本発明は、タンパク質等の荷電分子をそれらの等電点（ｐＩ）によって分離する新規な方法を提供し、該荷電分子を分離するために採用されるシステムおよびバッファー組成物を含む。本発明は、さらに、上記のクロマトグラフ方法に、実質的に同一のｐＩを示す複数荷電分子の分離を、バッファーのｐＫ_ａおよび溶離した荷電分子のｐＩの両方をそれらがイオン交換カラムを通過する間に変化させることによって可能にする改良法を提供する。

【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願
本出願は、両方ともその全体が参照により本明細書に組み込まれている米国仮出願第６０／４９８２８７号（２００３年８月２８日出願）および米国仮出願第６０／４７０８８９号（２００３年５月１６日出願）の利益を主張するものである。
【０００２】
発明の背景
本明細書に参照として載せているすべての出版物および特許出願は、それぞれの個別の出版物または特許出願が、あたかも参照により組み込まれて具体的かつ個別に示されたものと同程度に参照により組み込まれる。
【０００３】
１．発明の分野
本発明は、外部勾配クロマトクロマトグラフィーに関する。より詳しくは、本発明は、タンパク質等の荷電分子をそれらの等電点（ｐＩ）によって分離する新規な方法に関するものであり、該荷電分子を分離するために採用されるシステムおよびバッファー組成物を含む。
【０００４】
２．関連技術の説明
クロマトフォーカシングは、最初にＳｌｕｙｔｅｒｍａｎと共同研究者によって発表された陰イオン交換クロマトグラフィーの一形態である(例えば、L. A. AE SluytermanおよびO. Elgersma、Journal of Chromatography A、150(1)、1978、17-30；L. A. AE SluytermanおよびJ. Wijdenes、Journal of Chromatography A、150(1)、1978、31-44；L.A. AE. SluytermanおよびJ. Wijdenes、Journal of Chromatography A、206 (3)、1981、429-440；L. A. AE. SluytermanおよびJ. Wijdenes、Journal of Chromatography A、206 (3)、1981、441-447；L. A. AE. SluytermanおよびC. Kooistra、Journal of Chromatography A、470 (2)、1989、317-326を参照）。クロマトフォーカシングにおいては、保持されたｐＨ勾配が、溶離溶液中のＰｏｌｙｂｕｆｆｅｒの種類またはその他のバッファーの種類が、弱陰イオン交換樹脂の表面の官能基を滴定するときクロマトグラフカラム中に自動的に生じる。
【０００５】
クロマトフォーカシングに対する最初のＳｌｕｙｔｅｒｍａｎの最初のアプローチの多数の変形が公開されている。これらの技術のほとんどは、意図された内部ｐＨ勾配の一点において開始バッファーにより弱イオン交換樹脂カラムを予め平衡状態にする方法に基づいている。一般的にはタンパク質である荷電分子の試料は、カラムの入口から導入する。初期ｐＨにおいて、分離すべき分子はすべて、そのイオン交換樹脂と反対の電荷をもち、したがってそれに直ちに結合する。以下の議論において、分離すべき分子は、タンパク質と呼ぶが、それは好ましい態様として解釈すべきである。次に、その樹脂を望ましい最終ｐＨにおいて多成分バッファーからなる溶液に含浸させる。弱イオン交換樹脂に対するバッファーの種類による結合親和力の変動によって、保持ｐＨ勾配は、カラム内に自動的に生じる。弱陰イオン交換樹脂での勾配は、カラムの長さに沿ったｐＨの上昇勾配（弱陽イオン交換樹脂における下降勾配とは逆）であるが、経時的に単調に下降する（弱陽イオン交換樹脂については上昇する）ｐＨ勾配である。最終ｐＨのバッファーがカラムに入るとき、そのｐＨは、結合したそのタンパク質の等電点（ｐＩ）より低いために、分離過程が始まり、タンパク質の即時の開放を引き起こす。そのタンパク質は、次いで、それが、タンパク質のｐＩより高い漸進的に変化する保持ｐＨ勾配のｐＨに達するまでカラムの中を移動し、そこでタンパク質はイオン交換樹脂に再結合する。タンパク質の溶離は、溶離液の最前部の単調に減少するｐＨが、タンパク質のｐＩに再び達したときに再開し、そのタンパク質は、イオン交換樹脂への結合を中止する。そのタンパク質は、それがそのｐＩより高いｐＨに遭遇し、再び再結合するまでもう一度カラムを下方に移動する。この過程は、タンパク質がそのｐＩにおけるカラムから出てくるまで連続して繰り返される。主帯域の後に停滞するタンパク質分子は、それが、イオン交換樹脂に結合しているバッファーの基と同じ符号の電荷を有するｐＨのところにあるであろう。この状態は、完全に同じように荷電したタンパク質と、イオン交換樹脂に結合しているバッファーの基との間の静電反発力により、タンパク質がその帯域それ自身より素早くカラムを下に移動する原因となる。同様に、主帯域の前に拡散しているタンパク質分子は、イオン交換樹脂に対する結合親和力が増大することになり、その結果、主帯域より遅れて移動するであろう。全体の結果は、最適条件下では、ｐＩが０．０２ｐＨ単位程のわずかに違うだけのタンパク質の分離を可能にする強力な集束作用である。
【０００６】
最も広範に使用されるクロマトフォーカシング技術の有効なｐＨ範囲は、市販の特別のＰｏｌｙｂｕｆｆｅｒ（例えば、Ｐｈａｒｍａｌｙｔｅ ８−１０．５、Ｐｏｌｙｂｕｆｆｅｒ ９６およびＰｏｌｙｂｕｆｆｅｒ ７４）および弱交換樹脂（例えば、Ｍｏｎｏ Ｐ、ＰＢＥ９４およびＰＢＥ１１８）を利用し、約３ｐＨ単位、一般的には、９から６または７から４である。Ｐｏｌｙｂｕｆｆｅｒは、高価であり、タンパク質に十分に強く結合し、精製したタンパク質からそれらを除去することが重大な問題となる。その結果、この潜在的に並外れて価値のある高速の精製技術は、研究室の精製技術に限定されており、大量の工業的タンパク質精製においてはほとんど実際の用途が見出せない。
【０００７】
いくつかのグループが、溶出液としての比較的単純なバッファー溶液によりこれらの制限を克服することを試みたが、依然として特別に設計したかまたは普通に得られる弱陰イオン交換樹脂を採用している。これらのシステムで最も成功しているもの（Loganら、Biotechnology and Bioengineering, 62 (2), 1999）は、９．５の高さの初期ｐＨの弱陰イオンカラム中に発生する保持性勾配を生ずる下は５．０の低さのｐＨまで有用な容易に除去できるバッファー成分である通常の２成分溶出バッファーを利用している。このシステムは、十分に良く作動し、記載されているｐＨ範囲を通して高容量のクロマトフォーカシングを可能にすることを示す。しかしながら、Ｌｏｇａｎの方法においては、発生する勾配の外部制御は存在しない。
【０００８】
外部勾配および弱陰イオンカラムと組み合わせて少数の安価なバッファーを使用することを強く勧める数少ない出版物は、３．５単位の最大有効ｐＨ勾配範囲を報告しているが、それはＬｏｇａｎらにより報告されているものより２０％少ない（例えば、Yansheng LiuおよびDavid J. Anderson、Journal of Chromatography A、762 (1-2)、1997、207-217；Yansheng LiuおよびDavid J. Anderson、Journal of Chromatography A、762 (1-2)、1997、47-54；Lian ShanおよびDavid J. Anderson、Journal of Chromatography A、909 (2)、2001、191-205；Ronald C. Batesら、Journal of Chromatography A、890(1)、2000、25-36； Xuezhen Kang ら、Journal of Chromatography A、890(1)、2000、37-43；Douglas D. Freyら、米国特許第５８５１４００号；Jan Walther-RasmussenおよびNiels Hoiby、Journal of Chromatography B、746 (2)、2000、161-172を参照）。
【０００９】
発明の概要
本発明の一態様は、タンパク質等の荷電分子をそれらの等電点によりクロマトグラフ分離する新規な方法を提供することである。本発明の第２の目的は、自動化されたフィードバック制御の外部ｐＨ勾配発生システムを備える低圧または高圧液体クロマトグラフィーと共に使用する新規なクロマトグラフィーシステムを提供することである。
【００１０】
本発明の別の態様においては、異なる等電点を有する荷電分子をクロマトグラフィーにより分離する方法が提供され、その方法は
陰イオン交換吸着剤が荷電分子と反対の電荷をもつ初期ｐＨで、少なくとも３種のバッファー成分を含む溶媒を含浸した陰イオン交換吸着剤に、分離すべき荷電分子を加えるステップと、
第１の貯蔵器からポンプで送出される少なくとも３種のバッファー成分を含有する初期ｐＨの溶液を、第２の貯蔵器からポンプで送出される初期ｐＨとは前記少なくとも３種のバッファー成分を含有するｐＨの異なる溶液との連続混合で形成される、時間依存性のｐＨを形成する溶離液を、前記陰イオン交換吸着剤に供給するステップであって、その混合割合を、保持されていないｐＨ勾配を外部で定めた傾きで維持するために変動させるステップと、
それぞれが陰イオン交換吸着剤からその実効等電点において別々に溶離する荷電分子を収集するステップとを含む。
【００１１】
本発明の別の態様においては、異なる等電点を有する荷電分子をクロマトグラフィーにより分離する方法が提供され、その方法は
陽イオン交換吸着剤が荷電分子と反対の電荷をもつ初期ｐＨで、バッファー成分を含む溶媒を含浸した陽イオン交換吸着剤に、分離すべき荷電分子を加えるステップと、
第１の貯蔵器からポンプで送出されるバッファー成分を含有する初期ｐＨの溶液を、第２の貯蔵器からポンプで送出される初期ｐＨとは異なるｐＨのバッファー成分を含有する溶液との連続混合で形成される、時間依存性のｐＨを有する溶離液を、前記陽イオン交換吸着剤に供給するステップであって、その混合割合を、保持されていないｐＨ勾配を維持するために外部で定められた傾きで変動させるステップと、
それぞれが陽イオン交換吸着剤からその実効等電点において別々に溶離する荷電分子を収集するステップとを含む。
【００１２】
本発明の別の態様においては、異なる等電点を有する荷電分子をクロマトグラフィーにより分離するクロマトフォーカシング方法が提供され、その方法は
陰イオン交換吸着剤が荷電分子と反対の電荷をもつ最高の初期ｐＨで、少なくとも３種のバッファー成分を含む溶媒を含浸した陰イオン交換吸着剤に、分離すべき荷電分子を加えるステップと、
第１の貯蔵器からポンプで送出される初期ｐＨのさらなるバッファー成分があるかまたはない前記の少なくとも３種のバッファー成分を含有する初期ｐＨの溶液を、第２の貯蔵器からポンプで送出される異なるｐＨのさらなるバッファー成分があるかまたはない前記の少なくとも３種のバッファー成分を含有する溶液との連続混合で形成される、時間依存性のｐＨを有する溶離液を、前記陰イオン交換吸着剤に供給するステップであって、その混合割合を、保持されていないｐＨ勾配を維持するために外部で定められた傾きで変動させるステップと、
それぞれが陽イオン交換吸着剤からその実効等電点において別々に溶離する荷電分子を収集するステップとを含む。
【００１３】
本発明の別の態様においては、異なる等電点を有する荷電分子をクロマトグラフィーにより分離する逆クロマトフォーカシング方法が提供され、その方法は
陽イオン交換吸着剤が荷電分子と反対の電荷をもつ初期ｐＨで、バッファー成分を含む溶媒を含浸した陽イオン交換吸着剤に、分離すべき荷電分子を加えるステップと、
第１の貯蔵器からポンプで送出される初期ｐＨのさらなるバッファー成分があるかまたはない前記のバッファー成分を含有する初期ｐＨの溶液を、第２の貯蔵器からポンプで送出される初期ｐＨとは異なるｐＨのさらなるバッファー成分があるかまたはない前記のバッファー成分を含有する溶液との連続混合で形成される、時間依存性のｐＨを有する溶離液を、前記陽イオン交換吸着剤に供給するステップであって、その混合割合を、保持されていないｐＨ勾配を維持するために外部で定められた傾きで変動させるステップと、
それぞれが陽イオン交換吸着剤からその実効等電点において別々に溶離する荷電分子を収集するステップとを含む。
【００１４】
本発明のさらに別の態様においては、異なる等電点を有する荷電分子をクロマトグラフィーにより分離する方法が提供され、その方法は
イオン交換吸着剤に、前記荷電分子を温度Ｔ_０で加えるステップと、
前記イオン交換吸着剤に、初期ｐＨのバッファー成分を含む溶媒を含浸させるステップ（その場合イオン交換吸着剤は、荷電分子と反対の電荷をもつ）と、
イオン交換吸着剤の温度をＴ_１に変化させるステップと、
第１の貯蔵器からポンプで送出されるバッファー成分を含有する初期ｐＨの溶液を、第２の貯蔵器からポンプで送出される初期ｐＨとは異なるｐＨの前記のバッファー成分を含有する溶液との連続混合で形成される、時間依存性のｐＨを有する溶離液を、前記イオン交換吸着剤に供給するステップであって、その混合割合を、保持されていないｐＨ勾配を維持するために外部で定められた傾きで変動させるステップと、
それぞれがイオン交換吸着剤からその実効等電点において別々に溶離する荷電分子を収集するステップとを含み、
ここで、Ｔ_０とＴ_１の間の差が０℃と８０℃の間である。
【００１５】
本発明の別の態様においては、異なる等電点を有する荷電分子をクロマトグラフィーにより分離する方法が提供され、その方法は
イオン交換吸着剤に、温度Ｔ_０において、初期ｐＨのバッファー成分を含む溶媒を含浸させるステップ（その場合イオン交換吸着剤は、分離すべき荷電分子と反対の電荷をもつ）と、
イオン交換吸着剤の温度をＴ_１に変化させるステップと、
分離すべき荷電分子をイオン交換吸着剤に加えるステップと、
第１の貯蔵器からポンプで送出されるバッファー成分を含有する初期ｐＨの溶液を、第２の貯蔵器からポンプで送出される初期ｐＨとは異なるｐＨの前記のバッファー成分を含有する溶液との連続混合で形成される、時間依存性のｐＨを有する溶離液を、前記イオン交換吸着剤に供給するステップであって、その混合割合を、保持されていないｐＨ勾配を維持するために外部で定められた傾きで変動させるステップと、
それぞれがイオン交換吸着剤からその実効等電点において別々に溶離する荷電分子を収集するステップとを含み、
ここで、Ｔ_０とＴ_１の間の差が０℃と８０℃の間である。
【００１６】
本発明の別の態様においては、異なる等電点を有する荷電分子をクロマトグラフィーにより分離する複合外部勾配クロマトフォーカシング方法が提供され、その方法は、
陰イオン交換吸着剤が分離すべき荷電分子と反対の電荷をもつ最高の初期ｐＨで、少なくとも１種のバッファー成分を含む溶媒を含浸した陰イオン交換吸着剤に、分離すべき荷電分子を適用して結合させるステップと、
陽イオン交換吸着剤を陰イオン交換吸着剤の後に直列に接続し、両方の交換体を最高の初期ｐＨで平衡化させるステップと、
第１の貯蔵器からポンプで送出される少なくとも１種のバッファー成分を含有する初期ｐＨの溶液を、第２の貯蔵器からポンプで送出される前記少なくとも１種のバッファー成分を含有するｐＨの異なる溶液との連続混合で形成される時間依存性のｐＨを有する溶離液を、前記陰イオン交換吸着剤に供給するステップであって、その混合比率を、保持されていないｐＨ勾配を外部で定めた傾きで維持するために変動させるステップと、
荷電分子の溶離であって、それぞれが、所定の最小ｐＨに達するまでその実効等電点で陰イオン交換吸着剤から別々に溶離し、
荷電分子を含有する陰イオン交換吸着剤から得られた溶出液がさらに分離されるように陽イオン交換吸着剤中に導き、かつ
正帯電している荷電分子を陽イオン交換吸着剤に所定の最小ｐＨに達するまで結合させるステップと、
陰イオン交換吸着剤を取り除くステップと、
陽イオン交換吸着剤を所定の最小ｐＨから所定の最大ｐＨまで展開するように含浸させてｐＨ勾配を逆転させるステップと、
それぞれが別々に所定の最大ｐＨに達するまでその実効等電点において陽イオン交換吸着剤から溶離する荷電分子を収集するステップとを含む。
【００１７】
本発明の別の態様においては、異なる等電点を有する荷電分子をクロマトグラフィーにより分離する複合外部勾配クロマトフォーカシング方法が提供され、その方法は、
最低の初期ｐＨの少なくとも１種のバッファー成分を含む溶媒を含浸した陽イオン交換吸着剤（該陽イオン交換吸着剤は、分離すべき荷電分子と反対の電荷をもつ）に、分離すべき荷電分子を適用して結合させるステップと、
陰イオン交換吸着剤を陽イオン交換吸着剤の後に直列に接続し、両方の交換体を最低の初期ｐＨで平衡化させるステップと、
第１の貯蔵器からポンプで送出される少なくとも１種のバッファー成分を含有する初期ｐＨの溶液を、第２の貯蔵器からポンプで送出される前記少なくとも１種のバッファー成分を含有するｐＨの異なる溶液との連続混合で形成される時間依存性のｐＨを有する溶離液を、前記陽イオン交換吸着剤に供給するステップであって、その混合比率を、保持されていないｐＨ勾配を外部で定めた傾きで維持するために変動させるステップと、
荷電分子の溶離であって、それぞれが、所定の最大ｐＨに達するまでその実効等電点で陽イオン交換吸着剤から別々に溶離するステップと、
荷電分子を含有する陽イオン交換吸着剤から得られた溶出液がさらに分離されるように陰イオン交換吸着剤中に導き、かつ
負帯電している荷電分子を陰イオン交換吸着剤に所定の最小ｐＨに達するまで結合させるステップと、
陽イオン交換吸着剤を取り除くステップと、
陰イオン交換吸着剤を所定の最大ｐＨから所定の最小ｐＨまで展開するように含浸させてｐＨ勾配を逆転させるステップと、
それぞれが別々に所定の最大ｐＨに達するまでその実効等電点において陰イオン交換吸着剤から溶離する荷電分子を収集するステップとを含む。
【００１８】
本発明の別の態様においては、異なる等電点を有する荷電分子をクロマトグラフィーにより分離する複合外部勾配クロマトフォーカシング方法が提供され、その方法は、
分離すべき荷電分子を、後に陽イオン交換吸着剤が直列に接続されている陰イオン交換吸着剤に適用し、その結果、その２つの吸着剤が、少なくとも１つの初期ｐＨのバッファー成分を含む溶媒により含浸され、そこでそれぞれの分離すべき荷電分子が、３つの荷電の種類、すなわち、初期ｐＨより低い見掛けのｐＩを有する荷電分子は負に帯電したもの、初期ｐＨで陰イオン交換吸着剤または陽イオン交換吸着剤のいずれにも結合できない荷電分子は中性のもの、初期ｐＨより高い見掛けのｐＩを有する荷電分子は正に帯電したものの１つに分類されるステップと、
初期ｐＨで負に帯電した荷電分子を陰イオン交換吸着剤に結合させるステップと、
初期ｐＨで正に帯電した荷電分子を陽イオン交換吸着剤に結合させるステップと、
初期ｐＨで陽イオン交換吸着剤または陰イオン交換吸着剤のいずれにも結合できない荷電分子のものを収集するステップと、
陰イオン交換吸着剤と陽イオン交換吸着剤との初期ｐＨにおける接続を互いから切り離すステップと、
第１の貯蔵器からポンプで送出される少なくとも１種のバッファー成分を含有する初期ｐＨの溶液を、第２の貯蔵器からポンプで送出される前記少なくとも１種のバッファー成分を含有するｐＨの異なる溶液との連続混合で形成される、初期ｐＨに始まる時間依存的に減少するｐＨを有する溶離液を、前記陰イオン交換吸着剤に供給するステップであって、その混合比率を、保持されていないｐＨ勾配を外部で定めた傾きで維持するために変動させるステップと、
それぞれが最終の最小ｐＨに達するまでその実効等電点において陰イオン交換吸着剤から溶離する荷電分子を収集するステップと、
第１の貯蔵器からポンプで送出される少なくとも１種のバッファー成分を含有する初期ｐＨの溶液を、第２の貯蔵器からポンプで送出される前記少なくとも１種のバッファー成分を含有するｐＨの異なる溶液との連続混合で形成される、初期ｐＨに始まる時間依存的に増加するｐＨを有する溶離液を、前記陽イオン交換吸着剤に供給するステップであって、その混合比率を、保持されていないｐＨ勾配を外部で定めた傾きで維持するために変動させるステップと、
それぞれが最終の最大ｐＨに達するまでその実効等電点において陽イオン交換吸着剤から溶離する荷電分子を収集するステップとを含む。
【００１９】
本発明の別の態様においては、異なる等電点を有する荷電分子をクロマトグラフィーにより分離する複合外部勾配クロマトフォーカシング方法が提供され、その方法は、
分離すべき荷電分子を、後に陰イオン交換吸着剤が直列に接続されている陽イオン交換吸着剤に適用し、その結果、その２つの吸着剤が、少なくとも１つの初期ｐＨのバッファー成分を含む溶媒により含浸され、そこでそれぞれの分離すべき荷電分子が、３つの荷電の種類、すなわち、初期ｐＨより低い見掛けのｐＩを有する荷電分子は負に帯電したもの、初期ｐＨで陰イオン交換吸着剤または陽イオン交換吸着剤のいずれにも結合できない荷電分子は中性のもの、初期ｐＨより高い見掛けのｐＩを有する荷電分子は正に帯電したものの１つに分類されるステップと、
初期ｐＨで正に帯電した荷電分子を陽イオン交換吸着剤に結合させるステップと、
初期ｐＨで負に帯電した荷電分子を陰イオン交換吸着剤に結合させるステップと、
初期ｐＨで温度Ｔ_０で陰イオン交換吸着剤または温度Ｔ_１で陽イオン交換吸着剤のいずれにも結合できない荷電分子のものを収集するステップと、
陽イオン交換吸着剤と陰イオン交換吸着剤との初期ｐＨにおける接続を互いから切り離すステップと、
第１の貯蔵器からポンプで送出される少なくとも１種のバッファー成分を含有する初期ｐＨの溶液を、第２の貯蔵器からポンプで送出される前記少なくとも１種のバッファー成分を含有するｐＨの異なる溶液との連続混合で形成される、初期ｐＨに始まる時間依存的に増加するｐＨを有する溶離液を、前記陽イオン交換吸着剤に供給するステップであって、その混合比率を、保持されていないｐＨ勾配を外部で定めた傾きで維持するために変動させるステップと、
それぞれが最終の最大ｐＨに達するまでその実効等電点において陽イオン交換吸着剤から溶離する荷電分子を収集するステップと、
第１の貯蔵器からポンプで送出される少なくとも１種のバッファー成分を含有する初期ｐＨの溶液を、第２の貯蔵器からポンプで送出される前記少なくとも１種のバッファー成分を含有するｐＨの異なる溶液との連続混合で形成される、初期ｐＨに始まる時間依存的に減少するｐＨを有する溶離液を、前記陰イオン交換吸着剤に供給するステップであって、その混合比率を、保持されていないｐＨ勾配を外部で定めた傾きで維持するために変動させるステップと、
それぞれが最終の最小ｐＨに達するまでその実効等電点において陰イオン交換吸着剤から溶離する荷電分子を収集するステップとを含む。
【００２０】
本発明の別の態様においては、異なる等電点を有する荷電分子をクロマトグラフィーにより分離する複合外部勾配クロマトフォーカシング方法が提供され、その方法は、
最高の初期ｐＨおよび温度Ｔ_０における少なくとも１種のバッファー成分を含む溶媒を含浸した陰イオン交換吸着剤（該陰イオン交換吸着剤は、分離すべき荷電分子と反対の電荷をもつ）に、分離すべき荷電分子を適用して結合させるステップと、
陽イオン交換吸着剤を陰イオン交換吸着剤の後に直列に接続し、陽イオン交換吸着剤の温度をＴ_１に変化させ、両方の交換体を温度Ｔ_０の溶媒中で測定した最高の初期ｐＨで平衡化させるステップと、
第１の貯蔵器からポンプで送出される少なくとも１種のバッファー成分を含有する初期ｐＨの溶液を、第２の貯蔵器からポンプで送出される前記少なくとも１種のバッファー成分を含有するｐＨの異なる溶液との連続混合で形成される時間依存性のｐＨを有する溶離液を、前記陰イオン交換吸着剤に温度Ｔ_０で供給するステップであって、その混合比率を、保持されていないｐＨ勾配を外部で定めた傾きで維持するために変動させるステップと、
荷電分子の溶離であって、それぞれが、温度Ｔ_０で所定の最小ｐＨに達するまでその実効等電点で陰イオン交換吸着剤から別々に溶離するステップと、
荷電分子を含有する陰イオン交換吸着剤から得られた溶出液が、温度Ｔ_１でさらに分離されるように陽イオン交換吸着剤中に導くステップと、
正帯電している荷電分子を陽イオン交換吸着剤に温度Ｔ_０で所定の最小ｐＨに達するまで結合させるステップと、
陰イオン交換吸着剤を取り除くステップと、
陽イオン交換吸着剤を温度Ｔ_１における所定の最小ｐＨから所定の最大ｐＨまで展開するように含浸させてｐＨ勾配を逆転させるステップと、
それぞれが別々に温度Ｔ_１で所定の最大ｐＨに達するまでその実効等電点において陽イオン交換吸着剤から溶離する荷電分子を収集するステップとを含む。
【００２１】
本発明の別の態様においては、異なる等電点を有する荷電分子をクロマトグラフィーにより分離する複合外部勾配クロマトフォーカシング方法が提供され、その方法は、
最低の初期ｐＨおよび温度Ｔ_０における少なくとも１種のバッファー成分を含む溶媒を含浸した陽イオン交換吸着剤（該陽イオン交換吸着剤は、分離すべき荷電分子と反対の電荷をもつ）に、分離すべき荷電分子を適用して結合させるステップと、
