多重化ＦＲＥＴ解析により試料中の検体を検出する方法及びキット
本発明は、多重化ＦＲＥＴ（Forster Resonance Energy Transfer）解析により試料中の検体を検出するための方法に関し、この方法は、エネルギー移動ドナー、スペクトル的に異なる複数の量子ドット種、及び検体を含む試料を提供するステップであって、上記検体は、上記エネルギー移動ドナーと第１の量子ドット種とにより提供される第１のエネルギー移動ドナー−アクセプターの組におけるエネルギー移動を仲介するように構成されており、上記エネルギー移動ドナーは、上記第１のエネルギー移動ドナー−アクセプターの組においてエネルギー移動ドナーとして作用するように構成されており、かつ、上記第１の量子ドット種は、上記第１のエネルギー移動ドナー−アクセプターの組においてエネルギー移動アクセプターとして作用するように構成されている、ステップと、上記試料に対し励起光源から励起光を照射するステップと、上記第１のエネルギー移動ドナー−アクセプターの組において、上記励起光により励起された上記エネルギー移動ドナーから上記第１の量子ドット種へと励起エネルギーが移動するステップであって、当該エネルギー移動が上記検体によって仲介されるステップと、上記励起エネルギーを受け取った後に上記第１の量子ドット種により放射された発光を検出するステップとを含む。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、多重化ＦＲＥＴ（Forster Resonance Energy Transfer）解析により試料中の検体を検出する方法、及び多重化ＦＲＥＴ解析において１つ以上の検体を検出するキットに関する。
【０００２】
〔本発明の背景〕
ＦＲＥＴ（Forster Resonance Energy Transfer）の理論は、励起されたドナー（Ｄ）からアクセプター分子（Ａ）への１／ｒ６距離依存的な、非発光のエネルギー移動を規定する。容易に利用できる分光学的データと理論上の式との間の関係は、テオドール・フェルスター（Theodor Forster）の成果であり、したがって全ての種類の自然科学における多様なＦＲＥＴの適用の可能性を可能にする。ＦＲＥＴの理論の詳細は周知である。
【０００３】
広く適応したＦＲＥＴ適用の分光学的性質の本質は、いわゆるフェルスター半径（Forster Radius）Ｒ０、つまりエネルギー移動が５０％効率のときのＤとＡとの間の距離である。Ｒ０は、ドナー発光及びアクセプター吸収のスペクトルデータから計算することができ、これらは両方とも測定が容易である。これは主に、ドナーの発光スペクトル及びアクセプターの吸収スペクトルの重複、ならびにドナーの発光量子収量（吸収された光量子に対する発光された光量子の割合）に依存する。Ｒ０が大きいほど、距離が固定されている場合にはＦＲＥＴがより効率的であり、ＦＲＥＴ効率が固定されている場合にはＤ−Ａ距離が大きい。
【０００４】
ＦＲＥＴは、１〜１０ｎｍのスケールにおいて生化学的用途に使用されている（K. E. Sapsford et al., Angew. Chem. Int. Ed., 45, 4562, 2006）（例えばタンパク質−タンパク質結合、タンパク質折り畳み、細胞膜における分子間相互作用及び細胞膜内の分子間相互作用、ＤＮＡハイブリダイゼーション及びシークエンシング、抗原及び抗体の免疫反応）。このようなＦＲＥＴ測定の結果は、約１〜２０ｎｍの距離又は特定の物質の濃度である。ＦＲＥＴは、無数のＤｓ及びＡｓを含む溶液中の時間分解発光技術によって解析し得るため、このナノスケールの方法が巨視的な分野のために利用可能となり得る。さらに、共焦点顕微鏡技術は、全体にわたって平均化するよりむしろパラメータ分布を測定するために、単一分子レベルでＦＲＥＴを解析することができる。
【０００５】
これまでは、一般に使用されるＤ−Ａの組におけるＲ０値は、６ｎｍよりも大きくなることはめったにない（２７３個のＦＲＥＴの組のうち、６〜７ｎｍのＲ０を有するのはたった４つである（B. W. Van der Meer et al., Resoncance Energy Transfer: Theory and Data, Wiley-VCH, New York））。生化学的なＦＲＥＴ適用においてドナーとしてのランタニド複合体（ＬＣｓ）及びアクセプターとしての量子ドットを組み合わせた場合、１０ｎｍより大きいフェルスター半径が見られる。このように、通常の限界である１０ｎｍを破ることは可能である。ＬＣｓに関してはＦＲＥＴは比較的よく理解されている（P. R. Selvin, Ann. Rev. Biophys. Biomol. Struct., 31, 275, 2002）が、ＱＤに基づくＦＲＥＴ（特にＡｓとしてのＱＤｓについて）については深く理解されていない。
【０００６】
量子ドット（ＱＤｓ）は、よく特徴づけられかつ確立された、独特の光学的性質及び光物理学的性質を有するナノ粒子（特にＣｄＳｅ／ＺｎＳコア／シェルドット）である。ＱＤｓは、より大きなバンドギャップの半導体からなる保護シェルによってたいてい被覆されているナノメートルサイズの半導体材料のコア、ならびに水溶解性及び生体適合性のための外部の被覆シェルによって構成される。半導体材料であること、及びナノ結晶サイズであることによって（I. L. Medintz et al., Nat. Mater., 4, 435, 2005）、その吸収及び発光特性は、ＵＶから近赤外までのほとんど全てのスペクトル領域に対応することができる。ＱＤｓは、極めて大きい１つ及び２つの光量子吸収断面、励起及び発光の間のスペクトルの大きな乖離の可能性、ならびに狭い発光バンドを表す。ＱＤｓはまた、商業的に入手可能である（例えばＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｅｖｉｄｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。
【０００７】
ＱＤｓは、しばしば高い発光量子収量を表し、また有機色素よりも光退色に対しずっと耐性である（X. Y. Wu, Nat. Biotechnol. 2003, 21, 41）。さらに、多くのＤｓ又はＡｓは、単一のＱＤの大きな表面に付着し得るため、全体の効率が増加する複数分子のＦＲＥＴを可能にする。
【０００８】
ＱＤｓは、Ｄｓとしての一般的な有機フルオロフォアと組み合わされる場合には、おそらくこれらのフルオロフォアの寿命の短い励起状態（ｎｓ）により、効率的なＡｓであることはない（A. R. Clapp et al., J. Am. Chem. Soc., 127 1242, 2005）。これらの結果とは反対に、最近の文献において、Ｚｈａｏらは、ＦＩＴＣ（ＦＩＴＣ：ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）からＣｄＳｅ／ＺｎＳコア／シェルＱＤｓへのＦＲＥＴについて主張した（J. H. Wang et al., Colloids Surf. A, 302, 168, 2007）。あいにく、このＦＲＥＴを確認するための入手可能な分光学的データはほとんどない（定常状態のスペクトルのみ）ため、これが本当にＦＲＥＴであるかは非常に不確かである。他の寄稿では、ＱＤｓをＤｓとしてもＡｓとしても取り扱う（例えばY. B. Li et al., Luminescence, 22, 60, 2007）。しかしながら、寿命の短い励起状態という欠点は、通常非常に寿命が長い発光（最大ｍｓまで）を有するＬＣｓをＤｓとして用いることにより克服され得る。生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）を取り扱う適用の他に、ＱＤｓへのエネルギー移動における効率的な可能性は、ＤｓとしてＬＣｓの使用によって生じると考えられた（ａ）L. J. Charbonniere et al., J. Am. Chem. Soc., 128, 12800，ｂ）2006, N. Hildebrandt et al., Angew. Chem. Int. Ed., 44, 7612, 2005，ｃ）N. Hildebrandt et al., J. Biomed. Biotechnol., Article ID 79169, 6 pages, 2007，ｄ）H. Harma et al., Anal Chim. Acta, 604, 177, 2008；ｅ）N. Hildebrandt, Dissertation Thesis, University of Potsdam (Potsdam), 2006；ｆ）N. Hildebrandt et al., Curr. Chem. Biol., 1, 167, 2007.）。
【０００９】
ＱＤｓから、及びＱＤｓへ（Ｄｓ及びＡｓとして使用する）のエネルギー移動の詳細な調査によるＦＲＥＴプロセスの深い理解は、これまで得られていない。これは、ＬＣｓからＱＤｓへのエネルギー移動が本当にフェルスター型エネルギー移動かどうかがまだ明らかになっていないことを意味する。別の不確定要素は、サイズ及び安定性に関する。ＱＤの周りに大きい保護シェルがあると、安定性が高いが、ＤとＡとの間の距離が長くなってしまう（ＦＲＥＴ効率が低くなる）という結果になる。保護シェルを除けば、Ｄ−Ａ距離が短くなるが、安定性が低くなる。さらに、保護シェルは、発光量子収量に影響を及ぼすため、ＦＲＥＴシステム内で１つのＱＤから別のものに変化した場合には、別の不確定要素を導く。
【００１０】
ＦＲＥＴは、多重化解析によく使用されている。用語「多重化」は、全く同一の試料内の複数のパラメータの測定、例えば１人の患者の血液／血清／血漿試料内での複数の腫瘍マーカーの同時検出、を表す。これまで、ＱＤｓを用いた光学的な多重化ＦＲＥＴ測定は、ＱＤｓをＦＲＥＴドナーとして使用することによってのみ達成されている。最近の研究（A. R. Clapp et al., J. Am. Chem. Soc. 2005, 127, 18212）において、多重化ＦＲＥＴシステムの枠組みの中でのＱＤｓの使用を解析するために一連の実験が計画された。２つのエネルギーアクセプター（蛍光性Ｃｙ３及び非蛍光性ＧＳＹ−７）とともに単一のＱＤドナーを使用することにより、ならびにＣｙ３又はＧＳＹ−７とともに最大４つの一組のＱＤドナー（それぞれ５１０，５５５，５７０，及び５９０ｎｍにて発光する）を使用することにより、彼らは多重化システムを厳密に定量化し、かつ解析した。
【００１１】
それぞれ６０５ｎｍ及び６５５ｎｍにて発光する２つの異なるＱＤｓが、ビオチン（ＱＤｓの表面に付着された）のストレプトアビジン（ＬＣｓで標識された）への結合という、同一のバイオアッセイ様式の中で、同一のＬＣドナーとともに使用され得ることもまた示された。これらの結果は、分離された試料において達成された。これは、バイオアッセイにおいて２つの異なるＱＤｓがＦＲＥＴアクセプターとして使用され得ることの証明を提供する。
