卵胞のインビトロ成熟方法
本発明は、卵胞及び卵母細胞の成熟に使用する方法に関する。より具体的には、本発明は、卵胞及び卵母細胞のインビボ及びインビトロ成熟方法における、ホスファターゼであるＰＴＥＮのインヒビター、例えば、オキソバナデート及びペルオキソバナデート錯体の使用に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、卵胞及び卵母細胞のインビトロ成熟に使用する方法に関する。より具体的には、本発明は、卵胞及び卵母細胞のインビトロ成熟方法における、ホスファターゼであるＰＴＥＮのインヒビターの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
成熟を達成するための卵胞の活性化の誘導は、研究目的のみならず多数の応用分野において強く望まれている。原始卵胞は、インビトロ受精のための卵母細胞の供給源として潜在的に役に立ち得るものであるが、活性化及び成熟された卵胞を他の用途、例えば、化学療法後又は放射線照射後の癌の治療に利用することも非常に重要である。しかしながら、現在は、原始卵胞を活性化する手段がなく、これは、潜在的に重要な卵母細胞の供給源が利用されないままであることを示す。インビトロ受精に関する議論を踏まえて、そのような考察がますます重要になっている。
【０００３】
病院では、女性の原始卵胞が成長し始めることができなければ、すなわち、休止状態から活性化され得なければ、その卵胞は、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）などのホルモンに対して応答しないであろう。そうすると、その女性は不妊症であることとなり、彼女自身の卵母細胞をインビトロ受精に使用することができない。現在では、上述のように、インビトロ受精のための卵母細胞の供給源として原始卵胞を使用するための技術が存在しない。かくして、各種の用途のために卵胞のインビボ及び／又はインビトロ活性化及び成熟のいずれかを誘導するための方法を開発することが当該技術分野において必要とされている。
【０００４】
先行技術文献においては、イノシトールリン脂質のイノシトール環上の３’−ＯＨをリン酸化する、脂質キナーゼのホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）が開示されている。脂質ホスファターゼであるＰＴＥＮ（ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ａｎｄ ｔｅｎｓｉｎ ｈｏｍｏｌｏｇ ｄｅｌｅｔｅｄ ｏｎ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ｔｅｎ）は当該プロセスを逆行させ、かくして、ＰＩ３Ｋの作用の主要な負の調節因子として作用する（非特許文献１）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｃａｎｔｌｅｙ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００２， ２９６： １６５５−１６５７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明者は、原始卵胞の活性化を抑制する因子としてＰＴＥＮを同定した。卵母細胞特異的にＰｔｅｎ遺伝子が欠失したマウスモデルにおいて、全ての原始卵胞が時期尚早に活性化された。
【０００７】
したがって、本発明は、ＰＴＥＮの１つ又は複数のインヒビターの使用を含む、卵胞及び卵母細胞のインビトロ活性化及び成熟のための方法を提供する。前記方法は、インビトロ受精のための卵胞及び卵母細胞のインビトロ成熟の間に卵胞を活性化するために用いることができる。前記卵胞は、未成長卵胞、例えば、原始卵胞、中間卵胞（ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ ｆｏｌｌｉｃｌｅ）、及び一次卵胞であってよい。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、ＰＴＥＮの１つ又は複数のインヒビターを含む生理学的に許容される媒体中で卵胞及び／又は卵母細胞をインキュベートする工程を含んでよい。前記媒体は、ＦＳＨ及び／又はＣＧなどのゴナドトロピンをさらに含んでよい。
【０００９】
インキュベートの期間は、卵胞及び／又は卵母細胞の活性化及び／又は成熟が得られるのに十分な任意の時間であってよい。
【００１０】
ＰＴＥＮインヒビターは、卵胞及び／又は卵母細胞の活性化及び／又は成熟が得られる任意の濃度、例えば、１ｎＭから１．０ｍＭ、特に１．０から１００μＭの間の濃度で存在してよい。
【００１１】
本発明の好ましい実施態様では、卵胞及び／又は卵母細胞の活性化及び／又は成熟は、以下の工程：（ｉ）適切な対象から卵胞及び／又は卵母細胞の活性化及び／又は成熟のための適切な細胞及び／又は器官を得る工程、（ｉｉ）例えば実質的に３７℃かつ約５％のＣＯ２において、加湿インキュベーター中で前記細胞及び／又は器官を培養する工程、（ｉｉｉ）前記卵胞及び／又は卵母細胞の活性化及び／又は成熟を誘導するために、１ｎＭから１．０ｍＭ、好ましくは１．０から１００μＭの間の濃度のＰＴＥＮインヒビターとともに一時的又は持続的に前記細胞及び／又は器官をインキュベートする工程、及び（ｉｖ）本発明の範囲内で得られたものを利用する工程を含む。
【００１２】
本発明に係る方法は、ヒトの卵胞、又は家畜若しくは絶滅危惧種などの動物に由来する卵胞に適用することができる。前記家畜は、例えば、ウマ、ウシ、ブタ、ネコ、及びイヌなどであってよい。
【００１３】
本発明は、卵胞及び卵母細胞のインビトロ成熟、具体的には、原始卵胞、中間卵胞、及び一次卵胞などの未成長卵胞のインビトロ活性化の改善において使用するための医薬の調製における、１つ又は複数のＰＴＥＮインヒビターの使用も提供する。
【００１４】
卵胞及び卵母細胞のインビトロ成熟、具体的には、原始卵胞、中間卵胞、及び一次卵胞などの未成長卵胞のインビトロ活性化を促進するための１つ又は複数のＰＴＥＮインヒビターを含む組成物も提供する。前記組成物は、製薬学的に許容される担体、賦形剤、又は希釈剤も含むことができる。
【００１５】
ＰＴＥＮインヒビターは、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる、ＷＯ ２００５／０９７１１９及び対応する米国出願１０／５９９，７４８、ＷＯ ２００４／０７５８９７及び対応する米国出願ＵＳ１０／５４６，６３２に開示されている。
【００１６】
ＰＤＺドメイン相互作用、特にＭＡＧＩ（ｍｅｍｂｒａｎｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｇｕａｎｙｌａｔｅ ｋｉｎａｓｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｗｉｔｈ ｉｎｖｅｒｓｅ ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ）と結合したＰＴＥＮにおけるＰＤＺドメインの間の相互作用のインヒビターは、本発明に係るＰＴＥＮ活性のインヒビターとして使用することができる。その様なインヒビターは、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる、ＷＯ ２００４／０９２３４６、ＵＳ７，１４１，６００、ＷＯ ２００６／０７５４２に開示されている。
【００１７】
ペルオキソバナジウム錯体が、ＰＴＥＮの強力なインヒビターであることが示されている（Ｓｃｈｍｉｄ ｅｔ ａｌ． ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ ２００４， ５６６： ３５-３８； Ｒｏｓｉｖａｔｚ ｅｔ ａｌ． ＡＣＳ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ ２００６， １ ： ７８０−７９０）。
【００１８】
ペルオキソバナジウム錯体の合成は、Ｓｈａｖｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｉｎｏｒｇ Ｃｈｅｍ １９９３， ３２：３１０９−３１１３）、Ｒｏｓｉｖａｔｚ ｅｔ ａｌ．（ＡＣＳ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ ２００６， １： ７８０−７９０）、及びＰｏｓｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ １９９４，２６９：４５９６−６０４）に開示されているように実施することができる。
【００１９】
本発明によって使用することができる化合物の例は、
ｂｐＶ（ｂｉｐｙ）、カリウムビスペルオキソ（ビピリジン）オキソバナデート（Ｖ）、Ｋ［ＶＯ（Ｏ２）２Ｃ１０Ｈ８Ｎ２］・
ｂｐＶ（ｐｈｅｎ）、カリウムビスペルオキソ（ｌ，１０−フェナントロリン）オキソバナデート（Ｖ）、Ｋ［ＶＯ（Ｏ２）２ＣＩ２Ｈ８Ｎ２］
ｂｐＶ（ｐｉｃ）、二カリウムビスペルオキソ（ピコリナト）オキソバナデート（Ｖ）、Ｋ２［ＶＯ（Ｏ２）２Ｃ６Ｈ４ＮＯ２］・
ｂｐＶ−ＨＯｐｉｃ、二カリウムビスペルオキソ（５−ヒドロキシピリジン−２−カルボキシル）オキソバナデート（Ｖ） Ｋ２［ＶＯ（Ｏ２）２Ｃ６Ｈ４ＮＯ３］・
ＶＯ−ｐｉｃ、ジ−（ピコリネート）オキソバナデート（ＩＶ）、ＶＯＣ１０Ｈ１０ＮＯ４
ＶＯ−ＯＨｐｉｃ、ジ−（３−ヒドロキシピコリネート）オキソバナデート（ＩＶ）、ＶＯＣ１０Ｈ１０ＮＯ６
ｂｐＶ−ｂｉｇｕａｎ、カリウムビスペルオキソ（フェニルビグアニド）オキソバナデート（Ｖ）、Ｋ［ＶＯ（Ｏ２）２Ｃ８Ｈ１１Ｎ５］
ＶＯ−ｂｉｇｕａｎ、ジ−（フェニルビグアニド）オキソバナデート（ＩＶ）、ＶＯＣ１６Ｈ２０Ｎ１０
ｂｐＶ−ｉｓｏｑｕ、二カリウムビスペルオキソ（イソキノリンカルボン酸）オキソバナデート（Ｖ）、Ｋ２［ＶＯ（Ｏ２）２Ｃ１０Ｈ７ＮＯ２］；
下式
【化１】
［式中、
Ｒはシクロアルキル基であり、
Ａは低級アルキレン基であり、
カルボスチリル核の３位及び４位の間の結合は、単結合又は二重結合を意味する］
の化合物；
下式
【化２】
［式中、
Ｒ１は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ３アルキル、アリール、アルキルアリール、（ＣＨ２）ｎＣＯＸＲ３、（ＣＨ２）ｎＸＣＯＲ３、（ＣＨ２）ｎＣＯＲ３、（ＣＨ２）ｎＳＯ２Ｒ３、（ＣＨ２）ｎＸＲ３、（ＣＨ２）ｎＳＯ２ＸＲ３、（ＣＨ２）ｎＸＳＯ２Ｒ３、（ＣＨ２）ｎＮＲ３Ｒ４、又は（ＣＨ２）ｎＣＯ（ＣＨ２）ｍＸＲ３であり；
Ｒ２は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ３アルキル、アリール、アルキルアリール、（ＣＨ２）ｎＣＯＸＲ３、（ＣＨ２）ｎＸＣＯＲ３、（ＣＨ２）ｎＣＯＲ３、（ＣＨ２）ｎＳＯ２Ｒ３、（ＣＨ２）ｎＸＲ３、（ＣＨ２）ｎＳＯ２ＸＲ３、（ＣＨ２）ｎＸＳＯ２Ｒ３、（ＣＨ２）ｎＮＲ３Ｒ４、又は（ＣＨ２）ｎＣＯ（ＣＨ２）ｍＸＲ３であり；
Ｒ３、Ｒ５、Ｒ６は、独立して、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、アリール、又はアルキルアリールであり；
Ｒ４は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、アリール、アルキルアリール、ＮＨＳＯ２Ｒ５、ＮＨＣＯ２Ｒ５、又はＮＲ５Ｒ６；
ｍ＝０から３；ｎ＝０から３；及びＸはＯ又はＮＲ４である］
から選択されるアスコルビン酸誘導体又はデヒドロアスコルビン酸誘導体；
下式
【化３】
［式中、
Ｒ１は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、アリール、アルキルアリール、ＣＯＸＲ２、ＣＯＲ２、ＳＯ２ＸＲ２、又はＳＯ２Ｒ２であり；
Ｒ２は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、アリール、アルキルアリール、（ＣＨ２）ｎＣＯＸＲ４、（ＣＨ２）ｎＸＣＯＲ４、（ＣＨ２）ｎＸ Ｒ４、（ＣＨ２）ｎＳＯ２ＸＲ４、（ＣＨ２）ｎＸＳＯ2Ｒ４、ＮＨＳＯ２Ｒ４、ＮＨＣＯＲ４、ＮＨＣＯ２Ｒ４、ＮＨＣＯＣＯ２Ｒ４、又はＮＲ４Ｒ５であり；
Ｒ３は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、アリール、アルキルアリール、（ＣＨ２）ｎＣＯＸＲ４、（ＣＨ２）ｎＸＣＯＲ４、（ＣＨ２）ｎＸＲ４、（ＣＨ2）ｎＳＯ２ＸＲ４、（ＣＨ２）ｎＸＳＯ２Ｒ４、ＮＨＳＯ２Ｒ４、ＮＨＣＯＲ４、ＮＨＣＯ２Ｒ４、ＮＨＣＯＣＯ２Ｒ４、又はＮＲ４Ｒ５であり；
