完全暗所下で緑化する光合成生物
【課題】完全暗所下で緑化する植物を提供する。
【解決手段】完全暗所下で緑化すること、具体的には緑色物質（例えばクロロフィルｃ様色素）を産生することを特徴とする、植物、緑藻類、藍藻類などの光合成生物、並びに、この光合成生物を完全暗所下で発芽、育成し、緑色物質を産生すること、さらには緑色物質を分離することを含む、緑色物質の製造方法。
【解決手段】完全暗所下で緑化すること、具体的には緑色物質（例えばクロロフィルｃ様色素）を産生することを特徴とする、植物、緑藻類、藍藻類などの光合成生物、並びに、この光合成生物を完全暗所下で発芽、育成し、緑色物質を産生すること、さらには緑色物質を分離することを含む、緑色物質の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、完全暗所下で緑化する光合成生物に関する。具体的には、本発明の光合成生物は、完全暗所下で緑化物質を産生することを特徴とする。
本発明はまた、完全暗所下で緑化する表現型を示す、光合成生物の突然変異体のスクリーニング方法に関する。
本発明はさらに、上記光合成生物からの暗所緑化物質の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
通常、植物は、緑化のために必ず光を必要とする。この緑化に関わる物質はクロロフィルである。クロロフィルは光エネルギーを補足し、これを化学エネルギーに変換する働きをもつため、植物での光合成にとって必須の触媒である（非特許文献１）。
【０００３】
特に、暗所下で被子植物を発芽させると、モヤシなどのように黄化芽生えを起こし、緑化の表現型は現れない。被子植物などの緑色植物は、明所下でクロロフィルａ及びｂのみを合成するが、暗所下ではクロロフィルの合成が起こらない。被子植物が暗所で黄化するのは、暗所でのクロロフィル合成に必要な光非依存型プロトクロロフィリドレダクターゼをもっていないためであるが、ひとたび光照射を受けると光依存型プロトクロロフィリドレダクターゼが活性化されることによってクロロフィルの蓄積が開始される（非特許文献１）。
【０００４】
緑化の過程では、暗所で小さなエチオプラストの状態に留まっていた色素体がエチオクロロプラストを経てクロロプラスト（葉緑体）に発達し、それに伴い、プロラメラボディの消失、プロチラコイドの形成、チラコイド膜の発達、光合成装置の形成、光合成活性の出現、色素体の蛋白質含量や体積の顕著な増大などが生じる（非特許文献２）。
【０００５】
植物と同様に光合成を行う生物には、真核生物である緑藻類、原核生物である藍藻類（シアノバクテリア）などがある。緑藻類はクロロフィルａ及びｂを生合成し、藍藻類はクロロフィルａを生合成する。
【０００６】
一方、褐藻類、珪藻類、ハプト藻、クリプト藻などの藻類のなかには、暗所下又は弱光下でクロロフィルａ及びｃを産生するものがある。特にクロロフィルｃは、緑色植物、緑藻類、藍藻類などで生合成されないクロロフィルである（非特許文献３）。
クロロフィルｃは、ポルフィリン環を基本骨格とし、プロピオン酸側鎖をもたず、１７位の炭素にアクリル酸側鎖が結合している。ポルフィリン骨格に結合する側鎖の違いによりいくつかの分子種（例えばｃ１，ｃ２，ｃ３）が存在し、ポルフィリン環を基本骨格としているため４４０〜４５０ｎｍ付近の吸収が大きく、赤色光付近の吸収は小さいという吸収特性を示す（非特許文献３）。
【０００７】
【非特許文献１】増田建及び高宮健一郎、化学と生物４２巻３号１８３〜１８８頁（２００４年）
【非特許文献２】光合成事典（２００３年初版）３７０頁「緑化」（日本光合成研究会編、学会出版センター）
【非特許文献３】光合成事典（２００３年初版）９４頁「クロロフィルｃ」（日本光合成研究会編、学会出版センター）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、完全暗所下で緑化する光合成生物、より具体的に完全暗所下で緑化物質を産生する光合成生物、を提供することである。
【０００９】
本発明の別の目的は、上記光合成生物に完全暗所下で緑化物質を産生させること、並びに、上記光合成生物から、産生した緑化物質を製造する方法を提供することである。
【００１０】
本発明のさらに別の目的は、完全暗所下で緑化する表現型を示す、光合成生物の突然変異体をスクリーニングする方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、要約すると、以下の特徴を有する。
【００１２】
本発明は、完全暗所下で緑化することを特徴とする光合成生物を提供する。
本発明の実施形態において、光合成生物が、植物、緑藻類又は藍藻類からなる群から選択される。
本発明の別の実施形態において、光合成生物は完全暗所下で緑化物質を産生することを特徴とする。
本発明の別の実施形態において、緑化物質がクロロフィルｃ様色素であることを特徴とする。
本発明はまた、完全暗所下でクロロフィルｃ様色素を産生することを特徴とする、植物、緑藻類又は藍藻類からなる群から選択される光合成生物を提供する。
本発明の実施形態において、クロロフィルｃ様色素がクロロフィルｃであることを特徴とする。
【００１３】
本発明の光合成生物はさらに、次のような性質を有することができる。
（１）完全暗所下で発芽したのち光にさらすと枯死する；あるいは、
（２）最初から光照射下で発芽、育成すると生育し、種子を形成する；あるいは、
（３）最初から光照射下で発芽・生長したのち完全暗所下に置くと成長点から枯れる。
【００１４】
本発明の別の実施形態により、光合成生物がアブラナ科に属する植物であることを特徴とする。
本発明の別の実施態様により、アブラナ科に属する植物がシロイヌナズナであり、シロイヌナズナが例えばシロイヌナズナＧＲＤ−５１系統（ＦＥＲＭ Ｐ−２０９３５）であることを特徴とする。
【００１５】
本発明はまた、完全暗所下で緑化しクロロフィルｃ様色素を産生することを特徴とする、シロイヌナズナＧＲＤ−５１系統（ＦＥＲＭ Ｐ−２０９３５）を提供する。
【００１６】
本発明はさらに、上に定義した光合成生物又はシロイヌナズナＧＲＤ−５１系統（ＦＥＲＭ Ｐ−２０９３５）を完全暗所下で発芽、育成して緑化物質を作ることを含む、緑化物質の製造方法を提供する。
【００１７】
本発明の実施形態において、上記の方法は、光合成生物又はＧＲＤ−５１系統（好ましくは、その葉部）から緑化物質を分離することをさらに含むことを特徴とする。
本発明の別の実施形態において、緑化物質がクロロフィルｃ様色素であることを特徴とする。
本発明の別の実施形態において、クロロフィルｃ様色素がクロロフィルｃであることを特徴とする。
本発明の別の実施形態において、上記の分離工程が溶媒抽出工程を含むことを特徴とする。
本発明の別の実施形態において、上記の分離工程が液体クロマトグラフィー工程をさらに含むことを特徴とする。
【００１８】
本発明はさらに、変異原処理した植物種子、緑藻類又は藍藻類のなかから、ブラシノステロイド生合成阻害剤を含む培地にて、完全暗所下で緑化する表現型を示す突然変異体をスクリーニングする方法を提供する。
【発明の効果】
【００１９】
本発明の光合成生物（例えば植物、緑藻類又は藍藻類）は、完全暗所下で発芽、育成し、クロロフィル色素を生合成し緑化するという、これまでの常識を覆す特性を有している。完全暗所下での緑化が可能であることから、例えばビルの地下などの暗所にて栽培又は増殖して緑化した光合成生物を得ることが可能になる。さらに、本発明の光合成生物は、完全暗所にて本来生合成されることのない緑化物質であるクロロフィル色素、特にクロロフィルｃ様色素を産生するため、渇藻類とは異なり陸上で光合成生物を栽培又は増殖し、該生物から緑色色素を簡便に生産することができるなどの利点がある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本発明の光合成生物は、完全暗所下で緑化する、すなわち緑化物質を産生することを特徴とする。