【００１２】
〔本発明の概要〕
本発明の目的は、多重化ＦＲＥＴ（Forster Resonance Energy Transfer）解析により試料中の検体を検出する改良された方法、及び多重化ＦＲＥＴ解析において１つ以上の検体を光学的に検出するキットを提供することである。
【００１３】
本発明によれば、請求項１で明示されたＦＲＥＴ解析による試料中の検体の光学的な検出のための方法、及び請求項１３で明示されたキットが提供される。本発明における有利な改良は、従属請求項において提供される。
【００１４】
本発明の一態様によれば、多重化ＦＲＥＴ（Forster Resonance Energy Transfer）解析により試料中の検体を検出する方法が提供され、この方法は、以下のステップを含む：
エネルギー移動ドナー、スペクトル的に異なる複数の量子ドット種、及び検体を含む試料を提供するステップであって、
上記検体は、上記エネルギー移動ドナーと第１の量子ドット種とにより提供される第１のエネルギー移動ドナー−アクセプターの組におけるエネルギー移動を仲介するように構成されており、
上記エネルギー移動ドナーは、上記第１のエネルギー移動ドナー−アクセプターの組においてエネルギー移動ドナーとして作用するように構成されており、かつ、
上記第１の量子ドット種は、上記第１のエネルギー移動ドナー−アクセプターの組においてエネルギー移動アクセプターとして作用するように構成されている、ステップと、
上記試料に対し励起光源から励起光を照射するステップ、
上記第１のエネルギー移動ドナー−アクセプターの組において、上記励起光により励起された上記エネルギー移動ドナーから上記第１の量子ドット種へと励起エネルギーが移動するステップであって、当該エネルギー移動が上記検体によって仲介されるステップ、ならびに、
上記第１の量子ドット種が上記励起エネルギーを受け取った後に放射した発光を検出するステップ。
【００１５】
本発明の別の態様によれば、特に先行する請求項に記載の方法に使用するための、多重化ＦＲＥＴ解析において１つ以上の検体を検出するためのキットが提供される。このキットは、スペクトル的に異なる複数の量子ドット種及び少なくとも１つのエネルギー移動ドナーを含む。上記スペクトル的に異なる複数の量子ドット種及び上記少なくとも１つのエネルギー移動ドナーは、１つ以上の検体を含む試料中に１つ以上のエネルギー移動ドナー−アクセプターの組を提供するように構成されている。また、上記１つ以上のエネルギー移動ドナー−アクセプターの組において、上記少なくとも１つのエネルギードナーの光励起により、上記１つ以上の検体によってエネルギー移動が仲介される。
【００１６】
発光の検出は、定常状態及び時間分解測定の少なくとも１つによって行なわれ得る。
【００１７】
本発明は、特に生物学的及び生化学的用途について、検体を検出するための全く同一の試料（多重化）中で１つ以上の量子ドット（ＱＤ）をエネルギー移動（ＥＴ）アクセプターとして使用することを提供する。１つの試料において種々の検体を測定することは、経済上の理由により特に好ましく、経済上の理由とは、短時間、小スペース、試料の準備量の減少、試料の構成量の減少などであり、これら全てが時間とお金の節約につながる。注意点及び高処理量スクリーニングなどの重要な分野は、本発明から顕著に利益を得ることができる。
【００１８】
一実施形態において、長時間発光寿命であるランタニド複合体（ＬＣｓ）がＥＴドナーとして使用される。他の分子又は粒子もまたＥＴドナーになり得る。同時にいくつかの異なるＱＤｓ、例えば最大５個又はそれ以上の異なるＱＤｓ、が１つの試料中に提供される。
【００１９】
本発明は、分光法及び顕微鏡法においてあらゆる種類の測定のために使用され得、好ましくは約１ｎｍ〜２０ｎｍの距離のエネルギー移動が働く場合に使用され得る。定量的測定は、例えばイムノアッセイであってもよい。イムノアッセイは、ドナー及びアクセプターが異なる抗体、アプタマー、抗原もしくはタンパク質に標識され、かつマーカータンパク質、例えば腫瘍マーカー、の濃度（定量的シグナル）が測定されるべきものである。定性的測定は、例えばタンパク質折り畳みにおける、ＲＮＡもしくはＤＮＡベースの複合体における、又は細胞ベースの測定、例えば細胞内のシグナル伝達の研究、における、距離の測定であってもよい。１ｎｍ〜２０ｎｍの範囲での、このＥＴの距離の測定は、「分光学的ルーラー」といわれることもある。
【００２０】
一実施形態において、この方法はさらに以下のステップを含む：
上記検体と異なるさらなる検体を含む試料を提供するステップであって、
上記さらなる検体は、上記エネルギー移動ドナーと、上記第１の量子ドット種とは異なる第２の量子ドット種とにより提供される第２のエネルギー移動ドナー−アクセプターの組におけるエネルギー移動を仲介するように構成されており、
上記エネルギー移動ドナーは、上記第２のエネルギー移動ドナー−アクセプターの組においてエネルギー移動ドナーとして作用するように構成されており、かつ、
上記第２の量子ドット種は、上記第２のエネルギー移動ドナー−アクセプターの組においてエネルギー移動アクセプターとして作用するように構成されている、ステップ、
上記第２のエネルギー移動ドナー−アクセプターの組において、上記励起光により励起された上記エネルギー移動ドナーから上記第２の量子ドット種へと励起エネルギーが移動するステップであって、当該エネルギー移動が上記さらなる検体によって仲介されるステップ、ならびに、
上記第２の量子ドット種が上記励起エネルギーを受け取った後に放射した発光を検出するステップであって、当該第２の量子ドット種により放射された発光が、上記第１の量子ドット種により放射される発光とはスペクトル的に相違するステップ。
【００２１】
さらなる実施形態において、この方法は、以下のステップをさらに含む：
上記エネルギー移動ドナーとは異なるさらなるエネルギー移動ドナーを含む試料を提供するステップであって、
上記検体は、上記さらなるエネルギー移動ドナーと、上記第１の量子ドット種、上記第２の量子ドット種、及び第３の量子ドット種のいずれかとにより提供されるさらなるエネルギー移動ドナー−アクセプターの組におけるエネルギー移動を仲介するように構成されており、
上記さらなるエネルギー移動ドナーは、上記さらなるエネルギー移動ドナー−アクセプターの組においてエネルギー移動ドナーとして作用するように構成されており、かつ、
上記第１の量子ドット種、上記第２の量子ドット種又は上記第３の量子ドット種は、上記さらなるエネルギー移動ドナー−アクセプターの組においてエネルギー移動アクセプターとして作用するように構成されている、ステップ、
上記さらなるエネルギー移動ドナー−アクセプターの組において、上記励起光により励起された上記さらなるエネルギー移動ドナーから上記第１の量子ドット種、上記第２の量子ドット種及び上記第３の量子ドット種のいずれかへと励起エネルギーが移動するステップであって、当該エネルギー移動が上記検体によって仲介されるステップ、ならびに、
上記第１の量子ドット種、上記第２の量子ドット種及び上記第３の量子ドット種のいずれかが上記励起エネルギーを受け取った後に放射した発光を検出するステップであって、当該発光が、上記第１のエネルギー移動ドナー−アクセプターの組において上記第１の量子ドット種により放射される発光、及び上記第２のエネルギー移動ドナー−アクセプターの組において上記第２の量子ドット種により放出される発光とはスペクトル的に相違するステップ。
第３の量子ドット種は、第１及び第２の量子ドット種とは相違する。
【００２２】
さらなる実施形態において、この方法は、以下のうちの少なくとも２つを同時に検出するステップをさらに含む：上記第１のエネルギー移動ドナー−アクセプターの組において上記第１の量子ドット種により放射される発光；上記第２のエネルギー移動ドナー−アクセプターの組において上記第２の量子ドット種により放射される発光；及び上記さらなるエネルギー移動ドナー−アクセプターの組において上記第１の量子ドット種、上記第２の量子ドット種及び上記第３の量子ドット種のいずれかにより放射される発光。
【００２３】
また、さらなる実施形態では、この方法は、少なくとも３つの異なる検体を含む試料を提供するステップをさらに含み、これらの検体のそれぞれが、上記試料中のエネルギー移動ドナー−アクセプターの組におけるエネルギー移動を選択的に仲介するように構成されている。
【００２４】
別の実施形態において、この方法は、検出された発光から構造上の情報を引き出すステップをさらに含む。
【００２５】
さらなる実施形態において、上記構造上の情報を引き出すステップは、上記第１のエネルギー移動ドナー−アクセプターの組、上記第２のエネルギー移動ドナー−アクセプターの組、及び上記さらなるエネルギー移動ドナー−アクセプターの組のうちの少なくとも１つにおける励起エネルギー移動のためのエネルギー移動ドナー−アクセプターの距離を決定するステップを含む。
【００２６】
また、さらなる実施形態において、上記励起エネルギー移動のためのエネルギー移動ドナー−アクセプターの距離を決定するステップは、約１ｎｍ〜約２０ｎｍの間でエネルギー移動ドナー−アクセプターの距離を決定するステップを含む。
【００２７】
さらなる実施形態において、上記励起エネルギー移動のためのエネルギー移動ドナー−アクセプターの距離を決定するステップは、以下の構造の群から選択される構造においてエネルギー移動ドナー−アクセプターの距離を決定するステップを含む：ＤＮＡもしくはＲＮＡ構造、タンパク質折り畳み構造又は細胞構造などの、化学的構造、生化学的構造、及び生物学的構造。
【００２８】
さらなる実施形態において、この方法は、検出された上記発光から濃度情報を引き出すステップをさらに含む。
【００２９】
別のさらなる実施形態において、この方法は、上記試料を標識試料として提供するステップをさらに含み、上記標識試料において、スペクトル的に異なる複数の量子ドット種が、以下のラベリング種の群から選択される種々のラベリング種に対する標識化に用いられている：抗体、アプタマー、抗原、タンパク質、ホルモン、ＤＮＡ、ＲＮＡ、細胞及びウイルスなどの、化学的構造及び生体分子。
【００３０】
また、別の実施形態において、この方法は、上記エネルギー移動ドナー及び上記さらなるエネルギー移動ドナーの少なくとも１つにより放射された発光を検出するステップをさらに含む。発光の検出は、定常状態測定及び時間分解測定の少なくとも１つにより行なわれ得る。エネルギー移動ドナー発光の解析は、例えば、さらなる濃度情報及び／又は構造情報を引き出すために、又はエネルギー移動アクセプター発光解析を介して得られる情報を確認するために、使用され得る。エネルギー移動ドナー発光の解析はまた、試料中のばらつき効果、例えば試料中の試料構成物もしくは撹乱物質の濃度ばらつき、又は励起及び検出の設定、例えばバックグラウンド発光を撹乱させる光強度ばらつき、の修正のために使用され得、高い感度、低い検出限界ならびにより高い正確さ及び再現性を得ることができる。
