同一のＮ末端を有する塩基性繊維芽細胞増殖因子の高レベル発現
【課題】異なるＮ末端アミノ酸配列を有するヒト塩基性繊維芽細胞増殖因子のどの種も実質的に含んでいない、Ｎ末端にアミノ酸配列Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−を有するヒト塩基性繊維芽細胞増殖因子を提供すること。
【解決手段】上記課題は、異なるＮ末端アミノ酸配列を有するヒト塩基性繊維芽細胞増殖因子のどの種も実質的に含んでいない、Ｎ末端にアミノ酸配列Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−を有するヒト塩基性繊維芽細胞増殖因子およびその組成物を提供することにより達成された。
【解決手段】上記課題は、異なるＮ末端アミノ酸配列を有するヒト塩基性繊維芽細胞増殖因子のどの種も実質的に含んでいない、Ｎ末端にアミノ酸配列Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−を有するヒト塩基性繊維芽細胞増殖因子およびその組成物を提供することにより達成された。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、増殖因子の組み換え生産の分野に関する。特に、本発明は、同一のＮ末端を有するヒト塩基性繊維芽細胞増殖因子の生産に関する。本発明は、同一のＮ末端を有するヒト塩基性繊維芽細胞増殖因子の高レベルな発現および回収の手段および方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）は、毛細管内皮細胞を含む広範囲な細胞型において強力なマイトジェン活性を発現するタンパク質である。ウシの下垂体由来のｂＦＧＦの完全なアミノ酸配列が決定されている（Ｅｓｃｈ，Ｆ．ら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ（ＵＳＡ）（１９８５）８２：６５０７）。ヒトｂＦＧＦをコードするクローニングされたＤＮＡ配列は単離され、そのアミノ酸配列のヒトタンパク質の１３１−、１４６−および１５４−アミノ酸形態は決定されている（１９８７年３月２６日にＷＯ ８７／０１７２８として公開されているＰＣＴ出願 ＵＳ８６／０１８７９、Ａｂｒａｈａｍ，Ｊ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８６）２３３：５４５、Ａｂｒａｈａｍ，Ｊ．ら、Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ（１９８６）５：２５２３）。クローニングされたＤＮＡ配列を分析すると、可能な開始メチオニンコドンが、ｂＦＧＦの１５４−アミノ酸形態のコーディング配列のすぐ上流側に存在することが示され、このことは、（ｉ）この遺伝子からの一次翻訳産物の長さが１５５個の残基で、
（ｉｉ）１５４−アミノ酸形態が、開始メチオニンの翻訳後除去によって得られることを示している。次いで、Ｆｌｏｒｋｉｅｗｉｃｚ、Ｒ．およびＳｏｍｍｅｒ，Ａ．（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ（ＵＳＡ）（１９８９）８６：３９７８−３９８１）およびＰｒａｔｓ，Ｈ．ら、（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ（ＵＳＡ）（１９８９）８６：１８３６−１８４０）は、１５５−残基一次翻訳産物のメチオニン開始コドンの上流側に存在するロイシンコドンにおける、代替翻訳開始の結果として生産され得る、より長い形態のｂＦＧＦの存在を報告した。
【０００３】
部分的には、毛細管内皮細胞における強力なマイトジェン活性のために、ｂＦＧＦは、血管形成、すなわち新しい毛細血管を形成する工程を促進する。従って、ｂＦＧＦは、創傷が適切に治癒する場合の、新しい毛細血管床の形成が必要であるときに、創傷治癒剤として非常に有用である。
【０００４】
ヒトｂＦＧＦをコードする、単離されクローニングされたＤＮＡ配列を入手することによって、組み換えＤＮＡ技術を用いて、これらの配列を含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞においてタンパク質を発現し、そのタンパク質を臨床的使用のために回収することが可能になった。Ｎ末端メチオニンをプロセシングし得る原核および真核宿主において、ヒトｂＦＧＦおよびウシの等価物の１５５−残基一次翻訳産物を発現させることにより、微小不均一性のＮ末端を有するタンパク質が生産されることが観察されている（例えば、Ｂａｒｒ、Ｐｈｉｌｉｐ Ｊ．ら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ（１９８８）２６３（３１）：１６４７１を参照のこと）。Ｅ．ｃｏｌｉにおいてヒトｂＦＧＦの１５５−残基一次翻訳産物を発現させると、約７０／３０の比で、混合Ｎ末端配列Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−／Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−を有するタンパク質が回収されることを一貫して観察してきた。この微小不均一性は、分子の生物活性に影響を与えないようであるが、一般に、臨床用には、同一の物質、すなわち、分子間で実質的に同一のＮ末端配列を有するタンパク質を得ることが望まれると考えられる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、異なるＮ末端アミノ酸配列を有するヒト塩基性繊維芽細胞増殖因子のどの種も実質的に含んでいない、Ｎ末端にアミノ酸配列Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−を有するヒト塩基性繊維芽細胞増殖因子を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明によれば、Ｎ末端メチオニン残基が翻訳後欠失される宿主細胞内で、該Ｎ末端メチオニンの直後の２個のアラニン残基のうち少なくとも１個がない、哺乳類の塩基性繊維芽増殖因子の前駆体型の１５５アミノ酸をコードするＤＮＡ配列を発現する、工程；および該Ｎ末端メチオニン残基のない発現されたタンパク質を回収する、工程；を包含する、同一のＮ末端を有する塩基性繊維芽増殖因子を生産する方法が提供される。
【０００７】
１つの実施態様では、上記発現されるＤＮＡコーディング配列は、Ｎ末端メチオニン残基の直後にある２個のアラニン残基の１個が欠失されたヒト塩基性繊維芽細胞増殖因子の前駆体型の１５５アミノ酸をコードする配列を含有する。
【０００８】
好ましい実施態様では、上記発現されるＤＮＡコーディング配列は、塩基７から９のアラニン（ＧＣＣ）コドンを除いた図１のコーディング配列を含有する。
【０００９】
別の好ましい実施態様では、上記発現されるＤＮＡコーディング配列は、図２のコーディング配列である。
【００１０】
別の実施態様では、上記塩基性繊維芽細胞増殖因子は、宿主細胞によって発現された全タンパク質の少なくとも１０％のレベルで発現される。
【００１１】
本発明によれば、同一Ｎ末端を有する塩基性繊維芽細胞増殖因子を発現するためのベクターであって、該Ｎ末端メチオニン残基の直後にある２個のアラニン残基の１個がない、哺乳類の塩基性繊維芽細胞増殖因子の前駆体型の１５５アミノ酸をコードするＤＮＡ配列を含有し、該ＤＮＡ配列が、宿主細胞内でその発現を導き得る調節配列に作動可能に連結されている、ベクターが提供される。
【００１２】
１つの実施態様では、上記塩基性繊維芽細胞増殖因子をコードするＤＮＡ配列は、Ｎ末端メチオニン残基の直後にある２個のアラニン残基の１個が欠失された、ヒト塩基性繊維芽細胞増殖因子の前駆体型の１５５アミノ酸をコードする配列を含有する。
【００１３】
好ましい実施態様では、上記増殖因子のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列は、塩基７から９のアラニン（ＧＣＣ）コドンを除いた図１のコーディング配列を含有する。
【００１４】
別の好ましい実施態様では、上記増殖因子のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列は、図２のコーディング配列を含有する。
【００１５】
なお別の好ましい実施態様では、上記調節配列は、ｔｒｐプロモーター−オペレーター配列を含有する。
【００１６】
本発明によれば、上記のベクターで形質転換された、宿主細胞が提供される。
【００１７】
１つの実施態様では、上記細胞はＥ．ｃｏｌｉ細胞である。
【００１８】
好ましい実施態様では、上記宿主細胞はＥ．ｃｏｌｉＢ細胞である。
【００１９】
本発明によれば、Ｎ末端にアミノ酸配列Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−を有するヒト塩基性繊維芽細胞増殖因子であって、異なるＮ末端アミノ酸配列を有するヒト塩基性繊維芽細胞増殖因子のどの種も実質的に含んでいない、ヒト塩基性繊維芽細胞増殖因子が提供される。
【００２０】
１つの実施態様では、上記のヒト塩基性繊維芽細胞増殖因子は、図１のアミノ酸位３のＡｌａで始まる１５３アミノ酸配列を有する。
【００２１】
（発明の要旨）
本発明は、実質的に同一のＮ末端を有するヒトｂＦＧＦの高レベルな発現の方法および手段を提供する。「実質的に同一」とは、Ｅｄｍａｎ分解法による配列分析によって、ｂＦＧＦが、９５％、好ましくは９８％より多くの、同一Ｎ末端を有する物質を含むことが示されることを意味する。本発明は、ヒトｂＦＧＦの１５５−アミノ酸一次翻訳産物のＮ末端メチオニン残基の直後にある２つのアラニン残基の１つをコードするコドンが欠失すると、Ｎ末端が同一のヒトｂＦＧＦタンパク質が発現および回収されるという発見に基づいている。特にＮ末端メチオニンの翻訳後プロセシングに次いで、同一なＮ末端配列Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−を有する長さが１５３個のアミノ酸のヒトｂＦＧＦが生産される。さらに、以下の実施例３および５におけるＥ．ｃｏｌｉ発現ベクターを用いて、Ａｌａが欠失した配列が発現すると、その発現レベルは、Ａｌａを欠失していない対応のタンパク質配列の発現レベルよりもおよそ５０％から１００％高くなることが発見されている。
【００２２】
従って、本発明により同一のＮ末端を有するヒトｂＦＧＦを生産する方法が提供され、該方法は、Ｎ末端メチオニンを翻訳後除去し得る宿主細胞において、Ｎ末端メチオニンの直後に存在する２つのアラニン残基のうちの１つの残基のコドンが欠失している、ヒトｂＦＧＦの１５５−アミノ酸形態のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を発現する工程と、そのタンパク質を回収する工程と、を包含する。また、同一のＮ末端を有するヒト塩基性ＦＧＦの高レベルな発現および回収のためのベクターが提供される。このベクターは、ヒトｂＦＧＦの１５５−アミノ酸形態をコードするＤＮＡ配列を含み、このＤＮＡ配列からは、Ｎ末端メチオニンの直後にある２つのアラニンのうちの１つのアラニンのコドンが欠失しており、該ＤＮＡ配列は、宿主細胞においてその発現を方向づけ得る制御配列に、作動可能なように連結される。さらに、Ｎ末端配列Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−を有するヒトｂＦＧＦ配列の１５３個のアミノ酸を有する同一のタンパク質を含むヒトｂＦＧＦ組成物が提供される。
【発明の効果】
【００２３】
本発明によれば、異なるＮ末端アミノ酸配列を有するヒト塩基性繊維芽細胞増殖因子のどの種も実質的に含んでいない、Ｎ末端にアミノ酸配列Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−を有するヒト塩基性繊維芽細胞増殖因子が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
（発明の詳細な説明）
本発明は、ヒトｂＦＧＦの１５５−アミノ酸前駆体をコードし、Ｎ末端メチオニンのすぐ後ろの２つのアラニン残基のうち１つのアラニン残基のコドンを欠失しているＤＮＡ配列を使用する。以下では、ヒトｂＦＧＦをコードし改変された形を、一次翻訳産物がＮ末端配列Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−を有することを示すために「ｂＦＧＦ（ＭＡＧＳ）」と表す。このヒトｂＦＧＦおよびウシｂＦＧＦの１５５−残基形態のアミノ酸配列を、図１Ａおよび図１Ｂにそれぞれ示す。図１Ａおよび図１Ｂに示されるＤＮＡ配列は、ここに参考として援用されているＰＣＴ公報第ＷＯ ８７／０１７２８号に記載のように
決定された、天然のコーディング配列である。これらの配列のいずれかが、部位特異的変異誘発（Ｚｏｌｌｅｒ，Ｍ．Ｊ．，およびＳｍｉｔｈ，Ｍ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ（１９８２）１０：６４８７およびＡｄｅｌｍａｎ，Ｊ．Ｐ．ら．，ＤＮＡ（１９８３）２：１８３）によって改変され得、Ｎ末端メチオニンのすぐ後のアラニン残基の１つを欠いたヒトｂＦＧＦの類似体をコードするＤＮＡを生産する。周知のＤＮＡコードの変性により、他のＤＮＡ配列がＮ末端アラニン残基の１つを欠く所望のヒトｂＦＧＦ配列をコードする場合は、そのＤＮＡ配列が使用し得ることが理解される。好適な実施態様においては、アラニン残基を有しないヒトｂＦＧＦをコードするＤＮＡ配列が提供される。このような実施態様では、アラニン残基を欠くヒトｂＦＧＦをコードしているＤＮＡ配列が提供され、そこでは分子のＮ末端部をコードするＤＮＡの実質的な部分が、天然のＤＮＡ配列と比較するとＧ＋Ｃ含有量が減少しているように改変される。
【００２５】
所望するならば、ｂＦＧＦ（ＭＡＧＳ）をコードするＤＮＡ配列全体は、重複する合成オリゴヌクレオチドを連結することによって合成的に生産され、このように連結されて所望のＤＮＡ配列全体を形成する。個々のオリゴヌクレオチドは、Ｅｄｇｅ，ら，Ｎａｔｕｒｅ（１９８１）２９２：７５６およびＤｕｃｋｗｏｒｔｈ，ら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ（１９８１）９：１６９１に記載のホスホトリエステル法またはＢｅａｕｃａｇｅ，Ｓ．Ｌ．およびＣａｒｕｔｈｅｒｓ，Ｍ．Ｈ．，Ｔｅｔ Ｌｅｔｔｓ（１９８１）２２：１８５９およびＭａｔｔｅｕｃｃｉ，Ｍ．Ｄ．およびＣａｒｕｔｈｅｒｓ，Ｍ．Ｈ．，Ｊ Ａｍ
Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ（１９８１）１０３：３１８５に記載のホスホルアミダイト法によって調製し得、市販で入手可能な自動オリゴヌクレオチド合成機によっても調製し得る。このアプローチはかなりの長さの遺伝子全体を合成するために効果的に用いられている。
【００２６】
好ましくは、ｂＦＧＦ（ＭＡＧＳ）をコードするＤＮＡ配列は、ヒトｂＦＧＦの１５５−アミノ酸前駆体全長をコードするＤＮＡ配列のＮ末端アラニンコドンの１つを取り除くための、部位特異的変異誘発によって生産される。部位特異的変異誘発は、上記Ｚｏｌｌｅｒ，Ｍ．Ｊ．およびＳｍｉｔｈ，Ｍ．および上記Ａｄｅｌｍａｎ，Ｊ．Ｐ．に開示されている工程を用いて行ない得る。変異誘発は、ヒトｂＦＧＦの１５５−アミノ酸形態をコードする一本鎖ＤＮＡ（バクテリオファージＭ１３の誘導体に含まれる）上で、限定された誤対合を除き所望する変異（即ち、ＡＴＧ出発（メチオニン）コドンのすぐ後ろのアラニンコドンの１つを欠失）を示す一本鎖ＤＮＡに相補的な合成オリゴヌクレオチドプライマーを使用して行なわれる。
【００２７】
オリゴヌクレオチドプライマーの大きさは、変異が誘発される遺伝子領域ヘプライマーが安定してハイブリダイズする必要性および現在使用可能なオリゴヌクレオチド合成法の限界により決定される。オリゴヌクレオチド特異性の変異において用いられるオリゴヌクレオチドをデザインする際に考慮されるべき事柄（例えば、変異部位をはさむ部分の長さ、全体の長さ）は、Ｓｍｉｔｈ，ＭおよびＧｉｌｌａｍ，Ｓ．によるＧｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｐｌｅｎｕｍ
Ｐｒｅｓｓ（１９８１）３：１−３２に記載されている。一般的に、オリゴヌクレオチドの全体の長さは、変異部位からの５’および３’伸長部がＤＮＡポリメラーゼのエキソヌレアーゼ活性による変異の修正を回避するのに充分な長さであり、変異部位において、安定かつ固有のハイブリダイゼーションを最適に行えるものである。本発明にしたがって変異誘発に用いられるオリゴヌクレオチドは、通常、約１８から約４５の塩基を有し、好ましくは約２３から約２７の塩基を有する。それらは変化したまたは欠失したコドンの３’側に少なくとも約９個の塩基を有する。
【００２８】
アラニン残基の１つのコドンを欠く合成ヌクレオチドプライマーは、１５５−アミノ酸ｂＦＧＦをコードするＤＮＡ配列の鎖がクローニングされたＭ１３、ｆｄ、またはφＸ１
７４のような一本鎖ファージにハイブリダイズされる。ファージが遺伝子のセンス鎖またはアンチセンス鎖のいずれかを有し得ることが好ましい。ファージがアンチセンス鎖を有する場合は、プライマーは、欠失するアラニンを指定するコドンの欠失を除いて、変異する領域のコーディング配列と同一である。ファージがセンス鎖を有する場合は、プライマーは、欠失するアラニン残基をコードするものと相補的であるトリプレットの欠失を除いて、変異する領域のコーディング配列と相補的である。
【００２９】
ハイブリダイゼーションにおいて使用し得る条件は、上記Ｓｍｉｔｈ，ＭおよびＧｉｌｌａｍ，Ｓ．によって記載されている。一般に、温度は、約０℃から７０℃の間の範囲であり、さらに一般的には約１０℃から５０℃である。ハイブリダイゼーションの後、プライマーは、ＤＮＡポリメラーゼＩ（Ｋｌｅｎｏｗフラグメント）、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ、または他の適切なＤＮＡポリメラーゼとの反応により、ファージＤＮＡ上で伸長される。得られたｄｓＤＮＡは、Ｔ４リガーゼのようなＤＮＡリガーゼで閉環ｄｓＤＮＡに変換される。一本鎖領域を有するＤＮＡ分子は、Ｓ１エンドヌクレアーゼ処理により破壊し得る。あるいは、部分的二本鎖の調製物は、リガーゼまたはＳ１の処理を施さずに直接的に使用し得る。
