可溶性ＣＥＡに対する抵抗性を有する医薬抗体組成物
本発明は、ヒトにおける上皮腫瘍の治療のための医薬組成物に関し、前記医薬組成物はヒトＣＥＡと特異的に結合するＩｇＧ１抗体を含み、前記ＩｇＧ１抗体の可変領域は、少なくとも（ｉ）アミノ酸配列「ＳＹＷＭＨ」を有するＣＤＲ−Ｈ１と、アミノ酸配列「ＦＩＲＮＫＡＮＧＧＴＴＥＹＡＡＳＶＫＧ」を有するＣＤＲ−Ｈ２と、アミノ酸配列「ＤＲＧＬＲＦＹＦＤＹ」を有するＣＤＲ−Ｈ３、または（ｉｉ）アミノ酸配列「ＴＹＡＭＨ」を有するＣＤＲ−Ｈ１と、アミノ酸配列「ＬＩＳＮＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧ」を有するＣＤＲ−Ｈ２と、アミノ酸配列「ＤＲＧＬＲＦＹＦＤＹ」を有するＣＤＲ−Ｈ３を含む。さらに、前記医薬組成物の製造のためのプロセスならびにヒトＣＥＡ抗原に対して特異性を有するＩｇＧ１抗体分子の医学的／薬学的使用が開示される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、可溶性ＣＥＡに対する抵抗性を有する医薬抗体組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ゴールドおよびフリードマンが最初にヒト結腸癌組織抽出物における腫瘍関連癌胎児性抗原（ＣＥＡ）を記載してから３０年以上が経過した（Gold and Freedman; J. Exp. Med. 122 (1965); 467-481）。
その間、ＣＥＡ遺伝子ファミリーに関連する２８のその他の遺伝子／偽遺伝子が見出された。ＣＥＡ遺伝子ファミリーのメンバーに用いる命名を簡略化するために、該ファミリーは最近「ＣＥＡ関連細胞接着分子」（ＣＥＡＣＡＭ）と改名され、そのメンバーの命名が統一された（Beauchemin, Exp. Cell Res. 252 (1999), 243-249）。例えば、この命名に従って、ヒトＣＥＡ（ＣＤ６６ｅ）はＣＥＡＣＡＭ５と名付けられる。
【０００３】
ヒトＣＥＡ遺伝子ファミリーは、染色体１９ｑ１３．２の上に集まる（Olsen et al., Genomics 23 (1994); 659-668）。その２９遺伝子および偽遺伝子は３つのサブグループ、すなわち、７つの発現遺伝子を含有するＣＥＡサブグループ、１１の発現遺伝子を含有する妊娠特異的糖タンパク質（ＰＳＧ）サブグループおよび偽遺伝子のみを含有する第３のサブグループに分割することができる（Hammarstroem, Sem. Cancer Biol. 9 (1999), 67-81; Beauchemin, Exp. Cell Res. 252 (1999), 243-249）。ＣＥＡのアミノ酸配列および他のファミリーメンバーの解析により、それらが免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーに属することが明らかとなった（Williams and Barclay, Annul. Rev. Immunol. 6 (1988), 381-405）。ＣＥＡサブグループの全てのメンバーは細胞表面膜に付着している。胆汁糖タンパク質（ＣＥＡＣＡＭ１；ＢＧＰ１；ＴＭ−ＣＥＡ；ＣＤ６６ａ）、ＣＥＡ遺伝子ファミリーメンバー１（ＣＥＡＣＡＭ３；ＣＧＭ１；ＣＤ６６ｄ）およびＣＥＡ遺伝子ファミリーメンバー７（ＣＥＡＣＡＭ４；ＣＧＭ７）は疎水性の膜貫通ドメインを有するのに対し、癌胎児性抗原（癌胎児性抗原関連細胞接着分子５；ＣＥＡＣＡＭ５；ＣＥＡ；ＣＤ６６e）、非特異的交差反応性抗原（ＣＥＡＣＡＭ６；ＮＣＡ；ＮＣＡ−５０／９０；ＣＤ６６ｃ）、ＣＥＡ遺伝子ファミリーメンバー２（ＣＥＡＣＡＭ７；ＣＧＭ２）およびＣＥＡ遺伝子ファミリーメンバー６（ＣＥＡＣＡＭ８；ＣＧＭ６；ＣＤ６６ｂ）はグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）脂質部分によって血漿膜と繋がれている。ＣＥＡタンパク質は、Ｉｇドメインの数に応じて約３００ｋＤａまでの分子量で高度にグリコシル化されている。
【０００４】
ＣＥＡタンパク質の生物活性に関して、腫瘍細胞株を用いるインビトロ研究から、胆汁糖タンパク質、ＣＥＡおよび非特異的交差反応性抗原を含むいくつかのＣＥＡサブファミリーは、腫瘍細胞表面に発現すると、同種親和性の異型細胞接着分子として作用することができることが示唆された（Oikawa et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 186 (1992), 881-887；Zhou et al., Cancer Res. 53 (1993), 3817-3822）。より最近には、微生物による攻撃から結腸を守る自然免疫応答におけるＣＥＡおよび非特異的交差反応抗原の可能性のある役割が考察されている（Hammarstroem and Baranov, Trends Microbiol. 9 (2001), p. 119-125）。特に、これらのタンパク質は微生物と結合および捕獲することにより、それらが微絨毛の上皮細胞に到達し、侵入することを防ぐことが提唱されている。
【０００５】
ＣＥＡは、胎児期の間に発現し、健常成人には存在せず、再び癌に発現する癌胎児性抗原であると仮定された。しかし、ＣＥＡは、正常成人組織にも発現する。例えば、胆汁糖タンパク質、ＣＥＡ、非特異的交差反応性抗原およびＣＥＡ遺伝子ファミリーメンバー２は、正常ヒト結腸に、特に腸管内腔に面している成熟した円柱上皮細胞におよび陰窩口（crypt mouth）で高度に分化した細胞に発現する（Fraengsmyr et al., Cancer Res. 55 (1995), 2963-2967；Fraengsmyr et al., Tumor Biol. 20 (1999), 277-292）。より具体的には、これらのタンパク質は、フリーな管腔表面の内側を覆う成熟した結腸細胞の刷子縁多糖外被に局在する。胆汁糖タンパク質、ＣＥＡおよび非特異的交差反応性抗原はまた、多数の上皮性起源の腫瘍にも発現する（Hammarstriem, Sem. Cancer Biol. 9 (1999), 67-81; Shively and Beatty CRC Crit. Rev. Oncol. Hematol. 2 (1985), 355-399）。
【０００６】
既に１９７０年代後半および１９８０年代前半に、ＣＥＡは結腸直腸およびその他の上皮腫瘍の放射免疫学的局在に好まれる標的抗原となった。これは、ＣＥＡが胃腸癌および膵臓癌の９５％に、ならびに大部分の小細胞および非小細胞肺癌腫に過剰発現するという事実に起因する。また、それは乳癌ならびに頭部および頚部の扁平上皮癌にも発現する（Primus et al., Cancer 42 (1978), 1540-1545）。実際に、ＣＥＡは最も広く用いられている臨床腫瘍マーカーの１つである。それは、その安定性、正常成人組織での相当に制限された発現、ならびに上皮性起源の腫瘍での高度な発現のために、結腸直腸癌およびその他のいくつかの癌の血清腫瘍マーカーとして用いられている。健康な個体においてＣＥＡの大半は結腸で産生される。そこでそれは成熟した円柱細胞の頂端膜側から腸管内腔に放出され、糞便の中で消失する。従って、健康な個体からは、血液中に極めて低いレベルしか通常見出されない。例えば、健康な個体の血液中のＣＥＡレベルは２μｇ／ｌ未満である。それに対して、結腸直腸癌およびその他の癌腫の患者からの血清中のＣＥＡレベルは２０００μｇ／ｌを超える範囲まで増加している（Thomson et al., PNAS 64 (1969), 161-167）。特に、進行性、悪性、または後期の上皮腫瘍は、しばしば高い血清濃度の可溶性ＣＥＡを伴う（Fletcher; Ann. Intern. Med. 104 (1986), 66-73）。ＣＥＡを含む血漿膜からの成分は、血漿膜由来小胞のように表面から継続的に剥脱することが知られ（Taylor and Black, J. Natl. Cancer Inst. 74 (1985), 859-866；Sack et al., J Clin Invest. 82 (1988), 586-93）、それはリンパ管および血管を流れて最後に血液に行き着き得る。腫瘍サイズが増大するにつれて、より多くのＣＥＡが血液に蓄積する。腫瘍マーカーとしての血清ＣＥＡ決定の主な用途は、結腸癌の手術後のサーベイランスにある。増加したＣＥＡレベルは、患者のそれぞれ８１％（Minton et al., Cancer 55 (1985), 1284-1290）および８９％（Wanebo et al., Surg. Gynecol. Obstet. 169 (1989), 479-487）において、再発性疾患の最初の指標であった。血清ＣＥＡレベルはまた、予後指標としても用いることができる（Mulcahy and Benson, Curr. Oncol. Rep. 1 (1999), 168-172）。
【０００７】
多くの上皮癌でのその過剰発現に起因して、ＣＥＡは腫瘍マーカーとして用いられるだけでなく、抗腫瘍療法の標的としても用いられる。例えば、胃腸癌は高い割合のヒト上皮腫瘍の原因であり、米国において２００１年の胃癌の新規症例は２１，７００、結腸直腸癌の新規症例は１３５，４００と推定される（Greenlee; CA Cancer J Clin 51 (2001), 15-36）。結腸直腸癌は３番目に頻度の高い悪性腫瘍であり、男性および女性の両方において癌死の３番目の主な原因である（Ries; Cancer 88 (2000), 2398-2424）。これらの腫瘍に対する新規な治療法を見出すために、抗ＣＥＡモノクローナル抗体がＣＥＡ陽性癌の可能性のある治療法として調査されてきた（Murakami et al., Immunol. Invest. 25 (1996), 23-35）。
【０００８】
腫瘍量の少ない患者（低い血清ＣＥＡレベルに相当する）が首尾よく治療を受けるアプローチの一例は、ベアらによって行われた研究である。このアプローチでは、ラベツズマブ（labetuzumab）（ラベツズマブは、ヒト化形態の抗ＣＥＡモノクローナル抗体ＭＮ−１４である；Behr et al., Cancer, 94: 1373-1381, (2002), 1559-64）の131Ｉ標識変異体が、５−フルオロウラシルおよびフォリン酸に、または肝転移後のアジュバント・セッティングに対して化学療法抵抗性の、少量の転移性疾患を有する３０名のＣＲＣ患者が登録された第ＩＩ相試験において分析された。131Ｉ標識ラベツズマブの単回注射が行われた。評価可能な１９名の患者のうち、３名が部分的緩解を有し、８名がわずかな応答を１５ヶ月まで持続して示した。アジュバント・セッティングにおいて、９名のうち７名の患者が３年間まで疾患に罹らなかったのに対して、対照群の再発率は同じ期間で６７％であった。患者の血清ＣＥＡレベルは３．９〜４５ｎｇ／ｍｌの範囲であった（Behr et al., Cancer, 94: 1373-1381, 2002）。ＣＥＡ血清レベルの低い（＜５ｎｇ／ｍｌ）患者を特徴とする別の研究では、131Ｉ−ラベツズマブ（上記引用文中）を用いるＣＥＡの放射免疫療法は、肝臓における結腸直腸癌転移の救済切除（salvage resection）後の生存を向上したことが示された。２３名の患者に４０〜６０ｍＣｉ／ｍ2 131Ｉ−ラベツズマブの用量が投与された。５年生存率は、それぞれ処置群について５１．３％、対照群について７．４％であった（Liersch et al., JCO, 2005, ASCO Proc, Vol 23, No 16S: 3627）。
【０００９】
けれども、高い血清ＣＥＡ濃度に対応する治療的アプローチは、しばしば低いかまたは全くない抗腫瘍応答という結果をもたらした。例えば、ウォン（Clin. Cancer Res. 6 (2000): 3855-3863）は、転移性ＣＥＡを産生する悪性腫瘍を有する患者において前記抗体を評価するために、第Ｉ相放射免疫治療試験において、ＣＥＡに対して高い親和特異性を有する、遺伝子操作された90Ｙ標識ヒト／マウスキメラＩｇＧ Ｔ８４．６６抗体を用いた。２２名の患者が、111Ｉｎ標識抗体に続いて90Ｙ標識キメラ抗体の診断投与からなる１回の治療サイクルを受けた（３名の患者だけが２〜３サイクルを受けた）。主な抗腫瘍応答は見出されなかった。１６名の患者はヒト抗キメラ抗体（ＨＡＣＡ）を生じた。この研究に登録した患者における可溶性ＣＥＡレベルの範囲は１４．８〜１０２７ｎｇ／ｍｌ（中央値９７ｎｇ／ｍｌ）であった。追跡調査では、同じ抗体を５−フルオロ−ウラシル（５−ＦＵ）との併用療法に用いた。この第Ｉ相併用試験では、２１名の化学療法抵抗性の転移性結腸直腸癌患者に５−ＦＵおよび90Ｙ−ｃＴ８４．６６が投与された。客観的反応は観察されなかった。平均血清ＣＥＡレベルは２２７．４ｎｇ／ｍｌであり、＜２．５〜１３０５ｎｇ／ｍｌの範囲であった（Wong, Clin Cancer Res, 9 (2003): 5842-5852）。ハヤールらによる別の研究では、ヨウ素−１３１−標識ヒト化ＭＮ−１４抗ＣＥＡモノクローナル抗体が転移性胃腸および結腸直腸癌患者において評価された。この第Ｉ相試験では、２１名の患者が、事前の外部照射後または標準的な化学療法後のいずれかに抗体で処置された。２１名のうち７名の患者がヒト抗ヒト抗体（ＨＡＨＡ）を有したが、有害作用はなかった。抗腫瘍応答は観察されなかった。この場合もやはり、上昇した血漿ＣＥＡレベルが抗ＣＥＡ抗体アプローチの治療効果を妨げることが見出された（Hajjar et al., Clin Colorectal Cancer, 2 (2002), 31-42）。
【発明の開示】
【００１０】
上に述べた課題を考慮すると、進行性、悪性、または後期上皮腫瘍のための効果的な治療法のための手段および方法の提供が大いに望まれる。
【００１１】
従って、本発明の一態様は、ヒトにおける上皮腫瘍の治療のための医薬組成物に関し、前記医薬組成物はヒトＣＥＡと特異的に結合するＩｇＧ１抗体を含み、前記ＩｇＧ１抗体の可変領域は少なくとも、
（ａ）アミノ酸配列「ＳＹＷＭＨ」（配列番号２９）を有するＣＤＲ−Ｈ１と、アミノ酸配列「ＦＩＲＮＫＡＮＧＧＴＴＥＹＡＡＳＶＫＧ」（配列番号２８）を有するＣＤＲ−Ｈ２と、アミノ酸配列「ＤＲＧＬＲＦＹＦＤＹ」（配列番号２７）を有するＣＤＲ−Ｈ３、および
（ｂ）アミノ酸配列「ＴＹＡＭＨ」（配列番号３１）を有するＣＤＲ−Ｈ１と、アミノ酸配列「ＬＩＳＮＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧ」（配列番号３０）を有するＣＤＲ−Ｈ２と、アミノ酸配列「ＤＲＧＬＲＦＹＦＤＹ」（配列番号２７）を有するＣＤＲ−Ｈ３
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。
【００１２】
アミノ酸配列「ＤＲＧＬＲＦＹＦＤＹ」（配列番号２７）は、マウスモノクローナル抗体Ａ５Ｂ７のＣＤＲ−Ｈ３のKabatの位置９５〜１０２に相当する（Chester, Int. J. Cancer 57 (1994), 67-72; Harwood, Br J Cancer. 54 (1986), 75-82）。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明の医薬組成物の好ましい実施形態では、本明細書に定義されるＩｇＧ１抗体の前記可変領域は、アミノ酸配列「ＴＬＲＲＧＩＮＶＧＡＹＳＩＹ」（配列番号３４）を有するＣＤＲ−Ｌ１および／またはアミノ酸配列「ＹＫＳＤＳＤＫＱＱＧＳ」（配列番号３３）を有するＣＤＲ−Ｌ２および／またはアミノ酸配列「ＭＩＷＨＳＧＡＳＡＶ」（配列番号３２）を有するＣＤＲ−Ｌ３を含む。
【００１４】
ＣＤＲの決定は当業者に公知である；例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓ／＃ｃｄｒｉｄ参照。抗体中のアミノ酸配列の番号付けは、例えば、当分野に記載されるKabatの番号付けスキームに従って行ってよい；例えば、Kabat, E.A., T.T.Wu, H.M.Perry, K. S. Gottesman, and C. Foeller.1991. Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed. Bethesda, Md.: National Center for Biotechnology Information, National Library of Medicine参照。
【００１５】
本発明は、その血清／血漿中の可溶性ＣＥＡ濃度の高い患者における上皮腫瘍の治療に特に適した手段および方法を提供する。このような高い可溶性ＣＥＡ濃度は、進行性腫瘍、再発性、転移性、後期腫瘍を有する上皮腫瘍患者および腫瘍量の多い患者の血清／血漿に見出される。上記に定義される可変領域を含むヒトＣＥＡと特異的に結合するＩｇＧ１抗体は、ＣＥＡ陽性の標的細胞と結合するだけでなく、可溶性ＣＥＡとも結合することが見出されている；本発明の実施例５参照。驚くことに、可溶性ＣＥＡと結合するにもかかわらず、本発明のＩｇＧ１抗体は、高い濃度の可溶性ＣＥＡの存在下でさえもＣＥＡを有する腫瘍細胞を死滅させる。言い換えれば、前記ＩｇＧ１抗体構築物は、可溶性ＣＥＡによって、ＣＥＡ陽性の腫瘍細胞に対するそれらの細胞障害活性（抗体依存性細胞障害活性；ＡＤＣＣ）を阻害されない。例えば、実施例５は、漸増量の可溶性ＣＥＡ抗原の存在下での、上記に定義されるＣＥＡ反応性のＩｇＧ１抗体構築物のＫａｔｏ ＩＩＩ細胞（ＣＥＡ陽性のヒト胃癌腫細胞株）に対する細胞障害活性を示す。従って、本明細書に定義されるＩｇＧ１抗体に媒介される細胞障害活性は可溶性ＣＥＡに抵抗性である。本明細書に定義される本発明のＩｇＧ１抗体は、マウスモノクローナル抗体Ａ５Ｂ７のKabatの位置９５〜１０２に相当するＣＤＲ−Ｈ３「ＤＲＧＬＲＦＹＦＤＹ」（配列番号２７）アミノ酸配列を含む上記のＣＤＲ−Ｈ領域を有する可変領域を含む（Chester；Harwood；上記引用文中）。このモノクローナル抗体はまた、膜結合と可溶性ＣＥＡの両方と結合する（自己データ）。アミノ酸配列「ＤＲＧＬＲＦＹＦＤＹ」は、本明細書に定義されるヒト化抗ＣＥＡ ＩｇＧ１抗体の可変領域で用いられる場合、可溶性ＣＥＡに対する抵抗性を媒介することが見出された；実施例５参照。
【００１６】
その一方、実施例２に示されるように、ｈｕＩｇＧ１ ＣＥＡ ＩＩに媒介される細胞障害活性は、漸増量の可溶性ＣＥＡにより阻害される。ｈｕＩｇＧ１ ＣＥＡ ＩＩの可変領域は、ｍＡｂ Ｔ８４．６６に由来する（Neumaier, Cancer Res. 50 (1990), 2128-2134）。ｈｕＩｇＧ１ ＣＥＡ ＩＩは可溶性ＣＥＡと結合することが見出されているので、可溶性ＣＥＡ抗原は、抗体がその抗体に媒介される細胞障害活性を発揮することを阻止するということが結論付けられた。Ｔ８４．６６由来のＩｇＧ１構築物について得られた結果を鑑みると、可溶性ＣＥＡがＡ５Ｂ７由来の抗体構築物において細胞障害活性を阻害しないことは予測されなかった。より具体的に言えば、可溶性ＣＥＡ抗原に対する抵抗性は、その可変領域がマウスモノクローナル抗体Ａ５Ｂ７のＣＤＲ−Ｈ３のアミノ酸配列「ＤＲＧＬＲＦＹＦＤＹ」を含むＩｇＧ１抗体についてのみ、見出すことができた（Chester、上記引用文中；Harwood, Br J Cancer. 54 (1986), 75-82）。
【００１７】
上記に示したように、ヒトにおけるＣＥＡを有する上皮腫瘍に対して向けられる多くの治療的アプローチは、癌患者の血漿中の高いレベルの可溶性ＣＥＡ抗原の存在により著しく妨害される。可溶性ＣＥＡ抗原は、しばしば進行性腫瘍、再発性癌、転移性腫瘍、大きい腫瘍量、または後期腫瘍の癌患者の血清中に高い濃度で存在し、ＣＥＡ陽性の腫瘍細胞に対して向けられる治療薬を阻害し、従って腫瘍細胞認識および破壊を妨げる。従って、腫瘍に到達する治療薬の実際量は減少し、その結果低下した低い抗腫瘍活性をもたらすか、または実に抗腫瘍活性を全くもたらさない。この制限は、今までのところ、例えば、治療的な腫瘍細胞の相互作用を妨げるとは思われない可溶性ＣＥＡ抗原を非常に低い血清レベルで有する患者に対する抗体に基づくアプローチを制限する。現在のＣＥＡ特異的Ｉｇ分子を用いる治療的アプローチは、高い血清レベルの可溶性ＣＥＡを有する患者において抗腫瘍活性を示さない。
【００１８】
本発明において、腫瘍細胞に対して向けられる細胞障害（ＡＤＣＣ）活性が、さらに高い濃度の可溶性ＣＥＡ抗原に抵抗性である、ヒトＣＥＡに対する特異性を有する抗体治療薬を生成することが可能であることが見出された。この知見は、本発明のＩｇＧ１抗体が可溶性ＣＥＡ抗原と結合するという事実（実施例５参照）を考えると全く予想外である。それにもかかわらず、本明細書に定義されるＩｇＧ１抗体は、腫瘍細胞に対するそれらの細胞障害活性においてさらに高いレベルの可溶性ＣＥＡの存在に抵抗性である。従って、本発明は、（例えば腫瘍進行中に）観察される血漿中の可溶性ＣＥＡ濃度の高い腫瘍患者の治療に、再発性癌に、転移に、腫瘍量が多い患者に、または後期腫瘍に特に適した手段および方法を提供する。
【００１９】
この知見を鑑みると、以下の本発明の医薬組成物中のＩｇＧ１抗体は、可溶性ＣＥＡ抗原に対して抵抗性であるとみなされる。用語「可溶性ＣＥＡ抗原に対する抵抗性」、「可溶性ＣＥＡに対して抵抗性である」（または関連語）は、本明細書において、前記ＩｇＧ１抗体により媒介されるＣＥＡ陽性の腫瘍細胞に対する細胞障害活性が、漸増濃度の可溶性ＣＥＡにより影響されないという事実を指す。特に、細胞障害活性は、さらに高い濃度の可溶性ＣＥＡにより阻害されない。上記に示したように、健康な個体の血液中のＣＥＡレベルは２ｎｇ／ｍｌ未満である。腫瘍患者の血清／血漿中の可溶性ＣＥＡ濃度が高いことは、進行性腫瘍、再発性腫瘍、転移性腫瘍、または後期腫瘍、さらに腫瘍量の多い患者の特徴である。従って、本発明は、その血漿中にこのような高い可溶性ＣＥＡ濃度を有する上皮腫瘍患者の治療に特に適した手段および方法を提供する。用語「高い可溶性ＣＥＡ濃度」は、本明細書において、１０、２０、５０、７０、８０、９０または１００ｎｇ／ｍｌよりも高い可溶性の血清／血漿ＣＥＡ濃度を示す。血清／血漿ＣＥＡ濃度は、特に、ＥＬＩＳＡ法により測定されてよい。好ましくは、 前記可溶性血清／血漿ＣＥＡ濃度は、例えばＥＬＩＳＡで測定して１００ｎｇ／ｍｌよりも高い。ＣＥＡ血清中濃度は、例えばＣＥＡ ＥＬＩＳＡアッセイにより測定することができる（例えば、IBL CEA EIA、IBL Hamburg,Germany参照）。
【００２０】
本発明によれば、用語「医薬組成物」は、ヒト患者への投与のための組成物に関する。好ましくは、医薬組成物は、担体、安定剤および／または賦形剤からなる適した製剤を含む。好ましい実施形態では、医薬組成物は、非経口、経皮、管腔内、動脈内、くも膜下腔内および／または鼻腔内投与のための、または組織への直接注射による組成物を含む。前記組成物は、注入または注射によって患者へ投与されることが特に想定される。適した組成物の投与は、様々な方法によって、例えば、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、局所または皮内投与によって達成されてよい。本発明の組成物は、製薬上許容される担体をさらに含んでよい。適した医薬担体の例は当分野で周知であり、それにはリン酸緩衝生理食塩水溶液、水、様々な種類の湿潤剤、滅菌溶液、リポソームなどが含まれる。このような担体を含む組成物は、周知の従来法によって処方されてよい。これらの組成物は、被験体に適した用量で投与することができ、それは、本明細書に記載される可溶性血清ＣＥＡ抗原に対して抵抗性を示すＩｇＧ１抗体の漸増用量の投与による用量漸増試験により決定することができる。上記に示したように、本明細書に記載される、可溶性血清ＣＥＡ抗原に対する抵抗性を有するＩｇＧ１抗体は、高いＣＥＡ血清中濃度を有する癌患者、例えば、進行性腫瘍、再発性癌、転移性腫瘍、腫瘍量の大きな腫瘍、または後期腫瘍の治療に有利に用いることができる。これらの組成物はまた、その他のタンパク質性および非タンパク質性薬剤と組み合わせて、例えば併用療法（co-therapy）の形で投与することができる。これらの薬剤は、本明細書に定義されるＩｇＧ１抗体を含む組成物と同時に投与してもよいし、前記ＩｇＧ１抗体の投与の前後に適時に定められた間隔および用量で別々に投与してもよい。投与計画は主治医および臨床学的要因により決定される。医学分野で周知のように、任意の患者一人への投薬量は多くの要因によって決まり、それには患者の大きさ、体表面積、年齢、投与される特定の化合物、性別、投与時間および経路、全体的な健康状態、および同時に投与されるその他の薬剤が含まれる。非経口投与のための製剤としては、滅菌水溶液または非水溶液、および懸濁液が挙げられる。非水溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、および注射用の有機エステル類、例えばオレイン酸エチルである。水性担体としては、水、水溶液、または生理食塩水および緩衝媒体を含む懸濁液が挙げられる。非経口媒体としては、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、または乳酸化リンゲル液が挙げられる。静脈内媒体としては、液体および栄養素補充液、電解質補充液（リンゲルデキストロースに基づくものなど）などが挙げられる。防腐剤およびその他の添加剤も存在してよく、例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、不活性ガスなどが挙げられる。さらに、本発明の組成物は、例えば、好ましくはヒト起源の血清アルブミンまたは免疫グロブリンなどのタンパク質性担体を含んでもよい。併用療法は、本明細書に定義されるＩｇＧ１抗体に加えて、組成物の意図される使用によって、さらなる生物活性物質を含むことが想定される。このような物質は、胃腸管系に作用する薬剤、抗悪性腫瘍薬として作用する薬剤、化学療法薬、細胞増殖抑制剤（cytostatica）、高尿酸血症を予防する薬剤、免疫反応を阻害する薬剤（例えばコルチコステロイド）、炎症応答を調節する薬剤、循環系に作用する薬剤および／またはサイトカインなどの当分野で公知の薬剤であってよい。
【００２１】
好ましくは、本明細書に定義されるＩｇＧ１抗体は、緩衝液、安定剤および界面活性剤中に処方される。緩衝液は、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、コハク酸緩衝液または酢酸緩衝液であってよい。安定剤は、アミノ酸および／または糖であってよい。界面活性剤は、合成洗剤、ＰＥＧなどであってよい。より好ましくは、本明細書に定義されるＩｇＧ１抗体は、クエン酸塩、リシン、トレハロースおよびＴｗｅｅｎ８０中に処方される。本発明の医薬組成物の希釈液として、等張生理食塩水およびＴｗｅｅｎ８０が好ましい。
【００２２】
本明細書において、「抗体」は、免疫グロブリン分子、すなわち抗原、好ましくはヒトＣＥＡと免疫特異的に結合する抗原結合部位を含む分子を示す。全ての抗体は同じ方法で構築される。それらは対になった重および軽ポリペプチド鎖を形成し、免疫グロブリンという総称はこのようなタンパク質全てに用いられる。しかし、この一般的なカテゴリーの中で、５つの異なるクラスの免疫グロブリン（ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＥ）を、それらのＣ領域により識別することができる。ＩｇＧ抗体は大きな分子で、分子量は約１５０ｋＤａであり、２つの異なる種類のポリペプチド鎖からなる。その約５０ｋＤａの一方は、重鎖またはＨ鎖と称され、２５ｋＤａのもう一方は、軽鎖またはＬ鎖と称される。各ＩｇＧ分子は２本の重鎖と２本の軽鎖からなる。２本の重鎖は互いにジスルフィド結合によって連結され、各重鎖はジスルフィド結合によって軽鎖と連結されている。どのような任意の免疫グロブリン分子においても、２本の重鎖と２本の軽鎖は同一であり、抗体分子に２つの同一の抗原結合部位をもたらし、従って同時に２つの同一構造と結合する能力をもたらす。λおよびκと称される２種類の軽鎖が抗体中に見出される。λ鎖またはκ鎖のいずれかを有する所与の免疫グロブリンは、２本とも同じものである。λまたはκ軽鎖を有する抗体間で機能的な差は見出されず、いずれの種類の軽鎖も５つの主なクラスのいずれかの抗体に見出すことができる。２種類の軽鎖の比は種ごとに異なる。マウスでは、平均のκ：λ比は２０：１であり、それに対してヒトでは２：１、さらにウシでは１：２０である。この変異の理由は不明である。一方、クラス、および従って抗体のエフェクター機能は、その重鎖の構造により定義される。５つの主な重鎖クラスまたはアイソタイプがあり、その一部はいくつかのサブタイプを有し、これらが抗体分子の機能活性を決定する。免疫グロブリンの５つの主なクラスは、免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）、免疫グロブリンＤ（ＩｇＤ）、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）、免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）、および免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）である。それらの重鎖は対応する小文字のギリシャ文字（それぞれμ、δ、γ、α、およびε）で示される。ＩｇＧは群を抜いて最も豊富な免疫グロブリンであり、いくつかのサブクラス（ヒトにおいてＩｇＧ１、２、３、および４）を有する。それらの独特の機能特性は、軽鎖と関連しない、重鎖のカルボキシ末端部分により与えられる。全てのアイソタイプの一般的な構造上の特徴は類似している。血漿中で最も豊富なアイソタイプであるＩｇＧ抗体の構造を、典型的な抗体分子として図１に例示する。
【００２３】
好ましくは、本明細書に定義される抗体はＩｇＧ抗体である。当分野で周知のように、ＩｇＧは、高度に差別的な抗原認識および結合を担う抗体可変領域だけでなく、通常内因的に産生された抗体中に存在する抗体ポリペプチドの重鎖および軽鎖の定常領域を含み、一部の例では、炭水化物を含む１またはそれ以上の部位での修飾までも含む。このようなグリコシル化は一般にＩｇＧ型の顕著な特徴であり、これらの定常領域の部分は、インビボで様々なエフェクター機能、例えば抗体依存性細胞障害活性（ＡＤＣＣ）などを引き出すことが知られている完全抗体（full antibody）のいわゆるＦｃ領域を構成する。さらに、Ｆｃ領域はＩｇＧとＦｃ受容体の結合を媒介し、従ってインビボでの半減期を長くすると同時にＦｃ受容体の存在の増加した位置へのＩｇＧのホーミングを促進する。有利には、ＩｇＧ抗体は、ヒトＣＥＡ抗原と特異的に結合するＩｇＧ１抗体（それらのインビボでの作用機序は特に十分理解され、特徴づけられているために好まれる型である）である。これは特にＩｇＧ１抗体の場合である。
【００２４】
本明細書において称されるＩｇＧ１抗体は、上記に定義される可変領域を、ヒンジ領域、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３ドメインおよびＣＬドメインの全部または一部と併せて含む；例えば図１参照。一般に、可変領域において、ＶＨドメインはＶＬドメインと対になって抗体の抗原結合部位を提供する。好ましくは、（ｉ）アミノ酸配列「ＳＹＷＭＨ」（配列番号２９）を有するＣＤＲ−Ｈ１と、アミノ酸配列「ＦＩＲＮＫＡＮＧＧＴＴＥＹＡＡＳＶＫＧ」（配列番号２８）を有するＣＤＲ−Ｈ２と、マウスモノクローナル抗体Ａ５Ｂ７のＣＤＲ−Ｈ３のKabatの位置９５〜１０２に相当するアミノ酸配列「ＤＲＧＬＲＦＹＦＤＹ」（配列番号２７）を有するＣＤＲ−Ｈ３、または（ｉｉ）アミノ酸配列「ＴＹＡＭＨ」（配列番号３１）を有するＣＤＲ−Ｈ１と、アミノ酸配列「ＬＩＳＮＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧ」（配列番号３０）を有するＣＤＲ−Ｈ２と、マウスモノクローナル抗体Ａ５Ｂ７のＣＤＲ−Ｈ３のKabatの位置９５〜１０２に相当するアミノ酸配列「ＤＲＧＬＲＦＹＦＤＹ」（配列番号２７）を有するＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメインは、アミノ酸配列「ＴＬＲＲＧＩＮＶＧＡＹＳＩＹ」（配列番号３４）を有するＣＤＲ−Ｌ１と、アミノ酸配列「ＹＫＳＤＳＤＫＱＱＧＳ」（配列番号３３）を有するＣＤＲ−Ｌ２と、アミノ酸配列「ＭＩＷＨＳＧＡＳＡＶ」（配列番号３２）を有するＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインと、言及されるＶＨドメインのうちの１つと前記ＶＬドメインを含む抗体の抗原結合部位が形成されるように対となる。本明細書に定義される抗ＣＥＡ ＩｇＧ１抗体は、げっ歯類抗体（すなわち、マウスまたはラット起源）である。好ましくは、前記ＩｇＧ１抗体は、下記により詳細に示されるように、ヒト化抗体である。
【００２５】
本発明によれば、Ｉｇ由来抗原の相互作用と関連して用いられる、用語「結合ドメイン」または「可変領域」は、抗体、抗体断片またはその誘導体に由来する１つのＣＤＲを少なくとも含むポリペプチドの断片および誘導体を含む。本発明により、本明細書に定義されるＩｇＧ１抗体のヒトＣＥＡと特異的に結合する結合ドメインは、少なくとも１つのＣＤＲ、好ましくはＣＤＲ−Ｈ３、より好ましくはＡ５Ｂ７のＣＤＲ−Ｈ３のKabatの位置９５〜１０２に相当するアミノ酸配列「ＤＲＧＬＲＦＹＦＤＹ」（配列番号２７）を含むマウスモノクローナル抗体Ａ５Ｂ７のＣＤＲ−Ｈ３を含むことが想定される。以下の実施例に示されるように、前記ｍＡｂ Ａ５Ｂ７由来ＣＤＲ−Ｈ３「ＤＲＧＬＲＦＹＦＤＹ」（配列番号２７）アミノ酸配列を含む、本明細書に定義されるＩｇＧ１抗体の腫瘍細胞に対する細胞障害活性は、可溶性ＣＥＡ抗原に対して抵抗性があり、それにより、その血漿中の血清ＣＥＡ濃度の高い腫瘍患者の治療を可能にする。
【００２６】
本明細書において、「ヒト」とは、種Homo sapiensを指す。「ヒト」分子、例えばヒトＣＥＡは、従って、Homo sapiensにおいて天然に発現するその分子の変異体である。
【００２７】
用語「上皮腫瘍」とは、本明細書において、ＣＥＡ陽性である上皮性起源の腫瘍を意味する（Cancer Medicine;6th ed.; Kufe, Donald W.; Pollock, Raphael E.; Weichselbaum, Ralph R.; Bast, Robert C., Jr.; Gansler, Ted S.; Holland, James F.; Frei III, Emil., editors. Hamilton (Canada): BC Decker Inc. 2003;http://www.dkfz.de: HYPERLINK "http://www.krebsinformationsdienst.de/Krebsarten/index.html" http://www.krebsinformationsdienst.de/Krebsarten/index.html）。治療し得る上皮腫瘍は、胃腸腺癌、乳腺腺癌または肺腺癌である。前記胃腸腺癌は、好ましくは結腸直腸腺癌、膵臓腺癌、食道腺癌または胃腺癌である。本明細書に示されるように、本発明の医薬組成物は、腫瘍患者の血清／血漿中の高レベルの可溶性ＣＥＡ抗原を特徴とする、進行性腫瘍、転移、再発性癌、後期上皮腫瘍、上皮腫瘍量の多い患者、またはＣＥＡ血清中濃度が１００ｎｇ／ｍｌより高い腫瘍患者（例えばＥＬＩＳＡにより測定）の治療に特に有利である。前記医薬組成物が原発腫瘍の外科切除の後に投与されることも本発明の範囲内である。例えば、ＣＥＡ産生上皮腫瘍に由来する散在性の（disseminated）残存腫瘍細胞も、ＣＥＡをそれらの微小環境に流し、その周囲では可溶性ＣＥＡのレベルが高い。従って、本明細書に定義されるＩｇＧ１抗体の細胞障害活性の可溶性ＣＥＡに対する抵抗性は、最小残存病変の治療にも有利である。従って、本明細書に定義されるＩｇＧ１抗体は、残りの腫瘍細胞を死滅させるために、（ＣＥＡ源、すなわち原発腫瘍の除去によって）血清ＣＥＡレベルの低下する期間に投与し得ることが想定される。または、本明細書に定義されるＩｇＧ１抗体は、二次性腫瘍または転移の形成によって血清ＣＥＡレベルが増大する場合に、原発腫瘍の除去後に有用であり得る。ＣＥＡ血清中濃度は、例えばＣＥＡ ＥＬＩＳＡアッセイ（例えばＩＢＬ ＣＥＡ ＥＩＡ、ＩＢＬ Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ参照）により決定することができる。上記に示したように、多くの抗体に基づく治療的アプローチにおいて、前記血清ＣＥＡは、抗体と腫瘍細胞上の膜結合ＣＥＡの結合を阻害し、抗体の活性を遮断し、それにより抗腫瘍療法の成功を悪化させる。
【００２８】
本明細書において、用語「特異的に結合する」または「特異的結合」または「〜との／〜に対する特異的反応性」などの関連表現は、本明細書に定義されるＩｇＧ１抗体の結合ドメインの、可能な結合パートナーとしての複数の異なる分子のプールから、前記それぞれの第１および／または第２の分子にのみ結合する、あるいは有意に結合する程度まで第１および／または第２の分子を識別する能力を指す。このような結合測定は、例えばＢｉａｃｏｒｅ装置で、ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ分析などにより日常的に行うことができる。より具体的には、本明細書に定義されるＩｇＧ１抗体の結合ドメインは、下記に示すように、上皮腫瘍抗原、すなわち、ヒトＣＥＡ（癌胎児性抗原、癌胎児性抗原関連細胞接着分子５；ＣＥＡＣＡＭ５；ＣＤ６６ｅ）と結合する。用語「特異的結合」は、本発明によれば、ＩｇＧ１抗体分子が本明細書に定義されるヒトＣＥＡの少なくとも２、３、４、５、６、７、８、またはさらにそれより多くのアミノ酸と特異的に相互作用かつ／または結合できることを意味する。前記用語は、抗体分子の特異性、すなわち、本明細書に定義されるヒトＣＥＡ抗原の特定の領域を識別するその能力に関する。抗原相互作用部位とその特異的抗原との特異的相互作用は、例えば抗原の立体構造の変化の誘導、抗原のオリゴマー化などに起因する、シグナルの開始をもたらし得る。さらに、前記結合は、「キーロックの原則（key-lock-principle）」という特異性に例証され得る。従って、抗原相互作用部位および抗原のアミノ酸配列中の特異的モチーフは、それらの一次、二次または三次構造の結果ならびに前記構造の二次修飾の結果として相互に結合する。抗原相互作用部位のその特異的抗原との特異的相互作用は、さらに前記部位と抗原との結合をもたらし得る。
【００２９】
抗体の「特異的結合」は、主に２つのパラメータ：定性的パラメータ（結合エピトープ、すなわち抗体が結合する場所）および定量的パラメータ（結合親和性、すなわちそれが結合する場所でどの程度強く結合するか）に特徴付けられる。どのエピトープが抗体によって結合されるかは、例えば公知のＦＡＣＳ方法論、ペプチドスポットエピトープマッピング、質量分析またはペプチドＥＬＩＳＡにより有利に決定することができる。特定のエピトープと結合している抗体の強度は、例えば公知のＢｉａｃｏｒｅおよび／またはＥＬＩＳＡ法により有利に決定することができる。このような技法を組み合わせることにより、結合特異性の代表的な尺度としてのシグナル対ノイズ比の算出が可能となる。そのようなシグナル対ノイズ比では、シグナルは注目されるエピトープと結合する抗体の強度を表すのに対して、ノイズは注目されるエピトープとは異なる他の非関連エピトープと結合する抗体の強度を表す。好ましくは、注目されるエピトープに対するシグナル:ノイズ比（注目されるエピトープと異なるその他のエピトープに対するものより約５０倍高い）は、評価される抗体が注目されるエピトープと特異的な方法で結合する指標として考えることができる、言い換えれば「特異的結合剤」である。
【００３０】
本発明に従って用いられる用語「特異的結合」または「特異的相互作用」は、ＩｇＧ１抗体構築物が類似構造のポリペプチドと交差反応しないか、または本質的に交差反応しないことを意味する。研究中の抗体構築物のパネルの交差反応は、例えば、注目されるポリペプチドならびに程度の差はあるが（構造的かつ／または機能的に）密接に関連した多数のポリペプチドとの、従来条件下で抗体構築物の前記パネルの結合（例えば、Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988 ならびに Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999参照）を評価することにより試験することができる。例えば、本明細書に定義されるＩｇＧ１抗体の結合ドメインが、ヒトＣＥＡ（癌胎児性抗原；ＣＥＡＣＡＭ５；ＣＥＡ；ＣＤ６６ｅ）、すなわち可溶性ＣＥＡと膜結合ＣＥＡの双方と結合することは本発明の範囲内であるが、それに対して、その他のＣＥＡファミリーメンバー、例えば胆汁糖タンパク質（ＣＥＡＣＡＭ１；ＢＧＰ１；ＴＭ−ＣＥＡ；ＣＤ６６ａ）と結合しているＩｇＧ１抗体は、前記範囲から除外される。
【００３１】
抗原相互作用部位と特異的抗原との特異的相互作用の例は、その受容体のリガンドの特異性を含む。前記定義は、特にその特異的な受容体との結合の際にシグナルを誘導するリガンドの相互作用を含む。対応するリガンドの例は、その特異的なサイトカイン受容体と相互作用／結合するサイトカインを含む。また、前記定義により特に含まれるものは、抗原相互作用部位と、セレクチンファミリー、インテグリンおよびＥＧＦなどの成長因子のファミリーの抗原などの抗原との結合である。前記相互作用の別の例（それも前記定義により特に含まれる）は、抗原決定基（エピトープ）と抗体の抗原結合部位の相互作用である。