陰イオン交換吸着剤を陽イオン交換吸着剤の後に直列に接続し、陰イオン交換吸着剤の温度をＴ_１に変化させ、両方の交換体を温度Ｔ_０の溶媒中で測定した最低の初期ｐＨで平衡化させるステップと、
第１の貯蔵器からポンプで送出される少なくとも１種のバッファー成分を含有する初期ｐＨの溶液を、第２の貯蔵器からポンプで送出される前記少なくとも１種のバッファー成分を含有するｐＨの異なる溶液との連続混合で形成される時間依存性のｐＨを有する溶離液を、前記陽イオン交換吸着剤に温度Ｔ_０で供給するステップであって、その混合比率を、保持されていないｐＨ勾配を外部で定めた傾きで維持するために変動させるステップと、
荷電分子の溶離であって、それぞれが、温度Ｔ_０で所定の最大ｐＨに達するまでその実効等電点で陽イオン交換吸着剤から別々に溶離するステップと、
荷電分子を含有する陽イオン交換吸着剤から得られた溶出液が、温度Ｔ_１でさらに分離されるように陰イオン交換吸着剤中に導くステップと、
負帯電している荷電分子を陰イオン交換吸着剤に温度Ｔ_０で所定の最大ｐＨに達するまで結合させるステップと、
陽イオン交換吸着剤を取り除くステップと、
陰イオン交換吸着剤を温度Ｔ_１における所定の最大ｐＨから所定の最小ｐＨまで展開するように含浸させてｐＨ勾配を逆転させるステップと、
それぞれが別々に温度Ｔ_１で所定の最小ｐＨに達するまでその実効等電点において陰イオン交換吸着剤から溶離する荷電分子を収集するステップとを含む。
【００２２】
本発明の別の態様においては、異なる等電点を有する荷電分子をクロマトグラフィーにより分離する複合外部勾配クロマトフォーカシング方法が提供され、その方法は、
最高の初期ｐＨおよび温度Ｔ_０における少なくとも１種のバッファー成分を含む溶媒を含浸した陰イオン交換吸着剤（該陰イオン交換吸着剤は、分離すべき荷電分子と反対の電荷をもつ）に、分離すべき荷電分子を適用して結合させるステップと、
陽イオン交換吸着剤を陰イオン交換吸着剤の後に直列に接続し、温度をＴ_１に変化させ、両方の交換体を温度Ｔ_１で変化させた最高の初期ｐＨにおいて平衡化させるステップと、
温度Ｔ_１の第１の貯蔵器からポンプで送出される少なくとも１種のバッファー成分を含有する初期ｐＨの溶液を、温度Ｔ_１の第２の貯蔵器からポンプで送出される前記少なくとも１種のバッファー成分を含有するｐＨの異なる溶液との連続混合で形成される時間依存性のｐＨを有する溶離液を、前記陰イオン交換吸着剤に温度Ｔ_１で供給するステップであって、その混合比率を、保持されていないｐＨ勾配を外部で定めた傾きで維持するために変動させるステップと、
荷電分子の溶離であって、それぞれが、温度Ｔ_１で所定の最小ｐＨに達するまでその実効等電点で陰イオン交換吸着剤から別々に溶離するステップと、
荷電分子を含有する陰イオン交換吸着剤から得られた溶出液が、温度Ｔ_１でさらに分離されるように陽イオン交換吸着剤中に導き、かつ
正帯電している荷電分子を陽イオン交換吸着剤に温度Ｔ_１で所定の最小ｐＨに達するまで結合させるステップと、
陰イオン交換吸着剤を取り除くステップと、
陽イオン交換吸着剤を温度Ｔ_１における所定の最小ｐＨから所定の最大ｐＨまで展開するように含浸させてｐＨ勾配を逆転させるステップと、
それぞれが別々に温度Ｔ_１で所定の最大ｐＨに達するまでその実効等電点において陽イオン交換吸着剤から溶離する荷電分子を収集するステップとを含む。
【００２３】
本発明の別の態様においては、異なる等電点を有する荷電分子をクロマトグラフィーにより分離する複合外部勾配クロマトフォーカシング方法が提供され、その方法は、
最低の初期ｐＨおよび温度Ｔ_０における少なくとも１種のバッファー成分を含む溶媒を含浸した陽イオン交換吸着剤（該陽イオン交換吸着剤は、分離すべき荷電分子と反対の電荷をもつ）に、分離すべき荷電分子を適用して結合させるステップと、
陰イオン交換吸着剤を陽イオン交換吸着剤の後に直列に接続し、温度をＴ_１に変化させ、両方の交換体を温度Ｔ_１で変化させた最高の初期ｐＨにおいて平衡化させるステップと、
温度Ｔ_１の第１の貯蔵器からポンプで送出される少なくとも１種のバッファー成分を含有する初期ｐＨの溶液を、温度Ｔ_１の第２の貯蔵器からポンプで送出される前記少なくとも１種のバッファー成分を含有するｐＨの異なる溶液との連続混合で形成される時間依存性のｐＨを有する溶離液を、前記陽イオン交換吸着剤に温度Ｔ_１で供給するステップであって、その混合比率を、保持されていないｐＨ勾配を外部で定めた傾きで維持するために変動させるステップと、
荷電分子の溶離であって、それぞれが、温度Ｔ_１で所定の最大ｐＨに達するまでその実効等電点で陽イオン交換吸着剤から別々に溶離するステップと、
荷電分子を含有する陽イオン交換吸着剤から得られた溶出液が、温度Ｔ_１でさらに分離されるように陰イオン交換吸着剤中に導くステップと、
負帯電している荷電分子を陰イオン交換吸着剤に温度Ｔ_１で所定の最大ｐＨに達するまで結合させるステップと、
陽イオン交換吸着剤を取り除くステップと、
陰イオン交換吸着剤を温度Ｔ_１における所定の最大ｐＨから所定の最小ｐＨまで展開するように含浸させてｐＨ勾配を逆転させるステップと、
それぞれが別々に温度Ｔ_１で所定の最小ｐＨに達するまで陰イオン交換吸着剤から溶離する荷電分子を収集するステップとを含む。
【００２４】
本発明の別の態様においては、異なる等電点を有する荷電分子をクロマトグラフィーにより分離する複合外部勾配クロマトフォーカシング方法が提供され、その方法は、
最高の初期ｐＨおよび温度Ｔ_０における少なくとも１種のバッファー成分を含む溶媒を含浸した陰イオン交換吸着剤（該陰イオン交換吸着剤は、分離すべき荷電分子と反対の電荷をもつ）に、分離すべき荷電分子を適用して結合させるステップと、
陽イオン交換吸着剤を陰イオン交換吸着剤の後に直列に接続し、陽イオン交換体の温度をＴ_１に変化させ、両方の交換体を温度Ｔ_０で測定した最高の初期ｐＨにおいて平衡化させるステップと、
第１の貯蔵器からポンプで送出される少なくとも１種のバッファー成分を含有する初期ｐＨの溶液を、第２の貯蔵器からポンプで送出される前記少なくとも１種のバッファー成分を含有するｐＨの異なる溶液との連続混合で形成される時間依存性のｐＨを有する溶離液を、前記陰イオン交換吸着剤に温度Ｔ_０で供給するステップであって、その混合比率を、保持されていないｐＨ勾配を外部で定めた傾きで維持するために変動させるステップと、
荷電分子の溶離であって、それぞれが、温度Ｔ_０で所定の最小ｐＨに達するまでその実効等電点で陰イオン交換吸着剤から別々に溶離するステップと、
荷電分子を含有する陰イオン交換吸着剤から得られた溶出液が、温度Ｔ_１でさらに分離されるように陽イオン交換吸着剤中に導くステップと、
正帯電している荷電分子を陽イオン交換吸着剤に温度Ｔ_０で所定の最小ｐＨに達するまで結合させるステップと、
陰イオン交換吸着剤を取り除くステップと、
陽イオン交換吸着剤を温度Ｔ_１における所定の最小ｐＨから所定の最高の初期ｐＨまで展開するように含浸させてｐＨ勾配を逆転させるステップと、
それぞれが別々に温度Ｔ_１で所定の最高の初期ｐＨに達するまでその実効等電点において陽イオン交換吸着剤から溶離する荷電分子を収集するステップと、
陽イオン交換樹脂の温度をＴ_２に変化させるステップと、
温度Ｔ_２における所定の最高の初期ｐＨから所定の２番目の最大ｐＨまで時を合わせて増大するｐＨ勾配を有する陽イオン交換吸着剤を含浸させ続けるステップと、
それぞれがその実効等電点において陽イオン交換吸着剤から、温度Ｔ_２において前記所定の２番目の最大ｐＨに達するまで別々に溶離する荷電分子を収集するステップと、
増大しつつあるｐＨ勾配を使用する溶離が後に続く段階的な温度の変化を繰り返し、それぞれが最終温度Ｔ_ｆに達するまで陽イオン交換吸着剤から時を合わせて別々に溶離する荷電分子を収集するステップと、
所定の最後から２番目の最大ｐＨから所定の究極の最大ｐＨまで時を合わせて増大するｐＨ勾配を有する陽イオン交換吸着剤の含浸を継続するステップと、
それぞれが別々に最終温度Ｔ_ｆで究極の最大ｐＨに達するまでその実効等電点において陽イオン交換吸着剤から溶離する荷電分子を収集するステップとを含む。
【００２５】
本発明の別の態様においては、異なる等電点を有する荷電分子をクロマトグラフィーにより分離する複合外部勾配クロマトフォーカシング方法が提供され、その方法は、
最低の初期ｐＨおよび温度Ｔ_０における少なくとも１種のバッファー成分を含む溶媒を含浸した陽イオン交換吸着剤（該陽イオン交換吸着剤は、分離すべき荷電分子と反対の電荷をもつ）に、分離すべき荷電分子を適用して結合させるステップと、
陰イオン交換吸着剤を陽イオン交換吸着剤の後に直列に接続し、陰イオン交換体の温度をＴ_１に変化させ、両方の交換体を温度Ｔ_０で測定した最高の初期ｐＨにおいて平衡化させるステップと、
第１の貯蔵器からポンプで送出される少なくとも１種のバッファー成分を含有する初期ｐＨの溶液を、第２の貯蔵器からポンプで送出される前記少なくとも１種のバッファー成分を含有するｐＨの異なる溶液との連続混合で形成される時間依存性のｐＨを有する溶離液を、前記陽イオン交換吸着剤に温度Ｔ_０で供給するステップであって、その混合比率を、保持されていないｐＨ勾配を外部で定めた傾きで維持するために変動させるステップと、
荷電分子の溶離であって、それぞれが、温度Ｔ_０で所定の最大ｐＨに達するまでその実効等電点で陽イオン交換吸着剤から別々に溶離するステップと、
荷電分子を含有する陽イオン交換吸着剤から得られた溶出液が、温度Ｔ_１でさらに分離されるように陰イオン交換吸着剤中に導くステップと、
負帯電している荷電分子を陰イオン交換吸着剤に温度Ｔ_０で所定の最大ｐＨに達するまで結合させるステップと、
陽イオン交換吸着剤を取り除くステップと、
陰イオン交換吸着剤を温度Ｔ_１における所定の最大ｐＨから所定の最低の初期ｐＨまで展開するように含浸させてｐＨ勾配を逆転させるステップと、
それぞれが別々に温度Ｔ_１で所定の最低の初期ｐＨに達するまでその実効等電点において陰イオン交換吸着剤から溶離する荷電分子を収集するステップと、
陰イオン交換樹脂の温度をＴ_２に変化させるステップと、
温度Ｔ_２における所定の最低の初期ｐＨから所定の２番目の最小ｐＨまで時を合わせて減少するｐＨ勾配を有する陰イオン交換吸着剤を含浸させ続けるステップと、
それぞれがその実効等電点において陰イオン交換吸着剤から、温度Ｔ_２において前記所定の２番目の最小ｐＨに達するまで別々に溶離する荷電分子を収集するステップと、
増大しつつあるｐＨ勾配を使用する溶離が後に続く段階的な温度の変化を繰り返し、それぞれが最終温度Ｔ_ｆに達するまで陰イオン交換体から時を合わせて別々に溶離する荷電分子を収集するステップと、
所定の最後から２番目の最小ｐＨから所定の究極の最小ｐＨまで時を合わせて減少するｐＨ勾配を有する陰イオン交換吸着剤の含浸を継続するステップと、
それぞれが別々に最終温度Ｔ_ｆで究極の最小ｐＨに達するまでその実効等電点において陰イオン交換吸着剤から溶離する荷電分子を収集するステップとを含む。
【００２６】
本発明の別の態様においては、異なる等電点を有する荷電分子をクロマトグラフィーにより分離する複合外部勾配クロマトフォーカシング方法が提供され、その方法は、
分離すべき荷電分子を、温度Ｔ_０の陰イオン交換吸着剤に、続いて温度Ｔ_１で直列に接続されている陽イオン交換吸着剤に適用し、その結果、その２つの吸着剤が、少なくとも１つの温度Ｔ_０で測定される初期ｐＨのバッファー成分を含む溶媒により含浸され、そこで分離すべき荷電分子が、３つの荷電の種類、すなわち、初期ｐＨより低い見掛けのｐＩを有する荷電分子は負に帯電したもの、初期ｐＨで陰イオン交換吸着剤または陽イオン交換吸着剤のいずれにも結合できない荷電分子は中性のもの、初期ｐＨより高い見掛けのｐＩを有する荷電分子は正に帯電したものの少なくとも１つに分類されるステップと、
初期ｐＨで負に帯電した荷電分子を温度Ｔ_０で陰イオン交換吸着剤に結合させるステップと、
初期ｐＨで正に帯電した荷電分子を温度Ｔ_１で陽イオン交換吸着剤に結合させるステップと、
初期ｐＨで温度Ｔ_０で陰イオン交換吸着剤または温度Ｔ_１で陽イオン交換吸着剤のいずれにも結合できない荷電分子のものを収集するステップと、
陽イオン交換吸着剤と陰イオン交換吸着剤との初期ｐＨにおける接続を互いから切り離すステップと、
第１の貯蔵器からポンプで送出される少なくとも１種のバッファー成分を含有する初期ｐＨの溶液を、第２の貯蔵器からポンプで送出される前記少なくとも１種のバッファー成分を含有するｐＨの異なる溶液との連続混合で形成される、温度Ｔ_０で測定して初期ｐＨに始まる時間依存的に減少するｐＨを有する溶離液を、前記陰イオン交換吸着剤に供給するステップであって、その混合比率を、保持されていないｐＨ勾配を外部で定めた傾きで温度Ｔ_０で維持するために変動させるステップと、
それぞれが温度Ｔ_０で最終の最小ｐＨに達するまでその実効等電点において陰イオン交換吸着剤から溶離する荷電分子を収集するステップと、
第１の貯蔵器からポンプで送出される少なくとも１種のバッファー成分を含有する初期ｐＨの溶液を、第２の貯蔵器からポンプで送出される前記少なくとも１種のバッファー成分を含有するｐＨの異なる溶液との連続混合で形成される、温度Ｔ_１で測定して初期ｐＨに始まる時間依存的に増加するｐＨを有する溶離液を、前記陽イオン交換吸着剤に供給するステップであって、その混合比率を、保持されていないｐＨ勾配を外部で定めた傾きで温度Ｔ_１で維持するために変動させるステップと、
それぞれが温度Ｔ_１で最終の最大ｐＨに達するまでその実効等電点において陽イオン交換吸着剤から溶離する荷電分子を収集するステップとを含む。
【００２７】
本発明の別の態様においては、異なる等電点を有する荷電分子をクロマトグラフィーにより分離する複合外部勾配クロマトフォーカシング方法が提供され、その方法は、
分離すべき荷電分子を、温度Ｔ_０の陽イオン交換吸着剤に、続いて温度Ｔ_１で直列に接続されている陰イオン交換吸着剤に適用し、その結果、その２つの吸着剤が、少なくとも１つの温度Ｔ_０で測定される初期ｐＨのバッファー成分を含む溶媒により含浸され、そこで分離すべき荷電分子が、３つの荷電の種類、すなわち、初期ｐＨより低い見掛けのｐＩを有する荷電分子は負に帯電したもの、初期ｐＨで陰イオン交換吸着剤または陽イオン交換吸着剤のいずれにも結合できない荷電分子は中性のもの、初期ｐＨより高い見掛けのｐＩを有する荷電分子は正に帯電したものの１つに分類されるステップと、
初期ｐＨで正に帯電した荷電分子を温度Ｔ_０で陽イオン交換吸着剤に結合させるステップと、
初期ｐＨで負に帯電した荷電分子を温度Ｔ_１で陰イオン交換吸着剤に結合させるステップと、
初期ｐＨで温度Ｔ_０で陰イオン交換吸着剤または温度Ｔ_１で陽イオン交換吸着剤のいずれにも結合できない荷電分子のものを収集するステップと、
陽イオン交換吸着剤と陰イオン交換吸着剤との初期ｐＨにおける接続を互いから切り離すステップと、
第１の貯蔵器からポンプで送出される少なくとも１種のバッファー成分を含有する初期ｐＨの溶液を、第２の貯蔵器からポンプで送出される前記少なくとも１種のバッファー成分を含有するｐＨの異なる溶液との連続混合で形成される、温度Ｔ_０で測定して初期ｐＨに始まる時間依存的に増加するｐＨを有する溶離液を、前記陽イオン交換吸着剤に供給するステップであって、その混合比率を、保持されていないｐＨ勾配を外部で定めた傾きで温度Ｔ_０で維持するために変動させるステップと、
それぞれが温度Ｔ_０で最終の最大ｐＨに達するまでその実効等電点において陽イオン交換吸着剤から溶離する荷電分子を収集するステップと、
第１の貯蔵器からポンプで送出される少なくとも１種のバッファー成分を含有する初期ｐＨの溶液を、第２の貯蔵器からポンプで送出される前記少なくとも１種のバッファー成分を含有するｐＨの異なる溶液との連続混合で形成される、温度Ｔ_１で測定して初期ｐＨに始まる時間依存的に減少するｐＨを有する溶離液を、前記陰イオン交換吸着剤に供給するステップであって、その混合比率を、保持されていないｐＨ勾配を外部で定めた傾きで温度Ｔ_１で維持するために変動させるステップと、
それぞれが温度Ｔ_１で最終の最小ｐＨに達するまでその実効等電点において陰イオン交換吸着剤から溶離する荷電分子を収集するステップとを含む。
【００２８】
本発明の別の態様においては、異なる等電点を有する荷電分子をクロマトグラフィーにより分離する複合外部勾配クロマトフォーカシング方法が提供され、その方法は、
温度Ｔ_０で測定した最高の初期ｐＨにおける少なくとも１種のバッファー成分を含む溶媒を含浸した陰イオン交換吸着剤（該陰イオン交換吸着剤は、分離すべき荷電分子と反対の電荷をもつ）に、分離すべき荷電分子を適用して結合させるものであって、前記陰イオン交換吸着剤を、温度Ｔ_１から温度Ｔ_２までの温度勾配の下（温度Ｔ_１は、前記溶媒が吸着剤に入るときの温度であり、温度Ｔ_２は、前記溶媒が吸着剤を出るときの温度である）におくステップと、
陰イオン交換吸着剤の後に温度Ｔ_３から温度Ｔ_４までの温度勾配の下（温度Ｔ_３は、陰イオン交換吸着剤からの溶出液が、陽イオン交換体に入るときの陽イオン交換吸着剤の温度であり、温度Ｔ_４は、前記溶出液が、陽イオン交換体を出るときの温度である）におく陽イオン交換吸着剤を直列に接続し、温度Ｔ_０で測定した最高の初期ｐＨにおける両方のイオン交換体を平衡化させるステップと、
温度Ｔ_０の第１の貯蔵器からポンプで送出される少なくとも１種のバッファー成分を含有する初期ｐＨの溶液を、温度Ｔ_０の第２の貯蔵器からポンプで送出される前記少なくとも１種のバッファー成分を含有するｐＨの異なる溶液との連続混合で形成される時間依存性のｐＨを有する溶離液を、温度Ｔ_１から温度Ｔ_２の勾配にかけた前記陰イオン交換吸着剤に供給するステップであって、その混合比率を、保持されていないｐＨ勾配を外部で定めた傾きで維持するために変動させるステップと、
荷電分子の溶離であって、それぞれが、温度Ｔ_０で測定した所定の最小ｐＨに達するまでその実効等電点で陰イオン交換吸着剤から別々に溶離するステップと、
荷電分子を含有する陰イオン交換吸着剤から得られた溶出液が、さらに分離されるように、温度Ｔ_３から温度Ｔ_４までの温度勾配の下においた陽イオン交換吸着剤中に導くステップと、
正帯電している荷電分子を、温度Ｔ_０で測定した所定の最小ｐＨに達するまで温度Ｔ_３から温度Ｔ_４までの温度勾配の下においた陽イオン交換吸着剤に結合させるステップと、
陰イオン交換吸着剤を取り除くステップと、
温度Ｔ_３から温度Ｔ_４までの温度勾配の下においた陽イオン交換吸着剤を温度Ｔ_０で測定した所定の最小ｐＨから所定の最大ｐＨまで展開するように含浸させてｐＨ勾配を逆転させるステップと、
それぞれが別々に、温度Ｔ_０で測定して所定の最大ｐＨに達するまで、その実効等電点において温度Ｔ_３から温度Ｔ_４までの温度勾配の下においた陽イオン交換吸着剤から、溶離する荷電分子を収集するステップとを含む。
【００２９】
本発明の別の態様においては、異なる等電点を有する荷電分子をクロマトグラフィーにより分離する複合外部勾配クロマトフォーカシング方法が提供され、その方法は、
温度Ｔ_０で測定した最低の初期ｐＨにおける少なくとも１種のバッファー成分を含む溶媒を含浸した陽イオン交換吸着剤（該陽イオン交換吸着剤は、分離すべき荷電分子と反対の電荷をもつ）に、分離すべき荷電分子を適用して結合させるものであって、前記陽イオン交換吸着剤を、温度Ｔ_１から温度Ｔ_２までの温度勾配の下（温度Ｔ_１は、前記溶媒が吸着剤に入るときの温度であり、温度Ｔ_２は、前記溶媒が吸着剤を出るときの温度である）におくステップと、
陽イオン交換吸着剤の後に温度Ｔ_３から温度Ｔ_４までの温度勾配の下（温度Ｔ_３は、陽イオン交換吸着剤からの溶出液が、陰イオン交換体に入るときの陰イオン交換吸着剤の温度であり、温度Ｔ_４は、前記溶出液が、陰イオン交換体を出るときの温度である）におく陰イオン交換吸着剤を直列に接続し、温度Ｔ_０で測定した最低の初期ｐＨにおける両方のイオン交換体を平衡化させるステップと、
温度Ｔ_０の第１の貯蔵器からポンプで送出される少なくとも１種のバッファー成分を含有する初期ｐＨの溶液を、温度Ｔ_０の第２の貯蔵器からポンプで送出される前記少なくとも１種のバッファー成分を含有するｐＨの異なる溶液との連続混合で形成される時間依存性のｐＨを有する溶離液を、温度Ｔ_１から温度Ｔ_２の勾配にかけた前記陽イオン交換吸着剤に供給するステップであって、その混合比率を、保持されていないｐＨ勾配を外部で定めた傾きで維持するために変動させるステップと、
荷電分子の溶離であって、それぞれが、温度Ｔ_０で測定した所定の最大ｐＨに達するまでその実効等電点で陽イオン交換吸着剤から別々に溶離するステップと、
荷電分子を含有する陽イオン交換吸着剤から得られた溶出液が、さらに分離されるように、温度Ｔ_３から温度Ｔ_４までの温度勾配の下においた陰イオン交換吸着剤中に導くステップと、
負帯電している荷電分子を、温度Ｔ_０で測定した所定の最大ｐＨに達するまで温度Ｔ_３から温度Ｔ_４までの温度勾配の下においた陰イオン交換吸着剤に結合させるステップと、
陽イオン交換吸着剤を取り除くステップと、
温度Ｔ_３から温度Ｔ_４までの温度勾配の下においた陰イオン交換吸着剤を温度Ｔ_０で測定した所定の最大ｐＨから所定の最小ｐＨまで展開するように含浸させてｐＨ勾配を逆転させるステップと、
それぞれが別々に、温度Ｔ_０で測定して所定の最小ｐＨに達するまで、その実効等電点において温度Ｔ_３から温度Ｔ_４までの温度勾配の下においた陰イオン交換吸着剤から、溶離する荷電分子を収集するステップとを含む。
【００３０】
本発明のさらなる態様は、異なる等電点を有する荷電分子をイオン交換樹脂でクロマトグラフィーにより分離するためのバッファー組成物であって、その組成物は、予め定めたｐＨの前記組成物が別の予め定めたｐＨの前記組成物により滴定するとき、その２つの組成物の混合物のｐＨの変化が、その２つの組成物のそれぞれによって表される混合物の画分に直線的に正比例するような少なくとも３つのバッファー組成物の水溶液を含む。
【００３１】
本発明の別の態様は、荷電分子を分離するためのクロマトグラフシステムであって、そのシステムは、
初期ｐＨの少なくとも３種のバッファー成分を含む溶媒を含浸したイオン交換吸着剤を含有するカラム（前記イオン交換吸着剤は、分離すべき荷電分子と反対の電荷をもつ）と、
初期ｐＨの前記少なくとも３種のバッファー成分を含む第１の溶液を含有する第１の貯蔵器と、
初期ｐＨとは異なるｐＨの前記少なくとも３種のバッファー成分を含む第２の溶液を含有する第２の貯蔵器と、
前記第１および第２の溶液の外部で作製した混合物を送り込んで外部で規定したｐＨ勾配を吸着剤に形成させ、カラム内に保持されていないｐＨ勾配を出現させる手段と
を備えている。
【００３２】
本発明の別の態様は、荷電分子を分離するためのクロマトグラフシステムであって、そのシステムは、
初期ｐＨの少なくとも３種のバッファー成分を含む溶媒を含浸したイオン交換吸着剤を含有するカラム（前記イオン交換吸着剤は、分離すべき荷電分子と反対の電荷をもつ）と、
初期ｐＨのさらなるバッファー成分があるかまたはない前記少なくとも３種のバッファー成分を含む第１の溶液を含有する第１の貯蔵器と、
初期ｐＨとは異なるｐＨのさらなるバッファー成分があるかまたはない前記少なくとも３種のバッファー成分を含む第２の溶液を含有する第２の貯蔵器と、
前記第１および第２の溶液の外部で作製した混合物を送り込んで外部で規定した初期ｐＨから最終ｐＨまでのｐＨ勾配を形成させ、カラム内に保持されていないｐＨ勾配を出現させる手段とを備えている。
【００３３】
本発明の別の態様は、クロマトグラフシステムによって発生する前もってプログラムされた時間依存性ｐＨ勾配におけるｐＨ偏差を自動的に補正するためのフィードバック制御システムを含み、そのシステムは、
測定ｐＨの既知関数である出力電圧を生ずるｐＨ測定装置と、
フィードバック制御装置であって、
適切に短時間の間隔の入力として、クロマトグラフシステムによって発生する溶離液のｐＨを監視するｐＨ測定装置から電圧を受け取り、その電圧を、前もってプログラムされた時間依存性ｐＨ勾配の予想されるｐＨ値に対応するセットポイント電圧と比較し、
その絶対値が誤差と見なされる入力電圧（すなわち測定ｐＨ）とセットポイント電圧（すなわち予想ｐＨ）の間の差を計算し、かつ
クロマトグラフシステムの勾配を発生させるポンプのポンピング速度を、誤差の絶対値が最小となるように、適宜電流または電圧いずれかとしての訂正信号を計算するための任意の既知のフィードバックアルゴリズムを使用して調節する
制御装置とを備えている。
【００３４】
本発明のさらに別の態様は、荷電分子を分離するためおよびカラム内に調節された保持されていないｐＨ勾配を出現させるためのクロマトグラフシステムであって、そのシステムは、
初期ｐＨの少なくとも１種のバッファー成分を含む溶媒を含浸したイオン交換吸着剤を含有するカラム（前記イオン交換吸着剤は、分離すべき荷電分子と反対の電荷をもつ）と、
初期ｐＨの前記少なくとも１種のバッファー成分を含む第１の溶液を含有する第１の貯蔵器と、
