反応性非天然アミノ酸遺伝コード付加
本発明は真核細胞で遺伝的にコードされるアミノ酸の数を拡大する翻訳成分を作製するための組成物と方法を提供する。前記成分としては、直交ｔＲＮＡ、直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ、ｔＲＮＡ／シンテターゼ対及び非天然アミノ酸が挙げられる。蛋白質と、非天然アミノ酸を組込んだ蛋白質を真核細胞で生産する方法も提供する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛋白質を含有する組成物であって、前記蛋白質が少なくとも１種の非天然アミノ酸と、少なくとも１種の翻訳後修飾を含み、前記少なくとも１種の翻訳後修飾が第１の反応基を含む前記少なくとも１種の非天然アミノ酸への［３＋２］シクロ付加による第２の反応基を含む分子の結合を含む前記組成物。
【請求項２】
前記分子が色素、ポリマー、ポリエチレングリコール誘導体、光架橋剤、細胞傷害性化合物、アフィニティーラベル、ビオチン誘導体、樹脂、第２の蛋白質もしくはポリペプチド、金属キレート剤、補因子、脂肪酸、炭水化物、又はポリヌクレオチドである請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
第１の反応基がアルキニル又はアジド部分であり、第２の反応基がアジド又はアルキニル部分である請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
第１の反応基がアルキニル部分であり、第２の反応基がアジド部分である請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
非天然アミノ酸がｐ−プロパルギルオキシフェニルアラニンを含む請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
第１の反応基がアジド部分であり、第２の反応基がアルキニル部分である請求項３に記載の組成物。
【請求項７】
非天然アミノ酸がｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニンを含む請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
少なくとも１種の翻訳後修飾が真核細胞においてｉｎ ｖｉｖｏで行われる請求項６に記載の組成物。
【請求項９】
化学構造：
【化１】
をもつ非天然アミノ酸を含む組成物。
【請求項１０】
更に直交ｔＲＮＡを含む請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
非天然アミノ酸が直交ｔＲＮＡと共有結合している請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
非天然アミノ酸がアミノアシル結合を介して直交ｔＲＮＡと共有結合している請求項１０に記載の組成物。
【請求項１３】
非天然アミノ酸が直交ｔＲＮＡの末端リボース糖の３’ＯＨ又は２’ＯＨと共有結合している請求項１０に記載の組成物。
【請求項１４】
請求項９に記載の非天然アミノ酸を含む蛋白質。
【請求項１５】
請求項９に記載の非天然アミノ酸を含む細胞。
【請求項１６】
構造：
【化２】
をもつアジド色素を含む組成物。
【請求項１７】
構造：
【化３】
をもつアジド色素を含む組成物。
【請求項１８】
請求項１６又は１７に記載のアジド色素を含む蛋白質。
【請求項１９】
更に少なくとも１種の非天然アミノ酸を含み、アジド色素が［３＋２］シクロ付加により非天然アミノ酸と結合している請求項１８に記載の蛋白質。
【請求項２０】
非天然アミノ酸がアルキニルアミノ酸を含む請求項１９に記載の蛋白質。
【請求項２１】
構造：
【化４】
（式中、ｎは１００〜２，０００の整数である）をもつアルキニルポリエチレングリコールを含む組成物。
【請求項２２】
アルキニルポリエチレングリコールが約５，０００〜約１００，０００Ｄａの分子量をもつ請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
請求項２１に記載のアルキニルポリエチレングリコールを含む蛋白質。
【請求項２４】
更に少なくとも１種の非天然アミノ酸を含み、アルキニルポリエチレングリコールが［３＋２］シクロ付加により非天然アミノ酸と結合している請求項２３に記載の蛋白質。
【請求項２５】
非天然アミノ酸がアジドアミノ酸を含む請求項２４に記載の蛋白質。
【請求項２６】
ｐ−（プロパルギルオキシ）フェニルアラニン化合物の合成方法であって、
Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルチロシンとＫ２ＣＯ３を無水ＤＭＦに懸濁する段階と；
臭化プロパルギルを（ａ）の反応混合物に加え、ヒドロキシル基とカルボキシル基をアルキル化することにより、構造：
【化５】
をもつ保護中間体化合物を得る段階と；
保護中間体化合物をＭｅＯＨ中で無水ＨＣｌと混合し、アミン部分を脱保護することにより、ｐ−（プロパルギルオキシ）フェニルアラニン化合物を合成する段階を含む前記方法。
