本発明は、治療化合物の肝臓への送達を向上させるための受容体関連タンパク質（ＲＡＰ）およびそのフラグメントおよびその変異体の使用に関し、活性薬剤に結合体化したＲＡＰまたはＲＡＰ変異体を投与することによって、肝癌等の肝障害および状態を処置する方法を提供する。一態様において、本発明は被験体における肝障害を処置する方法を提供し、この方法は、肝障害の処置のための活性薬剤（ｂ）に結合した、配列番号１の受容体関連タンパク質（ＲＡＰ）、ＲＡＰフラグメント、および約１〜５ｎＭのＬＲＰ１へのＲＡＰ結合親和性を保持するＲＡＰ変異体からなる群から選択される受容体結合部分（ａ）を含む、有効量の結合体を上記被験体に投与することを含む。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願への相互参照）
本願は、２００６年９月１８日に出願された国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ０６／３６４５３号の利益を主張する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、治療薬または活性薬剤に結合した受容体関連タンパク質（ＲＡＰ）ポリペプチドを投与することを含む、肝臓の障害または状態の処置のための方法におけるＲＡＰ、ＲＡＰフラグメントおよびＲＡＰ変異体の使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
ＬＲＰ１は、低密度リポタンパク質受容体「ＬＤＬＲ」のメンバーである。ＬＲＰ１は、４５２５のアミノ酸（６００ｋＤａ）からなる巨大タンパク質であり、フューリンによって切断されて、５１５−αｋＤａおよび８５−βｋＤａの２つのサブユニットを生成する。これらのサブユニットは依然として非共有結合したままである。ＬＲＰは大部分の組織型で発現されるが、主として肝臓で見られる。低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）受容体ファミリーの他のメンバーとしては、ＬＤＬ−Ｒ（１３２ｋＤａ）；ＬＲＰ２（メガリン、ｇｐ３３０）；ＬＲＰ／ＬＲＰ１とＬＲＰ１Ｂ（６００ｋＤａ）；ＶＬＤＬ−Ｒ（１３０ｋＤａ）；ＬＲＰ５；ＬＲＰ６；およびａｐｏＥＲ−２（ＬＲＰ−８、１３０ｋＤａ）；モザイク ＬＤＬ−Ｒ（ＬＲ１１、２５０ＫＤａ）；ならびに他のメンバー（例えば、ＬＲＰ３、ＬＲＰ６、およびＬＲＰ−７）が挙げられる。
【０００４】
ＬＲＰ１は多機能受容体であると考えられている。ＬＤＬ受容体で見られるものに似ている結合繰り返しは、以前には無関係であると考えられていた種々のリガンドに結合する能力の分子原理である。これらのリガンドとしては、以下が挙げられる。すなわち、ラクトフェリン、受容体関連タンパク質（ＲＡＰ）、リポタンパク質リパーゼ、ａｐｏＥ、ＶＩＩＩ因子、β−アミロイド前駆体、α−２−マクログロブリン、トロンボスポンジン２ＭＭＰ−２（マトリックスメタロプロテイナーゼ−２）、ＭＰＰ−９−ＴＩＭＰ−１（マトリックスメタロプロテイナーゼ−１の組織阻害剤）、ｕＰＡ（ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子）：ＰＡＩ−１（プラスミノーゲン活性化因子阻害剤−１）：ｕＰＡＲ（ｕＰＡ受容体）、およびｔＰＡ（組織プラスミノーゲン活性化因子）：ＰＡＩ−１：ｕＰＡＲ、シュードモナス外毒素Ａ、ならびにヒトライノウイルス。Ｍｅｉｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ， ３６０：７０−７４（１９９５）を参照。ＬＲＰ１は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｘ１３９１６およびＳｗｉｓｓＰｒｏｔプライマリーアクセッション番号Ｑ０７９５４を有する。ＬＲＰ１遺伝子／タンパク質の代替名としては、以下が挙げられる。すなわち、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質１［前駆体］、ＬＲＰ、α−２−マクログロブリン受容体、Ａ２ＭＲ、アポリポタンパク質Ｅ受容体、ＡｐｏＥＲ、ＣＤ９１、ＬＲＰ１、またはＡ２ＭＲ。
【０００５】
小胞体シャペロンタンパク質（受容体関連タンパク質（ＲＡＰ））は、大体のＬＤＬＲ内の補体繰り返し（ＣＲ）配列に結合する。ＲＡＰは、分泌経路内でＬＤＬＲの折り畳みを補助し、ＬＤＬＲに結合する他のすべての公知のリガンドを拮抗する（Ｂｕ，（２００１）ｌｎｔ Ｒｅｖ Ｃｙｔｏｌ ２０９，７９−１１６）。ＲＡＰに関する詳細な構造情報の不足にもかかわらず、ＲＡＰのＣＲ折り畳みとの関連性は、受容体結合アッセイ、熱量測定、および変異誘発の組み合わせによって広範囲にわたって特徴づけられてきた（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５）。
【０００６】
ＲＡＰは、３つの弱い相同性を示す一連のドメイン（非特許文献６）を含む。これらのドメイン（ｄ１、ｄ２、およびｄ３）のそれぞれは、ＬＤＬＲ外部ドメイン内の直接隣接した複数対のＣＲ配列に対して種々の親和性で結合することが示されている。ＬＤＬＲ上の完全長ＲＡＰへの効果のそれぞれ（他の大体のリガンド（α−２−マクログロブリンを除く）の折り畳みの促進および結合の抑制を含む）は、単独のＲＡＰｄ３によって再利用される。ＲＡＰｄ３は、成熟したＵｎｉｐｒｏｔ Ｐ３０５３３の２００〜３２３のアミノ酸および前駆体Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ３０５３３の２３４〜３５７のアミノ酸を含む。
【０００７】
肝細胞は、肝臓の洞様血管の内側を覆う上皮細胞である。この細胞型は、全肝臓質量の約８０％を構成し、この器官の機能に必要な広大な血液接触面をもたらす。肝細胞は大量の低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質（ＬＲＰ１）を発現し、ＬＲＰ１は、リポタンパク質の代謝、具体的にはカイロミクロンレムナントの排除（１、２、３）ならびに他の循環タンパク質の肝臓への取り込み（２、４、５）に関与する。その生理的役割と一貫して、ＬＲＰ１は、受容体を輸送する高度に効率的なリガンドであり、急速な内部移行および再循環速度で恒常的なエンドサイトーシスを受ける（６）。内部移行に続いて、ＬＲＰ１は結合したカーゴをリソソームに送達し、そこでタンパク質が急速に分解される。
【０００８】
肝細胞癌（ＨＣＣ）は、肝細胞またはそれらの前駆体から生じる。ＨＣＣは、世界的に５番目に最も多い癌であり、癌関連死において３番目に最も多い死因であり、米国では発生率の増加を示している（７、８、９、１０、１１、１２）。肝細胞癌を発症する確率は、ウイルス感染症（Ｂ型およびＣ型肝炎）、アルコール依存症、喫煙、および肥満症によって増加する。この疾患の予後は悪く、報告されている５年間の生存率中央値は５％未満である。外科的切除、移植、および物理的切断は、処置の第１の選択であるが、わずかに５〜１０％の患者がこれらのアプローチに適した腫瘍を呈している。腫瘍の大きさ、肝臓内の腫瘍の散在、転移、器官機能レベルの低下、および高レベルの再発によって、外科的処置の有効性が制限される（１３）。経動脈化学塞栓療法（腫瘍への血液供給を遮断して（塞栓形成して）、化学療法剤を直接腫瘍に投与する手段）および肝内化学療法（肝組織に化学療法剤を直接導入する）は、場合によっては有用であるが低い全反応率をもたらすことが示されている（１４、１５）。全身的な化学療法（例えばアドリアマイシン）は、１５〜２０％の反応率をもたらすが、これは有効的な化学療法剤の全身毒性および該化学療法剤に対する腫瘍細胞の耐性の両理由からである（１６、１７）。ＨＣＣ症例の大多数は、肝機能がすでに損なわれている患者に生じているので、有効的な化学療法レジメン（その大多数が多少の肝毒性をもたらす）は、不十分な肝予備能および劇症肝不全の危険性のために禁忌であることが多い。結合体化型治療薬による静脈内投与後の肝臓への標的送達（例えば^９０イットリウム）は、これらの薬物に付随する全身毒性を有意に減少させ、ＨＣＣ処置の間、患者への危険性を少なくする。この標的送達を提供する１つの方法は、肝臓特異的分子（すなわち、高親和性で肝臓上の受容体に結合したリガンド（例えばＲＡＰ））を用いることもあり得る。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ａｎｄｅｒｓｅｎ，ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４０，１５４０８−１５４１７
【非特許文献２】；Ａｎｄｅｒｓｅｎ， ｅｔ ａｌ．，（２０００）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７５，２１０１７−２１０２４
【非特許文献３】；Ｍｉｇｌｉｏｒｉｎｉ， ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７８，１７９８６−１７９９２
【非特許文献４】；Ｎｅｅｌｓ， ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７４，３１３０５−３１３１１
【非特許文献５】Ｈｏｒｎ， ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７２，１３６０８−１３６１３）
【非特許文献６】Ｏｂｅｒｍｏｅｌｌｅｒ， ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７２，１０７６１−１０７６８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
従って、肝癌または他の肝疾患を処置するために、高親和性リガンドを用いる肝臓への治療薬の選択的な腫瘍標的化（例えば、化学療法剤または他の薬剤の肝細胞部位へのＲＡＰ依存型血液媒介送達）によって、さらに患者の危険性を減少させることが当該技術分野では必要である。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
（発明の要旨）
本発明は、肝臓への輸送を向上させたＲＡＰ結合体化活性薬剤を投与することによって被験体の肝障害を処置するためのＲＡＰ、ＲＡＰフラグメント、およびＲＡＰ変異体の使用に関する。
【００１２】
一態様において、本発明は被験体における肝障害を処置する方法を提供する。該方法は、
肝障害の処置のための活性薬剤（ｂ）に結合した、配列番号１の受容体関連タンパク質（ＲＡＰ）、ＲＡＰフラグメント、および約１〜５ｎＭのＬＲＰ１へのＲＡＰ結合親和性を保持するＲＡＰ変異体からなる群から選択される受容体結合部分（ａ）を含む、有効量の結合体を該被験体に投与することを含む。
【００１３】
ＲＡＰ変異体分子は、完全長のヒトＲＡＰの一部を構成することもある。一実施形態において、ＲＡＰ変異体は、配列番号１のＮ末端から少なくとも２００から最高２４３までのアミノ酸が欠損している。関連する実施形態において、ＲＡＰフラグメントまたは変異体は、配列番号１のＮ末端から２４３までのアミノ酸が欠損している。別の実施形態において、ＲＡＰ変異体は、配列番号１のＣ末端から最高１１までのアミノ酸が欠損し、および配列番号１のＣ末端からさらに少なくとも４のアミノ酸が欠損していることもある。さらなる実施形態において、ＲＡＰ変異体は、（ａ）長さが少なくとも７１のアミノ酸である成熟ＲＡＰ（配列番号１）の連続部分を含み、かつ（ｂ）２５６〜２７０のアミノ酸を含む。関連する実施形態において、ＲＡＰ変異体は、（ａ）長さが少なくとも７１のアミノ酸であるＲＡＰｄ３（配列番号２）の連続部分を含み、かつ（ｂ）２５６〜２７０のアミノ酸を含む。
【００１４】
一実施形態において、ＲＡＰ変異体は、ＲＡＰの第３のドメイン（ｄ３）内に変異を有する。ＲＡＰｄ３は、成熟ＲＡＰ（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ３０５３３）（配列番号２）から２００〜３２３のアミノ酸および前駆体ＲＡＰ（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ３０５３３）から２３４〜３５７のアミノ酸を含む。別の実施形態において、成熟ＲＡＰ（Ｐ３０５３３）から少なくとも１〜１４３のアミノ酸が欠如しているＲＡＰ変異体を含むポリペプチドが考えられる。さらなる実施形態において、ＲＡＰ変異体は、成熟ＲＡＰから少なくとも１〜１４３のアミノ酸および３２０〜３２３のアミノ酸が欠如している。さらに別の実施形態において、ポリペプチドは、成熟ＲＡＰ（Ｐ３０５３３）のＣ末端で最高４つまでのアミノ酸か欠如している。
【００１５】
関連する実施形態において、本発明は、前記受容体結合部分が、長さが約８５未満のアミノ酸であり、かつ配列番号４と少なくとも７０％同一である５０の連続するアミノ酸を含み、ＬＲＰ１に結合する環状ＲＡＰペプチドである方法が考えられる。関連する実施形態において、環状ＲＡＰペプチドは、約１×１０^−８Ｍ以下のＫｄを有するＬＲＰ１に結合する。
【００１６】
別の態様において、本発明は、ＲＡＰ、ＲＡＰフラグメント、またはＲＡＰ変異体が変異を含む方法を提供する。一実施形態において、変異は、配列番号１の天然のＲＡＰに関連する１つ以上の保存的置換を含む。別の実施形態において、変異は酸性アミノ酸の塩基性アミノ酸との置換である。一実施形態において、該酸性アミノ酸は、ＤおよびＥからなる群から選択される。関連する実施形態において、該塩基性アミノ酸は、ＫおよびＲからなる群から選択される。
【００１７】
関連する態様において、ＲＡＰ、ＲＡＰフラグメント、またはＲＡＰ変異体における該変異は、塩基性アミノ酸の酸性アミノ酸との置換である。一実施形態において、該塩基性アミノ酸は、ＫおよびＲからなる群から選択される。別の実施形態において、該酸性アミノ酸は、ＤおよびＥからなる群から選択される。
【００１８】
さらなる実施形態において、該変異は、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、およびＶからなる群から選択されるアミノ酸の、Ｆ、Ｙ、Ｗ、およびＨからなる群から選択されるアミノ酸との置換である。関連する実施形態において、本発明における使用で考えられるＲＡＰフラグメントまたはＲＡＰ変異体は、成熟ＲＡＰの２５１、２５６、２５７、２６６、２７０、２７９、２８０、２９６、または３０５のうちのいずれか１つの位置に変異を含む。
【００１９】
ＲＡＰ変異体単独に加えて、本発明は、ＲＡＰドメインまたはＲＡＰドメインの変異体のオリゴマー組み合わせを考える。ＲＡＰコード配列は、３つの部分（前述に定義されているドメイン）に分けられる。各ドメインは、約１０ｋＤａの分子量を有するおよそ１００のアミノ酸を含む。ドメイン１（またはｄ１）は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｐ３０５３３の成熟配列の１〜９４のアミノ酸からなる。ドメイン２（またはｄ２）は、９５〜１９８のアミノ酸からなる。ドメイン３（またはｄ３）は、１９９〜３１９のアミノ酸からなり、Ｃ末端４アミノ酸保留シグナル（配列番号９）が欠如している。
【００２０】
従って、本発明が考えるＲＡＰドメインの変異体は、ＲＡＰｄ１の２つ以上の変異体を含むポリペプチド、ＲＡＰｄ２の２つ以上の変異体を含むポリペプチド、ＲＡＰｄ３の２つ以上の変異体を含むポリペプチド、ＲＡＰｄ１の１つの変異体とＲＡＰｄ３の１つの変異体を含むがＲＡＰｄ２が欠如しているポリペプチド、種々の組み合わせ（例えば、ｄ１−ｄ３、ｄ１−ｄ３−ｄ３、ｄ１−ｄ１−ｄ３、ｄ１−ｄ１−ｄ３−ｄ３、ｄ１−ｄ３−ｄ１−ｄ３、ｄ１−ｄ３−ｄ１−ｄ３−ｄ１、ｄ３、ｄ１−ｄ２−ｄ１、ｄ２−ｄ２−ｄ３、ｄ３−ｄ２−ｄ３、ｄ２−ｄ３−ｄ２−ｄ３−ｄ２−ｄ３等）でＲＡＰｄ２もしくはＲＡＰｄ３の２つ以上の変異体と共にＲＡＰｄ１の２つ以上の変異体を含むポリペプチドが含まれ、種々の組み合わせでＲＡＰｄ１およびｄ２の複数の変異体を含み、または種々の組み合わせでＲＡＰｄ２およびｄ３の複数の変異体を含む同じ配列もしくは交互の配列の連続的繰り返しが含まれる、ＲＡＰドメインの変異体である。種々の組み合わせは、近接することもあり、またはドメインが同じＣＲ含有タンパク質内の異なるＣＲ対に結合することを可能にするまたは異なるＣＲ含有タンパク質のＣＲ対に結合することを可能にする三次元立体配置でドメインを表示するペプチドリンカーによって分離されることもある。
【００２１】
従って、典型的な実施形態において、本発明は、本明細書に記述するように環状ＲＡＰペプチドであるＲＡＰｄ３の変異体を２つ以上含むオリゴマー組み合わせを考える。
【００２２】
本発明は、診断薬または治療薬に結合体化したポリペプチド受容体関連タンパク質（ＲＡＰ）、ＲＡＰ変異体、ＲＡＰフラグメント、または変異体の組み合わせを含む結合体の使用をさらに考える。一実施形態において、ポリペプチドおよび診断薬または治療薬は、リンカーを介して連結される。さらなる実施形態において、該リンカーは、ペプチドリンカーである。
【００２３】
関連する態様において、本発明は、薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤に診断薬または治療薬に結合体化したＲＡＰ変異体を含む医薬組成物の使用を提供する。
【００２４】
別の態様において、本発明は、例えばＲＡＰ変異体およびＲＡＰ結合体を治療的に含む組成物を用いることを可能な量で、ＲＡＰ変異体および結合体を生成する方法を提供する。本発明は、また、本発明の方法において有用なＲＡＰ、ＲＡＰフラグメント、およびＲＡＰ変異体を含む前述のポリペプチドのいずれかをコードする核酸を提供する。かかる核酸を含むベクター、かかる核酸またはベクターを含有する宿主細胞、およびかかるポリペプチドを生成する方法（適切な培地で宿主細胞を培養するステップと、該宿主細胞または培地からポリペプチドを単離するステップとを含む）も提供する。
【００２５】
一態様において、本発明は、肝癌、肝炎、肝硬変、真菌感染、リケッチア感染、または寄生虫感染からなる群から選択される肝障害と関連する疾患または状態；アルコール毒素、化学的毒素、および薬物毒性に起因する損傷；ならびに代謝性肝疾患、突発性自己免疫性肝疾患、胆管閉塞、脂肪肝、胆汁うっ滞、および肝切除後の状態の処置のための方法を提供する。一実施形態において、肝癌は肝細胞癌である。
【００２６】
関連する実施形態において、肝癌は、肝細胞癌からなる群から選択され、および活性薬剤部分は細胞毒性化学治療薬である。
【００２７】
さらなる実施形態において、障害は、肝臓腫瘍または肝臓における腫瘍転移であり、治療薬は化学治療薬である。
【００２８】
一態様において、本発明は、活性薬剤が細胞傷害性薬である、処置の方法を提供する。一実施形態において、細胞傷害性薬は、塩酸メクロレタミン、シクロホスファミド、イホスファミド、クロラムブシル、メルファラン、ブスルファン、チオテパ、カルムスチン、ロムスチン、ダカルバジン、およびストレプトゾシンからなる群から選択される。
【００２９】
関連する態様において、細胞傷害性薬は放射性同位体である。関連する実施形態において、放射性同位体は、^１３１Ｉ、^１２５Ｉ、^１１１Ｉｎ、^９０Ｙ、^６７Ｃｕ、^１２７Ｌｕ、^２１２Ｂｉ、^２１３Ｂｉ、^２５５Ｆｍ、^１４９Ｔｂ、^２２３Ｒｄ、^２１３Ｐｂ、^２１２Ｐｂ、^２１１Ａｔ、^８９Ｓｒ、^１５３Ｓｍ、^１６６Ｈｏ、^２２５Ａｃ、^１８６Ｒｅ、^６７Ｇａ、^６８Ｇａ、および^９９ｍＴｃからなる群から選択される。
【００３０】
さらなる態様において、本発明の方法は、治療すべく障害はウイルスに起因する肝炎であり、治療薬は抗ウイルス剤である。
【００３１】
表２は、ＲＡＰｄ３変異体およびＲＡＰｖ２（ＲＡＰｖ２Ａ）変異体のＬＲＰ１ ＣＲ３〜５およびＬＲＰ２ ＣＲ８９への結合のデータを示す。ＮＦは、結合が測定できなかったこと、またはデータが単一結合部位の想定の下で非直線回帰を用いて確実に適合させることができなかったことを表す。最大結合のパーセントは、各リガンドで検査した最高濃度でのＯＤの割合およびその濃度でかかるリガンドのすべてで測定した最高ＯＤである。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１Ａ】図１Ａ〜Ｂは、ＲＡＰｄ３、メガＲＡＰ１ｄ３（ＲＡＰｖ２Ａｄ３）および中間配列変異体のＬＲＰ２ ＣＲ８９およびＬＲＰ１ ＣＲ３〜５への結合を表す。図１Ａは、ＲＡＰｄ３突然変異体およびＲＡＰｖ２Ａｄ３復帰変異体のＬＲＰ２ ＣＲ８９への結合を表す。
【図１Ｂ】図１Ａ〜Ｂは、ＲＡＰｄ３、メガＲＡＰ１ｄ３（ＲＡＰｖ２Ａｄ３）および中間配列変異体のＬＲＰ２ ＣＲ８９およびＬＲＰ１ ＣＲ３〜５への結合を表す。図１Ｂは、ＲＡＰｄ３突然変異体およびＲＡＰｖ２Ａｄ３復帰変異体のＬＲＰ１ ＣＲ３〜５への結合を表す。データは、単一結合部位の想定の下で非直線回帰によってプロットさせ、適合させた（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ）。標準偏差を有するＫｄ値は、回帰分析から算出した。
【図２】ＬＲＰ１受容体を発現する細胞へのＲＡＰペプチド−毒素結合体の投与後の細胞死のパーセントを示す。
【図３】環状ＲＡＰペプチドおよび多量体形成環状ＲＡＰペプチドの構造の図示である。
【図４】ｉｎ ｖｉｖｏで組織におけるｍＲＡＰｃ多量体形成ペプチドの摂取および生体内分布を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
本発明は、肝臓受容体ＬＲＰ１に結合して、肝臓内部に取り入れられるＲＡＰタンパク質結合体を投与することを含む、化合物の肝臓への送達方法に関する。ＲＡＰ結合体の内部移行は、肝疾患または状態を処置するために治療化合物または他の活性薬剤を肝臓に送達する有効的な手段である。
【００３４】
Ａ．定義
特に別の定義がなければ、本明細書で用いる専門用語および科学用語は、本発明が属する技術分野において当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。以下の参考文献は、本発明で用いる多くの用語の一般的定義を当業者に提供する。すなわち、Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ， ｅｔ ａｌ．， ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ ＯＦ ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ ＡＮＤ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ （２ｄ ｅｄ． １９９４）；ＴＨＥ ＣＡＭＢＲＩＤＧＥ ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ ＯＦ ＳＣＩＥＮＣＥ ＡＮＤ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ （Ｗａｌｋｅｒ ｅｄ．， １９８８）；ＴＨＥ ＧＬＯＳＳＡＲＹ ＯＦ ＧＥＮＥＴＩＣＳ， ５ＴＨ ＥＤ．， Ｒ． Ｒｉｅｇｅｒ， ｅｔ ａｌ． （ｅｄｓ．）， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ （１９９１）；およびＨａｌｅ ａｎｄ Ｍａｒｈａｍ， ＴＨＥ ＨＡＲＰＥＲ ＣＯＬＬＩＮＳ ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ ＯＦ ＢＩＯＬＯＧＹ （１９９１）。
【００３５】
本明細書で引用するそれぞれの刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献を、本開示と矛盾しない程度までその開示内容全体が参考として援用される。
【００３６】
本明細書および添付する特許請求の範囲で用いるように、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」の形態は、文脈で明確に指示しない限り、複数形も含むことをここに述べる。
