変異ＡＸＭＩ−Ｒ１δ−エンドトキシン遺伝子及びその使用方法
細菌、植物、植物細胞、組織及び種子に殺虫活性を付与する組成物及び方法が提供される。殺虫ポリペプチドについてのコード配列を含む組成物が提供される。そのコード配列は、植物及び細菌におけるトランスフォーメーション及び発現のためのＤＮＡ構築物又は発現カセットに使用することができる。組成物は、また、トランスフォーメーションされた細菌、植物、植物細胞、組織、及び種子を含む。特に、変異Ｃｒｙ３配列をコードする核酸分子が提供される。追加的に、ポリヌクレオチドに対応するアミノ酸配列が包含される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、分子生物学の分野に関する。殺虫タンパク質をコードする新規な遺伝子が提供される。これらのタンパク質及びそれらをコードする核酸配列は、殺虫製剤の調製及びトランスジェニック害虫抵抗性植物の産生に有用である。
【０００２】
発明の背景
Bacillus thuringiensis（Ｂｔ）は、ある目及び種の昆虫に特異的に毒性であるが、植物及び他のターゲティングされていない生物に無害な結晶状封入体を産生する能力を特徴とするグラム陽性芽胞形成土壌細菌である。この理由から、Bacillus thuringiensis株又はそれらの殺虫タンパク質を含む組成物は、多様なヒト又は動物疾患についての農業害虫又は媒介昆虫を防除する、環境的に許容されうる殺虫剤として使用することができる。
【０００３】
Bacillus thuringiensis由来結晶性（Ｃｒｙ）タンパク質（δ−エンドトキシン）は、主にLepidoptera、Diptera、及びColeoptera幼虫に対して強力な殺虫活性を有する。これらのタンパク質は、また、Hymenoptera、Homoptera、Phthiraptera、Mallophaga、及びAcari目の害虫、ならびにNemathelminthes、Platyhelminthes、及びSarcomastigorphora目などの他の無脊椎動物に対して活性を示した（Feitelson (1993) The Bacillus Thuringiensis family tree. In Advanced Engineered Pesticides, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y.）。元々これらのタンパク質は、主にその殺虫活性に基づきＣｒｙＩ〜ＣｒｙＶと分類された。主な種類は、Lepidoptera特異的（Ｉ）、Lepidoptera及びDiptera特異的（ＩＩ）、Coleoptera特異的（ＩＩＩ）、Diptera特異的（ＩＶ）、ならびに線虫特異的（Ｖ）及び（ＶＩ）であった。タンパク質は、さらにサブファミリーに分類され、各ファミリー内のより高度に関連したタンパク質にＣｒｙ１Ａ、Ｃｒｙ１Ｂ、Ｃｒｙ１Ｃなどの部門別文字が割り当てられた。各部門内のさらに近縁のタンパク質は、Ｃｒｙ１Ｃ１、Ｃｒｙ１Ｃ２などの名称を与えられた。
【０００４】
近年、昆虫ターゲット特異性よりもむしろアミノ酸配列相同性に基づいて、Ｃｒｙ遺伝子についての新しい命名が記載された（Crickmore et al. (1998) Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62:807-813）。この新しい分類では、各毒素は、第一階級（アラビア数字）、第二階級（大文字）、第三階級（小文字）、及び第四階級（別のアラビア数字）を組み入れた独自の名称が割り当てられる。新しい分類では、第一階級のローマ数字がアラビア数字に交換された。４５％未満の配列同一性を有するタンパク質は、異なる第一階級を有し、第二及び第三階級についての基準は、それぞれ７８％及び９５％である。
【０００５】
結晶状タンパク質は、昆虫の中腸に摂取され可溶化されるまで殺虫活性を示さない。摂取されたプロ毒素は、昆虫の消化管の中でプロテアーゼによって活性毒素分子に加水分解される。（Hofte and Whiteley (1989) Microbiol. Rev. 53:242-255）。この毒素は、ターゲット幼虫の中腸内で管腔側刷子縁レセプターに結合し、頂端膜内に挿入され、イオンチャネル又は小孔を作り、幼虫の死滅をもたらす。
【０００６】
δ−エンドトキシンは、一般に５個の保存された配列ドメイン及び３個の保存された構造ドメインを有する（例えば、de Maagd et al. (2001) Trends Genetics 17:193-199参照）。第１の保存された構造ドメインは、７個のαヘリックスから成り、膜内挿入及び孔形成に関与する。ドメインＩＩは、ギリシャキー立体配置にされた３個のβシートから成り、ドメインＩＩＩは、「ゼリーロール」構成の２個の逆平行βシートから成る（de Maagd et al., 2001、上記）。ドメインＩＩ及びＩＩＩは、レセプターの認識及び結合に関与し、それゆえに毒素の特異性の決定因子と見なされる。
【０００７】
Ｃｒｙ３型δエンドトキシンは、１９８０年代初期に最初に同定された。Ｃｒｙ３Ａａ１ δエンドトキシン（以前はｃｒｙＣ及びｃｒｙＩＩＩＡとしても知られている）は、以前にBacillus thuringiensis var san diego（Herrnstadt et al. (1987) Gene. 57:37-46）、Bacillus thuringiensis tenebrionis（Hofte et al. (1987) Nucleic acids Res. 15: 7183; McPherson et al. (1988) Bio/Technology 6:61-66; Sekar et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7036-7040）及びＥＧ２１５８（Donovan et al. (1988) Mol Gen Genet. 214(3):365-72）株から単離された。
【０００８】
Ｃｒｙ３Ａａは、多くの場合にある種のネイティブなBacillus株における菱形結晶の主成分として観察され、７２kDaタンパク質として産生され、そのタンパク質は続いて芽胞形成関連プロテアーゼによるタンパク質分解性プロセシングによって６６kDa毒素にプロセシングされる。この６６kDAタンパク質は、Coleopteraのコロラドハムシ（Colorado Potato Beetle）に活性を及ぼすことが知られている。
【０００９】
昆虫が与えうる破壊、及び害虫を防除することによる収量改善の理由で、新しい形の殺虫毒素を発見する継続的な必要性がある。
【００１０】
発明の概要
細菌、植物、植物細胞、組織及び種子に殺虫活性を付与するための組成物及び方法が提供される。組成物には、殺虫及び農薬ポリペプチドについての配列をコードする核酸分子、それらの核酸分子を含むベクター、ならびにそのベクターを含むホスト細胞が含まれる。組成物には、また、殺虫ポリペプチド配列及びそれらのポリペプチドに対する抗体が含まれる。ヌクレオチド配列は、微生物及び植物を含めた生物にトランスフォーメーション及び発現させるための、ＤＮＡ構築物又は発現カセットに使用することができる。ヌクレオチド又はアミノ酸配列は、非限定的に微生物又は植物を含めた生物における発現のために設計された合成配列のこともある。組成物は、また、トランスフォーメーションされた細菌、植物、植物細胞、組織、及び種子を含む。
【００１１】
特に、殺虫タンパク質をコードする単離された核酸分子が提供される。追加的に、殺虫タンパク質に対応するアミノ酸配列が包含される。特に本発明は、変異ＣＲＹ３をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子を提供する。本発明のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列、又は本発明の配列にハイブリダイゼーションするヌクレオチド配列もまた包含される。
【００１２】
本発明のポリペプチドを産生させる方法、及びLepidoptera、Coleoptera、線虫、又はDiptera害虫を防除又は殺滅するためにそれらのポリペプチドを使用する方法が提供される。試料中の本発明の核酸及びポリペプチドを検出するための方法及びキットもまた含まれる。
【００１３】
本発明の組成物及び方法は、害虫抵抗性又は寛容性が高められた生物の産生に有用である。これらの生物及びそれらの生物を含む組成物は、農業目的に望ましい。本発明の組成物は、また、殺虫活性を有する、変更若しくは改善されたタンパク質を生成させるために、又は産物若しくは生物中の殺虫タンパク質若しくは核酸の存在を検出するために有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】注釈付きＡＸＭＩ−Ｒ１配列（配列番号２）を示す図である。下線の領域は、ループ領域（Ｌ１、Ｌ２及びＬ３）を表す。縦棒は、ドメインＩ（ＤＩ）、ドメインＩＩ（ＤＩＩ）、及びドメインＩＩＩ（ＤＩＩＩ）の間の境界を表す。矢印は、変異の生成のためにターゲティングされた領域のいくつかを示す。
【図２】Ａｘｍｉ１６４（配列番号１３）、Ａｘｍｉ１６１（配列番号４４）、Ａｘｍｉ１５２（配列番号４５）、Ａｘｍｉ１５１（配列番号２６）、Ａｘｍｉ１４６（配列番号２７）、Ａｘｍｉ１４１（配列番号２８）、Ａｘｍｉ１２９（配列番号２９）、Ａｘｍｉ１２８（配列番号３０）、Ａｘｍｉ１２７（配列番号３１）、Ａｘｍｉ１２０（配列番号３２）、Ａｘｍｉ１１６（配列番号３３）、Ａｘｍｉ１１４（配列番号３４）、Ａｘｍｉ１０１（配列番号３５）、Ａｘｍｉ０９１（配列番号３６）、Ａｘｍｉ０８７（配列番号３７）、Ａｘｍｉ０３７（配列番号３８）、Ａｘｍｉ０２９（配列番号３９）、Ａｘｍｉ０２８（配列番号４０）、Ｃｒｙ８Ｂｂ１（配列番号４１）、Ｃｒｙ８Ｂｃ１（配列番号４２）、Ｃｒｙ７Ａａ（配列番号４３）、ＡｘｍｉＲ１ＰｅｒｍｕｔＰ３ｃ７（ｅｖｏ２１）（配列番号１３）、及びＡｘｍｉ−Ｒ１（配列番号２）のアライメントを示す図である。
【００１５】
詳細な説明
本発明は、生物における、特に植物又は植物細胞における害虫抵抗性又は寛容性を調節するための組成物及び方法を対象とする。「抵抗性」とは、本発明のポリペプチドを摂取したとき、又はそれと他の接触をしたときに、害虫（例えば昆虫）が死滅することが意図される。「寛容性」とは、害虫の運動、摂食、生殖、又は他の機能の障害又は減退が意図される。その方法は、本発明の殺虫タンパク質をコードするヌクレオチド配列を生物にトランスフォーメーションすることを伴う。特に、本発明のヌクレオチド配列は、殺虫活性を有する植物及び微生物を調製するために有用である。したがって、トランスフォーメーションされた細菌、植物、植物細胞、植物組織及び種子が提供される。
【００１６】
本明細書に提供されるのは、変異Ｃｒｙ３アミノ酸配列をコードする核酸配列を含む組成物であって、ここで、その変異体は殺虫活性、特にColeoptera害虫に対する殺虫活性を有する。「変異Ｃｒｙ３」アミノ酸配列とは、天然Ｃｒｙ３アミノ酸配列以外のＣｒｙ３配列が意図され、ここで、そのアミノ酸配列は、表１６に示される置換に対応する１個又は複数個のアミノ酸置換を有する。Ｃｒｙ３配列の一覧については、Crickmore et al. (1998), Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62:807-813を、定期的な更新についてはwww.biols.susx.ac.uk/Home/Neil_Crickmore/Bt/indexのCrickmore et al. (2003) "Bacillus thuringiensis toxin nomenclature"を参照されたい。
【００１７】
いくつかの態様では、天然又は「野生」Ｃｒｙ３配列は、配列番号１に示されるＡｘｍｉ−Ｒ１ヌクレオチド配列であり、その配列は、配列番号２に示されるアミノ酸配列をコードする。ＡＸＭＩ−Ｒ１配列は、GENBANK（登録商標）アクセッション番号Ｐ０Ａ３７９に記載されたｃｒｙ３Ａａ配列に対応する。しかしながら、表１６に記載された置換を、任意のＣｒｙ３Ａ、Ｃｒｙ３Ｂ、又はＣｒｙ３Ｃタンパク質などの任意のＣｒｙ３タンパク質の対応する位置に行うことができる。「対応する位置」は、配列番号２を有するターゲット配列をアライメントすることによって決定することができる。例えば図２に示すアライメントを参照されたい。
【００１８】
ｃｒｙ３Ａａタンパク質の結晶構造は、以前に決定された（Li et al, 1991, Nature 353:815-821）。この結晶構造は、様々なループ領域を明確化し、タンパク質の三次元構造に関してタンパク質分解性プロセシングの部位を示している。この構造は、その毒素が、他のδ−エンドトキシン配列の構造に一致する３個のドメイン（典型的にはドメインＩ、ＩＩ、及びＩＩＩと呼ばれる）に配置されることを示唆している。毒素の各ドメインは、結晶構造に基づいて定義されるループ領域を有する。この結晶構造の公表前に及び公表以来、Ｂｔエンドトキシン、特にｃｒｙ３型エンドトキシンの毒性の構造及び機能、ならびにこの活性に果たすタンパク質分解の役割に関する広範で簡単な規則を説明するために多数の試みがなされてきた。
【００１９】
例えば、Van Rieら、1997（米国特許第５，６５９，１２３号）は、毒性にマイナスの影響を与える位置を同定し、続いてこれらのループ内のある位置でアミノ酸をランダム置換することで、ドメインＩＩの改変を「ループ」と見なされる区域で行うことによる、毒性改善を導くアミノ酸の同定を示唆している。同様に、Wu及びDean（J.Mol. Biol., 1996, 255: 628-640）によるループＩＩ残基へのランダムなアラニン挿入は、タンパク質の機能を減退させた。Wuら（Febs Letters, 2000, 473:227-232）によるループＩの残基のランダム変異誘発は、大部分の場合で不安定なタンパク質及び減退したタンパク質機能を招き、二つの場合で毒性増加及び結合性の変更を有するタンパク質を回収したことが報告された。ｃｒｙ３Ｂｂ毒素について（Englishら、米国特許第６，０２３，０１３号、RE39,580として再交付）、その毒素におけるある置換がコーンルートワーム（corn rootworm）に対する活性改善を導いたが、大部分の場合でこれらの変更が、Van Rieによって示唆された残基又はWu及びDeanによって研究された残基とは異なる残基で起こったことが報告された。
【００２０】
加えて、Coleoptera、特にウエスタンコーンルートワーム（western corn rootworm）に及ぼすｃｒｙ３Ａの活性を改善しようと、トリプシン又はキモトリプシン様プロテアーゼによって普通は切断されるｃｒｙ３Ａ毒素の領域に改変が加えられた。Chenら（米国特許第７，０３０，２９５号）は、タンパク質の特異的位置での「カテプシンＧ切断部位」（又は「キモトリプシン／カテプシンＧ切断部位」; Walters et al, 2008, Applied and Environ. Micro. 74: 367-374）として記載された合成テトラペプチドＡＡＰＦ（配列番号２０）の挿入が、改善されたｃｒｙ３Ａ活性を導きうることを報告している。
【００２１】
ｃｒｙ３Ａのトリプシン切断は、当技術分野において周知であり、ネイティブなｃｒｙ３ＡペプチドのおよそＲ１５８−Ｎ１５９の領域に自然に生じることが示されている（Carroll et al 1989 Biochem J. 261:99-105）。さらにキモトリプシンは、この領域のＨｉｓ１６１−Ｓｅｒ１６２接合部で切断することが知られている（Carroll et al 1997 J Invert. Biol. 70: 41-49）。Waltersら（2008）は、改変Ｃｒｙ３Ａ（キモトリプシン／カテプシンＧプロテアーゼ認識部位を有する「ｍＣｒｙ３Ａ」）がこの領域のそのネイティブな位置（Ｈｉｓ１６１−Ｓｅｒ１６２接合部）でキモトリプシンによって切断されることを示した。Ｃｒｙ３Ａのこの領域における天然アミノ酸配列の突然変異誘発がColeoptera害虫に改善された殺虫活性を招くという報告はない。
【００２２】
したがって本発明は、対応する野生配列に比べて改善された殺虫活性を有する変異Ｃｒｙ３配列を提供する。様々な態様では、変異Ｃｒｙ３殺虫配列は、ＡＸＭＩ−Ｒ１の殺虫活性に比べて改善された殺虫活性を有する。「改善された活性」とは、死亡率の増加、摂食減退、又はターゲット害虫の成長減退が意図される。活性の改善は、野生配列、例えば、ＡＸＭＩ−Ｒ１の活性に比べて、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約１００％、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、又はそれよりも大きな活性増加である。いくつかの態様では、ターゲット害虫は、Coleoptera害虫である。
【００２３】
いくつかの態様では、本明細書に包含される殺虫配列は、配列番号１に示されるａｘｍｉ−Ｒ１配列の変異体を含む。「ａｘｍｉ−Ｒ１の変異体」とは、１個又は複数個の突然変異がＡＸＭＩ−Ｒ１配列のある領域（すなわち「ターゲット突然変異領域」）内に導入された、ＡＸＭＩ−Ｒ１に対応するヌクレオチド又はアミノ酸配列が意図される。特に規定しない限り、ターゲット突然変異領域外のアミノ酸領域は、ＡＸＭＩ−Ｒ１配列と同一である。同一の領域は、同一のアミノ酸配列、又は同一のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列のいずれかである。ヌクレオチド配列が、野生ヌクレオチド配列と異なろうとも、それでも遺伝コードの縮重のせいでまだ野生アミノ酸配列をコードしうることが理解されよう。
【００２４】
他の態様では、Ｃｒｙ３のターゲット突然変異領域は、Liら（1991, Nature 353:815-821、その全体で、特にｃｒｙ３Ａａタンパク質構造の記載に関して、参照により本明細書に組み入れられる）に記載された、提案されたプロセシング・孔形成領域に対応する。様々な態様では、ターゲット突然変異領域は、配列番号２の４８０〜４９０位及び５１０〜５３０位のアミノ酸に対応する。いくつかの態様では、変異Ｃｒｙ３配列は、最大で表１６に記載された全位置での突然変異までの表１６に挙げられた任意の突然変異の組み合わせを含めた、表１６に記載された１個又は複数個の突然変異を有する。
【００２５】
いくつかの態様では、本発明の変異Ｃｒｙ３配列は、配列番号２の１５８、４８２、４８３、及び５１９位に対応するアミノ酸位置より選択される１個又は複数個の置換を有する。別の態様では、変異Ｃｒｙ３配列は、次の置換を有さない：Ｐ１５４Ｈ、Ｖ１５５Ｈ、Ｒ３１５Ｗ、Ｒ３１５Ｄ、Ｒ３１５Ｍ、Ｒ３１５Ｌ、Ｇ３１６Ｋ、Ｇ３１６Ｎ、Ｇ３１６Ｖ、又はＧ３１６Ａ。なお別の態様では、本発明の変異Ｃｒｙ３配列は、米国特許第６，０２３，０１３号の表２に挙げられた突然変異の組み合わせを全く有さない。
【００２６】
別の態様では、変異Ｃｒｙ３配列は、配列番号６、８、１０、１３、１５、１７、１９、及び２１〜４３から成る群より選択される。なお別の態様では、本明細書に包含される変異Ｃｒｙ３配列は、プロセシング・孔形成領域における１個又は複数個の突然変異ならびにレセプター結合領域における１個又は複数個の突然変異から成る。本明細書に包含される変異体は、野生Ｃｒｙ３の殺虫活性に比べて改善された殺虫活性を有する。いくつかの態様では、改善された殺虫活性は、Coleoptera害虫、例えばルートワーム（rootworm）害虫に対する。
【００２７】
本発明の変異Ｃｒｙ３配列は、当技術分野において記載された１個又は複数個のＣｒｙ３突然変異を導入するためにさらに改変することができる。例えば、本明細書に包含される変異ＡＸＭＩ−Ｒ１配列は、米国特許第５，６５９，１２３号及び第６，０２3,013号；Wu及びDean（J.Mol. Biol., 1996, 255: 628-640）；若しくはWuら（Febs Letters, 2000, 473:227-232）に記載された１個若しくは複数個の突然変異、又はその任意の組み合わせ、及び表１６に挙げられた１個又は複数個の置換を含みうる。また、変異ＡＸＭＩ−Ｒ１配列は、（例えばネイティブなキモトリプシン又はトリプシン切断部位又はその近くに）上述のような１個又は複数個のカテプシンＧ切断部位の挿入を含むことがある。
【００２８】
本発明のなお別の態様では、表１６に記載された突然変異を、ＡＸＭＩ−Ｒ１に相同性を有する任意のアミノ酸配列の対応する位置に導入して、関心が持たれる害虫、特にルートワーム害虫などのColeoptera害虫に対する毒性を導入又は改善することができる。例えば、図２においてＡＸＭＩ−Ｒ１とアライメントされたアミノ酸配列、又は例えばGENBANK（登録商標）アクセッション番号Ｐ０Ａ３７９．１、ＡＡＡ２２３３６．１、ＡＡＡ２２５４２．１、ＡＡＳ７９４８７．１、ＡＡＵ２９４１１．１、ＡＡＷ８２８７２．１、ＡＡＡ７３１８４．１、ＣＡＡ５１９９６．１、１ＤＬＣ＿Ａ、Ｑ４５７４４．１、Ｑ０６１１７．１、ＡＡＡ７４１９８．１、Ｐ１７９６９．１に示された相同アミノ酸配列を参照されたい。相同アミノ酸配列を、本明細書に記載されたアライメントプログラムの一つを使用してアライメントして、突然変異についての対応する位置を同定することができる。又は、相同アミノ酸配列の結晶構造又はそれの他の三次元表示をＣｒｙ３Ａの結晶構造に重ね合わせ（Li et al. 1991, Nature 353:815-821に記載）、対応する位置をアライメントすることができる。Ｃｒｙ３Ｂタンパク質の結晶構造は、米国特許第６，０２３，０１３号に記載されている。
【００２９】
その配列は、関心が持たれる生物にその後トランスフォーメーションするための発現ベクターの構築に、他の相同（又は部分相同）遺伝子を単離するためのプローブとして、そしてドメインスワッピング又はＤＮＡシャフリングなどの当技術分野で公知の方法による変更された殺虫タンパク質の生成のために、用途をもつ。タンパク質は、Lepidoptera、Coleoptera、Diptera、及び線虫害虫集団の防除又は殺滅に、そして殺虫活性を有する組成物の産生のために、用途をもつ。
【００３０】
「殺虫毒素」又は「殺虫タンパク質」とは、非限定的にLepidoptera、Diptera、及びColeoptera目、若しくはNematoda門のメンバーを含めた１種類若しくは複数種類の害虫に対して毒性活性を有する毒素、又はそのようなタンパク質との相同性を有するタンパク質が意図される。殺虫タンパク質は、例えば、Bacillus sp.、Clostridium bifermentans及びPaenibacillus popilliaeを含めた生物から単離された。殺虫タンパク質には、本明細書に開示された完全長ヌクレオチド配列から推定されるアミノ酸配列、及び代替的な下流開始部位の使用又は殺虫活性を有するさらに短いタンパク質を産生するプロセッシングのいずれかが原因で完全長配列よりも短いアミノ酸配列が含まれる。プロセッシングは、そのタンパク質が発現される生物又はそのタンパク質を摂取後の害虫において起きることがある。
【００３１】
単離された核酸分子、ならびにその変異体及びフラグメント
本発明の一局面は、殺虫タンパク質及びポリペプチド又はその生物学的に活性な部分をコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子又はリコンビナント核酸分子、及び配列相同領域を有するタンパク質をコードする核酸分子を同定するためのハイブリダイゼーションプローブとして使用するために十分な核酸分子に関する。本明細書に使用されるような「核酸分子」という用語には、ＤＮＡ分子（例えばリコンビナントＤＮＡ、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ）及びＲＮＡ分子（例えばｍＲＮＡ）ならびにヌクレオチドアナログを使用して生成したＤＮＡ又はＲＮＡのアナログが含まれることが意図される。核酸分子は、１本鎖又は２本鎖でありうるが、好ましくは２本鎖ＤＮＡである。
【００３２】
「単離された」又は「リコンビナント」核酸配列（又はＤＮＡ）は、本明細書において、もはやその自然環境にない、例えばインビトロ又はリコンビナントの細菌又は植物ホスト細胞中の、核酸配列（又はＤＮＡ）を表すために使用される。いくつかの態様では、単離された核酸又はリコンビナント核酸は、その核酸が得られた生物のゲノムＤＮＡ中の核酸に自然に隣接する配列（好ましくはタンパク質をコードする配列）（すなわちその核酸の５’及び３’末端に位置する配列）を有さない。本発明のために、核酸分子を表すために使用される場合の「単離された」は、単離された染色体を除外する。例えば様々な態様では、核酸分子をコードする単離されたδ−エンドトキシンは、その核酸が得られた細胞のゲノムＤＮＡ中の核酸分子に自然に隣接する約５kb、４kb、３kb、２kb、１kb、０．５kb、又は０．１kb未満のヌクレオチド配列を有しうる。様々な態様では、細胞性物質を実質的に有さないδ−エンドトキシンタンパク質には、約３０％、２０％、１０％、又は５％（乾燥重量あたり）未満の非δ−エンドトキシンタンパク質（本明細書において「混入タンパク質」と呼ばれる）を有するタンパク質調製物が含まれる。
【００３３】
本発明のタンパク質をコードするヌクレオチド配列には、Ｃｒｙ３変異体をコードするヌクレオチド配列、及びそのフラグメント及び相補体が含まれる。「相補体」とは、所与のヌクレオチド配列にハイブリダイゼーションできるように十分に所与のヌクレオチド配列に相補的なことによって安定な二重鎖を形成するヌクレオチド配列が意図される。
【００３４】
殺虫タンパク質をコードするこれらのヌクレオチド配列のフラグメントである核酸分子もまた、本発明によって包含される。「フラグメント」とは、殺虫タンパク質をコードするヌクレオチド配列の部分が意図される。ヌクレオチド配列のフラグメントは、殺虫タンパク質の生物学的活性部分をコードしうるか、又は下記に開示される方法を用いてハイブリダイゼーションプローブ又はＰＣＲプライマーとして使用することのできるフラグメントでありうる。殺虫タンパク質をコードするヌクレオチド配列のフラグメントである核酸分子は、意図された使用に応じて少なくとも約５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１３５０、１４００個の連続ヌクレオチドを含むか、又は最大で本明細書に開示された殺虫タンパク質をコードする完全長ヌクレオチド配列に存在する数のヌクレオチドを含む。「連続」ヌクレオチドとは、相互に直接隣接するヌクレオチド残基が意図される。本発明のヌクレオチド配列のフラグメントは、殺虫タンパク質の生物学的活性を保持するタンパク質フラグメントをコードするので、殺虫活性を保持する。「活性を保持する」とは、そのフラグメントが、参照殺虫タンパク質（すなわち、本明細書に開示された殺虫性変異Ｃｒｙ３配列）の少なくとも約３０％、少なくとも約５０％、少なくとも約７０％、８０％、９０％、９５％又はそれよりも高い殺虫活性を有することが意図される。一態様では、殺虫活性は、殺Coleoptera害虫活性である。殺虫活性を測定するための方法は、当技術分野において周知である。例えば、全てがその全体で参照により本明細書に組み入れられるCzapla and Lang (1990) J. Econ. Entomol. 83:2480-2485; Andrews et al. (1988) Biochem. J. 252:199-206; Marrone et al. (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293；及び米国特許第５，７４３，４７７号を参照されたい。
【００３５】
本発明のタンパク質の生物学的活性部分をコードする殺虫タンパク質をコードするヌクレオチド配列のフラグメントは、少なくとも約１５、２５、３０、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０個の連続アミノ酸をコードするか、又は最大で本発明の完全長殺虫タンパク質に存在する全アミノ酸数をコードする。いくつかの態様では、フラグメントは、タンパク質分解性切断のフラグメントである。例えば、タンパク質分解性切断のフラグメントは、配列番号２に比べてＮ末端の少なくとも約１００個のアミノ酸、約１２０、約１３０、約１４０、約１５０、又は約１６０個のアミノ酸が短縮していることがある。様々な態様では、タンパク質分解性切断のフラグメントは、それぞれ配列番号２のそれぞれアミノ酸１５８−１５９位又は１６０−１６１位に対応するネイティブなトリプシン又はキモトリプシン切断部位に対応することがあるか、又はWalters et al, 2008, Applied and Environ. Micro. 74: 367-374に記載されたカテプシンＧ切断部位などの任意の人工的に挿入された切断部位に対応することがある。
【００３６】
本発明の好ましい殺虫タンパク質は、本明細書に包含される変異Ｃｒｙ３配列に十分に同一なヌクレオチド配列によってコードされる。「十分に同一な」とは、標準的なパラメーターを用いて本明細書に記載されたアライメントプログラムの一つを使用して、参照配列（例えば、ネイティブな若しくは変異のＣｒｙ３Ａ、Ｃｒｙ３Ｂ、若しくはＣｒｙ３Ｃ配列を含めた、ネイティブな若しくは変異のＣｒｙ３配列、又は配列番号２、６、８、１０、１３、１５、１７、１９、及び２１〜４３より選択される配列、又はこれらのネイティブな若しくは変異のＣｒｙ３タンパク質配列のいずれかをコードするヌクレオチド配列）に比べて少なくとも約６０％又は６５％の配列同一性、約７０％又は７５％の配列同一性、約８０％又は８５％の配列同一性、約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも大きな配列同一性を有するアミノ酸又はヌクレオチド配列が意図される。当業者は、コドンの縮重、アミノ酸類似性、リーディングフレームの位置決めを考慮することによってこれらの値を適切に調整して、二つのヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質の対応する同一性を決定することができることを認識している。
【００３７】
二つのアミノ酸配列又は二つの核酸の同一率を決定するために、それらの配列は、最適比較の目的でアライメントされる。二つの配列の間の同一率は、配列によって共有される同一位置数の関数である（すなわち同一率＝同一位置数／合計位置数（例えば重複する位置）×１００）。一態様では、二つの配列は同じ長さである。別の態様では、同一率は、参照配列（すなわち、本明細書に包含される変異Ｃｒｙ３配列）全体にわたり計算される。二つの配列の間の同一率は、ギャップを許して又は許さずに、下記技法に類似の技法を使用して決定することができる。同一率の計算では、典型的には完全マッチが計数される。
【００３８】
二つの配列の間の同一率の決定は、数学的アルゴリズムを使用して行うことができる。二つの配列を比較するために利用される数学的アルゴリズムの非限定的な例は、Karlin and Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264のアルゴリズムをKarlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877のように改変したものである。そのようなアルゴリズムは、Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403のＢＬＡＳＴＮ及びＢＬＡＳＴＸプログラムに組み入れられている。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索を、ＢＬＡＳＴＮプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２で行い、本発明の殺虫様核酸分子に相同なヌクレオチド配列を得ることができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索を、ＢＬＡＳＴＸプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３で行って、本発明の殺虫タンパク質分子に相同なアミノ酸配列を得ることができる。比較目的のギャップ付きアライメントを得るために、（ＢＬＡＳＴ２．０の）Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴを、Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389に記載されたように利用することができる。又は、ＰＳＩ−Ｂｌａｓｔを使用して分子間の距離関係を検出する反復検索を行うことができる。Altschul et al. (1997)、上記を参照されたい。ＢＬＡＳＴ、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ、及びＰＳＩ−Ｂｌａｓｔプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（例えば、ＢＬＡＳＴＸ及びＢＬＡＳＴＮ）のデフォルトパラメーターを使用することができる。アライメントは、検査によって手作業で行うこともできる。
【００３９】
配列の比較に利用される数学的アルゴリズムの別の非限定的な例は、ＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズムである（Higgins et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22:4673-4680）。ＣｌｕｓｔａｌＷは、配列を比較し、アミノ酸又はＤＮＡ配列の全体をアライメントし、したがってアミノ酸配列全体の配列保存性についてのデータを提供することができる。ＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズムは、Vector NTI Program Suite（Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA）のＡＬＩＧＮＸモジュールなどのいくつかの市販のＤＮＡ／アミノ酸解析ソフトウェアパッケージに使用されている。ＣｌｕｓｔａｌＷを用いたアミノ酸配列のアライメント後に、アミノ酸同一率を評価することができる。ＣｌｕｓｔａｌＷアライメントの解析に有用なソフトウェアプログラムの非限定的な例は、GENEDOC（商標）である。GENEDOC（商標）（Karl Nicholas）は、複数のタンパク質の間でのアミノ酸（又はＤＮＡ）の類似性及び同一性を評価することを可能にする。配列の比較のために利用される数学的アルゴリズムの別の非限定的な例は、Myers and Miller (1988) CABIOS 4:11-17のアルゴリズムである。そのようなアルゴリズムは、GCG Wisconsin Genetics Software Package、バージョン１０（Accelrys, Inc., 9685 Scranton Rd., San Diego, CA, USAから入手可能）の一部であるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み入れられている。アミノ酸配列を比較するためにＡＬＩＧＮプログラムを利用する場合、ＰＡＭ１２０重み残基表、ギャップ長ペナルティー１２、及びギャップペナルティー４を使用することができる。
【００４０】
特に述べない限り、Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48(3):443-453のアルゴリズムを使用するＧＡＰバージョン１０を使用して、以下のパラメーターを使用して配列同一性又は類似性を決定する：ヌクレオチド配列についての同一％及び類似％にはギャップ重み５０及び長さ重み３及びｎｗｓｇａｐｄｎａ．ｃｍｐスコア付けマトリックスを使用；アミノ酸配列についての同一％及び類似％にはＧＡＰ重み８及び長さ重み２及びＢＬＯＳＵＭ６２スコア付けプログラムを使用。同等のプログラムも使用することができる。「同等のプログラム」とは、ＧＡＰバージョン１０によって生成した対応するアライメントと比べたときに、問題となる任意の二つの配列について同一のヌクレオチド残基のマッチ及び同一の配列同一率を有するアライメントを生成する任意の配列比較プログラムが意図される。
【００４１】
本発明は、また、変異核酸分子を包含する。変異Ｃｒｙ３殺虫タンパク質をコードするヌクレオチド配列の「変異体」には、本明細書に開示された変異殺虫タンパク質をコードするが、遺伝コードの縮重が原因で保存的に異なる配列及び前記と十分に同一の配列が含まれる。変異ヌクレオチド配列には、また、例えば部位特異的突然変異誘発を使用することによって生成されたヌクレオチド配列であるが、下記のように本発明に開示された殺虫タンパク質を依然としてコードする、合成的に誘導されたヌクレオチド配列が含まれる。本発明によって包含される変異タンパク質は、生物学的に活性であり、すなわちそれらは、参照タンパク質（すなわち、本明細書に包含される変異Ｃｒｙ３配列）の所望の生物学的活性、すなわち殺虫活性を有し続ける。「活性を保持する」とは、変異体が参照タンパク質の殺虫活性の少なくとも約３０％、少なくとも約５０％、少なくとも約７０％、又は少なくとも約８０％を有することが意図される。いくつかの態様では、本明細書に記載される変異殺虫タンパク質は、配列番号２に示されるＡＸＭＩ−Ｒ１タンパク質に比べて改善された活性を示す。殺虫活性を測定するための方法は、当技術分野において周知である。例えば、全てがその全体で参照により本明細書に組み入れられるCzapla and Lang (1990) J. Econ. Entomol. 83: 2480-2485; Andrews et al. (1988) Biochem. J. 252:199-206; Marrone et al. (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293；及び米国特許第５，７４３，４７７号を参照されたい。
【００４２】
当業者は、さらに、本発明のヌクレオチド配列の突然変異によって変化を導入することによって、コードされる殺虫タンパク質の生物学的活性を変更せずに、そのタンパク質のアミノ酸配列に変化を導くことができることを認識している。したがって、本明細書に開示された対応するヌクレオチド配列に１個又は複数個のヌクレオチド置換、付加、又は欠失を導入することにより、コードされるタンパク質のターゲット突然変異領域に１個又は複数個のアミノ酸置換、付加又は欠失が導入されることによって、単離された変異核酸分子を創出することができる。突然変異は、部位特異的突然変異誘発及びＰＣＲ介在性突然変異誘発などの標準的な技法によって突然変異を導入することができる。そのような変異ヌクレオチド配列もまた、本発明によって包含される。
【００４３】
例えば、保存的アミノ酸置換を、１個又は複数の予測される非必須アミノ酸残基に加えることができる。「非必須」アミノ酸残基は、生物学的活性を実質的に変更せずに殺虫タンパク質の参照配列から変更することのできる残基であり、一方「必須」アミノ酸残基は、生物学的活性に必要とされる。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、類似の側鎖を有するアミノ酸残基と交換される置換である。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野において定義されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸（例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β−分岐側鎖を有するアミノ酸（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が挙げられる。
