多抗原性アルファウイルス・レプリコン粒子及び方法
ウイルス・レプリコンに選択された核酸発現ライブラリーは、寄生生物、病原体、又は新生物に関連した多数の抗原を分析するために、或いは寄生生物、病原体、又は新生物に特異的な免疫応答を生成するための免疫原性組成物を製造するために有用である。核酸発現ライブラリーの代表であるアルファウイルス・レプリコン粒子が好ましい。核酸ライブラリーは、ランダム・ライブラリーであることもあり、又はレプリコン・ベクター中にクローニングされる前に、例えばディファレンシャル・ハイブリダイゼーションによる選別ステップの後に調製されることもある。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組換えＤＮＡ技術に関し、特に外来核酸(単数又は複数)を真核宿主細胞に導入することに関し、さらに特異的に感染性伝播欠損ウイルス様粒子であって、病原体(ウイルス、真菌、細菌、又は原生動物)、寄生生物、又は腫瘍細胞の免疫原性タンパク質の代表的なセットを集合的に発現させる粒子を生成することに関する。これらのライブラリーは、ヒト及び獣医薬における用途を有する。
合衆国研究支援の記載
該当なし
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
ワクチンは、疾患の予防及び疾患の伝播を制御するための、最も効率よい、安全で、かつ経済的な戦略の一つである。慣用のワクチンは、特定の抗原に対する強力な宿主免疫記憶を作り出すことにより免疫防御を与えるため、疾患の発症前に与えられる免疫学的予防の形態である。ワクチン接種の初期の狙いは、適応特異的免疫応答を活性化することであり、先ず疾患又は病原体に付随する特異的抗原(単数又は複数)に対してＢ及びＴリンパ球を作り出すことである。
【０００３】
同様に、癌ワクチンは、癌腫瘍に付随する抗原に対する免疫応答を作り出すことを狙う。癌は、免疫原性でありうるし、かつ疾患を制御しそして腫瘍の退行を引き起こすことができる宿主免疫応答を活性化することができる。
【０００４】
しかしながら、同時に、癌は特異的及び非特異的に免疫抑制性であり、そして宿主免疫系から逃れることができる。多くのタンパク質／糖タンパク質の腫瘍関連抗原が同定されてきており、そして癌の特定の型へと関連されてきている。Ｈｅｒ-２-ｎｅｕ、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、ＭＡＧＥ-３、ＭＡＧＥ-１、ｇｐ１００、ＴＲＰ-２、チロシナーゼ、ＭＡＲＴ-１、β-ＨＣＧ、ＣＥＡ、Ｒａｓ；Ｂ-カテニン、ｇｐ４３、ＧＡＧＥ-１、ＢＡＧＥ-１、ＭＵＣ-１,２,３、及びＨＳＰ-７０は、幾つかの例である。
【０００５】
腫瘍関連抗原(ＴＡＡｓ)で癌患者を免疫化する点において、多くの試みが評価されている。臨床使用におけるワクチンは、全細胞から免疫原性ペプチドにいたる範囲の構成要素により決定される幾つかのカテゴリーに分類される。全細胞及び細胞ライセートのワクチンは、癌細胞の宿主の起源に左右されて、自己又は同種ワクチンとなりうる。自己全細胞癌ワクチンは、患者自身の腫瘍から作られた患者特異的製剤である。現在までに、多くの自己癌ワクチンは、例えば、ＧＭ-ＣＳＦ(Ward et al., 2002. Cancer Immunol. Immunother. 51:351-7)などのリンフォカインの共発現により、それら固有の免疫原性を増加するように改変されない限りでは、臨床的に成功しなかった。なぜなら自己癌ワクチンは、患者特異的であり、それらは値段が高く、そして患者細胞が単一細胞懸濁液(single cell suspension)を作るために十分な量で獲得されうる患者に限られるからである。付け加えて、本質的に限られた数の細胞は、改変又は複数ワクチン接種を必要とすることに関して問題であり、自己製剤を初期の疾患の予防又は治療に実用的ではないものにしてしまう。これらの問題の幾つかは、同種全細胞ワクチン又は遺伝子操作された全細胞ワクチンであって、ここでリンフォカインなどの免疫刺激性の作用物質を腫瘍ワクチンに外部導入的に供給する代わりに、腫瘍細胞がリンフォカインを内在的に発現するように遺伝的に改変されたワクチンで解決される。しかしながら、これらの方法は、時間がかかり、そして作り出すのに値段が法外に高い。
【０００６】
天然及び組換え癌タンパク質抗原ワクチンは、サブユニット・ワクチンである。全細胞ワクチンとは異なって、これらのサブユニットワクチンは、標準化レベルで確定された免疫原性抗原を含む。そうしたワクチンに関する主要な問題は、正確なアジュバント及びデリバリーシステムを発見することである。加えて、天然又は組換え腫瘍抗原は、面倒であり、そして必ずしも論理的に実用的ではない。タンパク質癌ワクチンは、腫瘍細胞を培養し、腫瘍抗原を精製し、特異的ペプチド又は組換えタンパク質を作り出すことを必要とする。加えて、単に腫瘍タンパク質／ペプチドから作られたワクチンは、該ワクチンが、正しい抗原提示経路に向けられる能力に限られ、又は宿主主要組織適合複合体(ＭＨＣ)の多型のため宿主により認識されないこともあるという点で固有の問題を有する。これらの理由のため、全細胞、又はベクターにデリバリーされる腫瘍ワクチンであって、たくさんの腫瘍抗原を発現するワクチンは、好ましいワクチン接種方法になることを期待されている。抗原自身を含むワクチンよりは腫瘍抗原をコードする核酸を含むワクチンは、これらの問題の幾つかに対応する。現在までに、これらのアプローチは、前臨床及び臨床試験において最良の見込みを示してきている。癌ワクチンに適用される現在の技術の中では、２つの特定システムがこの分野で適用される大きな潜在的可能性を示してきた。第一は、非限定的にアデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、ポックスウイルス、フラビウイルス、ピコルナウイルス、ヘルペスウイルス、及びアルファウイルスを含むウイルスベクターを使用してＴＡＡｓをデリバリーすることである(WO99／51263を参照のこと)。第二は、ＴＡＡｓを宿主へと移しそして発現するためのデリバリー・ビークルとしてex vivo由来の樹上細胞を使用して、腫瘍細胞タンパク質又はＲＮＡでワクチン接種することである(Heiser et al., 2002. J. Clin. Inv. 109: 409-417 and Kumamoto et al., 2002. Nature Biotech. 20: 64- 69)。
【０００７】
多くの腫瘍ワクチンアプローチにおける制限因子は、既知の腫瘍特異的抗原の限定された利用可能性であるように思える。これらの腫瘍特異的抗原は、腫瘍の由来元である組織型の間で変わるばかりでなく、同じ腫瘍内の細胞と細胞間でさえも変わりうる。ワクチン中における限定された数の腫瘍抗原標的のみを使用することに付随する交絡問題は、「腫瘍回避」の可能性である。ここでは、腫瘍は、特定の腫瘍関連抗原を欠失することによって、ワクチン誘導性の免疫効果細胞による検出から逃れる。
【０００８】
この観察結果により、研究者が腫瘍回避の性質を低減するために、複数の抗原を発現するワクチンを設計することが促進された。残念ながら今日までに同定された抗原の限定された数のために、この試みは、腫瘍の大部分に対して実行できるアプローチとはならない。それゆえ、癌治療の最近の展開は、全腫瘍抗原ライブラリーの使用となっている。これは、癌ワクチンにおいて望まれる複数の有利な特徴を混ぜ合わせる。全腫瘍レパートリーをコードするワクチンは、抗原同定及び単離の必要性を打ち消し；本来ワクチン接種者の免疫系は、どのＴＡＡｓに対し個人が応答するかという決定における選択を行うことができるのである。このアプローチの第二の明確な利点は、発現される抗原のレパートリーがかなり広範であるので、腫瘍回避の機会は、最小限にされるか、完全に無くされるという点である。現在、このアプローチは、腫瘍抗原ライブラリーをデリバリーするために樹上細胞を使用して、最も活発に追求されている。これらの細胞は、腫瘍抗原を免疫系に提示することにより抗原提示細胞として機能し、各癌患者から単離され、in vitroで培養及び増殖され、タンパク質又は核酸の形態のいずれかで腫瘍抗原を積み込まれる。米国特許第5,853,719号及び第6,306,388号を参照のこと。このアプローチは、ヒト試験において、有望な臨床データーを作り出し、そして数人の個人において腫瘍成長の退行及び多くの患者において腫瘍の寛解を導く能力を示した(Sadanaga et al., 2001, Clin. Cancer Res. 7: 2277-84)。この技術についての主な障害は、各個人のワクチン接種の前に、in vitro培養、増殖、及び患者由来樹上細胞への抗原の導入をなどを必要とすることである。これは、時間がかかりかつ高価な過程であり、そしてかなり変化しやすいことがある。なぜなら個人間の樹上細胞の集合が、そのフェノタイプ、成長特徴、及び活性の点において大きく変わるからである。
【０００９】
現在までに、剥き出しのＤＮＡ、ＲＮＡ、ウイルス及び細菌ベクターは、腫瘍抗原ライブラリーに対する癌特異的応答を誘導する能力について試験された。代わりのアプローチは、腫瘍抗原ライブラリーを癌患者へと運搬するためにウイルスベクターを使用することである。現在までに、幾つかの成功が剥き出しの核酸発現ライブラリーに関して達成された(例えば、米国特許第5,989,553号及び第5,703,057号を参照のこと)。剥き出しの核酸ベクターに対し誘発された免疫応答を増加させる試みは、剥き出しのＲＮＡ又はＤＮＡの形態において誘導された自己増殖性のウイルスベクターを使用することを含む(Ying et al., 1999, Nature Medicine, 5: 823-827)。
【００１０】
ウイルスベクターは、多くの感染性疾患標的を予防するための前臨床及び臨床試験においてかなりよい見込みを示した。ヒトにおいて予防用及び治療用ワクチンを使用するためのウイルスベクターの開発における最も差し迫った課題の一つは、制御が可能である形態において十分な粒子を作り出す能力である。多くのウイルスシステムでは、この目標は、手の届くところであり、そして数多くのベクターシステムが、臨床試験において正の免疫応答及び安全特性を作り出した。しかしながら、ワクチン・ベクター・プラットホームに対する多くの生成スキームは、特異的疾患標的、例えばポックスウイルスベクター中のＨＩＶのｇａｇ、ｐｏｌ、及びｅｎｖ遺伝子に対する１又は多くとも２若しくは３の既知の抗原を発現するワクチン粒子を大量に産生することに焦点をあてる。しかしながら、多くの場合、これらの大量製造アプローチは、個々の患者特異的ワクチンの製品には使用できない。
【００１１】
アルファウイルス・ベクター・デリバリー・システムは、多くの理由から魅力的なワクチンベクターとして同定されてきた。その理由は、非相同遺伝子配列の大量発現、良好な安全特性での非複製性(アルファ)ウイルス・レプリコン粒子(ＡＲＰ)の誘導、標的細胞の細胞質で複製し、そしてベクターのゲノムへの取り込みの機会を打ち消すＲＮＡゲノム、及び最終的に、アルファウイルス・ベクターが本来的に樹上細胞における複製を標的にし、それゆえ多数のワクチン抗原に対する強力かつ総合的な免疫応答を作り出すことができる(Rayner, Dryga and Kamrud, 2002, Rev. Med. Virol. 12: 279-296において総論される)という実証を含む。アルファウイルス属は、種々のウイルスを含み、それらの全ては、トガウイルス科のメンバーである。アルファウイルスは、非限定的に、東部ウマ脳炎ウイルス(ＥＥＥ)、ベネズエラ・ウマ脳炎ウイルス(ＶＥＥ)、エバーグレード・ウイルス(Everglades Virus)、ムカンボ・ウイルス(Mucambo Virus)、ピクスナ・ウイルス(Pixuna Virus)、西部ウマ脳炎ウイルス(WEE)、シンドビス・ウイルス、セムリキ森林ウイルス、ミデルブルグ・ウイルス(Middleburg Virus)、チクングニア・ウイルス、オニョンニョン・ウイルス、ロスリバー・ウイルス、バーマ森林ウイルス(Barmah Forest Virus)、ゲタ・ウイルス、サギヤマ・ウイルス、ベバル・ウイルス(Bebaru Virus)、マヤロ・ウイルス、ウナ・ウイルス(Una Virus)、アウラ・ウイルス(Aura Virus)、ワタロア・ウイルス(Whataroa Virus)、ババンキー・ウイルス(Babanki Virus)、キジラガッチェ・ウイルス(Kyzylagach Virus)、ハイランドＪウイルス(Highlands J virus)、フォート・モーガン・ウイルス(Fort Morgan Virus)、ヌヂュム・ウイルス(Ndumu Virus)、及びバギー・クリーク・ウイルス(Buggy Creek Virus)を含む。このウイルスゲノムは、一本鎖のメッセンジャーセンスＲＮＡであって、５’末端でメチル化キャップで修飾されており、そして３’末端で種々の長さのポリ(Ａ)鎖で修飾されているＲＮＡである。１のウイルスタンパク質、Ｃを含む構造的なサブユニットは、２０面体のヌクレオキャプシド中でＲＮＡゲノムと会合する。ビリオン中では、キャプシドは、整然と多数並んだ膜貫通タンパク質スパイクで覆われる脂質外被により取り囲まれ、該膜貫通タンパク質スパイクの各々は、二つの糖タンパク質、通常Ｅ１とＥ２のヘテロダイマー複合体からなった(Pedersen et al., J. Virol 14 : 40 (1974)を参照のこと)。シンドビス・ウイルスとセムリキ森林ウイルスは、アルファウイルスの原型と考えられており、そして広く研究された(Schlesinger, The Togaviridae and Flaviviridae, Plenum Publishing Corp. , New York (1986)を参照のこと)。ＶＥＥウイルスも広く研究された(例えば米国特許5,185,440号、並びに本明細書中で引用される別の文献を参照のこと)。
【００１２】
これらのウイルスの研究は、アルファウイルス病に対するワクチン接種技術の発展を導き、さらに関心の抗原をコードする外来ＤＮＡの導入用のアルファウイルス・ベクターの使用を介して別の疾患に対するワクチン接種技術の発展を導いた。Davis et al.,に対する米国特許第5,185,440号及びPCT公開WO 92/10578を参照のこと。発現可能な外来ＤＮＡを真核細胞中に導入することは、高い関心の題目となった。生弱毒化ウイルスワクチンは、ウイルス疾患を制御する最も成功した方法の一つであるということはよく知られている。しかしながら、幾つかのウイルス(又は別の)病原体については、生ウイルスの株での免疫化は、実用的でないか又は安全ではないかのどちらかであることがある。代替の戦略の一つは、そうした病因の免疫抗原をコードする配列を、生きた増殖株である別のウイルスへと入れ込むことである。生ＶＥＥベクターを使用するこうしたシステムの一つは、Johnston et al.,に対する米国特許第5,505,947号において開示される。別のこうしたシステムは、Hahn et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 2679-2683において開示され、ここでシンドビス・ウイルスコンストラクトは、インフルエンザ・ヘマグルチニン・タンパク質の切断形態を発現する。別の試みは、感染性、伝播欠損性のアルファウイルス粒子の使用であり、Garoff et al.,に対する米国特許第6,190,666号、Johnston et al.,に対する米国特許第5,792,462号及び第6,156,558号、米国出願公開第2002/0015945 A1(Polo et al.)、米国出願公開第2001-0016199(Johnston et al.)、Frolov et al.(1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 11371-11377 、及びPushko et al. (1997) Virology 239: 389-401に開示される。アルファウイルスは、比較的遺伝子操作が容易であることが示されてきており、それは、アルファウイルスをゲノム発現ライブラリーとして使用する特許出願が多いことにより反映される。例えば、米国特許第6,197,502号を参照のこと。抗原のライブラリーを発現するセムリキ森林ウイルス(ＳＦＶ)ベクターは、動物モデルにおいて調べられた。ここで、腫瘍抗原のライブラリーを発現するＳＦＶ粒子がｉｎ ｖｉｔｒｏで樹上細胞を感染するために使用され、そして樹上細胞が、グリオーマモデルにおけるいくらかの防御を示すマウスを免疫化するために使用された(Yamanaka et al., 2001, J. Neurosurg. 94: 474-81)。
【００１３】
特に弱毒化種がなく、又は新生物、寄生生物、又は病原体が分子レベルでよく特徴付けられていない場合、或いは防御免疫化が複数の抗原の発現を必要とすると認識される場合、当該技術分野において、新生物病又は寄生生物若しくは病原体感染に対してヒト又は動物を免疫化するために使用されうる外来抗原をコードする核酸配列について長く望まれた必要性が存在する。
【００１４】
発明の要約
新生物細胞、病原体又は寄生生物由来のウイルス・レプリコン粒子調製品、並びに同じ物を含む免疫原性組成物を提供することが、本発明の目的である。該調製品は、新生物細胞、病原体、又は寄生生物由来の複数の発現可能なコード配列を含み、該調製品が投与されるヒト又は動物患者においてコード配列の発現が、アルファウイルス・レプリコン核酸によりコードされ、そこから発現される複数の抗原決定因子に対する免疫応答の生成をもたらす。免疫原性組成物は、関心のアルファウイルスレプリコン粒子調製品及び医薬として許容される担体を含み、そして免疫応答を改良し又は刺激するために、免疫学的アジュバント及び／又はサイトカインをさらに含んだ。アルファウイルス・レプリコンは、数ある中でＶＥＥ、シンドビスウイルス、南アフリカアルボ・ウイルスＮｏ.８６、セムリキ森林ウイルス由来のいずれのアルファウイルスレプリコンＲＮＡベクターでありうる。好ましい実施態様では、アルファウイルス・ベクターは、１以上の弱毒化突然変異を含む。適切な突然変異、並びにそれらを同定するための方法が記載された(例えば、米国特許第5,505,947号；第5,639,650号；第5,811,407号を参照のこと)。
【００１５】
投与経路は、皮下(ｓ.ｃ.)、腹腔内(ｉ.ｐ.)、筋肉内(ｉ.ｍ.)、皮内(ｉ.ｄ.)、静脈内(ｉ.ｖ.)、腫瘍内、脳内(ｉ.ｃ.)、直接リンパ節注入(ｉ.ｎ.)、並びに粘膜経路、例えば経鼻、経気管支、経直腸、経膣、及び経口経路を含みうる。筋肉内投与は有利である。
【００１６】
ヒト及び動物投与は、約１×１０4〜約１×１０10の範囲であり、投与あたり約１×１０6〜約１×１０8の投与量が有利である。ワクチン型の免疫原アプローチでは、本発明者は、約１〜約１２ヶ月又はそれ以上の間、毎週、各週、又は毎月の投与を意図する。この投与に続き、必要とされる基準に基いて、例えば毎年、追加ワクチン接種される。
【００１７】
特に、アルファウイルス・レプリコン調製品が、特定の患者からの腫瘍細胞に由来する場合、患者特異的ワクチン調製品が作られ、そして同じ個人に戻して投与される；つまり、自己ワクチン経路である。同種アプローチもまた、本発明の範囲内であり、ここで一の患者腫瘍細胞由来のウイルス・レプリコンは、同じ新生物病を患う、患っていると信じられる、又は高い危険性にある別の患者に投与される。リスクの高い患者の例は、遺伝的性素因を有するか、又は癌についての遺伝性の高いリスクを証明された個人である。例えば、乳房癌は、乳房癌を患う患者の女系親族において、高い家族性のリスクを伴う。同様に、ＨＩＶ陽性の個人をワクチン接種すると同時に、未感染の個人を感染から妨げようとするために、同じワクチン調製品で、未感染のパートナーを予防的にワクチン接種しうる。
【００１８】
本発明は、ウイルス・レプリコン調製品又は同じものを含む免疫原性組成物を患者に投与することにより誘発される免疫応答をフォローし、患者が応答する腫瘍抗原を同定することをさらに含む。これらの応答は、液性及び／又は細胞性でありうる。このアプローチは、新規の抗原の同定を可能にし、そして患者を免疫化する抗原のより規定された集合を使用することを可能にする。これは、より限定されたＡＲＰ調製品で追加免疫を投与することにより、又は続いてより規定されたセットの抗原をコードするＡＲＰを含む調製品で別の患者又は個人を(予防投与計画で)免疫化を行うことにより、達成されうる。
【００１９】
本発明はまた、感染性疾患及び寄生生物感染の治療及び/又は予防に関する。ＨＩＶを例として使用して、患者特異的ＨＩＶ遺伝子から由来するか又は個人自身のウイルス調製品から直接由来する成功した多抗原性ＨＩＶ・ＡＲＰワクチンは、ウイルスの類似の遺伝種に感染されたヒト、或いは類似の種に晒されたか、晒されたと思われるか、又は晒された可能性のあるヒトに適用される。特に、関心の病原体又は寄生生物由来の免疫原性又は新規の免疫原は、新規の免疫原性タンパク質を同定するためのツールとしてＡＲＰｓを使用して同定される。同様に、疾患を引き起こすウイルス(例えばＨＩＶの認知クレード)又は寄生生物の複数の種は、本発明のＡＲＰ調製品中に混合されて、種特異的ではない強い免疫原性組成物を提供する。例えば、ＨＩＶの幾つかの異なるクレードは、認識されてきており、そして該クレードは、多クレードＨＩＶワクチンを提供するために混合される。
【００２０】
癌患者の場合、癌細胞抗原性決定因子コード配列を運搬するＡＲＰｓの投与は、特に、化学療法治療が、本発明のＡＲＰｓを含む免疫原性組成物を投与した後に発現される抗原に応答する免疫系の能力を取り除かない場合に化学療法治療を伴ってされる。
【００２１】
腫瘍若しくは癌、ウイルス、細菌、真菌若しくは原生動物病原体、又は寄生生物の特定の型の抗原性質を発現する本発明のＡＲＰ調製品は、予防用又は治療用処置投与計画において投与され、そしてＡＲＰｓの投与は、初回免疫及び/又は追加免疫用の別の免疫原性調製品の組合せで、例えばＡＲＰワクチンの初回免疫及び樹枝状細胞ワクチンの追加免疫を使用して、或いはＡＲＰ初回免疫及びアデノウイルスベクター追加免疫を使用して行われうる。ＤＮＡ、ＲＮＡ、アデノウイルス、ピコルナウイルス、アデノ随伴ウイルス、ポックスウイルス、レトロウイルス、アフトウイルス、ノダウイルス(nodaviruses)、フラビウイルス、樹枝状細胞、ペプチド、熱ショックタンパク質、ミニ遺伝子、腫瘍細胞全体及び腫瘍細胞ライセート・ワクチンは、本発明の関心の複数の抗原を発現するＡＲＰｓと組み合わせて使用されうる。サイトカイン又はケモカインなどのアジュバント、或いはケモカイン又はサイトカインの発現を仕向けるＡＲＰｓは、本発明の調製品中に使用されうる。ＡＲＰを発現する複数の遺伝子と組み合わせた異種性の初回免疫/追加免疫の添加は、１の又は比較的少数の腫瘍抗原を発現するベクター・レプリコン又はベクター・レプリコンのセットを伴うようである。これは、ＡＲＰ(単数又は複数)により誘発される広い免疫応答の前又は後に、特異的抗原上に免疫系を集中させるように機能する。類似のそうした異種性デリバリー・システムは、本アルファウイルス・レプリコン発現ライブラリーと組み合わせて使用されて、付加免疫記憶及び長期間免疫機能を増進し及び/又は維持する。
【００２２】
本発明のさらなる目的は、本発明のＡＲＰを含む免疫原性組成物を、患者が腫瘍病原体又は寄生生物に陽性であるとき、治療セットにおける癌又は別の病原体状態を治療するためばかりでなく、治療が成功しそして患者が寛解状態になった時点で、ヒトに投与することである。そうした継続した断続的な(追加)免疫化は、無腫瘍、無疾患、又は無寄生生物状態の維持を亢進することができ、そして腫瘍又は疾患それぞれの逆行又は再発を阻害しうる。
【００２３】
本発明の更なる目的は、ＡＲＰを含む本発明の免疫原性組成物を、抗体などの免疫応答を作り出すために、動物(例えば、ウマ、ブタ、ウシ、ヤギ、霊長類、ラビット、マウス、ハムスター、鳥類)に投与することである。そうした動物から回収された血清又は細胞は、ポリクローナル血清を提供する点で、或いはモノクローナル血清を作り出すハイブリドーマ生成のための細胞を提供する点で有用であり、そうした抗体調製品は、研究、診断、及び治療用途に有用である。
【００２４】
本発明のさらなる目的は、腫瘍、腫瘍細胞、病原体、寄生生物由来の複数の抗原をまとめてコードするアルファウイルス・レプリコン粒子(ＡＲＰｓ)の製造方法である。該方法は、以下のステップ：
関心の腫瘍、腫瘍細胞、病原体、又は寄生生物由来のＤＮＡ又はｃＤＮＡを調製し、そしてウイルス/アルファウイルス・レプリコン核酸中へとクローニングして改変ウイルス/アルファウイルス・レプリコン核酸を生成し、
改変ウイルス/アルファウイルス・レプリコン核酸を許容状態細胞中へ導入し、ここで当該改変ウイルス/アルファウイルス・レプリコン核酸は改変許容状態細胞を作り出すための少なくともウイルス・パッケージング・シグナルを含み、
少なくとも１のヘルパー機能の発現を許容し、かつ上記改変ウイルス／アルファウイルス核酸の複製及びパッケージングを許容する条件下で、当該改変許容状態細胞を培養して、ＡＲＰｓを形成し、そして
望ましくは、該培養された許容状態細胞を放出培地と接触して、細胞及び細胞片に結合されたＡＲＰｓを放出するステップ
を含む。改変ウイルス／アルファウイルス・レプリコン核酸は、パッケージングに必要とされるコード配列を既に含みかつ発現する許容状態細胞中へ導入され、或いはパッケージング遺伝子を運搬する１以上の「ヘルパー」ＤＮＡ若しくはＲＮＡ分子は、改変ウイルス／アルファウイルス・レプリコン核酸と共に導入されうる。場合により、放出培地ステップの前に、細胞からのＡＲＰｓの放出をもたらさない洗浄ステップが行われうる。有利なことに、該洗浄ステップは、ＤＮａｓｅ処理を含むか、又はＤＮＡは、ＡＲＰ調製においてＤＮａｓｅで切断されうる。例えば、ＤＮａｓｅは、セラチア・マルセッセンス(Serratia marcescens)由来であり、１０〜１０００ユニット／ｍｌの濃度において、３７℃で１０〜６０分間インキュベーションで使用される。放出培地は、望ましくは約ｐＨ６〜９、望ましくは約６.５〜約８.５であり、そして非限定的に酢酸アンモニウム、塩化アンモニウム、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、塩化カルシウム、塩化カリウム、硫酸アンモニウム、及び炭酸水素ナトリウムを含む塩約０.２〜約５Ｍを含む。改変アルファウイルス・レプリコン核酸が、電気穿孔により許容状態細胞中へと導入されるとき、細胞は、電気穿孔混合液１ｍｌあたり約１０7〜約５×１０8の密度で存在することは、有利である。
【００２５】
有利なことに、ＡＲＰｓが生成される細胞は、アルファウイルス・レプリコン・ベクター及びヘルパー核酸(単数又は複数)で電気穿孔される前に、細胞周期Ｇ２／Ｍ期に同期化される。特定の論理に束縛されることなく、より高い電気穿孔効率及び(核活性を含む本発明のこれらの実施態様では)核酸の核への移動は、Ｇ２／Ｍ期細胞において達成されるということが信じられている。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
本出願の文脈において、ｎｍはナノメートルを意味し、ｍｌはミリリットルを意味し、μｌはマイクロリットルを意味し、ｐｆｕ／ｍｌはプラーク形成ユニット／ミリリットルを意味し、ｉｕは感染単位を意味し、ＶＥＥはベネズエラ・ウマ脳炎ウイルスを意味し、ＥＭＣは脳心筋炎ウイルスを意味し、ＢＨＫは仔ハムスター腎臓細胞を意味し、ＨＡはヘマググルチニン遺伝子を意味し、ＣＡＴはクロラムフェニコール・アセチル・トランスフェラーゼを意味し、βｇａｌはβガラクトシダーゼを意味し、ＧＦＰはグリーン・フルオレセント・タンパク質遺伝子を意味し、Ｎはヌクレオキャプシド意味し、ＦＡＣＳは蛍光活性化セルソーターを意味し、ＥＬＩＳＡは酵素結合免疫吸着検定法を意味し、ＩＲＥＳは内部リボソーム侵入部位を意味する。「Ｅ２アミノ酸(例えば、Ｌｙｓ、Ｔｈｒなど)数字」という記載は、Ｅ２タンパク質の指示された残基での指示されたアミノ酸の事を指し、そしてＥ１遺伝子における特異的残基でのアミノ酸を指すためにも使用される。
【００２７】
「アルファウイルス」という用語は、当該技術分野における慣用的な意味を有し、そしてアルファウイルスの様々な種、例えば、東部ウマ脳炎ウイルス(ＥＥＥ)、ベネズエラ・ウマ脳炎ウイルス(ＶＥＥ)、エバーグレード・ウイルス、ムカンボ・ウイルス、ピクスナ・ウイルス、西部ウマ脳炎ウイルス(WEE)、シンドビス・ウイルス、南アフリカ・アルボウイルスＮｏ.８６、セムリキ森林ウイルス、ミデルブルグ・ウイルス、チクングニア・ウイルス、オニョンニョン・ウイルス、ロスリバー・ウイルス、バーマ森林ウイルス、ゲタ・ウイルス、サギヤマ・ウイルス、ベバル・ウイルス、マヤロ・ウイルス、ウナ・ウイルス、アウラ・ウイルス、ワタロア・ウイルス、ババンキー・ウイルス、キジラガッチェ・ウイルス、ハイランドＪウイルス、フォート・モーガン・ウイルス、ヌヂュム・ウイルス、及びバギー・クリーク・ウイルスを含む。本発明で使用される好ましいアルファウイルスＲＮＡ転写産物は、ＶＥＥウイルス、シンドビス・ウイルス、南アフリカ・アルボウイルスＮｏ.８６、及びセムリキ森林ウイルスＲＮＡ転写産物を含む。
【００２８】
本発明の方法において使用されるアルファウイルス-許容状態細胞は、アルファウイルスＲＮＡ転写産物でトランスフェクションされた際、ウイルス粒子を生成できる細胞である。アルファウイルスは、幅広い宿主範囲を有する。適切な宿主細胞は、非限定的にベロ、仔ハムスター腎臓(ＢＨＫ)、ＤＦ１、ＣＨＯ、２９３、２９３Ｔ、トリ胚線維芽細胞、及び昆虫細胞、例えばＳＦ２１、スポドプテラ・フルギペルダ(Spodoptera frugiperda; C6/36、アエデス・アルボピクツス(Aedes Albopictus)；ＴＲＡ-１７１、トキソリンチテス・アムボイネシス(Toxorhynchites amboinensis)；ＲＭＬ-１２、アエデス・アエギプチ(Aedes aegypti)；ＡＰ-６１、アエデス・シュードスキュテラリス(Aedes pseudoscutellaris)；及びＭＯＳ-５５、アノフレス・ガムビアエ(Anopheles gambiae)細胞を含む。
【００２９】
本明細書中に使用される「構造タンパク質」又は「アルファウイルス構造タンパク質」というフレーズは、ＲＮＡレプリコンをレプリコン粒子中にキャプシド形成するために必要とされるタンパク質であって、ウイルスによりコードされるタンパク質を指し、そしてキャプシド・タンパク質、Ｅ１糖タンパク質及びＥ２等タンパク質を含む。本明細書中に記載されるように、アルファウイルスの構造タンパク質は、１以上のヘルパー核酸の間に分配される。例えば、第一ヘルパーＲＮＡ及び第二ヘルパーＲＮＡが使用されうるか、又はアルファウイルス構造タンパク質の全てをコードするシングルＤＮＡヘルパーは使用されうる。付け加えて、１以上の構造タンパク質は、レプリコンＲＮＡと同じＲＮＡ分子上に局在化されることがあり、但し、レプリコン及び得られたアルファウイルス粒子が伝播-欠損性であるように、少なくとも１の構造タンパク質がレプリコンＲＮＡから欠失される。本明細書中に使用されるとき、「欠失された」又は「欠失」という用語は、特定の断片の完全な欠失か、又は特定の断片の一部の欠失であって、標準の使用に従って断片を動作不能又は機能がなくなるようにするために十分な欠失を意味する。例えばTermin et al.,に対する米国特許第4,650,764号を参照のこと。本明細書中に使用される「複製欠損」という用語は、「伝播欠損」と同意義であり、そして規定の宿主細胞中で作られた粒子が、ヘルパー機能の欠失、つまりレプリコン核酸をパッケージングするために必要とされるアルファウイルス構造タンパク質がないことから、別の宿主細胞中に子孫粒子(progeny particle)を作り出すことができないことを意味する。しかしながら、レプリコン核酸は、それ自身を複製することができ、そして導入された宿主細胞中に発現されることができる。
【００３０】