【００２１】
本明細書中で使用する「緑化」とは、光合成生物において、完全暗所にて緑色物質が生合成されることを意味する。
【００２２】
本明細書中で使用する「緑化物質」とは、クロロフィル色素、より具体的にはクロロフィルｃ様色素をいう。
【００２３】
本明細書中で使用する「完全暗所」とは、好ましくは光の非照射状態又は場所をいうが、場合により、緑色の波長５００〜５５０ｎｍ辺りの光は存在することができる。
【００２４】
本明細書中で使用する「光合成生物」とは、光合成を行うことができる真核又は原核生物であり、明所又は光の照射下でクロロフィルａ及び／又はｂを生合成するがクロロフィルｃを生合成しない生物である。
【００２５】
本発明の実施形態によれば、光合成生物は、植物、緑藻類又は藍藻類からなる群から選択される。
また、本発明の実施形態によれば、本発明の光合成生物は、完全暗所下でクロロフィルｃ様色素を産生することを特徴とする。
【００２６】
従来公知の植物、緑藻類又は藍藻類は、一般に暗所では緑色物質であるクロロフィル色素を合成できないが、光の照射下でクロロフィルを合成することができる。このとき合成されるクロロフィルは、クロロフィルａ又はｂである。これに対して、本発明の光合成生物は、光のない完全暗所下で緑色物質を生合成することを可能にするため、驚くべき特性を有する。本発明の光合成生物が暗所下で合成する緑色物質はクロロフィルｃ様色素であり、クロロフィルａ及びｂではない。
【００２７】
本発明において、クロロフィルｃ様色素は、クロロフィルｃと同様のポルフィリン環を基本骨格とし、ＵＶスペクトル上４３５〜４４５ｎｍに吸収極大を有しており、例えばワカメ（褐藻類）のクロロフィルｃのＵＶスペクトルと実質的に同一の微細構造を有している。このことから、本発明におけるクロロフィルｃ様色素はクロロフィルｃを包含する。クロロフィルｃにおいては、ポルフィリン骨格に結合する側鎖の違いによりいくつかの分子種（例えばｃ１，ｃ２，ｃ３）が存在するが、本発明では、クロロフィルｃ様色素又はクロロフィルｃは、上記の特徴を有する分子であればよく、その単一分子種でもよいし又はそれらの混合物であってもよい。
【００２８】
本発明の暗所下で緑色物質（クロロフィルｃ様色素）を産生する光合成生物は、以下の手順によって作製することができる。
【００２９】
（１）光合成生物を準備する。植物の場合、その種子を１０００粒以上、好ましくは５０００粒以上、より好ましくは１万粒以上、例えば約５万粒〜約１０万粒準備する。緑藻類及び藍藻類の場合、培養藻類を準備する。緑藻類の培養は、例えば、クラミドモナス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）でＴｒｉｓ−ａｃｅｔａｔｅ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ＴＡＰ）培地（Ｇｏｒｍａｎ ａｎｄ Ｌｅｖｉｎｅ，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ， ５４：１６６５−１６６９，１９６５）、２３時間明期及び１時間暗期、２５℃の培養条件で、また、藍藻類の培養は、例えばＳｙｎｅｃｈｏｓｙｓｔｉｓ ｓｐ． ＰＣＣ６８０３株で、ＢＧ−１１培地（Ｓｔａｎｉｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ Ｒｅｖ． ３５：１７１−２０５，１９７１）、３４℃、ＣＯ２（１％，ｖ／ｖ）、７０μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎ ｍ−２ｓ−１の培養条件で行うことができる。
【００３０】
（２）植物種子又は培養藻類を、培地の存在下又は非存在下で化学変異原又は物理的変異原で処理する。
化学変異原としては、例えばエチルメタンスルホン酸（ＥＭＳ）、１−メチル−１−ニトロソ尿素（ＭＮＵ）などを使用することができる。この変異原による処理は、例えば０．３〜１．５％のＥＭＳ、２５℃、６〜２０時間（撹拌しながら）浸し、滅菌水で３回ほど洗浄した後、土や培地へ播種などの手順によって行うことができる。
【００３１】
物理的変異原としては、放射線、例えばγ線、中性子線、重イオンビームなどを使用することができる。この変異原による処理は、例えばγ線だと３０〜５０ｋｒａｄ、中性子線だと４０〜６０Ｇｙ、重イオンビーム（炭素）５〜１５０Ｇｙの種子への照射を行い、Ｍ２での表現型を調べる、などの手順によって行うことができる。
【００３２】
（３）暗所下で緑色物質（クロロフィルｃ様色素）を産生する突然変異体の選抜を行う。
植物種子の場合、初めに、種子を殺菌剤で処理する。殺菌剤は、種子の殺菌用のいずれの薬剤も使用可能である。殺菌剤の例は、０．００５〜０．０５％（容量）の界面活性剤を含有する７０〜１００％（容量）エタノール水溶液である。界面活性剤は、イオン性及び非イオン性界面活性剤のいずれでもよく、特に限定されないが、例えばＴｒｉｔｏｎ Ｘなどの界面活性剤、中性洗剤（家庭用の市販のもの）などが含まれる。
【００３３】
殺菌した種子を風乾したのち、約３μＭのブラシノステロイド生合成阻害剤（Ａｓａｍｉ， Ｔ． ｅｔ ａｌ．， Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ． ４：３４８−３５３ （１９９９）；Ａｓａｍｉ， Ｔ． ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． １２３：９３−９９，２０００）；中野雄司及び浅見忠男、植物ホルモンのシグナル伝達（秀潤社）第６章、２：ブラシノステロイドのシグナル伝達、１７６−１８６頁、２００４年）を含有する１／２Ｍ培地（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ ＆ Ｓｋｏｏｇ ｍｅｄｉｕｍ；和光純薬カタログ３９２−００５９１を半分に希釈する）を含むシャーレに播く。ブラシノステロイド生合成阻害剤は、暗所で植物の茎が伸びないでかつ葉が開くようにする作用をもつため、この阻害剤の使用は、葉の緑化を判定するうえで重要である。ブラシノステロイド生合成阻害剤の例は、Ｂｒｚ−２２０、Ｂｒｚ−２００１、Ｂｒｚ−９１（Ａｓａｍｉ， Ｔ． ｅｔ ａｌ．， Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ． ４：３４８−３５３ （１９９９）；Ａｓａｍｉ， Ｔ． ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． １２３：９３−９９，２０００）などである。
【００３４】
前処理として約３時間の光照射処理を施し、アルミホイルで培地容器（シャーレ）全体を被覆し、４℃にて２〜４日間放置した。続いて、暗所にて２２℃、約６日間以上静置したのち、拡大鏡下で目視観察により緑化を基準にして暗所下で緑化物質（例えば、クロロフィルｃ様色素）を産生する突然変異体のスクリーニングを行う。
【００３５】
緑藻類及び藍藻類の場合、例えば次のように暗所下で緑化物質（例えば、クロロフィルｃ様色素）を産生する突然変異体をスクリーニングすることができる。
【００３６】
