少なくとも１つの保護されたチオール領域を有するアルブミンベースコロイド組成物、その製造方法および使用方法
少なくとも１つの保護されたチオール領域を有するアルブミンベースコロイド組成物を含んでなる組成物、それを製造する方法、ならびに毛細血管漏出症候群およびショックなどの血液減少症状の処置をはじめとするその使用方法が開示される。この組成物はまた、発色団などの指示試薬で修飾されている。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
関連出願の参照
本願は、２００２年３月２６日出願の米国特許出願第１０／１０６，７９３号の一部継続出願（ＣＩＰ）である、２００４年１１月９日出願の米国特許出願第１０／９８５，７９８号に基づく利益を主張するものである。
【０００２】
説明
本願では、種々の刊行物が括弧内の番号として引用される。これらの刊行物の完全な出典は本明細書の末尾、特許請求の範囲の前に示されている。これらの刊行物の開示は、本発明の属する技術の現状をより詳しく説明するために、引用することによりそのまま本明細書の一部とされる。
【０００３】
技術分野
本発明は、ショック、敗血症、出血および外科手術などの多様な血液減少症状の治療のための、ポリエチレンオキシド（ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）など）で修飾されたアルブミンであるＰＥＧ−Ａｌｂなどのアルブミンベースコロイド組成物の使用に関する。好ましい実施態様では、該組成物は少なくとも１つの保護されたチオール領域を有する。もう１つの実施態様では、該アルブミンは指示試薬で修飾されている。
【０００４】
発明の背景
全身性炎症性応答症候群(systemic inflammtory response syndrome, SIRS)の様々な兆候に共通している血液減少症の回復を目的とし、可能性のある療法の開発に多大な資源が費やされている。米国では敗血症だけでも年間７５０，０００症例にのぼり、２００，０００人の死者を出している（１）。この高い死亡率は、毛細血管漏出(capillary leak, CL)に続発する臓器の浮腫に関連する多臓器不全(multi organ dysfunction, MODS)によるものである。顕著なＣＬを有する患者は一般に、昇圧薬および他の支援物質に加え、オスモライト（例えば、アルブミン、デンプンまたはデキストラン）を含む蘇生液を投与することにより管理される。
【０００５】
多臓器不全（ＭＯＤＳ）、敗血症、外傷、火傷、出血性ショック、心肺バイパス術後、膵炎および全身性毛細血管症候群などの種々の症状に存在する毛細血管漏出は、多数の入院患者に病気や死をもたらす。毛細血管漏出（ＣＬ）は、敗血症および全身性炎症性応答症候群（ＳＩＲＳ）に続発するＭＯＤＳの中心的な構成要素である。それは間質性浮腫をもたらす毛細血管透過性の増大と、やがては臓器不全および壊死に至る組織潅流の低下を特徴とする。毛細血管漏出症候群(capillary leak syndrome, CLS)の漏出の側面は、もともとは毛細血管内に保持されていた水分および血清の高分子量成分の双方の間質空間への放出に現れる。
【０００６】
血液減少状態はしばしば生体器官の潅流不足を招き、臓器不全を引き起こし、やがて病気や死に至らせる（２）。血液減少症は出血性ショックの場合のように急に起こることもあるし、あるいは基礎にある疾病のために段階的に起こる場合もあり、どちらのタイプでも全身性の炎症プロセスが伴う。出血性ショックでは、血液減少症は血管内容量の急激かつ突発的な喪失により起こる。蘇生の際、再潅流組織に炎症プロセスが誘発され（虚血再潅流傷害）、内皮細胞（ＥＣ）傷害と毛細血管漏出（ＣＬ）が起こり、二次的な血液減少状態となる。敗血症および他の疾病では、その疾病により全身性炎症が誘発され、同様の機序でＥＣの傷害、ＣＬ、そしてやがて血液減少性ショックが起こる。
【０００７】
依然として血漿増量剤による蘇生が血液減少症の治療の頼みの綱であるが、結果は複雑である。コロイド（例えば、アルブミンおよびデンプン）およびクリスタロイドの双方を含む増量剤の有効性と安全性は、包括的研究と論争の対象であり続けている（３，４）。血漿増量剤としてのアルブミンの予想できない有効性は、基礎にあるＥＣ傷害の重篤度に連関していると考えられる（５）。具体的には、内皮の健全性が損なわれれば、アルブミンは容易に管外遊出でき、漏出アルブミンは、それを逆転させるのとは対照的に、ＣＬに有利なコロイド浸透圧勾配へと悪化させてしまうおそれがある。
【０００８】
ＣＬ症候群を誘発する生体機構はあまり理解されていないが、炎症性サイトカインの関与を示すいくつかの証拠がある。ヒトアルブミン溶液に置き換えても、アルブミンの管外空間への損失を止められるわけではないので、わずかな効果しかない。アルブミンは、血漿のコロイド浸透圧ならびに血中のナトリウムイオンの保持を担うため、重要である。
【０００９】
通常の条件下において、アルブミンは、総血液コロイド浸透圧の約８０％に寄与し（６）、低い生理学的速度で管外遊出するような大きさが理想的である（７）。ＣＬ患者では、循環血液量を増やし、血管内浸透圧特性を増大させるため、５％〜２０％のアルブミン溶液が投与されることが多い。このＣＬを遅延させる方法には、アルブミンはショック中もその通常の遅い管外遊出速度を維持しているのではないかという弱い推定がある。しなしながら、臨床データは、このアルブミンの有効性がいくらよく見ても矛盾していることを示している（８，９）。アルブミンによる蘇生は危篤患者の死亡率を高めているおそれがあることを示唆しているものさえある（１０）。
【００１０】
ＰＥＧ化は広く用いられている（１１，１２）。インターフェロンβ−１ａをポリエチレングリコールで修飾するとその半減期が長くなり、より高い抗ウイルス活性が得られる（１３）。血液代替物としてのＰＥＧ化ヘモグロビン（ＰＥＧ−Ｈｂ）の使用に関する研究がいくつかある（１４，１５，１６）。ラットにおいて、血管容積の８０％までを占める多量のＰＥＧ−Ｈｂは、ＰＥＧ−Ｈｂが血行力学と酸素送達を維持するのに効果的であることが示されている（１７）。これらの研究は、ＰＥＧ−Ｈｂが極めて高い用量であっても安全であることを示唆している。
【００１１】
有効性の程度は様々であるが、他のコロイドも毛細血管漏出症状の治療に使用されている。種々の不均質な（Ｍｒ平均分子量：１２５，０００〜４５０，０００Ｄａ）デンプンコロイドがアルブミン代替物として提案または使用されている（１８）。これらの化合物はそれほど高価なものではなく、ヒトアルブミンプール品よりも入手が容易であるが、デンプンコロイドの使用は、それらの使用を厳しく制限する安全上の問題のため、低用量に限られてきた。さらに、不均質なデンプンコロイド内の高Ｍｒ（＞１，０００，０００Ｄａ）部分は血液流動特性を変化させ、凝固障害を起こしかねない（１９）。大動脈閉塞再潅流傷害モデルでは、比較的不均質なペンタスターチ（Ｍｒ＝１１０，０００）は、肺傷害を軽減することが示されている（２０）。
【００１２】
最近の研究では、敗血症前処理ラットモデルで、ヘタスターチ（ＨＥＳ）を与えると、ＭＡＰおよび心拍数（ＨＲ）が有利な変化をしなかった（２１）。これに対し、重合ヘモグロビンで前処理したマウスでは、ＭＡＰ（上昇）およびＨＲ（低下）に有利な変化が見られた。これは、同じ分子濃度で、ＨＥＳのコロイド浸透圧（２７ｍｍ／Ｈｇ）は重合ヘモグロビンのコロイド浸透圧（２１ｍｍ／Ｈｇ）よりも高いという事実にもかかわらず生じた。しかしながら、通常の血漿増量剤としての後者の使用には議論があり、特に腎臓に関連する潜在的副作用が伴う。
【００１３】
最後に、アルブミンが細胞グルタチオンおよび核因子κＢの活性化の調節を媒介することにより内皮の抗アポトーシス作用を有することを示唆するいくつかの研究がある（２２，２３，２４）。これは、特に、内皮細胞アポトーシスに対する種々の全身性炎症性応答の兆候にＣＬを関連づけている最近の報告（２５）に鑑みれば、敗血症により誘発されるＣＬにおいて重要な役割を果たしている可能性がある。
【００１４】
現在利用可能なアルブミンは分子量が６９，０００であり、半減期が極めて短く（４〜６時間）、重篤な敗血症、膵炎、火傷および外傷などの毛細血管漏出症状において、管外空間に容易に漏出してしまう。この漏出により浮腫および／またはコンパートメント症候群の悪化を招き得る。ペンタスターチおよびヘキサスターチは小児患者には使用できず、出血を起こし得るので、その利用価値は限定されている。さらに、患者に１５ｃｃ／ｋｇしか使用できない。また、ペンタスターチおよびヘキサスターチは使用後に難治性のそう痒（かゆみ）を生じることが示されており、その作用は何年も続く。事実、代替物または増量剤としてのアルブミンの使用は、毛細血管の外へ体液を排出することにより浮腫を増大させることから、逆効果であるとする研究もある。
【００１５】
よって、上記の欠点を持たない、血液減少症状を効果的に予防および／または治療するための組成物および方法の必要性は大きい。
【００１６】
特に、出血性ショック（ＨＳ）は外傷後の主たる死因であることに着目すべきである（１ａ〜３ａ）。初期管理としては、止血の他、組織潅流を回復させるための輸液療法を施す必要がある。初期の輸液療法の選択はその結果に多大な影響を及ぼし得る。出血性ショックおよび蘇生の後、核因子−κＢ（ＮＦ−κＢ）が活性化され、内皮細胞（ＥＣ）、マクロファージ、好中球および他の細胞を活性化する、ＴＮＦ−αなどのサイトカイン、ケモカインおよび細胞接着分子の過剰産生を特徴とする炎症性応答が誘発される（４ａ）。これらの活性化細胞（５ａ，６ａ）は、血管の傷害と毛細血管漏出（ＣＬ）を招く反応性酸素種(reaction oxygen species, ROS)などの酸化産物を生じる（７ａ〜１０ａ）。再潅流後に生成した酸化体およびフリーラジカルは、特にＥＣのアポトーシスの強力な誘導物質（１１ａ）である。これらの細胞の減少は内皮細胞間ギャップの拡大を悪化させ、毛細血管漏出を悪化させ（１２ａ）、アルブミンの損失をもたらす。このような低レベルのアルブミンを伴う酸化ストレスの環境では、内皮の健全性は損なわれる（３２ａ，３４ａ，３５ａ）。酸化産物、サイトカインおよびCLにより悪化する血管枯渇は、内因性および外因性の昇圧に対する血管の無反応性に関与する（１０ａ，１３ａ，１４）。これらの事象は図１１に要約されている。
【００１７】
注目されるもう１つの分野においては、最近の研究で、出血性ショックの蘇生に使用される輸液のタイプが生理応答、免疫応答および全身の炎症状態に影響を及ぼすことが示されている。
【００１８】
クリスタロイド−乳酸リンゲル液（ＬＲ）および人工（合成）コロイドは好中球を活性化し、細胞接着分子をアップレギュレートするが、これらの作用はアルブミンまたは新鮮な全血では見られない（１０ａ，１１ａ）。さらに、ＬＲまたは人工コロイドで蘇生された動物では、特に肺および脾臓で著しいアポトーシスを生じた（１５ａ，１６ａ）。止血を行わずに積極的な大容量蘇生を行うと、初期に形成された軟らかい血栓が破れることで、また、凝固因子が薄められることで出血が悪化することがある（１７ａ）。逆に、高張生理食塩水（７．５％，ＨＴＳ）単独または合成コロイドとの組合せを用いた小容量蘇生は、特に頭部外傷の場合、および腹部または四肢のコンパートメント症候群を発症するリスクの高い患者の場合に、大容量蘇生よりも優れている。しかしながら、単独または合成コロイドと組み合わせて用いられる小容量ＨＴＳでは、高塩素血症性アシドーシス（１８ａ）およびコロイド成分に関連するアナフィラキシー様反応（１９ａ）をはじめとする有害作用が報告されている。乳酸ピルビン酸エチルおよびケトン系輸液などの前臨床試験下の他の輸液は、ＬＲに比べて、低い細胞傷害性と出血動物で良好な生存率を示す（２０ａ，２１ａ）。
【００１９】
コロイド−アルブミンをはじめとするコロイド血漿増量剤の有効性と安全性には議論がある（２２ａ，２３ａ）。デンプン（２４ａ）をはじめとする人工コロイドが、毛細血管漏出症状の治療において、有効性は様々であるが、アルブミンの代わりに用いられている。ヒトアルブミンよりも安価で、入手が容易ではあるが、その高Ｍｒ（＞１，０００，０００）成分が血液誘導特性に影響を及ぼし、凝固障害を招く（２３ａ）ことから、低用量に限定される。アルブミンとは対照的に、合成コロイドは炎症プロセスおよびアポトーシスプロセスを活性化する（２５ａ）。アルブミンは、再潅流傷害の重要な工程である好中球接着分子ＣＤ−１８の発現を高めないが、人工コロイドは高める（２６ａ）。アルブミンは血液コロイド浸透圧の８０％を占め（２７ａ）、低い生理学的速度で管外遊出する（２８ａ）。ＣＬ患者では、血液量を増し、コロイド浸透圧勾配を維持するために、５％または２５％アルブミン溶液が投与される。アルブミン処置の有効性には変動があり（２９ａ）、アルブミン蘇生が実際には死亡率を高めている可能性があることを示す研究もいくつかある（３０ａ）。しかしながら、通常の生理食塩水または４％アルブミンを投与された７０００名を超える外傷患者を含む、ニュージーランドおよびオーストラリアでの最近の無作為化二重盲検管理臨床試験では、２８日目でこの２群の間に死亡率の差は示されなかった（３１ａ）（Dr S. Finferによりthe 33 rd Congress of Society of Critical Care Medicine, Feb 2004, Orlando, Floridaに示された研究）。
【００２０】
抗アポトーシス薬および抗炎症薬としてのアルブミン−このアルブミン蘇生の臨床的有効性の矛盾した研究にもかかわらず、アルブミンが、内皮表面層の親水性の孔を埋めることで血管内皮の健全性を維持し（３２ａ〜３４ａ）、それらの安定性に寄与している（３５ａ）ことを示す、いくつかの系統の証拠がある。ラット皮膚におけるヒト組織外植片を用いた研究（３６ａ，３７ａ）では、アルブミンが内皮細胞のアポトーシスを阻害することが示されている。アルブミンはチオール基（Ｃｙｓ−３４）の供給源として働き、この作用は敗血症患者で実証されており、２００ｍｌの２０％アルブミンを投与した後、総チオール濃度を５０％まで高める（３８ａ）。in vitroにおける作用機序的研究では、細胞グルタチオンおよびＮＦ−κＢ脱活性化を調節することにより、アルブミンがその内皮抗アポトーシス作用を発揮することが示されている。生理学的濃度のアルブミンは、ＮＦ−κＢの活性化を阻害することによりＴＮＦαの誘導を阻害する（３９ａ）。ＨＳの齧歯類モデルでは、２５％アルブミン蘇生がＮＦ−κＢの輸送およびサイトカインにより誘導される好中球化学遊走物質メッセンジャーＲＮＡ濃度を低下させた（４０ａ）。
【００２１】
しかしながら、アルブミンが出血性ショックに有効でないことにも着目すべきである。これまでの研究において、非修飾アルブミンが血漿増量剤として有効でないこと（２７ａ，２９ａ，３０ａ）は、基礎にある内皮細胞傷害の重篤度に関連しているかもしれない。内皮の健全性が損なわれ、その結果、アルブミンが容易に管外遊出してしまえば、漏出するアルブミンが毛細血管漏出に有利なコロイド浸透圧勾配へと悪化させ得る（４１ａ）。
【発明の概要】
【００２２】
本発明の一つの態様は、アルブミンベースコロイド組成物を含んでなる組成物に関する。一つの態様では、アルブミンベースコロイド組成物は、その流体力学的半径が、そのコロイド浸透圧特性とナトリウムイオン、脂肪酸、薬剤およびビリルビンなどのリガンドと結合するその能力を保持しつつ、毛細血管からの漏出を妨げるに十分大きくなるように修飾される。いくつかのタンパク質が、生物活性の損失や著しい毒性を伴うことなく、リシンのε−アミノ基を介して結合されたポリエチレングリコールで修飾されているが、これまでにアルブミンタンパク質上の複数の位置でＰＥＧ化産物（ポリエチレンオキシドを含む）で修飾されたヒトアルブミンはなかった。本発明は、血液減少状態の危険性のある、または血液減少状態にある患者に投与した際に、アルブミンベースコロイド組成物がその血液減少症状を逆転させるような程度まで組成物の流体力学的半径を拡大するＰＥＧ化産物の使用を意図する。
【００２３】
本発明のアルブミンベースコロイド組成物は、重篤な敗血症、ショック、膵炎、火傷および外傷などのショック状態における増量に特に有用であり、それによりそれらの症状における生存率が高まる。
【００２４】
このアルブミンベースコロイド組成物はまた、腹膜透析における限外濾過を駆動するか、またはこれを引き起こす高浸透圧剤としても有用である。さらに他の使用としては、例えば、頭部外傷、過粘稠度状態、パーセンテシス（parcenthesis）後の肝硬変患者、白血球搬出(eukopheresis)、栄養性アルブミン欠乏症、ネフローゼ症候群、肝不全、重篤な低アルブミン血症患者および重篤な火傷患者における使用が挙げられる。
【００２５】
一つの態様では、本発明は、好ましい水和度を有するアルブミンベースコロイド組成物の組成物を含んでなる。本発明はさらに、アルブミンをポリエチレンオキシドで修飾することによりアルブミンベースコロイド組成物を製造するための２つの方法に関し、１つはＮ−ヒドロキシスクシンアミドエステルの使用によるものであり、もう１つは塩化シアヌル誘導体の使用によるものである。本発明のアルブミンベースコロイド組成物は安全であり、延長された有用な半減期を有する。このアルブミンベースコロイド組成物は、その免疫原性を軽減する組換えアルブミンを用いて合成することができる。
【００２６】
このアルブミンベースコロイド組成物は、その大きさのために管外遊出(extravascate)傾向が弱められ、それにより毛細血管漏出症候群および臨床的には浮腫やコンパートメント症候群などの血液減少症状の悪化を回避する。
【００２７】
別の態様では、アルブミンベースコロイド、例えば、ポリエチレングリコールが共有結合したアルブミン（ＰＥＧ−Ａｌｂ）の容積拡大特性は、より大きな水和度およびより大きな流体力学的半径を有する大きなアルブミンベースコロイド組成物である。このアルブミンベースコロイド組成物は、通常のアルブミンよりも管外空間に入りにくい。さらに、このアルブミンベースコロイド組成物は、オスモライトとしての、また、抗酸化剤としての、そしてヘムやビリルビンなどの溶解度の低い代謝産物の輸送体としての役割をはじめ、アルブミンの重要な生理学的機能を保持している（なお、後の２つの特徴は他のクリスタロイドおよびコロイドには付随しないものである）。
【００２８】
一つの態様では、本発明は、好ましい水和度を有する大きなアルブミンベースコロイドを含んでなる組成物に関する。この組成物はアルブミンベースコロイドであり、一つの実施態様では、その分子の、患者の毛細血管からの漏出を妨げるに十分な流体力学的半径を有するポリエチレングリコール修飾アルブミンを含んでなる。ある特定の実施態様では、このアルブミンベースコロイド組成物は少なくとも約８０〜約２５０ＫＤまたはそれを超える分子量を有する。この組成物は、ヒトアルブミン、ウシ血清アルブミン、ラクトアルブミンまたはオボアルブミンを含み得る。
【００２９】
このアルブミンベースコロイド組成物は、ナトリウムイオン、脂肪酸、ビリルビンおよび治療薬などのリガンドと結合する能力を有する。
【００３０】
別の態様では、本発明は、治療量の大きなアルブミンベースコロイド組成物をこのような症状を発症する危険性のある患者に投与することを含む、血液減少症状のin vivoでの予防または治療法に関する。
【００３１】
別の態様では、本発明は、アルブミンベースコロイドを含んでなる治療量の組成物を哺乳動物に投与することを含む、傷害された、または傷害のリスクのある哺乳動物組織の予防方法に関する。この組成物は哺乳動物の毛細血管から漏出することができず、組織を傷害から保護するに十分な量で存在する。この方法は、傷害のリスクが血液減少症、敗血症、ショック、火傷、外傷、外科手術、毛細血管漏出素因、過粘稠度ストレス、低アルブミン血症、および／または無酸素症によるものである場合に特に有用である。
【００３２】
さらに別の態様では、本発明は、アルブミンをポリエチレンオキシドで修飾することを含む、アルブミンベースコロイド組成物の製造方法に関する。アルブミンはＮ−ヒドロキシスクシンアミドエステルを用いることで修飾されるか、あるいはまた、塩化シアヌル誘導体を用いることで修飾される。ある特定の実施態様では、この方法は、アルブミンをリン酸カリウムに溶かしてアルブミン溶液を作製すること、メトキシポリエチレングリコールを塩化シアヌルで活性化し、水に溶かしてメトキシポリエチレングリコール溶液を作製すること、このメトキシポリエチレングリコール溶液をアルブミン溶液に加えて混合物を作製すること、この混合物を室温付近で好適な時間攪拌すること、約４℃で適当な時間、この混合物をリン酸緩衝生理食塩水溶液に対して透析すること、およびポリエチレングリコール修飾アルブミンを回収することを含む。ある特定の実施態様では、アルブミン溶液の容量に対するメチオキシグリコール(methyoxy glycol)溶液の容量の比率は約１〜約３の範囲である。
【００３３】
盲腸結紮穿刺（ＣＬＰ）ラットモデルおよび内毒素血症(endoxtoxemic)ラットモデルでは、複数の部位でメトキシポリエチレンとコンジュゲートした場合に（ＰＥＧ−Ａｌｂ）、非修飾アルブミンまたはクリスタロイドのいずれに比べても優れた（２〜３時間）アルブミンの輸液蘇生特性が見られる。大きなＰＥＧ−Ａｌｂ（アルブミンの大きさの約１６倍）およびその高まったコロイド浸透圧特性により、敗血症−毛細血管漏出（ＣＬ）症状下で管外遊出が少なくなる。その結果、ＰＥＧ−Ａｌｂで処置されたマウスは、血圧回復の向上とＣＬに誘発される血液濃縮の低下を示した。さらに、内毒素血症ラットにおいて、ＰＥＧ−Ａｌｂによる肺組織傷害の減少の証拠もあった。タンパク質のＰＥＧ化は、おそらくは生理学的ターンオーバー（例えば、タンパク質分解から保護する）および抗原性を軽減することにより、それらの血管内保持時間（半減期）を延長する。本発明は、１）アルブミンおよびＰＥＧ−Ａｌｂの血管内保持時間の同時（すなわち、同じ被験体で）評価を可能とし、２）生体器官の傷害の指標としての管外（または漏出）アルブミンおよびＰＥＧ−Ａｌｂの可視化を提供する方法を記載および検証する。本方法は、分光光度的に異なる発色団によりタグ付けされたアルブミンおよびＰＥＧ−Ａｌｂおよびそれらの濃度を経時的に繰り返し評価する二重発色団技術に基づく。このアルブミンは指示試薬で修飾されている。
【００３４】
より具体的には、本発明の方法は、色素とコンジュゲートしたアルブミンおよびＰＥＧ−Ａｌｂの作製に関する。ヒトアルブミン（５０ｍｇ／ｍｌ）を５０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌおよび０．５ｍＭジチオトレイトール中で１時間インキュベートした。このジチオトレイトール処理したアルブミンを４ｍＭの５−ヨードアセトアミドフルオレセインまたは１．５ｍＭのテキサスレッドマレイミド(Molecular Probes)とともに２時間インキュベートした。この色素修飾アルブミンを５倍希釈し、遠心分離濃縮器（カットオフ１０，０００Ｍｒ，Millipore）で３倍に再構成して組み込まれていない色素の大部分を除去し、その後、リン酸緩衝生理食塩水（４回交換）に対して４８時間透析した。
【発明の具体的説明】
【００３５】
本発明の一つの態様によれば、デンプンとは異なり、アルブミンベースコロイド組成物は、オスモライトとしての、また、抗酸化剤（２６）としての、そしてヘムやビリルビンなどの溶解度の低い代謝産物の輸送体（２７）としての役割をはじめ、アルブミンの重要な生理学的機能を保持している（なお、後の２つの特徴は他のクリスタロイドおよびコロイドには付随しないものである）。ＰＥＧ−Ａｌｂに対して行ったタンパク質の脱フォールディング研究は、アルブミンの機能が非常に良く保存されていることを示した。
【００３６】
本発明によれば、アルブミンベースコロイド組成物のこのコロイド浸透圧特性は、血液減少の処置の際の血漿増量に関して、非修飾アルブミンの場合よりも優れている。アルブミンベースコロイド組成物は、危篤患者において末端器官の傷害のおそれを軽減し、これにより罹患率および死亡率を引き下げる。本発明はまた、ＡＲＤＳを予防または緩和し、血圧を維持するよう、敗血症患者を前処置する方法に関する。分子量が大きく（好ましくは、約８０ＫＤ以上）、コロイド浸透圧機能が増強された本発明のアルブミンベースコロイド組成物は、内毒素誘発ショックの生理学的および組織学的兆候の改善に関して生理食塩水またはアルブミンよりも極めて優れている。
【００３７】
このアルブミンベースコロイド組成物は、毛細血管漏出が起こっている敗血状態であっても、患者の血管内コンパートメントに維持される。リポ多糖類（ＬＰＳ）誘導型のラット敗血症モデルでは、ヘマトクリット（ＨＣＴ）予備試験では違いはなかったが、敗血症誘導後は生理食塩水およびアルブミン処理群のヘマトクリットは上昇し、ＰＥＧ−Ａｌｂ群のヘマトクリットは低下した。図１は、第１群と第２群の前後のヘマトクリットでは正の変化を示し、第３群（ＰＥＧ−Ａｌｂ群）の前後のヘマトクリットには負の変化がある。このデータはまた、アルブミンが血液濃縮ならびに間質性空間への体液損失という点で違いがない傾向にあることを示す。
【００３８】
また、敗血症においては血圧の維持も重要である。敗血症により誘発される低血圧の予防のためのＰＥＧ−Ａｌｂ、生理食塩水およびアルブミン処理の有効性を図２に示す。ＬＰＳ（リポ多糖類）後２時間および３時間目において、ＭＡＰ（平均動脈圧）はアルブミン処理群および生理食塩水処理群の双方で基準値に比べて低下した。他方、ＰＥＧ−Ａｌｂラットの平均応答はどちらの時点でも変化はなかった。ＬＰＳ後のＭＡＰの変化は、処理群内であっても顕著な変動性を示した。しかしながらやはり、ＭＡＰの維持におけるＰＥＧ−Ａｌｂの高い有効性は統計学的に有意であった（二元配置反復測定ＡＮＯＶＡ；Ｐ＝０．０２３）。
【００３９】
組織病理学的所見は、ＰＥＧ−Ａｌｂ処理群がアルブミン群よりも肺胞傷害が少ないことを示す（図３Ａ〜Ｄ）。図４に示されるように、肺傷害（急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ））は、ＰＥＧＡ処理ラットでは、アルブミン処理ラットおよび生理食塩水処理ラットのいずれと比べても有意に少なかった（一元配置ＡＮＯＶＡ；Ｐ−．００２）。陽性対照およびアルブミン処理ラットに比べて、ＰＥＧ−Ａｌｂラットにおける肺組織の浸潤および硝子質化が最少であることを考えれば、ＬＰＳにより誘発された血液減少においてＰＥＧ−Ａｌｂ処理はアルブミンより良好である。
【００４０】
図５（左）は、ＰＥＧ−ＡｌｂのＳＤＳ−アクリルアミドゲル電気泳動を示す。
【００４１】
レーン１および４は上から下に、１）ミオシン（ＭＷ２０５ＫＤ）；２）ホスホリラーゼ（９７ＫＤ）；および３）ウシ血清アルブミン（６６ＫＤ）の標準マーカーを含む。レーン２は、ＰＥＧ化後のヒト血清アルブミンを含み、その分子量は２００ＫＤを超える。レーン３はＰＥＧ化前のヒト血清アルブミンを含む。
【００４２】
図５（右）は、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ Ｓ２００でのＰＥＧ−Ａｌｂのゲル濾過を示す−ＰＥＧＡサイズ標準を１０ｎＭ ＫＰＯ４、１５０ｎＭ ＮａＣｌで平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘに適用した。示された標準は、チログロブリン（Ｔｈｙｒ）、免疫グロブリン（ＩｇＧ）、アルブミン（ａｌｂ）、オボアルブミン（ＯＶＡＬ）およびミオグロビン（Ｍｙ）である。Ｐｅｇ−アルブミンは２週間で溶出した。ピークＩはボイド容量で、ピークＩＩはチログロブリンの後に溶出した。
【００４３】
本発明によれば、ＬＰＳによる敗血症の誘導前にＰＥＧ−Ａｌｂでラットを前処理すると、生理食塩水または非修飾アルブミンによる動物の前処理に比べ、ＬＰＳにより誘発されるショックの兆候が少なくなる。齧歯類はＬＰＳに対して比較的耐性があるので、高用量のＬＰＳを与え、ＭＯＤＳを有する重篤なヒト敗血症をシミュレートするには低血圧の持続が必要である。ＰＥＧ−Ａｌｂは血圧をより急速に回復し、ヘマトクリットを低下させ（ＣＬを特徴とする血液濃縮とは反対に血液希釈を示唆する）、肺傷害を有意に軽減する。ＰＥＧ−Ａｌｂ分子の有効サイズはより大きいので、細胞傷害の存在下でも、また、内皮の健全性が失われても管外遊出しにくい。
【００４４】
内毒素の投与後に起こるショックは二相の血圧応答を特徴とする。第一相では、ＬＰＳの注射後１０〜１５分で血圧降下が起こる。これは総てのＬＰＳ注射動物に顕著であったが、このことはＰＥＧ−Ａｌｂが内毒素それ自体を中和することにより働くものではないことを示唆する。低血圧の第二相は、主として、血漿量を実質的に低下させる誘導性硝酸オキシド（ｉＮＯＳ）の作用により生じる（２８）。この第二相において、ＰＥＧ−Ａｌｂは、アルブミンまたは生理食塩水に比べて優れた作用を持つ。ｉＮＯＳ ｍＲＮＡまたはペプチドは測定されなかったが、ここで用いたこれらの条件下、すなわち、２０ｍｇ／ＫｇのＬＰＳの静脈内投与下で、ｉＮＯＳが誘導された可能性が極めて高い。いずれの前処理モデルにも本質的な制限が存在するが、このデータは、ＬＰＳの前にＰＥＧ−Ａｌｂを投与すればラットをＡＲＤＳの発症から保護することを示す。
【００４５】
ヘマトクリット、平均動脈圧および組織学は総て、ＰＥＧ−ＡｌｂがＬＰＳにより誘導された血液減少の有益な治療となることを示す。ＰＥＧ−Ａｌｂ処理により達成される血液希釈およびＭＡＰの不変性は血漿増量（または少なくとも維持）の指標となり、アルブミンおよび生理食塩水では反対の作用が見られた。ＰＥＧ−Ａｌｂによる血管内容量の維持は毛細血管漏出の減少と一致している。組織病理学的所見（図３Ａ〜Ｄ）は、ＰＥＧ−Ａｌｂ処理ラットの肺組織では間質浸潤性および硝子質化が最少であることを示す。免疫蛍光研究は、ＰＥＧ−Ａｌｂが毛細血管漏出の際にアルブミンよりも高い程度で、血管空間に保持される傾向があることを示す（図３）。
【００４６】
このＰＥＧ−Ａｌｂのコロイド特性の向上は親水性の上昇によるものであるが、これは、ゲル濾過カラム上での挙動に表れるその極めて大きな流体力学的半径およびその理想的でない浸透圧特性から推測されるより大きな分子慣性半径（ＲＧ）および排除体積（Λ）により示される。これはまた、サイズ排除クロマトグラフィーを用いても証明され、ＰＥＧ−Ａｌｂ／アルブミンの溶出比は、コロイド浸透圧法によるＰＥＧ−Ａｌｂ／アルブミンの排除体積と一致した（図５）。１以上のＰＥＧ基との共有結合により修飾した後のタンパク質のＲＧおよびΛの同様の上昇は、Ｗｉｎｓｌｏｗおよび共同研究者らにより、ウシヘモグロビンの場合について既に報告されている（２９）。
【００４７】
ＰＥＧ−Ａｌｂのコロイド浸透圧特性は、ＣＬに関連した血液減少の治療の際の血漿増量に関して非修飾アルブミンよりも優れている。ＰＥＧ−Ａｌｂは、危篤患者において末端器官に傷害のおそれの軽減、従って罹患率および死亡率の軽減に有用である。本発明はＡＲＤＳを予防または緩和するため、また、血圧を維持するために患者を前処理するのに有用である。分子量がより大きく、コロイド浸透圧特性が増強されたＰＥＧ−Ａｌｂは、内毒素誘発ショックの生理学的および組織学的兆候の改善に関して、生理食塩水またはアルブミンよりも極めて優れている。
【実施例】
【００４８】
以下の実施例は本発明をさらに説明するために示されるものである。本発明の範囲は次の実施例だけからなるとみなされるべきでない。
【００４９】
実施例Ｉ：敗血症におけるポリエチレングリコール修飾アルブミン（ＰＥＧ−Ａｌｂ）の使用
材料および方法： ＰＥＧ−Ａｌｂの調製。２ｇのヒトアルブミン(Sigma, St. Louis, MO)を４５ｍｌの５０ＭＭリン酸カリウム（一塩基性と二塩基性の混合物）ｐＨ７．４に溶かした。５００ｍｇのメトキシポリエチレングリコール(Sigma, St. Louis, MO)を塩化シアヌルで活性化し、４ｍｌの水に溶かした。１．４ｍｌのメトキシポリエチレングリコール溶液を４５ｍｌのヒトアルブミン溶液に加え、この混合物を室温で２時間攪拌した。この混合物を透析チューブ（分子量カットオフ−１２５００）に移し、３０００ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水に対し、４℃で７２時間透析した。ポリエチレングリコール修飾アルブミン（ＰＥＧＡ）を回収した後、使用するまで−２０℃で冷凍した。
【００５０】
動物： 体重４００〜４８０ｇの成体雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット(Charles River Laboratories, Portage, MI)を用いた。動物はAmerican Association for Accreditation of Laboratory Animal Care, International (AAALACI)認可施設で飼育した。標準ラット餌と水を自由に与えた。プロトコールは総てInstitutional Animal Care and Use CommitteeおよびABC (Hazard) Committeeにより認可されたものである。
【００５１】
方法：
動物を一晩絶食させた。ただし、水は自由に与えた。ナトリウムペントバルビタール（５０ｍｇ／ｋｇ）を用いて動物を腹腔内麻酔し、試験過程で必要に応じて追加量を与えた。動脈カテーテル(Intramedic PE-50, Clay Adams)を頚動脈に留置し、継続的に血圧をモニタリングするための変換器／増幅器(TestPoint, Capital Equipment Corporation, Billerica, Mass.)にホックで留めた。Ｇ２４カテーテルを用い、反対側の内頚静脈に静脈内ラインを留置した。基準ヘマトクリットとして頸動脈ラインから血液サンプルを採取し、アルブミンおよび置換輸液（０．９％生理食塩水１ｍｌ）を静脈内ラインから注入した。第１群には生理食塩水５ｍｌを注入した。第２群にはアルブミン０．６ｇ／ｋｇ体重（ＢＷ）を与え、第３群にはＰＥＧＡ０．６ｇ／ｋｇ ＢＷを与えた。３０分後、第３群には内毒素（ＬＰＳ）(Sigma Chemicals, St. Louis, MO)を、用量を変えて与えた。ラットは受けた蘇生輸液に基づいて３群に分けた：第１群（ｎ＝９）には生理食塩水中非修飾アルブミンを０．６ｇ／ｋｇで施し、アルブミンの注射濃度は４０ｍｇ／ｍｌであり、注射容量は１．５ｍｌ／１００ｇ体重（ＢＷ）であった。第２群（ｎ＝１２）には、アルブミンの代わりに、第１群と同じ用量、タンパク質濃度および注射容量でＰＥＧ−Ａｌｂを施した。第３群（ｎ＝６）には１．５ｍｌ／１００ｇ ＢＷの生理食塩水を施した。内毒素注入した後３時間、血圧のモニタリングを行い、その後ラットを安楽死させた。
【００５２】
ヘマトクリットおよびアルブミンに対する試験後血液サンプルを採取した。右の肺をホルマリンに漬け、ヘマトキシリン−エオシン染色のために病理状態を固定した。
【００５３】
潜在的血漿増量剤としてＰＥＧ修飾アルブミン（ＰＥＧ−Ａｌｂ）を検討した。複数の部位でアルブミンを修飾すると、非修飾アルブミンよりも有効分子容積が大きくなり、より大きな浸透圧を示した。ＰＥＧ−Ａｌｂ、アルブミンの溶液および生理食塩水を、ラット内毒素誘発ショックモデルで試験した。ポリエチレングリコール修飾ヒトアルブミン（ＰＥＧ−Ａｌｂ）で前処理すると、平均動脈圧が維持され（ｐ＝０．０２３）、血液希釈溶液によって証明されるように容量が保持され（ｐ＝０．００１）、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）の組織学的兆候が弱まった（ｐ＝０．００２）。ラットを蛍光標識ＰＥＧ−Ａｌｂおよびローダミン標識アルブミンの単独および組合せで前処理した後、ＬＰＳで処理した。肺切片の蛍光顕微鏡観察では、蛍光標識ＰＥＧ−Ａｌｂは血管内に保持されていたが、ローダミン標識アルブミンは保持されていなかったことが示された。生理食塩水または非修飾ヒトアルブミンの使用に比べ、ＰＥＧ−Ａｌｂは、血液減少状態において使用することができる有用な代替の血漿増量剤である。
【００５４】
実施例ＩＩ： 内毒素誘発ショックにおいて血管容積を回復させ、急性肺傷害を軽減するためのＰＥＧ−Ａｌｂの使用
アルブミンおよびＰＥＧＡ（ＰＥＧ−Ａｌｂ）の調製：
５０ｍＭ ＫＰｉ（ｐＨ７．５）に５０〜６０ｍｇ／ｍｌで溶解させたヒトアルブミン（タイプＶ， Sigma Chemical Co.）に、２２℃にて１０分間隔で４回、穏やかに攪拌しながらメトキシポリエチレングリコール塩化シアヌル（平均Ｍｒ５０００）を加えた（添加する度にアルブミン１ｍｇにつき０．２ｍｇ）。試薬を最後に添加した後４０分、反応物を攪拌した。修飾は速やかで、室温で１５分までに完了し、修飾程度は主として試薬の添加量に依存した。動物に注入する前に、アルブミンおよびＰＥＧ−Ａｌｂはいずれも、高分子量カットオフ透析チューブ（５０ｋＤａ分子量カットオフ）を用い、リン酸緩衝生理食塩水に対して４８時間、バッファーを３回交換して透析した。
【００５５】
ＦＩＴＣ−アルブミンおよびＦＩＴＣ−ＰＥＧ−Ａｌｂ
ヒトアルブミン（５０ｍｇ／ｍｌ）を５０ｍＭ ＫＰｉ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌおよび０．５ｍＭジチオトレイトール中で１時間インキュベートした。ジチオトレイトール処理アルブミンを４ｍＭ ５−ヨードアセトアミドフルオレセインまたは１．５ｍＭテトラメチルローダミン−５−ヨードアセトアミドとともに２時間インキュベートした。フルオレセイン修飾アルブミンを、リン酸緩衝生理食塩水を４回交換して４８時間透析し、遊離フルオレセインを除去した。ローダミン標識アルブミンをＳｅｐｈａｄｅｘ ５０によるクロマトグラフィーに付した後、リン酸緩衝生理食塩水に対して徹底的に透析した。
【００５６】
フルオレセイン標識アルブミンのいくらかをメトキシポリエチレングリコール塩化シアヌルで修飾し、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ２００でのゲル濾過により精製した。２００，０００を超える見掛けの分子量で溶出するＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ２００からの画分をプールし、ＰＭ１０膜を備えたＡｍｉｃｏｎ限外濾過セルを用いて濃縮した。ゲル電気泳動によるフルオレセインおよびローダミン標識アルブミンの分析では、蛍光がタンパク質と会合しており、遊離フルオレセインまたはローダミンの位置には蛍光が検出されないことが明らかになった。
【００５７】
生理学的研究
試験プロトコールはオハイオ医学大学のthe Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC)およびthe Academic Chemical Hazardous Committee (ACHC)に認可されたものであった。体重４００〜４８０ｇの成体雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット(Charles River Laboratories, Portage, MI)を用いた。動物はAmerican Association for Accreditation of Laboratory Animal Care, International (AAALACI)認可施設で飼育した。標準ラット餌と水を自由に与えた。試験前に動物を一晩絶食させたが、水は自由に与えた。
【００５８】
総てのラットをナトリウムペントバルビタール（５０ｍｇ／ｋｇ体重）を用いて腹腔内麻酔した後、１時間間隔で維持用量を静脈添加した。右頚動脈に留置し、血圧変換器と増幅器（ＢＬＰＲおよびＴＢＭ４，World Precision Instruments, Sarasota, FL）に接続したカテーテル(Intramedic PE-50, Clay Adams)から継続的に平均動脈圧（ＭＡＰ）を測定し、コンピューター(TestPoint, Capital Equipment, Billerica, Mass)に採集した。
注入用静脈ラインを左頚静脈に挿入した(G24 Protectiv*Plus, Johnson and Johnson/ Ethicon, Arlington, Texas)。
【００５９】
ラットを、投与した蘇生輸液に基づいて３群に分けた：第１群（ｎ＝９）には生理食塩水中の非修飾アルブミンを０．６ｇ／ｋｇ用量で投与し、アルブミン注射濃度は４０ｍｇ／ｍｌであり、注射容量は１．５ｍｌ／１００ｇ体重（ＢＷ）であった。第２群（ｎ＝１２）には、アルブミンの代わりに、ＰＥＧ−Ａｌｂを第１群と同じ用量、タンパク質濃度および注射容量で投与した。第３群（ｎ＝６）には、１．５ｍｌ／１００ｇ ＢＷの生理食塩水を投与した。基準ヘマトクリット（Ｈｃｔ）の測定のために１ｍｌの基準血液サンプルを頸動脈ラインから採取し、同量の０．９％生理食塩水に置換した。輸液注入開始時にＭＡＰのモニタリングを始めた。３０分後、生理食塩水に溶かした２０ｍｇ／ｋｇ ＢＷの内毒素（大腸菌(E. Coli)リポ多糖類［ＬＰＳ］，血清型０５５：Ｂ４５， Sigma Chemicals, St. Louis MO）を投与し、その後３時間ラットをモニタリングした。次ぎに、敗血後のＨｃｔを評価するために血液サンプルを採取した後、ラットを１５０ｍｇ／ｋｇ／ＢＷのペントバルビタールＩＰで安楽死させ、全採血した。最後に、片方の腎臓と両肺を摘出し、後の組織検査のために１０％ホルマリン中で速やかに固定した。
【００６０】
組織学的研究
肺および腎臓組織をホルマリン溶液から取り出し、ヘマトキシリンおよびエオシン染色を含む標準的な処理を施した。コード化したこれらの標本を盲検病理学者が光学顕微鏡で調べ、次の５ポイントシステムを用いて炎症の組織学的特徴にスコアを付けた：０＝有意な組織病理学的変化無し；１＝最少の間質の炎症性浸潤；２＝軽度の硝子質化を伴った軽度の間質の炎症性浸潤；３＝中度の硝子質化を伴った中度の間質の炎症性浸潤；４＝重度の硝子質化を伴った重度の間質の炎症性浸潤。一貫性を確保するために、同じ病理学者が２回の別の機会にサンプルを調べ、平均したスコアを用いた。
【００６１】
分子／生物物理学的研究
ＳＤＳゲル電気泳動。非修飾アルブミンおよびＰＥＧＡのサンプルを、ＳＤＳ（１％，Ｗ／Ｖ）およびβメルカプトエタノール（５％，Ｖ／Ｖ）を加え、沸騰水浴中で１分間加熱することにより、電気泳動用に調製した。サンプルを、７．５％または１０％アクリルアミドゲルで電気泳動に付した（３０）。
