弱視の治療方法
本発明は、弱視の症状を治療または緩和するための方法に関する。この方法は、ヒトのうつ病治療において臨床的に活性が認められている特定の薬剤を反復投与することが、弱視眼の視力回復に繋がるという知見に基づくものである。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
弱視は、片方の目の視覚が、その目の発達段階における不十分な使用によって損なわれた症状であり、治療方法が存在しない一般的な成人の病である。本発明は、弱視の症状を治療または緩和するための方法に関する。本発明は、臨床学的にヒトのうつ症状の治療に活性であることが知られる特定の薬剤（抗うつ剤）の反復投与が、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）の発現増加及び皮質内抑制の低減を介して、実験動物における弱視の目の視覚を改善させるという発見などに基づくものである。
【背景技術】
【０００２】
弱視
弱視とは、視覚情報の処理における機能不全によって特徴付けられる臨床状態である。典型的には、眼科的検査による病的所見を伴わない視力低下として検出されるものである。弱視は、生後発育の臨界期に眼の使用が低下または偏ったことによる、視覚皮質内の視覚情報処理の異常に起因する。多くの場合、生後数年の内に片方の眼に生じた斜視、不同視または視覚遮蔽は、冒された眼の永久的な視力低下に繋がる（Holmes and Clarke, 2006）。弱視は単眼失明の最も一般的な原因であり、その有病率は子供で１〜５％、そして成人では約３％である（Holmes and Clarke, 2006）。成人の弱視には立体視の不足による奥行き知覚の低下が見られ、事故や疾病によって弱視ではない方の眼の視力が失われた場合に全盲となる危険性がかなり高い。幼児期に良い方の眼を眼科的または薬学的に遮蔽して弱い方の眼の使用を促進することで弱視は防ぐことができる。しかし、遮断療法は生後発育の臨界期にのみ有効であり、思春期に臨界期が（ヒトでは約１０歳で）段階的に終了すると、遮蔽はもはや有効な手段ではなく、弱視は永久的な物となる。
【０００３】
サル、ネコ、ラットやマウスなどの実験動物を用いた実験研究は、過去数十年にわたって弱視の根本に潜む神経生物学的な機構を明らかにしてきた（Berardi et al., 2003）。生後発育の初期には左眼と右眼のそれぞれからの入力が視覚皮質の神経支配に際して競合し、両眼が共に正視な場合、哺乳類の視覚皮質は眼球優位性（ＯＤ）コラムと呼ばれる眼特異的なコラムに組織化する。これは、それぞれの眼からの入力が、第１次視覚皮質のＩＶ層へ形態学的および機能的に分離されることを表している。視覚皮質の正常な神経支配には、両眼からのバランスのとれた視覚入力が必要である（Berardi et al., 2003）。従って、生後発育の初期に片眼を閉じ、成人期近くまで閉じたままにすると、開いている眼は遮蔽した眼を乗っ取って徐々に１次視覚皮質のほぼ全域に神経を分布させるが、一方、遮蔽した眼は、視覚皮質内のニューロンとの連結を解剖学的にも生理学的にも失う。このような再組織化は、種によって数日から数年におよぶ生後発育の臨界期に最も効果的に生じ、遮蔽した眼の重度の視力低下に繋がる（Berardi et al., 2003）。臨界期の終了した成人期では、片眼を閉じることは閉じた眼の視力と既に確立された脳内ＯＤコラムへの解剖学的および生理学的な分離に有意な影響を与えることはない。反対に、臨界期に遮蔽した眼は、成人期に眼を開けても、視力が向上したり、失われた解剖学的および生理学的な上記ニューロンとの連結が回復することはない。視覚皮質におけるγ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）介在性の神経抑制の増加と成熟が、発達過程において臨界期の終了をもたらす臨界的な因子であることが報告されている（Berardi et al., 2003）。まとめると、弱視は眼の問題（斜視、不同視または視覚遮蔽）の結果として生じるものの、臨界期の終了後には、弱視は眼の問題ではなく、眼と視覚皮質との間の神経結合の問題となる。臨界期の終了後に眼に潜在する発達過程の問題を正すことのできるいかなる手法（例えば、斜視の外科的処置）についても、弱視眼の視力を回復させたという報告はない。
【０００４】
現時点では、臨界期終了後の成人期に遮蔽した眼の視覚を回復または向上に有効な薬学的介入手段は存在しない（Holmes and Clarke, 2006）。Ｌ−ＤＯＰＡおよびシトコリンを用いた補助非盲検臨床試験は、薬理的処置によって成人の弱視を改善させる可能性を示唆したが（Campos and Fresina, 2006）、上記薬剤の副作用によってその使用は妨げられた。発達途中の眼の成長に影響を与えるために薬理物質を使用する方法が提案されているが、発達初期の眼の成長異常は不同視を生じ、弱視の発生へと繋がる恐れがある（WO 9425034 A1、WO 0152832 A1、WO 03032975 A1、US 5567731 A、US 5571823 A、US 2003114830 A1）。しかし、弱視は眼と脳との接続異常であるため、眼の成長に影響を与えるいかなる手段も、臨界期終了後の視覚皮質において失われた弱視眼の神経結合を改善することはできない。細胞外マトリクスを分解する酵素（コンドロイチナーゼＡＢＣ）の皮質内注入は、成体ラット脳の臨界期可塑性を回復させることが示されているが、視覚皮質の複数の位置に直接酵素を注射する必要がある（Pizzorusso et al, 2002、Pizzorusso et al, 2006）。弱視眼の視力を成人期に向上させることのできる処置は、特に臨界期の終了後に良い方の眼の視力が失われた場合に、非常に望ましいものである。
【０００５】
抗うつ薬
ヒトにおけるうつ病と気分障害の症状を治療するために臨床的に使用される薬剤を、抗うつ薬または抗うつ剤と呼ぶ。臨床的な活性が認められる抗うつ剤の大部分が、モノアミントランスポーターであるセロトニン（５−ヒドロキシトリプタミン、５−ＨＴ）またはノルネピネフリン（ＮＥ）のシナプス中の濃度を増加させるものであり、このような薬剤は、細胞による再取り込みを阻害するもの（再取り込み阻害剤）または上記トランスミッターを分解するモノアミンオキシダーゼ（ＭＡＯ）を阻害するもの（モノアミンオキシダーゼ阻害剤、ＭＡＯＩ）である。再取り込み阻害剤は、三環系抗うつ剤、選択的セロトニン再取り込み阻害剤（ＳＳＲＩ）および選択的ＮＥ再取り込み阻害剤（ＮＳＲＩ）に更に分類される。セロトニン−ノルネピネフリン再取り込み阻害剤（ＳＮＲＩ）は、細胞によるセロトニンとノルネピネフリンの両方の再取り込みを阻害する。抗うつ剤の中では、発生する副作用が比較的少ないと言う理由から、ＳＳＲＩが最も広く使用される薬剤クラスである。ＳＳＲＩの中では、フルオキセチンが最も広く使用されている薬剤である。５０年にわたる臨床経験によると、公知の抗うつ薬の全てにおいて、臨床的効果を達成するためには少なくとも数週間にわたる反復投与が必要である。
【０００６】
抗うつ剤と神経可塑性
神経可塑性は、新しいニューロンまたはシナプス結合を形成するか、現存する結合を解消するか、あるいは現存するシナプス結合の強度を増強または減少させることによって、ニューロンがその結合性を調節する能力を意味する。神経栄養因子である脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）は発達途中の脳と成体の脳の両方において重要な神経可塑性調節因子である。過去１０年に蓄積された事実は、抗うつ薬が神経可塑性の調節に関与することを示唆している（Castren, 2004）。抗うつ薬は海馬歯状回における新しいニューロンの産生を増加させ、海馬における軸索新芽形成とシナプス形成を増加させる。抗うつ剤による処置は、さらに海馬における可塑性関連遺伝子やタンパク質の発現も増加させる（Castren, 2004）。具体的には、全ての公知抗うつ剤クラスの代表的なものが、反復投与によってＢＤＮＦのｍＲＮＡの産生を増加し、１回または反復投与の後には、ＢＤＮＦ受容体であるｔｒｋＢの自己リン酸化の増加として測定されるｔｒｋＢの活性化をもたらした（Castren, 2004）。ＢＤＮＦとその受容体であるｔｒｋＢは、神経可塑性の重要なメディエーターであり、少なくとも齧歯動物においては、抗うつ薬の効力に対しても重要なメディエーターである。
【０００７】
発明の概要
本発明の目的は、生後視覚発達の臨界期を過ぎたヒトにおいて、弱視を治療または緩和するための方法を提供することである。
【０００８】
本願明細書において、「生後視覚発達の臨界期を過ぎたヒト」という表現は、生後視覚発達の臨界期を過ぎた全てのヒト（若者、成人）を意味する。臨界期の終了は段階的ではあるが、典型的には、ヒトで臨界期が約１０歳を超えることはない。
【０００９】
本発明の他の目的は、既にヒトの気分障害の治療に認められている抗うつ薬の新しい適応症として弱視を提示することにある。従って本発明は、生後視覚発達の臨界期を過ぎたヒトの弱視を治療または緩和するための薬剤の製造における、抗うつ薬の使用に関する。
【００１０】
本発明の更なる目的は、視覚皮質においてＢＤＮＦを増加させるか、ＧＡＢＡ介在性の抑制作用を減少させる化合物を用いて、弱視を治療または緩和するための方法を提供することである。
【００１１】
本発明の他の更なる目的は、薬剤療法とリハビリテーション療法とを組み合わせた、弱視の治療方法を提供することである。
【００１２】
本願明細書において「リハビリテーション」とは、弱視眼の使用を支持または促進する全ての手段を意味する。リハビリテーションには、弱視ではない方の眼の視界の物理的（眼帯による）遮蔽や薬理学的遮蔽、または弱視眼の使用を促進する強化プログラムが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００１３】
本発明の更なる目的は、生後視覚発達の臨界期を過ぎたヒトの弱視を治療または緩和するための方法であって、大脳皮質においてＢＤＮＦ（脳由来神経栄養因子）のレベルを増加させることが知られる少なくとも１種の薬剤を有効量投与することを包含し、好ましくは薬剤投与をリハビリテーション療法と組み合わせることを特徴とする方法を提供することである。
【００１４】
上記及び他の目的は、抗うつ薬、特にＳＳＲＩ、より具体的にはフルオキセチンが、生後視覚発達の臨界期を過ぎた哺乳動物において弱視の治療に使用可能であることを示す本発明によって達成されるものである。
【００１５】
発明の詳細な説明
本発明は、ヒトにおいてうつ病の緩和、皮質におけるＢＤＮＦ発現の増加または皮質抑制の減少をもたらす分子による弱視の治療または緩和に関する。さらに本発明は、このような処置とリハビリテーション療法を組み合わせて適用することによって弱視を緩和する方法に関する。
【００１６】
従って本発明の目的は、生後視覚発達の臨界期を過ぎた弱視のヒトに、ヒトのうつ症状を緩和する少なくとも１種の薬剤（抗うつ薬）を有効量投与することを包含する、弱視のヒトを治療するための方法に関する。
【００１７】
この方法は、弱視の対象者に少なくとも１種の抗うつ薬を経口投与することを含むことが好ましい。本発明の好ましい態様は、弱視眼の使用を支持または促進するためのリハビリテーション療法を更に包含する。
【００１８】
本発明の他の目的は、生後視覚発達の臨界期を過ぎたヒトの弱視を治療または緩和するために、好ましくはリハビリテーション療法と組み合わせて使用するための薬剤の製造における、抗うつ薬の使用に関する。
【００１９】
本発明は、うつ病患者に投与した際に臨床的な抗うつ活性を示すことが知られている、ある種の薬剤を成体ラットに投与すると、視覚皮質の可塑性変化を誘導し、発達途中の視覚系において発達臨界期に見られるのと同様の機能的な結果が得られるという知見（実施例を参照）に基づくものである。このような抗うつ薬としては、三環系抗うつ剤などの再取り込み阻害剤、選択的セロトニン再取り込み阻害剤（ＳＳＲＩ）、選択的ノルネピネフリン（ＮＥ）再取り込み阻害剤（ＮＳＲＩ）およびセロトニン−ノルネピネフリン再取り込み阻害剤（ＳＮＲＩ）などの再取り込み阻害剤が挙げられるが、これらに限定されるものではない。本発明の方法において使用することが好ましい抗うつ薬は、種々のＳＳＲＩからなる群より選ばれるものである。好ましいＳＳＲＩとしては、例えば、フルオキセチン、フルボキサミン、パロキセチン、セルトラリン、シタロプラムおよびエスシタロプラムが挙げられ、特にフルオキセチンが好ましい。ＳＮＲＩとしては、例えば、ドロキセチン、ベンラファキシン、デスベンラファキシン、ビシファジンおよびミルタザピンが挙げられる。
【００２０】
さらに公知の抗うつ薬に加え、大脳皮質における脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）のレベルを増加させることのできる他の化合物や治療剤も、生後視覚発達の臨界期を過ぎたヒトの弱視を治療または緩和するために、好ましくはリハビリテーション療法と組み合わせて使用することができる。
【００２１】
従って本発明は、生後視覚発達の臨界期を過ぎたヒトの弱視を治療または緩和するために、大脳皮質におけるＢＤＮＦ発現レベルの増加またはＧＡＢＡ介在性の皮質抑制の減少をもたらす分子を、好ましくはリハビリテーション療法と組み合わせて適用する方法にも関する。
【００２２】
本発明の更なる目的は、生後視覚発達の臨界期を過ぎたヒトの弱視を治療または緩和するための治療剤の製造における、大脳皮質のＢＤＮＦ発現レベルの増加またはＧＡＢＡ介在性の皮質抑制の減少をもたらす化合物の用途に関する。
【００２３】
ラット、サルおよびヒトにおいて、臨界的発達期間に比較的短期間（例えば、一週間）に渡って片眼を閉じること（片眼遮蔽、ＭＤ）は、開いている眼が閉じた眼の犠牲の上に優性となるほど劇的な再編成を視覚皮質の神経支配と機能にもたらすことが確立されている（Berardi et al., 2003）。この再編成は、閉じた眼の劇的な視力低下に反映され、ラットにおいては電気生理学的手法または行動学的手法によって観察することができる（実施例を参照）。同様に、同一種間に置いては、臨界期終了後の成体における同等のＭＤは認識できるほどの再編成を生じることはないことも確立されている。機能的には、成体におけるこのような再編成の欠如は、ＭＤ実施期間中の閉じた眼と開いた眼の視覚変化の欠如として反映される。しかし、実施例に記載したように、成体ラットを４週間に渡ってフルオキセチンで処置し、処置の最後の週にＭＤに付すと、開いている眼の視力が主要となる劇的なシフトが視覚皮質に観察される。このシフトは、刺激に対する応答が遮蔽した眼では低下し、開いていた眼では刺激に対する応答性に変化がないことから、臨界期の真最中にある若いＭＤラットに観察されるのと質的に類似している。成体ラットのフルオキセチン処置単独、即ち、片眼の遮蔽なしの処置は、どちらの眼にも視覚刺激に対する応答性のシフトを生じなかった。この結果は、抗うつ薬処置が視覚皮質における臨界期可塑性を回復させるが、視覚皮質の両眼性にシフトを生じるためには、片眼の視覚遮蔽が必要であることを示唆している。さらにフルオキセチン処置単独は、視覚皮質における方位選択性や細胞応答性に影響を与えることはなかった。
