大麦の選抜方法及び選抜マーカー
【課題】麦芽発酵飲料の泡持ちを良くする大麦の選抜方法を提供し、選抜された大麦を原料として泡持ちの良い麦芽発酵飲料の製造に貢献すること。麦芽発酵飲料の泡持ちを良くする大麦の選抜マーカーを提供すること。
【解決手段】本発明は、麦芽発酵飲料の泡持ちを良くする大麦の選抜方法であって、大麦の種子、その種子から得た麦芽、その麦芽から得た麦汁、その麦汁を発酵させて得た麦芽発酵飲料又は麦芽発酵飲料の発酵前原料液若しくは発酵中原料液、に含まれるプロテインＺ７の濃度を測定する測定ステップと、この濃度が低い場合に、この大麦は、麦芽発酵飲料の泡持ちを良くする大麦であると判断する判断ステップとを備える選抜方法を提供する。
【解決手段】本発明は、麦芽発酵飲料の泡持ちを良くする大麦の選抜方法であって、大麦の種子、その種子から得た麦芽、その麦芽から得た麦汁、その麦汁を発酵させて得た麦芽発酵飲料又は麦芽発酵飲料の発酵前原料液若しくは発酵中原料液、に含まれるプロテインＺ７の濃度を測定する測定ステップと、この濃度が低い場合に、この大麦は、麦芽発酵飲料の泡持ちを良くする大麦であると判断する判断ステップとを備える選抜方法を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、大麦の選抜方法及び選抜マーカーに関する。
【背景技術】
【０００２】
大麦の選抜方法には、優良株を交配して得られた交配後代を目的の形質を表現するまで栽培して選抜する方法の他に、交配後代のゲノムＤＮＡやタンパク質を種子や実生苗の段階で調べ、選抜マーカーとなるＤＮＡ領域又はタンパク質の有無を指標に選抜する方法がある。
【０００３】
麦芽発酵飲料の泡持ちは、麦芽発酵飲料の品質を判断するための重要な要素の１つであり、麦芽発酵飲料の泡持ちを良くする大麦が求められている。大麦に含まれる麦芽発酵飲料の泡持ちに関与するタンパク質としては、ＬＴＰ−１及びホルデインが報告されている（非特許文献１及び２）。
【０００４】
最近では、植物の選抜にプロテオミクスが利用されるようになり、大麦の種子中のタンパク質組成を網羅的に解析する試みや、麦芽特性と二次元電気泳動パターンとを比較して麦芽特性に関与するタンパク質を同定する試みがなされている（非特許文献３〜５）。
【０００５】
【非特許文献１】Ｂａｍｆｏｒｔｈら、２００４年、Ｊ． Ｓｃｉ． Ｆｏｏｄ Ａｇｒｉｃ．、８４巻、ｐ．１００１−１００４
【非特許文献２】Ｖａｎ Ｎｉｅｒｏｐら、２００４年、Ｊ． Ａｇｒｉｃ． Ｆｏｏｄ． Ｃｈｅｍ．、５２巻、ｐ．３１２０−３１２９
【非特許文献３】Ｏｓｔｅｒｇａａｒｄら、２００４年、Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ、４巻、ｐ．２４３７−２４４７
【非特許文献４】Ｓａｓｓ Ｂａｋ−Ｊｅｎｓｅｎら、２００４年、Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ、４巻、ｐ．７２８−７４２
【非特許文献５】ＦｉｎｎｉｅとＳｖｅｎｓｓｏｎ、２００４年、Ｐｒｏｃ． ９ｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｂａｒｌｅｙ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ、ｐ．４３１−４３６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、麦芽発酵飲料の泡持ちを良くする大麦の選抜を可能とする選抜マーカーは見出されておらず、麦芽発酵飲料の泡持ちを良くする大麦の選抜方法についても未だ存在しない。
【０００７】
大麦中のＬＴＰ−１やホルデインは、麦芽発酵飲料の泡持ちに関連すると報告されてはいるが、泡持ちの良さの判定基準であるＮＩＢＥＭ値との間の相関関係については明らかにされておらず、泡持ちの良い麦芽発酵飲料の製造に使用する大麦の選抜マーカーとして使用することは困難である。
【０００８】
そこで、本発明の目的は、麦芽発酵飲料の泡持ちを良くする大麦の選抜方法を提供し、選抜された大麦を原料として泡持ちの良い麦芽発酵飲料の製造に貢献することにある。本発明の目的はまた、麦芽発酵飲料の泡持ちを良くする大麦の選抜マーカーを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記目的を達成するため、本発明は、プロテインＺ７を選抜マーカーとして使用する、麦芽発酵飲料の泡持ちを良くする大麦の選抜方法であって、大麦の種子、その種子から得た麦芽、その麦芽から得た麦汁、その麦汁を発酵させて得た麦芽発酵飲料又はその麦芽発酵飲料の発酵前原料液若しくは発酵中原料液、に含まれるプロテインＺ７の濃度を測定する測定ステップと、この濃度が低い場合に、この大麦は麦芽発酵飲料の泡持ちを良くする大麦であると判断する判断ステップと、を備える選抜方法を提供する。
【００１０】
本発明者らは、プロテオミクスをツールとしてビール中のタンパク質を網羅的に解析し、泡持ちの良さの判定基準であるＮＩＢＥＭ値が高い泡持ちの良いビールでは、その原料として使用される大麦の種子及び麦汁中のプロテインＺ７の濃度並びに当該ビール中のプロテインＺ７の濃度が低いことを明らかにした。さらに、上記プロテインＺ７の濃度とＮＩＢＥＭ値との相関関係を統計的に解析した結果、上記プロテインＺ７の濃度を調べることにより、麦芽発酵飲料の泡持ちの良さを判定し、予測できることを見出した。
【００１１】
このため、大麦の種子、麦芽、麦汁、麦芽発酵飲料又は麦芽発酵飲料の発酵前原料液若しくは発酵中原料液に含まれるプロテインＺ７の濃度を測定すれば、最終製品である麦芽発酵飲料のＮＩＢＥＭ値を直接測定することなく、泡持ちを良くする大麦を選抜することが可能となる。また、ＮＩＢＥＭ値は、温度、天候、さらには人為的な要因が大きく影響するため、異なる条件で測定されたＮＩＢＥＭ値を相互に比較して泡持ちの良さを判定することは困難であるが、プロテインＺ７の濃度は、これらの要因の影響を排除して測定でき、プロテインＺ７の濃度とＮＩＢＥＭ値との間には相関関係があるため、泡持ちの良さの判定にも利用できる。
【００１２】
上記測定ステップは、大麦の種子、その種子から得た麦芽、その麦芽から得た麦汁、その麦汁を発酵させて得た麦芽発酵飲料又は麦芽発酵飲料の発酵前原料液若しくは発酵中原料液からタンパク質を抽出する抽出ステップと、抗プロテインＺ７抗体を使用して、タンパク質に含まれるプロテインＺ７を定量する定量ステップとを備えることが好ましい。
【００１３】
プロテインＺ７は、抗プロテインＺ７抗体により特異的に認識されるため、ＥＬＩＳＡ法、ウェスタンブロッティング法、プロテインチップ等を使用してプロテインＺ７を高感度に検出でき、その濃度を簡易に定量できる。
【００１４】
また本発明は、プロテインＺ７を選抜マーカーとして使用する、麦芽発酵飲料の泡持ちを良くする大麦の選抜方法であって、大麦の種子又はその種子から得た麦芽からＲＮＡを抽出する抽出ステップと、大麦の種子又は麦芽中に発現するプロテインＺ７ｍＲＮＡを定量する定量ステップと、プロテインＺ７ｍＲＮＡの発現量が低い場合に、この大麦は、麦芽発酵飲料の泡持ちを良くする大麦であると判断する判断ステップとを備える選抜方法を提供する。
【００１５】
