多発性骨髄腫、白血病、悪性リンパ腫、肺癌等の免疫療法剤
【課題】多発性骨髄腫は抗癌剤に抵抗性を示す難治性の造血器腫瘍であり、従来の化学療法や自家造血幹細胞移植だけでは長期的な治癒が期待できないので、従来の抗癌剤とは作用機序の異なる新しい治療方法としての免疫療法の確立が望まれる。上記の造血器腫瘍や、速進行性の肺癌等の固形癌の治療や再発防止に確固たる術のない現状を打開するため、安全・有効・均質な抗原を用いる癌の免疫療法の確立が期待される。
【解決手段】ヒト骨髄腫ＨＭ１．２４タンパク質に由来の合成ペプチド、該ペプチドを保有の抗原；該ペプチドをコードするＤＮＡ分子；該ペプチドに感作された樹状細胞あるいは該ペプチドの抗原提示細胞；該ペプチドに誘導された細胞傷害性Ｔリンパ球；多発性骨髄腫、白血病、悪性リンパ腫等の造血器悪性腫瘍、及び肺癌、乳癌等の固形癌の治療、転移、及び再発防止に優れて有効しかも安全な免疫療法剤等。
【解決手段】ヒト骨髄腫ＨＭ１．２４タンパク質に由来の合成ペプチド、該ペプチドを保有の抗原；該ペプチドをコードするＤＮＡ分子；該ペプチドに感作された樹状細胞あるいは該ペプチドの抗原提示細胞；該ペプチドに誘導された細胞傷害性Ｔリンパ球；多発性骨髄腫、白血病、悪性リンパ腫等の造血器悪性腫瘍、及び肺癌、乳癌等の固形癌の治療、転移、及び再発防止に優れて有効しかも安全な免疫療法剤等。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、多発性骨髄腫、白血病、悪性リンパ腫等の造血器悪性腫瘍、肺癌、乳癌等の固形癌等の治療、転移及び再発防止に有効な免疫療法剤と、該製剤を用いる免疫療法に関するものである。
更に詳しくは、ヒト骨髄腫のＨＭ１．２４タンパク質抗原をコードする遺伝子ＤＮＡのコンピューター解析の結果に基づき設計かつ合成されたペプチドである免疫活性ドメインないしはエピトープ、該ペプチドにより誘導される抗原提示細胞及び細胞傷害性Ｔリンパ球、該ペプチドをコードするＤＮＡ分子、並びにこれ等の用途に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
上記のＨＭ１．２４抗原は、ＩＩ型の膜貫通・糖タンパク質であり、骨髄腫細胞で特異的に高発現されている抗原として１９９４年、齋藤ら（徳島大学）により発見かつ報告された（非特許文献１）。その意義は、多発性骨髄腫やその他の癌に対する免疫療法の開発に有用かつ有望な手段あるいは標的を提示したことにある。爾後、この報告を契機として世界各地で、ＨＭ１．２４抗原とその遺伝子並びに抗体を用いる多発性骨髄腫及びその他の癌の診断、免疫療法等の研究及び技術開発が活発に展開されてきた。
既に開発された主な技術として、例えば、抗ＨＭ１．２４抗体による可溶性ＨＭ１．２４タンパク質抗原の測定（特許文献１）、ＨＭ１．２４抗原タンパク質をコードする遺伝子ＤＮＡとそのプローモーター領域並びにこれ等の用途（特許文献２）、発現ベクターによる可溶性ＨＭ１．２４抗原タンパク質の量産（特許文献３）、ＨＭ１．２４タンパク質によるパルス又は該遺伝子ＤＮＡの導入により作製された樹状細胞を有効成分として用いる癌ワクチン（特許文献４）等々が公知である。しかしながら、ＨＭ１．２４を用いる免疫療法の実用化は未だ知られていない。
【特許文献１】ＷＯ９９／４３７０３
【特許文献２】ＷＯ９９／４３８０３（特開２００３−２１９８９４）
【特許文献３】ＷＯ０１／７７３６２
【特許文献４】ＷＯ２００４／０３９３９８
【非特許文献１】Ｂｌｏｏｄ、第８４巻（６号）、１９２２−１９３３、１９９４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
前述した従来技術（例えば、特許文献３及び４）によれば、ＨＭ１．２４タンパク質を構成する完全長アミノ酸配列（アミノ酸数１８０）やその断片（アミノ酸数１１５）等、１０ｋＤを超える高分子ペプチドを抗原として用いている。そのため、かかる抗原１分子上の多様なエピトープないしは免疫活性ドメインの存在は、その作用効果の確認と同定を複雑かつ困難にしている。更に、これ等の抗原は、発現ベクターをＣＨＯ細胞に導入し得られる形質転換体の培養により量産されているので、抗原の高度精製、細胞や培養培地等に由来の毒性迷入因子の否定等々に係る品質管理及び品質保証の確立には長年を要する。
換言すれば、量産されたＨＭ１．２４抗原の安全性と有効性並びに均質性の確定と保証が、従来技術の実用化を遅延かつ遅滞させていると思量される。
更に、例えば、多発性骨髄腫は抗癌剤に抵抗性を示す難治性の造血器腫瘍であり、従来の化学療法や自家造血幹細胞移植だけでは長期的な治癒が期待できず、従来の抗癌剤とは作用機序の異なる新しい治療方法の開発、例えば、免疫療法の確立が望まれているところである。
従って、上記の理由、及び難治性の多発性骨髄腫や速進行性の肺癌等の治療や再発防止に確固たる術のない現状にあっては、安全かつ有効、しかも均質な物質あるいは抗原の提供とこれを用いる癌の免疫療法の確立は、患者とその家族、そして担当臨床医のみならず、全人類にとって、解決されるべき待望の課題である。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
先ず、この明細書で用いる略語につき以下に記述する。
ＨＬＡ（ヒト白血球抗原；ｈｕｍａｎ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ａｎｔｉｇｅｎ）；
（２）ＭＨＣ（主要組織適合抗原；ｍａｊｏｒ ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｐｉｂｉｌｉｔｙ
ａｎｔｉｇｅｎ）；
（３）ＣＴＬ（細胞傷害性Ｔリンパ球；ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ）；
（４）ＤＣ（樹状細胞；ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ）；
（５）ＩＦＮ（インターフェロン；ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ）；
（６）ＨＭ（ヒト骨髄腫；ｈｕｍａｎ ｍｙｅｌｏｍａ）；及び
（７）ＳＣＩＤ（重症複合免疫不全症；ｓｅｖｅｒｅ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ）。
【０００５】
本発明者らは、上述した実情と課題解決の必要性を臨床面から深く体験かつ認識すると共に、前述ＨＭ１．２４抗原が発見された機関（徳島大学）にあって、該抗原の有用性とその活用に熱い視線を注ぎ、癌の免疫療法の観点から長年にわたり多種多様な創意工夫と研究とを重ねた。
就中「ＨＭ１．２４抗原タンパク質のアミノ酸配列の中から、ＨＬＡとして頻度の高いＨＬＡ−Ａ２及びＨＬＡ−Ａ２４に提示される可能性のあるアミノ酸配列（ペプチド３次元構造）をバイオインフォマティクスによりスクリーニングし、得られた４種のアミノ酸配列に基づきそれぞれ合成したＨＭ１．２４に特異的なペプチド」の細胞性免疫誘導能につき研究を重ね、本発明者らは、次（１）〜（５）に記載の実に驚くべき現象を発見した。この発明は、これ等の発見に基づいている：
（１）上述の４種の各ペプチドと健常人の樹状細胞とをそれぞれ反応させた後、該樹状細胞で末梢血Ｔリンパ球を繰り返し刺激することにより、該４種の抗原ペプチドのうち、次の２種の抗原ペプチド（ａ）と（ｂ）：
（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列（ＫＬＱＤＡＳＡＥＶ）からなる
ペプチドＨＭ１．２４−１２６；及び
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列（ＡＰＱＬＬＩＶＬＬ）からなる
ペプチドＨＭ１．２４−１６５
をそれぞれ認識する細胞傷害性Ｔリンパ球が誘導される；
（２）更に驚くべきことに、多発性骨髄腫の患者から採取した末梢血幹細胞を用いても、上記（１）と全く同様に、樹状細胞及び細胞傷害性Ｔリンパ球が誘導される；
（３）上記（１）と（２）の細胞傷害性Ｔリンパ球はいずれも、骨髄腫細胞やＨＭ１．２４を高発現している造血器腫瘍や固形腫瘍の癌細胞に対し、ＨＬＡ拘束性に細胞傷害活性を発揮する。
（４）ＨＭ１．２４−１２６とＨＭ１．２４−１６５の両ペプチドは共に、ＨＬＡ−Ａ２及びＨＬＡ−Ａ２４を保有のヒトにおいて、抗原提示細胞である樹状細胞表面のＨＬＡに結合し、各ペプチドを認識する細胞傷害性Ｔリンパ球を特異的に増殖ないしは活性化させる作用を有する；及び
（５）ＨＭ１．２４タンパク質及び該ＨＭ１．２４タンパク質に由来のペプチド、例えば、ＨＭ１．２４−１２６やＨＭ１．２４−１６５等は多発性骨髄腫等の造血器腫瘍や肺癌等の腫瘍細胞において高発現されており、これ等の腫瘍細胞は、ＨＭ１．２４タンパク質やそれに由来のペプチドを特異的に認識する細胞傷害性Ｔ細胞により傷害・破壊され、その結果、癌に対する免疫が成立する。
【０００６】
以上の知見に基づき、この発明によれば、前述の課題を解決するための手段として、次の（１）〜（７）が提供される：
（１）配列番号１及び／又は２に記載のアミノ酸配列からなるペプチド；
（２）上記（１）のアミノ酸配列を有する抗原；
（３）前記（１）のペプチド、又は上記（２）の抗原により誘導される抗原提示細胞；
（４）前記（１）記載のペプチド、前記（２）の抗原、又は上記（３）の抗原提示細胞により誘導される細胞傷害性Ｔリンパ球；
（５）癌細胞を免疫系により死滅させる量の前記（１）のペプチド、前記（２）の抗原、前記（３）の抗原提示細胞、又は上記（４）の細胞傷害性Ｔリンパ球を含有することを特徴とする癌免疫療法剤；
（６）癌細胞が多発性骨髄腫、白血病、悪性リンパ腫、又は肺癌に由来の癌細胞である上記（５）の癌免疫療法剤；及び
（７）前記（１）のペプチドをコードするＤＮＡ分子。
【発明の効果】
【０００７】
この発明は、多発性骨髄腫、白血病、悪性リンパ腫等の造血器悪性腫瘍、更に、肺癌、乳癌等の固形癌等の治療、転移及び再発防止に優れて安全かつ有効そして均質な免疫療法剤を提供することにより、これ等の癌に対する免疫療法の確立を可能にする。換言すれば、この発明が人類の諸活動にもたらす精神的、物質的あるいは経済的効果は計り知れない。この発明は、世界の保健と医療行政に寄与するだけではなく、人類待望の癌の制圧に多大に貢献すると共に、長寿と延命という福音を全ての人類にもたらす。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
この発明の実施の形態に関し、次の通り詳述する：
合成ペプチド
配列番号１に記載のアミノ酸配列（ＫＬＱＤＡＳＡＥＶ）からなるペプチドＨＭ１．２４−１２６、及び配列番号２に記載のアミノ酸配列（ＡＰＱＬＬＩＶＬＬ）からなる
ペプチドＨＭ１．２４−１６５をそれぞれ単独、又は両者を混合し用いることができる。
