心不全を診断するための特異性抗体
本発明は、心不全のｉｎ ｖｉｔｒｏ診断に関する。更に特には、本発明は、プロＢＮＰ（１−１０８）のヒンジ領域Ｒ76Ｓ77の何れかの側に位置するペプチドドメインの特異的抗体に関する。特に、本発明は、前記抗体を取得する方法、及びＢＮＰ（１−７６）及びＢＮＰ（７７−１０８）以外の血中のプロＢＮＰ（１−１０８）を検出するための前記抗体の使用に関する。本発明は、血中プロＢＮＰ（１−１０８）の検出方法、試薬及びそのキットにも関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、心室性心不全のｉｎ ｖｉｔｒｏ診断の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
鬱血性の心不全は、特に高齢の人には、一般的な臨床症状である。鬱血性の心不全は、通常、運動に伴う咳、疲労及び抹消性浮腫の出現などの非特異的症状を、知らない間に引き起こすかたちで現れる。診断は、月並みに、臨床的兆候[４つのステージ、すなわちＮＹＨＡ（つまり、ニューヨーク心臓協会）のステージＩ〜ＩＶに分類される]、心エコー検査法、シンチグラフィ、運動テスト等の種々のパラメーターの研究に基いている。
【０００３】
心疾患の重大さ、またその治療の高コストのため、当該症状の早期診断が、明らかに大いに望まれている。すなわち、当該早期診断により、重度の心不全の症状の急速な進行を回避できる。そのためには、人の心不全の危険の確認が必要とされる。このことはまた、より速く、より簡便で、かつ高価でない治療モニタリングの採用を可能にしている。不幸なことに、十分満足でき、かつ実に参考となる疾患の診断方法は存在しない。
【０００４】
長年に渡り、心不全を予測する症状が起こる前のマーカーが捜し求められてきた。この点に関し、心臓肥大がナトリウム排泄増加活性を有するペプチドを生産し、分泌するという事実が説明されてきた。すなわち、心房性起源のペプチド、ＡＮＰ（atrial natriurenic peptide）が、Bold et al.,Life Science 1981,vol.28(1):89-94により、ラットで発見され、ＢＮＰ（brain natriurenic peptide）と呼ばれる心室起源のナトリウム排泄増加性ペプチドが、Sudoh et al.,Nature 1988,Vol.332:78-81により、豚で、続いてヒトで発見された。
【０００５】
ＢＮＰ前駆体は、前プロＢＮＰ（１−１３４）であり、心臓肥大では分子を前プロＢＮＰ（１−１３４）の形態で貯蔵している。当該前駆体が断されると、シグナルペプチド及びプロＢＮＰ（１−１０８）が放出される。プロＢＮＰ（１−１０８）は、１０８のアミノ酸のポリペプチドからなり、その配列は、
Ｈ1ＰＬＧＳＰＧＳＡＳＤＬＥＴＳＧＬＱＥＱＲＮＨＬＱＧＫＬＳＥＬＱＶＥＱＴＳＬＥＰＬＱＥＳＰＲＰＴＧＶＷＫＳＲＥＶＡＴＥＧＩＲＧＨＲＫＭＶＬＹＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳＧＣＦＧＲＫＭＤＲＩＳＳＳＳＧＬＧＣＫＶＬＲＲＨ108
（配列番号１）である。
【０００６】
プロＢＮＰ（１−１０８）は、分泌前及び／又は分泌中に、アミノ酸Ａｒｇ７６とＳｅｒ７７との間で切断され、まず、ＢＮＰ（７７−１０８）、ＢＮＰ−３２又はＢＮＰ（１−３２）とも言われるＢＮＰ、及びプロホルモンのＮ−末端部分、すなわちプロＢＮＰのＮ−末端フラグメント又はＮＴ−プロＢＮＰとも言われるＢＮＰ（１−７６）になる。
【０００７】
ＢＮＰ又はＢＮＰ（７７−１０８）、すなわち血管に作用する形態の分子は、３２のアミノ酸のペプチドからなり、その配列は、
Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳＧＣＦＧＲＫＭＤＲＩＳＳＳＳＧＬＧＣＫＶＬＲＲＨ108
（配列番号２）である。
【０００８】
ＮＴ−プロＢＮＰ又はＢＮＰ（１−７６）は、次の配列、
Ｈ1ＰＬＧＳＰＧＳＡＳＤＬＥＴＳＧＬＱＥＱＲＮＨＬＱＧＫＬＳＥＬＱＶＥＱＴＳＬＥＰＬＱＥＳＰＲＰＴＧＶＷＫＳＲＥＶＡＴＥＧＩＲＧＨＲＫＭＶＬＹＴＬＲＡＰＲ76
（配列番号３）を構成するプロＢＮＰ（１−１０８）の７６のＮ−末端アミノ酸からなる。
【０００９】
血中のホルホンのＢＮＰ、すなわちＢＮＰ（７７−１０８）は、心室ジストロフィーを示す患者では高値であった。その上、血漿中のＢＮＰ（７７−１０８）のアッセイでは、心室心不全を予測するマーカーとしてＢＮＰ（７７−１０８）の使用を説明してきた。
しかしながら、ホルモンのＢＮＰ（７７−１０８）が比較的不安定であることは良く知られている。その結果として、アッセイには特別の措置が必要である（Davidson, N.C.et al.,Circulation 1995,91:1276；Gobinet-Georges et al.,Clin.Chem.Lab.Med.2000; 38:519-23）。加えて、ＢＮＰの半減期は非常に短く、その血漿濃度はあまり高くない。その結果、心不全の危険においては、人によっては、一定の偽陰性の結果が観察される。従って、ＢＮＰ（７７−１０８）のアッセイは、ＮＹＨＡ分類のステージＩの患者と健常人とを正しく識別することができない（Clerico A.et al.,J.Endocrinol.Invest. 1998;21:170-9；Del Ry S, et al.,Scand.J.Clin.Lab.Invest.2000;60:81-90）。
【００１０】
当該困難を解決するために、特許出願国際公開第９３／２４５３１号パンフレットは、ＢＮＰ（１−７６）（プロＢＮＰのＮ−末端フラグメント）、すなわちＢＮＰ（７７−１０８）ホルモンと比べて長い半減期を有する多数の化合物の検出に基く、心不全のｉｎ ｖｉｔｒｏ診断方法を記載している。しかしながら、当該方法は、出願の国際公開第９３／２４５３１号パンフレットでは、血液試料中のＢＮＰ（１−７６）で実施するのは簡単ではないと考えられると記載している。事実、示した実施例のみがうまくいき、実際の血清では、合成ペプチド、ペプチドＢＮＰ（４７−６４）、ＢＮＰ（１−７６）の配列を使用すると、標準的レンジで得られた。この欠点を克服するには、それ以来、非常に洗練された自動システムが必要であることが判った。
【００１１】
論文Hunt et al.,Biochemical and Biophysical Research Communications, vol.214(3), 1995,pp.1175-1183は、プロＢＮＰ（１−１３）のＮ−末端フラグメントに対する抗血清を含む、心不全に苦しむ患者の血漿を用いるＢＮＰの競争的ＲＩＡアッセイを記述している。当該論文は、心不全患者において、ＢＮＰ（１−７６）の濃度、これはＢＮＰ(７７−１０８)の濃度と非常に良い相関を示すが、この濃度が、コントロールの人に観察される濃度と比べると非常に高いことを、はっきりと示している。
【００１２】
しかしながら、血漿ＢＮＰ（１−７６）のみを特異的に抽出するために記載されたプロトコールは、Ｓｅｐ−ｐａｋ Ｃ１８（登録商標）カートリッジ（Millipore−Waters）上で血漿を抽出した後に、ＨＰＬＣクロマトグラフィーに付す必要があるため、複雑である。その上、当該論文は、このようにして使用されてきたＲＩＡアッセイでは、プロＢＮＰ（１−１０８）は認識できるほど現れてこないことを強調している。このことは、むしろ、プロＢＮＰ（１−１０８）は心臓組織から循環系へ分泌されるが、その後、Ｎ−末端アミノ酸の切断により、非常に早く小さなペプチドに分解していく、ことを示唆している。あるいは、当該論文によれば、プロＢＮＰ（１−１０８）は、抗プロＢＮＰ（１−１０８）抗血清がそれに結合できないように存在している。最後に、ＢＮＰ（１−７６）（プロＢＮＰのＮ−末端フラグメント）は、ＢＮＰ（７７−１０８）よりもあるいはプロＢＮＰのＮ−末端フラグメントよりも、心臓機能障害のより特異的なマーカーであるとさえ示唆している。
【００１３】
論文Karl et al.,Scand.J.Clin.Lab.Invest.,1999,59(Suppl 230):177-181は、特許出願の国際公開第９３／２４５３１号パンフレットの方法と類似した、ＢＮＰ（１−７６）を検出する方法を記述しているが、患者の試料について得られた結果は示していない。
【００１４】
論文Schulz et al.,Scand.J.Clin.Lab.Invest.,2001,vol.61,pp.33-42はまた、ＢＮＰ（１−７６）（プロＢＮＰのＮ−末端フラグメント）に特異的なラジオイムノアッセイ、すなわち、抽出せずに、当該フラグメントのアミノ酸１−２１に対する抗血清を使用するアッセイを記述している。著者は、心室心不全の診断におけるＢＮＰ（１−７６）アッセイの利点と、またＢＮＰ（７７−１０８）のアッセイとの良好な相関関係を確認している。プロＢＮＰ（１−１０８）の種々の循環形態の研究において、著者は、プロＢＮＰ（１−１０８）が、プロホルモンそのものの形及び切断生成物、すなわちＢＮＰ（１−７６）（プロＢＮＰのＮ−末端フラグメント）及びＢＮＰ（７７−１０８）の形で血中を循環するという仮説を提唱した。しかしながら、プロＢＮＰ（１−１８０）の可能性のある生理学的活性及び心室心不全の予測又は診断マーカーとしてのプロＢＮＰ（１−１８０）の診断上の価値については、言及あるいは示唆が全くない。
【００１５】
論文Shimazu et al.,Clinica Chimica Acta,2002,vol.316 pp.129-135は、血中のヒトＢＮＰの分解、及び心不全患者の血漿中の免疫反応性ＢＮＰの循環分子形についての研究を示している。当該研究では、後者の血漿で、２つの免疫反応性ＢＮＰ形、すなわち高分子量ＢＮＰ（３６ＫＤで、これはプロＢＮＰ（１−１８０）のトリマーに対応する）及び低分子量ＢＮＰの存在を観察している。低分子量ＢＮＰは、ホルモンのＢＮＰ−３２（ここでは、ＢＮＰ（１−３２）と言う）のＮ−末端のセリン及びプロリンが欠けたＢＮＰ−３２の分解生成物の形（すなわち、脱ＳｅｒＰｒｏ−ＢＮＰ（ＢＮＰ３−３２））と同時に存在する。
【００１６】
プロＢＮＰ（１−１０８）及びホルモンのＢＮＰ（ＢＮＰ−３２、ＢＮＰ（１−３２）又はＢＮＰ（７７−１０８））は、心臓によって血中へ分泌される。しかしながら、著者は、オリゴマー化された形（トリマー）でのプロＢＮＰ（１−１０８）が循環ＢＮＰ（７７−１０８）の濃度と同様な濃度で存在することを示唆していると思われるが、それを測定はしていない。その結果、プロＢＮＰ（１−１０８）の濃度と患者の臨床症状との相関関係は研究されていない。結果として、プロＢＮＰ（１−１０８）血清の診断的又は予知的価値は、ここでは説明されておらず、低分子量ＢＮＰを慣例的にアッセイできることは示唆もされていない。
【００１７】
更に、プロＢＮＰ（１−１０８）に存在する一定の数のエピトープが知られている。すなわち、出願の国際公開第９７／３２９００号パンフレットのＢＮＰ（７７−１０８）検出の文脈に、ＢＮＰ（７７−１０８）の１０のＮ−末端アミノ酸（ＡＡ １−１０）に対応する配列Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳＧＣ86（配列番号１０５）のエピトープが記載されている。同様に、出願の国際公開第００／３５９５１号パンフレットのＢＮＰ（１−７６）（プロＢＮＰのＮ−末端フラグメント）検出の文脈に、ＢＮＰ（１−７６）（プロＢＮＰのＮ−末端フラグメント）の１２のＣ−末端アミノ酸に対応する配列Ｒ65ＫＭＶＬＹＴＬＲＡＰＲ76（配列番号１０６）のエピトープが記載され、類似した配列Ｈ64ＲＫＭＶＬＹＴＬＲＡＰＲ76（配列暗号１０７）は、出願の国際公開第００／４５１７６号パンフレットに記載されている。
しかしながら、上記文献の中で、当該配列の中間体及びハイブリッドであるエピトープの存在について記述又は示唆する特許出願は存在しない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
それゆえ、心不全の早期診断の状況には、先行技術の欠点を避ける方法の必要性がなお存在する。特に、一般的に使用され、信頼性があり、それ程多くは存在せず、比較的不安定なＢＮＰ（７７−１０８）検出の欠点を回避し、同時に、ＢＮＰの他の分子形をアッセイすることによって招く複合体の抽出を防ぎ、洗練された自動化を必要とする範囲で使用できる簡便な方法が必要である。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
そのため、本発明の著者は、提示された問題を解決するために、別の方法を開発しようとしてきた。本発明の中心には、本発明者によってなされた予期しない発見があり、それは、ヒンジ配列Ｙ70ＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳＧ85（配列番号４）又はプロＢＮＰ（１−１０８）の配列Ｙ70ＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳ84（配列番号１０８）のドメインに位置する特定の性質を有するエピトープであって、少なくとも配列ＲＡＰＲ76Ｓ77Ｐ（配列番号５）を含むエピトープについてである。
【００２０】
事実、ウサギを、プロＢＮＰ（１−１０８）のヒンジ領域、すなわち、配列ＣＹ70ＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳＧ85（配列番号１６）のペプチド、又は配列ＣＹ70ＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳ84（配列番号１０９）のペプチドで免疫すると、驚くべきことに、得られた抗血清は、ＢＮＰ（１−７６）形及びＢＮＰ（７７−１０８）形を実質的に認識せず、ヒンジ領域の前記ペプチドのみを特異的に認識する抗体を含むだけでなく、加えて、循環プロＢＮＰ（１−１０８）を認識する能力を有することを本発明者は発見した。
【００２１】
本願の著者は、最初に、循環プロＢＮＰ（１−１０８）が、心不全を予測する効果的なマーカーであり、健常人よりも心不全患者に著しく高い濃度で存在することも示している。
【００２２】
著者は、当該タイプの抗体の別の取得方は、完全なプロＢＮＰ（１−１０８）分子を用いて動物を免疫することであることも発見している。事実、著者は、完全なプロＢＮＰ（１−１０８）分子で免疫すると、ヒンジ領域の配列を特異的に認識する抗体の出現を誘導できることを見出している。
【００２３】
加えて、本発明の著者は、本発明に従う抗体によって認識される最小エピトープが次の配列ＲＡＰＲ76Ｓ77Ｐを有すると説明している。著者は、本発明の課題である抗体の成功した取得方法が、下記一般式：
ａ1−Ｘ1−ＲＡＰＲＳＰ−Ｘ2−ａ2 （Ｉ）
［式中、
ａ1は、水素原子であるかあるいはチオール、アルコール、アミノキシ、第一アミンもしくは第二アミン官能基、アミノカルボキシル基、ビオチニル基及びアセチル基から選ばれる官能基又は化学基を表し、
Ｘ1は、０〜３のアミノ酸のペプチド配列であって、プロＢＮＰ（１−１０８）の天然配列に由来しても由来しなくてもよい配列を表し、
Ｘ2は、０〜８のアミノ酸、好ましくは０〜７のアミノ酸のペプチド配列であって、プロＢＮＰ（１−１０８）の天然配列に由来しても由来しなくてもよい配列を表し、
ａ2は、ＯＨ官能基、ＮＨ2官能基又はアルコキシ基を表す。］
で表されるペプチドで、動物を免疫することであることも示している。
【００２４】
同様に、本発明の著者は、配列ＲＡＰＲ76Ｓ77Ｐを含むペプチド又は下記式：
Ｘ−Ｙ70ＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳＧ85−Ｚ （ＩＩ）
［式中、Ｘは、水素原子であるか又はアセチル基もしくはプロＢＮＰ（１−１０８）の配列に属さない１〜３のアミノ酸を表し、そして、Ｚは、ＯＨ官能基又はプロＢＮＰ（１−１０８）の配列に属さない１〜３のアミノ酸を表す。］
で表されるペプチドで動物を免疫することにより、同じ特異的な抗体を取得できることを示している。
【００２５】
加えて、本発明の著者は、下記式：
Ｘ−Ｙ70ＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳ84−Ｚ （ＩＩＩ）
［式中、Ｘは、水素原子であるか又はアセチル基もしくはプロＢＮＰ（１−１０８）の配列に属さない１〜３のアミノ酸を表し、そして、Ｚは、ＯＨ官能基又はプロＢＮＰ（１−１０８）の配列に属さない１〜３のアミノ酸を表す。］
で表されるペプチドで動物を免疫することにより、同じ特異的な抗体を取得できることを示している。
【００２６】
本発明の著者はまた、血中の循環プロＢＮＰ（１−１０８）の検出に基く心不全の早期診断として簡便で信頼できる方法、及び循環プロＢＮＰ（１−１０８）の当該検出を実施するためのキットを開発してきた。
【００２７】
従って、本発明の課題は、第一に、プロＢＮＰ（１−１０８）の配列Ｙ70ＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳＧ85を特異的に認識し、ＢＮＰ（１−７６）又はＢＮＰ（７７−１０８）を実質的に認識せず、第二に、ヒト血清又は血漿の試料中の循環プロＢＮＰ（１−１０８）を特異的に認識する能力を有する、ことを特徴とする抗プロＢＮＰ（１−１０８）抗体にある。
【００２８】
本発明の課題は、第一に、プロＢＮＰ（１−１０８）の配列Ｙ70ＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳ84を特異的に認識し、ＢＮＰ（１−７６）又はＢＮＰ（７７−１０８）を実質的に認識せず、第二に、ヒト血清又は血漿の試料中の循環プロＢＮＰ（１−１０８）を特異的に認識する能力を有する、ことを特徴とする抗プロＢＮＰ（１−１０８）抗体にもある。
【００２９】
本発明の課題は、特に、第一に、プロＢＮＰ（１−１０８）の配列ＰＡＰＲ76Ｓ77Ｐを特異的に認識し、ＢＮＰ（１−７６）又はＢＮＰ（７７−１０８）を実質的に認識せず、第二に、ヒト血清又は血漿の試料中の循環プロＢＮＰ（１−１０８）を特異的に認識する能力を有する、ことを特徴とする抗プロＢＮＰ（１−１０８）抗体にもある。
【００３０】
本発明の課題は、ＢＮＰ（１−７６）及びＢＮＰ（７７−１０８）を実質的に除き、プロＢＮＰ（１−１０８）の配列Ｙ70ＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳＧ85、配列Ｙ70ＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳ84及び／又は前記配列ＲＡＰＲ76Ｓ77Ｐを特異的に認識し、ヒト血清試料又は血漿試料中の循環プロＢＮＰ（１−１０８）を特異的に認識する能力を有する抗プロＢＮＰ（１−１０８）抗体を取得するための方法であって、動物をプロＢＮＰ（１−１０８）分子の全体で免疫し、ＢＮＰ（７７−１０８）ペプチド及び／又はＢＮＰ（１−７６）ペプチドを用いて、得られた抗血清を除去する方法にもある。
【００３１】
所定の特異性抗原（免疫抗原）に対して得られる「抗血清の除去」という表現は、上記抗血清を、「非特異性抗原」、すなわち免疫抗原とは異なる抗原に接触させ、インキュベートし、次いで、上記「非特異性抗原」と反応した抗体を免疫学的に分離、除去し、このように除去（すなわち、非特異性抗体の除去）された抗血清を回収することによって、当該血清中に潜在的に存在する非特異的抗体の除去を意味しようとするものである。当該除去は、慣用的に、特定の抗原に対する特異的抗血清を提供するために役立つ。
【００３２】
本発明の場合、プロＢＮＰ（１−１０８）の配列Ｙ70ＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳＧ85及び／又は配列Ｙ70ＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳ84又は配列ＲＡＰＲ76Ｓ77Ｐを認識する抗血清は、上記ＢＮＰ（７７−１０８）及び／又はＢＮＰ（１−７６）と接触させることにより、除去できる、すなわち、特異性を発現できる。例えば、後者については、固相に固定でき、当業者に知られた従来の技術に従う免疫吸着によるクロマトグラフィー用支持体として役立てることができる。
【００３３】
本発明の課題は、下記式：
ａ1−Ｘ1−ＲＡＰＲＳＰ−Ｘ2−ａ2 （Ｉ）
［式中、
ａ1は、水素原子であるかあるいはチオール、アルコール、アミノキシ、第一アミンもしくは第二アミン官能基、アミノカルボキシル基、ビオチニル基及びアセチル基から選ばれる官能基又は化学基を表し、
Ｘ1は、０〜３のアミノ酸のペプチド配列であって、プロＢＮＰ（１−１０８）の天然配列に由来しても由来しなくてもよい配列を表し、
Ｘ2は、０〜７のアミノ酸のペプチド配列であって、プロＢＮＰ（１−１０８）の天然配列に由来しても由来しなくてもよい配列を表し、
ａ2は、ＯＨ官能基、ＮＨ2官能基又はアルコキシ基を表す。］
で表されるペプチドにもある。
【００３４】
本発明の課題は、下記式：
Ｘ−Ｙ70ＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳＧ85−Ｚ （ＩＩ）
［式中、Ｘは、水素原子であるか又はアセチル基もしくはプロＢＮＰ（１−１０８）の配列に属さない１〜３のアミノ酸を表し、そして、Ｚは、ＯＨ官能基又はプロＢＮＰ（１−１０８）の配列に属さない１〜３のアミノ酸を表す。］
で表されるペプチドにもある。
【００３５】