プロテインＺ７を特異的に認識する抗プロテインＺ７抗体が入手できない場合であっても、例えば、ＰＣＲ法、ノーザンブロッティング法、ＤＮＡチップ等を使用して、プロテインＺ７ｍＲＮＡを高感度に検出でき、その発現量を簡易に定量できる。
【００１６】
また本発明は、プロテインＺ７からなる、麦芽発酵飲料の泡持ちを良くする大麦の選抜マーカーを提供する。
【００１７】
プロテインＺ７は、麦芽発酵飲料の泡持ちに対して負の要因として捉えることができ、プロテインＺ７の濃度が低い大麦の種子を原料として製造した麦芽発酵飲料の泡持ちが良くなるため、上記選抜マーカーは、泡持ちの良い麦芽発酵飲料の原料に使用する大麦品種の選抜に使用できる。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、大麦を原料に使用した最終製品である麦芽発酵飲料のＮＩＢＥＭ値を直接測定することなく、麦芽発酵飲料の泡持ちを良くする大麦を選抜できる。また、プロテインＺ７の濃度の測定は、温度、天候、さらには人為的な要因の影響を排除して行うことができ、プロテインＺ７の濃度とＮＩＢＥＭ値との間には相関関係があるため、本発明の選抜方法は、泡持ちの良い麦芽発酵飲料の判定方法としても使用できる。
【００１９】
さらに本発明の選抜マーカーは、泡持ちの良い麦芽発酵飲料に使用する大麦の選抜に使用できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
以下に、本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。
【００２１】
本発明の選抜方法は、プロテインＺ７を選抜マーカーとして使用する、麦芽発酵飲料の泡持ちを良くする大麦の選抜方法であって、大麦の種子、その種子から得た麦芽、その麦芽から得た麦汁、その麦汁を発酵させて得た麦芽発酵飲料又はその麦芽発酵飲料の発酵前原料液若しくは発酵中原料液、に含まれるプロテインＺ７の濃度を測定する測定ステップと、この濃度が低い場合に、この大麦は、麦芽発酵飲料の泡持ちを良くする大麦であると判断する判断ステップとを備えることを特徴とする。
【００２２】
本明細書における「大麦」とは、学名がＨｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅである植物のことをいい、大麦品種、大麦系統及び大麦の各大麦個体が該当する。
【００２３】
また、「泡持ち」とは、麦芽発酵飲料をグラスに注いだときに生じる泡が消えるまでに要する時間のことをいい、「泡持ちが良い」とは、この時間が長いことを意味し、「泡持ちが悪い」とはこの時間が短いことを意味する。「泡持ちを良くする大麦」とは、当該大麦を原料として麦芽発酵飲料を製造した場合に、大麦以外は同一の原料から製造した麦芽発酵飲料と比較して、泡持ちを良くすることに貢献する大麦のことをいう。
【００２４】
「麦芽発酵飲料」とは、麦芽を原料に用いて醸造した飲料のことをいい、例えば、ビール、発泡酒又は原料に麦芽を含有する雑酒が挙げられる。ビールとは、麦芽、ホップ及び水を原料として発酵させたもの又は麦芽、ホップ、水及び麦その他の政令で定める物品（麦、米、とうもろこし、こうりゃん、ばれいしょ、でんぷん、糖類、又は財務省で定める苦味料若しくは着色料）を原料として発酵させたものであって、麦芽使用率が２／３以上のものをいい、発泡酒とは、麦芽又は麦を原料の一部とした酒類で発泡性を有する酒類であって、麦芽使用率が２／３未満のものをいう。
【００２５】
「麦芽発酵飲料の発酵前原料液」とは、麦芽から麦汁を得る途中の仕込工程から麦汁を得るまでの間の原料液若しくは煮沸前の麦汁、又は、麦汁を煮沸し、引き続き冷却し、酵母を投入する前の冷麦汁ができるまでの間の麦汁若しくは冷麦汁のことをいう。「麦芽発酵飲料の発酵中原料液」とは、上記冷麦汁に酵母を投入した後、発酵工程を経て麦芽発酵飲料となるまでの全ての発酵液のことをいう。
【００２６】
また、「プロテインＺ７」とは、大麦の種子又はビール中に存在するセリンプロテアーゼインヒビターであり、分子量が約４３ｋＤａのタンパク質である（ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＣＡＡ６４５９９）。大麦種子中には、プロテインＺ７以外に、同じ大麦セリンプロテアーゼインヒビターのサブファミリーに属するプロテインＺ４（ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＣＡＡ６６２３２）が存在し、そのアミノ酸配列は、プロテインＺ７と約７３％の相同性を有している。
【００２７】
上記測定ステップは、大麦の種子、その種子から得た麦芽、その麦芽から得た麦汁、その麦汁を発酵させて得た麦芽発酵飲料又は麦芽発酵飲料の発酵前原料液若しくは発酵中原料液からタンパク質を抽出する抽出ステップと、抗プロテインＺ７抗体を使用して、タンパク質に含まれるプロテインＺ７を定量する定量ステップとを備えることが好ましい。例えば、ＥＬＩＳＡ法、ウエスタンブロッティング法、プロテインチップによる解析、アフィニティークロマトグラフィーによる定量分析等によってプロテインＺ７の濃度を定量できる。
【００２８】
ＥＬＩＳＡ法又はウエスタンブロッティング法で使用する抗プロテインＺ７抗体は、発酵に使用する大麦のプロテインＺ７を特異的に認識できる抗体が好ましく、例えば、プロテインＺ７のアミノ酸配列を基に合成したペプチドを抗原として使用し、ウサギやマウス等に免疫して作成できる。尚、これらの免疫学的手法については、当業者にとっては周知であるため本明細書では詳述しない。このような方法を記載する教本としては、例えば、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ」（Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ、１９８８年、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）等を参照されたい。
【００２９】
また、本発明の選抜方法は、プロテインＺ７を選抜マーカーとして使用する、麦芽発酵飲料の泡持ちを良くする大麦の選抜方法であって、大麦の種子又はその種子から得た麦芽からＲＮＡを抽出する抽出ステップと、大麦の種子又は麦芽中に発現するプロテインＺ７ｍＲＮＡを定量する定量ステップと、プロテインＺ７ｍＲＮＡの発現量が低い場合に、この大麦は、麦芽発酵飲料の泡持ちを良くする大麦であると判断する判断ステップとを備えることを特徴とする。
【００３０】
上記抽出ステップでは、例えば、ホットフェノール法（加温したフェノールとドデシル硫酸ナトリウムで大麦の種子又は麦芽を溶解しながらＲＮＡを抽出する方法）に従ってＲＮＡを抽出できるが、分解度の低い高純度ＲＮＡを得るために、大麦の種子又は麦芽を液体窒素で凍結した後、磨砕機で磨砕し、グアニジンチオシアネートを含有するＲＮＡ抽出試薬でＲＮＡを抽出ことがより好ましい。ＲＮＡ抽出試薬としては、ＩｓｏｇｅｎＴＭ（ニッポンジーン社製）が挙げられる。
【００３１】