Ｒ４は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、アリール、又はアルキルアリールであり:
Ｒ５は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、アリール、アルキルアリール、ＮＨＳＯ２Ｒ６、ＮＨＣＯＲ６、ＮＨＣＯ２Ｒ６、ＮＲ６Ｒ７、又はＮ＝Ｃ（Ｒ６Ｒ７）であり；
Ｒ６は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、アリール、又はアルキルアリールであり；
Ｒ７は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、アリール、又はアルキルアリールであり；
ｎ＝０から３；及びＸはＯ又はＮＲ５である］
の化合物；
下式
【化４】
［式中、
Ａは５又は６員環であり；Ｒ１は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ３アルキル、アリール、アルキルアリール、（ＣＨ２）ｎＣＯＸＲ３、（ＣＨ２）ｎＸＣＯＲ３、（ＣＨ２）ｎＣＯＲ３、（ＣＨ２）ｎＳＯ２Ｒ３、（ＣＨ２）ｎＸＲ３、（ＣＨ２）ｎＳＯ２ＸＲ３、（ＣＨ２）ｎＸＳＯ２Ｒ３、ＮＨＳＯ２Ｒ３、ＮＨＣＯ２Ｒ３、ＮＨＣＯＲ３、ＮＨＣＯＣＯ２Ｒ３、ＮＲ３Ｒ４、又は（ＣＨ２）ｎＣＯ（ＣＨ２）ｍＸ３であり;
Ｒ２は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ３アルキル、アリール、アルキルアリール、（ＣＨ２）ｎＣＯＸＲ３、（ＣＨ２）ｎＸＣＯＲ３、（ＣＨ２）ｎＣＯＲ３、（ＣＨ２）ｎＳＯ２Ｒ３、（ＣＨ２）ｎＸＲ３、（ＣＨ２）ｎＳＯ２ＸＲ３、（ＣＨ２）ｎＸＳＯ２Ｒ３、ＮＨＳＯ２Ｒ３、ＮＨＣＯ２Ｒ３、ＮＨＣＯＲ３、ＮＨＣＯＣＯ２Ｒ３、ＮＲ３Ｒ４、又は（ＣＨ２）ｎＣＯ（ＣＨ２）ｍＸ３であり；
Ｒ３は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、アリール、又はアルキルアリールであり；
Ｒ４は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、アリール、アルキルアリール、ＮＨＳＯ２Ｒ５、ＮＨＣＯ２Ｒ５、又はＮＲ５Ｒ６であり；
Ｒ５は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、アリール、又はアルキルアリールであり；
Ｒ６は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、アリール、又はアルキルアリールであり；ｎ＝０から３；ｍ＝０から３；及びＸは、Ｏ又はＮＲ４であり；Ａは、飽和、不飽和、又は芳香族であってよく、任意にＮ及びＯを含んでよい］
の化合物；
下式
【化５】
［式中、
Ｒ１は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、アリール、アルキルアリール、（ＣＨ２）ｎＣＯＸＲ３、（ＣＨ2）ｍＸＣＯＲ３、（ＣＨ2）ｍＸＲ３、（ＣＨ２）ｎＣＯＲ３、（ＣＨ２）ｎＳＯ２ＸＲ３、又は（ＣＨ２）ｍＸＳＯ２Ｒ３であり；
Ｒ２は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、アリール、又はアルキルアリールであり；
Ｒ３は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、アリール、又はアルキルアリールであり；
Ｒ４は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、アリール、アルキルアリール、ＮＨＳＯ２Ｒ５、ＮＨＣＯ２Ｒ５、Ｎ＝Ｃ（Ｒ５Ｒ６）、又はＮＲ５Ｒ６であり；
Ｒ５は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、アリール、又はアルキルアリールであり；
Ｒ６は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、アリール、又はアルキルアリールであり；ｍ＝１から３；ｎ＝０から３；及びＸはＯ又はＮＲ４である］
下式
【化６】
［式中、
Ｒｌは、Ｏ、Ｃ１−Ｃ４ アルキル、（ＣＨ２）ｎＣＯＸＲ２、（ＣＨ２）ｎＸＣＯＲ２、（ＣＨ２）ｎＸＲ２、（ＣＨ２）ｎＣＯＲ２、（ＣＨ２）ｎＳＯ２ＸＲ２、（ＣＨ２）ｎＸＳＯ2Ｒ２、又は（ＣＨ２）ｎＳＯ２Ｒ２であり；
Ｒ２は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４ アルキル、アリール、アルキルアリール、ＮＨＳＯ２Ｒ４、ＮＨＣＯＲ４、ＮＨＣＯ２Ｒ４、ＮＨＣＯＣＯ２Ｒ４、又はＮＲ４Ｒ５であり；
Ｒ３は、Ｈ、Ｃｌ−Ｃ４ アルキル、アリール、アルキルアリール、ＮＨＳＯ２Ｒ４、ＮＨＣＯＲ４、ＮＨＣＯ２Ｒ４、ＮＨＣＯＣＯ２Ｒ４、又はＮＲ４Ｒ５であり；
Ｒ４は、Ｈ、Ｃｌ−Ｃ４ アルキル、アリール、又はアルキルアリールであり；
Ｒ５は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４ アルキル、アリール、又はアルキルアリールであり；
Ｒ６は、出現するごとに、水素、ハロゲン、ＮＯ２、Ｒ４ Ｒｌ０、Ｃ１−Ｃ４ アルキル、ＮＨ（ＣＨ２）ｐＣＯ（ＣＨ２）ｑＸＲ２、（ＣＨ２）ＰＣＯＸＲ２、（ＣＨ２）ＰＸＣＯＲ２、（ＣＨ２）ＰＸＲ２、（ＣＨ２）ＰＣＯＲ２、（ＣＨ２）PＳＯ２ＸＲ２、又は（ＣＨ２）ＰＸＳＯ２Ｒ２から独立に選択され;
Ｒ７は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４ アルキル、アリール、アルキルアリール、ＳＯ２ Ｒ４、ＮＨＳＯ２ Ｒ４、ＮＨＣＯ２ Ｒ４、又はＮＲ８Ｒ９であり；
Ｒ８は、独立に、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４ アルキル、アリール、アルキルアリール、（ＣＨ２）ｎＣＯＸＲ２、又は （ＣＨ２）ｎＸＲ２であり；
Ｒ９は、独立に、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４ アルキル、アリール、アルキルアリール、（ＣＨ２）ｎＣＯＸＲ２、（ＣＨ２）ｎＸＲ２、（ＣＨ２）ｐＣＯＸＲ２、（ＣＨ２）ＰＸＣＯＲ２、（ＣＨ２）ＰＸ Ｒ２、（ＣＨ２）ＰＣＯＲ２、（ＣＨ２）ｐＳＯ２Ｘ Ｒ２、（ＣＨ２）ＰＸＳＯ２Ｒ２、又は（ＣＨ２）ＰＳＯ２Ｒ２であり；
Ｒ１０は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４ アルキル、アリール、アルキルアリール、ＳＯ２Ｒ４、ＮＨＳＯ２Ｒ４、ＮＨＣＯ２Ｒ４、又はＮＲ８Ｒ９であり；
ｍは独立に０又は１であり；ｎ＝１〜５；ｐ＝０〜５；ｑ＝０〜５；ＸはＯ又はＮＲ３であり；及びＺはＯ又はＮＲ７である］
の置換された１，１０−フェナントロリン−５，６−ジオン；
下式
【化７】
［式中、
Ｒ１は、Ｈ、ＮＯ２、ＮＲ５Ｒ６、ハロゲン、シアノ、アルキル、アルキルアリール、カルボニル、カルボキシ、ＣＯＲ２、又はＣＯＮＲ５Ｒ６であり；
Ｒ２及びＲ３は、独立に、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４ アルキル、アリール、又はアルキルアリールであり；
Ｒ４は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４ アルキル、アリール、アルキルアリール、ＳＯ２Ｒ２、ＮＨＳＯ２Ｒ２、ＮＨＣＯＲ２、ＮＨＣＯ２Ｒ２、Ｎ＝ＣＲ２Ｒ３、又はＮＲ５Ｒ６であり；
Ｒ５は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４ アルキル、アリール、アルキルアリール、（ＣＨ２）ｎＣＯＸ Ｒ２、（ＣＨ２）ｎＸ Ｒ２、（ＣＨ２）ｎＣＯ（ＣＨ２）ｍＸ Ｒ２、ＳＯ２Ｒ２、（ＣＨ２）ｎＣＯ（ＣＨ２）ｎＣＯＸＲ２、又は（ＣＨ２）ｎＸＯＲ２であり；
Ｒ６は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４ アルキル、アリール、アルキルアリール、（ＣＨ２）ｎＣＯＸ Ｒ２、（ＣＨ２）ｎＸ Ｒ２、（ＣＨ２）ｎＣＯ（ＣＨ２）ｍＸ Ｒ２、ＳＯ２Ｒ２、（ＣＨ２）ｎＣＯ（ＣＨ２）ｎＣＯＸＲ２、又は（ＣＨ２）ｎＣＯＲ２であり；
ｍ＝０〜３；ｎ＝０〜３；及びＸはＣＲ２Ｒ３、Ｏ、又はＮＲ４である］
の置換されたフェナントレン−９，１０−ジオン；
下式
【化８】
［式中、
Ｒ１は、Ｈ、ＮＯ２、ＮＲ５Ｒ６、ハロゲン、シアノ、アルキル、アルキルアリール、カルボニル、カルボキシ、ＣＯＲ２、ＣＯＮＲ５Ｒ６、ＳＯ３Ｒ２、又はＳＯ２ＮＲ２ Ｒ３であり；
Ｒ２及びＲ３は、独立に、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４ アルキル、アリール、又はアルキルアリールであり；
Ｒ４は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４ アルキル、アリール、アルキルアリール、ＳＯ２Ｒ２、ＮＨＳＯ２Ｒ２、ＮＨＣＯＲ２、ＮＨＣＯ２Ｒ２、Ｎ＝ＣＲ２Ｒ３、又はＮＲ５Ｒ６であり；
Ｒ５は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、アリール、アルキルアリール、（ＣＨ２）ｎＣＯＸＲ２、（ＣＨ２）ｎＸＲ２、（ＣＨ２）ｎＣＯ（ＣＨ２）ｍＸ Ｒ２、ＳＯ２Ｒ２、（ＣＨ２）ｎＣＯ（ＣＨ２）ｎＣＯＸＲ２、又は（ＣＨ２）ｎＣＯＲ２であり;
Ｒ６は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４ アルキル、アリール、アルキルアリール、（ＣＨ２）ｎＣＯＸＲ２、（ＣＨ２）ｎＸＲ２、（ＣＨ２）ｎＣＯ（ＣＨ２）ｎＸ Ｒ２、ＳＯ２Ｒ２、（ＣＨ２）ｎＣＯ（ＣＨ２）ｎＣＯＸＲ２、又は（ＣＨ２）ｎＣＯＲ２であり；
ｍ＝０〜３；ｎ＝０〜３；及びＸはＣＲ２Ｒ３、Ｏ、又はＮＲ４である］
の化合物；
下式
【化９】
［式中、
Ｒ１は、Ｈ、ＮＯ２、ＮＲ５Ｒ６、ハロゲン、シアノ、アルキル、アルキルアリール、カルボニル、カルボキシ、ＣＯＲ２、又はＣＯＮＲ５Ｒ６であり；
Ｒ２及びＲ３は、独立に、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４ アルキル、アリール、又はアルキルアリールであり；
Ｒ４は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４ アルキル、アリール、アルキルアリール、ＳＯ２Ｒ２、ＮＨＳＯ２Ｒ２、ＮＨＣＯＲ２、ＮＨＣＯ2Ｒ２、Ｎ＝ＣＲ２Ｒ３、又はＮＲ５Ｒ６であり；
Ｒ５は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４ アルキル、アリール、アルキルアリール、（ＣＨ２）ｎＣＯＸ Ｒ２、（ＣＨ２）ｎＸＲ２、（ＣＨ２）ｎＣＯ（ＣＨ２）ｍＸ Ｒ２、ＳＯ２Ｒ２、（ＣＨ２）ｎＣＯ（ＣＨ２）ｎＣＯＸＲ２、又は（ＣＨ２）ｎＣＯＲ２であり；
Ｒ６は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４ アルキル、アリール、アルキルアリール、（ＣＨ２）ｎＣＯＸ Ｒ２、（ＣＨ２）ｎＸＲ２、（ＣＨ２）ｎＣＯ（ＣＨ２）ｍＸ Ｒ２、ＳＯ２Ｒ２、（ＣＨ２）ｎＣＯ（ＣＨ２）ｎＣＯＸＲ２、又は（ＣＨ２）ｎＣＯＲ２であり；
ｍ＝０〜３；ｎ＝０〜３；及びＸはＣＲ２Ｒ３、Ｏ、又はＮＲ４である］
の置換されたフェナントレン−９−オール；
下式
【化１０】
［式中、
Ｒ１は、Ｈ、ＮＯ２、ＮＲ３Ｒ４、ハロゲン、シアノ、アルキル、アルキルアリール、カルボニル、カルボキシ、（ＣＨ２）ｎＣＯＸＲ３、ＣＯＲ２、ＳＯ３Ｒ２、ＳＯ２ＮＲ３ Ｒ４、ＮＨＳＯ２Ｒ３、ＮＨＣＯ２Ｒ３、ＮＨＣＯＲ３、ＮＨＣＯＣＯ２Ｒ３、ＮＲ３Ｒ４、又はＣＯＮＲ３Ｒ４であり；
Ｒ２は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４ アルキル、アリール、又はアルキルアリールであり;
Ｒ３及びＲ４は、独立に、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４ アルキル、アリール、アルキルアリール、（ＣＨ２）ｎＣＯＸＲ２、（ＣＨ２）ｎＯＲ２、又は（ＣＨ２）ｎＣＯ（ＣＨ２）ｍＸＲ２であり；
ｍ＝０〜３；ｎ＝０〜３；及びＸはＯ又はＮＲ２である］
の置換されたナフタレン−１，２−ジオン；
下式
【化１１】
［式中、
