ｄ１１と、を各々、ウアバインを含有するＩＭＤＭ改良培地、ＢＳＡ、Ｌ−グルタミン、及び２−メルカプトエタノールを含有するＩＭＤＭ改良培地を用いて、融合当日に２×１０７以上の細胞数を確保した。
【０１１８】
この融合ミエローマ細胞と、完全ヒト抗体を産生するＥＢＶ形質転換ヒトＢ細胞と、を、ＤＭＥＭでよく洗浄し、ＦＥＲＭ Ａ−２０５９０と５−１１Ｆ Ｄ１１との細胞数の比が１：５程度になるように混合し、遠心分離した。遠心後の上清を除去し、沈殿した細胞群を十分にほぐした後、撹拌しながら０．６ｇ／ｍＬのＰＥＧ（分子量４０００）を含む無血清培地１ｍＬを滴下した。次いで、１０ｍＬの無血清培地をゆっくりと加えた後、遠心分離した。再び上清を捨て、沈殿した細胞を、ウアバインを含有するＨＡＴ培地中に懸濁した。この懸濁物をプレートの各ウェルに分注し、７％炭酸ガスの存在下、適宜６―チオグアニン及びウアバインを含有するＨＡＴ培地を補いながら、３７℃で２週間程度培養した。
【０１１９】
このようにして得られた破傷風毒素に対する完全ヒト抗体産生ハイブリドーマの中から、ＥＬＩＳＡ法により抗体産生能が高いもの（１Ｃ１１、２Ｂ５、３Ｃ７、４Ｆ８、３Ｂ７、２Ｇ１１）を選出し、吸光度が比較的高いもの（１Ｃ１１、２Ｇ１１）を細胞増殖能が高いものとして選出した。
【０１２０】
［クローニング工程］
（第１回目クローニング）
１Ｃ１１を、別のプレートに移し、プレートの１ウェルに１個のハイブリドーマが含まれるように希釈して培養する限界希釈法によりクローニングを行った。クローニングされた株の中から、上述と同様の手順で、抗体産生能が高いもの（１Ｄ３、１Ｆ１０、２Ｅ３、２Ｅ７）を選出し、更に、細胞増殖能が高いもの（２Ｅ７）を選出した。同様に、２Ｇ１１から１Ｄ５及び１Ｃ６を選出した。
【０１２１】
（第２回目クローニング）
２Ｅ７を用いて第１回目クローニングと同じ手順でクローニングを行い、クローニングされた株の中から、上述と同様の手順で、抗体産生能が高いもの（１Ｆ５、２Ｄ４、１Ｂ４、１Ｇ７）を選出し、更に、細胞増殖能が高いもの（１Ｂ４、１Ｇ７）を選出し、次のクローニングを施すこととした。
【０１２２】
同様に、１Ｄ５から３Ｃ９、１Ｃ６から１Ｂ６及び２Ｇ１０を、それぞれ破傷風毒素に対する特異的抗体を持続的に産生し、且つ、安定に増殖するハイブリドーマとして得た。
【０１２３】
（第３回目クローニング）
１Ｂ４、１Ｇ７を用いて第１回目クローニングと同じ手順でクローニングを行い、破傷風毒素に対する特異的抗体を持続的に産生し、且つ、安定に増殖する６株のハイブリドーマ（１Ｃ４、１Ｆ８、２Ｄ３、２Ｆ１１、１Ｂ３、２Ｄ２）を得た。
【０１２４】
なお、以上説明した各細胞株の関係は、図４に示す通りである。
【０１２５】
［選抜工程］
選出したハイブリドーマの中から、定量的ＰＣＲ法を用いて、ＥＢＶゲノムが除去された完全ヒト抗体産生ハイブリドーマを選抜した。具体的には、これらの６株各々を、１０ｍｌのＨＹ培地に接種し、３７℃で３日間培養して得られたハイブリドーマ（細胞数５×１０６）から「ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ ｍｉｎｉ Ｋｉｔ」（キアゲン社製）を用いて精製したＤＮＡを鋳型とし、ＥＢＶゲノム内のＢＡＬＦ５領域を増幅可能なプライマー（配列表の配列番号３及び４記載のプライマー）を用いて、「ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ（登録商標） ７０００」（アプライドバイオシステムズ社製）等によるＲｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲを行った。また、プローブとして「ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ（登録商標） Ｐｒｏｂｅ ＰＣＲ Ｋｉｔ」（キアゲン社製）を使用し、内部標準としてヒトグリセルアルデヒド―３―リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）及びマウスβ―アクチンを用いた。その結果、前述した９株はいずれもＥＢＶゲノムの単位細胞あたりのコピー数が０又は０に限りなく近く、ＥＢＶゲノムが除去されていることが分かった（図５参照）。
