微小管相互作用薬の脂質−油−水型ナノエマルジョンデリバリシステム
人を含む温血動物で癌などの細胞過剰増殖によって特徴づけられる疾病、状態、症候群またはこれらの症状を治療、診断および予防する際に有益な医薬組成物およびこの使用方法と調製方法は、均質化を介した処理によって調製された脂質ナノエマルジョンであって、異常細胞内に優先的および選択的に能動的に内在化することが可能な少なくとも１つの非二層形成脂質をそれぞれ含む脂質粒子で構成された脂質ナノエマルジョンと；ナノエマルジョンに連結された有効量の少なくとも１つの治療用または診断用の微小管相互作用薬と；薬剤的に受容可能な担体とを組み込む。好適な実施形態では、この組成がさらに、タンパク質担体分子ならびに／または界面活性剤、植物性脂肪源、溶媒、およびこれらの組み合わせなどの乳化促進剤で構成されてもよい。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、治療薬と診断薬に関し、特に患者への導入に適しており、腫瘍細胞を含む過剰増殖によって特徴づけられた細胞内へ活性選択剤の濃度を促進可能な脂質−油−水のナノエマルジョンの微小管相互作用薬の製剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
腫瘍内およびこれらの微環境内の薬剤分布の役割は十分に研究されていない。現在、有効性を知るために、最も効き目のある薬剤でさえ高用量を投与して拡散と組織分布を促進しなければならない。しかしながら、腫瘤内の薬剤濃度を高めることが常に細胞の薬剤濃度あるいは細胞内の標的への到達能を高めるとは限らない。実際に、ある薬剤はポリマ結合、リポソームカプセル化、または固体脂質ナノ粒子製剤によって腫瘤内濃度を高めるかもしれないが、これらは事実上細胞の吸収量と分布を阻害するであろう。さらに、拡散によって腫瘍浸透を促進するために高用量投与することは一般に高い死亡率の癌治療に関連する副作用をもたらす場合がある。このため、腫瘍組織への薬剤浸透を改善し、高い安全性と有効性の側面を同時に提供しながら腫瘍細胞内のその濃度を高めるドラッグデリバリ技術を考案することが望ましい。腫瘍内への薬剤の受動的な蓄積について種々のアプローチが探究されているが、活発な腫瘍細胞の吸収量の促進について有効な技術はほとんどない。
【０００３】
脂溶性薬剤は容易に細胞膜に浸透し、細胞内へ輸送されるであろう。癌細胞などの過剰増殖によって特徴づけられた細胞は、一般に異常な脂質代謝を示し、脂質と脂肪酸の非常に高い優先的な吸収によって特徴づけられる。このように癌に関して脂質は、膜構造、成長および転移、信号伝達、ならびに輸送過程に不可欠な役割を果たすことが分かった。
【０００４】
腫瘍血管に特有の漏出性の特徴によって引き起こされ、脂質粒子、リポソーム、人工ナノ粒子、および他の高分子剤の強化された浸透性と貯留（ＥＰＲ）効果として知られている現象は固形腫瘍で一般的であり、例えばポリマ結合抗癌剤のより選択的なターゲティングと腫瘤蓄積について探究されてきた。ポリマ小胞、リポソーム、および固体ポリマ粒子あるいは脂質ナノ粒子などの封入剤の使用は、それぞれ様々な組成、製剤および構造で調製され、様々な生理学的条件下で投与されており、先行技術で報告されてきた。しかしながら、これらの作用薬は腫瘍に受動的な蓄積を可能にするに過ぎない。さらに、これらの作用薬はしばしば細網内皮系の広範囲の共蓄積によって循環系から急速に追い出され、しばしばこれらの作用薬の使用は細胞毒性に関連し、免疫反応を増強する。
【０００５】
複数のレセプタタイプとレセプタサブタイプ、輸送タンパク、および脂質ラフト現象は、同じ疾病を持つが変質した遺伝的特徴を持つ患者間でさえ、癌細胞内の脂質吸収量に関係する可能性があることを研究が示した。天然のレセプタ配位子を模倣し、癌細胞の標的と薬剤吸収量を増加する脂質型ナノ粒子またはＨＤＬもしくはＬＤＬ型薬物担体が、様々な治療薬と共に調製されているが、癌治療の能動的な腫瘍細胞の薬剤吸収を促進する最適化された製剤が欠けている。
【０００６】
参照により本書に組み込まれるＤ’Ａｒｒｉｇｏの米国特許第４６８４４７９号明細書および第５２１５６８０号明細書は、ガスあるいは空気で満たされた脂質コートマイクロバブル（ＬＣＭ）の製剤と、この製造方法および使用方法について記載しており、超音波法とドラッグデリバリの造影剤として用いられる。ＬＣＭの製造プロセスは、特定の鎖長で一定比率の飽和グリセリドとコレステロールエステルなどの非イオン脂質の水性懸濁液の単純な機械的振動に基づいている。全ての場合において、加えられた大部分の脂質（９９％）は凝集または沈殿し、ろ過による材料の追加損失を１％以下生じる。さらに、これらの人工ＬＣＭはとても長寿命であることが分かり、６ヶ月以上生体外で持ちこたえた。さらに、少ないろ過収量にも拘わらず、ＬＣＭは、腫瘍組織の微小循環系の有窓毛細血管壁を通過するのに十分に小さく十分に柔軟である。特に注目は、げっ歯類の脳腫瘍細胞内やイヌの自発性腫瘍内のＬＣＭの高い選択性、温度依存性、明らかな飽和吸収性であり、癌細胞のある脂質の自然吸収量によく似ていると考えられる。しかしながら、現在まで患者投与の有害な副作用を存在しないレベルまで最小化するＬＣＭ技術を利用した医薬品化合物の有効な製剤はなかった。
【０００７】
パクリタキセルはタキサンとして知られている薬剤の種類の要素であり、北米西岸イチイ木、セイヨウイチイ、および近縁種の樹皮から最初に分離される。アレルギ反応は製剤賦形剤で観察されたが、タキサンは卵巣癌、胸部癌、非小細胞肺癌、および頭頸部癌などの様々な癌の治療で有用であることが分かった。タキサンを投与する際の難しさは、この薬剤が一般に水に溶けないということである。従って、パクリタキセルはＣｒｅｍｏｐｈｏｒＥＬ（登録商標）（ポリオキシエチレンヒマシ油）とエタノールとの１：１の混合物内に調剤され、タキソール（登録商標）（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ社）を生成した。外部に結晶化する総ての薬剤を除去する直列型のろ過と共に、約１２時間安定する適切な担体の再構成が必要である。タキソール（登録商標）は神経毒性を示し、知覚障害を引き起こし、時には患者の運動神経障害を伴った。ＣｒｅｍｏｐｈｏｒＥＬ（登録商標）は、それ自体深刻な副作用がないので神経障害の一部の要因である。
【０００８】
安定した脂肪乳剤にパクリタキセルを製剤する試みも同様に失敗した。この薬剤は、大豆油を最初に含むイントラリピッド（登録商標）、または大豆とベニバナ油との混合物を含むリポシン（登録商標）などの脂肪乳剤に溶けないことが報告されている。大豆またはベニバナ油の何れかでパクリタキセルを加熱しても、あるいは超音波処理しても相当量の薬剤が溶解せず、均質化ステップ中の脂肪乳剤へのパクリタキセルの添加は一様に期待外れの結果に直面する。パクリタキセルを最大１５ｍｇ／ｍＬ組み込む乳剤は、トリアセチン、Ｌ−αレシチン、ポリソルベート８０、プルロニックＦ−６８、オレイン酸エチルおよびグリセロールと共に調剤された。しかしながら、これらの乳剤は非常に有毒で不安定である。パクリタキセルはさらに、ＬＣＭ製剤のＣｒｅｍｏｐｈｏｒＥＬ（登録商標）とエタノールとに結合された。しかしながら、ＬＣＭの腫瘍吸収の選択性はドラッグデリバリの観点から魅力的であるが、先行技術によれば製造歩留まりと薬剤積載能力が低すぎて実用的でない。パクリタキセルを持つＣｒｅｍｏｐｈｏｒＥＬ（登録商標）とエタノールの使用はさらに、恐らくこの製剤の毒性の一因となっている。
【０００９】
さらに、生産方法が複雑であり、条件の小さな変更が粒子径と性能特性とに有意差をもたらす場合がある。典型的なアプローチは、高せん断力均質化と超音波、高圧均質化、ホットホモジナイゼーション、コールドホモジナイゼーション、および溶媒乳化蒸発を含む。無菌ろ過または放射線による滅菌はさらに複雑かもしれない。このように、エタノールと水溶液への薬剤の添加、続いて高せん断力均質化によるＬＣＭの薬剤積載量と脂質溶解度を高める試みは、全く薬剤を含まない安定性に乏しくガスのない粒子の製剤をもたらす。
【００１０】
腫瘤内の蓄積と細胞内在化を同時に促進するが、健康な組織内の蓄積を制限する適切な輸送媒体に治療薬を投与することが非常に望ましい。より有効なデリバリにより、僅かな副作用または低減した副作用で同じ治療結果またはより良好な治療結果を達成しながら、全身の健康な組織の治療薬の濃度が減少されてもよい。固有レベルの腫瘍細胞選択性を持つ作用薬のこのデリバリは、さらなる利点を提供するであろう。さらに、単一の腫瘍型に限定されないが、腫瘤内の選択的な蓄積と種々の癌細胞型への細胞内在化とを可能にする輸送媒体が特に望ましく、より安全でより有効な癌治療を可能にするであろう。治療薬の高い積載能力を可能にする輸送媒体はさらに、この分野で著しい進歩となるであろう。
【００１１】
このため、安定的で、容易に調製され、生体適合性があり、効果的な製剤の微小管相互作用薬であって、腫瘍細胞への吸収を促進し、さらに最小限の副作用を示すパクリタキセルなどのタキサンを含んだ微小管相互作用薬に対する明らかな要望がある。
【００１２】
本発明の目的と産業上の利用可能性
従って、本発明の目的は、癌などの細胞過剰増殖によって特徴づけられる疾病、状態、および症候群の治療または診断で用いられる医薬組成物であって、腫瘍細胞への迅速で高い選択性と優先的な吸収性を示す医薬組成物を提供することである。
【００１３】
本発明の更なる目的は、癌などの細胞過剰増殖によって特徴づけられる疾病、状態、および症候群の治療または診断で用いられる医薬組成物であって、投与の際に最小限の副作用を引き起こす医薬組成物を提供することである。
【００１４】
また本発明の更なる目的は、癌などの細胞過剰増殖によって特徴づけられる疾病、状態、および症候群の治療または診断で用いられる医薬組成物であって、最小限の費用で容易に製造することができ、可能な限り長期間に渡って貯蔵することができる医薬組成物を提供することである。
【発明の概要】
【００１５】
これらの目的を達成するため、本発明は、人を含む温血動物の細胞過剰増殖によって特徴づけられる疾病、状態、もしくは症候群またはこれらの症状を治療、診断、または予防するのに有用な医薬組成物であって、以下に規定される脂質粒子であって、水相内に一様に分散されて、癌細胞を含む異常細胞内に選択的または優先的に内在化することが可能な脂質粒子で構成された脂質ナノエマルジョンと；前記脂質ナノエマルジョンに連結された少なくとも１つの有効量の治療薬または診断薬と；薬剤的に受容可能な担体とを含む医薬組成物を提供する。
【００１６】
この脂質粒子は少なくとも１つの非二層形成脂質をそれぞれ具える。この適切な脂質粒子は、癌細胞を含む過剰増殖によって特徴づけられた異常細胞内に治療薬または診断薬の標的されたデリバリと濃度を著しく高めることが分かっており、所望の治療効果を達成するのに必要な投与量と投与頻度を減少または少なくとも維持しながら治療効率と生体利用性を改善した。さらに、ナノエマルジョンは拡張された持続時間の優秀な物理的および化学的な安定性を示し、これによって安定的にすぐに投与できる形態で医薬組成物の販売前包装を非常に容易にし、さらにこれによって類似活性剤を含む先行技術の組成で現在実施されるような病床での希釈と製剤に関連した問題と不便さをなくしている。
【００１７】
この脂質粒子は薬剤的に活性な治療効果のある微小管相互作用薬を自身に連結した。適切な微小管相互作用薬は、限定されないが、例えばパクリタキセルなどのタキサンと；エポチロンと；例えばビンクリスチンなどのビンカアルカロイドと；エリュテロビンと；ジスコデルモリドと；ドラスチンと；コルヒチンと；コンブレスタチンと；フォモプシンＡと；ハリコンドリンＢと；スポンギスタチン１と；サルコジクチンと；ラウリマリドと；これらの誘導体、類似体、同属種および前述した各作用薬の組み合わせとを含む。微小管相互作用薬は、過剰増殖した細胞の成長を止めるか、または少なくとも中断するのに十分な量で存在する。
【００１８】
本発明の更なる態様では、人を含む温血動物の癌を含む細胞過剰増殖によって特徴づけられる疾病、状態または症候群を診断、治療または予防する方法であって、本書で開示された有効量の医薬組成物を温血動物に投与するステップを含む方法が提供される。
【００１９】
また本発明の更なる態様では、本書で開示された医薬組成物を調剤する方法であって、ａ）少なくとも１つの非二層形成脂質を少なくとも１つの有効量の診断薬または治療薬と混合して脂質部を得るステップと；ｂ）脂質部を水相に加えて分散を得るステップと；ｃ）分散を高せん断力の条件下で撹拌して少なくとも１つの非二層形成脂質を十分に分散し、脂質粒子で構成された脂質ナノエマルジョンを形成するステップと、を含む方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
以下の図面は本発明の実施形態の例示であり、明細書と特許請求の範囲全体に含まれるアプリケーションの範囲を限定するよう意図されていない。
【図１】図１は、本発明に係る２０％のＤＭＳＯに１０％のパクリタキセルを充填した脂質粒子の粒径分布とゼータ電位を示す図である。
【図２】図２は、ショ糖密度の研究におけるパクリタキセル充填脂質粒子の溶解率をプロットするグラフによって本発明に係る脂質粒子へのパクリタキセルの組み込みを示す図である。
【図３】図３Ａおよび図３Ｂは、本発明に係る細胞の脂質粒子吸収量を蛍光活性化細胞分類によって定量化することができることを示すグラフである。
【図４】図４Ａ−図４Ｄは、ＨＴ−２９結腸腫瘍細胞とＳＦ−５３９肺腫瘍細胞と比べた腫瘍細胞株による本発明に係る細胞の脂質粒子吸収量を示すグラフである。
【図５】図５は、ＣｒｅｍｏｐｈｏｒＥＬ（登録商標）で製剤されたパクリタキセルより本発明に係るある特定の混合物の脂質粒子で調剤されたパクリタキセルを腫瘍細胞が大量に取り込むことを示すグラフである。
【図６】図６は、ＬＮとＣｒｅｍｏｐｈｏｒＥＬ（登録商標）の双方を２時間薬剤培養後にパクリタキセルの細胞吸収量がプラトーに達したことを示すグラフである。
【図７】図７は、パクリタキセルの量が本発明に係る脂質粒子の細胞吸収量に対して飽和しているかどうかを測定する実験結果を示す図である。
【図８】図８Ａおよび図８Ｂは、コレステロールが本発明に係る脂質粒子の細胞吸収量の重大な成分であることを示すグラフである。
【図９】図９Ａおよび図９Ｂは、ＣｒｅｍｏｐｈｏｒＥＬ（登録商標）内のパクリタキセルより本発明に係る脂質粒子内のパクリタキセルが多く内在化することを示すグラフである。
【図１０】図１０Ａ−図１０Ｄは、パクリタキセル単独対本発明に係る脂質粒子内のパクリタキセルの細胞毒性を示すグラフである。
【図１１】図１１は、ＣｒｅｍｏｐｈｏｒＥＬ（登録商標）内に製剤された場合より本発明に係る脂質粒子内に調剤された場合にパクリタキセルがより強い細胞毒性を有することを示す図である。
【図１２】図１２Ａおよび図１２Ｂは、ＣｒｅｍｏｐｈｏｒＥＬ（登録商標）内に調剤された場合により本発明の脂質粒子内に調剤された場合に、パクリタキセルが著しく強い抗腫瘍活性を有することを示すグラフを示す。
【図１３】図１３は、ＥｍＰＡＣ、アブラキサン（登録商標）、またはタキソール（登録商標）により治療され、パクリタキセル特異抗体で染色されたＡ５４９細胞の代表的な画像である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明は一般に、温血動物の細胞過剰増殖によって特徴づけられる疾病、状態もしくは症候群またはこれらの症状を治療、診断または予防するための医薬品組成物に向けられている。この動物は、癌を含む細胞過剰増殖によって特徴づけられる疾病およびその他の病的状態および症候群に罹患しているヒト、ウマ、ウシ、イヌおよびネコを含む家畜などの哺乳類クラスを含む。本発明の医薬組成物は、脂質粒子で構成されたナノエマルジョンを含み、以下で規定されるように、少なくとも１つの治療用または診断用の微小管相互作用薬に操作的に連結され、これに対して脂質粒子が高い充填能力と、薬剤的に受容可能な担体または賦形剤を有し、これによって腫瘍などの異常細胞と病変組織への選択的なデリバリと有効濃度とに特に適切な脂質粒子を生成する。
【００２２】
ナノエマルジョンの脂質粒子は、腫瘍細胞と腫瘍組織とを含む異常細胞と病変組織への高い受動的な蓄積と能動的な内在化の双方を容易にするよう構築される。脂質粒子が病変組織の血管領域に受動的に蓄積するとき、脂質粒子は能動的な代謝吸収によってこれらの細胞へ取り込まれる。このように、本発明の脂質粒子は、腫瘍と癌細胞とを含む過剰増殖によって特徴づけられた細胞による吸収と内在化を選択的かつ優先的に標的とした輸送媒体を提供する。本書で使用される「内在化」とは、脂質粒子が細胞によって能動的に取り込まれることを意味する。粒子の治療薬または診断薬の高い充填能力と結合されたこの高い内在化レベルは、この標的に有効量の治療薬または診断薬を提供することによって、これらの標的の治療または診断に有力な媒体を提供し、これによって成長、誘導性分化の停止、または細胞の死滅を含む治療上の有益な効果を誘導する。
【００２３】
従って本発明の脂質粒子は、異常細胞と病変組織への治療薬のデリバリを強化するだけでなく、特に先行技術のデリバリシステムと比べて所望の効能を達成するのに必要な治療薬の量を減少する。本発明の脂質粒子は、拡張された時間に渡って物理的および化学的に非常に安定的であり、従って先行技術のデリバリシステムで一般に示される望ましくない沈殿、凝集または不溶による治療薬または診断薬のロスを最小化する。さらに、これらの脂質粒子はその他の長所を示し、これは制御された放出と；強化された薬剤安定性と；正の薬剤充填能力と；疎水性薬物との良好な互換性と；相対的に低い生体有毒性と；低い有機溶媒含有量とを含む。また、本脂質粒子は調製および投与するのが相対的に簡単で便利である。
【００２４】
本書で用いられるように、用語「脂質粒子」は一般にナノサイズの任意の脂質を含む構造を包含するよう意味し、これはナノエマルジョンの一部を形成する実質的に無傷の粒子である。用語「実質的に無傷」とは、リポソームと対比されるとき、膜がない状態で粒子がその形状を維持することをいう。この脂質粒子は少なくとも１つの非二層形成脂質で構成される。
【００２５】
脂質二層構造または脂質二層配置は一般に、親水性端子（極性の頭部）と疎水性端子（非極性の尾部）を有するある種類の脂質によって形成され、水溶液中の脂質分子の２つの対向層に自己組織化する能力および／または傾向を示す。脂質分子の２つの対向層が整列されてこれらの疎水性端子面は互いに対面して油状コアを形成するが、これらの親水性端子面は二層構造の何れかの側の水溶液に対面する。本発明では、用語「非二層形成脂質」は、水溶性の環境で脂質二層構造または脂質二層配置を形成するこの性能および／または傾向を欠く脂質を包含している。非二層形成脂質の実施例は、弱極性の脂質を含み、好ましくは実質的に非極性または中性である脂質を含む。本発明のより好適な脂質は中性脂質である。
【００２６】
本発明の脂質粒子は、米国特許第４６８４４７９号明細書と第５２１５６８０号明細書に記載されたガス含有マイクロバブルと区別され、例えば参照により本書に全て組み込まれる米国特許第６５６５８８９号明細書と第６５９６３０５号明細書に記載されたリポソームと構造上区別される。特に脂質粒子は、生理学的に受容可能である非二層形成脂質の混合物によって形成され、例えばリン脂質を含む帯電脂質または極性脂質がある状態で少なくとも実質的に遊離する。非二層形成脂質の好適例は、飽和カルボン酸および不飽和カルボン酸のグリセロールモノエステルと；飽和脂肪族アルコールのグリセロールモノエステルと；ステロール芳香族酸エステルと；ステロールと；テルペンと；胆汁酸と；胆汁酸のアルカリ金属塩と；脂肪酸のステロールエステルと；糖酸のステロールエステルと；糖酸のエステルと；脂肪族アルコールのエステルと；糖質のエステルと；脂肪酸のエステルと；糖酸と；サポニンと；サポゲニンと；グリセロールと；脂肪酸のグリセロールジエステルと；脂肪酸のグリセロールトリエステルと；脂肪族アルコールのグリセロールジエステルと；脂肪族アルコールのグリセロールトリエステルと；これらの組み合わせと、から選択されたものを含む。
【００２７】
本発明の実施形態では、脂質粒子は非二層形成脂質の選択群の混合物を最初に形成することによって調製され、これは以下に記載されたサイズを持つ脂質粒子であって、標的の病変組織と異常細胞に適用されたときに高い内在化レベルを促進する脂質粒子を提供する。脂質混合物は一般に、
ａ）約９乃至１８の炭素原子を含むカルボン酸のグリセロールモノエステルと、約１０乃至１８の炭素原子を含む脂肪族アルコールとから成る群から選択された少なくとも１つの第１要素と；
ｂ）ステロール芳香族酸エステルから成る群から選択された少なくとも１つの第２要素と；
ｃ）ステロール、テルペン、胆汁酸および胆汁酸のアルカリ金属塩から成る群から選択された少なくとも１つの第３要素と；
ｄ）約１乃至１８の炭素原子を含む脂肪酸のステロールエステルと；糖酸のステロールエステルと；約１０乃至１８の炭素原子を含む糖酸と脂肪族アルコールのエステルと；約１０乃至１８の炭素原子を含む糖質と脂肪酸のエステルと、糖酸と、サポニンと；サポゲニンとから成る群から選択された少なくとも１つの任意の第４要素と；
ｅ）グリセロールと、約１０乃至１８の炭素原子を含む脂肪酸のグリセロールジエステルまたはグリセロールトリエステルと、約１０乃至１８の炭素原子を含む脂肪族アルコールとから成る群から選択された少なくとも１つの任意の第５要素と、を含む。
【００２８】
上記に記載された脂質混合物は要素（ａ）乃至（ｃ）の存在を含むに過ぎないが、脂質粒子のサイズの長期安定性と均一性が、これら２つの任意の要素の存在によって理論上強化されるので、要素（ｄ）および／または（ｅ）を組み込むほうが好適である。
【００２９】
本発明の好適な実施形態では、本発明の脂質粒子を形成する脂質混合物を構成する５つの要素（任意の２つの要素を含む）は、それぞれ（ａ）：（ｂ）：（ｃ）：（ｄ）：（ｅ）が（１−５）：（０．２５−３）：（０．２５−３）：（０−３）：（０−３）の重量比で結合される。
【００３０】
脂質混合物の第１要素は、約１０乃至１８の炭素原子を含む飽和カルボン酸のグリセロールモノエステルを含むよう記載されたが、限定されないが９−炭素オレイン酸またはエライジン酸などの約９乃至１８の炭素原子を含むモノカルボン酸またはポリ不飽和カルボン酸のグリセロールモノエステルも脂質混合物の構造に有用であると考えられる。
【００３１】
脂質混合物の要素の大きさは、限定されないが、デリバリの標的の細胞および／または組織の種類と、充填される治療薬または診断薬と、治療薬または診断薬の所望の投与量と、用いられる薬剤的に受容可能な担体と、投与形態と、その他の賦形剤または添加剤の存在などを含む幾つかの因子に依存して変更してもよいことが理解されるであろう。さらに、標的の病変組織と異常細胞によって脂質粒子を選択的に内在化させることができる因子は、脂質混合物の組成と得られる脂質粒子の構造だけでなく以下に記載される粒子のサイズと分子量も含む。
【００３２】
本発明の脂質粒子は所望の粒径分布を維持しており、好ましくは、粒子の主要部分は約０．０２乃至０．２μ（ミクロン）、好ましくは０．０２μ乃至０．１μの範囲の平均粒子径を有し、上記または以下の範囲に留まる少量の粒子と最大約２００ｎｍの範囲しかない幾つかの脂質粒子とを変更する。本発明の脂質粒子で達成可能な粒子径範囲はさらに、拡張された時間に渡って強化された物理的および化学的安定性と、望ましくない凝集と薬剤沈殿の実質的な減少とへ導く。さらに、この範囲は癌の治療に特に適しており；より大きな粒子は他の利用（例えば、他の種類の細胞または組織のターゲティング）に適合されてもよい。本書で提供される範囲は、使用された脂質混合物と、追加された治療薬または診断薬の種類および量によっていくぶん決定されるであろう。
【００３３】
本発明で用いられる治療薬または診断薬は無帯電または帯電、非極性または極性、天然または合成などでもよい。本書で用いられる用語「治療薬」は、限定されないが、薬剤、ホルモン、ビタミン、栄養素、物質などを含む任意の物質を含み、これは微小管の生成、構造、連結、機能および破壊に影響を与え、これにより、癌を含む細胞過剰増殖によって特徴づけられる疾病、状態、症候群またはこれらの症状の予防と治療で有用である。したがって、本発明で有用な治療薬は、微小管の生成、構造、連結、機能および破壊に影響を与えるあらゆる種類の薬剤と、脂肪親和性ポリペプチドと、細胞毒素と、オリゴヌクレオチドと、細胞毒性抗腫瘍薬と、抗代謝剤と、ホルモンおよび放射性分子とを含む。用語「オリゴヌクレオチド」は、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびセンスオリゴヌクレオチド（例えばベクタとして従来知られている核酸）の双方を含む。オリゴヌクレオチドは、サブユニットまたはサブユニット間の結合に関して「天然」または「修飾」されてもよい。
【００３４】
しかしながら、本発明の特別な態様では、治療薬は微小管相互作用薬であって、例えばパクリタキセル、ドセタセル、セファロマンニンバッカチンＩＩＩ、１０−デアセチルバッカチンＩＩＩ、デアセチルパクリタキセルおよびデアセチル−７−エピパクリタキセルなどのタキサンと；例えばビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビン、ビンデシンおよびこれらの類似体などのビンカアルカロイドと；エポチロンと；エリュテロビンと；ジスコデルモリドと；ドラスチンと；コルヒチンと；コンブレスタチンと；フォモプシンＡと；ハリコンドリンＢと；スポンギスタチン１と；サルコジクチンと；ラウリマリドと；誘導体、類似体、同属種およびこれら前記作用薬の各々の結合と；この微小管相互作用活性を示すと知られている類似薬または類似物質とから成る群から選択した微小管相互作用薬である。
【００３５】
またパクリタキセルなどのタキサンは、より少量の徐放性投与量で抗炎症剤として用いられてもよい。この用途は、ステントなどの患者内に外科的に配置される生体医用器具の分野で特に重要である。ステント周囲およびステント内側の細胞の幾らかの蓄積は、この蓄積が平滑な被覆を形成し、これによって動脈自体にこの器具を組み込むときに好適であるが、この細胞蓄積がさらに内部の通路を妨げて、動脈の再狭窄を引き起こす場合がある。結果として、Ｂｏｓｔｏｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ株式会社は、ステント表面にパクリタキセルを結合する専用ポリマで覆われたパクリタキセル溶出冠状動脈ステントシステムを製造している。パクリタキセルポリマ複合体は、パクリタキセルの投与量と徐放特性を正確に制御することが可能であり、十分な量の薬物の溶出を可能にし、ステント周囲の細胞蓄積を阻害し、ステント周囲の再狭窄と血管再生を著しく防止する。本発明の医薬組成物は、特に治療薬がタキサンまたは他の微小管相互作用薬である場合、外科的に植え込まれた生体医用器具周囲の細胞蓄積を調整するのに同様に有用になると考えられる。
【００３６】
本発明の医薬組成物は、長期的な物理的および化学的安定性を示し、この組成を安定的にすぐに投与できる剤形に便利に販売前包装するのを可能にしており、これによって先行技術の類似組成に一般に関連する投与に先立って病床での希釈と製剤のニーズをなくしている。本発明の医薬組成物は、拡張された期間（例えば約３０℃で少なくとも１４日間および４℃で少なくとも１２ヶ月）に渡って所望の薬剤安定性と乳化安定性を示す。本発明の医薬組成物は、約０．１μｇ／ｍＬ乃至１０００μｇ／ｍＬ、好ましくは約１０μｇ／ｍＬ乃至８００μｇ／ｍＬ、および最も好ましくは約２００μｇ／ｍＬ乃至６００μｇ／ｍＬの量の脂質粒子を含む。医薬組成物の全容積に基づく治療薬または診断薬の典型的な濃度は、少なくとも０．００１重量／体積（ｗ／ｖ）％、好ましくは０．００１乃至９０重量／体積％、およびより好ましくは約０．１乃至２５重量／体積％でよい。医薬組成物に存在する治療薬または診断約の量は、約０．００１μｇ／ｍＬ乃至１０００μｇ／ｍＬ、好ましくは約０．１μｇ／ｍＬ乃至８００μｇ／ｍＬ、およびより好ましくは約６０μｇ／ｍＬ乃至４００μｇ／ｍＬに及んでよい。