【００４４】
δ−エンドトキシンは、一般に５個の保存された配列ドメイン、及び３個の保存された構造ドメインを有する（例えばde Maagd et al. (2001) Trends Genetics 17:193-199参照）。第一の保存された構造ドメインは、７個のαヘリックスから成り、膜内挿入及び孔形成に関与する。ドメインＩＩは、ギリシャキー立体配置にされた３個のβシートから成り、ドメインＩＩＩは、「ゼリーロール」構成の２個の逆平行βシートから成る（de Maagd et al., 2001、上記）。ドメインＩＩ及びＩＩＩは、レセプターの認識及び結合に関与し、それゆえに毒素の特異性の決定因子と見なされる。
【００４５】
アミノ酸置換は、機能を保持する非保存領域に行うことができる。一般に、そのような置換は、保存されたアミノ酸残基にも、保存されたモチーフ内にあるアミノ酸残基（そのような残基はタンパク質活性に必須である）にも行われないであろう。保存されている残基であって、タンパク質活性に必須でありうる残基の例には、例えば、本発明の配列に類似又は関係する毒素のアライメントの中に含まれる全てのタンパク質の間で同一の残基（例えば、相同タンパク質のアライメントにおいて同一の残基）が含まれる。保存されている残基であるが、保存的アミノ酸置換が可能であって、依然として活性を保持しうる残基の例には、例えば、本発明の配列に類似又は関係する毒素のアライメントの中に含まれる全てのタンパク質の間に保存的置換のみを有する残基（例えば、相同タンパク質のアライメントの中に含まれる全てのタンパク質の間で保存的置換のみを有する同一の残基）が含まれる。しかし、当業者は、機能的変異体が保存された残基にわずかに保存された変更又は非保存的な変更を有することがあることを理解しているであろう。
【００４６】
又は、変異ヌクレオチド配列は、ターゲット突然変異領域の全て又は一部にわたり、並べ替え又は飽和突然変異誘発などによってランダムに突然変異を導入することによって製造することができ、結果として生じた突然変異体を、殺虫活性を付与する能力についてスクリーニングして、活性を保持するか、又は改善された活性を示す突然変異体を同定することができる。突然変異誘発後に、コードされるタンパク質をリコンビナント発現させることができ、標準的なアッセイ技法を使用してタンパク質の活性を決定することができる。
【００４７】
ＰＣＲ、ハイブリダイゼーションなどの方法を用いて、本発明の配列に実質的な同一性を有する、対応する殺虫配列を同定することができる。例えば、Sambrook and Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY)及びInnis, et al. (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, NY)を参照されたい。
【００４８】
ハイブリダイゼーション法において、殺虫ヌクレオチド配列の全て又は一部を使用して、ｃＤＮＡ又はゲノムライブラリーをスクリーニングすることができる。そのようなｃＤＮＡ及びゲノムライブラリーを構築するための方法は、当技術分野において一般に公知であり、Sambrook and Russell, 2001、上記に開示されている。いわゆるハイブリダイゼーションプローブは、ゲノムＤＮＡフラグメント、ｃＤＮＡフラグメント、ＲＮＡフラグメント、又は他のオリゴヌクレオチドのことがあり、３２Ｐなどの検出可能な基、又は他の放射性同位体、蛍光化合物、酵素、又は酵素補因子などの任意の他の検出可能なマーカーでラベルすることができる。ハイブリダイゼーション用プローブは、本明細書に開示された、公知の殺虫タンパク質をコードするヌクレオチド配列をベースに合成オリゴヌクレオチドをラベルすることによって製造することができる。ヌクレオチド配列又はコードされるアミノ酸配列中の保存されたヌクレオチド又はアミノ酸残基をベースに設計された縮重プライマーを、追加的に使用することができる。プローブは、本発明の殺虫タンパク質をコードするヌクレオチド配列又はそのフラグメント若しくは変異体の少なくとも約１２、少なくとも約２５、少なくとも約５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、又は２００個の連続ヌクレオチドに典型的にはストリンジェントな条件でハイブリダイゼーションするヌクレオチド配列の領域を含む。ハイブリダイゼーション用プローブを調製するための方法は、当技術分野において一般に公知であり、参照により本明細書に組み入れられるSambrook and Russell, 2001、上記に開示されている。
【００４９】
例えば、本明細書に開示される殺虫タンパク質配列全体又はその一つ若しくは複数の部分を、対応する殺虫タンパク質様配列及びメッセンジャーＲＮＡに特異的にハイブリダイゼーションできるプローブとして使用することができる。様々な条件で特異的ハイブリダイゼーションを達成するために、そのようなプローブには、独特な配列であって、好ましくは少なくとも約１０ヌクレオチド長又は少なくとも約２０ヌクレオチド長の配列が含まれる。そのようなプローブは、選択された生物からＰＣＲによって対応する殺虫配列を増幅するために使用することができる。この技法を使用して、所望の生物から追加的なコード配列を単離することができ、又は診断アッセイとして生物におけるコード配列の存在を決定することができる。ハイブリダイゼーション技法には、プレーティングされたＤＮＡライブラリーのハイブリダイゼーションスクリーニングが含まれる（プラーク又はコロニーのいずれか；例えばSambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual（2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York）を参照されたい。
【００５０】
そのような配列のハイブリダイゼーションは、ストリンジェントな条件で実施することができる。「ストリンジェントな条件」又は「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、プローブがそのターゲット配列に他の配列よりも検出可能に大きな程度（例えばバックグラウンドに対して少なくとも２倍）でハイブリダイゼーションする条件が意図される。ストリンジェントな条件は、配列依存性であって、異なる状況では異なる。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシー及び／又は洗浄条件をコントロールすることによって、プローブに１００％相補的なターゲット配列を同定することができる（相同プロービング）。又は、ストリンジェンシー条件は、配列にいくつかのミスマッチを許すことにより、低度の類似性が検出されるように調整することができる（非相同プロービング）。全般に、プローブは約１０００ヌクレオチド長未満、好ましくは５００ヌクレオチド長未満である。
【００５１】
典型的にはストリンジェントな条件は、ｐＨ７．０〜８．３で塩濃度が約１．５Ｍ未満のＮａイオン、典型的には約０．０１〜１．０ＭのＮａイオン濃度（又は他の塩）であって、短いプローブ（例えば、１０〜５０ヌクレオチド）について温度が少なくとも約３０℃であって、長いプローブ（例えば、５０ヌクレオチドよりも大きい）について少なくとも約６０℃の条件である。ストリンジェントな条件は、また、ホルムアミドなどの不安定化剤を添加して達成することができる。例示的な低ストリンジェンシー条件には、３０〜３５％ホルムアミド、１Ｍ ＮａＣｌ、１％ ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）の緩衝溶液を用いた３７℃でのハイブリダイゼーション、及び１×〜２×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣ＝３．０Ｍ ＮａＣｌ／０．３Ｍクエン酸三ナトリウム）中で５０〜５５℃での洗浄が含まれる。例示的な中ストリンジェンシー条件には、４０〜４５％ホルムアミド、１．０Ｍ ＮａＣｌ、１％ＳＤＳ中で３７℃でのハイブリダイゼーション、及び０．５×〜１×ＳＳＣ中で５５〜６０℃での洗浄が含まれる。例示的な高ストリンジェンシー条件には、５０％ホルムアミド、１Ｍ ＮａＣｌ、１％ ＳＤＳ中で３７℃でのハイブリダイゼーション、及び０．１×ＳＳＣ中で６０〜６５℃での洗浄が含まれる。場合により、洗浄緩衝液は、約０．１％〜約１％ ＳＤＳを含むことがある。ハイブリダイゼーションの時間は、全般に約２４時間未満、通常は約４〜約１２時間である。
【００５２】
特異性は、典型的にはハイブリダイゼーション後の洗浄の関数であって、重大な要因は、最終洗浄溶液のイオン強度及び温度である。ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドについて、Ｔｍは、Meinkoth and Wahl (1984) Anal. Biochem. 138:267-284の式：Ｔｍ＝８１．５℃＋１６．６（ｌｏｇ Ｍ）＋０．４１（％ＧＣ）−０．６１（％ｆｏｒｍ）−５００／Ｌ［式中、Ｍは、一価陽イオンのモル濃度であり、％ＧＣは、ＤＮＡ中のグアノシン及びシトシンヌクレオチドのパーセンテージであり、％ｆｏｒｍは、ハイブリダイゼーション溶液中のホルムアミドのパーセンテージであり、Ｌは、ハイブリッドの長さを塩基対の数で表したものである］から近似することができる。Ｔｍは、相補的ターゲット配列の５０％が完全マッチのプローブと（所定のイオン強度及びｐＨで）ハイブリダイゼーションする温度である。Ｔｍは、１％のミスマッチ毎に約１℃低下し；したがって、Ｔｍ、ハイブリダイゼーション、及び／又は洗浄条件を調整して、所望の同一性の配列とハイブリダイゼーションさせることができる。例えば、≧９０％の同一性を有する配列を探す場合、Ｔｍは、１０℃減少させることができる。一般に、ストリンジェントな条件は、所定のイオン強度及びｐＨで特定の配列及びその相補体についての熱融解温度（Ｔｍ）よりも約５℃低いように選択される。しかしながら、激しくストリンジェントな条件は、熱融解温度（Ｔｍ）よりも１、２、３、又は４℃低いハイブリダイゼーション及び／又は洗浄を利用することができ；中程度ストリンジェントな条件は、熱融解温度（Ｔｍ）よりも６、７、８、９、又は１０℃低いハイブリダイゼーション及び／又は洗浄を利用することができ；低ストリンジェンシー条件は、熱融解温度（Ｔｍ）よりも１１、１２、１３、１４、１５、又は２０℃低いハイブリダイゼーション及び／又は洗浄を利用することができる。この式、ハイブリダイゼーション及び洗浄組成物、ならびに所望のＴｍを用いて、ハイブリダイゼーション及び／又は洗浄溶液のストリンジェンシーにおける変動が本質的に説明されることを、当業者は理解している。所望の程度のミスマッチが４５℃（水溶液）又は３２℃（ホルムアミド溶液）未満のＴｍをもたらす場合、高温を使用することができるようにＳＳＣ濃度を増加させることが好ましい。核酸のハイブリダイゼーションへの幅広い解説は、Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes, Part I, Chapter 2 (Elsevier, New York)；及びAusubel et al., eds. (1995) Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 2 (Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York)に見出される。Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York)を参照されたい。
【００５３】
単離されたタンパク質ならびにその変異体及びフラグメント
殺虫タンパク質もまた、本発明に包含される。「殺虫タンパク質」とは、本明細書に包含される殺虫変異Ｃｒｙ３配列が意図される。そのフラグメント、生物学的活性部分、及び変異体もまた提供され、本発明の方法の実施に使用することができる。「単離されたタンパク質」又は「リコンビナントタンパク質」は、もはやその自然環境中にないタンパク質、例えばインビトロ又はリコンビナントの細菌細胞又は植物ホスト細胞を表すために使用される。
【００５４】
「フラグメント」又は「生物学的活性部分」には、本明細書に包含され、殺虫活性を示す変異Ｃｒｙ３配列のポリペプチドフラグメントが含まれる。殺虫タンパク質の生物学的活性部分は、例えば、１０、２５、５０、１００、１５０、２００、２５０又はそれを超えるアミノ酸長のポリペプチドでありうる。そのような生物学的活性部分を、リコンビナント技法によって調製し、殺虫活性について評価することができる。殺虫活性を測定するための方法は、当技術分野において周知である。例えば、その全てがその全体で参照により本明細書に組み入れられるCzapla and Lang (1990) J. Econ. Entomol. 83:2480-2485; Andrews et al. (1988) Biochem. J. 252:199-206; Marrone et al. (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293；及び米国特許第５，７４３，４７７号を参照されたい。本明細書に使用するように、フラグメントは、参照タンパク質の少なくとも８個の連続するアミノ酸を含む。しかしながら本発明は、タンパク質中の約１０、２０、３０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、又はそれを超えるアミノ酸よりも大きな任意のフラグメントなどの他のフラグメントを包含する。
【００５５】
「変異体」とは、配列番号２のアミノ酸配列に少なくとも約６０％、６５％、約７０％、７５％、約８０％、８５％、約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一のアミノ酸配列を有するタンパク質又はポリペプチドが意図される。変異体は、また、本明細書に包含される変異Ｃｒｙ３配列をコードする核酸分子又はその相補体にストリンジェントな条件でハイブリダイゼーションする核酸分子によってコードされるポリペプチドが含まれる。変異体には、突然変異誘発が原因でアミノ酸配列が異なるポリペプチドが含まれる。本発明によって包含される変異タンパク質は生物学的に活性であって、すなわちそれらは、変異Ｃｒｙ３タンパク質の所望の生物学的活性を有し続け、すなわち殺虫活性を保持する。いくつかの態様では、変異体は、参照タンパク質に比べて（例えば、配列番号２に比べて、又は特異的変異Ｃｒｙ３タンパク質に比べて）改善された活性を有する。殺虫活性を測定するための方法は、当技術分野において周知である。例えば、その全てがその全体で参照により本明細書に組み入れられるCzapla and Lang (1990) J. Econ. Entomol. 83:2480-2485; Andrews et al. (1988) Biochem. J. 252:199-206; Marrone et al. (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293；及び米国特許第５，７４３，４７７号を参照されたい。
【００５６】
本発明のａｘｍｉ遺伝子などの細菌遺伝子は、かなり多くの場合でオープンリーディングフレームの開始部近辺に複数のメチオニン開始コドンを有する。多くの場合に、１個又は複数個のこれらの開始コドンでの翻訳開始は、機能的タンパク質の生成を導く。これらの開始コドンには、ＡＴＧコドンが含まれうる。しかしながら、Bacillus sp.などの細菌は、また、開始コドンとしてコドンＧＴＧを認識し、ＧＴＧコドンで翻訳を開始するタンパク質は、最初のアミノ酸にメチオニンを有する。まれな場合に、細菌システムにおける翻訳はＴＴＧコドンで開始することができるが、もっともこの事象においてＴＴＧはメチオニンをコードする。さらに、これらのコドンのどれが細菌において自然に使用されるかが先験的に決定されることは、あまり多くない。したがって、代替的メチオニンコドンの一つの使用もまた、殺虫タンパク質の生成を導きうることが理解されている。これらの殺虫タンパク質は、本発明に包含され、本発明の方法に使用することができる。植物に発現された場合に、適正な翻訳のために代替的な開始コドンをＡＴＧに変更することが必要なことが理解されている。
【００５７】
本発明のポリペプチド又はその変異体若しくはフラグメントに対する抗体もまた包含される。抗体を産生させる方法は、当技術分野において周知である（例えばHarlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY；米国特許第４，１９６，２６５号参照）。
【００５８】
変更又は改善された変異体
殺虫タンパク質のＤＮＡ配列を様々な方法によってさらに変更することができること、及びこれらの変更が本発明の殺虫タンパク質によってコードされるものと異なるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ配列をもたらしうることが認識されている。このタンパク質は、１個又は複数個のターゲット突然変異領域に最大で約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５、約５０、約５５、約６０、約６５、約７０、約７５、約８０、約８５、約９０、約１００、約１０５、約１１０、約１１５、約１２０、約１２５、約１３０、約１３５、約１４０、約１４５、約１５０、約１５５、又はそれを超えるアミノ酸の置換、欠失又は挿入を含む、本明細書に包含される変異Ｃｒｙ３配列１個又は複数個のアミノ酸のアミノ酸置換、欠失、短縮、及び挿入を含む様々な方法で変更することができる。そのような操作の方法は、当技術分野において一般に公知である。例えば、殺虫タンパク質のアミノ酸配列変異体は、ＤＮＡにおける突然変異によって調製することができる。これは、また、いくつかの形態の突然変異誘発の一つによって、かつ／又は定方向進化で達成することができる。いくつかの局面では、アミノ酸配列にコードされる変化は、タンパク質の機能に実質的に影響を与えない。そのような変異体は、所望の（又は改善された）殺虫活性を有する。しかし、殺虫タンパク質が殺虫活性を付与する能力を、本発明の組成物にそのような技法を使用することによって改善できることが理解されている。例えば、ＤＮＡ複製の間に高率の塩基の誤取込みを示すXL-1 Red（Stratagene、La Jolla, CA）などのホスト細胞を用いて殺虫タンパク質を発現させることができる。そのような株で増殖後に、（例えばプラスミドＤＮＡを調製することによって、又はＰＣＲによって増幅し、結果として生じたＰＣＲフラグメントをベクターにクローニングすることによって）ＤＮＡを単離し、非突然変異誘発株で殺虫タンパク質突然変異を培養し、そして例えば殺虫活性を試験するためにアッセイを行うことによって、殺虫活性を有する突然変異遺伝子を同定することができる。一般に、タンパク質を混合して摂食アッセイに使用する。例えばMarrone et al. (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293を参照されたい。そのようなアッセイには、植物を１種類又は複数種類の害虫と接触させること、及びその植物が生存し、かつ／又は害虫の死滅を引き起こす能力を決定することが含まれうる。毒性増加を招く突然変異の例は、Schnepf et al. (1998) Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62:775-806に見出される。
【００５９】
又は、活性に実質的に影響せずに、アミノ又はカルボキシ末端で多数のタンパク質のタンパク質配列に変更を加えることができる。これには、ＰＣＲ増幅で利用されるオリゴヌクレオチドにアミノ酸コード配列を包含させることによりタンパク質コード配列を変更又は伸長するＰＣＲ増幅を含めたＰＣＲなどの、最新の分子的方法によって導入される挿入、欠失、又は変更が含まれうる。又は、付加されるタンパク質配列には、タンパク質融合体を生成させるために当技術分野において通常に使用される配列などの、タンパク質コード配列全体が含まれうる。そのような融合タンパク質は、多くの場合に、関心が持たれるタンパク質の発現を増加させるために、（２）当技術分野で公知のタンパク質精製、タンパク質検出、又は他の実験的使用のいずれかを促進する結合ドメイン、酵素活性、又はエピトープを導入するために、（３）グラム陰性細菌の細胞膜周辺腔又は真核細胞の小胞体（これらの後者は、多くの場合にタンパク質のグリコシル化を招く）などの細胞内オルガネラへのタンパク質の分泌又は翻訳をターゲティングするために、使用される。
【００６０】
本発明の変異ヌクレオチド及びアミノ酸配列は、また、ＤＮＡシャフリングなどの突然変異誘発手順及びリコンビナント形成手順から得られた配列を包含する。そのような手順で、１種又は複数種の異なる殺虫タンパク質コード領域を使用して、所望の性質を有する新しい殺虫タンパク質を創出することができる。このようにして、実質的な配列同一性を有し、インビトロ又はインビボで相同リコンビネーションすることができる配列領域を含む関連配列ポリヌクレオチドの集団から、リコンビナントポリヌクレオチドのライブラリーを生成させる。例えば、このアプローチを使用して、関心が持たれるドメインをコードする配列モチーフを、本発明の殺虫遺伝子と他の公知の殺虫遺伝子との間でシャフリングして、増加した殺虫活性などの、関心が持たれる性質が改善されたタンパク質をコードする新しい遺伝子を得ることができる。そのようなＤＮＡシャフリングの戦略は、当技術分野において公知である。例えば、Stemmer (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:10747-10751; Stemmer (1994) Nature 370:389-391; Crameri et al. (1997) Nature Biotech. 15:436-438; Moore et al. (1997) J. Mol. Biol. 272:336-347; Zhang et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:4504-4509; Crameri et al. (1998) Nature 391:288-291；ならびに米国特許第５，６０５，７９３号及び同第５，８３７，４５８号を参照されたい。
【００６１】
ドメインスワッピング又はシャフリングは、変更された殺虫タンパク質を生成させる別のメカニズムである。ドメインを殺虫タンパク質の間でスワップさせて、殺虫活性又はターゲットのスペクトルが改善されたハイブリッド又はキメラ毒素をもたらすことができる。リコンビナントタンパク質を生成させる方法及びそれらを殺虫活性について試験する方法は、当技術分野において周知である（例えば、Naimov et al. (2001) Appl. Environ. Microbiol. 67:5328-5330; de Maagd et al. (1996) Appl. Environ. Microbiol. 62:1537-1543; Ge et al. (1991) J. Biol. Chem. 266:17954-17958; Schnepf et al. (1990) J. Biol. Chem. 265:20923-20930; Rang et al. 91999) Appl. Environ. Microbiol. 65:2918-2925を参照されたい）。
【００６２】
ベクター
本発明の殺虫配列は、関心が持たれる植物に発現させるための発現カセットの中に提供することができる。「植物発現カセット」とは、植物細胞におけるオープンリーディングフレームからタンパク質の発現をもたらすことができるＤＮＡ構築物が意図される。典型的には、これらはプロモーター及びコード配列を有する。多くの場合に、そのような構築物は、３’非翻訳領域も有する。そのような構築物は、クロロプラスト（又は他の色素体）、小胞体、又はゴルジ装置などのある種の細胞内構造へのペプチドの共翻訳又は翻訳後輸送を促進する「シグナル配列」又は「リーダー配列」を有することがある。
【００６３】
「シグナル配列」とは、細胞膜を通過して共翻訳又は翻訳後ペプチド輸送を招くことが公知であるか又は疑われる配列が意図される。真核生物においてシグナル配列は、典型的にはゴルジ装置への分泌を伴い、結果として幾分グリコシル化される。細菌の殺虫毒素は、多くの場合に、ターゲット害虫の腸管内でタンパク質分解的に活性化されるプロ毒素として合成される（Chang (1987) Methods Enzymol. 153:507-516）。本発明のいくつかの態様では、シグナル配列は、ネイティブな配列に位置するか、又は本発明の配列に由来しうる。「リーダー配列」とは、翻訳された場合に細胞内オルガネラへのペプチド鎖の共翻訳輸送をトリガーするに足るアミノ酸配列をもたらす任意の配列が意図される。したがって、これには、小胞体への通過、液胞、クロロプラストを含む色素体、ミトコンドリアなどへの通過による輸送及び／又はグリコシル化をターゲティングするリーダー配列が含まれる。
【００６４】
「植物トランスフォーメーションベクター」とは、植物細胞の効率的なトランスフォーメーションに必要なＤＮＡ分子が意図される。そのような分子は、１種又は複数種の植物発現カセットから成ることがあり、１種を超える「ベクター」ＤＮＡ分子に編成することができる。例えば、バイナリーベクターは、植物細胞のトランスフォーメーションのために必要な全てのシス及びトランス作用機能をコードする２種類の非連続ＤＮＡベクターを利用する植物トランスフォーメーションベクターである（Hellens and Mullineaux (2000) Trends in Plant Science 5:446-451）。「ベクター」は、異なるホスト細胞の間で伝達するように設計された核酸構築物を表す。「発現ベクター」は、外来細胞に異種ＤＮＡ配列又はフラグメントを組み入れ、組込み及び発現する能力を有するベクターを表す。カセットには、本発明の配列に作動可能に連結した５’及び３’調節配列が含まれる。「作動可能に連結した」とは、プロモーター配列が第二の配列に対応するＤＮＡ配列の転写を開始及び仲介するような、プロモーター配列と第二の配列との間の機能的連結が意図される。一般に、作動可能に連結したは、連結される核酸配列が隣接していること、及び二つのタンパク質のコード領域を隣接させて同じリーディングフレーム内に結合させることが必要な場所を意味する。カセットは、追加的に、生物に共トランスフォーメーションされる少なくとも１種の追加的な遺伝子を有することがある。又は、追加的な遺伝子は、複数の発現カセット上に提供することができる。
【００６５】
「プロモーター」は、下流のコード配列の転写を指令するように機能する核酸配列を表す。プロモーターは、他の転写及び翻訳調節核酸配列（「制御配列」とも呼ばれる）と一緒に、関心が持たれるＤＮＡ配列の発現に必要である。
【００６６】
そのような発現カセットには、殺虫配列の挿入が調節領域の転写調節下になるように、複数の制限部位が備えられる。
【００６７】
発現カセットには、植物において機能する５’−３’方向の転写、転写及び翻訳開始領域（すなわちプロモーター）、本発明のＤＮＡ配列、ならびに翻訳及び転写終止領域（すなわち終止領域）が含まれる。プロモーターは、本発明の植物ホスト及び／又はＤＮＡ配列に、ネイティブ若しくは類似、又は外来若しくは異種でありうる。追加的に、プロモーターは、天然配列であるか、又はその代わりに合成配列のことがある。プロモーターが植物ホストに「ネイティブ」又は「同種」である場合、プロモーターが導入されたネイティブな植物からそのプロモーターが見出されることが意図される。プロモーターが本発明のＤＮＡ配列に「外来」又は「異種」である場合、プロモーターが本発明の作動可能に連結したＤＮＡ配列に関してネイティブなプロモーターでも天然プロモーターでもないことが意図される。
【００６８】
終止領域は、転写開始領域と一緒にネイティブなことがあるか、関心が持たれる作動可能に連結したＤＮＡ配列と一緒にネイティブなことがあるか、植物ホストと一緒にネイティブなことがあるか、又は別の供給源由来（すなわち、プロモーター、関心が持たれるＤＮＡ配列、植物ホスト、又はその任意の組み合わせに対して外来又は異種）のことがある。好都合な終止領域は、オクトピンシンターゼ及びノパリンシンターゼ終止領域のようなA. tumefaciensのＴｉプラスミドから入手可能である。Guerineau et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 262:141-144; Proudfoot (1991) Cell 64:671-674; Sanfacon et al. (1991) Genes Dev. 5:141-149; Mogen et al. (1990) Plant Cell 2:1261-1272; Munroe et al. (1990) Gene 91:151-158; Ballas et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:7891-7903；及びJoshi et al. (1987) Nucleic Acid Res. 15:9627-9639もまた参照されたい。
【００６９】
適切であれば、トランスフォーメーションされたホスト細胞中の発現増加について遺伝子を最適化することができる。すなわち遺伝子は、改善された発現についてホスト細胞に好ましいコドンを使用して合成することができるか、又はホストに好ましいコドン利用頻度でコドンを利用して合成することができる。一般に、遺伝子のＧＣ含量が増加される。ホストに好ましいコドン利用の論考については、例えば、Campbell and Gowri (1990) Plant Physiol. 92:1-11を参照されたい。植物に好ましい遺伝子を合成するための方法は、当技術分野において利用可能である。例えば、参照により本明細書に組み入れられる米国特許第５，３８０，８３１号、及び第５，４３６，３９１号、ならびにMurray et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:477-498を参照されたい。
【００７０】
一態様では、殺虫タンパク質は、発現のためにクロロプラストにターゲティングされる。このようにして、殺虫タンパク質がクロロプラストに直接には挿入されない場合、発現カセットは、追加的に、殺虫タンパク質をクロロプラストに方向付ける輸送ペプチドをコードする核酸を有する。そのような輸送ペプチドは、当技術分野において公知である。例えば、Von Heijne et al. (1991) Plant Mol. Biol. Rep. 9:104-126; Clark et al. (1989) J. Biol. Chem. 264:17544-17550; Della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiol. 84:965-968; Romer et al. (1993) Biochem. Biophys. Res. Commun. 196:1414-1421;及びShah et al. (1986) Science 233:478-481を参照されたい。
【００７１】
クロロプラストにターゲティングされるべき殺虫遺伝子をクロロプラストにおける発現について最適化して、植物核とこのオルガネラとの間のコドン利用率の差を説明することができる。このようにしてクロロプラストに好ましいコドンを使用して、関心が持たれる核酸を合成することができる。例えば、参照により本明細書に組み入れられる米国特許第５，３８０，８３１号を参照されたい。
【００７２】
植物のトランスフォーメーション
本発明の方法は、植物にヌクレオチド構築物を導入することを伴う。「導入する」とは、ヌクレオチド構築物が植物の細胞内部に到達するようにその構築物を植物に提示することが意図される。本発明の方法は、植物にヌクレオチド構築物を導入する特定の方法が使用されることを必要とせず、ヌクレオチド構築物が植物の少なくとも１個の細胞内部に到達することだけを必要とする。非限定的に安定トランスフォーメーション法、一過性トランスフォーメーション法、及びウイルス介在法を含めた、植物にヌクレオチド構築物を導入するための方法は、当技術分野において公知である。
【００７３】
「植物」とは、植物全体、植物器官（例えば、葉、茎、根など）、種子、植物細胞、繁殖体、胚及びその子孫が意図される。植物細胞は、分化又は未分化のことがある（例えばカルス、懸濁培養細胞、プロトプラスト、葉細胞、根細胞、篩部細胞、花粉）。
【００７４】
「トランスジェニック植物」又は「トランスフォーメーションされた植物」又は「安定にトランスフォーメーションされた」植物又は細胞又は組織は、植物細胞に外因性核酸配列又はＤＮＡフラグメントが組み入れられた植物又は組み込まれた植物を表す。これらの核酸配列には、トランスフォーメーションされていない植物細胞に外因性の又は存在しない核酸配列、及びトランスフォーメーションされていない植物細胞に内因性の又は存在しうる核酸配列が含まれる。「異種」は、一般に核酸配列であって、その核酸配列が存在する細胞又はネイティブなゲノムの一部に内因性ではなく、感染、トランスフェクション、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、マイクロプロジェクションなどによって細胞に添加された核酸配列を表す。
【００７５】
本発明のトランスジェニック植物は、本明細書に開示された一つ又は複数の変異Ｃｒｙ３配列を発現する。様々な態様では、トランスジェニック植物は、さらに昆虫抵抗性についての１種又は複数種の追加的な遺伝子、例えば、Coleoptera害虫を防除するための１種又は複数種の追加的な遺伝子（例えば、Ｃｒｙ１Ａ、Ｃｒｙ１Ｂ、Ｃｒｙ１Ｃ、Ｃｒｙ１Ｄ、Ｃｒｙ１Ｅ、及びＣｒｙ１ＦファミリーのメンバーなどのＣｒｙ１；Ｃｒｙ２ＡファミリーのメンバーなどのＣｒｙ２；Ｃｒｙ９Ａ、Ｃｒｙ９Ｂ、Ｃｒｙ９Ｃ、Ｃｒｙ９Ｄ、Ｃｒｙ９Ｅ、及びＣｒｙ９ＦファミリーのメンバーなどのＣｒｙ９；Ｃｒｙ３４／３５；ＶＩＰ３などのＶＩＰ；又はColeoptera害虫に毒性を有すると当技術分野において公知の任意の改変Ｃｒｙ３Ａ又はＣｒｙ３Ｂ配列を含む。トランスジェニック植物は、関心が持たれる作物学的形質を与える任意の遺伝子を含みうることが当業者によって理解されている。
【００７６】
植物細胞のトランスフォーメーションは、当技術分野において公知のいくつかの技法のうちの一つによって達成することができる。本発明の殺虫遺伝子は、植物細胞における発現を得る又は高めるように改変することができる。典型的には、そのようなタンパク質を発現する構築物は、遺伝子の転写を推進するプロモーターに加えて、転写終止及びポリアデニル化を可能にする３’非翻訳領域を有するであろう。そのような構築物の編成は、当技術分野において周知である。場合によっては、結果として生じるペプチドが分泌されるか、又はさもなければ植物細胞内でターゲティングされるように遺伝子を操作することが有用なことがある。例えば、小胞体へのペプチドの移行を促進するシグナルペプチドを有するように遺伝子を操作することができる。発現のためにイントロンのｍＲＮＡプロセシングが必要とされるように、イントロンを有するように植物発現カセットを操作することが好ましいこともある。
【００７７】
典型的には、この「植物発現カセット」は、「植物トランスフォーメーションベクター」に挿入される。この植物トランスフォーメーションベクターは、植物トランスフォーメーションを達成するために必要な１種又は複数種のＤＮＡベクターから構成されることがある。例えば、一つよりも多い連続ＤＮＡセグメントから構成される植物トランスフォーメーションベクターを利用することが、当技術分野における慣行である。これらのベクターは、当技術分野においてしばしば「バイナリーベクター」と呼ばれる。効率的なトランスフォーメーションを達成するために必要なＤＮＡセグメントのサイズ及び複雑さが非常に大きく、別々のＤＮＡ分子に機能を分離することが好都合なAgrobacterium介在性トランスフォーメーションに、バイナリーベクター及びヘルパープラスミドを有するベクターが最も頻繁に使用される。バイナリーベクターは、典型的にはＴ−ＤＮＡ伝達に必要なシス作用配列（左境界及び右境界など）、植物細胞において発現可能なように操作された選択マーカー、及び「関心が持たれる遺伝子」（トランスジェニック植物の作製が望まれる植物細胞で発現可能なように操作された遺伝子）を有するプラスミドベクターを有する。同様にこのプラスミドベクターに存在するのは、細菌の複製に必要な配列である。シス作用配列は、植物細胞への効率的な伝達及びその中での発現を可能にする様式で配置される。例えば、選択マーカー遺伝子及び殺虫遺伝子は、左境界と右境界との間に位置する。多くの場合に第二のプラスミドベクターは、Agrobacteriumから植物細胞へのＴ−ＤＮＡ伝達を仲介するトランス作用因子を有する。当技術分野において理解されるように、このプラスミドは、多くの場合にAgrobacteriumによる植物細胞感染、ならびに境界配列での切断によるＤＮＡ伝達及びｖｉｒ介在性ＤＮＡ伝達を可能にするビルレンス機能（Ｖｉｒ遺伝子）を有する（Hellens and Mullineaux (2000) Trends in Plant Science 5:446-451）。いくつかの種類のAgrobacterium株（例えばＬＢＡ４４０４、ＧＶ３１０１、ＥＨＡ１０１、ＥＨＡ１０５など）を植物トランスフォーメーションに使用することができる。マイクロプロジェクション、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、ポリエチレングリコールなどの他の方法によって植物をトランスフォーメーションするために、第二のプラスミドベクターは必要ない。
【００７８】
一般に、植物トランスフォーメーション法は、ターゲット植物細胞（例えば未熟又は成熟胚、懸濁培養物、未分化のカルス、プロトプラストなど）に異種ＤＮＡを導入すること、続いて適切な選択（選択マーカー遺伝子に依存する）の最大閾値レベルを適用して、トランスフォーメーションされていない細胞塊の群からトランスフォーメーションされた植物細胞を回収することを伴う。外植片を、典型的には新鮮供給された同培地に移植し、慣例的に培養する。続いて、トランスフォーメーションされた細胞を、最大閾値レベルの選択薬を補充した再生培地上に供した後で芽に分化させる。次に、発根した芽又は小植物体を回収するために芽を発根選択培地に移植する。次に、トランスジェニック小植物体は成熟植物に成長し、稔性種子を産生する（例えば Hiei et al. (1994) The Plant Journal 6:271-282; Ishida et al. (1996) Nature Biotechnology 14:745-750）。典型的には新鮮供給された同培地に外植片を移植し、慣例的に培養する。トランスジェニック植物を作出するための技法及び方法の一般的な説明は、Ayres and Park (1994) Critical Reviews in Plant Science 13:219-239及びBommineni and Jauhar (1997) Maydica 42:107-120に見出される。トランスフォーメーションされた材料は多数の細胞を含むので、トランスフォーメーションされた細胞とトランスフォーメーションされていない細胞との両方が、対象とされたターゲットカルス又は組織又は細胞群の任意の小片に存在する。トランスフォーメーションされていない細胞を死滅させトランスフォーメーションされた細胞を増殖させる能力により、トランスフォーメーションされた植物培養物が生じる。多くの場合に、トランスフォーメーションされていない細胞を除去する能力は、トランスフォーメーションされた植物細胞の急速回復及びトランスジェニック植物の作出成功への制約である。