【００３７】
本明細書において、以下の用語は、特に明記しない限り、それらの用語が基づく意味を有する。
【００３８】
本明細書で用いるように「肝腫瘍および肝臓内または肝臓周辺の他の新生組織形成」には、原発腫瘍および／または肝臓内または肝臓周辺で発症する腫瘍転移の両方が含まれる。または、それは、生体内のほかの場所に移動するが、ＲＡＰ、ＲＡＰフラグメント、または化学治療薬とのＲＡＰ変異体ポリペプチド結合体に依然として応答する肝腫瘍の腫瘍転移を意味することもある。かかる腫瘍および新生組織形成の多数の型は公知である。原発性肝腫瘍としては、肝細胞癌および当該技術分野で公知の他のものが挙げられる。本明細書において、腫瘍および新生組織形成は、肝臓および肝組織と付随する可能性がある。かかる腫瘍は、ほとんどの場合固形腫瘍であるか、あるいは肝臓に局在する蓄積物を有する散在性腫瘍である。本発明によって処置する腫瘍または新生組織形成は、悪性または良性であり得、かつ以前に化学療法、放射線療法および／または他の処置によって処置されていることもあり得る。
【００３９】
用語「有効量」とは、被験体の健康状態、病状、および疾患に関して所望の結果をもたらすための、または診断の目的での十分な用量を意味する。所望の結果は、その用量のレシピエントにおいて主観的または客観的な改善を含むこともある。「治療的有効量」とは、健康面で意図された良い影響をもたらすために有効的な薬剤の量をいう。
【００４０】
「有機小分子」とは、通常、医薬品で用いられるそれらの有機分子と同程度の大きさの有機分子をいう。この用語は、有機生体高分子（例えば、タンパク質、核酸等）を除外する。好ましい有機小分子の大きさは、約５，０００Ｄａまで、約２，０００Ｄａまで、または約１，０００Ｄａまでに及ぶ。
【００４１】
診断または処置の「被験体」は、哺乳類もしくは霊長類を含むヒトまたは非ヒト動物である。
【００４２】
「処置」とは、予防処置もしくは治療処置または診断処置をいう。
【００４３】
「予防」処置とは、疾患の兆候を示さない、または疾患の初期兆候だけを示す被験体に、病状が発症する危険性を減少させる目的で投与される処置である。本発明の結合体化合物は予防処置として与えられ、病状を発症する可能性を減少させ、または発症した場合、病状の重症度を最小化することもできる。
【００４４】
「治療」処置とは、兆候または病状の症状を示す被験体に、それらの兆候または症状を軽減させるもしくは除去する目的で投与される処置である。兆候または症状は、生化学的、細胞性、組織学的、機能的、主観的、または客観的であり得る。本発明の結合体化合物を、治療処置としてまたは診断のために与えてもよい。
【００４５】
「診断」とは、病的状態の存在または性質を同定することを意味する。診断方法は、それらの特異性および選択性において異なる。特定の診断方法は、状態の確定診断を提供しないこともあるが、その方法が診断を支援する確かな指標を提供するならば、十分である。
【００４６】
「医薬組成物」とは、ヒトおよび哺乳類を含む被験体動物で医薬使用に適した組成物をいう。医薬組成物は、薬理学的に有効量の活性薬剤に結合体化したＲＡＰ、ＲＡＰフラグメント、またはＲＡＰ変異体のポリペプチドを含み、かつ薬学的に許容される担体も含む。医薬組成物は、活性成分および不活性成分を含む組成物を包含する。不活性成分は、担体ならびに任意の産物（これらの成分のいずれか２つ以上の組み合わせ、複合体形成、もしくは凝集によって、またはこれら成分の１つ以上の解離によって、またはこれら成分の１つ以上の他の種類の反応もしくは相互作用によって直接的もしくは間接的に生ずる）を作り上げている。従って、本発明の医薬組成物は、本発明の結合体化合物および薬学的に許容される担体を混合することによって作られる任意の組成物も包含する。
【００４７】
「薬学的に許容される担体」は、標準的医薬担体のいずれか、緩衝剤、および賦形剤（例えば、リン酸緩衝生理食塩水溶液、５％デキストロース水溶液、および乳濁液（例えば、油／水もしくは水／油乳剤））、ならびに種々の種類の湿潤剤および／またはアジュバントをいう。適切な医薬担体および剤形は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， １９ｔｈ Ｅｄ． （Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｅａｓｔｏｎ， １９９５）に記述されている。好ましい医薬担体は、活性薬剤の意図される投与モードに依存する。典型的な投与モードとしては、腸内（例えば経口）投与もしくは非経口（例えば、皮下、筋肉内、静脈内もしくは腹腔内注射、または局所、経皮、または経粘膜）投与が挙げられる。「薬学的に許容される塩」は、医薬使用のための化合物に調剤されることの可能な塩であり、例えば、金属塩（ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム等）およびアンモニア塩または有機アミン塩が挙げられる。
【００４８】
本明細書において、用語「単位剤形」とは、ヒトおよび動物の被験体に対する単位用量として適した、物理的に分離した単位をいい、各単位は、薬学的に許容される希釈剤、担体、媒体と結合して所望の効果を生じるのに十分な量で算出された、本発明の化合物の所定量を含有する。本発明の新規の単位剤形の規格は、使用する特定の結合体および達成されるべき効能、ならびに宿主中の各化合物と関連する薬力学に依存する。
【００４９】
本明細書において「調節する」とは、増加または減少によって（例えば、アンタゴニストまたはアゴニストとして作用させるために）変化する能力をいう。
【００５０】
本明細書において、「相対的な送達を増加させる」とは、意図する送達部位（例えば肝臓）において、活性薬剤に結合体化したＲＡＰ、ＲＡＰフラグメント、またはＲＡＰ変異体の蓄積が活性薬剤に非結合体化したＲＡＰ変異体の蓄積と比較して増加する効果をいう。
【００５１】
「治療係数」とは、最小限の治療量以上および容認不可能な毒性量以下の用量範囲（量および／または時期）をいう。
【００５２】
「同等用量」とは、同じ量の活性薬剤を含有する用量をいう。
【００５３】
「ポリヌクレオチド」とは、ヌクレオチド単位からなるポリマーをいう。ポリヌクレオチドは、天然に存在する核酸（例えばデオキシリボ核酸（「ＤＮＡ」）およびリボ核酸（「ＲＮＡ」）ならびに核酸類似体）が挙げられる。核酸類似体には、非天然に存在する塩基（天然に存在するリン酸ジエステル結合以外の他のヌクレオチドとの結合に関与するヌクレオチド）が含まれるもの、またはリン酸ジエステル結合以外の結合を介して付着した塩基が含まれるものが挙げられる。従って、ヌクレオチド類似体は、例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロトリエステル、ホスホロアミド酸、ボラノホスフェート、メチルホスホネート、キラル−メチルホスホネート、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ペプチド−核酸（ＰＮＡ）等が挙げられるがこれらに限定されない。かかるポリヌクレオチドは、例えば、自動ＤＮＡ合成機を用いて合成され得る。用語「核酸」とは、通常、大きいポリヌクレオチドをいう。用語「オリゴヌクレオチド」とは、通常、短いポリヌクレオチド、一般に約５０ヌクレオチドと同じくらいのものをいう。ヌクレオチド配列がＤＮＡ配列（すなわち、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ）によって表されるとき、これはＲＮＡ配列（すなわち、Ａ、Ｕ、Ｇ、Ｃ）（「Ｕ」が、「Ｔ」を置き換える）も含まれると理解される。タンパク質およびＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、イントロンを含み得る。
【００５４】
「ｃＤＮＡ」とは、一本鎖または二本鎖のいずれかの形態でｍＲＮＡに相補的であるまたはｍＲＮＡと同一であるＤＮＡをいう。
【００５５】
本明細書では従来の表示法を用いて、ポリヌクレオチド配列を記述する。すなわち、一本鎖ポリヌクレオチド配列の左側端が５’末端であり、二本鎖ポリヌクレオチド配列の左側方向を５’方向と呼ぶ。新生ＲＮＡ転写物へのヌクレオチドの５’から３’付加の方向は転写方法と呼ばれる。ｍＲＮＡと同じ配列を有するＤＮＡ鎖は、「コード鎖」と呼ばれる。そのＤＮＡから転写されるｍＲＮＡと同じ配列を有するＤＮＡ鎖上の配列で、ＲＮＡ転写物の５’から５’末端に位置している配列は、「上流配列」と呼ばれる。前記ＲＮＡと同じ配列を有するＤＮＡ鎖上の配列で、コードＲＮＡ転写物の３’から３’末端に位置する配列は、「下流配列」と呼ばれる。
【００５６】
「相補的」とは、形態上の適合性または２つのポリヌクレオチドの相互作用表面が一致することをいう。このように、２つの分子は相補的と記述されることができ、さらに、接触面の特徴は互いに相補的である。第１のポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が、第２のポリヌクレオチドのポリヌクレオチド結合パートナーのヌクレオチド配列と同一である場合、第１のポリヌクレオチドは、第２のポリヌクレオチドに相補的である。このように、５’−ＴＡＴＡＣ−３’配列のポリヌクレオチドは、５’−ＧＴＡＴＡ−３’配列のポリヌクレオチドと相補的である。
【００５７】
サザンブロットまたはノーザンブロットで１００を超える相補的残基を有する相補的核酸のハイブリダイゼーションをフィルター上で行うためのストリンジェントハイブリダイゼーション条件の一例として、５０％ホルマリンに１ｍｇのヘパリンを加えて、４２℃でハイブリダイゼーションを一晩行う。高ストリンジェント洗浄条件の一例としては、７２℃で０．１５ＭＮａＣｌに約１５分間である。ストリンジェント洗浄条件の一例は、０．２×ＳＳＣ洗浄を６５℃で約１５分間である（ＳＳＣ緩衝液の説明についてはＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．を参照）。
【００５８】
「補体繰り返し」または「ＣＲ」（低密度リポタンパク質受容体クラスＡドメイン（ＬＤＬ−Ａ、Ｐｆａｍ）としても公知である）とは、他の特徴の中で、６つのシステインおよび酸性アミノ酸の１つのクラスターによって定義されるタンパク質ドメインファミリーのメンバーである。いくつかの補体繰り返しは、ＬＤＬ受容体様モジュール（Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ， ＳＣＯＰ）と呼ばれる定義された構造に折り畳まれることがわかっている。ＣＲドメインは、ＬＤＬＲに属する受容体を含む多数の受容体のリガンド−結合決定基を構成する。各ＣＲ内でＡｘｃＢｘＣｘＤ（ｃは保存システインであり、ｘは任意のアミノ酸であり、ＢおよびＤはアスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギンのいずれかである）のモチーフを有するアミノ酸の直線状配列は、カルシウム結合およびリガンドの結合に関与することが示されている。特定のＣＲドメインに直接隣接した対は、ＲＡＰに結合することが示されている。ＲＡＰ結合ＣＲ対（Ａ、Ｃ、Ａ’、およびＣ’）の２つのＣＲドメインの両方においてＡおよびＣの位置のアミノ酸は、ＲＡＰ結合に関与することが示されている。
【００５９】
「組換えポリヌクレオチド」とは、自然には結合しない配列を有するポリヌクレオチドをいう。増幅または構築された組換えポリヌクレオチドは、適切なベクターに含まれることが可能であり、そのベクターを用いて適切な宿主細胞を形質転換することができる。組換えポリヌクレオチドを含む宿主細胞は、「組換え宿主細胞」とよばれる。遺伝子は、組換え宿主細胞内で発現され、例えば「組換えポリペプチド」を産生する。組換えポリヌクレオチドは、非コード機能（例えば、プロモーター、複製開始点、リボソーム結合部位）としても役割を果たし得る。
【００６０】
「発現制御配列」とは、それに作用可能に結合したヌクレオチド配列の発現（転写および／または翻訳）を調節するポリヌクレオチド内のヌクレオチド配列をいう。「作用可能に結合した」とは、２つの部分の間の機能的関係をいい、そこでは１つの部分の活性（例えば転写を調節する能力）がもう１つの部分上での作用（例えば配列の転写）をもたらす。発現制御配列としては、例えば、プロモーター配列（例えば誘導プロモーターまたは構成プロモーター）、エンハンサー、転写ターミネーター、開始コドン（すなわちＡＴＧ）、イントロンのためのスプライシングシグナル、および終止コドンが挙げられるがこれらに限定されない。
【００６１】
「発現ベクター」とは、発現されるべきヌクレオチド配列に作用可能に結合した発現制御配列を含む組換えポリヌクレオチドを含むベクターをいう。発現ベクターは、発現のための十分なシス作用要素を含み、発現のための他の要素は宿主細胞またはｉｎ ｖｉｔｒｏ発現系によって供給され得る。発現ベクターとしては、当該技術分野で公知のすべてのもの（例えば、コスミド、プラスミド（例えばネイキッド、またはリポソームに含有された）、および組換えポリヌクレオチドに組み入れるウイルス）が挙げられる。
【００６２】
「ポリペプチド」とは、アミノ酸残基、天然に存在する関連した構造変異体、およびペプチド結合を介して結合したそれらの非天然に存在する合成類似体で構成されるポリマーをいう。合成ポリペプチドは、例えば、自動ポリペプチド合成機を用いて合成され得る。用語「タンパク質」とは、通常、大きいポリペプチドをいう。用語「ペプチド」とは、通常、短いポリペプチドをいう。
【００６３】
「ＲＡＰ変異体」とは、α−２−マクログロブリン／低密度リポタンパク質受容体−関連タンパク質−関連タンパク質１（ＲＡＰ）（ＵｎｉｐｒｏｔアクセッションＰ３０５３３、Ｐｆａｍアクセッション番号ＰＦ０６４００およびＰＦ０６４０１）からのいずれか２つ以上の多形相をいう。変異体は、他のアミノ酸に対して１つ以上のアミノ酸の置換を伴う１つ以上の変異に基づくそれらのアミノ酸配列の組成において異なる。置換は、置換されるアミノ酸およびそれを置換するアミノ酸の物理化学的関連性または機能的関連性に基づき保存的または非保存的であり得る。
【００６４】
２つ以上のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列と関連して用語「同一の」または「パーセント同一性」とは、以下の配列比較アルゴリズムの１つを用いて、または目視検査によって測定する際、最大一致を比較し整列させるとき、同一である配列もしくはサブ配列、または同一であるヌクレオチドもしくはアミノ酸残基を指定した割合で有する２つ以上の配列もしくはサブ配列をいう。
【００６５】
２つの核酸またはポリペプチドと関連して、語句「実質的に相同の」または「実質的に同一の」とは、以下の配列比較アルゴリズムの１つを用いて、または目視検査によって測定する際、最大一致を比較し整列させるとき、少なくとも４０％、６０％、８０％、９０％、９５％、９８％同一性のヌクレオチドもしくはアミノ酸残基を有する２つ以上の配列もしくはサブ配列を通常いう。好ましくは、実質的同一性は、少なくとも約５０残基長である配列の領域にわたり、より好ましくは少なくとも約１００残基の領域にわたり存在する。最も好ましい配列は、少なくとも約１５０残基にわたり実質的に同一である。最も好ましい実施形態において、配列は、どちらかのまたは両方の比較バイオポリマーの全長にわたり実質的に同一である。
【００６６】
配列比較のために、通常、１つの配列は、試験配列が比較される参照配列としての機能を果たす。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列および参照配列はコンピュータに入力される。必要に応じてサブ配列座標が指定され、次いで配列アルゴリズムプログラムのパラメータが指定される。配列比較アルゴリズムは、指定されたプログラムのパラメータに基づいて、参照配列に対して試験配列のパーセント配列同一性を算出する。
【００６７】
比較のための配列の最適アライメントは、例えば局所的相同性アルゴリズム（Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ， Ａｄｖ． Ａｐｐｌ． Ｍａｔｈ． ２：４８２（１９８１））によって、相同性アライメントアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４８：４４３（１９７０））によって、類似性検索方法（Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５：２４４４（１９８８））によって、これらのアルゴリズムのコンピュータ化実行（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ＰａｃｋａｇｅのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ， ５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．， Ｍａｄｉｓｏｎ， Ｗｌ））によって、または目視検査によって行われることができる。パーセント配列同一性および配列類似性を決定するのに適したアルゴリズムの別の例は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５：４０３−４１０（１９９０）に記述されているＢＬＡＳＴアルゴリズムである。
【００６８】
「実質的に純粋の」または「単離された」とは、対象の種が存在する優勢種（すなわち、モルベースで、組成物中の他の個々の高分子種のいずれよりもより豊富な種）であり、実質的に精製された画分は、対象の種が存在するすべての高分子種の少なくとも約５０％（モルベースで）を含む組成物であることを意味する。通常、実質的に純粋な組成物とは、組成物中に存在する高分子種の約８０％〜９０％以上が目的の精製された種であることを意味する。組成物が基本的に単一の高分子種からなる場合、対象の種は基本的均一性（混入種は、従来の検出方法によって組成物では検出されることができない）まで精製される。溶媒種、低分子（＜５００ダルトン）、安定剤（例えばＢＳＡ）、および元素イオン種は、この定義の目的上、高分子種として見なさない。一部の実施形態において、本発明の結合体は、実質的に純粋なものまたは単離されたものである。一部の実施形態において、本発明の方法で有用な結合体は、それらの合成で用いた高分子出発物質に関して実質的に純粋であるか、または単離されている。一部の実施形態において、本発明の医薬組成物は、ＲＡＰ、ＲＡＰフラグメント、またはＲＡＰ変異体のポリペプチドの実質的に精製された結合体または単離された結合体、および１つ以上の薬学的に許容される賦形剤を混合した活性薬剤を含む。
【００６９】
物体に適用されるように「天然に存在する」とは、その物体が天然において見られることができるという事実をいう。例えば、天然の発生源から分離されることが可能な生物（ウイルスを含む）中に存在し、かつ研究室で人によって意図的に修飾されてないポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列は、天然に存在する。
【００７０】
「リンカー」とは、２つの他の分子を、共有結合的に、またはイオン結合、ファンデルワールス結合、もしくは水素結合を介してのいずれかで結合する分子（例えば、５’末端で１つの相補的配列とハイブリダイズし、３’末端で別の相補的配列とハイブリダイズし、このようにして２つの非相補的配列を結合させる核酸分子）をいう。
【００７１】
Ｂ．ＬＤＬＲ
「ＬＤＬＲ」とは、低密度リポタンパク質受容体ファミリーのメンバーをいい、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質１（ＬＲＰ１）、ＬＤＬ−Ｒ（１３２ｋＤａ）、ＬＲＰ２（メガリン、ｇｐ３３０）、ＬＲＰ／ＬＲＰ１およびＬＲＰ１Ｂ（６００ｋＤａ）、ＶＬＤＬ−Ｒ（１３０ｋＤａ）、ＬＲＰ５、ＬＲＰ６、ａｐｏＥＲ−２（ＬＲＰ−８、１３０ｋＤａ）、モザイクＬＤＬ−Ｒ（ＬＲ１１、２５０ＫＤａ）、ならびに他のメンバー（例えばＬＲＰ３、ＬＲＰ６、およびＬＲＰ−７）が挙げられる。
【００７２】
このファミリーの特性としては、細胞表面発現、細胞外リガンド結合ドメインの繰り返し（ＤｘＳＤＥ）、リガンド結合のためのＣａ^＋＋の必要性、ＲＡＰおよびａｐｏＥの結合、ＥＧＦ前駆体相同ドメインの繰り返し（ＹＷＴＤ）、単一の膜貫通領域、細胞質ドメイン内の内部移行シグナル（ＦＤＮＰＸＹ）、および種々のリガンドの受容体媒介エンドサイトーシスが挙げられる。このファミリーのＬＲＰ１を含む一部のメンバーは、シグナル伝達経路に関与する。
【００７３】
ＬＤＬＲリガントとは、ＬＤＬＲを結合することが知られているいくつかの分子をいう。これらの分子は、例えば、ラクトフェリン、ＲＡＰ、リポタンパク質リパーゼ、ａｐｏＥ、Ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩＩ因子、β−アミロイド前駆体、α−２−マクログロブリン、トロンボスポンジン２ＭＭＰ−２（マトリックスメタロプロテイナーゼ−２）、ＭＰＰ−９−ＴＩＭＰ−１（マトリックスメタロプロテイナーゼ−１の組織阻害剤）、ｕＰＡ（ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子）：ＰＡＩ−１（プラスミノーゲン活性化因子阻害剤−１）：ｕＰＡＲ（ｕＰＡ受容体）、およびｔＰＡ（組織プラスミノーゲン活性化因子）：ＰＡＩ−１：ｕＰＡＲが挙げられる。
【００７４】
ＬＤＬＲは、各受容体のＮ末端細胞外ドメイン内または外部ドメイン内の保存タンパク質ドメインを介して幅広い種類の細胞外リガンドに結合する。これらのドメインには、補体型繰り返し（ＣＲ、または低密度リポタンパク質受容体ドメインクラスＡ、ＩｄＩ−ａ）ドメイン、ＥＧＦ様繰り返しドメイン、およびＹＷＴＤドメイン、またはβ−プロペラドメインが挙げられる。ＣＲドメインは、同定されているほとんどのリガンドとの結合に関与する。ＣＲ配列は、ＬＤＬ受容体様モジュール（ＳＣＯＰ用語）と呼ばれる保存折り畳みを特定する。各およそ３６アミノ酸のＣＲは、１〜３、２〜５、４〜６の配置に３つの分子内システインを形成する６つのシステインと、二葉状ループの１つの葉内に結合したカルシウムイオンとを含有する。
【００７５】
ＬＲＰ１では、ヒトＬＲＰ１の第２のリガンド結合ドメインは、８つの連続するＣＲユニットからなる。隣接する可能性のある７つのＣＲ対のそれぞれは、個々に発現されて、ＲＡＰｄ３への結合に関してアッセイされている（Ａｎｄｅｒｓｅｎ， ｅｔ ａｌ．， （２０００） Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７５， ２１０１７−２１０２４）。第２のＣＲでＣＲ位置に好ましくない残基を含有する最後の一対（ＣＲ９およびＣＲ１０）を除外して、すべての対は類似する親和性（１〜５ｎＭ）でＲＡＰに結合する。
【００７６】
Ｃ．ＲＡＰフラグメントおよびＲＡＰ変異体