ヘルパー細胞はまた、パッケージング細胞とも呼ばれ、感染性伝播欠損アルファウイルス粒子を作り出すために使用され、レプリコン核酸をパッケージングするために十分なアルファウイルス構造タンパク質を発現しなければならないか又は発現できなければならない。構造タンパク質は、セットのＲＮＡ、典型的には２個のＲＮＡであって、レプリコン・ベクターの導入と同時に、又は導入前にヘルパー細胞へ導入されるＲＮＡから作られうる。第一ヘルパーＲＮＡは、少なくとも１のアルファウイルス構造タンパク質をコードするＲＮＡを含むが、アルファウイルス構造タンパク質の全部をコードしない。第一ヘルパーＲＮＡは、アルファウイルスＥ１糖タンパク質をコードするが、アルファウイルス・キャプシド・タンパク質及びアルファウイルスＥ２糖タンパク質をコードしないＲＮＡを含みうる。或いは、第一ヘルパーＲＮＡは、アルファウイルスＥ２糖タンパク質をコードするが、アルファウイルス・キャプシド・タンパク質及びアルファウイルスＥ１糖タンパク質をコードしないＲＮＡを含みうる。更なる実施態様では、第一ヘルパーＲＮＡは、アルファウイルスＥ１糖タンパク質及びアルファウイルスＥ２糖タンパク質をコードするが、アルファウイルス・キャプシド・タンパク質をコードしないＲＮＡを含みうる。第四の実施態様では、第一ヘルパーＲＮＡは、アルファウイルス・キャプシドをコードするが、アルファウイルス糖タンパク質のどれもコードしないＲＮＡを含みうる。第５の実施態様では、第一ヘルパーＲＮＡは、キャプシド及び糖タンパク質の１つ、つまりＥ１又はＥ２のいずれかをコードするが、両方はコードしないＲＮＡを含みうる。
【００３１】
これらの第一ヘルパーＲＮＡのいずれか１つと組み合わせて、第二ヘルパーＲＮＡは、少なくとも１のアルファウイルス構造タンパク質であって、第一ヘルパーＲＮＡによりコードされていないものをコードする。 たとえば、第一ヘルパーＲＮＡが、アルファウイルスＥ１糖タンパク質のみをコードする場合、第二ヘルパーＲＮＡは、アルファウイルスキャプシドタンパク質とアルファウイルスＥ２糖タンパク質のうちの１つ又は両方をコードしうる。第一ヘルパーＲＮＡが、アルファウイルス・キャプシドタンパク質のみをコードする場合、第二ヘルパーＲＮＡは、アルファウイルス糖タンパク質のうちの１つ又は両方をコードするＲＮＡを含みうる。第一ヘルパーＲＮＡが、アルファウイルスＥ２糖タンパク質のみをコードする場合、第二ヘルパーＲＮＡは、アルファウイルス・キャプシド・タンパク質とアルファウイルスＥ１糖タンパク質のうちの１つ又は両方をコードしうる。第一ヘルパーＲＮＡが、キャプシドとアルファウイルスＥ１糖タンパク質の両方をコードする場合、第二ヘルパーＲＮＡは、アルファウイルス・キャプシド・タンパク質とアルファウイルスＥ２糖タンパク質のうちの１つ又は両方をコードするＲＮＡを含みうる。
【００３２】
全てのヘルパー核酸において、これらの分子は、コードされた構造タンパク質配列がヘルパー細胞中において発現されるために必要とされる配列(翻訳及び適切である場合転写又は複製シグナルを含む)をさらに含むということは理解される。そうした配列は、例えば、(ウイルス、原核生物、又は真核生物の誘導性又は恒常性の)プロモーター、並びに５’及び３’ウイルスのレプリカーゼ認識配列を含みうる。１以上の糖タンパク質を発現するヘルパー核酸の場合、これらの配列は、核酸コンストラクト中の構造タンパク質のコード領域のＮ末端でのリーダー又はシグナル配列を伴って有利に発現されるということが当該技術分野から理解される。リーダー又はシグナル配列は、アルファウイルス由来、例えばＥ３又は６ｋでありうるし、或いは組織プラスミノーゲン・アクティベーターシグナルペプチドなどの異種性配列又は合成配列でありうる。こうして、一の例として、第一ヘルパー核酸は、キャプシド-Ｅ３-Ｅ１をコードするＲＮＡ分子であり、かつ第二ヘルパー核酸は、キャプシド-Ｅ３-Ｅ２をコードするＲＮＡ分子であることもある。或いは、第一ヘルパーＲＮＡは、キャプシドのみをコードし、そして第二ヘルパーＲＮＡは、Ｅ３-Ｅ２-６ｋ-Ｅ１をコードしうる。さらに、パッケージングシグナル、つまり「キャプシド化(encapsidation)配列」は、ウイルスゲノム中に存在し、そして全てのヘルパー核酸において存在しない。好ましくは、パッケージング・シグナルは、全てのヘルパー核酸から欠失される。
【００３３】
これらのＲＮＡヘルパーは、多くの方法で細胞中へ導入されうる。該ＲＮＡヘルパーは、細胞内に安定的に形質導入された１以上の発現カセットから発現されて、それによりパッケージング細胞系列を確立する(例えば、米国特許第6,242,259号を参照のこと)。或いは、ＲＮＡは、ヘルパー細胞内で、細胞のゲノム中に組み込まれることなく発現されるＲＮＡ又はＤＮＡ分子として導入されうる。導入方法は、電気穿孔、ウイルスベクター(例えば、ＳＶ４０、アデノウイルス、ノダウイルス、アストロウイルス)、及び脂質媒介トランスフェクションを含む。
【００３４】
複数のヘルパーＲＮＡの代替は、ウイルス・レプリコンＲＮＡを複製し、そしてアルファウイルス・レプリコンＲＮＡを感染性アルファウイルス・レプリコン粒子中にパッケージングするために必要なポリペプチドを合成するために必要な機能の全てをコードするシングル核酸分子の使用である。これは、必要な機能を規定するＲＮＡ分子又は必要な機能を規定するＤＮＡ分子で達成されうる。シングルＤＮＡヘルパー核酸は、非限定的に電気穿孔、脂質-媒介性トランスフェクション、ウイルスベクター(例えば、アデノウイルス又はＳＶ-４０)、及びリン酸カルシウム-媒介性トランスフェクションを含む当該技術分野に既知の方法のいずれかによりパッケージング細胞中に導入される。好ましくは、ＤＮＡは、細胞及び導入される核酸(単数又は複数)について最適化された電圧及び電気容量で、本発明の電気穿孔に基く方法を介して導入される。ＤＮＡは典型的に、ＲＮＡの取り込みに必要とされる電圧及び電気容量と比べて減少された電圧及び増加した電気容量で細胞中へと電気穿孔で入れられる。全ての電気穿孔において、電圧及び電気容量の値は、感染性アルファウイルス粒子を作り出すパッケージング細胞の能力を破壊することを避けるようにセットされなければならない。ＤＮＡは、電気穿孔の前に毒性汚染物質を取り除くために高度に精製され、そして約５ｍｇ／ｍｌに濃縮される。一般的に、１〜８ｍｇ／ｍｌ、好ましくは５〜８ｍｇ／ｍｌにＤＮＡを濃縮することが好ましい。ＤＮＡヘルパーは、電気穿孔混合液において、０.８ｍｌの電気穿孔混合液あたり約２０〜５００、望ましくは約５０〜３００、例えば約１５０μｇで存在し、望ましくは約５×１０7〜２×１０8細胞、例えば約１.２×１０8細胞を含んだ。
【００３５】
或いは、このフォーマットにおける及び誘導性のプロモーターの下でのヘルパー機能は、ウイルスＲＮＡベクター・レプリコン核酸の導入／発現の前にパッケージング細胞ゲノム中に組み込まれ、そして次にＲＮＡベクター・レプリコンの導入の直前に、同時に、又は後に適切な刺激で誘導された。
【００３６】
有利なことに、アルファウイルス構造タンパク質、つまりキャプシド、Ｅ１糖タンパク質及びＥ２糖タンパク質をコードする核酸は、少なくとも１の弱毒化突然変異を含む。本明細書中で使用される「弱毒化突然変異」及び「弱毒化アミノ酸」というフレーズは、当該技術分野の専門用語に従って(例えば、B. Davis, et al., Microbiology 132(3d ed. 1980)を参照のこと)、該突然変異が置換突然変異であろうと、イン-フレーム欠失若しくは突然変異の付加であろうと、その宿主において疾患を引き起こす可能性の低下(つまり病原性の低下)をもたらすヌクレオチド突然変異又はそうした突然変異の観点でコードされるアミノ酸を意味する。「弱毒化突然変異」という用語は、そうした突然変異が、弱毒化されたにもかかわらずウイルスの生存を可能にする「修復」突然変異と組み合わせて使用されない限り、ウイルスにとって致命的である突然変異を除外する。特定の実施態様では、ヘルパー核酸(単数又は複数)は、少なくとも１の弱毒化突然変異を含む。
【００３７】
アルファウイルス・ゲノムにおいて適切な弱毒化突然変異を同定する方法は、当該技術分野に既知である。Olmsted et al.,(1984; Science 225: 424)は、細胞培養において成長の早さについて選別することにより、シンドビス・ウイルスにおいて弱毒化突然変異を同定する方法を記載する。Johnston及びSmith(1988; Virology 162: 437)は、ＢＨＫ細胞の浸透を促進するために選択的な圧力を直接適用することにより、ＶＥＥにおける弱毒化突然変異を同定することを記載する。アルファウイルスにおける弱毒化突然変異は、当該技術分野に記載される。例えば、White et al. 2001 J. Virology 75: 3706; Kinney et al. 1989 Virology 70: 19; Heise et al. 2000 J. Virology 74: 4207; Bernard et al 2000 Virology 276: 93; Smith et al 2001 J Virology 75: 11196; Heidner & Johnston 1994 J.Virology 68: 8064; Klimstra et al. 1999 J. Virology 73: 10387; Glasgow et al. 1991 Virology 185: 741; Polo and Johnston 1990 J. Virology 64: 4438; and Smerdou and Liljestrom 1999 J. Virology 73 : 1092 である。
【００３８】
特定の実施態様では、レプリコンＲＮＡは、少なくとも１の弱毒化突然変異を含む。別の特異的実施態様では、ヘルパー核酸(単数又は複数)は、少なくとも１の弱毒化突然変異を含む。２個のヘルパー核酸分子を含む実施態様では、少なくとも１の分子は、少なくとも１の弱毒化突然変異を含むか、又は両方とも少なくとも１の弱毒化突然変異をコードしうる。或いは、ヘルパー核酸又は第一若しくは第二ヘルパー核酸のうちの少なくとも１は、少なくとも２個の又は複数の弱毒化突然変異を含む。適切な弱毒化突然変異は、使用されるアルファウイルスに左右される。例えば、アルファウイルスがＶＥＥである場合、適切な弱毒化突然変異は、Ｅ２アミノ酸位７６でのコドンであって、弱毒化アミノ酸、好ましくはリジン、アルギニン、又はヒスチジンをＥ２アミノ酸７６として指定するコドン；Ｅ２アミノ酸位１２０でのコドンであって、弱毒化アミノ酸、好ましくはリジンをＥ２アミノ酸１２０として指定するコドン；Ｅ２アミノ酸位２０９でのコドンであって、弱毒化アミノ酸、好ましくはリジン、アルギニン、又はヒスチジンをＥ２アミノ酸２０９として指定するコドン；Ｅ１アミノ酸位２７２でのコドンであって、弱毒化突然変異、好ましくはスレオニン又はセリンをＥ１アミノ酸２７２として指定するコドン；Ｅ１アミノ酸位８１でのコドンであって、弱毒化突然変異、好ましくはイソロイシン又はロイシンをＥ１アミノ酸８１として指定するコドン、並びにＥ１アミノ酸位２５３でのコドンであって、弱毒化突然変異、好ましくはセリン又はスレオニンをＥ１アミノ酸２５３として指定するコドンからなる群から選ばれうる。Ｅ３/Ｅ２のポリタンパク質が切断されないように、更なる弱毒化突然変異がＥ３とＥ２との間の切断ドメインにおける欠失又は置換突然変異を含む；Ｅ１-２５３での突然変異と組み合わせた突然変異は、本発明中で使用される好ましい弱毒化株である。同様に、現存の生ワクチン株中、例えばＴＣ８３株(Kinney et al., 1989, Virology 170: 19-30、特にヌクレオチド３での突然変異)中に存在する突然変異はまた、本発明の方法により精製された粒子中に有利に使用された。レプリコン核酸の非コード領域における弱毒化突然変異の例は、ＶＥＥにおけるヌクレオチド３でのＡ又はＣの置換である。
【００３９】
適切なヘルパー及びウイルス・レプリコンＲＮＡは、米国特許第6,156,558号において開示され、該文献は本明細書中に援用される。
【００４０】
アルファウイルスが、南アフリカ・アルボウイルスＮｏ.８６(Ｓ.Ａ.ＡＲ８６)である場合、適切な弱毒化突然変異は、以下の
ｎｓＰ１アミノ酸位５３８でのコドンであって、弱毒化アミノ酸、好ましくはイソロイシンをｎｓＰ１アミノ酸５３８として指定するコドン；
Ｅ２アミノ酸位３０４でのコドンであって、弱毒化アミノ酸、好ましくはスレオニンをＥ２アミノ酸３０４として指定するコドン；
Ｅ２アミノ酸位３１４でのコドンであって、弱毒化アミノ酸、好ましくはリジンをＥ２アミノ酸３１４として指定するコドン；
Ｅ２アミノ酸位３７６でのコドンであって、弱毒化アミノ酸、好ましくはアラニンをＥ２アミノ酸３７６として指定するコドン；
Ｅ２アミノ酸位３７２でのコドンであって、弱毒化アミノ酸、好ましくはロイシンをＥ２アミノ酸３７２として指定するコドン；
ｎｓＰ２アミノ酸位９６でのコドンであって、弱毒化アミノ酸、好ましくはグリシンをｎｓＰ２アミノ酸９６として指定するコドン；及び
ｎｓＰ２アミノ酸位３７２でのコドンであって、弱毒化アミノ酸、好ましくはバリンをｎｓＰ２アミノ酸３７２として指定するコドン；
からなる群から選ばれうる。別のアルファウイルスが使用される実施態様に有用な適切な弱毒化突然変異は、当業者に周知である。
【００４１】
弱毒化突然変異は、既知の方法に従って、特定部位突然変異誘導を行うことにより核酸中に導入されうる。Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488 (1985)を参照のこと、該開示は、その全てを本明細書中に援用される。或いは、既知の方法に従って、相同性制限酵素断片を置換することにより、又は変異誘導性ポリメラーゼ・チェーン反応方法により、突然変異は核酸中へ導入されうる。
【００４２】
ＡＲＰｓを生成する際に使用されるヘルパー核酸(単数又は複数)及びレプリコンＲＮＡが作られたなら、望ましくは電気穿孔によりそれらは適切な宿主細胞中へ導入される。比較的高い細胞密度で行われる電気穿孔は、ヘルパー核酸とウイルス・レプリコンＲＮＡの効果的な取り込みが可能になるということを、本発明者が発見した。ヘルパー及びレプリコン核酸は、電気穿孔における使用、又はＡＲＰ生成のため核酸を細胞に導入する別のプロトコルにおける使用のため精製されるべきであるが、ヘルパーＲＮＡはキャップされる必要はない。
【００４３】
感染性ウイルス粒子を細胞中に生成するステップは、慣用の技術を使用して行われうる。例えばDavis et al.,に対する米国特許第5,185,440号、Bioption AB,に対するPCT公開WO 92/10578、及びTemin et al.,に対する米国特許第4,650,764号を参照のこと。(しかし、Temin et al.,は、アルファウイルスよりむしろレトロウイルスに関する)。感染性ウイルス粒子は、本明細書中に記載される方法及び/又は慣用の粒子回収技術により改良される標準細胞培養成長技術、或いは本明細書中以下に記載される塩洗浄方法により精製されうる。塩洗浄液は、特に特定の表面荷電がＡＲＰ表面上に存在するとき、ＡＲＰ回収を改良するようである。ＶＥＥの場合では、Ｅ２＝３０９及びＥ２-１２-でのアミノ酸残基は、正の荷電を作り出す良好の部位を提供する。
【００４４】
ウイルス・レプリコンＲＮＡは、プロモーター並びに他の配列であってＡＲＰｓが導入されそして発現される予定の宿主細胞におけるコード配列の転写及び翻訳発現に必要とされる配列に発現可能なように結合される複数の異種性コード配列をコードする。
【００４５】
明細書中に記載されるアミノ酸配列中のアミノ酸の全ては、当該技術分野においてルーチンに使用される通常の３文字及び１文字表記を有する：Ａ、Ａｌａ、アラニン；Ｃ、Ｃｙｓ、システイン；Ｄ、Ａｓｐ、アスパラギン酸；Ｅ、Ｇｌｕ、グルタミン酸；Ｆ、Ｐｈｅ、フェニルアラニン；Ｇ、Ｇｌｙ、グリシン；Ｈ、Ｈｉｓ、ヒスチジン；Ｉ、Ｉｌｅ、イソロイシン；Ｋ、Ｌｙｓ、リジン；Ｌ、Ｌｅｕ、ロイシン；Ｍ、Ｍｅｔ、メチオニン；Ｎ、Ａｓｎ、アスパラギン；Ｐ、Ｐｒｏ、プロリン；Ｑ、Ｇｌｎ、グルタミン；Ｒ、Ａｒｇ、アルギニン；Ｓ、Ｓｅｒ、セリン；Ｔ、Ｔｈｒ、スレオニン；Ｖ、Ｖａｌ、Ｖａバリン；Ｗ、Ｔｒｙ、トリプトファン；Ｙ、Ｔｙｒ、チロシン。
【００４６】
本明細書中で使用されるとき、特定の配列により起こる「発現」は、付随された下流配列の転写である。適切でありかつ付随される配列が所望されるなら、ここで発現という用語はまた、転写されたＲＮＡの翻訳(タンパク質合成)も包含する。或いは、異なる配列は、転写及び翻訳させるために使用されうる。
【００４７】
ゲノムＤＮＡ(ここで遺伝子は、イントロンにより遮られておらず、及び/又はここでこれは、高度に繰り返され、又は発現されない配列に充てられている大部分のゲノムではない)又はｃＤＮＡは、適切に調製されたウイルス・ベクター核酸調製品へとクローン化されて、組換えベクター核酸調製品を生成する。組換えベクター核酸調製品は、組換えベクター核酸を感染性粒子にパッケージングを可能にする細胞中へ導入される。組換えベクター核酸調製品は、ヘルパー核酸、ＲＮＡ若しくはＤＮＡと共にパッケージングするために、例えば電気穿孔混合液１ｍｌあたり約１０7〜約１０9細胞の比較的高い細胞密度で、細胞へと電気穿孔して入れられる。細胞を次に成長培地中で培養して、組換えベクター核酸をウイルス・レプリコン粒子にパッケージングすることを可能にした。
【００４８】
ＡＲＰｓが塩洗浄により細胞から回収された後に、望ましくは細胞遊離上清から回収された後に、ＡＲＰｓは、イオン交換クロマトグラフィーにより部分的に精製される。
【００４９】
本発明の方法は、アルファウイルス由来、好ましくは弱毒化アルファウイルス由来のウイルス・レプリコン核酸へと有利に適用される。特に好ましいアルファウイルスは、ベネズエラ・ウマ脳炎ウイルス(ＶＥＥ)である。特別に例示される弱毒化ＶＥＥは、３０１４株であり、該ウイルス又はそれら由来のＡＲＰｓは、ヘパリン・アフィニティー・クロマトグラフィーを使用して精製されうる。ＶＥＥ３０４２株は、ＡＲＰ方法における使用に適した別の弱毒化ウイルスであるが、ウイルス又はそれ由来のＡＲＰｓの外皮は、ヘパリン・アフィニティー・クロマトグラフィーを使用して精製することができない。該ウイルス又はそれ由来のＡＲＰｓは、グリコサミノグリカン-結合性能力を与える突然変異を有し、塩洗浄ステップを使用する精製に特によく適しており、そしてそれらはヘパリン・アフィニティー・クロマトグラフィーを使用してさらに精製されうる。
【００５０】
本発明の方法において使用するために細胞が獲得される癌(新生物病)は、癌種、肉腫、白血病、及び神経系細胞由来の癌を含む。これらは、非限定的に脳腫瘍、例えば星状細胞腫、乏突起細胞腫、上衣細胞腫、髄芽細胞腫、及び未分化神経外胚葉性腫瘍(ＰＮＥＴ); 膵臓腫瘍、例えば膵管腺癌；肺腫瘍、例えば小細胞及び大細胞腺癌、扁平上皮癌及び細気管支肺胞上皮癌；大腸腫瘍、例えば上皮性腺癌、及びこれらの癌の肝臓転移；肝腫瘍、例えば肝細胞腫及び胆管癌;乳房腫瘍、例えば導管腺癌及び小葉腺癌; 婦人科腫瘍、例えば扁平上皮乳糖腫及び子宮頚部腺癌、及び子宮及び卵巣上皮性腺癌;前立腺腫瘍、例えば前立腺癌;膀胱腫瘍、例えば、移行性、扁平上皮癌;網内系(RES)の腫瘍、例えばＢ及びＴ細胞リンパ腫(結節性及び拡散性)、形質細胞腫及び急性及び慢性白血病;皮膚腫瘍、例えば黒色腫;及び軟部組織腫瘍、例えば軟部組織肉腫及び平滑筋肉腫を含む。
【００５１】
単数形又は複数形で使用される「新生物細胞」、「腫瘍細胞」、又は「癌細胞」は、宿主生物にとって有害となる悪性化した細胞のことを指す。原発性癌細胞(つまり悪性化部位の近くから取られた細胞)は、良く確立された技術、特に組織学的試験により、非癌細胞からたやすく区別され得うる。本明細書中で使用される癌細胞の定義は、非限定的に原発癌細胞だけではなく、癌原細胞由来のいずれの細胞を含む。癌細胞の定義は、転移癌細胞を含み、並びに癌細胞由来のin vitro培養細胞及び細胞系列を含む。通常固形癌として症状を示す癌のタイプについていうとき、「臨床的に検出できる腫瘍」は、例えばＣＡＴスキャン、磁気共鳴影像法(ＭＲＩ)、Ｘ線、超音波、又は触診などの方法により、腫瘤の基準に基いて検出できる腫瘍である。生化学的、又は免疫学的発見のみでは、この定義に適合するためには不十分である。
【００５２】
多抗原免疫学的応答が有利である病原体は、ウイルス、細菌、真菌、及び原生動物病原体を含む。免疫が所望されるウイルスは、非限定的に出血熱ウイルス(例えばエボラウイルス)、免疫不全ウイルス(例えばネコ又はヒト免疫不全症ウイルス)、ヘルペスウイルス、コロナウイルス、アデノウイルス、ポックスウイルス、レトロウイルス、アフトウイルス、ノダウイルス、ピコルナウイルス、オルトミクソウイルス、パラミクソウイルス、風疹、トガウイルス、フラビウイルス、ブンヤウイルス、レオウイルス、発癌性ウイルス、例えばレトロウイルス、病原性アルファウイルス(例えば、セムリキ森林ウイルス又はシンドビスウイルス)、ライノウイルス、肝炎ウイルス(グループＢ、Ｃなど)、インフルエンザウイルスを特に含む。免疫応答が役立つ細菌性病原体は、非限定的に、ブドウ球菌(staphylococci)、連鎖球菌(streptococci)、肺炎球菌(pneumococci)、サルモネラ(salmonellae)、大腸菌(escherichiae)、エルシニア(yersiniae)、腸球菌(enterococci)、クロストリジウム(clostridia)、コリネバクテリウム(corynebacteria)、ヘモフィルス(hemophilus)、ナイセリア(neisseriae)、バクテロイデス(bacteroides)、フランシセラ(francisella)、パスツレラ(pasteurellae)、ブルセラ菌(brucellae)、マイコバクテリウム(mycobacteriae)、ボルデテラ(bordetella)、スピロヘータ(spirochetes)、放線菌(actinomycetes)、クラミジア(clamydiae)、マイコプラズマ(mycoplasmas)、リケッチア(rickettsiae)などを含む。関心の病原性菌類は、非限定的にカンジダ、クリプトコッカス(cryptococci)、ブラストミセス(blastomyces)、ヒストプラスマ(histoplasma)、コクシジオイデス(coccidiodes)、藻菌類(phycomycetes)、トリコデルマ(trichodermas)、コウジカビ(aspergilli)、ニューモシスティス(pneumocystis)などを含む。免疫が有用である原生動物は、非限定的に、トキソプラズマ(toxoplasma)、プラスモディア(plasmodia)、住吸血虫(schistosomes)、アメーバ(amoebae)、ジルアジア(giardia)、バベシア(babesia)、レーシュマニア(leishmania)などを含む。他の寄生生物は、回虫、鉤中及びサナダムシ、糸状虫を含む。
【００５３】
本アルファウイルス・レプリコン・ベクター技術の長所の１つは、１以上の外来遺伝子を発現する能力である。現在までに、アルファウイルス・レプリコンワクチンは、単一又は一握りの異種性遺伝子の発現に限られてきた。この１以上の異種性遺伝子を発現する能力は、各個々の遺伝子発現をさせる複数のプロモーター単位を付加することを通して達成された。レプリコン・ベクターが持ち運ぶことができる異種性遺伝子の数は、キャプシド構造が収容できる核酸の量に限りがあるキャプシド構造により、最終的に制限される。２又は３個の抗原を発現するシングル・レプリコンについての代わりの戦略は、個々のアルファウイルス・レプリコン粒子の混合物を投与することであり、該粒子各々は複数抗原及び／又は本明細書中に記載される病原菌に対して免疫応答を誘発するための異なる抗原をコードしそして発現する。今日までに、これらのアプローチは、マルチ・プロモーター又は混合物レプリコン・セットのいずれにおいても、同時に数個(〜３)の抗原発現に限られた。
【００５４】
しかしながら、本明細書中に記載されるアルファウイルス・レプリコン粒子を生成する方法技術における最近の改良は、同じワクチン調製品中の複数抗原に対するワクチンの新たな機会についてドアを開けた。方法の改良は、高細胞密度電気穿孔法(５×１０7〜１.５×１０8細胞／ｍｌの電気穿孔液)と塩洗浄技術に基いた。別の改良は、電気穿孔混合液におけるキャップなし(又はキャップあり)ＲＮＡ分子又はＤＮＡ分子の使用を含む。これらの改良からの収量は、２〜３桁の大きさで増加された(１回のキュベット電気穿孔から１０11i.u.が生成される)。従来技術を超えるレプリコン生成の効率の有意な増加は、規模の観点から以前は実行できなかった多くのワクチン・アプローチが現在では可能であるということを意味する。本明細書中において、及び参照される仮出願において開示される方法を使用して達成されうる収量によって、ウイルス・レプリコン核酸中に挿入される核酸が調製された腫瘍、腫瘍細胞、病原体、又は寄生生物により発現される抗原の全長を発現するＡＲＰｓの生成が理論的に可能になる。
【００５５】
一のそうしたアプローチは「患者特異的ワクチン」であり、ここではシングル・ワクチン調製品は、感染性疾患又は新生物病、例えば癌の予防又は治療処置用に、患者毎に調製された。１の腫瘍細胞は、最大５,０００の遺伝子を発現すると見積もられているので、慣用的なアプローチを使用して数多くの遺伝子を発現するアルファウイルス・レプリコン腫瘍ライブラリー・ワクチンを作り出すいずれの試みも、各遺伝子を発現するレプリコンの数の点でかなり限られていた。さらに、粒子は臨床セットにおける投与及び製剤に適したものにするために精製を必要とし、そして精製はタイターのかなりの欠失をもたらすことが多い。改良されたＡＲＰ生成技術を使用して、我々は現在、レプリコンの集合を作り出すことができ、該集合では、全部ではないが多くの腫瘍細胞由来遺伝子は、１×１０5個の粒子の集合において、平均して少なくとも一回提示されるようである。このアプローチからの高い収量に加えて、該方法は感染ユニット基準あたりの純度の高い製剤を提供しうる。これは、次の精製ステップが必要とされなくなりうることを意味し、こうして次の過程での損失を妨げる。付け加えて、増大された純度は、宿主における抗ベクター及び抗汚染物質免疫応答を誘発する危険性を低減しうる。通常、そうした応答は、追加ワクチン接種の有効性を潜在的に妨げるか、又は危うくする。治療腫瘍処置などのアプローチでは、高タイター・ワクチンを純度の高い製剤中に頻繁にデリバリーする能力は、ワクチンの主要な望ましい特徴である。本発明は、アルファウイルス・レプリコン・ベクターを使用して行われる新規の多抗原性ライブラリー・アプローチを可能にする。これらのライブラリーは、多抗原、又は病原性生物、寄生生物、又は腫瘍細胞由来の遺伝子レパートリーの全部をコードしうる。
【００５６】
ＡＲＰ生成のための、細胞への導入用核酸を作り出すために使用される先行技術の方法は、高価でありかつ労力がかかる一方、本開示は、改良されたＡＲＰ収量を達成するための種々のパラメーターの改変を記載し、その上方法の単純化、そして桁違いにＡＲＰあたりの値段の低減を記載する。改良されたアルファウイルス粒子収量は、腫瘍細胞、病原体、又は寄生生物由来の核酸のアルファウイルス・レプリコン核酸へのクローニング、並びに十分な効率でパッケージングすることを可能にし、その結果、腫瘍細胞、病原体、又は寄生生物抗原の代表的なセットは、ＡＲＰ「発現ライブラリー」により生成される。ヒト又は動物患者が一定量のそうしたＡＲＰ調製品であって、場合によりさらに免疫学的アジュバントを含む調製品で接種されて、その結果、患者に投与された調製品及びＡＲＰライブラリー内にコードされる複数の抗原決定要因に対して免疫応答が作られるように、ＡＲＰｓの収量は、十分に高い。
【００５７】
表１は、ｃＤＮＡのプールから生成される多抗原性ＡＲＰのタイターを示す。１０個の異なる異種性遺伝子(クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ(ＣＡＴ)、β-ガラクトシダーゼ(β-ｇａｌ)、Ｒａｔ／Ｎｅｕ腫瘍遺伝子、ルシフェラーゼ、ＨＩＶ・Ｇａｇ、癌抗原Ａ、及び４種のマラリア抗原：ＰＰｋＭＳＰ１-４２、ＰｙＨｅｐ１７、ＰｆＡＭＡ１、及びＰｋＣＳＰ)を発現するアルファウイルス・レプリコン・コンストラクトをＮｏｔ１制限エンドヌクレアーゼで直線化し、プールし、そしてＲＮＡ転写産物は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを使用して作成された。ＲＮＡ分子のプールは、アルファウイルス・キャプシド及び糖タンパク質ヘルパー・ＲＮＡｓと、ベロ(ＶＥＲＯ)細胞中に共-電気穿孔されて、各遺伝子産物に特異的な免疫蛍光アッセイを使用するＡＲＰタイター決定により、１０個の異なる抗原を発現する個々のＡＲＰからなるＡＲＰの集団を生成した。
【００５８】
表２は、ＲＮＡｓのプールから生成される多抗原性ＲＡＰのタイターを示す。７個の異なる異種性遺伝子(ＣＭＶ ＩＥ１、ＣＭＶ ｇＢ、インフルエンザ、ＨＡ、ＨＩＶ・Ｐｏｌ、ＨＩＶ・Ｇａｐ、Ｒａｔ／ｎｅｕ、ＣＡＴ)を発現するアルファウイルス・レプリコン・コンストラクトは、Ｎｏｔ１制限酵素エンドヌクレアーゼで個々に直線化した。各レプリコンについてのＲＮＡ転写産物は、Ｔ７ＲＮＡ・ポリメラーゼを使用して作成された。７個の異なるＲＮＡ転写産物は、等濃度で混合されて、そしてアルファウイルス・キャプシド及び糖タンパク質ヘルパーＲＮＡと共に電気穿孔された。各遺伝子産物に特異的な免疫蛍光アッセイを使用するＡＲＰタイター決定により測定されるとき、７個の異なる抗原全てを発現するＡＲＰの集合を作成した。
【００５９】
表３は、(図１に示される)多抗原性ＡＲＰでワクチン接種された動物にける抗原特異的免疫応答の要約を提供する。液性免疫形態における抗原特異的免疫応答は、ＥＬＩＳＡにより測定されて、そして逆数幾何平均として表され、或いはウエスタンブロット又はＩＦＡにより測定されて、抗原特異的シグナルが検出できる最も低い希釈度として示された。細胞性免疫形態における抗原特異的免疫応答は、ＩＦＮ-γ分泌細胞のＥＬＩＳＰＯＴ検出により測定され、そして１０6リンパ球あたりの抗原特異的ＩＦＮ-ガンマ分泌リンパ球として表された。ｓ.ｃ.又はｉ.ｐ.経路の接種により、多抗原性ＡＲＰ調製品を受ける動物は、該調製品中の全ての抗原に対する免疫応答を増大した。ポジティブ・コントロールとして、ＨＩＶ-Ｇａｇ・ＡＲＰを受けた一の群は、Ｇａｇに対してのみ特異的な免疫応答を高めた。ネガティブ・コントロールの動物は、いずれの抗原に対する検出できる応答を有さなかった。多くのサンプルは、終点でタイターを調べておらず、そして得られた値より大きいか又は同等のタイターとして表される。多抗原性調製品の一部としてＨＩＶ・Ｇａｇ遺伝子タンパク質に対して誘発された免疫応答は、１つの(単一の)標準調製品として与えられたＨＩＶ・Ｇａｐタンパク質と比較して、液性及び細胞性基準に関して同等であった。このことによって、より大きい発現ライブラリーの構成要素として発現されたコード配列は、本発明の組成物及び方法を使用して効果的に免疫原性でありうるということが示された。
【００６０】
腫瘍細胞、病原体、又は寄生生物の複数の抗原性決定要素をコードする発現性のヌクレオチド配列を含む免疫学的ＡＲＰ調製品は、予防投与計画の一部として、つまり製剤が投与されるヒト又は動物が、新生物病、病原体感染、又は寄生生物感染を患う可能性を低減するために、投与されうるか、或いは治療用投与計画として、つまり存在する新生物病、病原体感染、又は寄生生物感染に付随するいずれの病気の重篤度を低減するために、又は調製品が投与されたヒト又は動物において作リ出された免疫応答のため、新生物病、病原体感染又は寄生生物感染を防ぐように投与される。
【００６１】
免疫応答の生成が、腫瘍細胞(又は新生物病)、病原体、又は寄生生物に対する少なくても幾つかのレベルの防御免疫を含む一方で、そうした新生物病又は寄生生物若しくは病原体での感染を患う患者における臨床結果は、当該技術分野に知られる適切な化学治療剤で患者を治療することによっても改良されうる。病原体がウイルスで或る場合、アシクロビルなどの抗ウイルス化合物は、例えばヘルペスウイルス感染を患う患者においてＡＲＰワクチンと同時に、又はＨＩＶに感染された個人においてＨＡＡＲＴ(高活性抗レトロウイルス療法)と同時に投与されうる。病原体が細菌病原体である場合、細菌が感受性である抗生物質は、望ましくは投与され、そして病原体が真菌である場合は、適切な抗真菌抗生物質が望ましくは投与される。同様に、寄生生物感染の制御及び/又は根絶用の化学薬剤は知られており、そして当該技術分野に既知の投与量及び投与計画を使用してヒト又は動物患者に有利に投与される。患者が新生物病、例えば癌を患う場合、ＡＲＰｓが投与された患者において多数の癌関連抗原を発現することができるＡＲＰｓを含む免疫原性組成物の投与は、望ましくは抗新生物薬剤(単数又は複数)の投与を伴う。該抗新生物薬剤(単数又は複数)は、非限定的に、ダウノルビシン、タキソール、チオ尿素(thioureas)、治療用放射性核種を結合された癌特異的抗体を含む。但し、該薬剤(単数又は複数)は、投与されたＡＲＰｓ及び患者において発現した抗原に対して、患者が免疫応答を作り出す能力を失わせてはならない。
【００６２】