ＥＭＳ（０．３％以下）あるいは重イオンビーム照射（炭素：５〜１５０Ｇｙ）で変異誘発した緑藻類、藍藻類を暗所下で培養する。変異体は明所では緑色に、青色光下（波長４４０〜４５０nm程度）で観察すると蛍光を発光するものとして観察される。
【００３７】
（４）選抜された突然変異体系統を光照射下で発芽、育成して、或いは培養して種子又は培養藻類を採取する。特に植物の場合、ホモ系統を単離し、野生株との戻し交雑を行い、純化する。このようにして、暗所下で緑色物質（例えば、クロロフィルｃ様色素）を産生する突然変異体系統を得る。
【００３８】
本発明によれば、上記の手順を実施するための生物対象は、すべての被子植物及び裸子植物である。被子植物は双子葉植物及び単子葉植物のいずれも含む。双子葉植物の例は、以下のものに限定されないが、アブラナ科、例えばシロイヌナズナ、ダイコン、ナタネ、ブロッコリーなど、ナス科、例えばタバコ、トマトなど、マメ科、例えばダイズ、ミヤコグサなどである。また、単子葉植物の例は、イネ科、例えばイネ、小麦、大麦、トウモロコシ、サトウキビなどである。また、裸子植物の例は、限定されないが、マツ、スギなどである。
【００３９】
さらに本発明によれば、上記の手順を実施するための別の生物対象は、緑藻類及び藍藻類である。緑藻類の例は、以下のものに限定されないが、アオミドロ、ヒラアオノリ、クラミドモナス、クロレラなどである。また、藍藻類の例は、以下のものに限定されないが、Ｇｌｏｅｏｂａｃｔｅｒ ｖｉｏｌａｃｅｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｅｌｏｎｇａｔｅｓ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．などである。
【００４０】
後述の実施例では、植物としてアブラナ科植物、例えばその代表的植物であるシロイヌナズナを選択し、上記の手順を実施し、完全暗所下で発芽させたときに緑色を呈する緑化突然変異体を得た。具体的には、化学変異原ＥＭＳ処理を施した約４万粒のＭ２種子群、或いは、速中性子線を照射したシロイヌナズナ（Ｃｏｌｕｍｂｉａ系統）約８万粒のＭ２種子群から、ブラシノイド生合成阻害剤を用いたスクリーニングによって、暗所緑化の表現型を示す突然変異体を見出した。さらに、それぞれ系統化し、１３００系統に絞り込んだのち、後代を各々チェックし、ヘテロとして分離する１系統を単離した。この系統は、白（野生型）：緑（変異体）＝３：１で安定して分離した。
【００４１】
単離されたこの変異体は、発芽後暗所を経験しないと枯れないことが判明したため、純系の暗所緑化変異体系統を作出し、さらに、自家交雑で代を重ねると枯死率の高い系統が出現するため分離比に注意しながら７回の野生株との戻し交雑を行い、これによって、シロイヌナズナの暗所緑化突然変異体ＧＲＤ−５１系統を得た。ＧＲＤ−５１系統の種子は、独立行政法人産業技術総合研究所、特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に平成１８年６月１６日付けで寄託し、受領番号ＦＥＲＭ ＡＰ−２０９３５（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２０９３５）を受領した。
【００４２】
本発明の暗所下で緑色物質を産生し緑化する光合成生物は、次のような性質によって特徴付けられる。
最も主要な特徴は、緑化物質としてクロロフィルｃ様色素を産生することである。
この色素は、ワカメ（褐藻類）のクロロフィルｃのＵＶスペクトルと実質的に同一の微細構造を有することから、おそらくクロロフィルｃであると考えられる。
【００４３】
クロロフィルｃ様色素などの緑色物質の分離は、次のようにして行うことができる。
植物の場合、葉部を切り取り、粉砕し溶媒抽出する。例えば、液体窒素で固体化し、吸湿のためにシリカゲルを適量入れた乳鉢等の容器内で葉部を粉砕する。次に、メタノール、アセトンなどの極性有機溶媒にて抽出を行い、必要に応じて濃縮し溶媒を除去する。
【００４４】
抽出物は、次いで、ＨＰＬＣなどの液体クロマトグラフィーによって処理して、クロロフィルｃ様色素などの緑色物質を単離する。クロマトグラフィーの好ましい担体は、シリカゲルである。好ましいクロマトグラフィーは、ＨＰＬＣであり、例えばカラム：ＰＥＧＡＳＩＬ ＯＤＳ−ＩＩ（センシュー科学製）、溶離液：（Ａ）ＭｅＯＨ：ＣＨ３ＣＮ：１Ｍ ＭｅＣＯＯＮＨ４＝５：３：２，（Ｂ）ＣＨ３ＣＮ：ＥｔＯＡｃ＝１：１のグラジエントＡ：Ｂ＝１００：０からＡ：Ｂ＝０：１００（２０分間）、温度：室温、検出：励起波長（Ｅｘ）４２０ｎｍ、発光波長（Ｅｍ）６５０ｎｍ、流速：０．２ｍｌ／分の条件で分取可能である。
【００４５】
クロロフィルｃ様色素などの緑色物質の分析は、上記と同様の条件下でのＨＰＬＣによる分析、ＵＶスペクトル分析、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）分析、ＦＴ−ＭＳ（質量分析）、ＮＭＲ（１Ｈ又は１３Ｃ核磁気共鳴スペクトル分析）、ＩＲ（赤外線吸収スペクトル分析）などによって行うことができる。
【００４６】
ＨＰＬＣによる分析は、上記の条件で、野生型シロイヌナズナ（暗所発芽）の葉部、本発明のシロイヌナズナＧＲＤ−５１系統（暗所発芽）の葉部、及びワカメからのメタノール抽出物について行い、それぞれ図１、図２、図３に示した。保持時間約１０．４分のピークは、野生型に存在しないが、ＧＲＤ−５１系統とワカメに存在し、これはクロロフィルｃを示す。因みに、図３の保持時間約２４．２分のピークは、ワカメのクロロフィルａを示すが、このピークは、野生型及びＧＲＤ−５１系統のいずれにも観察されない。
【００４７】
ＵＶスペクトル分析は、フォトダイオードアレイ（２００ｎｍから７２９ｎｍへ）の条件下で行うことができる。本発明のＧＲＤ−５１系統（暗所発芽）から単離したクロロフィルｃ様色素及びワカメから単離したクロロフィルｃのＵＶスペクトルをそれぞれ図４及び図５に示した。ＧＲＤ−５１系統から単離したクロロフィルｃ様色素は、４３７ｎｍに非常に強い吸収、６３２ｎｍに弱い吸収からなるスペクトルを示した。一方、ワカメから単離したクロロフィルｃは、４４３ｎｍに非常に強い吸収、６３２ｎｍに弱い吸収からなるスペクトルを示した。これらのＵＶスペクトルの微細構造は実質的に同じである。
【００４８】
ＴＬＣ分析は、本発明のＧＲＤ−５１系統（暗所発芽）から単離したクロロフィルｃ様色素及びワカメから単離したクロロフィルｃについて、シリカゲルプレート：Ｓｉｌｉｃａ ｇｅｌ６０ Ｆ２５４（ＭＥＲＣＫ社）、溶離液：アセトン／ヘキサン（５０／５０、容量％）の条件で行い、クロロフィルスポット（緑色）を目視で検出し、結果を図６に示した。サンプルをミックスしたときのワカメクロロフィルｃと本発明クロロフィルｃ様色素の移動度は完全に一致した。
【００４９】
以上の分析結果から、本発明のＧＲＤ−５１系統（暗所発芽）から単離したクロロフィルｃ様色素は、ワカメのクロロフィルｃに非常に類似したものであると推定される。
【００５０】
本発明の光合成生物、特に植物は、さらに次のような特徴を有する。
（１）完全暗所下で発芽したのち光にさらすと枯死する。
（２）最初から光照射下で発芽、育成すると、野生型と同様に生育し種子を形成する。この場合には、クロロフィルａ及びｂが合成され、クロロフィルｃ様色素は合成されない。
（３） 最初から光照射下で発芽し、生長したのち完全暗所下に置くと成長点から枯れるが、根は生き延びる。芽が出るところまで成長したあとは、芽からの新たな生長が可能になる。
【００５１】