【００３７】
本発明の医薬組成物はさらに、植物性脂肪源、溶媒、界面活性剤またはこれらの組み合わせから選択された乳化促進剤を含んでもよい。乳化促進剤は、脂質粒子の望ましくない沈殿または凝集を低減また最小限にすることによって、理論上脂質粒子の安定性を強化し、小さな粒子径特性を維持し、これによって癌細胞への脂質粒子の能動的取り込みに積極的に影響を及ぼし促進することが個々にまたは組み合わせで分かった。乳化促進剤はさらに、本発明の医薬組成物の物理的および化学的安定性と薬剤運搬容量を改善するはずである。
【００３８】
本発明の好適な実施形態では、植物性脂肪源は、例えば大豆油とアマニ油、大麻油、アマニ油、からし油、菜種油、キャノーラ油、ベニバナ油、ゴマ油、ひまわり油、ブドウ種油、アーモンド油、アプリコット油、ヒマシ油、トウモロコシ油、綿実油、ココナッツ油、ヘーゼルナッツ油、ニーム油、オリーブ油、ヤシ油、パーム核油、ピーナッツ油、パンプキンシード油、米ぬか油、くるみ油およびこれらの混合物など植物油の形態で一般に植物由来脂肪酸を含む。より好適な植物油は大豆油である。
【００３９】
植物油は通常、ナノエマルジョンの表面張力を高めるのに十分な量で存在し、これは次に標的細胞の細胞質膜またはその受容体と疎水的相互作用の確率を高める。植物性脂肪源は約０．００１乃至５．０体積／体積（ｖ／ｖ）％、より好ましくは約０．００５乃至４．０体積／体積％、および最も好ましくは約０．０１乃至２．５体積／体積％の量で存在してもよい。
【００４０】
本発明の別の好適な実施形態では、界面活性剤は非イオン性界面活性剤から選択されたものである。非イオン性界面活性剤の実施例は、脂肪族アシル化ソルビタンエステルおよびこのポリオキシエチレン誘導体などのソルビタンエステルならびにこの混合物と、限定されないがポロキサマ化合物（１８８、１８２、４０７および９０８）、チロキサポール、ポリソルベート２０、６０および８０、グリコール酸ナトリウム、硫酸ドデシルナトリウムなどを含むこれらの混合物と、これらの組み合わせとを含む。より好適な非イオン性界面活性剤は、例えばＴｗｅｅｎ（登録商標）−８０などの洗浄性ポリソルベートである。
【００４１】
界面活性剤は通常、ナノエマルジョンの疎水性成分と親水性成分の間の界面を安定し、疎水性成分が結合するよう維持することによって、ナノエマルジョンの動力学的安定性を高めるのに十分な量で存在し、このため一度形成されたナノエマルジョンは貯蔵中に著しく変化しない。界面活性剤は、約０．０１乃至４．０重量／体積％、より好ましくは約０．１乃至３．０重量／体積％、および最も好ましくは約０．２乃至２．５重量／体積％の量で存在する。
【００４２】
さらに本発明の別の好適な実施形態では、溶媒は任意の薬剤的に受容可能な水混和性希釈剤または例えば極性のプロトン性溶媒と極性の非プロトン性溶媒などの溶媒を含む。この溶媒は好ましくは、１，３−ブタンジオールと；ジメチルスルホキシドと；メタノール、ブタノール、ベンジルアルコール、イソプロパノールおよびエタノールなどのアルコールと；同種のものとから選択される。より好適な溶媒はベンジルアルコールである。
【００４３】
溶媒は通常、ナノエマルジョンの非イオン性界面活性剤の凝集の程度を制御するのに十分な量で存在する。溶媒は、約０．００１乃至９９．９体積／体積％、より好ましくは０．００５乃至８０体積／体積％、および最も好ましくは約０．００５乃至７０体積／体積％の量で存在してもよい。
【００４４】
本発明の組成は、治療薬または診断薬に内在する薬理活性または化学的性質を修飾または変更しないが、癌細胞または癌組織を含む異常細胞または病変組織への作用薬のデリバリおよび内在化を簡単に強化し、治療または診断の効果を提供する。癌治療の治療薬としてタキサンの使用に関する教示の実施例は、参照により本書にそれぞれ組み込まれる米国特許第６３４６５４３号明細書と；第６３８４０７１号明細書と；第６３８７９４６号明細書と；第６３９５７７１号明細書と；第６４０３６３４号明細書と；第６５００８５８号明細書とに例えば開示されている。
【００４５】
一般に、本発明の医薬組成物は、脂質粒子を治療薬または診断薬と結合し、同様に完全に混合することによって調製される。脂質混合物は、治療薬または診断薬と混合するのに先立って植物性脂肪源と組み合わせて界面活性剤と混合されてもよく、これ自体は溶解のため水混和性溶媒と混合されてもよい。次いで脂質粒子−治療薬／診断薬の結合が、水、好ましくは精製水と共に混合される。次いで得られた混合物は高せん断力に晒され、一般に標準的な従来のせん断集中均質化ミキサまたはホモジナイザ内に生成され、水相内に分散した脂質粒子を含むナノエマルジョンを生成する。十分に強いせん断力は、マサチューセッツ州ニュートンのＭｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ社により販売されるＭｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ（登録商標）流体材料プロセッサなどの適切なせん断集中均質化ミキサまたはホモジナイザにより生成することができる。得られたナノエマルジョンはさらに処理されてより精製された形態を得て、これは人を含む温血動物への投与に用いられてもよい。
【００４６】
ある実施例では、混合処理から過度に大きな粒子を除去することが望ましく、所望の範囲に粒径分布を維持する。マサチューセッツ州ウォルサムのミリポア株式会社のものなど適切な濾過システムがこの目的に利用可能である。このため、適切なろ過システムの選択は、所望の範囲に脂質粒子の粒径分布を制御する要因であり、熟練した職人の日常的なスキル内にするであろう。あるいは、ナノエマルジョンは透析によって処理されて不純物を除去してもよく、得られた透析物は薬剤的用途のため保存される。透析は、任意の非粒子の脂質混合物の成分、薬剤、および／または溶媒を除去し、任意の所望の緩衝剤の交換または濃度を達成する好適な方法である。５０００乃至５０００００の名目上の分子量を遮断する透析膜を用いることができ、１００００乃至３０００００の分子量が好ましい。記載されるように生成された脂質粒子は、透析により精製されて非粒子の薬剤を除去する場合、脂質粒子が例えばＣ６グリオーマ細胞などの標的細胞に内在化されるまで測定することを特徴としてもよい。
【００４７】
本発明の組成はさらに、薬剤的に受容可能な担体または賦形剤を含む。薬剤的に受容可能な担体の実施例はこの分野で周知であり、限定されないが、酸化防止剤、緩衝剤、キレート剤、香味料、着色剤、保存剤、生体利用性を高める吸収促進剤、抗菌剤およびこれらの組み合わせなどの医薬組成物に従来用いられるものを含む。この添加剤の量は所望の特性に依存し、これは当業者により容易に決定することができる。
【００４８】
本発明の医薬組成物は通常、塩、緩衝剤、保存剤および互換性のある担体を含み、任意に他の治療成分と組み合わせる。薬剤に用いられた場合、塩は薬剤的に受容可能であるはずだが、非薬剤的に受容可能な塩を上手い具合に用いてこの薬剤的に受容可能な塩を調製してもよく、これは本発明の範囲から除外されない。この薬理学的に受容可能な塩と薬剤的に受容可能な塩は、限定されないが、以下の酸：塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、マレイン酸、酢酸、サリチル酸、ｐ−トルエン、スルホン酸、酒石酸、クエン酸、メタン、スルホン酸、ギ酸、マロン酸、コハク酸、ナフタレン−２−スルホン酸、およびスルホン酸ベンゼンから調製されたものを含む。さらに、薬剤的に受容可能な塩は、カルボン酸基のナトリウム、カリウムまたはカルシウム塩などのアルカリ金属塩またはアルカリ土類塩として調製することができる。
【００４９】
本発明はさらに、細胞過剰増殖によって特徴づけられる疾病、状態もしくは症候群、またはこれらの症状の予防、診断または治療を実施するために細胞に少なくとも１つの治療薬または診断薬の有効量を送ることによって、治療薬または診断薬により患者を治療または診断する方法を提供する。改善された癌治療は特に、腫瘍の細胞増殖、血管形成、転移成長、アポトーシスの制御による一次腫瘍の治療および外科切除後または外科切除と並行の微小転移発育の治療と；一次腫瘍の放射線療法または他の化学療法と、を含めて考慮される。本発明の医薬組成物は、一次黒色腫または転移性黒色腫、リンパ腫、肉腫、肺癌、肝臓癌、ホジキンリンパ腫および非ホジキンリンパ腫、白血病、子宮癌、子宮頚部癌、膀胱癌、腎癌、結腸癌、ならびに乳癌、前立腺癌、卵巣癌および膵癌などの腺癌のような癌型で有用である。
【００５０】
治療用途および診断用途として、医薬組成物は、薬剤的に受容可能な担体と結合した場合に患者に直接投与することができる。この方法は、治療薬または診断薬単独または有効量の別の治療薬または診断薬と組み合わせて投与することによって実施されてもよく、これは第２の微小管相互作用薬でもよいし、そうでなくてもよい。微小管相互作用薬でない場合、この第２の作用薬は、限定されないが、細胞静止剤、葉酸阻害剤、アルキル化剤、トポイソメラーゼ阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤、ポドフィロトキシン、抗腫瘍抗生物質、化学療法剤、アポトーシス誘導剤、およびこれらの組み合わせでもよい。この治療薬はさらに代謝阻害剤試薬を含む。多くのこの治療薬がこの分野で知られている。併用療法は、治療法に対する患者の反応を増幅または確認するのに必要とされるので、この状態を治療するのと同時使用、逐次使用、または別使用として提供する。
【００５１】
本発明の方法は、医学的に許容可能な任意の投与形態を用いて実施されてもよく、臨床的に許容できない副作用を引き起こさずに活性化合物の有効レベルを生成する。非経口投与に特に適した製剤が好ましいが、本発明の組成は、エアゾール剤、スプレー剤、粉末剤、ゲル剤、ローション剤、クリーム剤、坐剤、軟膏剤などの形態で、吸入、口、局所、経皮、鼻、目、肺、直腸、口腔粘膜、静脈内、筋肉内、皮下、腹腔内、胸腔内、胸膜腔内、子宮内、腫瘍内、または点滴による方法もしくは投与用に調剤することができる。この製剤が望まれる場合、この分野で周知の他の添加剤が含まれて製剤に所望の一貫性と他の特性を与えてもよい。
【００５２】
治療薬または診断薬を投与する特定の方法が、選択される特定の作用薬と；投与が疾病、状態、症候群またはこれらの症状の治療、診断または予防用かどうかと；治療または診断される内科的疾患の重症度と；治療効力に必要とされる投与量と、に依存することを当業者は認識するであろう。例えば、白血病の治療用の抗癌剤を投与する好適な方法は静脈内投与を含むが、皮膚癌を治療する好適な方法は局所投与または皮内投与を含むであろう。
【００５３】
本書で用いられるように、「有効量」とは所望の治療効果または診断効果が達成される治療薬または診断薬の投与量または複数の投与量のことをいう。一般に、治療薬または診断薬の有効量は、使用される特定の作用薬の活性と；その作用薬の代謝的安定性および作用の長さと；被験者の種族、年齢、体重、健康状態、食事の状態、性別および食事と；投与の形態および時間と；排泄率と；もしあれば複合薬と；治療される特定の状態の症状および／または重症度の程度とにより変更してもよい。正確な投与量は、所望の結果を得るため１日当たり１回または数回の投与で、過度の実験をせずに当業者によって決定することができ、この投与量は、所望の治療効果を達成するためまたは任意の合併症の場合に個々の開業医により調整されてもよい。重要なことは、癌の治療に用いられる場合、使用される治療薬の投与量は、腫瘍細胞を抑制または死滅させるのに十分であるが、正常細胞を実質的に傷つけないでおくことである。
【００５４】
本発明の医薬組成物に含まれる治療薬または診断薬は、所望の最大量まで任意の量で調製することができ、これは所定の脂質粒子で可溶とされてもよいし、脂質粒子内で懸濁されてもよいし、脂質粒子に操作的に連結されてもよい。診断薬または治療薬の量は、０．００１μｇ／ｍＬ乃至１０００μｇ／ｍＬ、好ましくは約０．１μｇ／ｍＬ乃至８００μｇ／ｍＬ、およびより好ましくは約３００μｇ／ｍＬに及んでもよい。
【００５５】
通常、脂質粒子は患者に有効量を投与するのに十分な方法で提供されるであろう。投与量は、約０．１ｍｇ／ｋｇ乃至１７５ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約１ｍｇ／ｋｇ乃至８０ｍｇ／ｋｇ、およびより好ましくは５ｍｇ／ｋｇ乃至６０ｍｇ／ｋｇに及んでもよい。投与量は、単回投与または１日当たり１乃至４回以上など個々に分割投与の形態で投与されてもよい。被験者の反応がある投与量で不十分である場合、さらに高用量（または異なる局所的輸送経路で有効な高用量）が患者の許容量まで使用されてもよい。１日当たり複数回の投与が考慮され、適切な全身レベルまたは標的レベルの治療薬または診断薬を達成する。
【００５６】
さらに本発明の別の実施形態では、微小管相互作用薬は、生体外で診断薬として用いられてもよい。前に述べたように、問題の特定の腫瘍細胞または細胞型に依存して、異なる微小管相互作用薬が別個の腫瘍種の抑制で多少有効であるかもしれない。したがって、例えば適切な化学療法の戦略の判断または選択が困難である場合に、特定の腫瘍細胞型を標的にすると知られていた微小管相互作用薬による生体外の腫瘍細胞の培養試験は、代替アプローチを提供して腫瘍型と有効な治療を特定する。
【００５７】
本発明の別の態様では、本発明の医薬組成物を調製する方法が提供される。脂質混合物は、水相で処理する際、脂質粒子の分散を含む脂質ナノエマルジョンの組成を形成する量で治療薬または診断薬に組み込まれ、脂質粒子が分散された相は、ナノスケールオーダの粒子径の高分子または小分子の塊の形態で存在する。本発明の組成を調製する際に、脂質混合物および治療薬または診断薬は、水、好ましくはろ過水を含む水相と結合される。得られた混合物は処理されて典型的に平均粒子径範囲を有する脂質粒子であって、いつもではないが、癌の治療に特に適した最大２００ｎｍのサイズの範囲の脂質粒子を他の用途に適切な大きな粒子と共に形成する。得られる範囲は、使用された脂質混合物と、脂質混合物に加えられた治療薬または診断薬の種類および量と、脂質粒子を生成するのに用いられた技術とによって幾分影響される。
【００５８】
本発明の医薬組成物は、この分野で知られている従来の分散生成技術またはプロセスを用いて作ることができる。この技術は限定されないが、高せん断力均質化、超音波撹拌もしくは超音波処理、高圧均質化、溶媒乳化／蒸発などを含む。本発明の一実施例では、脂質粒子は適切な高圧ホモジナイザを用いる従来の高圧均質化技術によって調製されてもよい。適切なサイズのホモジナイザは商業上利用可能である。高圧ホモジナイザは通常、典型的に約１００乃至２０００の棒材により高圧で約数ミクロンに渡る狭い隙間を介して流体を押し出すよう設計されている。加圧流体は、超短距離で１０００ｋｍ／ｈｒ以上の超高速まで加速する。脂質混合物を含む加圧流体は、超高せん断応力と空洞化力に対抗し、サブミクロン範囲で粒子内に脂質混合物を分裂させて細かく砕く。前に論じられたように、大部分の脂質粒子は約０．０２μ乃至０．２μ、好ましくは０．０２μ乃至０．１μに及ぶ平均粒子径を有するべきであり、特に最大約２００ｎｍに及ぶ幾つかの脂質粒子と共に、この範囲以上または以下にとどまる少量の粒子に変更する。
【００５９】
脂質粒子を調製する別の特定の方法では、脂質混合物は、植物油などの植物性脂肪源と、非イオン性界面活性剤などの界面活性剤と混合されて脂質相を得てもよい。治療薬または診断薬は、水混和性溶媒などの溶媒と混合されて治療薬相または診断薬相を得てもよい。脂質相と治療薬または診断薬相はその後、好ましくは超音波処理を介して、水相の存在下で一緒に混合されブレンドされる。得られた混合物はその後、高せん断力下で均質化されて対応する本発明のナノエマルジョンを生成する。次いで、ナノエマルジョンは０．２μの膜を介してろ過されてもよく、未使用の脂質材料、過剰な治療薬または診断薬などの不純物を殺菌および／または除去し、治療または診断ニーズのある人を含む温血動物への医薬組成物としてデリバリに適した精製形態を得る。
【００６０】
本発明の医薬品組成物の理解を容易にするために以下の実施例を提供する。
【００６１】
実施例１
ＥｍＰＡＣの組成
パクリタキセルが第１薬剤候補として選択され、脂質ナノ粒子（ＬＮ）への充填を介して製剤について試験され、商業上利用可能な製品へ開発される。パクリタキセル／ＬＮの製剤は、水と４％のエタノールで直接調製され、続いて１１０Ｙ Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ（登録商標）高圧ホモジナイザ（Ｍ−１１０Ｙモデル、Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ社、ニュートン、マサチューセッツ州）を用いて１８０００ｐｓｉで４サイクルの高圧均質化を行う。先行研究は、最大〜２５重量／重量（ｗ／ｗ）％の脂質濃度のＬＮにパクリタキセルを組み込むことができることを示したが、この製剤は数時間しか安定しないことが分かったが、この問題は薬剤の組み込みよりも安定性に関係するように思われた。１ｍＭのピロリン酸ナトリウム（ｐＨ９．５）で調製されたＬＮは少なくとも２か月間安定したままであることを発見後、１ｍＭのピロリン酸ナトリウム（ｐＨ９．５）が薬剤の組み込み研究に１次試験媒体として選択された。
【００６２】
パクリタキセルが３サイクルで１５０００ｐｓｉで１ｍＭのピロリン酸ナトリウム中の４％のエタノール含有量と共にＬＮに組み込まれた場合、５％の薬剤充填を伴う製剤のみが安定し、この最終的な製剤でさえ有意な時間安定しないことが分かった。組み込み後２日目に、僅かな混濁が５％の充填サンプルで観察され、これは３日目に完全に沈殿した。一方３３％および１６％の薬剤充填サンプルでは即時の混濁が観察された。これらの発見は表１に要約されている。この安定性を低下させた有力な理由は、水におけるパクリタキセルの難溶性、低いアルコール含有量（４％）、高いｐＨの最終溶液（ｐＨ１１．５）、および／または調和できない脂質濃度であろう。
表１．４％のエタノールで調製されたＬＮに充填するパクリタキセル
【００６３】
この場合エチルアルコールである有機含有量の変更により、薬剤組み込み粒子の安定性を改善する可能性が高い。したがって、ＬＮは最初に異なるアルコール含有量（例えば５０体積／体積％、２５体積／体積％、１２．５体積／体積％）で調製された。薬剤のない粒子でさえ２５体積／体積％以下またはこれと同等のエタノール含有量で安定しないことが観察された。さらに、１２．５体積／体積％アルコールのＬＮのみが少なくとも１日間安定していた。したがって、１０％のパクリタキセルが１２．５体積／体積％のアルコール含有量と共にＬＮに充填された。３時間後、ゲル組成が観察され、高レベルのアルコールはＬＮ内のパクリタキセル製剤を安定させないことを強く示した。エチルアルコールはさらに通常、解乳化剤として用いられた。これは、安定した薬剤充填製剤を得る際に高い割合のエタノールが助力しないという理由であろう。その他の溶媒では、パクリタキセルはＤＭＳＯに非常に良好な溶解度を有すると知られているので、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）が選択肢の溶媒である。したがって、パクリタキセル充填サンプルは、第２機器であるＭｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ（登録商標）高圧ホモジナイザ（Ｍ−１１０ＥＨモデル、Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ社、ニュートン、マサチューセッツ州）Ｍ−１１０ＥＨで１５０００ｐｓｉおよび３サイクルで１０％のＤＭＳＯに調製された。
【００６４】
２つのコントロールが用いられ、一方はパクリタキセルがなく、他方は脂質成分がない。第２のコントロールから、このサンプルが脂質成分のない状態で沈殿したので、脂質成分が薬剤組み込みＬＮの安定性の役割を担うことは明らかである。しかしながら、５％のパクリタキセルのサンプルは透明であったが、１０％のパクリタキセルのサンプルは２日目に沈殿したことが観察された。これらのサンプルの高性能液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）アッセイでは、これらのサンプルでパクリタキセルが悪化したことが観察された。
【００６５】
パクリタキセルはＤＭＳＯによく溶けるので、異なる濃度のＤＭＳＯでパクリタキセルにより調製されたＬＮの安定性が試験された。濃度２０％のＤＭＳＯが１０重量／重量％のパクリタキセルを有する２００μｇ／ｍＬのＬＮに最も高い安定性をもたらしたことが分かった。代表的な粒径分布とゼータ電位値は図１に示されている。この変更された製剤の安定性のデータは表２に示されている。
表２．変更されたＤＭＳＯ製剤のパクリタキセル充填ＬＮの安定性
【００６６】
パクリタキセルの前記悪化（２４時間以内にほぼ１００％）は、この製剤の高いｐＨ（１１．０）によるものであると仮定された。１ｍＭのピロリン酸ナトリウムの添加が、９．５までｐＨを低下させた。したがって、１ｍＭのピロリン酸ナトリウムによりｐＨを調整することによってパクリタキセルと脂質成分の安定性の効果が研究された。
【００６７】
６．０に等しいｐＨまたは６．０を超えるｐＨでは、沈殿が観察されず、製剤は透明のままであった。しかしながら、６．０を超えるｐＨではパクリタキセルの相当な悪化があった。このように、最適解は、脂質成分とパクリタキセルの双方を製剤中で化学的および物理的に安定させ続けるために、希リン酸により６．０に調整されたｐＨを有する１ｍＭのピロリン酸ナトリウムを利用することである。全結果は表３に要約されている。
表３．脂質ナノ粒子の安定性におけるｐＨの効果￥
【００６８】
このようにＤＭＳＯとｐＨの制御は、製剤の長期安定性に導くことができることが発見されたので、製造中に製品を消毒するのにろ過が利用されるので、次の研究手段は、ろ過がパクリタキセル充填ＬＮサンプルの脂質成分と薬剤潜在能力に影響するかどうかであった。
【００６９】
ナイロン、ＰＶＤＦ、およびＰＥＳなどの異なる種類の膜の一次審査後、ポリエーテルサルフォン（ＰＥＳ）親水性膜が製剤のろ過に最も適切な膜であることが結論づけられた。２０％のＤＭＳＯで調製された１０％のパクリタキセル充填ＬＮが０．２２μｍのＰＥＳ薄膜フィルタによりろ過された場合、少なくとも９８％のパクリタキセルが膜を通過した。これら同じ製剤から脂質成分がＥＬＳＤによって分析された場合、平均して、全成分の９３％が膜を通過した。このようにろ過は製剤の品質も安定性も高めることが実証された。
【００７０】
パクリタキセルが２０％のＤＭＳＯがある状態でＬＮに組み込まれるかどうかを判定するために、または水相内へパクリタキセルを分配することによってＬＮへのパクリタキセルの組み込みをＤＭＳＯが妨げるどうかを判定するために、ＬＮからの１４Ｃ標識化パクリタキセルの分離がショ糖密度勾配を用いて行われた。放射能数の分布の測定は、どの画分がパクリタキセルを含むかに関するデータを提供する。したがって、２００μｇ／ｍＬのＬＮは、幾らかの１４Ｃ標識化パクリタキセルを含む１０重量／重量％のパクリタキセルの存在下で調製され、その調製品はショ糖密度勾配で分画された。画分が放射能数の分析のため集められてどの画分がパクリタキセルを含むかを決定した。沈殿した画分は勾配の底で発見され、これは最初に不溶性のパクリタキセルで構成された。バンドは、ＬＮであると確証された勾配で発見され、沈殿物とＬＮ画分の双方の放射性成分がＬＮを含む脂質がある状態で分析され、放射性標識は底部の沈殿物で殆ど発見されなかった。脂質がない状態では、大量の沈殿物が発見され、非常に小さな画分の放射標識が沈殿物画分で発見されている。
【００７１】
図２で分かるように、脂質がない状態では約８０％のパクリタキセルが沈殿したが、脂質がある状態では１．８％のパクリタキセルが沈殿するに過ぎなかった。これは、大部分のパクリタキセルがＬＮの脂質内に組み込まれているという考えを支持するものである。
【００７２】
臨床設定では、３−２４時間に渡る約２．５Ｌの静脈注射は通常、殆どの患者に安全で耐えられるものと考えられている。臨床用途の現在のパクリタキセルの投与量は、３−２４時間に渡って１３５〜１７５ｍｇ／ｍ２の範囲である。表面積が〜１．８ｍ２の平均サイズのオスを想定すると、この投与量を達成するのにパクリタキセルの〜９７μｇ／ｍＬの濃度が必要である。この時間および体積パラメータ内でこの治療用の投与量のパクリタキセルを提供するために、パクリタキセルは十分に高濃度でなければならない。従って、ベンチマークとしてこの投与量を達成するパクリタキセル充填ＬＮサンプルを製剤することが望ましい。しかしながら、本発明は腫瘍細胞を選択的に標的とすることができるので、パクリタキセルを組み込まれたＬＮに必要な治療用の投与量は事実上、非常に少なくてもよい。このように、投与された薬剤の大部分の画分は最終的に腫瘍細胞に行き着くであろう。
【００７３】
後に表４で明らかなように、１０％のパクリタキセルを充填する最大４００μｇ／ｍＬのＬＮを調製することが可能であり、これは凝集の兆候なく少なくとも５時間安定する。この調整品は、４０μｇ／ｍＬのパクリタキセル濃度を有し、静脈内投与に必要な時間に渡って安定した。
【００７４】
０．２２μｍのＰＥＳ膜によるろ過後、ＬＮに充填された１ｍＭピロリン酸ナトリウム（ｐＨ−６．０）の２０％ＤＭＳＯ内の１０％パクリタキセルのサンプルは、少なくとも３日間安定したままだった。ピロリン酸ナトリウム濃度を０．５ｍＭに変更した後、サンプルは７日間安定したままだった。最初に、全てのサンプルはろ過された形態およびろ過されてない形態でパクリタキセル成分と粒径分布について分析された。これによりこれらのデータは、臨床で現在利用される濃度のパクリタキセル製剤をＬＮ内に調製することができることを示した。
【００７５】
したがって、第２のパクリタキセル−ＬＮ製剤が調製され、これは６０μｇ／ｍＬのパクリタキセルと；３００μｇ／ｍＬの脂質混合物と；０．５％のブタノールと；０．５％の大豆油と；０．２５％のＴｗｅｅｎ（登録商標）−８０とから成る。この第２の製剤で行われた安定性研究は、４００μｇ／ｍＬの脂質と一定濃度のパクリタキセルを用いる製剤が少なくとも２４時間安定していることを明らかにした。結果は表４に要約されている。
表４．ナノ粒子安定性に対する脂質濃度の効果
【００７６】
具体的には、表５で分かるように、第２のパクリタキセル−ＬＮ製剤は少なくとも７日間室温で安定し、少なくとも３０日間２−８℃で安定することが分かった。
表５．第２の製剤の安定性
【００７７】
しかしながら、ブタノールはマウスに有毒であり、注射で昏睡状態を引き起こすことが分かったので（データは示されてない）、ブタノールはベンジルアルコールによって置換された。得られた第３の製剤は、６０μｇ／ｍＬのパクリタキセル、４００μｇ／ｍＬの脂質混合物、０．０６％のベンジルアルコール、０．５％の大豆油、および０．２５％のＴｗｅｅｎ（登録商標）−８０で構成される。表６で要約されるように、この第３の製剤は室温で少なくとも３週間および２−８℃で８０日間以上安定していたことが分かった。
表６．第３の製剤の安定性
【００７８】
実施例２
ＥＭＵＬＳＩＰＨＡＮとＥｍＰＡＣの細胞吸収
ここで記載された研究は、ヒト腫瘍細胞がＬＮを取り込むかどうかを判定し、かつそれらがＬＮを取り込む異なる能力を示すかどうかを判定するために行われた。試験された大抵の腫瘍細胞株が蛍光ＬＮを容易に取り込むだけでなく、異なる腫瘍細胞株からの腫瘍細胞株はＬＮを取り込む異なる能力を示すことが分かった。
【００７９】