【００３０】
得られた全部または一部が二本鎖になったＤＮＡは、ファージを保持する宿主バクテリア中に形質転換される。形質転換されたバクテリアの培養物は寒天表面にプレートされ、ファージを有する個々の細胞からのプラーク形成を可能にする。
【００３１】
理論的には、新しいプラークの５０％は、一本鎖に変異形を有するファージであり；５０％はオリジナルの配列を有している。得られたプラークは、レプリカとしてニトロセルロースフィルターまたは他の支持膜の上へ載せられた後、洗浄され、変性され、その後キナーゼ処理した合成プライマーとハイブリダイズされる。洗浄は、正確なマッチの結合は起こるが、オリジナル鎖とのミスマッチが起きるのは防がれるのに充分な温度で実施される。その後、プローブとハイブリダイズするプラークは取り出され、培養され、そしてＤＮＡが回収される。
【００３２】
さらに、本発明の範囲内には、アミノ酸配列におけるさらなる変化がＮ末端Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−の下流で起こるアラニンを欠失したヒトｂＦＧＦの１５５−アミノ酸配列形態の生産が含まれる。ここに参考として援用されているＰＣＴ公報第ＷＯ８９／００１９８号は、ｂＦＧＦの多くの類似体を開示しており、これらの類似体は天然のｂＦＧＦ配列のアミノ酸残基が分子特性において効果的な変化を起こすために他のアミノ酸で置換されている。特に、このＰＣＴ公報では、へパリン結合領域におけるアミノ酸残基が、１５５残基一次翻訳産物の１２８から１３８までの位置で、中性または陰性に荷電したアミノ酸残基によって置換されている類似対を開示している。さらに、１つ以上の天然のシステイン残基、好ましくは、１５５−残基一次翻訳産物の７８から９６位が、中性アミノ酸残基で置換されている類似体も開示されている。これらのアミノ酸置換物はいずれも、本発明のアラニン欠失物と共同させ得る。本発明の範囲から特別に除外されるのは、ＰＣＴ ＷＯ８９／００１９８に開示されているｂＦＧＦのＮ末端が短くなったものである。Ｎ末端がＭｅｔ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−であるその下流のアミノ酸配列の改変は、ＰＣＴ ＷＯ ８９／０１９８に開示されているＤＮＡの部位特異的変異により行なわれ得、この変異は、アラニンコドンを欠失する変異の前または後のいずれかで行なわれ得る。
【００３３】
ヒトｂＦＧＦ（ＭＡＧＳ）に対応するヒト以外の哺乳類のｂＦＧＦもまた、本発明によって提供し得る。例えば、ウシｂＦＧＦの１５５−残基前駆体のアミノ酸配列は、ヒト前駆体タンパク質とアミノ酸が２つ異なる。即ち、ウシタンパク質は、１２１位にＴｈｒではなくＳｅｒを有しており、１３７位にＳｅｒではなくＰｒｏを有している（１５５−ア
ミノ酸配列に基づくナンバーリングシステムによる）。このように、ヒトｂＦＧＦ（ＭＡＧＳ）に対応するウシタンパク質をコードするＤＮＡ配列は、図２のＤＮＡ配列の変異によって調製し得、１２０番および１３６番のアミノ酸残基に対応するコドンを変える。これは、各コドンにおいて１個のヌクレオチドの変異により達成される。
【００３４】
ｂＦＧＦ（ＭＡＧＳ）をコードするＤＮＡ配列を、適切な発現ベクターに挿入し、宿主細胞内のコーディング配列の発現を指示できる制御配列に作動可能なように結合する。「制御配列」とは、コーディング配列に適切に結合された場合に、その配列をそれが適合する宿主内において発現させる能力を有するＤＮＡ配列を示す。そのような制御配列は、少なくとも原核細胞および真核細胞の両方の宿主内のプロモーターを含み、そして任意にオペレーター配列、エンハンサーおよび転写終止シグナルを含む。特定の宿主において発現を行なう際に必要または有用なさらなる因子が使用し得る。「作動可能なように結合した」とは、成分が通常の機能を果たすように配置された並列形態を示す。このように、コーディング配列に作動可能なように結合した制御配列は、コーディング配列の発現を行なうことができる。当業者に周知のように、発現ベクターもまた、使用される宿主細胞内で機能する複製起点を有し得る。好ましくはベクターは、ベクターを有する宿主細胞の同定および選択を可能にする抗生物質耐性の遺伝子のような表現型マーカーも含有する。
【００３５】
発現ベクターは、適切な宿主細胞を形質転換するために使用される。原核および真核の両方の宿主が使用し得る。原核細胞としては非常に頻繁に、Ｅ．ｃｏｌｉの種々の株により代表される。しかし、他の微生物株も使用し得る。Ｅ．ｃｏｌｉは、ヒトｂＦＧＦの１５５−残基前駆体形態のＮ末端メチオニン残基を翻訳後プロセシングする能力を有する。Ｅ．ｃｏｌｉの有用な株としては、例えば、ＭＣ１０６１、ＤＨ１、ＲＲ１、Ｃ６００ｈｆｌ、Ｋ８０３、ＨＢ１０１、ＪＡ２２１、ＪＭ１０１、ＪＭ１０３、およびＢを含み、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｂが好ましい宿主である。プラスミドベクターとしては、複製領域、選択可能なマーカーおよび宿主に適合する種由来の制御配列を含むものが使用される；例えばＥ．ｃｏｌｉは、典型的には２つのＳａｌｍｏｎｅｌｌａ種、およびＢｏｌｉｖａｒら，Ｇｅｎｅ（１９７７）２：９５による１つのＥ．ｃｏｌｉ株から得られたプラスミド部分を組み合わせて得られたプラスミドである、ｐＢＲ３２２由来のベクターを用いて形質変換される。ｐＢＲ３２２は、アンピシリンとテトラサイクリン耐性の遺伝子を有し、所望されるベクターを構築する際に維持または破壊し得る、複数の選択可能なマーカーを提供する。本明細書で定義される、リボソーム結合部位配列と共に、任意にオペレーターを有し、転写を開始するためのプロモーターを含む一般的に用いられる原核細胞の制御配列には、β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）およびラクトース（ｌａｃ）プロモーターシステム（Ｃｈａｎｇら，Ｎａｔｕｒｅ（１９７７）１９８：１０５６）、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーターシステム（Ｇｏｅｄｄｅｌら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ（１９８０）８：４０５７）、Ｎ遺伝子リボソーム結合部位を有するラムダ由来のＰＬプロモーター（Ｓｈｉｍａｔａｋｅら，Ｎａｔｕｒｅ（１９８１）２９２：１２８）、およびｔｒｐ−ｌａｃ（ｔｒｃ）プロモーターシステム（Ａｍａｎｎ，Ｅ．およびＢｒｏｓｉｕｓ，Ｊ．，Ｇｅｎｅ（１９８５）４０：１８３）のような一般的に使用されるプロモーターを含む。
【００３６】
細菌に加えて、酵母またはチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞のような真核細胞もまた、宿主として使用し得る。当業者にとっては、種々の真核宿主との組み合わせに有用な制御配列、複製起点、マーカーなどは周知である。
【００３７】
ｂＦＧＦ（ＭＡＧＳ）のコーディング配列を含む発現ベクターを、宿主細胞を形質転換するために使用する。使用する宿主細胞に依存して、その細胞に適切な標準的技術を用いて形質転換を行なう。Ｃｏｈｅｎ，Ｓ．Ｎ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ（ＵＳＡ）（１９７２）６９：２１１０に記載の塩化カルシウムを使用したカルシウム処理
またはＭａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９８２）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，２５４ページおよびＨａｎａｈａｎ，Ｄ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ（１９８３）１６６：５５７−５８０に記載のＲｂＣｌ２法が、原核細胞または実質的に細胞壁バリアを有する他の細胞に使用し得る。そのような細胞壁を持たない哺乳類の細胞には、Ｇｒａｈａｍおよびｖａｎ ｄｅｒ Ｅｂ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９７８）５２：５４６のリン酸カルシウム沈澱法が使用し得、任意にＷｉｇｌｅｒ，Ｍ．ら、Ｃｅｌｌ（１９７９）１６：７７７−７８５によって改変された方法が使用し得る。酵母への形質転換は、Ｂｅｇｇｓ，Ｊ．Ｄ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９７８）２７５：１０４−１０９またはＨｉｎｎｅｎ，Ａ．，ら，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ（ＵＳＡ）（１９７８）７５：１９２９の方法により実施し得る。
【００３８】
ｂＦＧＦ（ＭＡＧＳ）発現ベクターを有する形質転換体は、ベクター構築の際組み込まれる特定の表現型マーカーに依存して、周知の技術によって同定し得る。即ち、アンピシリンのような抗生物質の存在下での成長によって同定する。制限酵素分析またはジデオキシ法による配列決定のような種々の周知技術は、正しいベクター構築を確認するために使用し得る。
【００３９】
ｂＦＧＦ（ＭＡＧＳ）の発現は、特定のベクター構築と使用する宿主細胞に大きく依存し、当業者には容易に理解される条件下で行ない得る。ベクターが、ｔｒｐプロモーターのような誘導プロモーターの制御下にｂＦＧＦ（ＭＡＧＳ）のＤＮＡ配列を有する場合には、形質転換された宿主細胞を適切な成長媒体に植菌し、至適密度まで増殖するように使用し得；制御プロモーターからのｂＦＧＦ（ＭＡＧＳ）の発現は、その後、適切なインデューサー（例えばｔｒｐプロモーターの場合は、３−β−インドールアクリル酸）の付加によって誘導し得る。発現したｂＦＧＦ（ＭＡＧＳ）は、天然源からのｂＦＧＦの精製技術で使用される周知の技術により回収し得る。好適な精製工程においては、発現したタンパク質を含む形質転換体を、機械的または化学的に溶解し、タンパク質を放出させる。ＤＮａｓｅおよびＲＮａｓｅで処理した後に、反応物を遠心し、上清を市販で入手可能なヘパリン−セファロースカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｉｎｃ．）上に負荷する。カラムを塩濃度が約１．０Ｍまたはそれ以下のＮａＣｌ緩衝液で洗浄した後、このｂＦＧＦ（ＭＡＧＳ）は２．０Ｍ ＮａＣｌカラムから溶出し得る。所望されれば、ヘパリン−セファロースクロマトグラフィー段階は、繰り返し得、あるいはＳ／Ｐ ＳｅｐｈａｄｅｘまたはＭｏｎｏ Ｓ樹脂上でのイオン交換クロマトグラフィーのような他の周知のタンパク質精製段階と組み合わし得る。工業規模の生産においては、最終の形態中にわずかな量のヘパリンも含むことは好ましくないため、ヘパリン−セファロースクロマトグラフィーよりも銅キレートアフィニティクロマトグラフィーが好ましい。
【００４０】
極めて驚くべきことに、ｂＦＧＦ（ＭＡＧＳ）がＥ．ｃｏｌｉ Ｂで発現するとき、その発現レベルは、同一の宿主ベクターシステムおよび同一の発現条件を用いた対応する野生型（突然変異していない）ヒトｂＦＧＦの発現よりも、５０％から１００％大きいオーダーであることが見い出された。特に、本発明の方法は、ｂＦＧＦ（ＭＡＧＳ）を、宿主細胞により発現させたタンパク質全体の少なくとも１０％のレベルで発現させる。さらにＮ末端アミノ酸分析によると、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢでのｂＦＧＦ（ＭＡＧＳ）発現により、実質的に同一のＮ末端を有する最終タンパク質産物が得られることが示され、即ち、このタンパク質をＥｄｍａｎ分解法でＮ末端分析すると、ｂＦＧＦの９５％以上、好ましくは９８％以上が同一Ｎ末端を有することが示される。Ｅ．ｃｏｌｉのような原核細胞宿主は、ｂＦＧＦのＡＴＧ出発コドンによりコードされたＮ末端メチオニン残基を除去できることが分かっている。従って、本発明の方法によって、Ｎ末端配列がＡｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−の１５３アミノ酸残基を有するｂＦＧＦが回収される。
【００４１】
本発明により得られるｂＦＧＦ（ＭＡＧＳ）は、Ｎ末端配列がＡｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−であるか、または混合Ｎ末端を有し、対応するｂＦＧＦと同一の有用性を有している。このｂＦＧＦ（ＭＡＧＳ）は、創傷の治癒を促進するために有用である。精製ｂＦＧＦ（ＭＡＧＳ）は一般に、外傷を負った組織に血管新生および治癒を促すために、局所的に適用される。適切な基質としては、火傷、皮膚潰瘍、形成手術のような外科的剥離、または治療を要するその他の創傷部位がある。ｂＦＧＦ（ＭＡＧＳ）の適用は治癒を促すので、感染の危険性も減少させる。
【００４２】
ｂＦＧＦ（ＭＡＧＳ）が新規の血管新生を促進する有用性がある適応症は、骨折、靱帯および腱の修復、腱炎、および滑液包炎などの筋骨格系の症状；火傷、切傷、裂傷、床ずれなどの皮膚症状、および糖尿病のような治癒の遅い潰瘍；および虚血および心筋梗塞下にある組織修復が含まれる。
【００４３】
組み換え的に生産されたｂＦＧＦ（ＭＡＧＳ）の、入手可能な賦形剤およびキャリアを用いた調合剤は、当業者に周知の標準的方法により調製される。このタンパク質は、外用水薬、ゲル、制御放出システムの一部、または所望されれば抗生物質のようなさらなる活性成分を含めた軟膏として調合し得る。
【００４４】
表面的な部位に最適である局所用投与では、標準的な局所用調合剤は、例えば、患部表面１ｃｍ２あたりに０．１−１００μｇのｂＦＧＦ（ＭＡＧＳ）が使用される。そのような溶液は、患部へ１度のみかあるいは、２から４週間（または不十分な治療条件ではこれよりも長い期間）の間に１日２回まで投与する。調合剤中のｂＦＧＦ（ＭＡＧＳ）および他の成分の濃度は、もちろん、創傷の種類と重篤度および患者の体質に依存する。投与量は、傷跡が残らないようにするために経時的に少なくし得る。例えば、３度の火傷のような最もひどい傷は、ｂＦＧＦ（ＭＡＧＳ）を１００μｇ／ｃｍ２の投与量で治療し得るが、治療開始後、投与量は傷が治るに従い次第に約０．１μｇ／ｃｍ２またはそれ以下にまで下げ得る。キャリアとしてＢＳＡを使用するＦＧＦの局所用調合剤は、Ｆｒａｎｋｌｉｎ，Ｊ．Ｄ．ら，Ｐｌａｓｔｉｃ ａｎｄ Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃ Ｓｕｒｇ（１９７９）６４：７６６−７７０に開示されている。
【００４５】
骨および深部軟組織（表面ではない）の修復には、投与は局所的であるが、注射または直接インプラントした患部の周辺にゆっくりとした放出形態で投与することが好ましい。骨の損傷のような症状では手術が必要になり得、従ってインプランテーションが直接的に適用となる。ゆっくりとした放出形態は、Ｈｙｄｒｏｎ（Ｌａｎｇｅｒ，Ｒ．，ら．，Ｎａｔｕｒｅ（１９７６）２６３：７９７−７９９）またはＥｌｖａｘ ４０Ｐ（Ｄｏｐｏｎｔ）（Ｍｕｒｒａｙ，Ｊ．Ｂ．，ら，Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ（１９８３）１９：７４３−７４７）のようにポリマー中に調合し得る。他の徐放システムは、Ｈｓｉｅｈ，Ｄ．Ｓ．Ｔ．，ら，Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ（１９８３）７２：１７−２２）によって提案され、および特に表皮増殖因子のための調合剤は、本発明では好ましくないが、Ｂｕｃｋｌｅｙ，Ａ．，ら，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ（ＵＳＡ）（１９８５）８２：７３４０−７３４４によって提案されている。
【００４６】
徐放送達の局所的投与では、調合剤中のｂＦＧＦ（ＭＡＧＳ）の濃度は、症状の性質や重篤度およびポリマーからのｂＦＧＦ（ＭＡＧＳ）の放出速度を含めた多くの要素に依存する。一般に調合は、Ｂｕｃｋｌｅｙら（上記Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ（ＵＳＡ））に記載のように、組織濃度の約１０倍の一定な局所的濃度を有するように組み立てられる。組織でのｂＦＧＦ濃度５−５０ｎｇ／ｇ湿重量に基づき（６０ｎｇ／ｇ湿重量であるＥＧＦと比較し得る）、１時間当り５０−５０００ｎｇのＦＧＦ放出が受容可能である。もちろん、初期濃度は傷の重篤度に依存する。
【００４７】
ｂＦＧＦ（ＭＡＧＳ）は、表皮増殖因子（ＥＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ−αまたはＴＧＦ−β）、インシュリン様増殖因子（ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２）、イアミン（Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ トリペプチド）および／または血小板由来の増殖因子（ＰＤＧＦ）などの他の増殖因子と共同して、および相乗的に、作用し得ることが予測される。さらに、特に骨の修復には、上皮小体のホルモンが骨の再吸収を速めるので、上皮小体ホルモンの拮抗薬と共同して作用し得る。そのため、本発明のｂＦＧＦ（ＭＡＧＳ）が、上記の１つ以上の因子と組み合わせた同一の組成物により、または同一のプロトコールで投与される実施例は、本発明の組成物および投与のプロトコールの範囲に含まれ、こうして所望される組織修復はさらに効果的に達成される。
【００４８】
ｂＦＧＦ（ＭＡＧＳ）は、神経突起生長、神経再生、および神経生存を促進するのに効果的であるため、アルツハイマー病およびパーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、および一般的な神経システムの老化、および脊髄および末梢神経の損傷のようなある種の神経学的疾患の治療に有用であり得る。
【００４９】
