医薬組成物およびアルギナーゼを用いる肝炎の処置方法
本発明は、ポリエチレングリコールによって修飾されたヒトアルギナーゼＩにより肝炎を処置するための方法、および医薬の製造におけるその使用を開示する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、医薬組成物およびその使用に関する。好ましい一実施形態では、本発明は、肝炎を処置することができる医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
肝炎の処置のための抗ウイルス性薬物は多数あり、以下のものは、最も高頻度に使用されている：（１）インターフェロン：細胞が、ウイルスを直接死滅または抑制するのではなく、細胞表面受容体に対する反応によってその自身の抗ウイルス性タンパク質を産生し、したがって、Ｂ型およびＣ型肝炎ウイルスの複製の抑制をもたらすように誘導する広域抗ウイルス剤。同時に、これは、ＮＫ細胞、マクロファージおよびＴリンパ球の活性を刺激し、免疫系を調節し、抗ウイルス性能力を増強する。（２）インターロイキン−２：免疫系を調節し、抗ウイルスおよび抗腫瘍能力を有するＴ細胞成長因子。（３）ヌクレオシド：例えば、アシクロビルは、種々のＤＮＡウイルスの複製を抑制する非環式プリンヌクレオシドである。（４）アラビノシド：インビボおよびインビトロの両方でＢ型肝炎に対して潜在的に有効であることが示されている。一部の患者は、処置中、異常な生化学および肝臓生検材料の改善を伴うＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼ潜在（ｌａｔｅｎｃｙ）を示す。（５）その他：肝細胞成長促進因子（ｐＨＧＦ）、サイモシン、抗Ｂ型肝炎リボ核酸、リバビリン、レバミゾール、レンチナン、ポテンリン（ｐｏｔｅｎｌｉｎｅ）、フィトヘマグルチニンなど。しかしながら、前述の薬物の有効性は、満足のいくものではなく、これらは、有害な副作用を容易に誘導する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
発明の概要
前述の背景に鑑み、本発明の目的は、肝炎を処置するためのより有効な医薬組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
好ましい一実施形態では、医薬組成物は、肝炎の処置において患者のアルギニンレベルを選択的に低下させるために提供される。
【０００５】
したがって、一態様において、アルギニンを分解する酵素（アルギニン分解酵素）が医薬の調製のために提供される。好ましい一実施形態では、アルギニン分解酵素はアルギナーゼまたはアルギニンデイミナーゼである。また別の実施形態では、アルギニン分解酵素は、単離され実質的に精製された組換えアルギナーゼである。より好ましい実施形態では、本発明のアルギナーゼはヒトアルギナーゼＩである。また別のより好ましい実施形態では、本発明のヒトアルギナーゼＩは、配列番号１または配列番号２に示すものと同じ核酸配列を含み、前記核酸配列は、配列番号３に示すものと同じアミノ酸配列を含む。また別の実施形態では、本発明の組換えヒトアルギナーゼＩは８０〜１００％純度である。より好ましい実施形態では、本発明の組換えヒトアルギナーゼＩは９０〜１００％純度である。
【０００６】
また別の好ましい実施形態では、本発明のアルギナーゼは、患者において少なくとも３日間、「充分なアルギニン奪取」（以下、本明細書において「ＡＡＤ」という）を維持するのに充分に高い酵素活性および安定性を有するように修飾される。修飾の好ましい方法
の一例は、６ヒスチジンのアミノ末端タグである。また別の好ましい修飾は、酵素の安定性を増大させるため、および患者によって惹起される免疫反応性を最小限に抑えるためのペグ化である。別のより好ましい実施形態では、ペグ化は、少なくとも１種類のポリエチレングリコールに共有結合されたカップリング剤を含む。最も好ましい実施形態では、カップリング剤は、２，４，６−トリクロロ−ｓ−トリアジン（塩化シアヌル、ＣＣ）またはスクシニミドプロピオン酸（ＳＰＡ）である。修飾アルギナーゼは、少なくとも２５０Ｉ．Ｕ．／ｍｇの比活性を有する。好ましい一実施形態では、比活性は少なくとも３００〜３５０Ｉ．Ｕ．／ｍｇである。最も好ましい実施形態では、比活性は少なくとも５００Ｉ．Ｕ．／ｍｇである。別の好ましい実施形態では、前記アルギナーゼは、充分な安定性を有するように、および少なくとも約３日間の血漿または血清半減期を有するように修飾される。
【０００７】
また別の好ましい実施形態では、本発明によって調製される医薬は、肝炎を処置するために提供される。より好ましい実施形態では、本発明によって調製される医薬は、Ｂ型肝炎を処置するために提供される。
【０００８】
別の実施において、単離され実質的に精製された組換えアルギナーゼを含む医薬組成物がさらに提供される。好ましい一実施形態では、８０〜１００％純度を有する組換えアルギナーゼを含む医薬組成物が本明細書において提供される。また別の好ましい実施形態では、組換えヒトアルギナーゼは、任意のアルギニン分解酵素、例えば、アルギニンデイミナーゼまたはヒトアルギナーゼＩである。最も好ましい実施形態では、前記酵素は、配列番号１または配列番号２に示すものと同じアミノ酸配列で本質的に構成され、前記アミノ酸コード配列は、配列番号３に示すものと同じアミノ酸配列を含む。好ましい一実施形態では、前記アルギナーゼは、患者の血漿または血清半減期において、約３日間高い比活性および充分な安定性を有するように修飾される。別の好ましい修飾は、酵素の安定性を増大させ、免疫反応性を最小限に抑えるためのペグ化である。
【０００９】
本発明のまた別の態様では、医薬組成物は、患者のアルギニンレベルを低下させるために提供される。好ましい一実施形態では、本発明は、肝炎を調節するためのものである。より好ましい実施形態では、本発明により、Ｂ型肝炎を処置することができる。別の実施形態では、本発明の医薬組成物は、固形物、液状物、エマルジョン、懸濁液、小アルブミン凝集体（ｓｍａｌｌ ａｌｂｕｍｉｎ ａｇｇｒｅｇａｔｅ）（ＳＡＡ）またはリポソームの形態で調製される。また別の好ましい実施形態では、本発明の医薬組成物は、経口または静脈内投与するのに好適である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
好ましい実施形態の詳細な説明
本明細書で用いる場合、用語「ペグ化されたアルギナーゼ」は、酵素の安定性を増大させるため、および免疫反応性を最小限に抑えるためにペグ化（ＷＯ２００４／００１０４８を参照）によって修飾された本発明のアルギナーゼＩをいう。
【００１１】
本明細書で用いる場合、語句「実質的に同じ」は、ＤＮＡのヌクレオチド配列、ＲＮＡのリボヌクレオチド配列、またはタンパク質のアミノ酸配列のいずれに関して用いる場合も、本明細書に開示する実際の配列に由来する、軽微で重大でない配列バリエーションを伴う配列をいう。実質的に同じ配列を有する種は、開示した配列と均等であるとみなし、したがって、添付の特許請求の範囲の範囲に含まれる。これに関連して、「軽微で重大でない配列バリエーション」は、本明細書に開示および／または特許請求の範囲に記載したＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質と実質的に同じである配列は、本明細書に開示および／または特許請求の範囲に記載した配列と機能的に等価であることを意味する。機能的に等価な配列は、実質的に同様に機能し、本明細書に開示および特許請求の範囲に記載した核
酸およびアミノ酸組成物と実質的に同じ組成物を産生させる。特に、機能的に等価なＤＮＡは、本明細書に開示したものと同じタンパク質、または保存的アミノ酸バリエーション（例えば、別の非極性残基での非極性残基の置換または同様の荷電残基での荷電残基の置換など）を有するタンパク質をコードする。これらの変化としては、当業者によって認識されるものであって、該タンパク質の３次構造を実質的に改変しないものが含まれる。用語「充分に高い酵素活性」は、少なくとも２５０Ｉ．Ｕ．／ｍｇ、好ましくは少なくとも３００〜３５０Ｉ．Ｕ．／ｍｇ、より好ましくは少なくとも５００Ｉ．Ｕ．／ｍｇの組換えヒトアルギナーゼの酵素比活性をいう。好ましい実施形態では、アルギナーゼは、５００〜６００Ｉ．Ｕ．／ｍｇの比活性を有する。用語「安定性」は、アルギナーゼのインビトロ安定性をいう。より好ましくは、該安定性は、インビボ安定性をいう。酵素活性の減少速度は、単離され精製された組換えヒトアルギナーゼの血漿中安定性に反比例する。この関係は、血漿中のヒトアルギナーゼの半減期に反映される。
【００１２】
本明細書で用いる場合、用語「充分なアルギニン奪取」（ＡＡＤ）は、１０μＭ以下のインビボアルギニンレベルをいう。用語「半減期」（１／２期）は、ヒト血漿中のアルギナーゼの濃度がインビトロで半分に低下するのに必要とされ得る時間をいう。
【００１３】
技術的専門知識および本明細書で用いる用語に関する他のすべての情報は、ＷＯ２００４／００１０４８およびＷＯ２００４／０００３４９に見られ得る。
【００１４】
アルギナーゼの抗Ｂ型肝炎ウイルス効果を調べるため、本発明では、Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子でトランスフェクトしたヒト肝臓癌細胞株２．２．１５を用いて、アルギナーゼの細胞毒性、アルギナーゼによるＨＢｓＡｇおよびＨＢｅＡｇ分泌の抑制、ならびにアルギナーゼによるＨＢＶ−ＤＮＡの抑制を試験する。ラミブジン（ＧｌａｘｏＷｅｌｌｃｏｍｅ，ＵＫ）を陽性コントロールとして用い、比較を行なう。結果は、８日間のＣＰＥ法の薬物添加後、ペグ化された組換えアルギナーゼのＴＣ５０は４０ＩＵ／ｍｌであり、ＴＣ０は２０±０ＩＵ／ｍｌであることを示す。ＴＣ０＝２０ＩＵ／ｍｌを用いた実験の２つのバッチでのＨＢｅＡｇ分泌の抑制割合、ＩＣ５０およびＳＩは、それぞれ６８．６９±８．８９、６．３７±０．４５ＩＵ／ｍｌ、６．３０±０．４５である。ＨＢｓＡｇ分泌の抑制割合、ＩＣ５０およびＳＩは、それぞれ２９．８１±２７．３５、１０．７２ＩＵ／ｍｌ（実験の一方のバッチのもの）および３．７３（実験の一方のバッチのもの）である。培養培地の上清みでのＨＢＶ−ＤＮＡドットブロットのＩＣ５０は１３．１８±０．４５ＩＵ／ｍＬであり、選択指数（ＳＩ）は３．１９±０．９８である。細胞におけるＨＢＶ−ＤＮＡ Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｌｏｔ ＳｕｍのＩＣ５０は１９．７９±７．９５ＩＵ／ｍｌであり、選択指数は２．９１±０．８８である。細胞におけるＨＢＶ−ＤＮＡ
Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｌｏｔ Ｉｎ ＬａｎｅのＩＣ５０は、２０．０６±１．９６ＩＵ／ｍｌであり、選択指数は２．００±０．２０である。陽性コントロールラミブジンのＴＣ５０およびＴＣ０は、それぞれ１１９８．９７±９７．５０および８００±０μｇ／ｍｌである。２．２．１５細胞のＨＢｅＡｇおよびＨＢｓＡｇ分泌は、ＴＣ０ ８００μｇ／ｍｌのラミブジンとの８日間のインキュベーション後、有意に抑制されない。培養培地の上清みにおけるＨＢＶ−ＤＮＡドットブロットのＩＣ５０は１１３．７６μｇ／ｍＬであり、選択指数は１０．５４である。細胞におけるＨＢＶ−ＤＮＡ Ｓｏｕｔｈｅｒｎ
Ｂｌｏｔ ＳｕｍのＩＣ５０は８８．７８±６．３７μｇ／ｍＬであり、選択指数は１３．５４±０．９７である。複数の実験結果は、公開された文献と一致し、実験は信頼性があることを示す。結果は、アルギナーゼが、ＨＢｓＡｇおよびＨＢｅＡｇの分泌を有意に抑制し、細胞内でＨＢＶ−ＤＮＡを低減させることを示す。
【実施例１】
【００１５】
材料の調製
１．１ 試験対象の薬物
名称：ペグ化組換えヒトアルギナーゼ（ＢＣＴ−１００）（以下、本明細書において「アルギナーゼ」という）。このアルギナーゼは、図１Ａ、１Ｂおよび１Ｃに示す核酸配列ならびにその対応するアミノ酸配列を含む。
【００１６】
調製：ＷＯ２００４／００１０４８の明細書中の実施例１〜８を参照されたい。組換えヒトアルギナーゼは、イケモトマサキ教授の研究室（京都大学；住所：日本国６０６−８５０７京都府京都市左京区聖護院川原町５３）から、ＷＯ２００４／００１０４８の最も早い出願日前に入手可能である。アルギナーゼは、表示した投薬群に従ってＭＥＭ培地で調製する。
【００１７】
保存：４℃の冷蔵庫内で保存。
１．２ 陽性コントロール：ラミブジン（ＧｌａｘｏＷｅｌｌｃｏｍｅ（ＵＫ）製）。バッチ番号：Ｂ００８９２３、錠剤１錠あたり１００ｍｇ、実験中、薬物を培地中に浸漬および溶解させ、遠心分離して沈殿物を除去し、ＭＥＭ培地で表示した投薬群に従って調製する。保存：４℃の冷蔵庫内で保存。
【００１８】
１．３ ２．２．１５細胞：Ｂ型肝炎ウイルスでトランスフェクトしたヒト肝臓癌細胞（Ｈｅｐ Ｇ２）の２．２．１５細胞株（Ｍｏｕｎｔ Ｓｉｎａｉ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒにより構築）。輸入し、本発明者らの研究所で培養。
【００１９】
１．４ 試薬：イーグルＭＥＭ粉末、Ｇ−４１８（ジェネティシン）、酵母ｔ−ＲＮＡ、プロテイナーゼ−Ｋ（Ｇｉｂｃｏ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）；ウシ胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ Ｌａｂ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）；Ｌ−グルタミン（Ｊｉｎｇｋｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｃｏｍｐａｎｙ；ＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇラジオイムノアッセイ（Ｃｈｉｎａ Ｉｓｏｔｏｐｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ Ｂｅｉｆａｎｇ Ｉｍｍｕｎｏｒｅａｇｅｎｔ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ）；カナマイシン（Ｎｏｒｔｈ Ｃｈｉｎａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｇｒｏｕｐ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）；ポリエチレングリコール（Ｆｌｕｋａ，スウェーデン）；ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ）；ｄ−３２ｐ−ｄＣＴＰ（Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｙａｈｕｉ Ｂｉｏ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ）。
【００２０】
１．５ 器具：培養ボトル（Ｔｕｎｃｌｏｎ ＴＭ，デンマーク）；９６ウェル、２４ウェルおよび６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）；二酸化炭素インキュベータ（Ｓｈｅｌ−Ｌａｂ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）；γ計数装置（Ｂｅｃｋｍａｎ，ドイツ）；スキャナー（Ｍｉｃｒｏｔｅｋ）；Ｇｅｌ−Ｐｒｏ解析ソフトウェア（ＭＥＤＩＡ Ｃｙｂｅｍｅｔｉｃｅ（登録商標）。
【００２１】
１．６ 細胞培養培地および試薬
ＭＥＭ培地１００ｍｌ：ウシ胎児血清１０％、グルタミン０．０３％、Ｇ４１８ ３８０μｇ／ｍｌ、カナマイシン５０μｇ／ｍｌ含有
１．７ ２．２．１５細胞培養物：０．２５％トリプシンを、充分成長させた２．２．１５細胞の入った培養ボトル内に添加し、１０分間３７℃で消化させ、培地を添加して分散させる。１：３継代培養、１０日後、充分成長
【実施例２】
【００２２】
細胞に対するアルギナーゼ毒性の試験
実験をコントロール群および異なる薬物濃度の試験群に分ける。細胞を消化し、２００，０００細胞／ｍｌに希釈し、培養プレートに移し（９６ウェルプレートに１００μｌ／ウェル）、２４時間、５％ＣＯ２下で３７℃にてインキュベートし、細胞が単層に成長したときを実験準備完了とする。アルギナーゼを培養培地で４０ＩＵ／ｍｌに希釈し、２０
、１０、５、２．５ＩＵ／ｍｌに連続希釈し、９６ウェルプレート内に添加し（全部で５種類の異なる濃度、１つの濃度あたり３ウェル）、アルギナーゼ溶液を４日毎に交換する（元の同じ濃度で）。細胞病理学的変化を８日間または４日間、顕微鏡下で観察する。完全な破壊を４；７５％破壊を３；５０％破壊を２，２５％破壊を１；変化なしを０とする。Ｒｅｅｄ−Ｍｕｅｎｃｈ法にしたがってＴＣ５０およびＴＣ０を計算する。
【００２３】
【数１】
【実施例３】
【００２４】
ＨＢｅＡｇおよびＨＢｓＡｇのアルギナーゼ抑制に関する試験
実験は、ＨＢｓＡｇおよびＨＢｅＡｇ陽性コントロール群、陰性コントロール群、細胞コントロール群および異なる薬物濃度の試験群を有するように設計する。２０００００細胞／ｍｌの２．２．１５細胞を２４ウェルプレート上（１ｍｌ／ウェル）で成長させ、２４時間５％ＣＯ２下で３７℃にてインキュベートする。ＴＣ０薬物溶液を、各薬物について５段階の希釈液に連続希釈し（アルギナーゼでは２０、１０、５、２．５、１．２５ＩＵ／ｍｌ；ラミブジンでは８００、４００、２００、１００、５０μｇ／ｍｌ、１つの濃度あたり４ウェル）、５％ＣＯ２下で３７℃にてインキュベートし、薬物溶液を４日毎に交換し（同じ濃度で）、第８日に培養培地を取り出し、−２０℃で保存する。実験を２バッチで繰り返し、ＨＢｓＡｇおよびＨＢｅＡｇについて別々に試験する。各ウェルについてγ計数装置を用いてｃｐｍ値を確認する。
【００２５】
薬物有効性の計算：細胞対照群および異なる薬物濃度群のＣｐｍの平均および標準偏差、Ｐ／Ｎ値ならびに抑制割合ＩＣ５０およびＳＩを計算する。
【００２６】
【数２】
【実施例４】
【００２７】
２．２．１５細胞ＤＮＡのアルギナーゼ抑制に関する試験
２．２．１５細胞上清みからのＨＢＶ−ＤＮＡの抽出：２０００００細胞／ｍｌの２．２．１５細胞を２４ウェルプレート上（１ｍｌ／ウェル）で成長させ、２４時間のインキュベーション後に薬物を添加し、薬物溶液を４日毎に交換し（同じ濃度で）、薬物を培養物に添加した日から数えて８日間のインキュベーション後の細胞培養物から上清みを回収し、ポリエチレングリコールで沈殿させ、プロテイナーゼＫで消化し、フェノール：クロロホルム：イソペンタノールで抽出し、無水エタノールによる核酸沈殿などの手順を行ない、真空乾燥し、ＴＥバッファー中に再溶解して試料とする。
【００２８】
ドットブロット：ドットの配置：２０μｌ試料（２５μｇ ＤＮＡ含有）を採取し、変性させ、中和し、２０×ＳＳＣバッファーで１：８希釈までニトロセルロース膜上で連続希釈し、オーブン乾燥し、予備ハイブリダイズさせ、ハイブリダイズさせ、膜を洗浄し、放射能自己曝露（ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ ｓｅｌｆ ｅｘｐｏｓｕｒｅ）などの手順を行なう。慣用法によりＸ線フィルムを現像する。現像したフィルムをスキャナーでスキャンし、Ｇｅｌ−Ｐｒｏソフトウェアにより密度を測定し、抑制率（ｒａｔｅ）およびＩＣ５０を計算する。
【００２９】
【数３】
【００３０】
サザンブロット：２．２．１５細胞からのＨＢＶ−ＤＮＡの抽出：薬物を添加して２．２．１５細胞を８日間インキュベートし、培地を除去して細胞を回収し、細胞を溶解溶液により溶解し、等量のフェノール：クロロホルム：イソペンタノールで２回抽出し、無水エタノールを添加して核酸を沈殿させ、真空乾燥し、２０μｌ ＴＥバッファーに再溶解し、ＤＮＡ試料バッファーを添加し、試料をアガロースゲルに置いて電気泳動させる。電気泳動後、変性させ、中和し、膜に移す。オーブン乾燥し、ハイブリダイズさせ、同じ回数（ｔｈｅ ｓａｍｅ ｔｉｍｅ）ドットブロットに曝露する。現像したフィルムをスキャナーでスキャンし、Ｇｅｌ−Ｐｒｏソフトウェアにより相対密度を解析し、抑制率およびＩＣ５０を計算する。
【００３１】
結果
ＴＣ５０およびＴＣ０を、Ｒｅｅｄ−Ｍｕｅｎｃｈ法により計算する。上記の式に従ってＨＢｓＡｇおよびＨＢｅＡｇ抑制を計算する。ＨＢＶ−ＤＮＡのアガロースゲル電気泳動の相対密度を解析することにより、抑制率およびＩＣ５０を計算する。
【００３２】
１． ２．２．１５細胞培養物におけるアルギナーゼ毒性
Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子でトランスフェクトしたヒト肝臓癌２．２．１５細胞に対するアルギナーゼ毒性を観察するため、連続希釈した薬物溶液を、２４時間のインキュベーション後の細胞培養物中に添加する。４０ＩＵ／ｍｌから開始し、続いて２０、１０、５、２．５ＩＵ／ｍｌとし、薬物溶液を４日毎に８日間まで交換し、細胞病理学的変化を顕微鏡下で観察し、ＣＰＥを顕微鏡で確認する。結果：ＣＰＥ法（８日間の薬物投与）によるＢ型肝炎ウイルス遺伝子でトランスフェクトしたヒト肝臓癌細胞２．２．１５細胞におけるアルギナーゼ毒性：２つのバッチ実験において、ＴＣ５０は４０ＩＵ／ｍｌであり、ＴＣ０は２０±０μｇ／ｍｌである。ラミブジン陽性コントロールでは、ＴＣ５０は１１９８．９７±９７．５０μｇ／ｍｌであり、ＴＣ０は８００±０μｇ／ｍｌである（表１Ａ参照）。