【００６２】
サイズ排除クロマトグラフィー
アルブミンおよびＰＥＧＡをベッド容量２４ｍｌのＳｕｐｅｒｏｓｅ ６カラム(Pharmacia)でのサイズ排除クロマトグラフィーにより分析した。サンプルまたは標品混合物（０．５ｍｌ）をカラムに適用し、１０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．５）および１５０ｍＭ ＮａＣｌを用い、０．５ｍｌ／分で溶出した。２８０ｎｍにおける吸光度を継続的にモニタリングした。
【００６３】
ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦタンパク質分析
表面増強レーザー脱離法／イオン化−タイム・オブ・フライト（ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析を用い、ＰＥＧ−アルブミンおよびアルブミンサンプルを同定した。サンプル１ｍｌ（１〜５ｍｇ／ｍｌ）を付着させ、脂肪コーティングしたアルミニウムＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐアレイ(H4 ProteinChip, Ciphergen Biosystems, Palo Alto, CA)の２ｍｍスポット上で直接風乾させた。１／２μｌのエネルギー吸収マトリックス（ＥＡＭ，５０％アセトニトリルおよび０．５％トリフルオロ酢酸水溶液中、３，５−ジメトキシ−４−ヒドロキシ桂皮酸の飽和溶液）を２回サンプルに適用し、風乾させた。
【００６４】
このＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐアレイをＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐリーダーに移し、真空チャンバー内でこのサンプルにレーザー（Ｎ２ ３２０ｎｍ−ＵＶ）を当てた。レーザーショット２回の後、そのマトリックスに吸着したタンパク質をイオン化し、アレイ表面から脱離させた。イオン化されたタンパク質を検出し、ＴＯＦ分析を用いて分子量を求めた。ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐシステム(PBSII series, Ciphergen)にて、Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ Ｐｅａｋｓ（バージョン２．１ｂ）ソフトウエアを用い、陽イオンモードでＴＯＦ質量スペクトルを採取した。６５回のレーザーショットのリアルタイムシグナル平均を求め、各スペクトルを作成した。
【００６５】
コロイド浸透圧（ＣＯＰ）
ＰＥＧＡ−Ａｌｂおよびアルブミンの双方をＣＯＰ測定のため同様に調製した。要するに、サンプルを１０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌに５０ｍｇ／ｍｌとなるように溶かし、３０℃にて１時間ジチオトレイトール（０．５ｍＭジチオトレイトール）で処理した後、３０℃１時間ヨードアセトアミド（５ｍＭヨードアセトアミド）とともにインキュベートした。次ぎに、このアセトアミド化アルブミン（５０ｍｇ／ｍｌを５ｍｌ）を、１０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．５）および１５０ｍＭ ＮａＣｌで平衡化し、アルブミン二量体および浸透圧の測定を妨げる他の低分子量および高分子量夾雑物を減らしたＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ３００（２．８ｃｍ×４０ｃｍ）でクロマトグラフィーに付した。最後に、アルブミンおよびＰＥＧＡの双方を、０．９％ＮａＣｌを数回交換して透析した。
【００６６】
各コロイドのＣＯＰの測定は、Ｗｅｓｃｏｒ Ｍｅｄｅｌ ４４２０コロイド浸透圧計(Logan, UT)を用い、広範囲の濃度で測定を繰り返した。この機器は０．９％生理食塩水をブランクとし、２０．２ｍＯｓｍアルブミン標準溶液で較正した。非修飾アルブミンの濃度は２８０ｎｍにおける吸光度から求め（ε２８０ｎｍ，１％＝５．３１）（３１）、乾重の測定により確認した。ＰＥＧ−Ａｌｂの濃度は乾重から推定した。
【００６７】
濃度［ｃ］に関して、ＣＯＰ［π］は、１）π−ｃ関係の理想的な成分から表される重量分子量［Ｍｒ］（３２）と、２）２つのパラメーターＢとおよびαを介した他の総てのビリアル係数の理想的でない関与を評価するための方程式の非線形最小２乗適合によって分析した。
【００６８】
この方程式の形は、ビリアル係数の数値の演繹的仮定を避ける従来使用されている方程式［π＝ＲＴ（ｃ／Ｍｒ＋Ｂｃ２＋Ｃｃ３．．．）］を微修正したさらに柔軟な形であり、Ｒ＝６３．３６４ｍｍＨｇ Ｍ−１、ｃは濃度（ｇ／ｄｌ）であり、Ｔは温度（２９５°Ｋ）である。
【００６９】
統計分析
これら３つの処理群の、ＬＰＳ前後のヘマトクリット間の差をＡＮＯＶＡで比較した。ここでは、ＡＮＯＶＡ二元配置反復測定を用い、ＬＰＳ前およびＬＰＳ後の種々の時点での平均動脈圧（ＭＡＰ）を比較した。各群間の個々の差をＴｕｋｅｙ多重比較検定を用いて評価した。ｐ＜０．０５を用い、統計学的有意性を示した。
【００７０】
生理学的研究
ＬＰＳ後の血管容積の収縮／拡大−誘発された敗血症をＭＡＰおよびＨｃｔの変化から推定した。これらの測定は双方とも、ＰＥＧ−Ａｌｂ、アルブミンまたは生理食塩水で前処理したラットでは有意に変動した。最初に、ＬＰＳボーラス注入後１５〜２５分内に３群総てがＭＡＰにおいて同様の〜４０％低下を示した（生理食塩水：１３５±１１から８１±３０ｍｍＨｇへ低下；アルブミン：１３４±１４から８５±２０ｍｍＨｇへ低下；ＰＥＧ−Ａｌｂ：１２５±１２から７９±１９ｍｍＨｇへ低下）（図２）。その後のＭＡＰの回復は、生理食塩水（９９±２９ｍｍＨｇ）およびアルブミン（１０８±１４ｍｍＨｇ）処理に比べ、ＰＥＧ−Ａｌｂ処理ラットでは有意に良好であった［ＭＡＰ［ＬＰＳ後３時間］＝１２０±１０ｍｍＨｇ；ｐ＝０．０２３）。ＭＡＰの回復は生理食塩水処理ラットに対してアルブミンではやや大きかったが、この差は有意ではなかった。
【００７１】
ＬＰＳ前のヘマトクリットは総ての試験群で同等であった［４４±２（生理食塩水）、４２±３（アルブミン）および４５±２（ＰＥＧ−Ａｌｂ）］。ＬＰＳ後３時間において、ヘマトクリット（後）は、アルブミン（Ｈｃｔ比（後／前）＝１．０９±０．１１）および生理食塩水（Ｈｃｔ比＝１．１９±０．０９）処理ラットの双方の基準（前）レベルよりも上昇したが、これは血管内液体容量の相対的低下または血液濃縮を示す（図１−Ａ）。これに対し、ＰＥＧ−Ａｌｂ処理ラットはＬＰＳ投与後の血液希釈を示した（Ｈｃｔ比＝０．９３±０．０７）。これらの傾向は各群内で再現性が高く、処理群間の差は統計学的に有意性が高かった（一元配置ＡＮＯＶＡ；ｐ＝０．００１）。最も重要なことでは、これらのＨＣＴの変化は、ＭＡＰ比とＨｃｔ比のクラスタリングにより証明されるように、一般にＭＡＰ回復の程度と層間していた（３３）。ここで、ＰＥＧ−Ａｌｂラットは一般にＨｃｔ比＜１（すなわち、血液希釈）およびＭＡＰ比１付近（すなわち、ＬＰＳ後３時間においてほぼ完全な回復）を示した。あるいは、生理食塩水およびアルブミン処理ラットでは、後／前ＭＡＰ比は相対的に低く（不完全なＭＡＰ回復）、Ｈｃｔ比は一般に＞１（血液濃縮）であった（図１Ｂ）。
【００７２】
組織学的研究
ＰＥＧ−Ａｌｂ処理ラットおよび対照（非敗血症）ラットから採取した肺組織切片の顕微鏡検査では、有意な組織病理学的変化が無かった（図３Ａ〜Ｄ）。その代わりに、ほとんどの生理食塩水処理ラットおよびアルブミン処理ラットでは、硝子質化および間質のリンパ性浸潤を含む、重度の急性肺傷害（ＡＬＩ）に一致する実質的な炎症性の組織病理学的変化が明らかであった（図３）。全体として、平均ＡＬＩスコア（０＝傷害無し；１＝最少；２＝軽度；３＝中度の；４＝重度）は、生理食塩水群（２．０±１．０；範囲０〜３）およびアルブミン群（２．４±０．９；範囲１〜４）の双方に比べ、ＰＥＧ−Ａｌｂ処理ラット（０．７６±０．４７；範囲０〜１）では有意に低かった（一元配置ＡＮＯＶＡ；Ｐ＝０．００２）。４つの群の総てで、腎臓の顕微鏡切片は有意な組織病理学的変化を示さなかった。
【００７３】
フルオレセイン標識ＰＥＧ−Ａｌｂ（緑）とローダミン標識アルブミン（赤）の混合物を注入した正常ラット（図８Ａ）および敗血症ラット（図８Ｂ）例からの結果は、これら２つの発色団の明瞭に異なる分布パターンを示した。特に、正常ラットの肺胞毛細血管領域は、敗血症ラットにおける発色団の拡散分布に比べ、黄色（すなわち、赤と緑）の局在を特徴とし、特に赤いローダミンはその管外遊出を示唆する。また、単一のコロイド種、すなわち、フルオレセイン標識ＰＥＧ−Ａｌｂ（図８Ｃ）およびフルオレセイン標識アルブミン（図８Ｄ）のいずれかを注射したラットからも一貫した知見が明らかである。ここでも、アルブミン処理敗血症ラットは拡散した蛍光を示したが、ＰＥＧ−Ａｌｂ処理ラットはそうではなかった。
【００７４】
ＰＥＧ−Ａｌｂの生物物理学的特性
分子サイズ−アルブミンおよびＰＥＧ−ＡｌｂのＳＤＳゲル電気泳動の結果を図５Ａ（右）に対比させる。予想としては、アルブミンはかなり均質のタンパク質として、その既知の分子量で泳動する。これに対し、ＰＥＧ−Ａｌｂはより大きな見掛けの分子量で泳動し、ＰＥＧ−Ａｌｂ材料はゲル内に容易に入らない。特筆すべきは、理想的でないタンパク質の場合、電気泳動移動度は、それらの分子量というより主としてそれらの拡大特性を反映したものである。修飾タンパク質の実質的不均質性は、複数のリシル残基でのＰＥＧ修飾によるものである。ＰＥＧ−Ａｌｂをゲル濾過でも調べた。ＳＤＳゲル電気泳動でのその挙動と一致して、この修飾タンパク質は実質的に不均質であり、５００，０００〜数百万の範囲の見掛けのＭｒとしてカラムから溶出する（図５Ｂ（左））。サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）カラムでのその挙動も、実際の分子量ではなく、結合されたＰＥＧの拡大特性の現れである。図７のアルブミンおよびＰＥＧ−Ａｌｂ双方の吸光度−Ｖｅ／Ｖ０データを用い、本発明者らは対応する平均Ｖｅ／Ｖ０がそれぞれ２．１１２および１．５８８であると算出した。これらのサンプルにおけるアルブミンおよびＰＥＧ−Ａｌｂの有効分子量（またはサイズ）はそれぞれ約７７，６７０Ｄａおよび９９４，３００Ｄａであり、あるいは相対的サイズ比は約１２．８であると判定された。アルブミン推定値は既知のアルブミンサイズ（６７，０００Ｄａ）よりも大きく、その単量体と二量体の間であり、これは、主要な単量体ピークと小さな二量体ピークという２つのアルブミン吸光度ピークの存在と一致している。
【００７５】
ＰＥＧ修飾の程度を種々の技術で調べるため、アルブミンおよびＰＥＧＡをＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析で分析した。両スペクトルとも、ａ）単量体と多量体の存在、より適切には、ｂ）一価種（ｚ＝１）ならびに多価種（ｚ＞２）の検出の結果としての複数ピークを示した。これらの作用によれば、主要な一価アルブミン単量体スペクトルピークは分子量６６，８８０±２，８００Ｄａを中心としていた（図６Ａ）。これに対し、対応するＰＥＧ−Ａｌｂピークはもっと不均質であり、７７．４から１００ｋＤａを超えるまでに離れた範囲の多数の分子量種を示した。これらの多様なＰＥＧ−Ａｌｂ成分は、リシル残基の修飾によりアルブミン１分子当たりに結合しているＰＥＧ基の数を反映したものである。実際に、これらのＰＥＧ−Ａｌｂ種の質量の隔たりは、試薬のサイズ（平均５０００Ｍｒ）と一致していた。ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦから推定されるＰＥＧ−Ａｌｂ単量体の平均分子量は９４．０００Ｄａ±８．０００Ｄａであった。これはアルブミン１つ当たりに平均５〜６個のＰＥＧ基の付着に相当していた。
【００７６】
コロイド浸透圧（π） アルブミンに比べ、オスモライトとしてのＰＥＧ−Ａｌｂの特性を評価するため、本発明者らはそれらの浸透圧（π）を広範な濃度（ｇ／ｄＬ）で調べた。アルブミンおよびＰＥＧ−Ａｌｂの双方は、たとえ異なっていても、タンパク質濃度に関して浸透圧の非線形的依存性を示し（図７）、それらの束一的特性、Ｄｏｎｎａｎ作用、およびそれらの分子排除体積（Λ）による作用を反映する。アルブミンに関するこれらのπ−濃度データを当てはめると、数平均分子量は６３，３００、ビリアル係数Ｂは１５．６という値、α＝２．０＊となった。これらの係数から、コンピューター計算したアルブミンの分子慣性半径（Ｒｇ）およびΛはそれぞれ３．９ｎｍおよび２，０７０ｎｍ３であった。これらの推定値は総て、これまでに発表されている値とよく一致している（３４）。ＰＥＧ−Ａｌｂのπ−濃度データは、アルブミンに比べて、より大きな非理想性またはひずみの増大を示した。ＰＥＧ−Ａｌｂの対応する数平均分子量は１２８，０００Ｄａ、Ｂ＝６２、α＝２．４０、Ｒｇ＝１０．０およびΛ＝３３，３７８ｎｍ３であった。これはＰＥＧ修飾後のΛの１６倍増に相当した。ＰＥＧ化によるタンパク質の拡大特性におけるこの相対的変化は、同じタンパク質に対するＳＥＣ測定から推定された１３倍増に匹敵する。
【００７７】
分子量を評価するためのこれら２つの方法（ＳＥＬＤＩおよびコロイド浸透圧測定）から、アルブミンでは同等の推定値が得られたが、ＰＥＧ−Ａｌｂの場合ではそうではなかった。後者の場合では、πに基づく推定値は１２８，０００Ｄａと予測されていたものよりも大きかった。浸透圧の導出から、その溶液中のあらゆる種の数平均分量が得られるので、この方法による分子量の過剰見積もりが多量体の存在に一致する。特定の理論に縛られるものではないが、ＳＥＬＤＩデータは実際にＰＥＧ−Ａｌｂ多量体の存在を示唆するので（図６）、これはこれらの明らかな差の可能性のある説明となると考えられる。
【００７８】
生理食塩水およびアルブミンに比べ、ＬＰＳ誘発性の敗血性ショックの前にＰＥＧ−Ａｌｂでラットを前処理すると、１）血圧のより完全な回復が得られ、２）ヘマトクリットは変化しないか、またはやや低下し（通常ＣＬを特徴とする血液濃縮とは反対の血液希釈を示唆する）、３）肺傷害が有意に軽減された。
【００７９】
齧歯類にはかなりの耐性があるので、ＭＯＤＳを伴う重度のヒト敗血症をシミュレートする方法として有意かつ持続的な低血圧を確保するために、比較的高用量のＬＰＳを試験に用いた（３５）。ＬＰＳに続発する低血圧は二相の応答を特徴とする。第一相では、ＬＰＳボーラス注入の１５〜２５分以内に動脈圧に急激な低下が起こる。この相は処理群間で違いはなく、アルブミンおよびＰＥＧ−Ａｌｂは、生理食塩水に比べて、内毒素の初期作用を変化させなかったことを示す。第二相の血圧降下は、主として、ＣＬを経て血漿容量を実質的に減らす誘導性硝酸オキシド（ｉＮＯＳ）の作用により起こる（３６）。ｉＮＯＳ ｍＲＮＡまたはペプチドは測定しなかったが、ｉＮＯＳは高ＬＰＳ用量（２０ｍｇ／Ｋｇ）の投与により誘導された可能性が高い（３７）。
【００８０】
アルブミンまたは生理食塩水に比べ、ＰＥＧ−Ａｌｂの優れた作用は、内毒素ショックのこの第二の血圧降下相に現れた。この証拠としては、より完全な血圧回復と相対的な血液希釈がある。また、肺の組織病理学からＰＥＧ−Ａｌｂ処理ラットの肺組織における最少の間質浸潤および硝子質化が明らかであり、一方、免疫蛍光研究は、ＣＬの存在下での明らかなアルブミンの管外遊出に比べ、ＰＥＧ−Ａｌｂは相当血管内に保持されることを示した。これらのことは総て、毛細血管漏出の低さおよび血漿増量特性の高さと一致する。
【００８１】
これらのin vitro測定は、アルブミンに比べ、ＰＥＧ−Ａｌｂ分子の実質的により大きな有効サイズおよびより大きなコロイド浸透圧は、細胞傷害および内皮の健全性の欠如の存在下で管外遊出しにくくなることを示している。実際に、ＳＥＣおよびコロイド浸透圧測定は、ＰＥＧ化後の分子構造の拡大／容積の拡大に１３〜１６倍増を示した。ＰＥＧ−Ａｌｂのコロイド特性の向上は親水性の増大をもたらし、これはより大きな流体力学／慣性半径（ＲＧ）および容積の拡大（Λ）に現れる。イヌ内毒素ショックモデルでは、毛細血管透過性の重篤度が、電気泳動による種々のタンパク質の分子量の測定から推定された（３８）。より大きな分子量はＭＷ９００，０００Ｄａに相当し、最小はアルブミン（６０，０００Ｄａ）である。アルブミンは慣性半径３．４ｎｍに相当し、最大タンパク質であるアポプフェリチン二量体は１２．１ｎｍであり、大きなギャップは中程度のギャップ（６０，０００〜５００，０００Ｄａ）に比べ、内皮にあまり典型的でなく（３９）、中度〜重度の漏出では、１０ｎｍの大きさのＰＥＧ−Ａｌｂが血管空間に保持されなければならないことが分かる。
【００８２】
実施例ＩＩＩ： ヒトアルブミンのマレイミド−ＰＥＧ誘導体の合成および精製が完成された
１０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌおよび０．５ｍＭジチオトレイトール中、ヒトアルブミン（Sigma Chemical Co., タイプＶ）５０ｍｇ／ｍｌを３０℃で１時間インキュベートした。マレイミド−メトキシポリエチレングリコール２０，０００Ｍｒ（Shearwater Inc., カタログ番号２Ｄ２ＭＯＰ０１）またはマレイミド−メトキシポリエチレングリコール４０，０００Ｍｒ（Shearwater Inc., カタログ番号２Ｄ２ＭＯＰ０１）を１ｍＭまで加え、反応物を３０℃で１時間インキュベートした。ＰＥＧ修飾アルブミンをＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ(Pharmacia)でのイオン交換クロマトグラフィーにより精製した。
【００８３】
図９は、ＰＥＧ−２０，０００（マレイミド）修飾アルブミンの精製を示す−マレイミドＰＥＧ２０，０００で修飾したヒトアルブミン（タンパク質７ｍｇ）を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ７．５、２５℃）で平衡化したＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（１．５ｃｍ×５ｃｍ）に適用した。このカラムを２７ｍｌ／時で溶出し、１．５ｍｌ画分を採取した。クロマトグラフィーは室温（２２℃）で行った。画分７からは、カラムを０〜０．５ＭのＮａＣｌ勾配（総量１００ｍｌ）で溶出した。非修飾アルブミンは画分３５〜４３の間に溶出する。図の挿入は、２８から始まる１つおきの画分のＳＤＳゲル電気泳動（１０％アクリルアミドゲル）の結果を示す。挿入部のゲルにおいてＡと表示されたレーンは、マーカーとしての非修飾アルブミンの泳動を示し、分子量マーカーの位置はゲルの右に示されている。
【００８４】
図１０は、ＰＥＧ−４０，０００（マレイミド）修飾アルブミンの精製を示す−マレイミドＰＥＧ４０，０００で修飾したヒトアルブミン（タンパク質６０ｍｇ）を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ７．５、２５℃）で平衡化したＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（１．５ｃｍ×１５ｃｍ）に適用した。クロマトグラフィーは室温（２２℃）で行った。このカラムを２７ｍｌ／時で溶出し、４ｍｌ画分を採取した。画分１５からは、カラムを０〜０．３ＭのＮａＣｌの直線勾配（総量２５０ｍｌ）で溶出した。非修飾アルブミンは画分４５〜５５の間に溶出する。図の挿入は、３１から始まる連続画分のＳＤＳゲル電気泳動（１０％アクリルアミドゲル）の結果を示す。挿入部のゲルにおいてＡと表示されたレーンは、マーカーとしての非修飾アルブミンの泳動を示し、分子量マーカーの位置はゲルの右に示されている。
【００８５】
実施例ＩＶ： より大きな、機能的に保存されたアルブミン（ＰＥＧ−ＡｌｂＣｙｓ−３４）の投与は肺血性ショックの転帰を改善する
別の態様では、本発明は、アルブミンより１６倍大きな（４２ａ）、本明細書において本発明者らが開発したポリエチレングリコール修飾アルブミン（ＰＥＧ−Ａｌｂ）に関する。代表的なＰＥＧ−Ａｌｂを図１１に示す。ＰＥＧ化は親水性の増大の他、血漿中のタンパク質の半減期を延長し（４３ａ）、タンパク質の免疫原性を低下させる（４４ａ〜４６ａ）。タンパク質にＰＥＧを結合させると、免疫系（細胞性または体液性）のタンパク質を非自己として認識する能力が低下する。ＰＥＧ化により誘導されるこのステルス効果は、ポリマーの結合による排除体積効果およびＰＥＧとアルブミンの間の適合性に二次的なものであり、これによりＰＥＧ−Ａｌｂは天然アルブミンに似たものとなる（４７ａ）。
【００８６】
合成コロイドとは異なり、ＰＥＧ−Ａｌｂは、オスモライトとしての、また抗酸化剤としての（３８ａ）、そしてヘムやビリルビンなどの溶解度の低い代謝産物の輸送体としての役割をはじめ、アルブミンの重要な生理学的機能を保持している（なお、後の２つの特徴は他のクリスタロイドおよびコロイドには付随しないものである）。様々なＰＥＧ修飾タンパク質を含む研究では、有意な毒性がないことが証明されている（４８ａ）。開発されている第一世代（ＰＥＧ−Ａｌｂ１）は、重度敗血症の盲腸結紮穿刺（ＣＬＰ）モデルおよびリポ多糖類（ＬＰＳ）モデルにおいて、アルブミンまたは生理食塩水よりも有効であった。ＰＥＧ−Ａｌｂ１で処理した動物は、コロイドのより良い血管内保持、良好な血行力学、および肺傷害の軽減を示した。ＰＥＧ−Ａｌｂ１の流体力学的半径の増大は、その管外遊出を減らし、血圧および器官潅流を維持しつつ末端器官の傷害を軽減した。さらに、コロイド浸透圧（ＣＯＰ）および高粘度などのＰＥＧ−Ａｌｂ１の生物物理学的特徴は、それ以下では末梢組織の潅流が不十分となるヘモグロビン（Ｈｂ）レベルとして定義される「輸血トリガー」点を低下させる（４９ａ）。
【００８７】
出血性ショックにおいては、毛細血管漏出（虚血／再潅流）の際のアルブミンの管外遊出が重要である。特に、血管内空間からのアルブミンの損失は２つの主要な系で有害である。１つは、アルブミンのコロイド浸透圧の力が失われ、組織浮腫が多臓器不全の発症に寄与するようになる。もう１つは、アルブミンにより提供される抗酸化作用が著しく低下し、酸化剤ストレスが血管傷害を起こし続けるようになり、さらなるアルブミンの毛細血管漏出および管外遊出を永続させる。特定の理論に縛られるわけではないが、本明細書において本発明者らは、より大きな（より大きな流体力学的半径）、機能的に保存された（その抗酸化剤機能に関してチオールとして保存されているＣｙｓ−３４）アルブミン（ＰＥＧ−ＡｌｂＣｙｓ−３４）は実験的出血性ショックの転帰を改善すると考えている。
【００８８】
一つの態様では、本発明は、出血性ショックの処置用の蘇生輸液としてのＰＥＧ−ＡｌｂＣｙｓ−３４に関する。有効流体力学的半径の大きいＰＥＧ−ＡｌｂＣｙｓ−３４は、虚血−再潅流傷害（Ｉ／Ｒ）およびショック状態を伴う毛細血管漏出において非修飾アルブミンで見られるように、血管内空間から漏出しない。血管内にＰＥＧ−ＡｌｂＣｙｓ−３４が保持されるとＰＥＧ−ＡｌｂＣｙｓ−３４は非修飾アルブミンおよび他の蘇生薬よりも、アルブミンのリガンド結合機能、抗酸化剤機能、抗炎症性機能および抗アポトーシス機能を保持しつつ、より有効となる。
【００８９】
別の態様では、本発明は軍用に特に有用である。第一に、ＰＥＧ−Ａｌｂは、ＬＰＳおよびＣＬＰショックモデルにおいて蘇生後のより良好な血圧回復によって証明されるように、血管容積を維持する。このデータはまた、ＰＥＧ−Ａｌｂが出血性ショックにおいても効果的である。第二に、その生物物理学的特徴（高ＣＯＰ、高粘度）のため、ＰＥＧ−Ａｌｂは輸血トリガーを７ｇ／ｄｌ未満のレベルにまで引き下げることができる。これは、末梢組織への酸素の送達が、輸血前に長時間、低ヘモグロビンレベルで維持されることを意味する。第三に、ＰＥＧ−Ａｌｂは凍結乾燥および再水和可能であり、これにより悪条件下でも保存および再構成が可能である。
【００９０】
生理学的研究
ＰＥＧ−Ａｌｂ１は３種類の異なるモデルで調べ、２つは敗血性ショックを模倣したものであり（ＣＬＰおよびＬＰＳ）、１つは出血性ショック（ＨＳ）を模倣するものである。これらの研究は、ＰＥＧ−ＡｌｂＣｙｓ−３４がＰＥＧ−Ａｌｂｉ、デンプンおよびＨＴＳよりも有効な蘇生薬であることを示す。
【００９１】
動物モデル
ＣＬＰモデル−メトキシポリエチレングリコールを用いて複数部位で修飾したアルブミンを評価した。この材料はＭＡＰの維持においてアルブミンまたは生理食塩水よりも有効である。ＰＥＧ−Ａｌｂ１はまた、血清コロイド浸透圧の維持にもより有効であった。ｍＰＥＧ５０００とアルブミンの混合物は、血圧の維持おいてアルブミン単独または生理食塩水よりも有効とは言えず、このことは、ＰＥＧ−Ａｌｂの有効性には、ＰＥＧがタンパク質と共有結合されていることが必要である。図１５に示されるように、遊離のＰＥＧが容易に排泄されることを示す研究（５０ａ）と一致して、遊離ＰＥＧ５０００の血液レベルは静脈投与後、尿に受け渡されるにつれ急速に低下する。１６ＡおよびＢで蛍光顕微鏡観察により示されるように、それぞれフルオレセインおよびテキサスレッドで標識したＰＥＧ−Ａｌｂ１および非修飾アルブミンをＣＬＰラットに投与した場合、フルオレセイン標識は肺血管系に保持されたが、テキサスレッドは肺の管外空間で検出された。対照動物では、フルオレセイン標識ＰＥＧ−Ａｌｂ１およびテキサスレッド標識アルブミンは双方とも、血管内空間にのみ見られた。これらの結果は、そのサイズが大きいことにより毛細血管漏出の際に血管にＰＥＧ−Ａｌｂ１が保持されることと一致する。
【００９２】
内毒素モデル−ラットＬＰＳショックモデルにおけるＰＥＧ−Ａｌｂ１も調べた。ＣＬＰモデルにおける結果と一致して、ＰＥＧ−Ａｌｂ１は非修飾アルブミンまたは生理食塩水に比べ、ＭＡＰの維持に有効であった。さらに、ＬＰＳ処理前のＰＥＧ−Ａｌｂ１の投与は生理食塩水またはアルブミン処理に比べ、肺傷害を有意に軽減した。硝子質化および間質のリンパ性浸潤を含む、重度の急性肺傷害（ＡＬＩ）に一致する炎症性の組織病理学的変化が、生理食塩水またはアルブミンで処理したほとんどのラットで検出されたが、ＰＥＧ−Ａｌｂ１で前処理されたラットではこれらの変化あまり明らかでない。肺傷害のスコアを示すため、代表的なＨ＆Ｅ切片を図１７に示す。急性肺傷害スコアは、生理食塩水（１．８±０．４）およびアルブミン（２±０．６３）処理動物に比べ、ＰＥＧ−Ａｌｂ１（１．１±１、ｐ＜０．０１）では有意に低かった。腎臓には有意な組織病理学的変化は検出されなかった。この結果は、血圧維持におけるその作用の他、内皮の健全性を維持することを示すが、ＰＥＧ−Ａｌｂ１の処理がＬＰＳショック誘発後に開始された場合には、この作用は見られなかった。保護の不在下で、ＬＰＳ後モデルにおける肺傷害作用は、チオール基（Ｃｙｓ−３４）をＰＥＧ化で保護する重要性を強調した。
【００９３】
出血性ショックモデル（ＨＳ）−ラット容積管理ＨＳモデルにおける、ＰＥＧ−Ａｌｂ１と非修飾アルブミンおよび生理食塩水の有効性を比較した。血液（２．６ｍｌ／１００ｇ ｂ．ｗ．）を１０分かけて抜き取って出血をシミュレートし、９０分後に生理食塩水、アルブミンまたはＰＥＧ−Ａｌｂ１で蘇生を開始した。図１８に示されるように、ＰＥＧ−Ａｌｂ１はアルブミンまたは生理食塩水よりも血圧の維持に有効であった。各群は出血後１５〜２５分でＭＡＰに同様の低下を示し、９０分後で同様の回復を示した。ＰＥＧ−Ａｌｂ処理動物は、生理食塩水またはアルブミン処理動物に比べ、処理の開始から４０分、５０分および６０分でＭＡＰに有意な増加を示した。ＰＥＧ−Ａｌｂ１では、ＭＡＰはゆっくり低下し、処理後により高いＭＡＰ応答プラトーに達した（ｐ＜０．０１）。Ｈｔｃは出血後低下し（表Ｉ）、蘇生後にさらに低下し、これはＰＥＧ−Ａｌｂ１蘇生で最も大きく、アルブミンよりもＰＥＧ−Ａｌｂの血管内保持が大きいことと一致していた（Ｐ＜０．０２）。生理食塩水およびアルブミン処理群のＣＯＰはＰＥＧ−Ａｌｂ１群よりも有意に低かった（図１８ａ表Ｉ）。これらの結果は敗血性ショックモデルと一致し、ＰＥＧ−Ａｌｂ１の有効性はショックのモデルに依存しないことを示す。
【００９４】
実施例１Ｖ−１ ＰＥＧ−ＡｌｂＣｙｓ−３４と他の蘇生薬との生理学的比較：
出血性ショックの試験モデル
ｃｙｓ ３４がチオールとして保持されているアルブミン（ＰＥＧ−ＡｌｂＣｙｓ−３４）を含むＰＥＧ−Ａｌｂを、十分特徴付けられているラットＨＳモデルで他の蘇生薬と比較した（５１ａ〜５３ａ）。肺傷害、組織潅流（過剰塩基、乳酸）、動脈血液ガス（ＡＢＧ）、平均動脈圧（ＭＡＰ）、心拍数（ＨＲ）および腎機能指数（クレアチニン）に関するものを含む、ショックの種々の側面の重篤度を反映するいくつかの生理学的パラメーターを調べた。この情報を用い、ＰＥＧ−Ａｌｂと、非修飾アルブミン、デンプンおよび高張生理食塩水などの確立された薬剤を比較した。また、ＰＥＧ−Ａｌｂの性能を最適化するため、ＰＥＧ−Ａｌｂを種々の程度のＰＥＧ修飾、種々のＰＥＧサイズ、および種々のタンパク質−ＰＥＧ結合と比較した。この試験モデルは、実際の生活に見られる状況を模倣する。フェーズ１（入院前）は初期外傷および野外で蘇生を施すことができる場所に個体を運ぶのに必要な時間に相当する。これは実際には、救急車で到着するＥＭＴにより施される蘇生または戦地の医者により提供された蘇生に相当する。フェーズＩＩ（入院）は、個体が病院に搬送された後に提供される処置に相当し、ここでは輸血を行うことができる。フェーズＩＩＩ（観察フェーズ）は、処置後の病院またはリハビリセンターでの時間に相当する。次のプロトコールを用いる。
【００９５】
フェーズＩ（入院前）−容積管理出血によりＨＳを開始する（２０分にわたり２．６ｍｌ／１００ｇ ｂ．ｗ．（Ｈ２０））。放出された血液は再注入のために保持する。２０分の時点で、８０分まで、輸液蘇生を行うか血液を抜き取るかしてＭＡＰを４０〜４５ｍｍ／Ｈｇの間に管理する。８０分の時点で、各処理群にラットを無作為化する。野外で施される蘇生をシミュレートするため、３０分間にわたり１１０分まで注入処置を行う。
【００９６】
フェーズＩＩ（病院フェーズ）−１１０分の時点で、輸血をシミュレートするために、放出された血液を１０分間にわたり注入する。これまでの研究では、このモデルを用い、フェーズＩＩの初期に重度の低血糖と代謝性アシドーシスで死に至るラットがあり、Ｈ２７０分まで、ＭＡＰを＞７０〜８０ｍｍ／Ｈｇに、グルコースを＞１５０ｍｇ／ｄｌに回復させるため重炭酸塩溶液とグルコースを注入する（５３ａ）。
【００９７】
フェーズＩＩＩ（観察フェーズ）−カテーテルを取り去り、麻酔を中断し、ラットをケージに戻して食物と水を与え、７２時間まで観察する。生存個体を２４時間おきにラット総合能力スコア（５４、５５） １＝正常、２＝中度障害、３＝重度障害、４＝昏睡、５＝脂肪）を用いて評価する。死に至るラットには７２時間前に壊死が起こる。生存個体を安楽死させる。フェーズＩおよびＩＩでは、ラットをペントバルビタール（５０ｍｇ／Ｋｇ ｉ．ｐ）で麻酔し、興奮に対して必要に応じて追加量（１２．５ｍｇ／Ｋｇ）を与える。切開部はブポバカイン（マーカイン０．０２５％）で処理する。プロトコールを図１９に模式的に示す。動脈血（０．３ｃｃ）を抜き取り、ＰＯ２、ＰＣＯ２、ｐＨ、Ｏ２飽和、乳酸塩、グルコース、ヘマトクリット、過剰塩基および電解質をモニタリングする(Stat Profile Ultra Gas and Electrolyte Analyzer, NOVA Biomedical, Waltham, MA)。０分、２０分、４５分、９０分、１５０分および２７０分の時点で採血し、ＲＬで置換する。基準時および安楽死の血液のクレアチニン、ＰＴ、ＰＴＴ（合成コロイドによっては凝固障害が伴う）、アルブミンレベル、粘度（円錐・平板型粘度計）およびコロイド浸透圧（モデル４４２０コロイド浸透圧計Wescor Inc., Logan, UT）を分析した。著しい低血圧から起こる心停止を避けるため、採血は最小限とする。
【００９８】
結果： データは、第一世代ＰＥＧ−Ａｌｂ（ＰＥＧ−Ａｌｂ１）が生理食塩水またはアルブミンよりも有効であることを示す。
【００９９】
比較を他の標準的な蘇生薬に拡げる。チオールが保護されたＰＥＧ−Ａｌｂ（ＰＥＧ−ＡｌｂＣｙｓ−３４）を調べる。２５％アルブミンは出血性ショックに有効であるが、５％アルブミンは有効でないことが分かっており（４０ａ、５６ａ）、蘇生薬の容量自体が重要である（同じ量であるがより高濃度の形態で与えられる）ことに着目することが重要である。濃縮形態が優れている理由は抗酸化作用を発揮するには閾値濃度のアルブミンが必要であるということで説明できる。あるいは、２５％アルブミンの使用に伴う高浸透圧が抗炎症作用に寄与する可能性もある（４０ａ）。５％および２５％のアルブミンおよびＰＥＧ−Ａｌｂをアルブミン含量に基づいて比較する。ヘタスターチ６％（Ｈｅｘｓｔｅｎｄ（登録商標））も蘇生に使用し、ＰＥＧ−Ａｌｂと比較する。高張生理食塩水（７．５％）はＰＥＧ−Ａｌｂと比較する第三の蘇生薬である。
【０１００】
毛細血管漏出研究
特定の理論に縛られるものではないが、本発明者らは、ＰＥＧ−Ａｌｂは毛細血管漏出の際に血管内に保持され、従って血液のコロイド浸透圧を維持すると考えている。本発明者らは、アルブミンよりも１６倍大きいＰＥＧ−Ａｌｂ１はＣＬＰおよびＬＰＳモデルに伴う毛細血管漏出状態にあって、管外遊出が少ないことを示した（４２ａ）。本発明者らは、出血性ショックモデルの場合にもそうであると決定付けた。本発明者らが開発した方法を用い、標識アルブミンおよびＰＥＧ−Ａｌｂ（テキサスレッド、ＴＲ）およびＰＥＧ−Ａｌｂ（フルオレセイン、Ｆ）をラットに注入し、注入後の異なる時点で分析のために尾の静脈から少量の血液を採取する。標識アルブミンの調製については、本明細書の、ＰＥＧ−Ａｌｂの生物物理学的同定を取り扱う節に記載されている。アルブミンが管外空間に失われ、ＰＥＧ−Ａｌｂが保持されるとすれば、アルブミンの喪失とＰＥＧ−Ａｌｂの優先的保持に一致して、フルオレセインとテキサスレッドの比（Ｆ／ＴＲ）が大きくなる。テキサスレッドとフルオレセインの励起スペクトルおよび発光スペクトルは有意に異なり、この２種類の色素の混合物は血清サンプル中で定量的に調べることができる。また、アルブミンとＰＥＧ−Ａｌｂの分布も、蛍光顕微鏡により肺の凍結組織切片で定量的に調べ、敗血性ショックのモデルで見られるように、ＰＥＧ−Ａｌｂが血管内に保持されるかどうかを判定することができる（図１６ＡおよびＢ）。
【０１０１】
この蛍光団がタンパク質の分布を変えないことを確認するためには、標識（フルオレセインアルブミンおよびテキサスレッドＰＥＧ−Ａｌｂ）を切り替える。気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬ）の蛍光アルブミンおよびＰＥＧ−Ａｌｂを調べ、もしＴＲアルブミンが優先的に漏出していれば、ＢＡＬのＦ／ＴＲ比が低下すると予測される。この方法を用い、一方が他方よりも有効に保持されるかどうかを判定するため、本発明者らが作製したＰＥＧ修飾アルブミンを比較する。
【０１０２】
他の態様では、肺の透過性を調べ、血管を透過しないエバンブルー色素（ＥＢＤ）を用いる別のアプローチが有用である（５７ａ）。ラットに内頚静脈カテーテルを通じて１％ＥＢＤ溶液を２０分間注入した後、安楽死させる。色素を完全に循環させた後（５分）、血液を抜き取り、血漿のＥＢＤ濃度を測定する。ラットを安楽死させ、肺、肝臓を摘出する。摘出した肺に対し、５ミリリットルの生理食塩水を３回注入してＢＡＬを行う。左の肺葉を、湿重／乾重測定用にとっておくため、生理食塩水が流れ込まないように結紮する。生理食塩水を注入しなかった肺を採取して重量測定し、乾燥のために真空炉に入れ、その後、管外液体漏出に代わるものとして湿重／乾重を測定する。合わせたＢＡＬ液を遠心分離して細胞を除去し、上清をＥＢＤに関して分析した。ＢＡＬ液のＥＢＤ濃度は、血漿中に存在するもののパーセンテージとして表す。すなわち、ＢＡＬ／血漿ＥＢＤを、肺組織の湿重／乾重とともに処理群の間で比較する。
【０１０３】
血行力学
敗血性ショックモデルで生理食塩水およびアルブミンと比べたＰＥＧ−Ａｌｂ１の特徴は、その血圧を維持し、血液濃縮を防ぐ能力である。出血性ショックモデルにおける重要な問題は、標準的な蘇生薬に比べてＰＥＧ−ＡｌｂＣｙｓ−３４がいかによく働くかということである。ラットをナトリウムペントバルビタールで麻酔した後、必要に応じて鎮静を維持する。右頚動脈に動脈カテーテル(Intramedic PE-50, Clay Adams)を挿入し、血圧変換器に接続し、増幅させ、継続的にモニタリングする（サンプリング速度１００Ｈｚ；ＭＰ１００, BioPac Systems Inc, Santa Barbara, CA）し、コンピューターに採集する。液体注入のため、左頚静脈に静脈ライン（G24 Protective*Plus, Johnson and Johnson/Ethicon, Arlington, Texas）を挿入する。種々の液体蘇生薬を投与した動物のＭＡＰおよびＨＲをモニタリングする。入院前フェーズでは、総てのラットに同レベルの虚血を最低６０分与え、その後、各処理群に無作為化する。クリスタロイド群にはコロイド群の容量の３倍、ＨＴＳ群の容量の８倍を与える。ＣＬは出血性ショック後２０分といった早いうちに起こり得るということに基づけば、ＰＥＧ−Ａｌｂは、初期段階（入院前）で始めるとＭＡＰに優れた能力を示す（５８ａ）。入院フェーズでは、ＰＥＧ−ＡｌｂＣｙｓ−３４群の能力は、次の理由から、他の処理群より優れている。１）処理後（再潅流）、毛細血管漏出はいっそう重篤になり、ここでＰＥＧ−Ａｌｂは血管空間により良く保持される；２）クリスタロイドおよび合成コロイドとは対照的に、ＰＥＧ−ＡｌｂＣｙｓ−３４は酸化産物を減らすことで、内因的血圧に対する血管の感受性を高める（１０ａ）。
【０１０４】
潅流研究：
出血性ショック中の生体器官の潅流不足が臓器不全の主因である。ＰＥＧ−Ａｌｂと他の蘇生薬を比較するため、薬剤血流低下の指標となるいくつかの生理学的パラメーターを調べる。
【０１０５】
ａ．乳酸−乳酸レベルは出血性ショックにおいて続発する臓器不全と相関がある（５９ａ）。エピネフリンレベルの上昇（ショックに続発する）により、Ｎａ＋−Ｋ＋ ＡＴＰアーゼの活性を刺激することでＡＴＰが低下し（６０ａ）、その結果、ミトコンドリアの機能不全と嫌気性解糖のために乳酸塩の生産が高まる。ＰＥＧ−Ａｌｂ処理群における潅流の向上は、次の要因に続発するものであると予測される。１）全身の血圧の維持が良好であること、および２）ＰＥＧ−Ａｌｂの生物物理学的特徴により高まった微細循環レベルで潅流が良好なこと（ＣＯＰおよび粘度の上昇）。これは、一酸化窒素の増加を刺激する能才血管レベルでの剪断応力を高め、その結果、血管拡張と潅流の向上がもたらされる（４９ａ）。
【０１０６】
ｂ．過剰塩基（ＢＥ）Ｆｅｎｃｌ−Ｓｔｅｗａｒｔ（６１ａ，６２ａ）法 不足塩基量は、生理学的正常値のＰａＯ２、ＰａＣＯ２および温度で、全血１リットルを通常のｐＨまで滴定するのに必要な塩基量と定義される（６３ａ）。ＢＥは、標準重炭酸塩において平均値２２．９からの偏差に因数１．２を掛けることにより得られる（６４ａ）。ＢＥの算出では、通常の水分含量、電解質およびアルブミンを仮定する。血漿アルブミン濃度の有意な変化が予測されるので、これは適切である。アルブミンが１ｇ／ｄｌだけ低下すると、ＢＥは３．７ｍＥｑ／Ｌだけ低下する（６１ａ）。小児科ＩＣＵ患者のコホートにおいてナトリウム、塩化物およびアルブミンに関して補正したＢＥは、ＢＥ算出値、陰イオンギャップおよび乳酸塩よりも死亡率と良好な相関を示した（６２ａ）。−５ｍＥｑ／Ｌ以上の値はいずれも有意である。測定されていない陰イオンに関する過剰塩基補正値（Ｂｅｕａ）は、次のように定義される：
Ｂｅｕａ＝ＢＥ−（Ｂｅｆｗ＋Ｂｅｃｌ＋Ｂｅａｌｂ）。
【０１０７】
この式の用語は以下のとおり：
ＢＥｕａ−測定されていない陰イオンに関して補正したＢＥ；
ＢＥｆｗ−自由水作用により生じる過剰塩基＝０．３＊Ｎａ−１４０；
ＢＥｃｌ−塩化物の変化により生じる過剰塩基＝１０２−Ｃｌｃｏｒ（ここで、Ｃｌｃｏｒ＝ＣＬ＊１４０／Ｎ）；
ＢＥａｌｂ−アルブミンの変化により生じる過剰塩基＝３．４＊（４．５−アルブミン）。
【０１０８】
ｃ．粘度−出血性ショックの処置の際、大容量のクリスタロイドおよびコロイドを用いる蘇生を行うと、ヘマトクリットおよび血液粘度が低下する。組織学的に、血液喪失の補正におけるコロイドおよびクリスタロイドの使用は、輸血トリガーと呼ばれるレベル（５０％のＨｂ喪失またはＨｂ７ｇ／ｄｌ）までは安全であるとみなした（６５ａ）。ヘマトクリットが基準値の５０％を下回るまでに低下する場合は、毛細血管レベルで剪断応力が低下し、その結果、血管収縮が起こり、組織への酸素送達が低下する。Ｔｓａｉのグループおよび他者による研究（４９ａ、６５ａ、６６ａ）では、粘度上昇は輸血または組織へ酸素を送るための他の薬剤の前に、組織への酸素送達を維持する助けとなることが示されている。ＰＥＧ−Ａｌｂは、他の重合タンパク質がそうであるように（６７ａ）、粘度を増すはずである。ＣＬＰラットにＰＥＧ−Ａｌｂを３ｇ／ｄｌで与えた場合、血清粘度（円錐・平板型粘度計で測定）は３ｃＰであり、その血液希釈度で酸素送達を維持するのに必要であるとみなれるレベルであった（６６ａ）。図２０に示されるように、粘度はＰＥＧ−Ａｌｂ濃度に直線的に依存するが、コロイド浸透圧は非線形濃度依存性である。
【０１０９】
実施例ＩＶ−２−酸化ストレスおよび全身性炎症性応答の抑制におけるＰＥＧ−ＡｌｂＣｙｓ−３４の有効性に関する分析
in vivo研究は、「酸化ストレスが強く、天然アルブミンが漏出する虚血／再潅流傷害の際にＰＥＧ−ＡｌｂＣｙｓ−３４を血管空間に維持する」と、血管空間の抗酸化能が高まり、アポトーシスが低下し、炎症が制御される。
【０１１０】
炎症研究
ＮＦ−κＢは出血性ショックの後に活性化され、ＴＮＦ−αなどのサイトカインの過剰発現および産生に至る（６８ａ）。虚血中（６９ａ）または蘇生中（７０ａ）のＮＦ−κＢの活性化は、炎症性応答の誘発および悪化した炎症性応答の持続において重要な段階である考えられる。重要なこととしては、アルブミンが投与される容量は炎症に重要な役割を果たしているのが明らかである。２５％アルブミンは、肺の好中球隔離を低下させ、ショック／蘇生後の肺傷害を防いだが、５％またはＲ／Ｌではそうではなかった（４０ａ）。これは、２種類の濃度を用いてアルブミン調製物を試験するための基礎である。
