培養皮膚の細胞間脂質の周期構造を改善する方法
【課題】皮膚のバリア機能に関与する角質細胞及び細胞間脂質を含み、より生体に近い条件で経皮吸収性や経皮毒性等の評価を行うことを可能にする培養皮膚の簡便な作製方法及び作製用キットを提供する。
【解決手段】角質層を形成している培養皮膚の角質層表面側からリポソーム分散液を投与することにより、細胞間脂質の周期構造を改善させた培養皮膚を作製する。この培養皮膚を用いることにより、より生体に近い条件で経皮吸収性や経皮毒性等の評価を行うことが可能となる。
【解決手段】角質層を形成している培養皮膚の角質層表面側からリポソーム分散液を投与することにより、細胞間脂質の周期構造を改善させた培養皮膚を作製する。この培養皮膚を用いることにより、より生体に近い条件で経皮吸収性や経皮毒性等の評価を行うことが可能となる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、培養皮膚に関する。より詳細には、培養皮膚の細胞間脂質の周期構造を改善する方法と、その方法により製造される培養皮膚の発明である。この培養皮膚をｉｎ ｖｉｔｒｏの経皮吸収性試験や経皮毒性試験に用いると、生体に経皮投与した物質の挙動を従来よりも正しく推測することができる。
【背景技術】
【０００２】
動物や人の皮膚は、外部からの異物の侵入を防ぎ、内部からの水の蒸散を防ぐため、周期構造を形成した細胞間脂質が角質細胞の周りを満たした構造の角質層を形成している。なお、本発明で言う細胞間脂質の周期構造とは、ラメラ構造と充填構造の双方を含んだ周期構造を意味する。
【０００３】
薬物等の経皮吸収に主に関与している経表皮経路の中でも、角質細胞間経路が物質の主な透過経路であると考えられている。つまり、細胞間脂質は皮膚バリア機能を担うと共に、物質の重要な透過経路のひとつでもある（特許文献１、非特許文献１、２）。
【０００４】
従来、薬物の経皮吸収性試験、経皮毒性試験や代謝試験には主に動物皮膚が用いられてきたが、動物愛護の観点から、培養皮膚による代替試験が望まれている。このような目的で用いられる培養皮膚には、その細胞間脂質が生体皮膚の細胞間脂質と同様の周期構造を持ち、生体皮膚と同様のバリア機能と物質透過経路とを有することが求められ、様々な培養皮膚が開発されてきた。
【０００５】
しかしながら、細胞間脂質の構成成分のひとつであるセラミドの含有量を高めた経皮吸収性試験用の培養皮膚においても、ヘアレスラット皮膚やヒト皮膚と比べてバリア機能が低く（非特許文献３）、実際の動物皮膚やヒト皮膚のような細胞間脂質の周期構造が充分に形成されていないことが知られている。従って、ヒト皮膚に投与した物質の挙動を正確に予測する培養皮膚としては、更なる改良が望まれている。
【０００６】
これまでに、培養皮膚の構造や機能を実際の皮膚に近付けて培養皮膚のバリア機能を改善するため、培地に様々な添加剤を加えて細胞培養する方法や、特徴のある培養用基剤を用いて細胞培養する方法等、細胞培養条件の検討により様々な改良が行われている（特許文献２〜５）。
【０００７】
しかしながら、細胞培養には通常数週間を要する上に管理が容易ではなく、熟練した技術が必要であるため、培養条件の管理を必要としない簡便な操作で培養皮膚の構造と機能を、動物やヒト皮膚に近付ける方法の開発が望まれている。
【０００８】
リン脂質は、構造中にリン酸エステル部位を持ち、両親媒性を持つ脂質の総称で、一般的にはグリセリンやスフィンゴシンに脂肪酸とリン酸が結合し、更にリン酸が窒素を含むアルコールと結合した構造を持ち、植物や動物体内にも多く含まれる脂質である。
【０００９】
以前より、リン脂質が経皮吸収促進効果を有することは知られている（特許文献６〜８、非特許文献４）。この効果は、リン脂質が細胞間脂質の流動性に変化を与えることで現れると考えられている（非特許文献５〜７）。
【００１０】
一方、リン脂質を含む混合物やラメラ構造を形成している組成物によっては、皮膚のバリア機能を高めるという効果も知られているが、これらは皮膚表面で被膜を形成したり（特許文献９〜１１）、リポソームに内包させた成分によってセラミド量が増加する（特許文献１２）ことによるものである。また、これらの評価は、角質水分蒸散量等の客観的なもので実施されており、メカニズムは不明なものも多い（特許文献１３、１４）。
【００１１】
つまり、リン脂質やラメラ構造を形成する組成物には、細胞間脂質に取り込まれることで、細胞間脂質の周期構造を乱して薬物の経皮吸収性を高めたり、リン脂質や組成物自身が角質層表面で被膜を形成したり、浸透した薬物の効果によって細胞間脂質の量が増加したりすることによってバリア機能を高める等様々な効果が知られているが、元々角質層に存在する細胞間脂質の周期構造の形成を促す効果については全く知られていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】特開２００９−１３１３４
【特許文献２】特開２０００−２０１６９５
【特許文献３】特開２００２−２１８９７１
【特許文献４】特開２００８−１０４３５８
【特許文献５】特開平８−８９２３９
【特許文献６】特開平８−３０６９
【特許文献７】特表２０１０−５１３２２１
【特許文献８】国際公開ＷＯ２００７／１４５２７６
【特許文献９】特開２０００−２２９８１１
【特許文献１０】特開２００３−８１８０９
【特許文献１１】特開平７−２８５８２７
【特許文献１２】特開２００４−１６８７６３
【特許文献１３】特表２００５−５２２４６３
【特許文献１４】国際公開ＷＯ９５／１９７６２
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍ，Ｖｏｌ．２０，Ｎｏ．４，４５２−４５９（２００５）
【非特許文献２】薬学雑誌、Ｖｏｌ．１２９，１４５３−１４５８（２００９）
【非特許文献３】Ａｌｔｅｒｎ．Ａｎｉｍａｌ Ｔｅｓｔ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ，８（１），１−１４（２００１）
【非特許文献４】Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｓｍｅｔｉｃ Ｓｃｉｅｎｃｅ，５３，６（２００２）３６３−３７４
【非特許文献５】薬学雑誌、１０７，８，６１６−６２１（１９８７）
【非特許文献６】フレグランスジャーナル、４、４９−５９（１９９６）
【非特許文献７】Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，ｖｏｌ．４２，３，２４９−２６２（１９９６）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
