安定かつ活性なヒトＯＢタンパク質と抗体Ｆｃ鎖とのコンジュゲートを含む組成物および方法
【課題】（ａ）体重の調節、（ｂ）脂肪症の調節、（ｃ）糖尿病軽減治療、（ｄ）血中脂質レベルの調節、（ｅ）脂肪除外体重の増加、または（ｆ）インスリン感受性の増加を行うことにより治療するための生理的ｐＨで安定かつ活性であるＯＢタンパク質懸濁液の提供。
【解決手段】免疫グロブリンのＦｃ領域をＯＢタンパク質部分のＮ末端に結合させることにより誘導体化されているヒトＯＢタンパク質。
【解決手段】免疫グロブリンのＦｃ領域をＯＢタンパク質部分のＮ末端に結合させることにより誘導体化されているヒトＯＢタンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高濃度における及び生理的ｐＨまたはその付近における安定かつ活性なヒトＯＢタンパク質組成物に関する。また、そのような組成物の関連組成物、製造方法および使用方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
肥満の分子的基礎はほとんど知られていないが、「ＯＢ遺伝子」およびコードされたタンパク質（「ＯＢタンパク質」）の同定により、身体の脂肪沈着を調節するために身体が用いているメカニズムが、ある程度解明されてきている（Ｚｈａｎｇら， Ｎａｔｕｒｅ ３７２： ４２５−４３２ （１９９４）； またＮａｔｕｒｅ ３７４： ４７９ （１９９５）の訂正も参照されたい）。１９９６年２月２２日付け公開のＰＣＴ公開ＷＯ ９６／０５３０９（発明の名称“Ｍｏｄｕｌａｔｏｒｓ ｏｆ Ｂｏｄｙ Ｗｅｉｇｈｔ， Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ， ａｎｄ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｕｓｅｓ Ｔｈｅｒｅｏｆ”）は、ＯＢタンパク質および関連組成物および方法を十分に記載しており、これを参照により本明細書に組み入れることとする。ヒトＯＢタンパク質のアミノ酸配列は、ＷＯ ９６／０５３０９（これを参照により本明細書に組み入れることとする）の配列番号４および６（その公開の第１７２および１７４頁）に記載されており、該成熟タンパク質の第１アミノ酸残基は、２２位に位置し、バリン残基である。該成熟タンパク質は、１４６残基（あるいは、４９位のグルタミンが存在しない場合には、１４５残基（配列番号６））である。
【０００３】
ＯＢタンパク質は、ｏｂ／ｏｂ突然変異マウス（ＯＢ遺伝子産物の産生の欠損により肥満したマウス）および正常な野生型マウスの両方においてインビボで活性である。その生物活性は、とりわけ、体重減少を示す。一般的には、Ｂａｒｉｎａｇａ， “Ｏｂｅｓｅ” Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｌｉｍｓ Ｍｉｃｅ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６９： ４７５−４５６ （１９９５）およびＦｒｉｅｄｍａｎ， “Ｔｈｅ Ａｌｐｈａｂｅｔ ｏｆ Ｗｅｉｇｈｔ Ｃｏｎｔｒｏｌ”， Ｎａｔｕｒｅ ３８５：１１９−１２０ （１９９７）を参照されたい。ｏｂ／ｏｂ突然変異マウスにおいてＯＢタンパク質を投与すると、例えば、血清インスリンレベルおよび血清グルコースレベルが減少することが公知である。また、ＯＢタンパク質を投与すると、体脂肪が減少することが公知である。これは、ｏｂ／ｏｂ突然変異マウスおよび非肥満正常マウスの両方で認められた［Ｐｅｌｌｅｙｍｏｕｎｔｅｒら， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６９： ５４０−５４３ （１９９５）； Ｈａｌａａｓら， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６９： ５４３−５４６ （１９９５）， また、Ｃａｍｐｆｉｅｌｄら， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６９： ５４６−５４９ （１９９５）（マイクログラム用量のＯＢタンパク質の末梢および中枢投与により、ｏｂ／ｏｂおよび食餌誘導肥満マウスでは食物摂取および体重が減少したが、ｄｂ／ｄｂ肥満マウスでは減少しなかった）も参照されたい］。これらの報告ではいずれも、最高用量においても毒性は認められていない。
【０００４】
ヒトに注射するための医薬組成物の調製（物）に関しては、該ヒトアミノ酸配列は、比較的高濃度（例えば、液体１ｍｌ当たり活性タンパク質約２ｍｇ以上）においては生理的ｐＨで不溶性であることが認められている。治療的に有効な量を大型哺乳動物（例えば、ヒト）に注射するには、ミリグラム（タンパク質）／ｋｇ体重の範囲の用量（例えば、０．５または１．０ｍｇ／ｋｇ／日以下）が望ましい。患者に不快感または恐らくは痛みを与えうる大容量の注射を避けるためには、タンパク質濃度を増加させる必要がある。
【０００５】
組換えＤＮＡ技術の進歩に伴い、治療用組換えタンパク質が入手可能になったことは、タンパク質の製剤化における進歩をもたらした。タンパク質の修飾および融合タンパク質を記載している概説としては、Ｆｒａｎｃｉｓ， Ｆｏｃｕｓ ｏｎ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ ３： ４−１０ （１９９２）が挙げられる。
【０００６】
そのような１つの修飾は、免疫グロブリンのＦｃ領域の使用である。抗体は、機能的に独立した２つの部分、すなわち、抗原に結合する「Ｆａｂ」として公知の可変ドメインと、エフェクター機能（例えば、補体または食細胞）に対する結合をもたらす「Ｆｃ」として公知の定常ドメインとからなる。免疫グロブリンのＦｃ部分は長い血漿半減期を有し、一方、Ｆａｂは短命である（Ｃａｐｏｎら， Ｎａｔｕｒｅ ３３７：５２５−５３１ （１９８９））。
【０００７】
より長い半減期を付与したり、あるいはＦｃ受容体結合、プロテインＡ結合、補体結合、胎盤通過などの機能（これらはすべて、免疫グロブリンのＦｃタンパク質に存在する）を付与するために、Ｆｃドメインを使用して、治療用タンパク質が構築されている（前掲誌）。例えば、ＩｇＧ１抗体のＦｃ領域が、ホジキン病腫瘍細胞、未分化リンパ腫細胞、Ｔ細胞白血病細胞および他の悪性細胞型上で発現されるＣＤ３０受容体に結合する分子であるＣＤ３０−ＬのＮ末端に融合されている（米国特許第５，４８０，９８１号を参照されたい）。抗炎症および抗拒絶物質であるＩＬ−１０をマウスＦｃγ２ａに融合させて、該サイトカインの短い循環半減期を増加させる試みが行なわれている（Ｚｈｅｎｇ， Ｘ．ら， Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， １５４： ５５９０−５６００ （１９９５））。また、敗血症性ショックの患者を治療するために、ヒトＩｇＧ１のＦｃタンパク質に結合させた腫瘍壊死因子受容体を使用することが、研究により評価されている（Ｆｉｓｈｅｒ， Ｃ．ら， Ｎ． Ｅｎｇ． Ｊ． Ｍｅｄ．， ３３４： １６９７−１７０２ （１９９６）； Ｖａｎ Ｚｅｅ， Ｋ．ら， Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， １５６： ２２２１−２２３０ （１９９６））。また、エイズ治療用タンパク質を製造するために、ＦｃがＣＤ４受容体と融合されている（Ｃａｐｏｎら， Ｎａｔｕｒｅ， ３３７：５２５−５３１ （１９８９）を参照されたい）。また、インターロイキン２の短い半減期およびその全身毒性を克服するために、インターロイキン２のＮ末端がＩｇＧ１またはＩｇＧ３のＦｃ部分に融合されている（Ｈａｒｖｉｌｌら， Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， １： ９５−１０５ （１９９５）を参照されたい）。
【０００８】
インスリンに関しては、懸濁製剤が報告されている。しかしながら、インスリンに適用可能な条件は、ＯＢタンパク質を含む他のいずれかのタンパク質の適用可能な条件を予測させるものではない。インスリンは、特定の物理的および化学的特性を有する非常に小さなタンパク質であり、これらの特性は、製剤化条件の決定に重要である。Ｂｒａｎｇｅ， Ｇａｌｅｎｉｃｓ ｏｆ Ｉｎｓｕｌｉｎ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ １９８７は、インスリン懸濁剤を記載している（ｐ． ３６）。また、Ｈａｓｓｅｌｌｂｌａｔｔら， Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ Ｎｅｗ Ｓｅｒｉｅｓ， Ｖｏｌ． ＸＸＸＩＩ−１／２ Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ Ｂｅｒｌｉｎ， Ｈｅｉｄｅｌｂｕｒｇ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９７５）中のＳｃｈｌｉｃｈｔｋｒｕｌｌら． Ｉｎｓｕｌｉｎ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ ｗｉｔｈ Ｐｒｏｌｏｎｇｅｄ Ｅｆｆｅｃｔ， ｐｐ． ７２９−７７７も参照されたい。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
現在のところ、生理的ｐＨで少なくとも約２ｍｇ／ｍｌの濃度のヒトＯＢタンパク質の安定な製剤の報告はなく、さらに、少なくとも約５０ｍｇ／ｍｌ以上の安定な濃度の活性ヒトＯＢタンパク質の報告はない。さらに、保存安定性を改善するために、凍結または凍結乾燥形態を用いることが可能であるが、そのような形態は、本明細書に記載の、そのまま使用できる懸濁液形態ほどは望ましくない。凍結形態は、一定の凍結温度での保存を要するが、これは、一般消費者用の冷蔵庫および冷凍庫の除霜サイクルのため不可能な場合がある。さらに、凍結乾燥形態は希釈および混合を要するが、これは不便であり、患者の遵守を妨げる可能性がある。製造者の観点から見ると、凍結液の製造、保存および出荷は、高い経費を要し、そのまま使用できる製剤の配給より一層厳重な監督を要する。また、凍結乾燥製剤用の適当な希釈剤を製造し又は入手可能にすることは、そのような希釈剤が必要でない場合より高い経費を要し、より低効率である。小容量の注射により運搬されうる活性なＯＢタンパク質を含有するヒト用医薬組成物の濃縮形態が必要とされている。本発明は、これらの要求を満たすものである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、一定の懸濁製剤が、生理的ｐＨで少なくとも約２ｍｇ／ｍｌの濃度の安定なＯＢタンパク質の製剤化を可能にするという観察に由来するものである。本発明で用いる「生理的ｐＨ」なる語は、約６．０〜約８．０のｐＨを意味する。そのような組成物の使用は、比較的小容量のＯＢタンパク質治療薬の送達を可能にする。本明細書中で更に詳しく開示するとおり、沈殿剤の使用により、以下の特性を有するヒトＯＢタンパク質の懸濁液の製造が可能となる：
１．溶液形態の同じヒトＯＢタンパク質と比較した場合の、生理的ｐＨにおける改善された安定性。後記実施例において、１０ｍｇ／ｍｌ以上の濃度およびｐＨ７のヒトＯＢタンパク質懸濁液を示すが、これは、溶解を可能にする最高ｐＨ（ヒトＯＢタンパク質の天然形態に関してはｐＨ４であり、生理的ｐＨにも満たない）における溶液中の同じ濃度のものと比べると、より良好なＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）プロフィールを有する。また、後記において、ｐＨ約７で５ｍｇ／ｍｌの濃度のＦｃ−ＯＢ融合タンパク質懸濁液を例示するが、これは、比較しうるＦｃ−ＯＢ融合タンパク質溶液より少ない分解産物を保存に際して示す。
【００１１】