【００３３】
２． ＨＢｅＡｇおよびＨＢｓＡｇのアルギナーゼ抑制
ＴＣ０濃度のアルギナーゼおよびラミブジンを２．２．１５細胞に添加し、８日後のＨＢｓＡｇおよびＨＢｅＡｇのｃｐｍ値を確認し、薬物抑制の有効性を計算する。実験結果については表２を参照のこと。
【００３４】
２．１． ＨＢｅＡｇのアルギナーゼ抑制割合
２つのバッチでのアルギナーゼ実験：ＴＣ０ ２０ＩＵ／ｍｌを１０、５、２．５および１．２５ＩＵ／ｍｌに連続希釈し、各濃度の２．２．１５細胞を８日間インキュベートする。上清みにおけるＨＢｅＡｇの平均抑制割合は、２０ＩＵ／ｍｌで６８．６９±８．８９％抑制；１０ＩＵ／ｍｌで６０．７３±１７．４９％抑制；５ＩＵ／ｍｌで５３．９６±２０．３６％抑制；２．５ＩＵ／ｍｌで５１．８３±１４．１６％抑制；１．２５ＩＵ／ｍｌで３７．３４％抑制である。平均ＩＣ５０は６．３７±０．４５ＩＵ／ｍｌであり、ＳＩは６．３０±０．４５である。
【００３５】
２．２ ＨＢｓＡｇのアルギナーゼ抑制割合
第１のバッチでのアルギナーゼ実験：２０、１０、５、２．５、１．２５ＩＵ／ｍｌの濃度での８日間のインキュベーション後の２．２．１５細胞培養物の細胞培養上清みにおけるＨＢｓＡｇの抑制割合は、それぞれ４９．１６％、４７．９７％、４２．２９％および３７．１８％である。ＩＣ５０は１０．７２ＩＵ／ｍｌであり、ＳＩは３．７．３である。しかしながら、抑制割合は、第２のバッチでは低い。ＨＢｓＡｇに対する抑制割合は５０％未満であり、ＴＣ０濃度は２０ＩＵ／ｍｌに等しく、ＩＣ５０＞２０ＩＵ／ｍｌである。
【００３６】
２．３． ＨＢｓＡｇおよびＨＢｅＡｇに対するラミブジンの効果
ラミブジンをＴＣ０濃度８００μｇ／ｍｌから、それぞれ４００、２００、１００および５０μｇ／ｍｌまで連続希釈し、２．２．１５細胞に添加し、８日間のインキュベーション後のＨＢｓＡｇおよびＨＢｅＡｇの力価を確認し、抑制の効果を計算する（表１Ｂ参照）。
【００３７】
２．４． ＨＢｅＡｇのラミブジン抑制割合
８００、４００、２００、１００および５０μｇ／ｍｌの濃度のラミブジンとの８日間のインキュベーション後の２．２．１５細胞培養物の細胞培養上清みにおけるＨＢｓＡｇの平均抑制割合は、８．２３±３．０２％、１２．９９±０．４６％、１７．８３±２．０９％、１５．８４±２．３３％、１４．１０±１．２７％である。有意な抑制は示されていない。
【００３８】
２．５． ＨＢｓＡｇのラミブジン抑制割合
８００、４００、２００、１００および５０μｇ／ｍｌの濃度のラミブジンとの８日間のインキュベーション後の２．２．１５細胞の細胞培養上清みにおけるＨＢｅＡｇの平均抑制割合は、４．６５±６．５８％、４．０５±５．７３％、５．６７±４．７０％、８．６０±４．８８％、３．４５±３．９５％である。有意な抑制は示されていない。
【００３９】
【表１】
【００４０】
３． ２．２．１５細胞培養物の上清みにおけるＨＢＶ−ＤＮＡのアルギナーゼおよびラミブジン抑制
３．１ ２．２．１５細胞培養物の上清みにおけるＨＢＶ−ＤＮＡにおけるアルギナーゼドットブロット
２．２．１５細胞培養物の上清みにおけるＨＢＶ−ＤＮＡに対するアルギナーゼの効果
、８日間のインキュベーション後のＨＢＶ−ＤＮＡに対する試験溶液の２つのバッチのＩＣ５０は、１６．０４、１０．３１ＩＵ／ｍｌである。平均ＩＣ５０は１３．１８±４．０５ＩＵ／ｍｌであり、ＳＩは２．４９、３．８８であり、平均は３．１９±０．９８である。結果については表２を参照のこと。
【００４１】
【表２】
【００４２】
３．２ ２．２．１５細胞培養物の上清みにおけるＨＢＶ−ＤＮＡに対するラミブジンの効果
第１のバッチ実験の２．２．１５細胞培養物の上清みにおけるＨＢＶ−ＤＮＡに対するラミブジンの効果：ＩＣ５０は１１３．７６μｇ／ｍｌであり、ＴＣ５０は１１９８．９７±９７．５０μｇ／ｍｌであり、ＳＩは１０．５４である。表３の結果を参照のこと。
【００４３】
【表３】
【００４４】
３．３． ２．２．１５細胞におけるＨＢＶ−ＤＮＡ Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｌｏｔのアルギナーゼおよびラミブジン抑制
３．３．１ アルギナーゼによる２．２．１５細胞におけるＨＢＶ−ＤＮＡ Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｌｏｔの抑制
結果は、２．２．１５細胞における全ＨＢＶ−ＤＮＡ Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｌｏｔの結果は、添加したアルギナーゼとの８日間のインキュベーション後、完全に抑制されることを示す：実験の２つのバッチのＩＣ５０は、２５．４２、１４．１７ＩＵ／ｍｌであり、平均ＩＣ５０は１９．７９±７．９５であり、ＳＩはそれぞれ１．５７および２．８２であり、平均は２．１９±０．８８である。２．２．１５細胞における全ＨＢＶ−ＤＮＡ
Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｌｏｔ Ｉｎ Ｌａｎｅの結果：実験の２つのバッチのＩＣ５０は２１．４５、１８．６７ＩＵ／ｍｌであり、平均は２０．０６±１．９６ＩＵ／ｍｌであり、ＳＩは１．８６、２．１４であり、平均は２．００±０．２０である。表４の結果を参照のこと。
【００４５】
【表４】
【００４６】
３．３．２ ラミブジンによる２．２．１５細胞におけるＨＢＶ−ＤＮＡ Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｌｏｔの抑制
結果は、ラミブジンによる２．２．１５細胞における全ＨＢＶ−ＤＮＡ Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｌｏｔの抑制効果を示す：実験の２つのバッチのＩＣ５０は８４．２７、９３．２８μｇ／ｍｌであり、平均は８８．７８±６．３７μｇ／ｍｌであり、ＴＣ５０は１１９８．９７μｇ／ｍｌであり、ＳＩはそれぞれ１４．２３および１２．８５であり、平均は１３．５４±０．９７である（表５参照）。
【００４７】
【表５】
【００４８】
考察
実験により、８日間の添加薬物のインキュベーション後、Ｂ型肝炎ウイルスでトランスフェクトしたヒト肝臓癌細胞２２１５細胞株に対するアルギナーゼおよび抗Ｂ型肝炎ウイルス陽性コントロール薬物ラミブジンの毒性、細胞培養上清みにおけるＨＢｓＡｇおよびＨＢｅＡｇ分泌（ａｎｄ）の抑制、ならびに細胞におけるＨＢＶ−ＤＮＡの抑制が観察される。概要については表６を参照のこと。
【００４９】
【表６】
【００５０】
１． ２．２．１５細胞に対するアルギナーゼ毒性
アルギナーゼのＴＣ５０は４０ＩＵ／ｍｌであり、ＴＣ０は２０±０ＩＵ／ｍｌである。
【００５１】
陽性コントロールラミブジンのＴＣ５０は１１９８．９７±９７．５０μｇ／ｍｌであり、ＴＣ０は８００±０ μｇ／ｍｌである。
【００５２】
２． ２．２．１５細胞におけるＨＢｓＡｇおよびＨＢｅＡｇの分泌のアルギナーゼおよびラミブジン抑制
ＴＣ０ ２０ＩＵ／ｍｌアルギナーゼの４つの濃度を連続希釈し、２．２．１５細胞に添加して８日間インキュベートする。ＨＢｅＡｇ分泌に関する実験の２つのバッチの平均抑制割合は６８．６９±８．８９％であり、ＨＢｅＡｇに対するＩＣ５０は６．３７±０．４５ＩＵ／ｍｌであり、ＳＩは６．３０±０．４５である。ＨＢｓＡｇの抑制割合は２９．８１±２７．３５％であり、ＨＢｓＡｇに対するＩＣ５０は、第１のバッチで１０．７２ＩＵ／ｍｌであり、ＳＩは３．７３であり第２のバッチで２０ＩＵ／ｍｌである。
【００５３】
抑制割合は５０％未満であり、ＩＣ５０＞２０ＩＵ／ｍｌであり、ＳＩ：≦１である。実験の２つのバッチの平均はとらなかった。
【００５４】
ＨＢｅＡｇおよびＨＢｓＡｇについて、２．２．１５細胞培養物にＴＣ０ ８００μｇ／ｍｌのラミブジンを添加して８日間インキュベートすることによる有意な抑制作用はない。有効濃度の半分およびＳＩは、計算することができない。
【００５５】
３． ２．２．１５細胞におけるＨＢＶ−ＤＮＡのアルギナーゼおよびラミブジン抑制
結果は、薬物を添加して８日間インキュベーションした後の細胞培養物の上清みのＨＢＶ−ＤＮＡ Ｄｏｔ ＢｌｏｔにおけるアルギナーゼのＩＣ５０は１３．１８±４．０５ＩＵ／ｍｌであり、ＳＩは３．１９±０．９８であること、８日後のＨＢＶ−ＤＮＡ Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ＢｌｏｔにおけるＩＣ５０は１９．７９±７．９５ＩＵ／ｍｌであり、ＳＩは２．１９±０．８８であること、薬物を添加して８日後のＨＢＶ−ＤＮＡ Ｄｏｔ
Ｂｌｏｔ Ｉｎ ＬａｎｅにおけるＩＣ５０は２０．０６±１．９６μｇ／ｍｌであり、ＳＩは２．００±０．２０であることを示す。
【００５６】
ＨＢＶ−ＤＮＡ Ｄｏｔ ＢｌｏｔにおけるラミブジンのＩＣ５０は１１３．７６μｇ／ｍｌであり、ＳＩは１０．５４である。Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔの抑制において、実験の両方のバッチのＩＣ５０は８４．２７および９３．２８μｇ／ｍｌであり、平均は８８．７８±６．３７μｇ／ｍｌであり、ＴＣ５０は１１９８．９７μｇ／ｍｌであり、ＳＩは、それぞれ１４．２３および１２．８５であり、平均は１３．５４±０．９７である。
【００５７】
本明細書で用いる場合および添付の特許請求の範囲において、単数形態「ａ」および「ｔｈｅ」は、本文中で特に明白な記載のない限り、複数の指示対象物を含むことに留意されたい。したがって、例えば、「単数形の医薬調製物（ａ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）」に対する言及は、異なる調製物の混合物を含み、「処置方法（ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」に対する言及は、当業者などにはわかる均等な工程および方法に対する言及を含む。
【００５８】