【請求項２７】
ｐ−（プロパルギルオキシ）フェニルアラニンＨＣｌをＮａＯＨとＭｅＯＨの水溶液に溶かし、室温で撹拌する段階と；
ｐＨをｐＨ７に調整する段階と；
ｐ−（プロパルギルオキシ）フェニルアラニン化合物を沈殿させる段階を更に含む請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
アジド色素の合成方法であって、
ハロゲン化スルホニル部分を含む色素化合物を提供する段階と；
３−アジドプロピルアミンとトリエチルアミンの存在下に色素化合物を室温まで昇温させる段階と；
３−アジドプロピルアミンのアミン部分を色素化合物のハロゲン化物位置にカップリングすることにより、アジド色素を合成する段階を含む前記方法。
【請求項２９】
色素化合物がダンシルクロリドを含み、アジド色素が請求項１６に記載の組成物を含む請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
反応混合物からアジド色素を精製する段階を更に含む請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
アジド色素の合成方法であって、
アミン含有色素化合物を提供する段階と；
アミン含有色素化合物を適切な溶媒中でカルボジイミド及び４−（３−アジドプロピルカルバモイル）−酪酸と混合し、酸のカルボニル基を色素化合物のアミン部分とカップリングすることにより、アジド色素を合成する段階を含む前記方法。
【請求項３２】
カルボジイミンが１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣＩ）を含む請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
アミン含有色素がフルオレセインアミンを含み、適切な溶媒がピリジンを含む請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
アミン含有色素がフルオレセインアミンを含み、アジド色素が請求項１７に記載の組成物を含む請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】
アジド色素を沈殿させる段階と；
沈殿をＨＣｌで洗浄する段階と；
洗浄した沈殿をＥｔＯＡｃに溶かす段階と；
アジド色素をヘキサン中で沈殿させる段階を更に含む請求項３１に記載の方法。
【請求項３６】
プロパルギルアミドポリエチレングリコールの合成方法であって、プロパルギルアミンを有機溶媒中で室温にてポリエチレングリコール（ＰＥＧ）−ヒドロキシスクシンイミドエステルと反応させ、請求項２１に記載のプロパルギルアミドポリエチレングリコールを得る段階を含む前記方法。
【請求項３７】
有機溶媒がＣＨ２Ｃｌ２を含む請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
酢酸エチルを使用してプロパルギルアミドポリエチレングリコールを沈殿させる段階を更に含む請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
プロパルギルアミドポリエチレングリコールをメタノール中で再結晶させる段階と；生成物を減圧乾燥する段階を更に含む請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）を含む真核細胞であって、前記Ｏ−ＲＳが直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）を真核細胞において少なくとも１種の非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化し；
（ａ）Ｏ−ＲＳ又はその一部が配列番号２０−２５のいずれか１種に記載のポリヌクレオチド配列、その相補的ポリヌクレオチド配列、又はその保存変異体によりコードされるか；
（ｂ）Ｏ−ＲＳが配列番号４８−６３のいずれか１種に記載のアミノ酸配列、又はその保存変異体を含むか；
（ｃ）Ｏ−ＲＳが天然に存在するチロシルアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＴｙｒＲＳ）と少なくとも９０％一致するアミノ酸配列を含むと共に、大腸菌ＴｙｒＲＳのＴｙｒ３７に対応する位置にグリシン、セリン、又はアラニン；大腸菌ＴｙｒＲＳのＡｓｎ１２６に対応する位置にアスパラギン酸；大腸菌ＴｙｒＲＳのＡｓｐ１８２に対応する位置にアスパラギン；大腸菌ＴｙｒＲＳのＰｈｅ１８３に対応する位置にアラニン、又はバリン；及び大腸菌ＴｙｒＲＳのＬｅｕ１８６に対応する位置にメチオニン、バリン、システイン、又はスレオニンから構成される群から選択される２種以上のアミノ酸を含むか；あるいは
（ｄ）Ｏ−ＲＳが配列番号４５に記載のアミノ酸配列をもつＯ−ＲＳの少なくとも５０％の効率でＯ−ｔＲＮＡを少なくとも１種の非天然アミノ酸でアミノアシル化する前記細胞。
【請求項４１】