Ｒ１は、Ｈ、ＮＯ２、ＮＲ３Ｒ４、ハロゲン、シアノ、アルキル、アルキルアリール、カルボニル、カルボキシ、（ＣＨ２）ｎＣＯＸＲ３、ＣＯＲ２、ＳＯ３Ｒ２、ＳＯ２ＮＲ３ Ｒ４、ＮＨＳＯ２Ｒ３、ＮＨＣＯ２Ｒ３、ＮＨＣＯＲ３、ＮＨＣＯＣＯ２Ｒ３、ＮＲ３Ｒ４、又はＣＯＮＲ３Ｒ４であり；
Ｒ２は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４ アルキル、アリール、又はアルキルアリールであり;
Ｒ３及びＲ４は、独立に、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４ アルキル、アリール、アルキルアリール、（ＣＨ２）ｎＣＯＸＲ２、（ＣＨ２）ｎＯＲ２、又は（ＣＨ２）ｎＣＯ（ＣＨ２）mＸＲ２であり；
ｍ＝０−３；ｎ＝０〜３；及びＸはＯ又はＮＲ２である］
の置換されたナフタレン−１，４−ジオン；並びに
下式
【化１２Ａ】
【化１２Ｂ】
［式中、
ｎは、０、１、又は２であり；
Ｘ１は、ＮＨ、Ｎ（ＣＨ３）、ＣＨ２、ＣＨ（ＣＨ３）、Ｃ（ＣＨ3）2、Ｏ、Ｓ、Ｓ（Ｏ）、又はＳＯ２であり:
Ｒ０は、Ｃ１−Ｃ３ アルキル、シクロプロピル、ハロ、ＯＲ５、及びＳ（Ｏ）ｍＲ５（式中、ｍは０、１、又は２である）からなる群から選択され；
Ｒ１及びＲ２は、Ｃ２−Ｃ８ アルケニル、フェニルシクロプロピル、フェニルプロペニル、Ｒ６−Ｘ２−Ｃ（Ｒ８）（Ｒ８）−Ｒ７−、Ｒ６−Ｘ２−Ｎ（Ｒ８）−Ｒ７−、及びＲ１０Ｘ３Ｒ７−からなる群から独立に選択され；
Ｒ３及びＲ４は、独立に、水素、メチル、又はエチルであり；
Ｒ５は、メチル又はエチルであり；
Ｒ６は、水素、Ｃ１−Ｃ１０ アルキル、アリール、Ｗ、Ｙ、ＮＨ２、ＮＨＣＯＮＲ３Ｒ４、ＮＨＣＯＯＲ３、及びＮＨＳＯ２Ｒ９からなる群から選択され；
Ｒ７は、直接結合、１から１０の炭素原子を有するアルキル基、アリール、−（ＮＨ）ｐ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ（ＮＨ）ｐ− （式中、ｐは０又は１であり、ｑは１から４の整数である）、及びＷからなる群から選択され；
Ｒ８は、Ｈ、Ｙ、ＯＨ、−ＮＨＣＯＮＲ３Ｒ４、−ＮＨＣＯＯＲ３、−ＮＨＳＯ２Ｒ９、−（ＣＨ２）ｒＣＯ２Ｒ３、及び（ＣＨ２）ｒＣＯＮＲ３Ｒ４（式中、ｒは１から３の整数である）からなる群から選択され；
Ｒ９は、アリール又はＣ１−Ｃ６ アルキルであり；
Ｒ１０は、Ｃ１−Ｃ１０ アルキル、アリール、及びＷから選択され；
Ｘ２は、直接結合、−ＮＨ−、−Ｎ（ＣＨ３）−、−ＮＣＯＮＲ３Ｒ４、−ＮＣＯＯＲ３、及び−ＮＳＯ２Ｒ９からなる群から選択され；
Ｘ３は、Ｏ、Ｓ、ＳＯ、及びＳＯ２から選択され；
Ｘ４は、−ＣＨ−、Ｃ−ハロゲン、−Ｃ（ＣＨ3）、又は−Ｃ（Ｃ２Ｈ5）から選択され;
Ｗは、飽和炭素環式基又は飽和複素環式基であり；
Ｙは、ＣＯＯＨ、ＣＯＯＲ３、ＣＯＮＲ３Ｒ４、ＣＯＮＨＳＯ２Ｒ５、ヒドロキシメチル、−ＣＨ２ＣＯＯＨ、ＣＨ２ＣＯＮＲ３Ｒ４、及び５−テトラゾリルからなる群から選択され；
Ｚは、−ＣＨ２−、−ＣＨ（ＣＨ３）−、−Ｃ（ＣＨ３）２−、又は−ＣＯ−である］
の化合物
である。
【００２０】
ＰＴＥＮをコードする核酸を標的とする、アンチセンスオリゴヌクレオチド及び二本鎖ＲＮＡが、本発明に係るＰＴＥＮインヒビターとして使用することができる。その様な化合物は、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる、ＷＯ ０１／０７４５７及びＷＯ ０１／９０３４１、ＷＯ ２００４／２７０３０及びＷＯ ２００４／６３３２９、並びに対応する米国特許ＵＳ６，０２０，１９９及びＵＳ６，２８４，５３８に開示されている。ＰＴＥＮに特異的なインヒビターとして作用する抗体及び／又は抗体断片も本発明の範囲内である。
【００２１】
本発明は、原始卵胞のインビトロ活性化に使用することが潜在的に可能である化合物を同定するための方法も提供する。前記方法は、ＰＴＥＮ活性のインヒビターとして作用する化合物の機能を測定する工程を含む。
【００２２】
ＰＴＥＮ活性は、Ｓｃｈｍｉｄ ｅｔ ａｌ（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ ２００４，５６６：３５−３８）によって開示されているようにリン酸の放出として測定することができる。本質的には、組換えＰＴＥＮの酵素活性は、５０ｎｇ／μｌ ＢＳＡ、１５０μＭ合成ジパルミトイル−ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｓ）、及び０．２５％（ｗ／ｖ）オクチルグリコシド（Ｓｉｇｍａ）を含有する２００ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４中において３０℃で３０分間に亘って測定される。酵素反応を停止するために、０．７倍量の呈色剤（３．６Ｍ ＨＣｌ及び１７ｍＭモリブデン酸アンモニウム中の２．３ｍｇ／ｍｌマラカイトグリーン）をアッセイ系に添加する。その混合物を２０分間に亘って放置して、６２５ｎｍの吸光を測定する。
【００２３】
化合物が１００μＭ未満のＩＣ５０、好ましくは１０μＭ未満のＩＣ５０、又はより好ましくは１μＭ未満のＩＣ５０を有する場合は、前記化合物をＰＴＥＮの阻害剤として同定する。
【００２４】
ＰＴＥＮインヒビターの機能は、ＰＴＥＮの存在下におけるＰＩ３Ｋキナーゼ活性の増大を測定することによって検証することができ、ＰＩ３Ｋキナーゼ活性は、セリン４７３におけるＡｋｔのリン酸化レベルを測定することによっても測定できる。
【００２５】
本発明は、本発明の方法による原始卵胞の活性化を含む、卵母細胞のインビトロ成熟方法も提供する。
【００２６】
本発明は、必要な胚を移植する工程を含む、インビトロ受精の方法であって、前記胚が、成熟した卵母細胞を精子で処理する工程を含む方法によって製造され、前記卵母細胞が、本発明の方法による原始卵胞の活性化を含む方法によって製造される、方法も提供する。
【００２７】
本発明は、卵母細胞に由来する胚を雌性の哺乳動物に移植する工程を含む、雌性の哺乳動物における、インビトロ受精又は胚移植後の胚の発達を改善するための方法であって、前記卵母細胞が、本発明の方法による原始卵胞の活性化を含む方法によって製造される、方法も提供する。
【００２８】
本発明は、１つ又は複数のＰＴＥＮインヒビターを含む組成物の投与を含む、卵胞及び卵母細胞のインビボ活性化及び成熟のための方法も提供する。好ましくは、前記投与は、局所注射、より好ましくは卵胞内又は卵巣被膜内注射で為される。前記卵胞は、原始卵胞、中間卵胞、及び一次卵胞などの未成長卵胞であってよい。前記方法は、家畜又は絶滅危惧種などの動物又は人に適用することができる。前記家畜は、例えば、ウマ、ウシ、ブタ、ネコ、及びイヌであってよい。
【００２９】
前記局所注射は、腹腔鏡検査又は超音波を用いて実施してよい。
【００３０】
本発明は、卵胞及び卵母細胞のインビボ活性化及び成熟、具体的には、原始卵胞、中間卵胞、及び一次卵胞などの未成長卵胞のインビボ活性化に使用するための医薬組成物の調製における、１つ又は複数のＰＴＥＮインヒビターの使用も提供する。前記組成物は、局所注射又は他のタイプの局所送達、好ましくは、卵胞内又は卵巣被膜内注射によって投与されることを意図することができる。前記組成物は、ヒト又は獣医学的用途を意図することができる。
【００３１】
本発明は、卵胞及び卵母細胞のインビボ活性化及び成熟、具体的には、原始卵胞、中間卵胞、及び一次卵胞などの未成長卵胞のインビボ活性化に使用するための１つ又は複数のＰＴＥＮインヒビターを含む組成物も提供する。前記組成物は、製薬学的に許容される担体、賦形剤、又は希釈剤をさらに含むことができる。前記組成物は、局所注射、好ましくは卵胞内又は卵巣被膜内注射用に製剤化することができる。前記組成物は、ヒト又は獣医学的用途を意図することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】図１は、卵母細胞からＰＴＥＮを欠失させたマウスにおける原始卵胞の過剰活性化を示す図である。３５日齢のマウスに由来する卵巣をパラフィンに埋め込み、８μｍの厚みの切片を作製して、ヘマトキシリンで染色した。Ａ．対照マウス：対照の正常マウスでは、原始卵胞が存在する（挿入図の矢印）。Ｂ〜Ｃ．卵母細胞のＰＴＥＮが欠失しているマウス。ＰＴＥＮが欠失している卵母細胞では、全ての卵胞が早熟に成長し（Ｃ，矢印）、卵巣全体が非常に大きい（Ｂ）。
【図２】図２は、ＰｔｅｎｌｏｘＰ／ｌｏｘＰ；ＧＣｒｅ＋卵母細胞におけるＡｋｔシグナル伝達の促進を示す図である。卵母細胞をＰＤ５及びＰＤ１２−１４においてＰｔｅｎｌｏｘＰ／ｌｏｘＰ；ＧＣｒｅ＋マウス及びＰｔｅｎｌｏｘＰ／ｌｏｘＰマウスの卵巣から単離して、ウエスタンブロットを実施した。（Ａ）ＰＤ１２−１４ ＰｔｅｎｌｏｘＰ／ｌｏｘＰ；ＧＣｒｅ＋卵母細胞及びＰｔｅｎｌｏｘＰ／ｌｏｘＰ卵母細胞におけるｐ−Ａｋｔ（セリン４７３）及び全Ａｋｔのレベル。（Ｂ）ＰＤ１２−１４ ＰｔｅｎｌｏｘＰ／ｌｏｘＰ；ＧＣｒｅ＋卵母細胞及びＰｔｅｎｌｏｘＰ／ｌｏｘＰ卵母細胞におけるキットリガンド（ＫＬ）処理（１００ｎｇ／ｍｌ、２分）によるＡｋｔ（ｐ−Ａｋｔ、セリン４７３）の活性化。Ａｋｔのレベルは内部対照を使用した。（Ｃ）ｐ−Ａｋｔ（セリン４７３）、ｒｐＳ６、ｐ−ｒｐＳ６（セリン２３５／６）、ｐ−ｍＴＯＲ（セリン２４４８）、ｐ−ＴＳＣ２（スレオニン１４６２）、及びｐ−Ｓ６Ｋ（スレオニン２８９）を示す、ＰＤ５及びＰＤ１２−１４におけるＰｔｅｎｌｏｘＰ／ｌｏｘＰ；ＧＣｒｅ＋卵母細胞及びＰｔｅｎｌｏｘＰ／ｌｏｘＰ卵母細胞におけるシグナル伝達試験。全Ａｋｔのレベル、ｍＴＯＲ、ＴＳＣ２、Ｓ６Ｋ、及びβ−アクチンを内部対照として使用した。全ての実験を少なくとも３回繰り返した。ウエスタンブロットのためにＰＤ５卵母細胞を単離するために、１０−１５ＰｔｅｎｌｏｘＰ／ｌｏｘＰ；ＧＣｒｅ＋マウス又はＰｔｅｎｌｏｘＰ／ｌｏｘＰマウスを各レーンで使用した。ＰＤ１２−１４卵母細胞の単離のために、３−５ＰｔｅｎｌｏｘＰ／ｌｏｘＰ；ＧＣｒｅ＋マウス又は６−１０ ＰｔｅｎｌｏｘＰ／ｌｏｘＰマウスをレーン毎に使用した。各レーンに、３０から４０μｇのタンパク質サンプルをロードした。
【図３】図３は、ＰＴＥＮインヒビターが、培養したマウス卵巣中の原始卵胞の生存及び発達を促進することを示す図である。原始卵胞を含有する出産後４日のマウス卵巣を、（Ａ）担体又は（Ｂ）ＰＴＥＮインヒビターｂｐｖ（Ｈｏｐｉｃ）とともに８日間に亘って培養した。ＰＴＥＮインヒビターは、培養卵巣中の卵胞の生存率を改善する（Ｂ中の矢印にたいしてＡ中の矢印、ＰＴＥＮインヒビターで処理した卵巣における壊死から救われていることを示す）。また、ＰＴＥＮインヒビターは、原始卵胞を成長段階に活性化するための重要なステップである、平坦な前顆粒膜細胞（矢頭、Ａ）から球状の顆粒膜細胞（矢頭、Ｂ）への増殖及び分化を刺激する。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
現在、動物又はヒトの原始卵胞がインビトロで培養される場合には、それらの成長を開始させ、成熟させることが非常に困難である。本発明によれば、ＰＴＥＮインヒビターの存在下において、ヒト又は家畜／絶滅危惧種由来の原始卵胞をインビトロで活性化すること、すなわち、原子卵胞の成長を開始させることが可能である。これらの活性化された卵胞は、次いで、成熟するまで培養され、インビトロ受精に使用できる。
【００３４】
前記方法は、ヒト又は家畜／絶滅危惧種に由来する原始卵胞を含有する卵巣の切片を培養し、１つ又は複数のＰＴＥＮインヒビターで一時的に処理して、その成長を開始させる。卵胞の成長が誘導されたら、ＰＴＥＮインヒビターを断ち、現在利用可能な技術を用いて、更なる卵胞培養を通常通りに維持する。
【００３５】
この方法は、天然には活性化され得ない原始卵胞を有する女性、又は癌の化学療法又は放射線照射を経る女性に有用である。この方法は、卵胞の供給源及びインビトロ受精の成功率を増大させるために、家畜又は絶滅危惧種の原始卵胞をインビトロで活性化するためにも使用できる。
【００３６】
培養した卵胞切片におけるＰＴＥＮ活性の効果的な抑制は、同時に培養されるマウス卵巣の切片を使用して観察することができる。
【実施例】
【００３７】
（実施例１）哺乳動物の卵胞活性化における卵母細胞ＰＩ３Ｋ経路の機能的役割
