培養移植片の製造方法
【課題】
動物由来脳下垂体を含有した基礎培地よりも細胞増殖能に優れ、倫理的な面において問題のない培地を使用した培養移植片の製造方法が求められている。
【解決手段】
本発明は、ヒト胎盤抽出物を含む培地を用いて、基材にヒト付着細胞を播種し、該ヒト付着細胞を培養することを特徴とする培養移植片の製造方法であり、ウシ脳下垂体含有培地よりも細胞増殖能に優れた培地を使用することにより、より迅速な培養移植片、特に培養皮膚の大量生産が可能になる。また、倫理的な面においても問題のない培養移植片、特に培養皮膚を提供することができる。
動物由来脳下垂体を含有した基礎培地よりも細胞増殖能に優れ、倫理的な面において問題のない培地を使用した培養移植片の製造方法が求められている。
【解決手段】
本発明は、ヒト胎盤抽出物を含む培地を用いて、基材にヒト付着細胞を播種し、該ヒト付着細胞を培養することを特徴とする培養移植片の製造方法であり、ウシ脳下垂体含有培地よりも細胞増殖能に優れた培地を使用することにより、より迅速な培養移植片、特に培養皮膚の大量生産が可能になる。また、倫理的な面においても問題のない培養移植片、特に培養皮膚を提供することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、培養移植片、特に培養皮膚の製造方法に関する。具体的には、ヒト胎盤抽出物を含む基礎培地を用いて、基材にヒト付着細胞を播種し、該ヒト付着細胞を培養する工程を含む培養移植片または培養皮膚の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、患者の健常な細胞を採取し、生分解性または生態適合性材料からなる培養基材などに細胞を播種、培養することで培養皮膚などの培養移植片の開発が注目を浴びている。これらの培養移植片は、患者の損傷欠損部に適用するために、その品質は高度なものが要求される。
【０００３】
上記培養移植片の製造における細胞培養の工程は、基礎培地中に細胞の増殖を促進するための増殖因子および天然物を添加したものが用いられており、天然物の代表的なものとして動物胎児血清やウシ脳下垂体抽出物などが挙げられる。
【０００４】
ウシ脳下垂体抽出物を用いた細胞培養には、表皮角化細胞やメラノサイトの培養した発明が開示されている（特許文献１）。しかし、ウシ脳下垂体抽出物は、増殖効果を安定に維持することは難しく、その増殖効果自体も不十分である。さらに、牛海綿状脳症（ＢＳＥ）の問題から、その使用は避けるべきものである。
【０００５】
また、線維芽細胞成長因子、血清、環状アデノシンモノホスフェートなどの補充物を添加したケラチノサイトからの調製物を添加し、同じくメラノサイトの増殖を促す方法が開示されている（特許文献２）。しかし、これらの技術は、添加物の調製に手間が掛るなどの問題があった。
【０００６】
【特許文献１】特開昭６２−９１１８０号公報
【特許文献２】特公表平２−５０１４４３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、培養工程における細胞増殖において、ウシ由来脳下垂体を含有した培地用いる培養方法よりも細胞増殖能に優れ、倫理的な問題を解決した培養移植片、特に培養皮膚の製造方法が求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、
（１） ヒト胎盤抽出物を含有する基礎培地からなる培地、
（２） 培地中におけるヒト胎盤抽出物のタンパク濃度が約０．０１〜８０ｍｇ／ｌである（１）に記載の培地、
（３） 基礎培地が、１９９、ＭＣＤＢ１５３、ＨａｍＦ１０、ＨａｍＦ１２、ＤＭＥＭ、ＥＢＳＳ、ＨＴＦまたはこれらの混合培地である（１）に記載の培地、
（４） 動物胎児血清またはウシ脳下垂体を含有しない（１）に記載の培地、
（５） ヒト胎盤抽出物を含有する培地を用いて、基材にヒト付着細胞を播種し、該ヒト付着細胞を培養する工程を含む培養移植片の製造方法、
（６） ヒト付着細胞が、ヒト由来の表皮細胞、線維芽細胞または軟骨細胞である（５）に記載の培養移植片の製造方法、
（７） 基材にヒト付着細胞を播種し、該ヒト付着細胞を培養する工程が、下記の(i)、(ii)または(i)および(ii)の両方である（５）に記載の培養移植片の製造方法；
(i) ヒトから採取したヒト付着細胞を、培養移植片の製造を目的に増殖培養する前培養工程：
(ii) 培養移植片を製造するためにヒト付着細胞を培養する培養移植片製造工程、
（８） 基材が、生体適合性材料をコーティングした培養皿、生体適合性材料から作製された不織布、スポンジ、シートまたはこれらの複合体である（５）に記載の培養移植片の製造方法、
（９） 生体適合性材料がコラーゲンである（８）に記載の培養移植片の製造方法、
（１０） ヒト胎盤抽出物を含有する培地を用いて、基材に表皮細胞または線維芽細胞を播種し、該細胞を培養する工程を含む培養皮膚の製造方法、
（１１） 基材に表皮細胞または線維芽細胞を播種し、該表皮細胞または線維芽細胞を培養する工程が、下記の(i)、(ii)または(i)および(ii)の両方である（１０）に記載の培養皮膚の製造方法；
(i) ヒトから採取した表皮細胞または線維芽細胞を、培養皮膚の製造を目的に増殖培養する前培養工程：
(ii) 培養皮膚を製造するために表皮細胞または線維芽細胞を培養する培養皮膚製造工程に関する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明は、ウシ脳下垂体含有培地よりも細胞増殖能に優れた培地を使用することにより、より迅速な培養移植片、特に培養皮膚の大量生産が可能になる。また、倫理的な面においても問題のない培養移植片、特に培養皮膚を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明の培養移植片の製造方法は、細胞増殖因子としてヒト胎盤抽出物を含有した培地を用いることを特徴としている。そして、好ましくは動物胎児血清またはウシ脳下垂体は使用しないものである。ヒト胎盤抽出物は、ヒト胎盤をホモジナイザーなどで砕き、精製したものである。上記ヒト胎盤は、臍帯血バンクで臍帯血を分離、採取したものを用いることができるが、インフォームドコンセントを得たものであることが重要である。インフォームドコンセントとは、胎盤提供者に十分な説明を行い、提供者が納得した上で、提供者の自己決定により同意を得ることで倫理的な問題を解決していることを意味する。
【００１１】
本発明に用いる培地は特に制限されるものではなく、基礎培地または基礎培地に任意に使用できる公知の成分を適時配合させてもよい。基礎培地としては、１９９、ＭＣＤＢ１５３、ＨａｍＦ１０、ＨａｍＦ１２、ＤＭＥＭ、ＥＢＳＳ、ＨＴＦおよびこれらの混合培地などが挙げられる。これらの基礎培地に適時配合させる任意の組成物は、インスリン、ヒドロコルチゾン、コロラドキシン、イソブチルメチルキサンチンおよびエタノールアミンなどが挙げられる。
【００１２】
胎盤抽出物は胎盤を粉砕、精製することにより得ることができる。胎盤の粉砕は、通常胎盤に蒸留水を加え、ホモジナイザーを用いて行われるが、これに限定されるものではない。粉砕した胎盤は、遠心分離により上清を回収する。遠心分離の条件は、約５０００〜２００００×ｇ、好ましくは約７５００〜１２５００×ｇで、時間は約１０〜６０分、このましくは約２０〜４０分である。この上清を、約５０〜９０容量％、好ましくは約６０〜８０容量％飽和硫酸アンモニウムを加え、約５０００〜２００００×ｇ、好ましくは約７５００〜１２５００×ｇで、時間は約１０〜６０分、好ましくは２０〜４０分で遠心分離をし、得られた沈殿物をセルロース製の透析チューブに入れ、リン酸緩衝液により一晩脱塩したものを用いる。この脱塩して得られた胎盤抽出物の溶液を胎盤エキスと呼ぶ。この胎盤エキスは脱塩したものをそのまま使用する。胎盤エキスのタンパク濃度は、一定量の胎盤エキスを乾燥させたタンパクの重量から特定することができ、上記の工程に従って作成すれば、約０．１〜２０ｍｇ／ｍｌの範囲内である。また、脱塩後に乾燥させたタンパクの重量を測定し、濃度調製して胎盤エキスを作成してもよいが、乾燥時にタンパクの一部が変性してしまう可能性があり、細胞増殖能を損なう可能性があるため、脱塩後はそのまま使用することが好ましい。上記胎盤エキスを培地中に約０．１〜４．０容量％、好ましくは約０．２〜２．０容量％加える。したがって、培地中における胎盤抽出物の含有量は、約０．０１〜８０ｍｇ／ｌの範囲内である。
【００１３】
本発明の培養移植片とは、健常な細胞を採取し、基材などに播種して体外培養することで製造されるものであり、患者の損傷部などに移植する再生医療分野における一般的な医療用具を意味する。具体的には、培養皮膚（培養表皮）および培養骨などが挙げられる。
