大部分がグリカンで二触角性バイシアリル化され、フコース化されていない形態の遺伝子組み換えプロセス及び形質転換ＦＶＩＩの組成物
【課題】本発明は、遺伝子組み換えプロセス及び形質転換ＦＶＩＩ組成物に関し、組成物を医薬品として利用する一方、組成物の調製を行う方法を実現することを目的としている。
【解決手段】このため、組成物の各ＦＶＩＩ分子はＮグリコシル化部位に結合されたグリカン形態を有しており、組成物のすべてのＦＶＩＩ分子の中で、二触角性でバイシアリル化されフコース化されていない形態が過半数であることを特徴としている。
【解決手段】このため、組成物の各ＦＶＩＩ分子はＮグリコシル化部位に結合されたグリカン形態を有しており、組成物のすべてのＦＶＩＩ分子の中で、二触角性でバイシアリル化されフコース化されていない形態が過半数であることを特徴としている。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明において、ＦＶＩＩ（「因子ＶＩＩ」ともいう。）はビタミンＫ依存性糖蛋白質で、その活性化された形態（ＦＶＩＩａ）では、カルシウムと組織因子の存在下で因子Ｘ及び因子ＩＸを活性化させる凝固プロセスに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ＦＶＩＩは分子量が５０ｋＤａ程度の４０６個の残基で構成される単一ペプチド鎖の形態で分泌される。
ＦＶＩＩは４つの明確な構造領域を含んでおり、それはＮ末端γカルボキシル（Ｇｌａ）領域、２つの『外皮成長因子（ＥＧＦ）状』領域、そしてセリン・プロテアーゼ領域である。
ＦＶＩＩからＦＶＩＩａへの活性化は結合Ａｒｇ152−Ｉｌｅ153 （アルギニン１５２−イソロイシン１５３）の断裂で特徴付けられる。
ＦＶＩＩａは単一のジスルフィド架橋（Ｃｙｓ135 −Ｃｔｓ262 ）で結合された分子量が約２０ｋＤａの１５２個のアミノ酸の軽鎖と分子量が約３０ｋＤａの２５４個のアミノ酸の重鎖で構成されている。
【０００３】
血漿ＦＶＩＩａ（ＦＶＩＩａ、ｐ）はいくつかの翻訳後修飾を有しており、最初の１０個のグルタミン酸はγカルボキシル化されており、Ａｓｐ63 （アスパラギン酸）は部分的に水酸化されており、Ｓｅｒ52（セリン５２）とＳｅｒ60（セリン６０）はＯ−グリコシル化されており、それぞれグルコース（キシロース）0−2 及びフコース部位を担持しており、Ａｓｎ145 （アスパラギン１４５）及びＡｓｎ322 （アスパラギン３２２）はＮ−グリコシル化されており、主に二触角性のバイシアリル化された複合グリカン形態を有している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】欧州特許第０、３４６、２４１
【特許文献２】欧州特許第０、５４７、９３２
【特許文献３】欧州特許第０、２００、４２１
【特許文献２】フランス特許第０６０４８７２
【特許文献３】米国特許第５、９９７、８６４
【特許文献３】米国特許第６、９０３、０６９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ところで、従来において、ＦＶＩＩは因子ＶＩＩＩ欠乏症（タイプＡ血友病）あるいは因子ＩＸ欠乏症を示す血友病（タイプＢ血友病）の患者、あるいはさらに凝血因子欠乏症、例えば先天性ＦＶＩＩ欠乏症を示す患者の治療のために用いられる。
ＦＶＩＩは脳血管損傷の治療のためにも使用が推奨される。
従って、注射用のＦＶＩＩａ濃縮物を利用できるようにすることが必要である。
【０００６】
ＦＶＩＩａ濃縮物を得るための最も古い方法は分留によって得られる血漿蛋白質から得られるＦＶＩＩａの精製によって行われていた。
【０００７】
この目的のために、文献欧州特許第０、３４６、２４１は吸収後に得られるＦＶＩＩａを多量に含む画分を調製し、次に、ＦＶＩＩとＦＶＩＩａ、さらに因子ＩＸ（ＦＩＸ）、Ｘ（ＦＸ）、そしてＩＩ（ＦＩＩ）などの蛋白質を含む血漿蛋白質の分留副産物、つまり、ＰＰＳＢ（Ｐ＝プロトロンビンあるいはＦＶＩＩ、Ｐ＝プロコンベルチンあるいはＦＶＩＩ、Ｓ＝スチュアート因子あるいはＦＸ、及びＢ＝抗血友病因子ＢあるいはＦＩＸ）の予備溶出液の溶出について述べている。
このプロセスの欠陥は、得られるＦＶＩＩ が依然として微量の凝固因子を含んでいることである。
【０００８】
同様に、文献欧州特許第０、５４７、９３２はビタミンＫ依存因子及びＦＶＩＩＩをほとんど含んでいない高純度ＦＶＩＩａ濃縮物の製造プロセスを開示している。
このプロセスで得られるＦＶＩＩはその純度にもかかわらず、残留血栓形成性活性を示す。
【０００９】
これらのプロセスの主な欠陥は、生成物の収量が非常に低いことである。
【００１０】
さらに、血液提供者から提供される血漿の体積に限界がある。
【００１１】
従って、１９８０年代以後、ヒト因子ＦＶＩＩをコードするＤＮＡが単離され（ハゲン（Ｈａｇｅｎ）ら、（１９８６）；Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ； Ａｐｒ ８３（８）：２４１２−６）、哺乳動物ＢＨＫ細胞（生まれたばかりのハムスターの腎臓）（文献欧州特許０、２００、４２１）で発現された。
【００１２】
本出願人によって出願されたフランス特許第０６０４８７２も形質転換された動物におけるＦＶＩＩａの製造について述べている。
【００１３】
これらの製造方法で得られた蛋白質はウイルスあるいはその他の病原性作用因子による汚染の面でより安全なものである。
さらに、こうしたプロセスは一次配列、つまり、ヒトの一次配列と同じ異なったアミノ酸間の連鎖を有する蛋白質を得ることを可能にする。
しかしながら、ヒト血漿性ＦＶＩＩは複雑な翻訳後修飾を有しており、最初の１０個のグルタミン酸はγカルボキシル化されており、Ａｓｐ63 （アスパラギン酸６３）は部分的に水酸化されており、Ｓｅｒ52（セリン５２）とＳｅｒ60（セリン６０）はＯ−グリコシル化されており、それぞれグルコース（キシロース）0−2 及びフコース部位を担持しており、Ａｓｎ145 （アスパラギン１４５）及びＡｓｎ322 （アスパラギン３２２）はＮ−グリコシル化されており、主に二触角性のバイシアリル化された複合グリカン形態を有している。
特に、Ｎ−グリカン（アスパラギンに結合されたグリカン）の付加は蛋白質の正しい折り重なり、イン・ビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ、「細胞内で」と換言できる。）及びイン・ビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ、「生体内で」と換言できる。）での安定性、生物活性、そして、生成された異質蛋白質の薬力学的特性（例えば、生物学的利用性）などに対して特に重要である。
従って、すべての翻訳後修飾の変差、あるいはその一部は前記蛋白質を一方では不活性化する危険性、他方では免疫源性にする危険性に曝すことになる。
【００１４】
さて、現在の遺伝子組み換えプロセス及び形質転換ＦＶＩＩの組成物は、ヒトの系とは違った系で発現されるので、ヒトの血漿性ＦＶＩＩのグリコシル化とは異なったグリコシル化を示し、そのことがその遺伝子組み換え蛋白質に向けられた抗体を発生させ、従ってヒトの血漿から生成されたヒトＦＶＩＩのものより有効性を低下させてしまう可能性がある。
【００１５】
従って、ヒトの血漿から精製されたヒトＦＶＩＩに近い機能的特性を有するＦＶＩＩａの治療的あるいは予防的組成物と、この蛋白質を大量に提供するというニーズを満たし得るその製造法を開発する必要性がある。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
そこで、この発明は、上述不都合を除去するために、それぞれの分子はＮグリコシル化部位に結合したグリカン形態を含んでいる遺伝子組み換えあるいは形質転換されたＦＶＩＩ（因子ＶＩＩ）の組成物で、前記組成物のＦＶＩＩのすべての分子のうちで、二触角性でバイシアリル化されておりフコース化されていないグリカン形態がその組成物のＦＶＩＩのＮグリコシル化部位に結合したすべてのグリカン形態と比較して多数であることを特徴とする。
また、それぞれの分子はＮグリコシル化部位に結合したグリカン形態を含んでいる遺伝子組み換えあるいは形質転換されたＦＶＩＩ（因子ＶＩＩ）の組成物で、前記組成物のＦＶＩＩのすべての分子の中で多数が二触角性のバイシリアル化されたグリカン形態であることを特徴とする組成物を調製するプロセスで、シアリルトランスフェラーゼの活性を可能にするために、シアル酸をシアル酸ドナー基質からＦＶＩＩに移行すると同時に、前記バイシアリル化された形態が増大して多数になるのに十分な時間と条件下で、適切な反応培養液内で部分的にシアリル化された形質転換された、あるいは遺伝子組み換えＦＶＩＩをシアル酸ドナー基質及びシアリルオランスフェラーゼと接触させるステップを含んでいる、ことを特徴とする。
【発明の効果】
【００１７】
以上詳細に説明した如くこの発明によれば、大部分がグリカンで二触角性バイシアリル化され、フコース化されていない形態の遺伝子組み換えプロセスを実現するとともに、形質転換ＦＶＩＩ組成物を提供し、ニーズを満たし得る。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、実施例１で得られるＦＶＩＩの組成物の抽出と精製のプロセスを示す図である。（実施例１）
【図２】図２は、Ｎ−グリコシル化部位を担持するペプチドの解析質量分光ＥＳＩを示す図である。（実施例３）
【図３】図３は、ＰＮＧａｓｅ ＰによるＦＶＩＩの脱グリコシル化後のエレクトロフェログラムＨＰＣＥ−ＬＩＦを示す図であり、上側はエレクトロフェログラム、ＦＶＩＩａ、ｐ、中央は両方ともエレクトロフェログラム、ＦＶＩＩ−Ｔｇ、下側はエレクトロフェログラム、ＦＶＩＩａ、ｒを示す。（実施例４）
【図４】図４は、ＮＰ−ＨＰＬＣによるＦＶＩＩの特徴づけを示す図であり、上側はクロマトグラム：ＦＶＩＩａ、ｐ、中央はクロマトグラム：ＦＶＩＩ−Ｔｇ、下側はクロマトグラム：ＦＶＩＩａ、ｒを示す。（実施例５）
【図５】図５は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳによる、ＦＶＩＩ−Ｔｇの過半数のグリカン形態に関する識別を示す図である。（実施例６）
【図６】図６は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳによる、ＦＶＩＩａ、ｒの過半数のグリカン形態に関する識別を示す図である。（実施例６）
【図７】図７は、イン・ビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ、「細胞内で」と換言できる。）での再シアリル化のＨＰＣＥ−ＬＩＦ分析を示す図であり、上側は再シアリル化後のＦＶＩＩ−Ｔｇのオリゴ糖マップ、下側は天然のＦＶＩＩ−Ｔｇのオリゴ糖マップを示す。（実施例８）
【図８】図８は、二触角性のバイシアリル化されフコース化されていない形態（Ａ２）とフコース化された形態（Ａ２Ｆ）の割合の時間変化で示すＦＶＵＵ−Ｔｇのシアリル化の動態を示す図である。（実施例８）
【図９】図９は、ウサギの形質転換され再シアリル化されていないＦＶＩＩ（ＦＶＩＩＴｇＮＲＳ）と形質転換され再シアリル化されたＦＶＩＩ（ＦＶＩＩＴｇＲＳ）との間の予備的な薬力学的比較研究の結果：除去の半対数曲線を示す図である。（実施例９）
【発明を実施するための形態】
【００１９】
従って、本発明は遺伝子組み換えプロセス及び形質転換ＦＶＩＩの組成物に関連しており、その組成物のＦＶＩＩの各分子はＮ−グリコシル化部位に結合したグリカン形態を含んでおり、前記組成物の因子ＶＩＩのすべての分子の中で、過半数は二触角性のバイシアリル化されフコース化はされていないグリカン形態で、すべてのグリカンはその組成物の因子ＶＩＩのＮ−グリコシル化部位に結合した形態であることを特徴としている。
【００２０】
驚くべきことに、本出願人はその過半数が二触角性のバイシアリル化されフコース化はされていないグリカン形態である遺伝子組み換えプロセス及び形質転換ＦＶＩＩの組成物が、バイシアリル化された形態の割合がより低い遺伝子組み換えプロセス及び形質転換ＦＶＩＩと比較して、つまりその過半数が二触角性のモノシアリル化されフコース化はされていない形態である遺伝子組み換えあるいは形質転換ＦＶＩＩの組成物と比較して、生物学的有用性が高く、クリアランスが少なく、そしてより高い安定性を示すことを発見した。
【００２１】
従って、本発明のＦＶＩＩは、バイシアリル化された形態がより低い、つまり、過半数がモノシアリル化されている形態の遺伝子組み換えプロセス及び形質転換ＦＶＩＩの組成物と比較して、患者に対する投与頻度はより低く、投与量もより少なくて済むと想定することができる。
【００２２】
生物学的有用性とは投与されたＦＶＩＩのうち血液循環中に拡散され、特に出血箇所に到達する割合に関している。
【００２３】
クリアランスとは完全に精製された理論的体積の画分を意味しており、一定の時間当たりそれ以上のＦＶＩＩが含まれないことを意味している。
言い換えると、これは一定の時間間隔の中で前記物質がまったく含まれない流体の仮定量に対応する。
【００２４】
安定性とはその有効期間全体の間その化学的、物理的、微生物学的、及び生物薬学的属性を一定の限度以内に保つことができる能力を意味している。
【００２５】
『二触角性のバイシアリル化されフコース化はされていない形態』とは、以下の形態を意味している。
【００２６】
形態Ａ２（二触角性のバイシアリル化されフコース化はされていない形態）
【００２７】
【数１】
【００２８】
これらのグリカン形態はアスパラギン１４５（Ａｓｎ１４５）とアスパラギン３２２（Ａｓｎ３２２）で構成されるＮ−グリコシル化部位に結合されている。
実際、本発明によるＦＶＩＩは、ヒトＦＶＩＩの場合と同様に、位置１４５と３２２の２つのＮ−グリコシル化部位と、位置５２と６０の２つのＯ−グリコシル化部位で構成されている。
１つのＮ−グリコシル化部位において、オリゴ糖鎖が１つのアスパラギン（Ｎ結合）に結合されている。
１つのＯ−グリコシル化部位において、オリゴ糖鎖はセリンに結合されている。
だから、本発明によるＦＶＩＩの各分子は２つのオリゴ糖Ｎ結合鎖で構成されている。
しかしながら、前記組成物のＦＶＩＩの分子は均一なグリコシル化は示さない。
つまり、すべてのＮ結合オリゴ糖鎖は同一ではない。
異なったグリカン形態の混合物である。
【００２９】
実際、すべてのＦＶＩＩは、血漿性、遺伝子組み換えプロセス、及び形質転換のいずれであれ、ＦＶＩＩのいくつかの蛋白質の混合物の形態で存在しており、これらのたちはそれらのグリコシル化と異なった名前で呼ばれているグリコ形態において違いを示す。
このグリコシル化は異なった細胞成分間のＦＶＩＩ蛋白質の移送に伴って細胞性オルガナイトによって行われる翻訳後修飾によるものである。
この生化学的修飾は蛋白質を非常に深く修飾するので、最終的な蛋白質は完全に構造化されてしまい、従って活性であり、生物によって良く受け入れられるようになっている。
この化学的修飾は蛋白質の活性の調整に関与し、さらに、その局所化にも関与している。
従って、ＦＶＩＩの組成物全体において、さらにはその組成物のＮ結合オリゴ糖鎖全体において、そのＦＶＩＩ組成物内に存在している各グリカン形態と各糖の割合は定量とすることができる。
【００３０】
Ｏ−グリコシル化は本願において、異なったグリカンの割合については考慮しない。
【００３１】
『ＦＶＩＩの組成物』とは、その分子全体だけがＦＶＩＩであり、好ましくは活性化されている場合の組成物を意味している。
【００３２】
上記組成物のＦＶＩＩの各分子は、同じ一次配列を示すが、グリコシル化は分子ごとに異なっている。
従って、『ＦＶＩＩの組成物』とはそのグリカン形態の含有量によって特徴付けられる同じ一次配列を有する分子の混合物のことを意味する。
本発明においては、『ＦＶＩＩ』という表現と『ＦＶＩＩの組成物』という表現とは同等である。
その結果、本発明においては、『ＦＶＩＩ』とはＦＶＩＩの分子自体を意味することもあれば、上に述べたような特徴を有するＦＶＩＩ分子の混合物を意味する場合もある。
【００３３】
本発明によるＦＶＩＩの組成物は主として二触角性の、バイシアリル化され、そしてフコース化されていないグリカン形態を含んでいるＦＶＩＩの組成物のことである。
これは、その組成物のすべてのＮ−結合オリゴ糖類のうちで、つまり、因子ＦＶＩＩのＮグリコシル化部位の結合しているすべてのグリカン形態のうちで、過半数が二触角性の、バイシアリル化され、そしてフコース化されていないグリカン形態であることを意味している。
【００３４】
好適に、二触角性の、バイシアリル化され、そしてフコース化されていないグリカン形態の割合は３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％あるいは９５％以上である。
特に好適なのは、この二触角性の、バイシアリル化され、そしてフコース化されていないグリカン形態の割合が４５％以上の場合である。
さらに好適なのはこの二触角性の、バイシアリル化され、そしてフコース化されていないグリカン形態の割合が４５％から６５％の、さらに好ましくは５０％から６０％の間の範囲にある場合である。
【００３５】
シアリル化された種の割合はＨＰＣＥ−ＬＩＦ（高性能毛細管電気泳動レーザー誘発蛍光）分析、あるいはＮＰ−ＨＰＬＣ（通常相高性能液体クロマトグラフィ）を異なったグリカンに対応するピークの面積を測定するか、あるいは当業者に公知のいずれかの方法を用いた定量を合わせて行うことで測定することができる。
【００３６】
本発明によるＦＶＩＩの組成物は、少数部分として二触角性の、モノシアリル化された、及び三触角性の、さらにはシアル酸を示さない中性形態を含んでいてもよい。
【００３７】
『遺伝子組み換えされた、あるいは形質転換されたＦＶＩＩ』とは、細胞によってつくりだされ、どのＤＮＡが遺伝子組み換えによって修飾され、ＦＶＩＩの分子を発現すると同時に上に述べたようなグリコシル化の特徴と示すようになった遺伝子工学によって得られるすべてのＦＶＩＩを意味している。
【００３８】
従って、本発明によるＦＶＩＩは細胞宿主内あるいは形質転換された動物の体内でＦＶＩＩをコードするＤＮＡ分子を転写、翻訳することによって得られる。
本発明によるこの遺伝子組み換えあるいは形質転換ＦＶＩＩは生物系で蛋白質の発現を可能にする当業者に公知の標準的な技術によって得ることが出来る。
【００３９】
より具体的には、『遺伝子組み換えＶＩＩ』とは遺伝子組み換えによって得られ、培養された細胞株内で発現されたいずれかのＦＶＩＩを意味する。
例えば、以下の細胞株を挙げることができる。
ＢＨＫ（ベビー・ハムスターの腎臓）及び具体的にはＢＨＫ ｔｋ−ｔｓ１３ （ＣＲＬ１０３１４、 Ｗａｅｃｈｔｅｒ ａｎｄ Ｂａｓｅｒｇａ、 Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７９：１１０６−１１１０．１９８２）、ＣＨＯ （ＡＴＣＣ ＣＣＬ、６１）、 ＣＯＳ−１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５０）、ＨＥＫ２９３ （ＡＴＣＣ ＣＲＬ １５７３； Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．、 Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ． ３６：５９−７２、１９７７）、Ｒａｔ Ｈｅｐ Ｉ （Ｒａｔ ｈｅｐａｔｏｍａ； ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６００）、Ｒａｔ Ｈｅｐ ＩＩ （Ｒａｔ ｈｅｐａｔｏｍａ； ＡＴＣＣ ＣＲＬ １５４８）、ＴＣＭＫ （ＡＴＣＣ ＣＣＬ、１３９）、ヒト肺（ＡＴＣＣ ＨＢ ８０６５）、ＮＣＴＣ １４６９ （ＡＴＣＣ ＣＣＬ ９．１）及びＤＵＫＸ細胞（ＣＨＯ細胞株）（Ｕｒｌａｕｂ ａｎｄ Ｃｈａｓｉｎ、 Ｐｒｏ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７７：４２１６−４２２０、１９８０）、３Ｔ３細胞、ナマルワ細胞、無血清培養に適合させられたＢＨＫ細胞（米国特許Ｎｏ．６、９０３、０６９）などである。
【００４０】
さらに具体的には、『形質転換されたＦＶＩＩ』とは遺伝子組み換えで得られ、動物あるいは植物の生きた組織で発現されたＦＶＩＩを意味している。
【００４１】
本発明によるバイシアリル化された形態の割合は、異なった方法で得ることが出来る。
【００４２】
１つの具体的な実施の形態で、本発明によるＦＶＩＩは上に述べたようなグリコシル化の特徴、つまり、過半数が二触角性の、バイシアリル化されそしてフコース化されていないグリカン形態であるという特徴を有する微生物、あるいは植物又は動物の細胞において発現される。
【００４３】
さらに別の１つの実施の形態で、本発明によるＦＶＩＩは主として二触角性の、バイシアリル化され、そしてフコース化されていないグリカン形態を示しているＦＶＩＩの組成物を獲得できない微生物、植物、あるいは動物において発現され、シアリル化は、その後で望ましいシアリル化が行われるように、つまり、二触角性のバイシアリル化された形態が過半数になって、三触角性の形態がトリシアリル化される脳に、１つ以上の酵素を用いてイン・ビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ、「細胞内で」と換言できる。）で実行される。
【００４４】
例えば、望ましいシアリル化を実行できるようにするために、適切な条件下で。その好ましい属性の故に選択したＦＶＩＩの組成物上で、シアリルトランスフェラーゼをイン・ビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ、「細胞内で」と換言できる。）で作用させることができる。
従って、本発明によるＦＶＩＩの組成物は部分的にシアリル化されたＦＶＩＩの組成物（ＦＶＩＩの開始組成物）上でシアリルトランスフェラーゼの作用で容易に得ることができる。
好適に、ＦＶＩＩの開始組成物はその過半数がモノシアリル化されたグリカン形態を示す。
好適に、ＦＶＩＩの開始組成物は、その過半数が二触角性ので、モノシアリル化されたフコース化されていないグリカン形態を示す。
シアリルトランスフェラーゼの作用は、モノシアリル化された形態に付加的にシアル酸を移入して、それらをバイシアリル化された形態に変えることができるようにする。
好適に、これらの二触角性のモノシアリル化された形態はＦＶＩＩの開始組成物内に４０％以上の高い割合で存在しており、特に好適には５０％、あるいは６０％以上の割合で存在する。
好適に、前記組成物は、二触角性のモノシアリル化されたフコース化されていないグリカン形態の割合が、２０％、あるいは３０％、４０％、さらには５０％以上の高い割合を示す。
【００４５】
好適に、ＦＶＩＩの開始組成物のシアル酸の少なくとも一部はａ２−６結合の存在を示す。
特に好適な場合、ａ２−６結合の存在を示すシアル酸の割合は６０％より高く、さらに７０％、８０％、あるいは９０％以上である。
特に、この割合は６０％から９０％の間の範囲である。
【００４６】
好ましくは、ＦＶＩＩの開始組成物のすべてのシアル酸がａ２−６結合の存在を示す。
【００４７】
１つの具体的な実施の形態で、ＦＶＩＩの開始組成物が例えば５０％以上、あるいはさらに６０％以上と言うような高い割合でフコース化の割合を示す場合は、その組成物の脱フコース化を可能にする１つあるいは複数の酵素を用いて二触角性のバイシアリル化されフコース化されていない形態を得ることができる。
過半数を二触角性のバイシアリル化されフコース化されていないグリカン形態を得る必要がある場合、例えば、フコシダーゼの使用をあげることができる。
【００４８】
特に好適な方法においては、ＦＶＩＩの開始組成物はその免疫源性の低さを目安に選ばれる。
【００４９】
好適に、上記開始物質はフランス特許第０６０４８７２に述べられているＦＶＩＩの組成物である。
なお、上記フランス特許の内容は本明細書に組み入れられるものとする。
【００５０】
好適に、本発明によるＦＶＩＩはポリペプチドであり、そのペプチド配列は天然のヒトＦＶＩＩの配列、つまりＦＶＩＩに関して特別の問題を示さないヒトの体内に存在している配列と同様であってもよい。
そうした配列は、例えばフランス特許０、２００、４２１に示されている配列１ｂによってコード化することができる。
【００５１】
好適に、本発明によるＦＶＩＩの配列はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１の配列である。