本発明の課題は、下記式：
Ｘ−Ｙ70ＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳ84−Ｚ （ＩＩＩ）
［式中、Ｘは、水素原子であるか又はアセチル基もしくはプロＢＮＰ（１−１０８）の配列に属さない１〜３のアミノ酸を表し、そして、Ｚは、ＯＨ官能基又はプロＢＮＰ（１−１０８）の配列に属さない１〜３のアミノ酸を表す。］
で表されるペプチドにもある。
【００３６】
上記式（Ｉ）及び（ＩＩ）において、アミノ酸の数（Ｙ70、Ｒ76、Ｓ77、Ｓ84又はＧ85）が、本発明の理解、及びプロＢＮＰ（１−１０８）配列に関する式（Ｉ）と（ＩＩ）の配列の位置づけに役立つように自然に維持されていたことは注目に値すべきである。本願中の他の配列に関する数についても同じことが当てはまる。
【００３７】
本発明は、配列Ｘ−Ｙ70ＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳＧ85−Ｚ（ＩＩ）、又は配列Ｘ−Ｙ70ＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳ84−Ｚ（ＩＩＩ）、あるいは部分ＲＡＰＲ76Ｓ77Ｐをそのまま維持（特に非置換）する条件下で、位置７０のアミノ酸の内の一つを位置８５又は８４に伝統的に又は非伝統的に置換した形での上述の配列（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）の内の一つをそれぞれ含むペプチドにも関する。
【００３８】
従って、本発明は、アミノ酸Ｙ70、Ｔ71、Ｌ72、Ｋ79、Ｍ80、Ｖ81、Ｑ82、Ｇ83、Ｓ84及びＧ85の内の１以上のアミノ酸で置換された配列Ｘ−Ｙ70ＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳＧ85−Ｚ（ＩＩ）又は配列Ｘ−Ｙ70ＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳ84−Ｚ（ＩＩＩ）であって、Ｘがないか又はアセチル基もしくはプロＢＮＰ（１−１０８）の配列に属さない１〜３のアミノ酸を表し、そして、Ｚがないか又はＯＨ官能基もしくはプロＢＮＰ（１−１０８）の配列に属さない１〜３のアミノ酸であり得る配列に由来する配列を含むペプチドである。
【００３９】
最後に、本発明は、配列Ｙ70ＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳＧ85のペプチド及び配列Ｙ70ＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳ84のペプチドに関する。
【００４０】
本発明の課題は、ＢＮＰ（１−７６）及びＢＮＰ（７７−１０８）を実質的に除き、プロＢＮＰ（１−１０８）の配列Ｙ70ＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳＧ85、配列Ｙ70ＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳ84及び／又は配列ＲＡＰＲ76Ｓ77Ｐを特異的に認識し、ヒト血清試料又は血漿試料中の循環プロＢＮＰ（１−１０８）を特異的に認識する能力を有する抗プロＢＮＰ（１−１０８）抗体を取得するための方法であって、下記式：
ａ1−Ｘ1−ＲＡＰＲＳＰ−Ｘ2−ａ2 （Ｉ）
［式中、ａ1、Ｘ1、Ｘ2及びａ2は、前記と同じ意味である。］
で表されるペプチドで動物を免疫し、場合により、ＢＮＰ（７７−１０８）ペプチド及び／又はＢＮＰ（１−７６）ペプチドを用いて、得られた抗血清を除くことを特徴とする方法にもある。このようにして得られた抗体は、単一特異的な抗体である。
【００４１】
本発明の課題は、ＢＮＰ（１−７６）及びＢＮＰ（７７−１０８）を実質的に除き、プロＢＮＰ（１−１０８）の配列Ｙ70ＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳＧ85、配列Ｙ70ＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳ84及び／又は配列ＲＡＰＲ76Ｓ77Ｐを特異的に認識し、ヒト血清試料又は血漿試料中の循環プロＢＮＰ（１−１０８）を特異的に認識する能力を有する抗プロＢＮＰ（１−１０８）抗体を取得するための方法であって、
下記式：
Ｘ−Ｙ70ＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳＧ85−Ｚ （ＩＩ）
又は下記式：
Ｘ−Ｙ70ＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳ84−Ｚ （ＩＩＩ）
［式中、Ｘ及びＺは、前記で定義したとおりである。］
で表されるペプチドで動物を免疫し、場合により、ＢＮＰ（７７−１０８）ペプチド及び／又はＢＮＰ（１−７６）ペプチドを用いて、得られる抗血清を除くことを特徴とする方法にもある。
【００４２】
本発明の課題は、ＢＮＰ（１−７６）及びＢＮＰ（７７−１０８）を実質的に除き、プロＢＮＰ（１−１０８）の配列Ｙ70ＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳＧ85、配列Ｙ70ＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳ84及び／又は配列ＲＡＰＲ76Ｓ77Ｐを特異的に認識し、ヒト血清試料又は血漿試料中の循環するプロＢＮＰ（１−１０８）を特異的に認識する能力を有する抗プロＢＮＰ（１−１０８）抗体を分泌するハイブリドーマを取得するための方法であって、
下記式：
Ｘ−Ｙ70ＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳＧ85−Ｚ （ＩＩ）
又は下記式：
Ｘ−Ｙ70ＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳ84−Ｚ （ＩＩＩ）
［式中、Ｘ及びＺは、前記で定義したとおりである。］
の部分ＲＡＰＲ76Ｓ77Ｐをそのまま維持（特に非置換）する条件下で、伝統的に又は非伝統的に置換された形でのペプチドで動物を免疫し、場合により、ＢＮＰ（７７−１０８）ペプチド及び／又はＢＮＰ（１−７６）ペプチドを用いて、得られた抗血清を除くことを特徴とする方法にもある。
【００４３】
本発明の課題は、ＢＮＰ（１−７６）ペプチド及びＢＮＰ（７７−１０８）ペプチドを実質的に除き、プロＢＮＰ（１−１０８）の配列Ｙ70ＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳＧ85、配列Ｙ70ＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳ84及び／又は配列ＲＡＰＲ76Ｓ77Ｐを特異的に認識し、ヒト血清試料又は血漿試料中の循環プロＢＮＰ（１−１０８）を特異的に認識する能力を有する抗プロＢＮＰ（１−１０８）抗体を取得するための方法であって、配列Ｙ70ＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳＧ85のペプチド又は配列Ｙ70ＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳ84のペプチドで動物を免疫し、場合により、ＢＮＰ（７７−１０８）ペプチド及び／又はＢＮＰ（１−７６）ペプチドを用いて、得られた抗血清を除くことを特徴とする方法にもある。
【００４４】
本発明の課題は、ＢＮＰ（１−７６）及びＢＮＰ（７７−１０８）を実質的に除き、プロＢＮＰ（１−１０８）の配列Ｙ70ＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳＧ85、配列Ｙ70ＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳ84及び／又は配列ＲＡＰＲ76Ｓ77Ｐを特異的に認識し、ヒト血清試料又は血漿試料中の循環するプロＢＮＰ（１−１０８）を特異的に認識する能力を有する抗プロＢＮＰ（１−１０８）抗体を分泌するハイブリドーマを取得するための方法であって、
次式：
ａ1−Ｘ1−ＲＡＰＲＳＰ−Ｘ2−ａ2 （Ｉ）
［式中、ａ1、Ｘ1、Ｘ2及びａ2は上記と同じ意味である。］；
Ｘ−Ｙ70ＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳＧ85−Ｚ （ＩＩ）
［式中、Ｘ及びＺは上記と同じ意味である。］；
Ｘ−Ｙ70ＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳ84−Ｚ （ＩＩＩ）
［式中、Ｘ及びＺは上記と同じ意味である。］；
部分ＲＡＰＲ76Ｓ77Ｐをそのまま維持（特に非置換）する条件下で、伝統的に又は非伝統的に置換された形での
Ｘ−Ｙ70ＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳＧ85−Ｚ （ＩＩ）
［式中、Ｘ及びＺは上記と同じ意味である。］；
部分ＲＡＰＲ76Ｓ77Ｐをそのまま維持（特に非置換）する条件下で、伝統的に又は非伝統的に置換された形での
Ｘ−Ｙ70ＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳ84−Ｚ （ＩＩＩ）
［式中、Ｘ及びＺは上記と同じ意味である。］；
Ｙ70ＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳＧ85；及び
Ｙ70ＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳ84
のペプチドから選ばれるペプチドで動物を免疫し、
イムノグロブリン分泌リンパ球を当該動物から採取し、次いで、
当該リンパ球をミエローマ細胞と融合して、少なくとも一種のイムノグロブリン分泌ハイブリドーマを得る、
ことを特徴とする方法にもある。
【００４５】
上記の方法は、ハイブリドーマ取得の慣用的な技術、すなわちKohler and Milstein,(1975) Nature(London),256:495-497に記載された原理に対応する。
【００４６】
本発明の課題は、このようなハイブリドーマ及び上記ハイブリドーマによって分泌されるモノクローナル抗プロＢＮＰ（１−１０８）抗体にもある。
【００４７】
本発明の課題は、生物学的試料、好ましくは血液、血漿又は血清を、ＢＮＰ（１−７６）及びＢＮＰ（７７−１０８）を実質的に除き、プロＢＮＰ（１−１０８）の配列Ｙ70ＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳＧ85、配列Ｙ70ＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳ84及び／又は配列ＲＡＰＲ76Ｓ77Ｐを特異的に認識し、ヒト血清試料又は血漿試料中の循環プロＢＮＰ（１−１０８）を特異的に認識する能力を有する抗プロＢＮＰ（１−１０８）抗体に接触させること、並びに試料中のプロＢＮＰ（１−１０８）を検出することを含む、ヒトの心不全のｉｎ ｖｉｔｒｏ診断の方法にもある。
【００４８】
本発明は、一般的に、ヒトの心不全のｉｎ ｖｉｔｒｏ診断方法であって、
ａ）生物学的試料、好ましくは血液、血漿又は血清を、ＢＮＰ（１−７６）及びＢＮＰ（７７−１０８）を実質的に除き、プロＢＮＰ（１−１０８）の配列Ｙ70ＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳＧ85、配列Ｙ70ＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳ84及び／又は配列ＲＡＰＲ76Ｓ77Ｐを特異的に認識し、ヒト血清試料又は血漿試料中の循環プロＢＮＰ（１−１０８）を特異的に認識する能力を有する抗プロＢＮＰ（１−１０８）抗体に接触させること、
ｂ）抗原抗体複合体の形成を可能にする条件下で、当該混合物をインキュベートすること、及び
ｃ）場合により、一次複合体中に存在するプロＢＮＰ（１−１０８）に特異的に結合できる標識検出抗体を用いるか、又は一次複合体中に存在する上記プロＢＮＰ（１−１０８）に対する抗体に結合できる標識検出抗原を用いるかして、形成された抗原抗体複合体を明らかにすること、
を含む方法を提供する。
【００４９】
特に、本発明は、上述のステップａ、ｂ及びｃに加えて、明らかにされた抗原抗体複合体の量を、人の臨床症状と相関させるためのステップｄ）を含む、ヒトの心不全のｉｎ ｖｉｔｒｏ診断方法を提供する。
【００５０】
本発明の課題は、生物学的な試料、特に血液、血漿又は血清の試料中のプロＢＮＰ（１−１０８）を検出するためのキットであって、ＢＮＰ（１−７６）及びＢＮＰ（７７−１０８）を実質的に除き、プロＢＮＰ（１−１０８）の配列Ｙ70ＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳＧ85、配列Ｙ70ＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳ84及び／又は配列ＲＡＰＲ76Ｓ77Ｐを特異的に認識し、ヒト血清試料又は血漿試料中の循環プロＢＮＰ（１−１０８）を特異的に認識する能力を有する、少なくとも一つの抗プロＢＮＰ（１−１０８）抗体を含むキットでもある。
【００５１】
最後に、本発明は、生物学的な試料、特に血液、血漿又は血清の試料中のプロＢＮＰ（１−１０８）を検出するためのキットであって
次式：
ａ1−Ｘ1−ＲＡＰＲＳＰ−Ｘ2−ａ2 （Ｉ）
［式中、ａ1、Ｘ1、Ｘ2及びａ2は上記と同じ意味である。］；
Ｘ−Ｙ70ＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳＧ85−Ｚ （ＩＩ）
［式中、Ｘ及びＺは上記と同じ意味である。］；
部分ＲＡＰＲ76Ｓ77Ｐをそのまま維持（特に非置換）する条件下で、伝統的に又は非伝統的に置換された形での
Ｘ−Ｙ70ＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳＧ85−Ｚ （ＩＩ）
［式中、Ｘ及びＺは上記と同じ意味である。］；
部分ＲＡＰＲ76Ｓ77Ｐをそのまま維持（特に非置換）する条件下で、伝統的に又は非伝統的に置換された形での
Ｘ−Ｙ70ＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳ84−Ｚ （ＩＩＩ）
［式中、Ｘ及びＺは上記と同じ意味である。］；
Ｙ70ＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳＧ85；及び
Ｙ70ＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳ84
のペプチドの群より選ばれる少なくとも一つのペプチドを含む化合物を、スタンダード及び／又はコントロールとして含むキットに関する。
【００５２】
＜定義＞
本発明の文脈において、「生物学的試料」又は「生物学的に流動性の試料」は、好ましくは、血液、血漿、血清、尿、濃脊髄液、唾液等の生物学的液体からなる。
【００５３】
「心不全」の用語は、心臓機能の異常が、器官の代謝要求を満足する程に十分に心臓が血液を送れないことに起因する、及び／又は、心臓が、異常な高充填圧力を除いて、当該要求を満たしていない、病状を意味することを意図している。特に、右及び／又は左の心不全である。
【００５４】
「抗体」の用語は、完全な抗体又は抗体の機能的フラグメント（遺伝子工学によって得られるものでも又は得られないものでもよい）であって、前記抗体を、少なくとも一つの抗原結合サイトにおいて、抗原性化合物の少なくとも一つの抗原決定部に結合させることを含む、あるいは結合させることからなるものを言う。
抗体フラグメントの例を挙げれば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’と（Ｆａｂ‘）２フラグメント、及び１本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ鎖）である。
【００５５】
本発明による抗プロＢＮＰ（１−１０８）抗体は、ポリクローナ抗体でも又はモノクローナル抗体でもよい。本発明に従うポリクローナル抗プロＢＮＰ（１−１０８）抗体は、特に、ウサギ、マウス等の動物をプロＢＮＰ（１−１０８）全体を使って免疫し、得られる抗血清を採取し、そしてそれを、例えばＢＮＰ（７７−１０８）及び／又はＢＮＰ（１−７６）を含む免疫吸着剤上で、それ自体当業者に知られた方法に従って除去することによって得られる。本発明に従うモノクローナル抗プロＢＮＰ（１−１０８）抗体は、特に、Kohler and Milstein(Nature(London),256:495-497(1975)の慣用的な方法によって得られる。
【００５６】
モノクローナル抗体又は単一特異的ポリクローナル血清、あるいは遺伝子ライブラリーをスクリーニングすることによって得られる抗体の製造は、本発明の文脈では有用であり、後に詳述する慣用的技術によってなされる。
【００５７】
「抗体捕獲」の用語は、抗体又は一部分の抗体、好ましくは固相に結合した抗体であって、生物学的試料中に存在するプロＢＮＰ（１−１０８）抗原を親和性結合によって保持できるものを意味する意図である。
【００５８】
生物学的試料中の抗原の存在は、「検出手段」によって明らかになる。抗原の検出に関して、少なくとも一つの「検出用抗体」を用いる特定の検出を想定している。かかる検出用抗体は、標識されており、親和性結合によって、捕獲された抗原に結合することができ、また捕獲抗体によって認識されるエピトープ部位とは異なったエピトープ部位を認識することができる。
【００５９】
「標識された」の用語は、直接標識（酵素、放射性同位体、蛍光色素、発光性化合物等の手段）及び非直接標識（例えばそれ自体が直接標識された抗体の手段、又は、限定されないが、標識アビジン−ビオチンペア等の標識「親和性ペア」の試薬を使用する手段）の両方を言う。
【００６０】
「抗原性フラグメント」の用語は、免疫された動物中に、プロＢＮＰ（１−１０８）のみに実質的に特異的な抗体の合成を誘導することができる、プロＢＮＰ（１−１０８）の部分を意味する意図である。
【００６１】
本発明によれば、「抗原性フラグメント」は、少なくとも「エピトープサイト」又はエピトープＲＡＰＲ76Ｓ77Ｐを含む。「エピトープサイト」又は「エピトープ」は、少なくとも一つの抗体によって認識され、その特異的結合をつくるアミノ酸の配列である。
【００６２】
「単一特異的ポリクローナル抗体」の用語は、一つのエピトープに特異性を有するポリクローナル抗体について使用する。これは、抗体が、当該エピトープを含むアミノ酸を含有するプロＢＮＰ（１−１０８）配列のアミノ酸配列に結合できるが、当該エピトープを含むアミノ酸を含有しない配列プロＢＮＰ（１−１０８）のアミノ酸配列には結合できないことを意味する。
【００６３】
「特異的に」の用語は、抗原に対する抗体の認識又は特異的結合について言う場合には、抗体が、他の抗原とは実質的に相互作用することなく、当該抗原と相互作用することを意味し、あるいはエピトープについて「特異的」認識と言う場合には、当該エピトープの事実上唯一の認識を意味する。会合定数は、１０8Ｌ.ｍｏｌ-1よりも大きいことが好ましい。
【００６４】
「保守的置換」の用語は、特に、ある類のアミノ酸を同じ類のアミノ酸に置換することであって、その置換は、得られるペプチドの免疫反応性を、もとのペプチドの免疫反応性に比べて著しくは変化させないことを意味する意図である。種々のアミノ酸の類の中では、極性側鎖を有するアミノ酸（アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン及びチロシン等）非極性側鎖を有するアミノ酸（グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン及びシステイン等）、塩基性側鎖を有するアミノ酸（リジン、アルギニン及びヒスチジン等）及び酸性側鎖を有するアミノ酸（アスパラギン酸、グルタミン酸等）に一般的に分類される。
【００６５】
「非伝統的な置換」の用語は、もとのペプチドの免疫反応性に比較して、得られるペプチドの免疫反応性を実質的に変化させない他のタイプの置換を意味する意図である。
【００６６】
「ＢＮＰ（１−７６）又はＢＮＰ（７７−１０８）を実質的に認識しない」の用語は、本発明による標的抗体が、２０％未満、特に１０％未満、好ましくは５％未満のＢＮＰ（１−７６）又はＢＮＰ（７７−１０８）と交差反応を示すことを意味する意図である。交差反応の割合は、それ自体当業者に知られた方法、例えば実施齢５に例示した方法に従って決定される。
【００６７】
ＢＮＰ（１−７６）又はＢＮＰ（７７−１０８）ペプチドの「実質的な」非認識は、本発明の抗体と当該ペプチドとの反応が存在しない、又は実質的に存在しないことに相当する。
【００６８】
「ＢＮＰ（１−７６）又はＢＮＰ（７７−１０８）を実質的に除き」の用語は、抗体が、上記に意味において、「実質的にＢＮＰ（１−７６）又はＢＮＰ（７７−１０８）を認識しない」ことを意味する意図である。
【発明の効果】
【００６９】
本発明により、ヒトプロＢＮＰ（１−１０８）のヒンジ領域に位置する新規なエピトープ、ＲＡＰＲ76Ｓ77Ｐを発見し、それを含む免疫原性ペプチドを得、更に、ＢＮＰ（１−７６）及びＢＮＰ（７７−１０８）を実質的に認識しないプロＢＮＰ（１−１０８）に特異的な抗体であって、その中の、ヒト血清又は血漿試料中の循環プロＢＮＰ（１−１０８）を特異的に認識する能力を有する抗体を取得できた、ことは開示の全体から明らかである。