無作為でかつ部位特異的なＲＡＰの変異原性は、ＣＲ対を有するリガンド複合体の親和性に不均衡に寄与するいくつかの残基があり得ることを示している（Ｍｉｇｌｉｏｒｉｎｉ， ｅｔ ａｌ．，（２００３） Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７８， １７９８６−１７９９２）。特に、ＲＡＰｄ３の２５６および２７０の位置でリジンがこのドメインがＬＲＰ１に結合するために重要であることが分っている。例えば、Ｈ２４９Ｔ、Ｅ２５１Ｋ、Ｋ２５６Ａ、およびＫ２７０Ｄ（完全長ＲＡＰ配列に基づく）の変異を有する、Ｍｅｇａ ＲＡＰ１と呼ばれるＲＡＰｄ３変異体は、ＬＲＰ１ ＣＲドメインに結合できない（図１、表２を参照）。２０５および２８５の位置に中心を置く１０アミノ酸の別々の２つの塩基性領域も、それぞれ重要である（Ｍｅｌｍａｎ，ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７６，２９３３８−２９３４６）。これらの観察は、限定された残基のセット（「ホットスポット」）が存在することと一致する。これらの残基は、ＲＡＰおよびＣＲ対の間の結合エネルギー（他のタンパク質−タンパク質の接触面で観察される現象）の大部分に寄与する（Ｌｉ，ｅｔ ａｌ，（２００５）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ （Ｃａｍｂ）１３，２９７−３０７；Ｈａｌｐｅｒｉｎ，ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｃａｍｂ）１２，１０２７−１０３８；Ｇａｏ，ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｊ ＭｏＩ Ｍｏｄｅｌ（Ｏｎｌｉｎｅ）１０，４４−５４；Ｄｗｙｅｒ，ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４０，１３４９１−１３５００；ＤｅＬａｎｏ，（２００２）Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ １２，１４−２０；Ｂｏｇａｎ，ｅｔ ａｌ．，（１９９８）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２８０，１−９；Ｃｌａｃｋｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．，（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６７，３８３−３８６）。
【００７７】
ＲＡＰ分子は、最初に、３２３のアミノ酸ペプチド（配列番号１）である成熟ＲＡＰを形成するために切断される３５のアミノ酸シグナル配列を有する３５７のアミノ酸タンパク質（配列番号６および７）として、生成される。成熟ＲＡＰは、また、４のアミノ酸Ｃ末端の小胞体保留シグナルを保持する。
【００７８】
ＲＡＰのどの部分がそのＬＲＰ結合および調節活性に重要であり、かつどの部分が結合活性を失わずに変異、変化、または欠失し得るかについて実質的なガイダンスが当該技術分野では存在する（Ｎｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９４：７５２１（１９９７）；およびＲａｌｌ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７３（３７）：２４１５２，１９９８を参照）。例えば、ＲＡＰのＬＲＰ結合機能は、ＲＡＰの重複ドメインを表す融合タンパク質上で直接結合の調査を行うことによりマッピングされている（Ｗｉｌｌｎｏｗ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６７（３６）：２６１７２−８０， １９９２を参照）。ＲＡＰ結合モチーフも、切断型ＲＡＰ突然変異体および部位特異的ＲＡＰ突然変異体を用いることによって特徴付けられている（Ｍｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７６（３１）：２９３３８−２９３４６， ２００１を参照）。本発明による使用に適した特定のＲＡＰポリペプチドフラグメントとしては、（ＲＡＰのＮ末端アミノ酸からＲＡＰのＣ末端アミノ酸の位置に定義される）１〜３２３（ＲＡＰ）；１〜３１９；１〜２５０；１〜１１０；９１〜２１０；１９１〜３２３；２２１〜３２３；１〜１９０；１〜２００；および１〜２１０のフラグメントが挙げられる。一態様において、本発明で使用するためのＲＡＰタンパク質は、シグナルペプチド（配列番号１）が欠如している成熟ＲＡＰである。関連する態様において、ＲＡＰは、Ｎ末端でＲＡＰシグナルペプチドおよびＣ末端（配列番号８）でＨＮＥＬ小胞体保留シグナルの両方が欠如している。好ましいＲＡＰポリペプチドとしては、１〜３２３（ＲＡＰ）のフラグメント、１〜３１９のフラグメント、１９１〜３２３のフラグメント、および１〜２１０のフラグメント、ならびに２５６〜２７０のアミノ酸を含むＲＡＰの少なくとも７１の連続したアミノ酸を有するフラグメント、および２５６〜２７０のアミノ酸を含みかつＲＡＰｄ３の連続部分を含むＲＡＰの少なくとも７１の連続したアミノ酸を有するＲＡＰフラグメントが挙げられる。配列ＫＤＥＬによって置換されたＣ末端４アミノ酸配列を有する修飾されたＲＡＰポリペプチドも適している。Ｃ末端４アミノ酸配列（ＨＮＥＬ）が欠失された修飾されたＲＡＰポリペプチドも適している。２０１〜２１０のアミノ酸からのＲＡＰの天然配列を含むＲＡＰポリペプチドフラグメントも好ましい。
【００７９】
ＲＡＰ変異体も特定のアミノ酸残基の保存的置換を含み得る。「保存的」アミノ酸置換は、関与する残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、および／または両親媒性の性質における類似性に基づいてなされる。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン（Ａｌａ、Ａ）、ロイシン（Ｌｅｕ、Ｌ）、イソロイシン（Ｉｌｅ、Ｉ）、バリン（Ｖａｌ、Ｖ）、プロリン（Ｐｒｏ、Ｐ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ、Ｆ）、トリプトファン（Ｔｒｐ、Ｗ）、およびメチオニン（Ｍｅｔ、Ｍ）、が挙げられ、中立極性アミノ酸としては、グリシン（Ｇｌｙ、Ｇ）、セリン（Ｓｅｒ、Ｓ）、スレオニン（Ｔｈｒ、Ｔ）、システイン（Ｃｙｓ、Ｃ）、チロシン（Ｔｙｒ、Ｙ）、アスパラギン（Ａｓｎ、Ｎ）、およびグルタミン（Ｇｌｎ、Ｑ）が挙げられ、正荷電（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン（Ａｒｇ、Ｒ）、リジン（Ｌｙｓ、Ｋ）、およびヒスチジン（Ｈｉｓ、Ｈ）が挙げられ、ならびに負荷電（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸（Ａｓｐ、Ｄ）およびグルタミン酸（Ｇｌｕ、Ｅ）が挙げられる。変異は、組換えＤＮＡ法を用いてポリペプチド分子内のアミノ酸の置換を体系的に行い、結果として生じる組換え変異体の活性に関してアッセイすることによって導入され得る。核酸変化は、異なる種と核酸が異なる部位（可変位置）でまたは高度に保存された領域（定常領域）が異なる部位で行なわれ得る。本発明で有用なポリペプチド組成物を発現させる方法は、以下でより詳細に記述される。
【００８０】
他の好ましい実施形態は、ポリペプチドが、２８２〜２８９、２０１〜２１０、および３１１〜３１９の位置上にＲＡＰの天然アミノ酸配列を含むヒトまたは哺乳類のＲＡＰポリペプチドを含む。ＬＲＰ受容体に結合するＲＡＰの突然変異型およびＮ末端またはＣ末端の切断型の変異体は、Ｍｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ． （Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７６（３１）：２９３３８−４６， ２００１）に開示されている。その開示内容全体およびこれらのＲＡＰ突然変異型および切断型の変異体を詳細に参考として本明細書で援用される。他の好ましいＲＡＰポリペプチドは、アミノ酸８５〜１４８および１７８〜２４８の間にＲＡＰの天然配列を含む（Ｆａｒｑｕｈａｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１：３１６１−３１６２ （１９９４）を参照）。
【００８１】
このように、多くの参考文献は、ＲＡＰおよびＲＡＰフラグメントのＬＲＰ受容体への結合のための結合部位および構造活性の関係を開示している。当業者は、ＬＲＰ結合部位を含有しかつ本発明によってＲＡＰポリペプチドとしての使用に適したＲＡＰポリペプチドを得るために、当該技術分野で周知の種々の技法を容易に適応させることができる。ＲＡＰの好ましいフラグメントは、生理的条件下で可溶性である。これらのポリペプチドのＮ末端またはＣ末端は、ＬＲＰ粒子の結合能力が損なわれてなければ、所望のように短縮させることができる。
【００８２】
Ｄ．環状ＲＡＰペプチド
ＲＡＰは、ＬＤＬＲ内の補体型繰り返し（ＣＲ）の特定のタンデム対に低ナノモル親和性で結合する第１のドメインおよび第３のドメイン（ｄ１およびｄ３）の両方を有し、機能的に二座である（２７）。約１１０のアミノ酸からなるドメイン３は、関連するＣＲ対に対して最も高い親和性を有することが示されている。免疫原性を最小化し、生成効率を最大化し、かつ有効性を向上させるために、受容体結合に直接関与するそれらの配列にＲＡＰを最小化することは有用である。しかし、ｄ３の安定な折り畳みのためには、受容体接触面の形成において直接的に関与しないＲＡＰ内に配列が必要であることが示されている（２８）。ｄ３のＮ末端領域およびｄ２のＣ末端領域内に見られるこれらの付加的な配列は、従って、安定な折り畳みおよび高親和性の受容体結合を確実にするために必要である。単離したｄ３は、完全長ＲＡＰの中でｄ３がなすようには受容体にしっかりと結合しない。折り畳みを安定させる配列が欠如しているｄ３の切断型も受容体にあまり結合しない。ＲＡＰｄ３とＬＤＬＲ ＣＲ３４（２９）との間の複合体に由来する構造データは、ＲＡＰｄ３の受容体結合配列が柔軟なループによって結合されたほぼ同じ長さの２つの逆平行αヘリックス内に見られることを示している。対のらせん状アンサンブルは、明白な左回りのねじれを有し、ねじれて延伸した「Ｕ」字に似ている。
【００８３】
非天然のジスルフィド結合は、ＲＡＰｄ３の受容体結合ユニットを構成する２つの逆平行ヘリックスの終端を連結することで操作された（共有米国特許出願第６０／９１９，２３８号、出願日２００７年３月２１日（代理人整理番号３１０７５／４２６２０）を参照）。その開示内容全体が参考として本明細書で援用される。この環化ペプチドは、ほぼ７５のアミノ酸長であるが、非環化ペプチドと比べて優れた結合親和性を有し、１１０のアミノ酸ＲＡＰｄ３と同程度の親和性を有する。かかる最小化ＲＡＰｄ３ペプチドの１つの可能な適用は、本発明の方法によって治療薬を送達するための標的薬剤としてである。
【００８４】
本発明によって考えられる環状ＲＡＰペプチドは、成熟ＲＡＰのアミノ酸配列（好ましくはドメイン３）に基づき、好ましくは長さが１２３未満のアミノ酸であり、かつ２つの非連続したアミノ酸の間に共有結合を含有する。一部の実施形態において、共有結合は、ＲＡＰペプチドの三次元構造を安定させる。一部の実施形態において、共有結合は、環状ＲＡＰペプチドが約１×１０^−８Ｍ以下（以下とは、親和性の向上を意味する）のＫｄを有するＣＲ含有タンパク質に結合するように、結合親和性に改善をもたらす。かかる結合親和性は、当該技術分野で公知の任意の方法（例えば、放射性免疫法、ＥＬＩＳＡ、表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）に基づく技法（例えばＢｉａｃｏｒｅ）解析、または結合平衡除外法（例えばＫｉｎＥｘＡ））によって測定されることができる。親和性データは、例えば、Ｓｃａｔｃｈａｒｄ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｎ Ｎ．Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ５１：６６０（１９４９）の方法によって解析され得る。典型的な実施形態において、ＣＲタンパク質（例えばＬＲＰ１）の結合親和性は、約１×１０^−９、１０^−１０、１０^−１１、１０^−１２、１０^−１３、１０^−１４Ｍ以下である。本発明は種々の大きさ（約１０３、約９９、約９５、約９０、約８５、約８２、約８０、約７８、約７６、７５、７４、７３、７２、７１、７０、６９、６８、６７、６６、６５、６４、６３、６２、６１、６０、５９、５８、５７、または５６以下のアミノ酸長）の環状ＲＡＰペプチドを提供する。一部の実施形態において、共有結合は、約７６、７５、７４、７３、７２、７１、７０、６９、６８、６７、６６、６５、６４、６３、６２、６１、６０、５９、５８、５７、または５６のアミノ酸によって分離されるアミノ酸の間で形成される。
【００８５】
一実施形態において、本発明の方法において有用なＲＡＰペプチド（環状ＲＡＰペプチドを含む）のアミノ酸配列は、成熟ＲＡＰのＮ末端から少なくとも２００、および最高２４３までのアミノ酸が欠損している。このように、ＲＡＰペプチドは、成熟ＲＡＰから１〜２００、１〜２２０、１〜２２５、１〜２３０、１〜２３５、１〜２４０、１〜２４１、１〜２４２、１〜２４３、あるいは、１〜２４４、１〜２４５、１〜２４６、１〜２４７、または１〜２４８のアミノ酸が欠損していることもある。関連する実施形態において、ＲＡＰペプチドアミノ酸配列は、成熟ＲＡＰのＣ末端から少なくとも４、および最高１１までのアミノ酸がさらに欠損している。このように、ＲＡＰペプチドは、成熟ＲＡＰから３１４〜３２３もしくは３１３〜３２３、あるいは３０４〜３２３、３０５〜３２３、３０６〜３２３、３０７〜３２３、３０８〜３２３、３０９〜３２３、３１０〜３２３、３１１〜３２３、または３１２〜３２３のアミノ酸が欠損していることもある。別の実施形態において、ＲＡＰペプチドアミノ酸配列は、（ａ）長さが少なくとも７１のアミノ酸であり、かつ（ｂ）２５６〜２７０のアミノ酸を含む成熟ＲＡＰの連続する部分を含む。関連する実施形態において、ＲＡＰペプチドアミノ酸配列は、（ａ）長さが少なくとも７１のアミノ酸であり、かつ（ｂ）２５６〜２７０のアミノ酸を含む成熟ＲＡＰドメイン３の連続する部分を含む。ＲＡＰペプチド（環状ＲＡＰペプチドを含む）の基礎を形成し得るＲＡＰの典型的な部分には、成熟ＲＡＰ（配列番号１）から２００〜３２３、２２１〜３２３、２００〜３１９、２２１〜３１９、２４３〜３１９、２４４〜３１９、２４９〜３１９、２００〜３１３、２２１〜３１３、２４３〜３１３、２４４〜３１３、２４９〜３１３、２００〜３０３、２２１〜３０３、２４３〜３０３、２４４〜３０３、または２４９〜３０３のアミノ酸が含まれる。
【００８６】
本明細書で記述するように、天然のＲＡＰのそれと類似している（例えば、天然のＲＡＰと比較して約５倍以下の相違）ＣＲ含有タンパク質に対して親和性および選択性を示す環状ＲＡＰペプチドを調製することができる。天然のＲＡＰと比較してＬＲＰ１に対して向上した親和性を示す環状ＲＡＰペプチドも、調製することができる。一実施形態において、環状ＲＡＰペプチドは、ＬＲＰ１（Ｐ９８１５７）に対して少なくとも１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、４倍、５倍、７倍、１０倍、または２０倍向上した親和性（天然のＲＡＰと比較して）を示す。
【００８７】
本発明によって考えられる環状ＲＡＰペプチドは、天然ＲＡＰ配列からなることもあり、または天然配列への変異が含まれることもある。典型的な実施形態において、本発明の環状ＲＡＰペプチドは、配列番号３に記述する２４３〜３１３のアミノ酸からなるＲＡＰまたは配列番号４に記述する２４９〜３０３のアミノ酸からなるＲＡＰのいずれかと少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、環状ＲＡＰペプチドは、長さが約８５未満のアミノ酸であり、５０の連続するアミノ酸を含む。これらのアミノ酸は、配列番号４と少なくとも７０％同一であり、約１×１０^−８Ｍ未満の結合親和性Ｋｄを有するＣＲ含有タンパク質に結合する。
【００８８】
環状ＲＡＰペプチドは、天然ＲＡＰ配列と比較して保存的置換（例えば、５まで、１０また、１５まで、２０まで、または２５まで）を含有するが、ＬＲＰ１に対して依然として結合親和性を保持するように作ら得る。非保存的置換を含有するＲＡＰペプチドも、ＬＲＰ１に対する結合親和性を保持することもある。例えば、成熟ＲＡＰの２１７、２４９、または２５１のいずれか１つの位置での非保存的突然変異は、結合親和性に影響を及ぼさないことが示されている。
【００８９】
前述の実施形態のいずれかにおいて、ＲＡＰペプチドは、前記ペプチドのＮ末端もしくはその近接にシステインを、および前記ペプチドのＣ末端もしくはその近接にシステインを含有することもあり、これら２つのシステイン間でジスルフィド結合を形成することによって該ペプチドを環化し、かつαヘリックスを安定させる。場合により、グリシンまたはプロリンは、これらのシステインおよびαヘリックス間（例えば、Ｎ末端のＣｙｓ−ＧｌｙおよびＣ末端のＧｌｙ−Ｃｙｓ）に挿入され得る。グリシンを導入することにより、隣接する非天然のヘリックス間ジスルフィド結合のためにαヘリックスで切断可能である。
【００９０】
環状ペプチド（Ｈｅｐ１）は、非天然の内部ジスルフィド結合によって安定する。これは、ペプチドとＬＲＰ１との間に複合体が形成されるとおそらくエントロピー損失を軽減させることによって結合熱力学が向上する（Ｋｄ＞５０ｎＭからＫｄ＜１ｎＭに）。ＬＲＰ１に結合し、かつ肝疾患の処置に有用な付加的なＲＡＰ変異体は、共有国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００６／３６４５３に記述されており、その開示内容全体が参考として本明細書で援用される。
【００９１】
Ｈｅｐ１配列は、Ｎ末端で３つの位置（ＬＥＡ／ＸＣＧ）およびＣ末端で２つの位置（ＲＩ／ＧＣ）（配列番号９）でヒトＲＡＰとは異なる。患者は、ＲＡＰに由来するペプチドに免疫学的に耐えなければならない。ＲＡＰのドメイン１および２内のエピトープは、ラットにおけるＨｅｙｍａｎｎ腎炎の実験的な発症に役割を果たし、一方Ｈｅｐ１ペプチドは、全体的にドメイン３に由来する。ヒトＲＡＰは、げっ歯類およびイヌの両ＲＡＰ配列に対して配列相違があるので、これらの種は、静脈内投与から数週間内に著しい抗薬物抗体力価を発現させることが期待される。
【００９２】
本明細書の環状ＲＡＰペプチドのいずれも、本明細書に記述するようにオリゴマー組み合わせに多量体形成されることがさらに考えられる。本明細書において「多量体形成環状ＲＡＰペプチド」は、本明細書で記述するように、環状ＲＡＰペプチドであるＲＡＰｄ３の変異体を２つ以上含むポリペプチドをいう。用語「多量体」および「オリゴマー」は、本明細書で同じ意味で使われる。一実施形態において、オリゴマーまたは多量体は、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、または少なくとも８つの環状ＲＡＰペプチドを含む。１つの典型的な実施形態において、環状ＲＡＰペプチドは、多量体化またはオリゴマー化を促進させるためにビオチン分子に結合体化される。ビオチン結合体化環状ペプチドは、次いで、ストレプトアビジンに結合することによって、または抗ビオチン抗体に結合することによって多量体形成され得る（図３）。環状ＲＡＰペプチドのオリゴマーまたは多量体は、また、以下に記述する当該技術分野で周知の他の技法によって作製されることもできる。
【００９３】
ペプチドの多量体またはオリゴマーを作製するためのいくつかの技法は、当該技術分野で公知である。例えば、ペプチドは、本明細書で記述するようにリンカーによって、またはポリエチレングリコールを介して結合されることができる。Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ． １４：８６−９２， ２００３（ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）スペーサーまたはわずか２つのアミノ酸のいずれかによって結合したアミロイド線維結合ペプチドは、原線維に対して１００倍高い親和性を表示し、一方分岐したＰＥＧ上にペプチドの６つのコピーを配置することによって結果として１００００倍高い親和性が生じた）を参照。その参考文献全体が参考として本明細書で援用される。ペプチドは、ストレプトアビジンへの共役を介してのビオチン化の後に、容易に多量体形成されることができる。例えば、Ｇｕｉｌｌａｕｍｅ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７８（７）：４５００−４５０９， ２００３（ペプチド多量体は、アビジンまたはアビジン誘導体を介する結合によって調製されることができ、かつ四量体および八量体の均質調製も可能である）を参照。その参考文献全体が参考として本明細書で援用される。受容体結合能力を有するペプチドは、抗体または免疫グロブリン骨格の異なるＣＤＲ領域に移植され得る。Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ． １０３（３９）：１４３０７−１２， ２００６．Ｅｐｕｂ Ｓｅｐ １４， ２００６（２つの移植されたｍｐｌ受容体結合ペプチドを含有する抗体およびフラグメントは、天然リガンドと等効力であると推定される方法でｍｐｌ受容体を刺激した）を参照。その参考文献全体が参考として本明細書で援用される。ペプチドは、リンカーの有無にかかわらず、タンデムな様式または分岐した様式で抗体Ｆｃドメインに付着され得る。国際公開第ＷＯ ００／２４７８２、公開日２０００年５月４日（その開示内容全体が参考として本明細書で援用される）を参照。ペプチドおよび他のタンパク質は、多酵素複合体に由来する高分子の骨格上に示され得る。Ｄｏｍｉｎｇｏ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． ３０５（２）：２５９−６７， ２００１（その開示内容全体が参考として本明細書で援用される）を参照。ペプチドを示すのに適したタンパク質の骨格の概説については、Ｈｏｓｓｅ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ １５：１４−２７， ２００６（フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン、リポカリン、ノッチング、チトクロム、ｂ５６２、クニッツ型プロテアーゼ阻害剤、Ｚ−ドメイン、および糖結合タンパク質ＣＢＭ４−２等の骨格を概説する）を参照。その参考文献全体が参考として本明細書で援用される。
【００９４】
従って、典型的な実施形態において、二価のオリゴマー組み合わせは、環状ＲＡＰペプチドおよび抗体Ｆｃ領域を含むポリペプチドのホモ二量体化によってなされる。四価のオリゴマー組み合わせは、環状ＲＡＰペプチドを含む四量体免疫グロブリン（２本の重鎖および２本の軽鎖を含有する）の抗体可変領域を置換することによってなされる。さらに他の実施形態において、二価、三価、四価、または他のオリゴマー組み合わせは、ＰＥＧ分子に環状ＲＡＰペプチドを結合体化させることによってなされる。他のオリゴマー組み合わせは、当該技術分野において当業者によって想定されることができる。
【００９５】
Ｅ．ＲＡＰ、ＲＡＰフラグメント、またはＲＡＰ変異体と活性薬剤との結合体
「ＲＡＰ結合体」、「リガンド−ポリペプチド結合体」、「活性薬剤に結合体化したＲＡＰ、ＲＡＰフラグメント、またはＲＡＰ変異体を含むキメラ分子」は、それぞれ活性薬剤に付着したＲＡＰ、ＲＡＰフラグメント、またはＲＡＰ変異体を含む化合物をいう。本明細書において、用語「結合体化した」とは、１つ以上の治療薬およびＲＡＰ、ＲＡＰフラグメント、またはＲＡＰ変異体のポリペプチドが、例えば、共有化学結合によって、物理的力（例えば、ファンデルワールス力もしくは疎水性相互作用、カプセル化、埋め込み、またはそれらの組み合わせ）によって物理的に結合されることを意味する。好ましい実施形態において、１つ以上の治療薬およびＲＡＰ、ＲＡＰフラグメント、またはＲＡＰ変異体のポリペプチドは、共有化学結合によって物理的結合される。そのようなものとして、好ましい化学療法薬は、ＲＡＰ、ＲＡＰフラグメント、またはＲＡＰ変異体もしくはそれらのフラグメントへの結合体化で用いられるアルコール基、酸性基、カルボニル基、チオール基、またはアミン基等の官能基を含有する。アドリアマイシンはアミンクラスに属し、しかもカルボニルクラスを介して結合する可能性もある。パクリタキセルは、アルコールクラスに属する。適切な結合体化基をもたない化学療法薬は、さらに修飾されてかかる基を付加することもある。これらの化合物のすべては、本発明で考えられる。複数の治療薬の場合、種々の結合体の組み合わせが用いられることができる。
【００９６】