培養皮膚の細胞間脂質の周期構造を容易に改善させることで、培養皮膚のバリア機能を向上させて生体皮膚に近付ける方法と、この方法によって作製されるバリア機能を生体皮膚に近付けた培養皮膚を提供することを目的とした。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者らは、これらの課題に対して鋭意検討した結果、角質層が形成されている培養皮膚の角質層表面側からリポソーム分散液を投与することにより、細胞間脂質の周期構造を改善させる方法を見出した。すなわち、本発明は、培養皮膚の細胞間脂質の周期構造を改善させる方法と、この方法によって作製した培養皮膚、又はこの方法を適用するための試薬・器具のキットを提供するものである。
【００１６】
培養皮膚とは、例えばポリカーボネート膜やコラーゲンゲル、線維芽細胞を含むコラーゲンゲル等の上に表皮角化細胞を播種し、必要に応じて浸漬培養、気相液体培養を行い作製されるものであり、三次元培養皮膚モデルとも呼ばれる。本発明に用いる培養皮膚は、作製方法や細胞の由来に特に限定されず、支持体の上に角質層が形成されたものであれば良い。主にヒト由来の細胞で作製される。
【００１７】
市販されている培養皮膚としては、例えば、ＴＥＳＴＳＫＩＮ ＬＳＥ−ｈｉｇｈ（東洋紡ライフサイエンス）、ＬａｂＣｙｔｅ ＥＰＩ−ＭＯＤＥＬ（Ｊ−ＴＥＣ）、Ｅｐｉｄｅｒｍ（クラボウ）、Ｅｐｉｓｋｉｎ（ＳｋｉｎＥｔｈｉｃ）等を使用することができる。
【００１８】
これらの培養皮膚の角質層表面側から、リポソーム分散液を投与する。リポソーム分散液を投与する方法として、例えば、スポイト等を用いて角質層の上部にリポソーム分散液を投与する方法が挙げられる。投与量は特に限定されないが、角質層全体をリポソーム分散液で満たすために、培養皮膚透過有効面積０．７９ｃｍ２あたり１０μＬから３００μＬ投与される。１０μＬ未満では、角質層全体がリポソーム分散液で満たされるのに十分ではなく、３００μＬを超えると、コスト面から不経済である。また、角質層上部からリポソーム分散液がこぼれないように、角質層の上にアッセイリング等を置き、その内部にリポソーム分散液を投与することもできる。さらに、経皮吸収試験において汎用される拡散セルに培養皮膚を挟みこみ、リポソーム分散液を角質層側から投与する方法もある。
【００１９】
リポソーム分散液の調製方法は特に限定されるものではなく、例えば、バンガム法、押し出し法、界面活性剤除去法、逆相蒸発法、高圧乳化法、超音波照射法等多くの調製法がある。その一例を示すと、リン脂質とクロロホルム等の有機溶剤を混合し、減圧下濃縮乾固させてリン脂質の薄膜を形成させたのち、このリン脂質に精製水を加えて水和し、超音波を照射してリポソームを形成させる。
【００２０】
リポソームは、天然由来のリン脂質あるいは合成リン脂質を用いることができるが、卵黄由来のリン脂質、大豆由来のリン脂質及び該リン脂質の水素添加物から選ばれる一種又は二種以上で形成すると製造コストの点で望ましい。
【００２１】
リン脂質としては、例えば、大豆由来リン脂質、大豆由来水素添加リン脂質、大豆由来水素添加リゾリン脂質、卵黄由来リン脂質、卵黄由来水素添加リン脂質、卵黄由来水素添加リゾリン脂質等を使用することが望ましく、必要に応じてその一種又は二種以上を用いることができる。特に、卵黄由来のリン脂質、大豆由来のリン脂質及び該リン脂質の水素添加物がよく、その中でも卵黄由来リン脂質が特に望ましい。
【００２２】
その中で、ホスファチジルコリン含量は特に限定されるものではないが、好ましくは８０重量％以上、さらに好ましくは９０重量％以上である。
【００２３】
本発明でのリポソーム分散液中のリン脂質含有量は特に限定されるものではないが、好ましくは０．１〜４重量％の範囲であり、さらに好ましくは０．１〜０．５重量％の範囲である。０．１重量％よりも少ない量では細胞間脂質の周期構造を改善する効果が期待できず、４重量％を越える量ではリポソーム分散液の安定性に問題がある場合がある。
【００２４】
本発明でのリポソームの平均粒子径は特に限定されるものではないが、好ましくは５００ｎｍ以下であり、さらに好ましくは９０〜２００ｎｍの範囲である。平均粒子径が１μｍを超えるとリポソーム調製直後から凝集により粒子径が大きくなりリポソームの安定性に問題がある場合がある。平均粒子径が９０ｎｍよりも小さい場合にはリポソームの形態を維持することができない場合がある。
【００２５】
本発明の方法では、培養皮膚の角質層表面側からリポソーム分散液を投与するだけで、バリア機能に重要となる細胞間脂質の周期構造を改善させ、角質層の構造を生体皮膚に近付けることができる。
【００２６】
さらに、バリア機能改善のために細胞培養の条件を調整する方法とは異なり、細胞間脂質の周期構造を改善させる操作に特別な設備も技術も要しないので、培養皮膚を製造する当業者のみならず、培養皮膚を利用する当業者の誰にでも実施可能である。
【００２７】
例えば、細胞培養の設備がなくても、市販されている三次元培養ヒト皮膚モデルを購入してこれにリポソーム分散液を投与するだけで、細胞間脂質の構造や機能を実際の動物やヒト皮膚に近づけた培養皮膚モデルとすることができ、本発明の培養皮膚を経皮吸収性試験や経皮毒性試験、代謝試験等に用いることができる。
【００２８】
また、本発明の培養皮膚を用いると、細胞間脂質に影響する経皮吸収促進剤等の添加剤を含む組成物の評価試験において、実際の動物皮膚やヒト皮膚での挙動を適切に推測することができる。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
培養皮膚の角質層表面側から、リポソーム分散液を投与する。本発明で言うリポソーム分散液は、リポソームを含んでいればクリーム等の組成物でも良い。リポソーム分散液は、バンガム法のほか、既知の方法を用いることで調製され、電子顕微鏡、透過型電子顕微鏡、原子間力顕微鏡等によって、脂質の膜構造を観察すれば、リポソームが形成されていることを確認することができる。
【００３０】
リポソーム分散液を投与してから、リポソームを構成する脂質が角質層に浸透するのに必要な時間経過後、リポソーム分散液の残渣を回収する。必要に応じてリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、生理食塩水及び精製水等で角質層表面側の洗浄を行うこともできる。投与してから残渣を回収するまでに必要な時間は、使用する培養皮膚によって異なるが、細胞間脂質の周期構造が不完全なものほど時間は短くて良く、１０分以内で充分な場合もある。長時間投与しても良いが、４８時間以上の投与は、投与後の経皮吸収性試験や経皮毒性試験等を実施することを鑑みて現実的でない。
【００３１】
本発明のリポソーム分散液調製キットとは、細胞間脂質の周期構造の改善に用いるリポソーム分散液を調製するために必要な試薬、器具及びリポソーム分散液を指す。投与のための器具や残渣除去のため器具、更に本発明の培養皮膚を使用する各種試験に必要な器具や培養皮膚そのものを含んでも含まなくとも良い。
【００３２】
一例として、経皮吸収性試験に用いられる三次元培養ヒト皮膚モデルに本発明の方法を適用し、細胞間脂質の周期構造を改善させた三次元培養ヒト皮膚モデルの作製方法の一例を示す。