【００３２】
用語「〜と結合／相互作用する」もまた、立体構造エピトープ、構造エピトープまたはヒト標的分子、すなわちヒトＣＥＡの２つの領域からなる不連続エピトープまたはその部分に関連する。本発明の文脈において、立体構造エピトープは、ポリペプチドが折りたたまれて未変性タンパク質となる際に分子の表面上に集まる一次配列において分離した２またはそれ以上の別個のアミノ酸配列により定義される（Sela、(1969) Science 166, 1365 およびLaver, (1990) Cell 61, 553-6）。
【００３３】
用語「不連続エピトープ」とは、本発明の文脈において、ポリペプチド鎖の離れた部分の残基から構築される非直線状エピトープを意味する。これらの残基は、ポリペプチド鎖が三次元構造に折りたたまれて立体構造／構造エピトープを構成する際に分子の表面上に集まる。
【００３４】
「ＣＥＡ」とは、上皮性起源の多数の腫瘍に発現した抗原である、癌胎児性抗原（癌胎児性抗原関連細胞接着分子５；ＣＥＡＣＡＭ５；ＣＥＡ；ＣＤ６６ｅ）を意味する（Hammarstroem, Sem. Cancer Biol. 9 (1999), 67-81; Shively and Beatty CRC Crit. Rev. Oncol. Hematol. 2 (1985), 355-399）。ヒトＣＥＡのアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００４３６３に表され、配列番号３７を含む。
【００３５】
本発明において、驚くことに、ヒトＣＥＡに対して特異性を有する抗体に基づく治療薬を生成することが可能であり、腫瘍細胞に対して向けられる細胞障害活性（ＡＤＣＣ）がさらに高い濃度の可溶性ＣＥＡ抗原に対して抵抗性であることが見出された。この知見は、本明細書に定義されるＩｇＧ１抗体が可溶性ＣＥＡ抗原と結合するという事実を考えると全く予期されないものである。例えば、モノクローナル抗体Ｔ８４．６６に由来するＩｇＧ１抗体構築物が作製される場合、これらの抗体は可溶性ＣＥＡ抗原に感受性が高かった、すなわちそれらの細胞障害活性（ＡＤＣＣ）は可溶性ＣＥＡ抗原の存在下で遮断されていた。これらの構築物はまた、可溶性ＣＥＡとの結合が可能であることが見出されている。このことを考えて、可溶性ＣＥＡ抗原は、抗体がその細胞障害活性を発揮することを妨げると結論付けられた。その一方、本明細書に定義されるＩｇＧ１抗体は、腫瘍細胞に対するそれらの細胞障害活性においてさらに高いレベルの可溶性ＣＥＡの存在に対して抵抗性である。さらにより驚くことには、マウスモノクローナル抗体Ａ５Ｂ７のＣＤＲ−Ｈ３のKabatの位置９５〜１０２に相当するアミノ酸配列「ＤＲＧＬＲＦＹＦＤＹ」（配列番号２７）は、ヒトＩｇＧ１抗体のヒトＣＥＡ結合ドメイン（すなわち、ヒトＣＥＡと特異的に結合するヒト結合ドメイン）に用いられる場合、可溶性ＣＥＡ抗原に対する抵抗性を媒介するのに十分であることが見出された。それらがヒト起源であることに起因して（「ＤＲＧＬＲＦＹＦＤＹ」アミノ酸配列は除く）、前記構築物はヒト腫瘍患者に投与すると免疫原性が低いかまたはない。要約すれば、本明細書に定義されるＩｇＧ１抗体を含む医薬組成物は、例えば腫瘍の進行中、再発性癌、転移、腫瘍量の多い患者、または後期腫瘍に観察される、血漿中の可溶性ＣＥＡ濃度の高い上皮腫瘍患者の治療に特に有用である。本明細書に定義されるこのようなＩｇＧ１抗体は、当分野に記載される方法により、例えばファージディスプレイに基づく技法により作製することができる；以下の実施例も参照されたい。
【００３６】
本明細書に定義されるＩｇＧ１抗体のヒトＣＥＡと特異的に結合する結合ドメインは、少なくとも１つのＣＤＲ、好ましくはＣＤＲ−Ｈ３、より好ましくは、Kabatの位置９５（「Ｄ」、アスパラギン酸）、９６（「Ｒ」；アルギニン）、９７（「Ｇ」；グリシン）、９８（「Ｌ」；ロイシン）、９９（「Ｒ」；アルギニン）、１００（「Ｆ」；フェニルアラニン）、１００ａ（「Ｙ」；チロシン）、１００ｂ（「Ｆ」；フェニルアラニン）、１０１（「Ｄ」；アスパラギン酸）、および１０２（「Ｙ」；チロシン）にそれぞれ相当するアミノ酸配列「ＤＲＧＬＲＦＹＦＤＹ」（配列番号２７）を含むマウスモノクローナル抗体Ａ５Ｂ７のＣＤＲ−Ｈ３の一部分または完全なＣＤＲ−Ｈ３を含むことが好ましい。Kabatシステムに従う番号付けは、例えばKabat, E.A., T.T.Wu, H.M.Perry, K.S.Gottesman, and C. Foeller. 1991. Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed. Bethesda, Md.: National Center for Biotechnology Information, National Library of Medicineに記載されている。
【００３７】
以下の実施例に示されるように、ＣＥＡと相互作用する結合ドメインの前記ｍＡｂ Ａ５Ｂ７由来のＣＤＲ−Ｈ３「ＤＲＧＬＲＦＹＦＤＹ」（配列番号２７）アミノ酸配列を含む、本明細書に定義されるＩｇＧ１抗体の腫瘍細胞に対する細胞障害活性（ＡＤＣＣ）は、可溶性ＣＥＡ抗原に対して抵抗性であり、それにより血漿中の血清ＣＥＡ濃度の高い腫瘍患者の治療が可能となる。
【００３８】
このＡ５Ｂ７由来「ＤＲＧＬＲＦＹＦＤＹ」ＣＤＲ−Ｈ３アミノ酸配列は、例えば、（上皮腫瘍細胞上の）ＣＥＡ標的抗原に対する親和性を改良するため、かつ／または本明細書に定義されるＩｇＧ１抗体の「微細な（fine）特異性」を最適化するためにさらに修飾することが望ましい。この目的のため、例えば、アミノ酸配列「ＤＸ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4ＦＹＦＤＹ」において、改良された親和性および／または微細な特異性を有する、修飾されたＣＤＲ−Ｈ３を同定するために、様々なアミノ酸残基を位置「Ｘ1」、「Ｘ2」、「Ｘ3」および／または「Ｘ4」（それぞれ、マウスモノクローナル抗体Ａ５Ｂ７のＣＤＲ−Ｈ３のKabatの位置９６（「Ｘ1」）、９７（「Ｘ2」）、９８（「Ｘ3」）および９９（「Ｘ4」）に対応）で試験してよい。例えば、「Ｘ1」、「Ｘ2」、「Ｘ3」または「Ｘ4」は、アミノ酸残基「Ｒ」（アルギニン）、「Ｇ」（グリシン）、「Ｌ」（ロイシン）、「Ｙ」（チロシン）、「Ａ」（アラニン）、「Ｄ」（アスパラギン酸）、「Ｓ」（セリン）、「Ｗ」（トリプトファン）、「Ｆ」（フェニルアラニン）または「Ｔ」（トレオニン）で表され得る。ここで、表示される「Ｘ」の位置の１、２、３または４つ全ては、ＣＤＲ−Ｈ３「ＤＲＧＬＲＦＹＦＤＹ」（配列番号２７）アミノ酸配列中のKabatの位置９６〜９９にて本来の「ＲＧＬＲ」アミノ酸配列と比較して交換されてよい。しかし、「Ｘ1」、「Ｘ2」、「Ｘ3」および「Ｘ4」が同じアミノ酸を表す場合、例えば「Ｘ1」、「Ｘ2」、「Ｘ3」および「Ｘ4」が全て「Ｆ」（フェニルアラニン）である場合は本発明の特許請求の範囲から除外される。上記のＡ５Ｂ７由来の「ＤＲＧＬＲＦＹＦＤＹ」ＣＤＲ−Ｈ３アミノ酸配列の修飾は当分野で公知の方法、例えば、ＣＥＡ結合ドメイン中に、このような修飾されたＣＤＲ−Ｈ３領域を含むＩｇＧ１抗体の作製を可能にするランダム化されたプライマーを用いるＰＣＲにより達成することができる。これらの修飾されたＩｇＧ１抗体の親和性または微細な特異性は、当分野で記載される方法、例えばＥＬＩＳＡ、ＢｉａｃｏｒｅまたはＦＡＣＳ分析により試験することができる。そのような修飾されたＣＤＲ−Ｈ３を含むＩｇＧ１抗体の可溶性ＣＥＡ抗原に対する抵抗性は、以下の実施例に記載されるように、漸増量の可溶性ＣＥＡの存在下で、細胞障害活性（抗体依存性細胞障害活性、ＡＤＣＣ）アッセイで試験することができる。
【００３９】
好ましくは、本明細書に定義されるＩｇＧ１抗体の可変領域は、少なくとも、（ａ）アミノ酸配列「ＳＹＷＭＨ」（配列番号２９）を有するＣＤＲ−Ｈ１と、アミノ酸配列「ＦＩＲＮＫＡＮＧＧＴＴＥＹＡＡＳＶＫＧ」（配列番号２８）を有するＣＤＲ−Ｈ２と、マウスモノクローナル抗体Ａ５Ｂ７のＣＤＲ−Ｈ３のKabatの位置９５〜１０２に相当するアミノ酸配列「ＤＲＧＬＲＦＹＦＤＹ」（配列番号２７）を有するＣＤＲ−Ｈ３；および
（ｂ）アミノ酸配列「ＴＹＡＭＨ」（配列番号３１）を有するＣＤＲ−Ｈ１と、アミノ酸配列「ＬＩＳＮＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧ」（配列番号３０）を有するＣＤＲ−Ｈ２と、マウスモノクローナル抗体Ａ５Ｂ７のＣＤＲ−Ｈ３のKabatの位置９５〜１０２に相当するアミノ酸配列「ＤＲＧＬＲＦＹＦＤＹ」（配列番号２７）を有するＣＤＲ−Ｈ３
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。
【００４０】
より好ましくは、前記可変領域は、アミノ酸配列「ＴＬＲＲＧＩＮＶＧＡＹＳＩＹ」（配列番号３４）を有するＣＤＲ−Ｌ１および／またはアミノ酸配列「ＹＫＳＤＳＤＫＱＱＧＳ」（配列番号３３）を有するＣＤＲ−Ｌ２および／またはアミノ酸配列「ＭＩＷＨＳＧＡＳＡＶ」（配列番号３２）を有するＣＤＲ−Ｌ３を含む。
【００４１】
本明細書に定義されるＩｇＧ１抗体のヒトＣＥＡに特異的な結合ドメインのＶＨ領域のアミノ酸配列は、配列番号２０、２２または２４であることが好ましい。
【００４２】
本明細書に定義されるＩｇＧ１抗体のヒトＣＥＡに特異的な結合ドメインのＶＬ領域のアミノ酸配列は、配列番号２６であることが好ましい。
【００４３】
さらにより好ましくは、本明細書に定義されるＩｇＧ１抗体のヒトＣＥＡに特異的な結合ドメインの可変（Ｖ）領域は、
（ａ）ＶＨ領域が配列番号２２に示されるアミノ酸配列からなり、かつ、ＶＬ領域が配列番号２６に示されるアミノ酸配列からなる；
（ｂ）ＶＨ領域が配列番号２０に示されるアミノ酸配列からなり、かつ、ＶＬ領域が配列番号２６に示されるアミノ酸配列からなる；および
（ｃ）ＶＨ領域が配列番号２４に示されるアミノ酸配列からなり、ＶＬ領域が配列番号２６に示されるアミノ酸配列からなる、
からなる群より選択される。
【００４４】
最も好ましくは、本明細書に定義される前記ＩｇＧ１抗体は、
（ａ）配列番号７７に示される重鎖のアミノ酸配列と配列番号８０に示される軽鎖のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号７８に示される重鎖のアミノ酸配列と配列番号８０に示される軽鎖のアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号７９に示される重鎖のアミノ酸配列と配列番号８０に示される軽鎖のアミノ酸配列；および
（ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一の、より好ましくは少なくとも９０％同一の、最も好ましくは少なくとも９５％同一のアミノ酸配列
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。
【００４５】
最も好ましくは、さらに添付の実施例に実証されるように、本発明の医薬組成物に用いられる「ＩｇＧ１抗体」は、マウスモノクローナル抗体Ａ５Ｂ７のＣＤＲ−Ｈ３のKabatの位置９５〜１０２（配列番号２７）に対応するアミノ酸配列「ＤＲＧＬＲＦＹＦＤＹ」を含む、ヒト定常領域およびヒト化可変領域を含むヒト化ＩｇＧ１抗体である。
【００４６】
好ましくは、前記ＩｇＧ１抗体の軽鎖定常領域はλ軽鎖定常領域、好ましくは、ヒトλ軽鎖定常領域である。
【００４７】
本明細書に定義されるＩｇＧ１抗体は、例えば有機ポリマー（例えばポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）および／またはポリビニルピロリドン（「ＰＶＰ」）の１またはそれ以上の分子）を用いて誘導体化してよい。当分野で公知のように、このような誘導体化は、抗体またはそのフラグメントの薬理学的特性を調節するのに有利であり得る。特に好ましいものは、システインアミノ酸のスルフヒドリル基を介する部位特異的な方法で抗体またはそのフラグメントとの共役を可能にする、ＰＥＧ−マレイミドとして誘導体化されたＰＥＧ分子である。これらの中で、特に好ましいものは２０ｋＤおよび／または４０ｋＤのＰＥＧ−マレイミドの分枝かまたは直鎖の形のものである。
【００４８】
さらに、本明細書に定義されるＩｇＧ１抗体を放射性核種（例えば131Ｉ）、細胞毒類（例えばシュードモナス毒素Ａ）またはサイトカイン類、例えばＩＬ−２と融合させてもよい。得られる融合タンパク質は、上皮腫瘍の治療において治療目的で用いられることが好ましい。放射性核種と融合した本発明の抗体もまた、例えば診断目的に有用であり得る。
【００４９】
本発明の医薬組成物のもう１つの好ましい実施形態では、治療されるべき前記上皮腫瘍は、胃腸腺癌、乳腺腺癌または肺腺癌である。前記胃腸腺癌は、好ましくは結腸直腸腺癌、膵臓腺癌、食道腺癌または胃腺癌である。
【００５０】
より好ましくは、本発明の前記医薬組成物は、進行性腫瘍、後期腫瘍、腫瘍量の多い腫瘍患者、転移性腫瘍、またはＣＥＡ血清中濃度が１００ｎｇ／ｍｌより高い腫瘍患者の治療のためのものである。前記ＣＥＡ血清中濃度は、例えばＥＬＩＳＡにより測定され得る。
【００５１】
本発明の医薬組成物のさらなる好ましい実施形態では、本明細書に定義されるＩｇＧ１抗体はヒト化および／または脱免疫化されている。
【００５２】
本明細書において、用語「ＣＤＲ移植」、「ヒト化された」または「ヒト化」は、その結合ドメイン中に非ヒト抗体またはそのフラグメント由来の少なくとも１つの相補性決定領域（「ＣＤＲ」）を含むヒトＩｇＧ１抗体を指すために同義的に用いられる。ヒト化アプローチは、例えばＷＯ ９１／０９９６８および米国特許第６，４０７，２１３号に記載されている。限定されない例として、この用語は、結合ドメインの可変領域が単一のＣＤＲ領域、例えば別の非ヒト動物、例えばげっ歯類由来のＶＨの第３のＣＤＲ領域（ＣＤＲ−Ｈ３）を含む場合、ならびに一方または両方の可変領域がそのそれぞれの第１、第２および第３のＣＤＲに前記非ヒト動物由来のＣＤＲを含む場合を包含する。抗体の結合ドメインの全てのＣＤＲが、例えばげっ歯類由来のそれらの対応する同等物で置換されている場合、通常「ＣＤＲ移植（CDR-grafting）」といい、この用語は本明細書において「ヒト化」という用語も包含していると理解される。用語「ヒト化」はまた、結合ドメインのＶＨおよび／またはＶＬ内での１またはそれ以上のＣＤＲ領域の置換に加えて、ＣＤＲ間のフレームワーク（「ＦＲ」）領域内の少なくとも単一のアミノ酸残基のさらなる変異（例えば置換）が、その位置のアミノ酸を、置換に用いたＣＤＲ領域の由来する動物におけるその位置のアミノ酸に合致させている場合も包含する。当分野で公知のように、このような個々の変異は、その標的分子のＣＤＲ供与体として用いられる非ヒト抗体の本来の結合親和性を回復させるために、ＣＤＲ移植の後にフレームワーク領域に作製される場合が多い。用語「ヒト化」は、上記のフレームワーク領域中のアミノ酸置換に加えて、非ヒト動物由来のＣＤＲ領域における、ヒト抗体由来の相当するＣＤＲ領域のアミノ酸へのアミノ酸置換（１または複数箇所）をさらに包含する。
【００５３】
より具体的には、本明細書において、「ヒト化抗体」または関連語は、マウスモノクローナル抗体Ａ５Ｂ７のＣＤＲ−Ｈ３のKabatの位置９５〜１０２に相当するアミノ酸配列「ＤＲＧＬＲＦＹＦＤＹ」（配列番号２７）を有するＣＤＲ−Ｈ３を除いて、ヒトＣＤＲ配列およびフレームワーク領域配列を含む可変領域を含むヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有するＩｇＧ１抗体を包含する。このような抗体は、以下の実施例に示されるように作製することができる。本明細書に記載されるＩｇＧ１抗体はヒト化抗体であることが特に有利である。ヒトへの治療的投与を意図する抗体剤を検討する際、この抗体の大部分がヒト起源であることが非常に有利である。ヒト患者への投与の後に、そのヒト化抗体（または断片）は、患者の免疫系により強い免疫原性応答を誘発しない可能性が最も高い、すなわち、「外来」、つまり非ヒトタンパク質であると認識されない。これは、どの宿主の抗体、すなわち患者の抗体も、治療的抗体に対して生成されないか、さもなければ治療的抗体の活性を阻害し、かつ／または患者の身体からの治療的抗体の排除を加速し、従ってその所望の治療効果を発揮することを妨げることを意味する。用語「ヒト化」抗体は、本明細書において、本明細書に定義されるＩｇＧ１抗体がヒト抗体レパートリーに含有されるアミノ酸配列、およびマウスモノクローナル抗体Ａ５Ｂ７のＣＤＲ−Ｈ３のKabatの位置９５〜１０２に相当するアミノ酸配列「ＤＲＧＬＲＦＹＦＤＹ」（配列番号２７）を有するＣＤＲ−Ｈ３を含むという意味として理解される。本明細書における定義の目的において、抗体、またはその断片は、従って、それがこのようなヒトアミノ酸配列からなる場合、すなわち、問題の抗体またはその断片のアミノ酸配列が、上記に示したマウスＣＤＲ−Ｈ３を除いて、発現したヒト生殖系列アミノ酸配列と同一である場合、ヒト化であると考えられる。本明細書に定義されるＩｇＧ１抗体も、それが体細胞超変異の跡（imprint）によるものであると予期されない、その近縁のヒト生殖系列配列に由来する配列からなる場合、ヒト化とみなされ得る。好ましくは、本明細書に定義される（ヒト化）ＩｇＧ１抗体は、ヒト定常領域と、マウスモノクローナル抗体Ａ５Ｂ７のＣＤＲ−Ｈ３のKabatの位置９５〜１０２に相当するアミノ酸配列「ＤＲＧＬＲＦＹＦＤＹ」（配列番号２７）を有するＣＤＲ−Ｈ３を含むヒト可変領域を有する。上記に示したように、前記ＣＤＲ−Ｈ３は可溶性ＣＥＡに対する抵抗性を媒介する。
【００５４】
本明細書において、用語「脱免疫化された」または「脱免疫化」は、元の野生型構築物と向かい合う結合ドメインを、ヒトにおいて前記野生型構築物を非免疫原性または低免疫原性にすることにより修飾することを意味する。脱免疫化アプローチは、例えばＷＯ ００／３４３１７号、ＷＯ ９８／５２９７６号、ＷＯ ０２／０７９４１５号またはＷＯ ９２／１０７５５号に示されている。用語「脱免疫化された」はまた、Ｔ細胞エピトープを形成する傾向の低下を示す構築物に関する。本発明に従って、用語「Ｔ細胞エピトープを形成する傾向の低下」とは、特異的なＴ細胞活性化をもたらすＴ細胞エピトープの除去に関する。さらに、「Ｔ細胞エピトープを形成する傾向の低下」とは、Ｔ細胞エピトープの形成に寄与するアミノ酸の置換、すなわち、Ｔ細胞エピトープの形成に必須のアミノ酸の置換を意味する。言い換えれば、「Ｔ細胞エピトープを形成する傾向の低下」は、免疫原性の低下または抗原非依存性のＴ細胞増殖を誘導する能力の低下に関する。用語「Ｔ細胞エピトープ」は、細胞内でペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の分解中に放出され、その後に、Ｔ細胞の活性化を引き起こすために主要組織適合抗原複合体（ＭＨＣ）の分子より提示される短いペプチド配列に関する；特に、ＷＯ ０２／０６６５１４号参照。ＭＨＣクラスＩＩで表されるペプチドに関して、このようなＴ細胞の活性化は、次に、Ｔ細胞の直接刺激による抗体応答を引き起こし、前記抗体を産生することができる。「Ｔ細胞エピトープを形成する傾向の低下」および／または「脱免疫化」は、当分野で公知の技法により測定することができる。Ｔ細胞増殖アッセイによりインビトロでタンパク質の脱免疫化を試験することが好ましい。このアッセイでは、世界で８０％を超えるＨＬＡ−ＤＲ対立遺伝子を提示するドナー由来のＰＢＭＣを、野生型かまたは脱免疫化されたペプチドのいずれかに応答する増殖についてスクリーニングする。理想的には、細胞増殖は野生型ペプチドに抗原提示細胞を負荷する（loading）際にのみ検出される。あるいは、全てのハプロタイプを提示するＨＬＡ−ＤＲ四量体を発現させることにより、脱免疫化を試験することができる。これらの四量体は、ペプチド結合について試験するか、または増殖アッセイにおいて抗原提示細胞の代わりをするペプチドを負荷してよい。脱免疫化されたペプチドがＨＬＡ−ＤＲハプロタイプに提示されるかどうかを試験するため、例えばＰＢＭＣ上の蛍光標識ペプチドの結合を測定することができる。さらに、脱免疫化は、患者への投与後に脱免疫化分子に対する抗体が形成されたかどうかを判定することにより証明することができる。好ましくは、ＣＤＲ領域の結合親和性が影響を受けないように、Ｔ細胞エピトープを誘導する傾向の低下をもたらすために、抗体由来分子をフレームワーク領域で脱免疫化し、大部分のＣＤＲ領域は修飾されない。たとえ１つのＴ細胞エピトープの除去であっても、結果として免疫原性が低下する。要約すれば、上記のアプローチは、上皮腫瘍患者に投与される場合、本明細書に定義される治療的ＩｇＧ１抗体の免疫原性を低下させるために役立つ。
【００５５】
別の態様では、本発明は、
（ａ）配列番号７７に示される重鎖のアミノ酸配列と配列番号８０に示される軽鎖のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号７８に示される重鎖のアミノ酸配列と配列番号８０に示される軽鎖のアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号７９に示される重鎖のアミノ酸配列と配列番号８０に示される軽鎖のアミノ酸配列；および
（ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一の、より好ましくは少なくとも９０％同一の、最も好ましくは少なくとも９５％同一のアミノ酸配列
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＩｇＧ１抗体に関する。
【００５６】
本発明はまた、上記に定義されるＩｇＧ１抗体をコードする核酸に関する。有利には、本明細書に定義される前記ＩｇＧ１抗体またはそれをコードする核酸は、ヒトにおいて上皮腫瘍の治療のための医薬組成物として使用される。前記上皮腫瘍はＣＥＡ陽性である。ＣＥＡ陽性の上皮腫瘍細胞に対するこれらの本発明の医薬組成物中のＩｇＧ１抗体の細胞障害活性は、腫瘍患者の血漿中のさらに高い濃度の可溶性ＣＥＡ抗原に対してでさえ抵抗性である。
【００５７】
特定のポリペプチドが本明細書に定義されるヌクレオチドまたはアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるかどうかは、公知のコンピュータープログラムを用いて従来法で決定してよい。クエリー配列（本明細書に定義される配列）と対象配列（subject sequence）との間で最も全体的に適合するものを決定するための好ましい方法（グローバル配列アラインメントとも称される）は、Bultragらのアルゴリズム（Comp. App. Biosci. 6:237-245 (1990)）に基づくＦＡＳＴＤＢコンピュータープログラムを用いて決定してよい。配列アラインメントにおいてクエリー配列と対象配列は、双方ともＤＮＡ配列である。ＲＮＡ配列はＵをＴに変換することにより比較され得る。
【００５８】
本発明はまた、本明細書に定義されるＩｇＧ１抗体をコードする核酸配列を含む医薬組成物を提供する。前記核酸は、以下により詳細に示されるように、ヒトにおいて上皮腫瘍を治療するために、例えば遺伝子治療アプローチに利用することができる。
【００５９】
本発明はさらに上記に定義される核酸配列を含むベクターを含む医薬組成物に関する。好ましくは、前記ベクターは、上記に定義される前記核酸配列と作動可能なように連結されている調節配列をさらに含む。より好ましくは、前記ベクターは発現ベクターである。例えば１つの発現ベクターが前記抗体の重鎖をコードし、それに対してもう1つの発現ベクターが軽鎖をコードすることも想定される。
【００６０】
さらに、本発明のベクターはまた、遺伝子導入または標的遺伝子組換えベクターであってよい。エキソビボ（ex-vivo）またはインビボ技術により治療遺伝子または核酸を細胞に導入することに基づく遺伝子治療は、遺伝子導入の最も重要な適用の一つである。インビトロまたはインビボでの遺伝子治療に適したベクター、方法または遺伝子送達系は、文献に記載され、当業者に公知である；例えば、Giordano, Nature Medicine 2 (1996), 534-539; Schaper, Circ. Res. 79 (1996), 911-919; Anderson, Science 256 (1992), 808-813, Isner, Lancet 348 (1996), 370-374; Muhlhauser, Circ. Res. 77 (1995), 1077-1086;Onodua, Blood 91 (1998), 30-36; Verzeletti, Hum. Gene Ther. 9 (199８), 2243-2251; Verma, Nature 389 (1997), 239-242; Anderson, Nature 392 (Supp. 1998), 25-30; Wang, Gene Therapy 4 (1997), 393-400;Wang, Nature Medicine 2 (1996), 714-716；ＷＯ ９４／２９４６９；ＷＯ ９７／００９５７；ＵＳ５，５８０，８５９；ＵＳ５，５８９，４６６；ＵＳ４，３９４，４４８またはSchaper, Current Opinion in Biotechnology 7 (1996), 635-640、ならびにそれに引用される参照文献を参照。本明細書に定義される核酸分子およびベクターは、細胞への直接導入用に、またはリポソーム、ウイルス（例えばアデノウイルス、レトロウイルス）ベクター、エレクトロポレーション、またはその他の送達系を介する細胞への導入用に設計することができる。さらに、バキュロウイルス系を本明細書に定義される核酸分子のための真核生物発現系として用いてもよい。導入および遺伝子治療アプローチは、好ましくは、本明細書に定義される機能的ＩｇＧ１抗体構築物の発現をもたらすべきであり、それによって、前記ＩｇＧ１抗体構築物はヒトにおける上皮腫瘍の治療、寛解および／または予防に特に有用である。
【００６１】
さらなる態様では、本発明は、上記に定義されるベクターまたは核酸で形質転換またはトランスフェクトされた宿主を含む医薬組成物に関する。
【００６２】
好ましくは、医薬組成物は、担体、安定剤および／または賦形剤からなる適した製剤をさらに含む。
【００６３】
別の態様では、本発明は、上記に定義される医薬組成物の製造のためのプロセスに関し、前記プロセスは上記に定義される宿主を上記に定義されるＩｇＧ１抗体の発現を可能にする条件下で培養することと、産生されたＩｇＧ１抗体を培養物から回収することを含む。本発明のさらなる態様は、ヒトにおける上皮腫瘍の予防、治療または寛解のための医薬組成物の調製のための、上記に定義されるＩｇＧ１抗体または上記に定義されるプロセスにより産生されたＩｇＧ１抗体、上記に定義される核酸分子、上記に定義されるベクターまたは上記に定義される宿主の使用に関する。本発明の別の態様は、ヒトにおける上皮腫瘍の予防、治療または寛解のための方法に関し、前記方法は本発明の、または上に示されるプロセスによって製造された医薬組成物の有効量を投与する段階を含む。当業者、特に主治医であれば、本発明の二重特異的分子／二重特異的一本鎖抗体の投与を必要とする患者の治療の成功を評価することができる。従って、投与計画ならびに投薬量および投与回数は前記当業者により判断され得る。つまり、判断される、対応する「寛解」および／または「治療」は下に定義される。
【００６４】
最も好ましい投与方法は、所与の時間／期間の静脈内投与である。本明細書に定義されるＩｇＧ１抗体は１回につき単独で投与されてよいが、好ましいものは、製薬上許容される担体中の投与である。適した医薬担体の例は当分野で周知であり、リン酸緩衝生理食塩水溶液、水、リポソーム、様々な種類の湿潤剤、滅菌溶液などが含まれる。このような担体を含む組成物は、周知の従来法により処方されてよい。これらの医薬組成物は被験体に適した用量で投与することができる。投与計画は主治医および臨床学的因子により決定される。医学分野で周知のように、任意の患者一人への投薬量は多くの要因によって決まり、それには患者の大きさ、体表面積、年齢、投与される特定の化合物、性別、投与時間および経路、全体的な健康状態、および同時に投与されるその他の薬剤が含まれる。非経口投与のための製剤としては、滅菌水溶液または非水溶液、および懸濁液が挙げられる。非水溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、および注射用の有機エステル類、例えばオレイン酸エチルである。水性担体としては、水、水溶液、または生理食塩水および緩衝媒体を含む懸濁液が挙げられる。非経口媒体としては、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸化リンゲル液、または硬化油が挙げられる。静脈内媒体としては、液体および栄養素補充液、電解質補充液（リンゲルデキストロースに基づくものなど）などが挙げられる。防腐剤およびその他の添加剤も存在してよく、例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、不活性ガスなどが挙げられる。さらに、組成物は、例えば、好ましくはヒト起源の血清アルブミンまたは免疫グロブリンなどのタンパク質性担体を含んでもよい。併用療法は、タンパク質性ＩｇＧ１抗体に加えて、医薬組成物の意図される使用に応じて、さらなる生物活性物質を含むことが想定される。このような物質は、胃腸管系に作用する物質、細胞増殖抑制剤として作用する物質、高尿酸血症を予防する物質、免疫反応を阻害する物質（例えばコルチコステロイド、ＦＫ５０６）、循環系に作用する薬剤および／またはＴ細胞共刺激分子またはサイトカインなどの当分野で公知の薬剤であってよい。好ましくは、本明細書に定義されるＩｇＧ１抗体は、緩衝液、安定剤および界面活性剤中に処方される。緩衝液は、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、コハク酸緩衝液または酢酸緩衝液であってよい。安定剤は、（１または複数の）アミノ酸および／または糖であってよい。界面活性剤は、合成洗剤、ＰＥＧなどであってよい。より好ましくは、本明細書に定義されるＩｇＧ１抗体は、クエン酸塩、リシン、トレハロースおよびＴｗｅｅｎ８０中に処方される。前記医薬組成物の希釈液として、等張生理食塩水およびＴｗｅｅｎ８０が好ましい。
【００６５】
本明細書において用語「寛解」とは、疾患、すなわち上皮腫瘍の重篤度の改善または緩和を指す。例えば、そのような寛解は、本発明の医薬組成物の投与に起因する、安定な疾患の達成、またさらにより好ましくは、上皮腫瘍の縮小、すなわち、微小、部分的応答または完全寛解であり得る。「安定な疾患」とは、臨床および／または組織学的診断方法により腫瘍進行／増殖が全くまたはほとんど観察されないまたは検出されない疾患状態を指す。例えば、指標病変の断面積の合計の５０％より多くの縮小である、腫瘍の縮小は、「部分応答」と考えられる。「完全寛解」は、治療後に病変がこれ以上全く検出されない状態を意味する。安定疾患と部分応答との間の腫瘍縮小を伴う応答は、微小応答と考えられ得る。例えば、指標病変の断面積の合計の２０％、２５％または３０％縮小は、微小応答と称され得る。
【００６６】
用語「寛解」は、本明細書において、上皮腫瘍の数の減少も包含する。それは、さらに腫瘍進行の阻止／減速を意味する。さらに、治療しなかった腫瘍患者と比較して、治療した腫瘍患者の全体的な生存の改善は、本明細書において「寛解」と考えられる。これは、必要な変更を加えて、治療しなかった腫瘍患者と比較して、治療した腫瘍患者の進行のない生存または再発のない生存の改善にも当てはまる。さらに、用語「寛解」はまた、上皮腫瘍の症状の強度の減少も指し、その結果得られる、例えば治療した腫瘍患者の生活の質の改善も指す。
【００６７】
用語「上皮腫瘍の予防」は、本明細書において、次のように理解される。原発上皮腫瘍のヒト患者からの外科切除後、および／または原発上皮腫瘍の化学療法または放射線治療後に、腫瘍細胞が全て身体から排除されない場合もあり得る。しかし、これらの残存腫瘍細胞は患者において再発性癌、すなわち、局所再発および／または転移を引き起こす可能性がある。転移はよく見られる癌の合併症であるが、癌細胞が原発腫瘍から播種されて遠位のコロニーを形成する過程はあまり分かっていない。転移性癌は、ほぼ例外なく難治性で新しい治療方法の必要性が生じる。本発明の医薬組成物を用いると、これらの播種された腫瘍細胞を死滅させて二次性腫瘍（一次治療後に身体に残存する腫瘍細胞から生じる）の形成を予防することができる。このように、本医薬組成物は、腫瘍患者において局所再発および／または転移の形成を予防するために役立つ。
【００６８】
抗腫瘍治療の成功は、それぞれの疾病について、例えばコンピュータ断層撮影、Ｘ線、核磁気共鳴断層撮影（例えば、米国国立癌研究所の判定基準に基づく応答評価（Cheson (1999), J. Clin. Oncol.; 17 (4):1244））、陽電子放射断層撮影走査、内視鏡検査、蛍光活性化セルソーター、骨髄の吸引、胸水または腹水、組織／組織学、および様々な上皮腫瘍特異的臨床化学パラメータ（例えば血清中の可溶性ＣＥＡ濃度）により確立された標準的な方法でモニターすることができ、さらに、その他の確立された標準的な方法を用いてよい。さらに、Ｔ細胞の活性化を測定するアッセイを用いてよい；例えば、ＷＯ ９９／０５４４４０号を参照。
【００６９】
治療しなかった腫瘍患者と比較して、治療した腫瘍患者の全体的な生存、進行のない生存または再発のない生存の決定のために統計学を用いてもよい。
【００７０】
好ましくは、前記上皮腫瘍は、胃腸腺癌、乳腺腺癌または肺腺癌である。前記胃腸腺癌は、より好ましくは、結腸直腸腺癌、膵臓腺癌、食道腺癌または胃腺癌である。
【００７１】
さらにより好ましくは、前記本発明の医薬組成物は、進行性腫瘍、後期腫瘍、腫瘍量の多い腫瘍患者、転移性腫瘍、またはＣＥＡ血清中濃度が１００ｎｇ／ｍｌより高い腫瘍患者の治療のためのものである。前記ＣＥＡ血清中濃度は、例えばＥＬＩＳＡにより測定され得る。
【００７２】
本発明の使用または方法のもう１つの好ましい実施形態では、上記に定義される前記医薬組成物は、さらなる薬剤と組み合わせて、すなわち、併用療法の一部として投与されるのに適している。前記併用療法では、活性薬剤を場合により、同医薬組成物中にＩｇＧ１抗体として含むか、別個の医薬組成物に含んでよい。後者の場合、前記別個の医薬組成物は、ＩｇＧ１抗体を含む前記医薬組成物の投与の前に、同時に、またはその投与の後に投与するのに適している。さらなる薬剤または医薬組成物は非タンパク質性化合物であってもタンパク質性化合物であってもよい。
【００７３】
好ましくは、前記タンパク質性化合物または非タンパク質性化合物は、上記に定義されるＩｇＧ１抗体、上記に定義される核酸分子、上記に定義されるベクター、または上記に定義される宿主と同時または非同時に投与してよい。好ましくは、治療される前記被験体はヒトである。
【００７４】
さらなる態様において、本発明は、上記に定義されるＩｇＧ１抗体、上記に定義される核酸分子、上記に定義されるベクター、または上記に定義される宿主を含むキットに関する。
【００７５】
これらおよびその他の実施形態は、本発明の説明および実施例に開示され、包含される。免疫学分野の組換え技術および方法は、例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual;Cold Spring Harbor Laboratory Press, 3rd edition 2001; Lefkovits; Immunology Methods Manual;The Comprehensive Sourcebook of Techniques;Academic Press, 1997; Golemis; Protein-Protein Interactions: A Molecular Cloning Manual;Cold Spring Laboratory Press, 2002に記載されている。本発明に従って用いられ得る抗体、方法、用途および化合物のいずれかに関するさらなる参照文献は、例えば電子装置を用いて公開されているライブラリーおよびデータベースから得ることができる。例えば、インターネットで利用可能な公開データベース「Ｍｅｄｌｉｎｅ」を、例えばｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｑｏｖ／ＰｕｂＭｅｄ／ｍｅｄｌｉｎｅ．ｈｔｍｌで利用してよい。さらなるデータベースおよびアドレス、例えばｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｉｍ．ｎｉｈ．ｑｏｖ／、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｎｆｏｂｉｏａｅｎ．ｆｒ／、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｆｍｉ．ｃｈ／ｂｉｏｌｏｑｖ／ｒｅｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌｓ．ｈｔｍｌ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｔｉｑｒ．ｏｒＱ／が当業者に公知であり、例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｌｖｃｏｓ．ｃｏｍを用いて得ることもできる。腫瘍関連の話題は、例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｉｈ．ｇｏｖまたはｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｋｆｚ．ｄｅを参照のこと。
【実施例】
【００７６】
以下の実施例は本発明を説明する。
実施例１：ヒトＣＥＡ（癌胎児性抗原関連細胞接着分子５；ＣＥＡＣＡＭ５）がトランスフェクトされたＣＨＯ細胞の作製
ＣＥＡ陽性の、Ｋａｔｏ ＩＩＩ細胞（ヒト胃癌腫細胞株；ＡＴＣＣ ＨＴＢ−１０３）を用いて全ＲＮＡを得、それをキットマニュアルの説明書（Ｑｉａｇｅｎ、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ）に従って単離した。得られたＲＮＡを、ランダムに開始される逆転写によるｃＤＮＡ合成に用いた。ＣＥＡ抗原の全長配列のクローニングのため、以下のオリゴヌクレオチドを用いた。５’ＣＥＡＣＡＭ５ ＥｃｏＲＩ ＧＡＡＴＴＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＧＴＣＴＣＣＣＴＣＧＧＣＣＣＣ（配列番号３５）および３’ＣＥＡＣＡＭ５ Ｓａｌ Ｉ ＧＴＣＧＡＣＣＴＡＴＡＴＣＡＧＡＧＣＡＡＣＣＣＣ（配列番号３６）。ＰＣＲ（第１サイクルに関して、９３℃にて５分間の変性、５８℃にて１分間のアニーリング、７２℃にて１分間の伸張；９３℃にて１分間の変性、５８℃にて１分間のアニーリング、７２℃にて１分間の伸張を３０サイクル；７２℃にて５分間の末端伸張）を用いてコード配列を増幅した。その後、ＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩで消化し、適切に消化した発現ベクターｐＥＦ−ＤＨＦＲに連結し、大腸菌に形質転換した。単離したプラスミドＤＮＡを配列決定し、確立されたＣＥＡＣＡＭ５の核酸配列（米国国立バイオテクノロジー情報センター（National Center for biotechnology information）のＮＭ＿００４３６３、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/；配列番号３７）と比較した。標準的なプロトコールに従って、上述の手順を実行した（Sambrook, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, New York (1989；2001)。確認された核酸配列を含むクローンを、構築物の真核生物における発現のためにＤＨＦＲ欠損ＣＨＯ細胞にトランスフェクトした。ＤＨＦＲ欠損ＣＨＯ細胞における真核生物タンパク質発現を、Kaufmannに記載のとおり行った（Kaufmann R.J., Methods Enzymol. 185 (1990), 537-566）。構築物の遺伝子増幅を、最大２０ｎＭ ＭＴＸの終濃度までの、漸増濃度のＭＴＸにより誘導した。次に、トランスフェクトした細胞を、ＦＡＣＳアッセイを用いてＣＥＡ抗原の発現について試験した。その目的のため、２．５×１０5の数のトランスフェクト細胞を、濃度５μｇ／ｍｌのマウスモノクローナル抗体ＣＯＬ−１（Ｎｅｏｍａｋｅｒｓ；Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ，ＵＳＡ）とともにインキュベートした。５０μｌ ＰＢＳ中２％ ＦＣＳ（Ｄｉａｎｏｖａ，Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙより入手）を用いて１：１００で希釈した、Ｒ−フィコエリトリン結合アフィニティー精製Ｆ（ａｂ’）２断片、ヤギ抗マウスＩｇＧ、Ｆｃ−γ断片特異的抗体を用いて、抗体の結合を検出した。細胞を、ＦＡＣＳ−Ｃａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ）でフローサイトメトリーにより分析した。ＦＡＣＳ染色および蛍光強度の測定を、Current Protocols in Immunology （Coligan, Kruisbeek, Margulies, Shevach and Strober, Wiley-Interscience, 2002）に記載のとおり行った。結果として、形質転換体は、ヒトＣＥＡ抗原について明らかな陽性染色を実証した。