【００７０】
本発明により、心不全を簡便に、一般的にかつ確実に診断することを可能にする循環プロＢＮＰ（１−１０８）ためのアッセイを開発することができたことも明らかである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００７１】
＜特異的抗体の製造＞
本発明で使用する抗体は、抗原特異性抗体であり、それゆえ、モノクローナル抗体又は単一特異的ポリクローナル抗体、すなわち一つのエピトープのみを特異的に認識する抗体である。
【００７２】
モノクローナル抗体は、Kohler and Milstein,Nature,1975,256:495-497によって説明されているリンパ球融合及びハイブリドーマ培養の慣用的方法によって取得できる。他のモノクローナル抗体の製造方法は（Harlow et al.,ed.,1988「抗生物質：研究室マニュアル」）でも知られている。モノクローナル抗体は、哺乳類（例えばマウス、ラット、ウサギ、ヒト等）を免疫し、リンパ球融合技術を用いて、ハイブリドーマを樹立することにより製造できる（Kohler and Milstein,1975）。
【００７３】
当該一般的な技術にとって換わる技術がある。例えば、ハイブリドーマからクローニングした核酸を発現することによってモノクローナル抗体を製造することができる。ファージ表示技術、すなわち、通常、線状ファージであって、当該ファージの表面にＶ遺伝子ライブラリーを与えるベクターにｃＤＮＡを導入することによって、モノクローナル抗体を製造することもできる（例えば大腸菌についてｆｕＳＥ５,J.K.Scott and G.P.Smith,Science,1990,249:386-390）。当該抗体ライブラリーを構築するためのプロトコールは、Marks et al.,1991,J.Mol.Biol,222:581-597に記載されている。
【００７４】
ポリクローナル抗体は、通常の手段に従い、本来ペプチドである抗原に免疫にした動物の血清から取得できる。このようにして得られたポリクローナル抗体は、必要ならば、それ自体当業者に知られた技術、例えばカラム免疫吸着剤に従い、ＢＮＰ（７７−１０８）及びＢＮＰ（１−７６）で除去することにより、配列Ｙ70ＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳＧ85、配列Ｙ70ＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳ84及び／又はＲＡＰＲ76Ｓ77Ｐを含むペプチドに対する単一特異性を発現し、実質的にＢＮＰ（１−７６）及びＢＮＰ（７７−１０８）を除き、プロＢＮＰ（１−１０８）についての特異性を確実にする。
【００７５】
＜捕獲抗体及び／又は検出抗体＞
サンドウィッチ技術では、捕獲抗体は、患者の天然抗原上のエピトープを特異的に認識するものを選択する。一方、検出抗体は、患者の天然抗原上の別のエピトープを特異的に認識するものを選択し、これは必ずしも好ましいことではない。
【００７６】
生物学的試料は、前段階で場合により処理し、検出するエピトープの露出を促進する条件下で、少なくとも一つの捕獲抗体と共に直接使用することができる。
【００７７】
本発明に従う診断方法は、当業者によく知られた種々のフォーマット、すなわち、固相又は均一相で、１段階又は２段階で、サンドウィッチ法又は競合法など限定されない例により実施できる。
【００７８】
好ましい具体例によれば、捕獲抗体は、固相上で免疫する。限定されない固相の例としては、マイクロプレート、特にDynal又はMerck-Eurolab（フランス）により市販されているポリスチレンマイクロプレートを使用してもよい。Dynal又はMerck-Eurolab（フランス）（登録商標はＥｓｔａｐｏｒ）によって提供される固相粒子もしくは固相ビーズ、常磁性ビーズ又はポリスチレンもしくはプロピレン試験管なども使用できる。
【００７９】
２つの抗体のサンドウィッチ（捕獲抗体及び検出抗体）等のイムノアッセイフォーマットは、生物学的試料中の抗原の検出に特に有利である。競合によって抗原を検出するイムノアッセイフォーマットも使用できる。他のイムノアッセイ様式もまた想定でき、当業者によく知られている。
【００８０】
ＥＬＩＳＡアッセイ、放射性免疫アッセイ又は他の検出技術は、形成した抗原抗体複合体の存在を明らかにするのに使用できる。
【００８１】
＜キット＞
本発明の方法に従う生物学的流動性試料中のプロＢＮＰ（１−１０８）の検出に使用するキット及び試薬は、多数の生物学的試料に簡便で適用可能である本発明の実施に提供できる。
【００８２】
生物学的試料中のプロＢＮＰ（１−１０８）の検出キットは、上で定義した少なくとも一つの抗体を含んでもよい。上で定義した式（Ｉ）もしくは（ＩＩ）のペプチド又は置換ペプチドの少なくとも一つを、スタンダード及び／又はコントロールとして含む他のキットも、本発明の実施に有用である。
【００８３】
そこで、別の特別な本発明の課題は、生物学的流動性試料中のプロＢＮＰ（１−１０８）を検出するキットである。このキットは、ＢＮＰ（１−７６）及びＢＮＰ（７７−１０８）を実質的に除き、プロＢＮＰ（１−１０８）の配列Ｙ70ＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳＧ85、配列Ｙ70ＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳ84及び／又は配列ＲＡＰＲ76Ｓ77Ｐを特異的に認識し、ヒト血清試料又は血漿試料中の循環プロＢＮＰ（１−１０８）を特異的に認識する能力を有する、少なくとも一つの抗プロＢＮＰ（１−１０８）抗体であって、好ましくは、前記生物学的試料中に存在する前記プロＢＮＰ（１−１０８）を捕獲するための抗体、並びに形成する抗原抗体複合体に特異的に結合できる標識コンジュゲート、を含む。
【００８４】
上述のように、捕獲抗体は、有利なことに、マイクロプレート、これに限定されるものではないが、のような固相上に固定化した形態で提供される。
【００８５】
好ましいキットは少なくとも、ＢＮＰ（１−７６）及びＢＮＰ（７７−１０８）を実質的に除き、プロＢＮＰ（１−１０８）の配列Ｙ70ＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳＧ85、配列Ｙ70ＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳ84及び／又は配列ＲＡＰＲ76Ｓ77Ｐを特異的に認識し、ヒト血清試料又は血漿試料中の循環プロＢＮＰ（１−１０８）を特異的に認識する能力を有する、抗プロＢＮＰ（１−１０８）捕獲抗体であって、固相上に固定されている抗体；並びにプロＢＮＰ（１−１０８）の別のエピトープであって、そのままのエピトープに対する標識検出抗体；あるいは、場合により、プロＢＮＰ（１−１０８）ペプチド又はプロＢＮＰ（１−１０８）そのものである標識検出抗原を含む。
【００８６】
特定の具体例によれば、生物学的試料中のプロＢＮＰ（１−１０８）を検出するためのキットは、一つの容器には、上で定義した少なくとも一つの抗体；並びにもう一つの容器には、スタンダード及び／又はコントロールとして特に有用である上で定義した少なくとも一つのペプチドを含んでもよい。
【００８７】
以下の図及び実施例は本発明を説明するものであるが、範囲を限定するものではない。
【実施例１】
【００８８】
実施例１：免疫用のペプチドの合成
合成ペプシドは、当業者によく知られた技術によって製造できる。例を挙げれば、簡単に実施できるという利点を有するメリフィールド型の合成によって製造できる（Merrifield,（1963）；R.C.Sheppard(1971)；Atherton et al.(1989)）。自動合成装置として、ミリポア（Millipore）の「９０５０プラス・ペップ・シンセザイザー」、パースペクティブ(Perspective)の「パイオニア」シンセサイザイー又はＡＢＩの「４３３Ａ」シンセサイザイーが使用できる。ペプチドは、均一相合成によっても得られる。
【００８９】
ここでの合成は、「Ｆｍｏｃ」（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル）化学を使ってパイオニアシンセサイザイーで行った。各ステップでは、試薬[すなわち、保護アミノ酸及びカップリング活性化剤（ＴＢＴＵ(２−(１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル)−１，１，３，３−テトラメチル−ウロニウム）]を大過剰に（試薬のモル／樹脂上の置換可能な基のモルの比５で）加えた。合成の最後には、ペプチドは、トリフルオロ酢酸系溶液（試薬Ｋ）で樹脂から分離した。このペプチドは、冷エーテル溶液で沈殿させ、そしてＨＰＬＣで精製した。
【００９０】
本発明者は、ヒンジ領域Ｒ76Ｓ77のアミノ酸配列を含む以下のペプチドを合成した。
配列番号６：Ｃ−Ｇ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ
配列番号７：アセチル−Ｃ−Ｇ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ
配列番号８：Ｃ−Ｇ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ｋ
配列番号９：アセチル−Ｃ−Ｇ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ｋ
配列番号１０：Ｃ−Ｇ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ｋ−Ｍ−Ｖ
配列番号１１：Ｃ−Ｇ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ｋ−Ｍ−Ｖ−Ｑ−Ｇ−Ｓ−Ｇ
配列番号１２：Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ｇ−Ｃ
配列番号１３：アセチル−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ｇ−Ｃ
配列番号１４：アセチル−Ｃ−Ｙ−Ｔ−Ｌ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ｋ
配列番号１５：Ｃ−Ｈ−Ｒ−Ｋ−Ｍ−Ｖ−Ｌ−Ｙ−Ｔ−Ｌ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ｋ
配列番号１６：Ｃ−Ｙ−Ｔ−Ｌ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ｋ−Ｍ−Ｖ−Ｑ−Ｇ−Ｓ−Ｇ（ペプチドＣ１３Ｐ３０）
配列番号１７：Ｃ−Ｆ−Ｔ−Ｌ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ｋ−Ｍ−Ｖ−Ｑ−Ｇ−Ｓ−Ｇ
配列番号１８：Ｃ−Ｆ−Ｓ−Ｉ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ｋ−Ｍ−Ｖ−Ｑ−Ｇ−Ｓ−Ｇ
配列番号１９：Ｃ−Ｙ−Ｔ−Ｌ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ｋ−Ｍ−Ｖ−Ｑ−Ｇ−Ｓ−βＡ
配列番号２０：Ｃ−Ｙ−Ｔ−Ｌ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ｋ−Ｍ−Ｖ−Ｑ−Ａ−Ｔ−βＡ
配列番号２１：Ｃ−Ｆ−Ｓ−Ｉ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ｋ−Ｍ−Ｖ−Ｑ−Ａ−Ｔ−βＡ
配列番号２２：Ｃ−Ｆ−Ｓ−Ｉ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ｓ−Ｇ−Ｔ−Ａ
及び
配列番号１０９：Ｃ−Ｙ−Ｔ−Ｌ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ｋ−Ｍ−Ｖ−Ｑ−Ｇ−Ｓ（ペプチドＣＮ３２）
配列番号１１０：Ｃ−Ｙ−Ｔ−Ｌ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ｋ
配列番号１１１：Ｃ−Ｙ−Ｔ−Ｌ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ｋ−Ｍ−Ｖ
配列番号１１２：Ｃ−Ｙ−Ｔ−Ｌ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ｋ−Ｍ−Ｖ−Ｑ
配列番号１１３：Ｃ−Ｙ−Ｔ−Ｌ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ｋ−Ｍ−Ｖ−Ｑ−Ｇ
配列番号１１４：アセチル−Ｃ−Ｔ−Ｌ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ｋ−Ｍ−Ｖ−Ｑ
配列番号１１５：Ｃ−Ｔ−Ｌ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ｋ−Ｍ−Ｖ−Ｑ−Ｇ
配列番号１１６：Ｃ−Ｔ−Ｌ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ｋ−Ｍ−Ｖ−Ｑ−Ｇ−Ｓ
配列番号１１７：Ｃ−Ｔ−Ｌ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ｋ−Ｍ−Ｖ−Ｑ−Ｇ−Ｓ−Ｇ
配列番号１１８：Ｃ−Ｌ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ｋ−Ｍ−Ｖ
配列番号１１９：Ｃ−Ｌ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ｋ−Ｍ−Ｖ−Ｑ
配列番号１２０：Ｌ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ｋ−Ｍ−Ｖ−Ｑ−Ｃ
配列番号１２１：Ｃ−Ｌ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ｋ−Ｍ−Ｖ−Ｑ−Ｇ−Ｓ
配列番号１２２：Ｃ−Ｌ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ｋ−Ｍ−Ｖ−Ｑ−Ｇ−Ｓ−Ｇ
注：βＡはβ−アラニンを意味する。
【００９１】
実施例２：免疫用の担体蛋白質へのペプチドの結合
ペプチドは、ペプチドの免疫原性を高めるために、種々の機能（チオール、アミン、アルデヒド等）によって、担体蛋白質、ＫＬＨ（Keyhole Limpet Hemocyanin）、チログロブリン、ＢＳＡ（牛胎児血清）に結合した。ペプチドを蛋白質に結合させるために使用するカップリング剤は、ヘテロ二官能性又はホモ二官能性である。最も一般的に使用される試薬は、ＢＳ３、ｓＳＭＣＣ、ＳＰＤＰ、グルタールアルデヒド等である。使用するカップリング技術の一つは、化学カップリング剤としてグルタールアルデヒド、担体蛋白質としてＫＬＨを用いる技術である。ＫＬＨのペプチドへの結合は、ペプチドのアミン機能を使用して行った（主にリジンによるＮ−末端基及びアミノ基）。
【００９２】
配列ＹＴＬＲＡＰＲＳＰＫＭＶＱＧＳＧ−ＮＨ2（配列番号１６）のペプチドＣ１３Ｐ３０又は配列ＹＴＬＲＡＰＲＳＰＫＭＶＱＧＳ−ＮＨ2（配列番号１０９）のペプチドＣＮ３２の５ｍｇ/ｍｌ溶液は、ｐＨ７．４の０．１５Ｍ ＮａＣｌを含むダルベッコ ＰＢＳ緩衝液で調製した。ＰＢＳ緩衝液で１０ｍｇ/ｍｌＫＬＨ溶液となるように、２０ｍｇの乾燥ＫＬＨのＰＢＳ緩衝液ボトル(Pierce＃77600)をとり、２ｍｌの水で注射調製した。
【００９３】
１ｍｌのペプチド溶液（すなわち、５ｍｇ）を１．２５ｍｌのＫＬＨ溶液（すなわち、１２．５ｍｇ）と混合した。吸引フードの下で、調製した２．２５ｍｌの２％グルタールアルデヒド溶液（２５％グルタールアルデヒド、Sigma＃G-5882）を当該混合物に即座に加えた。ＫＬＨ複合体の生成を避けるため、２％グルタールアルデヒド溶液は、１滴ずつ、混合物を攪拌しながら加えた。コンジュゲーション反応は、室温で２時間３０分インキュベートしながら行った。カップリング反応は、１０ｍｇ/ｍｌの最終濃度となるように、１００ｍｇ/ｍｌ水素化ホウ素ナトリウム溶液を加えて停止した。反応混合物を４℃で一晩インキュベートした。最後に、この溶液を、ｐＨ７．４のダルベッコ ＰＢＳ緩衝液で、４℃で一晩透析した。この溶液を最後に等分し、−８０℃で保存した。
【００９４】
実施例３：ペプチドによる免疫
ポリクローナル抗体の作製のために、ウサギ（ニュージーランド種の雌）を、実施例２に従って、ＫＬＨに結合したペプチドＣｙｓ−ＹＴＬＲＡＰＲＳＰＫＭＶＱＧＳＧ−ＮＨ2で免疫した。最初の注射用に、１．５ｍｌの完全フロイントアジュバント（Sigma＃F-5881）と共に、１．５ｍｌのＫＬＨ結合ペプチドのエマルションを調製し、１ｍｌの完全フロイントアジュバント（すなわち、２００μｇのペプチド）を各ウサギに皮内注射した。１ｍｌのＫＬＨ結合ペプチド（すなわち、２００μｇのペプチド）のエマルションを完全フロイントアジュバント（Sigma＃F-5881）と共に皮内注射することにより、２０日間離して２回の追加免疫を行った。第二の追加免疫の２０日後に、前の追加免疫と同じ方法、但し皮下注射で第三の追加免疫を行った。第三の追加免疫を行い、得られた抗体の力価を評価した２０日後に、ウサギの採血を行った。
【００９５】
特に、ＫＬＨに結合したペプチドＣ−ＹＴＬＲＡＰＲＳＰＫＭＶＱＧＳＧ−ＮＨ2（配列番号１６）の免疫によって得られる、番号＃０４６８０５及び０４６８３２によって特定されるウサギ由来のポリクローナル抗体、並びにＫＬＨに結合したペプチドＣ−ＹＴＬＲＡＰＲＳＰＫＭＶＱＧＳ−ＮＨ2（配列番号１０９）の免疫によって得られる、数＃Ｌ０１２３５によって特定されるウサギ由来のポリクローナル抗体は、本研究のその他として用いた。
【００９６】
実施例４：抗体の取得及び精製
精製した後、ウサギ血清を４℃、４５００ｒｐｍで３０分間遠心した。静置して分離後、当該血清を半分、１Ｍ Ｎａｃｌを含むｐＨ８．０の１．５Ｍグリセリン緩衝液で希釈した。
【００９７】
実施例４ａ：プロテインＡ−セファロース上でのＩｇＧ精製
ポリクローナル抗体の精製は、プロテインＡ−セファロースゲル（Amersham Biosciences＃17.1279.02）上でアフィニティクロマトグラフィーにより行った。黄色ブドウ球菌から抽出したプロテインＡをＩｇＧ分子のＦｃフラグメントと特異的に混合した。次いで、サブクラスを全て含むＩｇＧをｐＨ３．０で溶出した。
【００９８】
使用する全ての緩衝液は、気泡の生成を防ぐため、カラムに使用する前に、超音波洗浄機で１５分間、脱気した。
【００９９】
クロマトグラフィーカラムは、１２ｍｌのプロテインＡ−セファロースを使用して作った。ゲルカラムは、蒸留して脱気した水で４０分間、更に０．５Ｍ Ｎａｃｌを含むｐＨ７．４のダルベッコ ＰＢＳ緩衝液で４０分間、最後に１Ｍ ＮａＣｌを含むｐＨ８．０の１．５Ｍグリセリン緩衝液で、正しいベースラインが得られるまで平衡化した。
【０１００】
次に、１Ｍ ＮａＣｌを含むｐＨ８．０の１．５Ｍグリセリン緩衝液で半分希釈した１０ｍｌのウサギ血清を、０．５ｍｌ/分の流速でカラムに通過させた。アルブミンピークが現れた後、ＩｇＧ血清を、０．１Ｍ トリス−クエン酸ナトリウム緩衝液でｐＨ３．０に調整した０．１Ｍクエン酸溶液の方法で溶出した。ＩｇＧ溶出ピークを回収し、即座に、４℃で一晩、ｐＨ７．４のダルベッコ ＰＢＳ緩衝液中で透析した。
【０１０１】
プロテインＡによる精製後、ポリクローナル抗体の反応性を、プロＢＮＰ（１−１０８）、ＢＮＰ（１−７６）又はＢＮＰ（７７−１０８）を０．２５μｇ/ｍｌの吸着量で被覆した殻斗上でＥＬＩＳＡにより試験した。ウサギ＃０４６８０５由来のポリクローナル抗体について得られた結果を、図１に示す。ウサギ＃０４６８３２由来のポリクローナル抗体も同じ結果を与えた。ウサギ＃０４６８０５及び＃０４６８３２由来のポリクローナル抗体は、プロＢＮＰ（１−１０８）に対し、比較的特異的であった。しかしながら、我々は、高濃度において抗プロＢＮＰ（１−１０８）の反応性が低いことに気付くことができた。すなすち、ウサギ由来の単一特異的ポリクローナル抗体を作製し、実施例４．ｂで述べる方法に従い、ＢＮＰ−Ｋ3−ＮＨＳ−セファロース樹脂で除去することにより、無視できる反応性である。
【０１０２】
実施例４ｂ：ＢＮＰ−Ｋ3−ＮＭＳ−セファロース樹脂上でのＩｇＧの除去
当該操作の目的は、ＢＮＰ（７７−１０８）に関して観察される交差反応を排除することである。
【０１０３】
得られたポリクローナル抗体の交差反応は、ＢＮＰ（７７−１０８）分子のＮ−末端位に位置するので、排除するイムノグロブリンにＢＮＰ（７７−１０８）の当該領域を正しく提示することは重要である。当該目的のため、ＢＮＰ（７７−１０８）は、そのＣ−末端部によってＮＨＳ−セファロース樹脂への結合を促進するために、Ｃ−末端位を３つのリジン残基（ＢＮＰ−Ｋ3）で延長して合成した。
【０１０４】
ＢＮＰ−Ｋ3：Ｓ−Ｐ−Ｋ−Ｍ−Ｖ−Ｑ−Ｇ−Ｓ−Ｇ−Ｃ−Ｆ−Ｇ−Ｒ−Ｋ−Ｍ−Ｄ−Ｒ−Ｉ−Ｓ−Ｓ−Ｓ−Ｓ−Ｇ−Ｌ−Ｇ−Ｃ−Ｋ−Ｖ−Ｌ−Ｒ−Ｒ−Ｈ−Ｋ−Ｋ−Ｋ（配列番号１０４）は、実施例１で上述した、「Ｆｍｏｃ」（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル）化学を使ってパイオニアシンセサイザイーで行った。
