多孔質樹脂ビーズおよびそれを用いる核酸の製造方法
【課題】核酸合成の固相合成用担体として有用な多孔質樹脂ビーズを提供すること。
【解決手段】第一の芳香族モノビニル化合物−ジビニル化合物−（メタ）アクリロニトリル−第二の芳香族モノビニル化合物系共重合体からなる多孔質樹脂ビーズであって、第二の芳香族モノビニル化合物が、脱水縮合反応によりカルボキシル基と結合し得る基を含有し、かつ乾燥体積が２〜３ｍＬ／ｇであることを特徴とする、多孔質樹脂ビーズ。
【解決手段】第一の芳香族モノビニル化合物−ジビニル化合物−（メタ）アクリロニトリル−第二の芳香族モノビニル化合物系共重合体からなる多孔質樹脂ビーズであって、第二の芳香族モノビニル化合物が、脱水縮合反応によりカルボキシル基と結合し得る基を含有し、かつ乾燥体積が２〜３ｍＬ／ｇであることを特徴とする、多孔質樹脂ビーズ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多孔質樹脂ビーズに関する。より詳しくは、第一の芳香族モノビニル化合物−ジビニル化合物−（メタ）アクリロニトリル−第二の芳香族モノビニル化合物系共重合体からなる多孔質樹脂ビーズに関する。この多孔質樹脂ビーズは、特に核酸合成に有用である。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡオリゴヌクレオチドやＲＮＡといった核酸の化学合成に、ホスホロアミダイト法を用いた固相合成法が広く用いられている。この方法は、例えば、先ず合成する核酸の３’末端になるヌクレオシドを、スクシニル基などの開裂性リンカーを介して固相合成用担体にあらかじめ担持させ、この担体を反応カラムに入れ、核酸自動合成装置にセットする。以降は核酸自動合成装置の合成プログラムにしたがって、例えば以下のように反応カラム中に合成用試薬が流される。（１）トリクロロ酢酸／ジクロロメタン溶液またはジクロロ酢酸／トルエン溶液等による、ヌクレオシド５’−ＯＨ基の脱保護、（２）ヌクレオシドホスホロアミダイト（核酸モノマー）／アセトニトリル溶液、および、活性化剤（テトラゾール等）／アセトニトリル溶液による５’−ＯＨ基ヘのアミダイトのカップリング反応、（３）無水酢酸／ピリジン／メチルイミダゾール／ＴＨＦ等による未反応の５’−ＯＨ基のキャッピング、（４）ヨウ素／水／ピリジン等によるホスファイトの酸化。
この合成サイクルを繰り返し、目的の配列を持った核酸が合成される。最終的に合成された核酸は、アンモニアやメチルアミン等により開裂性リンカーを加水分解させることによって、固相合成用担体から切り出される（非特許文献１参照）。
【０００３】
核酸の合成に使用される固相合成用担体としては、これまでＣＰＧ（Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｐｏｒｅ Ｇｌａｓｓ）やシリカゲルのような無機粒子が用いられてきたが、近年、安価に、かつ大量に合成するために、固相合成用担体重量当りの核酸合成量を多くすることができる樹脂ビーズが用いられるようになってきた。このような樹脂ビーズとしては、例えば高架橋・非膨潤性の多孔質ポリスチレンビーズ（特許文献１参照）、低架橋・膨潤性の多孔質ポリスチレンビーズ（特許文献２参照）等が挙げられる。
【０００４】
しかしながら、固相合成用担体重量当りの核酸合成量をさらに増やすために、合成の起点となるヌクレオシドリンカーの担持量を多くし過ぎると、アミダイトのカップリング効率が悪くなり、得られる核酸の純度が著しく低下するという問題がある。例えば２０塩基配列のＤＮＡオリゴヌクレオチドを高純度で合成することができる、市販の固相合成用担体のヌクレオシドリンカー担持量の上限はこれまでのところ約２００μｍｏｌ／ｇ程度である。
【０００５】
アクリロニトリルを使用して種々の有機溶媒中における多孔質樹脂ビーズの膨潤率の変動を抑えることで、核酸の合成能を改善することが試みられている（特許文献３参照）。しかし、この文献における多孔質樹脂ビーズは、種々の有機溶媒中における多孔質樹脂ビーズの膨潤率の変動は小さいものの、核酸の合成能についてはさらなる改善が求められていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開平３−６８５９３号公報
【特許文献２】特開２００５−３２５２７２号公報
【特許文献３】特開２００８−７４９７９号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２０００），ＵＮＩＴ３．６ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｕｎｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、高合成量かつ高純度で核酸を合成するための多孔質樹脂ビーズを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、第一の芳香族モノビニル化合物−ジビニル化合物−（メタ）アクリロニトリル−第二の芳香族モノビニル化合物からなる多孔質樹脂ビーズのうち、
（１）第二の芳香族モノビニル化合物が、脱水縮合反応によりカルボキシル基と結合し得る基を含有し、かつ
（２）乾燥体積が２〜３ｍＬ／ｇである
ことを特徴とする多孔質樹脂ビーズを、固相合成用担体として核酸合成に用いた場合、驚くべきことに得られる核酸の合成量が増大し、かつその純度が向上することを初めて見いだした。
本発明者らはこれらの知見に基づいてさらに鋭意研究を行った結果、本発明を完成するに至った。
【００１０】
即ち本発明は、
［１］第一の芳香族モノビニル化合物−ジビニル化合物−（メタ）アクリロニトリル−第二の芳香族モノビニル化合物系共重合体からなる多孔質樹脂ビーズであって、第二の芳香族モノビニル化合物が、脱水縮合反応によりカルボキシル基と結合し得る基を含有し、かつ乾燥体積が２〜３ｍＬ／ｇであることを特徴とする、多孔質樹脂ビーズ；
［２］脱水縮合反応によりカルボキシル基と結合し得る基が、アミノ基、アミノアルキル基、ヒドロキシル基、およびヒドロキシアルキル基から選択される基である、［１］に記載の多孔質樹脂ビーズ；
［３］（メタ）アクリロニトリル構造単位の量が１〜４ｍｍｏｌ／ｇであることを特徴とする、［１］または［２］に記載の多孔質樹脂ビーズ；
［４］単量体合計量に対するジビニル化合物の仕込み量が、２〜１０ｍｏｌ％であることを特徴とする、［１］〜［３］のいずれか一に記載の多孔質樹脂ビーズ；
［５］ジビニル化合物がジビニルベンゼンである、［１］〜［４］のいずれか一に記載の多孔質樹脂ビーズ；および
［６］［１］〜［５］のいずれか一に記載の多孔質樹脂ビーズに対して開裂性のリンカーを介しヌクレオシドまたはヌクレオチドを順次結合させてオリゴヌクレオチドを得ることを特徴とする、核酸の製造方法；
などに関する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の多孔質樹脂ビーズは核酸の合成量および核酸の合成純度が高いので、この多孔質樹脂ビーズを使用することで、従来の多孔質樹脂ビーズを用いた場合よりも核酸合成を効率的に行うことが可能となる。
【００１２】
本発明の多孔質樹脂ビーズは、第一の芳香族モノビニル化合物−ジビニル化合物−（メタ）アクリロニトリル−第二の芳香族モノビニル化合物系共重合体からなる。
【００１３】
本発明の多孔質樹脂ビーズの構造単位（即ち、第一の芳香族モノビニル化合物−ジビニル化合物−（メタ）アクリロニトリル−第二の芳香族モノビニル化合物系共重合体における構造単位）の一つである「第一の芳香族モノビニル化合物」とは、スチレンまたはその置換体を意味する。スチレンの置換体としては、例えば、スチレンの１つ以上の水素原子が、炭素数１〜５のアルキル基（例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ｎ−アミル基、イソアミル基、ｓｅｃ−アミル基、ｔｅｒｔ−アミル基）、ハロゲン原子、カルボキシル基、スルホン酸基、シアノ基、炭素数１〜５のアルコキシ基（例えば、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、ブトキシ基、ペンチルオキシ基）、ニトロ基、アシル基（例えば、アセトキシ基、ベンゾキシ基）等で置換された化合物が挙げられる。
【００１４】
このような第一の芳香族モノビニル化合物としては、具体的には、例えばスチレン、ｏ−メチルスチレン、ｍ−メチルスチレン、ｐ−メチルスチレン、２，４−ジメチルスチレン、エチルスチレン、トリメチルスチレン、ｐ−ｔ−ブチルスチレン等の、ベンゼン環部分が置換されたスチレンである「核アルキル置換スチレン」；α−メチルスチレン、α−メチル−ｐ−メチルスチレン等のα−アルキル置換スチレン、クロロスチレン、ジクロロスチレン、フルオロスチレン、ペンタフルオロスチレン、ブロモスチレン等の、ベンゼン環部分がハロゲン化されたスチレンである「核ハロゲン化スチレン」；クロロメチルスチレン、フルオロメチルスチレン等のハロゲン化アルキルスチレン、ヒドロキシスチレン、ヒドロキシメチルスチレン、安息香酸ビニル、スチレンスルホン酸ナトリウム、シアノスチレン、メトキシスチレン、エトキシスチレン、ブトキシスチレン、ニトロスチレン、および、アセトキシスチレン、ベンゾキシスチレン等の「アシルオキシスチレン」等を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。本発明の第一の芳香族モノビニル化合物として好ましいものは、スチレンである。
【００１５】
本発明の多孔質樹脂ビーズの構造単位の一つである「ジビニル化合物」とは、芳香族ジビニル化合物、ジ（メタ）アクリル酸エステルまたはそれらの置換体を意味する。芳香族ジビニル化合物の置換体、ジ（メタ）アクリル酸エステルの置換体としては、例えば、芳香族ジビニル化合物やジ（メタ）アクリル酸エステルの１つ以上の水素原子が、炭素数１〜５のアルキル基、ハロゲン原子、カルボキシル基、スルホン酸基、シアノ基、炭素数１〜５のアルコキシ基、ニトロ基等で置換された化合物が挙げられる。
【００１６】
このようなジビニル化合物としては、具体的には、例えばジビニルベンゼン、メチルジビニルベンゼン、ジビニルトルエン、ジビニルナフタレン等の芳香族ジビニル化合物、エチレングリコールジ（メタ）アクリレート、ジエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、トリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、テトラエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、それ以上の多価のエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、プロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、ジプロピレンエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、それ以上の多価のプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、１，２−ブタンジオールジ（メタ）アクリレート、１，３−ブタンジオールジ（メタ）アクリレート、１，４−ブタンジオールジ（メタ）アクリレート、１，５−ペンタンジオールジ（メタ）アクリレート、１，６−ヘキサンジオールジ（メタ）アクリレート、１，９−ノナンジオールジ（メタ）アクリレート、１，１０−デカンジオールジ（メタ）アクリレート、２−メチル−１，８−オクタンジオール（メタ）アクリレート、１，４−シクロヘキサンジオールジメタクリレート等のジ（メタ）アクリレート系化合物等が挙げられる。本発明のジビニル化合物として好ましいものは、ジビニルベンゼンである。ジビニルベンゼンは、ｏ−、ｍ−又はｐ−ジビニルベンゼンやこれらの混合物が構造単位として用いられる。なかでも特に好ましいものは、ｍ−またはｐ−ジビニルベンゼンである。ジビニル化合物は、本発明の多孔質樹脂ビーズにおける架橋剤として機能する。架橋剤の量が少ないほうが、多孔質樹脂ビーズが膨潤しやすくなる傾向にあるため、ジビニル化合物の量は、膨潤率の増大化に貢献し得る。
【００１７】
本発明の多孔質樹脂ビーズの構造単位の一つである「（メタ）アクリロニトリル」とは、「アクリロニトリル」もしくは「メタクリロニトリル」、または「アクリロニトリルとメタクリロニトリルの両方」を意味する。すなわち本発明の多孔質樹脂ビーズに含まれる（メタ）アクリロニトリルの構造単位は、アクリロニトリルの構造単位またはメタクリロニトリルの構造単位がそれぞれ単独で含まれていても良いし、両方の単位が含まれていても良い。