【００３１】
〔本発明の好適な実施形態の説明〕
以下に、一例として、種々の実施形態を参照することにより、本発明をさらに詳細に説明する。図面において：
図１は、アクセプターとして量子ドット（ＱＤｓ）を用いた多重化エネルギー移動（ＥＴ）バイオアッセイの原理の概略図を示す。
【００３２】
図２は、カラー多重化のための１つのドナー（Ｄ）および複数のアクセプター（Ａ１〜ＡＸ）で標識された複数の抗体又はアプタマー（１〜Ｘ ａ／ｂ−マーカータンパク質１〜Ｘに特異的）を用いた同種イミノアッセイの原理の概略図を示す。
【００３３】
図３は、ドナー（Ｄ）とアクセプター（Ａ）との間の距離が重要な、分光学的ルーラー測定を示す。
【００３４】
図４は、タンパク質のストレプトアビジンを量子ドットに結合させるステップの概略図を示す。
【００３５】
図５は、Ｔｂランタニド複合体（ＬＣ）及び５個のＱＤｓの発光スペクトルを示す。
【００３６】
図６は、アクセプターとしてのＴｂ複合体を有するアクセプターとして使用したときの、種々のＱＤｓの分光学的データを示す。
【００３７】
図７Ａ〜図７Ｅは、ＱＤｓの別々の発光波長にて測定された５個のＱＤｓの強度割合（１００〜１２００μｓの時間枠内においてＱＤドナーの強度をＴｂアクセプターの強度で割ったもの）を示す。
【００３８】
図１は、アクセプターとして量子ドット（ＱＤｓ）を用いた多重化エネルギー移動（ＥＴ）バイオアッセイの原理を概略的に示す。この原理は、複数の異なったＱＤｓ（ｎ＞１）における典型的なものである、ＱＤｓ数がｎ＝３（三重）の多重化の例を示す。一番上の絵では、３つの異なったＱＤｓ（異なった発光波長）が、別々の生体分子（生体分子の数ｍ≧１、ここでは４）Ｂ、Ｅ及びＧ（例えば抗体、タンパク質、ＲＮＡ、ＤＮＡなど）で標識されている。これらの生体分子は、他の分子（ここではＸ、Ｙ及びＺ）に結合することができ、他の分子はｐ≧０の数で構成されてもよい（ｐ＝０のとき、ＢはＣに、ＥはＦに、そしてＧはＨに直接的に結合し得る；ｐ≧１のとき、Ｘ、Ｙ及びＺは別々の分子の複合体で構成され得る）。
【００３９】
生体分子の対応物（ここではＣ，Ｆ及びＨ）は、発光ＥＴドナー（Ｄ）、例えばランタニド複合体（ＬＣ）に結合される。これらのドナーは、同一（例えばＤが常に同一のＬＣなど）であってもよいし、異なった種類（例えば異なったＬＣｓなど）であってもよい。異なった分子の複合体（一番上の絵の左、真ん中及び右）が１つの試料中で共に混合されると、これらは中央の絵に示すように互いに結合し得る。この結合によって、ドナー、例えばＬＣと、アクセプター（ＱＤｓ）とが約１ｎｍ〜約２０ｎｍの範囲内に近接するようになり、ドナーが励起した後にＥＴ（湾曲した黒い矢印）が生じ得る（下の絵）。このＥＴにより、ＱＤｓが励起し、続いて種々のＱＤｓが別々の波長で発光する。
【００４０】
ドナー及びアクセプターの発光についての時間分解測定により、ＥＴによって生じる発光と直接励起を通した発光との間の区別がなされる。それぞれの時間分解による（異なる色の）ＥＴ発光シグナルは、ドナーとアクセプターとの間の特異的な複合体により生じる。本例では、ＱＤ１発光は、複合体ＢＣＸの定量的シグナルとこの複合体の長さについての定量的シグナルとを与え、ＱＤ２はＥＹＦに関し同様であり、ＱＤ３はＧＺＨに関し同様である。したがって、１〜２０ｎｍの範囲にわたる距離だけでなく、分子（例えば抗原、タンパク質などの生体分子）の濃度を測定し得る。
【００４１】
図２は、カラー多重化のための１つのドナー（Ｄ）および複数のアクセプター（Ａ１〜ＡＸ）で標識された複数の抗体又はアプタマー（１〜Ｘ ａ／ｂ−マーカータンパク質１〜Ｘに特異的）を用いた同種イミノアッセイの原理を概略的に示す。タンパク質がないとき（図２の左）、マーカーは、Ｄのみが、パルス状の光励起後に寿命が長い発光シグナルを表す（Ｄ−Ａ距離が長いため、ＦＲＥＴがない）。種々のタンパク質の添加により（図２の右）、特異的な結合が導かれ、同時にＡ１〜ＡＸからの特異的な（色の）寿命が長い発光シグナルが生じる（Ｄ−Ａ距離が短いため、ＦＲＥＴが生じる）。
【００４２】
イムノアッセイは、サンドイッチ複合体「Ｘａ−Ｘ−Ｘｂ」からなる必要はない。Ｘが直接的にドナー又はアクセプターに標識され、競合的アッセイ（標識されたＸ及び標識されていないＸによる）を行なうこともまた可能であり、またいくつかの適用（例えば、マーカータンパク質が１つの抗体又はアプタマーにのみ結合し得る）にとっては必要である。
【００４３】
図３は、ドナー（Ｄ）とアクセプター（Ａ）との間の距離が重要な、分光学的ルーラー測定を示す。黒い湾曲した矢印は、ＦＲＥＴを表す。ａ）ＦＲＥＴシグナルはＤとＡとの間の距離の指標である。このようにして、タンパク質（黒い曲線）の折り畳み構造内の距離を詳細に調べることができる。さらにＤとＡとが離れると、シグナルは低くなる。ｂ）細胞内のシグナル伝達は非常に重要である。ＦＲＥＴは、例えばイオンチャネルにおける相互作用を測定するために使用し得る。
【００４４】
図４は、タンパク質のストレプトアビジンを量子ドットに結合させるステップを概略的に示す。本実施形態においては約１２個のＴｂ ＬＣｓで標識されている、タンパク質のストレプトアビジン（ｓＡＶ）は、溶液中で、ビオチン化された（Ｂ）ＱＤｓと混合される。強いビオチン−ストレプトアビジン結合は、ドナー−アクセプター複合体を形成させ、ＴｂからＱＤへのＦＲＥＴが可能になる。一般的に、１つ以上のＴｂ ＬＣｓによる標識が可能である。
【００４５】
ＦＲＥＴアクセプターとして使用される量子ドット（ＱＤｓ）による多重化を実験的に証明するために、表面が約３〜６個のビオチン分子で標識された発光波長５２５，５６５，６０５，６５５及び７０５ｎｍを有する５個の異なるＱＤｓを使用した。ＣｄＳｅＴｅ／ＺｎＳ型であるＱＤ７０５以外の全てのＱＤｓは、コア／シェル構造のまわりにさらにポリマーシェル及び生体適合性シェルを有するＣｄＳｅ／ＺｎＳコア／シェル型ＱＤｓであった。これらのビオチン化ＱＤｓを、約１２個のＴｂ複合体で標識されたストレプトアビジンと混合した。ビオチンとストレプトアビジンとの強い結合は、Ｔｂ−ＬＣｓ（ドナーとして）及びＱＤｓ（アクセプターとして）を近く近接させ（図４を参照）、Ｔｂから異なるＱＤｓへのＦＲＥＴを可能にする。
【００４６】
３１５ｎｍにてパルス状のＵＶ光で励起した後、Ｔｂ及び全てのＱＤｓは、別々のＦＲＥＴシグナルである、寿命の長い発光を示す。図５は、Ｔｂ ＬＣ及び５個のＱＤｓの発光スペクトルを示す。全ての発光は、多重化アッセイ中に同時に存在する。発光強度は、全ての発光ピークを統一させるために標準化される。
【００４７】
アクセプターとしてのＴｂ複合体を有するアクセプターとして使用したときの、種々のＱＤｓにおける重要な分光学的データが、図６の表に示される。
【００４８】
表１では、ビオチン−ストレプトアビジンバイオアッセイにおいてアクセプターとして使用されるＱＤｓと、アクセプターとして使用される１つのＴｂＬＣとの距離における、多重化された特徴が示される。ＦＲＥＴデータは、ドナー発光及びアクセプター吸収のスペクトルの重なりと、その結果であるフェルスター半径とを示す。推定のサイズは、供給業者（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により与えられる。Ｔｂ（ドナーチャネル）及びそれぞれのＱＤについて、時間分解発光が解析される。τは、ＦＲＥＴ非存在下（τＤ）及びＦＲＥＴ存在下（τＤＡ）における発光減衰時間である。ηはＦＲＥＴ効率であり、またｒはＤ−Ａ距離を表す。ストレプトアビジンを標識する多くのＴｂ−ＬＣｓが存在し、またドットは全てが球状ではなく、楕円体のものもあるため、いくつかの可能な距離が存在する。計算の根拠のため、他の全ての可能な距離を表す２つの平均的な距離が選択された。計算された距離は、推測されるサイズ及び種々のＱＤｓのモデルにとてもよく適合し、主にＤ−Ａ距離に影響を与えることが理解されるだろう。
【００４９】
ＱＤｓのフェルスター半径、サイズ及び形状（球状又は楕円体）が非常に異なることが理解され得る。ドナー発光及びアクセプター発光における時間分解解析は、それぞれ、ＱＤサイズが異なることによるＤとＡとの間の異なる距離が測定され得ることを示す（Ｄ−Ａ距離は、ＱＤｓのサイズの増加により増加する）。これは、本発明が、多重化アッセイ（多重化された分光光学的ルーラー）において距離を測定し得ることを明確に示す。
【００５０】
感度のいい定量的解析を実現するために、小さい容積の１ｎＭのＢｉｏｔ−ＱＤｓを１ｎＭのＴｂ−ｓＡｖに加え、改良を加えた市販のイムノアナライザー（Ｃｅｚａｎｎｅ及びＢＲＡＨＭＳのＫＲＹＰＴＯＲ）において、時間が制限されている寿命の長い発光（０．１〜１．２ｍｓ）を測定した。この添加により、結合、ならびにＴｂからＱＤｓへのＦＲＥＴと、同時に生じる寿命の長いＱＤ発光との結果を導く。全てのＢｉｏｔ−ＱＤｓは、全く同一の試料中でサブ−ピコモル検出限界により検出されることができた。発光シグナルが、ストレプトアビジン−ビオチン結合によるＦＲＥＴに起因して起こり、溶液中の乱反射に起因したものでないことを示すために、単なるＴｂ−ＬＣを用いてコントロール実験を行なった。
【００５１】
図７Ａ〜図７Ｅは、ＱＤｓの別々の発光波長にて測定された５個全てのＱＤｓの強度割合（１００〜１２００μｓの時間枠内においてＱＤドナーの強度をＴｂアクセプターの強度で割ったもの）を示す。四角は、ビオチンとストレプトアビジンとの結合、及び同時に生じるＴｂから別々のＱＤｓへのＥＴによる、相対比（ゼロ濃度にて統一されるよう標準化された）の強い増加を示す。丸は、Ｔｂをストレプトアビジンなしで使用したコントロール実験を示す。割合の増加はここでは見ることができず、これは、バイオアッセイにおいて、ＥＴがビオチンとストレプトアビジンとの結合により可能になることを示す。検出限界（ゼロ濃度にて３０回の測定における３重の標準偏差を、増加割合曲線における直線の部分の傾きで割ったもの）は、同一試料において全てサブピコモルであり、これはアクセプターとしてＱＤｓを用いた多重化バイオアッセイの高い感受性を示す。
【００５２】
明細書、特許請求の範囲及び図面の少なくとも１つに開示された特徴は、独立して利用される種々の実施形態において、またはこれらの種々の組み合わせにおいて、本発明を実現するための材料であってもよい。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】図１は、アクセプターとして量子ドット（ＱＤｓ）を用いた多重化エネルギー移動（ＥＴ）バイオアッセイの原理の概略図を示す。
【図２】図２は、カラー多重化のための１つのドナー（Ｄ）および複数のアクセプター（Ａ１〜ＡＸ）で標識された複数の抗体又はアプタマー（１〜Ｘ ａ／ｂ−マーカータンパク質１〜Ｘに特異的）を用いた同種イミノアッセイの原理の概略図を示す。