初期ｐＨとは異なるｐＨの前記少なくとも１種のバッファー成分を含む第２の溶液を含有する第２の貯蔵器と、
第１および第２の溶液を混合するための第１の貯蔵器ポンプおよび第２の貯蔵器ポンプ（前記第１の貯蔵器ポンプおよび前記第２の貯蔵器ポンプのポンピング速度は、制御された流速で外部で定めた溶離液ｐＨ勾配を形成するべく調節される）と、
ｐＨ測定装置がｐＨフローセルである、制御された流速で外部で定めた溶離液ｐＨ勾配の形成を監視および補正するための上記のフィードバックコントロールシステムとを備えている。
【００３５】
本発明の別の態様においては、異なる等電点を有する荷電分子をクロマトグラフィーにより分離するクロマトフォーカシング方法が提供され、その方法は、
最高の初期ｐＨで、少なくとも１種のバッファー成分を含む溶媒を含浸した陰イオン交換吸着剤（該陰イオン交換吸着剤は、分離すべき荷電分子と反対の電荷をもつ）に、分離すべき荷電分子を加えるステップと、
第１の貯蔵器からポンプで送出される初期ｐＨのさらなるバッファー成分があるかまたはない前記の少なくとも１種のバッファー成分を含有する初期ｐＨの溶液を、第２の貯蔵器からミキサー中にポンプで送出される異なるｐＨのさらなるバッファー成分があるかまたはない前記の少なくとも１種のバッファー成分を含有する溶液との連続混合で形成される時間依存性のｐＨを有する溶離液を、前記陰イオン交換吸着剤に供給するステップと、
ｐＨに依存する電圧信号が発生し、第１の貯蔵器および第２の貯蔵器からポンプで送出される溶液の比率が、上述のフィードバックコントロールシステムによって、外部から定めて調節する勾配により保持されていないｐＨ勾配が維持されるように変動することを可能にするｐＨフローセルを通るミキサーからの溶離液を流すステップと、
それぞれが陰イオン交換吸着剤からその実効等電点において別々に溶離する荷電分子を収集するステップとを含む。
【００３６】
本発明の別の態様においては、異なる等電点を有する荷電分子をクロマトグラフィーにより分離する逆クロマトフォーカシング方法が提供され、その方法は、
最低の初期ｐＨの少なくとも１種のバッファー成分を含む溶媒を含浸した陽イオン交換吸着剤（該陽イオン交換吸着剤は、分離すべき荷電分子と反対の電荷をもつ）に、分離すべき荷電分子を加えるステップと、
第１の貯蔵器からポンプで送出される初期ｐＨのさらなるバッファー成分があるかまたはない前記の少なくとも１種のバッファー成分を含有する初期ｐＨの溶液を、第２の貯蔵器からミキサー中にポンプで送出される異なるｐＨのさらなるバッファー成分があるかまたはない前記の少なくとも１種のバッファー成分を含有する溶液との連続混合で形成される時間依存性のｐＨを有する溶離液を、前記陰イオン交換吸着剤に供給するステップと、
ｐＨに依存する電圧信号が発生し、第１の貯蔵器および第２の貯蔵器からポンプで送出される溶液の比率が、上で議論したフィードバックコントロールシステムによって、外部から定めて調節する勾配により保持されていないｐＨ勾配が維持されるように変動することを可能にするｐＨフローセルを通るミキサーからの溶離液を流すステップと、
それぞれが陽イオン交換吸着剤からその実効等電点において別々に溶離する荷電分子を収集するステップとを含む。
【００３７】
本発明のさらに別の態様は、荷電分子を分離するためおよびカラム内に調節された保持されていないｐＨ勾配を生じさせるためのクロマトグラフシステムであって、そのシステムは、
初期ｐＨの少なくとも１種のバッファー成分を含む溶媒を含浸したイオン交換吸着剤を含有するカラム（前記イオン交換吸着剤は、分離すべき荷電分子と反対の電荷をもつ）と、
初期ｐＨの前記少なくとも１種のバッファー成分を含む第１の溶液を含有する第１の貯蔵器と、
初期ｐＨとは異なるｐＨの前記少なくとも１種のバッファー成分を含む第２の溶液を含有する第２の貯蔵器と、
第１および第２の溶液を前記第１の溶液の所定の容量を含有する混合チャンバー中にポンピングするための第１の貯蔵器ポンプおよび第２の貯蔵器ポンプ（前記第１の貯蔵器ポンプおよび前記第２の貯蔵器ポンプのポンピング速度は、制御された流速で外部で定めた溶離液ｐＨ勾配を形成するべく調節される）と、
ｐＨ測定装置が混合チャンバー中に浸されたｐＨ電極である制御された流速で外部で定めた溶離液ｐＨ勾配の形成を監視および補正する上述のフィードバックコントロールシステムと、
当該混合溶液を混合チャンバーから制御された流速でポンピングするための手段と
を備えている。
【００３８】
本発明の別の態様においては、異なる等電点を有する荷電分子をクロマトグラフィーにより分離するクロマトフォーカシング方法が提供され、その方法は、
最高の初期ｐＨで、少なくとも１種のバッファー成分を含む溶媒を含浸した陰イオン交換吸着剤（該陰イオン交換吸着剤は、分離すべき荷電分子と反対の電荷をもつ）に、分離すべき荷電分子を加えるステップと、
第１の貯蔵器からポンプで送出される少なくとも１種のバッファー成分を含有する初期ｐＨの溶液を、第２の貯蔵器から混合チャンバー中にポンプで送出される異なるｐＨの前記の少なくとも１種のバッファー成分を含有する溶液との連続混合で形成される時間依存性のｐＨを有する溶離液を、前記陰イオン交換吸着剤に供給するステップと、
ｐＨ依存性の電圧信号を発生する混合チャンバー中に浸したｐＨ電極を用いて溶離液のｐＨを測定するステップと、
第１の貯蔵器から送られる溶液のポンピング速度および第２の貯蔵器から送られる溶液のポンピング速度を、外部から範囲を限定して調節する勾配により保持されていないｐＨ勾配が維持されるように、ｐＨ電極からの電圧信号およびうえで議論したフィードバックコントロールシステムを利用することによって補正するステップと、
溶離液を混合チャンバーから陰イオン交換吸着剤を含有するカラムを通して供給するステップと、
それぞれが陰イオン交換吸着剤からその実効等電点において別々に溶離する荷電分子を収集するステップとを含む。
【００３９】
本発明の別の態様においては、異なる等電点を有する荷電分子をクロマトグラフィーにより分離する逆クロマトフォーカシング方法が提供され、その方法は、
最低の初期ｐＨの少なくとも１種のバッファー成分を含む溶媒を含浸した陽イオン交換吸着剤（該陽イオン交換吸着剤は、分離すべき荷電分子と反対の電荷をもつ）に、分離すべき荷電分子を加えるステップと、
第１の貯蔵器からポンプで送出される少なくとも１種のバッファー成分を含有する初期ｐＨの溶液を、第２の貯蔵器から混合チャンバー中にポンプで送出される異なるｐＨの前記の少なくとも１種のバッファー成分を含有する溶液との連続混合で形成される時間依存性のｐＨを有する溶離液を、前記陽イオン交換吸着剤に供給するステップと、
ｐＨ依存性の電圧信号を発生する混合チャンバー中に浸したｐＨ電極を用いて溶離液のｐＨを測定するステップと、
第１の貯蔵器から送られる溶液のポンピング速度および第２の貯蔵器から送られる溶液のポンピング速度を、外部から範囲を限定して調節する勾配により保持されていないｐＨ勾配が維持されるように、ｐＨ電極からの電圧信号およびフィードバックコントロールシステムを利用することによって補正するステップと、
溶離液を、陽イオン交換吸着剤を含有するカラムを通して供給するステップと、
それぞれが陽イオン交換吸着剤からその実効等電点において別々に溶離する荷電分子を収集するステップとを含む。
【００４０】
本発明は、広義には上で明らかにした通りであるが、それがそれに限定されるのではなく以下で説明する態様をさらに含むことは、当業者であれば当然理解するであろう。
【００４１】
本発明のさらなる目的および利点は以下に続く説明から明らかとなろう。
【００４２】
発明の詳細な説明
他に明示しない限り、本明細書で使用されている技術および科学用語は、本発明が属する技術分野の通常の熟練者が一般に理解しているものと同じ意味を有する。本明細書に記載されているものと類似したまたは同等の任意の方法および材料が、本発明の実施または試験において使用され得るが、好ましい方法および材料が記載されている。
【００４３】
本明細書で使用する用語「クロマトグラフカラム」または「カラム」とは、吸着剤粒子が充填されておりクロマトグラフィーを行うために使用するチューブを指す。
【００４４】
本明細書で使用する用語「樹脂」または「吸着剤」または「交換体」とは、分離すべき１つまたは複数の荷電種を選択的に結合する（すなわち吸着する）クロマトグラフカラム内の固体材料を指す。その吸着剤は、陰イオン交換体または陽イオン交換体のいずれかである。
【００４５】
本明細書で使用する用語「両性電解質」とは、酸性および塩基性ｐＫ_ａ値の両方を有する基を含有する分子を指す。２個以上の荷電基を有する両性電解質は、ポリ両性電解質と呼ぶ。
【００４６】
本明細書で使用する用語「陰イオン交換吸着剤」とは、正に帯電しており、陰イオン（すなわち負に帯電している種）を結合する吸着剤を指す。
【００４７】
本明細書で使用する用語「陽イオン交換吸着剤」とは、負に帯電しており、陽イオン（すなわち正に帯電している種）を結合する吸着剤を指す。
【００４８】
本明細書で使用する用語「イオン交換吸着剤」は、陰イオン交換吸着剤および陽イオン交換吸着剤の両方を含む。
【００４９】
本明細書で使用する用語「保持されていないｐＨ勾配」とは、カラムが長さを有している事実のためにカラムの上端から下端までに存在するカラム内のｐＨ勾配を指す。外部勾配クロマトフォーカシング（逆クロマトフォーカシング）においては、外部ｐＨ勾配は、時間内に初期ｐＨから最終ｐＨに向かって展開し、その結果、カラムの下端におけるｐＨがカラムの上端におけるｐＨより初期ｐＨに近くなる。報告されている他のクロマトフォーカシング技術において、一般的には、保持ｐＨ勾配とは、Ｐｏｌｙｂｕｆｆｅｒの種類またはその他のバッファーの種類のカラムの長さを経た弱陰イオンまたは陽イオン交換体への差別的な結合のために生ずるカラム内の勾配を指す。
【００５０】
本明細書で使用する用語「外部で定めた傾き」とは、ｐＨ勾配の傾きが、それがコンピュータで制御される異なるｐＨの２つの外部のバッファーの混合によって生ずるために、外部から定められることを意味する。ｐＨが変化する度合い（すなわちｐＨ勾配の傾き）は、もっぱらオペレーターに依存し、それは、特に強イオン交換樹脂を使用するときはカラムの特性とは実質的に無関係である。これらの樹脂は、それらの全体の実用ｐＨ範囲にわたってそれらの（特性）電荷を変えることはない。対照的に、弱イオン交換樹脂を使用するときは、その傾きは、Ｓｌｕｙｔｅｒｍａｎにより記述されている伝統的なクロマトフォーカシングの場合またはＦｒｅｙおよびＬｏｇａｎにより記述されているクロマトフォーカシング手法におけるようにある程度カラムの特性に依存する。
【００５１】
開発されたクロマトグラフシステムの外部勾配クロマトフォーカシング（「ＥｘＧＣ」）および逆外部勾配クロマトフォーカシング（「ＲｅｖＥｘＧＣ」）は、いくつかの鍵となるやり方において既知のシステムとは根本的に異なる。１つには、ｐＨ２から１２またはそれ以上（カラムのｐＨ安定性による）の範囲にわたる強陰イオンまたは強陽イオンカラム上にほぼ直線状のｐＨ勾配の前例のない幅を実現するために、各成分のモル比率が初期ｐＨと最終のｐＨの間の変遷を通じて一定に留まるかまたは変動する、通常の安価な間隔が広くおかれているが重複しているｐＫ_ａを有する独特の組み合わせを採用する。この範囲は、公表されている最大ｐＨ範囲（４．５単位、Loganら、Biotechnology and Bioengineering, 62 (2), 1999）の２倍を超える。クロマトフォーカシングの確立されている変形と同じように、本発明は、また、非常に狭いｐＨ範囲（例えば０．１ｐＨ単位）に対しても良く機能し、この性能をカラム温度の変化と組み合わせるときは、最初の温度でほとんど同じｐＩを示すタンパク質であっても、例えば、異なる温度における２番目のクロマトフォーカシング精製ステップにおいて分離することができる。
【００５２】
既知の方法にまさる本発明の別の利点は、勾配の最初と最終ｐＨ値が、バッファー組成物のｐＨ範囲によるか強交換体樹脂の推奨される安定した作用ｐＨ範囲によるかのいずれかによってのみ制限されることである。本発明は、強弱両方の陰イオンおよび陽イオンカラム上で確実に機能するが、強陰イオンおよび強陽イオンカラムが好ましい態様である。図１〜５は、ｐＨ２．５と１０．５の間ならびに狭い範囲における本発明の汎用性を実証しているが、そればかりでなく、普通に入手できるバッファーにより、ｐＨ０から１４までであり得る強陰イオンおよび強陽イオン樹脂の最大限の作用範囲にわたって、このシステムにおいてはほぼ直線の勾配の生成が可能となる。しかしながら、ｐＨ勾配のこのほぼ直線性は、唯一外部から生じさせる勾配を使用することなしに実現することは依然として非常に困難である。
【００５３】
この勾配形成方法は、本発明のやり方と既知の保持性勾配技術の間の別の主要な違いを表している。外部勾配は、開始ｐＨのバッファーの異なるｐＨにおける２番目のバッファーとの連続的混合によって発生し、同時に２番目のバッファーの比率が、その混合物が所望のｐＨに達するまで増加する。そのｐＨ勾配を形成しているバッファー溶液のそれぞれは、同じバッファー組成物または異なるバッファー組成物のいずれかからなることができる。その勾配は、形状が直線状または非直線状（すなわち、凹状または凸状または階段状）であり得る。好ましい態様においては、カラムは、強陰イオンまたは強陽イオン交換カラムであり、それは、カラム吸着剤のイオン交換特性がカラムの作用ｐＨ範囲を通して変化しないことを意味する。
【００５４】
カラム吸着剤の荷電基がｐＨプロフィールを制御しないという事実にもかかわらず、本発明の方法の集束機能は文献に記載されているシステムと同等またはそれよりも良好である。本発明において集束を生じる状態は、公開されているシステムにおけるものと類似しているが、いくつかの重要な相違がある。例えば、強陰イオン交換カラムが選択されたアルカリ性ｐＨに前もって平衡化されており次いでタンパク質の混合物がカラムの上端で結合されたことを想像されたい。分離の過程で、溶離液バッファーのｐＨが特定のタンパク質のｐＩに達したとき、そのタンパク質は、カラムに強く結合するのを止め、最初ははっきりした帯となってカラムを通って降下を開始する。もし集束力が存在しなければ、この帯は、通常の拡散によって帯の動きの中心から離れて一層拡散されることになろう。しかしながら、弱陰イオンカラムに対する複合体バッファー種（すなわちポリバッファー）の差別的結合により形成される保持性勾配の場合に丁度そうであるように、溶離液の先端の下のカラム中のバッファーのｐＨは、その先端の下の間隔が増すに従って次第によりアルカリ性であり、一方上のバッファーは、その先端の上の間隔が増すに従って次第により酸性である。したがって、報告されているものとまさに同様に、溶離液最前部から遅れるタンパク質分子は、それらが遅れる距離が長いほどますます酸性になるバッファーのために、一層正帯電するようになり、その結果これらのタンパク質分子は、カラム吸着剤の同じ電荷からくる反発作用によりますます加速される。反対に、溶離液最前部の前方に拡散しているタンパク質分子は、それらが前方にあるほど（よりアルカリ性の前方のｐＨのため）より大きい負電荷を担持し、したがって、カラム吸着剤の反対の電荷に対して増加した結合によって速度を落とす。この過程の結果、タンパク質の帯は、連続的に再集束され、その鮮鋭さを保持し、細い帯としてカラムを出る。
【００５５】
２つのシステムにおいて再集束力は類似しているが、本発明の外部勾配クロマトフォーカシングは、２つの重要な態様において異なる。第１に、カラムの長さに沿ったｐＨ勾配は、Ｐｏｌｙｂｕｆｆｅｒシステムのそれとは違って、流体が、カラムの非常に低いところに早い時期に、したがって初期ｐＨに近いｐＨで、入ったという事実の結果である。したがって、カラムが長ければ長いほど上端と下端の間のｐＨ差は大きい。この効果は、最前部の大部分の流体をその下のカラム流体と単純に混合することによって幾分か増大し、勾配を大きくする傾向がある。一般に、その時々のカラムの上端からカラムの下端までのｐＨ勾配の範囲は、開始バッファーのｐＨと最終バッファーのｐＨとのｐＨの差、すなわち分離が行われるｐＨ範囲、よりはるかに狭い。第２に、カラムのｐＨ勾配は、そのときの勾配の範囲とは無関係であり、そのため、成し得る最高の分離のために最適化する空間的な勾配条件とこの分離を実現することができるｐＨの範囲との間にトレードオフが存在しない。対照的に、内部発生勾配システムにおいては、分離のために使用するｐＨの範囲が大きければ大きいほど、空間的カラム勾配が急となり、分離に障害が起こる。加えて、外部勾配クロマトフォーカシングシステムは、タンパク質がカラムから開放されるやいなやはっきりした溶離液の帯を生成するのに対して、内部勾配システムは、保持されたｐＨ勾配の範囲内でタンパク質がそのｐＩに達したときにのみ溶離タンパク質の帯の集束を開始する。
【００５６】
クロマトフォーカシングまたは逆クロマトフォーカシングのいずれかを用いて広いｐＨ範囲にわたる外部直線状勾配を構築することができることにより、この技術に独特の準備能力が付与される。１つの例は、大量のオボアルブミンを含有する鳥類の卵白等の混合物からいくつかの低存在量タンパク質を精製することである。そのオボアルブミンタンパク質は、４．６のｐＩを有している。Ｍｏｎｏ Ｓ等の強陽イオンカラムによる本発明の方法を使用することにより、そのカラムを最初にｐＨ４．６に平衡化し、試料を注入し、カラムを最初のバッファーで洗浄し、次いで最終の所要のｐＨに向けて溶離することができる。この逆クロマトフォーカシングの手法は、膨大な大部分のオボアルブミンが試料の注入および最初の定組成洗浄の間に結合しないでカラムを通過することを可能にし、かくしてｐＩ＞４．７のすべてのタンパク質の結合能力を増大させる。このｐＩ＞４．６のタンパク質からのオボアルブミンおよびｐＩ＜４．６のタンパク質の選択的および迅速な分離は、標準的なクロマトフォーカシング手順が使用された場合は不可能である。
【００５７】
外部勾配クロマトフォーカシングおよび逆クロマトフォーカシングの両方の別の利点は、我々が変温外部勾配クロマトフォーカシング、変温逆外部勾配クロマトフォーカシング、等温シフト外部勾配クロマトフォーカシングおよび等温シフト逆外部勾配クロマトフォーカシングと呼ぶ変形である。基本技術の変温変形は、分離すべき荷電分子を充填する前または分離すべき荷電分子を充填した後のいずれかに、交換カラムの上端から下端まで著しい温度勾配を持たせることを含む。基本技術の等温シフト変形は、分離すべき荷電分子を充填する前または分離すべき荷電分子を充填した後のいずれかに、カラムの温度を、最初の温度から最終の温度まで、その長さに沿って均一にカラム温度を変化させることを含む。
【００５８】
これら２つの熱技術により付与される利点は、バッファーのｐＫ_ａおよび溶離したタンパク質のｐＩがカラムを通り抜ける間に変動する事実と関係している。温度勾配または変動は、それ故、さまざまなタンパク質の全体の電荷が、一般にそれらの帯電したアミノ酸の異なる基により決定されるので、与えられた温度でほとんど同じｐＩを示すタンパク質種類の分離を、その与えられた温度から離れて温度が変動したときのｐＩの異なる変化によって可能にする。タンパク質のｐＩおよびバッファーのｐＫ_ａの変動は、Ｇｉｂｂｓ−Ｈｅｌｍｏｌｔｚの方程式：
【数１】


から直接得られる。解離のエンタルピー（ΔＨ）対気体定数Ｒの比は、カルボン酸基に対する約６００からアミノ基に対する約５５００まで変化する。
【００５９】
例えば２５℃から５５℃までの温度勾配またはジャンプは、カルボキシラート基のｐＫ_ａにおいて０．２ｐＨ単位の変動を生むが、多くのアミノ基に対しては約１．６ｐＨ単位である。荷電目的分子のｐＩを変動させてそれらの差を広げることにより当該方法の分離能力が向上する。多くの例において、与えられた温度範囲において非常に近似したｐＩを有する種類を分離するために必要なあらゆる適応性が等温変動の使用により提供される。
【００６０】
温度変動単独では十分にしっかりした分離を生じない場合は、温度勾配のアプローチが有利であることを立証することができる。多くのイオン交換樹脂の結合および分離特性は、温度変化に対して比較的鈍感である。この事実は、既知の溶離バッファーの組成とうまく組み合わせて使用し、温度の関数としてのｐＨを正確に予測することができる。与えられた温度でほぼ同等のｐＩを示す関係のないタンパク質またはタンパク質の変異体は、ほとんどいつも異なる一組のイオン化可能な残基を有しているので、温度勾配による溶離の間にそれらのｐＩは温度の関数として異なる速度で変化し、それらの異なる速度の移動を引き起こす。その結果室温のクロマトフォーカシング（逆クロマトフォーカシング）においては猛烈に重なっている溶離ピークを有するタンパク質が温度勾配の溶離中にうまく分離する。
【００６１】
実施例２の実施例４との比較は、両方の実施例の中に存在するすべてのタンパク質について、タンパク質を陰イオン交換体により分離するとき、低いｐＨに向かう各タンパク質の見掛けの（実効）ｐＩに、陽イオン交換体によるその見掛けのｐＩと比較した相対的変動が存在することを示している。反対に、タンパク質を陽イオン交換体により分離するとき、高いｐＨに向かう見掛けのｐＩに、陰イオン交換体によるその見掛けのｐＩと比較した相対的変動が存在する。例えば、βＬＧ、コンアルブミン、ヒトトランスフェリンおよびダイズトリプシンインヒビターに対し、ｐＩの変動は、単純な以下の一次方程式により十分に予測される：
Ｍｏｎｏ Ｓ陽イオン交換体による見掛けのｐＩ＝１．７０１９×［（Ｍｏｎｏ Ｑ陰イオン交換体による見掛けのｐＩ）−１．９０３４］または、別法では
Ｍｏｎｏ Ｑ陰イオン交換体による見掛けのｐＩ＝０．５５０６×［（Ｍｏｎｏ Ｓ陽イオン交換体による見掛けのｐＩ）＋１．３５１６］
【００６２】
この性質は、本発明の好ましい態様を引き起こして異なる等電点を有する荷電分子をクロマトグラフィーにより分離する複合外部勾配クロマトフォーカシング方法を提供し、その方法は：
最高の初期ｐＨで、少なくとも１種のバッファー成分を含む溶媒を含浸した陰イオン交換吸着剤（該陰イオン交換吸着剤は、分離すべき荷電分子と反対の電荷をもつ）に、分離すべき荷電分子を適用して結合させるステップと、
第１の貯蔵器からポンプで送出される少なくとも１種のバッファー成分を含有する初期ｐＨの溶液を、第２の貯蔵器からポンプで送出される前記少なくとも１種のバッファー成分を含有するｐＨの異なる溶液との連続混合で形成される時間依存性のｐＨを有する溶離液を、前記陰イオン交換吸着剤に供給するステップであって、その混合比率を、保持されていないｐＨ勾配を外部で定めた傾きで維持するために変動させるステップと、
荷電分子の溶離であって、それぞれが、所定の最小ｐＨに達するまでその実効等電点で陰イオン交換吸着剤から別々に溶離するステップと、
荷電分子を含有する陰イオン交換吸着剤から得られた溶出液がさらに分離されるように陽イオン交換吸着剤中に導くステップと、
正帯電している荷電分子を陽イオン交換吸着剤に所定の最小ｐＨに達するまで結合させるステップと、
陽イオン交換吸着剤を所定の最小ｐＨから所定の最大ｐＨまで展開するように含浸させてｐＨ勾配を逆転させるステップと、
それぞれが別々に所定の最大ｐＨに達するまでその実効等電点において陽イオン交換吸着剤から溶離する荷電分子を収集するステップとを含む。
【００６３】
この態様においては、陽イオン交換吸着剤は、陰イオン交換吸着剤の後に連続して接続され、負に帯電した分子が陰イオン交換体に結合した後でかつ減少するｐＨ勾配が始まる前に開始時のｐＨで平衡化される。陰イオン交換吸着剤は、次にさらに分離すべき正帯電した分子が陽イオン交換吸着剤に結合した後で、かつｐＨ勾配が時間に合わせて増大するものに逆転する前に陽イオン交換吸着剤から切り離される。
【００６４】
上記の陰イオン−陽イオンの態様を補完する本発明の別の好ましい態様は、異なる等電点を有する荷電分子の分離を提供し、それは：
最低の初期ｐＨの少なくとも１種のバッファー成分を含む溶媒を含浸した陽イオン交換吸着剤（該陽イオン交換吸着剤は、分離すべき荷電分子と反対の電荷をもつ）に、分離すべき荷電分子を適用して結合させるステップと、
第１の貯蔵器からポンプで送出される少なくとも１種のバッファー成分を含有する初期ｐＨの溶液を、第２の貯蔵器からポンプで送出される前記少なくとも１種のバッファー成分を含有するｐＨの異なる溶液との連続混合で形成される時間依存性のｐＨを有する溶離液を、前記陽イオン交換吸着剤に供給するステップであって、その混合比率を、保持されていないｐＨ勾配を外部で定めた傾きで維持するために変動させるステップと、
荷電分子の溶離であって、それぞれが、所定の最大ｐＨに達するまでその実効等電点で陽イオン交換吸着剤から別々に溶離するステップと、
荷電分子を含有する陽イオン交換吸着剤から得られた溶出液がさらに分離されるように陰イオン交換吸着剤中に導くステップと、
負帯電している荷電分子を陰イオン交換吸着剤に所定の最大ｐＨに達するまで結合させるステップと、
陰イオン交換吸着剤を所定の最大ｐＨから所定の最小ｐＨまで展開するように含浸させてｐＨ勾配を逆転させるステップと、