【００２４】
ＭＤに付した眼を臨界期に開くと、部分的または完全な回復が起こり、反転縫合する（reverse suture；即ち、遮蔽した眼を開き、今まで開いていた眼を閉じるように縫合する）と、遮蔽されていたが今は開いている眼に好ましい再編成が生じる。ヒトにおいては、これは臨界期により見える方の目に眼帯をすることで子供の弱視の発生を防止する方法に相当する。しかし、ＭＤが臨界期の終わりを過ぎて行われ、閉じた眼を成人期になってから開けた場合、機能的な回復または視力の回復は観察されない。同様に反転縫合も機能的または解剖学的な変化をもたらさない。臨床的には、実験動物における上記知見は、慢性弱視の発生、即ち、臨界期が終了する前に眼の遮蔽パラダイムによってＭＤまたは偏った眼の使用を処理しなかった場合と相関する。しかし、実施例で示したように、発達初期（生後２１日目）にＭＤに付した成体ラットに対して、うつ病のヒトを処置する際のフルオキセチン血漿レベルと同等になる量のフルオキセチンを用いて４週間に亘り経口処置を行い、処置の最後の２週間は反転縫合に付すと、発達過程では閉じていたが、薬剤処置の際は開いていた眼の方への劇的なシフトが生じた。より重要な点は、開けた目の視力が回復し、双眼視が回復したことである。これらの知見は、抗うつ剤であるフルオキセチンは、哺乳動物の成体において発達臨界期の再開を誘導し、臨界期の真最中で生じるのと同等の視覚皮質内の機能的再組織化を可能にすることを示唆している。
【００２５】
長期増強（ＬＴＰ）とは、特定のシナプス結合に対する短く強い刺激によってもたらされる、２つのニューロン間のシナプス強度の長期にわたる増加であり、神経可塑性と記憶の実験モデルと考えられている。白質内の視覚皮質に入る視床入力繊維のシータバースト刺激パラダイムによる刺激は、未成熟の視覚皮質においてＬＴＰ（ＷＭ−ＬＴＰ）を容易に誘導するが、成体の視覚皮質においてはＬＴＰを誘導しない（Artola and Singer, 1987、Kirkwood and Bear, 1994）。ＷＭ−ＬＴＰ誘導性の喪失は、視覚可塑性の臨界期の終了と相関する。局所ＧＡＢＡ含有インターニューロンによる抑制性制御の増加は、臨界期の終了とＷＭ−ＬＴＰ応答の喪失を制御する少なくとも１種のメカニズムと考えられている。
【００２６】
ＢＤＮＦは神経可塑性の重要なレギュレーターであることが知られている。抗うつ薬は、海馬におけるＢＤＮＦとそのｍＲＮＡのレベルを増加することが知られ、ＢＤＮＦシグナル伝達は、齧歯動物における抗うつ薬の行動効果に重要であることが示されている（Castren, 2004）。実施例で示したように、フルオキセチンによる３週間の処置は、視覚皮質においてもＢＤＮＦレベルを増加させる。さらに視覚皮質へのＢＤＮＦの注入は、フルオキセチンの経口投与による処置の後に観察されるのと同様の臨界期可塑性の再活性化を誘導し、これはＢＤＮＦ発現の増加は、視覚皮質におけるフルオキセチンの可塑性増強効果を仲介する可能性を示している。
【００２７】
ＧＡＢＡ介在性の皮質抑制は生後発育の途中に増加し、成熟する。このような皮質阻害の増加は臨界期の終了に不可欠な影響を与える。皮質のＧＡＢＡ含量は臨界期の終了に向けて増加し、このＧＡＢＡの増加を防止すると、臨界期は継続したままになる。反対に、実施例で示したように、フルオキセチンの３週間に亘る経口投与は、皮質の細胞外ＧＡＢＡレベルの低下をもたらし、視覚皮質の臨界期可塑性の再活性化に繋がる。フルオキセチンの経口投与期間中に、ＧＡＢＡ−Ａ受容体のエンハンサーであるジアゼパムの皮質内注射によって皮質のＧＡＢＡシグナル伝達を人工的に増加した場合、成体視覚皮質における可塑性の増加は防止される。
【００２８】
本発明は、生後視覚発達の臨界期終了後に弱視眼の視力を回復させるための抗うつ薬の使用に関する。さらに本発明は、遮蔽療法と抗うつ剤による薬剤処置との組み合わせにも関する。発達臨界期である幼少期には、物理的または薬理学的に視覚を妨げるか減少させて優勢な眼を不利な状況に置くことで、弱視を緩和または防止することが可能である（Holmes and Clarke, 2006）。ヒトにおいて遮蔽療法は、約１０歳以降はあまり効果的ではないことが知られている。気分障害のために抗うつ剤を摂取している生後視覚発達の臨界期を過ぎたヒトにおいて、弱視眼の視力が向上したという報告はないが、幼少期の弱視を防止するためには遮蔽療法が必要であることから、これは驚くべきことではない。実施例で示したように、出生後生活期間の初期にＭＤによって弱視となったラットの遮蔽（反転縫合）は、フルオキセチンの反復経口投与による処置と組み合わせると、臨界期の真最中における遮蔽方法によって生じるのと同様の変化をもたらすことができる。従って、抗うつ薬処置と、特定のリハビリテーション処置［例えば、視覚的方法（眼帯の使用）または薬学的方法（局所アトロピン目薬）で優性な眼を不利な状況に置くこと］を共に組み合わせて適用することが、成人期における回復にも必要であると考えられる。
【００２９】
弱視を患う哺乳動物に対する抗うつ薬の投与は、弱視眼の使用を支持または促進するいかなる手段（リハビリテーション処置）の適用前、適用と同時、または適用の前ならびに適用と同時に行うことができる。ヒトうつ病患者において抗うつ薬の臨床的に適切な効果が得られるまでには数週間の遅延があるため、弱視の場合も、遮蔽療法の開始前に数週間に亘って抗うつ薬の反復投与を行うことが好ましい。薬剤処置の総期間は達成される臨床応答によるが、実施例で示したラットほど急速に（約１週間以内に）変化が起こることは期待できず、薬剤処置の適用、または薬剤処置とリハビリテーションの組合せの適用は、より長期間、例えば１年間、に亘って継続する必要があると考えられる。また、連続的な薬剤処置と周期的な遮蔽療法を組み合わせたり、薬剤処置と遮蔽の両方を短期間行い、後に望ましい応答が得られるまで、複数回にわたって繰り返すことも考えられる。しかし、処置を一生続けなければならないとは考えられない。処置の最中に得られた安定な臨床応答は、抗うつ剤処置の適用、または抗うつ剤処置と遮断処置の組み合わせの適用を中止した後でも持続すると考えられる。
【００３０】
抗うつ薬は経口投与に適した医薬組成物の形態で投与することができる。実施例では、視力の有意な向上が血漿濃度３５０ｎｇ／ｍｌとなる量のフルオキセチンによる処置で達成され、この量は、うつ病の処置に推奨されているフルオキセチン血漿濃度（５０〜４５０ｎｇ／ｍｌ）の治療学的範囲内である。従って、投与する抗うつ薬の量は、少なくともうつ病の治療に推奨されるレベルの量であると考えられる。
【００３１】
本発明によると、弱視の治療を必要とする対象に投与する組成物は、薬学的に許容される担体と、抗うつ薬または視覚皮質においてＢＤＮＦレベルの増加またはＧＡＢＡレベルの減少をもたらす他の薬剤から選ばれる少なくとも１種を包含する。組成物における抗うつ薬の濃度は、抗うつ剤の種類と医薬処方に依存する。うつ病の経口処置に現在使用されている医薬処方が弱視の処置にも使用できると考えられる。
【００３２】
本発明について、以下の実施例で更に説明する。以下の実施例は、本願請求項の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【００３３】
抗うつ剤であるフルオキセチンにより誘発される、片眼遮蔽（monocular deprivation）された成体ラットの視覚皮質における機能的再編成。
【００３４】
１．１ 材料及び方法
１．１．１．動物治療実験
この実験では、成体のロングエバンスラット（Long-Evans hooded rats）を使用した。ラットは、プレキシグラスの檻（４０×３０×２０ｃｍ）にグループ分けして入れ、随意に餌と水を与える標準的な条件下で、１２時間：１２時間の明暗サイクルで飼育した。
【００３５】
フルオキセチン投与
生後日数（Ｐ）７０日の成体のラットに、フルオキセチン（濃度０．２ｍｇ・ｍｌ-1の飲料水）（塩酸フルオキセチン、Ｇｅｌｅｎｏ社（イタリア国、プラート）製）を４週間に亘り全身投与した。対照動物として、フルオキセチン投与を行わない以外は、上記と同様の条件でラットを飼育した。上記方法による投与は、ラットにおいて定常状態の血漿濃度３５６±９９ｎｇ／ｍｌとなり、これはヒトのうつ治療における推奨血漿濃度（５０〜４５０ｎｇ／ｍｌ）の範囲内である。
【００３６】
片眼遮蔽（monocular deprivation、ＭＤ）
眼球優位可塑性を評価するために、フルオキセチンまたはベヒクル投与の第３週開始時（Ｐ９０）に、まぶたを縫合することによる１週間の片眼遮蔽（ＭＤ）を行った。具体的には、処置中の成体動物を、アベルチン（１ｍｌ・ｋｇ-1）で麻酔し、定位装置上に固定して、片眼遮蔽した。まぶたの閉鎖は、縫合創が完全に治癒するまで毎日検査し、遮蔽した目が、ほんのわずかでも自発的に再開したものは除外した。ＭＤの後、数日は、抗生物質やコルチゾンを局所的に適用することにより、遮蔽した目の炎症や感染を防ぐよう細心の注意を払った。
【００３７】
また、長期間のＭＤ分析を行うために、ラットをアベルチン（１ｍｌ・ｋｇ-1）で麻酔し、まぶたを縫合することにより、Ｐ２１で片眼遮蔽した。まぶたの閉鎖は、縫合創が完全に治癒するまで毎日検査し、遮蔽した目が、ほんのわずかでも自発的に再開したものは除外した。次に、成体の弱視ラットは、フルオキセチンまたはベヒクルの反復投与の第２週開始時（Ｐ８５）に、麻酔下で反転縫合（reverse suture、ＲＳ）に付した。即ち、長期に亘って遮蔽された目を、薄型のハサミで再開し、他方の目を縫合により遮蔽した。ＲＳの後、数日は、抗生物質やコルチゾンを局所的に適用することにより、遮蔽していた目の炎症や感染を防ぐよう細心の注意を払った。
【００３８】
１．１．２．機能的変化の評価
In vivoでの電気生理学的分析、眼球優位可塑性及び視力
フルオキセチンの反復投与の最期の段階において、一週間片眼遮蔽された成体動物（Ｐ１００）を、ウレタン（０．７ｍｌ・ｋｇ-1、Sigma社製２０％生理食塩水溶液）を腹腔内注射することにより麻酔し、定位フレーム内に配置した。ウレタンを追加投与して、実験中、麻酔のレベルが一定になるようにした。ラットの体温は継続的にモニターし、実験中、サーモスタット付き電気毛布にて約３７℃に維持した。心電図は、継続的にモニターした。頭蓋骨の、遮蔽した目の反対側で一次視覚野の両眼性部位（両眼性領域Ｏｃ１Ｂ）に対応する位置にドリルで穴を開けた。脳の表面を露呈させた後、硬膜を除去し、ＮａＣｌ（３Ｍ）で満たされたマイクロピペット（２ＭΩ）を、λ（矢状縫合とラムダ状縫合とが交わる部位）から皮質に５ｍｍの深さまで挿入した。両眼とも固定し、眼球の外側を覆う調整可能な金属製リングによって開いた状態に維持した。両目の視力を、視覚誘発電位（ＶＥＰ）により測定した。一方の眼のＶＥＰ記録中は、他方の眼は黒の粘着テープで覆った。ＶＥＰを記録するために、電極を皮質の１００または４００μｍの深さまで到達させた。これらの深さでは、ＶＥＰの振幅は最大となる。得られた信号は、バンドパスフィルタ（０．１〜１００Ｈｚ）を通し、増幅して、公知の手法で分析するためにコンピュータに入力した（Huang et al.,1999）。簡単に説明すると、少なくとも１２８の事象を、コントラスト反転させた刺激と同期させて平均化した。時間領域における、急なコントラスト反転（０．５Ｈｚ）に対するＶＥＰの過渡応答を、ピーク−ベースライン振幅及び主要な陰性成分のピークレイテンシを測定することにより評価した。視覚刺激としては、異なる空間周波数及びコントラストの水平な正弦波グレーティングを用いた。この正弦波グレーティングは、ＶＳＧ２／２カードと専用のソフトウェアで生成し、ラットの眼から２０ｃｍの距離の位置に、予め特定した受容野と中心を揃えて配置したモニター（２０×２２ｃｍ、輝度：１５ｃｄｍ-2）上に表示した。視力は、ＶＥＰ振幅を対数空間周波数に対してプロットして得られる曲線における最期の４または５個のデータ点の線形回帰を、ゼロ振幅に外挿して得た。両眼性（眼球優位性）は、対側（contralateral）の同側(ipsilateral)に対するＶＥＰ比（Ｃ／Ｉ）（即ち、記録が行われている視覚皮質に対して対側及び同側の眼を刺激することにより記録されたＶＥＰの振幅の比）を計算することにより評価した。
【００３９】
視力の行動学的評価
ＲＳを行う前に、開いている（遮蔽されていない）方の眼の視力を測定し、フルオキセチン処置開始時に、長期片眼遮蔽ラット（Ｐ７０）の正常な方の眼の視力の行動学的評価を開始した。そして、ＲＳ後、治療の第３週（Ｐ９０）中に、長期遮蔽された眼の視力の測定を開始した。従って、以前遮蔽されていた眼の視力測定は、ラットが約Ｐ１００となり、フルオキセチン反復投与の終わりの段階で完了した。該視力の測定には、ビジュアルウォータータスク（visual water task）(Prusky et al., 2000)を使用した。ビジュアルウォータータスクは、最初、ラットを低い空間周波数（０．１サイクル／度（c deg-1））の縦型グレーティングをグレーから識別するよう訓練し、その後、より高い空間周波数でこの能力の限界を試験する。この装置は、一方の端に２枚のパネルが隣り合わせて配置されてなる台形のプールから成る。中央の分割体は、プールの広い方の端から中央に延び、１つの幹部と２つのアーム部を有する迷路を形成する。該分割体の長さによって、選択点と有効空間周波数が決定される。脱出道はグレーティングの下に位置する。ラットは、プールの該パネルの反対側の端の中央から放される。訓練するラットによって、グレーティングと脱出道の位置を疑似ランダムシーケンスで変更し、ラットを迷路の手の一方のグレーティングに向かって泳ぐように仕込んだ。ラットが、脱出道にたどり着かずに迷路のアーム部分に入った場合には、トライアルは不正確として記録する。ラットが、脱出道を見つけた場合には、ラットをプールから取り除いた。８０％の正確性が得られた時点で、識別能力の限界をグレーティングの空間周波数を上げることにより評価した。視力については、精神測定関数にあてはめたシグモイド関数の正しい選択の７０％に対応する空間周波数を視力とした。このセッションの間、実験者は実験グループを識別していなかった。