これらの実験に用いたＬＮ製剤は、以下のように調製された：適切な脂質が１０分間超音波処理により１０ｍｇ／ｍＬまで９５％のエタノールに可溶化された。次に、エタノール中の１００μＬの０．５ｍｇ／ｍＬコレステリルＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ（オレゴン州ユージーンのＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）が１ｍＬの可溶化された１０ｍｇ／ｍＬ脂質に加えられた。最後に、脂質とコレステリルＢＯＤＩＰＹ−ＦＬの混合物が１ｍＭピロリン酸ナトリウム水の５０ｍＬ溶液に加えられ、１１０Ｙ Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ（登録商標）高圧ホモジナイザ（Ｍ−１１０Ｙモデル、Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ社、ニュートン、マサチューセッツ州）により処理された。
【００８０】
蛍光標識化ナノ粒子の細胞吸収の程度が蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）による細胞蛍光強度に正比例することを最初に立証するため、図３Ａで分かるように、細胞当たりの平均蛍光強度がＬＮの濃度に正比例し、さらに図３Ｂから明らかなように、ＬＮがある状態で培養時間に正比例することが分かった。実際には、同じく治療された細胞がカバーガラスに固定された状態で、蛍光強度が蛍光ＬＮ吸収の程度に比例することが視覚的に確認された。ＬＮは、蛍光の脂肪親和性染料ＤｉＯ（オレゴン州ユージーンのＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）により標識化され、これはフルオレセインのフィルタセットを用いて検出することができる。ＬＮは顕微溶液化により２００μｇ／ｍＬの脂質と２．５μｇ／ｍＬのＤｉＯにより調製された。標識化されたＬＮは、Ｃ６細胞に加えられ、３７℃で培養された。この後、培地が除去され、細胞はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）により洗浄され、トリプシン処理され、４％のホルムアルデヒド内に固定する前に再び洗浄された。ＬＮは、０、１２．５、２５、５０および１００μｇ／ｍＬ加えられ、６０分間培養された。５０μｇ／ｍＬのＬＮが細胞に加えられ、培地の除去とＦＡＣＳ分析の処理の前に０、５、１０、１５、３０および６０分間培養された。図３Ａと図３Ｂで示される結果から明らかなように、細胞当たりの蛍光強度が濃度の増加と培養時間の増加とに正比例することをそれぞれ示しており、ＦＡＣＳによってＬＮ吸収を推定することができることは明らかである。
【００８１】
異種細胞株由来細胞がＬＮを取り込む異なる能力を示すかどうかを判定するため、かつ異種腫瘍型由来細胞がＬＮを取り込む相対的な能力をさらに推定するために、種々のパネルの腫瘍細胞株でＬＮ吸収が試験された。選択された細胞株は、国立癌研究所（ＮＣＩ）のＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｐｒｏｇｒａｍ Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇによって用いられたものから選択された。ＮＣＩ細胞株パネルは、多くの異なるヒト腫瘍株由来細胞株で構成され、幾つかの異種細胞株はそれぞれ代表的なヒト腫瘍株に由来した。使用される細胞株は、ＨＳ−５７８Ｔ、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、およびＭＸ−Ｉ乳癌と；Ｈ２３、Ｈ４６０、およびＨ５２２肺癌と；ＳＦ−５３９肝臓と；ＨＴ２９、ＳＷ−６２０、およびＣＯＬＯ２０５結腸腫瘍細胞株とを含んだ。
【００８２】
ＬＮは、顕微溶液化によって２００μｇ／ｍＬの脂質と０．５重量／重量％のコレステリル−ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬとにより調製された。標識化されたＬＮは細胞に加えられ、３７℃で培養された。この後、培地が除去され、細胞がＰＢＳで洗浄され、トリプシン処理され、および４％のホルムアルデヒド内に固定される前に再び洗浄された。サンプルはＦＡＣＳによって分析され、細胞当たりの平均蛍光強度が測定された。結腸、胸部、中枢神経系（ＣＮＳ）、および肺に由来する細胞は、ＨＴ−２９結腸癌細胞株とＳＦ−５３９肺癌細胞株のものと比較され、これは少量および多量の蛍光ＬＮをそれぞれ取り込むことが示された。ＬＮで治療された各細胞サンプルによる蛍光ＬＮ吸収量は、未治療の同じ細胞株の蛍光強度を控除することによって得られた。
【００８３】
図４Ａ〜４Ｄで分かるように、ＮＣＩパネルの細胞株によるＬＮ吸収量の比較は、ＬＮ吸収が異なった株の細胞型間で変化することを明らかにする。同じ腫瘍株の細胞間で幾らかの変異性が見られたが、相対的な吸収量は各腫瘍株で適正に一致する。例えば、胸部腫瘍細胞株と肺腫瘍細胞株は通常、結腸腫瘍細胞株に行ったものより高いＬＮ吸収量を示した。最も大きなＬＮ吸収量は、肺腫瘍およびＣＮＳの細胞株で発見された。全結果は表７に要約されている。
表７．腫瘍細胞株による脂質ナノ粒子の吸収
§細胞当たりの平均蛍光強度は、同じ各未治療の細胞株の蛍光と比較し、控除することによって、各蛍光ＬＮ治療サンプルについて得られた。
£ＮＤ−判定されていない。高レベルの沈殿のため粒径は判定できない。
【００８４】
次に、ＬＮ（ＥｍＰＡＣ）に調剤されたパクリタキセルの吸収量は、従来の媒体に調剤されたパクリタキセル、タキソール（登録商標）として知られている１：１のＣｒｅｍｏｐｈｏｒ／エタノール（ＣｒｅｍｏｐｈｏｒＥＬ（登録商標））と比較され、一連の実験で放射標識化パクリタキセルの培養された腫瘍細胞吸収量を分析した。
【００８５】
第１の実験では、１４Ｃ標識化パクリタキセルは、ＬＮに組み込まれ（これによってＥｍＰＡＣを形成する）、タキソール（登録商標）に組み込まれた。この実験で使用されるＥｍＰＡＣ製剤は、ＤＭＳＯを含む第１の製剤であった（実施例１を参照）。これらの製剤は、同じ濃度のパクリタキセルから成り、１時間１２の複製ウェルでＳＦ５３９神経膠腫とＡ５４９肺癌細胞に加えられた。媒体が除去され、細胞単層は薬剤の除去後に可溶化にされ、トルエンを含む同じ容量のシンチレーションカクテルによりＰＢＳ内で洗浄して各単層サンプルに連結されたパクリタキセルを測定した。各サンプルの放射標識数は、各サンプルに最初に追加された合計放射標識の僅かとして表わされた。この実験結果は、図５で実証されるように、ＳＦ５３９がタキソール（登録商標）よりもＬＮに調剤されたパクリタキセル（すなわちＥｍＰＡＣ）を著しく多く内在化することを示した。
【００８６】
この実験は前述したように実質的に繰り返され、薬剤に培養後に様々な時間で採取されたことを除いて、細胞は第２の製剤のＥｍＰＡＣで治療された。実質的に、各製剤について同じ量の放射標識化薬剤が各細胞サンプルに加えられた。細胞単層に連結された放射標識化薬剤の大体の数が示されている。さらに、細胞吸収量の動態を推定するために、パクリタキセルの吸収量が薬剤培養時間の関数として分析された。ＳＦ５３９グリオーマ細胞による以前の研究は、吸収量がプラトーに達する前に２時間に渡って増加したことを実証した。これはさらにＥｍＰＡＣとタキソール（登録商標）の双方について観察され、図６で分かるように、この違いはＣｒｅｍｏｐｈｏｒＥＬ（登録商標）製剤でのパクリタキセルの相対的な不溶性によるものではなかったことを示した。しかしながら、タキソール（登録商標）よりこれらの細胞に連結されたＥｍＰＡＣに著しい多量のパクリタキセルが存在した。
【００８７】
ＥｍＰＡＣのパクリタキセルまたは脂質混合物が細胞吸収量を飽和させることができるかどうかを判定するために、全ての未標識のパクリタキセルは変更されたが、脂質と放射標識化パクリタキセルの量は一定の状態を保って実験が行われた。図７で分かるように、パクリタキセルの量は細胞吸収量を飽和するように見えるが、これはこの特定の実験から完全には明らかではない。全てのパクリタキセルが変更される一方で、標識化パクリタキセルは一定であるので、全てのパクリタキセルの小さい画分または大きな画分を単に表わしてもよい。パクリタキセルの濃度の増加がさらに粒子の総数を増加するであろう。このため、同じ数の薬剤充填粒子が取り込まれても、少量の標識化パクリタキセルが取り込まれるであろう。
【００８８】
続いて、一連の実験が行なわれて細胞吸収量におけるＬＮの各脂質成分の寄与を確認した。１４Ｃ標識化コレステロールの追跡によって標識化されたＬＮサンプルは、１つの成分が組織的にない状態で調製された。ＬＮサンプルは、３００μｇ／ｍＬの脂質と２０％のＤＭＳＯを用いて調製された。その他の全成分は比例して増加し、失った成分を補った。このサンプルは、２時間ＳＦ５３９ヒトグリオーマ細胞に加えられた。ＬＮ粒子を作るためにコレステロールと１：１で混合された単一成分を用いて同じ実験が行なわれた。図８Ａと図８Ｂは共に、コレステロールは細胞吸収量を促進する際にＬＮの全脂質成分の最も重要な役割を果たすことを確証している。
【００８９】
細胞単層に連結された放射標識化パクリタキセルは、パクリタキセルの内在化の結果であると仮定されたが、パクリタキセルが内在化するのではなく、細胞の外部に配置された可能性があった。パクリタキセルが内在化するかどうかを判定するために、Ａ５４９ヒト肺腫瘍細胞が、２時間ＥｍＰＡＣまたはＣｒｅｍｏｐｈｏｒＥＬ（登録商標）で調剤されたパクリタキセルで治療された。細胞は続いて氷のように冷たいメタノールで固定され、反タキサン抗体（ハワイ州ホノルルのＨａｗａｉｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）で染色され、続いて２次抗体が蛍光性Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８分子（オレゴン州ユージーンのＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社）に結合された。パクリタキセルが内在化し、微小管に配置されることが図９Ａから明らかである。パクリタキセルは生体内で微小管に結合すると知られているので、これはＥｍＰＡＣと同様にＣｒｅｍｏｐｈｏｒＥＬ（登録商標）に調剤されたパクリタキセルが内在化することを示している。しかしながら、各細胞のエッジをトレースすることによって各サンプルについて多くの領域の細胞の細胞内蛍光強度も定量化され、トレースされた境界内の蛍光強度の定量化した。図９Ｂで分かるように、ＥｍＰＡＣで治療された細胞は、タキソール（登録商標）で治療された細胞のおよそ２倍の蛍光強度を有し、これにより早期の発見を確認することができる。
【００９０】
実施例３
ＥｍＰＡＣの細胞毒性
このセットの実験の目的は、ＥｍＰＡＣの相対的な腫瘍成長抑制と細胞毒性を測定することであった。ＥｍＰＡＣは、製造者によって推薦されるように、ＤＭＳＯで溶解されたパクリタキセルまたはタキソール（登録商標）と比較された。
【００９１】
ＬＮに組み込まれたパクリタキセルが細胞を死滅する能力を保持するかどうか判定するために、ＤＭＳＯ保存溶液に溶解されたパクリタキセル単独の細胞毒性が、多くの異種細胞株の等モル量のＥｍＰＡＣと比較された。ＭＴＳ細胞増殖アッセイが使用されて相対的な細胞毒性を推定した。ＭＴＳはテトラゾリウム化合物であり、これは可溶性のホルマザン製品へ生細胞によって生物還元（ｂｉｏｒｅｄｕｃｅｄ）される。４９０ｎｍの実行でホルマザン製品の吸光度を使用して相対的な数の生細胞を判定することができる。このように、ＭＴＳを用いてパクリタキセル単独の相対的な細胞毒性の潜在能力対ＥｍＰＡＣの潜在能力を推定することができる。試験された細胞株は子宮肉腫細胞株ＭＥＳ−ＳＡとその薬剤耐性副株ＭＥＳ−ＳＡ−ＤＸ５を含んでおり、ＬＮへのパクリタキセルの組み込みが薬物耐性細胞のパクリタキセルの細胞毒性に影響を与えるどうかを調べた。したがって、ＭＥＳ−ＳＡ、ＭＥＳ−ＳＡ−ＤＸ５、Ａ５４９およびＭＸ−Ｉ細胞株は、サブコンフルエントな密度で平板培養された。等モル濃度のパクリタキセル単独とＥｍＰＡＣは、組織培養培地で希釈され、細胞が平板培養された日後に細胞に加えられ、７２時間細胞で培養させた。培地が置き換えられ、ＭＴＳアッセイは製造者（Ｐｒｏｍｅｇａ社、マディソン、ウイスコンシン州）からの指示に従って行なわれた。各細胞株由来の未治療の細胞に対して生存率が正規化に基づいて計算された。図１１Ａ〜図１１Ｄの各データポイントは、６つのサンプル±ＳＥＭの平均値を表わす。
【００９２】
図１０Ａで分かるように、ＥｍＰＡＣは、より低いパクリタキセル濃度でＭＥＳ−ＳＡとＡ５４９細胞内のＤＭＳＯのパクリタキセルと比べて、およそ弱い細胞毒性を示したが、さらに図１０Ｃで分かるように、パクリタキセル単独よりも高濃度で大きな画分の細胞を死滅させるように見えた。これはパクリタキセル単独が水性溶媒に非常に不溶性であるという事実によるであろう；その疎水性はパクリタキセルをより高い濃度で凝集させ、細胞へのその進入を妨げる。ＬＮへのパクリタキセルの組み込みによって、パクリタキセルが水性溶媒で安定し、凝集を防止して、高い濃度のパクリタキセルが細胞に入るのを可能にしてもよい。図１０Ｄで明らかなように、ＥｍＰＡＣはさらにＭＸ−Ｉ乳癌細胞でパクリタキセル単独より顕著に強い細胞毒性を示し、図１０Ｂで分かるように、ＭＥＳ−ＳＡ−ＤＸ５細胞株へパクリタキセル単独より適度に強い細胞毒性を示した。これらの観察の基礎となるメカニズムは未知であるが、１つの仮説は、薬物耐性細胞株ＭＥＳ−ＳＡ ＤＸ−５の場合には、ＥｍＰＡＣがパクリタキセル単独でするのと同じくらい効率的に細胞の外に汲み出されないということであり、これが脂質に埋められ、少なくとも最初に、ＬＮの成分として扱われるためである。脂質粒子は、特定のメカニズムによって細胞の中に取り込まれ、これは薬剤耐性に基礎をなす細胞機構により影響されないであろう。
【００９３】
前述の実験は、ＥｍＰＡＣ対ＣｒｅｍｏｐｈｏｒＥＬ（登録商標）を比べるために変更された。この実験で使用されるＥｍＰＡＣ製剤が超音波処理によってＴｗｅｅｎ（登録商標）−８０と大豆油がある状態で専用の脂質混合物を可溶化し、続いてこの混合物をブタノール中の超音波処理によって可溶化したパクリタキセルに添加することによって調製された。混合物は、１１０ＥＨ Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ（登録商標）高圧ホモジナイザ（Ｍ−１１０Ｙモデル、Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ社、ニュートン、マサチューセッツ州）で顕微溶液化によって処理された。これらのパクリタキセル製剤は薬剤除去の前に１時間ＳＦ５３９グリオーマ細胞に晒した後に比べられ、この薬剤への短期被曝は、薬剤への連続被曝より生体内の抗腫瘍薬への腫瘍細胞被曝に非常によく似ており、パクリタキセルは生体内で１時間以下の生物的に利用可能な半減期を有する（Ｗｉｅｒｎｉｋら、１９８７年；Ｒｏｗｉｎｓｋｙら、１９９０年）。
【００９４】
薬剤の除去後、細胞は続いて生存と増殖がＭＴＴによって分析される前に、さらに７２時間増殖を許容された。生細胞は、死にそうな細胞または死細胞より強い脱水素酵素活性を有し、このため強いＭＴＴ活性レベルを有すると予想されるので、ＭＴＴアッセイは生細胞に存在するミトコンドリアの脱水素酵素を利用して細胞の生存率を測定する。各細胞サンプルの生存は、薬剤に晒されなかった各コントロール細胞株に関して画分として計算された。生存率は薬剤濃度の関数としてプロットされ、各曲線は４つのパラメータのロジスティック曲線に適合され、ＥＣ５０値が計算された。ＥｍＰＡＣ対ＣｒｅｍｏｐｈｏｒＥＬ（登録商標）間の統計的な有意差は、スチューデントのｔ検定によって各薬剤濃度について推定された。図１１で分かるように、ＥｍＰＡＣ単独は細胞致死と細胞生存に有意な効果がなかったが（データは示されない）、ＥｍＰＡＣはタキソール（登録商標）よりグリオーマ細胞に著しい細胞毒性があった。
【００９５】
実施例５
マウス腫瘍モデルのＥｍＰＡＣの腫瘍成長抑制
Ｈ２３ヒト肺腫瘍を皮下に植え込まれたヌードマウスがＥｍＰＡＣまたは等しい投与量のタキソール（登録商標）で治療された場合、等しい投与量のタキソール（登録商標）のパクリタキセルと比べてＥｍＰＡＣによる顕著に強い腫瘍成長抑制があったことが観察された。
【００９６】
ヌードマウスはＨ２３肺腫瘍細胞を皮下に植え込まれ、これは薬剤が投与される前の２５日間成長させられた。担癌動物は、２５、２７、２９、３２、３４、３６、３９、４２日にそれぞれ２ｍＬの６０μｇ／ｍＬ薬剤と共にＩＰを注射された。腫瘍容積は、これらの各注射日で測定された。最終の腫瘍容積測定は、腫瘍の植え込み後４５日に行われた。
注射された製剤の組成は表８に示される。
表８．Ｈ２３ＴＧＩの動物実験群
【００９７】
図１２Ａで分かるように、第１の薬物注入後２０日間に渡って、ＥｍＰＡＣで治療された動物の腫瘍は１日で容積が減少したが、タキソール（登録商標）で治療された動物の腫瘍は実験の終わりの恒常的成長過程を再開する前に最初の１１日間に腫瘍容積の退縮を示した。ＬＮコントロールで治療された動物または未治療の動物の腫瘍は、研究の全体に渡って恒常的成長を示した。このように、ＥｍＰＡＣはタキソール（登録商標）を行ったものより長時間の腫瘍サイズを低減することができた。図１２Ａのデータは、薬物療法の間の平均腫瘍容積を示すようプロットされた。
【００９８】
図１２Ｂに移り、腫瘍退縮率は薬物療法の１日目と最終日との腫瘍容積差を比べることによって求められた。腫瘍退縮の統計的有意差は、タキソール（登録商標）で治療されたマウスと、ＥｍＰＡＣ（ｐ＜０．０００５）で治療されたマウスとの間で示された。各群は、３±ＳＥＭの平均を表わす。研究の終りまでに、ＥｍＰＡＣで治療された動物の腫瘍は約７１％（７１．４±２．４％）まで退縮したが、タキソール（登録商標）で治療された動物の腫瘍は約１９％（１８．７±０．９％）まで退縮した。このため、データはＥｍＰＡＣがタキソール（登録商標）より顕著に強い抗腫瘍活性を有することを示す。
【００９９】
ＥｍＰＡＣによる腫瘍成長抑制の量を異なる濃度のパクリタキセルと比べるため、Ｈ４６０ヒト肺腫瘍細胞を植え込まれたヌードマウスは、実施例１の第３の製剤より２倍のパクリタキセルで調剤されたＥｍＰＡＣを注射された。タキソール（登録商標）はさらに先のＴＧＩ実験で得られた投与量の１乃至４倍投与された。結果は、ＥｍＰＡＣが４倍強いタキソール（登録商標）とおよそ同じくらい効果的であることを示す。
【０１００】
この実験では、６０と１３７μｇ／ｍＬパクリタキセルのＥｍＰＡＣ製剤と等量のパクリタキセルが使用され、さらに、最初の第３のＥｍＰＡＣ製剤（すなわち６０μｇ／ｍＬパクリタキセル）で得られた投与量のおよそ４倍のタキソール（登録商標）が、Ｈ４６０担癌マウスに投与された。マウス腫瘍は、先の実験より大きなサイズに成長させられた。動物は、毎週３回、３週間で２日おきに投与され、腫瘍は薬剤の注射の前に測定され、その腫瘍が切断サイズ限界以上に達した動物は自動的に安楽死させられた。経時的で相対的な腫瘍容積が計算され、時間の関数としてプロットされた。Ｔ検定が行われて異なる薬剤で治療された動物間に腫瘍成長抑制の有意差があったかどうかを判定した。さらに、生存曲線が生成され、終わりの端点は、治療に関連した原因または切断サイズ限界に達した腫瘍による安楽死による動物死として規定された。
【０１０１】
不運にも、動物群は無作為化されず、その結果コントロール群の動物は最も小さな腫瘍で開始したが、高用量の薬剤による治療群の動物は治療前に大きな腫瘍で開始した。しかしながら結果は、ＥｍＰＡＣが４倍の濃度のタキソール（登録商標）とおよそ同じくらい効果的であることを示した。
【０１０２】
実施例６
ＥｍＰＡＣの薬物動態と生体内分布
ＩＰ対ＩＶのＥｍＰＡＣの薬物動態の違い、およびＥｍＰＡＣの生体内分布を測定するために、Ａ５４９肺腫瘍を植え込まれたヌードマウスは、放射標識化パクリタキセルをそれぞれ含むＥｍＰＡＣまたはタキソール（登録商標）のパクリタキセルの何れかと共にＩＰまたはＩＶを注射された。
１４Ｃ標識化パクリタキセルを含むＥｍＰＡＣ製剤は以下のように調製された：
Ａ）緩衝剤の調製
１）１Ｌの水に４６６．１ｍｇのピロリン酸ナトリウムを加えて１ｍＭのピロリン酸ナトリウム溶液を作製する。
２）希リン酸を加えることによってｐＨを４．０に調整する。
３）０．２２μｍのＰＥＳフィルタによってろ過する。
４）１０ｍＬのこの緩衝剤に１０μＬの１０％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）−８０を加える。
Ｂ）脂質保存溶液
１）１０ｍｇの脂質混合粉末を測定して、１０ｍＬのＤＭＳＯに溶かして１ｍｇ／ｍＬの脂質／ＤＭＳＯ溶液を作製する。
２）透明な溶液が得られるまで超音波で処理する。
Ｃ）高温のパクリタキセル：
１）５０μＬの高温のパクリタキセルを取り込む。
２）８０℃の水浴で酢酸エチルを完全に蒸発させる。
Ｄ）製剤：高温のパクリタキセル溶液に８００μＬの脂質／ＤＭＳＯ溶液を加える。完全に混合して撹拌する。この溶液を得て、次いで３．２ｍＬの水性緩衝液に加える。
【０１０３】
動物は、注射後０（注射直後）、０．５、１、６、または１２時間後に安楽死させられた。血液は心臓穿刺によって抜かれ、選択された臓器（例えば腫瘍下の全脳、腎臓、肺、肝臓、胃、脾臓、膵臓、腫瘍、腫瘍の対側部位の筋肉、尿、糞便、全血および腫瘍筋）の組織が採取された。組織と血液は全て処理されて放射標識薬剤の数えた。組織は全て重さを量られて均質化された。組織は小さすぎて用いられる秤（秤は１つの小数位に読み取る）によって正確に重さを量ることができなかったので、用いられる緩衝剤を含む組織ホモジネートが量られた。ホモジネートの部分標本は、全てのホモジネートの画分を測定するためにシンチレーションを数える前に量られた。全ての臓器組織の全ての１４Ｃ標識化パクリタキセルが測定された。結果は、ＩＰ対ＩＶで注射されたある薬剤間の薬物動態に有意差がないことを示している。これらの結果はさらに、ＥｍＰＡＣ対タキソール（登録商標）のパクリタキセル間で類似する薬物動態を示す。組織が注射後０．２５、０．７５、３、６、または１２時間に採取された類似する実験は、ＥｍＰＡＣとタキソール（登録商標）が実質的に同じ薬物動態プロファイルを有し、その上、組織パクリタキセルレベルが注射後約３時間でピークに達することを示している。さらに、実施例１に記載された第３の製剤へＥｍＰＡＣ製剤を変更する際、ＥｍＰＡＣ製剤＃３がタキソール（登録商標）のものと同じ薬物動態プロファイルを有することを結果が示している。
【０１０４】
実施例７
タキソール（登録商標）およびアブラキサン（登録商標）として調剤したパクリタキセルと比較したＥｍＰＡＣとして調剤したパクリタキセルの細胞吸収量
タキソール（登録商標）（ＣｒｅｍｏｐｈｏｒＥＬ（登録商標）：エタノール １：１のパクリタキセル）は、数年間臨床で使用され、肺非小細胞癌と乳癌を含む様々な異なる癌適応症を治療してきた。アブラキサン（登録商標）（ＨＳＡで調剤されたパクリタキセルの製剤）は癌治療のＦＤＡによって承認された。この研究の目的は、ＥｍＰＡＣがタキソール（登録商標）とアブラキサン（登録商標）と異なるかどうかを判定することであり、各パクリタキセル製剤に１時間晒されたＡ５４９ヒト肺癌とＭＤＡ ＭＢ ４３５乳癌細胞株を用いる生体外の短期間の露出実験で、パクリタキセルの細胞吸収量に影響を及ぼした。次いで細胞が固定され、パクリタキセル対抗抗体、続いて蛍光に標識化された第２抗体によって染色された。細胞内のパクリタキセルは、細胞内蛍光染色によって検出できるように、エピ蛍光顕微鏡によって視覚化された。蛍光に標識化された細胞のデジタル像は、冷却されたＣＣＤカメラで取り込まれた。標識化された細胞の蛍光強度はデジタル画像ソフトウェアを用いて定量化され、各実験群の細胞の平均細胞内蛍光強度が比べられた。
【０１０５】
材料と方法
細胞株
米国培養菌保存施設（ＡＴＣＣ）から購入されたＡ５４９ヒト非小細胞肺腫瘍細胞は、１０％のウシ胎児血清（ＦＣＳ）と共にロズウェル公園記念研究所（ＲＰＭＩ）１６４０媒体で培養されて、１：３乃至１：８の比率で二次培養された。
【０１０６】
ＡＴＣＣから購入されたＭＤＡ ＭＢ ４３５ヒト乳癌細胞は、１０％のウシ胎児血清（ＦＣＳ）と共にロズウェル公園記念研究所（ＲＰＭＩ）１６４０媒体で培養されて、１：３〜１：８の比率で二次培養された。
【０１０７】
被験物質
タキソール（登録商標）（ロット＃７２９５３７）は、オハイオ州ベッドフォードのＢｅｎ Ｖｅｎｕｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社から得られた。
【０１０８】
ＥｍＰＡＣ（バッチ＃Ｔ３４３）は、０．３ｍＬベンジルアルコールと；５．６ｇの大豆油、６．６１ｇのＴｗｅｅｎ（登録商標）８０を含む超音波処理された混合物および１２３．２３ｍｇの脂質混合粉末と；３００ｍＬのＨＰＬＣグレード水と、に超音波処理によって溶解された９０．４２ｍｇのパクリタキセルを組み合わせ、１２５０の棒材で高圧均質化により乳化することによって調製された。次いで１０ｇのデキストロースが２００ｍＬのこの溶液に加えられ、溶かすために超音波処理され、０．２２μＭのフィルタによって無菌ろ過された。得られた製品は、２．０％の大豆油と、２．２％のＴｗｅｅｎ（登録商標）８０と、４００μｇ／ｍＬの脂質混合粉末と、０．１％のベンジルアルコールと、３００μｇ／ｍｌのパクリタキセル（ロット＃２８０４２／ｋｌ）とを含んだ。
【０１０９】
ＧｌｏｂａｌＲｘ社（エフランド（Ｅｆｌａｎｄ）、ノースカロライナ州）から購入された注射可能な懸濁液のアブラキサン（登録商標）（ロット＃２００４９５、期限２００７年４月；Ａｂｒａｘｉｓ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ社）は、１００ｍｇのパクリタキセルと９００ｍｇのＨＳＡを含む粉末として提供された。次いでアブラキサン（登録商標）粉末は、５ｍｇ／ｍＬのパクリタキセルと４５ｍｇ／ｍＬのＨＳＡを含む懸濁液を生成するために２０ｍＬの無菌ＰＢＳを加えることによって再構成された。再構成されたアブラキサン（登録商標）は、安定性の消失を回避するためにパッケージ説明書に従って２４時間以内で実験に利用された。
【０１１０】
試薬
１）ミリＱ水
２）ベンジルアルコール、シグマ、ロット＃０２７４８ＰＣ
３）大豆油、シグマ、ロット＃０７４ｋ０１６９
４）Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０、シグマウルトラ、ロット＃０７３Ｋ００６４１
５）パクリタキセル（研究開発グレード）、インデナ（Ｉｎｄｅｎａ）、ロット＃２８０４２／ｋｌ
６）デキストロース（無水粉末）、フィッシャー、ロット＃０２４２９１
７）エマルシファン（Ｅｍｕｌｓｉｐｈａｎ）脂質混合物＃００３／０５
【０１１１】
抗体
１）マウス抗パクリタキセルＩｇＧ。カタログ番号ＴＡ１２；ハワイバイオテクノロジー社、アイエーア、ハワイ州。
２）ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８結合ニワトリ抗マウスＩｇＧ。分子プローブ社、ユージーン、オレゴン州。
【０１１２】
材料を染色する追加抗体
１）Ｎｕｎｃ Ｌａｂ Ｔｅｋ Ｃｅｌｌ チャンバスライドシステム。Ｎａｌｇｅ Ｎｕｎｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社、ロチェスター、ニューヨーク州。
２）トリス緩衝食塩水（ＴＢＳ）。Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ、ウスター（Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ）、マサチューセッツ州
【０１１３】
研究デザインと手順
実験は、調査者が各被験物質の正体を知らされていないように設計された。被験物質は新しいチューブに配置され、実験に直接関与しない人によってラベルが張り替えられた；結果が計算された後、被験物質の正体が明かされた。
【０１１４】