以下の実施例によって本発明をさらに説明するが、本発明の範囲は、この実施例によって制限されないものとする。
【実施例】
【００５２】
完全暗所下でクロロフィルｃ様色素を産生するシロイヌナズナ突然変異体
化学変異原ＥＭＳ処理（濃度：０．３％、処理時間：１６時間）を施したシロイヌナズナ約４万粒のＭ２種子群、或いは、速中性子線を照射（５５Ｇｙ）したシロイヌナズナ（Ｃｏｌｕｍｂｉａ系統）約８万粒のＭ２種子群から、ブラシノステロイド生合成阻害剤（名称：Ｂｒｚ２２０，Ｂｒｚ２００１又はＢｒｚ９１（Ａｓａｍｉ， Ｔ． ｅｔ ａｌ．， Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ． ４：３４８−３５３ （１９９９）；Ａｓａｍｉ， Ｔ． ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． １２３：９３−９９，２０００）、濃度：３μＭ）を含む１／２ＭＳ培地上でのスクリーニングによって、暗所緑化の表現型を示す突然変異体を見出した。劣性の形質であることを想定し、約８万粒の種子を大凡１０００粒程度のカテゴリーに分け、そのうちの１つで再度暗所緑化形質を示す個体群を見出した。さらに、そのカテゴリーの種子から植物体を育成後、それぞれから採種・系統化し、後代をチェックした。その中から、ヘテロとして分離する１系統を単離した。この系統は、白（野生型）：緑（変異体）＝３：１で安定して分離した。
【００５３】
単離されたこの変異体は、発芽後暗所を経験しないと枯れないことが判明したため、純系の暗所緑化変異体系統を作出し、さらに、７回の野生株との戻し交雑を行い、これによって、完全暗所下でクロロフィルｃ様色素を産生するシロイヌナズナ突然変異体ＧＲＤ−５１系統を得た。
【００５４】
ＧＲＤ−５１系統の種子は、独立行政法人産業技術総合研究所、特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に平成１８年６月１６日付けで寄託し、受領番号ＦＥＲＭ ＡＰ−２０９３５（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２０９３５）を受領した。
【００５５】
完全暗所下で発芽、育成したＧＲＤ−５１系統からのクロロフィルｃ様色素の分離は、葉部をメタノール抽出し、上記の分取条件でＨＰＬＣに掛けることによって行い、ＨＰＬＣ分析とＴＬＣ分析により、ワカメのクロロフィルｃと同一又は非常に類似していることが分かった（図４〜図６）。
【産業上の利用可能性】
【００５６】
本発明で得ることができるクロロフィルｃ様色素は、緑色色素として、或いは光増感色素として利用可能であるし、また、ダイオキシンなどの有毒物質の体外排出のために利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】野生型シロイヌナズナ（暗所発芽）の葉部のメタノール抽出物のＨＰＬＣ分析結果を示す。
【図２】本発明のシロイヌナズナＧＲＤ−５１系統（暗所発芽）の葉部のメタノール抽出物のＨＰＬＣ分析結果を示す。矢印は、クロロフィルｃ様色素を示すピーク（図４も参照）である。
【図３】ワカメのメタノール抽出物のＨＰＬＣ分析結果を示す。矢印は、ワカメのクロロフィルｃを示すピーク（図５も参照）である。
【図４】本発明のＧＲＤ−５１系統（暗所発芽）から（ＨＰＬＣ分取により）単離したクロロフィルｃ様色素（図２のピーク）の吸光スペクトルを示す。
【図５】ワカメから（ＨＰＬＣ分取により）単離したクロロフィルｃ（図３のピーク）の吸光スペクトルを示す。
【図６】本発明のＧＲＤ−５１系統（暗所発芽）から（ＨＰＬＣ分取により）単離したクロロフィルｃ様色素及びワカメから（ＨＰＬＣ分取により）単離したクロロフィルｃのＴＬＣの結果を示す。レーン１は、ＧＲＤ−５１系統（暗所発芽）の葉からセトン抽出した緑色物質サンプル、レーン２は、１と３のサンプルを混ぜてスポッティングしたサンプル、レーン３は、ワカメの葉からセトン抽出した緑色物質サンプルである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、完全暗所下で緑化する光合成生物に関する。具体的には、本発明の光合成生物は、完全暗所下で緑化物質を産生することを特徴とする。
本発明はまた、完全暗所下で緑化する表現型を示す、光合成生物の突然変異体のスクリーニング方法に関する。
本発明はさらに、上記光合成生物からの暗所緑化物質の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
通常、植物は、緑化のために必ず光を必要とする。この緑化に関わる物質はクロロフィルである。クロロフィルは光エネルギーを補足し、これを化学エネルギーに変換する働きをもつため、植物での光合成にとって必須の触媒である（非特許文献１）。
【０００３】
特に、暗所下で被子植物を発芽させると、モヤシなどのように黄化芽生えを起こし、緑化の表現型は現れない。被子植物などの緑色植物は、明所下でクロロフィルａ及びｂのみを合成するが、暗所下ではクロロフィルの合成が起こらない。被子植物が暗所で黄化するのは、暗所でのクロロフィル合成に必要な光非依存型プロトクロロフィリドレダクターゼをもっていないためであるが、ひとたび光照射を受けると光依存型プロトクロロフィリドレダクターゼが活性化されることによってクロロフィルの蓄積が開始される（非特許文献１）。
【０００４】
緑化の過程では、暗所で小さなエチオプラストの状態に留まっていた色素体がエチオクロロプラストを経てクロロプラスト（葉緑体）に発達し、それに伴い、プロラメラボディの消失、プロチラコイドの形成、チラコイド膜の発達、光合成装置の形成、光合成活性の出現、色素体の蛋白質含量や体積の顕著な増大などが生じる（非特許文献２）。
【０００５】
植物と同様に光合成を行う生物には、真核生物である緑藻類、原核生物である藍藻類（シアノバクテリア）などがある。緑藻類はクロロフィルａ及びｂを生合成し、藍藻類はクロロフィルａを生合成する。
【０００６】
一方、褐藻類、珪藻類、ハプト藻、クリプト藻などの藻類のなかには、暗所下又は弱光下でクロロフィルａ及びｃを産生するものがある。特にクロロフィルｃは、緑色植物、緑藻類、藍藻類などで生合成されないクロロフィルである（非特許文献３）。
クロロフィルｃは、ポルフィリン環を基本骨格とし、プロピオン酸側鎖をもたず、１７位の炭素にアクリル酸側鎖が結合している。ポルフィリン骨格に結合する側鎖の違いによりいくつかの分子種（例えばｃ１，ｃ２，ｃ３）が存在し、ポルフィリン環を基本骨格としているため４４０〜４５０ｎｍ付近の吸収が大きく、赤色光付近の吸収は小さいという吸収特性を示す（非特許文献３）。
【０００７】
【非特許文献１】増田建及び高宮健一郎、化学と生物４２巻３号１８３〜１８８頁（２００４年）
【非特許文献２】光合成事典（２００３年初版）３７０頁「緑化」（日本光合成研究会編、学会出版センター）
【非特許文献３】光合成事典（２００３年初版）９４頁「クロロフィルｃ」（日本光合成研究会編、学会出版センター）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、完全暗所下で緑化する光合成生物、より具体的に完全暗所下で緑化物質を産生する光合成生物、を提供することである。
【０００９】
本発明の別の目的は、上記光合成生物に完全暗所下で緑化物質を産生させること、並びに、上記光合成生物から、産生した緑化物質を製造する方法を提供することである。
【００１０】