【００４０】
１．１．３．生化学的変化の評価
In vivoでの脳内微小透析
フルオキセチンの反復投与の１週間前に、成体ラット（Ｐ７０）を麻酔し、ステンレス製のガイドシャフトを、両眼性視覚野（両眼性領域Ｏｃ１Ｂ）の上、且つブレグマの７．３ｍｍ後方、正中矢状縫合の４．４ｍｍ横、頭蓋骨の１ｍｍ腹側の座標に定位的に埋め込んだ。フルオキセチンの反復投与終了後に、埋め込んだガイドシャフトに、微小透析プローブを挿入し、in vivoでの透析物のサンプリングを行った。具体的な操作については、Hernandez et al., 1986に報告されている。簡単に説明すると、上記のプローブは、溶融シリカ・ポリイミド被覆毛細管が、先端部１ｍｍが露出したセルロース幕（カットオフ分子量6000）である２６ゲージのステンレス製チューブに同心的に挿入されてなる。このプローブは、人工ＣＳＦ （142 mM NaCl、3.9 mM KCl、1.2 mM CaCl2、1 mM MgCl2、 1.35 mM Na2HPO4 、pH 7.4）を流速１μリットル・秒-1で供給する透析システムに連結した。プローブは、上記ガイドシャフトの先端から１ｍｍ突出していた。プローブの挿入から６時間（安定化期間）後にサンプリングを行った。自由に活動するフルオキセチン処置ラット及び対照ラットのそれぞれから６つのサンプル（各２０μｌ）を、２０分毎に２時間に亘って採取した。
【００４１】
組織学的分析
脳内微小透析の後、ラットは、抱水クロラールの過剰投与により殺し、上記したように心臓内潅流させた。ラットの脳は、２時間ポストフィックスした後、３０％スクロースのＰＢＳ溶液に浸漬させた。後頭葉皮質から冠状部位４０μｍを滑走式ミクロトーム(sledge microtome)で切り出して、ＰＢＳ中に採取した。採取した脳のサンプルは、Ｏｃ１Ｂ中のプローブの位置を確認するために、クレジルバイオレットで染色した。後の分析においては、プローブが正しい位置に存在しているラットだけを考慮した。
【００４２】
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）
微小透析物からのγ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）及びグルタミン酸塩（ＧＬＵ）の基底レベル分析を、蛍光検出器と組み合わされた高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて行った。o-フタルアルデヒドによるサンプル自動誘導化（Waters 2690 Alliance）を行った（Calabresi et al., 1995）。分離は、蛍光検出器（Waters 474、励起波長：350 nm、発光波長：450nm）に取り付けられたＣ１８逆相クロマトグラフィーカラムによって行った。緩衝液は以下の通りであった：溶液Ａ: 0.1M 酢酸ナトリウム（pH 5.8）/メタノール 20/80; 溶液Ｂ: 0.1M 酢酸ナトリウム（pH 5.8）/メタノール 80/20; 溶液Ｃ: 0.1M 酢酸ナトリウム（pH 6.0）/メタノール 80/20。勾配プログラムは以下の通りであった：初期無勾配段階０〜５分、 ５％ 溶液Ａ、９５％溶液Ｃ; ４〜５分 １５％溶液Ａ、８５％溶液Ｂ、その後、９分まで無勾配; １４．５分まで２２％溶液Ａ、６６％溶液Ｂ、その後、１７分まで、３４％溶液Ａ、６６％溶液Ｂ; １９分まで５％溶液Ａ、９５％溶液Ｃ、その後、無勾配。流速は、 0.9 ml・秒-1であった。ホモセリンを内部標準として使用し、アミノ酸濃度は、注射したアミノ酸の既知濃度から作成した一次標準曲線（linear standard curve）から計算した。ピーク面積を比較に用いた（Waters Millenium 32）。
【００４３】
ＬＴＰ記録
フルオキセチン処置ラット及び対照ラット（Ｐ１００）から脳を採取し、以下の組成の氷冷切断溶液に浸漬した(単位はｍＭ): スクロース 220、 KCl 3.1、 K2HPO4 1.0、NaHCO3 4.0、MgCl2 2.0、CaCl2 1.0、HEPES 10、アスコルビン酸 1.0、ミオイノシトール 0.5、ピルビン酸 2.0、キヌレン酸塩（pH 7.3） 1.0。ライカ ビブラトーム（ドイツ国、Nussloch社製）を用いて、視覚皮質の厚み０．３５ｍｍの切片を得た。切片（フルオキセチン処置ラットからの切片数は１２、標準ラットからの切片数は１４）は、３５℃の酸素添加記録溶液と共に２ｍｌ・秒-1の速度で環流した。この記録溶液は、上記の切断溶液とは以下の点で組成が異なる（単位はｍＭ）： NaCl 130、デキストロース 5.0、 MgC12 1.0、CaCl2 2.0、グリシン 0.01、キヌレン酸塩 ０、スクロース ０。電気刺激（刺激幅 １００μ秒）は、白質と第６層との境界に配置した２極同軸刺激電極（メイン州、ボードインハム、FHC社製）によって与えた。第２層−第３層間の電場電位は、NaCl（３Ｍ）で満たされたマイクロピペット（１〜３ＭΩ）によって記録した。ベースライン応答は、３０秒毎に、最大応答の半分の応答が得られる電気刺激にて測定した。１５分間、安定したベースライン（電場電位の振幅が１５％以内であり、明らかな増加または減少傾向が見られない状態）が得られた後に、θバースト刺激（ＴＢＳ）を与えた。ＴＢＳ後のシナプス後電場電位は、３０秒毎に３０分に亘って記録した。
【００４４】
酵素免疫定量法（ＥＬＩＳＡ）
ＢＤＮＦタンパク質の発現を、フルオキセチンの反復投与の最終段階において、ＥＬＩＳＡによって評価した。最初に、溶解緩衝液（1% Triton X-100、10% グリセロール、 20 mM TrisHCl pH 7.5、150 mM NaCl、10 mM EDTA、0.1 mM Na3VO4、1.25 g/ml ロイペピチン、 1.25 g/mlアプロチニン、1 mM PMSF）を用いて、新鮮な視覚皮質及び海馬のそれぞれからタンパク質を抽出した。サンプルの総濃度は、タンパク質アッセイキット（カリフォルニア州、ハーキュリーズ、Bio-rad社製）を用い、ＢＳＡで作成した標準曲線を利用して測定した。その後、ＢＤＮＦ発現を、合計１００μｇの３群のタンパク質をＥＬＩＳＡプレートに入れ、標準曲線と共に評価し、製造元のプロトコル（ＢＤＮＦ、Promega）の処方に従って処理した。
【００４５】
１．１．４．ＢＤＮＦの皮質内投与
１週間のＭＤの間に、異なるグループ（各４匹）の成体ラットの皮質内にＢＤＮＦを注入した。ＰＥチューブを介してステンレス製カニューレ（３０ゲージ）に連結された浸透圧ミニポンプを、遮蔽した眼の反対側の視覚皮質に埋め込んだ。浸透圧ミニポンプ（流速：０．５μｌ・時間-1）は、ＢＤＮＦ（１ｎｇ・μｌ-1）で満たした。ラットは、手術後、直ちに標準状態の檻に移した。ＶＥＰによるＣ／Ｉ比の電気生理学記録は、上記したように、ＢＤＮＦの皮質内投与の１週間後に行った。ＢＤＮＦは、この濃度（１ｎｇ・μｌ-1）では、注入箇所（λから４．５ｍｍ）の１．２ｍｍ横に拡散することを既に確認している。サンプルの偏りを防止するために、Ｏｃ１ｂ（λの横４．９、５．０、５．１ｍｍ）におけるＢＤＮＦの拡散領域内の３つの異なる貫通箇所においてＶＥＰを記録した。ＶＥＰの記録は、それぞれの貫通箇所において、深さ１００μｍ及び４００μｍで行った。
【００４６】
１．１．５．ベンゾジアゼピン（ジアゼパム）の皮質内注入
フルオキセチンによる長期処置の最後の週の始めにおいて（処置の２１日目）、異なるグループのラットをＭＤに付した。これと平行して、麻酔下で、ＰＥチューブを介してステンレス製カニューレ（３０ゲージ）に連結された浸透圧ミニポンプを、遮蔽した眼の反対側の視覚皮質に埋め込んだ。浸透圧ミニポンプ（流速：０．５μｌ・時間-1）は、ベンゾジアゼピンの作動薬であるジアゼパム（ＤＺ：２ｍｇ・ｍｌ-1、ｎ＝４）またはベヒクル溶液（５０％プロピレングリコール、ｎ＝４）で満たした。ラットは、手術後、直ちに標準状態の檻に移し、更に１週間、フルオキセチン処置に付した。ＶＥＰによるＣ／Ｉ比の電気生理学記録は、上記したように、抗うつ剤処置の終盤に行った。
【００４７】
１．２．結果
１．２．１．フルオキセチンの反復経口投与後の成体視覚皮質における眼球優位（ＯＤ）可塑性の再活性化
最初に、フルオキセチンで反復的に処置された成体ラットの眼球優位（ＯＤ）可塑性に対する１週間の片眼遮蔽（ＭＤ）の効果を、遮蔽された眼の反対側に位置する第１視覚皮質の両眼性領域における視覚誘発電位（ＶＥＰ）を記録することにより調べた。ＶＥＰは、パターン化された視覚刺激に対する１群のニューロンの統合反応を表し、視力（ＶＡ）及び両眼性変化の評価に一般的に利用されている（Huang et al, 1999、 Porciatti et al, 1999）。ＯＤ（両眼性）は、対側（contralateral）の同側(ipsilateral)に対するＶＥＰ比（Ｃ／Ｉ）（即ち、記録が行われている視覚皮質に対して対側及び同側の眼を刺激することにより記録されたＶＥＰの振幅の比）を計算することにより評価した。成体ラットにおいては、Ｃ／Ｉ ＶＥＰ比は２．５付近であり、網膜投影における交差繊維の優位性を反映している。対照ラットにおいて、ＭＤは遮蔽された眼の反対側の視覚皮質の両眼性に変化は与えなかった（Ｃ／Ｉ ＶＥＰ比：２．７３±０．２、ｎ＝５）。対照的に、フルオキセチン処置された成体ラットにおいては、ＭＤ後に非遮蔽眼の側にＯＤが顕著にシフトし（Ｃ／Ｉ ＶＥＰ比：１．０±０．０８、t検定：ｐ ＜ ０．００１、ｎ＝５）（図１のＡ）、通常は脳発達の初期に限られている可塑性変性が見られた。
【００４８】
１．２．２．フルオキセチンの反復経口投与後の成体弱視ラットにおける視覚機能の回復
次に、フルオキセチンによる反復処置が視覚皮質の可塑性に与える影響を更に評価するために、長期ＭＤにより弱視化し、最後の２週の抗うつ剤処置間に反転縫合（ＲＳ）を施した（「方法」の項目参照）成体ラットにおける視覚機能の回復を評価した。視力（ＶＡ）を、長期遮蔽眼の反対側の視覚皮質（ＶＣ）からの視覚誘発電位（ＶＥＰ）を記録して測定した。対照ラットにおいては、先に遮蔽した眼の視力（０．６２±０．０６ c deg-1) は、反対側の眼の視力（１．０６±０．０１ c deg-1)と比較して回復の兆候は見られなかった (図１のＢ)。対照的に、フルオキセチン処置された成体ラットは、完全な視力回復を見せた（０．９７±０．０４ c deg-1）。ＶＥＰを記録したのと同じラットにおけるＶＡの行動学的測定（ビジュアルウォータータスク）によって、電気生理学的データの妥当性を確認した：フルオキセチン処置した長期間片眼遮蔽ラットにおいては完全なＶＡの回復(０．８８±０．０２ c deg-1)が明らかであり、対照の方では回復が明らかでなかった（図１のＣ）。ＶＡを評価したのと同様のラットについて、Ｃ／Ｉ ＶＥＰ比を測定してＯＤを評価した。対照ラットにおいては、先に遮蔽した眼の反対側の視覚皮質の両眼性の回復は見られなかった（Ｃ／Ｉ ＶＥＰ比：１．１１±０．２０）（図１のＤ）。これに対して、フルオキセチン処置した成体ラットにおいては、Ｃ／Ｉ ＶＥＰ比が２．２５±０．１７であり、両眼性の完全な回復が見られた。
【００４９】
１．２．３． 成体視覚皮質のＢＤＮＦ発現に対する、フルオキセチンの反復経口投与の影響
抗うつ剤の反復投与は、辺縁構造、特に海馬、において神経栄養因子であるＢＤＮＦの発現を増加させるため（Nibuya et al, 1995、Castren, 2004）、フルオキセチンの反復投与を実施した後の成体ラット視覚皮質におけるＢＤＮＦタンパク質レベルをＥＬＩＳＡ法で測定した。ＢＤＮＦタンパク質発現は、対照と比べてフルオキセチン処置成体ラットの視覚皮質で有意に高かった（ｔ検定：ｐ＜０．０４、ｎ＝６）（図２のＡ）。ＢＤＮＦタンパク質発現は、フルオキセチン処置成体ラットの海馬においても、対照と比べて同様に増強されていた（ｔ検定：ｐ＜０．０１、ｎ＝６）（図２のＢ）。増加したＢＤＮＦ発現が成体の視神経系における可塑性の回復の原因となっているのかを調べるために、次にＭＤと並行してＢＤＮＦ（１ｎｇ・μｌ-1）の皮質内注入を（浸透圧ミニポンプで）実施したラットにおけるＯＤを評価した。ベヒクル養液を注入した対照ラットにおいては、遮蔽した眼と反対側の視覚皮質の両眼性に変化は見られなかった（Ｃ／Ｉ ＶＥＰ比：２．４４±０．１、ｎ＝２）。一方、ＢＤＮＦの皮質内注入を実施した成体ラットは、ＭＤに応じてＯＤシフトを示した（Ｃ／Ｉ ＶＥＰ比：１．３２±０．０８、ｔ検定：Ｐ＜０．００１、ｎ＝４）（図２のＣ）。
【００５０】
１．２．４． 成塾視覚皮質のＧＡＢＡ作動性神経伝達に対する、フルオキセチンの反復経口投与の影響
フルオキセチン誘導性の視覚皮質可塑性がＧＡＢＡ作動性神経伝達の変化と同時に起こるのか否かについて、in vivoの脳微小性透析を用いて調査した。γ−アミノブチル酪酸（ＧＡＢＡ）の細胞外基礎レベルを定量したところ、対照と比べて、フルオキセチン処置成体ラットの視覚皮質において皮質内抑制が有意に減少していることが判明した（図３のＡ）（二元配置分散分析ＡＮＯＶＡ：ｐ＝０．０２、post hoc Holm-Sidak検定：ｐ＜０．０２、ｎ＝５）。フルオキセチン処置動物と対照動物の間で、細胞外グルタメート（ＧＬＵ）レベルに違いは見られなかった（データは示さない）。
【００５１】
皮質内抑制の減少を更に評価するために、白質からのシータバースト刺激の後のII層−III層電位の長期増強（ＷＭ−ＬＴＰ）、即ち、皮質内抑制性回路の成熟故に成体には存在しないシナプス可塑性の一形態（Artola and Singer, 1987、Kirkwood and Bear, 1994）について調べた。注目すべきことに、フルオキセチン処置成体ラットにおいてＷＭ−ＬＴＰは完全に回復していた（図３のＢ）。対照動物にはＷＭ−ＬＴＰは見られなかった。
【００５２】
成人期における視覚皮質の可塑性の再開の根底に皮質内抑制の減少が存在するか否かを直接調べるために、ＭＤの期間中にベンゾジアゼピンの作動薬であるジアゼパム（２ｍｇ・μｌ-1）またはベヒクル溶液を皮質内注入したフルオキセチン処置成体ラットのＯＤを評価した（図３のＡ）。フルオキセチンの長期間処置を行った成体ラットにおけるジアゼパムの皮質投与は、ＭＤによって誘導されるＯＤシフトを完全に防止した（図３のＢ）。ベヒクル溶液の皮質内注入を実施した対照動物は、ＭＤ後に、遮蔽していない眼の方にＯＤシフトを示した（Ｃ／Ｉ ＶＥＰ比：１．０７±０．０４、ｔ検定：Ｐ＝０．０１、ｎ＝３）。
【００５３】
特許文献
WO 9425034 Al (University of Pennsylvania), 1994.