【０１１１】
ａ．組織学−急性肺傷害（ＡＬＩ）および広汎性肺胞傷害（ＤＡＤ）は出血性ショック後によくある合併症であり、重度の炎症性応答を伴う場合が多い（７１ａ）。ホルマリン固定した肺組織に標準的なヘマトキシリンおよびエオシン染色処理を行う。コード化した標本を盲検病理学者が光学顕微鏡で調べ、次の５点系を用いて急性炎症性肺傷害にスコアを付ける：０＝有意な組織病理学的変化無し；１＝最少の間質の炎症性浸潤；２＝軽度の硝子質化を伴った軽度の間質の炎症性浸潤；３＝中度の硝子質化を伴った中度の間質の炎症性浸潤；４＝重度の硝子質化を伴った重度の間質の炎症性浸潤。一貫性を確保するために、サンプルは２回調べ、スコアを平均する。
【０１１２】
ｂ．肺のミエロペルオキシダーゼ−好中球と種々の細胞、特に内皮細胞との間の相互作用は蘇生後の臓器傷害に決定的な役割を果たしている。好中球隔離の指標として、炎症の重篤度に関連している、肺抽出物中のミエロペルオキシダーゼ活性を測定する（７２ａ）。
【０１１３】
ｃ．サイトカイン−再潅流後、局部的な炎症反応には、好中球動員の他、ＴＮＦ−αなどのサイトカインが関与している（７３ａ，７４ａ）。同じＨＳラットモデルにおいて、肝臓のＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−α ｍＲＮＡの血漿レベルは出血が終わった後２０分で有意に増加していた（４ａ）。高濃度のアルブミンはＴＮＦ−αおよびＩＬ−６などの炎症性サイトカインの生産を低下させたことが示されている（３９ａ，７５ａ）。フェーズＩＩおよびＩＩＩ中の肺組織および肝臓組織でＴＮＦ−αおよびＩＬ−６を測定する。基準時とフェーズＩ、ＩＩおよびＩＩＩが終わった後に血清において、製造業者のプロトコールに従い(Pharmingen, San Diego, A)、標準的なサイトカインアッセイを行う。
【０１１４】
ｄ．ＮＦ−κＢ活性化−虚血期または蘇生後に起こるＮＦ−κＢの活性化は、出血性ショックおよび蘇生における機能不全的炎症応答と結びついている。電気泳動移動度シフトアッセイにより測定された肝臓ＮＦ−κＢ結合活性は出血が終わった後１０分の核抽出物において増加していた。ウエスタンブロット研究では、細胞質抽出物中の阻害タンパク質ＩκＢαのレベルが出血が終わった後５分で低下することを示している（４ａ）。炎症性サイトカインはＮＦ−κＢ結合部位を含み（７６ａ）、それらの部位へのＮＦ−κＢの結合が増えると、サイトカイン発現が増強され、炎症および組織傷害が増える。これは、ＮＦ−κＢのダウンレギュレーションが炎症を軽減すると予測されることを意味する。細胞培養系では、アルブミンが、ＴＮＦαに誘導されるＮＦ−κＢの移動を防ぐのに十分に細胞内グルタチオンを増加させたことが示されている（７７ａ）。フェーズＩＩおよびＩＩＩの後、肺および肝臓でＮＦ−κＢを測定する。ＮＦ−κＢの低下は正の蘇生作用の指標として用いられる。電気泳動移動度シフトアッセイを用いてＮＦ−κＢを測定し、ウエスタンブロット解析を用いてＩκＢαを測定する（４）。
【０１１５】
実施例ＩＶ−３−アポトーシスおよび酸化
虚血−再潅流の結果、内皮の健全性が損なわれる（７８ａ，７９ａ）。肺動脈内皮細胞（ＥＣ）虚血症のヒト血漿に曝したところ、１０分後にそれらは丸くなり、ギャップを形成し、その後、突起ができる（８０ａ，８１ａ）。毛細血管漏出症候群患者由来の血清に曝した後にミトコンドリアＥＣ培養物でも同じ形態変化が見られる（１２ａ）。ＥＣのアポトーシスを形態学的基準、血漿ホスファチジルセリン曝露（アネキシン染色）およびＤＮＡのフラグメンテーションにより明らかにした。内皮細胞におけるＢａｘ／Ｂｃｌ２に増加を免疫組織化学により検出した。これらの作用の機構を細胞内反応性酸素種（ＲＯＳ）を測定することで探索し、その結果から、酸化性の傷害がＥＣのアポトーシス機構に役割を果たしていることが示唆された（１２ａ）。酸化ストレスはアポトーシスの周知のインデューサーである（１１ａ）。さらに、外傷および出血後にアポトーシスの増強が起こる（１５ａ，７８ａ，７９ａ，８２ａ）。カスパーゼ阻害剤によるアポトーシスの阻害は、Ｉ／Ｒにより誘発される炎症を弱めた（３６ａ，８３ａ，８４ａ）。虚血−再潅流に曝された組織では、抗酸化剤がこの傷害からの損傷を最小限にした。アルブミンは血漿における主要な細胞外抗酸化剤である。アルブミンは酵素γグルタミルシステインジペプチドを通じてこの機能を発揮し、そこでアルブミンはグルタチオンの合成に重要な役割を果たす（３８ａ）。グルタチオンは哺乳動物細胞に存在する主要な低分子量可溶性チオールであり（８５ａ）、その枯渇はアポトーシスの誘導に役割を果たす（８６，８７）。アルブミンがいかにしてその抗酸化活性を発揮するかを見る別の研究では（４０）、１つの遊離チオール（ｃｙｓ３４）を修飾すると、抗酸化活性に４５％の低下を伴った（８８ａ）。アルブミンは、そのグルタチオン（ＧＳＨ）増加能により酸化から保護される。逆に、ＧＳＨが低下すると、ａ）カスパーゼ３およびポリＡＤＰリボースポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）のフラグメンテーションが活性化し（８９ａ）、ｂ）Ｂｃｌ−２／Ｂａｘ比が低下する。後者の比は細胞生存、特に酸化傷害に対する防御の強力な指標である（９０ａ，９１ａ）。結果として、アルブミンは、その抗酸化剤としての機能を通じて、アポトーシスからの保護作用に有意に寄与する。内皮に比べ、アルブミンは微小血管透過性を低下させ（３３ａ，９２ａ，９３ａ）、内皮細胞のアポトーシスを防ぐのに不可欠な役割を果たした（３６ａ，８４ａ）。
【０１１６】
実施例ＩＶ−４ 肺組織および肝臓組織におけるＩ／Ｒ後の細胞傷害に対するＰＥＧ−ＡｌｂｃＣｙｓ−３４の作用
ａ．ＴＵＮＥＬアッセイ−この方法では、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを用い、ＤＮＡ鎖の破断をフルオレセインコンジュゲートヌクレオチドで標識する（９４ａ）。アポトーシス検出キット(Boehringer, Indianapolis, IN)を用いる。組織サンプルは盲検病理学者が調べる。Ｂ．アポトーシスマーカーのウエスタンブロット解析−組織サンプルを急速冷凍し、ウエスタンブロット解析のための抽出まで−８０℃で保存する。アポトーシスは、その存在または修飾がアポトーシスに伴ういくつかのタンパク質を調べることにより検出される。ウエスタンブロット解析を用い、アポトーシス誘導タンパク質のＲｈｅ発現および抗アポトーシスタンパク質ｂｃｌ−２を調べる。ポリＡＤＰ−リボースポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）の切断産物に関する組織抽出物を分析する。ＰＡＲＰはカスパーゼ３および７の基質であり、認知されているアポトーシスマーカーである。全長ＰＡＲＰ（１１５Ｋｄａ）は、８５〜９０Ｋｄａと２３〜２４Ｋｄａの断片に切断され、その結果、その酵素活性が不活性化される（１１，９５）。
【０１１７】
ｂ．ｂａｘおよびカスパーゼ−３に対する免疫組織化学染色−組織をパラフィンに包埋し、免疫染色用に厚さ５ミクロンの切片に切断する。ＨＳ動物および対照動物から切片を作製する。活性型カスパーゼ−３に特異的なポリクローナルウサギ抗体を用いる。薄層組織切片中のカスパーゼ３の分布を、蛍光二次抗体を用いた免疫染色により判定する。内皮に同時局在させるため、ＣＤ３４染色および因子ＶＩＩＩ染色を用いる。陰性対照切片にも、一次抗体を除き、同じ処理を行う。対照動物および処理動物からの免疫染色スライドをコード化し、盲検のリーダーが４０倍で読み取る。各スライドについて独立した２回の読み取り値を得、陽性細胞／ｍｍ２組織のパーセンテージとして表す。
【０１１８】
ｃ．グルタチオンの測定−ＨＳに伴う酸化ストレスは、還元型／酸化型グルタチオンＧＳＨ／ＧＳＳＧ比に反映される。よって、肺における還元型および酸化型グルタチオンを、Hissin and Hilfが記載さいている手順（９６）に従って測定する。冷凍組織をＴＣＡで抽出し、中和し、抽出物中のＧＳＨおよびＧＳＳＧ含量をｏ−フタルジアルデヒド（ＯＰＴ）との反応により測定し、生じた蛍光を、標品として確実なＧＳＨおよびＧＳＳＧを用いてモニタリングする。ＰＥＧ−Ａｌｂ１を含む他の群に比べ、ＰＥＧ−ＡｌｂＣｙｓ−３４で処理した後のＧＳＨ／ＧＳＳＧは上昇する。これはＰＡＲＰの低さおよびｂａｘ／ｂｃｌ−２の低下により明らかなように、低いアポトーシス活性と相関している。
【０１１９】
ｄ．マロンジアルデヒドの測定−組織抽出物中のマロンジアルデヒド（ＭＤＡ）もＨＳに伴う酸化ストレスのマーカーとして用いられる。屠殺後に摘出した肺および肝臓のマロンジアルデヒド（ＭＤＡ）（９７ａ）および総抗酸化能（ＴＡＯＣ）（９８ａ，９９ａ）を測定する。ＭＤＡはＨＰＬＣ法を用いてアッセイする（９４ａ）。脂質の過酸化の初期マーカーであるＭＤＡはＴＡＯＣとともに上昇するが、ＧＳＨ／ＧＳＳＧ比は低下すると予測される。
【０１２０】
実施例ＩＶ−５ ＰＥＧ−Ａｌｂの作製および生物物理学的特徴付け
ＰＥＧ−アルブミンのin vivo有効性の実施例と並行して、ショック治療におけるそのin vivo有効性と相関する特性を特定するため、修飾アルブミンに対する物理的研究を行う。
【０１２１】
合成方法、産物サイズの分布、タンパク質の二次構造およびコンフォメーションに対する修飾の効果、アルブミンのコロイド浸透圧特性に対するＰＥＧ修飾の効果、および生理学的に関連のあるリガンドの結合に対する効果を評価する。実施例ＩＶ−５ａではＰＥＧ−Ａｌｂの作製および特性に関する予備研究を、実施例ＩＶ−５ｂでは提案される研究を記載する。
【０１２２】
実施例ＩＶ−５ａ ＰＥＧ−Ａｌｂに関する生物物理学的予備研究
１．ＰＥＧ−Ａｌｂの作製およびサイズ分析
修飾の様式および程度ならびにアルブミンに結合しているｍＰＥＧ（メトキシポリエチレングリコール）のサイズはその生物物理学的特性およびin vivo特性を変化させ得るので、本発明者らはＰＥＧとアルブミンを連結する種々の方法を検討し、サイズ、安定性および浸透圧特性に関して改変されたタンパク質を同定した。本発明者らはＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ｍＰＥＧ５０００）、塩化シアヌル（ｍＰＥＧ５０００）、およびチオール選択性マレイミド誘導体（ｍＰＥＧ２００００およびｍＰＥＧ４００００）を検討した。
【０１２３】
塩化シアヌル（ｍＰＥＧ５０００）誘導体を動物で試験した。これらの修飾様式は単純、迅速であり、ほとんどのアルブミンが修飾される。過剰量の試薬と非修飾アルブミンをゲル濾過またはイオン交換クロマトグラフィーにより除去する。ＮＨＳエステルおよび塩化シアヌル（双方ともリシルε−アミノ基に選択的）およびマレイミド（システイニルチオールに選択的）は市販されており、穏和な条件下で容易に反応する。図２１は塩化シアヌルｍＰＥＧ５０００で修飾されたアルブミンの分析結果を示す。複数の残基を修飾する試薬に対して予測されるように、ＣＮＣＩ−ｍＰＥＧ５０００修飾アルブミンは、ＳＤＳゲル電気泳動（Ｍｒ，ａｐｐ＞２５０，０００）またはＳｕｐｅｒｏｓｅ ６でのゲル濾過（Ｍｒ，ａｐｐ＞４５０，０００）で調べた際に不均質である。ＳＤＳゲルで見られた種の分子量はＰＥＧの拡大特性により、標品として用いたタンパク質と同じ質量のＳＤＳと結びついていない可能性があるという事実のために明らかでない。アルブミンは、修飾の際の試薬／タンパク質比を高めることで、この試薬でより広範囲に修飾することができる。生成物の不均質性はゲル濾過によるサイズ選択で軽減することができる。図２２は、分取Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ３００カラムで分画した材料（Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩと表示）のＳｕｐｅｒｏｓｅ ６による分析的ゲル濾過の結果を、非修飾アルブミンおよび非分画材料（Ｕと表示）とともに示す。
【０１２４】
ヒトアルブミンの単一のチオール（１００−１０２）はめずらしく低いｐＫａ（およそ５．５）を有するので、タンパク質のジスルフィド構造を混乱させずにチオール選択性試薬で修飾することができる。本発明の一つの態様に従い、本発明者らは、種々のサイズのｍＰＥＧと結合させた（２０，０００Ｍｒ誘導体および分枝型４０，０００Ｍｒ誘導体）。アルブミンをジチオトレイトールとともにインキュベートし、ｃｙｓ３４を介してアルブミンと結合している低分子量産物をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ５０クロマトグラフィーにより取り出した後、マレイミドｍＰＥＧ４００００で修飾した。図２３は、Ｑ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅでのｍＰＥＧ４００００修飾アルブミンの精製の結果を示す。ＣＮＣＩ−ｍＰＥＧ５０００修飾アルブミンとは異なり、この材料は均質であり、単一のシステイニル残基の修飾に一致する。本発明者らは同じアプローチを用いてｍＰＥＧ２００００アルブミンを作製し、それもまた均質なタンパク質として挙動する。ＳＤＳゲル電気泳動での挙動に一致して、ｍＰＥＧ２００００アルブミンおよびｍＰＥＧ４００００アルブミンは、図２４に示されるように、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ ６でのゲル濾過により調べた場合、単一の対称ピークとして溶出する。これらの修飾タンパク質は、単一修飾種として推定される分子量（ｍＰＥＧ２００００アルブミンでは８７，０００、ｍＰＥＧ４００００アルブミンでは１０７，０００）を考えれば、予測されるものよりも著しく大きいサイズで溶出する。この挙動はこれらのＰＥＧの拡大構造と一致する。ＰＥＧ４００００アルブミンのＳＥＬＤＩ質量分析では、１０８，０００Ｍｒを中心とする単一のブロードピークが得られたが、これはそれが単一の修飾であることを示している。これらの修飾アルブミンのゲル濾過での挙動は、それらがＰＥＧの拡大構造による拡大構造を持っていることを示す。
【０１２５】
２．ＰＥＧ−Ａｌｂの熱力学的安定性およびコンフォメーション
これらのｏＰＥＧ−Ａｌｂの分析の争点は、その修飾がアルブミンの天然構造、さらに可能性としては、リガンド結合特性および安定性を変化させるかどうかということである。本発明者らは、尿素により誘導される脱フォールディングを分析することより、ＰＥＧ−Ａｌｂの安定性を調べた。これは、タンパク質の熱力学的安定性を研究する標準的な方法であり、脱フォールディングの自由エネルギーが得られ、そのタンパク質が脱フォールディング中間体と考えられるかどうかを明らかにすることができる（１０３ａ−１０５ａ）。このタンパク質を変性剤の濃度を増しながらインキュベートし、天然状態および脱フォールディング状態に特徴的な分光光度シグナルを調べる。本発明者らは、トリプトファン（ｔｒｐ２１４）の蛍光発光波長（強度平均発光波長＜λ＞）におけるシフトをシグナルとして用いたが、これはタンパク質を脱フォールディングする際に顕著な赤色シフトが存在するためである（１０６ａ）。非修飾アルブミン（パネルＡ）、ｍＰＥＧ２００００修飾アルブミン（パネルＢ）およびｍＰＥＧ４００００修飾アルブミン（パネルＣ）を含むこのような研究の結果の例を図２５に示す。他者らの研究では、非修飾ヒトアルブミンは少なくとも１つの中間体種を伴う複雑な脱フォールディング経路を示すことが示されており（１０６ａ，１０７ａ）、本発明者らの結果が確認される。ｍＰＥＧ２００００およびｍＰＥＧ４００００修飾アルブミンの脱フォールディングは、非修飾アルブミンとの類似性が著しく（図１５パネルＡ）、このＰＥＧ修飾アルブミンは非修飾アルブミンによりもやや安定性を欠いているだけである。ｍＰＥＧ２００００修飾アルブミンは、中程度の尿素濃度で若干の青色シフトを示し、これは部分的に脱フォールディングした中間体種におけるトリプトファンの状態が変化している可能性があることを示唆する。ｍＰＥＧ２００００修飾アルブミンとｍＰＥＧ４００００修飾アルブミンは双方とも、この脱フォールディングの中間点は、非修飾アルブミンの場合と同じ濃度に存在する（７Ｍ）。本発明者らは、種々のサイズ分画多重修飾ｍＰＥＧ５０００アルブミンに対して同様の脱フォールディング研究を行ったところ、それらの結果は単一修飾のアルブミンで得られたものと同様である。全体として、ＰＥＧ修飾はそれほど安定性を欠いていない。
【０１２６】
本発明者らはまた、ＰＥＧ−Ａｌｂの１つ（ＰＥＧ４０−Ａｌｂ）と非修飾アルブミンを示差走査熱量測定法（ＤＳＣ）により比較した。このアプローチにより熱力学的安定性に関する情報が得られ、これを用いてコンフォメーションおよび安定性に対するリガンドの効果を検出することができる。図２６は、ＰＥＧ−Ａｌｂ４０（ＰＥＧ４０）および非修飾アルブミン（Ａｌｂ）を用いたＤＳＣ実験の結果を示す。これらのＤＳＣスキャンは、１つには、熱により誘導される脱フォールディングに対してタンパク質を安定化させる傾向がある脂肪酸の結合のために複雑である。重要な特徴は、ＰＥＧ４０−Ａｌｂが非修飾アルブミンと同じ特徴を示すことである。ＰＥＧ４０−Ａｌｂで見られる最初の遷移の遷移温度は、アルブミンに比べてＰＥＧ４０−Ａｌｂからのほうがより多くの脂肪酸が除去されることを表している（１０８ａ〜１１１ａ）。これらの結果は、ＰＥＧ４０修飾タンパク質が非修飾アルブミンの天然構造を保持していることを示す。
【０１２７】
これらの安定性の研究を拡張するため、本発明者らは、種々の薬剤による単一のトリプトファニル(typtophanyl)残基の蛍光から消光を調べた。トリプトファン蛍光は、タンパク質コンフォメーションの微細な変化が発光強度や発光スペクトルの形に変化を及ぼし得るので、天然構造の指標として使用することができる（１１２ａ，１１３ａ）。ｍＰＥＧ５０００によるアルブミンの修飾は、紫外線の吸光度に寄与し（２４０ｎｍ〜２８０ｎｍの間）、ＰＥＧ２００００およびＰＥＧ４００００修飾アルブミンの吸収スペクトルおよび蛍光発光スペクトルは実際には非修飾アルブミンと区別できなかった。ｍＰＥＧ５０００、ＰＥＧ２００００およびＰＥＧ４００００誘導体の蛍光発光スペクトルは非修飾アルブミンと同等であり、単一トリプトファニル残基という状態が有意に変化していなかったことを示す。
【０１２８】
本発明者らは、その蛍光がヨウ化物またはアクリルアミドによりどれだけ容易に消光し得るかを判定することにより、トリプトファンの溶媒接近性を調べた。図２７Ａは、修飾程度の異なるＰＥＧ−Ａｌｂを選択するためにサイズ分画したｍＰＥＧ５０００アルブミンに対するアクリルアミド消光研究を示す。なお、画分の表示は図２２でゲル濾過により分析したサンプルに相当する。最も修飾の少ない画分（ＩＩＩと表示）は非修飾アルブミンと同等であった。画分ＩとＩＩはアクリルアミドによる消光により高い感受性を示し、主として、このプロットの曲線の上の方に表される静的消光成分に現れている。この結果は、ある程度の疎水性があるアクリルアミドがＰＥＧ−Ａｌｂの表面と結合することを示唆する。本発明者らはまた、図２７Ｂに示されるように、電荷を有する極性消光剤であるＫＩによる消光を調べた。アルブミンのトリプトファンは埋め込まれており、特にヨウ化物による消光には感受性がなく、ＰＥＧによる修飾のレベルを高めても、画分ＩおよびＩＩで見られたようなその消光感受性はやや低下し、このことはＰＥＧ修飾が、トリプトファンを溶媒や極性溶質からさらに遮蔽することを示唆している。これに対し、ＰＥＧ２００００−ＡｌｂおよびＰＥＧ４００００−Ａｌｂはアクリルアミド消光では小さな変化しかしめさず（図２７Ｃに示される）、ヨウ化物消光では変化はなかった（示されていない）。これらの実験は、アルブミンの複数の部位をＰＥＧ５０００で修飾すると、そのタンパク質は溶媒や極性溶質からさらに遮蔽されるが、ＰＥＧ２００００またはＰＥＧ４００００による修飾はそうではないことを示す。
【０１２９】
３．ＰＥＧ２０−ＡｌｂおよびＰＥＧ４０−Ａｌｂの浸透圧特性
修飾アルブミンの浸透圧特性はin vivo機能に不可欠であることから、本発明者らは、図２８に示されるように、ｍＰＥＧ２００００、ｍＰＥＧ４００００、多重修飾ｍＰＥＧ５０００アルブミンおよび非修飾アルブミンの濃度に対するコロイド浸透圧の依存性（１１４ａ，１１５ａ）を調べた。１モル当たりで、ｍＰＥＧ２００００−Ａｌｂ、ｍＰＥＧ４００００−ＡｌｂおよびｍＰＥＧ５０００−Ａｌｂは非修飾アルブミンよりも高濃度でより高い浸透圧を示したが、低濃度では浸透圧はアルブミンの場合と同等であり、アルブミンの血清濃度はおよそ０．６ｍＭである。高濃度のｍＰＥＧ−Ａｌｂで見られる理想的でない挙動は、これらの種の大きな排除容量と水和程度を反映している。本発明者らはまたサイズ分画ｍＰＥＧ５０００修飾アルブミンも調べ、修飾の顕著な画分は修飾の低い画分よりも大きな浸透圧を示す。これらの研究は、血管内への保持を助け、組織の間質性空間への液体の管外遊出を軽減するコロイド浸透圧勾配を維持する特性である大きな排除容量を有する分子と一致する。
【０１３０】
４．蛍光標識を有するアルブミン
本発明者らは、ｃｙｓ３４を介して結合したフルオレセインまたはテキサスレッドを有する非修飾アルブミンおよびｍＰＥＧ−Ａｌｂを作製した。これらの蛍光アルブミン誘導体を用い、毛細血管漏出を伴う動物の循環中にいかに効率的にアルブミンが保持されるか調べる。なお、これらのアルブミンの傾向は、体液中の蛍光測定または組織切片の蛍光顕微鏡観察によりモニタリングすることができる。これら２つの蛍光団は十分離れた励起・発光スペクトルを有するので、２種類の（例えば、テキサスレッドを有する非修飾アルブミンとフルオレセインを有するＰＥＧ−アルブミン）アルブミンの混合物を含むサンプルを同じ動物で調べることができる。ｃｙｓ３４を介してＰＥＧを結合させる場合、本発明者らは、リシルε−アミノ基を介してアミン反応型のフルオレセインまたはテキサスレッドを結合させる。２種類の異なる蛍光団を有するアルブミンをもってすれば、フルオレセインを有するＰＥＧアルブミンが、テキサスレッドを有する非修飾アルブミンに比べ、いかに効率的に循環中に保持されるかを判定することができる。これらの蛍光アルブミンは、ショックモデルにおいて非修飾アルブミンとＰＥＧ−アルブミンの保持をモニタリングするため、またはin vivo半減期をモニタリングするために分析的に限って使用される。本発明者らは、血清希釈液において、他の蛍光物質のバックグラウンドを十分超えるフルオレセイン−アルブミンの蛍光を容易に検出した。必要に応じ、血清サンプル中の他の発色団から生じる内部フィルター効果（１１２ａ，１１３ａ）に関して強度測定値を補正するが、蛍光アルブミンを用いた本発明者らの研究では、必要とされる血清の大希釈（１：１０００〜１：２０００）による支障は無視できるものであることを示す。
【０１３１】
実施例ＩＶ−５ｂ 生物物理学的研究
１．ＰＥＧ−アルブミンの作製
本発明者らは、ＰＥＧとアルブミンを結合させるためのいくつかの試薬およびｍＰＥＧ５０００−Ａｌｂをin vivoで調べた。アルブミンと結合したＰＥＧのサイズ、その位置および共有結合の性質は安定性、生体半減期およびリガンド結合が有意に異なる生成物を生じるので、種々の結合様式およびｍＰＥＧの種類（４６ａ，１１６ａ〜１２０ａ）を検討する。複数のリシル残基を修飾する傾向があるアミン選択性試薬では、有効性のサイズ依存性を調べるためにより規定されたサイズ分布を有する材料を作製するための特定の方法を用いる。サイズ分布の制御は、１つには、本発明者らがマレイミドＰＥＧで行ったように、最初の反応の修飾程度を制限すること、生成物をイオン交換クロマトグラフィーまたはゲル濾過クロマトグラフィーにより精製すること、および特定の残基の選択的修飾により達成される。
【０１３２】
結合様式−これまで用いられている、試薬とアルブミンを結合させる様式は、所望のin vivo作用を有する生成物を作出してきたが、安定性また関連リガンドの結合に違いがある生成物を作製するのに他の結合様式も有用であるということが本発明の意図する範囲内にある。異なる反応基（主としてアミンおよびチオール反応性）を有する種々の大きさのＰＥＧが入手でき(Shearwater Corp., Huntsville Alabama)、この供給者は生体材料のＰＥＧ化に特異的な試薬を開発している。他に、ｍＰＥＧ試薬の品質および生物学的至適化への注意が重要であることを強調する者もいる（１１９ａ）。また、本発明は、条件（例えば、ｐＨ、イオン強度、温度）を変更する、また、天然構造を維持する付加的工程の使用も意図し、例えば、アルブミンのジスルフィド結合および構造を、タンパク質のチオール−ジスルフィド交換のために高ｐＨで妨げることができる。
【０１３３】
１．アミン選択性試薬−修飾に利用できる最も豊富な求核試薬種は表面リシル残基であり、これは置換度の高い生成物を得るために容易に修飾される。ｍＰＥＧ−スクシンイミジル−スクシネートは、血清エステラーゼの基質となり得るエステル結合を有する生成物を生成するが、同じリシル残基を修飾するが、より安定な結合を有し、in vivo半減期の長い、ｍＰＥＧ−スクシンイミジル−プロピオネート（図２９の１）およびｍＰＥＧ−スクシンイミジル−ブタノエート（図２９の２）などの他の試薬も有用である。ＰＥＧ−アルデヒド誘導体（例えば、図２９の３）は、生じたシッフ塩基のＮａＣＮＢＨ３による還元を介してリシル残基と結合させることができ（１１６ａ，１１９ａ）；このＰＥＧ試薬はリシル残基に対して選択性が高く、修飾されたリシル残基は陽電荷を保持し、このことはアルブミンの陰イオン結合特性の保持という点では問題であり、それはリンカーも導入できない。ＰＥＧは塩化トレシルの活性化を用いて直接タンパク質に結合させることができ（１２１ａ）、アルブミンとともに使用されている（１２２ａ）。リンカーを用いない方法（１１９ａ）には、未知の毒物学的特性を有する部分を持ち込まないという利点がある。ＰＥＧにはそれ自体免疫原性がないが（１２３ａ）、それとタンパク質とを結合させる要素には免疫原性があり得る。修飾の程度は、フルオレスカミンを用いて反応性アミンの消失を調べること（３ａ）、ＳＤＳゲル電気泳動により定性すること、分析的ゲル濾過によりサイズ分布を調べること、また、ＰＥＧ修飾タンパク質に使用可能なＰＥＧの比色定量アッセイを用いて評価される（１２４ａ）。
【０１３４】
２．チオール選択性試薬−チオールを介した修飾は、ヒト血清アルブミンがただ１つのチオール（ｃｙｓ３４）を有することから、ヒト血清アルブミンに有用なアプローチである（１００ａ，１０１ａ，１２５ａ）。ヒト血清アルブミンは、遊離チオールとしてのｃｙｓ３４を有するタンパク質と、グルタチオンで修飾されたチオールを有する、または２つのアルブミンのジスルフィド二量体としての実質的画分との混合物である。穏和な条件下で、Ｃｙｓ３４ジスルフィドは還元可能であるので、総てのｃｙｓ３４が接近可能性の小さいジスルフィドを減らすことなく、遊離チオールとして利用可能である。Ｃｙｓ３４は、Ｎ−エチルマレイミドおよびヨードアセトアミドをはじめとするチオール選択性試薬と反応性がある（１００ａ，１０１ａ，１２５ａ）。一つの実施態様では、ＰＥＧがタンパク質上の単一の部位に結合されるように、アルブミンをｍＰＥＧ−マレイミド誘導体で修飾する（図１６の４）。単一のユニークな部位における修飾は天然構造を混乱させる、またはアルブミンのリガンド結合特性を変化させる可能性が低い。従前の結果の節にしめされているように、本発明者らはこのような２つの形態のｍＰＥＧ−Ａｌｂを作製した。チオール修飾の潜在的欠点は、生成物の抗酸化特性が変更されることがあるという点である。
【０１３５】
種々のサイズおよび幾何学のＰＥＧ誘導体
種々のサイズのＰＥＧおよび分枝構造を有するＰＥＧで修飾されたアルブミンを調べる。使用可能なサイズとしては、３，４００Ｍｒ、５，０００Ｍｒ、２０，０００Ｍｒおよび４０，０００Ｍｒがある。タンパク質との結合に関して種々の化学特性を有する分枝型（図２９の３）およびフォーク型（図２９の５）のＰＥＧが存在する（４６ａ，１１７ａ）。ＰＥＧが大きいほど、同じ有効サイズを達成するのに少ない部位の修飾ですむ。サイズ分布が大きければ、組み込まれるＰＥＧは１つだけなので、ｃｙｓ３４を介した結合に特に重要である。試薬サイズに関して考慮することは、小さいＰＥＧ−ペプチド（例えば、ＰＥＧ≦１２００）（１１９）の方が腎臓から容易に排泄され、多重修飾アルブミンの分析が適正となるということである。ＰＥＧ鎖長を長くすると、循環中のその物質の半減期が長くなる（１１７ａ，１２６ａ）。
【０１３６】
Ｃｙｓ３４の保存−アポトーシスおよび他の生物学的特性の阻害におけるアルブミンの活性はチオール（おそらくｃｙｓ３４）に依存する。チオールとしてｃｙｓ３４を保持するｍＰＥＧ−Ａｌｂを作製する。アルブミンをやや過剰量のジチオトレイトールで処理した後、ｃｙｓ３４を５，５’−ジチオビス−２−ニトロ安息香酸で修飾する。低分子量産物をゲル濾過により取り出し、そのタンパク質をアミン選択性ＰＥＧ試薬で修飾する。このタンパク質をジチオトレイトールで処理してチオニトロ安息香酸（４１２ｎｍでスペクトルをモニタリング）を遊離させることで、遊離チオールを再生する。ｍＰＥＧアルブミンを精製して非修飾タンパク質、過剰な試薬および反応副産物を除去する。このアプローチを用いて製造されたｍＰＥＧ−アルブミンは、試薬がリシル残基を修飾するので、複数の部位で修飾される。しかしながら、意図される範囲内には、この方法がより大きなＰＥＧ試薬（例えば、ＰＥＧ２００００およびＰＥＧ４００００）の使用を含み得ることもあり、修飾される残基の数は試薬濃度や反応条件を変更することで最小とすることができる。
【０１３７】
ＰＥＧ−アルブミンのサイズ選択および分析−生成物のサイズ分布は、ＰＥＧ−アルブミンが毛細血管漏出中に血管内に保持されるように十分大きくなければならいということ、および広範囲に修飾されすぎた生成物はリガンド結合特性の低下または毒性などの望ましくない属性を有することがあるということの双方から重要である。サイズ分布の制御は、１つには、反応程度を制限すること、またはｃｙｓ３４の修飾の場合には、単一の残基の修飾に制限することにより達成される。修飾産物はゲル濾過またはイオン交換クロマトグラフィーにより精製し、比較的狭いサイズ分布のＰＥＧ−アルブミンを選択する。調製物のサイズ分布は、所定の分枝寸法およびＭｒのタンパク質を標準として用いるゲル濾過により、また、質量分析により測定する。ＰＥＧは拡大構造を有し、タンパク質が結合するようにはＳＤＳと結合しない可能性があるので、ゲル電気泳動（１２７ａ，１２８ａ）またはゲル濾過により、修飾アルブミンの分子量を実際に決定することはできない。より適当なパラメーターは相当半径またはストークス半径である。数平均分子量および有効分子体積はコロイド浸透圧の濃度依存から得ることができる（１１４ａ，１１５ａ）。これらの測定値の厳密な物理的意味を解釈しなければならないが、それらはin vivo有効性と相関させることができる種々の調製物およびパラメーターを比較する基礎を提供する。これらの分析はショックモデルで血管内へのＰＥＧ−アルブミンの保持に必要な修飾程度を定義し、種々の修飾程度のメリットを決定付ける。
【０１３８】
２．タンパク質構造および安定性に対するアルブミンのＰＥＧ修飾の効果
アルブミンの構造および安定性はその生理学的機能に重要である。分光光度技術を用いてコンフォメーションおよび二次構造を調べ、アルブミンのＰＥＧ修飾がそのタンパク質の構造および安定性を変化させる程度を判定する。非修飾アルブミンおよびＰＥＧ修飾アルブミンについて、近紫外線および遠紫外線における円二色性（ＣＤ）スペクトルを得る。近紫外線スペクトル（２５０〜３２０ｎｍ）の分析により、チロシル残基およびトリプトファニル残基の微小環境を混乱させた程度に関する情報が得られる（１２９ａ，１３０ａ）。遠紫外線ＣＤスペクトル（１８０〜２５０ｎｍ）からは、二次構造が混乱された程度に関する情報が得られる（１２９ａ，１３０ａ）。ヒト血清アルブミンはα−ヘリックスが優勢であり（６７％）（１００ａ〜１０２ａ）、両スペクトルとも、このタイプの二次構造を反映している。トリプトファニル残基の状態は内在のトリプトファン蛍光のヨウ化物およびアクリルアミド消光により調べ（１１２ａ，１１３ａ）、このような実験の例を結果の節に示す。トリプトファン蛍光およびその消光剤感受性はタンパク質コンフォメーションの高感度プローブである。本発明者らは非修飾アルブミンとＰＥＧ修飾アルブミンをヨウ化物消光により調べたところ、両タンパク質とも、その単一のトリプトファンはこの消光剤に比較的接近しにくく、ＰＥＧ修飾がその環境を変化させないということと一致していた。さらに、これら２つの天然タンパク質のトリプトファンの発光スペクトルは本質的に同じである。これらの例により、タンパク質のコンフォメーションおよび二次構造に最小限の変化だけでＰＥＧ−アルブミンを生じる修飾条件が特定される。
【０１３９】
アルブミンの安定性に対するＰＥＧ修飾の効果は、漸増濃度のカオトロピック溶質（グアニジン塩酸または尿素）の存在下、天然構造に特徴的な分光光度シグナル（内在トリプトファン蛍光およびＣＤ）を調べることにより評価する。このような実験データを分析すると、タンパク質の熱力学的安定性を反映する、変性剤の不在下での脱フォールディングの自由エネルギー（ΔＧ°Ｈ２Ｏ）が得られる（１０３ａ，１０５ａ）。図３０は、非修飾血清アルブミン（パネルＡ）およびｍＰＥＧ５０００修飾アルブミン（パネルＢ）の脱フォールディング研究の結果を示す。アルブミンの脱フォールディングは、ＣＤシグナルとトリプトファン蛍光シグナルの一致の欠如により示されるように、明らかに複雑な多段階プロセスであり、アルブミンがマルチドメインタンパク質であることと一致している（１００ａ〜１０２ａ，１３１ａ，１３２ａ）。ＣＤによりモニタリングされる脱フォールディングは、非修飾アルブミンおよび多重ｍＰＥＧ５０００修飾アルブミンで同等であり（図３０パネルＢ）、修飾が安定性を変化させないことを示している。
【０１４０】
別の態様では、本発明は、安定性を変化させずに所望の生物活性を有する産物を生じる修飾条件を特定する方法を提供する。ＰＥＧ−Ａｌｂの安定性は示差走査熱量測定法（ＤＳＣ）でも調べられる（１３３ａ〜１３５ａ）。このアプローチでは、タンパク質溶液をゆっくり加熱し、脱フォールディングを伴う過剰な熱量を測定する。このアプローチはアルブミンの安定性に対する脂肪酸およびトリプトファンの効果を研究するのに有用である（１０８ａ〜１１１ａ）。リガンドフリータンパク質と連結種の両者を比較するため、脂肪酸、トリプトファンおよび他の疎水性リガンドを炭素処理により除去し（１０８ａ）、脂肪酸、ヘム、Ｎ−アセチルトリプトファンを含む種々のリガンドを付加する効果を調べる。この分析から、タンパク質の安定性（脱フォールディングのエンタルピーを含む）および脱フォールディングプロセスに含まれる状態の数についての情報が得られ、これを用いてリガンド結合部位の健全性を評価することができる。
【０１４１】
１．ＰＥＧ−アルブミンのコロイド浸透圧特性の分析−ＰＥＧ−アルブミンのコロイド浸透圧の濃度依存性を調べると、この特性がどのようにin vivo有効性に関連するかが分かる。非修飾アルブミン、ＰＥＧ−Ａｌｂおよび匹敵する濃度の対応する非コンジュゲートｍＰＥＧを調べる。最も単純な場合では、ＰＥＧ−アルブミンの浸透圧活性は、匹敵する濃度の非修飾アルブミンと遊離ＰＥＧの浸透圧活性の和である。しかしながら、溶媒および溶質とタンパク質との相互作用は必ずしも単純ではなく、解は単純計算の和とはなり得ない。本発明は、全体として天然構造を保持する、浸透圧活性の高いＰＥＧ−アルブミン調製物を提供する。
【０１４２】
２．ＰＥＧ−アルブミンのリガンド結合特性の分析−アルブミンは、ナトリウムイオン、ビリルビン、マグネシウムイオン、脂肪酸および多くの薬剤を含む、いくつかの重要なリガンドと結合する。リガンドは、アルブミンの３つの主要ドメイン上の複数の異なる部位で結合する（１３１ａ，１３２ａ）。本発明者らは、ＰＥＧによるアルブミンの修飾が重要なリガンドの結合を変化させるかどうかを調べた。ビリルビン（１３７ａ）、脂肪酸（１３８ａ）、ヘム（１３９ａ）および種々の薬剤（１２５ａ）を含む種々の部位に結合する代表的リガンドを調べる。これらのリガンドの結合は分光光度アッセイにより測定することができるが（１３１ａ）、最も情報が多く、熱力学的に正確なアプローチは滴定熱量測定（ＩＴＣ）である（１４０ａ〜１４２ａ）。リガンド溶液をタンパク質溶液中へ滴定し、結合の際に放出または吸収された熱を測定する。このアプローチには発色団は必要なく、いずれのリガンドおよびアクセプターにも適用できる。ＩＴＣ試験により、会合定数、結合エンタルピー、結合エントロピーおよび化学量論が得られる。有意な制限だけが、強固な結合および弱いリガンドおよび溶解度の限定されたリガンドの分析に関連する。修飾がリガンド結合を変化させる程度は、リガンドの結合等温線を調べ、結合定数と結合部位数を求めることにより決定する。本発明はまた、非修飾アルブミンに比べ、修飾アルブミンにおける３つの結合部位の機能的健全性を評価するのに有用なリガンドの例も提供する。
【０１４３】
実施例ＩＶ−５ｃ ＰＥＧ−アルブミンのin vivo半減期の決定および毒物学的評価
１．ＰＥＧ−アルブミンの半減期の決定−ＰＥＧ−アルブミンの半減期はその有効性および潜在的副作用の双方の懸念点である。一般にタンパク質のＰＥＧ修飾（１１６ａ，１１９ａ）およびアルブミンは特異的に半減期を長くし、抗原性を小さくし、それらのタンパク質分解感受性を引き下げる。ＰＥＧ修飾はインターフェロンαの半減期（６時間から７５時間）およびＣ型肝炎の治療におけるその治療有効性に顕著な作用を有し（１４３ａ，１４４ａ）、ウシアルブミンでは、ウサギにおける半減期の変化はわずかである（１４３ａ）。アルブミンによる後者の結果は、ＰＥＧ修飾なしであっても比較的長命なタンパク質（ヒトで２０日）であるので、予期されないことではない。フルオレセインまたはテキサスレッドで修飾したＰＥＧアルブミンおよび通常のアルブミンはそのまま投与されるが、これらの蛍光団は循環からのクリアランスをモニタリングするためのシグナルを提供する。１つは非修飾アルブミンに対するもので、もう１つはＰＥＧ修飾アルブミンに対するものである２つの発色団を用いれば、この２種類のアルブミンを同じ動物でモニタリングすることができ、これにより循環中における優先的保持の程度が評価できる。本発明者らは、これらの双方の色素−アルブミンコンジュゲートを作製した。これらの色素−アルブミンコンジュゲートを本質的にトレーサーとして動物に投与し、分析のため１〜２週間にわたって尾の静脈から少量の血液サンプル（〜１００〜２００μｌ）を採取する。もし続いてクリアランスが起これば、ヒトアルブミンに特異的な市販のモノクローナル抗体を用いたウエスタンブロット解析によりタンパク質を定性的に調べる。なお、このアプローチは蛍光団をタンパク質に付加することがもたらし得るいずれの作用も回避する。ＰＥＧ−ａｌｂは非修飾アルブミンに比べ、ＳＤＳゲル上で劇的に異なる移動を示し、モノクローナル抗体がヒトアルブミンとラットアルブミンを識別する。ヒトアルブミンに特異的な抗体を用い、クリアランスが酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を用いて定量的にモニタリングされる。なお、抗体の使用には、ＰＥＧ修飾後もなおアルブミンと結合することの確認が必要である。
【０１４４】
２．ＰＥＧ−アルブミンの毒物学的特性の分析−ＰＥＧ修飾アルブミンが毛細血管漏出症候群の治療に有効であるためには、インターフェロンなどの治療的に用いられている他のＰＥＧ修飾タンパク質に比べ、比較的高用量で投与しなければならない。明らかな違いとしては、インターフェロン数マイクログラムに対し、ＰＥＧ修飾アルブミンは１グラム以上を与えなければならないということである。ＰＥＧアルブミンはこれらの用量で顕著な毒性がないことが重要である。比較的大用量の高分子量ＰＥＧ（４０００〜６０００Ｍｒ）は、いくつかの動物（ラット、ウサギおよびイヌ）でほとんど毒性を示さない（４５ａ，１４３ａ，１４５ａ〜１４７ａ）が、低分子量ＰＥＧ（例えば４００Ｍｒ）は毒性を示すことを示唆する証拠がいくつかある（４５ａ，１４８ａ，１４９ａ）。イヌの血液容量の大部分（３０〜５０％）は、２週間顕著な毒性なくＰＥＧ化ヘモグロビンで置換することができる（１４９ａ）。大量を投与したいくつかの研究では、食作用(phagacytosis)を示す肝臓および腎臓の細胞への封入が見られた。ほとんどの毒性研究では、相対的に長命なタンパク質と結合したＰＥＧではなく遊離ＰＥＧが調べられた。ＰＥＧ４０００を９０ｍｇ／Ｋｇまでの１日静脈用量で１年間イヌに投与しても毒性作用は惹起されず（１５０ａ）、顕著な解剖学的、顕微鏡的または生化学的以上は見られなかった。もし今日提案されていたとしたら、ＩＲＢ委員会がおそらく認可していないであろう実験において、明らかな病気の作用のない６人のヒト志願者にＰＥＧ６０００を静脈投与したところ（１４６ａ）、９４〜９９％のＰＥＧ６０００が１２時間以内に尿中に排泄された。ラットでは１０００〜１０，０００Ｍｒの範囲のＰＥＧは毒性がある（１４７ａ）（ＬＤ５０ １０〜２０ｇ／ｋｇ）が、ヒトおよびイヌを含む研究で与えられたものよりおよそ５０〜１００倍高い用量に過ぎず、これらの研究から推定される７５Ｋｇのヒトに対する同等用量は０．７５〜１．５Ｋｇと考えられる。本発明者らが行った研究では明らかな毒性は見られなかったが、本発明者らの研究は総て４時間以内で明白な短期作用を調べたものであったので、ＰＥＧ−アルブミンの異化作用およびＰＥＧ−ペプチドの遊離から生じる毒性は観察しなかった。
【０１４５】
毒物学的評価
最も有望なＰＥＧ−アルブミンコンジュゲートを、予測される治療用量で始め、かなり高い用量になるまでの範囲の用量で投与することにより毒性を評価する。動物を４週間までモニタリングする。単回用量と多回用量の双方を試験する。動物の屠殺前に採集するデータには、体重、食物摂取量、水摂取量、糞便の産生量および尿の産生量が含まれる。また、挙動変化の徴候に関しても動物を観察する。定期的に少量の血液を抜き取り、肝毒性に特徴的なマーカーに関して血清で酵素アッセイを行う。試験の終了時に、動物を屠殺し、組織および器官の顕微鏡的損傷証拠を調べる。肝臓、腎臓、肺、脳、心臓および骨格筋をはじめ、いくつかの組織の毒性証拠を顕微鏡で調べる。ビヒクルを与えた対照動物も同様に調べる。
【０１４６】
以下の実施例Ｖでは、指示試薬は色素または色素の組合せであり得る。この２種類の色素は赤、緑または同色でもよい。これらの発光波長および励起波長は大きく有意に異なっていなければならない。好ましい方法は二重発色団技術である。しかしながら、複数発色団であってもよい。