これ等のペプチドは、実施例１に記載の通り、抗原提示細胞が保有のＨＬＡクラスＩ（ないしはＭＨＣクラスＩ）分子に属するＨＬＡ−Ａと結合し、抗原として提示されるよう、コンピューター解析の結果に基づきアミノ酸配列が選定され、設計・合成されている。これ等のペプチドのアミノ酸配列は、ＨＬＡ−Ａを保有の抗原提示細胞に提示され、かかる提示に起因して該ペプチドを特異的に認識する細胞傷害性Ｔリンパ球が誘導される限り、該アミノ酸配列のうちの少なくとも１アミノ酸残基を置換、欠失、挿入又は付加することができる。
合成ペプチドを有する抗原
合成ペプチドを有する抗原とは、上記（１）の２種の合成ペプチドのうち、これ等の少なくとも１種を、抗原全体の一部分として保有する抗原を意味する。該抗原として、例えば、合計２５アミノ酸からなるペプチド分子であって、その一部分に上記（１）のアミノ酸配列を保有するペプチド抗原あるいは糖タンパク質抗原、上記（１）のペプチドを保有のリポソーム抗原、上記（１）のペプチドを搭載したＡＤ−ビークル（特願２００４−１２５０３６）、リン脂質及び／又は油脂及び／又は糖質及び／又はタンパク質からなるアジュバントと上記（１）のペプチドとの複合抗原等を挙げることができる。換言すれば、前記（１）のペプチドは、かかる抗原のかたちで用いることができる。
（３）抗原提示細胞
抗原提示細胞は、健常者ドナーのヘパリン加末梢血から、また、いわゆるテイラーメイド抗原提示細胞の自家移植を考慮し、癌患者自身の末梢血幹細胞分画から、末梢血単核細胞を分離し、これを目的抗原と共存させ刺激・培養することにより調製できる。抗原提示細胞としては、免疫担当細胞、例えば、血液幹細胞、樹状細胞ＤＣ、マクロファージ、及びＢ細胞が知られおり、これ等を候補として使用できるが、ＨＬＡ−ＡクラスＩ（ないしはＭＨＣクラスＩ）拘束性とＣＴＬ誘導能を考慮すると、例えば、実験例１（１）と（２）、実施例２（２）と（４）、及び実施例３に記載の通り、ＨＬＡ−Ａを保有のＤＣの使用が望ましい。ＤＣは、前記（１）の合成ペプチドあるいは前記（２）の抗原との接触刺激及び放射線照射の両処理により、目的抗原を提示する細胞としての機能を獲得させる［実験例１（２）参照］。この発明に係る抗原提示細胞としては、未処理（未感作）ＤＣ、及び感作ＤＣが好ましい。
細胞傷害性Ｔリンパ球ＣＴＬ
健常者の末梢血から、また、いわゆるテイラーメイドＣＴＬの自家移植を考慮し、癌患者の末梢血幹細胞分画から、ＣＤ８＋Ｔ細胞を分離し、これに上記（３）の抗原提示細胞を共存接触させると、該Ｔ細胞は細胞傷害性Ｔリンパ球に誘導・変換される。ＣＤ８＋Ｔ細胞からＣＴＬを誘導する具体例は、実験例１（２）に記載されている。尚、得られたＣＴＬは、細胞培養により増幅可能であり、また、継代することによりＣＴＬ株化細胞（ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ）あるいはＣＴＬ細胞株に形質転換できる。その具体例は、実験例１（２）に記載されている。
（４）前記（１）のペプチドをコードするＤＮＡ分子
該ＤＮＡ分子は、配列番号１及び／又は２に記載のアミノ酸配列に基づき合成することができる。また、これに相補的なＲＮＡ分子も合成できる。これ等の核酸分子は、免疫学的遺伝子治療剤の有効成分として有用である。例えば、ＤＮＡ分子は発現ベクターにより、また、ＲＮＡ分子はｍＲＮＡやＲＮＡｉとして、これ等を生体細胞内に移入し発現させ、該生体内で前記（１）のペプチドを生産させることができる。
（５）免疫療法剤としての投与量
この発明に係る合成ペプチド、抗原、核酸分子、及び発現ベクターは、免疫を奏する量、例えば、１０ｎｇから１００μg／ドーズにて用いる。
免疫担当細胞であるＤＣ、抗原で感作した（刺激済みの）抗原提示細胞、及びＣＴＬは、免疫を奏する量、例えば、１０３から１０８細胞／ドーズにて用いる。尚、これ等の免疫担当細胞、いわゆるエフェクター細胞の投与では、標的細胞である癌細胞ないしは腫瘍細胞に対する量的相関、即ち、エフェクター細胞数／標的細胞数の比率（Ｅ／Ｔ比）を考慮する必要がある。Ｅ／Ｔ比は、増加させるに伴い、細胞性免疫能あるいは癌細胞障害能が高まるが、かかる効果はいずれプラトーに達することが知られているので、１から２００の範囲が望ましい。
（６）免疫療法剤の性状と形態
この発明に係る合成ペプチド、抗原、核酸分子、及び発現ベクターは、アンプルやバイアル瓶に分注かつ密封され、液状や乾燥等の形態で提供される。
また、この発明に係る細胞、即ち、ＤＣ、感作ＤＣ、及びＣＴＬは、アンプルやバイアル瓶に分注かつ密封され、−６０℃以下で凍結保存された形態で提供される。
更に、この発明に係る合成ペプチド、及び抗原は、未感作ＤＣとのキットの形態で提供することができる。
【０００９】
以下、参考例、実験例及び実施例を上げ、本発明の構成と効果を具体的に説明する。但し、この発明は、これ等の参考例、実験例及び実施例だけに限定されるわけではない。
（参考例１）
【００１０】
（１）細胞株
Ｂ細胞株ＡＲＨ−７７（ＨＬＡ−Ａ２＋, Ａ２４−）、乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ＨＬＡ−Ａ２＋,
Ａ２４−）、慢性骨髄性白血病細胞株Ｋ５６２（ＨＬＡ−Ａ２−，Ａ２４−） はそれぞれ、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（米国ＭＡ）から入手した。ＥＢＶ−ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ
Ｂ細胞株ＹＮ（ＨＬＡ−Ａ２＋，Ａ２４＋）は西岡（徳島大学）から供与された。肺癌細胞株Ａ５４９（ＨＬＡ−Ａ２− ，Ａ２４−）とＳＢＣ−５（ＨＬＡ−Ａ２＋，Ａ２４−）はヒューマンサイエンス研究資源バンク（大阪府）から入手した。全ての細胞株は１０％（容量）ｆｅｔａｌ
ｃａｌｆ ｓｅｒｕｍ（ＦＣＳ）を含むＲＰＭＩ１６４０培地（Ｓｉｇｍａ米国製）にて培養した。
（実験例１）
【００１１】
（１）末梢血単核細胞からの樹状細胞の誘導
既報の方法により血液由来の樹状細胞を誘導した。即ち、健常人ドナーのヘパリン加末梢血からＦｉｃｏｌｌ／Ｐａｑｕｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｕｐｐｓａｌａ， Ｓｗｅｄｅｎ）比重遠心法を用いて末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を分離した。ＰＢＭＣからプラスチック付着法により単球を得た。付着した単球は１０％（容量）ＦＣＳと２５０ Ｕ／ｍＬのｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ （ＩＬ）−４（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）、及び５００ Ｕ／ｍｌのｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ（ＧＭ−ＣＳＦ， Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）を含むＲＰＭＩ１６４０培地にて培養した。培養４日目には、培養液をＩＬ−４とＧＭ−ＣＳＦを含む培養液で半量交換した。培養６日目に非付着細胞を回収し、洗浄後、ＩＬ−４、ＧＭ−ＣＳＦ及び５０ Ｕ／ｍｌのｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ （ＴＮＦ）−α（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を含む培養液で２４時間培養した。培養７日目に細胞を回収し、抗原刺激用の単球由来樹状細胞として使用した。ＣＤ８３、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ４０及びＨＬＡ−ＤＲの発現をフローサイトメトリーにて測定することにより、成熟樹状細胞を確認した。
尚、実施例２で後述される通り、多発性骨髄腫患者における細胞性免疫能の検討に際しては、自家末梢血幹細胞移植の目的で採取・凍結保存された末梢血幹細胞分画を融解して用い、同様の実験を行った。
【００１２】
（２）ペプチド特異的細胞傷害Ｔ細胞の誘導
ペプチド特異的細胞傷害Ｔ細胞（ＣＴＬ）は既報の方法の変法により誘導した。即ち、同一ドナーよりＭＡＣＳ ＣＤ８ Ｍｉｃｒｏｂｅａｄｓ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）を用いてＣＤ８＋Ｔ細胞を分離した。樹状細胞を各ペプチド１０μｇ／ｍｌで３７°Ｃにおいて４時間刺激した後、洗浄し、放射線照射した（２５Ｇｙ）。ＣＤ８＋細胞（１ｘ１０６ ） をペプチド処理した自己の樹状細胞（１ｘ１０５）と共に、１０％（容量）ｈｅａｔ−ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ ｈｕｍａｎ ＡＢ ｔｙｐｅ ｓｅｒｕｍと５ｎｇ／ｍｌのｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ＩＬ−７（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を含むＲＰＭＩ１６４０ 培地にて２４−ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅで培養した。ＣＤ８＋細胞をペプチド処理した自己の樹状細胞で毎週刺激し、刺激後１０ Ｕ／ｍＬの ＩＬ−２（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ，Ｒｏｃｋｙ Ｈｉｌｌ， ＮＪ）を添加した。２−３日ごとに１０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２を含む培養液で半量交換した。３回目の刺激後５日目（１９日目）に、同一のペプチド処理をした標的細胞に対するこれらの細胞の傷害活性を測定した。
【００１３】
（３）ＣＴＬの増幅法と株化ＣＴＬ
更に詳細な検討のために十分量のＣＴＬを得る目的で、既報の方法によりＣＴＬを増幅した。即ち、５ｘ１０４個のＣＴＬを刺激細胞としての５ｘ１０６自己ｉｒｒａｄｉａｔｅｄ（３０Ｇｙ） ｐｅｐｔｉｄｅ−ｐｕｌｓｅｄ ＰＢＭＣとｆｅｅｄｅｒ細胞としての１ｘ１０６ ｉｒｒａｄｉａｔｅｄ（３０Ｇｙ）ＥＢＶ−ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ＹＮ細胞と共に５ｍｌのｃｏｍｐｌｅｔｅ ｍｅｄｉｕｍにて培養した。培養１日目に、１２０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２を添加した。３日ごとに５０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２を含む培養液で交換した。２週間後、増殖した細胞を回収しＣＴＬ株として使用した。
【００１４】
（４）フローサイトメトリー（腫瘍抗原の検出）