哺乳動物の卵胞活性化における卵母細胞ＰＩ３Ｋ経路の機能的役割を試験するために、卵母細胞において特異的に活性化するｇｒｏｗｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ（Ｇｄｆ−９）プロモーター媒介Ｃｒｅリコンビナーゼを発現するトランスジェニックマウス（Ｌａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２００４，７１：１４６９）ＧＣｒｅマウスと称される）と、ＰｔｅｎｌｏｘＰ／ｌｏｘＰマウス（Ｇｒｏｓｚｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００１，２９４：２１８６）とを交配させることによってマウス卵母細胞からＰｔｅｎ遺伝子を欠失させた。６から３４週齢の試験期間の間に、ＰｔｅｎｌｏｘＰ／ｌｏｘＰ；ＧＣｒｅ＋のメス、すなわち、卵母細胞からＰＴＥＮを欠失させたマウスが、最大で一匹の子を産んだが、成人期の早期（すなわち、１２から１３週齢後）に不妊になった。卵母細胞からのＰｔｅｎの欠失がマウスの妊娠をどのように妨げるのか試験するために、本発明者は、ＰｔｅｎｌｏｘＰ／ｌｏｘＰ；ＧＣｒｅ＋マウス及び対照（ＰｔｅｎｌｏｘＰ／ｌｏｘＰ）マウスにおける原始卵胞発達の第一波を比較した。ＰｔｅｎｌｏｘＰ／ｌｏｘＰ；ＧＣｒｅ＋マウス及び対照マウスの妊娠後の日にち（ＰＤ）で５日目の卵巣には、明確な形態学的相違は認められなかった。双方の遺伝子型の卵巣は、平坦な前顆粒膜細胞に覆われた小さな卵母細胞を含有する多数の原始卵胞、及び大きくなった卵母細胞を含有する幾つかの活性化した卵胞を同程度の数で有していた。ＰＤ３５までに、ＰｔｅｎｌｏｘＰ／ｌｏｘＰ；ＧＣｒｅ＋卵巣（図１，Ｂ）は対照の卵巣よりも大きい状態であり、より活性化された卵胞を顕著に含有していた（図１，Ｃ）。実際は、原始卵胞が変異型の卵胞では認められなかったが、対照の卵胞における大半の卵胞は依然として原始段階にあった。したがって、原始卵胞のプール全体が、ＰｔｅｎｌｏｘＰ／ｌｏｘＰ；ＧＣｒｅ＋卵胞では活性化されていた。
【００３８】
かくして、原始卵胞のプールの活性化が、卵胞枯渇につながった。これによって、ＰｔｅｎｌｏｘＰ／ｌｏｘＰ；ＧＣｒｅ＋マウスにおけるＰＯＦ（早熟卵巣不全）が生じる。これらのマウスにおいて観察された表現型は、ヒトのＰＯＦと類似している（Ｂｅｃｋ−Ｐｅｃｃｏｚ ａｎｄ Ｐｅｒｓａｎｉ，Ｏｒｐｈａｎｅｔ．Ｊ．Ｒａｒｅ．Ｄｉｓ．２００６，１：９）。ＰｔｅｎｌｏｘＰ／ｌｏｘＰ；ＧＣｒｅ＋卵胞における卵母細胞の肥大の促進の根底にある分子メカニズムを解明するために、ＰＤ１２−１４ ＰｔｅｎｌｏｘＰ／ｌｏｘＰ；ＧＣｒｅ＋マウス及び対照マウスの卵胞から単離した卵母細胞におけるＡｋｔシグナル伝達を調べた。インビトロで培養して、血清飢餓状態にしたＰｔｅｎｌｏｘＰ／ｌｏｘＰ；ＧＣｒｅ＋卵母細胞において、リン酸−Ａｋｔ（ｐ−Ａｋｔ、セリン４７３）のレベルが上昇していることが認められた。加えて、卵母細胞表面受容体であるＫｉｔを解して卵母細胞を成長させる際にＰＩ３Ｋ経路を活性化することができる（Ｒｅｄｄｙ ｅｔ ａｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２００５，２８１：１６０）、Ｋｉｔリガンド（ＫＬ）が、対照の卵母細胞よりも、ＰｔｅｎｌｏｘＰ／ｌｏｘＰ；ＧＣｒｅ＋卵母細胞において大きくＡｋｔを活性化した（図２ ２Ｂ）。かくして、卵母細胞におけるＰｔｅｎの欠失は、卵母細胞のＰＩ３Ｋ／Ａｋｔシグナル伝達の促進を生じさせる。ＰｔｅｎｌｏｘＰ／ｌｏｘＰ；ＧＣｒｅ＋卵母細胞における卵母細胞成長の促進の原因を調べるために、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔシグナル伝達の促進が、リボソームタンパク質Ｓ６（ｒｐＳ６）の活性化の増大を引き起こすかどうか試験した。ＰｔｅｎｌｏｘＰ／ｌｏｘＰ；ＧＣｒｅ＋卵母細胞及び対照の卵母細胞との間に明らかな形態学的相違がない発達段階である（図２，Ａ−Ｃ）、ＰＤ５において、Ａｋｔの活性化が、ＰｔｅｎｌｏｘＰ／ｌｏｘＰ；ＧＣｒｅ＋卵母細胞において既に促進されていた（図２Ｃ、ＰＤ５、ｐ−Ａｋｔ）。これは、ｒｐＳ６の発現（図２Ｃ，ＰＤ５，ｒｐＳ６）及びリン酸化（活性化を示す）の促進と相関している（図２Ｃ，ＰＤ５，ｐ−ｒｐＳ６，セリン２３５／６）。この結果は、卵母細胞におけるＧｄｆ−９−Ｃｒｅ媒介Ｐｔｅｎ欠失がまさに生じた際に、タンパク質翻訳の促進が既に開始していたことを示唆する。同様に、ＰＤ１２−１４におけるＰｔｅｎｌｏｘＰ／ｌｏｘＰ；ＧＣｒｅ＋卵巣から単離した卵母細胞において、促進されたＰＩ３Ｋ／Ａｋｔシグナル伝達が、ｒｐＳ６の発現及びリン酸化の双方の上昇を生じさせる（図２Ｃ，ＰＤ１２−１４）。しかしながら、ｍａｍｍａｌｉａｎ ｔａｒｇｅｔ ｏｆ ｒａｐａｍｙｃｉｎ（ｍＴＯＲ）−ｐ７０ Ｓ６キナーゼ（Ｓ６Ｋ）カスケードの活性化は、Ｐｔｅｎの欠失によって増大せず、リン酸−ｍＴＯＲ（ｐ−ｍＴＯＲ、セリン２４４８）、リン酸−チューブリン／ＴＳＣ２（ｐ−ＴＳＣ２、スレオニン１４６２）、及びリン酸−Ｓ６Ｋ（ｐ−Ｓ６Ｋ、スレオニン３８９）はＰＤ５及びＰＤ１２−１４において、ＰｔｅｎｌｏｘＰ／ｌｏｘＰ；ＧＣｒｅ＋卵母細胞及び対照の卵母細胞において類似したままであった（図２Ｃ）。かくして、ｒｐＳ６の活性化の促進は、ｒｐＳ６発現の上昇自体によって生じていた（図２Ｃ）。しかしながら、変異型の卵母細胞におけるｒｐＳ６及びｓ６Ｋのリン酸化は、ＰＩ３Ｋ特異的インヒビターであるＬＹ２９４００２及びｍＴＯＲ特異的インヒビターであるラパマイシンに対して感受性を有し、このことは、ＰｔｅｎｌｏｘＰ／ｌｏｘＰ；ＧＣｒｅ＋卵母細胞におけるｒｐＳ６の活性化がＰＩ３Ｋ及びｍＴＯＲの活性化に依存することを示す。未知の卵巣内因子が幾つかの原始卵胞を刺激して、成長促進するが、残りの卵胞は休止したままであることは以前から仮説があった。
【００３９】
（実施例２）ＰＴＥＮインヒビターは、培養したマウス卵胞における原始卵胞の生存及び発達を促進する
妊娠後の日にちで４日目のマウス卵巣を無菌で取り出し、Ｃｅｌｌ Ｓｔｒａｉｎｅｒ（４０μｍの孔径）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ，Ｓｗｅｄｅｎ）において、１０μＭのＰＴＥＮインヒビターであるｂｐＶ−ＨＯｐｉｃ（二カリウムビスペルオキソ（５−ヒドロキシピリジン−２−カルボキシル）オキソバナデート（Ｖ）、Ｋ２［ＶＯ（Ｏ２）２Ｃ６Ｈ４ＮＯ３］）とともに又は無しで、２８ｍＭアスコルビン酸及び０．３％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを添加した１ｍｌのα−ＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）中で卵巣全体を培養した。培養期間にわたって三分の一の培地を新しい培地に毎日交換して、加湿インキュベーター（５％ＣＯ２、３７℃）で、培養卵巣をインキュベートした。固定化するために、前記卵巣をＰＢＳで一度洗浄して、４％パラホルムアルデヒドで一晩固定化し、形態分析用の埋め込みを実施した。
【００４０】
ＰＴＥＮインヒビターは、培養卵巣における卵胞の生存率を向上する（図３Ｂ矢印に対して、図３Ａ矢印）。このことは、ＰＴＥＮインヒビターで処理した卵胞は壊死から救出されたことを示す。また、ＰＴＥＮインヒビターは、原始卵胞を成長段階へと活性化するために必要なステップである、平坦な前顆粒細胞（図３Ａの矢頭）の球状の顆粒細胞（図３Ｂの矢頭）への増殖及び分化を刺激する。
【００４１】
結論
これらの実験データは、卵母細胞のＰＴＥＮが卵胞活性化の抑制因子として働くことを示す。卵母細胞内のＰＴＥＮ／ＰＩ３Ｋシグナル伝達カスケードは、卵母細胞の成長の開始に役割を担っているようである。本発明者は、各個体の卵母細胞におけるＰＩ３Ｋ経路の活性化が、原始卵胞の運命、すなわち、休止したままでいるか否か、ある時期に活性化されるか否か、又は原始段階から直接閉鎖するか否かを決定するのに重要であることを提示する。さらに、原始卵胞の過剰な活性化及び枯渇によって引き起こされる、Ｐｔｅｎを卵胞特異的に欠失したマウスのＰＯＦの特有の卵巣表現型が示されている。かくして、本試験の発見は、広く生理学的及び臨床的意味を有し、正常な卵巣の生理及び卵巣疾患の発症の双方における深い理解に寄与する。ヒトでは、ＰＯＦは、初潮がない（原発性無月経）ことに特徴付けられる原発性卵巣異常又は４０歳前の卵胞の早期枯渇／卵胞生産の停止（続発性無月経）として定義され、１％の確率で生じると見積もられている（Ｂｅｃｋ−Ｐｅｃｃｏｚ ａｎｄ Ｐｅｒｓａｎｉ，Ｏｒｐｈａｎｅｔ．Ｊ．Ｒａｒｅ．Ｄｉｓ．２００６，１：９）。ＰＯＦの様々なあり得る原因のうち、卵胞の過剰な活性化及び枯渇を生じさせる遺伝的変異が、ヒトにおいては、その１つである可能性がある。一方、それら双方が卵母細胞のＰＩ３Ｋ経路の活性化不足によって生じ得る、卵胞活性化の遅延及び／又は過剰な原始卵胞の閉鎖が、他方からＰＯＦを生じさせ得る。卵母細胞におけるＰＴＥＮ／ＰＩ３Ｋシグナル伝達ネットワークの重要性の認識が、哺乳動物の卵巣の生理学的及び病理学的プロセスの理解に関する新しい展望を開く。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、卵胞及び卵母細胞のインビトロ成熟に使用する方法に関する。より具体的には、本発明は、卵胞及び卵母細胞のインビトロ成熟方法における、ホスファターゼであるＰＴＥＮのインヒビターの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
成熟を達成するための卵胞の活性化の誘導は、研究目的のみならず多数の応用分野において強く望まれている。原始卵胞は、インビトロ受精のための卵母細胞の供給源として潜在的に役に立ち得るものであるが、活性化及び成熟された卵胞を他の用途、例えば、化学療法後又は放射線照射後の癌の治療に利用することも非常に重要である。しかしながら、現在は、原始卵胞を活性化する手段がなく、これは、潜在的に重要な卵母細胞の供給源が利用されないままであることを示す。インビトロ受精に関する議論を踏まえて、そのような考察がますます重要になっている。
【０００３】
病院では、女性の原始卵胞が成長し始めることができなければ、すなわち、休止状態から活性化され得なければ、その卵胞は、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）などのホルモンに対して応答しないであろう。そうすると、その女性は不妊症であることとなり、彼女自身の卵母細胞をインビトロ受精に使用することができない。現在では、上述のように、インビトロ受精のための卵母細胞の供給源として原始卵胞を使用するための技術が存在しない。かくして、各種の用途のために卵胞のインビボ及び／又はインビトロ活性化及び成熟のいずれかを誘導するための方法を開発することが当該技術分野において必要とされている。
【０００４】
先行技術文献においては、イノシトールリン脂質のイノシトール環上の３’−ＯＨをリン酸化する、脂質キナーゼのホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）が開示されている。脂質ホスファターゼであるＰＴＥＮ（ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ａｎｄ ｔｅｎｓｉｎ ｈｏｍｏｌｏｇ ｄｅｌｅｔｅｄ ｏｎ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ｔｅｎ）は当該プロセスを逆行させ、かくして、ＰＩ３Ｋの作用の主要な負の調節因子として作用する（非特許文献１）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｃａｎｔｌｅｙ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００２， ２９６： １６５５−１６５７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明者は、原始卵胞の活性化を抑制する因子としてＰＴＥＮを同定した。卵母細胞特異的にＰｔｅｎ遺伝子が欠失したマウスモデルにおいて、全ての原始卵胞が時期尚早に活性化された。
【０００７】
したがって、本発明は、ＰＴＥＮの１つ又は複数のインヒビターの使用を含む、卵胞及び卵母細胞のインビトロ活性化及び成熟のための方法を提供する。前記方法は、インビトロ受精のための卵胞及び卵母細胞のインビトロ成熟の間に卵胞を活性化するために用いることができる。前記卵胞は、未成長卵胞、例えば、原始卵胞、中間卵胞（ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ ｆｏｌｌｉｃｌｅ）、及び一次卵胞であってよい。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、ＰＴＥＮの１つ又は複数のインヒビターを含む生理学的に許容される媒体中で卵胞及び／又は卵母細胞をインキュベートする工程を含んでよい。前記媒体は、ＦＳＨ及び／又はＣＧなどのゴナドトロピンをさらに含んでよい。