【００１８】
本発明の多孔質樹脂ビーズの構造単位の一つである「第二の芳香族モノビニル化合物」とは、「脱水縮合反応によりカルボキシル基と結合し得る官能基」を含有することを特徴とする、スチレンまたはその置換体を意味する。従って目的の核酸を合成する場合、ヌクレオシドを多孔質樹脂ビーズと連結させるが、その際リンカーにカルボキシル基があるとリンカーのカルボキシル基と多孔質樹脂ビーズとを容易に結合させることができるので、核酸合成が効率的に行い得る点で有利である。このような「脱水縮合反応によりカルボキシル基と結合し得る官能基」としては、アミノ基、アミノアルキル基、ヒドロキシル基、ヒドロキシアルキル基などが挙げられる。より好ましくは、一級アミノ基、アミノメチル基、ヒドロキシル基、ヒドロキシメチル基などが挙げられる。「脱水縮合反応によりカルボキシル基と結合しうる官能基」はビニル基に対してパラ位に配置することが好ましいが、オルト位またはメタ位であってもよい。
【００１９】
このような第二の芳香族モノビニル化合物としては、具体的には、アミノスチレン等のアミノスチレン系単量体またはその置換体、アミノメチルスチレン等のアミノアルキルスチレン系単量体またはその置換体、ヒドロキシスチレン等のヒドロキシスチレン系単量体またはその置換体、ヒドロキシメチルスチレン等のヒドロキシアルキルスチレン系単量体またはその置換体等が挙げられ、好ましくはｐ−アミノスチレン、ｐ−アミノメチルスチレン、ｐ−ヒドロキシスチレン、ｐ−ヒドロキシメチルスチレンである。
ヒドロキシスチレン系単量体またはアミノスチレン系単量体の「置換体」としては、「脱水縮合反応によりカルボキシル基と結合しうる官能基」以外の１つ以上の水素原子が、炭素数１〜５のアルキル基、ハロゲン原子、カルボキシル基、スルホン酸基、シアノ基、メトキシ基、ニトロ基等で置換された化合物が挙げられる。
【００２０】
本発明の多孔質樹脂ビーズは、製造当初から前記「脱水縮合反応によりカルボキシル基と結合し得る官能基」を含有してなる第二の芳香族モノビニル化合物を直接用いて製造してもよい（製造方法は後述）が、一旦懸濁共重合等によって多孔質樹脂ビーズを合成した後、「脱水縮合反応によりカルボキシル基と結合し得る官能基」を導入することで製造してもよい。特に、「脱水縮合反応によりカルボキシル基と結合し得る官能基」としてヒドロキシ基を有する第二の芳香族モノビニル化合物（ヒドロキシスチレン）を本発明の多孔質樹脂ビーズの構造単位として導入する場合、ヒドロキシスチレン自体は非常に重合しやすい不安定な単量体であるため取扱いや保存が容易でないので、本製造方法で製造することが好ましい。
【００２１】
このような製造過程において、本発明の「第二の芳香族モノビニル化合物」の基となる芳香族モノビニル化合物としては、例えば、アセトアミノスチレンなどのアシルアミノスチレン、アセトキシスチレン、エタノイルオキシスチレン、ベンゾイルオキシスチレンなどのアシルオキシスチレン、クロロメチルスチレンなどのハロアルキルスチレンが挙げられる。
【００２２】
懸濁共重合等によって合成した多孔質樹脂ビーズ中のアシルオキシスチレン、アシルアミノスチレンの構造単位は、アルカリまたは酸による加水分解によって、本発明の多孔質樹脂ビーズの構造単位である「第二の芳香族モノビニル化合物」、具体的にはヒドロキシスチレン、アミノスチレンなどの構造単位に変換することができる。また、ハロアルキルスチレンの構造単位は、フタルイミドおよびヒドラジン、アンモニアまたは水酸化ナトリウムなどとの反応によって、本発明の多孔質樹脂ビーズの構造単位である「第二の芳香族モノビニル化合物」、具体的にはアミノアルキルスチレン、ヒドロキシアルキルスチレンなどの構造単位に変換することができる。変換して「脱水縮合反応によりカルボキシル基と結合しうる官能基」となるアシルオキシ基、アシルアミノ基、ハロアルキル基などは、ビニル基に対してパラ位に配置することが好ましいが、オルト位またはメタ位であってもよい。
【００２３】
あるいは、懸濁共重合等によって合成した、第一の芳香族モノビニル化合物−ジビニル化合物−（メタ）アクリロニトリル化合物系共重合体からなる多孔質樹脂ビーズを後処理して、第一の芳香族モノビニル化合物の構造単位の芳香族環に対してハロアルキル基を導入した後、これらをアミノアルキルスチレンまたはヒドロキシアルキルスチレンの構造単位に変換してもよい。例えば、第一の芳香族モノビニル化合物−ジビニル化合物−（メタ）アクリロニトリル化合物系共重合体からなる多孔質樹脂ビーズの分散液中に、クロロメチルメチルエーテルおよび塩化亜鉛を加えて反応させることによりクロロメチル基を導入する。次にアンモニアと反応させてアミノメチル基を導入することで「第二の芳香族モノビニル化合物」構成単位を導入する。このような製造過程を経ても、本発明の多孔質樹脂ビーズを得ることができる。ハロアルキル基は、ビニル基に対してパラ位に配置することが好ましいが、オルト位またはメタ位であってもよい。
【００２４】
本発明の多孔質樹脂ビーズの構造単位の合計重量に対する第一のモノビニル化合物の構造単位の量は、特に限定されないが、多孔質樹脂ビーズ重量当りに占める量として、好ましくは３．０〜８．３ｍｍｏｌ／ｇであり、好ましくは４．５〜８．０ｍｍｏｌ／ｇであり、さらに好ましくは５．０〜７．５ｍｍｏｌ／ｇである。
第一のモノビニル化合物の構造単位の量がこれよりも少ない場合は、多孔質樹脂ビーズの耐溶剤性、熱安定性、および、多孔度が十分でなく、核酸の固相合成に用いたときに所望の効果を期待し難い。またその量がこれよりも多い場合は、有機溶剤中での膨潤度が低くなるために核酸の固相合成に用いたときに得られる核酸の合成量が少なくなり、さらに核酸の純度も低下してしまう。
【００２５】
本発明の多孔質樹脂ビーズの構造単位の合計重量に対するジビニル化合物構造単位の量は、特に限定されないが多孔質樹脂ビーズ重量当りに占める量として好ましくは０．２〜１．０ｍｍｏｌ／ｇであり、好ましくは０．２５〜０．８ｍｍｏｌ／ｇであり、さらに好ましくは０．３〜０．７ｍｍｏｌ／ｇである。
ジビニル化合物構造単位の量がこれよりも少ない場合は、多孔質樹脂ビーズの耐溶剤性、熱安定性、および、多孔度が十分でなく、核酸の固相合成に用いたときに所望の効果を期待し難い。またその量がこれよりも多い場合は、有機溶剤中での膨潤度が低くなるために、核酸の固相合成に用いたときに得られる核酸の合成量が少なくなり、さらに核酸の純度も低下してしまう。
【００２６】
本発明の多孔質樹脂ビーズは、アセトニトリル中で大きく膨潤するが、その乾燥体積が２〜４ｍＬ／ｇであることを特徴とする。この乾燥体積は一般的な多孔質樹脂ビーズと比較して小さいものである。しかしながら本発明の多孔質樹脂ビーズはアセトニトリル中での膨潤率が大きいので、アセトニトリルを用いる核酸合成の反応場を大きくすることができる。そしてこのことによって、核酸合成の反応性を改善することができる。したがって本発明によれば、これまでの核酸合成用多孔質樹脂ビーズと比較して、合成量と合成純度との両方が高い核酸合成を可能にする、固相合成用担体に用いる多孔質樹脂ビーズを得ることができる。
【００２７】
そこで、本発明の多孔質樹脂ビーズの乾燥体積を２〜３ｍＬ／ｇとするためには、多孔質樹脂ビーズの構造単位の合計量に対する（メタ）アクリロニトリル構造単位の量を考慮する必要がある。
本発明の多孔質樹脂ビーズ体の構造単位の合計量に対する（メタ）アクリロニトリル構造単位の量は１〜４ｍｍｏｌ／ｇであり、好ましくは１．５〜３．５ｍｍｏｌ／ｇ、さらに好ましくは１．８〜３．０ｍｍｏｌ／ｇである。
（メタ）アクリロニトリル構造単位の量がこれよりも少ない場合は望ましい乾燥重量をの多孔質樹脂ビーズが得られず、核酸の固相合成に用いたときに所望の効果を期待し難い。またその量がこれよりも多い場合は多孔質樹脂ビーズそのものが形成し難い。本発明の多孔質樹脂ビーズ中における（メタ）アクリロニトリル構造単位の量は、全窒素分析により測定される。具体的には、試料を白金パンに入れ、ミクロ天秤で秤量した後、微量全窒素分析装置ＴＮ−１１０（三菱化学）により窒素量を測定し、（メタ）アクリロニトリル構造単位の分子量から計算して求める。
【００２８】
本発明の多孔質樹脂ビーズの構造単位の合計重量に対する第二の芳香族モノビニル化合物の構造単位の量は特に限定されないが、好ましくは０．０５〜１．５ｍｍｏｌ／ｇであり、より好ましくは０．１〜１．０ｍｍｏｌ／ｇであり、さらに好ましくは０．２〜０．８ｍｍｏｌ／ｇである。
第二の芳香族モノビニル化合物の構造単位の量がこれよりも少ない場合は効果が得られないからであり、その量がこれよりも多い場合は多孔質樹脂ビーズそのものを形成し難いからである。
【００２９】
本発明の多孔質樹脂ビーズにおける、第二のモノビニル化合物の構造単位が有する「脱水縮合反応によりカルボキシル基と結合しうる官能基」の量としては、例えばアミノ基、アミノアルキル基、ヒドロキシル基またはヒドロキシアルキル基の場合、多孔質樹脂ビーズ重量当りに占める量として好ましくは０．０５〜１．５ｍｍｏｌ／ｇであり、より好ましくは０．１〜１．０ｍｍｏｌ／ｇであり、さらに好ましくは０．２〜０．８ｍｍｏｌ／ｇである。
「脱水縮合反応によりカルボキシル基と結合しうる官能基」の量がこれよりも少ない場合は、核酸の固相合成用担体として用いた場合、核酸の合成量が少なくなる傾向にある。またその量がこれよりも多い場合は、核酸の固相合成用担体として用いた場合、核酸の純度が低下する傾向にある。
【００３０】
本発明の多孔質樹脂ビーズにおける、第二のモノビニル化合物の構造単位が有する「脱水縮合反応によりカルボキシル基と結合しうる官能基」については、例えばアミノ基、アミノアルキル基、ヒドロキシル基またはヒドロキシアルキル基の場合はＪＩＳ Ｋ００７０に基づく滴定により測定される。具体的には、測定対象の固相合成用担体のヒドロキシル基を既知量のアセチル化試薬（無水酢酸／ピリジン）によってアセチル化し、アセチル化に消費されなかった無水酢酸量を水酸化カリウムによって滴定して求めることによって、官能基量を算出することができる。
【００３１】
本発明の多孔質樹脂ビーズの製造方法は特に限定されず、例えば、
（１）第一の芳香族モノビニル化合物、ジビニル化合物、（メタ）アクリロニトリルおよび脱水縮合反応によりカルボキシル基と結合し得る官能基を含有する第二の芳香族モノビニル化合物を、有機溶媒および水を用いて懸濁共重合させて、多孔質樹脂ビーズを製造する方法
が挙げられる。あるいは、
（２）懸濁共重合等によって多孔質樹脂ビーズを合成した後、第二の芳香族モノビニル化合物の構造単位に、脱水縮合反応によりカルボキシル基と結合し得る官能基を導入して、多孔質樹脂ビーズを製造する方法
などが挙げられる。
【００３２】
懸濁共重合の際の、第一の芳香族モノビニル化合物、ジビニル化合物、（メタ）アクリロニトリル、第二の芳香族モノビニル化合物の合計量に対する第一の芳香族モノビニル化合物の仕込み量は、３１〜８５ｍｏｌ％であり、好ましくは４５〜８２ｍｏｌ％、さらに好ましくは５３〜７６ｍｏｌ％である。
【００３３】
懸濁共重合の際の、第一の芳香族モノビニル化合物、ジビニル化合物、（メタ）アクリロニトリル、第二の芳香族モノビニル化合物の合計量に対するジビニル化合物の仕込み量は、２〜１０ｍｏｌ％であり、好ましくは２．５〜８ｍｏｌ％、さらに好ましくは３〜７ｍｏｌ％である。
【００３４】
懸濁共重合の際の、第一の芳香族モノビニル化合物、ジビニル化合物、（メタ）アクリロニトリル、第二の芳香族モノビニル化合物の合計量に対する（メタ）アクリロニトリルの仕込み量は、１０〜４０ｍｏｌ％であり、好ましくは１３〜３５ｍｏｌ％、さらに好ましくは１８〜３０ｍｏｌ％である。
【００３５】
懸濁共重合の際の、第一の芳香族モノビニル化合物、ジビニル化合物、（メタ）アクリロニトリル、第二の芳香族モノビニル化合物の合計量に対する第二の芳香族モノビニル化合物の仕込み量は、０．５〜１５ｍｏｌ％であり、好ましくは１〜１０ｍｏｌ％、さらに好ましくは２〜８ｍｏｌ％である。この量は、一旦懸濁共重合等によって多孔質樹脂ビーズを合成した後、「脱水縮合反応によりカルボキシル基と結合し得る官能基」を導入して製造する場合の、第二の芳香族モノビニル化合物の基となる芳香族モノビニル化合物であっても同様である。
【００３６】
懸濁共重合は、上述の各化合物（以下、懸濁共重合される本発明の多孔質樹脂ビーズの構成成分（第一の芳香族モノビニル化合物、ジビニル化合物、（メタ）アクリロニトリル、第二の芳香族モノビニル化合物）のそれぞれを、「単量体」と記載する場合がある）と有機溶媒との混合物を水中で撹拌乳化することにより行われる。
【００３７】