【００１４】
したがって使用する細胞は、ヒト付着細胞を用いる。ヒト付着細胞とは、ヒトの組織に由来し、増殖する際に何らかの足場に付着して増殖していく特性を持つ細胞の総称であり、それらの細胞については種類を限定することなく使用可能であるが、培養移植片の作成に用いられる細胞が挙げられる。具体的には、表皮細胞、線維芽細胞および軟骨細胞などが挙げられる。
【００１５】
上記移植片の一般的な製造において、培養とは以下の２種類工程があることが一般的である。
(i) ヒトから採取したヒト付着細胞を、培養移植片の製造を目的に増殖培養する前培養工程。
(ii) 培養移植片を製造するためにヒト付着細胞を培養する培養移植片製造工程。
【００１６】
本発明における上記ヒト胎盤抽出物含有培地は、上記前培養工程、上記培養移植片製造工程またはこれらの両工程に使用することができる。好ましくは両工程で使用する場合である。
【００１７】
上記前培養工程とは、採取したヒト付着細胞が、培養移植片製造するにあたって不十分な細胞数である場合、細胞を増殖させることで十分な細胞数を得る一般的な継代培養の工程である。上記前培養工程の具体的な製造例としては、一般的な培養皿を基材として用いた培養方法が挙げられるが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００１８】
上記培養皿は、市販しているポリスチレンシャーレなどでもよいが、生体適合性材料でコーティングした培養皿が好ましい。具体的には、コラーゲンコートディッシュ、ゼラチンコートディッシュ、ラミニンコートディッシュおよびフィブロネクチンコートディッシュなどが挙げられる。
【００１９】
本発明の細胞培養方法は、基材に細胞を播種させる一般の細胞培養方法に準ずる。播種の方法は当業者がなし得る公知の方法を使用すればよい。播種後、基材に接着するまで３７℃、湿度１００％、５容量％炭酸ガスの培養条件で約０．５〜５時間インキュベートするのが一般的であるが、これに限定されるものではない。
【００２０】
インキュベート終了後、細胞を培養する。培養方法、条件は公知の一般的な方法でよく、培養する日数は、細胞がコンフルエントになる状態によって変化するが、一般的には、約８〜１２日間である。
【００２１】
培養後は、上記培養皿から細胞を剥離し、培養移植片製造工程に使用する。細胞を剥製する手段としては、トリプシンおよびディスパーゼなどが挙げられる。例えば、トリプシンの場合、０．０１容量％ＥＤＴＡ含有リン酸緩衝液の溶液として用いることが好ましく、濃度は約０．１０〜０．５０重量％、好ましくは約０．２０〜０．３５重量％である。
【００２２】
また、上記培養移植片製造工程とは、採取したヒト付着細胞をそのまま、または該細胞を上記前培養工程にて増殖した細胞を用いて実際に移植片を作成する工程である。作成工程の具体的な内容は、各移植片の一般的な製造方法に従うが、基本的には生体適合性材料からなる基材に播種、培養することで得ることが一般的である。
【００２３】
上記生体適合性材料としては、コラーゲン、ヒアルロン酸およびキチンなどの生体吸収性高分子、ならびにポリエステル、ポリアミドおよびポリ乳酸などの生分解性高分子などが挙げられる。好ましくは生体吸収性材料であり、さらに好ましくは架橋処理が可能な官能基を有するコラーゲンである。
【００２４】
コラーゲンは、例えば酵素可溶化コラーゲン、酸可溶化コラーゲン、アルカリ可溶化コラーゲンおよび中性可溶化コラーゲンなどが挙げられる。これらの可溶化コラーゲンとは、溶媒に溶解できるよう処理が施されたコラーゲンである。特に可溶化処理と同時にコラーゲンの抗原決定基であるテロペプタイドの除去処理が施されているアテロコラーゲンが好適である。また、コラーゲンの由来については、ウシ、ブタ、鳥類、魚類、ウサギ、ヒツジ、ネズミおよびヒトなどの動物種の皮膚、腱、骨、軟骨および臓器などから抽出されるものである。コラーゲンのタイプとしてはＩ型、III型などの分類可能なタイプのうちいずれかに限定されるものではない。
【００２５】
コラーゲン基材の形態としては、不織布、シートまたはスポンジなどが好適に使用されるが、同様な効果が得られる形態であればこれに限定されるものではない。
【００２６】
コラーゲン基材として、不織布を選択した場合は、線維束の間隙を培養対象となる細胞の大きさに合わせて調製することが好ましく、約０．０１〜５００μｍの間隙が好ましく、さらに好適であるのは約０．１〜２００μｍである。各線維間に均等に間隙が空いていることが好ましいが、部分的に接触していてもよい。
【００２７】
コラーゲン不織布を形成する線維は、常法に従ってコラーゲン水溶液から連続紡糸してコラーゲン糸を得、不織布状に加工することにより好適に製造される。コラーゲン水溶液の濃度は、使用するコラーゲンの種類により任意であり、紡糸可能であればどの様な濃度でも構わないが、通常は約０．１〜２０重量％、このうち湿式紡糸では約１〜１０重量％程度が特に好適である。また、紡糸時のコラーゲンの吐出速度は、紡糸可能である範囲であれば任意である。紡糸の際、コラーゲン溶液の吐出に用いる装置は、汎用のギアポンプ、ディスペンサー、各種押し出し装置等、何を用いても良いが、均一な紡糸を行うためには脈動が少なく安定してコラーゲン溶液を定量吐出できる装置が良い。また、紡糸を行う際の口金の孔径サイズは紡糸さえ可能であれば、特に限定はされないが、通常、約１０〜１０００μｍ、好ましくは約５０〜７００μｍの範囲が用いられる。さらに口金の孔数は単数でも複数でも良い。口金の形状も特に限定はされず、紡糸可能であれば、例えばスリット状、各種形状などの物を用いても良い。
【００２８】
湿式紡糸で用いられる凝固浴としては、一般的にコラーゲンを凝固させうる溶媒、懸濁液、乳濁液もしくは溶液であれが特に限定はされないが、無機塩類水溶液、無機塩類含有有機溶媒、アルコール類、ケトン類またはこれらの任意の組み合わせが用いられる。無機塩類水溶液としては、硫酸ナトリウム、塩化ナトリウム、硫酸アンモニウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウムなどの水溶液、特に塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、硫酸アンモニウムなどの水溶液が好ましい。これらの無機塩類をアルコール、アセトンに溶解または分散させた無機塩類含有有機溶媒等を用いてもよく、この場合特に塩化ナトリウムのエタノール溶解または分散溶液が好ましい。アルコール類としては、メタノール、エタノール、イソプロパノール、アミルアルコール、ペンタノール、ヘキサノールなどの炭素数１から６のアルコール類やエチレングリコールなどのグリコール類、好ましくはエタノールが挙げられる。ケトン類としてはアセトン、メチルエチルケトンなどが挙げられる。
【００２９】
上記凝固浴はコラーゲンの凝固のためだけではなく、後述する各種架橋剤との組み合わせにより、コラーゲンの凝固と架橋処理を同時に実施できる加工方法も有効である。たとえば、エタノールとグルタルアルデヒドを混和した溶液を、凝固処理と架橋処理を兼ね備えた凝固浴として使用した場合、両者の工程を一度に行うことができ、紡糸されたコラーゲン糸はそのまま架橋処理される。これらの同時処理は、工程の合理化だけではなく、希薄なコラーゲン溶液による紡糸や細径の糸を紡糸する際に非常に有効である。
【００３０】
コラーゲン不織布の作成方法は、紡糸された糸が任意の方向より交差し得る状態で連続的に押し出し、糸を多重多層状態にした後に凝固液を除去して再度エタノールで洗浄し、減圧乾燥する事により、非常に良好な綿状の線維状物を簡便に得ることができる。この方法は、紡糸と不織布化が同時に実施できるので、工程の簡素化、短縮化、経済性の面で特に有効である。
【００３１】
上記の例は代表的なものであり、不織布が得られさえすれば 、これに限定されるものではなく、例えば前述のコラーゲン線維ステープルを利用しても良いし、凝固浴の種類、凝固浴と架橋剤の混合浴の利用、また乾燥方法等を変更し、さらにそれらの組み合わせを変更してもよい。
【００３２】
一方、コラーゲン水溶液から間欠吐出による非連続紡糸、又は通常の連続紡糸を行った後に得られる糸を切断処置することにより、連続、非連続紡糸のいずれの場合においても短いステープル状の線維状物が得られる。これらを適当な大きさの容器に均一に分散させた状態で、減圧乾燥、自然乾燥などの方法により乾燥させた不織布を製造することも可能である。
【００３３】