本発明のさらに別の目的は、完全暗所下で緑化する表現型を示す、光合成生物の突然変異体をスクリーニングする方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、要約すると、以下の特徴を有する。
【００１２】
本発明は、完全暗所下で緑化することを特徴とする光合成生物を提供する。
本発明の実施形態において、光合成生物が、植物、緑藻類又は藍藻類からなる群から選択される。
本発明の別の実施形態において、光合成生物は完全暗所下で緑化物質を産生することを特徴とする。
本発明の別の実施形態において、緑化物質がクロロフィルｃ様色素であることを特徴とする。
本発明はまた、完全暗所下でクロロフィルｃ様色素を産生することを特徴とする、植物、緑藻類又は藍藻類からなる群から選択される光合成生物を提供する。
本発明の実施形態において、クロロフィルｃ様色素がクロロフィルｃであることを特徴とする。
【００１３】
本発明の光合成生物はさらに、次のような性質を有することができる。
（１）完全暗所下で発芽したのち光にさらすと枯死する；あるいは、
（２）最初から光照射下で発芽、育成すると生育し、種子を形成する；あるいは、
（３）最初から光照射下で発芽・生長したのち完全暗所下に置くと成長点から枯れる。
【００１４】
本発明の別の実施形態により、光合成生物がアブラナ科に属する植物であることを特徴とする。
本発明の別の実施態様により、アブラナ科に属する植物がシロイヌナズナであり、シロイヌナズナが例えばシロイヌナズナＧＲＤ−５１系統（ＦＥＲＭ Ｐ−２０９３５）であることを特徴とする。
【００１５】
本発明はまた、完全暗所下で緑化しクロロフィルｃ様色素を産生することを特徴とする、シロイヌナズナＧＲＤ−５１系統（ＦＥＲＭ Ｐ−２０９３５）を提供する。
【００１６】
本発明はさらに、上に定義した光合成生物又はシロイヌナズナＧＲＤ−５１系統（ＦＥＲＭ Ｐ−２０９３５）を完全暗所下で発芽、育成して緑化物質を作ることを含む、緑化物質の製造方法を提供する。
【００１７】
本発明の実施形態において、上記の方法は、光合成生物又はＧＲＤ−５１系統（好ましくは、その葉部）から緑化物質を分離することをさらに含むことを特徴とする。
本発明の別の実施形態において、緑化物質がクロロフィルｃ様色素であることを特徴とする。
本発明の別の実施形態において、クロロフィルｃ様色素がクロロフィルｃであることを特徴とする。
本発明の別の実施形態において、上記の分離工程が溶媒抽出工程を含むことを特徴とする。
本発明の別の実施形態において、上記の分離工程が液体クロマトグラフィー工程をさらに含むことを特徴とする。
【００１８】
本発明はさらに、変異原処理した植物種子、緑藻類又は藍藻類のなかから、ブラシノステロイド生合成阻害剤を含む培地にて、完全暗所下で緑化する表現型を示す突然変異体をスクリーニングする方法を提供する。
【発明の効果】
【００１９】
本発明の光合成生物（例えば植物、緑藻類又は藍藻類）は、完全暗所下で発芽、育成し、クロロフィル色素を生合成し緑化するという、これまでの常識を覆す特性を有している。完全暗所下での緑化が可能であることから、例えばビルの地下などの暗所にて栽培又は増殖して緑化した光合成生物を得ることが可能になる。さらに、本発明の光合成生物は、完全暗所にて本来生合成されることのない緑化物質であるクロロフィル色素、特にクロロフィルｃ様色素を産生するため、渇藻類とは異なり陸上で光合成生物を栽培又は増殖し、該生物から緑色色素を簡便に生産することができるなどの利点がある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本発明の光合成生物は、完全暗所下で緑化する、すなわち緑化物質を産生することを特徴とする。
【００２１】
本明細書中で使用する「緑化」とは、光合成生物において、完全暗所にて緑色物質が生合成されることを意味する。
【００２２】
本明細書中で使用する「緑化物質」とは、クロロフィル色素、より具体的にはクロロフィルｃ様色素をいう。
【００２３】
本明細書中で使用する「完全暗所」とは、好ましくは光の非照射状態又は場所をいうが、場合により、緑色の波長５００〜５５０ｎｍ辺りの光は存在することができる。
【００２４】
本明細書中で使用する「光合成生物」とは、光合成を行うことができる真核又は原核生物であり、明所又は光の照射下でクロロフィルａ及び／又はｂを生合成するがクロロフィルｃを生合成しない生物である。
【００２５】
本発明の実施形態によれば、光合成生物は、植物、緑藻類又は藍藻類からなる群から選択される。
また、本発明の実施形態によれば、本発明の光合成生物は、完全暗所下でクロロフィルｃ様色素を産生することを特徴とする。
【００２６】
従来公知の植物、緑藻類又は藍藻類は、一般に暗所では緑色物質であるクロロフィル色素を合成できないが、光の照射下でクロロフィルを合成することができる。このとき合成されるクロロフィルは、クロロフィルａ又はｂである。これに対して、本発明の光合成生物は、光のない完全暗所下で緑色物質を生合成することを可能にするため、驚くべき特性を有する。本発明の光合成生物が暗所下で合成する緑色物質はクロロフィルｃ様色素であり、クロロフィルａ及びｂではない。
【００２７】
本発明において、クロロフィルｃ様色素は、クロロフィルｃと同様のポルフィリン環を基本骨格とし、ＵＶスペクトル上４３５〜４４５ｎｍに吸収極大を有しており、例えばワカメ（褐藻類）のクロロフィルｃのＵＶスペクトルと実質的に同一の微細構造を有している。このことから、本発明におけるクロロフィルｃ様色素はクロロフィルｃを包含する。クロロフィルｃにおいては、ポルフィリン骨格に結合する側鎖の違いによりいくつかの分子種（例えばｃ１，ｃ２，ｃ３）が存在するが、本発明では、クロロフィルｃ様色素又はクロロフィルｃは、上記の特徴を有する分子であればよく、その単一分子種でもよいし又はそれらの混合物であってもよい。
【００２８】
本発明の暗所下で緑色物質（クロロフィルｃ様色素）を産生する光合成生物は、以下の手順によって作製することができる。
【００２９】
（１）光合成生物を準備する。植物の場合、その種子を１０００粒以上、好ましくは５０００粒以上、より好ましくは１万粒以上、例えば約５万粒〜約１０万粒準備する。緑藻類及び藍藻類の場合、培養藻類を準備する。緑藻類の培養は、例えば、クラミドモナス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）でＴｒｉｓ−ａｃｅｔａｔｅ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ＴＡＰ）培地（Ｇｏｒｍａｎ ａｎｄ Ｌｅｖｉｎｅ，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ， ５４：１６６５−１６６９，１９６５）、２３時間明期及び１時間暗期、２５℃の培養条件で、また、藍藻類の培養は、例えばＳｙｎｅｃｈｏｓｙｓｔｉｓ ｓｐ． ＰＣＣ６８０３株で、ＢＧ−１１培地（Ｓｔａｎｉｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ Ｒｅｖ． ３５：１７１−２０５，１９７１）、３４℃、ＣＯ２（１％，ｖ／ｖ）、７０μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎ ｍ−２ｓ−１の培養条件で行うことができる。
【００３０】
（２）植物種子又は培養藻類を、培地の存在下又は非存在下で化学変異原又は物理的変異原で処理する。