更に直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）を含み、前記Ｏ−ｔＲＮＡがセレクターコドンを認識し、Ｏ−ＲＳにより少なくとも１種の非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化され、前記Ｏ−ｔＲＮＡが配列番号６５に対応する核酸の細胞内プロセシングにより細胞内で生産され、前記Ｏ−ＲＳが配列番号４８−６３、及びその保存変異体から構成される群から選択されるポリペプチド配列を含む請求項４０に記載の細胞。
【請求項４２】
（ａ）配列番号４８−６３のいずれか１種に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｂ）配列番号２０−３５のいずれか１種に記載のポリヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｃ）（ａ）、又は（ｂ）のポリペプチドに特異的な抗体に対して特異的免疫反応性のポリペプチド；
（ｄ）天然に存在するチロシルアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＴｙｒＲＳ）のアミノ酸配列と少なくとも９０％一致するアミノ酸配列を含むと共に、大腸菌ＴｙｒＲＳのＴｙｒ３７に対応する位置にグリシン、セリン、又はアラニン；大腸菌ＴｙｒＲＳのＡｓｎ１２６に対応する位置にアスパラギン酸；大腸菌ＴｙｒＲＳのＡｓｐ１８２に対応する位置にアスパラギン；大腸菌ＴｙｒＲＳのＰｈｅ１８３に対応する位置にアラニン、又はバリン；及び大腸菌ＴｙｒＲＳのＬｅｕ１８６に対応する位置にメチオニン、バリン、システイン、又はスレオニンから構成される群から選択される２種以上のアミノ酸を含むポリペプチド；
（ｅ）配列番号３６−４８、又は８６の少なくとも２０個の連続アミノ酸を含むと共に、大腸菌ＴｙｒＲＳのＴｙｒ３７に対応する位置にグリシン、セリン、又はアラニン；大腸菌ＴｙｒＲＳのＡｓｎ１２６に対応する位置にアスパラギン酸；大腸菌ＴｙｒＲＳのＡｓｐ１８２に対応する位置にアスパラギン；大腸菌ＴｙｒＲＳのＰｈｅ１８３に対応する位置にアラニン、又はバリン；及び大腸菌ＴｙｒＲＳのＬｅｕ１８６に対応する位置にメチオニン、バリン、システイン、又はスレオニンから構成される群から選択される２種以上のアミノ酸置換を含むポリペプチド；並びに
（ｆ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、又は（ｅ）の保存変異体を含むアミノ酸配列から構成される群から選択されるポリペプチド。
【請求項４３】
請求項４２に記載のポリペプチドと賦形剤を含有する組成物。
【請求項４４】
請求項４２に記載のポリペプチドに対して特異的免疫反応性の抗体又は抗血清。
【請求項４５】
請求項４２に記載のポリペプチドと賦形剤を含有する組成物。
【請求項４６】
請求項４２に記載のポリペプチドに対して特異的免疫反応性の抗体又は抗血清。
【請求項４７】
（ａ）配列番号２０−３５のいずれか１種に記載のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（ｂ）（ａ）のポリヌクレオチド配列に相補的であるか又は前記配列をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号４８−６３のいずれか１種に記載のアミノ酸配列又はその保存変異体を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）請求項４２に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｅ）高ストリンジェント条件下で核酸の実質的に全長にわたって（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、又は（ｄ）のポリヌクレオチドとハイブリダイズする核酸；
（ｆ）天然に存在するチロシルアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＴｙｒＲＳ）のアミノ酸配列と少なくとも９０％一致するアミノ酸配列を含むと共に、大腸菌ＴｙｒＲＳのＴｙｒ３７に対応する位置にグリシン、セリン、又はアラニン；大腸菌ＴｙｒＲＳのＡｓｎ１２６に対応する位置にアスパラギン酸；大腸菌ＴｙｒＲＳのＡｓｐ１８２に対応する位置にアスパラギン；大腸菌ＴｙｒＲＳのＰｈｅ１８３に対応する位置にアラニン、又はバリン；及び大腸菌ＴｙｒＲＳのＬｅｕ１８６に対応する位置にメチオニン、バリン、システイン、又はスレオニンから構成される群から選択される２種以上の突然変異を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｇ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、又は（ｆ）のポリヌクレオチドと少なくとも９８％一致するポリヌクレオチド；並びに
（ｈ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、又は（ｇ）の保存変異体を含むポリヌクレオチドから構成される群から選択されるポリヌクレオチド。