細胞表面マーカーはＦＩＴＣ標識抗体を用いてフローサイトメトリー（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）にて解析した。樹状細胞用にはａｎｔｉ−ＣＤ８０、ａｎｔｉ−ＣＤ８６、ａｎｔｉ−ＣＤ４０、ａｎｔｉ−ＣＤ８３及びａｎｔｉ−ＨＬＡ−ＤＲ（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を、細胞株やＰＢＭＣのＨＬＡ−Ａ ｔｙｐｉｎｇにはａｎｔｉ−ＨＬＡ−Ａ２及びａｎｔｉ−ＨＬＡ−Ａ２
２４（ＵＳ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ，Ｓｗａｍｐｓｃｏｔｔ，ＭＡ）を、標的細胞のＨＭ１．２４発現の検出にはａｎｔｉ−ＨＭ１．２４抗体をそれぞれ用いた。
【００１５】
（５）インターフェロンγの測定（誘導されたＣＴＬ検出）
各ＣＴＬの培養上清を２回目の刺激後（ＣＴＬ誘導開始９日目）、３回目の刺激後（ＣＴＬ誘導開始１６日目）及び細胞傷害試験時（ＣＴＬ誘導開始１９日目）にそれぞれ回収した。インターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）の濃度はｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ）ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）により測定した。各実験は２回ずつ行われた。ＣＴＬ株によるＩＦＮγの産生量はＥＬＩＳＰＯＴ ａｓｓａｙ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）により測定した。１ｘ１０４のＣＴＬを１ｘ１０４の標的細胞とともに抗ＩＦＮγ抗体でコートしたＥＬＩＳＰＯＴ ｐｌａｔｅで２４時間培養し，使用の手引きに従いスポットを検出した。
【００１６】
（６）細胞傷害試験（ＣＴＬ活性の測定）
ＣＴＬの標的細胞に対する細胞傷害は、既報の方法により測定した。標的細胞を１００μＣｉの５１Ｃｒで３７°Ｃ、１時間培養した後、２回洗浄し、１０％（容量）ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０ｍｅｄｉｕｍで培養した。ペプチド処理標的細胞は１０μｇ／ｍｌのペプチドを添加し、３７°Ｃで一晩培養し作成した。ＣＴＬを９６−ｗｅｌｌ ｒｏｕｎｄ−ｂｏｔｔｏｍｅｄ ｐｌａｔｅに６ｘ１０４ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌにて分注した。次に標識した標的細胞を各ウェルに ３ｘ１０３ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌにて加えた。４時間の培養後、培養液中に遊離した５１Ｃｒをａｕｔｏｍａｔｅｄ ｇａｍｍａ ｃｏｕｎｔｅｒで計測した。特異細胞傷害活性は以下の式に基づき算出した：［（ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ ５１Ｃｒ−ｒｅｌｅａｓｅ−ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ ５１Ｃｒ−ｒｅｌｅａｓｅ）／（ｍａｘｉｍｕｍ ５１Ｃｒ−ｒｅｌｅａｓｅ−ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ ５１Ｃｒ−ｒｅｌｅａｓｅ）］ｘ１００。Ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ ５１Ｃｒ−ｒｅｌｅａｓｅには、ＣＴＬを加えない標識標的細胞を用いた。Ｍａｘｉｍｕｍ ５１Ｃｒ−ｒｅｌｅａｓｅには、標的細胞を５％（重量）Ｔｒｉｏｎ Ｘ−１００を含むｍｅｄｉｕｍにて培養した。全ての実験は２回ずつ行われた。
【００１７】
（７）ＣＴＬの阻害実験（ＣＴＬのＨＬＡ拘束性と抗原特異性の検定）
ＣＴＬ株の特異性はｃｏｌｄ ｔａｒｇｅｔ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ａｓｓａｙにて確認した。簡潔に言えば、５１Ｃｒ標識標的細胞 （３ｘ１０３ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ） とＣＴＬ （６ｘ１０４ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）を非標識標的細胞（６ｘ１０４ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）と共に９６−ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅにて培養した。ペプチド処理あるいは未処理のＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を非標識標的細胞として用いた。細胞傷害試験は前述のように行った。細胞傷害活性がＨＬＡ ｃｌａｓｓＩ拘束性か否かについて調べるため，標的細胞を細胞傷害試験の前に１０ μｇ／ｍｌの抗ＨＬＡ ｃｌａｓｓＩ抗体（ｗ６／３２，Ｄａｋｏ，Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ， ＣＡ）又はコントロールマウスＩｇＧ（ＵＰＣ−１０，Ｃａｐｐｅｌ，Ｍａｌｖｅｒｎ，ＰＡ） にて４５分間室温で培養した。その他の実験としては、ＣＴＬを加える前に標的細胞をＨＭ１．２４蛋白の細胞外エピトープのアミノ酸残基１１６−１２７を認識する抗ＨＭ１．２４抗体と室温で４５分間反応させ、細胞傷害試験に及ぼす影響につき検討した。
【実施例１】
【００１８】
（１）ペプチドのアミノ酸配列の選定と合成
Ｔ細胞認識エピトープを予測する２つのコンピューターソフトウエア Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ＆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｅｃｔｉｏｎ（ＢＩＭＡＳ， ｈｔｔｐ：／／ｂｉｍａｓ．ｄｃｒｔ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）とＳＹＦＰＥＩＴＨＩ（Ｔｂｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ，ｈｔｔｐ：／／ｓｙｆｐｅｉｔｈｉ．ｂｍｉ−ｈ
ｂｍｉ−ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ．ｃｏｍ） を用いてＨＭ１．２４蛋白の塩基配列を解析した。結合定数に基づき、ＨＬＡ−Ａ２４と結合する９個のアミノ酸からなるペプチドを３種類と、ＨＬＡ−Ａ２と結合するペプチド１種類を決定した。ＭＡＧＥ−３のアミノ酸残基１９５−２０３はＨＬＡ−Ａ２４と結合し細胞傷害Ｔ細胞を誘導することが知られているため、陽性コントロールとして用いた。
上記ペプチドの各アミノ酸配列と結合定数との相関を表１に示す。ＨＬＡ結合定数は２つのコンピュータープログラム（ＢＩＭＡＳとＳＹＦＰＥＩＴＨＩ）により推測した。各ペプチドの結合定数はＨＬＡ−Ａ２やＨＬＡ−Ａ２４分子との解離の半減時間や結合力を表す。
ペプチド合成は、自動ペプチド合成装置（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｔｕｃｏｎ，ＡＺ）を用い、固相法により９０％以上の純度で行った。ＨＭ１．２４−１２６、ＨＭ１．２４−１３６及びＨＭ１．２４−１５２はｍｉｌｌｉＱ水に、ＨＭ１．２４−１６５とＭＡＧＥ−３−１９５はｄｉｍｅｔｈｙｌ ｓｕｌｆｏｘｉｄｅに、それぞれ１ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解し、使用まで−８０°Ｃにて保存した。
【実施例２】
【００１９】
（１）腫瘍細胞におけるＨＭ１．２４の発現
参考例１に記載の各種腫瘍細胞がＨＭ１．２４に特異的なＣＴＬの標的となり得るか否かにつき調べるため、ＨＭ１．２４発現につき、フローサイトメトリー［実験例１（４）に記載］にて測定した。即ち、細胞をＦＩＴＣ標識マウスＩｇＧ（点線）又はＦＩＴＣ標識抗ＨＭ１．２４抗体（実線）にて染色後、発現量をフローサイトメトリーにて解析した。
その結果を図１に示す。ＡＲＨ−７７、ＹＮ及びＳＢＣ−５細胞は細胞表面ＨＭ１．２４を高発現していた。しかし、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１とＫ５６２細胞は共にＨＭ１．２４発現が低く、Ａ５４９にはＨＭ１．２４の発現が見られなかった。
【００２０】
（２）ペプチド処理樹状細胞によるＨＭ１．２４に特異的なＣＴＬの誘導
ペプチド処理樹状細胞により刺激されたＣＤ８＋細胞の上清を誘導開始から９日目、１６日目、及び１９日目にそれぞれ回収し、ＩＦＮγの産生量を測定［実験例１（５）に記載］することにより，ＨＭ１．２４特異的ＣＴＬの誘導効果について評価した。ドナー＃４３（ＨＬＡ−Ａ２−， Ａ２４＋）のＨＭ１．２４−１６５ペプチドによるＣＴＬにおいて、ＩＦＮγの産生量は９日目（８００ｐｇ／ｍｌ）や１９日目（１１００ｐｇ／ｍｌ）と比較し、１６日目において最大値を示した（１６００ｐｇ／ｍＬ）。ＨＭ１．２４−１２６やＭＡＧＥ−３−１９５ペプチドによっても１６日目におけるＩＦＮγが最高値であった。よって、以下の実験ではＩＦＮγ濃度は１６日目においてのみ測定した。４名のＨＬＡ−Ａ２＋，Ａ２４＋ドナーのうち、ＨＭ１．２４−１２６とＨＭ１．２４−１６５、陽性コントロールＭＡＧＥ−３−１９５ペプチド刺激により、２名がＣＤ８＋細胞上清中のＩＦＮγ高値を示した。しかし、これ等のドナーにおいては、ＨＭ１．２４−１３６とＨＭ１．２４−１５２ペプチドによるＣＤ８＋細胞のＩＦＮγ産生は見られなかった。
更に、これ等のペプチドによるＣＴＬ誘導作用を明らかにするため、合計２０名のドナーから樹状細胞を誘導し［実験例１（１）に記載］、ペプチドで処理した後に自己のＣＤ８＋Ｔ細胞を刺激した［実験例１（２）に記載］。３回の刺激後、同一ペプチドで処理したＹＮ細胞を標的とした細胞傷害活性を測定した［実験例１（６）に記載］。即ち、健常人２０名より分離したＣＤ８＋細胞をペプチド刺激樹状細胞で刺激し、１９日目にペプチド処理したＹＮ細胞に対するＣＴＬ活性を測定した。細胞傷害活性は４時間、５１Ｃｒ−ｒｅｌｅａｓｅ ａｓｓａｙ （Ｅ／Ｔ比２０）にて測定した。
その結果を表２に示す。尚、各ＣＴＬ活性（％）は、ペプチド処理樹状細胞によるＣＴＬペプチド活性測定値から、ペプチド未処理樹状細胞によるＣＴＬ活性測定値を差し引いた値で示し、１０％以上の細胞傷害を有意なＣＴＬ活性と見なした。
ＨＭ１．２４−１３６とＨＭ１．２４−１５２の各ペプチドによる特異的ＣＴＬの誘導は、合計２０例中、それぞれ１例と２例であった。
これに対し、ＨＭ１．２４−１２６ペプチドによる特異的ＣＴＬの誘導は、ＨＬＡ−Ａ２ドナー７例のうち４例、ＨＬＡ−Ａ２４ドナーは１５例中、４例であった。