２．溶液形態の同じヒトＯＢタンパク質と比較した場合の、持続的な注射時間放出プロフィール。後記実施例において、本発明の高濃縮ヒトＯＢタンパク質懸濁液を使用した場合の徐放効果を示す。物質の活性が比較的長時間維持され、したがって比較的高い効力が得られ、より少ない回数の注射しか必要とされない点で、そのような徐放効果は有利である。
【００１２】
したがって、本発明の１つの目的は、少なくとも約２ｍｇ（タンパク質）／ｍｌの濃度を有する生理的ｐＨの活性ヒトＯＢタンパク質の安定製剤である。例えば、少なくとも２．０ｍｇ／ｍｌの濃度およびｐＨ７．０の活性ヒトＯＢタンパク質の安定製剤を提供する。濃度の上限は、ヒトへの投与に利用可能な懸濁液形態であり、後記のとおり、実施例には、生理的ｐＨ（例えば、ｐＨ６．０〜ｐＨ８．０）で１００ｍｇ／ｍｌもの濃度が示されている。
【００１３】
もう１つの態様において、本発明は、少なくとも約１０ｍｇ／ｍｌの濃度を有する約６．０〜約８．０のｐＨ範囲内の活性ヒトＯＢタンパク質の安定製剤に関する。
【００１４】
さらにもう１つの態様において、本発明は、少なくとも約０．５ｍｇ／ｍｌの濃度および約６．０〜約８．０のｐＨの、免疫グロブリンのＦｃ領域の結合により誘導体化された活性ヒトＯＢタンパク質の安定製剤に関する。より詳しくは、ｐＨ約７．５で５ｍｇ／ｍｌ〜５０ｍｇ／ｍｌの濃度の活性Ｆｃ−ＯＢ融合タンパク質の安定製剤を提供する。
【００１５】
さらに他の態様において、本発明は、ｐＨ６．５〜ｐＨ７．５で２ｍｇ（タンパク質）／ｍｌ以上の濃度の安定かつ活性なヒトＯＢタンパク質のための製剤を提供する。より詳しくは、ｐＨ７．０で２０ｍｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌの濃度の安定かつ活性なヒトＯＢタンパク質のための製剤を提供する。
【００１６】
もう１つの態様において、本発明は、５．０〜８．０のｐＨで１０ｍｇ／ｍｌ以上の濃度の安定かつ活性なヒトＯＢタンパク質のための製剤を提供する。
【００１７】
さらにもう１つの態様において、本発明は、０．５ｍｇ／ｍｌ以上の濃度および約６．０〜約８．０のｐＨの、免疫グロブリンのＦｃ領域の結合により誘導体化された安定かつ活性なヒトＯＢタンパク質のための製剤を提供する。より詳しくは、ｐＨ約７．５で５ｍｇ／ｍｌ〜５０ｍｇ／ｍｌの濃度の、安定かつ活性なＦｃ−ＯＢ融合タンパク質のための製剤を提供する。
【００１８】
本発明のその他の態様には、前記の医薬組成物、そのような組成物の製造方法、および本組成物を使用する治療方法、およびそのような治療のための本組成物を含有する医薬の製造方法が含まれる。
【００１９】
図面の簡単な説明
図１Ａおよび１Ｂは、（１Ａ）実施例１の本発明ヒトＯＢ懸濁液および（１Ｂ）実施例１に記載の対照ヒトＯＢタンパク質溶液に関する、マウスにおける用量反応曲線である。
【００２０】
図２は、本発明ＯＢタンパク質懸濁液および対照ヒトＯＢタンパク質溶液（実施例１に記載のとおり）に関する、イヌにおけるＯＢの血清レベルを示すグラフである。
【００２１】
図３は、３７℃で７週間のヒトＯＢタンパク質製剤の逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）のトレースである。実施例１のヒトＯＢタンパク質亜鉛懸濁液は中央のトレース、実施例１のヒトＯＢタンパク質溶液対照は上側の線、−８０℃で５６日間維持したヒトＯＢタンパク質懸濁液は下側の線である。
【００２２】
図４は、１９℃で５６日間のヒトＯＢタンパク質製剤のＲＰ−ＨＰＬＣのトレースである。実施例１のヒトＯＢ溶液は上側の線、実施例２のヒトＯＢ結晶懸濁液は中央の線、−８０℃で５６日間の実施例２のヒトＯＢ結晶懸濁液は下側の線である。
【００２３】
図５Ａ〜５Ｃは、ヒトｍｅｔＦｃ−ＯＢタンパク質のＤＮＡ配列（配列番号１）およびアミノ酸配列（配列番号２）である。
【００２４】
図６Ａ〜６Ｃは、ヒトｍｅｔＦｃ−ＯＢタンパク質変異体のＤＮＡ配列（配列番号３）およびアミノ酸配列（配列番号４）である。
【００２５】
図７は、組換えメチオニルヒトＦｃ−ＯＢタンパク質に関する、逆相ＨＰＬＣで測定した場合のａｓｐ １０８（配列番号４の番号付けを使用するとａｓｐ ３３５）におけるイソａｓｐの生成速度を示すグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
本発明の安定かつ活性なＯＢタンパク質組成物は、該タンパク質部分が沈殿し液体部分中に懸濁しているため、一般に、懸濁液（懸濁剤）として分類される。該組成物は、活性なＯＢタンパク質部分、沈殿剤、ｐＨ調節剤および液体担体を含有する。このＯＢタンパク質は、無定形（アモルファス）または結晶形態である。
【００２７】
好ましくは、ヒトにおいて治療用または美容用組成物として使用するためには、細菌発現に付随するＮ末端メチオニル残基を所望により有する天然ヒトＯＢタンパク質（Ｚｈａｎｇら， Ｎａｔｕｒｅ， 前掲を参照されたい）のアミノ酸配列を有するＯＢタンパク質を使用する。使用可能なこのＯＢタンパク質を製造するための組換えＤＮＡ手段に関しては、参照により本明細書に組み入れるＰＣＴ公開ＷＯ９６／０５３０９を参照されたい。選択されたアミノ酸の変更が可能であるが、そのような変更は、該タンパク質の全体的なフォールディングまたは活性が維持される場合に限られる。以下の表１は、特定の特性（塩基性、酸性、極性、疎水性、芳香性およびサイズ（小型））に関する、使用可能な同類アミノ酸置換を記載する。一般的には、参照により本明細書に組み入れるＦｏｒｄら， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ２： ９５−１０７， １９９１を参照されたい。また、小さなアミノ末端伸長、例えばアミノ末端メチオニン残基、約２０〜２５残基までの小さなリンカーペプチドまたは精製を容易にする小さな伸長、例えばポリヒスチジン領域、抗原エピトープまたは結合ドメインが存在することが可能である。
【００２８】
【表１】
【００２９】
一般に、本懸濁液において増加した安定性を示すヒトＯＢタンパク質は、生理的ｐＨにさらされると、溶液中において、露出した疎水性領域を有するヒトＯＢタンパク質である。また、免疫グロブリンのＦｃ領域を該ＯＢタンパク質部分に結合させることにより誘導体化されたヒトＯＢタンパク質は、本懸濁液において増加した安定性を示す。
【００３０】
一般に、免疫グロブリンのＦｃ領域は、ヒトＯＢタンパク質に対して遺伝的または化学的に融合させることが可能である。好ましくは、該Ｆｃ領域を、該ＯＢタンパク質のＮ末端において融合させる。好ましいＦｃ−ＯＢ融合タンパク質に関しては、参照により本明細書に組み入れる１９９６年１２月２０日付けの同時係属米国特許出願第０８／７７０，９７３号を参照されたい。
【００３１】
好ましくは、ヒト免疫グロブリンＩｇＧ−１重鎖のアミノ酸配列（Ｅｌｌｉｓｏｎ， Ｊ． Ｗ．ら， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １０：４０７１−４０７９ （１９８２）を参照されたい）を有するＦｃ領域を使用する。好ましいＦｃ領域を、配列番号２（図５を参照されたい）に記載する。配列番号２の組換えＦｃ−ＯＢ配列は、３７８アミノ酸のＦｃ−ＯＢタンパク質である（メチオニン残基は数えていない）。図５のＦｃ−ＯＢタンパク質の最初のアミノ酸であるグルタミン酸を＋１とし、この場合、該メチオニンは−１位である。Ｆｃ部分の変異体または類似体を、例えば、アミノ酸残基または塩基対の種々の置換の作製により構築することができる。
【００３２】
Ｆｃ配列のジスルフィド架橋の形成を妨げるために、システイン残基を欠失させたり又は他のアミノ酸で置換することが可能である。特に、配列番号２の５位のアミノ酸はシステイン残基である。その５位のシステイン残基を除去したり、あるいはそれを１以上のアミノ酸で置換することが可能である。例えば、５位のシステイン残基をアラニン残基で置換して、変異アミノ酸配列を得ることが可能である。同様に、配列番号２の５位のシステインを、セリンまたは他のアミノ酸残基で置換したり、あるいは欠失させることが可能である。
【００３３】
また、１、２、３、４および５位のアミノ酸を欠失させて、３７３アミノ酸のＦｃ−ＯＢタンパク質を得ることにより（メチオニン残基は数えていない）、変異体または類似体を調製することができる。この配列は配列番号４（図６を参照されたい）に記載されている。また、これらの位置での置換も可能であり、本発明の範囲内に含まれる。
【００３４】
また、Ｆｃ受容体結合部位および補体（Ｃ１ｑ）結合部位を除去するために、４個のアミノ酸の置換を導入する修飾を行なうことも可能である。配列番号４の番号付けによれば、これらの変異体修飾には、１５位のロイシンからグルタミン酸への置換、９８位のグルタミン酸からアラニンへの置換、ならびに１００位および１０２位のリシンからアラニンへの置換が含まれる。
【００３５】
同様に、１以上のチロシン残基をフェニルアラニン残基で置換することも可能である。前記のとおり、選択されたアミノ酸の変更が可能であるが、そのような変更は、該融合タンパク質の全体的なフォールディングまたは活性が維持される場合に限られる。
【００３６】
さらに、該Ｆｃ領域を、化学的な又は種々の長さのアミノ酸の「リンカー」部分により該Ｆｃ−ＯＢ融合タンパク質のヒトＯＢタンパク質に結合させることができる。そのような化学的リンカーは当技術分野でよく知られている。アミノ酸リンカー配列には、以下のものを含めることが可能であるが、それらに限定されるものではない：
（ａ）ａｌａ、ａｌａ、ａｌａ；
（ｂ）ａｌａ、ａｌａ、ａｌａ、ａｌａ；
（ｃ）ａｌａ、ａｌａ、ａｌａ、ａｌａ、ａｌａ；
（ｄ）ｇｌｙ、ｇｌｙ；
（ｅ）ｇｌｙ、ｇｌｙ、ｇｌｙ；
（ｆ）ｇｌｙ、ｇｌｙ、ｇｌｙ、ｇｌｙ、ｇｌｙ；
（ｇ）ｇｌｙ、ｇｌｙ、ｇｌｙ、ｇｌｙ、ｇｌｙ、ｇｌｙ、ｇｌｙ；
（ｈ）ｇｌｙ−ｐｒｏ−ｇｌｙ；
（ｉ）ｇｌｙ、ｇｌｙ、ｐｒｏ、ｇｌｙ、ｇｌｙ；および
（ｊ）（ａ）〜（ｉ）項の任意の組合せ。
【００３７】
本沈殿剤は、カチオン成分を有する塩であることが可能であり、カルシウム、マグネシウム、亜鉛、ナトリウム、鉄、コバルト、マンガン、カリウムおよびニッケルから選択することができる。好ましくは、該塩は、医薬組成物中での使用に適したものである。
【００３８】
あるいは、沈殿剤は、タンパク質を沈殿させることが公知の医薬上許容される物質、例えば、ポリエチレングリコールまたは次の段落に記載する他の水溶性重合体から選択することができる。有用な沈殿剤は、中性ｐＨでＯＢタンパク質の沈殿を誘発するが、それは、生理的に適合する溶媒での希釈に際して可逆的または再溶解可能である。適当な沈殿剤の不存在下では、ＯＢタンパク質は中性ｐＨで沈殿して、生理的に適合する溶媒での希釈により可逆的でない形態になる。
【００３９】
該ｐＨ範囲は、好ましくは、ｐＨ約４．０〜ｐＨ約８．０、より好ましくは、約６．５〜約７．５である。医薬組成物に最も好ましいｐＨは、使用するＯＢタンパク質に、選ばれたタンパク質濃度においてその最高の生物活性を保有させるｐＨである。非生理的ｐＨにおいても、本発明ＯＢタンパク質懸濁液は利点を有する場合がある。５．０未満のｐＨでは、本発明ＯＢタンパク質懸濁液は、等しいｐＨおよび等しい濃度のＯＢタンパク質溶液より安定（保存寿命に関して）である可能性がある。例えば、ｐＨ４．０および５０ｍｇ／ｍｌの濃度では、本懸濁液は、インビボで投与されると、同等の溶液より大きな生物学的活性を有する可能性がある。
【００４０】
該バッファーは、該組成物の沈殿特性を改変することなく所望のｐＨを与えるバッファーから選択することができる。好ましくは、バッファーは、医薬製剤に許容されるものである。トリス、ＭＥＳおよびＰＩＰＥＳは、無定形形態および結晶形態の両方に許容される。リン酸塩は、結晶形態に好ましいバッファーである。
【００４１】