上記定量ステップでは、抽出ステップで抽出された大麦由来のＲＮＡに含まれるプロテインＺ７ｍＲＮＡを、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロッティング法、ＤＮＡチップ等を使用して高感度に検出し、その発現量を定量できる。これらの方法は、例えば、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ」（Ｍａｎｉａｔｉｓら、１９８９年、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス）や「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ｆ． Ｍ． Ａｕｓｕｂｅｌ、１９８８年、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．）等の遺伝子工学プロトコールに記載されている。
【００３２】
また、本発明の、麦芽発酵飲料の泡持ちを良くする大麦の選抜マーカーは、プロテインＺ７からなることを特徴とする。
【００３３】
プロテインＺ７は、麦芽発酵飲料の泡持ちに対して負の要因として捉えることができ、プロテインＺ７の濃度が低いと麦芽発酵飲料の泡持ちは良くなるため、この知見を利用すれば泡持ち判定用マーカーとして使用でき、泡持ちの良い麦芽発酵飲料の原料に使用する大麦の選抜マーカーとして使用できる。これまで、プロテインＺ７が負の要因として、麦芽発酵飲料の泡持ちの良さの判定及び泡持ちの良い麦芽発酵飲料の原料に使用する大麦の選抜に利用できることについては全く知られていなかった。
【００３４】
ここで、「泡持ち判定用マーカー」とは、大麦の種子、麦芽、麦汁、麦芽発酵飲料又は麦芽発酵飲料の発酵前原料液若しくは発酵中原料液中での濃度がＮＩＢＥＭ値と相関性を示すタンパク質のことをいい、麦芽発酵飲料の泡持ちの良さを判定又は予測するために指標とできるタンパク質のことをいう。
【００３５】
プロテインＺ７は、大麦の種子、麦芽、麦汁、麦芽発酵飲料又は麦芽発酵飲料の発酵前原料液若しくは発酵中原料液中に存在し、例えば、ＥＬＩＳＡ法、ウエスタンブロッティング法、プロテインチップによる解析、アフィニティークロマトグラフィーによる定量分析等によって測定できる。
【００３６】
さらに、本発明の麦芽発酵飲料の泡持ちを良くする大麦の選抜マーカーを使用すれば、麦芽発酵飲料の泡持ちの良さの判定方法を提供できる。すなわち、麦芽発酵飲料の泡持ちの良さの判定方法であって、麦芽発酵飲料に使用する大麦の種子、その種子から得た麦芽、その麦芽から得た麦汁、その麦汁を発酵させて得た麦芽発酵飲料又はその麦芽発酵飲料の発酵前原料液若しくは発酵中原料液に含まれるプロテインＺ７の濃度（ＭＺ７）を泡持ちに対する負の要因として、泡持ちの良さを判定する判定方法を提供できる。
【００３７】
大麦の種子、麦芽、麦汁、麦芽発酵飲料又は麦芽発酵飲料の発酵前原料液若しくは発酵中原料液に含まれるプロテインＺ７の濃度を測定すれば、ＮＩＢＥＭ値を測定することなく泡持ちの良さを判定することが可能となり、プロテインＺ７の濃度の測定は、温度、天候、さらには人為的な要因の影響を排除して行うことができるため、ＮＩＢＥＭ値の測定と比べて汎用性があり、かつ、正確な泡持ちの良さの判定を実現できる。
【００３８】
ここで「ＮＩＢＥＭ値」とは、２０℃の麦芽発酵飲料をＮＩＢＥＭ値測定用の標準泡注ぎ出し機により炭酸ガスを用いて標準グラスに注ぎ出して生じる泡の高さが３０ｍｍ降下するのに要する時間（秒）のことをいう。
【００３９】
上記判定方法は、上記のプロテインＺ７の濃度（ＭＺ７）に負の係数を乗じた数値が小さい方の麦芽発酵飲料を泡持ちが良い麦芽発酵飲料であると判定することが好ましく、例えば、この数値を、ａ−ｂ×ＭＺ７（但し、ａは正の数、負の数又は０であり、ｂは正の数である。）として算出することがより好ましい。また、このａ及びｂがＭＺ７を変数としたときの、麦芽発酵飲料のＮＩＢＥＭ値を予測する単回帰式の単回帰係数であればさらに好ましい。
【００４０】
麦芽発酵飲料のＮＩＢＥＭ値を予測する単回帰式の単回帰係数は、ＮＩＢＥＭ値を測定した複数の麦芽発酵飲料について、大麦の種子、麦芽、麦汁、麦芽発酵飲料又は麦芽発酵飲料の発酵前原料液若しくは発酵中原料液のプロテインＺ７の濃度（ＭＺ７）を測定し、各麦芽発酵飲料のＮＩＢＥＭ値を目的変数とし、上記プロテインＺ７の濃度（ＭＺ７）を説明変数として単回帰式分析をすれば求めることができる。
【実施例】
【００４１】
本発明を以下の実施例に基づいてさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００４２】
（実施例１）ビールの原料となる大麦の種子中のプロテインＺ７の濃度とＮＩＢＥＭ値との相関関係
７種類の大麦品種（品種Ａ：はるな二条、品種Ｂ：ＣＤＣ Ｋｅｎｄａｌｌ、品種Ｃ：あまぎ二条、品種Ｄ：ＣＤＣ Ｃｏｐｅｌａｎｄ、品種Ｅ：北育３９号、品種Ｆ：りょうふう、品種Ｇ：Ｌｏｆｔｙ Ｎｉｊｏ）の種子からそれぞれ麦芽を製造し、ビールの醸造に必要な麦芽以外の原料については同一の原料を使用して７種類のビールを醸造した。ビールの原料として使用した７種類の大麦品種の種子中のプロテインＺ７の濃度と７種類のビールのＮＩＢＥＭ値をそれぞれ測定し、各大麦品種の種子中のプロテインＺ７の濃度とＮＩＢＥＭ値との相関関係について調べた。
【００４３】
７種類の大麦品種の種子に含まれるプロテインＺ７の濃度は、以下のようにして定量した。まず、粉砕した各大麦品種の種子（５０ｍｇ）を、２ｍＬのスクリューキャップ付きチューブに取り、ジチオトレイトール（和光株式会社）を０．２８％含むＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒ Ｓａｌｉｎｅ）を１ｍＬ加えて懸濁し、４℃で一晩振とうすることによりプロテインＺ７を抽出した。その後、この縣濁液を４℃で５分間、１５，０００回転で遠心分離し、得られた上清を適宜希釈して、抗プロテインＺ７抗体でプロテインＺ７濃度を定量した。抗プロテインＺ７抗体は、オーストラリアタスマニア大学のＥｖａｎｓ博士から分譲されたものであり、抗プロテインＺ７抗体を用いたプロテインＺ７の定量は、Ｅｖａｎｓ博士らの論文（Ａｍｅｒ． Ｓｏｃ． Ｂｒｅｗ． Ｃｈｅｍ．、２００３年、６１巻、ｐ．５５−６２）に従って行った。
【００４４】
また、各大麦品種の種子を単独で用いたビールの醸造については、以下の方法で行った。まず、７種類の大麦品種（品種Ａ〜Ｇ）の種子を浸麦槽で水に浸漬して水分含量を約４３％とし、発芽室で６日間発芽させ、熱風で焙燥することにより７種類の大麦品種の麦芽をそれぞれ製造した。
【００４５】
その後、各麦芽に副原料であるコーンスターチ、コーングリッツ及び米と水を加え、５０〜６０℃で２０分、６５℃で４０分、７３℃で３分間の糖化処理を行い（糖化工程）、こうして得られた麦汁にホップを加えて９０分間煮沸し、１０℃まで冷却した後に酵母を加え、１０〜１５℃で７〜１０日間アルコール発酵させた（発酵工程）。発酵終了後は、−１〜２℃で２〜３週間熟成させ、得られた発酵物をビールとしてＮＩＢＥＭ値の測定に供した。
【００４６】
ＮＩＢＥＭ値の測定は、ＨＡＦＦＭＡＮＳ社のＮＩＢＥＭ−Ｔ装置、ＩＮＰＡＣＫ２０００及びＮＩＢＥＭ値測定用の標準グラスを用いて行った。具体的には、上記の麦芽発酵飲料をそれぞれ２０℃の状態にし、泡注ぎ出し機により炭酸ガスを用いて標準グラスに注ぎ出し、生じた泡の高さの降下をＮＩＢＥＭ−Ｔ装置で追尾し、泡の高さが３０ｍｍ降下するのに要した時間（秒）をＮＩＢＥＭ値として測定した。
【００４７】
表１は、７種類の大麦品種（品種Ａ〜Ｇ）の種子に含まれるプロテインＺ７の濃度と、７種類の大麦品種の種子をそれぞれ原料として醸造した７種類のビールのＮＩＢＥＭ値とを示した表である。