WO 0152832 Al (Valley Forge Pharmaceuticals), 2001.
WO 03032975 Al (The Trustees of the University of Pennsylvania), 2003.
US 5567731 A (Laties A., et al.), 1996.
US 5571823 A (Stone R. A., et al.), 1996.
US 2003114830 Al (Guerrero J.M.), 2003)
【００５４】
非特許文献
Artola A, Singer W (1987) Long-term potentiation and NMDA receptors in rat visual cortex. Nature 330:649-652.
Berardi, N., Pizzorusso, T., Ratto, G.M., and Maffei, L. (2003). Molecular basis of plasticity in the visual cortex. Trends in Neurosciences 26, 369-378.
Calabresi P, Fedele E, Pisani A, Fontana G, Mercuri NB, Bernardi G, Raiteri M (1995) Transmitter release associated with long-term synaptic depression in rat corticostriatal slices. Eur J Neurosci 7:1889-1894.
Campos EC, Fresina M. (2006) Medical treatment of amblyopia: present state and perspectives. Strabismus. 2006 14:71-3.
Castren, E. (2004). Neurotrophic effects of antidepressant drugs. Curr. Opin. Pharmacol. 4, 58-64.
Hernandez L, Stanley BG, Hoebel BG (1986) A small, removable microdialysis probe. Life Sci 39:2629-2637.
Holmes,J.M. and Clarke,M.P. (2006). Amblyopia. The Lancet 367, 1343-1351.
Huang ZJ, Kirkwood A, Pizzorusso T, Porciatti V, Morales B, Bear MF, Maffei L, Tonegawa S (1999) BDNF regulates the maturation of inhibition and the critical period of plasticity in mouse visual cortex. Cell 98:739-755.
Kirkwood A, Bear MF (1994) Hebbian synapses in visual cortex. J Neurosci 14:1634-1645.
Nibuya M, Morinobu S, Duman RS (1995) Regulation of BDNF and trkB mRNA in rat brain by chronic electroconvulsive seizure and antidepressant drug treatments. J Neurosci 15:7539-7547.
Pizzorusso T, Medini P, Berardi N, Chierzi S, Fawcett JW, Maffei L. (2002). Reactivation of ocular dominance plasticity in the adult visual cortex. Science, 298:1248-1251.
Pizzorusso T, Medini P, Landi S, Baldini S, Berardi N, Maffei L. (2006). Structural and functional recovery from early monocular deprivation in adult rats. Proc Natl Acad Sci U S A, 103:8517-8522.
Porciatti V, Pizzorusso T, Maffei L (1999) The visual physiology of the wild type mouse deter- mined with pattern VEPs. Vision Res 39:3071-3081.
Prusky GT, West PW, Douglas RM (2000) Behavioral assessment of visual acuity in mice and rats. Vision Res 40:2201-2209.
Sale A, Maya Vetencourt JF, Medini P, Cenni MC, Baroncelli L, De Pasquale R, Maffei L (2007) Environmental enrichment in adulthood promotes amblyopia recovery through a reduction of intracortical inhibition. Nat Neurosci 10: 679-681.
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】フルオキセチンによる反復処置後に見られる、成体における弱視の回復。（Ａ）成体の視覚皮質における可塑性の回復。フルオキセチン処置成体ラットにおける片眼遮蔽（ＭＤ）は、遮蔽していない眼に対する視覚皮質ニューロンの眼球優位性（ＯＤ）シフトを誘導したが（Ｃ／Ｉ ＶＥＰ比：１．０±０．０８、ｔ検定： ｐ＜０．００１、ｎ＝５）、対照動物では誘導しなかった（Ｃ／Ｉ ＶＥＰ比：２．７３±０．２、ｎ＝５）。 （Ｂ）〜（Ｃ）フルオキセチンによって反復処置した成体弱視ラットにおける視力（ＶＡ）の回復。以前に遮蔽した眼のＶＡを、電気生理学的に評価した結果（Ｂ）および行動学的に評価した結果（Ｃ）である。遮蔽していた眼のＶＡは対照動物の未処置眼よりも低かったが（対応有ｔ検定：ａはｐ＜０．００１、ｂはｐ＜０．００１、ｎ＝５）、フルオキセチン処置成体ラットにおいてはそのような傾向は見られなかった（対応有ｔ検定：（Ｂ）はｐ＝０．７０３、（Ｃ）はｐ＝０．３５４、ｎ＝５）。 （Ｄ）フルオキセチンによって反復処置した成体弱視ラットにおける両眼性（ＯＤ）の回復。Ｃ／Ｉ ＶＥＰ比は、対照（Ｃ／Ｉ ＶＥＰ比：１．１１±０．２０）と比べて、フルオキセチン処置成体ラットの視覚皮質（Ｃ／Ｉ ＶＥＰ比：２．２５±０．１７）において有意に高く（ｔ検定：ｐ＜０．００２、ｎ＝５）、その値は正常視の動物成体の範囲内だった。エラーバーは標準誤差、＊は統計的有意性を示す。
【図２】抗うつ剤処置後のＢＤＮＦタンパク質の発現。ＥＬＩＳＡで定量したＢＤＮＦの発現は、対照動物と比べて、フルオキセチンによって反復処置した成体ラットの視覚皮質（ｔ検定：ｐ＜０．０４、ｎ＝６）（Ａ）および海馬（ｔ検定：ｐ＜０．０１、ｎ＝６）（Ｂ）において有意に高かった。エラーバーは標準誤差、＊は統計的有意性を示す。 （Ｃ）ＢＤＮＦの皮質内投与。ＢＤＮＦを皮質に注入した成体動物は、対照と比べて、遮蔽した眼と反対側の視覚皮質にＯＤシフトを示した（ｔ検定：Ｐ＜０．００１、ｎ＝４）。エラーバーは標準誤差、＊は統計的有意性を示す。
【図３】抗うつ薬による反復処置後の成体ラット視覚皮質における皮質内抑制の減少とＢＤＮＦ発現の増加。（Ａ）フルオキセチン処置成体ラットの視覚皮質における脳微小透析。ＧＡＢＡの基礎細胞外レベルは、対照よりもフルオキセチン処置動物において有意に低かった（二元配置分散分析ＡＮＯＶＡ：ｐ＝０．０２、post hoc Holm-Sidak検定：ｐ＜０．０２、ｎ＝５）。（Ｂ）成塾視覚皮質における神経伝達の長期増強（ＬＴＰ）。白質からのシータバースト刺激（ＴＢＳ）の２０〜３０分後に測定した神経伝達のＬＴＰ（ＷＭ−ＬＴＰ）は、対照ラットと比べて、フルオキセチン処置動物の視覚皮質において有意に増強されていた（二元配置分散分析ＡＮＯＶＡ：ｐ＜０．００５、post hoc Student-Newman-Keuls検定：ｐ＜０．０１）。スケールバーは、基礎値の振幅の５０％および５ｍｓである。（Ｃ）および（Ｄ）：ジアゼパムの皮質内投与は、長期フルオキセチン投与の誘導するＯＤ可塑性の回復を防止した。（Ｃ）実施した実験手法を示す模式図（上）、および遮蔽した眼と反対側の両眼性視覚皮質における、浸透圧ミニポンプインプラント部位ならびにＶＥＰ記録部位を示す模式図（下）。ベンゾジアゼピンの作用薬であるジアゼパム（Ｄｚ）の皮質内投与は、抗うつ剤処置の最後の週にＭＤと並行して実施した。（Ｄ）Ｄｚの皮質内注入を行ったフルオキセチン処置ラットにおけるＯＤ可塑性の封鎖。ベンゾジアゼピンの作用薬であるジアゼパム（Ｄｚ）の皮質内投与を行ったフルオキセチン処置成体動物（Fluox + Dz）においては、ＭＤ後の遮蔽した眼と反対側の視覚皮質におけるＣ／Ｉ ＶＥＰ比は、対照（遮蔽なし）動物とほとんど変わらなかったが（Ｃ／Ｉ ＶＥＰ比：２．４８±０．２９、ｔ検定：Ｐ＝０．４８３、ｎ＝４）、長期フルオキセチン処置を行った成体ラット（Fluox）（ｔ検定：Ｐ＝０．００１、ｎ＝５）とも、ベヒクル養液の皮質内注入を行った動物（Fluox + Veh）（ｔ検定：Ｐ＝０．０１、ｎ＝３）とも有意に異なっていた。エラーバーは標準誤差、＊は統計的有意性を示す。
【技術分野】
【０００１】
弱視は、片方の目の視覚が、その目の発達段階における不十分な使用によって損なわれた症状であり、治療方法が存在しない一般的な成人の病である。本発明は、弱視の症状を治療または緩和するための方法に関する。本発明は、臨床学的にヒトのうつ症状の治療に活性であることが知られる特定の薬剤（抗うつ剤）の反復投与が、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）の発現増加及び皮質内抑制の低減を介して、実験動物における弱視の目の視覚を改善させるという発見などに基づくものである。
【背景技術】
【０００２】
弱視
弱視とは、視覚情報の処理における機能不全によって特徴付けられる臨床状態である。典型的には、眼科的検査による病的所見を伴わない視力低下として検出されるものである。弱視は、生後発育の臨界期に眼の使用が低下または偏ったことによる、視覚皮質内の視覚情報処理の異常に起因する。多くの場合、生後数年の内に片方の眼に生じた斜視、不同視または視覚遮蔽は、冒された眼の永久的な視力低下に繋がる（Holmes and Clarke, 2006）。弱視は単眼失明の最も一般的な原因であり、その有病率は子供で１〜５％、そして成人では約３％である（Holmes and Clarke, 2006）。成人の弱視には立体視の不足による奥行き知覚の低下が見られ、事故や疾病によって弱視ではない方の眼の視力が失われた場合に全盲となる危険性がかなり高い。幼児期に良い方の眼を眼科的または薬学的に遮蔽して弱い方の眼の使用を促進することで弱視は防ぐことができる。しかし、遮断療法は生後発育の臨界期にのみ有効であり、思春期に臨界期が（ヒトでは約１０歳で）段階的に終了すると、遮蔽はもはや有効な手段ではなく、弱視は永久的な物となる。
【０００３】
サル、ネコ、ラットやマウスなどの実験動物を用いた実験研究は、過去数十年にわたって弱視の根本に潜む神経生物学的な機構を明らかにしてきた（Berardi et al., 2003）。生後発育の初期には左眼と右眼のそれぞれからの入力が視覚皮質の神経支配に際して競合し、両眼が共に正視な場合、哺乳類の視覚皮質は眼球優位性（ＯＤ）コラムと呼ばれる眼特異的なコラムに組織化する。これは、それぞれの眼からの入力が、第１次視覚皮質のＩＶ層へ形態学的および機能的に分離されることを表している。視覚皮質の正常な神経支配には、両眼からのバランスのとれた視覚入力が必要である（Berardi et al., 2003）。従って、生後発育の初期に片眼を閉じ、成人期近くまで閉じたままにすると、開いている眼は遮蔽した眼を乗っ取って徐々に１次視覚皮質のほぼ全域に神経を分布させるが、一方、遮蔽した眼は、視覚皮質内のニューロンとの連結を解剖学的にも生理学的にも失う。このような再組織化は、種によって数日から数年におよぶ生後発育の臨界期に最も効果的に生じ、遮蔽した眼の重度の視力低下に繋がる（Berardi et al., 2003）。臨界期の終了した成人期では、片眼を閉じることは閉じた眼の視力と既に確立された脳内ＯＤコラムへの解剖学的および生理学的な分離に有意な影響を与えることはない。反対に、臨界期に遮蔽した眼は、成人期に眼を開けても、視力が向上したり、失われた解剖学的および生理学的な上記ニューロンとの連結が回復することはない。視覚皮質におけるγ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）介在性の神経抑制の増加と成熟が、発達過程において臨界期の終了をもたらす臨界的な因子であることが報告されている（Berardi et al., 2003）。まとめると、弱視は眼の問題（斜視、不同視または視覚遮蔽）の結果として生じるものの、臨界期の終了後には、弱視は眼の問題ではなく、眼と視覚皮質との間の神経結合の問題となる。臨界期の終了後に眼に潜在する発達過程の問題を正すことのできるいかなる手法（例えば、斜視の外科的処置）についても、弱視眼の視力を回復させたという報告はない。
【０００４】
現時点では、臨界期終了後の成人期に遮蔽した眼の視覚を回復または向上に有効な薬学的介入手段は存在しない（Holmes and Clarke, 2006）。Ｌ−ＤＯＰＡおよびシトコリンを用いた補助非盲検臨床試験は、薬理的処置によって成人の弱視を改善させる可能性を示唆したが（Campos and Fresina, 2006）、上記薬剤の副作用によってその使用は妨げられた。発達途中の眼の成長に影響を与えるために薬理物質を使用する方法が提案されているが、発達初期の眼の成長異常は不同視を生じ、弱視の発生へと繋がる恐れがある（WO 9425034 A1、WO 0152832 A1、WO 03032975 A1、US 5567731 A、US 5571823 A、US 2003114830 A1）。しかし、弱視は眼と脳との接続異常であるため、眼の成長に影響を与えるいかなる手段も、臨界期終了後の視覚皮質において失われた弱視眼の神経結合を改善することはできない。細胞外マトリクスを分解する酵素（コンドロイチナーゼＡＢＣ）の皮質内注入は、成体ラット脳の臨界期可塑性を回復させることが示されているが、視覚皮質の複数の位置に直接酵素を注射する必要がある（Pizzorusso et al, 2002、Pizzorusso et al, 2006）。弱視眼の視力を成人期に向上させることのできる処置は、特に臨界期の終了後に良い方の眼の視力が失われた場合に、非常に望ましいものである。