一部の実施形態において、直接的（介在する原子のない）または間接的（原子に共有結合した鎖等のリンカーを介して）のいずれかであり得る共有化学結合は、ＲＡＰ、ＲＡＰフラグメント、またはＲＡＰ変異体および活性薬剤を結合する。好ましい実施形態において、結合体のＲＡＰ、ＲＡＰフラグメント、またはＲＡＰ変異体および活性薬剤部分は、ＲＡＰ、ＲＡＰフラグメント、またはＲＡＰ変異体の原子と、活性薬剤の原子との間の共有結合によって直接的に結合される。一部の好ましい実施形態において、受容体結合部分は、本発明によって、リンカーによって化合物の活性薬剤の部分に結合される。リンカーは、ＲＡＰ、ＲＡＰフラグメント、もしくはＲＡＰ変異体を活性薬剤に結合することの可能な共有結合、または実質的に任意のアミノ酸配列のペプチド、または任意の分子もしくは原子を含む。
【００９７】
一部の実施形態において、リンカーは、１〜約６０の原子、または１〜３０以上の原子、２〜５の原子、２〜１０の原子、５〜１０の原子、または１０〜２０の原子の長さの鎖を含む。一部の実施形態において、鎖の原子は、すべて炭素原子である。一部の実施形態において、鎖の原子は、Ｃ、Ｏ、Ｎ、およびＳからなる群から選択される。鎖の原子およびリンカーは、より可溶な結合体をもたらすために、それらの予想される溶解度（親水性）によって選択され得る。一部の実施形態において、リンカーは、酵素攻撃の対象である官能基をリソソームに備えている。一部の実施形態において、リンカーは、標的組織または器官に見られる酵素によって攻撃される対象であり、かつ攻撃もしくは加水分解時に活性薬剤と、ＲＡＰ、ＲＡＰフラグメント、またはＲＡＰ変異体との結合として役立つ官能基を備える。一部の実施形態において、リンカーは、標的部位で見られる条件下（例えば低ｐＨのリソソーム）で加水分解にさらされる官能基を備える。リンカーは、かかる官能基を１つ以上含有する。一部の実施形態において、リンカーの長さは、（活性薬剤が大きいとき）ＲＡＰ、ＲＡＰフラグメント、またはＲＡＰ変異体の結合部位および活性薬剤の活性結合部位のうちの１つまたは両方との間の立体障害の可能性を減少させるのに十分な長さである。
【００９８】
リンカーが共有結合またはペプチドであり、かつ活性薬剤がポリペプチドである場合、結合体全体は、融合タンパク質であり得る。かかるペプチジルリンカーは、任意の長さでよい。典型的なリンカーは、長さが約１〜５０のアミノ酸、５〜５０、または１０〜３０のアミノ酸である。かかる融合タンパク質は、当業者に公知の組換え遺伝子操作方法によって生成され得る。一部の実施形態において、結合体のＲＡＰ、ＲＡＰフラグメント、またはＲＡＰ変異体は、迅速に分解して活性化合物を放出するように製剤化される。他の実施形態において、リンカーは、細胞内環境条件下で、またはより好ましくはリソソーム環境条件下で切断を受けやすく、ＲＡＰ、ＲＡＰフラグメント、またはＲＡＰ変異体のポリペプチド部分から活性薬剤の部分を放出または分離する。
【００９９】
結合体は、同一のＲＡＰ、ＲＡＰフラグメント、またはＲＡＰ変異体に結合された１つ以上の活性薬剤を含むことができる。例えば、結合体化反応は、活性薬剤の１〜５、約５、約１〜１０、約５〜１０、約１０〜２０、約２０〜３０、または３０以上の分子を、ＲＡＰ、ＲＡＰフラグメント、またはＲＡＰ変異体のポリペプチドに結合体化させることもある。これらの製剤は、混合物として利用されることもでき、または特定の化学量論的製剤に精製されることもできる。当業者は、どの形式、どの化学量論比が好ましいかを決定することができる。さらに、標的部位または区画に２つ以上の型の薬剤を送達することが望ましい場合、２つ以上の型の活性薬剤は、ＲＡＰ、ＲＡＰフラグメント、またはＲＡＰ変異体ポリペプチドに結合され得る。複数の活性薬剤種は、同一のＲＡＰ、ＲＡＰフラグメント、またはＲＡＰ変異体のポリペプチド（例えばアドリアマイシン−シスプラチンＲＡＰ、（または他のＲＡＰ変異体）結合体）に付着され得る。従って、結合体は様々な化学量論比からなり得、２種類以上の活性薬剤を取り込むこともできる。これらは、精製混合物に分離されることも可能であり、または全体として利用されることもできる。
【０１００】
本明細書に記述するように、当該技術分野で公知の方法を用いて結合体化されたＲＡＰ、ＲＡＰフラグメント、またはＲＡＰ変異体またはそれらのフラグメントは、所望通りに修飾され、その安定性または薬物動態特性（例えばＰＥＧ付加）を増強させることができる。ＲＡＰ変異体ポリペプチドおよび活性薬剤を結合体化させるために適切なリンカーおよびそれらの官能基、ならびにそれらを調製するために容易に順応できる合成化学方法は、米国特許出願第２００３２５３８９０号に記述されており、その開示内容全体が参考として本明細書で援用される。
【０１０１】
これらの結合体の合成は、効率的かつ簡便であり、増強された水溶解度を有する薬物を高収率で生成する。
【０１０２】
Ｆ．活性薬剤
本発明による活性薬剤は、生物学的過程に影響することができる薬剤を含む。本発明の化合物、組成物、および方法での使用に特に好ましい活性薬剤は、薬物および診断薬を含む治療薬である。用語「薬物」または「治療薬」とは、治療的有効量で投与されるとき、薬理活性を有するまたは健康に良い活性薬剤をいう。特に好ましい薬剤は、天然に存在する生物学的作用物質（例えば、酵素、タンパク質、ポリヌクレオチド、抗体、ポリペプチド、ナノ粒子、複合糖質）である。一部の実施形態において、ＲＡＰ、ＲＡＰフラグメント、またはＲＡＰ変異体に結合体化した活性薬剤は、生体宿主において生物学的過程を調節することの可能な分子、ならびに任意の結合部分またはそのフラグメントである。薬物または治療薬の例としては、疾患もしくは状態の予防、診断、軽減、処置、または治療で用いられる物質が挙げられる。前記薬剤は、疾患の原因となる薬剤ではないことが特に考えられる。
【０１０３】
ｉ．タンパク質活性薬剤
活性薬剤は、非タンパク質またはタンパク質であり得る。活性薬剤は、タンパク質もしくは酵素、またはタンパク質もしくは酵素の治療活性または生物活性をいくらか、実質的にすべて、もしくはすべてを依然として保持している任意のフラグメントであり得る。一部の実施形態において、発現されないもしくは生じない場合、または発現もしくは生成において実質的に減少する場合、タンパク質もしくは酵素は疾患を発症させるものである。好ましくは、タンパク質または酵素は、ヒトもしくはマウスに由来するまたはそれらから得られる。
【０１０４】
本発明の好ましい実施形態において、ＲＡＰ、ＲＡＰフラグメント、またはＲＡＰ変異体のポリペプチドに結合体化した活性薬剤がタンパク質もしくは酵素、またはタンパク質もしくは酵素の生物活性を有するそれらのフラグメントである場合、前記活性薬剤は、ヒトもしくは哺乳類のタンパク質もしくは酵素の対応する部分のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を有する。他の実施形態において、結合体の活性薬剤部分は、ヒトまたは哺乳類の種を原産とするタンパク質または酵素である。他の実施形態において、タンパク質もしくは酵素、またはそれらのフラグメントは、対応するヒトもしくは哺乳類のタンパク質または酵素の天然配列と実質的に相同（すなわち、少なくとも１０、２５、５０、１００，１５０、または２００のアミノ酸の長さにわたるアミノ酸配列において、または活性薬剤の全長において少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、より好ましくは９８％、または最も好ましくは９９％同一）である。
【０１０５】
ＲＡＰ、ＲＡＰフラグメント、またはＲＡＰ変異体−活性薬剤の結合体は、ＲＡＰ、ＲＡＰフラグメント、またはＲＡＰ変異体、またはそれらのＬＲＰ１−結合フラグメントに結合した１つ以上の活性薬剤部分（例えば、１〜１０もしくは１〜４もしくは２〜３の部分）を含むことができる。例えば、結合体化反応は、１から４以上の分子を単一のＲＡＰ、ＲＡＰフラグメント、またはＲＡＰ変異体に結合体化することができる。これらの製剤は、混合物として利用されことが可能であり、または特定のＲＡＰ、ＲＡＰフラグメント、またはＲＡＰ変異体のポリペプチド−薬剤の化学量論的製剤に精製されることもできる。当業者は、どの形式およびどの化学量論比が好ましいかを決定することができる。
【０１０６】
薬剤に結合体化したこれらのＲＡＰ、ＲＡＰフラグメント、またはＲＡＰ変異体は、様々な化学量論比からなり得る。これらは、精製混合物に分離されることも可能であり、または全体として利用されることもできる。融合においてＬＲＰ１に結合するＬＲＰ１結合部分の能力に重要であるのは、ＲＡＰ、ＲＡＰフラグメント、またはＲＡＰ変異体および活性薬剤の順序であり得る。従って、好ましい実施形態において、ＲＡＰ、ＲＡＰフラグメント、またはＲＡＰ変異体は、タンパク質活性薬剤コード配列へのＮ末端に位置している。
【０１０７】
ｉｉ．薬物活性薬剤
通常、薬物活性薬剤は、任意の大きさでもよい。好ましい薬物は、目的の標的に結合することの可能な有機小分子である。小分子の場合、結合体の薬物部分は、通常、少なくとも約５０Ｄａ、普通は少なくとも約１００Ｄａの分子量を有する。この場合分子量は５００Ｄａ以上の高い程度であり得るが、普通は約２０００Ｄａを超えることはない。
【０１０８】
薬物部分は、主題の方法を行う間に、結合体が投与される宿主内の標的と相互作用することができる。
【０１０９】
一部の実施形態において、活性薬剤または薬物は、イソシアネート試薬と反応するヒドロキシル基もしくはアミノ基を有し、あるいは活性薬剤は、イソシアネート試薬と反応するためのヒドロキシル基もしくはアミノ基を導入するように化学的に修飾される。
【０１１０】
一部の実施形態において、活性薬剤または薬物は、共有結合（好ましくは活性薬剤の所望の生物活性を失わずに）で修飾されることもおよび／または関与することもできる領域を含む。薬物部分は、上述の官能基から１つ以上と置換された環状炭素構造もしくは複素環構造および／または芳香族構造もしくは多環芳香属構造を含むことが多い。また、目的の薬物部分としての構造は、生体分子、タンパク質、酵素、多糖類、ならびにポリ核酸（ペプチド、糖類、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、それらの誘導体、構造類似体、または組み合わせを含む）に見られる。
【０１１１】
適切な活性薬剤としては、精神薬理剤、例えば（１）中枢神経系抑制剤、例えば全身麻酔薬（バルビツレート、ベンゾジアゼピン、ステロイド、シクロヘキサノン誘導体、および様々な薬剤）、催眠鎮静薬（ベンゾジアゼピン、バルビツレート、ピペリジンジオンおよびトリオン、キナゾリン誘導体、カルバメート、アルデヒドおよび誘導体、アミド、環状ウレイド、ベンゾアゼピンおよび関連薬物、フェノチアジン等）、中枢随意筋緊張修飾性薬（ヒダントイン、バルビツレート、オキサゾリジンジオン、スクシンイミド、アシルウレイド、グルタルイミド、ベンゾジアゼピン、第２級および第３級アルコール、ジベンゾアゼピン誘導体、バルプロ酸および誘導体、ＧＡＢＡ類似体等の抗痙攣薬）、鎮痛薬（モルヒネおよび誘導体、オリパビン誘導体、モルフィナン誘導体、フェニルピペリジン、２，６−メタン−３−ベンゾカイン誘導体、ジフェニルプロピルアミンおよびアイソスター、サリチル酸、ｐ−アミノフェノール誘導体、５−ピラゾロン誘導体、アリール酢酸誘導体、フェナム酸およびアイソスター等）、ならびに制吐薬（抗コリン薬、抗ヒスタミン薬、抗ドパミン薬等）、（２）中枢神経系刺激薬、例えば興奮薬（呼吸刺激薬、痙攣刺激薬、精神運動刺激薬）、麻薬拮抗薬（モルヒネ誘導体、オリパビン誘導体、２，６−メタン−３−ベンゾキサシン誘導体、モルフィナン誘導体）、向知性薬、（３）神経薬理物質、例えば抗不安鎮静薬（ベンゾジアゼピン、プロパンジオールカルバメート）、統合失調症治療薬（フェノチアジン誘導体、チオキサンチン誘導体、他の三環系 化合物、ブチロフェノン誘導体およびアイソスター、ジフェニルブチルアミン誘導体、置換ベンズアミド、アリールピペラジン誘導体、インドール誘導体等．）、抗うつ薬（三環系化合物、ＭＡＯ阻害剤等．）、（４）呼吸器薬、例えば中枢性鎮咳薬（アヘンアルカロイドおよびそれらの誘導体）；薬力学的作用薬、例えば（１）末梢神経系薬物、例えば局所麻酔薬（エステル誘導体、アミド誘導体）、（２）シナプス接合部位または神経効果器接合部位で作用する薬物（例えば、コリン作用薬、コリン遮断薬、神経筋遮断薬、アドレナリン作用薬、抗アドレナリン薬）、（３）平滑筋活性薬物、例えば鎮痙薬（抗コリン薬、筋向性鎮痙薬）、血管拡張剤、平滑筋刺激薬、（４）ヒスタミンならびに抗ヒスタミン薬、例えばヒスタミンおよびその誘導体（ベタゾール）、抗ヒスタミン薬（Ｈ１拮抗剤、Ｈ２拮抗剤）、ヒスタミン代謝薬物、（５）心血管治療薬、例えば強心剤（植物抽出物、ブテノライド、ペンタジエンオリド、エリスロフレウム種由来のアルカロイド、イオノフォア、アドレナリン受容体刺激薬等）、抗不整脈薬、血圧降下薬、抗高脂血薬（クロフィブリン酸誘導体、ニコチン酸誘導体、ホルモン、および類似体、抗生物質、サリチル酸および誘導体）、抗静脈瘤薬、止血薬、（６）血液および造血系薬物、例えば貧血治療薬、血液凝固薬（止血剤、抗凝固薬、抗血栓薬、血栓溶解薬、血液タンパク質およびそれらの画分）、（７）消化管薬物、例えば消化薬（健胃薬、利胆薬）、抗潰瘍薬、止痢薬、（８）局所作用薬；化学療法薬、例えば（１）抗感染症薬、例えば外部寄生虫駆除剤（塩素化炭化水素、ピレトリン、硫化化合物）、駆虫薬、抗原虫薬、抗マラリア剤、抗アメーバ薬、抗リーシュマニア薬、抗トリコモナス剤、抗トリパノソーマ剤、スルホンアミド、抗ミコバクテリア薬、抗ウイルス化学療法薬、（２）細胞増殖抑制剤、すなわち抗腫瘍薬または細胞傷害性薬（例えば、アルキル化剤（例えば、メクロレタミンハイドロクロライド（ナイトロジェンマスタード、Ｍｕｓｔａｒｇｅｎ、ＨＮ２）、シクロホスファミド（Ｃｙｔｏｘａｎ、Ｅｎｄｏｘａｎａ）、イホスファミド（ＩＦＥＸ）、クロラムブシル（Ｌｅｕｋｅｒａｎ）、メルファラン（フェニルアラニンマスタード、Ｌ−サルコリシン、Ａｌｋｅｒａｎ、Ｌ−ＰＡＭ）、ブスルファン（Ｍｙｌｅｒａｎ）、チオテパ（トリエチレンチオホスホルアミド）、カルムスチン（ＢｉＣＮＵ、ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣｅｅＮＵ、ＣＣＮＵ）、ストレプトゾシン（Ｚａｎｏｓａｒ）、ダカルバジン等）、植物アルカロイド（例えば、ビンクリスチン（Ｏｎｃｏｖｉｎ）、ビンブラスチン（Ｖｅｌｂａｎ、Ｖｅｌｂｅ）、パクリタキセル（Ｔａｘｏｌ）等）、代謝拮抗剤（例えば、メトトレキサート（ＭＴＸ）、メルカプトプリン（Ｐｕｒｉｎｅｔｈｏｌ、６−ＭＰ）、チオグアニン（６−ＴＧ）、フルオロウラシル（５−ＦＵ）、シタラビン（Ｃｙｔｏｓａｒ−Ｕ、Ａｒａ−Ｃ）、アザシチジン（Ｍｙｌｏｓａｒ、５−ＡＺＡ）等）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（アクチノマイシンＤ、Ｃｏｓｍｅｇｅｎ）、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、ダウノルビシン（ダウノマイシン、Ｃｅｒｕｂｉｄｉｎｅ）、イダルビシン（Ｉｄａｍｙｃｉｎ）、ブレオマイシン（Ｂｌｅｎｏｘａｎｅ）、ピカマイシン（ミトラマイシン，、Ｍｉｔｈｒａｃｉｎ）、マイトマイシン（Ｍｕｔａｍｙｃｉｎ）等）、ならびに他の抗細胞増殖剤（例えば、ヒドロキシ尿素（Ｈｙｄｒｅａ）、プロカルバジン（Ｍｕｔａｌａｎｅ）、ダカルバジン（ＤＴＩＣ−Ｄｏｍｅ）、シスプラチン（Ｐｌａｔｉｎｏｌ）、カルボプラチン（Ｐａｒａｐｌａｔｉｎ）、アスパラギナーゼ（Ｅｌｓｐａｒ）、エトポシド（ＶｅＰｅｓｉｄ、ＶＰ−１６−２１３）、アムサクリン（ＡＭＳＡ、ｍ−ＡＭＳＡ）、ミトタン（Ｌｙｓｏｄｒｅｎ）、ミトキサントロン（Ｎｏｖａｔｒｏｎｅ）、（３）以下のキナーゼを抑制し得る受容体チロシンキナーゼ阻害剤（ＦＧＦＲ、ＰＤＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、Ｅｂｒ−Ｂ２）および他（ＳＵ６６６８（ＦＧＦＲ、ＰＤＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ２）、スニチニブ（ＰＤＧＦＲ）、ベバシズマブ（ＶＥＧＦＲ）、ゲフィチニブ、エルロチニブ、セツキシマブ（ＥＧＦＲ）、ラパチニブ（Ｅｒｂ−Ｂ２）、トラスツズマブ（ＨＥＲ２）、およびアレムツズマブ（抗ＣＤ５２）、ダサチニブ、イマチニブ、ソラフェニブ、スニチニブ等を含むがこれらに限定されない。）、（４）抗腫瘍薬（ＳＵ６６６８、ベバシズマブ、スニチニブ、バンデタニブ（ＶＥＧＦＲ２）、ＢＭＳ−２７５２９１、ＣＯＬ−３、ネオバスタット（ＭＭＰ）、ビタキシン等を含むがこれらに限定されない。）。好ましい化学療法薬は、遊離型で、所望の用量で許容されない全身毒性を示すものである。かかる薬剤の治療レベルと付随した通常の全身毒性は、それらをＲＡＰ、ＲＡＰフラグメント、またはＲＡＰ変異体のポリペプチドに結合させることで減少させることができる。有用な治療薬であるが、用量が心毒性によって制限される心毒性化合物は特に好ましい。典型的な例は、アドリアマイシン（ドキソルビシンとしても公知である）およびその類似体（例えばダウノルビシン）である。ＲＡＰ、ＲＡＰフラグメント、またはＲＡＰ変異体のポリペプチドをかかる薬物に結合することによって、心臓での活性薬物の蓄積および付随する心毒性を阻止することができる。
【０１１２】
適切な活性薬剤としては、抗生物質、例えばアミノグリコシド（例えば、アミカシン、アプラマイシン、アルベカシン、バンベルマイシン、ブチロシン、ジベカシン、ジヒドロストレプトマイシン、フォーチミシン、ゲンタマイシン、イセパミシン、カナマイシン、ミクロノマイシン、ネオマイシン、ネチルマイシン、パロモマイシン、リボスタマイシン、シソマイシン、スペクチノマイシン、ストレプトマイシン、トプラマイシン、トロスペクトマイシン）、アンフェニコール（例えば、アジダムフェニコール、クロラムフェニコール、フロルフェニコール、およびチアンフェニコール）、アンサマイシン（例えば、リファミド、リファンピン、リファマイシン、リファペンチン、リファキシミン）、β−ラクタム（例えば、カルバセフェム、カルバペネム、セファロスポリン、セファマイシン、モノバクタム、オキサフェム、ペニシリン）、リンコサミド（例えば、クリンダマイシン、リンコマイシン）、マクロライド（例えば、クラリスロマイシン、ジリスロマイシン、エリスロマイシン等）、ポリペプチド（例えば、アンホマイシン、バシトラシン、カプレオマイシン等）、テトラサイクリン（例えば、アピサイクリン、クロルテトラサイクリン、クロモサイクリン等）、合成抗菌剤（例えば、２，４−ジアミノピリミジン、ニトロフラン、キノロンおよびその類似体、スルホンアミド、スルホン）が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１１３】
適切な活性薬剤としては、抗真菌剤、例えばポリエン（例えば、アンホテリシンＢ、カンジシジン、デルモスタチン、フィリピン、フンギクロミン、ハチマイシン、ハマイシン、ルセンソマイシン、メパルトリシン、ナタマイシン、ニスタチン、ペチロシン、ペリマイシン）；合成抗真菌薬、例えばアリルアミン（例えば、ブテナフィン、ナフチフィン、テルビナフィン）、イミダゾール（例えば、ビホナゾール、ブトコナゾール、クロダントイン、クロルミダゾール等）、チオカルバメート（例えばトルシクラート）、トリアゾール（例えば、フルコナゾール、イトラコナゾール、テルコナゾール）が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１１４】
適切な活性薬剤としては、駆虫薬（例えば、アレコリン、アスピジン、アスピジノール、ジクロロフェン、エンベリン、コシン、ナフタレン、ニクロサミド、ペレチエリン、キナクリン、アラントラクトン、アモカルジン、アモスカナート、アスカリドール、ベフェニウム、ビトスカナート、四塩化炭素、カルバクロール、シクロベンダゾール、ジエチルカルバマジン等）が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１１５】
適切な活性薬剤としては、抗マラリア薬（例えば、アセダプソン、アモジアキン、アルテテル、アルテメテル、アルテミシニン、アルテスナート、アトバコン、ベベエリン、ベルベリン、チラータ、クロログアニド、クロロキン、クロルプログアニル、キナ、シンコニジン、シンコニン、シクログアニル、ゲンチオピクリン、ハロファントリン、ヒドロキシクロロキン、塩酸メフロキン、３−メチルアルサセチン、パマキン、プラスモシド、プリマキン、ピリメタミン、キナクリン、キニジン、キニーネ、キノシド、キノリン、ヒ酸二ナトリウムが挙げられるがこれらに限定されない。
【０１１６】
適切な活性薬剤としては、抗原虫剤（例えば、アクラニル、チニダゾール、イプロニダゾール、エチルスチバミン、ペンタミジン、アセタルソン、アミニトロゾール、アニソマイシン、ニフラテル、チニダゾール、ベンズイダゾール、スラミン等）が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１１７】
活性薬剤としての使用に適した薬物も以下に一覧される。すなわち、Ｇｏｏｄｍａｎ ａｎｄ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ， Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ （９ｔｈ Ｅｄ）（Ｇｏｏｄｍａｎ ｅｔ ａｌ． ｅｄｓ）（ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ）（１９９６）；および１９９９ Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（１９９８）。
【０１１８】
適切な活性薬剤としては、米国特許第５，８８０，１６１号、第５，８７７，２０６号、第５，７８６，３４４号、第５，７６０，０４１号、第５，７５３，６６８号、第５，６９８，５２９号、第５，６８４，００４号、第５，６６５，７１５号、第５，６５４，４８４号、第５，６２４，９２４号、第５，６１８，８１３号、第５，６１０，２９２号、第５，５９７，８３１号、第５，５３０，０２６号、第５，５２５，６３３号、第５，５２５，６０６号、第５，５１２，６７８号、第５，５０８，２７７号、第５，４６３，１８１号、第５，４０９，８９３号、第５，３５８，９５２号、第５，３１８，９６５号、第５，２２３，５０３号、第５，２１４，０６８号、第５，１９６，４２４号、第５，１０９，０２４号、第５，１０６，９９６号、第５，１０１，０７２号、第５，０７７，４０４号、第５，０７１，８４８号、第５，０６６，４９３号、第５，０１９，３９０号、第４，９９６，２２９号、第４，９９６，２０６号、第４，９７０，３１８号、第４，９６８，８００号、第４，９６２，１１４号、第４，９２７，８２８号、第４，８９２，８８７号、第４，８８９，８５９号、第４，８８６，７９０号、第４，８８２，３３４号、第４，８８２，３３３号、第４，８７１，７４６号、第４，８６３，９５５号、第４，８４９，５６３号、第４，８４５，２１６号、第４，８３３，１４５号、第４，８２４，９５５号、第４，７８５，０８５号、第４，６８４，７４７号、第４，６１８，６８５号、第４，６１１，０６６号、第４，５５０，１８７号、第４，５５０，１８６号、第４，５４４，５０１号、第４，５４１，９５６号、第４，５３２，３２７号、第４，４９０，５４０号、第４，３９９，２８３号、第４，３９１，９８２号、第４，３８３，９９４号、第４，２９４，７６３号、第４，２８３，３９４号、第４，２４６，４１１号、第４，２１４，０８９号、第４，１５０，２３１号、第４，１４７，７９８号、第４，０５６，６７３号、第４，０２９，６６１号、第４，０１２，４４８号に開示される抗腫瘍薬が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１１９】
