反復配列タンパク質とフィロケイ酸塩粘土とのナノコンポジットおよびその調製
反復配列タンパク質ポリマーとフィロケイ酸塩とのナノコンポジットは、弾性の向上など、材料特性の向上が示され、縫合材料、組織足場材料および生分解性複合材料として有用なものである。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、空軍との共同研究開発協定の履行に当たりなされたものである。米国政府は、本発明を用いる一定の権利を有する。
【０００２】
関連する出願の参照
本出願は、２００５年８月２２日に出願された米国特許仮出願第６０／７１０，３０８号に対する優先権を主張するものである。
【０００３】
発明の分野
本発明は、反復配列タンパク質ポリマーと層状ケイ酸塩との組み合わせから生成されるナノコンポジットに関するものである。本発明はまた、こうしたナノコンポジット材料を合成する方法を提供するものである。
【背景技術】
【０００４】
ポリマーと無機充填剤材料との組み合わせについては、機械的特性、熱的特性および遮断性が非修飾ポリマーよりも向上したナノコンポジット材料の製造で知られている。ナノコンポジットに関する詳細な考察は、アジャヤン，Ｐ．Ｍ．，（Ａｊａｙａｎ，Ｐ．Ｍ．，）ナノコンポジットの科学と技術（Ｎａｎｏｃｏｍｐｏｓｉｔｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）（ワイリー（Ｗｉｌｅｙ），２００３）で確認することができる。
【０００５】
また、ポリマーと、スメクタイト粘土またはフィロケイ酸塩とも呼ばれる層状ケイ酸塩との組み合わせも、ナノコンポジットの合成手段として利用されてきた。この主題に関しては、アレクサンダー（Ａｌｅｘａｎｄｒｅ）およびデュボイス（Ｄｕｂｏｉｓ）（２００１）ならびにピナバイア，Ｔ．Ｊ．（Ｐｉｎｎａｖａｉａ，Ｔ．Ｊ．）；ベアルＧ．Ｗ．（Ｂｅａｌｌ，Ｇ．Ｗ．）ポリマークレイナノコンポジット（Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｃｌａｙ Ｎａｎｏｃｏｍｐｏｓｉｔｅｓ）ワイリー：ニューヨーク，２０００年で包括的な検討がなされている。スメクタイト粘土については、グリム，Ｒ．Ｅ．（Ｇｒｉｍ，Ｒ．Ｅ．）粘土鉱物学（Ｃｌａｙ Ｍｉｎｅｒａｌｏｌｏｇｙ）第２版；マグローヒル（ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ）：ニューヨーク １９６８年に記載されている。
【０００６】
ポリマークレイナノコンポジットを合成するいくつかの方法については、たとえば、臼杵（Ｕｓｕｋｉ）ら（１９９３）により最初に記載されたナイロン／粘土複合材料など、当該技術分野に記載がある。臼杵有光ら、「ナイロン６−粘土ハイブリッドの合成（Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｎｙｌｏｎ ６−ｃｌａｙ ｈｙｂｒｉｄ）」、ジャーナルオブマテリアルズリサーチ（Ｊ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．），第８巻，Ｎｏ．５，１９９３年５月，ｐ．１１７９−１１８４を参照のこと。このようなプロセスでは、ナイロンとモンモリロナイトとを高温で混合して、ポリマー単独に比べて材料特性の向上した層剥離型ナノコンポジットを生成する。
【０００７】
天然ポリマーと、可塑剤と、層構造を持ち１００グラム当たり陽イオン交換容量が３０〜３５０ミリグラム当量である層剥離した粘土とを含む生分解性熱可塑性材料については、米国特許第６，８１１，５９９Ｂ２号に記載されている。この天然ポリマーは、多糖である。
【０００８】
有機化学組成物とポリマーとで変性したスメクタイト粘土については、米国特許第６，５２１，６９０号に記載されている。
【０００９】
フィロケイ酸塩と合成ホモポリマーであるポリ−Ｌ−リジンとから生成されるナノコンポジットについても、記載されてきた。（クリコリアン，Ｖ（Ｋｒｉｋｏｒｉａｎ，Ｖ．）らジャーナルオブポリマーサイエンスＢ：ポリマーフィジックス（Ｊ．Ｐｏｌｙｍ．Ｓｃｉ．Ｂ：Ｐｏｌｙｍ．Ｐｈｙｓ．）２００２，４０，ｐ．２５７９）。また、大豆タンパク質単離物を、ナトリウムモンモリロナイト粘土を含むナノコンポジットに組み入れることも行われてきた（チェン，Ｐ．（Ｃｈｅｎ，Ｐ．）およびジャン，Ｌ．（Ｚｈａｎｇ，Ｌ．）バイオマクロモレキュールズ（Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ），２００６，７，ｐ．１７００）。
【００１０】
タンパク質は、多様な機能性をもたらすアミノ酸の複雑な配列により、ほとんどの生物の主要な構造要素を構成する。最も熱心に研究された構造タンパク質の１つであるカイコ絹は、クモの糸にも匹敵するその驚くべき機械的特性から大きな関心を集めてきた。もう１つのよく知られた構造タンパク質であるエラスチンは、大部分が体の動脈壁、肺、腸および皮膚に見られる。絹エラスチン様タンパク質（ＳＥＬＰ）は、絹様アミノ酸とエラスチン様アミノ酸との交互ブロックからなる組換えタンパク質である。ＳＥＬＰのような組換えタンパク質の機械的特性は、自然界に見られる構造タンパク質よりも劣ることが多い。
【００１１】
インビボ用途および体外用途で組換えタンパク質を用いるには、高温機械的挙動など、様々な特性の向上と変化とが必要かもしれない。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、フィロケイ酸塩と１種または複数種の反復配列タンパク質ポリマーとのナノコンポジットを含む組成物を対象にするものである。本発明の一実施形態では、フィロケイ酸塩は、スメクタイト粘土のＮａ＋モンモリロナイト（ＭＭＴ）であり、反復配列タンパク質ポリマーは、絹とエラスチンとに由来する配列を含む、ＳＥＬＰと呼ばれるコポリマーである。さらに本発明の別の実施形態では、反復配列タンパク質ポリマーは、タンパク質と無水コハク酸とが反応する化学修飾ＳＥＬＰ類縁体である。本発明の別の実施形態では、フィロケイ酸塩は、アタパルガイトである。さらに本発明の別の実施形態では、添加剤、たとえば、可塑剤またはタンパク質架橋剤、あるいは、可塑剤および架橋剤をフィロケイ酸塩と反復配列タンパク質ポリマーとに加える。
【００１３】
本発明の組成物は、ＲＳＰＰ単独に比べて材料特性の変化および／または強化を示すナノコンポジットである。
【００１４】
このナノコンポジットは、フィロケイ酸塩シートがタンパク質マトリックス内に分散したものである。分散または剥離は、タンパク質の正電荷を帯びたリジン残基と負電荷を帯びたフィロケイ酸塩シートとの間の相互作用に加え、タンパク質構造内のこれ以外の極性官能基によって起こるものである。
【００１５】
どのような特定の理論にも束縛されることを望むものではないが、タンパク質の静電特性は、粒子間の長距離相互作用を支配し、タンパク質の水素結合特性は、タンパク質とフィロケイ酸塩材料と間の局所的相互作用を支配すると考えられる。具体的には、カチオン性タンパク質が、層剥離形態をもたらす一方で、アニオン性タンパク質残基により、ＭＭＴシートとの斥力相互作用が引き起こされ、溶液中のＭＭＴのクラスター形成または凝集の低下の原因となり、固体の状態において少なくともある程度の不均一性が現れ得ることで、ナノコンポジットの形態に影響を与える。
【００１６】
本発明のナノコンポジットは、ＲＳＰＰ単独の弾性率値を少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％および少なくとも９０％上回る弾性率値で示されるような、変化および／または向上した弾性に対応し得るものである。また、このナノコンポジットは、引張特性、形態、ゼータ電位およびまたは熱膨張係数を変化させるように設計することもできる。
【００１７】
このタンパク質をベースとした、反復配列タンパク質ポリマーとフィロケイ酸塩とのナノコンポジットから、縫合材料、組織足場材料、人工組織材料または工業材料などの生分解性構造材料としての複合材料向けに好適な機械的特性を持つ反復配列タンパク質ポリマーが生成される。
【００１８】
また、本発明のナノコンポジットは、水、あるいは、ナノコンポジットを製造するために用いるその他の溶媒だけでなく、ナノコンポジットの特性に合わせて選択されるその他の添加剤を様々な比率で保持することもできる。
【００１９】
また、本発明は、フィロケイ酸塩と反復配列タンパク質ポリマーとからなるナノコンポジットを形成する方法も記載するものである。この方法は、フィロケイ酸塩を追加溶媒の有り無しで脱イオン水または緩衝水に懸濁させることと、フィロケイ酸塩懸濁液に反復配列タンパク質ポリマーを加えて、混合および／または超音波処理することとを含む。その結果得られる混合物を容器にキャストして、乾燥させてもよい。
【００２０】
フィロケイ酸塩懸濁液に加えるＳＥＬＰ材料の量については、ナノコンポジットに望ましい材料特性を持たせられるように選択すればよい。たとえば、複合材料におけるＳＥＬＰの量を変えることで、望ましい弾性率値または引っ張り強度値を持つナノコンポジットを製造することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
本発明は、フィロケイ酸塩材料と１種または複数種の反復配列タンパク質ポリマーとのナノコンポジットである組成物を対象にするものである。本発明の一実施形態では、フィロケイ酸塩材料は、たとえば、モンモリロナイト（ＭＭＴ）粘土などのスメクタイト粘土であり、反復配列タンパク質ポリマーは、ＳＥＬＰと呼ばれる、絹とエラスチンとに由来する配列を有するコポリマーである。本発明のさらに別の実施形態では、反復配列タンパク質ポリマーは、化学修飾ＳＥＬＰ類縁体であるため、このタンパク質は、無水コハク酸と反応する。
【００２２】
本発明のナノコンポジットは、管理された条件下で製造される高度に層剥離した材料である。本発明は、フィロケイ酸塩と反復配列タンパク質ポリマーとのナノコンポジットを形成する方法をさらに含むものである。この方法は、溶媒の有り無しでフィロケイ酸塩粘土を水に懸濁し、このフィロケイ酸塩懸濁液に反復配列タンパク質ポリマーを加え、混合および／または超音波処理する。その結果得られる混合物を容器にキャストして、水またはその他の溶媒を種々の量で保持したまま乾燥させることができる。添加剤を用いてもよく、ナノコンポジットの特性を決めるために加えることができる。
【００２３】
定義
本発明においては、以下の定義を適用するものとする。
【００２４】
「弾性率」または弾性係数とは、ある材料が応力の除去後に元の寸法に戻る力を表す測定値をいい、式Ｅ＝Ｓ／δで計算され、式中、Ｓは、応力度、δは、歪度である。本発明のナノコンポジットの弾性率は、フィロケイ酸塩材料を加えていないＲＳＰＰの弾性率を少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％および少なくとも９０％上回る。
【００２５】
「層剥離型ナノコンポジット」とは、出発フィロケイ酸塩材料に見られる全体的にインターカレートされた層構造から、フィロケイ酸塩成分の層が分散または離れている複合材料形態をいう。「高度に層剥離したナノコンポジット」は、多くの層で分散が起きた結果、ナノコンポジットがフィロケイ酸塩とＲＳＰＰとの特徴的な相を示し得ないため、全体的に均一である形態を示す。
【００２６】
どのような特定の理論にも束縛されることを望むものではないが、タンパク質の静電特性は、粒子間の長距離相互作用を支配し、タンパク質の水素結合特性は、タンパク質とフィロケイ酸塩材料との間の局所的相互作用を支配すると考えられる。具体的には、カチオン性タンパク質が、層剥離形態をもたらす一方で、アニオン性タンパク質残基により、ＭＭＴシートとの斥力相互作用が引き起こされ、溶液中のＭＭＴのクラスター形成または凝集の低下の原因となり、固体の状態において少なくともある程度の不均一性が現れ得ることで、ナノコンポジットの形態に影響を与える。
【００２７】
「材料特性」とは、引っ張り強度、弾性率、形態ならびに変化および／または向上した熱的特性をいう。
【００２８】
本発明のナノコンポジットは、反復配列タンパク質ポリマー単独に比べると、１種または複数種の材料特性の変化および／または向上を示すものである。
【００２９】
「ナノコンポジット」とは、密着した物理的に異なる２種以上の材料からなり、２種以上の相の少なくとも１つでは、少なくとも１つの寸法がナノメートルサイズの範囲（すなわち、１００ナノメートルよりも小さい）にある複合材料をいう。ナノコンポジットは相間が密着しているため、従来の複合材料に比べてこのクラスの材料に独特の特性が生じる。アジャヤン，Ｐ．Ｍ．，ナノコンポジットの科学と技術（Ｎａｎｏｃｏｍｐｏｓｉｔｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）（ワイリー，２００３）を参照されたい。