【０１４７】
好ましい色素は赤いマレイミド色素であるテキサスレッドである。インドシアニングリーンは優れた蛍光物質である。これはテキサスレッドとフルオレセイン(Fluorescine)の混合物でテキサスレッドの代わりに用いることができる。インドシアニングリーンの発光は近赤外領域（〜８４０ｎｍ）にあり、クルオロセインからの明瞭な発光を伴う優れたトレーサーである。
【０１４８】
この技術の好ましい使用は、多臓器不全に代わる血管漏出を測定および定量のためのマーカーとして使用するアッセイである。その意味するところは、臓器不全を発症する危険性のある患者を推定することである。これによりこのアッセイをこのような患者に特定の治療法を調整するために使用できる。また、これはタンパク質の半減期を研究するための新規な技術でもある。
【０１４９】
一つの実施態様では、本発明は、多臓器不全が起こる前、または初期にその発症を予測する技術である。この方法は、２以上のタンパク質、例えばアルブミンとＰＥＧ−アルブミンを投与することに基づく。これらのタンパク質は分子量が有意に異なり、発光波長および励起波長が異なる発色団でタグ付けされている。推定は、それらの発色団の濃度を経時的に評価することにより行う。本発明者らは、アルブミンの他、例えば、既知の分子量を有する別のタンパク質も使用できる。例えば、免疫グロブリンＧ分子量１５０．０００またはフォン・ビルブランド因子ＭＷ３００．０００などの他のタンパク質がある。
【０１５０】
実施例Ｖ 色素をコンジュゲートしたアルブミンおよびＰＥＧ−アルブミンの作製
色素コンジュゲートアルブミンＰＥＧ−Ａｌｂの作製方法は次の通りであった。ヒトアルブミン（５０ｍｇ／ｍｌ）を５０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌおよび０．５ｍＭジチオトレイトール中で１時間インキュベートした。このジチオトレイトール処理アルブミンを４ｍＭ ５−ヨードアセトアミドフルオレセインまたは１．５ｍＭテキサスレッドマレイミド(Molecular Probes)とともに２時間インキュベートした。これらの色素修飾アルブミンを５倍希釈し、遠心分離濃縮器（カットオフ１０，０００Ｍｒ、Millipore）で３回再濃縮して組み込まれなかった色素の大部分を除去した後、リン酸緩衝生理食塩水を４回交換して４８時間透析した。
【０１５１】
このフルオレセイン標識アルブミンをメトキシポリエチレングリコール塩化シアヌルで修飾し、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ２００でのゲル濾過により精製した。Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ２００から２００，００を超える見掛けの分子量で溶出する画分をプールし、ＰＭ１０メンブラン(Millipore)を用いた限外濾過により濃縮した後、０．９％生理食塩水を数回交換して透析した。フルオレセイン標識アルブミンとテキサスレッド標識アルブミンをゲル電気泳動により分析したところ、蛍光がタンパク質と会合していることが明らかになった。遊離色素の位置では蛍光は検出されなかった。定常状態の蛍光の測定はＱＭ４ＳＥ蛍光計(Photon Technology International, Monmouth Junction, NJ)で行った。
【０１５２】
次ぎに、非修飾アルブミンおよびｃｙｓ３４を介して結合したフルオレセインまたはテキサスレッドを有するｍＰＥＧ−Ａｌｂを作製した。これらの蛍光アルブミン誘導体を、毛細血管漏出を伴う動物の循環中にアルブミンがいかに有効に保持されるか調べるために用いた。これらのアルブミンの移動は、体液における蛍光測定または組織切片の蛍光顕微鏡観察によりモニタリングすることができる。体液における蛍光測定または組織切片の蛍光顕微鏡観察の２種類。この２つの蛍光団は十分離れた励起・発光スペクトルを持つので、２つのアルブミン（例えば、テキサスレッドを有する非修飾アルブミンとフルオレセインを有するＰＥＧ−アルブミン）の混合物を含むサンプルを同じ動物で調べることができる。ｃｙｓ３４を介してＰＥＧを結合させる場合、アミン反応型のフルオレセインまたはテキサスレッドはリシルε−アミノ基を介して結合させた。２種類の異なる蛍光団を有するアルブミンをもってすれば、フルオレセインを有するＰＥＧアルブミンが、２つの異なる蛍光団を有する非修飾アルブミンに比べ、いかに効率的に循環中に保持されるかを判定することができ、フルオレセインを有するＰＥＧアルブミンが、テキサスレッドを有する非修飾アルブミンに比べ、いかに効率的に循環中に保持されるかを判定することができる。これらの蛍光アルブミンは、ショックモデルにおいて非修飾アルブミンとＰＥＧ−アルブミンの保持をモニタリングするため、またはin vivo半減期をモニタリングするために分析的に限って使用した。血清希釈液において、他の蛍光物質のバックグラウンドを十分超えるフルオレセイン−アルブミンの蛍光が容易に検出された。必要に応じ、血清サンプル中の他の発色団から生じる内部フィルター効果に関して強度測定値を補正した。しかし、蛍光アルブミンを用いた研究では、必要とされる血清の大希釈（１：１０００〜１：２０００）による支障は無視できるものであることを示す。
【０１５３】
動物／測定プロトコール
正常な健康ラット（ｎ＝４）およびＣＬＰラット（ｎ＝１１）で測定を行った。ＣＬＰでは、ラット６匹に（ＰＥＧ−ＡＬＢ−ＦＬ＋アルブミン−ＴＲ）を注入し、５匹に逆の発色団を注入した。オハイオ医学大学のThe Institutional Animal Care and Use Committeeおよびthe Academic Chemical Hazards Committeeが試験プロトコールを認可した。動物はAmerican Association for Accreditation of Laboratory Animal Care; International (AAALACI)認可施設で飼育した。体重４００〜４８０ｇの成体雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット(Charles River Laboratories, Portage, Ml)を用いた。これらのラットには標準ラット餌と水を自由に与えた。試験前、動物を一晩絶食させたが、水は自由に与えた。本発明者らは盲腸結紮穿刺（ＣＬＰ）誘発敗血症ラットと擬似術モデルを用い、ＰＥＧ−Ａｌｂの蛍光団とアルブミンの蛍光団を注入した。ラットをナトリウムペントバルビタール（５０ｍｇ／ｋｇ ＢＷ、ｉ．ｐ．）で麻酔した後、必要に応じてペントバルビタールを追加した。正中腹部切開から開腹を行った。回盲弁直下で、腸の連続性が維持されるように３−０絹結紮糸にて盲腸を結紮した。この盲腸を１６ゲージの針で２箇所穿刺し、排便されるまで軽く押した。内臓を腹部に戻し、筋肉は一層のプロリン縫合糸、皮膚は３−０絹縫合糸で切開部を閉じた。擬似術ラットにも同じプロトコールを施し、盲腸は内臓を腹部に戻す前に穿刺を行わずに操作した。蘇生のため、体重１００グラム当たり３ｍｌの無菌０．９％塩化ナトリウム溶液を背部に皮下投与した。術後、ラットには食物は与えなかったが、水は自由に摂らせた。
【０１５４】
術後２０時間で動物を麻酔し、内頚静脈にカニューレを送管した。注入後４０分の時点（発色団を混合させ、各コンパートメントに分布させる）、そしてこれを０時点として、その後、３０分、１時間、３時間、５時間、８時間の時点で各１００〜１５０μｌの血液サンプルを採取した。８時間後、内頚静脈ラインを外した後２時間ラットを回復させた。今度は、尾の静脈から２２時間、２８時間、４５時間、５２時間、７０時間、９６時間、１０２時間、１４８時間、１６０時間、１７１時間またはラットが死に至るまでさらに血液サンプルを採取した。
【０１５５】
組織学／蛍光顕微鏡
ホルマリン固定した肺および腎臓組織に、ヘマトキシリンおよびエオシン染色を含む標準的な処理を施した。免疫蛍光研究のため、肺切片をＮｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｅ８００蛍光顕微鏡で調べ、Ｉｍａｇｅ Ｐｒｏ Ｐｌｕｓ Ｖｅｒｓｉｏｎ ４．０(Media Cybernetics, L.P.)を用いて対物２０倍および４０倍で写真を記録した。
【０１５６】
統計学的方法
特に断りのない限り、値は平均値±ＳＤで表す。処理群内で、各時点で繰り返して分析したデータ（各時点での蛍光濃度）を、多重比較用の補正を用いる事後両側ｔ検定を用い、反復測定分散分析により評価した。匹敵する時点の処理群間の差は分散分析により評価した。統計学的有意性をｐ＜０．０５およびｐ＜０．０１水準でリプレート(reprete)する。
【０１５７】
結果
色素−アルブミンコンジュゲートを動物に本質的にトレーサーとして投与し、少量の血液サンプル（〜１００〜２００マイクロリットル）を頚静脈から（最初の８時間）、その後は尾の静脈から採取した。これらのアルブミンの移動を、血中の蛍光測定および肺組織切片を調べる蛍光顕微鏡観察によりモニタリングした。本発明者らが開発した方法を用い、蛍光標識したアルブミンおよび（テキサスレッド、ＴＲ）およびＰＥＧ−Ａｌｂ（フルオレセイン、Ｆ）をラットに注入し、注入後の各時点で分析のため尾の静脈から少量の血液を採取する。アルブミンが管外空間へ失われ、ＰＥＧ−Ａｌｂが保持されていれば、アルブミンの喪失とＰＥＧ−Ａｌｂの優先的保持に一致してフルオレセイン／テキサスレッド（Ｆ／ＴＲ）比が経時的に高まる。テキサスレッドとフルオレセインの励起・発光スペクトルは、この２種類の色素の混合物が血清サンプル中で定量的に調べることができるように十分異なっている。これらの標識を切り替えれば（フルオレセインアルブミンおよびテキサスレッドＰＥＧ−Ａｌｂ）、そのタンパク質のクリアランスがそれらの蛍光団の特性ではないということを確認する、厳密に補足する結果が得られる。このクリアランスは、物質の別のコンパートメントへの再分布に一致するファーストフェーズとクリアランスを反映するスローフェーズを示す。ＰＥＧ−アルブミンはアルブミンに比べて〜３時間以内に急速にクリアランスされる。アルブミンとＰＥＧ−Ａｌｂの分布はまた、本発明者らが敗血性ショックで観察したように、ＰＥＧ−Ａｌｂが血管内に保持されるかどうかを判定するための蛍光顕微鏡観察により、肺の冷凍組織切片でも質的に調べられた。
【０１５８】
通常のアルブミンは漏出するのにＰＥＧ−Ａｌｂは血管内に保持されることを証明するため、フルオレセイン標識ＰＥＧ−Ａｌｂとテキサスレッド標識アルブミンの混合物を投与した。肺切片の蛍光顕微鏡観察により、擬似術を施したラットではテキサスレッドシグナルとフルオレセインシグナルが同時局在するのに対し、ＣＬＰラットでは、テキサスレッド蛍光（ＰＥＧ−Ａｌｂ）は血管構造内のみに検出されることが証明された。これらの色素の同時局在は双方が保持されていたことを示し、一方、その色素の一方が間質空間に存在することはその標識種の漏出を示す。
【０１５９】
図３１Ａおよび３１Ｂは、注入時点（０時点）での濃度に対する実際のアルブミンおよびＰＥＧ−Ａｌｂ蛍光データ（対数スケール）を示す。このグラフはＣＬＰラットでは１１個体総て（図３１Ａ）、また正常ラット４個体（図３１Ｂ）で平均した場合の時間の関数として示されている。直線はこれらの濃度データを二重外挿モデルに当てはめたものである。
【０１６０】
図３２Ａおよび３２Ｂはまた、注入時点（０時点）での濃度に対する指数で示したアルブミンおよびＰＥＧ−Ａｌｂ蛍光データ（対数スケール）を示す。このグラフは各ＣＬＰラットに対して時間の関数として示されている。図３２ＡはＰＥＧ−Ａｌｂ ＦＬとアルブミン−ＴＲを有するラット６個体に関するグラフである。図３２ＢはＰＥＧ−Ａｌｂ−ＴＲとアルブミン−ＦＬを有するラット５個体に関するグラフである。相当する分析データは表１に示す。
【０１６１】
【表１】
【０１６２】
【表２】
【０１６３】
フルオレセイン標識ＰＥＧ−Ａｌｂおよびテキサスレッド標識アルブミンは双方とも、対照動物では血管内空間でのみ見られた。これらの結果は毛細血管漏出中、ＰＥＧ−Ａｌｂが血管内に保持されることと一致している。
【０１６４】
図３３は注入時点（０時点）での濃度に対する指数で示したＰＥＧ−Ａｌｂ／アルブミン蛍光データを個々の正常ラットおよびＣＬＰラットに関して時間の関数として示している。血管透過性の増大はＳＩＲＳの初期の特徴である。これは多臓器不全症候群（ＭＯＤＳ）の明確な発症の数日前に起こる。敗血症、外傷などの全身性炎症応答症状（ＳＩＲＳ）の際には、アルブミン漏出速度が実質的に増す。ＭＯＤＳを発症する運命にある患者を迅速に特定できれば、疾病のプロセスを制限するため、極めて早期に治療戦略を適用することが可能となる。アルブミン（テキサスレッド）が管外空間に失われかつ／またはＰＥＧ−Ａｌｂ（Ｆｔｃで標識）が保持されれば、Ｆｔｃ／ＴＲ比は経時的に高まると予測される。全身性炎症性応答（ＳＩＲＳ）症状における毛細血管透過性の増大に代わるものとしてのＰＥＧ−Ａｌｂ／アルブミン比の段階的上昇が前記の図３３で示されている。本発明者らは、アルブミンとより大きなポリエチレングリコール修飾アルブミン（ＰＥＧ−Ａｌｂ）を分光光度的に異なる発色団［それぞれ、フルオレセイン（ＦＴＣ）とテキサスレッド（ＴＲ）］でタグ付けすることに基づくＣＬの早期検出のための二重発色団技術について記載する。１１個体の敗血症（盲腸結紮穿刺；ＣＬＰ）マウスと４個体の正常ラットに微量の両タンパク質を注入し、それらの濃度を注入後１４４時間まで蛍光分光法により繰り返し評価した。血管内ＰＥＧ−Ａｌｂは、正常ラットおよびＣＬＰラットの双方のアルブミンに比べて低い速度で低下した（比＞１、増加）；図３３。このＰＥＧ−Ａｌｂ／アルブミン比の上昇は、注入１日後および２日後では、ＣＬＰラットおよび正常ラットとも同等であった。敗血症ラットでＣＬが起こったと思われる２日後では、ＣＬＰラットでこの比が上昇し続けたのに対し、正常ラットでは変化しなかった。敗血症／正常発色団比の分離が見られた時点は顕著なＣＬの開始を示し、これらの２つの曲線の差がおそらく重篤度を表す（図）。これらの知見はＣＬの検出のための新規な技術の基礎となる。
【０１６５】
正常ラットとＣＬＰラットの双方におけるＰＥＧ−Ａｌｂ／アルブミンのｖ蛍光濃度は、トレーサー注入後４０時間またはＣＬＰ後６０時間までの曲線の最初の部分では有意な差はなかった。曲線の上向きの傾きは、ＰＥＧ−Ａｌｂのより高い保持またはアルブミンの喪失を示唆する。正常ラットにおいて、著しいアルブミンの喪失は予期されず、ＰＥＧ−Ａｌｂのクリアランスの低下が、正常ラットおよびＣＬＰラットにおいて、ＣＬＰの比較的早いこの段階でのこの比の上昇の一因である。ＣＬＰラットでは、ＣＬＰの発生４８時間後に重篤な毛細血管漏出が起こると予測された。この段階で、ＣＬＰラットにおけるＰＥＧ−Ａｌｂ／アルブミン比は６０時間後まで段階的に高まり、ＰＥＧ−Ａｌｂのクリアランスの低さに加え、（毛細血管漏出とともに）一貫したアルブミン喪失を示唆する。ＣＬＰ曲線下の面積および正常ラット曲線の上の面積は、毛細血管漏出または臓器不全指数の指標となる。毛細血管漏出の定量は、ＭＯＤＳの発症する運命にある患者を推定するのに重要である。これに関して、この指数を用いることで、明らかなＭＯＤＳの発症前の早期に敗血症に対して費用のかかる処置を（例えば、活性化タンパク質ＣまたはＸｉｇｒｉｓ（登録商標））を用いるかどうかの指針となる。重篤な敗血症において活性化タンパク質Ｃを用いるかどうかの指針となるのはＡＰＡＣＨＥ ＩＩスコア測定値であり、２５より大きければ、絶対死亡率を６％減らせることが示されている。ＡＰＡＣＨＥ ＩＩスコアは患者集団における疾病の重篤度の指標となるが、これらは個々の患者の転帰を推定するにはあまり有用でないかもしれない。
【０１６６】
本発明は、分子量が異なり、各々異なる離れた発光波長および励起波長を有する異なる蛍光団でタグ付けされた複数のタンパク質または分子を用いる。これらを多臓器不全を発症するリスクのある患者に投与する。この方法では、（血液濃縮および毛細血管漏出などの同じ病態生理学プロセス下で）連続的に複数回それらの濃度を追跡する。
【０１６７】
本発明を好ましい実施態様を強調して記載してきたが、当業者には、これらの好ましい実施態様が変更可能であるのは明らかである。本発明は本明細書に明示されたもの以外にも実施可能であると考えられる。よって、本発明はあらゆる変形形態を含み、付属の特許請求の範囲の精神および範囲を請求する。
【０１６８】
参照文献
【表３】
【０１６９】
追加の参照文献
【表４】
【図面の簡単な説明】
【０１７０】
【図１Ａ】生理食塩水、アルブミンおよびＰＥＧＡ群のヘマトクリット（％）の変化を示すグラフ。
【図１Ｂ】平均動脈圧とヘマトクリットとの相関を示す。
【図２】内毒素（ＥＴ）の注射直後、ＥＴ注射２時間後およびＥＴ注射３時間後の血圧（すなわち、平均動脈圧ＭＡＰ）（ノーマライズしたＰａｒｔ）の変化を示すグラフ。
【図３Ａ】種々の処理群で見られた典型的な組織病理学的変化を示す。
【図３Ｂ】種々の処理群で見られた典型的な組織病理学的変化を示す。
【図３Ｃ】種々の処理群で見られた典型的な組織病理学的変化を示す。
【図３Ｄ】種々の処理群で見られた典型的な組織病理学的変化を示す。
【図４】各処理群の急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）スコアを示す。
【図５】（右）ＰＥＧ−Ａｌｂの推定ＭＷが２５０，０００ダルトン以上であることを示すＳＤＳアクリルアミドゲル電気泳動。アルブミン、ＰＥＧ−Ａｌｂおよび標準タンパク質のサンプルを示すＰＥＧ−Ａｌｂの分析的ゲル濾過は、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ６上でクロマトグラフィーに付した。挿入は文字とともに垂直の矢印で示し、標準タンパク質の溶出位置を示す：α，α２マクログロブリン（７２０，０００）；チログロブリン（６６０，０００Ｍｒ）；Ｆ，アポフェリチン（４４０，０００）；Ａ２，アルブミン二量体（１３３，０００）；Ｇ，ＩｇＧ（１６０，０００）；Ｏ，オボアルブミン（４５，０００）；Ｍ，ミオグロビン（１７，０００）を示す。図５（左） 結果をＭｒに対するＶｅ／Ｖ０で示す。番号の付いた上向きの矢印は矢印で示される溶出位置にほぼ相当する。
【図６】ＰＥＧ−ＡｌｂおよびアルブミンのＳＥＬＤＩ質量分析を示す。図６Ａは、１６ピコモルのヒトアルブミンの分析を示す。図６Ｂは、１５ピコモルのＰＥＧ−Ａｌｂの分析を示す。
【図７】ＰＥＧ−Ａｌｂおよびアルブミン溶液の浸透圧を示す。アルブミン溶液の浸透圧は下記のように測定し、濃度に対する浸透圧（ｍｍＨｇ）としてプロットした。この直線は３次多項式への当てはめに相当する。
【図８Ａ】以下のことを示す蛍光画像を示す：ＡおよびＢ，正常動物、敗血症無し、肺胞毛細血管膜内にＦｌ標識されたＰＥＧ−Ａｌｂが局在しているが、ＢはＲｈ標識アルブミンとＦｌ標識ＰＥＧ−Ａｌｂの重複により黄色（緑＋赤）に見える。一方、敗血症を有する動物（Ｃ、Ｄ、Ｅ）では、Ｒｈ標識アルブミンが散剤し、肺胞毛細血管膜でＰＥＧ−Ａｌｂの濃度パターンが存在した。
【図８Ｂ】以下のことを示す蛍光画像を示す：ＡおよびＢ，正常動物、敗血症無し、肺胞毛細血管膜内にＦｌ標識されたＰＥＧ−Ａｌｂが局在しているが、ＢはＲｈ標識アルブミンとＦｌ標識ＰＥＧ−Ａｌｂの重複により黄色（緑＋赤）に見える。一方、敗血症を有する動物（Ｃ、Ｄ、Ｅ）では、Ｒｈ標識アルブミンが散剤し、肺胞毛細血管膜でＰＥＧ−Ａｌｂの濃度パターンが存在した。
【図８Ｃ】以下のことを示す蛍光画像を示す：ＡおよびＢ，正常動物、敗血症無し、肺胞毛細血管膜内にＦｌ標識されたＰＥＧ−Ａｌｂが局在しているが、ＢはＲｈ標識アルブミンとＦｌ標識ＰＥＧ−Ａｌｂの重複により黄色（緑＋赤）に見える。一方、敗血症を有する動物（Ｃ、Ｄ、Ｅ）では、Ｒｈ標識アルブミンが散剤し、肺胞毛細血管膜でＰＥＧ−Ａｌｂの濃度パターンが存在した。
【図８Ｄ】以下のことを示す蛍光画像を示す：ＡおよびＢ，正常動物、敗血症無し、肺胞毛細血管膜内にＦｌ標識されたＰＥＧ−Ａｌｂが局在しているが、ＢはＲｈ標識アルブミンとＦｌ標識ＰＥＧ−Ａｌｂの重複により黄色（緑＋赤）に見える。一方、敗血症を有する動物（Ｃ、Ｄ、Ｅ）では、Ｒｈ標識アルブミンが散剤し、肺胞毛細血管膜でＰＥＧ−Ａｌｂの濃度パターンが存在した。
【図８Ｅ】以下のことを示す蛍光画像を示す：ＡおよびＢ，正常動物、敗血症無し、肺胞毛細血管膜内にＦｌ標識されたＰＥＧ−Ａｌｂが局在しているが、ＢはＲｈ標識アルブミンとＦｌ標識ＰＥＧ−Ａｌｂの重複により黄色（緑＋赤）に見える。一方、敗血症を有する動物（Ｃ、Ｄ、Ｅ）では、Ｒｈ標識アルブミンが散剤し、肺胞毛細血管膜でＰＥＧ−Ａｌｂの濃度パターンが存在した。
【図９】ＰＥＧ−２０，０００（マレイミド）修飾アルブミンの精製を示す−マレイミドＰＥＧ２０，０００で修飾したヒトアルブミン（タンパク質７ｍｇ）を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ７．５、２５℃）で平衡化したＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（１．５ｃｍ×５ｃｍ）に適用した。
【図１０】ＰＥＧ−４０，０００（マレイミド）で修飾したアルブミンの精製を示す−マレイミドＰＥＧ４０，０００で修飾したヒトアルブミン（タンパク質６０ｍｇ）を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ７．５、２５℃）で平衡化したＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（１．５ｃｍ×５ｃｍ）に適用した。
【図１１】虚血／再潅流傷害がアポトーシスおよび毛細血管漏出をもたらすかどうかの概略図。
【図１２】ＰＥＧ−Ａｌｂを示す。このアルブミン構造は、リシル残基が緑、Ｃｙｓ３４が赤、ＰＥＧが模式的に示されている。
【図１３】酸化および炎症カスケードに対するＰＥＧ−Ａｌｂの提起される作用を示す。
【図１４】ＣＬＰラットにおける平均動脈血圧（ＭＡＰ）に対するアルブミン（○）、ＰＥＧ−Ａｌｂ（●）、生理食塩水（□）およびＰＥＧ＋アルブミン（黒四角）の作用を示す。
【図１５】血清および尿におけるＰＥＧの外観および排除を経時的に示す。
【図１６】対照ラット（図１６Ａ）およびＣＬＰラット（図１６Ｂ）由来の肺組織の蛍光顕微鏡写真を示す。動物にはフルオレセイン標識ＰＥＧ−Ａｌｂおよびテキサスレッド標識アルブミンを投与した。
【図１７】ＬＰＳ処理ラットの代表的な肺の組織切片（２ＯＸ Ｈ＆Ｅ）；図１７ａ，軽度（０〜１）；図１７ｂ，中度（１〜２）；図１７ｃ，重度（３〜４）。
【図１８】処理後のＨＳラットの血圧を示す。上の曲線の●はＰＥＧ−Ａｌｂ、中央の曲線の○はアルブミン、下の曲線の□は生理食塩水。
【図１８Ａ】出血性ショックラットにおけるヘマトクリット（Ｈｔｃ）およびコロイド浸透圧（ＣＯＰ）を示す表Ｉであり、データは平均値±ＳＤである。＊＝ｐ＜０．０５；＊＊＝ｐ＜０．０１であり、どの群の比較も、両側ｔ検定で処理前の値と対応する処理の終了時を比べた。ａ）同じ群内での処理前と処理後；ｂ）生理食塩水とアルブミン；ｃ）生理食塩水とＰＥＧ−Ａｌｂ；ｄ）アルブミンとＰＥＧ−Ａｌｂ；（ＮＳ）有意でない。
【図１９】出血性ショックモデル（病期ＩおよびＩＩ）を示す。下の数字は出血後の分数に相当する。
【図２０】コロイド浸透圧（●）および粘度（○）がＰＥＧ−Ａｌｂ濃度に依存していることを示す。
【図２１】Ｓｕｐｅｒｏｓｅ ６ ＨＰＬＣのよるｍＰＥＧ５０００修飾アルブミン（ＰＥＧＡ，実線）およびアルブミン（ＨＡＳ，破線）の分析を示す。矢印で示す位置に溶出する標準は、α，α−２−マクログロブリン；Ｔ，チログロブリン；Ｆ，フェリチン；Ｇ，ＩｇＧ；Ｏ，オボアルブミン；およびＭ，ミオグロビンである。
【図２２】Ｓｕｐｅｒｏｓｅ ６ ＨＰＬＣによるｍＰＥＧ５０００修飾アルブミン（ＰＥＧＡ）サイズ分画品（Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩで示す）および分画していない材料（Ｕで示す）の分析を示す。サイズ標準は図１１と同じである。
【図２３】ｍＰＥＧ−４０，０００修飾アルブミンの精製を示す−マレイミドｍＰＥＧ４００００で修飾したＨＳＡをＱ−Ｓｅｐｈａｒｏに適用し、０〜０．３ＭのＮａＣｌ勾配で溶出した。挿入：３１からはじまる連続画分に対するＳＤＳゲル電気泳動の結果。ゲルのレーンＡは非修飾アルブミンである。
【図２４】Ｓｕｐｅｒｏｓｅ ６ ＨＰＬＣによるｍＰＥＧ４００００（４０）およびｍＰＥＧ２００００（２０）修飾アルブミンとアルブミンの分析を示す。標準は図１１と同じである。
【図２５】アルブミン（図２５Ａ）、ｍＰＥＧ２００００アルブミン（図２５Ｂ）およびｍＰＥＧ４００００アルブミン（図２５Ｃ）の尿素脱フォールディングを示す。サンプル（１０ｍＭ ＫＰＩ（ｐＨ７．４）中０．０５ｍｇ／ｍｌアルブミン、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）を示された［尿素］で１２時間インキュベートした後、発光スペクトルを採取した。励起２９５ｎｍで３１０〜３７０ｎｍでの発光を測定し、結果を強度平均発光波長（＜λ＞ＩＥ）としてプロットした。実線は三次元非フォールディングモデルへの当てはめに相当する。
【図２６】ＰＥＧ４０−Ａｌｂ（ＰＥＧＡ４０）および非修飾アルブミン（ＨＳＡ）のＤＳＣスキャンを示す。
【図２７Ａ】ＰＥＧ修飾アルブミンの消光研究を示す。Ａ：アルブミンおよびサイズ分画ｍＰＥＧ５０００アルブミンのアクリルアミド消光。実線は静的消光のＳｔｅｍ−Ｖｏｌｍｅｒ方程式に当てはめたものである。
【図２７Ｂ】ＰＥＧ修飾アルブミンの消光研究を示す。Ｂ：アルブミンおよびサイズ分画ｍＰＥＧ５０００アルブミンのＫＩ消光。実線は静的消光のＳｔｅｍ−Ｖｏｌｍｅｒ方程式に当てはめたものである。
【図２７Ｃ】ＰＥＧ修飾アルブミンの消光研究を示す。Ｃ：アルブミン、ｍＰＥＧ２００００アルブミンおよびＰＥＧ４００００アルブミンのアクリルアミド消光。実線は静的消光のＳｔｅｍ−Ｖｏｌｍｅｒ方程式に当てはめたものである。
【図２８】ＰＥＧ修飾アルブミンの浸透圧−非修飾アルブミン、ｍＰＥＧ２００００マレイミド修飾アルブミン（ＰＥＧＡ２０）またはｍＰＥＧ４００００マレイミド修飾アルブミン（ＰＥＧＡ４０）、および非分画ｍＰＥＧ５０００修飾アルブミン（ＰＥＧＡ５）の溶液の浸透圧を示された濃度で２２℃にて測定した。直線は３次多項式に当てはめたものである。
【図２９】反応性ｍＰＥＧ試薬の構造を示す。
【図３０Ａ】非修飾ヒトアルブミンおよびｍＰＥＧ５０００修飾アルブミンの脱フォールディングを示す。図３０Ａ：ＣＤによりモニタリングした非修飾ヒトアルブミンの脱フォールディング。スケールの違いはタンパク質濃度の違いを表す。
【図３０Ｂ】非修飾ヒトアルブミンおよびｍＰＥＧ５０００修飾アルブミンの脱フォールディングを示す。図３０Ｂ：ＣＤによりモニタリングしたｍＰＥＧ５０００修飾ヒトアルブミンの脱フォールディング。スケールの違いはタンパク質濃度の違いを表す。
【図３１】
【図３１Ａ】注射時間における濃度に対する指数で示した蛍光データ（対数スケール）を示す。
【図３１Ｂ】注射時間における濃度に対する指数で示した蛍光データ（対数スケール）を示す。
【図３２Ａ】注射時間における濃度に対する指数で示した蛍光データ（対数スケール）を示す。
【図３２Ｂ】注射時間における濃度に対する指数で示した蛍光データ（対数スケール）を示す。
【図３３】個々の正常ラットおよびＣＬＰラットについて、注射時間（時間＝０）における濃度に対する指数で示したＰＥＧ−Ａｌｂ／アルブミン蛍光データを時間の関数として示す。
【発明の背景】
【０００１】
関連出願の参照
本願は、２００２年３月２６日出願の米国特許出願第１０／１０６，７９３号の一部継続出願（ＣＩＰ）である、２００４年１１月９日出願の米国特許出願第１０／９８５，７９８号に基づく利益を主張するものである。
【０００２】
説明
本願では、種々の刊行物が括弧内の番号として引用される。これらの刊行物の完全な出典は本明細書の末尾、特許請求の範囲の前に示されている。これらの刊行物の開示は、本発明の属する技術の現状をより詳しく説明するために、引用することによりそのまま本明細書の一部とされる。
【０００３】
技術分野
本発明は、ショック、敗血症、出血および外科手術などの多様な血液減少症状の治療のための、ポリエチレンオキシド（ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）など）で修飾されたアルブミンであるＰＥＧ−Ａｌｂなどのアルブミンベースコロイド組成物の使用に関する。好ましい実施態様では、該組成物は少なくとも１つの保護されたチオール領域を有する。もう１つの実施態様では、該アルブミンは指示試薬で修飾されている。
【０００４】
発明の背景
全身性炎症性応答症候群(systemic inflammtory response syndrome, SIRS)の様々な兆候に共通している血液減少症の回復を目的とし、可能性のある療法の開発に多大な資源が費やされている。米国では敗血症だけでも年間７５０，０００症例にのぼり、２００，０００人の死者を出している（１）。この高い死亡率は、毛細血管漏出(capillary leak, CL)に続発する臓器の浮腫に関連する多臓器不全(multi organ dysfunction, MODS)によるものである。顕著なＣＬを有する患者は一般に、昇圧薬および他の支援物質に加え、オスモライト（例えば、アルブミン、デンプンまたはデキストラン）を含む蘇生液を投与することにより管理される。
【０００５】
多臓器不全（ＭＯＤＳ）、敗血症、外傷、火傷、出血性ショック、心肺バイパス術後、膵炎および全身性毛細血管症候群などの種々の症状に存在する毛細血管漏出は、多数の入院患者に病気や死をもたらす。毛細血管漏出（ＣＬ）は、敗血症および全身性炎症性応答症候群（ＳＩＲＳ）に続発するＭＯＤＳの中心的な構成要素である。それは間質性浮腫をもたらす毛細血管透過性の増大と、やがては臓器不全および壊死に至る組織潅流の低下を特徴とする。毛細血管漏出症候群(capillary leak syndrome, CLS)の漏出の側面は、もともとは毛細血管内に保持されていた水分および血清の高分子量成分の双方の間質空間への放出に現れる。
【０００６】
血液減少状態はしばしば生体器官の潅流不足を招き、臓器不全を引き起こし、やがて病気や死に至らせる（２）。血液減少症は出血性ショックの場合のように急に起こることもあるし、あるいは基礎にある疾病のために段階的に起こる場合もあり、どちらのタイプでも全身性の炎症プロセスが伴う。出血性ショックでは、血液減少症は血管内容量の急激かつ突発的な喪失により起こる。蘇生の際、再潅流組織に炎症プロセスが誘発され（虚血再潅流傷害）、内皮細胞（ＥＣ）傷害と毛細血管漏出（ＣＬ）が起こり、二次的な血液減少状態となる。敗血症および他の疾病では、その疾病により全身性炎症が誘発され、同様の機序でＥＣの傷害、ＣＬ、そしてやがて血液減少性ショックが起こる。
【０００７】
依然として血漿増量剤による蘇生が血液減少症の治療の頼みの綱であるが、結果は複雑である。コロイド（例えば、アルブミンおよびデンプン）およびクリスタロイドの双方を含む増量剤の有効性と安全性は、包括的研究と論争の対象であり続けている（３，４）。血漿増量剤としてのアルブミンの予想できない有効性は、基礎にあるＥＣ傷害の重篤度に連関していると考えられる（５）。具体的には、内皮の健全性が損なわれれば、アルブミンは容易に管外遊出でき、漏出アルブミンは、それを逆転させるのとは対照的に、ＣＬに有利なコロイド浸透圧勾配へと悪化させてしまうおそれがある。
【０００８】
ＣＬ症候群を誘発する生体機構はあまり理解されていないが、炎症性サイトカインの関与を示すいくつかの証拠がある。ヒトアルブミン溶液に置き換えても、アルブミンの管外空間への損失を止められるわけではないので、わずかな効果しかない。アルブミンは、血漿のコロイド浸透圧ならびに血中のナトリウムイオンの保持を担うため、重要である。
【０００９】
通常の条件下において、アルブミンは、総血液コロイド浸透圧の約８０％に寄与し（６）、低い生理学的速度で管外遊出するような大きさが理想的である（７）。ＣＬ患者では、循環血液量を増やし、血管内浸透圧特性を増大させるため、５％〜２０％のアルブミン溶液が投与されることが多い。このＣＬを遅延させる方法には、アルブミンはショック中もその通常の遅い管外遊出速度を維持しているのではないかという弱い推定がある。しなしながら、臨床データは、このアルブミンの有効性がいくらよく見ても矛盾していることを示している（８，９）。アルブミンによる蘇生は危篤患者の死亡率を高めているおそれがあることを示唆しているものさえある（１０）。
【００１０】
ＰＥＧ化は広く用いられている（１１，１２）。インターフェロンβ−１ａをポリエチレングリコールで修飾するとその半減期が長くなり、より高い抗ウイルス活性が得られる（１３）。血液代替物としてのＰＥＧ化ヘモグロビン（ＰＥＧ−Ｈｂ）の使用に関する研究がいくつかある（１４，１５，１６）。ラットにおいて、血管容積の８０％までを占める多量のＰＥＧ−Ｈｂは、ＰＥＧ−Ｈｂが血行力学と酸素送達を維持するのに効果的であることが示されている（１７）。これらの研究は、ＰＥＧ−Ｈｂが極めて高い用量であっても安全であることを示唆している。
【００１１】
有効性の程度は様々であるが、他のコロイドも毛細血管漏出症状の治療に使用されている。種々の不均質な（Ｍｒ平均分子量：１２５，０００〜４５０，０００Ｄａ）デンプンコロイドがアルブミン代替物として提案または使用されている（１８）。これらの化合物はそれほど高価なものではなく、ヒトアルブミンプール品よりも入手が容易であるが、デンプンコロイドの使用は、それらの使用を厳しく制限する安全上の問題のため、低用量に限られてきた。さらに、不均質なデンプンコロイド内の高Ｍｒ（＞１，０００，０００Ｄａ）部分は血液流動特性を変化させ、凝固障害を起こしかねない（１９）。大動脈閉塞再潅流傷害モデルでは、比較的不均質なペンタスターチ（Ｍｒ＝１１０，０００）は、肺傷害を軽減することが示されている（２０）。
【００１２】
最近の研究では、敗血症前処理ラットモデルで、ヘタスターチ（ＨＥＳ）を与えると、ＭＡＰおよび心拍数（ＨＲ）が有利な変化をしなかった（２１）。これに対し、重合ヘモグロビンで前処理したマウスでは、ＭＡＰ（上昇）およびＨＲ（低下）に有利な変化が見られた。これは、同じ分子濃度で、ＨＥＳのコロイド浸透圧（２７ｍｍ／Ｈｇ）は重合ヘモグロビンのコロイド浸透圧（２１ｍｍ／Ｈｇ）よりも高いという事実にもかかわらず生じた。しかしながら、通常の血漿増量剤としての後者の使用には議論があり、特に腎臓に関連する潜在的副作用が伴う。
【００１３】
最後に、アルブミンが細胞グルタチオンおよび核因子κＢの活性化の調節を媒介することにより内皮の抗アポトーシス作用を有することを示唆するいくつかの研究がある（２２，２３，２４）。これは、特に、内皮細胞アポトーシスに対する種々の全身性炎症性応答の兆候にＣＬを関連づけている最近の報告（２５）に鑑みれば、敗血症により誘発されるＣＬにおいて重要な役割を果たしている可能性がある。
【００１４】
現在利用可能なアルブミンは分子量が６９，０００であり、半減期が極めて短く（４〜６時間）、重篤な敗血症、膵炎、火傷および外傷などの毛細血管漏出症状において、管外空間に容易に漏出してしまう。この漏出により浮腫および／またはコンパートメント症候群の悪化を招き得る。ペンタスターチおよびヘキサスターチは小児患者には使用できず、出血を起こし得るので、その利用価値は限定されている。さらに、患者に１５ｃｃ／ｋｇしか使用できない。また、ペンタスターチおよびヘキサスターチは使用後に難治性のそう痒（かゆみ）を生じることが示されており、その作用は何年も続く。事実、代替物または増量剤としてのアルブミンの使用は、毛細血管の外へ体液を排出することにより浮腫を増大させることから、逆効果であるとする研究もある。
【００１５】
よって、上記の欠点を持たない、血液減少症状を効果的に予防および／または治療するための組成物および方法の必要性は大きい。
【００１６】
特に、出血性ショック（ＨＳ）は外傷後の主たる死因であることに着目すべきである（１ａ〜３ａ）。初期管理としては、止血の他、組織潅流を回復させるための輸液療法を施す必要がある。初期の輸液療法の選択はその結果に多大な影響を及ぼし得る。出血性ショックおよび蘇生の後、核因子−κＢ（ＮＦ−κＢ）が活性化され、内皮細胞（ＥＣ）、マクロファージ、好中球および他の細胞を活性化する、ＴＮＦ−αなどのサイトカイン、ケモカインおよび細胞接着分子の過剰産生を特徴とする炎症性応答が誘発される（４ａ）。これらの活性化細胞（５ａ，６ａ）は、血管の傷害と毛細血管漏出（ＣＬ）を招く反応性酸素種(reaction oxygen species, ROS)などの酸化産物を生じる（７ａ〜１０ａ）。再潅流後に生成した酸化体およびフリーラジカルは、特にＥＣのアポトーシスの強力な誘導物質（１１ａ）である。これらの細胞の減少は内皮細胞間ギャップの拡大を悪化させ、毛細血管漏出を悪化させ（１２ａ）、アルブミンの損失をもたらす。このような低レベルのアルブミンを伴う酸化ストレスの環境では、内皮の健全性は損なわれる（３２ａ，３４ａ，３５ａ）。酸化産物、サイトカインおよびCLにより悪化する血管枯渇は、内因性および外因性の昇圧に対する血管の無反応性に関与する（１０ａ，１３ａ，１４）。これらの事象は図１１に要約されている。
【００１７】
注目されるもう１つの分野においては、最近の研究で、出血性ショックの蘇生に使用される輸液のタイプが生理応答、免疫応答および全身の炎症状態に影響を及ぼすことが示されている。
【００１８】
クリスタロイド−乳酸リンゲル液（ＬＲ）および人工（合成）コロイドは好中球を活性化し、細胞接着分子をアップレギュレートするが、これらの作用はアルブミンまたは新鮮な全血では見られない（１０ａ，１１ａ）。さらに、ＬＲまたは人工コロイドで蘇生された動物では、特に肺および脾臓で著しいアポトーシスを生じた（１５ａ，１６ａ）。止血を行わずに積極的な大容量蘇生を行うと、初期に形成された軟らかい血栓が破れることで、また、凝固因子が薄められることで出血が悪化することがある（１７ａ）。逆に、高張生理食塩水（７．５％，ＨＴＳ）単独または合成コロイドとの組合せを用いた小容量蘇生は、特に頭部外傷の場合、および腹部または四肢のコンパートメント症候群を発症するリスクの高い患者の場合に、大容量蘇生よりも優れている。しかしながら、単独または合成コロイドと組み合わせて用いられる小容量ＨＴＳでは、高塩素血症性アシドーシス（１８ａ）およびコロイド成分に関連するアナフィラキシー様反応（１９ａ）をはじめとする有害作用が報告されている。乳酸ピルビン酸エチルおよびケトン系輸液などの前臨床試験下の他の輸液は、ＬＲに比べて、低い細胞傷害性と出血動物で良好な生存率を示す（２０ａ，２１ａ）。
【００１９】
コロイド−アルブミンをはじめとするコロイド血漿増量剤の有効性と安全性には議論がある（２２ａ，２３ａ）。デンプン（２４ａ）をはじめとする人工コロイドが、毛細血管漏出症状の治療において、有効性は様々であるが、アルブミンの代わりに用いられている。ヒトアルブミンよりも安価で、入手が容易ではあるが、その高Ｍｒ（＞１，０００，０００）成分が血液誘導特性に影響を及ぼし、凝固障害を招く（２３ａ）ことから、低用量に限定される。アルブミンとは対照的に、合成コロイドは炎症プロセスおよびアポトーシスプロセスを活性化する（２５ａ）。アルブミンは、再潅流傷害の重要な工程である好中球接着分子ＣＤ−１８の発現を高めないが、人工コロイドは高める（２６ａ）。アルブミンは血液コロイド浸透圧の８０％を占め（２７ａ）、低い生理学的速度で管外遊出する（２８ａ）。ＣＬ患者では、血液量を増し、コロイド浸透圧勾配を維持するために、５％または２５％アルブミン溶液が投与される。アルブミン処置の有効性には変動があり（２９ａ）、アルブミン蘇生が実際には死亡率を高めている可能性があることを示す研究もいくつかある（３０ａ）。しかしながら、通常の生理食塩水または４％アルブミンを投与された７０００名を超える外傷患者を含む、ニュージーランドおよびオーストラリアでの最近の無作為化二重盲検管理臨床試験では、２８日目でこの２群の間に死亡率の差は示されなかった（３１ａ）（Dr S. Finferによりthe 33 rd Congress of Society of Critical Care Medicine, Feb 2004, Orlando, Floridaに示された研究）。
【００２０】
抗アポトーシス薬および抗炎症薬としてのアルブミン−このアルブミン蘇生の臨床的有効性の矛盾した研究にもかかわらず、アルブミンが、内皮表面層の親水性の孔を埋めることで血管内皮の健全性を維持し（３２ａ〜３４ａ）、それらの安定性に寄与している（３５ａ）ことを示す、いくつかの系統の証拠がある。ラット皮膚におけるヒト組織外植片を用いた研究（３６ａ，３７ａ）では、アルブミンが内皮細胞のアポトーシスを阻害することが示されている。アルブミンはチオール基（Ｃｙｓ−３４）の供給源として働き、この作用は敗血症患者で実証されており、２００ｍｌの２０％アルブミンを投与した後、総チオール濃度を５０％まで高める（３８ａ）。in vitroにおける作用機序的研究では、細胞グルタチオンおよびＮＦ−κＢ脱活性化を調節することにより、アルブミンがその内皮抗アポトーシス作用を発揮することが示されている。生理学的濃度のアルブミンは、ＮＦ−κＢの活性化を阻害することによりＴＮＦαの誘導を阻害する（３９ａ）。ＨＳの齧歯類モデルでは、２５％アルブミン蘇生がＮＦ−κＢの輸送およびサイトカインにより誘導される好中球化学遊走物質メッセンジャーＲＮＡ濃度を低下させた（４０ａ）。
【００２１】
しかしながら、アルブミンが出血性ショックに有効でないことにも着目すべきである。これまでの研究において、非修飾アルブミンが血漿増量剤として有効でないこと（２７ａ，２９ａ，３０ａ）は、基礎にある内皮細胞傷害の重篤度に関連しているかもしれない。内皮の健全性が損なわれ、その結果、アルブミンが容易に管外遊出してしまえば、漏出するアルブミンが毛細血管漏出に有利なコロイド浸透圧勾配へと悪化させ得る（４１ａ）。
【発明の概要】
【００２２】