ワクチン又は別の免疫原性組成物などの本発明の医薬製剤は、免疫原性量の感染性伝播欠損性アルファウイルス・レプリコン粒子を、医薬として許容される担体と組み合わせて含む。「免疫原性量」は、医薬製剤が投与された対象において免疫応答を誘発するために十分な感染性アルファウイルス粒子の量である。投与量あたりの約１０1〜約１０10、好ましくは１０5〜１０8の感染ユニットの量が適切であると信じられ、治療される対象の年齢及び種によって左右される。典型的な医薬として許容される担体は、非限定的にパイロジェン-フリー滅菌水及びパイロジェン-フリー滅菌生理食塩水を含む。免疫原性量の本発明の感染性伝播欠損アルファウイルス粒子を投与された対象は、非限定的にヒト及び動物(例えば、犬、ネコ、ウマ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ウサギ、ロバ、マウス、ハムスター、サル)対象を含む。免疫学的に活性な化合物、例えばサイトカイン及び/又はＢＣＧは、投与されたウイルス・レプリコン粒子調製品に対する免疫応答を増大するために加えられうる。投与は、腫瘍内、腹腔内、筋肉内、皮内、鼻腔内、経膣、経直腸、皮下、又は静脈内投与のいずれかのなどの適切な方法により行われうる。
【００６３】
本発明の方法を使用して生成される(該組成物がヒト又は動物に投与されるとき、関心の抗原を発現させる)ＡＲＰｓを含む免疫原性組成物は、当該技術分野に周知の方法のいずれかにより剤形されうる。そうした組成物、特にワクチンは、典型的には注射液として、液体溶液又は懸濁液のいずれかとして調製される。固体形態、例えば注射の前に液体中へ溶解若しくは懸濁することに適した凍結乾燥調製品を形成する。
【００６４】
活性免疫原性成分(ＡＲＰｓ)は、医薬として許容されかつ活性成分と適合性のある賦形剤又は担体と混合されることが多い。適切な賦形剤は、非限定的に滅菌水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール、又はそのような物並びにそれらの組合せを含む。
【００６５】
さらに、所望されるならば、前記ワクチンは、少量の補助物質、例えば湿潤剤又は乳濁剤、ｐＨ緩衝剤、及び/又はワクチンの有効性を高めるアジュバントを含みうる。効率的でありうるアジュバントの例は、非限定的に、水酸化アルミニウム；Ｎ-アセチル-ムラミル-Ｌ-スレオニル-Ｄ-イソグルタミン(ｔｈｒ-ＭＤＰ)；Ｎ-アセチル-ノル-ムラミル-Ｌ-アラニル-Ｄ-イソグルタミン(ＣＧＰ１１６３７、ｎｏｒ-ＭＤＰと呼ばれる)；Ｎ-アセチルムラミル-Ｌ-アラニル-Ｄ-イソグルタミニル-Ｌ-アラニン-２-(１’-２'-ジパルミトイル-ｓｎ-グリセロ-３ヒドロキシホスホリルオキシ)-エチルアミン(ＣＧＰ１９８３５Ａ、ＭＴＰ-ＰＥと呼ばれる);及び細菌から抽出された三種の構成要素：モノホスホリル・リピドＡ、トレハロース・ジミコレート、及び細胞壁骨格(ＭＰＬ+ＴＤＭ+ＣＷＳ)を、２％スクアレン/トゥィーン８０中に含むＲＩＢＩを含む。アジュバントの有効性は、種々のアジュバントを含むワクチン中の免疫原の投与から得られるＡＲＰ免疫原性生成物に対する抗体量を計測することにより測定されうる。当該技術分野に周知のそうしたさらなる製剤及び投与の方法は使用されうる。
【００６６】
１以上の免疫増強分子、例えばケモカイン及び/又はサイトカインは、患者又は動物に投与される免疫原性組成物中に取り込まれうる。代わりに、免疫増強分子のコード配列(単数又は複数)を含むアルファウイルス・レプリコン・ベクターは、免疫原性組成物中に取り込まれうる。ケモカイン及び/又はサイトカインの選択は、免疫応答が所望される新生物組織又は細胞、寄生生物若しくは病原体に従って変わりうる。実施例は、非限定的にインターロイキン-４、インターロイキン-１２、γ-インターフェロン、顆粒球マクロファージ・コロニー刺激因子、及びＦＬＴ-３リガンドを含みうる。
【００６７】
免疫原性の(又はそうでなければ、生理的に活性な)ＡＲＰを含む組成物は、投与剤形と適合性のある方式で、並びに予防及び/又は治療有効であるそうした量で投与される。投与される量は、投与量において一般的に約１０1〜約１０10、好ましくは１０5〜１０8感染ユニットの範囲であり、治療される対象、抗体を合成するための個人の免疫系の容量、及び所望される防御の程度に左右される。投与されるために必要とされる活性成分の正確な量は、医師、獣医師、又は別の保健従事者の判断に左右され、そして各個人について固有であるが、そうした決定はそうした従事者の技術の範囲内である。
【００６８】
ワクチン又は別の免疫原性組成物は、１回投与又は複数回投与計画において与えられうる。複数回投与計画は、ワクチンの初回治療コースが１〜１０又はそれを超える分けられた投与、続いて免疫応答を維持及び/又は増強するために必要とされる時間期間、例えば毎週、毎月、又は２回目の投与として１〜４ヶ月目で投与される投与、そして必要とされるなら、さらに数ヶ月/数年後の次の投与(単数又は複数)を含みうる計画である。
【００６９】
クローニング、ＤＮＡ単離、増幅及び精製について、並びにＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、制限エンドヌクレアーゼなどを含む酵素反応についての標準技術、そして種々の分離技術は、当業者に知られ、そして通常に使用される。標準技術の多くは、Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, New York; Maniatis et al.(1982) Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, New York; Wu (ed.) (1993) Meth. Enzymol. 218, Part I ; Wu (ed.) (1979) Meth. Enzymol. 68; Wu et al. (eds.) (1983) Meth. Enzymol. 100 and 101; Grossman and Moldave (eds.) Meth. Enzymol. 65; Miller (ed.) (1972) Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York; Old and Primrose (1981) Principles of Gene Manipulation, University of California Press, Berkeley; Schleif and Wensink (1982) Practical Methods in Molecular Biology ; Glover (ed.) (1985) DNA Cloning Vol.I and II, IRL Press, Oxford, UK; Hames and Higgins (eds.) (1985) Nucleic Acid Hybridization, IRL Press, Oxford, UK; Setlow and Hollaender (1979) Genetic Engineering : Principles and Methods, Vols. 1-4, Plenum Press, New York; and Ausubel et al. (1992) Current Protocols in Molecular Biology, Greene/Wiley, New York, NY.において記載される。使用される略記及び命名法は、当該技術分野に標準なものとみなされ、そして本明細書中で引用する専門論文において通常使用されている。
【００７０】
本出願中に引用される全ての参考文献は、本開示と矛盾がない程度にその全てを本明細書中に援用される。
【００７１】
以下の実施例は、例示の目的に提供され、そして本明細書中に特許請求される発明の範囲を制限することを意図しない。例示的な物品のいずれの変動であって、当業者が思いつくものは、本発明の範囲内に含まれることが意図される。
【実施例】
【００７２】
実施例１.腫瘍関連抗原のライブラリーを発現するアルファウイルス・レプリコンベクターの作成
腫瘍細胞は、典型的に切除、生検、又は内視鏡的サンプリングにより癌患者から取得される。細胞は、直接使用され、冷凍保存され、又は培養液中で維持され又は拡大された。ＲＮＡは、当該技術分野に周知の標準方法、例えば、市販の試薬及びキット、例えばトライゾル(Sigma, St. Louis, MO)又はＳ.Ｎ.Ａ.Ｐ.トータルＲＮＡアイソレーション・キット(S. N. A. P. total RNA isolation kit)(Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA)を使用し、続いてオリゴ(ｄＴ)-セファロース上でｍＲＮＡを精製することにより、腫瘍細胞から抽出された。ｍＲＮＡは、さらにサブトラクティブ・ハイブリダイゼーション又は当該技術分野に周知の別の方法により腫瘍特異的配列においてさらに濃縮されうる。ファーストストランドｃＤＮＡは、稀な制限酵素部位を５’末端に有するオリゴ(ｄＴ)オリゴヌクレオチドを使用して合成される。次にｃＤＮＡを精製し、セカンド・ストランドは、標準方法のいずれかを使用して、例えばＤＮＡポリメラーゼＩ-ＲｎａｓｅＨ又は非特異増幅を使用して生成される。アダプターは次にライゲーションされて、接着性末端を作り出し、そして二重鎖ＤＮＡは、オリゴ(ｄＴ)プライマー中に取り込まれた部位で、稀に認識される制限エンドヌクレアーゼ(例えばＤｒａＩ)で切断される。この方法は、ディレクショナル・クローニングに適した適合性のない接着性末端を伴う二重鎖ｃＤＮＡを作り出す。
【００７３】
或いは、実施例２(下記)に記載の戦略は、ディレクショナル・クローニングのための接着末端の作成に使用されうる。更なる実施態様では、接着性末端は、末端デオキシリボヌクレオチド・トランスフェラーゼにより結合されうる。二重鎖ｃＤＮＡは、プラスミド・レプリコン・ベクター中にクローン化され、または以下に記載の方式の１つに類似の方式でｉｎ ｖｉｔｒｏで組換えレプリコン分子を構成するために使用される。このアプローチは、３’末端上にビオチン標識及び５’末端にＴ７プロモーターを含む組換えレプリコン分子を作り出し、こうしてＴ７ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを使用して、組換え分子の選別及びｉｎ ｖｉｔｒｏでのＲＮＡの作成を可能にした。さらなる選別ステップは、腫瘍抗原ライブラリーに存在する抗原の数を「絞り込む(down-select)」ために行われる。そうしたサブトラクティブ・ハイブリダイゼーション及びディファレンシャル分析の方法は、当該技術分野に周知であり(米国特許第5,958,738号、第5,827,658号、及び第5,726,022号、及び米国出願公開2002-0018766を参照のこと)、そしてそうした選別方法は、ＶＥＥレプリコン・コンストラクト中にクローニングする直前に行われた。このアプローチは、腫瘍抗原プールを、腫瘍細胞において、過度に発現されるか又は好ましくは上方発現される遺伝子へと限定するために役に立つ。この選別は、抗原ライブラリーにおける通常細胞遺伝子の頻度及び／又は存在を低減又は削除するために役に立つ。いずれの特定の論理に拘束される事無く、更なる利益は、腫瘍関連抗原に対する免疫応答に焦点をあてる非腫瘍特異的抗原を削除する事を含むと信じられており、こうしてワクチン調製品の潜在的な特異性を最大化し、そして自己免疫応答を誘導する危険性を低減する。抗原レパートリーの「絞込み」はまた、初回―追加戦略にも関連する。多くの例では、広範囲の腫瘍抗原でワクチン接種し、そして続いて追加免疫接種において、特異的抗原について効果的に免疫系に焦点を当てるために抗原の数を制限／絞込みする事は、有利でありうる。これは、初回免疫化に続いて、どの抗原に宿主が応答したかを同定し、そして基本的に宿主が認識できると実証した抗原及び免疫応答を生じたことがある抗原に対する免疫応答を増加するために次なる各追加免疫をあつらえることに基いて、抗原を絞り込むことによって実行できる。
【００７４】
実施例２ 標的遺伝子配列が知られている場合における、感染組織又は血液のサンプルからの感染疾患生物特異的ｃＤＮＡを発現するアルファウイルス・レプリコン・ベクターの作成
遺伝子又は関心遺伝子(つまり、レプリコンにより発現される免疫原性成分をコードする遺伝子)が、周知の配列の媒介物から獲得される場合、この実施例は、急性若しくは慢性感染を患う個人に特異的なウイルス／細菌／寄生生物遺伝子レパートリーのクローニングを記載する。ｍＲＮＡは、当該技術分野に周知の標準方法、例えば、Ｓ.Ｎ.Ａ.Ｐ.トータルＲＮＡアイソレーション・キット(Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA)に従って、組織又は血液サンプルから単離される。ファースト・ストランドｃＤＮＡは、当該技術分野に周知の標準方法のいずれかにより、例えばｃＤＮＡサイクルキット(cDNA cycle kit)(Invitrogen,Inc, Carlsbad, CA)、又はＡＭＶリバース・トランスクリプターゼとランダム・プライマーを使用して合成される。関心の遺伝子(単数又は複数)は、標的遺伝子特異的プライマーを使用してｃＤＮＡから増幅され、続いてアンプリコンは、ＰＣＲ精製キット(Qiagen Inc., Valencia, CA)又は当該技術分野に周知である他の別の方法を使用して精製される。当業者に周知の方法を使用して、例えばG:Cクローニング、制限エンドヌクレアーゼ・切断の後のディレクショナル・クローニング、又はゲートウェイ(Gateway)(Invitrogen, Carlsbad, CA)等のIn vitro組換え方法、又はクレ-ロックス(Cre-lox)組換えシステムを使用して、アンプリコンは、ＶＥＥレプリコン中へクローン化される。
【００７５】
好ましい実施態様では、関心のコード配列(単数又は複数)は、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド・オリゴヌクレオチドを使用して増幅される。増幅に続いて、ＤＮＡアンプリコンは、ＮａＯＨで処理されて、プライマーのＲＮＡ成分を切断し、或いは希土類金属元素の存在下で５０℃でインキュベーションして、ライゲーションに必要とされる３’突出部を作り出すために、デオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチドの間のホスホジエステル結合を選択的に加水分解した(Chen et al., 2000, Biotechniques; 28 (3): 498-500,504-5 and Chen et al., 2002, Biotechniques, 32: 516,518-20)。 ベクター配列における相補的な３’突出部は、類似の様式で作られるか、又は制限エンドヌクレアーゼを使用する事により作られる。この方式では、レプリコン分子の２個の断片：左腕(left arm)及び右腕(right arm)が調製される。左腕は、VEE特異的配列に発現可能なように結合されるT7プロモーターを含み、該左腕は、使い勝手の良いクローニング部位の上流に存在するか、及び該部位を含む。右腕は、VEEの３’非翻訳領域を含む。右腕はまた、３’末端にビオチン標識を含む。増幅された３’突出部を含む断片は、Ｔ４ＤＮＡライゲースを使用して、ベクターの左及び右腕に結合される。集められた分子は、磁性を帯びたストレプトアビジン被膜ビーズ又は、他の別の類似の固相吸着技術を使用してライゲーション反応混合液から分離される。全長レプリコンＲＮＡは、Ｔ７ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを使用するin vitro翻訳により、精製組換えベクターＤＮＡから生成される。当該ステップは、全長組換え分子の生成のみをもたらす。なぜなら不完全な分子はストレプとアビジンに結合しないか、又はＴ７プロモーター配列を欠如するため翻訳されないからである。得られた組換えレプリコンＲＮＡ分子は、患者において感染性である標的の遺伝子型を表す標的遺伝子(単数又は複数)の包括的なレパートリーをコードする。この方法の利点は、個人由来の特定の遺伝子集合についてのすべてのバリアントを提示する能力であり、例えば、上記で概略を示した方法を使用して、ＨＩＶ-１エンベロープ・ｇｐ１６０遺伝子配列の増幅は、特定の患者由来のエンベロープ・バリアントの大部分又は全てをコードするＡＲＰ集合を作り出す。患者が複数の種のウイルスで感染されるか、又は元の親循環株から派生する区別されるバリアントで感染されるならば、上記の技術は、全てのバリアントを補足し、そして該バリアントは最終ＡＲＰワクチン集合中で提示される。
【００７６】
実施例３ 標的遺伝子配列が知られていない場合における、感染された組織／血液のサンプルからの感染疾患特異的ｃＤＮＡを発現するアルファウイルス・レプリコン・ベクターの作成
該実施例は、遺伝子又は関心の遺伝子が周知の配列ではない場合におけるウイルス／細菌／寄生生物遺伝子レパートリーのクローニングを記載する。ウイルス、細菌、又は寄生生物ｍＲＮＡは、マイクローブ発現キット(MICROBExpress KIT）(Ambion, Austin, TX)又は当業者に周知の別の方法を使用して、野外標本、又は保存培養品、又は精製調製品から単離される。ファースト・ストランドｃＤＮＡは、ランダム・プライマー、又は稀な制限酵素部位を５’末端に有するランダムプライマーを使用し、続いて当業者に周知のストランド方法を使用してＤＮＡ・ポリメラーゼＩ及びＲＮａｓｅＨでセカンド・ストランドｃＤＮＡの合成を行った。二重鎖ｃＤＮＡは、続いて以下のようにアダプター又はリンカー配列のライゲーション後に、ＶＥＥベクター中にクローン化される。ｃＤＮＡが稀な制限酵素部位を含むランダム・プライマーで合成される場合、リンカーは、二重鎖ｃＤＮＡの５’末端に異なる稀な第二制限酵素切断部位を結合するために使用される。これらの２個の制限エンドヌクレアーゼでのｃＤＮＡのプールの切断は、異なる接着末端を有するｃＤＮＡの作成をもたらし、当該技術分野に知られる方法を使用してレプリコン・ベクター中にディレクショナル・クローニングをするように機能する。ｃＤＮＡが更なる固有の制限酵素部位を欠如するランダムプライマーで作成される場合、二重鎖ｃＤＮＡは、ＥｃｏＲＩメチラーゼを使用してメチル化されて、ＥｃｏＲＩ制限酵素で切断される内部の配列を保護する。ＥｃｏＲＩリンカーは、次にＴ４ＤＮＡライゲースを使用して付着され、続いてＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼで切断される。これは、接着末端を有するｃＤＮＡ断片を作り出し、該断片はレプリコン中にクローン化される。クローニング戦略は、実施例２に記載される戦略に類似しており、３’末端でビオチン標識され、そして５’末端でＴ７ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを含むレプリコン分子のプールを作成するために使用されうる。再び、以前の実施例に記載されるように、サブトラクティブ・ハイブリダイゼーション又はディフェレンシャル・ディスプレイは、腫瘍特異的アプローチに記載される方式と類似の方式で、病原体特異的遺伝子配列を正又は負に選別するためのさらなる次のスクリーニング・ステップとして使用されうる。再び、これは、全てのワクチン接種で行われ、又はワクチン接種の間宿主がモニターされる「リアルタイム」に基いて行われ、そして該ワクチンは、宿主が認識及び応答を示す抗原を含むようにあつらえられる。
【００７７】
実施例４ 多抗原性ＡＲＰパッケージング
各ＡＲＰが、一回の電気穿孔実験から異なる抗原(単数又は複数)を発現するＡＲＰｓ集合の作成は、２つの別の方式において行われる。第一方法は、１０個の異なるレプリコン・ベクター・コンストラクト由来の０.５μｇのＤＮＡを混合することからなり、ここで各々は、１の異種性のコード配列を含む(表１)。ＤＮＡは、ＮｏｔＩ制限酵素で直線化され、そしてＲＮＡは、レプリコンＤＮＡから、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼで転写された。複数レプリコンＲＮＡ転写反応液を次にＲＮＥasyカラム(Qiagen Inc., Valencia, CA)を使用して精製した。３０μｇの各々精製されたキャプシド(Ｃ)ヘルパー及び糖タンパク質(ＧＰ)ヘルパーＲＮＡと混合された３０μｇの複数-レプリコンＲＮＡを使用して、０.８ｍｌ体積キュベットにおいて、１.０×１０8ベロ細胞中に電気穿孔することにより、ＡＲＰは作られた。電気穿孔の後に、細胞を２００ｍｌのオプティプロ(OptiPro）培地(Invitrogen, Carlsbad, CA)中に懸濁し、そして４,１７５ｃｍ2培養フラスコ中に蒔いた。電気穿孔の約２６時間後、各フラスコの培地は捨てられて、そして５ｍｌの塩洗浄液(２０ｍＭ・リン酸緩衝液(ｐＨ７.３)中の１Ｍ・ＮａＣｌ)に置き換えられた。フラスコを室温で１０分間インキュベーションし、該塩洗浄液を回収し、そして０.２ミクロン・シリンジ・フィルターを通してろ過した。抗原特異的抗体を使用して標準的な免疫蛍光方法により、個々のＡＲＰのタイターをベロ細胞中で測定した。一回の電気穿孔から得られたプールにおける各ＡＲＰのタイターを表１に示す。ＡＲＰ調製品のタイターは、４.１×１０9感染ユニット／ｍｌであり、１回のキュベット電気穿孔から得られる総ＡＲＰ８.２×１０10ｉ.ｕ.をもたらした。代表的な１０抗原の全ては、ＡＲＰ集合中に存在した。この実施例は、複数の異なる抗原のみが１のＡＲＰ調製品から発現されるばかりでなく、抗原型の範囲が、広く変化されるということを示す。この調製品では、抗原は、ウイルス感染疾患起源(ＨＩＶ)由来であり、寄生生物起源(マラリア)由来であり、又は癌起源(rat/Neu及び癌抗原Ａ)並びに酵素(ＣＡＴ、ルシフェラーゼ、及びβgal)由来である。
【００７８】
第二方法は、プールとしてよりはむしろ独立して各レプリコン・ベクターのＲＮＡ転写産物を作り出すことからなった。この実験において使用された７個のレプリコン・ベクターは、表２に記載される。１０μｇづつの精製されたレプリコンＲＮＡは、３０μｇづつの精製されたＣ-ヘルパー及びＧＰ-ヘルパーＲＮＡｓと混合されて、全体として１３０μｇになった。ＲＮＡ混合液を次に１.０×１０8ベロ細胞中に電気穿孔した。電気穿孔された細胞は、２００ｍｌのオプティプロ培地中に懸濁し、そして２３００ｃｍ2培養フラスコ中に蒔いた。電気穿孔後約２４時間後、各フラスコからの培地を回収し、そして１０ｍｌの塩洗浄液で置き換えた(２０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７.３中に、１Ｍ・ＮａＣｌ)。フラスコを、室温で５分間インキュベーションし、そして塩洗浄液を回収した。培地及び塩洗浄液物質の両方を０.２ミクロン・シリンジ・フィルターを通してろ過した。培地及び塩洗浄液中の個々のＡＲＰをＩＦＡに対する抗原特異的抗体を使用して、ベロ細胞中でタイターを計測した。培地又は塩洗浄液中で見られた各ＡＲＰのタイターを、表２に示す。培地中で回復されたＡＲＰのタイターは、５.３×１０7ｉ.ｕ.／ｍｌであり、作成された総ＡＲＰ、１.１×１０10ｉ.ｕ.をもたらした(５.３×１０7ｉ.u.／ｍｌ×２００ｍｌ＝１.１×１０10ｉ.u.)。塩洗浄液中で回収されたＡＲＰのタイターは、４.０５×１０9ｉ.ｕ.／ｍｌであり、１キュベット電気穿孔あたり総ＡＲＰ８.１×１０10ｉ.ｕ.をもたらした。塩洗浄液及び培地中の物質を、混合して、全体で９.２×１０10ｉ.ｕ.のＡＲＰを得た。代表的な７個の抗原すべてが、ＡＲＰ集合中に存在した。プールされたＡＲＰは、次にハイトラップ・ヘパリンHP(HiTrap Heparin HP）５ｍｌカラム(Amersham Bioscience,Upsala Sweden)上で、動物ワクチン研究において使用するために精製された。
【００７９】
ＡＲＰ調製品は、標準安全性試験により評価されて、複製能力のあるウイルス(ＲＣＶ)が存在しないことを確かめた。簡潔に説明すると、１×１０8i. u.の各調製品を、１未満のm.o.iで一時間、ベロ細胞単層上で感染させた。１時間の感染期間の後、成長培地を細胞単層に適用し、２４時間培養した。２４時間後、上清全部を、収集し、澄まし、そして新たなベロ細胞単層にさらに４８時間適用した。複製能力のあるウイルス粒子の汚染の存在を指し示す細胞単層の細胞変性作用(ＣＰＥ)のいずれかの存在についてモニターした。全ての場合、ＲＣＶは、いずれの多抗原性ＡＲＰワクチン調製品において検出されない。
【００８０】
実施例５ 多抗原性ウイルス粒子での動物試験
５〜６週齢の雌BALB/cマウスを、Charles River Laboratoriesから購入し、そして全ての方法の前に一週間順応させた。マウスを水(逆浸透水、１ｐｐｍＣｌ)及び放射線を照射された標準げっ歯類飼料(NIH31改変及び照射)であって、１８％タンパク質、５％脂質、及び５％繊維からなる飼料を自由に与えた。マウスを静置マイクロ隔離飼育器中で、２１〜２２℃(７０-７２°Ｆ)及び４０％〜６０％湿度で、１２時間の光サイクルで飼育した。全ての動物試験を、拘束、畜産、外科手法に関して実験動物の世話と使用についてのガイドラインの勧告に応じて行った。動物の世話と使用プログラムは、ＡＡＡＬＡＣ公認のものである。
【００８１】
初回及び追加注射のために、マウスの群は、イソフロラン麻酔の元で、後足蹠に希釈剤(ＰＢＳ・１％v/vヒト血清アルブミン及び５％w/vスクロース)中の多抗原性ＡＲＰを接種した。足蹠皮下(s.c.)注射を３０.５Ｇの針及び０.１０ｍｌのハミルトン・シリンジで、各足蹠で２０μlを注射することにより行った。同じシリンジ／針により、０.１ｍｌの体積で、腹腔内(ｉ.ｐ.)接種を行った。動物を１、２３、及び４４日に接種した。血清サンプルを、イソフロラン麻酔下で眼窩後ブロック採血により、最初の接種の７日前、及び０日、３０日目及び３５日目(初回接種の後)、及び５１日目及び５６日目(追加免疫の７日及び１２日後)において得た。追加免疫後７日目で、ＩＦＮ-γＥｌｉｓｐｏｔアッセイ用に脾臓を収集した。
【００８２】
ＡＲＰ感染ベロ細胞の免疫蛍光アッセイ(ＩＦＡ)を使用して、ワクチン調製品各々の力価又は感染タイターを計測した。全てのＡＲＰワクチンは、接種の前にタイターを調べた。各々の注射の日に、残りの接種液を逆タイター測定をした。タイターを維持するために、ＡＲＰワクチン接種液は、次のワクチン接種までの間４℃で維持した。試験群は、次のワクチン調製品：１×１０8又は１×１０6ｉ.ｕ.の投与量でそれぞれ投与された高投与量及び低投与量多抗原性ＡＲＰ調製品を含んだ。単一抗原を発現する単一のＡＲＰ調製品と比較した免疫応答をモニターするコントロールとして、ＨＩＶＧａｇのみを発現するＡＲＰは、多抗原性ミックスにおけるＨＩＶ-Ｇａｇ・ＡＲＰの数と等しい投与量で投与された。ネガティブ・コントロールの動物は、希釈剤のみで偽免疫化された。
【００８３】
実施例６ 多抗原性ＡＲＰ投与後の液性及び細胞性免疫応答の計測
ＥＬＩＳＡによりＨＩＶＧａｇ特異的抗体を検出した。ＨＩＶ-１サブタイプＣアイソレートDU４２２由来の精製された組み換えヒスチジン標識された(ｈｉｓ)-ｐ５５を抗原外皮として使用した。簡潔に説明すると、ＢＨＫ細胞をｈｉｓ-ｐ５５を発現するＶＥＥレプリコンＲＮＡで形質転換し、そしてトライトン-Ｘ１００ライセートを調製した。タンパク質を金属イオンアフィニティ・クロマトグラフィーにより、供給もとの推薦に従って精製した。
【００８４】
標準間接ＥＬＩＳＡにより、５１日目(追加免疫後７日目)の血清をＧａｐ特異的抗体の存在について評価した。Ｇａｐ特異的総ＩｇＧの検出のために、ＩｇＭ、ＩｇＧ、及びＩｇＡを検出する二次ポリクローナル抗体を終点タイター測定に使用した。簡潔に書くと、９６ウェルＭａｘｉｓｏｒｐＥｌｉｓａプレート(極性分子、つまり抗体への親和性を高めるために表面を改変されたポリスチレン・マルチウェル・プレート；Nunc, Naperville, IL)を１ウェルあたり４０〜８０ｎｇ・his-p55を含むｐＨ９.６の０.０５Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液５０μｌで被膜した。プレートを接着性プラスチックでカバーし、そして４℃で一晩インキュベーションした。次の日、未結合の抗原を捨て、そしてプレートを室温で２００μｌのブロッキング緩衝液(３％w／ｖＢＳＡを含むＰＢＳ)で１時間インキュベーションした。ウェルをＰＢＳで６回洗浄し、そして５０μl／ウェルの試験血清、連続的に緩衝液(０.１％ｗ／ｖＢＳＡ及び０.０５％ｖ／ｖトウィーン２０を伴うＰＢＳ)で２倍に希釈されたものを抗原コートされたウェルへと加えた。マウス抗ｐ２４モノクローナル抗体(Zeptometrix, Buffalo, NY)は、ポジティブ・コントロールとして全てのアッセイ中に含まれた。各アッセイにおけるネガティブ・コントロールは、ブランク(血清以外の全ての試薬及び処置を含むウェル)及び出血前血清を含む。プレートを室温で１時間インキュベーションし、そして次にＰＢＳで６回洗浄した。規定の濃度に希釈緩衝液で希釈された５０μl／ウェルのアルカリホスファターゼ(AP)-共役ヤギ抗マウス-ポリ-アイソタイプ二次抗体(Sigma)を、各ウェルへと加え、そして１時間室温でインキュベーションした。ウェルを６回ＰＢＳで洗浄し、次に１００μlのｐニトロフェニル・ホスフェート(ｐＮＰＰ)基質(Sigma)を加えた。血清抗体ＥＬＩＳＡタイターを、バックグランド(ブランク・ウェル)より０.２以上の４０５ｎｍでの吸光度を与える最大血清希釈度の逆数として定義した。ポジティブ抗体(免疫)反応を、多抗原性ＡＲＰ調製品でワクチン接種されたマウス及びＡＲＰ・ＨＩＶ-Ｇａｇを受けたマウスにおいて検出した。
【００８５】
Ｇａｇ及びＰｏｌ抗原特異的インターフェロン-γ(ＩＦＮ-γ)分泌細胞は、ＩＦＮ-γＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより検出される。ＡＲＰ免疫化されたＢＡＬＢ／ｃマウス由来の脾臓リンパ球の単一細胞懸濁液は、Ｒ１０培地(１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、０.１ｍＭ・ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液、０.０１Ｍ・ＨＥＰＥＳ、２ｍＭグルタミン及び１０％熱不活化ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ培地１６４０)中で脾臓被膜を物理的に破壊することにより調製される。リンパ球は、リンフォライトＭ(Lympholyte M)密度勾配遠心(Accurate Scientific, Westbury, NY）により単離し、２回洗浄し、そして新たなＲ１０培地中に再懸濁した。未分離の脾臓リンパ球集合全体を試験した。
【００８６】
マウスＩＦＮ-γＥＬＩＳＰＯＴキット(Monoclonal Antibody Technology, Nacka, Sweden)を使用して該アッセイを行った。生細胞を、抗ＩＦＮ-γモノクローナル抗体で前もってコートされたマルチスクリーン・イモビロン-Ｐ ＥＬＩＳＰＯＴプレート(高タンパク質結合ＰＶＤＦ膜を備えるＥＬＩＳＰＯＴ認定９６ウェルろ過プレート；Millipore, Bilerica, MA)中の個々のＥＬＩＳＰＯＴウェル中に蒔き、１６〜２０時間インキュベーションした。細胞を、緩衝液で複数回洗浄することにより取り除き、そしてウェルをビオチン化抗ＩＦＮ-γモノクローナル抗体でインキュベーションし、続いて洗浄しそしてアビジン-ペルオキシダーゼ複合体(Vectastain ABC Peroxidase Kit, Vector Laboratories, Burlingame, CA)とインキュベーションした。インキュベーションに続いて、ウェルを洗浄し、そして室温で４分間基質 (Avidin-Peroxidase Complex tablets, Sigma, St. Louis, MO) とインキュベーションして、スポットを形成させた。該スポットは、培養の間ＩＦＮ-γを分泌する個々の細胞の位置を表す。Zeiss KS ELISPOTシステムで自動化分析により、プレートを調べ列挙した。
【００８７】
HIV・GAG・ARP及びgagを発現する多抗原性ＨＩＶ・ＡＲＰコンストラクトで免疫化されたマウスからのリンパ球においてＧａｇ特異的ＩＦＮ-γ分泌細胞を数え上げるため、リンパ球は、免疫優勢ＣＤ８・Ｈ-２Ｋd-制限酵素処理ＨＩＶ-Ｇａｇペプチド、又は無関係のＮｅｆペプチド・プール(Ｎｅｆペプチドは、クレードＣ・ＨＩＶ・ＤＵ151株から作られた １１により重なり合う１０ １５merを含む)で(５％ＣＯ2、３７℃で)１６〜２０時間刺激された。Ｇａｇペプチドを、１０μｇ／ｍｌで試験し、そしてＮｅｆコントロールを２０μｇ／ｍｌで試験した。細胞からペプチドを引いたものは、バックグラウンド・コントロールとして役に立つ。ポジティブ・コントロールとして、細胞を同じくらいの時間４μｇ／ｍｌのコンカナバリンＡで刺激した。ペプチドを合成し、そして＞９０％に精製した(New England Peptide, Gardner, MA).