それぞれが別々に所定の最小ｐＨに達するまでその実効等電点において陰イオン交換吸着剤から溶離する荷電分子を収集するステップとを含む。
【００６５】
この実施形態においては、陰イオン交換吸着剤は、陽イオン交換吸着剤の後に連続して接続され、正に帯電した分子が陽イオン交換吸着剤に結合した後でかつ増大するｐＨ勾配が始まる前に開始時のｐＨで平衡化される。陽イオン交換吸着剤は、次にさらに分離すべき負帯電した分子が陰イオン交換吸着剤に結合した後で、かつｐＨ勾配が時間に合わせて減少するものに逆転する前に陰イオン交換吸着剤から切り離される。
【００６６】
さらに別の好ましい態様は、異なる等電点を有する荷電分子をクロマトグラフィーにより分離する複合外部勾配クロマトフォーカシング方法を提供し、その方法は：
分離すべき荷電分子を、後に陽イオン交換吸着剤が続く陰イオン交換吸着剤（または、補完の態様においては、後に陰イオン交換吸着剤が続く陽イオン交換吸着剤）に適用し、その結果、その２つの吸着剤が、少なくとも１つの初期ｐＨのバッファー成分を含む溶媒により含浸され、そこで分離すべき荷電分子が、３つの荷電の種類、すなわち、初期ｐＨより低い見掛けのｐＩを有する荷電分子は負に帯電したもの、初期ｐＨで陰イオン交換吸着剤または陽イオン交換吸着剤のいずれにも結合できない荷電分子は中性のもの、初期ｐＨより高い見掛けのｐＩを有する荷電分子は正に帯電したものの１つに分類されるステップと、
初期ｐＨで負に帯電した荷電分子を陰イオン交換吸着剤に結合させるステップと、
初期ｐＨで正に帯電した荷電分子を陽イオン交換吸着剤に結合させるステップと、
初期ｐＨでいずれの吸着剤にも結合できない荷電分子のものを収集するステップと、
陽イオン交換吸着剤と陰イオン交換吸着剤との初期ｐＨにおける接続を互いから切り離すステップと、
第１の貯蔵器からポンプで送出される少なくとも１種のバッファー成分を含有する初期ｐＨの溶液を、第２の貯蔵器からポンプで送出される前記少なくとも１種のバッファー成分を含有するｐＨの異なる溶液との連続混合で形成される、初期ｐＨに始まる時間依存的に減少するｐＨを有する溶離液を、前記陰イオン交換吸着剤に供給するステップであって、その混合比率を、保持されていないｐＨ勾配を外部で定めた傾きで維持するために変動させるステップと、
それぞれが最終の最小ｐＨに達するまでその実効等電点において陰イオン交換吸着剤から溶離する荷電分子を収集するステップと、
第１の貯蔵器からポンプで送出される少なくとも１種のバッファー成分を含有する初期ｐＨの溶液を、第２の貯蔵器からポンプで送出される前記少なくとも１種のバッファー成分を含有するｐＨの異なる溶液との連続混合で形成される、初期ｐＨに始まる時間依存的に増加するｐＨを有する溶離液を、前記陽イオン交換吸着剤に供給するステップであって、その混合比率を、保持されていないｐＨ勾配を外部で定めた傾きで維持するために変動させるステップと、
それぞれが最終の最大ｐＨに達するまでその実効等電点において陽イオン交換吸着剤から溶離する荷電分子を収集するステップとを含む。
【００６７】
複合外部勾配クロマトフォーカシング方法は、いくつかの点でさらなる適応性を提供する。最初の説明として、実施例２に示す陰イオン交換吸着剤によるＳＴＩおよびβ−ラクトグロブリンの分離は、決して理想的ではない。β−ラクトグロブリンは、ＳＴＩから十分に分離されておらず、ＳＴＩのピークの左側に肩として現れていることを見ることができる。その２つのタンパク質は、ｐＨ勾配を単に平坦化することによって、より良く分離することは可能である。しかしながら、これはいつもそうとは限らない。実施例２における理想的な分離達成の失敗は、２つ以上の分離すべき成分の見掛けのｐＩが理想的な分離を可能にするにはあまりにも似ているより一般的な場合を説明するのに使用することができる。ＥＧＣＦによる分離（実施例２で示されている）とは対照的に、ＥＧＲＣＦによる２つのタンパク質の分離は、実施例４に示されているように卓越している。目標が高度に精製されたＳＴＩを回収することである場合であれば、実施例２に示されているタンパク質の混合物は、ｐＨ４．５で陽イオン交換吸着剤単独に適用し、溶離をｐＨ４．５からｐＨ５．３までのｐＨ勾配により実施したときに卓越した分別が達成可能である。対照的に、ＳＴＩが非常に低濃度で存在するために十分な量の精製タンパク質を得るにはカラムに一連の試料を適用することが必要である場合、ならびにβ−ラクトグロブリンおよびその他のタンパク質が、はるかに高濃度で存在する不要の汚染物質である場合は、ＥＧＲＣＦを単独で使用し、４．８４よりは上であるが５．７２より下のｐＨで試料を適用することによって、ＳＴＩの各アリコ−トが陽イオン交換吸着剤を結合しないで通過し、β−ラクトグロブリンを含むほとんどすべてのその他の成分が結合されて残ることがもたらされる。その結果、一連の試料適用により集められたＳＴＩを含有する画分は、高度に精製されるが、著しく希釈されており、ＳＴＩはただでさえ非常に低濃度で存在するために、このことは重大な欠点である。一連の試料が４．８４より下のｐＨで適用される場合は、すべてのＳＴＩは、すべての不要なタンパク質と一緒に付加して結合するであろう。試料の適用を繰り返せば、陽イオン交換吸着剤を飽和させる危険を冒すことになる。ＥＧＲＣＦ技術を使用すると、ＳＴＩは、今度ははるかに高濃度で溶離するが、それを含有する画分は、また、分画されていない試料の繰り返される適用によりカラムに結合された過剰量のタンパク質が生じるか、あるいは、ＳＴＩのいくらかがカラムの飽和によって失われることになろう。
【００６８】
陽イオン交換吸着剤に連続して接続され、陰イオン交換吸着剤が後に続く複合ＥＧＣＦの態様においては、これらの制限は両方とも同時に処置される。試料を、例えば４．９５など、約４．８４よりわずかに上のｐＨで適用することにより、すべてのＳＴＩが結合せずに陽イオン交換吸着剤を通過するようにし、一方β−ラクトグロブリンを含む実質的にすべての不要なタンパク質は陽イオン交換吸着剤に結合させることが可能となる。４．０９におけるＳＴＩの陰イオンｐＩより十分に上である４．９５のｐＨにより、ＳＴＩの陰イオン交換吸着剤への結合がもたらされる。最後に、試料の陽イオン交換吸着剤への適用完了後、陽イオン交換吸着剤を、除去し、陰イオン交換吸着剤は、ｐＨ４．０９におけるｐＨ段階の溶離または非常に狭い負の傾きのｐＨ勾配（例えばｐＨ４．２からｐＨ３．９まで）のいずれかにより溶離し、高度に精製したＳＴＩを生じる。その最終の溶離は、陰イオン交換吸着剤からのみ起こるので、集束の効果は最大となり背景にあるタンパク質による不慮の汚染は最小限となる。
【００６９】
より複雑な状況を考える場合、複合ＥＧＣＦの利点は、さらに明らかとなる。再度、実施例２および４で分離されたタンパク質を説明として使用する。ＳＴＩおよびβ−ラクトグロブリンの両方が目的のタンパク質であるＳＴＩ、β−ラクトグロブリンおよびＨＴを含有する試料について考える。さらに、β−ラクトグロブリンは、非常に低濃度で存在し、ＨＴは、大過剰で存在する。単一のカラムを使用するときは、先に記した制限を有する前の例に置けるようにＥＧＲＣＦを利用することを強いられよう。複合クロマトフォーカシング方法では、丁度４．２３より上のｐＨにおける陰イオン交換吸着剤単独に複数の試料を最初に充填する。この処置により、ＳＴＩおよびβ−ラクトグロブリンを除いてすべてのＨＴが結合せずにカラムを通過し、かくして潜在的な汚染物質としてのＨＴを排除するステップがもたらされる。次のステップとして、陽イオン交換吸着剤を陰イオン交換吸着剤の下に取り付け、そのカラムのタンデムを４．０９より下のｐＨを有する溶液で段階的に洗浄する。このｐＨにおいて、ＳＴＩおよびβ−ラクトグロブリンの両方は陰イオン交換吸着剤から溶離するが、直ぐに、２番目の陽イオン交換吸着剤に結合する。最後のステップにおいて、陰イオン交換吸着剤を除去した後、ｐＨ勾配をｐＨ４．２からｐＨ６まで展開し、２つのきれいに分離したＳＴＩとβ−ラクトグロブリンの分画の溶離を生じさせる。同様のやり方で、実施例２および４に示されているいずれのタンパク質も、第２のカラムにより分画し、非常に高純度で溶離することができる。複合ＥＧＣＦ技術の実施形態の実例による説明は実施例７で示す。
【００７０】
複合クロマトフォーカシング技術の好ましい態様においては、ｐＨ勾配分離が、陰イオンおよび陽イオン吸着剤の両方に対して利用され、この技術の適応性を見せている。再度、実施例２と４を例として取り上げ、ＳＴＩ、ＨＴおよびコンアルブミンが目的生成物であって、ＨＴが非常に低い潤沢度で存在する試料を考える。ＨＴの濃度を大幅に増大することが必要である。最初にタンパク質混合物を適用し、陰イオン吸着剤に６．８のｐＨで結合させる。そのタンパク質の結合に続いて、陽イオン吸着剤を陰イオン吸着剤の後に連続して取り付け、両方の交換体をｐＨ６．８で平衡化させる。次に、低下するｐＨ勾配をｐＨ６．８からｐＨ４．８まで展開する。そのｐＨ勾配がｐＨ６でコンアルブミンを溶離し始めたとき、その溶出液を陽イオン吸着剤から離れた方向に向け、そのタンパク質を最初の精製した生成物質として回収する。コンアルブミンを回収した後、その溶出液を陽イオン吸着剤中に再度向きを変えて戻す。５．３から４．８のｐＨ範囲において、ＨＴは、陰イオン吸着剤から溶離するが、それは正に帯電しており、その見掛けの陽イオンｐＩが６．３７であるために陽イオン吸着剤に結合する。ｐＨ勾配が進行し、ｐＨが４．８より下に落ちたとき、その溶出液を再び陽イオン吸着剤から離れた方向に向け、ｐＨ範囲４．３から４．０において、ＳＴＩの画分を２番目の精製した生成物質として陰イオン吸着剤から溶離する。ＳＴＩの回収が完了した後、陰イオン吸着剤を陽イオン吸着剤から切り離し、掃除をしてｐＨ６．８で再度平衡化させ、分離すべき別のタンパク質試料を充填し、分画の同じ手順を繰り返す。次の分画に由来するｐＨ勾配の溶出液は、再びｐＨ５．３で開始して陽イオン交換体に入るので、６．８の初期ｐＨの陽イオン吸着剤を再び平衡化させる必要はない。このｐＨは、ＨＴの見掛けの陽イオンｐＩより十分に低く、それ故、陽イオン吸着剤に前から結合していたＨＴを取り除くことはない。陽イオン吸着剤上でのＨＴの十分な蓄積が達成されたとき、そのタンパク質は、ｐＨ６からｐＨ６．６までの逆ｐＨ勾配によるかまたはｐＨ６．３７において溶離する段階ｐＨによるかのいずれかにより溶離する。複合クロマトフォーカシングの説明した手順を使用することにより、３つのタンパク質すべてを十分に分離し、そのうちの１つを高度に濃縮した状態にすることが可能である。
【００７１】
複合ＥＧＣＦ技術の別の態様においては、いずれかのカラムの温度を個々に、または両方のカラムの温度を同時に、吸着剤（１つまたは複数）およびバッファー溶液の作用温度範囲を通して変化させることができる。分離を促進する手段としての温度の使用は、陽イオンから陰イオンに行く結合環境または逆に陰イオンから陽イオンに行く結合環境において、室温において分離する間の特定の目的分子のｐＩの変動が小さいときに必要となる。
【００７２】
タンパク質は、本発明の方法により分離する好ましい荷電分子であるが、その他の適当な荷電分子として、ＲＮＡ、ポリ両性電解質、アミノ糖類、ウロン酸を含有する電荷を担う多糖類および植物中に天然に発生するタンニン（タンパク質に結合しているポリフェノール酸）などの荷電した芳香族化合物が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７３】
本発明のクロマトグラフシステムで使用する適当な溶媒としては、水および当分野で知られている適当な有機溶媒が挙げられるが、これらに限定されない。水が、好ましい溶媒である。
【００７４】
本発明のクロマトグラフシステムで利用されるバッファー成分は、重複するｐＫ_ａを有する。荷電分子の混合物をクロマトグラフ分離する間、各バッファー成分のモル比率は、初期ｐＨと最終のｐＨの間の変遷を通して一定したままであるかまたは変化するかのいずれかであり得る。本発明のバッファー組成物の各バッファー成分は、アミノ基、アミド基、イミノ基、イミド基、カルボキシル基、スルホン基、リン酸基およびホスホン酸基からなる群から選択された少なくとも１つの官能基を含有しており、約０．００１ｍＭから約１０００ｍＭの濃度で存在する。適当なバッファー成分の例としては、１，２，３−トリアミノプロパン、１，２−ジ−（２−アミノエチルチオ）エタン、１，２−ジアミノ−２−メチルプロパン、１，２−ジアミノプロパン、１，３−ジアミノ−２，２−ジメチルプロパン、１，３−ジアミノプロパン−２−オール、１，３−ジアミノプロパン、２−（２−ヒドロキシプロピルアミノ）エチルアミン、２−（３−ヒドロキシプロピルアミノ）エチルアミン、２，２’−ジアミノジエチルスルフィド、２，２’−ジアミノジエチルアミン、２，２’−ジヒドロキシジエチルアミン、２，３−ジアミノ−２，３−ジメチルブタン、２，３−ジアミノブタン、２−アミノ−２’−ヒドロキシジエチルスルフィド、２−アミノエチルスルホン酸、２−カルボキシエチルイミノ二酢酸、２−メトキシエチルアミン、２−メトキシエチルイミノ二酢酸、２−メチル−４−ヒドロキシ−アミノベンズイミダゾール、２−メチルベンズイミダゾール、２−メチルイミダゾール、２−メチルチオエチルアミン、２−メチルチオエチルイミノ二酢酸、２−ホスホノエチルイミノ二酢酸、２−チエニルメチルアミン（２−チオフェンメタンアミン）、３，３’−ジアミノジ−ｎ−プロピルアミン、３−ヒドロキシプロピルイミノ二酢酸、４−（２−アミノエチル）モルホリン、４−ブロモイミダゾール、４−ヒドロキシ−６−アミノベンズイミダゾール、４−ヒドロキシベンズイミダゾール、４−ヒドロキシメチルイミダゾール、４−メトキシベンズイミダゾール、４−ニトロイミダゾール、６−ニトロベンズイミダゾール、ＡＣＥＳ（Ｎ−（カルバモイルメチル）−２−アミノエタンスルホン酸）、酢酸、ＡＤＡ（Ｎ−（２−アセトアミド）−２−イミノ二酢酸）、アジピン酸、ＡｌａＡｌａＡｌａ（アラニルアラニルアラニン）、アラニン、アミノマロン酸（アミノプロパン二酸）、ＡＭＰ（２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール）、ＡＭＰＤ（２−アミノ−２−メチル−１，３−プロパンジオール）、ＡＭＰＳＯ（３−［（１，１−ジメチル−ヒドロキシエチル）アミノ］−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）、アルギニン、アスパラギン酸、アスパルチルヒスチジン、アゼライン酸（１，７−ヘプタンジカルボン酸）、安息香酸、ベンジルグルタミン酸、ＢＥＳ（Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸）、ＢＩＣＩＮＥ（Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン）、ビス−トリス（２−ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ−２−（ヒドロキシメチル）−１，３−プロパンジオール）、ビス−トリス プロパン（１，３−ビス［トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ］プロパン）、ブタン酸、ＣＡＢＳ（４−（シクロヘキシルアミノ）−１−ブタンスルホン酸）、ＣＡＰＳ（３−（シクロヘキシルアミノ）−１−プロパンスルホン酸）、ＣＡＰＳＯ（３−（シクロヘキシルアミノ）−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホン酸）、ＣＨＥＳ（２−（シクロヘキシルアミノ）エタンスルホン酸）、クエン酸（２−ヒドロキシ−１，２，３−プロパントリカルボン酸）、システイン、シスチン、シスチニルジグリシン、ジ−（２−ヒドロキシエチル）アミノ酢酸、ジ−（カルボキシメチル）−アミノメチルホスホン酸、ジエタノールアミン、ジエチルアミノ酢酸、ジエチルマロン酸、ジグリシルシスチン、ジメチルアミノ酢酸、ジメチルマロン酸、ジ−ｎ−プロピルマロン酸、ＤＩＰＳＯ（Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−３−アミノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）、ＤＬ−１：２−ジクロロコハク酸、ＤＬ−１：２−ジメチルコハク酸、Ｄ−酒石酸、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）、ＥＰＰＳ（Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−（３−プロパンスルホン酸））、エタノールアミン、エチレンジアミン、エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−二酢酸、エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ−二酢酸、エチルマロン酸、エチル−ｎ−プロピルマロン酸、ギ酸、フマル酸、グルタミン酸、グルタル酸、グルタチオン−γ−Ｌ−グルタミル−Ｌ−システイニルグリシン、ＧｌｙＡｌａ（グリシルアラニン）、ＧｌｙＡｌａＡｌａ（グリシルアラニルアラニン）、グリシン、グリシンアミド（２−アミノアセトアミド）、グリコール酸、ＧｌｙＧｌｙ（グリシルグリシン）、Ｇ１ｙＧｌｙＧｌｙ（グリシルグリシルグリシン）、ＧｌｙＰｒｏ（グリシルプロリン）、ＨＥＰＢＳ（Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−（４−ブタンスルホン酸））、ＨＥＰＥＳ（Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−（２−エタンスルホン酸））、ＨＥＰＰＳＯ（Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−（２−ヒドロキシプロパンスルホン酸））、ヘキサメチレンテトラミン、ヒスチジン、ヒスタミン（１Ｈ−イミダゾール−４−エタンアミン）、ヒスチジルチロシン、ホモシスチン（４，４’−ジチオビス（２−アミノブタン酸））、ヒドロキシキノリン、イミダゾール、イミノ二酢酸、イミノジプロピオン酸、ｉ−プロピルマロン酸、乳酸、ロイシン、リジン、マレイン酸、マロン酸、メルカプトエチルアミン、ＭＥＳ（２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸）、メソ−１：２−ジブロモコハク酸、メソ−１：２−ジクロロコハク酸、メソ−１：２−ジメチルコハク酸、メソ−酒石酸、メチル−［β−ジエチルアミノ−エチル］スルフィド、メチルエチルマロン酸、メチルイミノ二酢酸、メチルマロン酸、メチル−α−アミノ−β−メルカプトプロピオネート、ＭＯＢＳ（４−（Ｎ−モルホリノ）ブタンスルホン酸）、ＭＯＰＳ（３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸）、ＭＯＰＳＯ（２−ヒドロキシ−３−モルホリノプロパンスルホン酸）、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−エチレンジアミン、Ｎ−（カルバモイルメチル）−イミノ二酢酸、Ｎ，Ｎ’−ジ−（２−アミノエチル）エチレンジアミン、Ｎ，Ｎ’−ジエチルエチレンジアミン、Ｎ，Ｎ−ジエチルエチレンジアミン、Ｎ，Ｎ’−ジグリシルエチレンジアミン、Ｎ，Ｎ’−ジメチルエチレンジアミン、Ｎ，Ｎ−ジメチルエチレンジアミン、Ｎ，Ｎ−ジメチルヒドロキシルアミン、Ｎ，Ｎ’−ジ−ｎ−プロピルエチレンジアミン、Ｎ−２−ヒドロキシエチルイミノ二酢酸、Ｎ−２−スルホエチルイミノ二酢酸、Ｎ−アセチルヒスチジン、Ｎ−アリルモルホリン、Ｎ−アリルピペリジン、Ｎ−ブチルアミノ酢酸、Ｎ−ジエチル−システアミン、Ｎ−ジメチル−システアミン、Ｎ−ジプロピル−システアミン、Ｎ−エチルアミノ酢酸、Ｎ−エチルエチレンジアミン、Ｎ−エチルモルホリン、Ｎ−エチルピペリジン、Ｎ−イソプロピルアミノ酢酸、Ｎ−イソプロピルエチレンジアミン、ニトリロ三酢酸、Ｎ−メチルアミノ酢酸、Ｎ−メチルジエタノールアミン、Ｎ−メチルエチレンジアミン、Ｎ−メチルモルホリン、Ｎ−メチルピペラジン（１−メチルピペラジン）、Ｎ−メチルピペリジン、Ｎ−メチルピロリジン、Ｎ−メチルトリメチレンイミン、Ｎ−ｎ−ブチルエチレンジアミン、Ｎ−ｎ−プロピルアミノ酢酸、Ｎ−ｎ−プロピルエチレンジアミン、ｎ−プロピルマロン酸、Ｎ−β−メルカプトエチル−モルホリン、Ｎ−β−メルカプトエチル−ピペリジン、Ｏ，Ｏ’−ジエチルコハク酸、Ｏ−Ｏ’−ジメチルコハク酸、シュウ酸、フタル酸、ピメリン酸、ピペラジン、ピペリジン、ＰＩＰＥＳ（ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸））、ＰＩＰＰＳ（ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（３−プロパンスルホン酸）、ＰＯＰＳＯ（ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシプロパンスルホン酸））、プロリン、サリチル酸、サルコシン（Ｎ−メチルグリシン）、スベリン酸、セリン、コハク酸、スルファニル酸、ＴＡＢＳ（Ｎ−トリス−（ヒドロキシメチル）メチル−４−アミノブタンスルホン酸）、ＴＡＰＳ（［（２−ヒドロキシ−１，１−ビス［ヒドロキシメチル］エチル）アミノ］−１−プロパンスルホン酸）、ＴＡＰＳＯ（３−（Ｎ−トリス［ヒドロキシメチル］メチルアミノ）−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）、タウリン（２−アミノエタンスルホン酸）、ＴＥＳ（２−［（２−ヒドロキシ−１，１−ビス［ヒドロキシメチル］エチル）アミノ］エタンスルホン酸）、テトラメチルコハク酸、トリアミノトリエチルアミン、トレオニン、トリシン Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］−グリシン、トリエタノールアミン、トリエチレンジアミン、トリカルバリル酸（１，２，３−プロパントリカルボン酸）、トリプトファン、チロシン、トリス （トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）；α，α−ジアミノ酪酸、α，β−ジアミノプロピオン酸、α，β−ジメルカプトコハク酸、β−エチルグルタル酸；β−ｎ−プロピルグルタル酸；β，β−ジエチルグルタル酸；β，β−ジメチルグルタル酸；β，β−ジ−ｎ−プロピルグルタル酸；β，β−メチルエチルグルタル酸、β−カルボキシメチルアミノプロピオン酸、β−メチルグルタル酸およびバリンが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７５】
好ましい態様において、バッファー成分は、ピペラジン、１−メチルピペラジン、トリエタノールアミン、ビス−トリスプロパンおよび場合によりギ酸を含んでいる。
【００７６】
バッファー成分を含有するバッファー組成物は、所定のｐＨにおける組成物が別の所定のｐＨにおけるバッファー組成物を滴定するとき、２つのその組成物の混合物のｐＨの変化は、その２つの組成物の各々によって表される混合物の画分に直線的に正比例する性質を有している。一般的には、所定のｐＨと別の所定のｐＨの間の差は、１ｐＨ単位から１０ｐＨ単位までのどこかである。そのｐＨは、一般に、イオン交換カラムの出口で測定する。
【００７７】
本発明の方法で用いるのに適した吸着剤は、弱陰イオン交換樹脂、弱陽イオン交換樹脂、強陰イオン交換樹脂および強陽イオン交換樹脂である。典型的な樹脂としては、Ｍｏｎｏ Ｑ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、３００ＶＨＰ（Ｖｙｄａｃ）、ＳｙｎＣｈｒｏｐａｋ ＳＡＸ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）およびＣＯＳＭＯＧＥＬ ＱＡ（Ｎａｃａｌａｉ Ｔｅｓｑｕｅ，Ｉｎｃ．）等の第四級アンモニウム強陰イオン交換体；Ｍｏｎｏ Ｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）等のスルホン酸メチル強陽イオン交換体；ＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、４００ＶＨＰ（Ｖｙｄａｃ）、ＴＳＫ ＳＰ−５ＰＷ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）およびＣＯＳＭＯＧＥＬ ＳＰ（Ｎａｃａｌａｉ Ｔｅｓｑｕｅ，Ｉｎｃ．）等のスルホプロピル強陽イオン交換体；Ｍｏｎｏ Ｐ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）等の第四級および第三級混合アミン弱陰イオン交換体；ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐａｃｋ ＤＥＡＥ ５ＰＷ（Ｗａｔｅｒｓ）、ＴＳＫ ＤＥＡＥ−５ＰＷ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）および３０１ＶＨＰ第三級アミン（中程度ＤＥＡＥ型）陰イオン交換体（Ｖｙｄａｃ）等のジエチルアミノエチルＤＥＡＥ弱陰イオン交換体；ＡＮＸ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ＦＦ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）等のジエチルアミノプロピル弱陰イオン交換体；ＣＭ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ＳｙｎＣｈｒｏｐａｋ ＷＣＸ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＩＥＣ ＣＭ−８２５（Ｓｈｏｄｅｘ）、ＳＴＹＲＯＳ（商標）ＣＭ（ＯｒａＣｈｒｏｍ，Ｉｎｃ．）およびＣＯＳＭＯＧＥＬ ＣＭ（Ｎａｃａｌａｉ Ｔｅｓｑｕｅ，Ｉｎｃ．）等のカルボキシメチル弱陽イオン交換体；ＰＬ １０００ ＳＡＸ、ＳｙｎＣｈｒｏｐａｋ ＷＡＸ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）等のポリエチレンイミンイオン交換カラムならびに弱陰イオン交換体架橋ポリエチレンイミン相ＭＩＣＲＡ−Ｇｏｌｄ ＡＸ１００、ＡＸ１０００およびＭＩＣＲＡ−Ｓｉｌｖｅｒ ＡＸ３００（Ｅｉｃｈｒｏｍ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７８】