【請求項４８】
請求項４７に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項４９】
ベクターがプラスミド、コスミド、ファージ、又はウイルスを含む請求項４８に記載のベクター。
【請求項５０】
ベクターが発現ベクターである請求項４８に記載のベクター。
【請求項５１】
請求項４８に記載のベクターを含む細胞。
【請求項５２】
少なくとも１種の非天然アミノ酸を含む少なくとも１種の蛋白質を真核細胞で生産する方法であって、
少なくとも１個のセレクターコドンを含み且つ前記蛋白質をコードする核酸を含む真核細胞を適当な培地で増殖させる段階を含み；前記培地が非天然アミノ酸を含み、前記真核細胞が、
前記細胞で機能し、前記セレクターコドンを認識する直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）と；
前記Ｏ−ｔＲＮＡを前記非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）を含み、前記Ｏ−ＲＳが配列番号４８−５３に対応するアミノ酸配列を含む前記方法。
【請求項５３】
少なくとも１種の非天然アミノ酸を含む少なくとも１種の蛋白質を真核細胞で生産する方法であって、
少なくとも１個のセレクターコドンを含み且つ前記蛋白質をコードする核酸を含む真核細胞を適当な培地で増殖させる段階を含み；前記培地が非天然アミノ酸を含み、前記真核細胞が、前記細胞で機能し、前記セレクターコドンを認識する直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）と、前記Ｏ−ｔＲＮＡを前記非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）を含み、更に、
第１の反応基を含む前記非天然アミノ酸を前記真核細胞において前記蛋白質に組込む段階と；
第２の反応基を含む分子と前記蛋白質を接触させる段階を含み、第１の反応基が第２の反応基と反応し、［３＋２］シクロ付加により前記分子を前記非天然アミノ酸と結合する前記方法。
【請求項５４】
前記分子が色素、ポリマー、ポリエチレングリコール誘導体、光架橋剤、細胞傷害性化合物、アフィニティーラベル、ビオチン誘導体、樹脂、第２の蛋白質もしくはポリペプチド、金属キレート剤、補因子、脂肪酸、炭水化物、又はポリヌクレオチドである請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
第１の反応基がアルキニル又はアジド部分であり、第２の反応基がアジド又はアルキニル部分である請求項５３に記載の方法。
【請求項５６】
第１の反応基がアルキニル部分であり、第２の反応基がアジド部分である請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
非天然アミノ酸がｐ−プロパルギルオキシフェニルアラニンを含む請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
第１の反応基がアジド部分であり、第２の反応基がアルキニル部分である請求項５５に記載の方法。
【請求項５９】
非天然アミノ酸がｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニンを含む請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
請求項５３に記載の方法により生産された蛋白質。
【請求項６１】
蛋白質が少なくとも１種のｉｎ ｖｉｖｏ翻訳後修飾により修飾されており、前記翻訳後修飾がＮ−グリコシル化、Ｏ−グリコシル化、アセチル化、アシル化、脂質修飾、パルミトイル化、パルミチン酸付加、リン酸化、及び糖脂質結合修飾から構成される群から選択される請求項６０に記載の蛋白質。
【請求項１】
蛋白質を含有する組成物であって、前記蛋白質が少なくとも１種の非天然アミノ酸と、少なくとも１種の翻訳後修飾を含み、前記少なくとも１種の翻訳後修飾が第１の反応基を含む前記少なくとも１種の非天然アミノ酸への［３＋２］シクロ付加による第２の反応基を含む分子の結合を含む前記組成物。
【請求項２】
前記分子が色素、ポリマー、ポリエチレングリコール誘導体、光架橋剤、細胞傷害性化合物、アフィニティーラベル、ビオチン誘導体、樹脂、第２の蛋白質もしくはポリペプチド、金属キレート剤、補因子、脂肪酸、炭水化物、又はポリヌクレオチドである請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
第１の反応基がアルキニル又はアジド部分であり、第２の反応基がアジド又はアルキニル部分である請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
第１の反応基がアルキニル部分であり、第２の反応基がアジド部分である請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