【００３０】
複合膜に用いられるような「引っ張り強度」は、引張試験で膜が破断（破損）する前に加え得る最大応力をいう。引っ張り強度は、パスカル（ＭＰａ）または重量ポンド毎平方インチ（ｐｓｉ）で表される。
【００３１】
「破断時伸び率」は、破断歪みと呼ばれることもあり、材料が破断するときの材料の歪みのことで、パーセントで表される。引張特性には、引っ張り強度および破断時伸び率が含まれる。
【００３２】
「ゼータ電位」とは、コロイド粒子の表面にイオンが集まることによって生じる電位をいう。
【００３３】
反復配列タンパク質ポリマー
反復配列タンパク質ポリマー（ＲＳＰＰ）は、少なくとも１個の明確なドメインが配列全体を通じて２回以上の繰り返されるのであれば、どのような変性ポリペプチドであってもよい。
【００３４】
本発明に好適なＲＳＰＰの少なくとも２個の明確な繰り返しドメインは、天然、化学合成および／もしくは変性、組換えタンパク質またはその混合物に由来し得る。たとえば、繰り返し配列単位は、絹、エラスチンおよびコラーゲンなどの材料を支持する天然構造の変性に由来してもよい。あるいは、繰り返し配列単位は、合成構造に由来してもよい。
【００３５】
当業者であれば、本発明の反復配列タンパク質ポリマーの設計と製造を行うために変性および使用が可能な繰り返し配列単位を含む、種々の天然由来のタンパク質を理解するであろうが、そのいずれをも本明細書に用いることができる。具体的には、６００種を超える繰り返しアミノ酸配列単位が、生物系に存在することが知られている。天然または合成タンパク質の繰り返しアミノ酸配列単位については、エラスチン、コラーゲン、アブダクチン、足糸、エクステンシン、鞭毛状の絹、ドラッグライン絹、グルテン高分子量サブユニット、タイチン、フィブロネクチン、ラミニン、グリアジン、接着性ポリペプチド、氷核タンパク質、ケラチンムチン、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ、レジリンまたはその混合物を変性することで得られる。
【００３６】
その全体を本明細書に援用する国際公開第０４０８０４２６Ａ１号（ＷＯ ０４０８０４２６Ａ１）に、上記の天然材料または合成材料のＲＳＰＰ繰り返し配列単位について記載され、アミノ酸配列が示されている。
【００３７】
反復配列タンパク質ポリマー（ＲＳＰＰ）の式は、以下の式を含み：
Ｔｙ［（Ａｎ）ｘ（Ｂ）ｂ（Ａ’ｎ’）ｘ’（Ｂ’）ｂ’（Ａ’’ｎ’’）ｘ’’］ｉＴ’ｙ’
式中：ＴおよびＴ’はそれぞれ、約１〜約１００個のアミノ酸のアミノ酸配列を含み、アミノ酸配列Ｔ’は、アミノ酸配列Ｔと同一または異なり；ｙおよびｙ’はそれぞれ、０〜１の整数であり、整数ｙ’は、整数ｙと同一または異なり；Ａ、Ａ’およびＡ’’はそれぞれ、個々に約３〜約３０個のアミノ酸を含む繰り返しアミノ酸配列単位であり、アミノ酸配列Ａ’およびアミノ酸配列Ａ’’は、アミノ酸配列Ａと同一または異なり；ｎ、ｎ’およびｎ’’はそれぞれ、少なくとも２および２５０以下の整数であり；ｘ、ｘ’およびｘ’’はそれぞれ、０または少なくとも１の整数であり、整数はそれぞれ異なり、個々のアミノ酸配列繰り返し単位Ａ、Ａ’およびＡ’’においてアミノ酸が少なくとも３０個になるように規定し、整数ｘ’および整数ｘ’’は、整数ｘと同一または異なり、ｘ、ｘ’およびｘ’’は、すべてが同時にゼロにはなり得ず；ＢおよびＢ’はそれぞれ、約４〜約５０個のアミノ酸のアミノ酸配列を含み、アミノ配列Ｂ’は、アミノ酸配列Ｂと同一または異なり；ｂおよびｂ’はそれぞれ、０〜３の整数であり、整数ｂ’は、整数ｂと同一または異なり；およびｉは、１〜５００の整数である。
【００３８】
繰り返しアミノ酸配列単位は、同一の繰り返し配列単位を含んでもよく、あるいは、一緒になってブロックコポリマーまたは交互ブロックコポリマーを形成する相異なる繰り返し配列単位の組み合わせを含んでもよい。加えて、反復配列タンパク質ポリマーの個々の繰り返しアミノ酸配列単位は、約３〜約３０個のアミノ酸または約３〜約８個のアミノ酸を含むものである。さらに、同じアミノ酸が、同じ繰り返し配列単位に少なくとも２回出現してもよい。
【００３９】
当業者であれば、本発明の反復配列タンパク質ポリマーは、単分散または多分散し得ることをさらに理解するであろう。本発明の定義および記載において、「単分散の」ポリマーとは、明確な単一の分子量を持つポリマーである。本発明の定義および記載において、「多分散の」ポリマーとは、タンパク質分解またはその他の細分化手段を施されているか、あるいは、分子量の分布が起こるようなやり方で製造または変性されたポリマーである。
【００４０】
一実施形態では、このコポリマーは、同じ単量体単位だけしかないポリマーとは異なる特性を持つ絹−エラスチンコポリマーを形成する、絹単位とエラスチン単位との組み合わせである。
【００４１】
絹−エラスチンポリマー、ＳＥＬＰ４７Ｋを、本発明の反復配列タンパク質ポリマーとして用いてもよい。ＳＥＬＰ４７Ｋは、絹様結晶性ブロックとエラスチン様柔軟型ブロックとだけからなるホモブロックタンパク質ポリマーである。ＳＥＬＰ４７Ｋは、プロリン７０％と、バリンと、アラニンとからなる変性材料であり、疎水性がある。また、反復配列タンパク質ポリマーは、ＳＥＬＰ ４７−Ｅ１３、ＳＥＬＰ ４７Ｒ−３、ＳＥＬＰ ４７Ｋ−３、ＳＥＬＰ４７ Ｅ−３、ＳＥＬＰ ６７ＫおよびＳＥＬＰ ５８を含んでもよい。
【００４２】
本発明の一実施形態では、絹エラスチン様タンパク質の構造は、頭−（Ｓ２Ｅ３ＥＫＥ４Ｓ２）１３−尾であり、Ｓは、絹様アミノ酸配列ＧＡＧＡＧＳであり、Ｅは、エラスチン様配列ＧＶＧＶＰであり、ＥＫは、リジン残基で変性されたエラスチン様配列ＧＫＧＶＰである。アミノ酸の頭配列は、ＭＤＰＶＶＱＲＲＤ ＷＥＮＰＧＶＴＱＬＮ ＲＬＡＡＨＰＰＦＡＳ ＤＰＭであり、尾配列は、ＡＧＡＧＳＧＡＧＡＭ ＤＰＧＲＹＱＤＬＲＳ ＨＨＨＨＨＨである。このコポリマーは、８８６個のアミノ酸を含み、７８０個のアミノ酸は、繰り返し配列単位にある。ＳＥＬＰ４７Ｋの分子量は、約７０，０００ダルトン、ｐＩは、１０．５である。その他のＳＥＬＰ変異体の特性を以下の表１に示す。
【表１】
【００４３】
当業者であれば、本発明の反復配列タンパク質ポリマーを製造するための種々の方法を理解するであろうが、そのいずれをも本明細書に用いることができる。たとえば、反復配列タンパク質ポリマーについては、Ｌ アンダーソン（Ｌ Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ）ら，ペプチドの大規模合成（Ｌａｒｇｅ−ｓｃａｌｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅｓ），バイオポリマーズ（Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ）５５（３），ｐ．２２７−５０（２０００））；遺伝子操作（たとえば、Ｊ．カペロ（Ｊ．Ｃａｐｐｅｌｌｏ），遺伝子改変タンパク質ポリマー（Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ），生分解性ポリマーハンドブック（Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ），ドム，Ａ．Ｊ．（Ｄｏｍｂ，Ａ．Ｊ．）；コスト，Ｊ．（Ｋｏｓｔ，Ｊ．）；ワイズマン，Ｄ．（Ｗｉｓｅｍａｎ，Ｄ．）（編），ハーバードアカデミックパブリッシャーズ（Ｈａｒｖａｒｄ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ），アムステルダム；ｐ．３８７−４１４）；および酵素的合成（たとえば、ＣＨ．ウォン（ＣＨ．Ｗｏｎｇ）およびＫ．Ｔ．ワン（Ｋ．Ｔ．Ｗａｎｇ），酵素的ペプチド合成の新たな展開（Ｎｅｗ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ），エクスペリエンティア（Ｅｘｐｅｒｉｅｎｔｉａ） ４７（１１−１２），ｐ．１１２３−９（１９９１））など、一般に認められた化学合成方法によって製造することができる。たとえば、本発明の反復配列タンパク質ポリマーを、その開示を本明細書に援用する米国特許第５，２４３，０３８号；同第６，３５５，７７６号；および国際公開第０７０８０４２６Ａ１号に記載の方法を用いて製造することができる。別の実施例では、反復配列タンパク質ポリマーを、非リボソームペプチドシンターゼを用いて製造することができる（Ｈ．Ｖ．ドーレン（Ｈ．Ｖ．Ｄｏｈｒｅｎ），ら，多官能ペプチドシンターゼ（Ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈａｓｅ），ケミカルレビュー（Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．）９７，ｐ．２６７５−２７０５（１９９７））など。
【００４４】
また、特定の絹−エラスチン反復配列タンパク質コポリマー、ＳＥＬＰ４７Ｋ、ＳＥＬＰ３７ＫおよびＳＥＬＰ２７Ｋの組換えＤＮＡを含む大腸菌株を、カリフォルニア州サンディエゴのプロテインポリマーテクノロジーズインク（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）から取得した。ＳＥＬＰ６７Ｋ、ＳＥＬＰ５８、ＳＥＬＰ３７ＫおよびＳＥＬＰ２７Ｋの変異体タンパク質を、上記のような標準的なＳＥＬＰ４７Ｋ製造プロトコルを用いて流加培養液１４Ｌで製造した。タンパク質を精製し、以下のような特徴付けを行った：１４Ｌの培養液から収集した細胞ペースト４０グラムをフレンチプレスで溶解し、続いて、ポリエチレンイミン（０．８ｗ／ｖ％）を加えた。遠心分離を用いて細胞抽出物を細胞残屑から分離した。ＳＥＬＰポリマーを、硫酸アンモニウム（飽和度３０％）を用いて細胞抽出物から沈殿させ、遠心分離で収集し、水で復元した。
【００４５】
変異体ＳＥＬＰ４７Ｅ、ＳＥＬＰ４７Ｋ−３、ＳＥＬＰ４７Ｒ−３およびＳＥＬＰ４７Ｅ−３の遺伝子操作に用いたプロトコルは、特定のＤＮＡ配列に沿った複数の部位で単一塩基対変化が生じるように設計された市販のキット（クイックチェンジ（登録商標）マルチ（ＱＵＩＫＣＨＡＮＧＥ（登録商標）Ｍｕｌｔｉ）（サイト−ディレクティドミュータジェネシスキット（Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ））、ストラタジーンキャット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ ｃａｔ）＃２００５１３）を改変したものである。標準プロトコルでは、目的のプラスミドテンプレート領域とハイブリダイゼーションして、点突然変異を取り込む単一方向の５’リン酸化プライマーの構築が必要になる。合成ごとに複数のプライマーを結合させるためのライゲーション反応を含む、サーモサイクリングを用いる。
【００４６】
フィロケイ酸塩
本発明に好適な層状ケイ酸塩材料は、フィロケイ酸塩であり、しばしばスメクタイト粘土と呼ばれる。フィロケイ酸塩には、複層構造があり、層の厚さは、約３オングストロームから約１０オングストロームである。二次元層はそれぞれ、八面体アルミナシートの両側に配置された２枚のシリカ四面体シートからなる。この複層は、陽イオンによって分離されている。多くのフィロケイ酸塩には、１００ｇ当たり２０〜２５０ｍＥｑの陽イオン交換容量がある。
【００４７】
層状フィロケイ酸塩は、水、あるいは、水素結合受容体および／または供与体として働くことで層間の空間を拡大できるその他の溶媒などの液体に触れると、膨張するという点で膨潤性粘土である。例として、モンモリロナイト、ベントナイト、ヘクトライト、サポナイト、ベイデライト、アタパルガイトおよびスチーブンサイトが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００４８】
一実施形態では、フィロケイ酸塩は、ナトリウムモンモリロナイトまたは天然由来の粘土を用いてナトリウム形から得られるそのイオン交換体である。ナトリウムモンモリロナイトは、負電荷を帯びた厚さ１ｎｍのアルミノケイ酸塩層からなり、表面に交換可能なナトリウム陽イオンがあるものである。このシートは、直径約１００ｎｍである。本発明の別の実施形態では、フィロケイ酸塩は、アタパルガイトである。
【００４９】
当業者であれば、非粘土材料を除去処理してあるフィロケイ酸塩粘土を、必要に応じて、粘土スラリーを陽イオン交換樹脂に通すか、あるいは、粘土と、水と、水溶性ナトリウム化合物との混合物を生成してこの混合物を剪断することで、ナトリウム形に転化することができることを理解するであろう。
【００５０】