【０００５】
抗うつ薬
ヒトにおけるうつ病と気分障害の症状を治療するために臨床的に使用される薬剤を、抗うつ薬または抗うつ剤と呼ぶ。臨床的な活性が認められる抗うつ剤の大部分が、モノアミントランスポーターであるセロトニン（５−ヒドロキシトリプタミン、５−ＨＴ）またはノルネピネフリン（ＮＥ）のシナプス中の濃度を増加させるものであり、このような薬剤は、細胞による再取り込みを阻害するもの（再取り込み阻害剤）または上記トランスミッターを分解するモノアミンオキシダーゼ（ＭＡＯ）を阻害するもの（モノアミンオキシダーゼ阻害剤、ＭＡＯＩ）である。再取り込み阻害剤は、三環系抗うつ剤、選択的セロトニン再取り込み阻害剤（ＳＳＲＩ）および選択的ＮＥ再取り込み阻害剤（ＮＳＲＩ）に更に分類される。セロトニン−ノルネピネフリン再取り込み阻害剤（ＳＮＲＩ）は、細胞によるセロトニンとノルネピネフリンの両方の再取り込みを阻害する。抗うつ剤の中では、発生する副作用が比較的少ないと言う理由から、ＳＳＲＩが最も広く使用される薬剤クラスである。ＳＳＲＩの中では、フルオキセチンが最も広く使用されている薬剤である。５０年にわたる臨床経験によると、公知の抗うつ薬の全てにおいて、臨床的効果を達成するためには少なくとも数週間にわたる反復投与が必要である。
【０００６】
抗うつ剤と神経可塑性
神経可塑性は、新しいニューロンまたはシナプス結合を形成するか、現存する結合を解消するか、あるいは現存するシナプス結合の強度を増強または減少させることによって、ニューロンがその結合性を調節する能力を意味する。神経栄養因子である脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）は発達途中の脳と成体の脳の両方において重要な神経可塑性調節因子である。過去１０年に蓄積された事実は、抗うつ薬が神経可塑性の調節に関与することを示唆している（Castren, 2004）。抗うつ薬は海馬歯状回における新しいニューロンの産生を増加させ、海馬における軸索新芽形成とシナプス形成を増加させる。抗うつ剤による処置は、さらに海馬における可塑性関連遺伝子やタンパク質の発現も増加させる（Castren, 2004）。具体的には、全ての公知抗うつ剤クラスの代表的なものが、反復投与によってＢＤＮＦのｍＲＮＡの産生を増加し、１回または反復投与の後には、ＢＤＮＦ受容体であるｔｒｋＢの自己リン酸化の増加として測定されるｔｒｋＢの活性化をもたらした（Castren, 2004）。ＢＤＮＦとその受容体であるｔｒｋＢは、神経可塑性の重要なメディエーターであり、少なくとも齧歯動物においては、抗うつ薬の効力に対しても重要なメディエーターである。
【０００７】
発明の概要
本発明の目的は、生後視覚発達の臨界期を過ぎたヒトにおいて、弱視を治療または緩和するための方法を提供することである。
【０００８】
本願明細書において、「生後視覚発達の臨界期を過ぎたヒト」という表現は、生後視覚発達の臨界期を過ぎた全てのヒト（若者、成人）を意味する。臨界期の終了は段階的ではあるが、典型的には、ヒトで臨界期が約１０歳を超えることはない。
【０００９】
本発明の他の目的は、既にヒトの気分障害の治療に認められている抗うつ薬の新しい適応症として弱視を提示することにある。従って本発明は、生後視覚発達の臨界期を過ぎたヒトの弱視を治療または緩和するための薬剤の製造における、抗うつ薬の使用に関する。
【００１０】
本発明の更なる目的は、視覚皮質においてＢＤＮＦを増加させるか、ＧＡＢＡ介在性の抑制作用を減少させる化合物を用いて、弱視を治療または緩和するための方法を提供することである。
【００１１】
本発明の他の更なる目的は、薬剤療法とリハビリテーション療法とを組み合わせた、弱視の治療方法を提供することである。
【００１２】
本願明細書において「リハビリテーション」とは、弱視眼の使用を支持または促進する全ての手段を意味する。リハビリテーションには、弱視ではない方の眼の視界の物理的（眼帯による）遮蔽や薬理学的遮蔽、または弱視眼の使用を促進する強化プログラムが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００１３】
本発明の更なる目的は、生後視覚発達の臨界期を過ぎたヒトの弱視を治療または緩和するための方法であって、大脳皮質においてＢＤＮＦ（脳由来神経栄養因子）のレベルを増加させることが知られる少なくとも１種の薬剤を有効量投与することを包含し、好ましくは薬剤投与をリハビリテーション療法と組み合わせることを特徴とする方法を提供することである。
【００１４】
上記及び他の目的は、抗うつ薬、特にＳＳＲＩ、より具体的にはフルオキセチンが、生後視覚発達の臨界期を過ぎた哺乳動物において弱視の治療に使用可能であることを示す本発明によって達成されるものである。
【００１５】
発明の詳細な説明
本発明は、ヒトにおいてうつ病の緩和、皮質におけるＢＤＮＦ発現の増加または皮質抑制の減少をもたらす分子による弱視の治療または緩和に関する。さらに本発明は、このような処置とリハビリテーション療法を組み合わせて適用することによって弱視を緩和する方法に関する。
【００１６】
従って本発明の目的は、生後視覚発達の臨界期を過ぎた弱視のヒトに、ヒトのうつ症状を緩和する少なくとも１種の薬剤（抗うつ薬）を有効量投与することを包含する、弱視のヒトを治療するための方法に関する。
【００１７】
この方法は、弱視の対象者に少なくとも１種の抗うつ薬を経口投与することを含むことが好ましい。本発明の好ましい態様は、弱視眼の使用を支持または促進するためのリハビリテーション療法を更に包含する。
【００１８】
本発明の他の目的は、生後視覚発達の臨界期を過ぎたヒトの弱視を治療または緩和するために、好ましくはリハビリテーション療法と組み合わせて使用するための薬剤の製造における、抗うつ薬の使用に関する。
【００１９】
本発明は、うつ病患者に投与した際に臨床的な抗うつ活性を示すことが知られている、ある種の薬剤を成体ラットに投与すると、視覚皮質の可塑性変化を誘導し、発達途中の視覚系において発達臨界期に見られるのと同様の機能的な結果が得られるという知見（実施例を参照）に基づくものである。このような抗うつ薬としては、三環系抗うつ剤などの再取り込み阻害剤、選択的セロトニン再取り込み阻害剤（ＳＳＲＩ）、選択的ノルネピネフリン（ＮＥ）再取り込み阻害剤（ＮＳＲＩ）およびセロトニン−ノルネピネフリン再取り込み阻害剤（ＳＮＲＩ）などの再取り込み阻害剤が挙げられるが、これらに限定されるものではない。本発明の方法において使用することが好ましい抗うつ薬は、種々のＳＳＲＩからなる群より選ばれるものである。好ましいＳＳＲＩとしては、例えば、フルオキセチン、フルボキサミン、パロキセチン、セルトラリン、シタロプラムおよびエスシタロプラムが挙げられ、特にフルオキセチンが好ましい。ＳＮＲＩとしては、例えば、ドロキセチン、ベンラファキシン、デスベンラファキシン、ビシファジンおよびミルタザピンが挙げられる。
【００２０】
さらに公知の抗うつ薬に加え、大脳皮質における脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）のレベルを増加させることのできる他の化合物や治療剤も、生後視覚発達の臨界期を過ぎたヒトの弱視を治療または緩和するために、好ましくはリハビリテーション療法と組み合わせて使用することができる。
【００２１】
従って本発明は、生後視覚発達の臨界期を過ぎたヒトの弱視を治療または緩和するために、大脳皮質におけるＢＤＮＦ発現レベルの増加またはＧＡＢＡ介在性の皮質抑制の減少をもたらす分子を、好ましくはリハビリテーション療法と組み合わせて適用する方法にも関する。
【００２２】
本発明の更なる目的は、生後視覚発達の臨界期を過ぎたヒトの弱視を治療または緩和するための治療剤の製造における、大脳皮質のＢＤＮＦ発現レベルの増加またはＧＡＢＡ介在性の皮質抑制の減少をもたらす化合物の用途に関する。
【００２３】
ラット、サルおよびヒトにおいて、臨界的発達期間に比較的短期間（例えば、一週間）に渡って片眼を閉じること（片眼遮蔽、ＭＤ）は、開いている眼が閉じた眼の犠牲の上に優性となるほど劇的な再編成を視覚皮質の神経支配と機能にもたらすことが確立されている（Berardi et al., 2003）。この再編成は、閉じた眼の劇的な視力低下に反映され、ラットにおいては電気生理学的手法または行動学的手法によって観察することができる（実施例を参照）。同様に、同一種間に置いては、臨界期終了後の成体における同等のＭＤは認識できるほどの再編成を生じることはないことも確立されている。機能的には、成体におけるこのような再編成の欠如は、ＭＤ実施期間中の閉じた眼と開いた眼の視覚変化の欠如として反映される。しかし、実施例に記載したように、成体ラットを４週間に渡ってフルオキセチンで処置し、処置の最後の週にＭＤに付すと、開いている眼の視力が主要となる劇的なシフトが視覚皮質に観察される。このシフトは、刺激に対する応答が遮蔽した眼では低下し、開いていた眼では刺激に対する応答性に変化がないことから、臨界期の真最中にある若いＭＤラットに観察されるのと質的に類似している。成体ラットのフルオキセチン処置単独、即ち、片眼の遮蔽なしの処置は、どちらの眼にも視覚刺激に対する応答性のシフトを生じなかった。この結果は、抗うつ薬処置が視覚皮質における臨界期可塑性を回復させるが、視覚皮質の両眼性にシフトを生じるためには、片眼の視覚遮蔽が必要であることを示唆している。さらにフルオキセチン処置単独は、視覚皮質における方位選択性や細胞応答性に影響を与えることはなかった。
【００２４】
ＭＤに付した眼を臨界期に開くと、部分的または完全な回復が起こり、反転縫合する（reverse suture；即ち、遮蔽した眼を開き、今まで開いていた眼を閉じるように縫合する）と、遮蔽されていたが今は開いている眼に好ましい再編成が生じる。ヒトにおいては、これは臨界期により見える方の目に眼帯をすることで子供の弱視の発生を防止する方法に相当する。しかし、ＭＤが臨界期の終わりを過ぎて行われ、閉じた眼を成人期になってから開けた場合、機能的な回復または視力の回復は観察されない。同様に反転縫合も機能的または解剖学的な変化をもたらさない。臨床的には、実験動物における上記知見は、慢性弱視の発生、即ち、臨界期が終了する前に眼の遮蔽パラダイムによってＭＤまたは偏った眼の使用を処理しなかった場合と相関する。しかし、実施例で示したように、発達初期（生後２１日目）にＭＤに付した成体ラットに対して、うつ病のヒトを処置する際のフルオキセチン血漿レベルと同等になる量のフルオキセチンを用いて４週間に亘り経口処置を行い、処置の最後の２週間は反転縫合に付すと、発達過程では閉じていたが、薬剤処置の際は開いていた眼の方への劇的なシフトが生じた。より重要な点は、開けた目の視力が回復し、双眼視が回復したことである。これらの知見は、抗うつ剤であるフルオキセチンは、哺乳動物の成体において発達臨界期の再開を誘導し、臨界期の真最中で生じるのと同等の視覚皮質内の機能的再組織化を可能にすることを示唆している。
【００２５】
長期増強（ＬＴＰ）とは、特定のシナプス結合に対する短く強い刺激によってもたらされる、２つのニューロン間のシナプス強度の長期にわたる増加であり、神経可塑性と記憶の実験モデルと考えられている。白質内の視覚皮質に入る視床入力繊維のシータバースト刺激パラダイムによる刺激は、未成熟の視覚皮質においてＬＴＰ（ＷＭ−ＬＴＰ）を容易に誘導するが、成体の視覚皮質においてはＬＴＰを誘導しない（Artola and Singer, 1987、Kirkwood and Bear, 1994）。ＷＭ−ＬＴＰ誘導性の喪失は、視覚可塑性の臨界期の終了と相関する。局所ＧＡＢＡ含有インターニューロンによる抑制性制御の増加は、臨界期の終了とＷＭ−ＬＴＰ応答の喪失を制御する少なくとも１種のメカニズムと考えられている。
【００２６】
ＢＤＮＦは神経可塑性の重要なレギュレーターであることが知られている。抗うつ薬は、海馬におけるＢＤＮＦとそのｍＲＮＡのレベルを増加することが知られ、ＢＤＮＦシグナル伝達は、齧歯動物における抗うつ薬の行動効果に重要であることが示されている（Castren, 2004）。実施例で示したように、フルオキセチンによる３週間の処置は、視覚皮質においてもＢＤＮＦレベルを増加させる。さらに視覚皮質へのＢＤＮＦの注入は、フルオキセチンの経口投与による処置の後に観察されるのと同様の臨界期可塑性の再活性化を誘導し、これはＢＤＮＦ発現の増加は、視覚皮質におけるフルオキセチンの可塑性増強効果を仲介する可能性を示している。
【００２７】
ＧＡＢＡ介在性の皮質抑制は生後発育の途中に増加し、成熟する。このような皮質阻害の増加は臨界期の終了に不可欠な影響を与える。皮質のＧＡＢＡ含量は臨界期の終了に向けて増加し、このＧＡＢＡの増加を防止すると、臨界期は継続したままになる。反対に、実施例で示したように、フルオキセチンの３週間に亘る経口投与は、皮質の細胞外ＧＡＢＡレベルの低下をもたらし、視覚皮質の臨界期可塑性の再活性化に繋がる。フルオキセチンの経口投与期間中に、ＧＡＢＡ−Ａ受容体のエンハンサーであるジアゼパムの皮質内注射によって皮質のＧＡＢＡシグナル伝達を人工的に増加した場合、成体視覚皮質における可塑性の増加は防止される。
【００２８】
本発明は、生後視覚発達の臨界期終了後に弱視眼の視力を回復させるための抗うつ薬の使用に関する。さらに本発明は、遮蔽療法と抗うつ剤による薬剤処置との組み合わせにも関する。発達臨界期である幼少期には、物理的または薬理学的に視覚を妨げるか減少させて優勢な眼を不利な状況に置くことで、弱視を緩和または防止することが可能である（Holmes and Clarke, 2006）。ヒトにおいて遮蔽療法は、約１０歳以降はあまり効果的ではないことが知られている。気分障害のために抗うつ剤を摂取している生後視覚発達の臨界期を過ぎたヒトにおいて、弱視眼の視力が向上したという報告はないが、幼少期の弱視を防止するためには遮蔽療法が必要であることから、これは驚くべきことではない。実施例で示したように、出生後生活期間の初期にＭＤによって弱視となったラットの遮蔽（反転縫合）は、フルオキセチンの反復経口投与による処置と組み合わせると、臨界期の真最中における遮蔽方法によって生じるのと同様の変化をもたらすことができる。従って、抗うつ薬処置と、特定のリハビリテーション処置［例えば、視覚的方法（眼帯の使用）または薬学的方法（局所アトロピン目薬）で優性な眼を不利な状況に置くこと］を共に組み合わせて適用することが、成人期における回復にも必要であると考えられる。