また、コラーゲン基材として、シートを選択した場合は、円形、楕円形、正方形または長方形など形状は特にとらわれないが、培養皮膚など生体に移植するものを作製する場合は、移植すべき面積よりも大きいものを使用する。また、シートの厚さは約０．０１〜１．０ｍｍ、好ましくは約０．０４〜０．５０ｍｍである。
【００３４】
コラーゲンシートは、特開平９−４７５０３に記載の方法またはこれに準ずる方法に従って作製することができる。具体的には、可溶化処理されたコラーゲン溶液をポリスチレン製またはポリ−４−フッ化エチレン製などのような撥水性の容器に流し込み、乾燥機の中で乾燥することで得ることができる。該コラーゲン溶液の濃度は約０．０５〜３０重量％が好ましく流し込む溶液の量によって好適な膜厚のシートを作製することができる。
【００３５】
さらに、上記コラーゲン基材としてスポンジの形態を選択することができる。本発明におけるスポンジとは、目視判定あるいは顕微鏡下に観察して、均一または不均一な大きさの多数の間隙を有する区画が連続または不連続に分散した多孔質を構成した状態をいう。また、スポンジは、作製時に用いる型によって様々な形状を取ることができ、直方体、立方体、円柱および球など様々な形をとることができ、る。さらに、スポンジの空隙率は、型の容積を１００％とした場合、約１０〜９９％が好ましく、より好ましくは約５０〜９５％である。
【００３６】
上記コラーゲンスポンジの製造方法は、コラーゲン溶液を任意の形状をした型に注入し、自然乾燥、真空乾燥、凍結真空乾燥などの方法により形成する。コラーゲン溶液を充填後に凍結し、真空にて乾燥する凍結真空乾燥法で形成することが、スポンジを均一に形成する上で好ましい。該コラーゲン溶液の濃度は約０．０５〜３０重量％である。充填するコラーゲン溶液の濃度を調節することにより、充填率が異なるスポンジをえることができる。また、乾燥条件は、コラーゲン溶液が凍結した後、約０．０８Ｔｏｒｒ以下の真空に保つことが好ましい。凍結乾燥後、コラーゲン基材を型から取り出すことにより、コラーゲンスポンジを得ることができる。
【００３７】
上記のコラーゲン基材は、必要によりさらに架橋処理を施してもよい。架橋方法には、大別して物理的架橋方法と化学的架橋方法が存在する。物理的架橋処理法としては、γ線照射、紫外線照射、電子線照射、プラズマ照射、熱脱水架橋処理などがあげられる。このうち熱脱水架橋処理が好ましい。熱脱水架橋処理では、コラーゲン単糸が巻き取られた状態で減圧下加熱処理することにより物理的に架橋処理される。この架橋処理では、架橋温度と架橋時間により生体適合性と分解吸収性をコントロールすることが可能である。物理的架橋と化学的架橋はそれぞれ単独で行ってもよいし、併用してもよく、また併用する場合にはその順番は問わない。
【００３８】
化学的架橋反応に用いる架橋剤としては、コラーゲンとの架橋反応が可能であれば如何なる架橋剤でも使用可能であり、例えばアルデヒド類、エポキシ類、カルボジイミド類、イソシアネート類などが挙げられる。アルデヒド類としてはホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、グリオキサル、ジアルデヒドデンプン等、エポキシ類としてはグリセロールジグリシジルエーテル等、カルボジイミド類としては水溶性カルボジイミド等、イソシアネート類としてはヘキサメチレンジイソシアネート等が挙げられる。好ましくはグルタルアルデヒドである。コラーゲン単糸の架橋は、通常、架橋剤の溶液中にコラーゲン単糸を浸漬することにより行われる。架橋剤溶液の溶媒は特に限定されないが、水やエタノール等が好適であり、特にエタノールが最適である。架橋剤溶液の濃度と浸漬時間により、分解吸収性と生体適合性をコントロールすることが可能である。架橋剤がグルタルアルデヒドである場合、溶液の濃度は、通常約０.００１〜２５容量％、好ましくは、約０．０１〜１．０容量％である。
【００３９】
本発明の培養移植片製造工程における細胞培養方法は、基材に細胞を播種させる一般の細胞培養方法に準ずる。播種の方法は当業者がなし得る公知の方法を使用すればよいが、基材がコラーゲンである場合、特開２０００−６０５４２に記載の方法またはこれに準ずる方法が好ましい。具体的には、生分解性基材上に細胞懸濁液の極微量の液滴をマイクロピペッタ−等の器具を使用することにより行う。液滴中における細胞の量としては、細胞濃度にして約０．１×１０４〜２．０×１０５ｃｅｌｌｓ／１００μｌの細胞懸濁液を約５０〜１００μｌ加えるのが望ましい。こうしてコラーゲン基材上に滴下された液滴中の細胞は、生分解性基材の上で接着するまで３７℃、湿度１００％、５容量％炭酸ガスの培養条件で約０．５〜５時間インキュベーターによってインキュベートする。
【００４０】
以下に、移植片の種類の一つである培養皮膚の作成について説明するが、本発明はこれに限定するものではない。本発明における培養皮膚とは、表皮層のみからなる培養表皮、真皮層のみからなる培養真皮ならびに表皮層および真皮層からなる培養皮膚のいずれも含む。
【００４１】
培養皮膚は、シートまたは不織布など平面状の基材に表皮細胞および／または線維芽細胞を播種、培養して作成することができる。具体的には、シートまたは不織布など平面状の基材に線維芽細胞播種、培養することで真皮層のみからなる培養真皮を得ることができる。さらに、該真皮層に表皮細胞を播種、培養することで表皮層および真皮層からなる培養皮膚を得ることができる。表皮層を形成する際の培養は、空気に晒された状態（空気曝露）で培養すると、角質化（メラニン形成）をするため好ましい。さらに、該培養皮膚をコラゲナーゼまたはディスパーゼなどで表皮層を真皮層から剥離することで表皮層からなる培養表皮を得ることができる。
【００４２】
上記表皮細胞は、清潔な環境下で採取された皮膚（表皮および真皮の一部、もしくは皮膚全層）を消毒し、ストレプトマイシン或いはバンコマイシンなどの抗生物質を含有する生理食塩水、ハンクス液またはリン酸緩衝液などの緩衝液に浸漬する。この皮膚をディスパーゼ濃度約５００〜２０００Ｕ／ｍｌに調製した培地に浸漬して表皮と真皮に分離する。ここで使用する培地は、ＭＣＤＢ１５３培地またはＤＭＥＭ培地などの市販されている培地を使用すればよい。
【００４３】
次に得られた表皮をトリプシン濃度約０．０１〜０．５０重量％に調製したハンクス液中に移し、約３７℃、約１０〜２０分間浸漬する。次にＤＭＥＭなどの培地中に移し、振盪することにより細胞を分散させ、約２００〜６００×ｇ、約４〜１０分間の遠心分離にて得ることができる。
【００４４】
上記線維芽細胞は、表皮細胞の調製の際に使用した皮膚片から表皮と真皮に分離する工程において得られた真皮を、ホモジナイザーなどを用いて砕き、約０．１〜１．０重量％のコラゲナーゼＤＭＥＭ溶液に加え、約２〜５時間、約３７℃にて振盪して結合組織を溶解させたうえで約４００×ｇ〜１０００×ｇ、好ましくは約５００×ｇ〜７００×ｇで遠心分離して採取する。もしくは、ホモジナイザーなどにより砕いた真皮組織細片を培養皿内に静置し、一面が培地で浸る程度にＤＭＥＭなどの培地を加え、約１週間後に真皮組織細片から生えだしてきた線維芽細胞を、トリプシン濃度約０．１〜０．５重量％に調製したハンクス溶液などを用いて剥離し、遠心分離する方法によって線維芽細胞を回収することもできる。
【００４５】
上記の方法で得られた表皮細胞および線維芽細胞は、例えばヒト胎盤エキス含有ＭＣＤＢ１５３培地で、約３７℃、５％二酸化炭素雰囲気下の継代培養にてそれぞれ増殖させることができる。
【００４６】
次に上記線維芽細胞を、生分解性基材上に播種、培養することで培養真皮を製造する。例えば、コラーゲンシート上に細胞濃度約２．０×１０５ｃｅｌｌｓ／１００μｌを滴下し、約３７℃、湿度１００％、５容量％炭酸ガスの培養条件で約０．５〜５時間インキュベートすることで播種することができる。培養方法もヒト胎盤エキス含有培地を用いて、一般的な方法で培養すればよく、例えば培養条件として例えば約３７℃、湿度約１００％、５容量％二酸化炭素雰囲気化で培養する方法が挙げられるが、これに限定されるものではない。また、培養する日数は、細胞がコンフルエントになる状態によって変化するが、一般的には、約８〜１２日間である。
【００４７】
次に上記の方法で得られた培養真皮上に表皮細胞を播種、培養することで培養皮膚を製造する。播種の方法は、上記の方法に従う。表皮細胞の培養の際には、まずヒト胎盤エキス含有培地中で、約８〜１２日間培養することに自己増殖層を形成させる。次に、空気曝露培養に切り替え、約８〜１２日間培養することにより表皮細胞を角質化させることで培養皮膚を得る。
【００４８】