本発明のナノコンポジットに用いたフィロケイ酸塩の重量濃度は、約０．１〜約９９％、約０．１〜約５０％、約１％〜約２０％、約１％〜約１０％および約４％〜約６％である。
【００５１】
このナノコンポジットは、水、あるいは、複合材料の製造に用いるその他の溶媒を種々の量で保持することができる。たとえば、このナノコンポジットは、水またはその他の溶媒の約０．１％〜約９０％、約１％〜約５０％、約１％〜約２５％、約１％〜約１５％、約１％〜約１０％、約５％〜約２０％および約５％〜約１０％を保持することができる。
【００５２】
このナノコンポジットは、特性の調整および変更を行うための添加剤を含んでもよい。たとえば、添加剤として、塩、オニウムイオン、可塑剤、抗菌剤、強化剤、タンパク質架橋剤、増殖因子、防腐剤、ナノ粒子、ナノファイバー、カオトロピック剤および電解質が挙げられる。
【００５３】
可塑剤は、特に室温でのナノコンポジット膜のガラス転移温度を引き下げ、膜の可撓性を高めるものである。こうした可塑剤の濃度は、懸濁液中の全固形分に対して約２ｗｔ％〜約１０ｗｔ％である。好適な可塑剤として、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）および単糖、多糖またはトレハロースなどの二糖が挙げられる。ナノコンポジット膜の可塑化に用いることもできる一般的な分子ファミリーには、アジピン酸誘導体、アゼイク酸誘導体、安息香酸誘導体、ジフェニル誘導体、クエン酸誘導体、エポキシド、グリコレート、イソフタル酸誘導体、マレイン酸誘導体、リン酸誘導体、フタル酸誘導体、ポリエステル、トリメリテートなどがある。具体的には、クエン酸エステル、クエン酸トリエチル、トリアセチン、フタル酸ジエチル、グリセリン、ポリエチレングリコールなどのポリアルキレングリコール、トレハロース、多糖類（ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒａｉｄｅｓ）、ポリスクシニミドおよびポリアスパラギン酸など、水溶性可塑剤を用いることができる。
【００５４】
グルタルアルデヒドなどのタンパク質架橋剤を用いれば、溶剤攻撃に対して膜を安定化させるばかりでなく、有効分子量を増やすことができる。グルタルアルデヒド架橋には一般に、濃度約０．６％〜約４％で用いる。タンパク質アミン、スルフヒドリル基およびカルボキシル基と主に反応するこれ以外の同種官能性およびヘテロ二官能性タンパク質架橋剤を用いてもよい。スルフヒドリル基と反応するホモ二官能性タンパク質架橋剤として、１，４−ビス［３−（２−ピリジルジチオ）プロピオンアミド］ブタン（ＤＰＤＰＢ）、ビス［２−（Ｎ−スクシニミジル−オキシカルボニルオキシ）エチル］スルホン（ＢＳＯＣＯＥＳ）、エチレングリコールジコハク酸ジ（Ｎ−スクシニミジル）エステル（ＥＧＳ）が挙げられる。通常、一級アミンと反応してアミジン結合を形成するホモ二官能性試薬は、ジメチル３，３’−ジチオプロピオンイミデートジヒドロクロリドである。アミン反応性の光反応性架橋剤には、ビス［２−（４−アジドサリチルアミド）エチル］ジスルフィド（ＢＡＳＥＤ）がある。アミン反応性のホモ二官能性架橋剤には、セバシン酸ビス（Ｎ−スクシニミジル）エステル（ＤＳＳ）がある。アミン基およびスルフヒドリル基と相互作用するヘテロ二官能性架橋剤には、スルホスクシニミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸）（スルホＳＭＣＣ）がある。ホモ二官能性でアミノ基に対して反応性を示すものには、ジチオビス（スクシニミジルプロピオネート）（ＤＳＰ）がある。タンパク質の反応基間の距離が分からなければ、こうした分子にスペーサーアームを用いることができる。また、後で架橋または官能基化できるように、エチル−３−（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）などの中間体架橋剤を用いて反応基を修飾してもよい。
【００５５】
以下の実施例は、本発明の実施形態を説明する目的で加えたものであり、その制限を意図したものではない。
【実施例１】
【００５６】
絹−エラスチン様タンパク質（ＳＥＬＰ）の製造
米国特許出願公開第２００４／０１８００２７Ａ１号に記載されているように、組換え大腸菌株を発酵させ、単分散のＳＥＬＰ４７Ｋを含む細胞ペーストを調製することで、単分散の絹−エラスチンタンパク質ポリマーであるＳＥＬＰ４７Ｋを製造した。この細胞ペーストを氷冷水に浸し、ホモジナイズして細胞抽出物を製造する。この細胞抽出物とポリエチレンイミンおよび濾過助剤とを混合し、７℃で１時間静置する。ポリエチレンイミンを用いて、細胞片と相当量の大腸菌タンパク質とを沈殿させる。次いで、このＳＥＬＰ４７Ｋ含有反応混合物を、ロータリードラムバキュームフィルター（Ｒｏｔａｒｙ Ｄｒｕｍ Ｖａｃｕｕｍ Ｆｉｌｔｅｒ）（ＲＶＤＦ）を用いて濾過する。次いで、ＳＥＬＰ４７Ｋが沈殿する飽和度２５％まで、濾過したＳＥＬＰ４７Ｋ溶液と、硫酸アンモニウムとを混合する。沈殿させたＳＥＬＰ４７Ｋおよび母液と濾過助剤とを混合し、ＲＶＤＦを用いて再び濾過する。ＳＥＬＰ４７Ｋおよび濾過助剤を含むＲＶＤＦケークと冷水とを混合し、ＳＥＬＰ４７Ｋを溶解させる。この沈殿および可溶化ステップを繰り返し、ＳＥＬＰ４７Ｋの純度プロファイルを高める。次いで、ＳＥＬＰ溶液の導電率が５０μＳ／ｃｍ２になるまで、精製した単分散ＳＥＬＰ４７Ｋを水交換する。次いで、この単分散ＳＥＬＰ溶液を１０％ｗｔ／ｖｏｌまで濃縮し、ここで、凍結乾燥して、粉になった単分散ＳＥＬＰ４７Ｋタンパク質ポリマーを得る。適合性試験で必要になるまで、この材料を−７０℃で保管した。
【実施例２】
【００５７】
サクシニル化ＳＥＬＰの調製
サクシニル化ＳＥＬＰを、室温で無水コハク酸（１５２ｍｇ）により処理した２５％水性アセトニトリル（１０ｍＬ）にＳＥＬＰ（０．７ｇ）を溶かした溶液から調製した。反応の過程でｐＨを７〜８に維持するため、水酸化ナトリウム溶液（３Ｍ）を滴加した。３時間後、アリコートがニンヒドリンに対して非反応性であることが判明し、有効なアミノ官能基の誘導体化が示された。このサンプルを水に対して一晩透析（３×２Ｌ）し、ここにおいて、凍結乾燥して海綿状の白色の固体（０．６２ｇ）を得た。
【実施例３】
【００５８】
ＲＳＰＰ／フィロケイ酸塩溶液および膜の調製：
粉状のクロイサイト（登録商標）（Ｃｌｏｉｓｉｔｅ（登録商標））Ｎａ＋モンモリロナイト（ＭＭＴ）フィロケイ酸塩（サザンクレイ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｃｌａｙ）、陽イオン交換容量［ＣＥＣ］９２ｍｅｑ／１００ｇ）を加え、水を脱イオン化し、０．１〜１．０ｗｔ％の懸濁液を得た。次いで、この水／ＭＭＴ懸濁液を、プローブソニケーターを用いて約１０分間超音波処理した。ゼータ電位を測定するために、粉状のＳＥＬＰをＭＭＴ懸濁液にゆっくりと加えた。薄膜の調製の場合、ＳＥＬＰを脱イオン水に溶解し、５ｗｔ％の溶液を得てから、ＭＭＴ懸濁液に加えた。次いで、この混合物をポリスチレン秤量皿にキャストして、数日間乾燥させた。その結果得られた膜は、フリースタンディングで光学的に透明であり、直径は約５ｃｍ、各膜における固形物の総量は、約１００ｍｇであった。ナノコンポジット材料におけるＭＭＴの最終量は、乾燥重量ベースで０％、２％、４％、６％、８％および１０％であった。
【００５９】
また、アタパルガイトを脱イオン水に加え、次いで、懸濁液とＳＥＬＰとを混合して、粉状のフィロケイ酸塩アタパルガイトを用いたナノコンポジットも調製した。膜については、上述のように調製した。
【実施例４】
【００６０】
ナノコンポジットの材料特性に特徴付けを行うための方法
ゼータ電位
ナノコンポジットの液体溶媒混合物のゼータ電位の測定を、ＺｅｔａＰＡＬＳ装置（ブルックヘブンインスツルメンツ社（Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｃｏｒｐ．）、ニューヨーク）により室温で実施した。各ＭＭＴ濃度での平均値を、１０回の測定から得た。水懸濁液中で０．０１ｗｔ％のＭＭＴと０．１ｗｔ％のＭＭＴとを一晩撹拌し、次いで、数日間沈降させた。次いで、ゼータ電位測定対象のサンプルを、沈降懸濁液の上清から取り出した。ＳＥＬＰまたはサクシニル化したＳＥＬＰ粉末を懸濁液に種々の量で加えた。ゼータ電位の結果は概して、相対濃度が同じであれば、０．０１ｗｔ％懸濁液と０．１ｗｔ％懸濁液との両方で類似していた。
【００６１】
Ｘ線解析プロファイル
Ｘ線小角散乱プロファイルを、真空ビームパスを備えた、カメラ長１８７０ｍｍ、ｘ線波長０．１３６６ｎｍの国立シンクロトロン光源（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｙｎｃｈｒｏｔｒｏｎ Ｌｉｇｈｔ Ｓｏｕｒｃｅ）の装置ビームラインＸ２７Ｃと、Ｍａｒ−ＣＣＤ（電荷結合素子）大面積検出器（マーＵＳＡ（Ｍａｒ ＵＳＡ）、イリノイ州エバンストン）とで収集した。広角散乱を、Ｒｉｇａｋｕ（商標）の回転陽極を５０ｋＶで作動させて実施した。同装置は、スタットン（Ｓｔａｔｔｏｎ（商標））カメラ（カメラ長７３ｍｍ）を備え、イメージングプレートが真空下で支えられ、ｘ線波長は０．１５４１８ｎｍであった。二次元パターンについては、Ｆｉｔ２Ｄソフトウェア（Ａ．ハマースレイ（Ａ．Ｈａｍｍｅｒｓｌｅｙ）、欧州シンクロトロン放射光施設（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｓｙｎｃｈｒｏｔｒｏｎ Ｒａｄｉａｔｉｏｎ Ｆａｃｉｌｉｔｙ））を用いて解析した。
【００６２】
透過電子顕微鏡法（ＴＥＭ）
透過電子顕微鏡法を、フィリップス（商標）（Ｐｈｉｌｉｐｓ（商標））ＣＭ２００−ＦＥＧ装置２００ｋｖで作動させて実施した。膜を断面寸法約２５ｍｍ２に切り、Ｓｐｕｒｒ（エレクトロンマイクロスコピーサイエンス（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ペンシルベニア州ハットフィールド（Ｈａｔｆｉｅｌｄ））エポキシに包埋し、室温で一晩硬化させた。ダイヤモンドナイフを備えたＲＭＣ ＰｏｗｅｒＴｏｍｅ（商標）で室温にて、横断面に顕微鏡切片作成法を実施した。切片の厚さは、１００〜１５０ｎｍであった。
【００６３】
引張試験
引っ張り強度試験を行うために、膜を約５×３５ｍｍの細片に切った。サンプル濃度ごとに５回の試験を行った。歪み０．２５％での応力歪み曲線の傾きを用いて、弾性率を計算した。また、破断時伸び率、すなわち破断歪みを、パーセント値として測定した。
【００６４】
熱機械解析
熱機械解析では、熱膨張係数（ＣＴＥ）について、一定応力対温度曲線におけるサンプルの長さを、サンプルの元の長さで除した商の傾きとして測定した。この傾きは、ゴム状領域（＞２００℃）において温度範囲２℃にわたり測定したものである。
【実施例５】
【００６５】
ナノコンポジットの材料特性
Ｘ線解析
図１ｂは、小角および広角領域における散乱曲線を示す。ＭＭＴ粉末対照物に見られるような１．２ｎｍに近い層間隔は存在しなかった。原子間（シート内）のＭＭＴ間隔に起因するピークおよびＳＥＬＰの幅の広いピークについては、１ｎｍ−１を超える散乱ベクター（ｑ）値として確認することができない。小角範囲（ｑ＜１ｎｍ−１）では、散乱プロファイルが非常に一様であり、こうしたより長い尺度でのピークに関する証拠は確認されない。
【００６６】
この結果から、タンパク質鎖がＭＭＴシート間に順序正しくインターカレートする中間体構造が存在しないことが示される。ＷＡＸＳ領域（ｑ＞１ｎｍ−１）では、ＳＥＬＰは、結晶性ではなく、ｄ＝０．７２ｎｍにおける絹特有のＩピークがないばかりでなく、絹のＩＩβシートの明確なピークもまったく見られない。
【００６７】
ＴＥＭ
図２は、ＳＥＬＰナノコンポジットサンプルにおいて、横断面の厚さ１５０ｎｍの２％、４％および８％ＭＭＴのＴＥＭ顕微鏡写真を示す。高倍率顕微鏡写真（２ｂ、ｄ、ｆ）では、ＳＥＬＰマトリックスにおいてＭＭＴが十分に分散しており、個々の厚さが１ｎｍのＭＭＴシートを確認することができる。また、ＭＭＴの密度も、数百ミクロンの長さに沿って上から下まで膜全体に極めて均一であるように見える（図２ａ、ｃ、ｅ）。
【００６８】
ＴＥＭおよびＸ線解析データはどちらも、高度に層剥離した構造の所見を裏付けるものである。
【００６９】
引張特性
膜引張試験では、２ＧＰａのＳＥＬＰ単独対照膜の弾性率（図３ａ）と５０Ｍｐａを超える引っ張り強度（データなし）とが示された。ＭＭＴ濃度が上昇すると、添加量４〜６％まで弾性率が３ＧＰａ程度へと上昇した。弾性率は、ＭＭＴ添加量が４〜６％を上回ると低下した。４％ＭＭＴでは、膜の弾性率は上昇したものの、膜は脆化し、破断時伸び率、すなわち破断歪みは、０％ＭＭＴの０．０４４（４．４％）から、４％ＭＭＴでは０．０１２（１．２％）に低下した。