本発明における有機溶媒とは、懸濁共重合系における水以外の溶媒を意味し、炭化水素およびアルコールが好ましく用いられる。炭化水素として具体的には、脂肪族の飽和または不飽和炭化水素、あるいは芳香族炭化水素を用いることができ、好ましくは炭素数５〜１２の脂肪族炭化水素であり、より好ましくは、ｎ−ヘキサン、ｎ−ヘプタン、ｎ−オクタン、イソオクタン、ウンデカン、ドデカン等が挙げられる。またこの際得られるビーズの多孔質度を増すために、アルコールを共存させることが望ましい（以下、多孔質度を増す目的で用いられるアルコールを、「多孔質化剤」と記載する）。本発明におけるアルコールとしては、例えば脂肪族アルコールを挙げることができ、その炭素数は、好ましくは５〜９である。このようなアルコールとして具体的には、２−エチルヘキサノール、アミルアルコール（例、ｔ−アミルアルコールなど）、ノニルアルコール、２−オクタノール、シクロヘキサノール等が挙げられる。
【００３８】
懸濁共重合に用いられる炭化水素とアルコールの重量比は、炭化水素およびアルコールの具体的な組合せによって適宜変更され、それにより得られる固相合成用担体の比表面積を大きくすることができる。炭化水素とアルコールの好ましい配合割合は、重量比で１：９〜６：４である。
【００３９】
懸濁共重合の際の有機溶媒の重量は、上記各単量体の総重量に対して好ましくは０．５〜２．５倍であり、より好ましくは０．８〜２．２であり、さらに好ましくは１．０〜２．０倍である。この値が大小いずれの場合でも、得られる多孔質樹脂ビーズの比表面積が小さくなり、化学反応による合成反応物の量が少なくなる。
【００４０】
本発明において、懸濁共重合する際の方法自体は従来公知の方法を援用してもよい。
【００４１】
懸濁共重合する際の分散安定剤としては特に限定されず、従来公知のポリビニルアルコール、ポリアクリル酸、ゼラチン、デンプン、カルボキシルメチルセルロース等の親水性保護コロイド剤、炭酸カルシウム、炭酸マグネシウム、りん酸カルシウム、硫酸バリウム、硫酸カルシウム、ベントナイト等の難溶性粉末等が用いられる。分散安定剤の添加量は特に限定されないが、好ましくは懸濁重合系の水の重量に対して０．０１〜１０重量％である。この値が少ない場合は、懸濁重合の分散安定性が損なわれて多量の凝集物が生成する。この値が多い場合は、微小ビーズが多数生成する。
【００４２】
懸濁共重合する際の重合開始剤としては特に限定されず、従来公知のジベンゾイルパーオキサイド、ジラウロイルパーオキサイド、ジステアロイルパーオキサイド、１，１−ジ（ｔ−ブチルペルオキシ）−２−メチルシクロヘキサン、１，１−ジ（ｔ−ヘキシルペルオキシ）−３，３，５−トリメチルシクロヘキサン、１，１−ジ（ｔ−ヘキシルペルオキシ）シクロヘキサン、１，１−ジ（ｔ−ブチルペルオキシ）シクロヘキサン、ジ−ｔ−ヘキシルパーオキサイド、ｔ−ブチルクミルパーオキサイド、ジ−ｔ−ブチルパーオキサイド、１，１，３，３−テトラメチルブチルペルオキシ−２−エチルヘキサノエート、ｔ−ヘキシルペルオキシ−２−エチルヘキサノエート、ｔ−ブチルペルオキシ−２−−エチルヘキサノエート、ｔ−ブチルペルオキシイソプロピルモノカルボネート等の過酸化物、２，２’−アゾビスイソブチロニトリル、２，２’−アゾビス−２−メチルブチロニトリル、２，２’−アゾビス−２，４−ジメチルバレロニトリル等のアゾ化合物が用いられる。重合開始剤の添加量は特に限定されず、当業者であれば適切な量を選択することが可能である。
【００４３】
懸濁共重合の際の反応条件は、適宜に設定することができ、例えば６０〜９０℃における３０分間〜４８時間の撹拌が挙げられる。撹拌速度は、例えば１００ｒｐｍ〜１０００ｒｐｍ、好ましくは２００ｒｐｍ〜５００ｒｐｍである。懸濁共重合により、第一の芳香族モノビニル化合物−ジビニル化合物−（メタ）アクリロニトリル−第二の芳香族モノビニル化合物共重合体を得ることができる。
【００４４】
得られた共重合体は適宜、洗浄、乾燥、分級等の処理を施してもよい。さらに、懸濁共重合等によって多孔質樹脂ビーズを合成した後、第二の芳香族モノビニル化合物の構造単位に、脱水縮合反応によりカルボキシル基と結合し得る官能基を導入してもよい。導入方法は、前記のとおりである。
【００４５】
以上のような処理を経て、本発明の多孔質樹脂ビーズを得ることができる。この多孔質樹脂ビーズは、固相合成用担体として利用することができる。
【００４６】
本発明の「多孔質樹脂ビーズ」は、必ずしも厳密な球状を呈する必要は無く、少なくとも粒状であれば良い。しかしながら、固相合成の反応カラムヘの充填効率を高くでき、また破損し難いという点から、本発明の多孔質樹脂ビーズ（固相合成用担体）は、好ましくは球状である。
【００４７】
本発明の多孔質樹脂ビーズのレーザー回折散乱法により測定したメジアン粒子径は、特に限定されないが、好ましくは１〜１０００μｍ、より好ましくは１０〜５００μｍ、さらに好ましくは２０〜３００μｍである。本発明の多孔質樹脂ビーズのメジアン粒子径は、レーザー回折散乱法により測定される。具体的には、５０ｖ／ｖ％エタノール水溶液を分散媒に用いて、レーザー回折散乱式粒度分布測定装置ＬＡ−９５０（堀場製作所製）により測定し、平均粒径を求める。
【００４８】
メジアン粒子径は、懸濁重合時の重合開始前の撹拌条件、多孔質化剤の種類や量、懸濁重合する際の分散安定剤の濃度に依存する。従ってこれらを調整することで、メジアン粒子径を望ましい範囲に調整することが可能である。多孔質化剤としては、前述のアルコールが挙げられる。また膨潤状態におけるメジアン粒子径を大きくすることは、多孔質樹脂ビーズの膨潤率を増大化することに貢献する。
【００４９】
本発明の多孔質樹脂ビーズの水銀圧入法により測定したメジアン細孔径は、特に限定されないが、好ましくは１〜１０００ｎｍ、より好ましくは５〜５００ｎｍ、さらに好ましくは１０〜３００ｎｍである。
本発明の多孔質樹脂ビーズのメジアン細孔径は、水銀圧入法により測定される。具体的には、０．２ｇの多孔質樹脂ビーズを水銀ポロシメーターＰｏｒｅＭａｓｔｅｒ６０−ＧＴ（ＱｕａｎｔａＣｈｒｏｍｅ社製）に投入し、水銀接触角１４０°、水銀表面張力４８０ｄｙｎ／ｃｍの条件における水銀圧入法により測定する。
【００５０】
本発明の多孔質樹脂ビーズの乾燥体積は、好ましくは２〜３ｍＬ／ｇ、より好ましくは２．２〜３ｍＬ／ｇ、さらに好ましくは２．２〜２．８ｍＬ／ｇである。本発明の多孔質樹脂ビーズは、この範囲の乾燥体積を有することを特徴としており、これまでの核酸合成用多孔質樹脂ビーズよりも合成量と合成純度との両方が高い核酸合成を可能にするものである。
乾燥体積が上記乾燥体積の下限よりも小さい場合は核酸の合成量と合成純度が低下する。一方、乾燥体積が上記乾燥体積の上限よりも大きい場合は、樹脂分が少ないので核酸の合成起点の数が少なくなり、結果的に反応容器あたりの核酸の合成量が低下する。通常、乾燥体積が小さい場合、核酸合成の場が小さくなり、核酸合成にとって不利になることが考えられる。しかしながら本発明の多孔質樹脂ビーズは意外なことに通常の固相合成用樹脂ビーズに比べて小さい体積であるにも関らず、通常の固相合成用樹脂ビーズよりも核酸の合成量や合成純度を高くすることができる。
【００５１】
本発明の多孔質樹脂ビーズの乾燥体積は、メスシリンダーにより測定される。具体的には、１．００ｇの多孔質樹脂ビーズを１０ｍＬ−メスシリンダーに容れ、メスシリンダーに軽く振動を加えて十分に多孔質樹脂ビーズを充填させた後、その見掛けの体積を測定する。
【００５２】
乾燥体積は、懸濁重合時の（メタ）アクリロニトリル単量体の量に依存する。（メタ）アクリロニトリルの配合量が１０〜４０ｍｏｌ％の時、得られる多孔質樹脂ビーズの乾燥体積は、（メタ）アクリロニトリルを配合しなかった場合に比べて小さくなる傾向にある。
【００５３】
また、乾燥体積は、懸濁共重合の際に単量体と混合する有機溶媒の量と種類に影響される。有機溶媒の量が少ないほど乾燥体積は小さくなる傾向にある。ただし、有機溶媒の量が少な過ぎると細孔径が小さくなり過ぎ、核酸合成能が低下するので、有機溶媒の量は単量体の総重量に対して好ましくは０．５〜２．５倍である。
【００５４】
本発明の多孔質樹脂ビーズは、各種の化学合成反応の担体として用いることができるが、特に、核酸合成において効果的に使用することができる。
【００５５】
本発明の多孔質樹脂ビーズを用いる核酸合成には、従来から知られている方法を適用することができる。例えば、本発明の多孔質樹脂ビーズ上の、脱水縮合反応によりカルボキシル基と結合し得る官能基に下記のヌクレオシドスクシニルリンカー；
【００５６】
【化１】
【００５７】
を結合する。次にこのヌクレオシドの５’末端から所定の塩基配列となるように、ヌクレオシドホスホロアミダイトを一段ずつ結合する。この合成反応は自動合成装置を用いて行うことができる。例えば、ヌクレオシドスクシニルリンカーを結合した多孔質樹脂ビーズを充填した装置の反応カラムに、５’−ＯＨ脱保護剤溶液、ヌクレオシドホスホロアミダイト溶液、アミダイト活性化剤溶液、酸化剤溶液、キャッピング剤溶液、洗浄溶液としてのアセトニトリルなどが順次送られ、反応が繰り返される。最終的には、スクシニルリンカー部分をアルカリ溶液で加水分解するなどして切断し、目的の核酸を得ることができる。リンカーは、従来公知のものが使用され、例えば、下記の構造をもつヌクレオシドリンカーを結合した多孔質樹脂ビーズなどが挙げられる。
【００５８】
【化２】
【００５９】
以下に実施例を挙げて、本発明をさらに具体的に説明する。
【実施例】
【００６０】
実施例１
冷却機、撹拌機および窒素導入管を付けた、５００ｍＬセパラブルフラスコを恒温水槽に設置し、ポリビニルアルコール（クラレ製）２．５ｇおよび蒸留水２５０ｇを入れ、３００ｒｐｍで撹拌してポリビニルアルコールを溶解した。ここにスチレン（和光純薬製）３５ｇ、ｐ−アセトキシスチレン（アルドリッチ製）４．５ｇ（４．８ｍｏｌ％）、ジビニルベンゼン（含有量５５％、和光純薬製）５．５ｇ（４．０ｍｏｌ％）、メタクリロニトリル（和光純薬製）１１．５ｇ（２９．７ｍｏｌ％）、２−エチルヘキサノール（和光純薬製）６０ｇ、イソオクタン（和光純薬製）３０ｇおよびベンゾイルパーオキサイド（２５％含水、日本油脂製）１ｇを混合して溶解した溶液を添加して、窒素気流下、室温にて撹拌（３００ｒｐｍ）した後、８０℃に昇温して２４時間、懸濁共重合を行った。
【００６１】
重合生成物を、蒸留水およびアセトン（和光純薬製）を用いて濾過洗浄して、全量約１Ｌになるようにアセトン中に分散させた。この分散液を、液を傾けても沈澱が乱れない程度になるまで放置した後、上清のアセトンを廃棄した。この沈澱に再びアセトンを加えて全量を約１Ｌにして、静置、アセトン廃棄の操作を繰り返すことにより分級した。この分散液を濾過し、減圧乾燥することにより、スチレン−ジビニルベンゼン−メタクリロニトリル−ｐ−アセトキシスチレン共重合体からなる多孔質樹脂ビーズを得た。
【００６２】
次いで冷却機、撹拌機および窒素導入管を付けた５００ｍＬフラスコに、上記の共重合体からなる多孔質樹脂ビーズの粉末２０ｇ、エタノール８０ｇ、蒸留水５０ｇおよび水酸化ナトリウム２ｇを仕込み、撹拌しながら７５℃で１８時間反応させた。この分散液を濾過し、減圧乾燥することにより、スチレン−ジビニルベンゼン−メタクリロニトリル−４−ヒドロキシスチレン共重合体からなる多孔質樹脂ビーズを得た。
【００６３】
実施例２
実施例１において、単量体として、スチレン３４ｇ、ｐ−アセトキシスチレン（アルドリッチ製）６ｇ（５．７ｍｏｌ％）、ジビニルベンゼン（含有量５５％、和光純薬製）８．５ｇ（５．５ｍｏｌ％）、アクリロニトリル１２ｇ（３４．６ｍｏｌ％）を用いた以外は実施例１と同様にして、スチレン−ジビニルベンゼン−アクリロニトリル−４−ヒドロキシスチレン共重合体からなる多孔質樹脂ビーズを得た。
【００６４】
実施例３
実施例１において、ポリビニルアルコール２．６ｇ、蒸留水２６０ｇ、スチレン２９ｇ、ｐ−アセトキシスチレン５ｇ（５．９ｍｏｌ％）、ジビニルベンゼン７．５ｇ（６．１ｍｏｌ％）、メタクリロニトリル１０．５ｇ（２９．９ｍｏｌ％）、２−エチルヘキサノール５８ｇ、イソオクタン２５ｇ、撹拌速度３５０ｒｐｍにした以外は実施例１と同様にして、スチレン−ジビニルベンゼン−メタクリロニトリル−４−ヒドロキシスチレン共重合体からなる多孔質樹脂ビーズを得た。
【００６５】
比較例１
実施例１において、単量体として、スチレン４９ｇ、ｐ−アセトキシスチレン４ｇ（４．５ｍｏｌ％）、ジビニルベンゼン７ｇ（５．４ｍｏｌ％）、（メタクリロニトリル０ｇ）を用いるとともに、２−エチルヘキサノールを５２ｇに、イソオクタンを２３ｇにした以外は実施例１と同様にして、スチレン−ジビニルベンゼン−４−ヒドロキシスチレン共重合体からなる多孔質樹脂ビーズを得た。