また、患者の損傷の程度によっては培養皮膚における真皮層が不要な場合も存在する。この場合、上記の方法で得た培養皮膚の表皮層と真皮層とを分離することで得た培養表皮を使用することができる。表皮層と真皮層とを分離する方法は、上記表皮細胞および線維芽細胞を作成した際の表皮と真皮の分離の方法に従えばよい。
【実施例】
【００４９】
以下に本発明を、実施例を用いて詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００５０】
製造例１：ヒト胎盤抽出物含有培地を調製
インフォームドコンセントを得た正常分娩後のヒト胎盤４５０ｇをリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄した後、２Ｍの塩化ナトリウム溶液４５０ｍｌを加え、４℃以下でポリトロンホモジナイザーを使いホモジナイズする。これを遠心分離（１５，０００×ｇ、３０分間）する。上清採取後、透析膜により透析して脱塩し、ヒト胎盤エキスを得た。この胎盤エキスのタンパク濃度は、約３．８ｍｇ／ｍｌであった。このヒト胎盤エキス２ｍｌをＭＣＤＢ１５３培地１Ｌに加え、さらに、インスリン（約５μｇ／ｍｌ）、ヒドロコルチゾン（約０．２μＭ）およびエタノールアミン（約０．５μＭ）を加えることでヒト胎盤抽出物含有培地を調製した。尚、この培地には動物胎児血清またはウシ脳下垂体エキスは含んでいない。
【００５１】
実施例１：表皮細胞の継代培養
細胞濃度が２．４×１０４ｃｅｌｌｓ／１００μｌ（２．４×１０３ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）になるように、製造例１の培地で調製した細胞懸濁液を、市販のコラーゲンコートディッシュ（直径１００ｍｍ）の中央部に１００μｌの液滴を滴下した。滴下した細胞懸濁液滴が零れないように気をつけながら、５容量％ＣＯ２インキュベーター内に約３７℃にて３時間放置し、コラーゲンコートディッシュに播種したヒト表皮細胞を接着させた。次にヒト胎盤抽出物含有培地を約１０ｍｌ添加して培養を開始した。３日おきに培地を交換し、培養開始から３１日後に培地を回収して培養を終了した。次に濃度約０．３０容量％トリプシン溶液（０．０１容量％ＥＤＴＡ含有リン酸緩衝液）で細胞を基材から剥離し、回収した細胞数をヘモサイトメーターでカウントした。
【００５２】
実施例１における継代培養３１日目の細胞数は、約２．５４×１０５であった。比較としてヒト胎盤エキスの変わりにウシ脳下垂体を含有した培地を用いて同条件で培養した時の細胞数は、約２．０１×１０５であった。ヒト胎盤抽出物含有培地が、ウシ脳下垂体含有培地を用いた培養３１日目の細胞数を上回ったことから、ヒト胎盤抽出物が、ウシ脳下垂体よりも増殖能に優れていることが明らかとなった。
【００５３】
実施例２：培養皮膚の製造
（１）コラーゲンシートの製造
ブタ由来I型、III型混合コラーゲン粉末（日本ハム株式会社製、ＳＯＦＤタイプ、Ｌｏｔ Ｎｏ． ＰＳ０２０２０）を注射用蒸留水に溶解し、１重量％に調製した。そして、この１重量％コラーゲン溶液を容量２０ｍｌ用のポリスチレン製のバランスディッシュに５ｍｌ添加し、乾燥させ、乾燥してできたシートをステンレスバッドに移し、バキュームドライオーブン（ＥＹＥＬＡ社製；ＶＯＳ３００ＶＤ型）と油回転真空ポンプ（ＵＬＶＡＣ社製；ＧＣＤ１３５−ＸＡ型）を用いて１２０℃、減圧下（１Ｔｏｒｒ以下）で２４時間熱脱水架橋反応を行った。その後、取り出したシートを３．７５ｗ／ｖ％炭酸水素ナトリウム水溶液中に約１時間浸漬し、次に１．８７５ｗ／ｖ％炭酸水素ナトリウム水溶液中に約１時間浸漬することによって中和処理を施した後、注射用蒸留水に約１２時間浸漬し、炭酸水素ナトリウムを洗浄した。蒸留水で洗浄後、乾燥させて再度上記と同様の条件で２４時間熱脱水架橋を施してコラーゲンシートを得た。
【００５４】
（２）線維芽細胞の継代培養
細胞濃度が２．４×１０４ｃｅｌｌｓ／１００μｌ（２．４×１０３ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）になるように、製造例１の培地で細胞懸濁液を調製した。この細胞懸濁液を、コラーゲンコートディッシュ（直径１００ｍｍ）の中央部に１００μｌの液滴で滴下した。滴下した細胞懸濁液滴が零れないように気をつけながら、５容量％ＣＯ２インキュベーター内に３７℃にて３時間放置し、コラーゲンコートディッシュに播種したヒト線維芽細胞を接着させた。次にヒト胎盤抽出物含有培地を約１０ｍｌ添加して培養を開始した。培養開始から約１０日後に細胞がコンフルエントになったので、培地を回収して培養を終了した。次に濃度約０．３０容量％トリプシン溶液（０．０１容量％ＥＤＴＡ含有リン酸緩衝液）で細胞を基材から剥離、回収した。
【００５５】
（３）培養真皮の製造
（２）で増殖したヒト線維芽細胞を、細胞濃度が２．４×１０４ｃｅｌｌｓ／１００μｌ（２．４×１０３ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）になるように、製造例１の培地で細胞懸濁液を調製した。この細胞懸濁液を、（１）で製造したコラーゲンシートの中央部に１００μｌの液滴で滴下した。滴下した細胞懸濁液滴が零れないように気をつけながら、５容量％ＣＯ２インキュベーター内に３７℃にて３時間放置し、コラーゲンシートに播種したヒト表皮細胞を接着させた。次にヒト胎盤抽出物含有培地を約１０ｍｌ添加して培養を開始した。培養開始から約８日後に細胞がコンフルエントになったので、培地を回収して培養を終了して培養真皮を得た。
【００５６】
（４）培養皮膚の製造
実施例１で増殖した表皮細胞を、細胞濃度が２．４×１０４ｃｅｌｌｓ／１００μｌ（２．４×１０３ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）になるように、製造例１の培地で細胞懸濁液を調製した。この細胞懸濁液を、（３）で得た培養真皮の中央部に１００μｌの液滴で滴下した。滴下した細胞懸濁液滴が零れないように気をつけながら、５容量％ＣＯ２インキュベーター内に３７℃にて３時間放置し、培養真皮に播種したヒト表皮細胞を接着させた。次にヒト胎盤抽出物含有培地を約１０ｍｌ添加して培養を開始した。約８日間培養液中で培養することで自己増殖層を形成させた。次に、空気曝露培養に切り替えることで重層化させた。培養開始から約１０日後、培地を回収して培養皮膚を得た。
【産業上の利用可能性】
【００５７】
本発明は、ウシ脳下垂体含有培地よりも細胞増殖能に優れた培地を使用することにより、より迅速な培養移植片、特に培養皮膚の大量生産が可能になる。また、倫理的な面においても問題のない培養移植片、特に培養皮膚を提供することができる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、培養移植片、特に培養皮膚の製造方法に関する。具体的には、ヒト胎盤抽出物を含む基礎培地を用いて、基材にヒト付着細胞を播種し、該ヒト付着細胞を培養する工程を含む培養移植片または培養皮膚の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、患者の健常な細胞を採取し、生分解性または生態適合性材料からなる培養基材などに細胞を播種、培養することで培養皮膚などの培養移植片の開発が注目を浴びている。これらの培養移植片は、患者の損傷欠損部に適用するために、その品質は高度なものが要求される。
【０００３】
上記培養移植片の製造における細胞培養の工程は、基礎培地中に細胞の増殖を促進するための増殖因子および天然物を添加したものが用いられており、天然物の代表的なものとして動物胎児血清やウシ脳下垂体抽出物などが挙げられる。
【０００４】
ウシ脳下垂体抽出物を用いた細胞培養には、表皮角化細胞やメラノサイトの培養した発明が開示されている（特許文献１）。しかし、ウシ脳下垂体抽出物は、増殖効果を安定に維持することは難しく、その増殖効果自体も不十分である。さらに、牛海綿状脳症（ＢＳＥ）の問題から、その使用は避けるべきものである。
【０００５】
また、線維芽細胞成長因子、血清、環状アデノシンモノホスフェートなどの補充物を添加したケラチノサイトからの調製物を添加し、同じくメラノサイトの増殖を促す方法が開示されている（特許文献２）。しかし、これらの技術は、添加物の調製に手間が掛るなどの問題があった。
【０００６】
【特許文献１】特開昭６２−９１１８０号公報
【特許文献２】特公表平２−５０１４４３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、培養工程における細胞増殖において、ウシ由来脳下垂体を含有した培地用いる培養方法よりも細胞増殖能に優れ、倫理的な問題を解決した培養移植片、特に培養皮膚の製造方法が求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、