【００７０】
示差走査熱量測定
示差走査熱量測定（ＤＳＣ）によれば、ＭＭＴを加えてもＳＥＬＰガラス転移に大きな変化はなかった。Ｔｇは、ＭＭＴの量に関わりなく１８０℃近くにとどまり、この値は、絹とエラスチンとの乾燥膜およびファイバーから測定したＴｇと同様の水準である。
【００７１】
熱的特性
熱機械解析（ＴＭＡ）を用いて、ゴム状領域（＞２００℃）の熱膨張係数（ＣＴＥ）を判定した。ＣＴＥは、ＭＭＴ量が増加すると低下し、ＳＥＬＰ単独の対照物では９４×１０−３℃−１であったが、８％ＭＭＴを添加すると４９×１０−３℃−１にまで低下した（図３ｂ）。ＤＳＣでは、Ｔｇ変化についての証拠は確認されなかったが、ガラス状領域とゴム状領域とにおけるサンプル長対温度曲線の傾きの交差から測定すると、サンプルがガラス挙動からゴム挙動へ移行する温度は、ＭＭＴ濃度の上昇に伴い大きく上昇することが確認された。この温度は、ＳＥＬＰでは１９３℃であったが、１０％ＭＭＴ／ＳＥＬＰサンプルでは２１３℃に上昇した。
【００７２】
ゼータ電位
図４は、ＳＥＬＰ／ＭＭＴの種々の重量比におけるゼータ電位のプロットを示す。純粋なＭＭＴ懸濁液とＳＥＬＰ溶液とのゼータ電位をそれぞれ、ＳＥＬＰ／ＭＭＴの相対濃度０．０００１と１００００とにおける対数線形プロットにプロットしている。水に加えた濃度０．１ｗｔ％のナトリウムＭＭＴのゼータ電位は、−４２ｍＶ（サザン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ））（商標）クレイＮａ＋、９２ｍｅｑ／１００ｇ）である。光散乱から測定した大きさの対数正規分布の中央値で見たＭＭＴシートの大きさは、９０ｎｍであった。ＳＥＬＰをより高い濃度で懸濁液に加えても、ＳＥＬＰ／ＭＭＴの重量比が約１になるまで、ＭＭＴシートの有効径および表面電荷は、ほとんど変わりがない。表面電荷の大きさは、ＳＥＬＰをＭＭＴに吸収させると小さくなり、ゼータ電位はゼロに向かい、次いで、ＳＥＬＰ／ＭＭＴの重量比８：１で中性になる。この系のゼータ電位は、タンパク質の正電荷全体が小さい（８８６個の全残基のうち正電荷を帯びたリジンはわずか１３個）ため、ＳＥＬＰを継続的加えても正電荷領域にはならない。ＳＥＬＰ溶液（０．５〜１ｗｔ％）のゼータ電位を測定すると、＋３ｍＶであった。この剥離型複合材料のＳＥＬＰ／ＭＭＴ重量比は、１０：１〜５０：１まで幅があるが、図４において、ＭＭＴ電荷は、こうした比率で吸収タンパク質によって中性になることが確認できる。
【００７３】
ＳＥＬＰｓｕｃｃナノコンポジットでは、ＳＥＬＰナノコンポジットと同様に、ナノメートルという長さの尺度で十分な分散が見られる。Ｘ線散乱では、ＭＭＴの層間隔およびインターカレーションピークが示されない。しかしながら、より大きな長さの尺度では、ＳＥＬＰｓｕｃｃにおいて巨視的な相分離をある程度確認することが可能であり、特に低倍率のＴＥＭ画像ではよく確認できる。図５は、ＳＥＬＰｓｕｃｃサンプルの電子顕微鏡写真を示し、ＭＭＴとタンパク質とに富んだ領域の明瞭な領域を確認することができる。
【００７４】
水性溶液では、イオン性残基がわずかであっても、ＳＥＬＰのＭＭＴシートへの吸収が起こりやすいようである。しかしながら、こうした残基は、ナノコンポジットの形態を決定する際に支配的な役割を果たしている。なぜなら、アニオン性残基は、ＭＭＴシートとの斥力相互作用を引き起こし、溶液中のＭＭＴのクラスター形成または凝集の低下の原因となり、固体の状態において不均一性が現れるためである。
【実施例６】
【００７５】
ＲＳＰＰの可塑化ナノコンポジット膜の調製。
【００７６】
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびトレハロースなどの可塑剤を用いて、膜のガラス転移温度を下げ、室温での膜の柔軟性を高めた。脱イオン水に加えたＭＭＴとのＳＥＬＰ溶液を、実施例３と同様に調製し、ＰＥＧ（分子量２００ｇ／ｍｏｌ）を、懸濁液の全固形分に対して２〜１０ｗｔ％の濃度範囲で加えた。３％ｗ／ｗのＭＭＴと、２％ｗ／ｗのＰＥＧと、９５％ｗ／ｗのＳＥＬＰとを含むサンプルを製造し、図６に示すように、これらのサンプルの引っ張り強度と、ＳＥＬＰ単独の引っ張り強度とを比較検討した。また、このようなナノコンポジット膜の可塑化に用いることもできる一般的な分子ファミリーとして、アジピン酸誘導体、アゼイク酸誘導体、安息香酸誘導体、ジフェニル誘導体、クエン酸誘導体、エポキシド、グリコレート、イソフタル酸誘導体、マレイン酸誘導体、リン酸誘導体、フタル酸誘導体、ポリエステル、トリメリテートなどが挙げられる。具体的には、クエン酸エステル、クエン酸トリエチル、トリアセチン、フタル酸ジエチル、グリセリン、ポリエチレングリコールなどのポリアルキレングリコール、トレハロース、多糖類（ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒａｉｄｅｓ）、ポリスクシニミドおよびポリアスパラギン酸などの水溶性可塑剤を用いることができる。
【実施例７】
【００７７】
架橋ＲＳＰＰナノコンポジット膜の調製。
【００７８】
タンパク質架橋剤を用いて、溶剤攻撃に対して膜を安定化させるとともに、有効分子量を増やした。実施例３に従って製造したＳＥＬＰ／ＭＭＴ膜を乾燥させた後、２．５ｖｏｌ．％グルタルアルデヒド溶液に浸し、１８時間架橋させた。グルタルアルデヒド架橋には通常、濃度約０．６％〜４％を用いた。次いで、この膜を２時間ＤＩ水に浸し、すすいでから乾燥させた。グルタルアルデヒド架橋には通常、濃度約０．６％〜約４％を用いる。
【図面の簡単な説明】
【００７９】
【図１】本発明のナノコンポジットのＸ線散乱曲線を示すグラフである。
【図２】本発明のナノコンポジットの低倍率と高倍率との透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）画像である。
【図３Ａ】本発明のナノコンポジットの弾性率と熱膨張係数（ＣＴＥ）とを示すグラフである。
【図３Ｂ】本発明のナノコンポジットの弾性率と熱膨張係数（ＣＴＥ）とを示すグラフである。
【図４】反復配列タンパク質ポリマーの濃度上昇に伴うフィロケイ酸塩の水性懸濁液のゼータ電位を示すグラフである。
【図５】本発明のナノコンポジットの低倍率と高倍率とのＴＥＭ画像である。
【図６】本発明のナノコンポジットの応力歪み曲線を示すグラフであり、表は、曲線から算出した弾性率（ＧＰａ）と破断時伸び率（％）とを示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、空軍との共同研究開発協定の履行に当たりなされたものである。米国政府は、本発明を用いる一定の権利を有する。
【０００２】
関連する出願の参照
本出願は、２００５年８月２２日に出願された米国特許仮出願第６０／７１０，３０８号に対する優先権を主張するものである。
【０００３】
発明の分野
本発明は、反復配列タンパク質ポリマーと層状ケイ酸塩との組み合わせから生成されるナノコンポジットに関するものである。本発明はまた、こうしたナノコンポジット材料を合成する方法を提供するものである。
【背景技術】
【０００４】
ポリマーと無機充填剤材料との組み合わせについては、機械的特性、熱的特性および遮断性が非修飾ポリマーよりも向上したナノコンポジット材料の製造で知られている。ナノコンポジットに関する詳細な考察は、アジャヤン，Ｐ．Ｍ．，（Ａｊａｙａｎ，Ｐ．Ｍ．，）ナノコンポジットの科学と技術（Ｎａｎｏｃｏｍｐｏｓｉｔｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）（ワイリー（Ｗｉｌｅｙ），２００３）で確認することができる。
【０００５】
また、ポリマーと、スメクタイト粘土またはフィロケイ酸塩とも呼ばれる層状ケイ酸塩との組み合わせも、ナノコンポジットの合成手段として利用されてきた。この主題に関しては、アレクサンダー（Ａｌｅｘａｎｄｒｅ）およびデュボイス（Ｄｕｂｏｉｓ）（２００１）ならびにピナバイア，Ｔ．Ｊ．（Ｐｉｎｎａｖａｉａ，Ｔ．Ｊ．）；ベアルＧ．Ｗ．（Ｂｅａｌｌ，Ｇ．Ｗ．）ポリマークレイナノコンポジット（Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｃｌａｙ Ｎａｎｏｃｏｍｐｏｓｉｔｅｓ）ワイリー：ニューヨーク，２０００年で包括的な検討がなされている。スメクタイト粘土については、グリム，Ｒ．Ｅ．（Ｇｒｉｍ，Ｒ．Ｅ．）粘土鉱物学（Ｃｌａｙ Ｍｉｎｅｒａｌｏｌｏｇｙ）第２版；マグローヒル（ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ）：ニューヨーク １９６８年に記載されている。
【０００６】
ポリマークレイナノコンポジットを合成するいくつかの方法については、たとえば、臼杵（Ｕｓｕｋｉ）ら（１９９３）により最初に記載されたナイロン／粘土複合材料など、当該技術分野に記載がある。臼杵有光ら、「ナイロン６−粘土ハイブリッドの合成（Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｎｙｌｏｎ ６−ｃｌａｙ ｈｙｂｒｉｄ）」、ジャーナルオブマテリアルズリサーチ（Ｊ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．），第８巻，Ｎｏ．５，１９９３年５月，ｐ．１１７９−１１８４を参照のこと。このようなプロセスでは、ナイロンとモンモリロナイトとを高温で混合して、ポリマー単独に比べて材料特性の向上した層剥離型ナノコンポジットを生成する。
【０００７】
天然ポリマーと、可塑剤と、層構造を持ち１００グラム当たり陽イオン交換容量が３０〜３５０ミリグラム当量である層剥離した粘土とを含む生分解性熱可塑性材料については、米国特許第６，８１１，５９９Ｂ２号に記載されている。この天然ポリマーは、多糖である。
【０００８】
有機化学組成物とポリマーとで変性したスメクタイト粘土については、米国特許第６，５２１，６９０号に記載されている。
【０００９】
フィロケイ酸塩と合成ホモポリマーであるポリ−Ｌ−リジンとから生成されるナノコンポジットについても、記載されてきた。（クリコリアン，Ｖ（Ｋｒｉｋｏｒｉａｎ，Ｖ．）らジャーナルオブポリマーサイエンスＢ：ポリマーフィジックス（Ｊ．Ｐｏｌｙｍ．Ｓｃｉ．Ｂ：Ｐｏｌｙｍ．Ｐｈｙｓ．）２００２，４０，ｐ．２５７９）。また、大豆タンパク質単離物を、ナトリウムモンモリロナイト粘土を含むナノコンポジットに組み入れることも行われてきた（チェン，Ｐ．（Ｃｈｅｎ，Ｐ．）およびジャン，Ｌ．（Ｚｈａｎｇ，Ｌ．）バイオマクロモレキュールズ（Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ），２００６，７，ｐ．１７００）。
【００１０】
タンパク質は、多様な機能性をもたらすアミノ酸の複雑な配列により、ほとんどの生物の主要な構造要素を構成する。最も熱心に研究された構造タンパク質の１つであるカイコ絹は、クモの糸にも匹敵するその驚くべき機械的特性から大きな関心を集めてきた。もう１つのよく知られた構造タンパク質であるエラスチンは、大部分が体の動脈壁、肺、腸および皮膚に見られる。絹エラスチン様タンパク質（ＳＥＬＰ）は、絹様アミノ酸とエラスチン様アミノ酸との交互ブロックからなる組換えタンパク質である。ＳＥＬＰのような組換えタンパク質の機械的特性は、自然界に見られる構造タンパク質よりも劣ることが多い。
【００１１】
インビボ用途および体外用途で組換えタンパク質を用いるには、高温機械的挙動など、様々な特性の向上と変化とが必要かもしれない。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、フィロケイ酸塩と１種または複数種の反復配列タンパク質ポリマーとのナノコンポジットを含む組成物を対象にするものである。本発明の一実施形態では、フィロケイ酸塩は、スメクタイト粘土のＮａ＋モンモリロナイト（ＭＭＴ）であり、反復配列タンパク質ポリマーは、絹とエラスチンとに由来する配列を含む、ＳＥＬＰと呼ばれるコポリマーである。さらに本発明の別の実施形態では、反復配列タンパク質ポリマーは、タンパク質と無水コハク酸とが反応する化学修飾ＳＥＬＰ類縁体である。本発明の別の実施形態では、フィロケイ酸塩は、アタパルガイトである。さらに本発明の別の実施形態では、添加剤、たとえば、可塑剤またはタンパク質架橋剤、あるいは、可塑剤および架橋剤をフィロケイ酸塩と反復配列タンパク質ポリマーとに加える。
【００１３】
本発明の組成物は、ＲＳＰＰ単独に比べて材料特性の変化および／または強化を示すナノコンポジットである。
【００１４】
このナノコンポジットは、フィロケイ酸塩シートがタンパク質マトリックス内に分散したものである。分散または剥離は、タンパク質の正電荷を帯びたリジン残基と負電荷を帯びたフィロケイ酸塩シートとの間の相互作用に加え、タンパク質構造内のこれ以外の極性官能基によって起こるものである。