【００５２】
さらに別の実施の形態で、本発明によるＦＶＩＩは天然のＦＶＩＩと比較して免疫源性がより高いものでない限り、天然のヒトＦＶＩＩの変種であってもよい。
この変種のペプチド配列は、天然のヒトＦＶＩＩの配列と少なくとも７０％、そして好適には少なくとも８０％か９０％、そしてより好適には少なくとも９９％の同一性を示し、そうした変種は天然のＦＶＩＩと実質的に同じ生物学的活性を有している。
【００５３】
さらに、本発明によるＦＶＩＩはその蛋白質の生物学的活性が天然のヒトＦＶＩＩと比較して減少するように集束されたＦＶＩＩのいずれかの配列も意味している。
血栓症の治療あるいは予防のために用いられる遺伝子組み換えされた不活性化ヒトＦＶＩＩ：ＦＦＲ−ＦＶＩＩａ（Ｈｏｌｓｔ ｅｔ ａｌ．、 Ｅｕｒ． Ｊ． Ｖａｓｃ． ＥＮｄｏｖａｓｃ． Ｓｕｒｇ．、 １９９８ Ｊｕｎ、１５（６）：５１５−５２０）を、例えば、その例として挙げることができる。
こうしたＦＶＩＩは１つ以上のアミノ酸が挿入されていたり、欠失されていたり、あるいは置換されていることによって天然のＦＶＩＩとは異なったアミノ酸配列を示すポリペプチドである。
【００５４】
本発明によるＦＶＩＩの生物学的活性は、例えば、米国特許Ｎｏ．５、９９７、８６４に述べられるているように、ＦＶＩＩ欠乏血漿及びトロンボプラスチンの使用によって血液凝固を誘発するＦＶＩＩの組成物の能力を測定することで定量することができる。
米国特許第５、９９７、８６４に述べられているテストにおいては、生物学的活性は比較対照サンプルと比較しての凝固にかかる時間によって表現され、血清１ｍｌあたり１単位（１ＵのＦＶＩＩ活性）を含んでいる標準的なヒト血清（プール）と比較しての『ＦＶＩＩ単位』に換算される。
【００５５】
本発明によるＦＶＩＩの組成物は血漿ＦＶＩＩのそれに近いグリコシル化の特徴を示す。実際、血漿ＦＶＩＩ（あるいは血漿ＦＶＩＩの組成物）の主要なＮグリカン形態は二触角性のバイシリアル化された形態でもある。
【００５６】
好適に、本発明による組成物のＦＶＩＩの二触角性のバイシリアル化された（フコース化された、あるいはされていない）形態の割合は３０％か４０％、あるいは５０％より高い。
特に好適には、二触角性のバイシリアル化された形態の割合は６０％、７０％、８０％、あるいは９０％を上回っている。
【００５７】
特に好適な場合、バイシリアル化された（フコース化された、及びフコース化されていない）形態の割合は５０％から８０％の間、あるいは６０％から９０％の間、あるいは好ましくは７０％と８５％の間の範囲である。
【００５８】
好適には、本発明によるＦＶＩＩの組成物におけるフコースの割合は２０％より高く、好適には２０％から５０％の範囲である。
この割合はその組成物のＦＶＩＩのすべてのグリカン形態に対して特製されるフコースの割合に対応している。
【００５９】
この特徴は本発明によるＦＶＩＩの利点のひとつである。
実際、市販されている遺伝子組み換えＦＶＩＩでは１００％のフコース化の割合を示すが、血漿ＦＶＩＩでのフコース化の割合は１６％程度である。
従って、本発明によるＦＶＩＩのフコース化は血漿ＦＶＩＩのそれに近く、そのことは非感染性という面で本発明のＦＶＩＩに利点をもたらしている。
【００６０】
好適に、本発明による因子ＶＩＩの組成物のシアル酸のすくなくとも一部はａ２−６結合の存在を示す。
特に好適な場合、ａ２−６結合の存在を示すシアル酸の割合は６０％より高く、あるいは７０％、８０％、あるいは９０％より高い。
具体的には、この割合は６０％から９０％の間の範囲である。
【００６１】
従って、本発明によるＦＶＩＩの組成物におけるａ２−６結合の存在を示すシアル酸の割合はゼロではない。
これは、血漿ＦＶＩＩには含まれてはいるが、ａ２−３結合の存在を示すシアル酸だけで構成されている遺伝子組み換えされた市販のＦＶＩＩと比較しての利点を示すものである。
【００６２】
本発明の１つの特に好ましい実施の形態において、本発明によるＦＶＩＩの組成物のすべてのシアル酸はａ２−６結合の存在を示唆している。
【００６３】
特に好ましい場合、すべてのシアル酸がａ２−６結合の存在を示し、つまり、すべてのシアル酸はａ２−６結合によってガラクトースと結合しており、特に、ＦＶＩＩのシアル酸の少なくとも９０％はａ２−６結合の存在を示唆している。
本発明によるＦＶＩＩの組成物はさらにａ２−３結合の存在を示唆するシアル酸を含んでいる場合もある。
【００６４】
ＦＶＩＩ組成物のシアル酸がａ２−６分岐の存在を示唆するという事実は、本発明によるＦＶＩＩの利点の１つである。
事実、市販の遺伝子組み換えＦＶＩＩのシアル酸はａ２−３結合の存在を示唆するためである。
血漿ＦＶＩＩはこれら２つの異性体の混合体である。
こうした血漿ＦＶＩＩは例えば異性体の４０％がａ２−３結合の存在を示唆し、異性体の６０％がａ２−６結合の存在を示唆する。
しかしながら、後者の方がより多くのａ２−６結合を含んでおり、このことは本発明のＦＶＩＩを血漿ＦＶＩＩにより近づけている。
【００６５】
さらに別の実施の形態で、本発明のＦＶＩＩの組成物のシアル酸の一部はａ２−３結合の存在を示唆する。
【００６６】
従って、本発明の特殊な実施の形態では、その組成物の遺伝子組み換えあるいは形質転換されたＦＶＩＩは、因子ＶＩＩのＮグリコシル化部位に結合している形態とは違って、主として二触角性のバイシリアル化されフコース化されていないグリカン形態を示し、ａ２−６結合の存在を示唆するシアル酸の割合は９０％を上回っている。
【００６７】
本発明の特に好ましい実施の形態においては、その組成物の遺伝子組み換え、あるいは形質転換されたＦＶＩＩは、因子ＶＩＩのＮグリコシル化された部位に結合したすべてのグリカン形態とは異なって、主として二触角性のバイシリアル化されフコース化はされていないグリカン形態を示し、ａ２−６結合の存在を示唆するシアル酸の割合は１００％に等しい。
【００６８】
本発明の特殊な実施の形態においては、その組成物の遺伝子組み換え、あるいは形質転換されたＦＶＩＩは、因子ＶＩＩのＮグリコシル化された部位に結合したすべてのグリカン形態とは異なって、主として二触角性のバイシリアル化されフコース化はされていないグリカン形態を示し、ＦＶＩＩの組成物におけるフコースの割合は２０％から５０％の範囲である。
【００６９】
本発明の特殊な実施の形態において、上記組成物の遺伝子組み換え、あるいは形質転換されたＦＶＩＩは、因子ＶＩＩのＮグリコシル化された部位に結合したすべてのグリカン形態とは異なって、主として二触角性のバイシリアル化されフコース化はされていないグリカン形態を示し、すべてのシアル酸がａ２−６結合の存在を示唆し、そして、そのＦＶＩＩの組成物におけるフコースの割合は、２０％から５０％の範囲である。
【００７０】
好適に、本発明によるＦＶＩＩの組成物はヒトでなく、形質転換された哺乳動物によって比較的容易につくりだすことができる。
【００７１】
この実施の形態においては、従って、本発明によるＦＶＩＩの組成物は『形質転換されている』ものと考えることができる。
形質転換された哺乳動物とはヒト以外の哺乳動物において、外来性の蛋白質を発現するように遺伝子操作されたものを意味しており、例えば、ウサギ、ヤギ、マウス、ラット、仔ウシ、ウマ、ブタ、昆虫、ヒツジなどを意味している。
なお、これらは例示的なものであって、限定的な例ではない。
その外来性たちとはＦＶＩＩ、好ましくはヒトＦＶＩＩである。
ヒト以外の形質転換された哺乳動物は、ＦＶＩＩに加えて、望ましいシリアル化を形質転換されたＦＶＩＩに付与するために外来性の酵素を発現することもできる。
この場合、上記の非ヒト形質転換性動物はＦＶＩＩをコードする遺伝子とシアリルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を同時に発現することができる。
【００７２】
本発明の特殊な実施の形態において、本発明による形質転換されたＦＶＩＩはそれら形質転換された哺乳動物の乳腺内で発現され、その母乳内でつくりだされる。
この場合、その形質転換遺伝子の発現はその動物の乳腺内でその形質転換された遺伝子を確実につくりださせるようにするプロモータによって、組織に依存した状態で実行される。
ＷＡＰプロモータ（乳清酸性蛋白質）、カゼイン・プロモータ、特にβ−カゼインあるいはａ−カゼイン・プロモータ、β−乳酸グロブリン、ａ−乳酸アルブミン・プロモータなどを挙げることができるが、これらは例示的なものであって、限定的なものではない。
【００７３】
好適に、本発明のＦＶＩＩの組成物は形質転換された雌ウサギによって簡単につくりだすことができ、その組成物はさらにイン・ビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ、「細胞内で」と換言できる。）でシアリル化され、その過半数は二触角性のバイシリアル化された形態である。
【００７４】
このウサギは治療用蛋白質の生産には特に好適な種であるが、それはウサギがプリオンに対しては影響を受けにくく、特に公衆衛生上の重大な問題である伝染性の海綿状亜急性脳症の影響を受けないからである。
【００７５】
さらに、ウサギとヒトの間の種のバリアも重要な意味を持っている。
逆に、ヒトと市販の遺伝子組み換えＦＶＩＩを産出するために使われるハムスターとの間の種の壁は、それほど重要な意味をもっていない。
【００７６】
従って、ウサギにおけるＦＶＩＩの生産は、プリオン・タイプの従来にはない病原性因子を含む病原因子の伝播に対する安全性という面で好適である。
【００７７】
本発明の１つの好ましい実施の形態で、本発明によるＦＶＩＩは形質転換された雌のウサギの乳腺でつくられる。
【００７８】
形質転換されたほどの母乳への分泌を可能にする乳腺による問題の蛋白質の分泌は遺伝子組み換え蛋白質の組織に依存した態様での発現の制御を可能にする当業者に公知の技術である。
【００７９】
この発現の組織制御はその動物の特定の組織に向けられた蛋白質発現を可能にする配列のおかげで実行される。
これらの配列とはプロモータ配列と信号ペプチド配列である。
【００８０】
乳腺内で目的の蛋白質の発現を促進するプロモータの例としては、ＷＡＰプロモータ（乳清酸性蛋白質）、カゼイン・プロモータ、特にβ−カゼイン、ａ−カゼイン・プロモータ、β−乳酸グロブリン、ａ−乳酸アルブミン・プロモータなどを挙げることができるが、これらは発明を限定的するものではない。
特に好適な態様においては、雌ウサギの乳酸の乳腺における発現は、β−カゼイン・プロモータ制御の下で行われる。
【００８１】
形質転換した動物の母乳内での遺伝子組み換え蛋白質を生産する方法は以下のステップを含むことができる。
ヒトＦＶＩＩをコード化し、母乳内に自然に分泌される蛋白質のプロモータの制御下にある合成ＤＮＡ分子をヒト以外の哺乳動物の胚に組み込む。
この胚を次に同じ種の雌の体内に入れる。
この胚から得られた哺乳動物が成長したら、その哺乳動物の乳の分泌を起こさせて、その乳を回収する。
そうすると、その母乳は問題の形質転換されたＦＶＩＩを含んでいる。
【００８２】
ヒト以外の雌の哺乳動物の母乳で形質転換された蛋白質をつくるプロセスの例が欧州特許０、２６４、１６６に述べられており、本発明のＦＶＩＩを生産するためにその教示を参照することができる。
【００８３】
ヒト以外の雌の哺乳動物の母乳で蛋白質をつくるプロセスの別の例は欧州特許第０、５２７、０６３に述べられており、本発明のＦＶＩＩを生産するためにその教示を参照することができる。
【００８４】
雌のウサギの乳腺でつくりだされたＦＶＩＩの組成物は、その因子ＶＩＩのシアル酸の少なくとも一部がａ２−６結合の存在を示唆する。
【００８５】
特に好ましい方法では、すべてのシアル酸がａ２−６結合の存在を示唆し、ＦＶＩＩのシアル酸の少なくとも９０％がａ２−６結合の存在を示唆する。
さらに、本発明によるＦＶＩＩの組成物はａ２−３結合の存在を示唆するシアル酸を含んでいる場合もある。
【００８６】
特に好適な態様では、ａ２−６結合の存在を示唆するシアル酸の割合は６０％より高く、７０％、８０％、あるいは９０％より高い場合もある。
具体的には、この割合は６０％から９０％の範囲である。
【００８７】
この雌のウサギの体内で発現されたＦＶＩＩの組成物の二触角性のモノシリアル化されたグリカン形態の中で、大部分のグリカン形態はフコース化されていない。
好適に、これらの二触角性のモノシリアル化されフコース化されていないグリカン形態はこの組成物のＦＶＩＩにおいては２０％を上回る割合で存在している。
好適に、この割合は２５％を上回り、４０％を上回る場合もある。
【００８８】
本発明の１つの実施の形態で、本発明によるこの組成物のＦＶＩＩのフコース化の割合は、２０％から５０％の範囲である。
本発明のさらに別の実施の形態では、この割合は１５％を下回る場合もある。
【００８９】
雌のウサギから得られる形質転換されたＦＶＩＩはいくつかの翻訳後修飾を含んでおり、最初の９ないし１０のＮ末端グルタミン酸はγ−カルボキシル化されており、Ｓｅｒ52（セリン５２）とＳｅｒ60（セリン６０）はＯ−グリコシル化されており、グルコース（キシロース）0−2 とフコース部位をそれぞれ含んでおり、そして、Ａｓｎ145 とＡｓｎ322 は主に二触角性のモノシリアル化されたグリカン複合形態によってグリコシル化されている。
【００９０】
上に述べたような雌のウサギの乳腺でつくりだされるＦＶＩＩの組成物は フランス特許第０６−０４８７２に述べられており、この特許の採用は本明細書の教示に組み込まれる。
【００９１】
形質転換された哺乳動物による母乳内でつくりだされるＦＶＩＩは当業者に公知の技術を用いることによってその母乳から精製することができる。
【００９２】
例えば、米国特許第６、２６８、４８７に述べられているような問題の蛋白質の精製方法は以下のようなステップを含むことができる。
ａ）上記母乳を保留分と透過分を形成するのに十分な孔度を有する膜を通じて接線ろ過にかけて、内因性蛋白質を含む透過分を得るステップと、
ｂ）その透過分をクロマトグラフィ装置にかけて内因性蛋白質を取り出すと同時に、溶出液を得るステップと、
ｃ）上記流出液と保留分を組み合わせるステップと、
ｄ）脂質、カゼイン小球からＦＶＩＩを回収して、ＦＶＩＩが少なくとも７５％まで回収されるまでステップａ）からｃ）までを繰り返すステップ。
【００９３】
形質転換された哺乳動物の母乳でつくられたＦＶＩＩを精製するための別の技術は本出願人が提出したフランス特許出願第０６ ０４８６４に述べられており、この特許出願の内容は参照により本明細書に組み入れられる。
形質転換された動物の母乳に含まれているＦＶＩＩの抽出及び精製プロセス（プロセスＡ）は以下のステップで構成されている。
ａ）母乳からＦＶＩＩを抽出するステップ。この因子ＶＩＩは前記母乳のカルシウムの有機及び／又は無機塩あるいは錯体と結合しており、これをその母乳に可溶性の塩を付加することで得られたカルシウム化合物を沈殿させ、その陰イオンは前記不溶性カルシウム化合物を形成する能力によって選択され、こうして因子ＶＩＩを前記塩及び／又は錯体から放出させ、因子ＶＩＩが液相で存在させるようにするステップ、
ｂ）カルシウム化合物の沈殿物から蛋白質を大量に含む液相を分離し、さらにその液相を脂質相と前記蛋白質を含む非脂質相とに分離するステップ、
ｃ）前記非脂質相を所定の濃度のリン酸塩に基づく溶出緩衝液を用いて親和性クロマトグラフィにかけるステップ、
及び
ｄ）ステップｃ）で得られた因子ＶＩＩの溶出物を弱塩基性タイプの陰イオン交換カラム上で、そのカラムに捕捉された因子ＶＩＩを連続溶出させるのに適した緩衝液を用いて２、３回クロマトグラフィにかけるステップ。
【００９４】
実際、本出願人は、驚くべきことに、ＦＶＩＩは乳清内で自然につくりだされた蛋白質のプロモータ、例えば、ＷＡＰプロモータあるいはβ−カゼイン・プロモータの制御下に置かれても、母乳のカルシウム・イオンと結合しやすく、従ってカゼイン小球と結合しやすい傾向がある。
【００９５】
形質転換された哺乳動物の母乳でつくられたＦＶＩＩの精製の別の技術は本出願人によって出願されたフランス出願第０６−１１５３６に述べられており、この内容は参照により、本明細書に組み込まれている。
形質転換された動物の母乳に含まれているＦＶＩＩの抽出及び精製のプロセス（プロセスＢ）は以下のステップで構成されている。
ａ）前記母乳の上澄みを採取して脱脂するステップ、
ｂ）前記蛋白質を含んでいる脱脂しスキミングされた画分を疎水性とイオン性の両方の正確を示す移植されたリガンドを用いてクロマトグラフィ基質にかけ、前記蛋白質がその基質上に捕捉されるようなｐＨ条件で反応を行わせるステップ、
ｄ）上記蛋白質を溶出させるステップ、
ｅ）前記溶出された画分から母乳蛋白質を除去することによって溶出された画分を精製するステップと、そして
ｆ）前記蛋白質を回収するステップ。
【００９６】
ＦＶＩＩの組成物が形質転換された雌のウサギによってつくりだされる場合、二触角性でバイシリアル化された形状が過半数にあるようにシアリル化の処理にかけられる。
【００９７】
本発明の１つの具体的な実施の形態で、このシアリル化はシアリル−トランスフェラーゼ、例えば、ａ２、６−（Ｎ）−シアリル−トランスフェラーゼ（あるいはβ−Ｄ−ガラクトシル−β１、４−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミン−ａ２、６−シアリルトランスフェラーゼ）、あるいはＧａｌベータ１、３ＧａｌＮＡｃアルファ２、３−シアリルトランスフェラーゼ、あるいはＧａｌベータ１、３（４）ＧｌｃＮａｃアルファ２、３シアリルトランスフェラーゼ、あるいはＧａｌＮａｃアルファ−２、６−シアリルトランスフェラーゼＩなどを用いて行われ、これらの酵素は市販されている。
【００９８】
好ましくは、用いられるシアリルトランスフェラーゼはａ２、６結合を介してシアル酸を転換させることができるシアリルトランスフェラーゼである。
実際、本発明によるＦＶＩＩの組成物はａ２、６結合の存在を示唆するシアル酸を示すが、それはこの異性体が血漿性ＦＶＩＩ内により多く存在するからである。
【００９９】
このシアリル化は、例えば、シアル酸そのもの、あるいは１つか複数のシアル基を含みそしシアル酸基を放出しやすいいずれかの分子を用いて行うことができる。
【０１００】
本発明の１つの実施の形態によれば、酵素がａ２、６−（Ｎ）−シアリルトランスフェラーゼである場合、シアル酸をシアル酸ドナー基からＦＶＩＩに移すのに適した反応培養液で、基質がシチジン−５’−モノホスホ−Ｎ−アセチル−ノイラミン酸であれば、二触角性のバイシリアル化された形態が過半数になる。
この反応培養液は、例えば、モルフォルノ−３−プロパノスルホン酸、及び例えばＴｗｅｅｎに基づく緩衝液であってもよい。
【０１０１】
本発明のさらに別の実施の形態によれば、この基質はシチジン−モノホスフェート（ＣＭＰ）−シアル酸シンセターゼ、シアル酸、ＣＴＰ（シスチジン・トリホスフェート）及びその反応が起こるのに十分な量の二価金属陽イオンを含んだ反応培養液内でも合成することができる。
この二価金属陽イオンは、例えば、カルシウム・イオン、亜鉛イオン、マグネシウム・イオン、クロム・イオン、銅イオン、鉄イオン、あるいはコバルト・イオンである。
【０１０２】
ＦＶＩＩの組成物のシアリル化を実行するために用いられる方法が何であれ、この反応は常にバイシアリル化された形態が十分に増大して、それらが過半数になるような適切な条件化で十分な時間をかけて実行される。
情報のために述べるとすれば、その反応のための時間は、例えば少なくとも０．５時間、そして少なくとも５時間、あるいは７時間、８時間、９時間、さらには１０時間の場合もある。
より好ましくは、培養は一昼夜をかけて行われる。
場合によっては、この反応は５−１２時間かけて行われる。
【０１０３】
好適には、本発明によるＦＶＩＩの組成物は活性化されている（ＦＶＩＩａ）。
【０１０４】
この場合、組織因子（ＴＦ）との相互作用において、（活性化されていない）ＦＶＩＩより２５−１００倍も高い凝集活性を示す場合がある。
ＦＶＩＩの活性化は、イン・ビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ、「生体内で」と換言できる。）では異なったプロテアーゼ（ＦＩＸａ、 ＦＸａ、ＦＶＩＩａ）によってチモーゲンがジスルフィド架橋によって結合された２つの鎖に切断されることによって生じる。
ＦＶＩＩａだけの場合は、酵素活性は非常に低いが、その共同因子との複合形態においては、ＦＸとＦＩＸを活性化することで、凝固プロセスを開始させる。
ＦＶＩＩａは例えば循環性の抗体による血友病での止血に関与する凝固因子である。
特に好適な態様においては、本発明によるＦＶＩＩは完全に活性化されている。
好適には、本発明によるＦＶＩＩａはいくつかの翻訳後修飾を含んでおり、それは、最初の９個あるいは１０個の末端グルタミン酸がγ−カルボキシル化されており、Ａｓｐ63が部分的に水酸化されており、Ｓｅｒ52とＳｅｒ60がＯ−グリコシル化されて、それぞれグルコース（キシロース）0−2 とフコースを担持しており、Ａｓｎ145 とＡｓｎ322 はＮ−グリコシル化されていて、主として、複合的な二触角性のバイシリアル化されており、フコース化されていない形態を示す。
【０１０５】
ＦＶＩＩの活性化は、例えば、イン・ビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ、「細胞内で」と換言できる。）で本発明のＦＶＩＩの精製を行うことによって実行されるプロセスからも起こり得る（実施例２参照）。
【０１０６】
従って、本発明によるＦＶＩＩａは分子量が約２０ｋＤａの１５２個のアミノ酸の軽鎖と分子量が約３０ｋＤａの２５４個のアミノ酸の重鎖で構成されており、これらの軽鎖と重鎖は単一のジスルフィド架橋（Ｃｙｓ135 −Ｃｙｓ262 ）によって結合されている。
【０１０７】
従って、本発明によるＦＶＩＩは血漿性ＦＶＩＩに近い活性及び構造を有する活性化されたＦＶＩＩである。
【０１０８】
ＦＶＩＩａは組織因子（ＴＦ）との相互作用においては、ＦＶＩＩと比較して、その凝固活性はＦＶＩＩと比較して２５倍から１００倍高い。
【０１０９】
本発明の１つの実施の形態で、ＦＶＩＩは因子Ｘａ、ＶＩＩａ、ＩＩａ、ＩＸａ及びＸＩＩａによってイン・ビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ、「細胞内で」と換言できる。）で活性化させることができる。
【０１１０】
本発明のＦＶＩＩはその精製プロセスでも活性化させることができる。
【０１１１】
本発明のさらに別の目的は医薬品として用いられる本発明のＦＶＩＩの組成物である。
【０１１２】
本発明の別の目的は、血友病患者の治療用の医薬品を調製するための、本発明による因子ＶＩＩの組成物の利用である。
【０１１３】
本発明の別の目的は、複数の血友病性傷害の治療のための医薬品を調製するための本発明による因子ＶＩＩの組成物の利用である。
【０１１４】
本発明のさらに別の目的は、抗凝固剤の過剰投与による出血を治療するための医薬品を調製するための本発明による因子ＶＩＩの組成物の利用である。
【０１１５】
本発明のさらに別の目的は、本発明による因子ＶＩＩを含む医薬品と賦形剤及び／又は薬学的に許容される基質である。
【０１１６】
本発明のさらに別の目的は、遺伝子組み換えあるいは形質転換された因子ＶＩＩの組成物を調製するためのプロセスであり、この組成物の因子ＶＩＩの各分子はＮ−グリコシル化部位に結合したグリカン形態で構成されており、前記組成物の因子ＶＩＩのすべての分子の中で、二触角性のバイシリアル化されたグリカン形態が過半数であり、さらにこのプロセスは、シアリルトランスフェラーゼを活性化させるのに適した反応培養液中で、シアル酸がシアル酸ドナー基質からＦＶＩＩに転換できるのに十分な時間、そしてその目的に即した条件の下で、そしてバイシアリル化された形態が十分に増大するようまで、上に述べたような部分的にシアリル化された形質転換されたあるいは遺伝子組み換えされた因子ＶＩＩの組成物をシアル酸ドナー基質及びシアリルトランスフェラーゼと接触させてシアリル化を行い、前記のバイシアリル化された形態が過半数になるようにするステップを含んでいる。
この反応を行うための条件は上に述べた通りであり、以下の実施例にも述べてある。
【０１１７】
『部分的にシアリル化された』とは、そのＮに結合されたグリカン形態がすべてはバイシアリル化されておらず、一部がモノシアリル化されているＦＶＩＩの組成物を意味している。
好適に、これらの二触角性のモノシリアル化された形態は４０％以上、特に好適な場合５０％、あるいは６０％以上の割合で存在している。