【０１２６】
［完全ヒト抗体の調製］
選抜された９株を、各々、５００ｍｌのＨＹ培地に接種し、スピナーフラスコ内、３７℃で培養した（大量培養）。この培養上清から、常法に従って、プロテインＡカラムクロマトグラフィーにより各々の抗体を精製することにより、破傷風毒素に対する完全ヒト抗体を得た。
【０１２７】
［アイソタイプ及びサブタイプの決定］
この完全ヒト抗体のアイソタイプはサンドウィッチＥＬＩＳＡにて決定し、コーティング緩衝液で５０００倍希釈したヤギ抗ヒト抗体（ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、重鎖、及び軽鎖）（０３０１−０２３１，Ｃａｐｐｅｌ社製）をＥＩＡプレート（ｃｏｓｔｅｒ社製）に各ウェル５０μｌで加え４℃にて一晩コーティングした。破傷風菌毒素特異的抗体の内訳は抗原特異的ＥＬＩＳＡを利用し、破傷風トキソイドを０．５μｇ／ｍｌにコーティング緩衝液で希釈しＥＩＡプレートに各ウェル５０μｌで加え４℃にて一晩コーティングした。その後、コーティング液を除き、２５％ブロックエース添加ＰＢＳ（−）を各ウェルに１００μｌずつ加え４℃にて一晩ブロッキングした。「ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ」（登録商標）１５０μｌで２回洗浄後に一次反応としてハイブリドーマあるいは不死化Ｂ細胞集団の１０倍希釈培養液を５０μｌで加え室温にて１時間静置し、その後４回洗浄した。
【０１２８】
二次抗体としては、それぞれ以下のものを使用した。
ＩｇＡ；マウス抗ヒトIgA Common Specificity腹水 (BRL, 9458SA)
ＩｇＭ；マウス抗ヒトIgM (Fab) 腹水 (BRL, 9480SA)
ＩｇＧ１；ビオチン化マウス抗ヒトIgG1 (クローン: HP6069) (ICN, 63472)
ＩｇＧ２；ビオチン化マウス抗ヒトIgG2 (クローン: HP6002) (ICN, 63473)
ＩｇＧ３；ビオチン化マウス抗ヒトIgG3 (クローン: HP6047) (ICN, 63474)
ＩｇＧ４；ビオチン化マウス抗ヒトIgG4 (クローン: HP6025) (ICN, 63475)
κ鎖；マウス抗ヒト軽鎖-κ腹水 (BRL, 9470SA)
λ鎖；マウス抗ヒト軽鎖-λ 腹水 (BRL, 9490SA)
【０１２９】
二次抗体がマウス腹水である場合は、二次反応として５０００倍希釈した上記抗体を５０μｌ／ウェルで加え室温で１時間静置した。４回洗浄し、三次反応として５０００倍希釈のＡＬＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ＋ＩｇＭ（ＡＭＩ３７０５，Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ社製）を５０μｌ／ウェルで加え室温で１時間静置した。その後４回洗浄し、終濃度１ｍｇ／ｍｌのｐＮＰＰを１００μｌずつ加え発色させた。二次抗体がビオチン化抗体である場合は、二次反応として１０００倍希釈した上記抗体を５０μｌ／ウェルで加え室温で１時間静置した。４回洗浄し、三次反応として５０００倍希釈のＡＬＰ標識アビジン（９５４２ＳＡ， Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ社製）を５０μｌ／ウェルで加え室温で１時間静置した。その後、４回洗浄し、基質ｐＮＰＰを１００μｌずつ加え発色させた。
【０１３０】