ＨＭ１．２４−１６５ペプチドによる特異的ＣＴＬの誘導も同様にＨＬＡ−Ａ２ドナー７例のうち４例、ＨＬＡ−Ａ２４ドナーは１５例中、７例であった。
以上の結果に基づき、ＨＭ１．２４−１２６とＨＭ１．２４−１６５の両ぺプチドは、ＨＬＡ−Ａ２又はＨＬＡ−Ａ２４を保有のヒトに対するＣＴＬ誘導能を有していると判定された。また、その程度は、これ等のペプチドのＨＬＡ−Ａ２４結合定数（表１参照）に一致し、ＨＬＡ−Ａ２−，２４＋ドナーに対するＨＭ１．２４−１６５とＭＡＧＥ−３−１９５のＣＴＬ誘導能は、ＨＭ１．２４−１２６のそれよりも優れていた。一方、ペプチド処理を行っていないＹＮ細胞に対しては、ＨＭ１．２４に特異的なＣＴＬの細胞傷害活活性が検出されなかったので、これ等のＣＴＬは標的細胞上の外因性ペプチドを認識することが示唆された。
【００２１】
（３）誘導されたＣＴＬの抗原認識特異性（誘導ペプチドとＨＬＡに対する特異性）
ＨＭ１．２４ペプチドやＭＡＧＥ−３−１９５ペプチドで処理したＹＮ細胞を標的とし、誘導されたＣＴＬの抗原認識特異性［実験例１（７）に記載］につき更に検討した。即ち、ＨＭ１．２４由来ペプチドやＭＡＧＥ−３−１９５で処理したＹＮ細胞を標的とし、ＣＴＬのペプチド特異性につき検討した。ドナー＃４２（ＨＬＡ−Ａ２＋，Ａ２４−）においてＨＭ１．２４−１２６（Ａ）やＨＭ１．２４−１６５（Ｂ）により誘導されたＣＴＬ活性を測定した（Ｅ／Ｔ比２０）。
その結果を図２に示す。ＨＭ１．２４−１２６とＨＭ１．２４−１６５により誘導されたＣＴＬは、それぞれ同一のペプチド処理されたＹＮ細胞に対し有意に反応を示した。しかし、他のＨＭ１．２４ペプチドで処理されたＹＮ細胞には反応しなかった。
ＨＭ１．２４−１２６、ＨＭ１．２４−１６５及びＭＡＧＥ−３−１９５で誘導した３例のＣＴＬにつき、ＨＬＡ−Ａの型が異なる標的細胞を用い、ＨＬＡ拘束性について検討した。即ち、異なるＨＬＡ型の３名のドナーより誘導したＣＴＬにおいて、ＡＲＨ−７７（ＨＬＡ−Ａ２＋，Ａ２４−）とペプチド処理したＹＮ細胞（ＨＬＡ−Ａ２＋，Ａ２４＋）に対する細胞傷害活性を比較した。細胞傷害活性は４時間 ５１Ｃｒ−ｒｅｌｅａｓｅ ａｓｓａｙ（Ｅ／Ｔ比２０）にて測定した。
その結果を図３に示す。ドナー＃２５（ＨＬＡ−Ａ２＋，Ａ２４＋）のＣＴＬはＡＲＨ−７７（ＨＬＡ−Ａ２＋，Ａ２４−）とペプチド処理したＹＮ細胞（ＨＬＡ−Ａ２＋，Ａ２４＋）の両者に反応した。ドナー＃１１（ＨＬＡ−Ａ２−，Ａ２４＋）のＣＴＬはＹＮ細胞に反応したがＡＲＨ−７７には反応しなかった。一方，ドナー＃２４（ＨＬＡ−Ａ２−，Ａ２４−）のＣＴＬはいずれの標的細胞にも反応しなかった。この結果から、誘導されたＣＴＬは、ＨＬＡ一致の標的細胞だけを傷害することが示唆された。
【００２２】
（４）ＣＴＬ株によるＨＭ１．２４発現腫瘍細胞の認識
ＨＭ１．２４ペプチドで誘導したＣＴＬにつき、更に詳細な検討を加えるため、ドナー＃４２（ＨＬＡ−Ａ２＋，Ａ２４−）の初代ＣＴＬから、ＨＭ１．２４−１２６、ＨＭ１．２４−１５２あるいはＨＭ１．２４−１６５を認識するＣＴＬ株を樹立した［実験例１（３）に記載］。即ち、ＨＭ１．２４特異的ＣＴＬ株のヒト腫瘍細胞に対する細胞傷害活性ドナー＃４２（ＨＬＡ−Ａ２＋，Ａ２４−）よりＣＤ８＋細胞を分離し、３種類のＨＭ１．２４ペプチド刺激樹状細胞で刺激した後、ＣＴＬ株を樹立した。
自然発現しているヒト癌細胞のＨＭ１．２４ペプチドをＣＴＬ株が認識するか否かにつき明らかにするため、ＣＴＬ株をＨＭ１．２４発現量の異なるＨＬＡ−Ａ２＋腫瘍細胞と反応させた。ＣＴＬ株による腫瘍細胞の認識はＩＦＮγのＥＬＩＳＰＯＴアッセイ［実験例１（５）に記載］により評価した。即ち、各ＣＴＬ（１ｘ１０４）を標的細胞（１ｘ１０４）と２４時間反応させた後、ＥＬＩＳＰＯＴ ａｓｓａｙによりＩＦＮγの産生を測定した。
その結果を図４（ａ）に示す。ＨＭ１．２４を強く発現しているＡＲＨ−７７と反応し、ＩＦＮγ産生細胞の増加が認められた。一方、ＨＭ１．２４を弱く発現しているＭＤＡ−ＭＢ−２３１に対しては、ＩＦＮγ産生は少量であったため、ＣＴＬ株による認識はＨＭ１．２４発現量に依存していることが示唆された。
次に、ＨＭ１．２４発現量が異なる腫瘍細胞に対するＣＴＬ株の細胞傷害について検討した。即ち、異なるＨＭ１．２４量を発現した腫瘍細胞に対するＣＴＬ株の細胞傷害活性を４時間、５１Ｃｒ−ｒｅｌｅａｓｅ ａｓｓａｙ（Ｅ／Ｔ比２０）にて測定した。
その結果を図４（ｂ）に示す。これ等のＨＭ１．２４に特異的なＣＴＬ株は、ＨＭ１．２４を発現しているＨＬＡ−Ａ２＋細胞、即ち、ＡＲＨ−７７、ＹＮ、ＳＢＣ−５及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１を傷害した。これ等ＣＴＬの細胞傷害活性はＩＦＮγ産生の結果と同様に，標的細胞のＨＭ１．２４発現量と相関していた。ＮＫ感受性でＨＬＡ−Ａ２−のＫ５６２細胞に対する傷害活性は認めなかったため、細胞傷害は非特異的ＮＫ活性にはよらないことが示唆された。
尚、図４（ｃ）に示す通り、ＣＴＬ株のＡＲＨ−７７細胞に対する細胞傷害活性はＥ／Ｔ比に比例ないしは依存していた。
【００２３】
（５）ＣＴＬ株のＨＬＡ拘束性と抗原特異性
ＣＴＬ株による細胞傷害がＨＬＡ拘束性によるか否かにつき調べるため、ＣＴＬによるＨＬＡクラスＩの認識過程を抗ＨＬＡクラスＩ抗体により阻害した［実験例１（７）に記載］。即ち、ドナー＃４２からＨＭ１．２４−１６５を用いて誘導したＣＴＬ株の細胞傷害活性を抗ＨＬＡクラスＩ抗体の存在下で測定した。標的細胞であるＡＲＨ−７７又はＹＮ細胞を抗ＨＬＡクラスＩ抗体で室温４５分間培養した後，ＣＴＬ株と反応させ、４時間、５１Ｃｒ−ｒｅｌｅａｓｅ ａｓｓａｙ（Ｅ／Ｔ比２０）にて細胞傷害活性を測定した。
その結果を図５に示す。ＨＭ１．２４−１６５により誘導されたＣＴＬ株のＡＲＨ−７７に対する認識は抗ＨＬＡクラスＩ抗体により抑制されたため、この細胞傷害活性はＨＬＡクラスＩ拘束性であることが示唆された。
更に、ＣＴＬ株のペプチド特異性につき、ｃｏｌｄ ｔａｒｇｅｔ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ａｓｓａｙ［実験例１（７）に記載］により検討した。即ち、ＨＭ１．２４−１６５誘導ＣＴＬ株（６ｘ１０４ ｃｅｌｌｓ）のＡＲＨ−７７（３ｘ１０３ ｃｅｌｌｓ）に対する細胞傷害活性につき、ＨＭ１．２４−１６５ペプチド処理や未処理の陰性コントロールＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞（６ｘ１０４ ｃｅｌｌｓ）の存在下で測定した。
その結果を図６に示す。ＨＭ１．２４−１６５により誘導されたＣＴＬ株によるＡＲＨ−７７の認識は，同一のペプチド処理をした陰性コントロールのＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞により顕著に抑制された。
【実施例３】
【００２４】
（１）多発性骨髄腫患者におけるＣＴＬの誘導
実施例１に記載の健常者例と全く同様にして、多発性骨髄腫患者におけるＣＴＬの誘導につき、検討した。即ち、多発性骨髄腫患者８例（ＨＬＡ−Ａ２＋又はＨＬＡ−Ａ２４＋）の末梢血幹細胞分画を用い，実験例１（１）の記載と同様にして、成熟樹状細胞の誘導を行った。その結果、全例において該誘導が可能であった。
更に、末梢血幹細胞分画のＣＤ８＋細胞を各ＨＭ１．２４ペプチドで処理した自己の樹状細胞で刺激し、特異的ＣＴＬの誘導につき検討した。即ち、多発性骨髄腫患者８例の末梢血幹細胞採取分画より樹状細胞を誘導し、各ペプチド処理した後、末梢血幹細胞採取分画の自己ＣＤ８＋細胞と培養することにより、ペプチド特異的ＣＴＬを誘導した。ＣＴＬの誘導はＧｒａｎｚｙｍｅ Ｂ ＥＬＩＳＰＯＴ ａｓｓａｙにより検討した。
その結果を表３に示す。ＨＭ１．２４−１２６ペプチドによる特異的ＣＴＬの誘導はＨＬＡ−Ａ２＋患者５例のうち４例、また、ＨＭ１．２４−１６５ペプチドによる上記誘導はＨＬＡ−Ａ２４＋患者６例中、２例であった。他のＨＭ１．２４−１５２やＭＡＧＥ−３−１９５によるＣＴＬ誘導は各１例しか認めず、ＨＭ１．２４−１３６によるＣＴＬ誘導は認められなかった。
以上の結果に基づき、多発性骨髄腫患者の末梢血中にはＨＭ１．２４特異的ＣＴＬ前駆細胞が存在していることが明らかになった。更に、末梢血幹細胞採取分画より樹状細胞の誘導が可能であり、ＨＭ１．２４−１２６やＨＭ１．２４−１６５ペプチドを用いることによりＨＭ１．２４に特異的なＣＴＬの誘導も可能であったことから、自家末梢血幹細胞移植後に、余剰の採取分画を用いたＨＭ１．２４ペプチド樹状細胞療法の臨床応用の可能性が示唆された。
【実施例４】
【００２５】
（１）前臨床試験（動物試験による安全性と有効性の確認）
生体内におけるＨＭ１．２４由来ペプチドの効果を検討するには、ＳＣＩＤ（重症複合免疫不全）マウスを用いたヒト癌細胞移植モデルを使用することができる。即ち、該ＳＣＩＤマウスにヒト由来の腫瘍細胞を移植した後、配列番号１及び２に記載のアミノ酸配列からなる各ペプチド並びに両者の混合により活性化した細胞傷害性Ｔリンパ球を作製の後、該リンパ球を上記ＳＣＩＤマウスに輸注し、移植腫瘍の縮小・消失を観察することにより、生体における上記ペプチドの免疫療法剤としての安全性と有効性・抗腫瘍効果を確認することができる。
【００２６】
【表１】
【００２７】
【表２】
【００２８】
【表３】
【産業上の利用可能性】
【００２９】
この発明は、多発性骨髄腫、白血病、悪性リンパ腫等の造血器悪性腫瘍、更に、肺癌、乳癌等の固形癌等の治療、転移、及び再発防止のための免疫療法剤や癌ワクチンを製造、検定、販売、仲介及び特殊輸送する産業分野、及び臨床検査の分野で利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】腫瘍細胞におけるＨＭ１．２４発現のフローサイトメトリー解析の結果を示す図。
【図２】ＨＭ１．２４ペプチド誘導ＣＴＬのペプチド特異性を示す図。
【図３】ＨＭ１．２４ペプチド誘導ＣＴＬのＨＬＡ拘束性を示す図。
【図４】ＨＭ１．２４ペプチド特異的ＣＴＬ株のヒト腫瘍細胞に対する細胞傷害活性を示す図。
【図５】ＨＭ１．２４ペプチド誘導ＣＴＬ株のＨＬＡ拘束性を示す図。
【図６】ＨＭ１．２４ペプチド誘導ＣＴＬ株の該誘導ペプチド特異性を示す図。
【技術分野】
【０００１】
この発明は、多発性骨髄腫、白血病、悪性リンパ腫等の造血器悪性腫瘍、肺癌、乳癌等の固形癌等の治療、転移及び再発防止に有効な免疫療法剤と、該製剤を用いる免疫療法に関するものである。
更に詳しくは、ヒト骨髄腫のＨＭ１．２４タンパク質抗原をコードする遺伝子ＤＮＡのコンピューター解析の結果に基づき設計かつ合成されたペプチドである免疫活性ドメインないしはエピトープ、該ペプチドにより誘導される抗原提示細胞及び細胞傷害性Ｔリンパ球、該ペプチドをコードするＤＮＡ分子、並びにこれ等の用途に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