【００１５】
どのような特定の理論にも束縛されることを望むものではないが、タンパク質の静電特性は、粒子間の長距離相互作用を支配し、タンパク質の水素結合特性は、タンパク質とフィロケイ酸塩材料と間の局所的相互作用を支配すると考えられる。具体的には、カチオン性タンパク質が、層剥離形態をもたらす一方で、アニオン性タンパク質残基により、ＭＭＴシートとの斥力相互作用が引き起こされ、溶液中のＭＭＴのクラスター形成または凝集の低下の原因となり、固体の状態において少なくともある程度の不均一性が現れ得ることで、ナノコンポジットの形態に影響を与える。
【００１６】
本発明のナノコンポジットは、ＲＳＰＰ単独の弾性率値を少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％および少なくとも９０％上回る弾性率値で示されるような、変化および／または向上した弾性に対応し得るものである。また、このナノコンポジットは、引張特性、形態、ゼータ電位およびまたは熱膨張係数を変化させるように設計することもできる。
【００１７】
このタンパク質をベースとした、反復配列タンパク質ポリマーとフィロケイ酸塩とのナノコンポジットから、縫合材料、組織足場材料、人工組織材料または工業材料などの生分解性構造材料としての複合材料向けに好適な機械的特性を持つ反復配列タンパク質ポリマーが生成される。
【００１８】
また、本発明のナノコンポジットは、水、あるいは、ナノコンポジットを製造するために用いるその他の溶媒だけでなく、ナノコンポジットの特性に合わせて選択されるその他の添加剤を様々な比率で保持することもできる。
【００１９】
また、本発明は、フィロケイ酸塩と反復配列タンパク質ポリマーとからなるナノコンポジットを形成する方法も記載するものである。この方法は、フィロケイ酸塩を追加溶媒の有り無しで脱イオン水または緩衝水に懸濁させることと、フィロケイ酸塩懸濁液に反復配列タンパク質ポリマーを加えて、混合および／または超音波処理することとを含む。その結果得られる混合物を容器にキャストして、乾燥させてもよい。
【００２０】
フィロケイ酸塩懸濁液に加えるＳＥＬＰ材料の量については、ナノコンポジットに望ましい材料特性を持たせられるように選択すればよい。たとえば、複合材料におけるＳＥＬＰの量を変えることで、望ましい弾性率値または引っ張り強度値を持つナノコンポジットを製造することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
本発明は、フィロケイ酸塩材料と１種または複数種の反復配列タンパク質ポリマーとのナノコンポジットである組成物を対象にするものである。本発明の一実施形態では、フィロケイ酸塩材料は、たとえば、モンモリロナイト（ＭＭＴ）粘土などのスメクタイト粘土であり、反復配列タンパク質ポリマーは、ＳＥＬＰと呼ばれる、絹とエラスチンとに由来する配列を有するコポリマーである。本発明のさらに別の実施形態では、反復配列タンパク質ポリマーは、化学修飾ＳＥＬＰ類縁体であるため、このタンパク質は、無水コハク酸と反応する。
【００２２】
本発明のナノコンポジットは、管理された条件下で製造される高度に層剥離した材料である。本発明は、フィロケイ酸塩と反復配列タンパク質ポリマーとのナノコンポジットを形成する方法をさらに含むものである。この方法は、溶媒の有り無しでフィロケイ酸塩粘土を水に懸濁し、このフィロケイ酸塩懸濁液に反復配列タンパク質ポリマーを加え、混合および／または超音波処理する。その結果得られる混合物を容器にキャストして、水またはその他の溶媒を種々の量で保持したまま乾燥させることができる。添加剤を用いてもよく、ナノコンポジットの特性を決めるために加えることができる。
【００２３】
定義
本発明においては、以下の定義を適用するものとする。
【００２４】
「弾性率」または弾性係数とは、ある材料が応力の除去後に元の寸法に戻る力を表す測定値をいい、式Ｅ＝Ｓ／δで計算され、式中、Ｓは、応力度、δは、歪度である。本発明のナノコンポジットの弾性率は、フィロケイ酸塩材料を加えていないＲＳＰＰの弾性率を少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％および少なくとも９０％上回る。
【００２５】
「層剥離型ナノコンポジット」とは、出発フィロケイ酸塩材料に見られる全体的にインターカレートされた層構造から、フィロケイ酸塩成分の層が分散または離れている複合材料形態をいう。「高度に層剥離したナノコンポジット」は、多くの層で分散が起きた結果、ナノコンポジットがフィロケイ酸塩とＲＳＰＰとの特徴的な相を示し得ないため、全体的に均一である形態を示す。
【００２６】
どのような特定の理論にも束縛されることを望むものではないが、タンパク質の静電特性は、粒子間の長距離相互作用を支配し、タンパク質の水素結合特性は、タンパク質とフィロケイ酸塩材料との間の局所的相互作用を支配すると考えられる。具体的には、カチオン性タンパク質が、層剥離形態をもたらす一方で、アニオン性タンパク質残基により、ＭＭＴシートとの斥力相互作用が引き起こされ、溶液中のＭＭＴのクラスター形成または凝集の低下の原因となり、固体の状態において少なくともある程度の不均一性が現れ得ることで、ナノコンポジットの形態に影響を与える。
【００２７】
「材料特性」とは、引っ張り強度、弾性率、形態ならびに変化および／または向上した熱的特性をいう。
【００２８】
本発明のナノコンポジットは、反復配列タンパク質ポリマー単独に比べると、１種または複数種の材料特性の変化および／または向上を示すものである。
【００２９】
「ナノコンポジット」とは、密着した物理的に異なる２種以上の材料からなり、２種以上の相の少なくとも１つでは、少なくとも１つの寸法がナノメートルサイズの範囲（すなわち、１００ナノメートルよりも小さい）にある複合材料をいう。ナノコンポジットは相間が密着しているため、従来の複合材料に比べてこのクラスの材料に独特の特性が生じる。アジャヤン，Ｐ．Ｍ．，ナノコンポジットの科学と技術（Ｎａｎｏｃｏｍｐｏｓｉｔｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）（ワイリー，２００３）を参照されたい。
【００３０】
複合膜に用いられるような「引っ張り強度」は、引張試験で膜が破断（破損）する前に加え得る最大応力をいう。引っ張り強度は、パスカル（ＭＰａ）または重量ポンド毎平方インチ（ｐｓｉ）で表される。
【００３１】
「破断時伸び率」は、破断歪みと呼ばれることもあり、材料が破断するときの材料の歪みのことで、パーセントで表される。引張特性には、引っ張り強度および破断時伸び率が含まれる。
【００３２】
「ゼータ電位」とは、コロイド粒子の表面にイオンが集まることによって生じる電位をいう。
【００３３】
反復配列タンパク質ポリマー
反復配列タンパク質ポリマー（ＲＳＰＰ）は、少なくとも１個の明確なドメインが配列全体を通じて２回以上の繰り返されるのであれば、どのような変性ポリペプチドであってもよい。
【００３４】
本発明に好適なＲＳＰＰの少なくとも２個の明確な繰り返しドメインは、天然、化学合成および／もしくは変性、組換えタンパク質またはその混合物に由来し得る。たとえば、繰り返し配列単位は、絹、エラスチンおよびコラーゲンなどの材料を支持する天然構造の変性に由来してもよい。あるいは、繰り返し配列単位は、合成構造に由来してもよい。
【００３５】
当業者であれば、本発明の反復配列タンパク質ポリマーの設計と製造を行うために変性および使用が可能な繰り返し配列単位を含む、種々の天然由来のタンパク質を理解するであろうが、そのいずれをも本明細書に用いることができる。具体的には、６００種を超える繰り返しアミノ酸配列単位が、生物系に存在することが知られている。天然または合成タンパク質の繰り返しアミノ酸配列単位については、エラスチン、コラーゲン、アブダクチン、足糸、エクステンシン、鞭毛状の絹、ドラッグライン絹、グルテン高分子量サブユニット、タイチン、フィブロネクチン、ラミニン、グリアジン、接着性ポリペプチド、氷核タンパク質、ケラチンムチン、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ、レジリンまたはその混合物を変性することで得られる。
【００３６】
その全体を本明細書に援用する国際公開第０４０８０４２６Ａ１号（ＷＯ ０４０８０４２６Ａ１）に、上記の天然材料または合成材料のＲＳＰＰ繰り返し配列単位について記載され、アミノ酸配列が示されている。
【００３７】
反復配列タンパク質ポリマー（ＲＳＰＰ）の式は、以下の式を含み：
Ｔｙ［（Ａｎ）ｘ（Ｂ）ｂ（Ａ’ｎ’）ｘ’（Ｂ’）ｂ’（Ａ’’ｎ’’）ｘ’’］ｉＴ’ｙ’
式中：ＴおよびＴ’はそれぞれ、約１〜約１００個のアミノ酸のアミノ酸配列を含み、アミノ酸配列Ｔ’は、アミノ酸配列Ｔと同一または異なり；ｙおよびｙ’はそれぞれ、０〜１の整数であり、整数ｙ’は、整数ｙと同一または異なり；Ａ、Ａ’およびＡ’’はそれぞれ、個々に約３〜約３０個のアミノ酸を含む繰り返しアミノ酸配列単位であり、アミノ酸配列Ａ’およびアミノ酸配列Ａ’’は、アミノ酸配列Ａと同一または異なり；ｎ、ｎ’およびｎ’’はそれぞれ、少なくとも２および２５０以下の整数であり；ｘ、ｘ’およびｘ’’はそれぞれ、０または少なくとも１の整数であり、整数はそれぞれ異なり、個々のアミノ酸配列繰り返し単位Ａ、Ａ’およびＡ’’においてアミノ酸が少なくとも３０個になるように規定し、整数ｘ’および整数ｘ’’は、整数ｘと同一または異なり、ｘ、ｘ’およびｘ’’は、すべてが同時にゼロにはなり得ず；ＢおよびＢ’はそれぞれ、約４〜約５０個のアミノ酸のアミノ酸配列を含み、アミノ配列Ｂ’は、アミノ酸配列Ｂと同一または異なり；ｂおよびｂ’はそれぞれ、０〜３の整数であり、整数ｂ’は、整数ｂと同一または異なり；およびｉは、１〜５００の整数である。
【００３８】
繰り返しアミノ酸配列単位は、同一の繰り返し配列単位を含んでもよく、あるいは、一緒になってブロックコポリマーまたは交互ブロックコポリマーを形成する相異なる繰り返し配列単位の組み合わせを含んでもよい。加えて、反復配列タンパク質ポリマーの個々の繰り返しアミノ酸配列単位は、約３〜約３０個のアミノ酸または約３〜約８個のアミノ酸を含むものである。さらに、同じアミノ酸が、同じ繰り返し配列単位に少なくとも２回出現してもよい。
【００３９】
当業者であれば、本発明の反復配列タンパク質ポリマーは、単分散または多分散し得ることをさらに理解するであろう。本発明の定義および記載において、「単分散の」ポリマーとは、明確な単一の分子量を持つポリマーである。本発明の定義および記載において、「多分散の」ポリマーとは、タンパク質分解またはその他の細分化手段を施されているか、あるいは、分子量の分布が起こるようなやり方で製造または変性されたポリマーである。
【００４０】
一実施形態では、このコポリマーは、同じ単量体単位だけしかないポリマーとは異なる特性を持つ絹−エラスチンコポリマーを形成する、絹単位とエラスチン単位との組み合わせである。
【００４１】
絹−エラスチンポリマー、ＳＥＬＰ４７Ｋを、本発明の反復配列タンパク質ポリマーとして用いてもよい。ＳＥＬＰ４７Ｋは、絹様結晶性ブロックとエラスチン様柔軟型ブロックとだけからなるホモブロックタンパク質ポリマーである。ＳＥＬＰ４７Ｋは、プロリン７０％と、バリンと、アラニンとからなる変性材料であり、疎水性がある。また、反復配列タンパク質ポリマーは、ＳＥＬＰ ４７−Ｅ１３、ＳＥＬＰ ４７Ｒ−３、ＳＥＬＰ ４７Ｋ−３、ＳＥＬＰ４７ Ｅ−３、ＳＥＬＰ ６７ＫおよびＳＥＬＰ ５８を含んでもよい。
【００４２】
本発明の一実施形態では、絹エラスチン様タンパク質の構造は、頭−（Ｓ２Ｅ３ＥＫＥ４Ｓ２）１３−尾であり、Ｓは、絹様アミノ酸配列ＧＡＧＡＧＳであり、Ｅは、エラスチン様配列ＧＶＧＶＰであり、ＥＫは、リジン残基で変性されたエラスチン様配列ＧＫＧＶＰである。アミノ酸の頭配列は、ＭＤＰＶＶＱＲＲＤ ＷＥＮＰＧＶＴＱＬＮ ＲＬＡＡＨＰＰＦＡＳ ＤＰＭであり、尾配列は、ＡＧＡＧＳＧＡＧＡＭ ＤＰＧＲＹＱＤＬＲＳ ＨＨＨＨＨＨである。このコポリマーは、８８６個のアミノ酸を含み、７８０個のアミノ酸は、繰り返し配列単位にある。ＳＥＬＰ４７Ｋの分子量は、約７０，０００ダルトン、ｐＩは、１０．５である。その他のＳＥＬＰ変異体の特性を以下の表１に示す。
【表１】
【００４３】