これらの適応のための薬剤投与は、好ましくは上記創傷治療に関連して述べたものと同じ形態でインプラントにより行われる。この薬剤は、移植療法のような細胞培養物のインプラントによって、即ち、移植する前に培養物を本発明のｂＦＧＦ（ＭＡＧＳ）調製物で処理するか、または組み換えＤＮＡ技術によって細胞をｂＦＧＦ（ＭＡＧＳ）産生化することにより、送達し得る。さらに、ｂＦＧＦ（ＭＡＧＳ）は、脊髄液に直接注射し得、または全身的に適用し得る。全身用調合剤は、一般に従来技術で知られており、緩衝液または生理食塩水またはその他の適切な賦形剤中の形態を含む。全身用調合剤の投与レベルは、上記の局所用調合剤に使用した濃度と同じ局所的濃度で作用組織へ送達し得る。組織培養または外植片維持には、０．１−１０ｎｇ／ｍｌの血清または培養培地が使用し得る。
【００５０】
ｂＦＧＦ（ＭＡＧＳ）は、手術中に受けた傷組織の再形成および修復を助けるために特に有用である。この使用のために、ｂＦＧＦ（ＭＡＧＳ）は、外科用留め金として使用されるポリマー中に含ませることが有用であり得る。こうしてこのタンパク質は、この留め金を用いて行われる機械的縫合を生物学的に補い、組織の修復において「自然な」治癒工程を促進し助けることができる。
【００５１】
さらに、ここで議論されているｂＦＧＦ（ＭＡＧＳ）により与えられるもののような脈管形成刺激（ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ ｓｔｉｍｕｌｉ）は組織プラスミノーゲン活性因子（ｔＰＡ）の放出、およびインビトロでの内皮細胞からのコラゲナーゼ放出（Ｇｒｏｓｓ，Ｊ．Ｌ．ら，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ（ＵＳＡ）（１９８３）８０：２６２３）を生じさせる。そのため、本発明のｂＦＧＦ（ＭＡＧＳ）もまた、これらの酵素に反応する症状の治療に有用である。急性の症状（心筋梗塞や心臓発作を伴う血塊の存在など）においては、血塊を溶かすためにｔＰＡを多量に直接投与することが必要であり得るが、塞栓を形成する慢性的傾向の治療においては、血中に適切なレベルのｔＰＡを保つためのｂＦＧＦ（ＭＡＧＳ）投与が所望され得る。そのため、この適応には、筋肉内または皮下注射のような従来の方法を用いる薬剤の全身的投与が好ましい。
【００５２】
以下の実施例は、本発明の実施をさらに示すことを意図するものであって、本発明の範囲をどのような点においても制限することを意図するものではない。出発物質として使用するウシｂＦＧＦをコードするｃＤＮＡは、初めにウシゲノムライブラリーをスクリーニングし、重要なプローブを得ることによって得られ、その後ＰＣＴ公報 ＷＯ ８７／０１７２８に詳述されている別のＤＮＡを回収する。しかし、この重要なプローブの配列、およびウシおよびヒトｂＦＧＦのコーディング領域の配列は周知であり、インビトロで化学的に構築し得るので、この工程を繰り返す必要はない。さらに、ヒトおよびウシｂＦＧＦの配列を有するバクテリオファージは、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ
Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託されている。従って、下記の実施例において出発物質として使用されるｂＦＧＦのＤＮＡ配列は、種々の起源のものから入手可能である。
【実施例】
【００５３】
（実施例１）
（ｐＴｒｐ−２３３細菌発現プラスミドの構築）
Ａ．合成トリプトファンオペロンプロモーターおよびオペレーター調節配列の構築
図３Ａに示す１０個のオリゴデオキシヌクレオチドを、ホスホトリエステル法によって合成し、精製した。１および１０以外のオリゴデオキシヌクレオチド各々５００ピコモルを、３７℃で３０分間、６０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８、１５ｍＭ ＤＴＴ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、［γ−３２ｐ］−ＡＴＰ２０μＣｉおよびポリヌクレオチドキナーゼ（Ｐ／Ｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）２０ユニットを含有する溶液２０μｌ中で別々にリン酸化した。続いて、６０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８、１５ ｍＭ ＤＴＴ、１０ ｍＭ ＭｇＣｌ２、１．５ｍＭ ＡＴＰおよび別のポリヌクレオチドキナーゼ２０ユニットを含有する溶液１０μｌを添加し、その後、３７℃で３０分間、インキュベートした。インキュベートした後、試料を１００℃で５分間、インキュベートした。オリゴデオキシヌクレオチド１および１０の５００ピコモルを、上記緩衝液からＡＴＰを除いた溶液３０μｌ中で希釈した。
【００５４】
二本鎖対を構築するオリゴデオキシヌクレオチド（例えば、オリゴデオキシヌクレオチド１および２、３および４等、図３Ａ）各々１６．７ピコモルを混合し、９０℃で２分間、インキュベートし、その後、ゆっくりと室温まで冷却した。その後、構築に、各々の対を他の二本鎖対と結合させ、フェノール／クロロホルムで抽出し、その後、エタノールで沈澱させた。得られたオリゴデオキシヌクレオチド対を、５ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８、１０ ｍＭ ＭｇＣｌ２、２０ ｍＭ ＤＴＴを含有する溶液３０ μｌ中で再構築し、５０℃で１０分間熱した後、室温まで冷却し、その後、ＡＴＰを添加することにより、最終濃度０．５ ｍＭを得た。Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ８００ユニットを添加し、得られた混合物を１２．５℃で１２−１６時間インキュベートした。
【００５５】
連結反応混合物をフェノール／クロロホルムを用いて抽出し、そのＤＮＡをエタノールで沈澱させた。乾燥したＤＮＡを、溶液３０ μｌ中で再構築し、ＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩを用いて３７℃で１時間消化した。得られた混合物をフェノール／クロロホルムを用いて抽出し、エタノールで沈澱させた。その後、Ｌａｅｍｍｌｉ，Ｎａｔｕｒｅ（１９７０）２２７：６８０の方法に従って、８％ポリアクリルアミドゲル上の電気泳動により、様々な二本鎖ＤＮＡセグメントを分離した。加湿ゲルオートラジオグラフィーによってＤＮＡ断片を視覚化し、長さで約１００ｂｐに相当するバンドを切出して、一晩溶出した。切出した合成ＤＮＡ断片を、同様にＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩによって消化したプラスミドＭ１３ｍｐ８またはＭ１３ｍｐ９（Ｍｅｓｓｉｎｇ，Ｊ．およびＶｉｅｉｒａ，Ｊ．，Ｇｅｎｅ（１９８２）１９：２６９）に連結し、得られた物質をジデオキシヌクレオチド配列分析（Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ．ら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ（ＵＳＡ）（１９７７）７４：５４６３）することにより、図３Ａに示す設計配列を確認した。正しい配列を含有するＭ１３誘導体をＭ１３−ｔｒｐと名付けた。Ｍ１３−ｔｒｐ中の設計配列は、ｔｒｐオペロンリーダーペプチドのリボソーム結合領域に加えて、プロモーター（−３５および−１０領域）およびトリプトファン（ｔｒｐ）オペロンのオペレーター領域を含有する（図３Ｂ）。図３Ｂに示す配列に類似の配列が、Ｅ．ｃｏｌｉ中における異種タンパク質の発現に有用であることが証明されている（Ｈａｌｌｅｗｅｌｌ，Ｒ．Ａ．、およびＥｍｔａｇｅ，Ｓ．，Ｇｅｎｅ（１９８０）９：２７，Ｉｋｅｈａｒａ，Ｍ．ら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ（ＵＳＡ）（１９８４）８１：５９５６）。
【００５６】
Ｂ．合成ｔｒｐプロモーター／オペレーター含有プラスミド、ｐＴｒｐ−２３３の構築
プラスミドｐＫＫ２３３−２（図４Ａ；Ａｍａｎｎ，Ｅ．およびＢｒｏｓｉｕｓ，Ｊ．，前出）を、ＮｄｅＩを用いて完全に消化し、その後、Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（１９８２），ｐ．３９４の方法により、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリマラーゼＩ、クレノウ断片（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｃ．）５ユニットを用いて、末端を満たし、５０ μＭにｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰおよびＴＴＰを添加した。得られた物質を２５℃で２０分間インキュベートした。フェノール／クロロホルム抽出およびエタノール沈澱に続いて、ＮｄｅＩで消化したＤＮＡを再連結させてＥ．ｃｏｌｉに形質転換した（Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｋ．ら、Ｊ Ｍｏｌ Ａｐｐｌ Ｇｅｎｅｔ（１９８２）１：２８９）。得られた、ＮｄｅＩ部位を欠いたプラスミドをｐＫＫ２３３−２−Ｎｄｅ（図４Ｂ）と命名した。
【００５７】
プラスミドｐＫＫ２３３−２−Ｎｄｅ ２０ナノグラムをＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩを用いて完全に消化し、その後、Ｍａｎｉａｔｉｓら、前出、ｐｐ．１３３−１３４に従って、仔ウシの腸ホスファターゼ処理（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を実施した。ＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩを用いて、このファージの複製型（二本鎖ＤＮＡ型）を消化することにより、Ｍ１３−ｔｒｐから合成ｔｒｐプロモーター／オペレーター配列５０ナノグラムを得、ＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩを用いて消化したｐＫＫ２３３−２−Ｎｄｅ１０ナノグラムと混合した。上記のようにＴ４ ＤＮＡリガーゼと連結した後、得られた混合物をＥ．ｃｏｌｉ ＪＡ２２１ １ｐｐ−／Ｉ’ｌａｃＩに形質転換した。形質転換体をスクリーニングすることにより、１００ ｂｐ ＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩ合成ｔｒｐプロモーター／オペレーターを含有するプラスミドＤＮＡの存在をスクリーニングした。その後、適切なプラスミドを単離してｐＴｒｐ−２３３と命名した。図４Ｃに、４．４−ｋｂプラスミドｐＴｒｐ−２３３のプラスミドマップを示す。
【００５８】
（実施例２）
（プラスミドｐＴｓＦ１１の構築）
Ａ．ヒト塩基性繊維芽細胞増殖因子をコードするｃＤＮＡ配列の構築
参考のため援用されるＰＣＴ公報ＷＯ ８７／０１７２８；Ａｂｒａｈａｍ，Ｊ．Ａ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８６），前出；およびＡｂｒａｈａｍ，Ｊ．Ａ．ら、Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ（１９８６），前出に記載されているように、ハイブリダイゼーションプローブをつくるために、クローンλＢＢ２中に含有されたウシ塩基性ＦＧＦ ｃＤＮＡを用いることにより、塩基性ＦＧＦクローンを、ヒトｃＤＮＡおよびゲノムライブラリーから単離した。
【００５９】
ウシ塩基性ＦＧＦとヒト塩基性ＦＧＦとの間には、１５５残基前駆体型に２つの、アミノ酸の違いがある：１２１位において、ウシのタンパク質はＳｅｒを有し、ヒトのタンパク質はＴｈｒを有すること；および１３７位において、ウシのタンパク質はＰｒｏを有し、ヒトのタンパク質はＳｅｒを有することである。これらの違いは各々の場合において、その部位におけるアミノ酸用のコドンにおける、ひとつのヌクレオチドの違いに相当する。それゆえ、以下に述べるように、ヒトのタンパク質をコードするために、部位特異性変異誘発によって、ウシのｃＤＮＡを便宜的に修正し得る。実際、部位特異性変異誘発技術の標準的なものを用いることにより、これらのコドンを変更した。ＥｃｏＲＩを用いてλ
ＢＢ２クローン（ＡＴＣＣ ＮＯ．４０１９６）を消化し、ｂＦＧＦタンパク質をコードする配列にわたる１．４ｋｂの領域を、Ｍ１３ｍｐ８のＥｃｏＲＩ部位に連結した。そして、正しい方向に挿入物を有するファージを回収した。３個のオリゴヌクレオチド：「万能」プライマーである１７−ｍｅｒ；コドン１２１においてコーディング配列を変更する変異誘発性の１６−ｍｅｒ ５’−ＧＡＡＡＴＡＣＡＣＣＡＧＴＴＧＧ−３’（配列番号１１）；コドン１３７において配列を変更する変異誘発性の１７−ｍｅｒ ５’−ＡＣＴＴＧＧＡＴＣＣＡＡＡＡＣＡＧ−３’（配列番号１２）の存在下で１回目のインビトロ
変異誘発を実行した。その後、得られた、変異誘発されたファージを、プライマーで方向づけられた、２回目のインビトロ変異誘発にかけることにより、変異誘発性２５−ｍｅｒ，５’ＴＴＴＴＡＣＡＴＧＡＡＧＣＴＴＴＡＴＡＴＴＴＣＡＧ−３’（配列番号１３）を用いて翻訳終止コドンから下流にＨｉｎｄＩＩＩ部位３４ ｂｐを作成した。
【００６０】
得られた、変異したＤＮＡをジデオキシヌクレオチド配列分析（Ｓａｎｇｅｒら、前出）によって配列分析することにより、所望の変異が起こったことを確認した。変異したＭ１３ファージＤＮＡの複製型からのＨｉｎｄＩＩＩを用いて、ＦＧＦコーディング領域にわたる約６４０ ｂｐの断片を切出し、ＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＵＣ１３（Ｍｅｓｓｉｎｇ，Ｊ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ（１９８３）１０１：２０）に連結することにより、中間プラスミドｐＪＪ１５−１を得た。
【００６１】
Ｂ． Ｎ末端のための合成コーディング領域を有するヒトｂＦＧＦ ｃＤＮＡの構築
ｐＪＪ１５−１中に含有されるコーディング領域の５’末端（最初の１２５ｂｐ）のＧ＋Ｃ含有量を低下させるために、連続する配列の上にリストアップされている合成オリゴヌクレオチドを用いて、下に示されている配列を有する合成ＤＮＡ断片を構築した。オリゴヌクレオチドを対にアニーリングし、その対を順に連結し、ＨｉｎｄＩＩＩで切断されたＭ１３ｍｐ９に連結した。Ｍ１３ｍｐ９にクローニングした合成１３５ｂｐ挿入物の配列を、ジデオキシ配列分析により確認した。合成断片を有するＭ１３ｍｐ９ファージの複製型を、ＨｉｎｄＩＩＩを用いて消化し、１３５ｂｐ断片を単離した。この断片を、ＨｉｎｄＩＩＩで切断されたｐＵＣ９に連結した。その後、得られたプラスミドをＮｄｅＩおよびＨｈａＩを用いて消化し、合成挿入物の１２６ｂｐサブ断片を単離した。この１２６ｂｐのＮｄｅＩからＨｈａＩのサブ断片を、ＪＪ１５−１からの３７７ｂｐのＨｈａＩからＨｉｎｄＩＩＩのＤＮＡ断片に結合した。上記３７７ｂｐのＨｈａＩからＨｉｎｄＩＩＩのＤＮＡ断片は塩基性ＦＧＦコーディング配列のほぼ４分の３にわたり、この部分は、カルボキシ末端である。その後、得られた物質を、発現ベクターｐＴｒｐ−２３３のＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位に連結することにより、プラスミドｐＴｓＦ１１（図５Ａ，５Ｂ）を得た。
【００６２】
【化１】
【００６３】
（実施例３）
（ｂＦＧＦのためのｐＴｓＦ−９Δβｇａｌ発現ベクターの生成）
ｔｒｐプロモーター／オペレーターの制御下でｂＦＧＦを発現させるためのコピー数の多い発現ベクターを、以下の方法で調製した。この方法を図５に示す。Ｅ．ｃｏｌｉ中で機能する複製起点（ｏｒｉ）、アンピシリン耐性遺伝子、ｌａｃプロモーター／オペレーター、およびポリリンカー領域を含有するプラスミドｐＵＣ９（図５Ｄ；Ｖｉｅｉｒａ，Ｊ．およびＭｅｓｓｉｎｇ，Ｊ．，Ｇｅｎｅ（１９８２）１９：２５９）を、ＰｖｕＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）およびＥｃｏＲＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ
Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて、製造会社の指示に従って、３．２５時間消化した。
【００６４】
同時に、上記のようにＰｖｕＩおよびＥｃｏＲＩを用いて、ｐＴｓＦ１１ＤＮＡ（図５Ｂ）をインキュベートした。２つの制限酵素を用いた消化によって生成したｐＵＣ９およびｐＴｓＦ１１断片を、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼの存在下で連結した。連結反応を、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｂに形質転換した。形質転換体のアンピシリン耐性コロニーからのプラスミドＤＮＡを、プラスミドサイズおよび制限分析によって分析することにより、プラスミドを単離した。このプラスミドにおいて、ｐＴｓＦ１１の適当な断片（ｔｒｐプロモーター／オペレーター領域、ｂＦＧＦコーディング領域、転写終止配列、およびＡｍｐ遺伝子の５’末端半分を含有する約１．５ｋｂのＰｖｕＩ−ＥｃｏＲＩ断片）を、図５Ｅに示す方向で、ｐＵＣ９の約１．７ｋｂのＰｖｕＩ−ＥｃｏＲＩ断片（複製起点およびＡｍｐ遺伝子の３’末端半分を含有する）に連結した。このプラスミドをｐＴｓＦ−９と命名した。
【００６５】
製造会社の指示に従って、ＰｖｕＩＩおよびＥｃｏＲＩを用いてｐＴｓＦ−９
ＤＮＡをインキュベートした。デオキシヌクレオシドトリホスフェートおよびＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片とともにＤＮＡをインキュベートすることにより、ＥｃｏＲＩの開裂部位における突出部を満たした。Ｔ４ ＤＮＡリガーゼの存在下での平滑末端の連結により、ＤＮＡを再び円形にした。Ｅ．ｃｏｌｉ