【００７７】
実施例２：マウスモノクローナル抗体（ｍＡｂ）Ａ５Ｂ７およびＴ８４．６６由来のＩｇＧ１抗体の作製および特性決定
完全なＩｇＧ抗体分子を発現するため、２つのベクターを作製した。これらのベクターのうちの一方は重鎖をコードし、それに対してもう一方は軽鎖をコードした。完全なＩｇＧ分子は、マウスモノクローナル抗体Ａ５Ｂ７（Chester, Int. J. Cancer 57 (1994), 67-72; Harwood、上記引用文中）およびＴ８４．６６（Neumaier, Cancer Res. 50 (1990), 2128-34）に由来している。それぞれの配列は文献から抽出され、対応するＶ領域はＥｎｔｅｌｅｃｈｏｎ，Ｇｅｒｍａｎｙにて遺伝子合成された。これらの合成されたＤＮＡ断片を以下のＰＣＲ段階の鋳型として用いた。
【００７８】
１．抗体ＣＥＡ Ｉ（Ａ５Ｂ７）およびＣＥＡ ＩＩ（Ｔ８４．６６）に基づくマウス軽鎖のクローニング
適した末端制限部位を作製するため、抗体ＣＥＡ Ｉ（Ａ５Ｂ７）のＶＬ領域をコードするＤＮＡ断片をＰＣＲにより再び増幅し、結果として５’末端にＢｓｕ３６Ｉ部位および３’末端にＸｈｏ Ｉ部位を含むＶκ断片を得た。プライマー５’−ＶＬ ＣＥＡ Ｉ Ｂｓｕ３６Ｉ（５’−ＴＴＣＴＣＴＣＣＴＴＡＧＧＴＧＴＣＣＡＣＴＣＣＧＡＣＡＴＴＧＡＧＣＴＣＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣ−３’）（配列番号８１）および３’−ＶＬ ＣＥＡ Ｉ Ｘｈｏ Ｉ（５’−ＣＡＴＧＣＡＣＴＣＧＡＧＣＴＴＧＧＴＣＣＣＴＣＣＡＣＣＧＡＡＣＧＴＣ−３’）（配列番号８２）をこの目的に用いた。次に、この断片を、Ｂｓｕ３６ＩおよびＸｈｏ Ｉによりヒトリーダー配列およびマウスＣκ（Hieter et al., 1980 Cell 22: 197-207）領域を含有するｐＢＳ由来のプラスミドにサブクローニングし、それにより哺乳類リーダー配列とマウスＣκ定常領域を加えた。ＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩを利用して、ＣＥＡ Ｉ ＶＬ−Ｃκ ＤＮＡを前記ベクターから切り出し、マウスジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）をコードするｃＤＮＡをマウスアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）をコードするそれと置換することにより発現ベクターｐＥＦ−ＤＨＦＲに由来する真核生物発現ベクターｐＥＦ−ＡＤＡにサブクローニングした（Mack et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92, 7021-5）。同じ手順を、適宜に、しかし異なる特異的プライマー：ＣＥＡ ＩＩ（Ｔ８４．６６）に対して、５’−ＶＬ ＣＥＡ ＩＩ Ｂｓｕ３６Ｉ（５’−ＴＴＣＴＣＴＣＣＴＴＡＧＧＴＧＴＣＣＡＣＴＣＣＧＡＣＡＴＴＧＴＧＣＴＧＡＣＣＣＡＡＴＣＴＣＣ−３’）（配列番号８３）および３’−ＶＬ ＣＥＡ ＩＩ Ｘｈｏ Ｉ（５’−ＣＡＴＧＣＡＣＴＣＧＡＧＣＴＴＧＧＴＣＣＣＣＣＣＡＣＣＧＡＡＣＧＴＧ−３’）（配列番号８４）を用いて抗体ＣＥＡ−ＩＩ（Ｔ８４．６６）のＶＬで行った。
【００７９】
この実験の結果として、抗体ＣＥＡ Ｉ（Ａ５Ｂ７）、およびＣＥＡ ＩＩ（Ｔ８４．６６）に基づくマウス軽鎖が作製された。ｍＡｂ Ａ５Ｂ７のＶＨ領域のアミノ酸配列は配列番号８で示され、一方、ＣＥＡ Ｉ（ｍＡｂ Ａ５Ｂ７）のＶＬ領域は配列番号１０で示される。ＣＥＡ ＩＩ（ｍＡｂ Ｔ８４．６６）のＶＨ領域のアミノ酸配列は配列番号１２で示され、一方、ｍＡｂ Ｔ８４．６６のＶＬ領域は配列番号１４で示される。
【００８０】
２．マウス重鎖可変ドメインのクローニング
ＣＥＡ Ｉ（Ａ５Ｂ７）およびＣＥＡ ＩＩ（Ｔ８４．６６）のマウスＶＨ領域から、重鎖の可変領域をＰＣＲにより再び増幅させ、両方の末端にＢｓｕ３６Ｉ制限部位を作製した。ＣＥＡ Ｉ（Ａ５Ｂ７）には、次の２つのプライマーの組み合わせ：５’−プライマー ５'ＣＥＡ Ｉ ＶＨ−Ｂｓｕ３６Ｉ（５’−ＴＴＣＴＣＴＣＣＴＴＡＧＧＴＧＴＣＣＡＣＴＣＣＣＡＧＧＴＣＣＡＡＣＴＧＣＡＧＧＡＧＴＣＡＧＧ−３’）（配列番号８７）および３’−プライマー ３’−ＣＶＨ−Ｂｓｕ３６Ｉ（５’−ＧＡＣＴＣＡＣＣＴＧＡＧＧＡＧＡＣＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＧＴＣＣＣＴＴＧＧ−３’）（配列番号８８）を用い、ＣＥＡ ＩＩ（Ｔ８４．６６）には、次の２つのプライマーの組み合わせ：５’−プライマー ５’ＣＥＡ ＩＩ ＶＨ−Ｂｓｕ３６Ｉ（５’−ＴＴＣＴＣＴＣＣＴＴＡＧＧＴＧＴＣＣＡＣＴＣＣＧＡＧＧＴＴＣＡＧＣＴＧＣＡＧＣＡＧＴＣＴＧＧ−３’）（配列番号８９）および３’−プライマー ３’ＣＥＡ ＩＩ ＶＨ−Ｂｓｕ３６Ｉ（５’−ＧＡＣＴＣＡＣＣＴＧＡＧＧＡＧＡＣＧＧＴＧＡＣＴＧＡＧＧＴＴＣＣＴＴＧＡＣＣ−３’）（配列番号９０）を用いた。
【００８１】
得られるＤＮＡ断片を、次に、これらの制限部位を用いて、既に真核生物のリーダー配列とヒトＩｇＧ１重鎖定常領域をコードするＤＮＡ断片を含有する真核生物発現ベクターｐＥＦ−ＤＨＦＲにサブクローニングした（Raum, Cancer Immunol Immunother. 50 (2001): 141-50参照）。従って重鎖可変領域はリーダー配列と重鎖定常領域との間に挿入した。
【００８２】
この実験の結果として、前記ヒトＩｇＧ１定常領域と連結されたマウス重鎖可変ドメインをコードするベクターが作製された。ｍＡｂ Ａ５Ｂ７のＶＨ領域のアミノ酸配列は配列番号８に示され、一方、ＣＥＡ Ｉ（ｍＡｂ Ａ５Ｂ７）のＶＬ領域は配列番号１０に示される。ＣＥＡ ＩＩ（ｍＡｂ Ｔ８４．６６）のＶＨ領域のアミノ酸配列は配列番号１２に示され、一方、ｍＡｂ Ｔ８４．６６のＶＬ領域は配列番号１４に示される。
【００８３】
３．完全なＩｇＧタンパク質の発現
完全なＩｇＧ１抗体を発現させるため、上記のように作製した１本の（マウス）軽鎖をコードするプラスミドおよび１本の重鎖（マウスＶＨ／ヒトＩｇＧ１定常領域）をコードするプラスミドを、一過性のタンパク質発現のための標準的なプロトコールに従ってＨＥＫ細胞に同時導入し、細胞を培養して免疫グロブリンの培地中への発現および産生を可能とした。このように、抗体ＣＥＡ Ｉ（Ａ５Ｂ７）由来のｈｕＩｇＧ１ ＣＥＡ Ｉおよび抗体ＣＥＡ ＩＩ（Ｔ８４．６６）由来のｈｕＩｇＧ１ ＣＥＡ ＩＩが産生された。前記ｈｕＩｇＧ１抗体構築物は、ＣＥＡ Ｉ（Ａ５Ｂ７）またはＣＥＡ ＩＩ（Ｔ８４．６６）に由来するマウス可変（Ｖ）領域、マウス定常（Ｃ）軽鎖（Ｃκ）領域ならびにヒト定常重鎖ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３およびヒンジ領域（ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域は、Raum, Cancer Immunol Immunother. 50 (2001): 141-50に記載されている）からなる。それぞれの製造期間の後、上清を回収し、免疫グロブリンの精製のための標準的なプロトコールに従ってプロテインＡクロマトグラフィーによってヒト免疫グロブリンを単離した。次に、培養上清、ならびに精製された免疫グロブリンをさらなる特性決定実験に用いた。
【００８４】
４．上記で作製されたＩｇＧ１抗体の特性決定
４．１ 固定化された可溶性ＣＥＡ（ｓＣＥＡ）抗原との結合
重鎖＋軽鎖の二重形質転換体の培養上清ならびに対応する精製抗体の調製物を、固定化された可溶性ＣＥＡ（ｓＣＥＡ；Ａｂｃａｍ，Ｌｔｄ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ ＵＫ）抗原上での結合についてＥＬＩＳＡにより標準的な手順に従って試験した。上記に示す通りに作製された抗体ＣＥＡ Ｉ（Ａ５Ｂ７）に由来するｈｕＩｇＧ１ ＣＥＡ Ｉと、抗体ＣＥＡ ＩＩ（Ｔ８４．６６）に由来するｈｕＩｇＧ１ ＣＥＡ ＩＩの抗体は、陰性対照と比較して固定化されたｓＣＥＡ抗原との明確な結合を示し、ｓＣＥＡ抗原がコートされない点で異なる同等の設定では結合を示さなかった（図４に示される通り）。
【００８５】
４．２ 膜結合ＣＥＡとの結合
抗体ＣＥＡ Ｉ（Ａ５Ｂ７）由来のｈｕＩｇＧ１ ＣＥＡ Ｉと抗体ＣＥＡ ＩＩ（Ｔ８４．６６）由来のｈｕＩｇＧ１ ＣＥＡ ＩＩの精製抗体調製物をＦＡＣＳ分析によりＣＥＡ陽性の胃癌細胞株Ｋａｔｏ ＩＩＩ、ＣＥＡトランスフェクトＣＨＯ細胞および非トランスフェクトＣＨＯ細胞上で試験した。
【００８６】
２×１０5細胞を、精製抗体調製物（通常１０〜２０μｇ／ｍｌ）とともにインキュベートした。細胞結合抗体の検出は、ＦＩＴＣ標識抗マウスＩｇＧ抗体または抗ヒトＩｇＧ抗体（通常１０〜２０μｇ／ｍｌ）を用いて行った。インキュベーションは２０〜４０分間氷上で行った。
【００８７】
抗体ＣＥＡ Ｉ（Ａ５Ｂ７）由来のｈｕＩｇＧ１ ＣＥＡ Ｉおよび抗体ＣＥＡ ＩＩ（Ｔ８４．６６）由来のｈｕＩｇＧ１ ＣＥＡ ＩＩは、ＣＥＡ陽性細胞に対して明確な結合を示した。非トランスフェクトＣＨＯ細胞との結合を示したＩｇＧ１抗体はなかった。ＩｇＧ−対照は、Ｋａｔｏ ＩＩＩ細胞、ＣＨＯ／ＣＥＡ−細胞および非トランスフェクトＣＨＯ細胞では陰性であった（図５Ａ、ＢおよびＣに示される通り）。
【００８８】
４．３ 抗体依存性細胞障害活性（ＡＤＣＣ）アッセイ（51Ｃｒ放出アッセイ）
51Ｃｒ放出アッセイのため、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をエフェクター細胞として健康なドナーから単離した。フィコール密度勾配遠心分離とその後の１００×ｇ遠心分離段階よりＰＢＭＣを分離した。刺激されていないＰＢＭＣ（５×１０5細胞）を、平底マイクロタイタープレートの各ウェルに１００μｌの容積の１０％ ＦＣＳを含むＲＰＭＩ １６４０培地に添加し、３７℃にて一晩インキュベートした。標的細胞として、ＣＥＡトランスフェクトＣＨＯ細胞を用いた。標的細胞を２時間51Ｃｒで標識した。標識した標的細胞（５０，０００細胞）および様々な濃度の抗体（１０ｐｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌ）をＰＢＭＣに添加し、３７℃にて１８時間インキュベートした。このアッセイは可溶性ＣＥＡ（ｓＣＥＡ）抗原の不在下で行われた。対応する結合していないアイソタイプを陰性対照として用いた。特異的溶解を、（（実験放出ｃｐｍ）−（自然放出ｃｐｍ））／（（最大放出ｃｐｍ）−（自然放出ｃｐｍ））として計算した。抗体ＣＥＡ Ｉ（Ａ５Ｂ７）由来のｈｕＩｇＧ１ ＣＥＡ Ｉおよび抗体ＣＥＡ ＩＩ（Ｔ８４．６６）由来のｈｕＩｇＧ１ ＣＥＡ ＩＩは、陰性対照と比較して、この51Ｃｒ放出アッセイにおいてＣＥＡ陽性ＣＨＯ細胞に有意な細胞障害活性を媒介することを示した。
【００８９】
２番目の細胞障害活性実験では、抗体サンプルを可溶性ＣＥＡ（ｓＣＥＡ）抗原で２０分間攪拌しながらプレインキュベートし、次に、標識した標的細胞およびヒトＰＢＭＣと混合した。さもなければ、アッセイを上記のように行った。可溶性ＣＥＡ（ｓＣＥＡ）抗原は様々な濃度、すなわち、１μｇ／ｍｌおよび１０μｇ／ｍｌで用いた。
【００９０】
可溶性ＣＥＡ、特に高い濃度の可溶性ＣＥＡの存在下で、抗体ＣＥＡ ＩＩ（Ｔ８４．６６）に由来するｈｕＩｇＧ１ ＣＥＡ ＩＩは、低下した細胞障害（ＡＤＣＣ）活性を示した。これに対し、抗体ＣＥＡ Ｉ（Ａ５Ｂ７）に由来するｈｕＩｇＧ１ ＣＥＡ Ｉは可溶性ＣＥＡの不在下での活性と比較して細胞障害活性の有意な低下を示さなかった。従って、抗体ＣＥＡ Ｉ（Ａ５Ｂ７）に由来するｈｕＩｇＧ１ ＣＥＡ Ｉに媒介されるＣＥＡ陽性腫瘍細胞に対する細胞障害活性は、可溶性ＣＥＡに対して抵抗性である。
【００９１】
要約すれば、抗体ＣＥＡ Ｉ（Ａ５Ｂ７）に由来するｈｕＩｇＧ１ ＣＥＡ Ｉの腫瘍細胞に対して向けられる細胞障害活性（ＡＤＣＣ）は、さらに高い濃度の可溶性ＣＥＡ抗原に対して抵抗性であることが見出された。この知見は、このＩｇＧ１抗体が可溶性ＣＥＡ抗原と結合するという事実を考えると全く予期しないものである。例えば、モノクローナル抗体Ｔ８４．６６に由来するＩｇＧ１抗体構築物を試験した場合、この抗体は可溶性ＣＥＡ抗原に対して非常に高い感受性がある、すなわち、細胞障害活性（ＡＤＣＣ）が可溶性ＣＥＡ抗原によって遮断されている。この抗体はまた、可溶性ＣＥＡと結合できることが見出されている。このことを考えると、可溶性ＣＥＡ抗原は抗体ＣＥＡ ＩＩ（Ｔ８４．６６）由来のｈｕＩｇＧ１ ＣＥＡ ＩＩがその抗体に媒介される細胞障害活性を発揮することを妨げると結論付けられる。その一方、本明細書に定義される抗体ＣＥＡ Ｉ（Ａ５Ｂ７）に由来するＩｇＧ１ ＣＥＡ Ｉ抗体は、腫瘍細胞に対する細胞障害活性において、さらに高いレベルの可溶性ＣＥＡの存在に対して抵抗性である。
【００９２】
実施例３：ヒトＶＬ領域の選択
癌患者に投与される際に免疫原性の低下したＩｇＧ１抗体を提供するため、可溶性ＣＥＡ抗原に対する抵抗性を有するヒト化ＩｇＧ１抗体を作製した。第１段階で、可溶性ＣＥＡに対する抵抗性を有するヒトＶＬ領域が単離された。従って、この実験の目的は、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）Ａ５Ｂ７の母親由来のマウスＶＨと対となり得るヒトＶＬ領域の選択である。
【００９３】
１．可溶性ヒトＣＥＡ抗原のビオチン化
ファージライブラリー選択のため、可溶性ＣＥＡ抗原をビオチン化した。ビオチン化は、５％ ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ）を含有するＰＢＳ中で、サンプルミキサー（Ｄｙｎａｌ）中で室温にて１時間１５倍モル過剰のＥＺ−Ｌｉｎｋ Ｓｕｌｆｏ ＮＨＳ−ＬＣ−ＬＣ−ビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて達成した。遊離ビオチンとビオチン化ＣＥＡ抗原の分離のため、標準的なプロトコールに従って、アッセイをＰＢＳに対して過剰に透析した。ビオチン標識したＣＥＡの保持された生物活性をＥＬＩＳＡ結合アッセイで確認した。
【００９４】
２．ＲＮＡのヒトＢ細胞からの単離
１００ｍＬの血液を５名の健康なヒトドナーから採取した。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を標準的な方法に従ってフィコール勾配により単離した。ＲＮｅａｓｙ（登録商標）Ｍｉｄｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を製造業者の説明書に従って用いて、全ＲＮＡを単離細胞から単離した。標準的な方法に従ってｃＤＮＡを合成した（Sambrook, Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989, 2001）。
【００９５】
３．可変軽鎖領域（ＶＬ−領域）のＰＣＲ増幅
軽鎖Ｖ領域ＤＮＡの単離のため、ＲＴ−ＰＣＲを、Ｖ−κ−（５’−ｈｕ−ＶＫ１−ＳａｃＩ−２００１（５’−ＧＡＧＣＣＧＣＡＣＧ ＡＧＣＣＣＧＡＧＣＴ ＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣ ＣＡＧＴＣＴＣＣ−３’）（配列番号３８）、５’−ｈｕ−ＶＫ２／４−ＳａｃＩ−２００１（５’−ＧＡＧＣＣＧＣＡＣＧ ＡＧＣＣＣＧＡＧＣＴ ＣＧＴＧＡＴＧＡＣＹ ＣＡＧＴＣＴＣＣ−３’）（配列番号３９）、５’−ｈｕ−ＶＫ３−ＳａｃＩ−２００１（５’−ＧＡＧＣＣＧＣＡＣＧ ＡＧＣＣＣＧＡＧＣＴ ＣＧＴＧＷＴＧＡＣＲ ＣＡＧＴＣＴＣＣ−３’）（配列番号４０）、５’−ｈｕ−ＶＫ５−ＳａｃＩ−２００１（５’−ＧＡＧＣＣＧＣＡＣＧ ＡＧＣＣＣＧＡＧＣＴ ＣＡＣＡＣＴＣＡＣＧ ＣＡＧＴＣＴＣＣ−３’）（配列番号４１）、５’−ｈｕ−ＶＫ６−ＳａｃＩ−２００１（５’−ＧＡＧＣＣＧＣＡＣＧ ＡＧＣＣＣＧＡＧＣＴ ＣＧＴＧＣＴＧＡＣＴ ＣＡＧＴＣＴＣＣ−３’）（配列番号４２）、３’−ｈｕ−Ｖｋ−Ｊ１−ＳｐｅＩ−ＢｓｉＷＩ （５’−ＧＡＣＧＡＣＡＣＴＡ ＧＴＴＧＣＡＧＣＣＡ ＣＣＧＴＡＣＧＴＴＴ ＧＡＴＴＴＣＣＡＣＣ ＴＴＧＧＴＣＣ−３’）（配列番号４３）、３’−ｈｕ−Ｖｋ−Ｊ２／４−ＳｐｅＩ−ＢｓｉＷＩ （５’−ＧＡＣＧＡＣＡＣＴＡ ＧＴＴＧＣＡＧＣＣＡ ＣＣＧＴＡＣＧＴＴＴ ＧＡＴＣＴＣＣＡＳＣ ＴＴＧＧＴＣＣ−３’）（配列番号４４）、３’−ｈｕ−Ｖｋ−Ｊ３−ＳｐｅＩ−ＢｓｉＷＩ （５’−ＧＡＣＧＡＣＡＣＴＡ ＧＴＴＧＣＡＧＣＣＡ ＣＣＧＴＡＣＧＴＴＴ ＧＡＴＡＴＣＣＡＣＴ ＴＴＧＧＴＣＣ−３’）（配列番号４５）、３’−ｈｕ−Ｖｋ−Ｊ５−ＳｐｅＩ−ＢｓｉＷＩ （５’−ＧＡＣＧＡＣＡＣＴＡ ＧＴＴＧＣＡＧＣＣＡ ＣＣＧＴＡＣＧＴＴＴ ＡＡＴＣＴＣＣＡＧＴ ＣＧＴＧＴＣＣ−３’）（配列番号４６））およびＶλ（５’−ｈｕＶＬ１ａ−ＳａｃＩ−２００１ （ＧＡＧ ＣＣＧ ＣＡＣ ＧＡＧ ＣＣＣ ＧＡＧ ＣＴＣ ＧＴＧ ＴＴＧ ＡＣＧ ＣＡＧ ＣＣＧ ＣＣＣ ＴＣ）（配列番号４７）、５’−ｈｕＶＬ１ｂ−ＳａｃＩ−２００１ （ＧＡＧ ＣＣＧ ＣＡＣ ＧＡＧ ＣＣＣ ＧＡＧ ＣＴＣ ＧＴＧ ＣＴＧ ＡＣＴ ＣＡＧ ＣＣＡ ＣＣＣ ＴＣ）（配列番号４８）、５’−ｈｕＶＬ２−ＳａｃＩ−２００１ （ＧＡＧ ＣＣＧ ＣＡＧ ＧＡＧ ＣＣＣ ＧＡＧ ＣＴＣ ＧＣＣ ＣＴＧ ＡＣＴ ＣＡＧ ＣＣＴ ＳＣＣ ＴＣＣ ＧＴ）（配列番号４９）、５’−ｈｕＶＬ４−ＳａｃＩ−２００１ （ＡＣＣ ＴＧＣ ＧＡＧ ＣＴＣ ＧＴＧ ＣＴＧ ＡＣＴ ＣＡＲ ＹＣＭ ＹＣＣ ＴＣＴ ＧＣ）（配列番号５０）、５’−ｈｕＶＬ５−ＳａｃＩ−２００１ （ＡＣＣ ＴＧＣ ＧＡＧ ＣＴＣ ＧＴＧ ＣＴＧ ＡＣＴ ＣＡＧ ＣＣＲ ＳＣＴ ＴＣＣ）（配列番号５１）、５’−ｈｕＶＬ６−ＳａｃＩ−２００１ （ＡＣＣ ＴＧＣ ＧＡＧ ＣＴＣ ＡＴＧ ＣＴＧ ＡＣＴ ＣＡＧ ＣＣＣ ＣＡＣ ＴＣ）（配列番号５２）、５’−ｈｕＶＬ３／９−ＳａｃＩ−２００１ （ＧＡＧ ＣＣＧ ＣＡＣ ＧＡＧ ＣＣＣ ＧＡＧ ＣＴＣ ＧＷＧ ＣＴＧ ＡＣＴ ＣＡＧ ＣＣＡ ＣＣＹ ＴＣ）（配列番号５３）、５’−ｈｕＶＬ７／８−ＳａｃＩ−２００１ （ＧＡＧ ＣＣＧ ＣＡＣ ＧＡＧ ＣＣＣ ＧＡＧ ＣＴＣ ＧＴＧ ＧＴＧ ＡＣＹ ＣＡＧ ＧＡＧ ＣＣＭ ＴＣ）（配列番号５４）、３’−ｈｕ−Ｖｌａｍ−ＢｌｎＩ−ＳｐｅＩ−２００１ （ＣＧＴ ＧＧＧ ＡＣＴ ＡＧＴ ＣＴＴ ＧＧＧ ＣＴＧ ＡＣＣ ＴＡＧ ＧＡＣ ＧＧＴ）（配列番号５５）、３’−ｈｕ−Ｖｌａｍ２−ＢｌｎＩ−ＳｐｅＩ−２００２：ＣＧＴ ＧＧＧ ＡＣＴ ＡＧＴ ＣＴＴ ＧＧＧ ＣＴＧ ＡＣＣ ＧＡＧ ＧＡＣ ＧＧＴ）（配列番号５６）プライマーセットを用いて行った。ヒトＢ細胞由来のＲＮＡをｃＤＮＡに転写し（上記の通り）、ＰＣＲ反応の鋳型ＤＮＡとして用いた。１回のＰＣＲ反応につき、１個の５’−プライマーを１個の３’−プライマーと組み合わせた。異なるＰＣＲ反応の数を、５’−および３’−プライマーの可能な組み合わせの数により決定した。増幅には次のＰＣＲプログラムを用いた。すなわち、９４℃にて１５秒間の変性、５２℃にて５０秒間のプライマーアニーリングおよび７２℃にて９０秒間のプライマー伸張を４０サイクル以上行い、それに続いて７２℃にて１０分間の最終伸張を行った。次に、軽鎖ＤＮＡ Ｖ断片を標準的なプロトコールに従って単離した。
【００９６】
４．ライブラリー構築−ヒトＶＬプールのクローニング
ファージディスプレイライブラリーは、概して、例えば「Phage Display: A Laboratory Manual」; Ed. Barbas, Burton, Scott & Silverman; Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001に開示されるような標準的な手順に基づいて構築された。ＰＣＲ増幅に選択されるプライマーは、軽鎖Ｖ断片の５’−ＳａｃＩおよび３’−ＳｐｅＩ認識部位を生じた。４回の連結反応をセットアップし、各々４００ｎｇの軽鎖断片（ＳａｃＩ−ＳｐｅＩ消化、２×κおよび２×λ）および１４００ｎｇのファージミドｐＣｏｍｂ３Ｈ５ＢＨｉｓ（ＳａｃＩ−ＳｐｅＩ消化；大きな断片；このベクターは、Ｒａｌｆ Ｌｕｔｔｅｒｂｕｅｓｅ博士の論文に記載されている）で構成された。次に、得られる４つの抗体Ｖ軽鎖プールを、エレクトロポレーション（２．５ｋＶ、０．２ｃｍギャップキュベット、２５ｍＦ、２００ Ｏｈｍ、Ｂｉｏｒａｄ ｇｅｎｅ−ｐｕｌｓｅｒ）により３００μｌのエレクトロコンピテント(electrocompetent)大腸菌（Escherichia coli）ＸＬ１ Ｂｌｕｅ株に各々形質転換して、
κ１：２×１０8
κ２：６×１０7
λ１：９×１０7
λ２：６×１０7
の独立したクローンからなるライブラリーサイズを得た。
【００９７】
様々なＰＣＲ増幅から得たκ（軽鎖）ＤＮＡ断片を、各連結について次のように秤量した。それぞれの５’−プライマーは特定のグループを定義する。これらのグループの中で、３’−プライマーはサブグループを定義する。κサブグループを、１：２：１：１（プライマー３’−ｈｕ−Ｖｋ−Ｊ１−ＳｐｅＩ−ＢｓｉＷＩ：３’−ｈｕ−Ｖｋ−Ｊ２／４−ＳｐｅＩ−ＢｓｉＷＩ：３’−ｈｕ−Ｖｋ−Ｊ３−ＳｐｅＩ−ＢｓｉＷＩ：３’−ｈｕ−Ｖｋ−Ｊ５−ＳｐｅＩ−ＢｓｉＷＩに対応）に秤量した。グループを、それらの生殖系列分布１：１：１：０．２：０．２（プライマー５’−ｈｕＶＫ１−Ｓａｃ−２００１：５’−ｈｕＶＫ３−Ｓａｃ−２００１：５’−ｈｕＶＫ２／４−Ｓａｃ−２００１：５’−ｈｕＶＫ５−Ｓａｃ−２００１：５’−ｈｕＶＫ６−Ｓａｃ−２００１に対応）に従って秤量した。
【００９８】
異なるＰＣＲ増幅から得たλ（軽鎖）ＤＮＡ断片を、各連結について次のように秤量した。それぞれの５’−プライマーは、特定のグループを定義する。これらのグループの中で、３’−プライマーはサブグループを定義する。λサブグループを、３：１（プライマー３’−ｈｕ−Ｖｌａｍ−ＢｌｎＩ−ＳｐｅＩ−２００１：３’−ｈｕ−Ｖｌａｍ２−ＢｌｎＩ−ＳｐｅＩ−２００２に対応）に秤量した。
【００９９】
グループを、それらの生殖系列分布１：１：２：２：２：３（プライマー５’−ｈｕＶＬ１ａ−ＳａｃＩ−２００１：５’−ｈｕＶＬ１ｂ−ＳａｃＩ−２００１：５’−ｈｕＶＬ２−ＳａｃＩ−２００１：５’−ｈｕＶＬ４−ＳａｃＩ−２００１＋５’−ｈｕＶＬ５−ＳａｃＩ−２００１：５’−ｈｕＶＬ６−ＳａｃＩ−２００１＋５’−ｈｕＶＬ７／８−ＳａｃＩ−２００１：５’−ｈｕＶＬ３／９−ＳａｃＩ−２００１に対応）に従って秤量した。
【０１００】
エレクトロポレーション後、それぞれの形質転換された大腸菌培養を表現型発現のためにＳＯＣ培養液（Ｆｌｕｋａ）中でインキュベートした。２つのκ培養物を組み合わせ、同様に２つのλ培養物も組み合わせた。得られるκ培養物および得られるλ培養物を、次にそれぞれ５００ｍＬの、５０μｇ／ｍｌ カルベニシリンおよび２％ ｗ／ｖ グルコースを含有するＳＢ選択培地中で一晩インキュベートした。翌日、細胞を遠心分離により回収し、市販のプラスミド調製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてプラスミドの調製を行った。
【０１０１】
５．抗体ライブラリーの構築−ヒトＶＬ−母親由来ＶＨ
ＰＣＲを行ってｍＡｂ Ａ５Ｂ７の母親由来のＶＨを前記母親由来のＶＨを含有するベクターから増幅した。増幅のために、５’−プライマー５’−ＡＶＨ−Ｘｈｏ Ｉ（５’−ＧＴＣ ＡＣＡ ＣＴＣ ＧＡＧ ＴＣＡ ＧＧＡ ＧＧＡ ＧＧＣ ＴＴＧ ＧＴＡ Ｃ−３’）（配列番号５７）および３’−プライマー３’−ＡＶＨ−ＢｓｔＥＩＩ（５’−ＧＴＣ ＡＣＡ ＧＧＴ ＧＡＣ ＣＧＴ ＧＧＴ ＣＣＣ ＴＴＧ ＧＣＣ ＣＣＡ Ｇ−３’（配列番号５８）を用いて標準的手順に従うＰＣＲプロトコールに従った。分析用アガロースゲルからの約３５０ｂｐ増幅産物の精製後、ＤＮＡ断片を制限酵素ＢｓｔＥＩＩおよびＸｈｏ Ｉで切り出した。ファージミドｐＣｏｍｂ３Ｈ５ＢＨｉｓ（このベクターはＲａｌｆ Ｌｕｔｔｅｒｂｕｅｓｅ博士の論文に記載されている。）をしかるべく消化させ、大きな断片を上述の断片と連結させた。大腸菌ＸＬ１ ｂｌｕｅへの形質転換後、単一のクローンを１００ｍＬ ＳＢ培地（５０μｇ／ｍｌ カルベニシリン含有）で培養し、プラスミドを標準的なプロトコールに従って調製した。挿入物を配列決定することにより首尾よいクローニングを確認した（Ｓｅｑｕｉｓｅｒｖｅ，Ｍｕｎｉｃｈ）。
【０１０２】
このベクターｐＣｏｍｂ３Ｈ５ＢＨｉｓ／ｍＡｂ Ａ５Ｂ７の母親由来ＶＨを制限酵素ＳａｃＩおよびＳｐｅＩで制限した。大きなベクター断片を単離した。プラスミド−ＤＮＡを含有するＶκライブラリーおよびＶλライブラリーを制限酵素ＳａｃＩおよびＳｐｅＩで制限した。小さなＶκ断片およびそれぞれのＶλ断片（各およそ３５０ｂｐ）を標準的なプロトコールに従って単離した。１２００ｎｇのベクター断片を各２００ｎｇのＶκおよびＶλ断片両方の混合と連結した。連結反応物をエレクトロポレーション（２．５ｋＶ、０．２ｃｍギャップキュベット、２５ｍＦ、２００ Ｏｈｍ）により３００μＬのエレクトロコンピテント(electrocompetent)大腸菌ＸＬ１ Ｂｌｕｅ株に形質転換して、１．２×１０8の独立したクローンからなる全ｓｃＦｖライブラリーサイズを得た。
【０１０３】
表現型発現およびカルベニシリンへの緩やかな適応の後、抗体ライブラリーをＳＢ−カルベニシリン（５０μｇ／ｍｌ）選択培地へ移した。次に、抗体ライブラリーを感染量の１×１０12粒子のヘルパーファージＶＣＳＭ１３で感染させ、その結果、繊維状のＭ１３ファージの産生および分泌が得られ、この各ファージ粒子は半ヒトｓｃＦｖ−断片をコードする一本鎖ｐＣｏｍｂ３Ｈ５ＢＨｉｓ−ＤＮＡを含み、ファージコートタンパク質ＩＩＩへの翻訳融合として対応するｓｃＦｖ−タンパク質を提示した。
【０１０４】
６．ヒトＶＬのファージディスプレイ選択
ｓｃＦｖ−レパートリーを有するファージ粒子をＰＥＧ８０００／ＮａＣｌ沈殿および遠心分離により培養上清から回収した。次に、約１×１０11〜１×１０12ｓｃＦｖファージ粒子を０．５ｍＬのＴＢＳ／１％ ＢＳＡに再懸濁し、ストレプトアビジンコートされたＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ）のウェル中で１時間固定されたビオチン化可溶性ＣＥＡとともにインキュベートした。抗原１０μg／ｍｌのＰＢＳ溶液（５０μｌ）をストレプトアビジンコートされたウェル中で４℃にて一晩インキュベートし、水で１回洗浄し、それに続いてＴＢＳ中２００μｌの３％ ＢＳＡで３７℃にて１時間ブロッキングし、それをインキュベーション後に取り除いた。
【０１０５】
標的抗原と特異的結合しなかったｓｃＦｖファージをＴＢＳ／０．０５％ Ｔｗｅｅｎでの洗浄段階により除去した。この洗浄手順は、さらなるラウンドで１０回まで繰り返された。
【０１０６】
洗浄後、ＨＣｌ−グリシン、ｐＨ ２．２を用いることにより結合体を溶出した。２Ｍ Ｔｒｉｓ、ｐＨ １２での中和後、溶出液を新鮮な非感染大腸菌ＸＬ１ Ｂｌｕｅ培養株の感染に用いた。
【０１０７】
残っている高結合体を溶出するため、５０μｌの新鮮な大腸菌ＸＬ１ ｂｌｕｅ培養株（ＯＤ６００≧０．５）をウェルに添加し、１５分間インキュベートした。次に、両方の培養物を混合し、ヒトｓｃＦｖ−断片をコードするファージミドコピーで首尾よく形質導入した細胞を再びカルベニシリン抵抗性について選択し、その後にＶＣＭＳ１３ヘルパーファージで感染させて、抗体提示およびインビトロでの選択の第２のラウンドを開始した。
【０１０８】
４ラウンドのパニングに対応するプラスミドＤＮＡを大腸菌培養物から単離した。可溶性ｓｃＦｖ−タンパク質の産生のため、ＶＨ−ＶＬ−ＤＮＡ断片をプラスミドから切り出し（Ｘｈｏ Ｉ−ＳｐｅＩ）、プラスミドｐＣｏｍｂ３Ｈ５ＢＦＩａｇ／Ｈｉｓ中の同じ制限部位を介してクローニングし、その発現構築物（例えばｓｃＦｖ）は、ｓｃＦｖとＨｉｓ６タグとの間にＦｌａｇタグ（ＴＧＤＹＫＤＤＤＤＫ）（配列番号５９）を含み、さらなるファージタンパク質が欠失している。
【０１０９】
連結後、各プール（異なるラウンドのパニング）のプラスミドＤＮＡを１００μＬ熱ショックコンピテント大腸菌ＴＧ１に形質転換し、カルベニシリンＬＢ寒天上にプレーティングした。単一のコロニーを選定し、９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ）中の１２０μＬのＬＢカルベニシリン（５０μｇ／ｍｌ）１％ グルコースに播種した。ウェルを半透膜（Ｇｒｅｉｎｅｒ）で密封し、振盪インキュベータでプレートを３７℃にて一晩インキュベートした（マスタープレート）。次に、１０μｌのマスタープレート培養物を、ウェルあたり９０μＬ ＬＢカルベニシリン（５０μｇ／ｍｌ）０．１％ グルコースを含有する第２の９６ウェルプレート（ワーキングプレート）に移した。３７℃の振盪インキュベータ中で４時間のインキュベーションの後、２０μＬ ＬＢカルベニシリン、６ｍＭ ＩＰＴＧを各ウェルに添加することによりｓｃＦｖ生成を誘導した。振盪しながら３０℃にて一晩の別のインキュベーション段階の後、細胞を、４０μＬ 溶解緩衝液（４００ｍＭ ホウ酸、３２０ｍＭ ＮａＣｌ、４ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８、２．５ｍｇ／ｍｌ リゾチーム）での室温にて１時間のインキュベーションで溶解した。残りの細胞および細胞片を１．９００×ｇで１２分間の遠心分離により分離した（Ｈｅｔｔｉｃｈ）。
【０１１０】
次に、ｓｃＦｖ分子を含有する上清を、フローサイトメトリー結合アッセイで結合について試験した。ヒトＣＥＡでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞をＣＥＡ陽性細胞株として用いた。最初に１００，０００〜２００，０００個の細胞をヒトｓｃＦｖまたは関連する対照を含有する周辺質（periplasmic）調製物とともにインキュベートすることにより細胞結合アッセイを行った。インキュベーション後、細胞をＰＢＳ／１％ ＦＣＳ（ウシ胎児血清）中で洗浄し、さらに５〜１０μｇ／ｍｌの抗ＦＬＡＧ Ｍ２抗体（Ｓｉｇｍａ）とともにインキュベートした。細胞を再び洗浄した後、それらをポリクローナル、ＰＥ標識抗マウス抗体（Ｄｉａｎｏｖａ）とともにインキュベートし、その後フローサイトメトリーにより分析した。およそ６００個のクローンをＣＥＡ陽性のＣＨＯ細胞で結合シグナルについて試験した。２７個の陽性クローンが得られた。それぞれのｓｃＦｖ ＤＮＡを配列決定した後、合計９個の異なる配列が得られた。
【０１１１】
図２は、フローサイトメトリー分析により測定される、９個の様々な半ヒトｓｃＦｖ（すなわち、マウスＡ５Ｂ７ ＶＨ−ヒトＶＬ）構築物とＣＥＡ−形質転換ＣＨＯ細胞株の結合を示す。前記図は複数の図表を含み、１つが試験された各構築物を表す。任意の所与図表中、黒色の分布は、いずれの構築物も不在下であるが、ｓｃＦｖの検出に用いられるあらゆる適切な検出剤を含むＰＢＳ単独でインキュベートした細胞の蛍光強度を示す。このようにして、観察されるいずれの蛍光シフトも間違いなく検出剤または緩衝液よりもｓｃＦｖ構築物に起因し得る。構築物とそれぞれの細胞株との結合の指標である蛍光のシフトは、各図表中灰色の線で示される。一般に、（黒色の）対照から離れてより高い強度のシフト、すなわち対照よりもはるかに遠いシフトはより強い結合を示し、一方、（黒色の）対照から離れてより低い強度のシフト、すなわち対照により近いシフトはより弱い結合を示す。
【０１１２】
図２から、構築物Ａ−１２１、Ａ−１８３、Ａ−２４０、Ａ−３１３、Ａ−２９０、Ａ−３１５、Ａ４−３５、Ａ４−５２、ＭＰ２−Ａ５は、それぞれの対照と比較して、蛍光強度において明らかに識別できるシフトを示し、ｓｃＦｖとＣＨＯ標的細胞上の膜結合ＣＥＡとの結合を示すことが分かる。以下で、ｓｃＦｖ Ａ−２４０のヒトＶＬ領域を選択し、ヒトＶＨ領域の単離に用いた。前記ヒトＡ−２４０ ＶＬ領域は、例えば配列番号２に包含される。
【０１１３】
実施例４：可溶性ＣＥＡ抗原に対して抵抗性のあるヒト化ＶＨ領域の抗体ライブラリーの構築およびファージディスプレイ選択
以下の実験の目的は、実施例３に記載されるように選択される、ｓｃＦｖ Ａ−２４０のヒトＶＬ領域と対となる可溶性ＣＥＡ抗原に対して抵抗性のある一連のヒト化ＶＨ領域の選択である。前記ヒトＡ−２４０ ＶＬ領域は、例えば配列番号２に包含される。
【０１１４】
１．末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からのＲＮＡの単離
１００ｍＬの血液を５名の健康なヒトドナーから採取した。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、標準的な方法に従ってフィコール勾配により単離した。全ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ（登録商標）Ｍｉｄｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を製造業者の説明書に従って用いてＰＢＭＣから単離した。ｃＤＮＡを標準的な方法に従って合成した（Sambrook, Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989, 2001）。
【０１１５】
２．可変重鎖領域（ＶＨ領域）のＰＣＲ増幅
ＶＨライブラリーを構築し、Ｌｉｂ １３４−ＶＨと名付けた。このＶＨ−ライブラリーは、その後にヒトＦＲ４生殖系列配列が続く母親由来の抗体のＶＨＣＤＲ３と作動可能なように連結された、ＰＣＲ増幅された上記のＰＢＭＣプールのＶＨ領域由来のＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３のヒトレパートリーで構成される。
【０１１６】
ヒト鋳型ＶＨ領域の単離のため、５’−ＶＨ特異的プライマーセット（５’−ｈｕＶＨ１，３，５−Ｘｈｏ Ｉ−２００１（５’−ＡＧＧ ＴＧＣ ＡＧＣ ＴＧＣ ＴＣＧ ＡＧＴ ＣＴＧ Ｇ−３’）（配列番号６０）、５’−ｈｕＶＨ４−Ｘｈｏ Ｉ−２００１（５’−ＣＡＧ ＧＴＧ ＣＡＧ ＣＴＧ ＣＴＣ ＧＡＧ ＴＣＧ ＧＧ−３’）（配列番号６１）、５’−ｈｕＶＨ４Ｂ−Ｘｈｏ Ｉ−２００１（５’−ＣＡＧ ＧＴＧ ＣＡＧ ＣＴＡ ＣＴＣ ＧＡＧ ＴＧＧ ＧＧ−３’）（配列番号６２））および２つの３’−ＶＨ特異的プライマーセット（３’−ｈｕ−ＶＨ−ＢｓｔＥＩＩ−２００１（５’−ＣＴＧ ＡＧＧ ＡＧＡ ＣＧＧ ＴＧＡ ＣＣ−３’）（配列番号６３）、３’−ｈｕ−ＶＨ−Ｊ３−ＢｓｔＥＩＩ−２００１（５’−ＣＴＧ ＡＡＧ ＡＧＡ ＣＧＧ ＴＧＡ ＣＣ−３’）（配列番号６４））を用いてＲＴ−ＰＣＲを行った。１回のＰＣＲ反応につき、１個の５’−プライマーを１個の３’−プライマーと組み合わせた；異なるＰＣＲ反応の数は、５’−および３’−プライマーの可能な組み合わせの数により決定した。５つのドナーのＰＢＭＣ ｃＤＮＡを、ＶＨ遺伝子の供給源として用いた。次のＰＣＲプログラム：９４℃にて１５秒間の変性、５２℃にて５０秒間のプライマーアニーリングおよび７２℃にて６０秒間のプライマー伸張を４０サイクル以上行い、それに続いて７２℃にて１０分間の最終伸張、を増幅に用いた。約３５０ｂｐのサイズの増幅産物を標準的な方法に従って単離した。
【０１１７】
Ｌｉｂ １３４−ＶＨ領域の単離のため、ＲＴ−ＰＣＲを二段階で行った。最初に、ヒト重鎖ＶＨ−セグメント（ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３）を、上記と同じ５’−ＶＨ特異的プライマーセット（５’−ｈｕＶＨ１，３，５−Ｘｈｏ Ｉ−２００１、５’−ｈｕＶＨ４−Ｘｈｏ Ｉ−２００１、５’−ｈｕＶＨ４Ｂ−Ｘｈｏ Ｉ−２００１；配列番号６０〜６２）および３’−特異的プライマーセット（３’−Ａ１３４−ＶＨ１Ａ（５’−ＧＴＡ ＧＴＣ ＡＡＡ ＧＴＡ ＧＡＡ ＣＣＧ ＴＡＧ ＣＣＣ ＣＣＴ ＡＴＣ ＴＣＴ ＹＧＣ ＡＣＡ ＧＴＡ ＡＴＡ ＣＡＣ ＧＧＣ−３’）（配列番号６５）、３’−Ａ１３４−ＶＨ１Ｂ（５’−ＧＴＡ ＧＴＣ ＡＡＡ ＧＴＡ ＧＡＡ ＣＣＧ ＴＡＧ ＣＣＣ ＣＣＴ ＡＴＣ ＴＣＴ ＹＧＣ ＡＣＡ ＧＴＡ ＡＴＡ ＣＡＹ ＲＧＣ−３’）（配列番号６６）、３’−Ａ１３４−ＶＨ３Ａ（５’−ＧＴＡ ＧＴＣ ＡＡＡ ＧＴＡ ＧＡＡ ＣＣＧ ＴＡＧ ＣＣＣ ＣＣＴ ＡＴＣ ＴＣＴ ＮＧＹ ＡＣＡ ＧＴＡ ＡＴＡ ＣＡＣ ＲＧＣ−３’）（配列番号６７）、３’−Ａ１３４−ＶＨ３Ｂ（５’−ＧＴＡ ＧＴＣ ＡＡＡ ＧＴＡ ＧＡＡ ＣＣＧ ＴＡＧ ＣＣＣ ＣＣＴ ＡＴＣ ＴＣＴ ＮＧＣ ＡＣＡ ＧＴＡ ＡＴＡ ＣＡＡ ＲＧＣ−３’）（配列番号６８）、３’−Ａ１３４−ＶＨ４（５’−ＧＴＡ ＧＴＣ ＡＡＡ ＧＴＡ ＧＡＡ ＣＣＧ ＴＡＧ ＣＣＣ ＣＣＴ ＡＴＣ ＴＣＴ ＳＧＣ ＡＣＡ ＧＴＡ ＡＴＡ ＣＡＣ ＲＧＣ−３’）（配列番号６９））を、ＦＲ３の非常に末端の領域で一致するヒトＶＨサブファミリー１、３および４に対して用いて、単離された鋳型ＶＨ断片からＰＣＲ増幅した。
【０１１８】
次のプライマーの組み合わせを用いた。
ａ）５’−ｈｕＶＨ１，３，５−Ｘｈｏ Ｉ−２００１ × ３’−Ａ１３４−ＶＨ１Ａ
ｂ）５’−ｈｕＶＨ１，３，５−Ｘｈｏ Ｉ−２００１ × ３’−Ａ１３４−ＶＨ１Ｂ
ｃ）５’−ｈｕＶＨ１，３，５−Ｘｈｏ Ｉ−２００１ × ３’−Ａ１３４−ＶＨ３Ａ
ｄ）５’−ｈｕＶＨ１，３，５−Ｘｈｏ Ｉ−２００１ × ３’−Ａ１３４−ＶＨ３Ｂ
ｅ）５’−ｈｕＶＨ４−Ｘｈｏ Ｉ−２００１ × ３’−Ａ１３４−ＶＨ４
ｆ）５’−ｈｕＶＨ４Ｂ−Ｘｈｏ Ｉ−２００１ × ３’−Ａ１３４−ＶＨ４
【０１１９】
１回のＰＣＲ反応につき、１個の５’−プライマーを１個の３’−プライマーと組み合わせた；異なるＰＣＲ反応の数は、５’−および３’−プライマーの可能な組み合わせの数により決定した。次のＰＣＲプログラム：９４℃にて１５秒間の変性、５２℃にて５０秒間のプライマーアニーリングおよび７２℃にて９０秒間のプライマー伸張を４０サイクル以上行い、それに続いて７２℃にて１０分間の最終伸張、を増幅に用いた。このＰＣＲ段階およびそれぞれの３’−プライマー配列によって、ヒトＶＨセグメントが母親由来のＶＨ ＣＤＲ３の一部分について延長された。それは言い換えると次の２番目の段階のＰＣＲ３’−プライマーのプライミングサイトである。
【０１２０】
これらのＶＨ−（ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３）ＤＮＡ断片を、次に、それぞれの５’ＶＨ特異的プライマーと、増幅されたＤＮＡ断片の普遍的な３’−末端に一致する普遍的な３’プライマー（３’Ａ１３４−ＪＨ６−ＢｓｔＥＩＩ、５’−ＣＧＡ ＧＡＣ ＧＧＴ ＧＡＣ ＣＧＴ ＧＧＴ ＣＣＣ ＴＴＧ ＧＣＣ ＣＣＡ ＧＴＡ ＧＴＣ ＡＡＡ ＧＴＡ ＧＡＡ ＣＣＧ ＴＡＧ ＣＣ−３’）（配列番号７０）を再び用いる２番目のＰＣＲ反応の鋳型として用いた。
【０１２１】
次のＰＣＲプログラム：
９４℃にて１５秒間の変性、５２℃にて５０秒間のプライマーアニーリングおよび７２℃にて６０秒間のプライマー伸張を４０サイクル以上行い、それに続いて７２℃にて１０分間の最終伸張、を増幅に用いた。ＤＮＡ Ｖ断片を標準的なプロトコールに従って単離した。
【０１２２】
３．ライブラリー構築−ヒトＶＨプールのクローニング
前述の方法の第２ラウンドでは、１回目の前の選択（実施例３参照）で同定されたｓｃＦｖ Ａ−２４０のヒトＶＬを選択し、それに続いてヒトｓｃＦｖを作製する目的でヒトＶＨ断片のライブラリーと組み合わせた。ファージディスプレイライブラリーは、概して、例えば「Phage Display: A Laboratory Manual」;Ed. Barbas, Burton, Scott & Silverman; Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001に開示されるような標準的な手順に基づいて構築された。
【０１２３】
異なるＰＣＲ増幅からの重鎖ＤＮＡ断片を各連結について次のように秤量した。
ａ：ｂ：ｃ：ｄ：ｅ：ｆ＝３：１：３：１：１：１、ここでａ〜ｆは次の意味：
ａ）初期プライマー組み合わせ ５’−ｈｕＶＨ１，３，５−Ｘｈｏ Ｉ−２００１ × ３’−Ａ１３４−ＶＨ１Ａに由来
ｂ）初期プライマー組み合わせ ５’−ｈｕＶＨ１，３，５−Ｘｈｏ Ｉ−２００１ × ３’−Ａ１３４−ＶＨ１Ｂに由来
ｃ）初期プライマー組み合わせ ５’−ｈｕＶＨ１，３，５−Ｘｈｏ Ｉ−２００１ × ３’−Ａ１３４−ＶＨ３Ａに由来
ｄ）初期プライマー組み合わせ ５’−ｈｕＶＨ１，３，５−Ｘｈｏ Ｉ−２００１ × ３’−Ａ１３４−ＶＨ３Ｂに由来
ｅ）初期プライマー組み合わせ ５’−ｈｕＶＨ４−Ｘｈｏ Ｉ−２００１ × ３’−Ａ１３４−ＶＨ４に由来
ｆ）初期プライマー組み合わせ ５’−ｈｕＶＨ４Ｂ−Ｘｈｏ Ｉ−２００１ × ３’−Ａ１３４−ＶＨ４に由来
を有する。
【０１２４】