【０１０５】
０．５Ｍ ＮａＣｌを１０ｍｇ/ｍｌの濃度で加えたｐＨ８．３の１００ｍＭ ＮａＨＣＯ3緩衝液を使って、５ｍｇのＢＮＰ−Ｋ3を溶解した。２ｍｌのＮＨＳ−セファロース樹脂（ＮＨＳ−活性化セファロース ４高速フロー、Amersham Biosciences ＃17.0906.01）を４℃、１０００ｒｐｍで３０秒間遠心した。樹脂を１５ｍｌの冷１ｍＭ ＨＣｌ溶液で洗浄した。ＨＣｌ溶液を遠心及び除去した後、樹脂をＢＮＰ−Ｋ3リガンドと１０ｍｇ/ｍｌで混合した。当該混合物を、ゆっくり攪拌しながら、室温で１時間インキュベートした。リガンド溶液を遠心及び除去した後、樹脂の非反応性基をｐＨ８．０の０．１Ｍ グリシン緩衝液５ｍｌでブロックした。当該混合物を、ゆっくり攪拌しながら、室温で１時間インキュベートした。ブロッキング緩衝液を遠心及び除去した後、０．５Ｍ ＮａＣｌを加えたｐＨ８．３の１００ｍＭ ＮａＨＣＯ3緩衝液５ｍｌで、樹脂を吸収し、当該緩衝液で４回洗浄した。最後の洗浄後、混合物をクロマトグラフィーカラムに装填した。
【０１０６】
クロマトグラフィーカラムを調製後、１０ｍｇのウサギ＃０４６８０５由来のＩｇＧ又はウサギ＃０４６８３２由来のＩｇＧを当該カラムに装填した。カラムに接続したペリスタポンプにより、４℃で一晩、ウサギ血清ＩｇＧを循環させることができた。次の日、ＩｇＧ溶液を回収した（ろ液）。ＢＮＰ−Ｋ3に結合したＩｇＧフラクションを、５Ｍ 尿素を含むｐＨ８．０の２０ｍＭトリス緩衝液溶出した（溶出液）。当該溶出液及びろ液は、除去の効果を確認するために試験した。図２及び３は、ウサギ＃０４６８０５及び＃０４６８３２由来の各ポリクローナル血清のろ液を用い、ＥＬＩＳＡにより行った試験結果を示す。図４及び５は、ウサギ＃０４６８０５及び＃０４６８３２由来の各ポリクローナル血清の溶出液を用い、ＥＬＩＳＡにより行った試験結果を示す。
【０１０７】
予想とおり、ウサギ＃０４６８０５及び＃０４６８３２由来のポリクローナル血清のろ液は、プロＢＮＰ（１−１０８）に特異的であった。すなわち、ＢＮＰ（１−７６）又はＢＮＰ（７７−１０８）では反応性が認められなかった。溶出液は、プロＢＮＰ（１−１０８）についてはかなりの反応性を有し、ＢＮＰ（７７−１０８）についても反応性を有していた。当該結果は、ＢＮＰ−Ｋ3−ＮＨＳ−セファロース樹脂に対するウサギポリクローナル血清の効果を確認するものである。
【０１０８】
ＢＮＰ（７７−１０８）は、Sigma（＃B-5900）から入手し、プロＢＮＰ（１−１０８）及びＢＮＰ（１−７６）は、ベクターｐＧＥＸ−２Ｔ（Amersham Pharmacia Biotech）にクローニングし、当業者によく知られた慣用的手段で大腸菌に導入した後に発現する組換え蛋白質の形で製造した。ベクターの起源はBerlex Biosciences(Richmond,CA,USA)社から提供を受け、その製造は、Yan et al.(PNAS,2000,vol.97,pp.8525-8529)によって記述されている。プロＢＮＰ（１−１０８）の濃度及びＢＮＰ（１−７６）の濃度は、比色蛋白質試験に関するＢｒａｄｆｏｒｄ法によって測定した（M.Bradford,Anal.Biochem.1976;72:248-54）。
【０１０９】
実施例５：ＢＮＰ（１−７６）及びＢＮＰ（７７−１０８）に関する、ウサギ＃０４６８０５及び＃Ｌ０１２３５由来の抗プロＢＮＰ（１−１０８）抗体の交差反応割合の決定
【０１１０】
材料：
１）固相：平底Maxisorpマイクロプレート、Nunc（Denmark）。
２）ＢＮＰ（７７−１０８）は、Sigma（＃B-5900）から入手し、プロＢＮＰ（１−１０８）及びＢＮＰ（１−７６）は、組換え蛋白質の形で製造した。当該蛋白質溶液の濃度は、比色分析蛋白質アッセイに関するＢｒａｄｆｏｒｄ法によって測定した（M.Bradford,Anal.Biochem.1976;72:248-54）。
３）使用したコンジュゲートは、ペルオキシダーゼ結合抗ウサギＩｇＧポリクローナル抗体（Sigma ＃A-9169）である。
４）飽和緩衝液：１％の牛胎児血清アルブミン（BSA,Sigma ＃A-7888）を含むｐＨ７．４のダルベッコＰＢＳ緩衝液。
５）希釈溶液：０．１％のＢＳＡ及び０．１％のツィーン２０を含むｐＨ７．４のダルベッコＰＢＳ緩衝液。
６）洗浄液：０．１％のツィーン２０を含むｐＨ７．４のダルベッコＰＢＳ緩衝液。
７）視覚化溶液：視覚化溶液は、
７ａ）基質溶液：０．３３％のＨ2Ｏ2を含む０．０１Ｍ クエン酸と０．０４Ｍ トリナトリウム・シトレートの最終ｐＨ５．６の溶液、及び
７ｂ）色原体：ＯＰＤ（オルト−フェニレンジアミン）錠で、１ＯＰＤ錠は、１０ｍｌの基質緩衝液に溶解している、
を含む。
８）停止溶液：４Ｎ Ｈ2ＳＯ4。
【０１１１】
プロトコール：
アッセイは、マイクロプレートの殻斗に固定された種々の蛋白質に対するポリクローナル抗体の免疫反応性を直接評価することにある。
【０１１２】
・ダルベッコ ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）で種々のコーティング溶液、すなわちＢＮＰ（７７−１０８）を０．２５μｇ/ｍｌ含む第一の溶液、プロＢＮＰ（１−１０８）を０．２５μｇ/ｍｌ含む第二の溶液、ＢＮＰ（１−７６）を０．２５μｇ/ｍｌ含む第三の溶液、及びＧＳＴ（バックグラウンドノイズ制御蛋白質）を０．２５μｇ/ｍｌ含む第四の溶液をまず調製した。
・当該溶液の各１００μｌをマイクロプレートのウェルに別々に入れた。
・このマイクロプレートを４℃で一晩インキュベートした。
・コーティング溶液を除いた後、マイクロプレートを、０．１％のツィーン２０を含むｐＨ７．４のダルべッコ ＰＢＳ緩衝液３００μｌで洗浄し、１％のＢＳＡを含むｐＨ７．４のダルべッコ ＰＢＳ緩衝液２５０μｌを添加して飽和させた。
・その後、マイクロプレートを３７℃で１時間インキュベートした。
・次いで、マイクロプレートを洗浄液で３回洗浄した。
・予め、ウサギ＃０４６８０５由来のポリクローナル血清については２及び１μｇ/ｍｌに、ウサギ＃Ｌ０１２３５由来のポリクローナル血清については１／２５００及び１／５０００に希釈したポリクローナル抗体溶液１００μｌを各殻斗に置いた。
・反応媒体を室温で２時間インキュベートした。
・次いで、マイクロプレートを３００μｌの洗浄液で３回洗浄した。
・１００μｌのペルオキシダーゼ結合抗ウサギＩｇＧポリクローナル抗体コンジュゲートを希釈緩衝液で１／８０００に希釈したマイクロプレートの各ウェルに加えた。
・反応媒体を室温で１時間インキュベートした。
・次いで、プレートを３００μｌの洗浄液で５回洗浄する。１００μｌの視覚化溶液を各殻斗に分注した。反応を黒っぽくなるまで、室温で２０分間放置した。
・次いで、５０μｌの停止溶液を各殻斗に分注した。
・反応を停止後、光学密度を４９０／６２０ｎｍで分光光度計で読んだ。
【０１１３】
抗プロＢＮＰ（１−１０８）抗体について、０．２５μｇ/ｍｌを吸着させたＢＮＰ（７７−１０８）、０．２５μｇ/ｍｌを吸着させたプロＢＮＰ（１−１０８）及び０．２５μｇ/ｍｌを吸着させたＧＳＴ上で試験し、ＢＮＰ（７７−１０８）抗体との交差反応の割合を次式：
【０１１４】
【数１】
【０１１５】
を使って計算した。
【０１１６】
抗プロＢＮＰ（１−１０８）抗体について、０．２５μｇ/ｍｌを吸着させたＢＮＰ（１−７６）、０．２５μｇ/ｍｌを吸着させたプロＢＮＰ（１−１０８）及び０．２５μｇ/ｍｌを吸着させたＧＳＴ上で試験し、ＢＮＰ（１−７６）抗体との交差反応の割合を次式：
【０１１７】
【数２】
【０１１８】
を使って計算した。
【０１１９】
【表１】
【０１２０】
結論：
上記血清ポリクローナル抗体の交差反応は、ＢＮＰ（１−７６）については２％未満であり、ＢＮＰ（７７−１０８）については５％未満であった。ＢＮＰ（７７−１０８）の交差反応性は、実施例４．ｂに記載した除去方法の手段により排除できた。しかしながら、当該ポリクローナル抗体は、実施例１９及び２０に記載のように、プロＢＮＰ（１−１０８）の免疫酵素測定法の条件、及び患者に通常見られるＢＮＰ（７７−１０８）濃度やＢＮＰ（１−７６）濃度では結果的に交差反応を示さずに、除去しない状態で使用できた。
【０１２１】
実施例６：ＢＮＰ−Ｋ3−ＮＨＳ−セファロース樹脂上で除去する前後の、ウサギ＃０４６８０５及び＃０４６８３２由来のポリクローナル血清によって認識されるエピトープの同定
ＮＰ−Ｋ3−ＮＨＳ−セファロース樹脂上で除去する前後の、ウサギ＃０４６８０５及び＃０４６８３２由来のポリクローナル血清は、当該ポリクローナル血清によって認識されるエピトープを同定するために、スポット法により試験した。Frankによって説明される当該方法（Tetrahedron,1992;48:9217-32）は、非常に多くの未特定配列のペプチドのニトロセルロース膜上での迅速合成が可能である。使用するプロトコールは、Molina et al.によって説明されている（Pet.Res.,1996;9:151-5）。
【０１２２】
アミノ化機能を含む直径約５ｍｍのスポットを１枚のシート上で作り、当該スポットは、合成ぺプチドのＣ−末端アミノ酸の支点として役立った。ペプチド鎖は、活性化Ｆｍｏｃアミノ酸の連続的な添加によって伸張できた。アミノ酸側鎖は、適当な化学基で保護した。全てのペプチドは、Ｎ−アセチル化したＮ−末端残基を用いて合成した。合成の最後には、側鎖はトリフルオロ酢酸の作用により脱保護した。当該処理は、ペプチド及びセルロース支持体との結合に影響を与えるものではなく、ペプチドの反応性は比色試験の手段により評価できた。
【０１２３】
膜上で合成した一連のペプチドは、プロＢＮＰ（１−１０８）の全体的配列を表す、３つのアミノ酸残基がシフトした３２のペンタデカペプチドから成っていた。
【０１２４】
【表２】
【０１２５】
０．１％ツィーン２０、５％ブロッキング緩衝液（Euromedex#SU-07-250）及び５％スクロースを加えたｐＨ７．０のＴＢＳ（トリス緩衝生理食塩水）緩衝液３０ｍｌで上記膜を飽和した後、１０μｇ/ｍｌに希釈したウサギポリクローナル血清２０ｍｌの反応性を試験した（３７℃で１時間３０分間、攪拌しながらインキュベートした後に試験した）。
【０１２６】
０．１％ツィーン２０を加えたｐＨ７．０のＴＢＳ緩衝液で洗浄した後、２０ｍｌのアルカリホスファターゼ結合抗ウサギＩｇＧコンジュゲート（Sigma＃A-8025）を室温で１時間、攪拌しながらインキュベートした。最後に、３０ｍｌの洗浄液で最終洗浄を行った後、３０ｍｌの基質溶液[０．１５Ｍ ＢＣＩＰ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート）１２０μｌ、１Ｍ ＭｇＣｌ２ １５０μｌ及び０．１Ｍ ＭＴＴ（チアゾイル・ブルー・テトラゾリウムブロミド）１８０μｌを含む、ｐＨ７．０のＣＢＳ（クエン酸緩衝生理食塩水）緩衝液３０ｍｌ］を添加することによって、当該スポットを視覚化した。
【０１２７】
上記膜をスキャンした後、膜のスポット強度を、画像処理ソフトウェアを用いて評価した（相対的強度単位で）。バックグラウンドノイズは、抗血清によって検出したスポットから計算した。除去前のウサギ＃０４６８０５由来のポリクローナル血清に関するエピトープ分析の結果を図６に示す。５つのペプチド（スポット２２〜２６）をポリクローナル血清によって検出し、これら５つのペプチドに共通の配列は、Ｒ76Ｓ77Ｐであった。
【０１２８】
しかしながら、ＲＡＰユニットをＲ76Ｓ77ＰユニットのＮ−末端位に加えると、反応性が顕著に増加した。ＢＮＰ−Ｋ3−ＮＨＳ−セファロース樹脂上での除去後のウサギ＃０４６８０５由来のポリクローナル血清に関するエピトープ分析の結果を、図７に示す。４つのペプチド（スポット２２〜２５）をポリクローナル血清によって検出し、これら５つのペプチドに共通の配列は、ＲＡＰＲ76Ｓ77Ｐであった。除去前のポリクローナル血清について観察されたものと異なり、Ｒ76Ｓ77Ｐユニットの反応性だけが観察されなかった（スポット２６）。
【０１２９】
このことは、ＢＮＰ−Ｋ3−ＮＨＳ−セファロース樹脂上での除去前では、ポリクローナル血清はＢＮＰ（７７−１０８）を検出しなかった、ことを説明している（心覚えに、Ｓ77Ｐユニットは、ＢＮＰ（７７−１０８）の配列の最初の２つのアミノ酸に対応していた）。結局、単一特異性を示すウサギ＃０４６８０５由来のポリクローナル血清によって認識されるエピトープは、ＲＡＰＲ76Ｓ77Ｐであった。
【０１３０】
実施例７：除去前後のウサギ＃０４６８０５及び＃０４６８３２由来のポリクローナル血清の最小エピトープの、アラニン（Ａｌａ）スキャン法による同定
ＮＰ−Ｋ3−ＮＨＳ−セファロース樹脂上で除去前後のウサギ＃０４６８０５及び＃０４６８３２由来のポリクローナル血清は、ポリクローナル血清によってプロＢＮＰ（１−１０８）のみを特異的に認識する、ヒンジペプチド中の最小エピトープを同定するために、（実施例６に記載の）スポット方法で試験した。ヒンジペプチドＹＴＬＲＡＰＲＳＰＫＭＶＱＧＳの配列を繰り返した１６つのペンタデカペプチドからなり、一つのアミノ酸がアラニン残基（アラニン・スキャニング又は「Ａｌａ−スキャン」）又はグリシン残基で順々に置換、この置換は、毎回、一つのアミノ酸残基ごとに右にシフトするような置換である、がなされている膜を合成した（表３−１、３−２）。ＢＮＰ−Ｋ3−ＮＨＳ−セファロース樹脂上で除去前後のウサギ＃０４６８０５及び＃０４６８３２由来のポリクローナル血清のＡｌａ−スキャン分析の結果を表３に示す。
【０１３１】
【表３】
【０１３２】
【表４】
【０１３３】
ウサギ＃０４６８０５及び＃０４６８３２由来のポリクローナル血清によって認識されるエピトープの認識に不可欠であるアミノ酸は、Ｒ76Ｓ77Ｐであった。しかし、ＢＮＰ−Ｋ3−ＮＨＳ−セファロース樹脂上でのウサギ＃０４６８０５由来のポリクローナル血清の除去後では、Ｒ76Ｓ77Ｐユニットに加えて、ＲＡユニットが認識に寄与していた。除去前のウサギ＃０４６８３２由来のポリクローナル血清に関しては、プロリンＰ78のみが認識に寄与するが、ＢＮＰ−Ｋ3−ＮＨＳ−セファロース樹脂上でのウサギ＃０４６８３２由来のポリクローナル血清の除去後では、認識に寄与するユニットはＲ−ＰＲ76Ｓ77Ｐであった。これらの結果は、ウサギ＃０４６８０５及び＃０４６８３２由来のポリクローナル血清によるプロＢＮＰ（１−１０８）の特異的認識に必須の最小エピトープがＲＡＰＲ76Ｓ77Ｐである、ことを示している。
【０１３４】
実施例８：Ａｌａ−スキャン法によるウサギ＃Ｌ０１２３５由来のポリクローナル血清の最小エピトープの同定
最初（除去の必要がない）からプロＢＮＰ（１−１０８）に特異的な、ウサギ＃Ｌ０１２３５由来にポリクローナル血清は、ポリクローナル抗体によってプロＢＮＰ（１−１０８）のみを特異的に認識する、ヒンジ中の最小エピトープを同定するために、（実施例６に記載の）スポット法で試験した。使用した膜は、実施例７に記載したものである。ウサギ＃Ｌ０１２３５由来のポリクローナル血清のＡｌａ−スキャン分析の結果を表４に示す。
【０１３５】
【表５】
【０１３６】
ウサギ＃０４６８０５及び＃０４６８３２由来のポリクローナル血清に関し（実施例７）、これらの結果は、ウサギ＃Ｌ０１２３５由来のポリクローナル血清によるプロＢＮＰ（１−１０８）の特異的認識に必須の最小エピトーがＲＡＰＲ76Ｓ77Ｐである、ことを示している。
【０１３７】
実施例９：プロＢＮＰ（１−１０８）組換え蛋白質によるマウスの免疫
ＢＡＬＢ／ｃ（雌性６週齢）のマウスを、実施例４．ｂで述べた組換えプロＢＮＰ（１−１０８）で、当業者によく知られた慣用的技術により免疫した。最初の注射では、プロＢＮＰ（１−１０８）１ｍｌの完全フロイントアジュバント（Sigma＃F-5881）１ｍｌによるエマルションを調製し、このエマルションの３００μｌ（すなわち１００μｇの蛋白質）を各マウスに皮下注射した。２つの追加免疫は、プロＢＮＰ（１−１０８）（すなわち１００μｇの蛋白質）の不完全フロイントアジュバント（Sigma＃F-5506）によるエマルション３００μｌの腹腔内注射により、１５日間あけて行った。第二の追加免疫の１５日後、第三の追加免疫を先と同じ方法により、但し皮下注射によって行った。最後に、最終追加免疫の１５日後、スポット技術による免疫反応を分析するために、マウスから血液試料を採取した。マウス１２の免疫反応は、本研究のリマインダーに特に有益であることが判った。
【０１３８】
実施例１０：マウス１２由来のポリクローナル抗体によって認識される、プロＢＮＰ（１−１０８）配列のエピトープの同定
マウス１２由来のポリクローナル抗体によって認識される、プロＢＮＰ（１−１０８）配列のエピトープの同定に使用したスポット法は、実施例６に記載した。
【０１３９】
膜上で合成した一連のペプチドは、プロＢＮＰ（１−１０８）の配列全体を表している９４のペンタデカペプチドからなり、各ぺプチドは、１アミノ酸残基ずつシフトしている。マウス１２由来のポリクローナル血清の反応性は、１／５００に希釈し、実施例６に記載の膜上で試験した。膜をスキャン後、膜上のスポット強度（相対的強度ユニット）を、画像処理ソフトウェアにより評価した。抗血清によって検出したスポットから計算したバックグラウンドノイズは、相対的強度ユニットが３０であった。
【０１４０】
プロＢＮＰ（１−１０８）の配列のＮ−末端位に位置する３領域は、マウス１２由来の抗血清の抗体によって特に良好に認識された。この３領域とは、配列Ｈ1ＰＬＧＳＰＧＳＡＳＤＬＥＴＳ15（配列番号２３）（スポット１〜１２）、配列Ｌ17ＱＥＱＲＮＨＬＱＧＫ27（配列番号１２３）（スポット１７〜２７）及び配列Ｌ38ＥＰＬＱＥＳＰＲＰＴＧ49（配列番号１２４）（スポット３８〜４９）である。
【０１４１】
驚いたことに、マウス１２由来の抗血清は、ぺプチド配列がＲＡＰＲ76Ｓ77Ｐユニットを含むスポット、すなわちスポト６４〜６８を認識することができる抗体も含んでいた。スポットのペプチド配列を表５に記載する。
【０１４２】
【表６】
【０１４３】
【表７】
【０１４４】
モノクローナル抗体作製のために選んだマウス（５週齢ＢＡＬＢ／ｃ雌性）を、ＫＬＨ（keyhole limpet hemocyanin）に結合した配列番号１６ Ｃ−ＹＴＬＰＡＰＲＳＰＫＭＶＱＧＳＧ−ＮＨ2（Ｃ１３Ｐ３０）のペプチドで、次のプロトコールに従い免疫した。すなわち、完全フロイントアジュバントで２倍に希釈した１００μｇのＫＬＨ結合ペプチドで皮下注射した。４回の追加免疫を、不完全フロイントアジュバントで２倍に希釈したＫＬＨ結合ぺプチド１００μｇの皮下注射により、３週間あけて行った。
【０１４５】
リンパ球融合を実施する前の３日間、マウスを次のプロトコールに従い、超免疫した。滅菌ＰＢＳ緩衝液中にＫＬＨに結合したＣ−ＹＴＬＰＡＰＲＳＰＫＭＶＱＧＳＧ−ＮＨ2ペプチド１００μｇについて、イムノゲンの総用量を４回の注射に分注した。第一及び第二の注射は各々、総用量の１／１０に相当した。これらの注射は、種々の部位に、４５分間おきに皮下に行った。総用量の２／１０に相当する第三の注射は、第二の注射の４５分後に皮下に行った。第三の注射の３０分後、アナフィラシー・ショックを避けるために、プロメタジンの殺菌ＰＢＳの１ｍｇ/ｍｌ溶液（２．５％ フェネルガン、Laboratories Medeva Parma）１００μｌを腹腔内注射した。最後に、１５分後、総用量の６／１０に相当する最終注射を腹腔内に行った。
【０１４６】
リンパ球ハイブリダイゼーションは、Kohler and Milstein（Nature,1975;256:495-97）によって説明されている方法に従って実施した。予め非動化した１０％の牛胎児血清（Bio-Whittaker＃BE02701E）及び８−アザグアニン（Sigma＃A-8526）を添加したＬ−グルタミン、ペニシリン及びストレプトマイシン（Sigma＃G-6784）の混合物を補足したＲＰＭＩ １６４０倍地（Bio-Whittaker＃BE12-167F）で前もって培養した、マウスの脾臓から抽出したリンパ球細胞及びミエローマ細胞（Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８．６５３）を使って行った。
【０１４７】
牛胎児血清を添加せず、Ｌ−グルタミン、ペニシリン及びストレプトマイシン（Sigma＃G-6784）の混合物を補足したＲＰＭＩ １６４０倍地（Bio-Whittaker＃BE12-167F）で前もって培養したリンパ球細胞及びミエローマ細胞は、１ミエローマ細胞につき５リンパ球の割合で混合した。
【０１４８】
当該混合物を室温、９００ｒｐｍで７分間遠心し、細胞ペレットを再懸濁した後、１ｍｌのハイブリ−マックス（登録商標）ポリスチレングリコール（Sigma＃P-7777）を加えた。３７℃のウォーターバスで１分間インキュベートした後、当該細胞を室温、１０００ｒｐｍで１分３０秒間遠心した。最後に、３７℃のウォーターバスで２分間インキュベートした後、ペレットを再懸濁し、Ｌ−グルタミン、ペニシリン及びストレプトマイシン（Sigma＃G-6784）の混合物を補足したＲＰＭＩ １６４０倍地（Bio-Whittaker＃BE12-167F）であって、予め３７℃にしておいた倍地６ｍｌを５秒毎に１００μｌに速度で添加し、９ｍｌの同じ倍地全てを直ちに添加した。室温、９００ｒｐｍで１０分間遠心し、上清を除いた後、予め非動化した１０％の牛胎児血清（Bio-Whittaker＃BE02701E）及びＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン、Sigma＃H-0262）を添加したＬ−グルタミン、ペニシリン及びストレプトマイシン（Sigma＃G-6784）の混合物を補足したＲＰＭＩ １６４０倍地（Bio-Whittaker＃BE12-167F）で、１ウェル当り１２００００細胞となるように、１００μｌを分注するために、当該ペレットを溶解した。