Ｂをアンピシリン耐性に形質転換するために、連結反応を用いた。単一のコロニー形質転換体からのプラスミドＤＮＡを、プラスミドサイズおよび制限分析によって分析することにより、図５ＦにおいてｐＴｓＦ−９Δβｇａｌと示されているプラスミドを単離した。満たしたＥｃｏＲＩ部位およびＰｖｕＩＩ部位の平滑末端連結の結果、ｐＴｓＦ−９Δβｇａｌ中のＥｃｏＲＩ部位を回復させた。プラスミドｐＴｓＦ−９Δβｇａｌは、ｔｒｐプロモーター／オペレーターの制御下のｂＦＧＦコーディング配列、アンピシリン耐性遺伝子およびＥ．ｃｏｌｉ中で機能する複製起点を含有する。
【００６６】
（実施例４）
（ｂＦＧＦ（ＭＡＧＳ）をコードするＤＮＡ配列の生成）
ｐＴｓＦ１１（ｔｒｐプロモーター／オペレーター領域およびヒトのｂＦＧＦの１５５残基前駆体型をコードするＤＮＡを含有する）の約５９０ ｂｐのＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩＤＮＡ断片を、Ｍ１３ｍｐ９のＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ部位に連結することにより、プラスミドＦＧＦｔ７９１０を構築した。ＦＧＦｔ７９１０の一本鎖ＤＮＡが単離されると、ＺｏｌｌｅｒおよびＳｍｉｔｈ，前出に記載されているように、インビトロ変異誘発を実行した。上記インビトロ変異誘発は、ＡＴＧ開始コドンによってコードされるメチオニンの直後の２つのアラニンのうちの１つのためのコドンを欠いた、ｂＦＧＦのＮ末端の一部位をコーディングする合成オリゴヌクレオチドを用いて行った。この変異誘発の結果、以下に示すアラニン用のコドンのうちの１つが除去された。
【００６７】
【化２】
【００６８】
一本鎖ＤＮＡ１μｇを、リン酸化した変異誘発性のオリゴヌクレオチド５’−ｐＧＴＡＴＣＡＣＡＴＡＴＧＧＣＴＧＧＴＴＣＴＡＴＣ−３’（配列番号２６）５ナノグラムおよびＭ１３万能配列プライマー（Ｐ．Ｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓから購入した１７ ｍｅｒ）１ナノグラムと、５５℃で５から１５分間、１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５および１０ ｍＭ ＭｇＣｌ２を含有する溶液０．０１ｍｌ中でハイブリダイズした。反応液を室温まで冷却し、その後、デオキシヌクレオシドトリホスフェートｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびＴＴＰ各々０．１２ ｍＭ、ＤＮＡポリメラーゼＩ（Ｂｏｅ
ｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）のクレノウ断片５ユニット、およびＴ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）２０ユニットを含有する溶液０．０１ ｍｌを添加し、１５℃で４−６時間インキュベートした。その後、反応液の一部（０．００２ ｍｌ）を、競合するＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０１細菌に添加し、３７℃でＬ寒天皿上で一晩培養した。得られたＭ１３プラークのＤＮＡを、２つのニトロセルロースフィルターの各々に移し、８０℃で減圧下で２時間焼成し、その後、４２℃で２時間、プレハイブリダイゼーション溶液中でインキュベートした。プレハイブリダイゼーション溶液は、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは１５０
ｍＭ ＮａＣｌ，１５ ｍＭクエン酸ナトリウム，ｐＨ７．０である），０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、２×デンハルツ（Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ）（０．０４％フィコール、０．０４％ポリビニルピロリドン、０．０４％ウシ血清アルブミン）、および変性サケ精子のＤＮＡ０．４ｍｇ／ｍｌを含有する。その後、［γ−３２Ｐ］−ＡＴＰおよびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼで標識された５’末端であった変異誘発性オリゴヌクレオチドを含有する新に調製したプレハイブリダイゼーション溶液を用いて、４２℃で３時間、フィルターをインキュベートした。その後、フィルターを、４×ＳＳＣを用いて室温で１５分間洗浄し、６５℃で１５分間一回洗浄し、室温でＴＭＡＣｌ溶液（３Ｍテトラメチルアンモニウムクロライド、５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、２ ｍＭ
ＥＤＴＡ、０．１％ＳＤＳ）中で一回洗浄し、６５℃でＴＭＡＣｌ溶液中で一回洗浄し、その後、得られたフィルターを、Ｘ線フィルムを室温で一晩露光するために用いた。その後、Ｘ線フィルム上の暗い複写が陽性であるクローンを元の皿から取り出した。ＤＮＡを単離して、その後、ジデオキシ配列分析法によって、変異した配列を検出するために分析した。変異したＭ１３クローンの複製型ＤＮＡを調製し、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いて消化し、変異した塩基性ＦＧＦをコードするＤＮＡ断片を、アガローゼゲル電気泳動によって単離した。この断片中の、ｂＦＧＦコーディング領域の配列を図２に示す。
【００６９】
（実施例５）
（ｂＦＧＦ（ＭＡＧＳ）のための発現ベクターの構築）
図６に示す方法に従って、ｂＦＧＦ（ＭＡＧＳ）をコードするＤＮＡ断片の挿入に適した発現ベクターを調製した。上記のプラスミドｐＴｒｐ−２３３（図５Ａ、図６Ａ）を製造会社の指示に従ってＥｃｏＲＩおよびＰｖｕＩを用いて消化し、ｔｒｐプロモーター／オペレーターを含有する断片を単離した。同時に、ＥｃｏＲＩおよびＰｖｕＩを用いて、ｐＵＣ９を消化し、複製起点を有する断片を単離した。単離した断片をＴ４ ＤＮＡの存在下で連結することにより、ｔｒｐプロモーター／オペレーターおよびｐＴｒｐ−２３３と複製起点とからのポリリンカー領域、ｌａｃプロモーター／オペレーターおよびｐＵＣ９からのポリリンカーを含有するプラスミドであるｐＴｒｐ−９を生成した（図６Ｃ）。ＥｃｏＲＩおよびＰｖｕＩＩを用いてｐＴｒｐ−９を消化し、上記のように、ＤＮＡポリメラーゼＩ、クレノウ断片およびデオキシヌクレオシドトリホスフフェートを用いてＥｃｏＲＩ末端を満たした。Ｔ４ ＤＮＡリガーゼの存在下で平滑末端を連結することにより、ＤＮＡを再び円形にした。Ｅ．ｃｏｌｉ Ｂをアンピシリン耐性に形質転換するために、連結反応を用いた。単一コロニー形質転換体からのプラスミドＤＮＡを、プラスミドサイズおよび制限分析によって分析することにより、ｐＴｓＦ−９Δβｇａｌ−ＧＭ−２（図６Ｄ）と示されたプラスミドを単離した。
【００７０】
プラスミドｐＴｓＦ−９Δβｇａｌ−ＧＭ−２を、製造会社の指示に従ってＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いてインキュベートし、アンピシリン耐性遺伝子および複製起点を含有する大きな断片をアガローゼゲル上で単離した。その後、ｂＦＧＦ（ＭＡＧＳ）コーディング配列およびｔｒｐプロモーター／オペレーターを含有するＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片（実施例４）をＴ４ ＤＮＡリガーゼの存在下で、ｐＴｓＦ−９Δβｇａ
ｌ−ＧＭ−２の、単離した断片に連結した。競合するＥ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０細胞を形質転換するために連結を用い、その後、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０細胞を、アンピシリン１００ μｇ／ｍｌを添加したＬ寒天皿上で一晩増殖させた。コロニーを選択して、アンピシリン１００ μｇ／ｍｌを添加したＬ肉汁中で増殖させ、その後、プラスミドＤＮＡを細菌から単離して制限消化によって分析することにより、所望の構築を確認した。得られたプラスミドはｐＴｓＦ−９Δβｇａｌ（ＭＡＧＳ）と命名されているが、これは、ｂＦＧＦコーディング配列に代えてｂＦＧＦ（ＭＡＧＳ）コーディング配列を含有する以外は、ｐＴｓＦ−９Δβｇａｌと同一である。
【００７１】
（実施例６）
（ｂＦＧＦおよびｂＦＧＦ（ＭＡＧＳ）の発現）
ｐＴｓＦ−９ΔβｇａｌおよびｐＴｓＦ−９Δβｇａｌ（ＭＡＧＳ）のプラスミドを別々にＥ．ｃｏｌｉのＢ細胞に形質転換した。単コロニーを用いて培養物をＬ＋ａｍｐ培地に植え付けた後、３０℃で５時間増殖させた。次にこれらの培養物を用いて発現培養物（０．５％のカサミノ酸（ｃａｓａｍｉｎｏ ａｃｉｄ）、０．４％のグルコース、２μｇ／ｍｌのチアミン、０．１ｍＭのＣａＣｌ２、０．８ｍＭのＭｇＳＯ４、および５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＭ９塩に１から１００倍に希釈したもの）を接種した。５０μｇ／ｍｌの３−β−インドールアクリル酸を添加して、ｔｒｐプロモーターを誘導して、培養物を一夜３０℃で増殖した。１４から１８時間後に、Ａ５５０を測定して、１単位吸光度の細胞ペレットを１００μｌのＳＤＳ含有ポリアクリルアミドゲル負荷用緩衝液に再懸濁して、煮沸した。得た１０μｌの上清を１５％のアルクリアミド−ＳＤＳゲルに負荷して、電気泳動にかけた。ゲルをクーマシーブルーで染色した。図７は、レーン１に分子量マーカーを伴った染色したゲルの写真である。レーン２および３に、ｐＴｓＦ−９Δβｇａｌ形質転換細胞の２つの培養物から抽出したタンパク質を負荷した。レーン４および５に、ｐＴｓＦ−９Δβｇａｌ（ＭＡＧＳ）形質転換細胞の２つの培養物から抽出したタンパク質を負荷した。レーン６は、ｂＦＧＦ標準を含有する。レーン４および５のｂＦＧＦ（ＭＡＧＳ）に対応するバンドは、レーン２および３のｂＦＧＦに対応するバンドより視覚的に暗い。
【００７２】
レーン２から５の、様々な種類のタンパク質の相対濃度をスキャニング濃度計により測定した。図８Ａから８Ｄはレーン２から５のそれぞれの濃度をプロットしたものである。ｂＦＧＦまたはｂＦＧＦ（ＭＡＧＳ）のピークは矢印で示されている。全細胞タンパク質に比例して発現するｂＦＧＦまたはｂＦＧＦ（ＭＡＧＳ）の量は、濃度計によるプロットのカーブの下の面積に基づいて各培養物について計算される。ｐＴｓＦ−９Δβｇａｌで形質転換された２つの培養物（図８Ａ−８Ｂ）の平均発現レベルは、全細胞タンパク質の６．７％であり、一方、ｐＴｓＦ−９Δβｇａｌ（ＭＡＧＳ）で形質転換された２つの培養物（図８Ｃ−８Ｄ）の平均発現レベルは、全細胞タンパク質の１０．８％であった。
【００７３】
（実施例７）
（ｂＦＧＦ（ＭＡＧＳ）のＮ末端配列の決定）
実施例６と同様の手順により、ｐＴｓＦ−９Δβｇａｌ（ＭＡＧＳ）で形質転換されたＥ．ｃｏｌｉＢ細胞をカサミノ酸および５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＭ９培地２リットルで増殖した。培養物を光学濃度が０．５８（５５０ｎｍで測定）になるまで増殖し、５０μｇ／ｍｌの３−β−インドールアクリル酸で誘導し、その後振盪させながら一夜３０℃でインキュベートした。培養物を遠心分離機にかけ、細胞ペレットを、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、５ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのフェニルメチルスルフォニルフルオライド、および０，５ｍｇ／ｍｌのリゾチーム含有溶液３０ｍｌに再懸濁した。氷の上に３０分置いた後、上清に超音波をあてて細胞を破砕した。ＲＮアーゼおよびＤＮアーゼを各１００μｇ添加した。氷の上に３０分置いた後、混合物を遠心分離機にかけ、上清を精製のため取り除いた。
【００７４】
上清を、２０ｍＭのリン酸ナトリウムｐＨ７、５ｍＭのＥＤＴＡで平衡化したＳＰ−セファデックスのカラム（２．５ｃｍ×２ｃｍ）に供した。カラムを、２８０ｎｍでの吸光度が基準レベルに戻るまで同じ緩衝液で洗浄した。タンパク質を２０ｍＭのリン酸ナトリウムｐＨ７、５ｍＭのＥＤＴＡ、５００ｍＭのＮａＣｌでカラムから溶離させた。
ＳＰ−セファデックスカラムから５００ｍＭのＮａＣｌをぬいて、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣＬ、ｐＨ７．５、５ｍＭのＥＤＴＡ、６００ｍＭのＮａＣｌで平衡化したヘパリン−セファロースのカラム（２．５ｃｍ×２ｃｍ）に負荷した。カラムを、２８０ｎｍでの吸光度が基準レベルに戻るまで同じ緩衝液で洗浄した。タンパク質を２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、５ｍＭのＥＤＴＡ、２ＭのＮａＣｌで溶離させた。
このようにして得られたｂＦＧＦ（ＭＡＧＳ）を自動ガス相シークエネーターを用いてエドマン分解法によりＮ末端アミノ酸配列を分析した。多量のタンパク質をシークエネーターに負荷すると、極少量の、すなわち１〜２％の、Ｎ末端配列Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−を有するタンパク質が検出され、残りは、Ｎ末端配列Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒを有するタンパク質であった。ｂＦＧＦをｐＴｓＦ−９Δβｇａｌで形質転換されたＥ．ｃｏｌｉＢ細胞を用いて、本質的に同様の方法で生産して精製すると、得られたタンパク質は約７０％のＡｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−および３０％のＡｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−を含有する混合Ｎ末端配列を示した。
（配列表）
【００７５】
【００７６】
【００７７】
【００７８】
【００７９】
【００８０】
【００８１】
【００８２】
【００８３】
【００８４】
【００８５】
【図面の簡単な説明】
【００８６】
【図１Ａ】図１Ａは、ヒトｂＦＧＦコードする単離された天然のｃＤＮＡ配列、ならびに１５５−残基一次翻訳産物の推定アミノ酸配列を示す（配列番号１および配列番号２）。
【図１Ｂ】図ｌＢは、ウシｂＦＧＦコードする単離された天然のｃＤＮＡ配列、ならびに１５５−残基一次翻訳産物の推定アミノ酸配列を示す（配列番号３および配列番号４）。
【図２】図２は、ｂＦＧＦをコードするＤＮＡ配列を示す（配列番号５および配列番号６）。このＤＮＡ配列は、図１Ｂのウシ配列の５’末端の部分（図示されているＨｈａＩ部位から上流）を、天然のウシ配列と比較してＧ＋Ｃの含有量が少ない合成ＤＮＡ配列と置き換え、Ｎ末端メチオニンの直後にある２つのアラニン残基のうちの１つの残基のコドンを欠失させ、図１Ｂのコドン１２１および１３７を、それぞれＡＣＣおよびＴＣＣに変換させ、ｃＤＮＡ配列が（ｉ）Ｎ末端アラニンの１つを欠失しているヒトｂＦＧＦをコードし、（ｉｉ）その５’および３’末端を、それぞれＮｄｅＩ部位およびＨｉｎｄＩＩＩ部位ではさまれるように、翻訳終止コドンの３’側にＨｉｎｄＩＩＩ制限エンドヌクレアーゼ部位を形成することによって、生産された。
【図３】図３は、本発明のＤＮＡ配列の制御発現に使用されるｔｒｐプロモーター／オペレーター配列（Ｂ）（配列番号９および配列番号１０）を結合することにより形成した、一連の合成オリゴデオキシヌクレオチド（Ａ）（配列番号７および配列番号８）を示す。
【図４】図４は、ヒトｂＦＧＦをコードするＤＮＡ配列が挿入されてｐＴｓＦ１１を形成する、ｐＴｒｐ−２３３の構築を示す。
【図５Ａ】図５Ａは、ヒトｂＦＧＦの発現ベクターである、ｐＴｓＦ−９Δβｇａｌの調製を模式的に示す。
【図５Ｂ】図５Ｂは、図５Ａの続きである。
【図６】図６は、ｂＦＧＦ（ＭＡＧＳ）コーディング配列の挿入に適した発現ベクターである、ｐＴｓＦ−９Δβｇａｌ−ＧＭ−２の調製を模式的に示す。
【図７】図７は、クーマシーブルーで染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの写真である。このゲル上では、ヒトｂＦＧＦをコードするＤＮＡ配列で形質転換されたＥ．ｃｏｌｉの発現産物が、ヒトｂＦＧＦのアラニン欠失形態をコードする本発明のＤＮＡ配列で形質転換されたＥ．ｃｏｌｉの発現産物に沿って電気泳動された。
【図８Ａ】図８Ａ、８Ｂ、８Ｃおよび８Ｄは、図７のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのレーン２から５におけるそれぞれのタンパク質の一連の走査デンシトメトリーによるプロットである。
【図８Ｂ】図８Ａ、８Ｂ、８Ｃおよび８Ｄは、図７のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのレーン２から５におけるそれぞれのタンパク質の一連の走査デンシトメトリーによるプロットである。
【図８Ｃ】図８Ａ、８Ｂ、８Ｃおよび８Ｄは、図７のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのレーン２から５におけるそれぞれのタンパク質の一連の走査デンシトメトリーによるプロットである。
【図８Ｄ】図８Ａ、８Ｂ、８Ｃおよび８Ｄは、図７のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのレーン２から５におけるそれぞれのタンパク質の一連の走査デンシトメトリーによるプロットである。