４００ｎｇのヒトＬｉｂ １３４−ＶＨ断片プール（Ｘｈｏ Ｉ-ＢｓｔＥＩＩ消化）および１２００ｎｇのプラスミドｐＣｏｍｂ３Ｈ５ＢＨｉｓ／Ａ−２４０ ＶＬ（ｓｃＦｖ Ａ−２４０のＶＬ領域をコードするＤＮＡを、制限部位ＳａｃＩおよびＳｐｅＩを介して標準手順に従ってｐＣｏｍｂ３Ｈ５ＢＨｉｓにクローニングした）で構成される、１回の連結反応を設定した。得られる抗体ヒトＶＨプールを、次に、３００μＬのエレクトロコンピテント大腸菌ＸＬ１ Ｂｌｕｅ株にエレクトロポレーション（２．５ｋＶ、０．２ｃｍギャップキュベット、２５ｍＦ、２００ Ｏｈｍ、Ｂｉｏｒａｄ ｇｅｎｅ−ｐｕｌｓｅｒ）により形質転換し、合計で０．８×１０8の独立したクローンからなるライブラリーサイズを得た。
【０１２５】
エレクトロポレーション後、アッセイをＳＯＣ培養液（Ｆｌｕｋａ）中で表現型発現のためにインキュベートした。次に培養物を、５０μｇ／ｍｌ カルベニシリンおよび２％ ｖ／ｖ グルコースを含有する５００ｍＬのＳＢ選択培地中で一晩それぞれインキュベートした。翌日、培養物の細胞を遠心分離により回収し、市販のプラスミド調製キット（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてプラスミド調製を行ってＤＮＡライブラリーを保存した。
【０１２６】
それぞれのｓｃＦｖプールをコードする、１．５μｇのこのプラスミドプールを、次に、大腸菌ＸＬ１ ｂｌｕｅ（２．５ｋＶ、０．２ｃｍギャップキュベット、２５ｍＦ、２００ Ｏｈｍ、Ｂｉｏｒａｄ ｇｅｎｅ−ｐｕｌｓｅｒ）に電気穿孔して合計で２．４×１０9の独立したクローンからなるライブラリーサイズを得た。表現型発現およびカルベニシリンへの緩やかな適応の後、抗体ライブラリーをＳＢ−カルベニシリン（５０μｇ／ｍｌ）選択培地へ移した。次に、抗体ライブラリーを感染量の１×１０12粒子のヘルパーファージＶＣＳＭ１３で感染させ、その結果、繊維状のＭ１３ファージの産生および分泌が得られ、この各ファージ粒子はヒトｓｃＦｖ−断片をコードする一本鎖ｐＣｏｍｂ３Ｈ５ＢＨｉｓ−ＤＮＡを含み、ファージコートタンパク質ＩＩＩへの翻訳融合として対応するｓｃＦｖ−タンパク質を提示した。
【０１２７】
４．ヒトＶＨのファージディスプレイ選択
ヒトｓｃＦｖ−レパートリーを有するファージ粒子をＰＥＧ８０００／ＮａＣｌ沈殿および遠心分離により培養上清から回収した。次に、約１×１０11〜１×１０12ｓｃＦｖファージ粒子を０．５ｍＬのＴＢＳ／１％ ＢＳＡに再懸濁し、ストレプトアビジンコートされたＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ）のウェル中で１時間固定されたビオチン化可溶性ＣＥＡとともにインキュベートした。抗原１０μg／ｍｌのＰＢＳ溶液（５０μｌ）をストレプトアビジンコートされたウェル中で４℃にて一晩インキュベートし、水で１回洗浄し、それに続いてＴＢＳ中２００μｌの３％ ＢＳＡで３７℃にて１時間ブロッキングし、それをインキュベーション後に取り除いた。
【０１２８】
標的抗原と特異的結合しなかったｓｃＦｖファージをＴＢＳ／０．０５％ Ｔｗｅｅｎでの洗浄段階により除去した。この洗浄手順は、さらなるラウンドで１０回まで繰り返された。
【０１２９】
洗浄後、ＨＣｌ−グリシン、ｐＨ ２．２を用いることにより結合体を溶出した。２Ｍ Ｔｒｉｓ、ｐＨ １２での中和後、溶出液を新鮮な非感染大腸菌ＸＬ１ Ｂｌｕｅ培養株の感染に用いた。
【０１３０】
残っている高結合体を溶出するため、５０μｌの新鮮な大腸菌ＸＬ１ ｂｌｕｅ培養株（ＯＤ６００≧０．５）をウェルに添加し、１５分間インキュベートした。次に、両方の培養物を混合し、ヒトｓｃＦｖ−断片をコードするファージミドコピーで首尾よく形質導入した細胞を再びカルベニシリン抵抗性について選択し、その後にＶＣＭＳ１３ヘルパーファージで感染させて、抗体提示およびインビトロでの選択の第２のラウンドを開始した。
【０１３１】
４ラウンドのパニングに対応するプラスミドＤＮＡを大腸菌培養物から単離した。可溶性ｓｃＦｖ−タンパク質の産生のため、ＶＨ−ＶＬ−ＤＮＡ断片をプラスミドから切り出し（Ｘｈｏ Ｉ−ＳｐｅＩ）、プラスミドｐＣｏｍｂ３Ｈ５ＢＦｌａｇ／Ｈｉｓ中の同じ制限部位を介してクローニングし、その発現構築物（例えばｓｃＦｖ）は、ｓｃＦｖとＨｉｓ６タグとの間にＦｌａｇタグ（ＴＧＤＹＫＤＤＤＤＫ）（配列番号５９）を含み、さらなるファージタンパク質が欠失している。
【０１３２】
連結後、各プール（異なるラウンドのパニング）のプラスミドＤＮＡを１００μＬ熱ショックコンピテント大腸菌ＴＧ１に形質転換し、カルベニシリンＬＢ寒天上にプレーティングした。単一のコロニーを選定し、９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ）中の１２０μＬのＬＢカルベニシリン（５０μｇ／ｍｌ）１％ グルコースに播種した。ウェルに半透膜（Ｇｒｅｉｎｅｒ）で密封し、振盪インキュベータでプレートを３７℃にて一晩インキュベートした（マスタープレート）。次に、１０μｌのマスタープレート培養物を、ウェルあたり９０μＬ ＬＢカルベニシリン（５０μｇ／ｍｌ）０．１％ グルコースを含有する第２の９６ウェルプレート（ワーキングプレート）に移した。３７℃の振盪インキュベータ中で４時間のインキュベーションの後、２０μＬ ＬＢカルベニシリン、６ｍＭ ＩＰＴＧを各ウェルに添加することによりｓｃＦｖ生成を誘導した。振盪しながら３０℃にて一晩の別のインキュベーション段階の後、細胞を、４０μＬ 溶解緩衝液（４００ｍＭ ホウ酸、３２０ｍＭ ＮａＣｌ、４ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８、２．５ｍｇ／ｍｌ リゾチーム）での室温にて１時間のインキュベーションで溶解した。残りの細胞および細胞片は１，９００×ｇで１２分間の遠心分離により分離した（Ｈｅｔｔｉｃｈ）。
【０１３３】
次に、ｓｃＦｖ分子を含有する上清を、フローサイトメトリー結合アッセイで結合について試験した。
【０１３４】
ヒトＣＥＡをトランスフェクトしたＣＨＯ細胞をＣＥＡ陽性細胞株として用いた。最初に１００，０００〜２００，０００個の細胞をヒトｓｃＦｖまたは関連する対照を含有する周辺質調製物とともにインキュベートすることにより細胞結合アッセイを行った。インキュベーション後、細胞をＰＢＳ／１％ ＦＣＳ（ウシ胎児血清）中で洗浄し、さらに５〜１０μｇ／ｍｌの抗ＦＬＡＧ Ｍ２抗体とともにインキュベートした。細胞を再び洗浄した後、それらをポリクローナル、ＰＥ標識抗マウス抗体（Ｄｉａｎｏｖａ）とともにインキュベートし、その後フローサイトメトリーにより分析した。４６個のクローンをＣＥＡ陽性のＣＨＯ細胞で結合シグナルについて試験した。それらの全てが陽性のシグナルを示した。それぞれのｓｃＦｖ ＤＮＡを配列決定した後、合計９個の異なる配列が得られ、そのうちの８個が高度の相同性を示した。ヒト化構築物ＭＰ５１０＿３Ａ−５．３（ＭＰ５１０−Ａ５；配列番号２）、ＭＰ５１０＿３−Ｂ９．１（ＭＰ５１１−Ｂ９；配列番号４）、ＭＰ５１０＿３−Ｄ８．１（ＭＰ５１１−Ｄ８；配列番号６）が、さらなる特性決定のために選択された。これらの構築物中のヒト化ＶＨ領域は、マウスモノクローナル抗体Ａ５Ｂ７のＣＤＲ−Ｈ３のKabatの位置９５〜１０２に相当するアミノ酸配列「ＤＲＧＬＲＦＹＦＤＹ」（配列番号２７）を含有する。ｓｃＦｖの対応するアミノ酸配列を表１に示す。
【０１３５】
前記ヒト化構築物ＭＰ５１０−Ａ５、ＭＰ５１１−Ｂ９、ＭＰ５１１−Ｄ８ならびに半ヒト構築物Ａ−２４０ Ｖλ．３（マウスＶＨ Ａ５Ｂ７／ヒトＶＬＡ２４０）の周辺質抽出物を、ＣＥＡ陽性および陰性の細胞株でのフローサイトメトリー実験でさらに分析した。図３から、ヒト化構築物ＭＰ５１０−Ａ５（配列番号２）、ＭＰ５１１−Ｂ９（配列番号４）、ＭＰ５１１−Ｄ８（配列番号６）は、それぞれの半ヒト対照Ａ−２４０ Ｖλ．３（マウスＶＨ Ａ５Ｂ７/ヒトＶＬＡ２４０）と比較して、明らかに識別できるシフトを蛍光強度において示すことが分かる。従って、ヒトｓｃＦｖ構築物は、膜結合ヒトＣＥＡに対して半ヒト構築物Ａ−２４０ Ｖλ．３よりも強い結合活性を示す。さらに、全てのヒト構築物は、ＣＥＡ陽性のヒトＫＡＴＯ ＩＩＩ細胞（ヒト胃癌細胞株）との明確な結合を示したのに対し、それらのどれもがＣＥＡ陰性の非トランスフェクトＣＨＯ細胞ならびにＣＥＡ陰性のヒトＮＡＬＭ６細胞（ヒトＢ細胞株）との結合を示さなかった（データは示さず）。
【０１３６】
実施例５：可溶性ＣＥＡ抗原に対する抵抗性を有するヒト化ＩｇＧ１抗体の作製および特性決定
細菌は機能的なＦａｂ断片を発現することが知られているが、それらは通常、完全な機能的免疫グロブリンを産生することはできない。完全な機能的ＩｇＧ１抗体の産生のためには、哺乳類細胞を使用する必要があり、そのために実施例４で選択したｓｃＦｖ Ａ−２４０のＶＬ領域およびｓｃＦｖ分子の様々なＶＨ領域（特にｓｃＦｖ Ａ５、ｓｃＦｖ Ｄ８およびｓｃＦｖ Ｂ９のＶＨ領域）が哺乳類発現ベクターにサブクローニングされた。
【０１３７】
１．ｓｃＦｖ Ａ−２４０に基づくヒト軽鎖のクローニング
クローンＡ−２４０のヒトＶＬは、Ｂｓｕ３６Ｉ制限部位をその核酸配列に含有した。従って、標準的なプロトコールを用いて、アミノ酸交換をもたらさないヌクレオチド交換を制限モチーフ中に有する変異体が生成された（Ａ−２４０ｄｅｌＢｓｕ）。
【０１３８】
ＶＬ Ａ−２４０の適した哺乳類発現ベクターへのクローニングのため、適した末端制限部位を挿入する必要があった。従って、ｓｃＦｖ Ａ２４０のＶＬ領域をコードするＤＮＡ断片を、プライマー、５’−Ａ２４０−Ｂｓｕ３６Ｉ （ＴＴＣＴＣＴＣＣＴＴＡＧＧＴＧＴＣＣＡＣＴＣＣ ＣＡＧ ＧＣＣ ＧＴＧ ＣＴＧ ＡＣＴ ＣＡＧ ＣＣＧ ＧＣ）（配列番号９３）および３’−Ａ２４０−オーバーラップ（ＧＣＣＴＴＧＧＧＣＴＧＡＣＣＴＡＧＧＡＣＧＧＴＣＡＡＣＴＴＧＧＴＣＣ）（配列番号９４）を用いるＰＣＲにより再び増幅した。
【０１３９】
２回目のＰＣＲでは、ヒトλ定常領域を、標準的な方法に従って５’−プライマー５’−Ｃｌａｍ−オーバーラップ（ＧＴＴＧＡＣＣＧＴＣＣＴＡＧＧＴＣＡＧＣＣＣＡＡＧＧＣＴＧＣＣＣＣＣＴＣＧ）（配列番号９５）および３’−プライマー３’−Ｃｌａｍ−Ｎｏｔｌ（ＧＡＣＧＴＡ ＧＣＧＧＣＣＧＣ ＧＴＣＧＡＣ ＣＴＡＴＧＡＡＣＡＴＴＣＴＧＴＡＧＧＧＧＣ）（配列番号９６）を用いてヒトｃＤＮＡプールから増幅した。両方のＰＣＲの約３３０ｂｐのＤＮＡ産物は同一の３’（Ａ−２４０）または５’（Ｃλ）オーバーラップを配列中に有した。
【０１４０】
２つの断片を、５’−プライマー５’−Ａ２４０−Ｂｓｕ３６Ｉおよび３’−プライマー３’−Ｃｌａｍ−Ｎｏｔｌと組み合わせて融合ＰＣＲに（標準的なプロトコールに従って）用いて、ヒトλ定常領域と融合したヒトＶＬ Ａ−２４０をコードする全長軽鎖産物を生成した（配列番号８０に示されるアミノ酸配列に対応）。このＤＮＡ断片は、５’末端にＢｓｕ３６Ｉ部位を含有し、かつ３’−末端にＳａｌＩ制限部位とそれに続いてＮｏｔＩ制限部位を含有した。
【０１４１】
次に、この断片を、Ｂｓｕ３６ＩおよびＮｏｔ Ｉにより、従ってヒトリーダー配列を加えることによりｐＢＳ由来のプラスミド（上記）にサブクローニングした。この構築物を配列決定により検証した。ＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩを利用して、Ａ−２４０ ＶＬ−ＣλＤＮＡを前記構築物から切り出し、マウスジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）をコードするｃＤＮＡをマウスアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）をコードするｃＤＮＡと置換することにより発現ベクターｐＥＦ−ＤＨＦＲに由来する真核生物発現ベクターｐＥＦ−ＡＤＡにサブクローニングした（Mack et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92, 7021-5）。ｐＥＦ−ＡＤＡはRaum（上記引用文中）に記載されている。Ａ−２４０ ＶＬ−Ｃλのアミノ酸配列（Ａ２４０軽鎖に対応）は配列番号８０に示される。
【０１４２】
２．ヒト化重鎖可変ドメインのクローニング
実施例４で選択された様々なヒト化ＶＨ領域（特にｓｃＦｖ Ａ５、ｓｃＦｖ Ｄ８およびｓｃＦｖ Ｂ９のＶＨ領域）から、可変領域をＰＣＲにより再増幅し、両末端にＢｓｕ３６Ｉ制限部位を生成した。全ての構築物について、２つのプライマーの組み合わせ：５’−プライマー５’−ＣＶＨ−Ｂｓｕ３６Ｉ （５’−ＴＴＣＴＣＴＣＣＴＴＡＧＧＴＧＴＣＣＡＣＴＣＣ ＧＡＧ ＧＴＧ ＣＡＧ ＣＴＧ ＧＴＣ ＧＡＧ ＴＣ−３’）（配列番号９７）および３’−プライマー３’−ＣＶＨ−Ｂｓｕ３６Ｉ （５’−ＧＡＣＴＣＡＣＣＴＧＡＧＧＡ ＧＡＣ ＧＧＴ ＧＡＣ ＣＧＴ ＧＧＴ ＣＣＣ ＴＴＧ Ｇ−３’）（配列番号９８）を用いた。次に、得られるＤＮＡ断片を、これらの制限部位を用いて、既に真核生物のリーダー配列とヒトＩｇＧ１重鎖定常領域をコードするＤＮＡ断片を含有する真核生物発現ベクターｐＥＦ−ＤＨＦＲにサブクローニングした。従って重鎖可変領域はリーダーと重鎖定常領域の間に挿入した。可変領域の正しい配列は配列決定により確認した。Ａ５重鎖のアミノ酸配列は配列番号７７に示され、Ｂ９重鎖のアミノ酸配列は配列番号７８に示され、Ｄ８重鎖のアミノ酸配列は配列番号７９に示される。
【０１４３】
３．ヒト化完全ＩｇＧタンパク質の発現
１本の軽鎖をコードするプラスミドおよび１本の重鎖をコードするプラスミド（ＶＨ／ヒトＩｇＧ１定常領域）を、一過性のタンパク質発現のための標準的なプロトコールに従ってＨＥＫ細胞に同時導入し、細胞を培養して免疫グロブリンの培地中への発現および産生を可能とした。このように、ｓｃＦｖ Ａ５に由来するＩｇＧ１ Ａ５、ｓｃＦｖ Ｄ８に由来するＩｇＧ１ Ｄ８およびｓｃＦｖ Ｂ９に由来するＩｇＧ１ Ｂ９を産生させた。それぞれの製造期間の後、上清を回収し、免疫グロブリンの精製のための標準的なプロトコールに従ってプロテインＡクロマトグラフィーによってヒト免疫グロブリンを単離した。次に、培養上清、ならびに精製された免疫グロブリンをさらなる特性決定実験に用いた。
【０１４４】
Ａ５重鎖のアミノ酸配列は配列番号７７に示され、Ｂ９重鎖のアミノ酸配列は配列番号７８に示され、Ｄ８重鎖のアミノ酸配列は配列番号７９に示される。Ａ２４０軽鎖のアミノ酸配列は、配列番号８０に示される。
【０１４５】
ｓｃＦｖ Ａ５に由来するＩｇＧ１ Ａ５は、配列番号７７に示されるＡ５重鎖と配列番号８０に示されるＡ２４０軽鎖のアミノ酸配列を含む。ｓｃＦｖ Ｂ９に由来するＩｇＧ１ Ｂ９は、配列番号７８に示されるＢ９重鎖のアミノ酸配列と配列番号８０に示されるＡ２４０軽鎖のアミノ酸配列を含む。ｓｃＦｖ Ｄ８に由来するＩｇＧ１ Ｄ８は、配列番号７９に示されるＤ８重鎖のアミノ酸配列と配列番号８０に示されるＡ２４０軽鎖のアミノ酸配列を含む。これらのＩｇＧ１抗体構築物中の（ヒト化）ＶＨ領域は、マウスモノクローナル抗体Ａ５Ｂ７のＣＤＲ−Ｈ３のKabatの位置９５〜１０２に相当するアミノ酸配列「ＤＲＧＬＲＦＹＦＤＹ」（配列番号２７）を含有する。上述の重鎖および軽鎖の対応するアミノ酸配列を表１に示す。
【０１４６】
４．可溶性ＣＥＡ抗原に対する抵抗性を有するヒト化ＩｇＧ１抗体の特性決定
４．１ 固定化された可溶性ＣＥＡ（ｓＣＥＡ）抗原との結合
重鎖＋軽鎖の二重形質転換体の培養上清ならびに対応する精製抗体の調製物を、固定化されたｓＣＥＡ抗原上での結合についてＥＬＩＳＡにより標準的な手順に従って試験した。無関係なヒトＩｇＧ１抗体を陰性対照として含んだ。
【０１４７】
手短に言えば、抗体結合を固定化ＣＥＡ抗原上で試験し、ＣＥＡ特異性を実証するために、それぞれ１０ｕｇ／ｍｌおよび１ｕｇ／ｍｌの培養上清および精製抗体溶液を用いて、コートされたＣＥＡ抗原の不在下でも試験した。これらの抗体溶液を、＋／−抗原コートウェル（４℃、一晩）およびＢＳＡブロックしたウェル（３７℃、１時間）に添加した。検出は、ペルオキシダーゼ標識ポリクローナルヒトＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）により行った。ＡＢＴＳ溶液での適切なインキュベーション後にシグナルを測定した。
【０１４８】
図４に示されるように、ヒト化抗体ＩｇＧ１ Ａ５、ＩｇＧ１ Ｄ８およびＩｇＧ１ Ｂ９ならびに実施例２のｈｕＩｇＧ１ ＣＥＡ ＩおよびＣＥＡ ＩＩ構築物は、陰性対照と比較して固定化された可溶性ＣＥＡ（ｓＣＥＡ）抗原との明確な結合を示し、ｓＣＥＡ抗原がコートされない点で異なる同等の設定では結合を示さなかった。
【０１４９】
４．２ 天然ＣＥＡ抗原との細胞上での結合
ヒト化ＩｇＧ１ Ａ５、ＩｇＧ１ Ｄ８およびＩｇＧ１ Ｂ９構築物の精製抗体調製物ならびに実施例２のｈｕＩｇＧ１−ＣＥＡ Ｉおよび−ＣＥＡ ＩＩ構築物を、ＣＥＡを発現しているＫａｔｏ ＩＩＩ細胞、ＣＥＡトランスフェクトＣＨＯ細胞およびＣＥＡ非トランスフェクトＣＨＯ細胞でＦＡＣＳ分析により試験した。
【０１５０】
２×１０5細胞を、精製抗体調製物とともにインキュベートした（通常１０〜２０μｇ／ｍｌ）。検出は、ビオチン化ポリクローナル抗ヒトＩｇＧ抗体（ＤＡＫＯ）、それに続いてＰＥ標識ストレプトアビジン（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）（通常１０〜２０μｇ／ｍｌ）により行った。インキュベーションは氷上で２０〜４０分間行った。
【０１５１】
ヒト化ＩｇＧ１ Ａ５、ＩｇＧ１ Ｄ８およびＩｇＧ１ Ｂ９構築物ならびに実施例２のｈｕＩｇＧ−ＣＥＡ Ｉおよび−ＣＥＡ ＩＩ構築物はＣＥＡ陽性細胞に対して明確な結合を示した（図５Ａ、ＢおよびＣ）。いずれの抗体も非トランスフェクトＣＨＯ細胞との結合を示さなかった。ＩｇＧ−対照はＫａｔｏ細胞、ＣＨＯ／ＣＥＡ−細胞および非トランスフェクトＣＨＯ細胞上で陰性であった。
【０１５２】
４．３ 抗体依存性の細胞に媒介される細胞障害活性（ＡＤＣＣ；51Ｃｒ放出アッセイ）
51Ｃｒ放出アッセイのため、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をエフェクター細胞として健康なドナーから単離した。フィコール密度勾配遠心分離とその後の１００×ｇ遠心分離段階よりＰＢＭＣを分離した。刺激されていないＰＢＭＣ（５×１０5細胞）を、平底マイクロタイタープレートの各ウェルに１００μｌの容積の１０％ ＦＣＳを含むＲＰＭＩ １６４０培地に添加し、３７℃にて一晩インキュベートした。標的細胞として、ＣＥＡ陽性の胃癌細胞株ＫＡＴＯ ＩＩＩを用いた。標的細胞（５０，０００細胞）を２時間51Ｃｒで標識した。標識した標的細胞（１００μｌ）および様々な濃度の抗体（１０ｐｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌ）をＰＢＭＣに添加し、３７℃にて１８時間インキュベートした。対応する結合していないアイソタイプを陰性対照として用いた。特異的溶解を、（（実験放出ｃｐｍ）−（自然放出ｃｐｍ））／（（最大放出ｃｐｍ）−（自然放出ｃｐｍ））として計算した。
【０１５３】
ｓＣＥＡの不在下で、ヒト化抗ＣＥＡ抗体ＩｇＧ１ Ａ５、ＩｇＧ１ Ｄ８およびＩｇＧ１ Ｂ９は、陰性対照と比較してＣＥＡ陽性胃癌細胞株ＫＡＴＯ ＩＩＩに細胞障害活性を媒介することが分かった。実施例２に示されるように、抗体ＣＥＡ ＩおよびＣＥＡ ＩＩ（ｈｕＩｇＧ１−ＣＥＡ ＩおよびＣＥＡ ＩＩ構築物）のＩｇＧ版に関して同じ結果が観察されている。同時に、抗体サンプルを攪拌下で２０分間可溶性ＣＥＡ（ｓＣＥＡ）抗原でプレインキュベートし、次に標識した標的細胞とヒトＰＢＭＣを混合した。さもなければ、アッセイは上記のように行った。可溶性ＣＥＡ（ｓＣＥＡ）抗原を、様々な濃度、すなわち、１μｇ／ｍｌおよび１０μｇ／ｍｌで用いた。アッセイを測定し、それぞれの細胞障害値をプロットした。
【０１５４】
２つの代表的な結果を、それぞれ抗体ＣＥＡ ＩＩおよび抗体ＩｇＧ１ Ａ５について図６ＡおよびＢに示す。このアッセイにおいて、抗体ＣＥＡ ＩＩの細胞溶解能が可溶性ＣＥＡ抗原の存在下で用量依存的に劇的に低減されたことが実証された。それぞれの曲線は、可溶性ＣＥＡを含まない曲線と比較して、１ｕｇ／ｍｌ ｓＣＥＡの存在下で明らかに右にシフトする。１０ｕｇ／ｍｌ ｓＣＥＡの存在下では、検出レベルを下回る抗体ＣＥＡ ＩＩの細胞溶解活性の完全な低下を示す、細胞溶解曲線は観察されなかった。それぞれのＥＣ５０値（最大半量の細胞溶解抗体濃度）は、ベースレベルで最も低い(the last)細胞障害値よりも濃度が高いと推定された。このことは、抗体ＣＥＡ ＩＩに関するＥＣ５０レベルの過小評価と、おそらくさらにより高い、下に定められる「阻害因子」を導く。
【０１５５】
これに対し、細胞溶解アッセイにおいて可溶性ＣＥＡ抗原の有意な阻害効果は抗体ＩｇＧ１ Ａ５、ＩｇＧ１ Ｂ９およびＩｇＧ１ Ｄ８に関して実証されなかった。全ての抗体が可溶性ＣＥＡの不在下で同程度のＥＣ５０値を示した。このことは可溶性ＣＥＡの不在下での同程度の細胞溶解活性を示す。
【０１５６】
ＥＣ５０値を解析ソフトウェアにより決定した。ＥＣ ５０値を表２に表す。
【０１５７】
【表１】
【０１５８】
可溶性ＣＥＡ抗原の存在下での細胞溶解性の阻害を「阻害因子」に変換した。この因子は、ＡＤＣＣアッセイにおける１０および１ｕｇ／ｍｌ 可溶性ＣＥＡの存在下でのＥＣ５０を可溶性ＣＥＡの不在下でのＥＣ５０で割ったものと定義される。阻害因子を表３に表す。
【０１５９】
【表２】
【０１６０】
阻害因子のグラフ表示が図７に示される。この図は明らかに、１ｕｇ／ｍｌの可溶性ＣＥＡ抗原の存在下で、可溶性ＣＥＡ抗原の存在下で３７倍以上の細胞溶解活性の低下を示し、ＣＥＡ ＩＩが劇的に細胞溶解活性を低減させたこと、一方、ＩｇＧ１ Ａ５およびＩｇＧ１ Ｄ８に媒介される、腫瘍細胞に対する細胞溶解活性は可溶性ＣＥＡに対して完全に抵抗性であることを示す。ＩｇＧ１ Ｂ９に媒介される、腫瘍細胞に対する細胞溶解活性はｓＣＥＡによりごくわずかな影響しか受けない。前記抗体構築物は１０を下回る阻害因子を示す。
【０１６１】
この効果は、ＡＤＣＣアッセイにおいて１０ｕｇ／ｍｌ濃度の可溶性ＣＥＡでさらにより明白である。抗体ＣＥＡ ＩＩの細胞溶解曲線はベースラインまで低下している（最大濃度でさえも細胞溶解活性は検知することができなかった）。従って、抗体ＣＥＡ ＩＩの阻害因子は、おそらくはるかに低く見積もって最高で７４であると推定された。
【０１６２】
要約すれば、可溶性ＣＥＡの存在下で、ｈｕＩｇＧ−ＣＥＡ ＩＩ（ｍＡｂ Ｔ８４．６６に由来）は、ＣＥＡ陽性標的細胞に対して劇的に低下した細胞障害活性のを示した；実施例２および５参照。これに対し、ヒト化ＣＥＡ抗体ＩｇＧ１ Ａ５、ＩｇＧ１ Ｄ８およびＩｇＧ１ Ｂ９は、可溶性ＣＥＡの不在下での活性と比較して、細胞溶解活性の有意な低下を示さなかった。ＩｇＧ１ Ａ５、ＩｇＧ１ Ｂ９およびＩｇＧ１ Ｄ８に媒介される、腫瘍細胞に対する細胞溶解活性は可溶性ＣＥＡに対して抵抗性である。驚くことに、そのほかの点では完全なヒトＩｇＧ１抗体のＩｇＧ１ Ａ５、ＩｇＧ１ Ｄ８およびＩｇＧ１ Ｂ９のＶＨ領域中のマウスモノクローナル抗体Ａ５Ｂ７のＣＤＲ−Ｈ３のKabatの位置９５〜１０２に相当するアミノ酸配列「ＤＲＧＬＲＦＹＦＤＹ」（配列番号２７）は、可溶性ＣＥＡ抗原に対する抵抗性を媒介するのに十分である。
【表３】
【図面の簡単な説明】
【０１６３】
【図１】ＶＨ、ＣH１、ヒンジ、ＣH２、ＣH３、ＶＬおよびＣL領域を含むＩｇＧ分子の模式図である。ＶＨおよびＶＬ領域のＣＤＲは黒色の長方形で示される。
【図２】Ｆｌａｇがタグされた、選択されたクローン由来のＣＥＡ特異的ｓｃＦｖタンパク質断片を含有する周辺質調製物のフローサイトメトリー分析を示す。ｓｃＦｖの各々は、実施例３に記載されるように、マウスＡ５Ｂ７ＶＨ領域とヒトＶＬ領域からなる。可溶性ｓｃＦｖタンパク質断片の周辺質調製物を１００，０００〜２００，０００個のＣＥＡをトランスフェクトしたＣＨＯ細胞に添加した。検出のため、モノクローナル抗Ｆｌａｇ抗体を用い、その後にＰＥ標識ポリクローナル抗マウス抗体を用いた。細胞と結合しているＳｃＦｖを、蛍光強度を増加させて、ＰＢＳのみでインキュベートした細胞と比較して測定した。蛍光強度をＸ軸にブロットし、イベントの数をＹ軸にブロットした。陰性対照（ＰＢＳおよび検出試薬）は黒く塗られた曲線で示し、個別のｓｃＦｖは灰色の線で示す。右への移動は細胞との正の結合を示す。全てのｓｃＦｖ、すなわち、Ａ−１２１、Ａ−１８３、Ａ−２４０、Ａ−３１３、Ａ−２９０、Ａ−３１５、Ａ４−３５、Ａ４−５２およびＭＰ２−Ａ５は、ＣＨＯ細胞上で膜と結合したＣＥＡと結合する。
【図３】Ｆｌａｇがタグされた、選択されたクローン由来のＣＥＡ特異的ｓｃＦｖタンパク質断片を含有する周辺質調製物のフローサイトメトリー分析を示す。これらのｓｃＦｖの各々は、実施例４に記載されるように、ヒト化ＶＨ領域とヒトＶＬ領域Ａ２４０からなる。可溶性ｓｃＦｖタンパク質断片の周辺質調製物を１００，０００〜２００，０００個のＣＥＡをトランスフェクトしたＣＨＯ細胞に添加した。モノクローナル抗Ｆｌａｇ抗体、続いてＰＥ標識ポリクローナル抗マウス抗体で検出を行った。細胞と結合しているＳｃＦｖを、蛍光強度を増加させて、ＰＢＳのみでインキュベートした細胞と比較して測定した。蛍光強度をＸ軸にブロットし、イベントの数をＹ軸にブロットした。陰性対照（ＰＢＳおよび検出試薬）は黒く塗られた曲線で示し、個別のｓｃＦｖは灰色の線で示す。右への移動は細胞との正の結合を示す。ヒト化ｓｃＦｖ構築物ＭＰ５１０＿３Ａ５．３、ＭＰ５１０＿３−Ｂ９．１、およびＭＰ５１０＿３−Ｄ８．１はＣＨＯ細胞上で膜と結合したＣＥＡと結合する。２４０Ｖλ．３は、マウスＡ５Ｂ７ＶＨ領域とヒトＶＬＡ−２４０領域からなるｓｃＦｖである。この構築物はまた、ＣＥＡ結合活性を示す。
【図４】ヒト化抗体Ａ５、Ｂ９、Ｄ８の精製ヒトＩｇＧ１版および抗体ＣＥＡ ＩおよびＣＥＡ ＩＩのヒトＩｇＧ１版ならびに抗体含有培養上清のＥＬＩＳＡ分析を示す。無関係なヒトＩｇＧ１抗体を陰性対照として含んだ。抗体結合を、固定化されたＣＥＡ抗原で、さらにＣＥＡ特異性の実証のためにコートされたＣＥＡ抗原の不在下で試験した。培養上清、１０ｕｇ／ｍｌおよび１ｕｇ／ｍｌ 抗体溶液をＢＳＡでブロックされた＋／−抗原コートウェルに添加した。検出をペルオキシダーゼ標識ポリクローナルヒトＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）により行った。ＡＢＴＳ溶液を用いる適当なインキュベーションの後にシグナルを測定した。シグナル強度をＹ軸にプロットする。抗体ＣＥＡ ＩおよびＣＥＡ ＩＩならびにヒト化抗体ＩｇＧ１ Ａ５、ＩｇＧ１ Ｂ９およびＩｇＧ１ Ｄ８と、固定化されたヒトＣＥＡ抗原との特異的結合をこの実験で実証することができた。
【図５Ａ】１０ｕｇ／ｍｌの抗体濃度を用いる、精製したＣＥＡ抗体およびそれぞれの陰性対照のフローサイトメトリー分析（図４参照）を示す。抗体サンプルを、１００，０００〜２００，０００個のＣＥＡ陽性Ｋａｔｏ ＩＩＩ細胞（Ａ）、ＣＥＡトランスフェクトＣＨＯ細胞（Ｂ）およびＣＥＡ陰性ＣＨＯ細胞（Ｃ）に添加した。検出は、ビオチン化ポリクローナル抗ヒトＩｇＧ抗体（ＤＡＫＯ）、それに続いてＰＥ標識ストレプトアビジン（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）で行った。細胞と結合している抗体を、蛍光強度を増加させて、それぞれのアイソタイプ対照とともにインキュベートした細胞と比較して測定した。蛍光強度をＸ軸にブロットし、イベントの数をＹ軸にブロットした。陰性対照（ＰＢＳおよび検出試薬）は黒く塗られた曲線で示し、それぞれの抗体は灰色の線で示す。右への移動は細胞との正の結合を示す。抗体ＣＥＡ ＩおよびＣＥＡ ＩＩならびにヒト化抗体ＩｇＧ１ Ａ５、ＩｇＧ１ Ｂ９およびＩｇＧ１ Ｄ８と、細胞上のヒトＣＥＡ抗原との特異的結合をこの実験で実証することができた。
【図５Ｂ】１０ｕｇ／ｍｌの抗体濃度を用いる、精製したＣＥＡ抗体およびそれぞれの陰性対照のフローサイトメトリー分析（図４参照）を示す。抗体サンプルを、１００，０００〜２００，０００個のＣＥＡ陽性Ｋａｔｏ ＩＩＩ細胞（Ａ）、ＣＥＡトランスフェクトＣＨＯ細胞（Ｂ）およびＣＥＡ陰性ＣＨＯ細胞（Ｃ）に添加した。検出は、ビオチン化ポリクローナル抗ヒトＩｇＧ抗体（ＤＡＫＯ）、それに続いてＰＥ標識ストレプトアビジン（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）で行った。細胞と結合している抗体を、蛍光強度を増加させて、それぞれのアイソタイプ対照とともにインキュベートした細胞と比較して測定した。蛍光強度をＸ軸にブロットし、イベントの数をＹ軸にブロットした。陰性対照（ＰＢＳおよび検出試薬）は黒く塗られた曲線で示し、それぞれの抗体は灰色の線で示す。右への移動は細胞との正の結合を示す。抗体ＣＥＡ ＩおよびＣＥＡ ＩＩならびにヒト化抗体ＩｇＧ１ Ａ５、ＩｇＧ１ Ｂ９およびＩｇＧ１ Ｄ８と、細胞上のヒトＣＥＡ抗原との特異的結合をこの実験で実証することができた。
【図５Ｃ】１０ｕｇ／ｍｌの抗体濃度を用いる、精製したＣＥＡ抗体およびそれぞれの陰性対照のフローサイトメトリー分析（図４参照）を示す。抗体サンプルを、１００，０００〜２００，０００個のＣＥＡ陽性Ｋａｔｏ ＩＩＩ細胞（Ａ）、ＣＥＡトランスフェクトＣＨＯ細胞（Ｂ）およびＣＥＡ陰性ＣＨＯ細胞（Ｃ）に添加した。検出は、ビオチン化ポリクローナル抗ヒトＩｇＧ抗体（ＤＡＫＯ）、それに続いてＰＥ標識ストレプトアビジン（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）で行った。細胞と結合している抗体を、蛍光強度を増加させて、それぞれのアイソタイプ対照とともにインキュベートした細胞と比較して測定した。蛍光強度をＸ軸にブロットし、イベントの数をＹ軸にブロットした。陰性対照（ＰＢＳおよび検出試薬）は黒く塗られた曲線で示し、それぞれの抗体は灰色の線で示す。右への移動は細胞との正の結合を示す。抗体ＣＥＡ ＩおよびＣＥＡ ＩＩならびにヒト化抗体ＩｇＧ１ Ａ５、ＩｇＧ１ Ｂ９およびＩｇＧ１ Ｄ８と、細胞上のヒトＣＥＡ抗原との特異的結合をこの実験で実証することができた。
【図６Ａ】ヒト化抗体Ａ５、Ｂ９、Ｄ８の精製ヒトＩｇＧ１版および抗体ＣＥＡ ＩＩのヒトＩｇＧ１版の細胞障害活性分析（ＡＤＣＣアッセイ）を示す。標的細胞（ＣＥＡトランスフェクトＣＨＯ細胞）をクロム５１で標識し、ヒトＰＢＭＣの存在下で個々の抗体の量を低下させて１８時間、そして２つの濃度の可溶性ヒトＣＥＡ抗原（それぞれ１０および１ｕｇ／ｍｌ）の存在下でインキュベートした。２つの代表結果は、図６ＡのＣＥＡ ＩＩ抗体および図６ＢのＩｇＧ１ Ａ５抗体に示される。これらの２つの例は、ヒト化抗体ＩｇＧ１ Ａ５に対する可溶性ＣＥＡの細胞障害阻害効果がないこと（図６Ｂ）、それに対してＣＥＡ ＩＩ抗体の細胞溶解活性は１ｕｇ／ｍｌの可溶性ＣＥＡの存在下で劇的に低下し、１０ｕｇ／ｍｌの可溶性ＣＥＡの存在下でさらに検出レベルを下回って低下する（図６Ａ)ことを明らかに示している。
【図６Ｂ】ヒト化抗体Ａ５、Ｂ９、Ｄ８の精製ヒトＩｇＧ１版および抗体ＣＥＡ ＩＩのヒトＩｇＧ１版の細胞障害活性分析（ＡＤＣＣアッセイ）を示す。標的細胞（ＣＥＡトランスフェクトＣＨＯ細胞）をクロム５１で標識し、ヒトＰＢＭＣの存在下で個々の抗体の量を低下させて１８時間、そして２つの濃度の可溶性ヒトＣＥＡ抗原（それぞれ１０および１ｕｇ／ｍｌ）の存在下でインキュベートした。２つの代表結果は、図６ＡのＣＥＡ ＩＩ抗体および図６ＢのＩｇＧ１ Ａ５抗体に示される。これらの２つの例は、ヒト化抗体ＩｇＧ１ Ａ５に対する可溶性ＣＥＡの細胞障害阻害効果がないこと（図６Ｂ）、それに対してＣＥＡ ＩＩ抗体の細胞溶解活性は１ｕｇ／ｍｌの可溶性ＣＥＡの存在下で劇的に低下し、１０ｕｇ／ｍｌの可溶性ＣＥＡの存在下でさらに検出レベルを下回って低下する（図６Ａ)ことを明らかに示している。
【図７】可溶性ＣＥＡ抗原の存在下での細胞溶解の阻害を「阻害因子」に変換した。この因子は、可溶性ＣＥＡの不在下でのＥＣ５０で割った、ＡＤＣＣアッセイにおける１０および１ｕｇ／ｍｌの可溶性ＣＥＡの存在下でのＥＣ５０として定義される。ＣＥＡ ＩＩが、可溶性ＣＥＡ抗原の存在下で劇的に低下した細胞溶解活性を有し、それに対してＩｇＧ１ Ａ５、ＩｇＧ１ Ｂ９およびＩｇＧ１ Ｄ８に媒介される、腫瘍細胞に対する細胞溶解活性は可溶性ＣＥＡに対して抵抗性であることが明らかに示され得る。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、可溶性ＣＥＡに対する抵抗性を有する医薬抗体組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ゴールドおよびフリードマンが最初にヒト結腸癌組織抽出物における腫瘍関連癌胎児性抗原（ＣＥＡ）を記載してから３０年以上が経過した（Gold and Freedman; J. Exp. Med. 122 (1965); 467-481）。
その間、ＣＥＡ遺伝子ファミリーに関連する２８のその他の遺伝子／偽遺伝子が見出された。ＣＥＡ遺伝子ファミリーのメンバーに用いる命名を簡略化するために、該ファミリーは最近「ＣＥＡ関連細胞接着分子」（ＣＥＡＣＡＭ）と改名され、そのメンバーの命名が統一された（Beauchemin, Exp. Cell Res. 252 (1999), 243-249）。例えば、この命名に従って、ヒトＣＥＡ（ＣＤ６６ｅ）はＣＥＡＣＡＭ５と名付けられる。
【０００３】
ヒトＣＥＡ遺伝子ファミリーは、染色体１９ｑ１３．２の上に集まる（Olsen et al., Genomics 23 (1994); 659-668）。その２９遺伝子および偽遺伝子は３つのサブグループ、すなわち、７つの発現遺伝子を含有するＣＥＡサブグループ、１１の発現遺伝子を含有する妊娠特異的糖タンパク質（ＰＳＧ）サブグループおよび偽遺伝子のみを含有する第３のサブグループに分割することができる（Hammarstroem, Sem. Cancer Biol. 9 (1999), 67-81; Beauchemin, Exp. Cell Res. 252 (1999), 243-249）。ＣＥＡのアミノ酸配列および他のファミリーメンバーの解析により、それらが免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーに属することが明らかとなった（Williams and Barclay, Annul. Rev. Immunol. 6 (1988), 381-405）。ＣＥＡサブグループの全てのメンバーは細胞表面膜に付着している。胆汁糖タンパク質（ＣＥＡＣＡＭ１；ＢＧＰ１；ＴＭ−ＣＥＡ；ＣＤ６６ａ）、ＣＥＡ遺伝子ファミリーメンバー１（ＣＥＡＣＡＭ３；ＣＧＭ１；ＣＤ６６ｄ）およびＣＥＡ遺伝子ファミリーメンバー７（ＣＥＡＣＡＭ４；ＣＧＭ７）は疎水性の膜貫通ドメインを有するのに対し、癌胎児性抗原（癌胎児性抗原関連細胞接着分子５；ＣＥＡＣＡＭ５；ＣＥＡ；ＣＤ６６e）、非特異的交差反応性抗原（ＣＥＡＣＡＭ６；ＮＣＡ；ＮＣＡ−５０／９０；ＣＤ６６ｃ）、ＣＥＡ遺伝子ファミリーメンバー２（ＣＥＡＣＡＭ７；ＣＧＭ２）およびＣＥＡ遺伝子ファミリーメンバー６（ＣＥＡＣＡＭ８；ＣＧＭ６；ＣＤ６６ｂ）はグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）脂質部分によって血漿膜と繋がれている。ＣＥＡタンパク質は、Ｉｇドメインの数に応じて約３００ｋＤａまでの分子量で高度にグリコシル化されている。
【０００４】
ＣＥＡタンパク質の生物活性に関して、腫瘍細胞株を用いるインビトロ研究から、胆汁糖タンパク質、ＣＥＡおよび非特異的交差反応性抗原を含むいくつかのＣＥＡサブファミリーは、腫瘍細胞表面に発現すると、同種親和性の異型細胞接着分子として作用することができることが示唆された（Oikawa et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 186 (1992), 881-887；Zhou et al., Cancer Res. 53 (1993), 3817-3822）。より最近には、微生物による攻撃から結腸を守る自然免疫応答におけるＣＥＡおよび非特異的交差反応抗原の可能性のある役割が考察されている（Hammarstroem and Baranov, Trends Microbiol. 9 (2001), p. 119-125）。特に、これらのタンパク質は微生物と結合および捕獲することにより、それらが微絨毛の上皮細胞に到達し、侵入することを防ぐことが提唱されている。
【０００５】
ＣＥＡは、胎児期の間に発現し、健常成人には存在せず、再び癌に発現する癌胎児性抗原であると仮定された。しかし、ＣＥＡは、正常成人組織にも発現する。例えば、胆汁糖タンパク質、ＣＥＡ、非特異的交差反応性抗原およびＣＥＡ遺伝子ファミリーメンバー２は、正常ヒト結腸に、特に腸管内腔に面している成熟した円柱上皮細胞におよび陰窩口（crypt mouth）で高度に分化した細胞に発現する（Fraengsmyr et al., Cancer Res. 55 (1995), 2963-2967；Fraengsmyr et al., Tumor Biol. 20 (1999), 277-292）。より具体的には、これらのタンパク質は、フリーな管腔表面の内側を覆う成熟した結腸細胞の刷子縁多糖外被に局在する。胆汁糖タンパク質、ＣＥＡおよび非特異的交差反応性抗原はまた、多数の上皮性起源の腫瘍にも発現する（Hammarstriem, Sem. Cancer Biol. 9 (1999), 67-81; Shively and Beatty CRC Crit. Rev. Oncol. Hematol. 2 (1985), 355-399）。
【０００６】
既に１９７０年代後半および１９８０年代前半に、ＣＥＡは結腸直腸およびその他の上皮腫瘍の放射免疫学的局在に好まれる標的抗原となった。これは、ＣＥＡが胃腸癌および膵臓癌の９５％に、ならびに大部分の小細胞および非小細胞肺癌腫に過剰発現するという事実に起因する。また、それは乳癌ならびに頭部および頚部の扁平上皮癌にも発現する（Primus et al., Cancer 42 (1978), 1540-1545）。実際に、ＣＥＡは最も広く用いられている臨床腫瘍マーカーの１つである。それは、その安定性、正常成人組織での相当に制限された発現、ならびに上皮性起源の腫瘍での高度な発現のために、結腸直腸癌およびその他のいくつかの癌の血清腫瘍マーカーとして用いられている。健康な個体においてＣＥＡの大半は結腸で産生される。そこでそれは成熟した円柱細胞の頂端膜側から腸管内腔に放出され、糞便の中で消失する。従って、健康な個体からは、血液中に極めて低いレベルしか通常見出されない。例えば、健康な個体の血液中のＣＥＡレベルは２μｇ／ｌ未満である。それに対して、結腸直腸癌およびその他の癌腫の患者からの血清中のＣＥＡレベルは２０００μｇ／ｌを超える範囲まで増加している（Thomson et al., PNAS 64 (1969), 161-167）。特に、進行性、悪性、または後期の上皮腫瘍は、しばしば高い血清濃度の可溶性ＣＥＡを伴う（Fletcher; Ann. Intern. Med. 104 (1986), 66-73）。ＣＥＡを含む血漿膜からの成分は、血漿膜由来小胞のように表面から継続的に剥脱することが知られ（Taylor and Black, J. Natl. Cancer Inst. 74 (1985), 859-866；Sack et al., J Clin Invest. 82 (1988), 586-93）、それはリンパ管および血管を流れて最後に血液に行き着き得る。腫瘍サイズが増大するにつれて、より多くのＣＥＡが血液に蓄積する。腫瘍マーカーとしての血清ＣＥＡ決定の主な用途は、結腸癌の手術後のサーベイランスにある。増加したＣＥＡレベルは、患者のそれぞれ８１％（Minton et al., Cancer 55 (1985), 1284-1290）および８９％（Wanebo et al., Surg. Gynecol. Obstet. 169 (1989), 479-487）において、再発性疾患の最初の指標であった。血清ＣＥＡレベルはまた、予後指標としても用いることができる（Mulcahy and Benson, Curr. Oncol. Rep. 1 (1999), 168-172）。
【０００７】
多くの上皮癌でのその過剰発現に起因して、ＣＥＡは腫瘍マーカーとして用いられるだけでなく、抗腫瘍療法の標的としても用いられる。例えば、胃腸癌は高い割合のヒト上皮腫瘍の原因であり、米国において２００１年の胃癌の新規症例は２１，７００、結腸直腸癌の新規症例は１３５，４００と推定される（Greenlee; CA Cancer J Clin 51 (2001), 15-36）。結腸直腸癌は３番目に頻度の高い悪性腫瘍であり、男性および女性の両方において癌死の３番目の主な原因である（Ries; Cancer 88 (2000), 2398-2424）。これらの腫瘍に対する新規な治療法を見出すために、抗ＣＥＡモノクローナル抗体がＣＥＡ陽性癌の可能性のある治療法として調査されてきた（Murakami et al., Immunol. Invest. 25 (1996), 23-35）。
【０００８】