【００３３】
三次元培養ヒト皮膚モデルを経皮吸収性試験用の拡散セルに挟みこみ、レシーバーをレシーバー液で満たす。経皮吸収性試験用の拡散セルは、縦型のものでも横型のものでも良い。レシーバー液は、三次元培養ヒト皮膚モデルに悪影響がなければ何を使用しても良く、例えばＰＢＳ（−）や生理食塩水等を用いることができる。拡散セルは、経皮吸収性試験を行う時と同様に例えば３２〜３７℃等で保温しても良い。
【００３４】
三次元培養ヒト皮膚モデルを挟み込んだ拡散セルの角質層表面側から、本発明のリポソーム分散液調製キットを用いて調製したリポソーム分散液を三次元培養ヒト皮膚モデルに投与する。これを１時間放置した後に、リポソーム分散液の残渣を回収し、ＰＢＳ（−）で角質層表面側の洗浄を行うことで、本発明の細胞間脂質の周期構造を改善させた培養皮膚が完成する。
【００３５】
角質層表面側からリポソーム分散液の残渣を除いた後、拡散セルに挟み込んだ状態のまま、本発明の細胞間脂質の周期構造を改善させた三次元培養ヒト皮膚モデルを用い、経皮吸収性試験を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】製造例４と比較例１の三次元培養ヒト皮膚モデルの小角Ｘ線プロファイル
【図２】製造例４と比較例１の三次元培養ヒト皮膚モデルの広角Ｘ線プロファイル
【図３】製造例１と比較例２の三次元培養ヒト皮膚モデルに対するカフェイン透過量の比較
【図４】製造例１の三次元培養ヒト皮膚モデルへのカフェイン水溶液とカフェインリポソーム製剤の適用によるカフェイン透過量の比較
【００３７】
本発明を詳細に説明するため、ホスファチジルコリンからなるリン脂質によって調製されたリポソーム分散液を角質層表面側から投与することにより作製される三次元培養ヒト皮膚モデルの製造例を挙げるが、本発明はこれに限定されるものではない。
【実施例１】
【００３８】
（製造例１）
卵黄由来のリン脂質（ＣＯＡＴＳＯＭＥ ＮＣ−５０、日油）４ｇをクロロホルム４０ｍＬに溶かし、減圧下濃縮して脂質の薄膜を形成させた。これに精製水１００ｍＬを加えて超音波処理し、孔径０．２μｍのフィルターでろ過してリン脂質の配合量が４重量％であるリポソーム分散液を得た。このリポソーム分散液を、精製水で希釈して適当な濃度として動的光散乱光度計（ＤＬＳ−７０００、大塚電子）で測定した。キュムラント法によって解析した平均粒子径は、２５０ｎｍであった。
【００３９】
角質層が形成されている三次元培養ヒト皮膚モデル（ＴＥＳＴＳＫＩＮ ＬＳＥ−ｈｉｇｈ、東洋紡ライフサイエンス）を購入し、購入したモデルの使用方法に従い、培地から取り出した。透過有効面積０．７９ｃｍ２でレシーバー容量５ｍＬの縦型拡散セル（パーメギア）にレシーバー液としてＰＢＳ（−）を満たし、レシーバー液を３２℃で保温して、角質層表面側からリポソーム分散液３００μＬを投与した。２０時間経過後、リポソーム分散液の残渣を回収し、角質層表面側を２００μＬのＰＢＳ（−）で５回洗浄し、リポソーム分散液の投与によって細胞間脂質の周期構造を改善させ、バリア機能をヒト皮膚に近付けた三次元培養ヒト皮膚モデルを作製した。
【００４０】
（製造例２）
卵黄由来のリン脂質（ＣＯＡＴＳＯＭＥ ＮＣ−５０、日油）０．１ｇをクロロホルム１ｍＬに溶かし、減圧下濃縮して脂質の薄膜を形成させた。これに精製水１００ｍＬを加えて超音波処理し、孔径０．２μｍのフィルターでろ過してリン脂質の配合量が０．１重量％であるリポソーム分散液を得た。このリポソーム分散液を用いて製造例１と同様に処理し、リポソーム分散液の投与によって細胞間脂質の周期構造を改善させ、バリア機能をヒト皮膚に近付けた三次元培養ヒト皮膚モデルを作製した。
【００４１】
（製造例３）
卵黄由来のリン脂質（ＣＯＡＴＳＯＭＥ ＮＣ−５０、日油）０．５ｇをクロロホルム５ｍＬに溶かし、減圧下濃縮し精製水１００ｍＬを加えて超音波処理し、孔径０．２μｍのフィルターでろ過してリン脂質の配合量が０．５重量％であるリポソーム分散液を得た。このリポソーム分散液を用いて製造例１と同様に処理し、リポソーム分散液の投与によって細胞間脂質の周期構造を改善させ、バリア機能をヒト皮膚に近付けた三次元培養ヒト皮膚モデルを作製した。
【００４２】
（製造例４）
大豆由来のリン脂質（ＳＬＰ−ＰＣ９２、辻製油）４ｇをクロロホルム４０ｍＬに溶かし、減圧下濃縮して脂質の薄膜を形成させた。これに精製水１００ｍＬを加えて超音波処理し、孔径０．２μｍのフィルターでろ過してリン脂質の配合量が４重量％であるリポソーム分散液を得た。このリポソーム分散液を用いて製造例１と同様に処理し、リポソーム分散液の投与によって細胞間脂質の周期構造を改善させ、バリア機能をヒト皮膚に近付けた三次元培養ヒト皮膚モデルを作製した。
【００４３】
（製造例５）
大豆由来のリン脂質（ＳＬＰ−ＰＣ９２Ｈ、辻製油）４ｇをクロロホルム４０ｍＬに溶かし、減圧下濃縮して脂質の薄膜を形成させた。これに精製水１００ｍＬを加えて超音波処理し、孔径０．２μｍのフィルターでろ過してリン脂質の配合量が４重量％であるリポソーム分散液を得た。このリポソーム分散液を用いて製造例１と同様に処理し、リポソーム分散液の投与によって細胞間脂質の周期構造を改善させ、バリア機能をヒト皮膚に近付けた三次元培養ヒト皮膚モデルを作製した。
【００４４】
（比較例１）
角質層が形成されている三次元培養ヒト皮膚モデル（ＴＥＳＴＳＫＩＮ ＬＳＥ−ｈｉｇｈ、東洋紡ライフサイエンス）を購入し、培地から取り出してリポソーム分散液非投与の三次元培養ヒト皮膚モデルとした。
【００４５】
（比較例２）
リポソーム分散液の代わりに精製水を用い、製造例１と同様に処理して、リポソーム分散液投与の比較対照となる、精製水を投与して細胞間脂質の周期構造とバリア機能がヒトに近付いていない三次元培養ヒト皮膚モデルを作製した。
【実施例２】
【００４６】
（試験例１）
製造例１〜製造例５の三次元培養ヒト皮膚モデルと比較例１の三次元培養ヒト皮膚モデルをそれぞれ０．１％トリプシン溶液に浸して角質層のみを剥離し、脱水後に精製水を加えて水分量が２０％になるように調整してキャピラリーチューブ（φ１ｍｍ；Ｗ．Ｍｕｌｌｅｒ）に詰め測定試料とした。
【００４７】
ＳＰｒｉｎｇ−８の高輝度Ｘ線を用いて、小角・広角Ｘ線回折同時測定を行い、細胞間脂質のラメラ構造と充填構造を同時に測定した。測定条件は、Ｘ線の波長０．１ｎｍ、カメラ長は４００ｎｍとし、カメラはＲＡＸＩＳ（リガク）、イメージングプレート型検出器のサイズは３００×３００ｍｍを使用した。得られたＸ線回折像は、ＦＩＴ２Ｄ（ＥＳＲＦ）を用いて二次元化した。即ち、標準試料にベヘン酸銀（格子定数ｄ＝５．８３８ｎｍ）を用い、横軸を散乱ベクトルＳ（＝ｑ／２π）、縦軸をピーク強度としてプロットした。比較例１のリポソーム分散液非投与の三次元培養ヒト皮膚モデルと比べて、小角Ｘ線回折のプロファイルにおけるＳ＝０．２７１ｎｍ−１の回折ピークが強まった場合にラメラ構造の改善効果あり、広角Ｘ線回折のプロファイルにおけるＳ＝２．４１ｎｍ−１の回折ピークが強まった場合に充填構造の改善効果ありと判定し、共に改善効果が見られたものを細胞間脂質の周期構造改善の効果ありと判定した。