【技術分野】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、増殖因子の組み換え生産の分野に関する。特に、本発明は、同一のＮ末端を有するヒト塩基性繊維芽細胞増殖因子の生産に関する。本発明は、同一のＮ末端を有するヒト塩基性繊維芽細胞増殖因子の高レベルな発現および回収の手段および方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）は、毛細管内皮細胞を含む広範囲な細胞型において強力なマイトジェン活性を発現するタンパク質である。ウシの下垂体由来のｂＦＧＦの完全なアミノ酸配列が決定されている（Ｅｓｃｈ，Ｆ．ら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ（ＵＳＡ）（１９８５）８２：６５０７）。ヒトｂＦＧＦをコードするクローニングされたＤＮＡ配列は単離され、そのアミノ酸配列のヒトタンパク質の１３１−、１４６−および１５４−アミノ酸形態は決定されている（１９８７年３月２６日にＷＯ ８７／０１７２８として公開されているＰＣＴ出願 ＵＳ８６／０１８７９、Ａｂｒａｈａｍ，Ｊ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８６）２３３：５４５、Ａｂｒａｈａｍ，Ｊ．ら、Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ（１９８６）５：２５２３）。クローニングされたＤＮＡ配列を分析すると、可能な開始メチオニンコドンが、ｂＦＧＦの１５４−アミノ酸形態のコーディング配列のすぐ上流側に存在することが示され、このことは、（ｉ）この遺伝子からの一次翻訳産物の長さが１５５個の残基で、
（ｉｉ）１５４−アミノ酸形態が、開始メチオニンの翻訳後除去によって得られることを示している。次いで、Ｆｌｏｒｋｉｅｗｉｃｚ、Ｒ．およびＳｏｍｍｅｒ，Ａ．（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ（ＵＳＡ）（１９８９）８６：３９７８−３９８１）およびＰｒａｔｓ，Ｈ．ら、（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ（ＵＳＡ）（１９８９）８６：１８３６−１８４０）は、１５５−残基一次翻訳産物のメチオニン開始コドンの上流側に存在するロイシンコドンにおける、代替翻訳開始の結果として生産され得る、より長い形態のｂＦＧＦの存在を報告した。
【０００３】
部分的には、毛細管内皮細胞における強力なマイトジェン活性のために、ｂＦＧＦは、血管形成、すなわち新しい毛細血管を形成する工程を促進する。従って、ｂＦＧＦは、創傷が適切に治癒する場合の、新しい毛細血管床の形成が必要であるときに、創傷治癒剤として非常に有用である。
【０００４】
ヒトｂＦＧＦをコードする、単離されクローニングされたＤＮＡ配列を入手することによって、組み換えＤＮＡ技術を用いて、これらの配列を含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞においてタンパク質を発現し、そのタンパク質を臨床的使用のために回収することが可能になった。Ｎ末端メチオニンをプロセシングし得る原核および真核宿主において、ヒトｂＦＧＦおよびウシの等価物の１５５−残基一次翻訳産物を発現させることにより、微小不均一性のＮ末端を有するタンパク質が生産されることが観察されている（例えば、Ｂａｒｒ、Ｐｈｉｌｉｐ Ｊ．ら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ（１９８８）２６３（３１）：１６４７１を参照のこと）。Ｅ．ｃｏｌｉにおいてヒトｂＦＧＦの１５５−残基一次翻訳産物を発現させると、約７０／３０の比で、混合Ｎ末端配列Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−／Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−を有するタンパク質が回収されることを一貫して観察してきた。この微小不均一性は、分子の生物活性に影響を与えないようであるが、一般に、臨床用には、同一の物質、すなわち、分子間で実質的に同一のＮ末端配列を有するタンパク質を得ることが望まれると考えられる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、異なるＮ末端アミノ酸配列を有するヒト塩基性繊維芽細胞増殖因子のどの種も実質的に含んでいない、Ｎ末端にアミノ酸配列Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−を有するヒト塩基性繊維芽細胞増殖因子を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明によれば、Ｎ末端メチオニン残基が翻訳後欠失される宿主細胞内で、該Ｎ末端メチオニンの直後の２個のアラニン残基のうち少なくとも１個がない、哺乳類の塩基性繊維芽増殖因子の前駆体型の１５５アミノ酸をコードするＤＮＡ配列を発現する、工程；および該Ｎ末端メチオニン残基のない発現されたタンパク質を回収する、工程；を包含する、同一のＮ末端を有する塩基性繊維芽増殖因子を生産する方法が提供される。
【０００７】
１つの実施態様では、上記発現されるＤＮＡコーディング配列は、Ｎ末端メチオニン残基の直後にある２個のアラニン残基の１個が欠失されたヒト塩基性繊維芽細胞増殖因子の前駆体型の１５５アミノ酸をコードする配列を含有する。
【０００８】
好ましい実施態様では、上記発現されるＤＮＡコーディング配列は、塩基７から９のアラニン（ＧＣＣ）コドンを除いた図１のコーディング配列を含有する。
【０００９】
別の好ましい実施態様では、上記発現されるＤＮＡコーディング配列は、図２のコーディング配列である。
【００１０】
別の実施態様では、上記塩基性繊維芽細胞増殖因子は、宿主細胞によって発現された全タンパク質の少なくとも１０％のレベルで発現される。
【００１１】
本発明によれば、同一Ｎ末端を有する塩基性繊維芽細胞増殖因子を発現するためのベクターであって、該Ｎ末端メチオニン残基の直後にある２個のアラニン残基の１個がない、哺乳類の塩基性繊維芽細胞増殖因子の前駆体型の１５５アミノ酸をコードするＤＮＡ配列を含有し、該ＤＮＡ配列が、宿主細胞内でその発現を導き得る調節配列に作動可能に連結されている、ベクターが提供される。
【００１２】
１つの実施態様では、上記塩基性繊維芽細胞増殖因子をコードするＤＮＡ配列は、Ｎ末端メチオニン残基の直後にある２個のアラニン残基の１個が欠失された、ヒト塩基性繊維芽細胞増殖因子の前駆体型の１５５アミノ酸をコードする配列を含有する。
【００１３】
好ましい実施態様では、上記増殖因子のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列は、塩基７から９のアラニン（ＧＣＣ）コドンを除いた図１のコーディング配列を含有する。
【００１４】
別の好ましい実施態様では、上記増殖因子のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列は、図２のコーディング配列を含有する。
【００１５】
なお別の好ましい実施態様では、上記調節配列は、ｔｒｐプロモーター−オペレーター配列を含有する。
【００１６】
本発明によれば、上記のベクターで形質転換された、宿主細胞が提供される。
【００１７】
１つの実施態様では、上記細胞はＥ．ｃｏｌｉ細胞である。
【００１８】
好ましい実施態様では、上記宿主細胞はＥ．ｃｏｌｉＢ細胞である。
【００１９】
本発明によれば、Ｎ末端にアミノ酸配列Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−を有するヒト塩基性繊維芽細胞増殖因子であって、異なるＮ末端アミノ酸配列を有するヒト塩基性繊維芽細胞増殖因子のどの種も実質的に含んでいない、ヒト塩基性繊維芽細胞増殖因子が提供される。
【００２０】
１つの実施態様では、上記のヒト塩基性繊維芽細胞増殖因子は、図１のアミノ酸位３のＡｌａで始まる１５３アミノ酸配列を有する。
【００２１】
（発明の要旨）
本発明は、実質的に同一のＮ末端を有するヒトｂＦＧＦの高レベルな発現の方法および手段を提供する。「実質的に同一」とは、Ｅｄｍａｎ分解法による配列分析によって、ｂＦＧＦが、９５％、好ましくは９８％より多くの、同一Ｎ末端を有する物質を含むことが示されることを意味する。本発明は、ヒトｂＦＧＦの１５５−アミノ酸一次翻訳産物のＮ末端メチオニン残基の直後にある２つのアラニン残基の１つをコードするコドンが欠失すると、Ｎ末端が同一のヒトｂＦＧＦタンパク質が発現および回収されるという発見に基づいている。特にＮ末端メチオニンの翻訳後プロセシングに次いで、同一なＮ末端配列Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−を有する長さが１５３個のアミノ酸のヒトｂＦＧＦが生産される。さらに、以下の実施例３および５におけるＥ．ｃｏｌｉ発現ベクターを用いて、Ａｌａが欠失した配列が発現すると、その発現レベルは、Ａｌａを欠失していない対応のタンパク質配列の発現レベルよりもおよそ５０％から１００％高くなることが発見されている。
【００２２】
従って、本発明により同一のＮ末端を有するヒトｂＦＧＦを生産する方法が提供され、該方法は、Ｎ末端メチオニンを翻訳後除去し得る宿主細胞において、Ｎ末端メチオニンの直後に存在する２つのアラニン残基のうちの１つの残基のコドンが欠失している、ヒトｂＦＧＦの１５５−アミノ酸形態のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を発現する工程と、そのタンパク質を回収する工程と、を包含する。また、同一のＮ末端を有するヒト塩基性ＦＧＦの高レベルな発現および回収のためのベクターが提供される。このベクターは、ヒトｂＦＧＦの１５５−アミノ酸形態をコードするＤＮＡ配列を含み、このＤＮＡ配列からは、Ｎ末端メチオニンの直後にある２つのアラニンのうちの１つのアラニンのコドンが欠失しており、該ＤＮＡ配列は、宿主細胞においてその発現を方向づけ得る制御配列に、作動可能なように連結される。さらに、Ｎ末端配列Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−を有するヒトｂＦＧＦ配列の１５３個のアミノ酸を有する同一のタンパク質を含むヒトｂＦＧＦ組成物が提供される。
【発明の効果】
【００２３】
本発明によれば、異なるＮ末端アミノ酸配列を有するヒト塩基性繊維芽細胞増殖因子のどの種も実質的に含んでいない、Ｎ末端にアミノ酸配列Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−を有するヒト塩基性繊維芽細胞増殖因子が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
（発明の詳細な説明）
本発明は、ヒトｂＦＧＦの１５５−アミノ酸前駆体をコードし、Ｎ末端メチオニンのすぐ後ろの２つのアラニン残基のうち１つのアラニン残基のコドンを欠失しているＤＮＡ配列を使用する。以下では、ヒトｂＦＧＦをコードし改変された形を、一次翻訳産物がＮ末端配列Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−を有することを示すために「ｂＦＧＦ（ＭＡＧＳ）」と表す。このヒトｂＦＧＦおよびウシｂＦＧＦの１５５−残基形態のアミノ酸配列を、図１Ａおよび図１Ｂにそれぞれ示す。図１Ａおよび図１Ｂに示されるＤＮＡ配列は、ここに参考として援用されているＰＣＴ公報第ＷＯ ８７／０１７２８号に記載のように
決定された、天然のコーディング配列である。これらの配列のいずれかが、部位特異的変異誘発（Ｚｏｌｌｅｒ，Ｍ．Ｊ．，およびＳｍｉｔｈ，Ｍ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ（１９８２）１０：６４８７およびＡｄｅｌｍａｎ，Ｊ．Ｐ．ら．，ＤＮＡ（１９８３）２：１８３）によって改変され得、Ｎ末端メチオニンのすぐ後のアラニン残基の１つを欠いたヒトｂＦＧＦの類似体をコードするＤＮＡを生産する。周知のＤＮＡコードの変性により、他のＤＮＡ配列がＮ末端アラニン残基の１つを欠く所望のヒトｂＦＧＦ配列をコードする場合は、そのＤＮＡ配列が使用し得ることが理解される。好適な実施態様においては、アラニン残基を有しないヒトｂＦＧＦをコードするＤＮＡ配列が提供される。このような実施態様では、アラニン残基を欠くヒトｂＦＧＦをコードしているＤＮＡ配列が提供され、そこでは分子のＮ末端部をコードするＤＮＡの実質的な部分が、天然のＤＮＡ配列と比較するとＧ＋Ｃ含有量が減少しているように改変される。
【００２５】
所望するならば、ｂＦＧＦ（ＭＡＧＳ）をコードするＤＮＡ配列全体は、重複する合成オリゴヌクレオチドを連結することによって合成的に生産され、このように連結されて所望のＤＮＡ配列全体を形成する。個々のオリゴヌクレオチドは、Ｅｄｇｅ，ら，Ｎａｔｕｒｅ（１９８１）２９２：７５６およびＤｕｃｋｗｏｒｔｈ，ら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ（１９８１）９：１６９１に記載のホスホトリエステル法またはＢｅａｕｃａｇｅ，Ｓ．Ｌ．およびＣａｒｕｔｈｅｒｓ，Ｍ．Ｈ．，Ｔｅｔ Ｌｅｔｔｓ（１９８１）２２：１８５９およびＭａｔｔｅｕｃｃｉ，Ｍ．Ｄ．およびＣａｒｕｔｈｅｒｓ，Ｍ．Ｈ．，Ｊ Ａｍ
Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ（１９８１）１０３：３１８５に記載のホスホルアミダイト法によって調製し得、市販で入手可能な自動オリゴヌクレオチド合成機によっても調製し得る。このアプローチはかなりの長さの遺伝子全体を合成するために効果的に用いられている。
【００２６】
好ましくは、ｂＦＧＦ（ＭＡＧＳ）をコードするＤＮＡ配列は、ヒトｂＦＧＦの１５５−アミノ酸前駆体全長をコードするＤＮＡ配列のＮ末端アラニンコドンの１つを取り除くための、部位特異的変異誘発によって生産される。部位特異的変異誘発は、上記Ｚｏｌｌｅｒ，Ｍ．Ｊ．およびＳｍｉｔｈ，Ｍ．および上記Ａｄｅｌｍａｎ，Ｊ．Ｐ．に開示されている工程を用いて行ない得る。変異誘発は、ヒトｂＦＧＦの１５５−アミノ酸形態をコードする一本鎖ＤＮＡ（バクテリオファージＭ１３の誘導体に含まれる）上で、限定された誤対合を除き所望する変異（即ち、ＡＴＧ出発（メチオニン）コドンのすぐ後ろのアラニンコドンの１つを欠失）を示す一本鎖ＤＮＡに相補的な合成オリゴヌクレオチドプライマーを使用して行なわれる。
【００２７】
オリゴヌクレオチドプライマーの大きさは、変異が誘発される遺伝子領域ヘプライマーが安定してハイブリダイズする必要性および現在使用可能なオリゴヌクレオチド合成法の限界により決定される。オリゴヌクレオチド特異性の変異において用いられるオリゴヌクレオチドをデザインする際に考慮されるべき事柄（例えば、変異部位をはさむ部分の長さ、全体の長さ）は、Ｓｍｉｔｈ，ＭおよびＧｉｌｌａｍ，Ｓ．によるＧｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｐｌｅｎｕｍ
Ｐｒｅｓｓ（１９８１）３：１−３２に記載されている。一般的に、オリゴヌクレオチドの全体の長さは、変異部位からの５’および３’伸長部がＤＮＡポリメラーゼのエキソヌレアーゼ活性による変異の修正を回避するのに充分な長さであり、変異部位において、安定かつ固有のハイブリダイゼーションを最適に行えるものである。本発明にしたがって変異誘発に用いられるオリゴヌクレオチドは、通常、約１８から約４５の塩基を有し、好ましくは約２３から約２７の塩基を有する。それらは変化したまたは欠失したコドンの３’側に少なくとも約９個の塩基を有する。
【００２８】
アラニン残基の１つのコドンを欠く合成ヌクレオチドプライマーは、１５５−アミノ酸ｂＦＧＦをコードするＤＮＡ配列の鎖がクローニングされたＭ１３、ｆｄ、またはφＸ１
７４のような一本鎖ファージにハイブリダイズされる。ファージが遺伝子のセンス鎖またはアンチセンス鎖のいずれかを有し得ることが好ましい。ファージがアンチセンス鎖を有する場合は、プライマーは、欠失するアラニンを指定するコドンの欠失を除いて、変異する領域のコーディング配列と同一である。ファージがセンス鎖を有する場合は、プライマーは、欠失するアラニン残基をコードするものと相補的であるトリプレットの欠失を除いて、変異する領域のコーディング配列と相補的である。
【００２９】
ハイブリダイゼーションにおいて使用し得る条件は、上記Ｓｍｉｔｈ，ＭおよびＧｉｌｌａｍ，Ｓ．によって記載されている。一般に、温度は、約０℃から７０℃の間の範囲であり、さらに一般的には約１０℃から５０℃である。ハイブリダイゼーションの後、プライマーは、ＤＮＡポリメラーゼＩ（Ｋｌｅｎｏｗフラグメント）、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ、または他の適切なＤＮＡポリメラーゼとの反応により、ファージＤＮＡ上で伸長される。得られたｄｓＤＮＡは、Ｔ４リガーゼのようなＤＮＡリガーゼで閉環ｄｓＤＮＡに変換される。一本鎖領域を有するＤＮＡ分子は、Ｓ１エンドヌクレアーゼ処理により破壊し得る。あるいは、部分的二本鎖の調製物は、リガーゼまたはＳ１の処理を施さずに直接的に使用し得る。
【００３０】
得られた全部または一部が二本鎖になったＤＮＡは、ファージを保持する宿主バクテリア中に形質転換される。形質転換されたバクテリアの培養物は寒天表面にプレートされ、ファージを有する個々の細胞からのプラーク形成を可能にする。
【００３１】
理論的には、新しいプラークの５０％は、一本鎖に変異形を有するファージであり；５０％はオリジナルの配列を有している。得られたプラークは、レプリカとしてニトロセルロースフィルターまたは他の支持膜の上へ載せられた後、洗浄され、変性され、その後キナーゼ処理した合成プライマーとハイブリダイズされる。洗浄は、正確なマッチの結合は起こるが、オリジナル鎖とのミスマッチが起きるのは防がれるのに充分な温度で実施される。その後、プローブとハイブリダイズするプラークは取り出され、培養され、そしてＤＮＡが回収される。
【００３２】