腫瘍量の少ない患者（低い血清ＣＥＡレベルに相当する）が首尾よく治療を受けるアプローチの一例は、ベアらによって行われた研究である。このアプローチでは、ラベツズマブ（labetuzumab）（ラベツズマブは、ヒト化形態の抗ＣＥＡモノクローナル抗体ＭＮ−１４である；Behr et al., Cancer, 94: 1373-1381, (2002), 1559-64）の131Ｉ標識変異体が、５−フルオロウラシルおよびフォリン酸に、または肝転移後のアジュバント・セッティングに対して化学療法抵抗性の、少量の転移性疾患を有する３０名のＣＲＣ患者が登録された第ＩＩ相試験において分析された。131Ｉ標識ラベツズマブの単回注射が行われた。評価可能な１９名の患者のうち、３名が部分的緩解を有し、８名がわずかな応答を１５ヶ月まで持続して示した。アジュバント・セッティングにおいて、９名のうち７名の患者が３年間まで疾患に罹らなかったのに対して、対照群の再発率は同じ期間で６７％であった。患者の血清ＣＥＡレベルは３．９〜４５ｎｇ／ｍｌの範囲であった（Behr et al., Cancer, 94: 1373-1381, 2002）。ＣＥＡ血清レベルの低い（＜５ｎｇ／ｍｌ）患者を特徴とする別の研究では、131Ｉ−ラベツズマブ（上記引用文中）を用いるＣＥＡの放射免疫療法は、肝臓における結腸直腸癌転移の救済切除（salvage resection）後の生存を向上したことが示された。２３名の患者に４０〜６０ｍＣｉ／ｍ2 131Ｉ−ラベツズマブの用量が投与された。５年生存率は、それぞれ処置群について５１．３％、対照群について７．４％であった（Liersch et al., JCO, 2005, ASCO Proc, Vol 23, No 16S: 3627）。
【０００９】
けれども、高い血清ＣＥＡ濃度に対応する治療的アプローチは、しばしば低いかまたは全くない抗腫瘍応答という結果をもたらした。例えば、ウォン（Clin. Cancer Res. 6 (2000): 3855-3863）は、転移性ＣＥＡを産生する悪性腫瘍を有する患者において前記抗体を評価するために、第Ｉ相放射免疫治療試験において、ＣＥＡに対して高い親和特異性を有する、遺伝子操作された90Ｙ標識ヒト／マウスキメラＩｇＧ Ｔ８４．６６抗体を用いた。２２名の患者が、111Ｉｎ標識抗体に続いて90Ｙ標識キメラ抗体の診断投与からなる１回の治療サイクルを受けた（３名の患者だけが２〜３サイクルを受けた）。主な抗腫瘍応答は見出されなかった。１６名の患者はヒト抗キメラ抗体（ＨＡＣＡ）を生じた。この研究に登録した患者における可溶性ＣＥＡレベルの範囲は１４．８〜１０２７ｎｇ／ｍｌ（中央値９７ｎｇ／ｍｌ）であった。追跡調査では、同じ抗体を５−フルオロ−ウラシル（５−ＦＵ）との併用療法に用いた。この第Ｉ相併用試験では、２１名の化学療法抵抗性の転移性結腸直腸癌患者に５−ＦＵおよび90Ｙ−ｃＴ８４．６６が投与された。客観的反応は観察されなかった。平均血清ＣＥＡレベルは２２７．４ｎｇ／ｍｌであり、＜２．５〜１３０５ｎｇ／ｍｌの範囲であった（Wong, Clin Cancer Res, 9 (2003): 5842-5852）。ハヤールらによる別の研究では、ヨウ素−１３１−標識ヒト化ＭＮ−１４抗ＣＥＡモノクローナル抗体が転移性胃腸および結腸直腸癌患者において評価された。この第Ｉ相試験では、２１名の患者が、事前の外部照射後または標準的な化学療法後のいずれかに抗体で処置された。２１名のうち７名の患者がヒト抗ヒト抗体（ＨＡＨＡ）を有したが、有害作用はなかった。抗腫瘍応答は観察されなかった。この場合もやはり、上昇した血漿ＣＥＡレベルが抗ＣＥＡ抗体アプローチの治療効果を妨げることが見出された（Hajjar et al., Clin Colorectal Cancer, 2 (2002), 31-42）。
【発明の開示】
【００１０】
上に述べた課題を考慮すると、進行性、悪性、または後期上皮腫瘍のための効果的な治療法のための手段および方法の提供が大いに望まれる。
【００１１】
従って、本発明の一態様は、ヒトにおける上皮腫瘍の治療のための医薬組成物に関し、前記医薬組成物はヒトＣＥＡと特異的に結合するＩｇＧ１抗体を含み、前記ＩｇＧ１抗体の可変領域は少なくとも、
（ａ）アミノ酸配列「ＳＹＷＭＨ」（配列番号２９）を有するＣＤＲ−Ｈ１と、アミノ酸配列「ＦＩＲＮＫＡＮＧＧＴＴＥＹＡＡＳＶＫＧ」（配列番号２８）を有するＣＤＲ−Ｈ２と、アミノ酸配列「ＤＲＧＬＲＦＹＦＤＹ」（配列番号２７）を有するＣＤＲ−Ｈ３、および
（ｂ）アミノ酸配列「ＴＹＡＭＨ」（配列番号３１）を有するＣＤＲ−Ｈ１と、アミノ酸配列「ＬＩＳＮＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧ」（配列番号３０）を有するＣＤＲ−Ｈ２と、アミノ酸配列「ＤＲＧＬＲＦＹＦＤＹ」（配列番号２７）を有するＣＤＲ−Ｈ３
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。
【００１２】
アミノ酸配列「ＤＲＧＬＲＦＹＦＤＹ」（配列番号２７）は、マウスモノクローナル抗体Ａ５Ｂ７のＣＤＲ−Ｈ３のKabatの位置９５〜１０２に相当する（Chester, Int. J. Cancer 57 (1994), 67-72; Harwood, Br J Cancer. 54 (1986), 75-82）。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明の医薬組成物の好ましい実施形態では、本明細書に定義されるＩｇＧ１抗体の前記可変領域は、アミノ酸配列「ＴＬＲＲＧＩＮＶＧＡＹＳＩＹ」（配列番号３４）を有するＣＤＲ−Ｌ１および／またはアミノ酸配列「ＹＫＳＤＳＤＫＱＱＧＳ」（配列番号３３）を有するＣＤＲ−Ｌ２および／またはアミノ酸配列「ＭＩＷＨＳＧＡＳＡＶ」（配列番号３２）を有するＣＤＲ−Ｌ３を含む。
【００１４】
ＣＤＲの決定は当業者に公知である；例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓ／＃ｃｄｒｉｄ参照。抗体中のアミノ酸配列の番号付けは、例えば、当分野に記載されるKabatの番号付けスキームに従って行ってよい；例えば、Kabat, E.A., T.T.Wu, H.M.Perry, K. S. Gottesman, and C. Foeller.1991. Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed. Bethesda, Md.: National Center for Biotechnology Information, National Library of Medicine参照。
【００１５】
本発明は、その血清／血漿中の可溶性ＣＥＡ濃度の高い患者における上皮腫瘍の治療に特に適した手段および方法を提供する。このような高い可溶性ＣＥＡ濃度は、進行性腫瘍、再発性、転移性、後期腫瘍を有する上皮腫瘍患者および腫瘍量の多い患者の血清／血漿に見出される。上記に定義される可変領域を含むヒトＣＥＡと特異的に結合するＩｇＧ１抗体は、ＣＥＡ陽性の標的細胞と結合するだけでなく、可溶性ＣＥＡとも結合することが見出されている；本発明の実施例５参照。驚くことに、可溶性ＣＥＡと結合するにもかかわらず、本発明のＩｇＧ１抗体は、高い濃度の可溶性ＣＥＡの存在下でさえもＣＥＡを有する腫瘍細胞を死滅させる。言い換えれば、前記ＩｇＧ１抗体構築物は、可溶性ＣＥＡによって、ＣＥＡ陽性の腫瘍細胞に対するそれらの細胞障害活性（抗体依存性細胞障害活性；ＡＤＣＣ）を阻害されない。例えば、実施例５は、漸増量の可溶性ＣＥＡ抗原の存在下での、上記に定義されるＣＥＡ反応性のＩｇＧ１抗体構築物のＫａｔｏ ＩＩＩ細胞（ＣＥＡ陽性のヒト胃癌腫細胞株）に対する細胞障害活性を示す。従って、本明細書に定義されるＩｇＧ１抗体に媒介される細胞障害活性は可溶性ＣＥＡに抵抗性である。本明細書に定義される本発明のＩｇＧ１抗体は、マウスモノクローナル抗体Ａ５Ｂ７のKabatの位置９５〜１０２に相当するＣＤＲ−Ｈ３「ＤＲＧＬＲＦＹＦＤＹ」（配列番号２７）アミノ酸配列を含む上記のＣＤＲ−Ｈ領域を有する可変領域を含む（Chester；Harwood；上記引用文中）。このモノクローナル抗体はまた、膜結合と可溶性ＣＥＡの両方と結合する（自己データ）。アミノ酸配列「ＤＲＧＬＲＦＹＦＤＹ」は、本明細書に定義されるヒト化抗ＣＥＡ ＩｇＧ１抗体の可変領域で用いられる場合、可溶性ＣＥＡに対する抵抗性を媒介することが見出された；実施例５参照。
【００１６】
その一方、実施例２に示されるように、ｈｕＩｇＧ１ ＣＥＡ ＩＩに媒介される細胞障害活性は、漸増量の可溶性ＣＥＡにより阻害される。ｈｕＩｇＧ１ ＣＥＡ ＩＩの可変領域は、ｍＡｂ Ｔ８４．６６に由来する（Neumaier, Cancer Res. 50 (1990), 2128-2134）。ｈｕＩｇＧ１ ＣＥＡ ＩＩは可溶性ＣＥＡと結合することが見出されているので、可溶性ＣＥＡ抗原は、抗体がその抗体に媒介される細胞障害活性を発揮することを阻止するということが結論付けられた。Ｔ８４．６６由来のＩｇＧ１構築物について得られた結果を鑑みると、可溶性ＣＥＡがＡ５Ｂ７由来の抗体構築物において細胞障害活性を阻害しないことは予測されなかった。より具体的に言えば、可溶性ＣＥＡ抗原に対する抵抗性は、その可変領域がマウスモノクローナル抗体Ａ５Ｂ７のＣＤＲ−Ｈ３のアミノ酸配列「ＤＲＧＬＲＦＹＦＤＹ」を含むＩｇＧ１抗体についてのみ、見出すことができた（Chester、上記引用文中；Harwood, Br J Cancer. 54 (1986), 75-82）。
【００１７】
上記に示したように、ヒトにおけるＣＥＡを有する上皮腫瘍に対して向けられる多くの治療的アプローチは、癌患者の血漿中の高いレベルの可溶性ＣＥＡ抗原の存在により著しく妨害される。可溶性ＣＥＡ抗原は、しばしば進行性腫瘍、再発性癌、転移性腫瘍、大きい腫瘍量、または後期腫瘍の癌患者の血清中に高い濃度で存在し、ＣＥＡ陽性の腫瘍細胞に対して向けられる治療薬を阻害し、従って腫瘍細胞認識および破壊を妨げる。従って、腫瘍に到達する治療薬の実際量は減少し、その結果低下した低い抗腫瘍活性をもたらすか、または実に抗腫瘍活性を全くもたらさない。この制限は、今までのところ、例えば、治療的な腫瘍細胞の相互作用を妨げるとは思われない可溶性ＣＥＡ抗原を非常に低い血清レベルで有する患者に対する抗体に基づくアプローチを制限する。現在のＣＥＡ特異的Ｉｇ分子を用いる治療的アプローチは、高い血清レベルの可溶性ＣＥＡを有する患者において抗腫瘍活性を示さない。
【００１８】
本発明において、腫瘍細胞に対して向けられる細胞障害（ＡＤＣＣ）活性が、さらに高い濃度の可溶性ＣＥＡ抗原に抵抗性である、ヒトＣＥＡに対する特異性を有する抗体治療薬を生成することが可能であることが見出された。この知見は、本発明のＩｇＧ１抗体が可溶性ＣＥＡ抗原と結合するという事実（実施例５参照）を考えると全く予想外である。それにもかかわらず、本明細書に定義されるＩｇＧ１抗体は、腫瘍細胞に対するそれらの細胞障害活性においてさらに高いレベルの可溶性ＣＥＡの存在に抵抗性である。従って、本発明は、（例えば腫瘍進行中に）観察される血漿中の可溶性ＣＥＡ濃度の高い腫瘍患者の治療に、再発性癌に、転移に、腫瘍量が多い患者に、または後期腫瘍に特に適した手段および方法を提供する。
【００１９】
この知見を鑑みると、以下の本発明の医薬組成物中のＩｇＧ１抗体は、可溶性ＣＥＡ抗原に対して抵抗性であるとみなされる。用語「可溶性ＣＥＡ抗原に対する抵抗性」、「可溶性ＣＥＡに対して抵抗性である」（または関連語）は、本明細書において、前記ＩｇＧ１抗体により媒介されるＣＥＡ陽性の腫瘍細胞に対する細胞障害活性が、漸増濃度の可溶性ＣＥＡにより影響されないという事実を指す。特に、細胞障害活性は、さらに高い濃度の可溶性ＣＥＡにより阻害されない。上記に示したように、健康な個体の血液中のＣＥＡレベルは２ｎｇ／ｍｌ未満である。腫瘍患者の血清／血漿中の可溶性ＣＥＡ濃度が高いことは、進行性腫瘍、再発性腫瘍、転移性腫瘍、または後期腫瘍、さらに腫瘍量の多い患者の特徴である。従って、本発明は、その血漿中にこのような高い可溶性ＣＥＡ濃度を有する上皮腫瘍患者の治療に特に適した手段および方法を提供する。用語「高い可溶性ＣＥＡ濃度」は、本明細書において、１０、２０、５０、７０、８０、９０または１００ｎｇ／ｍｌよりも高い可溶性の血清／血漿ＣＥＡ濃度を示す。血清／血漿ＣＥＡ濃度は、特に、ＥＬＩＳＡ法により測定されてよい。好ましくは、 前記可溶性血清／血漿ＣＥＡ濃度は、例えばＥＬＩＳＡで測定して１００ｎｇ／ｍｌよりも高い。ＣＥＡ血清中濃度は、例えばＣＥＡ ＥＬＩＳＡアッセイにより測定することができる（例えば、IBL CEA EIA、IBL Hamburg,Germany参照）。
【００２０】
本発明によれば、用語「医薬組成物」は、ヒト患者への投与のための組成物に関する。好ましくは、医薬組成物は、担体、安定剤および／または賦形剤からなる適した製剤を含む。好ましい実施形態では、医薬組成物は、非経口、経皮、管腔内、動脈内、くも膜下腔内および／または鼻腔内投与のための、または組織への直接注射による組成物を含む。前記組成物は、注入または注射によって患者へ投与されることが特に想定される。適した組成物の投与は、様々な方法によって、例えば、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、局所または皮内投与によって達成されてよい。本発明の組成物は、製薬上許容される担体をさらに含んでよい。適した医薬担体の例は当分野で周知であり、それにはリン酸緩衝生理食塩水溶液、水、様々な種類の湿潤剤、滅菌溶液、リポソームなどが含まれる。このような担体を含む組成物は、周知の従来法によって処方されてよい。これらの組成物は、被験体に適した用量で投与することができ、それは、本明細書に記載される可溶性血清ＣＥＡ抗原に対して抵抗性を示すＩｇＧ１抗体の漸増用量の投与による用量漸増試験により決定することができる。上記に示したように、本明細書に記載される、可溶性血清ＣＥＡ抗原に対する抵抗性を有するＩｇＧ１抗体は、高いＣＥＡ血清中濃度を有する癌患者、例えば、進行性腫瘍、再発性癌、転移性腫瘍、腫瘍量の大きな腫瘍、または後期腫瘍の治療に有利に用いることができる。これらの組成物はまた、その他のタンパク質性および非タンパク質性薬剤と組み合わせて、例えば併用療法（co-therapy）の形で投与することができる。これらの薬剤は、本明細書に定義されるＩｇＧ１抗体を含む組成物と同時に投与してもよいし、前記ＩｇＧ１抗体の投与の前後に適時に定められた間隔および用量で別々に投与してもよい。投与計画は主治医および臨床学的要因により決定される。医学分野で周知のように、任意の患者一人への投薬量は多くの要因によって決まり、それには患者の大きさ、体表面積、年齢、投与される特定の化合物、性別、投与時間および経路、全体的な健康状態、および同時に投与されるその他の薬剤が含まれる。非経口投与のための製剤としては、滅菌水溶液または非水溶液、および懸濁液が挙げられる。非水溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、および注射用の有機エステル類、例えばオレイン酸エチルである。水性担体としては、水、水溶液、または生理食塩水および緩衝媒体を含む懸濁液が挙げられる。非経口媒体としては、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、または乳酸化リンゲル液が挙げられる。静脈内媒体としては、液体および栄養素補充液、電解質補充液（リンゲルデキストロースに基づくものなど）などが挙げられる。防腐剤およびその他の添加剤も存在してよく、例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、不活性ガスなどが挙げられる。さらに、本発明の組成物は、例えば、好ましくはヒト起源の血清アルブミンまたは免疫グロブリンなどのタンパク質性担体を含んでもよい。併用療法は、本明細書に定義されるＩｇＧ１抗体に加えて、組成物の意図される使用によって、さらなる生物活性物質を含むことが想定される。このような物質は、胃腸管系に作用する薬剤、抗悪性腫瘍薬として作用する薬剤、化学療法薬、細胞増殖抑制剤（cytostatica）、高尿酸血症を予防する薬剤、免疫反応を阻害する薬剤（例えばコルチコステロイド）、炎症応答を調節する薬剤、循環系に作用する薬剤および／またはサイトカインなどの当分野で公知の薬剤であってよい。
【００２１】
好ましくは、本明細書に定義されるＩｇＧ１抗体は、緩衝液、安定剤および界面活性剤中に処方される。緩衝液は、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、コハク酸緩衝液または酢酸緩衝液であってよい。安定剤は、アミノ酸および／または糖であってよい。界面活性剤は、合成洗剤、ＰＥＧなどであってよい。より好ましくは、本明細書に定義されるＩｇＧ１抗体は、クエン酸塩、リシン、トレハロースおよびＴｗｅｅｎ８０中に処方される。本発明の医薬組成物の希釈液として、等張生理食塩水およびＴｗｅｅｎ８０が好ましい。
【００２２】
本明細書において、「抗体」は、免疫グロブリン分子、すなわち抗原、好ましくはヒトＣＥＡと免疫特異的に結合する抗原結合部位を含む分子を示す。全ての抗体は同じ方法で構築される。それらは対になった重および軽ポリペプチド鎖を形成し、免疫グロブリンという総称はこのようなタンパク質全てに用いられる。しかし、この一般的なカテゴリーの中で、５つの異なるクラスの免疫グロブリン（ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＥ）を、それらのＣ領域により識別することができる。ＩｇＧ抗体は大きな分子で、分子量は約１５０ｋＤａであり、２つの異なる種類のポリペプチド鎖からなる。その約５０ｋＤａの一方は、重鎖またはＨ鎖と称され、２５ｋＤａのもう一方は、軽鎖またはＬ鎖と称される。各ＩｇＧ分子は２本の重鎖と２本の軽鎖からなる。２本の重鎖は互いにジスルフィド結合によって連結され、各重鎖はジスルフィド結合によって軽鎖と連結されている。どのような任意の免疫グロブリン分子においても、２本の重鎖と２本の軽鎖は同一であり、抗体分子に２つの同一の抗原結合部位をもたらし、従って同時に２つの同一構造と結合する能力をもたらす。λおよびκと称される２種類の軽鎖が抗体中に見出される。λ鎖またはκ鎖のいずれかを有する所与の免疫グロブリンは、２本とも同じものである。λまたはκ軽鎖を有する抗体間で機能的な差は見出されず、いずれの種類の軽鎖も５つの主なクラスのいずれかの抗体に見出すことができる。２種類の軽鎖の比は種ごとに異なる。マウスでは、平均のκ：λ比は２０：１であり、それに対してヒトでは２：１、さらにウシでは１：２０である。この変異の理由は不明である。一方、クラス、および従って抗体のエフェクター機能は、その重鎖の構造により定義される。５つの主な重鎖クラスまたはアイソタイプがあり、その一部はいくつかのサブタイプを有し、これらが抗体分子の機能活性を決定する。免疫グロブリンの５つの主なクラスは、免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）、免疫グロブリンＤ（ＩｇＤ）、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）、免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）、および免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）である。それらの重鎖は対応する小文字のギリシャ文字（それぞれμ、δ、γ、α、およびε）で示される。ＩｇＧは群を抜いて最も豊富な免疫グロブリンであり、いくつかのサブクラス（ヒトにおいてＩｇＧ１、２、３、および４）を有する。それらの独特の機能特性は、軽鎖と関連しない、重鎖のカルボキシ末端部分により与えられる。全てのアイソタイプの一般的な構造上の特徴は類似している。血漿中で最も豊富なアイソタイプであるＩｇＧ抗体の構造を、典型的な抗体分子として図１に例示する。
【００２３】
好ましくは、本明細書に定義される抗体はＩｇＧ抗体である。当分野で周知のように、ＩｇＧは、高度に差別的な抗原認識および結合を担う抗体可変領域だけでなく、通常内因的に産生された抗体中に存在する抗体ポリペプチドの重鎖および軽鎖の定常領域を含み、一部の例では、炭水化物を含む１またはそれ以上の部位での修飾までも含む。このようなグリコシル化は一般にＩｇＧ型の顕著な特徴であり、これらの定常領域の部分は、インビボで様々なエフェクター機能、例えば抗体依存性細胞障害活性（ＡＤＣＣ）などを引き出すことが知られている完全抗体（full antibody）のいわゆるＦｃ領域を構成する。さらに、Ｆｃ領域はＩｇＧとＦｃ受容体の結合を媒介し、従ってインビボでの半減期を長くすると同時にＦｃ受容体の存在の増加した位置へのＩｇＧのホーミングを促進する。有利には、ＩｇＧ抗体は、ヒトＣＥＡ抗原と特異的に結合するＩｇＧ１抗体（それらのインビボでの作用機序は特に十分理解され、特徴づけられているために好まれる型である）である。これは特にＩｇＧ１抗体の場合である。
【００２４】
本明細書において称されるＩｇＧ１抗体は、上記に定義される可変領域を、ヒンジ領域、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３ドメインおよびＣＬドメインの全部または一部と併せて含む；例えば図１参照。一般に、可変領域において、ＶＨドメインはＶＬドメインと対になって抗体の抗原結合部位を提供する。好ましくは、（ｉ）アミノ酸配列「ＳＹＷＭＨ」（配列番号２９）を有するＣＤＲ−Ｈ１と、アミノ酸配列「ＦＩＲＮＫＡＮＧＧＴＴＥＹＡＡＳＶＫＧ」（配列番号２８）を有するＣＤＲ−Ｈ２と、マウスモノクローナル抗体Ａ５Ｂ７のＣＤＲ−Ｈ３のKabatの位置９５〜１０２に相当するアミノ酸配列「ＤＲＧＬＲＦＹＦＤＹ」（配列番号２７）を有するＣＤＲ−Ｈ３、または（ｉｉ）アミノ酸配列「ＴＹＡＭＨ」（配列番号３１）を有するＣＤＲ−Ｈ１と、アミノ酸配列「ＬＩＳＮＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧ」（配列番号３０）を有するＣＤＲ−Ｈ２と、マウスモノクローナル抗体Ａ５Ｂ７のＣＤＲ−Ｈ３のKabatの位置９５〜１０２に相当するアミノ酸配列「ＤＲＧＬＲＦＹＦＤＹ」（配列番号２７）を有するＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメインは、アミノ酸配列「ＴＬＲＲＧＩＮＶＧＡＹＳＩＹ」（配列番号３４）を有するＣＤＲ−Ｌ１と、アミノ酸配列「ＹＫＳＤＳＤＫＱＱＧＳ」（配列番号３３）を有するＣＤＲ−Ｌ２と、アミノ酸配列「ＭＩＷＨＳＧＡＳＡＶ」（配列番号３２）を有するＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインと、言及されるＶＨドメインのうちの１つと前記ＶＬドメインを含む抗体の抗原結合部位が形成されるように対となる。本明細書に定義される抗ＣＥＡ ＩｇＧ１抗体は、げっ歯類抗体（すなわち、マウスまたはラット起源）である。好ましくは、前記ＩｇＧ１抗体は、下記により詳細に示されるように、ヒト化抗体である。
【００２５】
本発明によれば、Ｉｇ由来抗原の相互作用と関連して用いられる、用語「結合ドメイン」または「可変領域」は、抗体、抗体断片またはその誘導体に由来する１つのＣＤＲを少なくとも含むポリペプチドの断片および誘導体を含む。本発明により、本明細書に定義されるＩｇＧ１抗体のヒトＣＥＡと特異的に結合する結合ドメインは、少なくとも１つのＣＤＲ、好ましくはＣＤＲ−Ｈ３、より好ましくはＡ５Ｂ７のＣＤＲ−Ｈ３のKabatの位置９５〜１０２に相当するアミノ酸配列「ＤＲＧＬＲＦＹＦＤＹ」（配列番号２７）を含むマウスモノクローナル抗体Ａ５Ｂ７のＣＤＲ−Ｈ３を含むことが想定される。以下の実施例に示されるように、前記ｍＡｂ Ａ５Ｂ７由来ＣＤＲ−Ｈ３「ＤＲＧＬＲＦＹＦＤＹ」（配列番号２７）アミノ酸配列を含む、本明細書に定義されるＩｇＧ１抗体の腫瘍細胞に対する細胞障害活性は、可溶性ＣＥＡ抗原に対して抵抗性があり、それにより、その血漿中の血清ＣＥＡ濃度の高い腫瘍患者の治療を可能にする。
【００２６】
本明細書において、「ヒト」とは、種Homo sapiensを指す。「ヒト」分子、例えばヒトＣＥＡは、従って、Homo sapiensにおいて天然に発現するその分子の変異体である。
【００２７】
用語「上皮腫瘍」とは、本明細書において、ＣＥＡ陽性である上皮性起源の腫瘍を意味する（Cancer Medicine;6th ed.; Kufe, Donald W.; Pollock, Raphael E.; Weichselbaum, Ralph R.; Bast, Robert C., Jr.; Gansler, Ted S.; Holland, James F.; Frei III, Emil., editors. Hamilton (Canada): BC Decker Inc. 2003;http://www.dkfz.de: HYPERLINK "http://www.krebsinformationsdienst.de/Krebsarten/index.html" http://www.krebsinformationsdienst.de/Krebsarten/index.html）。治療し得る上皮腫瘍は、胃腸腺癌、乳腺腺癌または肺腺癌である。前記胃腸腺癌は、好ましくは結腸直腸腺癌、膵臓腺癌、食道腺癌または胃腺癌である。本明細書に示されるように、本発明の医薬組成物は、腫瘍患者の血清／血漿中の高レベルの可溶性ＣＥＡ抗原を特徴とする、進行性腫瘍、転移、再発性癌、後期上皮腫瘍、上皮腫瘍量の多い患者、またはＣＥＡ血清中濃度が１００ｎｇ／ｍｌより高い腫瘍患者（例えばＥＬＩＳＡにより測定）の治療に特に有利である。前記医薬組成物が原発腫瘍の外科切除の後に投与されることも本発明の範囲内である。例えば、ＣＥＡ産生上皮腫瘍に由来する散在性の（disseminated）残存腫瘍細胞も、ＣＥＡをそれらの微小環境に流し、その周囲では可溶性ＣＥＡのレベルが高い。従って、本明細書に定義されるＩｇＧ１抗体の細胞障害活性の可溶性ＣＥＡに対する抵抗性は、最小残存病変の治療にも有利である。従って、本明細書に定義されるＩｇＧ１抗体は、残りの腫瘍細胞を死滅させるために、（ＣＥＡ源、すなわち原発腫瘍の除去によって）血清ＣＥＡレベルの低下する期間に投与し得ることが想定される。または、本明細書に定義されるＩｇＧ１抗体は、二次性腫瘍または転移の形成によって血清ＣＥＡレベルが増大する場合に、原発腫瘍の除去後に有用であり得る。ＣＥＡ血清中濃度は、例えばＣＥＡ ＥＬＩＳＡアッセイ（例えばＩＢＬ ＣＥＡ ＥＩＡ、ＩＢＬ Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ参照）により決定することができる。上記に示したように、多くの抗体に基づく治療的アプローチにおいて、前記血清ＣＥＡは、抗体と腫瘍細胞上の膜結合ＣＥＡの結合を阻害し、抗体の活性を遮断し、それにより抗腫瘍療法の成功を悪化させる。
【００２８】
本明細書において、用語「特異的に結合する」または「特異的結合」または「〜との／〜に対する特異的反応性」などの関連表現は、本明細書に定義されるＩｇＧ１抗体の結合ドメインの、可能な結合パートナーとしての複数の異なる分子のプールから、前記それぞれの第１および／または第２の分子にのみ結合する、あるいは有意に結合する程度まで第１および／または第２の分子を識別する能力を指す。このような結合測定は、例えばＢｉａｃｏｒｅ装置で、ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ分析などにより日常的に行うことができる。より具体的には、本明細書に定義されるＩｇＧ１抗体の結合ドメインは、下記に示すように、上皮腫瘍抗原、すなわち、ヒトＣＥＡ（癌胎児性抗原、癌胎児性抗原関連細胞接着分子５；ＣＥＡＣＡＭ５；ＣＤ６６ｅ）と結合する。用語「特異的結合」は、本発明によれば、ＩｇＧ１抗体分子が本明細書に定義されるヒトＣＥＡの少なくとも２、３、４、５、６、７、８、またはさらにそれより多くのアミノ酸と特異的に相互作用かつ／または結合できることを意味する。前記用語は、抗体分子の特異性、すなわち、本明細書に定義されるヒトＣＥＡ抗原の特定の領域を識別するその能力に関する。抗原相互作用部位とその特異的抗原との特異的相互作用は、例えば抗原の立体構造の変化の誘導、抗原のオリゴマー化などに起因する、シグナルの開始をもたらし得る。さらに、前記結合は、「キーロックの原則（key-lock-principle）」という特異性に例証され得る。従って、抗原相互作用部位および抗原のアミノ酸配列中の特異的モチーフは、それらの一次、二次または三次構造の結果ならびに前記構造の二次修飾の結果として相互に結合する。抗原相互作用部位のその特異的抗原との特異的相互作用は、さらに前記部位と抗原との結合をもたらし得る。
【００２９】
抗体の「特異的結合」は、主に２つのパラメータ：定性的パラメータ（結合エピトープ、すなわち抗体が結合する場所）および定量的パラメータ（結合親和性、すなわちそれが結合する場所でどの程度強く結合するか）に特徴付けられる。どのエピトープが抗体によって結合されるかは、例えば公知のＦＡＣＳ方法論、ペプチドスポットエピトープマッピング、質量分析またはペプチドＥＬＩＳＡにより有利に決定することができる。特定のエピトープと結合している抗体の強度は、例えば公知のＢｉａｃｏｒｅおよび／またはＥＬＩＳＡ法により有利に決定することができる。このような技法を組み合わせることにより、結合特異性の代表的な尺度としてのシグナル対ノイズ比の算出が可能となる。そのようなシグナル対ノイズ比では、シグナルは注目されるエピトープと結合する抗体の強度を表すのに対して、ノイズは注目されるエピトープとは異なる他の非関連エピトープと結合する抗体の強度を表す。好ましくは、注目されるエピトープに対するシグナル:ノイズ比（注目されるエピトープと異なるその他のエピトープに対するものより約５０倍高い）は、評価される抗体が注目されるエピトープと特異的な方法で結合する指標として考えることができる、言い換えれば「特異的結合剤」である。
【００３０】
本発明に従って用いられる用語「特異的結合」または「特異的相互作用」は、ＩｇＧ１抗体構築物が類似構造のポリペプチドと交差反応しないか、または本質的に交差反応しないことを意味する。研究中の抗体構築物のパネルの交差反応は、例えば、注目されるポリペプチドならびに程度の差はあるが（構造的かつ／または機能的に）密接に関連した多数のポリペプチドとの、従来条件下で抗体構築物の前記パネルの結合（例えば、Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988 ならびに Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999参照）を評価することにより試験することができる。例えば、本明細書に定義されるＩｇＧ１抗体の結合ドメインが、ヒトＣＥＡ（癌胎児性抗原；ＣＥＡＣＡＭ５；ＣＥＡ；ＣＤ６６ｅ）、すなわち可溶性ＣＥＡと膜結合ＣＥＡの双方と結合することは本発明の範囲内であるが、それに対して、その他のＣＥＡファミリーメンバー、例えば胆汁糖タンパク質（ＣＥＡＣＡＭ１；ＢＧＰ１；ＴＭ−ＣＥＡ；ＣＤ６６ａ）と結合しているＩｇＧ１抗体は、前記範囲から除外される。
【００３１】
抗原相互作用部位と特異的抗原との特異的相互作用の例は、その受容体のリガンドの特異性を含む。前記定義は、特にその特異的な受容体との結合の際にシグナルを誘導するリガンドの相互作用を含む。対応するリガンドの例は、その特異的なサイトカイン受容体と相互作用／結合するサイトカインを含む。また、前記定義により特に含まれるものは、抗原相互作用部位と、セレクチンファミリー、インテグリンおよびＥＧＦなどの成長因子のファミリーの抗原などの抗原との結合である。前記相互作用の別の例（それも前記定義により特に含まれる）は、抗原決定基（エピトープ）と抗体の抗原結合部位の相互作用である。
【００３２】
用語「〜と結合／相互作用する」もまた、立体構造エピトープ、構造エピトープまたはヒト標的分子、すなわちヒトＣＥＡの２つの領域からなる不連続エピトープまたはその部分に関連する。本発明の文脈において、立体構造エピトープは、ポリペプチドが折りたたまれて未変性タンパク質となる際に分子の表面上に集まる一次配列において分離した２またはそれ以上の別個のアミノ酸配列により定義される（Sela、(1969) Science 166, 1365 およびLaver, (1990) Cell 61, 553-6）。
【００３３】
用語「不連続エピトープ」とは、本発明の文脈において、ポリペプチド鎖の離れた部分の残基から構築される非直線状エピトープを意味する。これらの残基は、ポリペプチド鎖が三次元構造に折りたたまれて立体構造／構造エピトープを構成する際に分子の表面上に集まる。
【００３４】
「ＣＥＡ」とは、上皮性起源の多数の腫瘍に発現した抗原である、癌胎児性抗原（癌胎児性抗原関連細胞接着分子５；ＣＥＡＣＡＭ５；ＣＥＡ；ＣＤ６６ｅ）を意味する（Hammarstroem, Sem. Cancer Biol. 9 (1999), 67-81; Shively and Beatty CRC Crit. Rev. Oncol. Hematol. 2 (1985), 355-399）。ヒトＣＥＡのアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００４３６３に表され、配列番号３７を含む。
【００３５】
本発明において、驚くことに、ヒトＣＥＡに対して特異性を有する抗体に基づく治療薬を生成することが可能であり、腫瘍細胞に対して向けられる細胞障害活性（ＡＤＣＣ）がさらに高い濃度の可溶性ＣＥＡ抗原に対して抵抗性であることが見出された。この知見は、本明細書に定義されるＩｇＧ１抗体が可溶性ＣＥＡ抗原と結合するという事実を考えると全く予期されないものである。例えば、モノクローナル抗体Ｔ８４．６６に由来するＩｇＧ１抗体構築物が作製される場合、これらの抗体は可溶性ＣＥＡ抗原に感受性が高かった、すなわちそれらの細胞障害活性（ＡＤＣＣ）は可溶性ＣＥＡ抗原の存在下で遮断されていた。これらの構築物はまた、可溶性ＣＥＡとの結合が可能であることが見出されている。このことを考えて、可溶性ＣＥＡ抗原は、抗体がその細胞障害活性を発揮することを妨げると結論付けられた。その一方、本明細書に定義されるＩｇＧ１抗体は、腫瘍細胞に対するそれらの細胞障害活性においてさらに高いレベルの可溶性ＣＥＡの存在に対して抵抗性である。さらにより驚くことには、マウスモノクローナル抗体Ａ５Ｂ７のＣＤＲ−Ｈ３のKabatの位置９５〜１０２に相当するアミノ酸配列「ＤＲＧＬＲＦＹＦＤＹ」（配列番号２７）は、ヒトＩｇＧ１抗体のヒトＣＥＡ結合ドメイン（すなわち、ヒトＣＥＡと特異的に結合するヒト結合ドメイン）に用いられる場合、可溶性ＣＥＡ抗原に対する抵抗性を媒介するのに十分であることが見出された。それらがヒト起源であることに起因して（「ＤＲＧＬＲＦＹＦＤＹ」アミノ酸配列は除く）、前記構築物はヒト腫瘍患者に投与すると免疫原性が低いかまたはない。要約すれば、本明細書に定義されるＩｇＧ１抗体を含む医薬組成物は、例えば腫瘍の進行中、再発性癌、転移、腫瘍量の多い患者、または後期腫瘍に観察される、血漿中の可溶性ＣＥＡ濃度の高い上皮腫瘍患者の治療に特に有用である。本明細書に定義されるこのようなＩｇＧ１抗体は、当分野に記載される方法により、例えばファージディスプレイに基づく技法により作製することができる；以下の実施例も参照されたい。
【００３６】
本明細書に定義されるＩｇＧ１抗体のヒトＣＥＡと特異的に結合する結合ドメインは、少なくとも１つのＣＤＲ、好ましくはＣＤＲ−Ｈ３、より好ましくは、Kabatの位置９５（「Ｄ」、アスパラギン酸）、９６（「Ｒ」；アルギニン）、９７（「Ｇ」；グリシン）、９８（「Ｌ」；ロイシン）、９９（「Ｒ」；アルギニン）、１００（「Ｆ」；フェニルアラニン）、１００ａ（「Ｙ」；チロシン）、１００ｂ（「Ｆ」；フェニルアラニン）、１０１（「Ｄ」；アスパラギン酸）、および１０２（「Ｙ」；チロシン）にそれぞれ相当するアミノ酸配列「ＤＲＧＬＲＦＹＦＤＹ」（配列番号２７）を含むマウスモノクローナル抗体Ａ５Ｂ７のＣＤＲ−Ｈ３の一部分または完全なＣＤＲ−Ｈ３を含むことが好ましい。Kabatシステムに従う番号付けは、例えばKabat, E.A., T.T.Wu, H.M.Perry, K.S.Gottesman, and C. Foeller. 1991. Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed. Bethesda, Md.: National Center for Biotechnology Information, National Library of Medicineに記載されている。
【００３７】
以下の実施例に示されるように、ＣＥＡと相互作用する結合ドメインの前記ｍＡｂ Ａ５Ｂ７由来のＣＤＲ−Ｈ３「ＤＲＧＬＲＦＹＦＤＹ」（配列番号２７）アミノ酸配列を含む、本明細書に定義されるＩｇＧ１抗体の腫瘍細胞に対する細胞障害活性（ＡＤＣＣ）は、可溶性ＣＥＡ抗原に対して抵抗性であり、それにより血漿中の血清ＣＥＡ濃度の高い腫瘍患者の治療が可能となる。
【００３８】
このＡ５Ｂ７由来「ＤＲＧＬＲＦＹＦＤＹ」ＣＤＲ−Ｈ３アミノ酸配列は、例えば、（上皮腫瘍細胞上の）ＣＥＡ標的抗原に対する親和性を改良するため、かつ／または本明細書に定義されるＩｇＧ１抗体の「微細な（fine）特異性」を最適化するためにさらに修飾することが望ましい。この目的のため、例えば、アミノ酸配列「ＤＸ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4ＦＹＦＤＹ」において、改良された親和性および／または微細な特異性を有する、修飾されたＣＤＲ−Ｈ３を同定するために、様々なアミノ酸残基を位置「Ｘ1」、「Ｘ2」、「Ｘ3」および／または「Ｘ4」（それぞれ、マウスモノクローナル抗体Ａ５Ｂ７のＣＤＲ−Ｈ３のKabatの位置９６（「Ｘ1」）、９７（「Ｘ2」）、９８（「Ｘ3」）および９９（「Ｘ4」）に対応）で試験してよい。例えば、「Ｘ1」、「Ｘ2」、「Ｘ3」または「Ｘ4」は、アミノ酸残基「Ｒ」（アルギニン）、「Ｇ」（グリシン）、「Ｌ」（ロイシン）、「Ｙ」（チロシン）、「Ａ」（アラニン）、「Ｄ」（アスパラギン酸）、「Ｓ」（セリン）、「Ｗ」（トリプトファン）、「Ｆ」（フェニルアラニン）または「Ｔ」（トレオニン）で表され得る。ここで、表示される「Ｘ」の位置の１、２、３または４つ全ては、ＣＤＲ−Ｈ３「ＤＲＧＬＲＦＹＦＤＹ」（配列番号２７）アミノ酸配列中のKabatの位置９６〜９９にて本来の「ＲＧＬＲ」アミノ酸配列と比較して交換されてよい。しかし、「Ｘ1」、「Ｘ2」、「Ｘ3」および「Ｘ4」が同じアミノ酸を表す場合、例えば「Ｘ1」、「Ｘ2」、「Ｘ3」および「Ｘ4」が全て「Ｆ」（フェニルアラニン）である場合は本発明の特許請求の範囲から除外される。上記のＡ５Ｂ７由来の「ＤＲＧＬＲＦＹＦＤＹ」ＣＤＲ−Ｈ３アミノ酸配列の修飾は当分野で公知の方法、例えば、ＣＥＡ結合ドメイン中に、このような修飾されたＣＤＲ−Ｈ３領域を含むＩｇＧ１抗体の作製を可能にするランダム化されたプライマーを用いるＰＣＲにより達成することができる。これらの修飾されたＩｇＧ１抗体の親和性または微細な特異性は、当分野で記載される方法、例えばＥＬＩＳＡ、ＢｉａｃｏｒｅまたはＦＡＣＳ分析により試験することができる。そのような修飾されたＣＤＲ−Ｈ３を含むＩｇＧ１抗体の可溶性ＣＥＡ抗原に対する抵抗性は、以下の実施例に記載されるように、漸増量の可溶性ＣＥＡの存在下で、細胞障害活性（抗体依存性細胞障害活性、ＡＤＣＣ）アッセイで試験することができる。
【００３９】
好ましくは、本明細書に定義されるＩｇＧ１抗体の可変領域は、少なくとも、（ａ）アミノ酸配列「ＳＹＷＭＨ」（配列番号２９）を有するＣＤＲ−Ｈ１と、アミノ酸配列「ＦＩＲＮＫＡＮＧＧＴＴＥＹＡＡＳＶＫＧ」（配列番号２８）を有するＣＤＲ−Ｈ２と、マウスモノクローナル抗体Ａ５Ｂ７のＣＤＲ−Ｈ３のKabatの位置９５〜１０２に相当するアミノ酸配列「ＤＲＧＬＲＦＹＦＤＹ」（配列番号２７）を有するＣＤＲ−Ｈ３；および
（ｂ）アミノ酸配列「ＴＹＡＭＨ」（配列番号３１）を有するＣＤＲ−Ｈ１と、アミノ酸配列「ＬＩＳＮＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧ」（配列番号３０）を有するＣＤＲ−Ｈ２と、マウスモノクローナル抗体Ａ５Ｂ７のＣＤＲ−Ｈ３のKabatの位置９５〜１０２に相当するアミノ酸配列「ＤＲＧＬＲＦＹＦＤＹ」（配列番号２７）を有するＣＤＲ−Ｈ３
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。
【００４０】
より好ましくは、前記可変領域は、アミノ酸配列「ＴＬＲＲＧＩＮＶＧＡＹＳＩＹ」（配列番号３４）を有するＣＤＲ−Ｌ１および／またはアミノ酸配列「ＹＫＳＤＳＤＫＱＱＧＳ」（配列番号３３）を有するＣＤＲ−Ｌ２および／またはアミノ酸配列「ＭＩＷＨＳＧＡＳＡＶ」（配列番号３２）を有するＣＤＲ−Ｌ３を含む。
【００４１】
本明細書に定義されるＩｇＧ１抗体のヒトＣＥＡに特異的な結合ドメインのＶＨ領域のアミノ酸配列は、配列番号２０、２２または２４であることが好ましい。
【００４２】
本明細書に定義されるＩｇＧ１抗体のヒトＣＥＡに特異的な結合ドメインのＶＬ領域のアミノ酸配列は、配列番号２６であることが好ましい。
【００４３】
さらにより好ましくは、本明細書に定義されるＩｇＧ１抗体のヒトＣＥＡに特異的な結合ドメインの可変（Ｖ）領域は、
（ａ）ＶＨ領域が配列番号２２に示されるアミノ酸配列からなり、かつ、ＶＬ領域が配列番号２６に示されるアミノ酸配列からなる；
（ｂ）ＶＨ領域が配列番号２０に示されるアミノ酸配列からなり、かつ、ＶＬ領域が配列番号２６に示されるアミノ酸配列からなる；および
（ｃ）ＶＨ領域が配列番号２４に示されるアミノ酸配列からなり、ＶＬ領域が配列番号２６に示されるアミノ酸配列からなる、
からなる群より選択される。
【００４４】
最も好ましくは、本明細書に定義される前記ＩｇＧ１抗体は、