【０１４９】
当該溶液を、予め、ネズミのマクロファージを播種した９６培養プレートのウェルに１００μｌ加えた。当該プレートをＣＯ2インキュベーターに置いた。リンパ球ハイブリダイゼーションの１５日後、融合プレートに存在するクローンの数を見積り、ハイブリドーマの割合の変化で表した。
【０１５０】
ハイブリドーマの選択は、プロＢＮＰ（１−１０８）、ＢＮＰ（１−７６）、ＢＮＰ（７７−１０８）及び配列ＲＡＰＲ76Ｓ77Ｐ（Ｃ１３Ｐ３０）を有するペプチドのＥＬＩＳＡによって行った。プロＢＮＰ（１−１０８）及び配列ＲＡＰＲ76Ｓ77Ｐを有するＣ１３Ｐ３０ペプチドを検出することができ、実質的にＢＮＰ（１−７６）及びＢＮＰ（７７−１０８）を認識することができない抗体を分泌するハイブリドーマのみを選択した。選択したハイブリドーマは、培養で維持し、希釈を制限することによってクローン化した。このようにしてクローン化したハイブリドーマは、腹水中でモノクローナル抗体の分泌のために用いることができた。
【０１５１】
上記の方法により、本発明者は、本発明に従う抗体の特徴を有するアイソタイプＩｇＧ1κのイムノグロブリンを分泌するネズミのハイブリドーマ、クローン３Ｄ４を作製した。当該ハイブリドーマは、２００３年７月３１日に、寄託番号ＣＮＣＭ Ｉ−３０７３として、ＣＮＣＭ（Collection Nationale de Cultures de Microorganismes［National Collection of Microorganism Cultures］,Pasteur Institute,25 rue du Docteur Roux,75 724 Paris,Cedex 15,France）に寄託した。
【０１５２】
実施例１２：ハイブリドーマ３Ｄ４によって分泌された抗体の特異性のＥＬＩＳＡによる確認
材料：
１）固相：平底Maxisorpマイクロプレート、Nunc（Denmark）。
２）ＢＮＰ（７７−１０８）は、Sigma（＃B-5900）から入手し、プロＢＮＰ（１−１０８）及びＢＮＰ（１−７６）は、組換え蛋白質の形で製造した。当該蛋白質溶液の濃度は、比色分析蛋白質アッセイに関するＢｒａｄｆｏｒｄ法によって測定した（M.Bradford,Anal.Biochem.1976;72:248-54）。
３）使用したコンジュゲートは、ペルオキシダーゼ結合抗ウサギＩｇＧポリクローナル抗体（Sigma＃A-9169）である。
４）飽和緩衝液：１％の牛胎児血清アルブミン（BSA,Sigma＃A-7888）を含むｐＨ７．４のダルベッコＰＢＳ緩衝液。
５）希釈溶液：０．１％のＢＳＡ及び０．１％のツィーン２０を含むｐＨ７．４のダルベッコＰＢＳ緩衝液。
６）洗浄液：０．１％のツィーン２０を含むｐＨ７．４のダルベッコＰＢＳ緩衝液。
７）視覚化溶液：視覚化溶液は、
７ａ）基質溶液：０．３３％のＨ2Ｏ2を含む０．０１Ｍ クエン酸と０．０４Ｍ トリナトリウム・シトレートの最終ｐＨ５．６の溶液、及び
７ｂ）色原体：ＯＰＤ（オルト−フェニレンジアミン）錠で、１ＯＰＤ錠は、１０ｍｌの基質緩衝液に溶解している、
を含む。
８）停止溶液：４Ｎ Ｈ2ＳＯ4。
【０１５３】
プロトコール：
アッセイは、マイクロプレートの殻斗に固定された種々の蛋白質に対するハイブリドーマ３Ｄ４の培養上清の免疫反応性を直接評価することにある。
【０１５４】
・ダルベッコ ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）で種々のコーティング溶液、すなわちＢＮＰ（７７−１０８）を１μｇ/ｍｌ含む第一の溶液、プロＢＮＰ（１−１０８）を１μｇ/ｍｌ含む第二の溶液及びＢＮＰ（１−７６）を１μｇ/ｍｌ含む第三の溶液を全てまず調製した。
・当該溶液の各１００μｌをマイクロプレートのウェルに別々に入れた。
・このマイクロプレートを４℃で一晩インキュベートした。
・コーティング溶液を除いた後、マイクロプレートを、０．１％のツィーン２０を含むｐＨ７．４のダルべッコ ＰＢＳ緩衝液で洗浄し、１％のＢＳＡを含むｐＨ７．４のダルべッコ ＰＢＳ緩衝液２５０μｌを添加して飽和させた。
・その後、マイクロプレートを３７℃で１時間インキュベートした。
・次いで、マイクロプレートを３００μｌの洗浄液で３回洗浄した。
・予め、１／２に希釈したハイブリドーマ３Ｄ４上清１００μｌを各殻斗に置いた。
・反応媒体を室温で２時間インキュベートした。
・次いで、マイクロプレートを３００μｌの洗浄液で３回洗浄した。
・１００μｌのペルオキシダーゼ結合抗ウサギＩｇＧポリクローナル抗体コンジュゲートを希釈緩衝液で１／２０００に希釈し、マイクロプレートの各ウェルに加えた。
・反応媒体を室温で１時間インキュベートした。
・次いで、プレートを３００μｌの洗浄液で５回洗浄する。１００μｌの視覚化溶液を各殻斗に分注した。反応を黒っぽくなるまで、室温（１８〜２４℃）で２０分間放置した。
・次いで、５０μｌの停止溶液を各殻斗に分注した。
・反応を停止後、光学密度を４９０／６２０ｎｍで分光光度計で読んだ。
【０１５５】
図８は、当該アッセイの結果を説明している。ハイブリドーマ３Ｄ４上清中に分泌された抗体は、プロＢＮＰ（１−１０８）及びＣ１３Ｐ３０免疫ペプチドのみを検出することができ、ＢＮＰ（１−７６）及びＢＮＰ（７７−１０８）には反応しなかった。この結果により、ＢＮＰ（１−７６）及びＢＮＰ（７７−１０８）を除き、ハイブリドーマ３Ｄ４によって分泌された抗体のプロＢＮＰ（１−１０８）に対する特異性を確認した。
【０１５６】
従って、本発明に従うハイブリドーマ３Ｄ４由来の抗体は、実質的にＢＮＰ（１−７６）及びＢＮＰ（７７−１０８）を除き、抗体のプロＢＮＰ（１−１０８）を特異的に認識する抗体であることが明白である。
【０１５７】
実施例１３：ハイブリドーマ３Ｄ４によって分泌された抗体の特異性のウェスタンブロッティングによる確認
材料：
１）一般的なＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動装置。
２）スタッキングゲル：５％アクリルアミド。
３）溶解ゲル：１６％アクリルアミド。
４）陽極緩衝液：０．２Ｍ トリス、ｐＨ８．９。
５）陰極緩衝液：０．１Ｍ トリス−トリシン；０．１％ＳＤＳ。
６）試料緩衝液：０．５Ｍ トリス、ｐＨ６．８；２５％グリセロール；２％ＳＤＳ；１４．４ｍＭ β−メルカプトエタノール；０．１％ブロモフェノールブルー。
７）電気泳動装置。
８）移動緩衝液；１９０ｍＭグリシン；２０％メタノール；０．０５％ＳＤＳ。
９）ＢＮＰ（７７−１０８）は、Sigma（＃B-5900）から入手し、プロＢＮＰ（１−１０８）、ＢＮＰ（１−７６）−ＧＳＴ及びＧＳＴ（ネガティブコントロール）は、組換え蛋白質の形で製造した。当該蛋白質溶液の濃度は、比色分析蛋白質アッセイに関するＢｒａｄｆｏｒｄ法によって測定した（M.Bradford,Anal.Biochem.1976;72:248-54）。
１０）コンジュゲートは、ペルオキシダーゼ結合ロバ抗マウスＩｇＧポリクローナル抗体（Jackson Immunoresearch＃715-035-150）を用いた。
１１）ウェスタンブロッティングの検出用のＥＣＬキット（Amersham Biosciences#RPN2106）。
【０１５８】
プロトコール：
当該アッセイの実施は、１６％アクリルアミドゲル中の種々の蛋白質の電気泳動的な移動、当該蛋白質のニトロセルロース膜への転写、そして最後にウェスタンブロッティング、の３つの主なステップを含む。
【０１５９】
・種々の溶液、すなわちプロＢＮＰ（７７−１０８）を１μｇ含む第一の溶液、ＧＳＴを１μｇ含む第二の溶液、ＢＮＰ（１−７６）−ＧＳＴを１μｇ含む第三の溶液、及びＢＮＰ（７７−１０８）を１μｇ含む第四の溶液、を同一の緩衝液で３５μｌの最終体積に調製した。
・各溶液を１００℃で５分間、ウォーターバス中でインキュベートし、次いでゲルのウェルに装填した。アクリルアミドゲル中の移動は、１２０Ｖの一定の電圧下で１時間３０分間行った。図９は、得られるアクリルアミドゲルの写真である。装填した蛋白質はクマズーブルーで染色した。
・移動後、ゲル中の蛋白質を１２０ｍＡで１時間、ニトロセルロース膜上に転写した。
・ニトロセルロース膜は、０．１％ツィーン２０入りのＰＢＳ緩衝液で洗浄し、室温で３０分間、０．１％ツィーン２０、２％スキムムルク入りのＰＢＳ緩衝液で飽和させた。
・０．１％ツィーン２０入りのＰＢＳ緩衝液で３回洗浄後、当該膜に５ｍｌのハイブリドーマ３Ｄ４上清を加えて、３７℃で１時間、揺り動かしながらインキュベーした。
・０．１％ツィーン２０入りのＰＢＳ緩衝液で３回洗浄後、当該膜に０．１％ツィーン２０、２％スキムムルク入りのＰＢＳ緩衝液で１／２０００に希釈した１０ｍｌのペルオキシダーゼ結合抗マウスＩｇＧコンジュゲートを加えて、室温で１時間、揺り動かしながらインキュベートした。
・０．１％ツィーン２０入りのＰＢＳ緩衝液で３回洗浄後、写真用フィルムに４曝す前に、当該膜をＥＣＬ視覚化剤に４分間浸漬した。
【０１６０】
得られたスキャンした写真画像である図１０に示したようにハイブリドーマ３Ｄ４上清中に分泌した抗体は、プロＢＮＰ（１−１０８）に対応するバンドのみを検出することができた。ＢＮＰ（１−７６）、ＢＮＰ（７７−１０８）及びＧＳＴは、ハイブリドーマ３Ｄ４の抗体によっては検出されなかった。当該結果により、ハイブリドーマ３Ｄ４によって分泌した抗体のプロＢＮＰ（１−１０８）に対する特異性も確認した。
【０１６１】
本発明に従うハイブリドーマ３Ｄ４由来の抗体が、実施的にＢＮＰ（１−７６）、ＢＮＰ（７７−１０８）を除き、プロＢＮＰ（１−１０８）を特異的に認識する抗体であることは明白である。
【０１６２】
実施例１４：ハイブリドーマ３Ｄ４によって分泌される抗体によって認識されるエピトーピのスポット法による同定
ハイブリドーマ３Ｄ４上清は、ハイブリドーマ３Ｄ４抗体によって認識されるエピトープを同定するために、スポット法（実施例６に記載）で試験した。得られた結果は、３Ｄ４抗体がＲＡＰＲ76Ｓ77Ｐユニットを含むペプチド配列を効率良く認識することを示した。
【０１６３】
当該結果は、プロＢＮＰ（１−１０８）に対する３Ｄ４抗体の特異性を確認する、ＥＬＩＳＡ（実施例１２）及びウェスタンブロッティング（実施例１３）で得られた結果と一致した。
【０１６４】
実施例１５：プロＢＮＰ（１−１０８）のラジオイムノアッセイ
材料：
１）固相：平底分裂型ウェル（cleavable-well）Maxisorpマイクロプレート、Nunc（Denmark）。
２）使用した捕獲抗体は、ウサギ＃０４６８０５由来の血清から得られた、非除去のポリクローナル抗体である。
３）使用したコンジュゲートは、Ｉ125（抗ＢＮ：−Ｉ125）で標識した抗ＢＮＰ（７７−１０８）抗体である。当該抗体は、シオノギ社のシオノリアＢＮＰキットのトレーサー抗体である。
４）飽和緩衝液：１％牛胎児血清（BSA,Sigma＃A-7888）を含むｐＨ７．４のダルベッコＰＢＳ緩衝液。
５）希釈緩衝液：０．１％ＢＳＡ及び０．１％ツィーン２０（Sigma＃P-1379）を含むｐＨ７．４のダルベッコＰＢＳ緩衝液。
６）洗浄緩衝液：０．１％ツィーン２０を含むｐＨ７．４のダルベッコＰＢＳ緩衝液。
７）プロＢＮＰ（１−１０８）スタンダード：組換え蛋白質の形の製造物。
【０１６５】
プロトコール：
使用したアッセイの原理は、平底分裂型ウェルマイクロプレートで行うサンドウィッチラジオイムノアッセイ法に基く。試料（又はプロＢＮＰ（１−１０８）のスタンダード）及びトレーサーを次々に加えるワンステップアッセイである。
【０１６６】
・コーティング溶液を、まず、ウサギ＃０４６８０５由来のポリクローナル抗体を用いて、ダルベッコ ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）で４０μｇ/ｍｌに希釈し、全て調製した。当該溶液の３００μｌをマイクロプレートの各ウェルに加えた。
・このマイクロプレートを４℃で一晩インキュベートした。
・コーティング溶液を除いた後、マイクロプレートを、０．１％のツィーン２０を含むｐＨ７．４のダルべッコ ＰＢＳ緩衝液３００μｌで洗浄し、１％のＢＳＡを含むｐＨ７．４のダルべッコ ＰＢＳ緩衝液３００μｌを添加して飽和させた。
・その後、マイクロプレートを３７℃で１時間インキュベートした。
・次いで、マイクロプレートを洗浄液（０．１％のツィーン２０を含むｐＨ７．４のダルべッコ ＰＢＳ緩衝液）で３回洗浄した。
・１００μｌのスタンダードプロＢＮＰ（１−１０８）溶液、血清又は血漿を各殻斗（cupule）に入れた。プロＢＮＰ（１−１０８）をもし必要ならば固相上に保持されている捕獲抗体に結合させた。
・２００μｌの用時調製抗ＢＮＰ−Ｉ１２５トレーサー溶液（シオノギ社のシオノリアＢＮＰキットから入手）を各ウェルに加えた。
・反応媒体を４℃で一晩（１８〜２２時間）インキュベートした。
・翌日、マイクロプレートを３００μｌの洗浄液で３回洗浄した。最終洗浄し、洗浄溶液を吸引した後、各殻斗を不特定のチューブに移した。
・各殻斗に存在し、結合トレーサー量と試料中に存在のプロＢＮＰ（１−１０８）の量に比例する放射活性をガンマカウターを使って測定した。
【０１６７】
図１１は、プロＢＮＰ（１−１０８）のスタンダードレンジを使って得た結果を示す。
【０１６８】
実施例１６：ヒト試料のアッセイ結果
建常人の１４試料及び心不全に苦しむ患者の１５試料を、実施例１５に記載の本発明に従うプロＢＮＰ（１−１０８）ＩＲＭＡアッセイ、及びロシュ社から販売され、エレクシー（登録商標）自動装置を使用するＢＮＰ（１−７６）アッセイの手段により試験した。血液試料は全て、ＥＤＴＡを含むチューブに入れた。
図１２は、本発明に従うプロＢＮＰ（１−１０８）ＩＲＭＡアッセイにより当該試料について行った試験のｃｐｍ（counts per minute）の結果を示す。心不全に苦しむ患者の試料から得られた結果は、建常人の試料から得られた結果よりも、著しく高かった。当該結果は、心不全に苦しむ患者の試料中の循環プロＢＮＰ（１−１０８）の存在を明らかにするものであり、血清プロＢＮＰ（１−１０８）が心不全の予測マーカーであるという最初の証明である。
図１３は、心不全に苦しむ患者の１４試料についての、本発明に従うプロＢＮＰ（１−１０８）ＩＲＭＡアッセイの手段によって測定したプロＢＮＰ（１−１０８）濃度（ｐｇ/ｍｌ）とエレクシー（登録商標）自動装置を使用するロシュ社のアッセイの手段によって測定したプロＢＮＰ（１−１０８）濃度（ｐｇ/ｍｌ）との相関関係を示す。観察できた相関関係は、相関係数Ｒ2が０．８５で、有意であった。
【０１６９】
実施例１７：ウサギ＃０４６８０５由来のポリクローナル抗体とビオチンとのカップリング
カップリング法は、ＩｇＧの第一アミンと反応してアミド結合をつくるビオチンのＮ−ヒドロキシコハク酸アミド（ＮＨＳ）を使用した。
【０１７０】
（＋）−ビオチン・Ｎ−スクシンイミジルエステル（Fluka＃14405）の１００ｍＭ溶液を、ビオチンをジメチルホルムアミドに溶解して調製した。ビオチン化は、ガラスフラスコ中で行った。除去していない、予め精製したウサギ＃０４６８０５由来のポリクローナル抗体の５００μｇを、１００ｍＭのビオチン溶液（ビオチン／抗体のモル比は５００）１７μｌと一緒にフラスコに入れた。反応はｐＨ７．４のダルベッコＰＢＳ緩衝液中で行った。反応混合物を室温で１時間３０分、攪拌しながらインキュベートした。冷却後、２Ｍ グリシン緩衝液を加えて、ビオチンを不活性化した。混合物を室温で１０時間、ゆっくり攪拌しながらインキュベートした。最後に、混合物をｐＨ７．４のダルベッコＰＢＳ緩衝液で４℃一晩透析した。翌日、ナトリウムアジド溶液を０．０２％の最終濃度で加えた。当該コンジュゲートを４℃で保存した。
【０１７１】
実施例１８：プロＢＮＰ（１−１０８）の酵素免疫試験
本発明に従う酵素免疫試験を設定した。
【０１７２】
材料：
１）固相：平底Maxisorpマイクロプレート、Nunc(Denmark)。
２）使用した捕獲抗体は、Strategic Biosolution社から市販のポリクローナル抗ＢＮＰ（１−１０８）抗体(#B9105RA00-A0)である。
３）使用したコンジュゲートは、実施例１７に記載の方法に従う、ビオチンに結合した、非除去のウサギ＃０４６８０５由来のポリクローナル抗体である。
４）ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼコンジュゲート（Amersham Pharmacia Biotech＃RPN1231V）。
５）飽和緩衝液：１％牛胎児血清（BSA,Sigma＃A-7888）を含むｐＨ７．４のダルベッコＰＢＳ緩衝液。
６）希釈溶液：０．１％ＢＳＡ及び０．１％ツィーン２０を含むｐＨ７．４のダルベッコＰＢＳ緩衝液。
７）洗浄緩衝液：０．１％ツィーン２０を含むｐＨ７．４のダルベッコＰＢＳ緩衝液。
８）プロＢＮＰ（１−１０８）スタンダード：組換え蛋白質。
９）視覚化溶液：視覚化溶液は、
９ａ）基質溶液：０．３３％のＨ2Ｏ2を含む０．０１Ｍ クエン酸と０．０４Ｍ トリナトリウム・シトレートの最終ｐＨ５．６の溶液、及び
９ｂ）色原体：ＯＰＤ（オルト−フェニレンジアミン）錠で、１ＯＰＤ錠は、１０ｍｌの基質緩衝液に溶解している、
を含む。
１０）停止溶液：４Ｎ Ｈ2ＳＯ4。
【０１７３】
プロトコール：
使用したアッセイの原理は、平底プレート中で行うサンドウィッチ型酵素免疫法に基く。まず、試料（又はスタンダード溶液）を捕獲抗体とインキュベートし、次いでインキュベーション及び洗浄後、検出抗体を添加する２ステップアッセイである。
【０１７４】
・コーティング溶液は、まず、ｐＨ７．４のダルベッコ ＰＢＳ緩衝液で１０μｇ/ｍｌに希釈した抗ＢＮＰ（７−１０８）ポリクローナル抗体で調製した。１００μｌの当該溶液をマクロプレートの各ウェルに入れた。
・このマイクロプレートを４℃で一晩インキュベートした。
・コーティング溶液を除いた後、マイクロプレートを、０．１％のツィーン２０を含むｐＨ７．４のダルべッコ ＰＢＳ緩衝液３００μｌで洗浄し、１％のＢＳＡを含むｐＨ７．４のダルべッコ ＰＢＳ緩衝液２５０μｌを添加して飽和させた。
・その後、マイクロプレートを３７℃で１時間インキュベートした。
・次いで、マイクロプレートを洗浄液で３回洗浄した。
・１００μｌのスタンダードプロＢＮＰ（１−１０８）溶液、血清又は血漿を各殻斗に入れた。プロＢＮＰ（１−１０８）がもし存在するならば、固相に保持されている捕獲抗体に結合させた。
・反応媒体を室温で２時間インキュベートした。
・次いで、マイクロプレートを３００μｌの洗浄液で５回洗浄した。
・ウサギ＃０４６８０５由来のビオチン化ポリクローナル抗体１００μｌ（６μｇ/ｍｌに濃縮）をマイクロプレートの各ウェルに加えた。
・反応媒体を室温で１時間３０分インキュベートした。
・次いで、プレートを３００μｌの洗浄液で５回洗浄した。１００μｌの視覚化溶液を各殻斗に分注した。反応は、室温（１８〜２４℃）で２０分間、黒っぽくなるまで放置した。
・次いで、５０μｌの停止溶液を各殻斗に分注した。
・反応を停止後、光学密度を４９０／６２０ｎｍで分光光度計で読んだ。
【０１７５】
図１４は、スタンダードプロＢＮＰ（１−１０８）レンジを用いて得た結果を示す。
【０１７６】
実施例１９：抗プロＢＮＰ（１−１０８）ポリクローナル抗体を共存させる、サンドウィッチ型のプロＢＮＰ（１−１０８）ＥＬＩＳＡアッセイを用いる、ＢＮＰ（１−７６）及びＢＮＰ（７７−１０８）に関する、非除去の、ウサギ＃０４６８０５由来のビオチン結合ポリクローナル抗体の交差反応の評価
ＢＮＰ（１−７６）及びＢＮＰ（７７−１０８）に関する、本発明に従う、非除去の、ビオチン化抗プロＢＮＰ（１−１０８）ポリクローナル抗体の交差反応は、実施例８に記載のプロＢＮＰ（１−１０８）ＥＬＩＳＡアッセイの手段により評価した。プロＢＮＰ（１−１０８）、ＢＮＰ（１−７６）及びＢＮＰ（７７−１０８）の５ｎｇ/ｍｌ〜１００ｎｇ/ｍｌの濃度レンジを調製し、実施例１８に記載のプロＢＮＰ（１−１０８）ＥＬＩＳＡアッセイの手段により試験した。
【０１７７】
濃度に対する４９０ｎｍにおける光学密度の変化の結果を、各蛋白質について図１５に示す。ＢＮＰ（１−７６）又はＢＮＰ（７７−１０８）については全く交差反応が認められなかった。すなわち、得られたシグナルは、如何なる濃度で試験しても、バックグラウンドと等価であった。患者に一般的に見られるＢＮＰ（１−７６）及びＢＮＰ（７７−１０８）の濃度（最高濃度では、１ｎｇ/ｍｌのオーダー）では、ウサギ＃０４６８０５由来のポリクローナル抗体は、交差反応を示さない非除去バージョンに使用することができた。
【０１７８】
実施例２０：抗ＮＴ−プロＢＮＰ（１−２９）ポリクローナル抗体を共存させる、サンドウィッチ型のプロＢＮＰ（１−１０８）ＥＬＩＳＡアッセイを用いる、ＢＮＰ（１−７６）及びＢＮＰ（７７−１０８）に関する、非除去の、ウサギ＃０４６８０５由来のビオチン結合ポリクローナル抗体の交差反応の評価
ＢＮＰ（１−７６）及びＢＮＰ（７７−１０８）に関する、非除去の、ビオチン化ポリクローナル抗体の交差反応を、実施例２０では、抗プロＢＮＰ（１−１０８）抗体を抗ＮＴ−プロＢＮＰ（１−２９）ポリクローナル抗体に換える以外は、実施例８に記載のプロトコール及び試薬を用いるプロＢＮＰ（１−１０８）ＥＬＩＳＡアッセイの手段により評価した。