【０００９】
インキュベートの期間は、卵胞及び／又は卵母細胞の活性化及び／又は成熟が得られるのに十分な任意の時間であってよい。
【００１０】
ＰＴＥＮインヒビターは、卵胞及び／又は卵母細胞の活性化及び／又は成熟が得られる任意の濃度、例えば、１ｎＭから１．０ｍＭ、特に１．０から１００μＭの間の濃度で存在してよい。
【００１１】
本発明の好ましい実施態様では、卵胞及び／又は卵母細胞の活性化及び／又は成熟は、以下の工程：（ｉ）適切な対象から卵胞及び／又は卵母細胞の活性化及び／又は成熟のための適切な細胞及び／又は器官を得る工程、（ｉｉ）例えば実質的に３７℃かつ約５％のＣＯ２において、加湿インキュベーター中で前記細胞及び／又は器官を培養する工程、（ｉｉｉ）前記卵胞及び／又は卵母細胞の活性化及び／又は成熟を誘導するために、１ｎＭから１．０ｍＭ、好ましくは１．０から１００μＭの間の濃度のＰＴＥＮインヒビターとともに一時的又は持続的に前記細胞及び／又は器官をインキュベートする工程、及び（ｉｖ）本発明の範囲内で得られたものを利用する工程を含む。
【００１２】
本発明に係る方法は、ヒトの卵胞、又は家畜若しくは絶滅危惧種などの動物に由来する卵胞に適用することができる。前記家畜は、例えば、ウマ、ウシ、ブタ、ネコ、及びイヌなどであってよい。
【００１３】
本発明は、卵胞及び卵母細胞のインビトロ成熟、具体的には、原始卵胞、中間卵胞、及び一次卵胞などの未成長卵胞のインビトロ活性化の改善において使用するための医薬の調製における、１つ又は複数のＰＴＥＮインヒビターの使用も提供する。
【００１４】
卵胞及び卵母細胞のインビトロ成熟、具体的には、原始卵胞、中間卵胞、及び一次卵胞などの未成長卵胞のインビトロ活性化を促進するための１つ又は複数のＰＴＥＮインヒビターを含む組成物も提供する。前記組成物は、製薬学的に許容される担体、賦形剤、又は希釈剤も含むことができる。
【００１５】
ＰＴＥＮインヒビターは、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる、ＷＯ ２００５／０９７１１９及び対応する米国出願１０／５９９，７４８、ＷＯ ２００４／０７５８９７及び対応する米国出願ＵＳ１０／５４６，６３２に開示されている。
【００１６】
ＰＤＺドメイン相互作用、特にＭＡＧＩ（ｍｅｍｂｒａｎｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｇｕａｎｙｌａｔｅ ｋｉｎａｓｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｗｉｔｈ ｉｎｖｅｒｓｅ ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ）と結合したＰＴＥＮにおけるＰＤＺドメインの間の相互作用のインヒビターは、本発明に係るＰＴＥＮ活性のインヒビターとして使用することができる。その様なインヒビターは、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる、ＷＯ ２００４／０９２３４６、ＵＳ７，１４１，６００、ＷＯ ２００６／０７５４２に開示されている。
【００１７】
ペルオキソバナジウム錯体が、ＰＴＥＮの強力なインヒビターであることが示されている（Ｓｃｈｍｉｄ ｅｔ ａｌ． ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ ２００４， ５６６： ３５-３８； Ｒｏｓｉｖａｔｚ ｅｔ ａｌ． ＡＣＳ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ ２００６， １ ： ７８０−７９０）。
【００１８】
ペルオキソバナジウム錯体の合成は、Ｓｈａｖｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｉｎｏｒｇ Ｃｈｅｍ １９９３， ３２：３１０９−３１１３）、Ｒｏｓｉｖａｔｚ ｅｔ ａｌ．（ＡＣＳ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ ２００６， １： ７８０−７９０）、及びＰｏｓｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ １９９４，２６９：４５９６−６０４）に開示されているように実施することができる。
【００１９】
本発明によって使用することができる化合物の例は、
ｂｐＶ（ｂｉｐｙ）、カリウムビスペルオキソ（ビピリジン）オキソバナデート（Ｖ）、Ｋ［ＶＯ（Ｏ２）２Ｃ１０Ｈ８Ｎ２］・
ｂｐＶ（ｐｈｅｎ）、カリウムビスペルオキソ（ｌ，１０−フェナントロリン）オキソバナデート（Ｖ）、Ｋ［ＶＯ（Ｏ２）２ＣＩ２Ｈ８Ｎ２］
ｂｐＶ（ｐｉｃ）、二カリウムビスペルオキソ（ピコリナト）オキソバナデート（Ｖ）、Ｋ２［ＶＯ（Ｏ２）２Ｃ６Ｈ４ＮＯ２］・
ｂｐＶ−ＨＯｐｉｃ、二カリウムビスペルオキソ（５−ヒドロキシピリジン−２−カルボキシル）オキソバナデート（Ｖ） Ｋ２［ＶＯ（Ｏ２）２Ｃ６Ｈ４ＮＯ３］・
ＶＯ−ｐｉｃ、ジ−（ピコリネート）オキソバナデート（ＩＶ）、ＶＯＣ１０Ｈ１０ＮＯ４
ＶＯ−ＯＨｐｉｃ、ジ−（３−ヒドロキシピコリネート）オキソバナデート（ＩＶ）、ＶＯＣ１０Ｈ１０ＮＯ６
ｂｐＶ−ｂｉｇｕａｎ、カリウムビスペルオキソ（フェニルビグアニド）オキソバナデート（Ｖ）、Ｋ［ＶＯ（Ｏ２）２Ｃ８Ｈ１１Ｎ５］
ＶＯ−ｂｉｇｕａｎ、ジ−（フェニルビグアニド）オキソバナデート（ＩＶ）、ＶＯＣ１６Ｈ２０Ｎ１０
ｂｐＶ−ｉｓｏｑｕ、二カリウムビスペルオキソ（イソキノリンカルボン酸）オキソバナデート（Ｖ）、Ｋ２［ＶＯ（Ｏ２）２Ｃ１０Ｈ７ＮＯ２］；
下式
【化１】
［式中、
Ｒはシクロアルキル基であり、
Ａは低級アルキレン基であり、
カルボスチリル核の３位及び４位の間の結合は、単結合又は二重結合を意味する］
の化合物；
下式
【化２】
［式中、
Ｒ１は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ３アルキル、アリール、アルキルアリール、（ＣＨ２）ｎＣＯＸＲ３、（ＣＨ２）ｎＸＣＯＲ３、（ＣＨ２）ｎＣＯＲ３、（ＣＨ２）ｎＳＯ２Ｒ３、（ＣＨ２）ｎＸＲ３、（ＣＨ２）ｎＳＯ２ＸＲ３、（ＣＨ２）ｎＸＳＯ２Ｒ３、（ＣＨ２）ｎＮＲ３Ｒ４、又は（ＣＨ２）ｎＣＯ（ＣＨ２）ｍＸＲ３であり；
Ｒ２は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ３アルキル、アリール、アルキルアリール、（ＣＨ２）ｎＣＯＸＲ３、（ＣＨ２）ｎＸＣＯＲ３、（ＣＨ２）ｎＣＯＲ３、（ＣＨ２）ｎＳＯ２Ｒ３、（ＣＨ２）ｎＸＲ３、（ＣＨ２）ｎＳＯ２ＸＲ３、（ＣＨ２）ｎＸＳＯ２Ｒ３、（ＣＨ２）ｎＮＲ３Ｒ４、又は（ＣＨ２）ｎＣＯ（ＣＨ２）ｍＸＲ３であり；
Ｒ３、Ｒ５、Ｒ６は、独立して、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、アリール、又はアルキルアリールであり；
Ｒ４は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、アリール、アルキルアリール、ＮＨＳＯ２Ｒ５、ＮＨＣＯ２Ｒ５、又はＮＲ５Ｒ６；
ｍ＝０から３；ｎ＝０から３；及びＸはＯ又はＮＲ４である］
から選択されるアスコルビン酸誘導体又はデヒドロアスコルビン酸誘導体；
下式
【化３】
［式中、
Ｒ１は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、アリール、アルキルアリール、ＣＯＸＲ２、ＣＯＲ２、ＳＯ２ＸＲ２、又はＳＯ２Ｒ２であり；
Ｒ２は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、アリール、アルキルアリール、（ＣＨ２）ｎＣＯＸＲ４、（ＣＨ２）ｎＸＣＯＲ４、（ＣＨ２）ｎＸ Ｒ４、（ＣＨ２）ｎＳＯ２ＸＲ４、（ＣＨ２）ｎＸＳＯ2Ｒ４、ＮＨＳＯ２Ｒ４、ＮＨＣＯＲ４、ＮＨＣＯ２Ｒ４、ＮＨＣＯＣＯ２Ｒ４、又はＮＲ４Ｒ５であり；
Ｒ３は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、アリール、アルキルアリール、（ＣＨ２）ｎＣＯＸＲ４、（ＣＨ２）ｎＸＣＯＲ４、（ＣＨ２）ｎＸＲ４、（ＣＨ2）ｎＳＯ２ＸＲ４、（ＣＨ２）ｎＸＳＯ２Ｒ４、ＮＨＳＯ２Ｒ４、ＮＨＣＯＲ４、ＮＨＣＯ２Ｒ４、ＮＨＣＯＣＯ２Ｒ４、又はＮＲ４Ｒ５であり；
Ｒ４は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、アリール、又はアルキルアリールであり:
Ｒ５は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、アリール、アルキルアリール、ＮＨＳＯ２Ｒ６、ＮＨＣＯＲ６、ＮＨＣＯ２Ｒ６、ＮＲ６Ｒ７、又はＮ＝Ｃ（Ｒ６Ｒ７）であり；
Ｒ６は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、アリール、又はアルキルアリールであり；
Ｒ７は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、アリール、又はアルキルアリールであり；
ｎ＝０から３；及びＸはＯ又はＮＲ５である］
の化合物；
下式
【化４】
［式中、
Ａは５又は６員環であり；Ｒ１は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ３アルキル、アリール、アルキルアリール、（ＣＨ２）ｎＣＯＸＲ３、（ＣＨ２）ｎＸＣＯＲ３、（ＣＨ２）ｎＣＯＲ３、（ＣＨ２）ｎＳＯ２Ｒ３、（ＣＨ２）ｎＸＲ３、（ＣＨ２）ｎＳＯ２ＸＲ３、（ＣＨ２）ｎＸＳＯ２Ｒ３、ＮＨＳＯ２Ｒ３、ＮＨＣＯ２Ｒ３、ＮＨＣＯＲ３、ＮＨＣＯＣＯ２Ｒ３、ＮＲ３Ｒ４、又は（ＣＨ２）ｎＣＯ（ＣＨ２）ｍＸ３であり;
Ｒ２は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ３アルキル、アリール、アルキルアリール、（ＣＨ２）ｎＣＯＸＲ３、（ＣＨ２）ｎＸＣＯＲ３、（ＣＨ２）ｎＣＯＲ３、（ＣＨ２）ｎＳＯ２Ｒ３、（ＣＨ２）ｎＸＲ３、（ＣＨ２）ｎＳＯ２ＸＲ３、（ＣＨ２）ｎＸＳＯ２Ｒ３、ＮＨＳＯ２Ｒ３、ＮＨＣＯ２Ｒ３、ＮＨＣＯＲ３、ＮＨＣＯＣＯ２Ｒ３、ＮＲ３Ｒ４、又は（ＣＨ２）ｎＣＯ（ＣＨ２）ｍＸ３であり；
Ｒ３は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、アリール、又はアルキルアリールであり；
Ｒ４は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、アリール、アルキルアリール、ＮＨＳＯ２Ｒ５、ＮＨＣＯ２Ｒ５、又はＮＲ５Ｒ６であり；
Ｒ５は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、アリール、又はアルキルアリールであり；
Ｒ６は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、アリール、又はアルキルアリールであり；ｎ＝０から３；ｍ＝０から３；及びＸは、Ｏ又はＮＲ４であり；Ａは、飽和、不飽和、又は芳香族であってよく、任意にＮ及びＯを含んでよい］
の化合物；
下式
【化５】
［式中、
Ｒ１は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、アリール、アルキルアリール、（ＣＨ２）ｎＣＯＸＲ３、（ＣＨ2）ｍＸＣＯＲ３、（ＣＨ2）ｍＸＲ３、（ＣＨ２）ｎＣＯＲ３、（ＣＨ２）ｎＳＯ２ＸＲ３、又は（ＣＨ２）ｍＸＳＯ２Ｒ３であり；
Ｒ２は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、アリール、又はアルキルアリールであり；
Ｒ３は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、アリール、又はアルキルアリールであり；
Ｒ４は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、アリール、アルキルアリール、ＮＨＳＯ２Ｒ５、ＮＨＣＯ２Ｒ５、Ｎ＝Ｃ（Ｒ５Ｒ６）、又はＮＲ５Ｒ６であり；
Ｒ５は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、アリール、又はアルキルアリールであり；
Ｒ６は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、アリール、又はアルキルアリールであり；ｍ＝１から３；ｎ＝０から３；及びＸはＯ又はＮＲ４である］