＞５０％の密集度に成長させられた細胞について、媒体が除去され、細胞単層が５ｍＬのＰＢＳの添加によって簡単に洗浄され、続いて吸引された。２ｍＬのトリプシンエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）が各フラスコに加えられ、フラスコは５分間組織培養培養器に配置された。１０ｍＬの完全培地が酵素反応を停止させるために加えられ、細胞は血清ピペットにより再懸濁を繰り返すことによって分解された。１０μＬの細胞が１０μＬの０．４％トリパンブルー溶液に加えられ、混合され、この細胞溶液の〜１０乃至２０μＬが血球計算器のチャンバに配置された。生細胞の数は、１００Ｘ全体倍率で四角形の血球計算器チャンバのトリパンブルーを除外した細胞の数を数えることによって測定された。
【０１１５】
必要とされる細胞の容積は下記式によって測定された：
細胞の容積＝（Ａｘ１０４細胞／ｍＬ）（ｍＬに必要な細胞のＶｔｏｔａｌ）÷（２ｄｆ）（Ｂ細胞／ｍＬ）
ここで：ｄｆは希釈比であり；Ａは血球計算器で数えられた細胞の数であり；Ｂは実験に必要な細胞／ｍＬの濃度である。
【０１１６】
Ａ５４９肺腫瘍とＭＤＡ ＭＢ ４３５乳癌細胞は、４×１０４細胞／ｃｍ２で８つのウェルチャンバスライド内に培養された。細胞は、被験物質が加えられる前に２４時間夜通し培養させられた。
【０１１７】
被験物質（各々２．５μＭのパクリタキセルを含む）および被験物質のないコントロール完全培地が二重のチャンバスライドウェルに加えられ、培養哺乳動物細胞（５％ＣＯ２。９５％０２；３７℃）を用いて標準状態で１時間培養された。培養期間の終わりに、細胞サンプルは１ｍＬのＰＢＳの添加によって暖かいＰＢＳにより一度洗浄され、続いて暖かいＰＢＳを吸引した。３ｍＬの氷冷のメタノールが各組織培養ウェルに加えられ、細胞は１５分間〜２０℃でメタノール内で固定された。スライドは染色まで０．０２％のアジ化ナトリウムを含むＰＢＳに配置された。
【０１１８】
細胞サンプルは１時間ｐＨ８．０のＴＢＳ内の１０％の正常ニワトリ血清（ＮＣＳ）で遮断された。遮断後に溶液が除去され、細胞は、１時間および室温で２％のＮＣＳとマウス抗パクリタキセルを１：１００の希釈で含むＴＢＳで培養された。一次の抗体培養の終わりに、細胞サンプルが洗浄ボトル内のＴＢＳで簡単にすすがれ、チャンバスライド全体がＴＢＳを含むコプリン染色びんに浸された。チャンバスライドの洗浄は、１０分間撹拌プレートの撹拌棒によりＴＢＳを攪拌することによって達成された。チャンバスライドは３つ変更したＴＢＳで洗浄された。細胞は、室温で３０分間Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８に結合した２％ＮＣＳとニワトリ抗マウスＩｇＧを１：１００の希釈で含むＴＢＳにより染色された。第２の抗体培養の終わりに、細胞は洗浄ボトル内のＴＢＳで簡単にすすがれ、上述したように洗浄された。染色された細胞は、１４．３μＭの４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール，二塩酸塩（ＤＡＰＩ）を含むＦｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔＧ封入剤（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）により取り付けた細胞であり、カバーガラスで覆われた。
【０１１９】
スライドと細胞は、抗パクリタキセルのＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒの第２染色を視覚化するために、励起４８０ｎｍと出射５２０ｎｍを用いるエピ蛍光顕微鏡で観察された。ＤＡＰＩの染色体染色は、励起３５８ｎｍと出射４６１ｎｍのフィルタを用いて視覚化された。画像は、Ｚｅｉｓｓ ＡｘｉｏｃａｍＨＲデジタルカメラとＡｘｉｏｖｉｓｉｏｎ画像収集および解析ソフトウェアを用いて得られた。パクリタキセル染色とＤＡＰＩ染色の画像は、Ｚｅｉｓｓ ＡｘｉｏｃａｍＨＲデジタルカメラにより各細胞領域について同時に取り込まれた。細胞領域のパクリタキセル染色の細胞内蛍光強度は、Ａｘｉｏｖｉｓｉｏｎソフトウェアを用いることによって測定された。４乃至１９個の細胞を各々含む細胞の８乃至１１の重複しない領域の画像は、各サンプルの二重のウェルの双方から無作為に取り込まれた。全てにおいて、合計１２３乃至１４７個の細胞が各細胞サンプルについて分析された。細胞周囲長は、マウスカーソルで細胞のエッジをデジタルでトレースすることによって各細胞について手動で規定された。
【０１２０】
計算と統計的分析
蛍光強度と細胞面積の計算と統計的分析データはＥｘｃｅｌのスプレッドシートにコピーされ、個別細胞の面積当たりの平均蛍光強度がＥｘｃｅｌで計算された。
【０１２１】
平均細胞蛍光強度を計算するために、下記式が用いられた：
［（Ｉ１／Ａ１）＋（Ｉ２／Ａ２）＋（Ｉ３／Ａ３）＋．．．（Ｉｎ／Ａｎ）］／ｎ＝細胞面積当たりの平均蛍光強度
ここで：Ｉは、細胞周囲長の手動トレースによって規定された各細胞面積の強度であり；Ａは、各規定された細胞面積の面積であり；ｎは、サンプリングされた細胞の数である。
【０１２２】
平均細胞内パクリタキセルレベルは、各治療されたサンプルの面積当たりの平均蛍光強度によって測定され、異なる被験物質で治療された細胞間で比較された。
【０１２３】
ＥｍＰＡＣ−、タキソール（登録商標）−、アブラキサン（登録商標）−治療細胞の平均蛍光強度値の統計有意差は、スチューデントのｔ検定を用いて比較された。
【０１２４】
結果
ＥｍＰＡＣ、タキソール（登録商標）、またはアブラキサン（登録商標）で各々治療された１０８乃至１４７個のＡ５４９細胞の平均蛍光強度が測定された。各被験物質で治療したＡ５４９細胞サンプルの細胞当たりの平均蛍光強度は、表９に示されている。被験物質なしで治療された細胞は、特定の染色を示さなかった（データは示されない）。このため、未治療の細胞の蛍光強度は測定されなかった。さらに、これらはパクリタキセルで治療する際に形状が丸くなり、これが細胞質と細胞周辺を視覚化するのを困難にしたので、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞の蛍光強度は測定されなかった。
表９．様々なパクリタキセル製剤に１時間晒されたＡ５４９細胞の細胞内蛍光性パクリタキセル
各群につき１０乃至１２の領域で１０９乃至１４７個の細胞より測定された。
表１０．Ａ５４９腫瘍細胞のパクリタキセル製剤の細胞面積当たりの細胞内蛍光性パクリタキセル強度を比較するステューデントｔ検定の結果
【０１２５】
図１３で分かるように、ＥｍＰＡＣ、タキソール（登録商標）、またはアブラキサン（登録商標）で治療された細胞は全て、微小管の典型的な核周囲の繊維模様を有した蛍光染色を示した。これは、パクリタキセルが微小管に貪欲に結合し、最初に細胞の微小管に局在化したので、抗パクリタキセル染色が特異的であったことを示している。
【０１２６】
スチューデントのｔ検定は、細胞面積値当たりの平均蛍光強度によって示されるように（表９および表１０；ＥｍＰＡＣとアブラキサン（登録商標）間、およびタキソール（登録商標）とアブラキサン（登録商標）間の比較はＰ＜０．０００１）、ＥｍＰＡＣまたはタキソール（登録商標）の何れかで治療された細胞がアブラキサン（登録商標）のものと比べて著しく強い平均細胞内パクリタキセルレベルを有することを示した。この違いは統計的な有意値（Ｐ＝０．０８）以下であったが、ＥｍＰＡＣがタキソール（登録商標）より適度に強い細胞内パクリタキセルレベルを持っていたこととが分かった（表９、１１６．７±２．０および１１２±１．８、それぞれ）。
【０１２７】
議論／結論
この研究の結果は、ＥｍＰＡＣとタキソール（登録商標）製剤の双方がアブラキサン（登録商標）を行ったものよりパクリタキセルの細胞吸収を著しく多くすることができることを示している。これらの結果は、これらのパクリタキセル製剤による細胞増殖阻害に関する以前の研究の結果と一致しているように見え、これは、１時間細胞に一時的に晒された場合にＥｍＰＡＣとタキソール（登録商標）がアブラキサン（登録商標）と比べてより多くの細胞増殖阻害活性を持つことを示した。これらの３つの製剤が同じ活性成分を有するので、これらの３つの製剤の違いについて１つの可能性のある説明は、それらの媒体が原因であるであろう。この場合、アブラキサン（登録商標）の媒体が、パクリタキセル（ＥｍＰＡＣとタキソール（登録商標）の媒体と比べて、細胞の吸収量を抑制する可能性がある。
【０１２８】
この研究による結果は、タキソール（登録商標）で調剤されたものとＥｍＰＡＣで調剤された放射標識パクリタキセルの細胞の吸収量を比較した実施例２の結果と一致している。しかしながら、実施例２の結果は、タキソール（登録商標）で治療された細胞のパクリタキセル吸収量と比べて、ＥｍＰＡＣで治療されたＡ５４９細胞のパクリタキセル吸収量は著しく多いことを示した。多いが、タキソール（登録商標）で治療された細胞と比べてＥｍＰＡＣで治療された細胞のパクリタキセル吸収量が多いことがこの研究で観察されたが、この違いは統計的な有意値以下であった。この結果の違いは、ＥｍＰＡＣ製剤が２つの研究で異なっていたという事実によるであろう。
【０１２９】
参照
Ｉｂｒａｈｉｍ ＮＫ，Ｄｅｓａｉ Ｎ，Ｌｅｇｈａ Ｓ，Ｓｏｏｎ−Ｓｈｉｏｎｇ Ｐ，Ｔｈｅｒｉａｕｌｔ ＲＬ，Ｒｉｖｅｒａ Ｅ，Ｅｓｍａｅｌｉ Ｂ，Ｒｉｎｇ ＳＥ，Ｂｅｄｉｋｉａｎ Ａ，Ｈｏｒｔｏｂａｇｙｉ ＧＮ，およびＥｌｌｅｒｈｏｒｓｔ ＪＡ．２００２年 ＡＢＩ−００７ Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ無し タンパク質安定化 パクリタキセルのナノ粒子製剤のフェーズＩおよび薬物動態研究 Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．８：１０３８−１０４４。
Ｓｉｎｇｌａ ＡＫ、Ｇａｒｇ ＡおよびＡｇｇａｒｗａｌ Ｄ．２００２年 パクリタキセルとその製剤 Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．２３５：１７９−１９２。
【０１３０】
本発明は、癌細胞と癌組織を治療する抗癌剤を含む治療薬と診断薬を運ぶ組成形態でのデリバリシステムに向けられていることが理解されるであろう。したがって、全抗癌剤は本発明の範囲内であり、同様に異常な脂質代謝と脂質の高い吸収量を示す全病変組織と異常細胞は、癌細胞を含み、この治療薬によって治療されるであろう。
【０１３１】
前述の議論は、本発明の例示的実施形態を単に開示および記載するものである。当業者は、以下の特許請求の範囲に規定されている本発明の趣旨および範囲から外れずに、様々な変更、修飾および変形を行ってもよいことをこの議論および添付した特許請求の範囲から容易に理解するであろう。さらに、例示的実施形態が本書に記載されているが、他の当業者は本発明のその他の設計または使用に気づくであろう。したがって、本発明はその例示的実施形態に関して記載されているが、デザインおよび使用の双方における多くの変形が当業者に明らかであり、本出願が任意の適合またはその変形を包含するように意図されていることを理解されるであろう。よって、本発明は特許請求の範囲およびその均等物によってのみ限定されることを明確に意図する。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、治療薬と診断薬に関し、特に患者への導入に適しており、腫瘍細胞を含む過剰増殖によって特徴づけられた細胞内へ活性選択剤の濃度を促進可能な脂質−油−水のナノエマルジョンの微小管相互作用薬の製剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
腫瘍内およびこれらの微環境内の薬剤分布の役割は十分に研究されていない。現在、有効性を知るために、最も効き目のある薬剤でさえ高用量を投与して拡散と組織分布を促進しなければならない。しかしながら、腫瘤内の薬剤濃度を高めることが常に細胞の薬剤濃度あるいは細胞内の標的への到達能を高めるとは限らない。実際に、ある薬剤はポリマ結合、リポソームカプセル化、または固体脂質ナノ粒子製剤によって腫瘤内濃度を高めるかもしれないが、これらは事実上細胞の吸収量と分布を阻害するであろう。さらに、拡散によって腫瘍浸透を促進するために高用量投与することは一般に高い死亡率の癌治療に関連する副作用をもたらす場合がある。このため、腫瘍組織への薬剤浸透を改善し、高い安全性と有効性の側面を同時に提供しながら腫瘍細胞内のその濃度を高めるドラッグデリバリ技術を考案することが望ましい。腫瘍内への薬剤の受動的な蓄積について種々のアプローチが探究されているが、活発な腫瘍細胞の吸収量の促進について有効な技術はほとんどない。
【０００３】
脂溶性薬剤は容易に細胞膜に浸透し、細胞内へ輸送されるであろう。癌細胞などの過剰増殖によって特徴づけられた細胞は、一般に異常な脂質代謝を示し、脂質と脂肪酸の非常に高い優先的な吸収によって特徴づけられる。このように癌に関して脂質は、膜構造、成長および転移、信号伝達、ならびに輸送過程に不可欠な役割を果たすことが分かった。
【０００４】
腫瘍血管に特有の漏出性の特徴によって引き起こされ、脂質粒子、リポソーム、人工ナノ粒子、および他の高分子剤の強化された浸透性と貯留（ＥＰＲ）効果として知られている現象は固形腫瘍で一般的であり、例えばポリマ結合抗癌剤のより選択的なターゲティングと腫瘤蓄積について探究されてきた。ポリマ小胞、リポソーム、および固体ポリマ粒子あるいは脂質ナノ粒子などの封入剤の使用は、それぞれ様々な組成、製剤および構造で調製され、様々な生理学的条件下で投与されており、先行技術で報告されてきた。しかしながら、これらの作用薬は腫瘍に受動的な蓄積を可能にするに過ぎない。さらに、これらの作用薬はしばしば細網内皮系の広範囲の共蓄積によって循環系から急速に追い出され、しばしばこれらの作用薬の使用は細胞毒性に関連し、免疫反応を増強する。
【０００５】
複数のレセプタタイプとレセプタサブタイプ、輸送タンパク、および脂質ラフト現象は、同じ疾病を持つが変質した遺伝的特徴を持つ患者間でさえ、癌細胞内の脂質吸収量に関係する可能性があることを研究が示した。天然のレセプタ配位子を模倣し、癌細胞の標的と薬剤吸収量を増加する脂質型ナノ粒子またはＨＤＬもしくはＬＤＬ型薬物担体が、様々な治療薬と共に調製されているが、癌治療の能動的な腫瘍細胞の薬剤吸収を促進する最適化された製剤が欠けている。
【０００６】
参照により本書に組み込まれるＤ’Ａｒｒｉｇｏの米国特許第４６８４４７９号明細書および第５２１５６８０号明細書は、ガスあるいは空気で満たされた脂質コートマイクロバブル（ＬＣＭ）の製剤と、この製造方法および使用方法について記載しており、超音波法とドラッグデリバリの造影剤として用いられる。ＬＣＭの製造プロセスは、特定の鎖長で一定比率の飽和グリセリドとコレステロールエステルなどの非イオン脂質の水性懸濁液の単純な機械的振動に基づいている。全ての場合において、加えられた大部分の脂質（９９％）は凝集または沈殿し、ろ過による材料の追加損失を１％以下生じる。さらに、これらの人工ＬＣＭはとても長寿命であることが分かり、６ヶ月以上生体外で持ちこたえた。さらに、少ないろ過収量にも拘わらず、ＬＣＭは、腫瘍組織の微小循環系の有窓毛細血管壁を通過するのに十分に小さく十分に柔軟である。特に注目は、げっ歯類の脳腫瘍細胞内やイヌの自発性腫瘍内のＬＣＭの高い選択性、温度依存性、明らかな飽和吸収性であり、癌細胞のある脂質の自然吸収量によく似ていると考えられる。しかしながら、現在まで患者投与の有害な副作用を存在しないレベルまで最小化するＬＣＭ技術を利用した医薬品化合物の有効な製剤はなかった。
【０００７】
パクリタキセルはタキサンとして知られている薬剤の種類の要素であり、北米西岸イチイ木、セイヨウイチイ、および近縁種の樹皮から最初に分離される。アレルギ反応は製剤賦形剤で観察されたが、タキサンは卵巣癌、胸部癌、非小細胞肺癌、および頭頸部癌などの様々な癌の治療で有用であることが分かった。タキサンを投与する際の難しさは、この薬剤が一般に水に溶けないということである。従って、パクリタキセルはＣｒｅｍｏｐｈｏｒＥＬ（登録商標）（ポリオキシエチレンヒマシ油）とエタノールとの１：１の混合物内に調剤され、タキソール（登録商標）（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ社）を生成した。外部に結晶化する総ての薬剤を除去する直列型のろ過と共に、約１２時間安定する適切な担体の再構成が必要である。タキソール（登録商標）は神経毒性を示し、知覚障害を引き起こし、時には患者の運動神経障害を伴った。ＣｒｅｍｏｐｈｏｒＥＬ（登録商標）は、それ自体深刻な副作用がないので神経障害の一部の要因である。
【０００８】
安定した脂肪乳剤にパクリタキセルを製剤する試みも同様に失敗した。この薬剤は、大豆油を最初に含むイントラリピッド（登録商標）、または大豆とベニバナ油との混合物を含むリポシン（登録商標）などの脂肪乳剤に溶けないことが報告されている。大豆またはベニバナ油の何れかでパクリタキセルを加熱しても、あるいは超音波処理しても相当量の薬剤が溶解せず、均質化ステップ中の脂肪乳剤へのパクリタキセルの添加は一様に期待外れの結果に直面する。パクリタキセルを最大１５ｍｇ／ｍＬ組み込む乳剤は、トリアセチン、Ｌ−αレシチン、ポリソルベート８０、プルロニックＦ−６８、オレイン酸エチルおよびグリセロールと共に調剤された。しかしながら、これらの乳剤は非常に有毒で不安定である。パクリタキセルはさらに、ＬＣＭ製剤のＣｒｅｍｏｐｈｏｒＥＬ（登録商標）とエタノールとに結合された。しかしながら、ＬＣＭの腫瘍吸収の選択性はドラッグデリバリの観点から魅力的であるが、先行技術によれば製造歩留まりと薬剤積載能力が低すぎて実用的でない。パクリタキセルを持つＣｒｅｍｏｐｈｏｒＥＬ（登録商標）とエタノールの使用はさらに、恐らくこの製剤の毒性の一因となっている。
【０００９】
さらに、生産方法が複雑であり、条件の小さな変更が粒子径と性能特性とに有意差をもたらす場合がある。典型的なアプローチは、高せん断力均質化と超音波、高圧均質化、ホットホモジナイゼーション、コールドホモジナイゼーション、および溶媒乳化蒸発を含む。無菌ろ過または放射線による滅菌はさらに複雑かもしれない。このように、エタノールと水溶液への薬剤の添加、続いて高せん断力均質化によるＬＣＭの薬剤積載量と脂質溶解度を高める試みは、全く薬剤を含まない安定性に乏しくガスのない粒子の製剤をもたらす。
【００１０】
腫瘤内の蓄積と細胞内在化を同時に促進するが、健康な組織内の蓄積を制限する適切な輸送媒体に治療薬を投与することが非常に望ましい。より有効なデリバリにより、僅かな副作用または低減した副作用で同じ治療結果またはより良好な治療結果を達成しながら、全身の健康な組織の治療薬の濃度が減少されてもよい。固有レベルの腫瘍細胞選択性を持つ作用薬のこのデリバリは、さらなる利点を提供するであろう。さらに、単一の腫瘍型に限定されないが、腫瘤内の選択的な蓄積と種々の癌細胞型への細胞内在化とを可能にする輸送媒体が特に望ましく、より安全でより有効な癌治療を可能にするであろう。治療薬の高い積載能力を可能にする輸送媒体はさらに、この分野で著しい進歩となるであろう。
【００１１】
このため、安定的で、容易に調製され、生体適合性があり、効果的な製剤の微小管相互作用薬であって、腫瘍細胞への吸収を促進し、さらに最小限の副作用を示すパクリタキセルなどのタキサンを含んだ微小管相互作用薬に対する明らかな要望がある。
【００１２】
本発明の目的と産業上の利用可能性
従って、本発明の目的は、癌などの細胞過剰増殖によって特徴づけられる疾病、状態、および症候群の治療または診断で用いられる医薬組成物であって、腫瘍細胞への迅速で高い選択性と優先的な吸収性を示す医薬組成物を提供することである。
【００１３】
本発明の更なる目的は、癌などの細胞過剰増殖によって特徴づけられる疾病、状態、および症候群の治療または診断で用いられる医薬組成物であって、投与の際に最小限の副作用を引き起こす医薬組成物を提供することである。
【００１４】
また本発明の更なる目的は、癌などの細胞過剰増殖によって特徴づけられる疾病、状態、および症候群の治療または診断で用いられる医薬組成物であって、最小限の費用で容易に製造することができ、可能な限り長期間に渡って貯蔵することができる医薬組成物を提供することである。
【発明の概要】
【００１５】
これらの目的を達成するため、本発明は、人を含む温血動物の細胞過剰増殖によって特徴づけられる疾病、状態、もしくは症候群またはこれらの症状を治療、診断、または予防するのに有用な医薬組成物であって、以下に規定される脂質粒子であって、水相内に一様に分散されて、癌細胞を含む異常細胞内に選択的または優先的に内在化することが可能な脂質粒子で構成された脂質ナノエマルジョンと；前記脂質ナノエマルジョンに連結された少なくとも１つの有効量の治療薬または診断薬と；薬剤的に受容可能な担体とを含む医薬組成物を提供する。
【００１６】
この脂質粒子は少なくとも１つの非二層形成脂質をそれぞれ具える。この適切な脂質粒子は、癌細胞を含む過剰増殖によって特徴づけられた異常細胞内に治療薬または診断薬の標的されたデリバリと濃度を著しく高めることが分かっており、所望の治療効果を達成するのに必要な投与量と投与頻度を減少または少なくとも維持しながら治療効率と生体利用性を改善した。さらに、ナノエマルジョンは拡張された持続時間の優秀な物理的および化学的な安定性を示し、これによって安定的にすぐに投与できる形態で医薬組成物の販売前包装を非常に容易にし、さらにこれによって類似活性剤を含む先行技術の組成で現在実施されるような病床での希釈と製剤に関連した問題と不便さをなくしている。
【００１７】
この脂質粒子は薬剤的に活性な治療効果のある微小管相互作用薬を自身に連結した。適切な微小管相互作用薬は、限定されないが、例えばパクリタキセルなどのタキサンと；エポチロンと；例えばビンクリスチンなどのビンカアルカロイドと；エリュテロビンと；ジスコデルモリドと；ドラスチンと；コルヒチンと；コンブレスタチンと；フォモプシンＡと；ハリコンドリンＢと；スポンギスタチン１と；サルコジクチンと；ラウリマリドと；これらの誘導体、類似体、同属種および前述した各作用薬の組み合わせとを含む。微小管相互作用薬は、過剰増殖した細胞の成長を止めるか、または少なくとも中断するのに十分な量で存在する。
【００１８】
本発明の更なる態様では、人を含む温血動物の癌を含む細胞過剰増殖によって特徴づけられる疾病、状態または症候群を診断、治療または予防する方法であって、本書で開示された有効量の医薬組成物を温血動物に投与するステップを含む方法が提供される。
【００１９】
また本発明の更なる態様では、本書で開示された医薬組成物を調剤する方法であって、ａ）少なくとも１つの非二層形成脂質を少なくとも１つの有効量の診断薬または治療薬と混合して脂質部を得るステップと；ｂ）脂質部を水相に加えて分散を得るステップと；ｃ）分散を高せん断力の条件下で撹拌して少なくとも１つの非二層形成脂質を十分に分散し、脂質粒子で構成された脂質ナノエマルジョンを形成するステップと、を含む方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
以下の図面は本発明の実施形態の例示であり、明細書と特許請求の範囲全体に含まれるアプリケーションの範囲を限定するよう意図されていない。
【図１】図１は、本発明に係る２０％のＤＭＳＯに１０％のパクリタキセルを充填した脂質粒子の粒径分布とゼータ電位を示す図である。
【図２】図２は、ショ糖密度の研究におけるパクリタキセル充填脂質粒子の溶解率をプロットするグラフによって本発明に係る脂質粒子へのパクリタキセルの組み込みを示す図である。
【図３】図３Ａおよび図３Ｂは、本発明に係る細胞の脂質粒子吸収量を蛍光活性化細胞分類によって定量化することができることを示すグラフである。
【図４】図４Ａ−図４Ｄは、ＨＴ−２９結腸腫瘍細胞とＳＦ−５３９肺腫瘍細胞と比べた腫瘍細胞株による本発明に係る細胞の脂質粒子吸収量を示すグラフである。
【図５】図５は、ＣｒｅｍｏｐｈｏｒＥＬ（登録商標）で製剤されたパクリタキセルより本発明に係るある特定の混合物の脂質粒子で調剤されたパクリタキセルを腫瘍細胞が大量に取り込むことを示すグラフである。
【図６】図６は、ＬＮとＣｒｅｍｏｐｈｏｒＥＬ（登録商標）の双方を２時間薬剤培養後にパクリタキセルの細胞吸収量がプラトーに達したことを示すグラフである。
【図７】図７は、パクリタキセルの量が本発明に係る脂質粒子の細胞吸収量に対して飽和しているかどうかを測定する実験結果を示す図である。
【図８】図８Ａおよび図８Ｂは、コレステロールが本発明に係る脂質粒子の細胞吸収量の重大な成分であることを示すグラフである。
【図９】図９Ａおよび図９Ｂは、ＣｒｅｍｏｐｈｏｒＥＬ（登録商標）内のパクリタキセルより本発明に係る脂質粒子内のパクリタキセルが多く内在化することを示すグラフである。
【図１０】図１０Ａ−図１０Ｄは、パクリタキセル単独対本発明に係る脂質粒子内のパクリタキセルの細胞毒性を示すグラフである。
【図１１】図１１は、ＣｒｅｍｏｐｈｏｒＥＬ（登録商標）内に製剤された場合より本発明に係る脂質粒子内に調剤された場合にパクリタキセルがより強い細胞毒性を有することを示す図である。
【図１２】図１２Ａおよび図１２Ｂは、ＣｒｅｍｏｐｈｏｒＥＬ（登録商標）内に調剤された場合により本発明の脂質粒子内に調剤された場合に、パクリタキセルが著しく強い抗腫瘍活性を有することを示すグラフを示す。
【図１３】図１３は、ＥｍＰＡＣ、アブラキサン（登録商標）、またはタキソール（登録商標）により治療され、パクリタキセル特異抗体で染色されたＡ５４９細胞の代表的な画像である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明は一般に、温血動物の細胞過剰増殖によって特徴づけられる疾病、状態もしくは症候群またはこれらの症状を治療、診断または予防するための医薬品組成物に向けられている。この動物は、癌を含む細胞過剰増殖によって特徴づけられる疾病およびその他の病的状態および症候群に罹患しているヒト、ウマ、ウシ、イヌおよびネコを含む家畜などの哺乳類クラスを含む。本発明の医薬組成物は、脂質粒子で構成されたナノエマルジョンを含み、以下で規定されるように、少なくとも１つの治療用または診断用の微小管相互作用薬に操作的に連結され、これに対して脂質粒子が高い充填能力と、薬剤的に受容可能な担体または賦形剤を有し、これによって腫瘍などの異常細胞と病変組織への選択的なデリバリと有効濃度とに特に適切な脂質粒子を生成する。
【００２２】
ナノエマルジョンの脂質粒子は、腫瘍細胞と腫瘍組織とを含む異常細胞と病変組織への高い受動的な蓄積と能動的な内在化の双方を容易にするよう構築される。脂質粒子が病変組織の血管領域に受動的に蓄積するとき、脂質粒子は能動的な代謝吸収によってこれらの細胞へ取り込まれる。このように、本発明の脂質粒子は、腫瘍と癌細胞とを含む過剰増殖によって特徴づけられた細胞による吸収と内在化を選択的かつ優先的に標的とした輸送媒体を提供する。本書で使用される「内在化」とは、脂質粒子が細胞によって能動的に取り込まれることを意味する。粒子の治療薬または診断薬の高い充填能力と結合されたこの高い内在化レベルは、この標的に有効量の治療薬または診断薬を提供することによって、これらの標的の治療または診断に有力な媒体を提供し、これによって成長、誘導性分化の停止、または細胞の死滅を含む治療上の有益な効果を誘導する。
【００２３】
従って本発明の脂質粒子は、異常細胞と病変組織への治療薬のデリバリを強化するだけでなく、特に先行技術のデリバリシステムと比べて所望の効能を達成するのに必要な治療薬の量を減少する。本発明の脂質粒子は、拡張された時間に渡って物理的および化学的に非常に安定的であり、従って先行技術のデリバリシステムで一般に示される望ましくない沈殿、凝集または不溶による治療薬または診断薬のロスを最小化する。さらに、これらの脂質粒子はその他の長所を示し、これは制御された放出と；強化された薬剤安定性と；正の薬剤充填能力と；疎水性薬物との良好な互換性と；相対的に低い生体有毒性と；低い有機溶媒含有量とを含む。また、本脂質粒子は調製および投与するのが相対的に簡単で便利である。