【００７９】
トランスフォーメーションプロトコール及び植物にヌクレオチド配列を導入するためのプロトコールは、トランスフォーメーションのためにターゲティングされた植物又は植物細胞の種類、すなわち単子葉であるか双子葉かに応じて変動することがある。トランスジェニック植物の作出は、非限定的にマイクロインジェクション、エレクトロポレーション、直接遺伝子導入、Agrobacteriumによる植物細胞への異種ＤＮＡ導入（Agrobacterium介在性トランスフォーメーション）、パーティクルに接着した異種外来ＤＮＡを用いた植物細胞のボンバードメント、弾道パーティクル加速、エアロゾルビームトランスフォーメーション（米国特許出願公開第２００１００２６９４１号；米国特許第４，９４５，０５０号；国際公開公報第９１／００９１５号；米国特許出願公開第２００２０１５０６６号）、Ｌｅｃ１トランスフォーメーション、及びＤＮＡを伝達するための様々な他の非パーティクル性直接／介在法を含めたいくつかの方法の一つによって行うことができる。
【００８０】
クロロプラストをトランスフォーメーションするための方法は、当技術分野において公知である。例えば、Svab et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:8526-8530; Svab and Maliga (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:913-917; Svab and Maliga (1993) EMBO J. 12:601-606を参照されたい。この方法は、選択マーカーを有するＤＮＡのパーティクルガン送達及び相同組換えによる色素体ゲノムへのＤＮＡのターゲティングに依存する。追加的に、色素体トランスフォーメーションは、核にコードされる色素体指向性ＲＮＡポリメラーゼの組織優先発現によってサイレントな色素体担持導入遺伝子をトランス活性化することによって達成することができる。そのようなシステムは、McBride et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:7301-7305に報告された。
【００８１】
異種外来ＤＮＡを植物細胞に組み込んだ後に、次に培地中での最大閾値レベルの適切な選択を適用してトランスフォーメーションされていない細胞を死滅させ、新鮮培地に定期的に移植することによって、この選択処理から生存する推定的にトランスフォーメーションされた細胞を分離及び増殖させる。連続継代及び適切な選択を用いた誘発によって、プラスミドベクターでトランスフォーメーションされた細胞を同定及び増殖させる。次に、分子及び生化学的方法を使用して、トランスジェニック植物のゲノムに組み込まれた、関心が持たれる異種遺伝子の存在を確認することができる。
【００８２】
トランスフォーメーションされた細胞は、従来法により植物に成長させることができる。例えば、McCormick et al. (1986) Plant Cell Reports 5:81-84を参照されたい。次に、これらの植物を成長させ、同じトランスフォーメーションされた株又は異なる株のいずれかと受粉させ、結果として生じた、所望の表現型特性を構成的発現する雑種を同定することができる。所望の表現型特性の発現が安定的に維持され遺伝することを確かめるために２世代以上成長させ、次に所望の表現型特性の発現が達成されたことを確かめるために種子を収穫することができる。このようにして本発明は、本発明のヌクレオチド構築物、例えば本発明の発現カセットがゲノムに安定的に組み入れられた、トランスフォーメーションされた種子（「トランスジェニック種子」とも呼ばれる）を提供する。
【００８３】
植物トランスフォーメーションの評価
植物細胞に異種外来ＤＮＡを導入後、組み込まれた遺伝子に関連する核酸、タンパク質及び代謝物の分析などの様々な方法によって、植物ゲノムにおける異種遺伝子のトランスフォーメーション又は組み込みを確認する。
【００８４】
ＰＣＲ分析は、土壌に移植する前の初期段階で、組み入れられた遺伝子の存在についてトランスフォーメーションされた細胞、組織又は芽をスクリーニングする迅速法である（Sambrook and Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY）。ＰＣＲは、関心が持たれる遺伝子又はAgrobacteriumベクターのバックグランドなどに特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを使用して実施される。
【００８５】
植物トランスフォーメーションは、ゲノムＤＮＡのサザンブロット分析（Sambrook and Russell, 2001、上記）によって確認することができる。一般に、トランスフォーマントから総ＤＮＡを抽出し、適切な制限酵素で消化し、アガロースゲルで分画し、ニトロセルロース又はナイロンメンブランに移行させる。次に、メンブラン又は「ブロット」を、例えば放射性３２ＰターゲットＤＮＡフラグメントで探索して、植物ゲノムに導入された遺伝子の組み込みを標準技法によって確認する（Sambrook and Russell, 2001、上記）。
【００８６】
ノーザンブロット分析では、トランスフォーマントの特定組織からＲＮＡを単離し、ホルムアルデヒドアガロースゲルで分画し、当技術分野で慣用されている標準的な手順にしたがってナイロンフィルターに転写させる（Sambrook and Russell, 2001、上記）。当技術分野で公知の方法によりそのフィルターを殺虫遺伝子由来の放射性プローブとハイブリダイゼーションすることによって、殺虫遺伝子によってコードされるＲＮＡの発現を試験する（Sambrook and Russell, 2001、上記）。
【００８７】
ウエスタンブロット及び生化学アッセイなどをトランスジェニック植物に対して実施して、殺虫タンパク質上に存在する一つ又は複数のエピトープに結合する抗体を使用した標準的な手順（Sambrook and Russell, 2001、上記）により、殺虫遺伝子によりコードされるタンパク質の存在を確認することができる。
【００８８】
植物における殺虫活性
本発明の別の局面では、殺虫活性を有する殺虫タンパク質を発現しているトランスジェニック植物を作出することができる。一例としてトランスジェニック植物を作出するために上記方法を利用することができるが、トランスジェニック植物細胞が作出される方式は、本発明に重要ではない。Agrobacterium介在性トランスフォーメーション、バイオリスティックトランスフォーメーション、及び非パーティクル介在法などの、当技術分野において公知又は記載の方法を実験者の自由裁量で使用することができる。殺虫タンパク質を発現している植物は、当技術分野で記載されている通常法によって、例えばカルスのトランスフォーメーション、トランスフォーメーションされたカルスの選択、及びそのようなトランスジェニックカルスからの稔性植物の再生によって、単離することができる。そのようなプロセスでは、植物細胞におけるその遺伝子の発現がトランスフォーメーションされた細胞を同定又は選択する能力を付与する限り、選択マーカーとして任意の遺伝子を使用することができる。
【００８９】
クロラムフェニコール、アミノグリコシドＧ４１８、又はハイグロマイシン抵抗性などのいくつかのマーカーが、植物細胞と一緒に使用するために開発された。クロロプラスト代謝に関与する産物をコードする他の遺伝子もまた、選択マーカーとして使用することができる。例えばグリフォセート、ブロモキシニル、又はイミダゾリノンなどの植物除草剤に対する抵抗性を与える遺伝子が、特定の用途をもつことがある。そのような遺伝子が報告されている（Stalker et al. (1985) J. Biol. Chem. 263:6310-6314（ブロモキシニル抵抗性ニトリラーゼ遺伝子）；及びSathasivan et al. (1990) Nucl. Acids Res. 18:2188（ＡＨＡＳイミダゾリノン抵抗性遺伝子）。追加的に、本明細書に開示された遺伝子は、細菌又は植物細胞のトランスフォーメーションを評価するマーカーとして有用である。植物、植物器官（例えば、葉、茎、根など）、種子、植物細胞、繁殖体、胚及びその子孫における導入遺伝子の存在を検出するための方法は、当技術分野において周知である。一態様では、導入遺伝子の存在は、殺虫活性を試験することによって検出される。
【００９０】
殺虫タンパク質を発現している稔性植物を殺虫活性について検査し、最適な活性を示す植物をさらなる育種のために選択することができる。害虫活性についてアッセイする方法は、当技術分野において利用可能である。一般に、タンパク質を混合し、摂食アッセイに使用する。例えばMarrone et al. (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293を参照されたい。
【００９１】
本発明は、非限定的に単子葉植物及び双子葉植物を含めた任意の植物種をトランスフォーメーションするために使用することができる。関心が持たれる植物の例には、非限定的に、コーン（トウモロコシ）、ソルガム、コムギ、ヒマワリ、トマト、アブラナ科植物、コショウ、ジャガイモ、ワタ、イネ、ダイズ、テンサイ、サトウキビ、タバコ、オオムギ、及びアブラナ、Brassica sp.、アルファルファ、ライムギ、雑穀類（millet）、ベニバナ、ラッカセイ、サツマイモ、キャッサバ、コーヒー、ココナッツ、パイナップル、柑橘類、カカオ、チャノキ、バナナ、アボカド、イチジク、グアバ、マンゴー、オリーブ、パパイヤ、カシューナッツ、マカダミア、アーモンド、エンバク、野菜、観賞植物、及び針葉樹が挙げられる。
【００９２】
野菜には、非限定的にトマト、レタス、サヤインゲン、ライマメ、エンドウ、ならびにキュウリ、カンタループ、及びマスクメロンなどのCurcumis属のメンバーが挙げられる。観賞植物には、非限定的にツツジ、アジサイ、ハイビスカス、バラ、チューリップ、スイセン、ペチュニア、カーネーション、ポインセチア、及びキクが挙げられる。好ましくは本発明の植物は、作物植物（例えばトウモロコシ、ソルガム、コムギ、ヒマワリ、トマト、アブラナ科植物、コショウ、ジャガイモ、ワタ、イネ、ダイズ、テンサイ、サトウキビ、タバコ、オオムギ、アブラナなど）である。
【００９３】
殺虫性防除における使用
殺虫剤防除に、又は殺虫因子として他の生物を操作することに、本発明のヌクレオチド配列又はその変異体を含む株を採用する一般法は、当技術分野において公知である。例えば米国特許第５，０３９，５２３号及びEP0480762A2を採用されたい。
【００９４】
農作物及び農産物を害虫から保護するために、本発明のヌクレオチド配列若しくはその変異体を有するBacillus株、又は殺虫遺伝子及び殺虫タンパク質を有するように遺伝的に変更された微生物を使用することができる。本発明の一局面では、毒素（殺虫剤）産生生物の全細胞、すなわち未溶解細胞を、その細胞がターゲット害虫の環境に適用された場合に細胞中に産生される毒素の活性を延長する試薬で処理する。
【００９５】
又は、細胞性ホストに殺虫遺伝子を導入することによって殺虫剤を産生させる。殺虫遺伝子の発現の結果として、直接又は間接的に殺虫剤の細胞内産生及び維持が生じる。次に本発明の一局面では、これらの細胞がターゲット害虫の環境に適用された場合、細胞中に産生される毒素の活性を延長する条件で細胞が処理される。結果として生じた産物は、その毒素の毒性を保持する。次に、ターゲット害虫のホストとなる環境、例えば土壌、水、及び植物の普通葉に施用するために、従来技法に従ってこれらの自然封入された殺虫剤を製剤化することができる。例えばEPA0192319及びそこに引用された参考文献を参照されたい。又は、結果として生じた物質が殺虫剤として施用可能なように、本発明の遺伝子を発現している細胞を製剤化することができる。
【００９６】
本発明の活性成分は、普通は組成物の形で施用され、処置されるべき作物区域又は植物に他の化合物と同時に又は連続的に施用することができる。これらの化合物は、肥料、除草剤、凍害防御物質、界面活性剤、洗剤、殺虫用せっけん、ドーマントオイル（dormant oil）、ポリマー、及び／又は製剤の単回施用後にターゲット区域の長期薬物供給を可能にする持続放出性製剤又は生分解性担体製剤でありうる。それらは、また、所望によりさらなる製剤の技術分野で習慣的に採用される農業的に許容されうる担体、界面活性剤又は施用促進佐剤と一緒に、選択的除草剤、化学殺虫剤、殺ウイルス剤、殺菌剤、殺アメーバ剤、殺虫剤、殺真菌剤、殺細菌剤、殺線虫剤、軟体動物駆除剤、又はこれらの調製物のいくつかの混合物でありうる。適切な担体及び佐剤は、固体又は液体のことがあり、製剤技法において通常採用される物質、例えば天然又は再生無機物、溶媒、分散剤、湿潤剤、粘着付与剤、結合剤又は肥料に対応する。同様に製剤は、可食の「ベイト剤」に調製するか、又はターゲット害虫による殺虫製剤の摂食又は摂取を可能にする害虫「トラップ」の形に作ることができる。
【００９７】
本発明の細菌株によって産生される少なくとも１種の殺虫タンパク質を含有する本発明の活性成分又は本発明の農芸化学的組成物を施用する方法には、葉面施用、種子コーティング及び土壌施用が含まれる。施用回数及び施用量（rate of application）は、対応する害虫による侵襲強度に依存する。
【００９８】
組成物は、粉末、細粉（dust）、ペレット、顆粒、スプレー、エマルション、コロイド、溶液などとして製剤化することができ、ポリペプチドを含む細胞培養物の乾燥、凍結乾燥、均質化、抽出、濾過、遠心分離、沈降、又は濃縮などの従来手段によって調製することができる。少なくとも１種の殺虫ポリペプチドを含有するような全ての組成物において、ポリペプチドは、約１重量％〜約９９重量％の濃度で存在しうる。
【００９９】
Lepidoptera、Diptera、又はColeoptera害虫は、本発明の方法によっていくつかの所与の区域で死滅又は減少させることができるか、又は感受性の害虫による侵襲を防止するために環境区域に予防的に施用することができる。好ましくは害虫は、殺虫有効量のポリペプチドを摂取するか、又はそれと接触する。「殺虫有効量」は、少なくとも１種類の害虫の死滅をもたらすか、又は害虫の成長、摂食、若しくは通常の生理学的発生を顕著に減退することのできる殺虫剤の量が意図される。この量は、例えば防除されるべき特定のターゲット害虫、特定の環境、所在、植物、作物、又は処理されるべき農業部位、環境条件、ならびに殺虫的に有効なポリペプチド組成物の方法、割合、濃度、安定性、及び分量などの要因に応じて変動する。製剤は、また、天候条件、環境要件、及び／又は施用頻度及び／又は害虫侵襲の激しさに関して変動しうる。
【０１００】
記載された殺虫組成物は、細菌細胞、結晶及び／若しくは芽胞懸濁物、又は単離されたタンパク質成分のいずれかを所望の農業的に許容されうる担体と共に製剤化することによって製造することができる。その組成物は、施用の前に凍結乾燥、フリーズドライ、乾燥などの適切な手段で、又は食塩水若しくは他の緩衝液などの水性担体、媒質若しくは適切な希釈剤に入れて製剤化することができる。製剤化された組成物は、粉剤若しくは粒状物質、又は（植物又は鉱物）油への懸濁剤、又は水性若しくは水中油型乳剤の形、又は水和剤として、又は農業的施用に適した任意の他の担体物質と組み合わせでありうる。適切な農業用担体は、固体又は液体のことがあり、当技術分野において周知である。「農業的に許容されうる担体」という用語は、殺虫製剤技法に通常使用される全ての佐剤、不活性成分、分散剤、界面活性剤、粘着付与剤、結合剤などに及び、これらは、殺虫製剤の専門家に周知である。それらの製剤を、一つ又は複数の固体又は液体佐剤と混合し、様々な手段によって、例えば従来の製剤化技法を用いて殺虫組成物を適切な佐剤と均一に混合、ブレンド及び／又は粉砕することによって調製することができる。適切な製剤化及び施用方法は、参照により本明細書に組み入れられる米国特許第６，４６８，５２３号に記載されている。
【０１０１】
「害虫」には、非限定的に、昆虫、真菌、細菌、線虫、ダニ、マダニなどが含まれる。害虫には、Coleoptera、Diptera、Hymenoptera、Lepidoptera、Mallophaga、Homoptera、Hemiptera、Orthroptera、Thysanoptera、Dermaptera、Isoptera、Anoplura、Siphonaptera、Trichopteraなどの目より、特にColeoptera、Lepidoptera、及びDipteraより選択される昆虫が含まれる。
【０１０２】
Coleoptera目にはAdephaga及びPolyphaga亜目が含まれる。Adephaga亜目には、Caraboidea及びGyrinoidea上科が含まれ、一方でPolyphaga亜目には、Hydrophiloidea、Staphylinoidea、Cantharoidea、Cleroidea、Elateroidea、Dascilloidea、Dryopoidea、Byrrhoidea、Cucujoidea、Meloidea、Mordelloidea、Tenebrionoidea、Bostrichoidea、Scarabaeoidea、Cerambycoidea、Chrysomeloidea、及びCurculionoidea上科が含まれる。Caraboidea上科には、Cicindelidae、Carabidae、及びDytiscidae科が含まれる。Gyrinoidea上科にはGyrinidae科が含まれる。Hydrophiloidea上科にはHydrophilidae科が含まれる。Staphylinoidea上科には、Silphidae及びStaphylinidae科が含まれる。Cantharoidea上科には、Cantharidae及びLampyridae科が含まれる。Cleroidea上科には、Cleridae及びDermestidae科が含まれる。Elateroidea上科には、Elateridae及びBuprestidae科が含まれる。Cucujoidea上科にはCoccinellidae科が含まれる。Meloidea上科にはMeloidae科が含まれる。Tenebrionoidea上科にはTenebrionidae科が含まれる。Scarabaeoidea上科には、Passalidae及びScarabaeidae科が含まれる。Cerambycoidea上科にはCerambycidae科が含まれる。Chrysomeloidea上科にはChrysomelidae科が含まれる。Curculionoidea上科には、Curculionidae及びScolytidae科が含まれる。
【０１０３】
Diptera目には、Nematocera、Brachycera、及びCyclorrhapha亜目が含まれる。Nematocera亜目には、Tipulidae、Psychodidae、Culicidae、Ceratopogonidae、Chironomidae、Simuliidae、Bibionidae、及びCecidomyiidae科が含まれる。Brachycera亜目には、Stratiomyidae、Tabanidae、Therevidae、Asilidae、Mydidae、Bombyliidae、及びDolichopodidae科が含まれる。Cyclorrhapha亜目には、Aschiza及びAschiza群が含まれる。Aschiza群には、Phoridae、Syrphidae、及びConopidae科が含まれる。Aschiza群には、Acalyptratae及びCalyptratae類が含まれる。Acalyptratae類には、Otitidae、Tephritidae、Agromyzidae、及びDrosophilidae科が含まれる。Calyptratae類には、Hippoboscidae、Oestridae、Tachinidae、Anthomyiidae、Muscidae、Calliphoridae、及びSarcophagidae科が含まれる。
【０１０４】
Lepidoptera目には、Papilionidae、Pieridae、Lycaenidae、Nymphalidae、Danaidae、Satyridae、Hesperiidae、Sphingidae、Saturniidae、Geometridae、Arctiidae、Noctuidae、Lymantriidae、Sesiidae、及びTineidae科が含まれる。
【０１０５】
主要な作物についての本発明の害虫には:トウモロコシ：Ostrinia nubilalis、ヨーロピアンコーンボーラー（European corn borer）；Agrotis ipsilon、タマナヤガ（black cutworm）；Helicoverpa zea、アメリカタバコガ（corn earworm）；Spodoptera frugiperda、ツマジロクサヨトウ（fall armyworm）；Diatraea grandiosella、サウスウエスタンコーンボーラー（southwestern corn borer）；Elasmopalpus lignosellus、モロコシマダラメイガ（lesser cornstalk borer）；Diatraea saccharalis、シュガーケーンボーラー（surgarcane borer）；Diabrotica virgifera、ウエスタンコーンルートワーム；Diabrotica longicornis barberi、ノーザンコーンルートワーム（northern corn rootworm）；Diabrotica undecimpunctata howardi、サザンコーンルートワーム（southern corn rootworm）；Melanotus spp.、ワイヤーアーム（wireworm）；Cyclocephala borealis、ノーザンマスクトシェーファー（northern masked chafer）(ホワイトグラブ（white grub）)；Cyclocephala immaculata、サザンマスクトシェーファー（southern masked chafer）(ホワイトグラブ)；Popillia japonica、マメコガネ（Japanese beetle）；Chaetocnema pulicaria、コーンフリービートル（corn flea beetle）；Sphenophorus maidis、メイズビルバグ（maize billbug）；Rhopalosiphum maidis、トウモロコシアブラムシ（corn leaf aphid）；Anuraphis maidiradicis、コーンルートアフィド（corn root aphid）；Blissus leucopterus leucopterus、チンチナガカメムシ（chinch bug）；Melanoplus femurrubrum、レッドレッグドグラスホッパー（redlegged grasshopper）；Melanoplus sanguinipes、ミグラトリーグラスホッパー（migratory grasshopper）；Hylemya platura、シードコーンマゴット（seedcorn maggot）；Agromyza parvicornis、コーンブロットリーフマイナー（corn blot leafminer）；Anaphothrips obscrurus、クサキイロアザミウマ（grass thrips）；Solenopsis milesta、シーフアント（thief ant）；Tetranychus urticae、ツースポッテドスパイダーマイト（twospotted spider mite）；ソルガム：Chilo partellus、ソルガムボーラー（sorghum borer）；Spodoptera frugiperda、ツマジロクサヨトウ；Helicoverpa zea、アメリカタバコガ；Elasmopalpus lignosellus、モロコシマダラメイガ（lesser cornstalk borer）；Feltia subterranea、グラニュレートカットワーム（granulate cutworm）；Phyllophaga crinita、ホワイトグラブ；Eleodes、Conoderus、及びAeolus spp.、ワイヤーアーム；Oulema melanopus、シリアルリーフビートル（cereal leaf beetle）；Chaetocnema pulicaria、コーンフリービートル；Sphenophorus maidis、メイズビルバグ；Rhopalosiphum maidis；トウモロコシアブラムシ；Sipha flava、イエローシュガーケーンアフィッド（yellow sugaracane aphid）；Blissus leucopterus leucopterus、チンチナガカメムシ；Contarinia sorghicola、ソルガムミッジ（sorghum midge）；Tetranychus cinnabarinus、カーマインスパイダーマイト（carmine spider mite）；Tetranychus urticae、ツースポッテドスパイダーマイト；
コムギ：Pseudaletia unipunctata、アーミーワーム（army worm）；Spodoptera frugiperda、ツマジロクサヨトウ；Elasmopalpus lignosellus、モロコシマダラメイガ；Agrotis orthogonia、ウエスタンカットワーム（western cutworm）；Elasmopalpus lignosellus、モロコシマダラメイガ；Oulema melanopus、シリアルリーフビートル；Hypera punctata、クローバーリーフウィービル（clover leaf weevil）；Diabrotica undecimpunctata howardi、サザンコーンルートワーム；ラッシャンウィートアフィド（Russian wheat aphid）；Schizaphis graminum、グリーンバグ（greenbug）；Macrosiphum avenae、イングリッシュグレインアフィド（English grain aphid）；Melanoplus femurrubrum、レッドレッグドグラスホッパー；Melanoplus differentialis、ディファレンシャルグラスホッパー（differential grasshopper）；Melanoplus sanguinipes、ミグラトリーグラスホッパー；Mayetiola destructor、ヘシアンフライ（Hessian fly）；Sitodiplosis mosellana、ムギアカタマバエ（wheat midge）；Meromyza americana、ウィートステムマゴット（wheat stem maggot）；Hylemya coarctata、ウィートバルブフライ（wheat bulb fly）；Frankliniella fusca、タバコスリップス（tobacco thrips）；Cephus cinctus、ウィートステムソーフライ（wheat stem sawfly）；Aceria tulipae、ウィートカールマイト（wheat curl mite）；ヒマワリ：Suleima helianthana、サンフラワーバッドモス（sunflower bud moth）；Homoeosoma electellum、サンフラワーモス（sunflower moth）；zygogramma exclamationis、サンフラワービートル（sunflower beetle）；Bothyrus gibbosus、キャロットビートル（carrot beetle）；Neolasioptera murtfeldtiana、サンフラワーシードミッジ（sunflower seed midge）；ワタ：Heliothis virescens、コットンバッドワーム（cotton budworm）；Helicoverpa zea、アメリカタバコガ（cotton bollworm）；Spodoptera exigua、シロイチモジヨトウ（beet armyworm）；Pectinophora gossypiella、ワタアカミムシ（pink bollworm）；Anthonomus grandis、ワタミハナゾウムシ（boll weevil）；Aphis gossypii、ワタアブラムシ（cotton aphid）；Pseudatomoscelis seriatus、コーンフリーホッパー（cotton fleahopper）；Trialeurodes abutilonea、バンデドウイングドホワイトフライ（bandedwinged whitefly）；Lygus lineolaris、サビイロカスミカメムシ（tarnished plant bug）；Melanoplus femurrubrum、レッドレッグドグラスホッパー；Melanoplus differentialis、ディファレンシャルグラスホッパー；Thrips tabaci、ネギアザミウマ（onion thrips）；Franklinkiella fusca、タバコスリップス；Tetranychus cinnabarinus、カーマインスパイダーマイト；Tetranychus urticae、ツースポッテドスパイダーマイト；
イネ：Diatraea saccharalis、シュガーケーンボーラー（sugarcane borer）；Spodoptera frugiperda、ツマジロクサヨトウ；Helicoverpa zea、アメリカタバコガ；Colaspis brunnea、グレープコラプシス（grape colaspis）；Lissorhoptrus oryzophilus、イネミズゾウムシ（rice water weevil）；Sitophilus oryzae、ココクゾウムシ（rice weevil）；Nephotettix nigropictus、クロスジツマグロヨコバイ（rice leafhopper）；Blissus leucopterus leucopterus、チンチナガカメムシ；Acrosternum hilare、グリーンスティンクバグ（green stink bug）；ダイズ：Pseudoplusia includens、ソイビーンルーパ（soybean looper）；Anticarsia gemmatalis、ベルベットビーンキャタピラー（velvetbean caterpillar）；Plathypena scabra、グリーンクローバーワーム（green cloverworm）；Ostrinia nubilalis、ヨーロピアンコーンボーラー（European corn borer）；Agrotis ipsilon、タマナヤガ；Spodoptera exigua、シロイチモジヨトウ；Heliothis virescens、コットンバッドワーム；Helicoverpa zea、アメリカタバコガ；Epilachna varivestis、インゲンテントウ（Mexican bean beetle）；Myzus persicae、モモアカアブラムシ（green peach aphid）；Empoasca fabae、ジャガイモヒメヨコバイ（potato leafhopper）；Acrosternum hilare、グリーンスティンクバグ；Melanoplus femurrubrum、レッドレッグドグラスホッパー；Melanoplus differentialis、ディファレンシャルグラスホッパー；Hylemya platura、シードコーンマゴット；Sericothrips variabilis、ソイビーンスリップス（soybean thrips）；Thrips tabaci、ネギアザミウマ；Tetranychus turkestani、ストロベリースパイダーマイト（strawberry spider mite）；Tetranychus urticae、ツースポッテドスパイダーマイト；オオムギ：Ostrinia nubilalis、ヨーロピアンコーンボーラー；Agrotis ipsilon、タマナヤガ；Schizaphis graminum、グリーンバグ；Blissus leucopterus leucopterus、チンチナガカメムシ；Acrosternum hilare、グリーンスティンクバグ；Euschistus servus、ブラウンスティンクバグ（brown stink bug）；Delia platura、タネバエ；Mayetiola destructor、ヘシアンフライ；Petrobia latens、ブラウンウィートマイト（brown wheat mite）；アブラナ：Brevicoryne brassicae、ダイコンアブラムシ（cabbage aphid）；Phyllotreta cruciferae、フリービートル（Flea beetle）；Mamestra configurata、バーサアーミーワーム（Bertha armyworm）；Plutella xylostella、コナガ（Diamond-back moth）；Delia ssp.、ルートマゴット（Root maggot）が含まれる。
【０１０６】
線虫には、Heterodera spp.、Meloidogyne spp.、及びGlobodera spp.を含めたネコブセンチュウ、シストセンチュウ、及びネグサレセンチュウなどの寄生線虫；特に非限定的にHeterodera glycines（ダイズシストセンチュウ）；Heterodera schachtii（テンサイシストセンチュウ；Heterodera avenae（ムギシストセンチュウ）；ならびにGlobodera rostochiensis及びGlobodera pailida（ジャガイモのシストセンチュウ）を含めたシストセンチュウのメンバーが含まれる。ネグサレセンチュウにはPratylenchus spp.が含まれる。
【０１０７】
植物は、また、１種又は複数種の除草剤、殺虫剤、又は殺真菌剤を含めた１種又は複数種の化学組成物で処置することができる。例示的な化学組成物には：果物/野菜用除草剤：アトラジン、ブロマシル、ジウロン、グリフォセート、リニュロン、メトリブジン、シマジン、トリフルラリン、フルアジホップ、グルフォシネート、ハロスルフロンゴワン（Halosulfuron Gowan）、パラコート、プロピザミド、セトキシジム、ブタフェナシル、ハロスルフロン、インダジフラム（Indaziflam）；果物/野菜用殺虫剤：アルジカルブ、Bacillus thuriengiensis、カルバリル、カルボフラン、クロルピリホス、シペルメトリン、デルタメトリン、ダイアジノン、マラチオン、アバメクチン、シフルトリン/β-シフルトリン、エスフェンバレレート、λ−シハロトリン、アセキノシル、ビフェナゼート、メトキシフェノジド、ノバルロン、クロマフェノジド、チアクロプリド、ジノテフラン、フルアクリピリム、トルフェンピラド、クロチアニジン、スピロジクロフェン、γ-シハロトリン、スピロメシフェン、スピノサド、リナキシピル、Cyazypyr、スピノテラム（Spinoteram）、トリフルムロン、スピロテトラマト、イミダクロプリド、フルベンジアミド、チオジカルブ、メタフルミゾン、スルホキサフロール、シフルメトフェン、シアノピラフェン（Cyanopyrafen）、イミダクロプリド、クロチアニジン、チアメトキサム、スピノトラム（Spinotoram）、チオジカルブ、フロニカミド、メチオカルブ、エマメクチンベンゾエート、インドキサカルブ、ホズチアゼート（Fozthiazate）、フェナミホス、カズサホス（Cadusaphos）、ピリプロキシフェン（Pyriproxifen）、酸化フェンブタスズ、ヘキシチアゾクス（Hexthiazox）、メトミル、４−［［（６−クロルピリジン−３−イル）メチル］（２，２−ジフルオルエチル）アミノ］フラン−２（５Ｈ）−オン；果物／野菜用殺真菌剤：カルベンダジム、クロロタロニル、ＥＢＤＣ、硫黄、チオファネートメチル、アゾキシストロビン、シモキサニル、フルアジナム、ホセチル、イプロジオン、クレソキシムメチル、メタラキシル／メフェノキサム、トリフロキシストロビン、エタボキサム、イプロバリカルブ（Iprovalicarb）、トリフロキシストロビン、フェンヘキサミド、オキスポコナゾールフマラート、シアゾファミド、フェナミドン、ゾキサミド、ピコキシストロビン、ピラクロストロビン、シフルフェナミド（Cyflufenamid）、ボスカリド；
穀物用除草剤：イソプロツロン、ブロモキシニル、イオキシニル、フェノキシ類（Phenoxies）、クロルスルフロン、クロジナホップ、ジクロホップ、ジフルフェニカン、フェノキサプロップ、フロラスラム、フルロキシピル、メトスルフロン、トリアスルフロン、フルカルバゾン、ヨードスルフロン、プロポキシカルバゾン、ピコリナフェン、メソスルフロン、ベフルブタミド、ピノキサデン、アミドスルフロン、チフェンスルフロン、トリベヌロン、フルピルスルフロン、スルホスルフロン、ピラスルホトール（Pyrasulfotole）、ピロックススラム、フルフェナセット、トラルコキシジム、ピロキサスルホン；穀物用殺真菌剤：カルベンダジム、クロロタロニル、アゾキシストロビン、シプロコナゾール、シプロジニル、フェンプロピモルフ、エポキシコナゾール、クレソキシムメチル、キノキシフェン、テブコナゾール、トリフロキシストロビン、シメコナゾール、ピコキシストロビン、ピラクロストロビン、ジモキシストロビン、プロチオコナゾール、フルオキサストロビン（Fluoxastrobin）；穀物用殺虫剤：ジメトエート、λ−シハルトリン（cyhalthrin）、デルタメトリン、α−シペルメトリン、β−シフルトリン、ビフェントリン、イミダクロプリド、クロチアニジン、チアメトキサム、チアクロプリド、アセタミプリド、ジネトフラン（Dinetofuran）、クロルピリホス（Clorphyriphos）、メタミドホス、オキシデメトン（Oxidemethon）メチル、ピリミカーブ、メチオカルブ；トウモロコシ用除草剤：アトラジン、アラクロール、ブロモキシニル、アセトクロル、ジカンバ、クロピラリド、（Ｓ−）ジメテナミド、グルフォシネート、グリフォセート、イソキサフルトール、（Ｓ−）メトラクロル、メソトリオン、ニコスルフロン、プリミスルフロン、リムスルフロン、スルコトリオン、ホラムスルフロン、トプラメゾン、テンボトリオン、サフルフェナシル、チエンカルバゾン（Thiencarbazone）、フルフェナセット、ピロキサスルホン；トウモロコシ殺虫剤：カルボフラン、クロルピリホス、ビフェントリン、フィプロニル、イミダクロプリド、λ−シハロトリン、テフルトリン、テルブホス（Terbufos）、チアメトキサム、クロチアニジン、スピロメシフェン、フルベンジアミド、トリフルムロン、リナキシピル、デルタメトリン、チオジカルブ、β−シフルトリン、シペルメトリン、ビフェントリン、ルフェヌロン、トリフルモロン（Triflumoron）、テフルトリン、テブピリンホス、エチプロール、Cyazypyr、チアクロプリド、アセタミプリド、ジネトフラン、アベルメクチン、メチオカルブ、スピロジクロフェン、スピロテトラマト；トウモロコシ用殺真菌剤：フェニトロパン、チラム、プロチオコナゾール、テブコナゾール、トリフロキシストロビン；