（ａ）配列番号７７に示される重鎖のアミノ酸配列と配列番号８０に示される軽鎖のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号７８に示される重鎖のアミノ酸配列と配列番号８０に示される軽鎖のアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号７９に示される重鎖のアミノ酸配列と配列番号８０に示される軽鎖のアミノ酸配列；および
（ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一の、より好ましくは少なくとも９０％同一の、最も好ましくは少なくとも９５％同一のアミノ酸配列
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。
【００４５】
最も好ましくは、さらに添付の実施例に実証されるように、本発明の医薬組成物に用いられる「ＩｇＧ１抗体」は、マウスモノクローナル抗体Ａ５Ｂ７のＣＤＲ−Ｈ３のKabatの位置９５〜１０２（配列番号２７）に対応するアミノ酸配列「ＤＲＧＬＲＦＹＦＤＹ」を含む、ヒト定常領域およびヒト化可変領域を含むヒト化ＩｇＧ１抗体である。
【００４６】
好ましくは、前記ＩｇＧ１抗体の軽鎖定常領域はλ軽鎖定常領域、好ましくは、ヒトλ軽鎖定常領域である。
【００４７】
本明細書に定義されるＩｇＧ１抗体は、例えば有機ポリマー（例えばポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）および／またはポリビニルピロリドン（「ＰＶＰ」）の１またはそれ以上の分子）を用いて誘導体化してよい。当分野で公知のように、このような誘導体化は、抗体またはそのフラグメントの薬理学的特性を調節するのに有利であり得る。特に好ましいものは、システインアミノ酸のスルフヒドリル基を介する部位特異的な方法で抗体またはそのフラグメントとの共役を可能にする、ＰＥＧ−マレイミドとして誘導体化されたＰＥＧ分子である。これらの中で、特に好ましいものは２０ｋＤおよび／または４０ｋＤのＰＥＧ−マレイミドの分枝かまたは直鎖の形のものである。
【００４８】
さらに、本明細書に定義されるＩｇＧ１抗体を放射性核種（例えば131Ｉ）、細胞毒類（例えばシュードモナス毒素Ａ）またはサイトカイン類、例えばＩＬ−２と融合させてもよい。得られる融合タンパク質は、上皮腫瘍の治療において治療目的で用いられることが好ましい。放射性核種と融合した本発明の抗体もまた、例えば診断目的に有用であり得る。
【００４９】
本発明の医薬組成物のもう１つの好ましい実施形態では、治療されるべき前記上皮腫瘍は、胃腸腺癌、乳腺腺癌または肺腺癌である。前記胃腸腺癌は、好ましくは結腸直腸腺癌、膵臓腺癌、食道腺癌または胃腺癌である。
【００５０】
より好ましくは、本発明の前記医薬組成物は、進行性腫瘍、後期腫瘍、腫瘍量の多い腫瘍患者、転移性腫瘍、またはＣＥＡ血清中濃度が１００ｎｇ／ｍｌより高い腫瘍患者の治療のためのものである。前記ＣＥＡ血清中濃度は、例えばＥＬＩＳＡにより測定され得る。
【００５１】
本発明の医薬組成物のさらなる好ましい実施形態では、本明細書に定義されるＩｇＧ１抗体はヒト化および／または脱免疫化されている。
【００５２】
本明細書において、用語「ＣＤＲ移植」、「ヒト化された」または「ヒト化」は、その結合ドメイン中に非ヒト抗体またはそのフラグメント由来の少なくとも１つの相補性決定領域（「ＣＤＲ」）を含むヒトＩｇＧ１抗体を指すために同義的に用いられる。ヒト化アプローチは、例えばＷＯ ９１／０９９６８および米国特許第６，４０７，２１３号に記載されている。限定されない例として、この用語は、結合ドメインの可変領域が単一のＣＤＲ領域、例えば別の非ヒト動物、例えばげっ歯類由来のＶＨの第３のＣＤＲ領域（ＣＤＲ−Ｈ３）を含む場合、ならびに一方または両方の可変領域がそのそれぞれの第１、第２および第３のＣＤＲに前記非ヒト動物由来のＣＤＲを含む場合を包含する。抗体の結合ドメインの全てのＣＤＲが、例えばげっ歯類由来のそれらの対応する同等物で置換されている場合、通常「ＣＤＲ移植（CDR-grafting）」といい、この用語は本明細書において「ヒト化」という用語も包含していると理解される。用語「ヒト化」はまた、結合ドメインのＶＨおよび／またはＶＬ内での１またはそれ以上のＣＤＲ領域の置換に加えて、ＣＤＲ間のフレームワーク（「ＦＲ」）領域内の少なくとも単一のアミノ酸残基のさらなる変異（例えば置換）が、その位置のアミノ酸を、置換に用いたＣＤＲ領域の由来する動物におけるその位置のアミノ酸に合致させている場合も包含する。当分野で公知のように、このような個々の変異は、その標的分子のＣＤＲ供与体として用いられる非ヒト抗体の本来の結合親和性を回復させるために、ＣＤＲ移植の後にフレームワーク領域に作製される場合が多い。用語「ヒト化」は、上記のフレームワーク領域中のアミノ酸置換に加えて、非ヒト動物由来のＣＤＲ領域における、ヒト抗体由来の相当するＣＤＲ領域のアミノ酸へのアミノ酸置換（１または複数箇所）をさらに包含する。
【００５３】
より具体的には、本明細書において、「ヒト化抗体」または関連語は、マウスモノクローナル抗体Ａ５Ｂ７のＣＤＲ−Ｈ３のKabatの位置９５〜１０２に相当するアミノ酸配列「ＤＲＧＬＲＦＹＦＤＹ」（配列番号２７）を有するＣＤＲ−Ｈ３を除いて、ヒトＣＤＲ配列およびフレームワーク領域配列を含む可変領域を含むヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有するＩｇＧ１抗体を包含する。このような抗体は、以下の実施例に示されるように作製することができる。本明細書に記載されるＩｇＧ１抗体はヒト化抗体であることが特に有利である。ヒトへの治療的投与を意図する抗体剤を検討する際、この抗体の大部分がヒト起源であることが非常に有利である。ヒト患者への投与の後に、そのヒト化抗体（または断片）は、患者の免疫系により強い免疫原性応答を誘発しない可能性が最も高い、すなわち、「外来」、つまり非ヒトタンパク質であると認識されない。これは、どの宿主の抗体、すなわち患者の抗体も、治療的抗体に対して生成されないか、さもなければ治療的抗体の活性を阻害し、かつ／または患者の身体からの治療的抗体の排除を加速し、従ってその所望の治療効果を発揮することを妨げることを意味する。用語「ヒト化」抗体は、本明細書において、本明細書に定義されるＩｇＧ１抗体がヒト抗体レパートリーに含有されるアミノ酸配列、およびマウスモノクローナル抗体Ａ５Ｂ７のＣＤＲ−Ｈ３のKabatの位置９５〜１０２に相当するアミノ酸配列「ＤＲＧＬＲＦＹＦＤＹ」（配列番号２７）を有するＣＤＲ−Ｈ３を含むという意味として理解される。本明細書における定義の目的において、抗体、またはその断片は、従って、それがこのようなヒトアミノ酸配列からなる場合、すなわち、問題の抗体またはその断片のアミノ酸配列が、上記に示したマウスＣＤＲ−Ｈ３を除いて、発現したヒト生殖系列アミノ酸配列と同一である場合、ヒト化であると考えられる。本明細書に定義されるＩｇＧ１抗体も、それが体細胞超変異の跡（imprint）によるものであると予期されない、その近縁のヒト生殖系列配列に由来する配列からなる場合、ヒト化とみなされ得る。好ましくは、本明細書に定義される（ヒト化）ＩｇＧ１抗体は、ヒト定常領域と、マウスモノクローナル抗体Ａ５Ｂ７のＣＤＲ−Ｈ３のKabatの位置９５〜１０２に相当するアミノ酸配列「ＤＲＧＬＲＦＹＦＤＹ」（配列番号２７）を有するＣＤＲ−Ｈ３を含むヒト可変領域を有する。上記に示したように、前記ＣＤＲ−Ｈ３は可溶性ＣＥＡに対する抵抗性を媒介する。
【００５４】
本明細書において、用語「脱免疫化された」または「脱免疫化」は、元の野生型構築物と向かい合う結合ドメインを、ヒトにおいて前記野生型構築物を非免疫原性または低免疫原性にすることにより修飾することを意味する。脱免疫化アプローチは、例えばＷＯ ００／３４３１７号、ＷＯ ９８／５２９７６号、ＷＯ ０２／０７９４１５号またはＷＯ ９２／１０７５５号に示されている。用語「脱免疫化された」はまた、Ｔ細胞エピトープを形成する傾向の低下を示す構築物に関する。本発明に従って、用語「Ｔ細胞エピトープを形成する傾向の低下」とは、特異的なＴ細胞活性化をもたらすＴ細胞エピトープの除去に関する。さらに、「Ｔ細胞エピトープを形成する傾向の低下」とは、Ｔ細胞エピトープの形成に寄与するアミノ酸の置換、すなわち、Ｔ細胞エピトープの形成に必須のアミノ酸の置換を意味する。言い換えれば、「Ｔ細胞エピトープを形成する傾向の低下」は、免疫原性の低下または抗原非依存性のＴ細胞増殖を誘導する能力の低下に関する。用語「Ｔ細胞エピトープ」は、細胞内でペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の分解中に放出され、その後に、Ｔ細胞の活性化を引き起こすために主要組織適合抗原複合体（ＭＨＣ）の分子より提示される短いペプチド配列に関する；特に、ＷＯ ０２／０６６５１４号参照。ＭＨＣクラスＩＩで表されるペプチドに関して、このようなＴ細胞の活性化は、次に、Ｔ細胞の直接刺激による抗体応答を引き起こし、前記抗体を産生することができる。「Ｔ細胞エピトープを形成する傾向の低下」および／または「脱免疫化」は、当分野で公知の技法により測定することができる。Ｔ細胞増殖アッセイによりインビトロでタンパク質の脱免疫化を試験することが好ましい。このアッセイでは、世界で８０％を超えるＨＬＡ−ＤＲ対立遺伝子を提示するドナー由来のＰＢＭＣを、野生型かまたは脱免疫化されたペプチドのいずれかに応答する増殖についてスクリーニングする。理想的には、細胞増殖は野生型ペプチドに抗原提示細胞を負荷する（loading）際にのみ検出される。あるいは、全てのハプロタイプを提示するＨＬＡ−ＤＲ四量体を発現させることにより、脱免疫化を試験することができる。これらの四量体は、ペプチド結合について試験するか、または増殖アッセイにおいて抗原提示細胞の代わりをするペプチドを負荷してよい。脱免疫化されたペプチドがＨＬＡ−ＤＲハプロタイプに提示されるかどうかを試験するため、例えばＰＢＭＣ上の蛍光標識ペプチドの結合を測定することができる。さらに、脱免疫化は、患者への投与後に脱免疫化分子に対する抗体が形成されたかどうかを判定することにより証明することができる。好ましくは、ＣＤＲ領域の結合親和性が影響を受けないように、Ｔ細胞エピトープを誘導する傾向の低下をもたらすために、抗体由来分子をフレームワーク領域で脱免疫化し、大部分のＣＤＲ領域は修飾されない。たとえ１つのＴ細胞エピトープの除去であっても、結果として免疫原性が低下する。要約すれば、上記のアプローチは、上皮腫瘍患者に投与される場合、本明細書に定義される治療的ＩｇＧ１抗体の免疫原性を低下させるために役立つ。
【００５５】
別の態様では、本発明は、
（ａ）配列番号７７に示される重鎖のアミノ酸配列と配列番号８０に示される軽鎖のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号７８に示される重鎖のアミノ酸配列と配列番号８０に示される軽鎖のアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号７９に示される重鎖のアミノ酸配列と配列番号８０に示される軽鎖のアミノ酸配列；および
（ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一の、より好ましくは少なくとも９０％同一の、最も好ましくは少なくとも９５％同一のアミノ酸配列
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＩｇＧ１抗体に関する。
【００５６】
本発明はまた、上記に定義されるＩｇＧ１抗体をコードする核酸に関する。有利には、本明細書に定義される前記ＩｇＧ１抗体またはそれをコードする核酸は、ヒトにおいて上皮腫瘍の治療のための医薬組成物として使用される。前記上皮腫瘍はＣＥＡ陽性である。ＣＥＡ陽性の上皮腫瘍細胞に対するこれらの本発明の医薬組成物中のＩｇＧ１抗体の細胞障害活性は、腫瘍患者の血漿中のさらに高い濃度の可溶性ＣＥＡ抗原に対してでさえ抵抗性である。
【００５７】
特定のポリペプチドが本明細書に定義されるヌクレオチドまたはアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるかどうかは、公知のコンピュータープログラムを用いて従来法で決定してよい。クエリー配列（本明細書に定義される配列）と対象配列（subject sequence）との間で最も全体的に適合するものを決定するための好ましい方法（グローバル配列アラインメントとも称される）は、Bultragらのアルゴリズム（Comp. App. Biosci. 6:237-245 (1990)）に基づくＦＡＳＴＤＢコンピュータープログラムを用いて決定してよい。配列アラインメントにおいてクエリー配列と対象配列は、双方ともＤＮＡ配列である。ＲＮＡ配列はＵをＴに変換することにより比較され得る。
【００５８】
本発明はまた、本明細書に定義されるＩｇＧ１抗体をコードする核酸配列を含む医薬組成物を提供する。前記核酸は、以下により詳細に示されるように、ヒトにおいて上皮腫瘍を治療するために、例えば遺伝子治療アプローチに利用することができる。
【００５９】
本発明はさらに上記に定義される核酸配列を含むベクターを含む医薬組成物に関する。好ましくは、前記ベクターは、上記に定義される前記核酸配列と作動可能なように連結されている調節配列をさらに含む。より好ましくは、前記ベクターは発現ベクターである。例えば１つの発現ベクターが前記抗体の重鎖をコードし、それに対してもう1つの発現ベクターが軽鎖をコードすることも想定される。
【００６０】
さらに、本発明のベクターはまた、遺伝子導入または標的遺伝子組換えベクターであってよい。エキソビボ（ex-vivo）またはインビボ技術により治療遺伝子または核酸を細胞に導入することに基づく遺伝子治療は、遺伝子導入の最も重要な適用の一つである。インビトロまたはインビボでの遺伝子治療に適したベクター、方法または遺伝子送達系は、文献に記載され、当業者に公知である；例えば、Giordano, Nature Medicine 2 (1996), 534-539; Schaper, Circ. Res. 79 (1996), 911-919; Anderson, Science 256 (1992), 808-813, Isner, Lancet 348 (1996), 370-374; Muhlhauser, Circ. Res. 77 (1995), 1077-1086;Onodua, Blood 91 (1998), 30-36; Verzeletti, Hum. Gene Ther. 9 (199８), 2243-2251; Verma, Nature 389 (1997), 239-242; Anderson, Nature 392 (Supp. 1998), 25-30; Wang, Gene Therapy 4 (1997), 393-400;Wang, Nature Medicine 2 (1996), 714-716；ＷＯ ９４／２９４６９；ＷＯ ９７／００９５７；ＵＳ５，５８０，８５９；ＵＳ５，５８９，４６６；ＵＳ４，３９４，４４８またはSchaper, Current Opinion in Biotechnology 7 (1996), 635-640、ならびにそれに引用される参照文献を参照。本明細書に定義される核酸分子およびベクターは、細胞への直接導入用に、またはリポソーム、ウイルス（例えばアデノウイルス、レトロウイルス）ベクター、エレクトロポレーション、またはその他の送達系を介する細胞への導入用に設計することができる。さらに、バキュロウイルス系を本明細書に定義される核酸分子のための真核生物発現系として用いてもよい。導入および遺伝子治療アプローチは、好ましくは、本明細書に定義される機能的ＩｇＧ１抗体構築物の発現をもたらすべきであり、それによって、前記ＩｇＧ１抗体構築物はヒトにおける上皮腫瘍の治療、寛解および／または予防に特に有用である。
【００６１】
さらなる態様では、本発明は、上記に定義されるベクターまたは核酸で形質転換またはトランスフェクトされた宿主を含む医薬組成物に関する。
【００６２】
好ましくは、医薬組成物は、担体、安定剤および／または賦形剤からなる適した製剤をさらに含む。
【００６３】
別の態様では、本発明は、上記に定義される医薬組成物の製造のためのプロセスに関し、前記プロセスは上記に定義される宿主を上記に定義されるＩｇＧ１抗体の発現を可能にする条件下で培養することと、産生されたＩｇＧ１抗体を培養物から回収することを含む。本発明のさらなる態様は、ヒトにおける上皮腫瘍の予防、治療または寛解のための医薬組成物の調製のための、上記に定義されるＩｇＧ１抗体または上記に定義されるプロセスにより産生されたＩｇＧ１抗体、上記に定義される核酸分子、上記に定義されるベクターまたは上記に定義される宿主の使用に関する。本発明の別の態様は、ヒトにおける上皮腫瘍の予防、治療または寛解のための方法に関し、前記方法は本発明の、または上に示されるプロセスによって製造された医薬組成物の有効量を投与する段階を含む。当業者、特に主治医であれば、本発明の二重特異的分子／二重特異的一本鎖抗体の投与を必要とする患者の治療の成功を評価することができる。従って、投与計画ならびに投薬量および投与回数は前記当業者により判断され得る。つまり、判断される、対応する「寛解」および／または「治療」は下に定義される。
【００６４】
最も好ましい投与方法は、所与の時間／期間の静脈内投与である。本明細書に定義されるＩｇＧ１抗体は１回につき単独で投与されてよいが、好ましいものは、製薬上許容される担体中の投与である。適した医薬担体の例は当分野で周知であり、リン酸緩衝生理食塩水溶液、水、リポソーム、様々な種類の湿潤剤、滅菌溶液などが含まれる。このような担体を含む組成物は、周知の従来法により処方されてよい。これらの医薬組成物は被験体に適した用量で投与することができる。投与計画は主治医および臨床学的因子により決定される。医学分野で周知のように、任意の患者一人への投薬量は多くの要因によって決まり、それには患者の大きさ、体表面積、年齢、投与される特定の化合物、性別、投与時間および経路、全体的な健康状態、および同時に投与されるその他の薬剤が含まれる。非経口投与のための製剤としては、滅菌水溶液または非水溶液、および懸濁液が挙げられる。非水溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、および注射用の有機エステル類、例えばオレイン酸エチルである。水性担体としては、水、水溶液、または生理食塩水および緩衝媒体を含む懸濁液が挙げられる。非経口媒体としては、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸化リンゲル液、または硬化油が挙げられる。静脈内媒体としては、液体および栄養素補充液、電解質補充液（リンゲルデキストロースに基づくものなど）などが挙げられる。防腐剤およびその他の添加剤も存在してよく、例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、不活性ガスなどが挙げられる。さらに、組成物は、例えば、好ましくはヒト起源の血清アルブミンまたは免疫グロブリンなどのタンパク質性担体を含んでもよい。併用療法は、タンパク質性ＩｇＧ１抗体に加えて、医薬組成物の意図される使用に応じて、さらなる生物活性物質を含むことが想定される。このような物質は、胃腸管系に作用する物質、細胞増殖抑制剤として作用する物質、高尿酸血症を予防する物質、免疫反応を阻害する物質（例えばコルチコステロイド、ＦＫ５０６）、循環系に作用する薬剤および／またはＴ細胞共刺激分子またはサイトカインなどの当分野で公知の薬剤であってよい。好ましくは、本明細書に定義されるＩｇＧ１抗体は、緩衝液、安定剤および界面活性剤中に処方される。緩衝液は、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、コハク酸緩衝液または酢酸緩衝液であってよい。安定剤は、（１または複数の）アミノ酸および／または糖であってよい。界面活性剤は、合成洗剤、ＰＥＧなどであってよい。より好ましくは、本明細書に定義されるＩｇＧ１抗体は、クエン酸塩、リシン、トレハロースおよびＴｗｅｅｎ８０中に処方される。前記医薬組成物の希釈液として、等張生理食塩水およびＴｗｅｅｎ８０が好ましい。
【００６５】
本明細書において用語「寛解」とは、疾患、すなわち上皮腫瘍の重篤度の改善または緩和を指す。例えば、そのような寛解は、本発明の医薬組成物の投与に起因する、安定な疾患の達成、またさらにより好ましくは、上皮腫瘍の縮小、すなわち、微小、部分的応答または完全寛解であり得る。「安定な疾患」とは、臨床および／または組織学的診断方法により腫瘍進行／増殖が全くまたはほとんど観察されないまたは検出されない疾患状態を指す。例えば、指標病変の断面積の合計の５０％より多くの縮小である、腫瘍の縮小は、「部分応答」と考えられる。「完全寛解」は、治療後に病変がこれ以上全く検出されない状態を意味する。安定疾患と部分応答との間の腫瘍縮小を伴う応答は、微小応答と考えられ得る。例えば、指標病変の断面積の合計の２０％、２５％または３０％縮小は、微小応答と称され得る。
【００６６】
用語「寛解」は、本明細書において、上皮腫瘍の数の減少も包含する。それは、さらに腫瘍進行の阻止／減速を意味する。さらに、治療しなかった腫瘍患者と比較して、治療した腫瘍患者の全体的な生存の改善は、本明細書において「寛解」と考えられる。これは、必要な変更を加えて、治療しなかった腫瘍患者と比較して、治療した腫瘍患者の進行のない生存または再発のない生存の改善にも当てはまる。さらに、用語「寛解」はまた、上皮腫瘍の症状の強度の減少も指し、その結果得られる、例えば治療した腫瘍患者の生活の質の改善も指す。
【００６７】
用語「上皮腫瘍の予防」は、本明細書において、次のように理解される。原発上皮腫瘍のヒト患者からの外科切除後、および／または原発上皮腫瘍の化学療法または放射線治療後に、腫瘍細胞が全て身体から排除されない場合もあり得る。しかし、これらの残存腫瘍細胞は患者において再発性癌、すなわち、局所再発および／または転移を引き起こす可能性がある。転移はよく見られる癌の合併症であるが、癌細胞が原発腫瘍から播種されて遠位のコロニーを形成する過程はあまり分かっていない。転移性癌は、ほぼ例外なく難治性で新しい治療方法の必要性が生じる。本発明の医薬組成物を用いると、これらの播種された腫瘍細胞を死滅させて二次性腫瘍（一次治療後に身体に残存する腫瘍細胞から生じる）の形成を予防することができる。このように、本医薬組成物は、腫瘍患者において局所再発および／または転移の形成を予防するために役立つ。
【００６８】
抗腫瘍治療の成功は、それぞれの疾病について、例えばコンピュータ断層撮影、Ｘ線、核磁気共鳴断層撮影（例えば、米国国立癌研究所の判定基準に基づく応答評価（Cheson (1999), J. Clin. Oncol.; 17 (4):1244））、陽電子放射断層撮影走査、内視鏡検査、蛍光活性化セルソーター、骨髄の吸引、胸水または腹水、組織／組織学、および様々な上皮腫瘍特異的臨床化学パラメータ（例えば血清中の可溶性ＣＥＡ濃度）により確立された標準的な方法でモニターすることができ、さらに、その他の確立された標準的な方法を用いてよい。さらに、Ｔ細胞の活性化を測定するアッセイを用いてよい；例えば、ＷＯ ９９／０５４４４０号を参照。
【００６９】
治療しなかった腫瘍患者と比較して、治療した腫瘍患者の全体的な生存、進行のない生存または再発のない生存の決定のために統計学を用いてもよい。
【００７０】
好ましくは、前記上皮腫瘍は、胃腸腺癌、乳腺腺癌または肺腺癌である。前記胃腸腺癌は、より好ましくは、結腸直腸腺癌、膵臓腺癌、食道腺癌または胃腺癌である。
【００７１】
さらにより好ましくは、前記本発明の医薬組成物は、進行性腫瘍、後期腫瘍、腫瘍量の多い腫瘍患者、転移性腫瘍、またはＣＥＡ血清中濃度が１００ｎｇ／ｍｌより高い腫瘍患者の治療のためのものである。前記ＣＥＡ血清中濃度は、例えばＥＬＩＳＡにより測定され得る。
【００７２】
本発明の使用または方法のもう１つの好ましい実施形態では、上記に定義される前記医薬組成物は、さらなる薬剤と組み合わせて、すなわち、併用療法の一部として投与されるのに適している。前記併用療法では、活性薬剤を場合により、同医薬組成物中にＩｇＧ１抗体として含むか、別個の医薬組成物に含んでよい。後者の場合、前記別個の医薬組成物は、ＩｇＧ１抗体を含む前記医薬組成物の投与の前に、同時に、またはその投与の後に投与するのに適している。さらなる薬剤または医薬組成物は非タンパク質性化合物であってもタンパク質性化合物であってもよい。
【００７３】
好ましくは、前記タンパク質性化合物または非タンパク質性化合物は、上記に定義されるＩｇＧ１抗体、上記に定義される核酸分子、上記に定義されるベクター、または上記に定義される宿主と同時または非同時に投与してよい。好ましくは、治療される前記被験体はヒトである。
【００７４】
さらなる態様において、本発明は、上記に定義されるＩｇＧ１抗体、上記に定義される核酸分子、上記に定義されるベクター、または上記に定義される宿主を含むキットに関する。
【００７５】
これらおよびその他の実施形態は、本発明の説明および実施例に開示され、包含される。免疫学分野の組換え技術および方法は、例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual;Cold Spring Harbor Laboratory Press, 3rd edition 2001; Lefkovits; Immunology Methods Manual;The Comprehensive Sourcebook of Techniques;Academic Press, 1997; Golemis; Protein-Protein Interactions: A Molecular Cloning Manual;Cold Spring Laboratory Press, 2002に記載されている。本発明に従って用いられ得る抗体、方法、用途および化合物のいずれかに関するさらなる参照文献は、例えば電子装置を用いて公開されているライブラリーおよびデータベースから得ることができる。例えば、インターネットで利用可能な公開データベース「Ｍｅｄｌｉｎｅ」を、例えばｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｑｏｖ／ＰｕｂＭｅｄ／ｍｅｄｌｉｎｅ．ｈｔｍｌで利用してよい。さらなるデータベースおよびアドレス、例えばｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｉｍ．ｎｉｈ．ｑｏｖ／、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｎｆｏｂｉｏａｅｎ．ｆｒ／、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｆｍｉ．ｃｈ／ｂｉｏｌｏｑｖ／ｒｅｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌｓ．ｈｔｍｌ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｔｉｑｒ．ｏｒＱ／が当業者に公知であり、例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｌｖｃｏｓ．ｃｏｍを用いて得ることもできる。腫瘍関連の話題は、例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｉｈ．ｇｏｖまたはｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｋｆｚ．ｄｅを参照のこと。
【実施例】
【００７６】
以下の実施例は本発明を説明する。
実施例１：ヒトＣＥＡ（癌胎児性抗原関連細胞接着分子５；ＣＥＡＣＡＭ５）がトランスフェクトされたＣＨＯ細胞の作製
ＣＥＡ陽性の、Ｋａｔｏ ＩＩＩ細胞（ヒト胃癌腫細胞株；ＡＴＣＣ ＨＴＢ−１０３）を用いて全ＲＮＡを得、それをキットマニュアルの説明書（Ｑｉａｇｅｎ、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ）に従って単離した。得られたＲＮＡを、ランダムに開始される逆転写によるｃＤＮＡ合成に用いた。ＣＥＡ抗原の全長配列のクローニングのため、以下のオリゴヌクレオチドを用いた。５’ＣＥＡＣＡＭ５ ＥｃｏＲＩ ＧＡＡＴＴＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＧＴＣＴＣＣＣＴＣＧＧＣＣＣＣ（配列番号３５）および３’ＣＥＡＣＡＭ５ Ｓａｌ Ｉ ＧＴＣＧＡＣＣＴＡＴＡＴＣＡＧＡＧＣＡＡＣＣＣＣ（配列番号３６）。ＰＣＲ（第１サイクルに関して、９３℃にて５分間の変性、５８℃にて１分間のアニーリング、７２℃にて１分間の伸張；９３℃にて１分間の変性、５８℃にて１分間のアニーリング、７２℃にて１分間の伸張を３０サイクル；７２℃にて５分間の末端伸張）を用いてコード配列を増幅した。その後、ＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩで消化し、適切に消化した発現ベクターｐＥＦ−ＤＨＦＲに連結し、大腸菌に形質転換した。単離したプラスミドＤＮＡを配列決定し、確立されたＣＥＡＣＡＭ５の核酸配列（米国国立バイオテクノロジー情報センター（National Center for biotechnology information）のＮＭ＿００４３６３、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/；配列番号３７）と比較した。標準的なプロトコールに従って、上述の手順を実行した（Sambrook, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, New York (1989；2001)。確認された核酸配列を含むクローンを、構築物の真核生物における発現のためにＤＨＦＲ欠損ＣＨＯ細胞にトランスフェクトした。ＤＨＦＲ欠損ＣＨＯ細胞における真核生物タンパク質発現を、Kaufmannに記載のとおり行った（Kaufmann R.J., Methods Enzymol. 185 (1990), 537-566）。構築物の遺伝子増幅を、最大２０ｎＭ ＭＴＸの終濃度までの、漸増濃度のＭＴＸにより誘導した。次に、トランスフェクトした細胞を、ＦＡＣＳアッセイを用いてＣＥＡ抗原の発現について試験した。その目的のため、２．５×１０5の数のトランスフェクト細胞を、濃度５μｇ／ｍｌのマウスモノクローナル抗体ＣＯＬ−１（Ｎｅｏｍａｋｅｒｓ；Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ，ＵＳＡ）とともにインキュベートした。５０μｌ ＰＢＳ中２％ ＦＣＳ（Ｄｉａｎｏｖａ，Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙより入手）を用いて１：１００で希釈した、Ｒ−フィコエリトリン結合アフィニティー精製Ｆ（ａｂ’）２断片、ヤギ抗マウスＩｇＧ、Ｆｃ−γ断片特異的抗体を用いて、抗体の結合を検出した。細胞を、ＦＡＣＳ−Ｃａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ）でフローサイトメトリーにより分析した。ＦＡＣＳ染色および蛍光強度の測定を、Current Protocols in Immunology （Coligan, Kruisbeek, Margulies, Shevach and Strober, Wiley-Interscience, 2002）に記載のとおり行った。結果として、形質転換体は、ヒトＣＥＡ抗原について明らかな陽性染色を実証した。
【００７７】
実施例２：マウスモノクローナル抗体（ｍＡｂ）Ａ５Ｂ７およびＴ８４．６６由来のＩｇＧ１抗体の作製および特性決定
完全なＩｇＧ抗体分子を発現するため、２つのベクターを作製した。これらのベクターのうちの一方は重鎖をコードし、それに対してもう一方は軽鎖をコードした。完全なＩｇＧ分子は、マウスモノクローナル抗体Ａ５Ｂ７（Chester, Int. J. Cancer 57 (1994), 67-72; Harwood、上記引用文中）およびＴ８４．６６（Neumaier, Cancer Res. 50 (1990), 2128-34）に由来している。それぞれの配列は文献から抽出され、対応するＶ領域はＥｎｔｅｌｅｃｈｏｎ，Ｇｅｒｍａｎｙにて遺伝子合成された。これらの合成されたＤＮＡ断片を以下のＰＣＲ段階の鋳型として用いた。
【００７８】
１．抗体ＣＥＡ Ｉ（Ａ５Ｂ７）およびＣＥＡ ＩＩ（Ｔ８４．６６）に基づくマウス軽鎖のクローニング
適した末端制限部位を作製するため、抗体ＣＥＡ Ｉ（Ａ５Ｂ７）のＶＬ領域をコードするＤＮＡ断片をＰＣＲにより再び増幅し、結果として５’末端にＢｓｕ３６Ｉ部位および３’末端にＸｈｏ Ｉ部位を含むＶκ断片を得た。プライマー５’−ＶＬ ＣＥＡ Ｉ Ｂｓｕ３６Ｉ（５’−ＴＴＣＴＣＴＣＣＴＴＡＧＧＴＧＴＣＣＡＣＴＣＣＧＡＣＡＴＴＧＡＧＣＴＣＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣ−３’）（配列番号８１）および３’−ＶＬ ＣＥＡ Ｉ Ｘｈｏ Ｉ（５’−ＣＡＴＧＣＡＣＴＣＧＡＧＣＴＴＧＧＴＣＣＣＴＣＣＡＣＣＧＡＡＣＧＴＣ−３’）（配列番号８２）をこの目的に用いた。次に、この断片を、Ｂｓｕ３６ＩおよびＸｈｏ Ｉによりヒトリーダー配列およびマウスＣκ（Hieter et al., 1980 Cell 22: 197-207）領域を含有するｐＢＳ由来のプラスミドにサブクローニングし、それにより哺乳類リーダー配列とマウスＣκ定常領域を加えた。ＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩを利用して、ＣＥＡ Ｉ ＶＬ−Ｃκ ＤＮＡを前記ベクターから切り出し、マウスジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）をコードするｃＤＮＡをマウスアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）をコードするそれと置換することにより発現ベクターｐＥＦ−ＤＨＦＲに由来する真核生物発現ベクターｐＥＦ−ＡＤＡにサブクローニングした（Mack et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92, 7021-5）。同じ手順を、適宜に、しかし異なる特異的プライマー：ＣＥＡ ＩＩ（Ｔ８４．６６）に対して、５’−ＶＬ ＣＥＡ ＩＩ Ｂｓｕ３６Ｉ（５’−ＴＴＣＴＣＴＣＣＴＴＡＧＧＴＧＴＣＣＡＣＴＣＣＧＡＣＡＴＴＧＴＧＣＴＧＡＣＣＣＡＡＴＣＴＣＣ−３’）（配列番号８３）および３’−ＶＬ ＣＥＡ ＩＩ Ｘｈｏ Ｉ（５’−ＣＡＴＧＣＡＣＴＣＧＡＧＣＴＴＧＧＴＣＣＣＣＣＣＡＣＣＧＡＡＣＧＴＧ−３’）（配列番号８４）を用いて抗体ＣＥＡ−ＩＩ（Ｔ８４．６６）のＶＬで行った。
【００７９】
この実験の結果として、抗体ＣＥＡ Ｉ（Ａ５Ｂ７）、およびＣＥＡ ＩＩ（Ｔ８４．６６）に基づくマウス軽鎖が作製された。ｍＡｂ Ａ５Ｂ７のＶＨ領域のアミノ酸配列は配列番号８で示され、一方、ＣＥＡ Ｉ（ｍＡｂ Ａ５Ｂ７）のＶＬ領域は配列番号１０で示される。ＣＥＡ ＩＩ（ｍＡｂ Ｔ８４．６６）のＶＨ領域のアミノ酸配列は配列番号１２で示され、一方、ｍＡｂ Ｔ８４．６６のＶＬ領域は配列番号１４で示される。
【００８０】
２．マウス重鎖可変ドメインのクローニング
ＣＥＡ Ｉ（Ａ５Ｂ７）およびＣＥＡ ＩＩ（Ｔ８４．６６）のマウスＶＨ領域から、重鎖の可変領域をＰＣＲにより再び増幅させ、両方の末端にＢｓｕ３６Ｉ制限部位を作製した。ＣＥＡ Ｉ（Ａ５Ｂ７）には、次の２つのプライマーの組み合わせ：５’−プライマー ５'ＣＥＡ Ｉ ＶＨ−Ｂｓｕ３６Ｉ（５’−ＴＴＣＴＣＴＣＣＴＴＡＧＧＴＧＴＣＣＡＣＴＣＣＣＡＧＧＴＣＣＡＡＣＴＧＣＡＧＧＡＧＴＣＡＧＧ−３’）（配列番号８７）および３’−プライマー ３’−ＣＶＨ−Ｂｓｕ３６Ｉ（５’−ＧＡＣＴＣＡＣＣＴＧＡＧＧＡＧＡＣＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＧＴＣＣＣＴＴＧＧ−３’）（配列番号８８）を用い、ＣＥＡ ＩＩ（Ｔ８４．６６）には、次の２つのプライマーの組み合わせ：５’−プライマー ５’ＣＥＡ ＩＩ ＶＨ−Ｂｓｕ３６Ｉ（５’−ＴＴＣＴＣＴＣＣＴＴＡＧＧＴＧＴＣＣＡＣＴＣＣＧＡＧＧＴＴＣＡＧＣＴＧＣＡＧＣＡＧＴＣＴＧＧ−３’）（配列番号８９）および３’−プライマー ３’ＣＥＡ ＩＩ ＶＨ−Ｂｓｕ３６Ｉ（５’−ＧＡＣＴＣＡＣＣＴＧＡＧＧＡＧＡＣＧＧＴＧＡＣＴＧＡＧＧＴＴＣＣＴＴＧＡＣＣ−３’）（配列番号９０）を用いた。
【００８１】
得られるＤＮＡ断片を、次に、これらの制限部位を用いて、既に真核生物のリーダー配列とヒトＩｇＧ１重鎖定常領域をコードするＤＮＡ断片を含有する真核生物発現ベクターｐＥＦ−ＤＨＦＲにサブクローニングした（Raum, Cancer Immunol Immunother. 50 (2001): 141-50参照）。従って重鎖可変領域はリーダー配列と重鎖定常領域との間に挿入した。
【００８２】
この実験の結果として、前記ヒトＩｇＧ１定常領域と連結されたマウス重鎖可変ドメインをコードするベクターが作製された。ｍＡｂ Ａ５Ｂ７のＶＨ領域のアミノ酸配列は配列番号８に示され、一方、ＣＥＡ Ｉ（ｍＡｂ Ａ５Ｂ７）のＶＬ領域は配列番号１０に示される。ＣＥＡ ＩＩ（ｍＡｂ Ｔ８４．６６）のＶＨ領域のアミノ酸配列は配列番号１２に示され、一方、ｍＡｂ Ｔ８４．６６のＶＬ領域は配列番号１４に示される。
【００８３】
３．完全なＩｇＧタンパク質の発現
完全なＩｇＧ１抗体を発現させるため、上記のように作製した１本の（マウス）軽鎖をコードするプラスミドおよび１本の重鎖（マウスＶＨ／ヒトＩｇＧ１定常領域）をコードするプラスミドを、一過性のタンパク質発現のための標準的なプロトコールに従ってＨＥＫ細胞に同時導入し、細胞を培養して免疫グロブリンの培地中への発現および産生を可能とした。このように、抗体ＣＥＡ Ｉ（Ａ５Ｂ７）由来のｈｕＩｇＧ１ ＣＥＡ Ｉおよび抗体ＣＥＡ ＩＩ（Ｔ８４．６６）由来のｈｕＩｇＧ１ ＣＥＡ ＩＩが産生された。前記ｈｕＩｇＧ１抗体構築物は、ＣＥＡ Ｉ（Ａ５Ｂ７）またはＣＥＡ ＩＩ（Ｔ８４．６６）に由来するマウス可変（Ｖ）領域、マウス定常（Ｃ）軽鎖（Ｃκ）領域ならびにヒト定常重鎖ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３およびヒンジ領域（ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域は、Raum, Cancer Immunol Immunother. 50 (2001): 141-50に記載されている）からなる。それぞれの製造期間の後、上清を回収し、免疫グロブリンの精製のための標準的なプロトコールに従ってプロテインＡクロマトグラフィーによってヒト免疫グロブリンを単離した。次に、培養上清、ならびに精製された免疫グロブリンをさらなる特性決定実験に用いた。
【００８４】
４．上記で作製されたＩｇＧ１抗体の特性決定
４．１ 固定化された可溶性ＣＥＡ（ｓＣＥＡ）抗原との結合
重鎖＋軽鎖の二重形質転換体の培養上清ならびに対応する精製抗体の調製物を、固定化された可溶性ＣＥＡ（ｓＣＥＡ；Ａｂｃａｍ，Ｌｔｄ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ ＵＫ）抗原上での結合についてＥＬＩＳＡにより標準的な手順に従って試験した。上記に示す通りに作製された抗体ＣＥＡ Ｉ（Ａ５Ｂ７）に由来するｈｕＩｇＧ１ ＣＥＡ Ｉと、抗体ＣＥＡ ＩＩ（Ｔ８４．６６）に由来するｈｕＩｇＧ１ ＣＥＡ ＩＩの抗体は、陰性対照と比較して固定化されたｓＣＥＡ抗原との明確な結合を示し、ｓＣＥＡ抗原がコートされない点で異なる同等の設定では結合を示さなかった（図４に示される通り）。
【００８５】
４．２ 膜結合ＣＥＡとの結合
抗体ＣＥＡ Ｉ（Ａ５Ｂ７）由来のｈｕＩｇＧ１ ＣＥＡ Ｉと抗体ＣＥＡ ＩＩ（Ｔ８４．６６）由来のｈｕＩｇＧ１ ＣＥＡ ＩＩの精製抗体調製物をＦＡＣＳ分析によりＣＥＡ陽性の胃癌細胞株Ｋａｔｏ ＩＩＩ、ＣＥＡトランスフェクトＣＨＯ細胞および非トランスフェクトＣＨＯ細胞上で試験した。
【００８６】
２×１０5細胞を、精製抗体調製物（通常１０〜２０μｇ／ｍｌ）とともにインキュベートした。細胞結合抗体の検出は、ＦＩＴＣ標識抗マウスＩｇＧ抗体または抗ヒトＩｇＧ抗体（通常１０〜２０μｇ／ｍｌ）を用いて行った。インキュベーションは２０〜４０分間氷上で行った。
【００８７】
抗体ＣＥＡ Ｉ（Ａ５Ｂ７）由来のｈｕＩｇＧ１ ＣＥＡ Ｉおよび抗体ＣＥＡ ＩＩ（Ｔ８４．６６）由来のｈｕＩｇＧ１ ＣＥＡ ＩＩは、ＣＥＡ陽性細胞に対して明確な結合を示した。非トランスフェクトＣＨＯ細胞との結合を示したＩｇＧ１抗体はなかった。ＩｇＧ−対照は、Ｋａｔｏ ＩＩＩ細胞、ＣＨＯ／ＣＥＡ−細胞および非トランスフェクトＣＨＯ細胞では陰性であった（図５Ａ、ＢおよびＣに示される通り）。
【００８８】
４．３ 抗体依存性細胞障害活性（ＡＤＣＣ）アッセイ（51Ｃｒ放出アッセイ）