上記のＨＭ１．２４抗原は、ＩＩ型の膜貫通・糖タンパク質であり、骨髄腫細胞で特異的に高発現されている抗原として１９９４年、齋藤ら（徳島大学）により発見かつ報告された（非特許文献１）。その意義は、多発性骨髄腫やその他の癌に対する免疫療法の開発に有用かつ有望な手段あるいは標的を提示したことにある。爾後、この報告を契機として世界各地で、ＨＭ１．２４抗原とその遺伝子並びに抗体を用いる多発性骨髄腫及びその他の癌の診断、免疫療法等の研究及び技術開発が活発に展開されてきた。
既に開発された主な技術として、例えば、抗ＨＭ１．２４抗体による可溶性ＨＭ１．２４タンパク質抗原の測定（特許文献１）、ＨＭ１．２４抗原タンパク質をコードする遺伝子ＤＮＡとそのプローモーター領域並びにこれ等の用途（特許文献２）、発現ベクターによる可溶性ＨＭ１．２４抗原タンパク質の量産（特許文献３）、ＨＭ１．２４タンパク質によるパルス又は該遺伝子ＤＮＡの導入により作製された樹状細胞を有効成分として用いる癌ワクチン（特許文献４）等々が公知である。しかしながら、ＨＭ１．２４を用いる免疫療法の実用化は未だ知られていない。
【特許文献１】ＷＯ９９／４３７０３
【特許文献２】ＷＯ９９／４３８０３（特開２００３−２１９８９４）
【特許文献３】ＷＯ０１／７７３６２
【特許文献４】ＷＯ２００４／０３９３９８
【非特許文献１】Ｂｌｏｏｄ、第８４巻（６号）、１９２２−１９３３、１９９４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
前述した従来技術（例えば、特許文献３及び４）によれば、ＨＭ１．２４タンパク質を構成する完全長アミノ酸配列（アミノ酸数１８０）やその断片（アミノ酸数１１５）等、１０ｋＤを超える高分子ペプチドを抗原として用いている。そのため、かかる抗原１分子上の多様なエピトープないしは免疫活性ドメインの存在は、その作用効果の確認と同定を複雑かつ困難にしている。更に、これ等の抗原は、発現ベクターをＣＨＯ細胞に導入し得られる形質転換体の培養により量産されているので、抗原の高度精製、細胞や培養培地等に由来の毒性迷入因子の否定等々に係る品質管理及び品質保証の確立には長年を要する。
換言すれば、量産されたＨＭ１．２４抗原の安全性と有効性並びに均質性の確定と保証が、従来技術の実用化を遅延かつ遅滞させていると思量される。
更に、例えば、多発性骨髄腫は抗癌剤に抵抗性を示す難治性の造血器腫瘍であり、従来の化学療法や自家造血幹細胞移植だけでは長期的な治癒が期待できず、従来の抗癌剤とは作用機序の異なる新しい治療方法の開発、例えば、免疫療法の確立が望まれているところである。
従って、上記の理由、及び難治性の多発性骨髄腫や速進行性の肺癌等の治療や再発防止に確固たる術のない現状にあっては、安全かつ有効、しかも均質な物質あるいは抗原の提供とこれを用いる癌の免疫療法の確立は、患者とその家族、そして担当臨床医のみならず、全人類にとって、解決されるべき待望の課題である。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
先ず、この明細書で用いる略語につき以下に記述する。
ＨＬＡ（ヒト白血球抗原；ｈｕｍａｎ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ａｎｔｉｇｅｎ）；
（２）ＭＨＣ（主要組織適合抗原；ｍａｊｏｒ ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｐｉｂｉｌｉｔｙ
ａｎｔｉｇｅｎ）；
（３）ＣＴＬ（細胞傷害性Ｔリンパ球；ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ）；
（４）ＤＣ（樹状細胞；ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ）；
（５）ＩＦＮ（インターフェロン；ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ）；
（６）ＨＭ（ヒト骨髄腫；ｈｕｍａｎ ｍｙｅｌｏｍａ）；及び
（７）ＳＣＩＤ（重症複合免疫不全症；ｓｅｖｅｒｅ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ）。
【０００５】
本発明者らは、上述した実情と課題解決の必要性を臨床面から深く体験かつ認識すると共に、前述ＨＭ１．２４抗原が発見された機関（徳島大学）にあって、該抗原の有用性とその活用に熱い視線を注ぎ、癌の免疫療法の観点から長年にわたり多種多様な創意工夫と研究とを重ねた。
就中「ＨＭ１．２４抗原タンパク質のアミノ酸配列の中から、ＨＬＡとして頻度の高いＨＬＡ−Ａ２及びＨＬＡ−Ａ２４に提示される可能性のあるアミノ酸配列（ペプチド３次元構造）をバイオインフォマティクスによりスクリーニングし、得られた４種のアミノ酸配列に基づきそれぞれ合成したＨＭ１．２４に特異的なペプチド」の細胞性免疫誘導能につき研究を重ね、本発明者らは、次（１）〜（５）に記載の実に驚くべき現象を発見した。この発明は、これ等の発見に基づいている：
（１）上述の４種の各ペプチドと健常人の樹状細胞とをそれぞれ反応させた後、該樹状細胞で末梢血Ｔリンパ球を繰り返し刺激することにより、該４種の抗原ペプチドのうち、次の２種の抗原ペプチド（ａ）と（ｂ）：
（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列（ＫＬＱＤＡＳＡＥＶ）からなる
ペプチドＨＭ１．２４−１２６；及び
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列（ＡＰＱＬＬＩＶＬＬ）からなる
ペプチドＨＭ１．２４−１６５
をそれぞれ認識する細胞傷害性Ｔリンパ球が誘導される；
（２）更に驚くべきことに、多発性骨髄腫の患者から採取した末梢血幹細胞を用いても、上記（１）と全く同様に、樹状細胞及び細胞傷害性Ｔリンパ球が誘導される；
（３）上記（１）と（２）の細胞傷害性Ｔリンパ球はいずれも、骨髄腫細胞やＨＭ１．２４を高発現している造血器腫瘍や固形腫瘍の癌細胞に対し、ＨＬＡ拘束性に細胞傷害活性を発揮する。
（４）ＨＭ１．２４−１２６とＨＭ１．２４−１６５の両ペプチドは共に、ＨＬＡ−Ａ２及びＨＬＡ−Ａ２４を保有のヒトにおいて、抗原提示細胞である樹状細胞表面のＨＬＡに結合し、各ペプチドを認識する細胞傷害性Ｔリンパ球を特異的に増殖ないしは活性化させる作用を有する；及び
（５）ＨＭ１．２４タンパク質及び該ＨＭ１．２４タンパク質に由来のペプチド、例えば、ＨＭ１．２４−１２６やＨＭ１．２４−１６５等は多発性骨髄腫等の造血器腫瘍や肺癌等の腫瘍細胞において高発現されており、これ等の腫瘍細胞は、ＨＭ１．２４タンパク質やそれに由来のペプチドを特異的に認識する細胞傷害性Ｔ細胞により傷害・破壊され、その結果、癌に対する免疫が成立する。
【０００６】
以上の知見に基づき、この発明によれば、前述の課題を解決するための手段として、次の（１）〜（７）が提供される：
（１）配列番号１及び／又は２に記載のアミノ酸配列からなるペプチド；
（２）上記（１）のアミノ酸配列を有する抗原；
（３）前記（１）のペプチド、又は上記（２）の抗原により誘導される抗原提示細胞；
（４）前記（１）記載のペプチド、前記（２）の抗原、又は上記（３）の抗原提示細胞により誘導される細胞傷害性Ｔリンパ球；
（５）癌細胞を免疫系により死滅させる量の前記（１）のペプチド、前記（２）の抗原、前記（３）の抗原提示細胞、又は上記（４）の細胞傷害性Ｔリンパ球を含有することを特徴とする癌免疫療法剤；
（６）癌細胞が多発性骨髄腫、白血病、悪性リンパ腫、又は肺癌に由来の癌細胞である上記（５）の癌免疫療法剤；及び
（７）前記（１）のペプチドをコードするＤＮＡ分子。
【発明の効果】
【０００７】
この発明は、多発性骨髄腫、白血病、悪性リンパ腫等の造血器悪性腫瘍、更に、肺癌、乳癌等の固形癌等の治療、転移及び再発防止に優れて安全かつ有効そして均質な免疫療法剤を提供することにより、これ等の癌に対する免疫療法の確立を可能にする。換言すれば、この発明が人類の諸活動にもたらす精神的、物質的あるいは経済的効果は計り知れない。この発明は、世界の保健と医療行政に寄与するだけではなく、人類待望の癌の制圧に多大に貢献すると共に、長寿と延命という福音を全ての人類にもたらす。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
この発明の実施の形態に関し、次の通り詳述する：
合成ペプチド
配列番号１に記載のアミノ酸配列（ＫＬＱＤＡＳＡＥＶ）からなるペプチドＨＭ１．２４−１２６、及び配列番号２に記載のアミノ酸配列（ＡＰＱＬＬＩＶＬＬ）からなる
ペプチドＨＭ１．２４−１６５をそれぞれ単独、又は両者を混合し用いることができる。
これ等のペプチドは、実施例１に記載の通り、抗原提示細胞が保有のＨＬＡクラスＩ（ないしはＭＨＣクラスＩ）分子に属するＨＬＡ−Ａと結合し、抗原として提示されるよう、コンピューター解析の結果に基づきアミノ酸配列が選定され、設計・合成されている。これ等のペプチドのアミノ酸配列は、ＨＬＡ−Ａを保有の抗原提示細胞に提示され、かかる提示に起因して該ペプチドを特異的に認識する細胞傷害性Ｔリンパ球が誘導される限り、該アミノ酸配列のうちの少なくとも１アミノ酸残基を置換、欠失、挿入又は付加することができる。
合成ペプチドを有する抗原
合成ペプチドを有する抗原とは、上記（１）の２種の合成ペプチドのうち、これ等の少なくとも１種を、抗原全体の一部分として保有する抗原を意味する。該抗原として、例えば、合計２５アミノ酸からなるペプチド分子であって、その一部分に上記（１）のアミノ酸配列を保有するペプチド抗原あるいは糖タンパク質抗原、上記（１）のペプチドを保有のリポソーム抗原、上記（１）のペプチドを搭載したＡＤ−ビークル（特願２００４−１２５０３６）、リン脂質及び／又は油脂及び／又は糖質及び／又はタンパク質からなるアジュバントと上記（１）のペプチドとの複合抗原等を挙げることができる。換言すれば、前記（１）のペプチドは、かかる抗原のかたちで用いることができる。
（３）抗原提示細胞
抗原提示細胞は、健常者ドナーのヘパリン加末梢血から、また、いわゆるテイラーメイド抗原提示細胞の自家移植を考慮し、癌患者自身の末梢血幹細胞分画から、末梢血単核細胞を分離し、これを目的抗原と共存させ刺激・培養することにより調製できる。抗原提示細胞としては、免疫担当細胞、例えば、血液幹細胞、樹状細胞ＤＣ、マクロファージ、及びＢ細胞が知られおり、これ等を候補として使用できるが、ＨＬＡ−ＡクラスＩ（ないしはＭＨＣクラスＩ）拘束性とＣＴＬ誘導能を考慮すると、例えば、実験例１（１）と（２）、実施例２（２）と（４）、及び実施例３に記載の通り、ＨＬＡ−Ａを保有のＤＣの使用が望ましい。ＤＣは、前記（１）の合成ペプチドあるいは前記（２）の抗原との接触刺激及び放射線照射の両処理により、目的抗原を提示する細胞としての機能を獲得させる［実験例１（２）参照］。この発明に係る抗原提示細胞としては、未処理（未感作）ＤＣ、及び感作ＤＣが好ましい。