【００４８】
【表１】
【００４９】
図１は、ＮＩＢＥＭ値を目的変数とし、大麦の種子中のプロテインＺ７の濃度を説明変数として単回帰分析を行ったグラフである。図中の＊は、危険率５％で有意であることを示す。
【００５０】
その結果、ＮＩＢＥＭ値と大麦の種子中のプロテインＺ７の濃度との間には統計的に有意な相関関係が認められた。単回帰式は、ＮＩＢＥＭ値＝２７３．３１＋（−０．１２６×プロテインＺ７の濃度）となった（ｒ＝０．８４８）。
【００５１】
以上の結果より、大麦の種子中のプロテインＺ７の濃度は、当該大麦の種子を原料とする麦芽発酵飲料の泡持ちに対する負の要因として麦芽発酵飲料の泡持ちの良さの判定に利用でき、大麦の種子中のプロテインＺ７の濃度を測定することにより、麦芽発酵飲料の泡持ちを良くする大麦を選抜できることが明らかとなった。
【００５２】
（実施例２）コングレス麦汁中のプロテインＺ７の濃度とＮＩＢＥＭ値との相関関係
７種類の大麦品種（品種Ａ：はるな二条、品種Ｂ：ＣＤＣ Ｋｅｎｄａｌｌ、品種Ｃ：あまぎ二条、品種Ｄ：ＣＤＣ Ｃｏｐｅｌａｎｄ、品種Ｅ：北育３９号、品種Ｆ：りょうふう、品種Ｇ：Ｌｏｆｔｙ Ｎｉｊｏ）の種子からそれぞれ麦汁を製造し、ビールの醸造に必要な麦芽以外の原料については同一の原料を使用して７種類のビールを醸造した。ビールの原料として使用した７種類の大麦品種の種子から製造したコングレス麦汁中のプロテインＺ７の濃度と７種類のビールのＮＩＢＥＭ値をそれぞれ測定し、各コングレス麦汁中のプロテインＺ７の濃度とＮＩＢＥＭ値との相関関係について調べた。
【００５３】
コングレス麦汁の製造は以下の方法で行った。実施例１に記載した手順に従って製造した各大麦品種の麦芽を粉砕し、粉砕した麦芽（５０ｇ）に２００ｍＬの水を加え、４５℃で３０分間保持した後、１分間に１℃の割合で７０℃まで加熱昇温し、７０℃に達した時点で１００ｍＬの水を加えて１時間保持した。その後、そこに水を加えて全量を４５０gになるようにし、ろ過して得られた麦汁をコングレス麦汁とした。
【００５４】
ビールの醸造及びＮＩＢＥＭ値の測定は、実施例１で記載した方法と同じ手順で行った。コングレス麦汁中のプロテインＺ７の濃度の定量は、それぞれの液を適宜希釈し、抗プロテインＺ７抗体によるＥＬＩＳＡ法により定量した。
【００５５】
表２は、７種類の大麦品種（品種Ａ〜Ｇ）の種子から製造したコングレス麦汁に含まれるプロテインＺ７の濃度と、７種類の大麦種子をそれぞれ原料として醸造した７種類のビールのＮＩＢＥＭ値とを示した表である。
【００５６】
【表２】
【００５７】
図２は、ＮＩＢＥＭ値を目的変数とし、コングレス麦汁中のプロテインＺ７の濃度を説明変数として単回帰分析を行ったグラフである。図中の＊は、危険率５％で有意であることを示す。
【００５８】
その結果、ＮＩＢＥＭ値とコングレス麦汁中のプロテインＺ７の濃度との間には統計的に有意な相関関係が認められた。単回帰式は、ＮＩＢＥＭ値＝２７３．０５＋（−０．９００６×プロテインＺ７の濃度）となった（ｒ＝０．８５２）。
【００５９】
以上の結果より、コングレス麦汁中のプロテインＺ７の濃度は、当該麦汁を原料とする麦芽発酵飲料の泡持ちに対する負の要因として麦芽発酵飲料の泡持ちの良さの判定に利用でき、麦汁中のプロテインＺ７の濃度を測定することにより、麦芽発酵飲料の泡持ちを良くする大麦を選抜できることが明らかとなった。
【００６０】
（実施例３）ビール中のプロテインＺ７の濃度とＮＩＢＥＭ値との相関関係
７種類の大麦品種（品種Ａ：はるな二条、品種Ｂ：ＣＤＣ Ｋｅｎｄａｌｌ、品種Ｃ：あまぎ二条、品種Ｄ：ＣＤＣ Ｃｏｐｅｌａｎｄ、品種Ｅ：北育３９号、品種Ｆ：りょうふう、品種Ｇ：ＬｏｆｔｙＮｉｊｏ）の種子からそれぞれ麦芽を製造し、ビールの醸造に必要な麦芽以外の原料については同一の原料を使用して７種類のビールを醸造した。７種類のビールに含まれるプロテインＺ７の濃度と７種類のビールのＮＩＢＥＭ値をそれぞれ測定し、ビール中のプロテインＺ７の濃度とＮＩＢＥＭ値との相関関係について調べた。
【００６１】
ビールの醸造及びＮＩＢＥＭ値の測定は、実施例１で記載した方法と同じ手順で行った。ビール中のプロテインＺ７の濃度の定量は、それぞれの液を適宜希釈し、抗プロテインＺ７抗体によるＥＬＩＳＡ法により定量した。
【００６２】
表３は、７種類の大麦品種（品種Ａ〜Ｇ）の種子を原料として醸造した７種類のビールに含まれるプロテインＺ７の濃度と、７種類のビールのＮＩＢＥＭ値とを示した表である。
【００６３】
【表３】
【００６４】
図３は、ＮＩＢＥＭ値を目的変数とし、ビール中のプロテインＺ７の濃度を説明変数として単回帰分析を行ったグラフである。図中の＊＊は、危険率１％で有意であることを示す。
【００６５】
その結果、ＮＩＢＥＭ値とビール中のプロテインＺ７の濃度との間には統計的に有意な相関関係が認められた。単回帰式は、ＮＩＢＥＭ値＝２６６．５０＋（−２．８０８９×プロテインＺ７の濃度）となった（ｒ＝０．９２０）。
【００６６】
以上の結果より、ビール中のプロテインＺ７の濃度は、当該ビールの泡持ちに対する負の要因として麦芽発酵飲料の泡持ちの良さの判定に利用でき、ビール中のプロテインＺ７の濃度を測定することにより、麦芽発酵飲料の泡持ちを良くする大麦を選抜できることが明らかとなった。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】ＮＩＢＥＭ値を目的変数とし、大麦の種子中のプロテインＺ７の濃度を説明変数として単回帰分析を行ったグラフである。
【図２】ＮＩＢＥＭ値を目的変数とし、コングレス麦汁中のプロテインＺ７の濃度を説明変数として単回帰分析を行ったグラフである。
【図３】ＮＩＢＥＭ値を目的変数とし、ビール中のプロテインＺ７の濃度を説明変数として単回帰分析を行ったグラフである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、大麦の選抜方法及び選抜マーカーに関する。
【背景技術】
【０００２】
大麦の選抜方法には、優良株を交配して得られた交配後代を目的の形質を表現するまで栽培して選抜する方法の他に、交配後代のゲノムＤＮＡやタンパク質を種子や実生苗の段階で調べ、選抜マーカーとなるＤＮＡ領域又はタンパク質の有無を指標に選抜する方法がある。
【０００３】
麦芽発酵飲料の泡持ちは、麦芽発酵飲料の品質を判断するための重要な要素の１つであり、麦芽発酵飲料の泡持ちを良くする大麦が求められている。大麦に含まれる麦芽発酵飲料の泡持ちに関与するタンパク質としては、ＬＴＰ−１及びホルデインが報告されている（非特許文献１及び２）。
【０００４】
最近では、植物の選抜にプロテオミクスが利用されるようになり、大麦の種子中のタンパク質組成を網羅的に解析する試みや、麦芽特性と二次元電気泳動パターンとを比較して麦芽特性に関与するタンパク質を同定する試みがなされている（非特許文献３〜５）。
【０００５】
【非特許文献１】Ｂａｍｆｏｒｔｈら、２００４年、Ｊ． Ｓｃｉ． Ｆｏｏｄ Ａｇｒｉｃ．、８４巻、ｐ．１００１−１００４
【非特許文献２】Ｖａｎ Ｎｉｅｒｏｐら、２００４年、Ｊ． Ａｇｒｉｃ． Ｆｏｏｄ． Ｃｈｅｍ．、５２巻、ｐ．３１２０−３１２９
【非特許文献３】Ｏｓｔｅｒｇａａｒｄら、２００４年、Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ、４巻、ｐ．２４３７−２４４７