好適に、二触角性のモノシリアル化されフコース化されていないグリカン形態は２０％を上回っており、さらには３０％、４０％、場合によっては５０％以上である。
【０１１８】
好適に、シアリルトランスフェラーゼは、ａ２、６−（Ｎ）−シアリルトランスフェラーゼ（あるいはβ−Ｄ−ガラクトシル−β１、４−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミン−ａ２、６−シアリルトランスフェラーゼ）、あるいはＧａｌベータ１、３ＧａｌＮＡｃアルファ２、３−シアリルトランスフェラーゼ、あるいはＧａｌベータ１、３（４）ＧｌｃＮａｃアルファ２、３シアリルトランスフェラーゼ、あるいはＧａｌＮａｃアルファ−２、６−シアリルトランスフェラーゼＩである。
【０１１９】
好適に、シアリルトランスフェラーゼはａ２−６結合を解してシアル酸の形質転換を可能にするシアリルトランスフェラーゼである。
実際、本発明による組成物のＦＶＩＩはａ２−６結合の存在を示唆するシアル酸を示すＦＶＩＩであることは好適である。
というのは、この異性体は血漿性ＦＶＩＩ内ではより多く存在しているからである。
【０１２０】
このシアリル化はいずれのシアル酸ドナー基質を用いて行っても良い。
【０１２１】
１つの実施の形態によれば、酵素がａ２−６結−（Ｎ）−シアリルトランスフェラーゼである場合、基質はシチジン−５’−モノホスホ−Ｎ−アセチルノイラミン酸であり、シアル酸をシアル酸ドナー基からＦＶＩＩへの転換を可能にするのに適した反応培養液内で、二触角性のバイシアリル化形態が過半数になる。
【０１２２】
反応培養液は生物学的に受け入れ許容されるＴｗｅｅｎ（登録商標）８０あるいはＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００、あるいはそれらの混合物で濃度が０．０１％から０．２％の範囲のもの、あるいは２価の金属陽イオン、好ましくは、例えばＣａ２+、Ｍｎ２+、Ｍｇ２+、またはＣｏ２+、Ｃａ２+などで、濃度は５ｍＭから１０ｍＭの範囲のものであってもよい。
この反応培養液はさらに、カコジル酸ナトリウム、モルホリノ−３−プロパンスルホン酸、Ｔｒｉｓ及び塩酸など、その培養液のｐＨを招請するための１種類あるいは複数の種類のイオン力調整剤を、４０ｍＭから６０ｍＭの範囲で含んでいても良い。
ｐＨ値は通常６から７．５の範囲である。この反応培養液はさらにＢＳＡ（仔ウシ血清アルブミン）を０．０５から０．１５ｍｇ／ｍｌの範囲で含んでいてもよい。
【０１２３】
本発明のさらに別の実施の形態によれば、上記基質はこの培養液内にＣＭＰ−シアル酸シンセターゼ、シアル酸、ＣＴＰ（シチジン・トリホスターゼ）、及び十分な量の上に述べたような２価金属陽イオンを導入することによって合成することができる。
【０１２４】
ＦＶＩＩの組成物のシアリル化の方法がどのようなものであれ、この反応は常に、上にも述べたように、バイシリアル化された形態がかなり増大してそれらが過半数になるのに十分な時間とそれに適した条件の下で行われる。
【０１２５】
このプロセスにおいて固定化された酵素が用いられる場合、反応時間は好ましくは０．５から３時間の間、温度は摂氏４度から摂氏３７度の間、より好ましくは摂氏４度から摂氏２０度の間である。
【０１２６】
このプロセスがバッチ反応で行われる場合、反応時間は１−９時間、好ましくは１−６時間の範囲であり、温度は摂氏４度〜摂氏３７度、好ましくは摂氏４度〜摂氏２０度の範囲であることが好適である。
【０１２７】
好ましくは、本発明のプロセスは部分的にシアリル化された形質転換あるいは遺伝子組み換えされた因子ＶＩＩの生物学的使い捨て性を改善することを目的としたプロセスである。
この生物学的使い捨て性の改善は、上にも述べたように、その組成物をシアル酸ドナー基質及びシアリルトランスフェラーゼと接触させることによって得られる。
【０１２８】
『生物学的使い捨て性の改善』は、ＦＶＩＩの組成物の生物学的使い捨て性をそのシアリル化が修飾されていない同じＦＶＩＩの組成物と比較して、少なくとも５％、少なくとも１０％、あるいは好適には少なくとも３０％か５０％、そして、好ましくは８０％から９０％の増大を意味している。
【０１２９】
さらに別の実施の形態で、シアリル化ステップの前に、ガラクトース化のステップが実行される。
このステップはガラクトースが欠乏している形態、つまり、準ガラクトース化された、およびモノガラクトース化されたＦＶＩＩ形態にガラクトースを移入することを目的としている。
ガラクトースはＧｌｃＮＡｃに固定され、後のシアリル化ステップでシアル酸残基を固定しやすくなる。
このガラクトース化ステップは当業者に公知のＵＤＰ−Ｇａｌウリジン（５’−ジホスホガラクトース）を含む反応培養液内でガラクトシル−トランスフェラーゼを用いて行うことができる。
【０１３０】
好適に、部分的にシアリル化されたＦＶＩＩ組成物の過半数のグリカン形態は複合的な、二触角性のモノシアリル化されたタイプである。
そうしたグリカン形態を以下に示す。
【０１３１】
【数２】
【０１３２】
本発明の１つの特殊な実施の形態で、部分的にシアリル化されたＦＶＩＩの組成物は二触角性でシアリル化されていない（フコース化された、あるいはフコース化されていない）、三触覚性でシアリル化されていない（フコース化された、あるいはフコース化されていない）、そしてバイシアリル化された（フコース化された、あるいはフコース化されていない）複合形態も含んでいる。
【０１３３】
好適に、前記の部分的にシアリル化されたＦＶＩＩの組成物の二触角性でモノシアリル化されたグリカン形態のなかで、過半数のグリカン形態がフコース化されていない。
【０１３４】
好適に、部分的にシアリル化されたＦＶＩＩの組成物は、前にも述べたように一部のａ２、６結合の存在を示唆するシアル酸の一部を少なくとも示す。
【０１３５】
好ましくは、このプロセスは、さらに、形質転換された雌のウサギによって部分的にシアリル化された形質転換ＦＶＩＩの組成物をつくりだすステップを含んでいる。
このステップは上に述べたように実行される。
このステップはガラクトース化ステップの前に行っても良い。
【０１３６】
好適に、部分的にシアリル化されたＦＶＩＩの組成物のＦＶＩＩは活性化されている。
【０１３７】
本発明によるプロセスを用いると、前記組成物の因子ＶＩＩのすべての分子のうちで、二触角性でバイシアリル化された形態が過半数になる。
【０１３８】
好適に、シアル酸ドナー基はシチジン−５’−モノホスホ−Ｎ−アセチルノイラミン酸であり、シアリルトランスフェラーゼはａ２、６−（Ｎ）−シアリル−トランスフェラーゼである。
【０１３９】
部分的にシアリル化されたＦＶＩＩのそうした組成物は、形質転換された雌のウサギの乳腺でつくられた形質転換ＦＶＩＩの組成物であってよい。
【０１４０】
特に好適な場合、部分的にシリアル化されたＦＶＩＩの組成物はフランス特許第０６−０４８７２に述べられている組成物である。
なお、このフランス特許第０６−０４８７２の内容は本明細書に組み入れられるべきものとする。
【０１４１】
本発明のさらなる態様及び利点について以下の実施例で述べるが、これらは例示のためにのみ説明されるものであって、本発明の範囲の限定は意図していない。
【０１４２】
略語の説明
ＦＶＩＩ−Ｔｇ＝ＦＶＩＩａ−Ｔｇ：本発明による活性化された形質転換されたＦＶＩＩ
ＶＦＩＩ−ｒ＝ＶＦＩＩａ−ｒ：市販されている遺伝子組み換え活性化ＦＶＩＩ
ＦＶＩＩ−ｐ＝ＦＶＩＩａ−ｐ：活性化された血漿性ＦＶＩＩ、つまり、ヒトの血漿から精製されたＦＶＩＩ
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ：基質支援レーザ脱着イオン化−飛行時間
ＨＰＣＥ−ＬＩＦ：高性能毛細管電気泳動−レーザー誘発蛍光
ＥＳＩ−ＭＳ：質量分光−イオン化『電気スプレイ』
ＬＣ−ＥＳＩＭＳ：液体クロマトグラフィ−質量分光−イオン化『電気スプレイ』
ＮＰ−ＨＰＬＣ：正常相高性能液体クロマトグラフィ
ＰＮｇａｓｅ Ｆ：ペプチド： Ｎ−グリコシダーゼ Ｆ
ＬＣ−ＭＳ：液体クロマトグラフィ−質量分光
【実施例１】
【０１４３】
実施例１：母乳でヒトＦＶＩＩの蛋白質をつくりだす形質転換さえれた雌ウサギの産出
【０１４４】
先ず、ＷＡＰ遺伝子（Ｄｅｖｉｎｏｙ ｅｔ ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、 ｖｏｌ．１６、ｎｏ．１６、２５ ａｏｕｔ １９８８、 ｐ．８１８０参照）の配列をベクターｐ−ｐｏｌｙ ＩＩＩ−Ｉ（Ｌａｔｈ ｅｔ ａｌ．、Ｇｅｎｅ（１９８７）５７、１９３−２０１参照）のポリリンカーに導入することでプラスミドｐ１をつくりだす。
【０１４５】
このプラスミドｐ１から得られたプラスミドｐ２はウサギのＷＡＰ遺伝子のプロモータとヒトＦＶＩＩの遺伝子を含んでいる。
【０１４６】
この形質転換された雌のウサギは微量注射という古典的な技術によって得られたものであった（Ｂｒｉｎｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．、 Ｐｒｏｃ． ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ（１９８５）８２、４４３８−４４４２参照）。
この遺伝子を５００コピー含んでいる１−２ｐｌをウサギの胚の雄性前核に注入した。
遺伝子操作された遺伝子を含むこのベクターのフラグメントを微量注射した。
その後、これらの胚をホルモン的に調整した養子関係の雌の卵管内に移した。
これらの遺伝子操作された胚の約１０％が若いウサギを出産し、さらにこれら遺伝子操作された胚の２−５％が形質転換された若いウサギを出産した。
形質転換遺伝子の存在はウサギの尾から抽出されたＤＮＡからのサザーンの移入の技術で明らかにされた。
これらの動物の血液と母乳内でのＦＶＩＩの濃度を特殊な放射免疫学的アッセイで評価した。
【０１４７】
ＦＶＩＩの生物学的活性は細胞培養液かウサギ乳房外植片培養液に母乳を加えることで評価した。
【実施例２】
【０１４８】
実施例２：獲得されたＦＶＩＩの抽出と精製
【０１４９】
ａ）ＦＶＩＩの抽出
【０１５０】
９体積分の０．２５Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ８．２で希釈した生の脱脂していない母乳５００ｍｌを用いた。
室温で３０分攪拌した後、水性のＦＶＩＩの含量を増やした相を摂氏１５度の温度で１時間、１００００ｇで遠心分離にかける。
約８３５ｍｌの６ポット分が必要となる。
【０１５１】
遠心分離後、３つの相が存在する。
それは、表面の資質相（クリーム）、水性非脂質でＦＶＩＩを多量に含んだ相（過半数の相）、そして、残りの白色の固体相（不溶性カゼイン及びカルシウム化合物の沈殿物）の３相である。
【０１５２】
水性でＦＶＩＩを多量に含んだ非脂質相は蠕動ポンプで上記クリーム相の上側に回収される。
このクリーム相は別個に回収される。
固体相（沈殿物）は廃棄される。
【０１５３】
しかしながら、非脂質水性相は依然として非常に少ない量ではあるが脂質を含んでいるので、一連のフィルター（Ｐａｌｌ ＳＬＫ７００２Ｕ０１０ＺＰ）−孔サイズが１μｍのグラス・ファイバー・プレフィルター−Ｐａｌｌ ＳＬＫ７００２ＮＸＰ−孔サイズが０．４５ｍｙｕｍｕのＮｙｌｏｎ ６６）を通じてろ過される。
このろ過ステップが終了した段階で、脂質相はこのろ過配列を通過して、母乳は母乳内に含まれる顆粒が完全に除去されるので、ろ過液は透明である。
【０１５４】
このろ過された非脂質相は次に限外ろ過膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｂｉｏｍａｘ ５０ｋＤａ−０．１ｍ２ ）にかけられて、クロマトグラフィ段階にかけることができるようになる。
分子量が約５０ｋＤａのＦＶＩＩは母乳に含まれている塩類、糖類、そしてペプチドとは違ってこの膜を透過しない。
初回に、上記溶液（約５０００ｍｌ）が５００ｍｌに濃縮され、次に、限外ろ過によって体積を一定に保ちながら透析を行うことによって、電解汁を除去し、クロマトグラフィ・ステップのための生物素材を調製する。
この透析緩衝液は０．０２５Ｍリン酸ナトリウムで、ｐＨは８．２である。
【０１５５】
このＦＶＩＩを含む水性非脂質相はＦＶＩＩ−Ｔｇの含量を増やした乳清に順化させることができる。
この製剤はそのプロセスを続ける前に摂氏−３０度の温度で保存される。
【０１５６】
このステップのＦＶＩＩ回収の総収量は９０％と非常に満足の行くものである（リン酸による９１％抽出＋９９％透析／濃度）。
【０１５７】
この結果から得られるＦＶＩＩを含む非支出水性相は完全に透明で、クロマトグラフィ・スタッフで使用することができる。
【０１５８】
この段階で、約９３、０００ＩＵのＦＶＩＩ−Ｔｇが抽出される。
この製剤のＦＶＩＩの純度は０．２％程度である。
【０１５９】
ｂ）ＦＶＩＩの精製
【０１６０】
１．ヒドロキシアパタイト・ゲル上でのクロマトグラフィ（親和性クロマトグラフィ）
【０１６１】
Ａｍｉｃｏｎ９０（直径９ｃｍ−断面６４ｃｍ2 ）カラムにＢｉｏＲａｄ Ｃｅｒａｍｉｃ ヒドロキシアパタイト・ゲル・タイプＩ（ＣＨＴ−Ｉ）を充填する。
【０１６２】
このゲルを０．０２５Ｍリン酸ナトリウムと０．０４塩化ナトリウムの混合物で構成される水性緩衝液Ａ、ｐＨ８．０で均衡化させる。
この製剤全体を摂氏−３０度で保存して、氷が完全に溶けるまで摂氏３７度の水槽内で解凍し、次に、上記ゲル上に注入する（線形流量１００ｃｍ／ｈ、つまり１０５ｍｌ／分）。
捕捉されない画分は基線に戻るまで（ＲＢＬ）、０．２５Ｍリン酸ナトリウムと０．０４塩化ナトリウムの混合物、ｐＨ８．２に通過させて廃棄される。
【０１６３】
ＦＶＩＩ−Ｔｇを含んでいる画分の溶出は０．０２５Ｍリン酸ナトリウム及び０．４Ｍ塩化ナトリウムを含む緩衝液Ｂ、ｐＨ８．０を用いて実行される。
溶出された画分は、基線回帰まで回収される。
これらの化合物はλ＝２８０ｎｍでの吸着測定によって検出する。
【０１６４】
このクロマトグラフィを行うことで、ＦＶＩＩ−Ｔｇの９０％以上が回収でき、さらに乳清蛋白質の９５％以上は除去できる。
比活性（Ｓ．Ａ）は２５倍に増幅される。
この段階で、純度４％のＦＶＩＩ−Ｔｇが約８５０００ＩＵが入手できる。
【０１６５】
２．１００ｋＤａ接線ろ過及び５０ｋＤａ濃縮／透析
【０１６６】
前のステップから得られた溶出物全体を１００ｋＤａ限外ろ過膜（Ｐａｌｌ ＯＭＥＧＡ ＳＣ １００Ｋ−０．１ｍ2 ）を通じてろ過する。
ＦＶＩＩはこの１００ｋＤａ膜でろ過され、分子量が１００ｋＤａ以上の蛋白質はろ過されない。
【０１６７】
ろ過された画分はさらに約５００ｍｌの体積まで濃縮され、その後、上に述べたような５０ｋＤａ限外ろ過フィルターで透析される。
透析用緩衝液は０．１５Ｍ塩化ナトリウムである。
【０１６８】
プロセスのこの段階で、生成物は摂氏−３０度の温度で保存され、その後イオン交換クロマトグラフィにかけられる。
【０１６９】
分子量が１００ｋＤａより大きな蛋白質、特に酵素前駆体において減少が認められた。
１００ｋＤａ膜での処理は約５０％の蛋白質の捕捉を可能にし、そのうちのＦＶＩＩ−Ｔｇの９５％に相当する高分子量蛋白質、つまり８２、０００ＩＵのＦＶＩＩ−Ｔｇがろ過される。
【０１７０】
この処理によって、以下の段階での蛋白質分解性加水分解が起きる可能性を減らすことができる。
【０１７１】
３．Ｑ−ＳｅｆａｒｏｓｅRＦＦゲル（ステップＤ）でのクロマトグラフィ−プロセスＡ）
【０１７２】
イオン交換ゲルＱ−Ｓｅｆａｒｏｓｅ（登録商標）Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ （ＱＳＦＦ）上で行われるこれら３つの連続的なクロマトグラフィは、活性成分を精製し、をＦＶＩＩ（ＦＶＩＩａ）に活性化させ、最後に、ＦＶＩＩの組成物を濃縮形成するために行われる。
これらの化合物は波長λ＝２８０ｎｍでの吸収測定で検出される。
【０１７３】
３．１ Ｑ−ＳｅｆａｒｏｓｅRＦＦゲルによるステップ１−『高カルシウム』の溶出
【０１７４】
２．６ｃｍ直径（断面積：５．３ｃｍ2 ）カラムにＱ−Ｓｅｆａｒｏｓｅ（登録商標）Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ （Ｇｅ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）ゲルを１００ｍｌ充填する。
【０１７５】
このゲルを０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５で均衡化させる。
【０１７６】
摂氏−３０度で保存されている画分全体を摂氏３７度の水槽で氷が完全になくなるまで解凍する。
この画分をゲルに注入する前に（流量：１３ｍｌ／分、つかり１５０ｃｍ／時間の線形流量に相当）、均衡化緩衝液で１／２体積パーセントまで希釈し、その後、保持されなかった画分は基線回帰まで緩衝液を通過させて廃棄する。
【０１７７】
ＦＶＩＩの含有量が低い最初の蛋白質画分は０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ及び０．１５Ｍ塩化ナトリウムで構成される緩衝液（ｐＨ：７．５）を用いて、９ｍｌ／分（１００ｃｍ／時間の線形流量）で溶出させ、その後、廃棄する。
【０１７８】
二回目のＦＶＩＩ含量が増大した画分は０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ及び０．０５Ｍ塩化ナトリウム、さらに０．０５Ｍ塩化カルシウムで構成される緩衝液（ｐＨ：７．５）で、９ｍｌ／分（１００ｃｍ／時間の線形流量）で溶出させる。
【０１７９】
この二回目の画分をすでに上に述べた５０ｋＤａ限外ろ過フィルターで透析にかける。
この透析用緩衝液は０．１５Ｍ塩化ナトリウムである。
この画分は、二回目のイオン交換クロマトグラフィにかけられる前に摂氏＋４度の温度で保存される。
【０１８０】
このステップによって、ＦＶＩＩの７３％（つまり、６００００ＩＵのＦＶＩＩ−Ｔｇ）の回収が可能になると同時に、付随する蛋白質の８０％の除去が可能になる。
これによって、ＦＶＩＩがＦＶＩＩａに活性化される。
【０１８１】
３．２ Ｑ−Ｓｅｆａｒｏｓｅ（登録商標）ＦＦゲルによるステップ２−『低カルシウム』の溶出
【０１８２】
２．５ｃｍ直径（断面積：４．９ｃｍ2 ）カラムにＱ−Ｓｅｆａｒｏｓｅ（登録商標）Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ （Ｇｅ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）ゲルを３０ｍｌ充填する。
【０１８３】
このゲルを０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５で均衡化させる。
【０１８４】
摂氏＋４度で保存されている前に溶出された画分（二回目の画分）をゲルに注入する前に（流量：９ｍｌ／分、つまり１００ｃｍ／時間の線形流量に相当）、希釈する。
【０１８５】
二回目の画分を注入した後、捕捉されていない画分を除去するために、そのゲルを均衡化緩衝液で基線回帰まで洗浄する。
【０１８６】
非常に高純度のＦＶＩＩを含む画分を０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ、０．０５Ｍ塩化ナトリウム、及び０．００５塩化カルシウムの混合液（ｐＨ７．５）で溶出させる。
【０１８７】
約２３、０００ＩＵ、つまり１２ｍｇのＦＶＩＩ−Ｔｇが精製される。
【０１８８】
このステップによって付随する蛋白質（雌ウサギ母乳蛋白質）の９５％以上が除去される。
【０１８９】
純度が９０％以上この溶出物は、ヒトＦＶＩＩの天然の分子にほぼ近い構造的及び機能的特徴を示す。
この溶出物を三回目のイオン交換クロマトトグラフィで精製し、調製する。
【０１９０】
３．３ Ｑ−Ｓｅｆａｒｏｓｅ（登録商標）ＦＦゲルによるステップ３−『ナトリウム』の溶出
【０１９１】
２．５ｃｍ直径（断面積：４．９ｃｍ2 ）カラムにＱ−Ｓｅｆａｒｏｓｅ（登録商標）Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（Ｇｅ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）ゲルを１０ｍｌ充填する。
【０１９２】
このゲルを緩衝液である０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５で均衡化させる。
【０１９３】
この画分を注入した後、捕捉されていない画分を除去するために、均衡化緩衝液を用いて、このゲルを基線回帰まで洗浄する。
【０１９４】
前のステップから得られた溶出・精製された画分を注入用純水（ＰＷＩ）で５回希釈してから、ゲルに注入する（流量：４．５ｍｌ／分、５０ｃｍ／時間の線形流量に相当）。
【０１９５】
その後、ＦＶＩＩ−Ｔｇは０．０２ＭのＴｒｉｓ及び０．２８Ｍ塩化ナトリウムで構成される緩衝液（ｐＨ７．０）を用いて流量３ｍｌ／分（３６ｃｍ／時間の線形流量に相当）で溶出させる。
【０１９６】
ＦＶＩＩ−Ｔｇの組成物が純度９５％以上の濃度で調製された。
この生成物は静脈注射に用いることができる。
このプロセスの累積収量は２２％であり、従って、処理される母乳１リットルあたり少なくとも２０ｍｇのＦＶＩＩの精製が可能である。
【０１９７】
以下の表１は精製されたＦＶＩＩの組成物を提供するための本発明の好ましい実施の形態によるプロセス・ステップの概要を示すものであり、それぞれのステップであらわれる異なった収量、純度、及び比活性を示している。
【０１９８】
【表１】
【０１９９】
その後、ＦＶＩＩ−Ｔｇは以下の実施例に述べられているような、さまざまな構造分析にかけられる。
【実施例３】
【０２００】
実施例３：グリコシル化部位及びグリコペプチドのＭｓ−ＥＳＩによる特徴づけ
【０２０１】
ＦＶＩＩ−Ｔｇ、ＦＶＩＩａ、ｐ（血漿性ＦＶＩＩ）及びＦＶＩＩａ、ｒのＮグリコシル化部位をＬＣ−ＥＳＩＭＳ（／ＭＳ）で識別し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳで確認し、そしてそれぞれの部位に存在する種々のグリカンの代表的な特性をＬＣ−ＥＳＩＭＳで判定した。
【０２０２】
図２は両方のＡｓｎグリコシル化残基を含むグリコペプチドの解析ＥＳＩスペクトルを示している。
グリコシル化部位の局所化はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（／ＴＯＦ）及びエドマン配列決定法によって確認した。
【０２０３】
それぞれＡｓｎ145 及びＡｓｎ322 のＮグリコシル化箇所を示すＦＶＩＩａ、ｐのグリコペプチド［Ｄ123 −Ｒ152 ］と［Ｋ31.6−Ｒ353 ］の質量スペクトル分析は、二触角性のバイシアリル化されフコース化されていない（Ａ２）（Ａｓｎ145 を含むグリコペプチドの観察された質量：５５６３．８Ｄａ）及びフコース化された形態（Ａ２Ｆ）（Ａｓｎ145 グリコペプチドの観察された質量：５７０９．８Ｄａ）の存在を示す。
Ａｓｎ145 に関しても、三触角性のトリシアリル化されフコース化されていない形態（Ａ３）（観察６２２０．０Ｄａ）とフコース化された形態（Ａ３Ｆ）（観察された質量：６３６６．１ Ｄａ）の存在に注目。
【０２０４】
ＦＶＩＩａ、ｒの場合、Ａｓｎ145 はＡ２Ｆ、Ａ１Ｆタイプ及び”Ａ１Ｆ”のグリカンで修飾されており、これは他の触角のＧａｌＮＡｃ末端位置のモノシアリル化形態に対応している。
グリカンＡ３Ｆ（三触角性、トリシアリル化されフコース化された形態）の存在も認められる。
【０２０５】
ＦＶＩＩ−Ｔｇの場合、それぞれＮグリコシル化部位Ａｓｎ145 とＡｓｎ322 を示すグリコペプチド［Ｄ123 −Ｒ152 ］及び［Ｋ31.6−Ｒ353 ］の質量スペクトル分析は、二触角性のバイシアリル化されフコース化されていない（Ａ２）（Ａｓｎ145 を含むグリコペプチドの観察された質量：５５６３．８Ｄａ）とフコース化された形態（Ａ２Ｆ）（観察された質量：５７０９．７ Ｄａ）の存在を示している。
Ａｓｎ145 の過半数を示すオリゴ糖の存在は、二触角性のモノシアリル化されフコース化されていない形態（Ａ１）（観察された質量：５２７２．３Ｄａ）及びフコース化された形態（Ａ１Ｆ）（観察された質量：５４１８．７Ｄａ）の存在を示す。
三触角性形態はあまり示されていない。
なお、他方の触角の末端位置にＧａｌＮＡｃを有するモノシアリル化された形態は存在していない。
【０２０６】
Ａｓｎ322 の過半数のグリコ形態に関連して、同じグリカン構造が異なった割合で観察される。
図１はＡｓｎ145 形態の場合と同様に成熟度が低い形態（二触角性及びシアリル化の程度がより低い形態）の存在を示している。