細胞傷害性Ｔリンパ球ＣＴＬ
健常者の末梢血から、また、いわゆるテイラーメイドＣＴＬの自家移植を考慮し、癌患者の末梢血幹細胞分画から、ＣＤ８＋Ｔ細胞を分離し、これに上記（３）の抗原提示細胞を共存接触させると、該Ｔ細胞は細胞傷害性Ｔリンパ球に誘導・変換される。ＣＤ８＋Ｔ細胞からＣＴＬを誘導する具体例は、実験例１（２）に記載されている。尚、得られたＣＴＬは、細胞培養により増幅可能であり、また、継代することによりＣＴＬ株化細胞（ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ）あるいはＣＴＬ細胞株に形質転換できる。その具体例は、実験例１（２）に記載されている。
（４）前記（１）のペプチドをコードするＤＮＡ分子
該ＤＮＡ分子は、配列番号１及び／又は２に記載のアミノ酸配列に基づき合成することができる。また、これに相補的なＲＮＡ分子も合成できる。これ等の核酸分子は、免疫学的遺伝子治療剤の有効成分として有用である。例えば、ＤＮＡ分子は発現ベクターにより、また、ＲＮＡ分子はｍＲＮＡやＲＮＡｉとして、これ等を生体細胞内に移入し発現させ、該生体内で前記（１）のペプチドを生産させることができる。
（５）免疫療法剤としての投与量
この発明に係る合成ペプチド、抗原、核酸分子、及び発現ベクターは、免疫を奏する量、例えば、１０ｎｇから１００μg／ドーズにて用いる。
免疫担当細胞であるＤＣ、抗原で感作した（刺激済みの）抗原提示細胞、及びＣＴＬは、免疫を奏する量、例えば、１０３から１０８細胞／ドーズにて用いる。尚、これ等の免疫担当細胞、いわゆるエフェクター細胞の投与では、標的細胞である癌細胞ないしは腫瘍細胞に対する量的相関、即ち、エフェクター細胞数／標的細胞数の比率（Ｅ／Ｔ比）を考慮する必要がある。Ｅ／Ｔ比は、増加させるに伴い、細胞性免疫能あるいは癌細胞障害能が高まるが、かかる効果はいずれプラトーに達することが知られているので、１から２００の範囲が望ましい。
（６）免疫療法剤の性状と形態
この発明に係る合成ペプチド、抗原、核酸分子、及び発現ベクターは、アンプルやバイアル瓶に分注かつ密封され、液状や乾燥等の形態で提供される。
また、この発明に係る細胞、即ち、ＤＣ、感作ＤＣ、及びＣＴＬは、アンプルやバイアル瓶に分注かつ密封され、−６０℃以下で凍結保存された形態で提供される。
更に、この発明に係る合成ペプチド、及び抗原は、未感作ＤＣとのキットの形態で提供することができる。
【０００９】
以下、参考例、実験例及び実施例を上げ、本発明の構成と効果を具体的に説明する。但し、この発明は、これ等の参考例、実験例及び実施例だけに限定されるわけではない。
（参考例１）
【００１０】
（１）細胞株
Ｂ細胞株ＡＲＨ−７７（ＨＬＡ−Ａ２＋, Ａ２４−）、乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ＨＬＡ−Ａ２＋,
Ａ２４−）、慢性骨髄性白血病細胞株Ｋ５６２（ＨＬＡ−Ａ２−，Ａ２４−） はそれぞれ、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（米国ＭＡ）から入手した。ＥＢＶ−ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ
Ｂ細胞株ＹＮ（ＨＬＡ−Ａ２＋，Ａ２４＋）は西岡（徳島大学）から供与された。肺癌細胞株Ａ５４９（ＨＬＡ−Ａ２− ，Ａ２４−）とＳＢＣ−５（ＨＬＡ−Ａ２＋，Ａ２４−）はヒューマンサイエンス研究資源バンク（大阪府）から入手した。全ての細胞株は１０％（容量）ｆｅｔａｌ
ｃａｌｆ ｓｅｒｕｍ（ＦＣＳ）を含むＲＰＭＩ１６４０培地（Ｓｉｇｍａ米国製）にて培養した。
（実験例１）
【００１１】
（１）末梢血単核細胞からの樹状細胞の誘導
既報の方法により血液由来の樹状細胞を誘導した。即ち、健常人ドナーのヘパリン加末梢血からＦｉｃｏｌｌ／Ｐａｑｕｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｕｐｐｓａｌａ， Ｓｗｅｄｅｎ）比重遠心法を用いて末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を分離した。ＰＢＭＣからプラスチック付着法により単球を得た。付着した単球は１０％（容量）ＦＣＳと２５０ Ｕ／ｍＬのｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ （ＩＬ）−４（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）、及び５００ Ｕ／ｍｌのｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ（ＧＭ−ＣＳＦ， Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）を含むＲＰＭＩ１６４０培地にて培養した。培養４日目には、培養液をＩＬ−４とＧＭ−ＣＳＦを含む培養液で半量交換した。培養６日目に非付着細胞を回収し、洗浄後、ＩＬ−４、ＧＭ−ＣＳＦ及び５０ Ｕ／ｍｌのｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ （ＴＮＦ）−α（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を含む培養液で２４時間培養した。培養７日目に細胞を回収し、抗原刺激用の単球由来樹状細胞として使用した。ＣＤ８３、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ４０及びＨＬＡ−ＤＲの発現をフローサイトメトリーにて測定することにより、成熟樹状細胞を確認した。
尚、実施例２で後述される通り、多発性骨髄腫患者における細胞性免疫能の検討に際しては、自家末梢血幹細胞移植の目的で採取・凍結保存された末梢血幹細胞分画を融解して用い、同様の実験を行った。
【００１２】
（２）ペプチド特異的細胞傷害Ｔ細胞の誘導
ペプチド特異的細胞傷害Ｔ細胞（ＣＴＬ）は既報の方法の変法により誘導した。即ち、同一ドナーよりＭＡＣＳ ＣＤ８ Ｍｉｃｒｏｂｅａｄｓ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）を用いてＣＤ８＋Ｔ細胞を分離した。樹状細胞を各ペプチド１０μｇ／ｍｌで３７°Ｃにおいて４時間刺激した後、洗浄し、放射線照射した（２５Ｇｙ）。ＣＤ８＋細胞（１ｘ１０６ ） をペプチド処理した自己の樹状細胞（１ｘ１０５）と共に、１０％（容量）ｈｅａｔ−ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ ｈｕｍａｎ ＡＢ ｔｙｐｅ ｓｅｒｕｍと５ｎｇ／ｍｌのｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ＩＬ−７（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を含むＲＰＭＩ１６４０ 培地にて２４−ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅで培養した。ＣＤ８＋細胞をペプチド処理した自己の樹状細胞で毎週刺激し、刺激後１０ Ｕ／ｍＬの ＩＬ−２（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ，Ｒｏｃｋｙ Ｈｉｌｌ， ＮＪ）を添加した。２−３日ごとに１０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２を含む培養液で半量交換した。３回目の刺激後５日目（１９日目）に、同一のペプチド処理をした標的細胞に対するこれらの細胞の傷害活性を測定した。
【００１３】
（３）ＣＴＬの増幅法と株化ＣＴＬ
更に詳細な検討のために十分量のＣＴＬを得る目的で、既報の方法によりＣＴＬを増幅した。即ち、５ｘ１０４個のＣＴＬを刺激細胞としての５ｘ１０６自己ｉｒｒａｄｉａｔｅｄ（３０Ｇｙ） ｐｅｐｔｉｄｅ−ｐｕｌｓｅｄ ＰＢＭＣとｆｅｅｄｅｒ細胞としての１ｘ１０６ ｉｒｒａｄｉａｔｅｄ（３０Ｇｙ）ＥＢＶ−ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ＹＮ細胞と共に５ｍｌのｃｏｍｐｌｅｔｅ ｍｅｄｉｕｍにて培養した。培養１日目に、１２０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２を添加した。３日ごとに５０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２を含む培養液で交換した。２週間後、増殖した細胞を回収しＣＴＬ株として使用した。
【００１４】
（４）フローサイトメトリー（腫瘍抗原の検出）
細胞表面マーカーはＦＩＴＣ標識抗体を用いてフローサイトメトリー（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）にて解析した。樹状細胞用にはａｎｔｉ−ＣＤ８０、ａｎｔｉ−ＣＤ８６、ａｎｔｉ−ＣＤ４０、ａｎｔｉ−ＣＤ８３及びａｎｔｉ−ＨＬＡ−ＤＲ（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を、細胞株やＰＢＭＣのＨＬＡ−Ａ ｔｙｐｉｎｇにはａｎｔｉ−ＨＬＡ−Ａ２及びａｎｔｉ−ＨＬＡ−Ａ２
２４（ＵＳ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ，Ｓｗａｍｐｓｃｏｔｔ，ＭＡ）を、標的細胞のＨＭ１．２４発現の検出にはａｎｔｉ−ＨＭ１．２４抗体をそれぞれ用いた。
【００１５】
（５）インターフェロンγの測定（誘導されたＣＴＬ検出）
各ＣＴＬの培養上清を２回目の刺激後（ＣＴＬ誘導開始９日目）、３回目の刺激後（ＣＴＬ誘導開始１６日目）及び細胞傷害試験時（ＣＴＬ誘導開始１９日目）にそれぞれ回収した。インターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）の濃度はｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ）ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）により測定した。各実験は２回ずつ行われた。ＣＴＬ株によるＩＦＮγの産生量はＥＬＩＳＰＯＴ ａｓｓａｙ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）により測定した。１ｘ１０４のＣＴＬを１ｘ１０４の標的細胞とともに抗ＩＦＮγ抗体でコートしたＥＬＩＳＰＯＴ ｐｌａｔｅで２４時間培養し，使用の手引きに従いスポットを検出した。
【００１６】
（６）細胞傷害試験（ＣＴＬ活性の測定）