【図３】図３は、ドナー（Ｄ）とアクセプター（Ａ）との間の距離が重要な、分光学的ルーラー測定を示す。
【図４】図４は、タンパク質のストレプトアビジンを量子ドットに結合させるステップの概略図を示す。
【図５】図５は、Ｔｂランタニド複合体（ＬＣ）及び５個のＱＤｓの発光スペクトルを示す。
【図６】図６は、アクセプターとしてのＴｂ複合体を有するアクセプターとして使用したときの、種々のＱＤｓの分光学的データを示す。
【図７Ａ】図７Ａは、ＱＤｓの別々の発光波長にて測定された５個のＱＤｓの強度割合（１００〜１２００μｓの時間枠内においてＱＤドナーの強度をＴｂアクセプターの強度で割ったもの）を示す。
【図７Ｂ】図７Ｂは、ＱＤｓの別々の発光波長にて測定された５個のＱＤｓの強度割合（１００〜１２００μｓの時間枠内においてＱＤドナーの強度をＴｂアクセプターの強度で割ったもの）を示す。
【図７Ｃ】図７Ｃは、ＱＤｓの別々の発光波長にて測定された５個のＱＤｓの強度割合（１００〜１２００μｓの時間枠内においてＱＤドナーの強度をＴｂアクセプターの強度で割ったもの）を示す。
【図７Ｄ】図７Ｄは、ＱＤｓの別々の発光波長にて測定された５個のＱＤｓの強度割合（１００〜１２００μｓの時間枠内においてＱＤドナーの強度をＴｂアクセプターの強度で割ったもの）を示す。
【図７Ｅ】図７Ｅは、ＱＤｓの別々の発光波長にて測定された５個のＱＤｓの強度割合（１００〜１２００μｓの時間枠内においてＱＤドナーの強度をＴｂアクセプターの強度で割ったもの）を示す。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、多重化ＦＲＥＴ（Forster Resonance Energy Transfer）解析により試料中の検体を検出する方法、及び多重化ＦＲＥＴ解析において１つ以上の検体を検出するキットに関する。
【０００２】
〔本発明の背景〕
ＦＲＥＴ（Forster Resonance Energy Transfer）の理論は、励起されたドナー（Ｄ）からアクセプター分子（Ａ）への１／ｒ６距離依存的な、非発光のエネルギー移動を規定する。容易に利用できる分光学的データと理論上の式との間の関係は、テオドール・フェルスター（Theodor Forster）の成果であり、したがって全ての種類の自然科学における多様なＦＲＥＴの適用の可能性を可能にする。ＦＲＥＴの理論の詳細は周知である。
【０００３】
広く適応したＦＲＥＴ適用の分光学的性質の本質は、いわゆるフェルスター半径（Forster Radius）Ｒ０、つまりエネルギー移動が５０％効率のときのＤとＡとの間の距離である。Ｒ０は、ドナー発光及びアクセプター吸収のスペクトルデータから計算することができ、これらは両方とも測定が容易である。これは主に、ドナーの発光スペクトル及びアクセプターの吸収スペクトルの重複、ならびにドナーの発光量子収量（吸収された光量子に対する発光された光量子の割合）に依存する。Ｒ０が大きいほど、距離が固定されている場合にはＦＲＥＴがより効率的であり、ＦＲＥＴ効率が固定されている場合にはＤ−Ａ距離が大きい。
【０００４】
ＦＲＥＴは、１〜１０ｎｍのスケールにおいて生化学的用途に使用されている（K. E. Sapsford et al., Angew. Chem. Int. Ed., 45, 4562, 2006）（例えばタンパク質−タンパク質結合、タンパク質折り畳み、細胞膜における分子間相互作用及び細胞膜内の分子間相互作用、ＤＮＡハイブリダイゼーション及びシークエンシング、抗原及び抗体の免疫反応）。このようなＦＲＥＴ測定の結果は、約１〜２０ｎｍの距離又は特定の物質の濃度である。ＦＲＥＴは、無数のＤｓ及びＡｓを含む溶液中の時間分解発光技術によって解析し得るため、このナノスケールの方法が巨視的な分野のために利用可能となり得る。さらに、共焦点顕微鏡技術は、全体にわたって平均化するよりむしろパラメータ分布を測定するために、単一分子レベルでＦＲＥＴを解析することができる。
【０００５】
これまでは、一般に使用されるＤ−Ａの組におけるＲ０値は、６ｎｍよりも大きくなることはめったにない（２７３個のＦＲＥＴの組のうち、６〜７ｎｍのＲ０を有するのはたった４つである（B. W. Van der Meer et al., Resoncance Energy Transfer: Theory and Data, Wiley-VCH, New York））。生化学的なＦＲＥＴ適用においてドナーとしてのランタニド複合体（ＬＣｓ）及びアクセプターとしての量子ドットを組み合わせた場合、１０ｎｍより大きいフェルスター半径が見られる。このように、通常の限界である１０ｎｍを破ることは可能である。ＬＣｓに関してはＦＲＥＴは比較的よく理解されている（P. R. Selvin, Ann. Rev. Biophys. Biomol. Struct., 31, 275, 2002）が、ＱＤに基づくＦＲＥＴ（特にＡｓとしてのＱＤｓについて）については深く理解されていない。
【０００６】
量子ドット（ＱＤｓ）は、よく特徴づけられかつ確立された、独特の光学的性質及び光物理学的性質を有するナノ粒子（特にＣｄＳｅ／ＺｎＳコア／シェルドット）である。ＱＤｓは、より大きなバンドギャップの半導体からなる保護シェルによってたいてい被覆されているナノメートルサイズの半導体材料のコア、ならびに水溶解性及び生体適合性のための外部の被覆シェルによって構成される。半導体材料であること、及びナノ結晶サイズであることによって（I. L. Medintz et al., Nat. Mater., 4, 435, 2005）、その吸収及び発光特性は、ＵＶから近赤外までのほとんど全てのスペクトル領域に対応することができる。ＱＤｓは、極めて大きい１つ及び２つの光量子吸収断面、励起及び発光の間のスペクトルの大きな乖離の可能性、ならびに狭い発光バンドを表す。ＱＤｓはまた、商業的に入手可能である（例えばＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｅｖｉｄｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。
【０００７】
ＱＤｓは、しばしば高い発光量子収量を表し、また有機色素よりも光退色に対しずっと耐性である（X. Y. Wu, Nat. Biotechnol. 2003, 21, 41）。さらに、多くのＤｓ又はＡｓは、単一のＱＤの大きな表面に付着し得るため、全体の効率が増加する複数分子のＦＲＥＴを可能にする。
【０００８】
ＱＤｓは、Ｄｓとしての一般的な有機フルオロフォアと組み合わされる場合には、おそらくこれらのフルオロフォアの寿命の短い励起状態（ｎｓ）により、効率的なＡｓであることはない（A. R. Clapp et al., J. Am. Chem. Soc., 127 1242, 2005）。これらの結果とは反対に、最近の文献において、Ｚｈａｏらは、ＦＩＴＣ（ＦＩＴＣ：ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）からＣｄＳｅ／ＺｎＳコア／シェルＱＤｓへのＦＲＥＴについて主張した（J. H. Wang et al., Colloids Surf. A, 302, 168, 2007）。あいにく、このＦＲＥＴを確認するための入手可能な分光学的データはほとんどない（定常状態のスペクトルのみ）ため、これが本当にＦＲＥＴであるかは非常に不確かである。他の寄稿では、ＱＤｓをＤｓとしてもＡｓとしても取り扱う（例えばY. B. Li et al., Luminescence, 22, 60, 2007）。しかしながら、寿命の短い励起状態という欠点は、通常非常に寿命が長い発光（最大ｍｓまで）を有するＬＣｓをＤｓとして用いることにより克服され得る。生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）を取り扱う適用の他に、ＱＤｓへのエネルギー移動における効率的な可能性は、ＤｓとしてＬＣｓの使用によって生じると考えられた（ａ）L. J. Charbonniere et al., J. Am. Chem. Soc., 128, 12800，ｂ）2006, N. Hildebrandt et al., Angew. Chem. Int. Ed., 44, 7612, 2005，ｃ）N. Hildebrandt et al., J. Biomed. Biotechnol., Article ID 79169, 6 pages, 2007，ｄ）H. Harma et al., Anal Chim. Acta, 604, 177, 2008；ｅ）N. Hildebrandt, Dissertation Thesis, University of Potsdam (Potsdam), 2006；ｆ）N. Hildebrandt et al., Curr. Chem. Biol., 1, 167, 2007.）。
【０００９】
ＱＤｓから、及びＱＤｓへ（Ｄｓ及びＡｓとして使用する）のエネルギー移動の詳細な調査によるＦＲＥＴプロセスの深い理解は、これまで得られていない。これは、ＬＣｓからＱＤｓへのエネルギー移動が本当にフェルスター型エネルギー移動かどうかがまだ明らかになっていないことを意味する。別の不確定要素は、サイズ及び安定性に関する。ＱＤの周りに大きい保護シェルがあると、安定性が高いが、ＤとＡとの間の距離が長くなってしまう（ＦＲＥＴ効率が低くなる）という結果になる。保護シェルを除けば、Ｄ−Ａ距離が短くなるが、安定性が低くなる。さらに、保護シェルは、発光量子収量に影響を及ぼすため、ＦＲＥＴシステム内で１つのＱＤから別のものに変化した場合には、別の不確定要素を導く。
【００１０】
ＦＲＥＴは、多重化解析によく使用されている。用語「多重化」は、全く同一の試料内の複数のパラメータの測定、例えば１人の患者の血液／血清／血漿試料内での複数の腫瘍マーカーの同時検出、を表す。これまで、ＱＤｓを用いた光学的な多重化ＦＲＥＴ測定は、ＱＤｓをＦＲＥＴドナーとして使用することによってのみ達成されている。最近の研究（A. R. Clapp et al., J. Am. Chem. Soc. 2005, 127, 18212）において、多重化ＦＲＥＴシステムの枠組みの中でのＱＤｓの使用を解析するために一連の実験が計画された。２つのエネルギーアクセプター（蛍光性Ｃｙ３及び非蛍光性ＧＳＹ−７）とともに単一のＱＤドナーを使用することにより、ならびにＣｙ３又はＧＳＹ−７とともに最大４つの一組のＱＤドナー（それぞれ５１０，５５５，５７０，及び５９０ｎｍにて発光する）を使用することにより、彼らは多重化システムを厳密に定量化し、かつ解析した。
【００１１】
それぞれ６０５ｎｍ及び６５５ｎｍにて発光する２つの異なるＱＤｓが、ビオチン（ＱＤｓの表面に付着された）のストレプトアビジン（ＬＣｓで標識された）への結合という、同一のバイオアッセイ様式の中で、同一のＬＣドナーとともに使用され得ることもまた示された。これらの結果は、分離された試料において達成された。これは、バイオアッセイにおいて２つの異なるＱＤｓがＦＲＥＴアクセプターとして使用され得ることの証明を提供する。