【００６６】
比較例２
実施例１において、ポリビニルアルコールを２．６ｇに、蒸留水を２６０ｇに、スチレンを３３ｇに、ｐ−アセトキシスチレンを４ｇ（５．３ｍｏｌ％）に、ジビニルベンゼンを７ｇ（６．３ｍｏｌ％）に、メタクリロニトリルを５ｇ（１５．９ｍｏｌ％）に、２−エチルヘキサノールを６１ｇに、イソオクタンを２６ｇに、撹拌速度を４００ｒｐｍにした以外は実施例１と同様にして、スチレン−ジビニルベンゼン−メタクリロニトリル−４−ヒドロキシスチレン共重合体からなる多孔質樹脂ビーズを得た。
【００６７】
比較例３
実施例１において、ポリビニルアルコールを２．６ｇに、蒸留水を２６０ｇに、スチレンを４２ｇに、ｐ−アセトキシスチレンを７ｇ（６．３ｍｏｌ％）に、ジビニルベンゼンを５．５ｇ（３．４ｍｏｌ％）に、メタクリロニトリルを１３．５ｇ（２９．２ｍｏｌ％）に、イソオクタンを２０ｇに、ベンゾイルパーオキサイドを１．５ｇにし、２−エチルヘキサノール６０ｇの代わりに１−デカノール４８ｇを用い、かつ撹拌速度を４５０ｒｐｍにした以外は実施例１と同様にして、スチレン−ジビニルベンゼン−メタクリロニトリル−４−ヒドロキシスチレン共重合体からなる多孔質樹脂ビーズを得た。
【００６８】
実験例１：多孔質樹脂ビーズの物性測定
実施例１〜３および比較例１〜３で得られた多孔質樹脂ビーズについて以下の物性測定を行った。
【００６９】
（メジアン粒子径）
測定試料を５０ｖ／ｖ％エタノール液中で超音波分散した。この分散液を、５０ｖ／ｖ％エタノール液を分散媒に用いたレーザー回折／散乱式粒度分布装置ＬＡ−９２０（堀場製作所製）により測定した。
【００７０】
（メジアン細孔径）
測定試料０．２ｇを水銀ポロシメーターＰｏｒｅＭａｓｔｅｒ６０−ＧＴ（ＱｕａｎｔａＣｈｒｏｍｅ社製）に投入し、水銀接触角１４０°、水銀表面張力４８０ｄｙｎ／ｃｍの条件における水銀圧入法により測定した。
【００７１】
（官能基量）
測定試料０．５〜２ｇをフラスコに量り取り、アセチル化試薬（無水酢酸２５ｇとピリジンを加えて全量１００ｍＬにしたもの）０．５ｍＬとピリジン４．５ｍＬとを正確に加えた。フラスコ中の混合物を９５〜１００℃にして２時間経過後、室温まで放冷してから蒸留水１ｍＬを加えた。１０分間加熱してアセチル化に消費されなかった無水酢酸を分解した。フラスコの全量をビーカーに移し、蒸留水で全量１５０ｍＬに希釈した後、０．５Ｎの水酸化カリウム水溶液で滴定した。これとは別に、測定試料を入れずに上記と同様の操作により、ブランク測定を行った。測定試料の官能基量（水酸基量）は、以下の式（１）により算出した。ただし、Ａ（ｍｍｏｌ／ｇ）は測定試料の水酸基量であり、Ｂ（ｍＬ）はブランク測定における水酸化カリウム水溶液の滴定量であり、Ｃ（ｍＬ）は測定試料の測定における水酸化カリウム水溶液の滴定量であり、ｆは水酸化カリウム水溶液のファクターであり、Ｍ（ｇ）は量り取った測定試料の重量である。
【００７２】
【数１】
【００７３】
（（メタ）アクリロニトリル構造単位の含有量）
測定試料２〜３ｍｇを白金パンに入れてミクロ天秤で秤量したものについて、全窒素分析装置ＴＮ−１１０（三菱化学製）にて測定した。得られたＮ濃度（重量％）から以下の式（２）により、（メタ）アクリロニトリル構造単位Ｄの含有量を算出した。
【００７４】
【数２】
【００７５】
（乾燥体積）
測定試料１．００ｇを１０ｍＬ−メスシリンダーに容れ、振動を加えて試料を十分に充填させた後、見掛けの体積を測定した。
【００７６】
これらの結果を、表１に示す。
【００７７】
【表１】
【００７８】
実験例２：ＤＮＡオリゴヌクレオチドの合成およびその評価
実施例１〜２および比較例１〜２で得られた多孔質樹脂ビーズを用いて、以下のようにして２０塩基長のＤＮＡオリゴヌクレオチドを合成し、その評価を行った。
【００７９】
実施例１および比較例２で得られた多孔質樹脂ビーズの場合は、多孔質樹脂ビーズ５ｇ、ＤＭＴ−ｄＴ−３’−ｓｕｃｃｉｎａｔｅ（Ｂｅｉｊｉｎｇ ＯＭ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ製）１．９５ｇ、ＨＢＴＵ（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ製）１．００ｇ、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（アルドリッチ製）０．９０ｍｌ、アセトニトリル（和光純薬製）５０ｍｌを混合し、撹拌しながら室温で１２時間反応させ、アセトニトリルを用いて濾過洗浄した後、乾燥させた。
【００８０】
実施例２で得られた多孔質樹脂ビーズの場合は、多孔質樹脂ビーズ５ｇ、ＤＭＴ−ｄＴ−３’−ｓｕｃｃｉｎａｔｅ １．３５ｇ、ＨＢＴＵ ０．７０ｇ、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン０．６５ｍｌ、アセトニトリル５０ｍｌを混合し、撹拌しながら室温で１２時間反応させ、アセトニトリルを用いて濾過洗浄した後、乾燥させた。
【００８１】
比較例１で得られた多孔質樹脂ビーズの場合は、多孔質樹脂ビーズ５ｇ、ＤＭＴ−ｄＴ−３’−ｓｕｃｃｉｎａｔｅ １．９５ｇ、ＨＢＴＵ １．００ｇ、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン０．９４ｍｌ、アセトニトリル５０ｍｌを混合し、撹拌しながら室温で１２時間反応させ、アセトニトリルを用いて濾過洗浄した後、乾燥させた。
【００８２】
これらの多孔質樹脂ビーズに、ＣａｐＡ（２０％無水酢酸／８０％アセトニトリル）１０ｍｌ、ＣａｐＢ（２０％Ｎ−メチルイミダゾール／３０％ピリジン／５０％アセトニトリル）１０ｍｌ、４−ジメチルアミノピリジン（アルドリッチ製）０．１ｇ、アセトニトリル２５ｍｌを混合し、撹拌しながら室温で１２時間反応させ、アセトニトリルを用いて濾過洗浄した後、減圧乾燥してＤＭＴ−ｄＴ−３’−ｓｕｃｃｉｎａｔｅを結合した固相合成用担体を得た。ＤＭＴ−ｄＴ−３’−ｓｕｃｃｉｎａｔｅの結合量は、ｐ−トルエンスルホン酸／アセトニトリル溶液を用いて脱保護したＤＭＴ基の吸光度測定（４１２ｎｍ）から求めた。
【００８３】
上記で得られたＤＭＴ−ｄＴ−３’−ｓｕｃｃｉｎａｔｅを結合した多孔質樹脂ビーズ０．８〜１．１ｇを合成カラム（容量６．３ｍＬ）に詰め、ＡＫＴＡ ｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ ｐｌｕｓ １００（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製）にセットして、ヌクレオシドホスホロアミダイト濃度２ｅｑ／合成スケール、ＤＭＴ−ｏｎの条件にて２０ｍｅｒ混合配列のＤＮＡオリゴヌクレオチドを合成した。合成後、乾燥させた多孔質樹脂ビーズを２８％−アンモニア水２５ｍＬに浸漬し、５５℃にて１８時間反応させてＤＮＡオリゴヌクレオチドの切り出しおよび塩基アミノ基の脱保護を行った。フィルター濾過により多孔質樹脂ビーズを分離した濾液のＵＶ吸光度測定（２６０ｎｍ）から核酸のＯＤ収量（核酸合成量に相等）を求めた。また、濾液をＨＰＬＣ測定（ウォーターズ製）して、Ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ％（目的の配列長をもつＤＮＡオリゴヌクレオチドの割合）を求めた。結果を表２に示す。
【００８４】
【表２】
【００８５】
実施例３および比較例３で得られた多孔質樹脂ビーズを用いて、以下のようにして２０塩基長のＤＮＡオリゴヌクレオチドの合成および分析を行った。
【００８６】
実施例３で得られた多孔質樹脂ビーズの場合は、多孔質樹脂ビーズ５ｇ、ＤＭＴ−ｄＴ−３’−ｓｕｃｃｉｎａｔｅ １．９５ｇ、ＨＢＴＵ（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ製）１．００ｇ、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（アルドリッチ製）０．９０ｍｌ、アセトニトリル（和光純薬製）５０ｍｌを混合し、撹拌しながら室温で１２時間反応させ、アセトニトリルを用いて濾過洗浄した後、乾燥させた。
【００８７】
比較例３で得られた多孔質樹脂ビーズの場合は、多孔質樹脂ビーズ５ｇ、ＤＭＴ−ｄＴ−３’−ｓｕｃｃｉｎａｔｅ １．４６ｇ、ＨＢＴＵ ０．７５ｇ、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン０．６８ｍｌ、アセトニトリル５０ｍｌを混合し、撹拌しながら室温で１２時間反応させ、アセトニトリルを用いて濾過洗浄した後、乾燥させた。
【００８８】
これらの多孔質樹脂ビーズに、ＣａｐＡ（２０％無水酢酸／８０％アセトニトリル）１０ｍｌ、ＣａｐＢ（２０％Ｎ−メチルイミダゾール／３０％ピリジン／５０％アセトニトリル）１０ｍｌ、４−ジメチルアミノピリジン（アルドリッチ製）０．１ｇ、アセトニトリル２５ｍｌを混合し、撹拌しながら室温で１２時間反応させ、アセトニトリルを用いて濾過洗浄した後、減圧乾燥させてＤＭＴ−ｄＴ−３’−ｓｕｃｃｉｎａｔｅを結合した固相合成用担体を得た。ＤＭＴ−ｄＴ−３’−ｓｕｃｃｉｎａｔｅの結合量は、ｐ−トルエンスルホン酸／アセトニトリル溶液を用いて脱保護したＤＭＴ基の吸光度測定（４１２ｎｍ）から求めた。
【００８９】
上記で得られたＤＭＴ−ｄＴ−３’−ｓｕｃｃｉｎａｔｅを結合した多孔質樹脂ビーズ３．３ｍｇを合成カラムに詰め、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３４００ ＤＮＡ合成機（アプライドバイオシステムズ製）にセットして、ＤＭＴ−ｏｎの条件にて２０ｍｅｒ混合配列のＤＮＡオリゴヌクレオチドの合成を行った。合成後、乾燥させた多孔質樹脂ビーズをガラス瓶に移して２８％−アンモニア水１ｍＬを添加し、５５℃にて１５時間反応させてＤＮＡオリゴヌクレオチドの切り出しおよび塩基アミノ基の脱保護を行った。フィルター濾過により多孔質樹脂ビーズを分離した濾液のＵＶ吸光度測定（２６０ｎｍ）から核酸のＯＤ収量（核酸合成量に相等）を求めた。また、濾液をＨＰＬＣ測定（ウォーターズ製）して、Ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ％（目的の配列長をもつＤＮＡオリゴヌクレオチドの割合）を求めた。結果を表３に示す。
【００９０】
【表３】
【００９１】
表２、３から明らかなように、比較例に比べて本発明の多孔質樹脂ビーズを用いた場合、樹脂ビーズ当りのＤＮＡオリゴヌクレオチドの合成量（ＯＤ収量）が高く、さらに合成純度（Ｆｕｌｌ−Ｌｅｎｇｔｈ％）も高くなることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００９２】
本発明は、核酸合成の固相合成用担体として有用な多孔質樹脂ビーズを提供する。本発明の多孔質樹脂ビーズは核酸合成量および合成純度が高いので、この多孔質樹脂ビーズを使用することで、従来の多孔質樹脂ビーズを用いた場合よりも核酸合成を効率的に行うことが可能となる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多孔質樹脂ビーズに関する。より詳しくは、第一の芳香族モノビニル化合物−ジビニル化合物−（メタ）アクリロニトリル−第二の芳香族モノビニル化合物系共重合体からなる多孔質樹脂ビーズに関する。この多孔質樹脂ビーズは、特に核酸合成に有用である。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡオリゴヌクレオチドやＲＮＡといった核酸の化学合成に、ホスホロアミダイト法を用いた固相合成法が広く用いられている。この方法は、例えば、先ず合成する核酸の３’末端になるヌクレオシドを、スクシニル基などの開裂性リンカーを介して固相合成用担体にあらかじめ担持させ、この担体を反応カラムに入れ、核酸自動合成装置にセットする。以降は核酸自動合成装置の合成プログラムにしたがって、例えば以下のように反応カラム中に合成用試薬が流される。（１）トリクロロ酢酸／ジクロロメタン溶液またはジクロロ酢酸／トルエン溶液等による、ヌクレオシド５’−ＯＨ基の脱保護、（２）ヌクレオシドホスホロアミダイト（核酸モノマー）／アセトニトリル溶液、および、活性化剤（テトラゾール等）／アセトニトリル溶液による５’−ＯＨ基ヘのアミダイトのカップリング反応、（３）無水酢酸／ピリジン／メチルイミダゾール／ＴＨＦ等による未反応の５’−ＯＨ基のキャッピング、（４）ヨウ素／水／ピリジン等によるホスファイトの酸化。