陽性対照として、一次反応は同上、二次反応は「ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ」、三次反応抗体として５０００倍希釈したＡＬＰ標識ヤギ抗ヒトＩｇＡ、ＩｇＭ，ＩｇＧ＋Ｌ（ＡＨＩ１７０５，ＢＩＯＳＯＵＲＣＥ社製）及び５０００倍希釈したＡＬＰ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ（４６００，ＴＡＧＯ社製）を使用した。また、各反応系において一次反応を培地で行ったものを陰性対照とした。
【０１３１】
その結果、図４に示されるように、１Ｃ４、１Ｆ８、２Ｄ３、２Ｆ１１、１Ｂ３、及び２Ｄ２の６株は、ＩｇＧ１を産生する細胞株群ＴＴ１に属する一方、３Ｃ９、１Ｂ６、及び２Ｇ１０の３株は、ＩｇＧ４を産生する細胞株群ＴＴ２に属することが分かった。
【０１３２】
〔ＥＢＶゲノムの除去についての評価〕
（定性的ＰＣＲ法）
１Ｃ４、１Ｆ８、２Ｄ３、２Ｆ１１、１Ｂ３、２Ｄ２、３Ｃ９、１Ｂ６、２Ｇ１０及びその作製過程で得られたハイブリドーマ各々について、前述した手順と同じ手順の定性的ＰＣＲ法により、ＥＢＶゲノムの存否を確認した。その結果は、図１０の通りであった。
【０１３３】
図１０から、１Ｃ１１及び２Ｅ３を除き、ＥＢＶゲノムが、少なくとも検出限界以下にまで、除去されていることが分かった。
【０１３４】
（定量的ＰＣＲ法）
１Ｃ４、１Ｆ８、２Ｄ３、２Ｆ１１、１Ｂ３、２Ｄ２、３Ｃ９、１Ｂ６、２Ｇ１０及びその作製過程で得られたハイブリドーマ各々について、前述した手順と同じ手順の定性的ＰＣＲ法により、ＥＢＶゲノムの存否を確認した。その結果は、図５の通りであった。
【０１３５】
図５から、１Ｃ１１、２Ｅ３、１Ｆ８、２Ｇ１１、３Ｂ７を除き、単位細胞当たりのＥＢＶゲノムコピー数が、０もしくは０とほぼ近似できる程度にまで、除去されていることが分かった。
【０１３６】
〔完全ヒト抗体についての評価〕
完全ヒト抗体の破傷風毒素に対する中和能に関し、マウスを用いたｉｎ ｖｉｖｏ試験法で評価を行った。試験の手順は、抗血清等の国家検定等で利用される試験法に則り、Ｌ＋／１００レベルで試験を行った。破傷風毒素５００μｌ及び精製抗体溶液５００μｌを混合し、室温で３０分間静置した。得られた抗体抗原複合体を、４週齢のｄｄＹマウス雌（三協ラボサービス社より入手）の左大腿部皮下に、１匹あたり４００μｌ投与した。抗体としては、２Ｄ３から精製したもの（ＴＴ１のみ）、１Ｂ６から精製したもの（ＴＴ２のみ）、これらを等量ずつ混合したもの（ＴＴ１＋ＴＴ２）の３種を採用した。
【０１３７】
マウス１匹あたり投与される毒素量は一律４００ＬＤ５０（ＬＤ５０とは、母集団の半分が死亡する５０％致死量である）とし、マウス１匹あたり投与される抗体溶液を、抗体量が５００μｇ及び１２５μｇとなるように希釈した。検体数は、一群あたり５匹とした。
【０１３８】
その後２４時間おきに記録を採取することで、投与後のマウスの生存率の経時的変化を調べた。図１０（ａ）は抗体量５００μｇのとき、（ｂ）は抗体量１２５μｇのときの結果をそれぞれ示す。
【０１３９】
図１０に示されるように、ＴＴ１群から精製したもの（ＩｇＧ１）のみ、ＴＴ２群から精製したもの（ＩｇＧ４）のみの投与では、マウス生存率の改善の程度は不充分であった。これに対して、複数のサブタイプ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ４）を併用した場合には、マウス生存率が長期間に亘って高く維持された。この結果は、ＥＢＶ形質転換ヒトＢ細胞が産生する抗体のサブタイプの２種以上からなるＥＢＶゲノム陰性抗体を有効量投与することで、疾患を充分に治療又は予防できることを強く示唆するものである。
【０１４０】
また、この結果を異なる側面から見れば、細胞群ＴＴ２から精製した抗体（ＩｇＧ４）は、他のサブタイプであり細胞群ＴＴ１から精製した抗体（ＴＴ１）の効用を増強できることになる。
【０１４１】
＜ＤＮＡのクローニング＞
〔完全ヒト抗体産生ハイブリドーマに由来するハイブリドーマの使用〕