イネ用除草剤：ブタクロールプロパニル、アジムスルフロン、ベンスルフロン、シハロホップ、ダイムロン、フェントラザミド、イマズスルフロン、メフェナセット、オキサジクロメフォン、ピラゾスルフロン、ピリブチカルブ、キンクロラック、チオベンカルブ、インダノファン、フルフェナセット、フェントラザミド、ハロスルフロン、オキサジクロメフォン、ベンゾビシクロン、プリフタリド、ペノクスラム、ビスピリバック、オキサジアルギル、エトキシスルフロン、プレチラクロール、メソトリオン、テフリルトリオン、オキサジアゾン、フェノキサプロップ、ピリミスルファン；イネ用殺虫剤：ダイアジノン、フェニトロチオン、フェノブカルブ、モノクロトホス、ベンフラカルブ、ブプロフェジン、ジノテフラン、フィプロニル、イミダクロプリド、イソプロカルブ、チアクロプリド、クロマフェノジド、チアクロプリド、ジノテフラン、クロチアニジン、エチプロール、フルベンジアミド、リナキシピル、デルタメトリン、アセタミプリド、チアメトキサム、Cyazypyr、スピノサド、スピノトラム、エマメクチン安息香酸塩、シペルメトリン、クロルピリホス、カルタップ、メタミドホス、エトフェンプロクス、イサゾホス、４−［［（６−クロルピリジン−３−イル）メチル］（２，２−ジフルオルエチル）アミノ］フラン−２（５Ｈ）−オン、カルボフラン、ベンフラカルブ；イネ用殺真菌剤：チオファネートメチル、アゾキシストロビン、カルプロパミド、エジフェンホス、フェリムゾン、イプロベンホス、イソプロチオラン、ペンシクロン、プロベナゾール、ピロキロン、トリシクラゾール、トリフロキシストロビン、ジクロシメット、フェノキサニル、シメコナゾール、チアジニル（Tiadinil）；ワタ用除草剤：ジウロン、フルオメツロン、ＭＳＭＡ、オキシフルオルフェン、プロメトリン、トリフルラリン、カルフェントラゾン、クレトジム、フルアジホップブチル、グリフォセート、ノルフルラゾン、ペンディメタリン、ピリチオバックナトリウム、トリフロキシスルフロン、テプラロキシジム、グルフォシネート、フルミオキサジン、チジアズロン；ワタ用殺虫剤：アセフェート、アルジカルブ、クロルピリホス、シペルメトリン、デルタメトリン、マラチオン、モノクロトホス、アバメクチン、アセタミプリド、エマメクチン安息香酸塩、イミダクロプリド、インドキサカルブ、λ−シハロトリン、スピノサド、チオジカルブ、γ−シハロトリン、スピロメシフェン、ピリダリル、フロニカミド、フルベンジアミド、トリフルムロン、リナキシピル、β−シフルトリン、スピロテトラマト、クロチアニジン、チアメトキサム、チアクロプリド、ジネトフラン、フルベンジアミド、Cyazypyr、スピノサド、スピノトラム、γシハロトリン、４−［［（６−クロルピリジン−３−イル）メチル］（２，２−ジフルオルエチル）アミノ］フラン−２（５Ｈ）−オン、チオジカルブ、アベルメクチン、フロニカミド、ピリダリル、スピロメシフェン、スルホキサフロール、プロフェノホス（Profenophos）、トリアゾホス（Thriazophos）、エンドスルファン；ワタ用殺真菌剤：エトリジアゾール（Etridiazole）、メタラキシル、キントゼン；
ダイズ用除草剤：アラクロール、ベンタゾン、トリフルラリン、クロリムロンエチル、クロランスラムメチル、フェノキサプロップ、ホメサフェン、フルアジホップ、グリフォセート、イマザモックス、イマザキン、イマゼタピル、（Ｓ−）メトラクロル、メトリブジン、ペンディメタリン、テプラロキシジム、グルフォシネート；ダイズ用殺虫剤：λ−シハロトリン、メトミル、パラチオン、チオカルブ（Thiocarb）、イミダクロプリド、クロチアニジン、チアメトキサム、チアクロプリド、アセタミプリド、ジネトフラン、フルベンジアミド、リナキシピル、Cyazypyr、スピノサド、スピノトラム、エマメクチン安息香酸塩、フィプロニル、エチプロール、デルタメトリン、β−シフルトリン、γ及びλシハロトリン、４−［［（６−クロルピリジン−３−イル）メチル］（２，２−ジフルオルエチル）アミノ］フラン−２（５Ｈ）−オン、スピロテトラマト、スピノジクロフェン（Spinodiclofen）、トリフルムロン、フロニカミド、チオジカルブ、β−シフルトリン；ダイズ用殺真菌剤：アゾキシストロビン、シプロコナゾール、エポキシコナゾール、フルトリアホール、ピラクロストロビン、テブコナゾール、トリフロキシストロビン、プロチオコナゾール、テトラコナゾール；テンサイ用除草剤：クロリダゾン、デスメジファム、エトフメサート、フェンメディファム、トリアレート、クロピラリド、フルアジホップ、レナシル、メタミトロン、キンメラック、シクロキシジム、トリフルスルフロン、テプラロキシジム、キザロホップ；テンサイ用殺虫剤：イミダクロプリド、クロチアニジン、チアメトキサム、チアクロプリド、アセタミプリド、ジネトフラン、デルタメトリン、β−シフルトリン、γ／λシハロトリン、４−［［（６−クロルピリジン−３−イル）メチル］（２，２−ジフルオルエチル）アミノ］フラン−２（５Ｈ）−オン、テフルトリン、リナキシピル、Cyaxypyr、フィプロニル、カルボフラン；カノーラ用除草剤：クロピラリド、ジクロホップ、フルアジホップ、グルフォシネート、グリフォセート、メタザクロル、トリフルラリン、エタメトスルフロン、キンメラック、キザロホップ、クレトジム、テプラロキシジム；カノーラ用殺真菌剤：アゾキシストロビン、カルベンダジム、フルジオキソニル、イプロジオン、プロクロラズ、ビンクロゾリン；カノーラ用殺虫剤：カルボフラン、有機リン酸エステル、ピレスロイド、チアクロプリド、デルタメトリン、イミダクロプリド、クロチアニジン、チアメトキサム、アセタミプリド、ジネトフラン、β−シフルトリン、γ−及びλ−シハロトリン、τ−フルバレリエート（Fluvaleriate）、エチプロール、スピノサド、スピノトラム、フルベンジアミド、リナキシピル、Cyazypyr、４−［［（６−クロルピリジン−３−イル）メチル］（２，２−ジフルオルエチル）アミノ］フラン−２（５Ｈ）−オンが含まれる。
【０１０８】
植物の収量を増加させる方法
植物の収量を増加させる方法が提供される。その方法は、本明細書に開示された殺虫配列を含むポリヌクレオチドを植物又は植物細胞に導入することを含む。本明細書に定義されるように、植物の「収量」は、植物によって産生されるバイオマスの質及び／又は量を表す。「バイオマス」とは、任意の測定された植物産物が意図される。バイオマス産生の増加は、測定された植物産物の収量における任意の改善である。植物の収量増加は、いくつもの商業的な用途がある。例えば、植物葉バイオマスを増加させることで、ヒト又は動物が消費するための葉物野菜の収量を増加させることができる。追加的に、葉バイオマスの増加は、植物由来医薬品又は工業製品の生産を増加させるために用いることができる。収量の増加は、殺虫配列を発現していない植物に比べて、非限定的に収率の少なくとも１％の増加、少なくとも３％の増加、少なくとも５％の増加、少なくとも１０％の増加、少なくとも２０％の増加、少なくとも３０％の増加、少なくとも５０％の増加、少なくとも７０％の増加、少なくとも１００％の増加又はそれよりも大きな増加を含めた任意の統計的に有意な増加を含みうる。
【０１０９】
限定としてではなく、例証として以下の実施例を提供する。
【０１１０】
実験の部
実施例１． 発現構築物
ｐＡＸ５５１０は、ｐＲＳＦ１ｂ１ベクターシステム（Invitrogen）ベースの発現ベクターである。このベクターは、E. coli細胞におけるＴ７プロモーター（例えば、ＢＬ２１：ＤＥ３株における）の転写誘導が、Ｎ末端にＨｉｓタグを有するｃｒｙ−Ｒ１タンパク質（配列番号２、GENBANK（登録商標）アクセッション番号ＰＯＡ３７９に記載された配列に対応）の蓄積を招くように、Ｔ７プロモーター下流にオープンリーディングフレーム 配列番号１（本明細書においてａｘｍｉ−Ｒ１と呼ばれ、GENBANK（登録商標）アクセッション番号ＰＯＡ３７９に記載された配列をコードする）を有する。
【０１１１】
実施例２． ウエスタンコーンルートワーム（ＷＣＲＷ）及びサザンコーンルートワーム（ＳＣＲＷ）のバイオアッセイ
ウエスタンコーンルートワーム及びサザンコーンルートワームの卵（それぞれDiabrotica virgifera及びDiabrotica undecimpunctata）（Crop Characteristics, MN）を洗浄し、孵化近くまで２５℃でインキュベーションした。以前に記載されたように、溶かした人工飼料を調製し（参照により本明細書に組み入れられる米国特許第７，３５１，８８１号）、２４ウェル組織培養プレート（Corning 3527）中に１ml分量ずつ入れ、１時間放冷した。いったん固化したならば、４０μlの試料を各ウェルに入れ、試料に拡散させた。試料が吸収された後で、７．５μｌの卵：０．１５％の寒天スラリー（ウェル１個あたりルートワームの卵約２５個）を各ウェルの端に加え、乾燥させた。いったん乾燥したならば、プレートをBREATHE-EASY（登録商標）気体透過性メンブラン（Research Products International）で密封し、暗グロースチャンバー（２５℃、９０％の相対湿度（ＲＨ））の中に置いた。
【０１１２】
２４時間後に、各プレートからそのメンブランを、次に孵化していない卵を除去し、気体透過性メンブランで再度密封し、さらに４日間、暗グロースチャンバー（２５℃、９０％ＲＨ）に戻した。合計５日後に、試料ウェル中の昆虫をプレート内対照と比較し、成長阻害及び死亡率について評価した（スコア付けシステムについては表１参照）。
【０１１３】
【表１】
【０１１４】
実施例３． 突然変異誘発の戦略、及び第一の突然変異誘発ライブラリーの創出
第一世代の点突然変異ライブラリー（ＰＭライブラリー１、ＰＭ１）は、２８個の位置を含む配列番号２の４領域をターゲティングした。テンプレートとしてｐＡＸ５５１０を使用して、いくつかの個別の位置をQUIKCHANGE（登録商標）部位特異的突然変異誘発キットを使用して無作為化し、多数の変異体のＤＮＡ配列を決定した。ＤＮＡ配列の分析によって、所望の変異をプールし、一方で望まれないクローン（野生クローン、重複する突然変異体及びフレームシフト突然変異体など）を除去した。２９４種類の独特な変異体をＰＭライブラリー１から同定し、さらなる試験に供した。
【０１１５】
一次スクリーニング。プールされたライブラリー変異体及びｐＡＸ５５１０を、ＢＬ２１＊ＤＥ３細胞にトランスフォーメーションし、ＬＢ＋カナマイシン（１００μg/ml）上に蒔いた。新鮮なコロニーを釣り上げて８．５mlのＬＢ＋カナマイシン（１００ug/ml）液体培地に入れ、ＯＤ６００nmが０．３〜０．４に達するまで深型２４ウェルブロック中で３７℃及び２５０rpmで成長させた。ＩＰＴＧを終濃度０．５mMまで添加し、培養液を２０℃で追加的に１８時間インキュベーションした。ＯＤ６００nmを決定し、遠心分離によって細胞を収集した（４５００rpm、４℃で１０分間）。細胞ペレットを５０mM炭酸ナトリウム（ｐＨ１０．５）、１mM ＤＴＴ中に１０ OD600/mlの密度で再懸濁した。ビーズ撹拌によって細胞を破壊し、４０００rpm、４℃で１５分間遠心分離後に可溶性抽出物を得た。
【０１１６】
各変異体についてそれぞれ４回の繰り返しで、ＷＣＲＷ及びＳＣＲＷに対する活性について抽出物をアッセイした。５日後に、４回の繰り返しからのスコアを平均することによってルートワーム毒性スコアを決定した。この一次選別で変異体（合計４３６種類）をスクリーニングし、ライブラリーのカバー度１．５×を与えた。
【０１１７】
再アッセイ及びスケールアップ。一次選別において≧３のスコアとなった４３種類の変異体を、一次選別と同じ実験条件を用いて再アッセイした。一次選別及び再アッセイから得られたスコアを、過剰サンプリングによる繰り返し単離株からのスコアを含めて平均し、２０種類の変異体を優先的にさらに広範なスケールアップに供した。
【０１１８】
スケールアップのために、新鮮トランスフォーメーションされた５個のコロニーを釣り上げて１３５ml ＬＢ＋カナマイシン（１００μg/ml）に入れ、１リットル振盪フラスコ中で０．３〜０．４のＯＤ６００nmに達するまで３７℃及び２５０rpmで成長させた。ＩＰＴＧを０．５mMの終濃度まで添加し、培養物を２０℃で追加的に１８時間インキュベーションした。ＯＤ６００nmを決定し、細胞を遠心分離（５０００rpm、４℃で１０分間）によって収集した。細胞ペレットを５０mM炭酸ナトリウム（ｐＨ１０．５）、１mM ＤＴＴに１０ OD600/mlの密度で再懸濁した。ビーズ撹拌によって細胞を破壊し、４０００rpm、４℃で１５分間遠心分離後に可溶性抽出物を得た。クマシーで染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で、抽出液の系列希釈を公知の濃度のＢＳＡ標準と比較することによって、それらの抽出液中のＡＸＭＩ−Ｒ１変異体を定量した。検討したＡＸＭＩ−Ｒ１変異体の濃度は、０．１３〜０．２２μg/ulの範囲で近接していた。
【０１１９】
アッセイのために、ｐＲＳＦ１ｂでトランスフォーメーションされたＢＬ２１＊ＤＥ３からの対照抽出物でＡＸＭＩ−Ｒ１変異体を含有する抽出物の系列希釈物を調製した。希釈は、ＡＸＭＩ−Ｒ１変異体を含有する抽出物の４０〜１．２５μｌの範囲であった。したがって、ＡＸＭＩ−Ｒ１変異体の濃度を変化させ、ＢＬ２１＃ＤＥ３タンパク質の量を一定に保った。ＷＣＲＷは変異体及び希釈物毎に４０回の繰り返しでアッセイした。各希釈についての平均スコア及びＥＣ５０を決定した。
【０１２０】
４０μlの抽出物で平均バイオアッセイスコア（ｎ＝４０）によりＡＸＭＩ−Ｒ１変異体をランク付けした（表２）。比較のために、ＡＸＭＩ−Ｒ１野生（ｗｔ）の６個の生物学的繰り返しを調製したが、そのデータ及び標準偏差を提供する。
【０１２１】
変異体Ｄ４Ｆ１１、Ｈ９、Ｇ５、Ｈ４、Ｄ５Ｄ８、及びＤ４Ａ２は、ＷＣＲＷに対して有意に改善された活性を示した。Ｄ５Ｄ８をコードするヌクレオチド配列を配列番号５に示し、アミノ酸配列を配列番号６に示す。
【０１２２】
【表２】
【０１２３】
したがって、任意の特定の理論又はメカニズムに縛られるわけではないが、改善されたＷＣＲＷ活性は、ＡＸＭＩ−Ｒ１の三つの位置で突然変異と結びついている可能性がある（表２）。ＡＸＭＩ−Ｒ１の１５４及び１６０位は、提案されたプロセシング及び孔形成領域にあるが、３１６位は、提案されたレセプター結合領域にある（Li et al, 1991, Nature 353:815-821）。
【０１２４】
実施例４． 組み合わせ変異体：
３１６位の有利な突然変異を１５４及び１６０位の有利な突然変異と組み合わせた変異体を生成させ、プロセシング及びレセプター認識に累積的な改善を提供する突然変異の組み合わせを同定した。表３は、そのような試験の結果を一覧したものであり；バイオアッセイのデータは、組み合わせ突然変異体Ｐ１６０Ｉ；Ｇ３１６Ｔ（Ｈ９＋Ｄ５Ｄ８）及びＰ１６０Ｆ；Ｇ３１６Ｔ（Ｈ４＋Ｄ５Ｄ８）が活性に累積的な改善を提供することを示している。Ｈ９＋Ｄ５Ｄ８をコードするヌクレオチド配列を配列番号７に示し、アミノ酸配列を配列番号８に示す。Ｈ４＋Ｄ５Ｄ８についてのアミノ酸配列を配列番号２６に示す。
【０１２５】
【表３】
【０１２６】
【表４】
【０１２７】
実施例５． 点突然変異体ライブラリー２： ３１６位に隣接する残基
残基３１６における突然変異からＰＭライブラリー１（ＰＭ１）において改善された殺虫活性が生成したと仮定して、配列番号２に関する３１３、３１４、３１５、３１７、及び３１８位について第二の点突然変異ライブラリー（ＰＭライブラリー２、ＰＭ２）を生成させた。このライブラリーは、計算上６１種の変異体という多様性を有する。９２種の変異体をアッセイし、３１６位に隣接する５種の変異体（Ｒ３１５Ｆ、Ｒ３１５Ｍ、Ｒ３１５Ｗ、Ｙ３１７Ｅ、Ｙ３１７Ｎ）は、一次選別で幾分改善を示した。変異体Ｒ３１５Ｍ及びＲ３１５Ｗをスケールアップし、１２５〜２５０μg/mlの範囲のタンパク質濃度でアッセイした。データは、３１５位の変更がＣＲＷに対して改善された活性を生成できることを示している。
【０１２８】
【表５】
【０１２９】
【表６】
【０１３０】
実施例６． 並べ替えライブラリー１
１５４、１５５、１５８及び１６０位をターゲティングする並べ替え突然変異誘発ライブラリーを生成させた。このライブラリー（ライブラリーＰ１；Ｐ１）を、当技術分野で公知のオリゴ特異的突然変異誘発法を用いて生成させ、７６８種の変異体という理論的複雑性を有するライブラリーが生じた。ライブラリーに組み入れられた多様性は、以下の通りである：
【０１３１】
【表７】
【０１３２】
２４ウェル形式で５７３個のクローンを分析し（それぞれ４回の繰り返し）、さらなる試験のために１５５個のクローンを同定した。７３個のクローンを再試験し、最終的にスケールアップ後に８個のクローンを試験した（本明細書に記載）。
【０１３３】
実施例７． ＷＣＲＷ及びＳＣＲＷに及ぼす変異体の死亡率
本明細書記載のスケールアップ実験のために、所望の活性を示すＰ１由来のいくつかの変異体を選択した。結果として生じたタンパク質を、１２５〜２５０μg/mlの範囲のタンパク質濃度で試験した。いくつかの変異体は、これらのアッセイにおいてＷＣＲＷ及びＳＣＲＷを死滅させる能力を示したが、対照タンパク質ＡＸＭＩ−Ｒ１ｗｔは、これらのアッセイにおいてＷＣＲＷにもＳＣＲＷにも致死性を示さなかった。
【０１３４】
最初のセットの実験では、ＣＲＷの卵をウェルに入れ、試料を添加し、５日後にＣＲＷに対する損傷及びＣＲＷの死亡率％（適用可能な場合）をスコア付けした（表６）。平均スコア及び平均死亡率は、ＷＣＲＷについては４０回の繰り返しを、ＳＣＲＷについては２０回の繰り返しをベースとした。データは、変異体ＰｅｒｍｕｔＰ３ｃ６及びＰｅｒｍｕｔＰ３ｃ７がＷＣＲＷに対して８〜９％の死亡率及びＳＣＲＷに対して６０〜８０％の死亡率を与えるが、ＡＸＭＩ−Ｒ１ｗｔは致死性を示さなかったことを示した（表７）。３ｃ７変異体をコードするヌクレオチド配列を配列番号１２に示し、アミノ酸配列を配列番号１３に示す。
【０１３５】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるタンパク質の分析から、ＡＸＭＩ−Ｒ１ｗｔ、３ｃ６、及び３ｃ７の発現レベルが識別不能であり、おそらく同一であることが示される。
【０１３６】
【表８】
【０１３７】
【表９】
【０１３８】
以下の実験では、ＣＲＷの卵をウェルに入れ、試料を添加し、１日後に孵化していない卵を除いた。この方法は、試料の適用から１〜２日以内に試料に遭遇する、より同調した早期孵化ＣＲＷ幼虫集団を与える。これらの条件で、変異体３ｃ７は、ＷＣＲＷに対して４４％の死亡率及びＳＣＲＷに対して８６％の死亡率を達成した（表８）。
【０１３９】
【表１０】
【０１４０】
ＡＸＭＩ−Ｒ１対照に比べて第３の変異体３ａ１１（Ｖ１５５Ｋ；Ｒ１５８Ｇ；Ｐ１６０Ｔ）もまた、ＷＣＲＷに対して死亡を誘導した。この実験では、ＣＲＷの卵をウェルに入れ、試料を添加し、１日後に孵化していない卵を除いた。このアッセイにおいて、３ａ１１に曝露されたルートワームで３６％の死亡率が観察された（表９）。
【０１４１】
【表１１】
【０１４２】
【表１２】
【０１４３】
実施例８． 組み合わせ変異体
３ｃ７（Ｐ１５４Ａ、Ｖ１５５Ｋ、Ｐ１６０Ｖ）と、ライブラリーＰＭ１からの変異体Ｄ５Ｄ８（Ｇ３１６Ｔ）とを組み合わせた変異体を生成させ、ＣＲＷ活性について試験したが、この変異体は、１２５〜２５０μg/mlの範囲のタンパク質濃度でＷＣＲＷ及びＳＣＲＷに対して致死性を示した。３ｃ７＋Ｄ５Ｄ８変異体をコードするヌクレオチド配列を配列番号９に、アミノ酸配列を配列番号１０に示す。
【０１４４】
実施例９． ライブラリーＰＭ２
第二世代の点突然変異ライブラリー（ＰＭ２）を生成させ、４８２及び４８３位における変更を３１５及び３１６位における変更と組み合わせた。このライブラリーは、７５６個の変異体を有する。１１００個を超えるクローンを釣り上げ、活性について試験した。変異体「１ｇ８」（Ｇ３１６Ｅ、Ｑ４８２Ｌ、Ｇ４８３Ｋ）及び「２ｂ１１」（Ｇ３１６Ａ、Ｑ４８２Ｌ、Ｇ４８３Ｋ）は、ＡＸＭＩ−Ｒ１に比べてルートワーム害虫に対して改善された活性を示すことが見出された。変異体１ｇ８は、大部分の場合で３ｃ７よりも優れた活性を示した。１ｇ８変異体をコードするヌクレオチド配列を配列番号１４に、アミノ酸配列を配列番号１５に示す。
【０１４５】
【表１３】
【０１４６】
実施例１０． ライブラリーＰ３
ＡＸＭＩ−Ｒ１の４８１〜４８６位（本明細書において「ループ３」と呼ぶ）に対応する位置における変異体のライブラリー（ライブラリーＰ３）を生成させた。殺虫活性への各残基の寄与を評価するために個別のクローンを試験した。残基４８２及び４８３における変異体がコーンルートワームに対して改善された活性を示したので、これらの残基は活性に寄与することが見出された（表１２）。
【０１４７】
【表１４】
【０１４８】
実施例１１ 組み合わせ変異体
【０１４９】
変異体１ｇ８及び２ｂ１１に見られた変更を３ｃ７における変更と組み合わせたクローンを生成させた。結果として生じたクローンＡＸＭＩ−Ｒ１（３ｃ７＋１ｇ８）及びＡＸＭＩ−Ｒ１（３ｃ７＋２ｂ１１）を試験し、これらのクローンがコーンルートワームに活性を保持することを見出した。特に、ＡＸＭＩ−Ｒ１（３ｃ７＋１ｇ８）は、コーンルートワームに対して３ｃ７単独よりも高い死亡率を示すように見られた。ＡＸＭＩ−Ｒ１（３ｃ７＋２ｂ１１）もまた、一部の試験で３ｃ７単独よりも大きな活性を示すように見られた。
【０１５０】
実施例１２． ＡＸＭＩ−Ｒ１（ＥＶＯ２３）の生成
プロセシング領域についての第二世代の置換ライブラリーをＡＸＭＩ−Ｒ１（１ｇ８）（配列番号１５）にクローニングすることによって、レセプター結合領域に突然変異を有する変異体ＡＸＭＩ−Ｒ１（１ｇ８）に関連してプロセシング領域における多様性を選別することを可能にした。そのライブラリーの多様性は５７３である。変異体（ｎ＝８１３）をスクリーニングし、１６３個のクローンを再アッセイし、４０個の変異体をスケールアップした。ＡＸＭＩ−Ｒ１（ＥＶＯ２３）（配列番号１７）は、そのライブラリーの中で最高の活性を有した。ＡＸＭＩ−Ｒ１（ＥＶＯ２３）をコードするヌクレオチド配列を配列番号１６に示す。ＷＣＲＷに対するＥＶＯ２３の活性を表１３に示す。
【０１５１】
【表１５】
【０１５２】
実施例１３． ドメインＩＩ／ＩＩＩの界面変異体の生成
ａｘｍｉ−Ｒ１のモデル化は、ドメイン２とドメイン３との界面に寄与する三つの領域を同定した。これらの領域は、配列番号２の３３１〜３３５位、３６８〜３７３位、及び５１８〜５２４位に対応する。これらの領域をターゲティングする変異体ライブラリーを生成させた。５１８〜５２４位に対応するライブラリーの多様性は８であった（表１４）。１２個の変異体をスクリーニングし、Ｌ６１Ｅ１１を再アッセイ及びスケールアップした。
【０１５３】
【表１６】
【０１５４】
ＷＣＲＷに対するＬ６１Ｒ１１変異体の活性を表１５に示す。
【０１５５】
【表１７】
【０１５６】
本発明は、本明細書に記載された残基の変更が害虫に対して改善された活性を有する変異体をもたらすことを実証している。本発明において変更された残基の概要を表１６に提供する。
【０１５７】
【表１８】
【０１５８】
実施例１４． 他のＣｒｙタンパク質における進化したＡＸＭＩ−Ｒ１配列の使用：
プロセシング、レセプター結合及び活性を改善するために、有利な突然変異を有するＡＸＭＩ−Ｒ１配列セグメントを他の相同Ｃｒｙタンパク質に挿入することができよう。例えば、プロセシング領域にわたる、進化したＡＸＭＩ−Ｒ１変異体からの配列セグメントを使用して、ａｘｍｉ００８、ａｘｍｉ０２８、及び他のＣｒｙタンパク質における相同領域を交換することができよう。Ｃｒｙタンパク質の３Ｄフォールディングは保存されているので、雑種タンパク質のプロセシング及び効力の改善を達成することができる。これらのＡＸＭＩ−Ｒ１変異体配列のさらなる突然変異誘発により、ホストタンパク質に関連したＡＸＭＩ−Ｒ１変異体配列を適合及び改善することを助けることができる。
【０１５９】
実施例１５． 殺虫活性についての追加的なアッセイ
殺虫タンパク質を産生する能力について本発明のヌクレオチド配列を試験することができる。殺虫タンパク質が害虫に対して殺虫剤として作用する能力は、多くの場合にいくつかの方法で評価される。当技術分野において周知の一方法は、摂食アッセイを行うことである。そのような摂食アッセイでは、被験化合物又は対照試料のいずれかを含有する試料に害虫を曝露する。多くの場合に、これは被験物質又はそのような物質を適切に希釈したものを、害虫が摂取する人工飼料などの物質の上に置くことによって行われる。被験物質は、液体、固体、又はスラリーから構成されることがある。被験物質を、表面上に置き、次に乾燥させることができる。又は、被験物質を溶けた人工飼料と混合し、次にアッセイチャンバーに分注することができる。アッセイチャンバーは、例えば、カップ、ディッシュ、又はマイクロタイタープレートのウェルのことがある。
【０１６０】
吸汁性の害虫（例えばアブラムシ）についてのアッセイは、仕切りで昆虫から被験物質を、理想的には吸汁性昆虫の吸汁口部分で突き刺すことのできる部分を分離して、被験物質を摂取させることを伴うことがある。多くの場合に被験物質をスクロースなどの摂食刺激剤と混合し、被験化合物の摂取を促進する。
【０１６１】
他の種類のアッセイには、害虫の口又は腸管への被験物質のマイクロインジェクション、さらにはトランスジェニック植物の開発に続き、その害虫がそのトランスジェニック植物を摂食する能力の試験が含まれうる。植物試験は、通常は消費される植物部分の隔離、例えば葉に小さなケージを取り付けること、又は昆虫の入ったケージに植物全体を隔離することを伴うことがある。
【０１６２】
害虫をアッセイするための他の方法及びアプローチは、当技術分野において公知であり、例えばRobertson and Preisler、eds. (1992) Pesticide bioassays with arthropods、CRC、Boca Raton、FLに見出すことができる。又は、アッセイは、雑誌Arthropod Management Tests及びJournal of Economic Entomologyに、又はEntomological Society of America（ＥＳＡ）の会員との議論によって通例説明される。
【０１６３】
実施例１６． 植物発現用遺伝子のベクター化
本発明のコード領域を、植物において発現させるために適切なプロモーター及びターミネーター配列と接続する。そのような配列は当技術分野において周知であり、それらには、単子葉植物における発現用のイネアクチンプロモーター又はトウモロコシユビキチンプロモーター、双子葉植物における発現用のArabidopsis ＵＢＱ３プロモーター又はＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター、及びｎｏｓ又はＰｉｎＩＩターミネーターが含まれる。プロモーター−遺伝子−ターミネーター構築物を産生及び確認するための技法もまた、当技術分野において周知である。
【０１６４】
本発明の一局面では、合成ＤＮＡ配列が設計及び生成される。これらの合成配列は、親配列に比べて変更されたヌクレオチド配列を有するが、親配列と本質的に同一なタンパク質をコードする。
【０１６５】
本発明の別の態様では、結果として生じるペプチドが小胞体又はアポプラストなどの植物オルガネラにターゲティングされるように、改変版の合成遺伝子が設計される。植物オルガネラへの融合タンパク質のターゲティングを招くことが知られているペプチド配列は、当技術分野において公知である。例えば、シロバナルーピンLupinus albus（GENBANK（登録商標）ＩＤ ＧＩ：１４２７６８３８、Miller et al. (2001) Plant Physiology 127: 594-606）由来の酸性ホスファターゼ遺伝子のＮ末端領域は、異種タンパク質の小胞体ターゲティングを招くことが当技術分野において公知である。結果として生じた融合タンパク質が、また、Ｃ末端にペプチドＮ末端−リシン−アスパラギン酸−グルタミン酸−ロイシン（すなわち、「ＫＤＥＬ」モチーフ、配列番号１１）を含む小胞体保留配列を有する場合、その融合タンパク質は、小胞体にターゲティングされる。融合タンパク質がＣ末端に小胞体ターゲティング配列を欠如する場合、タンパク質は小胞体にターゲティングされるが、最終的にアポプラストに隔離される。
【０１６６】
したがって、この遺伝子は、本発明のアミノ酸配列のＮ末端に融合したシロバナルーピンLupinus albus（GENBANK（登録商標）ＩＤ ＧＩ：１４２７６８３８、Miller et al., 2001、上記）由来の酸性ホスファターゼ遺伝子の３１個のＮ末端アミノ酸及びＣ末端のＫＤＥＬ配列を有する融合タンパク質をコードする。したがって、結果として生じたタンパク質は、植物細胞に発現した場合、植物小胞体にターゲティングされると予測される。
【０１６７】
上記植物発現カセットは、トランスフォーメーションされた細胞及び組織の選択を助けるために適切な植物選択マーカーと組み合わされ、植物トランスフォーメーションベクターにライゲーションされる。これらには、Agrobacterium介在性トランスフォーメーションからのバイナリーベクター又はエアロゾル若しくはバイオリスティックトランスフォーメーション用の単純なプラスミドベクターが含まれうる。
【０１６８】
実施例１７． 本明細書記載の殺虫タンパク質遺伝子を有するトウモロコシ細胞のトランスフォーメーション
トウモロコシ穂を最良には受粉の８〜１２日後に収集する。穂から胚を単離し、大きさが０．８〜１．５mmの胚がトランスフォーメーションに使用するために好ましい。ＤＮ６２Ａ５Ｓ培地（３．９８g/L Ｎ６塩類；１mL/L（１０００×原液使用）Ｎ６ビタミン類；８００mg/L Ｌ−アスパラギン；１００mg/Lミオイノシトール；１．４ g/L Ｌ−プロリン；１００mg/Lカザミノ酸；５０g/Lスクロース；１mL/L（１mg/mL原液使用）２，４−Ｄ）などの適切なインキュベーション培地上にその胚を胚盤側を上にして蒔く。しかしながら、ＤＮ６２Ａ５Ｓ以外の培地及び塩類は、当技術分野において適切かつ公知である。胚を２５℃の暗条件で一晩インキュベーションする。しかしながら、胚を一晩インキュベーションすること自体は必要ない。
【０１６９】
結果として生じた外植片を正方形のメッシュに移植し（プレート１枚あたり３０〜４０個）、浸透圧培地上に約３０〜４５分間移植し、次にビーミングプレート（beaming plate）に移植する（例えば、ＰＣＴ公報WO/0138514及び米国特許第５，２４０，８４２号を参照されたい）。
【０１７０】
植物細胞における本発明の遺伝子に設計されたＤＮＡ構築物を、エアロゾルビームアクセレレーターを使用して、ＰＣＴ公報ＷＯ／０１３８５１４に本質的に記載されたような条件を用いて植物組織中に加速する。ビーム処理の後で、胚を浸透圧培地上で約３０分間インキュベーションし、２５℃の暗条件でインキュベーション培地上に一晩蒔く。ビーム処理された外植片を過度に損傷することを避けるために、回復培地に移植する前にそれらを少なくとも２４時間インキュベーションする。次に、胚を２５℃の暗条件で約５日間回復期培地上に広げ、次に選択培地に移植する。利用される特定の選択の性質及び特徴に応じて外植片を最大８週間選択培地中でインキュベーションする。選択期間の後に、結果として生じたカルスを成熟体細胞胚の形成が観察されるまで胚成熟培地に移植する。次に、結果として生じた成熟体細胞胚を低光量下に置き、当技術分野において公知の方法によって再生過程を開始させる。結果として生じたシュートを発根培地上で発根させ、結果として生じた植物を育苗ポットに移植し、トランスジェニック植物として繁殖させる。
【０１７１】
材料
【０１７２】
【表１９】
【０１７３】
溶液のｐＨを１Ｎ ＫＯＨ／１Ｎ ＫＣｌでｐＨ５．８に調整し、Gelrite（Sigma）を最大３g/Lの濃度で添加し、培地をオートクレーブにかける。５０℃に冷却後に、硝酸銀（Phytotechnology Labs）の５mg/ml原液を２ml/Lとなるように添加する。
【０１７４】
実施例１８． Agrobacterium介在性トランスフォーメーションによる植物細胞における本発明の遺伝子のトランスフォーメーション
穂を最良には受粉の８〜１２日後に収集する。穂から胚を単離し、大きさが０．８〜１．５mmの胚がトランスフォーメーションに使用するために好ましい。適切なインキュベーション培地上にその胚を胚盤側を上にして蒔き、２５℃の暗条件で一晩インキュベーションする。しかしながら、胚を一晩インキュベーションすること自体は必要ない。胚を、Ｔｉプラスミド介在性伝達のために適切なベクターを有するAgrobacterium株と約５〜１０分間接触させ、次に共培養培地上に約３日間（２５℃の暗条件）蒔く。共培養後に、外植片を回復期培地に約５日間（２５℃の暗条件）移植する。利用する特定の選択の性質及び特徴に依存して、外植片を選択培地中で最大８週間インキュベーションする。選択期間の後に、結果として生じたカルスを成熟体細胞胚の形成が観察されるまで胚成熟培地に移植する。次に、結果として生じた成熟体細胞胚を低光量下に置き、当技術分野で公知のような再生過程を開始させる。
【０１７５】
本明細書において言及された全ての刊行物及び特許出願は、本発明が属する技術分野の技術者の技術レベルを示している。全ての刊行物及び特許出願は、各個別の刊行物又は特許出願が具体的かつ個別に参照により組み入れられると示された場合と同程度に参照により本明細書に組み入れられる。
【０１７６】
理解を明瞭にするために、前述の発明を例証及び実例として幾分詳細に説明したものの、添付の特許請求の範囲内である変化又は改変を実施できることが明らかである。
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、分子生物学の分野に関する。殺虫タンパク質をコードする新規な遺伝子が提供される。これらのタンパク質及びそれらをコードする核酸配列は、殺虫製剤の調製及びトランスジェニック害虫抵抗性植物の産生に有用である。
【０００２】
発明の背景
Bacillus thuringiensis（Ｂｔ）は、ある目及び種の昆虫に特異的に毒性であるが、植物及び他のターゲティングされていない生物に無害な結晶状封入体を産生する能力を特徴とするグラム陽性芽胞形成土壌細菌である。この理由から、Bacillus thuringiensis株又はそれらの殺虫タンパク質を含む組成物は、多様なヒト又は動物疾患についての農業害虫又は媒介昆虫を防除する、環境的に許容されうる殺虫剤として使用することができる。
【０００３】
Bacillus thuringiensis由来結晶性（Ｃｒｙ）タンパク質（δ−エンドトキシン）は、主にLepidoptera、Diptera、及びColeoptera幼虫に対して強力な殺虫活性を有する。これらのタンパク質は、また、Hymenoptera、Homoptera、Phthiraptera、Mallophaga、及びAcari目の害虫、ならびにNemathelminthes、Platyhelminthes、及びSarcomastigorphora目などの他の無脊椎動物に対して活性を示した（Feitelson (1993) The Bacillus Thuringiensis family tree. In Advanced Engineered Pesticides, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y.）。元々これらのタンパク質は、主にその殺虫活性に基づきＣｒｙＩ〜ＣｒｙＶと分類された。主な種類は、Lepidoptera特異的（Ｉ）、Lepidoptera及びDiptera特異的（ＩＩ）、Coleoptera特異的（ＩＩＩ）、Diptera特異的（ＩＶ）、ならびに線虫特異的（Ｖ）及び（ＶＩ）であった。タンパク質は、さらにサブファミリーに分類され、各ファミリー内のより高度に関連したタンパク質にＣｒｙ１Ａ、Ｃｒｙ１Ｂ、Ｃｒｙ１Ｃなどの部門別文字が割り当てられた。各部門内のさらに近縁のタンパク質は、Ｃｒｙ１Ｃ１、Ｃｒｙ１Ｃ２などの名称を与えられた。
【０００４】
近年、昆虫ターゲット特異性よりもむしろアミノ酸配列相同性に基づいて、Ｃｒｙ遺伝子についての新しい命名が記載された（Crickmore et al. (1998) Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62:807-813）。この新しい分類では、各毒素は、第一階級（アラビア数字）、第二階級（大文字）、第三階級（小文字）、及び第四階級（別のアラビア数字）を組み入れた独自の名称が割り当てられる。新しい分類では、第一階級のローマ数字がアラビア数字に交換された。４５％未満の配列同一性を有するタンパク質は、異なる第一階級を有し、第二及び第三階級についての基準は、それぞれ７８％及び９５％である。
【０００５】
結晶状タンパク質は、昆虫の中腸に摂取され可溶化されるまで殺虫活性を示さない。摂取されたプロ毒素は、昆虫の消化管の中でプロテアーゼによって活性毒素分子に加水分解される。（Hofte and Whiteley (1989) Microbiol. Rev. 53:242-255）。この毒素は、ターゲット幼虫の中腸内で管腔側刷子縁レセプターに結合し、頂端膜内に挿入され、イオンチャネル又は小孔を作り、幼虫の死滅をもたらす。
【０００６】
δ−エンドトキシンは、一般に５個の保存された配列ドメイン及び３個の保存された構造ドメインを有する（例えば、de Maagd et al. (2001) Trends Genetics 17:193-199参照）。第１の保存された構造ドメインは、７個のαヘリックスから成り、膜内挿入及び孔形成に関与する。ドメインＩＩは、ギリシャキー立体配置にされた３個のβシートから成り、ドメインＩＩＩは、「ゼリーロール」構成の２個の逆平行βシートから成る（de Maagd et al., 2001、上記）。ドメインＩＩ及びＩＩＩは、レセプターの認識及び結合に関与し、それゆえに毒素の特異性の決定因子と見なされる。
【０００７】
Ｃｒｙ３型δエンドトキシンは、１９８０年代初期に最初に同定された。Ｃｒｙ３Ａａ１ δエンドトキシン（以前はｃｒｙＣ及びｃｒｙＩＩＩＡとしても知られている）は、以前にBacillus thuringiensis var san diego（Herrnstadt et al. (1987) Gene. 57:37-46）、Bacillus thuringiensis tenebrionis（Hofte et al. (1987) Nucleic acids Res. 15: 7183; McPherson et al. (1988) Bio/Technology 6:61-66; Sekar et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7036-7040）及びＥＧ２１５８（Donovan et al. (1988) Mol Gen Genet. 214(3):365-72）株から単離された。
【０００８】
Ｃｒｙ３Ａａは、多くの場合にある種のネイティブなBacillus株における菱形結晶の主成分として観察され、７２kDaタンパク質として産生され、そのタンパク質は続いて芽胞形成関連プロテアーゼによるタンパク質分解性プロセシングによって６６kDa毒素にプロセシングされる。この６６kDAタンパク質は、Coleopteraのコロラドハムシ（Colorado Potato Beetle）に活性を及ぼすことが知られている。
【０００９】
昆虫が与えうる破壊、及び害虫を防除することによる収量改善の理由で、新しい形の殺虫毒素を発見する継続的な必要性がある。
【００１０】
発明の概要
