本発明は、治療用タンパク質と、治療用タンパク質上のアミノ酸アクセプターに糖部分を転移する異種グリコシルトランスフェラーゼとを同時発現させることにより、原核微生物においてO-グリコシル化可溶性治療用タンパク質を生成する方法に関する。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
原核微生物においてO-グリコシル化可溶性治療用タンパク質を生成する方法であって、
a) 原核微生物において可溶性治療用タンパク質を発現させる段階、
b) 原核微生物において異種可溶性活性ヌクレオチド糖：ポリペプチドグリコシルトランスフェラーゼタンパク質を発現させる段階、および
c) 異種可溶性活性ヌクレオチド糖：ポリペプチドグリコシルトランスフェラーゼタンパク質による、第1ドナー基質から治療用タンパク質上のアミノ酸アクセプター基質への第1糖部分の細胞内転移を可能にする条件下で微生物を培養し、それによってO-グリコシル化可溶性治療用タンパク質を生成する段階
を含む、方法。
【請求項２】
原核微生物が細胞内酸化環境を有する、請求項1記載の方法。
【請求項３】
細胞内酸化環境を有するように原核微生物が遺伝子改変される、請求項2記載の方法。
【請求項４】
原核微生物が、大腸菌(E. coli)またはシュードモナス属(Pseudomonas)細菌である、請求項1記載の方法。
【請求項５】
微生物が大腸菌である、請求項3記載の方法。
【請求項６】
原核微生物が内因性還元酵素核酸に変異を有する、請求項5記載の方法。
【請求項７】
異種可溶性活性ヌクレオチド糖：ポリペプチドグリコシルトランスフェラーゼが、可溶性活性真核生物GalNAcTタンパク質である、請求項1記載の方法。
【請求項８】
d) 原核微生物において第1異種可溶性活性グリコシルトランスフェラーゼを発現させ、第1異種可溶性活性グリコシルトランスフェラーゼタンパク質による第2ドナー基質から治療用タンパク質上の第1アクセプター基質への第2糖部分の細胞内転移を可能にし、それによってO-グリコシル化可溶性治療用タンパク質を生成する段階
をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項９】
第1異種可溶性活性グリコシルトランスフェラーゼタンパク質が、真核生物コアIガラクトシルトランスフェラーゼ(コア1 GalT1)タンパク質およびST6 GalNAc 1タンパク質から選択される、請求項8記載の方法。
【請求項１０】
e) 原核微生物において第2異種可溶性活性グリコシルトランスフェラーゼを発現させ、第2可溶性活性グリコシルトランスフェラーゼタンパク質による第3ドナー基質から治療用タンパク質上の第2アクセプター基質への第3糖部分の細胞内転移を可能にし、それによってO-グリコシル化可溶性治療用タンパク質を生成する段階
をさらに含む、請求項9記載の方法。
【請求項１１】
第2異種可溶性活性グリコシルトランスフェラーゼタンパク質が、真核生物α(2,3)シアリルトランスフェラーゼ(ST3Gal1)タンパク質および細菌α(2,3)シアリルトランスフェラーゼタンパク質からなる群より選択されるシアリルトランスフェラーゼである、請求項10記載の方法。
【請求項１２】
ドナー基質の前駆体含む培地で微生物を培養する、請求項1記載の方法。
【請求項１３】
ドナー基質の産生を増強するように微生物が遺伝子改変される、請求項1記載の方法。
【請求項１４】
微生物が大腸菌である、請求項13記載の方法。
【請求項１５】
原核微生物を最適増殖温度より低い温度で培養する、請求項1記載の方法。
【請求項１６】
原核微生物からO-グリコシル化可溶性治療用タンパク質を単離する段階をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項１７】
O-グリコシル化可溶性治療用タンパク質を商業規模で生産する、請求項1記載の方法。
【請求項１８】
原核微生物が補助的酵素を発現し、補助的酵素が、UDP-グルコース4'エピメラーゼタンパク質、UDP-GlcNAc 4'エピメラーゼタンパク質、または二重機能UDP-グルコース4'エピメラーゼタンパク質/UDP-GlcNAc 4'エピメラーゼタンパク質からなる群より選択される、請求項1記載の方法。
【請求項１９】
O-グリコシル化治療用タンパク質をPEG部分の付加によって修飾する段階をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項２０】
O-グリコシル化可溶性治療用タンパク質と異種可溶性活性ヌクレオチド糖：ポリペプチドグリコシルトランスフェラーゼタンパク質とを含む原核微生物であって、
原核微生物内で、異種可溶性活性ヌクレオチド糖：ポリペプチドグリコシルトランスフェラーゼタンパク質が、第1ドナー基質からO-グリコシル化可溶性治療用タンパク質上のアミノ酸アクセプター基質へ第1糖部分を転移する、原核微生物。
【請求項２１】
細胞内酸化環境を有する、請求項20記載の原核微生物。

【図１】

【図２】

【図３】

【図４Ａ】

【図４Ｂ】

【図４Ｃ】

【図４Ｄ】

【図５】

【図６】

【図７】

【図８】

【図９】

【図１０】

【図１１】

【図１２】

【図１３】

【図１４】

【図１５】

【図１６】

【図１７】

【図１８−１】

【図１８−２】

【図１８−３】

【図１８−４】

【図１８−５】

【図１８−６】

【図１８−７】

【図１８−８】

【図１８−９】

【図１８−１０】

【図１８−１１】

【図１８−１２】

【図１８−１３】

【図１８−１４】

【図１８−１５】

【図１８−１６】

【図１８−１７】

【図１８−１８】

【公表番号】特表２００９−５３４０３４（Ｐ２００９−５３４０３４Ａ）
【公表日】平成２１年９月２４日（２００９．９．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５０６６２８（Ｐ２００９−５０６６２８）
【出願日】平成１９年４月１９日（２００７．４．１９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／００９７８２
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１２０９３２
【国際公開日】平成１９年１０月２５日（２００７．１０．２５）
【出願人】（３０９０２５８８９）ノヴォ　ノルディスク　アクティーゼルスカブ (1)
【Ｆターム（参考）】