【００２４】
本書で用いられるように、用語「脂質粒子」は一般にナノサイズの任意の脂質を含む構造を包含するよう意味し、これはナノエマルジョンの一部を形成する実質的に無傷の粒子である。用語「実質的に無傷」とは、リポソームと対比されるとき、膜がない状態で粒子がその形状を維持することをいう。この脂質粒子は少なくとも１つの非二層形成脂質で構成される。
【００２５】
脂質二層構造または脂質二層配置は一般に、親水性端子（極性の頭部）と疎水性端子（非極性の尾部）を有するある種類の脂質によって形成され、水溶液中の脂質分子の２つの対向層に自己組織化する能力および／または傾向を示す。脂質分子の２つの対向層が整列されてこれらの疎水性端子面は互いに対面して油状コアを形成するが、これらの親水性端子面は二層構造の何れかの側の水溶液に対面する。本発明では、用語「非二層形成脂質」は、水溶性の環境で脂質二層構造または脂質二層配置を形成するこの性能および／または傾向を欠く脂質を包含している。非二層形成脂質の実施例は、弱極性の脂質を含み、好ましくは実質的に非極性または中性である脂質を含む。本発明のより好適な脂質は中性脂質である。
【００２６】
本発明の脂質粒子は、米国特許第４６８４４７９号明細書と第５２１５６８０号明細書に記載されたガス含有マイクロバブルと区別され、例えば参照により本書に全て組み込まれる米国特許第６５６５８８９号明細書と第６５９６３０５号明細書に記載されたリポソームと構造上区別される。特に脂質粒子は、生理学的に受容可能である非二層形成脂質の混合物によって形成され、例えばリン脂質を含む帯電脂質または極性脂質がある状態で少なくとも実質的に遊離する。非二層形成脂質の好適例は、飽和カルボン酸および不飽和カルボン酸のグリセロールモノエステルと；飽和脂肪族アルコールのグリセロールモノエステルと；ステロール芳香族酸エステルと；ステロールと；テルペンと；胆汁酸と；胆汁酸のアルカリ金属塩と；脂肪酸のステロールエステルと；糖酸のステロールエステルと；糖酸のエステルと；脂肪族アルコールのエステルと；糖質のエステルと；脂肪酸のエステルと；糖酸と；サポニンと；サポゲニンと；グリセロールと；脂肪酸のグリセロールジエステルと；脂肪酸のグリセロールトリエステルと；脂肪族アルコールのグリセロールジエステルと；脂肪族アルコールのグリセロールトリエステルと；これらの組み合わせと、から選択されたものを含む。
【００２７】
本発明の実施形態では、脂質粒子は非二層形成脂質の選択群の混合物を最初に形成することによって調製され、これは以下に記載されたサイズを持つ脂質粒子であって、標的の病変組織と異常細胞に適用されたときに高い内在化レベルを促進する脂質粒子を提供する。脂質混合物は一般に、
ａ）約９乃至１８の炭素原子を含むカルボン酸のグリセロールモノエステルと、約１０乃至１８の炭素原子を含む脂肪族アルコールとから成る群から選択された少なくとも１つの第１要素と；
ｂ）ステロール芳香族酸エステルから成る群から選択された少なくとも１つの第２要素と；
ｃ）ステロール、テルペン、胆汁酸および胆汁酸のアルカリ金属塩から成る群から選択された少なくとも１つの第３要素と；
ｄ）約１乃至１８の炭素原子を含む脂肪酸のステロールエステルと；糖酸のステロールエステルと；約１０乃至１８の炭素原子を含む糖酸と脂肪族アルコールのエステルと；約１０乃至１８の炭素原子を含む糖質と脂肪酸のエステルと、糖酸と、サポニンと；サポゲニンとから成る群から選択された少なくとも１つの任意の第４要素と；
ｅ）グリセロールと、約１０乃至１８の炭素原子を含む脂肪酸のグリセロールジエステルまたはグリセロールトリエステルと、約１０乃至１８の炭素原子を含む脂肪族アルコールとから成る群から選択された少なくとも１つの任意の第５要素と、を含む。
【００２８】
上記に記載された脂質混合物は要素（ａ）乃至（ｃ）の存在を含むに過ぎないが、脂質粒子のサイズの長期安定性と均一性が、これら２つの任意の要素の存在によって理論上強化されるので、要素（ｄ）および／または（ｅ）を組み込むほうが好適である。
【００２９】
本発明の好適な実施形態では、本発明の脂質粒子を形成する脂質混合物を構成する５つの要素（任意の２つの要素を含む）は、それぞれ（ａ）：（ｂ）：（ｃ）：（ｄ）：（ｅ）が（１−５）：（０．２５−３）：（０．２５−３）：（０−３）：（０−３）の重量比で結合される。
【００３０】
脂質混合物の第１要素は、約１０乃至１８の炭素原子を含む飽和カルボン酸のグリセロールモノエステルを含むよう記載されたが、限定されないが９−炭素オレイン酸またはエライジン酸などの約９乃至１８の炭素原子を含むモノカルボン酸またはポリ不飽和カルボン酸のグリセロールモノエステルも脂質混合物の構造に有用であると考えられる。
【００３１】
脂質混合物の要素の大きさは、限定されないが、デリバリの標的の細胞および／または組織の種類と、充填される治療薬または診断薬と、治療薬または診断薬の所望の投与量と、用いられる薬剤的に受容可能な担体と、投与形態と、その他の賦形剤または添加剤の存在などを含む幾つかの因子に依存して変更してもよいことが理解されるであろう。さらに、標的の病変組織と異常細胞によって脂質粒子を選択的に内在化させることができる因子は、脂質混合物の組成と得られる脂質粒子の構造だけでなく以下に記載される粒子のサイズと分子量も含む。
【００３２】
本発明の脂質粒子は所望の粒径分布を維持しており、好ましくは、粒子の主要部分は約０．０２乃至０．２μ（ミクロン）、好ましくは０．０２μ乃至０．１μの範囲の平均粒子径を有し、上記または以下の範囲に留まる少量の粒子と最大約２００ｎｍの範囲しかない幾つかの脂質粒子とを変更する。本発明の脂質粒子で達成可能な粒子径範囲はさらに、拡張された時間に渡って強化された物理的および化学的安定性と、望ましくない凝集と薬剤沈殿の実質的な減少とへ導く。さらに、この範囲は癌の治療に特に適しており；より大きな粒子は他の利用（例えば、他の種類の細胞または組織のターゲティング）に適合されてもよい。本書で提供される範囲は、使用された脂質混合物と、追加された治療薬または診断薬の種類および量によっていくぶん決定されるであろう。
【００３３】
本発明で用いられる治療薬または診断薬は無帯電または帯電、非極性または極性、天然または合成などでもよい。本書で用いられる用語「治療薬」は、限定されないが、薬剤、ホルモン、ビタミン、栄養素、物質などを含む任意の物質を含み、これは微小管の生成、構造、連結、機能および破壊に影響を与え、これにより、癌を含む細胞過剰増殖によって特徴づけられる疾病、状態、症候群またはこれらの症状の予防と治療で有用である。したがって、本発明で有用な治療薬は、微小管の生成、構造、連結、機能および破壊に影響を与えるあらゆる種類の薬剤と、脂肪親和性ポリペプチドと、細胞毒素と、オリゴヌクレオチドと、細胞毒性抗腫瘍薬と、抗代謝剤と、ホルモンおよび放射性分子とを含む。用語「オリゴヌクレオチド」は、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびセンスオリゴヌクレオチド（例えばベクタとして従来知られている核酸）の双方を含む。オリゴヌクレオチドは、サブユニットまたはサブユニット間の結合に関して「天然」または「修飾」されてもよい。
【００３４】
しかしながら、本発明の特別な態様では、治療薬は微小管相互作用薬であって、例えばパクリタキセル、ドセタセル、セファロマンニンバッカチンＩＩＩ、１０−デアセチルバッカチンＩＩＩ、デアセチルパクリタキセルおよびデアセチル−７−エピパクリタキセルなどのタキサンと；例えばビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビン、ビンデシンおよびこれらの類似体などのビンカアルカロイドと；エポチロンと；エリュテロビンと；ジスコデルモリドと；ドラスチンと；コルヒチンと；コンブレスタチンと；フォモプシンＡと；ハリコンドリンＢと；スポンギスタチン１と；サルコジクチンと；ラウリマリドと；誘導体、類似体、同属種およびこれら前記作用薬の各々の結合と；この微小管相互作用活性を示すと知られている類似薬または類似物質とから成る群から選択した微小管相互作用薬である。
【００３５】
またパクリタキセルなどのタキサンは、より少量の徐放性投与量で抗炎症剤として用いられてもよい。この用途は、ステントなどの患者内に外科的に配置される生体医用器具の分野で特に重要である。ステント周囲およびステント内側の細胞の幾らかの蓄積は、この蓄積が平滑な被覆を形成し、これによって動脈自体にこの器具を組み込むときに好適であるが、この細胞蓄積がさらに内部の通路を妨げて、動脈の再狭窄を引き起こす場合がある。結果として、Ｂｏｓｔｏｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ株式会社は、ステント表面にパクリタキセルを結合する専用ポリマで覆われたパクリタキセル溶出冠状動脈ステントシステムを製造している。パクリタキセルポリマ複合体は、パクリタキセルの投与量と徐放特性を正確に制御することが可能であり、十分な量の薬物の溶出を可能にし、ステント周囲の細胞蓄積を阻害し、ステント周囲の再狭窄と血管再生を著しく防止する。本発明の医薬組成物は、特に治療薬がタキサンまたは他の微小管相互作用薬である場合、外科的に植え込まれた生体医用器具周囲の細胞蓄積を調整するのに同様に有用になると考えられる。
【００３６】
本発明の医薬組成物は、長期的な物理的および化学的安定性を示し、この組成を安定的にすぐに投与できる剤形に便利に販売前包装するのを可能にしており、これによって先行技術の類似組成に一般に関連する投与に先立って病床での希釈と製剤のニーズをなくしている。本発明の医薬組成物は、拡張された期間（例えば約３０℃で少なくとも１４日間および４℃で少なくとも１２ヶ月）に渡って所望の薬剤安定性と乳化安定性を示す。本発明の医薬組成物は、約０．１μｇ／ｍＬ乃至１０００μｇ／ｍＬ、好ましくは約１０μｇ／ｍＬ乃至８００μｇ／ｍＬ、および最も好ましくは約２００μｇ／ｍＬ乃至６００μｇ／ｍＬの量の脂質粒子を含む。医薬組成物の全容積に基づく治療薬または診断薬の典型的な濃度は、少なくとも０．００１重量／体積（ｗ／ｖ）％、好ましくは０．００１乃至９０重量／体積％、およびより好ましくは約０．１乃至２５重量／体積％でよい。医薬組成物に存在する治療薬または診断約の量は、約０．００１μｇ／ｍＬ乃至１０００μｇ／ｍＬ、好ましくは約０．１μｇ／ｍＬ乃至８００μｇ／ｍＬ、およびより好ましくは約６０μｇ／ｍＬ乃至４００μｇ／ｍＬに及んでよい。
【００３７】
本発明の医薬組成物はさらに、植物性脂肪源、溶媒、界面活性剤またはこれらの組み合わせから選択された乳化促進剤を含んでもよい。乳化促進剤は、脂質粒子の望ましくない沈殿または凝集を低減また最小限にすることによって、理論上脂質粒子の安定性を強化し、小さな粒子径特性を維持し、これによって癌細胞への脂質粒子の能動的取り込みに積極的に影響を及ぼし促進することが個々にまたは組み合わせで分かった。乳化促進剤はさらに、本発明の医薬組成物の物理的および化学的安定性と薬剤運搬容量を改善するはずである。
【００３８】
本発明の好適な実施形態では、植物性脂肪源は、例えば大豆油とアマニ油、大麻油、アマニ油、からし油、菜種油、キャノーラ油、ベニバナ油、ゴマ油、ひまわり油、ブドウ種油、アーモンド油、アプリコット油、ヒマシ油、トウモロコシ油、綿実油、ココナッツ油、ヘーゼルナッツ油、ニーム油、オリーブ油、ヤシ油、パーム核油、ピーナッツ油、パンプキンシード油、米ぬか油、くるみ油およびこれらの混合物など植物油の形態で一般に植物由来脂肪酸を含む。より好適な植物油は大豆油である。
【００３９】
植物油は通常、ナノエマルジョンの表面張力を高めるのに十分な量で存在し、これは次に標的細胞の細胞質膜またはその受容体と疎水的相互作用の確率を高める。植物性脂肪源は約０．００１乃至５．０体積／体積（ｖ／ｖ）％、より好ましくは約０．００５乃至４．０体積／体積％、および最も好ましくは約０．０１乃至２．５体積／体積％の量で存在してもよい。
【００４０】
本発明の別の好適な実施形態では、界面活性剤は非イオン性界面活性剤から選択されたものである。非イオン性界面活性剤の実施例は、脂肪族アシル化ソルビタンエステルおよびこのポリオキシエチレン誘導体などのソルビタンエステルならびにこの混合物と、限定されないがポロキサマ化合物（１８８、１８２、４０７および９０８）、チロキサポール、ポリソルベート２０、６０および８０、グリコール酸ナトリウム、硫酸ドデシルナトリウムなどを含むこれらの混合物と、これらの組み合わせとを含む。より好適な非イオン性界面活性剤は、例えばＴｗｅｅｎ（登録商標）−８０などの洗浄性ポリソルベートである。
【００４１】
界面活性剤は通常、ナノエマルジョンの疎水性成分と親水性成分の間の界面を安定し、疎水性成分が結合するよう維持することによって、ナノエマルジョンの動力学的安定性を高めるのに十分な量で存在し、このため一度形成されたナノエマルジョンは貯蔵中に著しく変化しない。界面活性剤は、約０．０１乃至４．０重量／体積％、より好ましくは約０．１乃至３．０重量／体積％、および最も好ましくは約０．２乃至２．５重量／体積％の量で存在する。
【００４２】
さらに本発明の別の好適な実施形態では、溶媒は任意の薬剤的に受容可能な水混和性希釈剤または例えば極性のプロトン性溶媒と極性の非プロトン性溶媒などの溶媒を含む。この溶媒は好ましくは、１，３−ブタンジオールと；ジメチルスルホキシドと；メタノール、ブタノール、ベンジルアルコール、イソプロパノールおよびエタノールなどのアルコールと；同種のものとから選択される。より好適な溶媒はベンジルアルコールである。
【００４３】
溶媒は通常、ナノエマルジョンの非イオン性界面活性剤の凝集の程度を制御するのに十分な量で存在する。溶媒は、約０．００１乃至９９．９体積／体積％、より好ましくは０．００５乃至８０体積／体積％、および最も好ましくは約０．００５乃至７０体積／体積％の量で存在してもよい。
【００４４】
本発明の組成は、治療薬または診断薬に内在する薬理活性または化学的性質を修飾または変更しないが、癌細胞または癌組織を含む異常細胞または病変組織への作用薬のデリバリおよび内在化を簡単に強化し、治療または診断の効果を提供する。癌治療の治療薬としてタキサンの使用に関する教示の実施例は、参照により本書にそれぞれ組み込まれる米国特許第６３４６５４３号明細書と；第６３８４０７１号明細書と；第６３８７９４６号明細書と；第６３９５７７１号明細書と；第６４０３６３４号明細書と；第６５００８５８号明細書とに例えば開示されている。
【００４５】
一般に、本発明の医薬組成物は、脂質粒子を治療薬または診断薬と結合し、同様に完全に混合することによって調製される。脂質混合物は、治療薬または診断薬と混合するのに先立って植物性脂肪源と組み合わせて界面活性剤と混合されてもよく、これ自体は溶解のため水混和性溶媒と混合されてもよい。次いで脂質粒子−治療薬／診断薬の結合が、水、好ましくは精製水と共に混合される。次いで得られた混合物は高せん断力に晒され、一般に標準的な従来のせん断集中均質化ミキサまたはホモジナイザ内に生成され、水相内に分散した脂質粒子を含むナノエマルジョンを生成する。十分に強いせん断力は、マサチューセッツ州ニュートンのＭｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ社により販売されるＭｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ（登録商標）流体材料プロセッサなどの適切なせん断集中均質化ミキサまたはホモジナイザにより生成することができる。得られたナノエマルジョンはさらに処理されてより精製された形態を得て、これは人を含む温血動物への投与に用いられてもよい。
【００４６】
ある実施例では、混合処理から過度に大きな粒子を除去することが望ましく、所望の範囲に粒径分布を維持する。マサチューセッツ州ウォルサムのミリポア株式会社のものなど適切な濾過システムがこの目的に利用可能である。このため、適切なろ過システムの選択は、所望の範囲に脂質粒子の粒径分布を制御する要因であり、熟練した職人の日常的なスキル内にするであろう。あるいは、ナノエマルジョンは透析によって処理されて不純物を除去してもよく、得られた透析物は薬剤的用途のため保存される。透析は、任意の非粒子の脂質混合物の成分、薬剤、および／または溶媒を除去し、任意の所望の緩衝剤の交換または濃度を達成する好適な方法である。５０００乃至５０００００の名目上の分子量を遮断する透析膜を用いることができ、１００００乃至３０００００の分子量が好ましい。記載されるように生成された脂質粒子は、透析により精製されて非粒子の薬剤を除去する場合、脂質粒子が例えばＣ６グリオーマ細胞などの標的細胞に内在化されるまで測定することを特徴としてもよい。
【００４７】
本発明の組成はさらに、薬剤的に受容可能な担体または賦形剤を含む。薬剤的に受容可能な担体の実施例はこの分野で周知であり、限定されないが、酸化防止剤、緩衝剤、キレート剤、香味料、着色剤、保存剤、生体利用性を高める吸収促進剤、抗菌剤およびこれらの組み合わせなどの医薬組成物に従来用いられるものを含む。この添加剤の量は所望の特性に依存し、これは当業者により容易に決定することができる。
【００４８】
本発明の医薬組成物は通常、塩、緩衝剤、保存剤および互換性のある担体を含み、任意に他の治療成分と組み合わせる。薬剤に用いられた場合、塩は薬剤的に受容可能であるはずだが、非薬剤的に受容可能な塩を上手い具合に用いてこの薬剤的に受容可能な塩を調製してもよく、これは本発明の範囲から除外されない。この薬理学的に受容可能な塩と薬剤的に受容可能な塩は、限定されないが、以下の酸：塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、マレイン酸、酢酸、サリチル酸、ｐ−トルエン、スルホン酸、酒石酸、クエン酸、メタン、スルホン酸、ギ酸、マロン酸、コハク酸、ナフタレン−２−スルホン酸、およびスルホン酸ベンゼンから調製されたものを含む。さらに、薬剤的に受容可能な塩は、カルボン酸基のナトリウム、カリウムまたはカルシウム塩などのアルカリ金属塩またはアルカリ土類塩として調製することができる。
【００４９】
本発明はさらに、細胞過剰増殖によって特徴づけられる疾病、状態もしくは症候群、またはこれらの症状の予防、診断または治療を実施するために細胞に少なくとも１つの治療薬または診断薬の有効量を送ることによって、治療薬または診断薬により患者を治療または診断する方法を提供する。改善された癌治療は特に、腫瘍の細胞増殖、血管形成、転移成長、アポトーシスの制御による一次腫瘍の治療および外科切除後または外科切除と並行の微小転移発育の治療と；一次腫瘍の放射線療法または他の化学療法と、を含めて考慮される。本発明の医薬組成物は、一次黒色腫または転移性黒色腫、リンパ腫、肉腫、肺癌、肝臓癌、ホジキンリンパ腫および非ホジキンリンパ腫、白血病、子宮癌、子宮頚部癌、膀胱癌、腎癌、結腸癌、ならびに乳癌、前立腺癌、卵巣癌および膵癌などの腺癌のような癌型で有用である。
【００５０】
治療用途および診断用途として、医薬組成物は、薬剤的に受容可能な担体と結合した場合に患者に直接投与することができる。この方法は、治療薬または診断薬単独または有効量の別の治療薬または診断薬と組み合わせて投与することによって実施されてもよく、これは第２の微小管相互作用薬でもよいし、そうでなくてもよい。微小管相互作用薬でない場合、この第２の作用薬は、限定されないが、細胞静止剤、葉酸阻害剤、アルキル化剤、トポイソメラーゼ阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤、ポドフィロトキシン、抗腫瘍抗生物質、化学療法剤、アポトーシス誘導剤、およびこれらの組み合わせでもよい。この治療薬はさらに代謝阻害剤試薬を含む。多くのこの治療薬がこの分野で知られている。併用療法は、治療法に対する患者の反応を増幅または確認するのに必要とされるので、この状態を治療するのと同時使用、逐次使用、または別使用として提供する。
【００５１】
本発明の方法は、医学的に許容可能な任意の投与形態を用いて実施されてもよく、臨床的に許容できない副作用を引き起こさずに活性化合物の有効レベルを生成する。非経口投与に特に適した製剤が好ましいが、本発明の組成は、エアゾール剤、スプレー剤、粉末剤、ゲル剤、ローション剤、クリーム剤、坐剤、軟膏剤などの形態で、吸入、口、局所、経皮、鼻、目、肺、直腸、口腔粘膜、静脈内、筋肉内、皮下、腹腔内、胸腔内、胸膜腔内、子宮内、腫瘍内、または点滴による方法もしくは投与用に調剤することができる。この製剤が望まれる場合、この分野で周知の他の添加剤が含まれて製剤に所望の一貫性と他の特性を与えてもよい。
【００５２】
治療薬または診断薬を投与する特定の方法が、選択される特定の作用薬と；投与が疾病、状態、症候群またはこれらの症状の治療、診断または予防用かどうかと；治療または診断される内科的疾患の重症度と；治療効力に必要とされる投与量と、に依存することを当業者は認識するであろう。例えば、白血病の治療用の抗癌剤を投与する好適な方法は静脈内投与を含むが、皮膚癌を治療する好適な方法は局所投与または皮内投与を含むであろう。
【００５３】
本書で用いられるように、「有効量」とは所望の治療効果または診断効果が達成される治療薬または診断薬の投与量または複数の投与量のことをいう。一般に、治療薬または診断薬の有効量は、使用される特定の作用薬の活性と；その作用薬の代謝的安定性および作用の長さと；被験者の種族、年齢、体重、健康状態、食事の状態、性別および食事と；投与の形態および時間と；排泄率と；もしあれば複合薬と；治療される特定の状態の症状および／または重症度の程度とにより変更してもよい。正確な投与量は、所望の結果を得るため１日当たり１回または数回の投与で、過度の実験をせずに当業者によって決定することができ、この投与量は、所望の治療効果を達成するためまたは任意の合併症の場合に個々の開業医により調整されてもよい。重要なことは、癌の治療に用いられる場合、使用される治療薬の投与量は、腫瘍細胞を抑制または死滅させるのに十分であるが、正常細胞を実質的に傷つけないでおくことである。
【００５４】
本発明の医薬組成物に含まれる治療薬または診断薬は、所望の最大量まで任意の量で調製することができ、これは所定の脂質粒子で可溶とされてもよいし、脂質粒子内で懸濁されてもよいし、脂質粒子に操作的に連結されてもよい。診断薬または治療薬の量は、０．００１μｇ／ｍＬ乃至１０００μｇ／ｍＬ、好ましくは約０．１μｇ／ｍＬ乃至８００μｇ／ｍＬ、およびより好ましくは約３００μｇ／ｍＬに及んでもよい。
【００５５】
通常、脂質粒子は患者に有効量を投与するのに十分な方法で提供されるであろう。投与量は、約０．１ｍｇ／ｋｇ乃至１７５ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約１ｍｇ／ｋｇ乃至８０ｍｇ／ｋｇ、およびより好ましくは５ｍｇ／ｋｇ乃至６０ｍｇ／ｋｇに及んでもよい。投与量は、単回投与または１日当たり１乃至４回以上など個々に分割投与の形態で投与されてもよい。被験者の反応がある投与量で不十分である場合、さらに高用量（または異なる局所的輸送経路で有効な高用量）が患者の許容量まで使用されてもよい。１日当たり複数回の投与が考慮され、適切な全身レベルまたは標的レベルの治療薬または診断薬を達成する。
【００５６】
さらに本発明の別の実施形態では、微小管相互作用薬は、生体外で診断薬として用いられてもよい。前に述べたように、問題の特定の腫瘍細胞または細胞型に依存して、異なる微小管相互作用薬が別個の腫瘍種の抑制で多少有効であるかもしれない。したがって、例えば適切な化学療法の戦略の判断または選択が困難である場合に、特定の腫瘍細胞型を標的にすると知られていた微小管相互作用薬による生体外の腫瘍細胞の培養試験は、代替アプローチを提供して腫瘍型と有効な治療を特定する。
【００５７】
本発明の別の態様では、本発明の医薬組成物を調製する方法が提供される。脂質混合物は、水相で処理する際、脂質粒子の分散を含む脂質ナノエマルジョンの組成を形成する量で治療薬または診断薬に組み込まれ、脂質粒子が分散された相は、ナノスケールオーダの粒子径の高分子または小分子の塊の形態で存在する。本発明の組成を調製する際に、脂質混合物および治療薬または診断薬は、水、好ましくはろ過水を含む水相と結合される。得られた混合物は処理されて典型的に平均粒子径範囲を有する脂質粒子であって、いつもではないが、癌の治療に特に適した最大２００ｎｍのサイズの範囲の脂質粒子を他の用途に適切な大きな粒子と共に形成する。得られる範囲は、使用された脂質混合物と、脂質混合物に加えられた治療薬または診断薬の種類および量と、脂質粒子を生成するのに用いられた技術とによって幾分影響される。
【００５８】
本発明の医薬組成物は、この分野で知られている従来の分散生成技術またはプロセスを用いて作ることができる。この技術は限定されないが、高せん断力均質化、超音波撹拌もしくは超音波処理、高圧均質化、溶媒乳化／蒸発などを含む。本発明の一実施例では、脂質粒子は適切な高圧ホモジナイザを用いる従来の高圧均質化技術によって調製されてもよい。適切なサイズのホモジナイザは商業上利用可能である。高圧ホモジナイザは通常、典型的に約１００乃至２０００の棒材により高圧で約数ミクロンに渡る狭い隙間を介して流体を押し出すよう設計されている。加圧流体は、超短距離で１０００ｋｍ／ｈｒ以上の超高速まで加速する。脂質混合物を含む加圧流体は、超高せん断応力と空洞化力に対抗し、サブミクロン範囲で粒子内に脂質混合物を分裂させて細かく砕く。前に論じられたように、大部分の脂質粒子は約０．０２μ乃至０．２μ、好ましくは０．０２μ乃至０．１μに及ぶ平均粒子径を有するべきであり、特に最大約２００ｎｍに及ぶ幾つかの脂質粒子と共に、この範囲以上または以下にとどまる少量の粒子に変更する。
【００５９】
脂質粒子を調製する別の特定の方法では、脂質混合物は、植物油などの植物性脂肪源と、非イオン性界面活性剤などの界面活性剤と混合されて脂質相を得てもよい。治療薬または診断薬は、水混和性溶媒などの溶媒と混合されて治療薬相または診断薬相を得てもよい。脂質相と治療薬または診断薬相はその後、好ましくは超音波処理を介して、水相の存在下で一緒に混合されブレンドされる。得られた混合物はその後、高せん断力下で均質化されて対応する本発明のナノエマルジョンを生成する。次いで、ナノエマルジョンは０．２μの膜を介してろ過されてもよく、未使用の脂質材料、過剰な治療薬または診断薬などの不純物を殺菌および／または除去し、治療または診断ニーズのある人を含む温血動物への医薬組成物としてデリバリに適した精製形態を得る。
【００６０】
本発明の医薬品組成物の理解を容易にするために以下の実施例を提供する。
【００６１】
実施例１
ＥｍＰＡＣの組成
パクリタキセルが第１薬剤候補として選択され、脂質ナノ粒子（ＬＮ）への充填を介して製剤について試験され、商業上利用可能な製品へ開発される。パクリタキセル／ＬＮの製剤は、水と４％のエタノールで直接調製され、続いて１１０Ｙ Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ（登録商標）高圧ホモジナイザ（Ｍ−１１０Ｙモデル、Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ社、ニュートン、マサチューセッツ州）を用いて１８０００ｐｓｉで４サイクルの高圧均質化を行う。先行研究は、最大〜２５重量／重量（ｗ／ｗ）％の脂質濃度のＬＮにパクリタキセルを組み込むことができることを示したが、この製剤は数時間しか安定しないことが分かったが、この問題は薬剤の組み込みよりも安定性に関係するように思われた。１ｍＭのピロリン酸ナトリウム（ｐＨ９．５）で調製されたＬＮは少なくとも２か月間安定したままであることを発見後、１ｍＭのピロリン酸ナトリウム（ｐＨ９．５）が薬剤の組み込み研究に１次試験媒体として選択された。
【００６２】