米国特許第５，１９２，７９９号、第５，０３６，０７０号、第４，７７８，８００号、第４，７５３，９５１号、第４，５９０，１８０号、第４，６９０，９３０号、第４，６４５，７７３号、第４，４２７，６９４号、第４，４２４，２０２号、第４，４４０，７８１号、第５，６８６，４８２号、第５，４７８，８２８号、第５，４６１，０６２号、第５，３８７，５９３号、第５，３８７，５８６号、第５，２５６，６６４号、第５，１９２，７９９号、第５，１２０，７３３号、第５，０３６，０７０号、第４，９７７，１６７号、第４，９０４，６６３号、第４，７８８，１８８号、第４，７７８，８００号、第４，７５３，９５１号、第４，６９０，９３０号、第４，６４５，７７３号、第４，６３１，２８５号、第４，６１７，３１４号、第４，６１３，６００号、第４，５９０，１８０号、第４，５６０，６８４号、第４，５４８，９３８号、第４，５２９，７２７号、第４，４５９，３０６号、第４，４４３，４５１号、第４，４４０，７８１号、第４，４２７，６９４号、第４，４２４，２０２号、第４，３９７，８５３号、第４，３５８，４５１号、第４，３２４，７８７号、第４，３１４，０８１号、第４，３１３，８９６号、第４，２９４，８２８号、第４，２７７，４７６号、第４，２６７，３２８号、第４，２６４，４９９号、第４，２３１，９３０号、第４，１９４，００９号、第４，１８８，３８８号、第４，１４８，７９６号、第４，１２８，７１７号、第４，０６２，８５８号、第４，０３１，２２６号、第４，０２０，０７２号、第４，０１８，８９５号、第４，０１８，７７９号、第４，０１３，６７２号、第３，９９４，８９８号、第３，９６８，１２５号、第３，９３９，１５２号、第３，９２８，３５６号、第３，８８０，８３４号、第３，６６８，２１０号に開示される神経薬理物質／向精神薬。
【０１２０】
米国特許第４，９６６，９６７号、第５，６６１，１２９号、第５，５５２，４１１号、第５，３３２，７３７号、第５，３８９，６７５号、第５，１９８，４４９号、第５，０７９，２４７号、第４，９６６，９６７号、第４，８７４，７６０号、第４，９５４，５２６号、第５，０５１，４２３号、第４，８８８，３３５号、第４，８５３，３９１号、第４，９０６，６３４号、第４，７７５，７５７号、第４，７２７，０７２号、第４，５４２，１６０号、第４，５２２，９４９号、第４，５２４，１５１号、第４，５２５，４７９号、第４，４７４，８０４号、第４，５２０，０２６号、第４，５２０，０２６号、第５，８６９，４７８号、第５，８５９，２３９号、第５，８３７，７０２号、第５，８０７，８８９号、第５，７３１，３２２号、第５，７２６，１７１号、第５，７２３，４５７号、第５，７０５，５２３号、第５，６９６，１１１号、第５，６９１，３３２号、第５，６７９，６７２号、第５，６６１，１２９号、第５，６５４，２９４号、第５，６４６，２７６号、第５，６３７，５８６号、第５，６３１，２５１号、第５，６１２，３７０号、第５，６１２，３２３号、第５，５７４，０３７号、第５，５６３，１７０号、第５，５５２，４１１号、第５，５５２，３９７号、第５，５４７，９６６号、第５，４８２，９２５号、第５，４５７，１１８号、第５，４１４，０１７号、第５，４１４，０１３号、第５，４０１，７５８号、第５，３９３，７７１号、第５，３６２，９０２号、第５，３３２，７３７号、第５，３１０，７３１号、第５，２６０，４４４号、第５，２２３，５１６号、第５，２１７，９５８号、第５，２０８，２４５号、第５，２０２，３３０号、第５，１９８，４４９号、第５，１８９，０３６号、第５，１８５，３６２号、第５，１４０，０３１号、第５，１２８，３４９号、第５，１１６，８６１号、第５，０７９，２４７号、第５，０７０，０９９号、第５，０６１，８１３号、第５，０５５，４６６号、第５，０５１，４２３号、第５，０３６，０６５号、第５，０２６，７１２号、第５，０１１，９３１号、第５，００６，５４２号、第４，９８１，８４３号、第４，９７７，１４４号、第４，９７１，９８４号、第４，９６６，９６７号、第４，９５９，３８３号、第４，９５４，５２６号、第４，９５２，６９２号、第４，９３９，１３７号、第４，９０６，６３４号、第４，８８９，８６６号、第４，８８８，３３５号、第４，８８３，８７２号、第４，８８３，８１１号、第４，８４７，３７９号、第４，８３５，１５７号、第４，８２４，８３１号、第４，７８０，５３８号、第４，７７５，７５７号、第４，７７４，２３９号、第４，７７１，０４７号、第４，７６９，３７１号、第４，７６７，７５６号、第４，７６２，８３７号、第４，７５３，９４６号、第４，７５２，６１６号、第４，７４９，７１５号、第４，７３８，９７８号、第４，７３５，９６２号、第４，７３４，４２６号、第４，７３４，４２５号、第４，７３４，４２４号、第４，７３０，０５２号、第４，７２７，０７２号、第４，７２１，７９６号、第４，７０７，５５０号、第４，７０４，３８２号、第４，７０３，１２０号、第４，６８１，９７０号、第４，６８１，８８２号、第４，６７０，５６０号、第４，６７０，４５３号、第４，６６８，７８７号、第４，６６３，３３７号、第４，６６３，３３６号、第４，６６１，５０６号、第４，６５６，２６７号、第４，６５６，１８５号、第４，６５４，３５７号、第４，６５４，３５６号、第４，６５４，３５５号、第４，６５４，３３５号、第４，６５２，５７８号、第４，６５２，５７６号、第４，６５０，８７４号、第４，６５０，７９７号、第４，６４９，１３９号、第４，６４７，５８５号、第４，６４７，５７３号、第４，６４７，５６５号、第４，６４７，５６１号、第４，６４５，８３６号、第４，６３９，４６１号、第４，６３８，０１２号、第４，６３８，０１１号、第４，６３２，９３１号、第４，６３１，２８３号、第４，６２８，０９５号、第４，６２６，５４８号、第４，６１４，８２５号、第４，６１１，００７号、第４，６１１，００６号、第４，６１１，００５号、第４，６０９，６７１号、第４，６０８，３８６号、第４，６０７，０４９号、第４，６０７，０４８号、第４，５９５，６９２号、第４，５９３，０４２号、第４，５９３，０２９号、第４，５９１，６０３号、第４，５８８，７４３号、第４，５８８，７４２号、第４，５８８，７４１号、第４，５８２，８５４号、第４，５７５，５１２号、第４，５６８，７６２号、第４，５６０，６９８号、第４，５５６，７３９号、第４，５５６，６７５号、第４，５５５，５７１号、第４，５５５，５７０号、第４，５５５，５２３号、第４，５５０，１２０号、第４，５４２，１６０号、第４，５４２，１５７号、第４，５４２，１５６号、第４，５４２，１５５号、第４，５４２，１５１号、第４，５３７，９８１号、第４，５３７，９０４号、第４，５３６，５１４号、第４，５３６，５１３号、第４，５３３，６７３号、第４，５２６，９０１号、第４，５２６，９００号、第４，５２５，４７９号、第４，５２４，１５１号、第４，５２２，９４９号、第４，５２１，５３９号、第４，５２０，０２６号、第４，５１７，１８８号、第４，４８２，５６２号、第４，４７４，８０４号、第４，４７４，８０３号、第４，４７２，４１１号、第４，４６６，９７９号、第４，４６３，０１５号、第４，４５６，６１７号、第４，４５６，６１６号、第４，４５６，６１５号、第４，４１８，０７６号、第４，４１６，８９６号、第４，２５２，８１５号、第４，２２０，５９４号、第４，１９０，５８７号、第４，１７７，２８０号、第４，１６４，５８６号、第４，１５１，２９７号、第４，１４５，４４３号、第４，１４３，０５４号、第４，１２３，５５０号、第４，０８３，９６８号、第４，０７６，８３４号、第４，０６４，２５９号、第４，０６４，２５８号、第４，０６４，２５７号、第４，０５８，６２０号、第４，００１，４２１号、第３，９９３，６３９号、第３，９９１，０５７号、第３，９８２，０１０号、第３，９８０，６５２号、第３，９６８，１１７号、第３，９５９，２９６号、第３，９５１，９５０号、第３，９３３，８３４号、第３，９２５，３６９号、第３，９２３，８１８号、第３，８９８，２１０号、第３，８９７，４４２号、第３，８９７，４４１号、第３，８８６，１５７号、第３，８８３，５４０号、第３，８７３，７１５号、第３，８６７，３８３号、第３，８７３，７１５号、第３，８６７，３８３号、第３，６９１，２１６号、第３，６２４，１２６号に開示される心血管治療薬。
【０１２１】
米国特許第５，９０２，５９４号、第５，８７４，４７６号、第５，８７４，４３６号、第５，８５９，０２７号、第５，８５６，３２０号、第５，８５４，２４２号、第５，８１１，０９１号、第５，７８６，３５０号、第５，７８３，１７７号、第５，７７３，４６９号、第５，７６２，９１９号、第５，７５３，７１５号、第５，７４１，５２６号、第５，７０９，８７０号、第５，７０７，９９０号、第５，６９６，１１７号、第５，６８４，０４２号、第５，６８３，７０９号、第５，６５６，５９１号、第５，６４３，９７１号、第５，６４３，９５０号、第５，６１０，１９６号、第５，６０８，０５６号、第５，６０４，２６２号、第５，５９５，７４２号、第５，５７６，３４１号、第５，５５４，３７３号、第５，５４１，２３３号、第５，５３４，５４６号、第５，５３４，５０８号、第５，５１４，７１５号、第５，５０８，４１７号、第５，４６４，８３２号、第５，４２８，０７３号、第５，４２８，０１６号、第５，４２４，３９６号、第５，３９９，５５３号、第５，３９１，５４４号、第５，３８５，９０２号、第５，３５９，０６６号、第５，３５６，８０３号、第５，３５４，８６２号、第５，３４６，９１３号、第５，３０２，５９２号、第５，２８８，６９３号、第５，２６６，５６７号、第５，２５４，６８５号、第５，２５２，７４５号、第５，２０９，９３０号、第５，１９６，４４１号、第５，１９０，９６１号、第５，１７５，１６０号、第５，１５７，０５１号、第５，０９６，７００号、第５，０９３，３４２号、第５，０８９，２５１号、第５，０７３，５７０号、第５，０６１，７０２号、第５，０３７，８０９号、第５，０３６，０７７号、第５，０１０，１０９号、第４，９７０，２２６号、第４，９１６，１５６号、第４，８８８，４３４号、第４，８７０，０９３号、第４，８５５，３１８号、第４，７８４，９９１号、第４，７４６，５０４号、第４，６８６，２２１号、第４，５９９，２２８号、第４，５５２，８８２号、第４，４９２，７００号、第４，４８９，０９８号、第４，４８９，０８５号、第４，４８７，７７６号、第４，４７９，９５３号、第４，４７７，４４８号、第４，４７４，８０７号、第４，４７０，９９４号、第４，３７０，４８４号、第４，３３７，１９９号、第４，３１１，７０９号、第４，３０８，２８３号、第４，３０４，９１０号、第４，２６０，６３４号、第４，２３３，３１１号、第４，２１５，１３１号、第４，１６６，１２２号、第４，１４１，９８１号、第４，１３０，６６４号、第４，０８９，９７７号、第４，０８９，９００号、第４，０６９，３４１号、第４，０５５，６５５号、第４，０４９，６６５号、第４，０４４，１３９号、第４，００２，７７５号、第３，９９１，２０１号、第３，９６６，９６８号、第３，９５４，８６８号、第３，９３６，３９３号、第３，９１７，４７６号、第３，９１５，８８９号、第３，８６７，５４８号、第３，８６５，７４８号、第３，８６７，５４８号、第３，８６５，７４８号、第３，７８３，１６０号、第３，７６４，６７６号、第３，７６４，６７７号に開示される抗菌薬。
【０１２２】
米国特許第５，８７２，１０９号、第５，８３７，７３５号、第５，８２７，８３７号、第５，８２１，２５０号、第５，８１４，６４８号、第５，７８０，０２６号、第５，７７６，９４６号、第５，７６０，００２号、第５，７５０，５４３号、第５，７４１，７９８号、第５，７３９，２７９号、第５，７３３，９３９号、第５，７２３，４８１号、第５，７１６，９６７号、第５，６８８，９４９号、第５，６８６，４８８号、第５，６８６，４７１号、第５，６８６，４３４号、第５，６８４，２０４号、第５，６８４，０４１号、第５，６８４，０３１号、第５，６８４，００２号、第５，６７７，３１８号、第５，６７４，８９１号、第５，６７２，６２０号、第５，６６５，７５２号、第５，６５６，６６１号、第５，６３５，５１６号、第５，６３１，２８３号、第５，６２２，９４８号、第５，６１８，８３５号、第５，６０７，９５９号、第５，５９３，９８０号、第５，５９３，９６０号、第５，５８０，８８８号、第５，５５２，４２４号、第５，５５２，４２２号、第５，５１６，７６４号、第５，５１０，３６１号、第５，５０８，０２６号、第５，５００，４１７号、第５，４９８，４０５号、第５，４９４，９２７号、第５，４７６，８７６号、第５，４７２，９７３号、第５，４７０，８８５号、第５，４７０，８４２号、第５，４６４，８５６号、第５，４６４，８４９号、第５，４６２，９５２号、第５，４５９，１５１号、第５，４５１，６８６号、第５，４４４，０４３号、第５，４３６，２６５号、第５，４３２，１８１号、第ＲＥ０３４９１８号、第５，３９３，７５６号、第５，３８０，７３８号、第５，３７６，６７０号、第５，３６０，８１１号、第５，３５４，７６８号、第５，３４８，９５７号、第５，３４７，０２９号、第５，３４０，８１５号、第５，３３８，７５３号、第５，３２４，６４８号、第５，３１９，０９９号、第５，３１８，９７１号、第５，３１２，８２１号、第５，３０２，５９７号、第５，２９８，６３３号、第５，２９８，５２２号、第５，２９８，４９８号、第５，２９０，８００号、第５，２９０，７８８号、第５，２８４，９４９号、第５，２８０，０４５号、第５，２７０，３１９号、第５，２６６，５６２号、第５，２５６，６８０号、第５，２５０，７００号、第５，２５０，５５２号、第５，２４８，６８２号、第５，２４４，９１７号、第５，２４０，９２９号、第５，２３４，９３９号、第５，２３４，９３７号、第５，２３２，９３９号、第５，２２５，５７１号、第５，２２５，４１８号、第５，２２０，０２５号、第５，２１２，１８９号、第５，２１２，１７２号、第５，２０８，２５０号、第５，２０４，３６５号、第５，２０２，３５０号、第５，１９６，４３１号、第５，１９１，０８４号、第５，１８７，１７５号、第５，１８５，３２６号、第５，１８３，９０６号、第５，１７７，０７９号、第５，１７１，８６４号、第５，１６９，９６３号、第５，１５５，１２２号、第５，１４３，９２９号、第５，１４３，９２８号、第５，１４３，９２７号、第５，１２４，４５５号、第５，１２４，３４７号、第５，１１４，９５８号、第５，１１２，８４６号、第５，１０４，６５６号、第５，０９８，６１３号、第５，０９５，０３７号、第５，０９５，０１９号、第５，０８６，０６４号、第５，０８１，２６１号、第５，０８１，１４７号、第５，０８１，１２６号、第５，０７５，３３０号、第５，０６６，６６８号、第５，０５９，６０２号、第５，０４３，４５７号、第５，０３７，８３５号、第５，０３７，８１１号、第５，０３６，０８８号、第５，０１３，８５０号、第５，０１３，７５１号、第５，０１３，７３６号、第５，００６，５４２号、第４，９９２，４４８号、第４，９９２，４４７号、第４，９８８，７３３号、第４，９８８，７２８号、第４，９８１，８６５号、第４，９６２，１１９号、第４，９５９，３７８号、第４，９５４，５１９号、第４，９４５，０９９号、第４，９４２，２３６号、第４，９３１，４５７号、第４，９２７，８３５号、第４，９１２，２４８号、第４，９１０，１９２号、第４，９０４，７８６号、第４，９０４，６８５号、第４，９０４，６７４号、第４，９０４，６７１号、第４，８９７，３９７号、第４，８９５，９５３号、第４，８９１，３７０号、第４，８７０，２１０号、第４，８５９，６８６号、第４，８５７，６４４号、第４，８５３，３９２号、第４，８５１，４１２号、第４，８４７，３０３号、第４，８４７，２９０号、第４，８４５，２４２号、第４，８３５，１６６号、第４，８２６，９９０号、第４，８０３，２１６号、第４，８０１，５９８号、第４，７９１，１２９号、第４，７８８，２０５号、第４，７７８，８１８号、第４，７７５，６７９号、第４，７７２，７０３号、第４，７６７，７７６号、第４，７６４，５２５号、第４，７６０，０５１号、第４，７４８，１５３号、第４，７２５，６１６号、第４，７２１，７１２号、第４，７１３，３９３号、第４，７０８，９６６号、第４，６９５，５７１号、第４，６８６，２３５号、第４，６８６，２２４号、第４，６８０，２９８号、第４，６７８，８０２号、第４，６５２，５６４号、第４，６４４，００５号、第４，６３２，９２３号、第４，６２９，７９３号、第４，６１４，７４１号、第４，５９９，３６０号、第４，５９６，８２８号、第４，５９５，６９４号、第４，５９５，６８６号、第４，５９４，３５７号、第４，５８５，７５５号、第４，５７９，８６６号、第４，５７８，３９０号、第４，５６９，９４２号、第４，５６７，２０１号、第４，５６３，４７６号、第４，５５９，３４８号、第４，５５８，０６７号、第４，５５６，６７２号、第４，５５６，６６９号、第４，５３９，３２６号、第４，５３７，９０３号、第４，５３６，５０３号、第４，５１８，６０８号、第４，５１４，４１５号、第４，５１２，９９０号、第４，５０１，７５５号、第４，４９５，１９７号、第４，４９３，８３９号、第４，４６５，６８７号、第４，４４０，７７９号、第４，４４０，７６３号、第４，４３５，４２０号、第４，４１２，９９５号、第４，４００，５３４号、第４，３５５，０３４号、第４，３３５，１４１号、第４，３２２，４２０号、第４，２７５，０６４号、第４，２４４，９６３号、第４，２３５，９０８号、第４，２３４，５９３号、第４，２２６，８８７号、第４，２０１，７７８号、第４，１８１，７２０号、第４，１７３，６５０号、第４，１７３，６３４号、第４，１４５，４４４号、第４，１２８，６６４号、第４，１２５，６１２号、第４，１２４，７２６号、第４，１２４，７０７号、第４，１１７，１３５号、第４，０２７，０３１号、第４，０２４，２８４号、第４，０２１，５５３号、第４，０２１，５５０号、第４，０１８，９２３号、第４，０１２，５２７号、第４，０１１，３２６号、第３，９９８，９７０号、第３，９９８，９５４号、第３，９９３，７６３号、第３，９９１，２１２号、第３，９８４，４０５号、第３，９７８，２２７号、第３，９７８，２１９号、第３，９７８，２０２号、第３，９７５，５４３号、第３，９６８，２２４号、第３，９５９，３６８号、第３，９４９，０８２号、第３，９４９，０８１号、第３，９４７，４７５号、第３，９３６，４５０号、第３，９３４，０１８号、第３，９３０，００５号、第３，８５７，９５５号、第３，８５６，９６２号、第３，８２１，３７７号、第３，８２１，４０１号、第３，７８９，１２１号、第３，７８９，１２３号、第３，７２６，９７８号、第３，６９４，４７１号、第３，６９１，２１４号、第３，６７８，１６９号、第３，６２４，２１６に開示される抗炎症薬。
【０１２３】
米国特許第４，４５０，１５９号、第４，４５０，１５９号、第５，９０５，０８５号、第５，８８３，１１９号、第５，８８０，２８０号、第５，８７７，１８４号、第５，８７４，５９４号、第５，８４３，４５２号、第５，８１７，６７２号、第５，８１７，６６１号、第５，８１７，６６０号、第５，８０１，１９３号、第５，７７６，９７４号、第５，７６３，４７８号、第５，７３９，１６９号、第５，７２３，４６６号、第５，７１９，１７６号、第５，６９６，１５６号、第５，６９５，７５３号、第５，６９３，６４８号、第５，６９３，６４５号、第５，６９１，３４６号、第５，６８６，４６９号、第５，６８６，４２４号、第５，６７９，７０５号、第５，６７９，６４０号、第５，６７０，５０４号、第５，６６５，７７４号、第５，６６５，７７２号、第５，６４８，３７６号、第５，６３９，４５５号、第５，６３３，２７７号、第５，６２４，９３０号、第５，６２２，９７０号、第５，６０５，９０３号、第５，６０４，２２９号、第５，５７４，０４１号、第５，５６５，５６０号、第５，５５０，２３３号、第５，５４５，７３４号、第５，５４０，９３１号、第５，５３２，２４８号、第５，５２７，８２０号、第５，５１６，７９７号、第５，５１４，６８８号、第５，５１２，６８７号、第５，５０６，２３３号、第５，５０６，２２８号、第５，４９４，８９５号、第５，４８４，７８８号、第５，４７０，８５７号、第５，４６４，６１５号、第５，４３２，１８３号、第５，４３１，８９６号、第５，３８５，９１８号、第５，３４９，０６１号、第５，３４４，９２５号、第５，３３０，９９３号、第５，３０８，８３７号、第５，２９０，７８３号、第５，２９０，７７２号、第５，２８４，８７７号、第５，２８４，８４０号、第５，２７３，９７９号、第５，２６２，５３３号、第５，２６０，３００号、第５，２５２，７３２号、第５，２５０，６７８号、第５，２４７，０７６号、第５，２４４，８９６号、第５，２３８，６８９号、第５，２１９，８８４号、第５，２０８，２４１号、第５，２０８，２２８号、第５，２０２，３３２号、第５，１９２，７７３号、第５，１８９，０４２号、第５，１６９，８５１号、第５，１６２，３３４号、第５，１５１，４１３号、第５，１４９，７０１号、第５，１４７，８７７号、第５，１４３，９１８号、第５，１３８，０５１号、第５，０９３，３３８号、第５，０９１，３８９号、第５，０６８，３２３号、第５，０６８，２４７号、第５，０６４，８３５号、第５，０６１，７２８号、第５，０５５，２９０号、第４，９８１，７９２号、第４，８１０，６９２号、第４，４１０，６９６号、第４，３４６，０９６号、第４，３４２，７６９号、第４，３１７，８２５号、第４，２５６，７６６号、第４，１８０，５８８号、第４，０００，２７５号、第３，７５９，９２１号に開示される免疫抑制薬。
【０１２４】
米国特許第４，４４６，１２８号、第４，５２４，１４７号、第４，７２０，４８４号、第４，７２２，８９９号、第４，７４８，０１８号、第４，８７７，６１９号、第４，９９８，９３１号、第５，０４９，３８７号、第５，１１８，５０９号、第５，１５２，９８０号、第５，２５６，４１６号、第５，４６８，７２９号、第５，５８３，１３９号、第５，６０４，２３４号、第５，６１２，０６０号、第５，６１２，３５０号、第５，６５８，５６４号、第５，６７２，６０５号、第５，６８１，５７１号、第５，７０８，００２号、第５，７２３，７１８号、第５，７３６，１４３号、第５，７４４，４９５号、第５，７５３，６８７号、第５，７７０，２０１号、第５，８６９，０５７号、第５，８９１，６５３号、第５，９３９，４５５号、第５，９４８，４０７号、第６，００６，７５２号、第６，０２４，９５７号、第６，０３０，６２４号、第６，０３７，３７２号、第６，０３７，３７３号、第６，０４３，２４７号、第６，０６０，０４９号、第６，０８７，０９６号、第６，０９６，３１５号、第６，０９９，８３８号、第６，１０３，２３５号、第６，１２４，４９５号、第６，１５３，２０３号、第６，１６９，０８７号、第６，２５５，２７８号、第６，２６２，０４４号、第６，２９０，９５０号、第６，３０６，６５１号、第６，３２２，７９６号、第６，３２９，１５３号、第６，３４４，４７６号、第６，３５２，６９８号、第６，３６５，１６３号、第６，３７９，６６８号、第６，３９１，３０３号、第６，３９５，７６７号、第６，４０３，５５５号、第６，４１０，５５６号、第６，４１２，４９２号、第６，４６８，５３７号、第６，４８９，３３０号、第６，５２１，２３２号、第６，５２５，０３５号、第６，５２５，２４２号、第６，５５８，６６３号、第６，５７２，８６０号に開示される免疫調節薬。
【０１２５】