細菌、植物、植物細胞、組織及び種子に殺虫活性を付与するための組成物及び方法が提供される。組成物には、殺虫及び農薬ポリペプチドについての配列をコードする核酸分子、それらの核酸分子を含むベクター、ならびにそのベクターを含むホスト細胞が含まれる。組成物には、また、殺虫ポリペプチド配列及びそれらのポリペプチドに対する抗体が含まれる。ヌクレオチド配列は、微生物及び植物を含めた生物にトランスフォーメーション及び発現させるための、ＤＮＡ構築物又は発現カセットに使用することができる。ヌクレオチド又はアミノ酸配列は、非限定的に微生物又は植物を含めた生物における発現のために設計された合成配列のこともある。組成物は、また、トランスフォーメーションされた細菌、植物、植物細胞、組織、及び種子を含む。
【００１１】
特に、殺虫タンパク質をコードする単離された核酸分子が提供される。追加的に、殺虫タンパク質に対応するアミノ酸配列が包含される。特に本発明は、変異ＣＲＹ３をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子を提供する。本発明のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列、又は本発明の配列にハイブリダイゼーションするヌクレオチド配列もまた包含される。
【００１２】
本発明のポリペプチドを産生させる方法、及びLepidoptera、Coleoptera、線虫、又はDiptera害虫を防除又は殺滅するためにそれらのポリペプチドを使用する方法が提供される。試料中の本発明の核酸及びポリペプチドを検出するための方法及びキットもまた含まれる。
【００１３】
本発明の組成物及び方法は、害虫抵抗性又は寛容性が高められた生物の産生に有用である。これらの生物及びそれらの生物を含む組成物は、農業目的に望ましい。本発明の組成物は、また、殺虫活性を有する、変更若しくは改善されたタンパク質を生成させるために、又は産物若しくは生物中の殺虫タンパク質若しくは核酸の存在を検出するために有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】注釈付きＡＸＭＩ−Ｒ１配列（配列番号２）を示す図である。下線の領域は、ループ領域（Ｌ１、Ｌ２及びＬ３）を表す。縦棒は、ドメインＩ（ＤＩ）、ドメインＩＩ（ＤＩＩ）、及びドメインＩＩＩ（ＤＩＩＩ）の間の境界を表す。矢印は、変異の生成のためにターゲティングされた領域のいくつかを示す。
【図２】Ａｘｍｉ１６４（配列番号１３）、Ａｘｍｉ１６１（配列番号４４）、Ａｘｍｉ１５２（配列番号４５）、Ａｘｍｉ１５１（配列番号２６）、Ａｘｍｉ１４６（配列番号２７）、Ａｘｍｉ１４１（配列番号２８）、Ａｘｍｉ１２９（配列番号２９）、Ａｘｍｉ１２８（配列番号３０）、Ａｘｍｉ１２７（配列番号３１）、Ａｘｍｉ１２０（配列番号３２）、Ａｘｍｉ１１６（配列番号３３）、Ａｘｍｉ１１４（配列番号３４）、Ａｘｍｉ１０１（配列番号３５）、Ａｘｍｉ０９１（配列番号３６）、Ａｘｍｉ０８７（配列番号３７）、Ａｘｍｉ０３７（配列番号３８）、Ａｘｍｉ０２９（配列番号３９）、Ａｘｍｉ０２８（配列番号４０）、Ｃｒｙ８Ｂｂ１（配列番号４１）、Ｃｒｙ８Ｂｃ１（配列番号４２）、Ｃｒｙ７Ａａ（配列番号４３）、ＡｘｍｉＲ１ＰｅｒｍｕｔＰ３ｃ７（ｅｖｏ２１）（配列番号１３）、及びＡｘｍｉ−Ｒ１（配列番号２）のアライメントを示す図である。
【００１５】
詳細な説明
本発明は、生物における、特に植物又は植物細胞における害虫抵抗性又は寛容性を調節するための組成物及び方法を対象とする。「抵抗性」とは、本発明のポリペプチドを摂取したとき、又はそれと他の接触をしたときに、害虫（例えば昆虫）が死滅することが意図される。「寛容性」とは、害虫の運動、摂食、生殖、又は他の機能の障害又は減退が意図される。その方法は、本発明の殺虫タンパク質をコードするヌクレオチド配列を生物にトランスフォーメーションすることを伴う。特に、本発明のヌクレオチド配列は、殺虫活性を有する植物及び微生物を調製するために有用である。したがって、トランスフォーメーションされた細菌、植物、植物細胞、植物組織及び種子が提供される。
【００１６】
本明細書に提供されるのは、変異Ｃｒｙ３アミノ酸配列をコードする核酸配列を含む組成物であって、ここで、その変異体は殺虫活性、特にColeoptera害虫に対する殺虫活性を有する。「変異Ｃｒｙ３」アミノ酸配列とは、天然Ｃｒｙ３アミノ酸配列以外のＣｒｙ３配列が意図され、ここで、そのアミノ酸配列は、表１６に示される置換に対応する１個又は複数個のアミノ酸置換を有する。Ｃｒｙ３配列の一覧については、Crickmore et al. (1998), Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62:807-813を、定期的な更新についてはwww.biols.susx.ac.uk/Home/Neil_Crickmore/Bt/indexのCrickmore et al. (2003) "Bacillus thuringiensis toxin nomenclature"を参照されたい。
【００１７】
いくつかの態様では、天然又は「野生」Ｃｒｙ３配列は、配列番号１に示されるＡｘｍｉ−Ｒ１ヌクレオチド配列であり、その配列は、配列番号２に示されるアミノ酸配列をコードする。ＡＸＭＩ−Ｒ１配列は、GENBANK（登録商標）アクセッション番号Ｐ０Ａ３７９に記載されたｃｒｙ３Ａａ配列に対応する。しかしながら、表１６に記載された置換を、任意のＣｒｙ３Ａ、Ｃｒｙ３Ｂ、又はＣｒｙ３Ｃタンパク質などの任意のＣｒｙ３タンパク質の対応する位置に行うことができる。「対応する位置」は、配列番号２を有するターゲット配列をアライメントすることによって決定することができる。例えば図２に示すアライメントを参照されたい。
【００１８】
ｃｒｙ３Ａａタンパク質の結晶構造は、以前に決定された（Li et al, 1991, Nature 353:815-821）。この結晶構造は、様々なループ領域を明確化し、タンパク質の三次元構造に関してタンパク質分解性プロセシングの部位を示している。この構造は、その毒素が、他のδ−エンドトキシン配列の構造に一致する３個のドメイン（典型的にはドメインＩ、ＩＩ、及びＩＩＩと呼ばれる）に配置されることを示唆している。毒素の各ドメインは、結晶構造に基づいて定義されるループ領域を有する。この結晶構造の公表前に及び公表以来、Ｂｔエンドトキシン、特にｃｒｙ３型エンドトキシンの毒性の構造及び機能、ならびにこの活性に果たすタンパク質分解の役割に関する広範で簡単な規則を説明するために多数の試みがなされてきた。
【００１９】
例えば、Van Rieら、1997（米国特許第５，６５９，１２３号）は、毒性にマイナスの影響を与える位置を同定し、続いてこれらのループ内のある位置でアミノ酸をランダム置換することで、ドメインＩＩの改変を「ループ」と見なされる区域で行うことによる、毒性改善を導くアミノ酸の同定を示唆している。同様に、Wu及びDean（J.Mol. Biol., 1996, 255: 628-640）によるループＩＩ残基へのランダムなアラニン挿入は、タンパク質の機能を減退させた。Wuら（Febs Letters, 2000, 473:227-232）によるループＩの残基のランダム変異誘発は、大部分の場合で不安定なタンパク質及び減退したタンパク質機能を招き、二つの場合で毒性増加及び結合性の変更を有するタンパク質を回収したことが報告された。ｃｒｙ３Ｂｂ毒素について（Englishら、米国特許第６，０２３，０１３号、RE39,580として再交付）、その毒素におけるある置換がコーンルートワーム（corn rootworm）に対する活性改善を導いたが、大部分の場合でこれらの変更が、Van Rieによって示唆された残基又はWu及びDeanによって研究された残基とは異なる残基で起こったことが報告された。
【００２０】
加えて、Coleoptera、特にウエスタンコーンルートワーム（western corn rootworm）に及ぼすｃｒｙ３Ａの活性を改善しようと、トリプシン又はキモトリプシン様プロテアーゼによって普通は切断されるｃｒｙ３Ａ毒素の領域に改変が加えられた。Chenら（米国特許第７，０３０，２９５号）は、タンパク質の特異的位置での「カテプシンＧ切断部位」（又は「キモトリプシン／カテプシンＧ切断部位」; Walters et al, 2008, Applied and Environ. Micro. 74: 367-374）として記載された合成テトラペプチドＡＡＰＦ（配列番号２０）の挿入が、改善されたｃｒｙ３Ａ活性を導きうることを報告している。
【００２１】
ｃｒｙ３Ａのトリプシン切断は、当技術分野において周知であり、ネイティブなｃｒｙ３ＡペプチドのおよそＲ１５８−Ｎ１５９の領域に自然に生じることが示されている（Carroll et al 1989 Biochem J. 261:99-105）。さらにキモトリプシンは、この領域のＨｉｓ１６１−Ｓｅｒ１６２接合部で切断することが知られている（Carroll et al 1997 J Invert. Biol. 70: 41-49）。Waltersら（2008）は、改変Ｃｒｙ３Ａ（キモトリプシン／カテプシンＧプロテアーゼ認識部位を有する「ｍＣｒｙ３Ａ」）がこの領域のそのネイティブな位置（Ｈｉｓ１６１−Ｓｅｒ１６２接合部）でキモトリプシンによって切断されることを示した。Ｃｒｙ３Ａのこの領域における天然アミノ酸配列の突然変異誘発がColeoptera害虫に改善された殺虫活性を招くという報告はない。
【００２２】
したがって本発明は、対応する野生配列に比べて改善された殺虫活性を有する変異Ｃｒｙ３配列を提供する。様々な態様では、変異Ｃｒｙ３殺虫配列は、ＡＸＭＩ−Ｒ１の殺虫活性に比べて改善された殺虫活性を有する。「改善された活性」とは、死亡率の増加、摂食減退、又はターゲット害虫の成長減退が意図される。活性の改善は、野生配列、例えば、ＡＸＭＩ−Ｒ１の活性に比べて、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約１００％、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、又はそれよりも大きな活性増加である。いくつかの態様では、ターゲット害虫は、Coleoptera害虫である。
【００２３】
いくつかの態様では、本明細書に包含される殺虫配列は、配列番号１に示されるａｘｍｉ−Ｒ１配列の変異体を含む。「ａｘｍｉ−Ｒ１の変異体」とは、１個又は複数個の突然変異がＡＸＭＩ−Ｒ１配列のある領域（すなわち「ターゲット突然変異領域」）内に導入された、ＡＸＭＩ−Ｒ１に対応するヌクレオチド又はアミノ酸配列が意図される。特に規定しない限り、ターゲット突然変異領域外のアミノ酸領域は、ＡＸＭＩ−Ｒ１配列と同一である。同一の領域は、同一のアミノ酸配列、又は同一のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列のいずれかである。ヌクレオチド配列が、野生ヌクレオチド配列と異なろうとも、それでも遺伝コードの縮重のせいでまだ野生アミノ酸配列をコードしうることが理解されよう。
【００２４】
他の態様では、Ｃｒｙ３のターゲット突然変異領域は、Liら（1991, Nature 353:815-821、その全体で、特にｃｒｙ３Ａａタンパク質構造の記載に関して、参照により本明細書に組み入れられる）に記載された、提案されたプロセシング・孔形成領域に対応する。様々な態様では、ターゲット突然変異領域は、配列番号２の４８０〜４９０位及び５１０〜５３０位のアミノ酸に対応する。いくつかの態様では、変異Ｃｒｙ３配列は、最大で表１６に記載された全位置での突然変異までの表１６に挙げられた任意の突然変異の組み合わせを含めた、表１６に記載された１個又は複数個の突然変異を有する。
【００２５】
いくつかの態様では、本発明の変異Ｃｒｙ３配列は、配列番号２の１５８、４８２、４８３、及び５１９位に対応するアミノ酸位置より選択される１個又は複数個の置換を有する。別の態様では、変異Ｃｒｙ３配列は、次の置換を有さない：Ｐ１５４Ｈ、Ｖ１５５Ｈ、Ｒ３１５Ｗ、Ｒ３１５Ｄ、Ｒ３１５Ｍ、Ｒ３１５Ｌ、Ｇ３１６Ｋ、Ｇ３１６Ｎ、Ｇ３１６Ｖ、又はＧ３１６Ａ。なお別の態様では、本発明の変異Ｃｒｙ３配列は、米国特許第６，０２３，０１３号の表２に挙げられた突然変異の組み合わせを全く有さない。
【００２６】
別の態様では、変異Ｃｒｙ３配列は、配列番号６、８、１０、１３、１５、１７、１９、及び２１〜４３から成る群より選択される。なお別の態様では、本明細書に包含される変異Ｃｒｙ３配列は、プロセシング・孔形成領域における１個又は複数個の突然変異ならびにレセプター結合領域における１個又は複数個の突然変異から成る。本明細書に包含される変異体は、野生Ｃｒｙ３の殺虫活性に比べて改善された殺虫活性を有する。いくつかの態様では、改善された殺虫活性は、Coleoptera害虫、例えばルートワーム（rootworm）害虫に対する。
【００２７】
本発明の変異Ｃｒｙ３配列は、当技術分野において記載された１個又は複数個のＣｒｙ３突然変異を導入するためにさらに改変することができる。例えば、本明細書に包含される変異ＡＸＭＩ−Ｒ１配列は、米国特許第５，６５９，１２３号及び第６，０２3,013号；Wu及びDean（J.Mol. Biol., 1996, 255: 628-640）；若しくはWuら（Febs Letters, 2000, 473:227-232）に記載された１個若しくは複数個の突然変異、又はその任意の組み合わせ、及び表１６に挙げられた１個又は複数個の置換を含みうる。また、変異ＡＸＭＩ−Ｒ１配列は、（例えばネイティブなキモトリプシン又はトリプシン切断部位又はその近くに）上述のような１個又は複数個のカテプシンＧ切断部位の挿入を含むことがある。
【００２８】
本発明のなお別の態様では、表１６に記載された突然変異を、ＡＸＭＩ−Ｒ１に相同性を有する任意のアミノ酸配列の対応する位置に導入して、関心が持たれる害虫、特にルートワーム害虫などのColeoptera害虫に対する毒性を導入又は改善することができる。例えば、図２においてＡＸＭＩ−Ｒ１とアライメントされたアミノ酸配列、又は例えばGENBANK（登録商標）アクセッション番号Ｐ０Ａ３７９．１、ＡＡＡ２２３３６．１、ＡＡＡ２２５４２．１、ＡＡＳ７９４８７．１、ＡＡＵ２９４１１．１、ＡＡＷ８２８７２．１、ＡＡＡ７３１８４．１、ＣＡＡ５１９９６．１、１ＤＬＣ＿Ａ、Ｑ４５７４４．１、Ｑ０６１１７．１、ＡＡＡ７４１９８．１、Ｐ１７９６９．１に示された相同アミノ酸配列を参照されたい。相同アミノ酸配列を、本明細書に記載されたアライメントプログラムの一つを使用してアライメントして、突然変異についての対応する位置を同定することができる。又は、相同アミノ酸配列の結晶構造又はそれの他の三次元表示をＣｒｙ３Ａの結晶構造に重ね合わせ（Li et al. 1991, Nature 353:815-821に記載）、対応する位置をアライメントすることができる。Ｃｒｙ３Ｂタンパク質の結晶構造は、米国特許第６，０２３，０１３号に記載されている。
【００２９】
その配列は、関心が持たれる生物にその後トランスフォーメーションするための発現ベクターの構築に、他の相同（又は部分相同）遺伝子を単離するためのプローブとして、そしてドメインスワッピング又はＤＮＡシャフリングなどの当技術分野で公知の方法による変更された殺虫タンパク質の生成のために、用途をもつ。タンパク質は、Lepidoptera、Coleoptera、Diptera、及び線虫害虫集団の防除又は殺滅に、そして殺虫活性を有する組成物の産生のために、用途をもつ。
【００３０】
「殺虫毒素」又は「殺虫タンパク質」とは、非限定的にLepidoptera、Diptera、及びColeoptera目、若しくはNematoda門のメンバーを含めた１種類若しくは複数種類の害虫に対して毒性活性を有する毒素、又はそのようなタンパク質との相同性を有するタンパク質が意図される。殺虫タンパク質は、例えば、Bacillus sp.、Clostridium bifermentans及びPaenibacillus popilliaeを含めた生物から単離された。殺虫タンパク質には、本明細書に開示された完全長ヌクレオチド配列から推定されるアミノ酸配列、及び代替的な下流開始部位の使用又は殺虫活性を有するさらに短いタンパク質を産生するプロセッシングのいずれかが原因で完全長配列よりも短いアミノ酸配列が含まれる。プロセッシングは、そのタンパク質が発現される生物又はそのタンパク質を摂取後の害虫において起きることがある。
【００３１】
単離された核酸分子、ならびにその変異体及びフラグメント
本発明の一局面は、殺虫タンパク質及びポリペプチド又はその生物学的に活性な部分をコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子又はリコンビナント核酸分子、及び配列相同領域を有するタンパク質をコードする核酸分子を同定するためのハイブリダイゼーションプローブとして使用するために十分な核酸分子に関する。本明細書に使用されるような「核酸分子」という用語には、ＤＮＡ分子（例えばリコンビナントＤＮＡ、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ）及びＲＮＡ分子（例えばｍＲＮＡ）ならびにヌクレオチドアナログを使用して生成したＤＮＡ又はＲＮＡのアナログが含まれることが意図される。核酸分子は、１本鎖又は２本鎖でありうるが、好ましくは２本鎖ＤＮＡである。
【００３２】
「単離された」又は「リコンビナント」核酸配列（又はＤＮＡ）は、本明細書において、もはやその自然環境にない、例えばインビトロ又はリコンビナントの細菌又は植物ホスト細胞中の、核酸配列（又はＤＮＡ）を表すために使用される。いくつかの態様では、単離された核酸又はリコンビナント核酸は、その核酸が得られた生物のゲノムＤＮＡ中の核酸に自然に隣接する配列（好ましくはタンパク質をコードする配列）（すなわちその核酸の５’及び３’末端に位置する配列）を有さない。本発明のために、核酸分子を表すために使用される場合の「単離された」は、単離された染色体を除外する。例えば様々な態様では、核酸分子をコードする単離されたδ−エンドトキシンは、その核酸が得られた細胞のゲノムＤＮＡ中の核酸分子に自然に隣接する約５kb、４kb、３kb、２kb、１kb、０．５kb、又は０．１kb未満のヌクレオチド配列を有しうる。様々な態様では、細胞性物質を実質的に有さないδ−エンドトキシンタンパク質には、約３０％、２０％、１０％、又は５％（乾燥重量あたり）未満の非δ−エンドトキシンタンパク質（本明細書において「混入タンパク質」と呼ばれる）を有するタンパク質調製物が含まれる。
【００３３】
本発明のタンパク質をコードするヌクレオチド配列には、Ｃｒｙ３変異体をコードするヌクレオチド配列、及びそのフラグメント及び相補体が含まれる。「相補体」とは、所与のヌクレオチド配列にハイブリダイゼーションできるように十分に所与のヌクレオチド配列に相補的なことによって安定な二重鎖を形成するヌクレオチド配列が意図される。
【００３４】
殺虫タンパク質をコードするこれらのヌクレオチド配列のフラグメントである核酸分子もまた、本発明によって包含される。「フラグメント」とは、殺虫タンパク質をコードするヌクレオチド配列の部分が意図される。ヌクレオチド配列のフラグメントは、殺虫タンパク質の生物学的活性部分をコードしうるか、又は下記に開示される方法を用いてハイブリダイゼーションプローブ又はＰＣＲプライマーとして使用することのできるフラグメントでありうる。殺虫タンパク質をコードするヌクレオチド配列のフラグメントである核酸分子は、意図された使用に応じて少なくとも約５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１３５０、１４００個の連続ヌクレオチドを含むか、又は最大で本明細書に開示された殺虫タンパク質をコードする完全長ヌクレオチド配列に存在する数のヌクレオチドを含む。「連続」ヌクレオチドとは、相互に直接隣接するヌクレオチド残基が意図される。本発明のヌクレオチド配列のフラグメントは、殺虫タンパク質の生物学的活性を保持するタンパク質フラグメントをコードするので、殺虫活性を保持する。「活性を保持する」とは、そのフラグメントが、参照殺虫タンパク質（すなわち、本明細書に開示された殺虫性変異Ｃｒｙ３配列）の少なくとも約３０％、少なくとも約５０％、少なくとも約７０％、８０％、９０％、９５％又はそれよりも高い殺虫活性を有することが意図される。一態様では、殺虫活性は、殺Coleoptera害虫活性である。殺虫活性を測定するための方法は、当技術分野において周知である。例えば、全てがその全体で参照により本明細書に組み入れられるCzapla and Lang (1990) J. Econ. Entomol. 83:2480-2485; Andrews et al. (1988) Biochem. J. 252:199-206; Marrone et al. (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293；及び米国特許第５，７４３，４７７号を参照されたい。
【００３５】
本発明のタンパク質の生物学的活性部分をコードする殺虫タンパク質をコードするヌクレオチド配列のフラグメントは、少なくとも約１５、２５、３０、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０個の連続アミノ酸をコードするか、又は最大で本発明の完全長殺虫タンパク質に存在する全アミノ酸数をコードする。いくつかの態様では、フラグメントは、タンパク質分解性切断のフラグメントである。例えば、タンパク質分解性切断のフラグメントは、配列番号２に比べてＮ末端の少なくとも約１００個のアミノ酸、約１２０、約１３０、約１４０、約１５０、又は約１６０個のアミノ酸が短縮していることがある。様々な態様では、タンパク質分解性切断のフラグメントは、それぞれ配列番号２のそれぞれアミノ酸１５８−１５９位又は１６０−１６１位に対応するネイティブなトリプシン又はキモトリプシン切断部位に対応することがあるか、又はWalters et al, 2008, Applied and Environ. Micro. 74: 367-374に記載されたカテプシンＧ切断部位などの任意の人工的に挿入された切断部位に対応することがある。
【００３６】
本発明の好ましい殺虫タンパク質は、本明細書に包含される変異Ｃｒｙ３配列に十分に同一なヌクレオチド配列によってコードされる。「十分に同一な」とは、標準的なパラメーターを用いて本明細書に記載されたアライメントプログラムの一つを使用して、参照配列（例えば、ネイティブな若しくは変異のＣｒｙ３Ａ、Ｃｒｙ３Ｂ、若しくはＣｒｙ３Ｃ配列を含めた、ネイティブな若しくは変異のＣｒｙ３配列、又は配列番号２、６、８、１０、１３、１５、１７、１９、及び２１〜４３より選択される配列、又はこれらのネイティブな若しくは変異のＣｒｙ３タンパク質配列のいずれかをコードするヌクレオチド配列）に比べて少なくとも約６０％又は６５％の配列同一性、約７０％又は７５％の配列同一性、約８０％又は８５％の配列同一性、約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも大きな配列同一性を有するアミノ酸又はヌクレオチド配列が意図される。当業者は、コドンの縮重、アミノ酸類似性、リーディングフレームの位置決めを考慮することによってこれらの値を適切に調整して、二つのヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質の対応する同一性を決定することができることを認識している。
【００３７】
二つのアミノ酸配列又は二つの核酸の同一率を決定するために、それらの配列は、最適比較の目的でアライメントされる。二つの配列の間の同一率は、配列によって共有される同一位置数の関数である（すなわち同一率＝同一位置数／合計位置数（例えば重複する位置）×１００）。一態様では、二つの配列は同じ長さである。別の態様では、同一率は、参照配列（すなわち、本明細書に包含される変異Ｃｒｙ３配列）全体にわたり計算される。二つの配列の間の同一率は、ギャップを許して又は許さずに、下記技法に類似の技法を使用して決定することができる。同一率の計算では、典型的には完全マッチが計数される。
【００３８】
二つの配列の間の同一率の決定は、数学的アルゴリズムを使用して行うことができる。二つの配列を比較するために利用される数学的アルゴリズムの非限定的な例は、Karlin and Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264のアルゴリズムをKarlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877のように改変したものである。そのようなアルゴリズムは、Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403のＢＬＡＳＴＮ及びＢＬＡＳＴＸプログラムに組み入れられている。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索を、ＢＬＡＳＴＮプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２で行い、本発明の殺虫様核酸分子に相同なヌクレオチド配列を得ることができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索を、ＢＬＡＳＴＸプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３で行って、本発明の殺虫タンパク質分子に相同なアミノ酸配列を得ることができる。比較目的のギャップ付きアライメントを得るために、（ＢＬＡＳＴ２．０の）Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴを、Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389に記載されたように利用することができる。又は、ＰＳＩ−Ｂｌａｓｔを使用して分子間の距離関係を検出する反復検索を行うことができる。Altschul et al. (1997)、上記を参照されたい。ＢＬＡＳＴ、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ、及びＰＳＩ−Ｂｌａｓｔプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（例えば、ＢＬＡＳＴＸ及びＢＬＡＳＴＮ）のデフォルトパラメーターを使用することができる。アライメントは、検査によって手作業で行うこともできる。
【００３９】
配列の比較に利用される数学的アルゴリズムの別の非限定的な例は、ＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズムである（Higgins et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22:4673-4680）。ＣｌｕｓｔａｌＷは、配列を比較し、アミノ酸又はＤＮＡ配列の全体をアライメントし、したがってアミノ酸配列全体の配列保存性についてのデータを提供することができる。ＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズムは、Vector NTI Program Suite（Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA）のＡＬＩＧＮＸモジュールなどのいくつかの市販のＤＮＡ／アミノ酸解析ソフトウェアパッケージに使用されている。ＣｌｕｓｔａｌＷを用いたアミノ酸配列のアライメント後に、アミノ酸同一率を評価することができる。ＣｌｕｓｔａｌＷアライメントの解析に有用なソフトウェアプログラムの非限定的な例は、GENEDOC（商標）である。GENEDOC（商標）（Karl Nicholas）は、複数のタンパク質の間でのアミノ酸（又はＤＮＡ）の類似性及び同一性を評価することを可能にする。配列の比較のために利用される数学的アルゴリズムの別の非限定的な例は、Myers and Miller (1988) CABIOS 4:11-17のアルゴリズムである。そのようなアルゴリズムは、GCG Wisconsin Genetics Software Package、バージョン１０（Accelrys, Inc., 9685 Scranton Rd., San Diego, CA, USAから入手可能）の一部であるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み入れられている。アミノ酸配列を比較するためにＡＬＩＧＮプログラムを利用する場合、ＰＡＭ１２０重み残基表、ギャップ長ペナルティー１２、及びギャップペナルティー４を使用することができる。
【００４０】
特に述べない限り、Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48(3):443-453のアルゴリズムを使用するＧＡＰバージョン１０を使用して、以下のパラメーターを使用して配列同一性又は類似性を決定する：ヌクレオチド配列についての同一％及び類似％にはギャップ重み５０及び長さ重み３及びｎｗｓｇａｐｄｎａ．ｃｍｐスコア付けマトリックスを使用；アミノ酸配列についての同一％及び類似％にはＧＡＰ重み８及び長さ重み２及びＢＬＯＳＵＭ６２スコア付けプログラムを使用。同等のプログラムも使用することができる。「同等のプログラム」とは、ＧＡＰバージョン１０によって生成した対応するアライメントと比べたときに、問題となる任意の二つの配列について同一のヌクレオチド残基のマッチ及び同一の配列同一率を有するアライメントを生成する任意の配列比較プログラムが意図される。
【００４１】
本発明は、また、変異核酸分子を包含する。変異Ｃｒｙ３殺虫タンパク質をコードするヌクレオチド配列の「変異体」には、本明細書に開示された変異殺虫タンパク質をコードするが、遺伝コードの縮重が原因で保存的に異なる配列及び前記と十分に同一の配列が含まれる。変異ヌクレオチド配列には、また、例えば部位特異的突然変異誘発を使用することによって生成されたヌクレオチド配列であるが、下記のように本発明に開示された殺虫タンパク質を依然としてコードする、合成的に誘導されたヌクレオチド配列が含まれる。本発明によって包含される変異タンパク質は、生物学的に活性であり、すなわちそれらは、参照タンパク質（すなわち、本明細書に包含される変異Ｃｒｙ３配列）の所望の生物学的活性、すなわち殺虫活性を有し続ける。「活性を保持する」とは、変異体が参照タンパク質の殺虫活性の少なくとも約３０％、少なくとも約５０％、少なくとも約７０％、又は少なくとも約８０％を有することが意図される。いくつかの態様では、本明細書に記載される変異殺虫タンパク質は、配列番号２に示されるＡＸＭＩ−Ｒ１タンパク質に比べて改善された活性を示す。殺虫活性を測定するための方法は、当技術分野において周知である。例えば、全てがその全体で参照により本明細書に組み入れられるCzapla and Lang (1990) J. Econ. Entomol. 83: 2480-2485; Andrews et al. (1988) Biochem. J. 252:199-206; Marrone et al. (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293；及び米国特許第５，７４３，４７７号を参照されたい。
【００４２】
当業者は、さらに、本発明のヌクレオチド配列の突然変異によって変化を導入することによって、コードされる殺虫タンパク質の生物学的活性を変更せずに、そのタンパク質のアミノ酸配列に変化を導くことができることを認識している。したがって、本明細書に開示された対応するヌクレオチド配列に１個又は複数個のヌクレオチド置換、付加、又は欠失を導入することにより、コードされるタンパク質のターゲット突然変異領域に１個又は複数個のアミノ酸置換、付加又は欠失が導入されることによって、単離された変異核酸分子を創出することができる。突然変異は、部位特異的突然変異誘発及びＰＣＲ介在性突然変異誘発などの標準的な技法によって突然変異を導入することができる。そのような変異ヌクレオチド配列もまた、本発明によって包含される。
【００４３】
例えば、保存的アミノ酸置換を、１個又は複数の予測される非必須アミノ酸残基に加えることができる。「非必須」アミノ酸残基は、生物学的活性を実質的に変更せずに殺虫タンパク質の参照配列から変更することのできる残基であり、一方「必須」アミノ酸残基は、生物学的活性に必要とされる。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、類似の側鎖を有するアミノ酸残基と交換される置換である。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野において定義されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸（例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β−分岐側鎖を有するアミノ酸（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が挙げられる。
【００４４】
δ−エンドトキシンは、一般に５個の保存された配列ドメイン、及び３個の保存された構造ドメインを有する（例えばde Maagd et al. (2001) Trends Genetics 17:193-199参照）。第一の保存された構造ドメインは、７個のαヘリックスから成り、膜内挿入及び孔形成に関与する。ドメインＩＩは、ギリシャキー立体配置にされた３個のβシートから成り、ドメインＩＩＩは、「ゼリーロール」構成の２個の逆平行βシートから成る（de Maagd et al., 2001、上記）。ドメインＩＩ及びＩＩＩは、レセプターの認識及び結合に関与し、それゆえに毒素の特異性の決定因子と見なされる。
【００４５】
アミノ酸置換は、機能を保持する非保存領域に行うことができる。一般に、そのような置換は、保存されたアミノ酸残基にも、保存されたモチーフ内にあるアミノ酸残基（そのような残基はタンパク質活性に必須である）にも行われないであろう。保存されている残基であって、タンパク質活性に必須でありうる残基の例には、例えば、本発明の配列に類似又は関係する毒素のアライメントの中に含まれる全てのタンパク質の間で同一の残基（例えば、相同タンパク質のアライメントにおいて同一の残基）が含まれる。保存されている残基であるが、保存的アミノ酸置換が可能であって、依然として活性を保持しうる残基の例には、例えば、本発明の配列に類似又は関係する毒素のアライメントの中に含まれる全てのタンパク質の間に保存的置換のみを有する残基（例えば、相同タンパク質のアライメントの中に含まれる全てのタンパク質の間で保存的置換のみを有する同一の残基）が含まれる。しかし、当業者は、機能的変異体が保存された残基にわずかに保存された変更又は非保存的な変更を有することがあることを理解しているであろう。
【００４６】
又は、変異ヌクレオチド配列は、ターゲット突然変異領域の全て又は一部にわたり、並べ替え又は飽和突然変異誘発などによってランダムに突然変異を導入することによって製造することができ、結果として生じた突然変異体を、殺虫活性を付与する能力についてスクリーニングして、活性を保持するか、又は改善された活性を示す突然変異体を同定することができる。突然変異誘発後に、コードされるタンパク質をリコンビナント発現させることができ、標準的なアッセイ技法を使用してタンパク質の活性を決定することができる。
【００４７】
ＰＣＲ、ハイブリダイゼーションなどの方法を用いて、本発明の配列に実質的な同一性を有する、対応する殺虫配列を同定することができる。例えば、Sambrook and Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY)及びInnis, et al. (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, NY)を参照されたい。
【００４８】
ハイブリダイゼーション法において、殺虫ヌクレオチド配列の全て又は一部を使用して、ｃＤＮＡ又はゲノムライブラリーをスクリーニングすることができる。そのようなｃＤＮＡ及びゲノムライブラリーを構築するための方法は、当技術分野において一般に公知であり、Sambrook and Russell, 2001、上記に開示されている。いわゆるハイブリダイゼーションプローブは、ゲノムＤＮＡフラグメント、ｃＤＮＡフラグメント、ＲＮＡフラグメント、又は他のオリゴヌクレオチドのことがあり、３２Ｐなどの検出可能な基、又は他の放射性同位体、蛍光化合物、酵素、又は酵素補因子などの任意の他の検出可能なマーカーでラベルすることができる。ハイブリダイゼーション用プローブは、本明細書に開示された、公知の殺虫タンパク質をコードするヌクレオチド配列をベースに合成オリゴヌクレオチドをラベルすることによって製造することができる。ヌクレオチド配列又はコードされるアミノ酸配列中の保存されたヌクレオチド又はアミノ酸残基をベースに設計された縮重プライマーを、追加的に使用することができる。プローブは、本発明の殺虫タンパク質をコードするヌクレオチド配列又はそのフラグメント若しくは変異体の少なくとも約１２、少なくとも約２５、少なくとも約５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、又は２００個の連続ヌクレオチドに典型的にはストリンジェントな条件でハイブリダイゼーションするヌクレオチド配列の領域を含む。ハイブリダイゼーション用プローブを調製するための方法は、当技術分野において一般に公知であり、参照により本明細書に組み入れられるSambrook and Russell, 2001、上記に開示されている。
【００４９】
例えば、本明細書に開示される殺虫タンパク質配列全体又はその一つ若しくは複数の部分を、対応する殺虫タンパク質様配列及びメッセンジャーＲＮＡに特異的にハイブリダイゼーションできるプローブとして使用することができる。様々な条件で特異的ハイブリダイゼーションを達成するために、そのようなプローブには、独特な配列であって、好ましくは少なくとも約１０ヌクレオチド長又は少なくとも約２０ヌクレオチド長の配列が含まれる。そのようなプローブは、選択された生物からＰＣＲによって対応する殺虫配列を増幅するために使用することができる。この技法を使用して、所望の生物から追加的なコード配列を単離することができ、又は診断アッセイとして生物におけるコード配列の存在を決定することができる。ハイブリダイゼーション技法には、プレーティングされたＤＮＡライブラリーのハイブリダイゼーションスクリーニングが含まれる（プラーク又はコロニーのいずれか；例えばSambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual（2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York）を参照されたい。
【００５０】
そのような配列のハイブリダイゼーションは、ストリンジェントな条件で実施することができる。「ストリンジェントな条件」又は「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、プローブがそのターゲット配列に他の配列よりも検出可能に大きな程度（例えばバックグラウンドに対して少なくとも２倍）でハイブリダイゼーションする条件が意図される。ストリンジェントな条件は、配列依存性であって、異なる状況では異なる。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシー及び／又は洗浄条件をコントロールすることによって、プローブに１００％相補的なターゲット配列を同定することができる（相同プロービング）。又は、ストリンジェンシー条件は、配列にいくつかのミスマッチを許すことにより、低度の類似性が検出されるように調整することができる（非相同プロービング）。全般に、プローブは約１０００ヌクレオチド長未満、好ましくは５００ヌクレオチド長未満である。