本発明の一つの態様は、アルブミンベースコロイド組成物を含んでなる組成物に関する。一つの態様では、アルブミンベースコロイド組成物は、その流体力学的半径が、そのコロイド浸透圧特性とナトリウムイオン、脂肪酸、薬剤およびビリルビンなどのリガンドと結合するその能力を保持しつつ、毛細血管からの漏出を妨げるに十分大きくなるように修飾される。いくつかのタンパク質が、生物活性の損失や著しい毒性を伴うことなく、リシンのε−アミノ基を介して結合されたポリエチレングリコールで修飾されているが、これまでにアルブミンタンパク質上の複数の位置でＰＥＧ化産物（ポリエチレンオキシドを含む）で修飾されたヒトアルブミンはなかった。本発明は、血液減少状態の危険性のある、または血液減少状態にある患者に投与した際に、アルブミンベースコロイド組成物がその血液減少症状を逆転させるような程度まで組成物の流体力学的半径を拡大するＰＥＧ化産物の使用を意図する。
【００２３】
本発明のアルブミンベースコロイド組成物は、重篤な敗血症、ショック、膵炎、火傷および外傷などのショック状態における増量に特に有用であり、それによりそれらの症状における生存率が高まる。
【００２４】
このアルブミンベースコロイド組成物はまた、腹膜透析における限外濾過を駆動するか、またはこれを引き起こす高浸透圧剤としても有用である。さらに他の使用としては、例えば、頭部外傷、過粘稠度状態、パーセンテシス（parcenthesis）後の肝硬変患者、白血球搬出(eukopheresis)、栄養性アルブミン欠乏症、ネフローゼ症候群、肝不全、重篤な低アルブミン血症患者および重篤な火傷患者における使用が挙げられる。
【００２５】
一つの態様では、本発明は、好ましい水和度を有するアルブミンベースコロイド組成物の組成物を含んでなる。本発明はさらに、アルブミンをポリエチレンオキシドで修飾することによりアルブミンベースコロイド組成物を製造するための２つの方法に関し、１つはＮ−ヒドロキシスクシンアミドエステルの使用によるものであり、もう１つは塩化シアヌル誘導体の使用によるものである。本発明のアルブミンベースコロイド組成物は安全であり、延長された有用な半減期を有する。このアルブミンベースコロイド組成物は、その免疫原性を軽減する組換えアルブミンを用いて合成することができる。
【００２６】
このアルブミンベースコロイド組成物は、その大きさのために管外遊出(extravascate)傾向が弱められ、それにより毛細血管漏出症候群および臨床的には浮腫やコンパートメント症候群などの血液減少症状の悪化を回避する。
【００２７】
別の態様では、アルブミンベースコロイド、例えば、ポリエチレングリコールが共有結合したアルブミン（ＰＥＧ−Ａｌｂ）の容積拡大特性は、より大きな水和度およびより大きな流体力学的半径を有する大きなアルブミンベースコロイド組成物である。このアルブミンベースコロイド組成物は、通常のアルブミンよりも管外空間に入りにくい。さらに、このアルブミンベースコロイド組成物は、オスモライトとしての、また、抗酸化剤としての、そしてヘムやビリルビンなどの溶解度の低い代謝産物の輸送体としての役割をはじめ、アルブミンの重要な生理学的機能を保持している（なお、後の２つの特徴は他のクリスタロイドおよびコロイドには付随しないものである）。
【００２８】
一つの態様では、本発明は、好ましい水和度を有する大きなアルブミンベースコロイドを含んでなる組成物に関する。この組成物はアルブミンベースコロイドであり、一つの実施態様では、その分子の、患者の毛細血管からの漏出を妨げるに十分な流体力学的半径を有するポリエチレングリコール修飾アルブミンを含んでなる。ある特定の実施態様では、このアルブミンベースコロイド組成物は少なくとも約８０〜約２５０ＫＤまたはそれを超える分子量を有する。この組成物は、ヒトアルブミン、ウシ血清アルブミン、ラクトアルブミンまたはオボアルブミンを含み得る。
【００２９】
このアルブミンベースコロイド組成物は、ナトリウムイオン、脂肪酸、ビリルビンおよび治療薬などのリガンドと結合する能力を有する。
【００３０】
別の態様では、本発明は、治療量の大きなアルブミンベースコロイド組成物をこのような症状を発症する危険性のある患者に投与することを含む、血液減少症状のin vivoでの予防または治療法に関する。
【００３１】
別の態様では、本発明は、アルブミンベースコロイドを含んでなる治療量の組成物を哺乳動物に投与することを含む、傷害された、または傷害のリスクのある哺乳動物組織の予防方法に関する。この組成物は哺乳動物の毛細血管から漏出することができず、組織を傷害から保護するに十分な量で存在する。この方法は、傷害のリスクが血液減少症、敗血症、ショック、火傷、外傷、外科手術、毛細血管漏出素因、過粘稠度ストレス、低アルブミン血症、および／または無酸素症によるものである場合に特に有用である。
【００３２】
さらに別の態様では、本発明は、アルブミンをポリエチレンオキシドで修飾することを含む、アルブミンベースコロイド組成物の製造方法に関する。アルブミンはＮ−ヒドロキシスクシンアミドエステルを用いることで修飾されるか、あるいはまた、塩化シアヌル誘導体を用いることで修飾される。ある特定の実施態様では、この方法は、アルブミンをリン酸カリウムに溶かしてアルブミン溶液を作製すること、メトキシポリエチレングリコールを塩化シアヌルで活性化し、水に溶かしてメトキシポリエチレングリコール溶液を作製すること、このメトキシポリエチレングリコール溶液をアルブミン溶液に加えて混合物を作製すること、この混合物を室温付近で好適な時間攪拌すること、約４℃で適当な時間、この混合物をリン酸緩衝生理食塩水溶液に対して透析すること、およびポリエチレングリコール修飾アルブミンを回収することを含む。ある特定の実施態様では、アルブミン溶液の容量に対するメチオキシグリコール(methyoxy glycol)溶液の容量の比率は約１〜約３の範囲である。
【００３３】
盲腸結紮穿刺（ＣＬＰ）ラットモデルおよび内毒素血症(endoxtoxemic)ラットモデルでは、複数の部位でメトキシポリエチレンとコンジュゲートした場合に（ＰＥＧ−Ａｌｂ）、非修飾アルブミンまたはクリスタロイドのいずれに比べても優れた（２〜３時間）アルブミンの輸液蘇生特性が見られる。大きなＰＥＧ−Ａｌｂ（アルブミンの大きさの約１６倍）およびその高まったコロイド浸透圧特性により、敗血症−毛細血管漏出（ＣＬ）症状下で管外遊出が少なくなる。その結果、ＰＥＧ−Ａｌｂで処置されたマウスは、血圧回復の向上とＣＬに誘発される血液濃縮の低下を示した。さらに、内毒素血症ラットにおいて、ＰＥＧ−Ａｌｂによる肺組織傷害の減少の証拠もあった。タンパク質のＰＥＧ化は、おそらくは生理学的ターンオーバー（例えば、タンパク質分解から保護する）および抗原性を軽減することにより、それらの血管内保持時間（半減期）を延長する。本発明は、１）アルブミンおよびＰＥＧ−Ａｌｂの血管内保持時間の同時（すなわち、同じ被験体で）評価を可能とし、２）生体器官の傷害の指標としての管外（または漏出）アルブミンおよびＰＥＧ−Ａｌｂの可視化を提供する方法を記載および検証する。本方法は、分光光度的に異なる発色団によりタグ付けされたアルブミンおよびＰＥＧ−Ａｌｂおよびそれらの濃度を経時的に繰り返し評価する二重発色団技術に基づく。このアルブミンは指示試薬で修飾されている。
【００３４】
より具体的には、本発明の方法は、色素とコンジュゲートしたアルブミンおよびＰＥＧ−Ａｌｂの作製に関する。ヒトアルブミン（５０ｍｇ／ｍｌ）を５０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌおよび０．５ｍＭジチオトレイトール中で１時間インキュベートした。このジチオトレイトール処理したアルブミンを４ｍＭの５−ヨードアセトアミドフルオレセインまたは１．５ｍＭのテキサスレッドマレイミド(Molecular Probes)とともに２時間インキュベートした。この色素修飾アルブミンを５倍希釈し、遠心分離濃縮器（カットオフ１０，０００Ｍｒ，Millipore）で３倍に再構成して組み込まれていない色素の大部分を除去し、その後、リン酸緩衝生理食塩水（４回交換）に対して４８時間透析した。
【発明の具体的説明】
【００３５】
本発明の一つの態様によれば、デンプンとは異なり、アルブミンベースコロイド組成物は、オスモライトとしての、また、抗酸化剤（２６）としての、そしてヘムやビリルビンなどの溶解度の低い代謝産物の輸送体（２７）としての役割をはじめ、アルブミンの重要な生理学的機能を保持している（なお、後の２つの特徴は他のクリスタロイドおよびコロイドには付随しないものである）。ＰＥＧ−Ａｌｂに対して行ったタンパク質の脱フォールディング研究は、アルブミンの機能が非常に良く保存されていることを示した。
【００３６】
本発明によれば、アルブミンベースコロイド組成物のこのコロイド浸透圧特性は、血液減少の処置の際の血漿増量に関して、非修飾アルブミンの場合よりも優れている。アルブミンベースコロイド組成物は、危篤患者において末端器官の傷害のおそれを軽減し、これにより罹患率および死亡率を引き下げる。本発明はまた、ＡＲＤＳを予防または緩和し、血圧を維持するよう、敗血症患者を前処置する方法に関する。分子量が大きく（好ましくは、約８０ＫＤ以上）、コロイド浸透圧機能が増強された本発明のアルブミンベースコロイド組成物は、内毒素誘発ショックの生理学的および組織学的兆候の改善に関して生理食塩水またはアルブミンよりも極めて優れている。
【００３７】
このアルブミンベースコロイド組成物は、毛細血管漏出が起こっている敗血状態であっても、患者の血管内コンパートメントに維持される。リポ多糖類（ＬＰＳ）誘導型のラット敗血症モデルでは、ヘマトクリット（ＨＣＴ）予備試験では違いはなかったが、敗血症誘導後は生理食塩水およびアルブミン処理群のヘマトクリットは上昇し、ＰＥＧ−Ａｌｂ群のヘマトクリットは低下した。図１は、第１群と第２群の前後のヘマトクリットでは正の変化を示し、第３群（ＰＥＧ−Ａｌｂ群）の前後のヘマトクリットには負の変化がある。このデータはまた、アルブミンが血液濃縮ならびに間質性空間への体液損失という点で違いがない傾向にあることを示す。
【００３８】
また、敗血症においては血圧の維持も重要である。敗血症により誘発される低血圧の予防のためのＰＥＧ−Ａｌｂ、生理食塩水およびアルブミン処理の有効性を図２に示す。ＬＰＳ（リポ多糖類）後２時間および３時間目において、ＭＡＰ（平均動脈圧）はアルブミン処理群および生理食塩水処理群の双方で基準値に比べて低下した。他方、ＰＥＧ−Ａｌｂラットの平均応答はどちらの時点でも変化はなかった。ＬＰＳ後のＭＡＰの変化は、処理群内であっても顕著な変動性を示した。しかしながらやはり、ＭＡＰの維持におけるＰＥＧ−Ａｌｂの高い有効性は統計学的に有意であった（二元配置反復測定ＡＮＯＶＡ；Ｐ＝０．０２３）。
【００３９】
組織病理学的所見は、ＰＥＧ−Ａｌｂ処理群がアルブミン群よりも肺胞傷害が少ないことを示す（図３Ａ〜Ｄ）。図４に示されるように、肺傷害（急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ））は、ＰＥＧＡ処理ラットでは、アルブミン処理ラットおよび生理食塩水処理ラットのいずれと比べても有意に少なかった（一元配置ＡＮＯＶＡ；Ｐ−．００２）。陽性対照およびアルブミン処理ラットに比べて、ＰＥＧ−Ａｌｂラットにおける肺組織の浸潤および硝子質化が最少であることを考えれば、ＬＰＳにより誘発された血液減少においてＰＥＧ−Ａｌｂ処理はアルブミンより良好である。
【００４０】
図５（左）は、ＰＥＧ−ＡｌｂのＳＤＳ−アクリルアミドゲル電気泳動を示す。
【００４１】
レーン１および４は上から下に、１）ミオシン（ＭＷ２０５ＫＤ）；２）ホスホリラーゼ（９７ＫＤ）；および３）ウシ血清アルブミン（６６ＫＤ）の標準マーカーを含む。レーン２は、ＰＥＧ化後のヒト血清アルブミンを含み、その分子量は２００ＫＤを超える。レーン３はＰＥＧ化前のヒト血清アルブミンを含む。
【００４２】
図５（右）は、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ Ｓ２００でのＰＥＧ−Ａｌｂのゲル濾過を示す−ＰＥＧＡサイズ標準を１０ｎＭ ＫＰＯ４、１５０ｎＭ ＮａＣｌで平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘに適用した。示された標準は、チログロブリン（Ｔｈｙｒ）、免疫グロブリン（ＩｇＧ）、アルブミン（ａｌｂ）、オボアルブミン（ＯＶＡＬ）およびミオグロビン（Ｍｙ）である。Ｐｅｇ−アルブミンは２週間で溶出した。ピークＩはボイド容量で、ピークＩＩはチログロブリンの後に溶出した。
【００４３】
本発明によれば、ＬＰＳによる敗血症の誘導前にＰＥＧ−Ａｌｂでラットを前処理すると、生理食塩水または非修飾アルブミンによる動物の前処理に比べ、ＬＰＳにより誘発されるショックの兆候が少なくなる。齧歯類はＬＰＳに対して比較的耐性があるので、高用量のＬＰＳを与え、ＭＯＤＳを有する重篤なヒト敗血症をシミュレートするには低血圧の持続が必要である。ＰＥＧ−Ａｌｂは血圧をより急速に回復し、ヘマトクリットを低下させ（ＣＬを特徴とする血液濃縮とは反対に血液希釈を示唆する）、肺傷害を有意に軽減する。ＰＥＧ−Ａｌｂ分子の有効サイズはより大きいので、細胞傷害の存在下でも、また、内皮の健全性が失われても管外遊出しにくい。
【００４４】
内毒素の投与後に起こるショックは二相の血圧応答を特徴とする。第一相では、ＬＰＳの注射後１０〜１５分で血圧降下が起こる。これは総てのＬＰＳ注射動物に顕著であったが、このことはＰＥＧ−Ａｌｂが内毒素それ自体を中和することにより働くものではないことを示唆する。低血圧の第二相は、主として、血漿量を実質的に低下させる誘導性硝酸オキシド（ｉＮＯＳ）の作用により生じる（２８）。この第二相において、ＰＥＧ−Ａｌｂは、アルブミンまたは生理食塩水に比べて優れた作用を持つ。ｉＮＯＳ ｍＲＮＡまたはペプチドは測定されなかったが、ここで用いたこれらの条件下、すなわち、２０ｍｇ／ＫｇのＬＰＳの静脈内投与下で、ｉＮＯＳが誘導された可能性が極めて高い。いずれの前処理モデルにも本質的な制限が存在するが、このデータは、ＬＰＳの前にＰＥＧ−Ａｌｂを投与すればラットをＡＲＤＳの発症から保護することを示す。
【００４５】
ヘマトクリット、平均動脈圧および組織学は総て、ＰＥＧ−ＡｌｂがＬＰＳにより誘導された血液減少の有益な治療となることを示す。ＰＥＧ−Ａｌｂ処理により達成される血液希釈およびＭＡＰの不変性は血漿増量（または少なくとも維持）の指標となり、アルブミンおよび生理食塩水では反対の作用が見られた。ＰＥＧ−Ａｌｂによる血管内容量の維持は毛細血管漏出の減少と一致している。組織病理学的所見（図３Ａ〜Ｄ）は、ＰＥＧ−Ａｌｂ処理ラットの肺組織では間質浸潤性および硝子質化が最少であることを示す。免疫蛍光研究は、ＰＥＧ−Ａｌｂが毛細血管漏出の際にアルブミンよりも高い程度で、血管空間に保持される傾向があることを示す（図３）。
【００４６】
このＰＥＧ−Ａｌｂのコロイド特性の向上は親水性の上昇によるものであるが、これは、ゲル濾過カラム上での挙動に表れるその極めて大きな流体力学的半径およびその理想的でない浸透圧特性から推測されるより大きな分子慣性半径（ＲＧ）および排除体積（Λ）により示される。これはまた、サイズ排除クロマトグラフィーを用いても証明され、ＰＥＧ−Ａｌｂ／アルブミンの溶出比は、コロイド浸透圧法によるＰＥＧ−Ａｌｂ／アルブミンの排除体積と一致した（図５）。１以上のＰＥＧ基との共有結合により修飾した後のタンパク質のＲＧおよびΛの同様の上昇は、Ｗｉｎｓｌｏｗおよび共同研究者らにより、ウシヘモグロビンの場合について既に報告されている（２９）。
【００４７】
ＰＥＧ−Ａｌｂのコロイド浸透圧特性は、ＣＬに関連した血液減少の治療の際の血漿増量に関して非修飾アルブミンよりも優れている。ＰＥＧ−Ａｌｂは、危篤患者において末端器官に傷害のおそれの軽減、従って罹患率および死亡率の軽減に有用である。本発明はＡＲＤＳを予防または緩和するため、また、血圧を維持するために患者を前処理するのに有用である。分子量がより大きく、コロイド浸透圧特性が増強されたＰＥＧ−Ａｌｂは、内毒素誘発ショックの生理学的および組織学的兆候の改善に関して、生理食塩水またはアルブミンよりも極めて優れている。
【実施例】
【００４８】
以下の実施例は本発明をさらに説明するために示されるものである。本発明の範囲は次の実施例だけからなるとみなされるべきでない。
【００４９】
実施例Ｉ：敗血症におけるポリエチレングリコール修飾アルブミン（ＰＥＧ−Ａｌｂ）の使用
材料および方法： ＰＥＧ−Ａｌｂの調製。２ｇのヒトアルブミン(Sigma, St. Louis, MO)を４５ｍｌの５０ＭＭリン酸カリウム（一塩基性と二塩基性の混合物）ｐＨ７．４に溶かした。５００ｍｇのメトキシポリエチレングリコール(Sigma, St. Louis, MO)を塩化シアヌルで活性化し、４ｍｌの水に溶かした。１．４ｍｌのメトキシポリエチレングリコール溶液を４５ｍｌのヒトアルブミン溶液に加え、この混合物を室温で２時間攪拌した。この混合物を透析チューブ（分子量カットオフ−１２５００）に移し、３０００ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水に対し、４℃で７２時間透析した。ポリエチレングリコール修飾アルブミン（ＰＥＧＡ）を回収した後、使用するまで−２０℃で冷凍した。
【００５０】
動物： 体重４００〜４８０ｇの成体雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット(Charles River Laboratories, Portage, MI)を用いた。動物はAmerican Association for Accreditation of Laboratory Animal Care, International (AAALACI)認可施設で飼育した。標準ラット餌と水を自由に与えた。プロトコールは総てInstitutional Animal Care and Use CommitteeおよびABC (Hazard) Committeeにより認可されたものである。
【００５１】
方法：
動物を一晩絶食させた。ただし、水は自由に与えた。ナトリウムペントバルビタール（５０ｍｇ／ｋｇ）を用いて動物を腹腔内麻酔し、試験過程で必要に応じて追加量を与えた。動脈カテーテル(Intramedic PE-50, Clay Adams)を頚動脈に留置し、継続的に血圧をモニタリングするための変換器／増幅器(TestPoint, Capital Equipment Corporation, Billerica, Mass.)にホックで留めた。Ｇ２４カテーテルを用い、反対側の内頚静脈に静脈内ラインを留置した。基準ヘマトクリットとして頸動脈ラインから血液サンプルを採取し、アルブミンおよび置換輸液（０．９％生理食塩水１ｍｌ）を静脈内ラインから注入した。第１群には生理食塩水５ｍｌを注入した。第２群にはアルブミン０．６ｇ／ｋｇ体重（ＢＷ）を与え、第３群にはＰＥＧＡ０．６ｇ／ｋｇ ＢＷを与えた。３０分後、第３群には内毒素（ＬＰＳ）(Sigma Chemicals, St. Louis, MO)を、用量を変えて与えた。ラットは受けた蘇生輸液に基づいて３群に分けた：第１群（ｎ＝９）には生理食塩水中非修飾アルブミンを０．６ｇ／ｋｇで施し、アルブミンの注射濃度は４０ｍｇ／ｍｌであり、注射容量は１．５ｍｌ／１００ｇ体重（ＢＷ）であった。第２群（ｎ＝１２）には、アルブミンの代わりに、第１群と同じ用量、タンパク質濃度および注射容量でＰＥＧ−Ａｌｂを施した。第３群（ｎ＝６）には１．５ｍｌ／１００ｇ ＢＷの生理食塩水を施した。内毒素注入した後３時間、血圧のモニタリングを行い、その後ラットを安楽死させた。
【００５２】
ヘマトクリットおよびアルブミンに対する試験後血液サンプルを採取した。右の肺をホルマリンに漬け、ヘマトキシリン−エオシン染色のために病理状態を固定した。
【００５３】
潜在的血漿増量剤としてＰＥＧ修飾アルブミン（ＰＥＧ−Ａｌｂ）を検討した。複数の部位でアルブミンを修飾すると、非修飾アルブミンよりも有効分子容積が大きくなり、より大きな浸透圧を示した。ＰＥＧ−Ａｌｂ、アルブミンの溶液および生理食塩水を、ラット内毒素誘発ショックモデルで試験した。ポリエチレングリコール修飾ヒトアルブミン（ＰＥＧ−Ａｌｂ）で前処理すると、平均動脈圧が維持され（ｐ＝０．０２３）、血液希釈溶液によって証明されるように容量が保持され（ｐ＝０．００１）、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）の組織学的兆候が弱まった（ｐ＝０．００２）。ラットを蛍光標識ＰＥＧ−Ａｌｂおよびローダミン標識アルブミンの単独および組合せで前処理した後、ＬＰＳで処理した。肺切片の蛍光顕微鏡観察では、蛍光標識ＰＥＧ−Ａｌｂは血管内に保持されていたが、ローダミン標識アルブミンは保持されていなかったことが示された。生理食塩水または非修飾ヒトアルブミンの使用に比べ、ＰＥＧ−Ａｌｂは、血液減少状態において使用することができる有用な代替の血漿増量剤である。
【００５４】
実施例ＩＩ： 内毒素誘発ショックにおいて血管容積を回復させ、急性肺傷害を軽減するためのＰＥＧ−Ａｌｂの使用
アルブミンおよびＰＥＧＡ（ＰＥＧ−Ａｌｂ）の調製：
５０ｍＭ ＫＰｉ（ｐＨ７．５）に５０〜６０ｍｇ／ｍｌで溶解させたヒトアルブミン（タイプＶ， Sigma Chemical Co.）に、２２℃にて１０分間隔で４回、穏やかに攪拌しながらメトキシポリエチレングリコール塩化シアヌル（平均Ｍｒ５０００）を加えた（添加する度にアルブミン１ｍｇにつき０．２ｍｇ）。試薬を最後に添加した後４０分、反応物を攪拌した。修飾は速やかで、室温で１５分までに完了し、修飾程度は主として試薬の添加量に依存した。動物に注入する前に、アルブミンおよびＰＥＧ−Ａｌｂはいずれも、高分子量カットオフ透析チューブ（５０ｋＤａ分子量カットオフ）を用い、リン酸緩衝生理食塩水に対して４８時間、バッファーを３回交換して透析した。
【００５５】
ＦＩＴＣ−アルブミンおよびＦＩＴＣ−ＰＥＧ−Ａｌｂ
ヒトアルブミン（５０ｍｇ／ｍｌ）を５０ｍＭ ＫＰｉ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌおよび０．５ｍＭジチオトレイトール中で１時間インキュベートした。ジチオトレイトール処理アルブミンを４ｍＭ ５−ヨードアセトアミドフルオレセインまたは１．５ｍＭテトラメチルローダミン−５−ヨードアセトアミドとともに２時間インキュベートした。フルオレセイン修飾アルブミンを、リン酸緩衝生理食塩水を４回交換して４８時間透析し、遊離フルオレセインを除去した。ローダミン標識アルブミンをＳｅｐｈａｄｅｘ ５０によるクロマトグラフィーに付した後、リン酸緩衝生理食塩水に対して徹底的に透析した。
【００５６】
フルオレセイン標識アルブミンのいくらかをメトキシポリエチレングリコール塩化シアヌルで修飾し、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ２００でのゲル濾過により精製した。２００，０００を超える見掛けの分子量で溶出するＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ２００からの画分をプールし、ＰＭ１０膜を備えたＡｍｉｃｏｎ限外濾過セルを用いて濃縮した。ゲル電気泳動によるフルオレセインおよびローダミン標識アルブミンの分析では、蛍光がタンパク質と会合しており、遊離フルオレセインまたはローダミンの位置には蛍光が検出されないことが明らかになった。
【００５７】
生理学的研究
試験プロトコールはオハイオ医学大学のthe Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC)およびthe Academic Chemical Hazardous Committee (ACHC)に認可されたものであった。体重４００〜４８０ｇの成体雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット(Charles River Laboratories, Portage, MI)を用いた。動物はAmerican Association for Accreditation of Laboratory Animal Care, International (AAALACI)認可施設で飼育した。標準ラット餌と水を自由に与えた。試験前に動物を一晩絶食させたが、水は自由に与えた。
【００５８】
総てのラットをナトリウムペントバルビタール（５０ｍｇ／ｋｇ体重）を用いて腹腔内麻酔した後、１時間間隔で維持用量を静脈添加した。右頚動脈に留置し、血圧変換器と増幅器（ＢＬＰＲおよびＴＢＭ４，World Precision Instruments, Sarasota, FL）に接続したカテーテル(Intramedic PE-50, Clay Adams)から継続的に平均動脈圧（ＭＡＰ）を測定し、コンピューター(TestPoint, Capital Equipment, Billerica, Mass)に採集した。
注入用静脈ラインを左頚静脈に挿入した(G24 Protectiv*Plus, Johnson and Johnson/ Ethicon, Arlington, Texas)。
【００５９】
ラットを、投与した蘇生輸液に基づいて３群に分けた：第１群（ｎ＝９）には生理食塩水中の非修飾アルブミンを０．６ｇ／ｋｇ用量で投与し、アルブミン注射濃度は４０ｍｇ／ｍｌであり、注射容量は１．５ｍｌ／１００ｇ体重（ＢＷ）であった。第２群（ｎ＝１２）には、アルブミンの代わりに、ＰＥＧ−Ａｌｂを第１群と同じ用量、タンパク質濃度および注射容量で投与した。第３群（ｎ＝６）には、１．５ｍｌ／１００ｇ ＢＷの生理食塩水を投与した。基準ヘマトクリット（Ｈｃｔ）の測定のために１ｍｌの基準血液サンプルを頸動脈ラインから採取し、同量の０．９％生理食塩水に置換した。輸液注入開始時にＭＡＰのモニタリングを始めた。３０分後、生理食塩水に溶かした２０ｍｇ／ｋｇ ＢＷの内毒素（大腸菌(E. Coli)リポ多糖類［ＬＰＳ］，血清型０５５：Ｂ４５， Sigma Chemicals, St. Louis MO）を投与し、その後３時間ラットをモニタリングした。次ぎに、敗血後のＨｃｔを評価するために血液サンプルを採取した後、ラットを１５０ｍｇ／ｋｇ／ＢＷのペントバルビタールＩＰで安楽死させ、全採血した。最後に、片方の腎臓と両肺を摘出し、後の組織検査のために１０％ホルマリン中で速やかに固定した。
【００６０】
組織学的研究
肺および腎臓組織をホルマリン溶液から取り出し、ヘマトキシリンおよびエオシン染色を含む標準的な処理を施した。コード化したこれらの標本を盲検病理学者が光学顕微鏡で調べ、次の５ポイントシステムを用いて炎症の組織学的特徴にスコアを付けた：０＝有意な組織病理学的変化無し；１＝最少の間質の炎症性浸潤；２＝軽度の硝子質化を伴った軽度の間質の炎症性浸潤；３＝中度の硝子質化を伴った中度の間質の炎症性浸潤；４＝重度の硝子質化を伴った重度の間質の炎症性浸潤。一貫性を確保するために、同じ病理学者が２回の別の機会にサンプルを調べ、平均したスコアを用いた。
【００６１】
分子／生物物理学的研究
ＳＤＳゲル電気泳動。非修飾アルブミンおよびＰＥＧＡのサンプルを、ＳＤＳ（１％，Ｗ／Ｖ）およびβメルカプトエタノール（５％，Ｖ／Ｖ）を加え、沸騰水浴中で１分間加熱することにより、電気泳動用に調製した。サンプルを、７．５％または１０％アクリルアミドゲルで電気泳動に付した（３０）。
【００６２】
サイズ排除クロマトグラフィー
アルブミンおよびＰＥＧＡをベッド容量２４ｍｌのＳｕｐｅｒｏｓｅ ６カラム(Pharmacia)でのサイズ排除クロマトグラフィーにより分析した。サンプルまたは標品混合物（０．５ｍｌ）をカラムに適用し、１０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．５）および１５０ｍＭ ＮａＣｌを用い、０．５ｍｌ／分で溶出した。２８０ｎｍにおける吸光度を継続的にモニタリングした。
【００６３】
ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦタンパク質分析
表面増強レーザー脱離法／イオン化−タイム・オブ・フライト（ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析を用い、ＰＥＧ−アルブミンおよびアルブミンサンプルを同定した。サンプル１ｍｌ（１〜５ｍｇ／ｍｌ）を付着させ、脂肪コーティングしたアルミニウムＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐアレイ(H4 ProteinChip, Ciphergen Biosystems, Palo Alto, CA)の２ｍｍスポット上で直接風乾させた。１／２μｌのエネルギー吸収マトリックス（ＥＡＭ，５０％アセトニトリルおよび０．５％トリフルオロ酢酸水溶液中、３，５−ジメトキシ−４−ヒドロキシ桂皮酸の飽和溶液）を２回サンプルに適用し、風乾させた。
【００６４】
このＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐアレイをＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐリーダーに移し、真空チャンバー内でこのサンプルにレーザー（Ｎ２ ３２０ｎｍ−ＵＶ）を当てた。レーザーショット２回の後、そのマトリックスに吸着したタンパク質をイオン化し、アレイ表面から脱離させた。イオン化されたタンパク質を検出し、ＴＯＦ分析を用いて分子量を求めた。ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐシステム(PBSII series, Ciphergen)にて、Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ Ｐｅａｋｓ（バージョン２．１ｂ）ソフトウエアを用い、陽イオンモードでＴＯＦ質量スペクトルを採取した。６５回のレーザーショットのリアルタイムシグナル平均を求め、各スペクトルを作成した。
【００６５】
コロイド浸透圧（ＣＯＰ）
ＰＥＧＡ−Ａｌｂおよびアルブミンの双方をＣＯＰ測定のため同様に調製した。要するに、サンプルを１０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌに５０ｍｇ／ｍｌとなるように溶かし、３０℃にて１時間ジチオトレイトール（０．５ｍＭジチオトレイトール）で処理した後、３０℃１時間ヨードアセトアミド（５ｍＭヨードアセトアミド）とともにインキュベートした。次ぎに、このアセトアミド化アルブミン（５０ｍｇ／ｍｌを５ｍｌ）を、１０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．５）および１５０ｍＭ ＮａＣｌで平衡化し、アルブミン二量体および浸透圧の測定を妨げる他の低分子量および高分子量夾雑物を減らしたＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ３００（２．８ｃｍ×４０ｃｍ）でクロマトグラフィーに付した。最後に、アルブミンおよびＰＥＧＡの双方を、０．９％ＮａＣｌを数回交換して透析した。
【００６６】
各コロイドのＣＯＰの測定は、Ｗｅｓｃｏｒ Ｍｅｄｅｌ ４４２０コロイド浸透圧計(Logan, UT)を用い、広範囲の濃度で測定を繰り返した。この機器は０．９％生理食塩水をブランクとし、２０．２ｍＯｓｍアルブミン標準溶液で較正した。非修飾アルブミンの濃度は２８０ｎｍにおける吸光度から求め（ε２８０ｎｍ，１％＝５．３１）（３１）、乾重の測定により確認した。ＰＥＧ−Ａｌｂの濃度は乾重から推定した。
【００６７】
濃度［ｃ］に関して、ＣＯＰ［π］は、１）π−ｃ関係の理想的な成分から表される重量分子量［Ｍｒ］（３２）と、２）２つのパラメーターＢとおよびαを介した他の総てのビリアル係数の理想的でない関与を評価するための方程式の非線形最小２乗適合によって分析した。
【００６８】
この方程式の形は、ビリアル係数の数値の演繹的仮定を避ける従来使用されている方程式［π＝ＲＴ（ｃ／Ｍｒ＋Ｂｃ２＋Ｃｃ３．．．）］を微修正したさらに柔軟な形であり、Ｒ＝６３．３６４ｍｍＨｇ Ｍ−１、ｃは濃度（ｇ／ｄｌ）であり、Ｔは温度（２９５°Ｋ）である。
【００６９】
統計分析
これら３つの処理群の、ＬＰＳ前後のヘマトクリット間の差をＡＮＯＶＡで比較した。ここでは、ＡＮＯＶＡ二元配置反復測定を用い、ＬＰＳ前およびＬＰＳ後の種々の時点での平均動脈圧（ＭＡＰ）を比較した。各群間の個々の差をＴｕｋｅｙ多重比較検定を用いて評価した。ｐ＜０．０５を用い、統計学的有意性を示した。
【００７０】
生理学的研究
ＬＰＳ後の血管容積の収縮／拡大−誘発された敗血症をＭＡＰおよびＨｃｔの変化から推定した。これらの測定は双方とも、ＰＥＧ−Ａｌｂ、アルブミンまたは生理食塩水で前処理したラットでは有意に変動した。最初に、ＬＰＳボーラス注入後１５〜２５分内に３群総てがＭＡＰにおいて同様の〜４０％低下を示した（生理食塩水：１３５±１１から８１±３０ｍｍＨｇへ低下；アルブミン：１３４±１４から８５±２０ｍｍＨｇへ低下；ＰＥＧ−Ａｌｂ：１２５±１２から７９±１９ｍｍＨｇへ低下）（図２）。その後のＭＡＰの回復は、生理食塩水（９９±２９ｍｍＨｇ）およびアルブミン（１０８±１４ｍｍＨｇ）処理に比べ、ＰＥＧ−Ａｌｂ処理ラットでは有意に良好であった［ＭＡＰ［ＬＰＳ後３時間］＝１２０±１０ｍｍＨｇ；ｐ＝０．０２３）。ＭＡＰの回復は生理食塩水処理ラットに対してアルブミンではやや大きかったが、この差は有意ではなかった。
【００７１】
ＬＰＳ前のヘマトクリットは総ての試験群で同等であった［４４±２（生理食塩水）、４２±３（アルブミン）および４５±２（ＰＥＧ−Ａｌｂ）］。ＬＰＳ後３時間において、ヘマトクリット（後）は、アルブミン（Ｈｃｔ比（後／前）＝１．０９±０．１１）および生理食塩水（Ｈｃｔ比＝１．１９±０．０９）処理ラットの双方の基準（前）レベルよりも上昇したが、これは血管内液体容量の相対的低下または血液濃縮を示す（図１−Ａ）。これに対し、ＰＥＧ−Ａｌｂ処理ラットはＬＰＳ投与後の血液希釈を示した（Ｈｃｔ比＝０．９３±０．０７）。これらの傾向は各群内で再現性が高く、処理群間の差は統計学的に有意性が高かった（一元配置ＡＮＯＶＡ；ｐ＝０．００１）。最も重要なことでは、これらのＨＣＴの変化は、ＭＡＰ比とＨｃｔ比のクラスタリングにより証明されるように、一般にＭＡＰ回復の程度と層間していた（３３）。ここで、ＰＥＧ−Ａｌｂラットは一般にＨｃｔ比＜１（すなわち、血液希釈）およびＭＡＰ比１付近（すなわち、ＬＰＳ後３時間においてほぼ完全な回復）を示した。あるいは、生理食塩水およびアルブミン処理ラットでは、後／前ＭＡＰ比は相対的に低く（不完全なＭＡＰ回復）、Ｈｃｔ比は一般に＞１（血液濃縮）であった（図１Ｂ）。
【００７２】
組織学的研究
ＰＥＧ−Ａｌｂ処理ラットおよび対照（非敗血症）ラットから採取した肺組織切片の顕微鏡検査では、有意な組織病理学的変化が無かった（図３Ａ〜Ｄ）。その代わりに、ほとんどの生理食塩水処理ラットおよびアルブミン処理ラットでは、硝子質化および間質のリンパ性浸潤を含む、重度の急性肺傷害（ＡＬＩ）に一致する実質的な炎症性の組織病理学的変化が明らかであった（図３）。全体として、平均ＡＬＩスコア（０＝傷害無し；１＝最少；２＝軽度；３＝中度の；４＝重度）は、生理食塩水群（２．０±１．０；範囲０〜３）およびアルブミン群（２．４±０．９；範囲１〜４）の双方に比べ、ＰＥＧ−Ａｌｂ処理ラット（０．７６±０．４７；範囲０〜１）では有意に低かった（一元配置ＡＮＯＶＡ；Ｐ＝０．００２）。４つの群の総てで、腎臓の顕微鏡切片は有意な組織病理学的変化を示さなかった。
【００７３】
フルオレセイン標識ＰＥＧ−Ａｌｂ（緑）とローダミン標識アルブミン（赤）の混合物を注入した正常ラット（図８Ａ）および敗血症ラット（図８Ｂ）例からの結果は、これら２つの発色団の明瞭に異なる分布パターンを示した。特に、正常ラットの肺胞毛細血管領域は、敗血症ラットにおける発色団の拡散分布に比べ、黄色（すなわち、赤と緑）の局在を特徴とし、特に赤いローダミンはその管外遊出を示唆する。また、単一のコロイド種、すなわち、フルオレセイン標識ＰＥＧ−Ａｌｂ（図８Ｃ）およびフルオレセイン標識アルブミン（図８Ｄ）のいずれかを注射したラットからも一貫した知見が明らかである。ここでも、アルブミン処理敗血症ラットは拡散した蛍光を示したが、ＰＥＧ−Ａｌｂ処理ラットはそうではなかった。
【００７４】
ＰＥＧ−Ａｌｂの生物物理学的特性
分子サイズ−アルブミンおよびＰＥＧ−ＡｌｂのＳＤＳゲル電気泳動の結果を図５Ａ（右）に対比させる。予想としては、アルブミンはかなり均質のタンパク質として、その既知の分子量で泳動する。これに対し、ＰＥＧ−Ａｌｂはより大きな見掛けの分子量で泳動し、ＰＥＧ−Ａｌｂ材料はゲル内に容易に入らない。特筆すべきは、理想的でないタンパク質の場合、電気泳動移動度は、それらの分子量というより主としてそれらの拡大特性を反映したものである。修飾タンパク質の実質的不均質性は、複数のリシル残基でのＰＥＧ修飾によるものである。ＰＥＧ−Ａｌｂをゲル濾過でも調べた。ＳＤＳゲル電気泳動でのその挙動と一致して、この修飾タンパク質は実質的に不均質であり、５００，０００〜数百万の範囲の見掛けのＭｒとしてカラムから溶出する（図５Ｂ（左））。サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）カラムでのその挙動も、実際の分子量ではなく、結合されたＰＥＧの拡大特性の現れである。図７のアルブミンおよびＰＥＧ−Ａｌｂ双方の吸光度−Ｖｅ／Ｖ０データを用い、本発明者らは対応する平均Ｖｅ／Ｖ０がそれぞれ２．１１２および１．５８８であると算出した。これらのサンプルにおけるアルブミンおよびＰＥＧ−Ａｌｂの有効分子量（またはサイズ）はそれぞれ約７７，６７０Ｄａおよび９９４，３００Ｄａであり、あるいは相対的サイズ比は約１２．８であると判定された。アルブミン推定値は既知のアルブミンサイズ（６７，０００Ｄａ）よりも大きく、その単量体と二量体の間であり、これは、主要な単量体ピークと小さな二量体ピークという２つのアルブミン吸光度ピークの存在と一致している。
【００７５】
ＰＥＧ修飾の程度を種々の技術で調べるため、アルブミンおよびＰＥＧＡをＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析で分析した。両スペクトルとも、ａ）単量体と多量体の存在、より適切には、ｂ）一価種（ｚ＝１）ならびに多価種（ｚ＞２）の検出の結果としての複数ピークを示した。これらの作用によれば、主要な一価アルブミン単量体スペクトルピークは分子量６６，８８０±２，８００Ｄａを中心としていた（図６Ａ）。これに対し、対応するＰＥＧ−Ａｌｂピークはもっと不均質であり、７７．４から１００ｋＤａを超えるまでに離れた範囲の多数の分子量種を示した。これらの多様なＰＥＧ−Ａｌｂ成分は、リシル残基の修飾によりアルブミン１分子当たりに結合しているＰＥＧ基の数を反映したものである。実際に、これらのＰＥＧ−Ａｌｂ種の質量の隔たりは、試薬のサイズ（平均５０００Ｍｒ）と一致していた。ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦから推定されるＰＥＧ−Ａｌｂ単量体の平均分子量は９４．０００Ｄａ±８．０００Ｄａであった。これはアルブミン１つ当たりに平均５〜６個のＰＥＧ基の付着に相当していた。
【００７６】
コロイド浸透圧（π） アルブミンに比べ、オスモライトとしてのＰＥＧ−Ａｌｂの特性を評価するため、本発明者らはそれらの浸透圧（π）を広範な濃度（ｇ／ｄＬ）で調べた。アルブミンおよびＰＥＧ−Ａｌｂの双方は、たとえ異なっていても、タンパク質濃度に関して浸透圧の非線形的依存性を示し（図７）、それらの束一的特性、Ｄｏｎｎａｎ作用、およびそれらの分子排除体積（Λ）による作用を反映する。アルブミンに関するこれらのπ−濃度データを当てはめると、数平均分子量は６３，３００、ビリアル係数Ｂは１５．６という値、α＝２．０＊となった。これらの係数から、コンピューター計算したアルブミンの分子慣性半径（Ｒｇ）およびΛはそれぞれ３．９ｎｍおよび２，０７０ｎｍ３であった。これらの推定値は総て、これまでに発表されている値とよく一致している（３４）。ＰＥＧ−Ａｌｂのπ−濃度データは、アルブミンに比べて、より大きな非理想性またはひずみの増大を示した。ＰＥＧ−Ａｌｂの対応する数平均分子量は１２８，０００Ｄａ、Ｂ＝６２、α＝２．４０、Ｒｇ＝１０．０およびΛ＝３３，３７８ｎｍ３であった。これはＰＥＧ修飾後のΛの１６倍増に相当した。ＰＥＧ化によるタンパク質の拡大特性におけるこの相対的変化は、同じタンパク質に対するＳＥＣ測定から推定された１３倍増に匹敵する。
【００７７】
分子量を評価するためのこれら２つの方法（ＳＥＬＤＩおよびコロイド浸透圧測定）から、アルブミンでは同等の推定値が得られたが、ＰＥＧ−Ａｌｂの場合ではそうではなかった。後者の場合では、πに基づく推定値は１２８，０００Ｄａと予測されていたものよりも大きかった。浸透圧の導出から、その溶液中のあらゆる種の数平均分量が得られるので、この方法による分子量の過剰見積もりが多量体の存在に一致する。特定の理論に縛られるものではないが、ＳＥＬＤＩデータは実際にＰＥＧ−Ａｌｂ多量体の存在を示唆するので（図６）、これはこれらの明らかな差の可能性のある説明となると考えられる。
【００７８】
生理食塩水およびアルブミンに比べ、ＬＰＳ誘発性の敗血性ショックの前にＰＥＧ−Ａｌｂでラットを前処理すると、１）血圧のより完全な回復が得られ、２）ヘマトクリットは変化しないか、またはやや低下し（通常ＣＬを特徴とする血液濃縮とは反対の血液希釈を示唆する）、３）肺傷害が有意に軽減された。
【００７９】
齧歯類にはかなりの耐性があるので、ＭＯＤＳを伴う重度のヒト敗血症をシミュレートする方法として有意かつ持続的な低血圧を確保するために、比較的高用量のＬＰＳを試験に用いた（３５）。ＬＰＳに続発する低血圧は二相の応答を特徴とする。第一相では、ＬＰＳボーラス注入の１５〜２５分以内に動脈圧に急激な低下が起こる。この相は処理群間で違いはなく、アルブミンおよびＰＥＧ−Ａｌｂは、生理食塩水に比べて、内毒素の初期作用を変化させなかったことを示す。第二相の血圧降下は、主として、ＣＬを経て血漿容量を実質的に減らす誘導性硝酸オキシド（ｉＮＯＳ）の作用により起こる（３６）。ｉＮＯＳ ｍＲＮＡまたはペプチドは測定しなかったが、ｉＮＯＳは高ＬＰＳ用量（２０ｍｇ／Ｋｇ）の投与により誘導された可能性が高い（３７）。
【００８０】