【００８８】
Ｐｏｌを発現する多抗原性ＡＲＰコンストラクトで免疫化されたマウス由来のリンパ球において、Ｐｏｌ特異的ＩＦＮ-γ分泌細胞を数え上げるため、上記プロトコルを以下の改変を伴って使用された。ＣＤ８及びＣＤ４Ｔ細胞に対するＨＩＶ-１・Ｐｏｌエピトープは、最近Ｈ-２ｄバックグラウンド(Casimiro et al., J. Virology 76: 185, 2002)において最近同定された。細胞集合は、３Ｐｏｌエピトープを含むペプチド・プール並びにネガティブ・コントロールとして無関係の抗原ペプチド・プール(nefプール)で刺激された。以下の３個のペプチドは、周知のマウスＰｏｌＣＴＬエピトープを同定するために、文献検索後に選ばれた。
ＶＹＹＤＰＳＫＤＬＩＡ(配列番号：１)(Casimiro et al, J. Virol. 76: 185,2002) ＥＬＲＱＨＬＬＲＷＧＬ(配列番号：２)(Casimiro et al, J. Virol. 76: 185,2002) ＥＬＲＥＨＬＬＫＷＧＦ(配列番号：３)(配列番号２のホモログ、我々の配列と同一)
これらの三つのぺプチドを各１０μｇ／ｍｌの濃度で混合し(総ペプチド濃度は、３０μｇ／ｍｌである)、そして三通りのウェルへ加えた。提示されたＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果を第二追加免疫後２６日で行った。
【００８９】
Ｒａｔ／ｎｅｕ特異的抗体の検出をＥＬＩＳＡにより行った。ＥＬＩＳＡ試薬として使用されるＲａｔ／ｎｅｕ抗原を以下のように調製した：ＰＣＲにより、ｐＲＡＴ／ｎｅｕ＃１４におけるＲａｔ／ｎｅｕコード配列のＣ末端にヒスチジン・タグを付けた。このＰＣＲ増幅産物を切断し、そしてＶＥＥレプリコン・プラスミド、ｐＥＲＫ中にライゲーションした。ｐＥＲＫ・Ｒａｔ／ｎｅｕ-ｈｉｓコンストラクトから作られたＲＮＡでＢＨＫ細胞を電気穿孔した。電気穿孔後１６時間で、細胞溶解液を調製し、そしてニッケル・アフィニティカラム上で精製し、ｈｉｓタグが付いたＲａｔ・ｎｅｕ抗原の６０〜７０％の純度を達成した。
【００９０】
５１日目(追加免疫後７日目)から得た血清を、間接ＥＬＩＳＡによりＲａｔ／ｎｅｕ特異的抗体の存在について評価した。Ｎｕｎｃ高結合性プレートを、炭酸―重炭酸被膜緩衝液中の７５ｎｇ／ウェルのｈｉｓタグＲａｔ・ｎｅｕで一晩４℃でコートした。次の日、プレートを、２００μｌ／ウェルのＰＢＳ中の３％ＢＳＡでブロッキングした。ＰＢＳで６回洗浄後、５０μｌのマウス血清サンプルを、１％ＢＳＡ、０.０５％トゥィーン２０を含むＰＢＳで希釈し、そして各ウェルに加え、そしてプレートを１時間３０℃でインキュベーションした。１：４０及び１：８０の出血前、並びに５１日目の血清の１：４０〜１：１２８０の２倍希釈液を、各実験動物について試験した。プレートを次に６回ＰＢＳで洗浄し、続いて５０μｌ／ウェルのヤギ抗マウスＨＲＰの１：５００希釈液を加え、そして１時間３０℃でインキュベーションした。プレートを以前のように洗浄し、そして１００μｌ／ウェルのＡＢＴＳ(ＫＰＬ)で現像し、そして標準ＥＬＩＳＡリーダーを使用して、吸光度を４０５ｎｍで読み取った。ポジティブ・サンプルを決定するためのカットオフ値は、１：４０で希釈された出血前血清サンプルの全てのＯＤ(吸光度)値を平均し、そして該数値を二倍することにより決定された。カットオフ値より大きいＯＤを有するサンプルの全てを、陽性とみなした。
【００９１】
抗ＣＡＴ特異的抗体の検出は、ＥＬＩＳＡによって行った。抗ＣＡＴ抗体ＥＬＩＳＡは、多抗原性ＡＲＰワクチン接種マウスにおける抗ＣＡＴ免疫応答を検出するために現像された。ヒツジ抗ＣＡＴポリクローナル抗体(Roche, Indianapolis, IN)でコートされたＥＬＩＳＡマイクロプレートに、ウェルあたり５０μLの体積のＣＡＴ・ＥＬＩＳＡサンプル緩衝液(Roche)中に懸濁された精製ＣＡＴタンパク質０.１５ｎｇをロードした。ＥＬＩＳＡプレートを、３７℃で４５分間インキュベーションし、そして０.２ｍｌＣＡＴ・ＥＬＩＳＡ洗浄緩衝液(Roche)で３回洗浄した。５０μｌのマウス血清、サンプル緩衝液で２倍連続希釈された液を、ウェルあたりにロードし、そしてプレートを３７℃で４５分間インキュベーションした。インキュベーションの後に、ＥＬＩＳＡプレートを上記のように３回洗浄した。サンプル緩衝液中に１：５００で希釈されたヤギ抗-マウスＨＲＰ-共役二次抗体(Kirkegaard and Perry Laboratories (KPL), Gaithersburg, MD) を各ウェルに加え(０.１ｍｌ/ウェル)、そして３７℃で４５分間インキュベーションした。インキュベーションの後に、プレートを上記のように３回洗浄し、そして０.１ｍｌのＡＢＴＳペルオキシダーゼ基質(２,２’-アジノ-ビス３-エチルベンズチアゾリン-ｂ-スルホン酸；ＫＰＬ)をウェル毎に加えた。発色現像を０.１ｍｌのストップ溶液(ＫＰＬ)の添加により終結し、そしてMolecular Devices Versamaxマイクロプレートリーダーを使用して、プレートの吸光度を４０５ｎｍで読み込んだ。陽性サンプルを決定するためのカット・オフ値は、１：４０希釈された全ての出血前血清サンプルのＯＤ値を平均し、そして該数値に２をかけることにより決定した。カットオフ値より大きいＯＤを有する全てのサンプルを、陽性であるとみなした。
【００９２】
ＣＭＶｇＢ特異的抗体の検出をウェスタンブロットによって行った。多抗原性ＡＲＰでワクチン接種された動物における抗-ｇＢ免疫応答の分析は、ウエスタンブロットによって行った。精製された組換えヒスチジン・タグ付きｇＢタンパク質を、４〜１０％ビスートリスＮｕＰＡＧＥゲル(ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミド・ゲル；Invitrogen, Carlsbad, CA)を介して電気泳動し、そしてNovex mini-cell(Invitrogen)電気泳動装置を使用してＰＶＤＦ膜に転写した。出血前及びワクチン接種後５１日目の血清を、各動物についてブロッキング緩衝液(Invitrogen)中に１；４０又は１：８０に希釈し、そしてｇＢタンパク質転写後のＰＶＤＦ膜片上でインキュベーションした。ブロッキング緩衝液中に１：１０,０００で希釈されたヤギ抗-マウス・アルカリ・ホスファターゼ共役抗体(Sigma. Louis, MO)を、２次抗体として使用した。ウエスタン・ブロットをＢＣＩＰ/ＮＢＴ(５-ブロモ,４-クロロ,３-インドリルホスフェート/ニトロブルー・テトラゾリウム；ＢｉｏＲａｄ, Hercules, CA)を使用して現像し、そして着色は、蒸留水で洗浄することにより停止された。陽性サンプルは、免疫ブロット上のｇＢの予期された分子量に適合する電気泳動移動度を有する免疫反応性のバンドを視覚的に検出することにより同定された。
【００９３】
インフルエンザＨＡ特異的抗体の検出は、免疫蛍光アッセイ(ＩＦＡ)により行われた。多抗原性ＡＲＰワクチン接種された動物における抗-ＨＡ免疫応答の分析は、ＩＦＡにより測定された。ベロ細胞をＨ１Ｎ１インフルエンザＨＡ遺伝子を発現させるＶＥＥレプリコン・ベクターで電気穿孔し、そして１ウェルあたり１×１０4個の電気穿孔された細胞を９６ウェル組織培養プレート中に蒔いた。電気穿孔されたベロ細胞を、メタノールで電気穿孔後１６時間で固定化した。出血前及びワクチン接種後５６日目の血清を、各動物についてブロッキング緩衝液(ＰＢＳ：ＦＢＳ(１：１))中に１：４０〜１：１６０に２倍に希釈し、そしてＨＡタンパク質を発現するベロ細胞上でインキュベーションした。１：４００希釈されたヤギ抗マウス・アレクサ・フルオール４８８共役抗体(Molecular Probes, Eugene, OR) を二次抗体として使用した。細胞をNikon Eclipse TE300 UV顕微鏡で、ＨＡ特異的蛍光について分析した。検出できる最も低い血清希釈値で、免疫蛍光細胞を視覚的に検出することによりタイターを測定した。
【００９４】
抗-ＣＭＶ・ＩＥ１特異的抗体の検出をＥＬＩＳＡにより行った。ＣＭＶ由来の精製された組換えヒスチジン-タグ付き(ｈｉｓ)-ＩＥ１を、抗原コートとして使用した。簡潔に記載すると、ＢＨＫ細胞をｈｉｓ-ＩＥ１を発現するＶＥＥレプリコンＲＮＡで形質転換し、そしてトライトンＸ１００ライセートを調製した。タンパク質をイオン金属アフィニティークロマトグラフィーにより精製した。
【００９５】
５１日目(追加免疫後７日目)の血清を、標準間接ＥＬＩＳＡによりＣＭＶ-ＩＥ１-特異的抗体の存在について評価した。ＣＭＶ-ＩＥ１-特異的総Ｉｇの検出のため、ＩｇＭ、ＩｇＧ、及びＩｇＡを検出する２次ポリクローナル抗体を、終点タイター測定に使用した。簡潔に記載すると、９６ウェルMaxisorp ELISAプレート(Nunc, Naperville, IL)を、各ウェルあたり、５０μＬの体積のクエン酸/リン酸ｐＨ８.３中の２μgのＩＥ１でコートした。プレートを、粘着性のプラスチックでカバーし、そして一晩４℃でインキュベーションした。次の日、未結合の抗原を捨て、そしてプレートを２００μｌのブロッキング緩衝液(３％ｗ/ｖＢＳＡを含むＰＢＳ)１時間室温でインキュベーションした。ウェルをＰＢＳで６回洗浄し、緩衝液(１％ｗ/ｖＢＳＡ及び０.０５％ｖ/ｖトウィーン２０を伴うＰＢＳ)で連続的に２倍に希釈された５０μｌの血清を抗原コートウェルに加えた。α-ＩＥ１モノクローナル抗体(Rumbaugh- Goodwin Institute for Cancer Research, Inc, Plantation, Florida)は、全てのアッセイにおいてポジティブ・コントロールとして含まれた。各アッセイにおけるネガティブ・コントロールは、ブランク(血清を除く全ての試薬及び処置を伴うウェル)並びに出血前血清を含んだ。プレートを室温で１時間インキュベーションし、そして次にＰＢＳで６回洗浄した。希釈緩衝液中に規定の濃度まで希釈される５０μｌ/ウェルのアルカリホスファターゼ(ＡＰ)共役ヤギ抗マウス・ポリ・アイソタイプ二次抗体(Sigma)を各ウェルへと加え、そして１時間室温でインキュベーションした。１００μlのｐ-ニトロフェニル・ホスフェート(ｐNPP)基質(Sigma)の添加前に、ウェルをPBSで６回洗浄した。血清抗体ＥＬＩＳＡタイターを、バックグランド(ブランク・ウェル)の０.２以上の４０５ｎｍでの光学密度を与える最大血清希釈度の逆数として定義した。
【００９６】
多抗原性ＡＲＰに対する免疫応答の要約
図１及び表３に示されるように、多抗原性ＡＲＰでワクチン接種された動物は、ＡＲＰ集合中に存在する７個の抗原全てに対して免疫応答を作り出した。これらの免疫応答は、液性及び細胞性応答の両方を含み、このタイプのアプローチが、免疫系の両部門を刺激できるということを指し示す。特異的抗原に対する免疫応答の強さは、多抗原性ＡＲＰの文脈で計測され、そして単一抗原ＡＲＰ調製品と比較される。抗-Ｇａｇ抗体及び細胞性免疫応答は、ＨＩＶ-ＧａｇＡＲＰが単独であるか又は多抗原性製剤中であるかに関わらず同等であり、複数の異なる抗原を添加することは、調製品の各個々の構成要素に対する免疫応答を低減しないようであるということを指し示す。この多抗原性調製品は、感染性疾患病原体(ＨＩＶ及びＣＭＶ)、癌抗原(Ｒａｔ/ｎｅｕ)及び細菌酵素(ＣＡＴ)から意図的に構成され、宿主システムが、一のＡＲＰ調製品内の広範な抗原類型に応答するように多抗原性ＡＲＰで刺激されるということを示す。
【００９７】
実施例７. 腫瘍ｃＤＮＡライブラリーを発現する多抗原性ＡＲＰｓでの動物試験
ｃＤＮＡライブラリーを、Ｃ５７６ＢＬ/６マウス由来のＢ１６Ｆ１０(Ｂ１６) [Gold et al., (2003) J. Immunol. 170: 5188-5194)色素性マウス・メラノーマ細胞系列から作成する。標的細胞が感染する際、異種性ｃＤＮＡがレプリコンから発現されるように、このライブラリーをアルファウイルス・レプリコンｃＤＮＡコンストラクト中にディレクショナル・クローニングする。ＡＲＰは、上記のように作成及び精製されて、Ｂ１６腫瘍細胞からのｃＤＮＡライブラリー全体を発現するＡＲＰ粒子の集合を作り出す。代表的な遺伝子、例えば、βアクチンなどの発現は、定量的ＰＣＲにより分析されて、該ライブラリーが既知の標準遺伝子を発現するかを決定される。遺伝子的に適合された非腫瘍原性の細胞系列に対するサブトラクティブ・ハイブリダイゼーション又はディファレンシャル・ディスプレイは、ライブラリーにおける腫瘍特異的配列の割合を高めるために使用されうる。
【００９８】
Ｃ５７ＢＬ/６マウスは、Ｂ１６ライブラリーＡＲＰ調製品で、０、２１、及び４２日目で１、２、又は３回ワクチン接種される。ＡＲＰにおける１０5〜１０9ｉ.ｕ.の投与量は、マウスの両方の後足蹠に与えられる皮下(ｓｃ.)経路を介して投与される。コントロール群のマウスは、偽ワクチン接種を受けるか、又は無関係の抗原を発現するＡＲＰを受ける。１の既知のメラノーマ特異的腫瘍抗原、例えばＴＹＲ、ＴＲＰ-２、ｇｐ１００、ＭＡＧＥ-１、又はＭＡＧＥ-３、或いは該抗原の組合せを発現するＡＲＰを、多抗原性アプローチの比較対象として受ける動物の更なるセットが含まれうる。
【００９９】
マウスは、最終ＡＲＰ免疫化後５日目において１０4、１０5、又は１０6のＢ１６メラノーマ細胞を右側に皮内注射される。マウスは、次に一日おきに触診により腫瘍形成について調べられる。腫瘍が２ｍｍ以上に達すると、腫瘍が存在すると記録される。腫瘍が進行している(通常１ｃｍのサイズになる)と確信されると、マウスは屠殺される。カプラン-マイヤーの腫瘍なし生存曲線が作られ、そして各群のあいだにおける腫瘍接種からの防御の統計的有意差を測定するために、ログ・ランク(log rank)分析を行った。
【０１００】
腫瘍接種の前に、免疫アッセイ用にマウスから血清及びリンパ球を収集する。ＡＲＰ・Ｂ１６ライブラリー中に存在することが予期される既知の腫瘍抗原に対する液性又は細胞性応答の存在は、標準方法及び当該技術分野に周知の技術を使用して、アッセイされる。
【０１０１】
イヌ悪性メラノーマ(ＣＭＭ)は、イヌに生じる自然発症し、侵攻性でありかつ転移性の新生物である。ＣＭＭは、比較的頻繁に診断される腫瘍であり、全てのイヌ腫瘍の約４％を占める。ＣＭＭは、先ず外科及び/又は分割放射線照射治療を含む局所的治療で処置されるが；しかしながら、全身転移性の疾患が通常発症する。ＣＭＭは、化学抵抗性の新生物である。全てのこれらの性質は、ヒトメラノーマと共通であり、そしてこれらの類似性に基いて、ＣＭＭは、ヒトメラノーマについての新たな治療を評価するための臨床モデルとして役に立つ [Bergman et al. (2003) Clin. Cancer Res. 9: 1284-1290)]。
【０１０２】
イヌは、組織学的に確認された自然発症悪性メラノーマがあるものについて選別される。前臨床評価は、完全な身体的評価、完全な血球数及び血小板数、血清化学プロフィール、検尿、ＬＤＨ、抗核抗体、及び存在するならば初期腫瘍の３次元計測(又は再診察の前に患畜が治療されているならば、医療記録からの最大腫瘍サイズ)を含む。転移性疾患の評価については、胸部の３-方向レントゲン写真が得られ、そして局所リンパ節は、微細針吸引/細胞学及び/又は生検/組織学で評価される。全てのイヌは、ステージＩＩ腫瘍(腫瘍２〜４ｃｍ直径、陰性の皮膚の腫れ(node))、ステージＩＩＩ(４ｃｍ超の腫瘍及び/又は陽性の皮膚の腫れ)、又はステージIV(遠隔転移を認める疾患)といったＷＨＯステージ決定システムに従ってステージを決められた。これらの３種の疾患ステージの全てを患うイヌは、本試験に含められる。但し、これらのイヌは、過去３週において他の治療形態を受けていなかった。
【０１０３】
微細針吸引又は生検は、各動物において悪性のメラノーマを細胞学又は組織学によりそれぞれ確認するために使用される。 原発腫瘤又は転移性腫瘤から得られたこれらのサンプルは、腫瘍ｃＤＮＡライブラリーの源として使用される。各動物について、腫瘍ＲＮＡは、腫瘍細胞集合から単離される。ｃＤＮＡライブラリーを各サンプルから調製する。多抗原性調製品を、本明細書中に記載されるように各動物について作成する。
【０１０４】
イヌの集団は、投与量範囲でイヌ患畜特異的ＡＲＰ調製品を複数回ワクチン接種される。イヌは、１〜３ヶ月の期間に渡り３〜１２回ワクチン接種される。皮下、皮内、又は筋肉内経路を介して投与されるＡＲＰｓの投与量は、１０6〜１０9i.ｕ.の範囲である。患畜特異的(自己)ＡＲＰワクチンを投与することに加え、いくつかの集団は、別のメラノーマ由来のワクチン調製品が、臨床利得を提供するかどうかを決定するために、別の患畜由来の(他者)ＡＲＰ調製品を受ける。
【０１０５】
各患畜の臨床状態は、ワクチン接種投与計画期間をとおしてモニターされ、そして治療後２年までモニターされる。患畜は、肉体的に、Ｘ線的に、及び生化学的に、腫瘍の存在及び進行又は退行の臨床証拠について通常の基準に基いて試験された。疾患の進行のため、クオリティーオブライフの低下により飼い主により安楽死が要求される場合、全身の検死が行なわれた後に、原発及び転移部位での腫瘍の大きさ及び組織学的状態を決定するために検死が行なわれる。多抗原性ＡＲＰワクチン接種の生存及び疾患進行に関する効果を測定するために、統計分析が行われる。統計分析のツールは、カプラン-マイヤー・プロダクト・リミット法(product limit method)、Cox比例ハザード分析、マン-ホイットニーU検定、及びスピアマン順位相関を含む。
【０１０６】
【表１】
【０１０７】
【表２】
【０１０８】
【表３】
【０１０９】
本明細書中に引用される参考文献
【表４】
【表５】
【図面の簡単な説明】
【０１１０】
【図１】図１は、多抗原性ＡＲＰでワクチン接種された動物における抗原特異的免疫応答を記述する棒グラフである。抗原特異的免疫応答(液性免疫の形態）は、ＥＬＩＳＡにより計測され、そして逆数相乗平均タイターとして表されるか、或いはウエスタンブロット又はＩＦＡにより計測され、抗原特異的シグナルが検出できる最低希釈度として表される。細胞性免疫の形態の抗原特異的免疫応答は、ＩＦＮ-γ分泌細胞のＥＬＩＳＰＴ検出により計測され、１０6リンパ球あたりの抗原特異的ＩＦＮ-γ分泌リンパ球として表される。皮下(ｓ.ｃ.）又は腹腔内(ｉ.ｐ.）経路の接種により多抗原性ＡＲＰ調製品を受ける動物は、調製品中の全ての抗原に対し免疫応答を高めた。ポジティブ・コントロールとして、１の群は、ＨＩＶ-Ｇａｇ・ＡＲＰを受け、そしてＧａｇにのみ特異的な免疫応答を高めた。ネガティブ・コントロール動物は、いずれの抗原に応答する検出できる応答を有さなかった。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組換えＤＮＡ技術に関し、特に外来核酸(単数又は複数)を真核宿主細胞に導入することに関し、さらに特異的に感染性伝播欠損ウイルス様粒子であって、病原体(ウイルス、真菌、細菌、又は原生動物)、寄生生物、又は腫瘍細胞の免疫原性タンパク質の代表的なセットを集合的に発現させる粒子を生成することに関する。これらのライブラリーは、ヒト及び獣医薬における用途を有する。
合衆国研究支援の記載
該当なし
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
ワクチンは、疾患の予防及び疾患の伝播を制御するための、最も効率よい、安全で、かつ経済的な戦略の一つである。慣用のワクチンは、特定の抗原に対する強力な宿主免疫記憶を作り出すことにより免疫防御を与えるため、疾患の発症前に与えられる免疫学的予防の形態である。ワクチン接種の初期の狙いは、適応特異的免疫応答を活性化することであり、先ず疾患又は病原体に付随する特異的抗原(単数又は複数)に対してＢ及びＴリンパ球を作り出すことである。
【０００３】
同様に、癌ワクチンは、癌腫瘍に付随する抗原に対する免疫応答を作り出すことを狙う。癌は、免疫原性でありうるし、かつ疾患を制御しそして腫瘍の退行を引き起こすことができる宿主免疫応答を活性化することができる。
【０００４】
しかしながら、同時に、癌は特異的及び非特異的に免疫抑制性であり、そして宿主免疫系から逃れることができる。多くのタンパク質／糖タンパク質の腫瘍関連抗原が同定されてきており、そして癌の特定の型へと関連されてきている。Ｈｅｒ-２-ｎｅｕ、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、ＭＡＧＥ-３、ＭＡＧＥ-１、ｇｐ１００、ＴＲＰ-２、チロシナーゼ、ＭＡＲＴ-１、β-ＨＣＧ、ＣＥＡ、Ｒａｓ；Ｂ-カテニン、ｇｐ４３、ＧＡＧＥ-１、ＢＡＧＥ-１、ＭＵＣ-１,２,３、及びＨＳＰ-７０は、幾つかの例である。
【０００５】
腫瘍関連抗原(ＴＡＡｓ)で癌患者を免疫化する点において、多くの試みが評価されている。臨床使用におけるワクチンは、全細胞から免疫原性ペプチドにいたる範囲の構成要素により決定される幾つかのカテゴリーに分類される。全細胞及び細胞ライセートのワクチンは、癌細胞の宿主の起源に左右されて、自己又は同種ワクチンとなりうる。自己全細胞癌ワクチンは、患者自身の腫瘍から作られた患者特異的製剤である。現在までに、多くの自己癌ワクチンは、例えば、ＧＭ-ＣＳＦ(Ward et al., 2002. Cancer Immunol. Immunother. 51:351-7)などのリンフォカインの共発現により、それら固有の免疫原性を増加するように改変されない限りでは、臨床的に成功しなかった。なぜなら自己癌ワクチンは、患者特異的であり、それらは値段が高く、そして患者細胞が単一細胞懸濁液(single cell suspension)を作るために十分な量で獲得されうる患者に限られるからである。付け加えて、本質的に限られた数の細胞は、改変又は複数ワクチン接種を必要とすることに関して問題であり、自己製剤を初期の疾患の予防又は治療に実用的ではないものにしてしまう。これらの問題の幾つかは、同種全細胞ワクチン又は遺伝子操作された全細胞ワクチンであって、ここでリンフォカインなどの免疫刺激性の作用物質を腫瘍ワクチンに外部導入的に供給する代わりに、腫瘍細胞がリンフォカインを内在的に発現するように遺伝的に改変されたワクチンで解決される。しかしながら、これらの方法は、時間がかかり、そして作り出すのに値段が法外に高い。
【０００６】
天然及び組換え癌タンパク質抗原ワクチンは、サブユニット・ワクチンである。全細胞ワクチンとは異なって、これらのサブユニットワクチンは、標準化レベルで確定された免疫原性抗原を含む。そうしたワクチンに関する主要な問題は、正確なアジュバント及びデリバリーシステムを発見することである。加えて、天然又は組換え腫瘍抗原は、面倒であり、そして必ずしも論理的に実用的ではない。タンパク質癌ワクチンは、腫瘍細胞を培養し、腫瘍抗原を精製し、特異的ペプチド又は組換えタンパク質を作り出すことを必要とする。加えて、単に腫瘍タンパク質／ペプチドから作られたワクチンは、該ワクチンが、正しい抗原提示経路に向けられる能力に限られ、又は宿主主要組織適合複合体(ＭＨＣ)の多型のため宿主により認識されないこともあるという点で固有の問題を有する。これらの理由のため、全細胞、又はベクターにデリバリーされる腫瘍ワクチンであって、たくさんの腫瘍抗原を発現するワクチンは、好ましいワクチン接種方法になることを期待されている。抗原自身を含むワクチンよりは腫瘍抗原をコードする核酸を含むワクチンは、これらの問題の幾つかに対応する。現在までに、これらのアプローチは、前臨床及び臨床試験において最良の見込みを示してきている。癌ワクチンに適用される現在の技術の中では、２つの特定システムがこの分野で適用される大きな潜在的可能性を示してきた。第一は、非限定的にアデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、ポックスウイルス、フラビウイルス、ピコルナウイルス、ヘルペスウイルス、及びアルファウイルスを含むウイルスベクターを使用してＴＡＡｓをデリバリーすることである(WO99／51263を参照のこと)。第二は、ＴＡＡｓを宿主へと移しそして発現するためのデリバリー・ビークルとしてex vivo由来の樹上細胞を使用して、腫瘍細胞タンパク質又はＲＮＡでワクチン接種することである(Heiser et al., 2002. J. Clin. Inv. 109: 409-417 and Kumamoto et al., 2002. Nature Biotech. 20: 64- 69)。
【０００７】
多くの腫瘍ワクチンアプローチにおける制限因子は、既知の腫瘍特異的抗原の限定された利用可能性であるように思える。これらの腫瘍特異的抗原は、腫瘍の由来元である組織型の間で変わるばかりでなく、同じ腫瘍内の細胞と細胞間でさえも変わりうる。ワクチン中における限定された数の腫瘍抗原標的のみを使用することに付随する交絡問題は、「腫瘍回避」の可能性である。ここでは、腫瘍は、特定の腫瘍関連抗原を欠失することによって、ワクチン誘導性の免疫効果細胞による検出から逃れる。
【０００８】
この観察結果により、研究者が腫瘍回避の性質を低減するために、複数の抗原を発現するワクチンを設計することが促進された。残念ながら今日までに同定された抗原の限定された数のために、この試みは、腫瘍の大部分に対して実行できるアプローチとはならない。それゆえ、癌治療の最近の展開は、全腫瘍抗原ライブラリーの使用となっている。これは、癌ワクチンにおいて望まれる複数の有利な特徴を混ぜ合わせる。全腫瘍レパートリーをコードするワクチンは、抗原同定及び単離の必要性を打ち消し；本来ワクチン接種者の免疫系は、どのＴＡＡｓに対し個人が応答するかという決定における選択を行うことができるのである。このアプローチの第二の明確な利点は、発現される抗原のレパートリーがかなり広範であるので、腫瘍回避の機会は、最小限にされるか、完全に無くされるという点である。現在、このアプローチは、腫瘍抗原ライブラリーをデリバリーするために樹上細胞を使用して、最も活発に追求されている。これらの細胞は、腫瘍抗原を免疫系に提示することにより抗原提示細胞として機能し、各癌患者から単離され、in vitroで培養及び増殖され、タンパク質又は核酸の形態のいずれかで腫瘍抗原を積み込まれる。米国特許第5,853,719号及び第6,306,388号を参照のこと。このアプローチは、ヒト試験において、有望な臨床データーを作り出し、そして数人の個人において腫瘍成長の退行及び多くの患者において腫瘍の寛解を導く能力を示した(Sadanaga et al., 2001, Clin. Cancer Res. 7: 2277-84)。この技術についての主な障害は、各個人のワクチン接種の前に、in vitro培養、増殖、及び患者由来樹上細胞への抗原の導入をなどを必要とすることである。これは、時間がかかりかつ高価な過程であり、そしてかなり変化しやすいことがある。なぜなら個人間の樹上細胞の集合が、そのフェノタイプ、成長特徴、及び活性の点において大きく変わるからである。
【０００９】
現在までに、剥き出しのＤＮＡ、ＲＮＡ、ウイルス及び細菌ベクターは、腫瘍抗原ライブラリーに対する癌特異的応答を誘導する能力について試験された。代わりのアプローチは、腫瘍抗原ライブラリーを癌患者へと運搬するためにウイルスベクターを使用することである。現在までに、幾つかの成功が剥き出しの核酸発現ライブラリーに関して達成された(例えば、米国特許第5,989,553号及び第5,703,057号を参照のこと)。剥き出しの核酸ベクターに対し誘発された免疫応答を増加させる試みは、剥き出しのＲＮＡ又はＤＮＡの形態において誘導された自己増殖性のウイルスベクターを使用することを含む(Ying et al., 1999, Nature Medicine, 5: 823-827)。
【００１０】
ウイルスベクターは、多くの感染性疾患標的を予防するための前臨床及び臨床試験においてかなりよい見込みを示した。ヒトにおいて予防用及び治療用ワクチンを使用するためのウイルスベクターの開発における最も差し迫った課題の一つは、制御が可能である形態において十分な粒子を作り出す能力である。多くのウイルスシステムでは、この目標は、手の届くところであり、そして数多くのベクターシステムが、臨床試験において正の免疫応答及び安全特性を作り出した。しかしながら、ワクチン・ベクター・プラットホームに対する多くの生成スキームは、特異的疾患標的、例えばポックスウイルスベクター中のＨＩＶのｇａｇ、ｐｏｌ、及びｅｎｖ遺伝子に対する１又は多くとも２若しくは３の既知の抗原を発現するワクチン粒子を大量に産生することに焦点をあてる。しかしながら、多くの場合、これらの大量製造アプローチは、個々の患者特異的ワクチンの製品には使用できない。
【００１１】