パクリタキセルが３サイクルで１５０００ｐｓｉで１ｍＭのピロリン酸ナトリウム中の４％のエタノール含有量と共にＬＮに組み込まれた場合、５％の薬剤充填を伴う製剤のみが安定し、この最終的な製剤でさえ有意な時間安定しないことが分かった。組み込み後２日目に、僅かな混濁が５％の充填サンプルで観察され、これは３日目に完全に沈殿した。一方３３％および１６％の薬剤充填サンプルでは即時の混濁が観察された。これらの発見は表１に要約されている。この安定性を低下させた有力な理由は、水におけるパクリタキセルの難溶性、低いアルコール含有量（４％）、高いｐＨの最終溶液（ｐＨ１１．５）、および／または調和できない脂質濃度であろう。
表１．４％のエタノールで調製されたＬＮに充填するパクリタキセル
【００６３】
この場合エチルアルコールである有機含有量の変更により、薬剤組み込み粒子の安定性を改善する可能性が高い。したがって、ＬＮは最初に異なるアルコール含有量（例えば５０体積／体積％、２５体積／体積％、１２．５体積／体積％）で調製された。薬剤のない粒子でさえ２５体積／体積％以下またはこれと同等のエタノール含有量で安定しないことが観察された。さらに、１２．５体積／体積％アルコールのＬＮのみが少なくとも１日間安定していた。したがって、１０％のパクリタキセルが１２．５体積／体積％のアルコール含有量と共にＬＮに充填された。３時間後、ゲル組成が観察され、高レベルのアルコールはＬＮ内のパクリタキセル製剤を安定させないことを強く示した。エチルアルコールはさらに通常、解乳化剤として用いられた。これは、安定した薬剤充填製剤を得る際に高い割合のエタノールが助力しないという理由であろう。その他の溶媒では、パクリタキセルはＤＭＳＯに非常に良好な溶解度を有すると知られているので、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）が選択肢の溶媒である。したがって、パクリタキセル充填サンプルは、第２機器であるＭｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ（登録商標）高圧ホモジナイザ（Ｍ−１１０ＥＨモデル、Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ社、ニュートン、マサチューセッツ州）Ｍ−１１０ＥＨで１５０００ｐｓｉおよび３サイクルで１０％のＤＭＳＯに調製された。
【００６４】
２つのコントロールが用いられ、一方はパクリタキセルがなく、他方は脂質成分がない。第２のコントロールから、このサンプルが脂質成分のない状態で沈殿したので、脂質成分が薬剤組み込みＬＮの安定性の役割を担うことは明らかである。しかしながら、５％のパクリタキセルのサンプルは透明であったが、１０％のパクリタキセルのサンプルは２日目に沈殿したことが観察された。これらのサンプルの高性能液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）アッセイでは、これらのサンプルでパクリタキセルが悪化したことが観察された。
【００６５】
パクリタキセルはＤＭＳＯによく溶けるので、異なる濃度のＤＭＳＯでパクリタキセルにより調製されたＬＮの安定性が試験された。濃度２０％のＤＭＳＯが１０重量／重量％のパクリタキセルを有する２００μｇ／ｍＬのＬＮに最も高い安定性をもたらしたことが分かった。代表的な粒径分布とゼータ電位値は図１に示されている。この変更された製剤の安定性のデータは表２に示されている。
表２．変更されたＤＭＳＯ製剤のパクリタキセル充填ＬＮの安定性
【００６６】
パクリタキセルの前記悪化（２４時間以内にほぼ１００％）は、この製剤の高いｐＨ（１１．０）によるものであると仮定された。１ｍＭのピロリン酸ナトリウムの添加が、９．５までｐＨを低下させた。したがって、１ｍＭのピロリン酸ナトリウムによりｐＨを調整することによってパクリタキセルと脂質成分の安定性の効果が研究された。
【００６７】
６．０に等しいｐＨまたは６．０を超えるｐＨでは、沈殿が観察されず、製剤は透明のままであった。しかしながら、６．０を超えるｐＨではパクリタキセルの相当な悪化があった。このように、最適解は、脂質成分とパクリタキセルの双方を製剤中で化学的および物理的に安定させ続けるために、希リン酸により６．０に調整されたｐＨを有する１ｍＭのピロリン酸ナトリウムを利用することである。全結果は表３に要約されている。
表３．脂質ナノ粒子の安定性におけるｐＨの効果￥
【００６８】
このようにＤＭＳＯとｐＨの制御は、製剤の長期安定性に導くことができることが発見されたので、製造中に製品を消毒するのにろ過が利用されるので、次の研究手段は、ろ過がパクリタキセル充填ＬＮサンプルの脂質成分と薬剤潜在能力に影響するかどうかであった。
【００６９】
ナイロン、ＰＶＤＦ、およびＰＥＳなどの異なる種類の膜の一次審査後、ポリエーテルサルフォン（ＰＥＳ）親水性膜が製剤のろ過に最も適切な膜であることが結論づけられた。２０％のＤＭＳＯで調製された１０％のパクリタキセル充填ＬＮが０．２２μｍのＰＥＳ薄膜フィルタによりろ過された場合、少なくとも９８％のパクリタキセルが膜を通過した。これら同じ製剤から脂質成分がＥＬＳＤによって分析された場合、平均して、全成分の９３％が膜を通過した。このようにろ過は製剤の品質も安定性も高めることが実証された。
【００７０】
パクリタキセルが２０％のＤＭＳＯがある状態でＬＮに組み込まれるかどうかを判定するために、または水相内へパクリタキセルを分配することによってＬＮへのパクリタキセルの組み込みをＤＭＳＯが妨げるどうかを判定するために、ＬＮからの１４Ｃ標識化パクリタキセルの分離がショ糖密度勾配を用いて行われた。放射能数の分布の測定は、どの画分がパクリタキセルを含むかに関するデータを提供する。したがって、２００μｇ／ｍＬのＬＮは、幾らかの１４Ｃ標識化パクリタキセルを含む１０重量／重量％のパクリタキセルの存在下で調製され、その調製品はショ糖密度勾配で分画された。画分が放射能数の分析のため集められてどの画分がパクリタキセルを含むかを決定した。沈殿した画分は勾配の底で発見され、これは最初に不溶性のパクリタキセルで構成された。バンドは、ＬＮであると確証された勾配で発見され、沈殿物とＬＮ画分の双方の放射性成分がＬＮを含む脂質がある状態で分析され、放射性標識は底部の沈殿物で殆ど発見されなかった。脂質がない状態では、大量の沈殿物が発見され、非常に小さな画分の放射標識が沈殿物画分で発見されている。
【００７１】
図２で分かるように、脂質がない状態では約８０％のパクリタキセルが沈殿したが、脂質がある状態では１．８％のパクリタキセルが沈殿するに過ぎなかった。これは、大部分のパクリタキセルがＬＮの脂質内に組み込まれているという考えを支持するものである。
【００７２】
臨床設定では、３−２４時間に渡る約２．５Ｌの静脈注射は通常、殆どの患者に安全で耐えられるものと考えられている。臨床用途の現在のパクリタキセルの投与量は、３−２４時間に渡って１３５〜１７５ｍｇ／ｍ２の範囲である。表面積が〜１．８ｍ２の平均サイズのオスを想定すると、この投与量を達成するのにパクリタキセルの〜９７μｇ／ｍＬの濃度が必要である。この時間および体積パラメータ内でこの治療用の投与量のパクリタキセルを提供するために、パクリタキセルは十分に高濃度でなければならない。従って、ベンチマークとしてこの投与量を達成するパクリタキセル充填ＬＮサンプルを製剤することが望ましい。しかしながら、本発明は腫瘍細胞を選択的に標的とすることができるので、パクリタキセルを組み込まれたＬＮに必要な治療用の投与量は事実上、非常に少なくてもよい。このように、投与された薬剤の大部分の画分は最終的に腫瘍細胞に行き着くであろう。
【００７３】
後に表４で明らかなように、１０％のパクリタキセルを充填する最大４００μｇ／ｍＬのＬＮを調製することが可能であり、これは凝集の兆候なく少なくとも５時間安定する。この調整品は、４０μｇ／ｍＬのパクリタキセル濃度を有し、静脈内投与に必要な時間に渡って安定した。
【００７４】
０．２２μｍのＰＥＳ膜によるろ過後、ＬＮに充填された１ｍＭピロリン酸ナトリウム（ｐＨ−６．０）の２０％ＤＭＳＯ内の１０％パクリタキセルのサンプルは、少なくとも３日間安定したままだった。ピロリン酸ナトリウム濃度を０．５ｍＭに変更した後、サンプルは７日間安定したままだった。最初に、全てのサンプルはろ過された形態およびろ過されてない形態でパクリタキセル成分と粒径分布について分析された。これによりこれらのデータは、臨床で現在利用される濃度のパクリタキセル製剤をＬＮ内に調製することができることを示した。
【００７５】
したがって、第２のパクリタキセル−ＬＮ製剤が調製され、これは６０μｇ／ｍＬのパクリタキセルと；３００μｇ／ｍＬの脂質混合物と；０．５％のブタノールと；０．５％の大豆油と；０．２５％のＴｗｅｅｎ（登録商標）−８０とから成る。この第２の製剤で行われた安定性研究は、４００μｇ／ｍＬの脂質と一定濃度のパクリタキセルを用いる製剤が少なくとも２４時間安定していることを明らかにした。結果は表４に要約されている。
表４．ナノ粒子安定性に対する脂質濃度の効果
【００７６】
具体的には、表５で分かるように、第２のパクリタキセル−ＬＮ製剤は少なくとも７日間室温で安定し、少なくとも３０日間２−８℃で安定することが分かった。
表５．第２の製剤の安定性
【００７７】
しかしながら、ブタノールはマウスに有毒であり、注射で昏睡状態を引き起こすことが分かったので（データは示されてない）、ブタノールはベンジルアルコールによって置換された。得られた第３の製剤は、６０μｇ／ｍＬのパクリタキセル、４００μｇ／ｍＬの脂質混合物、０．０６％のベンジルアルコール、０．５％の大豆油、および０．２５％のＴｗｅｅｎ（登録商標）−８０で構成される。表６で要約されるように、この第３の製剤は室温で少なくとも３週間および２−８℃で８０日間以上安定していたことが分かった。
表６．第３の製剤の安定性
【００７８】
実施例２
ＥＭＵＬＳＩＰＨＡＮとＥｍＰＡＣの細胞吸収
ここで記載された研究は、ヒト腫瘍細胞がＬＮを取り込むかどうかを判定し、かつそれらがＬＮを取り込む異なる能力を示すかどうかを判定するために行われた。試験された大抵の腫瘍細胞株が蛍光ＬＮを容易に取り込むだけでなく、異なる腫瘍細胞株からの腫瘍細胞株はＬＮを取り込む異なる能力を示すことが分かった。
【００７９】
これらの実験に用いたＬＮ製剤は、以下のように調製された：適切な脂質が１０分間超音波処理により１０ｍｇ／ｍＬまで９５％のエタノールに可溶化された。次に、エタノール中の１００μＬの０．５ｍｇ／ｍＬコレステリルＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ（オレゴン州ユージーンのＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）が１ｍＬの可溶化された１０ｍｇ／ｍＬ脂質に加えられた。最後に、脂質とコレステリルＢＯＤＩＰＹ−ＦＬの混合物が１ｍＭピロリン酸ナトリウム水の５０ｍＬ溶液に加えられ、１１０Ｙ Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ（登録商標）高圧ホモジナイザ（Ｍ−１１０Ｙモデル、Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ社、ニュートン、マサチューセッツ州）により処理された。
【００８０】
蛍光標識化ナノ粒子の細胞吸収の程度が蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）による細胞蛍光強度に正比例することを最初に立証するため、図３Ａで分かるように、細胞当たりの平均蛍光強度がＬＮの濃度に正比例し、さらに図３Ｂから明らかなように、ＬＮがある状態で培養時間に正比例することが分かった。実際には、同じく治療された細胞がカバーガラスに固定された状態で、蛍光強度が蛍光ＬＮ吸収の程度に比例することが視覚的に確認された。ＬＮは、蛍光の脂肪親和性染料ＤｉＯ（オレゴン州ユージーンのＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）により標識化され、これはフルオレセインのフィルタセットを用いて検出することができる。ＬＮは顕微溶液化により２００μｇ／ｍＬの脂質と２．５μｇ／ｍＬのＤｉＯにより調製された。標識化されたＬＮは、Ｃ６細胞に加えられ、３７℃で培養された。この後、培地が除去され、細胞はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）により洗浄され、トリプシン処理され、４％のホルムアルデヒド内に固定する前に再び洗浄された。ＬＮは、０、１２．５、２５、５０および１００μｇ／ｍＬ加えられ、６０分間培養された。５０μｇ／ｍＬのＬＮが細胞に加えられ、培地の除去とＦＡＣＳ分析の処理の前に０、５、１０、１５、３０および６０分間培養された。図３Ａと図３Ｂで示される結果から明らかなように、細胞当たりの蛍光強度が濃度の増加と培養時間の増加とに正比例することをそれぞれ示しており、ＦＡＣＳによってＬＮ吸収を推定することができることは明らかである。
【００８１】
異種細胞株由来細胞がＬＮを取り込む異なる能力を示すかどうかを判定するため、かつ異種腫瘍型由来細胞がＬＮを取り込む相対的な能力をさらに推定するために、種々のパネルの腫瘍細胞株でＬＮ吸収が試験された。選択された細胞株は、国立癌研究所（ＮＣＩ）のＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｐｒｏｇｒａｍ Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇによって用いられたものから選択された。ＮＣＩ細胞株パネルは、多くの異なるヒト腫瘍株由来細胞株で構成され、幾つかの異種細胞株はそれぞれ代表的なヒト腫瘍株に由来した。使用される細胞株は、ＨＳ−５７８Ｔ、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、およびＭＸ−Ｉ乳癌と；Ｈ２３、Ｈ４６０、およびＨ５２２肺癌と；ＳＦ−５３９肝臓と；ＨＴ２９、ＳＷ−６２０、およびＣＯＬＯ２０５結腸腫瘍細胞株とを含んだ。
【００８２】
ＬＮは、顕微溶液化によって２００μｇ／ｍＬの脂質と０．５重量／重量％のコレステリル−ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬとにより調製された。標識化されたＬＮは細胞に加えられ、３７℃で培養された。この後、培地が除去され、細胞がＰＢＳで洗浄され、トリプシン処理され、および４％のホルムアルデヒド内に固定される前に再び洗浄された。サンプルはＦＡＣＳによって分析され、細胞当たりの平均蛍光強度が測定された。結腸、胸部、中枢神経系（ＣＮＳ）、および肺に由来する細胞は、ＨＴ−２９結腸癌細胞株とＳＦ−５３９肺癌細胞株のものと比較され、これは少量および多量の蛍光ＬＮをそれぞれ取り込むことが示された。ＬＮで治療された各細胞サンプルによる蛍光ＬＮ吸収量は、未治療の同じ細胞株の蛍光強度を控除することによって得られた。
【００８３】
図４Ａ〜４Ｄで分かるように、ＮＣＩパネルの細胞株によるＬＮ吸収量の比較は、ＬＮ吸収が異なった株の細胞型間で変化することを明らかにする。同じ腫瘍株の細胞間で幾らかの変異性が見られたが、相対的な吸収量は各腫瘍株で適正に一致する。例えば、胸部腫瘍細胞株と肺腫瘍細胞株は通常、結腸腫瘍細胞株に行ったものより高いＬＮ吸収量を示した。最も大きなＬＮ吸収量は、肺腫瘍およびＣＮＳの細胞株で発見された。全結果は表７に要約されている。
表７．腫瘍細胞株による脂質ナノ粒子の吸収
§細胞当たりの平均蛍光強度は、同じ各未治療の細胞株の蛍光と比較し、控除することによって、各蛍光ＬＮ治療サンプルについて得られた。
£ＮＤ−判定されていない。高レベルの沈殿のため粒径は判定できない。
【００８４】
次に、ＬＮ（ＥｍＰＡＣ）に調剤されたパクリタキセルの吸収量は、従来の媒体に調剤されたパクリタキセル、タキソール（登録商標）として知られている１：１のＣｒｅｍｏｐｈｏｒ／エタノール（ＣｒｅｍｏｐｈｏｒＥＬ（登録商標））と比較され、一連の実験で放射標識化パクリタキセルの培養された腫瘍細胞吸収量を分析した。
【００８５】
第１の実験では、１４Ｃ標識化パクリタキセルは、ＬＮに組み込まれ（これによってＥｍＰＡＣを形成する）、タキソール（登録商標）に組み込まれた。この実験で使用されるＥｍＰＡＣ製剤は、ＤＭＳＯを含む第１の製剤であった（実施例１を参照）。これらの製剤は、同じ濃度のパクリタキセルから成り、１時間１２の複製ウェルでＳＦ５３９神経膠腫とＡ５４９肺癌細胞に加えられた。媒体が除去され、細胞単層は薬剤の除去後に可溶化にされ、トルエンを含む同じ容量のシンチレーションカクテルによりＰＢＳ内で洗浄して各単層サンプルに連結されたパクリタキセルを測定した。各サンプルの放射標識数は、各サンプルに最初に追加された合計放射標識の僅かとして表わされた。この実験結果は、図５で実証されるように、ＳＦ５３９がタキソール（登録商標）よりもＬＮに調剤されたパクリタキセル（すなわちＥｍＰＡＣ）を著しく多く内在化することを示した。
【００８６】
この実験は前述したように実質的に繰り返され、薬剤に培養後に様々な時間で採取されたことを除いて、細胞は第２の製剤のＥｍＰＡＣで治療された。実質的に、各製剤について同じ量の放射標識化薬剤が各細胞サンプルに加えられた。細胞単層に連結された放射標識化薬剤の大体の数が示されている。さらに、細胞吸収量の動態を推定するために、パクリタキセルの吸収量が薬剤培養時間の関数として分析された。ＳＦ５３９グリオーマ細胞による以前の研究は、吸収量がプラトーに達する前に２時間に渡って増加したことを実証した。これはさらにＥｍＰＡＣとタキソール（登録商標）の双方について観察され、図６で分かるように、この違いはＣｒｅｍｏｐｈｏｒＥＬ（登録商標）製剤でのパクリタキセルの相対的な不溶性によるものではなかったことを示した。しかしながら、タキソール（登録商標）よりこれらの細胞に連結されたＥｍＰＡＣに著しい多量のパクリタキセルが存在した。
【００８７】
ＥｍＰＡＣのパクリタキセルまたは脂質混合物が細胞吸収量を飽和させることができるかどうかを判定するために、全ての未標識のパクリタキセルは変更されたが、脂質と放射標識化パクリタキセルの量は一定の状態を保って実験が行われた。図７で分かるように、パクリタキセルの量は細胞吸収量を飽和するように見えるが、これはこの特定の実験から完全には明らかではない。全てのパクリタキセルが変更される一方で、標識化パクリタキセルは一定であるので、全てのパクリタキセルの小さい画分または大きな画分を単に表わしてもよい。パクリタキセルの濃度の増加がさらに粒子の総数を増加するであろう。このため、同じ数の薬剤充填粒子が取り込まれても、少量の標識化パクリタキセルが取り込まれるであろう。
【００８８】
続いて、一連の実験が行なわれて細胞吸収量におけるＬＮの各脂質成分の寄与を確認した。１４Ｃ標識化コレステロールの追跡によって標識化されたＬＮサンプルは、１つの成分が組織的にない状態で調製された。ＬＮサンプルは、３００μｇ／ｍＬの脂質と２０％のＤＭＳＯを用いて調製された。その他の全成分は比例して増加し、失った成分を補った。このサンプルは、２時間ＳＦ５３９ヒトグリオーマ細胞に加えられた。ＬＮ粒子を作るためにコレステロールと１：１で混合された単一成分を用いて同じ実験が行なわれた。図８Ａと図８Ｂは共に、コレステロールは細胞吸収量を促進する際にＬＮの全脂質成分の最も重要な役割を果たすことを確証している。
【００８９】
細胞単層に連結された放射標識化パクリタキセルは、パクリタキセルの内在化の結果であると仮定されたが、パクリタキセルが内在化するのではなく、細胞の外部に配置された可能性があった。パクリタキセルが内在化するかどうかを判定するために、Ａ５４９ヒト肺腫瘍細胞が、２時間ＥｍＰＡＣまたはＣｒｅｍｏｐｈｏｒＥＬ（登録商標）で調剤されたパクリタキセルで治療された。細胞は続いて氷のように冷たいメタノールで固定され、反タキサン抗体（ハワイ州ホノルルのＨａｗａｉｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）で染色され、続いて２次抗体が蛍光性Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８分子（オレゴン州ユージーンのＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社）に結合された。パクリタキセルが内在化し、微小管に配置されることが図９Ａから明らかである。パクリタキセルは生体内で微小管に結合すると知られているので、これはＥｍＰＡＣと同様にＣｒｅｍｏｐｈｏｒＥＬ（登録商標）に調剤されたパクリタキセルが内在化することを示している。しかしながら、各細胞のエッジをトレースすることによって各サンプルについて多くの領域の細胞の細胞内蛍光強度も定量化され、トレースされた境界内の蛍光強度の定量化した。図９Ｂで分かるように、ＥｍＰＡＣで治療された細胞は、タキソール（登録商標）で治療された細胞のおよそ２倍の蛍光強度を有し、これにより早期の発見を確認することができる。
【００９０】
実施例３
ＥｍＰＡＣの細胞毒性
このセットの実験の目的は、ＥｍＰＡＣの相対的な腫瘍成長抑制と細胞毒性を測定することであった。ＥｍＰＡＣは、製造者によって推薦されるように、ＤＭＳＯで溶解されたパクリタキセルまたはタキソール（登録商標）と比較された。
【００９１】
ＬＮに組み込まれたパクリタキセルが細胞を死滅する能力を保持するかどうか判定するために、ＤＭＳＯ保存溶液に溶解されたパクリタキセル単独の細胞毒性が、多くの異種細胞株の等モル量のＥｍＰＡＣと比較された。ＭＴＳ細胞増殖アッセイが使用されて相対的な細胞毒性を推定した。ＭＴＳはテトラゾリウム化合物であり、これは可溶性のホルマザン製品へ生細胞によって生物還元（ｂｉｏｒｅｄｕｃｅｄ）される。４９０ｎｍの実行でホルマザン製品の吸光度を使用して相対的な数の生細胞を判定することができる。このように、ＭＴＳを用いてパクリタキセル単独の相対的な細胞毒性の潜在能力対ＥｍＰＡＣの潜在能力を推定することができる。試験された細胞株は子宮肉腫細胞株ＭＥＳ−ＳＡとその薬剤耐性副株ＭＥＳ−ＳＡ−ＤＸ５を含んでおり、ＬＮへのパクリタキセルの組み込みが薬物耐性細胞のパクリタキセルの細胞毒性に影響を与えるどうかを調べた。したがって、ＭＥＳ−ＳＡ、ＭＥＳ−ＳＡ−ＤＸ５、Ａ５４９およびＭＸ−Ｉ細胞株は、サブコンフルエントな密度で平板培養された。等モル濃度のパクリタキセル単独とＥｍＰＡＣは、組織培養培地で希釈され、細胞が平板培養された日後に細胞に加えられ、７２時間細胞で培養させた。培地が置き換えられ、ＭＴＳアッセイは製造者（Ｐｒｏｍｅｇａ社、マディソン、ウイスコンシン州）からの指示に従って行なわれた。各細胞株由来の未治療の細胞に対して生存率が正規化に基づいて計算された。図１１Ａ〜図１１Ｄの各データポイントは、６つのサンプル±ＳＥＭの平均値を表わす。
【００９２】
図１０Ａで分かるように、ＥｍＰＡＣは、より低いパクリタキセル濃度でＭＥＳ−ＳＡとＡ５４９細胞内のＤＭＳＯのパクリタキセルと比べて、およそ弱い細胞毒性を示したが、さらに図１０Ｃで分かるように、パクリタキセル単独よりも高濃度で大きな画分の細胞を死滅させるように見えた。これはパクリタキセル単独が水性溶媒に非常に不溶性であるという事実によるであろう；その疎水性はパクリタキセルをより高い濃度で凝集させ、細胞へのその進入を妨げる。ＬＮへのパクリタキセルの組み込みによって、パクリタキセルが水性溶媒で安定し、凝集を防止して、高い濃度のパクリタキセルが細胞に入るのを可能にしてもよい。図１０Ｄで明らかなように、ＥｍＰＡＣはさらにＭＸ−Ｉ乳癌細胞でパクリタキセル単独より顕著に強い細胞毒性を示し、図１０Ｂで分かるように、ＭＥＳ−ＳＡ−ＤＸ５細胞株へパクリタキセル単独より適度に強い細胞毒性を示した。これらの観察の基礎となるメカニズムは未知であるが、１つの仮説は、薬物耐性細胞株ＭＥＳ−ＳＡ ＤＸ−５の場合には、ＥｍＰＡＣがパクリタキセル単独でするのと同じくらい効率的に細胞の外に汲み出されないということであり、これが脂質に埋められ、少なくとも最初に、ＬＮの成分として扱われるためである。脂質粒子は、特定のメカニズムによって細胞の中に取り込まれ、これは薬剤耐性に基礎をなす細胞機構により影響されないであろう。
【００９３】
前述の実験は、ＥｍＰＡＣ対ＣｒｅｍｏｐｈｏｒＥＬ（登録商標）を比べるために変更された。この実験で使用されるＥｍＰＡＣ製剤が超音波処理によってＴｗｅｅｎ（登録商標）−８０と大豆油がある状態で専用の脂質混合物を可溶化し、続いてこの混合物をブタノール中の超音波処理によって可溶化したパクリタキセルに添加することによって調製された。混合物は、１１０ＥＨ Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ（登録商標）高圧ホモジナイザ（Ｍ−１１０Ｙモデル、Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ社、ニュートン、マサチューセッツ州）で顕微溶液化によって処理された。これらのパクリタキセル製剤は薬剤除去の前に１時間ＳＦ５３９グリオーマ細胞に晒した後に比べられ、この薬剤への短期被曝は、薬剤への連続被曝より生体内の抗腫瘍薬への腫瘍細胞被曝に非常によく似ており、パクリタキセルは生体内で１時間以下の生物的に利用可能な半減期を有する（Ｗｉｅｒｎｉｋら、１９８７年；Ｒｏｗｉｎｓｋｙら、１９９０年）。
【００９４】
薬剤の除去後、細胞は続いて生存と増殖がＭＴＴによって分析される前に、さらに７２時間増殖を許容された。生細胞は、死にそうな細胞または死細胞より強い脱水素酵素活性を有し、このため強いＭＴＴ活性レベルを有すると予想されるので、ＭＴＴアッセイは生細胞に存在するミトコンドリアの脱水素酵素を利用して細胞の生存率を測定する。各細胞サンプルの生存は、薬剤に晒されなかった各コントロール細胞株に関して画分として計算された。生存率は薬剤濃度の関数としてプロットされ、各曲線は４つのパラメータのロジスティック曲線に適合され、ＥＣ５０値が計算された。ＥｍＰＡＣ対ＣｒｅｍｏｐｈｏｒＥＬ（登録商標）間の統計的な有意差は、スチューデントのｔ検定によって各薬剤濃度について推定された。図１１で分かるように、ＥｍＰＡＣ単独は細胞致死と細胞生存に有意な効果がなかったが（データは示されない）、ＥｍＰＡＣはタキソール（登録商標）よりグリオーマ細胞に著しい細胞毒性があった。
【００９５】
実施例５
マウス腫瘍モデルのＥｍＰＡＣの腫瘍成長抑制
Ｈ２３ヒト肺腫瘍を皮下に植え込まれたヌードマウスがＥｍＰＡＣまたは等しい投与量のタキソール（登録商標）で治療された場合、等しい投与量のタキソール（登録商標）のパクリタキセルと比べてＥｍＰＡＣによる顕著に強い腫瘍成長抑制があったことが観察された。
【００９６】
ヌードマウスはＨ２３肺腫瘍細胞を皮下に植え込まれ、これは薬剤が投与される前の２５日間成長させられた。担癌動物は、２５、２７、２９、３２、３４、３６、３９、４２日にそれぞれ２ｍＬの６０μｇ／ｍＬ薬剤と共にＩＰを注射された。腫瘍容積は、これらの各注射日で測定された。最終の腫瘍容積測定は、腫瘍の植え込み後４５日に行われた。
注射された製剤の組成は表８に示される。
表８．Ｈ２３ＴＧＩの動物実験群
【００９７】
図１２Ａで分かるように、第１の薬物注入後２０日間に渡って、ＥｍＰＡＣで治療された動物の腫瘍は１日で容積が減少したが、タキソール（登録商標）で治療された動物の腫瘍は実験の終わりの恒常的成長過程を再開する前に最初の１１日間に腫瘍容積の退縮を示した。ＬＮコントロールで治療された動物または未治療の動物の腫瘍は、研究の全体に渡って恒常的成長を示した。このように、ＥｍＰＡＣはタキソール（登録商標）を行ったものより長時間の腫瘍サイズを低減することができた。図１２Ａのデータは、薬物療法の間の平均腫瘍容積を示すようプロットされた。
【００９８】