【００５１】
典型的にはストリンジェントな条件は、ｐＨ７．０〜８．３で塩濃度が約１．５Ｍ未満のＮａイオン、典型的には約０．０１〜１．０ＭのＮａイオン濃度（又は他の塩）であって、短いプローブ（例えば、１０〜５０ヌクレオチド）について温度が少なくとも約３０℃であって、長いプローブ（例えば、５０ヌクレオチドよりも大きい）について少なくとも約６０℃の条件である。ストリンジェントな条件は、また、ホルムアミドなどの不安定化剤を添加して達成することができる。例示的な低ストリンジェンシー条件には、３０〜３５％ホルムアミド、１Ｍ ＮａＣｌ、１％ ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）の緩衝溶液を用いた３７℃でのハイブリダイゼーション、及び１×〜２×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣ＝３．０Ｍ ＮａＣｌ／０．３Ｍクエン酸三ナトリウム）中で５０〜５５℃での洗浄が含まれる。例示的な中ストリンジェンシー条件には、４０〜４５％ホルムアミド、１．０Ｍ ＮａＣｌ、１％ＳＤＳ中で３７℃でのハイブリダイゼーション、及び０．５×〜１×ＳＳＣ中で５５〜６０℃での洗浄が含まれる。例示的な高ストリンジェンシー条件には、５０％ホルムアミド、１Ｍ ＮａＣｌ、１％ ＳＤＳ中で３７℃でのハイブリダイゼーション、及び０．１×ＳＳＣ中で６０〜６５℃での洗浄が含まれる。場合により、洗浄緩衝液は、約０．１％〜約１％ ＳＤＳを含むことがある。ハイブリダイゼーションの時間は、全般に約２４時間未満、通常は約４〜約１２時間である。
【００５２】
特異性は、典型的にはハイブリダイゼーション後の洗浄の関数であって、重大な要因は、最終洗浄溶液のイオン強度及び温度である。ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドについて、Ｔｍは、Meinkoth and Wahl (1984) Anal. Biochem. 138:267-284の式：Ｔｍ＝８１．５℃＋１６．６（ｌｏｇ Ｍ）＋０．４１（％ＧＣ）−０．６１（％ｆｏｒｍ）−５００／Ｌ［式中、Ｍは、一価陽イオンのモル濃度であり、％ＧＣは、ＤＮＡ中のグアノシン及びシトシンヌクレオチドのパーセンテージであり、％ｆｏｒｍは、ハイブリダイゼーション溶液中のホルムアミドのパーセンテージであり、Ｌは、ハイブリッドの長さを塩基対の数で表したものである］から近似することができる。Ｔｍは、相補的ターゲット配列の５０％が完全マッチのプローブと（所定のイオン強度及びｐＨで）ハイブリダイゼーションする温度である。Ｔｍは、１％のミスマッチ毎に約１℃低下し；したがって、Ｔｍ、ハイブリダイゼーション、及び／又は洗浄条件を調整して、所望の同一性の配列とハイブリダイゼーションさせることができる。例えば、≧９０％の同一性を有する配列を探す場合、Ｔｍは、１０℃減少させることができる。一般に、ストリンジェントな条件は、所定のイオン強度及びｐＨで特定の配列及びその相補体についての熱融解温度（Ｔｍ）よりも約５℃低いように選択される。しかしながら、激しくストリンジェントな条件は、熱融解温度（Ｔｍ）よりも１、２、３、又は４℃低いハイブリダイゼーション及び／又は洗浄を利用することができ；中程度ストリンジェントな条件は、熱融解温度（Ｔｍ）よりも６、７、８、９、又は１０℃低いハイブリダイゼーション及び／又は洗浄を利用することができ；低ストリンジェンシー条件は、熱融解温度（Ｔｍ）よりも１１、１２、１３、１４、１５、又は２０℃低いハイブリダイゼーション及び／又は洗浄を利用することができる。この式、ハイブリダイゼーション及び洗浄組成物、ならびに所望のＴｍを用いて、ハイブリダイゼーション及び／又は洗浄溶液のストリンジェンシーにおける変動が本質的に説明されることを、当業者は理解している。所望の程度のミスマッチが４５℃（水溶液）又は３２℃（ホルムアミド溶液）未満のＴｍをもたらす場合、高温を使用することができるようにＳＳＣ濃度を増加させることが好ましい。核酸のハイブリダイゼーションへの幅広い解説は、Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes, Part I, Chapter 2 (Elsevier, New York)；及びAusubel et al., eds. (1995) Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 2 (Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York)に見出される。Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York)を参照されたい。
【００５３】
単離されたタンパク質ならびにその変異体及びフラグメント
殺虫タンパク質もまた、本発明に包含される。「殺虫タンパク質」とは、本明細書に包含される殺虫変異Ｃｒｙ３配列が意図される。そのフラグメント、生物学的活性部分、及び変異体もまた提供され、本発明の方法の実施に使用することができる。「単離されたタンパク質」又は「リコンビナントタンパク質」は、もはやその自然環境中にないタンパク質、例えばインビトロ又はリコンビナントの細菌細胞又は植物ホスト細胞を表すために使用される。
【００５４】
「フラグメント」又は「生物学的活性部分」には、本明細書に包含され、殺虫活性を示す変異Ｃｒｙ３配列のポリペプチドフラグメントが含まれる。殺虫タンパク質の生物学的活性部分は、例えば、１０、２５、５０、１００、１５０、２００、２５０又はそれを超えるアミノ酸長のポリペプチドでありうる。そのような生物学的活性部分を、リコンビナント技法によって調製し、殺虫活性について評価することができる。殺虫活性を測定するための方法は、当技術分野において周知である。例えば、その全てがその全体で参照により本明細書に組み入れられるCzapla and Lang (1990) J. Econ. Entomol. 83:2480-2485; Andrews et al. (1988) Biochem. J. 252:199-206; Marrone et al. (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293；及び米国特許第５，７４３，４７７号を参照されたい。本明細書に使用するように、フラグメントは、参照タンパク質の少なくとも８個の連続するアミノ酸を含む。しかしながら本発明は、タンパク質中の約１０、２０、３０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、又はそれを超えるアミノ酸よりも大きな任意のフラグメントなどの他のフラグメントを包含する。
【００５５】
「変異体」とは、配列番号２のアミノ酸配列に少なくとも約６０％、６５％、約７０％、７５％、約８０％、８５％、約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一のアミノ酸配列を有するタンパク質又はポリペプチドが意図される。変異体は、また、本明細書に包含される変異Ｃｒｙ３配列をコードする核酸分子又はその相補体にストリンジェントな条件でハイブリダイゼーションする核酸分子によってコードされるポリペプチドが含まれる。変異体には、突然変異誘発が原因でアミノ酸配列が異なるポリペプチドが含まれる。本発明によって包含される変異タンパク質は生物学的に活性であって、すなわちそれらは、変異Ｃｒｙ３タンパク質の所望の生物学的活性を有し続け、すなわち殺虫活性を保持する。いくつかの態様では、変異体は、参照タンパク質に比べて（例えば、配列番号２に比べて、又は特異的変異Ｃｒｙ３タンパク質に比べて）改善された活性を有する。殺虫活性を測定するための方法は、当技術分野において周知である。例えば、その全てがその全体で参照により本明細書に組み入れられるCzapla and Lang (1990) J. Econ. Entomol. 83:2480-2485; Andrews et al. (1988) Biochem. J. 252:199-206; Marrone et al. (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293；及び米国特許第５，７４３，４７７号を参照されたい。
【００５６】
本発明のａｘｍｉ遺伝子などの細菌遺伝子は、かなり多くの場合でオープンリーディングフレームの開始部近辺に複数のメチオニン開始コドンを有する。多くの場合に、１個又は複数個のこれらの開始コドンでの翻訳開始は、機能的タンパク質の生成を導く。これらの開始コドンには、ＡＴＧコドンが含まれうる。しかしながら、Bacillus sp.などの細菌は、また、開始コドンとしてコドンＧＴＧを認識し、ＧＴＧコドンで翻訳を開始するタンパク質は、最初のアミノ酸にメチオニンを有する。まれな場合に、細菌システムにおける翻訳はＴＴＧコドンで開始することができるが、もっともこの事象においてＴＴＧはメチオニンをコードする。さらに、これらのコドンのどれが細菌において自然に使用されるかが先験的に決定されることは、あまり多くない。したがって、代替的メチオニンコドンの一つの使用もまた、殺虫タンパク質の生成を導きうることが理解されている。これらの殺虫タンパク質は、本発明に包含され、本発明の方法に使用することができる。植物に発現された場合に、適正な翻訳のために代替的な開始コドンをＡＴＧに変更することが必要なことが理解されている。
【００５７】
本発明のポリペプチド又はその変異体若しくはフラグメントに対する抗体もまた包含される。抗体を産生させる方法は、当技術分野において周知である（例えばHarlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY；米国特許第４，１９６，２６５号参照）。
【００５８】
変更又は改善された変異体
殺虫タンパク質のＤＮＡ配列を様々な方法によってさらに変更することができること、及びこれらの変更が本発明の殺虫タンパク質によってコードされるものと異なるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ配列をもたらしうることが認識されている。このタンパク質は、１個又は複数個のターゲット突然変異領域に最大で約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５、約５０、約５５、約６０、約６５、約７０、約７５、約８０、約８５、約９０、約１００、約１０５、約１１０、約１１５、約１２０、約１２５、約１３０、約１３５、約１４０、約１４５、約１５０、約１５５、又はそれを超えるアミノ酸の置換、欠失又は挿入を含む、本明細書に包含される変異Ｃｒｙ３配列１個又は複数個のアミノ酸のアミノ酸置換、欠失、短縮、及び挿入を含む様々な方法で変更することができる。そのような操作の方法は、当技術分野において一般に公知である。例えば、殺虫タンパク質のアミノ酸配列変異体は、ＤＮＡにおける突然変異によって調製することができる。これは、また、いくつかの形態の突然変異誘発の一つによって、かつ／又は定方向進化で達成することができる。いくつかの局面では、アミノ酸配列にコードされる変化は、タンパク質の機能に実質的に影響を与えない。そのような変異体は、所望の（又は改善された）殺虫活性を有する。しかし、殺虫タンパク質が殺虫活性を付与する能力を、本発明の組成物にそのような技法を使用することによって改善できることが理解されている。例えば、ＤＮＡ複製の間に高率の塩基の誤取込みを示すXL-1 Red（Stratagene、La Jolla, CA）などのホスト細胞を用いて殺虫タンパク質を発現させることができる。そのような株で増殖後に、（例えばプラスミドＤＮＡを調製することによって、又はＰＣＲによって増幅し、結果として生じたＰＣＲフラグメントをベクターにクローニングすることによって）ＤＮＡを単離し、非突然変異誘発株で殺虫タンパク質突然変異を培養し、そして例えば殺虫活性を試験するためにアッセイを行うことによって、殺虫活性を有する突然変異遺伝子を同定することができる。一般に、タンパク質を混合して摂食アッセイに使用する。例えばMarrone et al. (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293を参照されたい。そのようなアッセイには、植物を１種類又は複数種類の害虫と接触させること、及びその植物が生存し、かつ／又は害虫の死滅を引き起こす能力を決定することが含まれうる。毒性増加を招く突然変異の例は、Schnepf et al. (1998) Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62:775-806に見出される。
【００５９】
又は、活性に実質的に影響せずに、アミノ又はカルボキシ末端で多数のタンパク質のタンパク質配列に変更を加えることができる。これには、ＰＣＲ増幅で利用されるオリゴヌクレオチドにアミノ酸コード配列を包含させることによりタンパク質コード配列を変更又は伸長するＰＣＲ増幅を含めたＰＣＲなどの、最新の分子的方法によって導入される挿入、欠失、又は変更が含まれうる。又は、付加されるタンパク質配列には、タンパク質融合体を生成させるために当技術分野において通常に使用される配列などの、タンパク質コード配列全体が含まれうる。そのような融合タンパク質は、多くの場合に、関心が持たれるタンパク質の発現を増加させるために、（２）当技術分野で公知のタンパク質精製、タンパク質検出、又は他の実験的使用のいずれかを促進する結合ドメイン、酵素活性、又はエピトープを導入するために、（３）グラム陰性細菌の細胞膜周辺腔又は真核細胞の小胞体（これらの後者は、多くの場合にタンパク質のグリコシル化を招く）などの細胞内オルガネラへのタンパク質の分泌又は翻訳をターゲティングするために、使用される。
【００６０】
本発明の変異ヌクレオチド及びアミノ酸配列は、また、ＤＮＡシャフリングなどの突然変異誘発手順及びリコンビナント形成手順から得られた配列を包含する。そのような手順で、１種又は複数種の異なる殺虫タンパク質コード領域を使用して、所望の性質を有する新しい殺虫タンパク質を創出することができる。このようにして、実質的な配列同一性を有し、インビトロ又はインビボで相同リコンビネーションすることができる配列領域を含む関連配列ポリヌクレオチドの集団から、リコンビナントポリヌクレオチドのライブラリーを生成させる。例えば、このアプローチを使用して、関心が持たれるドメインをコードする配列モチーフを、本発明の殺虫遺伝子と他の公知の殺虫遺伝子との間でシャフリングして、増加した殺虫活性などの、関心が持たれる性質が改善されたタンパク質をコードする新しい遺伝子を得ることができる。そのようなＤＮＡシャフリングの戦略は、当技術分野において公知である。例えば、Stemmer (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:10747-10751; Stemmer (1994) Nature 370:389-391; Crameri et al. (1997) Nature Biotech. 15:436-438; Moore et al. (1997) J. Mol. Biol. 272:336-347; Zhang et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:4504-4509; Crameri et al. (1998) Nature 391:288-291；ならびに米国特許第５，６０５，７９３号及び同第５，８３７，４５８号を参照されたい。
【００６１】
ドメインスワッピング又はシャフリングは、変更された殺虫タンパク質を生成させる別のメカニズムである。ドメインを殺虫タンパク質の間でスワップさせて、殺虫活性又はターゲットのスペクトルが改善されたハイブリッド又はキメラ毒素をもたらすことができる。リコンビナントタンパク質を生成させる方法及びそれらを殺虫活性について試験する方法は、当技術分野において周知である（例えば、Naimov et al. (2001) Appl. Environ. Microbiol. 67:5328-5330; de Maagd et al. (1996) Appl. Environ. Microbiol. 62:1537-1543; Ge et al. (1991) J. Biol. Chem. 266:17954-17958; Schnepf et al. (1990) J. Biol. Chem. 265:20923-20930; Rang et al. 91999) Appl. Environ. Microbiol. 65:2918-2925を参照されたい）。
【００６２】
ベクター
本発明の殺虫配列は、関心が持たれる植物に発現させるための発現カセットの中に提供することができる。「植物発現カセット」とは、植物細胞におけるオープンリーディングフレームからタンパク質の発現をもたらすことができるＤＮＡ構築物が意図される。典型的には、これらはプロモーター及びコード配列を有する。多くの場合に、そのような構築物は、３’非翻訳領域も有する。そのような構築物は、クロロプラスト（又は他の色素体）、小胞体、又はゴルジ装置などのある種の細胞内構造へのペプチドの共翻訳又は翻訳後輸送を促進する「シグナル配列」又は「リーダー配列」を有することがある。
【００６３】
「シグナル配列」とは、細胞膜を通過して共翻訳又は翻訳後ペプチド輸送を招くことが公知であるか又は疑われる配列が意図される。真核生物においてシグナル配列は、典型的にはゴルジ装置への分泌を伴い、結果として幾分グリコシル化される。細菌の殺虫毒素は、多くの場合に、ターゲット害虫の腸管内でタンパク質分解的に活性化されるプロ毒素として合成される（Chang (1987) Methods Enzymol. 153:507-516）。本発明のいくつかの態様では、シグナル配列は、ネイティブな配列に位置するか、又は本発明の配列に由来しうる。「リーダー配列」とは、翻訳された場合に細胞内オルガネラへのペプチド鎖の共翻訳輸送をトリガーするに足るアミノ酸配列をもたらす任意の配列が意図される。したがって、これには、小胞体への通過、液胞、クロロプラストを含む色素体、ミトコンドリアなどへの通過による輸送及び／又はグリコシル化をターゲティングするリーダー配列が含まれる。
【００６４】
「植物トランスフォーメーションベクター」とは、植物細胞の効率的なトランスフォーメーションに必要なＤＮＡ分子が意図される。そのような分子は、１種又は複数種の植物発現カセットから成ることがあり、１種を超える「ベクター」ＤＮＡ分子に編成することができる。例えば、バイナリーベクターは、植物細胞のトランスフォーメーションのために必要な全てのシス及びトランス作用機能をコードする２種類の非連続ＤＮＡベクターを利用する植物トランスフォーメーションベクターである（Hellens and Mullineaux (2000) Trends in Plant Science 5:446-451）。「ベクター」は、異なるホスト細胞の間で伝達するように設計された核酸構築物を表す。「発現ベクター」は、外来細胞に異種ＤＮＡ配列又はフラグメントを組み入れ、組込み及び発現する能力を有するベクターを表す。カセットには、本発明の配列に作動可能に連結した５’及び３’調節配列が含まれる。「作動可能に連結した」とは、プロモーター配列が第二の配列に対応するＤＮＡ配列の転写を開始及び仲介するような、プロモーター配列と第二の配列との間の機能的連結が意図される。一般に、作動可能に連結したは、連結される核酸配列が隣接していること、及び二つのタンパク質のコード領域を隣接させて同じリーディングフレーム内に結合させることが必要な場所を意味する。カセットは、追加的に、生物に共トランスフォーメーションされる少なくとも１種の追加的な遺伝子を有することがある。又は、追加的な遺伝子は、複数の発現カセット上に提供することができる。
【００６５】
「プロモーター」は、下流のコード配列の転写を指令するように機能する核酸配列を表す。プロモーターは、他の転写及び翻訳調節核酸配列（「制御配列」とも呼ばれる）と一緒に、関心が持たれるＤＮＡ配列の発現に必要である。
【００６６】
そのような発現カセットには、殺虫配列の挿入が調節領域の転写調節下になるように、複数の制限部位が備えられる。
【００６７】
発現カセットには、植物において機能する５’−３’方向の転写、転写及び翻訳開始領域（すなわちプロモーター）、本発明のＤＮＡ配列、ならびに翻訳及び転写終止領域（すなわち終止領域）が含まれる。プロモーターは、本発明の植物ホスト及び／又はＤＮＡ配列に、ネイティブ若しくは類似、又は外来若しくは異種でありうる。追加的に、プロモーターは、天然配列であるか、又はその代わりに合成配列のことがある。プロモーターが植物ホストに「ネイティブ」又は「同種」である場合、プロモーターが導入されたネイティブな植物からそのプロモーターが見出されることが意図される。プロモーターが本発明のＤＮＡ配列に「外来」又は「異種」である場合、プロモーターが本発明の作動可能に連結したＤＮＡ配列に関してネイティブなプロモーターでも天然プロモーターでもないことが意図される。
【００６８】
終止領域は、転写開始領域と一緒にネイティブなことがあるか、関心が持たれる作動可能に連結したＤＮＡ配列と一緒にネイティブなことがあるか、植物ホストと一緒にネイティブなことがあるか、又は別の供給源由来（すなわち、プロモーター、関心が持たれるＤＮＡ配列、植物ホスト、又はその任意の組み合わせに対して外来又は異種）のことがある。好都合な終止領域は、オクトピンシンターゼ及びノパリンシンターゼ終止領域のようなA. tumefaciensのＴｉプラスミドから入手可能である。Guerineau et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 262:141-144; Proudfoot (1991) Cell 64:671-674; Sanfacon et al. (1991) Genes Dev. 5:141-149; Mogen et al. (1990) Plant Cell 2:1261-1272; Munroe et al. (1990) Gene 91:151-158; Ballas et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:7891-7903；及びJoshi et al. (1987) Nucleic Acid Res. 15:9627-9639もまた参照されたい。
【００６９】
適切であれば、トランスフォーメーションされたホスト細胞中の発現増加について遺伝子を最適化することができる。すなわち遺伝子は、改善された発現についてホスト細胞に好ましいコドンを使用して合成することができるか、又はホストに好ましいコドン利用頻度でコドンを利用して合成することができる。一般に、遺伝子のＧＣ含量が増加される。ホストに好ましいコドン利用の論考については、例えば、Campbell and Gowri (1990) Plant Physiol. 92:1-11を参照されたい。植物に好ましい遺伝子を合成するための方法は、当技術分野において利用可能である。例えば、参照により本明細書に組み入れられる米国特許第５，３８０，８３１号、及び第５，４３６，３９１号、ならびにMurray et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:477-498を参照されたい。
【００７０】
一態様では、殺虫タンパク質は、発現のためにクロロプラストにターゲティングされる。このようにして、殺虫タンパク質がクロロプラストに直接には挿入されない場合、発現カセットは、追加的に、殺虫タンパク質をクロロプラストに方向付ける輸送ペプチドをコードする核酸を有する。そのような輸送ペプチドは、当技術分野において公知である。例えば、Von Heijne et al. (1991) Plant Mol. Biol. Rep. 9:104-126; Clark et al. (1989) J. Biol. Chem. 264:17544-17550; Della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiol. 84:965-968; Romer et al. (1993) Biochem. Biophys. Res. Commun. 196:1414-1421;及びShah et al. (1986) Science 233:478-481を参照されたい。
【００７１】
クロロプラストにターゲティングされるべき殺虫遺伝子をクロロプラストにおける発現について最適化して、植物核とこのオルガネラとの間のコドン利用率の差を説明することができる。このようにしてクロロプラストに好ましいコドンを使用して、関心が持たれる核酸を合成することができる。例えば、参照により本明細書に組み入れられる米国特許第５，３８０，８３１号を参照されたい。
【００７２】
植物のトランスフォーメーション
本発明の方法は、植物にヌクレオチド構築物を導入することを伴う。「導入する」とは、ヌクレオチド構築物が植物の細胞内部に到達するようにその構築物を植物に提示することが意図される。本発明の方法は、植物にヌクレオチド構築物を導入する特定の方法が使用されることを必要とせず、ヌクレオチド構築物が植物の少なくとも１個の細胞内部に到達することだけを必要とする。非限定的に安定トランスフォーメーション法、一過性トランスフォーメーション法、及びウイルス介在法を含めた、植物にヌクレオチド構築物を導入するための方法は、当技術分野において公知である。
【００７３】
「植物」とは、植物全体、植物器官（例えば、葉、茎、根など）、種子、植物細胞、繁殖体、胚及びその子孫が意図される。植物細胞は、分化又は未分化のことがある（例えばカルス、懸濁培養細胞、プロトプラスト、葉細胞、根細胞、篩部細胞、花粉）。
【００７４】
「トランスジェニック植物」又は「トランスフォーメーションされた植物」又は「安定にトランスフォーメーションされた」植物又は細胞又は組織は、植物細胞に外因性核酸配列又はＤＮＡフラグメントが組み入れられた植物又は組み込まれた植物を表す。これらの核酸配列には、トランスフォーメーションされていない植物細胞に外因性の又は存在しない核酸配列、及びトランスフォーメーションされていない植物細胞に内因性の又は存在しうる核酸配列が含まれる。「異種」は、一般に核酸配列であって、その核酸配列が存在する細胞又はネイティブなゲノムの一部に内因性ではなく、感染、トランスフェクション、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、マイクロプロジェクションなどによって細胞に添加された核酸配列を表す。
【００７５】
本発明のトランスジェニック植物は、本明細書に開示された一つ又は複数の変異Ｃｒｙ３配列を発現する。様々な態様では、トランスジェニック植物は、さらに昆虫抵抗性についての１種又は複数種の追加的な遺伝子、例えば、Coleoptera害虫を防除するための１種又は複数種の追加的な遺伝子（例えば、Ｃｒｙ１Ａ、Ｃｒｙ１Ｂ、Ｃｒｙ１Ｃ、Ｃｒｙ１Ｄ、Ｃｒｙ１Ｅ、及びＣｒｙ１ＦファミリーのメンバーなどのＣｒｙ１；Ｃｒｙ２ＡファミリーのメンバーなどのＣｒｙ２；Ｃｒｙ９Ａ、Ｃｒｙ９Ｂ、Ｃｒｙ９Ｃ、Ｃｒｙ９Ｄ、Ｃｒｙ９Ｅ、及びＣｒｙ９ＦファミリーのメンバーなどのＣｒｙ９；Ｃｒｙ３４／３５；ＶＩＰ３などのＶＩＰ；又はColeoptera害虫に毒性を有すると当技術分野において公知の任意の改変Ｃｒｙ３Ａ又はＣｒｙ３Ｂ配列を含む。トランスジェニック植物は、関心が持たれる作物学的形質を与える任意の遺伝子を含みうることが当業者によって理解されている。
【００７６】
植物細胞のトランスフォーメーションは、当技術分野において公知のいくつかの技法のうちの一つによって達成することができる。本発明の殺虫遺伝子は、植物細胞における発現を得る又は高めるように改変することができる。典型的には、そのようなタンパク質を発現する構築物は、遺伝子の転写を推進するプロモーターに加えて、転写終止及びポリアデニル化を可能にする３’非翻訳領域を有するであろう。そのような構築物の編成は、当技術分野において周知である。場合によっては、結果として生じるペプチドが分泌されるか、又はさもなければ植物細胞内でターゲティングされるように遺伝子を操作することが有用なことがある。例えば、小胞体へのペプチドの移行を促進するシグナルペプチドを有するように遺伝子を操作することができる。発現のためにイントロンのｍＲＮＡプロセシングが必要とされるように、イントロンを有するように植物発現カセットを操作することが好ましいこともある。
【００７７】
典型的には、この「植物発現カセット」は、「植物トランスフォーメーションベクター」に挿入される。この植物トランスフォーメーションベクターは、植物トランスフォーメーションを達成するために必要な１種又は複数種のＤＮＡベクターから構成されることがある。例えば、一つよりも多い連続ＤＮＡセグメントから構成される植物トランスフォーメーションベクターを利用することが、当技術分野における慣行である。これらのベクターは、当技術分野においてしばしば「バイナリーベクター」と呼ばれる。効率的なトランスフォーメーションを達成するために必要なＤＮＡセグメントのサイズ及び複雑さが非常に大きく、別々のＤＮＡ分子に機能を分離することが好都合なAgrobacterium介在性トランスフォーメーションに、バイナリーベクター及びヘルパープラスミドを有するベクターが最も頻繁に使用される。バイナリーベクターは、典型的にはＴ−ＤＮＡ伝達に必要なシス作用配列（左境界及び右境界など）、植物細胞において発現可能なように操作された選択マーカー、及び「関心が持たれる遺伝子」（トランスジェニック植物の作製が望まれる植物細胞で発現可能なように操作された遺伝子）を有するプラスミドベクターを有する。同様にこのプラスミドベクターに存在するのは、細菌の複製に必要な配列である。シス作用配列は、植物細胞への効率的な伝達及びその中での発現を可能にする様式で配置される。例えば、選択マーカー遺伝子及び殺虫遺伝子は、左境界と右境界との間に位置する。多くの場合に第二のプラスミドベクターは、Agrobacteriumから植物細胞へのＴ−ＤＮＡ伝達を仲介するトランス作用因子を有する。当技術分野において理解されるように、このプラスミドは、多くの場合にAgrobacteriumによる植物細胞感染、ならびに境界配列での切断によるＤＮＡ伝達及びｖｉｒ介在性ＤＮＡ伝達を可能にするビルレンス機能（Ｖｉｒ遺伝子）を有する（Hellens and Mullineaux (2000) Trends in Plant Science 5:446-451）。いくつかの種類のAgrobacterium株（例えばＬＢＡ４４０４、ＧＶ３１０１、ＥＨＡ１０１、ＥＨＡ１０５など）を植物トランスフォーメーションに使用することができる。マイクロプロジェクション、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、ポリエチレングリコールなどの他の方法によって植物をトランスフォーメーションするために、第二のプラスミドベクターは必要ない。
【００７８】
一般に、植物トランスフォーメーション法は、ターゲット植物細胞（例えば未熟又は成熟胚、懸濁培養物、未分化のカルス、プロトプラストなど）に異種ＤＮＡを導入すること、続いて適切な選択（選択マーカー遺伝子に依存する）の最大閾値レベルを適用して、トランスフォーメーションされていない細胞塊の群からトランスフォーメーションされた植物細胞を回収することを伴う。外植片を、典型的には新鮮供給された同培地に移植し、慣例的に培養する。続いて、トランスフォーメーションされた細胞を、最大閾値レベルの選択薬を補充した再生培地上に供した後で芽に分化させる。次に、発根した芽又は小植物体を回収するために芽を発根選択培地に移植する。次に、トランスジェニック小植物体は成熟植物に成長し、稔性種子を産生する（例えば Hiei et al. (1994) The Plant Journal 6:271-282; Ishida et al. (1996) Nature Biotechnology 14:745-750）。典型的には新鮮供給された同培地に外植片を移植し、慣例的に培養する。トランスジェニック植物を作出するための技法及び方法の一般的な説明は、Ayres and Park (1994) Critical Reviews in Plant Science 13:219-239及びBommineni and Jauhar (1997) Maydica 42:107-120に見出される。トランスフォーメーションされた材料は多数の細胞を含むので、トランスフォーメーションされた細胞とトランスフォーメーションされていない細胞との両方が、対象とされたターゲットカルス又は組織又は細胞群の任意の小片に存在する。トランスフォーメーションされていない細胞を死滅させトランスフォーメーションされた細胞を増殖させる能力により、トランスフォーメーションされた植物培養物が生じる。多くの場合に、トランスフォーメーションされていない細胞を除去する能力は、トランスフォーメーションされた植物細胞の急速回復及びトランスジェニック植物の作出成功への制約である。
【００７９】
トランスフォーメーションプロトコール及び植物にヌクレオチド配列を導入するためのプロトコールは、トランスフォーメーションのためにターゲティングされた植物又は植物細胞の種類、すなわち単子葉であるか双子葉かに応じて変動することがある。トランスジェニック植物の作出は、非限定的にマイクロインジェクション、エレクトロポレーション、直接遺伝子導入、Agrobacteriumによる植物細胞への異種ＤＮＡ導入（Agrobacterium介在性トランスフォーメーション）、パーティクルに接着した異種外来ＤＮＡを用いた植物細胞のボンバードメント、弾道パーティクル加速、エアロゾルビームトランスフォーメーション（米国特許出願公開第２００１００２６９４１号；米国特許第４，９４５，０５０号；国際公開公報第９１／００９１５号；米国特許出願公開第２００２０１５０６６号）、Ｌｅｃ１トランスフォーメーション、及びＤＮＡを伝達するための様々な他の非パーティクル性直接／介在法を含めたいくつかの方法の一つによって行うことができる。
【００８０】
クロロプラストをトランスフォーメーションするための方法は、当技術分野において公知である。例えば、Svab et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:8526-8530; Svab and Maliga (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:913-917; Svab and Maliga (1993) EMBO J. 12:601-606を参照されたい。この方法は、選択マーカーを有するＤＮＡのパーティクルガン送達及び相同組換えによる色素体ゲノムへのＤＮＡのターゲティングに依存する。追加的に、色素体トランスフォーメーションは、核にコードされる色素体指向性ＲＮＡポリメラーゼの組織優先発現によってサイレントな色素体担持導入遺伝子をトランス活性化することによって達成することができる。そのようなシステムは、McBride et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:7301-7305に報告された。
【００８１】
異種外来ＤＮＡを植物細胞に組み込んだ後に、次に培地中での最大閾値レベルの適切な選択を適用してトランスフォーメーションされていない細胞を死滅させ、新鮮培地に定期的に移植することによって、この選択処理から生存する推定的にトランスフォーメーションされた細胞を分離及び増殖させる。連続継代及び適切な選択を用いた誘発によって、プラスミドベクターでトランスフォーメーションされた細胞を同定及び増殖させる。次に、分子及び生化学的方法を使用して、トランスジェニック植物のゲノムに組み込まれた、関心が持たれる異種遺伝子の存在を確認することができる。
【００８２】
トランスフォーメーションされた細胞は、従来法により植物に成長させることができる。例えば、McCormick et al. (1986) Plant Cell Reports 5:81-84を参照されたい。次に、これらの植物を成長させ、同じトランスフォーメーションされた株又は異なる株のいずれかと受粉させ、結果として生じた、所望の表現型特性を構成的発現する雑種を同定することができる。所望の表現型特性の発現が安定的に維持され遺伝することを確かめるために２世代以上成長させ、次に所望の表現型特性の発現が達成されたことを確かめるために種子を収穫することができる。このようにして本発明は、本発明のヌクレオチド構築物、例えば本発明の発現カセットがゲノムに安定的に組み入れられた、トランスフォーメーションされた種子（「トランスジェニック種子」とも呼ばれる）を提供する。
【００８３】
植物トランスフォーメーションの評価
植物細胞に異種外来ＤＮＡを導入後、組み込まれた遺伝子に関連する核酸、タンパク質及び代謝物の分析などの様々な方法によって、植物ゲノムにおける異種遺伝子のトランスフォーメーション又は組み込みを確認する。
【００８４】
ＰＣＲ分析は、土壌に移植する前の初期段階で、組み入れられた遺伝子の存在についてトランスフォーメーションされた細胞、組織又は芽をスクリーニングする迅速法である（Sambrook and Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY）。ＰＣＲは、関心が持たれる遺伝子又はAgrobacteriumベクターのバックグランドなどに特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを使用して実施される。
【００８５】
植物トランスフォーメーションは、ゲノムＤＮＡのサザンブロット分析（Sambrook and Russell, 2001、上記）によって確認することができる。一般に、トランスフォーマントから総ＤＮＡを抽出し、適切な制限酵素で消化し、アガロースゲルで分画し、ニトロセルロース又はナイロンメンブランに移行させる。次に、メンブラン又は「ブロット」を、例えば放射性３２ＰターゲットＤＮＡフラグメントで探索して、植物ゲノムに導入された遺伝子の組み込みを標準技法によって確認する（Sambrook and Russell, 2001、上記）。
【００８６】
ノーザンブロット分析では、トランスフォーマントの特定組織からＲＮＡを単離し、ホルムアルデヒドアガロースゲルで分画し、当技術分野で慣用されている標準的な手順にしたがってナイロンフィルターに転写させる（Sambrook and Russell, 2001、上記）。当技術分野で公知の方法によりそのフィルターを殺虫遺伝子由来の放射性プローブとハイブリダイゼーションすることによって、殺虫遺伝子によってコードされるＲＮＡの発現を試験する（Sambrook and Russell, 2001、上記）。
【００８７】
ウエスタンブロット及び生化学アッセイなどをトランスジェニック植物に対して実施して、殺虫タンパク質上に存在する一つ又は複数のエピトープに結合する抗体を使用した標準的な手順（Sambrook and Russell, 2001、上記）により、殺虫遺伝子によりコードされるタンパク質の存在を確認することができる。
【００８８】
植物における殺虫活性