例えば、血漿生成物の場合、Ａｓｎ322 ではＡｓｎ145 と比較して、三触角性形態はより低い割合で示され、ＦＶＩＩａ、ｒ及びＦＶＩＩ−Ｔｇでは存在していない。
さらに、Ａｓｎ145 及び322 は１００％の割合でグリコシル化されていることも注目すべきである。
準定量的だけではあるが、これらの結果はＨＰＣＥ−ＬＩＦ及びＮＰ−ＨＰＬＣによって得られる提供的データと一致している。
【実施例４】
【０２０７】
実施例４： ＨＰＣＥ−ＬＩＦによるＮグリカンの定量
【０２０８】
Ｎ結合オリゴ糖の同定と定量はＰＮＧａｓｅ Ｆによる脱グリコシル化の後に、ＨＰＣＥ−ＬＩＦによって行われる。
ＦＶＩＩのサンプルはそれぞれの単離された構造の同定と識別が確実に行えるような方法で、エグゾゴルコキシダーゼ（シアリダーゼ（酵素／基質比：１ｍＩＵ／１０μｇ）、ガラクトシダーゼ、ヘキシナカーゼ（キット Ｐｒｏｚｙｍｅ）、フコーシダーゼ（Ｅ／Ｓ比率：１ｍＵＩ／１０μｇ）を用いて処理される。
得られたグリカンをフルオロクロムでラベルし、その質量と電荷に基づいて分離する。
２つの基準（グルコースのホモポリマー、オリゴ糖性）に基づいて、それらの構造を同定することができる。
定量は定量されたオリゴ糖全体に対する各ピークの減少した割合（％）を積分することで行われる。
【０２０９】
毛管電気泳動装置であるＰｒｏｔｅｏｍｅＬａｂ ＰＡ８００ （Ｂａｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用い、その毛管はＮ−ＣＨＯ『被覆』（Ｂａｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ）で、その内径は５０ｃｍｘ５０μｍである。
分離用緩衝液『ゲル緩衝液Ｎ』（Ｂａｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いる。
移行は２５ｋＶの電圧を、２０分間、摂氏２０度の温度でかけることによって行われる。
検出は励起波長λ４８８ｎｍと励起波長λ５２０ｎｍで行われる。
【０２１０】
フコース化の割合は、シアリダーゼ、ガラクトシダーゼ、及びヘキシナカーゼを同時に用いて脱グルコース化の後、『コア』とフコース化された『コア』に対応するピークの表面間の関係によって計算される。
【０２１１】
ＦＶＩＩａ、ｐのグリカンは過半数が二触角性でバイシリアル化されておりフコース化されていない（Ａ２）タイプのものと、二触角性でバイシリアル化されておりフコース化されている（Ａ２Ｆ）タイプのものである。ＦＶＩＩ−Ｔｇのグリカンの特徴は二触角性でモノシリアル化されておりフコース化ているものとされていないもの（Ａ１Ｆ、Ａ１）と、二触角性でバイシリアル化されておりフコース化もの、あるいはフコース化されていないもの（Ａ２Ｆ、Ａ２）形態の存在を示唆している。
その分布はこれらの種々の形態間で異なっている。
【０２１２】
ＦＶＩＩａ、ｒは二触角性でシアリル化され、フコース化されたグリカン形態で、過半数はＡ２Ｆ形態で二触角性のモノシリアル化されフコース化（Ａ１Ｆ）形態である。
これらの構造の場合に通常観察される移行時間と比較して、Ａ２Ｆ及びＡ１Ｆ形態に関しては種々の移行時間が認められる。
【０２１３】
ＦＶＩＩ−Ｔｇの両方のバッチ（Ａ及びＢ）のグリカンの特徴（図３、中央の両方の電気泳動図参照）が二触角性のモノシリアル化されフコース化された形態とフコース化されていない形態（Ａ１ＦとＡ１）、及び二触角性のバイシリアル化されフコース化された形態とフコース化されていない形態（Ａ２ＦとＡ２）を示している。
【０２１４】
【表２】
【０２１５】
種々のグリカン形態の定量的分析（表２）は、ＦＶＩＩａ、ｐの場合、シアリル化形態が優勢で、バイシリアル化されたグリカン（Ａ２及びＡ２Ｆ）が５１％、そして、三触角性のシリアル化されフコース化されていない形態とフコース化された形態（それぞれＧ３とＧ３Ｆ）が３０％である（結果は示さず）。
ＦＶＩＩ−Ｔｇ（バッチＡ及びＢ）はＦＶＩＩａ、ｐと比較するとシアリル化の程度が低く、二触角性のバイシリアル化された形態が３５％、そして三触角性のシリアル化された形態はわずか６％であった（結果は示さず）。
主要な形態はモノシリアル化された形態で、その構造の５０％がＡとＡ１Ｆである。
ＦＶＩＩａ、ｒもＦＶＩＩａ、ｐと比較するとシリアル化の程度が低く、Ａ２Ｆ構造が４５％、そして三触角性でシリアル化さたグリカンはわずか６％であった（結果は示さず）。ＦＶＩＩａ、ｒのフコース化されていない形態がないことに注意。
【０２１６】
【表３】
【０２１７】
これらの結果はＦＶＩＩａ、ｐのフコース化の割合は低く（１６％）、ＦＶＩＩ−Ｔｇのフコース化の割合は２４〜４２％、そしてＦＶＩＩａ、ｒのフコース化の比率は１００％であることを示している。
【実施例５】
【０２１８】
実施例５：ＮＰ−ＨＰＬＣによるＮグリカンの定量
【０２１９】
ＦＶＩＩａ、ｐ、ＦＶＩＩａ、ｒ及びＦＶＩＩ−Ｔｇの定性及び定量分析をＮＰ−ＨＰＬＣで行った（図４参照）。
蛋白質を脱塩、乾燥した後、この蛋白質を変性させ、当業者に公知の方法を用いて還元した。
その後、これらのグリカンを酵素反応（エンドグリコシダーゼ ＰＮＧａｓｅ Ｆ）にかけて、エタノールで沈殿させて精製した。
このようにして得られたグリカンをフルオロフォア、２−アミノベンズアミド（２−ＡＢ）でラベルする。
ラベルされたグリカンその疎水性に基づいて、４．６ｘ２５０ｍｍのＡｍｉｄｅ‐８０カラム（Ｔｏｓｏｈａａｓ）を用いて３０℃の温度に保って正常相ＨＰＬＣクロマトグラフィによって分離する。
【０２２０】
サンプルを注入する前に、このカラムを８０％アセトニトリルの緩衝液で均衡化させる。
５０ｍＭギ酸アンモニウム、ｐＨ４．４５の増大勾配で、１４０分間以上の時間をかけて溶出させる。
検出は波長３３０ｎｍと波長４２０ｎｍで蛍光測定で行う。
【０２２１】
ＦＶＩＩａ、ｐのクロマトグラフィー的特徴は、グリカンの過半数が二触角性のバイシリアル化されたタイプ（Ａ２）で、その割合は３９％であることを示している。
さらに、より少ない量ではあるが、二触角性でバイシアリル化されフコース化されたタイプ（Ａ２Ｆ）、モノシアリル化されたタイプ（Ａ１）、トリシアリル化されフコース化されたタイプとフコース化されていない形態（Ａ３Ｆ及びＡ３）が認められる。
【０２２２】
ＦＶＩＩ−Ｔｇに関して行われるＮＰ−ＨＰＬＣはタイプＡ１のオリゴ糖の存在を確認し、その割合は２７％である。
Ａ１Ｆ、Ａ２及びＡ２Ｆ形態の割合はより低く、三触角性の形態は微量である。
このことはＦＶＩＩａ、ｐと因子ＦＶＩＩ−Ｔｇ（バッチＢ）との間の差、シリアル化の程度がより低いことを示している。
【０２２３】
同じ分析を因子ＦＶＩＩａ、ｒで行うと、主な形態がタイプＡ２Ｆで、その割合が３０％であることを示す。
形態Ａ１Ｆの量はより少なく、三触角性の形態は微量である。
ＦＶＩＩａ、ｒの分析もＡ１Ｆ形態とＡ２Ｆ形態の保持時間の間に重要な時間差があることを示しており、これらの形態がＦＶＩＩａ、ｐ及びＦＶＩＩ−Ｔｇに存在しているものと違っていることを示している。
【０２２４】
これらの結果はＨＰＣＥ−ＬＩＦで得られた結果と一致している。
【実施例６】
【０２２５】
実施例６：ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳによる同定
【０２２６】
質量分光分析ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ （基質支援レーザー脱着／イオン化飛行時間質量分光分析）はペプチド、蛋白質、グリカン、オリゴ糖、及びイオン化可能なポリマーの大部分を高度の正確さで測定するための技術である。
【０２２７】
分析対象のペプチド、蛋白質、及びグリカンを用いられるレーザーの特定の波長で光を吸収する基質と混合と混合する。
主な基質は、ペプチドに対してはα−シアノ−４−水酸化桂皮酸（ＨＣＣＡ）、蛋白質に対してはシナピン酸（ＳＡ）、そしてオリゴ糖の分析用には２、５−ジヒドロ安息香酸（ＤＨＢ）である。
【０２２８】
この方法はパルス化レーザーによって共結晶基質／検体を照射するステップで構成されており、これによって、基質と検体分子の共脱着が誘発される。
ガス相でイオン化した後、この検体分子を飛行時間中に検出器を通過させる。
質量と飛行時間は直接的な相関関係を有しているので、後者を測定することは、目標の検体の質量判定を可能にしてくれる。
同定は観察された質量を測定して、それを理論値と比較することで行われる。
配列決定は得られた画分イオンに基づいて、ＭＳ／ＭＳモードで行うことができる。
用いられる計器はＴＯＦ及びＴＯＦ／ＴＯＦモードで作動するＢｒｕｋｅｒ Ａｕｔｏｆｌｅｘ２である。
【０２２９】
ＦＶＩＩ−Ｔｇ及びＦＶＩＩａ、ｒ内に存在しているグリカン形態を同定するために、予備的ＮＰ−ＨＰＬＣから得られる溶出画分上で行われる。
【０２３０】
ＦＶＩＩ−ＴｇのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析によって、ＮＰ−ＨＰＬＣによって分離されたグリカン、つまり過半数であるモノシアリル化されたＡ１形態と少数部分のＡ１Ｆ、Ａ２Ｆ及びＡ２タイプの同定が可能になる。
【０２３１】
この調査は小数部分の形態である三触角性のバイシリアル化、トリシリアル化タイプ、ハイブリッド形態、及びＭａｎ５及びＭａｎ６−Ｐ−ＨｅｘＮＡｃタイプの同定を可能にしてくれる（図５参照）。
【０２３２】
ＦＶＩＩａ、ｒでのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ分析は図６に示されているグリカン形態の存在を明らかにする。
因子ＦＶＩＩａ、ｒは部分的にしかフコース化されないＦＶＩＩ−Ｔｇとは違って、ほぼ完璧にフコース化される。
なお、過半数のグリカン形態はＡ２Ｆで、ＮＰ−ＨＰＬＣによって定量された比率は３０％である。
二触角性でモノシリアル化され、フコース化された形態 （Ａ１Ｆ）で、他方の触角部分の末端位置にＧａｌＮＡｃを含んでいる形態が同定され、一方及び／又は両方のアンテナ上にＨｅｘ−Ｎａｃ−ＨｅｘＮＡｃ部位を有する天然の二触角性のフコース化された形態も同定される。
三触角性のトリシリアル化されフコース化された形態も注目される。
フコース化されていない形態は微量存在している。
【実施例７】
【０２３３】
実施例７：シアル酸−ガラクトース結合のＨＰＣＥ−ＬＩＦ分析
【０２３４】
シアル酸−ガラクトース結合（『分岐』）の研究に関して言えば、実験的手順は実施例４に述べたのと類似している。
ＰＮＧａｓｅＦによる脱グリコシル化を行った後、オリゴ糖を特殊なエグゾシアリダーゼを用いて、それぞれその結合の同定と各単離された構造の定量が行える方法で処理される。
用いられるシアリダーゼはＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（連鎖球菌感染症病原体）（ａ２−３結合固有、０．０２ＩＵ、Ｅ／Ｓ＝０．４ ｍ／ｍ）、Ｃ． ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ（ガス壊疽脱疽菌群）（ａ２−３−及びａ２−６−結合固有、０．０４ＩＵ、Ｅ／Ｓ＝０．１ｍ／ｍ）及び、Ａ． ｕｒｅｆａｃｉｅｎｓ（ａ２−３、ａ２−６、ａ２−８及びａ２−９結合を加水分解、０．０１ＩＵ、Ｅ／Ｓ＝０．０５ｍ／ｍ）から得られた遺伝子組み換え酵素である。
【０２３５】
これらの分析の結果として、ＦＶＩＩａ、ｒはＡ２Ｆを主体とする二触角性のシアリル化されフコース化された形態と二触角性のモノシアリル化されフコース化された形態（Ａ１Ｆ）を有していることを示している。
これらのＡ２Ｆ及びＡ１Ｆ構造に関しては、これらの形態に通常認められる移行時間と比較してばらつきのある移行時間が観察されている。
特に、これらのオリゴ糖性ノシアリル化された形態は、ＨＰＣＥ−ＬＩＦ及びＮＰ−ＨＰＬＣにおいてＦＶＩＩ−Ｔｇのものと比較してばらつきのある移行時間を示す。
一方、オリゴ糖の組成物の分析においてＮｅｕ５Ａｃ以外の特別のシアル酸は認められず、質量分光分析ではバイシアリル化されたタイプの質量を有するグリカンの存在を示す。
最終的に、ＦＶＩＩａ、ｒのグリカンを脱シアリル化すると、ＦＶＩＩ−Ｔｇのオリゴ糖のものと同等のクロマトグラフィ及び電気泳動挙動を見ることが出来る。
【０２３６】
クロマトグラフィ及び電気泳動挙動におけるこれらの差は、従って、シアル酸の異なった分岐に基づいて説明することができる。
こうした仮定は、ＨＰＣＥ−ＬＩＦ及びＭＳによる異なったアプローチで確認された。
【０２３７】
これらの結果を以下の表４に示す。
【０２３８】
【表４】
【０２３９】
これらの結果は、両方のＦＶＩＩ間でシアル酸レベルでの違いを示している。
実際、ＦＶＩＩａ、ｒのシアル酸はａ２−３結合の存在を示唆しているが、ＦＶＩＩ−Ｔｇはａ２−６分岐を示している。
【０２４０】
ＦＶＩＩ−Ｔｇと比較してのＨＰＣＥ−ＬＩＦ及びＮＰ−ＨＰＬＣ挙動におけるＦＶＩＩａ、ｒのグリカンの違いはシアル酸レベルでの異性の違いに関係している。
【実施例８】
【０２４１】
実施例８：ＦＶＩＩ−Ｔｇのイン・ビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ、「細胞内で」と換言できる。）での再シアリル化
【０２４２】
文献（Ｚｈａｎｇ Ｘ ｅｔ ａｌ、 Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ １９９８、 １４２５；４４１−５２）は、糖蛋白質をより完全にシアリル化すると、イン・ビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ、「細胞内で」と換言できる。）でもイン・ビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ、「生体内で」と換言できる。）でも安定性が改善されると述べている。
この研究の目的は、イン・ビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ、「細胞内で」と換言できる。）でのシアリル化の実行可能性を実証することにある。
【０２４３】
再シアリル化はａ２−６−（Ｎ）−シアリルトランスフェラーゼ（ラット、Ｓｐｏｄｏｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ、比活性＝１単位／ｍｇ、４１ｋＤａ、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）と基質としてのシチジン−５’−モノホスホ−Ｎ−アセチルノイラミン酸（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を用いて行う。
これら２つの試薬は不安定なので摂氏−８０度の温度で保存する。
シアリル化基質（シチジン−５’−モノホスホ−Ｎ−アセチルノイラミン酸）と酵素ａ２、６−（Ｎ）−シアリルトランスフェラーゼ）を反応緩衝液内で混合して、一昼夜摂氏３７度の温度で放置した。
用いられた反応緩衝液は５０ｍＭのモルフォリノ−３プロパンスルホン酸、０．１％ Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０、０．１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ（仔ウシ血清アルブミン）の混合物で、ｐＨを７．４に調整したものである（試薬 Ｓｉｇｍａ）。
【０２４４】
以下の表５は実験条件を示すものである。
【０２４５】
【表５】
【０２４６】
実施例２の精製後に得られたものなどの天然のＦＶＩＩ−Ｔｇの電気泳動図（図７、下側参照）は、二触角性のモノシアリル化Ａ１形態が主体（４２％）であり、それより少ない割合でＡ２、Ａ２Ｆ及びＡ１Ｆが存在していることを示している。
再シアリル化後（図７、上側参照）、モノシアリル化された形態はわずか６％で、バイシアリル化された形態、特に非フコース化された形態の割合は過半数の５２％である。
【０２４７】
再シアリル化の前と後のグリカンの定量を下の図５に示す。
【０２４８】
【表６】
【０２４９】
形質転換されたＦＶＩＩのシアリル化の反応速度を図８に示す。
【０２５０】
この研究はイン・ビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ、「細胞内で」と換言できる。）での再シアリル化の効率を示しており、バイシアリル化された形態の割合は１００％以上増大している。
【実施例９】
【０２５１】
実施例９：ウサギに関する形質転換され再シアリル化されていないＦＶＩＩ（ＦＶＩＩ Ｔｇ ＮＲＳ）と、実施例８から得られた形質転換され再シアリル化されたＦＶＩＩ （ＦＶＩＩ Ｔｇ ＲＳ）との比較研究
【０２５２】
この研究の目的はニュージーランド産雄ウサギ上でのＦＶＩＩ−ＴｇＲＳとＦＶＩＩ−ＴｇＮＲＳとの薬力学的特徴の比較研究である。
【０２５３】
テストで用いられた投与量は一匹あたり２００μｇ／ｋｇで、これはヒトに投与される遺伝子組み換えＦＶＩＩの２倍の量である。
採血はＪ−４（製品を注射する４日前）とＪ−１（製品を注射した当日）に、Ｔ０．１７ｈ（注射当日、注射１０分後）、Ｔ０．３３ｈ（注射当日、注射２０分後）、Ｔ１ｈ（注射当日、注射１時間後）、Ｔ３ｈ（注射当日、注射３時間後）、Ｔ６ｈ（注射当日、注射６時間後）、Ｔ８ｈ（注射当日、注射８時間後）に行う。
【０２５４】
ＦＶＩＩ：Ａｇ（ＦＶＩＩの抗原）の投与量はＥＬＩＳＡ（Ａｓｓｅｒａｃｈｒｏｍキット）に従って決める。
ウサギの血漿でのＦＶＩＩ：Ａｇの投与量を決めることで、一方では、除去特性、他方では、薬力学的パラメータを判定することができる。
薬量データと実験グループを表７に示す。
【０２５５】
【表７】
【０２５６】
除去曲線を図９に示す。結果は表８に示す。
【０２５７】
【表８】
【０２５８】
投与された量に基づいて、除去半減期、平均残留時間（ＭＲＴ）、最大濃度（Ｃｍａｘ）、及び回収比率（『回収』）を両方の実験グループで比較可能である。
【０２５９】
ＦＶＩＩ−ＴｇＲＳはＦＶＩＩ−ＴｇＮＲＳとは違った反応力学特性を示す。
ＦＶＩＩ−Ｔｇを再シリアル化すると、半減期、平均残留時間（ＭＲＴ）、Ｃｍａｘ及び『回収』が目立たない程度ではあるが向上する。
【０２６０】
ＡＵＣパラメータ・レベル（ピーク・エリア）、Ｃ１（間隔）、及び分布体積（Ｖｄ）（この体積は投与された、あるいは吸収された用量を血漿濃度で割ることによって得られる）で違いが観察され、このことは、血液循環からＦＶＩＩ−ＴｇＲＳが多少除去されることを示している。
【０２６１】
ＦＶＩＩ−Ｔｇの再シリアル化は製品の生物学的利用可能性を約３０％程度増大させる。
【技術分野】
【０００１】
この発明において、ＦＶＩＩ（「因子ＶＩＩ」ともいう。）はビタミンＫ依存性糖蛋白質で、その活性化された形態（ＦＶＩＩａ）では、カルシウムと組織因子の存在下で因子Ｘ及び因子ＩＸを活性化させる凝固プロセスに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ＦＶＩＩは分子量が５０ｋＤａ程度の４０６個の残基で構成される単一ペプチド鎖の形態で分泌される。
ＦＶＩＩは４つの明確な構造領域を含んでおり、それはＮ末端γカルボキシル（Ｇｌａ）領域、２つの『外皮成長因子（ＥＧＦ）状』領域、そしてセリン・プロテアーゼ領域である。
ＦＶＩＩからＦＶＩＩａへの活性化は結合Ａｒｇ152−Ｉｌｅ153 （アルギニン１５２−イソロイシン１５３）の断裂で特徴付けられる。
ＦＶＩＩａは単一のジスルフィド架橋（Ｃｙｓ135 −Ｃｔｓ262 ）で結合された分子量が約２０ｋＤａの１５２個のアミノ酸の軽鎖と分子量が約３０ｋＤａの２５４個のアミノ酸の重鎖で構成されている。
【０００３】
血漿ＦＶＩＩａ（ＦＶＩＩａ、ｐ）はいくつかの翻訳後修飾を有しており、最初の１０個のグルタミン酸はγカルボキシル化されており、Ａｓｐ63 （アスパラギン酸）は部分的に水酸化されており、Ｓｅｒ52（セリン５２）とＳｅｒ60（セリン６０）はＯ−グリコシル化されており、それぞれグルコース（キシロース）0−2 及びフコース部位を担持しており、Ａｓｎ145 （アスパラギン１４５）及びＡｓｎ322 （アスパラギン３２２）はＮ−グリコシル化されており、主に二触角性のバイシアリル化された複合グリカン形態を有している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】欧州特許第０、３４６、２４１
【特許文献２】欧州特許第０、５４７、９３２
【特許文献３】欧州特許第０、２００、４２１
【特許文献２】フランス特許第０６０４８７２
【特許文献３】米国特許第５、９９７、８６４
【特許文献３】米国特許第６、９０３、０６９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ところで、従来において、ＦＶＩＩは因子ＶＩＩＩ欠乏症（タイプＡ血友病）あるいは因子ＩＸ欠乏症を示す血友病（タイプＢ血友病）の患者、あるいはさらに凝血因子欠乏症、例えば先天性ＦＶＩＩ欠乏症を示す患者の治療のために用いられる。
ＦＶＩＩは脳血管損傷の治療のためにも使用が推奨される。
従って、注射用のＦＶＩＩａ濃縮物を利用できるようにすることが必要である。
【０００６】
ＦＶＩＩａ濃縮物を得るための最も古い方法は分留によって得られる血漿蛋白質から得られるＦＶＩＩａの精製によって行われていた。
【０００７】
この目的のために、文献欧州特許第０、３４６、２４１は吸収後に得られるＦＶＩＩａを多量に含む画分を調製し、次に、ＦＶＩＩとＦＶＩＩａ、さらに因子ＩＸ（ＦＩＸ）、Ｘ（ＦＸ）、そしてＩＩ（ＦＩＩ）などの蛋白質を含む血漿蛋白質の分留副産物、つまり、ＰＰＳＢ（Ｐ＝プロトロンビンあるいはＦＶＩＩ、Ｐ＝プロコンベルチンあるいはＦＶＩＩ、Ｓ＝スチュアート因子あるいはＦＸ、及びＢ＝抗血友病因子ＢあるいはＦＩＸ）の予備溶出液の溶出について述べている。
このプロセスの欠陥は、得られるＦＶＩＩ が依然として微量の凝固因子を含んでいることである。
【０００８】
同様に、文献欧州特許第０、５４７、９３２はビタミンＫ依存因子及びＦＶＩＩＩをほとんど含んでいない高純度ＦＶＩＩａ濃縮物の製造プロセスを開示している。
このプロセスで得られるＦＶＩＩはその純度にもかかわらず、残留血栓形成性活性を示す。
【０００９】
これらのプロセスの主な欠陥は、生成物の収量が非常に低いことである。
【００１０】
さらに、血液提供者から提供される血漿の体積に限界がある。
【００１１】
従って、１９８０年代以後、ヒト因子ＦＶＩＩをコードするＤＮＡが単離され（ハゲン（Ｈａｇｅｎ）ら、（１９８６）；Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ； Ａｐｒ ８３（８）：２４１２−６）、哺乳動物ＢＨＫ細胞（生まれたばかりのハムスターの腎臓）（文献欧州特許０、２００、４２１）で発現された。
【００１２】
本出願人によって出願されたフランス特許第０６０４８７２も形質転換された動物におけるＦＶＩＩａの製造について述べている。
【００１３】
これらの製造方法で得られた蛋白質はウイルスあるいはその他の病原性作用因子による汚染の面でより安全なものである。
さらに、こうしたプロセスは一次配列、つまり、ヒトの一次配列と同じ異なったアミノ酸間の連鎖を有する蛋白質を得ることを可能にする。
しかしながら、ヒト血漿性ＦＶＩＩは複雑な翻訳後修飾を有しており、最初の１０個のグルタミン酸はγカルボキシル化されており、Ａｓｐ63 （アスパラギン酸６３）は部分的に水酸化されており、Ｓｅｒ52（セリン５２）とＳｅｒ60（セリン６０）はＯ−グリコシル化されており、それぞれグルコース（キシロース）0−2 及びフコース部位を担持しており、Ａｓｎ145 （アスパラギン１４５）及びＡｓｎ322 （アスパラギン３２２）はＮ−グリコシル化されており、主に二触角性のバイシアリル化された複合グリカン形態を有している。
特に、Ｎ−グリカン（アスパラギンに結合されたグリカン）の付加は蛋白質の正しい折り重なり、イン・ビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ、「細胞内で」と換言できる。）及びイン・ビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ、「生体内で」と換言できる。）での安定性、生物活性、そして、生成された異質蛋白質の薬力学的特性（例えば、生物学的利用性）などに対して特に重要である。
従って、すべての翻訳後修飾の変差、あるいはその一部は前記蛋白質を一方では不活性化する危険性、他方では免疫源性にする危険性に曝すことになる。