【００２９】
弱視を患う哺乳動物に対する抗うつ薬の投与は、弱視眼の使用を支持または促進するいかなる手段（リハビリテーション処置）の適用前、適用と同時、または適用の前ならびに適用と同時に行うことができる。ヒトうつ病患者において抗うつ薬の臨床的に適切な効果が得られるまでには数週間の遅延があるため、弱視の場合も、遮蔽療法の開始前に数週間に亘って抗うつ薬の反復投与を行うことが好ましい。薬剤処置の総期間は達成される臨床応答によるが、実施例で示したラットほど急速に（約１週間以内に）変化が起こることは期待できず、薬剤処置の適用、または薬剤処置とリハビリテーションの組合せの適用は、より長期間、例えば１年間、に亘って継続する必要があると考えられる。また、連続的な薬剤処置と周期的な遮蔽療法を組み合わせたり、薬剤処置と遮蔽の両方を短期間行い、後に望ましい応答が得られるまで、複数回にわたって繰り返すことも考えられる。しかし、処置を一生続けなければならないとは考えられない。処置の最中に得られた安定な臨床応答は、抗うつ剤処置の適用、または抗うつ剤処置と遮断処置の組み合わせの適用を中止した後でも持続すると考えられる。
【００３０】
抗うつ薬は経口投与に適した医薬組成物の形態で投与することができる。実施例では、視力の有意な向上が血漿濃度３５０ｎｇ／ｍｌとなる量のフルオキセチンによる処置で達成され、この量は、うつ病の処置に推奨されているフルオキセチン血漿濃度（５０〜４５０ｎｇ／ｍｌ）の治療学的範囲内である。従って、投与する抗うつ薬の量は、少なくともうつ病の治療に推奨されるレベルの量であると考えられる。
【００３１】
本発明によると、弱視の治療を必要とする対象に投与する組成物は、薬学的に許容される担体と、抗うつ薬または視覚皮質においてＢＤＮＦレベルの増加またはＧＡＢＡレベルの減少をもたらす他の薬剤から選ばれる少なくとも１種を包含する。組成物における抗うつ薬の濃度は、抗うつ剤の種類と医薬処方に依存する。うつ病の経口処置に現在使用されている医薬処方が弱視の処置にも使用できると考えられる。
【００３２】
本発明について、以下の実施例で更に説明する。以下の実施例は、本願請求項の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【００３３】
抗うつ剤であるフルオキセチンにより誘発される、片眼遮蔽（monocular deprivation）された成体ラットの視覚皮質における機能的再編成。
【００３４】
１．１ 材料及び方法
１．１．１．動物治療実験
この実験では、成体のロングエバンスラット（Long-Evans hooded rats）を使用した。ラットは、プレキシグラスの檻（４０×３０×２０ｃｍ）にグループ分けして入れ、随意に餌と水を与える標準的な条件下で、１２時間：１２時間の明暗サイクルで飼育した。
【００３５】
フルオキセチン投与
生後日数（Ｐ）７０日の成体のラットに、フルオキセチン（濃度０．２ｍｇ・ｍｌ-1の飲料水）（塩酸フルオキセチン、Ｇｅｌｅｎｏ社（イタリア国、プラート）製）を４週間に亘り全身投与した。対照動物として、フルオキセチン投与を行わない以外は、上記と同様の条件でラットを飼育した。上記方法による投与は、ラットにおいて定常状態の血漿濃度３５６±９９ｎｇ／ｍｌとなり、これはヒトのうつ治療における推奨血漿濃度（５０〜４５０ｎｇ／ｍｌ）の範囲内である。
【００３６】
片眼遮蔽（monocular deprivation、ＭＤ）
眼球優位可塑性を評価するために、フルオキセチンまたはベヒクル投与の第３週開始時（Ｐ９０）に、まぶたを縫合することによる１週間の片眼遮蔽（ＭＤ）を行った。具体的には、処置中の成体動物を、アベルチン（１ｍｌ・ｋｇ-1）で麻酔し、定位装置上に固定して、片眼遮蔽した。まぶたの閉鎖は、縫合創が完全に治癒するまで毎日検査し、遮蔽した目が、ほんのわずかでも自発的に再開したものは除外した。ＭＤの後、数日は、抗生物質やコルチゾンを局所的に適用することにより、遮蔽した目の炎症や感染を防ぐよう細心の注意を払った。
【００３７】
また、長期間のＭＤ分析を行うために、ラットをアベルチン（１ｍｌ・ｋｇ-1）で麻酔し、まぶたを縫合することにより、Ｐ２１で片眼遮蔽した。まぶたの閉鎖は、縫合創が完全に治癒するまで毎日検査し、遮蔽した目が、ほんのわずかでも自発的に再開したものは除外した。次に、成体の弱視ラットは、フルオキセチンまたはベヒクルの反復投与の第２週開始時（Ｐ８５）に、麻酔下で反転縫合（reverse suture、ＲＳ）に付した。即ち、長期に亘って遮蔽された目を、薄型のハサミで再開し、他方の目を縫合により遮蔽した。ＲＳの後、数日は、抗生物質やコルチゾンを局所的に適用することにより、遮蔽していた目の炎症や感染を防ぐよう細心の注意を払った。
【００３８】
１．１．２．機能的変化の評価
In vivoでの電気生理学的分析、眼球優位可塑性及び視力
フルオキセチンの反復投与の最期の段階において、一週間片眼遮蔽された成体動物（Ｐ１００）を、ウレタン（０．７ｍｌ・ｋｇ-1、Sigma社製２０％生理食塩水溶液）を腹腔内注射することにより麻酔し、定位フレーム内に配置した。ウレタンを追加投与して、実験中、麻酔のレベルが一定になるようにした。ラットの体温は継続的にモニターし、実験中、サーモスタット付き電気毛布にて約３７℃に維持した。心電図は、継続的にモニターした。頭蓋骨の、遮蔽した目の反対側で一次視覚野の両眼性部位（両眼性領域Ｏｃ１Ｂ）に対応する位置にドリルで穴を開けた。脳の表面を露呈させた後、硬膜を除去し、ＮａＣｌ（３Ｍ）で満たされたマイクロピペット（２ＭΩ）を、λ（矢状縫合とラムダ状縫合とが交わる部位）から皮質に５ｍｍの深さまで挿入した。両眼とも固定し、眼球の外側を覆う調整可能な金属製リングによって開いた状態に維持した。両目の視力を、視覚誘発電位（ＶＥＰ）により測定した。一方の眼のＶＥＰ記録中は、他方の眼は黒の粘着テープで覆った。ＶＥＰを記録するために、電極を皮質の１００または４００μｍの深さまで到達させた。これらの深さでは、ＶＥＰの振幅は最大となる。得られた信号は、バンドパスフィルタ（０．１〜１００Ｈｚ）を通し、増幅して、公知の手法で分析するためにコンピュータに入力した（Huang et al.,1999）。簡単に説明すると、少なくとも１２８の事象を、コントラスト反転させた刺激と同期させて平均化した。時間領域における、急なコントラスト反転（０．５Ｈｚ）に対するＶＥＰの過渡応答を、ピーク−ベースライン振幅及び主要な陰性成分のピークレイテンシを測定することにより評価した。視覚刺激としては、異なる空間周波数及びコントラストの水平な正弦波グレーティングを用いた。この正弦波グレーティングは、ＶＳＧ２／２カードと専用のソフトウェアで生成し、ラットの眼から２０ｃｍの距離の位置に、予め特定した受容野と中心を揃えて配置したモニター（２０×２２ｃｍ、輝度：１５ｃｄｍ-2）上に表示した。視力は、ＶＥＰ振幅を対数空間周波数に対してプロットして得られる曲線における最期の４または５個のデータ点の線形回帰を、ゼロ振幅に外挿して得た。両眼性（眼球優位性）は、対側（contralateral）の同側(ipsilateral)に対するＶＥＰ比（Ｃ／Ｉ）（即ち、記録が行われている視覚皮質に対して対側及び同側の眼を刺激することにより記録されたＶＥＰの振幅の比）を計算することにより評価した。
【００３９】
視力の行動学的評価
ＲＳを行う前に、開いている（遮蔽されていない）方の眼の視力を測定し、フルオキセチン処置開始時に、長期片眼遮蔽ラット（Ｐ７０）の正常な方の眼の視力の行動学的評価を開始した。そして、ＲＳ後、治療の第３週（Ｐ９０）中に、長期遮蔽された眼の視力の測定を開始した。従って、以前遮蔽されていた眼の視力測定は、ラットが約Ｐ１００となり、フルオキセチン反復投与の終わりの段階で完了した。該視力の測定には、ビジュアルウォータータスク（visual water task）(Prusky et al., 2000)を使用した。ビジュアルウォータータスクは、最初、ラットを低い空間周波数（０．１サイクル／度（c deg-1））の縦型グレーティングをグレーから識別するよう訓練し、その後、より高い空間周波数でこの能力の限界を試験する。この装置は、一方の端に２枚のパネルが隣り合わせて配置されてなる台形のプールから成る。中央の分割体は、プールの広い方の端から中央に延び、１つの幹部と２つのアーム部を有する迷路を形成する。該分割体の長さによって、選択点と有効空間周波数が決定される。脱出道はグレーティングの下に位置する。ラットは、プールの該パネルの反対側の端の中央から放される。訓練するラットによって、グレーティングと脱出道の位置を疑似ランダムシーケンスで変更し、ラットを迷路の手の一方のグレーティングに向かって泳ぐように仕込んだ。ラットが、脱出道にたどり着かずに迷路のアーム部分に入った場合には、トライアルは不正確として記録する。ラットが、脱出道を見つけた場合には、ラットをプールから取り除いた。８０％の正確性が得られた時点で、識別能力の限界をグレーティングの空間周波数を上げることにより評価した。視力については、精神測定関数にあてはめたシグモイド関数の正しい選択の７０％に対応する空間周波数を視力とした。このセッションの間、実験者は実験グループを識別していなかった。
【００４０】
１．１．３．生化学的変化の評価
In vivoでの脳内微小透析
フルオキセチンの反復投与の１週間前に、成体ラット（Ｐ７０）を麻酔し、ステンレス製のガイドシャフトを、両眼性視覚野（両眼性領域Ｏｃ１Ｂ）の上、且つブレグマの７．３ｍｍ後方、正中矢状縫合の４．４ｍｍ横、頭蓋骨の１ｍｍ腹側の座標に定位的に埋め込んだ。フルオキセチンの反復投与終了後に、埋め込んだガイドシャフトに、微小透析プローブを挿入し、in vivoでの透析物のサンプリングを行った。具体的な操作については、Hernandez et al., 1986に報告されている。簡単に説明すると、上記のプローブは、溶融シリカ・ポリイミド被覆毛細管が、先端部１ｍｍが露出したセルロース幕（カットオフ分子量6000）である２６ゲージのステンレス製チューブに同心的に挿入されてなる。このプローブは、人工ＣＳＦ （142 mM NaCl、3.9 mM KCl、1.2 mM CaCl2、1 mM MgCl2、 1.35 mM Na2HPO4 、pH 7.4）を流速１μリットル・秒-1で供給する透析システムに連結した。プローブは、上記ガイドシャフトの先端から１ｍｍ突出していた。プローブの挿入から６時間（安定化期間）後にサンプリングを行った。自由に活動するフルオキセチン処置ラット及び対照ラットのそれぞれから６つのサンプル（各２０μｌ）を、２０分毎に２時間に亘って採取した。
【００４１】
組織学的分析
脳内微小透析の後、ラットは、抱水クロラールの過剰投与により殺し、上記したように心臓内潅流させた。ラットの脳は、２時間ポストフィックスした後、３０％スクロースのＰＢＳ溶液に浸漬させた。後頭葉皮質から冠状部位４０μｍを滑走式ミクロトーム(sledge microtome)で切り出して、ＰＢＳ中に採取した。採取した脳のサンプルは、Ｏｃ１Ｂ中のプローブの位置を確認するために、クレジルバイオレットで染色した。後の分析においては、プローブが正しい位置に存在しているラットだけを考慮した。
【００４２】
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）
微小透析物からのγ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）及びグルタミン酸塩（ＧＬＵ）の基底レベル分析を、蛍光検出器と組み合わされた高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて行った。o-フタルアルデヒドによるサンプル自動誘導化（Waters 2690 Alliance）を行った（Calabresi et al., 1995）。分離は、蛍光検出器（Waters 474、励起波長：350 nm、発光波長：450nm）に取り付けられたＣ１８逆相クロマトグラフィーカラムによって行った。緩衝液は以下の通りであった：溶液Ａ: 0.1M 酢酸ナトリウム（pH 5.8）/メタノール 20/80; 溶液Ｂ: 0.1M 酢酸ナトリウム（pH 5.8）/メタノール 80/20; 溶液Ｃ: 0.1M 酢酸ナトリウム（pH 6.0）/メタノール 80/20。勾配プログラムは以下の通りであった：初期無勾配段階０〜５分、 ５％ 溶液Ａ、９５％溶液Ｃ; ４〜５分 １５％溶液Ａ、８５％溶液Ｂ、その後、９分まで無勾配; １４．５分まで２２％溶液Ａ、６６％溶液Ｂ、その後、１７分まで、３４％溶液Ａ、６６％溶液Ｂ; １９分まで５％溶液Ａ、９５％溶液Ｃ、その後、無勾配。流速は、 0.9 ml・秒-1であった。ホモセリンを内部標準として使用し、アミノ酸濃度は、注射したアミノ酸の既知濃度から作成した一次標準曲線（linear standard curve）から計算した。ピーク面積を比較に用いた（Waters Millenium 32）。
【００４３】
ＬＴＰ記録
フルオキセチン処置ラット及び対照ラット（Ｐ１００）から脳を採取し、以下の組成の氷冷切断溶液に浸漬した(単位はｍＭ): スクロース 220、 KCl 3.1、 K2HPO4 1.0、NaHCO3 4.0、MgCl2 2.0、CaCl2 1.0、HEPES 10、アスコルビン酸 1.0、ミオイノシトール 0.5、ピルビン酸 2.0、キヌレン酸塩（pH 7.3） 1.0。ライカ ビブラトーム（ドイツ国、Nussloch社製）を用いて、視覚皮質の厚み０．３５ｍｍの切片を得た。切片（フルオキセチン処置ラットからの切片数は１２、標準ラットからの切片数は１４）は、３５℃の酸素添加記録溶液と共に２ｍｌ・秒-1の速度で環流した。この記録溶液は、上記の切断溶液とは以下の点で組成が異なる（単位はｍＭ）： NaCl 130、デキストロース 5.0、 MgC12 1.0、CaCl2 2.0、グリシン 0.01、キヌレン酸塩 ０、スクロース ０。電気刺激（刺激幅 １００μ秒）は、白質と第６層との境界に配置した２極同軸刺激電極（メイン州、ボードインハム、FHC社製）によって与えた。第２層−第３層間の電場電位は、NaCl（３Ｍ）で満たされたマイクロピペット（１〜３ＭΩ）によって記録した。ベースライン応答は、３０秒毎に、最大応答の半分の応答が得られる電気刺激にて測定した。１５分間、安定したベースライン（電場電位の振幅が１５％以内であり、明らかな増加または減少傾向が見られない状態）が得られた後に、θバースト刺激（ＴＢＳ）を与えた。ＴＢＳ後のシナプス後電場電位は、３０秒毎に３０分に亘って記録した。
【００４４】
酵素免疫定量法（ＥＬＩＳＡ）