アルファウイルス・ベクター・デリバリー・システムは、多くの理由から魅力的なワクチンベクターとして同定されてきた。その理由は、非相同遺伝子配列の大量発現、良好な安全特性での非複製性(アルファ)ウイルス・レプリコン粒子(ＡＲＰ)の誘導、標的細胞の細胞質で複製し、そしてベクターのゲノムへの取り込みの機会を打ち消すＲＮＡゲノム、及び最終的に、アルファウイルス・ベクターが本来的に樹上細胞における複製を標的にし、それゆえ多数のワクチン抗原に対する強力かつ総合的な免疫応答を作り出すことができる(Rayner, Dryga and Kamrud, 2002, Rev. Med. Virol. 12: 279-296において総論される)という実証を含む。アルファウイルス属は、種々のウイルスを含み、それらの全ては、トガウイルス科のメンバーである。アルファウイルスは、非限定的に、東部ウマ脳炎ウイルス(ＥＥＥ)、ベネズエラ・ウマ脳炎ウイルス(ＶＥＥ)、エバーグレード・ウイルス(Everglades Virus)、ムカンボ・ウイルス(Mucambo Virus)、ピクスナ・ウイルス(Pixuna Virus)、西部ウマ脳炎ウイルス(WEE)、シンドビス・ウイルス、セムリキ森林ウイルス、ミデルブルグ・ウイルス(Middleburg Virus)、チクングニア・ウイルス、オニョンニョン・ウイルス、ロスリバー・ウイルス、バーマ森林ウイルス(Barmah Forest Virus)、ゲタ・ウイルス、サギヤマ・ウイルス、ベバル・ウイルス(Bebaru Virus)、マヤロ・ウイルス、ウナ・ウイルス(Una Virus)、アウラ・ウイルス(Aura Virus)、ワタロア・ウイルス(Whataroa Virus)、ババンキー・ウイルス(Babanki Virus)、キジラガッチェ・ウイルス(Kyzylagach Virus)、ハイランドＪウイルス(Highlands J virus)、フォート・モーガン・ウイルス(Fort Morgan Virus)、ヌヂュム・ウイルス(Ndumu Virus)、及びバギー・クリーク・ウイルス(Buggy Creek Virus)を含む。このウイルスゲノムは、一本鎖のメッセンジャーセンスＲＮＡであって、５’末端でメチル化キャップで修飾されており、そして３’末端で種々の長さのポリ(Ａ)鎖で修飾されているＲＮＡである。１のウイルスタンパク質、Ｃを含む構造的なサブユニットは、２０面体のヌクレオキャプシド中でＲＮＡゲノムと会合する。ビリオン中では、キャプシドは、整然と多数並んだ膜貫通タンパク質スパイクで覆われる脂質外被により取り囲まれ、該膜貫通タンパク質スパイクの各々は、二つの糖タンパク質、通常Ｅ１とＥ２のヘテロダイマー複合体からなった(Pedersen et al., J. Virol 14 : 40 (1974)を参照のこと)。シンドビス・ウイルスとセムリキ森林ウイルスは、アルファウイルスの原型と考えられており、そして広く研究された(Schlesinger, The Togaviridae and Flaviviridae, Plenum Publishing Corp. , New York (1986)を参照のこと)。ＶＥＥウイルスも広く研究された(例えば米国特許5,185,440号、並びに本明細書中で引用される別の文献を参照のこと)。
【００１２】
これらのウイルスの研究は、アルファウイルス病に対するワクチン接種技術の発展を導き、さらに関心の抗原をコードする外来ＤＮＡの導入用のアルファウイルス・ベクターの使用を介して別の疾患に対するワクチン接種技術の発展を導いた。Davis et al.,に対する米国特許第5,185,440号及びPCT公開WO 92/10578を参照のこと。発現可能な外来ＤＮＡを真核細胞中に導入することは、高い関心の題目となった。生弱毒化ウイルスワクチンは、ウイルス疾患を制御する最も成功した方法の一つであるということはよく知られている。しかしながら、幾つかのウイルス(又は別の)病原体については、生ウイルスの株での免疫化は、実用的でないか又は安全ではないかのどちらかであることがある。代替の戦略の一つは、そうした病因の免疫抗原をコードする配列を、生きた増殖株である別のウイルスへと入れ込むことである。生ＶＥＥベクターを使用するこうしたシステムの一つは、Johnston et al.,に対する米国特許第5,505,947号において開示される。別のこうしたシステムは、Hahn et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 2679-2683において開示され、ここでシンドビス・ウイルスコンストラクトは、インフルエンザ・ヘマグルチニン・タンパク質の切断形態を発現する。別の試みは、感染性、伝播欠損性のアルファウイルス粒子の使用であり、Garoff et al.,に対する米国特許第6,190,666号、Johnston et al.,に対する米国特許第5,792,462号及び第6,156,558号、米国出願公開第2002/0015945 A1(Polo et al.)、米国出願公開第2001-0016199(Johnston et al.)、Frolov et al.(1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 11371-11377 、及びPushko et al. (1997) Virology 239: 389-401に開示される。アルファウイルスは、比較的遺伝子操作が容易であることが示されてきており、それは、アルファウイルスをゲノム発現ライブラリーとして使用する特許出願が多いことにより反映される。例えば、米国特許第6,197,502号を参照のこと。抗原のライブラリーを発現するセムリキ森林ウイルス(ＳＦＶ)ベクターは、動物モデルにおいて調べられた。ここで、腫瘍抗原のライブラリーを発現するＳＦＶ粒子がｉｎ ｖｉｔｒｏで樹上細胞を感染するために使用され、そして樹上細胞が、グリオーマモデルにおけるいくらかの防御を示すマウスを免疫化するために使用された(Yamanaka et al., 2001, J. Neurosurg. 94: 474-81)。
【００１３】
特に弱毒化種がなく、又は新生物、寄生生物、又は病原体が分子レベルでよく特徴付けられていない場合、或いは防御免疫化が複数の抗原の発現を必要とすると認識される場合、当該技術分野において、新生物病又は寄生生物若しくは病原体感染に対してヒト又は動物を免疫化するために使用されうる外来抗原をコードする核酸配列について長く望まれた必要性が存在する。
【００１４】
発明の要約
新生物細胞、病原体又は寄生生物由来のウイルス・レプリコン粒子調製品、並びに同じ物を含む免疫原性組成物を提供することが、本発明の目的である。該調製品は、新生物細胞、病原体、又は寄生生物由来の複数の発現可能なコード配列を含み、該調製品が投与されるヒト又は動物患者においてコード配列の発現が、アルファウイルス・レプリコン核酸によりコードされ、そこから発現される複数の抗原決定因子に対する免疫応答の生成をもたらす。免疫原性組成物は、関心のアルファウイルスレプリコン粒子調製品及び医薬として許容される担体を含み、そして免疫応答を改良し又は刺激するために、免疫学的アジュバント及び／又はサイトカインをさらに含んだ。アルファウイルス・レプリコンは、数ある中でＶＥＥ、シンドビスウイルス、南アフリカアルボ・ウイルスＮｏ.８６、セムリキ森林ウイルス由来のいずれのアルファウイルスレプリコンＲＮＡベクターでありうる。好ましい実施態様では、アルファウイルス・ベクターは、１以上の弱毒化突然変異を含む。適切な突然変異、並びにそれらを同定するための方法が記載された(例えば、米国特許第5,505,947号；第5,639,650号；第5,811,407号を参照のこと)。
【００１５】
投与経路は、皮下(ｓ.ｃ.)、腹腔内(ｉ.ｐ.)、筋肉内(ｉ.ｍ.)、皮内(ｉ.ｄ.)、静脈内(ｉ.ｖ.)、腫瘍内、脳内(ｉ.ｃ.)、直接リンパ節注入(ｉ.ｎ.)、並びに粘膜経路、例えば経鼻、経気管支、経直腸、経膣、及び経口経路を含みうる。筋肉内投与は有利である。
【００１６】
ヒト及び動物投与は、約１×１０4〜約１×１０10の範囲であり、投与あたり約１×１０6〜約１×１０8の投与量が有利である。ワクチン型の免疫原アプローチでは、本発明者は、約１〜約１２ヶ月又はそれ以上の間、毎週、各週、又は毎月の投与を意図する。この投与に続き、必要とされる基準に基いて、例えば毎年、追加ワクチン接種される。
【００１７】
特に、アルファウイルス・レプリコン調製品が、特定の患者からの腫瘍細胞に由来する場合、患者特異的ワクチン調製品が作られ、そして同じ個人に戻して投与される；つまり、自己ワクチン経路である。同種アプローチもまた、本発明の範囲内であり、ここで一の患者腫瘍細胞由来のウイルス・レプリコンは、同じ新生物病を患う、患っていると信じられる、又は高い危険性にある別の患者に投与される。リスクの高い患者の例は、遺伝的性素因を有するか、又は癌についての遺伝性の高いリスクを証明された個人である。例えば、乳房癌は、乳房癌を患う患者の女系親族において、高い家族性のリスクを伴う。同様に、ＨＩＶ陽性の個人をワクチン接種すると同時に、未感染の個人を感染から妨げようとするために、同じワクチン調製品で、未感染のパートナーを予防的にワクチン接種しうる。
【００１８】
本発明は、ウイルス・レプリコン調製品又は同じものを含む免疫原性組成物を患者に投与することにより誘発される免疫応答をフォローし、患者が応答する腫瘍抗原を同定することをさらに含む。これらの応答は、液性及び／又は細胞性でありうる。このアプローチは、新規の抗原の同定を可能にし、そして患者を免疫化する抗原のより規定された集合を使用することを可能にする。これは、より限定されたＡＲＰ調製品で追加免疫を投与することにより、又は続いてより規定されたセットの抗原をコードするＡＲＰを含む調製品で別の患者又は個人を(予防投与計画で)免疫化を行うことにより、達成されうる。
【００１９】
本発明はまた、感染性疾患及び寄生生物感染の治療及び/又は予防に関する。ＨＩＶを例として使用して、患者特異的ＨＩＶ遺伝子から由来するか又は個人自身のウイルス調製品から直接由来する成功した多抗原性ＨＩＶ・ＡＲＰワクチンは、ウイルスの類似の遺伝種に感染されたヒト、或いは類似の種に晒されたか、晒されたと思われるか、又は晒された可能性のあるヒトに適用される。特に、関心の病原体又は寄生生物由来の免疫原性又は新規の免疫原は、新規の免疫原性タンパク質を同定するためのツールとしてＡＲＰｓを使用して同定される。同様に、疾患を引き起こすウイルス(例えばＨＩＶの認知クレード)又は寄生生物の複数の種は、本発明のＡＲＰ調製品中に混合されて、種特異的ではない強い免疫原性組成物を提供する。例えば、ＨＩＶの幾つかの異なるクレードは、認識されてきており、そして該クレードは、多クレードＨＩＶワクチンを提供するために混合される。
【００２０】
癌患者の場合、癌細胞抗原性決定因子コード配列を運搬するＡＲＰｓの投与は、特に、化学療法治療が、本発明のＡＲＰｓを含む免疫原性組成物を投与した後に発現される抗原に応答する免疫系の能力を取り除かない場合に化学療法治療を伴ってされる。
【００２１】
腫瘍若しくは癌、ウイルス、細菌、真菌若しくは原生動物病原体、又は寄生生物の特定の型の抗原性質を発現する本発明のＡＲＰ調製品は、予防用又は治療用処置投与計画において投与され、そしてＡＲＰｓの投与は、初回免疫及び/又は追加免疫用の別の免疫原性調製品の組合せで、例えばＡＲＰワクチンの初回免疫及び樹枝状細胞ワクチンの追加免疫を使用して、或いはＡＲＰ初回免疫及びアデノウイルスベクター追加免疫を使用して行われうる。ＤＮＡ、ＲＮＡ、アデノウイルス、ピコルナウイルス、アデノ随伴ウイルス、ポックスウイルス、レトロウイルス、アフトウイルス、ノダウイルス(nodaviruses)、フラビウイルス、樹枝状細胞、ペプチド、熱ショックタンパク質、ミニ遺伝子、腫瘍細胞全体及び腫瘍細胞ライセート・ワクチンは、本発明の関心の複数の抗原を発現するＡＲＰｓと組み合わせて使用されうる。サイトカイン又はケモカインなどのアジュバント、或いはケモカイン又はサイトカインの発現を仕向けるＡＲＰｓは、本発明の調製品中に使用されうる。ＡＲＰを発現する複数の遺伝子と組み合わせた異種性の初回免疫/追加免疫の添加は、１の又は比較的少数の腫瘍抗原を発現するベクター・レプリコン又はベクター・レプリコンのセットを伴うようである。これは、ＡＲＰ(単数又は複数)により誘発される広い免疫応答の前又は後に、特異的抗原上に免疫系を集中させるように機能する。類似のそうした異種性デリバリー・システムは、本アルファウイルス・レプリコン発現ライブラリーと組み合わせて使用されて、付加免疫記憶及び長期間免疫機能を増進し及び/又は維持する。
【００２２】
本発明のさらなる目的は、本発明のＡＲＰを含む免疫原性組成物を、患者が腫瘍病原体又は寄生生物に陽性であるとき、治療セットにおける癌又は別の病原体状態を治療するためばかりでなく、治療が成功しそして患者が寛解状態になった時点で、ヒトに投与することである。そうした継続した断続的な(追加)免疫化は、無腫瘍、無疾患、又は無寄生生物状態の維持を亢進することができ、そして腫瘍又は疾患それぞれの逆行又は再発を阻害しうる。
【００２３】
本発明の更なる目的は、ＡＲＰを含む本発明の免疫原性組成物を、抗体などの免疫応答を作り出すために、動物(例えば、ウマ、ブタ、ウシ、ヤギ、霊長類、ラビット、マウス、ハムスター、鳥類)に投与することである。そうした動物から回収された血清又は細胞は、ポリクローナル血清を提供する点で、或いはモノクローナル血清を作り出すハイブリドーマ生成のための細胞を提供する点で有用であり、そうした抗体調製品は、研究、診断、及び治療用途に有用である。
【００２４】
本発明のさらなる目的は、腫瘍、腫瘍細胞、病原体、寄生生物由来の複数の抗原をまとめてコードするアルファウイルス・レプリコン粒子(ＡＲＰｓ)の製造方法である。該方法は、以下のステップ：
関心の腫瘍、腫瘍細胞、病原体、又は寄生生物由来のＤＮＡ又はｃＤＮＡを調製し、そしてウイルス/アルファウイルス・レプリコン核酸中へとクローニングして改変ウイルス/アルファウイルス・レプリコン核酸を生成し、
改変ウイルス/アルファウイルス・レプリコン核酸を許容状態細胞中へ導入し、ここで当該改変ウイルス/アルファウイルス・レプリコン核酸は改変許容状態細胞を作り出すための少なくともウイルス・パッケージング・シグナルを含み、
少なくとも１のヘルパー機能の発現を許容し、かつ上記改変ウイルス／アルファウイルス核酸の複製及びパッケージングを許容する条件下で、当該改変許容状態細胞を培養して、ＡＲＰｓを形成し、そして
望ましくは、該培養された許容状態細胞を放出培地と接触して、細胞及び細胞片に結合されたＡＲＰｓを放出するステップ
を含む。改変ウイルス／アルファウイルス・レプリコン核酸は、パッケージングに必要とされるコード配列を既に含みかつ発現する許容状態細胞中へ導入され、或いはパッケージング遺伝子を運搬する１以上の「ヘルパー」ＤＮＡ若しくはＲＮＡ分子は、改変ウイルス／アルファウイルス・レプリコン核酸と共に導入されうる。場合により、放出培地ステップの前に、細胞からのＡＲＰｓの放出をもたらさない洗浄ステップが行われうる。有利なことに、該洗浄ステップは、ＤＮａｓｅ処理を含むか、又はＤＮＡは、ＡＲＰ調製においてＤＮａｓｅで切断されうる。例えば、ＤＮａｓｅは、セラチア・マルセッセンス(Serratia marcescens)由来であり、１０〜１０００ユニット／ｍｌの濃度において、３７℃で１０〜６０分間インキュベーションで使用される。放出培地は、望ましくは約ｐＨ６〜９、望ましくは約６.５〜約８.５であり、そして非限定的に酢酸アンモニウム、塩化アンモニウム、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、塩化カルシウム、塩化カリウム、硫酸アンモニウム、及び炭酸水素ナトリウムを含む塩約０.２〜約５Ｍを含む。改変アルファウイルス・レプリコン核酸が、電気穿孔により許容状態細胞中へと導入されるとき、細胞は、電気穿孔混合液１ｍｌあたり約１０7〜約５×１０8の密度で存在することは、有利である。
【００２５】
有利なことに、ＡＲＰｓが生成される細胞は、アルファウイルス・レプリコン・ベクター及びヘルパー核酸(単数又は複数)で電気穿孔される前に、細胞周期Ｇ２／Ｍ期に同期化される。特定の論理に束縛されることなく、より高い電気穿孔効率及び(核活性を含む本発明のこれらの実施態様では)核酸の核への移動は、Ｇ２／Ｍ期細胞において達成されるということが信じられている。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
本出願の文脈において、ｎｍはナノメートルを意味し、ｍｌはミリリットルを意味し、μｌはマイクロリットルを意味し、ｐｆｕ／ｍｌはプラーク形成ユニット／ミリリットルを意味し、ｉｕは感染単位を意味し、ＶＥＥはベネズエラ・ウマ脳炎ウイルスを意味し、ＥＭＣは脳心筋炎ウイルスを意味し、ＢＨＫは仔ハムスター腎臓細胞を意味し、ＨＡはヘマググルチニン遺伝子を意味し、ＣＡＴはクロラムフェニコール・アセチル・トランスフェラーゼを意味し、βｇａｌはβガラクトシダーゼを意味し、ＧＦＰはグリーン・フルオレセント・タンパク質遺伝子を意味し、Ｎはヌクレオキャプシド意味し、ＦＡＣＳは蛍光活性化セルソーターを意味し、ＥＬＩＳＡは酵素結合免疫吸着検定法を意味し、ＩＲＥＳは内部リボソーム侵入部位を意味する。「Ｅ２アミノ酸(例えば、Ｌｙｓ、Ｔｈｒなど)数字」という記載は、Ｅ２タンパク質の指示された残基での指示されたアミノ酸の事を指し、そしてＥ１遺伝子における特異的残基でのアミノ酸を指すためにも使用される。
【００２７】
「アルファウイルス」という用語は、当該技術分野における慣用的な意味を有し、そしてアルファウイルスの様々な種、例えば、東部ウマ脳炎ウイルス(ＥＥＥ)、ベネズエラ・ウマ脳炎ウイルス(ＶＥＥ)、エバーグレード・ウイルス、ムカンボ・ウイルス、ピクスナ・ウイルス、西部ウマ脳炎ウイルス(WEE)、シンドビス・ウイルス、南アフリカ・アルボウイルスＮｏ.８６、セムリキ森林ウイルス、ミデルブルグ・ウイルス、チクングニア・ウイルス、オニョンニョン・ウイルス、ロスリバー・ウイルス、バーマ森林ウイルス、ゲタ・ウイルス、サギヤマ・ウイルス、ベバル・ウイルス、マヤロ・ウイルス、ウナ・ウイルス、アウラ・ウイルス、ワタロア・ウイルス、ババンキー・ウイルス、キジラガッチェ・ウイルス、ハイランドＪウイルス、フォート・モーガン・ウイルス、ヌヂュム・ウイルス、及びバギー・クリーク・ウイルスを含む。本発明で使用される好ましいアルファウイルスＲＮＡ転写産物は、ＶＥＥウイルス、シンドビス・ウイルス、南アフリカ・アルボウイルスＮｏ.８６、及びセムリキ森林ウイルスＲＮＡ転写産物を含む。
【００２８】
本発明の方法において使用されるアルファウイルス-許容状態細胞は、アルファウイルスＲＮＡ転写産物でトランスフェクションされた際、ウイルス粒子を生成できる細胞である。アルファウイルスは、幅広い宿主範囲を有する。適切な宿主細胞は、非限定的にベロ、仔ハムスター腎臓(ＢＨＫ)、ＤＦ１、ＣＨＯ、２９３、２９３Ｔ、トリ胚線維芽細胞、及び昆虫細胞、例えばＳＦ２１、スポドプテラ・フルギペルダ(Spodoptera frugiperda; C6/36、アエデス・アルボピクツス(Aedes Albopictus)；ＴＲＡ-１７１、トキソリンチテス・アムボイネシス(Toxorhynchites amboinensis)；ＲＭＬ-１２、アエデス・アエギプチ(Aedes aegypti)；ＡＰ-６１、アエデス・シュードスキュテラリス(Aedes pseudoscutellaris)；及びＭＯＳ-５５、アノフレス・ガムビアエ(Anopheles gambiae)細胞を含む。
【００２９】
本明細書中に使用される「構造タンパク質」又は「アルファウイルス構造タンパク質」というフレーズは、ＲＮＡレプリコンをレプリコン粒子中にキャプシド形成するために必要とされるタンパク質であって、ウイルスによりコードされるタンパク質を指し、そしてキャプシド・タンパク質、Ｅ１糖タンパク質及びＥ２等タンパク質を含む。本明細書中に記載されるように、アルファウイルスの構造タンパク質は、１以上のヘルパー核酸の間に分配される。例えば、第一ヘルパーＲＮＡ及び第二ヘルパーＲＮＡが使用されうるか、又はアルファウイルス構造タンパク質の全てをコードするシングルＤＮＡヘルパーは使用されうる。付け加えて、１以上の構造タンパク質は、レプリコンＲＮＡと同じＲＮＡ分子上に局在化されることがあり、但し、レプリコン及び得られたアルファウイルス粒子が伝播-欠損性であるように、少なくとも１の構造タンパク質がレプリコンＲＮＡから欠失される。本明細書中に使用されるとき、「欠失された」又は「欠失」という用語は、特定の断片の完全な欠失か、又は特定の断片の一部の欠失であって、標準の使用に従って断片を動作不能又は機能がなくなるようにするために十分な欠失を意味する。例えばTermin et al.,に対する米国特許第4,650,764号を参照のこと。本明細書中に使用される「複製欠損」という用語は、「伝播欠損」と同意義であり、そして規定の宿主細胞中で作られた粒子が、ヘルパー機能の欠失、つまりレプリコン核酸をパッケージングするために必要とされるアルファウイルス構造タンパク質がないことから、別の宿主細胞中に子孫粒子(progeny particle)を作り出すことができないことを意味する。しかしながら、レプリコン核酸は、それ自身を複製することができ、そして導入された宿主細胞中に発現されることができる。
【００３０】
ヘルパー細胞はまた、パッケージング細胞とも呼ばれ、感染性伝播欠損アルファウイルス粒子を作り出すために使用され、レプリコン核酸をパッケージングするために十分なアルファウイルス構造タンパク質を発現しなければならないか又は発現できなければならない。構造タンパク質は、セットのＲＮＡ、典型的には２個のＲＮＡであって、レプリコン・ベクターの導入と同時に、又は導入前にヘルパー細胞へ導入されるＲＮＡから作られうる。第一ヘルパーＲＮＡは、少なくとも１のアルファウイルス構造タンパク質をコードするＲＮＡを含むが、アルファウイルス構造タンパク質の全部をコードしない。第一ヘルパーＲＮＡは、アルファウイルスＥ１糖タンパク質をコードするが、アルファウイルス・キャプシド・タンパク質及びアルファウイルスＥ２糖タンパク質をコードしないＲＮＡを含みうる。或いは、第一ヘルパーＲＮＡは、アルファウイルスＥ２糖タンパク質をコードするが、アルファウイルス・キャプシド・タンパク質及びアルファウイルスＥ１糖タンパク質をコードしないＲＮＡを含みうる。更なる実施態様では、第一ヘルパーＲＮＡは、アルファウイルスＥ１糖タンパク質及びアルファウイルスＥ２糖タンパク質をコードするが、アルファウイルス・キャプシド・タンパク質をコードしないＲＮＡを含みうる。第四の実施態様では、第一ヘルパーＲＮＡは、アルファウイルス・キャプシドをコードするが、アルファウイルス糖タンパク質のどれもコードしないＲＮＡを含みうる。第５の実施態様では、第一ヘルパーＲＮＡは、キャプシド及び糖タンパク質の１つ、つまりＥ１又はＥ２のいずれかをコードするが、両方はコードしないＲＮＡを含みうる。
【００３１】
これらの第一ヘルパーＲＮＡのいずれか１つと組み合わせて、第二ヘルパーＲＮＡは、少なくとも１のアルファウイルス構造タンパク質であって、第一ヘルパーＲＮＡによりコードされていないものをコードする。 たとえば、第一ヘルパーＲＮＡが、アルファウイルスＥ１糖タンパク質のみをコードする場合、第二ヘルパーＲＮＡは、アルファウイルスキャプシドタンパク質とアルファウイルスＥ２糖タンパク質のうちの１つ又は両方をコードしうる。第一ヘルパーＲＮＡが、アルファウイルス・キャプシドタンパク質のみをコードする場合、第二ヘルパーＲＮＡは、アルファウイルス糖タンパク質のうちの１つ又は両方をコードするＲＮＡを含みうる。第一ヘルパーＲＮＡが、アルファウイルスＥ２糖タンパク質のみをコードする場合、第二ヘルパーＲＮＡは、アルファウイルス・キャプシド・タンパク質とアルファウイルスＥ１糖タンパク質のうちの１つ又は両方をコードしうる。第一ヘルパーＲＮＡが、キャプシドとアルファウイルスＥ１糖タンパク質の両方をコードする場合、第二ヘルパーＲＮＡは、アルファウイルス・キャプシド・タンパク質とアルファウイルスＥ２糖タンパク質のうちの１つ又は両方をコードするＲＮＡを含みうる。
【００３２】
全てのヘルパー核酸において、これらの分子は、コードされた構造タンパク質配列がヘルパー細胞中において発現されるために必要とされる配列(翻訳及び適切である場合転写又は複製シグナルを含む)をさらに含むということは理解される。そうした配列は、例えば、(ウイルス、原核生物、又は真核生物の誘導性又は恒常性の)プロモーター、並びに５’及び３’ウイルスのレプリカーゼ認識配列を含みうる。１以上の糖タンパク質を発現するヘルパー核酸の場合、これらの配列は、核酸コンストラクト中の構造タンパク質のコード領域のＮ末端でのリーダー又はシグナル配列を伴って有利に発現されるということが当該技術分野から理解される。リーダー又はシグナル配列は、アルファウイルス由来、例えばＥ３又は６ｋでありうるし、或いは組織プラスミノーゲン・アクティベーターシグナルペプチドなどの異種性配列又は合成配列でありうる。こうして、一の例として、第一ヘルパー核酸は、キャプシド-Ｅ３-Ｅ１をコードするＲＮＡ分子であり、かつ第二ヘルパー核酸は、キャプシド-Ｅ３-Ｅ２をコードするＲＮＡ分子であることもある。或いは、第一ヘルパーＲＮＡは、キャプシドのみをコードし、そして第二ヘルパーＲＮＡは、Ｅ３-Ｅ２-６ｋ-Ｅ１をコードしうる。さらに、パッケージングシグナル、つまり「キャプシド化(encapsidation)配列」は、ウイルスゲノム中に存在し、そして全てのヘルパー核酸において存在しない。好ましくは、パッケージング・シグナルは、全てのヘルパー核酸から欠失される。
【００３３】
これらのＲＮＡヘルパーは、多くの方法で細胞中へ導入されうる。該ＲＮＡヘルパーは、細胞内に安定的に形質導入された１以上の発現カセットから発現されて、それによりパッケージング細胞系列を確立する(例えば、米国特許第6,242,259号を参照のこと)。或いは、ＲＮＡは、ヘルパー細胞内で、細胞のゲノム中に組み込まれることなく発現されるＲＮＡ又はＤＮＡ分子として導入されうる。導入方法は、電気穿孔、ウイルスベクター(例えば、ＳＶ４０、アデノウイルス、ノダウイルス、アストロウイルス)、及び脂質媒介トランスフェクションを含む。
【００３４】
複数のヘルパーＲＮＡの代替は、ウイルス・レプリコンＲＮＡを複製し、そしてアルファウイルス・レプリコンＲＮＡを感染性アルファウイルス・レプリコン粒子中にパッケージングするために必要なポリペプチドを合成するために必要な機能の全てをコードするシングル核酸分子の使用である。これは、必要な機能を規定するＲＮＡ分子又は必要な機能を規定するＤＮＡ分子で達成されうる。シングルＤＮＡヘルパー核酸は、非限定的に電気穿孔、脂質-媒介性トランスフェクション、ウイルスベクター(例えば、アデノウイルス又はＳＶ-４０)、及びリン酸カルシウム-媒介性トランスフェクションを含む当該技術分野に既知の方法のいずれかによりパッケージング細胞中に導入される。好ましくは、ＤＮＡは、細胞及び導入される核酸(単数又は複数)について最適化された電圧及び電気容量で、本発明の電気穿孔に基く方法を介して導入される。ＤＮＡは典型的に、ＲＮＡの取り込みに必要とされる電圧及び電気容量と比べて減少された電圧及び増加した電気容量で細胞中へと電気穿孔で入れられる。全ての電気穿孔において、電圧及び電気容量の値は、感染性アルファウイルス粒子を作り出すパッケージング細胞の能力を破壊することを避けるようにセットされなければならない。ＤＮＡは、電気穿孔の前に毒性汚染物質を取り除くために高度に精製され、そして約５ｍｇ／ｍｌに濃縮される。一般的に、１〜８ｍｇ／ｍｌ、好ましくは５〜８ｍｇ／ｍｌにＤＮＡを濃縮することが好ましい。ＤＮＡヘルパーは、電気穿孔混合液において、０.８ｍｌの電気穿孔混合液あたり約２０〜５００、望ましくは約５０〜３００、例えば約１５０μｇで存在し、望ましくは約５×１０7〜２×１０8細胞、例えば約１.２×１０8細胞を含んだ。
【００３５】
或いは、このフォーマットにおける及び誘導性のプロモーターの下でのヘルパー機能は、ウイルスＲＮＡベクター・レプリコン核酸の導入／発現の前にパッケージング細胞ゲノム中に組み込まれ、そして次にＲＮＡベクター・レプリコンの導入の直前に、同時に、又は後に適切な刺激で誘導された。
【００３６】
有利なことに、アルファウイルス構造タンパク質、つまりキャプシド、Ｅ１糖タンパク質及びＥ２糖タンパク質をコードする核酸は、少なくとも１の弱毒化突然変異を含む。本明細書中で使用される「弱毒化突然変異」及び「弱毒化アミノ酸」というフレーズは、当該技術分野の専門用語に従って(例えば、B. Davis, et al., Microbiology 132(3d ed. 1980)を参照のこと)、該突然変異が置換突然変異であろうと、イン-フレーム欠失若しくは突然変異の付加であろうと、その宿主において疾患を引き起こす可能性の低下(つまり病原性の低下)をもたらすヌクレオチド突然変異又はそうした突然変異の観点でコードされるアミノ酸を意味する。「弱毒化突然変異」という用語は、そうした突然変異が、弱毒化されたにもかかわらずウイルスの生存を可能にする「修復」突然変異と組み合わせて使用されない限り、ウイルスにとって致命的である突然変異を除外する。特定の実施態様では、ヘルパー核酸(単数又は複数)は、少なくとも１の弱毒化突然変異を含む。
【００３７】