この合成サイクルを繰り返し、目的の配列を持った核酸が合成される。最終的に合成された核酸は、アンモニアやメチルアミン等により開裂性リンカーを加水分解させることによって、固相合成用担体から切り出される（非特許文献１参照）。
【０００３】
核酸の合成に使用される固相合成用担体としては、これまでＣＰＧ（Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｐｏｒｅ Ｇｌａｓｓ）やシリカゲルのような無機粒子が用いられてきたが、近年、安価に、かつ大量に合成するために、固相合成用担体重量当りの核酸合成量を多くすることができる樹脂ビーズが用いられるようになってきた。このような樹脂ビーズとしては、例えば高架橋・非膨潤性の多孔質ポリスチレンビーズ（特許文献１参照）、低架橋・膨潤性の多孔質ポリスチレンビーズ（特許文献２参照）等が挙げられる。
【０００４】
しかしながら、固相合成用担体重量当りの核酸合成量をさらに増やすために、合成の起点となるヌクレオシドリンカーの担持量を多くし過ぎると、アミダイトのカップリング効率が悪くなり、得られる核酸の純度が著しく低下するという問題がある。例えば２０塩基配列のＤＮＡオリゴヌクレオチドを高純度で合成することができる、市販の固相合成用担体のヌクレオシドリンカー担持量の上限はこれまでのところ約２００μｍｏｌ／ｇ程度である。
【０００５】
アクリロニトリルを使用して種々の有機溶媒中における多孔質樹脂ビーズの膨潤率の変動を抑えることで、核酸の合成能を改善することが試みられている（特許文献３参照）。しかし、この文献における多孔質樹脂ビーズは、種々の有機溶媒中における多孔質樹脂ビーズの膨潤率の変動は小さいものの、核酸の合成能についてはさらなる改善が求められていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開平３−６８５９３号公報
【特許文献２】特開２００５−３２５２７２号公報
【特許文献３】特開２００８−７４９７９号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２０００），ＵＮＩＴ３．６ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｕｎｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、高合成量かつ高純度で核酸を合成するための多孔質樹脂ビーズを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、第一の芳香族モノビニル化合物−ジビニル化合物−（メタ）アクリロニトリル−第二の芳香族モノビニル化合物からなる多孔質樹脂ビーズのうち、
（１）第二の芳香族モノビニル化合物が、脱水縮合反応によりカルボキシル基と結合し得る基を含有し、かつ
（２）乾燥体積が２〜３ｍＬ／ｇである
ことを特徴とする多孔質樹脂ビーズを、固相合成用担体として核酸合成に用いた場合、驚くべきことに得られる核酸の合成量が増大し、かつその純度が向上することを初めて見いだした。
本発明者らはこれらの知見に基づいてさらに鋭意研究を行った結果、本発明を完成するに至った。
【００１０】
即ち本発明は、
［１］第一の芳香族モノビニル化合物−ジビニル化合物−（メタ）アクリロニトリル−第二の芳香族モノビニル化合物系共重合体からなる多孔質樹脂ビーズであって、第二の芳香族モノビニル化合物が、脱水縮合反応によりカルボキシル基と結合し得る基を含有し、かつ乾燥体積が２〜３ｍＬ／ｇであることを特徴とする、多孔質樹脂ビーズ；
［２］脱水縮合反応によりカルボキシル基と結合し得る基が、アミノ基、アミノアルキル基、ヒドロキシル基、およびヒドロキシアルキル基から選択される基である、［１］に記載の多孔質樹脂ビーズ；
［３］（メタ）アクリロニトリル構造単位の量が１〜４ｍｍｏｌ／ｇであることを特徴とする、［１］または［２］に記載の多孔質樹脂ビーズ；
［４］単量体合計量に対するジビニル化合物の仕込み量が、２〜１０ｍｏｌ％であることを特徴とする、［１］〜［３］のいずれか一に記載の多孔質樹脂ビーズ；
［５］ジビニル化合物がジビニルベンゼンである、［１］〜［４］のいずれか一に記載の多孔質樹脂ビーズ；および
［６］［１］〜［５］のいずれか一に記載の多孔質樹脂ビーズに対して開裂性のリンカーを介しヌクレオシドまたはヌクレオチドを順次結合させてオリゴヌクレオチドを得ることを特徴とする、核酸の製造方法；
などに関する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の多孔質樹脂ビーズは核酸の合成量および核酸の合成純度が高いので、この多孔質樹脂ビーズを使用することで、従来の多孔質樹脂ビーズを用いた場合よりも核酸合成を効率的に行うことが可能となる。
【００１２】
本発明の多孔質樹脂ビーズは、第一の芳香族モノビニル化合物−ジビニル化合物−（メタ）アクリロニトリル−第二の芳香族モノビニル化合物系共重合体からなる。
【００１３】
本発明の多孔質樹脂ビーズの構造単位（即ち、第一の芳香族モノビニル化合物−ジビニル化合物−（メタ）アクリロニトリル−第二の芳香族モノビニル化合物系共重合体における構造単位）の一つである「第一の芳香族モノビニル化合物」とは、スチレンまたはその置換体を意味する。スチレンの置換体としては、例えば、スチレンの１つ以上の水素原子が、炭素数１〜５のアルキル基（例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ｎ−アミル基、イソアミル基、ｓｅｃ−アミル基、ｔｅｒｔ−アミル基）、ハロゲン原子、カルボキシル基、スルホン酸基、シアノ基、炭素数１〜５のアルコキシ基（例えば、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、ブトキシ基、ペンチルオキシ基）、ニトロ基、アシル基（例えば、アセトキシ基、ベンゾキシ基）等で置換された化合物が挙げられる。
【００１４】
このような第一の芳香族モノビニル化合物としては、具体的には、例えばスチレン、ｏ−メチルスチレン、ｍ−メチルスチレン、ｐ−メチルスチレン、２，４−ジメチルスチレン、エチルスチレン、トリメチルスチレン、ｐ−ｔ−ブチルスチレン等の、ベンゼン環部分が置換されたスチレンである「核アルキル置換スチレン」；α−メチルスチレン、α−メチル−ｐ−メチルスチレン等のα−アルキル置換スチレン、クロロスチレン、ジクロロスチレン、フルオロスチレン、ペンタフルオロスチレン、ブロモスチレン等の、ベンゼン環部分がハロゲン化されたスチレンである「核ハロゲン化スチレン」；クロロメチルスチレン、フルオロメチルスチレン等のハロゲン化アルキルスチレン、ヒドロキシスチレン、ヒドロキシメチルスチレン、安息香酸ビニル、スチレンスルホン酸ナトリウム、シアノスチレン、メトキシスチレン、エトキシスチレン、ブトキシスチレン、ニトロスチレン、および、アセトキシスチレン、ベンゾキシスチレン等の「アシルオキシスチレン」等を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。本発明の第一の芳香族モノビニル化合物として好ましいものは、スチレンである。
【００１５】
本発明の多孔質樹脂ビーズの構造単位の一つである「ジビニル化合物」とは、芳香族ジビニル化合物、ジ（メタ）アクリル酸エステルまたはそれらの置換体を意味する。芳香族ジビニル化合物の置換体、ジ（メタ）アクリル酸エステルの置換体としては、例えば、芳香族ジビニル化合物やジ（メタ）アクリル酸エステルの１つ以上の水素原子が、炭素数１〜５のアルキル基、ハロゲン原子、カルボキシル基、スルホン酸基、シアノ基、炭素数１〜５のアルコキシ基、ニトロ基等で置換された化合物が挙げられる。
【００１６】
このようなジビニル化合物としては、具体的には、例えばジビニルベンゼン、メチルジビニルベンゼン、ジビニルトルエン、ジビニルナフタレン等の芳香族ジビニル化合物、エチレングリコールジ（メタ）アクリレート、ジエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、トリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、テトラエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、それ以上の多価のエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、プロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、ジプロピレンエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、それ以上の多価のプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、１，２−ブタンジオールジ（メタ）アクリレート、１，３−ブタンジオールジ（メタ）アクリレート、１，４−ブタンジオールジ（メタ）アクリレート、１，５−ペンタンジオールジ（メタ）アクリレート、１，６−ヘキサンジオールジ（メタ）アクリレート、１，９−ノナンジオールジ（メタ）アクリレート、１，１０−デカンジオールジ（メタ）アクリレート、２−メチル−１，８−オクタンジオール（メタ）アクリレート、１，４−シクロヘキサンジオールジメタクリレート等のジ（メタ）アクリレート系化合物等が挙げられる。本発明のジビニル化合物として好ましいものは、ジビニルベンゼンである。ジビニルベンゼンは、ｏ−、ｍ−又はｐ−ジビニルベンゼンやこれらの混合物が構造単位として用いられる。なかでも特に好ましいものは、ｍ−またはｐ−ジビニルベンゼンである。ジビニル化合物は、本発明の多孔質樹脂ビーズにおける架橋剤として機能する。架橋剤の量が少ないほうが、多孔質樹脂ビーズが膨潤しやすくなる傾向にあるため、ジビニル化合物の量は、膨潤率の増大化に貢献し得る。
【００１７】
本発明の多孔質樹脂ビーズの構造単位の一つである「（メタ）アクリロニトリル」とは、「アクリロニトリル」もしくは「メタクリロニトリル」、または「アクリロニトリルとメタクリロニトリルの両方」を意味する。すなわち本発明の多孔質樹脂ビーズに含まれる（メタ）アクリロニトリルの構造単位は、アクリロニトリルの構造単位またはメタクリロニトリルの構造単位がそれぞれ単独で含まれていても良いし、両方の単位が含まれていても良い。
【００１８】
本発明の多孔質樹脂ビーズの構造単位の一つである「第二の芳香族モノビニル化合物」とは、「脱水縮合反応によりカルボキシル基と結合し得る官能基」を含有することを特徴とする、スチレンまたはその置換体を意味する。従って目的の核酸を合成する場合、ヌクレオシドを多孔質樹脂ビーズと連結させるが、その際リンカーにカルボキシル基があるとリンカーのカルボキシル基と多孔質樹脂ビーズとを容易に結合させることができるので、核酸合成が効率的に行い得る点で有利である。このような「脱水縮合反応によりカルボキシル基と結合し得る官能基」としては、アミノ基、アミノアルキル基、ヒドロキシル基、ヒドロキシアルキル基などが挙げられる。より好ましくは、一級アミノ基、アミノメチル基、ヒドロキシル基、ヒドロキシメチル基などが挙げられる。「脱水縮合反応によりカルボキシル基と結合しうる官能基」はビニル基に対してパラ位に配置することが好ましいが、オルト位またはメタ位であってもよい。
【００１９】
このような第二の芳香族モノビニル化合物としては、具体的には、アミノスチレン等のアミノスチレン系単量体またはその置換体、アミノメチルスチレン等のアミノアルキルスチレン系単量体またはその置換体、ヒドロキシスチレン等のヒドロキシスチレン系単量体またはその置換体、ヒドロキシメチルスチレン等のヒドロキシアルキルスチレン系単量体またはその置換体等が挙げられ、好ましくはｐ−アミノスチレン、ｐ−アミノメチルスチレン、ｐ−ヒドロキシスチレン、ｐ−ヒドロキシメチルスチレンである。
ヒドロキシスチレン系単量体またはアミノスチレン系単量体の「置換体」としては、「脱水縮合反応によりカルボキシル基と結合しうる官能基」以外の１つ以上の水素原子が、炭素数１〜５のアルキル基、ハロゲン原子、カルボキシル基、スルホン酸基、シアノ基、メトキシ基、ニトロ基等で置換された化合物が挙げられる。
【００２０】
本発明の多孔質樹脂ビーズは、製造当初から前記「脱水縮合反応によりカルボキシル基と結合し得る官能基」を含有してなる第二の芳香族モノビニル化合物を直接用いて製造してもよい（製造方法は後述）が、一旦懸濁共重合等によって多孔質樹脂ビーズを合成した後、「脱水縮合反応によりカルボキシル基と結合し得る官能基」を導入することで製造してもよい。特に、「脱水縮合反応によりカルボキシル基と結合し得る官能基」としてヒドロキシ基を有する第二の芳香族モノビニル化合物（ヒドロキシスチレン）を本発明の多孔質樹脂ビーズの構造単位として導入する場合、ヒドロキシスチレン自体は非常に重合しやすい不安定な単量体であるため取扱いや保存が容易でないので、本製造方法で製造することが好ましい。