当業者であれば、本発明の反復配列タンパク質ポリマーを製造するための種々の方法を理解するであろうが、そのいずれをも本明細書に用いることができる。たとえば、反復配列タンパク質ポリマーについては、Ｌ アンダーソン（Ｌ Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ）ら，ペプチドの大規模合成（Ｌａｒｇｅ−ｓｃａｌｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅｓ），バイオポリマーズ（Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ）５５（３），ｐ．２２７−５０（２０００））；遺伝子操作（たとえば、Ｊ．カペロ（Ｊ．Ｃａｐｐｅｌｌｏ），遺伝子改変タンパク質ポリマー（Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ），生分解性ポリマーハンドブック（Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ），ドム，Ａ．Ｊ．（Ｄｏｍｂ，Ａ．Ｊ．）；コスト，Ｊ．（Ｋｏｓｔ，Ｊ．）；ワイズマン，Ｄ．（Ｗｉｓｅｍａｎ，Ｄ．）（編），ハーバードアカデミックパブリッシャーズ（Ｈａｒｖａｒｄ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ），アムステルダム；ｐ．３８７−４１４）；および酵素的合成（たとえば、ＣＨ．ウォン（ＣＨ．Ｗｏｎｇ）およびＫ．Ｔ．ワン（Ｋ．Ｔ．Ｗａｎｇ），酵素的ペプチド合成の新たな展開（Ｎｅｗ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ），エクスペリエンティア（Ｅｘｐｅｒｉｅｎｔｉａ） ４７（１１−１２），ｐ．１１２３−９（１９９１））など、一般に認められた化学合成方法によって製造することができる。たとえば、本発明の反復配列タンパク質ポリマーを、その開示を本明細書に援用する米国特許第５，２４３，０３８号；同第６，３５５，７７６号；および国際公開第０７０８０４２６Ａ１号に記載の方法を用いて製造することができる。別の実施例では、反復配列タンパク質ポリマーを、非リボソームペプチドシンターゼを用いて製造することができる（Ｈ．Ｖ．ドーレン（Ｈ．Ｖ．Ｄｏｈｒｅｎ），ら，多官能ペプチドシンターゼ（Ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈａｓｅ），ケミカルレビュー（Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．）９７，ｐ．２６７５−２７０５（１９９７））など。
【００４４】
また、特定の絹−エラスチン反復配列タンパク質コポリマー、ＳＥＬＰ４７Ｋ、ＳＥＬＰ３７ＫおよびＳＥＬＰ２７Ｋの組換えＤＮＡを含む大腸菌株を、カリフォルニア州サンディエゴのプロテインポリマーテクノロジーズインク（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）から取得した。ＳＥＬＰ６７Ｋ、ＳＥＬＰ５８、ＳＥＬＰ３７ＫおよびＳＥＬＰ２７Ｋの変異体タンパク質を、上記のような標準的なＳＥＬＰ４７Ｋ製造プロトコルを用いて流加培養液１４Ｌで製造した。タンパク質を精製し、以下のような特徴付けを行った：１４Ｌの培養液から収集した細胞ペースト４０グラムをフレンチプレスで溶解し、続いて、ポリエチレンイミン（０．８ｗ／ｖ％）を加えた。遠心分離を用いて細胞抽出物を細胞残屑から分離した。ＳＥＬＰポリマーを、硫酸アンモニウム（飽和度３０％）を用いて細胞抽出物から沈殿させ、遠心分離で収集し、水で復元した。
【００４５】
変異体ＳＥＬＰ４７Ｅ、ＳＥＬＰ４７Ｋ−３、ＳＥＬＰ４７Ｒ−３およびＳＥＬＰ４７Ｅ−３の遺伝子操作に用いたプロトコルは、特定のＤＮＡ配列に沿った複数の部位で単一塩基対変化が生じるように設計された市販のキット（クイックチェンジ（登録商標）マルチ（ＱＵＩＫＣＨＡＮＧＥ（登録商標）Ｍｕｌｔｉ）（サイト−ディレクティドミュータジェネシスキット（Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ））、ストラタジーンキャット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ ｃａｔ）＃２００５１３）を改変したものである。標準プロトコルでは、目的のプラスミドテンプレート領域とハイブリダイゼーションして、点突然変異を取り込む単一方向の５’リン酸化プライマーの構築が必要になる。合成ごとに複数のプライマーを結合させるためのライゲーション反応を含む、サーモサイクリングを用いる。
【００４６】
フィロケイ酸塩
本発明に好適な層状ケイ酸塩材料は、フィロケイ酸塩であり、しばしばスメクタイト粘土と呼ばれる。フィロケイ酸塩には、複層構造があり、層の厚さは、約３オングストロームから約１０オングストロームである。二次元層はそれぞれ、八面体アルミナシートの両側に配置された２枚のシリカ四面体シートからなる。この複層は、陽イオンによって分離されている。多くのフィロケイ酸塩には、１００ｇ当たり２０〜２５０ｍＥｑの陽イオン交換容量がある。
【００４７】
層状フィロケイ酸塩は、水、あるいは、水素結合受容体および／または供与体として働くことで層間の空間を拡大できるその他の溶媒などの液体に触れると、膨張するという点で膨潤性粘土である。例として、モンモリロナイト、ベントナイト、ヘクトライト、サポナイト、ベイデライト、アタパルガイトおよびスチーブンサイトが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００４８】
一実施形態では、フィロケイ酸塩は、ナトリウムモンモリロナイトまたは天然由来の粘土を用いてナトリウム形から得られるそのイオン交換体である。ナトリウムモンモリロナイトは、負電荷を帯びた厚さ１ｎｍのアルミノケイ酸塩層からなり、表面に交換可能なナトリウム陽イオンがあるものである。このシートは、直径約１００ｎｍである。本発明の別の実施形態では、フィロケイ酸塩は、アタパルガイトである。
【００４９】
当業者であれば、非粘土材料を除去処理してあるフィロケイ酸塩粘土を、必要に応じて、粘土スラリーを陽イオン交換樹脂に通すか、あるいは、粘土と、水と、水溶性ナトリウム化合物との混合物を生成してこの混合物を剪断することで、ナトリウム形に転化することができることを理解するであろう。
【００５０】
本発明のナノコンポジットに用いたフィロケイ酸塩の重量濃度は、約０．１〜約９９％、約０．１〜約５０％、約１％〜約２０％、約１％〜約１０％および約４％〜約６％である。
【００５１】
このナノコンポジットは、水、あるいは、複合材料の製造に用いるその他の溶媒を種々の量で保持することができる。たとえば、このナノコンポジットは、水またはその他の溶媒の約０．１％〜約９０％、約１％〜約５０％、約１％〜約２５％、約１％〜約１５％、約１％〜約１０％、約５％〜約２０％および約５％〜約１０％を保持することができる。
【００５２】
このナノコンポジットは、特性の調整および変更を行うための添加剤を含んでもよい。たとえば、添加剤として、塩、オニウムイオン、可塑剤、抗菌剤、強化剤、タンパク質架橋剤、増殖因子、防腐剤、ナノ粒子、ナノファイバー、カオトロピック剤および電解質が挙げられる。
【００５３】
可塑剤は、特に室温でのナノコンポジット膜のガラス転移温度を引き下げ、膜の可撓性を高めるものである。こうした可塑剤の濃度は、懸濁液中の全固形分に対して約２ｗｔ％〜約１０ｗｔ％である。好適な可塑剤として、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）および単糖、多糖またはトレハロースなどの二糖が挙げられる。ナノコンポジット膜の可塑化に用いることもできる一般的な分子ファミリーには、アジピン酸誘導体、アゼイク酸誘導体、安息香酸誘導体、ジフェニル誘導体、クエン酸誘導体、エポキシド、グリコレート、イソフタル酸誘導体、マレイン酸誘導体、リン酸誘導体、フタル酸誘導体、ポリエステル、トリメリテートなどがある。具体的には、クエン酸エステル、クエン酸トリエチル、トリアセチン、フタル酸ジエチル、グリセリン、ポリエチレングリコールなどのポリアルキレングリコール、トレハロース、多糖類（ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒａｉｄｅｓ）、ポリスクシニミドおよびポリアスパラギン酸など、水溶性可塑剤を用いることができる。
【００５４】
グルタルアルデヒドなどのタンパク質架橋剤を用いれば、溶剤攻撃に対して膜を安定化させるばかりでなく、有効分子量を増やすことができる。グルタルアルデヒド架橋には一般に、濃度約０．６％〜約４％で用いる。タンパク質アミン、スルフヒドリル基およびカルボキシル基と主に反応するこれ以外の同種官能性およびヘテロ二官能性タンパク質架橋剤を用いてもよい。スルフヒドリル基と反応するホモ二官能性タンパク質架橋剤として、１，４−ビス［３−（２−ピリジルジチオ）プロピオンアミド］ブタン（ＤＰＤＰＢ）、ビス［２−（Ｎ−スクシニミジル−オキシカルボニルオキシ）エチル］スルホン（ＢＳＯＣＯＥＳ）、エチレングリコールジコハク酸ジ（Ｎ−スクシニミジル）エステル（ＥＧＳ）が挙げられる。通常、一級アミンと反応してアミジン結合を形成するホモ二官能性試薬は、ジメチル３，３’−ジチオプロピオンイミデートジヒドロクロリドである。アミン反応性の光反応性架橋剤には、ビス［２−（４−アジドサリチルアミド）エチル］ジスルフィド（ＢＡＳＥＤ）がある。アミン反応性のホモ二官能性架橋剤には、セバシン酸ビス（Ｎ−スクシニミジル）エステル（ＤＳＳ）がある。アミン基およびスルフヒドリル基と相互作用するヘテロ二官能性架橋剤には、スルホスクシニミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸）（スルホＳＭＣＣ）がある。ホモ二官能性でアミノ基に対して反応性を示すものには、ジチオビス（スクシニミジルプロピオネート）（ＤＳＰ）がある。タンパク質の反応基間の距離が分からなければ、こうした分子にスペーサーアームを用いることができる。また、後で架橋または官能基化できるように、エチル−３−（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）などの中間体架橋剤を用いて反応基を修飾してもよい。
【００５５】
以下の実施例は、本発明の実施形態を説明する目的で加えたものであり、その制限を意図したものではない。
【実施例１】
【００５６】
絹−エラスチン様タンパク質（ＳＥＬＰ）の製造
米国特許出願公開第２００４／０１８００２７Ａ１号に記載されているように、組換え大腸菌株を発酵させ、単分散のＳＥＬＰ４７Ｋを含む細胞ペーストを調製することで、単分散の絹−エラスチンタンパク質ポリマーであるＳＥＬＰ４７Ｋを製造した。この細胞ペーストを氷冷水に浸し、ホモジナイズして細胞抽出物を製造する。この細胞抽出物とポリエチレンイミンおよび濾過助剤とを混合し、７℃で１時間静置する。ポリエチレンイミンを用いて、細胞片と相当量の大腸菌タンパク質とを沈殿させる。次いで、このＳＥＬＰ４７Ｋ含有反応混合物を、ロータリードラムバキュームフィルター（Ｒｏｔａｒｙ Ｄｒｕｍ Ｖａｃｕｕｍ Ｆｉｌｔｅｒ）（ＲＶＤＦ）を用いて濾過する。次いで、ＳＥＬＰ４７Ｋが沈殿する飽和度２５％まで、濾過したＳＥＬＰ４７Ｋ溶液と、硫酸アンモニウムとを混合する。沈殿させたＳＥＬＰ４７Ｋおよび母液と濾過助剤とを混合し、ＲＶＤＦを用いて再び濾過する。ＳＥＬＰ４７Ｋおよび濾過助剤を含むＲＶＤＦケークと冷水とを混合し、ＳＥＬＰ４７Ｋを溶解させる。この沈殿および可溶化ステップを繰り返し、ＳＥＬＰ４７Ｋの純度プロファイルを高める。次いで、ＳＥＬＰ溶液の導電率が５０μＳ／ｃｍ２になるまで、精製した単分散ＳＥＬＰ４７Ｋを水交換する。次いで、この単分散ＳＥＬＰ溶液を１０％ｗｔ／ｖｏｌまで濃縮し、ここで、凍結乾燥して、粉になった単分散ＳＥＬＰ４７Ｋタンパク質ポリマーを得る。適合性試験で必要になるまで、この材料を−７０℃で保管した。
【実施例２】
【００５７】
サクシニル化ＳＥＬＰの調製
サクシニル化ＳＥＬＰを、室温で無水コハク酸（１５２ｍｇ）により処理した２５％水性アセトニトリル（１０ｍＬ）にＳＥＬＰ（０．７ｇ）を溶かした溶液から調製した。反応の過程でｐＨを７〜８に維持するため、水酸化ナトリウム溶液（３Ｍ）を滴加した。３時間後、アリコートがニンヒドリンに対して非反応性であることが判明し、有効なアミノ官能基の誘導体化が示された。このサンプルを水に対して一晩透析（３×２Ｌ）し、ここにおいて、凍結乾燥して海綿状の白色の固体（０．６２ｇ）を得た。
【実施例３】
【００５８】
ＲＳＰＰ／フィロケイ酸塩溶液および膜の調製：