特に記載のない限り、本明細書で用いるすべての科学技術用語は、本発明が属する技術分野の当業者が一般に理解するものと同じ意味を有する。本明細書に記載したもの類似または同等な任意の方法および材料が本発明の実施または試験において使用され得るが、好ましい方法および材料を以下に記載する。本明細書に挙げたすべての刊行物は、引用により本明細書に組み込まれ、具体的な情報を記載および開示する。これらの参考文献は、該情報との関連で本明細書に挙げた。本発明を充分に記載したが、その範囲内に含まれる修正は当業者に自明である。かかる修正はすべて、本発明の範囲内に含まれる。
【００５９】
本発明の医薬組成物の製剤は、固形物、溶液、エマルジョン、分散液、ミセル、リポソームなどの形態で使用され得、ここで、得られる製剤は、１種類または複数の修飾ヒトア
ルギナーゼを本発明の実施における活性成分として、経腸または非経口適用に適した有機系または無機系の担体または賦形剤との混合物で含有する。活性成分は、アルギナーゼであり得、例えば、錠剤、ペレット剤、カプセル、坐剤、液剤、乳剤、懸濁剤、および固形、半固形または液状形態の調製物の製造における使用に適した任意の他の形態のための通常の無毒性の医薬的に許容され得る担体を伴い得る。助剤に加え、安定剤、増粘剤および着色剤ならびに香料が使用され得る。１種類または複数のアルギナーゼ活性成分が医薬製剤内に、標的となるプロセス、症状または疾患に対して所望の効果をもたらすのに充分な量で含まれる。
【００６０】
本明細書において想定する活性成分を含有する医薬製剤は、経口使用に適した形態、例えば、錠剤、トローチ剤、舐剤、水性もしくは油状懸濁剤、分散性の粉剤もしくは顆粒剤、乳剤、硬質もしくは軟質カプセル、またはシロップ剤もしくはエリキシル剤などであり得る。経口使用が意図される製剤は、医薬製剤の製造のための当該技術分野で知られた任意の方法に従って調製され得る。錠剤は、コーティングがなくてもよく、胃腸管内での崩壊および吸収を遅延させ、それにより、長時間にわたる持続作用を提供するために、公知の手法によってコーティングしてもよい。該錠剤はまた、制御放出のための浸透圧性治療用錠剤を形成するためにコーティングされ得る。
【００６１】
場合によっては、経口使用のための製剤は、活性成分が不活性固体希釈剤、例えば、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、カオリンなどと混合された硬質ゼラチンカプセルの形態であり得る。該錠剤はまた、活性成分が水または油媒体、例えば、ピーナッツ油、液状パラフィンもしくはオリーブ油と混合された軟質ゼラチンカプセルの形態であり得る。
【００６２】
医薬製剤はまた、滅菌された注射用の溶液または懸濁液の形態であり得る。この懸濁液は、適当な分散剤または湿潤剤および懸濁剤を用い、公知の方法に従って製剤化され得る。また、滅菌された注射用調製物は、無毒性の非経口用に許容され得る希釈剤または溶媒中での滅菌された注射用の溶液または懸濁液、例えば、１，４−ブタンジオールの溶液であり得る。滅菌された固定油は、溶媒または懸濁媒体として慣用的に使用されているものである。この目的のため、任意のブランド固定油が使用され得、合成のモノ−もしくはジグリセリド、脂肪酸（オレイン酸など）、天然に存在する植物油、例えば、ゴマ油、ココナッツ油、ピーナッツ油、綿実油など、または合成脂肪族ビヒクル、例えば、オレイン酸エチルなどが挙げられる。緩衝剤、デキストロース溶液、保存剤、抗酸化剤などが、必要に応じて、可溶性酵素を溶解するために溶質として組み込まれるか、または使用され得る。
【００６３】
医薬製剤はまた、他の化学療法剤と併用する付加処置であり得る。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１Ａ】図１Ａ、１Ｂおよび１Ｃは、ヒトアルギナーゼＩの核酸配列および対応するアミノ酸配列である。図１Ａは、プラスミド ｐＡＢ１０１のＥｃｏＲＩ／ＭｕｎＩ部位からＸｂａＩ部位までの核酸配列（配列番号１）である。核酸（ｎｔ）１〜６はＥｃｏＲＩ／ＭｕｎＩ部位；ｎｔ ４８１〜４８６はプロモーター１の３５までの領域；ｎｔ ５０４〜５０９はプロモーター１の１０までの領域；ｎｔ ５４４〜５４９はプロモーター２の３５までの領域；ｎｔ ５６６〜５７１はプロモーター２の１０までの領域；ｎｔ ６００〜６０５はリボソーム結合部位；ｎｔ ６１４〜６１６は開始コドン；ｎｔ ６３２〜６３７はＮｄｅＩ部位；ｎｔ １６０１〜１６０３、停止コドン；ｎｔ １９９７〜２００２はＸｂａＩ部位。
【図１Ｂ】図１Ａ、１Ｂおよび１Ｃは、ヒトアルギナーゼＩの核酸配列および対応するアミノ酸配列である。図１Ｂは、修飾ヒトアルギナーゼの核酸配列（配列番号２）およびその対応するアミノ酸配列（配列番号３）である。図１Ａの核酸６１４〜１６０３は、修飾アルギナーゼアミノ酸配列のコード領域である。Ｎ末端上の６個のヒスチジン（配列番号４）を下線で示す。翻訳停止コドンに＊を付す。
【図１Ｃ】図１Ａ、１Ｂおよび１Ｃは、ヒトアルギナーゼＩの核酸配列および対応するアミノ酸配列である。図１Ｃは、通常のヒトアルギナーゼＩの核酸配列（配列番号８）およびその対応するアミノ酸配列（配列番号９）である。
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、医薬組成物およびその使用に関する。好ましい一実施形態では、本発明は、肝炎を処置することができる医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
肝炎の処置のための抗ウイルス性薬物は多数あり、以下のものは、最も高頻度に使用されている：（１）インターフェロン：細胞が、ウイルスを直接死滅または抑制するのではなく、細胞表面受容体に対する反応によってその自身の抗ウイルス性タンパク質を産生し、したがって、Ｂ型およびＣ型肝炎ウイルスの複製の抑制をもたらすように誘導する広域抗ウイルス剤。同時に、これは、ＮＫ細胞、マクロファージおよびＴリンパ球の活性を刺激し、免疫系を調節し、抗ウイルス性能力を増強する。（２）インターロイキン−２：免疫系を調節し、抗ウイルスおよび抗腫瘍能力を有するＴ細胞成長因子。（３）ヌクレオシド：例えば、アシクロビルは、種々のＤＮＡウイルスの複製を抑制する非環式プリンヌクレオシドである。（４）アラビノシド：インビボおよびインビトロの両方でＢ型肝炎に対して潜在的に有効であることが示されている。一部の患者は、処置中、異常な生化学および肝臓生検材料の改善を伴うＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼ潜在（ｌａｔｅｎｃｙ）を示す。（５）その他：肝細胞成長促進因子（ｐＨＧＦ）、サイモシン、抗Ｂ型肝炎リボ核酸、リバビリン、レバミゾール、レンチナン、ポテンリン（ｐｏｔｅｎｌｉｎｅ）、フィトヘマグルチニンなど。しかしながら、前述の薬物の有効性は、満足のいくものではなく、これらは、有害な副作用を容易に誘導する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
発明の概要
前述の背景に鑑み、本発明の目的は、肝炎を処置するためのより有効な医薬組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
好ましい一実施形態では、医薬組成物は、肝炎の処置において患者のアルギニンレベルを選択的に低下させるために提供される。
【０００５】
したがって、一態様において、アルギニンを分解する酵素（アルギニン分解酵素）が医薬の調製のために提供される。好ましい一実施形態では、アルギニン分解酵素はアルギナーゼまたはアルギニンデイミナーゼである。また別の実施形態では、アルギニン分解酵素は、単離され実質的に精製された組換えアルギナーゼである。より好ましい実施形態では、本発明のアルギナーゼはヒトアルギナーゼＩである。また別のより好ましい実施形態では、本発明のヒトアルギナーゼＩは、配列番号１または配列番号２に示すものと同じ核酸配列を含み、前記核酸配列は、配列番号３に示すものと同じアミノ酸配列を含む。また別の実施形態では、本発明の組換えヒトアルギナーゼＩは８０〜１００％純度である。より好ましい実施形態では、本発明の組換えヒトアルギナーゼＩは９０〜１００％純度である。
【０００６】
また別の好ましい実施形態では、本発明のアルギナーゼは、患者において少なくとも３日間、「充分なアルギニン奪取」（以下、本明細書において「ＡＡＤ」という）を維持するのに充分に高い酵素活性および安定性を有するように修飾される。修飾の好ましい方法
の一例は、６ヒスチジンのアミノ末端タグである。また別の好ましい修飾は、酵素の安定性を増大させるため、および患者によって惹起される免疫反応性を最小限に抑えるためのペグ化である。別のより好ましい実施形態では、ペグ化は、少なくとも１種類のポリエチレングリコールに共有結合されたカップリング剤を含む。最も好ましい実施形態では、カップリング剤は、２，４，６−トリクロロ−ｓ−トリアジン（塩化シアヌル、ＣＣ）またはスクシニミドプロピオン酸（ＳＰＡ）である。修飾アルギナーゼは、少なくとも２５０Ｉ．Ｕ．／ｍｇの比活性を有する。好ましい一実施形態では、比活性は少なくとも３００〜３５０Ｉ．Ｕ．／ｍｇである。最も好ましい実施形態では、比活性は少なくとも５００Ｉ．Ｕ．／ｍｇである。別の好ましい実施形態では、前記アルギナーゼは、充分な安定性を有するように、および少なくとも約３日間の血漿または血清半減期を有するように修飾される。
【０００７】
また別の好ましい実施形態では、本発明によって調製される医薬は、肝炎を処置するために提供される。より好ましい実施形態では、本発明によって調製される医薬は、Ｂ型肝炎を処置するために提供される。
【０００８】
別の実施において、単離され実質的に精製された組換えアルギナーゼを含む医薬組成物がさらに提供される。好ましい一実施形態では、８０〜１００％純度を有する組換えアルギナーゼを含む医薬組成物が本明細書において提供される。また別の好ましい実施形態では、組換えヒトアルギナーゼは、任意のアルギニン分解酵素、例えば、アルギニンデイミナーゼまたはヒトアルギナーゼＩである。最も好ましい実施形態では、前記酵素は、配列番号１または配列番号２に示すものと同じアミノ酸配列で本質的に構成され、前記アミノ酸コード配列は、配列番号３に示すものと同じアミノ酸配列を含む。好ましい一実施形態では、前記アルギナーゼは、患者の血漿または血清半減期において、約３日間高い比活性および充分な安定性を有するように修飾される。別の好ましい修飾は、酵素の安定性を増大させ、免疫反応性を最小限に抑えるためのペグ化である。
【０００９】