下式
【化６】
［式中、
Ｒｌは、Ｏ、Ｃ１−Ｃ４ アルキル、（ＣＨ２）ｎＣＯＸＲ２、（ＣＨ２）ｎＸＣＯＲ２、（ＣＨ２）ｎＸＲ２、（ＣＨ２）ｎＣＯＲ２、（ＣＨ２）ｎＳＯ２ＸＲ２、（ＣＨ２）ｎＸＳＯ2Ｒ２、又は（ＣＨ２）ｎＳＯ２Ｒ２であり；
Ｒ２は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４ アルキル、アリール、アルキルアリール、ＮＨＳＯ２Ｒ４、ＮＨＣＯＲ４、ＮＨＣＯ２Ｒ４、ＮＨＣＯＣＯ２Ｒ４、又はＮＲ４Ｒ５であり；
Ｒ３は、Ｈ、Ｃｌ−Ｃ４ アルキル、アリール、アルキルアリール、ＮＨＳＯ２Ｒ４、ＮＨＣＯＲ４、ＮＨＣＯ２Ｒ４、ＮＨＣＯＣＯ２Ｒ４、又はＮＲ４Ｒ５であり；
Ｒ４は、Ｈ、Ｃｌ−Ｃ４ アルキル、アリール、又はアルキルアリールであり；
Ｒ５は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４ アルキル、アリール、又はアルキルアリールであり；
Ｒ６は、出現するごとに、水素、ハロゲン、ＮＯ２、Ｒ４ Ｒｌ０、Ｃ１−Ｃ４ アルキル、ＮＨ（ＣＨ２）ｐＣＯ（ＣＨ２）ｑＸＲ２、（ＣＨ２）ＰＣＯＸＲ２、（ＣＨ２）ＰＸＣＯＲ２、（ＣＨ２）ＰＸＲ２、（ＣＨ２）ＰＣＯＲ２、（ＣＨ２）PＳＯ２ＸＲ２、又は（ＣＨ２）ＰＸＳＯ２Ｒ２から独立に選択され;
Ｒ７は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４ アルキル、アリール、アルキルアリール、ＳＯ２ Ｒ４、ＮＨＳＯ２ Ｒ４、ＮＨＣＯ２ Ｒ４、又はＮＲ８Ｒ９であり；
Ｒ８は、独立に、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４ アルキル、アリール、アルキルアリール、（ＣＨ２）ｎＣＯＸＲ２、又は （ＣＨ２）ｎＸＲ２であり；
Ｒ９は、独立に、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４ アルキル、アリール、アルキルアリール、（ＣＨ２）ｎＣＯＸＲ２、（ＣＨ２）ｎＸＲ２、（ＣＨ２）ｐＣＯＸＲ２、（ＣＨ２）ＰＸＣＯＲ２、（ＣＨ２）ＰＸ Ｒ２、（ＣＨ２）ＰＣＯＲ２、（ＣＨ２）ｐＳＯ２Ｘ Ｒ２、（ＣＨ２）ＰＸＳＯ２Ｒ２、又は（ＣＨ２）ＰＳＯ２Ｒ２であり；
Ｒ１０は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４ アルキル、アリール、アルキルアリール、ＳＯ２Ｒ４、ＮＨＳＯ２Ｒ４、ＮＨＣＯ２Ｒ４、又はＮＲ８Ｒ９であり；
ｍは独立に０又は１であり；ｎ＝１〜５；ｐ＝０〜５；ｑ＝０〜５；ＸはＯ又はＮＲ３であり；及びＺはＯ又はＮＲ７である］
の置換された１，１０−フェナントロリン−５，６−ジオン；
下式
【化７】
［式中、
Ｒ１は、Ｈ、ＮＯ２、ＮＲ５Ｒ６、ハロゲン、シアノ、アルキル、アルキルアリール、カルボニル、カルボキシ、ＣＯＲ２、又はＣＯＮＲ５Ｒ６であり；
Ｒ２及びＲ３は、独立に、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４ アルキル、アリール、又はアルキルアリールであり；
Ｒ４は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４ アルキル、アリール、アルキルアリール、ＳＯ２Ｒ２、ＮＨＳＯ２Ｒ２、ＮＨＣＯＲ２、ＮＨＣＯ２Ｒ２、Ｎ＝ＣＲ２Ｒ３、又はＮＲ５Ｒ６であり；
Ｒ５は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４ アルキル、アリール、アルキルアリール、（ＣＨ２）ｎＣＯＸ Ｒ２、（ＣＨ２）ｎＸ Ｒ２、（ＣＨ２）ｎＣＯ（ＣＨ２）ｍＸ Ｒ２、ＳＯ２Ｒ２、（ＣＨ２）ｎＣＯ（ＣＨ２）ｎＣＯＸＲ２、又は（ＣＨ２）ｎＸＯＲ２であり；
Ｒ６は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４ アルキル、アリール、アルキルアリール、（ＣＨ２）ｎＣＯＸ Ｒ２、（ＣＨ２）ｎＸ Ｒ２、（ＣＨ２）ｎＣＯ（ＣＨ２）ｍＸ Ｒ２、ＳＯ２Ｒ２、（ＣＨ２）ｎＣＯ（ＣＨ２）ｎＣＯＸＲ２、又は（ＣＨ２）ｎＣＯＲ２であり；
ｍ＝０〜３；ｎ＝０〜３；及びＸはＣＲ２Ｒ３、Ｏ、又はＮＲ４である］
の置換されたフェナントレン−９，１０−ジオン；
下式
【化８】
［式中、
Ｒ１は、Ｈ、ＮＯ２、ＮＲ５Ｒ６、ハロゲン、シアノ、アルキル、アルキルアリール、カルボニル、カルボキシ、ＣＯＲ２、ＣＯＮＲ５Ｒ６、ＳＯ３Ｒ２、又はＳＯ２ＮＲ２ Ｒ３であり；
Ｒ２及びＲ３は、独立に、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４ アルキル、アリール、又はアルキルアリールであり；
Ｒ４は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４ アルキル、アリール、アルキルアリール、ＳＯ２Ｒ２、ＮＨＳＯ２Ｒ２、ＮＨＣＯＲ２、ＮＨＣＯ２Ｒ２、Ｎ＝ＣＲ２Ｒ３、又はＮＲ５Ｒ６であり；
Ｒ５は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、アリール、アルキルアリール、（ＣＨ２）ｎＣＯＸＲ２、（ＣＨ２）ｎＸＲ２、（ＣＨ２）ｎＣＯ（ＣＨ２）ｍＸ Ｒ２、ＳＯ２Ｒ２、（ＣＨ２）ｎＣＯ（ＣＨ２）ｎＣＯＸＲ２、又は（ＣＨ２）ｎＣＯＲ２であり;
Ｒ６は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４ アルキル、アリール、アルキルアリール、（ＣＨ２）ｎＣＯＸＲ２、（ＣＨ２）ｎＸＲ２、（ＣＨ２）ｎＣＯ（ＣＨ２）ｎＸ Ｒ２、ＳＯ２Ｒ２、（ＣＨ２）ｎＣＯ（ＣＨ２）ｎＣＯＸＲ２、又は（ＣＨ２）ｎＣＯＲ２であり；
ｍ＝０〜３；ｎ＝０〜３；及びＸはＣＲ２Ｒ３、Ｏ、又はＮＲ４である］
の化合物；
下式
【化９】
［式中、
Ｒ１は、Ｈ、ＮＯ２、ＮＲ５Ｒ６、ハロゲン、シアノ、アルキル、アルキルアリール、カルボニル、カルボキシ、ＣＯＲ２、又はＣＯＮＲ５Ｒ６であり；
Ｒ２及びＲ３は、独立に、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４ アルキル、アリール、又はアルキルアリールであり；
Ｒ４は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４ アルキル、アリール、アルキルアリール、ＳＯ２Ｒ２、ＮＨＳＯ２Ｒ２、ＮＨＣＯＲ２、ＮＨＣＯ2Ｒ２、Ｎ＝ＣＲ２Ｒ３、又はＮＲ５Ｒ６であり；
Ｒ５は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４ アルキル、アリール、アルキルアリール、（ＣＨ２）ｎＣＯＸ Ｒ２、（ＣＨ２）ｎＸＲ２、（ＣＨ２）ｎＣＯ（ＣＨ２）ｍＸ Ｒ２、ＳＯ２Ｒ２、（ＣＨ２）ｎＣＯ（ＣＨ２）ｎＣＯＸＲ２、又は（ＣＨ２）ｎＣＯＲ２であり；
Ｒ６は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４ アルキル、アリール、アルキルアリール、（ＣＨ２）ｎＣＯＸ Ｒ２、（ＣＨ２）ｎＸＲ２、（ＣＨ２）ｎＣＯ（ＣＨ２）ｍＸ Ｒ２、ＳＯ２Ｒ２、（ＣＨ２）ｎＣＯ（ＣＨ２）ｎＣＯＸＲ２、又は（ＣＨ２）ｎＣＯＲ２であり；
ｍ＝０〜３；ｎ＝０〜３；及びＸはＣＲ２Ｒ３、Ｏ、又はＮＲ４である］
の置換されたフェナントレン−９−オール；
下式
【化１０】
［式中、
Ｒ１は、Ｈ、ＮＯ２、ＮＲ３Ｒ４、ハロゲン、シアノ、アルキル、アルキルアリール、カルボニル、カルボキシ、（ＣＨ２）ｎＣＯＸＲ３、ＣＯＲ２、ＳＯ３Ｒ２、ＳＯ２ＮＲ３ Ｒ４、ＮＨＳＯ２Ｒ３、ＮＨＣＯ２Ｒ３、ＮＨＣＯＲ３、ＮＨＣＯＣＯ２Ｒ３、ＮＲ３Ｒ４、又はＣＯＮＲ３Ｒ４であり；
Ｒ２は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４ アルキル、アリール、又はアルキルアリールであり;
Ｒ３及びＲ４は、独立に、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４ アルキル、アリール、アルキルアリール、（ＣＨ２）ｎＣＯＸＲ２、（ＣＨ２）ｎＯＲ２、又は（ＣＨ２）ｎＣＯ（ＣＨ２）ｍＸＲ２であり；
ｍ＝０〜３；ｎ＝０〜３；及びＸはＯ又はＮＲ２である］
の置換されたナフタレン−１，２−ジオン；
下式
【化１１】
［式中、
Ｒ１は、Ｈ、ＮＯ２、ＮＲ３Ｒ４、ハロゲン、シアノ、アルキル、アルキルアリール、カルボニル、カルボキシ、（ＣＨ２）ｎＣＯＸＲ３、ＣＯＲ２、ＳＯ３Ｒ２、ＳＯ２ＮＲ３ Ｒ４、ＮＨＳＯ２Ｒ３、ＮＨＣＯ２Ｒ３、ＮＨＣＯＲ３、ＮＨＣＯＣＯ２Ｒ３、ＮＲ３Ｒ４、又はＣＯＮＲ３Ｒ４であり；
Ｒ２は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４ アルキル、アリール、又はアルキルアリールであり;
Ｒ３及びＲ４は、独立に、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４ アルキル、アリール、アルキルアリール、（ＣＨ２）ｎＣＯＸＲ２、（ＣＨ２）ｎＯＲ２、又は（ＣＨ２）ｎＣＯ（ＣＨ２）mＸＲ２であり；
ｍ＝０−３；ｎ＝０〜３；及びＸはＯ又はＮＲ２である］
の置換されたナフタレン−１，４−ジオン；並びに
下式
【化１２Ａ】
【化１２Ｂ】
［式中、
ｎは、０、１、又は２であり；
Ｘ１は、ＮＨ、Ｎ（ＣＨ３）、ＣＨ２、ＣＨ（ＣＨ３）、Ｃ（ＣＨ3）2、Ｏ、Ｓ、Ｓ（Ｏ）、又はＳＯ２であり:
Ｒ０は、Ｃ１−Ｃ３ アルキル、シクロプロピル、ハロ、ＯＲ５、及びＳ（Ｏ）ｍＲ５（式中、ｍは０、１、又は２である）からなる群から選択され；
Ｒ１及びＲ２は、Ｃ２−Ｃ８ アルケニル、フェニルシクロプロピル、フェニルプロペニル、Ｒ６−Ｘ２−Ｃ（Ｒ８）（Ｒ８）−Ｒ７−、Ｒ６−Ｘ２−Ｎ（Ｒ８）−Ｒ７−、及びＲ１０Ｘ３Ｒ７−からなる群から独立に選択され；
Ｒ３及びＲ４は、独立に、水素、メチル、又はエチルであり；
Ｒ５は、メチル又はエチルであり；
Ｒ６は、水素、Ｃ１−Ｃ１０ アルキル、アリール、Ｗ、Ｙ、ＮＨ２、ＮＨＣＯＮＲ３Ｒ４、ＮＨＣＯＯＲ３、及びＮＨＳＯ２Ｒ９からなる群から選択され；
Ｒ７は、直接結合、１から１０の炭素原子を有するアルキル基、アリール、−（ＮＨ）ｐ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ（ＮＨ）ｐ− （式中、ｐは０又は１であり、ｑは１から４の整数である）、及びＷからなる群から選択され；
Ｒ８は、Ｈ、Ｙ、ＯＨ、−ＮＨＣＯＮＲ３Ｒ４、−ＮＨＣＯＯＲ３、−ＮＨＳＯ２Ｒ９、−（ＣＨ２）ｒＣＯ２Ｒ３、及び（ＣＨ２）ｒＣＯＮＲ３Ｒ４（式中、ｒは１から３の整数である）からなる群から選択され；
Ｒ９は、アリール又はＣ１−Ｃ６ アルキルであり；
Ｒ１０は、Ｃ１−Ｃ１０ アルキル、アリール、及びＷから選択され；
Ｘ２は、直接結合、−ＮＨ−、−Ｎ（ＣＨ３）−、−ＮＣＯＮＲ３Ｒ４、−ＮＣＯＯＲ３、及び−ＮＳＯ２Ｒ９からなる群から選択され；
Ｘ３は、Ｏ、Ｓ、ＳＯ、及びＳＯ２から選択され；
Ｘ４は、−ＣＨ−、Ｃ−ハロゲン、−Ｃ（ＣＨ3）、又は−Ｃ（Ｃ２Ｈ5）から選択され;
Ｗは、飽和炭素環式基又は飽和複素環式基であり；
Ｙは、ＣＯＯＨ、ＣＯＯＲ３、ＣＯＮＲ３Ｒ４、ＣＯＮＨＳＯ２Ｒ５、ヒドロキシメチル、−ＣＨ２ＣＯＯＨ、ＣＨ２ＣＯＮＲ３Ｒ４、及び５−テトラゾリルからなる群から選択され；
Ｚは、−ＣＨ２−、−ＣＨ（ＣＨ３）−、−Ｃ（ＣＨ３）２−、又は−ＣＯ−である］
の化合物
である。
【００２０】
ＰＴＥＮをコードする核酸を標的とする、アンチセンスオリゴヌクレオチド及び二本鎖ＲＮＡが、本発明に係るＰＴＥＮインヒビターとして使用することができる。その様な化合物は、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる、ＷＯ ０１／０７４５７及びＷＯ ０１／９０３４１、ＷＯ ２００４／２７０３０及びＷＯ ２００４／６３３２９、並びに対応する米国特許ＵＳ６，０２０，１９９及びＵＳ６，２８４，５３８に開示されている。ＰＴＥＮに特異的なインヒビターとして作用する抗体及び／又は抗体断片も本発明の範囲内である。
【００２１】
本発明は、原始卵胞のインビトロ活性化に使用することが潜在的に可能である化合物を同定するための方法も提供する。前記方法は、ＰＴＥＮ活性のインヒビターとして作用する化合物の機能を測定する工程を含む。
【００２２】