51Ｃｒ放出アッセイのため、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をエフェクター細胞として健康なドナーから単離した。フィコール密度勾配遠心分離とその後の１００×ｇ遠心分離段階よりＰＢＭＣを分離した。刺激されていないＰＢＭＣ（５×１０5細胞）を、平底マイクロタイタープレートの各ウェルに１００μｌの容積の１０％ ＦＣＳを含むＲＰＭＩ １６４０培地に添加し、３７℃にて一晩インキュベートした。標的細胞として、ＣＥＡトランスフェクトＣＨＯ細胞を用いた。標的細胞を２時間51Ｃｒで標識した。標識した標的細胞（５０，０００細胞）および様々な濃度の抗体（１０ｐｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌ）をＰＢＭＣに添加し、３７℃にて１８時間インキュベートした。このアッセイは可溶性ＣＥＡ（ｓＣＥＡ）抗原の不在下で行われた。対応する結合していないアイソタイプを陰性対照として用いた。特異的溶解を、（（実験放出ｃｐｍ）−（自然放出ｃｐｍ））／（（最大放出ｃｐｍ）−（自然放出ｃｐｍ））として計算した。抗体ＣＥＡ Ｉ（Ａ５Ｂ７）由来のｈｕＩｇＧ１ ＣＥＡ Ｉおよび抗体ＣＥＡ ＩＩ（Ｔ８４．６６）由来のｈｕＩｇＧ１ ＣＥＡ ＩＩは、陰性対照と比較して、この51Ｃｒ放出アッセイにおいてＣＥＡ陽性ＣＨＯ細胞に有意な細胞障害活性を媒介することを示した。
【００８９】
２番目の細胞障害活性実験では、抗体サンプルを可溶性ＣＥＡ（ｓＣＥＡ）抗原で２０分間攪拌しながらプレインキュベートし、次に、標識した標的細胞およびヒトＰＢＭＣと混合した。さもなければ、アッセイを上記のように行った。可溶性ＣＥＡ（ｓＣＥＡ）抗原は様々な濃度、すなわち、１μｇ／ｍｌおよび１０μｇ／ｍｌで用いた。
【００９０】
可溶性ＣＥＡ、特に高い濃度の可溶性ＣＥＡの存在下で、抗体ＣＥＡ ＩＩ（Ｔ８４．６６）に由来するｈｕＩｇＧ１ ＣＥＡ ＩＩは、低下した細胞障害（ＡＤＣＣ）活性を示した。これに対し、抗体ＣＥＡ Ｉ（Ａ５Ｂ７）に由来するｈｕＩｇＧ１ ＣＥＡ Ｉは可溶性ＣＥＡの不在下での活性と比較して細胞障害活性の有意な低下を示さなかった。従って、抗体ＣＥＡ Ｉ（Ａ５Ｂ７）に由来するｈｕＩｇＧ１ ＣＥＡ Ｉに媒介されるＣＥＡ陽性腫瘍細胞に対する細胞障害活性は、可溶性ＣＥＡに対して抵抗性である。
【００９１】
要約すれば、抗体ＣＥＡ Ｉ（Ａ５Ｂ７）に由来するｈｕＩｇＧ１ ＣＥＡ Ｉの腫瘍細胞に対して向けられる細胞障害活性（ＡＤＣＣ）は、さらに高い濃度の可溶性ＣＥＡ抗原に対して抵抗性であることが見出された。この知見は、このＩｇＧ１抗体が可溶性ＣＥＡ抗原と結合するという事実を考えると全く予期しないものである。例えば、モノクローナル抗体Ｔ８４．６６に由来するＩｇＧ１抗体構築物を試験した場合、この抗体は可溶性ＣＥＡ抗原に対して非常に高い感受性がある、すなわち、細胞障害活性（ＡＤＣＣ）が可溶性ＣＥＡ抗原によって遮断されている。この抗体はまた、可溶性ＣＥＡと結合できることが見出されている。このことを考えると、可溶性ＣＥＡ抗原は抗体ＣＥＡ ＩＩ（Ｔ８４．６６）由来のｈｕＩｇＧ１ ＣＥＡ ＩＩがその抗体に媒介される細胞障害活性を発揮することを妨げると結論付けられる。その一方、本明細書に定義される抗体ＣＥＡ Ｉ（Ａ５Ｂ７）に由来するＩｇＧ１ ＣＥＡ Ｉ抗体は、腫瘍細胞に対する細胞障害活性において、さらに高いレベルの可溶性ＣＥＡの存在に対して抵抗性である。
【００９２】
実施例３：ヒトＶＬ領域の選択
癌患者に投与される際に免疫原性の低下したＩｇＧ１抗体を提供するため、可溶性ＣＥＡ抗原に対する抵抗性を有するヒト化ＩｇＧ１抗体を作製した。第１段階で、可溶性ＣＥＡに対する抵抗性を有するヒトＶＬ領域が単離された。従って、この実験の目的は、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）Ａ５Ｂ７の母親由来のマウスＶＨと対となり得るヒトＶＬ領域の選択である。
【００９３】
１．可溶性ヒトＣＥＡ抗原のビオチン化
ファージライブラリー選択のため、可溶性ＣＥＡ抗原をビオチン化した。ビオチン化は、５％ ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ）を含有するＰＢＳ中で、サンプルミキサー（Ｄｙｎａｌ）中で室温にて１時間１５倍モル過剰のＥＺ−Ｌｉｎｋ Ｓｕｌｆｏ ＮＨＳ−ＬＣ−ＬＣ−ビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて達成した。遊離ビオチンとビオチン化ＣＥＡ抗原の分離のため、標準的なプロトコールに従って、アッセイをＰＢＳに対して過剰に透析した。ビオチン標識したＣＥＡの保持された生物活性をＥＬＩＳＡ結合アッセイで確認した。
【００９４】
２．ＲＮＡのヒトＢ細胞からの単離
１００ｍＬの血液を５名の健康なヒトドナーから採取した。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を標準的な方法に従ってフィコール勾配により単離した。ＲＮｅａｓｙ（登録商標）Ｍｉｄｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を製造業者の説明書に従って用いて、全ＲＮＡを単離細胞から単離した。標準的な方法に従ってｃＤＮＡを合成した（Sambrook, Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989, 2001）。
【００９５】
３．可変軽鎖領域（ＶＬ−領域）のＰＣＲ増幅
軽鎖Ｖ領域ＤＮＡの単離のため、ＲＴ−ＰＣＲを、Ｖ−κ−（５’−ｈｕ−ＶＫ１−ＳａｃＩ−２００１（５’−ＧＡＧＣＣＧＣＡＣＧ ＡＧＣＣＣＧＡＧＣＴ ＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣ ＣＡＧＴＣＴＣＣ−３’）（配列番号３８）、５’−ｈｕ−ＶＫ２／４−ＳａｃＩ−２００１（５’−ＧＡＧＣＣＧＣＡＣＧ ＡＧＣＣＣＧＡＧＣＴ ＣＧＴＧＡＴＧＡＣＹ ＣＡＧＴＣＴＣＣ−３’）（配列番号３９）、５’−ｈｕ−ＶＫ３−ＳａｃＩ−２００１（５’−ＧＡＧＣＣＧＣＡＣＧ ＡＧＣＣＣＧＡＧＣＴ ＣＧＴＧＷＴＧＡＣＲ ＣＡＧＴＣＴＣＣ−３’）（配列番号４０）、５’−ｈｕ−ＶＫ５−ＳａｃＩ−２００１（５’−ＧＡＧＣＣＧＣＡＣＧ ＡＧＣＣＣＧＡＧＣＴ ＣＡＣＡＣＴＣＡＣＧ ＣＡＧＴＣＴＣＣ−３’）（配列番号４１）、５’−ｈｕ−ＶＫ６−ＳａｃＩ−２００１（５’−ＧＡＧＣＣＧＣＡＣＧ ＡＧＣＣＣＧＡＧＣＴ ＣＧＴＧＣＴＧＡＣＴ ＣＡＧＴＣＴＣＣ−３’）（配列番号４２）、３’−ｈｕ−Ｖｋ−Ｊ１−ＳｐｅＩ−ＢｓｉＷＩ （５’−ＧＡＣＧＡＣＡＣＴＡ ＧＴＴＧＣＡＧＣＣＡ ＣＣＧＴＡＣＧＴＴＴ ＧＡＴＴＴＣＣＡＣＣ ＴＴＧＧＴＣＣ−３’）（配列番号４３）、３’−ｈｕ−Ｖｋ−Ｊ２／４−ＳｐｅＩ−ＢｓｉＷＩ （５’−ＧＡＣＧＡＣＡＣＴＡ ＧＴＴＧＣＡＧＣＣＡ ＣＣＧＴＡＣＧＴＴＴ ＧＡＴＣＴＣＣＡＳＣ ＴＴＧＧＴＣＣ−３’）（配列番号４４）、３’−ｈｕ−Ｖｋ−Ｊ３−ＳｐｅＩ−ＢｓｉＷＩ （５’−ＧＡＣＧＡＣＡＣＴＡ ＧＴＴＧＣＡＧＣＣＡ ＣＣＧＴＡＣＧＴＴＴ ＧＡＴＡＴＣＣＡＣＴ ＴＴＧＧＴＣＣ−３’）（配列番号４５）、３’−ｈｕ−Ｖｋ−Ｊ５−ＳｐｅＩ−ＢｓｉＷＩ （５’−ＧＡＣＧＡＣＡＣＴＡ ＧＴＴＧＣＡＧＣＣＡ ＣＣＧＴＡＣＧＴＴＴ ＡＡＴＣＴＣＣＡＧＴ ＣＧＴＧＴＣＣ−３’）（配列番号４６））およびＶλ（５’−ｈｕＶＬ１ａ−ＳａｃＩ−２００１ （ＧＡＧ ＣＣＧ ＣＡＣ ＧＡＧ ＣＣＣ ＧＡＧ ＣＴＣ ＧＴＧ ＴＴＧ ＡＣＧ ＣＡＧ ＣＣＧ ＣＣＣ ＴＣ）（配列番号４７）、５’−ｈｕＶＬ１ｂ−ＳａｃＩ−２００１ （ＧＡＧ ＣＣＧ ＣＡＣ ＧＡＧ ＣＣＣ ＧＡＧ ＣＴＣ ＧＴＧ ＣＴＧ ＡＣＴ ＣＡＧ ＣＣＡ ＣＣＣ ＴＣ）（配列番号４８）、５’−ｈｕＶＬ２−ＳａｃＩ−２００１ （ＧＡＧ ＣＣＧ ＣＡＧ ＧＡＧ ＣＣＣ ＧＡＧ ＣＴＣ ＧＣＣ ＣＴＧ ＡＣＴ ＣＡＧ ＣＣＴ ＳＣＣ ＴＣＣ ＧＴ）（配列番号４９）、５’−ｈｕＶＬ４−ＳａｃＩ−２００１ （ＡＣＣ ＴＧＣ ＧＡＧ ＣＴＣ ＧＴＧ ＣＴＧ ＡＣＴ ＣＡＲ ＹＣＭ ＹＣＣ ＴＣＴ ＧＣ）（配列番号５０）、５’−ｈｕＶＬ５−ＳａｃＩ−２００１ （ＡＣＣ ＴＧＣ ＧＡＧ ＣＴＣ ＧＴＧ ＣＴＧ ＡＣＴ ＣＡＧ ＣＣＲ ＳＣＴ ＴＣＣ）（配列番号５１）、５’−ｈｕＶＬ６−ＳａｃＩ−２００１ （ＡＣＣ ＴＧＣ ＧＡＧ ＣＴＣ ＡＴＧ ＣＴＧ ＡＣＴ ＣＡＧ ＣＣＣ ＣＡＣ ＴＣ）（配列番号５２）、５’−ｈｕＶＬ３／９−ＳａｃＩ−２００１ （ＧＡＧ ＣＣＧ ＣＡＣ ＧＡＧ ＣＣＣ ＧＡＧ ＣＴＣ ＧＷＧ ＣＴＧ ＡＣＴ ＣＡＧ ＣＣＡ ＣＣＹ ＴＣ）（配列番号５３）、５’−ｈｕＶＬ７／８−ＳａｃＩ−２００１ （ＧＡＧ ＣＣＧ ＣＡＣ ＧＡＧ ＣＣＣ ＧＡＧ ＣＴＣ ＧＴＧ ＧＴＧ ＡＣＹ ＣＡＧ ＧＡＧ ＣＣＭ ＴＣ）（配列番号５４）、３’−ｈｕ−Ｖｌａｍ−ＢｌｎＩ−ＳｐｅＩ−２００１ （ＣＧＴ ＧＧＧ ＡＣＴ ＡＧＴ ＣＴＴ ＧＧＧ ＣＴＧ ＡＣＣ ＴＡＧ ＧＡＣ ＧＧＴ）（配列番号５５）、３’−ｈｕ−Ｖｌａｍ２−ＢｌｎＩ−ＳｐｅＩ−２００２：ＣＧＴ ＧＧＧ ＡＣＴ ＡＧＴ ＣＴＴ ＧＧＧ ＣＴＧ ＡＣＣ ＧＡＧ ＧＡＣ ＧＧＴ）（配列番号５６）プライマーセットを用いて行った。ヒトＢ細胞由来のＲＮＡをｃＤＮＡに転写し（上記の通り）、ＰＣＲ反応の鋳型ＤＮＡとして用いた。１回のＰＣＲ反応につき、１個の５’−プライマーを１個の３’−プライマーと組み合わせた。異なるＰＣＲ反応の数を、５’−および３’−プライマーの可能な組み合わせの数により決定した。増幅には次のＰＣＲプログラムを用いた。すなわち、９４℃にて１５秒間の変性、５２℃にて５０秒間のプライマーアニーリングおよび７２℃にて９０秒間のプライマー伸張を４０サイクル以上行い、それに続いて７２℃にて１０分間の最終伸張を行った。次に、軽鎖ＤＮＡ Ｖ断片を標準的なプロトコールに従って単離した。
【００９６】
４．ライブラリー構築−ヒトＶＬプールのクローニング
ファージディスプレイライブラリーは、概して、例えば「Phage Display: A Laboratory Manual」; Ed. Barbas, Burton, Scott & Silverman; Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001に開示されるような標準的な手順に基づいて構築された。ＰＣＲ増幅に選択されるプライマーは、軽鎖Ｖ断片の５’−ＳａｃＩおよび３’−ＳｐｅＩ認識部位を生じた。４回の連結反応をセットアップし、各々４００ｎｇの軽鎖断片（ＳａｃＩ−ＳｐｅＩ消化、２×κおよび２×λ）および１４００ｎｇのファージミドｐＣｏｍｂ３Ｈ５ＢＨｉｓ（ＳａｃＩ−ＳｐｅＩ消化；大きな断片；このベクターは、Ｒａｌｆ Ｌｕｔｔｅｒｂｕｅｓｅ博士の論文に記載されている）で構成された。次に、得られる４つの抗体Ｖ軽鎖プールを、エレクトロポレーション（２．５ｋＶ、０．２ｃｍギャップキュベット、２５ｍＦ、２００ Ｏｈｍ、Ｂｉｏｒａｄ ｇｅｎｅ−ｐｕｌｓｅｒ）により３００μｌのエレクトロコンピテント(electrocompetent)大腸菌（Escherichia coli）ＸＬ１ Ｂｌｕｅ株に各々形質転換して、
κ１：２×１０8
κ２：６×１０7
λ１：９×１０7
λ２：６×１０7
の独立したクローンからなるライブラリーサイズを得た。
【００９７】
様々なＰＣＲ増幅から得たκ（軽鎖）ＤＮＡ断片を、各連結について次のように秤量した。それぞれの５’−プライマーは特定のグループを定義する。これらのグループの中で、３’−プライマーはサブグループを定義する。κサブグループを、１：２：１：１（プライマー３’−ｈｕ−Ｖｋ−Ｊ１−ＳｐｅＩ−ＢｓｉＷＩ：３’−ｈｕ−Ｖｋ−Ｊ２／４−ＳｐｅＩ−ＢｓｉＷＩ：３’−ｈｕ−Ｖｋ−Ｊ３−ＳｐｅＩ−ＢｓｉＷＩ：３’−ｈｕ−Ｖｋ−Ｊ５−ＳｐｅＩ−ＢｓｉＷＩに対応）に秤量した。グループを、それらの生殖系列分布１：１：１：０．２：０．２（プライマー５’−ｈｕＶＫ１−Ｓａｃ−２００１：５’−ｈｕＶＫ３−Ｓａｃ−２００１：５’−ｈｕＶＫ２／４−Ｓａｃ−２００１：５’−ｈｕＶＫ５−Ｓａｃ−２００１：５’−ｈｕＶＫ６−Ｓａｃ−２００１に対応）に従って秤量した。
【００９８】
異なるＰＣＲ増幅から得たλ（軽鎖）ＤＮＡ断片を、各連結について次のように秤量した。それぞれの５’−プライマーは、特定のグループを定義する。これらのグループの中で、３’−プライマーはサブグループを定義する。λサブグループを、３：１（プライマー３’−ｈｕ−Ｖｌａｍ−ＢｌｎＩ−ＳｐｅＩ−２００１：３’−ｈｕ−Ｖｌａｍ２−ＢｌｎＩ−ＳｐｅＩ−２００２に対応）に秤量した。
【００９９】
グループを、それらの生殖系列分布１：１：２：２：２：３（プライマー５’−ｈｕＶＬ１ａ−ＳａｃＩ−２００１：５’−ｈｕＶＬ１ｂ−ＳａｃＩ−２００１：５’−ｈｕＶＬ２−ＳａｃＩ−２００１：５’−ｈｕＶＬ４−ＳａｃＩ−２００１＋５’−ｈｕＶＬ５−ＳａｃＩ−２００１：５’−ｈｕＶＬ６−ＳａｃＩ−２００１＋５’−ｈｕＶＬ７／８−ＳａｃＩ−２００１：５’−ｈｕＶＬ３／９−ＳａｃＩ−２００１に対応）に従って秤量した。
【０１００】
エレクトロポレーション後、それぞれの形質転換された大腸菌培養を表現型発現のためにＳＯＣ培養液（Ｆｌｕｋａ）中でインキュベートした。２つのκ培養物を組み合わせ、同様に２つのλ培養物も組み合わせた。得られるκ培養物および得られるλ培養物を、次にそれぞれ５００ｍＬの、５０μｇ／ｍｌ カルベニシリンおよび２％ ｗ／ｖ グルコースを含有するＳＢ選択培地中で一晩インキュベートした。翌日、細胞を遠心分離により回収し、市販のプラスミド調製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてプラスミドの調製を行った。
【０１０１】
５．抗体ライブラリーの構築−ヒトＶＬ−母親由来ＶＨ
ＰＣＲを行ってｍＡｂ Ａ５Ｂ７の母親由来のＶＨを前記母親由来のＶＨを含有するベクターから増幅した。増幅のために、５’−プライマー５’−ＡＶＨ−Ｘｈｏ Ｉ（５’−ＧＴＣ ＡＣＡ ＣＴＣ ＧＡＧ ＴＣＡ ＧＧＡ ＧＧＡ ＧＧＣ ＴＴＧ ＧＴＡ Ｃ−３’）（配列番号５７）および３’−プライマー３’−ＡＶＨ−ＢｓｔＥＩＩ（５’−ＧＴＣ ＡＣＡ ＧＧＴ ＧＡＣ ＣＧＴ ＧＧＴ ＣＣＣ ＴＴＧ ＧＣＣ ＣＣＡ Ｇ−３’（配列番号５８）を用いて標準的手順に従うＰＣＲプロトコールに従った。分析用アガロースゲルからの約３５０ｂｐ増幅産物の精製後、ＤＮＡ断片を制限酵素ＢｓｔＥＩＩおよびＸｈｏ Ｉで切り出した。ファージミドｐＣｏｍｂ３Ｈ５ＢＨｉｓ（このベクターはＲａｌｆ Ｌｕｔｔｅｒｂｕｅｓｅ博士の論文に記載されている。）をしかるべく消化させ、大きな断片を上述の断片と連結させた。大腸菌ＸＬ１ ｂｌｕｅへの形質転換後、単一のクローンを１００ｍＬ ＳＢ培地（５０μｇ／ｍｌ カルベニシリン含有）で培養し、プラスミドを標準的なプロトコールに従って調製した。挿入物を配列決定することにより首尾よいクローニングを確認した（Ｓｅｑｕｉｓｅｒｖｅ，Ｍｕｎｉｃｈ）。
【０１０２】
このベクターｐＣｏｍｂ３Ｈ５ＢＨｉｓ／ｍＡｂ Ａ５Ｂ７の母親由来ＶＨを制限酵素ＳａｃＩおよびＳｐｅＩで制限した。大きなベクター断片を単離した。プラスミド−ＤＮＡを含有するＶκライブラリーおよびＶλライブラリーを制限酵素ＳａｃＩおよびＳｐｅＩで制限した。小さなＶκ断片およびそれぞれのＶλ断片（各およそ３５０ｂｐ）を標準的なプロトコールに従って単離した。１２００ｎｇのベクター断片を各２００ｎｇのＶκおよびＶλ断片両方の混合と連結した。連結反応物をエレクトロポレーション（２．５ｋＶ、０．２ｃｍギャップキュベット、２５ｍＦ、２００ Ｏｈｍ）により３００μＬのエレクトロコンピテント(electrocompetent)大腸菌ＸＬ１ Ｂｌｕｅ株に形質転換して、１．２×１０8の独立したクローンからなる全ｓｃＦｖライブラリーサイズを得た。
【０１０３】
表現型発現およびカルベニシリンへの緩やかな適応の後、抗体ライブラリーをＳＢ−カルベニシリン（５０μｇ／ｍｌ）選択培地へ移した。次に、抗体ライブラリーを感染量の１×１０12粒子のヘルパーファージＶＣＳＭ１３で感染させ、その結果、繊維状のＭ１３ファージの産生および分泌が得られ、この各ファージ粒子は半ヒトｓｃＦｖ−断片をコードする一本鎖ｐＣｏｍｂ３Ｈ５ＢＨｉｓ−ＤＮＡを含み、ファージコートタンパク質ＩＩＩへの翻訳融合として対応するｓｃＦｖ−タンパク質を提示した。
【０１０４】
６．ヒトＶＬのファージディスプレイ選択
ｓｃＦｖ−レパートリーを有するファージ粒子をＰＥＧ８０００／ＮａＣｌ沈殿および遠心分離により培養上清から回収した。次に、約１×１０11〜１×１０12ｓｃＦｖファージ粒子を０．５ｍＬのＴＢＳ／１％ ＢＳＡに再懸濁し、ストレプトアビジンコートされたＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ）のウェル中で１時間固定されたビオチン化可溶性ＣＥＡとともにインキュベートした。抗原１０μg／ｍｌのＰＢＳ溶液（５０μｌ）をストレプトアビジンコートされたウェル中で４℃にて一晩インキュベートし、水で１回洗浄し、それに続いてＴＢＳ中２００μｌの３％ ＢＳＡで３７℃にて１時間ブロッキングし、それをインキュベーション後に取り除いた。
【０１０５】
標的抗原と特異的結合しなかったｓｃＦｖファージをＴＢＳ／０．０５％ Ｔｗｅｅｎでの洗浄段階により除去した。この洗浄手順は、さらなるラウンドで１０回まで繰り返された。
【０１０６】
洗浄後、ＨＣｌ−グリシン、ｐＨ ２．２を用いることにより結合体を溶出した。２Ｍ Ｔｒｉｓ、ｐＨ １２での中和後、溶出液を新鮮な非感染大腸菌ＸＬ１ Ｂｌｕｅ培養株の感染に用いた。
【０１０７】
残っている高結合体を溶出するため、５０μｌの新鮮な大腸菌ＸＬ１ ｂｌｕｅ培養株（ＯＤ６００≧０．５）をウェルに添加し、１５分間インキュベートした。次に、両方の培養物を混合し、ヒトｓｃＦｖ−断片をコードするファージミドコピーで首尾よく形質導入した細胞を再びカルベニシリン抵抗性について選択し、その後にＶＣＭＳ１３ヘルパーファージで感染させて、抗体提示およびインビトロでの選択の第２のラウンドを開始した。
【０１０８】
４ラウンドのパニングに対応するプラスミドＤＮＡを大腸菌培養物から単離した。可溶性ｓｃＦｖ−タンパク質の産生のため、ＶＨ−ＶＬ−ＤＮＡ断片をプラスミドから切り出し（Ｘｈｏ Ｉ−ＳｐｅＩ）、プラスミドｐＣｏｍｂ３Ｈ５ＢＦＩａｇ／Ｈｉｓ中の同じ制限部位を介してクローニングし、その発現構築物（例えばｓｃＦｖ）は、ｓｃＦｖとＨｉｓ６タグとの間にＦｌａｇタグ（ＴＧＤＹＫＤＤＤＤＫ）（配列番号５９）を含み、さらなるファージタンパク質が欠失している。
【０１０９】
連結後、各プール（異なるラウンドのパニング）のプラスミドＤＮＡを１００μＬ熱ショックコンピテント大腸菌ＴＧ１に形質転換し、カルベニシリンＬＢ寒天上にプレーティングした。単一のコロニーを選定し、９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ）中の１２０μＬのＬＢカルベニシリン（５０μｇ／ｍｌ）１％ グルコースに播種した。ウェルを半透膜（Ｇｒｅｉｎｅｒ）で密封し、振盪インキュベータでプレートを３７℃にて一晩インキュベートした（マスタープレート）。次に、１０μｌのマスタープレート培養物を、ウェルあたり９０μＬ ＬＢカルベニシリン（５０μｇ／ｍｌ）０．１％ グルコースを含有する第２の９６ウェルプレート（ワーキングプレート）に移した。３７℃の振盪インキュベータ中で４時間のインキュベーションの後、２０μＬ ＬＢカルベニシリン、６ｍＭ ＩＰＴＧを各ウェルに添加することによりｓｃＦｖ生成を誘導した。振盪しながら３０℃にて一晩の別のインキュベーション段階の後、細胞を、４０μＬ 溶解緩衝液（４００ｍＭ ホウ酸、３２０ｍＭ ＮａＣｌ、４ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８、２．５ｍｇ／ｍｌ リゾチーム）での室温にて１時間のインキュベーションで溶解した。残りの細胞および細胞片を１．９００×ｇで１２分間の遠心分離により分離した（Ｈｅｔｔｉｃｈ）。
【０１１０】
次に、ｓｃＦｖ分子を含有する上清を、フローサイトメトリー結合アッセイで結合について試験した。ヒトＣＥＡでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞をＣＥＡ陽性細胞株として用いた。最初に１００，０００〜２００，０００個の細胞をヒトｓｃＦｖまたは関連する対照を含有する周辺質（periplasmic）調製物とともにインキュベートすることにより細胞結合アッセイを行った。インキュベーション後、細胞をＰＢＳ／１％ ＦＣＳ（ウシ胎児血清）中で洗浄し、さらに５〜１０μｇ／ｍｌの抗ＦＬＡＧ Ｍ２抗体（Ｓｉｇｍａ）とともにインキュベートした。細胞を再び洗浄した後、それらをポリクローナル、ＰＥ標識抗マウス抗体（Ｄｉａｎｏｖａ）とともにインキュベートし、その後フローサイトメトリーにより分析した。およそ６００個のクローンをＣＥＡ陽性のＣＨＯ細胞で結合シグナルについて試験した。２７個の陽性クローンが得られた。それぞれのｓｃＦｖ ＤＮＡを配列決定した後、合計９個の異なる配列が得られた。
【０１１１】
図２は、フローサイトメトリー分析により測定される、９個の様々な半ヒトｓｃＦｖ（すなわち、マウスＡ５Ｂ７ ＶＨ−ヒトＶＬ）構築物とＣＥＡ−形質転換ＣＨＯ細胞株の結合を示す。前記図は複数の図表を含み、１つが試験された各構築物を表す。任意の所与図表中、黒色の分布は、いずれの構築物も不在下であるが、ｓｃＦｖの検出に用いられるあらゆる適切な検出剤を含むＰＢＳ単独でインキュベートした細胞の蛍光強度を示す。このようにして、観察されるいずれの蛍光シフトも間違いなく検出剤または緩衝液よりもｓｃＦｖ構築物に起因し得る。構築物とそれぞれの細胞株との結合の指標である蛍光のシフトは、各図表中灰色の線で示される。一般に、（黒色の）対照から離れてより高い強度のシフト、すなわち対照よりもはるかに遠いシフトはより強い結合を示し、一方、（黒色の）対照から離れてより低い強度のシフト、すなわち対照により近いシフトはより弱い結合を示す。
【０１１２】
図２から、構築物Ａ−１２１、Ａ−１８３、Ａ−２４０、Ａ−３１３、Ａ−２９０、Ａ−３１５、Ａ４−３５、Ａ４−５２、ＭＰ２−Ａ５は、それぞれの対照と比較して、蛍光強度において明らかに識別できるシフトを示し、ｓｃＦｖとＣＨＯ標的細胞上の膜結合ＣＥＡとの結合を示すことが分かる。以下で、ｓｃＦｖ Ａ−２４０のヒトＶＬ領域を選択し、ヒトＶＨ領域の単離に用いた。前記ヒトＡ−２４０ ＶＬ領域は、例えば配列番号２に包含される。
【０１１３】
実施例４：可溶性ＣＥＡ抗原に対して抵抗性のあるヒト化ＶＨ領域の抗体ライブラリーの構築およびファージディスプレイ選択
以下の実験の目的は、実施例３に記載されるように選択される、ｓｃＦｖ Ａ−２４０のヒトＶＬ領域と対となる可溶性ＣＥＡ抗原に対して抵抗性のある一連のヒト化ＶＨ領域の選択である。前記ヒトＡ−２４０ ＶＬ領域は、例えば配列番号２に包含される。
【０１１４】
１．末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からのＲＮＡの単離
１００ｍＬの血液を５名の健康なヒトドナーから採取した。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、標準的な方法に従ってフィコール勾配により単離した。全ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ（登録商標）Ｍｉｄｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を製造業者の説明書に従って用いてＰＢＭＣから単離した。ｃＤＮＡを標準的な方法に従って合成した（Sambrook, Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989, 2001）。
【０１１５】
２．可変重鎖領域（ＶＨ領域）のＰＣＲ増幅
ＶＨライブラリーを構築し、Ｌｉｂ １３４−ＶＨと名付けた。このＶＨ−ライブラリーは、その後にヒトＦＲ４生殖系列配列が続く母親由来の抗体のＶＨＣＤＲ３と作動可能なように連結された、ＰＣＲ増幅された上記のＰＢＭＣプールのＶＨ領域由来のＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３のヒトレパートリーで構成される。
【０１１６】
ヒト鋳型ＶＨ領域の単離のため、５’−ＶＨ特異的プライマーセット（５’−ｈｕＶＨ１，３，５−Ｘｈｏ Ｉ−２００１（５’−ＡＧＧ ＴＧＣ ＡＧＣ ＴＧＣ ＴＣＧ ＡＧＴ ＣＴＧ Ｇ−３’）（配列番号６０）、５’−ｈｕＶＨ４−Ｘｈｏ Ｉ−２００１（５’−ＣＡＧ ＧＴＧ ＣＡＧ ＣＴＧ ＣＴＣ ＧＡＧ ＴＣＧ ＧＧ−３’）（配列番号６１）、５’−ｈｕＶＨ４Ｂ−Ｘｈｏ Ｉ−２００１（５’−ＣＡＧ ＧＴＧ ＣＡＧ ＣＴＡ ＣＴＣ ＧＡＧ ＴＧＧ ＧＧ−３’）（配列番号６２））および２つの３’−ＶＨ特異的プライマーセット（３’−ｈｕ−ＶＨ−ＢｓｔＥＩＩ−２００１（５’−ＣＴＧ ＡＧＧ ＡＧＡ ＣＧＧ ＴＧＡ ＣＣ−３’）（配列番号６３）、３’−ｈｕ−ＶＨ−Ｊ３−ＢｓｔＥＩＩ−２００１（５’−ＣＴＧ ＡＡＧ ＡＧＡ ＣＧＧ ＴＧＡ ＣＣ−３’）（配列番号６４））を用いてＲＴ−ＰＣＲを行った。１回のＰＣＲ反応につき、１個の５’−プライマーを１個の３’−プライマーと組み合わせた；異なるＰＣＲ反応の数は、５’−および３’−プライマーの可能な組み合わせの数により決定した。５つのドナーのＰＢＭＣ ｃＤＮＡを、ＶＨ遺伝子の供給源として用いた。次のＰＣＲプログラム：９４℃にて１５秒間の変性、５２℃にて５０秒間のプライマーアニーリングおよび７２℃にて６０秒間のプライマー伸張を４０サイクル以上行い、それに続いて７２℃にて１０分間の最終伸張、を増幅に用いた。約３５０ｂｐのサイズの増幅産物を標準的な方法に従って単離した。
【０１１７】
Ｌｉｂ １３４−ＶＨ領域の単離のため、ＲＴ−ＰＣＲを二段階で行った。最初に、ヒト重鎖ＶＨ−セグメント（ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３）を、上記と同じ５’−ＶＨ特異的プライマーセット（５’−ｈｕＶＨ１，３，５−Ｘｈｏ Ｉ−２００１、５’−ｈｕＶＨ４−Ｘｈｏ Ｉ−２００１、５’−ｈｕＶＨ４Ｂ−Ｘｈｏ Ｉ−２００１；配列番号６０〜６２）および３’−特異的プライマーセット（３’−Ａ１３４−ＶＨ１Ａ（５’−ＧＴＡ ＧＴＣ ＡＡＡ ＧＴＡ ＧＡＡ ＣＣＧ ＴＡＧ ＣＣＣ ＣＣＴ ＡＴＣ ＴＣＴ ＹＧＣ ＡＣＡ ＧＴＡ ＡＴＡ ＣＡＣ ＧＧＣ−３’）（配列番号６５）、３’−Ａ１３４−ＶＨ１Ｂ（５’−ＧＴＡ ＧＴＣ ＡＡＡ ＧＴＡ ＧＡＡ ＣＣＧ ＴＡＧ ＣＣＣ ＣＣＴ ＡＴＣ ＴＣＴ ＹＧＣ ＡＣＡ ＧＴＡ ＡＴＡ ＣＡＹ ＲＧＣ−３’）（配列番号６６）、３’−Ａ１３４−ＶＨ３Ａ（５’−ＧＴＡ ＧＴＣ ＡＡＡ ＧＴＡ ＧＡＡ ＣＣＧ ＴＡＧ ＣＣＣ ＣＣＴ ＡＴＣ ＴＣＴ ＮＧＹ ＡＣＡ ＧＴＡ ＡＴＡ ＣＡＣ ＲＧＣ−３’）（配列番号６７）、３’−Ａ１３４−ＶＨ３Ｂ（５’−ＧＴＡ ＧＴＣ ＡＡＡ ＧＴＡ ＧＡＡ ＣＣＧ ＴＡＧ ＣＣＣ ＣＣＴ ＡＴＣ ＴＣＴ ＮＧＣ ＡＣＡ ＧＴＡ ＡＴＡ ＣＡＡ ＲＧＣ−３’）（配列番号６８）、３’−Ａ１３４−ＶＨ４（５’−ＧＴＡ ＧＴＣ ＡＡＡ ＧＴＡ ＧＡＡ ＣＣＧ ＴＡＧ ＣＣＣ ＣＣＴ ＡＴＣ ＴＣＴ ＳＧＣ ＡＣＡ ＧＴＡ ＡＴＡ ＣＡＣ ＲＧＣ−３’）（配列番号６９））を、ＦＲ３の非常に末端の領域で一致するヒトＶＨサブファミリー１、３および４に対して用いて、単離された鋳型ＶＨ断片からＰＣＲ増幅した。
【０１１８】
次のプライマーの組み合わせを用いた。
ａ）５’−ｈｕＶＨ１，３，５−Ｘｈｏ Ｉ−２００１ × ３’−Ａ１３４−ＶＨ１Ａ
ｂ）５’−ｈｕＶＨ１，３，５−Ｘｈｏ Ｉ−２００１ × ３’−Ａ１３４−ＶＨ１Ｂ
ｃ）５’−ｈｕＶＨ１，３，５−Ｘｈｏ Ｉ−２００１ × ３’−Ａ１３４−ＶＨ３Ａ
ｄ）５’−ｈｕＶＨ１，３，５−Ｘｈｏ Ｉ−２００１ × ３’−Ａ１３４−ＶＨ３Ｂ
ｅ）５’−ｈｕＶＨ４−Ｘｈｏ Ｉ−２００１ × ３’−Ａ１３４−ＶＨ４
ｆ）５’−ｈｕＶＨ４Ｂ−Ｘｈｏ Ｉ−２００１ × ３’−Ａ１３４−ＶＨ４
【０１１９】
１回のＰＣＲ反応につき、１個の５’−プライマーを１個の３’−プライマーと組み合わせた；異なるＰＣＲ反応の数は、５’−および３’−プライマーの可能な組み合わせの数により決定した。次のＰＣＲプログラム：９４℃にて１５秒間の変性、５２℃にて５０秒間のプライマーアニーリングおよび７２℃にて９０秒間のプライマー伸張を４０サイクル以上行い、それに続いて７２℃にて１０分間の最終伸張、を増幅に用いた。このＰＣＲ段階およびそれぞれの３’−プライマー配列によって、ヒトＶＨセグメントが母親由来のＶＨ ＣＤＲ３の一部分について延長された。それは言い換えると次の２番目の段階のＰＣＲ３’−プライマーのプライミングサイトである。
【０１２０】
これらのＶＨ−（ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３）ＤＮＡ断片を、次に、それぞれの５’ＶＨ特異的プライマーと、増幅されたＤＮＡ断片の普遍的な３’−末端に一致する普遍的な３’プライマー（３’Ａ１３４−ＪＨ６−ＢｓｔＥＩＩ、５’−ＣＧＡ ＧＡＣ ＧＧＴ ＧＡＣ ＣＧＴ ＧＧＴ ＣＣＣ ＴＴＧ ＧＣＣ ＣＣＡ ＧＴＡ ＧＴＣ ＡＡＡ ＧＴＡ ＧＡＡ ＣＣＧ ＴＡＧ ＣＣ−３’）（配列番号７０）を再び用いる２番目のＰＣＲ反応の鋳型として用いた。
【０１２１】
次のＰＣＲプログラム：
９４℃にて１５秒間の変性、５２℃にて５０秒間のプライマーアニーリングおよび７２℃にて６０秒間のプライマー伸張を４０サイクル以上行い、それに続いて７２℃にて１０分間の最終伸張、を増幅に用いた。ＤＮＡ Ｖ断片を標準的なプロトコールに従って単離した。
【０１２２】
３．ライブラリー構築−ヒトＶＨプールのクローニング
前述の方法の第２ラウンドでは、１回目の前の選択（実施例３参照）で同定されたｓｃＦｖ Ａ−２４０のヒトＶＬを選択し、それに続いてヒトｓｃＦｖを作製する目的でヒトＶＨ断片のライブラリーと組み合わせた。ファージディスプレイライブラリーは、概して、例えば「Phage Display: A Laboratory Manual」;Ed. Barbas, Burton, Scott & Silverman; Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001に開示されるような標準的な手順に基づいて構築された。
【０１２３】
異なるＰＣＲ増幅からの重鎖ＤＮＡ断片を各連結について次のように秤量した。
ａ：ｂ：ｃ：ｄ：ｅ：ｆ＝３：１：３：１：１：１、ここでａ〜ｆは次の意味：
ａ）初期プライマー組み合わせ ５’−ｈｕＶＨ１，３，５−Ｘｈｏ Ｉ−２００１ × ３’−Ａ１３４−ＶＨ１Ａに由来
ｂ）初期プライマー組み合わせ ５’−ｈｕＶＨ１，３，５−Ｘｈｏ Ｉ−２００１ × ３’−Ａ１３４−ＶＨ１Ｂに由来
ｃ）初期プライマー組み合わせ ５’−ｈｕＶＨ１，３，５−Ｘｈｏ Ｉ−２００１ × ３’−Ａ１３４−ＶＨ３Ａに由来
ｄ）初期プライマー組み合わせ ５’−ｈｕＶＨ１，３，５−Ｘｈｏ Ｉ−２００１ × ３’−Ａ１３４−ＶＨ３Ｂに由来
ｅ）初期プライマー組み合わせ ５’−ｈｕＶＨ４−Ｘｈｏ Ｉ−２００１ × ３’−Ａ１３４−ＶＨ４に由来
ｆ）初期プライマー組み合わせ ５’−ｈｕＶＨ４Ｂ−Ｘｈｏ Ｉ−２００１ × ３’−Ａ１３４−ＶＨ４に由来
を有する。
【０１２４】
４００ｎｇのヒトＬｉｂ １３４−ＶＨ断片プール（Ｘｈｏ Ｉ-ＢｓｔＥＩＩ消化）および１２００ｎｇのプラスミドｐＣｏｍｂ３Ｈ５ＢＨｉｓ／Ａ−２４０ ＶＬ（ｓｃＦｖ Ａ−２４０のＶＬ領域をコードするＤＮＡを、制限部位ＳａｃＩおよびＳｐｅＩを介して標準手順に従ってｐＣｏｍｂ３Ｈ５ＢＨｉｓにクローニングした）で構成される、１回の連結反応を設定した。得られる抗体ヒトＶＨプールを、次に、３００μＬのエレクトロコンピテント大腸菌ＸＬ１ Ｂｌｕｅ株にエレクトロポレーション（２．５ｋＶ、０．２ｃｍギャップキュベット、２５ｍＦ、２００ Ｏｈｍ、Ｂｉｏｒａｄ ｇｅｎｅ−ｐｕｌｓｅｒ）により形質転換し、合計で０．８×１０8の独立したクローンからなるライブラリーサイズを得た。
【０１２５】
エレクトロポレーション後、アッセイをＳＯＣ培養液（Ｆｌｕｋａ）中で表現型発現のためにインキュベートした。次に培養物を、５０μｇ／ｍｌ カルベニシリンおよび２％ ｖ／ｖ グルコースを含有する５００ｍＬのＳＢ選択培地中で一晩それぞれインキュベートした。翌日、培養物の細胞を遠心分離により回収し、市販のプラスミド調製キット（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてプラスミド調製を行ってＤＮＡライブラリーを保存した。
【０１２６】
それぞれのｓｃＦｖプールをコードする、１．５μｇのこのプラスミドプールを、次に、大腸菌ＸＬ１ ｂｌｕｅ（２．５ｋＶ、０．２ｃｍギャップキュベット、２５ｍＦ、２００ Ｏｈｍ、Ｂｉｏｒａｄ ｇｅｎｅ−ｐｕｌｓｅｒ）に電気穿孔して合計で２．４×１０9の独立したクローンからなるライブラリーサイズを得た。表現型発現およびカルベニシリンへの緩やかな適応の後、抗体ライブラリーをＳＢ−カルベニシリン（５０μｇ／ｍｌ）選択培地へ移した。次に、抗体ライブラリーを感染量の１×１０12粒子のヘルパーファージＶＣＳＭ１３で感染させ、その結果、繊維状のＭ１３ファージの産生および分泌が得られ、この各ファージ粒子はヒトｓｃＦｖ−断片をコードする一本鎖ｐＣｏｍｂ３Ｈ５ＢＨｉｓ−ＤＮＡを含み、ファージコートタンパク質ＩＩＩへの翻訳融合として対応するｓｃＦｖ−タンパク質を提示した。
【０１２７】
４．ヒトＶＨのファージディスプレイ選択
ヒトｓｃＦｖ−レパートリーを有するファージ粒子をＰＥＧ８０００／ＮａＣｌ沈殿および遠心分離により培養上清から回収した。次に、約１×１０11〜１×１０12ｓｃＦｖファージ粒子を０．５ｍＬのＴＢＳ／１％ ＢＳＡに再懸濁し、ストレプトアビジンコートされたＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ）のウェル中で１時間固定されたビオチン化可溶性ＣＥＡとともにインキュベートした。抗原１０μg／ｍｌのＰＢＳ溶液（５０μｌ）をストレプトアビジンコートされたウェル中で４℃にて一晩インキュベートし、水で１回洗浄し、それに続いてＴＢＳ中２００μｌの３％ ＢＳＡで３７℃にて１時間ブロッキングし、それをインキュベーション後に取り除いた。
【０１２８】
標的抗原と特異的結合しなかったｓｃＦｖファージをＴＢＳ／０．０５％ Ｔｗｅｅｎでの洗浄段階により除去した。この洗浄手順は、さらなるラウンドで１０回まで繰り返された。
【０１２９】
洗浄後、ＨＣｌ−グリシン、ｐＨ ２．２を用いることにより結合体を溶出した。２Ｍ Ｔｒｉｓ、ｐＨ １２での中和後、溶出液を新鮮な非感染大腸菌ＸＬ１ Ｂｌｕｅ培養株の感染に用いた。
【０１３０】
残っている高結合体を溶出するため、５０μｌの新鮮な大腸菌ＸＬ１ ｂｌｕｅ培養株（ＯＤ６００≧０．５）をウェルに添加し、１５分間インキュベートした。次に、両方の培養物を混合し、ヒトｓｃＦｖ−断片をコードするファージミドコピーで首尾よく形質導入した細胞を再びカルベニシリン抵抗性について選択し、その後にＶＣＭＳ１３ヘルパーファージで感染させて、抗体提示およびインビトロでの選択の第２のラウンドを開始した。
【０１３１】
４ラウンドのパニングに対応するプラスミドＤＮＡを大腸菌培養物から単離した。可溶性ｓｃＦｖ−タンパク質の産生のため、ＶＨ−ＶＬ−ＤＮＡ断片をプラスミドから切り出し（Ｘｈｏ Ｉ−ＳｐｅＩ）、プラスミドｐＣｏｍｂ３Ｈ５ＢＦｌａｇ／Ｈｉｓ中の同じ制限部位を介してクローニングし、その発現構築物（例えばｓｃＦｖ）は、ｓｃＦｖとＨｉｓ６タグとの間にＦｌａｇタグ（ＴＧＤＹＫＤＤＤＤＫ）（配列番号５９）を含み、さらなるファージタンパク質が欠失している。
【０１３２】
連結後、各プール（異なるラウンドのパニング）のプラスミドＤＮＡを１００μＬ熱ショックコンピテント大腸菌ＴＧ１に形質転換し、カルベニシリンＬＢ寒天上にプレーティングした。単一のコロニーを選定し、９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ）中の１２０μＬのＬＢカルベニシリン（５０μｇ／ｍｌ）１％ グルコースに播種した。ウェルに半透膜（Ｇｒｅｉｎｅｒ）で密封し、振盪インキュベータでプレートを３７℃にて一晩インキュベートした（マスタープレート）。次に、１０μｌのマスタープレート培養物を、ウェルあたり９０μＬ ＬＢカルベニシリン（５０μｇ／ｍｌ）０．１％ グルコースを含有する第２の９６ウェルプレート（ワーキングプレート）に移した。３７℃の振盪インキュベータ中で４時間のインキュベーションの後、２０μＬ ＬＢカルベニシリン、６ｍＭ ＩＰＴＧを各ウェルに添加することによりｓｃＦｖ生成を誘導した。振盪しながら３０℃にて一晩の別のインキュベーション段階の後、細胞を、４０μＬ 溶解緩衝液（４００ｍＭ ホウ酸、３２０ｍＭ ＮａＣｌ、４ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８、２．５ｍｇ／ｍｌ リゾチーム）での室温にて１時間のインキュベーションで溶解した。残りの細胞および細胞片は１，９００×ｇで１２分間の遠心分離により分離した（Ｈｅｔｔｉｃｈ）。
【０１３３】
次に、ｓｃＦｖ分子を含有する上清を、フローサイトメトリー結合アッセイで結合について試験した。
【０１３４】
ヒトＣＥＡをトランスフェクトしたＣＨＯ細胞をＣＥＡ陽性細胞株として用いた。最初に１００，０００〜２００，０００個の細胞をヒトｓｃＦｖまたは関連する対照を含有する周辺質調製物とともにインキュベートすることにより細胞結合アッセイを行った。インキュベーション後、細胞をＰＢＳ／１％ ＦＣＳ（ウシ胎児血清）中で洗浄し、さらに５〜１０μｇ／ｍｌの抗ＦＬＡＧ Ｍ２抗体とともにインキュベートした。細胞を再び洗浄した後、それらをポリクローナル、ＰＥ標識抗マウス抗体（Ｄｉａｎｏｖａ）とともにインキュベートし、その後フローサイトメトリーにより分析した。４６個のクローンをＣＥＡ陽性のＣＨＯ細胞で結合シグナルについて試験した。それらの全てが陽性のシグナルを示した。それぞれのｓｃＦｖ ＤＮＡを配列決定した後、合計９個の異なる配列が得られ、そのうちの８個が高度の相同性を示した。ヒト化構築物ＭＰ５１０＿３Ａ−５．３（ＭＰ５１０−Ａ５；配列番号２）、ＭＰ５１０＿３−Ｂ９．１（ＭＰ５１１−Ｂ９；配列番号４）、ＭＰ５１０＿３−Ｄ８．１（ＭＰ５１１−Ｄ８；配列番号６）が、さらなる特性決定のために選択された。これらの構築物中のヒト化ＶＨ領域は、マウスモノクローナル抗体Ａ５Ｂ７のＣＤＲ−Ｈ３のKabatの位置９５〜１０２に相当するアミノ酸配列「ＤＲＧＬＲＦＹＦＤＹ」（配列番号２７）を含有する。ｓｃＦｖの対応するアミノ酸配列を表１に示す。
【０１３５】
前記ヒト化構築物ＭＰ５１０−Ａ５、ＭＰ５１１−Ｂ９、ＭＰ５１１−Ｄ８ならびに半ヒト構築物Ａ−２４０ Ｖλ．３（マウスＶＨ Ａ５Ｂ７／ヒトＶＬＡ２４０）の周辺質抽出物を、ＣＥＡ陽性および陰性の細胞株でのフローサイトメトリー実験でさらに分析した。図３から、ヒト化構築物ＭＰ５１０−Ａ５（配列番号２）、ＭＰ５１１−Ｂ９（配列番号４）、ＭＰ５１１−Ｄ８（配列番号６）は、それぞれの半ヒト対照Ａ−２４０ Ｖλ．３（マウスＶＨ Ａ５Ｂ７/ヒトＶＬＡ２４０）と比較して、明らかに識別できるシフトを蛍光強度において示すことが分かる。従って、ヒトｓｃＦｖ構築物は、膜結合ヒトＣＥＡに対して半ヒト構築物Ａ−２４０ Ｖλ．３よりも強い結合活性を示す。さらに、全てのヒト構築物は、ＣＥＡ陽性のヒトＫＡＴＯ ＩＩＩ細胞（ヒト胃癌細胞株）との明確な結合を示したのに対し、それらのどれもがＣＥＡ陰性の非トランスフェクトＣＨＯ細胞ならびにＣＥＡ陰性のヒトＮＡＬＭ６細胞（ヒトＢ細胞株）との結合を示さなかった（データは示さず）。
【０１３６】
実施例５：可溶性ＣＥＡ抗原に対する抵抗性を有するヒト化ＩｇＧ１抗体の作製および特性決定
細菌は機能的なＦａｂ断片を発現することが知られているが、それらは通常、完全な機能的免疫グロブリンを産生することはできない。完全な機能的ＩｇＧ１抗体の産生のためには、哺乳類細胞を使用する必要があり、そのために実施例４で選択したｓｃＦｖ Ａ−２４０のＶＬ領域およびｓｃＦｖ分子の様々なＶＨ領域（特にｓｃＦｖ Ａ５、ｓｃＦｖ Ｄ８およびｓｃＦｖ Ｂ９のＶＨ領域）が哺乳類発現ベクターにサブクローニングされた。
【０１３７】
１．ｓｃＦｖ Ａ−２４０に基づくヒト軽鎖のクローニング
クローンＡ−２４０のヒトＶＬは、Ｂｓｕ３６Ｉ制限部位をその核酸配列に含有した。従って、標準的なプロトコールを用いて、アミノ酸交換をもたらさないヌクレオチド交換を制限モチーフ中に有する変異体が生成された（Ａ−２４０ｄｅｌＢｓｕ）。
【０１３８】
ＶＬ Ａ−２４０の適した哺乳類発現ベクターへのクローニングのため、適した末端制限部位を挿入する必要があった。従って、ｓｃＦｖ Ａ２４０のＶＬ領域をコードするＤＮＡ断片を、プライマー、５’−Ａ２４０−Ｂｓｕ３６Ｉ （ＴＴＣＴＣＴＣＣＴＴＡＧＧＴＧＴＣＣＡＣＴＣＣ ＣＡＧ ＧＣＣ ＧＴＧ ＣＴＧ ＡＣＴ ＣＡＧ ＣＣＧ ＧＣ）（配列番号９３）および３’−Ａ２４０−オーバーラップ（ＧＣＣＴＴＧＧＧＣＴＧＡＣＣＴＡＧＧＡＣＧＧＴＣＡＡＣＴＴＧＧＴＣＣ）（配列番号９４）を用いるＰＣＲにより再び増幅した。
【０１３９】
２回目のＰＣＲでは、ヒトλ定常領域を、標準的な方法に従って５’−プライマー５’−Ｃｌａｍ−オーバーラップ（ＧＴＴＧＡＣＣＧＴＣＣＴＡＧＧＴＣＡＧＣＣＣＡＡＧＧＣＴＧＣＣＣＣＣＴＣＧ）（配列番号９５）および３’−プライマー３’−Ｃｌａｍ−Ｎｏｔｌ（ＧＡＣＧＴＡ ＧＣＧＧＣＣＧＣ ＧＴＣＧＡＣ ＣＴＡＴＧＡＡＣＡＴＴＣＴＧＴＡＧＧＧＧＣ）（配列番号９６）を用いてヒトｃＤＮＡプールから増幅した。両方のＰＣＲの約３３０ｂｐのＤＮＡ産物は同一の３’（Ａ−２４０）または５’（Ｃλ）オーバーラップを配列中に有した。
【０１４０】