アルファウイルス・ゲノムにおいて適切な弱毒化突然変異を同定する方法は、当該技術分野に既知である。Olmsted et al.,(1984; Science 225: 424)は、細胞培養において成長の早さについて選別することにより、シンドビス・ウイルスにおいて弱毒化突然変異を同定する方法を記載する。Johnston及びSmith(1988; Virology 162: 437)は、ＢＨＫ細胞の浸透を促進するために選択的な圧力を直接適用することにより、ＶＥＥにおける弱毒化突然変異を同定することを記載する。アルファウイルスにおける弱毒化突然変異は、当該技術分野に記載される。例えば、White et al. 2001 J. Virology 75: 3706; Kinney et al. 1989 Virology 70: 19; Heise et al. 2000 J. Virology 74: 4207; Bernard et al 2000 Virology 276: 93; Smith et al 2001 J Virology 75: 11196; Heidner & Johnston 1994 J.Virology 68: 8064; Klimstra et al. 1999 J. Virology 73: 10387; Glasgow et al. 1991 Virology 185: 741; Polo and Johnston 1990 J. Virology 64: 4438; and Smerdou and Liljestrom 1999 J. Virology 73 : 1092 である。
【００３８】
特定の実施態様では、レプリコンＲＮＡは、少なくとも１の弱毒化突然変異を含む。別の特異的実施態様では、ヘルパー核酸(単数又は複数)は、少なくとも１の弱毒化突然変異を含む。２個のヘルパー核酸分子を含む実施態様では、少なくとも１の分子は、少なくとも１の弱毒化突然変異を含むか、又は両方とも少なくとも１の弱毒化突然変異をコードしうる。或いは、ヘルパー核酸又は第一若しくは第二ヘルパー核酸のうちの少なくとも１は、少なくとも２個の又は複数の弱毒化突然変異を含む。適切な弱毒化突然変異は、使用されるアルファウイルスに左右される。例えば、アルファウイルスがＶＥＥである場合、適切な弱毒化突然変異は、Ｅ２アミノ酸位７６でのコドンであって、弱毒化アミノ酸、好ましくはリジン、アルギニン、又はヒスチジンをＥ２アミノ酸７６として指定するコドン；Ｅ２アミノ酸位１２０でのコドンであって、弱毒化アミノ酸、好ましくはリジンをＥ２アミノ酸１２０として指定するコドン；Ｅ２アミノ酸位２０９でのコドンであって、弱毒化アミノ酸、好ましくはリジン、アルギニン、又はヒスチジンをＥ２アミノ酸２０９として指定するコドン；Ｅ１アミノ酸位２７２でのコドンであって、弱毒化突然変異、好ましくはスレオニン又はセリンをＥ１アミノ酸２７２として指定するコドン；Ｅ１アミノ酸位８１でのコドンであって、弱毒化突然変異、好ましくはイソロイシン又はロイシンをＥ１アミノ酸８１として指定するコドン、並びにＥ１アミノ酸位２５３でのコドンであって、弱毒化突然変異、好ましくはセリン又はスレオニンをＥ１アミノ酸２５３として指定するコドンからなる群から選ばれうる。Ｅ３/Ｅ２のポリタンパク質が切断されないように、更なる弱毒化突然変異がＥ３とＥ２との間の切断ドメインにおける欠失又は置換突然変異を含む；Ｅ１-２５３での突然変異と組み合わせた突然変異は、本発明中で使用される好ましい弱毒化株である。同様に、現存の生ワクチン株中、例えばＴＣ８３株(Kinney et al., 1989, Virology 170: 19-30、特にヌクレオチド３での突然変異)中に存在する突然変異はまた、本発明の方法により精製された粒子中に有利に使用された。レプリコン核酸の非コード領域における弱毒化突然変異の例は、ＶＥＥにおけるヌクレオチド３でのＡ又はＣの置換である。
【００３９】
適切なヘルパー及びウイルス・レプリコンＲＮＡは、米国特許第6,156,558号において開示され、該文献は本明細書中に援用される。
【００４０】
アルファウイルスが、南アフリカ・アルボウイルスＮｏ.８６(Ｓ.Ａ.ＡＲ８６)である場合、適切な弱毒化突然変異は、以下の
ｎｓＰ１アミノ酸位５３８でのコドンであって、弱毒化アミノ酸、好ましくはイソロイシンをｎｓＰ１アミノ酸５３８として指定するコドン；
Ｅ２アミノ酸位３０４でのコドンであって、弱毒化アミノ酸、好ましくはスレオニンをＥ２アミノ酸３０４として指定するコドン；
Ｅ２アミノ酸位３１４でのコドンであって、弱毒化アミノ酸、好ましくはリジンをＥ２アミノ酸３１４として指定するコドン；
Ｅ２アミノ酸位３７６でのコドンであって、弱毒化アミノ酸、好ましくはアラニンをＥ２アミノ酸３７６として指定するコドン；
Ｅ２アミノ酸位３７２でのコドンであって、弱毒化アミノ酸、好ましくはロイシンをＥ２アミノ酸３７２として指定するコドン；
ｎｓＰ２アミノ酸位９６でのコドンであって、弱毒化アミノ酸、好ましくはグリシンをｎｓＰ２アミノ酸９６として指定するコドン；及び
ｎｓＰ２アミノ酸位３７２でのコドンであって、弱毒化アミノ酸、好ましくはバリンをｎｓＰ２アミノ酸３７２として指定するコドン；
からなる群から選ばれうる。別のアルファウイルスが使用される実施態様に有用な適切な弱毒化突然変異は、当業者に周知である。
【００４１】
弱毒化突然変異は、既知の方法に従って、特定部位突然変異誘導を行うことにより核酸中に導入されうる。Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488 (1985)を参照のこと、該開示は、その全てを本明細書中に援用される。或いは、既知の方法に従って、相同性制限酵素断片を置換することにより、又は変異誘導性ポリメラーゼ・チェーン反応方法により、突然変異は核酸中へ導入されうる。
【００４２】
ＡＲＰｓを生成する際に使用されるヘルパー核酸(単数又は複数)及びレプリコンＲＮＡが作られたなら、望ましくは電気穿孔によりそれらは適切な宿主細胞中へ導入される。比較的高い細胞密度で行われる電気穿孔は、ヘルパー核酸とウイルス・レプリコンＲＮＡの効果的な取り込みが可能になるということを、本発明者が発見した。ヘルパー及びレプリコン核酸は、電気穿孔における使用、又はＡＲＰ生成のため核酸を細胞に導入する別のプロトコルにおける使用のため精製されるべきであるが、ヘルパーＲＮＡはキャップされる必要はない。
【００４３】
感染性ウイルス粒子を細胞中に生成するステップは、慣用の技術を使用して行われうる。例えばDavis et al.,に対する米国特許第5,185,440号、Bioption AB,に対するPCT公開WO 92/10578、及びTemin et al.,に対する米国特許第4,650,764号を参照のこと。(しかし、Temin et al.,は、アルファウイルスよりむしろレトロウイルスに関する)。感染性ウイルス粒子は、本明細書中に記載される方法及び/又は慣用の粒子回収技術により改良される標準細胞培養成長技術、或いは本明細書中以下に記載される塩洗浄方法により精製されうる。塩洗浄液は、特に特定の表面荷電がＡＲＰ表面上に存在するとき、ＡＲＰ回収を改良するようである。ＶＥＥの場合では、Ｅ２＝３０９及びＥ２-１２-でのアミノ酸残基は、正の荷電を作り出す良好の部位を提供する。
【００４４】
ウイルス・レプリコンＲＮＡは、プロモーター並びに他の配列であってＡＲＰｓが導入されそして発現される予定の宿主細胞におけるコード配列の転写及び翻訳発現に必要とされる配列に発現可能なように結合される複数の異種性コード配列をコードする。
【００４５】
明細書中に記載されるアミノ酸配列中のアミノ酸の全ては、当該技術分野においてルーチンに使用される通常の３文字及び１文字表記を有する：Ａ、Ａｌａ、アラニン；Ｃ、Ｃｙｓ、システイン；Ｄ、Ａｓｐ、アスパラギン酸；Ｅ、Ｇｌｕ、グルタミン酸；Ｆ、Ｐｈｅ、フェニルアラニン；Ｇ、Ｇｌｙ、グリシン；Ｈ、Ｈｉｓ、ヒスチジン；Ｉ、Ｉｌｅ、イソロイシン；Ｋ、Ｌｙｓ、リジン；Ｌ、Ｌｅｕ、ロイシン；Ｍ、Ｍｅｔ、メチオニン；Ｎ、Ａｓｎ、アスパラギン；Ｐ、Ｐｒｏ、プロリン；Ｑ、Ｇｌｎ、グルタミン；Ｒ、Ａｒｇ、アルギニン；Ｓ、Ｓｅｒ、セリン；Ｔ、Ｔｈｒ、スレオニン；Ｖ、Ｖａｌ、Ｖａバリン；Ｗ、Ｔｒｙ、トリプトファン；Ｙ、Ｔｙｒ、チロシン。
【００４６】
本明細書中で使用されるとき、特定の配列により起こる「発現」は、付随された下流配列の転写である。適切でありかつ付随される配列が所望されるなら、ここで発現という用語はまた、転写されたＲＮＡの翻訳(タンパク質合成)も包含する。或いは、異なる配列は、転写及び翻訳させるために使用されうる。
【００４７】
ゲノムＤＮＡ(ここで遺伝子は、イントロンにより遮られておらず、及び/又はここでこれは、高度に繰り返され、又は発現されない配列に充てられている大部分のゲノムではない)又はｃＤＮＡは、適切に調製されたウイルス・ベクター核酸調製品へとクローン化されて、組換えベクター核酸調製品を生成する。組換えベクター核酸調製品は、組換えベクター核酸を感染性粒子にパッケージングを可能にする細胞中へ導入される。組換えベクター核酸調製品は、ヘルパー核酸、ＲＮＡ若しくはＤＮＡと共にパッケージングするために、例えば電気穿孔混合液１ｍｌあたり約１０7〜約１０9細胞の比較的高い細胞密度で、細胞へと電気穿孔して入れられる。細胞を次に成長培地中で培養して、組換えベクター核酸をウイルス・レプリコン粒子にパッケージングすることを可能にした。
【００４８】
ＡＲＰｓが塩洗浄により細胞から回収された後に、望ましくは細胞遊離上清から回収された後に、ＡＲＰｓは、イオン交換クロマトグラフィーにより部分的に精製される。
【００４９】
本発明の方法は、アルファウイルス由来、好ましくは弱毒化アルファウイルス由来のウイルス・レプリコン核酸へと有利に適用される。特に好ましいアルファウイルスは、ベネズエラ・ウマ脳炎ウイルス(ＶＥＥ)である。特別に例示される弱毒化ＶＥＥは、３０１４株であり、該ウイルス又はそれら由来のＡＲＰｓは、ヘパリン・アフィニティー・クロマトグラフィーを使用して精製されうる。ＶＥＥ３０４２株は、ＡＲＰ方法における使用に適した別の弱毒化ウイルスであるが、ウイルス又はそれ由来のＡＲＰｓの外皮は、ヘパリン・アフィニティー・クロマトグラフィーを使用して精製することができない。該ウイルス又はそれ由来のＡＲＰｓは、グリコサミノグリカン-結合性能力を与える突然変異を有し、塩洗浄ステップを使用する精製に特によく適しており、そしてそれらはヘパリン・アフィニティー・クロマトグラフィーを使用してさらに精製されうる。
【００５０】
本発明の方法において使用するために細胞が獲得される癌(新生物病)は、癌種、肉腫、白血病、及び神経系細胞由来の癌を含む。これらは、非限定的に脳腫瘍、例えば星状細胞腫、乏突起細胞腫、上衣細胞腫、髄芽細胞腫、及び未分化神経外胚葉性腫瘍(ＰＮＥＴ); 膵臓腫瘍、例えば膵管腺癌；肺腫瘍、例えば小細胞及び大細胞腺癌、扁平上皮癌及び細気管支肺胞上皮癌；大腸腫瘍、例えば上皮性腺癌、及びこれらの癌の肝臓転移；肝腫瘍、例えば肝細胞腫及び胆管癌;乳房腫瘍、例えば導管腺癌及び小葉腺癌; 婦人科腫瘍、例えば扁平上皮乳糖腫及び子宮頚部腺癌、及び子宮及び卵巣上皮性腺癌;前立腺腫瘍、例えば前立腺癌;膀胱腫瘍、例えば、移行性、扁平上皮癌;網内系(RES)の腫瘍、例えばＢ及びＴ細胞リンパ腫(結節性及び拡散性)、形質細胞腫及び急性及び慢性白血病;皮膚腫瘍、例えば黒色腫;及び軟部組織腫瘍、例えば軟部組織肉腫及び平滑筋肉腫を含む。
【００５１】
単数形又は複数形で使用される「新生物細胞」、「腫瘍細胞」、又は「癌細胞」は、宿主生物にとって有害となる悪性化した細胞のことを指す。原発性癌細胞(つまり悪性化部位の近くから取られた細胞)は、良く確立された技術、特に組織学的試験により、非癌細胞からたやすく区別され得うる。本明細書中で使用される癌細胞の定義は、非限定的に原発癌細胞だけではなく、癌原細胞由来のいずれの細胞を含む。癌細胞の定義は、転移癌細胞を含み、並びに癌細胞由来のin vitro培養細胞及び細胞系列を含む。通常固形癌として症状を示す癌のタイプについていうとき、「臨床的に検出できる腫瘍」は、例えばＣＡＴスキャン、磁気共鳴影像法(ＭＲＩ)、Ｘ線、超音波、又は触診などの方法により、腫瘤の基準に基いて検出できる腫瘍である。生化学的、又は免疫学的発見のみでは、この定義に適合するためには不十分である。
【００５２】
多抗原免疫学的応答が有利である病原体は、ウイルス、細菌、真菌、及び原生動物病原体を含む。免疫が所望されるウイルスは、非限定的に出血熱ウイルス(例えばエボラウイルス)、免疫不全ウイルス(例えばネコ又はヒト免疫不全症ウイルス)、ヘルペスウイルス、コロナウイルス、アデノウイルス、ポックスウイルス、レトロウイルス、アフトウイルス、ノダウイルス、ピコルナウイルス、オルトミクソウイルス、パラミクソウイルス、風疹、トガウイルス、フラビウイルス、ブンヤウイルス、レオウイルス、発癌性ウイルス、例えばレトロウイルス、病原性アルファウイルス(例えば、セムリキ森林ウイルス又はシンドビスウイルス)、ライノウイルス、肝炎ウイルス(グループＢ、Ｃなど)、インフルエンザウイルスを特に含む。免疫応答が役立つ細菌性病原体は、非限定的に、ブドウ球菌(staphylococci)、連鎖球菌(streptococci)、肺炎球菌(pneumococci)、サルモネラ(salmonellae)、大腸菌(escherichiae)、エルシニア(yersiniae)、腸球菌(enterococci)、クロストリジウム(clostridia)、コリネバクテリウム(corynebacteria)、ヘモフィルス(hemophilus)、ナイセリア(neisseriae)、バクテロイデス(bacteroides)、フランシセラ(francisella)、パスツレラ(pasteurellae)、ブルセラ菌(brucellae)、マイコバクテリウム(mycobacteriae)、ボルデテラ(bordetella)、スピロヘータ(spirochetes)、放線菌(actinomycetes)、クラミジア(clamydiae)、マイコプラズマ(mycoplasmas)、リケッチア(rickettsiae)などを含む。関心の病原性菌類は、非限定的にカンジダ、クリプトコッカス(cryptococci)、ブラストミセス(blastomyces)、ヒストプラスマ(histoplasma)、コクシジオイデス(coccidiodes)、藻菌類(phycomycetes)、トリコデルマ(trichodermas)、コウジカビ(aspergilli)、ニューモシスティス(pneumocystis)などを含む。免疫が有用である原生動物は、非限定的に、トキソプラズマ(toxoplasma)、プラスモディア(plasmodia)、住吸血虫(schistosomes)、アメーバ(amoebae)、ジルアジア(giardia)、バベシア(babesia)、レーシュマニア(leishmania)などを含む。他の寄生生物は、回虫、鉤中及びサナダムシ、糸状虫を含む。
【００５３】
本アルファウイルス・レプリコン・ベクター技術の長所の１つは、１以上の外来遺伝子を発現する能力である。現在までに、アルファウイルス・レプリコンワクチンは、単一又は一握りの異種性遺伝子の発現に限られてきた。この１以上の異種性遺伝子を発現する能力は、各個々の遺伝子発現をさせる複数のプロモーター単位を付加することを通して達成された。レプリコン・ベクターが持ち運ぶことができる異種性遺伝子の数は、キャプシド構造が収容できる核酸の量に限りがあるキャプシド構造により、最終的に制限される。２又は３個の抗原を発現するシングル・レプリコンについての代わりの戦略は、個々のアルファウイルス・レプリコン粒子の混合物を投与することであり、該粒子各々は複数抗原及び／又は本明細書中に記載される病原菌に対して免疫応答を誘発するための異なる抗原をコードしそして発現する。今日までに、これらのアプローチは、マルチ・プロモーター又は混合物レプリコン・セットのいずれにおいても、同時に数個(〜３)の抗原発現に限られた。
【００５４】
しかしながら、本明細書中に記載されるアルファウイルス・レプリコン粒子を生成する方法技術における最近の改良は、同じワクチン調製品中の複数抗原に対するワクチンの新たな機会についてドアを開けた。方法の改良は、高細胞密度電気穿孔法(５×１０7〜１.５×１０8細胞／ｍｌの電気穿孔液)と塩洗浄技術に基いた。別の改良は、電気穿孔混合液におけるキャップなし(又はキャップあり)ＲＮＡ分子又はＤＮＡ分子の使用を含む。これらの改良からの収量は、２〜３桁の大きさで増加された(１回のキュベット電気穿孔から１０11i.u.が生成される)。従来技術を超えるレプリコン生成の効率の有意な増加は、規模の観点から以前は実行できなかった多くのワクチン・アプローチが現在では可能であるということを意味する。本明細書中において、及び参照される仮出願において開示される方法を使用して達成されうる収量によって、ウイルス・レプリコン核酸中に挿入される核酸が調製された腫瘍、腫瘍細胞、病原体、又は寄生生物により発現される抗原の全長を発現するＡＲＰｓの生成が理論的に可能になる。
【００５５】
一のそうしたアプローチは「患者特異的ワクチン」であり、ここではシングル・ワクチン調製品は、感染性疾患又は新生物病、例えば癌の予防又は治療処置用に、患者毎に調製された。１の腫瘍細胞は、最大５,０００の遺伝子を発現すると見積もられているので、慣用的なアプローチを使用して数多くの遺伝子を発現するアルファウイルス・レプリコン腫瘍ライブラリー・ワクチンを作り出すいずれの試みも、各遺伝子を発現するレプリコンの数の点でかなり限られていた。さらに、粒子は臨床セットにおける投与及び製剤に適したものにするために精製を必要とし、そして精製はタイターのかなりの欠失をもたらすことが多い。改良されたＡＲＰ生成技術を使用して、我々は現在、レプリコンの集合を作り出すことができ、該集合では、全部ではないが多くの腫瘍細胞由来遺伝子は、１×１０5個の粒子の集合において、平均して少なくとも一回提示されるようである。このアプローチからの高い収量に加えて、該方法は感染ユニット基準あたりの純度の高い製剤を提供しうる。これは、次の精製ステップが必要とされなくなりうることを意味し、こうして次の過程での損失を妨げる。付け加えて、増大された純度は、宿主における抗ベクター及び抗汚染物質免疫応答を誘発する危険性を低減しうる。通常、そうした応答は、追加ワクチン接種の有効性を潜在的に妨げるか、又は危うくする。治療腫瘍処置などのアプローチでは、高タイター・ワクチンを純度の高い製剤中に頻繁にデリバリーする能力は、ワクチンの主要な望ましい特徴である。本発明は、アルファウイルス・レプリコン・ベクターを使用して行われる新規の多抗原性ライブラリー・アプローチを可能にする。これらのライブラリーは、多抗原、又は病原性生物、寄生生物、又は腫瘍細胞由来の遺伝子レパートリーの全部をコードしうる。
【００５６】
ＡＲＰ生成のための、細胞への導入用核酸を作り出すために使用される先行技術の方法は、高価でありかつ労力がかかる一方、本開示は、改良されたＡＲＰ収量を達成するための種々のパラメーターの改変を記載し、その上方法の単純化、そして桁違いにＡＲＰあたりの値段の低減を記載する。改良されたアルファウイルス粒子収量は、腫瘍細胞、病原体、又は寄生生物由来の核酸のアルファウイルス・レプリコン核酸へのクローニング、並びに十分な効率でパッケージングすることを可能にし、その結果、腫瘍細胞、病原体、又は寄生生物抗原の代表的なセットは、ＡＲＰ「発現ライブラリー」により生成される。ヒト又は動物患者が一定量のそうしたＡＲＰ調製品であって、場合によりさらに免疫学的アジュバントを含む調製品で接種されて、その結果、患者に投与された調製品及びＡＲＰライブラリー内にコードされる複数の抗原決定要因に対して免疫応答が作られるように、ＡＲＰｓの収量は、十分に高い。
【００５７】
表１は、ｃＤＮＡのプールから生成される多抗原性ＡＲＰのタイターを示す。１０個の異なる異種性遺伝子(クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ(ＣＡＴ)、β-ガラクトシダーゼ(β-ｇａｌ)、Ｒａｔ／Ｎｅｕ腫瘍遺伝子、ルシフェラーゼ、ＨＩＶ・Ｇａｇ、癌抗原Ａ、及び４種のマラリア抗原：ＰＰｋＭＳＰ１-４２、ＰｙＨｅｐ１７、ＰｆＡＭＡ１、及びＰｋＣＳＰ)を発現するアルファウイルス・レプリコン・コンストラクトをＮｏｔ１制限エンドヌクレアーゼで直線化し、プールし、そしてＲＮＡ転写産物は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを使用して作成された。ＲＮＡ分子のプールは、アルファウイルス・キャプシド及び糖タンパク質ヘルパー・ＲＮＡｓと、ベロ(ＶＥＲＯ)細胞中に共-電気穿孔されて、各遺伝子産物に特異的な免疫蛍光アッセイを使用するＡＲＰタイター決定により、１０個の異なる抗原を発現する個々のＡＲＰからなるＡＲＰの集団を生成した。
【００５８】
表２は、ＲＮＡｓのプールから生成される多抗原性ＲＡＰのタイターを示す。７個の異なる異種性遺伝子(ＣＭＶ ＩＥ１、ＣＭＶ ｇＢ、インフルエンザ、ＨＡ、ＨＩＶ・Ｐｏｌ、ＨＩＶ・Ｇａｐ、Ｒａｔ／ｎｅｕ、ＣＡＴ)を発現するアルファウイルス・レプリコン・コンストラクトは、Ｎｏｔ１制限酵素エンドヌクレアーゼで個々に直線化した。各レプリコンについてのＲＮＡ転写産物は、Ｔ７ＲＮＡ・ポリメラーゼを使用して作成された。７個の異なるＲＮＡ転写産物は、等濃度で混合されて、そしてアルファウイルス・キャプシド及び糖タンパク質ヘルパーＲＮＡと共に電気穿孔された。各遺伝子産物に特異的な免疫蛍光アッセイを使用するＡＲＰタイター決定により測定されるとき、７個の異なる抗原全てを発現するＡＲＰの集合を作成した。
【００５９】
表３は、(図１に示される)多抗原性ＡＲＰでワクチン接種された動物にける抗原特異的免疫応答の要約を提供する。液性免疫形態における抗原特異的免疫応答は、ＥＬＩＳＡにより測定されて、そして逆数幾何平均として表され、或いはウエスタンブロット又はＩＦＡにより測定されて、抗原特異的シグナルが検出できる最も低い希釈度として示された。細胞性免疫形態における抗原特異的免疫応答は、ＩＦＮ-γ分泌細胞のＥＬＩＳＰＯＴ検出により測定され、そして１０6リンパ球あたりの抗原特異的ＩＦＮ-ガンマ分泌リンパ球として表された。ｓ.ｃ.又はｉ.ｐ.経路の接種により、多抗原性ＡＲＰ調製品を受ける動物は、該調製品中の全ての抗原に対する免疫応答を増大した。ポジティブ・コントロールとして、ＨＩＶ-Ｇａｇ・ＡＲＰを受けた一の群は、Ｇａｇに対してのみ特異的な免疫応答を高めた。ネガティブ・コントロールの動物は、いずれの抗原に対する検出できる応答を有さなかった。多くのサンプルは、終点でタイターを調べておらず、そして得られた値より大きいか又は同等のタイターとして表される。多抗原性調製品の一部としてＨＩＶ・Ｇａｇ遺伝子タンパク質に対して誘発された免疫応答は、１つの(単一の)標準調製品として与えられたＨＩＶ・Ｇａｐタンパク質と比較して、液性及び細胞性基準に関して同等であった。このことによって、より大きい発現ライブラリーの構成要素として発現されたコード配列は、本発明の組成物及び方法を使用して効果的に免疫原性でありうるということが示された。
【００６０】
腫瘍細胞、病原体、又は寄生生物の複数の抗原性決定要素をコードする発現性のヌクレオチド配列を含む免疫学的ＡＲＰ調製品は、予防投与計画の一部として、つまり製剤が投与されるヒト又は動物が、新生物病、病原体感染、又は寄生生物感染を患う可能性を低減するために、投与されうるか、或いは治療用投与計画として、つまり存在する新生物病、病原体感染、又は寄生生物感染に付随するいずれの病気の重篤度を低減するために、又は調製品が投与されたヒト又は動物において作リ出された免疫応答のため、新生物病、病原体感染又は寄生生物感染を防ぐように投与される。
【００６１】
免疫応答の生成が、腫瘍細胞(又は新生物病)、病原体、又は寄生生物に対する少なくても幾つかのレベルの防御免疫を含む一方で、そうした新生物病又は寄生生物若しくは病原体での感染を患う患者における臨床結果は、当該技術分野に知られる適切な化学治療剤で患者を治療することによっても改良されうる。病原体がウイルスで或る場合、アシクロビルなどの抗ウイルス化合物は、例えばヘルペスウイルス感染を患う患者においてＡＲＰワクチンと同時に、又はＨＩＶに感染された個人においてＨＡＡＲＴ(高活性抗レトロウイルス療法)と同時に投与されうる。病原体が細菌病原体である場合、細菌が感受性である抗生物質は、望ましくは投与され、そして病原体が真菌である場合は、適切な抗真菌抗生物質が望ましくは投与される。同様に、寄生生物感染の制御及び/又は根絶用の化学薬剤は知られており、そして当該技術分野に既知の投与量及び投与計画を使用してヒト又は動物患者に有利に投与される。患者が新生物病、例えば癌を患う場合、ＡＲＰｓが投与された患者において多数の癌関連抗原を発現することができるＡＲＰｓを含む免疫原性組成物の投与は、望ましくは抗新生物薬剤(単数又は複数)の投与を伴う。該抗新生物薬剤(単数又は複数)は、非限定的に、ダウノルビシン、タキソール、チオ尿素(thioureas)、治療用放射性核種を結合された癌特異的抗体を含む。但し、該薬剤(単数又は複数)は、投与されたＡＲＰｓ及び患者において発現した抗原に対して、患者が免疫応答を作り出す能力を失わせてはならない。
【００６２】
ワクチン又は別の免疫原性組成物などの本発明の医薬製剤は、免疫原性量の感染性伝播欠損性アルファウイルス・レプリコン粒子を、医薬として許容される担体と組み合わせて含む。「免疫原性量」は、医薬製剤が投与された対象において免疫応答を誘発するために十分な感染性アルファウイルス粒子の量である。投与量あたりの約１０1〜約１０10、好ましくは１０5〜１０8の感染ユニットの量が適切であると信じられ、治療される対象の年齢及び種によって左右される。典型的な医薬として許容される担体は、非限定的にパイロジェン-フリー滅菌水及びパイロジェン-フリー滅菌生理食塩水を含む。免疫原性量の本発明の感染性伝播欠損アルファウイルス粒子を投与された対象は、非限定的にヒト及び動物(例えば、犬、ネコ、ウマ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ウサギ、ロバ、マウス、ハムスター、サル)対象を含む。免疫学的に活性な化合物、例えばサイトカイン及び/又はＢＣＧは、投与されたウイルス・レプリコン粒子調製品に対する免疫応答を増大するために加えられうる。投与は、腫瘍内、腹腔内、筋肉内、皮内、鼻腔内、経膣、経直腸、皮下、又は静脈内投与のいずれかのなどの適切な方法により行われうる。
【００６３】
本発明の方法を使用して生成される(該組成物がヒト又は動物に投与されるとき、関心の抗原を発現させる)ＡＲＰｓを含む免疫原性組成物は、当該技術分野に周知の方法のいずれかにより剤形されうる。そうした組成物、特にワクチンは、典型的には注射液として、液体溶液又は懸濁液のいずれかとして調製される。固体形態、例えば注射の前に液体中へ溶解若しくは懸濁することに適した凍結乾燥調製品を形成する。
【００６４】
活性免疫原性成分(ＡＲＰｓ)は、医薬として許容されかつ活性成分と適合性のある賦形剤又は担体と混合されることが多い。適切な賦形剤は、非限定的に滅菌水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール、又はそのような物並びにそれらの組合せを含む。
【００６５】
さらに、所望されるならば、前記ワクチンは、少量の補助物質、例えば湿潤剤又は乳濁剤、ｐＨ緩衝剤、及び/又はワクチンの有効性を高めるアジュバントを含みうる。効率的でありうるアジュバントの例は、非限定的に、水酸化アルミニウム；Ｎ-アセチル-ムラミル-Ｌ-スレオニル-Ｄ-イソグルタミン(ｔｈｒ-ＭＤＰ)；Ｎ-アセチル-ノル-ムラミル-Ｌ-アラニル-Ｄ-イソグルタミン(ＣＧＰ１１６３７、ｎｏｒ-ＭＤＰと呼ばれる)；Ｎ-アセチルムラミル-Ｌ-アラニル-Ｄ-イソグルタミニル-Ｌ-アラニン-２-(１’-２'-ジパルミトイル-ｓｎ-グリセロ-３ヒドロキシホスホリルオキシ)-エチルアミン(ＣＧＰ１９８３５Ａ、ＭＴＰ-ＰＥと呼ばれる);及び細菌から抽出された三種の構成要素：モノホスホリル・リピドＡ、トレハロース・ジミコレート、及び細胞壁骨格(ＭＰＬ+ＴＤＭ+ＣＷＳ)を、２％スクアレン/トゥィーン８０中に含むＲＩＢＩを含む。アジュバントの有効性は、種々のアジュバントを含むワクチン中の免疫原の投与から得られるＡＲＰ免疫原性生成物に対する抗体量を計測することにより測定されうる。当該技術分野に周知のそうしたさらなる製剤及び投与の方法は使用されうる。
【００６６】
１以上の免疫増強分子、例えばケモカイン及び/又はサイトカインは、患者又は動物に投与される免疫原性組成物中に取り込まれうる。代わりに、免疫増強分子のコード配列(単数又は複数)を含むアルファウイルス・レプリコン・ベクターは、免疫原性組成物中に取り込まれうる。ケモカイン及び/又はサイトカインの選択は、免疫応答が所望される新生物組織又は細胞、寄生生物若しくは病原体に従って変わりうる。実施例は、非限定的にインターロイキン-４、インターロイキン-１２、γ-インターフェロン、顆粒球マクロファージ・コロニー刺激因子、及びＦＬＴ-３リガンドを含みうる。
【００６７】