【０１７９】
抗ＮＴ−プロＢＮＰ（１−２９）ポリクローナル抗体は、イムノゲンとして使用したペプチドがＫＬＨに結合したペプチドＮＴ−プロＢＮＰ（１−１０８）であった事実を除いて、実施例３に記載のプロトコールに従って作製した。プロＢＮＰ（１−１０８）、ＢＮＰ（１−７６）及びＢＮＰ（７７−１０８）の５ｎｇ/ｍｌ〜１００ｎｇ/ｍｌの濃度レンジを調製し、プロＢＮＰ（１−１０８）ＥＬＩＳＡアッセイの手段により試験した。
【０１８０】
濃度に対する４９０ｎｍにおける光学密度の変化の結果を、各蛋白質について図１６に示す。本発明に従うウサギ＃０４６８０５由来のポリクローナル抗体の交差反応は、ＢＮＰ（１−７６）又はＢＮＰ（７７−１０８）については全く認められなかった。すなわち、得られたシグナルは、如何なる濃度で試験しても、バックグラウンドと等価であった。患者に一般的に見られるＢＮＰ（１−７６）及びＢＮＰ（７７−１０８）の濃度（最高濃度では、１ｎｇ/ｍｌのオーダー）では、ウサギ＃０４６８０５由来のポリクローナル抗体は、交差反応を示さない非除去バージョンに使用することができた。
【図面の簡単な説明】
【０１８１】
【図１】図１は、プロテインＡ−セファロースで精製したウサギ＃０４６８０５由来のポリクローナル抗体の、マイクロプレート上に０．２５μｇ/ｍｌで吸着させたプロＢＮＰ（１−１０８）、ＢＮＰ（１−７６）フラグメント、ＢＮＰ（７７−１０８）又はＧＳＴ（glutathione-S-transferase、コントロール蛋白質として用いた）との反応性を示す。
【図２】図２は、ＢＮＰ−Ｋ3−ＮＨＳ−セファロース樹脂で除去した後に得たウサギ＃０４６８０５のろ液のポリクローナル抗体の反応性を示す。当該ポリクローナル抗体は、２〜２０μｇ/ｍｌのレンジの希釈形態で調製し、次いで０．２５μｇ/ｍｌの吸着量のプロＢＮＰ（１−１０８）、ＢＮＰ（１−７６）又はＢＮＰ（７７−１０８）ポリペプチドで被覆した殻斗上で試験した。
【図３】図３は、ＢＮＰ−Ｋ3−ＮＨＳ−セファロース樹脂で除去した後に得たウサギ＃０４６８３２のろ液のポリクローナル抗体の反応性を示す。当該ポリクローナル抗体は、５〜２０μｇ/ｍｌのレンジの希釈形態で調製し、次いで０．２５μｇ/ｍｌの吸着量のプロＢＮＰ（１−１０８）、ＢＮＰ（１−７６）又はＢＮＰ（７７−１０８）ポリペプチドで被覆した殻斗上で試験した。
【図４】図４は、ＢＮＰ−Ｋ3−ＮＨＳ−セファロース樹脂で除去した後に得たウサギ＃０４６８０５のポリクローナル血清の溶出液の反応性を示す。当該ポリクローナル抗体は、２〜２０μｇ/ｍｌのレンジの希釈形態で調製し、次いで０．２５μｇ/ｍｌの吸着量のプロＢＮＰ（１−１０８）、ＢＮＰ（１−７６）又はＢＮＰ（７７−１０８）ポリペプチドで被覆した殻斗上で試験した。
【図５】図５は、ＢＮＰ−Ｋ3−ＮＨＳ−セファロース樹脂で除去した後に得たウサギ＃０４６８３２のポリクローナル血清の溶出液の反応性を示す。当該ポリクローナル抗体は、５〜２０μｇ/ｍｌのレンジの希釈形態で調製し、次いで０．２５μｇ/ｍｌの吸着量のプロＢＮＰ（１−１０８）、ＢＮＰ（１−７６）又はＢＮＰ（７７−１０８）ポリペプチドで被覆した殻斗上で試験した。
【図６】図６は、スポット技術の手段による、除去前のウサギ０４６８０５由来のポリクローナル血清のエピトープ分析を表す（当該実施例では、ノイズのバックグラウンドは、３０．４±５．９３相対強度単位）。
【図７】図７は、スポット技術の手段による、ＢＮＰ−Ｋ3−ＮＨＳ−セファロース樹脂上での除去後のウサギ０４６８０５由来のポリクローナル血清のエピトープ分析を表す（当該実施例では、ノイズのバックグラウンドは、３１．３±６．３１相対強度単位）。
【図８】図８は、０．２５μｇ/ｍｌの吸着量のプロＢＮＰ（１−１０８）、ＢＮＰ（１−７６）、ＢＮＰ（７７−１０８）又はペプチドＹＴＬＲＡＰＲＳＰＫＭＶＱＧＳＧ（Ｃ１３Ｐ３０）で被覆した殻斗上で試験した、１／２に希釈したハイブリドーマ３Ｄ４の培養上清の反応性を表す。
【図９】図９は、各々の蛋白質が移動している（１レーン当たり、１μｇの蛋白質）、１６％アクリルアミドゲルの写真を示す。レーン１：分子量マーカー；レーン２：プロＢＮＰ（１−１０８）−ＧＳＴ；レーン３：ＧＳＴ（ネガティブコントロール蛋白質）；レーン４：ＢＮＰ（１−７６）−ＧＳＴ；レーン５：ＢＮＰ（７７−１０８）。
【図１０】図１０は、プロＢＮＰ（１−１０８）−ＧＳＴ（レーン２）、ＧＳＴ（ネガティブコントロール蛋白質）（レーン３）、ＢＮＰ（１−７６）−ＧＳＴ（レーン４）及びＢＮＰ（７７−１０８）（レーン５）をゲル（１ゲル当たり、１μｇの蛋白質）上に装填し、次いでニトロセルロース膜上に移す、３Ｄ４ハイブリドーマによって分泌された抗体を用いるウェスタンブロッティングアッセイの結果を示す。
【図１１】図１１は、プロＢＮＰ（１−１０８）ＩＲＭＡアッセイのスタンダードカーブを表す。
【図１２】図１２は、１４人の健常人からの試料及び心不全に苦しむ１５人の患者からの試料中のプロＢＮＰ（１−１０８）のＩＲＭＡアッセイの結果をｃｐｍ（counts per minute）で示す。
【図１３】図１３は、心不全に苦しむ１４人の患者からの試料について、本発明に従う免疫放射定量測定法の手段によって測定したプロＢＮＰ（１−１０８）（ｐｇ/ｍｌ）の濃度と、エレクシー(Ｅｌｅｃｓｙｓ)(登録商標)自動装置（ホフマン・ラロシュ社の登録商標）によるアッセイの手段によって測定したＢＮＰ（１−７６）（ｐｇ/ｍｌ）の濃度との関係を示す。
【図１４】図１４は、本発明に従うプロＢＮＰ（１−１０８）のＥＬＩＳＡＡアッセイのスタンダードカーブを表す。
【図１５】図１５は、プロＢＮＰ（１−１０８）ＥＬＩＳＡアッセイで、抗ＢＮＰ（７７−１０８）ポリクローナル抗体を共存させ、サンドウィッチに使用した、除去を行わず、ビオチンに結合させたウサギ＃０４６８０５のポリクローナル抗体のＢＮＰ（１−７６）及びＢＮＰ（７７−１０８）に関する交差反応の評価を表す。
【図１６】図１６は、プロＢＮＰ（１−１０８）ＥＬＩＳＡアッセイで、抗ＮＴ−プロＢＮＰ（１−２９）ポリクローナル抗体を共存させ、サンドウィッチに使用した、除去を行わず、ビオチンに結合させたウサギ＃０４６８０５のポリクローナル抗体のＢＮＰ（１−７６）及びＢＮＰ（７７−１０８）に関する交差反応の評価を表す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、心室性心不全のｉｎ ｖｉｔｒｏ診断の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
鬱血性の心不全は、特に高齢の人には、一般的な臨床症状である。鬱血性の心不全は、通常、運動に伴う咳、疲労及び抹消性浮腫の出現などの非特異的症状を、知らない間に引き起こすかたちで現れる。診断は、月並みに、臨床的兆候[４つのステージ、すなわちＮＹＨＡ（つまり、ニューヨーク心臓協会）のステージＩ〜ＩＶに分類される]、心エコー検査法、シンチグラフィ、運動テスト等の種々のパラメーターの研究に基いている。
【０００３】
心疾患の重大さ、またその治療の高コストのため、当該症状の早期診断が、明らかに大いに望まれている。すなわち、当該早期診断により、重度の心不全の症状の急速な進行を回避できる。そのためには、人の心不全の危険の確認が必要とされる。このことはまた、より速く、より簡便で、かつ高価でない治療モニタリングの採用を可能にしている。不幸なことに、十分満足でき、かつ実に参考となる疾患の診断方法は存在しない。
【０００４】
長年に渡り、心不全を予測する症状が起こる前のマーカーが捜し求められてきた。この点に関し、心臓肥大がナトリウム排泄増加活性を有するペプチドを生産し、分泌するという事実が説明されてきた。すなわち、心房性起源のペプチド、ＡＮＰ（atrial natriurenic peptide）が、Bold et al.,Life Science 1981,vol.28(1):89-94により、ラットで発見され、ＢＮＰ（brain natriurenic peptide）と呼ばれる心室起源のナトリウム排泄増加性ペプチドが、Sudoh et al.,Nature 1988,Vol.332:78-81により、豚で、続いてヒトで発見された。
【０００５】
ＢＮＰ前駆体は、前プロＢＮＰ（１−１３４）であり、心臓肥大では分子を前プロＢＮＰ（１−１３４）の形態で貯蔵している。当該前駆体が断されると、シグナルペプチド及びプロＢＮＰ（１−１０８）が放出される。プロＢＮＰ（１−１０８）は、１０８のアミノ酸のポリペプチドからなり、その配列は、
Ｈ1ＰＬＧＳＰＧＳＡＳＤＬＥＴＳＧＬＱＥＱＲＮＨＬＱＧＫＬＳＥＬＱＶＥＱＴＳＬＥＰＬＱＥＳＰＲＰＴＧＶＷＫＳＲＥＶＡＴＥＧＩＲＧＨＲＫＭＶＬＹＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳＧＣＦＧＲＫＭＤＲＩＳＳＳＳＧＬＧＣＫＶＬＲＲＨ108
（配列番号１）である。
【０００６】
プロＢＮＰ（１−１０８）は、分泌前及び／又は分泌中に、アミノ酸Ａｒｇ７６とＳｅｒ７７との間で切断され、まず、ＢＮＰ（７７−１０８）、ＢＮＰ−３２又はＢＮＰ（１−３２）とも言われるＢＮＰ、及びプロホルモンのＮ−末端部分、すなわちプロＢＮＰのＮ−末端フラグメント又はＮＴ−プロＢＮＰとも言われるＢＮＰ（１−７６）になる。
【０００７】
ＢＮＰ又はＢＮＰ（７７−１０８）、すなわち血管に作用する形態の分子は、３２のアミノ酸のペプチドからなり、その配列は、
Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳＧＣＦＧＲＫＭＤＲＩＳＳＳＳＧＬＧＣＫＶＬＲＲＨ108
（配列番号２）である。
【０００８】
ＮＴ−プロＢＮＰ又はＢＮＰ（１−７６）は、次の配列、
Ｈ1ＰＬＧＳＰＧＳＡＳＤＬＥＴＳＧＬＱＥＱＲＮＨＬＱＧＫＬＳＥＬＱＶＥＱＴＳＬＥＰＬＱＥＳＰＲＰＴＧＶＷＫＳＲＥＶＡＴＥＧＩＲＧＨＲＫＭＶＬＹＴＬＲＡＰＲ76
（配列番号３）を構成するプロＢＮＰ（１−１０８）の７６のＮ−末端アミノ酸からなる。
【０００９】
血中のホルホンのＢＮＰ、すなわちＢＮＰ（７７−１０８）は、心室ジストロフィーを示す患者では高値であった。その上、血漿中のＢＮＰ（７７−１０８）のアッセイでは、心室心不全を予測するマーカーとしてＢＮＰ（７７−１０８）の使用を説明してきた。
しかしながら、ホルモンのＢＮＰ（７７−１０８）が比較的不安定であることは良く知られている。その結果として、アッセイには特別の措置が必要である（Davidson, N.C.et al.,Circulation 1995,91:1276；Gobinet-Georges et al.,Clin.Chem.Lab.Med.2000; 38:519-23）。加えて、ＢＮＰの半減期は非常に短く、その血漿濃度はあまり高くない。その結果、心不全の危険においては、人によっては、一定の偽陰性の結果が観察される。従って、ＢＮＰ（７７−１０８）のアッセイは、ＮＹＨＡ分類のステージＩの患者と健常人とを正しく識別することができない（Clerico A.et al.,J.Endocrinol.Invest. 1998;21:170-9；Del Ry S, et al.,Scand.J.Clin.Lab.Invest.2000;60:81-90）。
【００１０】
当該困難を解決するために、特許出願国際公開第９３／２４５３１号パンフレットは、ＢＮＰ（１−７６）（プロＢＮＰのＮ−末端フラグメント）、すなわちＢＮＰ（７７−１０８）ホルモンと比べて長い半減期を有する多数の化合物の検出に基く、心不全のｉｎ ｖｉｔｒｏ診断方法を記載している。しかしながら、当該方法は、出願の国際公開第９３／２４５３１号パンフレットでは、血液試料中のＢＮＰ（１−７６）で実施するのは簡単ではないと考えられると記載している。事実、示した実施例のみがうまくいき、実際の血清では、合成ペプチド、ペプチドＢＮＰ（４７−６４）、ＢＮＰ（１−７６）の配列を使用すると、標準的レンジで得られた。この欠点を克服するには、それ以来、非常に洗練された自動システムが必要であることが判った。
【００１１】
論文Hunt et al.,Biochemical and Biophysical Research Communications, vol.214(3), 1995,pp.1175-1183は、プロＢＮＰ（１−１３）のＮ−末端フラグメントに対する抗血清を含む、心不全に苦しむ患者の血漿を用いるＢＮＰの競争的ＲＩＡアッセイを記述している。当該論文は、心不全患者において、ＢＮＰ（１−７６）の濃度、これはＢＮＰ(７７−１０８)の濃度と非常に良い相関を示すが、この濃度が、コントロールの人に観察される濃度と比べると非常に高いことを、はっきりと示している。
【００１２】
しかしながら、血漿ＢＮＰ（１−７６）のみを特異的に抽出するために記載されたプロトコールは、Ｓｅｐ−ｐａｋ Ｃ１８（登録商標）カートリッジ（Millipore−Waters）上で血漿を抽出した後に、ＨＰＬＣクロマトグラフィーに付す必要があるため、複雑である。その上、当該論文は、このようにして使用されてきたＲＩＡアッセイでは、プロＢＮＰ（１−１０８）は認識できるほど現れてこないことを強調している。このことは、むしろ、プロＢＮＰ（１−１０８）は心臓組織から循環系へ分泌されるが、その後、Ｎ−末端アミノ酸の切断により、非常に早く小さなペプチドに分解していく、ことを示唆している。あるいは、当該論文によれば、プロＢＮＰ（１−１０８）は、抗プロＢＮＰ（１−１０８）抗血清がそれに結合できないように存在している。最後に、ＢＮＰ（１−７６）（プロＢＮＰのＮ−末端フラグメント）は、ＢＮＰ（７７−１０８）よりもあるいはプロＢＮＰのＮ−末端フラグメントよりも、心臓機能障害のより特異的なマーカーであるとさえ示唆している。
【００１３】
論文Karl et al.,Scand.J.Clin.Lab.Invest.,1999,59(Suppl 230):177-181は、特許出願の国際公開第９３／２４５３１号パンフレットの方法と類似した、ＢＮＰ（１−７６）を検出する方法を記述しているが、患者の試料について得られた結果は示していない。
【００１４】
論文Schulz et al.,Scand.J.Clin.Lab.Invest.,2001,vol.61,pp.33-42はまた、ＢＮＰ（１−７６）（プロＢＮＰのＮ−末端フラグメント）に特異的なラジオイムノアッセイ、すなわち、抽出せずに、当該フラグメントのアミノ酸１−２１に対する抗血清を使用するアッセイを記述している。著者は、心室心不全の診断におけるＢＮＰ（１−７６）アッセイの利点と、またＢＮＰ（７７−１０８）のアッセイとの良好な相関関係を確認している。プロＢＮＰ（１−１０８）の種々の循環形態の研究において、著者は、プロＢＮＰ（１−１０８）が、プロホルモンそのものの形及び切断生成物、すなわちＢＮＰ（１−７６）（プロＢＮＰのＮ−末端フラグメント）及びＢＮＰ（７７−１０８）の形で血中を循環するという仮説を提唱した。しかしながら、プロＢＮＰ（１−１８０）の可能性のある生理学的活性及び心室心不全の予測又は診断マーカーとしてのプロＢＮＰ（１−１８０）の診断上の価値については、言及あるいは示唆が全くない。
【００１５】
論文Shimazu et al.,Clinica Chimica Acta,2002,vol.316 pp.129-135は、血中のヒトＢＮＰの分解、及び心不全患者の血漿中の免疫反応性ＢＮＰの循環分子形についての研究を示している。当該研究では、後者の血漿で、２つの免疫反応性ＢＮＰ形、すなわち高分子量ＢＮＰ（３６ＫＤで、これはプロＢＮＰ（１−１８０）のトリマーに対応する）及び低分子量ＢＮＰの存在を観察している。低分子量ＢＮＰは、ホルモンのＢＮＰ−３２（ここでは、ＢＮＰ（１−３２）と言う）のＮ−末端のセリン及びプロリンが欠けたＢＮＰ−３２の分解生成物の形（すなわち、脱ＳｅｒＰｒｏ−ＢＮＰ（ＢＮＰ３−３２））と同時に存在する。
【００１６】
プロＢＮＰ（１−１０８）及びホルモンのＢＮＰ（ＢＮＰ−３２、ＢＮＰ（１−３２）又はＢＮＰ（７７−１０８））は、心臓によって血中へ分泌される。しかしながら、著者は、オリゴマー化された形（トリマー）でのプロＢＮＰ（１−１０８）が循環ＢＮＰ（７７−１０８）の濃度と同様な濃度で存在することを示唆していると思われるが、それを測定はしていない。その結果、プロＢＮＰ（１−１０８）の濃度と患者の臨床症状との相関関係は研究されていない。結果として、プロＢＮＰ（１−１０８）血清の診断的又は予知的価値は、ここでは説明されておらず、低分子量ＢＮＰを慣例的にアッセイできることは示唆もされていない。
【００１７】
更に、プロＢＮＰ（１−１０８）に存在する一定の数のエピトープが知られている。すなわち、出願の国際公開第９７／３２９００号パンフレットのＢＮＰ（７７−１０８）検出の文脈に、ＢＮＰ（７７−１０８）の１０のＮ−末端アミノ酸（ＡＡ １−１０）に対応する配列Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳＧＣ86（配列番号１０５）のエピトープが記載されている。同様に、出願の国際公開第００／３５９５１号パンフレットのＢＮＰ（１−７６）（プロＢＮＰのＮ−末端フラグメント）検出の文脈に、ＢＮＰ（１−７６）（プロＢＮＰのＮ−末端フラグメント）の１２のＣ−末端アミノ酸に対応する配列Ｒ65ＫＭＶＬＹＴＬＲＡＰＲ76（配列番号１０６）のエピトープが記載され、類似した配列Ｈ64ＲＫＭＶＬＹＴＬＲＡＰＲ76（配列暗号１０７）は、出願の国際公開第００／４５１７６号パンフレットに記載されている。
しかしながら、上記文献の中で、当該配列の中間体及びハイブリッドであるエピトープの存在について記述又は示唆する特許出願は存在しない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
それゆえ、心不全の早期診断の状況には、先行技術の欠点を避ける方法の必要性がなお存在する。特に、一般的に使用され、信頼性があり、それ程多くは存在せず、比較的不安定なＢＮＰ（７７−１０８）検出の欠点を回避し、同時に、ＢＮＰの他の分子形をアッセイすることによって招く複合体の抽出を防ぎ、洗練された自動化を必要とする範囲で使用できる簡便な方法が必要である。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
そのため、本発明の著者は、提示された問題を解決するために、別の方法を開発しようとしてきた。本発明の中心には、本発明者によってなされた予期しない発見があり、それは、ヒンジ配列Ｙ70ＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳＧ85（配列番号４）又はプロＢＮＰ（１−１０８）の配列Ｙ70ＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳ84（配列番号１０８）のドメインに位置する特定の性質を有するエピトープであって、少なくとも配列ＲＡＰＲ76Ｓ77Ｐ（配列番号５）を含むエピトープについてである。
【００２０】
事実、ウサギを、プロＢＮＰ（１−１０８）のヒンジ領域、すなわち、配列ＣＹ70ＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳＧ85（配列番号１６）のペプチド、又は配列ＣＹ70ＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳ84（配列番号１０９）のペプチドで免疫すると、驚くべきことに、得られた抗血清は、ＢＮＰ（１−７６）形及びＢＮＰ（７７−１０８）形を実質的に認識せず、ヒンジ領域の前記ペプチドのみを特異的に認識する抗体を含むだけでなく、加えて、循環プロＢＮＰ（１−１０８）を認識する能力を有することを本発明者は発見した。
【００２１】
本願の著者は、最初に、循環プロＢＮＰ（１−１０８）が、心不全を予測する効果的なマーカーであり、健常人よりも心不全患者に著しく高い濃度で存在することも示している。
【００２２】
著者は、当該タイプの抗体の別の取得方は、完全なプロＢＮＰ（１−１０８）分子を用いて動物を免疫することであることも発見している。事実、著者は、完全なプロＢＮＰ（１−１０８）分子で免疫すると、ヒンジ領域の配列を特異的に認識する抗体の出現を誘導できることを見出している。
【００２３】
加えて、本発明の著者は、本発明に従う抗体によって認識される最小エピトープが次の配列ＲＡＰＲ76Ｓ77Ｐを有すると説明している。著者は、本発明の課題である抗体の成功した取得方法が、下記一般式：
ａ1−Ｘ1−ＲＡＰＲＳＰ−Ｘ2−ａ2 （Ｉ）
［式中、
ａ1は、水素原子であるかあるいはチオール、アルコール、アミノキシ、第一アミンもしくは第二アミン官能基、アミノカルボキシル基、ビオチニル基及びアセチル基から選ばれる官能基又は化学基を表し、
Ｘ1は、０〜３のアミノ酸のペプチド配列であって、プロＢＮＰ（１−１０８）の天然配列に由来しても由来しなくてもよい配列を表し、
Ｘ2は、０〜８のアミノ酸、好ましくは０〜７のアミノ酸のペプチド配列であって、プロＢＮＰ（１−１０８）の天然配列に由来しても由来しなくてもよい配列を表し、
ａ2は、ＯＨ官能基、ＮＨ2官能基又はアルコキシ基を表す。］
で表されるペプチドで、動物を免疫することであることも示している。
【００２４】
同様に、本発明の著者は、配列ＲＡＰＲ76Ｓ77Ｐを含むペプチド又は下記式：
Ｘ−Ｙ70ＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳＧ85−Ｚ （ＩＩ）