代表的なクロマトグラフ分離で採用される初期ｐＨと最終のｐＨの間の差は、大きく変動し、肝要なｐＨ範囲にわたって安定した直線状外部ｐＨ勾配を形成することを可能にするバッファー溶液中に含まれるバッファーの種類、分離すべき化合物のｐＩ、分離すべき化合物のｐＩの密接度および実験者が勾配の形状を制御することができるｐＨ範囲の幅等の要因に依存する。一般にその差は、約１ｐＨ単位から約１２ｐＨ単位までのどこかである。吸着剤が陰イオン交換吸着剤であるときは、初期ｐＨは、最終のｐＨより高く（すなわちよりアルカリ性）、一方吸着剤が陽イオン交換吸着剤であるときは、初期ｐＨは、最終のｐＨより低い（すなわちより酸性）。
【００７９】
変温外部勾配クロマトフォーカシング（変温ＥｘＧＣ）および変温逆外部勾配クロマトフォーカシング（変温ＲｅｖＥｘＧＣ）を提供する本発明の態様の１つにおいて、荷電分子を加えるところから分離した荷電分子を収集するところまで吸着剤に沿って上昇する温度勾配が存在するように、吸着剤を加熱することができる。別の態様においては、荷電分子を加えるところから分離した荷電分子を収集するところまで吸着剤に沿って下降する温度勾配が存在するように、吸着剤を冷却することができる。両方の実施形態において、温度勾配の範囲は、０℃と８０℃の間である。
【００８０】
本発明の他の態様は、自動化され制御された溶離外部ｐＨ勾配の形成を可能にするフィードバックシステムを備えたＥｘＧＣおよびＲｅｖＥｘＧＣにより荷電分子を分離するための低圧または高圧液体クロマトグラフィー用のクロマトグラフシステムを提供する。このクロマトグラフシステムは、例えば、デュアルポンプブロック、ミキサー、インジェクションバルブ、分子の分離を監視する光検出器またはその他の型の検出器、圧変換器、フラクションコレクターおよびコンピュータ等の液体クロマトグラフに一般的に存在する要素を含有している。Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓは、吸光度、伝導度およびｐＨ（ｐＨフローセルによる）を監視する高度な複合検出器を有しており、現在、保持性勾配クロマトフォーカシングにより荷電分子の分離に使用することができる、ＡＫＴＡｅｘｐｌｏｒｅｒ、ＡＫＴＡｐｕｒｉｆｌｅｒ、ＡＫＴＡ_ＦＰＬＣ（ＦＰＬＣ−高速タンパク質液体クロマトグラフィー）およびＡＫＴＡｐｉｌｏｔ等の液体クロマトグラフシステムを提供している。荷電分子のＥｘＧＣ（またはＲｅｖＥｘＧＣ）に対するｐＨ勾配形成を自動的に制御するために、本発明に記載されているフィードバックｐＨ制御システムを付加することにより、市販の低圧液体クロマトグラフィーまたはＨＰＬＣシステムを、容易に適応させることができる。
【００８１】
ＥｘＧＣ（またはＲｅｖＥｘＧＣ）に対するクロマトグラフシステムの態様においては、比較的小さいｐＨフローセル（図６パネルＡに例示されている）または混合チャンバー中に浸されたｐＨ電極（図６パネルＢに例示されている）のいずれかをｐＨ測定装置およびフィードバック信号発生装置として使用する。上で論じたように、ＥｘＧＣ（またはＲｅｖＥｘＧＣ）においては、ｐＨ勾配の形成は、カラムに充填されている強イオン交換樹脂の特性とは実質的に無関係である。それは、ｐＨフィードバック装置が一般的に分離カラムより上流に置かれる理由である。小さいｐＨフローセルフィードバックシステムを備えたこのクロマトグラフシステムの実施形態（図６パネルＡに例示されている）は、それに限られないが、好ましくは、ポンプＡおよびＢからポンプ輸送される溶液の比率の小さな変化の結果大きなｐＨの変化を起こすことができないように複数のバッファー成分を含有するｐＨ勾配形成溶液で使用する。
【００８２】
好ましい態様において、混合チャンバーを備えたクロマトグラフシステム（図６パネルＢに例示されている）に対するｐＨ制御・補正方法は、次の通り説明される。カラムを最初にｐＨ溶液Ａで平衡化し、混合チャンバーを満たす。さらに、ポンプＡおよびＢを、最初の速度にセットし、ｐＨ溶液Ｂを混合チャンバーに加えることにより溶離液の流れのｐＨが最終ｐＨの方向に変化を始めるようにする。ポンプＣを一定のまたは変動するポンピング速度のいずれかでポンピングするようにセットする。ｐＨ電極は、電圧の変化としてのｐＨの実際の変化を連続的に測定し、それが、事実上フィードバック制御電子黒板またはプログラム可能もしくはコンピュータ制御されるフィードバックコントローラを備えたコンピュータであるフィードバック制御装置に送られる。そのフィードバック制御装置は、ｐＨが前もってプログラムされた勾配によって仮に正確に変化する場合は予想される電圧を決定するアルゴリズムまたはルックアップテーブルを有している。これを理想電圧と呼ぶ。その装置は、そのとき、実際の電圧と理想電圧の間の差（−ΔＶ）を計算する。この差は、次に、例えば、ＤＥＴ（動的当量点滴定）−ＬａｂＸ滴定ソフトウェア付きのＭｅｔｔｌｅｒ Ｔｏｌｅｄｏ ＤＬ５８等の自動滴定装置に使用される−パンフレット、Automatic and flexible DL5x and DL7x titration systems, 2003；Ｍｅｔｒｏｈｍ Ｔｉｔｒｉｎｏ ７１６−Ｍｅｔｒｏｈｍ Ｌｔｄ． ７１６ ＤＭＳ Ｔｉｔｒｉｎｏ、Ｍｅｔｒｏｈｍ ＡＧ、ヘリーザウ、スイス、１９９２）；ＰＩＤ（比例積分微分）、例えばＹｏｋｏｇａｗａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ製のＹＳ−１７０ｐＨコントローラ、アプリケーションノート）；ニューラルネットワーク（W. L. M. N. Karim, A. J. Morris, and E. B. Martin, Comput. Chem.Eng., 20:S1017-S1022, 1996), Neural Network Applications in Control, Edited byG. W. Irwin, K. Warwick and K. J. Hunt 1995）；ファジー理論（S. Menzl, M.Stuhler, and R. Benz,Wat. Res., 30 (4): 981-991, 1996）、R. Babuska, J. Oosterhoff, A.Oudshoorn, P.M. Bruijn, EngineeringApplications of Artificial Intelligence 15 (1) (2002) pp. 3-15）その他等、いくつかの利用できるフィードバック制御アルゴリズムの１つにより、ポンプＡおよびＢに送るべき補正電圧を発生させて、次に測定されるΔＶの絶対値ができるだけ小さく、前もってプログラムされた範囲内にΔｐＨを維持するように変換される。ポンプＣは、ｐＨ勾配形成の初めと終わりで混合チャンバー中の溶液の容積が等しくなるように一定の速度にポンプをセットすることができる。別法では、そのポンピング速度は、混合チャンバー中の溶液の体積の純変化がｐＨ勾配形成の制御を危うくしないような任意の速度であり得る。ポンプＡおよびＢの個々のポンピング速度に対する段階的な補正が全体のポンピング速度と比較して小さい限り、外部ｐＨ勾配の制御は、フィードバックシステムによって維持することができる。このことは、貯蔵器Ｂ中で１つだけの弱酸（酢酸）および１つだけの強塩基、水酸化カリウム（ＫＯＨ）、を用いて広いｐＨ範囲にわたってｐＨ勾配を形成するＲｅｖＥｘＧＣの挑戦的例によって明らかにすることができる。最初にポンプＡを用いて混合チャンバー中に溶液の一定容量を注入して維持し、一方ポンプＣは、酢酸を汲み出して含浸させて強陽イオン交換カラムを平衡化させる。ｐＨ勾配形成が開始したら、ポンプＡのスイッチを切る。フィードバックシステムの性能を、開始時のｐＨにおいてと、Ｂからのポンピング速度が最高である最大バッファー能力（ｐＫ_ａ）のｐＨにおいてと、開始時のｐＨがその下であるずっと上のｐＫ_ａのｐＨにおいてと、ほとんどバッファー能力が無く、ポンピング速度が最低である最終のｐＨにおいて試験する。酢酸の濃度は、１０ｍＭであり、したがって開始時のｐＨは、３に非常に近い。貯蔵器Ｂは、ｐＨ１３の３００ｍＭのＫＯＨを含有している。実験者は、１ｍｌ／分の一定の溶離速度でｐＨ３からｐＨ９まで０．１ｐＨ単位／分の一定のΔｐＨでｐＨに傾きをつけることを決める。混合チャンバーは、最大容量を３．５リットルに設定し、３リットルの１０ｍＭの酢酸を注ぐ。ｐＨ３において酢酸は、９８．２％が会合しているのに対してｐＨ３．１でそれは９７．８％が会合している（すなわち、会合した酸の濃度の４０μＭの減少）。したがって、３リットルの溶液が存在するため、ｐＨを０．１単位変化させるためには、最初の１分で１２０μｍｏｌのＫＯＨを加えなければならない。ＫＯＨの各１ｍｌは、３００μｍｏｌのＫＯＨを含有しており、そこで０．４ｍｌ／分でＫＯＨの添加を開始しなければならない。酢酸の最大バッファー能力は、それが５０％解離しているｐＨ＝ｐＫ_ａ＝４．７５において起こる。ｐＨ４．７５において、チャンバー中には１５ｍｍｏｌの解離していない酸が存在する。ｐＨ４．８５では１３．２７ｍｍｏｌの解離していない酸が存在する（すなわち、０．１ｐＨ単位の変化を誘発するには１．７３ｍｍｏｌのＫＯＨを添加する必要がある）。したがって、ポンプＢの最大ポンピング速度は、５．７７ｍｍｏｌ／分に近づき、それは、十分に利用できるポンプの能力の範囲内である。系がｐＨ６．５に到達する時までに、ｐＨ６．６まで滴下するのに必要なＫＯＨの量は、０．３〜０．４ｍｌ／分の範囲のポンピング速度に対して、約１００μｍｏｌである。最後に、ｐＨが、制御して８．９に到達したと仮定した場合、１分間でｐＨ９．０を達成するための塩基の添加は、残存している会合した酢酸が非常に少ないために、その時はごくわずかのはずである。そのシステムの制限は、その時、ポンプＢの計算されたポンピング速度（すなわち、ＫＯＨの添加）が、そのポンプが可能である最低のポンピング速度より下まで落ちないことである。ｐＨ８．９において、混合チャンバー中には解離する２．１μｍｏｌの会合した酸が残存していよう。ｐＨ９．０においては、１．７μｍｏｌの会合した酸が残っている。したがって、０．１ｐＨ単位／分の増加を誘発するためには１分当たり０．４μｍｏｌのＫＯＨを送らなければならない（すなわち、ポンピング速度は１．３μｌ／分でなければならない）。入手できる実験室用ポンプ（例えば、Ｊａｓｃｏ ＨＰＬＣシリーズ）は、１μｌ／分から１０μｌ／分のポンピング速度の有効範囲を有している。ＫＯＨが非操作のポンプＡにより連続的に加えられたために酢酸濃度が低下していることに注意を払わなければならない。優れた最初の概算に向けて、酢酸濃度の減少を、最初の酢酸を全体容積中に希釈することによって計算する。ｐＨ勾配形成の時間は６０分であり、そのため、その時間内にポンプＣにより６０ｍｌを除去する。ＫＯＨの平均ポンピング速度は、始めの４０分間はほぼ３ｍｌ／分であるが、最後の２０分間は約０．２ｍｌ／分に過ぎない。これにより計算すると、ｐＨ勾配形成の終点では、混合チャンバー中で、約３，０６４ｍｌの正味の全体積になる。したがって、酢酸濃度の減少の存在は、わずか約２％に過ぎない。濃ＫＯＨを添加するために、溶液のモル濃度の同時的変化は、十分に許容できる低レベルのイオン強度の範囲内である１０ｍＭから約２２ｍＭまでである。この実施例は、極めて単純で安価なバッファーの化学的性質により、非常に強力な結果を達成することができることを特に説明するために使用した。実際、ｐＨ勾配の範囲を通して単一の弱酸または弱塩基に強塩基または強酸を加えることに対応する混合チャンバー中のｐＨの変化を計算することの相対的な平易さにより、バックアップ補正を提供するフィードバック制御システムによりポンプを運転する簡単な計算アルゴリズムを備えたコンピュータプログラムが可能となる。しかしながら、バッファーの化学的性質が複雑になればなるほど、計算のアルゴリズムがより厄介になり、予想されるのは、最も好ましい態様においては、２つ以上の弱酸または弱塩基を混合チャンバー中に最初に存在させることである。複数のバッファー化合物の溶液をフィードバック制御システムと組み合わせて使用することにより、必要なｐＨ範囲を通して適度の速度で、その間、滴下溶液の化学的性質のあらゆる変化に対応する新しい複雑なアルゴリズムに変化させることを必要とせずに正確なｐＨ勾配を維持して、ポンピングすることが可能となる。
【００８３】
実施例
実施例で登場するすべてのクロマトグラフ分離は、コンピュータ制御のＡＣＴＡ_ＦＰＬＣ高速タンパク質液体クロマトグラフィーシステム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｈｅｃｈ、ウプサラ、スウェーデン）により行い、それは、Ｐ−９２０ポンプ装置、ミキサーＭ−９２５、ＵＰＣ９００監視装置、Ｈｇ光学素子、５ｍｍフローセル、伝導度セルおよびフラクションコレクターＦｒａｃ−９００を装備している。タンパク質のカラムからの溶離は、２８０ｎｍまたは２５４ｎｍにおける溶出液ＵＶ吸光度により監視した。各分離の間に１または０．５ｍｌの画分を回収し、それらのｐＨを、実験の完了直後にＰＨＭ８２標準ｐＨメーター（Ｒａｄｉｏｍｅｔｅｒ、コペンハーゲン、デンマーク）により測定した。カラム、Ｍｏｎｏ Ｑ ＨＲ ５／５強陰イオン交換体、Ｍｏｎｏ Ｓ ＨＲ ５／５強陽イオン交換体およびＭｏｎｏ Ｐ ＨＲ ５／２０弱陰イオン交換体は、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈから購入した。トリエタノールアミンは、Ｓｉｇｍａ（セントルイス、ミズーリ州、米国）から、イミノ二酢酸、ピペラジン、メチルピペラジンおよびギ酸は、Ａｌｄｒｉｃｈ（ミルウォーキー、ウィスコンシン州、米国）から、ビス−トリスプロパンは、ＩＣＮ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．（アーヴィン、カリフォルニア州、米国）から、Ｐｏｌｙｂｕｆｆｅｒ９６、Ｐｏｌｙｂｕｆｆｅｒ７４は、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈからである。タンパク質は、Ｓｉｇｍａ（セントルイス、ミズーリ州、米国）およびＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ（サンディエゴ、カリフォルニア州、米国）から入手し、さらなる精製はしないで使用した。ｐＨ勾配形成溶液は、バッファーの種類を必要な濃度で水に溶解し、それらのそれぞれのｐＨまで塩酸で滴定し、最終容積まで希釈し、０．４５μｍのフィルターを通して真空ろ過することにより各実験前に新たに用意した。特に別の指示がない限り、すべて分離は、以下の手順を使用して行った。分離すべきタンパク質の１ないし２ｍｇを、開始時ｐＨのバッファーに溶解し、０．４５μｍの低タンパク質結合性フィルターを通してろ過した。各分離の前に、カラムを少なくとも１０カラム体積分の開始バッファーで平衡化させた（溶出液のｐＨが開始バッファーのｐＨと同じになるまで）。タンパク質試料を次にカラムの入口に注入し、結合していない物質を除去するために、カラムを３ないし５カラム体積の開始バッファーにより洗浄した（溶出液中に検出される吸光度の変化がなくなるまで）。その後ポンプを停止することなく、コンピュータ制御の外部勾配クロマトフォーカシング（逆クロマトフォーカシング）分離を、ＡＣＴＡ_ＦＰＬＣシステムのソフトウェア（Ｕｎｉｃｏｒｎ Ｖ．３）による前もってプログラムされたクロマトグラフ方法を実行することにより実施した。その方法に包含されていた情報は、溶離液の流速、カラムに適用される前もって形成された外部ｐＨ勾配の長さおよび形状、カラムの特性、ならびに前段の溶離および後段の溶離時間に関するものである。
【００８４】
最終バッファーのｐＨにおける勾配形成および２〜７カラム体積の最終バッファーによるカラムの洗浄が完了すると同時にデータの収集は終了した。提示した実施例は、比較的小規模の分析的分離を明らかにしているが、分析用のカラム、例えばＭｏｎｏ ＱおよびＭｏｎｏ Ｓ ＨＲ ５／５で展開した外部ｐＨ勾配クロマトフォーカシングおよび逆クロマトフォーカシングは、容易に拡大可能であり、より大きなカラム例えばＭｏｎｏ Ｑ、Ｍｏｎｏ Ｓ ＨＲ １０／１０、ＨＲ １６／１０またはそれ以上のものによる大規模な精製に使用することができる。
【００８５】
実施例１
強陰イオン交換体Ｍｏｎｏ Ｑ ＨＲ５／５による室温における複雑なタンパク質の混合物の外部勾配クロマトフォーカシング分離。開始バッファーＡ−５ｍＭのメチルピペラジン、５ｍＭのピペラジン、５ｍＭのＴＥ ｐＨ９．５、最終バッファーＢ−５ｍＭのメチルピペラジン、５ｍＭのピペラジン、５ｍＭのＴＥ ｐＨ３．５。流速１ｍｌ／分、０％Ｂから１００％Ｂまでの直線状勾配形成の長さ４０カラム体積。この実施例における外部勾配を形成するために使用された３成分のバッファーシステムは、極端ではない非直線性のｐＨプロフィールを示している（図１、パネルＢ，点線）。試料の複雑性、いくつもの種類のｐＩが接近していることおよびすべての化合物を分離するために必要な広いｐＨ範囲にもかかわらず、すばらしい分離が達成されている（図１、パネルＡおよびＢ）。
【００８６】
実施例２
本発明の４成分バッファーシステムを用いる強陰イオン交換体Ｍｏｎｏ Ｑ ＨＲ ５／５による室温における外部勾配クロマトフォーカシングにより分離した実施例１におけるのと同じ組成のタンパク質混合物。開始バッファーＡ−４ｍＭのトリス−ビスプロパン、４ｍＭのメチルピペラジン、４ｍＭのピペラジン、４ｍＭのＴＥ ｐＨ９．５、最終バッファーＢ−４ｍＭのトリス−ビスプロパン、４ｍＭのメチルピペラジン、４ｍＭのピペラジン、４ｍＭのＴＥ ｐＨ３．５。流速１ｍｌ／分、０％Ｂから１００％Ｂまでの直線状勾配形成の長さ４０カラム体積。分離における改良は顕著ではないが、勾配形成溶液（ＡおよびＢ）にビス−トリスプロパンを加えることによりｐＨプロフィールがより一層直線になっている（図２、パネルＢ，点線）。図２、パネルＡは、分離されたタンパク質種類のＵＶ吸光度対ｐＨを示している。
【００８７】
実施例３
酵母ホスホグリセリン酸キナーゼ０．２ｍｇの２つの変異体の弱および強陰イオン交換体による内部保持ｐＨ勾配クロマトフォーカシングと外部ｐＨ勾配クロマトフォーカシングの分離の比較。パネルＡ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｔｅｃｈにより提供されたＰｏｌｙｂｕｆｆｅｒｓおよびＭｏｎｏ Ｐ ＨＲ５／２０カラムによるクロマトフォーカシング。平衡化バッファーＡ−２５ｍＭのＴＥ イミノ二酢酸によるｐＨ８．３ 溶離バッファーＢ−６ｍｌのＰｏｌｙｂｕｆｆｅｒ９６＋１４ｍｌのＰｏｌｙｂｕｆｆｅｒ７４、イミノ二酢酸によるｐＨ５ ２００ｍｌに希釈。内部保持ｐＨ勾配を発生させ、タンパク質を１ｍｌ／分の流速の１２カラム体積のＰｏｌｙｂｕｆｆｅｒにより溶離した。図３パネルＢ。
【００８８】
Ｐｏｌｙｂｕｆｆｅｒｓを使用しない弱陰イオン交換体Ｍｏｎｏ Ｐ ＨＲ ５／２０および単純な２成分のバッファーシステムに基づくハイブリッド（外部プラス保持性内部勾配）クロマトフォーカシングにより達成されたＰＧＫの分離。直線状の外部溶離勾配を、流速１ｍｌ／分の開始バッファーＡ−５ｍＭのピペラジン、５ｍＭのＴＥ ｐＨ８．２、および最終バッファーＢ−５ｍＭのピペラジン、５ｍＭのＴＥ ｐＨ５、を使用し、１８カラム体積で生じた。溶出液ｐＨプロフィールの直線性が大幅に解決されている（点線）ことを見ることができる。図３、パネルＣ。強陰イオン交換体Ｍｏｎｏ Ｑ ＨＲ ５／５に基づく以外は例３パネルＢにおけるものと同様の２成分バッファーシステムを利用した外部勾配クロマトフォーカシングにより分離したＰＧＫ。
【００８９】
本実施例は、より良好な直線状の溶出液ｐＨプロフィール（点線）およびより良好な分離を示している。流速１ｍｌ／分、ｐＨ８．３からｐＨ５までの直線状外部勾配の長さ３５カラム体積。図３、パネルＤ。本発明の４成分バッファーを採用し、Ｍｏｎｏ Ｑ ＨＲ ５／５に基づく外部ｐＨ勾配クロマトフォーカシング（実施例２参照）により分離したＰＧＫ。流速１ｍｌ／分、外部ｐＨ勾配による溶離の長さ２０カラム体積。著しく直線的な溶出液のｐＨ勾配（点線）および得られたタンパク質種の最良の分離に注目されたい。
【００９０】
実施例４
ｐＨ４からｐＨ９．５までの広範な直線状ｐＨ勾配（図４Ｂ、点線）および本発明の４成分バッファーシステムを用いる強陽イオンカラムＭｏｎｏ Ｓ ＨＲ ５／５によるタンパク質混合物の外部ｐＨ勾配逆クロマトフォーカシング。ＳＴＩおよびβ−ラクトグロブリンが、この実施例では非常に良く分離されるが、実施例２で示したように、同じバッファーシステムを使用する同じｐＨ範囲にわたる陰イオンカラムでは分離が困難であることに注意することが重要である。これは、利用できる２つの機能、クロマトフォーカシングおよび逆クロマトフォーカシング、を有することの１つの重要な理由を明示している。
【００９１】
実施例５
この実施例は、非常に広いｐＨ範囲にわたって、外部勾配クロマトフォーカシングおよび逆クロマトフォーカシングにより荷電分子を分離するために使用される強力なバッファーシステムを示している。その外部勾配は、溶離液１ミリリットル当たり０．１０ｐＨ単位の直線状ｐＨ勾配を維持するように前もってプログラムされている（パネルＢ、曲線１、３）。両方の技術において観察される平均のｐＨ変化は、溶離液１ミリリットル当たり０．１０ｐＨ単位（パネルＡ、曲線１、３）である。その外部勾配は、次のようにして前もってプログラムして形成した：１．クロマトフォーカシングにおいて−５８カラム体積で０％のＢから９０％のＢと、１５カラム体積で９０から１００％までのＢと，その後１００％のＢの７カラム体積が続く（パネルＢ曲線１）；２．逆クロマトフォーカシングにおいて−１５カラム体積で１００％のＢから９０％のＢと、６６カラム体積で９０から０％までのＢと，その後０％のＢの７カラム体積が続く（パネルＢ曲線３）。溶出液の吸光度は、バッファー種の低い吸収性を示し、したがって、両方の技術によって分離した際のバッファーシステムが荷電分子の分光学的検出に対して有する影響が無視できる２５４ｎｍで監視した（パネルＡ曲線２、４）。溶出液伝導度の直線状の変化（パネルＢ曲線２、４）および直線状ｐＨプロフィール（パネルＡ曲線１、３）は、両方とも、前もって形成された外部ｐＨ勾配の形状に対するＭｏｎｏ ＱおよびＭｏｎｏ Ｓカラム樹脂の妨害が低いことを反映している。流速１ｍｌ／分。
【００９２】
実施例６
この実施例は、外部ｐＨ勾配クロマトフォーカシングおよび逆クロマトフォーカシングにより荷電分子を分離するための典型的なクロマトグラフシステムのブロックダイヤグラムを示し、イオン交換カラムに送るｐＨ勾配の形成を監視および調整する自動フィードバックシステムを含む（図６に例示）。このクロマトグラフシステムは、フィードバック源として、ｐＨフローセル（図６、パネルＡ）またはミキサーチャンバーに組み込まれているｐＨ電極（図６、パネルＢ）のいずれかを利用することができる。どちらの場合も、そのｐＨ測定装置は、実際のｐＨ勾配の前もってプログラムされたｐＨ勾配からの偏差を補正するために勾配形成溶液のポンピング速度を調節するフィードバックコントローラにｐＨに依存する電圧信号を送る。これらのシステムの間の違いは、ミキサーチャンバーシステムにおいては、時間依存のｐＨにより生じた溶離液が、追加のポンプによってミキサーチャンバーからイオン交換カラムに送られることである。そのミキサーチャンバーシステムは、異なる容量のチャンバーを使用することができるために、実際のｐＨ勾配の前もってプログラムされたｐＨ勾配からの大きなｐＨの偏差を防ぐことができる。ミキサーチャンバー中で滴定される溶液の容積が大きいほどｐＨを変えるのはより困難である。この技術の実際の応用では、強酸溶液と弱塩基溶液との、または、強塩基溶液と弱酸溶液との任意の組み合わせを使用してｐＨ勾配を形成することが可能である。