ＢＤＮＦタンパク質の発現を、フルオキセチンの反復投与の最終段階において、ＥＬＩＳＡによって評価した。最初に、溶解緩衝液（1% Triton X-100、10% グリセロール、 20 mM TrisHCl pH 7.5、150 mM NaCl、10 mM EDTA、0.1 mM Na3VO4、1.25 g/ml ロイペピチン、 1.25 g/mlアプロチニン、1 mM PMSF）を用いて、新鮮な視覚皮質及び海馬のそれぞれからタンパク質を抽出した。サンプルの総濃度は、タンパク質アッセイキット（カリフォルニア州、ハーキュリーズ、Bio-rad社製）を用い、ＢＳＡで作成した標準曲線を利用して測定した。その後、ＢＤＮＦ発現を、合計１００μｇの３群のタンパク質をＥＬＩＳＡプレートに入れ、標準曲線と共に評価し、製造元のプロトコル（ＢＤＮＦ、Promega）の処方に従って処理した。
【００４５】
１．１．４．ＢＤＮＦの皮質内投与
１週間のＭＤの間に、異なるグループ（各４匹）の成体ラットの皮質内にＢＤＮＦを注入した。ＰＥチューブを介してステンレス製カニューレ（３０ゲージ）に連結された浸透圧ミニポンプを、遮蔽した眼の反対側の視覚皮質に埋め込んだ。浸透圧ミニポンプ（流速：０．５μｌ・時間-1）は、ＢＤＮＦ（１ｎｇ・μｌ-1）で満たした。ラットは、手術後、直ちに標準状態の檻に移した。ＶＥＰによるＣ／Ｉ比の電気生理学記録は、上記したように、ＢＤＮＦの皮質内投与の１週間後に行った。ＢＤＮＦは、この濃度（１ｎｇ・μｌ-1）では、注入箇所（λから４．５ｍｍ）の１．２ｍｍ横に拡散することを既に確認している。サンプルの偏りを防止するために、Ｏｃ１ｂ（λの横４．９、５．０、５．１ｍｍ）におけるＢＤＮＦの拡散領域内の３つの異なる貫通箇所においてＶＥＰを記録した。ＶＥＰの記録は、それぞれの貫通箇所において、深さ１００μｍ及び４００μｍで行った。
【００４６】
１．１．５．ベンゾジアゼピン（ジアゼパム）の皮質内注入
フルオキセチンによる長期処置の最後の週の始めにおいて（処置の２１日目）、異なるグループのラットをＭＤに付した。これと平行して、麻酔下で、ＰＥチューブを介してステンレス製カニューレ（３０ゲージ）に連結された浸透圧ミニポンプを、遮蔽した眼の反対側の視覚皮質に埋め込んだ。浸透圧ミニポンプ（流速：０．５μｌ・時間-1）は、ベンゾジアゼピンの作動薬であるジアゼパム（ＤＺ：２ｍｇ・ｍｌ-1、ｎ＝４）またはベヒクル溶液（５０％プロピレングリコール、ｎ＝４）で満たした。ラットは、手術後、直ちに標準状態の檻に移し、更に１週間、フルオキセチン処置に付した。ＶＥＰによるＣ／Ｉ比の電気生理学記録は、上記したように、抗うつ剤処置の終盤に行った。
【００４７】
１．２．結果
１．２．１．フルオキセチンの反復経口投与後の成体視覚皮質における眼球優位（ＯＤ）可塑性の再活性化
最初に、フルオキセチンで反復的に処置された成体ラットの眼球優位（ＯＤ）可塑性に対する１週間の片眼遮蔽（ＭＤ）の効果を、遮蔽された眼の反対側に位置する第１視覚皮質の両眼性領域における視覚誘発電位（ＶＥＰ）を記録することにより調べた。ＶＥＰは、パターン化された視覚刺激に対する１群のニューロンの統合反応を表し、視力（ＶＡ）及び両眼性変化の評価に一般的に利用されている（Huang et al, 1999、 Porciatti et al, 1999）。ＯＤ（両眼性）は、対側（contralateral）の同側(ipsilateral)に対するＶＥＰ比（Ｃ／Ｉ）（即ち、記録が行われている視覚皮質に対して対側及び同側の眼を刺激することにより記録されたＶＥＰの振幅の比）を計算することにより評価した。成体ラットにおいては、Ｃ／Ｉ ＶＥＰ比は２．５付近であり、網膜投影における交差繊維の優位性を反映している。対照ラットにおいて、ＭＤは遮蔽された眼の反対側の視覚皮質の両眼性に変化は与えなかった（Ｃ／Ｉ ＶＥＰ比：２．７３±０．２、ｎ＝５）。対照的に、フルオキセチン処置された成体ラットにおいては、ＭＤ後に非遮蔽眼の側にＯＤが顕著にシフトし（Ｃ／Ｉ ＶＥＰ比：１．０±０．０８、t検定：ｐ ＜ ０．００１、ｎ＝５）（図１のＡ）、通常は脳発達の初期に限られている可塑性変性が見られた。
【００４８】
１．２．２．フルオキセチンの反復経口投与後の成体弱視ラットにおける視覚機能の回復
次に、フルオキセチンによる反復処置が視覚皮質の可塑性に与える影響を更に評価するために、長期ＭＤにより弱視化し、最後の２週の抗うつ剤処置間に反転縫合（ＲＳ）を施した（「方法」の項目参照）成体ラットにおける視覚機能の回復を評価した。視力（ＶＡ）を、長期遮蔽眼の反対側の視覚皮質（ＶＣ）からの視覚誘発電位（ＶＥＰ）を記録して測定した。対照ラットにおいては、先に遮蔽した眼の視力（０．６２±０．０６ c deg-1) は、反対側の眼の視力（１．０６±０．０１ c deg-1)と比較して回復の兆候は見られなかった (図１のＢ)。対照的に、フルオキセチン処置された成体ラットは、完全な視力回復を見せた（０．９７±０．０４ c deg-1）。ＶＥＰを記録したのと同じラットにおけるＶＡの行動学的測定（ビジュアルウォータータスク）によって、電気生理学的データの妥当性を確認した：フルオキセチン処置した長期間片眼遮蔽ラットにおいては完全なＶＡの回復(０．８８±０．０２ c deg-1)が明らかであり、対照の方では回復が明らかでなかった（図１のＣ）。ＶＡを評価したのと同様のラットについて、Ｃ／Ｉ ＶＥＰ比を測定してＯＤを評価した。対照ラットにおいては、先に遮蔽した眼の反対側の視覚皮質の両眼性の回復は見られなかった（Ｃ／Ｉ ＶＥＰ比：１．１１±０．２０）（図１のＤ）。これに対して、フルオキセチン処置した成体ラットにおいては、Ｃ／Ｉ ＶＥＰ比が２．２５±０．１７であり、両眼性の完全な回復が見られた。
【００４９】
１．２．３． 成体視覚皮質のＢＤＮＦ発現に対する、フルオキセチンの反復経口投与の影響
抗うつ剤の反復投与は、辺縁構造、特に海馬、において神経栄養因子であるＢＤＮＦの発現を増加させるため（Nibuya et al, 1995、Castren, 2004）、フルオキセチンの反復投与を実施した後の成体ラット視覚皮質におけるＢＤＮＦタンパク質レベルをＥＬＩＳＡ法で測定した。ＢＤＮＦタンパク質発現は、対照と比べてフルオキセチン処置成体ラットの視覚皮質で有意に高かった（ｔ検定：ｐ＜０．０４、ｎ＝６）（図２のＡ）。ＢＤＮＦタンパク質発現は、フルオキセチン処置成体ラットの海馬においても、対照と比べて同様に増強されていた（ｔ検定：ｐ＜０．０１、ｎ＝６）（図２のＢ）。増加したＢＤＮＦ発現が成体の視神経系における可塑性の回復の原因となっているのかを調べるために、次にＭＤと並行してＢＤＮＦ（１ｎｇ・μｌ-1）の皮質内注入を（浸透圧ミニポンプで）実施したラットにおけるＯＤを評価した。ベヒクル養液を注入した対照ラットにおいては、遮蔽した眼と反対側の視覚皮質の両眼性に変化は見られなかった（Ｃ／Ｉ ＶＥＰ比：２．４４±０．１、ｎ＝２）。一方、ＢＤＮＦの皮質内注入を実施した成体ラットは、ＭＤに応じてＯＤシフトを示した（Ｃ／Ｉ ＶＥＰ比：１．３２±０．０８、ｔ検定：Ｐ＜０．００１、ｎ＝４）（図２のＣ）。
【００５０】
１．２．４． 成塾視覚皮質のＧＡＢＡ作動性神経伝達に対する、フルオキセチンの反復経口投与の影響
フルオキセチン誘導性の視覚皮質可塑性がＧＡＢＡ作動性神経伝達の変化と同時に起こるのか否かについて、in vivoの脳微小性透析を用いて調査した。γ−アミノブチル酪酸（ＧＡＢＡ）の細胞外基礎レベルを定量したところ、対照と比べて、フルオキセチン処置成体ラットの視覚皮質において皮質内抑制が有意に減少していることが判明した（図３のＡ）（二元配置分散分析ＡＮＯＶＡ：ｐ＝０．０２、post hoc Holm-Sidak検定：ｐ＜０．０２、ｎ＝５）。フルオキセチン処置動物と対照動物の間で、細胞外グルタメート（ＧＬＵ）レベルに違いは見られなかった（データは示さない）。
【００５１】
皮質内抑制の減少を更に評価するために、白質からのシータバースト刺激の後のII層−III層電位の長期増強（ＷＭ−ＬＴＰ）、即ち、皮質内抑制性回路の成熟故に成体には存在しないシナプス可塑性の一形態（Artola and Singer, 1987、Kirkwood and Bear, 1994）について調べた。注目すべきことに、フルオキセチン処置成体ラットにおいてＷＭ−ＬＴＰは完全に回復していた（図３のＢ）。対照動物にはＷＭ−ＬＴＰは見られなかった。
【００５２】
成人期における視覚皮質の可塑性の再開の根底に皮質内抑制の減少が存在するか否かを直接調べるために、ＭＤの期間中にベンゾジアゼピンの作動薬であるジアゼパム（２ｍｇ・μｌ-1）またはベヒクル溶液を皮質内注入したフルオキセチン処置成体ラットのＯＤを評価した（図３のＡ）。フルオキセチンの長期間処置を行った成体ラットにおけるジアゼパムの皮質投与は、ＭＤによって誘導されるＯＤシフトを完全に防止した（図３のＢ）。ベヒクル溶液の皮質内注入を実施した対照動物は、ＭＤ後に、遮蔽していない眼の方にＯＤシフトを示した（Ｃ／Ｉ ＶＥＰ比：１．０７±０．０４、ｔ検定：Ｐ＝０．０１、ｎ＝３）。
【００５３】
特許文献
WO 9425034 Al (University of Pennsylvania), 1994.
WO 0152832 Al (Valley Forge Pharmaceuticals), 2001.
WO 03032975 Al (The Trustees of the University of Pennsylvania), 2003.
US 5567731 A (Laties A., et al.), 1996.
US 5571823 A (Stone R. A., et al.), 1996.
US 2003114830 Al (Guerrero J.M.), 2003)
【００５４】
非特許文献
Artola A, Singer W (1987) Long-term potentiation and NMDA receptors in rat visual cortex. Nature 330:649-652.
Berardi, N., Pizzorusso, T., Ratto, G.M., and Maffei, L. (2003). Molecular basis of plasticity in the visual cortex. Trends in Neurosciences 26, 369-378.
Calabresi P, Fedele E, Pisani A, Fontana G, Mercuri NB, Bernardi G, Raiteri M (1995) Transmitter release associated with long-term synaptic depression in rat corticostriatal slices. Eur J Neurosci 7:1889-1894.
Campos EC, Fresina M. (2006) Medical treatment of amblyopia: present state and perspectives. Strabismus. 2006 14:71-3.
Castren, E. (2004). Neurotrophic effects of antidepressant drugs. Curr. Opin. Pharmacol. 4, 58-64.
Hernandez L, Stanley BG, Hoebel BG (1986) A small, removable microdialysis probe. Life Sci 39:2629-2637.
Holmes,J.M. and Clarke,M.P. (2006). Amblyopia. The Lancet 367, 1343-1351.
Huang ZJ, Kirkwood A, Pizzorusso T, Porciatti V, Morales B, Bear MF, Maffei L, Tonegawa S (1999) BDNF regulates the maturation of inhibition and the critical period of plasticity in mouse visual cortex. Cell 98:739-755.
Kirkwood A, Bear MF (1994) Hebbian synapses in visual cortex. J Neurosci 14:1634-1645.
Nibuya M, Morinobu S, Duman RS (1995) Regulation of BDNF and trkB mRNA in rat brain by chronic electroconvulsive seizure and antidepressant drug treatments. J Neurosci 15:7539-7547.
Pizzorusso T, Medini P, Berardi N, Chierzi S, Fawcett JW, Maffei L. (2002). Reactivation of ocular dominance plasticity in the adult visual cortex. Science, 298:1248-1251.
Pizzorusso T, Medini P, Landi S, Baldini S, Berardi N, Maffei L. (2006). Structural and functional recovery from early monocular deprivation in adult rats. Proc Natl Acad Sci U S A, 103:8517-8522.
Porciatti V, Pizzorusso T, Maffei L (1999) The visual physiology of the wild type mouse deter- mined with pattern VEPs. Vision Res 39:3071-3081.
Prusky GT, West PW, Douglas RM (2000) Behavioral assessment of visual acuity in mice and rats. Vision Res 40:2201-2209.
Sale A, Maya Vetencourt JF, Medini P, Cenni MC, Baroncelli L, De Pasquale R, Maffei L (2007) Environmental enrichment in adulthood promotes amblyopia recovery through a reduction of intracortical inhibition. Nat Neurosci 10: 679-681.