さらに、本発明の範囲内には、アミノ酸配列におけるさらなる変化がＮ末端Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−の下流で起こるアラニンを欠失したヒトｂＦＧＦの１５５−アミノ酸配列形態の生産が含まれる。ここに参考として援用されているＰＣＴ公報第ＷＯ８９／００１９８号は、ｂＦＧＦの多くの類似体を開示しており、これらの類似体は天然のｂＦＧＦ配列のアミノ酸残基が分子特性において効果的な変化を起こすために他のアミノ酸で置換されている。特に、このＰＣＴ公報では、へパリン結合領域におけるアミノ酸残基が、１５５残基一次翻訳産物の１２８から１３８までの位置で、中性または陰性に荷電したアミノ酸残基によって置換されている類似対を開示している。さらに、１つ以上の天然のシステイン残基、好ましくは、１５５−残基一次翻訳産物の７８から９６位が、中性アミノ酸残基で置換されている類似体も開示されている。これらのアミノ酸置換物はいずれも、本発明のアラニン欠失物と共同させ得る。本発明の範囲から特別に除外されるのは、ＰＣＴ ＷＯ８９／００１９８に開示されているｂＦＧＦのＮ末端が短くなったものである。Ｎ末端がＭｅｔ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−であるその下流のアミノ酸配列の改変は、ＰＣＴ ＷＯ ８９／０１９８に開示されているＤＮＡの部位特異的変異により行なわれ得、この変異は、アラニンコドンを欠失する変異の前または後のいずれかで行なわれ得る。
【００３３】
ヒトｂＦＧＦ（ＭＡＧＳ）に対応するヒト以外の哺乳類のｂＦＧＦもまた、本発明によって提供し得る。例えば、ウシｂＦＧＦの１５５−残基前駆体のアミノ酸配列は、ヒト前駆体タンパク質とアミノ酸が２つ異なる。即ち、ウシタンパク質は、１２１位にＴｈｒではなくＳｅｒを有しており、１３７位にＳｅｒではなくＰｒｏを有している（１５５−ア
ミノ酸配列に基づくナンバーリングシステムによる）。このように、ヒトｂＦＧＦ（ＭＡＧＳ）に対応するウシタンパク質をコードするＤＮＡ配列は、図２のＤＮＡ配列の変異によって調製し得、１２０番および１３６番のアミノ酸残基に対応するコドンを変える。これは、各コドンにおいて１個のヌクレオチドの変異により達成される。
【００３４】
ｂＦＧＦ（ＭＡＧＳ）をコードするＤＮＡ配列を、適切な発現ベクターに挿入し、宿主細胞内のコーディング配列の発現を指示できる制御配列に作動可能なように結合する。「制御配列」とは、コーディング配列に適切に結合された場合に、その配列をそれが適合する宿主内において発現させる能力を有するＤＮＡ配列を示す。そのような制御配列は、少なくとも原核細胞および真核細胞の両方の宿主内のプロモーターを含み、そして任意にオペレーター配列、エンハンサーおよび転写終止シグナルを含む。特定の宿主において発現を行なう際に必要または有用なさらなる因子が使用し得る。「作動可能なように結合した」とは、成分が通常の機能を果たすように配置された並列形態を示す。このように、コーディング配列に作動可能なように結合した制御配列は、コーディング配列の発現を行なうことができる。当業者に周知のように、発現ベクターもまた、使用される宿主細胞内で機能する複製起点を有し得る。好ましくはベクターは、ベクターを有する宿主細胞の同定および選択を可能にする抗生物質耐性の遺伝子のような表現型マーカーも含有する。
【００３５】
発現ベクターは、適切な宿主細胞を形質転換するために使用される。原核および真核の両方の宿主が使用し得る。原核細胞としては非常に頻繁に、Ｅ．ｃｏｌｉの種々の株により代表される。しかし、他の微生物株も使用し得る。Ｅ．ｃｏｌｉは、ヒトｂＦＧＦの１５５−残基前駆体形態のＮ末端メチオニン残基を翻訳後プロセシングする能力を有する。Ｅ．ｃｏｌｉの有用な株としては、例えば、ＭＣ１０６１、ＤＨ１、ＲＲ１、Ｃ６００ｈｆｌ、Ｋ８０３、ＨＢ１０１、ＪＡ２２１、ＪＭ１０１、ＪＭ１０３、およびＢを含み、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｂが好ましい宿主である。プラスミドベクターとしては、複製領域、選択可能なマーカーおよび宿主に適合する種由来の制御配列を含むものが使用される；例えばＥ．ｃｏｌｉは、典型的には２つのＳａｌｍｏｎｅｌｌａ種、およびＢｏｌｉｖａｒら，Ｇｅｎｅ（１９７７）２：９５による１つのＥ．ｃｏｌｉ株から得られたプラスミド部分を組み合わせて得られたプラスミドである、ｐＢＲ３２２由来のベクターを用いて形質変換される。ｐＢＲ３２２は、アンピシリンとテトラサイクリン耐性の遺伝子を有し、所望されるベクターを構築する際に維持または破壊し得る、複数の選択可能なマーカーを提供する。本明細書で定義される、リボソーム結合部位配列と共に、任意にオペレーターを有し、転写を開始するためのプロモーターを含む一般的に用いられる原核細胞の制御配列には、β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）およびラクトース（ｌａｃ）プロモーターシステム（Ｃｈａｎｇら，Ｎａｔｕｒｅ（１９７７）１９８：１０５６）、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーターシステム（Ｇｏｅｄｄｅｌら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ（１９８０）８：４０５７）、Ｎ遺伝子リボソーム結合部位を有するラムダ由来のＰＬプロモーター（Ｓｈｉｍａｔａｋｅら，Ｎａｔｕｒｅ（１９８１）２９２：１２８）、およびｔｒｐ−ｌａｃ（ｔｒｃ）プロモーターシステム（Ａｍａｎｎ，Ｅ．およびＢｒｏｓｉｕｓ，Ｊ．，Ｇｅｎｅ（１９８５）４０：１８３）のような一般的に使用されるプロモーターを含む。
【００３６】
細菌に加えて、酵母またはチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞のような真核細胞もまた、宿主として使用し得る。当業者にとっては、種々の真核宿主との組み合わせに有用な制御配列、複製起点、マーカーなどは周知である。
【００３７】
ｂＦＧＦ（ＭＡＧＳ）のコーディング配列を含む発現ベクターを、宿主細胞を形質転換するために使用する。使用する宿主細胞に依存して、その細胞に適切な標準的技術を用いて形質転換を行なう。Ｃｏｈｅｎ，Ｓ．Ｎ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ（ＵＳＡ）（１９７２）６９：２１１０に記載の塩化カルシウムを使用したカルシウム処理
またはＭａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９８２）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，２５４ページおよびＨａｎａｈａｎ，Ｄ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ（１９８３）１６６：５５７−５８０に記載のＲｂＣｌ２法が、原核細胞または実質的に細胞壁バリアを有する他の細胞に使用し得る。そのような細胞壁を持たない哺乳類の細胞には、Ｇｒａｈａｍおよびｖａｎ ｄｅｒ Ｅｂ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９７８）５２：５４６のリン酸カルシウム沈澱法が使用し得、任意にＷｉｇｌｅｒ，Ｍ．ら、Ｃｅｌｌ（１９７９）１６：７７７−７８５によって改変された方法が使用し得る。酵母への形質転換は、Ｂｅｇｇｓ，Ｊ．Ｄ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９７８）２７５：１０４−１０９またはＨｉｎｎｅｎ，Ａ．，ら，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ（ＵＳＡ）（１９７８）７５：１９２９の方法により実施し得る。
【００３８】
ｂＦＧＦ（ＭＡＧＳ）発現ベクターを有する形質転換体は、ベクター構築の際組み込まれる特定の表現型マーカーに依存して、周知の技術によって同定し得る。即ち、アンピシリンのような抗生物質の存在下での成長によって同定する。制限酵素分析またはジデオキシ法による配列決定のような種々の周知技術は、正しいベクター構築を確認するために使用し得る。
【００３９】
ｂＦＧＦ（ＭＡＧＳ）の発現は、特定のベクター構築と使用する宿主細胞に大きく依存し、当業者には容易に理解される条件下で行ない得る。ベクターが、ｔｒｐプロモーターのような誘導プロモーターの制御下にｂＦＧＦ（ＭＡＧＳ）のＤＮＡ配列を有する場合には、形質転換された宿主細胞を適切な成長媒体に植菌し、至適密度まで増殖するように使用し得；制御プロモーターからのｂＦＧＦ（ＭＡＧＳ）の発現は、その後、適切なインデューサー（例えばｔｒｐプロモーターの場合は、３−β−インドールアクリル酸）の付加によって誘導し得る。発現したｂＦＧＦ（ＭＡＧＳ）は、天然源からのｂＦＧＦの精製技術で使用される周知の技術により回収し得る。好適な精製工程においては、発現したタンパク質を含む形質転換体を、機械的または化学的に溶解し、タンパク質を放出させる。ＤＮａｓｅおよびＲＮａｓｅで処理した後に、反応物を遠心し、上清を市販で入手可能なヘパリン−セファロースカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｉｎｃ．）上に負荷する。カラムを塩濃度が約１．０Ｍまたはそれ以下のＮａＣｌ緩衝液で洗浄した後、このｂＦＧＦ（ＭＡＧＳ）は２．０Ｍ ＮａＣｌカラムから溶出し得る。所望されれば、ヘパリン−セファロースクロマトグラフィー段階は、繰り返し得、あるいはＳ／Ｐ ＳｅｐｈａｄｅｘまたはＭｏｎｏ Ｓ樹脂上でのイオン交換クロマトグラフィーのような他の周知のタンパク質精製段階と組み合わし得る。工業規模の生産においては、最終の形態中にわずかな量のヘパリンも含むことは好ましくないため、ヘパリン−セファロースクロマトグラフィーよりも銅キレートアフィニティクロマトグラフィーが好ましい。
【００４０】
極めて驚くべきことに、ｂＦＧＦ（ＭＡＧＳ）がＥ．ｃｏｌｉ Ｂで発現するとき、その発現レベルは、同一の宿主ベクターシステムおよび同一の発現条件を用いた対応する野生型（突然変異していない）ヒトｂＦＧＦの発現よりも、５０％から１００％大きいオーダーであることが見い出された。特に、本発明の方法は、ｂＦＧＦ（ＭＡＧＳ）を、宿主細胞により発現させたタンパク質全体の少なくとも１０％のレベルで発現させる。さらにＮ末端アミノ酸分析によると、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢでのｂＦＧＦ（ＭＡＧＳ）発現により、実質的に同一のＮ末端を有する最終タンパク質産物が得られることが示され、即ち、このタンパク質をＥｄｍａｎ分解法でＮ末端分析すると、ｂＦＧＦの９５％以上、好ましくは９８％以上が同一Ｎ末端を有することが示される。Ｅ．ｃｏｌｉのような原核細胞宿主は、ｂＦＧＦのＡＴＧ出発コドンによりコードされたＮ末端メチオニン残基を除去できることが分かっている。従って、本発明の方法によって、Ｎ末端配列がＡｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−の１５３アミノ酸残基を有するｂＦＧＦが回収される。
【００４１】
本発明により得られるｂＦＧＦ（ＭＡＧＳ）は、Ｎ末端配列がＡｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−であるか、または混合Ｎ末端を有し、対応するｂＦＧＦと同一の有用性を有している。このｂＦＧＦ（ＭＡＧＳ）は、創傷の治癒を促進するために有用である。精製ｂＦＧＦ（ＭＡＧＳ）は一般に、外傷を負った組織に血管新生および治癒を促すために、局所的に適用される。適切な基質としては、火傷、皮膚潰瘍、形成手術のような外科的剥離、または治療を要するその他の創傷部位がある。ｂＦＧＦ（ＭＡＧＳ）の適用は治癒を促すので、感染の危険性も減少させる。
【００４２】
ｂＦＧＦ（ＭＡＧＳ）が新規の血管新生を促進する有用性がある適応症は、骨折、靱帯および腱の修復、腱炎、および滑液包炎などの筋骨格系の症状；火傷、切傷、裂傷、床ずれなどの皮膚症状、および糖尿病のような治癒の遅い潰瘍；および虚血および心筋梗塞下にある組織修復が含まれる。
【００４３】
組み換え的に生産されたｂＦＧＦ（ＭＡＧＳ）の、入手可能な賦形剤およびキャリアを用いた調合剤は、当業者に周知の標準的方法により調製される。このタンパク質は、外用水薬、ゲル、制御放出システムの一部、または所望されれば抗生物質のようなさらなる活性成分を含めた軟膏として調合し得る。
【００４４】
表面的な部位に最適である局所用投与では、標準的な局所用調合剤は、例えば、患部表面１ｃｍ２あたりに０．１−１００μｇのｂＦＧＦ（ＭＡＧＳ）が使用される。そのような溶液は、患部へ１度のみかあるいは、２から４週間（または不十分な治療条件ではこれよりも長い期間）の間に１日２回まで投与する。調合剤中のｂＦＧＦ（ＭＡＧＳ）および他の成分の濃度は、もちろん、創傷の種類と重篤度および患者の体質に依存する。投与量は、傷跡が残らないようにするために経時的に少なくし得る。例えば、３度の火傷のような最もひどい傷は、ｂＦＧＦ（ＭＡＧＳ）を１００μｇ／ｃｍ２の投与量で治療し得るが、治療開始後、投与量は傷が治るに従い次第に約０．１μｇ／ｃｍ２またはそれ以下にまで下げ得る。キャリアとしてＢＳＡを使用するＦＧＦの局所用調合剤は、Ｆｒａｎｋｌｉｎ，Ｊ．Ｄ．ら，Ｐｌａｓｔｉｃ ａｎｄ Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃ Ｓｕｒｇ（１９７９）６４：７６６−７７０に開示されている。
【００４５】
骨および深部軟組織（表面ではない）の修復には、投与は局所的であるが、注射または直接インプラントした患部の周辺にゆっくりとした放出形態で投与することが好ましい。骨の損傷のような症状では手術が必要になり得、従ってインプランテーションが直接的に適用となる。ゆっくりとした放出形態は、Ｈｙｄｒｏｎ（Ｌａｎｇｅｒ，Ｒ．，ら．，Ｎａｔｕｒｅ（１９７６）２６３：７９７−７９９）またはＥｌｖａｘ ４０Ｐ（Ｄｏｐｏｎｔ）（Ｍｕｒｒａｙ，Ｊ．Ｂ．，ら，Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ（１９８３）１９：７４３−７４７）のようにポリマー中に調合し得る。他の徐放システムは、Ｈｓｉｅｈ，Ｄ．Ｓ．Ｔ．，ら，Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ（１９８３）７２：１７−２２）によって提案され、および特に表皮増殖因子のための調合剤は、本発明では好ましくないが、Ｂｕｃｋｌｅｙ，Ａ．，ら，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ（ＵＳＡ）（１９８５）８２：７３４０−７３４４によって提案されている。
【００４６】
徐放送達の局所的投与では、調合剤中のｂＦＧＦ（ＭＡＧＳ）の濃度は、症状の性質や重篤度およびポリマーからのｂＦＧＦ（ＭＡＧＳ）の放出速度を含めた多くの要素に依存する。一般に調合は、Ｂｕｃｋｌｅｙら（上記Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ（ＵＳＡ））に記載のように、組織濃度の約１０倍の一定な局所的濃度を有するように組み立てられる。組織でのｂＦＧＦ濃度５−５０ｎｇ／ｇ湿重量に基づき（６０ｎｇ／ｇ湿重量であるＥＧＦと比較し得る）、１時間当り５０−５０００ｎｇのＦＧＦ放出が受容可能である。もちろん、初期濃度は傷の重篤度に依存する。
【００４７】
ｂＦＧＦ（ＭＡＧＳ）は、表皮増殖因子（ＥＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ−αまたはＴＧＦ−β）、インシュリン様増殖因子（ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２）、イアミン（Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ トリペプチド）および／または血小板由来の増殖因子（ＰＤＧＦ）などの他の増殖因子と共同して、および相乗的に、作用し得ることが予測される。さらに、特に骨の修復には、上皮小体のホルモンが骨の再吸収を速めるので、上皮小体ホルモンの拮抗薬と共同して作用し得る。そのため、本発明のｂＦＧＦ（ＭＡＧＳ）が、上記の１つ以上の因子と組み合わせた同一の組成物により、または同一のプロトコールで投与される実施例は、本発明の組成物および投与のプロトコールの範囲に含まれ、こうして所望される組織修復はさらに効果的に達成される。
【００４８】
ｂＦＧＦ（ＭＡＧＳ）は、神経突起生長、神経再生、および神経生存を促進するのに効果的であるため、アルツハイマー病およびパーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、および一般的な神経システムの老化、および脊髄および末梢神経の損傷のようなある種の神経学的疾患の治療に有用であり得る。
【００４９】
これらの適応のための薬剤投与は、好ましくは上記創傷治療に関連して述べたものと同じ形態でインプラントにより行われる。この薬剤は、移植療法のような細胞培養物のインプラントによって、即ち、移植する前に培養物を本発明のｂＦＧＦ（ＭＡＧＳ）調製物で処理するか、または組み換えＤＮＡ技術によって細胞をｂＦＧＦ（ＭＡＧＳ）産生化することにより、送達し得る。さらに、ｂＦＧＦ（ＭＡＧＳ）は、脊髄液に直接注射し得、または全身的に適用し得る。全身用調合剤は、一般に従来技術で知られており、緩衝液または生理食塩水またはその他の適切な賦形剤中の形態を含む。全身用調合剤の投与レベルは、上記の局所用調合剤に使用した濃度と同じ局所的濃度で作用組織へ送達し得る。組織培養または外植片維持には、０．１−１０ｎｇ／ｍｌの血清または培養培地が使用し得る。
【００５０】
ｂＦＧＦ（ＭＡＧＳ）は、手術中に受けた傷組織の再形成および修復を助けるために特に有用である。この使用のために、ｂＦＧＦ（ＭＡＧＳ）は、外科用留め金として使用されるポリマー中に含ませることが有用であり得る。こうしてこのタンパク質は、この留め金を用いて行われる機械的縫合を生物学的に補い、組織の修復において「自然な」治癒工程を促進し助けることができる。
【００５１】