アルブミンまたは生理食塩水に比べ、ＰＥＧ−Ａｌｂの優れた作用は、内毒素ショックのこの第二の血圧降下相に現れた。この証拠としては、より完全な血圧回復と相対的な血液希釈がある。また、肺の組織病理学からＰＥＧ−Ａｌｂ処理ラットの肺組織における最少の間質浸潤および硝子質化が明らかであり、一方、免疫蛍光研究は、ＣＬの存在下での明らかなアルブミンの管外遊出に比べ、ＰＥＧ−Ａｌｂは相当血管内に保持されることを示した。これらのことは総て、毛細血管漏出の低さおよび血漿増量特性の高さと一致する。
【００８１】
これらのin vitro測定は、アルブミンに比べ、ＰＥＧ−Ａｌｂ分子の実質的により大きな有効サイズおよびより大きなコロイド浸透圧は、細胞傷害および内皮の健全性の欠如の存在下で管外遊出しにくくなることを示している。実際に、ＳＥＣおよびコロイド浸透圧測定は、ＰＥＧ化後の分子構造の拡大／容積の拡大に１３〜１６倍増を示した。ＰＥＧ−Ａｌｂのコロイド特性の向上は親水性の増大をもたらし、これはより大きな流体力学／慣性半径（ＲＧ）および容積の拡大（Λ）に現れる。イヌ内毒素ショックモデルでは、毛細血管透過性の重篤度が、電気泳動による種々のタンパク質の分子量の測定から推定された（３８）。より大きな分子量はＭＷ９００，０００Ｄａに相当し、最小はアルブミン（６０，０００Ｄａ）である。アルブミンは慣性半径３．４ｎｍに相当し、最大タンパク質であるアポプフェリチン二量体は１２．１ｎｍであり、大きなギャップは中程度のギャップ（６０，０００〜５００，０００Ｄａ）に比べ、内皮にあまり典型的でなく（３９）、中度〜重度の漏出では、１０ｎｍの大きさのＰＥＧ−Ａｌｂが血管空間に保持されなければならないことが分かる。
【００８２】
実施例ＩＩＩ： ヒトアルブミンのマレイミド−ＰＥＧ誘導体の合成および精製が完成された
１０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌおよび０．５ｍＭジチオトレイトール中、ヒトアルブミン（Sigma Chemical Co., タイプＶ）５０ｍｇ／ｍｌを３０℃で１時間インキュベートした。マレイミド−メトキシポリエチレングリコール２０，０００Ｍｒ（Shearwater Inc., カタログ番号２Ｄ２ＭＯＰ０１）またはマレイミド−メトキシポリエチレングリコール４０，０００Ｍｒ（Shearwater Inc., カタログ番号２Ｄ２ＭＯＰ０１）を１ｍＭまで加え、反応物を３０℃で１時間インキュベートした。ＰＥＧ修飾アルブミンをＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ(Pharmacia)でのイオン交換クロマトグラフィーにより精製した。
【００８３】
図９は、ＰＥＧ−２０，０００（マレイミド）修飾アルブミンの精製を示す−マレイミドＰＥＧ２０，０００で修飾したヒトアルブミン（タンパク質７ｍｇ）を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ７．５、２５℃）で平衡化したＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（１．５ｃｍ×５ｃｍ）に適用した。このカラムを２７ｍｌ／時で溶出し、１．５ｍｌ画分を採取した。クロマトグラフィーは室温（２２℃）で行った。画分７からは、カラムを０〜０．５ＭのＮａＣｌ勾配（総量１００ｍｌ）で溶出した。非修飾アルブミンは画分３５〜４３の間に溶出する。図の挿入は、２８から始まる１つおきの画分のＳＤＳゲル電気泳動（１０％アクリルアミドゲル）の結果を示す。挿入部のゲルにおいてＡと表示されたレーンは、マーカーとしての非修飾アルブミンの泳動を示し、分子量マーカーの位置はゲルの右に示されている。
【００８４】
図１０は、ＰＥＧ−４０，０００（マレイミド）修飾アルブミンの精製を示す−マレイミドＰＥＧ４０，０００で修飾したヒトアルブミン（タンパク質６０ｍｇ）を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ７．５、２５℃）で平衡化したＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（１．５ｃｍ×１５ｃｍ）に適用した。クロマトグラフィーは室温（２２℃）で行った。このカラムを２７ｍｌ／時で溶出し、４ｍｌ画分を採取した。画分１５からは、カラムを０〜０．３ＭのＮａＣｌの直線勾配（総量２５０ｍｌ）で溶出した。非修飾アルブミンは画分４５〜５５の間に溶出する。図の挿入は、３１から始まる連続画分のＳＤＳゲル電気泳動（１０％アクリルアミドゲル）の結果を示す。挿入部のゲルにおいてＡと表示されたレーンは、マーカーとしての非修飾アルブミンの泳動を示し、分子量マーカーの位置はゲルの右に示されている。
【００８５】
実施例ＩＶ： より大きな、機能的に保存されたアルブミン（ＰＥＧ−ＡｌｂＣｙｓ−３４）の投与は肺血性ショックの転帰を改善する
別の態様では、本発明は、アルブミンより１６倍大きな（４２ａ）、本明細書において本発明者らが開発したポリエチレングリコール修飾アルブミン（ＰＥＧ−Ａｌｂ）に関する。代表的なＰＥＧ−Ａｌｂを図１１に示す。ＰＥＧ化は親水性の増大の他、血漿中のタンパク質の半減期を延長し（４３ａ）、タンパク質の免疫原性を低下させる（４４ａ〜４６ａ）。タンパク質にＰＥＧを結合させると、免疫系（細胞性または体液性）のタンパク質を非自己として認識する能力が低下する。ＰＥＧ化により誘導されるこのステルス効果は、ポリマーの結合による排除体積効果およびＰＥＧとアルブミンの間の適合性に二次的なものであり、これによりＰＥＧ−Ａｌｂは天然アルブミンに似たものとなる（４７ａ）。
【００８６】
合成コロイドとは異なり、ＰＥＧ−Ａｌｂは、オスモライトとしての、また抗酸化剤としての（３８ａ）、そしてヘムやビリルビンなどの溶解度の低い代謝産物の輸送体としての役割をはじめ、アルブミンの重要な生理学的機能を保持している（なお、後の２つの特徴は他のクリスタロイドおよびコロイドには付随しないものである）。様々なＰＥＧ修飾タンパク質を含む研究では、有意な毒性がないことが証明されている（４８ａ）。開発されている第一世代（ＰＥＧ−Ａｌｂ１）は、重度敗血症の盲腸結紮穿刺（ＣＬＰ）モデルおよびリポ多糖類（ＬＰＳ）モデルにおいて、アルブミンまたは生理食塩水よりも有効であった。ＰＥＧ−Ａｌｂ１で処理した動物は、コロイドのより良い血管内保持、良好な血行力学、および肺傷害の軽減を示した。ＰＥＧ−Ａｌｂ１の流体力学的半径の増大は、その管外遊出を減らし、血圧および器官潅流を維持しつつ末端器官の傷害を軽減した。さらに、コロイド浸透圧（ＣＯＰ）および高粘度などのＰＥＧ−Ａｌｂ１の生物物理学的特徴は、それ以下では末梢組織の潅流が不十分となるヘモグロビン（Ｈｂ）レベルとして定義される「輸血トリガー」点を低下させる（４９ａ）。
【００８７】
出血性ショックにおいては、毛細血管漏出（虚血／再潅流）の際のアルブミンの管外遊出が重要である。特に、血管内空間からのアルブミンの損失は２つの主要な系で有害である。１つは、アルブミンのコロイド浸透圧の力が失われ、組織浮腫が多臓器不全の発症に寄与するようになる。もう１つは、アルブミンにより提供される抗酸化作用が著しく低下し、酸化剤ストレスが血管傷害を起こし続けるようになり、さらなるアルブミンの毛細血管漏出および管外遊出を永続させる。特定の理論に縛られるわけではないが、本明細書において本発明者らは、より大きな（より大きな流体力学的半径）、機能的に保存された（その抗酸化剤機能に関してチオールとして保存されているＣｙｓ−３４）アルブミン（ＰＥＧ−ＡｌｂＣｙｓ−３４）は実験的出血性ショックの転帰を改善すると考えている。
【００８８】
一つの態様では、本発明は、出血性ショックの処置用の蘇生輸液としてのＰＥＧ−ＡｌｂＣｙｓ−３４に関する。有効流体力学的半径の大きいＰＥＧ−ＡｌｂＣｙｓ−３４は、虚血−再潅流傷害（Ｉ／Ｒ）およびショック状態を伴う毛細血管漏出において非修飾アルブミンで見られるように、血管内空間から漏出しない。血管内にＰＥＧ−ＡｌｂＣｙｓ−３４が保持されるとＰＥＧ−ＡｌｂＣｙｓ−３４は非修飾アルブミンおよび他の蘇生薬よりも、アルブミンのリガンド結合機能、抗酸化剤機能、抗炎症性機能および抗アポトーシス機能を保持しつつ、より有効となる。
【００８９】
別の態様では、本発明は軍用に特に有用である。第一に、ＰＥＧ−Ａｌｂは、ＬＰＳおよびＣＬＰショックモデルにおいて蘇生後のより良好な血圧回復によって証明されるように、血管容積を維持する。このデータはまた、ＰＥＧ−Ａｌｂが出血性ショックにおいても効果的である。第二に、その生物物理学的特徴（高ＣＯＰ、高粘度）のため、ＰＥＧ−Ａｌｂは輸血トリガーを７ｇ／ｄｌ未満のレベルにまで引き下げることができる。これは、末梢組織への酸素の送達が、輸血前に長時間、低ヘモグロビンレベルで維持されることを意味する。第三に、ＰＥＧ−Ａｌｂは凍結乾燥および再水和可能であり、これにより悪条件下でも保存および再構成が可能である。
【００９０】
生理学的研究
ＰＥＧ−Ａｌｂ１は３種類の異なるモデルで調べ、２つは敗血性ショックを模倣したものであり（ＣＬＰおよびＬＰＳ）、１つは出血性ショック（ＨＳ）を模倣するものである。これらの研究は、ＰＥＧ−ＡｌｂＣｙｓ−３４がＰＥＧ−Ａｌｂｉ、デンプンおよびＨＴＳよりも有効な蘇生薬であることを示す。
【００９１】
動物モデル
ＣＬＰモデル−メトキシポリエチレングリコールを用いて複数部位で修飾したアルブミンを評価した。この材料はＭＡＰの維持においてアルブミンまたは生理食塩水よりも有効である。ＰＥＧ−Ａｌｂ１はまた、血清コロイド浸透圧の維持にもより有効であった。ｍＰＥＧ５０００とアルブミンの混合物は、血圧の維持おいてアルブミン単独または生理食塩水よりも有効とは言えず、このことは、ＰＥＧ−Ａｌｂの有効性には、ＰＥＧがタンパク質と共有結合されていることが必要である。図１５に示されるように、遊離のＰＥＧが容易に排泄されることを示す研究（５０ａ）と一致して、遊離ＰＥＧ５０００の血液レベルは静脈投与後、尿に受け渡されるにつれ急速に低下する。１６ＡおよびＢで蛍光顕微鏡観察により示されるように、それぞれフルオレセインおよびテキサスレッドで標識したＰＥＧ−Ａｌｂ１および非修飾アルブミンをＣＬＰラットに投与した場合、フルオレセイン標識は肺血管系に保持されたが、テキサスレッドは肺の管外空間で検出された。対照動物では、フルオレセイン標識ＰＥＧ−Ａｌｂ１およびテキサスレッド標識アルブミンは双方とも、血管内空間にのみ見られた。これらの結果は、そのサイズが大きいことにより毛細血管漏出の際に血管にＰＥＧ−Ａｌｂ１が保持されることと一致する。
【００９２】
内毒素モデル−ラットＬＰＳショックモデルにおけるＰＥＧ−Ａｌｂ１も調べた。ＣＬＰモデルにおける結果と一致して、ＰＥＧ−Ａｌｂ１は非修飾アルブミンまたは生理食塩水に比べ、ＭＡＰの維持に有効であった。さらに、ＬＰＳ処理前のＰＥＧ−Ａｌｂ１の投与は生理食塩水またはアルブミン処理に比べ、肺傷害を有意に軽減した。硝子質化および間質のリンパ性浸潤を含む、重度の急性肺傷害（ＡＬＩ）に一致する炎症性の組織病理学的変化が、生理食塩水またはアルブミンで処理したほとんどのラットで検出されたが、ＰＥＧ−Ａｌｂ１で前処理されたラットではこれらの変化あまり明らかでない。肺傷害のスコアを示すため、代表的なＨ＆Ｅ切片を図１７に示す。急性肺傷害スコアは、生理食塩水（１．８±０．４）およびアルブミン（２±０．６３）処理動物に比べ、ＰＥＧ−Ａｌｂ１（１．１±１、ｐ＜０．０１）では有意に低かった。腎臓には有意な組織病理学的変化は検出されなかった。この結果は、血圧維持におけるその作用の他、内皮の健全性を維持することを示すが、ＰＥＧ−Ａｌｂ１の処理がＬＰＳショック誘発後に開始された場合には、この作用は見られなかった。保護の不在下で、ＬＰＳ後モデルにおける肺傷害作用は、チオール基（Ｃｙｓ−３４）をＰＥＧ化で保護する重要性を強調した。
【００９３】
出血性ショックモデル（ＨＳ）−ラット容積管理ＨＳモデルにおける、ＰＥＧ−Ａｌｂ１と非修飾アルブミンおよび生理食塩水の有効性を比較した。血液（２．６ｍｌ／１００ｇ ｂ．ｗ．）を１０分かけて抜き取って出血をシミュレートし、９０分後に生理食塩水、アルブミンまたはＰＥＧ−Ａｌｂ１で蘇生を開始した。図１８に示されるように、ＰＥＧ−Ａｌｂ１はアルブミンまたは生理食塩水よりも血圧の維持に有効であった。各群は出血後１５〜２５分でＭＡＰに同様の低下を示し、９０分後で同様の回復を示した。ＰＥＧ−Ａｌｂ処理動物は、生理食塩水またはアルブミン処理動物に比べ、処理の開始から４０分、５０分および６０分でＭＡＰに有意な増加を示した。ＰＥＧ−Ａｌｂ１では、ＭＡＰはゆっくり低下し、処理後により高いＭＡＰ応答プラトーに達した（ｐ＜０．０１）。Ｈｔｃは出血後低下し（表Ｉ）、蘇生後にさらに低下し、これはＰＥＧ−Ａｌｂ１蘇生で最も大きく、アルブミンよりもＰＥＧ−Ａｌｂの血管内保持が大きいことと一致していた（Ｐ＜０．０２）。生理食塩水およびアルブミン処理群のＣＯＰはＰＥＧ−Ａｌｂ１群よりも有意に低かった（図１８ａ表Ｉ）。これらの結果は敗血性ショックモデルと一致し、ＰＥＧ−Ａｌｂ１の有効性はショックのモデルに依存しないことを示す。
【００９４】
実施例１Ｖ−１ ＰＥＧ−ＡｌｂＣｙｓ−３４と他の蘇生薬との生理学的比較：
出血性ショックの試験モデル
ｃｙｓ ３４がチオールとして保持されているアルブミン（ＰＥＧ−ＡｌｂＣｙｓ−３４）を含むＰＥＧ−Ａｌｂを、十分特徴付けられているラットＨＳモデルで他の蘇生薬と比較した（５１ａ〜５３ａ）。肺傷害、組織潅流（過剰塩基、乳酸）、動脈血液ガス（ＡＢＧ）、平均動脈圧（ＭＡＰ）、心拍数（ＨＲ）および腎機能指数（クレアチニン）に関するものを含む、ショックの種々の側面の重篤度を反映するいくつかの生理学的パラメーターを調べた。この情報を用い、ＰＥＧ−Ａｌｂと、非修飾アルブミン、デンプンおよび高張生理食塩水などの確立された薬剤を比較した。また、ＰＥＧ−Ａｌｂの性能を最適化するため、ＰＥＧ−Ａｌｂを種々の程度のＰＥＧ修飾、種々のＰＥＧサイズ、および種々のタンパク質−ＰＥＧ結合と比較した。この試験モデルは、実際の生活に見られる状況を模倣する。フェーズ１（入院前）は初期外傷および野外で蘇生を施すことができる場所に個体を運ぶのに必要な時間に相当する。これは実際には、救急車で到着するＥＭＴにより施される蘇生または戦地の医者により提供された蘇生に相当する。フェーズＩＩ（入院）は、個体が病院に搬送された後に提供される処置に相当し、ここでは輸血を行うことができる。フェーズＩＩＩ（観察フェーズ）は、処置後の病院またはリハビリセンターでの時間に相当する。次のプロトコールを用いる。
【００９５】
フェーズＩ（入院前）−容積管理出血によりＨＳを開始する（２０分にわたり２．６ｍｌ／１００ｇ ｂ．ｗ．（Ｈ２０））。放出された血液は再注入のために保持する。２０分の時点で、８０分まで、輸液蘇生を行うか血液を抜き取るかしてＭＡＰを４０〜４５ｍｍ／Ｈｇの間に管理する。８０分の時点で、各処理群にラットを無作為化する。野外で施される蘇生をシミュレートするため、３０分間にわたり１１０分まで注入処置を行う。
【００９６】
フェーズＩＩ（病院フェーズ）−１１０分の時点で、輸血をシミュレートするために、放出された血液を１０分間にわたり注入する。これまでの研究では、このモデルを用い、フェーズＩＩの初期に重度の低血糖と代謝性アシドーシスで死に至るラットがあり、Ｈ２７０分まで、ＭＡＰを＞７０〜８０ｍｍ／Ｈｇに、グルコースを＞１５０ｍｇ／ｄｌに回復させるため重炭酸塩溶液とグルコースを注入する（５３ａ）。
【００９７】
フェーズＩＩＩ（観察フェーズ）−カテーテルを取り去り、麻酔を中断し、ラットをケージに戻して食物と水を与え、７２時間まで観察する。生存個体を２４時間おきにラット総合能力スコア（５４、５５） １＝正常、２＝中度障害、３＝重度障害、４＝昏睡、５＝脂肪）を用いて評価する。死に至るラットには７２時間前に壊死が起こる。生存個体を安楽死させる。フェーズＩおよびＩＩでは、ラットをペントバルビタール（５０ｍｇ／Ｋｇ ｉ．ｐ）で麻酔し、興奮に対して必要に応じて追加量（１２．５ｍｇ／Ｋｇ）を与える。切開部はブポバカイン（マーカイン０．０２５％）で処理する。プロトコールを図１９に模式的に示す。動脈血（０．３ｃｃ）を抜き取り、ＰＯ２、ＰＣＯ２、ｐＨ、Ｏ２飽和、乳酸塩、グルコース、ヘマトクリット、過剰塩基および電解質をモニタリングする(Stat Profile Ultra Gas and Electrolyte Analyzer, NOVA Biomedical, Waltham, MA)。０分、２０分、４５分、９０分、１５０分および２７０分の時点で採血し、ＲＬで置換する。基準時および安楽死の血液のクレアチニン、ＰＴ、ＰＴＴ（合成コロイドによっては凝固障害が伴う）、アルブミンレベル、粘度（円錐・平板型粘度計）およびコロイド浸透圧（モデル４４２０コロイド浸透圧計Wescor Inc., Logan, UT）を分析した。著しい低血圧から起こる心停止を避けるため、採血は最小限とする。
【００９８】
結果： データは、第一世代ＰＥＧ−Ａｌｂ（ＰＥＧ−Ａｌｂ１）が生理食塩水またはアルブミンよりも有効であることを示す。
【００９９】
比較を他の標準的な蘇生薬に拡げる。チオールが保護されたＰＥＧ−Ａｌｂ（ＰＥＧ−ＡｌｂＣｙｓ−３４）を調べる。２５％アルブミンは出血性ショックに有効であるが、５％アルブミンは有効でないことが分かっており（４０ａ、５６ａ）、蘇生薬の容量自体が重要である（同じ量であるがより高濃度の形態で与えられる）ことに着目することが重要である。濃縮形態が優れている理由は抗酸化作用を発揮するには閾値濃度のアルブミンが必要であるということで説明できる。あるいは、２５％アルブミンの使用に伴う高浸透圧が抗炎症作用に寄与する可能性もある（４０ａ）。５％および２５％のアルブミンおよびＰＥＧ−Ａｌｂをアルブミン含量に基づいて比較する。ヘタスターチ６％（Ｈｅｘｓｔｅｎｄ（登録商標））も蘇生に使用し、ＰＥＧ−Ａｌｂと比較する。高張生理食塩水（７．５％）はＰＥＧ−Ａｌｂと比較する第三の蘇生薬である。
【０１００】
毛細血管漏出研究
特定の理論に縛られるものではないが、本発明者らは、ＰＥＧ−Ａｌｂは毛細血管漏出の際に血管内に保持され、従って血液のコロイド浸透圧を維持すると考えている。本発明者らは、アルブミンよりも１６倍大きいＰＥＧ−Ａｌｂ１はＣＬＰおよびＬＰＳモデルに伴う毛細血管漏出状態にあって、管外遊出が少ないことを示した（４２ａ）。本発明者らは、出血性ショックモデルの場合にもそうであると決定付けた。本発明者らが開発した方法を用い、標識アルブミンおよびＰＥＧ−Ａｌｂ（テキサスレッド、ＴＲ）およびＰＥＧ−Ａｌｂ（フルオレセイン、Ｆ）をラットに注入し、注入後の異なる時点で分析のために尾の静脈から少量の血液を採取する。標識アルブミンの調製については、本明細書の、ＰＥＧ−Ａｌｂの生物物理学的同定を取り扱う節に記載されている。アルブミンが管外空間に失われ、ＰＥＧ−Ａｌｂが保持されるとすれば、アルブミンの喪失とＰＥＧ−Ａｌｂの優先的保持に一致して、フルオレセインとテキサスレッドの比（Ｆ／ＴＲ）が大きくなる。テキサスレッドとフルオレセインの励起スペクトルおよび発光スペクトルは有意に異なり、この２種類の色素の混合物は血清サンプル中で定量的に調べることができる。また、アルブミンとＰＥＧ−Ａｌｂの分布も、蛍光顕微鏡により肺の凍結組織切片で定量的に調べ、敗血性ショックのモデルで見られるように、ＰＥＧ−Ａｌｂが血管内に保持されるかどうかを判定することができる（図１６ＡおよびＢ）。
【０１０１】
この蛍光団がタンパク質の分布を変えないことを確認するためには、標識（フルオレセインアルブミンおよびテキサスレッドＰＥＧ−Ａｌｂ）を切り替える。気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬ）の蛍光アルブミンおよびＰＥＧ−Ａｌｂを調べ、もしＴＲアルブミンが優先的に漏出していれば、ＢＡＬのＦ／ＴＲ比が低下すると予測される。この方法を用い、一方が他方よりも有効に保持されるかどうかを判定するため、本発明者らが作製したＰＥＧ修飾アルブミンを比較する。
【０１０２】
他の態様では、肺の透過性を調べ、血管を透過しないエバンブルー色素（ＥＢＤ）を用いる別のアプローチが有用である（５７ａ）。ラットに内頚静脈カテーテルを通じて１％ＥＢＤ溶液を２０分間注入した後、安楽死させる。色素を完全に循環させた後（５分）、血液を抜き取り、血漿のＥＢＤ濃度を測定する。ラットを安楽死させ、肺、肝臓を摘出する。摘出した肺に対し、５ミリリットルの生理食塩水を３回注入してＢＡＬを行う。左の肺葉を、湿重／乾重測定用にとっておくため、生理食塩水が流れ込まないように結紮する。生理食塩水を注入しなかった肺を採取して重量測定し、乾燥のために真空炉に入れ、その後、管外液体漏出に代わるものとして湿重／乾重を測定する。合わせたＢＡＬ液を遠心分離して細胞を除去し、上清をＥＢＤに関して分析した。ＢＡＬ液のＥＢＤ濃度は、血漿中に存在するもののパーセンテージとして表す。すなわち、ＢＡＬ／血漿ＥＢＤを、肺組織の湿重／乾重とともに処理群の間で比較する。
【０１０３】
血行力学
敗血性ショックモデルで生理食塩水およびアルブミンと比べたＰＥＧ−Ａｌｂ１の特徴は、その血圧を維持し、血液濃縮を防ぐ能力である。出血性ショックモデルにおける重要な問題は、標準的な蘇生薬に比べてＰＥＧ−ＡｌｂＣｙｓ−３４がいかによく働くかということである。ラットをナトリウムペントバルビタールで麻酔した後、必要に応じて鎮静を維持する。右頚動脈に動脈カテーテル(Intramedic PE-50, Clay Adams)を挿入し、血圧変換器に接続し、増幅させ、継続的にモニタリングする（サンプリング速度１００Ｈｚ；ＭＰ１００, BioPac Systems Inc, Santa Barbara, CA）し、コンピューターに採集する。液体注入のため、左頚静脈に静脈ライン（G24 Protective*Plus, Johnson and Johnson/Ethicon, Arlington, Texas）を挿入する。種々の液体蘇生薬を投与した動物のＭＡＰおよびＨＲをモニタリングする。入院前フェーズでは、総てのラットに同レベルの虚血を最低６０分与え、その後、各処理群に無作為化する。クリスタロイド群にはコロイド群の容量の３倍、ＨＴＳ群の容量の８倍を与える。ＣＬは出血性ショック後２０分といった早いうちに起こり得るということに基づけば、ＰＥＧ−Ａｌｂは、初期段階（入院前）で始めるとＭＡＰに優れた能力を示す（５８ａ）。入院フェーズでは、ＰＥＧ−ＡｌｂＣｙｓ−３４群の能力は、次の理由から、他の処理群より優れている。１）処理後（再潅流）、毛細血管漏出はいっそう重篤になり、ここでＰＥＧ−Ａｌｂは血管空間により良く保持される；２）クリスタロイドおよび合成コロイドとは対照的に、ＰＥＧ−ＡｌｂＣｙｓ−３４は酸化産物を減らすことで、内因的血圧に対する血管の感受性を高める（１０ａ）。
【０１０４】
潅流研究：
出血性ショック中の生体器官の潅流不足が臓器不全の主因である。ＰＥＧ−Ａｌｂと他の蘇生薬を比較するため、薬剤血流低下の指標となるいくつかの生理学的パラメーターを調べる。
【０１０５】
ａ．乳酸−乳酸レベルは出血性ショックにおいて続発する臓器不全と相関がある（５９ａ）。エピネフリンレベルの上昇（ショックに続発する）により、Ｎａ＋−Ｋ＋ ＡＴＰアーゼの活性を刺激することでＡＴＰが低下し（６０ａ）、その結果、ミトコンドリアの機能不全と嫌気性解糖のために乳酸塩の生産が高まる。ＰＥＧ−Ａｌｂ処理群における潅流の向上は、次の要因に続発するものであると予測される。１）全身の血圧の維持が良好であること、および２）ＰＥＧ−Ａｌｂの生物物理学的特徴により高まった微細循環レベルで潅流が良好なこと（ＣＯＰおよび粘度の上昇）。これは、一酸化窒素の増加を刺激する能才血管レベルでの剪断応力を高め、その結果、血管拡張と潅流の向上がもたらされる（４９ａ）。
【０１０６】
ｂ．過剰塩基（ＢＥ）Ｆｅｎｃｌ−Ｓｔｅｗａｒｔ（６１ａ，６２ａ）法 不足塩基量は、生理学的正常値のＰａＯ２、ＰａＣＯ２および温度で、全血１リットルを通常のｐＨまで滴定するのに必要な塩基量と定義される（６３ａ）。ＢＥは、標準重炭酸塩において平均値２２．９からの偏差に因数１．２を掛けることにより得られる（６４ａ）。ＢＥの算出では、通常の水分含量、電解質およびアルブミンを仮定する。血漿アルブミン濃度の有意な変化が予測されるので、これは適切である。アルブミンが１ｇ／ｄｌだけ低下すると、ＢＥは３．７ｍＥｑ／Ｌだけ低下する（６１ａ）。小児科ＩＣＵ患者のコホートにおいてナトリウム、塩化物およびアルブミンに関して補正したＢＥは、ＢＥ算出値、陰イオンギャップおよび乳酸塩よりも死亡率と良好な相関を示した（６２ａ）。−５ｍＥｑ／Ｌ以上の値はいずれも有意である。測定されていない陰イオンに関する過剰塩基補正値（Ｂｅｕａ）は、次のように定義される：
Ｂｅｕａ＝ＢＥ−（Ｂｅｆｗ＋Ｂｅｃｌ＋Ｂｅａｌｂ）。
【０１０７】
この式の用語は以下のとおり：
ＢＥｕａ−測定されていない陰イオンに関して補正したＢＥ；
ＢＥｆｗ−自由水作用により生じる過剰塩基＝０．３＊Ｎａ−１４０；
ＢＥｃｌ−塩化物の変化により生じる過剰塩基＝１０２−Ｃｌｃｏｒ（ここで、Ｃｌｃｏｒ＝ＣＬ＊１４０／Ｎ）；
ＢＥａｌｂ−アルブミンの変化により生じる過剰塩基＝３．４＊（４．５−アルブミン）。
【０１０８】
ｃ．粘度−出血性ショックの処置の際、大容量のクリスタロイドおよびコロイドを用いる蘇生を行うと、ヘマトクリットおよび血液粘度が低下する。組織学的に、血液喪失の補正におけるコロイドおよびクリスタロイドの使用は、輸血トリガーと呼ばれるレベル（５０％のＨｂ喪失またはＨｂ７ｇ／ｄｌ）までは安全であるとみなした（６５ａ）。ヘマトクリットが基準値の５０％を下回るまでに低下する場合は、毛細血管レベルで剪断応力が低下し、その結果、血管収縮が起こり、組織への酸素送達が低下する。Ｔｓａｉのグループおよび他者による研究（４９ａ、６５ａ、６６ａ）では、粘度上昇は輸血または組織へ酸素を送るための他の薬剤の前に、組織への酸素送達を維持する助けとなることが示されている。ＰＥＧ−Ａｌｂは、他の重合タンパク質がそうであるように（６７ａ）、粘度を増すはずである。ＣＬＰラットにＰＥＧ−Ａｌｂを３ｇ／ｄｌで与えた場合、血清粘度（円錐・平板型粘度計で測定）は３ｃＰであり、その血液希釈度で酸素送達を維持するのに必要であるとみなれるレベルであった（６６ａ）。図２０に示されるように、粘度はＰＥＧ−Ａｌｂ濃度に直線的に依存するが、コロイド浸透圧は非線形濃度依存性である。
【０１０９】
実施例ＩＶ−２−酸化ストレスおよび全身性炎症性応答の抑制におけるＰＥＧ−ＡｌｂＣｙｓ−３４の有効性に関する分析
in vivo研究は、「酸化ストレスが強く、天然アルブミンが漏出する虚血／再潅流傷害の際にＰＥＧ−ＡｌｂＣｙｓ−３４を血管空間に維持する」と、血管空間の抗酸化能が高まり、アポトーシスが低下し、炎症が制御される。
【０１１０】
炎症研究
ＮＦ−κＢは出血性ショックの後に活性化され、ＴＮＦ−αなどのサイトカインの過剰発現および産生に至る（６８ａ）。虚血中（６９ａ）または蘇生中（７０ａ）のＮＦ−κＢの活性化は、炎症性応答の誘発および悪化した炎症性応答の持続において重要な段階である考えられる。重要なこととしては、アルブミンが投与される容量は炎症に重要な役割を果たしているのが明らかである。２５％アルブミンは、肺の好中球隔離を低下させ、ショック／蘇生後の肺傷害を防いだが、５％またはＲ／Ｌではそうではなかった（４０ａ）。これは、２種類の濃度を用いてアルブミン調製物を試験するための基礎である。
【０１１１】
ａ．組織学−急性肺傷害（ＡＬＩ）および広汎性肺胞傷害（ＤＡＤ）は出血性ショック後によくある合併症であり、重度の炎症性応答を伴う場合が多い（７１ａ）。ホルマリン固定した肺組織に標準的なヘマトキシリンおよびエオシン染色処理を行う。コード化した標本を盲検病理学者が光学顕微鏡で調べ、次の５点系を用いて急性炎症性肺傷害にスコアを付ける：０＝有意な組織病理学的変化無し；１＝最少の間質の炎症性浸潤；２＝軽度の硝子質化を伴った軽度の間質の炎症性浸潤；３＝中度の硝子質化を伴った中度の間質の炎症性浸潤；４＝重度の硝子質化を伴った重度の間質の炎症性浸潤。一貫性を確保するために、サンプルは２回調べ、スコアを平均する。
【０１１２】
ｂ．肺のミエロペルオキシダーゼ−好中球と種々の細胞、特に内皮細胞との間の相互作用は蘇生後の臓器傷害に決定的な役割を果たしている。好中球隔離の指標として、炎症の重篤度に関連している、肺抽出物中のミエロペルオキシダーゼ活性を測定する（７２ａ）。
【０１１３】
ｃ．サイトカイン−再潅流後、局部的な炎症反応には、好中球動員の他、ＴＮＦ−αなどのサイトカインが関与している（７３ａ，７４ａ）。同じＨＳラットモデルにおいて、肝臓のＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−α ｍＲＮＡの血漿レベルは出血が終わった後２０分で有意に増加していた（４ａ）。高濃度のアルブミンはＴＮＦ−αおよびＩＬ−６などの炎症性サイトカインの生産を低下させたことが示されている（３９ａ，７５ａ）。フェーズＩＩおよびＩＩＩ中の肺組織および肝臓組織でＴＮＦ−αおよびＩＬ−６を測定する。基準時とフェーズＩ、ＩＩおよびＩＩＩが終わった後に血清において、製造業者のプロトコールに従い(Pharmingen, San Diego, A)、標準的なサイトカインアッセイを行う。
【０１１４】
ｄ．ＮＦ−κＢ活性化−虚血期または蘇生後に起こるＮＦ−κＢの活性化は、出血性ショックおよび蘇生における機能不全的炎症応答と結びついている。電気泳動移動度シフトアッセイにより測定された肝臓ＮＦ−κＢ結合活性は出血が終わった後１０分の核抽出物において増加していた。ウエスタンブロット研究では、細胞質抽出物中の阻害タンパク質ＩκＢαのレベルが出血が終わった後５分で低下することを示している（４ａ）。炎症性サイトカインはＮＦ−κＢ結合部位を含み（７６ａ）、それらの部位へのＮＦ−κＢの結合が増えると、サイトカイン発現が増強され、炎症および組織傷害が増える。これは、ＮＦ−κＢのダウンレギュレーションが炎症を軽減すると予測されることを意味する。細胞培養系では、アルブミンが、ＴＮＦαに誘導されるＮＦ−κＢの移動を防ぐのに十分に細胞内グルタチオンを増加させたことが示されている（７７ａ）。フェーズＩＩおよびＩＩＩの後、肺および肝臓でＮＦ−κＢを測定する。ＮＦ−κＢの低下は正の蘇生作用の指標として用いられる。電気泳動移動度シフトアッセイを用いてＮＦ−κＢを測定し、ウエスタンブロット解析を用いてＩκＢαを測定する（４）。
【０１１５】
実施例ＩＶ−３−アポトーシスおよび酸化
虚血−再潅流の結果、内皮の健全性が損なわれる（７８ａ，７９ａ）。肺動脈内皮細胞（ＥＣ）虚血症のヒト血漿に曝したところ、１０分後にそれらは丸くなり、ギャップを形成し、その後、突起ができる（８０ａ，８１ａ）。毛細血管漏出症候群患者由来の血清に曝した後にミトコンドリアＥＣ培養物でも同じ形態変化が見られる（１２ａ）。ＥＣのアポトーシスを形態学的基準、血漿ホスファチジルセリン曝露（アネキシン染色）およびＤＮＡのフラグメンテーションにより明らかにした。内皮細胞におけるＢａｘ／Ｂｃｌ２に増加を免疫組織化学により検出した。これらの作用の機構を細胞内反応性酸素種（ＲＯＳ）を測定することで探索し、その結果から、酸化性の傷害がＥＣのアポトーシス機構に役割を果たしていることが示唆された（１２ａ）。酸化ストレスはアポトーシスの周知のインデューサーである（１１ａ）。さらに、外傷および出血後にアポトーシスの増強が起こる（１５ａ，７８ａ，７９ａ，８２ａ）。カスパーゼ阻害剤によるアポトーシスの阻害は、Ｉ／Ｒにより誘発される炎症を弱めた（３６ａ，８３ａ，８４ａ）。虚血−再潅流に曝された組織では、抗酸化剤がこの傷害からの損傷を最小限にした。アルブミンは血漿における主要な細胞外抗酸化剤である。アルブミンは酵素γグルタミルシステインジペプチドを通じてこの機能を発揮し、そこでアルブミンはグルタチオンの合成に重要な役割を果たす（３８ａ）。グルタチオンは哺乳動物細胞に存在する主要な低分子量可溶性チオールであり（８５ａ）、その枯渇はアポトーシスの誘導に役割を果たす（８６，８７）。アルブミンがいかにしてその抗酸化活性を発揮するかを見る別の研究では（４０）、１つの遊離チオール（ｃｙｓ３４）を修飾すると、抗酸化活性に４５％の低下を伴った（８８ａ）。アルブミンは、そのグルタチオン（ＧＳＨ）増加能により酸化から保護される。逆に、ＧＳＨが低下すると、ａ）カスパーゼ３およびポリＡＤＰリボースポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）のフラグメンテーションが活性化し（８９ａ）、ｂ）Ｂｃｌ−２／Ｂａｘ比が低下する。後者の比は細胞生存、特に酸化傷害に対する防御の強力な指標である（９０ａ，９１ａ）。結果として、アルブミンは、その抗酸化剤としての機能を通じて、アポトーシスからの保護作用に有意に寄与する。内皮に比べ、アルブミンは微小血管透過性を低下させ（３３ａ，９２ａ，９３ａ）、内皮細胞のアポトーシスを防ぐのに不可欠な役割を果たした（３６ａ，８４ａ）。
【０１１６】
実施例ＩＶ−４ 肺組織および肝臓組織におけるＩ／Ｒ後の細胞傷害に対するＰＥＧ−ＡｌｂｃＣｙｓ−３４の作用
ａ．ＴＵＮＥＬアッセイ−この方法では、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを用い、ＤＮＡ鎖の破断をフルオレセインコンジュゲートヌクレオチドで標識する（９４ａ）。アポトーシス検出キット(Boehringer, Indianapolis, IN)を用いる。組織サンプルは盲検病理学者が調べる。Ｂ．アポトーシスマーカーのウエスタンブロット解析−組織サンプルを急速冷凍し、ウエスタンブロット解析のための抽出まで−８０℃で保存する。アポトーシスは、その存在または修飾がアポトーシスに伴ういくつかのタンパク質を調べることにより検出される。ウエスタンブロット解析を用い、アポトーシス誘導タンパク質のＲｈｅ発現および抗アポトーシスタンパク質ｂｃｌ−２を調べる。ポリＡＤＰ−リボースポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）の切断産物に関する組織抽出物を分析する。ＰＡＲＰはカスパーゼ３および７の基質であり、認知されているアポトーシスマーカーである。全長ＰＡＲＰ（１１５Ｋｄａ）は、８５〜９０Ｋｄａと２３〜２４Ｋｄａの断片に切断され、その結果、その酵素活性が不活性化される（１１，９５）。
【０１１７】
ｂ．ｂａｘおよびカスパーゼ−３に対する免疫組織化学染色−組織をパラフィンに包埋し、免疫染色用に厚さ５ミクロンの切片に切断する。ＨＳ動物および対照動物から切片を作製する。活性型カスパーゼ−３に特異的なポリクローナルウサギ抗体を用いる。薄層組織切片中のカスパーゼ３の分布を、蛍光二次抗体を用いた免疫染色により判定する。内皮に同時局在させるため、ＣＤ３４染色および因子ＶＩＩＩ染色を用いる。陰性対照切片にも、一次抗体を除き、同じ処理を行う。対照動物および処理動物からの免疫染色スライドをコード化し、盲検のリーダーが４０倍で読み取る。各スライドについて独立した２回の読み取り値を得、陽性細胞／ｍｍ２組織のパーセンテージとして表す。
【０１１８】
ｃ．グルタチオンの測定−ＨＳに伴う酸化ストレスは、還元型／酸化型グルタチオンＧＳＨ／ＧＳＳＧ比に反映される。よって、肺における還元型および酸化型グルタチオンを、Hissin and Hilfが記載さいている手順（９６）に従って測定する。冷凍組織をＴＣＡで抽出し、中和し、抽出物中のＧＳＨおよびＧＳＳＧ含量をｏ−フタルジアルデヒド（ＯＰＴ）との反応により測定し、生じた蛍光を、標品として確実なＧＳＨおよびＧＳＳＧを用いてモニタリングする。ＰＥＧ−Ａｌｂ１を含む他の群に比べ、ＰＥＧ−ＡｌｂＣｙｓ−３４で処理した後のＧＳＨ／ＧＳＳＧは上昇する。これはＰＡＲＰの低さおよびｂａｘ／ｂｃｌ−２の低下により明らかなように、低いアポトーシス活性と相関している。
【０１１９】
ｄ．マロンジアルデヒドの測定−組織抽出物中のマロンジアルデヒド（ＭＤＡ）もＨＳに伴う酸化ストレスのマーカーとして用いられる。屠殺後に摘出した肺および肝臓のマロンジアルデヒド（ＭＤＡ）（９７ａ）および総抗酸化能（ＴＡＯＣ）（９８ａ，９９ａ）を測定する。ＭＤＡはＨＰＬＣ法を用いてアッセイする（９４ａ）。脂質の過酸化の初期マーカーであるＭＤＡはＴＡＯＣとともに上昇するが、ＧＳＨ／ＧＳＳＧ比は低下すると予測される。
【０１２０】
実施例ＩＶ−５ ＰＥＧ−Ａｌｂの作製および生物物理学的特徴付け
ＰＥＧ−アルブミンのin vivo有効性の実施例と並行して、ショック治療におけるそのin vivo有効性と相関する特性を特定するため、修飾アルブミンに対する物理的研究を行う。
【０１２１】
合成方法、産物サイズの分布、タンパク質の二次構造およびコンフォメーションに対する修飾の効果、アルブミンのコロイド浸透圧特性に対するＰＥＧ修飾の効果、および生理学的に関連のあるリガンドの結合に対する効果を評価する。実施例ＩＶ−５ａではＰＥＧ−Ａｌｂの作製および特性に関する予備研究を、実施例ＩＶ−５ｂでは提案される研究を記載する。
【０１２２】
実施例ＩＶ−５ａ ＰＥＧ−Ａｌｂに関する生物物理学的予備研究
１．ＰＥＧ−Ａｌｂの作製およびサイズ分析
修飾の様式および程度ならびにアルブミンに結合しているｍＰＥＧ（メトキシポリエチレングリコール）のサイズはその生物物理学的特性およびin vivo特性を変化させ得るので、本発明者らはＰＥＧとアルブミンを連結する種々の方法を検討し、サイズ、安定性および浸透圧特性に関して改変されたタンパク質を同定した。本発明者らはＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ｍＰＥＧ５０００）、塩化シアヌル（ｍＰＥＧ５０００）、およびチオール選択性マレイミド誘導体（ｍＰＥＧ２００００およびｍＰＥＧ４００００）を検討した。
【０１２３】
塩化シアヌル（ｍＰＥＧ５０００）誘導体を動物で試験した。これらの修飾様式は単純、迅速であり、ほとんどのアルブミンが修飾される。過剰量の試薬と非修飾アルブミンをゲル濾過またはイオン交換クロマトグラフィーにより除去する。ＮＨＳエステルおよび塩化シアヌル（双方ともリシルε−アミノ基に選択的）およびマレイミド（システイニルチオールに選択的）は市販されており、穏和な条件下で容易に反応する。図２１は塩化シアヌルｍＰＥＧ５０００で修飾されたアルブミンの分析結果を示す。複数の残基を修飾する試薬に対して予測されるように、ＣＮＣＩ−ｍＰＥＧ５０００修飾アルブミンは、ＳＤＳゲル電気泳動（Ｍｒ，ａｐｐ＞２５０，０００）またはＳｕｐｅｒｏｓｅ ６でのゲル濾過（Ｍｒ，ａｐｐ＞４５０，０００）で調べた際に不均質である。ＳＤＳゲルで見られた種の分子量はＰＥＧの拡大特性により、標品として用いたタンパク質と同じ質量のＳＤＳと結びついていない可能性があるという事実のために明らかでない。アルブミンは、修飾の際の試薬／タンパク質比を高めることで、この試薬でより広範囲に修飾することができる。生成物の不均質性はゲル濾過によるサイズ選択で軽減することができる。図２２は、分取Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ３００カラムで分画した材料（Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩと表示）のＳｕｐｅｒｏｓｅ ６による分析的ゲル濾過の結果を、非修飾アルブミンおよび非分画材料（Ｕと表示）とともに示す。
【０１２４】
ヒトアルブミンの単一のチオール（１００−１０２）はめずらしく低いｐＫａ（およそ５．５）を有するので、タンパク質のジスルフィド構造を混乱させずにチオール選択性試薬で修飾することができる。本発明の一つの態様に従い、本発明者らは、種々のサイズのｍＰＥＧと結合させた（２０，０００Ｍｒ誘導体および分枝型４０，０００Ｍｒ誘導体）。アルブミンをジチオトレイトールとともにインキュベートし、ｃｙｓ３４を介してアルブミンと結合している低分子量産物をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ５０クロマトグラフィーにより取り出した後、マレイミドｍＰＥＧ４００００で修飾した。図２３は、Ｑ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅでのｍＰＥＧ４００００修飾アルブミンの精製の結果を示す。ＣＮＣＩ−ｍＰＥＧ５０００修飾アルブミンとは異なり、この材料は均質であり、単一のシステイニル残基の修飾に一致する。本発明者らは同じアプローチを用いてｍＰＥＧ２００００アルブミンを作製し、それもまた均質なタンパク質として挙動する。ＳＤＳゲル電気泳動での挙動に一致して、ｍＰＥＧ２００００アルブミンおよびｍＰＥＧ４００００アルブミンは、図２４に示されるように、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ ６でのゲル濾過により調べた場合、単一の対称ピークとして溶出する。これらの修飾タンパク質は、単一修飾種として推定される分子量（ｍＰＥＧ２００００アルブミンでは８７，０００、ｍＰＥＧ４００００アルブミンでは１０７，０００）を考えれば、予測されるものよりも著しく大きいサイズで溶出する。この挙動はこれらのＰＥＧの拡大構造と一致する。ＰＥＧ４００００アルブミンのＳＥＬＤＩ質量分析では、１０８，０００Ｍｒを中心とする単一のブロードピークが得られたが、これはそれが単一の修飾であることを示している。これらの修飾アルブミンのゲル濾過での挙動は、それらがＰＥＧの拡大構造による拡大構造を持っていることを示す。
【０１２５】
２．ＰＥＧ−Ａｌｂの熱力学的安定性およびコンフォメーション