【非特許文献４】Ｓａｓｓ Ｂａｋ−Ｊｅｎｓｅｎら、２００４年、Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ、４巻、ｐ．７２８−７４２
【非特許文献５】ＦｉｎｎｉｅとＳｖｅｎｓｓｏｎ、２００４年、Ｐｒｏｃ． ９ｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｂａｒｌｅｙ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ、ｐ．４３１−４３６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、麦芽発酵飲料の泡持ちを良くする大麦の選抜を可能とする選抜マーカーは見出されておらず、麦芽発酵飲料の泡持ちを良くする大麦の選抜方法についても未だ存在しない。
【０００７】
大麦中のＬＴＰ−１やホルデインは、麦芽発酵飲料の泡持ちに関連すると報告されてはいるが、泡持ちの良さの判定基準であるＮＩＢＥＭ値との間の相関関係については明らかにされておらず、泡持ちの良い麦芽発酵飲料の製造に使用する大麦の選抜マーカーとして使用することは困難である。
【０００８】
そこで、本発明の目的は、麦芽発酵飲料の泡持ちを良くする大麦の選抜方法を提供し、選抜された大麦を原料として泡持ちの良い麦芽発酵飲料の製造に貢献することにある。本発明の目的はまた、麦芽発酵飲料の泡持ちを良くする大麦の選抜マーカーを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記目的を達成するため、本発明は、プロテインＺ７を選抜マーカーとして使用する、麦芽発酵飲料の泡持ちを良くする大麦の選抜方法であって、大麦の種子、その種子から得た麦芽、その麦芽から得た麦汁、その麦汁を発酵させて得た麦芽発酵飲料又はその麦芽発酵飲料の発酵前原料液若しくは発酵中原料液、に含まれるプロテインＺ７の濃度を測定する測定ステップと、この濃度が低い場合に、この大麦は麦芽発酵飲料の泡持ちを良くする大麦であると判断する判断ステップと、を備える選抜方法を提供する。
【００１０】
本発明者らは、プロテオミクスをツールとしてビール中のタンパク質を網羅的に解析し、泡持ちの良さの判定基準であるＮＩＢＥＭ値が高い泡持ちの良いビールでは、その原料として使用される大麦の種子及び麦汁中のプロテインＺ７の濃度並びに当該ビール中のプロテインＺ７の濃度が低いことを明らかにした。さらに、上記プロテインＺ７の濃度とＮＩＢＥＭ値との相関関係を統計的に解析した結果、上記プロテインＺ７の濃度を調べることにより、麦芽発酵飲料の泡持ちの良さを判定し、予測できることを見出した。
【００１１】
このため、大麦の種子、麦芽、麦汁、麦芽発酵飲料又は麦芽発酵飲料の発酵前原料液若しくは発酵中原料液に含まれるプロテインＺ７の濃度を測定すれば、最終製品である麦芽発酵飲料のＮＩＢＥＭ値を直接測定することなく、泡持ちを良くする大麦を選抜することが可能となる。また、ＮＩＢＥＭ値は、温度、天候、さらには人為的な要因が大きく影響するため、異なる条件で測定されたＮＩＢＥＭ値を相互に比較して泡持ちの良さを判定することは困難であるが、プロテインＺ７の濃度は、これらの要因の影響を排除して測定でき、プロテインＺ７の濃度とＮＩＢＥＭ値との間には相関関係があるため、泡持ちの良さの判定にも利用できる。
【００１２】
上記測定ステップは、大麦の種子、その種子から得た麦芽、その麦芽から得た麦汁、その麦汁を発酵させて得た麦芽発酵飲料又は麦芽発酵飲料の発酵前原料液若しくは発酵中原料液からタンパク質を抽出する抽出ステップと、抗プロテインＺ７抗体を使用して、タンパク質に含まれるプロテインＺ７を定量する定量ステップとを備えることが好ましい。
【００１３】
プロテインＺ７は、抗プロテインＺ７抗体により特異的に認識されるため、ＥＬＩＳＡ法、ウェスタンブロッティング法、プロテインチップ等を使用してプロテインＺ７を高感度に検出でき、その濃度を簡易に定量できる。
【００１４】
また本発明は、プロテインＺ７を選抜マーカーとして使用する、麦芽発酵飲料の泡持ちを良くする大麦の選抜方法であって、大麦の種子又はその種子から得た麦芽からＲＮＡを抽出する抽出ステップと、大麦の種子又は麦芽中に発現するプロテインＺ７ｍＲＮＡを定量する定量ステップと、プロテインＺ７ｍＲＮＡの発現量が低い場合に、この大麦は、麦芽発酵飲料の泡持ちを良くする大麦であると判断する判断ステップとを備える選抜方法を提供する。
【００１５】
プロテインＺ７を特異的に認識する抗プロテインＺ７抗体が入手できない場合であっても、例えば、ＰＣＲ法、ノーザンブロッティング法、ＤＮＡチップ等を使用して、プロテインＺ７ｍＲＮＡを高感度に検出でき、その発現量を簡易に定量できる。
【００１６】
また本発明は、プロテインＺ７からなる、麦芽発酵飲料の泡持ちを良くする大麦の選抜マーカーを提供する。
【００１７】
プロテインＺ７は、麦芽発酵飲料の泡持ちに対して負の要因として捉えることができ、プロテインＺ７の濃度が低い大麦の種子を原料として製造した麦芽発酵飲料の泡持ちが良くなるため、上記選抜マーカーは、泡持ちの良い麦芽発酵飲料の原料に使用する大麦品種の選抜に使用できる。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、大麦を原料に使用した最終製品である麦芽発酵飲料のＮＩＢＥＭ値を直接測定することなく、麦芽発酵飲料の泡持ちを良くする大麦を選抜できる。また、プロテインＺ７の濃度の測定は、温度、天候、さらには人為的な要因の影響を排除して行うことができ、プロテインＺ７の濃度とＮＩＢＥＭ値との間には相関関係があるため、本発明の選抜方法は、泡持ちの良い麦芽発酵飲料の判定方法としても使用できる。
【００１９】
さらに本発明の選抜マーカーは、泡持ちの良い麦芽発酵飲料に使用する大麦の選抜に使用できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
以下に、本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。
【００２１】
本発明の選抜方法は、プロテインＺ７を選抜マーカーとして使用する、麦芽発酵飲料の泡持ちを良くする大麦の選抜方法であって、大麦の種子、その種子から得た麦芽、その麦芽から得た麦汁、その麦汁を発酵させて得た麦芽発酵飲料又はその麦芽発酵飲料の発酵前原料液若しくは発酵中原料液、に含まれるプロテインＺ７の濃度を測定する測定ステップと、この濃度が低い場合に、この大麦は、麦芽発酵飲料の泡持ちを良くする大麦であると判断する判断ステップとを備えることを特徴とする。
【００２２】
本明細書における「大麦」とは、学名がＨｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅである植物のことをいい、大麦品種、大麦系統及び大麦の各大麦個体が該当する。
【００２３】
また、「泡持ち」とは、麦芽発酵飲料をグラスに注いだときに生じる泡が消えるまでに要する時間のことをいい、「泡持ちが良い」とは、この時間が長いことを意味し、「泡持ちが悪い」とはこの時間が短いことを意味する。「泡持ちを良くする大麦」とは、当該大麦を原料として麦芽発酵飲料を製造した場合に、大麦以外は同一の原料から製造した麦芽発酵飲料と比較して、泡持ちを良くすることに貢献する大麦のことをいう。