非天然アミノ酸がｐ−プロパルギルオキシフェニルアラニンを含む請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
第１の反応基がアジド部分であり、第２の反応基がアルキニル部分である請求項３に記載の組成物。
【請求項７】
非天然アミノ酸がｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニンを含む請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
少なくとも１種の翻訳後修飾が真核細胞においてｉｎ ｖｉｖｏで行われる請求項６に記載の組成物。
【請求項９】
化学構造：
【化１】
をもつ非天然アミノ酸を含む組成物。
【請求項１０】
更に直交ｔＲＮＡを含む請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
非天然アミノ酸が直交ｔＲＮＡと共有結合している請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
非天然アミノ酸がアミノアシル結合を介して直交ｔＲＮＡと共有結合している請求項１０に記載の組成物。
【請求項１３】
非天然アミノ酸が直交ｔＲＮＡの末端リボース糖の３’ＯＨ又は２’ＯＨと共有結合している請求項１０に記載の組成物。
【請求項１４】
請求項９に記載の非天然アミノ酸を含む蛋白質。
【請求項１５】
請求項９に記載の非天然アミノ酸を含む細胞。
【請求項１６】
構造：
【化２】
をもつアジド色素を含む組成物。
【請求項１７】
構造：
【化３】
をもつアジド色素を含む組成物。
【請求項１８】
請求項１６又は１７に記載のアジド色素を含む蛋白質。
【請求項１９】
更に少なくとも１種の非天然アミノ酸を含み、アジド色素が［３＋２］シクロ付加により非天然アミノ酸と結合している請求項１８に記載の蛋白質。
【請求項２０】
非天然アミノ酸がアルキニルアミノ酸を含む請求項１９に記載の蛋白質。
【請求項２１】
構造：
【化４】
（式中、ｎは１００〜２，０００の整数である）をもつアルキニルポリエチレングリコールを含む組成物。
【請求項２２】
アルキニルポリエチレングリコールが約５，０００〜約１００，０００Ｄａの分子量をもつ請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
請求項２１に記載のアルキニルポリエチレングリコールを含む蛋白質。
【請求項２４】
更に少なくとも１種の非天然アミノ酸を含み、アルキニルポリエチレングリコールが［３＋２］シクロ付加により非天然アミノ酸と結合している請求項２３に記載の蛋白質。
【請求項２５】
非天然アミノ酸がアジドアミノ酸を含む請求項２４に記載の蛋白質。
【請求項２６】
ｐ−（プロパルギルオキシ）フェニルアラニン化合物の合成方法であって、
Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルチロシンとＫ２ＣＯ３を無水ＤＭＦに懸濁する段階と；
臭化プロパルギルを（ａ）の反応混合物に加え、ヒドロキシル基とカルボキシル基をアルキル化することにより、構造：
【化５】
をもつ保護中間体化合物を得る段階と；
保護中間体化合物をＭｅＯＨ中で無水ＨＣｌと混合し、アミン部分を脱保護することにより、ｐ−（プロパルギルオキシ）フェニルアラニン化合物を合成する段階を含む前記方法。
【請求項２７】
ｐ−（プロパルギルオキシ）フェニルアラニンＨＣｌをＮａＯＨとＭｅＯＨの水溶液に溶かし、室温で撹拌する段階と；
ｐＨをｐＨ７に調整する段階と；
ｐ−（プロパルギルオキシ）フェニルアラニン化合物を沈殿させる段階を更に含む請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
アジド色素の合成方法であって、
ハロゲン化スルホニル部分を含む色素化合物を提供する段階と；
３−アジドプロピルアミンとトリエチルアミンの存在下に色素化合物を室温まで昇温させる段階と；
３−アジドプロピルアミンのアミン部分を色素化合物のハロゲン化物位置にカップリングすることにより、アジド色素を合成する段階を含む前記方法。
【請求項２９】
色素化合物がダンシルクロリドを含み、アジド色素が請求項１６に記載の組成物を含む請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
反応混合物からアジド色素を精製する段階を更に含む請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
アジド色素の合成方法であって、
アミン含有色素化合物を提供する段階と；
アミン含有色素化合物を適切な溶媒中でカルボジイミド及び４−（３−アジドプロピルカルバモイル）−酪酸と混合し、酸のカルボニル基を色素化合物のアミン部分とカップリングすることにより、アジド色素を合成する段階を含む前記方法。
【請求項３２】
カルボジイミンが１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣＩ）を含む請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