該最終懸濁液は、治療投与の容易さの点で、好ましくは、５ｍｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌの濃度を有する。
【００４２】
使用方法
治療剤
治療用途には、体重の調節、糖尿病の治療または予防、血中脂質の減少（および関連状態の治療）、脂肪除外体重の増加、およびインスリン感受性の増加が含まれる。また、本組成物は、前記状態の治療または改善のための１以上の医薬の製造に使用することができる。投与方法は、典型的には、注射であるが、他の手段、例えば肺運搬を用いることができる。例えば、参照により本明細書に組み入れるＰＣＴ ＷＯ ９６／０５３０９（８３頁以降）を参照されたい。本懸濁液を噴霧乾燥して、１０ミクロン未満、より好ましくは０．５〜５ミクロンの平均サイズを有する粒子にすることが可能である。
【００４３】
体重の調節
本組成物および方法は、体重の減少のために使用することができる。別の見方をすると、本組成物は、所望の体重または脂質症（肥満）レベルの維持のために使用することができる。マウスモデルにおいて示されているとおり（前掲を参照されたい）、本ＯＢタンパク質の投与は体重減少をもたらす。失われた体重は、主として、脂肪組織または脂肪の重量である。そのような体重減少は、付随する状態（例えば、後記のもの）の治療に結びつく可能性があり、したがって治療用途を構成する。また、体重の調節が専ら容姿の改善のためである場合には、本発明は美容用途を提供する。
【００４４】
糖尿病の治療
本組成物および方法は、ＩＩ型糖尿病の予防または治療において使用することができる。ＩＩ型糖尿病は肥満と相関しうるため、体重を減少させる（または所望の体重を維持する、または脂肪症レベルを減少もしくは維持する）ための本発明の使用はまた、糖尿病の発生を軽減または予防しうる。さらに、体重減少を引き起こすのに十分な用量の不存在下であっても、本組成物を使用して糖尿病を予防または改善することが可能である。
【００４５】
血中脂質の調節
本組成物および方法は、血中脂質レベルの調節において使用することができる。理論的には、血中脂質レベルの減少のみを望む場合、または血中脂質レベルの維持を望む場合には、その用量は、体重減少を引き起こすには不十分であろう。したがって、肥満患者の初期治療経過中は、体重の減少およびそれに伴う血中脂質レベルの減少が達成される用量を投与することが可能である。十分な体重減少が達成されたら、体重が再び増加するのを防ぐのに十分で、かつ、所望の血中脂質レベルまたは例えば本明細書に記載の他の状態を維持するのに十分な用量を投与することができる。ＯＢタンパク質の効果は可逆的であるため（例えば、Ｃａｍｐｆｉｅｌｄら， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６９： ５４６−５４９ （１９９５） ｐ． ５４７）、これらの用量は実験的に決定することができる。したがって、体重減少を望まない場合に、ある用量で体重減少が生じることが認められたら、所望の血中脂質レベルを得、かつ、所望の体重を維持するために、より低い用量を投与することになる。例えば、参照により本明細書に組み入れるＰＣＴ公開ＷＯ ９７／０６８１６を参照されたい。
【００４６】
脂肪除外体重またはインスリン感受性の増加
理論的には、脂肪除外体重の増加のみを望む場合には、その用量は、体重減少を引き起こすには不十分であろう。したがって、肥満者の初期治療経過中は、体重の減少およびそれに伴う脂肪組織の減少／脂肪除外体重の増加が達成される用量を投与することが可能である。十分な体重減少が達成されたら、体重が再び増加するのを防ぐのに十分で、かつ、所望の脂肪除外重の増加（または脂肪除外体重の減少（ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）の予防）を維持するのに十分な用量を投与することができる。インスリンに対する個体の感受性を増加させるためには、投与に関する同様の考慮事項を考慮することができる。糖尿病の治療のために個体に投与するインスリン（または、潜在的には、アミリン、アミリンアンタゴニストもしくはアゴニスト、またはチアゾリジンジオン、または他の潜在的な糖尿病治療薬）の量を減少させるのに十分な、体重減少を伴わない脂肪除外体重の増加を達成することが可能である。全身的（ｏｖｅｒａｌｌ）強度を増加するためには、投与に関する同様の考慮事項を考慮することが可能である。全身的強度の増加を伴う脂肪除外体重の増加は、体重減少を引き起こすには不十分な用量で達成することが可能である。赤血球（および血中の酸素化）の増加、骨吸収または骨粗鬆症の軽減などの他の利点も、体重減少を伴うことなく達成することが可能である。例えば、参照により本明細書に組み入れるＰＣＴ公開ＷＯ ９７／１８８３３を参照されたい。
【００４７】
組合せ療法
本組成物および方法は、改変された食事および運動などの他の療法と共に用いることができる。他の医薬、例えば、糖尿病の治療に有用な薬（例えば、インスリンおよび恐らくはアミリン、そのアンタゴニストもしくはアゴニスト、チアゾリジンジオン（例えば、参照により本明細書に組み入れるＰＣＴ公開ＷＯ ９８／０８５１２を参照されたい）、または他の潜在的糖尿病治療薬）、コレステロールおよび血圧降下薬（例えば、血中脂質レベルを減少させる薬物または他の心臓血管薬）、活動亢進薬（例えば、アンフェタミン）、利尿薬（液体の排泄のためのもの）、および食欲抑制剤（例えば、神経ペプチドγ受容体に作用する物質またはセロトニン再取込み抑制剤）を使用することができる。そのような投与は、同時にまたは連続的に行なうことができる。さらに、本方法は、身体の全体的な外観を変えるよう意図された整容手術（例えば、体重を減少させるよう意図された脂肪吸引またはレーザー手術、または体の外観上のかさを増加させるよう意図されたインプラント手術）などの外科的方法と共に用いることができる。動脈斑などの脂肪沈着による血管の遮断阻害により引き起こされる有害な状態を軽減するよう意図された心臓手術（バイパス手術その他の手術）から得られる健康上の利益は、本組成物および方法の併用により増強される可能性がある。また、超音波またはレーザー法などの胆石除去方法を、一連の本治療方法の前、間または後のいずれかで使用することができる。さらに、本方法は、骨折、筋肉損傷の手術または療法、または脂肪除外組織量の増加により改善される他の療法の補助手段として用いることができる。
【００４８】
以下の実施例は、本発明をより完全に例示するものであり、本発明の範囲を限定するものではない。実施例１には、ｐＨ７．０で１００ｍｇ／ｍｌの濃度の無定形（後記の結晶性のものと対比させるため）ヒトＯＢタンパク質懸濁液の製造を記載する。実施例２には、結晶性ＯＢタンパク質懸濁液の製造を記載する。実施例３では、ＯＢタンパク質溶液と比較した場合のＯＢタンパク質懸濁液に関する改善された用量反応を示す。実施例４では、イヌモデルにおける本懸濁液の遅延時間（ｄｅｌａｙｅｄ ｔｉｍｅ）作用プロフィールを示す。実施例５には、無定形Ｆｃ−ＯＢタンパク質懸濁液の製造を記載する。実施例６および７では、本懸濁液の改善された安定性を示す。
【実施例】
【００４９】
実施例１：無定形ＯＢタンパク質懸濁液の製造
本実施例は、本発明のヒトＯＢタンパク質懸濁液の１つの製造を例示する。亜鉛塩での沈殿により、無定形ヒトＯＢタンパク質懸濁液を製造した。最終ｐＨである６．０〜ｐＨ８．０において、１００ｍｇ（タンパク質）／ｍｌ（液体）の濃度が得られた。また、ヒトＯＢタンパク質溶液に関するｐＨ４．０の対照組成物を記載する。
【００５０】
組成物：
タンパク質部分：アミノ酸番号２２（Ｖａｌ）から開始し、アミノ酸番号１６７で終結し、Ｎ末端にメチオニル残基を有する、ＰＣＴ公開ＷＯ ９６／０５３０９の配列番号４に記載の組換えメチオニルヒトＯＢタンパク質（「ｒｍｅｔＨｕ−レプチン」）。
沈殿剤：塩化亜鉛
バッファー：トリス、ＭＥＳ、ピペス
最終ｐＨ：６．０〜８．０
製造プロトコール：組換えメチオニルヒトＯＢタンパク質（「ｒｍｅｔＨｕ−レプチン」）溶液を、注射用水中で約４０ｍｇ／ｍｌにまで濃縮し、ＨＣｌでｐＨ３．０にまで酸性化した。塩化亜鉛を加え、適当なバッファーを加えることによりｐＨを中性付近（約ｐＨ７．０）に調節することにより、懸濁液を得た。トリス、ＭＥＳおよびＰＩＰＥＳバッファーが成功裡に使用されている。該最終条件は、典型的には、１０〜１５ｍＭバッファー、２０〜１０００μＭ亜鉛、ｐＨ６．０〜８．０、および１０ｍｇ／ｍｌのｒｍｅｔＨｕ−レプチンであった。該粒子を４℃で数時間沈降させ、該上清を除去することにより、該懸濁液が濃縮されている。最高濃度が得られるまで、この手順を数回繰返すことが可能であり、約１００ｍｇ／ｍｌの懸濁液を得るためにそれを用いた。
【００５１】
対照組成物：１０ｍＭ酢酸塩および５％ ｗ／ｖソルビトールを含有する２０ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ４．０の組換えメチオニルヒトＯＢタンパク質（前記）溶液を、対照組成物として使用した。
【００５２】
実施例２：結晶性ＯＢタンパク質懸濁液の製造
本実施例は、本発明の結晶性ＯＢタンパク質懸濁液の製造を例示する。
【００５３】
タンパク質部分：前記実施例１と同じ組換えメチオニルヒトＯＢタンパク質を使用した。
【００５４】
方法：１ｍＭ ＨＣｌ中１５ｍｇ／ｍｌの濃度のｒｍｅｔＨｕ−レプチンを、４Ｍ ＮａＣｌ、１００ｍＭトリス（ｐＨ８．５）、２％ ｖ／ｖエタノールと１：１の比で４℃で混合した。ゆっくり数時間かけて温度を１４℃〜２５℃に調節し、その温度を、最終温度への加温の持続時間に応じて少なくとも２時間維持することにより、結晶が自然に生成した。遠心分離および再懸濁（適当な結晶安定化溶媒中）により該結晶を収穫することにより、該「母液」（すなわち、該結晶が成長する場となった液体）を、より適当な注射用溶媒で置換した。適当な置換溶媒は、２０〜２５％ポリエチレングリコール［約４０００ダルトン〜約２０，０００ダルトンの分子量を有するもの（この「約」なる語は、市販のＰＥＧ調製物に関する分子量のおよその平均を意味する）］、適当な中性ｐＨバッファー、好ましくはｐＨ約６．０〜ｐＨ約８．０のもの、および、好ましくは、ｐＨ６．０〜ｐＨ７．５の１０ｍＭリン酸塩バッファー、および２％エタノールｖ／ｖである。典型的な調製物においては、ある程度の残留塩（通常、０．２５Ｍ未満）が残存しうる。
【００５５】
実施例３：ＯＢタンパク質溶液と比較した場合のＯＢタンパク質懸濁液に関する改善された用量反応
本実施例では、本ＯＢタンパク質懸濁液が、ＯＢタンパク質溶液より有効であることを示す。正常な痩せたマウスに、１、１０および５０ｍｇ（タンパク質）／ｋｇ体重の本懸濁液または同じ用量のＯＢタンパク質溶液を、５日間、毎日注射した。該懸濁液を与えたマウスは、与えたＯＢタンパク質の質量単位当たり、等しい用量の該溶液製剤を与えたマウスより、大きな体重減少を示した。これを図１Ａおよび図１Ｂに示す。図１Ａは、実施例１の懸濁液を与えた場合の体重変化率（％）を示す。図１Ｂは、実施例１の対照溶液を与えた場合の体重変化率（％）を示す。
【００５６】
これは、同じ用量の本懸濁液が、溶液形態で与えられた場合より有効であることを示している。理論に束縛されることを望むものではないが、これは、該懸濁液が該溶液より遅い吸収速度を有することによる可能性がある。該懸濁液は、血中に進入する前に溶解される必要があり、したがってこの徐放効果は、より高い効力をもたらす。質量の点では、該タンパク質の必要投与量は、懸濁液においては溶液の場合より少なくてすむ。さらに、溶液においては、５日（投与の最終日）の時点で、１０ｍｇ／ｋｇの用量と５０ｍｇ／ｋｇの用量との間で差がない（以下の表２を参照されたい）。該懸濁液は、該溶液製剤より決定的な用量反応曲線を与える。
【００５７】
【表２】
【００５８】
方法：
動物：正常なＣＤ−１マウスを使用した。
基礎体重：約２０グラム。
投与：動物の同一部位に、５日間毎日、皮下注射した。