本発明のまた別の態様では、医薬組成物は、患者のアルギニンレベルを低下させるために提供される。好ましい一実施形態では、本発明は、肝炎を調節するためのものである。より好ましい実施形態では、本発明により、Ｂ型肝炎を処置することができる。別の実施形態では、本発明の医薬組成物は、固形物、液状物、エマルジョン、懸濁液、小アルブミン凝集体（ｓｍａｌｌ ａｌｂｕｍｉｎ ａｇｇｒｅｇａｔｅ）（ＳＡＡ）またはリポソームの形態で調製される。また別の好ましい実施形態では、本発明の医薬組成物は、経口または静脈内投与するのに好適である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
好ましい実施形態の詳細な説明
本明細書で用いる場合、用語「ペグ化されたアルギナーゼ」は、酵素の安定性を増大させるため、および免疫反応性を最小限に抑えるためにペグ化（ＷＯ２００４／００１０４８を参照）によって修飾された本発明のアルギナーゼＩをいう。
【００１１】
本明細書で用いる場合、語句「実質的に同じ」は、ＤＮＡのヌクレオチド配列、ＲＮＡのリボヌクレオチド配列、またはタンパク質のアミノ酸配列のいずれに関して用いる場合も、本明細書に開示する実際の配列に由来する、軽微で重大でない配列バリエーションを伴う配列をいう。実質的に同じ配列を有する種は、開示した配列と均等であるとみなし、したがって、添付の特許請求の範囲の範囲に含まれる。これに関連して、「軽微で重大でない配列バリエーション」は、本明細書に開示および／または特許請求の範囲に記載したＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質と実質的に同じである配列は、本明細書に開示および／または特許請求の範囲に記載した配列と機能的に等価であることを意味する。機能的に等価な配列は、実質的に同様に機能し、本明細書に開示および特許請求の範囲に記載した核
酸およびアミノ酸組成物と実質的に同じ組成物を産生させる。特に、機能的に等価なＤＮＡは、本明細書に開示したものと同じタンパク質、または保存的アミノ酸バリエーション（例えば、別の非極性残基での非極性残基の置換または同様の荷電残基での荷電残基の置換など）を有するタンパク質をコードする。これらの変化としては、当業者によって認識されるものであって、該タンパク質の３次構造を実質的に改変しないものが含まれる。用語「充分に高い酵素活性」は、少なくとも２５０Ｉ．Ｕ．／ｍｇ、好ましくは少なくとも３００〜３５０Ｉ．Ｕ．／ｍｇ、より好ましくは少なくとも５００Ｉ．Ｕ．／ｍｇの組換えヒトアルギナーゼの酵素比活性をいう。好ましい実施形態では、アルギナーゼは、５００〜６００Ｉ．Ｕ．／ｍｇの比活性を有する。用語「安定性」は、アルギナーゼのインビトロ安定性をいう。より好ましくは、該安定性は、インビボ安定性をいう。酵素活性の減少速度は、単離され精製された組換えヒトアルギナーゼの血漿中安定性に反比例する。この関係は、血漿中のヒトアルギナーゼの半減期に反映される。
【００１２】
本明細書で用いる場合、用語「充分なアルギニン奪取」（ＡＡＤ）は、１０μＭ以下のインビボアルギニンレベルをいう。用語「半減期」（１／２期）は、ヒト血漿中のアルギナーゼの濃度がインビトロで半分に低下するのに必要とされ得る時間をいう。
【００１３】
技術的専門知識および本明細書で用いる用語に関する他のすべての情報は、ＷＯ２００４／００１０４８およびＷＯ２００４／０００３４９に見られ得る。
【００１４】
アルギナーゼの抗Ｂ型肝炎ウイルス効果を調べるため、本発明では、Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子でトランスフェクトしたヒト肝臓癌細胞株２．２．１５を用いて、アルギナーゼの細胞毒性、アルギナーゼによるＨＢｓＡｇおよびＨＢｅＡｇ分泌の抑制、ならびにアルギナーゼによるＨＢＶ−ＤＮＡの抑制を試験する。ラミブジン（ＧｌａｘｏＷｅｌｌｃｏｍｅ，ＵＫ）を陽性コントロールとして用い、比較を行なう。結果は、８日間のＣＰＥ法の薬物添加後、ペグ化された組換えアルギナーゼのＴＣ５０は４０ＩＵ／ｍｌであり、ＴＣ０は２０±０ＩＵ／ｍｌであることを示す。ＴＣ０＝２０ＩＵ／ｍｌを用いた実験の２つのバッチでのＨＢｅＡｇ分泌の抑制割合、ＩＣ５０およびＳＩは、それぞれ６８．６９±８．８９、６．３７±０．４５ＩＵ／ｍｌ、６．３０±０．４５である。ＨＢｓＡｇ分泌の抑制割合、ＩＣ５０およびＳＩは、それぞれ２９．８１±２７．３５、１０．７２ＩＵ／ｍｌ（実験の一方のバッチのもの）および３．７３（実験の一方のバッチのもの）である。培養培地の上清みでのＨＢＶ−ＤＮＡドットブロットのＩＣ５０は１３．１８±０．４５ＩＵ／ｍＬであり、選択指数（ＳＩ）は３．１９±０．９８である。細胞におけるＨＢＶ−ＤＮＡ Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｌｏｔ ＳｕｍのＩＣ５０は１９．７９±７．９５ＩＵ／ｍｌであり、選択指数は２．９１±０．８８である。細胞におけるＨＢＶ−ＤＮＡ
Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｌｏｔ Ｉｎ ＬａｎｅのＩＣ５０は、２０．０６±１．９６ＩＵ／ｍｌであり、選択指数は２．００±０．２０である。陽性コントロールラミブジンのＴＣ５０およびＴＣ０は、それぞれ１１９８．９７±９７．５０および８００±０μｇ／ｍｌである。２．２．１５細胞のＨＢｅＡｇおよびＨＢｓＡｇ分泌は、ＴＣ０ ８００μｇ／ｍｌのラミブジンとの８日間のインキュベーション後、有意に抑制されない。培養培地の上清みにおけるＨＢＶ−ＤＮＡドットブロットのＩＣ５０は１１３．７６μｇ／ｍＬであり、選択指数は１０．５４である。細胞におけるＨＢＶ−ＤＮＡ Ｓｏｕｔｈｅｒｎ
Ｂｌｏｔ ＳｕｍのＩＣ５０は８８．７８±６．３７μｇ／ｍＬであり、選択指数は１３．５４±０．９７である。複数の実験結果は、公開された文献と一致し、実験は信頼性があることを示す。結果は、アルギナーゼが、ＨＢｓＡｇおよびＨＢｅＡｇの分泌を有意に抑制し、細胞内でＨＢＶ−ＤＮＡを低減させることを示す。
【実施例１】
【００１５】
材料の調製
１．１ 試験対象の薬物
名称：ペグ化組換えヒトアルギナーゼ（ＢＣＴ−１００）（以下、本明細書において「アルギナーゼ」という）。このアルギナーゼは、図１Ａ、１Ｂおよび１Ｃに示す核酸配列ならびにその対応するアミノ酸配列を含む。
【００１６】
調製：ＷＯ２００４／００１０４８の明細書中の実施例１〜８を参照されたい。組換えヒトアルギナーゼは、イケモトマサキ教授の研究室（京都大学；住所：日本国６０６−８５０７京都府京都市左京区聖護院川原町５３）から、ＷＯ２００４／００１０４８の最も早い出願日前に入手可能である。アルギナーゼは、表示した投薬群に従ってＭＥＭ培地で調製する。
【００１７】
保存：４℃の冷蔵庫内で保存。
１．２ 陽性コントロール：ラミブジン（ＧｌａｘｏＷｅｌｌｃｏｍｅ（ＵＫ）製）。バッチ番号：Ｂ００８９２３、錠剤１錠あたり１００ｍｇ、実験中、薬物を培地中に浸漬および溶解させ、遠心分離して沈殿物を除去し、ＭＥＭ培地で表示した投薬群に従って調製する。保存：４℃の冷蔵庫内で保存。
【００１８】
１．３ ２．２．１５細胞：Ｂ型肝炎ウイルスでトランスフェクトしたヒト肝臓癌細胞（Ｈｅｐ Ｇ２）の２．２．１５細胞株（Ｍｏｕｎｔ Ｓｉｎａｉ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒにより構築）。輸入し、本発明者らの研究所で培養。
【００１９】
１．４ 試薬：イーグルＭＥＭ粉末、Ｇ−４１８（ジェネティシン）、酵母ｔ−ＲＮＡ、プロテイナーゼ−Ｋ（Ｇｉｂｃｏ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）；ウシ胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ Ｌａｂ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）；Ｌ−グルタミン（Ｊｉｎｇｋｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｃｏｍｐａｎｙ；ＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇラジオイムノアッセイ（Ｃｈｉｎａ Ｉｓｏｔｏｐｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ Ｂｅｉｆａｎｇ Ｉｍｍｕｎｏｒｅａｇｅｎｔ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ）；カナマイシン（Ｎｏｒｔｈ Ｃｈｉｎａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｇｒｏｕｐ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）；ポリエチレングリコール（Ｆｌｕｋａ，スウェーデン）；ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ）；ｄ−３２ｐ−ｄＣＴＰ（Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｙａｈｕｉ Ｂｉｏ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ）。
【００２０】
１．５ 器具：培養ボトル（Ｔｕｎｃｌｏｎ ＴＭ，デンマーク）；９６ウェル、２４ウェルおよび６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）；二酸化炭素インキュベータ（Ｓｈｅｌ−Ｌａｂ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）；γ計数装置（Ｂｅｃｋｍａｎ，ドイツ）；スキャナー（Ｍｉｃｒｏｔｅｋ）；Ｇｅｌ−Ｐｒｏ解析ソフトウェア（ＭＥＤＩＡ Ｃｙｂｅｍｅｔｉｃｅ（登録商標）。
【００２１】
１．６ 細胞培養培地および試薬
ＭＥＭ培地１００ｍｌ：ウシ胎児血清１０％、グルタミン０．０３％、Ｇ４１８ ３８０μｇ／ｍｌ、カナマイシン５０μｇ／ｍｌ含有
１．７ ２．２．１５細胞培養物：０．２５％トリプシンを、充分成長させた２．２．１５細胞の入った培養ボトル内に添加し、１０分間３７℃で消化させ、培地を添加して分散させる。１：３継代培養、１０日後、充分成長
【実施例２】
【００２２】
細胞に対するアルギナーゼ毒性の試験
実験をコントロール群および異なる薬物濃度の試験群に分ける。細胞を消化し、２００，０００細胞／ｍｌに希釈し、培養プレートに移し（９６ウェルプレートに１００μｌ／ウェル）、２４時間、５％ＣＯ２下で３７℃にてインキュベートし、細胞が単層に成長したときを実験準備完了とする。アルギナーゼを培養培地で４０ＩＵ／ｍｌに希釈し、２０