粉状のクロイサイト（登録商標）（Ｃｌｏｉｓｉｔｅ（登録商標））Ｎａ＋モンモリロナイト（ＭＭＴ）フィロケイ酸塩（サザンクレイ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｃｌａｙ）、陽イオン交換容量［ＣＥＣ］９２ｍｅｑ／１００ｇ）を加え、水を脱イオン化し、０．１〜１．０ｗｔ％の懸濁液を得た。次いで、この水／ＭＭＴ懸濁液を、プローブソニケーターを用いて約１０分間超音波処理した。ゼータ電位を測定するために、粉状のＳＥＬＰをＭＭＴ懸濁液にゆっくりと加えた。薄膜の調製の場合、ＳＥＬＰを脱イオン水に溶解し、５ｗｔ％の溶液を得てから、ＭＭＴ懸濁液に加えた。次いで、この混合物をポリスチレン秤量皿にキャストして、数日間乾燥させた。その結果得られた膜は、フリースタンディングで光学的に透明であり、直径は約５ｃｍ、各膜における固形物の総量は、約１００ｍｇであった。ナノコンポジット材料におけるＭＭＴの最終量は、乾燥重量ベースで０％、２％、４％、６％、８％および１０％であった。
【００５９】
また、アタパルガイトを脱イオン水に加え、次いで、懸濁液とＳＥＬＰとを混合して、粉状のフィロケイ酸塩アタパルガイトを用いたナノコンポジットも調製した。膜については、上述のように調製した。
【実施例４】
【００６０】
ナノコンポジットの材料特性に特徴付けを行うための方法
ゼータ電位
ナノコンポジットの液体溶媒混合物のゼータ電位の測定を、ＺｅｔａＰＡＬＳ装置（ブルックヘブンインスツルメンツ社（Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｃｏｒｐ．）、ニューヨーク）により室温で実施した。各ＭＭＴ濃度での平均値を、１０回の測定から得た。水懸濁液中で０．０１ｗｔ％のＭＭＴと０．１ｗｔ％のＭＭＴとを一晩撹拌し、次いで、数日間沈降させた。次いで、ゼータ電位測定対象のサンプルを、沈降懸濁液の上清から取り出した。ＳＥＬＰまたはサクシニル化したＳＥＬＰ粉末を懸濁液に種々の量で加えた。ゼータ電位の結果は概して、相対濃度が同じであれば、０．０１ｗｔ％懸濁液と０．１ｗｔ％懸濁液との両方で類似していた。
【００６１】
Ｘ線解析プロファイル
Ｘ線小角散乱プロファイルを、真空ビームパスを備えた、カメラ長１８７０ｍｍ、ｘ線波長０．１３６６ｎｍの国立シンクロトロン光源（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｙｎｃｈｒｏｔｒｏｎ Ｌｉｇｈｔ Ｓｏｕｒｃｅ）の装置ビームラインＸ２７Ｃと、Ｍａｒ−ＣＣＤ（電荷結合素子）大面積検出器（マーＵＳＡ（Ｍａｒ ＵＳＡ）、イリノイ州エバンストン）とで収集した。広角散乱を、Ｒｉｇａｋｕ（商標）の回転陽極を５０ｋＶで作動させて実施した。同装置は、スタットン（Ｓｔａｔｔｏｎ（商標））カメラ（カメラ長７３ｍｍ）を備え、イメージングプレートが真空下で支えられ、ｘ線波長は０．１５４１８ｎｍであった。二次元パターンについては、Ｆｉｔ２Ｄソフトウェア（Ａ．ハマースレイ（Ａ．Ｈａｍｍｅｒｓｌｅｙ）、欧州シンクロトロン放射光施設（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｓｙｎｃｈｒｏｔｒｏｎ Ｒａｄｉａｔｉｏｎ Ｆａｃｉｌｉｔｙ））を用いて解析した。
【００６２】
透過電子顕微鏡法（ＴＥＭ）
透過電子顕微鏡法を、フィリップス（商標）（Ｐｈｉｌｉｐｓ（商標））ＣＭ２００−ＦＥＧ装置２００ｋｖで作動させて実施した。膜を断面寸法約２５ｍｍ２に切り、Ｓｐｕｒｒ（エレクトロンマイクロスコピーサイエンス（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ペンシルベニア州ハットフィールド（Ｈａｔｆｉｅｌｄ））エポキシに包埋し、室温で一晩硬化させた。ダイヤモンドナイフを備えたＲＭＣ ＰｏｗｅｒＴｏｍｅ（商標）で室温にて、横断面に顕微鏡切片作成法を実施した。切片の厚さは、１００〜１５０ｎｍであった。
【００６３】
引張試験
引っ張り強度試験を行うために、膜を約５×３５ｍｍの細片に切った。サンプル濃度ごとに５回の試験を行った。歪み０．２５％での応力歪み曲線の傾きを用いて、弾性率を計算した。また、破断時伸び率、すなわち破断歪みを、パーセント値として測定した。
【００６４】
熱機械解析
熱機械解析では、熱膨張係数（ＣＴＥ）について、一定応力対温度曲線におけるサンプルの長さを、サンプルの元の長さで除した商の傾きとして測定した。この傾きは、ゴム状領域（＞２００℃）において温度範囲２℃にわたり測定したものである。
【実施例５】
【００６５】
ナノコンポジットの材料特性
Ｘ線解析
図１ｂは、小角および広角領域における散乱曲線を示す。ＭＭＴ粉末対照物に見られるような１．２ｎｍに近い層間隔は存在しなかった。原子間（シート内）のＭＭＴ間隔に起因するピークおよびＳＥＬＰの幅の広いピークについては、１ｎｍ−１を超える散乱ベクター（ｑ）値として確認することができない。小角範囲（ｑ＜１ｎｍ−１）では、散乱プロファイルが非常に一様であり、こうしたより長い尺度でのピークに関する証拠は確認されない。
【００６６】
この結果から、タンパク質鎖がＭＭＴシート間に順序正しくインターカレートする中間体構造が存在しないことが示される。ＷＡＸＳ領域（ｑ＞１ｎｍ−１）では、ＳＥＬＰは、結晶性ではなく、ｄ＝０．７２ｎｍにおける絹特有のＩピークがないばかりでなく、絹のＩＩβシートの明確なピークもまったく見られない。
【００６７】
ＴＥＭ
図２は、ＳＥＬＰナノコンポジットサンプルにおいて、横断面の厚さ１５０ｎｍの２％、４％および８％ＭＭＴのＴＥＭ顕微鏡写真を示す。高倍率顕微鏡写真（２ｂ、ｄ、ｆ）では、ＳＥＬＰマトリックスにおいてＭＭＴが十分に分散しており、個々の厚さが１ｎｍのＭＭＴシートを確認することができる。また、ＭＭＴの密度も、数百ミクロンの長さに沿って上から下まで膜全体に極めて均一であるように見える（図２ａ、ｃ、ｅ）。
【００６８】
ＴＥＭおよびＸ線解析データはどちらも、高度に層剥離した構造の所見を裏付けるものである。
【００６９】
引張特性
膜引張試験では、２ＧＰａのＳＥＬＰ単独対照膜の弾性率（図３ａ）と５０Ｍｐａを超える引っ張り強度（データなし）とが示された。ＭＭＴ濃度が上昇すると、添加量４〜６％まで弾性率が３ＧＰａ程度へと上昇した。弾性率は、ＭＭＴ添加量が４〜６％を上回ると低下した。４％ＭＭＴでは、膜の弾性率は上昇したものの、膜は脆化し、破断時伸び率、すなわち破断歪みは、０％ＭＭＴの０．０４４（４．４％）から、４％ＭＭＴでは０．０１２（１．２％）に低下した。
【００７０】
示差走査熱量測定
示差走査熱量測定（ＤＳＣ）によれば、ＭＭＴを加えてもＳＥＬＰガラス転移に大きな変化はなかった。Ｔｇは、ＭＭＴの量に関わりなく１８０℃近くにとどまり、この値は、絹とエラスチンとの乾燥膜およびファイバーから測定したＴｇと同様の水準である。
【００７１】
熱的特性
熱機械解析（ＴＭＡ）を用いて、ゴム状領域（＞２００℃）の熱膨張係数（ＣＴＥ）を判定した。ＣＴＥは、ＭＭＴ量が増加すると低下し、ＳＥＬＰ単独の対照物では９４×１０−３℃−１であったが、８％ＭＭＴを添加すると４９×１０−３℃−１にまで低下した（図３ｂ）。ＤＳＣでは、Ｔｇ変化についての証拠は確認されなかったが、ガラス状領域とゴム状領域とにおけるサンプル長対温度曲線の傾きの交差から測定すると、サンプルがガラス挙動からゴム挙動へ移行する温度は、ＭＭＴ濃度の上昇に伴い大きく上昇することが確認された。この温度は、ＳＥＬＰでは１９３℃であったが、１０％ＭＭＴ／ＳＥＬＰサンプルでは２１３℃に上昇した。
【００７２】
ゼータ電位
図４は、ＳＥＬＰ／ＭＭＴの種々の重量比におけるゼータ電位のプロットを示す。純粋なＭＭＴ懸濁液とＳＥＬＰ溶液とのゼータ電位をそれぞれ、ＳＥＬＰ／ＭＭＴの相対濃度０．０００１と１００００とにおける対数線形プロットにプロットしている。水に加えた濃度０．１ｗｔ％のナトリウムＭＭＴのゼータ電位は、−４２ｍＶ（サザン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ））（商標）クレイＮａ＋、９２ｍｅｑ／１００ｇ）である。光散乱から測定した大きさの対数正規分布の中央値で見たＭＭＴシートの大きさは、９０ｎｍであった。ＳＥＬＰをより高い濃度で懸濁液に加えても、ＳＥＬＰ／ＭＭＴの重量比が約１になるまで、ＭＭＴシートの有効径および表面電荷は、ほとんど変わりがない。表面電荷の大きさは、ＳＥＬＰをＭＭＴに吸収させると小さくなり、ゼータ電位はゼロに向かい、次いで、ＳＥＬＰ／ＭＭＴの重量比８：１で中性になる。この系のゼータ電位は、タンパク質の正電荷全体が小さい（８８６個の全残基のうち正電荷を帯びたリジンはわずか１３個）ため、ＳＥＬＰを継続的加えても正電荷領域にはならない。ＳＥＬＰ溶液（０．５〜１ｗｔ％）のゼータ電位を測定すると、＋３ｍＶであった。この剥離型複合材料のＳＥＬＰ／ＭＭＴ重量比は、１０：１〜５０：１まで幅があるが、図４において、ＭＭＴ電荷は、こうした比率で吸収タンパク質によって中性になることが確認できる。
【００７３】
ＳＥＬＰｓｕｃｃナノコンポジットでは、ＳＥＬＰナノコンポジットと同様に、ナノメートルという長さの尺度で十分な分散が見られる。Ｘ線散乱では、ＭＭＴの層間隔およびインターカレーションピークが示されない。しかしながら、より大きな長さの尺度では、ＳＥＬＰｓｕｃｃにおいて巨視的な相分離をある程度確認することが可能であり、特に低倍率のＴＥＭ画像ではよく確認できる。図５は、ＳＥＬＰｓｕｃｃサンプルの電子顕微鏡写真を示し、ＭＭＴとタンパク質とに富んだ領域の明瞭な領域を確認することができる。
【００７４】
水性溶液では、イオン性残基がわずかであっても、ＳＥＬＰのＭＭＴシートへの吸収が起こりやすいようである。しかしながら、こうした残基は、ナノコンポジットの形態を決定する際に支配的な役割を果たしている。なぜなら、アニオン性残基は、ＭＭＴシートとの斥力相互作用を引き起こし、溶液中のＭＭＴのクラスター形成または凝集の低下の原因となり、固体の状態において不均一性が現れるためである。
【実施例６】
【００７５】
ＲＳＰＰの可塑化ナノコンポジット膜の調製。
【００７６】
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびトレハロースなどの可塑剤を用いて、膜のガラス転移温度を下げ、室温での膜の柔軟性を高めた。脱イオン水に加えたＭＭＴとのＳＥＬＰ溶液を、実施例３と同様に調製し、ＰＥＧ（分子量２００ｇ／ｍｏｌ）を、懸濁液の全固形分に対して２〜１０ｗｔ％の濃度範囲で加えた。３％ｗ／ｗのＭＭＴと、２％ｗ／ｗのＰＥＧと、９５％ｗ／ｗのＳＥＬＰとを含むサンプルを製造し、図６に示すように、これらのサンプルの引っ張り強度と、ＳＥＬＰ単独の引っ張り強度とを比較検討した。また、このようなナノコンポジット膜の可塑化に用いることもできる一般的な分子ファミリーとして、アジピン酸誘導体、アゼイク酸誘導体、安息香酸誘導体、ジフェニル誘導体、クエン酸誘導体、エポキシド、グリコレート、イソフタル酸誘導体、マレイン酸誘導体、リン酸誘導体、フタル酸誘導体、ポリエステル、トリメリテートなどが挙げられる。具体的には、クエン酸エステル、クエン酸トリエチル、トリアセチン、フタル酸ジエチル、グリセリン、ポリエチレングリコールなどのポリアルキレングリコール、トレハロース、多糖類（ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒａｉｄｅｓ）、ポリスクシニミドおよびポリアスパラギン酸などの水溶性可塑剤を用いることができる。
【実施例７】
【００７７】
架橋ＲＳＰＰナノコンポジット膜の調製。
【００７８】
タンパク質架橋剤を用いて、溶剤攻撃に対して膜を安定化させるとともに、有効分子量を増やした。実施例３に従って製造したＳＥＬＰ／ＭＭＴ膜を乾燥させた後、２．５ｖｏｌ．％グルタルアルデヒド溶液に浸し、１８時間架橋させた。グルタルアルデヒド架橋には通常、濃度約０．６％〜４％を用いた。次いで、この膜を２時間ＤＩ水に浸し、すすいでから乾燥させた。グルタルアルデヒド架橋には通常、濃度約０．６％〜約４％を用いる。
【図面の簡単な説明】
【００７９】
【図１】本発明のナノコンポジットのＸ線散乱曲線を示すグラフである。
【図２】本発明のナノコンポジットの低倍率と高倍率との透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）画像である。
【図３Ａ】本発明のナノコンポジットの弾性率と熱膨張係数（ＣＴＥ）とを示すグラフである。
【図３Ｂ】本発明のナノコンポジットの弾性率と熱膨張係数（ＣＴＥ）とを示すグラフである。
【図４】反復配列タンパク質ポリマーの濃度上昇に伴うフィロケイ酸塩の水性懸濁液のゼータ電位を示すグラフである。
【図５】本発明のナノコンポジットの低倍率と高倍率とのＴＥＭ画像である。
【図６】本発明のナノコンポジットの応力歪み曲線を示すグラフであり、表は、曲線から算出した弾性率（ＧＰａ）と破断時伸び率（％）とを示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１種類の反復配列タンパク質ポリマーとフィロケイ酸塩とを含む、ナノコンポジット。
【請求項２】
前記反復配列タンパク質ポリマーの式が：