取扱い：動物は集団で収容し、それらの動物には任意量の食餌を与えた。
【００５９】
組成物：
溶液：実施例１のｒｍｅｔＨｕ−レプチン溶液を２０ｍｇ／ｍｌの濃度で使用した。
懸濁液：実施例１のｒｍｅｔＨｕ−レプチン懸濁液をｐＨ７．０、１０ｍＭ ＭＥＳバッファー、５００ｍＭ Ｚｎ、２０ｍｇ／ｍｌで使用した。
ＰＢＳ：リン酸緩衝食塩水をプラシーボとして使用した。（タンパク質の不存在下で懸濁液の液体または溶液の液体のみを使用する対照に関する用量反応は、ＰＢＳの場合に類似していた。データは示していない）。
【００６０】
実施例４：イヌにおけるＯＢタンパク質血清レベル
本実施例は、本懸濁液の遅延時間作用プロフィールを示す。
方法：ｒｍｅｔＨｕ−レプチンの懸濁液または溶液をビーグル犬に投与した。血清を採取し、ＯＢタンパク質レベルを、図２に示されている時点で測定した。
【００６１】
【表３】
【００６２】
使用した組成物：
溶液：実施例１に記載の溶液を５ｍｇ／ｋｇ／日の用量で使用した。
懸濁液：実施例２に記載の懸濁液を使用した。表を参照されたい。
【００６３】
動物：表３に示すデータは、３匹の動物の平均である。動物は正常なビーグル犬であった。
取扱い：動物は１匹ずつ収容し、それらの動物には任意量の食餌を与えた。優良動物取扱い規範（ｇｏｏｄ ａｎｉｍａｌ ｈａｎｄｌｉｎｇ ｐｒａｃｔｉｃｅｓ）を遵守した。
【００６４】
アッセイ：Ｈｏｔｔａら， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ ２７１：２５５３２７−２５３３１ （１９９６）に記載されているとおりに、抗体アッセイを用いた。
結果：図２から認められるとおり、該溶液の濃度は、タンパク質の投与後１〜２時間で最大になり、一方、該懸濁液の濃度は、それよりはるかに後の１０〜１２時間後に最大になる。このことは、該懸濁液が、より長時間、最小有効量を維持することを示している。
【００６５】
実施例５：無定形Ｆｃ−ＯＢタンパク質懸濁液の製造
本実施例は、本発明のヒトＦｃ−ＯＢタンパク質懸濁液の１つの製造を例示する。亜鉛塩での沈殿により、無定形ヒトＦｃ−ＯＢタンパク質懸濁液を製造した。また、ヒトＦｃ−ＯＢタンパク質溶液に関するｐＨ７．５の対照組成物を記載する。
【００６６】
組成物：
タンパク質部分：配列番号４に記載の組換えメチオニルヒトＦｃ−ＯＢタンパク質（「ｒｍｅｔＨｕ−Ｆｃ−レプチン」）（これは、３７３アミノ酸の融合タンパク質であり、該タンパク質のＦｃ部分はアミノ酸１〜２２７であり、該タンパク質のヒトＯＢタンパク質部分はアミノ酸２２８〜３７３であり、そのＮ末端にメチオニル残基を有する）。
沈殿剤：塩化亜鉛
バッファー：１００ｍＭトリス
最終ｐＨ：７．５
製造プロトコール：ｒｍｅｔＨｕ−Ｆｃ−レプチン溶液を、１００ｍＭトリスバッファー（ｐＨ７．５）中、約５ｍｇ／ｍｌまで濃縮した。塩化亜鉛を加えて、該懸濁液を得た。
【００６７】
対照組成物：１００ｍＭトリスを含有する５ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ７．５のｒｍｅｔＨｕ−Ｆｃ−レプチン溶液（前記）を、対照組成物として使用した。
【００６８】
実施例６：本ヒトＯＢタンパク質懸濁液の安定性
本実施例では、本懸濁液の無定形形態および結晶形態の両方が、促進（ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ）安定性アッセイ条件下で、溶液中の物質より安定であることを示す。
【００６９】
図３は、亜鉛無定形形態の本懸濁液（実施例１のとおり）を溶液形態（同様に実施例１のとおり）と３７℃で７週間比較した場合のＲＰ−ＨＰＬＣのトレースを示す。図から認められるとおり、本懸濁液（中央の線）は、該溶液形態（上側の線）より少数のピーク（より少数の分解産物を示す）を有する。比較として、下側の線は、−８０℃で７週間保存されていた亜鉛無定形形態を示す。
【００７０】
図４は、実施例２の結晶懸濁液形態を溶液形態（実施例１のもの）と比較した場合のＲＰ−ＨＰＬＣのトレースを示す。該物質は、１９℃で５６日間保存した。（３７℃での保存は適当な条件ではない。なぜなら、該結晶形態はその結晶構造を３７℃で失うからである）。図４は、該溶液形態（主ピーク＝８６％）では、該懸濁液形態（主ピーク＝９４％）の場合より多数のピーク（より多数の分解を示す）が存在することを示している。下側の線の対照は、−８０℃で５６日間保存した結晶形態であった。４℃では、分解がより遅く生じたものの、同様の結果が認められた。
【００７１】
該主分解産物は、アミノ酸１０８位（「Ｖａｌ」残基を１位として使用するＰＣＴ ＷＯ ９６／０５３０９の配列番号４に従う場合）のアスパルタートであるらしかった。該分子の安定性を増加させるために、この位置における、より安定な化学的部分（例えば、別のアミノ酸）を、実験的に選択することが可能である。全体的に見て、本発明の懸濁液は、ＯＢタンパク質溶液より安定である。
【００７２】
実施例７：本ヒトＦｃ−ＯＢタンパク質懸濁液の安定性
本実施例では、本Ｆｃ−ＯＢタンパク質懸濁液の無定形形態が、促進安定性アッセイ条件下で、溶液中の物質より安定であることを示す。
【００７３】
本懸濁液の亜鉛無定形形態（実施例５のとおり）および溶液形態（同様に実施例５のとおり）を、該懸濁液および溶液の両形態を４℃、２９℃および３７℃で２週間保存することにより、安定性試験に付した。図７に示すとおり、２９℃および３７℃で保存したＦｃ−レプチン懸濁液は、それぞれ同じ温度で保存したＦｃ−レプチン溶液より低い割合の分解産物（該ＯＢタンパク質のアミノ酸１０８位のアスパルタートに関連しているもの）を示している。
【００７４】
以上、本発明を好ましい実施形態に関して説明してきたが、変更および修飾が当業者に見出されると理解される。したがって、添付の請求の範囲は、特許請求されている本発明の範囲内に含まれる同等なすべての変更を含むと意図される。
【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１Ａ】実施例１の本発明ヒトＯＢ懸濁液に関する、マウスにおける用量反応曲線である。
【図１Ｂ】実施例１に記載の対照ヒトＯＢタンパク質溶液に関する、マウスにおける用量反応曲線である。
【図２】本発明ＯＢタンパク質懸濁液および対照ヒトＯＢタンパク質溶液（実施例１に記載のとおり）に関する、イヌにおけるＯＢの血清レベルを示すグラフである。
【図３】３７℃で７週間のヒトＯＢタンパク質製剤の逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）のトレースである。実施例１のヒトＯＢタンパク質亜鉛懸濁液は中央のトレース、実施例１のヒトＯＢタンパク質溶液対照は上側の線、−８０℃で５６日間維持したヒトＯＢタンパク質懸濁液は下側の線である。
【図４】１９℃で５６日間のヒトＯＢタンパク質製剤のＲＰ−ＨＰＬＣのトレースである。実施例１のヒトＯＢ溶液は上側の線、実施例２のヒトＯＢ結晶懸濁液は中央の線、−８０℃で５６日間の実施例２のヒトＯＢ結晶懸濁液は下側の線である。
【図５Ａ】ヒトｍｅｔＦｃ−ＯＢタンパク質のＤＮＡ配列（配列番号１）およびアミノ酸配列（配列番号２）である。
【図５Ｂ】ヒトｍｅｔＦｃ−ＯＢタンパク質のＤＮＡ配列（配列番号１）およびアミノ酸配列（配列番号２）である。
【図５Ｃ】ヒトｍｅｔＦｃ−ＯＢタンパク質のＤＮＡ配列（配列番号１）およびアミノ酸配列（配列番号２）である。
【図６Ａ】ヒトｍｅｔＦｃ−ＯＢタンパク質変異体のＤＮＡ配列（配列番号３）およびアミノ酸配列（配列番号４）である。
【図６Ｂ】ヒトｍｅｔＦｃ−ＯＢタンパク質変異体のＤＮＡ配列（配列番号３）およびアミノ酸配列（配列番号４）である。
【図６Ｃ】ヒトｍｅｔＦｃ−ＯＢタンパク質変異体のＤＮＡ配列（配列番号３）およびアミノ酸配列（配列番号４）である。
【図７】組換えメチオニルヒトＦｃ−ＯＢタンパク質に関する、逆相ＨＰＬＣで測定した場合のａｓｐ １０８（配列番号４の番号付けを使用するとａｓｐ ３３５）におけるイソａｓｐの生成速度を示すグラフである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高濃度における及び生理的ｐＨまたはその付近における安定かつ活性なヒトＯＢタンパク質組成物に関する。また、そのような組成物の関連組成物、製造方法および使用方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
肥満の分子的基礎はほとんど知られていないが、「ＯＢ遺伝子」およびコードされたタンパク質（「ＯＢタンパク質」）の同定により、身体の脂肪沈着を調節するために身体が用いているメカニズムが、ある程度解明されてきている（Ｚｈａｎｇら， Ｎａｔｕｒｅ ３７２： ４２５−４３２ （１９９４）； またＮａｔｕｒｅ ３７４： ４７９ （１９９５）の訂正も参照されたい）。１９９６年２月２２日付け公開のＰＣＴ公開ＷＯ ９６／０５３０９（発明の名称“Ｍｏｄｕｌａｔｏｒｓ ｏｆ Ｂｏｄｙ Ｗｅｉｇｈｔ， Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ， ａｎｄ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｕｓｅｓ Ｔｈｅｒｅｏｆ”）は、ＯＢタンパク質および関連組成物および方法を十分に記載しており、これを参照により本明細書に組み入れることとする。ヒトＯＢタンパク質のアミノ酸配列は、ＷＯ ９６／０５３０９（これを参照により本明細書に組み入れることとする）の配列番号４および６（その公開の第１７２および１７４頁）に記載されており、該成熟タンパク質の第１アミノ酸残基は、２２位に位置し、バリン残基である。該成熟タンパク質は、１４６残基（あるいは、４９位のグルタミンが存在しない場合には、１４５残基（配列番号６））である。
【０００３】
ＯＢタンパク質は、ｏｂ／ｏｂ突然変異マウス（ＯＢ遺伝子産物の産生の欠損により肥満したマウス）および正常な野生型マウスの両方においてインビボで活性である。その生物活性は、とりわけ、体重減少を示す。一般的には、Ｂａｒｉｎａｇａ， “Ｏｂｅｓｅ” Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｌｉｍｓ Ｍｉｃｅ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６９： ４７５−４５６ （１９９５）およびＦｒｉｅｄｍａｎ， “Ｔｈｅ Ａｌｐｈａｂｅｔ ｏｆ Ｗｅｉｇｈｔ Ｃｏｎｔｒｏｌ”， Ｎａｔｕｒｅ ３８５：１１９−１２０ （１９９７）を参照されたい。ｏｂ／ｏｂ突然変異マウスにおいてＯＢタンパク質を投与すると、例えば、血清インスリンレベルおよび血清グルコースレベルが減少することが公知である。また、ＯＢタンパク質を投与すると、体脂肪が減少することが公知である。これは、ｏｂ／ｏｂ突然変異マウスおよび非肥満正常マウスの両方で認められた［Ｐｅｌｌｅｙｍｏｕｎｔｅｒら， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６９： ５４０−５４３ （１９９５）； Ｈａｌａａｓら， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６９： ５４３−５４６ （１９９５）， また、Ｃａｍｐｆｉｅｌｄら， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６９： ５４６−５４９ （１９９５）（マイクログラム用量のＯＢタンパク質の末梢および中枢投与により、ｏｂ／ｏｂおよび食餌誘導肥満マウスでは食物摂取および体重が減少したが、ｄｂ／ｄｂ肥満マウスでは減少しなかった）も参照されたい］。これらの報告ではいずれも、最高用量においても毒性は認められていない。
【０００４】