これらのｏＰＥＧ−Ａｌｂの分析の争点は、その修飾がアルブミンの天然構造、さらに可能性としては、リガンド結合特性および安定性を変化させるかどうかということである。本発明者らは、尿素により誘導される脱フォールディングを分析することより、ＰＥＧ−Ａｌｂの安定性を調べた。これは、タンパク質の熱力学的安定性を研究する標準的な方法であり、脱フォールディングの自由エネルギーが得られ、そのタンパク質が脱フォールディング中間体と考えられるかどうかを明らかにすることができる（１０３ａ−１０５ａ）。このタンパク質を変性剤の濃度を増しながらインキュベートし、天然状態および脱フォールディング状態に特徴的な分光光度シグナルを調べる。本発明者らは、トリプトファン（ｔｒｐ２１４）の蛍光発光波長（強度平均発光波長＜λ＞）におけるシフトをシグナルとして用いたが、これはタンパク質を脱フォールディングする際に顕著な赤色シフトが存在するためである（１０６ａ）。非修飾アルブミン（パネルＡ）、ｍＰＥＧ２００００修飾アルブミン（パネルＢ）およびｍＰＥＧ４００００修飾アルブミン（パネルＣ）を含むこのような研究の結果の例を図２５に示す。他者らの研究では、非修飾ヒトアルブミンは少なくとも１つの中間体種を伴う複雑な脱フォールディング経路を示すことが示されており（１０６ａ，１０７ａ）、本発明者らの結果が確認される。ｍＰＥＧ２００００およびｍＰＥＧ４００００修飾アルブミンの脱フォールディングは、非修飾アルブミンとの類似性が著しく（図１５パネルＡ）、このＰＥＧ修飾アルブミンは非修飾アルブミンによりもやや安定性を欠いているだけである。ｍＰＥＧ２００００修飾アルブミンは、中程度の尿素濃度で若干の青色シフトを示し、これは部分的に脱フォールディングした中間体種におけるトリプトファンの状態が変化している可能性があることを示唆する。ｍＰＥＧ２００００修飾アルブミンとｍＰＥＧ４００００修飾アルブミンは双方とも、この脱フォールディングの中間点は、非修飾アルブミンの場合と同じ濃度に存在する（７Ｍ）。本発明者らは、種々のサイズ分画多重修飾ｍＰＥＧ５０００アルブミンに対して同様の脱フォールディング研究を行ったところ、それらの結果は単一修飾のアルブミンで得られたものと同様である。全体として、ＰＥＧ修飾はそれほど安定性を欠いていない。
【０１２６】
本発明者らはまた、ＰＥＧ−Ａｌｂの１つ（ＰＥＧ４０−Ａｌｂ）と非修飾アルブミンを示差走査熱量測定法（ＤＳＣ）により比較した。このアプローチにより熱力学的安定性に関する情報が得られ、これを用いてコンフォメーションおよび安定性に対するリガンドの効果を検出することができる。図２６は、ＰＥＧ−Ａｌｂ４０（ＰＥＧ４０）および非修飾アルブミン（Ａｌｂ）を用いたＤＳＣ実験の結果を示す。これらのＤＳＣスキャンは、１つには、熱により誘導される脱フォールディングに対してタンパク質を安定化させる傾向がある脂肪酸の結合のために複雑である。重要な特徴は、ＰＥＧ４０−Ａｌｂが非修飾アルブミンと同じ特徴を示すことである。ＰＥＧ４０−Ａｌｂで見られる最初の遷移の遷移温度は、アルブミンに比べてＰＥＧ４０−Ａｌｂからのほうがより多くの脂肪酸が除去されることを表している（１０８ａ〜１１１ａ）。これらの結果は、ＰＥＧ４０修飾タンパク質が非修飾アルブミンの天然構造を保持していることを示す。
【０１２７】
これらの安定性の研究を拡張するため、本発明者らは、種々の薬剤による単一のトリプトファニル(typtophanyl)残基の蛍光から消光を調べた。トリプトファン蛍光は、タンパク質コンフォメーションの微細な変化が発光強度や発光スペクトルの形に変化を及ぼし得るので、天然構造の指標として使用することができる（１１２ａ，１１３ａ）。ｍＰＥＧ５０００によるアルブミンの修飾は、紫外線の吸光度に寄与し（２４０ｎｍ〜２８０ｎｍの間）、ＰＥＧ２００００およびＰＥＧ４００００修飾アルブミンの吸収スペクトルおよび蛍光発光スペクトルは実際には非修飾アルブミンと区別できなかった。ｍＰＥＧ５０００、ＰＥＧ２００００およびＰＥＧ４００００誘導体の蛍光発光スペクトルは非修飾アルブミンと同等であり、単一トリプトファニル残基という状態が有意に変化していなかったことを示す。
【０１２８】
本発明者らは、その蛍光がヨウ化物またはアクリルアミドによりどれだけ容易に消光し得るかを判定することにより、トリプトファンの溶媒接近性を調べた。図２７Ａは、修飾程度の異なるＰＥＧ−Ａｌｂを選択するためにサイズ分画したｍＰＥＧ５０００アルブミンに対するアクリルアミド消光研究を示す。なお、画分の表示は図２２でゲル濾過により分析したサンプルに相当する。最も修飾の少ない画分（ＩＩＩと表示）は非修飾アルブミンと同等であった。画分ＩとＩＩはアクリルアミドによる消光により高い感受性を示し、主として、このプロットの曲線の上の方に表される静的消光成分に現れている。この結果は、ある程度の疎水性があるアクリルアミドがＰＥＧ−Ａｌｂの表面と結合することを示唆する。本発明者らはまた、図２７Ｂに示されるように、電荷を有する極性消光剤であるＫＩによる消光を調べた。アルブミンのトリプトファンは埋め込まれており、特にヨウ化物による消光には感受性がなく、ＰＥＧによる修飾のレベルを高めても、画分ＩおよびＩＩで見られたようなその消光感受性はやや低下し、このことはＰＥＧ修飾が、トリプトファンを溶媒や極性溶質からさらに遮蔽することを示唆している。これに対し、ＰＥＧ２００００−ＡｌｂおよびＰＥＧ４００００−Ａｌｂはアクリルアミド消光では小さな変化しかしめさず（図２７Ｃに示される）、ヨウ化物消光では変化はなかった（示されていない）。これらの実験は、アルブミンの複数の部位をＰＥＧ５０００で修飾すると、そのタンパク質は溶媒や極性溶質からさらに遮蔽されるが、ＰＥＧ２００００またはＰＥＧ４００００による修飾はそうではないことを示す。
【０１２９】
３．ＰＥＧ２０−ＡｌｂおよびＰＥＧ４０−Ａｌｂの浸透圧特性
修飾アルブミンの浸透圧特性はin vivo機能に不可欠であることから、本発明者らは、図２８に示されるように、ｍＰＥＧ２００００、ｍＰＥＧ４００００、多重修飾ｍＰＥＧ５０００アルブミンおよび非修飾アルブミンの濃度に対するコロイド浸透圧の依存性（１１４ａ，１１５ａ）を調べた。１モル当たりで、ｍＰＥＧ２００００−Ａｌｂ、ｍＰＥＧ４００００−ＡｌｂおよびｍＰＥＧ５０００−Ａｌｂは非修飾アルブミンよりも高濃度でより高い浸透圧を示したが、低濃度では浸透圧はアルブミンの場合と同等であり、アルブミンの血清濃度はおよそ０．６ｍＭである。高濃度のｍＰＥＧ−Ａｌｂで見られる理想的でない挙動は、これらの種の大きな排除容量と水和程度を反映している。本発明者らはまたサイズ分画ｍＰＥＧ５０００修飾アルブミンも調べ、修飾の顕著な画分は修飾の低い画分よりも大きな浸透圧を示す。これらの研究は、血管内への保持を助け、組織の間質性空間への液体の管外遊出を軽減するコロイド浸透圧勾配を維持する特性である大きな排除容量を有する分子と一致する。
【０１３０】
４．蛍光標識を有するアルブミン
本発明者らは、ｃｙｓ３４を介して結合したフルオレセインまたはテキサスレッドを有する非修飾アルブミンおよびｍＰＥＧ−Ａｌｂを作製した。これらの蛍光アルブミン誘導体を用い、毛細血管漏出を伴う動物の循環中にいかに効率的にアルブミンが保持されるか調べる。なお、これらのアルブミンの傾向は、体液中の蛍光測定または組織切片の蛍光顕微鏡観察によりモニタリングすることができる。これら２つの蛍光団は十分離れた励起・発光スペクトルを有するので、２種類の（例えば、テキサスレッドを有する非修飾アルブミンとフルオレセインを有するＰＥＧ−アルブミン）アルブミンの混合物を含むサンプルを同じ動物で調べることができる。ｃｙｓ３４を介してＰＥＧを結合させる場合、本発明者らは、リシルε−アミノ基を介してアミン反応型のフルオレセインまたはテキサスレッドを結合させる。２種類の異なる蛍光団を有するアルブミンをもってすれば、フルオレセインを有するＰＥＧアルブミンが、テキサスレッドを有する非修飾アルブミンに比べ、いかに効率的に循環中に保持されるかを判定することができる。これらの蛍光アルブミンは、ショックモデルにおいて非修飾アルブミンとＰＥＧ−アルブミンの保持をモニタリングするため、またはin vivo半減期をモニタリングするために分析的に限って使用される。本発明者らは、血清希釈液において、他の蛍光物質のバックグラウンドを十分超えるフルオレセイン−アルブミンの蛍光を容易に検出した。必要に応じ、血清サンプル中の他の発色団から生じる内部フィルター効果（１１２ａ，１１３ａ）に関して強度測定値を補正するが、蛍光アルブミンを用いた本発明者らの研究では、必要とされる血清の大希釈（１：１０００〜１：２０００）による支障は無視できるものであることを示す。
【０１３１】
実施例ＩＶ−５ｂ 生物物理学的研究
１．ＰＥＧ−アルブミンの作製
本発明者らは、ＰＥＧとアルブミンを結合させるためのいくつかの試薬およびｍＰＥＧ５０００−Ａｌｂをin vivoで調べた。アルブミンと結合したＰＥＧのサイズ、その位置および共有結合の性質は安定性、生体半減期およびリガンド結合が有意に異なる生成物を生じるので、種々の結合様式およびｍＰＥＧの種類（４６ａ，１１６ａ〜１２０ａ）を検討する。複数のリシル残基を修飾する傾向があるアミン選択性試薬では、有効性のサイズ依存性を調べるためにより規定されたサイズ分布を有する材料を作製するための特定の方法を用いる。サイズ分布の制御は、１つには、本発明者らがマレイミドＰＥＧで行ったように、最初の反応の修飾程度を制限すること、生成物をイオン交換クロマトグラフィーまたはゲル濾過クロマトグラフィーにより精製すること、および特定の残基の選択的修飾により達成される。
【０１３２】
結合様式−これまで用いられている、試薬とアルブミンを結合させる様式は、所望のin vivo作用を有する生成物を作出してきたが、安定性また関連リガンドの結合に違いがある生成物を作製するのに他の結合様式も有用であるということが本発明の意図する範囲内にある。異なる反応基（主としてアミンおよびチオール反応性）を有する種々の大きさのＰＥＧが入手でき(Shearwater Corp., Huntsville Alabama)、この供給者は生体材料のＰＥＧ化に特異的な試薬を開発している。他に、ｍＰＥＧ試薬の品質および生物学的至適化への注意が重要であることを強調する者もいる（１１９ａ）。また、本発明は、条件（例えば、ｐＨ、イオン強度、温度）を変更する、また、天然構造を維持する付加的工程の使用も意図し、例えば、アルブミンのジスルフィド結合および構造を、タンパク質のチオール−ジスルフィド交換のために高ｐＨで妨げることができる。
【０１３３】
１．アミン選択性試薬−修飾に利用できる最も豊富な求核試薬種は表面リシル残基であり、これは置換度の高い生成物を得るために容易に修飾される。ｍＰＥＧ−スクシンイミジル−スクシネートは、血清エステラーゼの基質となり得るエステル結合を有する生成物を生成するが、同じリシル残基を修飾するが、より安定な結合を有し、in vivo半減期の長い、ｍＰＥＧ−スクシンイミジル−プロピオネート（図２９の１）およびｍＰＥＧ−スクシンイミジル−ブタノエート（図２９の２）などの他の試薬も有用である。ＰＥＧ−アルデヒド誘導体（例えば、図２９の３）は、生じたシッフ塩基のＮａＣＮＢＨ３による還元を介してリシル残基と結合させることができ（１１６ａ，１１９ａ）；このＰＥＧ試薬はリシル残基に対して選択性が高く、修飾されたリシル残基は陽電荷を保持し、このことはアルブミンの陰イオン結合特性の保持という点では問題であり、それはリンカーも導入できない。ＰＥＧは塩化トレシルの活性化を用いて直接タンパク質に結合させることができ（１２１ａ）、アルブミンとともに使用されている（１２２ａ）。リンカーを用いない方法（１１９ａ）には、未知の毒物学的特性を有する部分を持ち込まないという利点がある。ＰＥＧにはそれ自体免疫原性がないが（１２３ａ）、それとタンパク質とを結合させる要素には免疫原性があり得る。修飾の程度は、フルオレスカミンを用いて反応性アミンの消失を調べること（３ａ）、ＳＤＳゲル電気泳動により定性すること、分析的ゲル濾過によりサイズ分布を調べること、また、ＰＥＧ修飾タンパク質に使用可能なＰＥＧの比色定量アッセイを用いて評価される（１２４ａ）。
【０１３４】
２．チオール選択性試薬−チオールを介した修飾は、ヒト血清アルブミンがただ１つのチオール（ｃｙｓ３４）を有することから、ヒト血清アルブミンに有用なアプローチである（１００ａ，１０１ａ，１２５ａ）。ヒト血清アルブミンは、遊離チオールとしてのｃｙｓ３４を有するタンパク質と、グルタチオンで修飾されたチオールを有する、または２つのアルブミンのジスルフィド二量体としての実質的画分との混合物である。穏和な条件下で、Ｃｙｓ３４ジスルフィドは還元可能であるので、総てのｃｙｓ３４が接近可能性の小さいジスルフィドを減らすことなく、遊離チオールとして利用可能である。Ｃｙｓ３４は、Ｎ−エチルマレイミドおよびヨードアセトアミドをはじめとするチオール選択性試薬と反応性がある（１００ａ，１０１ａ，１２５ａ）。一つの実施態様では、ＰＥＧがタンパク質上の単一の部位に結合されるように、アルブミンをｍＰＥＧ−マレイミド誘導体で修飾する（図１６の４）。単一のユニークな部位における修飾は天然構造を混乱させる、またはアルブミンのリガンド結合特性を変化させる可能性が低い。従前の結果の節にしめされているように、本発明者らはこのような２つの形態のｍＰＥＧ−Ａｌｂを作製した。チオール修飾の潜在的欠点は、生成物の抗酸化特性が変更されることがあるという点である。
【０１３５】
種々のサイズおよび幾何学のＰＥＧ誘導体
種々のサイズのＰＥＧおよび分枝構造を有するＰＥＧで修飾されたアルブミンを調べる。使用可能なサイズとしては、３，４００Ｍｒ、５，０００Ｍｒ、２０，０００Ｍｒおよび４０，０００Ｍｒがある。タンパク質との結合に関して種々の化学特性を有する分枝型（図２９の３）およびフォーク型（図２９の５）のＰＥＧが存在する（４６ａ，１１７ａ）。ＰＥＧが大きいほど、同じ有効サイズを達成するのに少ない部位の修飾ですむ。サイズ分布が大きければ、組み込まれるＰＥＧは１つだけなので、ｃｙｓ３４を介した結合に特に重要である。試薬サイズに関して考慮することは、小さいＰＥＧ−ペプチド（例えば、ＰＥＧ≦１２００）（１１９）の方が腎臓から容易に排泄され、多重修飾アルブミンの分析が適正となるということである。ＰＥＧ鎖長を長くすると、循環中のその物質の半減期が長くなる（１１７ａ，１２６ａ）。
【０１３６】
Ｃｙｓ３４の保存−アポトーシスおよび他の生物学的特性の阻害におけるアルブミンの活性はチオール（おそらくｃｙｓ３４）に依存する。チオールとしてｃｙｓ３４を保持するｍＰＥＧ−Ａｌｂを作製する。アルブミンをやや過剰量のジチオトレイトールで処理した後、ｃｙｓ３４を５，５’−ジチオビス−２−ニトロ安息香酸で修飾する。低分子量産物をゲル濾過により取り出し、そのタンパク質をアミン選択性ＰＥＧ試薬で修飾する。このタンパク質をジチオトレイトールで処理してチオニトロ安息香酸（４１２ｎｍでスペクトルをモニタリング）を遊離させることで、遊離チオールを再生する。ｍＰＥＧアルブミンを精製して非修飾タンパク質、過剰な試薬および反応副産物を除去する。このアプローチを用いて製造されたｍＰＥＧ−アルブミンは、試薬がリシル残基を修飾するので、複数の部位で修飾される。しかしながら、意図される範囲内には、この方法がより大きなＰＥＧ試薬（例えば、ＰＥＧ２００００およびＰＥＧ４００００）の使用を含み得ることもあり、修飾される残基の数は試薬濃度や反応条件を変更することで最小とすることができる。
【０１３７】
ＰＥＧ−アルブミンのサイズ選択および分析−生成物のサイズ分布は、ＰＥＧ−アルブミンが毛細血管漏出中に血管内に保持されるように十分大きくなければならいということ、および広範囲に修飾されすぎた生成物はリガンド結合特性の低下または毒性などの望ましくない属性を有することがあるということの双方から重要である。サイズ分布の制御は、１つには、反応程度を制限すること、またはｃｙｓ３４の修飾の場合には、単一の残基の修飾に制限することにより達成される。修飾産物はゲル濾過またはイオン交換クロマトグラフィーにより精製し、比較的狭いサイズ分布のＰＥＧ−アルブミンを選択する。調製物のサイズ分布は、所定の分枝寸法およびＭｒのタンパク質を標準として用いるゲル濾過により、また、質量分析により測定する。ＰＥＧは拡大構造を有し、タンパク質が結合するようにはＳＤＳと結合しない可能性があるので、ゲル電気泳動（１２７ａ，１２８ａ）またはゲル濾過により、修飾アルブミンの分子量を実際に決定することはできない。より適当なパラメーターは相当半径またはストークス半径である。数平均分子量および有効分子体積はコロイド浸透圧の濃度依存から得ることができる（１１４ａ，１１５ａ）。これらの測定値の厳密な物理的意味を解釈しなければならないが、それらはin vivo有効性と相関させることができる種々の調製物およびパラメーターを比較する基礎を提供する。これらの分析はショックモデルで血管内へのＰＥＧ−アルブミンの保持に必要な修飾程度を定義し、種々の修飾程度のメリットを決定付ける。
【０１３８】
２．タンパク質構造および安定性に対するアルブミンのＰＥＧ修飾の効果
アルブミンの構造および安定性はその生理学的機能に重要である。分光光度技術を用いてコンフォメーションおよび二次構造を調べ、アルブミンのＰＥＧ修飾がそのタンパク質の構造および安定性を変化させる程度を判定する。非修飾アルブミンおよびＰＥＧ修飾アルブミンについて、近紫外線および遠紫外線における円二色性（ＣＤ）スペクトルを得る。近紫外線スペクトル（２５０〜３２０ｎｍ）の分析により、チロシル残基およびトリプトファニル残基の微小環境を混乱させた程度に関する情報が得られる（１２９ａ，１３０ａ）。遠紫外線ＣＤスペクトル（１８０〜２５０ｎｍ）からは、二次構造が混乱された程度に関する情報が得られる（１２９ａ，１３０ａ）。ヒト血清アルブミンはα−ヘリックスが優勢であり（６７％）（１００ａ〜１０２ａ）、両スペクトルとも、このタイプの二次構造を反映している。トリプトファニル残基の状態は内在のトリプトファン蛍光のヨウ化物およびアクリルアミド消光により調べ（１１２ａ，１１３ａ）、このような実験の例を結果の節に示す。トリプトファン蛍光およびその消光剤感受性はタンパク質コンフォメーションの高感度プローブである。本発明者らは非修飾アルブミンとＰＥＧ修飾アルブミンをヨウ化物消光により調べたところ、両タンパク質とも、その単一のトリプトファンはこの消光剤に比較的接近しにくく、ＰＥＧ修飾がその環境を変化させないということと一致していた。さらに、これら２つの天然タンパク質のトリプトファンの発光スペクトルは本質的に同じである。これらの例により、タンパク質のコンフォメーションおよび二次構造に最小限の変化だけでＰＥＧ−アルブミンを生じる修飾条件が特定される。
【０１３９】
アルブミンの安定性に対するＰＥＧ修飾の効果は、漸増濃度のカオトロピック溶質（グアニジン塩酸または尿素）の存在下、天然構造に特徴的な分光光度シグナル（内在トリプトファン蛍光およびＣＤ）を調べることにより評価する。このような実験データを分析すると、タンパク質の熱力学的安定性を反映する、変性剤の不在下での脱フォールディングの自由エネルギー（ΔＧ°Ｈ２Ｏ）が得られる（１０３ａ，１０５ａ）。図３０は、非修飾血清アルブミン（パネルＡ）およびｍＰＥＧ５０００修飾アルブミン（パネルＢ）の脱フォールディング研究の結果を示す。アルブミンの脱フォールディングは、ＣＤシグナルとトリプトファン蛍光シグナルの一致の欠如により示されるように、明らかに複雑な多段階プロセスであり、アルブミンがマルチドメインタンパク質であることと一致している（１００ａ〜１０２ａ，１３１ａ，１３２ａ）。ＣＤによりモニタリングされる脱フォールディングは、非修飾アルブミンおよび多重ｍＰＥＧ５０００修飾アルブミンで同等であり（図３０パネルＢ）、修飾が安定性を変化させないことを示している。
【０１４０】
別の態様では、本発明は、安定性を変化させずに所望の生物活性を有する産物を生じる修飾条件を特定する方法を提供する。ＰＥＧ−Ａｌｂの安定性は示差走査熱量測定法（ＤＳＣ）でも調べられる（１３３ａ〜１３５ａ）。このアプローチでは、タンパク質溶液をゆっくり加熱し、脱フォールディングを伴う過剰な熱量を測定する。このアプローチはアルブミンの安定性に対する脂肪酸およびトリプトファンの効果を研究するのに有用である（１０８ａ〜１１１ａ）。リガンドフリータンパク質と連結種の両者を比較するため、脂肪酸、トリプトファンおよび他の疎水性リガンドを炭素処理により除去し（１０８ａ）、脂肪酸、ヘム、Ｎ−アセチルトリプトファンを含む種々のリガンドを付加する効果を調べる。この分析から、タンパク質の安定性（脱フォールディングのエンタルピーを含む）および脱フォールディングプロセスに含まれる状態の数についての情報が得られ、これを用いてリガンド結合部位の健全性を評価することができる。
【０１４１】
１．ＰＥＧ−アルブミンのコロイド浸透圧特性の分析−ＰＥＧ−アルブミンのコロイド浸透圧の濃度依存性を調べると、この特性がどのようにin vivo有効性に関連するかが分かる。非修飾アルブミン、ＰＥＧ−Ａｌｂおよび匹敵する濃度の対応する非コンジュゲートｍＰＥＧを調べる。最も単純な場合では、ＰＥＧ−アルブミンの浸透圧活性は、匹敵する濃度の非修飾アルブミンと遊離ＰＥＧの浸透圧活性の和である。しかしながら、溶媒および溶質とタンパク質との相互作用は必ずしも単純ではなく、解は単純計算の和とはなり得ない。本発明は、全体として天然構造を保持する、浸透圧活性の高いＰＥＧ−アルブミン調製物を提供する。
【０１４２】
２．ＰＥＧ−アルブミンのリガンド結合特性の分析−アルブミンは、ナトリウムイオン、ビリルビン、マグネシウムイオン、脂肪酸および多くの薬剤を含む、いくつかの重要なリガンドと結合する。リガンドは、アルブミンの３つの主要ドメイン上の複数の異なる部位で結合する（１３１ａ，１３２ａ）。本発明者らは、ＰＥＧによるアルブミンの修飾が重要なリガンドの結合を変化させるかどうかを調べた。ビリルビン（１３７ａ）、脂肪酸（１３８ａ）、ヘム（１３９ａ）および種々の薬剤（１２５ａ）を含む種々の部位に結合する代表的リガンドを調べる。これらのリガンドの結合は分光光度アッセイにより測定することができるが（１３１ａ）、最も情報が多く、熱力学的に正確なアプローチは滴定熱量測定（ＩＴＣ）である（１４０ａ〜１４２ａ）。リガンド溶液をタンパク質溶液中へ滴定し、結合の際に放出または吸収された熱を測定する。このアプローチには発色団は必要なく、いずれのリガンドおよびアクセプターにも適用できる。ＩＴＣ試験により、会合定数、結合エンタルピー、結合エントロピーおよび化学量論が得られる。有意な制限だけが、強固な結合および弱いリガンドおよび溶解度の限定されたリガンドの分析に関連する。修飾がリガンド結合を変化させる程度は、リガンドの結合等温線を調べ、結合定数と結合部位数を求めることにより決定する。本発明はまた、非修飾アルブミンに比べ、修飾アルブミンにおける３つの結合部位の機能的健全性を評価するのに有用なリガンドの例も提供する。
【０１４３】
実施例ＩＶ−５ｃ ＰＥＧ−アルブミンのin vivo半減期の決定および毒物学的評価
１．ＰＥＧ−アルブミンの半減期の決定−ＰＥＧ−アルブミンの半減期はその有効性および潜在的副作用の双方の懸念点である。一般にタンパク質のＰＥＧ修飾（１１６ａ，１１９ａ）およびアルブミンは特異的に半減期を長くし、抗原性を小さくし、それらのタンパク質分解感受性を引き下げる。ＰＥＧ修飾はインターフェロンαの半減期（６時間から７５時間）およびＣ型肝炎の治療におけるその治療有効性に顕著な作用を有し（１４３ａ，１４４ａ）、ウシアルブミンでは、ウサギにおける半減期の変化はわずかである（１４３ａ）。アルブミンによる後者の結果は、ＰＥＧ修飾なしであっても比較的長命なタンパク質（ヒトで２０日）であるので、予期されないことではない。フルオレセインまたはテキサスレッドで修飾したＰＥＧアルブミンおよび通常のアルブミンはそのまま投与されるが、これらの蛍光団は循環からのクリアランスをモニタリングするためのシグナルを提供する。１つは非修飾アルブミンに対するもので、もう１つはＰＥＧ修飾アルブミンに対するものである２つの発色団を用いれば、この２種類のアルブミンを同じ動物でモニタリングすることができ、これにより循環中における優先的保持の程度が評価できる。本発明者らは、これらの双方の色素−アルブミンコンジュゲートを作製した。これらの色素−アルブミンコンジュゲートを本質的にトレーサーとして動物に投与し、分析のため１〜２週間にわたって尾の静脈から少量の血液サンプル（〜１００〜２００μｌ）を採取する。もし続いてクリアランスが起これば、ヒトアルブミンに特異的な市販のモノクローナル抗体を用いたウエスタンブロット解析によりタンパク質を定性的に調べる。なお、このアプローチは蛍光団をタンパク質に付加することがもたらし得るいずれの作用も回避する。ＰＥＧ−ａｌｂは非修飾アルブミンに比べ、ＳＤＳゲル上で劇的に異なる移動を示し、モノクローナル抗体がヒトアルブミンとラットアルブミンを識別する。ヒトアルブミンに特異的な抗体を用い、クリアランスが酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を用いて定量的にモニタリングされる。なお、抗体の使用には、ＰＥＧ修飾後もなおアルブミンと結合することの確認が必要である。
【０１４４】
２．ＰＥＧ−アルブミンの毒物学的特性の分析−ＰＥＧ修飾アルブミンが毛細血管漏出症候群の治療に有効であるためには、インターフェロンなどの治療的に用いられている他のＰＥＧ修飾タンパク質に比べ、比較的高用量で投与しなければならない。明らかな違いとしては、インターフェロン数マイクログラムに対し、ＰＥＧ修飾アルブミンは１グラム以上を与えなければならないということである。ＰＥＧアルブミンはこれらの用量で顕著な毒性がないことが重要である。比較的大用量の高分子量ＰＥＧ（４０００〜６０００Ｍｒ）は、いくつかの動物（ラット、ウサギおよびイヌ）でほとんど毒性を示さない（４５ａ，１４３ａ，１４５ａ〜１４７ａ）が、低分子量ＰＥＧ（例えば４００Ｍｒ）は毒性を示すことを示唆する証拠がいくつかある（４５ａ，１４８ａ，１４９ａ）。イヌの血液容量の大部分（３０〜５０％）は、２週間顕著な毒性なくＰＥＧ化ヘモグロビンで置換することができる（１４９ａ）。大量を投与したいくつかの研究では、食作用(phagacytosis)を示す肝臓および腎臓の細胞への封入が見られた。ほとんどの毒性研究では、相対的に長命なタンパク質と結合したＰＥＧではなく遊離ＰＥＧが調べられた。ＰＥＧ４０００を９０ｍｇ／Ｋｇまでの１日静脈用量で１年間イヌに投与しても毒性作用は惹起されず（１５０ａ）、顕著な解剖学的、顕微鏡的または生化学的以上は見られなかった。もし今日提案されていたとしたら、ＩＲＢ委員会がおそらく認可していないであろう実験において、明らかな病気の作用のない６人のヒト志願者にＰＥＧ６０００を静脈投与したところ（１４６ａ）、９４〜９９％のＰＥＧ６０００が１２時間以内に尿中に排泄された。ラットでは１０００〜１０，０００Ｍｒの範囲のＰＥＧは毒性がある（１４７ａ）（ＬＤ５０ １０〜２０ｇ／ｋｇ）が、ヒトおよびイヌを含む研究で与えられたものよりおよそ５０〜１００倍高い用量に過ぎず、これらの研究から推定される７５Ｋｇのヒトに対する同等用量は０．７５〜１．５Ｋｇと考えられる。本発明者らが行った研究では明らかな毒性は見られなかったが、本発明者らの研究は総て４時間以内で明白な短期作用を調べたものであったので、ＰＥＧ−アルブミンの異化作用およびＰＥＧ−ペプチドの遊離から生じる毒性は観察しなかった。
【０１４５】
毒物学的評価
最も有望なＰＥＧ−アルブミンコンジュゲートを、予測される治療用量で始め、かなり高い用量になるまでの範囲の用量で投与することにより毒性を評価する。動物を４週間までモニタリングする。単回用量と多回用量の双方を試験する。動物の屠殺前に採集するデータには、体重、食物摂取量、水摂取量、糞便の産生量および尿の産生量が含まれる。また、挙動変化の徴候に関しても動物を観察する。定期的に少量の血液を抜き取り、肝毒性に特徴的なマーカーに関して血清で酵素アッセイを行う。試験の終了時に、動物を屠殺し、組織および器官の顕微鏡的損傷証拠を調べる。肝臓、腎臓、肺、脳、心臓および骨格筋をはじめ、いくつかの組織の毒性証拠を顕微鏡で調べる。ビヒクルを与えた対照動物も同様に調べる。
【０１４６】
以下の実施例Ｖでは、指示試薬は色素または色素の組合せであり得る。この２種類の色素は赤、緑または同色でもよい。これらの発光波長および励起波長は大きく有意に異なっていなければならない。好ましい方法は二重発色団技術である。しかしながら、複数発色団であってもよい。
【０１４７】
好ましい色素は赤いマレイミド色素であるテキサスレッドである。インドシアニングリーンは優れた蛍光物質である。これはテキサスレッドとフルオレセイン(Fluorescine)の混合物でテキサスレッドの代わりに用いることができる。インドシアニングリーンの発光は近赤外領域（〜８４０ｎｍ）にあり、クルオロセインからの明瞭な発光を伴う優れたトレーサーである。
【０１４８】
この技術の好ましい使用は、多臓器不全に代わる血管漏出を測定および定量のためのマーカーとして使用するアッセイである。その意味するところは、臓器不全を発症する危険性のある患者を推定することである。これによりこのアッセイをこのような患者に特定の治療法を調整するために使用できる。また、これはタンパク質の半減期を研究するための新規な技術でもある。
【０１４９】
一つの実施態様では、本発明は、多臓器不全が起こる前、または初期にその発症を予測する技術である。この方法は、２以上のタンパク質、例えばアルブミンとＰＥＧ−アルブミンを投与することに基づく。これらのタンパク質は分子量が有意に異なり、発光波長および励起波長が異なる発色団でタグ付けされている。推定は、それらの発色団の濃度を経時的に評価することにより行う。本発明者らは、アルブミンの他、例えば、既知の分子量を有する別のタンパク質も使用できる。例えば、免疫グロブリンＧ分子量１５０．０００またはフォン・ビルブランド因子ＭＷ３００．０００などの他のタンパク質がある。
【０１５０】
実施例Ｖ 色素をコンジュゲートしたアルブミンおよびＰＥＧ−アルブミンの作製
色素コンジュゲートアルブミンＰＥＧ−Ａｌｂの作製方法は次の通りであった。ヒトアルブミン（５０ｍｇ／ｍｌ）を５０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌおよび０．５ｍＭジチオトレイトール中で１時間インキュベートした。このジチオトレイトール処理アルブミンを４ｍＭ ５−ヨードアセトアミドフルオレセインまたは１．５ｍＭテキサスレッドマレイミド(Molecular Probes)とともに２時間インキュベートした。これらの色素修飾アルブミンを５倍希釈し、遠心分離濃縮器（カットオフ１０，０００Ｍｒ、Millipore）で３回再濃縮して組み込まれなかった色素の大部分を除去した後、リン酸緩衝生理食塩水を４回交換して４８時間透析した。
【０１５１】
このフルオレセイン標識アルブミンをメトキシポリエチレングリコール塩化シアヌルで修飾し、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ２００でのゲル濾過により精製した。Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ２００から２００，００を超える見掛けの分子量で溶出する画分をプールし、ＰＭ１０メンブラン(Millipore)を用いた限外濾過により濃縮した後、０．９％生理食塩水を数回交換して透析した。フルオレセイン標識アルブミンとテキサスレッド標識アルブミンをゲル電気泳動により分析したところ、蛍光がタンパク質と会合していることが明らかになった。遊離色素の位置では蛍光は検出されなかった。定常状態の蛍光の測定はＱＭ４ＳＥ蛍光計(Photon Technology International, Monmouth Junction, NJ)で行った。
【０１５２】
次ぎに、非修飾アルブミンおよびｃｙｓ３４を介して結合したフルオレセインまたはテキサスレッドを有するｍＰＥＧ−Ａｌｂを作製した。これらの蛍光アルブミン誘導体を、毛細血管漏出を伴う動物の循環中にアルブミンがいかに有効に保持されるか調べるために用いた。これらのアルブミンの移動は、体液における蛍光測定または組織切片の蛍光顕微鏡観察によりモニタリングすることができる。体液における蛍光測定または組織切片の蛍光顕微鏡観察の２種類。この２つの蛍光団は十分離れた励起・発光スペクトルを持つので、２つのアルブミン（例えば、テキサスレッドを有する非修飾アルブミンとフルオレセインを有するＰＥＧ−アルブミン）の混合物を含むサンプルを同じ動物で調べることができる。ｃｙｓ３４を介してＰＥＧを結合させる場合、アミン反応型のフルオレセインまたはテキサスレッドはリシルε−アミノ基を介して結合させた。２種類の異なる蛍光団を有するアルブミンをもってすれば、フルオレセインを有するＰＥＧアルブミンが、２つの異なる蛍光団を有する非修飾アルブミンに比べ、いかに効率的に循環中に保持されるかを判定することができ、フルオレセインを有するＰＥＧアルブミンが、テキサスレッドを有する非修飾アルブミンに比べ、いかに効率的に循環中に保持されるかを判定することができる。これらの蛍光アルブミンは、ショックモデルにおいて非修飾アルブミンとＰＥＧ−アルブミンの保持をモニタリングするため、またはin vivo半減期をモニタリングするために分析的に限って使用した。血清希釈液において、他の蛍光物質のバックグラウンドを十分超えるフルオレセイン−アルブミンの蛍光が容易に検出された。必要に応じ、血清サンプル中の他の発色団から生じる内部フィルター効果に関して強度測定値を補正した。しかし、蛍光アルブミンを用いた研究では、必要とされる血清の大希釈（１：１０００〜１：２０００）による支障は無視できるものであることを示す。
【０１５３】
動物／測定プロトコール
正常な健康ラット（ｎ＝４）およびＣＬＰラット（ｎ＝１１）で測定を行った。ＣＬＰでは、ラット６匹に（ＰＥＧ−ＡＬＢ−ＦＬ＋アルブミン−ＴＲ）を注入し、５匹に逆の発色団を注入した。オハイオ医学大学のThe Institutional Animal Care and Use Committeeおよびthe Academic Chemical Hazards Committeeが試験プロトコールを認可した。動物はAmerican Association for Accreditation of Laboratory Animal Care; International (AAALACI)認可施設で飼育した。体重４００〜４８０ｇの成体雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット(Charles River Laboratories, Portage, Ml)を用いた。これらのラットには標準ラット餌と水を自由に与えた。試験前、動物を一晩絶食させたが、水は自由に与えた。本発明者らは盲腸結紮穿刺（ＣＬＰ）誘発敗血症ラットと擬似術モデルを用い、ＰＥＧ−Ａｌｂの蛍光団とアルブミンの蛍光団を注入した。ラットをナトリウムペントバルビタール（５０ｍｇ／ｋｇ ＢＷ、ｉ．ｐ．）で麻酔した後、必要に応じてペントバルビタールを追加した。正中腹部切開から開腹を行った。回盲弁直下で、腸の連続性が維持されるように３−０絹結紮糸にて盲腸を結紮した。この盲腸を１６ゲージの針で２箇所穿刺し、排便されるまで軽く押した。内臓を腹部に戻し、筋肉は一層のプロリン縫合糸、皮膚は３−０絹縫合糸で切開部を閉じた。擬似術ラットにも同じプロトコールを施し、盲腸は内臓を腹部に戻す前に穿刺を行わずに操作した。蘇生のため、体重１００グラム当たり３ｍｌの無菌０．９％塩化ナトリウム溶液を背部に皮下投与した。術後、ラットには食物は与えなかったが、水は自由に摂らせた。
【０１５４】
術後２０時間で動物を麻酔し、内頚静脈にカニューレを送管した。注入後４０分の時点（発色団を混合させ、各コンパートメントに分布させる）、そしてこれを０時点として、その後、３０分、１時間、３時間、５時間、８時間の時点で各１００〜１５０μｌの血液サンプルを採取した。８時間後、内頚静脈ラインを外した後２時間ラットを回復させた。今度は、尾の静脈から２２時間、２８時間、４５時間、５２時間、７０時間、９６時間、１０２時間、１４８時間、１６０時間、１７１時間またはラットが死に至るまでさらに血液サンプルを採取した。
【０１５５】
組織学／蛍光顕微鏡
ホルマリン固定した肺および腎臓組織に、ヘマトキシリンおよびエオシン染色を含む標準的な処理を施した。免疫蛍光研究のため、肺切片をＮｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｅ８００蛍光顕微鏡で調べ、Ｉｍａｇｅ Ｐｒｏ Ｐｌｕｓ Ｖｅｒｓｉｏｎ ４．０(Media Cybernetics, L.P.)を用いて対物２０倍および４０倍で写真を記録した。
【０１５６】
統計学的方法
特に断りのない限り、値は平均値±ＳＤで表す。処理群内で、各時点で繰り返して分析したデータ（各時点での蛍光濃度）を、多重比較用の補正を用いる事後両側ｔ検定を用い、反復測定分散分析により評価した。匹敵する時点の処理群間の差は分散分析により評価した。統計学的有意性をｐ＜０．０５およびｐ＜０．０１水準でリプレート(reprete)する。
【０１５７】
結果
色素−アルブミンコンジュゲートを動物に本質的にトレーサーとして投与し、少量の血液サンプル（〜１００〜２００マイクロリットル）を頚静脈から（最初の８時間）、その後は尾の静脈から採取した。これらのアルブミンの移動を、血中の蛍光測定および肺組織切片を調べる蛍光顕微鏡観察によりモニタリングした。本発明者らが開発した方法を用い、蛍光標識したアルブミンおよび（テキサスレッド、ＴＲ）およびＰＥＧ−Ａｌｂ（フルオレセイン、Ｆ）をラットに注入し、注入後の各時点で分析のため尾の静脈から少量の血液を採取する。アルブミンが管外空間へ失われ、ＰＥＧ−Ａｌｂが保持されていれば、アルブミンの喪失とＰＥＧ−Ａｌｂの優先的保持に一致してフルオレセイン／テキサスレッド（Ｆ／ＴＲ）比が経時的に高まる。テキサスレッドとフルオレセインの励起・発光スペクトルは、この２種類の色素の混合物が血清サンプル中で定量的に調べることができるように十分異なっている。これらの標識を切り替えれば（フルオレセインアルブミンおよびテキサスレッドＰＥＧ−Ａｌｂ）、そのタンパク質のクリアランスがそれらの蛍光団の特性ではないということを確認する、厳密に補足する結果が得られる。このクリアランスは、物質の別のコンパートメントへの再分布に一致するファーストフェーズとクリアランスを反映するスローフェーズを示す。ＰＥＧ−アルブミンはアルブミンに比べて〜３時間以内に急速にクリアランスされる。アルブミンとＰＥＧ−Ａｌｂの分布はまた、本発明者らが敗血性ショックで観察したように、ＰＥＧ−Ａｌｂが血管内に保持されるかどうかを判定するための蛍光顕微鏡観察により、肺の冷凍組織切片でも質的に調べられた。
【０１５８】
通常のアルブミンは漏出するのにＰＥＧ−Ａｌｂは血管内に保持されることを証明するため、フルオレセイン標識ＰＥＧ−Ａｌｂとテキサスレッド標識アルブミンの混合物を投与した。肺切片の蛍光顕微鏡観察により、擬似術を施したラットではテキサスレッドシグナルとフルオレセインシグナルが同時局在するのに対し、ＣＬＰラットでは、テキサスレッド蛍光（ＰＥＧ−Ａｌｂ）は血管構造内のみに検出されることが証明された。これらの色素の同時局在は双方が保持されていたことを示し、一方、その色素の一方が間質空間に存在することはその標識種の漏出を示す。
【０１５９】
図３１Ａおよび３１Ｂは、注入時点（０時点）での濃度に対する実際のアルブミンおよびＰＥＧ−Ａｌｂ蛍光データ（対数スケール）を示す。このグラフはＣＬＰラットでは１１個体総て（図３１Ａ）、また正常ラット４個体（図３１Ｂ）で平均した場合の時間の関数として示されている。直線はこれらの濃度データを二重外挿モデルに当てはめたものである。
【０１６０】
図３２Ａおよび３２Ｂはまた、注入時点（０時点）での濃度に対する指数で示したアルブミンおよびＰＥＧ−Ａｌｂ蛍光データ（対数スケール）を示す。このグラフは各ＣＬＰラットに対して時間の関数として示されている。図３２ＡはＰＥＧ−Ａｌｂ ＦＬとアルブミン−ＴＲを有するラット６個体に関するグラフである。図３２ＢはＰＥＧ−Ａｌｂ−ＴＲとアルブミン−ＦＬを有するラット５個体に関するグラフである。相当する分析データは表１に示す。
【０１６１】
【表１】
【０１６２】
【表２】
【０１６３】
フルオレセイン標識ＰＥＧ−Ａｌｂおよびテキサスレッド標識アルブミンは双方とも、対照動物では血管内空間でのみ見られた。これらの結果は毛細血管漏出中、ＰＥＧ−Ａｌｂが血管内に保持されることと一致している。
【０１６４】
図３３は注入時点（０時点）での濃度に対する指数で示したＰＥＧ−Ａｌｂ／アルブミン蛍光データを個々の正常ラットおよびＣＬＰラットに関して時間の関数として示している。血管透過性の増大はＳＩＲＳの初期の特徴である。これは多臓器不全症候群（ＭＯＤＳ）の明確な発症の数日前に起こる。敗血症、外傷などの全身性炎症応答症状（ＳＩＲＳ）の際には、アルブミン漏出速度が実質的に増す。ＭＯＤＳを発症する運命にある患者を迅速に特定できれば、疾病のプロセスを制限するため、極めて早期に治療戦略を適用することが可能となる。アルブミン（テキサスレッド）が管外空間に失われかつ／またはＰＥＧ−Ａｌｂ（Ｆｔｃで標識）が保持されれば、Ｆｔｃ／ＴＲ比は経時的に高まると予測される。全身性炎症性応答（ＳＩＲＳ）症状における毛細血管透過性の増大に代わるものとしてのＰＥＧ−Ａｌｂ／アルブミン比の段階的上昇が前記の図３３で示されている。本発明者らは、アルブミンとより大きなポリエチレングリコール修飾アルブミン（ＰＥＧ−Ａｌｂ）を分光光度的に異なる発色団［それぞれ、フルオレセイン（ＦＴＣ）とテキサスレッド（ＴＲ）］でタグ付けすることに基づくＣＬの早期検出のための二重発色団技術について記載する。１１個体の敗血症（盲腸結紮穿刺；ＣＬＰ）マウスと４個体の正常ラットに微量の両タンパク質を注入し、それらの濃度を注入後１４４時間まで蛍光分光法により繰り返し評価した。血管内ＰＥＧ−Ａｌｂは、正常ラットおよびＣＬＰラットの双方のアルブミンに比べて低い速度で低下した（比＞１、増加）；図３３。このＰＥＧ−Ａｌｂ／アルブミン比の上昇は、注入１日後および２日後では、ＣＬＰラットおよび正常ラットとも同等であった。敗血症ラットでＣＬが起こったと思われる２日後では、ＣＬＰラットでこの比が上昇し続けたのに対し、正常ラットでは変化しなかった。敗血症／正常発色団比の分離が見られた時点は顕著なＣＬの開始を示し、これらの２つの曲線の差がおそらく重篤度を表す（図）。これらの知見はＣＬの検出のための新規な技術の基礎となる。
【０１６５】
正常ラットとＣＬＰラットの双方におけるＰＥＧ−Ａｌｂ／アルブミンのｖ蛍光濃度は、トレーサー注入後４０時間またはＣＬＰ後６０時間までの曲線の最初の部分では有意な差はなかった。曲線の上向きの傾きは、ＰＥＧ−Ａｌｂのより高い保持またはアルブミンの喪失を示唆する。正常ラットにおいて、著しいアルブミンの喪失は予期されず、ＰＥＧ−Ａｌｂのクリアランスの低下が、正常ラットおよびＣＬＰラットにおいて、ＣＬＰの比較的早いこの段階でのこの比の上昇の一因である。ＣＬＰラットでは、ＣＬＰの発生４８時間後に重篤な毛細血管漏出が起こると予測された。この段階で、ＣＬＰラットにおけるＰＥＧ−Ａｌｂ／アルブミン比は６０時間後まで段階的に高まり、ＰＥＧ−Ａｌｂのクリアランスの低さに加え、（毛細血管漏出とともに）一貫したアルブミン喪失を示唆する。ＣＬＰ曲線下の面積および正常ラット曲線の上の面積は、毛細血管漏出または臓器不全指数の指標となる。毛細血管漏出の定量は、ＭＯＤＳの発症する運命にある患者を推定するのに重要である。これに関して、この指数を用いることで、明らかなＭＯＤＳの発症前の早期に敗血症に対して費用のかかる処置を（例えば、活性化タンパク質ＣまたはＸｉｇｒｉｓ（登録商標））を用いるかどうかの指針となる。重篤な敗血症において活性化タンパク質Ｃを用いるかどうかの指針となるのはＡＰＡＣＨＥ ＩＩスコア測定値であり、２５より大きければ、絶対死亡率を６％減らせることが示されている。ＡＰＡＣＨＥ ＩＩスコアは患者集団における疾病の重篤度の指標となるが、これらは個々の患者の転帰を推定するにはあまり有用でないかもしれない。