完全ヒト抗体産生ハイブリドーマに由来する２Ｄ３及び１Ｂ６を用い、抗体の重鎖及び軽鎖をコードする塩基配列を有するＤＮＡのクローニングを行った。まず、ハイブリドーマから「ＱｕｉｃｋＰｒｅｐ ｍｉｃｒｏ ｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ」（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いてｍＲＮＡを抽出し、このｍＲＮＡを鋳型にして、「Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ 」（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いてｃＤＮＡを調製した。実際の調製法は、添付説明書の記載に従った。
【０１４２】
クローニング及びポリペプチド発現は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社の「ＧＡＴＥＷＡＹ」（登録商標）システムを利用した。まず、調製した完全長ｃＤＮＡをｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯベクターに挿入し、クローニングした。重鎖をコードする塩基配列を有するＤＮＡのクローニングは、「Ｐｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ」（Ｔａｋａｒａ社製）を使用し、９４℃にて１分静置した後、９４℃にて１５秒、５６℃にて９０秒、６８℃にて９０秒のサイクルを２５回繰り返し、最後に６８℃にて５分の伸長反応を行った。プライマーとしては、分泌シグナルの違いにより５’末端側に５種類、３’末端側に共通で１種類の計５種類の組合せを準備した。各プライマーの配列は、以下に示す通りとした。
【０１４３】
【表１】
【０１４４】
λ鎖及びκ鎖の伸長は、「ＫＯＤプラスＤＮＡポリメラーゼ」（Ｔｏｙｏｂｏ社製）を使用し、９４℃にて１分静置した後、９４℃にて１５秒、５６℃にて３０秒、６８℃にて４５秒のサイクルを３５回繰り返し、最後に６８℃にて５分の伸長反応を行った。プライマーとしては、分泌シグナルの違いにより５’末端側にκ鎖について２種類、λ鎖について３種類、３’末端側にそれぞれ１種類準備した。プライマーの組合せとしては、κ鎖で２種類、λ鎖で３種類を準備した。各プライマーの配列は、以下に示す通りとした。
【０１４５】
【表２】
【０１４６】
クローニングした抗体遺伝子のＤＮＡの塩基配列について、Ｍ１３フォワードプライマー（５’−Ｇ ＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧ ３’）及びＭ１３リバースプライマー（５’−ＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡ Ｃ−３’）を用い、「ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１００ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ」（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）により決定した。この結果、２Ｄ３（ＩｇＧ１）の軽鎖の塩基配列は配列番号３、重鎖の塩基配列は配列番号４の通り、また、１Ｂ６（ＩｇＧ４）の軽鎖の塩基配列は配列番号１、重鎖の塩基配列は配列番号２の通りであることが分かった。
【０１４７】
ＴＴ１群である２Ｄ３に由来するＤＮＡは、重鎖５’−４（センス）プライマー及びラムダ５’−３（センス）プライマーの組合せ、ＴＴ２群である１Ｂ６に由来するＤＮＡは、重鎖５’−５（センス）プライマー及びカッパ５’−１（センス）の組合せ、をそれぞれ使用した場合にのみ増幅が確認された。また、決定した塩基配列に基づき、Ｋａｂａｔデータベースを使用して可変領域のアミノ酸配列を解析した。これにより、２Ｄ３に由来する抗体と、１Ｂ６に由来するＤＮＡとでは、抗原への結合に重要な相補性決定領域（ＣＤ１、ＣＤ２、ＣＤ３）が大きく異なることが確認された。この結果は、前述のタンパク質レベルで行った試験の結果と一致するものである。