ヒトに注射するための医薬組成物の調製（物）に関しては、該ヒトアミノ酸配列は、比較的高濃度（例えば、液体１ｍｌ当たり活性タンパク質約２ｍｇ以上）においては生理的ｐＨで不溶性であることが認められている。治療的に有効な量を大型哺乳動物（例えば、ヒト）に注射するには、ミリグラム（タンパク質）／ｋｇ体重の範囲の用量（例えば、０．５または１．０ｍｇ／ｋｇ／日以下）が望ましい。患者に不快感または恐らくは痛みを与えうる大容量の注射を避けるためには、タンパク質濃度を増加させる必要がある。
【０００５】
組換えＤＮＡ技術の進歩に伴い、治療用組換えタンパク質が入手可能になったことは、タンパク質の製剤化における進歩をもたらした。タンパク質の修飾および融合タンパク質を記載している概説としては、Ｆｒａｎｃｉｓ， Ｆｏｃｕｓ ｏｎ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ ３： ４−１０ （１９９２）が挙げられる。
【０００６】
そのような１つの修飾は、免疫グロブリンのＦｃ領域の使用である。抗体は、機能的に独立した２つの部分、すなわち、抗原に結合する「Ｆａｂ」として公知の可変ドメインと、エフェクター機能（例えば、補体または食細胞）に対する結合をもたらす「Ｆｃ」として公知の定常ドメインとからなる。免疫グロブリンのＦｃ部分は長い血漿半減期を有し、一方、Ｆａｂは短命である（Ｃａｐｏｎら， Ｎａｔｕｒｅ ３３７：５２５−５３１ （１９８９））。
【０００７】
より長い半減期を付与したり、あるいはＦｃ受容体結合、プロテインＡ結合、補体結合、胎盤通過などの機能（これらはすべて、免疫グロブリンのＦｃタンパク質に存在する）を付与するために、Ｆｃドメインを使用して、治療用タンパク質が構築されている（前掲誌）。例えば、ＩｇＧ１抗体のＦｃ領域が、ホジキン病腫瘍細胞、未分化リンパ腫細胞、Ｔ細胞白血病細胞および他の悪性細胞型上で発現されるＣＤ３０受容体に結合する分子であるＣＤ３０−ＬのＮ末端に融合されている（米国特許第５，４８０，９８１号を参照されたい）。抗炎症および抗拒絶物質であるＩＬ−１０をマウスＦｃγ２ａに融合させて、該サイトカインの短い循環半減期を増加させる試みが行なわれている（Ｚｈｅｎｇ， Ｘ．ら， Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， １５４： ５５９０−５６００ （１９９５））。また、敗血症性ショックの患者を治療するために、ヒトＩｇＧ１のＦｃタンパク質に結合させた腫瘍壊死因子受容体を使用することが、研究により評価されている（Ｆｉｓｈｅｒ， Ｃ．ら， Ｎ． Ｅｎｇ． Ｊ． Ｍｅｄ．， ３３４： １６９７−１７０２ （１９９６）； Ｖａｎ Ｚｅｅ， Ｋ．ら， Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， １５６： ２２２１−２２３０ （１９９６））。また、エイズ治療用タンパク質を製造するために、ＦｃがＣＤ４受容体と融合されている（Ｃａｐｏｎら， Ｎａｔｕｒｅ， ３３７：５２５−５３１ （１９８９）を参照されたい）。また、インターロイキン２の短い半減期およびその全身毒性を克服するために、インターロイキン２のＮ末端がＩｇＧ１またはＩｇＧ３のＦｃ部分に融合されている（Ｈａｒｖｉｌｌら， Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， １： ９５−１０５ （１９９５）を参照されたい）。
【０００８】
インスリンに関しては、懸濁製剤が報告されている。しかしながら、インスリンに適用可能な条件は、ＯＢタンパク質を含む他のいずれかのタンパク質の適用可能な条件を予測させるものではない。インスリンは、特定の物理的および化学的特性を有する非常に小さなタンパク質であり、これらの特性は、製剤化条件の決定に重要である。Ｂｒａｎｇｅ， Ｇａｌｅｎｉｃｓ ｏｆ Ｉｎｓｕｌｉｎ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ １９８７は、インスリン懸濁剤を記載している（ｐ． ３６）。また、Ｈａｓｓｅｌｌｂｌａｔｔら， Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ Ｎｅｗ Ｓｅｒｉｅｓ， Ｖｏｌ． ＸＸＸＩＩ−１／２ Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ Ｂｅｒｌｉｎ， Ｈｅｉｄｅｌｂｕｒｇ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９７５）中のＳｃｈｌｉｃｈｔｋｒｕｌｌら． Ｉｎｓｕｌｉｎ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ ｗｉｔｈ Ｐｒｏｌｏｎｇｅｄ Ｅｆｆｅｃｔ， ｐｐ． ７２９−７７７も参照されたい。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
現在のところ、生理的ｐＨで少なくとも約２ｍｇ／ｍｌの濃度のヒトＯＢタンパク質の安定な製剤の報告はなく、さらに、少なくとも約５０ｍｇ／ｍｌ以上の安定な濃度の活性ヒトＯＢタンパク質の報告はない。さらに、保存安定性を改善するために、凍結または凍結乾燥形態を用いることが可能であるが、そのような形態は、本明細書に記載の、そのまま使用できる懸濁液形態ほどは望ましくない。凍結形態は、一定の凍結温度での保存を要するが、これは、一般消費者用の冷蔵庫および冷凍庫の除霜サイクルのため不可能な場合がある。さらに、凍結乾燥形態は希釈および混合を要するが、これは不便であり、患者の遵守を妨げる可能性がある。製造者の観点から見ると、凍結液の製造、保存および出荷は、高い経費を要し、そのまま使用できる製剤の配給より一層厳重な監督を要する。また、凍結乾燥製剤用の適当な希釈剤を製造し又は入手可能にすることは、そのような希釈剤が必要でない場合より高い経費を要し、より低効率である。小容量の注射により運搬されうる活性なＯＢタンパク質を含有するヒト用医薬組成物の濃縮形態が必要とされている。本発明は、これらの要求を満たすものである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、一定の懸濁製剤が、生理的ｐＨで少なくとも約２ｍｇ／ｍｌの濃度の安定なＯＢタンパク質の製剤化を可能にするという観察に由来するものである。本発明で用いる「生理的ｐＨ」なる語は、約６．０〜約８．０のｐＨを意味する。そのような組成物の使用は、比較的小容量のＯＢタンパク質治療薬の送達を可能にする。本明細書中で更に詳しく開示するとおり、沈殿剤の使用により、以下の特性を有するヒトＯＢタンパク質の懸濁液の製造が可能となる：
１．溶液形態の同じヒトＯＢタンパク質と比較した場合の、生理的ｐＨにおける改善された安定性。後記実施例において、１０ｍｇ／ｍｌ以上の濃度およびｐＨ７のヒトＯＢタンパク質懸濁液を示すが、これは、溶解を可能にする最高ｐＨ（ヒトＯＢタンパク質の天然形態に関してはｐＨ４であり、生理的ｐＨにも満たない）における溶液中の同じ濃度のものと比べると、より良好なＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）プロフィールを有する。また、後記において、ｐＨ約７で５ｍｇ／ｍｌの濃度のＦｃ−ＯＢ融合タンパク質懸濁液を例示するが、これは、比較しうるＦｃ−ＯＢ融合タンパク質溶液より少ない分解産物を保存に際して示す。
【００１１】
２．溶液形態の同じヒトＯＢタンパク質と比較した場合の、持続的な注射時間放出プロフィール。後記実施例において、本発明の高濃縮ヒトＯＢタンパク質懸濁液を使用した場合の徐放効果を示す。物質の活性が比較的長時間維持され、したがって比較的高い効力が得られ、より少ない回数の注射しか必要とされない点で、そのような徐放効果は有利である。
【００１２】
したがって、本発明の１つの目的は、少なくとも約２ｍｇ（タンパク質）／ｍｌの濃度を有する生理的ｐＨの活性ヒトＯＢタンパク質の安定製剤である。例えば、少なくとも２．０ｍｇ／ｍｌの濃度およびｐＨ７．０の活性ヒトＯＢタンパク質の安定製剤を提供する。濃度の上限は、ヒトへの投与に利用可能な懸濁液形態であり、後記のとおり、実施例には、生理的ｐＨ（例えば、ｐＨ６．０〜ｐＨ８．０）で１００ｍｇ／ｍｌもの濃度が示されている。
【００１３】
もう１つの態様において、本発明は、少なくとも約１０ｍｇ／ｍｌの濃度を有する約６．０〜約８．０のｐＨ範囲内の活性ヒトＯＢタンパク質の安定製剤に関する。
【００１４】
さらにもう１つの態様において、本発明は、少なくとも約０．５ｍｇ／ｍｌの濃度および約６．０〜約８．０のｐＨの、免疫グロブリンのＦｃ領域の結合により誘導体化された活性ヒトＯＢタンパク質の安定製剤に関する。より詳しくは、ｐＨ約７．５で５ｍｇ／ｍｌ〜５０ｍｇ／ｍｌの濃度の活性Ｆｃ−ＯＢ融合タンパク質の安定製剤を提供する。
【００１５】
さらに他の態様において、本発明は、ｐＨ６．５〜ｐＨ７．５で２ｍｇ（タンパク質）／ｍｌ以上の濃度の安定かつ活性なヒトＯＢタンパク質のための製剤を提供する。より詳しくは、ｐＨ７．０で２０ｍｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌの濃度の安定かつ活性なヒトＯＢタンパク質のための製剤を提供する。
【００１６】
もう１つの態様において、本発明は、５．０〜８．０のｐＨで１０ｍｇ／ｍｌ以上の濃度の安定かつ活性なヒトＯＢタンパク質のための製剤を提供する。
【００１７】
さらにもう１つの態様において、本発明は、０．５ｍｇ／ｍｌ以上の濃度および約６．０〜約８．０のｐＨの、免疫グロブリンのＦｃ領域の結合により誘導体化された安定かつ活性なヒトＯＢタンパク質のための製剤を提供する。より詳しくは、ｐＨ約７．５で５ｍｇ／ｍｌ〜５０ｍｇ／ｍｌの濃度の、安定かつ活性なＦｃ−ＯＢ融合タンパク質のための製剤を提供する。
【００１８】
本発明のその他の態様には、前記の医薬組成物、そのような組成物の製造方法、および本組成物を使用する治療方法、およびそのような治療のための本組成物を含有する医薬の製造方法が含まれる。
【００１９】
図面の簡単な説明
図１Ａおよび１Ｂは、（１Ａ）実施例１の本発明ヒトＯＢ懸濁液および（１Ｂ）実施例１に記載の対照ヒトＯＢタンパク質溶液に関する、マウスにおける用量反応曲線である。
【００２０】
図２は、本発明ＯＢタンパク質懸濁液および対照ヒトＯＢタンパク質溶液（実施例１に記載のとおり）に関する、イヌにおけるＯＢの血清レベルを示すグラフである。
【００２１】
図３は、３７℃で７週間のヒトＯＢタンパク質製剤の逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）のトレースである。実施例１のヒトＯＢタンパク質亜鉛懸濁液は中央のトレース、実施例１のヒトＯＢタンパク質溶液対照は上側の線、−８０℃で５６日間維持したヒトＯＢタンパク質懸濁液は下側の線である。
【００２２】
図４は、１９℃で５６日間のヒトＯＢタンパク質製剤のＲＰ−ＨＰＬＣのトレースである。実施例１のヒトＯＢ溶液は上側の線、実施例２のヒトＯＢ結晶懸濁液は中央の線、−８０℃で５６日間の実施例２のヒトＯＢ結晶懸濁液は下側の線である。
【００２３】
図５Ａ〜５Ｃは、ヒトｍｅｔＦｃ−ＯＢタンパク質のＤＮＡ配列（配列番号１）およびアミノ酸配列（配列番号２）である。
【００２４】
図６Ａ〜６Ｃは、ヒトｍｅｔＦｃ−ＯＢタンパク質変異体のＤＮＡ配列（配列番号３）およびアミノ酸配列（配列番号４）である。
【００２５】
図７は、組換えメチオニルヒトＦｃ−ＯＢタンパク質に関する、逆相ＨＰＬＣで測定した場合のａｓｐ １０８（配列番号４の番号付けを使用するとａｓｐ ３３５）におけるイソａｓｐの生成速度を示すグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