ＰＴＥＮ活性は、Ｓｃｈｍｉｄ ｅｔ ａｌ（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ ２００４，５６６：３５−３８）によって開示されているようにリン酸の放出として測定することができる。本質的には、組換えＰＴＥＮの酵素活性は、５０ｎｇ／μｌ ＢＳＡ、１５０μＭ合成ジパルミトイル−ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｓ）、及び０．２５％（ｗ／ｖ）オクチルグリコシド（Ｓｉｇｍａ）を含有する２００ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４中において３０℃で３０分間に亘って測定される。酵素反応を停止するために、０．７倍量の呈色剤（３．６Ｍ ＨＣｌ及び１７ｍＭモリブデン酸アンモニウム中の２．３ｍｇ／ｍｌマラカイトグリーン）をアッセイ系に添加する。その混合物を２０分間に亘って放置して、６２５ｎｍの吸光を測定する。
【００２３】
化合物が１００μＭ未満のＩＣ５０、好ましくは１０μＭ未満のＩＣ５０、又はより好ましくは１μＭ未満のＩＣ５０を有する場合は、前記化合物をＰＴＥＮの阻害剤として同定する。
【００２４】
ＰＴＥＮインヒビターの機能は、ＰＴＥＮの存在下におけるＰＩ３Ｋキナーゼ活性の増大を測定することによって検証することができ、ＰＩ３Ｋキナーゼ活性は、セリン４７３におけるＡｋｔのリン酸化レベルを測定することによっても測定できる。
【００２５】
本発明は、本発明の方法による原始卵胞の活性化を含む、卵母細胞のインビトロ成熟方法も提供する。
【００２６】
本発明は、必要な胚を移植する工程を含む、インビトロ受精の方法であって、前記胚が、成熟した卵母細胞を精子で処理する工程を含む方法によって製造され、前記卵母細胞が、本発明の方法による原始卵胞の活性化を含む方法によって製造される、方法も提供する。
【００２７】
本発明は、卵母細胞に由来する胚を雌性の哺乳動物に移植する工程を含む、雌性の哺乳動物における、インビトロ受精又は胚移植後の胚の発達を改善するための方法であって、前記卵母細胞が、本発明の方法による原始卵胞の活性化を含む方法によって製造される、方法も提供する。
【００２８】
本発明は、１つ又は複数のＰＴＥＮインヒビターを含む組成物の投与を含む、卵胞及び卵母細胞のインビボ活性化及び成熟のための方法も提供する。好ましくは、前記投与は、局所注射、より好ましくは卵胞内又は卵巣被膜内注射で為される。前記卵胞は、原始卵胞、中間卵胞、及び一次卵胞などの未成長卵胞であってよい。前記方法は、家畜又は絶滅危惧種などの動物又は人に適用することができる。前記家畜は、例えば、ウマ、ウシ、ブタ、ネコ、及びイヌであってよい。
【００２９】
前記局所注射は、腹腔鏡検査又は超音波を用いて実施してよい。
【００３０】
本発明は、卵胞及び卵母細胞のインビボ活性化及び成熟、具体的には、原始卵胞、中間卵胞、及び一次卵胞などの未成長卵胞のインビボ活性化に使用するための医薬組成物の調製における、１つ又は複数のＰＴＥＮインヒビターの使用も提供する。前記組成物は、局所注射又は他のタイプの局所送達、好ましくは、卵胞内又は卵巣被膜内注射によって投与されることを意図することができる。前記組成物は、ヒト又は獣医学的用途を意図することができる。
【００３１】
本発明は、卵胞及び卵母細胞のインビボ活性化及び成熟、具体的には、原始卵胞、中間卵胞、及び一次卵胞などの未成長卵胞のインビボ活性化に使用するための１つ又は複数のＰＴＥＮインヒビターを含む組成物も提供する。前記組成物は、製薬学的に許容される担体、賦形剤、又は希釈剤をさらに含むことができる。前記組成物は、局所注射、好ましくは卵胞内又は卵巣被膜内注射用に製剤化することができる。前記組成物は、ヒト又は獣医学的用途を意図することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】図１は、卵母細胞からＰＴＥＮを欠失させたマウスにおける原始卵胞の過剰活性化を示す図である。３５日齢のマウスに由来する卵巣をパラフィンに埋め込み、８μｍの厚みの切片を作製して、ヘマトキシリンで染色した。Ａ．対照マウス：対照の正常マウスでは、原始卵胞が存在する（挿入図の矢印）。Ｂ〜Ｃ．卵母細胞のＰＴＥＮが欠失しているマウス。ＰＴＥＮが欠失している卵母細胞では、全ての卵胞が早熟に成長し（Ｃ，矢印）、卵巣全体が非常に大きい（Ｂ）。
【図２】図２は、ＰｔｅｎｌｏｘＰ／ｌｏｘＰ；ＧＣｒｅ＋卵母細胞におけるＡｋｔシグナル伝達の促進を示す図である。卵母細胞をＰＤ５及びＰＤ１２−１４においてＰｔｅｎｌｏｘＰ／ｌｏｘＰ；ＧＣｒｅ＋マウス及びＰｔｅｎｌｏｘＰ／ｌｏｘＰマウスの卵巣から単離して、ウエスタンブロットを実施した。（Ａ）ＰＤ１２−１４ ＰｔｅｎｌｏｘＰ／ｌｏｘＰ；ＧＣｒｅ＋卵母細胞及びＰｔｅｎｌｏｘＰ／ｌｏｘＰ卵母細胞におけるｐ−Ａｋｔ（セリン４７３）及び全Ａｋｔのレベル。（Ｂ）ＰＤ１２−１４ ＰｔｅｎｌｏｘＰ／ｌｏｘＰ；ＧＣｒｅ＋卵母細胞及びＰｔｅｎｌｏｘＰ／ｌｏｘＰ卵母細胞におけるキットリガンド（ＫＬ）処理（１００ｎｇ／ｍｌ、２分）によるＡｋｔ（ｐ−Ａｋｔ、セリン４７３）の活性化。Ａｋｔのレベルは内部対照を使用した。（Ｃ）ｐ−Ａｋｔ（セリン４７３）、ｒｐＳ６、ｐ−ｒｐＳ６（セリン２３５／６）、ｐ−ｍＴＯＲ（セリン２４４８）、ｐ−ＴＳＣ２（スレオニン１４６２）、及びｐ−Ｓ６Ｋ（スレオニン２８９）を示す、ＰＤ５及びＰＤ１２−１４におけるＰｔｅｎｌｏｘＰ／ｌｏｘＰ；ＧＣｒｅ＋卵母細胞及びＰｔｅｎｌｏｘＰ／ｌｏｘＰ卵母細胞におけるシグナル伝達試験。全Ａｋｔのレベル、ｍＴＯＲ、ＴＳＣ２、Ｓ６Ｋ、及びβ−アクチンを内部対照として使用した。全ての実験を少なくとも３回繰り返した。ウエスタンブロットのためにＰＤ５卵母細胞を単離するために、１０−１５ＰｔｅｎｌｏｘＰ／ｌｏｘＰ；ＧＣｒｅ＋マウス又はＰｔｅｎｌｏｘＰ／ｌｏｘＰマウスを各レーンで使用した。ＰＤ１２−１４卵母細胞の単離のために、３−５ＰｔｅｎｌｏｘＰ／ｌｏｘＰ；ＧＣｒｅ＋マウス又は６−１０ ＰｔｅｎｌｏｘＰ／ｌｏｘＰマウスをレーン毎に使用した。各レーンに、３０から４０μｇのタンパク質サンプルをロードした。
【図３】図３は、ＰＴＥＮインヒビターが、培養したマウス卵巣中の原始卵胞の生存及び発達を促進することを示す図である。原始卵胞を含有する出産後４日のマウス卵巣を、（Ａ）担体又は（Ｂ）ＰＴＥＮインヒビターｂｐｖ（Ｈｏｐｉｃ）とともに８日間に亘って培養した。ＰＴＥＮインヒビターは、培養卵巣中の卵胞の生存率を改善する（Ｂ中の矢印にたいしてＡ中の矢印、ＰＴＥＮインヒビターで処理した卵巣における壊死から救われていることを示す）。また、ＰＴＥＮインヒビターは、原始卵胞を成長段階に活性化するための重要なステップである、平坦な前顆粒膜細胞（矢頭、Ａ）から球状の顆粒膜細胞（矢頭、Ｂ）への増殖及び分化を刺激する。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
現在、動物又はヒトの原始卵胞がインビトロで培養される場合には、それらの成長を開始させ、成熟させることが非常に困難である。本発明によれば、ＰＴＥＮインヒビターの存在下において、ヒト又は家畜／絶滅危惧種由来の原始卵胞をインビトロで活性化すること、すなわち、原子卵胞の成長を開始させることが可能である。これらの活性化された卵胞は、次いで、成熟するまで培養され、インビトロ受精に使用できる。
【００３４】
前記方法は、ヒト又は家畜／絶滅危惧種に由来する原始卵胞を含有する卵巣の切片を培養し、１つ又は複数のＰＴＥＮインヒビターで一時的に処理して、その成長を開始させる。卵胞の成長が誘導されたら、ＰＴＥＮインヒビターを断ち、現在利用可能な技術を用いて、更なる卵胞培養を通常通りに維持する。
【００３５】
この方法は、天然には活性化され得ない原始卵胞を有する女性、又は癌の化学療法又は放射線照射を経る女性に有用である。この方法は、卵胞の供給源及びインビトロ受精の成功率を増大させるために、家畜又は絶滅危惧種の原始卵胞をインビトロで活性化するためにも使用できる。
【００３６】
培養した卵胞切片におけるＰＴＥＮ活性の効果的な抑制は、同時に培養されるマウス卵巣の切片を使用して観察することができる。
【実施例】
【００３７】
（実施例１）哺乳動物の卵胞活性化における卵母細胞ＰＩ３Ｋ経路の機能的役割
哺乳動物の卵胞活性化における卵母細胞ＰＩ３Ｋ経路の機能的役割を試験するために、卵母細胞において特異的に活性化するｇｒｏｗｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ（Ｇｄｆ−９）プロモーター媒介Ｃｒｅリコンビナーゼを発現するトランスジェニックマウス（Ｌａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２００４，７１：１４６９）ＧＣｒｅマウスと称される）と、ＰｔｅｎｌｏｘＰ／ｌｏｘＰマウス（Ｇｒｏｓｚｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００１，２９４：２１８６）とを交配させることによってマウス卵母細胞からＰｔｅｎ遺伝子を欠失させた。６から３４週齢の試験期間の間に、ＰｔｅｎｌｏｘＰ／ｌｏｘＰ；ＧＣｒｅ＋のメス、すなわち、卵母細胞からＰＴＥＮを欠失させたマウスが、最大で一匹の子を産んだが、成人期の早期（すなわち、１２から１３週齢後）に不妊になった。卵母細胞からのＰｔｅｎの欠失がマウスの妊娠をどのように妨げるのか試験するために、本発明者は、ＰｔｅｎｌｏｘＰ／ｌｏｘＰ；ＧＣｒｅ＋マウス及び対照（ＰｔｅｎｌｏｘＰ／ｌｏｘＰ）マウスにおける原始卵胞発達の第一波を比較した。ＰｔｅｎｌｏｘＰ／ｌｏｘＰ；ＧＣｒｅ＋マウス及び対照マウスの妊娠後の日にち（ＰＤ）で５日目の卵巣には、明確な形態学的相違は認められなかった。双方の遺伝子型の卵巣は、平坦な前顆粒膜細胞に覆われた小さな卵母細胞を含有する多数の原始卵胞、及び大きくなった卵母細胞を含有する幾つかの活性化した卵胞を同程度の数で有していた。ＰＤ３５までに、ＰｔｅｎｌｏｘＰ／ｌｏｘＰ；ＧＣｒｅ＋卵巣（図１，Ｂ）は対照の卵巣よりも大きい状態であり、より活性化された卵胞を顕著に含有していた（図１，Ｃ）。実際は、原始卵胞が変異型の卵胞では認められなかったが、対照の卵胞における大半の卵胞は依然として原始段階にあった。したがって、原始卵胞のプール全体が、ＰｔｅｎｌｏｘＰ／ｌｏｘＰ；ＧＣｒｅ＋卵胞では活性化されていた。
【００３８】
かくして、原始卵胞のプールの活性化が、卵胞枯渇につながった。これによって、ＰｔｅｎｌｏｘＰ／ｌｏｘＰ；ＧＣｒｅ＋マウスにおけるＰＯＦ（早熟卵巣不全）が生じる。これらのマウスにおいて観察された表現型は、ヒトのＰＯＦと類似している（Ｂｅｃｋ−Ｐｅｃｃｏｚ ａｎｄ Ｐｅｒｓａｎｉ，Ｏｒｐｈａｎｅｔ．Ｊ．Ｒａｒｅ．Ｄｉｓ．２００６，１：９）。ＰｔｅｎｌｏｘＰ／ｌｏｘＰ；ＧＣｒｅ＋卵胞における卵母細胞の肥大の促進の根底にある分子メカニズムを解明するために、ＰＤ１２−１４ ＰｔｅｎｌｏｘＰ／ｌｏｘＰ；ＧＣｒｅ＋マウス及び対照マウスの卵胞から単離した卵母細胞におけるＡｋｔシグナル伝達を調べた。インビトロで培養して、血清飢餓状態にしたＰｔｅｎｌｏｘＰ／ｌｏｘＰ；ＧＣｒｅ＋卵母細胞において、リン酸−Ａｋｔ（ｐ−Ａｋｔ、セリン４７３）のレベルが上昇していることが認められた。加えて、卵母細胞表面受容体であるＫｉｔを解して卵母細胞を成長させる際にＰＩ３Ｋ経路を活性化することができる（Ｒｅｄｄｙ ｅｔ ａｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２００５，２８１：１６０）、Ｋｉｔリガンド（ＫＬ）が、対照の卵母細胞よりも、ＰｔｅｎｌｏｘＰ／ｌｏｘＰ；ＧＣｒｅ＋卵母細胞において大きくＡｋｔを活性化した（図２ ２Ｂ）。かくして、卵母細胞におけるＰｔｅｎの欠失は、卵母細胞のＰＩ３Ｋ／Ａｋｔシグナル伝達の促進を生じさせる。ＰｔｅｎｌｏｘＰ／ｌｏｘＰ；ＧＣｒｅ＋卵母細胞における卵母細胞成長の促進の原因を調べるために、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔシグナル伝達の促進が、リボソームタンパク質Ｓ６（ｒｐＳ６）の活性化の増大を引き起こすかどうか試験した。ＰｔｅｎｌｏｘＰ／ｌｏｘＰ；ＧＣｒｅ＋卵母細胞及び対照の卵母細胞との間に明らかな形態学的相違がない発達段階である（図２，Ａ−Ｃ）、ＰＤ５において、Ａｋｔの活性化が、ＰｔｅｎｌｏｘＰ／ｌｏｘＰ；ＧＣｒｅ＋卵母細胞において既に促進されていた（図２Ｃ、ＰＤ５、ｐ−Ａｋｔ）。これは、ｒｐＳ６の発現（図２Ｃ，ＰＤ５，ｒｐＳ６）及びリン酸化（活性化を示す）の促進と相関している（図２Ｃ，ＰＤ５，ｐ−ｒｐＳ６，セリン２３５／６）。この結果は、卵母細胞におけるＧｄｆ−９−Ｃｒｅ媒介Ｐｔｅｎ欠失がまさに生じた際に、タンパク質翻訳の促進が既に開始していたことを示唆する。同様に、ＰＤ１２−１４におけるＰｔｅｎｌｏｘＰ／ｌｏｘＰ；ＧＣｒｅ＋卵巣から単離した卵母細胞において、促進されたＰＩ３Ｋ／Ａｋｔシグナル伝達が、ｒｐＳ６の発現及びリン酸化の双方の上昇を生じさせる（図２Ｃ，ＰＤ１２−１４）。しかしながら、ｍａｍｍａｌｉａｎ ｔａｒｇｅｔ ｏｆ ｒａｐａｍｙｃｉｎ（ｍＴＯＲ）−ｐ７０ Ｓ６キナーゼ（Ｓ６Ｋ）カスケードの活性化は、Ｐｔｅｎの欠失によって増大せず、リン酸−ｍＴＯＲ（ｐ−ｍＴＯＲ、セリン２４４８）、リン酸−チューブリン／ＴＳＣ２（ｐ−ＴＳＣ２、スレオニン１４６２）、及びリン酸−Ｓ６Ｋ（ｐ−Ｓ６Ｋ、スレオニン３８９）はＰＤ５及びＰＤ１２−１４において、ＰｔｅｎｌｏｘＰ／ｌｏｘＰ；ＧＣｒｅ＋卵母細胞及び対照の卵母細胞において類似したままであった（図２Ｃ）。かくして、ｒｐＳ６の活性化の促進は、ｒｐＳ６発現の上昇自体によって生じていた（図２Ｃ）。しかしながら、変異型の卵母細胞におけるｒｐＳ６及びｓ６Ｋのリン酸化は、ＰＩ３Ｋ特異的インヒビターであるＬＹ２９４００２及びｍＴＯＲ特異的インヒビターであるラパマイシンに対して感受性を有し、このことは、ＰｔｅｎｌｏｘＰ／ｌｏｘＰ；ＧＣｒｅ＋卵母細胞におけるｒｐＳ６の活性化がＰＩ３Ｋ及びｍＴＯＲの活性化に依存することを示す。未知の卵巣内因子が幾つかの原始卵胞を刺激して、成長促進するが、残りの卵胞は休止したままであることは以前から仮説があった。