【０１４８】
〔完全ヒト抗体産生ハイブリドーマの使用〕
次に、完全ヒト抗体産生ハイブリドーマ１Ｃ１１及び２Ｇ１１を用いても、ＤＮＡをクローニングできるか否かを確認する試験を行った。まず、クローン１Ｃ１１及び２Ｇ１１に関して１０６細胞から１０細胞まで段階的に希釈した細胞懸濁液からｍＲＮＡを調製し、このｍＲＮＡからｃＤＮＡを逆転写した。このｃＤＮＡを鋳型としたところ、前述したプライマーの組合せにおいてのみ、ＤＮＡの増幅が確認され、完全ヒト抗体産生ハイブリドーマを用いてもＤＮＡをクローニングできることが分かった。また、最小１０細胞から調製されるｃＤＮＡの量であっても、充分量にまで増幅でき、クローニングできることが分かった（図８（ａ）参照）。
【０１４９】
更に、１Ｃ１１及び２Ｇ１１の単クローン１〜３を用いて、同様の手順でＤＮＡのクローニングを試みた。この結果を図８（ｂ）に示す。１Ｃ１１の単クローン２の重鎖ＤＮＡのように、ｍＲＮＡの発現量の低下によると考えられる低増幅効率のクローンも存在したが、単クローンからでも容易にＤＮＡをクローニングできることが明らかになった。
【０１５０】
〔親和性〕
ハイブリドーマ２Ｄ３及び１Ｂ６が産生する天然完全ヒト抗体（細胞群ＴＴ１又はＴＴ２から精製）、及び同様のアミノ酸配列を有する合成ポリペプチドの、破傷風毒素（ＴＴ）及び不活化トキソイド（Ｔｔｄ）に対する親和性の評価を行った。破傷風毒素としては国立感染症研究所より入手した「Ｔ１４０３−Ｋ」を使用し、この毒素を０．５％ホルマリンで処理した毒素を不活化破傷風毒素として使用した。
【０１５１】
破傷風毒素及び不活化破傷風毒素をコーティング緩衝液にて０．５μｇ／ｍｌに希釈してコーティング液を調製した。このコーティング液をＥＩＡプレートに各ウェル５０μｌで加え、４℃で一晩コーティングを行った。コーティング液を除去し、０．５％（ｗ／ｖ）ゼラチン添加ＰＢＳ（−）を、各ウェルに１００μｌずつ加え、４℃で一晩ブロッキングを行った。「ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ」で２回洗浄した後、一次反応として、「ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ」で抗体又はポリペプチドを１μｇ／ｍｌから段階的に１０倍希釈した希釈液を５０μｌで加え、室温で１時間静置した。「ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ」で４回洗浄し、５０００倍希釈したＡＬＰ標識ヤギ抗ヒト抗体（ＡＨＩ１７０５，Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ社製）を加え、更に１時間静置した。４回洗浄した後、基質ｐＮＰＰを１００μｌずつ加えて発色させ、ＥＬＩＳＡリーダにより吸光度を測定した。この結果を図９に示す。なお、測定は３点で行い、その測定値を平均値±標準偏差で表示する。
【０１５２】
図９（ａ）に示されるように、細胞群ＴＴ１及びＴＴ２から精製した抗体は、破傷風毒素及び不活化トキソイドに対する親和性に優れることが分かった。一方、破傷風毒素に対する親和性は、細胞群ＴＴ１から精製した抗体において非常に高い一方、ＴＴ２から精製した抗体において低いことも分かった。また、図９（ｂ）に示されるように、合成ポリペプチドは、天然抗体と同様の親和性を有することが分かった。
【０１５３】
以上より、細胞群ＴＴ２から精製した抗体（ＩｇＧ４）は、他のサブタイプであり細胞群ＴＴ１から精製した抗体（ＴＴ１）の効用を増強できることが確認された。
【図面の簡単な説明】
【０１５４】
【図１】本発明に係るＤＮＡの作製に使用される完全ヒト抗体産生ハイブリドーマの作製手順のフローチャート。
【図２】本発明で用いられる融合ミエローマ細胞の調整手順のフローチャート。