米国特許第５，２９２，７３６号、第５，６８８，８２５号、第５，５５４，７８９号、第５，４５５，２３０号、第５，２９２，７３６号、第５，２９８，５２２号、第５，２１６，１６５号、第５，４３８，０６４号、第５，２０４，３６５号、第５，０１７，５７８号、第４，９０６，６５５号、第４，９０６，６５５号、第４，９９４，４５０号、第４，７４９，７９２号、第４，９８０，３６５号、第４，７９４，１１０号、第４，６７０，５４１号、第４，７３７，４９３号、第４，６２２，３２６号、第４，５３６，５１２号、第４，７１９，２３１号、第４，５３３，６７１号、第４，５５２，８６６号、第４，５３９，３１２号、第４，５６９，９４２号、第４，６８１，８７９号、第４，５１１，７２４号、第４，５５６，６７２号、第４，７２１，７１２号、第４，４７４，８０６号、第４，５９５，６８６号、第４，４４０，７７９号、第４，４３４，１７５号、第４，６０８，３７４号、第４，３９５，４０２号、第４，４００，５３４号、第４，３７４，１３９号、第４，３６１，５８３号、第４，２５２，８１６号、第４，２５１，５３０号、第５，８７４，４５９号、第５，６８８，８２５号、第５，５５４，７８９号、第５，４５５，２３０号、第５，４３８，０６４号、第５，２９８，５２２号、第５，２１６，１６５号、第５，２０４，３６５号、第５，０３０，６３９号、第５，０１７，５７８号、第５，００８，２６４号、第４，９９４，４５０号、第４，９８０，３６５号、第４，９０６，６５５号、第４，８４７，２９０号、第４，８４４，９０７号、第４，７９４，１１０号、第４，７９１，１２９号、第４，７７４，２５６号、第４，７４９，７９２号、第４，７３７，４９３号、第４，７２１，７１２号、第４，７１９，２３１号、第４，６８１，８７９号、第４，６７０，５４１号、第４，６６７，０３９号、第４，６５８，０３７号、第４，６３４，７０８号、第４，６２３，６４８号、第４，６２２，３２６号、第４，６０８，３７４号、第４，５９５，６８６号、第４，５９４，１８８号、第４，５６９，９４２号、第４，５５６，６７２号、第４，５５２，８６６号、第４，５３９，３１２号、第４，５３６，５１２号、第４，５３３，６７１号、第４，５１１，７２４号、第４，４４０，７７９号、第４，４３４，１７５号、第４，４００，５３４号、第４，３９５，４０２号、第４，３９１，８２７号、第４，３７４，１３９号、第４，３６１，５８３号、第４，３２２，４２０号、第４，３０６，０９７号、第４，２５２，８１６号、第４，２５１，５３０号、第４，２４４，９５５号、第４，２３２，０１８号、第４，２０９，５２０号、第４，１６４，５１４号、第４，１４７，８７２号、第４，１３３，８１９号、第４，１２４，７１３号、第４，１１７，０１２号、第４，０６４，２７２号、第４，０２２，８３６号、第３，９６６，９４４号に開示される鎮痛薬。
【０１２６】
米国特許第５，２１９，８７２号、第５，２１９，８７３号、第５，０７３，５６０号、第５，０７３，５６０号、第５，３４６，９１１号、第５，４２４，３０１号、第５，０７３，５６０号、第５，２１９，８７２号、第４，９００，７４８号、第４，７８６，６４８号、第４，７９８，８４１号、第４，７８２，０７１号、第４，７１０，５０８号、第５，４８２，９３８号、第５，４６４，８４２号、第５，３７８，７２３号、第５，３４６，９１１号、第５，３１８，９７８号、第５，２１９，８７３号、第５，２１９，８７２号、第５，０８４，２８１号、第５，０７３，５６０号、第５，００２，９５５号、第４，９８８，７１０号、第４，９００，７４８号、第４，７９８，８４１号、第４，７８６，６４８号、第４，７８２，０７１号、第４，７４５，１２３号、第４，７１０，５０８号に開示されるコリン作用薬。
【０１２７】
米国特許第５，０９１，５２８号、第５，０９１，５２８号、第４，８３５，１５７号、第５，７０８，０１５号、第５，５９４，０２７号、第５，５８０，８９２号、第５，５７６，３３２号、第５，５１０，３７６号、第５，４８２，９６１号、第５，３３４，６０１号、第５，２０２，３４７号、第５，１３５，９２６号、第５，１１６，８６７号、第５，０９１，５２８号、第５，０１７，６１８号、第４，８３５，１５７号、第４，８２９，０８６号、第４，５７９，８６７号、第４，５６８，６７９号、第４，４６９，６９０号、第４，３９５，５５９号、第４，３８１，３０９号、第４，３６３，８０８号、第４，３４３，８００号、第４，３２９，２８９号、第４，３１４，９４３号、第４，３１１，７０８号、第４，３０４，７２１号、第４，２９６，１１７号、第４，２８５，８７３号、第４，２８１，１８９号、第４，２７８，６０８号、第４，２４７，７１０号、第４，１４５，５５０号、第４，１４５，４２５号、第４，１３９，５３５号、第４，０８２，８４３号、第４，０１１，３２１号、第４，００１，４２１号、第３，９８２，０１０号、第３，９４０，４０７号、第３，８５２，４６８号、第３，８３２，４７０号に開示されるアドレナリン作用薬。
【０１２８】
米国特許第５，８７４，４７９号、第５，８６３，９３８号、第５，８５６，３６４号、第５，７７０，６１２号、第５，７０２，６８８号、第５，６７４，９１２号、第５，６６３，２０８号、第５，６５８，９５７号、第５，６５２，２７４号、第５，６４８，３８０号、第５，６４６，１９０号、第５，６４１，８１４号、第５，６３３，２８５号、第５，６１４，５６１号、第５，６０２，１８３号、第４，９２３，８９２号、第４，７８２，０５８号、第４，３９３，２１０号、第４，１８０，５８３号、第３，９６５，２５７号、第３，９４６，０２２号、第３，９３１，１９７号に開示される抗ヒスタミン薬。
【０１２９】
米国特許第５，８６３，５３８号、第５，８５５，９０７号、第５，８５５，８６６号、第５，７８０，５９２号、第５，７７６，４２７号、第５，６５１，９８７号、第５，３４６，８８７号、第５，２５６，４０８号、第５，２５２，３１９号、第５，２０９，９２６号、第４，９９６，３３５号、第４，９２７，８０７号、第４，９１０，１９２号、第４，７１０，４９５号、第４，０４９，８０５号、第４，００４，００５号、第３，６７０，０７９号、第３，６０８，０７６号、第５，８９２，０２８号、第５，８８８，９９５号、第５，８８３，０８７号、第５，８８０，１１５号、第５，８６９，４７５号、第５，８６６，５５８号、第５，８６１，３９０号、第５，８６１，３８８号、第５，８５４，２３５号、第５，８３７，６９８号、第５，８３４，４５２号、第５，８３０，８８６号、第５，７９２，７５８号、第５，７９２，７５７号、第５，７６３，３６１号、第５，７４４，４６２号、第５，７４１，７８７号、第５，７４１，７８６号、第５，７３３，８９９号、第５，７３１，３４５号、第５，７２３，６３８号、第５，７２１，２２６号、第５，７１２，２６４号、第５，７１２，２６３号、第５，７１０，１４４号、第５，７０７，９８４号、第５，７０５，４９４号、第５，７００，７９３号、第５，６９８，７２０号、第５，６９８，５４５号、第５，６９６，１０６号、第５，６７７，２９３号、第５，６７４，８６１号、第５，６６１，１４１号、第５，６５６，６２１号、第５，６４６，１３６号、第５，６３７，６９１号、第５，６１６，５７４号、第５，６１４，５１４号、第５，６０４，２１５号、第５，６０４，２１３号、第５，５９９，８０７号、第５，５８５，４８２号、第５，５６５，５８８号、第５，５６３，２５９号、第５，５６３，１３１号、第５，５６１，１２４号、第５，５５６，８４５号、第５，５４７，９４９号、第５，５３６，７１４号、第５，５２７，８０６号、第５，５０６，３５４号、第５，５０６，２２１号、第５，４９４，９０７号、第５，４９１，１３６号、第５，４７８，９５６号、第５，４２６，１７９号、第５，４２２，２６２号、第５，３９１，７７６号、第５，３８２，６６１号、第５，３８０，８４１号、第５，３８０，８４０号、第５，３８０，８３９号、第５，３７３，０９５号、第５，３７１，０７８号、第５，３５２，８０９号、第５，３４４，８２７号、第５，３４４，８２６号、第５，３３８，８３７号、第５，３３６，６８６号、第５，２９２，９０６号、第５，２９２，８７８号、第５，２８１，５８７号、第５，２７２，１４０号、第５，２４４，８８６号、第５，２３６，９１２号、第５，２３２，９１５号、第５，２１９，８７９号、第５，２１８，１０９号、第５，２１５，９７２号、第５，２１２，１６６号、第５，２０６，４１５号、第５，１９４，６０２号、第５，１６６，２０１号、第５，１６６，０５５号、第５，１２６，４８８号、第５，１１６，８２９号、第５，１０８，９９６号、第５，０９９，０３７号、第５，０９６，８９２号、第５，０９３，５０２号、第５，０８６，０４７号、第５，０８４，４５０号、第５，０８２，８３５号、第５，０８１，１１４号、第５，０５３，４０４号、第５，０４１，４３３号、第５，０４１，４３２号、第５，０３４，５４８号、第５，０３２，５８６号、第５，０２６，８８２号、第４，９９６，３３５号、第４，９７５，５３７号、第４，９７０，２０５号、第４，９５４，４４６号、第４，９５０，４２８号、第４，９４６，８３４号、第４，９３７，２３７号、第４，９２１，８４６号、第４，９２０，０９９号、第４，９１０，２２６号、第４，９００，７２５号、第４，８９２，８６７号、第４，８８８，３３６号、第４，８８５，２８０号、第４，８８２，３２２号、第４，８８２，３１９号、第４，８８２，３１５号、第４，８７４，８５５号、第４，８６８，１６７号、第４，８６５，７６７号、第４，８６１，８７５号、第４，８６１，７６５号、第４，８６１，７６３号、第４，８４７，０１４号、第４，７７４，２３６号、第４，７５３，９３２号、第４，７１１，８５６号、第４，７１０，４９５号、第４，７０１，４５０号、第４，７０１，４４９号、第４，６８９，４１０号、第４，６８０，２９０号、第４，６７０，５５１号、第４，６６４，８５０号、第４，６５９，５１６号、第４，６４７，４１０号、第４，６３４，６９５号、第４，６３４，６９３号、第４，５８８，５３０号、第４，５６７，０００号、第４，５６０，５５７号、第４，５５８，０４１号、第４，５５２，８７１号、第４，５５２，８６８号、第４，５４１，９５６号、第４，５１９，９４６号、第４，５１５，７８７号、第４，５１２，９８６号、第４，５０２，９８９号、第４，４９５，１０２号に開示されるステロイド薬。
上述すべての開示内容が参考として本明細書で援用される。
【０１３０】
結合体の薬物部分は、目的の標的に対してその親和性および特異性を保持する薬物全体もしくは結合フラグメントまたはその部分であり得ると同時に、ベクタータンパク質リガンドまたはリンカーに共有結合する結合部位を有する。かかる薬物の結合体は、その薬物自体と同じ障害、疾患、および効能のために使用され得る。
【０１３１】
Ｇ．癌化学療法活性薬剤
本発明の方法において有用な結合体に基づいてＲＡＰ、ＲＡＰフラグメント、またはＲＡＰ変異体で使用される好ましい癌化学療法薬には、肝臓腫瘍または肝臓内もしくは肝臓周辺で他の新生組織形成の処置に有用であり得る（遊離型で有用である、または遊離型ではかかる腫瘍にあまり有用でない場合、ＲＡＰ、ＲＡＰフラグメントもしくはＲＡＰ変異体、またはそのＬＲＰ１結合フラグメントに結合するときに有用である）すべての薬物が含まれる。かかる化学療法薬は、好ましくは細胞傷害性化学療法薬であり、アドリアマイシン（ドキソルビシンとしても公知である）、シスプラチン、パクリタキセル、それらの類似体、およびｅｘ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｖｏで腫瘍に対して活性を示す他の化学療法薬を含むがこれらに限定されない。かかる化学療法薬には、また、アルキル化剤、代謝拮抗剤、天然物（ビンカアルカロイド、エピドフィロトキシン、抗生物質、酵素、および生物学的応答調節物質）、トポイソメラーゼ阻害剤、微小管阻害剤、紡錐体毒、ホルモンおよび拮抗剤、ならびに種々の薬剤（例えば、白金配位複合体、アントラセンジオン、置換尿素等）が含まれる。他の化学療法薬は当業者に既知であろう。
【０１３２】
癌または新生組織形成を処置する際に有用である細胞傷害性化学療法薬は、例えば、^１３１Ｉ（ヨード）、^１２５Ｉ、^１１１Ｉｎ（インジウム）、^９０Ｙ（イットリウム）、^６７Ｃｕ（銅）、^１２７Ｌｕ（ルテチウム）、^２１２Ｂｉ（ビスマス）、^２１３Ｂｉ、^２５５Ｆｍ（フェルミウム）、^１４９Ｔｂ（テルビウム）、^２２３Ｒｄ（ラジウム）、^２１３Ｐｂ（鉛）、^２１２Ｐｂ、^２１１Ａｔ（アスタチン）、^８９Ｓｒ（ストロンチウム）、^１５３Ｓｍ（サマリウム）、^１６６Ｈｏ（ホルミウム）、^２２５Ａｃ（アクチニウム）、^１８６Ｒｅ（レニウム）、^６７Ｇａ（ガリウム）、^６８Ｇａ、および^９９ｍＴｃ（テクネチウム）の放射性同位体を含むがこれらに限定されず、かつ本発明で有用なＲＡＰ、ＲＡＰフラグメント、またはＲＡＰ変異体に結合体化され得る。放射性同位体は、当該技術分野で一般的な金属キレート剤を用いてポリペプチドに結合されることが可能であり、かかる目的の金属キレート剤としては、１，４，７，１０−テトラアザシクロ−１１ドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’、Ｎ’’’−四酢酸（ＤＯＴＡ）、１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカンＮ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−四酢酸（ＴＥＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、ジメルカプトコハク酸（ＤＭＳＡ）、テトラアザシクロトリデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−四酢酸（ＴＲＩＴＡ）、および１，５，９，１３−テトラアザシクロヘキサデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−四酢酸（ＨＥＴＡ）、ヒドロキシエチリデンジホスホン酸（ＨＥＤＰ）、ＨＥＸＡ、ならびにエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）が挙げられるがこれらに限定されない。これらは、ポリペプチド上への放射性同位体の「添加」を可能にする。
【０１３３】
好ましい化学療法薬は、遊離型で、所望の用量で許容されない全身毒性を示すものである。かかる薬剤の治療レベルと付随した通常の全身毒性は、かかる薬剤をＲＡＰ、ＲＡＰフラグメント、またはＲＡＰ変異体に結合させることで減少させることができる。特に好ましいのは、有用な治療薬であるが、用量が心毒性によって制限される心毒性化合物である。典型的な例は、アドリアマイシン（ドキソルビシンとしても公知である）およびその類似体（例えばダウノルビシン）である。ＲＡＰ、ＲＡＰフラグメント、またはＲＡＰ変異体をかかる薬物に結合することによって、心臓で蓄積および付随する心毒性を阻止することができる。
【０１３４】
Ｈ．ナノ粒子
ナノ粒子は、生分解性および非生分解性ポリマーから、または脂質等の他の物質から構築された高分子集合体である。かかる集合体は、ナノ粒子内の空洞に治療用分子を含有させるように操作され得る。この方法によって、ナノ粒子は、薬物の生体内分布、薬物動態、免疫原性、および効力を変化させる方法を提供する。同様に、適切なＲＡＰ、ＲＡＰフラグメント、またはＲＡＰ変異体を付着させることによって、これらの分子の組織分布の特異性を増加させる方法を提供する。
【０１３５】
Ｉ．ＲＡＰ結合体生成方法
ｉ．宿主細胞
キメラタンパク質を生成するために用いる宿主細胞は、バクテリア細胞、酵母細胞、昆虫細胞、非哺乳類脊椎動物細胞、または哺乳類細胞である。哺乳類細胞は、ハムスター、サル、チンパンジー、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、およびヒトの細胞を含むがこれらに限定されない。宿主細胞は、不死化細胞（細胞系）または非不死化細胞（一次細胞または二次細胞）であり得、線維芽細胞、角化細胞、上皮細胞（例えば、乳腺上皮細胞、腸管上皮細胞）、卵巣細胞（例えばチャイニーズハムスター卵巣、すなわちＣＨＯ細胞）、内皮細胞、グリア細胞、神経系細胞、血液有形成分（例えばリンパ細胞、骨髄細胞）、筋細胞、肝細胞、およびこれらの体細胞型の前駆体など多種多様な細胞型のいずれかであり得るがこれらに限定されない。宿主細胞には、ＬＲＰ（例えばＣＨＯ１３−５−１）を発現しないＣＨＯ細胞の突然変異体が含まれ得る（ＦｉｔｚＧｅｒａｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．，１２９（６）：１５３３−４１，１９９５）。
【０１３６】
キメラタンパク質をコードするＤＮＡまたはＲＮＡを含有し発現する細胞を、本明細書では遺伝子改変細胞と呼ぶ。キメラタンパク質をコードするＤＮＡまたはＲＮＡを含有し発現する哺乳類細胞を、本明細書では遺伝子改変哺乳類細胞と呼ぶ。ＤＮＡまたはＲＮＡの細胞への導入は、公知のトランスフェクション方法（例えば、電気穿孔法、マイクロインジェクション法、微粒子銃法、リン酸カルシウム沈澱法、リン酸カルシウム沈澱法変法、陽イオン性脂質処置法、光穿孔法、融合方法、受容体媒介転移法、またはポリブレン沈澱法）による。あるいは、ＤＮＡまたはＲＮＡは、ウイルスベクターによる感染によって導入され得る。キメラタンパク質をコードするＤＮＡまたはＲＮＡを発現する、哺乳類細胞を含む細胞を生成する方法は、米国特許第６，０４８，７２９，号、第５，９９４，１２９号、および第６，０６３，６３０号に記載されている。これらの出願の各々の教示は、その開示内容全体が参考として本明細書で明示的に援用される。
【０１３７】
ｉｉ．核酸コンストラクト
キメラタンパク質を発現させるために用いる核酸コンストラクトは、トランスフェクトした哺乳類細胞内で、染色体外で（エピソームで）発現されるものであり得、または相同的組換えを介してレシピエント細胞のゲノムに無作為的にまたは事前に選択した標的部位に組み込むものであり得る。染色体外で発現される核酸コンストラクトは、キメラタンパク質コード配列に加えて、細胞内でタンパク質を発現するために、および場合によりコンストラクトを複製させるために十分な配列を含む。通常、核酸コンストラクトには、プロモーター、キメラタンパク質コードＤＮＡ、およびポリアデニル化部位が含まれる。キメラタンパク質コードＤＮＡ配列は、その発現がプロモーターの制御下にあるような様式で核酸コンストラクトに位置している。場合により、核酸コンストラクトは、例えば以下の成分から１つ以上を付加的に含有することも可能である。すなわち、スプライス部位、エンハンサー配列、適切なプロモーターの制御下で選択可能なマーカー遺伝子、および適切なプロモーターの制御下で増殖可能なマーカー遺伝子。
【０１３８】
ＤＮＡコンストラクトを細胞ゲノムに組み込む実施形態において、核酸コンストラクトは、キメラタンパク質コード核酸配列だけを含む必要がある。場合により、核酸コンストラクトは、プロモーター、エンハンサー配列、１つのポリアデニル化部位もしくは複数の部位、１つのスプライス部位もしくは複数の部位、１つの選択可能なマーカーもしくは複数のマーカーをコードする核酸配列、増殖可能なマーカーをコードする核酸配列、および／またはゲノム内の選択部位へのＤＮＡの組込みを標的にするためにレシピエント細胞内のゲノムＤＮＡと相同であるＤＮＡ（標的ＤＮＡもしくはＤＮＡ配列）を含むことが可能である。
【０１３９】
ｉｉｉ．細胞培養方法
キメラタンパク質をコードするＤＮＡまたはＲＮＡを含有する哺乳類細胞は、細胞の増殖およびＤＮＡまたはＲＮＡの発現に適した条件下で培養される。キメラタンパク質を発現するこれらの細胞は、公知の方法および本明細書に記述する方法を用いて同定され得、ならびにキメラタンパク質産生の増幅の有無にかかわらず、公知の方法および本明細書に記述する方法を用いてキメラタンパク質は単離および精製され得る。同定は、例えば、キメラタンパク質をコードするＤＮＡまたはＲＮＡの存在を示す表現型を示している遺伝子改変型哺乳類細胞のスクリーニング（例えば、ＰＣＲスクリーニング、サザンブロット解析によるスクリーニング、またはキメラタンパク質発現のスクリーニング）を介して行なわれ得る。キメラタンパク質コードＤＮＡを組み入れた細胞の選択は、選択可能なマーカーをＤＮＡコンストラクトに入れることと、選択可能なマーカー遺伝子を含有する、トランスフェクトした細胞または感染した細胞を、その選択可能なマーカー遺伝子を発現する細胞だけが生存するのに適した条件下で培養することとによって達成され得る。さらに導入したＤＮＡコンストラクトの増幅は、増幅に適した条件下で遺伝子改変型哺乳類細胞を培養すること（例えば、増殖可能なマーカー遺伝子の複数のコピーを含有する細胞だけが生存し得る薬物濃度の存在下で、増殖可能なマーカー遺伝子を含有する遺伝子改変型哺乳類細胞を培養すること）によって影響され得る。
【０１４０】
キメラタンパク質を発現する遺伝子改変型哺乳類細胞は、本明細書に記述するように、発現産物の検出によって同定され得る。例えば、担体がＲＡＰ、ＲＡＰフラグメント、またはＲＡＰ変異体であるキメラタンパク質を発現する哺乳類細胞は、サンドイッチ酵素免疫測定法によって同定され得る。抗体は、結合体のＬＲＰ１結合部分または活性薬剤部分に向けられ得る。
【０１４１】
ｉｖ．ＲＡＰフラグメントポリペプチドまたはＲＡＰ変異体のポリペプチドの生成
本発明による使用のためのＲＡＰフラグメントまたはＲＡＰ変異体のポリペプチドは、米国特許第５，４７４，７６６号および国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２００６／３６４５３号に開示されているものを含む。これらは、本発明の化合物および組成物において使用するためにかかるペプチドおよびそれらの生成を開示する目的でその開示内容全体が参考として本明細書で援用される。ＲＡＰフラグメントおよびＲＡＰ変異体のポリペプチドは、当業者に公知のいずれかのタンパク質調製法および精製法を用いて生成される。
【０１４２】
リガンドは、天然のタンパク質源から精製され、リガンドを発現する組換え宿主から単離されるか、またはタンパク質合成で周知の技法を用いて合成され得る。受容体結合部位を含有するＲＡＰフラグメントまたはＲＡＰ変異体を得るために、当業者は、かかる種々の技法を容易に適応させる（Ｍｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７６（３１）：２９３３８−２９３４６ （２００１）； Ｓａｖｏｎｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． ２７４（３６）：２５８７７−２５８８２ （１９９９）； Ｎｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９４：７５２１−７５２５ （１９９７）； Ｍｅｄｖｅｄ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７４（２）：７１７−７２７ （１９９９）； Ｒａｌｌ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７３（３７）：２４１５２−２４１５７ （１９９８）； Ｏｒｌａｎｄｏ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ３１６１−３１６３ （１９９４））。
【０１４３】
天然のＲＡＰタンパク質の単離は、すでに記述されている（Ａｓｈｃｏｍ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １１０：１０４１−１０４８ （１９９０）およびＪｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ２５５：２７５−２８０ （１９８９））。ＲＡＰ変異体およびフラグメントは、単離した天然のタンパク質から生成され、酵素的切断および／または化学分解によって変換され、そのタンパク質全体のフラグメントを生成する。ＲＡＰ変異体ポリペプチドを得るためのかかる方法に関して、特に米国特許第６，４４７，７７５号が参考として本明細書で援用される。さらに、ＲＡＰフラグメントまたはＲＡＰ変異体は、組換え菌内で発現する（Ｗｉｌｌｉａｍｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６７：９０３５−９０４０ （１９９２）； Ｗｕｒｓｈａｗｓｋｙ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６９：３３２５−３３３０ （１９９４））。組換え大腸菌株由来の３９ｋＤａのＲＡＰタンパク質を精製する手順は、すでに記述されている（Ｈｅｒｚ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６６， ２１２３２−２１２３８ （１９９１）、米国特許第５，４７４，７６６号）。
【０１４４】