本発明の別の局面では、殺虫活性を有する殺虫タンパク質を発現しているトランスジェニック植物を作出することができる。一例としてトランスジェニック植物を作出するために上記方法を利用することができるが、トランスジェニック植物細胞が作出される方式は、本発明に重要ではない。Agrobacterium介在性トランスフォーメーション、バイオリスティックトランスフォーメーション、及び非パーティクル介在法などの、当技術分野において公知又は記載の方法を実験者の自由裁量で使用することができる。殺虫タンパク質を発現している植物は、当技術分野で記載されている通常法によって、例えばカルスのトランスフォーメーション、トランスフォーメーションされたカルスの選択、及びそのようなトランスジェニックカルスからの稔性植物の再生によって、単離することができる。そのようなプロセスでは、植物細胞におけるその遺伝子の発現がトランスフォーメーションされた細胞を同定又は選択する能力を付与する限り、選択マーカーとして任意の遺伝子を使用することができる。
【００８９】
クロラムフェニコール、アミノグリコシドＧ４１８、又はハイグロマイシン抵抗性などのいくつかのマーカーが、植物細胞と一緒に使用するために開発された。クロロプラスト代謝に関与する産物をコードする他の遺伝子もまた、選択マーカーとして使用することができる。例えばグリフォセート、ブロモキシニル、又はイミダゾリノンなどの植物除草剤に対する抵抗性を与える遺伝子が、特定の用途をもつことがある。そのような遺伝子が報告されている（Stalker et al. (1985) J. Biol. Chem. 263:6310-6314（ブロモキシニル抵抗性ニトリラーゼ遺伝子）；及びSathasivan et al. (1990) Nucl. Acids Res. 18:2188（ＡＨＡＳイミダゾリノン抵抗性遺伝子）。追加的に、本明細書に開示された遺伝子は、細菌又は植物細胞のトランスフォーメーションを評価するマーカーとして有用である。植物、植物器官（例えば、葉、茎、根など）、種子、植物細胞、繁殖体、胚及びその子孫における導入遺伝子の存在を検出するための方法は、当技術分野において周知である。一態様では、導入遺伝子の存在は、殺虫活性を試験することによって検出される。
【００９０】
殺虫タンパク質を発現している稔性植物を殺虫活性について検査し、最適な活性を示す植物をさらなる育種のために選択することができる。害虫活性についてアッセイする方法は、当技術分野において利用可能である。一般に、タンパク質を混合し、摂食アッセイに使用する。例えばMarrone et al. (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293を参照されたい。
【００９１】
本発明は、非限定的に単子葉植物及び双子葉植物を含めた任意の植物種をトランスフォーメーションするために使用することができる。関心が持たれる植物の例には、非限定的に、コーン（トウモロコシ）、ソルガム、コムギ、ヒマワリ、トマト、アブラナ科植物、コショウ、ジャガイモ、ワタ、イネ、ダイズ、テンサイ、サトウキビ、タバコ、オオムギ、及びアブラナ、Brassica sp.、アルファルファ、ライムギ、雑穀類（millet）、ベニバナ、ラッカセイ、サツマイモ、キャッサバ、コーヒー、ココナッツ、パイナップル、柑橘類、カカオ、チャノキ、バナナ、アボカド、イチジク、グアバ、マンゴー、オリーブ、パパイヤ、カシューナッツ、マカダミア、アーモンド、エンバク、野菜、観賞植物、及び針葉樹が挙げられる。
【００９２】
野菜には、非限定的にトマト、レタス、サヤインゲン、ライマメ、エンドウ、ならびにキュウリ、カンタループ、及びマスクメロンなどのCurcumis属のメンバーが挙げられる。観賞植物には、非限定的にツツジ、アジサイ、ハイビスカス、バラ、チューリップ、スイセン、ペチュニア、カーネーション、ポインセチア、及びキクが挙げられる。好ましくは本発明の植物は、作物植物（例えばトウモロコシ、ソルガム、コムギ、ヒマワリ、トマト、アブラナ科植物、コショウ、ジャガイモ、ワタ、イネ、ダイズ、テンサイ、サトウキビ、タバコ、オオムギ、アブラナなど）である。
【００９３】
殺虫性防除における使用
殺虫剤防除に、又は殺虫因子として他の生物を操作することに、本発明のヌクレオチド配列又はその変異体を含む株を採用する一般法は、当技術分野において公知である。例えば米国特許第５，０３９，５２３号及びEP0480762A2を採用されたい。
【００９４】
農作物及び農産物を害虫から保護するために、本発明のヌクレオチド配列若しくはその変異体を有するBacillus株、又は殺虫遺伝子及び殺虫タンパク質を有するように遺伝的に変更された微生物を使用することができる。本発明の一局面では、毒素（殺虫剤）産生生物の全細胞、すなわち未溶解細胞を、その細胞がターゲット害虫の環境に適用された場合に細胞中に産生される毒素の活性を延長する試薬で処理する。
【００９５】
又は、細胞性ホストに殺虫遺伝子を導入することによって殺虫剤を産生させる。殺虫遺伝子の発現の結果として、直接又は間接的に殺虫剤の細胞内産生及び維持が生じる。次に本発明の一局面では、これらの細胞がターゲット害虫の環境に適用された場合、細胞中に産生される毒素の活性を延長する条件で細胞が処理される。結果として生じた産物は、その毒素の毒性を保持する。次に、ターゲット害虫のホストとなる環境、例えば土壌、水、及び植物の普通葉に施用するために、従来技法に従ってこれらの自然封入された殺虫剤を製剤化することができる。例えばEPA0192319及びそこに引用された参考文献を参照されたい。又は、結果として生じた物質が殺虫剤として施用可能なように、本発明の遺伝子を発現している細胞を製剤化することができる。
【００９６】
本発明の活性成分は、普通は組成物の形で施用され、処置されるべき作物区域又は植物に他の化合物と同時に又は連続的に施用することができる。これらの化合物は、肥料、除草剤、凍害防御物質、界面活性剤、洗剤、殺虫用せっけん、ドーマントオイル（dormant oil）、ポリマー、及び／又は製剤の単回施用後にターゲット区域の長期薬物供給を可能にする持続放出性製剤又は生分解性担体製剤でありうる。それらは、また、所望によりさらなる製剤の技術分野で習慣的に採用される農業的に許容されうる担体、界面活性剤又は施用促進佐剤と一緒に、選択的除草剤、化学殺虫剤、殺ウイルス剤、殺菌剤、殺アメーバ剤、殺虫剤、殺真菌剤、殺細菌剤、殺線虫剤、軟体動物駆除剤、又はこれらの調製物のいくつかの混合物でありうる。適切な担体及び佐剤は、固体又は液体のことがあり、製剤技法において通常採用される物質、例えば天然又は再生無機物、溶媒、分散剤、湿潤剤、粘着付与剤、結合剤又は肥料に対応する。同様に製剤は、可食の「ベイト剤」に調製するか、又はターゲット害虫による殺虫製剤の摂食又は摂取を可能にする害虫「トラップ」の形に作ることができる。
【００９７】
本発明の細菌株によって産生される少なくとも１種の殺虫タンパク質を含有する本発明の活性成分又は本発明の農芸化学的組成物を施用する方法には、葉面施用、種子コーティング及び土壌施用が含まれる。施用回数及び施用量（rate of application）は、対応する害虫による侵襲強度に依存する。
【００９８】
組成物は、粉末、細粉（dust）、ペレット、顆粒、スプレー、エマルション、コロイド、溶液などとして製剤化することができ、ポリペプチドを含む細胞培養物の乾燥、凍結乾燥、均質化、抽出、濾過、遠心分離、沈降、又は濃縮などの従来手段によって調製することができる。少なくとも１種の殺虫ポリペプチドを含有するような全ての組成物において、ポリペプチドは、約１重量％〜約９９重量％の濃度で存在しうる。
【００９９】
Lepidoptera、Diptera、又はColeoptera害虫は、本発明の方法によっていくつかの所与の区域で死滅又は減少させることができるか、又は感受性の害虫による侵襲を防止するために環境区域に予防的に施用することができる。好ましくは害虫は、殺虫有効量のポリペプチドを摂取するか、又はそれと接触する。「殺虫有効量」は、少なくとも１種類の害虫の死滅をもたらすか、又は害虫の成長、摂食、若しくは通常の生理学的発生を顕著に減退することのできる殺虫剤の量が意図される。この量は、例えば防除されるべき特定のターゲット害虫、特定の環境、所在、植物、作物、又は処理されるべき農業部位、環境条件、ならびに殺虫的に有効なポリペプチド組成物の方法、割合、濃度、安定性、及び分量などの要因に応じて変動する。製剤は、また、天候条件、環境要件、及び／又は施用頻度及び／又は害虫侵襲の激しさに関して変動しうる。
【０１００】
記載された殺虫組成物は、細菌細胞、結晶及び／若しくは芽胞懸濁物、又は単離されたタンパク質成分のいずれかを所望の農業的に許容されうる担体と共に製剤化することによって製造することができる。その組成物は、施用の前に凍結乾燥、フリーズドライ、乾燥などの適切な手段で、又は食塩水若しくは他の緩衝液などの水性担体、媒質若しくは適切な希釈剤に入れて製剤化することができる。製剤化された組成物は、粉剤若しくは粒状物質、又は（植物又は鉱物）油への懸濁剤、又は水性若しくは水中油型乳剤の形、又は水和剤として、又は農業的施用に適した任意の他の担体物質と組み合わせでありうる。適切な農業用担体は、固体又は液体のことがあり、当技術分野において周知である。「農業的に許容されうる担体」という用語は、殺虫製剤技法に通常使用される全ての佐剤、不活性成分、分散剤、界面活性剤、粘着付与剤、結合剤などに及び、これらは、殺虫製剤の専門家に周知である。それらの製剤を、一つ又は複数の固体又は液体佐剤と混合し、様々な手段によって、例えば従来の製剤化技法を用いて殺虫組成物を適切な佐剤と均一に混合、ブレンド及び／又は粉砕することによって調製することができる。適切な製剤化及び施用方法は、参照により本明細書に組み入れられる米国特許第６，４６８，５２３号に記載されている。
【０１０１】
「害虫」には、非限定的に、昆虫、真菌、細菌、線虫、ダニ、マダニなどが含まれる。害虫には、Coleoptera、Diptera、Hymenoptera、Lepidoptera、Mallophaga、Homoptera、Hemiptera、Orthroptera、Thysanoptera、Dermaptera、Isoptera、Anoplura、Siphonaptera、Trichopteraなどの目より、特にColeoptera、Lepidoptera、及びDipteraより選択される昆虫が含まれる。
【０１０２】
Coleoptera目にはAdephaga及びPolyphaga亜目が含まれる。Adephaga亜目には、Caraboidea及びGyrinoidea上科が含まれ、一方でPolyphaga亜目には、Hydrophiloidea、Staphylinoidea、Cantharoidea、Cleroidea、Elateroidea、Dascilloidea、Dryopoidea、Byrrhoidea、Cucujoidea、Meloidea、Mordelloidea、Tenebrionoidea、Bostrichoidea、Scarabaeoidea、Cerambycoidea、Chrysomeloidea、及びCurculionoidea上科が含まれる。Caraboidea上科には、Cicindelidae、Carabidae、及びDytiscidae科が含まれる。Gyrinoidea上科にはGyrinidae科が含まれる。Hydrophiloidea上科にはHydrophilidae科が含まれる。Staphylinoidea上科には、Silphidae及びStaphylinidae科が含まれる。Cantharoidea上科には、Cantharidae及びLampyridae科が含まれる。Cleroidea上科には、Cleridae及びDermestidae科が含まれる。Elateroidea上科には、Elateridae及びBuprestidae科が含まれる。Cucujoidea上科にはCoccinellidae科が含まれる。Meloidea上科にはMeloidae科が含まれる。Tenebrionoidea上科にはTenebrionidae科が含まれる。Scarabaeoidea上科には、Passalidae及びScarabaeidae科が含まれる。Cerambycoidea上科にはCerambycidae科が含まれる。Chrysomeloidea上科にはChrysomelidae科が含まれる。Curculionoidea上科には、Curculionidae及びScolytidae科が含まれる。
【０１０３】
Diptera目には、Nematocera、Brachycera、及びCyclorrhapha亜目が含まれる。Nematocera亜目には、Tipulidae、Psychodidae、Culicidae、Ceratopogonidae、Chironomidae、Simuliidae、Bibionidae、及びCecidomyiidae科が含まれる。Brachycera亜目には、Stratiomyidae、Tabanidae、Therevidae、Asilidae、Mydidae、Bombyliidae、及びDolichopodidae科が含まれる。Cyclorrhapha亜目には、Aschiza及びAschiza群が含まれる。Aschiza群には、Phoridae、Syrphidae、及びConopidae科が含まれる。Aschiza群には、Acalyptratae及びCalyptratae類が含まれる。Acalyptratae類には、Otitidae、Tephritidae、Agromyzidae、及びDrosophilidae科が含まれる。Calyptratae類には、Hippoboscidae、Oestridae、Tachinidae、Anthomyiidae、Muscidae、Calliphoridae、及びSarcophagidae科が含まれる。
【０１０４】
Lepidoptera目には、Papilionidae、Pieridae、Lycaenidae、Nymphalidae、Danaidae、Satyridae、Hesperiidae、Sphingidae、Saturniidae、Geometridae、Arctiidae、Noctuidae、Lymantriidae、Sesiidae、及びTineidae科が含まれる。
【０１０５】
主要な作物についての本発明の害虫には:トウモロコシ：Ostrinia nubilalis、ヨーロピアンコーンボーラー（European corn borer）；Agrotis ipsilon、タマナヤガ（black cutworm）；Helicoverpa zea、アメリカタバコガ（corn earworm）；Spodoptera frugiperda、ツマジロクサヨトウ（fall armyworm）；Diatraea grandiosella、サウスウエスタンコーンボーラー（southwestern corn borer）；Elasmopalpus lignosellus、モロコシマダラメイガ（lesser cornstalk borer）；Diatraea saccharalis、シュガーケーンボーラー（surgarcane borer）；Diabrotica virgifera、ウエスタンコーンルートワーム；Diabrotica longicornis barberi、ノーザンコーンルートワーム（northern corn rootworm）；Diabrotica undecimpunctata howardi、サザンコーンルートワーム（southern corn rootworm）；Melanotus spp.、ワイヤーアーム（wireworm）；Cyclocephala borealis、ノーザンマスクトシェーファー（northern masked chafer）(ホワイトグラブ（white grub）)；Cyclocephala immaculata、サザンマスクトシェーファー（southern masked chafer）(ホワイトグラブ)；Popillia japonica、マメコガネ（Japanese beetle）；Chaetocnema pulicaria、コーンフリービートル（corn flea beetle）；Sphenophorus maidis、メイズビルバグ（maize billbug）；Rhopalosiphum maidis、トウモロコシアブラムシ（corn leaf aphid）；Anuraphis maidiradicis、コーンルートアフィド（corn root aphid）；Blissus leucopterus leucopterus、チンチナガカメムシ（chinch bug）；Melanoplus femurrubrum、レッドレッグドグラスホッパー（redlegged grasshopper）；Melanoplus sanguinipes、ミグラトリーグラスホッパー（migratory grasshopper）；Hylemya platura、シードコーンマゴット（seedcorn maggot）；Agromyza parvicornis、コーンブロットリーフマイナー（corn blot leafminer）；Anaphothrips obscrurus、クサキイロアザミウマ（grass thrips）；Solenopsis milesta、シーフアント（thief ant）；Tetranychus urticae、ツースポッテドスパイダーマイト（twospotted spider mite）；ソルガム：Chilo partellus、ソルガムボーラー（sorghum borer）；Spodoptera frugiperda、ツマジロクサヨトウ；Helicoverpa zea、アメリカタバコガ；Elasmopalpus lignosellus、モロコシマダラメイガ（lesser cornstalk borer）；Feltia subterranea、グラニュレートカットワーム（granulate cutworm）；Phyllophaga crinita、ホワイトグラブ；Eleodes、Conoderus、及びAeolus spp.、ワイヤーアーム；Oulema melanopus、シリアルリーフビートル（cereal leaf beetle）；Chaetocnema pulicaria、コーンフリービートル；Sphenophorus maidis、メイズビルバグ；Rhopalosiphum maidis；トウモロコシアブラムシ；Sipha flava、イエローシュガーケーンアフィッド（yellow sugaracane aphid）；Blissus leucopterus leucopterus、チンチナガカメムシ；Contarinia sorghicola、ソルガムミッジ（sorghum midge）；Tetranychus cinnabarinus、カーマインスパイダーマイト（carmine spider mite）；Tetranychus urticae、ツースポッテドスパイダーマイト；
コムギ：Pseudaletia unipunctata、アーミーワーム（army worm）；Spodoptera frugiperda、ツマジロクサヨトウ；Elasmopalpus lignosellus、モロコシマダラメイガ；Agrotis orthogonia、ウエスタンカットワーム（western cutworm）；Elasmopalpus lignosellus、モロコシマダラメイガ；Oulema melanopus、シリアルリーフビートル；Hypera punctata、クローバーリーフウィービル（clover leaf weevil）；Diabrotica undecimpunctata howardi、サザンコーンルートワーム；ラッシャンウィートアフィド（Russian wheat aphid）；Schizaphis graminum、グリーンバグ（greenbug）；Macrosiphum avenae、イングリッシュグレインアフィド（English grain aphid）；Melanoplus femurrubrum、レッドレッグドグラスホッパー；Melanoplus differentialis、ディファレンシャルグラスホッパー（differential grasshopper）；Melanoplus sanguinipes、ミグラトリーグラスホッパー；Mayetiola destructor、ヘシアンフライ（Hessian fly）；Sitodiplosis mosellana、ムギアカタマバエ（wheat midge）；Meromyza americana、ウィートステムマゴット（wheat stem maggot）；Hylemya coarctata、ウィートバルブフライ（wheat bulb fly）；Frankliniella fusca、タバコスリップス（tobacco thrips）；Cephus cinctus、ウィートステムソーフライ（wheat stem sawfly）；Aceria tulipae、ウィートカールマイト（wheat curl mite）；ヒマワリ：Suleima helianthana、サンフラワーバッドモス（sunflower bud moth）；Homoeosoma electellum、サンフラワーモス（sunflower moth）；zygogramma exclamationis、サンフラワービートル（sunflower beetle）；Bothyrus gibbosus、キャロットビートル（carrot beetle）；Neolasioptera murtfeldtiana、サンフラワーシードミッジ（sunflower seed midge）；ワタ：Heliothis virescens、コットンバッドワーム（cotton budworm）；Helicoverpa zea、アメリカタバコガ（cotton bollworm）；Spodoptera exigua、シロイチモジヨトウ（beet armyworm）；Pectinophora gossypiella、ワタアカミムシ（pink bollworm）；Anthonomus grandis、ワタミハナゾウムシ（boll weevil）；Aphis gossypii、ワタアブラムシ（cotton aphid）；Pseudatomoscelis seriatus、コーンフリーホッパー（cotton fleahopper）；Trialeurodes abutilonea、バンデドウイングドホワイトフライ（bandedwinged whitefly）；Lygus lineolaris、サビイロカスミカメムシ（tarnished plant bug）；Melanoplus femurrubrum、レッドレッグドグラスホッパー；Melanoplus differentialis、ディファレンシャルグラスホッパー；Thrips tabaci、ネギアザミウマ（onion thrips）；Franklinkiella fusca、タバコスリップス；Tetranychus cinnabarinus、カーマインスパイダーマイト；Tetranychus urticae、ツースポッテドスパイダーマイト；
イネ：Diatraea saccharalis、シュガーケーンボーラー（sugarcane borer）；Spodoptera frugiperda、ツマジロクサヨトウ；Helicoverpa zea、アメリカタバコガ；Colaspis brunnea、グレープコラプシス（grape colaspis）；Lissorhoptrus oryzophilus、イネミズゾウムシ（rice water weevil）；Sitophilus oryzae、ココクゾウムシ（rice weevil）；Nephotettix nigropictus、クロスジツマグロヨコバイ（rice leafhopper）；Blissus leucopterus leucopterus、チンチナガカメムシ；Acrosternum hilare、グリーンスティンクバグ（green stink bug）；ダイズ：Pseudoplusia includens、ソイビーンルーパ（soybean looper）；Anticarsia gemmatalis、ベルベットビーンキャタピラー（velvetbean caterpillar）；Plathypena scabra、グリーンクローバーワーム（green cloverworm）；Ostrinia nubilalis、ヨーロピアンコーンボーラー（European corn borer）；Agrotis ipsilon、タマナヤガ；Spodoptera exigua、シロイチモジヨトウ；Heliothis virescens、コットンバッドワーム；Helicoverpa zea、アメリカタバコガ；Epilachna varivestis、インゲンテントウ（Mexican bean beetle）；Myzus persicae、モモアカアブラムシ（green peach aphid）；Empoasca fabae、ジャガイモヒメヨコバイ（potato leafhopper）；Acrosternum hilare、グリーンスティンクバグ；Melanoplus femurrubrum、レッドレッグドグラスホッパー；Melanoplus differentialis、ディファレンシャルグラスホッパー；Hylemya platura、シードコーンマゴット；Sericothrips variabilis、ソイビーンスリップス（soybean thrips）；Thrips tabaci、ネギアザミウマ；Tetranychus turkestani、ストロベリースパイダーマイト（strawberry spider mite）；Tetranychus urticae、ツースポッテドスパイダーマイト；オオムギ：Ostrinia nubilalis、ヨーロピアンコーンボーラー；Agrotis ipsilon、タマナヤガ；Schizaphis graminum、グリーンバグ；Blissus leucopterus leucopterus、チンチナガカメムシ；Acrosternum hilare、グリーンスティンクバグ；Euschistus servus、ブラウンスティンクバグ（brown stink bug）；Delia platura、タネバエ；Mayetiola destructor、ヘシアンフライ；Petrobia latens、ブラウンウィートマイト（brown wheat mite）；アブラナ：Brevicoryne brassicae、ダイコンアブラムシ（cabbage aphid）；Phyllotreta cruciferae、フリービートル（Flea beetle）；Mamestra configurata、バーサアーミーワーム（Bertha armyworm）；Plutella xylostella、コナガ（Diamond-back moth）；Delia ssp.、ルートマゴット（Root maggot）が含まれる。
【０１０６】
線虫には、Heterodera spp.、Meloidogyne spp.、及びGlobodera spp.を含めたネコブセンチュウ、シストセンチュウ、及びネグサレセンチュウなどの寄生線虫；特に非限定的にHeterodera glycines（ダイズシストセンチュウ）；Heterodera schachtii（テンサイシストセンチュウ；Heterodera avenae（ムギシストセンチュウ）；ならびにGlobodera rostochiensis及びGlobodera pailida（ジャガイモのシストセンチュウ）を含めたシストセンチュウのメンバーが含まれる。ネグサレセンチュウにはPratylenchus spp.が含まれる。
【０１０７】
植物は、また、１種又は複数種の除草剤、殺虫剤、又は殺真菌剤を含めた１種又は複数種の化学組成物で処置することができる。例示的な化学組成物には：果物/野菜用除草剤：アトラジン、ブロマシル、ジウロン、グリフォセート、リニュロン、メトリブジン、シマジン、トリフルラリン、フルアジホップ、グルフォシネート、ハロスルフロンゴワン（Halosulfuron Gowan）、パラコート、プロピザミド、セトキシジム、ブタフェナシル、ハロスルフロン、インダジフラム（Indaziflam）；果物/野菜用殺虫剤：アルジカルブ、Bacillus thuriengiensis、カルバリル、カルボフラン、クロルピリホス、シペルメトリン、デルタメトリン、ダイアジノン、マラチオン、アバメクチン、シフルトリン/β-シフルトリン、エスフェンバレレート、λ−シハロトリン、アセキノシル、ビフェナゼート、メトキシフェノジド、ノバルロン、クロマフェノジド、チアクロプリド、ジノテフラン、フルアクリピリム、トルフェンピラド、クロチアニジン、スピロジクロフェン、γ-シハロトリン、スピロメシフェン、スピノサド、リナキシピル、Cyazypyr、スピノテラム（Spinoteram）、トリフルムロン、スピロテトラマト、イミダクロプリド、フルベンジアミド、チオジカルブ、メタフルミゾン、スルホキサフロール、シフルメトフェン、シアノピラフェン（Cyanopyrafen）、イミダクロプリド、クロチアニジン、チアメトキサム、スピノトラム（Spinotoram）、チオジカルブ、フロニカミド、メチオカルブ、エマメクチンベンゾエート、インドキサカルブ、ホズチアゼート（Fozthiazate）、フェナミホス、カズサホス（Cadusaphos）、ピリプロキシフェン（Pyriproxifen）、酸化フェンブタスズ、ヘキシチアゾクス（Hexthiazox）、メトミル、４−［［（６−クロルピリジン−３−イル）メチル］（２，２−ジフルオルエチル）アミノ］フラン−２（５Ｈ）−オン；果物／野菜用殺真菌剤：カルベンダジム、クロロタロニル、ＥＢＤＣ、硫黄、チオファネートメチル、アゾキシストロビン、シモキサニル、フルアジナム、ホセチル、イプロジオン、クレソキシムメチル、メタラキシル／メフェノキサム、トリフロキシストロビン、エタボキサム、イプロバリカルブ（Iprovalicarb）、トリフロキシストロビン、フェンヘキサミド、オキスポコナゾールフマラート、シアゾファミド、フェナミドン、ゾキサミド、ピコキシストロビン、ピラクロストロビン、シフルフェナミド（Cyflufenamid）、ボスカリド；
穀物用除草剤：イソプロツロン、ブロモキシニル、イオキシニル、フェノキシ類（Phenoxies）、クロルスルフロン、クロジナホップ、ジクロホップ、ジフルフェニカン、フェノキサプロップ、フロラスラム、フルロキシピル、メトスルフロン、トリアスルフロン、フルカルバゾン、ヨードスルフロン、プロポキシカルバゾン、ピコリナフェン、メソスルフロン、ベフルブタミド、ピノキサデン、アミドスルフロン、チフェンスルフロン、トリベヌロン、フルピルスルフロン、スルホスルフロン、ピラスルホトール（Pyrasulfotole）、ピロックススラム、フルフェナセット、トラルコキシジム、ピロキサスルホン；穀物用殺真菌剤：カルベンダジム、クロロタロニル、アゾキシストロビン、シプロコナゾール、シプロジニル、フェンプロピモルフ、エポキシコナゾール、クレソキシムメチル、キノキシフェン、テブコナゾール、トリフロキシストロビン、シメコナゾール、ピコキシストロビン、ピラクロストロビン、ジモキシストロビン、プロチオコナゾール、フルオキサストロビン（Fluoxastrobin）；穀物用殺虫剤：ジメトエート、λ−シハルトリン（cyhalthrin）、デルタメトリン、α−シペルメトリン、β−シフルトリン、ビフェントリン、イミダクロプリド、クロチアニジン、チアメトキサム、チアクロプリド、アセタミプリド、ジネトフラン（Dinetofuran）、クロルピリホス（Clorphyriphos）、メタミドホス、オキシデメトン（Oxidemethon）メチル、ピリミカーブ、メチオカルブ；トウモロコシ用除草剤：アトラジン、アラクロール、ブロモキシニル、アセトクロル、ジカンバ、クロピラリド、（Ｓ−）ジメテナミド、グルフォシネート、グリフォセート、イソキサフルトール、（Ｓ−）メトラクロル、メソトリオン、ニコスルフロン、プリミスルフロン、リムスルフロン、スルコトリオン、ホラムスルフロン、トプラメゾン、テンボトリオン、サフルフェナシル、チエンカルバゾン（Thiencarbazone）、フルフェナセット、ピロキサスルホン；トウモロコシ殺虫剤：カルボフラン、クロルピリホス、ビフェントリン、フィプロニル、イミダクロプリド、λ−シハロトリン、テフルトリン、テルブホス（Terbufos）、チアメトキサム、クロチアニジン、スピロメシフェン、フルベンジアミド、トリフルムロン、リナキシピル、デルタメトリン、チオジカルブ、β−シフルトリン、シペルメトリン、ビフェントリン、ルフェヌロン、トリフルモロン（Triflumoron）、テフルトリン、テブピリンホス、エチプロール、Cyazypyr、チアクロプリド、アセタミプリド、ジネトフラン、アベルメクチン、メチオカルブ、スピロジクロフェン、スピロテトラマト；トウモロコシ用殺真菌剤：フェニトロパン、チラム、プロチオコナゾール、テブコナゾール、トリフロキシストロビン；
イネ用除草剤：ブタクロールプロパニル、アジムスルフロン、ベンスルフロン、シハロホップ、ダイムロン、フェントラザミド、イマズスルフロン、メフェナセット、オキサジクロメフォン、ピラゾスルフロン、ピリブチカルブ、キンクロラック、チオベンカルブ、インダノファン、フルフェナセット、フェントラザミド、ハロスルフロン、オキサジクロメフォン、ベンゾビシクロン、プリフタリド、ペノクスラム、ビスピリバック、オキサジアルギル、エトキシスルフロン、プレチラクロール、メソトリオン、テフリルトリオン、オキサジアゾン、フェノキサプロップ、ピリミスルファン；イネ用殺虫剤：ダイアジノン、フェニトロチオン、フェノブカルブ、モノクロトホス、ベンフラカルブ、ブプロフェジン、ジノテフラン、フィプロニル、イミダクロプリド、イソプロカルブ、チアクロプリド、クロマフェノジド、チアクロプリド、ジノテフラン、クロチアニジン、エチプロール、フルベンジアミド、リナキシピル、デルタメトリン、アセタミプリド、チアメトキサム、Cyazypyr、スピノサド、スピノトラム、エマメクチン安息香酸塩、シペルメトリン、クロルピリホス、カルタップ、メタミドホス、エトフェンプロクス、イサゾホス、４−［［（６−クロルピリジン−３−イル）メチル］（２，２−ジフルオルエチル）アミノ］フラン−２（５Ｈ）−オン、カルボフラン、ベンフラカルブ；イネ用殺真菌剤：チオファネートメチル、アゾキシストロビン、カルプロパミド、エジフェンホス、フェリムゾン、イプロベンホス、イソプロチオラン、ペンシクロン、プロベナゾール、ピロキロン、トリシクラゾール、トリフロキシストロビン、ジクロシメット、フェノキサニル、シメコナゾール、チアジニル（Tiadinil）；ワタ用除草剤：ジウロン、フルオメツロン、ＭＳＭＡ、オキシフルオルフェン、プロメトリン、トリフルラリン、カルフェントラゾン、クレトジム、フルアジホップブチル、グリフォセート、ノルフルラゾン、ペンディメタリン、ピリチオバックナトリウム、トリフロキシスルフロン、テプラロキシジム、グルフォシネート、フルミオキサジン、チジアズロン；ワタ用殺虫剤：アセフェート、アルジカルブ、クロルピリホス、シペルメトリン、デルタメトリン、マラチオン、モノクロトホス、アバメクチン、アセタミプリド、エマメクチン安息香酸塩、イミダクロプリド、インドキサカルブ、λ−シハロトリン、スピノサド、チオジカルブ、γ−シハロトリン、スピロメシフェン、ピリダリル、フロニカミド、フルベンジアミド、トリフルムロン、リナキシピル、β−シフルトリン、スピロテトラマト、クロチアニジン、チアメトキサム、チアクロプリド、ジネトフラン、フルベンジアミド、Cyazypyr、スピノサド、スピノトラム、γシハロトリン、４−［［（６−クロルピリジン−３−イル）メチル］（２，２−ジフルオルエチル）アミノ］フラン−２（５Ｈ）−オン、チオジカルブ、アベルメクチン、フロニカミド、ピリダリル、スピロメシフェン、スルホキサフロール、プロフェノホス（Profenophos）、トリアゾホス（Thriazophos）、エンドスルファン；ワタ用殺真菌剤：エトリジアゾール（Etridiazole）、メタラキシル、キントゼン；
ダイズ用除草剤：アラクロール、ベンタゾン、トリフルラリン、クロリムロンエチル、クロランスラムメチル、フェノキサプロップ、ホメサフェン、フルアジホップ、グリフォセート、イマザモックス、イマザキン、イマゼタピル、（Ｓ−）メトラクロル、メトリブジン、ペンディメタリン、テプラロキシジム、グルフォシネート；ダイズ用殺虫剤：λ−シハロトリン、メトミル、パラチオン、チオカルブ（Thiocarb）、イミダクロプリド、クロチアニジン、チアメトキサム、チアクロプリド、アセタミプリド、ジネトフラン、フルベンジアミド、リナキシピル、Cyazypyr、スピノサド、スピノトラム、エマメクチン安息香酸塩、フィプロニル、エチプロール、デルタメトリン、β−シフルトリン、γ及びλシハロトリン、４−［［（６−クロルピリジン−３−イル）メチル］（２，２−ジフルオルエチル）アミノ］フラン−２（５Ｈ）−オン、スピロテトラマト、スピノジクロフェン（Spinodiclofen）、トリフルムロン、フロニカミド、チオジカルブ、β−シフルトリン；ダイズ用殺真菌剤：アゾキシストロビン、シプロコナゾール、エポキシコナゾール、フルトリアホール、ピラクロストロビン、テブコナゾール、トリフロキシストロビン、プロチオコナゾール、テトラコナゾール；テンサイ用除草剤：クロリダゾン、デスメジファム、エトフメサート、フェンメディファム、トリアレート、クロピラリド、フルアジホップ、レナシル、メタミトロン、キンメラック、シクロキシジム、トリフルスルフロン、テプラロキシジム、キザロホップ；テンサイ用殺虫剤：イミダクロプリド、クロチアニジン、チアメトキサム、チアクロプリド、アセタミプリド、ジネトフラン、デルタメトリン、β−シフルトリン、γ／λシハロトリン、４−［［（６−クロルピリジン−３−イル）メチル］（２，２−ジフルオルエチル）アミノ］フラン−２（５Ｈ）−オン、テフルトリン、リナキシピル、Cyaxypyr、フィプロニル、カルボフラン；カノーラ用除草剤：クロピラリド、ジクロホップ、フルアジホップ、グルフォシネート、グリフォセート、メタザクロル、トリフルラリン、エタメトスルフロン、キンメラック、キザロホップ、クレトジム、テプラロキシジム；カノーラ用殺真菌剤：アゾキシストロビン、カルベンダジム、フルジオキソニル、イプロジオン、プロクロラズ、ビンクロゾリン；カノーラ用殺虫剤：カルボフラン、有機リン酸エステル、ピレスロイド、チアクロプリド、デルタメトリン、イミダクロプリド、クロチアニジン、チアメトキサム、アセタミプリド、ジネトフラン、β−シフルトリン、γ−及びλ−シハロトリン、τ−フルバレリエート（Fluvaleriate）、エチプロール、スピノサド、スピノトラム、フルベンジアミド、リナキシピル、Cyazypyr、４−［［（６−クロルピリジン−３−イル）メチル］（２，２−ジフルオルエチル）アミノ］フラン−２（５Ｈ）−オンが含まれる。
【０１０８】
植物の収量を増加させる方法
植物の収量を増加させる方法が提供される。その方法は、本明細書に開示された殺虫配列を含むポリヌクレオチドを植物又は植物細胞に導入することを含む。本明細書に定義されるように、植物の「収量」は、植物によって産生されるバイオマスの質及び／又は量を表す。「バイオマス」とは、任意の測定された植物産物が意図される。バイオマス産生の増加は、測定された植物産物の収量における任意の改善である。植物の収量増加は、いくつもの商業的な用途がある。例えば、植物葉バイオマスを増加させることで、ヒト又は動物が消費するための葉物野菜の収量を増加させることができる。追加的に、葉バイオマスの増加は、植物由来医薬品又は工業製品の生産を増加させるために用いることができる。収量の増加は、殺虫配列を発現していない植物に比べて、非限定的に収率の少なくとも１％の増加、少なくとも３％の増加、少なくとも５％の増加、少なくとも１０％の増加、少なくとも２０％の増加、少なくとも３０％の増加、少なくとも５０％の増加、少なくとも７０％の増加、少なくとも１００％の増加又はそれよりも大きな増加を含めた任意の統計的に有意な増加を含みうる。