さらに、ここで議論されているｂＦＧＦ（ＭＡＧＳ）により与えられるもののような脈管形成刺激（ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ ｓｔｉｍｕｌｉ）は組織プラスミノーゲン活性因子（ｔＰＡ）の放出、およびインビトロでの内皮細胞からのコラゲナーゼ放出（Ｇｒｏｓｓ，Ｊ．Ｌ．ら，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ（ＵＳＡ）（１９８３）８０：２６２３）を生じさせる。そのため、本発明のｂＦＧＦ（ＭＡＧＳ）もまた、これらの酵素に反応する症状の治療に有用である。急性の症状（心筋梗塞や心臓発作を伴う血塊の存在など）においては、血塊を溶かすためにｔＰＡを多量に直接投与することが必要であり得るが、塞栓を形成する慢性的傾向の治療においては、血中に適切なレベルのｔＰＡを保つためのｂＦＧＦ（ＭＡＧＳ）投与が所望され得る。そのため、この適応には、筋肉内または皮下注射のような従来の方法を用いる薬剤の全身的投与が好ましい。
【００５２】
以下の実施例は、本発明の実施をさらに示すことを意図するものであって、本発明の範囲をどのような点においても制限することを意図するものではない。出発物質として使用するウシｂＦＧＦをコードするｃＤＮＡは、初めにウシゲノムライブラリーをスクリーニングし、重要なプローブを得ることによって得られ、その後ＰＣＴ公報 ＷＯ ８７／０１７２８に詳述されている別のＤＮＡを回収する。しかし、この重要なプローブの配列、およびウシおよびヒトｂＦＧＦのコーディング領域の配列は周知であり、インビトロで化学的に構築し得るので、この工程を繰り返す必要はない。さらに、ヒトおよびウシｂＦＧＦの配列を有するバクテリオファージは、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ
Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託されている。従って、下記の実施例において出発物質として使用されるｂＦＧＦのＤＮＡ配列は、種々の起源のものから入手可能である。
【実施例】
【００５３】
（実施例１）
（ｐＴｒｐ−２３３細菌発現プラスミドの構築）
Ａ．合成トリプトファンオペロンプロモーターおよびオペレーター調節配列の構築
図３Ａに示す１０個のオリゴデオキシヌクレオチドを、ホスホトリエステル法によって合成し、精製した。１および１０以外のオリゴデオキシヌクレオチド各々５００ピコモルを、３７℃で３０分間、６０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８、１５ｍＭ ＤＴＴ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、［γ−３２ｐ］−ＡＴＰ２０μＣｉおよびポリヌクレオチドキナーゼ（Ｐ／Ｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）２０ユニットを含有する溶液２０μｌ中で別々にリン酸化した。続いて、６０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８、１５ ｍＭ ＤＴＴ、１０ ｍＭ ＭｇＣｌ２、１．５ｍＭ ＡＴＰおよび別のポリヌクレオチドキナーゼ２０ユニットを含有する溶液１０μｌを添加し、その後、３７℃で３０分間、インキュベートした。インキュベートした後、試料を１００℃で５分間、インキュベートした。オリゴデオキシヌクレオチド１および１０の５００ピコモルを、上記緩衝液からＡＴＰを除いた溶液３０μｌ中で希釈した。
【００５４】
二本鎖対を構築するオリゴデオキシヌクレオチド（例えば、オリゴデオキシヌクレオチド１および２、３および４等、図３Ａ）各々１６．７ピコモルを混合し、９０℃で２分間、インキュベートし、その後、ゆっくりと室温まで冷却した。その後、構築に、各々の対を他の二本鎖対と結合させ、フェノール／クロロホルムで抽出し、その後、エタノールで沈澱させた。得られたオリゴデオキシヌクレオチド対を、５ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８、１０ ｍＭ ＭｇＣｌ２、２０ ｍＭ ＤＴＴを含有する溶液３０ μｌ中で再構築し、５０℃で１０分間熱した後、室温まで冷却し、その後、ＡＴＰを添加することにより、最終濃度０．５ ｍＭを得た。Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ８００ユニットを添加し、得られた混合物を１２．５℃で１２−１６時間インキュベートした。
【００５５】
連結反応混合物をフェノール／クロロホルムを用いて抽出し、そのＤＮＡをエタノールで沈澱させた。乾燥したＤＮＡを、溶液３０ μｌ中で再構築し、ＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩを用いて３７℃で１時間消化した。得られた混合物をフェノール／クロロホルムを用いて抽出し、エタノールで沈澱させた。その後、Ｌａｅｍｍｌｉ，Ｎａｔｕｒｅ（１９７０）２２７：６８０の方法に従って、８％ポリアクリルアミドゲル上の電気泳動により、様々な二本鎖ＤＮＡセグメントを分離した。加湿ゲルオートラジオグラフィーによってＤＮＡ断片を視覚化し、長さで約１００ｂｐに相当するバンドを切出して、一晩溶出した。切出した合成ＤＮＡ断片を、同様にＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩによって消化したプラスミドＭ１３ｍｐ８またはＭ１３ｍｐ９（Ｍｅｓｓｉｎｇ，Ｊ．およびＶｉｅｉｒａ，Ｊ．，Ｇｅｎｅ（１９８２）１９：２６９）に連結し、得られた物質をジデオキシヌクレオチド配列分析（Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ．ら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ（ＵＳＡ）（１９７７）７４：５４６３）することにより、図３Ａに示す設計配列を確認した。正しい配列を含有するＭ１３誘導体をＭ１３−ｔｒｐと名付けた。Ｍ１３−ｔｒｐ中の設計配列は、ｔｒｐオペロンリーダーペプチドのリボソーム結合領域に加えて、プロモーター（−３５および−１０領域）およびトリプトファン（ｔｒｐ）オペロンのオペレーター領域を含有する（図３Ｂ）。図３Ｂに示す配列に類似の配列が、Ｅ．ｃｏｌｉ中における異種タンパク質の発現に有用であることが証明されている（Ｈａｌｌｅｗｅｌｌ，Ｒ．Ａ．、およびＥｍｔａｇｅ，Ｓ．，Ｇｅｎｅ（１９８０）９：２７，Ｉｋｅｈａｒａ，Ｍ．ら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ（ＵＳＡ）（１９８４）８１：５９５６）。
【００５６】
Ｂ．合成ｔｒｐプロモーター／オペレーター含有プラスミド、ｐＴｒｐ−２３３の構築
プラスミドｐＫＫ２３３−２（図４Ａ；Ａｍａｎｎ，Ｅ．およびＢｒｏｓｉｕｓ，Ｊ．，前出）を、ＮｄｅＩを用いて完全に消化し、その後、Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（１９８２），ｐ．３９４の方法により、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリマラーゼＩ、クレノウ断片（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｃ．）５ユニットを用いて、末端を満たし、５０ μＭにｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰおよびＴＴＰを添加した。得られた物質を２５℃で２０分間インキュベートした。フェノール／クロロホルム抽出およびエタノール沈澱に続いて、ＮｄｅＩで消化したＤＮＡを再連結させてＥ．ｃｏｌｉに形質転換した（Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｋ．ら、Ｊ Ｍｏｌ Ａｐｐｌ Ｇｅｎｅｔ（１９８２）１：２８９）。得られた、ＮｄｅＩ部位を欠いたプラスミドをｐＫＫ２３３−２−Ｎｄｅ（図４Ｂ）と命名した。
【００５７】
プラスミドｐＫＫ２３３−２−Ｎｄｅ ２０ナノグラムをＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩを用いて完全に消化し、その後、Ｍａｎｉａｔｉｓら、前出、ｐｐ．１３３−１３４に従って、仔ウシの腸ホスファターゼ処理（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を実施した。ＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩを用いて、このファージの複製型（二本鎖ＤＮＡ型）を消化することにより、Ｍ１３−ｔｒｐから合成ｔｒｐプロモーター／オペレーター配列５０ナノグラムを得、ＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩを用いて消化したｐＫＫ２３３−２−Ｎｄｅ１０ナノグラムと混合した。上記のようにＴ４ ＤＮＡリガーゼと連結した後、得られた混合物をＥ．ｃｏｌｉ ＪＡ２２１ １ｐｐ−／Ｉ’ｌａｃＩに形質転換した。形質転換体をスクリーニングすることにより、１００ ｂｐ ＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩ合成ｔｒｐプロモーター／オペレーターを含有するプラスミドＤＮＡの存在をスクリーニングした。その後、適切なプラスミドを単離してｐＴｒｐ−２３３と命名した。図４Ｃに、４．４−ｋｂプラスミドｐＴｒｐ−２３３のプラスミドマップを示す。
【００５８】
（実施例２）
（プラスミドｐＴｓＦ１１の構築）
Ａ．ヒト塩基性繊維芽細胞増殖因子をコードするｃＤＮＡ配列の構築
参考のため援用されるＰＣＴ公報ＷＯ ８７／０１７２８；Ａｂｒａｈａｍ，Ｊ．Ａ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８６），前出；およびＡｂｒａｈａｍ，Ｊ．Ａ．ら、Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ（１９８６），前出に記載されているように、ハイブリダイゼーションプローブをつくるために、クローンλＢＢ２中に含有されたウシ塩基性ＦＧＦ ｃＤＮＡを用いることにより、塩基性ＦＧＦクローンを、ヒトｃＤＮＡおよびゲノムライブラリーから単離した。
【００５９】
ウシ塩基性ＦＧＦとヒト塩基性ＦＧＦとの間には、１５５残基前駆体型に２つの、アミノ酸の違いがある：１２１位において、ウシのタンパク質はＳｅｒを有し、ヒトのタンパク質はＴｈｒを有すること；および１３７位において、ウシのタンパク質はＰｒｏを有し、ヒトのタンパク質はＳｅｒを有することである。これらの違いは各々の場合において、その部位におけるアミノ酸用のコドンにおける、ひとつのヌクレオチドの違いに相当する。それゆえ、以下に述べるように、ヒトのタンパク質をコードするために、部位特異性変異誘発によって、ウシのｃＤＮＡを便宜的に修正し得る。実際、部位特異性変異誘発技術の標準的なものを用いることにより、これらのコドンを変更した。ＥｃｏＲＩを用いてλ
ＢＢ２クローン（ＡＴＣＣ ＮＯ．４０１９６）を消化し、ｂＦＧＦタンパク質をコードする配列にわたる１．４ｋｂの領域を、Ｍ１３ｍｐ８のＥｃｏＲＩ部位に連結した。そして、正しい方向に挿入物を有するファージを回収した。３個のオリゴヌクレオチド：「万能」プライマーである１７−ｍｅｒ；コドン１２１においてコーディング配列を変更する変異誘発性の１６−ｍｅｒ ５’−ＧＡＡＡＴＡＣＡＣＣＡＧＴＴＧＧ−３’（配列番号１１）；コドン１３７において配列を変更する変異誘発性の１７−ｍｅｒ ５’−ＡＣＴＴＧＧＡＴＣＣＡＡＡＡＣＡＧ−３’（配列番号１２）の存在下で１回目のインビトロ
変異誘発を実行した。その後、得られた、変異誘発されたファージを、プライマーで方向づけられた、２回目のインビトロ変異誘発にかけることにより、変異誘発性２５−ｍｅｒ，５’ＴＴＴＴＡＣＡＴＧＡＡＧＣＴＴＴＡＴＡＴＴＴＣＡＧ−３’（配列番号１３）を用いて翻訳終止コドンから下流にＨｉｎｄＩＩＩ部位３４ ｂｐを作成した。
【００６０】
得られた、変異したＤＮＡをジデオキシヌクレオチド配列分析（Ｓａｎｇｅｒら、前出）によって配列分析することにより、所望の変異が起こったことを確認した。変異したＭ１３ファージＤＮＡの複製型からのＨｉｎｄＩＩＩを用いて、ＦＧＦコーディング領域にわたる約６４０ ｂｐの断片を切出し、ＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＵＣ１３（Ｍｅｓｓｉｎｇ，Ｊ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ（１９８３）１０１：２０）に連結することにより、中間プラスミドｐＪＪ１５−１を得た。
【００６１】
Ｂ． Ｎ末端のための合成コーディング領域を有するヒトｂＦＧＦ ｃＤＮＡの構築
ｐＪＪ１５−１中に含有されるコーディング領域の５’末端（最初の１２５ｂｐ）のＧ＋Ｃ含有量を低下させるために、連続する配列の上にリストアップされている合成オリゴヌクレオチドを用いて、下に示されている配列を有する合成ＤＮＡ断片を構築した。オリゴヌクレオチドを対にアニーリングし、その対を順に連結し、ＨｉｎｄＩＩＩで切断されたＭ１３ｍｐ９に連結した。Ｍ１３ｍｐ９にクローニングした合成１３５ｂｐ挿入物の配列を、ジデオキシ配列分析により確認した。合成断片を有するＭ１３ｍｐ９ファージの複製型を、ＨｉｎｄＩＩＩを用いて消化し、１３５ｂｐ断片を単離した。この断片を、ＨｉｎｄＩＩＩで切断されたｐＵＣ９に連結した。その後、得られたプラスミドをＮｄｅＩおよびＨｈａＩを用いて消化し、合成挿入物の１２６ｂｐサブ断片を単離した。この１２６ｂｐのＮｄｅＩからＨｈａＩのサブ断片を、ＪＪ１５−１からの３７７ｂｐのＨｈａＩからＨｉｎｄＩＩＩのＤＮＡ断片に結合した。上記３７７ｂｐのＨｈａＩからＨｉｎｄＩＩＩのＤＮＡ断片は塩基性ＦＧＦコーディング配列のほぼ４分の３にわたり、この部分は、カルボキシ末端である。その後、得られた物質を、発現ベクターｐＴｒｐ−２３３のＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位に連結することにより、プラスミドｐＴｓＦ１１（図５Ａ，５Ｂ）を得た。
【００６２】
【化１】
【００６３】
（実施例３）
（ｂＦＧＦのためのｐＴｓＦ−９Δβｇａｌ発現ベクターの生成）
ｔｒｐプロモーター／オペレーターの制御下でｂＦＧＦを発現させるためのコピー数の多い発現ベクターを、以下の方法で調製した。この方法を図５に示す。Ｅ．ｃｏｌｉ中で機能する複製起点（ｏｒｉ）、アンピシリン耐性遺伝子、ｌａｃプロモーター／オペレーター、およびポリリンカー領域を含有するプラスミドｐＵＣ９（図５Ｄ；Ｖｉｅｉｒａ，Ｊ．およびＭｅｓｓｉｎｇ，Ｊ．，Ｇｅｎｅ（１９８２）１９：２５９）を、ＰｖｕＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）およびＥｃｏＲＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ
Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて、製造会社の指示に従って、３．２５時間消化した。
【００６４】
同時に、上記のようにＰｖｕＩおよびＥｃｏＲＩを用いて、ｐＴｓＦ１１ＤＮＡ（図５Ｂ）をインキュベートした。２つの制限酵素を用いた消化によって生成したｐＵＣ９およびｐＴｓＦ１１断片を、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼの存在下で連結した。連結反応を、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｂに形質転換した。形質転換体のアンピシリン耐性コロニーからのプラスミドＤＮＡを、プラスミドサイズおよび制限分析によって分析することにより、プラスミドを単離した。このプラスミドにおいて、ｐＴｓＦ１１の適当な断片（ｔｒｐプロモーター／オペレーター領域、ｂＦＧＦコーディング領域、転写終止配列、およびＡｍｐ遺伝子の５’末端半分を含有する約１．５ｋｂのＰｖｕＩ−ＥｃｏＲＩ断片）を、図５Ｅに示す方向で、ｐＵＣ９の約１．７ｋｂのＰｖｕＩ−ＥｃｏＲＩ断片（複製起点およびＡｍｐ遺伝子の３’末端半分を含有する）に連結した。このプラスミドをｐＴｓＦ−９と命名した。
【００６５】
製造会社の指示に従って、ＰｖｕＩＩおよびＥｃｏＲＩを用いてｐＴｓＦ−９
ＤＮＡをインキュベートした。デオキシヌクレオシドトリホスフェートおよびＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片とともにＤＮＡをインキュベートすることにより、ＥｃｏＲＩの開裂部位における突出部を満たした。Ｔ４ ＤＮＡリガーゼの存在下での平滑末端の連結により、ＤＮＡを再び円形にした。Ｅ．ｃｏｌｉ
Ｂをアンピシリン耐性に形質転換するために、連結反応を用いた。単一のコロニー形質転換体からのプラスミドＤＮＡを、プラスミドサイズおよび制限分析によって分析することにより、図５ＦにおいてｐＴｓＦ−９Δβｇａｌと示されているプラスミドを単離した。満たしたＥｃｏＲＩ部位およびＰｖｕＩＩ部位の平滑末端連結の結果、ｐＴｓＦ−９Δβｇａｌ中のＥｃｏＲＩ部位を回復させた。プラスミドｐＴｓＦ−９Δβｇａｌは、ｔｒｐプロモーター／オペレーターの制御下のｂＦＧＦコーディング配列、アンピシリン耐性遺伝子およびＥ．ｃｏｌｉ中で機能する複製起点を含有する。
【００６６】
（実施例４）
（ｂＦＧＦ（ＭＡＧＳ）をコードするＤＮＡ配列の生成）
ｐＴｓＦ１１（ｔｒｐプロモーター／オペレーター領域およびヒトのｂＦＧＦの１５５残基前駆体型をコードするＤＮＡを含有する）の約５９０ ｂｐのＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩＤＮＡ断片を、Ｍ１３ｍｐ９のＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ部位に連結することにより、プラスミドＦＧＦｔ７９１０を構築した。ＦＧＦｔ７９１０の一本鎖ＤＮＡが単離されると、ＺｏｌｌｅｒおよびＳｍｉｔｈ，前出に記載されているように、インビトロ変異誘発を実行した。上記インビトロ変異誘発は、ＡＴＧ開始コドンによってコードされるメチオニンの直後の２つのアラニンのうちの１つのためのコドンを欠いた、ｂＦＧＦのＮ末端の一部位をコーディングする合成オリゴヌクレオチドを用いて行った。この変異誘発の結果、以下に示すアラニン用のコドンのうちの１つが除去された。