Ｔｙ［（Ａｎ）ｘ（Ｂ）ｂ（Ａ’ｎ’）ｘ’（Ｂ’）ｂ’（Ａ’’ｎ’’）ｘ’’］ｉＴ’ｙ’を含み、
式中：
ＴおよびＴ’はそれぞれ、約１〜約１００個のアミノ酸のアミノ酸配列を含み、前記アミノ酸配列Ｔ’は、前記アミノ酸配列Ｔと同一または異なり；
ｙおよびｙ’はそれぞれ、０〜１の整数であり、前記整数ｙ’は、前記整数ｙと同一または異なり；
Ａ、Ａ’およびＡ’’はそれぞれ、個々に約３〜約３０個のアミノ酸を含む繰り返し配列単位であり、前記アミノ酸配列Ａ’および前記アミノ酸配列Ａ’’は、前記アミノ酸配列Ａと同一または異なり；
ｎ、ｎ’およびｎ’’は、少なくとも２であり、なおかつ２５０以下の整数であり；
ｘ、ｘ’およびｘ’’はそれぞれ、０または少なくとも１の整数であり、各整数は、異なり、個々の繰り返し配列単位Ａ、Ａ’およびＡ’’においてアミノ酸が少なくとも３０個になるように規定し、前記整数ｘ’および前記整数ｘ’’は、前記整数ｘと同一または異なり；
ＢおよびＢ’はそれぞれ、約４〜約５０個のアミノ酸のアミノ酸配列を含み、前記アミノ配列Ｂ’は、前記アミノ酸配列Ｂと同一または異なり；
ｂおよびｂ’はそれぞれ、０〜３の整数であり、前記整数ｂ’は、前記整数ｂと同一または異なり；
ｉは、１〜１００の整数である、請求項１に記載のナノコンポジット。
【請求項３】
前記フィロケイ酸塩が、モンモリロナイト、ベントナイト、ヘクトライト、サポナイト、ベイデライト、アタパルガイトおよびスチーブンサイトから選択される、請求項２に記載のナノコンポジット。
【請求項４】
可塑剤、タンパク質架橋剤、または可塑剤およびタンパク質架橋剤をさらに含む、請求項２に記載のナノコンポジット。
【請求項５】
前記可塑剤が、アジピン酸誘導体、アゼイク酸誘導体、安息香酸誘導体、ジフェニル誘導体、クエン酸誘導体、エポキシド、グリコレート、イソフタル酸誘導体、マレイン酸誘導体、リン酸誘導体（ｄｅｒｉｖａｔｉｅｓ）、フタル酸誘導体、ポリエステル、トリメリテート、ポリアルキレングリコール、多糖類、二糖類および単糖類から選択される、請求項４に記載のナノコンポジット。
【請求項６】
前記可塑剤が、ポリエチレングリコールまたはトレハロースであり、前記タンパク質架橋剤は、グルタルアルデヒドである、請求項４に記載のナノコンポジット。
【請求項７】
前記フィロケイ酸塩を加えていない前記反復配列タンパク質ポリマーの材料特性と比較した場合、少なくとも１つの材料特性が変化した、請求項２に記載のナノコンポジット。
【請求項８】
前記変化した少なくとも１つの材料特性が、引っ張り強度、弾性率、形態および熱膨張係数から選択される、請求項７に記載のナノコンポジット。
【請求項９】
層剥離形態である、請求項８に記載のナノコンポジット。
【請求項１０】
全体的に均一な形態である、請求項８に記載のナノコンポジット。
【請求項１１】
前記ナノコンポジットの前記弾性率が、前記フィロケイ酸塩を加えていない前記反復配列タンパク質ポリマーの前記弾性率を少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％および少なくとも９０％上回る、請求項８に記載のナノコンポジット。
【請求項１２】
前記ナノコンポジットの前記膨張係数が、フィロケイ酸塩を加えていない前記反復配列タンパク質ポリマーの熱膨張係数よりも小さい、請求項８に記載のナノコンポジット。
【請求項１３】
前記反復配列タンパク質ポリマーを加えていない前記フィロケイ酸塩のゼータ電位と比較した場合、前記ナノコンポジットのゼータ電位が変化している、請求項２に記載のナノコンポジット。
【請求項１４】
可塑剤を含む前記ナノコンポジットであって、前記ナノコンポジットが、可塑剤なしのナノコンポジットの破断時伸び率と比較した場合、破断時伸び率が大きい、請求項５に記載のナノコンポジット。
【請求項１５】
反復配列絹−エラスチンタンパク質ポリマーまたはその誘導体とフィロケイ酸塩粘土とを含む、ナノコンポジット。
【請求項１６】
前記ナノコンポジットが、縫合材料である、請求項２に記載のナノコンポジット。
【請求項１７】
前記ナノコンポジットが、縫合材料である、請求項１５に記載のナノコンポジット。
【請求項１８】
前記ナノコンポジットが、組織足場材料である、請求項２に記載のナノコンポジット。
【請求項１９】
前記ナノコンポジットが、組織足場材料である、請求項１５に記載のナノコンポジット。
【請求項２０】
前記ナノコンポジットが、生分解性構造材料である、請求項２に記載のナノコンポジット。
【請求項２１】
前記ナノコンポジットが、生分解性構造材料である、請求項１５に記載のナノコンポジット。
【請求項２２】
ナノコンポジットを製造する方法であって：
少なくとも１種類の反復配列タンパク質ポリマーを選択することと；
フィロケイ酸塩を選択することと；
前記フィロケイ酸塩を水性液体に加えて、懸濁液を作製することと；
前記少なくとも１種類の反復配列タンパク質ポリマーと前記懸濁液とを混合することと；
前記懸濁液と混合した前記少なくとも１種類の反復配列タンパク質ポリマーを乾燥させることとを含む、方法。
【請求項２３】
前記懸濁液と混合した前記少なくとも１種類の反復配列タンパク質ポリマーは、何らかの表面にキャストする、請求項１８に記載の方法。
【請求項２４】
可塑剤、タンパク質架橋剤、または可塑剤およびタンパク質架橋剤を加えることをさらに含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項１】
少なくとも１種類の反復配列タンパク質ポリマーとフィロケイ酸塩とを含む、ナノコンポジット。
【請求項２】
前記反復配列タンパク質ポリマーの式が：
Ｔｙ［（Ａｎ）ｘ（Ｂ）ｂ（Ａ’ｎ’）ｘ’（Ｂ’）ｂ’（Ａ’’ｎ’’）ｘ’’］ｉＴ’ｙ’を含み、
式中：
ＴおよびＴ’はそれぞれ、約１〜約１００個のアミノ酸のアミノ酸配列を含み、前記アミノ酸配列Ｔ’は、前記アミノ酸配列Ｔと同一または異なり；
ｙおよびｙ’はそれぞれ、０〜１の整数であり、前記整数ｙ’は、前記整数ｙと同一または異なり；
Ａ、Ａ’およびＡ’’はそれぞれ、個々に約３〜約３０個のアミノ酸を含む繰り返し配列単位であり、前記アミノ酸配列Ａ’および前記アミノ酸配列Ａ’’は、前記アミノ酸配列Ａと同一または異なり；
ｎ、ｎ’およびｎ’’は、少なくとも２であり、なおかつ２５０以下の整数であり；
ｘ、ｘ’およびｘ’’はそれぞれ、０または少なくとも１の整数であり、各整数は、異なり、個々の繰り返し配列単位Ａ、Ａ’およびＡ’’においてアミノ酸が少なくとも３０個になるように規定し、前記整数ｘ’および前記整数ｘ’’は、前記整数ｘと同一または異なり；
ＢおよびＢ’はそれぞれ、約４〜約５０個のアミノ酸のアミノ酸配列を含み、前記アミノ配列Ｂ’は、前記アミノ酸配列Ｂと同一または異なり；
ｂおよびｂ’はそれぞれ、０〜３の整数であり、前記整数ｂ’は、前記整数ｂと同一または異なり；
ｉは、１〜１００の整数である、請求項１に記載のナノコンポジット。
【請求項３】
前記フィロケイ酸塩が、モンモリロナイト、ベントナイト、ヘクトライト、サポナイト、ベイデライト、アタパルガイトおよびスチーブンサイトから選択される、請求項２に記載のナノコンポジット。
【請求項４】
可塑剤、タンパク質架橋剤、または可塑剤およびタンパク質架橋剤をさらに含む、請求項２に記載のナノコンポジット。
【請求項５】
前記可塑剤が、アジピン酸誘導体、アゼイク酸誘導体、安息香酸誘導体、ジフェニル誘導体、クエン酸誘導体、エポキシド、グリコレート、イソフタル酸誘導体、マレイン酸誘導体、リン酸誘導体（ｄｅｒｉｖａｔｉｅｓ）、フタル酸誘導体、ポリエステル、トリメリテート、ポリアルキレングリコール、多糖類、二糖類および単糖類から選択される、請求項４に記載のナノコンポジット。
【請求項６】
前記可塑剤が、ポリエチレングリコールまたはトレハロースであり、前記タンパク質架橋剤は、グルタルアルデヒドである、請求項４に記載のナノコンポジット。
【請求項７】
前記フィロケイ酸塩を加えていない前記反復配列タンパク質ポリマーの材料特性と比較した場合、少なくとも１つの材料特性が変化した、請求項２に記載のナノコンポジット。
【請求項８】
前記変化した少なくとも１つの材料特性が、引っ張り強度、弾性率、形態および熱膨張係数から選択される、請求項７に記載のナノコンポジット。
【請求項９】
層剥離形態である、請求項８に記載のナノコンポジット。
【請求項１０】
全体的に均一な形態である、請求項８に記載のナノコンポジット。
【請求項１１】
前記ナノコンポジットの前記弾性率が、前記フィロケイ酸塩を加えていない前記反復配列タンパク質ポリマーの前記弾性率を少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％および少なくとも９０％上回る、請求項８に記載のナノコンポジット。
【請求項１２】
前記ナノコンポジットの前記膨張係数が、フィロケイ酸塩を加えていない前記反復配列タンパク質ポリマーの熱膨張係数よりも小さい、請求項８に記載のナノコンポジット。
【請求項１３】
前記反復配列タンパク質ポリマーを加えていない前記フィロケイ酸塩のゼータ電位と比較した場合、前記ナノコンポジットのゼータ電位が変化している、請求項２に記載のナノコンポジット。
【請求項１４】
可塑剤を含む前記ナノコンポジットであって、前記ナノコンポジットが、可塑剤なしのナノコンポジットの破断時伸び率と比較した場合、破断時伸び率が大きい、請求項５に記載のナノコンポジット。
【請求項１５】
反復配列絹−エラスチンタンパク質ポリマーまたはその誘導体とフィロケイ酸塩粘土とを含む、ナノコンポジット。
【請求項１６】
前記ナノコンポジットが、縫合材料である、請求項２に記載のナノコンポジット。
【請求項１７】
前記ナノコンポジットが、縫合材料である、請求項１５に記載のナノコンポジット。
【請求項１８】
前記ナノコンポジットが、組織足場材料である、請求項２に記載のナノコンポジット。
【請求項１９】
前記ナノコンポジットが、組織足場材料である、請求項１５に記載のナノコンポジット。
【請求項２０】
前記ナノコンポジットが、生分解性構造材料である、請求項２に記載のナノコンポジット。
【請求項２１】
前記ナノコンポジットが、生分解性構造材料である、請求項１５に記載のナノコンポジット。
【請求項２２】
ナノコンポジットを製造する方法であって：
少なくとも１種類の反復配列タンパク質ポリマーを選択することと；
フィロケイ酸塩を選択することと；
前記フィロケイ酸塩を水性液体に加えて、懸濁液を作製することと；
前記少なくとも１種類の反復配列タンパク質ポリマーと前記懸濁液とを混合することと；
前記懸濁液と混合した前記少なくとも１種類の反復配列タンパク質ポリマーを乾燥させることとを含む、方法。
【請求項２３】
前記懸濁液と混合した前記少なくとも１種類の反復配列タンパク質ポリマーは、何らかの表面にキャストする、請求項１８に記載の方法。
【請求項２４】
可塑剤、タンパク質架橋剤、または可塑剤およびタンパク質架橋剤を加えることをさらに含む、請求項１８に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４】
【図５】
【図６】
【公表番号】特表２００９−５２８２５５（Ｐ２００９−５２８２５５Ａ）
【公表日】平成２１年８月６日（２００９．８．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５３１１２３（Ｐ２００８−５３１１２３）
【出願日】平成１８年８月２２日（２００６．８．２２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０３２５９８
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０２４１０５
【国際公開日】平成２０年２月２８日（２００８．２．２８）
【出願人】（５００２８４５８０）ジェネンコー・インターナショナル・インク (67)
【出願人】（３０９０１７３１２）
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年８月６日（２００９．８．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年８月２２日（２００６．８．２２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０３２５９８
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０２４１０５
【国際公開日】平成２０年２月２８日（２００８．２．２８）
【出願人】（５００２８４５８０）ジェネンコー・インターナショナル・インク (67)
【出願人】（３０９０１７３１２）
【Ｆターム（参考）】
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