【００４８】
図１は、製造例４及び比較例１の測定試料における小角Ｘ線回折のプロファイルを示す。比較例１のリポソーム分散液非投与の三次元培養ヒト皮膚モデルにおいて、細胞間脂質のラメラ構造に相当するＳ＝０．２７１ｎｍ−１の回折ピークは見られず、コレステロールの周期であるＳ＝０．２９４ｎｍ−１の回折ピークがわずかに見られた。一方、製造例４の三次元培養ヒト皮膚モデルにおいては、Ｓ＝０．２７１ｎｍ−１に回折ピークが出現した。これらのことは、製造例４の三次元培養ヒト皮膚モデルにおいて、細胞間脂質のラメラ構造が改善されたことを示す。
【００４９】
図２は、製造例４及び比較例１の測定試料における広角Ｘ線回折のプロファイルを示す。比較例１のリポソーム分散液非投与の三次元培養ヒト皮膚モデルにおいて、細胞間脂質の充填構造に相当するＳ＝２．４１ｎｍ−１の回折ピークがわずかに見られた。一方、製造例４の三次元培養ヒト皮膚モデルにおいては、Ｓ＝２．４１ｎｍ−１の回折ピークが強まった。これらのことは、製造例４の三次元培養ヒト皮膚モデルにおいて、細胞間脂質の充填構造が改善されたことを示す。
【００５０】
製造例１から製造例５のリン脂質分散液を三次元培養ヒト皮膚モデルへ投与した場合の細胞間脂質の周期構造改善効果について検討した結果を表１に示す。細胞間脂質の周期構造改善の効果が見られたものは○、改善の効果がより強く見られたものは◎と示した。いずれのリン脂質分散液の投与によっても、細胞間脂質のラメラ構造や充填構造に由来する回折ピークが強まり、細胞間脂質の周期構造が改善されることが示された。さらに、これらの結果は、リン脂質が角質層表面で周期構造を形成したのではなく、元々三次元培養ヒト皮膚モデルに含まれていた細胞間脂質が周期構造を形成したことを示している。
【００５１】
【表１】
【実施例３】
【００５２】
（試験例２）
製造例１の三次元培養ヒト皮膚モデル及び比較例２の三次元培養ヒト皮膚モデルを、レシーバー液としてＰＢＳ（−）を満たした拡散セルに挟み込み、レシーバー液を３２℃で保温した。角質層表面側からカフェインの２重量％水溶液３００μＬを適用し、３時間後のレシーバー液を回収し、三次元培養ヒト皮膚モデルを透過したカフェイン量をＨＰＬＣにて定量した。
【００５３】
図３は、三次元培養ヒト皮膚モデルを透過したカフェイン量を示す。この結果から明らかなように、リポソーム分散液を角質層表面側から投与した三次元培養ヒト皮膚モデルにおいては、水溶性低分子であるカフェインの透過量が少ないことから、バリア機能が高まったことが示された。つまり、簡便な操作によって、バリア機能が実際の皮膚に近付いた三次元培養ヒト皮膚モデルを作製できることが明らかとなった。
【実施例４】
【００５４】
（被験物質１）
大豆由来のホスファチジルコリン（ＳＬＰ−ＰＣ９２、辻製油）０．５ｇをクロロホルム５ｍＬに溶かし、減圧下濃縮し、カフェインの２重量％水溶液１００ｍＬを加えて超音波処理し、孔径０．２μｍのフィルターでろ過してカフェインリポソーム製剤を調製した。
（被験物質２）
カフェインリポソーム製剤の比較対照として、カフェインの２重量％水溶液を調製した。
【００５５】
（試験例３）
製造例１の三次元培養ヒト皮膚モデルを、レシーバー液としてＰＢＳ（−）を満たした縦型拡散セルに挟み込み、レシーバー液を３２℃で保温した。被験物質１（カフェインリポソーム製剤）又は被験物質２（カフェインの２重量％水溶液）３００μＬを適用し、３時間後にレシーバー液を回収し、三次元培養ヒト皮膚モデルを透過したカフェイン量をＨＰＬＣにて定量した。
【００５６】
図４は、三次元培養ヒト皮膚モデルを透過したカフェイン量を示す。この結果は、リポソーム製剤によって、カフェインの透過量が促進することを示しており、モルモット皮膚において行われた同様の試験の結果と類似する。以上から、本発明の培養皮膚は、生体皮膚での挙動を正しく推測するのに適したものであると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００５７】
薬物の経皮吸収性試験、経皮毒性試験や有効性試験等に適した培養皮膚をそれぞれ最適な条件で作製した後、本発明の方法でリポソーム分散液を投与するだけで、生体皮膚での挙動を正しく推測するのに適した培養皮膚を得ることができる。また、培養皮膚を用いた動物試験代替の発展に貢献することができる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、培養皮膚に関する。より詳細には、培養皮膚の細胞間脂質の周期構造を改善する方法と、その方法により製造される培養皮膚の発明である。この培養皮膚をｉｎ ｖｉｔｒｏの経皮吸収性試験や経皮毒性試験に用いると、生体に経皮投与した物質の挙動を従来よりも正しく推測することができる。
【背景技術】
【０００２】
動物や人の皮膚は、外部からの異物の侵入を防ぎ、内部からの水の蒸散を防ぐため、周期構造を形成した細胞間脂質が角質細胞の周りを満たした構造の角質層を形成している。なお、本発明で言う細胞間脂質の周期構造とは、ラメラ構造と充填構造の双方を含んだ周期構造を意味する。
【０００３】
薬物等の経皮吸収に主に関与している経表皮経路の中でも、角質細胞間経路が物質の主な透過経路であると考えられている。つまり、細胞間脂質は皮膚バリア機能を担うと共に、物質の重要な透過経路のひとつでもある（特許文献１、非特許文献１、２）。
【０００４】
従来、薬物の経皮吸収性試験、経皮毒性試験や代謝試験には主に動物皮膚が用いられてきたが、動物愛護の観点から、培養皮膚による代替試験が望まれている。このような目的で用いられる培養皮膚には、その細胞間脂質が生体皮膚の細胞間脂質と同様の周期構造を持ち、生体皮膚と同様のバリア機能と物質透過経路とを有することが求められ、様々な培養皮膚が開発されてきた。
【０００５】
しかしながら、細胞間脂質の構成成分のひとつであるセラミドの含有量を高めた経皮吸収性試験用の培養皮膚においても、ヘアレスラット皮膚やヒト皮膚と比べてバリア機能が低く（非特許文献３）、実際の動物皮膚やヒト皮膚のような細胞間脂質の周期構造が充分に形成されていないことが知られている。従って、ヒト皮膚に投与した物質の挙動を正確に予測する培養皮膚としては、更なる改良が望まれている。
【０００６】
これまでに、培養皮膚の構造や機能を実際の皮膚に近付けて培養皮膚のバリア機能を改善するため、培地に様々な添加剤を加えて細胞培養する方法や、特徴のある培養用基剤を用いて細胞培養する方法等、細胞培養条件の検討により様々な改良が行われている（特許文献２〜５）。
【０００７】
しかしながら、細胞培養には通常数週間を要する上に管理が容易ではなく、熟練した技術が必要であるため、培養条件の管理を必要としない簡便な操作で培養皮膚の構造と機能を、動物やヒト皮膚に近付ける方法の開発が望まれている。