、１０、５、２．５ＩＵ／ｍｌに連続希釈し、９６ウェルプレート内に添加し（全部で５種類の異なる濃度、１つの濃度あたり３ウェル）、アルギナーゼ溶液を４日毎に交換する（元の同じ濃度で）。細胞病理学的変化を８日間または４日間、顕微鏡下で観察する。完全な破壊を４；７５％破壊を３；５０％破壊を２，２５％破壊を１；変化なしを０とする。Ｒｅｅｄ−Ｍｕｅｎｃｈ法にしたがってＴＣ５０およびＴＣ０を計算する。
【００２３】
【数１】
【実施例３】
【００２４】
ＨＢｅＡｇおよびＨＢｓＡｇのアルギナーゼ抑制に関する試験
実験は、ＨＢｓＡｇおよびＨＢｅＡｇ陽性コントロール群、陰性コントロール群、細胞コントロール群および異なる薬物濃度の試験群を有するように設計する。２０００００細胞／ｍｌの２．２．１５細胞を２４ウェルプレート上（１ｍｌ／ウェル）で成長させ、２４時間５％ＣＯ２下で３７℃にてインキュベートする。ＴＣ０薬物溶液を、各薬物について５段階の希釈液に連続希釈し（アルギナーゼでは２０、１０、５、２．５、１．２５ＩＵ／ｍｌ；ラミブジンでは８００、４００、２００、１００、５０μｇ／ｍｌ、１つの濃度あたり４ウェル）、５％ＣＯ２下で３７℃にてインキュベートし、薬物溶液を４日毎に交換し（同じ濃度で）、第８日に培養培地を取り出し、−２０℃で保存する。実験を２バッチで繰り返し、ＨＢｓＡｇおよびＨＢｅＡｇについて別々に試験する。各ウェルについてγ計数装置を用いてｃｐｍ値を確認する。
【００２５】
薬物有効性の計算：細胞対照群および異なる薬物濃度群のＣｐｍの平均および標準偏差、Ｐ／Ｎ値ならびに抑制割合ＩＣ５０およびＳＩを計算する。
【００２６】
【数２】
【実施例４】
【００２７】
２．２．１５細胞ＤＮＡのアルギナーゼ抑制に関する試験
２．２．１５細胞上清みからのＨＢＶ−ＤＮＡの抽出：２０００００細胞／ｍｌの２．２．１５細胞を２４ウェルプレート上（１ｍｌ／ウェル）で成長させ、２４時間のインキュベーション後に薬物を添加し、薬物溶液を４日毎に交換し（同じ濃度で）、薬物を培養物に添加した日から数えて８日間のインキュベーション後の細胞培養物から上清みを回収し、ポリエチレングリコールで沈殿させ、プロテイナーゼＫで消化し、フェノール：クロロホルム：イソペンタノールで抽出し、無水エタノールによる核酸沈殿などの手順を行ない、真空乾燥し、ＴＥバッファー中に再溶解して試料とする。
【００２８】
ドットブロット：ドットの配置：２０μｌ試料（２５μｇ ＤＮＡ含有）を採取し、変性させ、中和し、２０×ＳＳＣバッファーで１：８希釈までニトロセルロース膜上で連続希釈し、オーブン乾燥し、予備ハイブリダイズさせ、ハイブリダイズさせ、膜を洗浄し、放射能自己曝露（ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ ｓｅｌｆ ｅｘｐｏｓｕｒｅ）などの手順を行なう。慣用法によりＸ線フィルムを現像する。現像したフィルムをスキャナーでスキャンし、Ｇｅｌ−Ｐｒｏソフトウェアにより密度を測定し、抑制率（ｒａｔｅ）およびＩＣ５０を計算する。
【００２９】
【数３】
【００３０】
サザンブロット：２．２．１５細胞からのＨＢＶ−ＤＮＡの抽出：薬物を添加して２．２．１５細胞を８日間インキュベートし、培地を除去して細胞を回収し、細胞を溶解溶液により溶解し、等量のフェノール：クロロホルム：イソペンタノールで２回抽出し、無水エタノールを添加して核酸を沈殿させ、真空乾燥し、２０μｌ ＴＥバッファーに再溶解し、ＤＮＡ試料バッファーを添加し、試料をアガロースゲルに置いて電気泳動させる。電気泳動後、変性させ、中和し、膜に移す。オーブン乾燥し、ハイブリダイズさせ、同じ回数（ｔｈｅ ｓａｍｅ ｔｉｍｅ）ドットブロットに曝露する。現像したフィルムをスキャナーでスキャンし、Ｇｅｌ−Ｐｒｏソフトウェアにより相対密度を解析し、抑制率およびＩＣ５０を計算する。
【００３１】
結果
ＴＣ５０およびＴＣ０を、Ｒｅｅｄ−Ｍｕｅｎｃｈ法により計算する。上記の式に従ってＨＢｓＡｇおよびＨＢｅＡｇ抑制を計算する。ＨＢＶ−ＤＮＡのアガロースゲル電気泳動の相対密度を解析することにより、抑制率およびＩＣ５０を計算する。
【００３２】
１． ２．２．１５細胞培養物におけるアルギナーゼ毒性
Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子でトランスフェクトしたヒト肝臓癌２．２．１５細胞に対するアルギナーゼ毒性を観察するため、連続希釈した薬物溶液を、２４時間のインキュベーション後の細胞培養物中に添加する。４０ＩＵ／ｍｌから開始し、続いて２０、１０、５、２．５ＩＵ／ｍｌとし、薬物溶液を４日毎に８日間まで交換し、細胞病理学的変化を顕微鏡下で観察し、ＣＰＥを顕微鏡で確認する。結果：ＣＰＥ法（８日間の薬物投与）によるＢ型肝炎ウイルス遺伝子でトランスフェクトしたヒト肝臓癌細胞２．２．１５細胞におけるアルギナーゼ毒性：２つのバッチ実験において、ＴＣ５０は４０ＩＵ／ｍｌであり、ＴＣ０は２０±０μｇ／ｍｌである。ラミブジン陽性コントロールでは、ＴＣ５０は１１９８．９７±９７．５０μｇ／ｍｌであり、ＴＣ０は８００±０μｇ／ｍｌである（表１Ａ参照）。
【００３３】
２． ＨＢｅＡｇおよびＨＢｓＡｇのアルギナーゼ抑制
ＴＣ０濃度のアルギナーゼおよびラミブジンを２．２．１５細胞に添加し、８日後のＨＢｓＡｇおよびＨＢｅＡｇのｃｐｍ値を確認し、薬物抑制の有効性を計算する。実験結果については表２を参照のこと。
【００３４】
２．１． ＨＢｅＡｇのアルギナーゼ抑制割合
２つのバッチでのアルギナーゼ実験：ＴＣ０ ２０ＩＵ／ｍｌを１０、５、２．５および１．２５ＩＵ／ｍｌに連続希釈し、各濃度の２．２．１５細胞を８日間インキュベートする。上清みにおけるＨＢｅＡｇの平均抑制割合は、２０ＩＵ／ｍｌで６８．６９±８．８９％抑制；１０ＩＵ／ｍｌで６０．７３±１７．４９％抑制；５ＩＵ／ｍｌで５３．９６±２０．３６％抑制；２．５ＩＵ／ｍｌで５１．８３±１４．１６％抑制；１．２５ＩＵ／ｍｌで３７．３４％抑制である。平均ＩＣ５０は６．３７±０．４５ＩＵ／ｍｌであり、ＳＩは６．３０±０．４５である。
【００３５】
２．２ ＨＢｓＡｇのアルギナーゼ抑制割合
第１のバッチでのアルギナーゼ実験：２０、１０、５、２．５、１．２５ＩＵ／ｍｌの濃度での８日間のインキュベーション後の２．２．１５細胞培養物の細胞培養上清みにおけるＨＢｓＡｇの抑制割合は、それぞれ４９．１６％、４７．９７％、４２．２９％および３７．１８％である。ＩＣ５０は１０．７２ＩＵ／ｍｌであり、ＳＩは３．７．３である。しかしながら、抑制割合は、第２のバッチでは低い。ＨＢｓＡｇに対する抑制割合は５０％未満であり、ＴＣ０濃度は２０ＩＵ／ｍｌに等しく、ＩＣ５０＞２０ＩＵ／ｍｌである。
【００３６】
２．３． ＨＢｓＡｇおよびＨＢｅＡｇに対するラミブジンの効果
ラミブジンをＴＣ０濃度８００μｇ／ｍｌから、それぞれ４００、２００、１００および５０μｇ／ｍｌまで連続希釈し、２．２．１５細胞に添加し、８日間のインキュベーション後のＨＢｓＡｇおよびＨＢｅＡｇの力価を確認し、抑制の効果を計算する（表１Ｂ参照）。
【００３７】
２．４． ＨＢｅＡｇのラミブジン抑制割合
８００、４００、２００、１００および５０μｇ／ｍｌの濃度のラミブジンとの８日間のインキュベーション後の２．２．１５細胞培養物の細胞培養上清みにおけるＨＢｓＡｇの平均抑制割合は、８．２３±３．０２％、１２．９９±０．４６％、１７．８３±２．０９％、１５．８４±２．３３％、１４．１０±１．２７％である。有意な抑制は示されていない。
【００３８】
２．５． ＨＢｓＡｇのラミブジン抑制割合
８００、４００、２００、１００および５０μｇ／ｍｌの濃度のラミブジンとの８日間のインキュベーション後の２．２．１５細胞の細胞培養上清みにおけるＨＢｅＡｇの平均抑制割合は、４．６５±６．５８％、４．０５±５．７３％、５．６７±４．７０％、８．６０±４．８８％、３．４５±３．９５％である。有意な抑制は示されていない。
【００３９】
【表１】
【００４０】
３． ２．２．１５細胞培養物の上清みにおけるＨＢＶ−ＤＮＡのアルギナーゼおよびラミブジン抑制
３．１ ２．２．１５細胞培養物の上清みにおけるＨＢＶ−ＤＮＡにおけるアルギナーゼドットブロット
２．２．１５細胞培養物の上清みにおけるＨＢＶ−ＤＮＡに対するアルギナーゼの効果
、８日間のインキュベーション後のＨＢＶ−ＤＮＡに対する試験溶液の２つのバッチのＩＣ５０は、１６．０４、１０．３１ＩＵ／ｍｌである。平均ＩＣ５０は１３．１８±４．０５ＩＵ／ｍｌであり、ＳＩは２．４９、３．８８であり、平均は３．１９±０．９８である。結果については表２を参照のこと。
【００４１】
【表２】
【００４２】
３．２ ２．２．１５細胞培養物の上清みにおけるＨＢＶ−ＤＮＡに対するラミブジンの効果
第１のバッチ実験の２．２．１５細胞培養物の上清みにおけるＨＢＶ−ＤＮＡに対するラミブジンの効果：ＩＣ５０は１１３．７６μｇ／ｍｌであり、ＴＣ５０は１１９８．９７±９７．５０μｇ／ｍｌであり、ＳＩは１０．５４である。表３の結果を参照のこと。
【００４３】
【表３】
【００４４】
３．３． ２．２．１５細胞におけるＨＢＶ−ＤＮＡ Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｌｏｔのアルギナーゼおよびラミブジン抑制
３．３．１ アルギナーゼによる２．２．１５細胞におけるＨＢＶ−ＤＮＡ Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｌｏｔの抑制
結果は、２．２．１５細胞における全ＨＢＶ−ＤＮＡ Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｌｏｔの結果は、添加したアルギナーゼとの８日間のインキュベーション後、完全に抑制されることを示す：実験の２つのバッチのＩＣ５０は、２５．４２、１４．１７ＩＵ／ｍｌであり、平均ＩＣ５０は１９．７９±７．９５であり、ＳＩはそれぞれ１．５７および２．８２であり、平均は２．１９±０．８８である。２．２．１５細胞における全ＨＢＶ−ＤＮＡ
Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｌｏｔ Ｉｎ Ｌａｎｅの結果：実験の２つのバッチのＩＣ５０は２１．４５、１８．６７ＩＵ／ｍｌであり、平均は２０．０６±１．９６ＩＵ／ｍｌであり、ＳＩは１．８６、２．１４であり、平均は２．００±０．２０である。表４の結果を参照のこと。
【００４５】
【表４】
【００４６】
３．３．２ ラミブジンによる２．２．１５細胞におけるＨＢＶ−ＤＮＡ Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｌｏｔの抑制