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】フルオキセチンによる反復処置後に見られる、成体における弱視の回復。（Ａ）成体の視覚皮質における可塑性の回復。フルオキセチン処置成体ラットにおける片眼遮蔽（ＭＤ）は、遮蔽していない眼に対する視覚皮質ニューロンの眼球優位性（ＯＤ）シフトを誘導したが（Ｃ／Ｉ ＶＥＰ比：１．０±０．０８、ｔ検定： ｐ＜０．００１、ｎ＝５）、対照動物では誘導しなかった（Ｃ／Ｉ ＶＥＰ比：２．７３±０．２、ｎ＝５）。 （Ｂ）〜（Ｃ）フルオキセチンによって反復処置した成体弱視ラットにおける視力（ＶＡ）の回復。以前に遮蔽した眼のＶＡを、電気生理学的に評価した結果（Ｂ）および行動学的に評価した結果（Ｃ）である。遮蔽していた眼のＶＡは対照動物の未処置眼よりも低かったが（対応有ｔ検定：ａはｐ＜０．００１、ｂはｐ＜０．００１、ｎ＝５）、フルオキセチン処置成体ラットにおいてはそのような傾向は見られなかった（対応有ｔ検定：（Ｂ）はｐ＝０．７０３、（Ｃ）はｐ＝０．３５４、ｎ＝５）。 （Ｄ）フルオキセチンによって反復処置した成体弱視ラットにおける両眼性（ＯＤ）の回復。Ｃ／Ｉ ＶＥＰ比は、対照（Ｃ／Ｉ ＶＥＰ比：１．１１±０．２０）と比べて、フルオキセチン処置成体ラットの視覚皮質（Ｃ／Ｉ ＶＥＰ比：２．２５±０．１７）において有意に高く（ｔ検定：ｐ＜０．００２、ｎ＝５）、その値は正常視の動物成体の範囲内だった。エラーバーは標準誤差、＊は統計的有意性を示す。
【図２】抗うつ剤処置後のＢＤＮＦタンパク質の発現。ＥＬＩＳＡで定量したＢＤＮＦの発現は、対照動物と比べて、フルオキセチンによって反復処置した成体ラットの視覚皮質（ｔ検定：ｐ＜０．０４、ｎ＝６）（Ａ）および海馬（ｔ検定：ｐ＜０．０１、ｎ＝６）（Ｂ）において有意に高かった。エラーバーは標準誤差、＊は統計的有意性を示す。 （Ｃ）ＢＤＮＦの皮質内投与。ＢＤＮＦを皮質に注入した成体動物は、対照と比べて、遮蔽した眼と反対側の視覚皮質にＯＤシフトを示した（ｔ検定：Ｐ＜０．００１、ｎ＝４）。エラーバーは標準誤差、＊は統計的有意性を示す。
【図３】抗うつ薬による反復処置後の成体ラット視覚皮質における皮質内抑制の減少とＢＤＮＦ発現の増加。（Ａ）フルオキセチン処置成体ラットの視覚皮質における脳微小透析。ＧＡＢＡの基礎細胞外レベルは、対照よりもフルオキセチン処置動物において有意に低かった（二元配置分散分析ＡＮＯＶＡ：ｐ＝０．０２、post hoc Holm-Sidak検定：ｐ＜０．０２、ｎ＝５）。（Ｂ）成塾視覚皮質における神経伝達の長期増強（ＬＴＰ）。白質からのシータバースト刺激（ＴＢＳ）の２０〜３０分後に測定した神経伝達のＬＴＰ（ＷＭ−ＬＴＰ）は、対照ラットと比べて、フルオキセチン処置動物の視覚皮質において有意に増強されていた（二元配置分散分析ＡＮＯＶＡ：ｐ＜０．００５、post hoc Student-Newman-Keuls検定：ｐ＜０．０１）。スケールバーは、基礎値の振幅の５０％および５ｍｓである。（Ｃ）および（Ｄ）：ジアゼパムの皮質内投与は、長期フルオキセチン投与の誘導するＯＤ可塑性の回復を防止した。（Ｃ）実施した実験手法を示す模式図（上）、および遮蔽した眼と反対側の両眼性視覚皮質における、浸透圧ミニポンプインプラント部位ならびにＶＥＰ記録部位を示す模式図（下）。ベンゾジアゼピンの作用薬であるジアゼパム（Ｄｚ）の皮質内投与は、抗うつ剤処置の最後の週にＭＤと並行して実施した。（Ｄ）Ｄｚの皮質内注入を行ったフルオキセチン処置ラットにおけるＯＤ可塑性の封鎖。ベンゾジアゼピンの作用薬であるジアゼパム（Ｄｚ）の皮質内投与を行ったフルオキセチン処置成体動物（Fluox + Dz）においては、ＭＤ後の遮蔽した眼と反対側の視覚皮質におけるＣ／Ｉ ＶＥＰ比は、対照（遮蔽なし）動物とほとんど変わらなかったが（Ｃ／Ｉ ＶＥＰ比：２．４８±０．２９、ｔ検定：Ｐ＝０．４８３、ｎ＝４）、長期フルオキセチン処置を行った成体ラット（Fluox）（ｔ検定：Ｐ＝０．００１、ｎ＝５）とも、ベヒクル養液の皮質内注入を行った動物（Fluox + Veh）（ｔ検定：Ｐ＝０．０１、ｎ＝３）とも有意に異なっていた。エラーバーは標準誤差、＊は統計的有意性を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生後視覚発達の臨界期を過ぎたヒトの弱視を治療または緩和するための薬剤の製造のための、少なくとも１種の抗うつ剤の使用。
【請求項２】
生後視覚発達の臨界期を過ぎたヒトの弱視を治療または緩和するための薬剤の製造のための、大脳皮質内の脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）のレベルを向上させる化合物の使用。
【請求項３】
生後視覚発達の臨界期を過ぎたヒトの弱視を治療または緩和するための薬剤の製造における、大脳皮質におけるγ-アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）介在性の抑制作用を低減する化合物の使用。
【請求項４】
該薬剤の投与を、弱視の目の使用を支持または促進する手段の適用と共に行うことを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の使用。
【請求項５】
該薬剤の投与を、弱視の目の使用を支持または促進する手段の適用の前、該適用と同時、若しくは該適用の前並びに該適用と同時に行うことを特徴とする請求項４に記載の使用。
【請求項６】
該薬剤を連続的に投与し、弱視の目の使用を支持または促進する手段を周期的に適用することを特徴とする請求項５に記載の使用。
【請求項７】
弱視の目の使用を支持または促進する該手段が、弱視ではない方の目の視覚の物理的遮蔽、及び弱視ではない方の目の視覚の薬理学的遮蔽よりなる群から選ばれることを特徴とする請求項４〜６のいずれかに記載の使用。
【請求項８】
該抗うつ剤が、選択的セロトニン再取り込み阻害薬群（ＳＳＲＩ）より選ばれることを特徴とする請求項１に記載の使用。
【請求項９】
該選択的セロトニン再取り込み阻害薬が、フルオキセチン、フルボキサミン、パロキセチン、セルトラリン、シタロプラム及びエスシタロプラムよりなる群から選ばれることを特徴とする請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
該抗うつ剤が、フルオキセチンであることを特徴とする請求項１に記載の使用。
【請求項１１】
該薬剤が、経口投与用であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の使用。
【請求項１２】
生後視覚発達の臨界期を過ぎたヒトの弱視を治療または緩和するための方法に用いる抗うつ剤。
【請求項１３】
生後視覚発達の臨界期を過ぎたヒトの弱視を治療または緩和するための方法に使用される化合物であって、大脳皮質内の脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）のレベルを向上させる化合物。
【請求項１４】
生後視覚発達の臨界期を過ぎたヒトの弱視を治療または緩和するための方法に使用される化合物であって、大脳皮質におけるγ-アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）介在性の抑制作用を増加させる化合物。
【請求項１５】
生後視覚発達の臨界期を過ぎた弱視のヒトに、ヒトのうつ症状を緩和する少なくとも１種の薬剤（抗うつ剤）を有効量投与することを包含する、弱視のヒトを治療するための方法。
【請求項１６】
生後視覚発達の臨界期を過ぎた弱視のヒトに、大脳皮質内の脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）のレベルを向上させる少なくとも１種の化合物を有効量投与することを包含する、弱視のヒトを治療するための方法。
【請求項１７】
生後視覚発達の臨界期を過ぎた弱視のヒトに、大脳皮質におけるγ-アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）介在性の抑制作用を減少させる少なくとも１種の化合物を有効量投与することを包含する、弱視のヒトを治療するための方法。
【請求項１８】
該薬剤が、選択的セロトニン再取り込み阻害薬群（ＳＳＲＩ）より選ばれることを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
該選択的セロトニン再取り込み阻害薬が、フルオキセチン、フルボキサミン、パロキセチン、セルトラリン、シタロプラム及びエスシタロプラムよりなる群から選ばれることを特徴とする請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
該抗うつ剤が、フルオキセチンであることを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
該薬剤または化合物を経口投与することを特徴とする請求項１５〜１７のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
該薬剤または化合物の投与を、弱視の目の使用を支持または促進する手段の適用と共に行うことを特徴とする請求項１５〜１７のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
該薬剤または化合物の投与を、弱視の目の使用を支持または促進する手段の適用の前、該適用と同時、若しくは該適用の前並びに該適用と同時に行うことを特徴とする請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
該薬剤または化合物を連続的に投与し、弱視の目の使用を支持または促進する手段を周期的に適用する特徴とする請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
弱視の目の使用を支持または促進する該手段が、弱視ではない方の目の視覚の物理的遮断、及び弱視ではない方の目の視覚の薬理学的遮断よりなる群から選ばれることを特徴とする請求項２２〜２４のいずれかに記載の方法。
【請求項１】
生後視覚発達の臨界期を過ぎたヒトの弱視を治療または緩和するための薬剤の製造のための、少なくとも１種の抗うつ剤の使用。
【請求項２】
生後視覚発達の臨界期を過ぎたヒトの弱視を治療または緩和するための薬剤の製造のための、大脳皮質内の脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）のレベルを向上させる化合物の使用。
【請求項３】
生後視覚発達の臨界期を過ぎたヒトの弱視を治療または緩和するための薬剤の製造における、大脳皮質におけるγ-アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）介在性の抑制作用を低減する化合物の使用。
【請求項４】
該薬剤の投与を、弱視の目の使用を支持または促進する手段の適用と共に行うことを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の使用。
【請求項５】
該薬剤の投与を、弱視の目の使用を支持または促進する手段の適用の前、該適用と同時、若しくは該適用の前並びに該適用と同時に行うことを特徴とする請求項４に記載の使用。
【請求項６】
該薬剤を連続的に投与し、弱視の目の使用を支持または促進する手段を周期的に適用することを特徴とする請求項５に記載の使用。
【請求項７】
弱視の目の使用を支持または促進する該手段が、弱視ではない方の目の視覚の物理的遮蔽、及び弱視ではない方の目の視覚の薬理学的遮蔽よりなる群から選ばれることを特徴とする請求項４〜６のいずれかに記載の使用。
【請求項８】
該抗うつ剤が、選択的セロトニン再取り込み阻害薬群（ＳＳＲＩ）より選ばれることを特徴とする請求項１に記載の使用。
【請求項９】
該選択的セロトニン再取り込み阻害薬が、フルオキセチン、フルボキサミン、パロキセチン、セルトラリン、シタロプラム及びエスシタロプラムよりなる群から選ばれることを特徴とする請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
該抗うつ剤が、フルオキセチンであることを特徴とする請求項１に記載の使用。
【請求項１１】
該薬剤が、経口投与用であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の使用。
【請求項１２】
生後視覚発達の臨界期を過ぎたヒトの弱視を治療または緩和するための方法に用いる抗うつ剤。
【請求項１３】
生後視覚発達の臨界期を過ぎたヒトの弱視を治療または緩和するための方法に使用される化合物であって、大脳皮質内の脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）のレベルを向上させる化合物。
【請求項１４】
生後視覚発達の臨界期を過ぎたヒトの弱視を治療または緩和するための方法に使用される化合物であって、大脳皮質におけるγ-アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）介在性の抑制作用を増加させる化合物。
【請求項１５】
生後視覚発達の臨界期を過ぎた弱視のヒトに、ヒトのうつ症状を緩和する少なくとも１種の薬剤（抗うつ剤）を有効量投与することを包含する、弱視のヒトを治療するための方法。
【請求項１６】
生後視覚発達の臨界期を過ぎた弱視のヒトに、大脳皮質内の脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）のレベルを向上させる少なくとも１種の化合物を有効量投与することを包含する、弱視のヒトを治療するための方法。
【請求項１７】
生後視覚発達の臨界期を過ぎた弱視のヒトに、大脳皮質におけるγ-アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）介在性の抑制作用を減少させる少なくとも１種の化合物を有効量投与することを包含する、弱視のヒトを治療するための方法。
【請求項１８】
該薬剤が、選択的セロトニン再取り込み阻害薬群（ＳＳＲＩ）より選ばれることを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
該選択的セロトニン再取り込み阻害薬が、フルオキセチン、フルボキサミン、パロキセチン、セルトラリン、シタロプラム及びエスシタロプラムよりなる群から選ばれることを特徴とする請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
該抗うつ剤が、フルオキセチンであることを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
該薬剤または化合物を経口投与することを特徴とする請求項１５〜１７のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
該薬剤または化合物の投与を、弱視の目の使用を支持または促進する手段の適用と共に行うことを特徴とする請求項１５〜１７のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
該薬剤または化合物の投与を、弱視の目の使用を支持または促進する手段の適用の前、該適用と同時、若しくは該適用の前並びに該適用と同時に行うことを特徴とする請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
該薬剤または化合物を連続的に投与し、弱視の目の使用を支持または促進する手段を周期的に適用する特徴とする請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
弱視の目の使用を支持または促進する該手段が、弱視ではない方の目の視覚の物理的遮断、及び弱視ではない方の目の視覚の薬理学的遮断よりなる群から選ばれることを特徴とする請求項２２〜２４のいずれかに記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公表番号】特表２０１０−５３１８５８（Ｐ２０１０−５３１８５８Ａ）
【公表日】平成２２年９月３０日（２０１０．９．３０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５１４０２３（Ｐ２０１０−５１４０２３）
【出願日】平成２０年６月２７日（２００８．６．２７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＩ２００８／０５０３９２
【国際公開番号】ＷＯ２００９／００４１１４
【国際公開日】平成２１年１月８日（２００９．１．８）
【出願人】（５１０００３２２１）ハーモ ファーマ オイ (1)
【氏名又は名称原語表記】ＨＥＲＭＯ ＰＨＡＲＭＡ ＯＹ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年９月３０日（２０１０．９．３０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年６月２７日（２００８．６．２７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＩ２００８／０５０３９２
【国際公開番号】ＷＯ２００９／００４１１４
【国際公開日】平成２１年１月８日（２００９．１．８）
【出願人】（５１０００３２２１）ハーモ ファーマ オイ (1)
【氏名又は名称原語表記】ＨＥＲＭＯ ＰＨＡＲＭＡ ＯＹ
【Ｆターム（参考）】
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