【０００８】
リン脂質は、構造中にリン酸エステル部位を持ち、両親媒性を持つ脂質の総称で、一般的にはグリセリンやスフィンゴシンに脂肪酸とリン酸が結合し、更にリン酸が窒素を含むアルコールと結合した構造を持ち、植物や動物体内にも多く含まれる脂質である。
【０００９】
以前より、リン脂質が経皮吸収促進効果を有することは知られている（特許文献６〜８、非特許文献４）。この効果は、リン脂質が細胞間脂質の流動性に変化を与えることで現れると考えられている（非特許文献５〜７）。
【００１０】
一方、リン脂質を含む混合物やラメラ構造を形成している組成物によっては、皮膚のバリア機能を高めるという効果も知られているが、これらは皮膚表面で被膜を形成したり（特許文献９〜１１）、リポソームに内包させた成分によってセラミド量が増加する（特許文献１２）ことによるものである。また、これらの評価は、角質水分蒸散量等の客観的なもので実施されており、メカニズムは不明なものも多い（特許文献１３、１４）。
【００１１】
つまり、リン脂質やラメラ構造を形成する組成物には、細胞間脂質に取り込まれることで、細胞間脂質の周期構造を乱して薬物の経皮吸収性を高めたり、リン脂質や組成物自身が角質層表面で被膜を形成したり、浸透した薬物の効果によって細胞間脂質の量が増加したりすることによってバリア機能を高める等様々な効果が知られているが、元々角質層に存在する細胞間脂質の周期構造の形成を促す効果については全く知られていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】特開２００９−１３１３４
【特許文献２】特開２０００−２０１６９５
【特許文献３】特開２００２−２１８９７１
【特許文献４】特開２００８−１０４３５８
【特許文献５】特開平８−８９２３９
【特許文献６】特開平８−３０６９
【特許文献７】特表２０１０−５１３２２１
【特許文献８】国際公開ＷＯ２００７／１４５２７６
【特許文献９】特開２０００−２２９８１１
【特許文献１０】特開２００３−８１８０９
【特許文献１１】特開平７−２８５８２７
【特許文献１２】特開２００４−１６８７６３
【特許文献１３】特表２００５−５２２４６３
【特許文献１４】国際公開ＷＯ９５／１９７６２
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍ，Ｖｏｌ．２０，Ｎｏ．４，４５２−４５９（２００５）
【非特許文献２】薬学雑誌、Ｖｏｌ．１２９，１４５３−１４５８（２００９）
【非特許文献３】Ａｌｔｅｒｎ．Ａｎｉｍａｌ Ｔｅｓｔ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ，８（１），１−１４（２００１）
【非特許文献４】Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｓｍｅｔｉｃ Ｓｃｉｅｎｃｅ，５３，６（２００２）３６３−３７４
【非特許文献５】薬学雑誌、１０７，８，６１６−６２１（１９８７）
【非特許文献６】フレグランスジャーナル、４、４９−５９（１９９６）
【非特許文献７】Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，ｖｏｌ．４２，３，２４９−２６２（１９９６）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
培養皮膚の細胞間脂質の周期構造を容易に改善させることで、培養皮膚のバリア機能を向上させて生体皮膚に近付ける方法と、この方法によって作製されるバリア機能を生体皮膚に近付けた培養皮膚を提供することを目的とした。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者らは、これらの課題に対して鋭意検討した結果、角質層が形成されている培養皮膚の角質層表面側からリポソーム分散液を投与することにより、細胞間脂質の周期構造を改善させる方法を見出した。すなわち、本発明は、培養皮膚の細胞間脂質の周期構造を改善させる方法と、この方法によって作製した培養皮膚、又はこの方法を適用するための試薬・器具のキットを提供するものである。
【００１６】
培養皮膚とは、例えばポリカーボネート膜やコラーゲンゲル、線維芽細胞を含むコラーゲンゲル等の上に表皮角化細胞を播種し、必要に応じて浸漬培養、気相液体培養を行い作製されるものであり、三次元培養皮膚モデルとも呼ばれる。本発明に用いる培養皮膚は、作製方法や細胞の由来に特に限定されず、支持体の上に角質層が形成されたものであれば良い。主にヒト由来の細胞で作製される。
【００１７】
市販されている培養皮膚としては、例えば、ＴＥＳＴＳＫＩＮ ＬＳＥ−ｈｉｇｈ（東洋紡ライフサイエンス）、ＬａｂＣｙｔｅ ＥＰＩ−ＭＯＤＥＬ（Ｊ−ＴＥＣ）、Ｅｐｉｄｅｒｍ（クラボウ）、Ｅｐｉｓｋｉｎ（ＳｋｉｎＥｔｈｉｃ）等を使用することができる。
【００１８】
これらの培養皮膚の角質層表面側から、リポソーム分散液を投与する。リポソーム分散液を投与する方法として、例えば、スポイト等を用いて角質層の上部にリポソーム分散液を投与する方法が挙げられる。投与量は特に限定されないが、角質層全体をリポソーム分散液で満たすために、培養皮膚透過有効面積０．７９ｃｍ２あたり１０μＬから３００μＬ投与される。１０μＬ未満では、角質層全体がリポソーム分散液で満たされるのに十分ではなく、３００μＬを超えると、コスト面から不経済である。また、角質層上部からリポソーム分散液がこぼれないように、角質層の上にアッセイリング等を置き、その内部にリポソーム分散液を投与することもできる。さらに、経皮吸収試験において汎用される拡散セルに培養皮膚を挟みこみ、リポソーム分散液を角質層側から投与する方法もある。
【００１９】
リポソーム分散液の調製方法は特に限定されるものではなく、例えば、バンガム法、押し出し法、界面活性剤除去法、逆相蒸発法、高圧乳化法、超音波照射法等多くの調製法がある。その一例を示すと、リン脂質とクロロホルム等の有機溶剤を混合し、減圧下濃縮乾固させてリン脂質の薄膜を形成させたのち、このリン脂質に精製水を加えて水和し、超音波を照射してリポソームを形成させる。
【００２０】
リポソームは、天然由来のリン脂質あるいは合成リン脂質を用いることができるが、卵黄由来のリン脂質、大豆由来のリン脂質及び該リン脂質の水素添加物から選ばれる一種又は二種以上で形成すると製造コストの点で望ましい。
【００２１】
リン脂質としては、例えば、大豆由来リン脂質、大豆由来水素添加リン脂質、大豆由来水素添加リゾリン脂質、卵黄由来リン脂質、卵黄由来水素添加リン脂質、卵黄由来水素添加リゾリン脂質等を使用することが望ましく、必要に応じてその一種又は二種以上を用いることができる。特に、卵黄由来のリン脂質、大豆由来のリン脂質及び該リン脂質の水素添加物がよく、その中でも卵黄由来リン脂質が特に望ましい。
【００２２】
その中で、ホスファチジルコリン含量は特に限定されるものではないが、好ましくは８０重量％以上、さらに好ましくは９０重量％以上である。