【図３】本発明で用いられる完全ヒト抗体を産生するＥＢＶ形質転換ヒトＢ細胞の調整手順のフローチャート。
【図４】本発明の実施例で得た各細胞株の関係を示す図。
【図５】本発明の実施例における定量的ＰＣＲ法による解析の結果を示す図。
【図６】本発明の実施例における完全ヒト抗体をマウスに投与したときの、マウス生存率の経時的変化を示すグラフ。
【図７】本発明の実施例における完全ヒト抗体の可変領域アミノ酸配列を示す図。
【図８】本発明の実施例におけるＤＮＡクローニングの結果を示す図。
【図９】本発明の実施例における完全ヒト抗体又はポリペプチドの、破傷風毒素に対する親和性を示すグラフ。
【図１０】本発明の実施例における定性的ＰＣＲ法による解析結果を示す電気泳動図。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）から（ｄ）のいずれかのＤＮＡ。
（ａ）ヒトミエローマ細胞及びマウスミエローマ細胞を細胞融合して得られたヘテロハイブリドーマに、ヒトＢ細胞が更に細胞融合され、ＥＢＶゲノム陰性であることを指標に選抜されて得られた融合ミエローマ細胞と、ある抗原に対する抗体を産生するＥＢＶ形質転換ヒトＢ細胞と、を細胞融合して得られる完全ヒト抗体産生ハイブリドーマ、又はこの完全ヒト抗体産生ハイブリドーマに由来するハイブリドーマから得られ、前記抗体の重鎖又は軽鎖をコードする塩基配列を有するＤＮＡ
（ｂ）塩基配列（ａ）とストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる塩基配列を有するＤＮＡ
（ｃ）前記抗体の重鎖又は軽鎖のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ
（ｄ）塩基配列（ａ）と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなるＤＮＡ
【請求項２】
前記抗体は、ＩｇＧ４サブタイプである請求項１記載のＤＮＡ。
【請求項３】
塩基配列（ａ）は、配列番号１又は２の塩基配列である請求項２記載のＤＮＡ。
【請求項４】
請求項１から３いずれか記載のＤＮＡを含むベクター。
【請求項５】
請求項４記載のベクターが導入された形質転換体。
【請求項６】
複数のサブクラスの前記完全ヒト抗体を発現する請求項５記載の形質転換体。
【請求項７】
前記複数のサブクラスは、前記完全ヒト抗体産生ハイブリドーマが産生する抗体群に含まれるものである請求項６記載の形質転換体。
【請求項８】
請求項１から３いずれか記載のＤＮＡによりコードされるポリペプチド。
【請求項９】
ヒトミエローマ細胞及びマウスミエローマ細胞を細胞融合して得られたヘテロハイブリドーマに、ヒトＢ細胞が更に細胞融合され、ＥＢＶゲノム陰性であることを指標に選抜されて得られた融合ミエローマ細胞と、ある抗原に対する抗体を産生するＥＢＶ形質転換ヒトＢ細胞と、を細胞融合して得られる完全ヒト抗体産生ハイブリドーマが産生する完全ヒト抗体のサブタイプの２種以上からなるＥＢＶゲノム陰性抗体を有効成分とする医薬組成物。
【請求項１０】
前記ＥＢＶゲノム陰性抗体は、ヒトミエローマ細胞及びマウスミエローマ細胞を細胞融合して得られたヘテロハイブリドーマに、ヒトＢ細胞が更に細胞融合され、ＥＢＶゲノム陰性であることを指標に選抜されて得られた融合ミエローマ細胞と、ある抗原に対する抗体を産生するＥＢＶ形質転換ヒトＢ細胞と、を細胞融合して得られる完全ヒト抗体産生ハイブリドーマに由来するＥＢＶゲノム陰性細胞株から得られる抗体である請求項９記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記ＥＢＶゲノム陰性抗体は、請求項８記載のポリペプチドである請求項９記載の医薬組成物。
【請求項１２】
前記ＥＢＶゲノム陰性抗体は、少なくともＩｇＧ４サブタイプを含む請求項９から１１いずれか記載の医薬組成物。
【請求項１３】
破傷風の治療に用いられ、