発現プラスミドｐＧＥＸ−３９ｋＤａを有する大腸菌株ＤＨ５αの培養物は、３７℃にて、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを有するＬＢ培地で対数期の中間部まで増殖させる。培養物を３０℃まで冷却し、０．０１％イソプロピルチオ−β−ガラクトシドを追加して、グルタチオン−Ｓ−転移酵素−３９ｋＤａ融合タンパク質の発現を誘導する。３０℃で４〜６時間、誘導した後に、培養物を氷で冷却し、遠心分離によって回収する。さらに、４℃でステップを続ける。細胞ペレットを、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１μＭペプスタチン、２．５μｇ／ｍｌロイペプチン、０．２ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）、および１μＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を有するＰＢＳ中で溶解させる。溶解物をＢｒａｎｓｏｎ Ｍｏｄｅｌ４５０ Ｓｏｎｉｆｉｅｒで超音波処理し、結果として生じる膜および他の細胞残屑を、１５分間、１５，０００ｇで遠心分離によって分離する。回収した上清を、ＰＢＳおよび０．１％アジ化ナトリウム中で、固定化アガロースグルタチオンビーズ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ）を用いて一晩インキュベートする。ビーズを洗浄して、融合タンパク質を、５ｍＭ還元グルタチオン（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ）との競合によって溶出させる。透析に続いて、融合タンパク質を、融合タンパク質５０μｇあたり１００ｎｇの活性化ヒトトロンビンを用いて一晩インキュベートすることによって切断させる。続いて、グルタチオン−Ｓ−転移酵素エピトープを、固定化アガロースグルタチオンビーズを用いてさらにインキュベートすることによって除去する。
【０１４５】
上記の方法を、上述のようにＲＡＰの生成および精製の目的で記述するが、他のＲＡＰフラグメントまたはＲＡＰ変異体も、同様の技法を用いて生成し得る。かかるリガンドの概説は、Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ ａｎｄ Ｂｉｒｎ， （Ａｍ． Ｊ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｒｅｎａｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．， ２８０：Ｆ５６２−Ｆ５７３， ２００１、特に、表２およびそれに引用される参考文献を参照）に見られる。かかるリガンドを作製し精製する技法は、当業者に周知である。
【０１４６】
Ｊ．ＲＡＰ結合体の特徴づけ
ｉ．ラベル
一部の実施形態において、ＲＡＰ、ＲＡＰフラグメント、およびＲＡＰ変異体に基づく活性薬剤の結合体を標識し、その検出を容易にする。「標識」または「検出可能な部分」は、分光的方法、光化学的方法、生化学的方法、免疫化学的方法、化学的方法、または他の物理的方法によって検出可能な組成物である。例えば、本発明における使用に適した標識としては、例えば、放射性標識（例えば^３２Ｐ）、フルオロフォア（例えば フルオレセイン）、高電子密度試薬、酵素（例えばＥＬＩＳＡで一般に使用される）、ビオチン、ジゴキシゲニン、またはハプテン、および例えば、ハプテンもしくはペプチドに放射標識を組み込むことによって検出可能となり得るタンパク質、またはハプテンもしくはペプチドに特異的に反応する抗体を検出するために用いられるタンパク質が挙げられる。
【０１４７】
上述のように、用いるスクリーニングアッセイに応じて、活性薬剤、リンカー、または結合体のＲＡＰ、ＲＡＰフラグメント、もしくはＲＡＰ変異体のポリペプチド部分を標識してもよい。使用する特定の標識または検出可能な基は、結合体の生物活性を著しく妨げない限りは、本発明の重要な態様ではない。検出可能な基は、検出可能な物理的または化学的特性を有する任意の物質でもよい。従って、標識は、分光的方法、光化学的方法、生化学的方法、免疫化学的方法、電気的方法、光学的方法、または化学的方法によって検出可能な任意の組成物である。
【０１４８】
本発明における使用に適した標識の例としては、蛍光染料（例えば、フルオレセインイソシオシアネート、Ｔｅｘａｓ ｒｅｄ、ローダミン等）、放射標識（例えば、^３Ｈ、^１２５Ｉ、^３５Ｓ、^１４Ｃ、または^３２Ｐ）、酵素（セイヨウワサビペルオキシダ−ゼ、アルカリホスファターゼ、およびＥＬＩＳＡで一般に使用される他の酵素）、および比色標識（例えば、コロイド金もしくは着色ガラスもしくはプラスチックビーズ（例えばポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックス等））が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１４９】
標識は、当該技術分野で周知の方法によって、アッセイの所望の成分に直接的または間接的に結合され得る。好ましくは、一実施形態における標識は、本発明によって活性薬剤を結合体化するためイソシアネート試薬を用いて、生体高分子に共有結合される。本発明の一態様において、本発明の二機能性イソシアネート試薬を用いて、生体高分子に標識を結合体化し、それに付着した活性薬剤なしで標識生体高分子の結合体を形成することができる。標識生体高分子結合体は、本発明によって標識結合体を合成するための中間体として使用され得る、または生体高分子結合体を検出するために使用され得る。上述のように、多種多様な標識は、所要の感度に応じた標識の選択、アッセイの所望の成分との結合体化の容易さ、利用可能な器具の安定性要件、および廃棄条件で使用され得る。非放射性標識は、間接的な方法によって付着されることが多い。通常、リガンド分子（例えばビオチン）は、分子に共有結合される。リガンドは、別の分子（例えばストレプトアビジン）分子、すなわち、シグナル系（例えば、検出可能な酵素、蛍光化合物、または化学発光化合物）に本質的に検出可能に結合されるか、または共有結合される分子に結合する。
【０１５０】
結合体は、例えば、酵素またはフルオロフォアと結合体化することによって化合物を生成するシグナルに直接的に結合体化され得る。標識としての使用に適した酵素としては、例えば、ヒドロラーゼ（特に、ホスファターゼ、エステラーゼ、およびグリコシダーゼ）、またはオキシダーゼ（特にペルオキシダ−ゼ）が挙げられるがこれらに限定されない。標的としての使用に適した蛍光化合物（すなわちフルオロフォア）としては、フルオレセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロン等が挙げられるがこれらに限定されない。さらに、適したフルオロフォアの例には、エオシン、ＴＲＩＴＣ−アミン、キニーネ、フルオレセインＷ、アクリジンイエロー、リサミンローダミン、Ｂスルホニルクロリドエリスロセイン、ルテニウム（トリス、ビピリジニウム）、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、フラビンアデニンジヌクレオチド等が挙げられるがこれらに限定されない。標識としての使用に適した化学発光化合物には、ルシフェリンおよび２，３−ジヒドロフタラジンジオン（例えばルミノール）が挙げられるがこれらに限定されない。本発明の方法で使用できる種々の標識化またはシグナル生成系の概説については、米国特許第４，３９１，９０４号を参照。
【０１５１】
標識を検出する方法は、当業者に周知である。従って、例えば、標識が放射性標識である場合、検出方法としては、オートラジオグラフィーの場合、シンチレーションカウンターまたは写真用フィルムが挙げられる。標識が蛍光標識の場合、標識は、光の適切な波長で蛍光色素を励起させ、結果として生じる蛍光発光を検出することによって検出され得る。蛍光は、電子検出器（例えば、電荷結合素子（ＣＣＤ）または光電子増倍管等）を用いることによって視覚的に検出され得る。同様に、酵素標識は、適切な物質を酵素に与え、結果として生じる反応生成物を検出することによって検出され得る。比色標識または化学発光標識は、標識に関連する色を観察することによって容易に検出され得る。本発明の方法での使用に適した他の標識化および検出系は、当業者に容易に認識される。かかる標識モジュレータおよびリガンドは、疾患または健康状態の診断に用いられ得る。
【０１５２】
Ｋ．医薬組成物を用いる方法およびその投与
結合体は、それらを水性溶媒または非水性溶媒（例えば、植物油もしくは他の類似する油、合成脂肪酸グリセリド、高脂肪酸エステル、またはプロピレングリコール）に溶解、懸濁または乳化させることで、さらに所望であれば、通常の添加物（例えば、可溶化剤、等張剤、懸濁化剤、乳化剤、安定剤、および保存剤）を添加することで、注射用製剤に製剤化され得る。
【０１５３】
結合体は、吸入を介して投与されるエアロゾル製剤で利用され得る。本発明の化合物は、許容される加圧噴霧剤（例えば、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素等）に製剤化され得る。
【０１５４】
注射または静脈内投与のための単位剤形は、滅菌水、生理食塩水、または他の薬学的に許容される担体中の溶液として、組成物に結合体を含み得る。
【０１５５】
実用的用途において、本明細書に記述するＲＡＰ、ＲＡＰフラグメント、またはＲＡＰ変異体の結合体は、従来の医薬配合技術によって、密な混合物中の有効成分として医薬担体と組み合わされ得る。担体は、投与（例えば、経口または非経口（静脈内を含む））用の所望の製剤形状に応じて多種多様な形にすることができる。
【０１５６】
投与の経皮経路に関して、薬物の経皮投与の方法は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， １７ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ， （Ｇｅｎｎａｒｏ ｅｔ ａｌ． Ｅｄｓ． Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， １９８５）に開示されている。真皮パッチまたは皮膚パッチは、本発明の方法で有用な結合体の経皮送達の好ましい手段である。パッチは、好ましくは、化合物の吸収を増加させる吸収促進薬（例えばＤＭＳＯ）を提供する。経皮薬物送達の他の方法は、米国特許第５，９６２，０１２号および第６，２６１，５９５号に開示されている。これらの各参考文献全体が参考として援用される。
【０１５７】
薬学的に許容される賦形剤（例えば、媒体、アジュバント、担体、または希釈剤）は、市販されている。さらに、薬学的に許容される補助物質（例えば、ｐＨ調節剤および緩衝剤、浸透圧調節剤、安定剤、湿潤剤等）は、市販されている。
【０１５８】
当業者は、用量レベルが特定の化合物、症状の重症度、および副作用に対する被験体の感受性に応じて変化し得ることを容易に認識する。所定の化合物の好ましい用量は、当業者による種々の方法（患者、試験動物、およびｉｎ ｖｉｔｒｏで行なわれる用量反応および薬物動態評価が含まれるがこれらに限定されない）によって容易に決定できる。
【０１５９】
これらの態様のそれぞれにおいて、いずれかの所定の場合最も適した経路は、処置中の状態の性質および重症度、ならびに有効成分の性質に一部依存し、組成物としては、経口、直腸、局所、非経口（皮下、筋肉内、および静脈内を含む）の投与、経肺（鼻腔吸入もしくは頬側吸入）投与、または経鼻投与に適した組成物が挙げられるが、これらに限定されない。典型的な投与経路は、経口経路および静脈内経路である。組成物は、単位剤形で簡便に提供され、薬剤の分野で周知の方法のいずれかによって調製され得る。
【０１６０】
本発明の組成物は、カプセルに入れて、またはウイルス外皮もしくはベシクルに付着させて、または細胞に組み入れて投与され得る。ベシクルは、通常、球状であり、かつしばしば脂質であるミセル粒子である。リポソームは、二重層膜から形成されたベシクルである。適切なベシクルとしては、単層ベシクルおよび多層状脂質のベシクルまたはリポソームが挙げられるがこれらに限定されない。かかるベシクルおよびリポソームは、例えば米国特許第４，３９４，４４８号に記載されるような標準的な技法を用いて、広範囲の脂質またはリン脂質化合物（例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジン酸、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴミエリン、糖脂質、ガングリオシド等）から作製され得る。かかるベシクルまたはリポソームを用いて、細胞内部に化学物を投与し、および化合物を標的器官に送達することもできる。目的のｐ９７−組成物の徐放は、また、カプセル化用いて達成され得る（例えば、米国特許第５，１８６，９４１号を参照）。
【０１６１】
ＲＡＰ、ＲＡＰフラグメント、またはＲＡＰ変異体に基づく活性薬剤の結合体を血流に送達する任意の投与経路を用いてもよい。好ましくは、組成物は、末梢血管に、最も好ましくは静脈内に投与される、または心臓カテーテルによって投与される。頚静脈内注入および頚動脈内注入も有用である。組成物は、局所的または局部的に（例えば、腹腔内もしくは皮下または筋肉内に）投与されてもよい。一態様において、組成物は、適切な医薬希釈剤または担体とともに投与される。
【０１６２】
投与されるべき用量は、個々の必要性、所望の効果、使用される活性薬剤、生体高分子、および選択される投与経路に依存する。結合体の好ましい用量は、約０．２ピコモル／ｋｇ〜約２５ナノモル／ｋｇの範囲であり、特に好ましい用量は、２〜２５０ピコモル／ｋｇの範囲である。あるいは、結合体の好ましい用量は、０．０２〜２０００ｍｇ／ｋｇの範囲であり得る。これらの用量は、生体高分子に結合される活性薬剤または薬物部分の数に影響される。あるいは、用量は、投与される活性薬剤に基づいて算出され得る。
【０１６３】
好ましい実施形態において、結合体はＲＡＰ変異体を含む。例えば、０．００５〜１００ｍｇ／ｋｇのアドリアマイシンを含むＲＡＰ、ＲＡＰフラグメント、またはＲＡＰ変異体−アドリアマイシンの用量も、ｉｎ ｖｉｖｏで有用である。特に好ましいのは、０．０５ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇのアドリアマイシンを含むＲＡＰ、ＲＡＰフラグメント、またはＲＡＰ変異体−アドリアマイシンの用量である。当業者は、ＲＡＰ変異体に結合される化合物の適切な用量を、その化合物の遊離型で用いられる推奨用量にある程度基づいて決定することができる。活性薬剤をＲＡＰ変異体に結合体化させることで、通常、同じ効果を得るために必要な薬物の量を減少させる。
【０１６４】
本発明の結合体およびモジュレータは、動物、特にヒトにおける治療、予防、および診断の介入に有用である。ＲＡＰ、ＲＡＰフラグメント、またはＲＡＰ変異体の化合物は、特定の組織で優先蓄積を示す可能性がある。診断用途で好ましい医療適用としては、例えば目的の標的器官（例えば、肺、肝臓、腎臓、脾臓）に付随する任意の状態でも含まれる。
【０１６５】
主題の方法は、種々の異なる病状の処置における用途を見出す。いくつかの実施形態において、特に興味深いのは、所望の活性を有する活性薬剤または薬物はすでに同定されているが、その活性薬剤または薬物が標的部位、領域、または区画に適切に送達されてなく、十分に満足できる治療結果をもたらしてない病状における主題の方法の用途である。かかる活性薬剤または薬物に関して、活性薬剤をＲＡＰ、ＲＡＰフラグメント、またはＲＡＰ変異体に結合体化する主題の方法を用いて、治療効果および活性薬剤もしくは薬物の治療係数を向上させることができる。
【０１６６】
主題の結合体を用いて処置可能な特定の病状は、結合体に存在し得る薬物部分の型と同じくらい多様である。従って、肝臓に影響を及ぼし、本発明の方法によって処置可能な病状としては、腫瘍性疾患、自己免疫疾患、ホルモン異常疾患、変性疾患、加齢疾患等の細胞増殖疾患が挙げられる。
【０１６７】
処置とは、結合体の投与に付随し被験体に対する任意の有益な結果を包含し、疾患にかかる可能性の減少、疾患の予防、疾患の進行の遅延、停止、もしくは好転、または宿主を苦しめている病状に付随する症状の寛解が含まれることを意味する。寛解または有益性は、広義で用いられ、少なくともパラメーターの大きさ（例えば、処置される病状に付随する症状（例えば、それに付随する炎症および疼痛））においての減少をいう。そのようなものとして、処置は、宿主が病状、または少なくとも病状を特徴付ける症状にもはや苦しまないように、病状または少なくともそれに付随する症状が完全に抑制される（例えば、発症しないように妨げられる）、または停止される（例えば、終結する）状況も含む。
【０１６８】
Ｌ．肝臓へのＲＡＰ結合体の送達
肝臓の大部分は、門脈によって主に灌流される。初回通過捕捉の効率と関連して、腫瘍の動脈血への依存により、ＲＡＰ結合体化型化学療法薬を静脈内に投与した後、非癌性肝臓組織のかなりの部分が残されることが可能になるはずである。
【０１６９】
肝臓の脈管構造によってもたらされる潜在的利点に加えて、ＨＣＣ腫瘍細胞および周囲の組織上でのＬＲＰ１の相対的発現レベルは、ＲＡＰ結合体の有効性にさらに有利に働く可能性がある。研究は、悪性形質転換後、肝細胞上のＬＲＰ１発現が少なくとも１０倍向上したことを示している（２３）。好対照に、他は、ＬＲＰ１が肝硬変組織以外の非腫瘍肝臓組織では著しく低発現であることを示している（２４）。病的肝臓の他の部分での減弱した発現とともに、腫瘍細胞上で向上したＬＲＰ１発現は、初回通過捕捉による動脈送達のように、腫瘍組織に対する優先を有するＲＡＰ結合体の不均一送達をもたらすはずである。化学療法薬に対して一般に向上した急速に増殖する腫瘍細胞の感受性に加えて、不均一送達により、減弱した肝臓保存が提示する処置に対する障壁をＨＣＣ患者の大多数において回避することが可能となる。
【０１７０】
肝細胞癌を処置する有効的な方法は、イットリウム−９０（^９０Ｙ）の投与である。^９０Ｙは、多種類の腫瘍に対して高い抗生物質有効性を有する癌化学療法薬である。^９０Ｙ崩壊は、高エネルギーβ粒子を生成し、ＨＣＣでよく見られるような大きな固形腫瘍に特に適した選択となる。イットリウムは、崩壊すると安定な元素ジルコニウムになる。肝細胞腫瘍への^９０Ｙの送達は、現在、経動脈カテーテル法によって投与される不溶性ガラスビーズ（ＴＨＥＲＡＳＰＨＥＲＥ（登録商標））を含有する核種を使用することによって達成される。この方法は、大きく、境界明瞭な腫瘍の処置に有効であるが、多発性の小さな腫瘍を含む症例または転移が関与する場合には有用性が低い。別のアプローチは、腫瘍細胞を選択的に標的にする薬剤に^９０Ｙまたは他の化学療法薬を結合体化させることである。このアプローチの例は、非ホジキンリンパ腫の治療薬ＺＥＶＡＬＩＮ（登録商標）（イブリツモマブチウキセタン）（注入前に^９０Ｙを添加された金属キレート剤を有する抗ＣＤ−２２モノクローナル抗体）に見られる。
【０１７１】
ＲＡＰは、投与後、肝臓への急速な拡散を示す。３０ピコモルのタンパク質の静脈内ボーラス注入後、外因性ＲＡＰの７０％超が１０分以内に肝臓に蓄積される（２０）。注入されたＲＡＰの循環半減期は、１分未満である。これらの薬物動態は、ラットで２．５ｍｇ／ｋｇ（６０ｎモル／ｋｇ）までの静脈内注入でも観察される（２０）。同様の薬物動態が、別の高親和性ＬＲＰ１リガンド、プロテアーゼ活性化α−２−マクログロブリン（７２５ｋＤａ四量体血清糖タンパク質）で報告されている（２１）。少量のＲＡＰ（＜注入用量の１％）のみが心臓、脳、筋肉、または腎臓に蓄積され、これらの組織においてＲＡＰ結合ＬＤＬＲの組織および血管の両発現がこの適用で極わずかであることを示している。静脈内に投与されたＲＡＰは、げっ歯類種およびネコ種において測定可能な毒性を何ら示していない。肝臓によるＲＡＰの捕捉効率は、最初、肝細胞上の豊富な細胞表面ヘパリン硫酸プロテオグリカンへの低親和性結合ステップによって、続いてＬＲＰ１による高親和性結合およびエンドサイトーシスによって向上される（１、２２）。本発明によれば、静脈内投与後、化学療法薬（例えば^９０Ｙ）に結合体化したＲＡＰ、ＲＡＰフラグメント、またはＲＡＰ変異体の肝臓へのほぼ定量的な送達は、これらの薬物に付随する全身毒性を著しく減少させ、ＨＣＣの処置の間、患者へのリスクを減少させる。^９０Ｙまたは他の活性薬剤に結合体化したＲＡＰまたはＲＡＰフラグメントまたはＲＡＰ変異体は、肝臓への活性薬剤の送達の有効的な方法を提供する。
【０１７２】
いくつかの因子は、ＲＡＰ結合体が標的にする選択的な肝腫瘍に有利に働き、かかる薬剤が転移したＨＣＣに有効であることを示唆している。転移した腫瘍細胞は、異所部位への移行後直ちにそれらの特徴を保持する傾向があり、肝外転移したヒトＨＣＣにおいてＬＲＰ１の減弱していない発現を示している（２５）。この因子は、転移したＨＣＣを同様に、ＲＡＰ、ＲＡＰフラグメント、およびＲＡＰ変異体、ならびに適切な化学療法薬または他の活性薬剤の静脈内投与された結合体の影響を受けやすい状態にすることもできる。
【０１７３】
Ｍ．肝障害
本発明の一態様は、肝疾患の処置のための治療化合物を肝臓に送達するために、化学療法薬物または他の薬剤をＲＡＰ、ＲＡＰフラグメントもしくはＲＡＰ変異体に結合体化することを意図する。肝疾患を処置するためのＲＡＰ結合体の投与は、肝疾患の処置に付随するいくつかの問題（例えば、肝臓による薬剤のクリアランス、または細胞膜内の薬物耐性機構（ＭＤＲ、Ｐ−糖タンパク質））に取り組む。
【０１７４】
本発明が意図する肝疾患としては、以下記述する障害が挙げられるがこれらに限定されない。肝細胞癌（すなわち肝癌）は、世界で５番目に多い癌であり、発症率は着実に上昇している。腫瘍原性肝細胞は、高レベルのＬＲＰ１発現を保持する。肝細胞癌は、化学療法に十分な効果を示さない。これは、腫瘍細胞が高い比率で薬物耐性を示すため、および使用される化学療法が全身性（静脈内）投与のために、特に心臓および腎臓で深刻な毒性を有するためである。
【０１７５】
肝炎は、肝臓の炎症の総称である。肝炎は急性または慢性であり得、急性もしくは慢性肝不全、例えばウイルス（例えばＡ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｄ型、もしくはＥ型肝炎または非ＡＢＣＤＥ型、ＣＭＶ、Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ肝炎）、真菌感染症、リケッチア感染症、もしくは寄生虫感染症、アルコール、化学的毒素、薬物（例えばアセトアミノフェン、アミオダロン、イソニアジド、ハロタン、クロルプロマジン、エリスロマイシン）、代謝性肝疾患（例えばウィルソン病、α１−アンチトリプシン欠乏症）、癌、突発性自己免疫性肝疾患、肝硬変（例えば原発性胆汁性肝硬変）、胆管閉塞に起因する肝炎が挙げられる。Ａ型、Ｂ型、および／またはＣ型ウイルス肝炎による肝臓の感染は徐々に肝疾患へと進行し、肝不全へと至る可能性がある。急性肝炎感染症は、Ａ型肝炎に最も多く起因する。Ｂ型肝炎およびＣ型肝炎の両感染症は、生体内に残留し、長期にわたる感染症（慢性）になり得る。Ｃ型肝炎は、肝硬変および癌を含む危険状態を引き起こす可能性がある。
【０１７６】
さらに、ＲＡＰもしくはＲＡＰフラグメントまたは変異体に結合体化した組成物を用いて処置可能であると考えられる肝障害または状態は、脂肪肝（米国特許第６，５９６，７６２号）、胆汁うっ滞（米国特許第６，０６９，１６７号）、肝硬変、中毒性肝障害、肝切除後の状態、および胆管閉塞が挙げられる。
【０１７７】
肝疾患の処置のためのＲＡＰもしくはＲＡＰフラグメントまたは変異体に結合体化する候補薬物としては、５−フルオロウラシル、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、マイトマイシンＣ、シスプラチン、エピルビシン、ダウノルビシン、エトポシド、および表１に示す他の化学療法薬、アデホビル、ラミブジン、エンテカビル、リバビリン、インターフェロンα、ペグ化インターフェロンα−２ａ、インターフェロンα−２ｂ、および他の抗ウイルス剤、ビタミンＥ、ウルソデオキシコール酸、ならびに肝障害を処置するために使用する他の薬剤が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１７８】
【表１−１】