【００２１】
このような製造過程において、本発明の「第二の芳香族モノビニル化合物」の基となる芳香族モノビニル化合物としては、例えば、アセトアミノスチレンなどのアシルアミノスチレン、アセトキシスチレン、エタノイルオキシスチレン、ベンゾイルオキシスチレンなどのアシルオキシスチレン、クロロメチルスチレンなどのハロアルキルスチレンが挙げられる。
【００２２】
懸濁共重合等によって合成した多孔質樹脂ビーズ中のアシルオキシスチレン、アシルアミノスチレンの構造単位は、アルカリまたは酸による加水分解によって、本発明の多孔質樹脂ビーズの構造単位である「第二の芳香族モノビニル化合物」、具体的にはヒドロキシスチレン、アミノスチレンなどの構造単位に変換することができる。また、ハロアルキルスチレンの構造単位は、フタルイミドおよびヒドラジン、アンモニアまたは水酸化ナトリウムなどとの反応によって、本発明の多孔質樹脂ビーズの構造単位である「第二の芳香族モノビニル化合物」、具体的にはアミノアルキルスチレン、ヒドロキシアルキルスチレンなどの構造単位に変換することができる。変換して「脱水縮合反応によりカルボキシル基と結合しうる官能基」となるアシルオキシ基、アシルアミノ基、ハロアルキル基などは、ビニル基に対してパラ位に配置することが好ましいが、オルト位またはメタ位であってもよい。
【００２３】
あるいは、懸濁共重合等によって合成した、第一の芳香族モノビニル化合物−ジビニル化合物−（メタ）アクリロニトリル化合物系共重合体からなる多孔質樹脂ビーズを後処理して、第一の芳香族モノビニル化合物の構造単位の芳香族環に対してハロアルキル基を導入した後、これらをアミノアルキルスチレンまたはヒドロキシアルキルスチレンの構造単位に変換してもよい。例えば、第一の芳香族モノビニル化合物−ジビニル化合物−（メタ）アクリロニトリル化合物系共重合体からなる多孔質樹脂ビーズの分散液中に、クロロメチルメチルエーテルおよび塩化亜鉛を加えて反応させることによりクロロメチル基を導入する。次にアンモニアと反応させてアミノメチル基を導入することで「第二の芳香族モノビニル化合物」構成単位を導入する。このような製造過程を経ても、本発明の多孔質樹脂ビーズを得ることができる。ハロアルキル基は、ビニル基に対してパラ位に配置することが好ましいが、オルト位またはメタ位であってもよい。
【００２４】
本発明の多孔質樹脂ビーズの構造単位の合計重量に対する第一のモノビニル化合物の構造単位の量は、特に限定されないが、多孔質樹脂ビーズ重量当りに占める量として、好ましくは３．０〜８．３ｍｍｏｌ／ｇであり、好ましくは４．５〜８．０ｍｍｏｌ／ｇであり、さらに好ましくは５．０〜７．５ｍｍｏｌ／ｇである。
第一のモノビニル化合物の構造単位の量がこれよりも少ない場合は、多孔質樹脂ビーズの耐溶剤性、熱安定性、および、多孔度が十分でなく、核酸の固相合成に用いたときに所望の効果を期待し難い。またその量がこれよりも多い場合は、有機溶剤中での膨潤度が低くなるために核酸の固相合成に用いたときに得られる核酸の合成量が少なくなり、さらに核酸の純度も低下してしまう。
【００２５】
本発明の多孔質樹脂ビーズの構造単位の合計重量に対するジビニル化合物構造単位の量は、特に限定されないが多孔質樹脂ビーズ重量当りに占める量として好ましくは０．２〜１．０ｍｍｏｌ／ｇであり、好ましくは０．２５〜０．８ｍｍｏｌ／ｇであり、さらに好ましくは０．３〜０．７ｍｍｏｌ／ｇである。
ジビニル化合物構造単位の量がこれよりも少ない場合は、多孔質樹脂ビーズの耐溶剤性、熱安定性、および、多孔度が十分でなく、核酸の固相合成に用いたときに所望の効果を期待し難い。またその量がこれよりも多い場合は、有機溶剤中での膨潤度が低くなるために、核酸の固相合成に用いたときに得られる核酸の合成量が少なくなり、さらに核酸の純度も低下してしまう。
【００２６】
本発明の多孔質樹脂ビーズは、アセトニトリル中で大きく膨潤するが、その乾燥体積が２〜４ｍＬ／ｇであることを特徴とする。この乾燥体積は一般的な多孔質樹脂ビーズと比較して小さいものである。しかしながら本発明の多孔質樹脂ビーズはアセトニトリル中での膨潤率が大きいので、アセトニトリルを用いる核酸合成の反応場を大きくすることができる。そしてこのことによって、核酸合成の反応性を改善することができる。したがって本発明によれば、これまでの核酸合成用多孔質樹脂ビーズと比較して、合成量と合成純度との両方が高い核酸合成を可能にする、固相合成用担体に用いる多孔質樹脂ビーズを得ることができる。
【００２７】
そこで、本発明の多孔質樹脂ビーズの乾燥体積を２〜３ｍＬ／ｇとするためには、多孔質樹脂ビーズの構造単位の合計量に対する（メタ）アクリロニトリル構造単位の量を考慮する必要がある。
本発明の多孔質樹脂ビーズ体の構造単位の合計量に対する（メタ）アクリロニトリル構造単位の量は１〜４ｍｍｏｌ／ｇであり、好ましくは１．５〜３．５ｍｍｏｌ／ｇ、さらに好ましくは１．８〜３．０ｍｍｏｌ／ｇである。
（メタ）アクリロニトリル構造単位の量がこれよりも少ない場合は望ましい乾燥重量をの多孔質樹脂ビーズが得られず、核酸の固相合成に用いたときに所望の効果を期待し難い。またその量がこれよりも多い場合は多孔質樹脂ビーズそのものが形成し難い。本発明の多孔質樹脂ビーズ中における（メタ）アクリロニトリル構造単位の量は、全窒素分析により測定される。具体的には、試料を白金パンに入れ、ミクロ天秤で秤量した後、微量全窒素分析装置ＴＮ−１１０（三菱化学）により窒素量を測定し、（メタ）アクリロニトリル構造単位の分子量から計算して求める。
【００２８】
本発明の多孔質樹脂ビーズの構造単位の合計重量に対する第二の芳香族モノビニル化合物の構造単位の量は特に限定されないが、好ましくは０．０５〜１．５ｍｍｏｌ／ｇであり、より好ましくは０．１〜１．０ｍｍｏｌ／ｇであり、さらに好ましくは０．２〜０．８ｍｍｏｌ／ｇである。
第二の芳香族モノビニル化合物の構造単位の量がこれよりも少ない場合は効果が得られないからであり、その量がこれよりも多い場合は多孔質樹脂ビーズそのものを形成し難いからである。
【００２９】
本発明の多孔質樹脂ビーズにおける、第二のモノビニル化合物の構造単位が有する「脱水縮合反応によりカルボキシル基と結合しうる官能基」の量としては、例えばアミノ基、アミノアルキル基、ヒドロキシル基またはヒドロキシアルキル基の場合、多孔質樹脂ビーズ重量当りに占める量として好ましくは０．０５〜１．５ｍｍｏｌ／ｇであり、より好ましくは０．１〜１．０ｍｍｏｌ／ｇであり、さらに好ましくは０．２〜０．８ｍｍｏｌ／ｇである。
「脱水縮合反応によりカルボキシル基と結合しうる官能基」の量がこれよりも少ない場合は、核酸の固相合成用担体として用いた場合、核酸の合成量が少なくなる傾向にある。またその量がこれよりも多い場合は、核酸の固相合成用担体として用いた場合、核酸の純度が低下する傾向にある。
【００３０】
本発明の多孔質樹脂ビーズにおける、第二のモノビニル化合物の構造単位が有する「脱水縮合反応によりカルボキシル基と結合しうる官能基」については、例えばアミノ基、アミノアルキル基、ヒドロキシル基またはヒドロキシアルキル基の場合はＪＩＳ Ｋ００７０に基づく滴定により測定される。具体的には、測定対象の固相合成用担体のヒドロキシル基を既知量のアセチル化試薬（無水酢酸／ピリジン）によってアセチル化し、アセチル化に消費されなかった無水酢酸量を水酸化カリウムによって滴定して求めることによって、官能基量を算出することができる。
【００３１】
本発明の多孔質樹脂ビーズの製造方法は特に限定されず、例えば、
（１）第一の芳香族モノビニル化合物、ジビニル化合物、（メタ）アクリロニトリルおよび脱水縮合反応によりカルボキシル基と結合し得る官能基を含有する第二の芳香族モノビニル化合物を、有機溶媒および水を用いて懸濁共重合させて、多孔質樹脂ビーズを製造する方法
が挙げられる。あるいは、
（２）懸濁共重合等によって多孔質樹脂ビーズを合成した後、第二の芳香族モノビニル化合物の構造単位に、脱水縮合反応によりカルボキシル基と結合し得る官能基を導入して、多孔質樹脂ビーズを製造する方法
などが挙げられる。
【００３２】
懸濁共重合の際の、第一の芳香族モノビニル化合物、ジビニル化合物、（メタ）アクリロニトリル、第二の芳香族モノビニル化合物の合計量に対する第一の芳香族モノビニル化合物の仕込み量は、３１〜８５ｍｏｌ％であり、好ましくは４５〜８２ｍｏｌ％、さらに好ましくは５３〜７６ｍｏｌ％である。
【００３３】
懸濁共重合の際の、第一の芳香族モノビニル化合物、ジビニル化合物、（メタ）アクリロニトリル、第二の芳香族モノビニル化合物の合計量に対するジビニル化合物の仕込み量は、２〜１０ｍｏｌ％であり、好ましくは２．５〜８ｍｏｌ％、さらに好ましくは３〜７ｍｏｌ％である。
【００３４】
懸濁共重合の際の、第一の芳香族モノビニル化合物、ジビニル化合物、（メタ）アクリロニトリル、第二の芳香族モノビニル化合物の合計量に対する（メタ）アクリロニトリルの仕込み量は、１０〜４０ｍｏｌ％であり、好ましくは１３〜３５ｍｏｌ％、さらに好ましくは１８〜３０ｍｏｌ％である。
【００３５】
懸濁共重合の際の、第一の芳香族モノビニル化合物、ジビニル化合物、（メタ）アクリロニトリル、第二の芳香族モノビニル化合物の合計量に対する第二の芳香族モノビニル化合物の仕込み量は、０．５〜１５ｍｏｌ％であり、好ましくは１〜１０ｍｏｌ％、さらに好ましくは２〜８ｍｏｌ％である。この量は、一旦懸濁共重合等によって多孔質樹脂ビーズを合成した後、「脱水縮合反応によりカルボキシル基と結合し得る官能基」を導入して製造する場合の、第二の芳香族モノビニル化合物の基となる芳香族モノビニル化合物であっても同様である。
【００３６】
懸濁共重合は、上述の各化合物（以下、懸濁共重合される本発明の多孔質樹脂ビーズの構成成分（第一の芳香族モノビニル化合物、ジビニル化合物、（メタ）アクリロニトリル、第二の芳香族モノビニル化合物）のそれぞれを、「単量体」と記載する場合がある）と有機溶媒との混合物を水中で撹拌乳化することにより行われる。
【００３７】
本発明における有機溶媒とは、懸濁共重合系における水以外の溶媒を意味し、炭化水素およびアルコールが好ましく用いられる。炭化水素として具体的には、脂肪族の飽和または不飽和炭化水素、あるいは芳香族炭化水素を用いることができ、好ましくは炭素数５〜１２の脂肪族炭化水素であり、より好ましくは、ｎ−ヘキサン、ｎ−ヘプタン、ｎ−オクタン、イソオクタン、ウンデカン、ドデカン等が挙げられる。またこの際得られるビーズの多孔質度を増すために、アルコールを共存させることが望ましい（以下、多孔質度を増す目的で用いられるアルコールを、「多孔質化剤」と記載する）。本発明におけるアルコールとしては、例えば脂肪族アルコールを挙げることができ、その炭素数は、好ましくは５〜９である。このようなアルコールとして具体的には、２−エチルヘキサノール、アミルアルコール（例、ｔ−アミルアルコールなど）、ノニルアルコール、２−オクタノール、シクロヘキサノール等が挙げられる。
【００３８】
懸濁共重合に用いられる炭化水素とアルコールの重量比は、炭化水素およびアルコールの具体的な組合せによって適宜変更され、それにより得られる固相合成用担体の比表面積を大きくすることができる。炭化水素とアルコールの好ましい配合割合は、重量比で１：９〜６：４である。
【００３９】
懸濁共重合の際の有機溶媒の重量は、上記各単量体の総重量に対して好ましくは０．５〜２．５倍であり、より好ましくは０．８〜２．２であり、さらに好ましくは１．０〜２．０倍である。この値が大小いずれの場合でも、得られる多孔質樹脂ビーズの比表面積が小さくなり、化学反応による合成反応物の量が少なくなる。
【００４０】
本発明において、懸濁共重合する際の方法自体は従来公知の方法を援用してもよい。
【００４１】
懸濁共重合する際の分散安定剤としては特に限定されず、従来公知のポリビニルアルコール、ポリアクリル酸、ゼラチン、デンプン、カルボキシルメチルセルロース等の親水性保護コロイド剤、炭酸カルシウム、炭酸マグネシウム、りん酸カルシウム、硫酸バリウム、硫酸カルシウム、ベントナイト等の難溶性粉末等が用いられる。分散安定剤の添加量は特に限定されないが、好ましくは懸濁重合系の水の重量に対して０．０１〜１０重量％である。この値が少ない場合は、懸濁重合の分散安定性が損なわれて多量の凝集物が生成する。この値が多い場合は、微小ビーズが多数生成する。
【００４２】