【００３９】
（実施例２）ＰＴＥＮインヒビターは、培養したマウス卵胞における原始卵胞の生存及び発達を促進する
妊娠後の日にちで４日目のマウス卵巣を無菌で取り出し、Ｃｅｌｌ Ｓｔｒａｉｎｅｒ（４０μｍの孔径）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ，Ｓｗｅｄｅｎ）において、１０μＭのＰＴＥＮインヒビターであるｂｐＶ−ＨＯｐｉｃ（二カリウムビスペルオキソ（５−ヒドロキシピリジン−２−カルボキシル）オキソバナデート（Ｖ）、Ｋ２［ＶＯ（Ｏ２）２Ｃ６Ｈ４ＮＯ３］）とともに又は無しで、２８ｍＭアスコルビン酸及び０．３％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを添加した１ｍｌのα−ＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）中で卵巣全体を培養した。培養期間にわたって三分の一の培地を新しい培地に毎日交換して、加湿インキュベーター（５％ＣＯ２、３７℃）で、培養卵巣をインキュベートした。固定化するために、前記卵巣をＰＢＳで一度洗浄して、４％パラホルムアルデヒドで一晩固定化し、形態分析用の埋め込みを実施した。
【００４０】
ＰＴＥＮインヒビターは、培養卵巣における卵胞の生存率を向上する（図３Ｂ矢印に対して、図３Ａ矢印）。このことは、ＰＴＥＮインヒビターで処理した卵胞は壊死から救出されたことを示す。また、ＰＴＥＮインヒビターは、原始卵胞を成長段階へと活性化するために必要なステップである、平坦な前顆粒細胞（図３Ａの矢頭）の球状の顆粒細胞（図３Ｂの矢頭）への増殖及び分化を刺激する。
【００４１】
結論
これらの実験データは、卵母細胞のＰＴＥＮが卵胞活性化の抑制因子として働くことを示す。卵母細胞内のＰＴＥＮ／ＰＩ３Ｋシグナル伝達カスケードは、卵母細胞の成長の開始に役割を担っているようである。本発明者は、各個体の卵母細胞におけるＰＩ３Ｋ経路の活性化が、原始卵胞の運命、すなわち、休止したままでいるか否か、ある時期に活性化されるか否か、又は原始段階から直接閉鎖するか否かを決定するのに重要であることを提示する。さらに、原始卵胞の過剰な活性化及び枯渇によって引き起こされる、Ｐｔｅｎを卵胞特異的に欠失したマウスのＰＯＦの特有の卵巣表現型が示されている。かくして、本試験の発見は、広く生理学的及び臨床的意味を有し、正常な卵巣の生理及び卵巣疾患の発症の双方における深い理解に寄与する。ヒトでは、ＰＯＦは、初潮がない（原発性無月経）ことに特徴付けられる原発性卵巣異常又は４０歳前の卵胞の早期枯渇／卵胞生産の停止（続発性無月経）として定義され、１％の確率で生じると見積もられている（Ｂｅｃｋ−Ｐｅｃｃｏｚ ａｎｄ Ｐｅｒｓａｎｉ，Ｏｒｐｈａｎｅｔ．Ｊ．Ｒａｒｅ．Ｄｉｓ．２００６，１：９）。ＰＯＦの様々なあり得る原因のうち、卵胞の過剰な活性化及び枯渇を生じさせる遺伝的変異が、ヒトにおいては、その１つである可能性がある。一方、それら双方が卵母細胞のＰＩ３Ｋ経路の活性化不足によって生じ得る、卵胞活性化の遅延及び／又は過剰な原始卵胞の閉鎖が、他方からＰＯＦを生じさせ得る。卵母細胞におけるＰＴＥＮ／ＰＩ３Ｋシグナル伝達ネットワークの重要性の認識が、哺乳動物の卵巣の生理学的及び病理学的プロセスの理解に関する新しい展望を開く。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＰＴＥＮインヒビターの使用を含む、卵胞及び卵母細胞のインビトロ成熟方法。
【請求項２】
前記卵胞が原始卵胞、中間卵胞、及び一次卵胞などの未成長卵胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
成熟卵母細胞がインビトロ受精にさらに使用される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記卵胞又は卵母細胞がヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記卵胞又は卵母細胞が動物由来である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ＰＴＥＮインヒビターが、
ビスペルオキソ（ビピリジン）オキソバナデート、
ビスペルオキソ（１，１０−フェナントロリン）オキソバナデート、
ビスペルオキソ（ピコリナト）オキソバナデート、
ビスペルオキソ（５−ヒドロキシピリジン−２−カルボキシル）オキソバナデート、
ジ−（ピコリネート）オキソバナデート、
ジ−（３−ヒドロキシピコリネート）オキソバナデート、
ビスペルオキソ（フェニルビグアニド）オキソバナデート、
ジ−（フェニルビグアニド）オキソバナデート、及び
ビスペルオキソ（イソキノリンカルボン酸）オキソバナデート
から選択される、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
請求項１に規定の卵胞の活性化を含む、卵母細胞のインビトロ成熟方法。
【請求項８】
必要な胚を移植する工程を含むインビトロ受精方法であって、前記胚が成熟卵母細胞を精子に接触させる工程を含む方法によって製造され、前記卵母細胞が請求項７に記載の方法によって製造される、方法。
【請求項９】
ＰＴＥＮインヒビターとして作用する化合物の機能の測定を含む、卵胞及び／又は卵母細胞のインビトロ成熟に使用することが潜在的に可能な化合物の同定方法。
【請求項１０】
卵胞及び卵母細胞のインビトロ成熟を改善するための使用、並びに原始卵胞、中間卵胞、及び一次卵胞などの未成長卵胞のインビトロ活性化における使用のための医薬の調製における、１つ又は複数のＰＴＥＮインヒビターの使用。
【請求項１１】
卵胞及び卵母細胞のインビトロ成熟、並びに原始卵胞、中間卵胞、及び一次卵胞などの未成長卵胞のインビトロ活性化の促進のための、１つ又は複数のＰＴＥＮインヒビターを含む組成物。
【請求項１２】
製薬学的に許容される担体、賦形剤、又は希釈剤をさらに含む、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
１つ又は複数のＰＴＥＮインヒビターを含む組成物の投与を含む、卵巣及び卵母細胞のインビボ活性化及び／又は成熟方法。
【請求項１４】
前記投与が局所注射によって実施される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記投与が卵胞内又は卵巣被膜内注射によって実施される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１】
ＰＴＥＮインヒビターの使用を含む、卵胞及び卵母細胞のインビトロ成熟方法。
【請求項２】
前記卵胞が原始卵胞、中間卵胞、及び一次卵胞などの未成長卵胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
成熟卵母細胞がインビトロ受精にさらに使用される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記卵胞又は卵母細胞がヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記卵胞又は卵母細胞が動物由来である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ＰＴＥＮインヒビターが、
ビスペルオキソ（ビピリジン）オキソバナデート、
ビスペルオキソ（１，１０−フェナントロリン）オキソバナデート、
ビスペルオキソ（ピコリナト）オキソバナデート、
ビスペルオキソ（５−ヒドロキシピリジン−２−カルボキシル）オキソバナデート、
ジ−（ピコリネート）オキソバナデート、
ジ−（３−ヒドロキシピコリネート）オキソバナデート、
ビスペルオキソ（フェニルビグアニド）オキソバナデート、
ジ−（フェニルビグアニド）オキソバナデート、及び
ビスペルオキソ（イソキノリンカルボン酸）オキソバナデート
から選択される、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
請求項１に規定の卵胞の活性化を含む、卵母細胞のインビトロ成熟方法。
【請求項８】
必要な胚を移植する工程を含むインビトロ受精方法であって、前記胚が成熟卵母細胞を精子に接触させる工程を含む方法によって製造され、前記卵母細胞が請求項７に記載の方法によって製造される、方法。
【請求項９】
ＰＴＥＮインヒビターとして作用する化合物の機能の測定を含む、卵胞及び／又は卵母細胞のインビトロ成熟に使用することが潜在的に可能な化合物の同定方法。
【請求項１０】
卵胞及び卵母細胞のインビトロ成熟を改善するための使用、並びに原始卵胞、中間卵胞、及び一次卵胞などの未成長卵胞のインビトロ活性化における使用のための医薬の調製における、１つ又は複数のＰＴＥＮインヒビターの使用。
【請求項１１】
卵胞及び卵母細胞のインビトロ成熟、並びに原始卵胞、中間卵胞、及び一次卵胞などの未成長卵胞のインビトロ活性化の促進のための、１つ又は複数のＰＴＥＮインヒビターを含む組成物。
【請求項１２】
製薬学的に許容される担体、賦形剤、又は希釈剤をさらに含む、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
１つ又は複数のＰＴＥＮインヒビターを含む組成物の投与を含む、卵巣及び卵母細胞のインビボ活性化及び／又は成熟方法。
【請求項１４】
前記投与が局所注射によって実施される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記投与が卵胞内又は卵巣被膜内注射によって実施される、請求項１４に記載の方法。
【図２】
【図３】
【図３】
【公表番号】特表２０１１−５０９６７０（Ｐ２０１１−５０９６７０Ａ）
【公表日】平成２３年３月３１日（２０１１．３．３１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５４３０８６（Ｐ２０１０−５４３０８６）
【出願日】平成２１年１月１９日（２００９．１．１９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＳＥ２００９／０５００４９
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０９１３３２
【国際公開日】平成２１年７月２３日（２００９．７．２３）
【出願人】（５１０１９７１２８）
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年３月３１日（２０１１．３．３１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１月１９日（２００９．１．１９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＳＥ２００９／０５００４９
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０９１３３２
【国際公開日】平成２１年７月２３日（２００９．７．２３）
【出願人】（５１０１９７１２８）
【Ｆターム（参考）】
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