アミン含有色素がフルオレセインアミンを含み、適切な溶媒がピリジンを含む請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
アミン含有色素がフルオレセインアミンを含み、アジド色素が請求項１７に記載の組成物を含む請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】
アジド色素を沈殿させる段階と；
沈殿をＨＣｌで洗浄する段階と；
洗浄した沈殿をＥｔＯＡｃに溶かす段階と；
アジド色素をヘキサン中で沈殿させる段階を更に含む請求項３１に記載の方法。
【請求項３６】
プロパルギルアミドポリエチレングリコールの合成方法であって、プロパルギルアミンを有機溶媒中で室温にてポリエチレングリコール（ＰＥＧ）−ヒドロキシスクシンイミドエステルと反応させ、請求項２１に記載のプロパルギルアミドポリエチレングリコールを得る段階を含む前記方法。
【請求項３７】
有機溶媒がＣＨ２Ｃｌ２を含む請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
酢酸エチルを使用してプロパルギルアミドポリエチレングリコールを沈殿させる段階を更に含む請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
プロパルギルアミドポリエチレングリコールをメタノール中で再結晶させる段階と；生成物を減圧乾燥する段階を更に含む請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）を含む真核細胞であって、前記Ｏ−ＲＳが直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）を真核細胞において少なくとも１種の非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化し；
（ａ）Ｏ−ＲＳ又はその一部が配列番号２０−２５のいずれか１種に記載のポリヌクレオチド配列、その相補的ポリヌクレオチド配列、又はその保存変異体によりコードされるか；
（ｂ）Ｏ−ＲＳが配列番号４８−６３のいずれか１種に記載のアミノ酸配列、又はその保存変異体を含むか；
（ｃ）Ｏ−ＲＳが天然に存在するチロシルアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＴｙｒＲＳ）と少なくとも９０％一致するアミノ酸配列を含むと共に、大腸菌ＴｙｒＲＳのＴｙｒ３７に対応する位置にグリシン、セリン、又はアラニン；大腸菌ＴｙｒＲＳのＡｓｎ１２６に対応する位置にアスパラギン酸；大腸菌ＴｙｒＲＳのＡｓｐ１８２に対応する位置にアスパラギン；大腸菌ＴｙｒＲＳのＰｈｅ１８３に対応する位置にアラニン、又はバリン；及び大腸菌ＴｙｒＲＳのＬｅｕ１８６に対応する位置にメチオニン、バリン、システイン、又はスレオニンから構成される群から選択される２種以上のアミノ酸を含むか；あるいは
（ｄ）Ｏ−ＲＳが配列番号４５に記載のアミノ酸配列をもつＯ−ＲＳの少なくとも５０％の効率でＯ−ｔＲＮＡを少なくとも１種の非天然アミノ酸でアミノアシル化する前記細胞。
【請求項４１】
更に直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）を含み、前記Ｏ−ｔＲＮＡがセレクターコドンを認識し、Ｏ−ＲＳにより少なくとも１種の非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化され、前記Ｏ−ｔＲＮＡが配列番号６５に対応する核酸の細胞内プロセシングにより細胞内で生産され、前記Ｏ−ＲＳが配列番号４８−６３、及びその保存変異体から構成される群から選択されるポリペプチド配列を含む請求項４０に記載の細胞。
【請求項４２】
（ａ）配列番号４８−６３のいずれか１種に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｂ）配列番号２０−３５のいずれか１種に記載のポリヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｃ）（ａ）、又は（ｂ）のポリペプチドに特異的な抗体に対して特異的免疫反応性のポリペプチド；
（ｄ）天然に存在するチロシルアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＴｙｒＲＳ）のアミノ酸配列と少なくとも９０％一致するアミノ酸配列を含むと共に、大腸菌ＴｙｒＲＳのＴｙｒ３７に対応する位置にグリシン、セリン、又はアラニン；大腸菌ＴｙｒＲＳのＡｓｎ１２６に対応する位置にアスパラギン酸；大腸菌ＴｙｒＲＳのＡｓｐ１８２に対応する位置にアスパラギン；大腸菌ＴｙｒＲＳのＰｈｅ１８３に対応する位置にアラニン、又はバリン；及び大腸菌ＴｙｒＲＳのＬｅｕ１８６に対応する位置にメチオニン、バリン、システイン、又はスレオニンから構成される群から選択される２種以上のアミノ酸を含むポリペプチド；