懸濁共重合する際の重合開始剤としては特に限定されず、従来公知のジベンゾイルパーオキサイド、ジラウロイルパーオキサイド、ジステアロイルパーオキサイド、１，１−ジ（ｔ−ブチルペルオキシ）−２−メチルシクロヘキサン、１，１−ジ（ｔ−ヘキシルペルオキシ）−３，３，５−トリメチルシクロヘキサン、１，１−ジ（ｔ−ヘキシルペルオキシ）シクロヘキサン、１，１−ジ（ｔ−ブチルペルオキシ）シクロヘキサン、ジ−ｔ−ヘキシルパーオキサイド、ｔ−ブチルクミルパーオキサイド、ジ−ｔ−ブチルパーオキサイド、１，１，３，３−テトラメチルブチルペルオキシ−２−エチルヘキサノエート、ｔ−ヘキシルペルオキシ−２−エチルヘキサノエート、ｔ−ブチルペルオキシ−２−−エチルヘキサノエート、ｔ−ブチルペルオキシイソプロピルモノカルボネート等の過酸化物、２，２’−アゾビスイソブチロニトリル、２，２’−アゾビス−２−メチルブチロニトリル、２，２’−アゾビス−２，４−ジメチルバレロニトリル等のアゾ化合物が用いられる。重合開始剤の添加量は特に限定されず、当業者であれば適切な量を選択することが可能である。
【００４３】
懸濁共重合の際の反応条件は、適宜に設定することができ、例えば６０〜９０℃における３０分間〜４８時間の撹拌が挙げられる。撹拌速度は、例えば１００ｒｐｍ〜１０００ｒｐｍ、好ましくは２００ｒｐｍ〜５００ｒｐｍである。懸濁共重合により、第一の芳香族モノビニル化合物−ジビニル化合物−（メタ）アクリロニトリル−第二の芳香族モノビニル化合物共重合体を得ることができる。
【００４４】
得られた共重合体は適宜、洗浄、乾燥、分級等の処理を施してもよい。さらに、懸濁共重合等によって多孔質樹脂ビーズを合成した後、第二の芳香族モノビニル化合物の構造単位に、脱水縮合反応によりカルボキシル基と結合し得る官能基を導入してもよい。導入方法は、前記のとおりである。
【００４５】
以上のような処理を経て、本発明の多孔質樹脂ビーズを得ることができる。この多孔質樹脂ビーズは、固相合成用担体として利用することができる。
【００４６】
本発明の「多孔質樹脂ビーズ」は、必ずしも厳密な球状を呈する必要は無く、少なくとも粒状であれば良い。しかしながら、固相合成の反応カラムヘの充填効率を高くでき、また破損し難いという点から、本発明の多孔質樹脂ビーズ（固相合成用担体）は、好ましくは球状である。
【００４７】
本発明の多孔質樹脂ビーズのレーザー回折散乱法により測定したメジアン粒子径は、特に限定されないが、好ましくは１〜１０００μｍ、より好ましくは１０〜５００μｍ、さらに好ましくは２０〜３００μｍである。本発明の多孔質樹脂ビーズのメジアン粒子径は、レーザー回折散乱法により測定される。具体的には、５０ｖ／ｖ％エタノール水溶液を分散媒に用いて、レーザー回折散乱式粒度分布測定装置ＬＡ−９５０（堀場製作所製）により測定し、平均粒径を求める。
【００４８】
メジアン粒子径は、懸濁重合時の重合開始前の撹拌条件、多孔質化剤の種類や量、懸濁重合する際の分散安定剤の濃度に依存する。従ってこれらを調整することで、メジアン粒子径を望ましい範囲に調整することが可能である。多孔質化剤としては、前述のアルコールが挙げられる。また膨潤状態におけるメジアン粒子径を大きくすることは、多孔質樹脂ビーズの膨潤率を増大化することに貢献する。
【００４９】
本発明の多孔質樹脂ビーズの水銀圧入法により測定したメジアン細孔径は、特に限定されないが、好ましくは１〜１０００ｎｍ、より好ましくは５〜５００ｎｍ、さらに好ましくは１０〜３００ｎｍである。
本発明の多孔質樹脂ビーズのメジアン細孔径は、水銀圧入法により測定される。具体的には、０．２ｇの多孔質樹脂ビーズを水銀ポロシメーターＰｏｒｅＭａｓｔｅｒ６０−ＧＴ（ＱｕａｎｔａＣｈｒｏｍｅ社製）に投入し、水銀接触角１４０°、水銀表面張力４８０ｄｙｎ／ｃｍの条件における水銀圧入法により測定する。
【００５０】
本発明の多孔質樹脂ビーズの乾燥体積は、好ましくは２〜３ｍＬ／ｇ、より好ましくは２．２〜３ｍＬ／ｇ、さらに好ましくは２．２〜２．８ｍＬ／ｇである。本発明の多孔質樹脂ビーズは、この範囲の乾燥体積を有することを特徴としており、これまでの核酸合成用多孔質樹脂ビーズよりも合成量と合成純度との両方が高い核酸合成を可能にするものである。
乾燥体積が上記乾燥体積の下限よりも小さい場合は核酸の合成量と合成純度が低下する。一方、乾燥体積が上記乾燥体積の上限よりも大きい場合は、樹脂分が少ないので核酸の合成起点の数が少なくなり、結果的に反応容器あたりの核酸の合成量が低下する。通常、乾燥体積が小さい場合、核酸合成の場が小さくなり、核酸合成にとって不利になることが考えられる。しかしながら本発明の多孔質樹脂ビーズは意外なことに通常の固相合成用樹脂ビーズに比べて小さい体積であるにも関らず、通常の固相合成用樹脂ビーズよりも核酸の合成量や合成純度を高くすることができる。
【００５１】
本発明の多孔質樹脂ビーズの乾燥体積は、メスシリンダーにより測定される。具体的には、１．００ｇの多孔質樹脂ビーズを１０ｍＬ−メスシリンダーに容れ、メスシリンダーに軽く振動を加えて十分に多孔質樹脂ビーズを充填させた後、その見掛けの体積を測定する。
【００５２】
乾燥体積は、懸濁重合時の（メタ）アクリロニトリル単量体の量に依存する。（メタ）アクリロニトリルの配合量が１０〜４０ｍｏｌ％の時、得られる多孔質樹脂ビーズの乾燥体積は、（メタ）アクリロニトリルを配合しなかった場合に比べて小さくなる傾向にある。
【００５３】
また、乾燥体積は、懸濁共重合の際に単量体と混合する有機溶媒の量と種類に影響される。有機溶媒の量が少ないほど乾燥体積は小さくなる傾向にある。ただし、有機溶媒の量が少な過ぎると細孔径が小さくなり過ぎ、核酸合成能が低下するので、有機溶媒の量は単量体の総重量に対して好ましくは０．５〜２．５倍である。
【００５４】
本発明の多孔質樹脂ビーズは、各種の化学合成反応の担体として用いることができるが、特に、核酸合成において効果的に使用することができる。
【００５５】
本発明の多孔質樹脂ビーズを用いる核酸合成には、従来から知られている方法を適用することができる。例えば、本発明の多孔質樹脂ビーズ上の、脱水縮合反応によりカルボキシル基と結合し得る官能基に下記のヌクレオシドスクシニルリンカー；
【００５６】
【化１】
【００５７】
を結合する。次にこのヌクレオシドの５’末端から所定の塩基配列となるように、ヌクレオシドホスホロアミダイトを一段ずつ結合する。この合成反応は自動合成装置を用いて行うことができる。例えば、ヌクレオシドスクシニルリンカーを結合した多孔質樹脂ビーズを充填した装置の反応カラムに、５’−ＯＨ脱保護剤溶液、ヌクレオシドホスホロアミダイト溶液、アミダイト活性化剤溶液、酸化剤溶液、キャッピング剤溶液、洗浄溶液としてのアセトニトリルなどが順次送られ、反応が繰り返される。最終的には、スクシニルリンカー部分をアルカリ溶液で加水分解するなどして切断し、目的の核酸を得ることができる。リンカーは、従来公知のものが使用され、例えば、下記の構造をもつヌクレオシドリンカーを結合した多孔質樹脂ビーズなどが挙げられる。
【００５８】
【化２】
【００５９】
以下に実施例を挙げて、本発明をさらに具体的に説明する。
【実施例】
【００６０】
実施例１
冷却機、撹拌機および窒素導入管を付けた、５００ｍＬセパラブルフラスコを恒温水槽に設置し、ポリビニルアルコール（クラレ製）２．５ｇおよび蒸留水２５０ｇを入れ、３００ｒｐｍで撹拌してポリビニルアルコールを溶解した。ここにスチレン（和光純薬製）３５ｇ、ｐ−アセトキシスチレン（アルドリッチ製）４．５ｇ（４．８ｍｏｌ％）、ジビニルベンゼン（含有量５５％、和光純薬製）５．５ｇ（４．０ｍｏｌ％）、メタクリロニトリル（和光純薬製）１１．５ｇ（２９．７ｍｏｌ％）、２−エチルヘキサノール（和光純薬製）６０ｇ、イソオクタン（和光純薬製）３０ｇおよびベンゾイルパーオキサイド（２５％含水、日本油脂製）１ｇを混合して溶解した溶液を添加して、窒素気流下、室温にて撹拌（３００ｒｐｍ）した後、８０℃に昇温して２４時間、懸濁共重合を行った。
【００６１】
重合生成物を、蒸留水およびアセトン（和光純薬製）を用いて濾過洗浄して、全量約１Ｌになるようにアセトン中に分散させた。この分散液を、液を傾けても沈澱が乱れない程度になるまで放置した後、上清のアセトンを廃棄した。この沈澱に再びアセトンを加えて全量を約１Ｌにして、静置、アセトン廃棄の操作を繰り返すことにより分級した。この分散液を濾過し、減圧乾燥することにより、スチレン−ジビニルベンゼン−メタクリロニトリル−ｐ−アセトキシスチレン共重合体からなる多孔質樹脂ビーズを得た。
【００６２】
次いで冷却機、撹拌機および窒素導入管を付けた５００ｍＬフラスコに、上記の共重合体からなる多孔質樹脂ビーズの粉末２０ｇ、エタノール８０ｇ、蒸留水５０ｇおよび水酸化ナトリウム２ｇを仕込み、撹拌しながら７５℃で１８時間反応させた。この分散液を濾過し、減圧乾燥することにより、スチレン−ジビニルベンゼン−メタクリロニトリル−４−ヒドロキシスチレン共重合体からなる多孔質樹脂ビーズを得た。
【００６３】
実施例２
実施例１において、単量体として、スチレン３４ｇ、ｐ−アセトキシスチレン（アルドリッチ製）６ｇ（５．７ｍｏｌ％）、ジビニルベンゼン（含有量５５％、和光純薬製）８．５ｇ（５．５ｍｏｌ％）、アクリロニトリル１２ｇ（３４．６ｍｏｌ％）を用いた以外は実施例１と同様にして、スチレン−ジビニルベンゼン−アクリロニトリル−４−ヒドロキシスチレン共重合体からなる多孔質樹脂ビーズを得た。
【００６４】
実施例３
実施例１において、ポリビニルアルコール２．６ｇ、蒸留水２６０ｇ、スチレン２９ｇ、ｐ−アセトキシスチレン５ｇ（５．９ｍｏｌ％）、ジビニルベンゼン７．５ｇ（６．１ｍｏｌ％）、メタクリロニトリル１０．５ｇ（２９．９ｍｏｌ％）、２−エチルヘキサノール５８ｇ、イソオクタン２５ｇ、撹拌速度３５０ｒｐｍにした以外は実施例１と同様にして、スチレン−ジビニルベンゼン−メタクリロニトリル−４−ヒドロキシスチレン共重合体からなる多孔質樹脂ビーズを得た。
【００６５】
比較例１
実施例１において、単量体として、スチレン４９ｇ、ｐ−アセトキシスチレン４ｇ（４．５ｍｏｌ％）、ジビニルベンゼン７ｇ（５．４ｍｏｌ％）、（メタクリロニトリル０ｇ）を用いるとともに、２−エチルヘキサノールを５２ｇに、イソオクタンを２３ｇにした以外は実施例１と同様にして、スチレン−ジビニルベンゼン−４−ヒドロキシスチレン共重合体からなる多孔質樹脂ビーズを得た。
【００６６】
比較例２
実施例１において、ポリビニルアルコールを２．６ｇに、蒸留水を２６０ｇに、スチレンを３３ｇに、ｐ−アセトキシスチレンを４ｇ（５．３ｍｏｌ％）に、ジビニルベンゼンを７ｇ（６．３ｍｏｌ％）に、メタクリロニトリルを５ｇ（１５．９ｍｏｌ％）に、２−エチルヘキサノールを６１ｇに、イソオクタンを２６ｇに、撹拌速度を４００ｒｐｍにした以外は実施例１と同様にして、スチレン−ジビニルベンゼン−メタクリロニトリル−４−ヒドロキシスチレン共重合体からなる多孔質樹脂ビーズを得た。
【００６７】
比較例３
実施例１において、ポリビニルアルコールを２．６ｇに、蒸留水を２６０ｇに、スチレンを４２ｇに、ｐ−アセトキシスチレンを７ｇ（６．３ｍｏｌ％）に、ジビニルベンゼンを５．５ｇ（３．４ｍｏｌ％）に、メタクリロニトリルを１３．５ｇ（２９．２ｍｏｌ％）に、イソオクタンを２０ｇに、ベンゾイルパーオキサイドを１．５ｇにし、２−エチルヘキサノール６０ｇの代わりに１−デカノール４８ｇを用い、かつ撹拌速度を４５０ｒｐｍにした以外は実施例１と同様にして、スチレン−ジビニルベンゼン−メタクリロニトリル−４−ヒドロキシスチレン共重合体からなる多孔質樹脂ビーズを得た。
【００６８】
実験例１：多孔質樹脂ビーズの物性測定
実施例１〜３および比較例１〜３で得られた多孔質樹脂ビーズについて以下の物性測定を行った。
【００６９】
（メジアン粒子径）
測定試料を５０ｖ／ｖ％エタノール液中で超音波分散した。この分散液を、５０ｖ／ｖ％エタノール液を分散媒に用いたレーザー回折／散乱式粒度分布装置ＬＡ−９２０（堀場製作所製）により測定した。
【００７０】
（メジアン細孔径）
測定試料０．２ｇを水銀ポロシメーターＰｏｒｅＭａｓｔｅｒ６０−ＧＴ（ＱｕａｎｔａＣｈｒｏｍｅ社製）に投入し、水銀接触角１４０°、水銀表面張力４８０ｄｙｎ／ｃｍの条件における水銀圧入法により測定した。
【００７１】
（官能基量）