【００１２】
〔本発明の概要〕
本発明の目的は、多重化ＦＲＥＴ（Forster Resonance Energy Transfer）解析により試料中の検体を検出する改良された方法、及び多重化ＦＲＥＴ解析において１つ以上の検体を光学的に検出するキットを提供することである。
【００１３】
本発明によれば、請求項１で明示されたＦＲＥＴ解析による試料中の検体の光学的な検出のための方法、及び請求項１３で明示されたキットが提供される。本発明における有利な改良は、従属請求項において提供される。
【００１４】
本発明の一態様によれば、多重化ＦＲＥＴ（Forster Resonance Energy Transfer）解析により試料中の検体を検出する方法が提供され、この方法は、以下のステップを含む：
エネルギー移動ドナー、スペクトル的に異なる複数の量子ドット種、及び検体を含む試料を提供するステップであって、
上記検体は、上記エネルギー移動ドナーと第１の量子ドット種とにより提供される第１のエネルギー移動ドナー−アクセプターの組におけるエネルギー移動を仲介するように構成されており、
上記エネルギー移動ドナーは、上記第１のエネルギー移動ドナー−アクセプターの組においてエネルギー移動ドナーとして作用するように構成されており、かつ、
上記第１の量子ドット種は、上記第１のエネルギー移動ドナー−アクセプターの組においてエネルギー移動アクセプターとして作用するように構成されている、ステップと、
上記試料に対し励起光源から励起光を照射するステップ、
上記第１のエネルギー移動ドナー−アクセプターの組において、上記励起光により励起された上記エネルギー移動ドナーから上記第１の量子ドット種へと励起エネルギーが移動するステップであって、当該エネルギー移動が上記検体によって仲介されるステップ、ならびに、
上記第１の量子ドット種が上記励起エネルギーを受け取った後に放射した発光を検出するステップ。
【００１５】
本発明の別の態様によれば、特に先行する請求項に記載の方法に使用するための、多重化ＦＲＥＴ解析において１つ以上の検体を検出するためのキットが提供される。このキットは、スペクトル的に異なる複数の量子ドット種及び少なくとも１つのエネルギー移動ドナーを含む。上記スペクトル的に異なる複数の量子ドット種及び上記少なくとも１つのエネルギー移動ドナーは、１つ以上の検体を含む試料中に１つ以上のエネルギー移動ドナー−アクセプターの組を提供するように構成されている。また、上記１つ以上のエネルギー移動ドナー−アクセプターの組において、上記少なくとも１つのエネルギードナーの光励起により、上記１つ以上の検体によってエネルギー移動が仲介される。
【００１６】
発光の検出は、定常状態及び時間分解測定の少なくとも１つによって行なわれ得る。
【００１７】
本発明は、特に生物学的及び生化学的用途について、検体を検出するための全く同一の試料（多重化）中で１つ以上の量子ドット（ＱＤ）をエネルギー移動（ＥＴ）アクセプターとして使用することを提供する。１つの試料において種々の検体を測定することは、経済上の理由により特に好ましく、経済上の理由とは、短時間、小スペース、試料の準備量の減少、試料の構成量の減少などであり、これら全てが時間とお金の節約につながる。注意点及び高処理量スクリーニングなどの重要な分野は、本発明から顕著に利益を得ることができる。
【００１８】
一実施形態において、長時間発光寿命であるランタニド複合体（ＬＣｓ）がＥＴドナーとして使用される。他の分子又は粒子もまたＥＴドナーになり得る。同時にいくつかの異なるＱＤｓ、例えば最大５個又はそれ以上の異なるＱＤｓ、が１つの試料中に提供される。
【００１９】
本発明は、分光法及び顕微鏡法においてあらゆる種類の測定のために使用され得、好ましくは約１ｎｍ〜２０ｎｍの距離のエネルギー移動が働く場合に使用され得る。定量的測定は、例えばイムノアッセイであってもよい。イムノアッセイは、ドナー及びアクセプターが異なる抗体、アプタマー、抗原もしくはタンパク質に標識され、かつマーカータンパク質、例えば腫瘍マーカー、の濃度（定量的シグナル）が測定されるべきものである。定性的測定は、例えばタンパク質折り畳みにおける、ＲＮＡもしくはＤＮＡベースの複合体における、又は細胞ベースの測定、例えば細胞内のシグナル伝達の研究、における、距離の測定であってもよい。１ｎｍ〜２０ｎｍの範囲での、このＥＴの距離の測定は、「分光学的ルーラー」といわれることもある。
【００２０】
一実施形態において、この方法はさらに以下のステップを含む：
上記検体と異なるさらなる検体を含む試料を提供するステップであって、
上記さらなる検体は、上記エネルギー移動ドナーと、上記第１の量子ドット種とは異なる第２の量子ドット種とにより提供される第２のエネルギー移動ドナー−アクセプターの組におけるエネルギー移動を仲介するように構成されており、
上記エネルギー移動ドナーは、上記第２のエネルギー移動ドナー−アクセプターの組においてエネルギー移動ドナーとして作用するように構成されており、かつ、
上記第２の量子ドット種は、上記第２のエネルギー移動ドナー−アクセプターの組においてエネルギー移動アクセプターとして作用するように構成されている、ステップ、
上記第２のエネルギー移動ドナー−アクセプターの組において、上記励起光により励起された上記エネルギー移動ドナーから上記第２の量子ドット種へと励起エネルギーが移動するステップであって、当該エネルギー移動が上記さらなる検体によって仲介されるステップ、ならびに、
上記第２の量子ドット種が上記励起エネルギーを受け取った後に放射した発光を検出するステップであって、当該第２の量子ドット種により放射された発光が、上記第１の量子ドット種により放射される発光とはスペクトル的に相違するステップ。
【００２１】
さらなる実施形態において、この方法は、以下のステップをさらに含む：
上記エネルギー移動ドナーとは異なるさらなるエネルギー移動ドナーを含む試料を提供するステップであって、
上記検体は、上記さらなるエネルギー移動ドナーと、上記第１の量子ドット種、上記第２の量子ドット種、及び第３の量子ドット種のいずれかとにより提供されるさらなるエネルギー移動ドナー−アクセプターの組におけるエネルギー移動を仲介するように構成されており、
上記さらなるエネルギー移動ドナーは、上記さらなるエネルギー移動ドナー−アクセプターの組においてエネルギー移動ドナーとして作用するように構成されており、かつ、
上記第１の量子ドット種、上記第２の量子ドット種又は上記第３の量子ドット種は、上記さらなるエネルギー移動ドナー−アクセプターの組においてエネルギー移動アクセプターとして作用するように構成されている、ステップ、
上記さらなるエネルギー移動ドナー−アクセプターの組において、上記励起光により励起された上記さらなるエネルギー移動ドナーから上記第１の量子ドット種、上記第２の量子ドット種及び上記第３の量子ドット種のいずれかへと励起エネルギーが移動するステップであって、当該エネルギー移動が上記検体によって仲介されるステップ、ならびに、
上記第１の量子ドット種、上記第２の量子ドット種及び上記第３の量子ドット種のいずれかが上記励起エネルギーを受け取った後に放射した発光を検出するステップであって、当該発光が、上記第１のエネルギー移動ドナー−アクセプターの組において上記第１の量子ドット種により放射される発光、及び上記第２のエネルギー移動ドナー−アクセプターの組において上記第２の量子ドット種により放出される発光とはスペクトル的に相違するステップ。
第３の量子ドット種は、第１及び第２の量子ドット種とは相違する。
【００２２】
さらなる実施形態において、この方法は、以下のうちの少なくとも２つを同時に検出するステップをさらに含む：上記第１のエネルギー移動ドナー−アクセプターの組において上記第１の量子ドット種により放射される発光；上記第２のエネルギー移動ドナー−アクセプターの組において上記第２の量子ドット種により放射される発光；及び上記さらなるエネルギー移動ドナー−アクセプターの組において上記第１の量子ドット種、上記第２の量子ドット種及び上記第３の量子ドット種のいずれかにより放射される発光。
【００２３】
また、さらなる実施形態では、この方法は、少なくとも３つの異なる検体を含む試料を提供するステップをさらに含み、これらの検体のそれぞれが、上記試料中のエネルギー移動ドナー−アクセプターの組におけるエネルギー移動を選択的に仲介するように構成されている。
【００２４】
別の実施形態において、この方法は、検出された発光から構造上の情報を引き出すステップをさらに含む。
【００２５】
さらなる実施形態において、上記構造上の情報を引き出すステップは、上記第１のエネルギー移動ドナー−アクセプターの組、上記第２のエネルギー移動ドナー−アクセプターの組、及び上記さらなるエネルギー移動ドナー−アクセプターの組のうちの少なくとも１つにおける励起エネルギー移動のためのエネルギー移動ドナー−アクセプターの距離を決定するステップを含む。
【００２６】
また、さらなる実施形態において、上記励起エネルギー移動のためのエネルギー移動ドナー−アクセプターの距離を決定するステップは、約１ｎｍ〜約２０ｎｍの間でエネルギー移動ドナー−アクセプターの距離を決定するステップを含む。
【００２７】
さらなる実施形態において、上記励起エネルギー移動のためのエネルギー移動ドナー−アクセプターの距離を決定するステップは、以下の構造の群から選択される構造においてエネルギー移動ドナー−アクセプターの距離を決定するステップを含む：ＤＮＡもしくはＲＮＡ構造、タンパク質折り畳み構造又は細胞構造などの、化学的構造、生化学的構造、及び生物学的構造。
【００２８】
さらなる実施形態において、この方法は、検出された上記発光から濃度情報を引き出すステップをさらに含む。
【００２９】
別のさらなる実施形態において、この方法は、上記試料を標識試料として提供するステップをさらに含み、上記標識試料において、スペクトル的に異なる複数の量子ドット種が、以下のラベリング種の群から選択される種々のラベリング種に対する標識化に用いられている：抗体、アプタマー、抗原、タンパク質、ホルモン、ＤＮＡ、ＲＮＡ、細胞及びウイルスなどの、化学的構造及び生体分子。
【００３０】
また、別の実施形態において、この方法は、上記エネルギー移動ドナー及び上記さらなるエネルギー移動ドナーの少なくとも１つにより放射された発光を検出するステップをさらに含む。発光の検出は、定常状態測定及び時間分解測定の少なくとも１つにより行なわれ得る。エネルギー移動ドナー発光の解析は、例えば、さらなる濃度情報及び／又は構造情報を引き出すために、又はエネルギー移動アクセプター発光解析を介して得られる情報を確認するために、使用され得る。エネルギー移動ドナー発光の解析はまた、試料中のばらつき効果、例えば試料中の試料構成物もしくは撹乱物質の濃度ばらつき、又は励起及び検出の設定、例えばバックグラウンド発光を撹乱させる光強度ばらつき、の修正のために使用され得、高い感度、低い検出限界ならびにより高い正確さ及び再現性を得ることができる。