（ｅ）配列番号３６−４８、又は８６の少なくとも２０個の連続アミノ酸を含むと共に、大腸菌ＴｙｒＲＳのＴｙｒ３７に対応する位置にグリシン、セリン、又はアラニン；大腸菌ＴｙｒＲＳのＡｓｎ１２６に対応する位置にアスパラギン酸；大腸菌ＴｙｒＲＳのＡｓｐ１８２に対応する位置にアスパラギン；大腸菌ＴｙｒＲＳのＰｈｅ１８３に対応する位置にアラニン、又はバリン；及び大腸菌ＴｙｒＲＳのＬｅｕ１８６に対応する位置にメチオニン、バリン、システイン、又はスレオニンから構成される群から選択される２種以上のアミノ酸置換を含むポリペプチド；並びに
（ｆ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、又は（ｅ）の保存変異体を含むアミノ酸配列から構成される群から選択されるポリペプチド。
【請求項４３】
請求項４２に記載のポリペプチドと賦形剤を含有する組成物。
【請求項４４】
請求項４２に記載のポリペプチドに対して特異的免疫反応性の抗体又は抗血清。
【請求項４５】
請求項４２に記載のポリペプチドと賦形剤を含有する組成物。
【請求項４６】
請求項４２に記載のポリペプチドに対して特異的免疫反応性の抗体又は抗血清。
【請求項４７】
（ａ）配列番号２０−３５のいずれか１種に記載のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（ｂ）（ａ）のポリヌクレオチド配列に相補的であるか又は前記配列をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号４８−６３のいずれか１種に記載のアミノ酸配列又はその保存変異体を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）請求項４２に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｅ）高ストリンジェント条件下で核酸の実質的に全長にわたって（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、又は（ｄ）のポリヌクレオチドとハイブリダイズする核酸；
（ｆ）天然に存在するチロシルアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＴｙｒＲＳ）のアミノ酸配列と少なくとも９０％一致するアミノ酸配列を含むと共に、大腸菌ＴｙｒＲＳのＴｙｒ３７に対応する位置にグリシン、セリン、又はアラニン；大腸菌ＴｙｒＲＳのＡｓｎ１２６に対応する位置にアスパラギン酸；大腸菌ＴｙｒＲＳのＡｓｐ１８２に対応する位置にアスパラギン；大腸菌ＴｙｒＲＳのＰｈｅ１８３に対応する位置にアラニン、又はバリン；及び大腸菌ＴｙｒＲＳのＬｅｕ１８６に対応する位置にメチオニン、バリン、システイン、又はスレオニンから構成される群から選択される２種以上の突然変異を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｇ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、又は（ｆ）のポリヌクレオチドと少なくとも９８％一致するポリヌクレオチド；並びに
（ｈ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、又は（ｇ）の保存変異体を含むポリヌクレオチドから構成される群から選択されるポリヌクレオチド。
【請求項４８】
請求項４７に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項４９】
ベクターがプラスミド、コスミド、ファージ、又はウイルスを含む請求項４８に記載のベクター。
【請求項５０】
ベクターが発現ベクターである請求項４８に記載のベクター。
【請求項５１】
請求項４８に記載のベクターを含む細胞。
【請求項５２】
少なくとも１種の非天然アミノ酸を含む少なくとも１種の蛋白質を真核細胞で生産する方法であって、
少なくとも１個のセレクターコドンを含み且つ前記蛋白質をコードする核酸を含む真核細胞を適当な培地で増殖させる段階を含み；前記培地が非天然アミノ酸を含み、前記真核細胞が、
前記細胞で機能し、前記セレクターコドンを認識する直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）と；
前記Ｏ−ｔＲＮＡを前記非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）を含み、前記Ｏ−ＲＳが配列番号４８−５３に対応するアミノ酸配列を含む前記方法。
【請求項５３】
少なくとも１種の非天然アミノ酸を含む少なくとも１種の蛋白質を真核細胞で生産する方法であって、
少なくとも１個のセレクターコドンを含み且つ前記蛋白質をコードする核酸を含む真核細胞を適当な培地で増殖させる段階を含み；前記培地が非天然アミノ酸を含み、前記真核細胞が、前記細胞で機能し、前記セレクターコドンを認識する直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）と、前記Ｏ−ｔＲＮＡを前記非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）を含み、更に、