化学変異原としては、例えばエチルメタンスルホン酸（ＥＭＳ）、１−メチル−１−ニトロソ尿素（ＭＮＵ）などを使用することができる。この変異原による処理は、例えば０．３〜１．５％のＥＭＳ、２５℃、６〜２０時間（撹拌しながら）浸し、滅菌水で３回ほど洗浄した後、土や培地へ播種などの手順によって行うことができる。
【００３１】
物理的変異原としては、放射線、例えばγ線、中性子線、重イオンビームなどを使用することができる。この変異原による処理は、例えばγ線だと３０〜５０ｋｒａｄ、中性子線だと４０〜６０Ｇｙ、重イオンビーム（炭素）５〜１５０Ｇｙの種子への照射を行い、Ｍ２での表現型を調べる、などの手順によって行うことができる。
【００３２】
（３）暗所下で緑色物質（クロロフィルｃ様色素）を産生する突然変異体の選抜を行う。
植物種子の場合、初めに、種子を殺菌剤で処理する。殺菌剤は、種子の殺菌用のいずれの薬剤も使用可能である。殺菌剤の例は、０．００５〜０．０５％（容量）の界面活性剤を含有する７０〜１００％（容量）エタノール水溶液である。界面活性剤は、イオン性及び非イオン性界面活性剤のいずれでもよく、特に限定されないが、例えばＴｒｉｔｏｎ Ｘなどの界面活性剤、中性洗剤（家庭用の市販のもの）などが含まれる。
【００３３】
殺菌した種子を風乾したのち、約３μＭのブラシノステロイド生合成阻害剤（Ａｓａｍｉ， Ｔ． ｅｔ ａｌ．， Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ． ４：３４８−３５３ （１９９９）；Ａｓａｍｉ， Ｔ． ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． １２３：９３−９９，２０００）；中野雄司及び浅見忠男、植物ホルモンのシグナル伝達（秀潤社）第６章、２：ブラシノステロイドのシグナル伝達、１７６−１８６頁、２００４年）を含有する１／２Ｍ培地（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ ＆ Ｓｋｏｏｇ ｍｅｄｉｕｍ；和光純薬カタログ３９２−００５９１を半分に希釈する）を含むシャーレに播く。ブラシノステロイド生合成阻害剤は、暗所で植物の茎が伸びないでかつ葉が開くようにする作用をもつため、この阻害剤の使用は、葉の緑化を判定するうえで重要である。ブラシノステロイド生合成阻害剤の例は、Ｂｒｚ−２２０、Ｂｒｚ−２００１、Ｂｒｚ−９１（Ａｓａｍｉ， Ｔ． ｅｔ ａｌ．， Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ． ４：３４８−３５３ （１９９９）；Ａｓａｍｉ， Ｔ． ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． １２３：９３−９９，２０００）などである。
【００３４】
前処理として約３時間の光照射処理を施し、アルミホイルで培地容器（シャーレ）全体を被覆し、４℃にて２〜４日間放置した。続いて、暗所にて２２℃、約６日間以上静置したのち、拡大鏡下で目視観察により緑化を基準にして暗所下で緑化物質（例えば、クロロフィルｃ様色素）を産生する突然変異体のスクリーニングを行う。
【００３５】
緑藻類及び藍藻類の場合、例えば次のように暗所下で緑化物質（例えば、クロロフィルｃ様色素）を産生する突然変異体をスクリーニングすることができる。
【００３６】
ＥＭＳ（０．３％以下）あるいは重イオンビーム照射（炭素：５〜１５０Ｇｙ）で変異誘発した緑藻類、藍藻類を暗所下で培養する。変異体は明所では緑色に、青色光下（波長４４０〜４５０nm程度）で観察すると蛍光を発光するものとして観察される。
【００３７】
（４）選抜された突然変異体系統を光照射下で発芽、育成して、或いは培養して種子又は培養藻類を採取する。特に植物の場合、ホモ系統を単離し、野生株との戻し交雑を行い、純化する。このようにして、暗所下で緑色物質（例えば、クロロフィルｃ様色素）を産生する突然変異体系統を得る。
【００３８】
本発明によれば、上記の手順を実施するための生物対象は、すべての被子植物及び裸子植物である。被子植物は双子葉植物及び単子葉植物のいずれも含む。双子葉植物の例は、以下のものに限定されないが、アブラナ科、例えばシロイヌナズナ、ダイコン、ナタネ、ブロッコリーなど、ナス科、例えばタバコ、トマトなど、マメ科、例えばダイズ、ミヤコグサなどである。また、単子葉植物の例は、イネ科、例えばイネ、小麦、大麦、トウモロコシ、サトウキビなどである。また、裸子植物の例は、限定されないが、マツ、スギなどである。
【００３９】
さらに本発明によれば、上記の手順を実施するための別の生物対象は、緑藻類及び藍藻類である。緑藻類の例は、以下のものに限定されないが、アオミドロ、ヒラアオノリ、クラミドモナス、クロレラなどである。また、藍藻類の例は、以下のものに限定されないが、Ｇｌｏｅｏｂａｃｔｅｒ ｖｉｏｌａｃｅｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｅｌｏｎｇａｔｅｓ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．などである。
【００４０】
後述の実施例では、植物としてアブラナ科植物、例えばその代表的植物であるシロイヌナズナを選択し、上記の手順を実施し、完全暗所下で発芽させたときに緑色を呈する緑化突然変異体を得た。具体的には、化学変異原ＥＭＳ処理を施した約４万粒のＭ２種子群、或いは、速中性子線を照射したシロイヌナズナ（Ｃｏｌｕｍｂｉａ系統）約８万粒のＭ２種子群から、ブラシノイド生合成阻害剤を用いたスクリーニングによって、暗所緑化の表現型を示す突然変異体を見出した。さらに、それぞれ系統化し、１３００系統に絞り込んだのち、後代を各々チェックし、ヘテロとして分離する１系統を単離した。この系統は、白（野生型）：緑（変異体）＝３：１で安定して分離した。
【００４１】
単離されたこの変異体は、発芽後暗所を経験しないと枯れないことが判明したため、純系の暗所緑化変異体系統を作出し、さらに、自家交雑で代を重ねると枯死率の高い系統が出現するため分離比に注意しながら７回の野生株との戻し交雑を行い、これによって、シロイヌナズナの暗所緑化突然変異体ＧＲＤ−５１系統を得た。ＧＲＤ−５１系統の種子は、独立行政法人産業技術総合研究所、特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に平成１８年６月１６日付けで寄託し、受領番号ＦＥＲＭ ＡＰ−２０９３５（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２０９３５）を受領した。
【００４２】
本発明の暗所下で緑色物質を産生し緑化する光合成生物は、次のような性質によって特徴付けられる。
最も主要な特徴は、緑化物質としてクロロフィルｃ様色素を産生することである。
この色素は、ワカメ（褐藻類）のクロロフィルｃのＵＶスペクトルと実質的に同一の微細構造を有することから、おそらくクロロフィルｃであると考えられる。
【００４３】
クロロフィルｃ様色素などの緑色物質の分離は、次のようにして行うことができる。
植物の場合、葉部を切り取り、粉砕し溶媒抽出する。例えば、液体窒素で固体化し、吸湿のためにシリカゲルを適量入れた乳鉢等の容器内で葉部を粉砕する。次に、メタノール、アセトンなどの極性有機溶媒にて抽出を行い、必要に応じて濃縮し溶媒を除去する。
【００４４】
抽出物は、次いで、ＨＰＬＣなどの液体クロマトグラフィーによって処理して、クロロフィルｃ様色素などの緑色物質を単離する。クロマトグラフィーの好ましい担体は、シリカゲルである。好ましいクロマトグラフィーは、ＨＰＬＣであり、例えばカラム：ＰＥＧＡＳＩＬ ＯＤＳ−ＩＩ（センシュー科学製）、溶離液：（Ａ）ＭｅＯＨ：ＣＨ３ＣＮ：１Ｍ ＭｅＣＯＯＮＨ４＝５：３：２，（Ｂ）ＣＨ３ＣＮ：ＥｔＯＡｃ＝１：１のグラジエントＡ：Ｂ＝１００：０からＡ：Ｂ＝０：１００（２０分間）、温度：室温、検出：励起波長（Ｅｘ）４２０ｎｍ、発光波長（Ｅｍ）６５０ｎｍ、流速：０．２ｍｌ／分の条件で分取可能である。