【００２４】
「麦芽発酵飲料」とは、麦芽を原料に用いて醸造した飲料のことをいい、例えば、ビール、発泡酒又は原料に麦芽を含有する雑酒が挙げられる。ビールとは、麦芽、ホップ及び水を原料として発酵させたもの又は麦芽、ホップ、水及び麦その他の政令で定める物品（麦、米、とうもろこし、こうりゃん、ばれいしょ、でんぷん、糖類、又は財務省で定める苦味料若しくは着色料）を原料として発酵させたものであって、麦芽使用率が２／３以上のものをいい、発泡酒とは、麦芽又は麦を原料の一部とした酒類で発泡性を有する酒類であって、麦芽使用率が２／３未満のものをいう。
【００２５】
「麦芽発酵飲料の発酵前原料液」とは、麦芽から麦汁を得る途中の仕込工程から麦汁を得るまでの間の原料液若しくは煮沸前の麦汁、又は、麦汁を煮沸し、引き続き冷却し、酵母を投入する前の冷麦汁ができるまでの間の麦汁若しくは冷麦汁のことをいう。「麦芽発酵飲料の発酵中原料液」とは、上記冷麦汁に酵母を投入した後、発酵工程を経て麦芽発酵飲料となるまでの全ての発酵液のことをいう。
【００２６】
また、「プロテインＺ７」とは、大麦の種子又はビール中に存在するセリンプロテアーゼインヒビターであり、分子量が約４３ｋＤａのタンパク質である（ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＣＡＡ６４５９９）。大麦種子中には、プロテインＺ７以外に、同じ大麦セリンプロテアーゼインヒビターのサブファミリーに属するプロテインＺ４（ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＣＡＡ６６２３２）が存在し、そのアミノ酸配列は、プロテインＺ７と約７３％の相同性を有している。
【００２７】
上記測定ステップは、大麦の種子、その種子から得た麦芽、その麦芽から得た麦汁、その麦汁を発酵させて得た麦芽発酵飲料又は麦芽発酵飲料の発酵前原料液若しくは発酵中原料液からタンパク質を抽出する抽出ステップと、抗プロテインＺ７抗体を使用して、タンパク質に含まれるプロテインＺ７を定量する定量ステップとを備えることが好ましい。例えば、ＥＬＩＳＡ法、ウエスタンブロッティング法、プロテインチップによる解析、アフィニティークロマトグラフィーによる定量分析等によってプロテインＺ７の濃度を定量できる。
【００２８】
ＥＬＩＳＡ法又はウエスタンブロッティング法で使用する抗プロテインＺ７抗体は、発酵に使用する大麦のプロテインＺ７を特異的に認識できる抗体が好ましく、例えば、プロテインＺ７のアミノ酸配列を基に合成したペプチドを抗原として使用し、ウサギやマウス等に免疫して作成できる。尚、これらの免疫学的手法については、当業者にとっては周知であるため本明細書では詳述しない。このような方法を記載する教本としては、例えば、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ」（Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ、１９８８年、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）等を参照されたい。
【００２９】
また、本発明の選抜方法は、プロテインＺ７を選抜マーカーとして使用する、麦芽発酵飲料の泡持ちを良くする大麦の選抜方法であって、大麦の種子又はその種子から得た麦芽からＲＮＡを抽出する抽出ステップと、大麦の種子又は麦芽中に発現するプロテインＺ７ｍＲＮＡを定量する定量ステップと、プロテインＺ７ｍＲＮＡの発現量が低い場合に、この大麦は、麦芽発酵飲料の泡持ちを良くする大麦であると判断する判断ステップとを備えることを特徴とする。
【００３０】
上記抽出ステップでは、例えば、ホットフェノール法（加温したフェノールとドデシル硫酸ナトリウムで大麦の種子又は麦芽を溶解しながらＲＮＡを抽出する方法）に従ってＲＮＡを抽出できるが、分解度の低い高純度ＲＮＡを得るために、大麦の種子又は麦芽を液体窒素で凍結した後、磨砕機で磨砕し、グアニジンチオシアネートを含有するＲＮＡ抽出試薬でＲＮＡを抽出ことがより好ましい。ＲＮＡ抽出試薬としては、ＩｓｏｇｅｎＴＭ（ニッポンジーン社製）が挙げられる。
【００３１】
上記定量ステップでは、抽出ステップで抽出された大麦由来のＲＮＡに含まれるプロテインＺ７ｍＲＮＡを、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロッティング法、ＤＮＡチップ等を使用して高感度に検出し、その発現量を定量できる。これらの方法は、例えば、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ」（Ｍａｎｉａｔｉｓら、１９８９年、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス）や「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ｆ． Ｍ． Ａｕｓｕｂｅｌ、１９８８年、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．）等の遺伝子工学プロトコールに記載されている。
【００３２】
また、本発明の、麦芽発酵飲料の泡持ちを良くする大麦の選抜マーカーは、プロテインＺ７からなることを特徴とする。
【００３３】
プロテインＺ７は、麦芽発酵飲料の泡持ちに対して負の要因として捉えることができ、プロテインＺ７の濃度が低いと麦芽発酵飲料の泡持ちは良くなるため、この知見を利用すれば泡持ち判定用マーカーとして使用でき、泡持ちの良い麦芽発酵飲料の原料に使用する大麦の選抜マーカーとして使用できる。これまで、プロテインＺ７が負の要因として、麦芽発酵飲料の泡持ちの良さの判定及び泡持ちの良い麦芽発酵飲料の原料に使用する大麦の選抜に利用できることについては全く知られていなかった。
【００３４】
ここで、「泡持ち判定用マーカー」とは、大麦の種子、麦芽、麦汁、麦芽発酵飲料又は麦芽発酵飲料の発酵前原料液若しくは発酵中原料液中での濃度がＮＩＢＥＭ値と相関性を示すタンパク質のことをいい、麦芽発酵飲料の泡持ちの良さを判定又は予測するために指標とできるタンパク質のことをいう。
【００３５】
プロテインＺ７は、大麦の種子、麦芽、麦汁、麦芽発酵飲料又は麦芽発酵飲料の発酵前原料液若しくは発酵中原料液中に存在し、例えば、ＥＬＩＳＡ法、ウエスタンブロッティング法、プロテインチップによる解析、アフィニティークロマトグラフィーによる定量分析等によって測定できる。
【００３６】
さらに、本発明の麦芽発酵飲料の泡持ちを良くする大麦の選抜マーカーを使用すれば、麦芽発酵飲料の泡持ちの良さの判定方法を提供できる。すなわち、麦芽発酵飲料の泡持ちの良さの判定方法であって、麦芽発酵飲料に使用する大麦の種子、その種子から得た麦芽、その麦芽から得た麦汁、その麦汁を発酵させて得た麦芽発酵飲料又はその麦芽発酵飲料の発酵前原料液若しくは発酵中原料液に含まれるプロテインＺ７の濃度（ＭＺ７）を泡持ちに対する負の要因として、泡持ちの良さを判定する判定方法を提供できる。
【００３７】
大麦の種子、麦芽、麦汁、麦芽発酵飲料又は麦芽発酵飲料の発酵前原料液若しくは発酵中原料液に含まれるプロテインＺ７の濃度を測定すれば、ＮＩＢＥＭ値を測定することなく泡持ちの良さを判定することが可能となり、プロテインＺ７の濃度の測定は、温度、天候、さらには人為的な要因の影響を排除して行うことができるため、ＮＩＢＥＭ値の測定と比べて汎用性があり、かつ、正確な泡持ちの良さの判定を実現できる。