【００６７】
【化２】
【００６８】
一本鎖ＤＮＡ１μｇを、リン酸化した変異誘発性のオリゴヌクレオチド５’−ｐＧＴＡＴＣＡＣＡＴＡＴＧＧＣＴＧＧＴＴＣＴＡＴＣ−３’（配列番号２６）５ナノグラムおよびＭ１３万能配列プライマー（Ｐ．Ｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓから購入した１７ ｍｅｒ）１ナノグラムと、５５℃で５から１５分間、１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５および１０ ｍＭ ＭｇＣｌ２を含有する溶液０．０１ｍｌ中でハイブリダイズした。反応液を室温まで冷却し、その後、デオキシヌクレオシドトリホスフェートｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびＴＴＰ各々０．１２ ｍＭ、ＤＮＡポリメラーゼＩ（Ｂｏｅ
ｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）のクレノウ断片５ユニット、およびＴ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）２０ユニットを含有する溶液０．０１ ｍｌを添加し、１５℃で４−６時間インキュベートした。その後、反応液の一部（０．００２ ｍｌ）を、競合するＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０１細菌に添加し、３７℃でＬ寒天皿上で一晩培養した。得られたＭ１３プラークのＤＮＡを、２つのニトロセルロースフィルターの各々に移し、８０℃で減圧下で２時間焼成し、その後、４２℃で２時間、プレハイブリダイゼーション溶液中でインキュベートした。プレハイブリダイゼーション溶液は、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは１５０
ｍＭ ＮａＣｌ，１５ ｍＭクエン酸ナトリウム，ｐＨ７．０である），０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、２×デンハルツ（Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ）（０．０４％フィコール、０．０４％ポリビニルピロリドン、０．０４％ウシ血清アルブミン）、および変性サケ精子のＤＮＡ０．４ｍｇ／ｍｌを含有する。その後、［γ−３２Ｐ］−ＡＴＰおよびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼで標識された５’末端であった変異誘発性オリゴヌクレオチドを含有する新に調製したプレハイブリダイゼーション溶液を用いて、４２℃で３時間、フィルターをインキュベートした。その後、フィルターを、４×ＳＳＣを用いて室温で１５分間洗浄し、６５℃で１５分間一回洗浄し、室温でＴＭＡＣｌ溶液（３Ｍテトラメチルアンモニウムクロライド、５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、２ ｍＭ
ＥＤＴＡ、０．１％ＳＤＳ）中で一回洗浄し、６５℃でＴＭＡＣｌ溶液中で一回洗浄し、その後、得られたフィルターを、Ｘ線フィルムを室温で一晩露光するために用いた。その後、Ｘ線フィルム上の暗い複写が陽性であるクローンを元の皿から取り出した。ＤＮＡを単離して、その後、ジデオキシ配列分析法によって、変異した配列を検出するために分析した。変異したＭ１３クローンの複製型ＤＮＡを調製し、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いて消化し、変異した塩基性ＦＧＦをコードするＤＮＡ断片を、アガローゼゲル電気泳動によって単離した。この断片中の、ｂＦＧＦコーディング領域の配列を図２に示す。
【００６９】
（実施例５）
（ｂＦＧＦ（ＭＡＧＳ）のための発現ベクターの構築）
図６に示す方法に従って、ｂＦＧＦ（ＭＡＧＳ）をコードするＤＮＡ断片の挿入に適した発現ベクターを調製した。上記のプラスミドｐＴｒｐ−２３３（図５Ａ、図６Ａ）を製造会社の指示に従ってＥｃｏＲＩおよびＰｖｕＩを用いて消化し、ｔｒｐプロモーター／オペレーターを含有する断片を単離した。同時に、ＥｃｏＲＩおよびＰｖｕＩを用いて、ｐＵＣ９を消化し、複製起点を有する断片を単離した。単離した断片をＴ４ ＤＮＡの存在下で連結することにより、ｔｒｐプロモーター／オペレーターおよびｐＴｒｐ−２３３と複製起点とからのポリリンカー領域、ｌａｃプロモーター／オペレーターおよびｐＵＣ９からのポリリンカーを含有するプラスミドであるｐＴｒｐ−９を生成した（図６Ｃ）。ＥｃｏＲＩおよびＰｖｕＩＩを用いてｐＴｒｐ−９を消化し、上記のように、ＤＮＡポリメラーゼＩ、クレノウ断片およびデオキシヌクレオシドトリホスフフェートを用いてＥｃｏＲＩ末端を満たした。Ｔ４ ＤＮＡリガーゼの存在下で平滑末端を連結することにより、ＤＮＡを再び円形にした。Ｅ．ｃｏｌｉ Ｂをアンピシリン耐性に形質転換するために、連結反応を用いた。単一コロニー形質転換体からのプラスミドＤＮＡを、プラスミドサイズおよび制限分析によって分析することにより、ｐＴｓＦ−９Δβｇａｌ−ＧＭ−２（図６Ｄ）と示されたプラスミドを単離した。
【００７０】
プラスミドｐＴｓＦ−９Δβｇａｌ−ＧＭ−２を、製造会社の指示に従ってＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いてインキュベートし、アンピシリン耐性遺伝子および複製起点を含有する大きな断片をアガローゼゲル上で単離した。その後、ｂＦＧＦ（ＭＡＧＳ）コーディング配列およびｔｒｐプロモーター／オペレーターを含有するＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片（実施例４）をＴ４ ＤＮＡリガーゼの存在下で、ｐＴｓＦ−９Δβｇａ
ｌ−ＧＭ−２の、単離した断片に連結した。競合するＥ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０細胞を形質転換するために連結を用い、その後、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０細胞を、アンピシリン１００ μｇ／ｍｌを添加したＬ寒天皿上で一晩増殖させた。コロニーを選択して、アンピシリン１００ μｇ／ｍｌを添加したＬ肉汁中で増殖させ、その後、プラスミドＤＮＡを細菌から単離して制限消化によって分析することにより、所望の構築を確認した。得られたプラスミドはｐＴｓＦ−９Δβｇａｌ（ＭＡＧＳ）と命名されているが、これは、ｂＦＧＦコーディング配列に代えてｂＦＧＦ（ＭＡＧＳ）コーディング配列を含有する以外は、ｐＴｓＦ−９Δβｇａｌと同一である。
【００７１】
（実施例６）
（ｂＦＧＦおよびｂＦＧＦ（ＭＡＧＳ）の発現）
ｐＴｓＦ−９ΔβｇａｌおよびｐＴｓＦ−９Δβｇａｌ（ＭＡＧＳ）のプラスミドを別々にＥ．ｃｏｌｉのＢ細胞に形質転換した。単コロニーを用いて培養物をＬ＋ａｍｐ培地に植え付けた後、３０℃で５時間増殖させた。次にこれらの培養物を用いて発現培養物（０．５％のカサミノ酸（ｃａｓａｍｉｎｏ ａｃｉｄ）、０．４％のグルコース、２μｇ／ｍｌのチアミン、０．１ｍＭのＣａＣｌ２、０．８ｍＭのＭｇＳＯ４、および５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＭ９塩に１から１００倍に希釈したもの）を接種した。５０μｇ／ｍｌの３−β−インドールアクリル酸を添加して、ｔｒｐプロモーターを誘導して、培養物を一夜３０℃で増殖した。１４から１８時間後に、Ａ５５０を測定して、１単位吸光度の細胞ペレットを１００μｌのＳＤＳ含有ポリアクリルアミドゲル負荷用緩衝液に再懸濁して、煮沸した。得た１０μｌの上清を１５％のアルクリアミド−ＳＤＳゲルに負荷して、電気泳動にかけた。ゲルをクーマシーブルーで染色した。図７は、レーン１に分子量マーカーを伴った染色したゲルの写真である。レーン２および３に、ｐＴｓＦ−９Δβｇａｌ形質転換細胞の２つの培養物から抽出したタンパク質を負荷した。レーン４および５に、ｐＴｓＦ−９Δβｇａｌ（ＭＡＧＳ）形質転換細胞の２つの培養物から抽出したタンパク質を負荷した。レーン６は、ｂＦＧＦ標準を含有する。レーン４および５のｂＦＧＦ（ＭＡＧＳ）に対応するバンドは、レーン２および３のｂＦＧＦに対応するバンドより視覚的に暗い。
【００７２】
レーン２から５の、様々な種類のタンパク質の相対濃度をスキャニング濃度計により測定した。図８Ａから８Ｄはレーン２から５のそれぞれの濃度をプロットしたものである。ｂＦＧＦまたはｂＦＧＦ（ＭＡＧＳ）のピークは矢印で示されている。全細胞タンパク質に比例して発現するｂＦＧＦまたはｂＦＧＦ（ＭＡＧＳ）の量は、濃度計によるプロットのカーブの下の面積に基づいて各培養物について計算される。ｐＴｓＦ−９Δβｇａｌで形質転換された２つの培養物（図８Ａ−８Ｂ）の平均発現レベルは、全細胞タンパク質の６．７％であり、一方、ｐＴｓＦ−９Δβｇａｌ（ＭＡＧＳ）で形質転換された２つの培養物（図８Ｃ−８Ｄ）の平均発現レベルは、全細胞タンパク質の１０．８％であった。
【００７３】
（実施例７）
（ｂＦＧＦ（ＭＡＧＳ）のＮ末端配列の決定）
実施例６と同様の手順により、ｐＴｓＦ−９Δβｇａｌ（ＭＡＧＳ）で形質転換されたＥ．ｃｏｌｉＢ細胞をカサミノ酸および５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＭ９培地２リットルで増殖した。培養物を光学濃度が０．５８（５５０ｎｍで測定）になるまで増殖し、５０μｇ／ｍｌの３−β−インドールアクリル酸で誘導し、その後振盪させながら一夜３０℃でインキュベートした。培養物を遠心分離機にかけ、細胞ペレットを、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、５ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのフェニルメチルスルフォニルフルオライド、および０，５ｍｇ／ｍｌのリゾチーム含有溶液３０ｍｌに再懸濁した。氷の上に３０分置いた後、上清に超音波をあてて細胞を破砕した。ＲＮアーゼおよびＤＮアーゼを各１００μｇ添加した。氷の上に３０分置いた後、混合物を遠心分離機にかけ、上清を精製のため取り除いた。
【００７４】
上清を、２０ｍＭのリン酸ナトリウムｐＨ７、５ｍＭのＥＤＴＡで平衡化したＳＰ−セファデックスのカラム（２．５ｃｍ×２ｃｍ）に供した。カラムを、２８０ｎｍでの吸光度が基準レベルに戻るまで同じ緩衝液で洗浄した。タンパク質を２０ｍＭのリン酸ナトリウムｐＨ７、５ｍＭのＥＤＴＡ、５００ｍＭのＮａＣｌでカラムから溶離させた。
ＳＰ−セファデックスカラムから５００ｍＭのＮａＣｌをぬいて、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣＬ、ｐＨ７．５、５ｍＭのＥＤＴＡ、６００ｍＭのＮａＣｌで平衡化したヘパリン−セファロースのカラム（２．５ｃｍ×２ｃｍ）に負荷した。カラムを、２８０ｎｍでの吸光度が基準レベルに戻るまで同じ緩衝液で洗浄した。タンパク質を２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、５ｍＭのＥＤＴＡ、２ＭのＮａＣｌで溶離させた。
このようにして得られたｂＦＧＦ（ＭＡＧＳ）を自動ガス相シークエネーターを用いてエドマン分解法によりＮ末端アミノ酸配列を分析した。多量のタンパク質をシークエネーターに負荷すると、極少量の、すなわち１〜２％の、Ｎ末端配列Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−を有するタンパク質が検出され、残りは、Ｎ末端配列Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒを有するタンパク質であった。ｂＦＧＦをｐＴｓＦ−９Δβｇａｌで形質転換されたＥ．ｃｏｌｉＢ細胞を用いて、本質的に同様の方法で生産して精製すると、得られたタンパク質は約７０％のＡｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−および３０％のＡｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−を含有する混合Ｎ末端配列を示した。
（配列表）
【００７５】
【００７６】
【００７７】
【００７８】
【００７９】
【００８０】
【００８１】
【００８２】
【００８３】
【００８４】
【００８５】
【図面の簡単な説明】
【００８６】
【図１Ａ】図１Ａは、ヒトｂＦＧＦコードする単離された天然のｃＤＮＡ配列、ならびに１５５−残基一次翻訳産物の推定アミノ酸配列を示す（配列番号１および配列番号２）。
【図１Ｂ】図ｌＢは、ウシｂＦＧＦコードする単離された天然のｃＤＮＡ配列、ならびに１５５−残基一次翻訳産物の推定アミノ酸配列を示す（配列番号３および配列番号４）。
【図２】図２は、ｂＦＧＦをコードするＤＮＡ配列を示す（配列番号５および配列番号６）。このＤＮＡ配列は、図１Ｂのウシ配列の５’末端の部分（図示されているＨｈａＩ部位から上流）を、天然のウシ配列と比較してＧ＋Ｃの含有量が少ない合成ＤＮＡ配列と置き換え、Ｎ末端メチオニンの直後にある２つのアラニン残基のうちの１つの残基のコドンを欠失させ、図１Ｂのコドン１２１および１３７を、それぞれＡＣＣおよびＴＣＣに変換させ、ｃＤＮＡ配列が（ｉ）Ｎ末端アラニンの１つを欠失しているヒトｂＦＧＦをコードし、（ｉｉ）その５’および３’末端を、それぞれＮｄｅＩ部位およびＨｉｎｄＩＩＩ部位ではさまれるように、翻訳終止コドンの３’側にＨｉｎｄＩＩＩ制限エンドヌクレアーゼ部位を形成することによって、生産された。
【図３】図３は、本発明のＤＮＡ配列の制御発現に使用されるｔｒｐプロモーター／オペレーター配列（Ｂ）（配列番号９および配列番号１０）を結合することにより形成した、一連の合成オリゴデオキシヌクレオチド（Ａ）（配列番号７および配列番号８）を示す。
【図４】図４は、ヒトｂＦＧＦをコードするＤＮＡ配列が挿入されてｐＴｓＦ１１を形成する、ｐＴｒｐ−２３３の構築を示す。
【図５Ａ】図５Ａは、ヒトｂＦＧＦの発現ベクターである、ｐＴｓＦ−９Δβｇａｌの調製を模式的に示す。
【図５Ｂ】図５Ｂは、図５Ａの続きである。
【図６】図６は、ｂＦＧＦ（ＭＡＧＳ）コーディング配列の挿入に適した発現ベクターである、ｐＴｓＦ−９Δβｇａｌ−ＧＭ−２の調製を模式的に示す。
【図７】図７は、クーマシーブルーで染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの写真である。このゲル上では、ヒトｂＦＧＦをコードするＤＮＡ配列で形質転換されたＥ．ｃｏｌｉの発現産物が、ヒトｂＦＧＦのアラニン欠失形態をコードする本発明のＤＮＡ配列で形質転換されたＥ．ｃｏｌｉの発現産物に沿って電気泳動された。
【図８Ａ】図８Ａ、８Ｂ、８Ｃおよび８Ｄは、図７のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのレーン２から５におけるそれぞれのタンパク質の一連の走査デンシトメトリーによるプロットである。
【図８Ｂ】図８Ａ、８Ｂ、８Ｃおよび８Ｄは、図７のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのレーン２から５におけるそれぞれのタンパク質の一連の走査デンシトメトリーによるプロットである。
【図８Ｃ】図８Ａ、８Ｂ、８Ｃおよび８Ｄは、図７のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのレーン２から５におけるそれぞれのタンパク質の一連の走査デンシトメトリーによるプロットである。
【図８Ｄ】図８Ａ、８Ｂ、８Ｃおよび８Ｄは、図７のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのレーン２から５におけるそれぞれのタンパク質の一連の走査デンシトメトリーによるプロットである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
本願明細書に記載されるような、繊維芽増殖因子。
【請求項１】
本願明細書に記載されるような、繊維芽増殖因子。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６】
【図７】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図８Ｃ】
【図８Ｄ】
【図１Ｂ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６】
【図７】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図８Ｃ】
【図８Ｄ】
【公開番号】特開２００８−１５６３６１（Ｐ２００８−１５６３６１Ａ）
【公開日】平成２０年７月１０日（２００８．７．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−６２１７（Ｐ２００８−６２１７）
【出願日】平成２０年１月１５日（２００８．１．１５）
【分割の表示】特願２００７−２１６５２８（Ｐ２００７−２１６５２８）の分割
【原出願日】平成３年３月２８日（１９９１．３．２８）
【出願人】（５９３２１５１１７）サイオス インコーポレイテッド (10)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年７月１０日（２００８．７．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１月１５日（２００８．１．１５）
【分割の表示】特願２００７−２１６５２８（Ｐ２００７−２１６５２８）の分割
【原出願日】平成３年３月２８日（１９９１．３．２８）
【出願人】（５９３２１５１１７）サイオス インコーポレイテッド (10)
【Ｆターム（参考）】
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