免疫原性の(又はそうでなければ、生理的に活性な)ＡＲＰを含む組成物は、投与剤形と適合性のある方式で、並びに予防及び/又は治療有効であるそうした量で投与される。投与される量は、投与量において一般的に約１０1〜約１０10、好ましくは１０5〜１０8感染ユニットの範囲であり、治療される対象、抗体を合成するための個人の免疫系の容量、及び所望される防御の程度に左右される。投与されるために必要とされる活性成分の正確な量は、医師、獣医師、又は別の保健従事者の判断に左右され、そして各個人について固有であるが、そうした決定はそうした従事者の技術の範囲内である。
【００６８】
ワクチン又は別の免疫原性組成物は、１回投与又は複数回投与計画において与えられうる。複数回投与計画は、ワクチンの初回治療コースが１〜１０又はそれを超える分けられた投与、続いて免疫応答を維持及び/又は増強するために必要とされる時間期間、例えば毎週、毎月、又は２回目の投与として１〜４ヶ月目で投与される投与、そして必要とされるなら、さらに数ヶ月/数年後の次の投与(単数又は複数)を含みうる計画である。
【００６９】
クローニング、ＤＮＡ単離、増幅及び精製について、並びにＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、制限エンドヌクレアーゼなどを含む酵素反応についての標準技術、そして種々の分離技術は、当業者に知られ、そして通常に使用される。標準技術の多くは、Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, New York; Maniatis et al.(1982) Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, New York; Wu (ed.) (1993) Meth. Enzymol. 218, Part I ; Wu (ed.) (1979) Meth. Enzymol. 68; Wu et al. (eds.) (1983) Meth. Enzymol. 100 and 101; Grossman and Moldave (eds.) Meth. Enzymol. 65; Miller (ed.) (1972) Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York; Old and Primrose (1981) Principles of Gene Manipulation, University of California Press, Berkeley; Schleif and Wensink (1982) Practical Methods in Molecular Biology ; Glover (ed.) (1985) DNA Cloning Vol.I and II, IRL Press, Oxford, UK; Hames and Higgins (eds.) (1985) Nucleic Acid Hybridization, IRL Press, Oxford, UK; Setlow and Hollaender (1979) Genetic Engineering : Principles and Methods, Vols. 1-4, Plenum Press, New York; and Ausubel et al. (1992) Current Protocols in Molecular Biology, Greene/Wiley, New York, NY.において記載される。使用される略記及び命名法は、当該技術分野に標準なものとみなされ、そして本明細書中で引用する専門論文において通常使用されている。
【００７０】
本出願中に引用される全ての参考文献は、本開示と矛盾がない程度にその全てを本明細書中に援用される。
【００７１】
以下の実施例は、例示の目的に提供され、そして本明細書中に特許請求される発明の範囲を制限することを意図しない。例示的な物品のいずれの変動であって、当業者が思いつくものは、本発明の範囲内に含まれることが意図される。
【実施例】
【００７２】
実施例１.腫瘍関連抗原のライブラリーを発現するアルファウイルス・レプリコンベクターの作成
腫瘍細胞は、典型的に切除、生検、又は内視鏡的サンプリングにより癌患者から取得される。細胞は、直接使用され、冷凍保存され、又は培養液中で維持され又は拡大された。ＲＮＡは、当該技術分野に周知の標準方法、例えば、市販の試薬及びキット、例えばトライゾル(Sigma, St. Louis, MO)又はＳ.Ｎ.Ａ.Ｐ.トータルＲＮＡアイソレーション・キット(S. N. A. P. total RNA isolation kit)(Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA)を使用し、続いてオリゴ(ｄＴ)-セファロース上でｍＲＮＡを精製することにより、腫瘍細胞から抽出された。ｍＲＮＡは、さらにサブトラクティブ・ハイブリダイゼーション又は当該技術分野に周知の別の方法により腫瘍特異的配列においてさらに濃縮されうる。ファーストストランドｃＤＮＡは、稀な制限酵素部位を５’末端に有するオリゴ(ｄＴ)オリゴヌクレオチドを使用して合成される。次にｃＤＮＡを精製し、セカンド・ストランドは、標準方法のいずれかを使用して、例えばＤＮＡポリメラーゼＩ-ＲｎａｓｅＨ又は非特異増幅を使用して生成される。アダプターは次にライゲーションされて、接着性末端を作り出し、そして二重鎖ＤＮＡは、オリゴ(ｄＴ)プライマー中に取り込まれた部位で、稀に認識される制限エンドヌクレアーゼ(例えばＤｒａＩ)で切断される。この方法は、ディレクショナル・クローニングに適した適合性のない接着性末端を伴う二重鎖ｃＤＮＡを作り出す。
【００７３】
或いは、実施例２(下記)に記載の戦略は、ディレクショナル・クローニングのための接着末端の作成に使用されうる。更なる実施態様では、接着性末端は、末端デオキシリボヌクレオチド・トランスフェラーゼにより結合されうる。二重鎖ｃＤＮＡは、プラスミド・レプリコン・ベクター中にクローン化され、または以下に記載の方式の１つに類似の方式でｉｎ ｖｉｔｒｏで組換えレプリコン分子を構成するために使用される。このアプローチは、３’末端上にビオチン標識及び５’末端にＴ７プロモーターを含む組換えレプリコン分子を作り出し、こうしてＴ７ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを使用して、組換え分子の選別及びｉｎ ｖｉｔｒｏでのＲＮＡの作成を可能にした。さらなる選別ステップは、腫瘍抗原ライブラリーに存在する抗原の数を「絞り込む(down-select)」ために行われる。そうしたサブトラクティブ・ハイブリダイゼーション及びディファレンシャル分析の方法は、当該技術分野に周知であり(米国特許第5,958,738号、第5,827,658号、及び第5,726,022号、及び米国出願公開2002-0018766を参照のこと)、そしてそうした選別方法は、ＶＥＥレプリコン・コンストラクト中にクローニングする直前に行われた。このアプローチは、腫瘍抗原プールを、腫瘍細胞において、過度に発現されるか又は好ましくは上方発現される遺伝子へと限定するために役に立つ。この選別は、抗原ライブラリーにおける通常細胞遺伝子の頻度及び／又は存在を低減又は削除するために役に立つ。いずれの特定の論理に拘束される事無く、更なる利益は、腫瘍関連抗原に対する免疫応答に焦点をあてる非腫瘍特異的抗原を削除する事を含むと信じられており、こうしてワクチン調製品の潜在的な特異性を最大化し、そして自己免疫応答を誘導する危険性を低減する。抗原レパートリーの「絞込み」はまた、初回―追加戦略にも関連する。多くの例では、広範囲の腫瘍抗原でワクチン接種し、そして続いて追加免疫接種において、特異的抗原について効果的に免疫系に焦点を当てるために抗原の数を制限／絞込みする事は、有利でありうる。これは、初回免疫化に続いて、どの抗原に宿主が応答したかを同定し、そして基本的に宿主が認識できると実証した抗原及び免疫応答を生じたことがある抗原に対する免疫応答を増加するために次なる各追加免疫をあつらえることに基いて、抗原を絞り込むことによって実行できる。
【００７４】
実施例２ 標的遺伝子配列が知られている場合における、感染組織又は血液のサンプルからの感染疾患生物特異的ｃＤＮＡを発現するアルファウイルス・レプリコン・ベクターの作成
遺伝子又は関心遺伝子(つまり、レプリコンにより発現される免疫原性成分をコードする遺伝子)が、周知の配列の媒介物から獲得される場合、この実施例は、急性若しくは慢性感染を患う個人に特異的なウイルス／細菌／寄生生物遺伝子レパートリーのクローニングを記載する。ｍＲＮＡは、当該技術分野に周知の標準方法、例えば、Ｓ.Ｎ.Ａ.Ｐ.トータルＲＮＡアイソレーション・キット(Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA)に従って、組織又は血液サンプルから単離される。ファースト・ストランドｃＤＮＡは、当該技術分野に周知の標準方法のいずれかにより、例えばｃＤＮＡサイクルキット(cDNA cycle kit)(Invitrogen,Inc, Carlsbad, CA)、又はＡＭＶリバース・トランスクリプターゼとランダム・プライマーを使用して合成される。関心の遺伝子(単数又は複数)は、標的遺伝子特異的プライマーを使用してｃＤＮＡから増幅され、続いてアンプリコンは、ＰＣＲ精製キット(Qiagen Inc., Valencia, CA)又は当該技術分野に周知である他の別の方法を使用して精製される。当業者に周知の方法を使用して、例えばG:Cクローニング、制限エンドヌクレアーゼ・切断の後のディレクショナル・クローニング、又はゲートウェイ(Gateway)(Invitrogen, Carlsbad, CA)等のIn vitro組換え方法、又はクレ-ロックス(Cre-lox)組換えシステムを使用して、アンプリコンは、ＶＥＥレプリコン中へクローン化される。
【００７５】
好ましい実施態様では、関心のコード配列(単数又は複数)は、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド・オリゴヌクレオチドを使用して増幅される。増幅に続いて、ＤＮＡアンプリコンは、ＮａＯＨで処理されて、プライマーのＲＮＡ成分を切断し、或いは希土類金属元素の存在下で５０℃でインキュベーションして、ライゲーションに必要とされる３’突出部を作り出すために、デオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチドの間のホスホジエステル結合を選択的に加水分解した(Chen et al., 2000, Biotechniques; 28 (3): 498-500,504-5 and Chen et al., 2002, Biotechniques, 32: 516,518-20)。 ベクター配列における相補的な３’突出部は、類似の様式で作られるか、又は制限エンドヌクレアーゼを使用する事により作られる。この方式では、レプリコン分子の２個の断片：左腕(left arm)及び右腕(right arm)が調製される。左腕は、VEE特異的配列に発現可能なように結合されるT7プロモーターを含み、該左腕は、使い勝手の良いクローニング部位の上流に存在するか、及び該部位を含む。右腕は、VEEの３’非翻訳領域を含む。右腕はまた、３’末端にビオチン標識を含む。増幅された３’突出部を含む断片は、Ｔ４ＤＮＡライゲースを使用して、ベクターの左及び右腕に結合される。集められた分子は、磁性を帯びたストレプトアビジン被膜ビーズ又は、他の別の類似の固相吸着技術を使用してライゲーション反応混合液から分離される。全長レプリコンＲＮＡは、Ｔ７ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを使用するin vitro翻訳により、精製組換えベクターＤＮＡから生成される。当該ステップは、全長組換え分子の生成のみをもたらす。なぜなら不完全な分子はストレプとアビジンに結合しないか、又はＴ７プロモーター配列を欠如するため翻訳されないからである。得られた組換えレプリコンＲＮＡ分子は、患者において感染性である標的の遺伝子型を表す標的遺伝子(単数又は複数)の包括的なレパートリーをコードする。この方法の利点は、個人由来の特定の遺伝子集合についてのすべてのバリアントを提示する能力であり、例えば、上記で概略を示した方法を使用して、ＨＩＶ-１エンベロープ・ｇｐ１６０遺伝子配列の増幅は、特定の患者由来のエンベロープ・バリアントの大部分又は全てをコードするＡＲＰ集合を作り出す。患者が複数の種のウイルスで感染されるか、又は元の親循環株から派生する区別されるバリアントで感染されるならば、上記の技術は、全てのバリアントを補足し、そして該バリアントは最終ＡＲＰワクチン集合中で提示される。
【００７６】
実施例３ 標的遺伝子配列が知られていない場合における、感染された組織／血液のサンプルからの感染疾患特異的ｃＤＮＡを発現するアルファウイルス・レプリコン・ベクターの作成
該実施例は、遺伝子又は関心の遺伝子が周知の配列ではない場合におけるウイルス／細菌／寄生生物遺伝子レパートリーのクローニングを記載する。ウイルス、細菌、又は寄生生物ｍＲＮＡは、マイクローブ発現キット(MICROBExpress KIT）(Ambion, Austin, TX)又は当業者に周知の別の方法を使用して、野外標本、又は保存培養品、又は精製調製品から単離される。ファースト・ストランドｃＤＮＡは、ランダム・プライマー、又は稀な制限酵素部位を５’末端に有するランダムプライマーを使用し、続いて当業者に周知のストランド方法を使用してＤＮＡ・ポリメラーゼＩ及びＲＮａｓｅＨでセカンド・ストランドｃＤＮＡの合成を行った。二重鎖ｃＤＮＡは、続いて以下のようにアダプター又はリンカー配列のライゲーション後に、ＶＥＥベクター中にクローン化される。ｃＤＮＡが稀な制限酵素部位を含むランダム・プライマーで合成される場合、リンカーは、二重鎖ｃＤＮＡの５’末端に異なる稀な第二制限酵素切断部位を結合するために使用される。これらの２個の制限エンドヌクレアーゼでのｃＤＮＡのプールの切断は、異なる接着末端を有するｃＤＮＡの作成をもたらし、当該技術分野に知られる方法を使用してレプリコン・ベクター中にディレクショナル・クローニングをするように機能する。ｃＤＮＡが更なる固有の制限酵素部位を欠如するランダムプライマーで作成される場合、二重鎖ｃＤＮＡは、ＥｃｏＲＩメチラーゼを使用してメチル化されて、ＥｃｏＲＩ制限酵素で切断される内部の配列を保護する。ＥｃｏＲＩリンカーは、次にＴ４ＤＮＡライゲースを使用して付着され、続いてＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼで切断される。これは、接着末端を有するｃＤＮＡ断片を作り出し、該断片はレプリコン中にクローン化される。クローニング戦略は、実施例２に記載される戦略に類似しており、３’末端でビオチン標識され、そして５’末端でＴ７ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを含むレプリコン分子のプールを作成するために使用されうる。再び、以前の実施例に記載されるように、サブトラクティブ・ハイブリダイゼーション又はディフェレンシャル・ディスプレイは、腫瘍特異的アプローチに記載される方式と類似の方式で、病原体特異的遺伝子配列を正又は負に選別するためのさらなる次のスクリーニング・ステップとして使用されうる。再び、これは、全てのワクチン接種で行われ、又はワクチン接種の間宿主がモニターされる「リアルタイム」に基いて行われ、そして該ワクチンは、宿主が認識及び応答を示す抗原を含むようにあつらえられる。
【００７７】
実施例４ 多抗原性ＡＲＰパッケージング
各ＡＲＰが、一回の電気穿孔実験から異なる抗原(単数又は複数)を発現するＡＲＰｓ集合の作成は、２つの別の方式において行われる。第一方法は、１０個の異なるレプリコン・ベクター・コンストラクト由来の０.５μｇのＤＮＡを混合することからなり、ここで各々は、１の異種性のコード配列を含む(表１)。ＤＮＡは、ＮｏｔＩ制限酵素で直線化され、そしてＲＮＡは、レプリコンＤＮＡから、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼで転写された。複数レプリコンＲＮＡ転写反応液を次にＲＮＥasyカラム(Qiagen Inc., Valencia, CA)を使用して精製した。３０μｇの各々精製されたキャプシド(Ｃ)ヘルパー及び糖タンパク質(ＧＰ)ヘルパーＲＮＡと混合された３０μｇの複数-レプリコンＲＮＡを使用して、０.８ｍｌ体積キュベットにおいて、１.０×１０8ベロ細胞中に電気穿孔することにより、ＡＲＰは作られた。電気穿孔の後に、細胞を２００ｍｌのオプティプロ(OptiPro）培地(Invitrogen, Carlsbad, CA)中に懸濁し、そして４,１７５ｃｍ2培養フラスコ中に蒔いた。電気穿孔の約２６時間後、各フラスコの培地は捨てられて、そして５ｍｌの塩洗浄液(２０ｍＭ・リン酸緩衝液(ｐＨ７.３)中の１Ｍ・ＮａＣｌ)に置き換えられた。フラスコを室温で１０分間インキュベーションし、該塩洗浄液を回収し、そして０.２ミクロン・シリンジ・フィルターを通してろ過した。抗原特異的抗体を使用して標準的な免疫蛍光方法により、個々のＡＲＰのタイターをベロ細胞中で測定した。一回の電気穿孔から得られたプールにおける各ＡＲＰのタイターを表１に示す。ＡＲＰ調製品のタイターは、４.１×１０9感染ユニット／ｍｌであり、１回のキュベット電気穿孔から得られる総ＡＲＰ８.２×１０10ｉ.ｕ.をもたらした。代表的な１０抗原の全ては、ＡＲＰ集合中に存在した。この実施例は、複数の異なる抗原のみが１のＡＲＰ調製品から発現されるばかりでなく、抗原型の範囲が、広く変化されるということを示す。この調製品では、抗原は、ウイルス感染疾患起源(ＨＩＶ)由来であり、寄生生物起源(マラリア)由来であり、又は癌起源(rat/Neu及び癌抗原Ａ)並びに酵素(ＣＡＴ、ルシフェラーゼ、及びβgal)由来である。
【００７８】
第二方法は、プールとしてよりはむしろ独立して各レプリコン・ベクターのＲＮＡ転写産物を作り出すことからなった。この実験において使用された７個のレプリコン・ベクターは、表２に記載される。１０μｇづつの精製されたレプリコンＲＮＡは、３０μｇづつの精製されたＣ-ヘルパー及びＧＰ-ヘルパーＲＮＡｓと混合されて、全体として１３０μｇになった。ＲＮＡ混合液を次に１.０×１０8ベロ細胞中に電気穿孔した。電気穿孔された細胞は、２００ｍｌのオプティプロ培地中に懸濁し、そして２３００ｃｍ2培養フラスコ中に蒔いた。電気穿孔後約２４時間後、各フラスコからの培地を回収し、そして１０ｍｌの塩洗浄液で置き換えた(２０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７.３中に、１Ｍ・ＮａＣｌ)。フラスコを、室温で５分間インキュベーションし、そして塩洗浄液を回収した。培地及び塩洗浄液物質の両方を０.２ミクロン・シリンジ・フィルターを通してろ過した。培地及び塩洗浄液中の個々のＡＲＰをＩＦＡに対する抗原特異的抗体を使用して、ベロ細胞中でタイターを計測した。培地又は塩洗浄液中で見られた各ＡＲＰのタイターを、表２に示す。培地中で回復されたＡＲＰのタイターは、５.３×１０7ｉ.ｕ.／ｍｌであり、作成された総ＡＲＰ、１.１×１０10ｉ.ｕ.をもたらした(５.３×１０7ｉ.u.／ｍｌ×２００ｍｌ＝１.１×１０10ｉ.u.)。塩洗浄液中で回収されたＡＲＰのタイターは、４.０５×１０9ｉ.ｕ.／ｍｌであり、１キュベット電気穿孔あたり総ＡＲＰ８.１×１０10ｉ.ｕ.をもたらした。塩洗浄液及び培地中の物質を、混合して、全体で９.２×１０10ｉ.ｕ.のＡＲＰを得た。代表的な７個の抗原すべてが、ＡＲＰ集合中に存在した。プールされたＡＲＰは、次にハイトラップ・ヘパリンHP(HiTrap Heparin HP）５ｍｌカラム(Amersham Bioscience,Upsala Sweden)上で、動物ワクチン研究において使用するために精製された。
【００７９】
ＡＲＰ調製品は、標準安全性試験により評価されて、複製能力のあるウイルス(ＲＣＶ)が存在しないことを確かめた。簡潔に説明すると、１×１０8i. u.の各調製品を、１未満のm.o.iで一時間、ベロ細胞単層上で感染させた。１時間の感染期間の後、成長培地を細胞単層に適用し、２４時間培養した。２４時間後、上清全部を、収集し、澄まし、そして新たなベロ細胞単層にさらに４８時間適用した。複製能力のあるウイルス粒子の汚染の存在を指し示す細胞単層の細胞変性作用(ＣＰＥ)のいずれかの存在についてモニターした。全ての場合、ＲＣＶは、いずれの多抗原性ＡＲＰワクチン調製品において検出されない。
【００８０】
実施例５ 多抗原性ウイルス粒子での動物試験
５〜６週齢の雌BALB/cマウスを、Charles River Laboratoriesから購入し、そして全ての方法の前に一週間順応させた。マウスを水(逆浸透水、１ｐｐｍＣｌ)及び放射線を照射された標準げっ歯類飼料(NIH31改変及び照射)であって、１８％タンパク質、５％脂質、及び５％繊維からなる飼料を自由に与えた。マウスを静置マイクロ隔離飼育器中で、２１〜２２℃(７０-７２°Ｆ)及び４０％〜６０％湿度で、１２時間の光サイクルで飼育した。全ての動物試験を、拘束、畜産、外科手法に関して実験動物の世話と使用についてのガイドラインの勧告に応じて行った。動物の世話と使用プログラムは、ＡＡＡＬＡＣ公認のものである。
【００８１】
初回及び追加注射のために、マウスの群は、イソフロラン麻酔の元で、後足蹠に希釈剤(ＰＢＳ・１％v/vヒト血清アルブミン及び５％w/vスクロース)中の多抗原性ＡＲＰを接種した。足蹠皮下(s.c.)注射を３０.５Ｇの針及び０.１０ｍｌのハミルトン・シリンジで、各足蹠で２０μlを注射することにより行った。同じシリンジ／針により、０.１ｍｌの体積で、腹腔内(ｉ.ｐ.)接種を行った。動物を１、２３、及び４４日に接種した。血清サンプルを、イソフロラン麻酔下で眼窩後ブロック採血により、最初の接種の７日前、及び０日、３０日目及び３５日目(初回接種の後)、及び５１日目及び５６日目(追加免疫の７日及び１２日後)において得た。追加免疫後７日目で、ＩＦＮ-γＥｌｉｓｐｏｔアッセイ用に脾臓を収集した。
【００８２】
ＡＲＰ感染ベロ細胞の免疫蛍光アッセイ(ＩＦＡ)を使用して、ワクチン調製品各々の力価又は感染タイターを計測した。全てのＡＲＰワクチンは、接種の前にタイターを調べた。各々の注射の日に、残りの接種液を逆タイター測定をした。タイターを維持するために、ＡＲＰワクチン接種液は、次のワクチン接種までの間４℃で維持した。試験群は、次のワクチン調製品：１×１０8又は１×１０6ｉ.ｕ.の投与量でそれぞれ投与された高投与量及び低投与量多抗原性ＡＲＰ調製品を含んだ。単一抗原を発現する単一のＡＲＰ調製品と比較した免疫応答をモニターするコントロールとして、ＨＩＶＧａｇのみを発現するＡＲＰは、多抗原性ミックスにおけるＨＩＶ-Ｇａｇ・ＡＲＰの数と等しい投与量で投与された。ネガティブ・コントロールの動物は、希釈剤のみで偽免疫化された。
【００８３】
実施例６ 多抗原性ＡＲＰ投与後の液性及び細胞性免疫応答の計測
ＥＬＩＳＡによりＨＩＶＧａｇ特異的抗体を検出した。ＨＩＶ-１サブタイプＣアイソレートDU４２２由来の精製された組み換えヒスチジン標識された(ｈｉｓ)-ｐ５５を抗原外皮として使用した。簡潔に説明すると、ＢＨＫ細胞をｈｉｓ-ｐ５５を発現するＶＥＥレプリコンＲＮＡで形質転換し、そしてトライトン-Ｘ１００ライセートを調製した。タンパク質を金属イオンアフィニティ・クロマトグラフィーにより、供給もとの推薦に従って精製した。
【００８４】
標準間接ＥＬＩＳＡにより、５１日目(追加免疫後７日目)の血清をＧａｐ特異的抗体の存在について評価した。Ｇａｐ特異的総ＩｇＧの検出のために、ＩｇＭ、ＩｇＧ、及びＩｇＡを検出する二次ポリクローナル抗体を終点タイター測定に使用した。簡潔に書くと、９６ウェルＭａｘｉｓｏｒｐＥｌｉｓａプレート(極性分子、つまり抗体への親和性を高めるために表面を改変されたポリスチレン・マルチウェル・プレート；Nunc, Naperville, IL)を１ウェルあたり４０〜８０ｎｇ・his-p55を含むｐＨ９.６の０.０５Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液５０μｌで被膜した。プレートを接着性プラスチックでカバーし、そして４℃で一晩インキュベーションした。次の日、未結合の抗原を捨て、そしてプレートを室温で２００μｌのブロッキング緩衝液(３％w／ｖＢＳＡを含むＰＢＳ)で１時間インキュベーションした。ウェルをＰＢＳで６回洗浄し、そして５０μl／ウェルの試験血清、連続的に緩衝液(０.１％ｗ／ｖＢＳＡ及び０.０５％ｖ／ｖトウィーン２０を伴うＰＢＳ)で２倍に希釈されたものを抗原コートされたウェルへと加えた。マウス抗ｐ２４モノクローナル抗体(Zeptometrix, Buffalo, NY)は、ポジティブ・コントロールとして全てのアッセイ中に含まれた。各アッセイにおけるネガティブ・コントロールは、ブランク(血清以外の全ての試薬及び処置を含むウェル)及び出血前血清を含む。プレートを室温で１時間インキュベーションし、そして次にＰＢＳで６回洗浄した。規定の濃度に希釈緩衝液で希釈された５０μl／ウェルのアルカリホスファターゼ(AP)-共役ヤギ抗マウス-ポリ-アイソタイプ二次抗体(Sigma)を、各ウェルへと加え、そして１時間室温でインキュベーションした。ウェルを６回ＰＢＳで洗浄し、次に１００μlのｐニトロフェニル・ホスフェート(ｐＮＰＰ)基質(Sigma)を加えた。血清抗体ＥＬＩＳＡタイターを、バックグランド(ブランク・ウェル)より０.２以上の４０５ｎｍでの吸光度を与える最大血清希釈度の逆数として定義した。ポジティブ抗体(免疫)反応を、多抗原性ＡＲＰ調製品でワクチン接種されたマウス及びＡＲＰ・ＨＩＶ-Ｇａｇを受けたマウスにおいて検出した。
【００８５】
Ｇａｇ及びＰｏｌ抗原特異的インターフェロン-γ(ＩＦＮ-γ)分泌細胞は、ＩＦＮ-γＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより検出される。ＡＲＰ免疫化されたＢＡＬＢ／ｃマウス由来の脾臓リンパ球の単一細胞懸濁液は、Ｒ１０培地(１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、０.１ｍＭ・ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液、０.０１Ｍ・ＨＥＰＥＳ、２ｍＭグルタミン及び１０％熱不活化ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ培地１６４０)中で脾臓被膜を物理的に破壊することにより調製される。リンパ球は、リンフォライトＭ(Lympholyte M)密度勾配遠心(Accurate Scientific, Westbury, NY）により単離し、２回洗浄し、そして新たなＲ１０培地中に再懸濁した。未分離の脾臓リンパ球集合全体を試験した。
【００８６】
マウスＩＦＮ-γＥＬＩＳＰＯＴキット(Monoclonal Antibody Technology, Nacka, Sweden)を使用して該アッセイを行った。生細胞を、抗ＩＦＮ-γモノクローナル抗体で前もってコートされたマルチスクリーン・イモビロン-Ｐ ＥＬＩＳＰＯＴプレート(高タンパク質結合ＰＶＤＦ膜を備えるＥＬＩＳＰＯＴ認定９６ウェルろ過プレート；Millipore, Bilerica, MA)中の個々のＥＬＩＳＰＯＴウェル中に蒔き、１６〜２０時間インキュベーションした。細胞を、緩衝液で複数回洗浄することにより取り除き、そしてウェルをビオチン化抗ＩＦＮ-γモノクローナル抗体でインキュベーションし、続いて洗浄しそしてアビジン-ペルオキシダーゼ複合体(Vectastain ABC Peroxidase Kit, Vector Laboratories, Burlingame, CA)とインキュベーションした。インキュベーションに続いて、ウェルを洗浄し、そして室温で４分間基質 (Avidin-Peroxidase Complex tablets, Sigma, St. Louis, MO) とインキュベーションして、スポットを形成させた。該スポットは、培養の間ＩＦＮ-γを分泌する個々の細胞の位置を表す。Zeiss KS ELISPOTシステムで自動化分析により、プレートを調べ列挙した。
【００８７】
HIV・GAG・ARP及びgagを発現する多抗原性ＨＩＶ・ＡＲＰコンストラクトで免疫化されたマウスからのリンパ球においてＧａｇ特異的ＩＦＮ-γ分泌細胞を数え上げるため、リンパ球は、免疫優勢ＣＤ８・Ｈ-２Ｋd-制限酵素処理ＨＩＶ-Ｇａｇペプチド、又は無関係のＮｅｆペプチド・プール(Ｎｅｆペプチドは、クレードＣ・ＨＩＶ・ＤＵ151株から作られた １１により重なり合う１０ １５merを含む)で(５％ＣＯ2、３７℃で)１６〜２０時間刺激された。Ｇａｇペプチドを、１０μｇ／ｍｌで試験し、そしてＮｅｆコントロールを２０μｇ／ｍｌで試験した。細胞からペプチドを引いたものは、バックグラウンド・コントロールとして役に立つ。ポジティブ・コントロールとして、細胞を同じくらいの時間４μｇ／ｍｌのコンカナバリンＡで刺激した。ペプチドを合成し、そして＞９０％に精製した(New England Peptide, Gardner, MA).