【００３８】
ここで「ＮＩＢＥＭ値」とは、２０℃の麦芽発酵飲料をＮＩＢＥＭ値測定用の標準泡注ぎ出し機により炭酸ガスを用いて標準グラスに注ぎ出して生じる泡の高さが３０ｍｍ降下するのに要する時間（秒）のことをいう。
【００３９】
上記判定方法は、上記のプロテインＺ７の濃度（ＭＺ７）に負の係数を乗じた数値が小さい方の麦芽発酵飲料を泡持ちが良い麦芽発酵飲料であると判定することが好ましく、例えば、この数値を、ａ−ｂ×ＭＺ７（但し、ａは正の数、負の数又は０であり、ｂは正の数である。）として算出することがより好ましい。また、このａ及びｂがＭＺ７を変数としたときの、麦芽発酵飲料のＮＩＢＥＭ値を予測する単回帰式の単回帰係数であればさらに好ましい。
【００４０】
麦芽発酵飲料のＮＩＢＥＭ値を予測する単回帰式の単回帰係数は、ＮＩＢＥＭ値を測定した複数の麦芽発酵飲料について、大麦の種子、麦芽、麦汁、麦芽発酵飲料又は麦芽発酵飲料の発酵前原料液若しくは発酵中原料液のプロテインＺ７の濃度（ＭＺ７）を測定し、各麦芽発酵飲料のＮＩＢＥＭ値を目的変数とし、上記プロテインＺ７の濃度（ＭＺ７）を説明変数として単回帰式分析をすれば求めることができる。
【実施例】
【００４１】
本発明を以下の実施例に基づいてさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００４２】
（実施例１）ビールの原料となる大麦の種子中のプロテインＺ７の濃度とＮＩＢＥＭ値との相関関係
７種類の大麦品種（品種Ａ：はるな二条、品種Ｂ：ＣＤＣ Ｋｅｎｄａｌｌ、品種Ｃ：あまぎ二条、品種Ｄ：ＣＤＣ Ｃｏｐｅｌａｎｄ、品種Ｅ：北育３９号、品種Ｆ：りょうふう、品種Ｇ：Ｌｏｆｔｙ Ｎｉｊｏ）の種子からそれぞれ麦芽を製造し、ビールの醸造に必要な麦芽以外の原料については同一の原料を使用して７種類のビールを醸造した。ビールの原料として使用した７種類の大麦品種の種子中のプロテインＺ７の濃度と７種類のビールのＮＩＢＥＭ値をそれぞれ測定し、各大麦品種の種子中のプロテインＺ７の濃度とＮＩＢＥＭ値との相関関係について調べた。
【００４３】
７種類の大麦品種の種子に含まれるプロテインＺ７の濃度は、以下のようにして定量した。まず、粉砕した各大麦品種の種子（５０ｍｇ）を、２ｍＬのスクリューキャップ付きチューブに取り、ジチオトレイトール（和光株式会社）を０．２８％含むＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒ Ｓａｌｉｎｅ）を１ｍＬ加えて懸濁し、４℃で一晩振とうすることによりプロテインＺ７を抽出した。その後、この縣濁液を４℃で５分間、１５，０００回転で遠心分離し、得られた上清を適宜希釈して、抗プロテインＺ７抗体でプロテインＺ７濃度を定量した。抗プロテインＺ７抗体は、オーストラリアタスマニア大学のＥｖａｎｓ博士から分譲されたものであり、抗プロテインＺ７抗体を用いたプロテインＺ７の定量は、Ｅｖａｎｓ博士らの論文（Ａｍｅｒ． Ｓｏｃ． Ｂｒｅｗ． Ｃｈｅｍ．、２００３年、６１巻、ｐ．５５−６２）に従って行った。
【００４４】
また、各大麦品種の種子を単独で用いたビールの醸造については、以下の方法で行った。まず、７種類の大麦品種（品種Ａ〜Ｇ）の種子を浸麦槽で水に浸漬して水分含量を約４３％とし、発芽室で６日間発芽させ、熱風で焙燥することにより７種類の大麦品種の麦芽をそれぞれ製造した。
【００４５】
その後、各麦芽に副原料であるコーンスターチ、コーングリッツ及び米と水を加え、５０〜６０℃で２０分、６５℃で４０分、７３℃で３分間の糖化処理を行い（糖化工程）、こうして得られた麦汁にホップを加えて９０分間煮沸し、１０℃まで冷却した後に酵母を加え、１０〜１５℃で７〜１０日間アルコール発酵させた（発酵工程）。発酵終了後は、−１〜２℃で２〜３週間熟成させ、得られた発酵物をビールとしてＮＩＢＥＭ値の測定に供した。
【００４６】
ＮＩＢＥＭ値の測定は、ＨＡＦＦＭＡＮＳ社のＮＩＢＥＭ−Ｔ装置、ＩＮＰＡＣＫ２０００及びＮＩＢＥＭ値測定用の標準グラスを用いて行った。具体的には、上記の麦芽発酵飲料をそれぞれ２０℃の状態にし、泡注ぎ出し機により炭酸ガスを用いて標準グラスに注ぎ出し、生じた泡の高さの降下をＮＩＢＥＭ−Ｔ装置で追尾し、泡の高さが３０ｍｍ降下するのに要した時間（秒）をＮＩＢＥＭ値として測定した。
【００４７】
表１は、７種類の大麦品種（品種Ａ〜Ｇ）の種子に含まれるプロテインＺ７の濃度と、７種類の大麦品種の種子をそれぞれ原料として醸造した７種類のビールのＮＩＢＥＭ値とを示した表である。
【００４８】
【表１】
【００４９】
図１は、ＮＩＢＥＭ値を目的変数とし、大麦の種子中のプロテインＺ７の濃度を説明変数として単回帰分析を行ったグラフである。図中の＊は、危険率５％で有意であることを示す。
【００５０】
その結果、ＮＩＢＥＭ値と大麦の種子中のプロテインＺ７の濃度との間には統計的に有意な相関関係が認められた。単回帰式は、ＮＩＢＥＭ値＝２７３．３１＋（−０．１２６×プロテインＺ７の濃度）となった（ｒ＝０．８４８）。
【００５１】
以上の結果より、大麦の種子中のプロテインＺ７の濃度は、当該大麦の種子を原料とする麦芽発酵飲料の泡持ちに対する負の要因として麦芽発酵飲料の泡持ちの良さの判定に利用でき、大麦の種子中のプロテインＺ７の濃度を測定することにより、麦芽発酵飲料の泡持ちを良くする大麦を選抜できることが明らかとなった。
【００５２】
（実施例２）コングレス麦汁中のプロテインＺ７の濃度とＮＩＢＥＭ値との相関関係
７種類の大麦品種（品種Ａ：はるな二条、品種Ｂ：ＣＤＣ Ｋｅｎｄａｌｌ、品種Ｃ：あまぎ二条、品種Ｄ：ＣＤＣ Ｃｏｐｅｌａｎｄ、品種Ｅ：北育３９号、品種Ｆ：りょうふう、品種Ｇ：Ｌｏｆｔｙ Ｎｉｊｏ）の種子からそれぞれ麦汁を製造し、ビールの醸造に必要な麦芽以外の原料については同一の原料を使用して７種類のビールを醸造した。ビールの原料として使用した７種類の大麦品種の種子から製造したコングレス麦汁中のプロテインＺ７の濃度と７種類のビールのＮＩＢＥＭ値をそれぞれ測定し、各コングレス麦汁中のプロテインＺ７の濃度とＮＩＢＥＭ値との相関関係について調べた。
【００５３】
コングレス麦汁の製造は以下の方法で行った。実施例１に記載した手順に従って製造した各大麦品種の麦芽を粉砕し、粉砕した麦芽（５０ｇ）に２００ｍＬの水を加え、４５℃で３０分間保持した後、１分間に１℃の割合で７０℃まで加熱昇温し、７０℃に達した時点で１００ｍＬの水を加えて１時間保持した。その後、そこに水を加えて全量を４５０gになるようにし、ろ過して得られた麦汁をコングレス麦汁とした。
【００５４】
ビールの醸造及びＮＩＢＥＭ値の測定は、実施例１で記載した方法と同じ手順で行った。コングレス麦汁中のプロテインＺ７の濃度の定量は、それぞれの液を適宜希釈し、抗プロテインＺ７抗体によるＥＬＩＳＡ法により定量した。
【００５５】
表２は、７種類の大麦品種（品種Ａ〜Ｇ）の種子から製造したコングレス麦汁に含まれるプロテインＺ７の濃度と、７種類の大麦種子をそれぞれ原料として醸造した７種類のビールのＮＩＢＥＭ値とを示した表である。
【００５６】
【表２】
【００５７】
図２は、ＮＩＢＥＭ値を目的変数とし、コングレス麦汁中のプロテインＺ７の濃度を説明変数として単回帰分析を行ったグラフである。図中の＊は、危険率５％で有意であることを示す。