【００２３】
本発明でのリポソーム分散液中のリン脂質含有量は特に限定されるものではないが、好ましくは０．１〜４重量％の範囲であり、さらに好ましくは０．１〜０．５重量％の範囲である。０．１重量％よりも少ない量では細胞間脂質の周期構造を改善する効果が期待できず、４重量％を越える量ではリポソーム分散液の安定性に問題がある場合がある。
【００２４】
本発明でのリポソームの平均粒子径は特に限定されるものではないが、好ましくは５００ｎｍ以下であり、さらに好ましくは９０〜２００ｎｍの範囲である。平均粒子径が１μｍを超えるとリポソーム調製直後から凝集により粒子径が大きくなりリポソームの安定性に問題がある場合がある。平均粒子径が９０ｎｍよりも小さい場合にはリポソームの形態を維持することができない場合がある。
【００２５】
本発明の方法では、培養皮膚の角質層表面側からリポソーム分散液を投与するだけで、バリア機能に重要となる細胞間脂質の周期構造を改善させ、角質層の構造を生体皮膚に近付けることができる。
【００２６】
さらに、バリア機能改善のために細胞培養の条件を調整する方法とは異なり、細胞間脂質の周期構造を改善させる操作に特別な設備も技術も要しないので、培養皮膚を製造する当業者のみならず、培養皮膚を利用する当業者の誰にでも実施可能である。
【００２７】
例えば、細胞培養の設備がなくても、市販されている三次元培養ヒト皮膚モデルを購入してこれにリポソーム分散液を投与するだけで、細胞間脂質の構造や機能を実際の動物やヒト皮膚に近づけた培養皮膚モデルとすることができ、本発明の培養皮膚を経皮吸収性試験や経皮毒性試験、代謝試験等に用いることができる。
【００２８】
また、本発明の培養皮膚を用いると、細胞間脂質に影響する経皮吸収促進剤等の添加剤を含む組成物の評価試験において、実際の動物皮膚やヒト皮膚での挙動を適切に推測することができる。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
培養皮膚の角質層表面側から、リポソーム分散液を投与する。本発明で言うリポソーム分散液は、リポソームを含んでいればクリーム等の組成物でも良い。リポソーム分散液は、バンガム法のほか、既知の方法を用いることで調製され、電子顕微鏡、透過型電子顕微鏡、原子間力顕微鏡等によって、脂質の膜構造を観察すれば、リポソームが形成されていることを確認することができる。
【００３０】
リポソーム分散液を投与してから、リポソームを構成する脂質が角質層に浸透するのに必要な時間経過後、リポソーム分散液の残渣を回収する。必要に応じてリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、生理食塩水及び精製水等で角質層表面側の洗浄を行うこともできる。投与してから残渣を回収するまでに必要な時間は、使用する培養皮膚によって異なるが、細胞間脂質の周期構造が不完全なものほど時間は短くて良く、１０分以内で充分な場合もある。長時間投与しても良いが、４８時間以上の投与は、投与後の経皮吸収性試験や経皮毒性試験等を実施することを鑑みて現実的でない。
【００３１】
本発明のリポソーム分散液調製キットとは、細胞間脂質の周期構造の改善に用いるリポソーム分散液を調製するために必要な試薬、器具及びリポソーム分散液を指す。投与のための器具や残渣除去のため器具、更に本発明の培養皮膚を使用する各種試験に必要な器具や培養皮膚そのものを含んでも含まなくとも良い。
【００３２】
一例として、経皮吸収性試験に用いられる三次元培養ヒト皮膚モデルに本発明の方法を適用し、細胞間脂質の周期構造を改善させた三次元培養ヒト皮膚モデルの作製方法の一例を示す。
【００３３】
三次元培養ヒト皮膚モデルを経皮吸収性試験用の拡散セルに挟みこみ、レシーバーをレシーバー液で満たす。経皮吸収性試験用の拡散セルは、縦型のものでも横型のものでも良い。レシーバー液は、三次元培養ヒト皮膚モデルに悪影響がなければ何を使用しても良く、例えばＰＢＳ（−）や生理食塩水等を用いることができる。拡散セルは、経皮吸収性試験を行う時と同様に例えば３２〜３７℃等で保温しても良い。
【００３４】
三次元培養ヒト皮膚モデルを挟み込んだ拡散セルの角質層表面側から、本発明のリポソーム分散液調製キットを用いて調製したリポソーム分散液を三次元培養ヒト皮膚モデルに投与する。これを１時間放置した後に、リポソーム分散液の残渣を回収し、ＰＢＳ（−）で角質層表面側の洗浄を行うことで、本発明の細胞間脂質の周期構造を改善させた培養皮膚が完成する。
【００３５】
角質層表面側からリポソーム分散液の残渣を除いた後、拡散セルに挟み込んだ状態のまま、本発明の細胞間脂質の周期構造を改善させた三次元培養ヒト皮膚モデルを用い、経皮吸収性試験を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】製造例４と比較例１の三次元培養ヒト皮膚モデルの小角Ｘ線プロファイル
【図２】製造例４と比較例１の三次元培養ヒト皮膚モデルの広角Ｘ線プロファイル
【図３】製造例１と比較例２の三次元培養ヒト皮膚モデルに対するカフェイン透過量の比較
【図４】製造例１の三次元培養ヒト皮膚モデルへのカフェイン水溶液とカフェインリポソーム製剤の適用によるカフェイン透過量の比較
【００３７】
本発明を詳細に説明するため、ホスファチジルコリンからなるリン脂質によって調製されたリポソーム分散液を角質層表面側から投与することにより作製される三次元培養ヒト皮膚モデルの製造例を挙げるが、本発明はこれに限定されるものではない。
【実施例１】
【００３８】
（製造例１）
卵黄由来のリン脂質（ＣＯＡＴＳＯＭＥ ＮＣ−５０、日油）４ｇをクロロホルム４０ｍＬに溶かし、減圧下濃縮して脂質の薄膜を形成させた。これに精製水１００ｍＬを加えて超音波処理し、孔径０．２μｍのフィルターでろ過してリン脂質の配合量が４重量％であるリポソーム分散液を得た。このリポソーム分散液を、精製水で希釈して適当な濃度として動的光散乱光度計（ＤＬＳ−７０００、大塚電子）で測定した。キュムラント法によって解析した平均粒子径は、２５０ｎｍであった。
【００３９】
角質層が形成されている三次元培養ヒト皮膚モデル（ＴＥＳＴＳＫＩＮ ＬＳＥ−ｈｉｇｈ、東洋紡ライフサイエンス）を購入し、購入したモデルの使用方法に従い、培地から取り出した。透過有効面積０．７９ｃｍ２でレシーバー容量５ｍＬの縦型拡散セル（パーメギア）にレシーバー液としてＰＢＳ（−）を満たし、レシーバー液を３２℃で保温して、角質層表面側からリポソーム分散液３００μＬを投与した。２０時間経過後、リポソーム分散液の残渣を回収し、角質層表面側を２００μＬのＰＢＳ（−）で５回洗浄し、リポソーム分散液の投与によって細胞間脂質の周期構造を改善させ、バリア機能をヒト皮膚に近付けた三次元培養ヒト皮膚モデルを作製した。
【００４０】
（製造例２）