［式中、Ｘは、水素原子であるか又はアセチル基もしくはプロＢＮＰ（１−１０８）の配列に属さない１〜３のアミノ酸を表し、そして、Ｚは、ＯＨ官能基又はプロＢＮＰ（１−１０８）の配列に属さない１〜３のアミノ酸を表す。］
で表されるペプチドで動物を免疫することにより、同じ特異的な抗体を取得できることを示している。
【００２５】
加えて、本発明の著者は、下記式：
Ｘ−Ｙ70ＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳ84−Ｚ （ＩＩＩ）
［式中、Ｘは、水素原子であるか又はアセチル基もしくはプロＢＮＰ（１−１０８）の配列に属さない１〜３のアミノ酸を表し、そして、Ｚは、ＯＨ官能基又はプロＢＮＰ（１−１０８）の配列に属さない１〜３のアミノ酸を表す。］
で表されるペプチドで動物を免疫することにより、同じ特異的な抗体を取得できることを示している。
【００２６】
本発明の著者はまた、血中の循環プロＢＮＰ（１−１０８）の検出に基く心不全の早期診断として簡便で信頼できる方法、及び循環プロＢＮＰ（１−１０８）の当該検出を実施するためのキットを開発してきた。
【００２７】
従って、本発明の課題は、第一に、プロＢＮＰ（１−１０８）の配列Ｙ70ＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳＧ85を特異的に認識し、ＢＮＰ（１−７６）又はＢＮＰ（７７−１０８）を実質的に認識せず、第二に、ヒト血清又は血漿の試料中の循環プロＢＮＰ（１−１０８）を特異的に認識する能力を有する、ことを特徴とする抗プロＢＮＰ（１−１０８）抗体にある。
【００２８】
本発明の課題は、第一に、プロＢＮＰ（１−１０８）の配列Ｙ70ＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳ84を特異的に認識し、ＢＮＰ（１−７６）又はＢＮＰ（７７−１０８）を実質的に認識せず、第二に、ヒト血清又は血漿の試料中の循環プロＢＮＰ（１−１０８）を特異的に認識する能力を有する、ことを特徴とする抗プロＢＮＰ（１−１０８）抗体にもある。
【００２９】
本発明の課題は、特に、第一に、プロＢＮＰ（１−１０８）の配列ＰＡＰＲ76Ｓ77Ｐを特異的に認識し、ＢＮＰ（１−７６）又はＢＮＰ（７７−１０８）を実質的に認識せず、第二に、ヒト血清又は血漿の試料中の循環プロＢＮＰ（１−１０８）を特異的に認識する能力を有する、ことを特徴とする抗プロＢＮＰ（１−１０８）抗体にもある。
【００３０】
本発明の課題は、ＢＮＰ（１−７６）及びＢＮＰ（７７−１０８）を実質的に除き、プロＢＮＰ（１−１０８）の配列Ｙ70ＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳＧ85、配列Ｙ70ＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳ84及び／又は前記配列ＲＡＰＲ76Ｓ77Ｐを特異的に認識し、ヒト血清試料又は血漿試料中の循環プロＢＮＰ（１−１０８）を特異的に認識する能力を有する抗プロＢＮＰ（１−１０８）抗体を取得するための方法であって、動物をプロＢＮＰ（１−１０８）分子の全体で免疫し、ＢＮＰ（７７−１０８）ペプチド及び／又はＢＮＰ（１−７６）ペプチドを用いて、得られた抗血清を除去する方法にもある。
【００３１】
所定の特異性抗原（免疫抗原）に対して得られる「抗血清の除去」という表現は、上記抗血清を、「非特異性抗原」、すなわち免疫抗原とは異なる抗原に接触させ、インキュベートし、次いで、上記「非特異性抗原」と反応した抗体を免疫学的に分離、除去し、このように除去（すなわち、非特異性抗体の除去）された抗血清を回収することによって、当該血清中に潜在的に存在する非特異的抗体の除去を意味しようとするものである。当該除去は、慣用的に、特定の抗原に対する特異的抗血清を提供するために役立つ。
【００３２】
本発明の場合、プロＢＮＰ（１−１０８）の配列Ｙ70ＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳＧ85及び／又は配列Ｙ70ＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳ84又は配列ＲＡＰＲ76Ｓ77Ｐを認識する抗血清は、上記ＢＮＰ（７７−１０８）及び／又はＢＮＰ（１−７６）と接触させることにより、除去できる、すなわち、特異性を発現できる。例えば、後者については、固相に固定でき、当業者に知られた従来の技術に従う免疫吸着によるクロマトグラフィー用支持体として役立てることができる。
【００３３】
本発明の課題は、下記式：
ａ1−Ｘ1−ＲＡＰＲＳＰ−Ｘ2−ａ2 （Ｉ）
［式中、
ａ1は、水素原子であるかあるいはチオール、アルコール、アミノキシ、第一アミンもしくは第二アミン官能基、アミノカルボキシル基、ビオチニル基及びアセチル基から選ばれる官能基又は化学基を表し、
Ｘ1は、０〜３のアミノ酸のペプチド配列であって、プロＢＮＰ（１−１０８）の天然配列に由来しても由来しなくてもよい配列を表し、
Ｘ2は、０〜７のアミノ酸のペプチド配列であって、プロＢＮＰ（１−１０８）の天然配列に由来しても由来しなくてもよい配列を表し、
ａ2は、ＯＨ官能基、ＮＨ2官能基又はアルコキシ基を表す。］
で表されるペプチドにもある。
【００３４】
本発明の課題は、下記式：
Ｘ−Ｙ70ＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳＧ85−Ｚ （ＩＩ）
［式中、Ｘは、水素原子であるか又はアセチル基もしくはプロＢＮＰ（１−１０８）の配列に属さない１〜３のアミノ酸を表し、そして、Ｚは、ＯＨ官能基又はプロＢＮＰ（１−１０８）の配列に属さない１〜３のアミノ酸を表す。］
で表されるペプチドにもある。
【００３５】
本発明の課題は、下記式：
Ｘ−Ｙ70ＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳ84−Ｚ （ＩＩＩ）
［式中、Ｘは、水素原子であるか又はアセチル基もしくはプロＢＮＰ（１−１０８）の配列に属さない１〜３のアミノ酸を表し、そして、Ｚは、ＯＨ官能基又はプロＢＮＰ（１−１０８）の配列に属さない１〜３のアミノ酸を表す。］
で表されるペプチドにもある。
【００３６】
上記式（Ｉ）及び（ＩＩ）において、アミノ酸の数（Ｙ70、Ｒ76、Ｓ77、Ｓ84又はＧ85）が、本発明の理解、及びプロＢＮＰ（１−１０８）配列に関する式（Ｉ）と（ＩＩ）の配列の位置づけに役立つように自然に維持されていたことは注目に値すべきである。本願中の他の配列に関する数についても同じことが当てはまる。
【００３７】
本発明は、配列Ｘ−Ｙ70ＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳＧ85−Ｚ（ＩＩ）、又は配列Ｘ−Ｙ70ＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳ84−Ｚ（ＩＩＩ）、あるいは部分ＲＡＰＲ76Ｓ77Ｐをそのまま維持（特に非置換）する条件下で、位置７０のアミノ酸の内の一つを位置８５又は８４に伝統的に又は非伝統的に置換した形での上述の配列（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）の内の一つをそれぞれ含むペプチドにも関する。
【００３８】
従って、本発明は、アミノ酸Ｙ70、Ｔ71、Ｌ72、Ｋ79、Ｍ80、Ｖ81、Ｑ82、Ｇ83、Ｓ84及びＧ85の内の１以上のアミノ酸で置換された配列Ｘ−Ｙ70ＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳＧ85−Ｚ（ＩＩ）又は配列Ｘ−Ｙ70ＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳ84−Ｚ（ＩＩＩ）であって、Ｘがないか又はアセチル基もしくはプロＢＮＰ（１−１０８）の配列に属さない１〜３のアミノ酸を表し、そして、Ｚがないか又はＯＨ官能基もしくはプロＢＮＰ（１−１０８）の配列に属さない１〜３のアミノ酸であり得る配列に由来する配列を含むペプチドである。
【００３９】
最後に、本発明は、配列Ｙ70ＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳＧ85のペプチド及び配列Ｙ70ＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳ84のペプチドに関する。
【００４０】
本発明の課題は、ＢＮＰ（１−７６）及びＢＮＰ（７７−１０８）を実質的に除き、プロＢＮＰ（１−１０８）の配列Ｙ70ＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳＧ85、配列Ｙ70ＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳ84及び／又は配列ＲＡＰＲ76Ｓ77Ｐを特異的に認識し、ヒト血清試料又は血漿試料中の循環プロＢＮＰ（１−１０８）を特異的に認識する能力を有する抗プロＢＮＰ（１−１０８）抗体を取得するための方法であって、下記式：
ａ1−Ｘ1−ＲＡＰＲＳＰ−Ｘ2−ａ2 （Ｉ）
［式中、ａ1、Ｘ1、Ｘ2及びａ2は、前記と同じ意味である。］
で表されるペプチドで動物を免疫し、場合により、ＢＮＰ（７７−１０８）ペプチド及び／又はＢＮＰ（１−７６）ペプチドを用いて、得られた抗血清を除くことを特徴とする方法にもある。このようにして得られた抗体は、単一特異的な抗体である。
【００４１】
本発明の課題は、ＢＮＰ（１−７６）及びＢＮＰ（７７−１０８）を実質的に除き、プロＢＮＰ（１−１０８）の配列Ｙ70ＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳＧ85、配列Ｙ70ＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳ84及び／又は配列ＲＡＰＲ76Ｓ77Ｐを特異的に認識し、ヒト血清試料又は血漿試料中の循環プロＢＮＰ（１−１０８）を特異的に認識する能力を有する抗プロＢＮＰ（１−１０８）抗体を取得するための方法であって、
下記式：
Ｘ−Ｙ70ＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳＧ85−Ｚ （ＩＩ）
又は下記式：
Ｘ−Ｙ70ＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳ84−Ｚ （ＩＩＩ）
［式中、Ｘ及びＺは、前記で定義したとおりである。］
で表されるペプチドで動物を免疫し、場合により、ＢＮＰ（７７−１０８）ペプチド及び／又はＢＮＰ（１−７６）ペプチドを用いて、得られる抗血清を除くことを特徴とする方法にもある。
【００４２】
本発明の課題は、ＢＮＰ（１−７６）及びＢＮＰ（７７−１０８）を実質的に除き、プロＢＮＰ（１−１０８）の配列Ｙ70ＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳＧ85、配列Ｙ70ＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳ84及び／又は配列ＲＡＰＲ76Ｓ77Ｐを特異的に認識し、ヒト血清試料又は血漿試料中の循環するプロＢＮＰ（１−１０８）を特異的に認識する能力を有する抗プロＢＮＰ（１−１０８）抗体を分泌するハイブリドーマを取得するための方法であって、
下記式：
Ｘ−Ｙ70ＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳＧ85−Ｚ （ＩＩ）
又は下記式：
Ｘ−Ｙ70ＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳ84−Ｚ （ＩＩＩ）
［式中、Ｘ及びＺは、前記で定義したとおりである。］
の部分ＲＡＰＲ76Ｓ77Ｐをそのまま維持（特に非置換）する条件下で、伝統的に又は非伝統的に置換された形でのペプチドで動物を免疫し、場合により、ＢＮＰ（７７−１０８）ペプチド及び／又はＢＮＰ（１−７６）ペプチドを用いて、得られた抗血清を除くことを特徴とする方法にもある。
【００４３】
本発明の課題は、ＢＮＰ（１−７６）ペプチド及びＢＮＰ（７７−１０８）ペプチドを実質的に除き、プロＢＮＰ（１−１０８）の配列Ｙ70ＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳＧ85、配列Ｙ70ＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳ84及び／又は配列ＲＡＰＲ76Ｓ77Ｐを特異的に認識し、ヒト血清試料又は血漿試料中の循環プロＢＮＰ（１−１０８）を特異的に認識する能力を有する抗プロＢＮＰ（１−１０８）抗体を取得するための方法であって、配列Ｙ70ＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳＧ85のペプチド又は配列Ｙ70ＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳ84のペプチドで動物を免疫し、場合により、ＢＮＰ（７７−１０８）ペプチド及び／又はＢＮＰ（１−７６）ペプチドを用いて、得られた抗血清を除くことを特徴とする方法にもある。
【００４４】
本発明の課題は、ＢＮＰ（１−７６）及びＢＮＰ（７７−１０８）を実質的に除き、プロＢＮＰ（１−１０８）の配列Ｙ70ＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳＧ85、配列Ｙ70ＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳ84及び／又は配列ＲＡＰＲ76Ｓ77Ｐを特異的に認識し、ヒト血清試料又は血漿試料中の循環するプロＢＮＰ（１−１０８）を特異的に認識する能力を有する抗プロＢＮＰ（１−１０８）抗体を分泌するハイブリドーマを取得するための方法であって、
次式：
ａ1−Ｘ1−ＲＡＰＲＳＰ−Ｘ2−ａ2 （Ｉ）
［式中、ａ1、Ｘ1、Ｘ2及びａ2は上記と同じ意味である。］；
Ｘ−Ｙ70ＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳＧ85−Ｚ （ＩＩ）
［式中、Ｘ及びＺは上記と同じ意味である。］；
Ｘ−Ｙ70ＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳ84−Ｚ （ＩＩＩ）
［式中、Ｘ及びＺは上記と同じ意味である。］；
部分ＲＡＰＲ76Ｓ77Ｐをそのまま維持（特に非置換）する条件下で、伝統的に又は非伝統的に置換された形での
Ｘ−Ｙ70ＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳＧ85−Ｚ （ＩＩ）
［式中、Ｘ及びＺは上記と同じ意味である。］；
部分ＲＡＰＲ76Ｓ77Ｐをそのまま維持（特に非置換）する条件下で、伝統的に又は非伝統的に置換された形での
Ｘ−Ｙ70ＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳ84−Ｚ （ＩＩＩ）
［式中、Ｘ及びＺは上記と同じ意味である。］；
Ｙ70ＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳＧ85；及び
Ｙ70ＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳ84
のペプチドから選ばれるペプチドで動物を免疫し、
イムノグロブリン分泌リンパ球を当該動物から採取し、次いで、
当該リンパ球をミエローマ細胞と融合して、少なくとも一種のイムノグロブリン分泌ハイブリドーマを得る、
ことを特徴とする方法にもある。
【００４５】
上記の方法は、ハイブリドーマ取得の慣用的な技術、すなわちKohler and Milstein,(1975) Nature(London),256:495-497に記載された原理に対応する。
【００４６】
本発明の課題は、このようなハイブリドーマ及び上記ハイブリドーマによって分泌されるモノクローナル抗プロＢＮＰ（１−１０８）抗体にもある。
【００４７】
本発明の課題は、生物学的試料、好ましくは血液、血漿又は血清を、ＢＮＰ（１−７６）及びＢＮＰ（７７−１０８）を実質的に除き、プロＢＮＰ（１−１０８）の配列Ｙ70ＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳＧ85、配列Ｙ70ＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳ84及び／又は配列ＲＡＰＲ76Ｓ77Ｐを特異的に認識し、ヒト血清試料又は血漿試料中の循環プロＢＮＰ（１−１０８）を特異的に認識する能力を有する抗プロＢＮＰ（１−１０８）抗体に接触させること、並びに試料中のプロＢＮＰ（１−１０８）を検出することを含む、ヒトの心不全のｉｎ ｖｉｔｒｏ診断の方法にもある。
【００４８】
本発明は、一般的に、ヒトの心不全のｉｎ ｖｉｔｒｏ診断方法であって、
ａ）生物学的試料、好ましくは血液、血漿又は血清を、ＢＮＰ（１−７６）及びＢＮＰ（７７−１０８）を実質的に除き、プロＢＮＰ（１−１０８）の配列Ｙ70ＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳＧ85、配列Ｙ70ＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳ84及び／又は配列ＲＡＰＲ76Ｓ77Ｐを特異的に認識し、ヒト血清試料又は血漿試料中の循環プロＢＮＰ（１−１０８）を特異的に認識する能力を有する抗プロＢＮＰ（１−１０８）抗体に接触させること、
ｂ）抗原抗体複合体の形成を可能にする条件下で、当該混合物をインキュベートすること、及び
ｃ）場合により、一次複合体中に存在するプロＢＮＰ（１−１０８）に特異的に結合できる標識検出抗体を用いるか、又は一次複合体中に存在する上記プロＢＮＰ（１−１０８）に対する抗体に結合できる標識検出抗原を用いるかして、形成された抗原抗体複合体を明らかにすること、
を含む方法を提供する。
【００４９】
特に、本発明は、上述のステップａ、ｂ及びｃに加えて、明らかにされた抗原抗体複合体の量を、人の臨床症状と相関させるためのステップｄ）を含む、ヒトの心不全のｉｎ ｖｉｔｒｏ診断方法を提供する。
【００５０】
本発明の課題は、生物学的な試料、特に血液、血漿又は血清の試料中のプロＢＮＰ（１−１０８）を検出するためのキットであって、ＢＮＰ（１−７６）及びＢＮＰ（７７−１０８）を実質的に除き、プロＢＮＰ（１−１０８）の配列Ｙ70ＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳＧ85、配列Ｙ70ＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳ84及び／又は配列ＲＡＰＲ76Ｓ77Ｐを特異的に認識し、ヒト血清試料又は血漿試料中の循環プロＢＮＰ（１−１０８）を特異的に認識する能力を有する、少なくとも一つの抗プロＢＮＰ（１−１０８）抗体を含むキットでもある。
【００５１】
最後に、本発明は、生物学的な試料、特に血液、血漿又は血清の試料中のプロＢＮＰ（１−１０８）を検出するためのキットであって
次式：
ａ1−Ｘ1−ＲＡＰＲＳＰ−Ｘ2−ａ2 （Ｉ）
［式中、ａ1、Ｘ1、Ｘ2及びａ2は上記と同じ意味である。］；
Ｘ−Ｙ70ＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳＧ85−Ｚ （ＩＩ）
［式中、Ｘ及びＺは上記と同じ意味である。］；
部分ＲＡＰＲ76Ｓ77Ｐをそのまま維持（特に非置換）する条件下で、伝統的に又は非伝統的に置換された形での
Ｘ−Ｙ70ＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳＧ85−Ｚ （ＩＩ）
［式中、Ｘ及びＺは上記と同じ意味である。］；
部分ＲＡＰＲ76Ｓ77Ｐをそのまま維持（特に非置換）する条件下で、伝統的に又は非伝統的に置換された形での
Ｘ−Ｙ70ＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳ84−Ｚ （ＩＩＩ）
［式中、Ｘ及びＺは上記と同じ意味である。］；
Ｙ70ＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳＧ85；及び
Ｙ70ＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳ84
のペプチドの群より選ばれる少なくとも一つのペプチドを含む化合物を、スタンダード及び／又はコントロールとして含むキットに関する。
【００５２】
＜定義＞
本発明の文脈において、「生物学的試料」又は「生物学的に流動性の試料」は、好ましくは、血液、血漿、血清、尿、濃脊髄液、唾液等の生物学的液体からなる。
【００５３】
「心不全」の用語は、心臓機能の異常が、器官の代謝要求を満足する程に十分に心臓が血液を送れないことに起因する、及び／又は、心臓が、異常な高充填圧力を除いて、当該要求を満たしていない、病状を意味することを意図している。特に、右及び／又は左の心不全である。
【００５４】
「抗体」の用語は、完全な抗体又は抗体の機能的フラグメント（遺伝子工学によって得られるものでも又は得られないものでもよい）であって、前記抗体を、少なくとも一つの抗原結合サイトにおいて、抗原性化合物の少なくとも一つの抗原決定部に結合させることを含む、あるいは結合させることからなるものを言う。