前記ＩｇＧ４サブタイプは、配列番号１の塩基配列と、配列番号２の塩基配列と、によってコードされる請求項１２記載の医薬組成物。
【請求項１４】
配列番号３の塩基配列と、配列番号３の塩基配列と、によってコードされるＩｇＧ１サブタイプを更に含む請求項１３記載の医薬組成物。
【請求項１５】
ヒトミエローマ細胞及びマウスミエローマ細胞を細胞融合して得られたヘテロハイブリドーマに、ヒトＢ細胞が更に細胞融合され、ＥＢＶゲノム陰性であることを指標に選抜されて得られた融合ミエローマ細胞と、ある抗原に対する抗体を産生するＥＢＶ形質転換ヒトＢ細胞と、を細胞融合して得られる完全ヒト抗体産生ハイブリドーマが産生する完全ヒト抗体のＩｇＧ４サブタイプを有効成分とし、他のサブタイプの効用を増強する抗体増強剤。
【請求項１６】
前記効用は破傷風の治療におけるものであり、
前記ＩｇＧ４サブタイプは、配列番号１の塩基配列と、配列番号２の塩基配列と、によってコードされる請求項１５記載の抗体増強剤。
【請求項１７】
抗体の重鎖又は軽鎖をコードする塩基配列を有するＤＮＡのクローニング方法であって、
ヒトミエローマ細胞及びマウスミエローマ細胞を細胞融合して得られたヘテロハイブリドーマに、ヒトＢ細胞が更に細胞融合され、ＥＢＶゲノム陰性であることを指標に選抜されて得られた融合ミエローマ細胞と、ある抗原に対する抗体を産生するＥＢＶ形質転換ヒトＢ細胞と、を細胞融合して得られる完全ヒト抗体産生ハイブリドーマ、又はこの完全ヒト抗体産生ハイブリドーマに由来するハイブリドーマから抽出されるｍＲＮＡを鋳型として、前記抗体の重鎖又は軽鎖をコードする塩基配列を有するＤＮＡを特異的に増幅する手順を含むクローニング方法。
【請求項１８】
前記完全ヒト抗体産生ハイブリドーマからｍＲＮＡを抽出する請求項１７記載のクローニング方法。
【請求項１】
以下の（ａ）から（ｄ）のいずれかのＤＮＡ。
（ａ）ヒトミエローマ細胞及びマウスミエローマ細胞を細胞融合して得られたヘテロハイブリドーマに、ヒトＢ細胞が更に細胞融合され、ＥＢＶゲノム陰性であることを指標に選抜されて得られた融合ミエローマ細胞と、ある抗原に対する抗体を産生するＥＢＶ形質転換ヒトＢ細胞と、を細胞融合して得られる完全ヒト抗体産生ハイブリドーマ、又はこの完全ヒト抗体産生ハイブリドーマに由来するハイブリドーマから得られ、前記抗体の重鎖又は軽鎖をコードする塩基配列を有するＤＮＡ
（ｂ）塩基配列（ａ）とストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる塩基配列を有するＤＮＡ
（ｃ）前記抗体の重鎖又は軽鎖のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ
（ｄ）塩基配列（ａ）と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなるＤＮＡ
【請求項２】
前記抗体は、ＩｇＧ４サブタイプである請求項１記載のＤＮＡ。
【請求項３】
塩基配列（ａ）は、配列番号１又は２の塩基配列である請求項２記載のＤＮＡ。
【請求項４】
請求項１から３いずれか記載のＤＮＡを含むベクター。
【請求項５】
請求項４記載のベクターが導入された形質転換体。
【請求項６】
複数のサブクラスの前記完全ヒト抗体を発現する請求項５記載の形質転換体。
【請求項７】
前記複数のサブクラスは、前記完全ヒト抗体産生ハイブリドーマが産生する抗体群に含まれるものである請求項６記載の形質転換体。
【請求項８】
請求項１から３いずれか記載のＤＮＡによりコードされるポリペプチド。
【請求項９】
ヒトミエローマ細胞及びマウスミエローマ細胞を細胞融合して得られたヘテロハイブリドーマに、ヒトＢ細胞が更に細胞融合され、ＥＢＶゲノム陰性であることを指標に選抜されて得られた融合ミエローマ細胞と、ある抗原に対する抗体を産生するＥＢＶ形質転換ヒトＢ細胞と、を細胞融合して得られる完全ヒト抗体産生ハイブリドーマが産生する完全ヒト抗体のサブタイプの２種以上からなるＥＢＶゲノム陰性抗体を有効成分とする医薬組成物。