【００４５】
クロロフィルｃ様色素などの緑色物質の分析は、上記と同様の条件下でのＨＰＬＣによる分析、ＵＶスペクトル分析、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）分析、ＦＴ−ＭＳ（質量分析）、ＮＭＲ（１Ｈ又は１３Ｃ核磁気共鳴スペクトル分析）、ＩＲ（赤外線吸収スペクトル分析）などによって行うことができる。
【００４６】
ＨＰＬＣによる分析は、上記の条件で、野生型シロイヌナズナ（暗所発芽）の葉部、本発明のシロイヌナズナＧＲＤ−５１系統（暗所発芽）の葉部、及びワカメからのメタノール抽出物について行い、それぞれ図１、図２、図３に示した。保持時間約１０．４分のピークは、野生型に存在しないが、ＧＲＤ−５１系統とワカメに存在し、これはクロロフィルｃを示す。因みに、図３の保持時間約２４．２分のピークは、ワカメのクロロフィルａを示すが、このピークは、野生型及びＧＲＤ−５１系統のいずれにも観察されない。
【００４７】
ＵＶスペクトル分析は、フォトダイオードアレイ（２００ｎｍから７２９ｎｍへ）の条件下で行うことができる。本発明のＧＲＤ−５１系統（暗所発芽）から単離したクロロフィルｃ様色素及びワカメから単離したクロロフィルｃのＵＶスペクトルをそれぞれ図４及び図５に示した。ＧＲＤ−５１系統から単離したクロロフィルｃ様色素は、４３７ｎｍに非常に強い吸収、６３２ｎｍに弱い吸収からなるスペクトルを示した。一方、ワカメから単離したクロロフィルｃは、４４３ｎｍに非常に強い吸収、６３２ｎｍに弱い吸収からなるスペクトルを示した。これらのＵＶスペクトルの微細構造は実質的に同じである。
【００４８】
ＴＬＣ分析は、本発明のＧＲＤ−５１系統（暗所発芽）から単離したクロロフィルｃ様色素及びワカメから単離したクロロフィルｃについて、シリカゲルプレート：Ｓｉｌｉｃａ ｇｅｌ６０ Ｆ２５４（ＭＥＲＣＫ社）、溶離液：アセトン／ヘキサン（５０／５０、容量％）の条件で行い、クロロフィルスポット（緑色）を目視で検出し、結果を図６に示した。サンプルをミックスしたときのワカメクロロフィルｃと本発明クロロフィルｃ様色素の移動度は完全に一致した。
【００４９】
以上の分析結果から、本発明のＧＲＤ−５１系統（暗所発芽）から単離したクロロフィルｃ様色素は、ワカメのクロロフィルｃに非常に類似したものであると推定される。
【００５０】
本発明の光合成生物、特に植物は、さらに次のような特徴を有する。
（１）完全暗所下で発芽したのち光にさらすと枯死する。
（２）最初から光照射下で発芽、育成すると、野生型と同様に生育し種子を形成する。この場合には、クロロフィルａ及びｂが合成され、クロロフィルｃ様色素は合成されない。
（３） 最初から光照射下で発芽し、生長したのち完全暗所下に置くと成長点から枯れるが、根は生き延びる。芽が出るところまで成長したあとは、芽からの新たな生長が可能になる。
【００５１】
以下の実施例によって本発明をさらに説明するが、本発明の範囲は、この実施例によって制限されないものとする。
【実施例】
【００５２】
完全暗所下でクロロフィルｃ様色素を産生するシロイヌナズナ突然変異体
化学変異原ＥＭＳ処理（濃度：０．３％、処理時間：１６時間）を施したシロイヌナズナ約４万粒のＭ２種子群、或いは、速中性子線を照射（５５Ｇｙ）したシロイヌナズナ（Ｃｏｌｕｍｂｉａ系統）約８万粒のＭ２種子群から、ブラシノステロイド生合成阻害剤（名称：Ｂｒｚ２２０，Ｂｒｚ２００１又はＢｒｚ９１（Ａｓａｍｉ， Ｔ． ｅｔ ａｌ．， Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ． ４：３４８−３５３ （１９９９）；Ａｓａｍｉ， Ｔ． ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． １２３：９３−９９，２０００）、濃度：３μＭ）を含む１／２ＭＳ培地上でのスクリーニングによって、暗所緑化の表現型を示す突然変異体を見出した。劣性の形質であることを想定し、約８万粒の種子を大凡１０００粒程度のカテゴリーに分け、そのうちの１つで再度暗所緑化形質を示す個体群を見出した。さらに、そのカテゴリーの種子から植物体を育成後、それぞれから採種・系統化し、後代をチェックした。その中から、ヘテロとして分離する１系統を単離した。この系統は、白（野生型）：緑（変異体）＝３：１で安定して分離した。
【００５３】
単離されたこの変異体は、発芽後暗所を経験しないと枯れないことが判明したため、純系の暗所緑化変異体系統を作出し、さらに、７回の野生株との戻し交雑を行い、これによって、完全暗所下でクロロフィルｃ様色素を産生するシロイヌナズナ突然変異体ＧＲＤ−５１系統を得た。
【００５４】
ＧＲＤ−５１系統の種子は、独立行政法人産業技術総合研究所、特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に平成１８年６月１６日付けで寄託し、受領番号ＦＥＲＭ ＡＰ−２０９３５（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２０９３５）を受領した。
【００５５】
完全暗所下で発芽、育成したＧＲＤ−５１系統からのクロロフィルｃ様色素の分離は、葉部をメタノール抽出し、上記の分取条件でＨＰＬＣに掛けることによって行い、ＨＰＬＣ分析とＴＬＣ分析により、ワカメのクロロフィルｃと同一又は非常に類似していることが分かった（図４〜図６）。
【産業上の利用可能性】
【００５６】
本発明で得ることができるクロロフィルｃ様色素は、緑色色素として、或いは光増感色素として利用可能であるし、また、ダイオキシンなどの有毒物質の体外排出のために利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】野生型シロイヌナズナ（暗所発芽）の葉部のメタノール抽出物のＨＰＬＣ分析結果を示す。
【図２】本発明のシロイヌナズナＧＲＤ−５１系統（暗所発芽）の葉部のメタノール抽出物のＨＰＬＣ分析結果を示す。矢印は、クロロフィルｃ様色素を示すピーク（図４も参照）である。
【図３】ワカメのメタノール抽出物のＨＰＬＣ分析結果を示す。矢印は、ワカメのクロロフィルｃを示すピーク（図５も参照）である。
【図４】本発明のＧＲＤ−５１系統（暗所発芽）から（ＨＰＬＣ分取により）単離したクロロフィルｃ様色素（図２のピーク）の吸光スペクトルを示す。
【図５】ワカメから（ＨＰＬＣ分取により）単離したクロロフィルｃ（図３のピーク）の吸光スペクトルを示す。
【図６】本発明のＧＲＤ−５１系統（暗所発芽）から（ＨＰＬＣ分取により）単離したクロロフィルｃ様色素及びワカメから（ＨＰＬＣ分取により）単離したクロロフィルｃのＴＬＣの結果を示す。レーン１は、ＧＲＤ−５１系統（暗所発芽）の葉からセトン抽出した緑色物質サンプル、レーン２は、１と３のサンプルを混ぜてスポッティングしたサンプル、レーン３は、ワカメの葉からセトン抽出した緑色物質サンプルである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
完全暗所下で緑化することを特徴とする光合成生物。
【請求項２】
光合成生物が、植物、緑藻類又は藍藻類からなる群から選択される、請求項１に記載の光合成生物。
【請求項３】