ＣＴＬの標的細胞に対する細胞傷害は、既報の方法により測定した。標的細胞を１００μＣｉの５１Ｃｒで３７°Ｃ、１時間培養した後、２回洗浄し、１０％（容量）ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０ｍｅｄｉｕｍで培養した。ペプチド処理標的細胞は１０μｇ／ｍｌのペプチドを添加し、３７°Ｃで一晩培養し作成した。ＣＴＬを９６−ｗｅｌｌ ｒｏｕｎｄ−ｂｏｔｔｏｍｅｄ ｐｌａｔｅに６ｘ１０４ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌにて分注した。次に標識した標的細胞を各ウェルに ３ｘ１０３ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌにて加えた。４時間の培養後、培養液中に遊離した５１Ｃｒをａｕｔｏｍａｔｅｄ ｇａｍｍａ ｃｏｕｎｔｅｒで計測した。特異細胞傷害活性は以下の式に基づき算出した：［（ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ ５１Ｃｒ−ｒｅｌｅａｓｅ−ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ ５１Ｃｒ−ｒｅｌｅａｓｅ）／（ｍａｘｉｍｕｍ ５１Ｃｒ−ｒｅｌｅａｓｅ−ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ ５１Ｃｒ−ｒｅｌｅａｓｅ）］ｘ１００。Ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ ５１Ｃｒ−ｒｅｌｅａｓｅには、ＣＴＬを加えない標識標的細胞を用いた。Ｍａｘｉｍｕｍ ５１Ｃｒ−ｒｅｌｅａｓｅには、標的細胞を５％（重量）Ｔｒｉｏｎ Ｘ−１００を含むｍｅｄｉｕｍにて培養した。全ての実験は２回ずつ行われた。
【００１７】
（７）ＣＴＬの阻害実験（ＣＴＬのＨＬＡ拘束性と抗原特異性の検定）
ＣＴＬ株の特異性はｃｏｌｄ ｔａｒｇｅｔ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ａｓｓａｙにて確認した。簡潔に言えば、５１Ｃｒ標識標的細胞 （３ｘ１０３ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ） とＣＴＬ （６ｘ１０４ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）を非標識標的細胞（６ｘ１０４ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）と共に９６−ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅにて培養した。ペプチド処理あるいは未処理のＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を非標識標的細胞として用いた。細胞傷害試験は前述のように行った。細胞傷害活性がＨＬＡ ｃｌａｓｓＩ拘束性か否かについて調べるため，標的細胞を細胞傷害試験の前に１０ μｇ／ｍｌの抗ＨＬＡ ｃｌａｓｓＩ抗体（ｗ６／３２，Ｄａｋｏ，Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ， ＣＡ）又はコントロールマウスＩｇＧ（ＵＰＣ−１０，Ｃａｐｐｅｌ，Ｍａｌｖｅｒｎ，ＰＡ） にて４５分間室温で培養した。その他の実験としては、ＣＴＬを加える前に標的細胞をＨＭ１．２４蛋白の細胞外エピトープのアミノ酸残基１１６−１２７を認識する抗ＨＭ１．２４抗体と室温で４５分間反応させ、細胞傷害試験に及ぼす影響につき検討した。
【実施例１】
【００１８】
（１）ペプチドのアミノ酸配列の選定と合成
Ｔ細胞認識エピトープを予測する２つのコンピューターソフトウエア Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ＆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｅｃｔｉｏｎ（ＢＩＭＡＳ， ｈｔｔｐ：／／ｂｉｍａｓ．ｄｃｒｔ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）とＳＹＦＰＥＩＴＨＩ（Ｔｂｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ，ｈｔｔｐ：／／ｓｙｆｐｅｉｔｈｉ．ｂｍｉ−ｈ
ｂｍｉ−ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ．ｃｏｍ） を用いてＨＭ１．２４蛋白の塩基配列を解析した。結合定数に基づき、ＨＬＡ−Ａ２４と結合する９個のアミノ酸からなるペプチドを３種類と、ＨＬＡ−Ａ２と結合するペプチド１種類を決定した。ＭＡＧＥ−３のアミノ酸残基１９５−２０３はＨＬＡ−Ａ２４と結合し細胞傷害Ｔ細胞を誘導することが知られているため、陽性コントロールとして用いた。
上記ペプチドの各アミノ酸配列と結合定数との相関を表１に示す。ＨＬＡ結合定数は２つのコンピュータープログラム（ＢＩＭＡＳとＳＹＦＰＥＩＴＨＩ）により推測した。各ペプチドの結合定数はＨＬＡ−Ａ２やＨＬＡ−Ａ２４分子との解離の半減時間や結合力を表す。
ペプチド合成は、自動ペプチド合成装置（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｔｕｃｏｎ，ＡＺ）を用い、固相法により９０％以上の純度で行った。ＨＭ１．２４−１２６、ＨＭ１．２４−１３６及びＨＭ１．２４−１５２はｍｉｌｌｉＱ水に、ＨＭ１．２４−１６５とＭＡＧＥ−３−１９５はｄｉｍｅｔｈｙｌ ｓｕｌｆｏｘｉｄｅに、それぞれ１ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解し、使用まで−８０°Ｃにて保存した。
【実施例２】
【００１９】
（１）腫瘍細胞におけるＨＭ１．２４の発現
参考例１に記載の各種腫瘍細胞がＨＭ１．２４に特異的なＣＴＬの標的となり得るか否かにつき調べるため、ＨＭ１．２４発現につき、フローサイトメトリー［実験例１（４）に記載］にて測定した。即ち、細胞をＦＩＴＣ標識マウスＩｇＧ（点線）又はＦＩＴＣ標識抗ＨＭ１．２４抗体（実線）にて染色後、発現量をフローサイトメトリーにて解析した。
その結果を図１に示す。ＡＲＨ−７７、ＹＮ及びＳＢＣ−５細胞は細胞表面ＨＭ１．２４を高発現していた。しかし、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１とＫ５６２細胞は共にＨＭ１．２４発現が低く、Ａ５４９にはＨＭ１．２４の発現が見られなかった。
【００２０】
（２）ペプチド処理樹状細胞によるＨＭ１．２４に特異的なＣＴＬの誘導
ペプチド処理樹状細胞により刺激されたＣＤ８＋細胞の上清を誘導開始から９日目、１６日目、及び１９日目にそれぞれ回収し、ＩＦＮγの産生量を測定［実験例１（５）に記載］することにより，ＨＭ１．２４特異的ＣＴＬの誘導効果について評価した。ドナー＃４３（ＨＬＡ−Ａ２−， Ａ２４＋）のＨＭ１．２４−１６５ペプチドによるＣＴＬにおいて、ＩＦＮγの産生量は９日目（８００ｐｇ／ｍｌ）や１９日目（１１００ｐｇ／ｍｌ）と比較し、１６日目において最大値を示した（１６００ｐｇ／ｍＬ）。ＨＭ１．２４−１２６やＭＡＧＥ−３−１９５ペプチドによっても１６日目におけるＩＦＮγが最高値であった。よって、以下の実験ではＩＦＮγ濃度は１６日目においてのみ測定した。４名のＨＬＡ−Ａ２＋，Ａ２４＋ドナーのうち、ＨＭ１．２４−１２６とＨＭ１．２４−１６５、陽性コントロールＭＡＧＥ−３−１９５ペプチド刺激により、２名がＣＤ８＋細胞上清中のＩＦＮγ高値を示した。しかし、これ等のドナーにおいては、ＨＭ１．２４−１３６とＨＭ１．２４−１５２ペプチドによるＣＤ８＋細胞のＩＦＮγ産生は見られなかった。
更に、これ等のペプチドによるＣＴＬ誘導作用を明らかにするため、合計２０名のドナーから樹状細胞を誘導し［実験例１（１）に記載］、ペプチドで処理した後に自己のＣＤ８＋Ｔ細胞を刺激した［実験例１（２）に記載］。３回の刺激後、同一ペプチドで処理したＹＮ細胞を標的とした細胞傷害活性を測定した［実験例１（６）に記載］。即ち、健常人２０名より分離したＣＤ８＋細胞をペプチド刺激樹状細胞で刺激し、１９日目にペプチド処理したＹＮ細胞に対するＣＴＬ活性を測定した。細胞傷害活性は４時間、５１Ｃｒ−ｒｅｌｅａｓｅ ａｓｓａｙ （Ｅ／Ｔ比２０）にて測定した。
その結果を表２に示す。尚、各ＣＴＬ活性（％）は、ペプチド処理樹状細胞によるＣＴＬペプチド活性測定値から、ペプチド未処理樹状細胞によるＣＴＬ活性測定値を差し引いた値で示し、１０％以上の細胞傷害を有意なＣＴＬ活性と見なした。
ＨＭ１．２４−１３６とＨＭ１．２４−１５２の各ペプチドによる特異的ＣＴＬの誘導は、合計２０例中、それぞれ１例と２例であった。
これに対し、ＨＭ１．２４−１２６ペプチドによる特異的ＣＴＬの誘導は、ＨＬＡ−Ａ２ドナー７例のうち４例、ＨＬＡ−Ａ２４ドナーは１５例中、４例であった。
ＨＭ１．２４−１６５ペプチドによる特異的ＣＴＬの誘導も同様にＨＬＡ−Ａ２ドナー７例のうち４例、ＨＬＡ−Ａ２４ドナーは１５例中、７例であった。
以上の結果に基づき、ＨＭ１．２４−１２６とＨＭ１．２４−１６５の両ぺプチドは、ＨＬＡ−Ａ２又はＨＬＡ−Ａ２４を保有のヒトに対するＣＴＬ誘導能を有していると判定された。また、その程度は、これ等のペプチドのＨＬＡ−Ａ２４結合定数（表１参照）に一致し、ＨＬＡ−Ａ２−，２４＋ドナーに対するＨＭ１．２４−１６５とＭＡＧＥ−３−１９５のＣＴＬ誘導能は、ＨＭ１．２４−１２６のそれよりも優れていた。一方、ペプチド処理を行っていないＹＮ細胞に対しては、ＨＭ１．２４に特異的なＣＴＬの細胞傷害活活性が検出されなかったので、これ等のＣＴＬは標的細胞上の外因性ペプチドを認識することが示唆された。
【００２１】
（３）誘導されたＣＴＬの抗原認識特異性（誘導ペプチドとＨＬＡに対する特異性）
ＨＭ１．２４ペプチドやＭＡＧＥ−３−１９５ペプチドで処理したＹＮ細胞を標的とし、誘導されたＣＴＬの抗原認識特異性［実験例１（７）に記載］につき更に検討した。即ち、ＨＭ１．２４由来ペプチドやＭＡＧＥ−３−１９５で処理したＹＮ細胞を標的とし、ＣＴＬのペプチド特異性につき検討した。ドナー＃４２（ＨＬＡ−Ａ２＋，Ａ２４−）においてＨＭ１．２４−１２６（Ａ）やＨＭ１．２４−１６５（Ｂ）により誘導されたＣＴＬ活性を測定した（Ｅ／Ｔ比２０）。
その結果を図２に示す。ＨＭ１．２４−１２６とＨＭ１．２４−１６５により誘導されたＣＴＬは、それぞれ同一のペプチド処理されたＹＮ細胞に対し有意に反応を示した。しかし、他のＨＭ１．２４ペプチドで処理されたＹＮ細胞には反応しなかった。
ＨＭ１．２４−１２６、ＨＭ１．２４−１６５及びＭＡＧＥ−３−１９５で誘導した３例のＣＴＬにつき、ＨＬＡ−Ａの型が異なる標的細胞を用い、ＨＬＡ拘束性について検討した。即ち、異なるＨＬＡ型の３名のドナーより誘導したＣＴＬにおいて、ＡＲＨ−７７（ＨＬＡ−Ａ２＋，Ａ２４−）とペプチド処理したＹＮ細胞（ＨＬＡ−Ａ２＋，Ａ２４＋）に対する細胞傷害活性を比較した。細胞傷害活性は４時間 ５１Ｃｒ−ｒｅｌｅａｓｅ ａｓｓａｙ（Ｅ／Ｔ比２０）にて測定した。