【０１０９】
限定としてではなく、例証として以下の実施例を提供する。
【０１１０】
実験の部
実施例１． 発現構築物
ｐＡＸ５５１０は、ｐＲＳＦ１ｂ１ベクターシステム（Invitrogen）ベースの発現ベクターである。このベクターは、E. coli細胞におけるＴ７プロモーター（例えば、ＢＬ２１：ＤＥ３株における）の転写誘導が、Ｎ末端にＨｉｓタグを有するｃｒｙ−Ｒ１タンパク質（配列番号２、GENBANK（登録商標）アクセッション番号ＰＯＡ３７９に記載された配列に対応）の蓄積を招くように、Ｔ７プロモーター下流にオープンリーディングフレーム 配列番号１（本明細書においてａｘｍｉ−Ｒ１と呼ばれ、GENBANK（登録商標）アクセッション番号ＰＯＡ３７９に記載された配列をコードする）を有する。
【０１１１】
実施例２． ウエスタンコーンルートワーム（ＷＣＲＷ）及びサザンコーンルートワーム（ＳＣＲＷ）のバイオアッセイ
ウエスタンコーンルートワーム及びサザンコーンルートワームの卵（それぞれDiabrotica virgifera及びDiabrotica undecimpunctata）（Crop Characteristics, MN）を洗浄し、孵化近くまで２５℃でインキュベーションした。以前に記載されたように、溶かした人工飼料を調製し（参照により本明細書に組み入れられる米国特許第７，３５１，８８１号）、２４ウェル組織培養プレート（Corning 3527）中に１ml分量ずつ入れ、１時間放冷した。いったん固化したならば、４０μlの試料を各ウェルに入れ、試料に拡散させた。試料が吸収された後で、７．５μｌの卵：０．１５％の寒天スラリー（ウェル１個あたりルートワームの卵約２５個）を各ウェルの端に加え、乾燥させた。いったん乾燥したならば、プレートをBREATHE-EASY（登録商標）気体透過性メンブラン（Research Products International）で密封し、暗グロースチャンバー（２５℃、９０％の相対湿度（ＲＨ））の中に置いた。
【０１１２】
２４時間後に、各プレートからそのメンブランを、次に孵化していない卵を除去し、気体透過性メンブランで再度密封し、さらに４日間、暗グロースチャンバー（２５℃、９０％ＲＨ）に戻した。合計５日後に、試料ウェル中の昆虫をプレート内対照と比較し、成長阻害及び死亡率について評価した（スコア付けシステムについては表１参照）。
【０１１３】
【表１】
【０１１４】
実施例３． 突然変異誘発の戦略、及び第一の突然変異誘発ライブラリーの創出
第一世代の点突然変異ライブラリー（ＰＭライブラリー１、ＰＭ１）は、２８個の位置を含む配列番号２の４領域をターゲティングした。テンプレートとしてｐＡＸ５５１０を使用して、いくつかの個別の位置をQUIKCHANGE（登録商標）部位特異的突然変異誘発キットを使用して無作為化し、多数の変異体のＤＮＡ配列を決定した。ＤＮＡ配列の分析によって、所望の変異をプールし、一方で望まれないクローン（野生クローン、重複する突然変異体及びフレームシフト突然変異体など）を除去した。２９４種類の独特な変異体をＰＭライブラリー１から同定し、さらなる試験に供した。
【０１１５】
一次スクリーニング。プールされたライブラリー変異体及びｐＡＸ５５１０を、ＢＬ２１＊ＤＥ３細胞にトランスフォーメーションし、ＬＢ＋カナマイシン（１００μg/ml）上に蒔いた。新鮮なコロニーを釣り上げて８．５mlのＬＢ＋カナマイシン（１００ug/ml）液体培地に入れ、ＯＤ６００nmが０．３〜０．４に達するまで深型２４ウェルブロック中で３７℃及び２５０rpmで成長させた。ＩＰＴＧを終濃度０．５mMまで添加し、培養液を２０℃で追加的に１８時間インキュベーションした。ＯＤ６００nmを決定し、遠心分離によって細胞を収集した（４５００rpm、４℃で１０分間）。細胞ペレットを５０mM炭酸ナトリウム（ｐＨ１０．５）、１mM ＤＴＴ中に１０ OD600/mlの密度で再懸濁した。ビーズ撹拌によって細胞を破壊し、４０００rpm、４℃で１５分間遠心分離後に可溶性抽出物を得た。
【０１１６】
各変異体についてそれぞれ４回の繰り返しで、ＷＣＲＷ及びＳＣＲＷに対する活性について抽出物をアッセイした。５日後に、４回の繰り返しからのスコアを平均することによってルートワーム毒性スコアを決定した。この一次選別で変異体（合計４３６種類）をスクリーニングし、ライブラリーのカバー度１．５×を与えた。
【０１１７】
再アッセイ及びスケールアップ。一次選別において≧３のスコアとなった４３種類の変異体を、一次選別と同じ実験条件を用いて再アッセイした。一次選別及び再アッセイから得られたスコアを、過剰サンプリングによる繰り返し単離株からのスコアを含めて平均し、２０種類の変異体を優先的にさらに広範なスケールアップに供した。
【０１１８】
スケールアップのために、新鮮トランスフォーメーションされた５個のコロニーを釣り上げて１３５ml ＬＢ＋カナマイシン（１００μg/ml）に入れ、１リットル振盪フラスコ中で０．３〜０．４のＯＤ６００nmに達するまで３７℃及び２５０rpmで成長させた。ＩＰＴＧを０．５mMの終濃度まで添加し、培養物を２０℃で追加的に１８時間インキュベーションした。ＯＤ６００nmを決定し、細胞を遠心分離（５０００rpm、４℃で１０分間）によって収集した。細胞ペレットを５０mM炭酸ナトリウム（ｐＨ１０．５）、１mM ＤＴＴに１０ OD600/mlの密度で再懸濁した。ビーズ撹拌によって細胞を破壊し、４０００rpm、４℃で１５分間遠心分離後に可溶性抽出物を得た。クマシーで染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で、抽出液の系列希釈を公知の濃度のＢＳＡ標準と比較することによって、それらの抽出液中のＡＸＭＩ−Ｒ１変異体を定量した。検討したＡＸＭＩ−Ｒ１変異体の濃度は、０．１３〜０．２２μg/ulの範囲で近接していた。
【０１１９】
アッセイのために、ｐＲＳＦ１ｂでトランスフォーメーションされたＢＬ２１＊ＤＥ３からの対照抽出物でＡＸＭＩ−Ｒ１変異体を含有する抽出物の系列希釈物を調製した。希釈は、ＡＸＭＩ−Ｒ１変異体を含有する抽出物の４０〜１．２５μｌの範囲であった。したがって、ＡＸＭＩ−Ｒ１変異体の濃度を変化させ、ＢＬ２１＃ＤＥ３タンパク質の量を一定に保った。ＷＣＲＷは変異体及び希釈物毎に４０回の繰り返しでアッセイした。各希釈についての平均スコア及びＥＣ５０を決定した。
【０１２０】
４０μlの抽出物で平均バイオアッセイスコア（ｎ＝４０）によりＡＸＭＩ−Ｒ１変異体をランク付けした（表２）。比較のために、ＡＸＭＩ−Ｒ１野生（ｗｔ）の６個の生物学的繰り返しを調製したが、そのデータ及び標準偏差を提供する。
【０１２１】
変異体Ｄ４Ｆ１１、Ｈ９、Ｇ５、Ｈ４、Ｄ５Ｄ８、及びＤ４Ａ２は、ＷＣＲＷに対して有意に改善された活性を示した。Ｄ５Ｄ８をコードするヌクレオチド配列を配列番号５に示し、アミノ酸配列を配列番号６に示す。
【０１２２】
【表２】
【０１２３】
したがって、任意の特定の理論又はメカニズムに縛られるわけではないが、改善されたＷＣＲＷ活性は、ＡＸＭＩ−Ｒ１の三つの位置で突然変異と結びついている可能性がある（表２）。ＡＸＭＩ−Ｒ１の１５４及び１６０位は、提案されたプロセシング及び孔形成領域にあるが、３１６位は、提案されたレセプター結合領域にある（Li et al, 1991, Nature 353:815-821）。
【０１２４】
実施例４． 組み合わせ変異体：
３１６位の有利な突然変異を１５４及び１６０位の有利な突然変異と組み合わせた変異体を生成させ、プロセシング及びレセプター認識に累積的な改善を提供する突然変異の組み合わせを同定した。表３は、そのような試験の結果を一覧したものであり；バイオアッセイのデータは、組み合わせ突然変異体Ｐ１６０Ｉ；Ｇ３１６Ｔ（Ｈ９＋Ｄ５Ｄ８）及びＰ１６０Ｆ；Ｇ３１６Ｔ（Ｈ４＋Ｄ５Ｄ８）が活性に累積的な改善を提供することを示している。Ｈ９＋Ｄ５Ｄ８をコードするヌクレオチド配列を配列番号７に示し、アミノ酸配列を配列番号８に示す。Ｈ４＋Ｄ５Ｄ８についてのアミノ酸配列を配列番号２６に示す。
【０１２５】
【表３】
【０１２６】
【表４】
【０１２７】
実施例５． 点突然変異体ライブラリー２： ３１６位に隣接する残基
残基３１６における突然変異からＰＭライブラリー１（ＰＭ１）において改善された殺虫活性が生成したと仮定して、配列番号２に関する３１３、３１４、３１５、３１７、及び３１８位について第二の点突然変異ライブラリー（ＰＭライブラリー２、ＰＭ２）を生成させた。このライブラリーは、計算上６１種の変異体という多様性を有する。９２種の変異体をアッセイし、３１６位に隣接する５種の変異体（Ｒ３１５Ｆ、Ｒ３１５Ｍ、Ｒ３１５Ｗ、Ｙ３１７Ｅ、Ｙ３１７Ｎ）は、一次選別で幾分改善を示した。変異体Ｒ３１５Ｍ及びＲ３１５Ｗをスケールアップし、１２５〜２５０μg/mlの範囲のタンパク質濃度でアッセイした。データは、３１５位の変更がＣＲＷに対して改善された活性を生成できることを示している。
【０１２８】
【表５】
【０１２９】
【表６】
【０１３０】
実施例６． 並べ替えライブラリー１
１５４、１５５、１５８及び１６０位をターゲティングする並べ替え突然変異誘発ライブラリーを生成させた。このライブラリー（ライブラリーＰ１；Ｐ１）を、当技術分野で公知のオリゴ特異的突然変異誘発法を用いて生成させ、７６８種の変異体という理論的複雑性を有するライブラリーが生じた。ライブラリーに組み入れられた多様性は、以下の通りである：
【０１３１】
【表７】
【０１３２】
２４ウェル形式で５７３個のクローンを分析し（それぞれ４回の繰り返し）、さらなる試験のために１５５個のクローンを同定した。７３個のクローンを再試験し、最終的にスケールアップ後に８個のクローンを試験した（本明細書に記載）。
【０１３３】
実施例７． ＷＣＲＷ及びＳＣＲＷに及ぼす変異体の死亡率
本明細書記載のスケールアップ実験のために、所望の活性を示すＰ１由来のいくつかの変異体を選択した。結果として生じたタンパク質を、１２５〜２５０μg/mlの範囲のタンパク質濃度で試験した。いくつかの変異体は、これらのアッセイにおいてＷＣＲＷ及びＳＣＲＷを死滅させる能力を示したが、対照タンパク質ＡＸＭＩ−Ｒ１ｗｔは、これらのアッセイにおいてＷＣＲＷにもＳＣＲＷにも致死性を示さなかった。
【０１３４】
最初のセットの実験では、ＣＲＷの卵をウェルに入れ、試料を添加し、５日後にＣＲＷに対する損傷及びＣＲＷの死亡率％（適用可能な場合）をスコア付けした（表６）。平均スコア及び平均死亡率は、ＷＣＲＷについては４０回の繰り返しを、ＳＣＲＷについては２０回の繰り返しをベースとした。データは、変異体ＰｅｒｍｕｔＰ３ｃ６及びＰｅｒｍｕｔＰ３ｃ７がＷＣＲＷに対して８〜９％の死亡率及びＳＣＲＷに対して６０〜８０％の死亡率を与えるが、ＡＸＭＩ−Ｒ１ｗｔは致死性を示さなかったことを示した（表７）。３ｃ７変異体をコードするヌクレオチド配列を配列番号１２に示し、アミノ酸配列を配列番号１３に示す。
【０１３５】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるタンパク質の分析から、ＡＸＭＩ−Ｒ１ｗｔ、３ｃ６、及び３ｃ７の発現レベルが識別不能であり、おそらく同一であることが示される。
【０１３６】
【表８】
【０１３７】
【表９】
【０１３８】
以下の実験では、ＣＲＷの卵をウェルに入れ、試料を添加し、１日後に孵化していない卵を除いた。この方法は、試料の適用から１〜２日以内に試料に遭遇する、より同調した早期孵化ＣＲＷ幼虫集団を与える。これらの条件で、変異体３ｃ７は、ＷＣＲＷに対して４４％の死亡率及びＳＣＲＷに対して８６％の死亡率を達成した（表８）。
【０１３９】
【表１０】
【０１４０】
ＡＸＭＩ−Ｒ１対照に比べて第３の変異体３ａ１１（Ｖ１５５Ｋ；Ｒ１５８Ｇ；Ｐ１６０Ｔ）もまた、ＷＣＲＷに対して死亡を誘導した。この実験では、ＣＲＷの卵をウェルに入れ、試料を添加し、１日後に孵化していない卵を除いた。このアッセイにおいて、３ａ１１に曝露されたルートワームで３６％の死亡率が観察された（表９）。
【０１４１】
【表１１】
【０１４２】
【表１２】
【０１４３】
実施例８． 組み合わせ変異体
３ｃ７（Ｐ１５４Ａ、Ｖ１５５Ｋ、Ｐ１６０Ｖ）と、ライブラリーＰＭ１からの変異体Ｄ５Ｄ８（Ｇ３１６Ｔ）とを組み合わせた変異体を生成させ、ＣＲＷ活性について試験したが、この変異体は、１２５〜２５０μg/mlの範囲のタンパク質濃度でＷＣＲＷ及びＳＣＲＷに対して致死性を示した。３ｃ７＋Ｄ５Ｄ８変異体をコードするヌクレオチド配列を配列番号９に、アミノ酸配列を配列番号１０に示す。
【０１４４】
実施例９． ライブラリーＰＭ２
第二世代の点突然変異ライブラリー（ＰＭ２）を生成させ、４８２及び４８３位における変更を３１５及び３１６位における変更と組み合わせた。このライブラリーは、７５６個の変異体を有する。１１００個を超えるクローンを釣り上げ、活性について試験した。変異体「１ｇ８」（Ｇ３１６Ｅ、Ｑ４８２Ｌ、Ｇ４８３Ｋ）及び「２ｂ１１」（Ｇ３１６Ａ、Ｑ４８２Ｌ、Ｇ４８３Ｋ）は、ＡＸＭＩ−Ｒ１に比べてルートワーム害虫に対して改善された活性を示すことが見出された。変異体１ｇ８は、大部分の場合で３ｃ７よりも優れた活性を示した。１ｇ８変異体をコードするヌクレオチド配列を配列番号１４に、アミノ酸配列を配列番号１５に示す。
【０１４５】
【表１３】
【０１４６】
実施例１０． ライブラリーＰ３
ＡＸＭＩ−Ｒ１の４８１〜４８６位（本明細書において「ループ３」と呼ぶ）に対応する位置における変異体のライブラリー（ライブラリーＰ３）を生成させた。殺虫活性への各残基の寄与を評価するために個別のクローンを試験した。残基４８２及び４８３における変異体がコーンルートワームに対して改善された活性を示したので、これらの残基は活性に寄与することが見出された（表１２）。
【０１４７】
【表１４】
【０１４８】
実施例１１ 組み合わせ変異体
【０１４９】
変異体１ｇ８及び２ｂ１１に見られた変更を３ｃ７における変更と組み合わせたクローンを生成させた。結果として生じたクローンＡＸＭＩ−Ｒ１（３ｃ７＋１ｇ８）及びＡＸＭＩ−Ｒ１（３ｃ７＋２ｂ１１）を試験し、これらのクローンがコーンルートワームに活性を保持することを見出した。特に、ＡＸＭＩ−Ｒ１（３ｃ７＋１ｇ８）は、コーンルートワームに対して３ｃ７単独よりも高い死亡率を示すように見られた。ＡＸＭＩ−Ｒ１（３ｃ７＋２ｂ１１）もまた、一部の試験で３ｃ７単独よりも大きな活性を示すように見られた。
【０１５０】
実施例１２． ＡＸＭＩ−Ｒ１（ＥＶＯ２３）の生成
プロセシング領域についての第二世代の置換ライブラリーをＡＸＭＩ−Ｒ１（１ｇ８）（配列番号１５）にクローニングすることによって、レセプター結合領域に突然変異を有する変異体ＡＸＭＩ−Ｒ１（１ｇ８）に関連してプロセシング領域における多様性を選別することを可能にした。そのライブラリーの多様性は５７３である。変異体（ｎ＝８１３）をスクリーニングし、１６３個のクローンを再アッセイし、４０個の変異体をスケールアップした。ＡＸＭＩ−Ｒ１（ＥＶＯ２３）（配列番号１７）は、そのライブラリーの中で最高の活性を有した。ＡＸＭＩ−Ｒ１（ＥＶＯ２３）をコードするヌクレオチド配列を配列番号１６に示す。ＷＣＲＷに対するＥＶＯ２３の活性を表１３に示す。
【０１５１】
【表１５】
【０１５２】
実施例１３． ドメインＩＩ／ＩＩＩの界面変異体の生成
ａｘｍｉ−Ｒ１のモデル化は、ドメイン２とドメイン３との界面に寄与する三つの領域を同定した。これらの領域は、配列番号２の３３１〜３３５位、３６８〜３７３位、及び５１８〜５２４位に対応する。これらの領域をターゲティングする変異体ライブラリーを生成させた。５１８〜５２４位に対応するライブラリーの多様性は８であった（表１４）。１２個の変異体をスクリーニングし、Ｌ６１Ｅ１１を再アッセイ及びスケールアップした。
【０１５３】
【表１６】
【０１５４】
ＷＣＲＷに対するＬ６１Ｒ１１変異体の活性を表１５に示す。
【０１５５】
【表１７】
【０１５６】
本発明は、本明細書に記載された残基の変更が害虫に対して改善された活性を有する変異体をもたらすことを実証している。本発明において変更された残基の概要を表１６に提供する。
【０１５７】
【表１８】
【０１５８】
実施例１４． 他のＣｒｙタンパク質における進化したＡＸＭＩ−Ｒ１配列の使用：
プロセシング、レセプター結合及び活性を改善するために、有利な突然変異を有するＡＸＭＩ−Ｒ１配列セグメントを他の相同Ｃｒｙタンパク質に挿入することができよう。例えば、プロセシング領域にわたる、進化したＡＸＭＩ−Ｒ１変異体からの配列セグメントを使用して、ａｘｍｉ００８、ａｘｍｉ０２８、及び他のＣｒｙタンパク質における相同領域を交換することができよう。Ｃｒｙタンパク質の３Ｄフォールディングは保存されているので、雑種タンパク質のプロセシング及び効力の改善を達成することができる。これらのＡＸＭＩ−Ｒ１変異体配列のさらなる突然変異誘発により、ホストタンパク質に関連したＡＸＭＩ−Ｒ１変異体配列を適合及び改善することを助けることができる。
【０１５９】
実施例１５． 殺虫活性についての追加的なアッセイ
殺虫タンパク質を産生する能力について本発明のヌクレオチド配列を試験することができる。殺虫タンパク質が害虫に対して殺虫剤として作用する能力は、多くの場合にいくつかの方法で評価される。当技術分野において周知の一方法は、摂食アッセイを行うことである。そのような摂食アッセイでは、被験化合物又は対照試料のいずれかを含有する試料に害虫を曝露する。多くの場合に、これは被験物質又はそのような物質を適切に希釈したものを、害虫が摂取する人工飼料などの物質の上に置くことによって行われる。被験物質は、液体、固体、又はスラリーから構成されることがある。被験物質を、表面上に置き、次に乾燥させることができる。又は、被験物質を溶けた人工飼料と混合し、次にアッセイチャンバーに分注することができる。アッセイチャンバーは、例えば、カップ、ディッシュ、又はマイクロタイタープレートのウェルのことがある。
【０１６０】
吸汁性の害虫（例えばアブラムシ）についてのアッセイは、仕切りで昆虫から被験物質を、理想的には吸汁性昆虫の吸汁口部分で突き刺すことのできる部分を分離して、被験物質を摂取させることを伴うことがある。多くの場合に被験物質をスクロースなどの摂食刺激剤と混合し、被験化合物の摂取を促進する。
【０１６１】
他の種類のアッセイには、害虫の口又は腸管への被験物質のマイクロインジェクション、さらにはトランスジェニック植物の開発に続き、その害虫がそのトランスジェニック植物を摂食する能力の試験が含まれうる。植物試験は、通常は消費される植物部分の隔離、例えば葉に小さなケージを取り付けること、又は昆虫の入ったケージに植物全体を隔離することを伴うことがある。
【０１６２】
害虫をアッセイするための他の方法及びアプローチは、当技術分野において公知であり、例えばRobertson and Preisler、eds. (1992) Pesticide bioassays with arthropods、CRC、Boca Raton、FLに見出すことができる。又は、アッセイは、雑誌Arthropod Management Tests及びJournal of Economic Entomologyに、又はEntomological Society of America（ＥＳＡ）の会員との議論によって通例説明される。
【０１６３】
実施例１６． 植物発現用遺伝子のベクター化
本発明のコード領域を、植物において発現させるために適切なプロモーター及びターミネーター配列と接続する。そのような配列は当技術分野において周知であり、それらには、単子葉植物における発現用のイネアクチンプロモーター又はトウモロコシユビキチンプロモーター、双子葉植物における発現用のArabidopsis ＵＢＱ３プロモーター又はＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター、及びｎｏｓ又はＰｉｎＩＩターミネーターが含まれる。プロモーター−遺伝子−ターミネーター構築物を産生及び確認するための技法もまた、当技術分野において周知である。
【０１６４】
本発明の一局面では、合成ＤＮＡ配列が設計及び生成される。これらの合成配列は、親配列に比べて変更されたヌクレオチド配列を有するが、親配列と本質的に同一なタンパク質をコードする。
【０１６５】
本発明の別の態様では、結果として生じるペプチドが小胞体又はアポプラストなどの植物オルガネラにターゲティングされるように、改変版の合成遺伝子が設計される。植物オルガネラへの融合タンパク質のターゲティングを招くことが知られているペプチド配列は、当技術分野において公知である。例えば、シロバナルーピンLupinus albus（GENBANK（登録商標）ＩＤ ＧＩ：１４２７６８３８、Miller et al. (2001) Plant Physiology 127: 594-606）由来の酸性ホスファターゼ遺伝子のＮ末端領域は、異種タンパク質の小胞体ターゲティングを招くことが当技術分野において公知である。結果として生じた融合タンパク質が、また、Ｃ末端にペプチドＮ末端−リシン−アスパラギン酸−グルタミン酸−ロイシン（すなわち、「ＫＤＥＬ」モチーフ、配列番号１１）を含む小胞体保留配列を有する場合、その融合タンパク質は、小胞体にターゲティングされる。融合タンパク質がＣ末端に小胞体ターゲティング配列を欠如する場合、タンパク質は小胞体にターゲティングされるが、最終的にアポプラストに隔離される。
【０１６６】
したがって、この遺伝子は、本発明のアミノ酸配列のＮ末端に融合したシロバナルーピンLupinus albus（GENBANK（登録商標）ＩＤ ＧＩ：１４２７６８３８、Miller et al., 2001、上記）由来の酸性ホスファターゼ遺伝子の３１個のＮ末端アミノ酸及びＣ末端のＫＤＥＬ配列を有する融合タンパク質をコードする。したがって、結果として生じたタンパク質は、植物細胞に発現した場合、植物小胞体にターゲティングされると予測される。
【０１６７】
上記植物発現カセットは、トランスフォーメーションされた細胞及び組織の選択を助けるために適切な植物選択マーカーと組み合わされ、植物トランスフォーメーションベクターにライゲーションされる。これらには、Agrobacterium介在性トランスフォーメーションからのバイナリーベクター又はエアロゾル若しくはバイオリスティックトランスフォーメーション用の単純なプラスミドベクターが含まれうる。
【０１６８】
実施例１７． 本明細書記載の殺虫タンパク質遺伝子を有するトウモロコシ細胞のトランスフォーメーション
トウモロコシ穂を最良には受粉の８〜１２日後に収集する。穂から胚を単離し、大きさが０．８〜１．５mmの胚がトランスフォーメーションに使用するために好ましい。ＤＮ６２Ａ５Ｓ培地（３．９８g/L Ｎ６塩類；１mL/L（１０００×原液使用）Ｎ６ビタミン類；８００mg/L Ｌ−アスパラギン；１００mg/Lミオイノシトール；１．４ g/L Ｌ−プロリン；１００mg/Lカザミノ酸；５０g/Lスクロース；１mL/L（１mg/mL原液使用）２，４−Ｄ）などの適切なインキュベーション培地上にその胚を胚盤側を上にして蒔く。しかしながら、ＤＮ６２Ａ５Ｓ以外の培地及び塩類は、当技術分野において適切かつ公知である。胚を２５℃の暗条件で一晩インキュベーションする。しかしながら、胚を一晩インキュベーションすること自体は必要ない。
【０１６９】
結果として生じた外植片を正方形のメッシュに移植し（プレート１枚あたり３０〜４０個）、浸透圧培地上に約３０〜４５分間移植し、次にビーミングプレート（beaming plate）に移植する（例えば、ＰＣＴ公報WO/0138514及び米国特許第５，２４０，８４２号を参照されたい）。
【０１７０】
植物細胞における本発明の遺伝子に設計されたＤＮＡ構築物を、エアロゾルビームアクセレレーターを使用して、ＰＣＴ公報ＷＯ／０１３８５１４に本質的に記載されたような条件を用いて植物組織中に加速する。ビーム処理の後で、胚を浸透圧培地上で約３０分間インキュベーションし、２５℃の暗条件でインキュベーション培地上に一晩蒔く。ビーム処理された外植片を過度に損傷することを避けるために、回復培地に移植する前にそれらを少なくとも２４時間インキュベーションする。次に、胚を２５℃の暗条件で約５日間回復期培地上に広げ、次に選択培地に移植する。利用される特定の選択の性質及び特徴に応じて外植片を最大８週間選択培地中でインキュベーションする。選択期間の後に、結果として生じたカルスを成熟体細胞胚の形成が観察されるまで胚成熟培地に移植する。次に、結果として生じた成熟体細胞胚を低光量下に置き、当技術分野において公知の方法によって再生過程を開始させる。結果として生じたシュートを発根培地上で発根させ、結果として生じた植物を育苗ポットに移植し、トランスジェニック植物として繁殖させる。
【０１７１】
材料
【０１７２】
【表１９】
【０１７３】
溶液のｐＨを１Ｎ ＫＯＨ／１Ｎ ＫＣｌでｐＨ５．８に調整し、Gelrite（Sigma）を最大３g/Lの濃度で添加し、培地をオートクレーブにかける。５０℃に冷却後に、硝酸銀（Phytotechnology Labs）の５mg/ml原液を２ml/Lとなるように添加する。
【０１７４】
実施例１８． Agrobacterium介在性トランスフォーメーションによる植物細胞における本発明の遺伝子のトランスフォーメーション
穂を最良には受粉の８〜１２日後に収集する。穂から胚を単離し、大きさが０．８〜１．５mmの胚がトランスフォーメーションに使用するために好ましい。適切なインキュベーション培地上にその胚を胚盤側を上にして蒔き、２５℃の暗条件で一晩インキュベーションする。しかしながら、胚を一晩インキュベーションすること自体は必要ない。胚を、Ｔｉプラスミド介在性伝達のために適切なベクターを有するAgrobacterium株と約５〜１０分間接触させ、次に共培養培地上に約３日間（２５℃の暗条件）蒔く。共培養後に、外植片を回復期培地に約５日間（２５℃の暗条件）移植する。利用する特定の選択の性質及び特徴に依存して、外植片を選択培地中で最大８週間インキュベーションする。選択期間の後に、結果として生じたカルスを成熟体細胞胚の形成が観察されるまで胚成熟培地に移植する。次に、結果として生じた成熟体細胞胚を低光量下に置き、当技術分野で公知のような再生過程を開始させる。
【０１７５】
本明細書において言及された全ての刊行物及び特許出願は、本発明が属する技術分野の技術者の技術レベルを示している。全ての刊行物及び特許出願は、各個別の刊行物又は特許出願が具体的かつ個別に参照により組み入れられると示された場合と同程度に参照により本明細書に組み入れられる。
【０１７６】
理解を明瞭にするために、前述の発明を例証及び実例として幾分詳細に説明したものの、添付の特許請求の範囲内である変化又は改変を実施できることが明らかである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
変異Ｃｒｙ３アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むリコンビナント核酸分子であって、該変異体が、表１６に挙げられるアミノ酸置換に対応する１個又は複数個のアミノ酸置換を含み、かつ殺虫活性を有する、リコンビナント核酸分子。
【請求項２】
変異体の殺虫活性が、配列番号２の殺虫活性に比べて改善されている、請求項１記載のリコンビナント核酸分子。
【請求項３】
殺虫活性が、Coleoptera害虫に対する、請求項１又は２記載のリコンビナント核酸分子。
【請求項４】
殺虫活性が、ルートワーム害虫に対する、請求項１〜３のいずれか記載のリコンビナント核酸分子。
【請求項５】
ルートワームが、ウエスタンコーンルートワーム又はサザンコーンルートワームである、請求項１〜４のいずれか記載のリコンビナント核酸分子。
【請求項６】
ヌクレオチド配列が、植物における発現のために設計された合成配列である、請求項１〜５のいずれか記載のリコンビナント核酸分子。
【請求項７】
ヌクレオチド配列が、植物細胞における該ヌクレオチド配列の発現を指令可能なプロモーターに作動可能に連結している、請求項１〜６のいずれか記載のリコンビナント核酸分子。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項９】
異種ポリペプチドをコードする核酸分子をさらに含む、請求項８記載のベクター。
【請求項１０】
請求項８又は９記載のベクターを含むホスト細胞。
【請求項１１】
細菌ホスト細胞である、請求項１０記載のホスト細胞。
【請求項１２】
植物ホスト細胞である、請求項１０記載のホスト細胞。
【請求項１３】
請求項１２記載のホスト細胞を含むトランスジェニック植物。
【請求項１４】
トウモロコシ、ソルガム、コムギ、キャベツ、ヒマワリ、トマト、アブラナ科植物、コショウ、ジャガイモ、ワタ、イネ、ダイズ、テンサイ、サトウキビ、タバコ、オオムギ、及びアブラナから成る群より選択される、請求項１３記載のトランスジェニック植物。
【請求項１５】
請求項１〜７のいずれか記載の核酸分子を含む種子。
【請求項１６】
変異Ｃｒｙ３アミノ酸配列を含むリコンビナントポリペプチドであって、該変異体が、表１６に挙げられるアミノ酸置換に対応する１個又は複数個のアミノ酸置換を含み、かつ殺虫活性を有する、リコンビナントポリペプチド。
【請求項１７】
変異体の殺虫活性が、配列番号２の殺虫活性に比べて改善されている、請求項１６記載のリコンビナントポリペプチド。
【請求項１８】
殺虫活性が、Coleoptera害虫に対する、請求項１６又は１７記載のリコンビナントポリペプチド。
【請求項１９】
殺虫活性が、ルートワーム害虫に対する、請求項１８記載のリコンビナントポリペプチド。
【請求項２０】
ルートワームが、ウエスタンコーンルートワーム又はサザンコーンルートワームである、請求項１９記載のリコンビナントポリペプチド。
【請求項２１】
異種アミノ酸配列をさらに含む、請求項１６〜２０のいずれか記載のポリペプチド。
【請求項２２】
請求項１６記載のポリペプチドを含む組成物。
【請求項２３】
粉末、細粉、ペレット、顆粒、スプレー、エマルション、コロイド、及び溶液から成る群より選択される、請求項２２記載の組成物。
【請求項２４】
Bacillus thuringiensis細胞培養物の乾燥、凍結乾燥、均質化、抽出、濾過、遠心分離、沈降、又は濃縮によって調製される、請求項２２又は２３記載の組成物。
【請求項２５】
約１重量％〜約９９重量％のポリペプチドを含む、請求項２２〜２４のいずれか記載の組成物。
【請求項２６】
Coleoptera害虫集団を請求項１６記載の殺虫有効量のポリペプチドと接触させることを含む、該集団を防除する方法。
【請求項２７】
Coleoptera害虫を請求項１６記載の殺虫有効量のポリペプチドと接触させること、又は該害虫に殺虫有効量の該ポリペプチドを摂食させることを含む、該害虫を死滅させる方法。
【請求項２８】
請求項８記載のベクターを含むホスト細胞を培養することを含む、Coleoptera害虫に対して殺虫活性を有するポリペプチドを産生させる方法。
【請求項２９】
変異Ｃｒｙ３アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を含むＤＮＡ構築物がゲノムに安定的に組み入れられた植物であって、該変異体が、表１６に挙げられるアミノ酸置換に対応する１個又は複数個のアミノ酸置換を含み、かつ殺虫活性を有する、植物。
【請求項３０】
変異体の殺虫活性が、配列番号２の殺虫活性に比べて改善されている、請求項２９記載の植物。
【請求項３１】
殺虫活性が、Coleoptera活性である、請求項２９又は３０記載の植物。
【請求項３２】
活性が、ルートワーム害虫に対する、請求項３１記載の植物。
【請求項３３】
ルートワームが、ウエスタンコーンルートワーム又はサザンコーンルートワームである、請求項３２記載の植物。
【請求項３４】
植物が、植物細胞である、請求項２９〜３３のいずれか記載の植物。
【請求項３５】
変異Ｃｒｙ３アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を植物又はその細胞において発現させることを含む、植物を害虫から保護する方法であって、該変異体が、表１６に挙げられるアミノ酸置換に対応する１個又は複数個のアミノ酸置換を含み、かつ殺虫活性を有する、方法。
【請求項３６】
変異体の殺虫活性が、配列番号２の殺虫活性に比べて改善されている、請求項３５記載の方法。
【請求項１】
変異Ｃｒｙ３アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むリコンビナント核酸分子であって、該変異体が、表１６に挙げられるアミノ酸置換に対応する１個又は複数個のアミノ酸置換を含み、かつ殺虫活性を有する、リコンビナント核酸分子。
【請求項２】
変異体の殺虫活性が、配列番号２の殺虫活性に比べて改善されている、請求項１記載のリコンビナント核酸分子。
【請求項３】
殺虫活性が、Coleoptera害虫に対する、請求項１又は２記載のリコンビナント核酸分子。
【請求項４】
殺虫活性が、ルートワーム害虫に対する、請求項１〜３のいずれか記載のリコンビナント核酸分子。
【請求項５】
ルートワームが、ウエスタンコーンルートワーム又はサザンコーンルートワームである、請求項１〜４のいずれか記載のリコンビナント核酸分子。
【請求項６】
ヌクレオチド配列が、植物における発現のために設計された合成配列である、請求項１〜５のいずれか記載のリコンビナント核酸分子。
【請求項７】
ヌクレオチド配列が、植物細胞における該ヌクレオチド配列の発現を指令可能なプロモーターに作動可能に連結している、請求項１〜６のいずれか記載のリコンビナント核酸分子。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項９】
異種ポリペプチドをコードする核酸分子をさらに含む、請求項８記載のベクター。
【請求項１０】
請求項８又は９記載のベクターを含むホスト細胞。
【請求項１１】
細菌ホスト細胞である、請求項１０記載のホスト細胞。
【請求項１２】
植物ホスト細胞である、請求項１０記載のホスト細胞。
【請求項１３】
請求項１２記載のホスト細胞を含むトランスジェニック植物。
【請求項１４】
トウモロコシ、ソルガム、コムギ、キャベツ、ヒマワリ、トマト、アブラナ科植物、コショウ、ジャガイモ、ワタ、イネ、ダイズ、テンサイ、サトウキビ、タバコ、オオムギ、及びアブラナから成る群より選択される、請求項１３記載のトランスジェニック植物。
【請求項１５】
請求項１〜７のいずれか記載の核酸分子を含む種子。
【請求項１６】
変異Ｃｒｙ３アミノ酸配列を含むリコンビナントポリペプチドであって、該変異体が、表１６に挙げられるアミノ酸置換に対応する１個又は複数個のアミノ酸置換を含み、かつ殺虫活性を有する、リコンビナントポリペプチド。
【請求項１７】
変異体の殺虫活性が、配列番号２の殺虫活性に比べて改善されている、請求項１６記載のリコンビナントポリペプチド。
【請求項１８】
殺虫活性が、Coleoptera害虫に対する、請求項１６又は１７記載のリコンビナントポリペプチド。
【請求項１９】
殺虫活性が、ルートワーム害虫に対する、請求項１８記載のリコンビナントポリペプチド。
【請求項２０】
ルートワームが、ウエスタンコーンルートワーム又はサザンコーンルートワームである、請求項１９記載のリコンビナントポリペプチド。
【請求項２１】
異種アミノ酸配列をさらに含む、請求項１６〜２０のいずれか記載のポリペプチド。
【請求項２２】
請求項１６記載のポリペプチドを含む組成物。
【請求項２３】
粉末、細粉、ペレット、顆粒、スプレー、エマルション、コロイド、及び溶液から成る群より選択される、請求項２２記載の組成物。
【請求項２４】
Bacillus thuringiensis細胞培養物の乾燥、凍結乾燥、均質化、抽出、濾過、遠心分離、沈降、又は濃縮によって調製される、請求項２２又は２３記載の組成物。
【請求項２５】
約１重量％〜約９９重量％のポリペプチドを含む、請求項２２〜２４のいずれか記載の組成物。
【請求項２６】
Coleoptera害虫集団を請求項１６記載の殺虫有効量のポリペプチドと接触させることを含む、該集団を防除する方法。
【請求項２７】
Coleoptera害虫を請求項１６記載の殺虫有効量のポリペプチドと接触させること、又は該害虫に殺虫有効量の該ポリペプチドを摂食させることを含む、該害虫を死滅させる方法。
【請求項２８】
請求項８記載のベクターを含むホスト細胞を培養することを含む、Coleoptera害虫に対して殺虫活性を有するポリペプチドを産生させる方法。
【請求項２９】
変異Ｃｒｙ３アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を含むＤＮＡ構築物がゲノムに安定的に組み入れられた植物であって、該変異体が、表１６に挙げられるアミノ酸置換に対応する１個又は複数個のアミノ酸置換を含み、かつ殺虫活性を有する、植物。
【請求項３０】
変異体の殺虫活性が、配列番号２の殺虫活性に比べて改善されている、請求項２９記載の植物。
【請求項３１】
殺虫活性が、Coleoptera活性である、請求項２９又は３０記載の植物。
【請求項３２】
活性が、ルートワーム害虫に対する、請求項３１記載の植物。
【請求項３３】
ルートワームが、ウエスタンコーンルートワーム又はサザンコーンルートワームである、請求項３２記載の植物。
【請求項３４】
植物が、植物細胞である、請求項２９〜３３のいずれか記載の植物。
【請求項３５】
変異Ｃｒｙ３アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を植物又はその細胞において発現させることを含む、植物を害虫から保護する方法であって、該変異体が、表１６に挙げられるアミノ酸置換に対応する１個又は複数個のアミノ酸置換を含み、かつ殺虫活性を有する、方法。
【請求項３６】
変異体の殺虫活性が、配列番号２の殺虫活性に比べて改善されている、請求項３５記載の方法。
【図１】
【図２】
【図２】
【公表番号】特表２０１２−５１６７００（Ｐ２０１２−５１６７００Ａ）
【公表日】平成２４年７月２６日（２０１２．７．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５４９２７４（Ｐ２０１１−５４９２７４）
【出願日】平成２２年２月５日（２０１０．２．５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０２３２９１
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０９１２３０
【国際公開日】平成２２年８月１２日（２０１０．８．１２）
【出願人】（５１０３３０３８９）アテニックス・コーポレーション (4)
【氏名又は名称原語表記】ＡＴＨＥＮＩＸ ＣＯＲＰＯＲＡＴＯＮ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年７月２６日（２０１２．７．２６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年２月５日（２０１０．２．５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０２３２９１
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０９１２３０
【国際公開日】平成２２年８月１２日（２０１０．８．１２）
【出願人】（５１０３３０３８９）アテニックス・コーポレーション (4)
【氏名又は名称原語表記】ＡＴＨＥＮＩＸ ＣＯＲＰＯＲＡＴＯＮ
【Ｆターム（参考）】
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