測定試料０．５〜２ｇをフラスコに量り取り、アセチル化試薬（無水酢酸２５ｇとピリジンを加えて全量１００ｍＬにしたもの）０．５ｍＬとピリジン４．５ｍＬとを正確に加えた。フラスコ中の混合物を９５〜１００℃にして２時間経過後、室温まで放冷してから蒸留水１ｍＬを加えた。１０分間加熱してアセチル化に消費されなかった無水酢酸を分解した。フラスコの全量をビーカーに移し、蒸留水で全量１５０ｍＬに希釈した後、０．５Ｎの水酸化カリウム水溶液で滴定した。これとは別に、測定試料を入れずに上記と同様の操作により、ブランク測定を行った。測定試料の官能基量（水酸基量）は、以下の式（１）により算出した。ただし、Ａ（ｍｍｏｌ／ｇ）は測定試料の水酸基量であり、Ｂ（ｍＬ）はブランク測定における水酸化カリウム水溶液の滴定量であり、Ｃ（ｍＬ）は測定試料の測定における水酸化カリウム水溶液の滴定量であり、ｆは水酸化カリウム水溶液のファクターであり、Ｍ（ｇ）は量り取った測定試料の重量である。
【００７２】
【数１】
【００７３】
（（メタ）アクリロニトリル構造単位の含有量）
測定試料２〜３ｍｇを白金パンに入れてミクロ天秤で秤量したものについて、全窒素分析装置ＴＮ−１１０（三菱化学製）にて測定した。得られたＮ濃度（重量％）から以下の式（２）により、（メタ）アクリロニトリル構造単位Ｄの含有量を算出した。
【００７４】
【数２】
【００７５】
（乾燥体積）
測定試料１．００ｇを１０ｍＬ−メスシリンダーに容れ、振動を加えて試料を十分に充填させた後、見掛けの体積を測定した。
【００７６】
これらの結果を、表１に示す。
【００７７】
【表１】
【００７８】
実験例２：ＤＮＡオリゴヌクレオチドの合成およびその評価
実施例１〜２および比較例１〜２で得られた多孔質樹脂ビーズを用いて、以下のようにして２０塩基長のＤＮＡオリゴヌクレオチドを合成し、その評価を行った。
【００７９】
実施例１および比較例２で得られた多孔質樹脂ビーズの場合は、多孔質樹脂ビーズ５ｇ、ＤＭＴ−ｄＴ−３’−ｓｕｃｃｉｎａｔｅ（Ｂｅｉｊｉｎｇ ＯＭ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ製）１．９５ｇ、ＨＢＴＵ（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ製）１．００ｇ、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（アルドリッチ製）０．９０ｍｌ、アセトニトリル（和光純薬製）５０ｍｌを混合し、撹拌しながら室温で１２時間反応させ、アセトニトリルを用いて濾過洗浄した後、乾燥させた。
【００８０】
実施例２で得られた多孔質樹脂ビーズの場合は、多孔質樹脂ビーズ５ｇ、ＤＭＴ−ｄＴ−３’−ｓｕｃｃｉｎａｔｅ １．３５ｇ、ＨＢＴＵ ０．７０ｇ、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン０．６５ｍｌ、アセトニトリル５０ｍｌを混合し、撹拌しながら室温で１２時間反応させ、アセトニトリルを用いて濾過洗浄した後、乾燥させた。
【００８１】
比較例１で得られた多孔質樹脂ビーズの場合は、多孔質樹脂ビーズ５ｇ、ＤＭＴ−ｄＴ−３’−ｓｕｃｃｉｎａｔｅ １．９５ｇ、ＨＢＴＵ １．００ｇ、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン０．９４ｍｌ、アセトニトリル５０ｍｌを混合し、撹拌しながら室温で１２時間反応させ、アセトニトリルを用いて濾過洗浄した後、乾燥させた。
【００８２】
これらの多孔質樹脂ビーズに、ＣａｐＡ（２０％無水酢酸／８０％アセトニトリル）１０ｍｌ、ＣａｐＢ（２０％Ｎ−メチルイミダゾール／３０％ピリジン／５０％アセトニトリル）１０ｍｌ、４−ジメチルアミノピリジン（アルドリッチ製）０．１ｇ、アセトニトリル２５ｍｌを混合し、撹拌しながら室温で１２時間反応させ、アセトニトリルを用いて濾過洗浄した後、減圧乾燥してＤＭＴ−ｄＴ−３’−ｓｕｃｃｉｎａｔｅを結合した固相合成用担体を得た。ＤＭＴ−ｄＴ−３’−ｓｕｃｃｉｎａｔｅの結合量は、ｐ−トルエンスルホン酸／アセトニトリル溶液を用いて脱保護したＤＭＴ基の吸光度測定（４１２ｎｍ）から求めた。
【００８３】
上記で得られたＤＭＴ−ｄＴ−３’−ｓｕｃｃｉｎａｔｅを結合した多孔質樹脂ビーズ０．８〜１．１ｇを合成カラム（容量６．３ｍＬ）に詰め、ＡＫＴＡ ｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ ｐｌｕｓ １００（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製）にセットして、ヌクレオシドホスホロアミダイト濃度２ｅｑ／合成スケール、ＤＭＴ−ｏｎの条件にて２０ｍｅｒ混合配列のＤＮＡオリゴヌクレオチドを合成した。合成後、乾燥させた多孔質樹脂ビーズを２８％−アンモニア水２５ｍＬに浸漬し、５５℃にて１８時間反応させてＤＮＡオリゴヌクレオチドの切り出しおよび塩基アミノ基の脱保護を行った。フィルター濾過により多孔質樹脂ビーズを分離した濾液のＵＶ吸光度測定（２６０ｎｍ）から核酸のＯＤ収量（核酸合成量に相等）を求めた。また、濾液をＨＰＬＣ測定（ウォーターズ製）して、Ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ％（目的の配列長をもつＤＮＡオリゴヌクレオチドの割合）を求めた。結果を表２に示す。
【００８４】
【表２】
【００８５】
実施例３および比較例３で得られた多孔質樹脂ビーズを用いて、以下のようにして２０塩基長のＤＮＡオリゴヌクレオチドの合成および分析を行った。
【００８６】
実施例３で得られた多孔質樹脂ビーズの場合は、多孔質樹脂ビーズ５ｇ、ＤＭＴ−ｄＴ−３’−ｓｕｃｃｉｎａｔｅ １．９５ｇ、ＨＢＴＵ（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ製）１．００ｇ、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（アルドリッチ製）０．９０ｍｌ、アセトニトリル（和光純薬製）５０ｍｌを混合し、撹拌しながら室温で１２時間反応させ、アセトニトリルを用いて濾過洗浄した後、乾燥させた。
【００８７】
比較例３で得られた多孔質樹脂ビーズの場合は、多孔質樹脂ビーズ５ｇ、ＤＭＴ−ｄＴ−３’−ｓｕｃｃｉｎａｔｅ １．４６ｇ、ＨＢＴＵ ０．７５ｇ、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン０．６８ｍｌ、アセトニトリル５０ｍｌを混合し、撹拌しながら室温で１２時間反応させ、アセトニトリルを用いて濾過洗浄した後、乾燥させた。
【００８８】
これらの多孔質樹脂ビーズに、ＣａｐＡ（２０％無水酢酸／８０％アセトニトリル）１０ｍｌ、ＣａｐＢ（２０％Ｎ−メチルイミダゾール／３０％ピリジン／５０％アセトニトリル）１０ｍｌ、４−ジメチルアミノピリジン（アルドリッチ製）０．１ｇ、アセトニトリル２５ｍｌを混合し、撹拌しながら室温で１２時間反応させ、アセトニトリルを用いて濾過洗浄した後、減圧乾燥させてＤＭＴ−ｄＴ−３’−ｓｕｃｃｉｎａｔｅを結合した固相合成用担体を得た。ＤＭＴ−ｄＴ−３’−ｓｕｃｃｉｎａｔｅの結合量は、ｐ−トルエンスルホン酸／アセトニトリル溶液を用いて脱保護したＤＭＴ基の吸光度測定（４１２ｎｍ）から求めた。
【００８９】
上記で得られたＤＭＴ−ｄＴ−３’−ｓｕｃｃｉｎａｔｅを結合した多孔質樹脂ビーズ３．３ｍｇを合成カラムに詰め、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３４００ ＤＮＡ合成機（アプライドバイオシステムズ製）にセットして、ＤＭＴ−ｏｎの条件にて２０ｍｅｒ混合配列のＤＮＡオリゴヌクレオチドの合成を行った。合成後、乾燥させた多孔質樹脂ビーズをガラス瓶に移して２８％−アンモニア水１ｍＬを添加し、５５℃にて１５時間反応させてＤＮＡオリゴヌクレオチドの切り出しおよび塩基アミノ基の脱保護を行った。フィルター濾過により多孔質樹脂ビーズを分離した濾液のＵＶ吸光度測定（２６０ｎｍ）から核酸のＯＤ収量（核酸合成量に相等）を求めた。また、濾液をＨＰＬＣ測定（ウォーターズ製）して、Ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ％（目的の配列長をもつＤＮＡオリゴヌクレオチドの割合）を求めた。結果を表３に示す。
【００９０】
【表３】
【００９１】
表２、３から明らかなように、比較例に比べて本発明の多孔質樹脂ビーズを用いた場合、樹脂ビーズ当りのＤＮＡオリゴヌクレオチドの合成量（ＯＤ収量）が高く、さらに合成純度（Ｆｕｌｌ−Ｌｅｎｇｔｈ％）も高くなることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００９２】
本発明は、核酸合成の固相合成用担体として有用な多孔質樹脂ビーズを提供する。本発明の多孔質樹脂ビーズは核酸合成量および合成純度が高いので、この多孔質樹脂ビーズを使用することで、従来の多孔質樹脂ビーズを用いた場合よりも核酸合成を効率的に行うことが可能となる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第一の芳香族モノビニル化合物−ジビニル化合物−（メタ）アクリロニトリル−第二の芳香族モノビニル化合物系共重合体からなる多孔質樹脂ビーズであって、第二の芳香族モノビニル化合物が、脱水縮合反応によりカルボキシル基と結合し得る基を含有し、かつ乾燥体積が２〜３ｍＬ／ｇであることを特徴とする、多孔質樹脂ビーズ。
【請求項２】
脱水縮合反応によりカルボキシル基と結合し得る基が、アミノ基、アミノアルキル基、ヒドロキシル基、およびヒドロキシアルキル基から選択される基である、請求項１に記載の多孔質樹脂ビーズ。
【請求項３】
（メタ）アクリロニトリル構造単位の量が１〜４ｍｍｏｌ／ｇであることを特徴とする、請求項１または２に記載の多孔質樹脂ビーズ。
【請求項４】
単量体合計量に対するジビニル化合物の仕込み量が、２〜１０ｍｏｌ％であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の多孔質樹脂ビーズ。
【請求項５】
ジビニル化合物がジビニルベンゼンである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の多孔質樹脂ビーズ。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の多孔質樹脂ビーズに対して開裂性のリンカーを介しヌクレオシドまたはヌクレオチドを順次結合させてオリゴヌクレオチドを得ることを特徴とする、核酸の製造方法。
【請求項１】
第一の芳香族モノビニル化合物−ジビニル化合物−（メタ）アクリロニトリル−第二の芳香族モノビニル化合物系共重合体からなる多孔質樹脂ビーズであって、第二の芳香族モノビニル化合物が、脱水縮合反応によりカルボキシル基と結合し得る基を含有し、かつ乾燥体積が２〜３ｍＬ／ｇであることを特徴とする、多孔質樹脂ビーズ。
【請求項２】
脱水縮合反応によりカルボキシル基と結合し得る基が、アミノ基、アミノアルキル基、ヒドロキシル基、およびヒドロキシアルキル基から選択される基である、請求項１に記載の多孔質樹脂ビーズ。
【請求項３】
（メタ）アクリロニトリル構造単位の量が１〜４ｍｍｏｌ／ｇであることを特徴とする、請求項１または２に記載の多孔質樹脂ビーズ。
【請求項４】
単量体合計量に対するジビニル化合物の仕込み量が、２〜１０ｍｏｌ％であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の多孔質樹脂ビーズ。
【請求項５】
ジビニル化合物がジビニルベンゼンである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の多孔質樹脂ビーズ。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の多孔質樹脂ビーズに対して開裂性のリンカーを介しヌクレオシドまたはヌクレオチドを順次結合させてオリゴヌクレオチドを得ることを特徴とする、核酸の製造方法。
【公開番号】特開２０１１−６３７２８（Ｐ２０１１−６３７２８Ａ）
【公開日】平成２３年３月３１日（２０１１．３．３１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−２１６２１４（Ｐ２００９−２１６２１４）
【出願日】平成２１年９月１７日（２００９．９．１７）
【出願人】（０００００３９６４）日東電工株式会社 (5,557)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年３月３１日（２０１１．３．３１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年９月１７日（２００９．９．１７）
【出願人】（０００００３９６４）日東電工株式会社 (5,557)
【Ｆターム（参考）】
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