本発明の安定かつ活性なＯＢタンパク質組成物は、該タンパク質部分が沈殿し液体部分中に懸濁しているため、一般に、懸濁液（懸濁剤）として分類される。該組成物は、活性なＯＢタンパク質部分、沈殿剤、ｐＨ調節剤および液体担体を含有する。このＯＢタンパク質は、無定形（アモルファス）または結晶形態である。
【００２７】
好ましくは、ヒトにおいて治療用または美容用組成物として使用するためには、細菌発現に付随するＮ末端メチオニル残基を所望により有する天然ヒトＯＢタンパク質（Ｚｈａｎｇら， Ｎａｔｕｒｅ， 前掲を参照されたい）のアミノ酸配列を有するＯＢタンパク質を使用する。使用可能なこのＯＢタンパク質を製造するための組換えＤＮＡ手段に関しては、参照により本明細書に組み入れるＰＣＴ公開ＷＯ９６／０５３０９を参照されたい。選択されたアミノ酸の変更が可能であるが、そのような変更は、該タンパク質の全体的なフォールディングまたは活性が維持される場合に限られる。以下の表１は、特定の特性（塩基性、酸性、極性、疎水性、芳香性およびサイズ（小型））に関する、使用可能な同類アミノ酸置換を記載する。一般的には、参照により本明細書に組み入れるＦｏｒｄら， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ２： ９５−１０７， １９９１を参照されたい。また、小さなアミノ末端伸長、例えばアミノ末端メチオニン残基、約２０〜２５残基までの小さなリンカーペプチドまたは精製を容易にする小さな伸長、例えばポリヒスチジン領域、抗原エピトープまたは結合ドメインが存在することが可能である。
【００２８】
【表１】
【００２９】
一般に、本懸濁液において増加した安定性を示すヒトＯＢタンパク質は、生理的ｐＨにさらされると、溶液中において、露出した疎水性領域を有するヒトＯＢタンパク質である。また、免疫グロブリンのＦｃ領域を該ＯＢタンパク質部分に結合させることにより誘導体化されたヒトＯＢタンパク質は、本懸濁液において増加した安定性を示す。
【００３０】
一般に、免疫グロブリンのＦｃ領域は、ヒトＯＢタンパク質に対して遺伝的または化学的に融合させることが可能である。好ましくは、該Ｆｃ領域を、該ＯＢタンパク質のＮ末端において融合させる。好ましいＦｃ−ＯＢ融合タンパク質に関しては、参照により本明細書に組み入れる１９９６年１２月２０日付けの同時係属米国特許出願第０８／７７０，９７３号を参照されたい。
【００３１】
好ましくは、ヒト免疫グロブリンＩｇＧ−１重鎖のアミノ酸配列（Ｅｌｌｉｓｏｎ， Ｊ． Ｗ．ら， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １０：４０７１−４０７９ （１９８２）を参照されたい）を有するＦｃ領域を使用する。好ましいＦｃ領域を、配列番号２（図５を参照されたい）に記載する。配列番号２の組換えＦｃ−ＯＢ配列は、３７８アミノ酸のＦｃ−ＯＢタンパク質である（メチオニン残基は数えていない）。図５のＦｃ−ＯＢタンパク質の最初のアミノ酸であるグルタミン酸を＋１とし、この場合、該メチオニンは−１位である。Ｆｃ部分の変異体または類似体を、例えば、アミノ酸残基または塩基対の種々の置換の作製により構築することができる。
【００３２】
Ｆｃ配列のジスルフィド架橋の形成を妨げるために、システイン残基を欠失させたり又は他のアミノ酸で置換することが可能である。特に、配列番号２の５位のアミノ酸はシステイン残基である。その５位のシステイン残基を除去したり、あるいはそれを１以上のアミノ酸で置換することが可能である。例えば、５位のシステイン残基をアラニン残基で置換して、変異アミノ酸配列を得ることが可能である。同様に、配列番号２の５位のシステインを、セリンまたは他のアミノ酸残基で置換したり、あるいは欠失させることが可能である。
【００３３】
また、１、２、３、４および５位のアミノ酸を欠失させて、３７３アミノ酸のＦｃ−ＯＢタンパク質を得ることにより（メチオニン残基は数えていない）、変異体または類似体を調製することができる。この配列は配列番号４（図６を参照されたい）に記載されている。また、これらの位置での置換も可能であり、本発明の範囲内に含まれる。
【００３４】
また、Ｆｃ受容体結合部位および補体（Ｃ１ｑ）結合部位を除去するために、４個のアミノ酸の置換を導入する修飾を行なうことも可能である。配列番号４の番号付けによれば、これらの変異体修飾には、１５位のロイシンからグルタミン酸への置換、９８位のグルタミン酸からアラニンへの置換、ならびに１００位および１０２位のリシンからアラニンへの置換が含まれる。
【００３５】
同様に、１以上のチロシン残基をフェニルアラニン残基で置換することも可能である。前記のとおり、選択されたアミノ酸の変更が可能であるが、そのような変更は、該融合タンパク質の全体的なフォールディングまたは活性が維持される場合に限られる。
【００３６】
さらに、該Ｆｃ領域を、化学的な又は種々の長さのアミノ酸の「リンカー」部分により該Ｆｃ−ＯＢ融合タンパク質のヒトＯＢタンパク質に結合させることができる。そのような化学的リンカーは当技術分野でよく知られている。アミノ酸リンカー配列には、以下のものを含めることが可能であるが、それらに限定されるものではない：
（ａ）ａｌａ、ａｌａ、ａｌａ；
（ｂ）ａｌａ、ａｌａ、ａｌａ、ａｌａ；
（ｃ）ａｌａ、ａｌａ、ａｌａ、ａｌａ、ａｌａ；
（ｄ）ｇｌｙ、ｇｌｙ；
（ｅ）ｇｌｙ、ｇｌｙ、ｇｌｙ；
（ｆ）ｇｌｙ、ｇｌｙ、ｇｌｙ、ｇｌｙ、ｇｌｙ；
（ｇ）ｇｌｙ、ｇｌｙ、ｇｌｙ、ｇｌｙ、ｇｌｙ、ｇｌｙ、ｇｌｙ；
（ｈ）ｇｌｙ−ｐｒｏ−ｇｌｙ；
（ｉ）ｇｌｙ、ｇｌｙ、ｐｒｏ、ｇｌｙ、ｇｌｙ；および
（ｊ）（ａ）〜（ｉ）項の任意の組合せ。
【００３７】
本沈殿剤は、カチオン成分を有する塩であることが可能であり、カルシウム、マグネシウム、亜鉛、ナトリウム、鉄、コバルト、マンガン、カリウムおよびニッケルから選択することができる。好ましくは、該塩は、医薬組成物中での使用に適したものである。
【００３８】
あるいは、沈殿剤は、タンパク質を沈殿させることが公知の医薬上許容される物質、例えば、ポリエチレングリコールまたは次の段落に記載する他の水溶性重合体から選択することができる。有用な沈殿剤は、中性ｐＨでＯＢタンパク質の沈殿を誘発するが、それは、生理的に適合する溶媒での希釈に際して可逆的または再溶解可能である。適当な沈殿剤の不存在下では、ＯＢタンパク質は中性ｐＨで沈殿して、生理的に適合する溶媒での希釈により可逆的でない形態になる。
【００３９】
該ｐＨ範囲は、好ましくは、ｐＨ約４．０〜ｐＨ約８．０、より好ましくは、約６．５〜約７．５である。医薬組成物に最も好ましいｐＨは、使用するＯＢタンパク質に、選ばれたタンパク質濃度においてその最高の生物活性を保有させるｐＨである。非生理的ｐＨにおいても、本発明ＯＢタンパク質懸濁液は利点を有する場合がある。５．０未満のｐＨでは、本発明ＯＢタンパク質懸濁液は、等しいｐＨおよび等しい濃度のＯＢタンパク質溶液より安定（保存寿命に関して）である可能性がある。例えば、ｐＨ４．０および５０ｍｇ／ｍｌの濃度では、本懸濁液は、インビボで投与されると、同等の溶液より大きな生物学的活性を有する可能性がある。
【００４０】
該バッファーは、該組成物の沈殿特性を改変することなく所望のｐＨを与えるバッファーから選択することができる。好ましくは、バッファーは、医薬製剤に許容されるものである。トリス、ＭＥＳおよびＰＩＰＥＳは、無定形形態および結晶形態の両方に許容される。リン酸塩は、結晶形態に好ましいバッファーである。
【００４１】
該最終懸濁液は、治療投与の容易さの点で、好ましくは、５ｍｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌの濃度を有する。
【００４２】
使用方法
治療剤
治療用途には、体重の調節、糖尿病の治療または予防、血中脂質の減少（および関連状態の治療）、脂肪除外体重の増加、およびインスリン感受性の増加が含まれる。また、本組成物は、前記状態の治療または改善のための１以上の医薬の製造に使用することができる。投与方法は、典型的には、注射であるが、他の手段、例えば肺運搬を用いることができる。例えば、参照により本明細書に組み入れるＰＣＴ ＷＯ ９６／０５３０９（８３頁以降）を参照されたい。本懸濁液を噴霧乾燥して、１０ミクロン未満、より好ましくは０．５〜５ミクロンの平均サイズを有する粒子にすることが可能である。
【００４３】
体重の調節
本組成物および方法は、体重の減少のために使用することができる。別の見方をすると、本組成物は、所望の体重または脂質症（肥満）レベルの維持のために使用することができる。マウスモデルにおいて示されているとおり（前掲を参照されたい）、本ＯＢタンパク質の投与は体重減少をもたらす。失われた体重は、主として、脂肪組織または脂肪の重量である。そのような体重減少は、付随する状態（例えば、後記のもの）の治療に結びつく可能性があり、したがって治療用途を構成する。また、体重の調節が専ら容姿の改善のためである場合には、本発明は美容用途を提供する。
【００４４】
糖尿病の治療
本組成物および方法は、ＩＩ型糖尿病の予防または治療において使用することができる。ＩＩ型糖尿病は肥満と相関しうるため、体重を減少させる（または所望の体重を維持する、または脂肪症レベルを減少もしくは維持する）ための本発明の使用はまた、糖尿病の発生を軽減または予防しうる。さらに、体重減少を引き起こすのに十分な用量の不存在下であっても、本組成物を使用して糖尿病を予防または改善することが可能である。
【００４５】
血中脂質の調節
本組成物および方法は、血中脂質レベルの調節において使用することができる。理論的には、血中脂質レベルの減少のみを望む場合、または血中脂質レベルの維持を望む場合には、その用量は、体重減少を引き起こすには不十分であろう。したがって、肥満患者の初期治療経過中は、体重の減少およびそれに伴う血中脂質レベルの減少が達成される用量を投与することが可能である。十分な体重減少が達成されたら、体重が再び増加するのを防ぐのに十分で、かつ、所望の血中脂質レベルまたは例えば本明細書に記載の他の状態を維持するのに十分な用量を投与することができる。ＯＢタンパク質の効果は可逆的であるため（例えば、Ｃａｍｐｆｉｅｌｄら， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６９： ５４６−５４９ （１９９５） ｐ． ５４７）、これらの用量は実験的に決定することができる。したがって、体重減少を望まない場合に、ある用量で体重減少が生じることが認められたら、所望の血中脂質レベルを得、かつ、所望の体重を維持するために、より低い用量を投与することになる。例えば、参照により本明細書に組み入れるＰＣＴ公開ＷＯ ９７／０６８１６を参照されたい。
【００４６】
脂肪除外体重またはインスリン感受性の増加
理論的には、脂肪除外体重の増加のみを望む場合には、その用量は、体重減少を引き起こすには不十分であろう。したがって、肥満者の初期治療経過中は、体重の減少およびそれに伴う脂肪組織の減少／脂肪除外体重の増加が達成される用量を投与することが可能である。十分な体重減少が達成されたら、体重が再び増加するのを防ぐのに十分で、かつ、所望の脂肪除外重の増加（または脂肪除外体重の減少（ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）の予防）を維持するのに十分な用量を投与することができる。インスリンに対する個体の感受性を増加させるためには、投与に関する同様の考慮事項を考慮することができる。糖尿病の治療のために個体に投与するインスリン（または、潜在的には、アミリン、アミリンアンタゴニストもしくはアゴニスト、またはチアゾリジンジオン、または他の潜在的な糖尿病治療薬）の量を減少させるのに十分な、体重減少を伴わない脂肪除外体重の増加を達成することが可能である。全身的（ｏｖｅｒａｌｌ）強度を増加するためには、投与に関する同様の考慮事項を考慮することが可能である。全身的強度の増加を伴う脂肪除外体重の増加は、体重減少を引き起こすには不十分な用量で達成することが可能である。赤血球（および血中の酸素化）の増加、骨吸収または骨粗鬆症の軽減などの他の利点も、体重減少を伴うことなく達成することが可能である。例えば、参照により本明細書に組み入れるＰＣＴ公開ＷＯ ９７／１８８３３を参照されたい。