完全暗所下で緑化物質を産生することを特徴とする、請求項１又は２に記載の光合成生物。
【請求項４】
緑化物質がクロロフィルｃ様色素であることを特徴とする、請求項３に記載の光合成生物。
【請求項５】
完全暗所下でクロロフィルｃ様色素を産生することを特徴とする、植物、緑藻類又は藍藻類からなる群から選択される光合成生物。
【請求項６】
クロロフィルｃ様色素がクロロフィルｃであることを特徴とする、請求項４又は５に記載の光合成生物。
【請求項７】
完全暗所下で発芽したのち光にさらすと枯死することを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載の光合成生物。
【請求項８】
最初から光照射下で発芽、育成すると生育し、種子を形成することを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項に記載の光合成生物。
【請求項９】
最初から光照射下で発芽し、生長したのち完全暗所下に置くと成長点から枯れることを特徴とする、請求項１〜８のいずれか１項に記載の光合成生物。
【請求項１０】
植物がアブラナ科に属する植物であることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか１項に記載の光合成生物。
【請求項１１】
アブラナ科に属する植物がシロイヌナズナであることを特徴とする、請求項１０に記載の光合成生物。
【請求項１２】
シロイヌナズナがシロイヌナズナＧＲＤ−５１系統（ＦＥＲＭ Ｐ−２０９３５）であることを特徴とする、請求項１１に記載の光合成生物。
【請求項１３】
シロイヌナズナＧＲＤ−５１系統（ＦＥＲＭ Ｐ−２０９３５）。
【請求項１４】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の光合成生物又は請求項１３に記載のシロイヌナズナＧＲＤ−５１系統（ＦＥＲＭ Ｐ−２０９３５）を完全暗所下で発芽、育成して緑化物質を作ることを含む、緑化物質の製造方法。
【請求項１５】
光合成生物又はＧＲＤ−５１系統から緑化物質を分離することをさらに含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
緑化物質がクロロフィルｃ様色素であることを特徴とする、請求項１４又は１５に記載の方法。
【請求項１７】
クロロフィルｃ様色素がクロロフィルｃであることを特徴とする、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
分離工程が溶媒抽出工程を含むことを特徴とする、請求項１４〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
分離工程が液体クロマトグラフィー工程をさらに含むことを特徴とする、請求項１４〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
変異原処理した植物種子、緑藻類又は藍藻類のなかから、ブラシノステロイド生合成阻害剤を含む培地にて、完全暗所下で緑化する表現型を示す突然変異体をスクリーニングする方法。
【請求項１】
完全暗所下で緑化することを特徴とする光合成生物。
【請求項２】
光合成生物が、植物、緑藻類又は藍藻類からなる群から選択される、請求項１に記載の光合成生物。
【請求項３】
完全暗所下で緑化物質を産生することを特徴とする、請求項１又は２に記載の光合成生物。
【請求項４】
緑化物質がクロロフィルｃ様色素であることを特徴とする、請求項３に記載の光合成生物。
【請求項５】
完全暗所下でクロロフィルｃ様色素を産生することを特徴とする、植物、緑藻類又は藍藻類からなる群から選択される光合成生物。
【請求項６】
クロロフィルｃ様色素がクロロフィルｃであることを特徴とする、請求項４又は５に記載の光合成生物。
【請求項７】
完全暗所下で発芽したのち光にさらすと枯死することを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載の光合成生物。
【請求項８】
最初から光照射下で発芽、育成すると生育し、種子を形成することを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項に記載の光合成生物。
【請求項９】
最初から光照射下で発芽し、生長したのち完全暗所下に置くと成長点から枯れることを特徴とする、請求項１〜８のいずれか１項に記載の光合成生物。
【請求項１０】
植物がアブラナ科に属する植物であることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか１項に記載の光合成生物。
【請求項１１】
アブラナ科に属する植物がシロイヌナズナであることを特徴とする、請求項１０に記載の光合成生物。
【請求項１２】
シロイヌナズナがシロイヌナズナＧＲＤ−５１系統（ＦＥＲＭ Ｐ−２０９３５）であることを特徴とする、請求項１１に記載の光合成生物。
【請求項１３】
シロイヌナズナＧＲＤ−５１系統（ＦＥＲＭ Ｐ−２０９３５）。
【請求項１４】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の光合成生物又は請求項１３に記載のシロイヌナズナＧＲＤ−５１系統（ＦＥＲＭ Ｐ−２０９３５）を完全暗所下で発芽、育成して緑化物質を作ることを含む、緑化物質の製造方法。
【請求項１５】
光合成生物又はＧＲＤ−５１系統から緑化物質を分離することをさらに含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
緑化物質がクロロフィルｃ様色素であることを特徴とする、請求項１４又は１５に記載の方法。
【請求項１７】
クロロフィルｃ様色素がクロロフィルｃであることを特徴とする、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
分離工程が溶媒抽出工程を含むことを特徴とする、請求項１４〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
分離工程が液体クロマトグラフィー工程をさらに含むことを特徴とする、請求項１４〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
変異原処理した植物種子、緑藻類又は藍藻類のなかから、ブラシノステロイド生合成阻害剤を含む培地にて、完全暗所下で緑化する表現型を示す突然変異体をスクリーニングする方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２００８−１７７１８（Ｐ２００８−１７７１８Ａ）
【公開日】平成２０年１月３１日（２００８．１．３１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−１８９７７３（Ｐ２００６−１８９７７３）
【出願日】平成１８年７月１０日（２００６．７．１０）
【出願人】（５０３３５９８２１）独立行政法人理化学研究所 (1,056)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年１月３１日（２００８．１．３１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年７月１０日（２００６．７．１０）
【出願人】（５０３３５９８２１）独立行政法人理化学研究所 (1,056)
【Ｆターム（参考）】
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