【００９３】
実施例７
この実施例は、複合外部勾配クロマトフォーカシング技術の汎用性を説明する。２つのカラム、Ｍｏｎｏ Ｑ強陰イオン交換カラムおよびＭｏｎｏ Ｓ強陽イオン交換カラムを連続して接続し、開始ｐＨ７で平衡化させる。最初のステップでヒトトランスフェリンおよびβｌｇを注入し、陰イオン交換体に結合させる。２番目のＥＧＣＦステップで、ｐＨ７からｐＨ４までのｐＨ勾配を展開させ、タンパク質を分離して陰イオン交換体から溶離させ、直ちに陽イオン交換体に結合させる。ＥＧＣＦの完了と同時に、２つのカラムを互いから切り離し、Ｍｏｎｏ Ｑカラムを流路から除去する。最終のＥＧＲＣＦステップにおいて、ｐＨ４からｐＨ７．５まで展開されたｐＨ勾配によって、タンパク質を陽イオン交換体から溶離する。パネルＡは、後にＥＧＲＣＦステップ（破線）が続く最初のＥＧＣＦステップ（実線）に基づく吸光度およびｐＨの変化を図示している。パネルＢは、後に２番目のＥＧＲＣＦステップ（破線）が続く最初のＥＧＣＦステップ（実線）の間のｐＨの関数としての吸光度および伝導度の変化を示している。ＣＥＧＣＦ法は、ＥＧＲＣＦにより開始し、同様にＥＧＣＦにより終了する逆の順序で実施することができる。
【００９４】
これまでの詳細な説明は、単にはっきりと理解することのために提供したものであって、当業者にとって修正は自明のことであるのでそこからは不必要な限定が無いことを理解すべきである。
【００９５】
本発明をその特定の実施形態と関連付けて説明してきたが、当然のことながら、それはさらなる修正が可能であり、この出願は、一般に、本発明の原理を受け、本発明が関係する技術分野内の既知の習慣または慣行に入り、上文で説明した本質的な特徴に適用することができ、添付の特許請求の範囲に従うものであるような本開示に由来する新機軸を含む本発明のどのような変形、使用、または適応も対象とすることを意図している。
【図面の簡単な説明】
【００９６】
添付の図面は、上に列挙した本発明の特徴、利点および目的を詳細に理解することができるように本明細書に包含されている。これらの図面は、特許明細書の一部を形成している。しかしながら、添付した図面は、本発明の好ましい態様を図解するものであって、本明細書に記載されている発明の範囲を限定するものと考えるべきではないことに留意しなければならない。
【００９７】
【図１】３成分バッファーシステムを用いる強陰イオン交換カラムに基づく外部勾配クロマトフォーカシングによるタンパク質の複雑な混合物の分離を描く図である。パネルＡは、ミオグロビン、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）、コンアルブミン、コンアルブミン鉄錯体、ヒトトランスフェリン（ＨＴ）、β−ラクトグロブリン（βｌｇ）およびダイズトリプシンインヒビター（ＳＴＩ）の混合物を５ｍＭのメチルピペラジン、５ｍＭのピペラジン、５ｍＭのトリエタノールアミン（ＴＥ）バッファーｐＨ９．５に溶解し、Ｍｏｎｏ Ｑ ＨＲ ５／５カラムにｐＨ９．５で結合し、外部勾配クロマトフォーカシングにより分離した図である。パネルＢは、５ｍＭのメチルピペラジン、５ｍＭのピペラジン、５ｍＭのＴＥバッファーｐＨ９．５の、５ｍＭのメチルピペラジン、５ｍＭのピペラジン、５ｍＭのＴＥバッファーｐＨ３．５との混合により生じた外部ｐＨ勾配によるＭｏｎｏ Ｑ ＨＲ ５／５の溶離の間に観察された溶出液ｐＨのプロフィール（点線）を示す図である。Ｍｏｎｏ Ｑ ＨＲ ５／５は、５ｍＭのメチルピペラジン、５ｍＭのピペラジン、５ｍＭのＴＥバッファーｐＨ９．５により平衡化させた。流速１ｍｌ／分、ｐＨ９．５からｐＨ３．５までのｐＨ勾配形成の長さ４０カラム体積。
【図２】４成分バッファーシステムを用いる強陰イオン交換カラムに基づくクロマトフォーカシングによるタンパク質の複雑な混合物の分離を描く図である。パネルＡは、ミオグロビン、ＰＧＫ、コンアルブミン、コンアルブミン鉄錯体、ヒトトランスフェリン、βｌｇおよびダイズトリプシンインヒビターの混合物を４ｍＭのビス−トリスプロパン、４ｍＭのメチルピペラジン、４ｍＭのピペラジン、４ｍＭのＴＥバッファーｐＨ９．５に溶解し、Ｍｏｎｏ Ｑ ＨＲ ５／５カラムにｐＨ９．５で結合し、外部勾配クロマトフォーカシングにより分離した図である。パネルＢは、４ｍＭのビス−トリスプロパン、４ｍＭのメチルピペラジン、４ｍＭのピペラジン、４ｍＭのＴＥバッファーｐＨ９．５の４ｍＭのビス−トリスプロパン、４ｍＭのメチルピペラジン、４ｍＭのピペラジン、４ｍＭのＴＥバッファーｐＨ３．５との混合に基づいて生じた外部ｐＨ勾配によるＭｏｎｏ Ｑ ＨＲ ５／５の溶離の間に観察された溶出液ｐＨのプロフィール（点線）を示す図である。Ｍｏｎｏ Ｑ ＨＲ ５／５は、４ｍＭのビス−トリスプロパン、４ｍＭのメチルピペラジン、４ｍＭのピペラジン、４ｍＭのＴＥバッファーｐＨ９．５により平衡化させた。流速１ｍｌ／分、ｐＨ９．５からｐＨ３．５までの勾配形成（溶離）の長さ４０カラム体積。
【図３】さまざまなクロマトフォーカシング技術を採用した酵母ホスホグリセリン酸キナーゼの２つの変異体の分離の比較を描く図である。パネルＡは、Ｐｈａｒｍａｃｉａにより市販されているクロマトフォーカシングシステム−弱陰イオン交換カラム、Ｍｏｎｏ Ｐ ＨＲ ５／２０およびＰｏｌｙｂｕｆｆｅｒｓ−を採用したＰＧＫの保持ｐＨ勾配クロマトフォーカシング分離の図であり、開始バッファーが２５ｍＭのＴＥのイミノ二酢酸によるｐＨ８．３、溶離バッファーが６ｍｌのＰｏｌｙｂｕｆｆｅｒ９６＋１４ｍｌのＰｏｌｙｂｕｆｆｅｒ７４のイミノ二酢酸によるｐＨ５で２００ｍｌに希釈したものである。流速１ｍｌ／分、Ｐｏｌｙｂｕｆｆｅｒによる溶離の長さ１２カラム体積。ピーク間の分離が小さいことに注意。パネルＢは、単純な２成分のバッファーシステム、５ｍＭのピペラジン、５ｍＭのＴＥおよびＭｏｎｏ Ｐ ＨＲ ５／２０を用いて分離したＰＧＫの図であり、分離がＰｏｌｙｂｕｆｆｅｒｓを使用しない弱陰イオン交換体に基づくハイブリッド（外部プラス保持性内部勾配）クロマトフォーカシングにより達成可能であることを示している。流速１ｍｌ／分、外部ｐＨ勾配による溶離の長さ１８カラム体積。パネルＣは、強陰イオン交換体Ｍｏｎｏ Ｑ ＨＲ ５／５に基づく以外は実施例３パネルＢにおけるものと同様の２成分バッファーシステムを用いた外部勾配クロマトフォーカシングにより分離したＰＧＫの図であり、より良好な直線状ｐＨのプロフィール（点線）を示している。流速１ｍｌ／分、外部直線状ｐＨ勾配による溶離の長さ３５カラム体積。パネルＤは、実施例２で示した本発明の４成分バッファーを用いたＭｏｎｏ Ｑ ＨＲ ５／５に基づいて分離したＰＧＫの外部ｐＨ勾配クロマトフォーカシングの図である。流速１ｍｌ／分、勾配形成の長さ２０カラム体積。溶出液の著しく直線的なｐＨ勾配（点線）および得られたタンパク質種類の最良の分離に注目されたい。
【図４】４成分バッファーシステムを用いる強陽イオン交換カラムに基づく外部勾配逆クロマトフォーカシングによるタンパク質の混合物の分離を描く図である。パネルＡは、ダイズトリプシンインヒビター、βｌｇ、ヒトトランスフェリンおよびコンアルブミンの混合物を、４ｍＭのビス−トリスプロパン、４ｍＭのメチルピペラジン、４ｍＭのピペラジン、４ｍＭのＴＥバッファーｐＨ４に溶解し、Ｍｏｎｏ Ｓ ＨＲ ５／５カラムにｐＨ４で結合し、外部勾配逆クロマトフォーカシングにより分離した図である。パネルＢは、４ｍＭのビス−トリスプロパン、４ｍＭのメチルピペラジン、４ｍＭのピペラジン、４ｍＭのＴＥバッファーｐＨ４の、４ｍＭのビス−トリスプロパン、４ｍＭのメチルピペラジン、４ｍＭのピペラジン、４ｍＭのＴＥバッファーｐＨ９．５との混合に基づいて生じた外部ｐＨ勾配によるＭｏｎｏ Ｑ ＨＲ ５／５の溶離の間に観察された溶出液ｐＨのプロフィール（点線）を示す図である。Ｍｏｎｏ Ｓ ＨＲ ５／５は、４ｍＭのビス−トリスプロパン、４ｍＭのメチルピペラジン、４ｍＭのピペラジン、４ｍＭのＴＥバッファーｐＨ４により平衡化させた。流速１ｍｌ／分、ｐＨ４からｐＨ９．５までの外部直線状ｐＨ勾配による溶離の長さ３７カラム体積。
【図５】溶出液のｐＨ、吸光度および伝導度ならびに予めプログラムされた外部勾配の線を示す図であり、クロマトフォーカシングおよび逆クロマトフォーカシング技術における広いｐＨ範囲のバッファーシステム（開始バッファー：４ｍＭのビス−トリスプロパン、４ｍＭのメチルピペラジン、４ｍＭのピペラジンおよび４ｍＭのトリエタノールアミンで、Ｍｏｎｏ Ｑ ＨＲ ５／５にはｐＨ９．７またはＭｏｎｏ Ｓ ＨＲ ５／５にはｐＨ１０．５。最終バッファー：４ｍＭのビス−トリスプロパン、４ｍＭのメチルピペラジン、４ｍＭのピペラジン、４ｍＭのトリエタノールアミンおよび２ｍＭのギ酸によるｐＨ２．５）の適用性を立証している。流速１ｍｌ／分、外部勾配形成（溶離）の長さは、クロマトフォーカシングには７３カラム体積、逆クロマトフォーカシングの間は８１カラム体積。パネルＡは、広いｐＨ範囲のバッファーシステムを利用したＭｏｎｏ Ｑ ＨＲ ５／５に基づくクロマトフォーカシング（曲線１、２）およびＭｏｎｏ Ｓ ＨＲ ５／５に基づく逆クロマトフォーカシング（曲線３、４）の間の溶出液ｐＨおよび吸光度のプロフィールの図である。パネルＢは、広いｐＨ範囲のバッファーシステムを利用したＭｏｎｏ Ｑ ＨＲ ５／５に基づくクロマトフォーカシング（曲線１、２）およびＭｏｎｏ Ｓ ＨＲ５／５に基づく逆クロマトフォーカシング（曲線３、４）による溶出液伝導度により反映される前もってプログラムされた外部勾配の形成および実際の勾配の進展の濃度線の図である。
【図６】イオン交換カラムに与えるｐＨ勾配の形成を監視および調整する自動フィードバックシステムを備えた外部ｐＨ勾配クロマトフォーカシングおよび逆クロマトフォーカシングにより荷電分子を分離するためのクロマトグラフシステムを示す図である。パネルＡは、必要なときにｐＨ勾配の形成を補正するフィードバックコントローラにｐＨ依存性の電圧信号を送るフィードバック源としてのｐＨフローセルを利用するクロマトグラフシステムの図である。パネルＢは、必要なときにｐＨ勾配の形成を補正するフィードバックコントローラにｐＨ依存性の電圧信号を送るフィードバック源としての混合チャンバー中のｐＨ電極を利用するクロマトグラフシステムの図である。時間依存性ｐＨを有する溶離液は、混合チャンバーからポンプで送出されてさらなるポンプによってイオン交換カラムに送られる。
【図７】クロマトフォーカシングの後に逆クロマトフォーカシングが続く組み合わせられた外部勾配クロマトフォーカシング（ＣＥＧＣＦ）を示す図である。陰イオン交換カラム（例えば、Ｍｏｎｏ Ｑ）および陽イオン交換カラム（例えばＭｏｎｏ Ｓ）は、連続して接続する。タンパク質は、最初に開始ｐＨで加えて陰イオン交換体に結合させる。ｐＨ７からｐＨ４までのｐＨ勾配が展開されるとタンパク質は分離され、陰イオン交換体から溶離し、陽イオン交換体に結合する。クロマトフォーカシングのステップが完了すると同時に、２つのカラムを切り離し、タンパク質をｐＨ４からｐＨ７．５のｐＨ勾配を有する逆クロマトフォーカシングにより陽イオン交換体から溶離させる。パネルＡは、後に逆クロマトフォーカシングのステップ（破線）が続く最初のクロマトフォーカシングのステップ（実線）に基づく吸光度およびｐＨの変化を図示している。パネルＢは、後に２番目の逆クロマトフォーカシングのステップ（破線）が続く最初のクロマトフォーカシングのステップ（実線）の間のｐＨの関数としての吸光度および伝導度の変化を示している。ＣＥＧＣＦ法は、ＥＧＲＣＦにより開始し、同様にＥＧＣＦにより終了する逆の順序で実施することができる。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
異なる等電点を有する荷電分子をクロマトグラフィーにより分離するクロマトフォーカシング方法であって、
陰イオン交換吸着剤が荷電分子と反対の電荷をもつ最高の初期ｐＨで、少なくとも３種のバッファー成分を含む溶媒を含浸した陰イオン交換吸着剤に、分離すべき荷電分子を加えるステップと、
第１の貯蔵器からポンプで送出される少なくとも３種のバッファー成分を含有する初期ｐＨの溶液を、第２の貯蔵器からポンプで送出される前記少なくとも３種のバッファー成分を含有するｐＨの異なる溶液との連続混合で形成される時間依存性のｐＨを有する溶離液を、前記陰イオン交換吸着剤に供給するステップであって、その混合割合を、保持されていないｐＨ勾配を外部で定めた傾きで維持するために変動させるステップと、
それぞれが陰イオン交換吸着剤からその実効等電点において別々に溶離する荷電分子を収集するステップと
を含む方法。
【請求項２】
異なる等電点を有する荷電分子をクロマトグラフィーにより分離する逆クロマトフォーカシング方法であって、
陽イオン交換吸着剤が荷電分子と反対の電荷をもつ初期ｐＨで、バッファー成分を含む溶媒を含浸した陽イオン交換吸着剤に、分離すべき荷電分子を加えるステップと、
第１の貯蔵器からポンプで送出されるバッファー成分を含有する初期ｐＨの溶液を、第２の貯蔵器からポンプで送出される初期ｐＨとは異なるｐＨの前記のバッファー成分を含有する溶液との連続混合で形成される、時間依存性のｐＨを有する溶離液を、前記陽イオン交換吸着剤に供給するステップであって、その混合割合を、保持されていないｐＨ勾配を外部で定めた傾きで維持するために変動させるステップと、
それぞれが陽イオン交換吸着剤からその実効等電点において別々に溶離する荷電分子を収集するステップと
を含む方法。
【請求項３】
荷電分子がタンパク質である請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
溶媒が水である請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
バッファー成分が、重複するｐＫ_ａを有しており、各成分のモル比率が初期ｐＨと最終ｐＨの間の変遷を通して一定に維持される請求項１または２に記載の方法。
【請求項６】
各バッファー成分が、アミノ、アミド、イミノ、イミド、カルボキシル、スルホン、リン酸およびホスホン酸からなる群から選択された少なくとも１つの官能基を含有している請求項５に記載の方法。
【請求項７】
バッファー成分が、ピペラジン、１−メチルピペラジン、トリエタノールアミンおよびビス−トリスプロパンを含んでいる請求項５に記載の方法。
【請求項８】
陰イオン交換吸着剤が、強陰イオン交換樹脂および弱陰イオン交換樹脂からなる群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項９】
陰イオン交換吸着剤が、強陰イオン交換樹脂である請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
陽イオン交換吸着剤が、強陽イオン交換樹脂および弱陽イオン交換樹脂からなる群から選択される請求項２に記載の方法。
【請求項１１】
陽イオン交換吸着剤が、強陽イオン交換樹脂である請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
初期ｐＨと初期ｐＨとは異なるｐＨの間の差が、約１単位から約１２単位までである請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項１３】
外部で定めた傾きが、ほぼ直線勾配または非直線勾配である請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項１４】
初期ｐＨが、初期ｐＨとは異なるｐＨより高い請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
初期ｐＨが、初期ｐＨとは異なるｐＨより低い請求項２に記載の方法。
【請求項１６】
荷電分子を加えるところから分離した荷電分子を収集するところまで吸着剤に沿って上昇する温度勾配が存在するように吸着剤を加熱することをさらに含む請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項１７】
温度勾配の範囲が、０℃と８０℃の間である請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
荷電分子を加えるところから分離した荷電分子を収集するところまで吸着剤に沿って下降する温度勾配が存在するように吸着剤を冷却することをさらに含む請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項１９】
温度勾配の範囲が、０℃と８０℃の間である請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
異なる等電点を有する荷電分子をクロマトグラフィーにより分離する方法であって、
イオン交換吸着剤に、前記荷電分子を温度Ｔ_０で加えるステップと、
前記イオン交換吸着剤に、初期ｐＨのバッファー成分を含む溶媒を含浸させるステップであって、ここでイオン交換吸着剤は荷電分子と反対の電荷をもつ、ステップと、
イオン交換吸着剤の温度をＴ_１に変化させるステップと、
第１の貯蔵器からポンプで送出されるバッファー成分を含有する初期ｐＨの溶液を、第２の貯蔵器からポンプで送出される初期ｐＨとは異なるｐＨの前記のバッファー成分を含有する溶液との連続混合で形成される、時間依存性のｐＨを有する溶離液を、前記イオン交換吸着剤に供給するステップであって、その混合割合を、保持されていないｐＨ勾配を外部で定めた傾きで維持するために変動させるステップと、
それぞれがイオン交換吸着剤からその実効等電点において別々に溶離する荷電分子を収集するステップであって、Ｔ_０とＴ_１の間の差が０℃と８０℃の間であるステップと
を含む方法。
【請求項２１】
異なる等電点を有する荷電分子をクロマトグラフィーにより分離する方法であって、
イオン交換吸着剤に、温度Ｔ_０において、初期ｐＨのバッファー成分を含む溶媒を含浸させるステップであって、ここでイオン交換吸着剤は、分離すべき荷電分子と反対の電荷をもつ、ステップと、
イオン交換吸着剤の温度をＴ_１に変化させるステップと、
分離すべき荷電分子をイオン交換吸着剤に加えるステップと、
第１の貯蔵器からポンプで送出されるバッファー成分を含有する初期ｐＨの溶液を、第２の貯蔵器からポンプで送出される初期ｐＨとは異なるｐＨの前記のバッファー成分を含有する溶液との連続混合で形成される、時間依存性のｐＨを有する溶離液を、前記イオン交換吸着剤に供給するステップであって、その混合割合を、保持されていないｐＨ勾配を外部で定めた傾きで維持するために変動させるステップと、
それぞれがイオン交換吸着剤からその実効等電点において別々に溶離する荷電分子を収集するステップであって、Ｔ_０とＴ_１の間の差が０℃と８０℃の間であるステップと
を含む方法。
【請求項２２】
異なる等電点を有する荷電分子をイオン交換樹脂でクロマトグラフィーにより分離するためのバッファー組成物であって、予め定めたｐＨの前記組成物が別の予め定めたｐＨの前記組成物により滴定するとき、その２つの組成物の混合物のｐＨの変化が、その２つの組成物のそれぞれによって表される混合物の画分に直線的に正比例するような少なくとも３つのバッファー組成物の水溶液を含む組成物。
【請求項２３】
予め定めたｐＨと別の予め定めたｐＨの間の差が、１から１０のｐＨ単位である請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
ｐＨをイオン交換カラムの出口で測定する請求項２２に記載の組成物。
【請求項２５】
各バッファー成分が、アミノ、アミド、イミノ、イミド、カルボキシル、スルホン、リン酸およびホスホン酸からなる群から選択された少なくとも１つの官能基を含有している請求項２２に記載の組成物。
【請求項２６】
各バッファー成分が０．００１ｍＭから１０００ｍＭの濃度で存在する請求項２２に記載の組成物。
【請求項２７】
バッファー成分が、ピペラジン、１−メチルピペラジン、トリエタノールアミンおよびビス−トリスプロパンを含んでいる請求項２２に記載の組成物。
【請求項２８】
荷電分子を分離するためのクロマトグラフシステムであって、
初期ｐＨの少なくとも３種のバッファー成分を含む溶媒を含浸したイオン交換吸着剤を含有するカラムであって、ここで前記イオン交換吸着剤は、分離すべき荷電分子と反対の電荷をもつ、カラムと、
初期ｐＨの前記少なくとも３種のバッファー成分を含む第１の溶液を含有する第１の貯蔵器と、
初期ｐＨとは異なるｐＨの前記少なくとも３種のバッファー成分を含む第２の溶液を含有する第２の貯蔵器と、
前記第１および第２の溶液の外部で作製した混合物を送り込んで外部で定めたｐＨ勾配を吸着剤に形成させ、カラム内に保持されていないｐＨ勾配を出現させる手段と
を備えたシステム。
【請求項２９】
カラム内の保持されていないｐＨ勾配が、直線状である請求項２８に記載のシステム。
【請求項３０】
カラム内の保持されていないｐＨ勾配が、非直線状である請求項２８に記載のシステム。
【請求項３１】
カラム内の非直線状のｐＨ勾配が、凹形、凸形または階段状である請求項３０に記載のシステム。
【請求項３２】
異なる等電点を有する荷電分子をクロマトグラフィーにより分離するクロマトフォーカシング方法であって、
陰イオン交換吸着剤が荷電分子と反対の電荷をもつ最高の初期ｐＨで、少なくとも３種のバッファー成分を含む溶媒を含浸した陰イオン交換吸着剤に、分離すべき荷電分子を加えるステップと、
第１の貯蔵器からポンプで送出される初期ｐＨのさらなるバッファー成分があるかまたはない前記の少なくとも３種のバッファー成分を含有する初期ｐＨの溶液を、第２の貯蔵器からポンプで送出される異なるｐＨのさらなるバッファー成分があるかまたはない前記の少なくとも３種のバッファー成分を含有する溶液との連続混合で形成される、時間依存性のｐＨを有する溶離液を、前記陰イオン交換吸着剤に供給するステップであって、その混合割合を、保持されていないｐＨ勾配を外部で定めた傾きで維持するために変動させるステップと、
それぞれが陽イオン交換吸着剤からその実効等電点において別々に溶離する荷電分子を収集するステップと
を含む方法。
【請求項３３】
異なる等電点を有する荷電分子をクロマトグラフィーにより分離する逆クロマトフォーカシング方法であって、
陽イオン交換吸着剤が荷電分子と反対の電荷をもつ初期ｐＨで、バッファー成分を含む溶媒を含浸した陽イオン交換吸着剤に、分離すべき荷電分子を加えるステップと、
第１の貯蔵器からポンプで送出される初期ｐＨのさらなるバッファー成分があるかまたはない前記のバッファー成分を含有する初期ｐＨの溶液を、第２の貯蔵器からポンプで送出される初期ｐＨとは異なるｐＨのさらなるバッファー成分があるかまたはない前記のバッファー成分を含有する溶液との連続混合で形成される、時間依存性のｐＨを有する溶離液を、前記陽イオン交換吸着剤に供給するステップであって、その混合割合を、保持されていないｐＨ勾配を外部で定めた傾きで維持するために変動させるステップと、
それぞれが陽イオン交換吸着剤からその実効等電点において別々に溶離する荷電分子を収集するステップと
を含む方法。
【請求項３４】
バッファー成分が、重複するｐＫ_ａを有しており、各成分のモル比率が初期ｐＨと最終ｐＨの間の変遷を通して一定に維持されるかまたは変動する請求項３２または３３に記載の方法。
【請求項３５】
バッファー成分が、ピペラジン、１−メチルピペラジン、トリエタノールアミン、ビス−トリスプロパンおよびギ酸を含んでいる請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
荷電分子を分離するためのクロマトグラフシステムであって、
初期ｐＨの少なくとも３種のバッファー成分を含む溶媒を含浸したイオン交換吸着剤を含有するカラムであって、ここで前記イオン交換吸着剤は、分離すべき荷電分子と反対の電荷をもつ、カラムと、
初期ｐＨのさらなるバッファー成分があるかまたはない前記少なくとも３種のバッファー成分を含む第１の溶液を含有する第１の貯蔵器と、
初期ｐＨとは異なるｐＨのさらなるバッファー成分があるかまたはない前記少なくとも３種のバッファー成分を含む第２の溶液を含有する第２の貯蔵器と、
前記第１および第２の溶液の外部で作製した混合物を送り込んで外部で定めた初期ｐＨから最終ｐＨまでのｐＨ勾配を形成させ、カラム内に保持されていないｐＨ勾配を出現させる手段と
を備えたシステム。
【請求項３７】
クロマトグラフシステムによって発生する前もってプログラムされた時間依存性ｐＨ勾配におけるｐＨ偏差を自動的に補正するためのフィードバック制御システムであって、
測定ｐＨの既知関数である出力電圧を生ずるｐＨ測定装置と、
フィードバック制御装置であって、
適切に短時間の間隔の入力として、クロマトグラフシステムによって発生する溶離液のｐＨを監視するｐＨ測定装置から電圧を受け取り、その電圧を、前もってプログラムされた時間依存性ｐＨ勾配の予想されるｐＨ値に対応するセットポイント電圧と比較し、
その絶対値が誤差と見なされる入力電圧（すなわち測定ｐＨ）とセットポイント電圧（すなわち予想ｐＨ）の間の差を計算し、かつ