【００１４】
さて、現在の遺伝子組み換えプロセス及び形質転換ＦＶＩＩの組成物は、ヒトの系とは違った系で発現されるので、ヒトの血漿性ＦＶＩＩのグリコシル化とは異なったグリコシル化を示し、そのことがその遺伝子組み換え蛋白質に向けられた抗体を発生させ、従ってヒトの血漿から生成されたヒトＦＶＩＩのものより有効性を低下させてしまう可能性がある。
【００１５】
従って、ヒトの血漿から精製されたヒトＦＶＩＩに近い機能的特性を有するＦＶＩＩａの治療的あるいは予防的組成物と、この蛋白質を大量に提供するというニーズを満たし得るその製造法を開発する必要性がある。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
そこで、この発明は、上述不都合を除去するために、それぞれの分子はＮグリコシル化部位に結合したグリカン形態を含んでいる遺伝子組み換えあるいは形質転換されたＦＶＩＩ（因子ＶＩＩ）の組成物で、前記組成物のＦＶＩＩのすべての分子のうちで、二触角性でバイシアリル化されておりフコース化されていないグリカン形態がその組成物のＦＶＩＩのＮグリコシル化部位に結合したすべてのグリカン形態と比較して多数であることを特徴とする。
また、それぞれの分子はＮグリコシル化部位に結合したグリカン形態を含んでいる遺伝子組み換えあるいは形質転換されたＦＶＩＩ（因子ＶＩＩ）の組成物で、前記組成物のＦＶＩＩのすべての分子の中で多数が二触角性のバイシリアル化されたグリカン形態であることを特徴とする組成物を調製するプロセスで、シアリルトランスフェラーゼの活性を可能にするために、シアル酸をシアル酸ドナー基質からＦＶＩＩに移行すると同時に、前記バイシアリル化された形態が増大して多数になるのに十分な時間と条件下で、適切な反応培養液内で部分的にシアリル化された形質転換された、あるいは遺伝子組み換えＦＶＩＩをシアル酸ドナー基質及びシアリルオランスフェラーゼと接触させるステップを含んでいる、ことを特徴とする。
【発明の効果】
【００１７】
以上詳細に説明した如くこの発明によれば、大部分がグリカンで二触角性バイシアリル化され、フコース化されていない形態の遺伝子組み換えプロセスを実現するとともに、形質転換ＦＶＩＩ組成物を提供し、ニーズを満たし得る。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、実施例１で得られるＦＶＩＩの組成物の抽出と精製のプロセスを示す図である。（実施例１）
【図２】図２は、Ｎ−グリコシル化部位を担持するペプチドの解析質量分光ＥＳＩを示す図である。（実施例３）
【図３】図３は、ＰＮＧａｓｅ ＰによるＦＶＩＩの脱グリコシル化後のエレクトロフェログラムＨＰＣＥ−ＬＩＦを示す図であり、上側はエレクトロフェログラム、ＦＶＩＩａ、ｐ、中央は両方ともエレクトロフェログラム、ＦＶＩＩ−Ｔｇ、下側はエレクトロフェログラム、ＦＶＩＩａ、ｒを示す。（実施例４）
【図４】図４は、ＮＰ−ＨＰＬＣによるＦＶＩＩの特徴づけを示す図であり、上側はクロマトグラム：ＦＶＩＩａ、ｐ、中央はクロマトグラム：ＦＶＩＩ−Ｔｇ、下側はクロマトグラム：ＦＶＩＩａ、ｒを示す。（実施例５）
【図５】図５は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳによる、ＦＶＩＩ−Ｔｇの過半数のグリカン形態に関する識別を示す図である。（実施例６）
【図６】図６は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳによる、ＦＶＩＩａ、ｒの過半数のグリカン形態に関する識別を示す図である。（実施例６）
【図７】図７は、イン・ビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ、「細胞内で」と換言できる。）での再シアリル化のＨＰＣＥ−ＬＩＦ分析を示す図であり、上側は再シアリル化後のＦＶＩＩ−Ｔｇのオリゴ糖マップ、下側は天然のＦＶＩＩ−Ｔｇのオリゴ糖マップを示す。（実施例８）
【図８】図８は、二触角性のバイシアリル化されフコース化されていない形態（Ａ２）とフコース化された形態（Ａ２Ｆ）の割合の時間変化で示すＦＶＵＵ−Ｔｇのシアリル化の動態を示す図である。（実施例８）
【図９】図９は、ウサギの形質転換され再シアリル化されていないＦＶＩＩ（ＦＶＩＩＴｇＮＲＳ）と形質転換され再シアリル化されたＦＶＩＩ（ＦＶＩＩＴｇＲＳ）との間の予備的な薬力学的比較研究の結果：除去の半対数曲線を示す図である。（実施例９）
【発明を実施するための形態】
【００１９】
従って、本発明は遺伝子組み換えプロセス及び形質転換ＦＶＩＩの組成物に関連しており、その組成物のＦＶＩＩの各分子はＮ−グリコシル化部位に結合したグリカン形態を含んでおり、前記組成物の因子ＶＩＩのすべての分子の中で、過半数は二触角性のバイシアリル化されフコース化はされていないグリカン形態で、すべてのグリカンはその組成物の因子ＶＩＩのＮ−グリコシル化部位に結合した形態であることを特徴としている。
【００２０】
驚くべきことに、本出願人はその過半数が二触角性のバイシアリル化されフコース化はされていないグリカン形態である遺伝子組み換えプロセス及び形質転換ＦＶＩＩの組成物が、バイシアリル化された形態の割合がより低い遺伝子組み換えプロセス及び形質転換ＦＶＩＩと比較して、つまりその過半数が二触角性のモノシアリル化されフコース化はされていない形態である遺伝子組み換えあるいは形質転換ＦＶＩＩの組成物と比較して、生物学的有用性が高く、クリアランスが少なく、そしてより高い安定性を示すことを発見した。
【００２１】
従って、本発明のＦＶＩＩは、バイシアリル化された形態がより低い、つまり、過半数がモノシアリル化されている形態の遺伝子組み換えプロセス及び形質転換ＦＶＩＩの組成物と比較して、患者に対する投与頻度はより低く、投与量もより少なくて済むと想定することができる。
【００２２】
生物学的有用性とは投与されたＦＶＩＩのうち血液循環中に拡散され、特に出血箇所に到達する割合に関している。
【００２３】
クリアランスとは完全に精製された理論的体積の画分を意味しており、一定の時間当たりそれ以上のＦＶＩＩが含まれないことを意味している。
言い換えると、これは一定の時間間隔の中で前記物質がまったく含まれない流体の仮定量に対応する。
【００２４】
安定性とはその有効期間全体の間その化学的、物理的、微生物学的、及び生物薬学的属性を一定の限度以内に保つことができる能力を意味している。
【００２５】
『二触角性のバイシアリル化されフコース化はされていない形態』とは、以下の形態を意味している。
【００２６】
形態Ａ２（二触角性のバイシアリル化されフコース化はされていない形態）
【００２７】
【数１】
【００２８】
これらのグリカン形態はアスパラギン１４５（Ａｓｎ１４５）とアスパラギン３２２（Ａｓｎ３２２）で構成されるＮ−グリコシル化部位に結合されている。
実際、本発明によるＦＶＩＩは、ヒトＦＶＩＩの場合と同様に、位置１４５と３２２の２つのＮ−グリコシル化部位と、位置５２と６０の２つのＯ−グリコシル化部位で構成されている。
１つのＮ−グリコシル化部位において、オリゴ糖鎖が１つのアスパラギン（Ｎ結合）に結合されている。
１つのＯ−グリコシル化部位において、オリゴ糖鎖はセリンに結合されている。
だから、本発明によるＦＶＩＩの各分子は２つのオリゴ糖Ｎ結合鎖で構成されている。
しかしながら、前記組成物のＦＶＩＩの分子は均一なグリコシル化は示さない。
つまり、すべてのＮ結合オリゴ糖鎖は同一ではない。
異なったグリカン形態の混合物である。
【００２９】
実際、すべてのＦＶＩＩは、血漿性、遺伝子組み換えプロセス、及び形質転換のいずれであれ、ＦＶＩＩのいくつかの蛋白質の混合物の形態で存在しており、これらのたちはそれらのグリコシル化と異なった名前で呼ばれているグリコ形態において違いを示す。
このグリコシル化は異なった細胞成分間のＦＶＩＩ蛋白質の移送に伴って細胞性オルガナイトによって行われる翻訳後修飾によるものである。
この生化学的修飾は蛋白質を非常に深く修飾するので、最終的な蛋白質は完全に構造化されてしまい、従って活性であり、生物によって良く受け入れられるようになっている。
この化学的修飾は蛋白質の活性の調整に関与し、さらに、その局所化にも関与している。
従って、ＦＶＩＩの組成物全体において、さらにはその組成物のＮ結合オリゴ糖鎖全体において、そのＦＶＩＩ組成物内に存在している各グリカン形態と各糖の割合は定量とすることができる。
【００３０】
Ｏ−グリコシル化は本願において、異なったグリカンの割合については考慮しない。
【００３１】
『ＦＶＩＩの組成物』とは、その分子全体だけがＦＶＩＩであり、好ましくは活性化されている場合の組成物を意味している。
【００３２】
上記組成物のＦＶＩＩの各分子は、同じ一次配列を示すが、グリコシル化は分子ごとに異なっている。
従って、『ＦＶＩＩの組成物』とはそのグリカン形態の含有量によって特徴付けられる同じ一次配列を有する分子の混合物のことを意味する。
本発明においては、『ＦＶＩＩ』という表現と『ＦＶＩＩの組成物』という表現とは同等である。
その結果、本発明においては、『ＦＶＩＩ』とはＦＶＩＩの分子自体を意味することもあれば、上に述べたような特徴を有するＦＶＩＩ分子の混合物を意味する場合もある。
【００３３】
本発明によるＦＶＩＩの組成物は主として二触角性の、バイシアリル化され、そしてフコース化されていないグリカン形態を含んでいるＦＶＩＩの組成物のことである。
これは、その組成物のすべてのＮ−結合オリゴ糖類のうちで、つまり、因子ＦＶＩＩのＮグリコシル化部位の結合しているすべてのグリカン形態のうちで、過半数が二触角性の、バイシアリル化され、そしてフコース化されていないグリカン形態であることを意味している。
【００３４】
好適に、二触角性の、バイシアリル化され、そしてフコース化されていないグリカン形態の割合は３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％あるいは９５％以上である。
特に好適なのは、この二触角性の、バイシアリル化され、そしてフコース化されていないグリカン形態の割合が４５％以上の場合である。
さらに好適なのはこの二触角性の、バイシアリル化され、そしてフコース化されていないグリカン形態の割合が４５％から６５％の、さらに好ましくは５０％から６０％の間の範囲にある場合である。
【００３５】
シアリル化された種の割合はＨＰＣＥ−ＬＩＦ（高性能毛細管電気泳動レーザー誘発蛍光）分析、あるいはＮＰ−ＨＰＬＣ（通常相高性能液体クロマトグラフィ）を異なったグリカンに対応するピークの面積を測定するか、あるいは当業者に公知のいずれかの方法を用いた定量を合わせて行うことで測定することができる。
【００３６】
本発明によるＦＶＩＩの組成物は、少数部分として二触角性の、モノシアリル化された、及び三触角性の、さらにはシアル酸を示さない中性形態を含んでいてもよい。
【００３７】
『遺伝子組み換えされた、あるいは形質転換されたＦＶＩＩ』とは、細胞によってつくりだされ、どのＤＮＡが遺伝子組み換えによって修飾され、ＦＶＩＩの分子を発現すると同時に上に述べたようなグリコシル化の特徴と示すようになった遺伝子工学によって得られるすべてのＦＶＩＩを意味している。
【００３８】
従って、本発明によるＦＶＩＩは細胞宿主内あるいは形質転換された動物の体内でＦＶＩＩをコードするＤＮＡ分子を転写、翻訳することによって得られる。
本発明によるこの遺伝子組み換えあるいは形質転換ＦＶＩＩは生物系で蛋白質の発現を可能にする当業者に公知の標準的な技術によって得ることが出来る。
【００３９】
より具体的には、『遺伝子組み換えＶＩＩ』とは遺伝子組み換えによって得られ、培養された細胞株内で発現されたいずれかのＦＶＩＩを意味する。
例えば、以下の細胞株を挙げることができる。
ＢＨＫ（ベビー・ハムスターの腎臓）及び具体的にはＢＨＫ ｔｋ−ｔｓ１３ （ＣＲＬ１０３１４、 Ｗａｅｃｈｔｅｒ ａｎｄ Ｂａｓｅｒｇａ、 Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７９：１１０６−１１１０．１９８２）、ＣＨＯ （ＡＴＣＣ ＣＣＬ、６１）、 ＣＯＳ−１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５０）、ＨＥＫ２９３ （ＡＴＣＣ ＣＲＬ １５７３； Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．、 Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ． ３６：５９−７２、１９７７）、Ｒａｔ Ｈｅｐ Ｉ （Ｒａｔ ｈｅｐａｔｏｍａ； ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６００）、Ｒａｔ Ｈｅｐ ＩＩ （Ｒａｔ ｈｅｐａｔｏｍａ； ＡＴＣＣ ＣＲＬ １５４８）、ＴＣＭＫ （ＡＴＣＣ ＣＣＬ、１３９）、ヒト肺（ＡＴＣＣ ＨＢ ８０６５）、ＮＣＴＣ １４６９ （ＡＴＣＣ ＣＣＬ ９．１）及びＤＵＫＸ細胞（ＣＨＯ細胞株）（Ｕｒｌａｕｂ ａｎｄ Ｃｈａｓｉｎ、 Ｐｒｏ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７７：４２１６−４２２０、１９８０）、３Ｔ３細胞、ナマルワ細胞、無血清培養に適合させられたＢＨＫ細胞（米国特許Ｎｏ．６、９０３、０６９）などである。
【００４０】
さらに具体的には、『形質転換されたＦＶＩＩ』とは遺伝子組み換えで得られ、動物あるいは植物の生きた組織で発現されたＦＶＩＩを意味している。
【００４１】
本発明によるバイシアリル化された形態の割合は、異なった方法で得ることが出来る。
【００４２】
１つの具体的な実施の形態で、本発明によるＦＶＩＩは上に述べたようなグリコシル化の特徴、つまり、過半数が二触角性の、バイシアリル化されそしてフコース化されていないグリカン形態であるという特徴を有する微生物、あるいは植物又は動物の細胞において発現される。
【００４３】
さらに別の１つの実施の形態で、本発明によるＦＶＩＩは主として二触角性の、バイシアリル化され、そしてフコース化されていないグリカン形態を示しているＦＶＩＩの組成物を獲得できない微生物、植物、あるいは動物において発現され、シアリル化は、その後で望ましいシアリル化が行われるように、つまり、二触角性のバイシアリル化された形態が過半数になって、三触角性の形態がトリシアリル化される脳に、１つ以上の酵素を用いてイン・ビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ、「細胞内で」と換言できる。）で実行される。
【００４４】
例えば、望ましいシアリル化を実行できるようにするために、適切な条件下で。その好ましい属性の故に選択したＦＶＩＩの組成物上で、シアリルトランスフェラーゼをイン・ビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ、「細胞内で」と換言できる。）で作用させることができる。
従って、本発明によるＦＶＩＩの組成物は部分的にシアリル化されたＦＶＩＩの組成物（ＦＶＩＩの開始組成物）上でシアリルトランスフェラーゼの作用で容易に得ることができる。
好適に、ＦＶＩＩの開始組成物はその過半数がモノシアリル化されたグリカン形態を示す。
好適に、ＦＶＩＩの開始組成物は、その過半数が二触角性ので、モノシアリル化されたフコース化されていないグリカン形態を示す。
シアリルトランスフェラーゼの作用は、モノシアリル化された形態に付加的にシアル酸を移入して、それらをバイシアリル化された形態に変えることができるようにする。
好適に、これらの二触角性のモノシアリル化された形態はＦＶＩＩの開始組成物内に４０％以上の高い割合で存在しており、特に好適には５０％、あるいは６０％以上の割合で存在する。
好適に、前記組成物は、二触角性のモノシアリル化されたフコース化されていないグリカン形態の割合が、２０％、あるいは３０％、４０％、さらには５０％以上の高い割合を示す。
【００４５】
好適に、ＦＶＩＩの開始組成物のシアル酸の少なくとも一部はａ２−６結合の存在を示す。
特に好適な場合、ａ２−６結合の存在を示すシアル酸の割合は６０％より高く、さらに７０％、８０％、あるいは９０％以上である。
特に、この割合は６０％から９０％の間の範囲である。
【００４６】
好ましくは、ＦＶＩＩの開始組成物のすべてのシアル酸がａ２−６結合の存在を示す。
【００４７】
１つの具体的な実施の形態で、ＦＶＩＩの開始組成物が例えば５０％以上、あるいはさらに６０％以上と言うような高い割合でフコース化の割合を示す場合は、その組成物の脱フコース化を可能にする１つあるいは複数の酵素を用いて二触角性のバイシアリル化されフコース化されていない形態を得ることができる。
過半数を二触角性のバイシアリル化されフコース化されていないグリカン形態を得る必要がある場合、例えば、フコシダーゼの使用をあげることができる。
【００４８】
特に好適な方法においては、ＦＶＩＩの開始組成物はその免疫源性の低さを目安に選ばれる。
【００４９】
好適に、上記開始物質はフランス特許第０６０４８７２に述べられているＦＶＩＩの組成物である。
なお、上記フランス特許の内容は本明細書に組み入れられるものとする。
【００５０】
好適に、本発明によるＦＶＩＩはポリペプチドであり、そのペプチド配列は天然のヒトＦＶＩＩの配列、つまりＦＶＩＩに関して特別の問題を示さないヒトの体内に存在している配列と同様であってもよい。
そうした配列は、例えばフランス特許０、２００、４２１に示されている配列１ｂによってコード化することができる。
【００５１】
好適に、本発明によるＦＶＩＩの配列はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１の配列である。
【００５２】
さらに別の実施の形態で、本発明によるＦＶＩＩは天然のＦＶＩＩと比較して免疫源性がより高いものでない限り、天然のヒトＦＶＩＩの変種であってもよい。
この変種のペプチド配列は、天然のヒトＦＶＩＩの配列と少なくとも７０％、そして好適には少なくとも８０％か９０％、そしてより好適には少なくとも９９％の同一性を示し、そうした変種は天然のＦＶＩＩと実質的に同じ生物学的活性を有している。
【００５３】
さらに、本発明によるＦＶＩＩはその蛋白質の生物学的活性が天然のヒトＦＶＩＩと比較して減少するように集束されたＦＶＩＩのいずれかの配列も意味している。
血栓症の治療あるいは予防のために用いられる遺伝子組み換えされた不活性化ヒトＦＶＩＩ：ＦＦＲ−ＦＶＩＩａ（Ｈｏｌｓｔ ｅｔ ａｌ．、 Ｅｕｒ． Ｊ． Ｖａｓｃ． ＥＮｄｏｖａｓｃ． Ｓｕｒｇ．、 １９９８ Ｊｕｎ、１５（６）：５１５−５２０）を、例えば、その例として挙げることができる。
こうしたＦＶＩＩは１つ以上のアミノ酸が挿入されていたり、欠失されていたり、あるいは置換されていることによって天然のＦＶＩＩとは異なったアミノ酸配列を示すポリペプチドである。
【００５４】
本発明によるＦＶＩＩの生物学的活性は、例えば、米国特許Ｎｏ．５、９９７、８６４に述べられるているように、ＦＶＩＩ欠乏血漿及びトロンボプラスチンの使用によって血液凝固を誘発するＦＶＩＩの組成物の能力を測定することで定量することができる。
米国特許第５、９９７、８６４に述べられているテストにおいては、生物学的活性は比較対照サンプルと比較しての凝固にかかる時間によって表現され、血清１ｍｌあたり１単位（１ＵのＦＶＩＩ活性）を含んでいる標準的なヒト血清（プール）と比較しての『ＦＶＩＩ単位』に換算される。
【００５５】
本発明によるＦＶＩＩの組成物は血漿ＦＶＩＩのそれに近いグリコシル化の特徴を示す。実際、血漿ＦＶＩＩ（あるいは血漿ＦＶＩＩの組成物）の主要なＮグリカン形態は二触角性のバイシリアル化された形態でもある。
【００５６】
好適に、本発明による組成物のＦＶＩＩの二触角性のバイシリアル化された（フコース化された、あるいはされていない）形態の割合は３０％か４０％、あるいは５０％より高い。
特に好適には、二触角性のバイシリアル化された形態の割合は６０％、７０％、８０％、あるいは９０％を上回っている。
【００５７】
特に好適な場合、バイシリアル化された（フコース化された、及びフコース化されていない）形態の割合は５０％から８０％の間、あるいは６０％から９０％の間、あるいは好ましくは７０％と８５％の間の範囲である。
【００５８】
好適には、本発明によるＦＶＩＩの組成物におけるフコースの割合は２０％より高く、好適には２０％から５０％の範囲である。
この割合はその組成物のＦＶＩＩのすべてのグリカン形態に対して特製されるフコースの割合に対応している。
【００５９】
この特徴は本発明によるＦＶＩＩの利点のひとつである。
実際、市販されている遺伝子組み換えＦＶＩＩでは１００％のフコース化の割合を示すが、血漿ＦＶＩＩでのフコース化の割合は１６％程度である。
従って、本発明によるＦＶＩＩのフコース化は血漿ＦＶＩＩのそれに近く、そのことは非感染性という面で本発明のＦＶＩＩに利点をもたらしている。
【００６０】
好適に、本発明による因子ＶＩＩの組成物のシアル酸のすくなくとも一部はａ２−６結合の存在を示す。
特に好適な場合、ａ２−６結合の存在を示すシアル酸の割合は６０％より高く、あるいは７０％、８０％、あるいは９０％より高い。
具体的には、この割合は６０％から９０％の間の範囲である。
【００６１】
従って、本発明によるＦＶＩＩの組成物におけるａ２−６結合の存在を示すシアル酸の割合はゼロではない。
これは、血漿ＦＶＩＩには含まれてはいるが、ａ２−３結合の存在を示すシアル酸だけで構成されている遺伝子組み換えされた市販のＦＶＩＩと比較しての利点を示すものである。
【００６２】
本発明の１つの特に好ましい実施の形態において、本発明によるＦＶＩＩの組成物のすべてのシアル酸はａ２−６結合の存在を示唆している。
【００６３】
特に好ましい場合、すべてのシアル酸がａ２−６結合の存在を示し、つまり、すべてのシアル酸はａ２−６結合によってガラクトースと結合しており、特に、ＦＶＩＩのシアル酸の少なくとも９０％はａ２−６結合の存在を示唆している。
本発明によるＦＶＩＩの組成物はさらにａ２−３結合の存在を示唆するシアル酸を含んでいる場合もある。
【００６４】
ＦＶＩＩ組成物のシアル酸がａ２−６分岐の存在を示唆するという事実は、本発明によるＦＶＩＩの利点の１つである。
事実、市販の遺伝子組み換えＦＶＩＩのシアル酸はａ２−３結合の存在を示唆するためである。
血漿ＦＶＩＩはこれら２つの異性体の混合体である。
こうした血漿ＦＶＩＩは例えば異性体の４０％がａ２−３結合の存在を示唆し、異性体の６０％がａ２−６結合の存在を示唆する。
しかしながら、後者の方がより多くのａ２−６結合を含んでおり、このことは本発明のＦＶＩＩを血漿ＦＶＩＩにより近づけている。
【００６５】
さらに別の実施の形態で、本発明のＦＶＩＩの組成物のシアル酸の一部はａ２−３結合の存在を示唆する。
【００６６】
従って、本発明の特殊な実施の形態では、その組成物の遺伝子組み換えあるいは形質転換されたＦＶＩＩは、因子ＶＩＩのＮグリコシル化部位に結合している形態とは違って、主として二触角性のバイシリアル化されフコース化されていないグリカン形態を示し、ａ２−６結合の存在を示唆するシアル酸の割合は９０％を上回っている。
【００６７】
本発明の特に好ましい実施の形態においては、その組成物の遺伝子組み換え、あるいは形質転換されたＦＶＩＩは、因子ＶＩＩのＮグリコシル化された部位に結合したすべてのグリカン形態とは異なって、主として二触角性のバイシリアル化されフコース化はされていないグリカン形態を示し、ａ２−６結合の存在を示唆するシアル酸の割合は１００％に等しい。
【００６８】
本発明の特殊な実施の形態においては、その組成物の遺伝子組み換え、あるいは形質転換されたＦＶＩＩは、因子ＶＩＩのＮグリコシル化された部位に結合したすべてのグリカン形態とは異なって、主として二触角性のバイシリアル化されフコース化はされていないグリカン形態を示し、ＦＶＩＩの組成物におけるフコースの割合は２０％から５０％の範囲である。
【００６９】
本発明の特殊な実施の形態において、上記組成物の遺伝子組み換え、あるいは形質転換されたＦＶＩＩは、因子ＶＩＩのＮグリコシル化された部位に結合したすべてのグリカン形態とは異なって、主として二触角性のバイシリアル化されフコース化はされていないグリカン形態を示し、すべてのシアル酸がａ２−６結合の存在を示唆し、そして、そのＦＶＩＩの組成物におけるフコースの割合は、２０％から５０％の範囲である。
【００７０】
好適に、本発明によるＦＶＩＩの組成物はヒトでなく、形質転換された哺乳動物によって比較的容易につくりだすことができる。