【０１７９】
【表１−２】

【０１８０】
【表１−３】

本発明の付加的な態様および詳細は、以下の実施例により明白である。これらの実施例は、限定することよりはむしろ例証することを目的としている。
【実施例】
【０１８１】
（実施例１） ＲＡＰ結合体は、ＬＲＰ１経路を介して細胞に毒素を送達する。
【０１８２】
細胞傷害性薬に結合体化したＲＡＰペプチドが細胞に毒素を効率的に送達し、細胞死を惹起できるか決定するために、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイを用いて、ＲＡＰ−ＬＲＰ１結合および内部移行経路を介して毒素の送達を評価した。
【０１８３】
野生型のＬＲＰ１が欠損したＣＨＯ−Ｋ１細胞を、５％ウシ胎仔血清を追加したＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ Ｕｌｔｒａ−ＣＨＯ中で増殖させた。実験の４８時間前に、細胞を１２ウェルプレートに播種した。ビオチン化し、内部にジスルフィドを結合した、ＲＡＰｄ３（ミニＲＡＰｃ、Ｈｅｐ１：ビオチン−ＧＧＳＧＧＣＧＦＲＥＥＬＫＨＦＥＡＫＩＥＫＨＮＨＹＱＫＱＬＥＩＡＨＥＫＬＲＨＡＥＳＶＧＤＧＥＲＶＳＲＳ ＲＥＫＨＡＬＬＥＧＲＴＫＥＬＧＹＴＶＫＫＨＬＱＤＬＳＧＧＣ）（配列番号９）の部分に対応する切断型ペプチドを、ストレプトアビジンと、細菌性毒素サポリン（ＺＡＰ， Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）との間の等モル量の結合体と組み合わせた。この混合物を、増殖培地に１００ｎＭまで希釈して、２連のウェルに添加した。対照として、２連のウェルを、ＲＡＰｄ３ペプチド単独（ミニＲＡＰｃ）、ストレプトアビジン−サポリン結合体単独（ＺＡＰ）と共に（両方とも１００ｎＭ濃度で、およびサポリン単独は１μＭ（ＳＡＰ）で）インキュベートした。細胞を、加湿チャンバーで、３７℃、５％ＣＯ_２で４８時間、インキュベートした。各処理状態の細胞生存率を、ＭＴＴアッセイキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）を用いて決定した。
【０１８４】
図２は、単独のペプチドが細胞生存への有意な影響を全く及ぼさなかったことを示す。単独のストレプトアビジン−サポリン結合体は、生存細胞の数を野生型ＣＨＯ−Ｋ１に対して約１０％減少させ、ＬＲＰ欠損細胞には全く影響がなかった。ペプチドと細胞傷害性結合体との組み合わせは、生存細胞の数を野生型ＣＨＯ−Ｋ１に対してはほぼ４０％減少させ、ＬＲＰ欠損ＣＨＯ−Ｋ１での減少はわずか５％であった。サポリン単独（１μＭ）は、約５５％（野生型）および３５％（ＬＲＰ欠損）の減少をもたらした。
【０１８５】
このデータは、ＲＡＰｄ３ペプチドがＬＲＰ１エンドサイトーシス経路を介して結合した毒素の内部移行を効率的に推進することができ、かつ化合物および治療薬を送達する有用な系を提供することを示す。
【０１８６】
（実施例２） ＲＡＰおよびＲＡＰペプチド結合体のｉｎ ｖｉｖｏ投与
Ｂ型肝炎ウイルスによる感染は、無症候性感染から急性肝炎、劇症（急激かつ重症な発症）肝炎、または慢性の低レベル持続感染の発症に及ぶ種々の結果をもたらし得る。感染した成人の５〜１０％は、慢性保因者になる。慢性保因者状態の人々のうち２５〜３５％は、肝硬変または肝細胞癌（ＨＣＣ）のいずれかによる感染の合併症から最終的に死亡にいたる。肝細胞癌を発症する確率も、アルコール依存症、喫煙、および肥満症によって増加する。この疾患の予後は悪く、報告されている５年間の生存率中央値は５％未満である。
【０１８７】
ＨＣＣは、診断が５番目に多い悪性腫瘍であり、毎年世界で約５０万の死亡数が報告されている。腫瘍組織の外科的切除、移植、および物理的破壊は、処置の第１の選択であるが、患者のうちわずかに５〜１０％がこうしたアプローチに適した腫瘍を呈する（１３〜１５）。さらに、全身化学療法は、化学療法薬の毒性および腫瘍細胞の耐性の両理由で、１５〜２０％の低い反応率をもたらす（１６〜１７）。
【０１８８】
例えば、ドキソルビシンは、種々の腫瘍に対して高い効率を有する癌化学療法薬であり、特に、腫瘍細胞を含む急激に増殖する細胞への毒性を有する。しかし、肝細胞癌の処置におけるドキソルビシンの使用は、著しい肝臓および心臓の毒性ならびに血液細胞産生の抑制によって制限される（３４）。さらに、肝細胞癌細胞は、薬物耐性型への高転換率を示す（３５）。
【０１８９】
療法の別のアプローチは、放射線療法の利用である。例えば、現在、検証されている肝癌の新規の処置は、放射性物質（^９０Ｙ）で標識した微細なガラスビーズを、腫瘍組織を灌流する微小血管に通ずる主肝動脈に注入することを含む。次いで、放射線は、腫瘍組織を破壊する。しかし、肝動脈から肺への血液の著しい短絡は、多数の患者においてガラスビーズの使用を不可能にする。消化管に送り込まれる動脈へのビーズの著しい逆流も、深刻な副作用の原因となり得る。従って、腫瘍組織への放射線療法薬の有効的な送達は、血管に閉じ込められる大きな物質に依存しないより管理されたアプローチを必要とする。
【０１９０】
治療薬の生体内分布および有効性を検査するための、肝細胞癌（ＨＣＣ）の関連動物モデルは、ウッドチャック肝炎ウイルス（ＷＨＶ）に感染したＥａｓｔｅｒｎウッドチャックである（３３）。新生児期に該ウイルスに感染したほぼすべてのウッドチャックは、２４カ月の中央値内でＨＣＣを発症する。平均余命の中央値は３０カ月であるが、ＷＨＶに感染したウッドチャックは、肝硬変（すなわち、ＨＣＣ患者の大半に存在する状態）を発症しない。ウッドチャック肝炎ウイルスおよびヒトＢ型肝炎ウイルスは、構造、遺伝的特徴、感染方法、感染経過、および肝細胞癌への進行が類似している。このモデルの重要性を強調する著しい類似点がある。ヒトと同じように、生後間もなく肝炎ウイルスに曝露された全ウッドチャックの半数以上が慢性感染症を発症し、慢性的に感染したウッドチャックのほぼすべてが、曝露から約２０〜２８カ月後に肝細胞癌を発症する。残りの接種された新生仔のウッドチャックは、急性肝炎を発症することが多いが、該ウイルスに対する抗体が発生して、回復する。これらの「回復した」動物の１７〜２５％は、曝露から２９〜５６カ月後にＨＣＣを発症する。肝炎感染から明らかに回復した後のＨＣＣ発症もヒトにおいて見られる。
【０１９１】
肝臓への薬剤の送達へのＲＡＰおよびＲＡＰペプチドの効果を決定するために、対照およびＲＡＰペプチド結合体治療薬の摂取および毒性を、ウッドチャックＨＣＣモデルで検査する。慢性的に感染した６匹のウッドチャックおよび非感染の４匹のウッドチャック（約１．５〜２歳）を用いる。
【０１９２】
薬物動態の最初の検査として、ＲＡＰペプチドを^９０Ｙ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に結合体化し、麻酔をかけた、ＨＣＣを有するウッドチャックの静脈内に投与する。ＲＡＰペプチドは、Ｎ末端にＤＯＴＡキレート部分を含有し、^９０Ｙ等の放射性同位体を負荷することが可能となる。従って、ＲＡＰヘプチドの修飾は、イットリウム−９０で修飾したＲＡＰペプチドをインキュベートすることによってＲＡＰペプチド−^９０Ｙの生成を可能にする。有用な送達化合物は、通常、以下の特徴を示す。すなわち、１）すでに損なわれている肝臓の機能に悪影響を及ぼさない、２）肝臓および悪性肝臓組織によって測定可能に摂取される、および３）摂取後に、腫瘍細胞に対して毒性を有し、腫瘍退縮を引き起こす。
【０１９３】
対照として、さらに腫瘍を有するウッドチャックに、ＲＡＰ−^９０Ｙの生成を可能にするために等モル量の遊離型^９０ＹまたはＣ末端でマレイミド−ＤＯＴＡに結合体化したシステインを含有し、細菌で発現された完全長ＲＡＰを注入する。
【０１９４】
^９０Ｙは、明確な毒性および発癌性特性を有する。ＲＡＰペプチド−ＤＯＴＡ−^９０Ｙ結合体の薬物動態特性は、急速かつほぼ定量的な肝臓蓄積を有するＲＡＰと著しく異ならないことが予想される。ＲＡＰペプチド薬物動態は、ＬＲＰ１機能、配列、および発現が亜門内で良く保存されているため、すべての哺乳類種において極めて類似している可能性がある。同様に、ヒト配列は他の霊長類のそれとのみ同一であるにもかかわらず、ＲＡＰ配列は哺乳類種の間で相同である。
【０１９５】
動物を比較するベースラインレベルを決定するために、血清を、ウイルス負荷および以下の分子のベースラインレベルについて分析する。すなわち、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）−胆管に関連する酵素。胆管が塞がれると増加することが多い；アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）−ＡＳＴは、損傷した細胞から放出される、肝臓の細胞質酵素である。ウイルス肝炎で最も高い上昇が起こる。肝毒性アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）は、ＡＳＴよりもより肝臓特異性であるが、腎臓および筋肉にも存在する。ＡＳＴ上昇が肝臓器官のＡＳＴであることを確認するために（例えば、ＡＳＴおよびＡＬＴの両上昇は、肝細胞の損傷を強く示唆する）用いられる；ビリルビン−結合体化したビリルビンの不均衡な上昇は、胆汁うっ滞および慢性肝疾患の後期で見られる。血清ビリルビンは、肝細胞の損傷で増加する；アルブミン−肝臓によって生成される主なタンパク質を測定し、肝臓がこのタンパク質を適切な量で生成しているかどうかを示す；γグルタミルトランスフェラーゼ（ＧＧＴ）−肝細胞で見られる酵素であり、かつ肝臓損傷および修復に高い感受性がある；乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）−肝細胞に見られる。通常、細胞死および／または損傷による細胞からの漏出物を見つけると増加する；プロトロビン時間（ＰＴ）−ビタミンＫ依存性因子（ＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、およびＸ）の肝臓合成に依存する。ＰＴの上昇は、肝不全の兆候であり得る；および総タンパク質濃度−アルブミンおよび血中の他のすべてのタンパク質（抗体を含む）を測定することは、感染症を撃退する助けとなる。
【０１９６】
処置に先立ち肝臓の基本的な状態を決定した時点で、動物に麻酔をかけ、両後肢の毛をそり、消毒する。脚の主要静脈（足根の）を露出させ、片脚にカテーテルを注入する。次いで、このウッドチャックを磁気共鳴イメージング装置（ＭＲＩ）、７Ｔ ＭＲＩに配置する。肝臓のスカウト画像を撮像し、肝臓の位置および大きさを決定する。ウッドチャックの人工呼吸をゲートでコントロールし、マルチスライス、マルチエコー、Ｔ２−強調画像を撮像し、全肝臓および任意の腫瘍の位置について高品質の画像を得る。造影剤（ガドリニウム）をカテーテルから注入し、Ｔ２画像の画像品質を向上させて、腫瘍を位置づける。肝臓も、２Ｄ−ＣＳＩ（二次元化学シフトイメージング）リン分光法を用いて撮像する。イメージングを完了した時点で、麻酔をかけたウッドチャックをＭＲＩから移動させ、試験薬剤を投与の準備をする。
【０１９７】
感染した２匹のウッドチャックに、カテーテルが注入されてない脚の静脈にＲＡＰペプチド−^９０Ｙを注入する。感染したウッドチャックの２番目の２匹に、ＲＡＰ−^９０Ｙを注入する。感染したウッドチャックの３番目の２匹に、ＤＯＴＡ−^９０Ｙを注入する。^９０Ｙには標的部分を付着させてないので、この状態を陰性対照として用いる。４匹の対照群ウッドチャックに、生理食塩水に溶解させたＲＡＰペプチド−^９０ＹまたはＲＡＰ−^９０Ｙのいずれかを注入し、罹患している肝臓および健常な肝臓を有する動物を用いてこれら２つの試験化合物の相対的分布の比較を行う。
【０１９８】
薬物注入開始から５分ごとに、対側のカテーテルから別の無菌容器に血液を採取する。薬物を注入してから３０分後、ウッドチャックを安楽死させ、死体全体を凍結させる。実験中、すべてのウッドチャックから採取した全血液試料を分析して、血液中を循環する^９０Ｙ標識薬物の量を決定する。
【０１９９】
ＳＴＤ１０（処置した動物の１０％に強い毒性をもたらす用量）ペプチド決定を確定し、続いて非げっ歯動物で同等量の１０分の１の試験を行う。病理組織診断とともに肝臓酵素の上昇から、肝毒性についての信頼できる測定結果がもたらされるはずである。非げっ歯類における強い毒性の非存在によって、ラットＳＴＤ１０のヒト同等用量の１０分の１で第１相試験のヒト初期投与量の直接算出が可能となる。有効用量の概算は、以前のデータを基にして行うことができる。１００ピコモル／ｋｇ（３ｎモル／ｍ２）の有効用量を、５００ＭＢｑ用量、ＲＡＰペプチド−ＤＯＴＡへの^９０Ｙの定量的な負荷、およびモルあたり７４ペタベクレルのＹＣ１３に対する比活性を想定することによって引き出す。
【０２００】
ＨＣＣ細胞に対していくらかの優先を有する肝臓へのＲＡＰおよびＲＡＰペプチドならびに他の化合物の初回送達は、他の組織部位と比較すると、ＲＡＰを介する肝蔵への薬剤の有効かつ好ましい送達を示唆する。著しい非肝臓送達または正常な細胞への優先を有する肝臓送達は、この送達経路が肝臓およびＨＣＣ細胞に特異的でないことを示す。
【０２０１】
さらに、ＲＡＰタンパク質およびＲＡＰペプチドの投与ならびに薬物動態特性の分析は、ＲＡＰペプチドおよび完全長のＲＡＰタンパク質が、両方とも活性薬剤を肝臓に輸送するための有効的な分子であることと、ＲＡＰおよびＲＡＰペプチド結合体が、完全長の非結合体化型ＲＡＰの挙動をｉｎ ｖｏｖｏで標的にするＬＲＰ１を模倣することとを決定する方法を提供する。
【０２０２】
従って、完全長のＲＡＰ ＬＲＰ−１特異的結合を模倣する完全長のＲＡＰおよび短いＲＡＰフラグメントの両方は、健常な組織に毒性を誘導することなく治療化合物を肝臓に送達するための有効的な手段であることが予想される。
【０２０３】
（実施例３） Ｉｎ ｖｉｖｏ投与後のＲＡＰ分布の分析
ＲＡＰ、ＲＡＰフラグメント、またはＲＡＰ変異体が、他の組織よりも肝臓をより特異的に標的にするかどうかを決定するために、^９０Ｙに結合体化したＲＡＰタンパク質およびフラグメントの局在化および分布を行う。動物の対照薬物および腫瘍細胞の局在化ならびに分布についてのモニターも行う。
【０２０４】
オスウッドチャック（Ｍａｒｍｏｔａ ｍｏｎａｘ）の組織での残留放射能の相対的レベルを決定するために、^９０Ｙ標識ペプチドまたはタンパク質治療薬の単回投与後に、処置した動物の凍結切片を分析する。肝臓の腫瘍および非腫瘍の領域を区別する際に特に注意を払う。
【０２０５】
分析する組織切片としては、脂肪組織、消化管、皮膚、腎臓、脊髄、肝臓、脾臓、副腎、腫瘍組織、非腫瘍組織、胸腺、骨（椎骨）、肺、甲状腺／副甲状腺、骨髄、リンパ節、脳、心筋、膵臓、胃壁、唾液腺（耳下腺）、ならびに小腸および大腸が挙げられる。
【０２０６】
屠殺直後、動物の各標本をＣＯ_２／ヘキサンで急速冷凍する。当該技術分野の動物飼育プロトコル基準に従って、適切なステップを講じて、凍結切片に適した動物標本を作製し、２％カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）に包埋する。標本ブロックを、Ｌｅｉｃａ ＣＭ−３６００クリオミクロトームで３０μｍに切片化する。
【０２０７】
切片を、ミクロトームクリオキャビネット内で少なくとも１６時間凍結乾燥させるか、またはＴｈｅｒｍｏＳａｖａｎｔ凍結乾燥器内で約３０分間凍結乾燥させる。早急に最高の分解能を提供するために、各切片の代表を^１４Ｃ−イメージ板に３０分間、１、２、６、１２、２４、４８、および７２時間曝露させる（放射線療法のノイズのアーチファクトを最小化するために鉛の箱内で、およそ４℃で冷蔵する）。曝露の後、イメージ板をＦｕｊｉ ＢＡＳ−２５００スキャナーおよびそのソフトウェアＦｕｊｉ Ｉｍａｇｅ Ｒｅａｄｅｒバージョン１．１で読み取る。
【０２０８】
ＲＡＰ結合体は、対象動物、特に肝細胞癌または他の肝臓損傷を有する動物の肝臓で優先的に見られることが予想される。
【０２０９】
（実施例４） 最小化ＲＡＰペプチドの生成およびＬＲＰ１への結合親和性の評価
さらに最小化したＲＡＰペプチドを本明細書に記述するように生成した。
【０２１０】
ｍＲＡＰ−８ｃおよびｍＲＡＰ−１４ｃと命名した付加的な２つのペプチドを生成した。ｍＲＡＰ−８ｃ（配列番号１０）は、フラグメントのＮ末端にアミノ酸置換Ｅ２４６Ｃ、Ｌ２４７Ｇを、Ｃ末端にアミノ酸置換Ｌ３１１Ｇ、Ｓ３１２Ｃを含む。ｍＲＡＰ−１４ｃ（配列番号１１）は、アミノ酸置換Ｆ２５０ＣおよびＬ３０８Ｇ、Ｑ３０９Ｃを含む。ＧＧＳＧＧ（配列番号１２）を各ペプチドのＮ末端に付加した。
【０２１１】
ｍＲＡＰ−８ｃおよびｍＲＡＰ−１４ｃのペプチドのＬＲＰ１クラスターＩＩへの親和性を固相結合アッセイによって決定した。簡潔に、組換えヒトＬＲＰ１クラスターＩＩ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ， ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ７８６−１１６５， ｗｉｔｈ Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ Ｆｃ ｔａｇ， １μｇ）を用いて、５ｍＭ ＣａＣｌ_２（ＴＢＳＣ）を補充したＴＢＳ（ｐＨ８）中でＮｕｎｃ ＭＡＸＩＳＯＲＰ（登録商標）９６ウェルを４℃で一晩コーティングした。ウェルをＴＢＳＣで洗浄して、２％ＢＳＡを含有するＴＢＳＣでブロックした。
【０２１２】
ストレプトアビジンとビオチン化ペプチドとの間に複合体を含むアッセイでは、ＬＲＰ１リガンドを、阻害剤の存在下または非存在下で、固定化受容体とともに、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を補充した上述のブロック緩衝液中で、室温にて２時間インキュベートした。抗ビオチン抗体およびビオチン化ペプチドの複合体を含むアッセイでは、ＲＡＰｄ３リガンドの追加を指示する前に、すべての阻害剤溶液を、固定化ＬＲＰ１−Ｃ２を用いて１時間、プレインキュベートした。ＣＲ対の応答能を結合するリガンドは、カルシウムを必要とするため、同一の結合反応を５０ｍＭ ＥＤＴＡの存在下で行い、非特異的結合の評価基準を提供した。対照ウェルは追加した阻害剤を含まなかった。ウェルを、５ｍＭ ＣａＣｌ_２および０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を補充したＴＢＳで洗浄した。結合したリガンドを、抗−Ｓ−ペプチド−ＨＲＰ結合体（Ａｂｃａｍ）または抗−α−２−マクログロブリン−ＨＲＰ結合体（Ａｂｃａｍ）のいずれかを用いて検出した。過剰なＨＲＰ結合体を除去して、ウェルを洗浄した。ＴＭＢ試薬（ＢｉｏＲａｄ， Ｈｅｒｃｕｌｅｓ， ＣＡ）を用いて色素を発色させた。４５０ｎｍでの吸収を、マイクロプレート分光光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ）を用いて測定した。
【０２１３】
結合アッセイの結果、ｍＲＡＰ−８ｃは約４ｎＭのＬＲＰ１クラスターＩＩへの親和性を示し、一方、ｍＲＡＰ−１４ｃは約２１ｎＭの親和性を示した。
【０２１４】
これらの結果は、完全長ＲＡＰｄ３の大きさの約半分であり得る最小化ＲＡＰフラグメントが、ＲＡＰ受容体ＬＲＰ１に効率的に結合し、ＬＲＰ１エンドサイトーシスを介して肝臓に薬物を送達するのに有用であることを確認する。
【０２１５】
（実施例５） 環状ＲＡＰペプチドオリゴマー組み合わせの評価
最小化ＲＡＰ環状ペプチドは、適切なＣＲ対への同様の親和性を保持するが、多数のＣＲ対で受容体に結合する完全長ＲＡＰによって与えられる結合価の利点を示さない。この結合価の利点を再構成するために、ストレプトアビジンまたは抗ビオチン抗体上でビオチン化ＲＡＰｄ３ペプチドの多量体集合体を生成した（図３）。
【０２１６】
ＲＡＰｄ３に由来し、分子内ジスルフィド結合によって環化した切断型ペプチド（ｍＲＡＰｃ）を用いて、ＬＲＰ１の第２のリガンド結合ドメイン（ＬＲＰ１−Ｃ２）への結合にたいして多量体化の影響を試験した。検出を単純化して、ストレプトアビジンまたは抗ビオチン抗体によってペプチドの多量体化を可能にするために、ペプチドにＮ末端ビオチン残基（ペンタペプチドリンカー（ＧＧＳＧＧ）（配列番号１２）によってＲＡＰ配列から分離した）を合わせた。単量体ｍＲＡＰｃペプチドを、ＬＲＰ１−Ｃ２への高親和性で結合するために上記に示した。ＬＲＰ１−Ｃ２のＣＲ７対のうち６対は、ＲＡＰ結合のために必要なモチーフを共有し、および同様の親和性（１〜５ｎＭ）でＲＡＰｄ３に独立的に結合することが示されている（Ｏｂｅｒｍｏｅｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７２：１０７６１−１０７６８， １９９７； Ａｎｄｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７５：２１０１７−２１０２４， ２０００）。
【０２１７】
ストレプトアビジンまたは抗ビオチン抗体のいずれかの存在下および非存在下で、組換えＲＡＰｄ３のＬＲＰ１−Ｃ２への結合を抑制するｍＲＡＰｃの能力を、上述のように固相結合アッセイによって測定した。
【０２１８】
結果は、単量体ペプチドのための抑制（ＥＣ５０）の程度が２９±７ｎＭ（表３）であったことを示す。ｍＲＡＰｃのＥＣ５０をストレプトアビジンに相当する１／２モルと組み合わせたが、他の同一の条件下において、６±１ｎＭであり、ペプチド単独よりもほぼ５倍向上した。成熟ＲＡＰは０．８±３ｎＭのＥＣ５０であり、単量体ｍＲＡＰｃペプチドよりも３６倍優れており、かつストレプトアビジン上で構築したペプチドよりも依然として約１０倍優れていた。ストレプトアビジン単独は、抑制効果がなかった。ストレプトアビジンの存在下で見られる抑制の種々の増強は、最小化ＲＡＰドメインの多量体化の結合活性における向上と一致している。
【０２１９】
【表３】

ビオチンへの抗ビオチン抗体の比較的に弱い一価親和性（低ナノモルＫＤ）を考慮に入れて、適切に隣接した２つの受容体結合ペプチドおよび単一の抗体からなる多価複合体の予備構築は、ペプチド−抗体複合体を安定させると仮定されていた。従って、洗浄およびその後のＲＡＰｄ３リガンドの付加に先立って、１対３のモル比で抗体およびペプチドを、固定化受容体を用いてインキュベートした。対照、ペプチド単独、抗体単独、および完全長ＲＡＰに対して同じ手順を用いた。この方法で、単量体ｍＲＡＰｃペプチドのＥＣ５０を、２０±１ｎＭとして測定した（表４）。
【０２２０】
【表４】

ｍＲＡＰｃと抗ビオチン抗体との組み合わせによって３±１ｎＭのＥＣ５０を得た。完全長ＲＡＰは、０．５±５ｎＭのＥＣ５０をもたらした。抗体単独は、ＲＡＰｄ３の受容体への結合に影響を及ぼさなかった。抗体の予備構築によって、ｍＲＡＰｃ阻害能力は、明らかにストレプトアビジンよりもより効率的に（約７倍）改善した。抗体の存在下でｍＲＡＰｃのＥＣ５０は、完全長ＲＡＰのそれよりも６倍高いままであった。従って、四価ストレプトアビジンによる場合のように、二価抗体の付加は、ＲＡＰｄ３のＬＲＰ１−Ｃ２への結合を抑制するペプチドの能力を向上させた。
【０２２１】
他のＬＲＰ１−リガンドの結合を抑制するｍＲＡＰｃの多量体形成の能力を、ｍＲＡＰｃ単量体および完全長ＲＡＰによる抑制に比較した。トリプシン活性化α−２−マクログロブリンおよびｕＰＡ／ＰＡＩ−１の複合体を、ｍＲＡＰｃペプチドの存在下で、単一のリガント濃度を用いてインキュベートした。これら両方の場合において、ストレプトアビジンおよびｍＲＡＰｃの複合体は、ＲＡＰおよびｍＲＡＰｃ単量体の間のほぼ中ほどでＥＣ５０との結合を抑制した。
【０２２２】
（実施例６） 環状ＲＡＰペプチドオリゴマー組み合わせの肝臓への侵入の評価
静脈内注入後に、多量体ペプチドが完全長ＲＡＰのｉｎ ｖｉｖｏ生体内分布挙動を複製するか決定するために、肝臓内のｍＲＡＰｃペプチド蓄積濃度を測定した。ビオチン化ＲＡＰペプチド、ビオチン化ＲＡＰタンパク質、または緩衝剤を^３５Ｓ−ＳＬＲ−ストレプトアビジン（０．７ｍＣｉ／ｍＬ、３００Ｃｉ／ミリモル、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）と組み合わせ、Ｄ−ＴＵＢＥ（登録商標）透析カセット（１４ｋＤａ ＭＷＣＯ， ＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によってリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に対して透析した。オスＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（６〜８週齢）に、試験物質（２μｌ／ｇ、約２０μＣｉ／ラット）を尾静脈から注入した。動物を、注入から３０分後にペントバルビタール（２００ｍｇ／ｋｇ）で犠牲にした。すべての対象動物を、実験動物の人道的処置に関するＣａｎａｄｉａｎ Ｃｏｕｎｃｉｌ ｏｎ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅによって記述されるガイドラインに従って処置した。死体を凍結させ、カルボキシメチルセルロースに包埋して、Ｆｕｊｉ ＢＡＳ−２５００ホスフォイメージャーを用いて半定量的全身オートラジオルミノグラフィ（ＱＷＢＡ）による分析のために切片化した。各動物の分析した器官内で明確に描出された領域を発光分析（Ｆｕｊｉ Ｉｍａｇｅ Ｒｅａｄｅｒ ｖ１．１およびＦｕｊｉ Ｉｍａｇｅ Ｇａｕｇｅ ｖ３．１２）のために選択した。値を、単位領域あたりの光刺激発光の単位で表す（ＰＳＬ／ｍｍ^２）。
【０２２３】
^３５Ｓ−標識ストレプトアビジンの製剤を、ビオチン化ｍＲＡＰｃペプチド（２０対１のモル比で）またはｉｎ ｖｉｖｏビオチン化ＲＡＰ（５対１のモル比で）と組み合わせ、ラットに静脈内注入した。標識ストレプトアビジン単独を対照として使用した。
【０２２４】
ストレプトアビジンは、静脈内注入後、腎臓に蓄積されるが、肝臓での蓄積はわずかであると報告されている（Ｗｉｌｂｕｒ， ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ ９：１００−１０７， １９９８； Ｒｏｓｅｂｒｏｕｇｈ，ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｎｕｃｌ Ｍｅｄ ３７：１３８０−１３８４， １９９６）。本実験において、ビオチン化ＲＡＰの製剤は、ストレプトアビジン単独のそれよりも２．７倍高いレベルで肝臓に分布され、検査した他のすべての組織では、同様のレベルまたは低いレベルで分布された（図３）。標識ストレプトアビジン上で予備構築したｍＲＡＰｃペプチドは、ストレプトアビジン単独のそれよりも７倍を超えるレベルで肝臓に分布され、および検査した他のすべての組織において、比較したレベルは同様のレベルまたは低いレベルで分布された（図３）。血中の競合するＬＲＰ１リガンドの高レベルは、ペプチド複合体の肝臓摂取を明らかに遮断できなかったことを示すことに注目すべきである。静脈内に投与された完全長ＲＡＰについて以前に観察が行なわれた（Ｗａｒｓｈａｗｓｋｙ，ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ ９２：９３７−９４４， １９９３）。
【０２２５】
ラットにおける生体内分布の研究に加えて、ｍＲＡＰｃ多量体形成ペプチドの分布をウッドチャックで評価した。ウッドチャックは、肝障害（例えば肝細胞癌）を研究する際に有用である（実施例２を参照）。生体内分布研究を、基本的に上述のようにｍＲＡＰｃ−ストレプトアビジンおよび対照としてストレプトアビジン単独で行った。研究の結果は、ウッドチャックの肝臓でｍＲＡＰｃ−ストレプトアビジンの摂取（１９７９年の平均値ＰＳＬ／ｍｍ^２）は、ストレプトアビジン単独の摂取よりも約４．５倍高かった（平均値４３５ＰＳＬ／ｍｍ^２）ことを示す。
【０２２６】
これらの結果は、多量体形成ｍＲＡＰｃが肝臓によってｉｎ ｖｉｖｏで効率的に取り込まれ、および多量体形成ＲＡＰｃが肝障害の処置のために肝臓に治療薬を投与するための有効的な媒体であることを示す。
【０２２７】
上記の例示的な実施例で記述するように当業者には本発明で多数の修正および変化が起こることが予想される。従って、添付の特許請求の範囲に表示するようにそのような限定だけを本発明に記載する必要がある。
【０２２８】
（参考文献）
【０２２９】
【表５−１】

【０２３０】
【表５−２】

【０２３１】
【表５−３】

【０２３２】
【表２】

【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体の肝障害を処置する方法であって、
肝障害の処置のための活性薬剤（ｂ）に結合した、配列番号１の受容体関連タンパク質（ＲＡＰ）、ＲＡＰフラグメント、および約１〜５ｎＭのＬＲＰ１へのＲＡＰ結合親和性を保持するＲＡＰ変異体からなる群から選択される受容体結合部分（ａ）を含む、有効量の結合体を該被験体に投与することを含む、方法。
【請求項２】
前記結合体の受容体結合部分が、配列番号１のＮ末端から少なくとも２００、および最高２４３までのアミノ酸を欠損しているＲＡＰフラグメントまたは変異体である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記結合体の受容体結合部分が、配列番号１のＮ末端から少なくとも２００、および最高２４３までのアミノ酸を欠損しているＲＡＰフラグメントである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ＲＡＰフラグメントまたは変異体が、配列番号１のＮ末端から２４３のアミノ酸を欠損している、請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
前記ＲＡＰフラグメントまたは変異体が、配列番号１のＣ末端から少なくとも４、
および最高１１のアミノ酸をさらに欠損している、請求項２〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記ＲＡＰフラグメントまたは変異体が、配列番号１のＣ末端から１１のアミノ酸をさらに欠損している、請求項２〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記ＲＡＰフラグメントまたは変異体が、配列番号１の成熟ＲＡＰから１〜１４３および３２０〜３２３のアミノ酸を欠失している、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記ＲＡＰフラグメントまたは変異体が、（ａ）少なくとも長さが７１のアミノ酸であるＲＡＰｄ３（配列番号２）の連続部分を含み、かつ（ｂ）２５６〜２７０のアミノ酸を含む、請求項２〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記受容体結合部分が、長さ約８５未満のアミノ酸であり、配列番号４と少なくとも７０％同一である５０の連続するアミノ酸を含み、かつ約１×１０^−８Ｍ以下のＫｄを有するＬＲＰ１に結合する環状ＲＡＰペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記受容体結合部分がＲＡＰ変異体であり、該ＲＡＰ変異体が配列番号１の天然のＲＡＰと比較して１つ以上の保存的置換を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記受容体結合部分がＲＡＰ変異体であり、該ＲＡＰ変異体が成熟ＲＡＰの２１７、２４９、または２５１の位置のいずれか１つに変異を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＲＡＰ変異体が１つの変異を含み、該変異が酸性アミノ酸の塩基性アミノ酸との置換である、請求項２〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記酸性アミノ酸がＤおよびＥからなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記塩基性アミノ酸がＫおよびＲからなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＲＡＰ変異体が１つの変異を含み、該変異が塩基性アミノ酸の酸性アミノ酸との置換である、請求項２〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記塩基性アミノ酸がＫおよびＲからなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記酸性アミノ酸がＤおよびＥからなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＲＡＰ変異体が１つの変異を含み、該変異がＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、およびＶからなる群から選択されるアミノ酸の、Ｆ、Ｙ、Ｗ、およびＨからなる群から選択されるアミノ酸との置換である、請求項２〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記結合体の前記受容体結合部分が配列番号９に示されるＲＡＰフラグメントまたは変異体である、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＲＡＰ、ＲＡＰフラグメント、またはＲＡＰ変異体、および診断薬剤または治療薬剤がリンカーを介して連結される、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記リンカーがペプチドリンカーである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記受容体結合部分がＲＡＰフラグメントまたはＲＡＰ変異体のオリゴマー組み合わせである、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記結合体が、薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤を含む医薬組成物中に存在する、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記肝障害が、肝癌、肝炎、肝硬変、真菌感染、リケッチア感染または寄生虫感染、アルコール毒素、化学的毒素、薬物毒性に起因する損傷、代謝性肝疾患、突発性自己免疫性肝疾患、胆管閉塞、脂肪肝、胆汁うっ滞、および肝切除後の状態からなる群から選択される、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記肝癌が肝細胞癌からなる群から選択され、前記活性薬剤部分が細胞傷害性化学療法薬剤である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記肝障害が肝臓腫瘍または肝臓内での腫瘍転移であり、そして前記治療薬剤が化学療法薬剤である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記活性薬剤が細胞傷害性薬剤である、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記細胞傷害性薬剤が、塩酸メクロレタミン、シクロホスファミド、イホスファミド、クロラムブシル、メルファラン、ブスルファン、チオテパ、カルムスチン、ロムスチン、ダカルバジン、およびストレプトゾシンからなる群から選択される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記活性薬剤が放射性同位体である、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記放射性同位体が、^１３１Ｉ、^１２５Ｉ、^１１１Ｉｎ、^９０Ｙ、^６７Ｃｕ、^１２７Ｌｕ、^２１２Ｂｉ、^２１３Ｂｉ、^２５５Ｆｍ、^１４９Ｔｂ、^２２３Ｒｄ、^２１３Ｐｂ、^２１２Ｐｂ、^２１１Ａｔ、^８９Ｓｒ、^１５３Ｓｍ、^１６６Ｈｏ、^２２５Ａｃ、^１８６Ｒｅ、^６７Ｇａ、^６８Ｇａ、および^９９ｍＴｃからなる群から選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記肝障害がウイルスに起因する肝炎であり、そして前記治療薬が抗ウイルス剤である、請求項２４に記載の方法。

【図１Ａ】

【図１Ｂ】

【図２】

【図３】

【図４】

【公表番号】特表２０１０−５０３７１０（Ｐ２０１０−５０３７１０Ａ）
【公表日】平成２２年２月４日（２０１０．２．４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５２８５３０（Ｐ２００９−５２８５３０）
【出願日】平成１９年９月１８日（２００７．９．１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０７８７９２
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０３６６８２
【国際公開日】平成２０年３月２７日（２００８．３．２７）
【出願人】（５０８０８００１２）ラプトール　ファーマシューティカル　インコーポレイテッド (3)
【Ｆターム（参考）】