クロマトグラフシステムの勾配を発生させるポンプのポンピング速度を、誤差の絶対値が最小となるように、適宜電流または電圧いずれかとしての訂正信号を計算するための任意の既知のフィードバックアルゴリズムを使用して調節する
制御装置と
を備えたシステム。
【請求項３８】
荷電分子を分離するためおよびカラム内に調節された保持されていないｐＨ勾配を出現させるためのクロマトグラフシステムであって、
初期ｐＨの少なくとも１種のバッファー成分を含む溶媒を含浸したイオン交換吸着剤を含有するカラムであって、ここで前記イオン交換吸着剤は、分離すべき荷電分子と反対の電荷をもつ、カラムと、
初期ｐＨの前記少なくとも１種のバッファー成分を含む第１の溶液を含有する第１の貯蔵器と、
初期ｐＨとは異なるｐＨの前記少なくとも１種のバッファー成分を含む第２の溶液を含有する第２の貯蔵器と、
第１および第２の溶液を混合するための第１の貯蔵器ポンプおよび第２の貯蔵器ポンプであって、前記第１の貯蔵器ポンプおよび前記第２の貯蔵器ポンプのポンピング速度は、制御された流速で外部で定めた溶離液ｐＨ勾配を形成するべく調節される、ポンプと、
ｐＨ測定装置がｐＨフローセルである、制御された流速で外部で定めた溶離液ｐＨ勾配の形成を監視および補正する請求項３７に記載のフィードバックコントロールシステムと
を備えたシステム。
【請求項３９】
カラム内の調節された保持されていないｐＨ勾配が、直線状である請求項３８に記載のシステム。
【請求項４０】
カラム内の調節された保持されていないｐＨ勾配が、非直線状である請求項３８に記載のシステム。
【請求項４１】
カラム内の調節された非直線状のｐＨ勾配が、凹形、凸形または階段状である請求項４０に記載のシステム。
【請求項４２】
ｐＨフローセルが、第１および第２溶液が混合される場所から下流に位置する請求項３８に記載のシステム。
【請求項４３】
異なる等電点を有する荷電分子をクロマトグラフィーにより分離するクロマトフォーカシング方法であって、
最高の初期ｐＨで、少なくとも１種のバッファー成分を含む溶媒を含浸した陰イオン交換吸着剤であって分離すべき荷電分子と反対の電荷をもつ陰イオン交換吸着剤に、分離すべき荷電分子を加えるステップと、
第１の貯蔵器からポンプで送出される初期ｐＨのさらなるバッファー成分があるかまたはない前記の少なくとも１種のバッファー成分を含有する初期ｐＨの溶液を、第２の貯蔵器からミキサー中にポンプで送出される異なるｐＨのさらなるバッファー成分があるかまたはない前記の少なくとも１種のバッファー成分を含有する溶液との連続混合で形成される時間依存性のｐＨを有する溶離液を、前記陰イオン交換吸着剤に供給するステップと、
ｐＨに依存する電圧信号が発生し、第１の貯蔵器および第２の貯蔵器からポンプで送出される溶液の比率が、請求項３７に記載のフィードバックコントロールシステムによって、外部から定め調節する勾配により保持されていないｐＨ勾配が維持されるように変動することを可能にするｐＨフローセルを通ってミキサーから溶離液を流すステップと、
それぞれが陰イオン交換吸着剤からその実効等電点において別々に溶離する荷電分子を収集するステップと
を含む方法。
【請求項４４】
異なる等電点を有する荷電分子をクロマトグラフィーにより分離する逆クロマトフォーカシング方法であって、
最低の初期ｐＨで、少なくとも１種のバッファー成分を含む溶媒を含浸した陽イオン交換吸着剤であって分離すべき荷電分子と反対の電荷をもつ陽イオン交換吸着剤に、分離すべき荷電分子を加えるステップと、
第１の貯蔵器からポンプで送出される初期ｐＨのさらなるバッファー成分があるかまたはない前記の少なくとも１種のバッファー成分を含有する初期ｐＨの溶液を、第２の貯蔵器からミキサー中にポンプで送出される異なるｐＨのさらなるバッファー成分があるかまたはない前記の少なくとも１種のバッファー成分を含有する溶液との連続混合で形成される時間依存性のｐＨを有する溶離液を、前記陰イオン交換吸着剤に供給するステップと、
ｐＨに依存する電圧信号が発生し、第１の貯蔵器および第２の貯蔵器からポンプで送出される溶液の比率が、請求項３７に記載のフィードバックコントロールシステムによって、外部から定め調節する勾配により保持されていないｐＨ勾配が維持されるように変動することを可能にするｐＨフローセルを通ってミキサーから溶離液を流すステップと、
それぞれが陽イオン交換吸着剤からその実効等電点において別々に溶離する荷電分子を収集するステップと
を含む方法。
【請求項４５】
少なくとも１種のバッファー成分が、少なくとも２つの成分であるとき、該複数成分が、重複するｐＫ_ａを有しており、各成分のモル比率が初期ｐＨと最終ｐＨの間の変遷を通して一定に維持されるかまたは変動する請求項４３または４４に記載の方法。
【請求項４６】
少なくとも１種のバッファー成分が、少なくとも２つの成分であるとき、成分の１つが強酸であるかまたは強塩基であり、各成分のモル比率が初期ｐＨと最終ｐＨの間の変遷を通して一定に維持されるかまたは変動する請求項４３または４４に記載の方法。
【請求項４７】
荷電分子を分離するためおよびカラム内に調節された保持されていないｐＨ勾配を生じさせるためのクロマトグラフシステムであって、
初期ｐＨの少なくとも１種のバッファー成分を含む溶媒を含浸したイオン交換吸着剤を含有するカラムであって、ここで前記イオン交換吸着剤は、分離すべき荷電分子と反対の電荷をもつ、カラムと、
初期ｐＨの前記少なくとも１種のバッファー成分を含む第１の溶液を含有する第１の貯蔵器と、
初期ｐＨとは異なるｐＨの前記少なくとも１種のバッファー成分を含む第２の溶液を含有する第２の貯蔵器と、
第１および第２の溶液を前記第１の溶液の所定の容量を含有する混合チャンバー中にポンピングするための第１の貯蔵器ポンプおよび第２の貯蔵器ポンプであって、前記第１の貯蔵器ポンプおよび前記第２の貯蔵器ポンプのポンピング速度は、制御された流速で外部で定めた溶離液ｐＨ勾配を形成するべく調節される、ポンプと、
ｐＨ測定装置が混合チャンバー中に浸されたｐＨ電極である、制御された流速で外部で定めた溶離液ｐＨ勾配の形成を監視および補正する請求項３７に記載のフィードバックコントロールシステムと、
当該混合溶液を混合チャンバーから制御された流速でポンピングするための手段と
を備えたシステム。
【請求項４８】
カラム内の調節された保持されていないｐＨ勾配が、直線状である請求項４７に記載のシステム。
【請求項４９】
カラム内の調節された保持されていないｐＨ勾配が、非直線状である請求項４７に記載のシステム。
【請求項５０】
カラム内の調節された非直線状のｐＨ勾配が、凹形、凸形または階段状である請求項４９に記載のシステム。
【請求項５１】
異なる等電点を有する荷電分子をクロマトグラフィーにより分離するクロマトフォーカシング方法であって、
最高の初期ｐＨで、少なくとも１種のバッファー成分を含む溶媒を含浸した陰イオン交換吸着剤であって分離すべき荷電分子と反対の電荷をもつ陰イオン交換吸着剤に、分離すべき荷電分子を加えるステップと、
第１の貯蔵器からポンプで送出される少なくとも１種のバッファー成分を含有する初期ｐＨの溶液を、第２の貯蔵器から混合チャンバー中にポンプで送出される異なるｐＨの前記の少なくとも１種のバッファー成分を含有する溶液との連続混合で形成される時間依存性のｐＨを有する溶離液を、前記陰イオン交換吸着剤に供給するステップと、
ｐＨ依存性の電圧信号を発生する混合チャンバー中に浸したｐＨ電極を用いて溶離液のｐＨを測定するステップと、
第１の貯蔵器から送られる溶液のポンピング速度および第２の貯蔵器から送られる溶液のポンピング速度を、外部から定め調節する勾配により保持されていないｐＨ勾配が維持されるように、ｐＨ電極からの電圧信号および請求項３７に記載のフィードバックコントロールシステムを利用することによって補正するステップと、
溶離液を混合チャンバーから陰イオン交換吸着剤を含有するカラムを通して供給するステップと、
それぞれが陰イオン交換吸着剤からその実効等電点において別々に溶離する荷電分子を収集するステップと
を含む方法。
【請求項５２】
異なる等電点を有する荷電分子をクロマトグラフィーにより分離する逆クロマトフォーカシング方法であって、
最低の初期ｐＨの少なくとも１種のバッファー成分を含む溶媒を含浸した陽イオン交換吸着剤であって分離すべき荷電分子と反対の電荷をもつ陽イオン交換吸着剤に、分離すべき荷電分子を加えるステップと、
第１の貯蔵器からポンプで送出される少なくとも１種のバッファー成分を含有する初期ｐＨの溶液を、第２の貯蔵器から混合チャンバー中にポンプで送出される異なるｐＨの前記の少なくとも１種のバッファー成分を含有する溶液との連続混合で形成される時間依存性のｐＨを有する溶離液を、前記陽イオン交換吸着剤に供給するステップと、
ｐＨ依存性の電圧信号を発生する混合チャンバー中に浸したｐＨ電極を用いて溶離液のｐＨを測定するステップと、
第１の貯蔵器から送られる溶液のポンピング速度および第２の貯蔵器から送られる溶液のポンピング速度を、外部から定め調節する勾配により保持されていないｐＨ勾配が維持されるように、ｐＨ電極からの電圧信号および請求項３７に記載のフィードバックコントロールシステムを利用することによって補正するステップと、
溶離液を陽イオン交換吸着剤を含有するカラムを通して供給するステップと、
それぞれが陽イオン交換吸着剤からその実効等電点において別々に溶離する荷電分子を収集するステップと
を含む方法。
【請求項５３】
少なくとも１種のバッファー成分が、少なくとも２つの成分であるとき、該複数成分が、重複するｐＫ_ａを有しており、各成分のモル比率が初期ｐＨと最終ｐＨの間の変遷を通して一定に維持されるかまたは変動する請求項４３、４４、５１または５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
少なくとも１種のバッファー成分が、少なくとも２つの成分であるとき、成分の１つが強酸であるかまたは強塩基であり、各成分のモル比率が初期ｐＨと最終ｐＨの間の変遷を通して一定に維持されるかまたは変動する請求項４３、４４、５１または５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
異なる等電点を有する荷電分子をクロマトグラフィーにより分離する複合外部勾配クロマトフォーカシング方法であって、
最高の初期ｐＨで、少なくとも１種のバッファー成分を含む溶媒を含浸した陰イオン交換吸着剤であって分離すべき荷電分子と反対の電荷をもつ陰イオン交換吸着剤に、分離すべき荷電分子を適用して結合させるステップと、
陽イオン交換吸着剤を陰イオン交換吸着剤の後に直列に接続し、両方の交換体を最高の初期ｐＨで平衡化させるステップと、
第１の貯蔵器からポンプで送出される少なくとも１種のバッファー成分を含有する初期ｐＨの溶液を、第２の貯蔵器からポンプで送出される前記少なくとも１種のバッファー成分を含有するｐＨの異なる溶液との連続混合で形成される時間依存性のｐＨを有する溶離液を、前記陰イオン交換吸着剤に供給するステップであって、その混合比率を、保持されていないｐＨ勾配を外部で定めた傾きで維持するために変動させるステップと、
荷電分子の溶離であって、それぞれが、所定の最小ｐＨに達するまでその実効等電点で陰イオン交換吸着剤から別々に溶離するステップと、
荷電分子を含有する陰イオン交換吸着剤から得られた溶出液がさらに分離されるように陽イオン交換吸着剤中に導き、かつ
正帯電している荷電分子を陽イオン交換吸着剤に所定の最小ｐＨに達するまで結合させるステップと、
陰イオン交換吸着剤を取り除くステップと、
陽イオン交換吸着剤を所定の最小ｐＨから所定の最大ｐＨまで展開するように含浸させてｐＨ勾配を逆転させるステップと、
それぞれが別々に所定の最大ｐＨに達するまでその実効等電点において陽イオン交換吸着剤から溶離する荷電分子を収集するステップと
を含む方法。
【請求項５６】
異なる等電点を有する荷電分子をクロマトグラフィーにより分離する複合外部勾配クロマトフォーカシング方法であって、
最低の初期ｐＨの少なくとも１種のバッファー成分を含む溶媒を含浸した陽イオン交換吸着剤であって分離すべき荷電分子と反対の電荷をもつ陽イオン交換吸着剤に、分離すべき荷電分子を適用して結合させるステップと、
陰イオン交換吸着剤を陽イオン交換吸着剤の後に直列に接続し、両方の交換体を最低の初期ｐＨで平衡化させるステップと、
第１の貯蔵器からポンプで送出される少なくとも１種のバッファー成分を含有する初期ｐＨの溶液を、第２の貯蔵器からポンプで送出される前記少なくとも１種のバッファー成分を含有するｐＨの異なる溶液との連続混合で形成される時間依存性のｐＨを有する溶離液を、前記陽イオン交換吸着剤に供給するステップであって、その混合比率を、保持されていないｐＨ勾配を外部で定めた傾きで維持するために変動させるステップと、
荷電分子の溶離であって、それぞれが、所定の最大ｐＨに達するまでその実効等電点で陽イオン交換吸着剤から別々に溶離するステップと、
荷電分子を含有する陽イオン交換吸着剤から得られた溶出液がさらに分離されるように陰イオン交換吸着剤中に導き、かつ
負帯電している荷電分子を陰イオン交換吸着剤に所定の最大ｐＨに達するまで結合させるステップと、
陽イオン交換吸着剤を取り除くステップと、
陰イオン交換吸着剤を所定の最大ｐＨから所定の最小ｐＨまで展開するように含浸させてｐＨ勾配を逆転させるステップと、
それぞれが別々に所定の最小ｐＨに達するまでその実効等電点において陰イオン交換吸着剤から溶離する荷電分子を収集するステップと
を含む方法。
【請求項５７】
異なる等電点を有する荷電分子をクロマトグラフィーにより分離する複合外部勾配クロマトフォーカシング方法であって、
分離すべき荷電分子を、後に陽イオン交換吸着剤が直列に接続されている陰イオン交換吸着剤に適用し、その結果、その２つの吸着剤が、少なくとも１つの初期ｐＨのバッファー成分を含む溶媒により含浸され、そこでそれぞれの分離すべき荷電分子が、３つの荷電の種類、すなわち、初期ｐＨより低い見掛けのｐＩを有する荷電分子は負に帯電したもの、初期ｐＨで陰イオン交換吸着剤または陽イオン交換吸着剤のいずれにも結合できない荷電分子は中性のもの、初期ｐＨより高い見掛けのｐＩを有する荷電分子は正に帯電したものの１つに分類されるステップと、
初期ｐＨで負に帯電した荷電分子を陰イオン交換吸着剤に結合させるステップと、
初期ｐＨで正に帯電した荷電分子を陽イオン交換吸着剤に結合させるステップと、
初期ｐＨで陽イオン交換吸着剤または陰イオン交換吸着剤のいずれにも結合できない荷電分子のものを収集するステップと、
陰イオン交換吸着剤と陽イオン交換吸着剤との初期ｐＨにおける接続を互いから切り離すステップと、
第１の貯蔵器からポンプで送出される少なくとも１種のバッファー成分を含有する初期ｐＨの溶液を、第２の貯蔵器からポンプで送出される前記少なくとも１種のバッファー成分を含有するｐＨの異なる溶液との連続混合で形成される、初期ｐＨに始まる時間依存的に減少するｐＨを有する溶離液を、前記陰イオン交換吸着剤に供給するステップであって、その混合比率を、保持されていないｐＨ勾配を外部で定めた傾きで維持するために変動させるステップと、
それぞれが最終の最小ｐＨに達するまでその実効等電点において陰イオン交換吸着剤から溶離する荷電分子を収集するステップと、
第１の貯蔵器からポンプで送出される少なくとも１種のバッファー成分を含有する初期ｐＨの溶液を、第２の貯蔵器からポンプで送出される前記少なくとも１種のバッファー成分を含有するｐＨの異なる溶液との連続混合で形成される、初期ｐＨに始まる時間依存的に増加するｐＨを有する溶離液を、前記陽イオン交換吸着剤に供給するステップであって、その混合比率を、保持されていないｐＨ勾配を外部で定めた傾きで維持するために変動させるステップと、
それぞれが最終の最大ｐＨに達するまでその実効等電点において陽イオン交換吸着剤から溶離する荷電分子を収集するステップと
を含む方法。
【請求項５８】
異なる等電点を有する荷電分子をクロマトグラフィーにより分離する複合外部勾配クロマトフォーカシング方法であって、
分離すべき荷電分子を、後に陰イオン交換吸着剤が直列に接続されている陽イオン交換吸着剤に適用し、その結果、その２つの吸着剤が、少なくとも１つの初期ｐＨのバッファー成分を含む溶媒により含浸され、そこでそれぞれの分離すべき荷電分子が、３つの荷電の種類、すなわち、初期ｐＨより低い見掛けのｐＩを有する荷電分子は負に帯電したもの、初期ｐＨで陰イオン交換吸着剤または陽イオン交換吸着剤のいずれにも結合できない荷電分子は中性のもの、初期ｐＨより高い見掛けのｐＩを有する荷電分子は正に帯電したものの１つに分類されるステップと、
初期ｐＨで正に帯電した荷電分子を陽イオン交換吸着剤に結合させるステップと、
初期ｐＨで負に帯電した荷電分子を陰イオン交換吸着剤に結合させるステップと、
初期ｐＨで陰イオン交換吸着剤または陽イオン交換吸着剤のいずれにも結合できない荷電分子のものを収集するステップと、
陽イオン交換吸着剤と陰イオン交換吸着剤との初期ｐＨにおける接続を互いから切り離すステップと、
第１の貯蔵器からポンプで送出される少なくとも１種のバッファー成分を含有する初期ｐＨの溶液を、第２の貯蔵器からポンプで送出される前記少なくとも１種のバッファー成分を含有するｐＨの異なる溶液との連続混合で形成される、初期ｐＨに始まる時間依存的に増加するｐＨを有する溶離液を、前記陽イオン交換吸着剤に供給するステップであって、その混合比率を、保持されていないｐＨ勾配を外部で定めた傾きで維持するために変動させるステップと、
それぞれが最終の最大ｐＨに達するまでその実効等電点において陽イオン交換吸着剤から溶離する荷電分子を収集するステップと、
第１の貯蔵器からポンプで送出される少なくとも１種のバッファー成分を含有する初期ｐＨの溶液を、第２の貯蔵器からポンプで送出される前記少なくとも１種のバッファー成分を含有するｐＨの異なる溶液との連続混合で形成される、初期ｐＨに始まる時間依存的に減少するｐＨを有する溶離液を、前記陰イオン交換吸着剤に供給するステップであって、その混合比率を、保持されていないｐＨ勾配を外部で定めた傾きで維持するために変動させるステップと、
それぞれが最終の最小ｐＨに達するまでその実効等電点において陰イオン交換吸着剤から溶離する荷電分子を収集するステップと
を含む方法。
【請求項５９】
カラム内の保持されていないｐＨ勾配が直線状である請求項５５から５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６０】
カラム内の保持されていないｐＨ勾配が非直線状である請求項５５から５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６１】
カラム内の非直線状のｐＨ勾配が、凹形、凸形または階段状である請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
荷電分子がタンパク質である請求項５５から５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６３】
溶媒が水である請求項５５から５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６４】
バッファー成分が、重複するｐＫ_ａを有しており、各成分のモル比率が初期ｐＨと最終ｐＨの間の変遷を通して一定に維持されるかまたは変動する請求項５５から５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６５】
各バッファー成分が、アミノ、アミド、イミノ、イミド、カルボキシル、スルホン、リン酸およびホスホン酸からなる群から選択された少なくとも１つの官能基を含有している請求項５５から５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６６】
各バッファー成分が０．００１ｍＭから１０００ｍＭの濃度で存在する請求項５５から５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６７】
バッファー成分が、ピペラジン、１−メチルピペラジン、トリエタノールアミン、ビス−トリスプロパンおよびギ酸を含んでいる請求項５５から５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６８】
陰イオン交換吸着剤を、強陰イオン交換樹脂および弱陰イオン交換樹脂からなる群から選択する請求項５５から５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６９】
陰イオン交換吸着剤が、強陰イオン交換樹脂である請求項５５から５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７０】
陽イオン交換吸着剤を、強陽イオン交換樹脂および弱陽イオン交換樹脂からなる群から選択する請求項５５から５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７１】
陽イオン交換吸着剤が、強陽イオン交換樹脂である請求項５５から５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７２】
初期ｐＨと初期ｐＨとは異なるｐＨの間の差が、＞０単位から約１２単位までである請求項５５から５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７３】
分離すべき分子を加えるところから分離した分子を収集するところまで１または複数の吸着剤に沿って上昇する温度勾配が存在するように第１の吸着剤または第２の吸着剤または両方の吸着剤を加熱することをさらに含む請求項５５から５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７４】
温度勾配の範囲が、０℃と８０℃の間である請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
分離すべき分子を加えるところから分離した分子を収集するところまで１または複数の吸着剤に沿って降下する温度勾配が存在するように第１の吸着剤または第２の吸着剤または両方の吸着剤を冷却するステップをさらに含む請求項５５から５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７６】
温度勾配の範囲が、０℃と８０℃の間である請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
異なる等電点を有する荷電分子をクロマトグラフィーにより分離する複合外部勾配クロマトフォーカシング方法であって、
最高の初期ｐＨおよび温度Ｔ_０における少なくとも１種のバッファー成分を含む溶媒を含浸した陰イオン交換吸着剤であって分離すべき荷電分子と反対の電荷をもつ陰イオン交換吸着剤に、分離すべき荷電分子を適用して結合させるステップと、
陽イオン交換吸着剤を陰イオン交換吸着剤の後に直列に接続し、陽イオン交換吸着剤の温度をＴ_１に変化させ、両方の交換体を温度Ｔ_０の溶媒中で測定した最高の初期ｐＨで平衡化させるステップと、
第１の貯蔵器からポンプで送出される少なくとも１種のバッファー成分を含有する初期ｐＨの溶液を、第２の貯蔵器からポンプで送出される前記少なくとも１種のバッファー成分を含有するｐＨの異なる溶液との連続混合で形成される時間依存性のｐＨを有する溶離液を、前記陰イオン交換吸着剤に温度Ｔ_０で供給するステップであって、その混合比率を、保持されていないｐＨ勾配を外部で定めた傾きで維持するために変動させるステップと、
荷電分子の溶離であって、それぞれが、温度Ｔ_０で所定の最小ｐＨに達するまでその実効等電点で陰イオン交換吸着剤から別々に溶離するステップと、
荷電分子を含有する陰イオン交換吸着剤から得られた溶出液が、温度Ｔ_１でさらに分離されるように陽イオン交換吸着剤中に導き、かつ
正帯電している荷電分子を陽イオン交換吸着剤に温度Ｔ_０で所定の最小ｐＨに達するまで結合させるステップと、
陰イオン交換吸着剤を取り除くステップと、
陽イオン交換吸着剤を温度Ｔ_１における所定の最小ｐＨから所定の最大ｐＨまで展開するように含浸させてｐＨ勾配を逆転させるステップと、
それぞれが別々に温度Ｔ_１で所定の最大ｐＨに達するまでその実効等電点において陽イオン交換吸着剤から溶離する荷電分子を収集するステップと
を含む方法。
【請求項７８】
異なる等電点を有する荷電分子をクロマトグラフィーにより分離する複合外部勾配クロマトフォーカシング方法であって、
最低の初期ｐＨおよび温度Ｔ_０における少なくとも１種のバッファー成分を含む溶媒を含浸した陽イオン交換吸着剤であって分離すべき荷電分子と反対の電荷をもつ陽イオン交換吸着剤に、分離すべき荷電分子を適用して結合させるステップと、
陰イオン交換吸着剤を陽イオン交換吸着剤の後に直列に接続し、陰イオン交換吸着剤の温度をＴ_１に変化させ、両方の交換体を温度Ｔ_０の溶媒中で測定した最低の初期ｐＨで平衡化させるステップと、