図１２Ｂに移り、腫瘍退縮率は薬物療法の１日目と最終日との腫瘍容積差を比べることによって求められた。腫瘍退縮の統計的有意差は、タキソール（登録商標）で治療されたマウスと、ＥｍＰＡＣ（ｐ＜０．０００５）で治療されたマウスとの間で示された。各群は、３±ＳＥＭの平均を表わす。研究の終りまでに、ＥｍＰＡＣで治療された動物の腫瘍は約７１％（７１．４±２．４％）まで退縮したが、タキソール（登録商標）で治療された動物の腫瘍は約１９％（１８．７±０．９％）まで退縮した。このため、データはＥｍＰＡＣがタキソール（登録商標）より顕著に強い抗腫瘍活性を有することを示す。
【００９９】
ＥｍＰＡＣによる腫瘍成長抑制の量を異なる濃度のパクリタキセルと比べるため、Ｈ４６０ヒト肺腫瘍細胞を植え込まれたヌードマウスは、実施例１の第３の製剤より２倍のパクリタキセルで調剤されたＥｍＰＡＣを注射された。タキソール（登録商標）はさらに先のＴＧＩ実験で得られた投与量の１乃至４倍投与された。結果は、ＥｍＰＡＣが４倍強いタキソール（登録商標）とおよそ同じくらい効果的であることを示す。
【０１００】
この実験では、６０と１３７μｇ／ｍＬパクリタキセルのＥｍＰＡＣ製剤と等量のパクリタキセルが使用され、さらに、最初の第３のＥｍＰＡＣ製剤（すなわち６０μｇ／ｍＬパクリタキセル）で得られた投与量のおよそ４倍のタキソール（登録商標）が、Ｈ４６０担癌マウスに投与された。マウス腫瘍は、先の実験より大きなサイズに成長させられた。動物は、毎週３回、３週間で２日おきに投与され、腫瘍は薬剤の注射の前に測定され、その腫瘍が切断サイズ限界以上に達した動物は自動的に安楽死させられた。経時的で相対的な腫瘍容積が計算され、時間の関数としてプロットされた。Ｔ検定が行われて異なる薬剤で治療された動物間に腫瘍成長抑制の有意差があったかどうかを判定した。さらに、生存曲線が生成され、終わりの端点は、治療に関連した原因または切断サイズ限界に達した腫瘍による安楽死による動物死として規定された。
【０１０１】
不運にも、動物群は無作為化されず、その結果コントロール群の動物は最も小さな腫瘍で開始したが、高用量の薬剤による治療群の動物は治療前に大きな腫瘍で開始した。しかしながら結果は、ＥｍＰＡＣが４倍の濃度のタキソール（登録商標）とおよそ同じくらい効果的であることを示した。
【０１０２】
実施例６
ＥｍＰＡＣの薬物動態と生体内分布
ＩＰ対ＩＶのＥｍＰＡＣの薬物動態の違い、およびＥｍＰＡＣの生体内分布を測定するために、Ａ５４９肺腫瘍を植え込まれたヌードマウスは、放射標識化パクリタキセルをそれぞれ含むＥｍＰＡＣまたはタキソール（登録商標）のパクリタキセルの何れかと共にＩＰまたはＩＶを注射された。
１４Ｃ標識化パクリタキセルを含むＥｍＰＡＣ製剤は以下のように調製された：
Ａ）緩衝剤の調製
１）１Ｌの水に４６６．１ｍｇのピロリン酸ナトリウムを加えて１ｍＭのピロリン酸ナトリウム溶液を作製する。
２）希リン酸を加えることによってｐＨを４．０に調整する。
３）０．２２μｍのＰＥＳフィルタによってろ過する。
４）１０ｍＬのこの緩衝剤に１０μＬの１０％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）−８０を加える。
Ｂ）脂質保存溶液
１）１０ｍｇの脂質混合粉末を測定して、１０ｍＬのＤＭＳＯに溶かして１ｍｇ／ｍＬの脂質／ＤＭＳＯ溶液を作製する。
２）透明な溶液が得られるまで超音波で処理する。
Ｃ）高温のパクリタキセル：
１）５０μＬの高温のパクリタキセルを取り込む。
２）８０℃の水浴で酢酸エチルを完全に蒸発させる。
Ｄ）製剤：高温のパクリタキセル溶液に８００μＬの脂質／ＤＭＳＯ溶液を加える。完全に混合して撹拌する。この溶液を得て、次いで３．２ｍＬの水性緩衝液に加える。
【０１０３】
動物は、注射後０（注射直後）、０．５、１、６、または１２時間後に安楽死させられた。血液は心臓穿刺によって抜かれ、選択された臓器（例えば腫瘍下の全脳、腎臓、肺、肝臓、胃、脾臓、膵臓、腫瘍、腫瘍の対側部位の筋肉、尿、糞便、全血および腫瘍筋）の組織が採取された。組織と血液は全て処理されて放射標識薬剤の数えた。組織は全て重さを量られて均質化された。組織は小さすぎて用いられる秤（秤は１つの小数位に読み取る）によって正確に重さを量ることができなかったので、用いられる緩衝剤を含む組織ホモジネートが量られた。ホモジネートの部分標本は、全てのホモジネートの画分を測定するためにシンチレーションを数える前に量られた。全ての臓器組織の全ての１４Ｃ標識化パクリタキセルが測定された。結果は、ＩＰ対ＩＶで注射されたある薬剤間の薬物動態に有意差がないことを示している。これらの結果はさらに、ＥｍＰＡＣ対タキソール（登録商標）のパクリタキセル間で類似する薬物動態を示す。組織が注射後０．２５、０．７５、３、６、または１２時間に採取された類似する実験は、ＥｍＰＡＣとタキソール（登録商標）が実質的に同じ薬物動態プロファイルを有し、その上、組織パクリタキセルレベルが注射後約３時間でピークに達することを示している。さらに、実施例１に記載された第３の製剤へＥｍＰＡＣ製剤を変更する際、ＥｍＰＡＣ製剤＃３がタキソール（登録商標）のものと同じ薬物動態プロファイルを有することを結果が示している。
【０１０４】
実施例７
タキソール（登録商標）およびアブラキサン（登録商標）として調剤したパクリタキセルと比較したＥｍＰＡＣとして調剤したパクリタキセルの細胞吸収量
タキソール（登録商標）（ＣｒｅｍｏｐｈｏｒＥＬ（登録商標）：エタノール １：１のパクリタキセル）は、数年間臨床で使用され、肺非小細胞癌と乳癌を含む様々な異なる癌適応症を治療してきた。アブラキサン（登録商標）（ＨＳＡで調剤されたパクリタキセルの製剤）は癌治療のＦＤＡによって承認された。この研究の目的は、ＥｍＰＡＣがタキソール（登録商標）とアブラキサン（登録商標）と異なるかどうかを判定することであり、各パクリタキセル製剤に１時間晒されたＡ５４９ヒト肺癌とＭＤＡ ＭＢ ４３５乳癌細胞株を用いる生体外の短期間の露出実験で、パクリタキセルの細胞吸収量に影響を及ぼした。次いで細胞が固定され、パクリタキセル対抗抗体、続いて蛍光に標識化された第２抗体によって染色された。細胞内のパクリタキセルは、細胞内蛍光染色によって検出できるように、エピ蛍光顕微鏡によって視覚化された。蛍光に標識化された細胞のデジタル像は、冷却されたＣＣＤカメラで取り込まれた。標識化された細胞の蛍光強度はデジタル画像ソフトウェアを用いて定量化され、各実験群の細胞の平均細胞内蛍光強度が比べられた。
【０１０５】
材料と方法
細胞株
米国培養菌保存施設（ＡＴＣＣ）から購入されたＡ５４９ヒト非小細胞肺腫瘍細胞は、１０％のウシ胎児血清（ＦＣＳ）と共にロズウェル公園記念研究所（ＲＰＭＩ）１６４０媒体で培養されて、１：３乃至１：８の比率で二次培養された。
【０１０６】
ＡＴＣＣから購入されたＭＤＡ ＭＢ ４３５ヒト乳癌細胞は、１０％のウシ胎児血清（ＦＣＳ）と共にロズウェル公園記念研究所（ＲＰＭＩ）１６４０媒体で培養されて、１：３〜１：８の比率で二次培養された。
【０１０７】
被験物質
タキソール（登録商標）（ロット＃７２９５３７）は、オハイオ州ベッドフォードのＢｅｎ Ｖｅｎｕｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社から得られた。
【０１０８】
ＥｍＰＡＣ（バッチ＃Ｔ３４３）は、０．３ｍＬベンジルアルコールと；５．６ｇの大豆油、６．６１ｇのＴｗｅｅｎ（登録商標）８０を含む超音波処理された混合物および１２３．２３ｍｇの脂質混合粉末と；３００ｍＬのＨＰＬＣグレード水と、に超音波処理によって溶解された９０．４２ｍｇのパクリタキセルを組み合わせ、１２５０の棒材で高圧均質化により乳化することによって調製された。次いで１０ｇのデキストロースが２００ｍＬのこの溶液に加えられ、溶かすために超音波処理され、０．２２μＭのフィルタによって無菌ろ過された。得られた製品は、２．０％の大豆油と、２．２％のＴｗｅｅｎ（登録商標）８０と、４００μｇ／ｍＬの脂質混合粉末と、０．１％のベンジルアルコールと、３００μｇ／ｍｌのパクリタキセル（ロット＃２８０４２／ｋｌ）とを含んだ。
【０１０９】
ＧｌｏｂａｌＲｘ社（エフランド（Ｅｆｌａｎｄ）、ノースカロライナ州）から購入された注射可能な懸濁液のアブラキサン（登録商標）（ロット＃２００４９５、期限２００７年４月；Ａｂｒａｘｉｓ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ社）は、１００ｍｇのパクリタキセルと９００ｍｇのＨＳＡを含む粉末として提供された。次いでアブラキサン（登録商標）粉末は、５ｍｇ／ｍＬのパクリタキセルと４５ｍｇ／ｍＬのＨＳＡを含む懸濁液を生成するために２０ｍＬの無菌ＰＢＳを加えることによって再構成された。再構成されたアブラキサン（登録商標）は、安定性の消失を回避するためにパッケージ説明書に従って２４時間以内で実験に利用された。
【０１１０】
試薬
１）ミリＱ水
２）ベンジルアルコール、シグマ、ロット＃０２７４８ＰＣ
３）大豆油、シグマ、ロット＃０７４ｋ０１６９
４）Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０、シグマウルトラ、ロット＃０７３Ｋ００６４１
５）パクリタキセル（研究開発グレード）、インデナ（Ｉｎｄｅｎａ）、ロット＃２８０４２／ｋｌ
６）デキストロース（無水粉末）、フィッシャー、ロット＃０２４２９１
７）エマルシファン（Ｅｍｕｌｓｉｐｈａｎ）脂質混合物＃００３／０５
【０１１１】
抗体
１）マウス抗パクリタキセルＩｇＧ。カタログ番号ＴＡ１２；ハワイバイオテクノロジー社、アイエーア、ハワイ州。
２）ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８結合ニワトリ抗マウスＩｇＧ。分子プローブ社、ユージーン、オレゴン州。
【０１１２】
材料を染色する追加抗体
１）Ｎｕｎｃ Ｌａｂ Ｔｅｋ Ｃｅｌｌ チャンバスライドシステム。Ｎａｌｇｅ Ｎｕｎｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社、ロチェスター、ニューヨーク州。
２）トリス緩衝食塩水（ＴＢＳ）。Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ、ウスター（Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ）、マサチューセッツ州
【０１１３】
研究デザインと手順
実験は、調査者が各被験物質の正体を知らされていないように設計された。被験物質は新しいチューブに配置され、実験に直接関与しない人によってラベルが張り替えられた；結果が計算された後、被験物質の正体が明かされた。
【０１１４】
＞５０％の密集度に成長させられた細胞について、媒体が除去され、細胞単層が５ｍＬのＰＢＳの添加によって簡単に洗浄され、続いて吸引された。２ｍＬのトリプシンエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）が各フラスコに加えられ、フラスコは５分間組織培養培養器に配置された。１０ｍＬの完全培地が酵素反応を停止させるために加えられ、細胞は血清ピペットにより再懸濁を繰り返すことによって分解された。１０μＬの細胞が１０μＬの０．４％トリパンブルー溶液に加えられ、混合され、この細胞溶液の〜１０乃至２０μＬが血球計算器のチャンバに配置された。生細胞の数は、１００Ｘ全体倍率で四角形の血球計算器チャンバのトリパンブルーを除外した細胞の数を数えることによって測定された。
【０１１５】
必要とされる細胞の容積は下記式によって測定された：
細胞の容積＝（Ａｘ１０４細胞／ｍＬ）（ｍＬに必要な細胞のＶｔｏｔａｌ）÷（２ｄｆ）（Ｂ細胞／ｍＬ）
ここで：ｄｆは希釈比であり；Ａは血球計算器で数えられた細胞の数であり；Ｂは実験に必要な細胞／ｍＬの濃度である。
【０１１６】
Ａ５４９肺腫瘍とＭＤＡ ＭＢ ４３５乳癌細胞は、４×１０４細胞／ｃｍ２で８つのウェルチャンバスライド内に培養された。細胞は、被験物質が加えられる前に２４時間夜通し培養させられた。
【０１１７】
被験物質（各々２．５μＭのパクリタキセルを含む）および被験物質のないコントロール完全培地が二重のチャンバスライドウェルに加えられ、培養哺乳動物細胞（５％ＣＯ２。９５％０２；３７℃）を用いて標準状態で１時間培養された。培養期間の終わりに、細胞サンプルは１ｍＬのＰＢＳの添加によって暖かいＰＢＳにより一度洗浄され、続いて暖かいＰＢＳを吸引した。３ｍＬの氷冷のメタノールが各組織培養ウェルに加えられ、細胞は１５分間〜２０℃でメタノール内で固定された。スライドは染色まで０．０２％のアジ化ナトリウムを含むＰＢＳに配置された。
【０１１８】
細胞サンプルは１時間ｐＨ８．０のＴＢＳ内の１０％の正常ニワトリ血清（ＮＣＳ）で遮断された。遮断後に溶液が除去され、細胞は、１時間および室温で２％のＮＣＳとマウス抗パクリタキセルを１：１００の希釈で含むＴＢＳで培養された。一次の抗体培養の終わりに、細胞サンプルが洗浄ボトル内のＴＢＳで簡単にすすがれ、チャンバスライド全体がＴＢＳを含むコプリン染色びんに浸された。チャンバスライドの洗浄は、１０分間撹拌プレートの撹拌棒によりＴＢＳを攪拌することによって達成された。チャンバスライドは３つ変更したＴＢＳで洗浄された。細胞は、室温で３０分間Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８に結合した２％ＮＣＳとニワトリ抗マウスＩｇＧを１：１００の希釈で含むＴＢＳにより染色された。第２の抗体培養の終わりに、細胞は洗浄ボトル内のＴＢＳで簡単にすすがれ、上述したように洗浄された。染色された細胞は、１４．３μＭの４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール，二塩酸塩（ＤＡＰＩ）を含むＦｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔＧ封入剤（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）により取り付けた細胞であり、カバーガラスで覆われた。
【０１１９】
スライドと細胞は、抗パクリタキセルのＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒの第２染色を視覚化するために、励起４８０ｎｍと出射５２０ｎｍを用いるエピ蛍光顕微鏡で観察された。ＤＡＰＩの染色体染色は、励起３５８ｎｍと出射４６１ｎｍのフィルタを用いて視覚化された。画像は、Ｚｅｉｓｓ ＡｘｉｏｃａｍＨＲデジタルカメラとＡｘｉｏｖｉｓｉｏｎ画像収集および解析ソフトウェアを用いて得られた。パクリタキセル染色とＤＡＰＩ染色の画像は、Ｚｅｉｓｓ ＡｘｉｏｃａｍＨＲデジタルカメラにより各細胞領域について同時に取り込まれた。細胞領域のパクリタキセル染色の細胞内蛍光強度は、Ａｘｉｏｖｉｓｉｏｎソフトウェアを用いることによって測定された。４乃至１９個の細胞を各々含む細胞の８乃至１１の重複しない領域の画像は、各サンプルの二重のウェルの双方から無作為に取り込まれた。全てにおいて、合計１２３乃至１４７個の細胞が各細胞サンプルについて分析された。細胞周囲長は、マウスカーソルで細胞のエッジをデジタルでトレースすることによって各細胞について手動で規定された。
【０１２０】
計算と統計的分析
蛍光強度と細胞面積の計算と統計的分析データはＥｘｃｅｌのスプレッドシートにコピーされ、個別細胞の面積当たりの平均蛍光強度がＥｘｃｅｌで計算された。
【０１２１】
平均細胞蛍光強度を計算するために、下記式が用いられた：
［（Ｉ１／Ａ１）＋（Ｉ２／Ａ２）＋（Ｉ３／Ａ３）＋．．．（Ｉｎ／Ａｎ）］／ｎ＝細胞面積当たりの平均蛍光強度
ここで：Ｉは、細胞周囲長の手動トレースによって規定された各細胞面積の強度であり；Ａは、各規定された細胞面積の面積であり；ｎは、サンプリングされた細胞の数である。
【０１２２】
平均細胞内パクリタキセルレベルは、各治療されたサンプルの面積当たりの平均蛍光強度によって測定され、異なる被験物質で治療された細胞間で比較された。
【０１２３】
ＥｍＰＡＣ−、タキソール（登録商標）−、アブラキサン（登録商標）−治療細胞の平均蛍光強度値の統計有意差は、スチューデントのｔ検定を用いて比較された。
【０１２４】
結果
ＥｍＰＡＣ、タキソール（登録商標）、またはアブラキサン（登録商標）で各々治療された１０８乃至１４７個のＡ５４９細胞の平均蛍光強度が測定された。各被験物質で治療したＡ５４９細胞サンプルの細胞当たりの平均蛍光強度は、表９に示されている。被験物質なしで治療された細胞は、特定の染色を示さなかった（データは示されない）。このため、未治療の細胞の蛍光強度は測定されなかった。さらに、これらはパクリタキセルで治療する際に形状が丸くなり、これが細胞質と細胞周辺を視覚化するのを困難にしたので、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞の蛍光強度は測定されなかった。
表９．様々なパクリタキセル製剤に１時間晒されたＡ５４９細胞の細胞内蛍光性パクリタキセル
各群につき１０乃至１２の領域で１０９乃至１４７個の細胞より測定された。
表１０．Ａ５４９腫瘍細胞のパクリタキセル製剤の細胞面積当たりの細胞内蛍光性パクリタキセル強度を比較するステューデントｔ検定の結果
【０１２５】
図１３で分かるように、ＥｍＰＡＣ、タキソール（登録商標）、またはアブラキサン（登録商標）で治療された細胞は全て、微小管の典型的な核周囲の繊維模様を有した蛍光染色を示した。これは、パクリタキセルが微小管に貪欲に結合し、最初に細胞の微小管に局在化したので、抗パクリタキセル染色が特異的であったことを示している。
【０１２６】
スチューデントのｔ検定は、細胞面積値当たりの平均蛍光強度によって示されるように（表９および表１０；ＥｍＰＡＣとアブラキサン（登録商標）間、およびタキソール（登録商標）とアブラキサン（登録商標）間の比較はＰ＜０．０００１）、ＥｍＰＡＣまたはタキソール（登録商標）の何れかで治療された細胞がアブラキサン（登録商標）のものと比べて著しく強い平均細胞内パクリタキセルレベルを有することを示した。この違いは統計的な有意値（Ｐ＝０．０８）以下であったが、ＥｍＰＡＣがタキソール（登録商標）より適度に強い細胞内パクリタキセルレベルを持っていたこととが分かった（表９、１１６．７±２．０および１１２±１．８、それぞれ）。
【０１２７】
議論／結論
この研究の結果は、ＥｍＰＡＣとタキソール（登録商標）製剤の双方がアブラキサン（登録商標）を行ったものよりパクリタキセルの細胞吸収を著しく多くすることができることを示している。これらの結果は、これらのパクリタキセル製剤による細胞増殖阻害に関する以前の研究の結果と一致しているように見え、これは、１時間細胞に一時的に晒された場合にＥｍＰＡＣとタキソール（登録商標）がアブラキサン（登録商標）と比べてより多くの細胞増殖阻害活性を持つことを示した。これらの３つの製剤が同じ活性成分を有するので、これらの３つの製剤の違いについて１つの可能性のある説明は、それらの媒体が原因であるであろう。この場合、アブラキサン（登録商標）の媒体が、パクリタキセル（ＥｍＰＡＣとタキソール（登録商標）の媒体と比べて、細胞の吸収量を抑制する可能性がある。
【０１２８】
この研究による結果は、タキソール（登録商標）で調剤されたものとＥｍＰＡＣで調剤された放射標識パクリタキセルの細胞の吸収量を比較した実施例２の結果と一致している。しかしながら、実施例２の結果は、タキソール（登録商標）で治療された細胞のパクリタキセル吸収量と比べて、ＥｍＰＡＣで治療されたＡ５４９細胞のパクリタキセル吸収量は著しく多いことを示した。多いが、タキソール（登録商標）で治療された細胞と比べてＥｍＰＡＣで治療された細胞のパクリタキセル吸収量が多いことがこの研究で観察されたが、この違いは統計的な有意値以下であった。この結果の違いは、ＥｍＰＡＣ製剤が２つの研究で異なっていたという事実によるであろう。
【０１２９】
参照
Ｉｂｒａｈｉｍ ＮＫ，Ｄｅｓａｉ Ｎ，Ｌｅｇｈａ Ｓ，Ｓｏｏｎ−Ｓｈｉｏｎｇ Ｐ，Ｔｈｅｒｉａｕｌｔ ＲＬ，Ｒｉｖｅｒａ Ｅ，Ｅｓｍａｅｌｉ Ｂ，Ｒｉｎｇ ＳＥ，Ｂｅｄｉｋｉａｎ Ａ，Ｈｏｒｔｏｂａｇｙｉ ＧＮ，およびＥｌｌｅｒｈｏｒｓｔ ＪＡ．２００２年 ＡＢＩ−００７ Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ無し タンパク質安定化 パクリタキセルのナノ粒子製剤のフェーズＩおよび薬物動態研究 Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．８：１０３８−１０４４。
Ｓｉｎｇｌａ ＡＫ、Ｇａｒｇ ＡおよびＡｇｇａｒｗａｌ Ｄ．２００２年 パクリタキセルとその製剤 Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．２３５：１７９−１９２。
【０１３０】
本発明は、癌細胞と癌組織を治療する抗癌剤を含む治療薬と診断薬を運ぶ組成形態でのデリバリシステムに向けられていることが理解されるであろう。したがって、全抗癌剤は本発明の範囲内であり、同様に異常な脂質代謝と脂質の高い吸収量を示す全病変組織と異常細胞は、癌細胞を含み、この治療薬によって治療されるであろう。
【０１３１】
前述の議論は、本発明の例示的実施形態を単に開示および記載するものである。当業者は、以下の特許請求の範囲に規定されている本発明の趣旨および範囲から外れずに、様々な変更、修飾および変形を行ってもよいことをこの議論および添付した特許請求の範囲から容易に理解するであろう。さらに、例示的実施形態が本書に記載されているが、他の当業者は本発明のその他の設計または使用に気づくであろう。したがって、本発明はその例示的実施形態に関して記載されているが、デザインおよび使用の双方における多くの変形が当業者に明らかであり、本出願が任意の適合またはその変形を包含するように意図されていることを理解されるであろう。よって、本発明は特許請求の範囲およびその均等物によってのみ限定されることを明確に意図する。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
人を含む温血動物の細胞過剰増殖によって特徴づけられる疾病、状態もしくは症候群またはこれらの症状を治療または予防するのに有用な医薬組成物であって、当該医薬組成物が、
異常細胞内に優先的または選択的に内在化することが可能な少なくとも１つの非二層形成脂質をそれぞれ含む脂質粒子で構成された脂質ナノエマルジョンと；
前記脂質ナノエマルジョンに連結される有効量の少なくとも１つの治療薬と；
薬剤的に受容可能な担体とを具え、
前記医薬組成物が均質化を介した処理によって生成されることを特徴とする医薬組成物。
【請求項２】
請求項１に記載の医薬組成物において、前記治療薬が微小管相互作用薬であることを特徴とする医薬組成物。
【請求項３】
請求項２に記載の医薬組成物において、前記微小管相互作用薬が、タキサン、ビンカアルカロイド、エポチロン、エリュテロビン、ドラスチン、コンブレスタチン、サルコジクチン、ラウリマリド、ジスコデルモリド、コルヒチン、フォモプシンＡ、ハリコンドリンＢ、スポンギスタチン１、ならびにこれらの誘導体、類似体、同属種および組み合わせから成る群から選択されることを特徴とする医薬組成物。
【請求項４】
請求項３に記載の医薬組成物において、前記タキサンが、パクリタキセル、セファロマンニン、ドセタセル、バッカチンＩＩＩ、１０−デアセチルバッカチンＩＩＩ、デアセチルパクリタキセル、デアセチル−７−エピパクリタキセル、ならびにこれらの誘導体、同属種、類似体および組み合わせから成る群から選択されること特徴とする医薬組成物。
【請求項５】
請求項３に記載の医薬組成物において、前記ビンカアルカロイドが、ビンクリスチン、ビンブラスチン、酒石酸ビノレルビン、ビンデシン、ならびにこれらの誘導体、同属種、類似体および組み合わせから成る群から選択されること特徴とする医薬組成物。
【請求項６】
請求項１に記載の医薬組成物において、前記治療薬の量が前記医薬組成物の総体積ベースで少なくとも０．００１重量％であることを特徴とする医薬組成物。
【請求項７】
請求項６に記載の医薬組成物において、前記治療薬の量が前記医薬組成物の総体積ベースで０．１乃至９０重量％存在することを特徴とする医薬組成物。
【請求項８】
請求項１に記載の医薬組成物において、前記非二層形成脂質が弱極性に過ぎないことを特徴とする医薬組成物。
【請求項９】
請求項８に記載の医薬組成物において、前記非二層形成脂質が実質的に非極性または中性であることを特徴とする医薬組成物。
【請求項１０】
請求項８に記載の医薬組成物において、前記非二層形成脂質が中性であることを特徴とする医薬組成物。
【請求項１１】
請求項１に記載の医薬組成物において、前記脂質粒子が非二層形成脂質の混合物で構成されること特徴とする医薬組成物。
【請求項１２】
請求項１に記載の医薬組成物において、前記脂質粒子が少なくとも７日間水相で安定的に分散されていること特徴とする医薬組成物。
【請求項１３】
請求項１２に記載の医薬組成物において、前記脂質粒子が少なくとも１４日間水相で安定的に分散されていること特徴とする医薬組成物。
【請求項１４】
請求項１３に記載の医薬組成物において、前記脂質粒子が少なくとも１ヶ月間水相で安定的に分散されていること特徴とする医薬組成物。
【請求項１５】
請求項１４に記載の医薬組成物において、前記脂質粒子が少なくとも６ヶ月間水相で安定的に分散されていること特徴とする医薬組成物。
【請求項１６】
請求項１５に記載の医薬組成物において、前記脂質粒子が少なくとも１年間水相で安定的に分散されていること特徴とする医薬組成物。
【請求項１７】
請求項１に記載の医薬組成物がさらに、乳化促進剤を含むこと特徴とする医薬組成物。
【請求項１８】
請求項１７に記載の医薬組成物において、前記乳化促進剤が、界面活性剤、植物性脂肪源、溶媒およびこれらの組み合わせから成る群から選択されること特徴とする医薬組成物。
【請求項１９】
請求項１８に記載の医薬組成物において、前記界面活性剤が非イオン性界面活性剤であることを特徴とする医薬組成物。
【請求項２０】
請求項１９に記載の医薬組成物において、前記非イオン性界面活性剤が洗浄性ポリソルベートであることを特徴とする医薬組成物。
【請求項２１】
請求項２０に記載の医薬組成物において、前記洗浄性ポリソルベートがＴｗｅｅｎ８０（登録商標）であることを特徴とする医薬組成物。
【請求項２２】
請求項１８に記載の医薬組成物において、前記非イオン性界面活性剤がソルビタンエステルであることを特徴とする医薬組成物。
【請求項２３】
請求項２２に記載の医薬組成物において、前記ソルビタンエステルが、脂肪族アシル化ソルビタンエステルとこのポリオキシエチレン誘導体、およびこれらの混合物から成る群から選択されることを特徴とする医薬組成物。
【請求項２４】
請求項１８に記載の医薬組成物において、前記界面活性剤が、前記ナノエマルジョンの保存中の変質を防止するのに十分な量で存在することを特徴とする医薬組成物。
【請求項２５】
請求項２４に記載の医薬組成物において、前記界面活性剤が０．０１乃至４．０重量／体積（ｗ／ｖ）％の量で存在することを特徴とする医薬組成物。
【請求項２６】
請求項２５に記載の医薬組成物において、前記界面活性剤が０．１乃至３．０重量／体積％の量で存在することを特徴とする医薬組成物。
【請求項２７】
請求項１８に記載の医薬組成物において、前記溶媒が水混和性溶媒であることを特徴とする医薬組成物。
【請求項２８】
請求項２７に記載の医薬組成物において、前記水混和性溶媒が、極性溶媒およびこの組み合わせから成る群から選択されることを特徴とする医薬組成物。
【請求項２９】
請求項２８に記載の医薬組成物において、前記溶媒が、極性の非プロトン性溶媒、極性のプロトン性溶媒、およびこれらの組み合わせから成る群から選択されることを特徴とする医薬組成物。
【請求項３０】
請求項２９に記載の医薬組成物において、前記極性の非プロトン性溶媒がジメチルスルホキシドであることを特徴とする医薬組成物。
【請求項３１】
請求項２９に記載の医薬組成物において、前記極性のプロトン性溶媒がアルコールであることを特徴とする医薬組成物。
【請求項３２】