２つの断片を、５’−プライマー５’−Ａ２４０−Ｂｓｕ３６Ｉおよび３’−プライマー３’−Ｃｌａｍ−Ｎｏｔｌと組み合わせて融合ＰＣＲに（標準的なプロトコールに従って）用いて、ヒトλ定常領域と融合したヒトＶＬ Ａ−２４０をコードする全長軽鎖産物を生成した（配列番号８０に示されるアミノ酸配列に対応）。このＤＮＡ断片は、５’末端にＢｓｕ３６Ｉ部位を含有し、かつ３’−末端にＳａｌＩ制限部位とそれに続いてＮｏｔＩ制限部位を含有した。
【０１４１】
次に、この断片を、Ｂｓｕ３６ＩおよびＮｏｔ Ｉにより、従ってヒトリーダー配列を加えることによりｐＢＳ由来のプラスミド（上記）にサブクローニングした。この構築物を配列決定により検証した。ＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩを利用して、Ａ−２４０ ＶＬ−ＣλＤＮＡを前記構築物から切り出し、マウスジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）をコードするｃＤＮＡをマウスアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）をコードするｃＤＮＡと置換することにより発現ベクターｐＥＦ−ＤＨＦＲに由来する真核生物発現ベクターｐＥＦ−ＡＤＡにサブクローニングした（Mack et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92, 7021-5）。ｐＥＦ−ＡＤＡはRaum（上記引用文中）に記載されている。Ａ−２４０ ＶＬ−Ｃλのアミノ酸配列（Ａ２４０軽鎖に対応）は配列番号８０に示される。
【０１４２】
２．ヒト化重鎖可変ドメインのクローニング
実施例４で選択された様々なヒト化ＶＨ領域（特にｓｃＦｖ Ａ５、ｓｃＦｖ Ｄ８およびｓｃＦｖ Ｂ９のＶＨ領域）から、可変領域をＰＣＲにより再増幅し、両末端にＢｓｕ３６Ｉ制限部位を生成した。全ての構築物について、２つのプライマーの組み合わせ：５’−プライマー５’−ＣＶＨ−Ｂｓｕ３６Ｉ （５’−ＴＴＣＴＣＴＣＣＴＴＡＧＧＴＧＴＣＣＡＣＴＣＣ ＧＡＧ ＧＴＧ ＣＡＧ ＣＴＧ ＧＴＣ ＧＡＧ ＴＣ−３’）（配列番号９７）および３’−プライマー３’−ＣＶＨ−Ｂｓｕ３６Ｉ （５’−ＧＡＣＴＣＡＣＣＴＧＡＧＧＡ ＧＡＣ ＧＧＴ ＧＡＣ ＣＧＴ ＧＧＴ ＣＣＣ ＴＴＧ Ｇ−３’）（配列番号９８）を用いた。次に、得られるＤＮＡ断片を、これらの制限部位を用いて、既に真核生物のリーダー配列とヒトＩｇＧ１重鎖定常領域をコードするＤＮＡ断片を含有する真核生物発現ベクターｐＥＦ−ＤＨＦＲにサブクローニングした。従って重鎖可変領域はリーダーと重鎖定常領域の間に挿入した。可変領域の正しい配列は配列決定により確認した。Ａ５重鎖のアミノ酸配列は配列番号７７に示され、Ｂ９重鎖のアミノ酸配列は配列番号７８に示され、Ｄ８重鎖のアミノ酸配列は配列番号７９に示される。
【０１４３】
３．ヒト化完全ＩｇＧタンパク質の発現
１本の軽鎖をコードするプラスミドおよび１本の重鎖をコードするプラスミド（ＶＨ／ヒトＩｇＧ１定常領域）を、一過性のタンパク質発現のための標準的なプロトコールに従ってＨＥＫ細胞に同時導入し、細胞を培養して免疫グロブリンの培地中への発現および産生を可能とした。このように、ｓｃＦｖ Ａ５に由来するＩｇＧ１ Ａ５、ｓｃＦｖ Ｄ８に由来するＩｇＧ１ Ｄ８およびｓｃＦｖ Ｂ９に由来するＩｇＧ１ Ｂ９を産生させた。それぞれの製造期間の後、上清を回収し、免疫グロブリンの精製のための標準的なプロトコールに従ってプロテインＡクロマトグラフィーによってヒト免疫グロブリンを単離した。次に、培養上清、ならびに精製された免疫グロブリンをさらなる特性決定実験に用いた。
【０１４４】
Ａ５重鎖のアミノ酸配列は配列番号７７に示され、Ｂ９重鎖のアミノ酸配列は配列番号７８に示され、Ｄ８重鎖のアミノ酸配列は配列番号７９に示される。Ａ２４０軽鎖のアミノ酸配列は、配列番号８０に示される。
【０１４５】
ｓｃＦｖ Ａ５に由来するＩｇＧ１ Ａ５は、配列番号７７に示されるＡ５重鎖と配列番号８０に示されるＡ２４０軽鎖のアミノ酸配列を含む。ｓｃＦｖ Ｂ９に由来するＩｇＧ１ Ｂ９は、配列番号７８に示されるＢ９重鎖のアミノ酸配列と配列番号８０に示されるＡ２４０軽鎖のアミノ酸配列を含む。ｓｃＦｖ Ｄ８に由来するＩｇＧ１ Ｄ８は、配列番号７９に示されるＤ８重鎖のアミノ酸配列と配列番号８０に示されるＡ２４０軽鎖のアミノ酸配列を含む。これらのＩｇＧ１抗体構築物中の（ヒト化）ＶＨ領域は、マウスモノクローナル抗体Ａ５Ｂ７のＣＤＲ−Ｈ３のKabatの位置９５〜１０２に相当するアミノ酸配列「ＤＲＧＬＲＦＹＦＤＹ」（配列番号２７）を含有する。上述の重鎖および軽鎖の対応するアミノ酸配列を表１に示す。
【０１４６】
４．可溶性ＣＥＡ抗原に対する抵抗性を有するヒト化ＩｇＧ１抗体の特性決定
４．１ 固定化された可溶性ＣＥＡ（ｓＣＥＡ）抗原との結合
重鎖＋軽鎖の二重形質転換体の培養上清ならびに対応する精製抗体の調製物を、固定化されたｓＣＥＡ抗原上での結合についてＥＬＩＳＡにより標準的な手順に従って試験した。無関係なヒトＩｇＧ１抗体を陰性対照として含んだ。
【０１４７】
手短に言えば、抗体結合を固定化ＣＥＡ抗原上で試験し、ＣＥＡ特異性を実証するために、それぞれ１０ｕｇ／ｍｌおよび１ｕｇ／ｍｌの培養上清および精製抗体溶液を用いて、コートされたＣＥＡ抗原の不在下でも試験した。これらの抗体溶液を、＋／−抗原コートウェル（４℃、一晩）およびＢＳＡブロックしたウェル（３７℃、１時間）に添加した。検出は、ペルオキシダーゼ標識ポリクローナルヒトＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）により行った。ＡＢＴＳ溶液での適切なインキュベーション後にシグナルを測定した。
【０１４８】
図４に示されるように、ヒト化抗体ＩｇＧ１ Ａ５、ＩｇＧ１ Ｄ８およびＩｇＧ１ Ｂ９ならびに実施例２のｈｕＩｇＧ１ ＣＥＡ ＩおよびＣＥＡ ＩＩ構築物は、陰性対照と比較して固定化された可溶性ＣＥＡ（ｓＣＥＡ）抗原との明確な結合を示し、ｓＣＥＡ抗原がコートされない点で異なる同等の設定では結合を示さなかった。
【０１４９】
４．２ 天然ＣＥＡ抗原との細胞上での結合
ヒト化ＩｇＧ１ Ａ５、ＩｇＧ１ Ｄ８およびＩｇＧ１ Ｂ９構築物の精製抗体調製物ならびに実施例２のｈｕＩｇＧ１−ＣＥＡ Ｉおよび−ＣＥＡ ＩＩ構築物を、ＣＥＡを発現しているＫａｔｏ ＩＩＩ細胞、ＣＥＡトランスフェクトＣＨＯ細胞およびＣＥＡ非トランスフェクトＣＨＯ細胞でＦＡＣＳ分析により試験した。
【０１５０】
２×１０5細胞を、精製抗体調製物とともにインキュベートした（通常１０〜２０μｇ／ｍｌ）。検出は、ビオチン化ポリクローナル抗ヒトＩｇＧ抗体（ＤＡＫＯ）、それに続いてＰＥ標識ストレプトアビジン（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）（通常１０〜２０μｇ／ｍｌ）により行った。インキュベーションは氷上で２０〜４０分間行った。
【０１５１】
ヒト化ＩｇＧ１ Ａ５、ＩｇＧ１ Ｄ８およびＩｇＧ１ Ｂ９構築物ならびに実施例２のｈｕＩｇＧ−ＣＥＡ Ｉおよび−ＣＥＡ ＩＩ構築物はＣＥＡ陽性細胞に対して明確な結合を示した（図５Ａ、ＢおよびＣ）。いずれの抗体も非トランスフェクトＣＨＯ細胞との結合を示さなかった。ＩｇＧ−対照はＫａｔｏ細胞、ＣＨＯ／ＣＥＡ−細胞および非トランスフェクトＣＨＯ細胞上で陰性であった。
【０１５２】
４．３ 抗体依存性の細胞に媒介される細胞障害活性（ＡＤＣＣ；51Ｃｒ放出アッセイ）
51Ｃｒ放出アッセイのため、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をエフェクター細胞として健康なドナーから単離した。フィコール密度勾配遠心分離とその後の１００×ｇ遠心分離段階よりＰＢＭＣを分離した。刺激されていないＰＢＭＣ（５×１０5細胞）を、平底マイクロタイタープレートの各ウェルに１００μｌの容積の１０％ ＦＣＳを含むＲＰＭＩ １６４０培地に添加し、３７℃にて一晩インキュベートした。標的細胞として、ＣＥＡ陽性の胃癌細胞株ＫＡＴＯ ＩＩＩを用いた。標的細胞（５０，０００細胞）を２時間51Ｃｒで標識した。標識した標的細胞（１００μｌ）および様々な濃度の抗体（１０ｐｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌ）をＰＢＭＣに添加し、３７℃にて１８時間インキュベートした。対応する結合していないアイソタイプを陰性対照として用いた。特異的溶解を、（（実験放出ｃｐｍ）−（自然放出ｃｐｍ））／（（最大放出ｃｐｍ）−（自然放出ｃｐｍ））として計算した。
【０１５３】
ｓＣＥＡの不在下で、ヒト化抗ＣＥＡ抗体ＩｇＧ１ Ａ５、ＩｇＧ１ Ｄ８およびＩｇＧ１ Ｂ９は、陰性対照と比較してＣＥＡ陽性胃癌細胞株ＫＡＴＯ ＩＩＩに細胞障害活性を媒介することが分かった。実施例２に示されるように、抗体ＣＥＡ ＩおよびＣＥＡ ＩＩ（ｈｕＩｇＧ１−ＣＥＡ ＩおよびＣＥＡ ＩＩ構築物）のＩｇＧ版に関して同じ結果が観察されている。同時に、抗体サンプルを攪拌下で２０分間可溶性ＣＥＡ（ｓＣＥＡ）抗原でプレインキュベートし、次に標識した標的細胞とヒトＰＢＭＣを混合した。さもなければ、アッセイは上記のように行った。可溶性ＣＥＡ（ｓＣＥＡ）抗原を、様々な濃度、すなわち、１μｇ／ｍｌおよび１０μｇ／ｍｌで用いた。アッセイを測定し、それぞれの細胞障害値をプロットした。
【０１５４】
２つの代表的な結果を、それぞれ抗体ＣＥＡ ＩＩおよび抗体ＩｇＧ１ Ａ５について図６ＡおよびＢに示す。このアッセイにおいて、抗体ＣＥＡ ＩＩの細胞溶解能が可溶性ＣＥＡ抗原の存在下で用量依存的に劇的に低減されたことが実証された。それぞれの曲線は、可溶性ＣＥＡを含まない曲線と比較して、１ｕｇ／ｍｌ ｓＣＥＡの存在下で明らかに右にシフトする。１０ｕｇ／ｍｌ ｓＣＥＡの存在下では、検出レベルを下回る抗体ＣＥＡ ＩＩの細胞溶解活性の完全な低下を示す、細胞溶解曲線は観察されなかった。それぞれのＥＣ５０値（最大半量の細胞溶解抗体濃度）は、ベースレベルで最も低い(the last)細胞障害値よりも濃度が高いと推定された。このことは、抗体ＣＥＡ ＩＩに関するＥＣ５０レベルの過小評価と、おそらくさらにより高い、下に定められる「阻害因子」を導く。
【０１５５】
これに対し、細胞溶解アッセイにおいて可溶性ＣＥＡ抗原の有意な阻害効果は抗体ＩｇＧ１ Ａ５、ＩｇＧ１ Ｂ９およびＩｇＧ１ Ｄ８に関して実証されなかった。全ての抗体が可溶性ＣＥＡの不在下で同程度のＥＣ５０値を示した。このことは可溶性ＣＥＡの不在下での同程度の細胞溶解活性を示す。
【０１５６】
ＥＣ５０値を解析ソフトウェアにより決定した。ＥＣ ５０値を表２に表す。
【０１５７】
【表１】
【０１５８】
可溶性ＣＥＡ抗原の存在下での細胞溶解性の阻害を「阻害因子」に変換した。この因子は、ＡＤＣＣアッセイにおける１０および１ｕｇ／ｍｌ 可溶性ＣＥＡの存在下でのＥＣ５０を可溶性ＣＥＡの不在下でのＥＣ５０で割ったものと定義される。阻害因子を表３に表す。
【０１５９】
【表２】
【０１６０】
阻害因子のグラフ表示が図７に示される。この図は明らかに、１ｕｇ／ｍｌの可溶性ＣＥＡ抗原の存在下で、可溶性ＣＥＡ抗原の存在下で３７倍以上の細胞溶解活性の低下を示し、ＣＥＡ ＩＩが劇的に細胞溶解活性を低減させたこと、一方、ＩｇＧ１ Ａ５およびＩｇＧ１ Ｄ８に媒介される、腫瘍細胞に対する細胞溶解活性は可溶性ＣＥＡに対して完全に抵抗性であることを示す。ＩｇＧ１ Ｂ９に媒介される、腫瘍細胞に対する細胞溶解活性はｓＣＥＡによりごくわずかな影響しか受けない。前記抗体構築物は１０を下回る阻害因子を示す。
【０１６１】
この効果は、ＡＤＣＣアッセイにおいて１０ｕｇ／ｍｌ濃度の可溶性ＣＥＡでさらにより明白である。抗体ＣＥＡ ＩＩの細胞溶解曲線はベースラインまで低下している（最大濃度でさえも細胞溶解活性は検知することができなかった）。従って、抗体ＣＥＡ ＩＩの阻害因子は、おそらくはるかに低く見積もって最高で７４であると推定された。
【０１６２】
要約すれば、可溶性ＣＥＡの存在下で、ｈｕＩｇＧ−ＣＥＡ ＩＩ（ｍＡｂ Ｔ８４．６６に由来）は、ＣＥＡ陽性標的細胞に対して劇的に低下した細胞障害活性のを示した；実施例２および５参照。これに対し、ヒト化ＣＥＡ抗体ＩｇＧ１ Ａ５、ＩｇＧ１ Ｄ８およびＩｇＧ１ Ｂ９は、可溶性ＣＥＡの不在下での活性と比較して、細胞溶解活性の有意な低下を示さなかった。ＩｇＧ１ Ａ５、ＩｇＧ１ Ｂ９およびＩｇＧ１ Ｄ８に媒介される、腫瘍細胞に対する細胞溶解活性は可溶性ＣＥＡに対して抵抗性である。驚くことに、そのほかの点では完全なヒトＩｇＧ１抗体のＩｇＧ１ Ａ５、ＩｇＧ１ Ｄ８およびＩｇＧ１ Ｂ９のＶＨ領域中のマウスモノクローナル抗体Ａ５Ｂ７のＣＤＲ−Ｈ３のKabatの位置９５〜１０２に相当するアミノ酸配列「ＤＲＧＬＲＦＹＦＤＹ」（配列番号２７）は、可溶性ＣＥＡ抗原に対する抵抗性を媒介するのに十分である。
【表３】
【図面の簡単な説明】
【０１６３】
【図１】ＶＨ、ＣH１、ヒンジ、ＣH２、ＣH３、ＶＬおよびＣL領域を含むＩｇＧ分子の模式図である。ＶＨおよびＶＬ領域のＣＤＲは黒色の長方形で示される。
【図２】Ｆｌａｇがタグされた、選択されたクローン由来のＣＥＡ特異的ｓｃＦｖタンパク質断片を含有する周辺質調製物のフローサイトメトリー分析を示す。ｓｃＦｖの各々は、実施例３に記載されるように、マウスＡ５Ｂ７ＶＨ領域とヒトＶＬ領域からなる。可溶性ｓｃＦｖタンパク質断片の周辺質調製物を１００，０００〜２００，０００個のＣＥＡをトランスフェクトしたＣＨＯ細胞に添加した。検出のため、モノクローナル抗Ｆｌａｇ抗体を用い、その後にＰＥ標識ポリクローナル抗マウス抗体を用いた。細胞と結合しているＳｃＦｖを、蛍光強度を増加させて、ＰＢＳのみでインキュベートした細胞と比較して測定した。蛍光強度をＸ軸にブロットし、イベントの数をＹ軸にブロットした。陰性対照（ＰＢＳおよび検出試薬）は黒く塗られた曲線で示し、個別のｓｃＦｖは灰色の線で示す。右への移動は細胞との正の結合を示す。全てのｓｃＦｖ、すなわち、Ａ−１２１、Ａ−１８３、Ａ−２４０、Ａ−３１３、Ａ−２９０、Ａ−３１５、Ａ４−３５、Ａ４−５２およびＭＰ２−Ａ５は、ＣＨＯ細胞上で膜と結合したＣＥＡと結合する。
【図３】Ｆｌａｇがタグされた、選択されたクローン由来のＣＥＡ特異的ｓｃＦｖタンパク質断片を含有する周辺質調製物のフローサイトメトリー分析を示す。これらのｓｃＦｖの各々は、実施例４に記載されるように、ヒト化ＶＨ領域とヒトＶＬ領域Ａ２４０からなる。可溶性ｓｃＦｖタンパク質断片の周辺質調製物を１００，０００〜２００，０００個のＣＥＡをトランスフェクトしたＣＨＯ細胞に添加した。モノクローナル抗Ｆｌａｇ抗体、続いてＰＥ標識ポリクローナル抗マウス抗体で検出を行った。細胞と結合しているＳｃＦｖを、蛍光強度を増加させて、ＰＢＳのみでインキュベートした細胞と比較して測定した。蛍光強度をＸ軸にブロットし、イベントの数をＹ軸にブロットした。陰性対照（ＰＢＳおよび検出試薬）は黒く塗られた曲線で示し、個別のｓｃＦｖは灰色の線で示す。右への移動は細胞との正の結合を示す。ヒト化ｓｃＦｖ構築物ＭＰ５１０＿３Ａ５．３、ＭＰ５１０＿３−Ｂ９．１、およびＭＰ５１０＿３−Ｄ８．１はＣＨＯ細胞上で膜と結合したＣＥＡと結合する。２４０Ｖλ．３は、マウスＡ５Ｂ７ＶＨ領域とヒトＶＬＡ−２４０領域からなるｓｃＦｖである。この構築物はまた、ＣＥＡ結合活性を示す。
【図４】ヒト化抗体Ａ５、Ｂ９、Ｄ８の精製ヒトＩｇＧ１版および抗体ＣＥＡ ＩおよびＣＥＡ ＩＩのヒトＩｇＧ１版ならびに抗体含有培養上清のＥＬＩＳＡ分析を示す。無関係なヒトＩｇＧ１抗体を陰性対照として含んだ。抗体結合を、固定化されたＣＥＡ抗原で、さらにＣＥＡ特異性の実証のためにコートされたＣＥＡ抗原の不在下で試験した。培養上清、１０ｕｇ／ｍｌおよび１ｕｇ／ｍｌ 抗体溶液をＢＳＡでブロックされた＋／−抗原コートウェルに添加した。検出をペルオキシダーゼ標識ポリクローナルヒトＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）により行った。ＡＢＴＳ溶液を用いる適当なインキュベーションの後にシグナルを測定した。シグナル強度をＹ軸にプロットする。抗体ＣＥＡ ＩおよびＣＥＡ ＩＩならびにヒト化抗体ＩｇＧ１ Ａ５、ＩｇＧ１ Ｂ９およびＩｇＧ１ Ｄ８と、固定化されたヒトＣＥＡ抗原との特異的結合をこの実験で実証することができた。
【図５Ａ】１０ｕｇ／ｍｌの抗体濃度を用いる、精製したＣＥＡ抗体およびそれぞれの陰性対照のフローサイトメトリー分析（図４参照）を示す。抗体サンプルを、１００，０００〜２００，０００個のＣＥＡ陽性Ｋａｔｏ ＩＩＩ細胞（Ａ）、ＣＥＡトランスフェクトＣＨＯ細胞（Ｂ）およびＣＥＡ陰性ＣＨＯ細胞（Ｃ）に添加した。検出は、ビオチン化ポリクローナル抗ヒトＩｇＧ抗体（ＤＡＫＯ）、それに続いてＰＥ標識ストレプトアビジン（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）で行った。細胞と結合している抗体を、蛍光強度を増加させて、それぞれのアイソタイプ対照とともにインキュベートした細胞と比較して測定した。蛍光強度をＸ軸にブロットし、イベントの数をＹ軸にブロットした。陰性対照（ＰＢＳおよび検出試薬）は黒く塗られた曲線で示し、それぞれの抗体は灰色の線で示す。右への移動は細胞との正の結合を示す。抗体ＣＥＡ ＩおよびＣＥＡ ＩＩならびにヒト化抗体ＩｇＧ１ Ａ５、ＩｇＧ１ Ｂ９およびＩｇＧ１ Ｄ８と、細胞上のヒトＣＥＡ抗原との特異的結合をこの実験で実証することができた。
【図５Ｂ】１０ｕｇ／ｍｌの抗体濃度を用いる、精製したＣＥＡ抗体およびそれぞれの陰性対照のフローサイトメトリー分析（図４参照）を示す。抗体サンプルを、１００，０００〜２００，０００個のＣＥＡ陽性Ｋａｔｏ ＩＩＩ細胞（Ａ）、ＣＥＡトランスフェクトＣＨＯ細胞（Ｂ）およびＣＥＡ陰性ＣＨＯ細胞（Ｃ）に添加した。検出は、ビオチン化ポリクローナル抗ヒトＩｇＧ抗体（ＤＡＫＯ）、それに続いてＰＥ標識ストレプトアビジン（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）で行った。細胞と結合している抗体を、蛍光強度を増加させて、それぞれのアイソタイプ対照とともにインキュベートした細胞と比較して測定した。蛍光強度をＸ軸にブロットし、イベントの数をＹ軸にブロットした。陰性対照（ＰＢＳおよび検出試薬）は黒く塗られた曲線で示し、それぞれの抗体は灰色の線で示す。右への移動は細胞との正の結合を示す。抗体ＣＥＡ ＩおよびＣＥＡ ＩＩならびにヒト化抗体ＩｇＧ１ Ａ５、ＩｇＧ１ Ｂ９およびＩｇＧ１ Ｄ８と、細胞上のヒトＣＥＡ抗原との特異的結合をこの実験で実証することができた。
【図５Ｃ】１０ｕｇ／ｍｌの抗体濃度を用いる、精製したＣＥＡ抗体およびそれぞれの陰性対照のフローサイトメトリー分析（図４参照）を示す。抗体サンプルを、１００，０００〜２００，０００個のＣＥＡ陽性Ｋａｔｏ ＩＩＩ細胞（Ａ）、ＣＥＡトランスフェクトＣＨＯ細胞（Ｂ）およびＣＥＡ陰性ＣＨＯ細胞（Ｃ）に添加した。検出は、ビオチン化ポリクローナル抗ヒトＩｇＧ抗体（ＤＡＫＯ）、それに続いてＰＥ標識ストレプトアビジン（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）で行った。細胞と結合している抗体を、蛍光強度を増加させて、それぞれのアイソタイプ対照とともにインキュベートした細胞と比較して測定した。蛍光強度をＸ軸にブロットし、イベントの数をＹ軸にブロットした。陰性対照（ＰＢＳおよび検出試薬）は黒く塗られた曲線で示し、それぞれの抗体は灰色の線で示す。右への移動は細胞との正の結合を示す。抗体ＣＥＡ ＩおよびＣＥＡ ＩＩならびにヒト化抗体ＩｇＧ１ Ａ５、ＩｇＧ１ Ｂ９およびＩｇＧ１ Ｄ８と、細胞上のヒトＣＥＡ抗原との特異的結合をこの実験で実証することができた。
【図６Ａ】ヒト化抗体Ａ５、Ｂ９、Ｄ８の精製ヒトＩｇＧ１版および抗体ＣＥＡ ＩＩのヒトＩｇＧ１版の細胞障害活性分析（ＡＤＣＣアッセイ）を示す。標的細胞（ＣＥＡトランスフェクトＣＨＯ細胞）をクロム５１で標識し、ヒトＰＢＭＣの存在下で個々の抗体の量を低下させて１８時間、そして２つの濃度の可溶性ヒトＣＥＡ抗原（それぞれ１０および１ｕｇ／ｍｌ）の存在下でインキュベートした。２つの代表結果は、図６ＡのＣＥＡ ＩＩ抗体および図６ＢのＩｇＧ１ Ａ５抗体に示される。これらの２つの例は、ヒト化抗体ＩｇＧ１ Ａ５に対する可溶性ＣＥＡの細胞障害阻害効果がないこと（図６Ｂ）、それに対してＣＥＡ ＩＩ抗体の細胞溶解活性は１ｕｇ／ｍｌの可溶性ＣＥＡの存在下で劇的に低下し、１０ｕｇ／ｍｌの可溶性ＣＥＡの存在下でさらに検出レベルを下回って低下する（図６Ａ)ことを明らかに示している。
【図６Ｂ】ヒト化抗体Ａ５、Ｂ９、Ｄ８の精製ヒトＩｇＧ１版および抗体ＣＥＡ ＩＩのヒトＩｇＧ１版の細胞障害活性分析（ＡＤＣＣアッセイ）を示す。標的細胞（ＣＥＡトランスフェクトＣＨＯ細胞）をクロム５１で標識し、ヒトＰＢＭＣの存在下で個々の抗体の量を低下させて１８時間、そして２つの濃度の可溶性ヒトＣＥＡ抗原（それぞれ１０および１ｕｇ／ｍｌ）の存在下でインキュベートした。２つの代表結果は、図６ＡのＣＥＡ ＩＩ抗体および図６ＢのＩｇＧ１ Ａ５抗体に示される。これらの２つの例は、ヒト化抗体ＩｇＧ１ Ａ５に対する可溶性ＣＥＡの細胞障害阻害効果がないこと（図６Ｂ）、それに対してＣＥＡ ＩＩ抗体の細胞溶解活性は１ｕｇ／ｍｌの可溶性ＣＥＡの存在下で劇的に低下し、１０ｕｇ／ｍｌの可溶性ＣＥＡの存在下でさらに検出レベルを下回って低下する（図６Ａ)ことを明らかに示している。
【図７】可溶性ＣＥＡ抗原の存在下での細胞溶解の阻害を「阻害因子」に変換した。この因子は、可溶性ＣＥＡの不在下でのＥＣ５０で割った、ＡＤＣＣアッセイにおける１０および１ｕｇ／ｍｌの可溶性ＣＥＡの存在下でのＥＣ５０として定義される。ＣＥＡ ＩＩが、可溶性ＣＥＡ抗原の存在下で劇的に低下した細胞溶解活性を有し、それに対してＩｇＧ１ Ａ５、ＩｇＧ１ Ｂ９およびＩｇＧ１ Ｄ８に媒介される、腫瘍細胞に対する細胞溶解活性は可溶性ＣＥＡに対して抵抗性であることが明らかに示され得る。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトにおける上皮腫瘍の治療のための医薬組成物であって、前記医薬組成物がヒトＣＥＡと特異的に結合するＩｇＧ１抗体を含み、前記ＩｇＧ１抗体の可変領域が、少なくとも、
（ａ）アミノ酸配列「ＳＹＷＭＨ」（配列番号２９）を有するＣＤＲ−Ｈ１と、アミノ酸配列「ＦＩＲＮＫＡＮＧＧＴＴＥＹＡＡＳＶＫＧ」（配列番号２８）を有するＣＤＲ−Ｈ２と、アミノ酸配列「ＤＲＧＬＲＦＹＦＤＹ」（配列番号２７）を有するＣＤＲ−Ｈ３、および
（ｂ）アミノ酸配列「ＴＹＡＭＨ」（配列番号３１）を有するＣＤＲ−Ｈ１と、アミノ酸配列「ＬＩＳＮＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧ」（配列番号３０）を有するＣＤＲ−Ｈ２と、アミノ酸配列「ＤＲＧＬＲＦＹＦＤＹ」（配列番号２７）を有するＣＤＲ−Ｈ３
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、医薬組成物。
【請求項２】
前記可変領域が、アミノ酸配列「ＴＬＲＲＧＩＮＶＧＡＹＳＩＹ」（配列番号３４）を有するＣＤＲ−Ｌ１および／またはアミノ酸配列「ＹＫＳＤＳＤＫＱＱＧＳ」（配列番号３３）を有するＣＤＲ−Ｌ２および／またはアミノ酸配列「ＭＩＷＨＳＧＡＳＡＶ」（配列番号３２）を有するＣＤＲ−Ｌ３を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記ＩｇＧ１抗体の軽鎖定常領域がλ軽鎖定常領域である、請求項１または２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記ＩｇＧ１抗体の可変領域のＶＨ領域のアミノ酸配列が配列番号２０、２２または２４である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記ＩｇＧ１抗体の可変領域のＶＬ領域のアミノ酸配列が配列番号２６である、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記ＩｇＧ１抗体の可変領域が、
（ａ）ＶＨ領域が、配列番号２２に示されるアミノ酸配列からなり、ＶＬ領域が、配列番号２６に示されるアミノ酸配列からなる；
（ｂ）ＶＨ領域が、配列番号２０に示されるアミノ酸配列からなり、ＶＬ領域が、配列番号２６に示されるアミノ酸配列からなる；および
（ｃ）ＶＨ領域が、配列番号２４に示されるアミノ酸配列からなり、ＶＬ領域が、配列番号２６に示されるアミノ酸配列からなる
からなる群より選択される、請求項１から５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記ＩｇＧ１抗体が、
（ａ）配列番号７７に示される重鎖のアミノ酸配列と、配列番号８０に示される軽鎖のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号７８に示される重鎖のアミノ酸配列と、配列番号８０に示される軽鎖のアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号７９に示される重鎖のアミノ酸配列と、配列番号８０に示される軽鎖のアミノ酸配列；および
（ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一の、より好ましくは少なくとも９０％同一の、最も好ましくは少なくとも９５％同一のアミノ酸配列
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記上皮腫瘍が、胃腸腺癌（gastrointestinal adenocarcinoma）、乳腺腺癌または肺腺癌である、請求項１から７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記胃腸腺癌が、結腸直腸腺癌、膵臓腺癌、食道腺癌または胃腺癌である、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記医薬組成物が進行性腫瘍、後期腫瘍、腫瘍量の多い腫瘍患者、転移性腫瘍、またはＣＥＡ血清中濃度が１００ｎｇ／ｍｌより高い腫瘍患者の治療のためのものである、請求項１から９のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項１１】
ＩｇＧ１抗体が、ＣＤＲ移植、ヒト化および／または脱免疫化されている、請求項１から１０のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項１２】
請求項１から１１のいずれかに記載のＩｇＧ１抗体をコードする核酸配列を含む、医薬組成物。
【請求項１３】
請求項１２に記載の核酸配列を含むベクターを含む、医薬組成物。
【請求項１４】
前記ベクターが、請求項１２に記載の前記核酸配列と作動可能なように連結されている調節配列をさらに含む、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
前記ベクターが発現ベクターである、請求項１３または１４に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
請求項１２に記載の核酸または請求項１３から１５のいずれかに記載のベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主を含む、医薬組成物。
【請求項１７】
請求項１から１１のいずれかに記載の医薬組成物の製造のためのプロセスであって、前記プロセスが、請求項１６に記載の宿主を請求項１から１１のいずれかに記載のＩｇＧ１抗体の発現を可能にする条件下で培養する段階と、産生されたＩｇＧ１抗体を培養物から回収する段階とを含む、プロセス。
【請求項１８】
担体、安定剤および／または賦形剤からなる、適した製剤をさらに含む、請求項１から１１のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項１９】
請求項１から１１のいずれかに記載のＩｇＧ１抗体、請求項１２に記載の核酸分子、請求項１３から１５のいずれかに記載のベクター、または請求項１６に記載の宿主の、ヒトにおける上皮腫瘍の予防、治療または寛解のための医薬組成物の調製のための使用。
【請求項２０】
前記上皮腫瘍が、胃腸腺癌、乳腺腺癌または肺腺癌である、請求項１９に記載の使用。
【請求項２１】
前記胃腸腺癌が、結腸直腸腺癌、膵臓腺癌、食道腺癌または胃腺癌である、請求項２０に記載の使用。
【請求項２２】
医薬組成物が、進行性腫瘍、後期腫瘍、腫瘍量の多い腫瘍患者、転移性腫瘍、またはＣＥＡ血清中濃度が１００ｎｇ／ｍｌより高い腫瘍患者の治療のためのものである、請求項１９から２１のいずれかに記載の使用。
【請求項２３】
前記医薬組成物が、さらなる薬剤と組み合わせて投与されることに適している、請求項１９から２２のいずれかに記載の使用。
【請求項２４】
上皮腫瘍の予防、治療または寛解を、それを必要とする被験体において行う方法であって、前記方法が、請求項１から１１のいずれかに記載の、または請求項１７に記載のプロセスに従って作製された医薬組成物の有効量を十分な時間投与する段階を含む、方法。
【請求項２５】
前記上皮腫瘍が、胃腸腺癌、乳腺腺癌または肺腺癌である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記胃腸腺癌が、結腸直腸腺癌、膵臓腺癌、食道腺癌または胃腺癌である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
医薬組成物が、進行性腫瘍、後期腫瘍、腫瘍量の多い腫瘍患者、転移性腫瘍、またはＣＥＡ血清中濃度が１００ｎｇ／ｍｌより高い腫瘍患者の治療のためのものである、請求項２４から２６のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
前記医薬組成物が、さらなる薬剤と組み合わせて投与される、請求項２４から２７のいずれかに記載の方法。
【請求項２９】
前記薬剤が、非タンパク質性化合物またはタンパク質性化合物である、請求項２８に記載の方法または請求項２３に記載の使用。
【請求項３０】
前記タンパク質性化合物または非タンパク質性化合物が、請求項１から１１のいずれかに記載のＩｇＧ１抗体、請求項１２に記載の核酸分子、請求項１３から１５のいずれかに記載のベクター、または請求項１６に記載の宿主と同時または非同時に投与される、請求項２８または２９に記載の方法あるいは請求項２９に記載の使用。
【請求項３１】
前記被験体がヒトである、請求項２４から３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
請求項１から１１のいずれかに記載のＩｇＧ１抗体、請求項１２に記載の核酸分子、請求項１３から１５のいずれかに記載のベクター、または請求項１６に記載の宿主を含む、キット。
【請求項３３】
前記ＣＥＡ血清中濃度がＥＬＩＳＡにより測定される、請求項１０に記載の医薬組成物、請求項２２に記載の使用、または請求項２７に記載の方法。
【請求項１】
ヒトにおける上皮腫瘍の治療のための医薬組成物であって、前記医薬組成物がヒトＣＥＡと特異的に結合するＩｇＧ１抗体を含み、前記ＩｇＧ１抗体の可変領域が、少なくとも、
（ａ）アミノ酸配列「ＳＹＷＭＨ」（配列番号２９）を有するＣＤＲ−Ｈ１と、アミノ酸配列「ＦＩＲＮＫＡＮＧＧＴＴＥＹＡＡＳＶＫＧ」（配列番号２８）を有するＣＤＲ−Ｈ２と、アミノ酸配列「ＤＲＧＬＲＦＹＦＤＹ」（配列番号２７）を有するＣＤＲ−Ｈ３、および
（ｂ）アミノ酸配列「ＴＹＡＭＨ」（配列番号３１）を有するＣＤＲ−Ｈ１と、アミノ酸配列「ＬＩＳＮＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧ」（配列番号３０）を有するＣＤＲ−Ｈ２と、アミノ酸配列「ＤＲＧＬＲＦＹＦＤＹ」（配列番号２７）を有するＣＤＲ−Ｈ３
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、医薬組成物。
【請求項２】
前記可変領域が、アミノ酸配列「ＴＬＲＲＧＩＮＶＧＡＹＳＩＹ」（配列番号３４）を有するＣＤＲ−Ｌ１および／またはアミノ酸配列「ＹＫＳＤＳＤＫＱＱＧＳ」（配列番号３３）を有するＣＤＲ−Ｌ２および／またはアミノ酸配列「ＭＩＷＨＳＧＡＳＡＶ」（配列番号３２）を有するＣＤＲ−Ｌ３を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記ＩｇＧ１抗体の軽鎖定常領域がλ軽鎖定常領域である、請求項１または２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記ＩｇＧ１抗体の可変領域のＶＨ領域のアミノ酸配列が配列番号２０、２２または２４である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記ＩｇＧ１抗体の可変領域のＶＬ領域のアミノ酸配列が配列番号２６である、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記ＩｇＧ１抗体の可変領域が、
（ａ）ＶＨ領域が、配列番号２２に示されるアミノ酸配列からなり、ＶＬ領域が、配列番号２６に示されるアミノ酸配列からなる；
（ｂ）ＶＨ領域が、配列番号２０に示されるアミノ酸配列からなり、ＶＬ領域が、配列番号２６に示されるアミノ酸配列からなる；および
（ｃ）ＶＨ領域が、配列番号２４に示されるアミノ酸配列からなり、ＶＬ領域が、配列番号２６に示されるアミノ酸配列からなる
からなる群より選択される、請求項１から５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記ＩｇＧ１抗体が、
（ａ）配列番号７７に示される重鎖のアミノ酸配列と、配列番号８０に示される軽鎖のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号７８に示される重鎖のアミノ酸配列と、配列番号８０に示される軽鎖のアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号７９に示される重鎖のアミノ酸配列と、配列番号８０に示される軽鎖のアミノ酸配列；および
（ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一の、より好ましくは少なくとも９０％同一の、最も好ましくは少なくとも９５％同一のアミノ酸配列
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記上皮腫瘍が、胃腸腺癌（gastrointestinal adenocarcinoma）、乳腺腺癌または肺腺癌である、請求項１から７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記胃腸腺癌が、結腸直腸腺癌、膵臓腺癌、食道腺癌または胃腺癌である、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記医薬組成物が進行性腫瘍、後期腫瘍、腫瘍量の多い腫瘍患者、転移性腫瘍、またはＣＥＡ血清中濃度が１００ｎｇ／ｍｌより高い腫瘍患者の治療のためのものである、請求項１から９のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項１１】
ＩｇＧ１抗体が、ＣＤＲ移植、ヒト化および／または脱免疫化されている、請求項１から１０のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項１２】
請求項１から１１のいずれかに記載のＩｇＧ１抗体をコードする核酸配列を含む、医薬組成物。
【請求項１３】
請求項１２に記載の核酸配列を含むベクターを含む、医薬組成物。
【請求項１４】
前記ベクターが、請求項１２に記載の前記核酸配列と作動可能なように連結されている調節配列をさらに含む、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
前記ベクターが発現ベクターである、請求項１３または１４に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
請求項１２に記載の核酸または請求項１３から１５のいずれかに記載のベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主を含む、医薬組成物。
【請求項１７】
請求項１から１１のいずれかに記載の医薬組成物の製造のためのプロセスであって、前記プロセスが、請求項１６に記載の宿主を請求項１から１１のいずれかに記載のＩｇＧ１抗体の発現を可能にする条件下で培養する段階と、産生されたＩｇＧ１抗体を培養物から回収する段階とを含む、プロセス。
【請求項１８】
担体、安定剤および／または賦形剤からなる、適した製剤をさらに含む、請求項１から１１のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項１９】
請求項１から１１のいずれかに記載のＩｇＧ１抗体、請求項１２に記載の核酸分子、請求項１３から１５のいずれかに記載のベクター、または請求項１６に記載の宿主の、ヒトにおける上皮腫瘍の予防、治療または寛解のための医薬組成物の調製のための使用。
【請求項２０】
前記上皮腫瘍が、胃腸腺癌、乳腺腺癌または肺腺癌である、請求項１９に記載の使用。
【請求項２１】
前記胃腸腺癌が、結腸直腸腺癌、膵臓腺癌、食道腺癌または胃腺癌である、請求項２０に記載の使用。
【請求項２２】
医薬組成物が、進行性腫瘍、後期腫瘍、腫瘍量の多い腫瘍患者、転移性腫瘍、またはＣＥＡ血清中濃度が１００ｎｇ／ｍｌより高い腫瘍患者の治療のためのものである、請求項１９から２１のいずれかに記載の使用。
【請求項２３】
前記医薬組成物が、さらなる薬剤と組み合わせて投与されることに適している、請求項１９から２２のいずれかに記載の使用。
【請求項２４】
上皮腫瘍の予防、治療または寛解を、それを必要とする被験体において行う方法であって、前記方法が、請求項１から１１のいずれかに記載の、または請求項１７に記載のプロセスに従って作製された医薬組成物の有効量を十分な時間投与する段階を含む、方法。
【請求項２５】
前記上皮腫瘍が、胃腸腺癌、乳腺腺癌または肺腺癌である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記胃腸腺癌が、結腸直腸腺癌、膵臓腺癌、食道腺癌または胃腺癌である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
医薬組成物が、進行性腫瘍、後期腫瘍、腫瘍量の多い腫瘍患者、転移性腫瘍、またはＣＥＡ血清中濃度が１００ｎｇ／ｍｌより高い腫瘍患者の治療のためのものである、請求項２４から２６のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
前記医薬組成物が、さらなる薬剤と組み合わせて投与される、請求項２４から２７のいずれかに記載の方法。
【請求項２９】
前記薬剤が、非タンパク質性化合物またはタンパク質性化合物である、請求項２８に記載の方法または請求項２３に記載の使用。
【請求項３０】
前記タンパク質性化合物または非タンパク質性化合物が、請求項１から１１のいずれかに記載のＩｇＧ１抗体、請求項１２に記載の核酸分子、請求項１３から１５のいずれかに記載のベクター、または請求項１６に記載の宿主と同時または非同時に投与される、請求項２８または２９に記載の方法あるいは請求項２９に記載の使用。
【請求項３１】
前記被験体がヒトである、請求項２４から３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
請求項１から１１のいずれかに記載のＩｇＧ１抗体、請求項１２に記載の核酸分子、請求項１３から１５のいずれかに記載のベクター、または請求項１６に記載の宿主を含む、キット。
【請求項３３】
前記ＣＥＡ血清中濃度がＥＬＩＳＡにより測定される、請求項１０に記載の医薬組成物、請求項２２に記載の使用、または請求項２７に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図７】
【公表番号】特表２００９−５２０７３３（Ｐ２００９−５２０７３３Ａ）
【公表日】平成２１年５月２８日（２００９．５．２８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５４６２６９（Ｐ２００８−５４６２６９）
【出願日】平成１８年１２月２１日（２００６．１２．２１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００６／０１２４０９
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０７１４２２
【国際公開日】平成１９年６月２８日（２００７．６．２８）
【出願人】（５０２３４３８６１）マイクロメット アーゲー (6)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年５月２８日（２００９．５．２８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１２月２１日（２００６．１２．２１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００６／０１２４０９
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０７１４２２
【国際公開日】平成１９年６月２８日（２００７．６．２８）
【出願人】（５０２３４３８６１）マイクロメット アーゲー (6)
【Ｆターム（参考）】
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