【００７１】
この実施の形態においては、従って、本発明によるＦＶＩＩの組成物は『形質転換されている』ものと考えることができる。
形質転換された哺乳動物とはヒト以外の哺乳動物において、外来性の蛋白質を発現するように遺伝子操作されたものを意味しており、例えば、ウサギ、ヤギ、マウス、ラット、仔ウシ、ウマ、ブタ、昆虫、ヒツジなどを意味している。
なお、これらは例示的なものであって、限定的な例ではない。
その外来性たちとはＦＶＩＩ、好ましくはヒトＦＶＩＩである。
ヒト以外の形質転換された哺乳動物は、ＦＶＩＩに加えて、望ましいシリアル化を形質転換されたＦＶＩＩに付与するために外来性の酵素を発現することもできる。
この場合、上記の非ヒト形質転換性動物はＦＶＩＩをコードする遺伝子とシアリルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を同時に発現することができる。
【００７２】
本発明の特殊な実施の形態において、本発明による形質転換されたＦＶＩＩはそれら形質転換された哺乳動物の乳腺内で発現され、その母乳内でつくりだされる。
この場合、その形質転換遺伝子の発現はその動物の乳腺内でその形質転換された遺伝子を確実につくりださせるようにするプロモータによって、組織に依存した状態で実行される。
ＷＡＰプロモータ（乳清酸性蛋白質）、カゼイン・プロモータ、特にβ−カゼインあるいはａ−カゼイン・プロモータ、β−乳酸グロブリン、ａ−乳酸アルブミン・プロモータなどを挙げることができるが、これらは例示的なものであって、限定的なものではない。
【００７３】
好適に、本発明のＦＶＩＩの組成物は形質転換された雌ウサギによって簡単につくりだすことができ、その組成物はさらにイン・ビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ、「細胞内で」と換言できる。）でシアリル化され、その過半数は二触角性のバイシリアル化された形態である。
【００７４】
このウサギは治療用蛋白質の生産には特に好適な種であるが、それはウサギがプリオンに対しては影響を受けにくく、特に公衆衛生上の重大な問題である伝染性の海綿状亜急性脳症の影響を受けないからである。
【００７５】
さらに、ウサギとヒトの間の種のバリアも重要な意味を持っている。
逆に、ヒトと市販の遺伝子組み換えＦＶＩＩを産出するために使われるハムスターとの間の種の壁は、それほど重要な意味をもっていない。
【００７６】
従って、ウサギにおけるＦＶＩＩの生産は、プリオン・タイプの従来にはない病原性因子を含む病原因子の伝播に対する安全性という面で好適である。
【００７７】
本発明の１つの好ましい実施の形態で、本発明によるＦＶＩＩは形質転換された雌のウサギの乳腺でつくられる。
【００７８】
形質転換されたほどの母乳への分泌を可能にする乳腺による問題の蛋白質の分泌は遺伝子組み換え蛋白質の組織に依存した態様での発現の制御を可能にする当業者に公知の技術である。
【００７９】
この発現の組織制御はその動物の特定の組織に向けられた蛋白質発現を可能にする配列のおかげで実行される。
これらの配列とはプロモータ配列と信号ペプチド配列である。
【００８０】
乳腺内で目的の蛋白質の発現を促進するプロモータの例としては、ＷＡＰプロモータ（乳清酸性蛋白質）、カゼイン・プロモータ、特にβ−カゼイン、ａ−カゼイン・プロモータ、β−乳酸グロブリン、ａ−乳酸アルブミン・プロモータなどを挙げることができるが、これらは発明を限定的するものではない。
特に好適な態様においては、雌ウサギの乳酸の乳腺における発現は、β−カゼイン・プロモータ制御の下で行われる。
【００８１】
形質転換した動物の母乳内での遺伝子組み換え蛋白質を生産する方法は以下のステップを含むことができる。
ヒトＦＶＩＩをコード化し、母乳内に自然に分泌される蛋白質のプロモータの制御下にある合成ＤＮＡ分子をヒト以外の哺乳動物の胚に組み込む。
この胚を次に同じ種の雌の体内に入れる。
この胚から得られた哺乳動物が成長したら、その哺乳動物の乳の分泌を起こさせて、その乳を回収する。
そうすると、その母乳は問題の形質転換されたＦＶＩＩを含んでいる。
【００８２】
ヒト以外の雌の哺乳動物の母乳で形質転換された蛋白質をつくるプロセスの例が欧州特許０、２６４、１６６に述べられており、本発明のＦＶＩＩを生産するためにその教示を参照することができる。
【００８３】
ヒト以外の雌の哺乳動物の母乳で蛋白質をつくるプロセスの別の例は欧州特許第０、５２７、０６３に述べられており、本発明のＦＶＩＩを生産するためにその教示を参照することができる。
【００８４】
雌のウサギの乳腺でつくりだされたＦＶＩＩの組成物は、その因子ＶＩＩのシアル酸の少なくとも一部がａ２−６結合の存在を示唆する。
【００８５】
特に好ましい方法では、すべてのシアル酸がａ２−６結合の存在を示唆し、ＦＶＩＩのシアル酸の少なくとも９０％がａ２−６結合の存在を示唆する。
さらに、本発明によるＦＶＩＩの組成物はａ２−３結合の存在を示唆するシアル酸を含んでいる場合もある。
【００８６】
特に好適な態様では、ａ２−６結合の存在を示唆するシアル酸の割合は６０％より高く、７０％、８０％、あるいは９０％より高い場合もある。
具体的には、この割合は６０％から９０％の範囲である。
【００８７】
この雌のウサギの体内で発現されたＦＶＩＩの組成物の二触角性のモノシリアル化されたグリカン形態の中で、大部分のグリカン形態はフコース化されていない。
好適に、これらの二触角性のモノシリアル化されフコース化されていないグリカン形態はこの組成物のＦＶＩＩにおいては２０％を上回る割合で存在している。
好適に、この割合は２５％を上回り、４０％を上回る場合もある。
【００８８】
本発明の１つの実施の形態で、本発明によるこの組成物のＦＶＩＩのフコース化の割合は、２０％から５０％の範囲である。
本発明のさらに別の実施の形態では、この割合は１５％を下回る場合もある。
【００８９】
雌のウサギから得られる形質転換されたＦＶＩＩはいくつかの翻訳後修飾を含んでおり、最初の９ないし１０のＮ末端グルタミン酸はγ−カルボキシル化されており、Ｓｅｒ52（セリン５２）とＳｅｒ60（セリン６０）はＯ−グリコシル化されており、グルコース（キシロース）0−2 とフコース部位をそれぞれ含んでおり、そして、Ａｓｎ145 とＡｓｎ322 は主に二触角性のモノシリアル化されたグリカン複合形態によってグリコシル化されている。
【００９０】
上に述べたような雌のウサギの乳腺でつくりだされるＦＶＩＩの組成物は フランス特許第０６−０４８７２に述べられており、この特許の採用は本明細書の教示に組み込まれる。
【００９１】
形質転換された哺乳動物による母乳内でつくりだされるＦＶＩＩは当業者に公知の技術を用いることによってその母乳から精製することができる。
【００９２】
例えば、米国特許第６、２６８、４８７に述べられているような問題の蛋白質の精製方法は以下のようなステップを含むことができる。
ａ）上記母乳を保留分と透過分を形成するのに十分な孔度を有する膜を通じて接線ろ過にかけて、内因性蛋白質を含む透過分を得るステップと、
ｂ）その透過分をクロマトグラフィ装置にかけて内因性蛋白質を取り出すと同時に、溶出液を得るステップと、
ｃ）上記流出液と保留分を組み合わせるステップと、
ｄ）脂質、カゼイン小球からＦＶＩＩを回収して、ＦＶＩＩが少なくとも７５％まで回収されるまでステップａ）からｃ）までを繰り返すステップ。
【００９３】
形質転換された哺乳動物の母乳でつくられたＦＶＩＩを精製するための別の技術は本出願人が提出したフランス特許出願第０６ ０４８６４に述べられており、この特許出願の内容は参照により本明細書に組み入れられる。
形質転換された動物の母乳に含まれているＦＶＩＩの抽出及び精製プロセス（プロセスＡ）は以下のステップで構成されている。
ａ）母乳からＦＶＩＩを抽出するステップ。この因子ＶＩＩは前記母乳のカルシウムの有機及び／又は無機塩あるいは錯体と結合しており、これをその母乳に可溶性の塩を付加することで得られたカルシウム化合物を沈殿させ、その陰イオンは前記不溶性カルシウム化合物を形成する能力によって選択され、こうして因子ＶＩＩを前記塩及び／又は錯体から放出させ、因子ＶＩＩが液相で存在させるようにするステップ、
ｂ）カルシウム化合物の沈殿物から蛋白質を大量に含む液相を分離し、さらにその液相を脂質相と前記蛋白質を含む非脂質相とに分離するステップ、
ｃ）前記非脂質相を所定の濃度のリン酸塩に基づく溶出緩衝液を用いて親和性クロマトグラフィにかけるステップ、
及び
ｄ）ステップｃ）で得られた因子ＶＩＩの溶出物を弱塩基性タイプの陰イオン交換カラム上で、そのカラムに捕捉された因子ＶＩＩを連続溶出させるのに適した緩衝液を用いて２、３回クロマトグラフィにかけるステップ。
【００９４】
実際、本出願人は、驚くべきことに、ＦＶＩＩは乳清内で自然につくりだされた蛋白質のプロモータ、例えば、ＷＡＰプロモータあるいはβ−カゼイン・プロモータの制御下に置かれても、母乳のカルシウム・イオンと結合しやすく、従ってカゼイン小球と結合しやすい傾向がある。
【００９５】
形質転換された哺乳動物の母乳でつくられたＦＶＩＩの精製の別の技術は本出願人によって出願されたフランス出願第０６−１１５３６に述べられており、この内容は参照により、本明細書に組み込まれている。
形質転換された動物の母乳に含まれているＦＶＩＩの抽出及び精製のプロセス（プロセスＢ）は以下のステップで構成されている。
ａ）前記母乳の上澄みを採取して脱脂するステップ、
ｂ）前記蛋白質を含んでいる脱脂しスキミングされた画分を疎水性とイオン性の両方の正確を示す移植されたリガンドを用いてクロマトグラフィ基質にかけ、前記蛋白質がその基質上に捕捉されるようなｐＨ条件で反応を行わせるステップ、
ｄ）上記蛋白質を溶出させるステップ、
ｅ）前記溶出された画分から母乳蛋白質を除去することによって溶出された画分を精製するステップと、そして
ｆ）前記蛋白質を回収するステップ。
【００９６】
ＦＶＩＩの組成物が形質転換された雌のウサギによってつくりだされる場合、二触角性でバイシリアル化された形状が過半数にあるようにシアリル化の処理にかけられる。
【００９７】
本発明の１つの具体的な実施の形態で、このシアリル化はシアリル−トランスフェラーゼ、例えば、ａ２、６−（Ｎ）−シアリル−トランスフェラーゼ（あるいはβ−Ｄ−ガラクトシル−β１、４−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミン−ａ２、６−シアリルトランスフェラーゼ）、あるいはＧａｌベータ１、３ＧａｌＮＡｃアルファ２、３−シアリルトランスフェラーゼ、あるいはＧａｌベータ１、３（４）ＧｌｃＮａｃアルファ２、３シアリルトランスフェラーゼ、あるいはＧａｌＮａｃアルファ−２、６−シアリルトランスフェラーゼＩなどを用いて行われ、これらの酵素は市販されている。
【００９８】
好ましくは、用いられるシアリルトランスフェラーゼはａ２、６結合を介してシアル酸を転換させることができるシアリルトランスフェラーゼである。
実際、本発明によるＦＶＩＩの組成物はａ２、６結合の存在を示唆するシアル酸を示すが、それはこの異性体が血漿性ＦＶＩＩ内により多く存在するからである。
【００９９】
このシアリル化は、例えば、シアル酸そのもの、あるいは１つか複数のシアル基を含みそしシアル酸基を放出しやすいいずれかの分子を用いて行うことができる。
【０１００】
本発明の１つの実施の形態によれば、酵素がａ２、６−（Ｎ）−シアリルトランスフェラーゼである場合、シアル酸をシアル酸ドナー基からＦＶＩＩに移すのに適した反応培養液で、基質がシチジン−５’−モノホスホ−Ｎ−アセチル−ノイラミン酸であれば、二触角性のバイシリアル化された形態が過半数になる。
この反応培養液は、例えば、モルフォルノ−３−プロパノスルホン酸、及び例えばＴｗｅｅｎに基づく緩衝液であってもよい。
【０１０１】
本発明のさらに別の実施の形態によれば、この基質はシチジン−モノホスフェート（ＣＭＰ）−シアル酸シンセターゼ、シアル酸、ＣＴＰ（シスチジン・トリホスフェート）及びその反応が起こるのに十分な量の二価金属陽イオンを含んだ反応培養液内でも合成することができる。
この二価金属陽イオンは、例えば、カルシウム・イオン、亜鉛イオン、マグネシウム・イオン、クロム・イオン、銅イオン、鉄イオン、あるいはコバルト・イオンである。
【０１０２】
ＦＶＩＩの組成物のシアリル化を実行するために用いられる方法が何であれ、この反応は常にバイシアリル化された形態が十分に増大して、それらが過半数になるような適切な条件化で十分な時間をかけて実行される。
情報のために述べるとすれば、その反応のための時間は、例えば少なくとも０．５時間、そして少なくとも５時間、あるいは７時間、８時間、９時間、さらには１０時間の場合もある。
より好ましくは、培養は一昼夜をかけて行われる。
場合によっては、この反応は５−１２時間かけて行われる。
【０１０３】
好適には、本発明によるＦＶＩＩの組成物は活性化されている（ＦＶＩＩａ）。
【０１０４】
この場合、組織因子（ＴＦ）との相互作用において、（活性化されていない）ＦＶＩＩより２５−１００倍も高い凝集活性を示す場合がある。
ＦＶＩＩの活性化は、イン・ビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ、「生体内で」と換言できる。）では異なったプロテアーゼ（ＦＩＸａ、 ＦＸａ、ＦＶＩＩａ）によってチモーゲンがジスルフィド架橋によって結合された２つの鎖に切断されることによって生じる。
ＦＶＩＩａだけの場合は、酵素活性は非常に低いが、その共同因子との複合形態においては、ＦＸとＦＩＸを活性化することで、凝固プロセスを開始させる。
ＦＶＩＩａは例えば循環性の抗体による血友病での止血に関与する凝固因子である。
特に好適な態様においては、本発明によるＦＶＩＩは完全に活性化されている。
好適には、本発明によるＦＶＩＩａはいくつかの翻訳後修飾を含んでおり、それは、最初の９個あるいは１０個の末端グルタミン酸がγ−カルボキシル化されており、Ａｓｐ63が部分的に水酸化されており、Ｓｅｒ52とＳｅｒ60がＯ−グリコシル化されて、それぞれグルコース（キシロース）0−2 とフコースを担持しており、Ａｓｎ145 とＡｓｎ322 はＮ−グリコシル化されていて、主として、複合的な二触角性のバイシリアル化されており、フコース化されていない形態を示す。
【０１０５】
ＦＶＩＩの活性化は、例えば、イン・ビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ、「細胞内で」と換言できる。）で本発明のＦＶＩＩの精製を行うことによって実行されるプロセスからも起こり得る（実施例２参照）。
【０１０６】
従って、本発明によるＦＶＩＩａは分子量が約２０ｋＤａの１５２個のアミノ酸の軽鎖と分子量が約３０ｋＤａの２５４個のアミノ酸の重鎖で構成されており、これらの軽鎖と重鎖は単一のジスルフィド架橋（Ｃｙｓ135 −Ｃｙｓ262 ）によって結合されている。
【０１０７】
従って、本発明によるＦＶＩＩは血漿性ＦＶＩＩに近い活性及び構造を有する活性化されたＦＶＩＩである。
【０１０８】
ＦＶＩＩａは組織因子（ＴＦ）との相互作用においては、ＦＶＩＩと比較して、その凝固活性はＦＶＩＩと比較して２５倍から１００倍高い。
【０１０９】
本発明の１つの実施の形態で、ＦＶＩＩは因子Ｘａ、ＶＩＩａ、ＩＩａ、ＩＸａ及びＸＩＩａによってイン・ビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ、「細胞内で」と換言できる。）で活性化させることができる。
【０１１０】
本発明のＦＶＩＩはその精製プロセスでも活性化させることができる。
【０１１１】
本発明のさらに別の目的は医薬品として用いられる本発明のＦＶＩＩの組成物である。
【０１１２】
本発明の別の目的は、血友病患者の治療用の医薬品を調製するための、本発明による因子ＶＩＩの組成物の利用である。
【０１１３】
本発明の別の目的は、複数の血友病性傷害の治療のための医薬品を調製するための本発明による因子ＶＩＩの組成物の利用である。
【０１１４】
本発明のさらに別の目的は、抗凝固剤の過剰投与による出血を治療するための医薬品を調製するための本発明による因子ＶＩＩの組成物の利用である。
【０１１５】
本発明のさらに別の目的は、本発明による因子ＶＩＩを含む医薬品と賦形剤及び／又は薬学的に許容される基質である。
【０１１６】
本発明のさらに別の目的は、遺伝子組み換えあるいは形質転換された因子ＶＩＩの組成物を調製するためのプロセスであり、この組成物の因子ＶＩＩの各分子はＮ−グリコシル化部位に結合したグリカン形態で構成されており、前記組成物の因子ＶＩＩのすべての分子の中で、二触角性のバイシリアル化されたグリカン形態が過半数であり、さらにこのプロセスは、シアリルトランスフェラーゼを活性化させるのに適した反応培養液中で、シアル酸がシアル酸ドナー基質からＦＶＩＩに転換できるのに十分な時間、そしてその目的に即した条件の下で、そしてバイシアリル化された形態が十分に増大するようまで、上に述べたような部分的にシアリル化された形質転換されたあるいは遺伝子組み換えされた因子ＶＩＩの組成物をシアル酸ドナー基質及びシアリルトランスフェラーゼと接触させてシアリル化を行い、前記のバイシアリル化された形態が過半数になるようにするステップを含んでいる。
この反応を行うための条件は上に述べた通りであり、以下の実施例にも述べてある。
【０１１７】
『部分的にシアリル化された』とは、そのＮに結合されたグリカン形態がすべてはバイシアリル化されておらず、一部がモノシアリル化されているＦＶＩＩの組成物を意味している。
好適に、これらの二触角性のモノシリアル化された形態は４０％以上、特に好適な場合５０％、あるいは６０％以上の割合で存在している。
好適に、二触角性のモノシリアル化されフコース化されていないグリカン形態は２０％を上回っており、さらには３０％、４０％、場合によっては５０％以上である。
【０１１８】
好適に、シアリルトランスフェラーゼは、ａ２、６−（Ｎ）−シアリルトランスフェラーゼ（あるいはβ−Ｄ−ガラクトシル−β１、４−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミン−ａ２、６−シアリルトランスフェラーゼ）、あるいはＧａｌベータ１、３ＧａｌＮＡｃアルファ２、３−シアリルトランスフェラーゼ、あるいはＧａｌベータ１、３（４）ＧｌｃＮａｃアルファ２、３シアリルトランスフェラーゼ、あるいはＧａｌＮａｃアルファ−２、６−シアリルトランスフェラーゼＩである。
【０１１９】
好適に、シアリルトランスフェラーゼはａ２−６結合を解してシアル酸の形質転換を可能にするシアリルトランスフェラーゼである。
実際、本発明による組成物のＦＶＩＩはａ２−６結合の存在を示唆するシアル酸を示すＦＶＩＩであることは好適である。
というのは、この異性体は血漿性ＦＶＩＩ内ではより多く存在しているからである。
【０１２０】
このシアリル化はいずれのシアル酸ドナー基質を用いて行っても良い。
【０１２１】
１つの実施の形態によれば、酵素がａ２−６結−（Ｎ）−シアリルトランスフェラーゼである場合、基質はシチジン−５’−モノホスホ−Ｎ−アセチルノイラミン酸であり、シアル酸をシアル酸ドナー基からＦＶＩＩへの転換を可能にするのに適した反応培養液内で、二触角性のバイシアリル化形態が過半数になる。
【０１２２】
反応培養液は生物学的に受け入れ許容されるＴｗｅｅｎ（登録商標）８０あるいはＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００、あるいはそれらの混合物で濃度が０．０１％から０．２％の範囲のもの、あるいは２価の金属陽イオン、好ましくは、例えばＣａ２+、Ｍｎ２+、Ｍｇ２+、またはＣｏ２+、Ｃａ２+などで、濃度は５ｍＭから１０ｍＭの範囲のものであってもよい。
この反応培養液はさらに、カコジル酸ナトリウム、モルホリノ−３−プロパンスルホン酸、Ｔｒｉｓ及び塩酸など、その培養液のｐＨを招請するための１種類あるいは複数の種類のイオン力調整剤を、４０ｍＭから６０ｍＭの範囲で含んでいても良い。
ｐＨ値は通常６から７．５の範囲である。この反応培養液はさらにＢＳＡ（仔ウシ血清アルブミン）を０．０５から０．１５ｍｇ／ｍｌの範囲で含んでいてもよい。
【０１２３】
本発明のさらに別の実施の形態によれば、上記基質はこの培養液内にＣＭＰ−シアル酸シンセターゼ、シアル酸、ＣＴＰ（シチジン・トリホスターゼ）、及び十分な量の上に述べたような２価金属陽イオンを導入することによって合成することができる。
【０１２４】
ＦＶＩＩの組成物のシアリル化の方法がどのようなものであれ、この反応は常に、上にも述べたように、バイシリアル化された形態がかなり増大してそれらが過半数になるのに十分な時間とそれに適した条件の下で行われる。
【０１２５】
このプロセスにおいて固定化された酵素が用いられる場合、反応時間は好ましくは０．５から３時間の間、温度は摂氏４度から摂氏３７度の間、より好ましくは摂氏４度から摂氏２０度の間である。
【０１２６】
このプロセスがバッチ反応で行われる場合、反応時間は１−９時間、好ましくは１−６時間の範囲であり、温度は摂氏４度〜摂氏３７度、好ましくは摂氏４度〜摂氏２０度の範囲であることが好適である。
【０１２７】
好ましくは、本発明のプロセスは部分的にシアリル化された形質転換あるいは遺伝子組み換えされた因子ＶＩＩの生物学的使い捨て性を改善することを目的としたプロセスである。
この生物学的使い捨て性の改善は、上にも述べたように、その組成物をシアル酸ドナー基質及びシアリルトランスフェラーゼと接触させることによって得られる。
【０１２８】
『生物学的使い捨て性の改善』は、ＦＶＩＩの組成物の生物学的使い捨て性をそのシアリル化が修飾されていない同じＦＶＩＩの組成物と比較して、少なくとも５％、少なくとも１０％、あるいは好適には少なくとも３０％か５０％、そして、好ましくは８０％から９０％の増大を意味している。
【０１２９】
さらに別の実施の形態で、シアリル化ステップの前に、ガラクトース化のステップが実行される。
このステップはガラクトースが欠乏している形態、つまり、準ガラクトース化された、およびモノガラクトース化されたＦＶＩＩ形態にガラクトースを移入することを目的としている。
ガラクトースはＧｌｃＮＡｃに固定され、後のシアリル化ステップでシアル酸残基を固定しやすくなる。
このガラクトース化ステップは当業者に公知のＵＤＰ−Ｇａｌウリジン（５’−ジホスホガラクトース）を含む反応培養液内でガラクトシル−トランスフェラーゼを用いて行うことができる。
【０１３０】
好適に、部分的にシアリル化されたＦＶＩＩ組成物の過半数のグリカン形態は複合的な、二触角性のモノシアリル化されたタイプである。
そうしたグリカン形態を以下に示す。
【０１３１】
【数２】
【０１３２】
本発明の１つの特殊な実施の形態で、部分的にシアリル化されたＦＶＩＩの組成物は二触角性でシアリル化されていない（フコース化された、あるいはフコース化されていない）、三触覚性でシアリル化されていない（フコース化された、あるいはフコース化されていない）、そしてバイシアリル化された（フコース化された、あるいはフコース化されていない）複合形態も含んでいる。
【０１３３】
好適に、前記の部分的にシアリル化されたＦＶＩＩの組成物の二触角性でモノシアリル化されたグリカン形態のなかで、過半数のグリカン形態がフコース化されていない。
【０１３４】
好適に、部分的にシアリル化されたＦＶＩＩの組成物は、前にも述べたように一部のａ２、６結合の存在を示唆するシアル酸の一部を少なくとも示す。
【０１３５】
好ましくは、このプロセスは、さらに、形質転換された雌のウサギによって部分的にシアリル化された形質転換ＦＶＩＩの組成物をつくりだすステップを含んでいる。
このステップは上に述べたように実行される。
このステップはガラクトース化ステップの前に行っても良い。
【０１３６】
好適に、部分的にシアリル化されたＦＶＩＩの組成物のＦＶＩＩは活性化されている。
【０１３７】
本発明によるプロセスを用いると、前記組成物の因子ＶＩＩのすべての分子のうちで、二触角性でバイシアリル化された形態が過半数になる。
【０１３８】
好適に、シアル酸ドナー基はシチジン−５’−モノホスホ−Ｎ−アセチルノイラミン酸であり、シアリルトランスフェラーゼはａ２、６−（Ｎ）−シアリル−トランスフェラーゼである。
【０１３９】
部分的にシアリル化されたＦＶＩＩのそうした組成物は、形質転換された雌のウサギの乳腺でつくられた形質転換ＦＶＩＩの組成物であってよい。
【０１４０】
特に好適な場合、部分的にシリアル化されたＦＶＩＩの組成物はフランス特許第０６−０４８７２に述べられている組成物である。