卵黄由来のリン脂質（ＣＯＡＴＳＯＭＥ ＮＣ−５０、日油）０．１ｇをクロロホルム１ｍＬに溶かし、減圧下濃縮して脂質の薄膜を形成させた。これに精製水１００ｍＬを加えて超音波処理し、孔径０．２μｍのフィルターでろ過してリン脂質の配合量が０．１重量％であるリポソーム分散液を得た。このリポソーム分散液を用いて製造例１と同様に処理し、リポソーム分散液の投与によって細胞間脂質の周期構造を改善させ、バリア機能をヒト皮膚に近付けた三次元培養ヒト皮膚モデルを作製した。
【００４１】
（製造例３）
卵黄由来のリン脂質（ＣＯＡＴＳＯＭＥ ＮＣ−５０、日油）０．５ｇをクロロホルム５ｍＬに溶かし、減圧下濃縮し精製水１００ｍＬを加えて超音波処理し、孔径０．２μｍのフィルターでろ過してリン脂質の配合量が０．５重量％であるリポソーム分散液を得た。このリポソーム分散液を用いて製造例１と同様に処理し、リポソーム分散液の投与によって細胞間脂質の周期構造を改善させ、バリア機能をヒト皮膚に近付けた三次元培養ヒト皮膚モデルを作製した。
【００４２】
（製造例４）
大豆由来のリン脂質（ＳＬＰ−ＰＣ９２、辻製油）４ｇをクロロホルム４０ｍＬに溶かし、減圧下濃縮して脂質の薄膜を形成させた。これに精製水１００ｍＬを加えて超音波処理し、孔径０．２μｍのフィルターでろ過してリン脂質の配合量が４重量％であるリポソーム分散液を得た。このリポソーム分散液を用いて製造例１と同様に処理し、リポソーム分散液の投与によって細胞間脂質の周期構造を改善させ、バリア機能をヒト皮膚に近付けた三次元培養ヒト皮膚モデルを作製した。
【００４３】
（製造例５）
大豆由来のリン脂質（ＳＬＰ−ＰＣ９２Ｈ、辻製油）４ｇをクロロホルム４０ｍＬに溶かし、減圧下濃縮して脂質の薄膜を形成させた。これに精製水１００ｍＬを加えて超音波処理し、孔径０．２μｍのフィルターでろ過してリン脂質の配合量が４重量％であるリポソーム分散液を得た。このリポソーム分散液を用いて製造例１と同様に処理し、リポソーム分散液の投与によって細胞間脂質の周期構造を改善させ、バリア機能をヒト皮膚に近付けた三次元培養ヒト皮膚モデルを作製した。
【００４４】
（比較例１）
角質層が形成されている三次元培養ヒト皮膚モデル（ＴＥＳＴＳＫＩＮ ＬＳＥ−ｈｉｇｈ、東洋紡ライフサイエンス）を購入し、培地から取り出してリポソーム分散液非投与の三次元培養ヒト皮膚モデルとした。
【００４５】
（比較例２）
リポソーム分散液の代わりに精製水を用い、製造例１と同様に処理して、リポソーム分散液投与の比較対照となる、精製水を投与して細胞間脂質の周期構造とバリア機能がヒトに近付いていない三次元培養ヒト皮膚モデルを作製した。
【実施例２】
【００４６】
（試験例１）
製造例１〜製造例５の三次元培養ヒト皮膚モデルと比較例１の三次元培養ヒト皮膚モデルをそれぞれ０．１％トリプシン溶液に浸して角質層のみを剥離し、脱水後に精製水を加えて水分量が２０％になるように調整してキャピラリーチューブ（φ１ｍｍ；Ｗ．Ｍｕｌｌｅｒ）に詰め測定試料とした。
【００４７】
ＳＰｒｉｎｇ−８の高輝度Ｘ線を用いて、小角・広角Ｘ線回折同時測定を行い、細胞間脂質のラメラ構造と充填構造を同時に測定した。測定条件は、Ｘ線の波長０．１ｎｍ、カメラ長は４００ｎｍとし、カメラはＲＡＸＩＳ（リガク）、イメージングプレート型検出器のサイズは３００×３００ｍｍを使用した。得られたＸ線回折像は、ＦＩＴ２Ｄ（ＥＳＲＦ）を用いて二次元化した。即ち、標準試料にベヘン酸銀（格子定数ｄ＝５．８３８ｎｍ）を用い、横軸を散乱ベクトルＳ（＝ｑ／２π）、縦軸をピーク強度としてプロットした。比較例１のリポソーム分散液非投与の三次元培養ヒト皮膚モデルと比べて、小角Ｘ線回折のプロファイルにおけるＳ＝０．２７１ｎｍ−１の回折ピークが強まった場合にラメラ構造の改善効果あり、広角Ｘ線回折のプロファイルにおけるＳ＝２．４１ｎｍ−１の回折ピークが強まった場合に充填構造の改善効果ありと判定し、共に改善効果が見られたものを細胞間脂質の周期構造改善の効果ありと判定した。
【００４８】
図１は、製造例４及び比較例１の測定試料における小角Ｘ線回折のプロファイルを示す。比較例１のリポソーム分散液非投与の三次元培養ヒト皮膚モデルにおいて、細胞間脂質のラメラ構造に相当するＳ＝０．２７１ｎｍ−１の回折ピークは見られず、コレステロールの周期であるＳ＝０．２９４ｎｍ−１の回折ピークがわずかに見られた。一方、製造例４の三次元培養ヒト皮膚モデルにおいては、Ｓ＝０．２７１ｎｍ−１に回折ピークが出現した。これらのことは、製造例４の三次元培養ヒト皮膚モデルにおいて、細胞間脂質のラメラ構造が改善されたことを示す。
【００４９】
図２は、製造例４及び比較例１の測定試料における広角Ｘ線回折のプロファイルを示す。比較例１のリポソーム分散液非投与の三次元培養ヒト皮膚モデルにおいて、細胞間脂質の充填構造に相当するＳ＝２．４１ｎｍ−１の回折ピークがわずかに見られた。一方、製造例４の三次元培養ヒト皮膚モデルにおいては、Ｓ＝２．４１ｎｍ−１の回折ピークが強まった。これらのことは、製造例４の三次元培養ヒト皮膚モデルにおいて、細胞間脂質の充填構造が改善されたことを示す。
【００５０】
製造例１から製造例５のリン脂質分散液を三次元培養ヒト皮膚モデルへ投与した場合の細胞間脂質の周期構造改善効果について検討した結果を表１に示す。細胞間脂質の周期構造改善の効果が見られたものは○、改善の効果がより強く見られたものは◎と示した。いずれのリン脂質分散液の投与によっても、細胞間脂質のラメラ構造や充填構造に由来する回折ピークが強まり、細胞間脂質の周期構造が改善されることが示された。さらに、これらの結果は、リン脂質が角質層表面で周期構造を形成したのではなく、元々三次元培養ヒト皮膚モデルに含まれていた細胞間脂質が周期構造を形成したことを示している。
【００５１】
【表１】
【実施例３】
【００５２】
（試験例２）
製造例１の三次元培養ヒト皮膚モデル及び比較例２の三次元培養ヒト皮膚モデルを、レシーバー液としてＰＢＳ（−）を満たした拡散セルに挟み込み、レシーバー液を３２℃で保温した。角質層表面側からカフェインの２重量％水溶液３００μＬを適用し、３時間後のレシーバー液を回収し、三次元培養ヒト皮膚モデルを透過したカフェイン量をＨＰＬＣにて定量した。
【００５３】
図３は、三次元培養ヒト皮膚モデルを透過したカフェイン量を示す。この結果から明らかなように、リポソーム分散液を角質層表面側から投与した三次元培養ヒト皮膚モデルにおいては、水溶性低分子であるカフェインの透過量が少ないことから、バリア機能が高まったことが示された。つまり、簡便な操作によって、バリア機能が実際の皮膚に近付いた三次元培養ヒト皮膚モデルを作製できることが明らかとなった。
【実施例４】
【００５４】
（被験物質１）
大豆由来のホスファチジルコリン（ＳＬＰ−ＰＣ９２、辻製油）０．５ｇをクロロホルム５ｍＬに溶かし、減圧下濃縮し、カフェインの２重量％水溶液１００ｍＬを加えて超音波処理し、孔径０．２μｍのフィルターでろ過してカフェインリポソーム製剤を調製した。
（被験物質２）
カフェインリポソーム製剤の比較対照として、カフェインの２重量％水溶液を調製した。