第１の貯蔵器からポンプで送出される少なくとも１種のバッファー成分を含有する初期ｐＨの溶液を、第２の貯蔵器からポンプで送出される前記少なくとも１種のバッファー成分を含有するｐＨの異なる溶液との連続混合で形成される時間依存性のｐＨを有する溶離液を、前記陽イオン交換吸着剤に温度Ｔ_０で供給するステップであって、その混合比率を、保持されていないｐＨ勾配を外部で定めた傾きで維持するために変動させるステップと、
荷電分子の溶離であって、それぞれが、温度Ｔ_０で所定の最大ｐＨに達するまでその実効等電点で陽イオン交換吸着剤から別々に溶離するステップと、
荷電分子を含有する陽イオン交換吸着剤から得られた溶出液が、温度Ｔ_１でさらに分離されるように陰イオン交換吸着剤中に導くステップと、
負帯電している荷電分子を陰イオン交換吸着剤に温度Ｔ_０で所定の最大ｐＨに達するまで結合させるステップと、
陽イオン交換吸着剤を取り除くステップと、
陰イオン交換吸着剤を温度Ｔ_１における所定の最大ｐＨから所定の最小ｐＨまで展開するように含浸させてｐＨ勾配を逆転させるステップと、
それぞれが別々に温度Ｔ_１で所定の最小ｐＨに達するまでその実効等電点において陰イオン交換吸着剤から溶離する荷電分子を収集するステップと
を含む方法。
【請求項７９】
異なる等電点を有する荷電分子をクロマトグラフィーにより分離する複合外部勾配クロマトフォーカシング方法であって、
最高の初期ｐＨおよび温度Ｔ_０における少なくとも１種のバッファー成分を含む溶媒を含浸した陰イオン交換吸着剤であって分離すべき荷電分子と反対の電荷をもつ陰イオン交換吸着剤に、分離すべき荷電分子を適用して結合させるステップと、
陽イオン交換吸着剤を陰イオン交換吸着剤の後に直列に接続し、温度をＴ_１に変化させ、両方の交換体を温度Ｔ_１で変化させた最高の初期ｐＨにおいて平衡化させるステップと、
温度Ｔ_１の第１の貯蔵器からポンプで送出される少なくとも１種のバッファー成分を含有する初期ｐＨの溶液を、温度Ｔ_１の第２の貯蔵器からポンプで送出される前記少なくとも１種のバッファー成分を含有するｐＨの異なる溶液との連続混合で形成される時間依存性のｐＨを有する溶離液を、前記陰イオン交換吸着剤に温度Ｔ_１で供給するステップであって、その混合比率を、保持されていないｐＨ勾配を外部で定めた傾きで維持するために変動させるステップと、
荷電分子の溶離であって、それぞれが、温度Ｔ_１で所定の最小ｐＨに達するまでその実効等電点で陰イオン交換吸着剤から別々に溶離するステップと、
荷電分子を含有する陰イオン交換吸着剤から得られた溶出液が、温度Ｔ_１でさらに分離されるように陽イオン交換吸着剤中に導き、かつ
正帯電している荷電分子を陽イオン交換吸着剤に温度Ｔ_１で所定の最小ｐＨに達するまで結合させるステップと、
陰イオン交換吸着剤を取り除くステップと、
陽イオン交換吸着剤を温度Ｔ_１における所定の最小ｐＨから所定の最大ｐＨまで展開するように含浸させてｐＨ勾配を逆転させるステップと、
それぞれが別々に温度Ｔ_１で所定の最大ｐＨに達するまでその実効等電点において陽イオン交換吸着剤から溶離する荷電分子を収集するステップと
を含む方法。
【請求項８０】
異なる等電点を有する荷電分子をクロマトグラフィーにより分離する複合外部勾配クロマトフォーカシング方法であって、
最低の初期ｐＨおよび温度Ｔ_０における少なくとも１種のバッファー成分を含む溶媒を含浸した陽イオン交換吸着剤であって分離すべき荷電分子と反対の電荷をもつ陽イオン交換吸着剤に、分離すべき荷電分子を適用して結合させるステップと、
陰イオン交換吸着剤を陽イオン交換吸着剤の後に直列に接続し、温度をＴ_１に変化させ、両方の交換体を温度Ｔ_１で変化させた最高の初期ｐＨにおいて平衡化させるステップと、
温度Ｔ_１の第１の貯蔵器からポンプで送出される少なくとも１種のバッファー成分を含有する初期ｐＨの溶液を、温度Ｔ_１の第２の貯蔵器からポンプで送出される前記少なくとも１種のバッファー成分を含有するｐＨの異なる溶液との連続混合で形成される時間依存性のｐＨを有する溶離液を、前記陽イオン交換吸着剤に温度Ｔ_１で供給するステップであって、その混合比率を、保持されていないｐＨ勾配を外部で定めた傾きで維持するために変動させるステップと、
荷電分子の溶離であって、それぞれが、温度Ｔ_１で所定の最大ｐＨに達するまでその実効等電点で陽イオン交換吸着剤から別々に溶離するステップと、
荷電分子を含有する陽イオン交換吸着剤から得られた溶出液が、温度Ｔ_１でさらに分離されるように陰イオン交換吸着剤中に導くステップと、
負帯電している荷電分子を陰イオン交換吸着剤に温度Ｔ_１で所定の最大ｐＨに達するまで結合させるステップと、
陽イオン交換吸着剤を取り除くステップと、
陰イオン交換吸着剤を温度Ｔ_１における所定の最大ｐＨから所定の最小ｐＨまで展開するように含浸させてｐＨ勾配を逆転させるステップと、
それぞれが別々に温度Ｔ_１で所定の最小ｐＨに達するまで陰イオン交換吸着剤から溶離する荷電分子を収集するステップと
を含む方法。
【請求項８１】
異なる等電点を有する荷電分子をクロマトグラフィーにより分離する複合外部勾配クロマトフォーカシング方法であって、
最高の初期ｐＨおよび温度Ｔ_０における少なくとも１種のバッファー成分を含む溶媒を含浸した陰イオン交換吸着剤であって分離すべき荷電分子と反対の電荷をもつ陰イオン交換吸着剤に、分離すべき荷電分子を適用して結合させるステップと、
陽イオン交換吸着剤を陰イオン交換吸着剤の後に直列に接続し、陽イオン交換体の温度をＴ_１に変化させ、両方の交換体を温度Ｔ_０で測定した最高の初期ｐＨにおいて平衡化させるステップと、
第１の貯蔵器からポンプで送出される少なくとも１種のバッファー成分を含有する初期ｐＨの溶液を、第２の貯蔵器からポンプで送出される前記少なくとも１種のバッファー成分を含有するｐＨの異なる溶液との連続混合で形成される時間依存性のｐＨを有する溶離液を、前記陰イオン交換吸着剤に温度Ｔ_０で供給するステップであって、その混合比率を、保持されていないｐＨ勾配を外部で定めた傾きで維持するために変動させるステップと、
荷電分子の溶離であって、それぞれが、温度Ｔ_０で所定の最小ｐＨに達するまでその実効等電点で陰イオン交換吸着剤から別々に溶離するステップと、
荷電分子を含有する陰イオン交換吸着剤から得られた溶出液が、温度Ｔ_１でさらに分離されるように陽イオン交換吸着剤中に導くステップと、
正帯電している荷電分子を陽イオン交換吸着剤に温度Ｔ_０で所定の最小ｐＨに達するまで結合させるステップと、
陰イオン交換吸着剤を取り除くステップと、
陽イオン交換吸着剤を温度Ｔ_１における所定の最小ｐＨから所定の最高の初期ｐＨまで展開するように含浸させてｐＨ勾配を逆転させるステップと、
それぞれが別々に温度Ｔ_１で所定の最高の初期ｐＨに達するまでその実効等電点において陽イオン交換吸着剤から溶離する荷電分子を収集するステップと、
陽イオン交換樹脂の温度をＴ_２に変化させるステップと、
温度Ｔ_２における所定の最高の初期ｐＨから所定の２番目の最大ｐＨまで時を合わせて増大するｐＨ勾配を有する陽イオン交換吸着剤を含浸させ続けるステップと、
それぞれがその実効等電点において陽イオン交換吸着剤から、温度Ｔ_２において前記所定の２番目の最大ｐＨに達するまで別々に溶離する荷電分子を収集するステップと、
増大しつつあるｐＨ勾配を使用する溶離が後に続く段階的な温度の変化を繰り返し、それぞれが最終温度Ｔ_ｆに達するまで陽イオン交換吸着剤から時を合わせて別々に溶離する荷電分子を収集するステップと、
所定の最後から２番目の最大ｐＨから所定の究極の最大ｐＨまで時を合わせて増大するｐＨ勾配を有する陽イオン交換吸着剤の含浸を継続するステップと、
それぞれが別々に最終温度Ｔ_ｆで究極の最大ｐＨに達するまでその実効等電点において陽イオン交換吸着剤から溶離する荷電分子を収集するステップと
を含む方法。
【請求項８２】
異なる等電点を有する荷電分子をクロマトグラフィーにより分離する複合外部勾配クロマトフォーカシング方法であって、
最低の初期ｐＨおよび温度Ｔ_０における少なくとも１種のバッファー成分を含む溶媒を含浸した陽イオン交換吸着剤であって分離すべき荷電分子と反対の電荷をもつ陽イオン交換吸着剤に、分離すべき荷電分子を適用して結合させるステップと、
陰イオン交換吸着剤を陽イオン交換吸着剤の後に直列に接続し、陰イオン交換体の温度をＴ_１に変化させ、両方の交換体を温度Ｔ_０で測定した最低の初期ｐＨにおいて平衡化させるステップと、
第１の貯蔵器からポンプで送出される少なくとも１種のバッファー成分を含有する初期ｐＨの溶液を、第２の貯蔵器からポンプで送出される前記少なくとも１種のバッファー成分を含有するｐＨの異なる溶液との連続混合で形成される時間依存性のｐＨを有する溶離液を、前記陽イオン交換吸着剤に温度Ｔ_０で供給するステップであって、その混合比率を、保持されていないｐＨ勾配を外部で定めた傾きで維持するために変動させるステップと、
荷電分子の溶離であって、それぞれが、温度Ｔ_０で所定の最大ｐＨに達するまでその実効等電点で陽イオン交換吸着剤から別々に溶離するステップと、
荷電分子を含有する陽イオン交換吸着剤から得られた溶出液が、温度Ｔ_１でさらに分離されるように陰イオン交換吸着剤中に導くステップと、
負帯電している荷電分子を陰イオン交換吸着剤に温度Ｔ_０で所定の最大ｐＨに達するまで結合させるステップと、
陽イオン交換吸着剤を取り除くステップと、
陰イオン交換吸着剤を温度Ｔ_１における所定の最大ｐＨから所定の最低の初期ｐＨまで展開するように含浸させてｐＨ勾配を逆転させるステップと、
それぞれが別々に温度Ｔ_１で所定の最低の初期ｐＨに達するまでその実効等電点において陰イオン交換吸着剤から溶離する荷電分子を収集するステップと、
陰イオン交換樹脂の温度をＴ_２に変化させるステップと、
温度Ｔ_２における所定の最低の初期ｐＨから所定の２番目の最小ｐＨまで時を合わせて減少するｐＨ勾配を有する陰イオン交換吸着剤を含浸させ続けるステップと、
それぞれがその実効等電点において陰イオン交換吸着剤から、温度Ｔ_２において前記所定の２番目の最小ｐＨに達するまで別々に溶離する荷電分子を収集するステップと、
増大しつつあるｐＨ勾配を使用する溶離が後に続く段階的な温度の変化を繰り返し、それぞれが最終温度Ｔ_ｆに達するまで陰イオン交換体から時を合わせて別々に溶離する荷電分子を収集するステップと、
所定の最後から２番目の最小ｐＨから所定の究極の最小ｐＨまで時を合わせて減少するｐＨ勾配を有する陰イオン交換吸着剤の含浸を継続するステップと、
それぞれが別々に最終温度Ｔ_ｆで究極の最小ｐＨに達するまでその実効等電点において陰イオン交換吸着剤から溶離する荷電分子を収集するステップと
を含む方法。
【請求項８３】
異なる等電点を有する荷電分子をクロマトグラフィーにより分離する複合外部勾配クロマトフォーカシング方法であって、
分離すべき荷電分子を、温度Ｔ_０の陰イオン交換吸着剤に、続いて温度Ｔ_１で直列に接続されている陽イオン交換吸着剤に適用し、その結果、その２つの吸着剤が、少なくとも１つの温度Ｔ_０で測定される初期ｐＨのバッファー成分を含む溶媒により含浸され、そこで分離すべき荷電分子が、３つの荷電の種類、すなわち、初期ｐＨより低い見掛けのｐＩを有する荷電分子は負に帯電したもの、初期ｐＨで陰イオン交換吸着剤または陽イオン交換吸着剤のいずれにも結合できない荷電分子は中性のもの、初期ｐＨより高い見掛けのｐＩを有する荷電分子は正に帯電したものの少なくとも１つに分類されるステップと、
初期ｐＨで負に帯電した荷電分子を温度Ｔ_０で陰イオン交換吸着剤に結合させるステップと、
初期ｐＨで正に帯電した荷電分子を温度Ｔ_１で陽イオン交換吸着剤に結合させるステップと、
初期ｐＨで温度Ｔ_０で陰イオン交換吸着剤または温度Ｔ_１で陽イオン交換吸着剤のいずれにも結合できない荷電分子のものを収集するステップと、
陽イオン交換吸着剤と陰イオン交換吸着剤との初期ｐＨにおける接続を互いから切り離すステップと、
第１の貯蔵器からポンプで送出される少なくとも１種のバッファー成分を含有する初期ｐＨの溶液を、第２の貯蔵器からポンプで送出される前記少なくとも１種のバッファー成分を含有するｐＨの異なる溶液との連続混合で形成される、温度Ｔ_０で測定して初期ｐＨに始まる時間依存的に減少するｐＨを有する溶離液を、前記陰イオン交換吸着剤に供給するステップであって、その混合比率を、保持されていないｐＨ勾配を外部で定めた傾きで温度Ｔ_０で維持するために変動させるステップと、
それぞれが温度Ｔ_０で最終の最小ｐＨに達するまでその実効等電点において陰イオン交換吸着剤から溶離する荷電分子を収集するステップと、
第１の貯蔵器からポンプで送出される少なくとも１種のバッファー成分を含有する初期ｐＨの溶液を、第２の貯蔵器からポンプで送出される前記少なくとも１種のバッファー成分を含有するｐＨの異なる溶液との連続混合で形成される、温度Ｔ_１で測定して初期ｐＨに始まる時間依存的に増加するｐＨを有する溶離液を、前記陽イオン交換吸着剤に供給するステップであって、その混合比率を、保持されていないｐＨ勾配を外部で定めた傾きで温度Ｔ_１で維持するために変動させるステップと、
それぞれが温度Ｔ_１で最終の最大ｐＨに達するまでその実効等電点において陽イオン交換吸着剤から溶離する荷電分子を収集するステップと
を含む方法。
【請求項８４】
異なる等電点を有する荷電分子をクロマトグラフィーにより分離する複合外部勾配クロマトフォーカシング方法であって、
分離すべき荷電分子を、温度Ｔ_０の陽イオン交換吸着剤に、続いて温度Ｔ_１で直列に接続されている陰イオン交換吸着剤に適用し、その結果、その２つの吸着剤が、少なくとも１つの温度Ｔ_０で測定される初期ｐＨのバッファー成分を含む溶媒により含浸され、そこで分離すべき荷電分子が、３つの荷電の種類、すなわち、初期ｐＨより低い見掛けのｐＩを有する荷電分子は負に帯電したもの、初期ｐＨで陰イオン交換吸着剤または陽イオン交換吸着剤のいずれにも結合できない荷電分子は中性のもの、初期ｐＨより高い見掛けのｐＩを有する荷電分子は正に帯電したものの１つに分類されるステップと、
初期ｐＨで正に帯電した荷電分子を温度Ｔ_０で陽イオン交換吸着剤に結合させるステップと、
初期ｐＨで負に帯電した荷電分子を温度Ｔ_１で陰イオン交換吸着剤に結合させるステップと、
初期ｐＨで温度Ｔ_０で陰イオン交換吸着剤または温度Ｔ_１で陽イオン交換吸着剤のいずれにも結合できない荷電分子のものを収集するステップと、
陽イオン交換吸着剤と陰イオン交換吸着剤との初期ｐＨにおける接続を互いから切り離すステップと、
第１の貯蔵器からポンプで送出される少なくとも１種のバッファー成分を含有する初期ｐＨの溶液を、第２の貯蔵器からポンプで送出される前記少なくとも１種のバッファー成分を含有するｐＨの異なる溶液との連続混合で形成される、温度Ｔ_０で測定して初期ｐＨに始まる時間依存的に増加するｐＨを有する溶離液を、前記陽イオン交換吸着剤に供給するステップであって、その混合比率を、保持されていないｐＨ勾配を外部で定めた傾きで温度Ｔ_０で維持するために変動させるステップと、
それぞれが温度Ｔ_０で最終の最大ｐＨに達するまでその実効等電点において陽イオン交換吸着剤から溶離する荷電分子を収集するステップと、
第１の貯蔵器からポンプで送出される少なくとも１種のバッファー成分を含有する初期ｐＨの溶液を、第２の貯蔵器からポンプで送出される前記少なくとも１種のバッファー成分を含有するｐＨの異なる溶液との連続混合で形成される、温度Ｔ_１で測定して初期ｐＨに始まる時間依存的に減少するｐＨを有する溶離液を、前記陰イオン交換吸着剤に供給するステップであって、その混合比率を、保持されていないｐＨ勾配を外部で定めた傾きで温度Ｔ_１で維持するために変動させるステップと、
それぞれが温度Ｔ_１で最終の最小ｐＨに達するまでその実効等電点において陰イオン交換吸着剤から溶離する荷電分子を収集するステップと
を含む方法。
【請求項８５】
カラム内の保持されていないｐＨ勾配が直線状である請求項７７から８４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８６】
カラム内の保持されていないｐＨ勾配が非直線状である請求項７７から８４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８７】
カラム内の非直線状のｐＨ勾配が、凹形、凸形または階段状である請求項８６に記載の方法。
【請求項８８】
荷電分子がタンパク質である請求項７７から８４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８９】
溶媒が水である請求項７７から８４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９０】
バッファー成分が、重複するｐＫ_ａを有しており、各成分のモル比率が初期ｐＨと最終ｐＨの間の変遷を通して一定に維持されるかまたは変動する請求項７７から８４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９１】
各バッファー成分が、アミノ、アミド、イミノ、イミド、カルボキシル、スルホン、リン酸およびホスホン酸からなる群から選択された少なくとも１つの官能基を含有している請求項７７から８４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９２】
各バッファー成分が０．００１ｍＭから１０００ｍＭの濃度で存在する請求項７７から８４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９３】
バッファー成分が、ピペラジン、１−メチルピペラジン、トリエタノールアミン、ビス−トリスプロパンおよびギ酸を含んでいる請求項７７から８４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９４】
陰イオン交換吸着剤を、強陰イオン交換樹脂および弱陰イオン交換樹脂からなる群から選択する請求項７７から８４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９５】
陰イオン交換吸着剤が、強陰イオン交換樹脂である請求項７７から８４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９６】
陽イオン交換吸着剤を、強陽イオン交換樹脂および弱陽イオン交換樹脂からなる群から選択する請求項７７から８４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９７】
陽イオン交換吸着剤が、強陽イオン交換樹脂である請求項７７から８４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９８】
初期ｐＨと初期ｐＨとは異なるｐＨの間の差が、＞０単位から約１２単位までである請求項７７から８４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９９】
温度勾配の範囲が、０℃と８０℃の間である請求項７７から８４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１００】
異なる等電点を有する荷電分子をクロマトグラフィーにより分離する複合外部勾配クロマトフォーカシング方法であって、
温度Ｔ_０で測定した最高の初期ｐＨにおける少なくとも１種のバッファー成分を含む溶媒を含浸した陰イオン交換吸着剤であって分離すべき荷電分子と反対の電荷をもつ陰イオン交換吸着剤に、分離すべき荷電分子を適用して結合させるものであって、前記陰イオン交換吸着剤を、前記溶媒が吸着剤に入るときの温度である温度Ｔ_１から前記溶媒が吸着剤を出るときの温度である温度Ｔ_２までの温度勾配の下におくステップと、
陰イオン交換吸着剤の後に、陰イオン交換吸着剤からの溶出液が陽イオン交換体に入るときの陽イオン交換吸着剤の温度である温度Ｔ_３から前記溶出液が陽イオン交換体を出るときの温度である温度Ｔ_４までの温度勾配の下におく陽イオン交換吸着剤を直列に接続し、温度Ｔ_０で測定した最高の初期ｐＨにおける両方のイオン交換体を平衡化させるステップと、
温度Ｔ_０の第１の貯蔵器からポンプで送出される少なくとも１種のバッファー成分を含有する初期ｐＨの溶液を、温度Ｔ_０の第２の貯蔵器からポンプで送出される前記少なくとも１種のバッファー成分を含有するｐＨの異なる溶液との連続混合で形成される時間依存性のｐＨを有する溶離液を、温度Ｔ_１から温度Ｔ_２の勾配にかけた前記陰イオン交換吸着剤に供給するステップであって、その混合比率を、保持されていないｐＨ勾配を外部で定めた傾きで維持するために変動させるステップと、
荷電分子の溶離であって、それぞれが、温度Ｔ_０で測定した所定の最小ｐＨに達するまでその実効等電点で陰イオン交換吸着剤から別々に溶離するステップと、
荷電分子を含有する陰イオン交換吸着剤から得られた溶出液が、さらに分離されるように、温度Ｔ_３から温度Ｔ_４までの温度勾配の下においた陽イオン交換吸着剤中に導くステップと、
正帯電している荷電分子を、温度Ｔ_０で測定した所定の最小ｐＨに達するまで温度Ｔ_３から温度Ｔ_４までの温度勾配の下においた陽イオン交換吸着剤に結合させるステップと、
陰イオン交換吸着剤を取り除くステップと、
温度Ｔ_３から温度Ｔ_４までの温度勾配の下においた陽イオン交換吸着剤を温度Ｔ_０で測定した所定の最小ｐＨから所定の最大ｐＨまで展開するように含浸させてｐＨ勾配を逆転させるステップと、
それぞれが別々に、温度Ｔ_０で測定して所定の最大ｐＨに達するまで、その実効等電点において温度Ｔ_３から温度Ｔ_４までの温度勾配の下においた陽イオン交換吸着剤から、溶離する荷電分子を収集するステップと
を含む方法。
【請求項１０１】
異なる等電点を有する荷電分子をクロマトグラフィーにより分離する複合外部勾配クロマトフォーカシング方法であって、
温度Ｔ_０で測定した最低の初期ｐＨにおける少なくとも１種のバッファー成分を含む溶媒を含浸した陽イオン交換吸着剤であって分離すべき荷電分子と反対の電荷をもつ陽イオン交換吸着剤に、分離すべき荷電分子を適用して結合させるものであって、前記陽イオン交換吸着剤を、前記溶媒が吸着剤に入るときの温度である温度Ｔ_１から前記溶媒が吸着剤を出るときの温度である温度Ｔ_２までの温度勾配の下におくステップと、
陽イオン交換吸着剤の後に、陽イオン交換吸着剤からの溶出液が、陰イオン交換体に入るときの陰イオン交換吸着剤の温度である温度Ｔ_３から前記溶出液が陰イオン交換体を出るときの温度である温度Ｔ_４までの温度勾配の下におく陰イオン交換吸着剤を直列に接続し、温度Ｔ_０で測定した最低の初期ｐＨにおける両方のイオン交換体を平衡化させるステップと、
温度Ｔ_０の第１の貯蔵器からポンプで送出される少なくとも１種のバッファー成分を含有する初期ｐＨの溶液を、温度Ｔ_０の第２の貯蔵器からポンプで送出される前記少なくとも１種のバッファー成分を含有するｐＨの異なる溶液との連続混合で形成される時間依存性のｐＨを有する溶離液を、温度Ｔ_１から温度Ｔ_２の勾配にかけた前記陽イオン交換吸着剤に供給するステップであって、その混合比率を、保持されていないｐＨ勾配を外部で定めた傾きで維持するために変動させるステップと、
荷電分子の溶離であって、それぞれが、温度Ｔ_０で測定した所定の最大ｐＨに達するまでその実効等電点で陽イオン交換吸着剤から別々に溶離するステップと、
荷電分子を含有する陽イオン交換吸着剤から得られた溶出液が、さらに分離されるように、温度Ｔ_３から温度Ｔ_４までの温度勾配の下においた陰イオン交換吸着剤中に導くステップと、
負帯電している荷電分子を、温度Ｔ_０で測定した所定の最大ｐＨに達するまで温度Ｔ_３から温度Ｔ_４までの温度勾配の下においた陰イオン交換吸着剤に結合させるステップと、
陽イオン交換吸着剤を取り除くステップと、
温度Ｔ_３から温度Ｔ_４までの温度勾配の下においた陰イオン交換吸着剤を温度Ｔ_０で測定した所定の最大ｐＨから所定の最小ｐＨまで展開するように含浸させてｐＨ勾配を逆転させるステップと、
それぞれが別々に、温度Ｔ_０で測定して所定の最小ｐＨに達するまで、その実効等電点において温度Ｔ_３から温度Ｔ_４までの温度勾配の下においた陰イオン交換吸着剤から、溶離する荷電分子を収集するステップと
を含む方法。
【請求項１０２】
ｎ∈｛０，１，２，３，４｝およびｍ∈｛０，１，２，３，４｝の場合に、任意の一組の温度についての温度差の絶対値｜Ｔｎ〜Ｔｍ｜が０℃から８０℃の範囲である、請求項１００または請求項１０１に記載の方法。

【図１】

【図２】

【図３】

【図４】

【図５】

【図６】

【図７】

【公表番号】特表２００７−５００８５２（Ｐ２００７−５００８５２Ａ）
【公表日】平成１９年１月１８日（２００７．１．１８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５３３０８９（Ｐ２００６−５３３０８９）
【出願日】平成１６年５月１４日（２００４．５．１４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１５２１６
【国際公開番号】ＷＯ２００４／１０３５１９
【国際公開日】平成１６年１２月２日（２００４．１２．２）
【出願人】（５０５４２６０３７）クリオバイオフィジカ，　インコーポレイテッド (1)
【Ｆターム（参考）】