第１の反応基を含む前記非天然アミノ酸を前記真核細胞において前記蛋白質に組込む段階と；
第２の反応基を含む分子と前記蛋白質を接触させる段階を含み、第１の反応基が第２の反応基と反応し、［３＋２］シクロ付加により前記分子を前記非天然アミノ酸と結合する前記方法。
【請求項５４】
前記分子が色素、ポリマー、ポリエチレングリコール誘導体、光架橋剤、細胞傷害性化合物、アフィニティーラベル、ビオチン誘導体、樹脂、第２の蛋白質もしくはポリペプチド、金属キレート剤、補因子、脂肪酸、炭水化物、又はポリヌクレオチドである請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
第１の反応基がアルキニル又はアジド部分であり、第２の反応基がアジド又はアルキニル部分である請求項５３に記載の方法。
【請求項５６】
第１の反応基がアルキニル部分であり、第２の反応基がアジド部分である請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
非天然アミノ酸がｐ−プロパルギルオキシフェニルアラニンを含む請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
第１の反応基がアジド部分であり、第２の反応基がアルキニル部分である請求項５５に記載の方法。
【請求項５９】
非天然アミノ酸がｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニンを含む請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
請求項５３に記載の方法により生産された蛋白質。
【請求項６１】
蛋白質が少なくとも１種のｉｎ ｖｉｖｏ翻訳後修飾により修飾されており、前記翻訳後修飾がＮ−グリコシル化、Ｏ−グリコシル化、アセチル化、アシル化、脂質修飾、パルミトイル化、パルミチン酸付加、リン酸化、及び糖脂質結合修飾から構成される群から選択される請求項６０に記載の蛋白質。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６】
【図７】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図８Ｃ】
【図８Ｄ】
【図９】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１０Ｃ】
【図１０Ｄ】
【図１０Ｅ】
【図１０Ｆ】
【図１０Ｇ】
【図１０Ｈ】
【図１１】
【図１２】
【図１３Ａ】
【図１３Ｂ】
【図１３Ｃ】
【図１４】
【図１５Ａ】
【図１５Ｂ】
【図１６】
【図１７Ａ】
【図１７Ｂ】
【図１７Ｃ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６】
【図７】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図８Ｃ】
【図８Ｄ】
【図９】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１０Ｃ】
【図１０Ｄ】
【図１０Ｅ】
【図１０Ｆ】
【図１０Ｇ】
【図１０Ｈ】
【図１１】
【図１２】
【図１３Ａ】
【図１３Ｂ】
【図１３Ｃ】
【図１４】
【図１５Ａ】
【図１５Ｂ】
【図１６】
【図１７Ａ】
【図１７Ｂ】
【図１７Ｃ】
【公表番号】特表２００７−５３６８９９（Ｐ２００７−５３６８９９Ａ）
【公表日】平成１９年１２月２０日（２００７．１２．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５１７０８８（Ｐ２００６−５１７０８８）
【出願日】平成１６年４月１６日（２００４．４．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１１８３３
【国際公開番号】ＷＯ２００５／００３２９４
【国際公開日】平成１７年１月１３日（２００５．１．１３）
【出願人】（５９３０５２７８５）ザ スクリップス リサーチ インスティテュート (91)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年１２月２０日（２００７．１２．２０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年４月１６日（２００４．４．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１１８３３
【国際公開番号】ＷＯ２００５／００３２９４
【国際公開日】平成１７年１月１３日（２００５．１．１３）
【出願人】（５９３０５２７８５）ザ スクリップス リサーチ インスティテュート (91)
【Ｆターム（参考）】
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