その結果を図３に示す。ドナー＃２５（ＨＬＡ−Ａ２＋，Ａ２４＋）のＣＴＬはＡＲＨ−７７（ＨＬＡ−Ａ２＋，Ａ２４−）とペプチド処理したＹＮ細胞（ＨＬＡ−Ａ２＋，Ａ２４＋）の両者に反応した。ドナー＃１１（ＨＬＡ−Ａ２−，Ａ２４＋）のＣＴＬはＹＮ細胞に反応したがＡＲＨ−７７には反応しなかった。一方，ドナー＃２４（ＨＬＡ−Ａ２−，Ａ２４−）のＣＴＬはいずれの標的細胞にも反応しなかった。この結果から、誘導されたＣＴＬは、ＨＬＡ一致の標的細胞だけを傷害することが示唆された。
【００２２】
（４）ＣＴＬ株によるＨＭ１．２４発現腫瘍細胞の認識
ＨＭ１．２４ペプチドで誘導したＣＴＬにつき、更に詳細な検討を加えるため、ドナー＃４２（ＨＬＡ−Ａ２＋，Ａ２４−）の初代ＣＴＬから、ＨＭ１．２４−１２６、ＨＭ１．２４−１５２あるいはＨＭ１．２４−１６５を認識するＣＴＬ株を樹立した［実験例１（３）に記載］。即ち、ＨＭ１．２４特異的ＣＴＬ株のヒト腫瘍細胞に対する細胞傷害活性ドナー＃４２（ＨＬＡ−Ａ２＋，Ａ２４−）よりＣＤ８＋細胞を分離し、３種類のＨＭ１．２４ペプチド刺激樹状細胞で刺激した後、ＣＴＬ株を樹立した。
自然発現しているヒト癌細胞のＨＭ１．２４ペプチドをＣＴＬ株が認識するか否かにつき明らかにするため、ＣＴＬ株をＨＭ１．２４発現量の異なるＨＬＡ−Ａ２＋腫瘍細胞と反応させた。ＣＴＬ株による腫瘍細胞の認識はＩＦＮγのＥＬＩＳＰＯＴアッセイ［実験例１（５）に記載］により評価した。即ち、各ＣＴＬ（１ｘ１０４）を標的細胞（１ｘ１０４）と２４時間反応させた後、ＥＬＩＳＰＯＴ ａｓｓａｙによりＩＦＮγの産生を測定した。
その結果を図４（ａ）に示す。ＨＭ１．２４を強く発現しているＡＲＨ−７７と反応し、ＩＦＮγ産生細胞の増加が認められた。一方、ＨＭ１．２４を弱く発現しているＭＤＡ−ＭＢ−２３１に対しては、ＩＦＮγ産生は少量であったため、ＣＴＬ株による認識はＨＭ１．２４発現量に依存していることが示唆された。
次に、ＨＭ１．２４発現量が異なる腫瘍細胞に対するＣＴＬ株の細胞傷害について検討した。即ち、異なるＨＭ１．２４量を発現した腫瘍細胞に対するＣＴＬ株の細胞傷害活性を４時間、５１Ｃｒ−ｒｅｌｅａｓｅ ａｓｓａｙ（Ｅ／Ｔ比２０）にて測定した。
その結果を図４（ｂ）に示す。これ等のＨＭ１．２４に特異的なＣＴＬ株は、ＨＭ１．２４を発現しているＨＬＡ−Ａ２＋細胞、即ち、ＡＲＨ−７７、ＹＮ、ＳＢＣ−５及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１を傷害した。これ等ＣＴＬの細胞傷害活性はＩＦＮγ産生の結果と同様に，標的細胞のＨＭ１．２４発現量と相関していた。ＮＫ感受性でＨＬＡ−Ａ２−のＫ５６２細胞に対する傷害活性は認めなかったため、細胞傷害は非特異的ＮＫ活性にはよらないことが示唆された。
尚、図４（ｃ）に示す通り、ＣＴＬ株のＡＲＨ−７７細胞に対する細胞傷害活性はＥ／Ｔ比に比例ないしは依存していた。
【００２３】
（５）ＣＴＬ株のＨＬＡ拘束性と抗原特異性
ＣＴＬ株による細胞傷害がＨＬＡ拘束性によるか否かにつき調べるため、ＣＴＬによるＨＬＡクラスＩの認識過程を抗ＨＬＡクラスＩ抗体により阻害した［実験例１（７）に記載］。即ち、ドナー＃４２からＨＭ１．２４−１６５を用いて誘導したＣＴＬ株の細胞傷害活性を抗ＨＬＡクラスＩ抗体の存在下で測定した。標的細胞であるＡＲＨ−７７又はＹＮ細胞を抗ＨＬＡクラスＩ抗体で室温４５分間培養した後，ＣＴＬ株と反応させ、４時間、５１Ｃｒ−ｒｅｌｅａｓｅ ａｓｓａｙ（Ｅ／Ｔ比２０）にて細胞傷害活性を測定した。
その結果を図５に示す。ＨＭ１．２４−１６５により誘導されたＣＴＬ株のＡＲＨ−７７に対する認識は抗ＨＬＡクラスＩ抗体により抑制されたため、この細胞傷害活性はＨＬＡクラスＩ拘束性であることが示唆された。
更に、ＣＴＬ株のペプチド特異性につき、ｃｏｌｄ ｔａｒｇｅｔ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ａｓｓａｙ［実験例１（７）に記載］により検討した。即ち、ＨＭ１．２４−１６５誘導ＣＴＬ株（６ｘ１０４ ｃｅｌｌｓ）のＡＲＨ−７７（３ｘ１０３ ｃｅｌｌｓ）に対する細胞傷害活性につき、ＨＭ１．２４−１６５ペプチド処理や未処理の陰性コントロールＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞（６ｘ１０４ ｃｅｌｌｓ）の存在下で測定した。
その結果を図６に示す。ＨＭ１．２４−１６５により誘導されたＣＴＬ株によるＡＲＨ−７７の認識は，同一のペプチド処理をした陰性コントロールのＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞により顕著に抑制された。
【実施例３】
【００２４】
（１）多発性骨髄腫患者におけるＣＴＬの誘導
実施例１に記載の健常者例と全く同様にして、多発性骨髄腫患者におけるＣＴＬの誘導につき、検討した。即ち、多発性骨髄腫患者８例（ＨＬＡ−Ａ２＋又はＨＬＡ−Ａ２４＋）の末梢血幹細胞分画を用い，実験例１（１）の記載と同様にして、成熟樹状細胞の誘導を行った。その結果、全例において該誘導が可能であった。
更に、末梢血幹細胞分画のＣＤ８＋細胞を各ＨＭ１．２４ペプチドで処理した自己の樹状細胞で刺激し、特異的ＣＴＬの誘導につき検討した。即ち、多発性骨髄腫患者８例の末梢血幹細胞採取分画より樹状細胞を誘導し、各ペプチド処理した後、末梢血幹細胞採取分画の自己ＣＤ８＋細胞と培養することにより、ペプチド特異的ＣＴＬを誘導した。ＣＴＬの誘導はＧｒａｎｚｙｍｅ Ｂ ＥＬＩＳＰＯＴ ａｓｓａｙにより検討した。
その結果を表３に示す。ＨＭ１．２４−１２６ペプチドによる特異的ＣＴＬの誘導はＨＬＡ−Ａ２＋患者５例のうち４例、また、ＨＭ１．２４−１６５ペプチドによる上記誘導はＨＬＡ−Ａ２４＋患者６例中、２例であった。他のＨＭ１．２４−１５２やＭＡＧＥ−３−１９５によるＣＴＬ誘導は各１例しか認めず、ＨＭ１．２４−１３６によるＣＴＬ誘導は認められなかった。
以上の結果に基づき、多発性骨髄腫患者の末梢血中にはＨＭ１．２４特異的ＣＴＬ前駆細胞が存在していることが明らかになった。更に、末梢血幹細胞採取分画より樹状細胞の誘導が可能であり、ＨＭ１．２４−１２６やＨＭ１．２４−１６５ペプチドを用いることによりＨＭ１．２４に特異的なＣＴＬの誘導も可能であったことから、自家末梢血幹細胞移植後に、余剰の採取分画を用いたＨＭ１．２４ペプチド樹状細胞療法の臨床応用の可能性が示唆された。
【実施例４】
【００２５】
（１）前臨床試験（動物試験による安全性と有効性の確認）
生体内におけるＨＭ１．２４由来ペプチドの効果を検討するには、ＳＣＩＤ（重症複合免疫不全）マウスを用いたヒト癌細胞移植モデルを使用することができる。即ち、該ＳＣＩＤマウスにヒト由来の腫瘍細胞を移植した後、配列番号１及び２に記載のアミノ酸配列からなる各ペプチド並びに両者の混合により活性化した細胞傷害性Ｔリンパ球を作製の後、該リンパ球を上記ＳＣＩＤマウスに輸注し、移植腫瘍の縮小・消失を観察することにより、生体における上記ペプチドの免疫療法剤としての安全性と有効性・抗腫瘍効果を確認することができる。
【００２６】
【表１】
【００２７】
【表２】
【００２８】
【表３】
【産業上の利用可能性】
【００２９】
この発明は、多発性骨髄腫、白血病、悪性リンパ腫等の造血器悪性腫瘍、更に、肺癌、乳癌等の固形癌等の治療、転移、及び再発防止のための免疫療法剤や癌ワクチンを製造、検定、販売、仲介及び特殊輸送する産業分野、及び臨床検査の分野で利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】腫瘍細胞におけるＨＭ１．２４発現のフローサイトメトリー解析の結果を示す図。
【図２】ＨＭ１．２４ペプチド誘導ＣＴＬのペプチド特異性を示す図。
【図３】ＨＭ１．２４ペプチド誘導ＣＴＬのＨＬＡ拘束性を示す図。
【図４】ＨＭ１．２４ペプチド特異的ＣＴＬ株のヒト腫瘍細胞に対する細胞傷害活性を示す図。
【図５】ＨＭ１．２４ペプチド誘導ＣＴＬ株のＨＬＡ拘束性を示す図。
【図６】ＨＭ１．２４ペプチド誘導ＣＴＬ株の該誘導ペプチド特異性を示す図。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１及び／又は２に記載のアミノ酸配列からなるペプチド。
【請求項２】
請求項１に記載のアミノ酸配列を有する抗原。
【請求項３】
請求項１に記載のペプチド又は請求項２に記載の抗原により誘導される抗原提示細胞。
【請求項４】
請求項１記載のペプチド、請求項２記載の抗原、又は請求項３記載の抗原提示細胞により誘導される細胞傷害性Ｔリンパ球。
【請求項５】
癌細胞を免疫系により死滅させる量の請求項１記載のペプチド、請求項２記載の抗原、請求項３記載の抗原提示細胞、又は請求項４記載の細胞傷害性Ｔリンパ球を含有することを特徴とする癌の免疫療法剤。
【請求項６】
癌細胞が多発性骨髄腫、白血病、悪性リンパ腫、又は肺癌に由来の細胞である請求項５に記載の癌の免疫療法剤。
【請求項７】
請求項１に記載のペプチドをコードするＤＮＡ分子。
【請求項１】
配列番号１及び／又は２に記載のアミノ酸配列からなるペプチド。
【請求項２】
請求項１に記載のアミノ酸配列を有する抗原。
【請求項３】
請求項１に記載のペプチド又は請求項２に記載の抗原により誘導される抗原提示細胞。
【請求項４】
請求項１記載のペプチド、請求項２記載の抗原、又は請求項３記載の抗原提示細胞により誘導される細胞傷害性Ｔリンパ球。
【請求項５】
癌細胞を免疫系により死滅させる量の請求項１記載のペプチド、請求項２記載の抗原、請求項３記載の抗原提示細胞、又は請求項４記載の細胞傷害性Ｔリンパ球を含有することを特徴とする癌の免疫療法剤。
【請求項６】
癌細胞が多発性骨髄腫、白血病、悪性リンパ腫、又は肺癌に由来の細胞である請求項５に記載の癌の免疫療法剤。
【請求項７】
請求項１に記載のペプチドをコードするＤＮＡ分子。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２００６−１４１２０８（Ｐ２００６−１４１２０８Ａ）
【公開日】平成１８年６月８日（２００６．６．８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−３３１５６９（Ｐ２００４−３３１５６９）
【出願日】平成１６年１１月１６日（２００４．１１．１６）
【出願人】（３０４０２０２９２）国立大学法人徳島大学 (307)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年６月８日（２００６．６．８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年１１月１６日（２００４．１１．１６）
【出願人】（３０４０２０２９２）国立大学法人徳島大学 (307)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]