【００５５】
（試験例３）
製造例１の三次元培養ヒト皮膚モデルを、レシーバー液としてＰＢＳ（−）を満たした縦型拡散セルに挟み込み、レシーバー液を３２℃で保温した。被験物質１（カフェインリポソーム製剤）又は被験物質２（カフェインの２重量％水溶液）３００μＬを適用し、３時間後にレシーバー液を回収し、三次元培養ヒト皮膚モデルを透過したカフェイン量をＨＰＬＣにて定量した。
【００５６】
図４は、三次元培養ヒト皮膚モデルを透過したカフェイン量を示す。この結果は、リポソーム製剤によって、カフェインの透過量が促進することを示しており、モルモット皮膚において行われた同様の試験の結果と類似する。以上から、本発明の培養皮膚は、生体皮膚での挙動を正しく推測するのに適したものであると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００５７】
薬物の経皮吸収性試験、経皮毒性試験や有効性試験等に適した培養皮膚をそれぞれ最適な条件で作製した後、本発明の方法でリポソーム分散液を投与するだけで、生体皮膚での挙動を正しく推測するのに適した培養皮膚を得ることができる。また、培養皮膚を用いた動物試験代替の発展に貢献することができる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
培養皮膚の角質層表面側からリポソーム分散液を投与して、細胞間脂質の周期構造を改善する方法。
【請求項２】
リポソームが卵黄由来のリン脂質、大豆由来のリン脂質及び該リン脂質の水素添加物から選ばれる一種又は二種以上で形成される、請求項１記載の細胞間脂質の周期構造を改善する方法。
【請求項３】
リポソームが卵黄由来のリン脂質で形成される、請求項１又は２記載の細胞間脂質の周期構造を改善する方法。
【請求項４】
リン脂質に含まれるホスファチジルコリン含量が９０重量％以上である、請求項１〜３のいずれか一項記載の細胞間脂質の周期構造を改善する方法。
【請求項５】
リン脂質の配合量が０．１〜４重量％の範囲である、請求項１〜４のいずれか一項記載の細胞間脂質の周期構造を改善する方法。
【請求項６】
リン脂質の配合量が０．１〜０．５重量％の範囲である、請求項１〜５のいずれか一項記載の細胞間脂質の周期構造を改善する方法。
【請求項７】
リポソーム分散液の平均粒子径が５００ｎｍ以下である、請求項１〜６のいずれか一項記載の細胞間脂質の周期構造を改善する方法。
【請求項８】
リポソーム分散液の平均粒子径が９０〜２００ｎｍの範囲である、請求項１〜６のいずれか一項記載の細胞間脂質の周期構造を改善する方法。
【請求項９】
培養皮膚が、線維芽細胞を含むコラーゲンゲルの上に表皮角化細胞を播種して培養し、下から基底層、有棘層、顆粒層及び角質層が形成された培養皮膚である、請求項１〜８のいずれか一項記載の細胞間脂質の周期構造を改善する方法。
【請求項１０】
リポソーム分散液の投与方法が、拡散セルに挟みこんだ培養皮膚に、リポソーム分散液が角質層を満たすように投与する方法である、請求項１〜９のいずれか一項記載の細胞間脂質の周期構造を改善する方法。
【請求項１１】
リポソーム分散液の投与方法が、投与後にリポソーム分散液を取り除く工程を含む方法である、請求項１０記載の細胞間脂質の周期構造を改善する方法。
【請求項１２】
請求項１〜８のいずれか一項記載の方法により作製される培養皮膚。
【請求項１３】
請求項１〜８のいずれか一項記載の方法を適用した培養皮膚を用いて経皮吸収性試験、経皮毒性試験、代謝試験及び皮膚外用剤の有効性試験を行う方法、並びにそのためのリポソーム分散液調製用キット。
【請求項１】
培養皮膚の角質層表面側からリポソーム分散液を投与して、細胞間脂質の周期構造を改善する方法。
【請求項２】
リポソームが卵黄由来のリン脂質、大豆由来のリン脂質及び該リン脂質の水素添加物から選ばれる一種又は二種以上で形成される、請求項１記載の細胞間脂質の周期構造を改善する方法。
【請求項３】
リポソームが卵黄由来のリン脂質で形成される、請求項１又は２記載の細胞間脂質の周期構造を改善する方法。
【請求項４】
リン脂質に含まれるホスファチジルコリン含量が９０重量％以上である、請求項１〜３のいずれか一項記載の細胞間脂質の周期構造を改善する方法。
【請求項５】
リン脂質の配合量が０．１〜４重量％の範囲である、請求項１〜４のいずれか一項記載の細胞間脂質の周期構造を改善する方法。
【請求項６】
リン脂質の配合量が０．１〜０．５重量％の範囲である、請求項１〜５のいずれか一項記載の細胞間脂質の周期構造を改善する方法。
【請求項７】
リポソーム分散液の平均粒子径が５００ｎｍ以下である、請求項１〜６のいずれか一項記載の細胞間脂質の周期構造を改善する方法。
【請求項８】
リポソーム分散液の平均粒子径が９０〜２００ｎｍの範囲である、請求項１〜６のいずれか一項記載の細胞間脂質の周期構造を改善する方法。
【請求項９】
培養皮膚が、線維芽細胞を含むコラーゲンゲルの上に表皮角化細胞を播種して培養し、下から基底層、有棘層、顆粒層及び角質層が形成された培養皮膚である、請求項１〜８のいずれか一項記載の細胞間脂質の周期構造を改善する方法。
【請求項１０】
リポソーム分散液の投与方法が、拡散セルに挟みこんだ培養皮膚に、リポソーム分散液が角質層を満たすように投与する方法である、請求項１〜９のいずれか一項記載の細胞間脂質の周期構造を改善する方法。
【請求項１１】
リポソーム分散液の投与方法が、投与後にリポソーム分散液を取り除く工程を含む方法である、請求項１０記載の細胞間脂質の周期構造を改善する方法。
【請求項１２】
請求項１〜８のいずれか一項記載の方法により作製される培養皮膚。
【請求項１３】
請求項１〜８のいずれか一項記載の方法を適用した培養皮膚を用いて経皮吸収性試験、経皮毒性試験、代謝試験及び皮膚外用剤の有効性試験を行う方法、並びにそのためのリポソーム分散液調製用キット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２０１２−１８７０３８（Ｐ２０１２−１８７０３８Ａ）
【公開日】平成２４年１０月４日（２０１２．１０．４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５２９２８（Ｐ２０１１−５２９２８）
【出願日】平成２３年３月１０日（２０１１．３．１０）
【出願人】（５９２２６２５４３）日本メナード化粧品株式会社 (223)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年１０月４日（２０１２．１０．４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年３月１０日（２０１１．３．１０）
【出願人】（５９２２６２５４３）日本メナード化粧品株式会社 (223)
【Ｆターム（参考）】
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