結果は、ラミブジンによる２．２．１５細胞における全ＨＢＶ−ＤＮＡ Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｌｏｔの抑制効果を示す：実験の２つのバッチのＩＣ５０は８４．２７、９３．２８μｇ／ｍｌであり、平均は８８．７８±６．３７μｇ／ｍｌであり、ＴＣ５０は１１９８．９７μｇ／ｍｌであり、ＳＩはそれぞれ１４．２３および１２．８５であり、平均は１３．５４±０．９７である（表５参照）。
【００４７】
【表５】
【００４８】
考察
実験により、８日間の添加薬物のインキュベーション後、Ｂ型肝炎ウイルスでトランスフェクトしたヒト肝臓癌細胞２２１５細胞株に対するアルギナーゼおよび抗Ｂ型肝炎ウイルス陽性コントロール薬物ラミブジンの毒性、細胞培養上清みにおけるＨＢｓＡｇおよびＨＢｅＡｇ分泌（ａｎｄ）の抑制、ならびに細胞におけるＨＢＶ−ＤＮＡの抑制が観察される。概要については表６を参照のこと。
【００４９】
【表６】
【００５０】
１． ２．２．１５細胞に対するアルギナーゼ毒性
アルギナーゼのＴＣ５０は４０ＩＵ／ｍｌであり、ＴＣ０は２０±０ＩＵ／ｍｌである。
【００５１】
陽性コントロールラミブジンのＴＣ５０は１１９８．９７±９７．５０μｇ／ｍｌであり、ＴＣ０は８００±０ μｇ／ｍｌである。
【００５２】
２． ２．２．１５細胞におけるＨＢｓＡｇおよびＨＢｅＡｇの分泌のアルギナーゼおよびラミブジン抑制
ＴＣ０ ２０ＩＵ／ｍｌアルギナーゼの４つの濃度を連続希釈し、２．２．１５細胞に添加して８日間インキュベートする。ＨＢｅＡｇ分泌に関する実験の２つのバッチの平均抑制割合は６８．６９±８．８９％であり、ＨＢｅＡｇに対するＩＣ５０は６．３７±０．４５ＩＵ／ｍｌであり、ＳＩは６．３０±０．４５である。ＨＢｓＡｇの抑制割合は２９．８１±２７．３５％であり、ＨＢｓＡｇに対するＩＣ５０は、第１のバッチで１０．７２ＩＵ／ｍｌであり、ＳＩは３．７３であり第２のバッチで２０ＩＵ／ｍｌである。
【００５３】
抑制割合は５０％未満であり、ＩＣ５０＞２０ＩＵ／ｍｌであり、ＳＩ：≦１である。実験の２つのバッチの平均はとらなかった。
【００５４】
ＨＢｅＡｇおよびＨＢｓＡｇについて、２．２．１５細胞培養物にＴＣ０ ８００μｇ／ｍｌのラミブジンを添加して８日間インキュベートすることによる有意な抑制作用はない。有効濃度の半分およびＳＩは、計算することができない。
【００５５】
３． ２．２．１５細胞におけるＨＢＶ−ＤＮＡのアルギナーゼおよびラミブジン抑制
結果は、薬物を添加して８日間インキュベーションした後の細胞培養物の上清みのＨＢＶ−ＤＮＡ Ｄｏｔ ＢｌｏｔにおけるアルギナーゼのＩＣ５０は１３．１８±４．０５ＩＵ／ｍｌであり、ＳＩは３．１９±０．９８であること、８日後のＨＢＶ−ＤＮＡ Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ＢｌｏｔにおけるＩＣ５０は１９．７９±７．９５ＩＵ／ｍｌであり、ＳＩは２．１９±０．８８であること、薬物を添加して８日後のＨＢＶ−ＤＮＡ Ｄｏｔ
Ｂｌｏｔ Ｉｎ ＬａｎｅにおけるＩＣ５０は２０．０６±１．９６μｇ／ｍｌであり、ＳＩは２．００±０．２０であることを示す。
【００５６】
ＨＢＶ−ＤＮＡ Ｄｏｔ ＢｌｏｔにおけるラミブジンのＩＣ５０は１１３．７６μｇ／ｍｌであり、ＳＩは１０．５４である。Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔの抑制において、実験の両方のバッチのＩＣ５０は８４．２７および９３．２８μｇ／ｍｌであり、平均は８８．７８±６．３７μｇ／ｍｌであり、ＴＣ５０は１１９８．９７μｇ／ｍｌであり、ＳＩは、それぞれ１４．２３および１２．８５であり、平均は１３．５４±０．９７である。
【００５７】
本明細書で用いる場合および添付の特許請求の範囲において、単数形態「ａ」および「ｔｈｅ」は、本文中で特に明白な記載のない限り、複数の指示対象物を含むことに留意されたい。したがって、例えば、「単数形の医薬調製物（ａ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）」に対する言及は、異なる調製物の混合物を含み、「処置方法（ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」に対する言及は、当業者などにはわかる均等な工程および方法に対する言及を含む。
【００５８】
特に記載のない限り、本明細書で用いるすべての科学技術用語は、本発明が属する技術分野の当業者が一般に理解するものと同じ意味を有する。本明細書に記載したもの類似または同等な任意の方法および材料が本発明の実施または試験において使用され得るが、好ましい方法および材料を以下に記載する。本明細書に挙げたすべての刊行物は、引用により本明細書に組み込まれ、具体的な情報を記載および開示する。これらの参考文献は、該情報との関連で本明細書に挙げた。本発明を充分に記載したが、その範囲内に含まれる修正は当業者に自明である。かかる修正はすべて、本発明の範囲内に含まれる。
【００５９】
本発明の医薬組成物の製剤は、固形物、溶液、エマルジョン、分散液、ミセル、リポソームなどの形態で使用され得、ここで、得られる製剤は、１種類または複数の修飾ヒトア
ルギナーゼを本発明の実施における活性成分として、経腸または非経口適用に適した有機系または無機系の担体または賦形剤との混合物で含有する。活性成分は、アルギナーゼであり得、例えば、錠剤、ペレット剤、カプセル、坐剤、液剤、乳剤、懸濁剤、および固形、半固形または液状形態の調製物の製造における使用に適した任意の他の形態のための通常の無毒性の医薬的に許容され得る担体を伴い得る。助剤に加え、安定剤、増粘剤および着色剤ならびに香料が使用され得る。１種類または複数のアルギナーゼ活性成分が医薬製剤内に、標的となるプロセス、症状または疾患に対して所望の効果をもたらすのに充分な量で含まれる。
【００６０】
本明細書において想定する活性成分を含有する医薬製剤は、経口使用に適した形態、例えば、錠剤、トローチ剤、舐剤、水性もしくは油状懸濁剤、分散性の粉剤もしくは顆粒剤、乳剤、硬質もしくは軟質カプセル、またはシロップ剤もしくはエリキシル剤などであり得る。経口使用が意図される製剤は、医薬製剤の製造のための当該技術分野で知られた任意の方法に従って調製され得る。錠剤は、コーティングがなくてもよく、胃腸管内での崩壊および吸収を遅延させ、それにより、長時間にわたる持続作用を提供するために、公知の手法によってコーティングしてもよい。該錠剤はまた、制御放出のための浸透圧性治療用錠剤を形成するためにコーティングされ得る。
【００６１】
場合によっては、経口使用のための製剤は、活性成分が不活性固体希釈剤、例えば、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、カオリンなどと混合された硬質ゼラチンカプセルの形態であり得る。該錠剤はまた、活性成分が水または油媒体、例えば、ピーナッツ油、液状パラフィンもしくはオリーブ油と混合された軟質ゼラチンカプセルの形態であり得る。
【００６２】
医薬製剤はまた、滅菌された注射用の溶液または懸濁液の形態であり得る。この懸濁液は、適当な分散剤または湿潤剤および懸濁剤を用い、公知の方法に従って製剤化され得る。また、滅菌された注射用調製物は、無毒性の非経口用に許容され得る希釈剤または溶媒中での滅菌された注射用の溶液または懸濁液、例えば、１，４−ブタンジオールの溶液であり得る。滅菌された固定油は、溶媒または懸濁媒体として慣用的に使用されているものである。この目的のため、任意のブランド固定油が使用され得、合成のモノ−もしくはジグリセリド、脂肪酸（オレイン酸など）、天然に存在する植物油、例えば、ゴマ油、ココナッツ油、ピーナッツ油、綿実油など、または合成脂肪族ビヒクル、例えば、オレイン酸エチルなどが挙げられる。緩衝剤、デキストロース溶液、保存剤、抗酸化剤などが、必要に応じて、可溶性酵素を溶解するために溶質として組み込まれるか、または使用され得る。
【００６３】
医薬製剤はまた、他の化学療法剤と併用する付加処置であり得る。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１Ａ】図１Ａ、１Ｂおよび１Ｃは、ヒトアルギナーゼＩの核酸配列および対応するアミノ酸配列である。図１Ａは、プラスミド ｐＡＢ１０１のＥｃｏＲＩ／ＭｕｎＩ部位からＸｂａＩ部位までの核酸配列（配列番号１）である。核酸（ｎｔ）１〜６はＥｃｏＲＩ／ＭｕｎＩ部位；ｎｔ ４８１〜４８６はプロモーター１の３５までの領域；ｎｔ ５０４〜５０９はプロモーター１の１０までの領域；ｎｔ ５４４〜５４９はプロモーター２の３５までの領域；ｎｔ ５６６〜５７１はプロモーター２の１０までの領域；ｎｔ ６００〜６０５はリボソーム結合部位；ｎｔ ６１４〜６１６は開始コドン；ｎｔ ６３２〜６３７はＮｄｅＩ部位；ｎｔ １６０１〜１６０３、停止コドン；ｎｔ １９９７〜２００２はＸｂａＩ部位。
【図１Ｂ】図１Ａ、１Ｂおよび１Ｃは、ヒトアルギナーゼＩの核酸配列および対応するアミノ酸配列である。図１Ｂは、修飾ヒトアルギナーゼの核酸配列（配列番号２）およびその対応するアミノ酸配列（配列番号３）である。図１Ａの核酸６１４〜１６０３は、修飾アルギナーゼアミノ酸配列のコード領域である。Ｎ末端上の６個のヒスチジン（配列番号４）を下線で示す。翻訳停止コドンに＊を付す。
【図１Ｃ】図１Ａ、１Ｂおよび１Ｃは、ヒトアルギナーゼＩの核酸配列および対応するアミノ酸配列である。図１Ｃは、通常のヒトアルギナーゼＩの核酸配列（配列番号８）およびその対応するアミノ酸配列（配列番号９）である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
肝炎の処置のための医薬の製造におけるアルギニン分解酵素の使用。
【請求項２】
前記酵素が、単離され実質的に精製された組換えアルギナーゼである、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記組換えアルギナーゼの純度が８０〜１００％である、請求項１に記載の使用。
【請求項４】
前記組換えアルギナーゼがヒトアルギナーゼＩである、請求項３に記載の使用。
【請求項５】
前記組換えアルギナーゼがアルギニンデイミナーゼである、請求項３に記載の使用。
【請求項６】
前記酵素が配列番号１または配列番号２に示すものと実質的に同じ核酸配列を含み、前記核酸配列が配列番号３に示すものと実質的に同じアミノ酸配列を含む、請求項４に記載の使用。
【請求項７】
前記酵素が２５０Ｉ．Ｕ．／ｍｇの比活性を有する、請求項４に記載の使用。
【請求項８】