請求項３１に記載の医薬組成物において、前記アルコールが、ブタノール、プロパノール、エタノール、メタノール、ベンジルアルコール、およびこれらの組み合わせから成る群から選択されることを特徴とする医薬組成物。
【請求項３３】
請求項１８に記載の医薬組成物において、前記溶媒が前記界面活性剤の凝集の程度を制御するのに十分な量で存在することを特徴とする医薬組成物。
【請求項３４】
請求項３３に記載の医薬組成物において、前記溶媒が０．００１乃至９９．９体積／体積（ｖ／ｖ）％の量で存在することを特徴とする医薬組成物。
【請求項３５】
請求項３４に記載の医薬組成物において、前記溶媒が０．００５乃至８０体積／体積％の量で存在することを特徴とする医薬組成物。
【請求項３６】
請求項１８に記載の医薬組成物において、前記植物性脂肪源が植物油であることを特徴とする医薬組成物。
【請求項３７】
請求項３６に記載の医薬組成物において、前記植物油が、大豆油、亜麻油、大麻油、アマニ油、からし油、菜種油、キャノーラ油、ベニバナ油、ゴマ油、ひまわり油、ブドウ種油、アーモンド油、アプリコット油、ヒマシ油、トウモロコシ油、綿実油、ココナッツ油、ヘーゼルナッツ油、ニーム油、オリーブ油、ヤシ油、パーム核油、ピーナッツ油、パンプキンシード油、米ぬか油、くるみ油、およびこれらの組み合わせから成る群から選択されることを特徴とする医薬組成物。
【請求項３８】
請求項３７に記載の医薬組成物において、前記植物油が大豆油であることを特徴とする医薬組成物。
【請求項３９】
請求項１８に記載の医薬組成物において、前記植物性脂肪源が、前記ナノエマルジョンの表面張力を高めるのに十分な量で存在し、これにより標的細胞の細胞質膜との疎水的相互作用の確率を高めることを特徴とする医薬組成物。
【請求項４０】
請求項３９に記載の医薬組成物において、前記植物性脂肪源が０．００１乃至５．０体積／体積％の量で存在することを特徴とする医薬組成物。
【請求項４１】
請求項４０に記載の医薬組成物において、前記植物性脂肪源が０．００５乃至４．０体積／体積％の量で存在することを特徴とする医薬組成物。
【請求項４２】
請求項１に記載の医薬組成物において、前記少なくとも１つの非二層形成脂質が、カルボン酸のグリセロールモノエステル、脂肪族アルコール、ステロール芳香族酸エステル、ステロール、テルペン、胆汁酸、胆汁酸のアルカリ金属塩、脂肪酸のステロールエステル、糖酸のステロールエステル、糖酸のエステル、脂肪族アルコールのエステル、糖質のエステル、脂肪酸のエステル、糖酸、サポニン、サポゲニン、グリセロール、脂肪酸のグリセロールジエステル、脂肪酸のグリセロールトリエステル、脂肪族アルコールのグリセロールジエステル、および脂肪族アルコールのグリセロールトリエステル、ならびにこれらの組み合わせからなる群から選択されることを特徴とする医薬組成物。
【請求項４３】
請求項１に記載の医薬組成物において、前記少なくとも１つの非二層形成脂質が脂質混合物の形態で、
ａ）９乃至１８の炭素原子を含むカルボン酸のグリセロールモノエステルと、１０乃至１８の炭素原子を含む脂肪族アルコールとから成る群から選択された少なくとも１つの第１要素と；
ｂ）ステロール芳香族酸エステルから成る群から選択された少なくとも１つの第２要素と；
ｃ）ステロール、テルペン、胆汁酸および胆汁酸のアルカリ金属塩から成る群から選択された少なくとも１つの第３要素とを含むことを特徴とする医薬組成物。
【請求項４４】
請求項４３に記載の医薬組成物において、前記カルボン酸のグリセロールモノエステルが飽和していることを特徴とする医薬組成物。
【請求項４５】
請求項４３に記載の医薬組成物において、前記カルボン酸のグリセロールモノエステルが飽和していないことを特徴とする医薬組成物。
【請求項４６】
請求項４３に記載の医薬組成物において、前記脂質混合物は、前記脂質粒子の総重量ベースで（ａ）：（ｂ）：（ｃ）が（１−５）：（０．２５−３）：（０．２５−３）の重量比を有することを特徴とする医薬組成物。
【請求項４７】
請求項４３に記載の医薬組成物において、前記脂質混合物がさらに、
ｄ）１乃至１８の炭素原子を含む脂肪酸のステロールエステルと；糖酸のステロールエステルと；糖酸のエステルおよび１０乃至１８の炭素原子を含む脂肪族アルコールと；糖質のエステルおよび１０乃至１８の炭素原子を含む脂肪酸と；糖酸と、サポニンと；サポゲニンと；から成る群から選択された少なくとも１つの第４要素と、
ｅ）グリセロールと；１０乃至１８の炭素原子を含む脂肪酸のグリセロールジエステルおよびトリエステルと；１０乃至１８の炭素原子を含む脂肪族アルコールとから成る群から選択された少なくとも１つの第５要素とを含むことを特徴とする医薬組成物。
【請求項４８】
請求項４７に記載の医薬組成物において、前記脂質混合物は、前記脂質粒子の総重量ベースで（ａ）：（ｂ）：（ｃ）：（ｄ）：（ｅ）が（１−５）：（０．２５−３）：（０．２５−３）：（０．２５−３）：（０．２５−３）の重量比を有することを特徴とする医薬組成物。
【請求項４９】
請求項１に記載の医薬組成物において、前記脂質粒子が０．１μｇ／ｍＬ乃至１０００μｇ／ｍＬの量で存在することを特徴とする医薬組成物。
【請求項５０】
請求項４９に記載の医薬組成物において、前記脂質粒子が１０μｇ／ｍＬ乃至８００μｇ／ｍＬの量で存在することを特徴とする医薬組成物。
【請求項５１】
請求項５０に記載の医薬組成物において、前記脂質粒子が２００μｇ／ｍＬ乃至６００μｇ／ｍＬの量で存在することを特徴とする医薬組成物。
【請求項５２】
請求項１に記載の医薬組成物において、前記脂質粒子の平均粒子径が最大０．２μ（ミクロン）であることを特徴とする医薬組成物。
【請求項５３】
請求項５２に記載の医薬組成物において、前記脂質粒子の平均粒子径が０．０２μ乃至０．２μであることを特徴とする医薬組成物。
【請求項５４】
人を含む温血動物の疾病、状態、症候群、またはこれらの症状を診断するのに有用な医薬組成物であって、当該医薬組成物が、
癌細胞を含む異常細胞内に優先的または選択的に内在化することが可能な少なくとも１つの非二層形成脂質をそれぞれ含む脂質粒子で構成された脂質ナノエマルジョンと；
前記脂質ナノエマルジョンに連結される有効量の少なくとも１つの治療薬と；
薬剤的に受容可能な担体とを具え、
前記医薬組成物が均質化を介した処理によって生成されることを特徴とする医薬組成物。
【請求項５５】
人を含む温血動物の疾病、状態および症候群を治療または予防する方法であって、請求項１に記載の有効量の医薬組成物を前記動物に投与するステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項５６】
請求項５５に記載の方法において、前記医薬組成物が動物の体内に外科的に挿入された生体医用器具の表面に染み込ませられることを特徴とする方法。
【請求項５７】
請求項５６に記載の方法において、前記生体医用器具はステントであることを特徴とする方法。
【請求項５８】
請求項１に記載の医薬組成物を調製する方法であって、
ａ）前記少なくとも１つの非二層形成脂質を有効量の少なくとも１つの治療薬と混合して脂質部を得るステップと；
ｂ）前記脂質部を水相に加えて分散を得るステップと；
ｃ）前記分散を高せん断力の条件下で撹拌して前記少なくとも１つの非二層形成脂質を十分に分散し、脂質粒子で構成された脂質ナノエマルジョンを形成するステップと、を含むことを特徴とする方法。
【請求項５９】
請求項５８に記載の方法がさらに、前記医薬組成物に乳化促進剤を加えるステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項６０】
請求項５９に記載の方法において、前記乳化促進剤が、界面活性剤、溶媒、植物性脂肪源、およびこれらの組み合わせから成る群から選択されること特徴とする方法。
【請求項６１】
請求項６０に記載の方法がさらに、前記治療薬と混合するステップに先立って前記界面活性剤を前記少なくとも１つの非二層形成脂質と混合するステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項６２】
請求項６０に記載の方法がさらに、前記治療薬と混合するステップに先立って前記植物性脂肪源を前記少なくとも１つの非二層形成脂質と混合するステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項６３】
請求項６０に記載の方法であって、前記少なくとも１つの非二層形成脂質と混合するステップに先立って前記溶媒を前記治療薬と混合するステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項６４】
請求項５８に記載の方法において、前記撹拌するステップが前記脂質混合物を流体均質化プロセスによって処理するステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項６５】
請求項６４に記載の方法において、前記流体均質化プロセスが、高せん断力均質化、超音波均質化、高圧均質化、およびこれらの組み合わせから成る群から選択されることを特徴とする方法。
【請求項６６】
請求項５８に記載の方法がさらに、前記ナノエマルジョンを殺菌するステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項６７】
請求項５８に記載の方法がさらに、前記ナノエマルジョンを無菌ろ過によって処理するステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項６８】
請求項６７に記載の方法において、前記処理するステップが前記ナノエマルジョンを０．２μの膜に通すステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項６９】
人を含む温血動物の細胞過剰増殖によって特徴づけられた疾病、状態、症候群、またはこれらの症状を診断する方法であって、前記温血動物に請求項５４に記載の有効量の医薬組成物を投与するステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項１】
人を含む温血動物の細胞過剰増殖によって特徴づけられる疾病、状態もしくは症候群またはこれらの症状を治療または予防するのに有用な医薬組成物であって、当該医薬組成物が、
異常細胞内に優先的または選択的に内在化することが可能な少なくとも１つの非二層形成脂質をそれぞれ含む脂質粒子で構成された脂質ナノエマルジョンと；
前記脂質ナノエマルジョンに連結される有効量の少なくとも１つの治療薬と；
薬剤的に受容可能な担体とを具え、
前記医薬組成物が均質化を介した処理によって生成されることを特徴とする医薬組成物。
【請求項２】
請求項１に記載の医薬組成物において、前記治療薬が微小管相互作用薬であることを特徴とする医薬組成物。
【請求項３】
請求項２に記載の医薬組成物において、前記微小管相互作用薬が、タキサン、ビンカアルカロイド、エポチロン、エリュテロビン、ドラスチン、コンブレスタチン、サルコジクチン、ラウリマリド、ジスコデルモリド、コルヒチン、フォモプシンＡ、ハリコンドリンＢ、スポンギスタチン１、ならびにこれらの誘導体、類似体、同属種および組み合わせから成る群から選択されることを特徴とする医薬組成物。
【請求項４】
請求項３に記載の医薬組成物において、前記タキサンが、パクリタキセル、セファロマンニン、ドセタセル、バッカチンＩＩＩ、１０−デアセチルバッカチンＩＩＩ、デアセチルパクリタキセル、デアセチル−７−エピパクリタキセル、ならびにこれらの誘導体、同属種、類似体および組み合わせから成る群から選択されること特徴とする医薬組成物。
【請求項５】
請求項３に記載の医薬組成物において、前記ビンカアルカロイドが、ビンクリスチン、ビンブラスチン、酒石酸ビノレルビン、ビンデシン、ならびにこれらの誘導体、同属種、類似体および組み合わせから成る群から選択されること特徴とする医薬組成物。
【請求項６】
請求項１に記載の医薬組成物において、前記治療薬の量が前記医薬組成物の総体積ベースで少なくとも０．００１重量％であることを特徴とする医薬組成物。
【請求項７】
請求項６に記載の医薬組成物において、前記治療薬の量が前記医薬組成物の総体積ベースで０．１乃至９０重量％存在することを特徴とする医薬組成物。
【請求項８】
請求項１に記載の医薬組成物において、前記非二層形成脂質が弱極性に過ぎないことを特徴とする医薬組成物。
【請求項９】
請求項８に記載の医薬組成物において、前記非二層形成脂質が実質的に非極性または中性であることを特徴とする医薬組成物。
【請求項１０】
請求項８に記載の医薬組成物において、前記非二層形成脂質が中性であることを特徴とする医薬組成物。
【請求項１１】
請求項１に記載の医薬組成物において、前記脂質粒子が非二層形成脂質の混合物で構成されること特徴とする医薬組成物。
【請求項１２】
請求項１に記載の医薬組成物において、前記脂質粒子が少なくとも７日間水相で安定的に分散されていること特徴とする医薬組成物。
【請求項１３】
請求項１２に記載の医薬組成物において、前記脂質粒子が少なくとも１４日間水相で安定的に分散されていること特徴とする医薬組成物。
【請求項１４】
請求項１３に記載の医薬組成物において、前記脂質粒子が少なくとも１ヶ月間水相で安定的に分散されていること特徴とする医薬組成物。
【請求項１５】
請求項１４に記載の医薬組成物において、前記脂質粒子が少なくとも６ヶ月間水相で安定的に分散されていること特徴とする医薬組成物。
【請求項１６】
請求項１５に記載の医薬組成物において、前記脂質粒子が少なくとも１年間水相で安定的に分散されていること特徴とする医薬組成物。
【請求項１７】
請求項１に記載の医薬組成物がさらに、乳化促進剤を含むこと特徴とする医薬組成物。
【請求項１８】
請求項１７に記載の医薬組成物において、前記乳化促進剤が、界面活性剤、植物性脂肪源、溶媒およびこれらの組み合わせから成る群から選択されること特徴とする医薬組成物。
【請求項１９】
請求項１８に記載の医薬組成物において、前記界面活性剤が非イオン性界面活性剤であることを特徴とする医薬組成物。
【請求項２０】
請求項１９に記載の医薬組成物において、前記非イオン性界面活性剤が洗浄性ポリソルベートであることを特徴とする医薬組成物。
【請求項２１】
請求項２０に記載の医薬組成物において、前記洗浄性ポリソルベートがＴｗｅｅｎ８０（登録商標）であることを特徴とする医薬組成物。
【請求項２２】
請求項１８に記載の医薬組成物において、前記非イオン性界面活性剤がソルビタンエステルであることを特徴とする医薬組成物。
【請求項２３】
請求項２２に記載の医薬組成物において、前記ソルビタンエステルが、脂肪族アシル化ソルビタンエステルとこのポリオキシエチレン誘導体、およびこれらの混合物から成る群から選択されることを特徴とする医薬組成物。
【請求項２４】
請求項１８に記載の医薬組成物において、前記界面活性剤が、前記ナノエマルジョンの保存中の変質を防止するのに十分な量で存在することを特徴とする医薬組成物。
【請求項２５】
請求項２４に記載の医薬組成物において、前記界面活性剤が０．０１乃至４．０重量／体積（ｗ／ｖ）％の量で存在することを特徴とする医薬組成物。
【請求項２６】
請求項２５に記載の医薬組成物において、前記界面活性剤が０．１乃至３．０重量／体積％の量で存在することを特徴とする医薬組成物。
【請求項２７】
請求項１８に記載の医薬組成物において、前記溶媒が水混和性溶媒であることを特徴とする医薬組成物。
【請求項２８】
請求項２７に記載の医薬組成物において、前記水混和性溶媒が、極性溶媒およびこの組み合わせから成る群から選択されることを特徴とする医薬組成物。
【請求項２９】
請求項２８に記載の医薬組成物において、前記溶媒が、極性の非プロトン性溶媒、極性のプロトン性溶媒、およびこれらの組み合わせから成る群から選択されることを特徴とする医薬組成物。
【請求項３０】
請求項２９に記載の医薬組成物において、前記極性の非プロトン性溶媒がジメチルスルホキシドであることを特徴とする医薬組成物。
【請求項３１】
請求項２９に記載の医薬組成物において、前記極性のプロトン性溶媒がアルコールであることを特徴とする医薬組成物。
【請求項３２】
請求項３１に記載の医薬組成物において、前記アルコールが、ブタノール、プロパノール、エタノール、メタノール、ベンジルアルコール、およびこれらの組み合わせから成る群から選択されることを特徴とする医薬組成物。
【請求項３３】
請求項１８に記載の医薬組成物において、前記溶媒が前記界面活性剤の凝集の程度を制御するのに十分な量で存在することを特徴とする医薬組成物。
【請求項３４】
請求項３３に記載の医薬組成物において、前記溶媒が０．００１乃至９９．９体積／体積（ｖ／ｖ）％の量で存在することを特徴とする医薬組成物。
【請求項３５】
請求項３４に記載の医薬組成物において、前記溶媒が０．００５乃至８０体積／体積％の量で存在することを特徴とする医薬組成物。
【請求項３６】
請求項１８に記載の医薬組成物において、前記植物性脂肪源が植物油であることを特徴とする医薬組成物。
【請求項３７】
請求項３６に記載の医薬組成物において、前記植物油が、大豆油、亜麻油、大麻油、アマニ油、からし油、菜種油、キャノーラ油、ベニバナ油、ゴマ油、ひまわり油、ブドウ種油、アーモンド油、アプリコット油、ヒマシ油、トウモロコシ油、綿実油、ココナッツ油、ヘーゼルナッツ油、ニーム油、オリーブ油、ヤシ油、パーム核油、ピーナッツ油、パンプキンシード油、米ぬか油、くるみ油、およびこれらの組み合わせから成る群から選択されることを特徴とする医薬組成物。
【請求項３８】
請求項３７に記載の医薬組成物において、前記植物油が大豆油であることを特徴とする医薬組成物。
【請求項３９】
請求項１８に記載の医薬組成物において、前記植物性脂肪源が、前記ナノエマルジョンの表面張力を高めるのに十分な量で存在し、これにより標的細胞の細胞質膜との疎水的相互作用の確率を高めることを特徴とする医薬組成物。
【請求項４０】
請求項３９に記載の医薬組成物において、前記植物性脂肪源が０．００１乃至５．０体積／体積％の量で存在することを特徴とする医薬組成物。
【請求項４１】
請求項４０に記載の医薬組成物において、前記植物性脂肪源が０．００５乃至４．０体積／体積％の量で存在することを特徴とする医薬組成物。
【請求項４２】
請求項１に記載の医薬組成物において、前記少なくとも１つの非二層形成脂質が、カルボン酸のグリセロールモノエステル、脂肪族アルコール、ステロール芳香族酸エステル、ステロール、テルペン、胆汁酸、胆汁酸のアルカリ金属塩、脂肪酸のステロールエステル、糖酸のステロールエステル、糖酸のエステル、脂肪族アルコールのエステル、糖質のエステル、脂肪酸のエステル、糖酸、サポニン、サポゲニン、グリセロール、脂肪酸のグリセロールジエステル、脂肪酸のグリセロールトリエステル、脂肪族アルコールのグリセロールジエステル、および脂肪族アルコールのグリセロールトリエステル、ならびにこれらの組み合わせからなる群から選択されることを特徴とする医薬組成物。
【請求項４３】
請求項１に記載の医薬組成物において、前記少なくとも１つの非二層形成脂質が脂質混合物の形態で、
ａ）９乃至１８の炭素原子を含むカルボン酸のグリセロールモノエステルと、１０乃至１８の炭素原子を含む脂肪族アルコールとから成る群から選択された少なくとも１つの第１要素と；
ｂ）ステロール芳香族酸エステルから成る群から選択された少なくとも１つの第２要素と；
ｃ）ステロール、テルペン、胆汁酸および胆汁酸のアルカリ金属塩から成る群から選択された少なくとも１つの第３要素とを含むことを特徴とする医薬組成物。
【請求項４４】
請求項４３に記載の医薬組成物において、前記カルボン酸のグリセロールモノエステルが飽和していることを特徴とする医薬組成物。
【請求項４５】
請求項４３に記載の医薬組成物において、前記カルボン酸のグリセロールモノエステルが飽和していないことを特徴とする医薬組成物。
【請求項４６】
請求項４３に記載の医薬組成物において、前記脂質混合物は、前記脂質粒子の総重量ベースで（ａ）：（ｂ）：（ｃ）が（１−５）：（０．２５−３）：（０．２５−３）の重量比を有することを特徴とする医薬組成物。
【請求項４７】
請求項４３に記載の医薬組成物において、前記脂質混合物がさらに、
ｄ）１乃至１８の炭素原子を含む脂肪酸のステロールエステルと；糖酸のステロールエステルと；糖酸のエステルおよび１０乃至１８の炭素原子を含む脂肪族アルコールと；糖質のエステルおよび１０乃至１８の炭素原子を含む脂肪酸と；糖酸と、サポニンと；サポゲニンと；から成る群から選択された少なくとも１つの第４要素と、
ｅ）グリセロールと；１０乃至１８の炭素原子を含む脂肪酸のグリセロールジエステルおよびトリエステルと；１０乃至１８の炭素原子を含む脂肪族アルコールとから成る群から選択された少なくとも１つの第５要素とを含むことを特徴とする医薬組成物。
【請求項４８】
請求項４７に記載の医薬組成物において、前記脂質混合物は、前記脂質粒子の総重量ベースで（ａ）：（ｂ）：（ｃ）：（ｄ）：（ｅ）が（１−５）：（０．２５−３）：（０．２５−３）：（０．２５−３）：（０．２５−３）の重量比を有することを特徴とする医薬組成物。
【請求項４９】
請求項１に記載の医薬組成物において、前記脂質粒子が０．１μｇ／ｍＬ乃至１０００μｇ／ｍＬの量で存在することを特徴とする医薬組成物。
【請求項５０】
請求項４９に記載の医薬組成物において、前記脂質粒子が１０μｇ／ｍＬ乃至８００μｇ／ｍＬの量で存在することを特徴とする医薬組成物。
【請求項５１】
請求項５０に記載の医薬組成物において、前記脂質粒子が２００μｇ／ｍＬ乃至６００μｇ／ｍＬの量で存在することを特徴とする医薬組成物。
【請求項５２】
請求項１に記載の医薬組成物において、前記脂質粒子の平均粒子径が最大０．２μ（ミクロン）であることを特徴とする医薬組成物。
【請求項５３】
請求項５２に記載の医薬組成物において、前記脂質粒子の平均粒子径が０．０２μ乃至０．２μであることを特徴とする医薬組成物。
【請求項５４】
人を含む温血動物の疾病、状態、症候群、またはこれらの症状を診断するのに有用な医薬組成物であって、当該医薬組成物が、
癌細胞を含む異常細胞内に優先的または選択的に内在化することが可能な少なくとも１つの非二層形成脂質をそれぞれ含む脂質粒子で構成された脂質ナノエマルジョンと；
前記脂質ナノエマルジョンに連結される有効量の少なくとも１つの治療薬と；
薬剤的に受容可能な担体とを具え、
前記医薬組成物が均質化を介した処理によって生成されることを特徴とする医薬組成物。
【請求項５５】
人を含む温血動物の疾病、状態および症候群を治療または予防する方法であって、請求項１に記載の有効量の医薬組成物を前記動物に投与するステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項５６】
請求項５５に記載の方法において、前記医薬組成物が動物の体内に外科的に挿入された生体医用器具の表面に染み込ませられることを特徴とする方法。
【請求項５７】
請求項５６に記載の方法において、前記生体医用器具はステントであることを特徴とする方法。
【請求項５８】
請求項１に記載の医薬組成物を調製する方法であって、
ａ）前記少なくとも１つの非二層形成脂質を有効量の少なくとも１つの治療薬と混合して脂質部を得るステップと；
ｂ）前記脂質部を水相に加えて分散を得るステップと；
ｃ）前記分散を高せん断力の条件下で撹拌して前記少なくとも１つの非二層形成脂質を十分に分散し、脂質粒子で構成された脂質ナノエマルジョンを形成するステップと、を含むことを特徴とする方法。
【請求項５９】
請求項５８に記載の方法がさらに、前記医薬組成物に乳化促進剤を加えるステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項６０】
請求項５９に記載の方法において、前記乳化促進剤が、界面活性剤、溶媒、植物性脂肪源、およびこれらの組み合わせから成る群から選択されること特徴とする方法。
【請求項６１】
請求項６０に記載の方法がさらに、前記治療薬と混合するステップに先立って前記界面活性剤を前記少なくとも１つの非二層形成脂質と混合するステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項６２】
請求項６０に記載の方法がさらに、前記治療薬と混合するステップに先立って前記植物性脂肪源を前記少なくとも１つの非二層形成脂質と混合するステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項６３】
請求項６０に記載の方法であって、前記少なくとも１つの非二層形成脂質と混合するステップに先立って前記溶媒を前記治療薬と混合するステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項６４】
請求項５８に記載の方法において、前記撹拌するステップが前記脂質混合物を流体均質化プロセスによって処理するステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項６５】
請求項６４に記載の方法において、前記流体均質化プロセスが、高せん断力均質化、超音波均質化、高圧均質化、およびこれらの組み合わせから成る群から選択されることを特徴とする方法。
【請求項６６】
請求項５８に記載の方法がさらに、前記ナノエマルジョンを殺菌するステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項６７】
請求項５８に記載の方法がさらに、前記ナノエマルジョンを無菌ろ過によって処理するステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項６８】
請求項６７に記載の方法において、前記処理するステップが前記ナノエマルジョンを０．２μの膜に通すステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項６９】
人を含む温血動物の細胞過剰増殖によって特徴づけられた疾病、状態、症候群、またはこれらの症状を診断する方法であって、前記温血動物に請求項５４に記載の有効量の医薬組成物を投与するステップを含むことを特徴とする方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【公表番号】特表２０１１−５１６４７２（Ｐ２０１１−５１６４７２Ａ）
【公表日】平成２３年５月２６日（２０１１．５．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５０２９０６（Ｐ２０１１−５０２９０６）
【出願日】平成２０年４月４日（２００８．４．４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／００４３９３
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１２３５９５
【国際公開日】平成２１年１０月８日（２００９．１０．８）
【出願人】（５１０２３７２６２）
【氏名又は名称原語表記】ＳＨＯＲＲ，Ｒｏｂｅｒｔ
【出願人】（５１０２３７２７３）
【氏名又は名称原語表記】ＲＯＤＲＩＧＵＥＺ，Ｒｏｂｅｒｔ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年５月２６日（２０１１．５．２６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年４月４日（２００８．４．４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／００４３９３
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１２３５９５
【国際公開日】平成２１年１０月８日（２００９．１０．８）
【出願人】（５１０２３７２６２）
【氏名又は名称原語表記】ＳＨＯＲＲ，Ｒｏｂｅｒｔ
【出願人】（５１０２３７２７３）
【氏名又は名称原語表記】ＲＯＤＲＩＧＵＥＺ，Ｒｏｂｅｒｔ
【Ｆターム（参考）】
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