【００８８】
Ｐｏｌを発現する多抗原性ＡＲＰコンストラクトで免疫化されたマウス由来のリンパ球において、Ｐｏｌ特異的ＩＦＮ-γ分泌細胞を数え上げるため、上記プロトコルを以下の改変を伴って使用された。ＣＤ８及びＣＤ４Ｔ細胞に対するＨＩＶ-１・Ｐｏｌエピトープは、最近Ｈ-２ｄバックグラウンド(Casimiro et al., J. Virology 76: 185, 2002)において最近同定された。細胞集合は、３Ｐｏｌエピトープを含むペプチド・プール並びにネガティブ・コントロールとして無関係の抗原ペプチド・プール(nefプール)で刺激された。以下の３個のペプチドは、周知のマウスＰｏｌＣＴＬエピトープを同定するために、文献検索後に選ばれた。
ＶＹＹＤＰＳＫＤＬＩＡ(配列番号：１)(Casimiro et al, J. Virol. 76: 185,2002) ＥＬＲＱＨＬＬＲＷＧＬ(配列番号：２)(Casimiro et al, J. Virol. 76: 185,2002) ＥＬＲＥＨＬＬＫＷＧＦ(配列番号：３)(配列番号２のホモログ、我々の配列と同一)
これらの三つのぺプチドを各１０μｇ／ｍｌの濃度で混合し(総ペプチド濃度は、３０μｇ／ｍｌである)、そして三通りのウェルへ加えた。提示されたＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果を第二追加免疫後２６日で行った。
【００８９】
Ｒａｔ／ｎｅｕ特異的抗体の検出をＥＬＩＳＡにより行った。ＥＬＩＳＡ試薬として使用されるＲａｔ／ｎｅｕ抗原を以下のように調製した：ＰＣＲにより、ｐＲＡＴ／ｎｅｕ＃１４におけるＲａｔ／ｎｅｕコード配列のＣ末端にヒスチジン・タグを付けた。このＰＣＲ増幅産物を切断し、そしてＶＥＥレプリコン・プラスミド、ｐＥＲＫ中にライゲーションした。ｐＥＲＫ・Ｒａｔ／ｎｅｕ-ｈｉｓコンストラクトから作られたＲＮＡでＢＨＫ細胞を電気穿孔した。電気穿孔後１６時間で、細胞溶解液を調製し、そしてニッケル・アフィニティカラム上で精製し、ｈｉｓタグが付いたＲａｔ・ｎｅｕ抗原の６０〜７０％の純度を達成した。
【００９０】
５１日目(追加免疫後７日目)から得た血清を、間接ＥＬＩＳＡによりＲａｔ／ｎｅｕ特異的抗体の存在について評価した。Ｎｕｎｃ高結合性プレートを、炭酸―重炭酸被膜緩衝液中の７５ｎｇ／ウェルのｈｉｓタグＲａｔ・ｎｅｕで一晩４℃でコートした。次の日、プレートを、２００μｌ／ウェルのＰＢＳ中の３％ＢＳＡでブロッキングした。ＰＢＳで６回洗浄後、５０μｌのマウス血清サンプルを、１％ＢＳＡ、０.０５％トゥィーン２０を含むＰＢＳで希釈し、そして各ウェルに加え、そしてプレートを１時間３０℃でインキュベーションした。１：４０及び１：８０の出血前、並びに５１日目の血清の１：４０〜１：１２８０の２倍希釈液を、各実験動物について試験した。プレートを次に６回ＰＢＳで洗浄し、続いて５０μｌ／ウェルのヤギ抗マウスＨＲＰの１：５００希釈液を加え、そして１時間３０℃でインキュベーションした。プレートを以前のように洗浄し、そして１００μｌ／ウェルのＡＢＴＳ(ＫＰＬ)で現像し、そして標準ＥＬＩＳＡリーダーを使用して、吸光度を４０５ｎｍで読み取った。ポジティブ・サンプルを決定するためのカットオフ値は、１：４０で希釈された出血前血清サンプルの全てのＯＤ(吸光度)値を平均し、そして該数値を二倍することにより決定された。カットオフ値より大きいＯＤを有するサンプルの全てを、陽性とみなした。
【００９１】
抗ＣＡＴ特異的抗体の検出は、ＥＬＩＳＡによって行った。抗ＣＡＴ抗体ＥＬＩＳＡは、多抗原性ＡＲＰワクチン接種マウスにおける抗ＣＡＴ免疫応答を検出するために現像された。ヒツジ抗ＣＡＴポリクローナル抗体(Roche, Indianapolis, IN)でコートされたＥＬＩＳＡマイクロプレートに、ウェルあたり５０μLの体積のＣＡＴ・ＥＬＩＳＡサンプル緩衝液(Roche)中に懸濁された精製ＣＡＴタンパク質０.１５ｎｇをロードした。ＥＬＩＳＡプレートを、３７℃で４５分間インキュベーションし、そして０.２ｍｌＣＡＴ・ＥＬＩＳＡ洗浄緩衝液(Roche)で３回洗浄した。５０μｌのマウス血清、サンプル緩衝液で２倍連続希釈された液を、ウェルあたりにロードし、そしてプレートを３７℃で４５分間インキュベーションした。インキュベーションの後に、ＥＬＩＳＡプレートを上記のように３回洗浄した。サンプル緩衝液中に１：５００で希釈されたヤギ抗-マウスＨＲＰ-共役二次抗体(Kirkegaard and Perry Laboratories (KPL), Gaithersburg, MD) を各ウェルに加え(０.１ｍｌ/ウェル)、そして３７℃で４５分間インキュベーションした。インキュベーションの後に、プレートを上記のように３回洗浄し、そして０.１ｍｌのＡＢＴＳペルオキシダーゼ基質(２,２’-アジノ-ビス３-エチルベンズチアゾリン-ｂ-スルホン酸；ＫＰＬ)をウェル毎に加えた。発色現像を０.１ｍｌのストップ溶液(ＫＰＬ)の添加により終結し、そしてMolecular Devices Versamaxマイクロプレートリーダーを使用して、プレートの吸光度を４０５ｎｍで読み込んだ。陽性サンプルを決定するためのカット・オフ値は、１：４０希釈された全ての出血前血清サンプルのＯＤ値を平均し、そして該数値に２をかけることにより決定した。カットオフ値より大きいＯＤを有する全てのサンプルを、陽性であるとみなした。
【００９２】
ＣＭＶｇＢ特異的抗体の検出をウェスタンブロットによって行った。多抗原性ＡＲＰでワクチン接種された動物における抗-ｇＢ免疫応答の分析は、ウエスタンブロットによって行った。精製された組換えヒスチジン・タグ付きｇＢタンパク質を、４〜１０％ビスートリスＮｕＰＡＧＥゲル(ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミド・ゲル；Invitrogen, Carlsbad, CA)を介して電気泳動し、そしてNovex mini-cell(Invitrogen)電気泳動装置を使用してＰＶＤＦ膜に転写した。出血前及びワクチン接種後５１日目の血清を、各動物についてブロッキング緩衝液(Invitrogen)中に１；４０又は１：８０に希釈し、そしてｇＢタンパク質転写後のＰＶＤＦ膜片上でインキュベーションした。ブロッキング緩衝液中に１：１０,０００で希釈されたヤギ抗-マウス・アルカリ・ホスファターゼ共役抗体(Sigma. Louis, MO)を、２次抗体として使用した。ウエスタン・ブロットをＢＣＩＰ/ＮＢＴ(５-ブロモ,４-クロロ,３-インドリルホスフェート/ニトロブルー・テトラゾリウム；ＢｉｏＲａｄ, Hercules, CA)を使用して現像し、そして着色は、蒸留水で洗浄することにより停止された。陽性サンプルは、免疫ブロット上のｇＢの予期された分子量に適合する電気泳動移動度を有する免疫反応性のバンドを視覚的に検出することにより同定された。
【００９３】
インフルエンザＨＡ特異的抗体の検出は、免疫蛍光アッセイ(ＩＦＡ)により行われた。多抗原性ＡＲＰワクチン接種された動物における抗-ＨＡ免疫応答の分析は、ＩＦＡにより測定された。ベロ細胞をＨ１Ｎ１インフルエンザＨＡ遺伝子を発現させるＶＥＥレプリコン・ベクターで電気穿孔し、そして１ウェルあたり１×１０4個の電気穿孔された細胞を９６ウェル組織培養プレート中に蒔いた。電気穿孔されたベロ細胞を、メタノールで電気穿孔後１６時間で固定化した。出血前及びワクチン接種後５６日目の血清を、各動物についてブロッキング緩衝液(ＰＢＳ：ＦＢＳ(１：１))中に１：４０〜１：１６０に２倍に希釈し、そしてＨＡタンパク質を発現するベロ細胞上でインキュベーションした。１：４００希釈されたヤギ抗マウス・アレクサ・フルオール４８８共役抗体(Molecular Probes, Eugene, OR) を二次抗体として使用した。細胞をNikon Eclipse TE300 UV顕微鏡で、ＨＡ特異的蛍光について分析した。検出できる最も低い血清希釈値で、免疫蛍光細胞を視覚的に検出することによりタイターを測定した。
【００９４】
抗-ＣＭＶ・ＩＥ１特異的抗体の検出をＥＬＩＳＡにより行った。ＣＭＶ由来の精製された組換えヒスチジン-タグ付き(ｈｉｓ)-ＩＥ１を、抗原コートとして使用した。簡潔に記載すると、ＢＨＫ細胞をｈｉｓ-ＩＥ１を発現するＶＥＥレプリコンＲＮＡで形質転換し、そしてトライトンＸ１００ライセートを調製した。タンパク質をイオン金属アフィニティークロマトグラフィーにより精製した。
【００９５】
５１日目(追加免疫後７日目)の血清を、標準間接ＥＬＩＳＡによりＣＭＶ-ＩＥ１-特異的抗体の存在について評価した。ＣＭＶ-ＩＥ１-特異的総Ｉｇの検出のため、ＩｇＭ、ＩｇＧ、及びＩｇＡを検出する２次ポリクローナル抗体を、終点タイター測定に使用した。簡潔に記載すると、９６ウェルMaxisorp ELISAプレート(Nunc, Naperville, IL)を、各ウェルあたり、５０μＬの体積のクエン酸/リン酸ｐＨ８.３中の２μgのＩＥ１でコートした。プレートを、粘着性のプラスチックでカバーし、そして一晩４℃でインキュベーションした。次の日、未結合の抗原を捨て、そしてプレートを２００μｌのブロッキング緩衝液(３％ｗ/ｖＢＳＡを含むＰＢＳ)１時間室温でインキュベーションした。ウェルをＰＢＳで６回洗浄し、緩衝液(１％ｗ/ｖＢＳＡ及び０.０５％ｖ/ｖトウィーン２０を伴うＰＢＳ)で連続的に２倍に希釈された５０μｌの血清を抗原コートウェルに加えた。α-ＩＥ１モノクローナル抗体(Rumbaugh- Goodwin Institute for Cancer Research, Inc, Plantation, Florida)は、全てのアッセイにおいてポジティブ・コントロールとして含まれた。各アッセイにおけるネガティブ・コントロールは、ブランク(血清を除く全ての試薬及び処置を伴うウェル)並びに出血前血清を含んだ。プレートを室温で１時間インキュベーションし、そして次にＰＢＳで６回洗浄した。希釈緩衝液中に規定の濃度まで希釈される５０μｌ/ウェルのアルカリホスファターゼ(ＡＰ)共役ヤギ抗マウス・ポリ・アイソタイプ二次抗体(Sigma)を各ウェルへと加え、そして１時間室温でインキュベーションした。１００μlのｐ-ニトロフェニル・ホスフェート(ｐNPP)基質(Sigma)の添加前に、ウェルをPBSで６回洗浄した。血清抗体ＥＬＩＳＡタイターを、バックグランド(ブランク・ウェル)の０.２以上の４０５ｎｍでの光学密度を与える最大血清希釈度の逆数として定義した。
【００９６】
多抗原性ＡＲＰに対する免疫応答の要約
図１及び表３に示されるように、多抗原性ＡＲＰでワクチン接種された動物は、ＡＲＰ集合中に存在する７個の抗原全てに対して免疫応答を作り出した。これらの免疫応答は、液性及び細胞性応答の両方を含み、このタイプのアプローチが、免疫系の両部門を刺激できるということを指し示す。特異的抗原に対する免疫応答の強さは、多抗原性ＡＲＰの文脈で計測され、そして単一抗原ＡＲＰ調製品と比較される。抗-Ｇａｇ抗体及び細胞性免疫応答は、ＨＩＶ-ＧａｇＡＲＰが単独であるか又は多抗原性製剤中であるかに関わらず同等であり、複数の異なる抗原を添加することは、調製品の各個々の構成要素に対する免疫応答を低減しないようであるということを指し示す。この多抗原性調製品は、感染性疾患病原体(ＨＩＶ及びＣＭＶ)、癌抗原(Ｒａｔ/ｎｅｕ)及び細菌酵素(ＣＡＴ)から意図的に構成され、宿主システムが、一のＡＲＰ調製品内の広範な抗原類型に応答するように多抗原性ＡＲＰで刺激されるということを示す。
【００９７】
実施例７. 腫瘍ｃＤＮＡライブラリーを発現する多抗原性ＡＲＰｓでの動物試験
ｃＤＮＡライブラリーを、Ｃ５７６ＢＬ/６マウス由来のＢ１６Ｆ１０(Ｂ１６) [Gold et al., (2003) J. Immunol. 170: 5188-5194)色素性マウス・メラノーマ細胞系列から作成する。標的細胞が感染する際、異種性ｃＤＮＡがレプリコンから発現されるように、このライブラリーをアルファウイルス・レプリコンｃＤＮＡコンストラクト中にディレクショナル・クローニングする。ＡＲＰは、上記のように作成及び精製されて、Ｂ１６腫瘍細胞からのｃＤＮＡライブラリー全体を発現するＡＲＰ粒子の集合を作り出す。代表的な遺伝子、例えば、βアクチンなどの発現は、定量的ＰＣＲにより分析されて、該ライブラリーが既知の標準遺伝子を発現するかを決定される。遺伝子的に適合された非腫瘍原性の細胞系列に対するサブトラクティブ・ハイブリダイゼーション又はディファレンシャル・ディスプレイは、ライブラリーにおける腫瘍特異的配列の割合を高めるために使用されうる。
【００９８】
Ｃ５７ＢＬ/６マウスは、Ｂ１６ライブラリーＡＲＰ調製品で、０、２１、及び４２日目で１、２、又は３回ワクチン接種される。ＡＲＰにおける１０5〜１０9ｉ.ｕ.の投与量は、マウスの両方の後足蹠に与えられる皮下(ｓｃ.)経路を介して投与される。コントロール群のマウスは、偽ワクチン接種を受けるか、又は無関係の抗原を発現するＡＲＰを受ける。１の既知のメラノーマ特異的腫瘍抗原、例えばＴＹＲ、ＴＲＰ-２、ｇｐ１００、ＭＡＧＥ-１、又はＭＡＧＥ-３、或いは該抗原の組合せを発現するＡＲＰを、多抗原性アプローチの比較対象として受ける動物の更なるセットが含まれうる。
【００９９】
マウスは、最終ＡＲＰ免疫化後５日目において１０4、１０5、又は１０6のＢ１６メラノーマ細胞を右側に皮内注射される。マウスは、次に一日おきに触診により腫瘍形成について調べられる。腫瘍が２ｍｍ以上に達すると、腫瘍が存在すると記録される。腫瘍が進行している(通常１ｃｍのサイズになる)と確信されると、マウスは屠殺される。カプラン-マイヤーの腫瘍なし生存曲線が作られ、そして各群のあいだにおける腫瘍接種からの防御の統計的有意差を測定するために、ログ・ランク(log rank)分析を行った。
【０１００】
腫瘍接種の前に、免疫アッセイ用にマウスから血清及びリンパ球を収集する。ＡＲＰ・Ｂ１６ライブラリー中に存在することが予期される既知の腫瘍抗原に対する液性又は細胞性応答の存在は、標準方法及び当該技術分野に周知の技術を使用して、アッセイされる。
【０１０１】
イヌ悪性メラノーマ(ＣＭＭ)は、イヌに生じる自然発症し、侵攻性でありかつ転移性の新生物である。ＣＭＭは、比較的頻繁に診断される腫瘍であり、全てのイヌ腫瘍の約４％を占める。ＣＭＭは、先ず外科及び/又は分割放射線照射治療を含む局所的治療で処置されるが；しかしながら、全身転移性の疾患が通常発症する。ＣＭＭは、化学抵抗性の新生物である。全てのこれらの性質は、ヒトメラノーマと共通であり、そしてこれらの類似性に基いて、ＣＭＭは、ヒトメラノーマについての新たな治療を評価するための臨床モデルとして役に立つ [Bergman et al. (2003) Clin. Cancer Res. 9: 1284-1290)]。
【０１０２】
イヌは、組織学的に確認された自然発症悪性メラノーマがあるものについて選別される。前臨床評価は、完全な身体的評価、完全な血球数及び血小板数、血清化学プロフィール、検尿、ＬＤＨ、抗核抗体、及び存在するならば初期腫瘍の３次元計測(又は再診察の前に患畜が治療されているならば、医療記録からの最大腫瘍サイズ)を含む。転移性疾患の評価については、胸部の３-方向レントゲン写真が得られ、そして局所リンパ節は、微細針吸引/細胞学及び/又は生検/組織学で評価される。全てのイヌは、ステージＩＩ腫瘍(腫瘍２〜４ｃｍ直径、陰性の皮膚の腫れ(node))、ステージＩＩＩ(４ｃｍ超の腫瘍及び/又は陽性の皮膚の腫れ)、又はステージIV(遠隔転移を認める疾患)といったＷＨＯステージ決定システムに従ってステージを決められた。これらの３種の疾患ステージの全てを患うイヌは、本試験に含められる。但し、これらのイヌは、過去３週において他の治療形態を受けていなかった。
【０１０３】
微細針吸引又は生検は、各動物において悪性のメラノーマを細胞学又は組織学によりそれぞれ確認するために使用される。 原発腫瘤又は転移性腫瘤から得られたこれらのサンプルは、腫瘍ｃＤＮＡライブラリーの源として使用される。各動物について、腫瘍ＲＮＡは、腫瘍細胞集合から単離される。ｃＤＮＡライブラリーを各サンプルから調製する。多抗原性調製品を、本明細書中に記載されるように各動物について作成する。
【０１０４】
イヌの集団は、投与量範囲でイヌ患畜特異的ＡＲＰ調製品を複数回ワクチン接種される。イヌは、１〜３ヶ月の期間に渡り３〜１２回ワクチン接種される。皮下、皮内、又は筋肉内経路を介して投与されるＡＲＰｓの投与量は、１０6〜１０9i.ｕ.の範囲である。患畜特異的(自己)ＡＲＰワクチンを投与することに加え、いくつかの集団は、別のメラノーマ由来のワクチン調製品が、臨床利得を提供するかどうかを決定するために、別の患畜由来の(他者)ＡＲＰ調製品を受ける。
【０１０５】
各患畜の臨床状態は、ワクチン接種投与計画期間をとおしてモニターされ、そして治療後２年までモニターされる。患畜は、肉体的に、Ｘ線的に、及び生化学的に、腫瘍の存在及び進行又は退行の臨床証拠について通常の基準に基いて試験された。疾患の進行のため、クオリティーオブライフの低下により飼い主により安楽死が要求される場合、全身の検死が行なわれた後に、原発及び転移部位での腫瘍の大きさ及び組織学的状態を決定するために検死が行なわれる。多抗原性ＡＲＰワクチン接種の生存及び疾患進行に関する効果を測定するために、統計分析が行われる。統計分析のツールは、カプラン-マイヤー・プロダクト・リミット法(product limit method)、Cox比例ハザード分析、マン-ホイットニーU検定、及びスピアマン順位相関を含む。
【０１０６】
【表１】
【０１０７】
【表２】
【０１０８】
【表３】
【０１０９】
本明細書中に引用される参考文献
【表４】
【表５】
【図面の簡単な説明】
【０１１０】
【図１】図１は、多抗原性ＡＲＰでワクチン接種された動物における抗原特異的免疫応答を記述する棒グラフである。抗原特異的免疫応答(液性免疫の形態）は、ＥＬＩＳＡにより計測され、そして逆数相乗平均タイターとして表されるか、或いはウエスタンブロット又はＩＦＡにより計測され、抗原特異的シグナルが検出できる最低希釈度として表される。細胞性免疫の形態の抗原特異的免疫応答は、ＩＦＮ-γ分泌細胞のＥＬＩＳＰＴ検出により計測され、１０6リンパ球あたりの抗原特異的ＩＦＮ-γ分泌リンパ球として表される。皮下(ｓ.ｃ.）又は腹腔内(ｉ.ｐ.）経路の接種により多抗原性ＡＲＰ調製品を受ける動物は、調製品中の全ての抗原に対し免疫応答を高めた。ポジティブ・コントロールとして、１の群は、ＨＩＶ-Ｇａｇ・ＡＲＰを受け、そしてＧａｇにのみ特異的な免疫応答を高めた。ネガティブ・コントロール動物は、いずれの抗原に応答する検出できる応答を有さなかった。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の抗原をコードしかつ発現するアルファウイルス・レプリコン粒子(ＡＲＰｓ)の製造方法であって、以下のステップ：
(ａ) 複数のアルファウイルス・レプリコン核酸を複数の細胞へ導入し、ここで該細胞は、アルファウイルス複製及びパッケージングに許容状態であり、ここで該レプリコン核酸が、少なくともウイルス・パッケージング・シグナル及び上記アルファウイルス・レプリコン核酸中で発現できる少なくとも１の異種コード配列を含み、ここで該細胞が改変細胞を生成するために少なくとも１のヘルパー機能を含み、そしてここで該複数のアルファウイルス・レプリコン核酸が複数の改変細胞を生成するために、複数の抗原をコードし；
(ｂ) ステップ(ａ)の上記複数の改変細胞を、上記少なくとも１のヘルパー機能の発現を許容し、上記アルファウイルス・レプリコン核酸の複製及び該アルファウイルス・レプリコン核酸のパッケージングを許容する条件下で培養して、ＡＲＰｓを形成し；
(ｃ) ステップ(ｂ)の後に上記改変細胞を０.２Ｍ〜５Ｍのイオン強度を有する水溶液と接触して、上記ＡＲＰｓを水溶液中に放出させてＡＲＰを含む溶液を生成し；そして
(ｄ) ステップ(ｃ)の上記ＡＲＰを含む溶液からＡＲＰｓを収集する
を含む、前記方法。
【請求項２】
ステップ(ａ）の前記宿主細胞における前記少なくとも１のヘルパー機能は、該宿主細胞のゲノム中に安定して組み込まれる核酸配列によりコードされる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細胞における前記少なくとも１のヘルパー機能は、前記アルファウイルス・レプリコン核酸を結合できるキャプシド・タンパク質、及び少なくとも１のアルファウイルス糖タンパク質をコードする少なくとも１のヘルパー核酸に基いて導入され、ここで該アルファウイルス糖タンパク質は、該アルファウイルス・レプリコン核酸及び該キャプシドタンパク質と会合し、ここで該少なくとも１のヘルパー核酸分子が、該アルファウイルス・レプリコン核酸と共に該細胞内に導入される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記少なくとも１のヘルパー機能が、少なくとも２個のヘルパー核酸分子によりコードされ、ここで該２個のヘルパー核酸分子の各々が、少なくとも１のアルファウイルス・ヘルパー機能をコードする、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記少なくとも１のヘルパー核酸分子及び前記アルファウイルス・レプリコンＲＮＡがＲＮＡ分子である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記少なくとも１のヘルパー核酸分子が、キャップされていない、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記少なくとも１のヘルパー核酸分子が、ＤＮＡ分子である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記レプリコン核酸が、電気穿孔により前記宿主細胞内に導入される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記電気穿孔環境において前記細胞密度が、１ｍｌあたり１０7〜５×１０8である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記電気穿孔が、電気穿孔キュベット内で行われる、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
ステップ(ｄ)の後にイオン交換クロマトグラフィー・ステップ又はヘパリン・アフィニティー・クロマトグラフィー・ステップを行う、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記アルファウイルスが、弱毒化アルファウイルスである、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記弱毒化アルファウイルスが、ベネズエラ・ウマ脳炎ウイルス(ＶＥＥ)である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記弱毒化ＶＥＥが、３０１４株である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記洗浄ステップが、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ2、ＣａＣｌ2、ＮＨ4Ｃｌ、(ＮＨ4)2ＳＯ4、酢酸アンモニウム、又は重炭酸アンモニウムである、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１に記載の方法により製造されるアルファウイルス・レプリコン粒子調製品。
【請求項１７】
前記複数のコードされた抗原が腫瘍細胞由来である、請求項１６に記載のアルファウイルス・レプリコン粒子調製品。
【請求項１８】
前記複数のコードされた抗原が、寄生生物若しくは病原体由来である、請求項１６に記載のアルファウイルス・レプリコン粒子調製品。
【請求項１９】
前記複数のコードされた抗原が、ウイルス、真菌、酵母、細菌、及び原生動物からなる群から選ばれる病原体由来である、請求項１８に記載のアルファウイルス・レプリコン粒子調製品。
【請求項２０】
ヒト又は動物を寄生生物、病原体、又は癌に対して免疫化する方法であって、該寄生生物、病原体、又は癌の少なくとも１の抗原に免疫応答を作るために有効な、請求項１５に記載のウイルス・レプリコン粒子調製品の量を投与するステップを含む、前記方法。
【請求項２１】
前記病原体が、ウイルス、細菌、酵母、真菌、又は原生動物である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記ウイルスが、インフルエンザ・ウイルス、ヘルペス・ウイルス、パラインフルエンザ・ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、サイトメガロウイルス、ヒト・パピローマウイルス、又はヒト免疫不全ウイルスである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記原生動物が、プラスモジウム・ファルシパルム(Plasmodium falciparum)である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記細菌が、マイコバクテリウム・ツベルクロシス(Mycobacterium tuberculosis)である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
前記癌が、膵臓癌、腎臓癌、肉腫、神経芽細胞腫、神経膠腫、大腸癌、メラノーマ、乳癌、卵巣癌、及び前立腺癌からなる群から選ばれる、請求項２０に記載の方法。
【請求項２６】
複数の抗原をコードしかつ発現するアルファウイルス・レプリコン粒子(ＡＲＰｓ)の製造方法であって、以下のステップ：
(ａ) 複数のアルファウイルス・レプリコン核酸を複数の細胞へ導入し、ここで該細胞は、アルファウイルス複製及びパッケージングに許容状態であり、ここで該レプリコン核酸が、少なくともウイルス・パッケージング・シグナル及び上記アルファウイルス・レプリコン核酸中で発現できる少なくとも１の異種コード配列を含み、ここで該細胞が改変細胞を生成するために少なくとも１のヘルパー機能を含み、そしてここで該複数のアルファウイルス・レプリコン核酸が複数の改変細胞を生成するために、複数の抗原をコードし、ここで核酸を導入するステップが、該細胞を電気穿孔混合液１ｍｌあたり５×１０7〜５×１０8の密度で電気穿孔することにより行われ；
(ｂ) ステップ(ａ)の上記複数の改変細胞を、上記少なくとも１のヘルパー機能の発現を許容し、上記アルファウイルス・レプリコン核酸の複製及び該アルファウイルス・レプリコン核酸のパッケージングを許容する条件下で培養して、ＡＲＰｓを形成し；
(ｃ) ステップ(ｂ)の後に上記改変細胞を０.２Ｍ〜５Ｍのイオン強度を有する水溶液と接触して、上記ＡＲＰｓを水溶液中に放出させてＡＲＰを含む溶液を生成し；そして
(ｄ) ステップ(ｃ)の上記ＡＲＰを含む溶液からＡＲＰｓを収集する
を含む、前記方法。
【請求項１】
複数の抗原をコードしかつ発現するアルファウイルス・レプリコン粒子(ＡＲＰｓ)の製造方法であって、以下のステップ：
(ａ) 複数のアルファウイルス・レプリコン核酸を複数の細胞へ導入し、ここで該細胞は、アルファウイルス複製及びパッケージングに許容状態であり、ここで該レプリコン核酸が、少なくともウイルス・パッケージング・シグナル及び上記アルファウイルス・レプリコン核酸中で発現できる少なくとも１の異種コード配列を含み、ここで該細胞が改変細胞を生成するために少なくとも１のヘルパー機能を含み、そしてここで該複数のアルファウイルス・レプリコン核酸が複数の改変細胞を生成するために、複数の抗原をコードし；
(ｂ) ステップ(ａ)の上記複数の改変細胞を、上記少なくとも１のヘルパー機能の発現を許容し、上記アルファウイルス・レプリコン核酸の複製及び該アルファウイルス・レプリコン核酸のパッケージングを許容する条件下で培養して、ＡＲＰｓを形成し；
(ｃ) ステップ(ｂ)の後に上記改変細胞を０.２Ｍ〜５Ｍのイオン強度を有する水溶液と接触して、上記ＡＲＰｓを水溶液中に放出させてＡＲＰを含む溶液を生成し；そして
(ｄ) ステップ(ｃ)の上記ＡＲＰを含む溶液からＡＲＰｓを収集する
を含む、前記方法。
【請求項２】
ステップ(ａ）の前記宿主細胞における前記少なくとも１のヘルパー機能は、該宿主細胞のゲノム中に安定して組み込まれる核酸配列によりコードされる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細胞における前記少なくとも１のヘルパー機能は、前記アルファウイルス・レプリコン核酸を結合できるキャプシド・タンパク質、及び少なくとも１のアルファウイルス糖タンパク質をコードする少なくとも１のヘルパー核酸に基いて導入され、ここで該アルファウイルス糖タンパク質は、該アルファウイルス・レプリコン核酸及び該キャプシドタンパク質と会合し、ここで該少なくとも１のヘルパー核酸分子が、該アルファウイルス・レプリコン核酸と共に該細胞内に導入される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記少なくとも１のヘルパー機能が、少なくとも２個のヘルパー核酸分子によりコードされ、ここで該２個のヘルパー核酸分子の各々が、少なくとも１のアルファウイルス・ヘルパー機能をコードする、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記少なくとも１のヘルパー核酸分子及び前記アルファウイルス・レプリコンＲＮＡがＲＮＡ分子である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記少なくとも１のヘルパー核酸分子が、キャップされていない、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記少なくとも１のヘルパー核酸分子が、ＤＮＡ分子である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記レプリコン核酸が、電気穿孔により前記宿主細胞内に導入される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記電気穿孔環境において前記細胞密度が、１ｍｌあたり１０7〜５×１０8である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記電気穿孔が、電気穿孔キュベット内で行われる、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
ステップ(ｄ)の後にイオン交換クロマトグラフィー・ステップ又はヘパリン・アフィニティー・クロマトグラフィー・ステップを行う、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記アルファウイルスが、弱毒化アルファウイルスである、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記弱毒化アルファウイルスが、ベネズエラ・ウマ脳炎ウイルス(ＶＥＥ)である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記弱毒化ＶＥＥが、３０１４株である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記洗浄ステップが、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ2、ＣａＣｌ2、ＮＨ4Ｃｌ、(ＮＨ4)2ＳＯ4、酢酸アンモニウム、又は重炭酸アンモニウムである、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１に記載の方法により製造されるアルファウイルス・レプリコン粒子調製品。
【請求項１７】
前記複数のコードされた抗原が腫瘍細胞由来である、請求項１６に記載のアルファウイルス・レプリコン粒子調製品。
【請求項１８】
前記複数のコードされた抗原が、寄生生物若しくは病原体由来である、請求項１６に記載のアルファウイルス・レプリコン粒子調製品。
【請求項１９】
前記複数のコードされた抗原が、ウイルス、真菌、酵母、細菌、及び原生動物からなる群から選ばれる病原体由来である、請求項１８に記載のアルファウイルス・レプリコン粒子調製品。
【請求項２０】
ヒト又は動物を寄生生物、病原体、又は癌に対して免疫化する方法であって、該寄生生物、病原体、又は癌の少なくとも１の抗原に免疫応答を作るために有効な、請求項１５に記載のウイルス・レプリコン粒子調製品の量を投与するステップを含む、前記方法。
【請求項２１】
前記病原体が、ウイルス、細菌、酵母、真菌、又は原生動物である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記ウイルスが、インフルエンザ・ウイルス、ヘルペス・ウイルス、パラインフルエンザ・ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、サイトメガロウイルス、ヒト・パピローマウイルス、又はヒト免疫不全ウイルスである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記原生動物が、プラスモジウム・ファルシパルム(Plasmodium falciparum)である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記細菌が、マイコバクテリウム・ツベルクロシス(Mycobacterium tuberculosis)である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
前記癌が、膵臓癌、腎臓癌、肉腫、神経芽細胞腫、神経膠腫、大腸癌、メラノーマ、乳癌、卵巣癌、及び前立腺癌からなる群から選ばれる、請求項２０に記載の方法。
【請求項２６】
複数の抗原をコードしかつ発現するアルファウイルス・レプリコン粒子(ＡＲＰｓ)の製造方法であって、以下のステップ：
(ａ) 複数のアルファウイルス・レプリコン核酸を複数の細胞へ導入し、ここで該細胞は、アルファウイルス複製及びパッケージングに許容状態であり、ここで該レプリコン核酸が、少なくともウイルス・パッケージング・シグナル及び上記アルファウイルス・レプリコン核酸中で発現できる少なくとも１の異種コード配列を含み、ここで該細胞が改変細胞を生成するために少なくとも１のヘルパー機能を含み、そしてここで該複数のアルファウイルス・レプリコン核酸が複数の改変細胞を生成するために、複数の抗原をコードし、ここで核酸を導入するステップが、該細胞を電気穿孔混合液１ｍｌあたり５×１０7〜５×１０8の密度で電気穿孔することにより行われ；
(ｂ) ステップ(ａ)の上記複数の改変細胞を、上記少なくとも１のヘルパー機能の発現を許容し、上記アルファウイルス・レプリコン核酸の複製及び該アルファウイルス・レプリコン核酸のパッケージングを許容する条件下で培養して、ＡＲＰｓを形成し；
(ｃ) ステップ(ｂ)の後に上記改変細胞を０.２Ｍ〜５Ｍのイオン強度を有する水溶液と接触して、上記ＡＲＰｓを水溶液中に放出させてＡＲＰを含む溶液を生成し；そして
(ｄ) ステップ(ｃ)の上記ＡＲＰを含む溶液からＡＲＰｓを収集する
を含む、前記方法。
【図１】
【公表番号】特表２００６−５０９５２３（Ｐ２００６−５０９５２３Ａ）
【公表日】平成１８年３月２３日（２００６．３．２３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−５６０８５４（Ｐ２００４−５６０８５４）
【出願日】平成１５年１２月１２日（２００３．１２．１２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００３／０３９７２３
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０５５１６６
【国際公開日】平成１６年７月１日（２００４．７．１）
【出願人】（５０５２２２７５０）アルファバックス，インコーポレイティド (4)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年３月２３日（２００６．３．２３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１５年１２月１２日（２００３．１２．１２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００３／０３９７２３
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０５５１６６
【国際公開日】平成１６年７月１日（２００４．７．１）
【出願人】（５０５２２２７５０）アルファバックス，インコーポレイティド (4)
【Ｆターム（参考）】
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