【０１６６】
本発明は、分子量が異なり、各々異なる離れた発光波長および励起波長を有する異なる蛍光団でタグ付けされた複数のタンパク質または分子を用いる。これらを多臓器不全を発症するリスクのある患者に投与する。この方法では、（血液濃縮および毛細血管漏出などの同じ病態生理学プロセス下で）連続的に複数回それらの濃度を追跡する。
【０１６７】
本発明を好ましい実施態様を強調して記載してきたが、当業者には、これらの好ましい実施態様が変更可能であるのは明らかである。本発明は本明細書に明示されたもの以外にも実施可能であると考えられる。よって、本発明はあらゆる変形形態を含み、付属の特許請求の範囲の精神および範囲を請求する。
【０１６８】
参照文献
【表３】
【０１６９】
追加の参照文献
【表４】
【図面の簡単な説明】
【０１７０】
【図１Ａ】生理食塩水、アルブミンおよびＰＥＧＡ群のヘマトクリット（％）の変化を示すグラフ。
【図１Ｂ】平均動脈圧とヘマトクリットとの相関を示す。
【図２】内毒素（ＥＴ）の注射直後、ＥＴ注射２時間後およびＥＴ注射３時間後の血圧（すなわち、平均動脈圧ＭＡＰ）（ノーマライズしたＰａｒｔ）の変化を示すグラフ。
【図３Ａ】種々の処理群で見られた典型的な組織病理学的変化を示す。
【図３Ｂ】種々の処理群で見られた典型的な組織病理学的変化を示す。
【図３Ｃ】種々の処理群で見られた典型的な組織病理学的変化を示す。
【図３Ｄ】種々の処理群で見られた典型的な組織病理学的変化を示す。
【図４】各処理群の急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）スコアを示す。
【図５】（右）ＰＥＧ−Ａｌｂの推定ＭＷが２５０，０００ダルトン以上であることを示すＳＤＳアクリルアミドゲル電気泳動。アルブミン、ＰＥＧ−Ａｌｂおよび標準タンパク質のサンプルを示すＰＥＧ−Ａｌｂの分析的ゲル濾過は、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ６上でクロマトグラフィーに付した。挿入は文字とともに垂直の矢印で示し、標準タンパク質の溶出位置を示す：α，α２マクログロブリン（７２０，０００）；チログロブリン（６６０，０００Ｍｒ）；Ｆ，アポフェリチン（４４０，０００）；Ａ２，アルブミン二量体（１３３，０００）；Ｇ，ＩｇＧ（１６０，０００）；Ｏ，オボアルブミン（４５，０００）；Ｍ，ミオグロビン（１７，０００）を示す。図５（左） 結果をＭｒに対するＶｅ／Ｖ０で示す。番号の付いた上向きの矢印は矢印で示される溶出位置にほぼ相当する。
【図６】ＰＥＧ−ＡｌｂおよびアルブミンのＳＥＬＤＩ質量分析を示す。図６Ａは、１６ピコモルのヒトアルブミンの分析を示す。図６Ｂは、１５ピコモルのＰＥＧ−Ａｌｂの分析を示す。
【図７】ＰＥＧ−Ａｌｂおよびアルブミン溶液の浸透圧を示す。アルブミン溶液の浸透圧は下記のように測定し、濃度に対する浸透圧（ｍｍＨｇ）としてプロットした。この直線は３次多項式への当てはめに相当する。
【図８Ａ】以下のことを示す蛍光画像を示す：ＡおよびＢ，正常動物、敗血症無し、肺胞毛細血管膜内にＦｌ標識されたＰＥＧ−Ａｌｂが局在しているが、ＢはＲｈ標識アルブミンとＦｌ標識ＰＥＧ−Ａｌｂの重複により黄色（緑＋赤）に見える。一方、敗血症を有する動物（Ｃ、Ｄ、Ｅ）では、Ｒｈ標識アルブミンが散剤し、肺胞毛細血管膜でＰＥＧ−Ａｌｂの濃度パターンが存在した。
【図８Ｂ】以下のことを示す蛍光画像を示す：ＡおよびＢ，正常動物、敗血症無し、肺胞毛細血管膜内にＦｌ標識されたＰＥＧ−Ａｌｂが局在しているが、ＢはＲｈ標識アルブミンとＦｌ標識ＰＥＧ−Ａｌｂの重複により黄色（緑＋赤）に見える。一方、敗血症を有する動物（Ｃ、Ｄ、Ｅ）では、Ｒｈ標識アルブミンが散剤し、肺胞毛細血管膜でＰＥＧ−Ａｌｂの濃度パターンが存在した。
【図８Ｃ】以下のことを示す蛍光画像を示す：ＡおよびＢ，正常動物、敗血症無し、肺胞毛細血管膜内にＦｌ標識されたＰＥＧ−Ａｌｂが局在しているが、ＢはＲｈ標識アルブミンとＦｌ標識ＰＥＧ−Ａｌｂの重複により黄色（緑＋赤）に見える。一方、敗血症を有する動物（Ｃ、Ｄ、Ｅ）では、Ｒｈ標識アルブミンが散剤し、肺胞毛細血管膜でＰＥＧ−Ａｌｂの濃度パターンが存在した。
【図８Ｄ】以下のことを示す蛍光画像を示す：ＡおよびＢ，正常動物、敗血症無し、肺胞毛細血管膜内にＦｌ標識されたＰＥＧ−Ａｌｂが局在しているが、ＢはＲｈ標識アルブミンとＦｌ標識ＰＥＧ−Ａｌｂの重複により黄色（緑＋赤）に見える。一方、敗血症を有する動物（Ｃ、Ｄ、Ｅ）では、Ｒｈ標識アルブミンが散剤し、肺胞毛細血管膜でＰＥＧ−Ａｌｂの濃度パターンが存在した。
【図８Ｅ】以下のことを示す蛍光画像を示す：ＡおよびＢ，正常動物、敗血症無し、肺胞毛細血管膜内にＦｌ標識されたＰＥＧ−Ａｌｂが局在しているが、ＢはＲｈ標識アルブミンとＦｌ標識ＰＥＧ−Ａｌｂの重複により黄色（緑＋赤）に見える。一方、敗血症を有する動物（Ｃ、Ｄ、Ｅ）では、Ｒｈ標識アルブミンが散剤し、肺胞毛細血管膜でＰＥＧ−Ａｌｂの濃度パターンが存在した。
【図９】ＰＥＧ−２０，０００（マレイミド）修飾アルブミンの精製を示す−マレイミドＰＥＧ２０，０００で修飾したヒトアルブミン（タンパク質７ｍｇ）を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ７．５、２５℃）で平衡化したＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（１．５ｃｍ×５ｃｍ）に適用した。
【図１０】ＰＥＧ−４０，０００（マレイミド）で修飾したアルブミンの精製を示す−マレイミドＰＥＧ４０，０００で修飾したヒトアルブミン（タンパク質６０ｍｇ）を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ７．５、２５℃）で平衡化したＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（１．５ｃｍ×５ｃｍ）に適用した。
【図１１】虚血／再潅流傷害がアポトーシスおよび毛細血管漏出をもたらすかどうかの概略図。
【図１２】ＰＥＧ−Ａｌｂを示す。このアルブミン構造は、リシル残基が緑、Ｃｙｓ３４が赤、ＰＥＧが模式的に示されている。
【図１３】酸化および炎症カスケードに対するＰＥＧ−Ａｌｂの提起される作用を示す。
【図１４】ＣＬＰラットにおける平均動脈血圧（ＭＡＰ）に対するアルブミン（○）、ＰＥＧ−Ａｌｂ（●）、生理食塩水（□）およびＰＥＧ＋アルブミン（黒四角）の作用を示す。
【図１５】血清および尿におけるＰＥＧの外観および排除を経時的に示す。
【図１６】対照ラット（図１６Ａ）およびＣＬＰラット（図１６Ｂ）由来の肺組織の蛍光顕微鏡写真を示す。動物にはフルオレセイン標識ＰＥＧ−Ａｌｂおよびテキサスレッド標識アルブミンを投与した。
【図１７】ＬＰＳ処理ラットの代表的な肺の組織切片（２ＯＸ Ｈ＆Ｅ）；図１７ａ，軽度（０〜１）；図１７ｂ，中度（１〜２）；図１７ｃ，重度（３〜４）。
【図１８】処理後のＨＳラットの血圧を示す。上の曲線の●はＰＥＧ−Ａｌｂ、中央の曲線の○はアルブミン、下の曲線の□は生理食塩水。
【図１８Ａ】出血性ショックラットにおけるヘマトクリット（Ｈｔｃ）およびコロイド浸透圧（ＣＯＰ）を示す表Ｉであり、データは平均値±ＳＤである。＊＝ｐ＜０．０５；＊＊＝ｐ＜０．０１であり、どの群の比較も、両側ｔ検定で処理前の値と対応する処理の終了時を比べた。ａ）同じ群内での処理前と処理後；ｂ）生理食塩水とアルブミン；ｃ）生理食塩水とＰＥＧ−Ａｌｂ；ｄ）アルブミンとＰＥＧ−Ａｌｂ；（ＮＳ）有意でない。
【図１９】出血性ショックモデル（病期ＩおよびＩＩ）を示す。下の数字は出血後の分数に相当する。
【図２０】コロイド浸透圧（●）および粘度（○）がＰＥＧ−Ａｌｂ濃度に依存していることを示す。
【図２１】Ｓｕｐｅｒｏｓｅ ６ ＨＰＬＣのよるｍＰＥＧ５０００修飾アルブミン（ＰＥＧＡ，実線）およびアルブミン（ＨＡＳ，破線）の分析を示す。矢印で示す位置に溶出する標準は、α，α−２−マクログロブリン；Ｔ，チログロブリン；Ｆ，フェリチン；Ｇ，ＩｇＧ；Ｏ，オボアルブミン；およびＭ，ミオグロビンである。
【図２２】Ｓｕｐｅｒｏｓｅ ６ ＨＰＬＣによるｍＰＥＧ５０００修飾アルブミン（ＰＥＧＡ）サイズ分画品（Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩで示す）および分画していない材料（Ｕで示す）の分析を示す。サイズ標準は図１１と同じである。
【図２３】ｍＰＥＧ−４０，０００修飾アルブミンの精製を示す−マレイミドｍＰＥＧ４００００で修飾したＨＳＡをＱ−Ｓｅｐｈａｒｏに適用し、０〜０．３ＭのＮａＣｌ勾配で溶出した。挿入：３１からはじまる連続画分に対するＳＤＳゲル電気泳動の結果。ゲルのレーンＡは非修飾アルブミンである。
【図２４】Ｓｕｐｅｒｏｓｅ ６ ＨＰＬＣによるｍＰＥＧ４００００（４０）およびｍＰＥＧ２００００（２０）修飾アルブミンとアルブミンの分析を示す。標準は図１１と同じである。
【図２５】アルブミン（図２５Ａ）、ｍＰＥＧ２００００アルブミン（図２５Ｂ）およびｍＰＥＧ４００００アルブミン（図２５Ｃ）の尿素脱フォールディングを示す。サンプル（１０ｍＭ ＫＰＩ（ｐＨ７．４）中０．０５ｍｇ／ｍｌアルブミン、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）を示された［尿素］で１２時間インキュベートした後、発光スペクトルを採取した。励起２９５ｎｍで３１０〜３７０ｎｍでの発光を測定し、結果を強度平均発光波長（＜λ＞ＩＥ）としてプロットした。実線は三次元非フォールディングモデルへの当てはめに相当する。
【図２６】ＰＥＧ４０−Ａｌｂ（ＰＥＧＡ４０）および非修飾アルブミン（ＨＳＡ）のＤＳＣスキャンを示す。
【図２７Ａ】ＰＥＧ修飾アルブミンの消光研究を示す。Ａ：アルブミンおよびサイズ分画ｍＰＥＧ５０００アルブミンのアクリルアミド消光。実線は静的消光のＳｔｅｍ−Ｖｏｌｍｅｒ方程式に当てはめたものである。
【図２７Ｂ】ＰＥＧ修飾アルブミンの消光研究を示す。Ｂ：アルブミンおよびサイズ分画ｍＰＥＧ５０００アルブミンのＫＩ消光。実線は静的消光のＳｔｅｍ−Ｖｏｌｍｅｒ方程式に当てはめたものである。
【図２７Ｃ】ＰＥＧ修飾アルブミンの消光研究を示す。Ｃ：アルブミン、ｍＰＥＧ２００００アルブミンおよびＰＥＧ４００００アルブミンのアクリルアミド消光。実線は静的消光のＳｔｅｍ−Ｖｏｌｍｅｒ方程式に当てはめたものである。
【図２８】ＰＥＧ修飾アルブミンの浸透圧−非修飾アルブミン、ｍＰＥＧ２００００マレイミド修飾アルブミン（ＰＥＧＡ２０）またはｍＰＥＧ４００００マレイミド修飾アルブミン（ＰＥＧＡ４０）、および非分画ｍＰＥＧ５０００修飾アルブミン（ＰＥＧＡ５）の溶液の浸透圧を示された濃度で２２℃にて測定した。直線は３次多項式に当てはめたものである。
【図２９】反応性ｍＰＥＧ試薬の構造を示す。
【図３０Ａ】非修飾ヒトアルブミンおよびｍＰＥＧ５０００修飾アルブミンの脱フォールディングを示す。図３０Ａ：ＣＤによりモニタリングした非修飾ヒトアルブミンの脱フォールディング。スケールの違いはタンパク質濃度の違いを表す。
【図３０Ｂ】非修飾ヒトアルブミンおよびｍＰＥＧ５０００修飾アルブミンの脱フォールディングを示す。図３０Ｂ：ＣＤによりモニタリングしたｍＰＥＧ５０００修飾ヒトアルブミンの脱フォールディング。スケールの違いはタンパク質濃度の違いを表す。
【図３１】
【図３１Ａ】注射時間における濃度に対する指数で示した蛍光データ（対数スケール）を示す。
【図３１Ｂ】注射時間における濃度に対する指数で示した蛍光データ（対数スケール）を示す。
【図３２Ａ】注射時間における濃度に対する指数で示した蛍光データ（対数スケール）を示す。
【図３２Ｂ】注射時間における濃度に対する指数で示した蛍光データ（対数スケール）を示す。
【図３３】個々の正常ラットおよびＣＬＰラットについて、注射時間（時間＝０）における濃度に対する指数で示したＰＥＧ−Ａｌｂ／アルブミン蛍光データを時間の関数として示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの保護されたチオール領域を有するアルブミンベースコロイド組成物を含んでなる組成物であって、そのアルブミンが指示試薬で修飾されている、組成物。
【請求項２】
指示試薬が色素とコンジュゲートした試薬である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
アルブミンが、色素とコンジュゲートしたアルブミンまたは色素とコンジュゲートしたＰＥＧ−アルブミンである、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
指示試薬が色素である、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
指示試薬が、発光波長および励起波長を有する第一の色素ならびに発光波長および励起波長を有する第二の色素であり、第二の色素の発光波長および励起波長が第一の色素の発光波長および励起波長から大きくかつ有意に離れている、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
第一の色素がある色を有し、第二の色素が第一の色素と同じ色である、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
第一の色素が緑色であり、第二の色素が赤色である、請求項５に記載の組成物。
【請求項８】
色素が緑色である、請求項４に記載の組成物。
【請求項９】
色素が赤いマレイミド色素またはインドシアニングリーンである、請求項４に記載の組成物。
【請求項１０】
指示試薬がフルオレセインである、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
インドシアニングリーンがフルオレセインと併用される、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
フルオレセインが５−ヨードアセトアミドフルオレセインである、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１３】
アルブミンベースコロイド組成物が、ジチオトレイトール処理したアルブミン組成物である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１４】
アルブミンベースコロイド組成物が、組成物が患者の毛細血管から漏出しないように十分に大きな分子排除体積および流体力学的半径を有するアルブミンベースコロイドの少なくとも１つのＰＥＧ化産物であり、アルブミンがある分子排除体積を有し、ＰＥＧ化産物の分子排除体積がアルブミンの分子排除体積より１６倍大きい、請求項１に記載の組成物。
【請求項１５】
アルブミンベースコロイド組成物が、組成物が患者の毛細血管から漏出しないように十分に大きな分子排除体積および流体力学的半径を有するアルブミンベースコロイドの少なくとも１つのＰＥＧ化産物であり、アルブミンがある流体力学的半径を有し、ＰＥＧ化産物の流体力学的半径がアルブミンの流体力学的半径より１３倍大きい、請求項１に記載の組成物。
【請求項１６】
ＰＥＧ−ＡｌｂＣｙｓ−３４を含んでなる、請求項１に記載の組成物。
【請求項１７】
ＰＥＧ−ＡｌｂＣｙｓ−３４を含んでなる、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１８】
請求項１に記載の組成物を製造する方法であって、
アルブミンまたはＰＥＧ−アルブミンを、アルブミンタンパク質のジスルフィド構造を混乱させずに少なくとも１種のチオール選択性試薬で修飾すること、
前記チオ修飾タンパク質を指示試薬で修飾すること、および
アルブミンまたはＰＥＧ−アルブミンを精製して、非修飾タンパク質、過剰な試薬および反応副産物を除去すること
を含んでなる、方法。
【請求項１９】
アルブミンまたはＰＥＧ−アルブミンをチオ試薬で修飾する工程が、過剰量のジチオトレイトールで処理することによって行われる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記方法を多重発色団技術に基づいて行うための工程を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記方法を二重発色団技術に基づいて行うための工程を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
アルブミンおよびＰＥＧ−アルブミンを分光光度的に異なる発色団でタグ付けする工程、および
経時的にその発色団の濃度を繰り返し評価する工程
を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
多臓器不全の発症が起こる前またはその不全の初期に、多臓器不全の発症を予測する工程を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
多臓器不全の発症が起こる前またはその不全の初期に、多臓器不全の発症を予測する方法であって、
既知分子量の第一のタンパク質を準備すること、
有意に異なる分子量の第二のタンパク質を準備すること、
第一および第二のタンパク質を、離れた発光波長および励起波長を有する発色団でタグ付けすること、および
経時的にその発色団の濃度を繰り返し評価すること
を含んでなる、方法。
【請求項２５】
指示試薬が色素である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２６】
前記色素が、大きくかつ有意に異なる発光波長および励起波長を有する色素の組合せである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
色素が赤いマレイミド色素またはインドシアニンである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２８】
指示試薬がフルオレセインである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２９】
インドシアニングリーンがフルオレセインと併用される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
フルオレセインが５−ヨードアセトアミドフルオレセインである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
多臓器不全症候群を発症するリスクのある患者を正確に特定する方法であって、
分子量が異なり、各々明瞭に異なる離れた発光波長および励起波長を有する異なる蛍光団でタグ付けされた複数のタンパク質または分子を使用すること、
それら複数のタンパク質または分子を、多臓器不全を発症するリスクのある患者に投与すること、および
同じ病態生理学的プロセス下で、連続的に複数回、その異なる蛍光団の濃度を追跡すること
を含んでなる、方法。
【請求項３２】
前記病態生理学的プロセスが血液濃縮および毛細血管漏出である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
治療量の請求項１に記載の組成物を哺乳動物に投与することを含んでなる、少なくとも血液減少症状からの哺乳動物組織の傷害を予防する方法であって、
その組成物が哺乳動物の毛細血管から漏出できず、該組織を傷害から保護するのに十分な量で存在する、方法。
【請求項３４】
治療量の請求項１に記載の組成物を哺乳動物に投与することを含んでなる、少なくとも血液減少症状からの哺乳動物組織の傷害を予防する方法であって、
その組成物が哺乳動物の毛細血管から漏出できず、該組織を傷害から保護するのに十分な量で存在する、方法。
【請求項３５】
前記傷害が、敗血症、ショック、火傷、外傷、外科手術、毛細血管漏出素因、過粘稠度状態、低アルブミン血症、白血球搬出、栄養性アルブミン欠乏症、腎炎症候群、肝不全、および／または無酸素症によるものである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記組成物を、多臓器不全に代わる血管漏出を測定および定量するためのマーカーとして使用する工程、および
臓器不全を発症するリスクのある患者を予測する工程
を含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
血液減少症状または多臓器不全のリスクのある患者において、毛細血管漏出により引き起こされるこのような症状または不全を治療または予防する方法であって、
ａ）このような症状または不全のリスクのある患者に対して、その患者に毛細血管漏出の増加があるかどうかを判定する診断試験を行うこと、
そして、その患者に毛細血管漏出の増加があれば、
ｂ）患者に治療上有効な量の血漿増量剤を投与すること
を含んでなる、方法。
【請求項３８】
診断試験の実施が、
ａ）患者の血流に、第一の検出可能な標識にコンジュゲートされた血液タンパク質分子を含んでなる第一のマーカー組成物を投与すること、
ｂ）患者の血流に、工程（ａ）と同じであるが、第一の検出可能な標識から識別して検出することができる第二の検出可能な標識にコンジュゲートされ、非修飾血液タンパク質分子の分子排除体積よりも実質的に大きな分子排除体積を有するように修飾されている血液タンパク質分子を含んでなる第二のマーカー組成物を投与すること、および
ｃ）第一および第二のマーカー組成物を投与した後の２以上の時点で患者から採取した血液サンプル中の第一のマーカー組成物の量と第二のマーカー組成物の量の相対的低下速度を測定すること
を含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
第二のマーカー組成物の低下速度に比べ、第一のマーカー組成物の量の低下速度が速ければ、その患者に毛細血管漏出の増加があることを示す、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記血液タンパク質分子がアルブミンまたはヘモグロビンである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
血液タンパク質分子の分子排除体積が、血液タンパク質分子と１以上のポリエチレングリコール分子との共有結合により実質的に大きくされている、請求項３８に記載の方法。
【請求項４２】
第一のマーカー組成物と第二のマーカー組成物が同時に患者に投与される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４３】
第一のマーカー組成物と第二のマーカー組成物が患者に投与するための単一の製剤中に処方される、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
第一の検出可能な標識と第二の検出可能な標識がともに蛍光マーカーである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４５】
前記血漿増量剤がＰＥＧ化アルブミンまたはＰＥＧ化ヘモグロビンである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４６】
前記アルブミンが、ヒトアルブミン、ウシアルブミン、ラクトアルブミンおよびオボアルブミンからなる群から選択されるものである、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記患者が、敗血症、ショック、火傷、外傷、外科手術、毛細血管漏出素因、過粘稠度状態、低アルブミン血症、白血球搬出、栄養性アルブミン欠乏症、腎炎症候群、肝不全または無酸素症の結果としてのこのような症状または不全のリスクを有する、請求項３７に記載の方法。
【請求項４８】
第一のマーカー組成物および第二のマーカー組成物の双方の血液タンパク質分子がアルブミンであり、第二のマーカー組成物のアルブミンが、該アルブミンと１以上のポリエチレングリコール分子との共有結合により修飾されている、請求項３８に記載の方法。
【請求項４９】
診断試験の実施が、
ａ）患者の血流に、第一の検出可能な標識にコンジュゲートされた血液タンパク質分子を含んでなる第一のマーカー組成物を投与すること、
ｂ）患者の血流に、工程（ａ）と同じであるが、第一の検出可能な標識から識別して検出することができる第二の検出可能な標識にコンジュゲートされ、非修飾血液タンパク質分子の分子排除体積よりも実質的に大きな分子排除体積を有するように修飾されている血液タンパク質分子を含んでなる第二のマーカー組成物を投与すること、および
ｃ）第一および第二のマーカー組成物を投与した後の２以上の時点で、第一のマーカー組成物の量と第二のマーカー組成物の量の比率を測定すること
を含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項５０】
第一の検出可能な標識の量と第二の検出可能な標識の量との比率が、第一および第二のマーカー組成物を投与した後の３以上の時点で測定され、
経時的な比率の変化の曲線が作成され、曲線下面積が測定される、
請求項４９に記載の方法。
【請求項１】
少なくとも１つの保護されたチオール領域を有するアルブミンベースコロイド組成物を含んでなる組成物であって、そのアルブミンが指示試薬で修飾されている、組成物。
【請求項２】
指示試薬が色素とコンジュゲートした試薬である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
アルブミンが、色素とコンジュゲートしたアルブミンまたは色素とコンジュゲートしたＰＥＧ−アルブミンである、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
指示試薬が色素である、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
指示試薬が、発光波長および励起波長を有する第一の色素ならびに発光波長および励起波長を有する第二の色素であり、第二の色素の発光波長および励起波長が第一の色素の発光波長および励起波長から大きくかつ有意に離れている、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
第一の色素がある色を有し、第二の色素が第一の色素と同じ色である、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
第一の色素が緑色であり、第二の色素が赤色である、請求項５に記載の組成物。
【請求項８】
色素が緑色である、請求項４に記載の組成物。
【請求項９】
色素が赤いマレイミド色素またはインドシアニングリーンである、請求項４に記載の組成物。
【請求項１０】
指示試薬がフルオレセインである、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
インドシアニングリーンがフルオレセインと併用される、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
フルオレセインが５−ヨードアセトアミドフルオレセインである、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１３】
アルブミンベースコロイド組成物が、ジチオトレイトール処理したアルブミン組成物である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１４】
アルブミンベースコロイド組成物が、組成物が患者の毛細血管から漏出しないように十分に大きな分子排除体積および流体力学的半径を有するアルブミンベースコロイドの少なくとも１つのＰＥＧ化産物であり、アルブミンがある分子排除体積を有し、ＰＥＧ化産物の分子排除体積がアルブミンの分子排除体積より１６倍大きい、請求項１に記載の組成物。
【請求項１５】
アルブミンベースコロイド組成物が、組成物が患者の毛細血管から漏出しないように十分に大きな分子排除体積および流体力学的半径を有するアルブミンベースコロイドの少なくとも１つのＰＥＧ化産物であり、アルブミンがある流体力学的半径を有し、ＰＥＧ化産物の流体力学的半径がアルブミンの流体力学的半径より１３倍大きい、請求項１に記載の組成物。
【請求項１６】
ＰＥＧ−ＡｌｂＣｙｓ−３４を含んでなる、請求項１に記載の組成物。
【請求項１７】
ＰＥＧ−ＡｌｂＣｙｓ−３４を含んでなる、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１８】
請求項１に記載の組成物を製造する方法であって、
アルブミンまたはＰＥＧ−アルブミンを、アルブミンタンパク質のジスルフィド構造を混乱させずに少なくとも１種のチオール選択性試薬で修飾すること、
前記チオ修飾タンパク質を指示試薬で修飾すること、および
アルブミンまたはＰＥＧ−アルブミンを精製して、非修飾タンパク質、過剰な試薬および反応副産物を除去すること
を含んでなる、方法。
【請求項１９】
アルブミンまたはＰＥＧ−アルブミンをチオ試薬で修飾する工程が、過剰量のジチオトレイトールで処理することによって行われる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記方法を多重発色団技術に基づいて行うための工程を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記方法を二重発色団技術に基づいて行うための工程を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
アルブミンおよびＰＥＧ−アルブミンを分光光度的に異なる発色団でタグ付けする工程、および
経時的にその発色団の濃度を繰り返し評価する工程
を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
多臓器不全の発症が起こる前またはその不全の初期に、多臓器不全の発症を予測する工程を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
多臓器不全の発症が起こる前またはその不全の初期に、多臓器不全の発症を予測する方法であって、
既知分子量の第一のタンパク質を準備すること、
有意に異なる分子量の第二のタンパク質を準備すること、
第一および第二のタンパク質を、離れた発光波長および励起波長を有する発色団でタグ付けすること、および
経時的にその発色団の濃度を繰り返し評価すること
を含んでなる、方法。
【請求項２５】
指示試薬が色素である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２６】
前記色素が、大きくかつ有意に異なる発光波長および励起波長を有する色素の組合せである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
色素が赤いマレイミド色素またはインドシアニンである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２８】
指示試薬がフルオレセインである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２９】
インドシアニングリーンがフルオレセインと併用される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
フルオレセインが５−ヨードアセトアミドフルオレセインである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
多臓器不全症候群を発症するリスクのある患者を正確に特定する方法であって、
分子量が異なり、各々明瞭に異なる離れた発光波長および励起波長を有する異なる蛍光団でタグ付けされた複数のタンパク質または分子を使用すること、
それら複数のタンパク質または分子を、多臓器不全を発症するリスクのある患者に投与すること、および
同じ病態生理学的プロセス下で、連続的に複数回、その異なる蛍光団の濃度を追跡すること
を含んでなる、方法。
【請求項３２】
前記病態生理学的プロセスが血液濃縮および毛細血管漏出である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
治療量の請求項１に記載の組成物を哺乳動物に投与することを含んでなる、少なくとも血液減少症状からの哺乳動物組織の傷害を予防する方法であって、
その組成物が哺乳動物の毛細血管から漏出できず、該組織を傷害から保護するのに十分な量で存在する、方法。
【請求項３４】
治療量の請求項１に記載の組成物を哺乳動物に投与することを含んでなる、少なくとも血液減少症状からの哺乳動物組織の傷害を予防する方法であって、
その組成物が哺乳動物の毛細血管から漏出できず、該組織を傷害から保護するのに十分な量で存在する、方法。
【請求項３５】
前記傷害が、敗血症、ショック、火傷、外傷、外科手術、毛細血管漏出素因、過粘稠度状態、低アルブミン血症、白血球搬出、栄養性アルブミン欠乏症、腎炎症候群、肝不全、および／または無酸素症によるものである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記組成物を、多臓器不全に代わる血管漏出を測定および定量するためのマーカーとして使用する工程、および
臓器不全を発症するリスクのある患者を予測する工程
を含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
血液減少症状または多臓器不全のリスクのある患者において、毛細血管漏出により引き起こされるこのような症状または不全を治療または予防する方法であって、
ａ）このような症状または不全のリスクのある患者に対して、その患者に毛細血管漏出の増加があるかどうかを判定する診断試験を行うこと、
そして、その患者に毛細血管漏出の増加があれば、
ｂ）患者に治療上有効な量の血漿増量剤を投与すること
を含んでなる、方法。
【請求項３８】
診断試験の実施が、
ａ）患者の血流に、第一の検出可能な標識にコンジュゲートされた血液タンパク質分子を含んでなる第一のマーカー組成物を投与すること、
ｂ）患者の血流に、工程（ａ）と同じであるが、第一の検出可能な標識から識別して検出することができる第二の検出可能な標識にコンジュゲートされ、非修飾血液タンパク質分子の分子排除体積よりも実質的に大きな分子排除体積を有するように修飾されている血液タンパク質分子を含んでなる第二のマーカー組成物を投与すること、および
ｃ）第一および第二のマーカー組成物を投与した後の２以上の時点で患者から採取した血液サンプル中の第一のマーカー組成物の量と第二のマーカー組成物の量の相対的低下速度を測定すること
を含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
第二のマーカー組成物の低下速度に比べ、第一のマーカー組成物の量の低下速度が速ければ、その患者に毛細血管漏出の増加があることを示す、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記血液タンパク質分子がアルブミンまたはヘモグロビンである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
血液タンパク質分子の分子排除体積が、血液タンパク質分子と１以上のポリエチレングリコール分子との共有結合により実質的に大きくされている、請求項３８に記載の方法。
【請求項４２】
第一のマーカー組成物と第二のマーカー組成物が同時に患者に投与される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４３】
第一のマーカー組成物と第二のマーカー組成物が患者に投与するための単一の製剤中に処方される、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
第一の検出可能な標識と第二の検出可能な標識がともに蛍光マーカーである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４５】
前記血漿増量剤がＰＥＧ化アルブミンまたはＰＥＧ化ヘモグロビンである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４６】
前記アルブミンが、ヒトアルブミン、ウシアルブミン、ラクトアルブミンおよびオボアルブミンからなる群から選択されるものである、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記患者が、敗血症、ショック、火傷、外傷、外科手術、毛細血管漏出素因、過粘稠度状態、低アルブミン血症、白血球搬出、栄養性アルブミン欠乏症、腎炎症候群、肝不全または無酸素症の結果としてのこのような症状または不全のリスクを有する、請求項３７に記載の方法。
【請求項４８】
第一のマーカー組成物および第二のマーカー組成物の双方の血液タンパク質分子がアルブミンであり、第二のマーカー組成物のアルブミンが、該アルブミンと１以上のポリエチレングリコール分子との共有結合により修飾されている、請求項３８に記載の方法。
【請求項４９】
診断試験の実施が、
ａ）患者の血流に、第一の検出可能な標識にコンジュゲートされた血液タンパク質分子を含んでなる第一のマーカー組成物を投与すること、
ｂ）患者の血流に、工程（ａ）と同じであるが、第一の検出可能な標識から識別して検出することができる第二の検出可能な標識にコンジュゲートされ、非修飾血液タンパク質分子の分子排除体積よりも実質的に大きな分子排除体積を有するように修飾されている血液タンパク質分子を含んでなる第二のマーカー組成物を投与すること、および
ｃ）第一および第二のマーカー組成物を投与した後の２以上の時点で、第一のマーカー組成物の量と第二のマーカー組成物の量の比率を測定すること
を含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項５０】
第一の検出可能な標識の量と第二の検出可能な標識の量との比率が、第一および第二のマーカー組成物を投与した後の３以上の時点で測定され、
経時的な比率の変化の曲線が作成され、曲線下面積が測定される、
請求項４９に記載の方法。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図３Ｄ】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図８Ｃ】
【図８Ｄ】
【図８Ｅ】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６Ａ】
【図１６Ｂ】
【図１７Ａ】
【図１７Ｂ】
【図１７Ｃ】
【図１８】
【図１８Ａ】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７Ａ】
【図２７Ｂ】
【図２７Ｃ】
【図２８】
【図２９】
【図３０Ａ】
【図３０Ｂ】
【図３１】
【図３１Ａ】
【図３１Ｂ】
【図３２Ａ】
【図３２Ｂ】
【図３３】
【図１Ｂ】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図３Ｄ】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図８Ｃ】
【図８Ｄ】
【図８Ｅ】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６Ａ】
【図１６Ｂ】
【図１７Ａ】
【図１７Ｂ】
【図１７Ｃ】
【図１８】
【図１８Ａ】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７Ａ】
【図２７Ｂ】
【図２７Ｃ】
【図２８】
【図２９】
【図３０Ａ】
【図３０Ｂ】
【図３１】
【図３１Ａ】
【図３１Ｂ】
【図３２Ａ】
【図３２Ｂ】
【図３３】
【公表番号】特表２００９−５１３６４３（Ｐ２００９−５１３６４３Ａ）
【公表日】平成２１年４月２日（２００９．４．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５３７８６９（Ｐ２００８−５３７８６９）
【出願日】平成１８年１０月２４日（２００６．１０．２４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０４１４３２
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０５０５８１
【国際公開日】平成１９年５月３日（２００７．５．３）
【出願人】（５０８１０３５０６）メディカル、ユニバーシティー、オブ、オハイオ、アット、トレド (1)
【氏名又は名称原語表記】ＭＥＤＩＣＡＬ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＯＦ ＯＨＩＯ ＡＴ ＴＯＬＥＤＯ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年４月２日（２００９．４．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１０月２４日（２００６．１０．２４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０４１４３２
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０５０５８１
【国際公開日】平成１９年５月３日（２００７．５．３）
【出願人】（５０８１０３５０６）メディカル、ユニバーシティー、オブ、オハイオ、アット、トレド (1)
【氏名又は名称原語表記】ＭＥＤＩＣＡＬ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＯＦ ＯＨＩＯ ＡＴ ＴＯＬＥＤＯ
【Ｆターム（参考）】
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