【請求項１０】
前記ＥＢＶゲノム陰性抗体は、ヒトミエローマ細胞及びマウスミエローマ細胞を細胞融合して得られたヘテロハイブリドーマに、ヒトＢ細胞が更に細胞融合され、ＥＢＶゲノム陰性であることを指標に選抜されて得られた融合ミエローマ細胞と、ある抗原に対する抗体を産生するＥＢＶ形質転換ヒトＢ細胞と、を細胞融合して得られる完全ヒト抗体産生ハイブリドーマに由来するＥＢＶゲノム陰性細胞株から得られる抗体である請求項９記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記ＥＢＶゲノム陰性抗体は、請求項８記載のポリペプチドである請求項９記載の医薬組成物。
【請求項１２】
前記ＥＢＶゲノム陰性抗体は、少なくともＩｇＧ４サブタイプを含む請求項９から１１いずれか記載の医薬組成物。
【請求項１３】
破傷風の治療に用いられ、
前記ＩｇＧ４サブタイプは、配列番号１の塩基配列と、配列番号２の塩基配列と、によってコードされる請求項１２記載の医薬組成物。
【請求項１４】
配列番号３の塩基配列と、配列番号３の塩基配列と、によってコードされるＩｇＧ１サブタイプを更に含む請求項１３記載の医薬組成物。
【請求項１５】
ヒトミエローマ細胞及びマウスミエローマ細胞を細胞融合して得られたヘテロハイブリドーマに、ヒトＢ細胞が更に細胞融合され、ＥＢＶゲノム陰性であることを指標に選抜されて得られた融合ミエローマ細胞と、ある抗原に対する抗体を産生するＥＢＶ形質転換ヒトＢ細胞と、を細胞融合して得られる完全ヒト抗体産生ハイブリドーマが産生する完全ヒト抗体のＩｇＧ４サブタイプを有効成分とし、他のサブタイプの効用を増強する抗体増強剤。
【請求項１６】
前記効用は破傷風の治療におけるものであり、
前記ＩｇＧ４サブタイプは、配列番号１の塩基配列と、配列番号２の塩基配列と、によってコードされる請求項１５記載の抗体増強剤。
【請求項１７】
抗体の重鎖又は軽鎖をコードする塩基配列を有するＤＮＡのクローニング方法であって、
ヒトミエローマ細胞及びマウスミエローマ細胞を細胞融合して得られたヘテロハイブリドーマに、ヒトＢ細胞が更に細胞融合され、ＥＢＶゲノム陰性であることを指標に選抜されて得られた融合ミエローマ細胞と、ある抗原に対する抗体を産生するＥＢＶ形質転換ヒトＢ細胞と、を細胞融合して得られる完全ヒト抗体産生ハイブリドーマ、又はこの完全ヒト抗体産生ハイブリドーマに由来するハイブリドーマから抽出されるｍＲＮＡを鋳型として、前記抗体の重鎖又は軽鎖をコードする塩基配列を有するＤＮＡを特異的に増幅する手順を含むクローニング方法。
【請求項１８】
前記完全ヒト抗体産生ハイブリドーマからｍＲＮＡを抽出する請求項１７記載のクローニング方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図９】
【図８】
【図１０】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図９】
【図８】
【図１０】
【公開番号】特開２００８−２５３１４９（Ｐ２００８−２５３１４９Ａ）
【公開日】平成２０年１０月２３日（２００８．１０．２３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−９５３８０（Ｐ２００７−９５３８０）
【出願日】平成１９年３月３０日（２００７．３．３０）
【出願人】（８０３０００１１５）学校法人東京理科大学 (545)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年１０月２３日（２００８．１０．２３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年３月３０日（２００７．３．３０）
【出願人】（８０３０００１１５）学校法人東京理科大学 (545)
【Ｆターム（参考）】
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