【００３１】
〔本発明の好適な実施形態の説明〕
以下に、一例として、種々の実施形態を参照することにより、本発明をさらに詳細に説明する。図面において：
図１は、アクセプターとして量子ドット（ＱＤｓ）を用いた多重化エネルギー移動（ＥＴ）バイオアッセイの原理の概略図を示す。
【００３２】
図２は、カラー多重化のための１つのドナー（Ｄ）および複数のアクセプター（Ａ１〜ＡＸ）で標識された複数の抗体又はアプタマー（１〜Ｘ ａ／ｂ−マーカータンパク質１〜Ｘに特異的）を用いた同種イミノアッセイの原理の概略図を示す。
【００３３】
図３は、ドナー（Ｄ）とアクセプター（Ａ）との間の距離が重要な、分光学的ルーラー測定を示す。
【００３４】
図４は、タンパク質のストレプトアビジンを量子ドットに結合させるステップの概略図を示す。
【００３５】
図５は、Ｔｂランタニド複合体（ＬＣ）及び５個のＱＤｓの発光スペクトルを示す。
【００３６】
図６は、アクセプターとしてのＴｂ複合体を有するアクセプターとして使用したときの、種々のＱＤｓの分光学的データを示す。
【００３７】
図７Ａ〜図７Ｅは、ＱＤｓの別々の発光波長にて測定された５個のＱＤｓの強度割合（１００〜１２００μｓの時間枠内においてＱＤドナーの強度をＴｂアクセプターの強度で割ったもの）を示す。
【００３８】
図１は、アクセプターとして量子ドット（ＱＤｓ）を用いた多重化エネルギー移動（ＥＴ）バイオアッセイの原理を概略的に示す。この原理は、複数の異なったＱＤｓ（ｎ＞１）における典型的なものである、ＱＤｓ数がｎ＝３（三重）の多重化の例を示す。一番上の絵では、３つの異なったＱＤｓ（異なった発光波長）が、別々の生体分子（生体分子の数ｍ≧１、ここでは４）Ｂ、Ｅ及びＧ（例えば抗体、タンパク質、ＲＮＡ、ＤＮＡなど）で標識されている。これらの生体分子は、他の分子（ここではＸ、Ｙ及びＺ）に結合することができ、他の分子はｐ≧０の数で構成されてもよい（ｐ＝０のとき、ＢはＣに、ＥはＦに、そしてＧはＨに直接的に結合し得る；ｐ≧１のとき、Ｘ、Ｙ及びＺは別々の分子の複合体で構成され得る）。
【００３９】
生体分子の対応物（ここではＣ，Ｆ及びＨ）は、発光ＥＴドナー（Ｄ）、例えばランタニド複合体（ＬＣ）に結合される。これらのドナーは、同一（例えばＤが常に同一のＬＣなど）であってもよいし、異なった種類（例えば異なったＬＣｓなど）であってもよい。異なった分子の複合体（一番上の絵の左、真ん中及び右）が１つの試料中で共に混合されると、これらは中央の絵に示すように互いに結合し得る。この結合によって、ドナー、例えばＬＣと、アクセプター（ＱＤｓ）とが約１ｎｍ〜約２０ｎｍの範囲内に近接するようになり、ドナーが励起した後にＥＴ（湾曲した黒い矢印）が生じ得る（下の絵）。このＥＴにより、ＱＤｓが励起し、続いて種々のＱＤｓが別々の波長で発光する。
【００４０】
ドナー及びアクセプターの発光についての時間分解測定により、ＥＴによって生じる発光と直接励起を通した発光との間の区別がなされる。それぞれの時間分解による（異なる色の）ＥＴ発光シグナルは、ドナーとアクセプターとの間の特異的な複合体により生じる。本例では、ＱＤ１発光は、複合体ＢＣＸの定量的シグナルとこの複合体の長さについての定量的シグナルとを与え、ＱＤ２はＥＹＦに関し同様であり、ＱＤ３はＧＺＨに関し同様である。したがって、１〜２０ｎｍの範囲にわたる距離だけでなく、分子（例えば抗原、タンパク質などの生体分子）の濃度を測定し得る。
【００４１】
図２は、カラー多重化のための１つのドナー（Ｄ）および複数のアクセプター（Ａ１〜ＡＸ）で標識された複数の抗体又はアプタマー（１〜Ｘ ａ／ｂ−マーカータンパク質１〜Ｘに特異的）を用いた同種イミノアッセイの原理を概略的に示す。タンパク質がないとき（図２の左）、マーカーは、Ｄのみが、パルス状の光励起後に寿命が長い発光シグナルを表す（Ｄ−Ａ距離が長いため、ＦＲＥＴがない）。種々のタンパク質の添加により（図２の右）、特異的な結合が導かれ、同時にＡ１〜ＡＸからの特異的な（色の）寿命が長い発光シグナルが生じる（Ｄ−Ａ距離が短いため、ＦＲＥＴが生じる）。
【００４２】
イムノアッセイは、サンドイッチ複合体「Ｘａ−Ｘ−Ｘｂ」からなる必要はない。Ｘが直接的にドナー又はアクセプターに標識され、競合的アッセイ（標識されたＸ及び標識されていないＸによる）を行なうこともまた可能であり、またいくつかの適用（例えば、マーカータンパク質が１つの抗体又はアプタマーにのみ結合し得る）にとっては必要である。
【００４３】
図３は、ドナー（Ｄ）とアクセプター（Ａ）との間の距離が重要な、分光学的ルーラー測定を示す。黒い湾曲した矢印は、ＦＲＥＴを表す。ａ）ＦＲＥＴシグナルはＤとＡとの間の距離の指標である。このようにして、タンパク質（黒い曲線）の折り畳み構造内の距離を詳細に調べることができる。さらにＤとＡとが離れると、シグナルは低くなる。ｂ）細胞内のシグナル伝達は非常に重要である。ＦＲＥＴは、例えばイオンチャネルにおける相互作用を測定するために使用し得る。
【００４４】
図４は、タンパク質のストレプトアビジンを量子ドットに結合させるステップを概略的に示す。本実施形態においては約１２個のＴｂ ＬＣｓで標識されている、タンパク質のストレプトアビジン（ｓＡＶ）は、溶液中で、ビオチン化された（Ｂ）ＱＤｓと混合される。強いビオチン−ストレプトアビジン結合は、ドナー−アクセプター複合体を形成させ、ＴｂからＱＤへのＦＲＥＴが可能になる。一般的に、１つ以上のＴｂ ＬＣｓによる標識が可能である。
【００４５】
ＦＲＥＴアクセプターとして使用される量子ドット（ＱＤｓ）による多重化を実験的に証明するために、表面が約３〜６個のビオチン分子で標識された発光波長５２５，５６５，６０５，６５５及び７０５ｎｍを有する５個の異なるＱＤｓを使用した。ＣｄＳｅＴｅ／ＺｎＳ型であるＱＤ７０５以外の全てのＱＤｓは、コア／シェル構造のまわりにさらにポリマーシェル及び生体適合性シェルを有するＣｄＳｅ／ＺｎＳコア／シェル型ＱＤｓであった。これらのビオチン化ＱＤｓを、約１２個のＴｂ複合体で標識されたストレプトアビジンと混合した。ビオチンとストレプトアビジンとの強い結合は、Ｔｂ−ＬＣｓ（ドナーとして）及びＱＤｓ（アクセプターとして）を近く近接させ（図４を参照）、Ｔｂから異なるＱＤｓへのＦＲＥＴを可能にする。
【００４６】
３１５ｎｍにてパルス状のＵＶ光で励起した後、Ｔｂ及び全てのＱＤｓは、別々のＦＲＥＴシグナルである、寿命の長い発光を示す。図５は、Ｔｂ ＬＣ及び５個のＱＤｓの発光スペクトルを示す。全ての発光は、多重化アッセイ中に同時に存在する。発光強度は、全ての発光ピークを統一させるために標準化される。
【００４７】
アクセプターとしてのＴｂ複合体を有するアクセプターとして使用したときの、種々のＱＤｓにおける重要な分光学的データが、図６の表に示される。
【００４８】
表１では、ビオチン−ストレプトアビジンバイオアッセイにおいてアクセプターとして使用されるＱＤｓと、アクセプターとして使用される１つのＴｂＬＣとの距離における、多重化された特徴が示される。ＦＲＥＴデータは、ドナー発光及びアクセプター吸収のスペクトルの重なりと、その結果であるフェルスター半径とを示す。推定のサイズは、供給業者（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により与えられる。Ｔｂ（ドナーチャネル）及びそれぞれのＱＤについて、時間分解発光が解析される。τは、ＦＲＥＴ非存在下（τＤ）及びＦＲＥＴ存在下（τＤＡ）における発光減衰時間である。ηはＦＲＥＴ効率であり、またｒはＤ−Ａ距離を表す。ストレプトアビジンを標識する多くのＴｂ−ＬＣｓが存在し、またドットは全てが球状ではなく、楕円体のものもあるため、いくつかの可能な距離が存在する。計算の根拠のため、他の全ての可能な距離を表す２つの平均的な距離が選択された。計算された距離は、推測されるサイズ及び種々のＱＤｓのモデルにとてもよく適合し、主にＤ−Ａ距離に影響を与えることが理解されるだろう。
【００４９】
ＱＤｓのフェルスター半径、サイズ及び形状（球状又は楕円体）が非常に異なることが理解され得る。ドナー発光及びアクセプター発光における時間分解解析は、それぞれ、ＱＤサイズが異なることによるＤとＡとの間の異なる距離が測定され得ることを示す（Ｄ−Ａ距離は、ＱＤｓのサイズの増加により増加する）。これは、本発明が、多重化アッセイ（多重化された分光光学的ルーラー）において距離を測定し得ることを明確に示す。
【００５０】
感度のいい定量的解析を実現するために、小さい容積の１ｎＭのＢｉｏｔ−ＱＤｓを１ｎＭのＴｂ−ｓＡｖに加え、改良を加えた市販のイムノアナライザー（Ｃｅｚａｎｎｅ及びＢＲＡＨＭＳのＫＲＹＰＴＯＲ）において、時間が制限されている寿命の長い発光（０．１〜１．２ｍｓ）を測定した。この添加により、結合、ならびにＴｂからＱＤｓへのＦＲＥＴと、同時に生じる寿命の長いＱＤ発光との結果を導く。全てのＢｉｏｔ−ＱＤｓは、全く同一の試料中でサブ−ピコモル検出限界により検出されることができた。発光シグナルが、ストレプトアビジン−ビオチン結合によるＦＲＥＴに起因して起こり、溶液中の乱反射に起因したものでないことを示すために、単なるＴｂ−ＬＣを用いてコントロール実験を行なった。
【００５１】
図７Ａ〜図７Ｅは、ＱＤｓの別々の発光波長にて測定された５個全てのＱＤｓの強度割合（１００〜１２００μｓの時間枠内においてＱＤドナーの強度をＴｂアクセプターの強度で割ったもの）を示す。四角は、ビオチンとストレプトアビジンとの結合、及び同時に生じるＴｂから別々のＱＤｓへのＥＴによる、相対比（ゼロ濃度にて統一されるよう標準化された）の強い増加を示す。丸は、Ｔｂをストレプトアビジンなしで使用したコントロール実験を示す。割合の増加はここでは見ることができず、これは、バイオアッセイにおいて、ＥＴがビオチンとストレプトアビジンとの結合により可能になることを示す。検出限界（ゼロ濃度にて３０回の測定における３重の標準偏差を、増加割合曲線における直線の部分の傾きで割ったもの）は、同一試料において全てサブピコモルであり、これはアクセプターとしてＱＤｓを用いた多重化バイオアッセイの高い感受性を示す。
【００５２】
明細書、特許請求の範囲及び図面の少なくとも１つに開示された特徴は、独立して利用される種々の実施形態において、またはこれらの種々の組み合わせにおいて、本発明を実現するための材料であってもよい。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】図１は、アクセプターとして量子ドット（ＱＤｓ）を用いた多重化エネルギー移動（ＥＴ）バイオアッセイの原理の概略図を示す。
【図２】図２は、カラー多重化のための１つのドナー（Ｄ）および複数のアクセプター（Ａ１〜ＡＸ）で標識された複数の抗体又はアプタマー（１〜Ｘ ａ／ｂ−マーカータンパク質１〜Ｘに特異的）を用いた同種イミノアッセイの原理の概略図を示す。