【００５８】
その結果、ＮＩＢＥＭ値とコングレス麦汁中のプロテインＺ７の濃度との間には統計的に有意な相関関係が認められた。単回帰式は、ＮＩＢＥＭ値＝２７３．０５＋（−０．９００６×プロテインＺ７の濃度）となった（ｒ＝０．８５２）。
【００５９】
以上の結果より、コングレス麦汁中のプロテインＺ７の濃度は、当該麦汁を原料とする麦芽発酵飲料の泡持ちに対する負の要因として麦芽発酵飲料の泡持ちの良さの判定に利用でき、麦汁中のプロテインＺ７の濃度を測定することにより、麦芽発酵飲料の泡持ちを良くする大麦を選抜できることが明らかとなった。
【００６０】
（実施例３）ビール中のプロテインＺ７の濃度とＮＩＢＥＭ値との相関関係
７種類の大麦品種（品種Ａ：はるな二条、品種Ｂ：ＣＤＣ Ｋｅｎｄａｌｌ、品種Ｃ：あまぎ二条、品種Ｄ：ＣＤＣ Ｃｏｐｅｌａｎｄ、品種Ｅ：北育３９号、品種Ｆ：りょうふう、品種Ｇ：ＬｏｆｔｙＮｉｊｏ）の種子からそれぞれ麦芽を製造し、ビールの醸造に必要な麦芽以外の原料については同一の原料を使用して７種類のビールを醸造した。７種類のビールに含まれるプロテインＺ７の濃度と７種類のビールのＮＩＢＥＭ値をそれぞれ測定し、ビール中のプロテインＺ７の濃度とＮＩＢＥＭ値との相関関係について調べた。
【００６１】
ビールの醸造及びＮＩＢＥＭ値の測定は、実施例１で記載した方法と同じ手順で行った。ビール中のプロテインＺ７の濃度の定量は、それぞれの液を適宜希釈し、抗プロテインＺ７抗体によるＥＬＩＳＡ法により定量した。
【００６２】
表３は、７種類の大麦品種（品種Ａ〜Ｇ）の種子を原料として醸造した７種類のビールに含まれるプロテインＺ７の濃度と、７種類のビールのＮＩＢＥＭ値とを示した表である。
【００６３】
【表３】
【００６４】
図３は、ＮＩＢＥＭ値を目的変数とし、ビール中のプロテインＺ７の濃度を説明変数として単回帰分析を行ったグラフである。図中の＊＊は、危険率１％で有意であることを示す。
【００６５】
その結果、ＮＩＢＥＭ値とビール中のプロテインＺ７の濃度との間には統計的に有意な相関関係が認められた。単回帰式は、ＮＩＢＥＭ値＝２６６．５０＋（−２．８０８９×プロテインＺ７の濃度）となった（ｒ＝０．９２０）。
【００６６】
以上の結果より、ビール中のプロテインＺ７の濃度は、当該ビールの泡持ちに対する負の要因として麦芽発酵飲料の泡持ちの良さの判定に利用でき、ビール中のプロテインＺ７の濃度を測定することにより、麦芽発酵飲料の泡持ちを良くする大麦を選抜できることが明らかとなった。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】ＮＩＢＥＭ値を目的変数とし、大麦の種子中のプロテインＺ７の濃度を説明変数として単回帰分析を行ったグラフである。
【図２】ＮＩＢＥＭ値を目的変数とし、コングレス麦汁中のプロテインＺ７の濃度を説明変数として単回帰分析を行ったグラフである。
【図３】ＮＩＢＥＭ値を目的変数とし、ビール中のプロテインＺ７の濃度を説明変数として単回帰分析を行ったグラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロテインＺ７を選抜マーカーとして使用する、麦芽発酵飲料の泡持ちを良くする大麦の選抜方法であって、
前記大麦の種子、前記種子から得た麦芽、前記麦芽から得た麦汁、前記麦汁を発酵させて得た麦芽発酵飲料又は前記麦芽発酵飲料の発酵前原料液若しくは発酵中原料液、に含まれるプロテインＺ７の濃度を測定する測定ステップと、
前記濃度が低い場合に、前記大麦は、麦芽発酵飲料の泡持ちを良くする大麦であると判断する判断ステップと、
を備える選抜方法。
【請求項２】
前記測定ステップは、前記大麦の種子、前記種子から得た麦芽、前記麦芽から得た麦汁、前記麦汁を発酵させて得た麦芽発酵飲料又は前記麦芽発酵飲料の発酵前原料液若しくは発酵中原料液からタンパク質を抽出する抽出ステップと、
抗プロテインＺ７抗体を使用して、前記タンパク質に含まれる前記プロテインＺ７を定量する定量ステップと、
を備える請求項１記載の選抜方法。
【請求項３】
プロテインＺ７を選抜マーカーとして使用する、麦芽発酵飲料の泡持ちを良くする大麦の選抜方法であって、
前記大麦の種子又は前記種子から得た麦芽からＲＮＡを抽出する抽出ステップと、
前記大麦の種子又は前記麦芽中に発現するプロテインＺ７ｍＲＮＡを定量する定量ステップと、
前記プロテインＺ７ｍＲＮＡの発現量が低い場合に、前記大麦は、麦芽発酵飲料の泡持ちを良くする大麦であると判断する判断ステップと、
を備える選抜方法。
【請求項４】
前記プロテインＺ７からなる、麦芽発酵飲料の泡持ちを良くする大麦の選抜マーカー。
【請求項１】
プロテインＺ７を選抜マーカーとして使用する、麦芽発酵飲料の泡持ちを良くする大麦の選抜方法であって、
前記大麦の種子、前記種子から得た麦芽、前記麦芽から得た麦汁、前記麦汁を発酵させて得た麦芽発酵飲料又は前記麦芽発酵飲料の発酵前原料液若しくは発酵中原料液、に含まれるプロテインＺ７の濃度を測定する測定ステップと、
前記濃度が低い場合に、前記大麦は、麦芽発酵飲料の泡持ちを良くする大麦であると判断する判断ステップと、
を備える選抜方法。
【請求項２】
前記測定ステップは、前記大麦の種子、前記種子から得た麦芽、前記麦芽から得た麦汁、前記麦汁を発酵させて得た麦芽発酵飲料又は前記麦芽発酵飲料の発酵前原料液若しくは発酵中原料液からタンパク質を抽出する抽出ステップと、
抗プロテインＺ７抗体を使用して、前記タンパク質に含まれる前記プロテインＺ７を定量する定量ステップと、
を備える請求項１記載の選抜方法。
【請求項３】
プロテインＺ７を選抜マーカーとして使用する、麦芽発酵飲料の泡持ちを良くする大麦の選抜方法であって、
前記大麦の種子又は前記種子から得た麦芽からＲＮＡを抽出する抽出ステップと、
前記大麦の種子又は前記麦芽中に発現するプロテインＺ７ｍＲＮＡを定量する定量ステップと、
前記プロテインＺ７ｍＲＮＡの発現量が低い場合に、前記大麦は、麦芽発酵飲料の泡持ちを良くする大麦であると判断する判断ステップと、
を備える選抜方法。
【請求項４】
前記プロテインＺ７からなる、麦芽発酵飲料の泡持ちを良くする大麦の選抜マーカー。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２００８−２１６２０７（Ｐ２００８−２１６２０７Ａ）
【公開日】平成２０年９月１８日（２００８．９．１８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５７６３２（Ｐ２００７−５７６３２）
【出願日】平成１９年３月７日（２００７．３．７）
【出願人】（３０３０４０１８３）サッポロビール株式会社 (150)
【出願人】（５０４１４７２４３）国立大学法人 岡山大学 (444)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年９月１８日（２００８．９．１８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年３月７日（２００７．３．７）
【出願人】（３０３０４０１８３）サッポロビール株式会社 (150)
【出願人】（５０４１４７２４３）国立大学法人 岡山大学 (444)
【Ｆターム（参考）】
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