なお、このフランス特許第０６−０４８７２の内容は本明細書に組み入れられるべきものとする。
【０１４１】
本発明のさらなる態様及び利点について以下の実施例で述べるが、これらは例示のためにのみ説明されるものであって、本発明の範囲の限定は意図していない。
【０１４２】
略語の説明
ＦＶＩＩ−Ｔｇ＝ＦＶＩＩａ−Ｔｇ：本発明による活性化された形質転換されたＦＶＩＩ
ＶＦＩＩ−ｒ＝ＶＦＩＩａ−ｒ：市販されている遺伝子組み換え活性化ＦＶＩＩ
ＦＶＩＩ−ｐ＝ＦＶＩＩａ−ｐ：活性化された血漿性ＦＶＩＩ、つまり、ヒトの血漿から精製されたＦＶＩＩ
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ：基質支援レーザ脱着イオン化−飛行時間
ＨＰＣＥ−ＬＩＦ：高性能毛細管電気泳動−レーザー誘発蛍光
ＥＳＩ−ＭＳ：質量分光−イオン化『電気スプレイ』
ＬＣ−ＥＳＩＭＳ：液体クロマトグラフィ−質量分光−イオン化『電気スプレイ』
ＮＰ−ＨＰＬＣ：正常相高性能液体クロマトグラフィ
ＰＮｇａｓｅ Ｆ：ペプチド： Ｎ−グリコシダーゼ Ｆ
ＬＣ−ＭＳ：液体クロマトグラフィ−質量分光
【実施例１】
【０１４３】
実施例１：母乳でヒトＦＶＩＩの蛋白質をつくりだす形質転換さえれた雌ウサギの産出
【０１４４】
先ず、ＷＡＰ遺伝子（Ｄｅｖｉｎｏｙ ｅｔ ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、 ｖｏｌ．１６、ｎｏ．１６、２５ ａｏｕｔ １９８８、 ｐ．８１８０参照）の配列をベクターｐ−ｐｏｌｙ ＩＩＩ−Ｉ（Ｌａｔｈ ｅｔ ａｌ．、Ｇｅｎｅ（１９８７）５７、１９３−２０１参照）のポリリンカーに導入することでプラスミドｐ１をつくりだす。
【０１４５】
このプラスミドｐ１から得られたプラスミドｐ２はウサギのＷＡＰ遺伝子のプロモータとヒトＦＶＩＩの遺伝子を含んでいる。
【０１４６】
この形質転換された雌のウサギは微量注射という古典的な技術によって得られたものであった（Ｂｒｉｎｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．、 Ｐｒｏｃ． ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ（１９８５）８２、４４３８−４４４２参照）。
この遺伝子を５００コピー含んでいる１−２ｐｌをウサギの胚の雄性前核に注入した。
遺伝子操作された遺伝子を含むこのベクターのフラグメントを微量注射した。
その後、これらの胚をホルモン的に調整した養子関係の雌の卵管内に移した。
これらの遺伝子操作された胚の約１０％が若いウサギを出産し、さらにこれら遺伝子操作された胚の２−５％が形質転換された若いウサギを出産した。
形質転換遺伝子の存在はウサギの尾から抽出されたＤＮＡからのサザーンの移入の技術で明らかにされた。
これらの動物の血液と母乳内でのＦＶＩＩの濃度を特殊な放射免疫学的アッセイで評価した。
【０１４７】
ＦＶＩＩの生物学的活性は細胞培養液かウサギ乳房外植片培養液に母乳を加えることで評価した。
【実施例２】
【０１４８】
実施例２：獲得されたＦＶＩＩの抽出と精製
【０１４９】
ａ）ＦＶＩＩの抽出
【０１５０】
９体積分の０．２５Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ８．２で希釈した生の脱脂していない母乳５００ｍｌを用いた。
室温で３０分攪拌した後、水性のＦＶＩＩの含量を増やした相を摂氏１５度の温度で１時間、１００００ｇで遠心分離にかける。
約８３５ｍｌの６ポット分が必要となる。
【０１５１】
遠心分離後、３つの相が存在する。
それは、表面の資質相（クリーム）、水性非脂質でＦＶＩＩを多量に含んだ相（過半数の相）、そして、残りの白色の固体相（不溶性カゼイン及びカルシウム化合物の沈殿物）の３相である。
【０１５２】
水性でＦＶＩＩを多量に含んだ非脂質相は蠕動ポンプで上記クリーム相の上側に回収される。
このクリーム相は別個に回収される。
固体相（沈殿物）は廃棄される。
【０１５３】
しかしながら、非脂質水性相は依然として非常に少ない量ではあるが脂質を含んでいるので、一連のフィルター（Ｐａｌｌ ＳＬＫ７００２Ｕ０１０ＺＰ）−孔サイズが１μｍのグラス・ファイバー・プレフィルター−Ｐａｌｌ ＳＬＫ７００２ＮＸＰ−孔サイズが０．４５ｍｙｕｍｕのＮｙｌｏｎ ６６）を通じてろ過される。
このろ過ステップが終了した段階で、脂質相はこのろ過配列を通過して、母乳は母乳内に含まれる顆粒が完全に除去されるので、ろ過液は透明である。
【０１５４】
このろ過された非脂質相は次に限外ろ過膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｂｉｏｍａｘ ５０ｋＤａ−０．１ｍ２ ）にかけられて、クロマトグラフィ段階にかけることができるようになる。
分子量が約５０ｋＤａのＦＶＩＩは母乳に含まれている塩類、糖類、そしてペプチドとは違ってこの膜を透過しない。
初回に、上記溶液（約５０００ｍｌ）が５００ｍｌに濃縮され、次に、限外ろ過によって体積を一定に保ちながら透析を行うことによって、電解汁を除去し、クロマトグラフィ・ステップのための生物素材を調製する。
この透析緩衝液は０．０２５Ｍリン酸ナトリウムで、ｐＨは８．２である。
【０１５５】
このＦＶＩＩを含む水性非脂質相はＦＶＩＩ−Ｔｇの含量を増やした乳清に順化させることができる。
この製剤はそのプロセスを続ける前に摂氏−３０度の温度で保存される。
【０１５６】
このステップのＦＶＩＩ回収の総収量は９０％と非常に満足の行くものである（リン酸による９１％抽出＋９９％透析／濃度）。
【０１５７】
この結果から得られるＦＶＩＩを含む非支出水性相は完全に透明で、クロマトグラフィ・スタッフで使用することができる。
【０１５８】
この段階で、約９３、０００ＩＵのＦＶＩＩ−Ｔｇが抽出される。
この製剤のＦＶＩＩの純度は０．２％程度である。
【０１５９】
ｂ）ＦＶＩＩの精製
【０１６０】
１．ヒドロキシアパタイト・ゲル上でのクロマトグラフィ（親和性クロマトグラフィ）
【０１６１】
Ａｍｉｃｏｎ９０（直径９ｃｍ−断面６４ｃｍ2 ）カラムにＢｉｏＲａｄ Ｃｅｒａｍｉｃ ヒドロキシアパタイト・ゲル・タイプＩ（ＣＨＴ−Ｉ）を充填する。
【０１６２】
このゲルを０．０２５Ｍリン酸ナトリウムと０．０４塩化ナトリウムの混合物で構成される水性緩衝液Ａ、ｐＨ８．０で均衡化させる。
この製剤全体を摂氏−３０度で保存して、氷が完全に溶けるまで摂氏３７度の水槽内で解凍し、次に、上記ゲル上に注入する（線形流量１００ｃｍ／ｈ、つまり１０５ｍｌ／分）。
捕捉されない画分は基線に戻るまで（ＲＢＬ）、０．２５Ｍリン酸ナトリウムと０．０４塩化ナトリウムの混合物、ｐＨ８．２に通過させて廃棄される。
【０１６３】
ＦＶＩＩ−Ｔｇを含んでいる画分の溶出は０．０２５Ｍリン酸ナトリウム及び０．４Ｍ塩化ナトリウムを含む緩衝液Ｂ、ｐＨ８．０を用いて実行される。
溶出された画分は、基線回帰まで回収される。
これらの化合物はλ＝２８０ｎｍでの吸着測定によって検出する。
【０１６４】
このクロマトグラフィを行うことで、ＦＶＩＩ−Ｔｇの９０％以上が回収でき、さらに乳清蛋白質の９５％以上は除去できる。
比活性（Ｓ．Ａ）は２５倍に増幅される。
この段階で、純度４％のＦＶＩＩ−Ｔｇが約８５０００ＩＵが入手できる。
【０１６５】
２．１００ｋＤａ接線ろ過及び５０ｋＤａ濃縮／透析
【０１６６】
前のステップから得られた溶出物全体を１００ｋＤａ限外ろ過膜（Ｐａｌｌ ＯＭＥＧＡ ＳＣ １００Ｋ−０．１ｍ2 ）を通じてろ過する。
ＦＶＩＩはこの１００ｋＤａ膜でろ過され、分子量が１００ｋＤａ以上の蛋白質はろ過されない。
【０１６７】
ろ過された画分はさらに約５００ｍｌの体積まで濃縮され、その後、上に述べたような５０ｋＤａ限外ろ過フィルターで透析される。
透析用緩衝液は０．１５Ｍ塩化ナトリウムである。
【０１６８】
プロセスのこの段階で、生成物は摂氏−３０度の温度で保存され、その後イオン交換クロマトグラフィにかけられる。
【０１６９】
分子量が１００ｋＤａより大きな蛋白質、特に酵素前駆体において減少が認められた。
１００ｋＤａ膜での処理は約５０％の蛋白質の捕捉を可能にし、そのうちのＦＶＩＩ−Ｔｇの９５％に相当する高分子量蛋白質、つまり８２、０００ＩＵのＦＶＩＩ−Ｔｇがろ過される。
【０１７０】
この処理によって、以下の段階での蛋白質分解性加水分解が起きる可能性を減らすことができる。
【０１７１】
３．Ｑ−ＳｅｆａｒｏｓｅRＦＦゲル（ステップＤ）でのクロマトグラフィ−プロセスＡ）
【０１７２】
イオン交換ゲルＱ−Ｓｅｆａｒｏｓｅ（登録商標）Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ （ＱＳＦＦ）上で行われるこれら３つの連続的なクロマトグラフィは、活性成分を精製し、をＦＶＩＩ（ＦＶＩＩａ）に活性化させ、最後に、ＦＶＩＩの組成物を濃縮形成するために行われる。
これらの化合物は波長λ＝２８０ｎｍでの吸収測定で検出される。
【０１７３】
３．１ Ｑ−ＳｅｆａｒｏｓｅRＦＦゲルによるステップ１−『高カルシウム』の溶出
【０１７４】
２．６ｃｍ直径（断面積：５．３ｃｍ2 ）カラムにＱ−Ｓｅｆａｒｏｓｅ（登録商標）Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ （Ｇｅ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）ゲルを１００ｍｌ充填する。
【０１７５】
このゲルを０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５で均衡化させる。
【０１７６】
摂氏−３０度で保存されている画分全体を摂氏３７度の水槽で氷が完全になくなるまで解凍する。
この画分をゲルに注入する前に（流量：１３ｍｌ／分、つかり１５０ｃｍ／時間の線形流量に相当）、均衡化緩衝液で１／２体積パーセントまで希釈し、その後、保持されなかった画分は基線回帰まで緩衝液を通過させて廃棄する。
【０１７７】
ＦＶＩＩの含有量が低い最初の蛋白質画分は０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ及び０．１５Ｍ塩化ナトリウムで構成される緩衝液（ｐＨ：７．５）を用いて、９ｍｌ／分（１００ｃｍ／時間の線形流量）で溶出させ、その後、廃棄する。
【０１７８】
二回目のＦＶＩＩ含量が増大した画分は０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ及び０．０５Ｍ塩化ナトリウム、さらに０．０５Ｍ塩化カルシウムで構成される緩衝液（ｐＨ：７．５）で、９ｍｌ／分（１００ｃｍ／時間の線形流量）で溶出させる。
【０１７９】
この二回目の画分をすでに上に述べた５０ｋＤａ限外ろ過フィルターで透析にかける。
この透析用緩衝液は０．１５Ｍ塩化ナトリウムである。
この画分は、二回目のイオン交換クロマトグラフィにかけられる前に摂氏＋４度の温度で保存される。
【０１８０】
このステップによって、ＦＶＩＩの７３％（つまり、６００００ＩＵのＦＶＩＩ−Ｔｇ）の回収が可能になると同時に、付随する蛋白質の８０％の除去が可能になる。
これによって、ＦＶＩＩがＦＶＩＩａに活性化される。
【０１８１】
３．２ Ｑ−Ｓｅｆａｒｏｓｅ（登録商標）ＦＦゲルによるステップ２−『低カルシウム』の溶出
【０１８２】
２．５ｃｍ直径（断面積：４．９ｃｍ2 ）カラムにＱ−Ｓｅｆａｒｏｓｅ（登録商標）Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ （Ｇｅ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）ゲルを３０ｍｌ充填する。
【０１８３】
このゲルを０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５で均衡化させる。
【０１８４】
摂氏＋４度で保存されている前に溶出された画分（二回目の画分）をゲルに注入する前に（流量：９ｍｌ／分、つまり１００ｃｍ／時間の線形流量に相当）、希釈する。
【０１８５】
二回目の画分を注入した後、捕捉されていない画分を除去するために、そのゲルを均衡化緩衝液で基線回帰まで洗浄する。
【０１８６】
非常に高純度のＦＶＩＩを含む画分を０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ、０．０５Ｍ塩化ナトリウム、及び０．００５塩化カルシウムの混合液（ｐＨ７．５）で溶出させる。
【０１８７】
約２３、０００ＩＵ、つまり１２ｍｇのＦＶＩＩ−Ｔｇが精製される。
【０１８８】
このステップによって付随する蛋白質（雌ウサギ母乳蛋白質）の９５％以上が除去される。
【０１８９】
純度が９０％以上この溶出物は、ヒトＦＶＩＩの天然の分子にほぼ近い構造的及び機能的特徴を示す。
この溶出物を三回目のイオン交換クロマトトグラフィで精製し、調製する。
【０１９０】
３．３ Ｑ−Ｓｅｆａｒｏｓｅ（登録商標）ＦＦゲルによるステップ３−『ナトリウム』の溶出
【０１９１】
２．５ｃｍ直径（断面積：４．９ｃｍ2 ）カラムにＱ−Ｓｅｆａｒｏｓｅ（登録商標）Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（Ｇｅ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）ゲルを１０ｍｌ充填する。
【０１９２】
このゲルを緩衝液である０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５で均衡化させる。
【０１９３】
この画分を注入した後、捕捉されていない画分を除去するために、均衡化緩衝液を用いて、このゲルを基線回帰まで洗浄する。
【０１９４】
前のステップから得られた溶出・精製された画分を注入用純水（ＰＷＩ）で５回希釈してから、ゲルに注入する（流量：４．５ｍｌ／分、５０ｃｍ／時間の線形流量に相当）。
【０１９５】
その後、ＦＶＩＩ−Ｔｇは０．０２ＭのＴｒｉｓ及び０．２８Ｍ塩化ナトリウムで構成される緩衝液（ｐＨ７．０）を用いて流量３ｍｌ／分（３６ｃｍ／時間の線形流量に相当）で溶出させる。
【０１９６】
ＦＶＩＩ−Ｔｇの組成物が純度９５％以上の濃度で調製された。
この生成物は静脈注射に用いることができる。
このプロセスの累積収量は２２％であり、従って、処理される母乳１リットルあたり少なくとも２０ｍｇのＦＶＩＩの精製が可能である。
【０１９７】
以下の表１は精製されたＦＶＩＩの組成物を提供するための本発明の好ましい実施の形態によるプロセス・ステップの概要を示すものであり、それぞれのステップであらわれる異なった収量、純度、及び比活性を示している。
【０１９８】
【表１】
【０１９９】
その後、ＦＶＩＩ−Ｔｇは以下の実施例に述べられているような、さまざまな構造分析にかけられる。
【実施例３】
【０２００】
実施例３：グリコシル化部位及びグリコペプチドのＭｓ−ＥＳＩによる特徴づけ
【０２０１】
ＦＶＩＩ−Ｔｇ、ＦＶＩＩａ、ｐ（血漿性ＦＶＩＩ）及びＦＶＩＩａ、ｒのＮグリコシル化部位をＬＣ−ＥＳＩＭＳ（／ＭＳ）で識別し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳで確認し、そしてそれぞれの部位に存在する種々のグリカンの代表的な特性をＬＣ−ＥＳＩＭＳで判定した。
【０２０２】
図２は両方のＡｓｎグリコシル化残基を含むグリコペプチドの解析ＥＳＩスペクトルを示している。
グリコシル化部位の局所化はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（／ＴＯＦ）及びエドマン配列決定法によって確認した。
【０２０３】
それぞれＡｓｎ145 及びＡｓｎ322 のＮグリコシル化箇所を示すＦＶＩＩａ、ｐのグリコペプチド［Ｄ123 −Ｒ152 ］と［Ｋ31.6−Ｒ353 ］の質量スペクトル分析は、二触角性のバイシアリル化されフコース化されていない（Ａ２）（Ａｓｎ145 を含むグリコペプチドの観察された質量：５５６３．８Ｄａ）及びフコース化された形態（Ａ２Ｆ）（Ａｓｎ145 グリコペプチドの観察された質量：５７０９．８Ｄａ）の存在を示す。
Ａｓｎ145 に関しても、三触角性のトリシアリル化されフコース化されていない形態（Ａ３）（観察６２２０．０Ｄａ）とフコース化された形態（Ａ３Ｆ）（観察された質量：６３６６．１ Ｄａ）の存在に注目。
【０２０４】
ＦＶＩＩａ、ｒの場合、Ａｓｎ145 はＡ２Ｆ、Ａ１Ｆタイプ及び”Ａ１Ｆ”のグリカンで修飾されており、これは他の触角のＧａｌＮＡｃ末端位置のモノシアリル化形態に対応している。
グリカンＡ３Ｆ（三触角性、トリシアリル化されフコース化された形態）の存在も認められる。
【０２０５】
ＦＶＩＩ−Ｔｇの場合、それぞれＮグリコシル化部位Ａｓｎ145 とＡｓｎ322 を示すグリコペプチド［Ｄ123 −Ｒ152 ］及び［Ｋ31.6−Ｒ353 ］の質量スペクトル分析は、二触角性のバイシアリル化されフコース化されていない（Ａ２）（Ａｓｎ145 を含むグリコペプチドの観察された質量：５５６３．８Ｄａ）とフコース化された形態（Ａ２Ｆ）（観察された質量：５７０９．７ Ｄａ）の存在を示している。
Ａｓｎ145 の過半数を示すオリゴ糖の存在は、二触角性のモノシアリル化されフコース化されていない形態（Ａ１）（観察された質量：５２７２．３Ｄａ）及びフコース化された形態（Ａ１Ｆ）（観察された質量：５４１８．７Ｄａ）の存在を示す。
三触角性形態はあまり示されていない。
なお、他方の触角の末端位置にＧａｌＮＡｃを有するモノシアリル化された形態は存在していない。
【０２０６】
Ａｓｎ322 の過半数のグリコ形態に関連して、同じグリカン構造が異なった割合で観察される。
図１はＡｓｎ145 形態の場合と同様に成熟度が低い形態（二触角性及びシアリル化の程度がより低い形態）の存在を示している。
例えば、血漿生成物の場合、Ａｓｎ322 ではＡｓｎ145 と比較して、三触角性形態はより低い割合で示され、ＦＶＩＩａ、ｒ及びＦＶＩＩ−Ｔｇでは存在していない。
さらに、Ａｓｎ145 及び322 は１００％の割合でグリコシル化されていることも注目すべきである。
準定量的だけではあるが、これらの結果はＨＰＣＥ−ＬＩＦ及びＮＰ−ＨＰＬＣによって得られる提供的データと一致している。
【実施例４】
【０２０７】
実施例４： ＨＰＣＥ−ＬＩＦによるＮグリカンの定量
【０２０８】
Ｎ結合オリゴ糖の同定と定量はＰＮＧａｓｅ Ｆによる脱グリコシル化の後に、ＨＰＣＥ−ＬＩＦによって行われる。
ＦＶＩＩのサンプルはそれぞれの単離された構造の同定と識別が確実に行えるような方法で、エグゾゴルコキシダーゼ（シアリダーゼ（酵素／基質比：１ｍＩＵ／１０μｇ）、ガラクトシダーゼ、ヘキシナカーゼ（キット Ｐｒｏｚｙｍｅ）、フコーシダーゼ（Ｅ／Ｓ比率：１ｍＵＩ／１０μｇ）を用いて処理される。
得られたグリカンをフルオロクロムでラベルし、その質量と電荷に基づいて分離する。
２つの基準（グルコースのホモポリマー、オリゴ糖性）に基づいて、それらの構造を同定することができる。
定量は定量されたオリゴ糖全体に対する各ピークの減少した割合（％）を積分することで行われる。
【０２０９】
毛管電気泳動装置であるＰｒｏｔｅｏｍｅＬａｂ ＰＡ８００ （Ｂａｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用い、その毛管はＮ−ＣＨＯ『被覆』（Ｂａｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ）で、その内径は５０ｃｍｘ５０μｍである。
分離用緩衝液『ゲル緩衝液Ｎ』（Ｂａｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いる。
移行は２５ｋＶの電圧を、２０分間、摂氏２０度の温度でかけることによって行われる。
検出は励起波長λ４８８ｎｍと励起波長λ５２０ｎｍで行われる。
【０２１０】
フコース化の割合は、シアリダーゼ、ガラクトシダーゼ、及びヘキシナカーゼを同時に用いて脱グルコース化の後、『コア』とフコース化された『コア』に対応するピークの表面間の関係によって計算される。
【０２１１】
ＦＶＩＩａ、ｐのグリカンは過半数が二触角性でバイシリアル化されておりフコース化されていない（Ａ２）タイプのものと、二触角性でバイシリアル化されておりフコース化されている（Ａ２Ｆ）タイプのものである。ＦＶＩＩ−Ｔｇのグリカンの特徴は二触角性でモノシリアル化されておりフコース化ているものとされていないもの（Ａ１Ｆ、Ａ１）と、二触角性でバイシリアル化されておりフコース化もの、あるいはフコース化されていないもの（Ａ２Ｆ、Ａ２）形態の存在を示唆している。
その分布はこれらの種々の形態間で異なっている。
【０２１２】
ＦＶＩＩａ、ｒは二触角性でシアリル化され、フコース化されたグリカン形態で、過半数はＡ２Ｆ形態で二触角性のモノシリアル化されフコース化（Ａ１Ｆ）形態である。
これらの構造の場合に通常観察される移行時間と比較して、Ａ２Ｆ及びＡ１Ｆ形態に関しては種々の移行時間が認められる。
【０２１３】
ＦＶＩＩ−Ｔｇの両方のバッチ（Ａ及びＢ）のグリカンの特徴（図３、中央の両方の電気泳動図参照）が二触角性のモノシリアル化されフコース化された形態とフコース化されていない形態（Ａ１ＦとＡ１）、及び二触角性のバイシリアル化されフコース化された形態とフコース化されていない形態（Ａ２ＦとＡ２）を示している。
【０２１４】
【表２】
【０２１５】
種々のグリカン形態の定量的分析（表２）は、ＦＶＩＩａ、ｐの場合、シアリル化形態が優勢で、バイシリアル化されたグリカン（Ａ２及びＡ２Ｆ）が５１％、そして、三触角性のシリアル化されフコース化されていない形態とフコース化された形態（それぞれＧ３とＧ３Ｆ）が３０％である（結果は示さず）。
ＦＶＩＩ−Ｔｇ（バッチＡ及びＢ）はＦＶＩＩａ、ｐと比較するとシアリル化の程度が低く、二触角性のバイシリアル化された形態が３５％、そして三触角性のシリアル化された形態はわずか６％であった（結果は示さず）。
主要な形態はモノシリアル化された形態で、その構造の５０％がＡとＡ１Ｆである。
ＦＶＩＩａ、ｒもＦＶＩＩａ、ｐと比較するとシリアル化の程度が低く、Ａ２Ｆ構造が４５％、そして三触角性でシリアル化さたグリカンはわずか６％であった（結果は示さず）。ＦＶＩＩａ、ｒのフコース化されていない形態がないことに注意。
【０２１６】
【表３】
【０２１７】
これらの結果はＦＶＩＩａ、ｐのフコース化の割合は低く（１６％）、ＦＶＩＩ−Ｔｇのフコース化の割合は２４〜４２％、そしてＦＶＩＩａ、ｒのフコース化の比率は１００％であることを示している。
【実施例５】
【０２１８】
実施例５：ＮＰ−ＨＰＬＣによるＮグリカンの定量
【０２１９】
ＦＶＩＩａ、ｐ、ＦＶＩＩａ、ｒ及びＦＶＩＩ−Ｔｇの定性及び定量分析をＮＰ−ＨＰＬＣで行った（図４参照）。
蛋白質を脱塩、乾燥した後、この蛋白質を変性させ、当業者に公知の方法を用いて還元した。
その後、これらのグリカンを酵素反応（エンドグリコシダーゼ ＰＮＧａｓｅ Ｆ）にかけて、エタノールで沈殿させて精製した。
このようにして得られたグリカンをフルオロフォア、２−アミノベンズアミド（２−ＡＢ）でラベルする。
ラベルされたグリカンその疎水性に基づいて、４．６ｘ２５０ｍｍのＡｍｉｄｅ‐８０カラム（Ｔｏｓｏｈａａｓ）を用いて３０℃の温度に保って正常相ＨＰＬＣクロマトグラフィによって分離する。
【０２２０】
サンプルを注入する前に、このカラムを８０％アセトニトリルの緩衝液で均衡化させる。
５０ｍＭギ酸アンモニウム、ｐＨ４．４５の増大勾配で、１４０分間以上の時間をかけて溶出させる。
検出は波長３３０ｎｍと波長４２０ｎｍで蛍光測定で行う。
【０２２１】
ＦＶＩＩａ、ｐのクロマトグラフィー的特徴は、グリカンの過半数が二触角性のバイシリアル化されたタイプ（Ａ２）で、その割合は３９％であることを示している。
さらに、より少ない量ではあるが、二触角性でバイシアリル化されフコース化されたタイプ（Ａ２Ｆ）、モノシアリル化されたタイプ（Ａ１）、トリシアリル化されフコース化されたタイプとフコース化されていない形態（Ａ３Ｆ及びＡ３）が認められる。
【０２２２】
ＦＶＩＩ−Ｔｇに関して行われるＮＰ−ＨＰＬＣはタイプＡ１のオリゴ糖の存在を確認し、その割合は２７％である。
Ａ１Ｆ、Ａ２及びＡ２Ｆ形態の割合はより低く、三触角性の形態は微量である。
このことはＦＶＩＩａ、ｐと因子ＦＶＩＩ−Ｔｇ（バッチＢ）との間の差、シリアル化の程度がより低いことを示している。
【０２２３】
同じ分析を因子ＦＶＩＩａ、ｒで行うと、主な形態がタイプＡ２Ｆで、その割合が３０％であることを示す。
形態Ａ１Ｆの量はより少なく、三触角性の形態は微量である。