【図３】図３は、ドナー（Ｄ）とアクセプター（Ａ）との間の距離が重要な、分光学的ルーラー測定を示す。
【図４】図４は、タンパク質のストレプトアビジンを量子ドットに結合させるステップの概略図を示す。
【図５】図５は、Ｔｂランタニド複合体（ＬＣ）及び５個のＱＤｓの発光スペクトルを示す。
【図６】図６は、アクセプターとしてのＴｂ複合体を有するアクセプターとして使用したときの、種々のＱＤｓの分光学的データを示す。
【図７Ａ】図７Ａは、ＱＤｓの別々の発光波長にて測定された５個のＱＤｓの強度割合（１００〜１２００μｓの時間枠内においてＱＤドナーの強度をＴｂアクセプターの強度で割ったもの）を示す。
【図７Ｂ】図７Ｂは、ＱＤｓの別々の発光波長にて測定された５個のＱＤｓの強度割合（１００〜１２００μｓの時間枠内においてＱＤドナーの強度をＴｂアクセプターの強度で割ったもの）を示す。
【図７Ｃ】図７Ｃは、ＱＤｓの別々の発光波長にて測定された５個のＱＤｓの強度割合（１００〜１２００μｓの時間枠内においてＱＤドナーの強度をＴｂアクセプターの強度で割ったもの）を示す。
【図７Ｄ】図７Ｄは、ＱＤｓの別々の発光波長にて測定された５個のＱＤｓの強度割合（１００〜１２００μｓの時間枠内においてＱＤドナーの強度をＴｂアクセプターの強度で割ったもの）を示す。
【図７Ｅ】図７Ｅは、ＱＤｓの別々の発光波長にて測定された５個のＱＤｓの強度割合（１００〜１２００μｓの時間枠内においてＱＤドナーの強度をＴｂアクセプターの強度で割ったもの）を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
エネルギー移動ドナー、スペクトル的に異なる複数の量子ドット種、及び検体を含む試料を提供するステップであって、
上記検体は、上記エネルギー移動ドナーと第１の量子ドット種とにより提供される第１のエネルギー移動ドナー−アクセプターの組におけるエネルギー移動を仲介するように構成されており、
上記エネルギー移動ドナーは、上記第１のエネルギー移動ドナー−アクセプターの組においてエネルギー移動ドナーとして作用するように構成されており、かつ、
上記第１の量子ドット種は、上記第１のエネルギー移動ドナー−アクセプターの組においてエネルギー移動アクセプターとして作用するように構成されている、ステップと、
上記試料に対し励起光源から励起光を照射するステップと、
上記第１のエネルギー移動ドナー−アクセプターの組において、上記励起光により励起された上記エネルギー移動ドナーから上記第１の量子ドット種へと励起エネルギーが移動するステップであって、当該エネルギー移動が上記検体によって仲介されるステップと、
上記第１の量子ドット種が上記励起エネルギーを受け取った後に放射した発光を検出するステップとを含むことを特徴とする、多重化ＦＲＥＴ（Forster Resonance Energy Transfer）解析により試料中の検体を検出する方法。
【請求項２】
上記検体と異なるさらなる検体を含む試料を提供するステップであって、
上記さらなる検体は、上記エネルギー移動ドナーと、上記第１の量子ドット種とは異なる第２の量子ドット種とにより提供される第２のエネルギー移動ドナー−アクセプターの組におけるエネルギー移動を仲介するように構成されており、
上記エネルギー移動ドナーは、上記第２のエネルギー移動ドナー−アクセプターの組においてエネルギー移動ドナーとして作用するように構成されており、かつ、
上記第２の量子ドット種は、上記第２のエネルギー移動ドナー−アクセプターの組においてエネルギー移動アクセプターとして作用するように構成されている、ステップと、
上記第２のエネルギー移動ドナー−アクセプターの組において、上記励起光により励起された上記エネルギー移動ドナーから上記第２の量子ドット種へと励起エネルギーが移動するステップであって、当該エネルギー移動が上記さらなる検体によって仲介されるステップと、
上記第２の量子ドット種が上記励起エネルギーを受け取った後に放射した発光を検出するステップであって、当該第２の量子ドット種により放射された発光が、上記第１の量子ドット種により放射される発光とはスペクトル的に相違するステップとをさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
上記エネルギー移動ドナーとは異なるさらなるエネルギー移動ドナーを含む試料を提供するステップであって、
上記検体は、上記さらなるエネルギー移動ドナーと、上記第１の量子ドット種、上記第２の量子ドット種、及び第３の量子ドット種のいずれかとにより提供されるさらなるエネルギー移動ドナー−アクセプターの組におけるエネルギー移動を仲介するように構成されており、
上記さらなるエネルギー移動ドナーは、上記さらなるエネルギー移動ドナー−アクセプターの組においてエネルギー移動ドナーとして作用するように構成されており、かつ、
上記第１の量子ドット種、上記第２の量子ドット種又は上記第３の量子ドット種は、上記さらなるエネルギー移動ドナー−アクセプターの組においてエネルギー移動アクセプターとして作用するように構成されている、ステップと、
上記さらなるエネルギー移動ドナー−アクセプターの組において、上記励起光により励起された上記さらなるエネルギー移動ドナーから上記第１の量子ドット種、上記第２の量子ドット種及び上記第３の量子ドット種のいずれかへと励起エネルギーが移動するステップであって、当該エネルギー移動が上記検体によって仲介されるステップと、
上記第１の量子ドット種、上記第２の量子ドット種及び上記第３の量子ドット種のいずれかが上記励起エネルギーを受け取った後に放射した発光を検出するステップであって、当該発光が、上記第１のエネルギー移動ドナー−アクセプターの組において上記第１の量子ドット種により放射される発光、及び上記第２のエネルギー移動ドナー−アクセプターの組において上記第２の量子ドット種により放出される発光とはスペクトル的に相違するステップとをさらに含むことを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
以下のうちの少なくとも２つを同時に検出するステップをさらに含むことを特徴とする請求項２又は３に記載の方法：
上記第１のエネルギー移動ドナー−アクセプターの組において上記第１の量子ドット種により放射される発光；
上記第２のエネルギー移動ドナー−アクセプターの組において上記第２の量子ドット種により放射される発光；及び
上記さらなるエネルギー移動ドナー−アクセプターの組において上記第１の量子ドット種、上記第２の量子ドット種及び上記第３の量子ドット種のいずれかにより放射される発光。
【請求項５】
少なくとも３つの異なる検体を含む試料を提供するステップをさらに含み、
上記検体のそれぞれが、上記試料中のエネルギー移動ドナー−アクセプターの組におけるエネルギー移動を選択的に仲介するように構成されていることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
検出された上記発光から構造上の情報を引き出すステップをさらに含むことを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
上記構造上の情報を引き出すステップは、上記第１のエネルギー移動ドナー−アクセプターの組、上記第２のエネルギー移動ドナー−アクセプターの組、及び上記さらなるエネルギー移動ドナー−アクセプターの組のうちの少なくとも１つにおける励起エネルギー移動のためのエネルギー移動ドナー−アクセプターの距離を決定するステップを含むことを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項８】
上記励起エネルギー移動のためのエネルギー移動ドナー−アクセプターの距離を決定するステップは、約１ｎｍ〜約２０ｎｍの間でエネルギー移動ドナー−アクセプターの距離を決定するステップを含むことを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項９】
上記励起エネルギー移動のためのエネルギー移動ドナー−アクセプターの距離を決定するステップは、以下の構造の群から選択される構造においてエネルギー移動ドナー−アクセプターの距離を決定するステップを含むことを特徴とする請求項７又は８に記載の方法：ＤＮＡもしくはＲＮＡ構造、タンパク質折り畳み構造又は細胞構造などの、化学的構造、生化学的構造、及び生物学的構造。
【請求項１０】
検出された上記発光から濃度情報を引き出すステップをさらに含むことを特徴とする請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
上記試料を標識試料として提供するステップをさらに含み、
上記標識試料において、スペクトル的に異なる複数の量子ドット種が、以下のラベリング種の群から選択される種々のラベリング種に対する標識化に用いられていることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法：抗体、アプタマー、抗原、タンパク質、ホルモン、ＤＮＡ、ＲＮＡ、細胞及びウイルスなどの、化学的構造及び生体分子。
【請求項１２】
上記エネルギー移動ドナー及び上記さらなるエネルギー移動ドナーの少なくとも１つにより放射された発光を検出するステップをさらに含むことを特徴とする請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
特に請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法に使用するための、多重化ＦＲＥＴ解析において１つ以上の検体を検出するためのキットであって、
スペクトル的に異なる複数の量子ドット種及び少なくとも１つのエネルギー移動ドナーを含み、
上記スペクトル的に異なる複数の量子ドット種及び上記少なくとも１つのエネルギー移動ドナーは、１つ以上の検体を含む試料中に１つ以上のエネルギー移動ドナー−アクセプターの組を提供するように構成されており、かつ、
上記１つ以上のエネルギー移動ドナー−アクセプターの組において、上記少なくとも１つのエネルギードナーの光励起により、上記１つ以上の検体によってエネルギー移動が仲介されることを特徴とするキット。
【請求項１４】
上記キットがイムノアッセイ型キットとして提供されることを特徴とする請求項１３に記載のキット。
【請求項１５】
上記キットが距離測定キットとして提供されることを特徴とする請求項１２又は１３に記載のキット。
【請求項１】
エネルギー移動ドナー、スペクトル的に異なる複数の量子ドット種、及び検体を含む試料を提供するステップであって、
上記検体は、上記エネルギー移動ドナーと第１の量子ドット種とにより提供される第１のエネルギー移動ドナー−アクセプターの組におけるエネルギー移動を仲介するように構成されており、