【００４７】
組合せ療法
本組成物および方法は、改変された食事および運動などの他の療法と共に用いることができる。他の医薬、例えば、糖尿病の治療に有用な薬（例えば、インスリンおよび恐らくはアミリン、そのアンタゴニストもしくはアゴニスト、チアゾリジンジオン（例えば、参照により本明細書に組み入れるＰＣＴ公開ＷＯ ９８／０８５１２を参照されたい）、または他の潜在的糖尿病治療薬）、コレステロールおよび血圧降下薬（例えば、血中脂質レベルを減少させる薬物または他の心臓血管薬）、活動亢進薬（例えば、アンフェタミン）、利尿薬（液体の排泄のためのもの）、および食欲抑制剤（例えば、神経ペプチドγ受容体に作用する物質またはセロトニン再取込み抑制剤）を使用することができる。そのような投与は、同時にまたは連続的に行なうことができる。さらに、本方法は、身体の全体的な外観を変えるよう意図された整容手術（例えば、体重を減少させるよう意図された脂肪吸引またはレーザー手術、または体の外観上のかさを増加させるよう意図されたインプラント手術）などの外科的方法と共に用いることができる。動脈斑などの脂肪沈着による血管の遮断阻害により引き起こされる有害な状態を軽減するよう意図された心臓手術（バイパス手術その他の手術）から得られる健康上の利益は、本組成物および方法の併用により増強される可能性がある。また、超音波またはレーザー法などの胆石除去方法を、一連の本治療方法の前、間または後のいずれかで使用することができる。さらに、本方法は、骨折、筋肉損傷の手術または療法、または脂肪除外組織量の増加により改善される他の療法の補助手段として用いることができる。
【００４８】
以下の実施例は、本発明をより完全に例示するものであり、本発明の範囲を限定するものではない。実施例１には、ｐＨ７．０で１００ｍｇ／ｍｌの濃度の無定形（後記の結晶性のものと対比させるため）ヒトＯＢタンパク質懸濁液の製造を記載する。実施例２には、結晶性ＯＢタンパク質懸濁液の製造を記載する。実施例３では、ＯＢタンパク質溶液と比較した場合のＯＢタンパク質懸濁液に関する改善された用量反応を示す。実施例４では、イヌモデルにおける本懸濁液の遅延時間（ｄｅｌａｙｅｄ ｔｉｍｅ）作用プロフィールを示す。実施例５には、無定形Ｆｃ−ＯＢタンパク質懸濁液の製造を記載する。実施例６および７では、本懸濁液の改善された安定性を示す。
【実施例】
【００４９】
実施例１：無定形ＯＢタンパク質懸濁液の製造
本実施例は、本発明のヒトＯＢタンパク質懸濁液の１つの製造を例示する。亜鉛塩での沈殿により、無定形ヒトＯＢタンパク質懸濁液を製造した。最終ｐＨである６．０〜ｐＨ８．０において、１００ｍｇ（タンパク質）／ｍｌ（液体）の濃度が得られた。また、ヒトＯＢタンパク質溶液に関するｐＨ４．０の対照組成物を記載する。
【００５０】
組成物：
タンパク質部分：アミノ酸番号２２（Ｖａｌ）から開始し、アミノ酸番号１６７で終結し、Ｎ末端にメチオニル残基を有する、ＰＣＴ公開ＷＯ ９６／０５３０９の配列番号４に記載の組換えメチオニルヒトＯＢタンパク質（「ｒｍｅｔＨｕ−レプチン」）。
沈殿剤：塩化亜鉛
バッファー：トリス、ＭＥＳ、ピペス
最終ｐＨ：６．０〜８．０
製造プロトコール：組換えメチオニルヒトＯＢタンパク質（「ｒｍｅｔＨｕ−レプチン」）溶液を、注射用水中で約４０ｍｇ／ｍｌにまで濃縮し、ＨＣｌでｐＨ３．０にまで酸性化した。塩化亜鉛を加え、適当なバッファーを加えることによりｐＨを中性付近（約ｐＨ７．０）に調節することにより、懸濁液を得た。トリス、ＭＥＳおよびＰＩＰＥＳバッファーが成功裡に使用されている。該最終条件は、典型的には、１０〜１５ｍＭバッファー、２０〜１０００μＭ亜鉛、ｐＨ６．０〜８．０、および１０ｍｇ／ｍｌのｒｍｅｔＨｕ−レプチンであった。該粒子を４℃で数時間沈降させ、該上清を除去することにより、該懸濁液が濃縮されている。最高濃度が得られるまで、この手順を数回繰返すことが可能であり、約１００ｍｇ／ｍｌの懸濁液を得るためにそれを用いた。
【００５１】
対照組成物：１０ｍＭ酢酸塩および５％ ｗ／ｖソルビトールを含有する２０ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ４．０の組換えメチオニルヒトＯＢタンパク質（前記）溶液を、対照組成物として使用した。
【００５２】
実施例２：結晶性ＯＢタンパク質懸濁液の製造
本実施例は、本発明の結晶性ＯＢタンパク質懸濁液の製造を例示する。
【００５３】
タンパク質部分：前記実施例１と同じ組換えメチオニルヒトＯＢタンパク質を使用した。
【００５４】
方法：１ｍＭ ＨＣｌ中１５ｍｇ／ｍｌの濃度のｒｍｅｔＨｕ−レプチンを、４Ｍ ＮａＣｌ、１００ｍＭトリス（ｐＨ８．５）、２％ ｖ／ｖエタノールと１：１の比で４℃で混合した。ゆっくり数時間かけて温度を１４℃〜２５℃に調節し、その温度を、最終温度への加温の持続時間に応じて少なくとも２時間維持することにより、結晶が自然に生成した。遠心分離および再懸濁（適当な結晶安定化溶媒中）により該結晶を収穫することにより、該「母液」（すなわち、該結晶が成長する場となった液体）を、より適当な注射用溶媒で置換した。適当な置換溶媒は、２０〜２５％ポリエチレングリコール［約４０００ダルトン〜約２０，０００ダルトンの分子量を有するもの（この「約」なる語は、市販のＰＥＧ調製物に関する分子量のおよその平均を意味する）］、適当な中性ｐＨバッファー、好ましくはｐＨ約６．０〜ｐＨ約８．０のもの、および、好ましくは、ｐＨ６．０〜ｐＨ７．５の１０ｍＭリン酸塩バッファー、および２％エタノールｖ／ｖである。典型的な調製物においては、ある程度の残留塩（通常、０．２５Ｍ未満）が残存しうる。
【００５５】
実施例３：ＯＢタンパク質溶液と比較した場合のＯＢタンパク質懸濁液に関する改善された用量反応
本実施例では、本ＯＢタンパク質懸濁液が、ＯＢタンパク質溶液より有効であることを示す。正常な痩せたマウスに、１、１０および５０ｍｇ（タンパク質）／ｋｇ体重の本懸濁液または同じ用量のＯＢタンパク質溶液を、５日間、毎日注射した。該懸濁液を与えたマウスは、与えたＯＢタンパク質の質量単位当たり、等しい用量の該溶液製剤を与えたマウスより、大きな体重減少を示した。これを図１Ａおよび図１Ｂに示す。図１Ａは、実施例１の懸濁液を与えた場合の体重変化率（％）を示す。図１Ｂは、実施例１の対照溶液を与えた場合の体重変化率（％）を示す。
【００５６】
これは、同じ用量の本懸濁液が、溶液形態で与えられた場合より有効であることを示している。理論に束縛されることを望むものではないが、これは、該懸濁液が該溶液より遅い吸収速度を有することによる可能性がある。該懸濁液は、血中に進入する前に溶解される必要があり、したがってこの徐放効果は、より高い効力をもたらす。質量の点では、該タンパク質の必要投与量は、懸濁液においては溶液の場合より少なくてすむ。さらに、溶液においては、５日（投与の最終日）の時点で、１０ｍｇ／ｋｇの用量と５０ｍｇ／ｋｇの用量との間で差がない（以下の表２を参照されたい）。該懸濁液は、該溶液製剤より決定的な用量反応曲線を与える。
【００５７】
【表２】
【００５８】
方法：
動物：正常なＣＤ−１マウスを使用した。
基礎体重：約２０グラム。
投与：動物の同一部位に、５日間毎日、皮下注射した。
取扱い：動物は集団で収容し、それらの動物には任意量の食餌を与えた。
【００５９】
組成物：
溶液：実施例１のｒｍｅｔＨｕ−レプチン溶液を２０ｍｇ／ｍｌの濃度で使用した。
懸濁液：実施例１のｒｍｅｔＨｕ−レプチン懸濁液をｐＨ７．０、１０ｍＭ ＭＥＳバッファー、５００ｍＭ Ｚｎ、２０ｍｇ／ｍｌで使用した。
ＰＢＳ：リン酸緩衝食塩水をプラシーボとして使用した。（タンパク質の不存在下で懸濁液の液体または溶液の液体のみを使用する対照に関する用量反応は、ＰＢＳの場合に類似していた。データは示していない）。
【００６０】
実施例４：イヌにおけるＯＢタンパク質血清レベル
本実施例は、本懸濁液の遅延時間作用プロフィールを示す。
方法：ｒｍｅｔＨｕ−レプチンの懸濁液または溶液をビーグル犬に投与した。血清を採取し、ＯＢタンパク質レベルを、図２に示されている時点で測定した。
【００６１】
【表３】
【００６２】
使用した組成物：
溶液：実施例１に記載の溶液を５ｍｇ／ｋｇ／日の用量で使用した。
懸濁液：実施例２に記載の懸濁液を使用した。表を参照されたい。
【００６３】
動物：表３に示すデータは、３匹の動物の平均である。動物は正常なビーグル犬であった。
取扱い：動物は１匹ずつ収容し、それらの動物には任意量の食餌を与えた。優良動物取扱い規範（ｇｏｏｄ ａｎｉｍａｌ ｈａｎｄｌｉｎｇ ｐｒａｃｔｉｃｅｓ）を遵守した。
【００６４】
アッセイ：Ｈｏｔｔａら， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ ２７１：２５５３２７−２５３３１ （１９９６）に記載されているとおりに、抗体アッセイを用いた。
結果：図２から認められるとおり、該溶液の濃度は、タンパク質の投与後１〜２時間で最大になり、一方、該懸濁液の濃度は、それよりはるかに後の１０〜１２時間後に最大になる。このことは、該懸濁液が、より長時間、最小有効量を維持することを示している。
【００６５】
実施例５：無定形Ｆｃ−ＯＢタンパク質懸濁液の製造
本実施例は、本発明のヒトＦｃ−ＯＢタンパク質懸濁液の１つの製造を例示する。亜鉛塩での沈殿により、無定形ヒトＦｃ−ＯＢタンパク質懸濁液を製造した。また、ヒトＦｃ−ＯＢタンパク質溶液に関するｐＨ７．５の対照組成物を記載する。
【００６６】
組成物：
タンパク質部分：配列番号４に記載の組換えメチオニルヒトＦｃ−ＯＢタンパク質（「ｒｍｅｔＨｕ−Ｆｃ−レプチン」）（これは、３７３アミノ酸の融合タンパク質であり、該タンパク質のＦｃ部分はアミノ酸１〜２２７であり、該タンパク質のヒトＯＢタンパク質部分はアミノ酸２２８〜３７３であり、そのＮ末端にメチオニル残基を有する）。
沈殿剤：塩化亜鉛
バッファー：１００ｍＭトリス
最終ｐＨ：７．５
製造プロトコール：ｒｍｅｔＨｕ−Ｆｃ−レプチン溶液を、１００ｍＭトリスバッファー（ｐＨ７．５）中、約５ｍｇ／ｍｌまで濃縮した。塩化亜鉛を加えて、該懸濁液を得た。
【００６７】
対照組成物：１００ｍＭトリスを含有する５ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ７．５のｒｍｅｔＨｕ−Ｆｃ−レプチン溶液（前記）を、対照組成物として使用した。
【００６８】
実施例６：本ヒトＯＢタンパク質懸濁液の安定性
本実施例では、本懸濁液の無定形形態および結晶形態の両方が、促進（ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ）安定性アッセイ条件下で、溶液中の物質より安定であることを示す。
【００６９】
図３は、亜鉛無定形形態の本懸濁液（実施例１のとおり）を溶液形態（同様に実施例１のとおり）と３７℃で７週間比較した場合のＲＰ−ＨＰＬＣのトレースを示す。図から認められるとおり、本懸濁液（中央の線）は、該溶液形態（上側の線）より少数のピーク（より少数の分解産物を示す）を有する。比較として、下側の線は、−８０℃で７週間保存されていた亜鉛無定形形態を示す。
【００７０】
図４は、実施例２の結晶懸濁液形態を溶液形態（実施例１のもの）と比較した場合のＲＰ−ＨＰＬＣのトレースを示す。該物質は、１９℃で５６日間保存した。（３７℃での保存は適当な条件ではない。なぜなら、該結晶形態はその結晶構造を３７℃で失うからである）。図４は、該溶液形態（主ピーク＝８６％）では、該懸濁液形態（主ピーク＝９４％）の場合より多数のピーク（より多数の分解を示す）が存在することを示している。下側の線の対照は、−８０℃で５６日間保存した結晶形態であった。４℃では、分解がより遅く生じたものの、同様の結果が認められた。
【００７１】