（１） ヒト胎盤抽出物を含有する基礎培地からなる培地、
（２） 培地中におけるヒト胎盤抽出物のタンパク濃度が約０．０１〜８０ｍｇ／ｌである（１）に記載の培地、
（３） 基礎培地が、１９９、ＭＣＤＢ１５３、ＨａｍＦ１０、ＨａｍＦ１２、ＤＭＥＭ、ＥＢＳＳ、ＨＴＦまたはこれらの混合培地である（１）に記載の培地、
（４） 動物胎児血清またはウシ脳下垂体を含有しない（１）に記載の培地、
（５） ヒト胎盤抽出物を含有する培地を用いて、基材にヒト付着細胞を播種し、該ヒト付着細胞を培養する工程を含む培養移植片の製造方法、
（６） ヒト付着細胞が、ヒト由来の表皮細胞、線維芽細胞または軟骨細胞である（５）に記載の培養移植片の製造方法、
（７） 基材にヒト付着細胞を播種し、該ヒト付着細胞を培養する工程が、下記の(i)、(ii)または(i)および(ii)の両方である（５）に記載の培養移植片の製造方法；
(i) ヒトから採取したヒト付着細胞を、培養移植片の製造を目的に増殖培養する前培養工程：
(ii) 培養移植片を製造するためにヒト付着細胞を培養する培養移植片製造工程、
（８） 基材が、生体適合性材料をコーティングした培養皿、生体適合性材料から作製された不織布、スポンジ、シートまたはこれらの複合体である（５）に記載の培養移植片の製造方法、
（９） 生体適合性材料がコラーゲンである（８）に記載の培養移植片の製造方法、
（１０） ヒト胎盤抽出物を含有する培地を用いて、基材に表皮細胞または線維芽細胞を播種し、該細胞を培養する工程を含む培養皮膚の製造方法、
（１１） 基材に表皮細胞または線維芽細胞を播種し、該表皮細胞または線維芽細胞を培養する工程が、下記の(i)、(ii)または(i)および(ii)の両方である（１０）に記載の培養皮膚の製造方法；
(i) ヒトから採取した表皮細胞または線維芽細胞を、培養皮膚の製造を目的に増殖培養する前培養工程：
(ii) 培養皮膚を製造するために表皮細胞または線維芽細胞を培養する培養皮膚製造工程に関する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明は、ウシ脳下垂体含有培地よりも細胞増殖能に優れた培地を使用することにより、より迅速な培養移植片、特に培養皮膚の大量生産が可能になる。また、倫理的な面においても問題のない培養移植片、特に培養皮膚を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明の培養移植片の製造方法は、細胞増殖因子としてヒト胎盤抽出物を含有した培地を用いることを特徴としている。そして、好ましくは動物胎児血清またはウシ脳下垂体は使用しないものである。ヒト胎盤抽出物は、ヒト胎盤をホモジナイザーなどで砕き、精製したものである。上記ヒト胎盤は、臍帯血バンクで臍帯血を分離、採取したものを用いることができるが、インフォームドコンセントを得たものであることが重要である。インフォームドコンセントとは、胎盤提供者に十分な説明を行い、提供者が納得した上で、提供者の自己決定により同意を得ることで倫理的な問題を解決していることを意味する。
【００１１】
本発明に用いる培地は特に制限されるものではなく、基礎培地または基礎培地に任意に使用できる公知の成分を適時配合させてもよい。基礎培地としては、１９９、ＭＣＤＢ１５３、ＨａｍＦ１０、ＨａｍＦ１２、ＤＭＥＭ、ＥＢＳＳ、ＨＴＦおよびこれらの混合培地などが挙げられる。これらの基礎培地に適時配合させる任意の組成物は、インスリン、ヒドロコルチゾン、コロラドキシン、イソブチルメチルキサンチンおよびエタノールアミンなどが挙げられる。
【００１２】
胎盤抽出物は胎盤を粉砕、精製することにより得ることができる。胎盤の粉砕は、通常胎盤に蒸留水を加え、ホモジナイザーを用いて行われるが、これに限定されるものではない。粉砕した胎盤は、遠心分離により上清を回収する。遠心分離の条件は、約５０００〜２００００×ｇ、好ましくは約７５００〜１２５００×ｇで、時間は約１０〜６０分、このましくは約２０〜４０分である。この上清を、約５０〜９０容量％、好ましくは約６０〜８０容量％飽和硫酸アンモニウムを加え、約５０００〜２００００×ｇ、好ましくは約７５００〜１２５００×ｇで、時間は約１０〜６０分、好ましくは２０〜４０分で遠心分離をし、得られた沈殿物をセルロース製の透析チューブに入れ、リン酸緩衝液により一晩脱塩したものを用いる。この脱塩して得られた胎盤抽出物の溶液を胎盤エキスと呼ぶ。この胎盤エキスは脱塩したものをそのまま使用する。胎盤エキスのタンパク濃度は、一定量の胎盤エキスを乾燥させたタンパクの重量から特定することができ、上記の工程に従って作成すれば、約０．１〜２０ｍｇ／ｍｌの範囲内である。また、脱塩後に乾燥させたタンパクの重量を測定し、濃度調製して胎盤エキスを作成してもよいが、乾燥時にタンパクの一部が変性してしまう可能性があり、細胞増殖能を損なう可能性があるため、脱塩後はそのまま使用することが好ましい。上記胎盤エキスを培地中に約０．１〜４．０容量％、好ましくは約０．２〜２．０容量％加える。したがって、培地中における胎盤抽出物の含有量は、約０．０１〜８０ｍｇ／ｌの範囲内である。
【００１３】
本発明の培養移植片とは、健常な細胞を採取し、基材などに播種して体外培養することで製造されるものであり、患者の損傷部などに移植する再生医療分野における一般的な医療用具を意味する。具体的には、培養皮膚（培養表皮）および培養骨などが挙げられる。
【００１４】
したがって使用する細胞は、ヒト付着細胞を用いる。ヒト付着細胞とは、ヒトの組織に由来し、増殖する際に何らかの足場に付着して増殖していく特性を持つ細胞の総称であり、それらの細胞については種類を限定することなく使用可能であるが、培養移植片の作成に用いられる細胞が挙げられる。具体的には、表皮細胞、線維芽細胞および軟骨細胞などが挙げられる。
【００１５】
上記移植片の一般的な製造において、培養とは以下の２種類工程があることが一般的である。
(i) ヒトから採取したヒト付着細胞を、培養移植片の製造を目的に増殖培養する前培養工程。
(ii) 培養移植片を製造するためにヒト付着細胞を培養する培養移植片製造工程。
【００１６】
本発明における上記ヒト胎盤抽出物含有培地は、上記前培養工程、上記培養移植片製造工程またはこれらの両工程に使用することができる。好ましくは両工程で使用する場合である。
【００１７】
上記前培養工程とは、採取したヒト付着細胞が、培養移植片製造するにあたって不十分な細胞数である場合、細胞を増殖させることで十分な細胞数を得る一般的な継代培養の工程である。上記前培養工程の具体的な製造例としては、一般的な培養皿を基材として用いた培養方法が挙げられるが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００１８】
上記培養皿は、市販しているポリスチレンシャーレなどでもよいが、生体適合性材料でコーティングした培養皿が好ましい。具体的には、コラーゲンコートディッシュ、ゼラチンコートディッシュ、ラミニンコートディッシュおよびフィブロネクチンコートディッシュなどが挙げられる。
【００１９】
本発明の細胞培養方法は、基材に細胞を播種させる一般の細胞培養方法に準ずる。播種の方法は当業者がなし得る公知の方法を使用すればよい。播種後、基材に接着するまで３７℃、湿度１００％、５容量％炭酸ガスの培養条件で約０．５〜５時間インキュベートするのが一般的であるが、これに限定されるものではない。
【００２０】
インキュベート終了後、細胞を培養する。培養方法、条件は公知の一般的な方法でよく、培養する日数は、細胞がコンフルエントになる状態によって変化するが、一般的には、約８〜１２日間である。
【００２１】
培養後は、上記培養皿から細胞を剥離し、培養移植片製造工程に使用する。細胞を剥製する手段としては、トリプシンおよびディスパーゼなどが挙げられる。例えば、トリプシンの場合、０．０１容量％ＥＤＴＡ含有リン酸緩衝液の溶液として用いることが好ましく、濃度は約０．１０〜０．５０重量％、好ましくは約０．２０〜０．３５重量％である。
【００２２】
また、上記培養移植片製造工程とは、採取したヒト付着細胞をそのまま、または該細胞を上記前培養工程にて増殖した細胞を用いて実際に移植片を作成する工程である。作成工程の具体的な内容は、各移植片の一般的な製造方法に従うが、基本的には生体適合性材料からなる基材に播種、培養することで得ることが一般的である。
【００２３】