ＦＶＩＩａ、ｒの分析もＡ１Ｆ形態とＡ２Ｆ形態の保持時間の間に重要な時間差があることを示しており、これらの形態がＦＶＩＩａ、ｐ及びＦＶＩＩ−Ｔｇに存在しているものと違っていることを示している。
【０２２４】
これらの結果はＨＰＣＥ−ＬＩＦで得られた結果と一致している。
【実施例６】
【０２２５】
実施例６：ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳによる同定
【０２２６】
質量分光分析ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ （基質支援レーザー脱着／イオン化飛行時間質量分光分析）はペプチド、蛋白質、グリカン、オリゴ糖、及びイオン化可能なポリマーの大部分を高度の正確さで測定するための技術である。
【０２２７】
分析対象のペプチド、蛋白質、及びグリカンを用いられるレーザーの特定の波長で光を吸収する基質と混合と混合する。
主な基質は、ペプチドに対してはα−シアノ−４−水酸化桂皮酸（ＨＣＣＡ）、蛋白質に対してはシナピン酸（ＳＡ）、そしてオリゴ糖の分析用には２、５−ジヒドロ安息香酸（ＤＨＢ）である。
【０２２８】
この方法はパルス化レーザーによって共結晶基質／検体を照射するステップで構成されており、これによって、基質と検体分子の共脱着が誘発される。
ガス相でイオン化した後、この検体分子を飛行時間中に検出器を通過させる。
質量と飛行時間は直接的な相関関係を有しているので、後者を測定することは、目標の検体の質量判定を可能にしてくれる。
同定は観察された質量を測定して、それを理論値と比較することで行われる。
配列決定は得られた画分イオンに基づいて、ＭＳ／ＭＳモードで行うことができる。
用いられる計器はＴＯＦ及びＴＯＦ／ＴＯＦモードで作動するＢｒｕｋｅｒ Ａｕｔｏｆｌｅｘ２である。
【０２２９】
ＦＶＩＩ−Ｔｇ及びＦＶＩＩａ、ｒ内に存在しているグリカン形態を同定するために、予備的ＮＰ−ＨＰＬＣから得られる溶出画分上で行われる。
【０２３０】
ＦＶＩＩ−ＴｇのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析によって、ＮＰ−ＨＰＬＣによって分離されたグリカン、つまり過半数であるモノシアリル化されたＡ１形態と少数部分のＡ１Ｆ、Ａ２Ｆ及びＡ２タイプの同定が可能になる。
【０２３１】
この調査は小数部分の形態である三触角性のバイシリアル化、トリシリアル化タイプ、ハイブリッド形態、及びＭａｎ５及びＭａｎ６−Ｐ−ＨｅｘＮＡｃタイプの同定を可能にしてくれる（図５参照）。
【０２３２】
ＦＶＩＩａ、ｒでのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ分析は図６に示されているグリカン形態の存在を明らかにする。
因子ＦＶＩＩａ、ｒは部分的にしかフコース化されないＦＶＩＩ−Ｔｇとは違って、ほぼ完璧にフコース化される。
なお、過半数のグリカン形態はＡ２Ｆで、ＮＰ−ＨＰＬＣによって定量された比率は３０％である。
二触角性でモノシリアル化され、フコース化された形態 （Ａ１Ｆ）で、他方の触角部分の末端位置にＧａｌＮＡｃを含んでいる形態が同定され、一方及び／又は両方のアンテナ上にＨｅｘ−Ｎａｃ−ＨｅｘＮＡｃ部位を有する天然の二触角性のフコース化された形態も同定される。
三触角性のトリシリアル化されフコース化された形態も注目される。
フコース化されていない形態は微量存在している。
【実施例７】
【０２３３】
実施例７：シアル酸−ガラクトース結合のＨＰＣＥ−ＬＩＦ分析
【０２３４】
シアル酸−ガラクトース結合（『分岐』）の研究に関して言えば、実験的手順は実施例４に述べたのと類似している。
ＰＮＧａｓｅＦによる脱グリコシル化を行った後、オリゴ糖を特殊なエグゾシアリダーゼを用いて、それぞれその結合の同定と各単離された構造の定量が行える方法で処理される。
用いられるシアリダーゼはＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（連鎖球菌感染症病原体）（ａ２−３結合固有、０．０２ＩＵ、Ｅ／Ｓ＝０．４ ｍ／ｍ）、Ｃ． ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ（ガス壊疽脱疽菌群）（ａ２−３−及びａ２−６−結合固有、０．０４ＩＵ、Ｅ／Ｓ＝０．１ｍ／ｍ）及び、Ａ． ｕｒｅｆａｃｉｅｎｓ（ａ２−３、ａ２−６、ａ２−８及びａ２−９結合を加水分解、０．０１ＩＵ、Ｅ／Ｓ＝０．０５ｍ／ｍ）から得られた遺伝子組み換え酵素である。
【０２３５】
これらの分析の結果として、ＦＶＩＩａ、ｒはＡ２Ｆを主体とする二触角性のシアリル化されフコース化された形態と二触角性のモノシアリル化されフコース化された形態（Ａ１Ｆ）を有していることを示している。
これらのＡ２Ｆ及びＡ１Ｆ構造に関しては、これらの形態に通常認められる移行時間と比較してばらつきのある移行時間が観察されている。
特に、これらのオリゴ糖性ノシアリル化された形態は、ＨＰＣＥ−ＬＩＦ及びＮＰ−ＨＰＬＣにおいてＦＶＩＩ−Ｔｇのものと比較してばらつきのある移行時間を示す。
一方、オリゴ糖の組成物の分析においてＮｅｕ５Ａｃ以外の特別のシアル酸は認められず、質量分光分析ではバイシアリル化されたタイプの質量を有するグリカンの存在を示す。
最終的に、ＦＶＩＩａ、ｒのグリカンを脱シアリル化すると、ＦＶＩＩ−Ｔｇのオリゴ糖のものと同等のクロマトグラフィ及び電気泳動挙動を見ることが出来る。
【０２３６】
クロマトグラフィ及び電気泳動挙動におけるこれらの差は、従って、シアル酸の異なった分岐に基づいて説明することができる。
こうした仮定は、ＨＰＣＥ−ＬＩＦ及びＭＳによる異なったアプローチで確認された。
【０２３７】
これらの結果を以下の表４に示す。
【０２３８】
【表４】
【０２３９】
これらの結果は、両方のＦＶＩＩ間でシアル酸レベルでの違いを示している。
実際、ＦＶＩＩａ、ｒのシアル酸はａ２−３結合の存在を示唆しているが、ＦＶＩＩ−Ｔｇはａ２−６分岐を示している。
【０２４０】
ＦＶＩＩ−Ｔｇと比較してのＨＰＣＥ−ＬＩＦ及びＮＰ−ＨＰＬＣ挙動におけるＦＶＩＩａ、ｒのグリカンの違いはシアル酸レベルでの異性の違いに関係している。
【実施例８】
【０２４１】
実施例８：ＦＶＩＩ−Ｔｇのイン・ビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ、「細胞内で」と換言できる。）での再シアリル化
【０２４２】
文献（Ｚｈａｎｇ Ｘ ｅｔ ａｌ、 Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ １９９８、 １４２５；４４１−５２）は、糖蛋白質をより完全にシアリル化すると、イン・ビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ、「細胞内で」と換言できる。）でもイン・ビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ、「生体内で」と換言できる。）でも安定性が改善されると述べている。
この研究の目的は、イン・ビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ、「細胞内で」と換言できる。）でのシアリル化の実行可能性を実証することにある。
【０２４３】
再シアリル化はａ２−６−（Ｎ）−シアリルトランスフェラーゼ（ラット、Ｓｐｏｄｏｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ、比活性＝１単位／ｍｇ、４１ｋＤａ、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）と基質としてのシチジン−５’−モノホスホ−Ｎ−アセチルノイラミン酸（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を用いて行う。
これら２つの試薬は不安定なので摂氏−８０度の温度で保存する。
シアリル化基質（シチジン−５’−モノホスホ−Ｎ−アセチルノイラミン酸）と酵素ａ２、６−（Ｎ）−シアリルトランスフェラーゼ）を反応緩衝液内で混合して、一昼夜摂氏３７度の温度で放置した。
用いられた反応緩衝液は５０ｍＭのモルフォリノ−３プロパンスルホン酸、０．１％ Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０、０．１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ（仔ウシ血清アルブミン）の混合物で、ｐＨを７．４に調整したものである（試薬 Ｓｉｇｍａ）。
【０２４４】
以下の表５は実験条件を示すものである。
【０２４５】
【表５】
【０２４６】
実施例２の精製後に得られたものなどの天然のＦＶＩＩ−Ｔｇの電気泳動図（図７、下側参照）は、二触角性のモノシアリル化Ａ１形態が主体（４２％）であり、それより少ない割合でＡ２、Ａ２Ｆ及びＡ１Ｆが存在していることを示している。
再シアリル化後（図７、上側参照）、モノシアリル化された形態はわずか６％で、バイシアリル化された形態、特に非フコース化された形態の割合は過半数の５２％である。
【０２４７】
再シアリル化の前と後のグリカンの定量を下の図５に示す。
【０２４８】
【表６】
【０２４９】
形質転換されたＦＶＩＩのシアリル化の反応速度を図８に示す。
【０２５０】
この研究はイン・ビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ、「細胞内で」と換言できる。）での再シアリル化の効率を示しており、バイシアリル化された形態の割合は１００％以上増大している。
【実施例９】
【０２５１】
実施例９：ウサギに関する形質転換され再シアリル化されていないＦＶＩＩ（ＦＶＩＩ Ｔｇ ＮＲＳ）と、実施例８から得られた形質転換され再シアリル化されたＦＶＩＩ （ＦＶＩＩ Ｔｇ ＲＳ）との比較研究
【０２５２】
この研究の目的はニュージーランド産雄ウサギ上でのＦＶＩＩ−ＴｇＲＳとＦＶＩＩ−ＴｇＮＲＳとの薬力学的特徴の比較研究である。
【０２５３】
テストで用いられた投与量は一匹あたり２００μｇ／ｋｇで、これはヒトに投与される遺伝子組み換えＦＶＩＩの２倍の量である。
採血はＪ−４（製品を注射する４日前）とＪ−１（製品を注射した当日）に、Ｔ０．１７ｈ（注射当日、注射１０分後）、Ｔ０．３３ｈ（注射当日、注射２０分後）、Ｔ１ｈ（注射当日、注射１時間後）、Ｔ３ｈ（注射当日、注射３時間後）、Ｔ６ｈ（注射当日、注射６時間後）、Ｔ８ｈ（注射当日、注射８時間後）に行う。
【０２５４】
ＦＶＩＩ：Ａｇ（ＦＶＩＩの抗原）の投与量はＥＬＩＳＡ（Ａｓｓｅｒａｃｈｒｏｍキット）に従って決める。
ウサギの血漿でのＦＶＩＩ：Ａｇの投与量を決めることで、一方では、除去特性、他方では、薬力学的パラメータを判定することができる。
薬量データと実験グループを表７に示す。
【０２５５】
【表７】
【０２５６】
除去曲線を図９に示す。結果は表８に示す。
【０２５７】
【表８】
【０２５８】
投与された量に基づいて、除去半減期、平均残留時間（ＭＲＴ）、最大濃度（Ｃｍａｘ）、及び回収比率（『回収』）を両方の実験グループで比較可能である。
【０２５９】
ＦＶＩＩ−ＴｇＲＳはＦＶＩＩ−ＴｇＮＲＳとは違った反応力学特性を示す。
ＦＶＩＩ−Ｔｇを再シリアル化すると、半減期、平均残留時間（ＭＲＴ）、Ｃｍａｘ及び『回収』が目立たない程度ではあるが向上する。
【０２６０】
ＡＵＣパラメータ・レベル（ピーク・エリア）、Ｃ１（間隔）、及び分布体積（Ｖｄ）（この体積は投与された、あるいは吸収された用量を血漿濃度で割ることによって得られる）で違いが観察され、このことは、血液循環からＦＶＩＩ−ＴｇＲＳが多少除去されることを示している。
【０２６１】
ＦＶＩＩ−Ｔｇの再シリアル化は製品の生物学的利用可能性を約３０％程度増大させる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
それぞれの分子はＮグリコシル化部位に結合したグリカン形態を含んでいる遺伝子組み換えあるいは形質転換されたＦＶＩＩ（因子ＶＩＩ）の組成物で、前記組成物のＦＶＩＩのすべての分子のうちで、二触角性でバイシアリル化されておりフコース化されていないグリカン形態がその組成物のＦＶＩＩのＮグリコシル化部位に結合したすべてのグリカン形態と比較して多数であることを特徴とする形質転換ＦＶＩＩ組成物。
【請求項２】
二触角性でバイシアリル化されておりフコース化された形態とフコース化されていない形態の比率が５０％を上回っていることを特徴とする、請求項１記載の形質転換ＦＶＩＩ組成物。
【請求項３】
前記組成物のＦＶＩＩのすべての分子の中で、フコースの比率が２０％から５０％の範囲内であることを特徴とする、請求項１あるいは請求項２記載の形質転換ＦＶＩＩ組成物。
【請求項４】
前記組成物のＦＶＩＩのシアル酸のうちの少なくとも一部がａ２，６結合の存在を示唆していることを特徴とする、請求項１から請求項３までのいずれか１項記載の形質転換ＦＶＩＩ組成物。
【請求項５】
前記組成物のＦＶＩＩのすべてのシアル酸がａ２，６結合の存在を示唆していることを特徴とする、請求項４記載の形質転換ＦＶＩＩ組成物。
【請求項６】
前記組成物のＦＶＩＩがさらにａ２，３結合のシアル酸も含んでいることを特徴とする、請求項４記載の形質転換ＦＶＩＩ組成物。
【請求項７】
前記ＦＶＩＩが活性化されていることを特徴とする、請求項１−６のいずれか１項記載の形質転換ＦＶＩＩ組成物。
【請求項８】
医薬品として使用するための、請求項１−７のいずれか１項記載の形質転換ＦＶＩＩ組成物。
【請求項９】
血友病患者の治療のための医薬品を調製するための、請求項１−７のいずれか１項記載の形質転換ＦＶＩＩ組成物。
【請求項１０】
多重出血性トラウマ治療用医薬品を調製するための、請求項１−７のいずれか１項記載の形質転換ＦＶＩＩ組成物。
【請求項１１】
抗凝結剤の過剰投与による出血治療用の医薬品を調製するための、請求項１−７のいずれか１項記載の形質転換ＦＶＩＩ組成物。
【請求項１２】
請求項１−７のいずれか１項記載のＦＶＩＩ、賦形剤及び／又は薬学的に許容される基質を含む形質転換ＦＶＩＩ組成物。
【請求項１３】
それぞれの分子はＮグリコシル化部位に結合したグリカン形態を含んでいる遺伝子組み換えあるいは形質転換されたＦＶＩＩ（因子ＶＩＩ）の組成物で、前記組成物のＦＶＩＩのすべての分子の中で多数が二触角性のバイシリアル化されたグリカン形態であることを特徴とする組成物を調製するプロセスで、シアリルトランスフェラーゼの活性を可能にするために、シアル酸をシアル酸ドナー基質からＦＶＩＩに移行すると同時に、前記バイシアリル化された形態が増大して多数になるのに十分な時間と条件下で、適切な反応培養液内で部分的にシアリル化された形質転換された、あるいは遺伝子組み換えＦＶＩＩをシアル酸ドナー基質及びシアリルオランスフェラーゼと接触させるステップを含んでいる、ことを特徴とする大部分がグリカンで二触角性バイシアリル化され、フコース化されていない形態の遺伝子組み換えプロセス。
【請求項１４】
前記シアリル化ステップの前に、ＦＶＩＩのガラクトース化が不十分でモノガラクトース化された状態を含むガラクトース欠乏形態にガラクトースを移植するためにガラクトース化のステップが行われることを特徴とする、請求項１３記載の大部分がグリカンで二触角性バイシアリル化され、フコース化されていない形態の遺伝子組み換えプロセス。
【請求項１５】
前記の部分的にシアリル化されたＦＶＩＩの組成物が主として二触角性のモノシアリル化されたグリカン形態を示すことを特徴とする、請求項１３及び１４のいずれか１項記載の大部分がグリカンで二触角性バイシアリル化され、フコース化されていない形態の遺伝子組み換えプロセス。
【請求項１６】
前記の部分的にシアリル化されたＦＶＩＩの組成物の二触角性のモノシアリル化されたグリカン形態のうちで、過半数のグリカン形態がフコース化されていないことを特徴とする、請求項１５記載の大部分がグリカンで二触角性バイシアリル化され、フコース化されていない形態の遺伝子組み換えプロセス。
【請求項１７】
部分的にシアリル化されたＦＶＩＩの前記組成物において、少なくとも一部のシアル酸がａ２−６結合の存在を示すことを特徴とする、請求項１３−１６のいずれか１項記載の大部分がグリカンで二触角性バイシアリル化され、フコース化されていない形態の遺伝子組み換えプロセス。
【請求項１８】
上記のシアリル化ステップの前に、形質転換された雌のウサギによって部分的にシアリル化された形質転換ＦＶＩＩの組成物を精製するステップが含まれていることを特徴とする請求項１３−１７のいずれか１項記載の大部分がグリカンで二触角性バイシアリル化され、フコース化されていない形態の遺伝子組み換えプロセス。
【請求項１９】
前記部分的にシアリル化されたＦＶＩＩの組成物のＦＶＩＩが活性化されていることを特徴とする、請求項１３−１８のいずれか１項記載の大部分がグリカンで二触角性バイシアリル化され、フコース化されていない形態の遺伝子組み換えプロセス。
【請求項２０】
前記シアリルトランスフェラーゼがａ２，６−（Ｎ）−シアリルトランスフェラーゼであり、前記シアル酸ドナー基がシチジン−５´−モノホスホ−アセチル−ノイラミン酸であることを特徴とする請求項１３−１９のいずれか１項記載の大部分がグリカンで二触角性バイシアリル化され、フコース化されていない形態の遺伝子組み換えプロセス。
【請求項１】
それぞれの分子はＮグリコシル化部位に結合したグリカン形態を含んでいる遺伝子組み換えあるいは形質転換されたＦＶＩＩ（因子ＶＩＩ）の組成物で、前記組成物のＦＶＩＩのすべての分子のうちで、二触角性でバイシアリル化されておりフコース化されていないグリカン形態がその組成物のＦＶＩＩのＮグリコシル化部位に結合したすべてのグリカン形態と比較して多数であることを特徴とする形質転換ＦＶＩＩ組成物。
【請求項２】
二触角性でバイシアリル化されておりフコース化された形態とフコース化されていない形態の比率が５０％を上回っていることを特徴とする、請求項１記載の形質転換ＦＶＩＩ組成物。
【請求項３】
前記組成物のＦＶＩＩのすべての分子の中で、フコースの比率が２０％から５０％の範囲内であることを特徴とする、請求項１あるいは請求項２記載の形質転換ＦＶＩＩ組成物。
【請求項４】
前記組成物のＦＶＩＩのシアル酸のうちの少なくとも一部がａ２，６結合の存在を示唆していることを特徴とする、請求項１から請求項３までのいずれか１項記載の形質転換ＦＶＩＩ組成物。
【請求項５】
前記組成物のＦＶＩＩのすべてのシアル酸がａ２，６結合の存在を示唆していることを特徴とする、請求項４記載の形質転換ＦＶＩＩ組成物。
【請求項６】
前記組成物のＦＶＩＩがさらにａ２，３結合のシアル酸も含んでいることを特徴とする、請求項４記載の形質転換ＦＶＩＩ組成物。
【請求項７】
前記ＦＶＩＩが活性化されていることを特徴とする、請求項１−６のいずれか１項記載の形質転換ＦＶＩＩ組成物。
【請求項８】
医薬品として使用するための、請求項１−７のいずれか１項記載の形質転換ＦＶＩＩ組成物。
【請求項９】
血友病患者の治療のための医薬品を調製するための、請求項１−７のいずれか１項記載の形質転換ＦＶＩＩ組成物。
【請求項１０】
多重出血性トラウマ治療用医薬品を調製するための、請求項１−７のいずれか１項記載の形質転換ＦＶＩＩ組成物。
【請求項１１】
抗凝結剤の過剰投与による出血治療用の医薬品を調製するための、請求項１−７のいずれか１項記載の形質転換ＦＶＩＩ組成物。
【請求項１２】
請求項１−７のいずれか１項記載のＦＶＩＩ、賦形剤及び／又は薬学的に許容される基質を含む形質転換ＦＶＩＩ組成物。
【請求項１３】
それぞれの分子はＮグリコシル化部位に結合したグリカン形態を含んでいる遺伝子組み換えあるいは形質転換されたＦＶＩＩ（因子ＶＩＩ）の組成物で、前記組成物のＦＶＩＩのすべての分子の中で多数が二触角性のバイシリアル化されたグリカン形態であることを特徴とする組成物を調製するプロセスで、シアリルトランスフェラーゼの活性を可能にするために、シアル酸をシアル酸ドナー基質からＦＶＩＩに移行すると同時に、前記バイシアリル化された形態が増大して多数になるのに十分な時間と条件下で、適切な反応培養液内で部分的にシアリル化された形質転換された、あるいは遺伝子組み換えＦＶＩＩをシアル酸ドナー基質及びシアリルオランスフェラーゼと接触させるステップを含んでいる、ことを特徴とする大部分がグリカンで二触角性バイシアリル化され、フコース化されていない形態の遺伝子組み換えプロセス。
【請求項１４】
前記シアリル化ステップの前に、ＦＶＩＩのガラクトース化が不十分でモノガラクトース化された状態を含むガラクトース欠乏形態にガラクトースを移植するためにガラクトース化のステップが行われることを特徴とする、請求項１３記載の大部分がグリカンで二触角性バイシアリル化され、フコース化されていない形態の遺伝子組み換えプロセス。
【請求項１５】
前記の部分的にシアリル化されたＦＶＩＩの組成物が主として二触角性のモノシアリル化されたグリカン形態を示すことを特徴とする、請求項１３及び１４のいずれか１項記載の大部分がグリカンで二触角性バイシアリル化され、フコース化されていない形態の遺伝子組み換えプロセス。
【請求項１６】
前記の部分的にシアリル化されたＦＶＩＩの組成物の二触角性のモノシアリル化されたグリカン形態のうちで、過半数のグリカン形態がフコース化されていないことを特徴とする、請求項１５記載の大部分がグリカンで二触角性バイシアリル化され、フコース化されていない形態の遺伝子組み換えプロセス。
【請求項１７】
部分的にシアリル化されたＦＶＩＩの前記組成物において、少なくとも一部のシアル酸がａ２−６結合の存在を示すことを特徴とする、請求項１３−１６のいずれか１項記載の大部分がグリカンで二触角性バイシアリル化され、フコース化されていない形態の遺伝子組み換えプロセス。
【請求項１８】
上記のシアリル化ステップの前に、形質転換された雌のウサギによって部分的にシアリル化された形質転換ＦＶＩＩの組成物を精製するステップが含まれていることを特徴とする請求項１３−１７のいずれか１項記載の大部分がグリカンで二触角性バイシアリル化され、フコース化されていない形態の遺伝子組み換えプロセス。
【請求項１９】
前記部分的にシアリル化されたＦＶＩＩの組成物のＦＶＩＩが活性化されていることを特徴とする、請求項１３−１８のいずれか１項記載の大部分がグリカンで二触角性バイシアリル化され、フコース化されていない形態の遺伝子組み換えプロセス。
【請求項２０】
前記シアリルトランスフェラーゼがａ２，６−（Ｎ）−シアリルトランスフェラーゼであり、前記シアル酸ドナー基がシチジン−５´−モノホスホ−アセチル−ノイラミン酸であることを特徴とする請求項１３−１９のいずれか１項記載の大部分がグリカンで二触角性バイシアリル化され、フコース化されていない形態の遺伝子組み換えプロセス。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【公表番号】特表２００９−５４５５７５（Ｐ２００９−５４５５７５Ａ）
【公表日】平成２１年１２月２４日（２００９．１２．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５２２３０４（Ｐ２００９−５２２３０４）
【出願日】平成１９年７月３１日（２００７．７．３１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＲ２００７／００１３２４
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０１５３３９
【国際公開日】平成２０年２月７日（２００８．２．７）
【出願人】（５０８２４６４０１）エルエフビー バイオテクノロジーズ (3)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年１２月２４日（２００９．１２．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年７月３１日（２００７．７．３１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＲ２００７／００１３２４
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０１５３３９
【国際公開日】平成２０年２月７日（２００８．２．７）
【出願人】（５０８２４６４０１）エルエフビー バイオテクノロジーズ (3)
【Ｆターム（参考）】
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