該主分解産物は、アミノ酸１０８位（「Ｖａｌ」残基を１位として使用するＰＣＴ ＷＯ ９６／０５３０９の配列番号４に従う場合）のアスパルタートであるらしかった。該分子の安定性を増加させるために、この位置における、より安定な化学的部分（例えば、別のアミノ酸）を、実験的に選択することが可能である。全体的に見て、本発明の懸濁液は、ＯＢタンパク質溶液より安定である。
【００７２】
実施例７：本ヒトＦｃ−ＯＢタンパク質懸濁液の安定性
本実施例では、本Ｆｃ−ＯＢタンパク質懸濁液の無定形形態が、促進安定性アッセイ条件下で、溶液中の物質より安定であることを示す。
【００７３】
本懸濁液の亜鉛無定形形態（実施例５のとおり）および溶液形態（同様に実施例５のとおり）を、該懸濁液および溶液の両形態を４℃、２９℃および３７℃で２週間保存することにより、安定性試験に付した。図７に示すとおり、２９℃および３７℃で保存したＦｃ−レプチン懸濁液は、それぞれ同じ温度で保存したＦｃ−レプチン溶液より低い割合の分解産物（該ＯＢタンパク質のアミノ酸１０８位のアスパルタートに関連しているもの）を示している。
【００７４】
以上、本発明を好ましい実施形態に関して説明してきたが、変更および修飾が当業者に見出されると理解される。したがって、添付の請求の範囲は、特許請求されている本発明の範囲内に含まれる同等なすべての変更を含むと意図される。
【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１Ａ】実施例１の本発明ヒトＯＢ懸濁液に関する、マウスにおける用量反応曲線である。
【図１Ｂ】実施例１に記載の対照ヒトＯＢタンパク質溶液に関する、マウスにおける用量反応曲線である。
【図２】本発明ＯＢタンパク質懸濁液および対照ヒトＯＢタンパク質溶液（実施例１に記載のとおり）に関する、イヌにおけるＯＢの血清レベルを示すグラフである。
【図３】３７℃で７週間のヒトＯＢタンパク質製剤の逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）のトレースである。実施例１のヒトＯＢタンパク質亜鉛懸濁液は中央のトレース、実施例１のヒトＯＢタンパク質溶液対照は上側の線、−８０℃で５６日間維持したヒトＯＢタンパク質懸濁液は下側の線である。
【図４】１９℃で５６日間のヒトＯＢタンパク質製剤のＲＰ−ＨＰＬＣのトレースである。実施例１のヒトＯＢ溶液は上側の線、実施例２のヒトＯＢ結晶懸濁液は中央の線、−８０℃で５６日間の実施例２のヒトＯＢ結晶懸濁液は下側の線である。
【図５Ａ】ヒトｍｅｔＦｃ−ＯＢタンパク質のＤＮＡ配列（配列番号１）およびアミノ酸配列（配列番号２）である。
【図５Ｂ】ヒトｍｅｔＦｃ−ＯＢタンパク質のＤＮＡ配列（配列番号１）およびアミノ酸配列（配列番号２）である。
【図５Ｃ】ヒトｍｅｔＦｃ−ＯＢタンパク質のＤＮＡ配列（配列番号１）およびアミノ酸配列（配列番号２）である。
【図６Ａ】ヒトｍｅｔＦｃ−ＯＢタンパク質変異体のＤＮＡ配列（配列番号３）およびアミノ酸配列（配列番号４）である。
【図６Ｂ】ヒトｍｅｔＦｃ−ＯＢタンパク質変異体のＤＮＡ配列（配列番号３）およびアミノ酸配列（配列番号４）である。
【図６Ｃ】ヒトｍｅｔＦｃ−ＯＢタンパク質変異体のＤＮＡ配列（配列番号３）およびアミノ酸配列（配列番号４）である。
【図７】組換えメチオニルヒトＦｃ−ＯＢタンパク質に関する、逆相ＨＰＬＣで測定した場合のａｓｐ １０８（配列番号４の番号付けを使用するとａｓｐ ３３５）におけるイソａｓｐの生成速度を示すグラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
約６．０〜約８．０のｐＨおよび少なくとも０．５ｍｇ／ｍｌの濃度を有するヒトＯＢタンパク質懸濁液であって、該ＯＢタンパク質が、免疫グロブリンのＦｃ領域を該ＯＢタンパク質部分のＮ末端に結合させることにより誘導体化されていることを特徴とするヒトＯＢタンパク質懸濁液。
【請求項２】
該ヒトＦｃ−ＯＢタンパク質のＦｃ部分が、
（ａ）配列番号２および４に記載のＦｃアミノ酸配列；
（ｂ）以下の位置（配列番号２の番号付けを使用している）の１以上において置換された異なるアミノ酸を有するか又は欠失している（ａ）項のアミノ酸配列：
（ｉ）アラニンまたはセリン残基で置換された１以上のシステイン残基；
（ｉｉ）フェニルアラニン残基で置換された１以上のチロシン残基；
（ｉｉｉ）アラニンで置換された５位のアミノ酸；
（ｉｖ）グルタミン酸で置換された２０位のアミノ酸；
（ｖ）アラニンで置換された１０３位のアミノ酸；
（ｖｉ）アラニンで置換された１０５位のアミノ酸；
（ｖｉｉ）アラニンで置換された１０７位のアミノ酸；
（ｖｉｉｉ）欠失している１、２、３、４または５位のアミノ酸；
（ｉｘ）Ｆｃ受容体結合部位を除去するために置換された又は欠失している１以上の残基；
（ｘ）補体（Ｃ１ｑ）結合部位を除去するために置換された又は欠失している１以上の残基；および
（ｘｉ）ｉ〜ｘ項の組合せ；および
（ｃ）Ｎ末端にメチオニル残基を有する（ａ）または（ｂ）項のアミノ酸配列；
よりなる群から選ばれる、請求項１に記載のヒトＯＢタンパク質懸濁液。
【請求項３】
該濃度が少なくとも５ｍｇ／ｍｌである、請求項１に記載のヒトＯＢタンパク質懸濁液。
【請求項４】
該濃度が５ｍｇ／ｍｌ〜５０ｍｇ／ｍｌである、請求項１に記載のヒトＯＢタンパク質懸濁液。
【請求項５】
該ｐＨがｐＨ７．０である、請求項１に記載のヒトＯＢタンパク質懸濁液。
【請求項６】
該ヒトＯＢタンパク質がｒｍｅｔＨｕ−Ｆｃ−レプチンである、請求項２に記載のヒトＯＢタンパク質懸濁液。
【請求項７】
医薬上許容される沈殿剤を含有する、請求項１に記載のヒトＯＢタンパク質懸濁液。
【請求項８】
塩および水溶性重合体から選ばれる沈殿剤を含有する、請求項１に記載のヒトＯＢタンパク質懸濁液。
【請求項９】
カルシウム、マグネシウム、亜鉛、ナトリウム、鉄、コバルト、マンガン、カリウムおよびニッケルから選ばれる沈殿剤を含有する、請求項１に記載のヒトＯＢタンパク質懸濁液。
【請求項１０】
請求項１に記載のヒトＯＢ懸濁液の有効量を投与することにより、
（ａ）体重の調節、
（ｂ）脂肪症の調節、
（ｃ）糖尿病、
（ｄ）血中脂質レベルの調節、
（ｅ）脂肪除外体重の増加、および
（ｆ）インスリン感受性の増加
から選ばれる状態に関して個体を治療する方法。
【請求項１１】
沈殿剤と溶液中のヒトＯＢタンパク質（該ＯＢタンパク質は、免疫グロブリンのＦｃ領域を該ＯＢタンパク質部分のＮ末端に結合させることにより誘導体化されている）とを適当な条件下で一緒にし、該ヒトＯＢタンパク質を沈殿させ、前記の沈殿したヒトＯＢタンパク質を集め、所望により該ヒトＯＢタンパク質を希釈剤中に再懸濁させることを含んでなる、ヒトＯＢタンパク質懸濁液の製造方法。
【請求項１２】
該ヒトＯＢタンパク質を、６．０〜８．０のｐＨを有する希釈剤中に再懸濁させる、請求項１１に記載の製造方法。
【請求項１３】
該ヒトＯＢタンパク質がｒｍｅｔＨｕ−Ｆｃ−レプチンである、請求項１１に記載の製造方法。
【請求項１】
約６．０〜約８．０のｐＨおよび少なくとも０．５ｍｇ／ｍｌの濃度を有するヒトＯＢタンパク質懸濁液であって、該ＯＢタンパク質が、免疫グロブリンのＦｃ領域を該ＯＢタンパク質部分のＮ末端に結合させることにより誘導体化されていることを特徴とするヒトＯＢタンパク質懸濁液。
【請求項２】
該ヒトＦｃ−ＯＢタンパク質のＦｃ部分が、
（ａ）配列番号２および４に記載のＦｃアミノ酸配列；
（ｂ）以下の位置（配列番号２の番号付けを使用している）の１以上において置換された異なるアミノ酸を有するか又は欠失している（ａ）項のアミノ酸配列：
（ｉ）アラニンまたはセリン残基で置換された１以上のシステイン残基；
（ｉｉ）フェニルアラニン残基で置換された１以上のチロシン残基；
（ｉｉｉ）アラニンで置換された５位のアミノ酸；
（ｉｖ）グルタミン酸で置換された２０位のアミノ酸；
（ｖ）アラニンで置換された１０３位のアミノ酸；
（ｖｉ）アラニンで置換された１０５位のアミノ酸；
（ｖｉｉ）アラニンで置換された１０７位のアミノ酸；
（ｖｉｉｉ）欠失している１、２、３、４または５位のアミノ酸；
（ｉｘ）Ｆｃ受容体結合部位を除去するために置換された又は欠失している１以上の残基；
（ｘ）補体（Ｃ１ｑ）結合部位を除去するために置換された又は欠失している１以上の残基；および
（ｘｉ）ｉ〜ｘ項の組合せ；および
（ｃ）Ｎ末端にメチオニル残基を有する（ａ）または（ｂ）項のアミノ酸配列；
よりなる群から選ばれる、請求項１に記載のヒトＯＢタンパク質懸濁液。
【請求項３】
該濃度が少なくとも５ｍｇ／ｍｌである、請求項１に記載のヒトＯＢタンパク質懸濁液。
【請求項４】
該濃度が５ｍｇ／ｍｌ〜５０ｍｇ／ｍｌである、請求項１に記載のヒトＯＢタンパク質懸濁液。
【請求項５】
該ｐＨがｐＨ７．０である、請求項１に記載のヒトＯＢタンパク質懸濁液。
【請求項６】
該ヒトＯＢタンパク質がｒｍｅｔＨｕ−Ｆｃ−レプチンである、請求項２に記載のヒトＯＢタンパク質懸濁液。
【請求項７】
医薬上許容される沈殿剤を含有する、請求項１に記載のヒトＯＢタンパク質懸濁液。
【請求項８】
塩および水溶性重合体から選ばれる沈殿剤を含有する、請求項１に記載のヒトＯＢタンパク質懸濁液。
【請求項９】
カルシウム、マグネシウム、亜鉛、ナトリウム、鉄、コバルト、マンガン、カリウムおよびニッケルから選ばれる沈殿剤を含有する、請求項１に記載のヒトＯＢタンパク質懸濁液。
【請求項１０】
請求項１に記載のヒトＯＢ懸濁液の有効量を投与することにより、
（ａ）体重の調節、
（ｂ）脂肪症の調節、
（ｃ）糖尿病、
（ｄ）血中脂質レベルの調節、
（ｅ）脂肪除外体重の増加、および
（ｆ）インスリン感受性の増加
から選ばれる状態に関して個体を治療する方法。
【請求項１１】
沈殿剤と溶液中のヒトＯＢタンパク質（該ＯＢタンパク質は、免疫グロブリンのＦｃ領域を該ＯＢタンパク質部分のＮ末端に結合させることにより誘導体化されている）とを適当な条件下で一緒にし、該ヒトＯＢタンパク質を沈殿させ、前記の沈殿したヒトＯＢタンパク質を集め、所望により該ヒトＯＢタンパク質を希釈剤中に再懸濁させることを含んでなる、ヒトＯＢタンパク質懸濁液の製造方法。
【請求項１２】
該ヒトＯＢタンパク質を、６．０〜８．０のｐＨを有する希釈剤中に再懸濁させる、請求項１１に記載の製造方法。
【請求項１３】
該ヒトＯＢタンパク質がｒｍｅｔＨｕ−Ｆｃ−レプチンである、請求項１１に記載の製造方法。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ】
【図７】
【図１Ｂ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ】
【図７】
【公開番号】特開２００８−１５０３６９（Ｐ２００８−１５０３６９Ａ）
【公開日】平成２０年７月３日（２００８．７．３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−３１７９５１（Ｐ２００７−３１７９５１）
【出願日】平成１９年１２月１０日（２００７．１２．１０）
【分割の表示】特願平１０−５４４３３８の分割
【原出願日】平成１０年４月１６日（１９９８．４．１６）
【出願人】（５０００４９７１６）アムジエン・インコーポレーテツド (242)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年７月３日（２００８．７．３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１２月１０日（２００７．１２．１０）
【分割の表示】特願平１０−５４４３３８の分割
【原出願日】平成１０年４月１６日（１９９８．４．１６）
【出願人】（５０００４９７１６）アムジエン・インコーポレーテツド (242)
【Ｆターム（参考）】
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