上記生体適合性材料としては、コラーゲン、ヒアルロン酸およびキチンなどの生体吸収性高分子、ならびにポリエステル、ポリアミドおよびポリ乳酸などの生分解性高分子などが挙げられる。好ましくは生体吸収性材料であり、さらに好ましくは架橋処理が可能な官能基を有するコラーゲンである。
【００２４】
コラーゲンは、例えば酵素可溶化コラーゲン、酸可溶化コラーゲン、アルカリ可溶化コラーゲンおよび中性可溶化コラーゲンなどが挙げられる。これらの可溶化コラーゲンとは、溶媒に溶解できるよう処理が施されたコラーゲンである。特に可溶化処理と同時にコラーゲンの抗原決定基であるテロペプタイドの除去処理が施されているアテロコラーゲンが好適である。また、コラーゲンの由来については、ウシ、ブタ、鳥類、魚類、ウサギ、ヒツジ、ネズミおよびヒトなどの動物種の皮膚、腱、骨、軟骨および臓器などから抽出されるものである。コラーゲンのタイプとしてはＩ型、III型などの分類可能なタイプのうちいずれかに限定されるものではない。
【００２５】
コラーゲン基材の形態としては、不織布、シートまたはスポンジなどが好適に使用されるが、同様な効果が得られる形態であればこれに限定されるものではない。
【００２６】
コラーゲン基材として、不織布を選択した場合は、線維束の間隙を培養対象となる細胞の大きさに合わせて調製することが好ましく、約０．０１〜５００μｍの間隙が好ましく、さらに好適であるのは約０．１〜２００μｍである。各線維間に均等に間隙が空いていることが好ましいが、部分的に接触していてもよい。
【００２７】
コラーゲン不織布を形成する線維は、常法に従ってコラーゲン水溶液から連続紡糸してコラーゲン糸を得、不織布状に加工することにより好適に製造される。コラーゲン水溶液の濃度は、使用するコラーゲンの種類により任意であり、紡糸可能であればどの様な濃度でも構わないが、通常は約０．１〜２０重量％、このうち湿式紡糸では約１〜１０重量％程度が特に好適である。また、紡糸時のコラーゲンの吐出速度は、紡糸可能である範囲であれば任意である。紡糸の際、コラーゲン溶液の吐出に用いる装置は、汎用のギアポンプ、ディスペンサー、各種押し出し装置等、何を用いても良いが、均一な紡糸を行うためには脈動が少なく安定してコラーゲン溶液を定量吐出できる装置が良い。また、紡糸を行う際の口金の孔径サイズは紡糸さえ可能であれば、特に限定はされないが、通常、約１０〜１０００μｍ、好ましくは約５０〜７００μｍの範囲が用いられる。さらに口金の孔数は単数でも複数でも良い。口金の形状も特に限定はされず、紡糸可能であれば、例えばスリット状、各種形状などの物を用いても良い。
【００２８】
湿式紡糸で用いられる凝固浴としては、一般的にコラーゲンを凝固させうる溶媒、懸濁液、乳濁液もしくは溶液であれが特に限定はされないが、無機塩類水溶液、無機塩類含有有機溶媒、アルコール類、ケトン類またはこれらの任意の組み合わせが用いられる。無機塩類水溶液としては、硫酸ナトリウム、塩化ナトリウム、硫酸アンモニウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウムなどの水溶液、特に塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、硫酸アンモニウムなどの水溶液が好ましい。これらの無機塩類をアルコール、アセトンに溶解または分散させた無機塩類含有有機溶媒等を用いてもよく、この場合特に塩化ナトリウムのエタノール溶解または分散溶液が好ましい。アルコール類としては、メタノール、エタノール、イソプロパノール、アミルアルコール、ペンタノール、ヘキサノールなどの炭素数１から６のアルコール類やエチレングリコールなどのグリコール類、好ましくはエタノールが挙げられる。ケトン類としてはアセトン、メチルエチルケトンなどが挙げられる。
【００２９】
上記凝固浴はコラーゲンの凝固のためだけではなく、後述する各種架橋剤との組み合わせにより、コラーゲンの凝固と架橋処理を同時に実施できる加工方法も有効である。たとえば、エタノールとグルタルアルデヒドを混和した溶液を、凝固処理と架橋処理を兼ね備えた凝固浴として使用した場合、両者の工程を一度に行うことができ、紡糸されたコラーゲン糸はそのまま架橋処理される。これらの同時処理は、工程の合理化だけではなく、希薄なコラーゲン溶液による紡糸や細径の糸を紡糸する際に非常に有効である。
【００３０】
コラーゲン不織布の作成方法は、紡糸された糸が任意の方向より交差し得る状態で連続的に押し出し、糸を多重多層状態にした後に凝固液を除去して再度エタノールで洗浄し、減圧乾燥する事により、非常に良好な綿状の線維状物を簡便に得ることができる。この方法は、紡糸と不織布化が同時に実施できるので、工程の簡素化、短縮化、経済性の面で特に有効である。
【００３１】
上記の例は代表的なものであり、不織布が得られさえすれば 、これに限定されるものではなく、例えば前述のコラーゲン線維ステープルを利用しても良いし、凝固浴の種類、凝固浴と架橋剤の混合浴の利用、また乾燥方法等を変更し、さらにそれらの組み合わせを変更してもよい。
【００３２】
一方、コラーゲン水溶液から間欠吐出による非連続紡糸、又は通常の連続紡糸を行った後に得られる糸を切断処置することにより、連続、非連続紡糸のいずれの場合においても短いステープル状の線維状物が得られる。これらを適当な大きさの容器に均一に分散させた状態で、減圧乾燥、自然乾燥などの方法により乾燥させた不織布を製造することも可能である。
【００３３】
また、コラーゲン基材として、シートを選択した場合は、円形、楕円形、正方形または長方形など形状は特にとらわれないが、培養皮膚など生体に移植するものを作製する場合は、移植すべき面積よりも大きいものを使用する。また、シートの厚さは約０．０１〜１．０ｍｍ、好ましくは約０．０４〜０．５０ｍｍである。
【００３４】
コラーゲンシートは、特開平９−４７５０３に記載の方法またはこれに準ずる方法に従って作製することができる。具体的には、可溶化処理されたコラーゲン溶液をポリスチレン製またはポリ−４−フッ化エチレン製などのような撥水性の容器に流し込み、乾燥機の中で乾燥することで得ることができる。該コラーゲン溶液の濃度は約０．０５〜３０重量％が好ましく流し込む溶液の量によって好適な膜厚のシートを作製することができる。
【００３５】
さらに、上記コラーゲン基材としてスポンジの形態を選択することができる。本発明におけるスポンジとは、目視判定あるいは顕微鏡下に観察して、均一または不均一な大きさの多数の間隙を有する区画が連続または不連続に分散した多孔質を構成した状態をいう。また、スポンジは、作製時に用いる型によって様々な形状を取ることができ、直方体、立方体、円柱および球など様々な形をとることができ、る。さらに、スポンジの空隙率は、型の容積を１００％とした場合、約１０〜９９％が好ましく、より好ましくは約５０〜９５％である。
【００３６】
上記コラーゲンスポンジの製造方法は、コラーゲン溶液を任意の形状をした型に注入し、自然乾燥、真空乾燥、凍結真空乾燥などの方法により形成する。コラーゲン溶液を充填後に凍結し、真空にて乾燥する凍結真空乾燥法で形成することが、スポンジを均一に形成する上で好ましい。該コラーゲン溶液の濃度は約０．０５〜３０重量％である。充填するコラーゲン溶液の濃度を調節することにより、充填率が異なるスポンジをえることができる。また、乾燥条件は、コラーゲン溶液が凍結した後、約０．０８Ｔｏｒｒ以下の真空に保つことが好ましい。凍結乾燥後、コラーゲン基材を型から取り出すことにより、コラーゲンスポンジを得ることができる。
【００３７】
上記のコラーゲン基材は、必要によりさらに架橋処理を施してもよい。架橋方法には、大別して物理的架橋方法と化学的架橋方法が存在する。物理的架橋処理法としては、γ線照射、紫外線照射、電子線照射、プラズマ照射、熱脱水架橋処理などがあげられる。このうち熱脱水架橋処理が好ましい。熱脱水架橋処理では、コラーゲン単糸が巻き取られた状態で減圧下加熱処理することにより物理的に架橋処理される。この架橋処理では、架橋温度と架橋時間により生体適合性と分解吸収性をコントロールすることが可能である。物理的架橋と化学的架橋はそれぞれ単独で行ってもよいし、併用してもよく、また併用する場合にはその順番は問わない。
【００３８】