上記エネルギー移動ドナーは、上記第１のエネルギー移動ドナー−アクセプターの組においてエネルギー移動ドナーとして作用するように構成されており、かつ、
上記第１の量子ドット種は、上記第１のエネルギー移動ドナー−アクセプターの組においてエネルギー移動アクセプターとして作用するように構成されている、ステップと、
上記試料に対し励起光源から励起光を照射するステップと、
上記第１のエネルギー移動ドナー−アクセプターの組において、上記励起光により励起された上記エネルギー移動ドナーから上記第１の量子ドット種へと励起エネルギーが移動するステップであって、当該エネルギー移動が上記検体によって仲介されるステップと、
上記第１の量子ドット種が上記励起エネルギーを受け取った後に放射した発光を検出するステップとを含むことを特徴とする、多重化ＦＲＥＴ（Forster Resonance Energy Transfer）解析により試料中の検体を検出する方法。
【請求項２】
上記検体と異なるさらなる検体を含む試料を提供するステップであって、
上記さらなる検体は、上記エネルギー移動ドナーと、上記第１の量子ドット種とは異なる第２の量子ドット種とにより提供される第２のエネルギー移動ドナー−アクセプターの組におけるエネルギー移動を仲介するように構成されており、
上記エネルギー移動ドナーは、上記第２のエネルギー移動ドナー−アクセプターの組においてエネルギー移動ドナーとして作用するように構成されており、かつ、
上記第２の量子ドット種は、上記第２のエネルギー移動ドナー−アクセプターの組においてエネルギー移動アクセプターとして作用するように構成されている、ステップと、
上記第２のエネルギー移動ドナー−アクセプターの組において、上記励起光により励起された上記エネルギー移動ドナーから上記第２の量子ドット種へと励起エネルギーが移動するステップであって、当該エネルギー移動が上記さらなる検体によって仲介されるステップと、
上記第２の量子ドット種が上記励起エネルギーを受け取った後に放射した発光を検出するステップであって、当該第２の量子ドット種により放射された発光が、上記第１の量子ドット種により放射される発光とはスペクトル的に相違するステップとをさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
上記エネルギー移動ドナーとは異なるさらなるエネルギー移動ドナーを含む試料を提供するステップであって、
上記検体は、上記さらなるエネルギー移動ドナーと、上記第１の量子ドット種、上記第２の量子ドット種、及び第３の量子ドット種のいずれかとにより提供されるさらなるエネルギー移動ドナー−アクセプターの組におけるエネルギー移動を仲介するように構成されており、
上記さらなるエネルギー移動ドナーは、上記さらなるエネルギー移動ドナー−アクセプターの組においてエネルギー移動ドナーとして作用するように構成されており、かつ、
上記第１の量子ドット種、上記第２の量子ドット種又は上記第３の量子ドット種は、上記さらなるエネルギー移動ドナー−アクセプターの組においてエネルギー移動アクセプターとして作用するように構成されている、ステップと、
上記さらなるエネルギー移動ドナー−アクセプターの組において、上記励起光により励起された上記さらなるエネルギー移動ドナーから上記第１の量子ドット種、上記第２の量子ドット種及び上記第３の量子ドット種のいずれかへと励起エネルギーが移動するステップであって、当該エネルギー移動が上記検体によって仲介されるステップと、
上記第１の量子ドット種、上記第２の量子ドット種及び上記第３の量子ドット種のいずれかが上記励起エネルギーを受け取った後に放射した発光を検出するステップであって、当該発光が、上記第１のエネルギー移動ドナー−アクセプターの組において上記第１の量子ドット種により放射される発光、及び上記第２のエネルギー移動ドナー−アクセプターの組において上記第２の量子ドット種により放出される発光とはスペクトル的に相違するステップとをさらに含むことを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
以下のうちの少なくとも２つを同時に検出するステップをさらに含むことを特徴とする請求項２又は３に記載の方法：
上記第１のエネルギー移動ドナー−アクセプターの組において上記第１の量子ドット種により放射される発光；
上記第２のエネルギー移動ドナー−アクセプターの組において上記第２の量子ドット種により放射される発光；及び
上記さらなるエネルギー移動ドナー−アクセプターの組において上記第１の量子ドット種、上記第２の量子ドット種及び上記第３の量子ドット種のいずれかにより放射される発光。
【請求項５】
少なくとも３つの異なる検体を含む試料を提供するステップをさらに含み、
上記検体のそれぞれが、上記試料中のエネルギー移動ドナー−アクセプターの組におけるエネルギー移動を選択的に仲介するように構成されていることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
検出された上記発光から構造上の情報を引き出すステップをさらに含むことを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
上記構造上の情報を引き出すステップは、上記第１のエネルギー移動ドナー−アクセプターの組、上記第２のエネルギー移動ドナー−アクセプターの組、及び上記さらなるエネルギー移動ドナー−アクセプターの組のうちの少なくとも１つにおける励起エネルギー移動のためのエネルギー移動ドナー−アクセプターの距離を決定するステップを含むことを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項８】
上記励起エネルギー移動のためのエネルギー移動ドナー−アクセプターの距離を決定するステップは、約１ｎｍ〜約２０ｎｍの間でエネルギー移動ドナー−アクセプターの距離を決定するステップを含むことを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項９】
上記励起エネルギー移動のためのエネルギー移動ドナー−アクセプターの距離を決定するステップは、以下の構造の群から選択される構造においてエネルギー移動ドナー−アクセプターの距離を決定するステップを含むことを特徴とする請求項７又は８に記載の方法：ＤＮＡもしくはＲＮＡ構造、タンパク質折り畳み構造又は細胞構造などの、化学的構造、生化学的構造、及び生物学的構造。
【請求項１０】
検出された上記発光から濃度情報を引き出すステップをさらに含むことを特徴とする請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
上記試料を標識試料として提供するステップをさらに含み、
上記標識試料において、スペクトル的に異なる複数の量子ドット種が、以下のラベリング種の群から選択される種々のラベリング種に対する標識化に用いられていることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法：抗体、アプタマー、抗原、タンパク質、ホルモン、ＤＮＡ、ＲＮＡ、細胞及びウイルスなどの、化学的構造及び生体分子。
【請求項１２】
上記エネルギー移動ドナー及び上記さらなるエネルギー移動ドナーの少なくとも１つにより放射された発光を検出するステップをさらに含むことを特徴とする請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
特に請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法に使用するための、多重化ＦＲＥＴ解析において１つ以上の検体を検出するためのキットであって、
スペクトル的に異なる複数の量子ドット種及び少なくとも１つのエネルギー移動ドナーを含み、
上記スペクトル的に異なる複数の量子ドット種及び上記少なくとも１つのエネルギー移動ドナーは、１つ以上の検体を含む試料中に１つ以上のエネルギー移動ドナー−アクセプターの組を提供するように構成されており、かつ、
上記１つ以上のエネルギー移動ドナー−アクセプターの組において、上記少なくとも１つのエネルギードナーの光励起により、上記１つ以上の検体によってエネルギー移動が仲介されることを特徴とするキット。
【請求項１４】
上記キットがイムノアッセイ型キットとして提供されることを特徴とする請求項１３に記載のキット。
【請求項１５】
上記キットが距離測定キットとして提供されることを特徴とする請求項１２又は１３に記載のキット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図７Ｃ】
【図７Ｄ】
【図７Ｅ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図７Ｃ】
【図７Ｄ】
【図７Ｅ】
【公表番号】特表２０１２−５１５９０５（Ｐ２０１２−５１５９０５Ａ）
【公表日】平成２４年７月１２日（２０１２．７．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５４６６９４（Ｐ２０１１−５４６６９４）
【出願日】平成２２年１月２２日（２０１０．１．２２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／０００３８８
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０８４０１５
【国際公開日】平成２２年７月２９日（２０１０．７．２９）
【出願人】（５０６０９４５６３）ウニベルジテート ポツダム (4)
【出願人】（５１１１７２０７０）
【氏名又は名称原語表記】ＣＮＲＳ
【住所又は居所原語表記】２３ ｒｕｅ ｄｕｅ Ｌｏｅｓｓ，ＢＰ ２０，Ｆ−６７０３７ Ｓｔｒａｓｂｏｕｒｇ Ｆｒａｎｃｅ
【出願人】（５０８０５８１９２）
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年７月１２日（２０１２．７．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１月２２日（２０１０．１．２２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／０００３８８
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０８４０１５
【国際公開日】平成２２年７月２９日（２０１０．７．２９）
【出願人】（５０６０９４５６３）ウニベルジテート ポツダム (4)
【出願人】（５１１１７２０７０）
【氏名又は名称原語表記】ＣＮＲＳ
【住所又は居所原語表記】２３ ｒｕｅ ｄｕｅ Ｌｏｅｓｓ，ＢＰ ２０，Ｆ−６７０３７ Ｓｔｒａｓｂｏｕｒｇ Ｆｒａｎｃｅ
【出願人】（５０８０５８１９２）
【Ｆターム（参考）】
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