前記酵素が、充分な安定性および少なくとも約３日間のインビトロ血漿半減期を有することをもたらす修飾を含む、請求項４に記載の使用。
【請求項９】
前記酵素がペグ化されている、請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
前記ペグ化が、カップリング剤を用いた前記アルギナーゼへの少なくとも１種類のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分の共有結合により生じる、請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
前記カップリング剤が、２，４，６−トリクロロ−ｓ−トリアジン（塩化シアヌル、ＣＣ）またはスクシニミドプロピオン酸（ＳＰＡ）である、請求項９に記載の使用。
【請求項１２】
前記ヒトアルギナーゼＩが、そのアミノ末端に結合した６個のヒスチジンを含む、請求項４に記載の使用。
【請求項１３】
前記肝炎がＢ型肝炎である、請求項１に記載の使用。
【請求項１４】
アルギニン分解酵素を含む医薬組成物。
【請求項１５】
前記酵素が、単離され実質的に精製された組換えアルギナーゼである、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
前記組換えアルギナーゼの純度が８０〜１００％である、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
前記組換えアルギナーゼがヒトアルギナーゼＩである、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
前記組換えアルギナーゼがアルギニンデイミナーゼである、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
前記酵素が配列番号１または配列番号２に示すものと実質的に同じ核酸配列を含み、前
記核酸配列が配列番号３に示すものと実質的に同じアミノ酸配列を含む、請求項１７に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
前記酵素が２５０Ｉ．Ｕ．／ｍｇの比活性を有する、請求項１７に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
前記酵素が、患者血漿中で少なくとも３日間の半減期を有する、請求項１７に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
前記酵素が、患者血漿中で少なくとも１日間の半減期を有する、請求項１７に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
前記酵素がペグ化によって修飾されている、請求項１７に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
前記ヒトアルギナーゼＩが、そのアミノ末端に結合した６個のヒスチジンを含む、請求項１７に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
前記酵素が患者の生理学的アルギニンレベルを低下させる、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
前記酵素が肝炎を調節する、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項２７】
前記肝炎がＢ型肝炎である、請求項２４に記載の医薬組成物。
【請求項２８】
前記組成物が、固形物、溶液、エマルジョン、分散液、ミセルまたはリポソームの形態にさらに製造され得る、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項２９】
前記組成物が経口使用または注射に好適である、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１】
肝炎の処置のための医薬の製造におけるアルギニン分解酵素の使用。
【請求項２】
前記酵素が、単離され実質的に精製された組換えアルギナーゼである、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記組換えアルギナーゼの純度が８０〜１００％である、請求項１に記載の使用。
【請求項４】
前記組換えアルギナーゼがヒトアルギナーゼＩである、請求項３に記載の使用。
【請求項５】
前記組換えアルギナーゼがアルギニンデイミナーゼである、請求項３に記載の使用。
【請求項６】
前記酵素が配列番号１または配列番号２に示すものと実質的に同じ核酸配列を含み、前記核酸配列が配列番号３に示すものと実質的に同じアミノ酸配列を含む、請求項４に記載の使用。
【請求項７】
前記酵素が２５０Ｉ．Ｕ．／ｍｇの比活性を有する、請求項４に記載の使用。
【請求項８】
前記酵素が、充分な安定性および少なくとも約３日間のインビトロ血漿半減期を有することをもたらす修飾を含む、請求項４に記載の使用。
【請求項９】
前記酵素がペグ化されている、請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
前記ペグ化が、カップリング剤を用いた前記アルギナーゼへの少なくとも１種類のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分の共有結合により生じる、請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
前記カップリング剤が、２，４，６−トリクロロ−ｓ−トリアジン（塩化シアヌル、ＣＣ）またはスクシニミドプロピオン酸（ＳＰＡ）である、請求項９に記載の使用。
【請求項１２】
前記ヒトアルギナーゼＩが、そのアミノ末端に結合した６個のヒスチジンを含む、請求項４に記載の使用。
【請求項１３】
前記肝炎がＢ型肝炎である、請求項１に記載の使用。
【請求項１４】
アルギニン分解酵素を含む医薬組成物。
【請求項１５】
前記酵素が、単離され実質的に精製された組換えアルギナーゼである、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
前記組換えアルギナーゼの純度が８０〜１００％である、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
前記組換えアルギナーゼがヒトアルギナーゼＩである、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
前記組換えアルギナーゼがアルギニンデイミナーゼである、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
前記酵素が配列番号１または配列番号２に示すものと実質的に同じ核酸配列を含み、前
記核酸配列が配列番号３に示すものと実質的に同じアミノ酸配列を含む、請求項１７に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
前記酵素が２５０Ｉ．Ｕ．／ｍｇの比活性を有する、請求項１７に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
前記酵素が、患者血漿中で少なくとも３日間の半減期を有する、請求項１７に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
前記酵素が、患者血漿中で少なくとも１日間の半減期を有する、請求項１７に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
前記酵素がペグ化によって修飾されている、請求項１７に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
前記ヒトアルギナーゼＩが、そのアミノ末端に結合した６個のヒスチジンを含む、請求項１７に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
前記酵素が患者の生理学的アルギニンレベルを低下させる、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
前記酵素が肝炎を調節する、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項２７】
前記肝炎がＢ型肝炎である、請求項２４に記載の医薬組成物。
【請求項２８】
前記組成物が、固形物、溶液、エマルジョン、分散液、ミセルまたはリポソームの形態にさらに製造され得る、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項２９】
前記組成物が経口使用または注射に好適である、請求項１４に記載の医薬組成物。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【公表番号】特表２００８−５１２３９９（Ｐ２００８−５１２３９９Ａ）
【公表日】平成２０年４月２４日（２００８．４．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５３０５７２（Ｐ２００７−５３０５７２）
【出願日】平成１７年９月６日（２００５．９．６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＮ２００５／００１４１１
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０２６９１５
【国際公開日】平成１８年３月１６日（２００６．３．１６）
【出願人】（５０７０７４３２８）康達医藥科技有限公司 (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年４月２４日（２００８．４．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年９月６日（２００５．９．６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＮ２００５／００１４１１
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０２６９１５
【国際公開日】平成１８年３月１６日（２００６．３．１６）
【出願人】（５０７０７４３２８）康達医藥科技有限公司 (1)
【Ｆターム（参考）】
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