化学的架橋反応に用いる架橋剤としては、コラーゲンとの架橋反応が可能であれば如何なる架橋剤でも使用可能であり、例えばアルデヒド類、エポキシ類、カルボジイミド類、イソシアネート類などが挙げられる。アルデヒド類としてはホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、グリオキサル、ジアルデヒドデンプン等、エポキシ類としてはグリセロールジグリシジルエーテル等、カルボジイミド類としては水溶性カルボジイミド等、イソシアネート類としてはヘキサメチレンジイソシアネート等が挙げられる。好ましくはグルタルアルデヒドである。コラーゲン単糸の架橋は、通常、架橋剤の溶液中にコラーゲン単糸を浸漬することにより行われる。架橋剤溶液の溶媒は特に限定されないが、水やエタノール等が好適であり、特にエタノールが最適である。架橋剤溶液の濃度と浸漬時間により、分解吸収性と生体適合性をコントロールすることが可能である。架橋剤がグルタルアルデヒドである場合、溶液の濃度は、通常約０.００１〜２５容量％、好ましくは、約０．０１〜１．０容量％である。
【００３９】
本発明の培養移植片製造工程における細胞培養方法は、基材に細胞を播種させる一般の細胞培養方法に準ずる。播種の方法は当業者がなし得る公知の方法を使用すればよいが、基材がコラーゲンである場合、特開２０００−６０５４２に記載の方法またはこれに準ずる方法が好ましい。具体的には、生分解性基材上に細胞懸濁液の極微量の液滴をマイクロピペッタ−等の器具を使用することにより行う。液滴中における細胞の量としては、細胞濃度にして約０．１×１０４〜２．０×１０５ｃｅｌｌｓ／１００μｌの細胞懸濁液を約５０〜１００μｌ加えるのが望ましい。こうしてコラーゲン基材上に滴下された液滴中の細胞は、生分解性基材の上で接着するまで３７℃、湿度１００％、５容量％炭酸ガスの培養条件で約０．５〜５時間インキュベーターによってインキュベートする。
【００４０】
以下に、移植片の種類の一つである培養皮膚の作成について説明するが、本発明はこれに限定するものではない。本発明における培養皮膚とは、表皮層のみからなる培養表皮、真皮層のみからなる培養真皮ならびに表皮層および真皮層からなる培養皮膚のいずれも含む。
【００４１】
培養皮膚は、シートまたは不織布など平面状の基材に表皮細胞および／または線維芽細胞を播種、培養して作成することができる。具体的には、シートまたは不織布など平面状の基材に線維芽細胞播種、培養することで真皮層のみからなる培養真皮を得ることができる。さらに、該真皮層に表皮細胞を播種、培養することで表皮層および真皮層からなる培養皮膚を得ることができる。表皮層を形成する際の培養は、空気に晒された状態（空気曝露）で培養すると、角質化（メラニン形成）をするため好ましい。さらに、該培養皮膚をコラゲナーゼまたはディスパーゼなどで表皮層を真皮層から剥離することで表皮層からなる培養表皮を得ることができる。
【００４２】
上記表皮細胞は、清潔な環境下で採取された皮膚（表皮および真皮の一部、もしくは皮膚全層）を消毒し、ストレプトマイシン或いはバンコマイシンなどの抗生物質を含有する生理食塩水、ハンクス液またはリン酸緩衝液などの緩衝液に浸漬する。この皮膚をディスパーゼ濃度約５００〜２０００Ｕ／ｍｌに調製した培地に浸漬して表皮と真皮に分離する。ここで使用する培地は、ＭＣＤＢ１５３培地またはＤＭＥＭ培地などの市販されている培地を使用すればよい。
【００４３】
次に得られた表皮をトリプシン濃度約０．０１〜０．５０重量％に調製したハンクス液中に移し、約３７℃、約１０〜２０分間浸漬する。次にＤＭＥＭなどの培地中に移し、振盪することにより細胞を分散させ、約２００〜６００×ｇ、約４〜１０分間の遠心分離にて得ることができる。
【００４４】
上記線維芽細胞は、表皮細胞の調製の際に使用した皮膚片から表皮と真皮に分離する工程において得られた真皮を、ホモジナイザーなどを用いて砕き、約０．１〜１．０重量％のコラゲナーゼＤＭＥＭ溶液に加え、約２〜５時間、約３７℃にて振盪して結合組織を溶解させたうえで約４００×ｇ〜１０００×ｇ、好ましくは約５００×ｇ〜７００×ｇで遠心分離して採取する。もしくは、ホモジナイザーなどにより砕いた真皮組織細片を培養皿内に静置し、一面が培地で浸る程度にＤＭＥＭなどの培地を加え、約１週間後に真皮組織細片から生えだしてきた線維芽細胞を、トリプシン濃度約０．１〜０．５重量％に調製したハンクス溶液などを用いて剥離し、遠心分離する方法によって線維芽細胞を回収することもできる。
【００４５】
上記の方法で得られた表皮細胞および線維芽細胞は、例えばヒト胎盤エキス含有ＭＣＤＢ１５３培地で、約３７℃、５％二酸化炭素雰囲気下の継代培養にてそれぞれ増殖させることができる。
【００４６】
次に上記線維芽細胞を、生分解性基材上に播種、培養することで培養真皮を製造する。例えば、コラーゲンシート上に細胞濃度約２．０×１０５ｃｅｌｌｓ／１００μｌを滴下し、約３７℃、湿度１００％、５容量％炭酸ガスの培養条件で約０．５〜５時間インキュベートすることで播種することができる。培養方法もヒト胎盤エキス含有培地を用いて、一般的な方法で培養すればよく、例えば培養条件として例えば約３７℃、湿度約１００％、５容量％二酸化炭素雰囲気化で培養する方法が挙げられるが、これに限定されるものではない。また、培養する日数は、細胞がコンフルエントになる状態によって変化するが、一般的には、約８〜１２日間である。
【００４７】
次に上記の方法で得られた培養真皮上に表皮細胞を播種、培養することで培養皮膚を製造する。播種の方法は、上記の方法に従う。表皮細胞の培養の際には、まずヒト胎盤エキス含有培地中で、約８〜１２日間培養することに自己増殖層を形成させる。次に、空気曝露培養に切り替え、約８〜１２日間培養することにより表皮細胞を角質化させることで培養皮膚を得る。
【００４８】
また、患者の損傷の程度によっては培養皮膚における真皮層が不要な場合も存在する。この場合、上記の方法で得た培養皮膚の表皮層と真皮層とを分離することで得た培養表皮を使用することができる。表皮層と真皮層とを分離する方法は、上記表皮細胞および線維芽細胞を作成した際の表皮と真皮の分離の方法に従えばよい。
【実施例】
【００４９】
以下に本発明を、実施例を用いて詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００５０】
製造例１：ヒト胎盤抽出物含有培地を調製
インフォームドコンセントを得た正常分娩後のヒト胎盤４５０ｇをリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄した後、２Ｍの塩化ナトリウム溶液４５０ｍｌを加え、４℃以下でポリトロンホモジナイザーを使いホモジナイズする。これを遠心分離（１５，０００×ｇ、３０分間）する。上清採取後、透析膜により透析して脱塩し、ヒト胎盤エキスを得た。この胎盤エキスのタンパク濃度は、約３．８ｍｇ／ｍｌであった。このヒト胎盤エキス２ｍｌをＭＣＤＢ１５３培地１Ｌに加え、さらに、インスリン（約５μｇ／ｍｌ）、ヒドロコルチゾン（約０．２μＭ）およびエタノールアミン（約０．５μＭ）を加えることでヒト胎盤抽出物含有培地を調製した。尚、この培地には動物胎児血清またはウシ脳下垂体エキスは含んでいない。
【００５１】
実施例１：表皮細胞の継代培養
細胞濃度が２．４×１０４ｃｅｌｌｓ／１００μｌ（２．４×１０３ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）になるように、製造例１の培地で調製した細胞懸濁液を、市販のコラーゲンコートディッシュ（直径１００ｍｍ）の中央部に１００μｌの液滴を滴下した。滴下した細胞懸濁液滴が零れないように気をつけながら、５容量％ＣＯ２インキュベーター内に約３７℃にて３時間放置し、コラーゲンコートディッシュに播種したヒト表皮細胞を接着させた。次にヒト胎盤抽出物含有培地を約１０ｍｌ添加して培養を開始した。３日おきに培地を交換し、培養開始から３１日後に培地を回収して培養を終了した。次に濃度約０．３０容量％トリプシン溶液（０．０１容量％ＥＤＴＡ含有リン酸緩衝液）で細胞を基材から剥離し、回収した細胞数をヘモサイトメーターでカウントした。
【００５２】
実施例１における継代培養３１日目の細胞数は、約２．５４×１０５であった。比較としてヒト胎盤エキスの変わりにウシ脳下垂体を含有した培地を用いて同条件で培養した時の細胞数は、約２．０１×１０５であった。ヒト胎盤抽出物含有培地が、ウシ脳下垂体含有培地を用いた培養３１日目の細胞数を上回ったことから、ヒト胎盤抽出物が、ウシ脳下垂体よりも増殖能に優れていることが明らかとなった。
【００５３】
実施例２：培養皮膚の製造
（１）コラーゲンシートの製造
ブタ由来I型、III型混合コラーゲン粉末（日本ハム株式会社製、ＳＯＦＤタイプ、Ｌｏｔ Ｎｏ． ＰＳ０２０２０）を注射用蒸留水に溶解し、１重量％に調製した。そして、この１重量％コラーゲン溶液を容量２０ｍｌ用のポリスチレン製のバランスディッシュに５ｍｌ添加し、乾燥させ、乾燥してできたシートをステンレスバッドに移し、バキュームドライオーブン（ＥＹＥＬＡ社製；ＶＯＳ３００ＶＤ型）と油回転真空ポンプ（ＵＬＶＡＣ社製；ＧＣＤ１３５−ＸＡ型）を用いて１２０℃、減圧下（１Ｔｏｒｒ以下）で２４時間熱脱水架橋反応を行った。その後、取り出したシートを３．７５ｗ／ｖ％炭酸水素ナトリウム水溶液中に約１時間浸漬し、次に１．８７５ｗ／ｖ％炭酸水素ナトリウム水溶液中に約１時間浸漬することによって中和処理を施した後、注射用蒸留水に約１２時間浸漬し、炭酸水素ナトリウムを洗浄した。蒸留水で洗浄後、乾燥させて再度上記と同様の条件で２４時間熱脱水架橋を施してコラーゲンシートを得た。
【００５４】
（２）線維芽細胞の継代培養
細胞濃度が２．４×１０４ｃｅｌｌｓ／１００μｌ（２．４×１０３ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）になるように、製造例１の培地で細胞懸濁液を調製した。この細胞懸濁液を、コラーゲンコートディッシュ（直径１００ｍｍ）の中央部に１００μｌの液滴で滴下した。滴下した細胞懸濁液滴が零れないように気をつけながら、５容量％ＣＯ２インキュベーター内に３７℃にて３時間放置し、コラーゲンコートディッシュに播種したヒト線維芽細胞を接着させた。次にヒト胎盤抽出物含有培地を約１０ｍｌ添加して培養を開始した。培養開始から約１０日後に細胞がコンフルエントになったので、培地を回収して培養を終了した。次に濃度約０．３０容量％トリプシン溶液（０．０１容量％ＥＤＴＡ含有リン酸緩衝液）で細胞を基材から剥離、回収した。
【００５５】
（３）培養真皮の製造
（２）で増殖したヒト線維芽細胞を、細胞濃度が２．４×１０４ｃｅｌｌｓ／１００μｌ（２．４×１０３ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）になるように、製造例１の培地で細胞懸濁液を調製した。この細胞懸濁液を、（１）で製造したコラーゲンシートの中央部に１００μｌの液滴で滴下した。滴下した細胞懸濁液滴が零れないように気をつけながら、５容量％ＣＯ２インキュベーター内に３７℃にて３時間放置し、コラーゲンシートに播種したヒト表皮細胞を接着させた。次にヒト胎盤抽出物含有培地を約１０ｍｌ添加して培養を開始した。培養開始から約８日後に細胞がコンフルエントになったので、培地を回収して培養を終了して培養真皮を得た。
【００５６】
（４）培養皮膚の製造
実施例１で増殖した表皮細胞を、細胞濃度が２．４×１０４ｃｅｌｌｓ／１００μｌ（２．４×１０３ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）になるように、製造例１の培地で細胞懸濁液を調製した。この細胞懸濁液を、（３）で得た培養真皮の中央部に１００μｌの液滴で滴下した。滴下した細胞懸濁液滴が零れないように気をつけながら、５容量％ＣＯ２インキュベーター内に３７℃にて３時間放置し、培養真皮に播種したヒト表皮細胞を接着させた。次にヒト胎盤抽出物含有培地を約１０ｍｌ添加して培養を開始した。約８日間培養液中で培養することで自己増殖層を形成させた。次に、空気曝露培養に切り替えることで重層化させた。培養開始から約１０日後、培地を回収して培養皮膚を得た。
【産業上の利用可能性】
【００５７】
本発明は、ウシ脳下垂体含有培地よりも細胞増殖能に優れた培地を使用することにより、より迅速な培養移植片、特に培養皮膚の大量生産が可能になる。また、倫理的な面においても問題のない培養移植片、特に培養皮膚を提供することができる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト胎盤抽出物を含有する基礎培地からなる培地。
【請求項２】
培地中におけるヒト胎盤抽出物のタンパク濃度が約０．０１〜８０ｍｇ／ｌである請求項１に記載の培地。
【請求項３】
基礎培地が、１９９、ＭＣＤＢ１５３、ＨａｍＦ１０、ＨａｍＦ１２、ＤＭＥＭ、ＥＢＳＳ、ＨＴＦまたはこれらの混合培地である請求項１に記載の培地。
【請求項４】
動物胎児血清またはウシ脳下垂体を含有しない請求項１に記載の培地。
【請求項５】
ヒト胎盤抽出物を含有する培地を用いて、基材にヒト付着細胞を播種し、該ヒト付着細胞を培養する工程を含む培養移植片の製造方法。
【請求項６】
ヒト付着細胞が、ヒト由来の表皮細胞、線維芽細胞または軟骨細胞である請求項５に記載の培養移植片の製造方法。
【請求項７】
基材にヒト付着細胞を播種し、該ヒト付着細胞を培養する工程が、下記の(i)、(ii)または(i)および(ii)の両方である請求項５に記載の培養移植片の製造方法；
(i) ヒトから採取したヒト付着細胞を、培養移植片の製造を目的に増殖培養する前培養工程：
(ii) 培養移植片を製造するためにヒト付着細胞を培養する培養移植片製造工程。
【請求項８】
基材が、生体適合性材料をコーティングした培養皿、生体適合性材料から作製された不織布、スポンジ、シートまたはこれらの複合体である請求項５に記載の培養移植片の製造方法。
【請求項９】
生体適合性材料がコラーゲンである請求項８に記載の培養移植片の製造方法。
【請求項１０】
ヒト胎盤抽出物を含有する培地を用いて、基材に表皮細胞または線維芽細胞を播種し、該細胞を培養する工程を含む培養皮膚の製造方法。
【請求項１１】
基材に表皮細胞または線維芽細胞を播種し、該表皮細胞または線維芽細胞を培養する工程が、下記の(i)、(ii)または(i)および(ii)の両方である請求項１０に記載の培養皮膚の製造方法；
(i) ヒトから採取した表皮細胞または線維芽細胞を、培養皮膚の製造を目的に増殖培養する前培養工程：
(ii) 培養皮膚を製造するために表皮細胞または線維芽細胞を培養する培養皮膚製造工程。
【請求項１】
ヒト胎盤抽出物を含有する基礎培地からなる培地。
【請求項２】
培地中におけるヒト胎盤抽出物のタンパク濃度が約０．０１〜８０ｍｇ／ｌである請求項１に記載の培地。
【請求項３】
基礎培地が、１９９、ＭＣＤＢ１５３、ＨａｍＦ１０、ＨａｍＦ１２、ＤＭＥＭ、ＥＢＳＳ、ＨＴＦまたはこれらの混合培地である請求項１に記載の培地。
【請求項４】
動物胎児血清またはウシ脳下垂体を含有しない請求項１に記載の培地。
【請求項５】
ヒト胎盤抽出物を含有する培地を用いて、基材にヒト付着細胞を播種し、該ヒト付着細胞を培養する工程を含む培養移植片の製造方法。
【請求項６】
ヒト付着細胞が、ヒト由来の表皮細胞、線維芽細胞または軟骨細胞である請求項５に記載の培養移植片の製造方法。
【請求項７】
基材にヒト付着細胞を播種し、該ヒト付着細胞を培養する工程が、下記の(i)、(ii)または(i)および(ii)の両方である請求項５に記載の培養移植片の製造方法；
(i) ヒトから採取したヒト付着細胞を、培養移植片の製造を目的に増殖培養する前培養工程：
(ii) 培養移植片を製造するためにヒト付着細胞を培養する培養移植片製造工程。
【請求項８】
基材が、生体適合性材料をコーティングした培養皿、生体適合性材料から作製された不織布、スポンジ、シートまたはこれらの複合体である請求項５に記載の培養移植片の製造方法。
【請求項９】
生体適合性材料がコラーゲンである請求項８に記載の培養移植片の製造方法。
【請求項１０】
ヒト胎盤抽出物を含有する培地を用いて、基材に表皮細胞または線維芽細胞を播種し、該細胞を培養する工程を含む培養皮膚の製造方法。
【請求項１１】
基材に表皮細胞または線維芽細胞を播種し、該表皮細胞または線維芽細胞を培養する工程が、下記の(i)、(ii)または(i)および(ii)の両方である請求項１０に記載の培養皮膚の製造方法；
(i) ヒトから採取した表皮細胞または線維芽細胞を、培養皮膚の製造を目的に増殖培養する前培養工程：
(ii) 培養皮膚を製造するために表皮細胞または線維芽細胞を培養する培養皮膚製造工程。
【公開番号】特開２００６−７５１２１（Ｐ２００６−７５１２１Ａ）
【公開日】平成１８年３月２３日（２００６．３．２３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−２６４９０５（Ｐ２００４−２６４９０５）
【出願日】平成１６年９月１３日（２００４．９．１３）
【出願人】（０００１３５０３６）ニプロ株式会社 (583)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年３月２３日（２００６．３．２３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年９月１３日（２００４．９．１３）
【出願人】（０００１３５０３６）ニプロ株式会社 (583)
【Ｆターム（参考）】
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