抗体フラグメントの例を挙げれば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’と（Ｆａｂ‘）２フラグメント、及び１本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ鎖）である。
【００５５】
本発明による抗プロＢＮＰ（１−１０８）抗体は、ポリクローナ抗体でも又はモノクローナル抗体でもよい。本発明に従うポリクローナル抗プロＢＮＰ（１−１０８）抗体は、特に、ウサギ、マウス等の動物をプロＢＮＰ（１−１０８）全体を使って免疫し、得られる抗血清を採取し、そしてそれを、例えばＢＮＰ（７７−１０８）及び／又はＢＮＰ（１−７６）を含む免疫吸着剤上で、それ自体当業者に知られた方法に従って除去することによって得られる。本発明に従うモノクローナル抗プロＢＮＰ（１−１０８）抗体は、特に、Kohler and Milstein(Nature(London),256:495-497(1975)の慣用的な方法によって得られる。
【００５６】
モノクローナル抗体又は単一特異的ポリクローナル血清、あるいは遺伝子ライブラリーをスクリーニングすることによって得られる抗体の製造は、本発明の文脈では有用であり、後に詳述する慣用的技術によってなされる。
【００５７】
「抗体捕獲」の用語は、抗体又は一部分の抗体、好ましくは固相に結合した抗体であって、生物学的試料中に存在するプロＢＮＰ（１−１０８）抗原を親和性結合によって保持できるものを意味する意図である。
【００５８】
生物学的試料中の抗原の存在は、「検出手段」によって明らかになる。抗原の検出に関して、少なくとも一つの「検出用抗体」を用いる特定の検出を想定している。かかる検出用抗体は、標識されており、親和性結合によって、捕獲された抗原に結合することができ、また捕獲抗体によって認識されるエピトープ部位とは異なったエピトープ部位を認識することができる。
【００５９】
「標識された」の用語は、直接標識（酵素、放射性同位体、蛍光色素、発光性化合物等の手段）及び非直接標識（例えばそれ自体が直接標識された抗体の手段、又は、限定されないが、標識アビジン−ビオチンペア等の標識「親和性ペア」の試薬を使用する手段）の両方を言う。
【００６０】
「抗原性フラグメント」の用語は、免疫された動物中に、プロＢＮＰ（１−１０８）のみに実質的に特異的な抗体の合成を誘導することができる、プロＢＮＰ（１−１０８）の部分を意味する意図である。
【００６１】
本発明によれば、「抗原性フラグメント」は、少なくとも「エピトープサイト」又はエピトープＲＡＰＲ76Ｓ77Ｐを含む。「エピトープサイト」又は「エピトープ」は、少なくとも一つの抗体によって認識され、その特異的結合をつくるアミノ酸の配列である。
【００６２】
「単一特異的ポリクローナル抗体」の用語は、一つのエピトープに特異性を有するポリクローナル抗体について使用する。これは、抗体が、当該エピトープを含むアミノ酸を含有するプロＢＮＰ（１−１０８）配列のアミノ酸配列に結合できるが、当該エピトープを含むアミノ酸を含有しない配列プロＢＮＰ（１−１０８）のアミノ酸配列には結合できないことを意味する。
【００６３】
「特異的に」の用語は、抗原に対する抗体の認識又は特異的結合について言う場合には、抗体が、他の抗原とは実質的に相互作用することなく、当該抗原と相互作用することを意味し、あるいはエピトープについて「特異的」認識と言う場合には、当該エピトープの事実上唯一の認識を意味する。会合定数は、１０8Ｌ.ｍｏｌ-1よりも大きいことが好ましい。
【００６４】
「保守的置換」の用語は、特に、ある類のアミノ酸を同じ類のアミノ酸に置換することであって、その置換は、得られるペプチドの免疫反応性を、もとのペプチドの免疫反応性に比べて著しくは変化させないことを意味する意図である。種々のアミノ酸の類の中では、極性側鎖を有するアミノ酸（アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン及びチロシン等）非極性側鎖を有するアミノ酸（グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン及びシステイン等）、塩基性側鎖を有するアミノ酸（リジン、アルギニン及びヒスチジン等）及び酸性側鎖を有するアミノ酸（アスパラギン酸、グルタミン酸等）に一般的に分類される。
【００６５】
「非伝統的な置換」の用語は、もとのペプチドの免疫反応性に比較して、得られるペプチドの免疫反応性を実質的に変化させない他のタイプの置換を意味する意図である。
【００６６】
「ＢＮＰ（１−７６）又はＢＮＰ（７７−１０８）を実質的に認識しない」の用語は、本発明による標的抗体が、２０％未満、特に１０％未満、好ましくは５％未満のＢＮＰ（１−７６）又はＢＮＰ（７７−１０８）と交差反応を示すことを意味する意図である。交差反応の割合は、それ自体当業者に知られた方法、例えば実施齢５に例示した方法に従って決定される。
【００６７】
ＢＮＰ（１−７６）又はＢＮＰ（７７−１０８）ペプチドの「実質的な」非認識は、本発明の抗体と当該ペプチドとの反応が存在しない、又は実質的に存在しないことに相当する。
【００６８】
「ＢＮＰ（１−７６）又はＢＮＰ（７７−１０８）を実質的に除き」の用語は、抗体が、上記に意味において、「実質的にＢＮＰ（１−７６）又はＢＮＰ（７７−１０８）を認識しない」ことを意味する意図である。
【発明の効果】
【００６９】
本発明により、ヒトプロＢＮＰ（１−１０８）のヒンジ領域に位置する新規なエピトープ、ＲＡＰＲ76Ｓ77Ｐを発見し、それを含む免疫原性ペプチドを得、更に、ＢＮＰ（１−７６）及びＢＮＰ（７７−１０８）を実質的に認識しないプロＢＮＰ（１−１０８）に特異的な抗体であって、その中の、ヒト血清又は血漿試料中の循環プロＢＮＰ（１−１０８）を特異的に認識する能力を有する抗体を取得できた、ことは開示の全体から明らかである。
【００７０】
本発明により、心不全を簡便に、一般的にかつ確実に診断することを可能にする循環プロＢＮＰ（１−１０８）ためのアッセイを開発することができたことも明らかである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００７１】
＜特異的抗体の製造＞
本発明で使用する抗体は、抗原特異性抗体であり、それゆえ、モノクローナル抗体又は単一特異的ポリクローナル抗体、すなわち一つのエピトープのみを特異的に認識する抗体である。
【００７２】
モノクローナル抗体は、Kohler and Milstein,Nature,1975,256:495-497によって説明されているリンパ球融合及びハイブリドーマ培養の慣用的方法によって取得できる。他のモノクローナル抗体の製造方法は（Harlow et al.,ed.,1988「抗生物質：研究室マニュアル」）でも知られている。モノクローナル抗体は、哺乳類（例えばマウス、ラット、ウサギ、ヒト等）を免疫し、リンパ球融合技術を用いて、ハイブリドーマを樹立することにより製造できる（Kohler and Milstein,1975）。
【００７３】
当該一般的な技術にとって換わる技術がある。例えば、ハイブリドーマからクローニングした核酸を発現することによってモノクローナル抗体を製造することができる。ファージ表示技術、すなわち、通常、線状ファージであって、当該ファージの表面にＶ遺伝子ライブラリーを与えるベクターにｃＤＮＡを導入することによって、モノクローナル抗体を製造することもできる（例えば大腸菌についてｆｕＳＥ５,J.K.Scott and G.P.Smith,Science,1990,249:386-390）。当該抗体ライブラリーを構築するためのプロトコールは、Marks et al.,1991,J.Mol.Biol,222:581-597に記載されている。
【００７４】
ポリクローナル抗体は、通常の手段に従い、本来ペプチドである抗原に免疫にした動物の血清から取得できる。このようにして得られたポリクローナル抗体は、必要ならば、それ自体当業者に知られた技術、例えばカラム免疫吸着剤に従い、ＢＮＰ（７７−１０８）及びＢＮＰ（１−７６）で除去することにより、配列Ｙ70ＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳＧ85、配列Ｙ70ＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳ84及び／又はＲＡＰＲ76Ｓ77Ｐを含むペプチドに対する単一特異性を発現し、実質的にＢＮＰ（１−７６）及びＢＮＰ（７７−１０８）を除き、プロＢＮＰ（１−１０８）についての特異性を確実にする。
【００７５】
＜捕獲抗体及び／又は検出抗体＞
サンドウィッチ技術では、捕獲抗体は、患者の天然抗原上のエピトープを特異的に認識するものを選択する。一方、検出抗体は、患者の天然抗原上の別のエピトープを特異的に認識するものを選択し、これは必ずしも好ましいことではない。
【００７６】
生物学的試料は、前段階で場合により処理し、検出するエピトープの露出を促進する条件下で、少なくとも一つの捕獲抗体と共に直接使用することができる。
【００７７】
本発明に従う診断方法は、当業者によく知られた種々のフォーマット、すなわち、固相又は均一相で、１段階又は２段階で、サンドウィッチ法又は競合法など限定されない例により実施できる。
【００７８】
好ましい具体例によれば、捕獲抗体は、固相上で免疫する。限定されない固相の例としては、マイクロプレート、特にDynal又はMerck-Eurolab（フランス）により市販されているポリスチレンマイクロプレートを使用してもよい。Dynal又はMerck-Eurolab（フランス）（登録商標はＥｓｔａｐｏｒ）によって提供される固相粒子もしくは固相ビーズ、常磁性ビーズ又はポリスチレンもしくはプロピレン試験管なども使用できる。
【００７９】
２つの抗体のサンドウィッチ（捕獲抗体及び検出抗体）等のイムノアッセイフォーマットは、生物学的試料中の抗原の検出に特に有利である。競合によって抗原を検出するイムノアッセイフォーマットも使用できる。他のイムノアッセイ様式もまた想定でき、当業者によく知られている。
【００８０】
ＥＬＩＳＡアッセイ、放射性免疫アッセイ又は他の検出技術は、形成した抗原抗体複合体の存在を明らかにするのに使用できる。
【００８１】
＜キット＞
本発明の方法に従う生物学的流動性試料中のプロＢＮＰ（１−１０８）の検出に使用するキット及び試薬は、多数の生物学的試料に簡便で適用可能である本発明の実施に提供できる。
【００８２】
生物学的試料中のプロＢＮＰ（１−１０８）の検出キットは、上で定義した少なくとも一つの抗体を含んでもよい。上で定義した式（Ｉ）もしくは（ＩＩ）のペプチド又は置換ペプチドの少なくとも一つを、スタンダード及び／又はコントロールとして含む他のキットも、本発明の実施に有用である。
【００８３】
そこで、別の特別な本発明の課題は、生物学的流動性試料中のプロＢＮＰ（１−１０８）を検出するキットである。このキットは、ＢＮＰ（１−７６）及びＢＮＰ（７７−１０８）を実質的に除き、プロＢＮＰ（１−１０８）の配列Ｙ70ＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳＧ85、配列Ｙ70ＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳ84及び／又は配列ＲＡＰＲ76Ｓ77Ｐを特異的に認識し、ヒト血清試料又は血漿試料中の循環プロＢＮＰ（１−１０８）を特異的に認識する能力を有する、少なくとも一つの抗プロＢＮＰ（１−１０８）抗体であって、好ましくは、前記生物学的試料中に存在する前記プロＢＮＰ（１−１０８）を捕獲するための抗体、並びに形成する抗原抗体複合体に特異的に結合できる標識コンジュゲート、を含む。
【００８４】
上述のように、捕獲抗体は、有利なことに、マイクロプレート、これに限定されるものではないが、のような固相上に固定化した形態で提供される。
【００８５】
好ましいキットは少なくとも、ＢＮＰ（１−７６）及びＢＮＰ（７７−１０８）を実質的に除き、プロＢＮＰ（１−１０８）の配列Ｙ70ＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳＧ85、配列Ｙ70ＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳ84及び／又は配列ＲＡＰＲ76Ｓ77Ｐを特異的に認識し、ヒト血清試料又は血漿試料中の循環プロＢＮＰ（１−１０８）を特異的に認識する能力を有する、抗プロＢＮＰ（１−１０８）捕獲抗体であって、固相上に固定されている抗体；並びにプロＢＮＰ（１−１０８）の別のエピトープであって、そのままのエピトープに対する標識検出抗体；あるいは、場合により、プロＢＮＰ（１−１０８）ペプチド又はプロＢＮＰ（１−１０８）そのものである標識検出抗原を含む。
【００８６】
特定の具体例によれば、生物学的試料中のプロＢＮＰ（１−１０８）を検出するためのキットは、一つの容器には、上で定義した少なくとも一つの抗体；並びにもう一つの容器には、スタンダード及び／又はコントロールとして特に有用である上で定義した少なくとも一つのペプチドを含んでもよい。
【００８７】
以下の図及び実施例は本発明を説明するものであるが、範囲を限定するものではない。
【実施例１】
【００８８】
実施例１：免疫用のペプチドの合成
合成ペプシドは、当業者によく知られた技術によって製造できる。例を挙げれば、簡単に実施できるという利点を有するメリフィールド型の合成によって製造できる（Merrifield,（1963）；R.C.Sheppard(1971)；Atherton et al.(1989)）。自動合成装置として、ミリポア（Millipore）の「９０５０プラス・ペップ・シンセザイザー」、パースペクティブ(Perspective)の「パイオニア」シンセサイザイー又はＡＢＩの「４３３Ａ」シンセサイザイーが使用できる。ペプチドは、均一相合成によっても得られる。
【００８９】
ここでの合成は、「Ｆｍｏｃ」（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル）化学を使ってパイオニアシンセサイザイーで行った。各ステップでは、試薬[すなわち、保護アミノ酸及びカップリング活性化剤（ＴＢＴＵ(２−(１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル)−１，１，３，３−テトラメチル−ウロニウム）]を大過剰に（試薬のモル／樹脂上の置換可能な基のモルの比５で）加えた。合成の最後には、ペプチドは、トリフルオロ酢酸系溶液（試薬Ｋ）で樹脂から分離した。このペプチドは、冷エーテル溶液で沈殿させ、そしてＨＰＬＣで精製した。
【００９０】
本発明者は、ヒンジ領域Ｒ76Ｓ77のアミノ酸配列を含む以下のペプチドを合成した。
配列番号６：Ｃ−Ｇ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ
配列番号７：アセチル−Ｃ−Ｇ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ
配列番号８：Ｃ−Ｇ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ｋ
配列番号９：アセチル−Ｃ−Ｇ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ｋ
配列番号１０：Ｃ−Ｇ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ｋ−Ｍ−Ｖ
配列番号１１：Ｃ−Ｇ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ｋ−Ｍ−Ｖ−Ｑ−Ｇ−Ｓ−Ｇ
配列番号１２：Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ｇ−Ｃ
配列番号１３：アセチル−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ｇ−Ｃ
配列番号１４：アセチル−Ｃ−Ｙ−Ｔ−Ｌ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ｋ
配列番号１５：Ｃ−Ｈ−Ｒ−Ｋ−Ｍ−Ｖ−Ｌ−Ｙ−Ｔ−Ｌ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ｋ
配列番号１６：Ｃ−Ｙ−Ｔ−Ｌ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ｋ−Ｍ−Ｖ−Ｑ−Ｇ−Ｓ−Ｇ（ペプチドＣ１３Ｐ３０）
配列番号１７：Ｃ−Ｆ−Ｔ−Ｌ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ｋ−Ｍ−Ｖ−Ｑ−Ｇ−Ｓ−Ｇ
配列番号１８：Ｃ−Ｆ−Ｓ−Ｉ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ｋ−Ｍ−Ｖ−Ｑ−Ｇ−Ｓ−Ｇ
配列番号１９：Ｃ−Ｙ−Ｔ−Ｌ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ｋ−Ｍ−Ｖ−Ｑ−Ｇ−Ｓ−βＡ
配列番号２０：Ｃ−Ｙ−Ｔ−Ｌ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ｋ−Ｍ−Ｖ−Ｑ−Ａ−Ｔ−βＡ
配列番号２１：Ｃ−Ｆ−Ｓ−Ｉ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ｋ−Ｍ−Ｖ−Ｑ−Ａ−Ｔ−βＡ
配列番号２２：Ｃ−Ｆ−Ｓ−Ｉ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ｓ−Ｇ−Ｔ−Ａ
及び
配列番号１０９：Ｃ−Ｙ−Ｔ−Ｌ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ｋ−Ｍ−Ｖ−Ｑ−Ｇ−Ｓ（ペプチドＣＮ３２）
配列番号１１０：Ｃ−Ｙ−Ｔ−Ｌ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ｋ
配列番号１１１：Ｃ−Ｙ−Ｔ−Ｌ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ｋ−Ｍ−Ｖ
配列番号１１２：Ｃ−Ｙ−Ｔ−Ｌ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ｋ−Ｍ−Ｖ−Ｑ
配列番号１１３：Ｃ−Ｙ−Ｔ−Ｌ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ｋ−Ｍ−Ｖ−Ｑ−Ｇ
配列番号１１４：アセチル−Ｃ−Ｔ−Ｌ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ｋ−Ｍ−Ｖ−Ｑ
配列番号１１５：Ｃ−Ｔ−Ｌ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ｋ−Ｍ−Ｖ−Ｑ−Ｇ
配列番号１１６：Ｃ−Ｔ−Ｌ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ｋ−Ｍ−Ｖ−Ｑ−Ｇ−Ｓ
配列番号１１７：Ｃ−Ｔ−Ｌ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ｋ−Ｍ−Ｖ−Ｑ−Ｇ−Ｓ−Ｇ
配列番号１１８：Ｃ−Ｌ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ｋ−Ｍ−Ｖ
配列番号１１９：Ｃ−Ｌ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ｋ−Ｍ−Ｖ−Ｑ
配列番号１２０：Ｌ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ｋ−Ｍ−Ｖ−Ｑ−Ｃ
配列番号１２１：Ｃ−Ｌ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ｋ−Ｍ−Ｖ−Ｑ−Ｇ−Ｓ
配列番号１２２：Ｃ−Ｌ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ｋ−Ｍ−Ｖ−Ｑ−Ｇ−Ｓ−Ｇ
注：βＡはβ−アラニンを意味する。
【００９１】
実施例２：免疫用の担体蛋白質へのペプチドの結合
ペプチドは、ペプチドの免疫原性を高めるために、種々の機能（チオール、アミン、アルデヒド等）によって、担体蛋白質、ＫＬＨ（Keyhole Limpet Hemocyanin）、チログロブリン、ＢＳＡ（牛胎児血清）に結合した。ペプチドを蛋白質に結合させるために使用するカップリング剤は、ヘテロ二官能性又はホモ二官能性である。最も一般的に使用される試薬は、ＢＳ３、ｓＳＭＣＣ、ＳＰＤＰ、グルタールアルデヒド等である。使用するカップリング技術の一つは、化学カップリング剤としてグルタールアルデヒド、担体蛋白質としてＫＬＨを用いる技術である。ＫＬＨのペプチドへの結合は、ペプチドのアミン機能を使用して行った（主にリジンによるＮ−末端基及びアミノ基）。
【００９２】
配列ＹＴＬＲＡＰＲＳＰＫＭＶＱＧＳＧ−ＮＨ2（配列番号１６）のペプチドＣ１３Ｐ３０又は配列ＹＴＬＲＡＰＲＳＰＫＭＶＱＧＳ−ＮＨ2（配列番号１０９）のペプチドＣＮ３２の５ｍｇ/ｍｌ溶液は、ｐＨ７．４の０．１５Ｍ ＮａＣｌを含むダルベッコ ＰＢＳ緩衝液で調製した。ＰＢＳ緩衝液で１０ｍｇ/ｍｌＫＬＨ溶液となるように、２０ｍｇの乾燥ＫＬＨのＰＢＳ緩衝液ボトル(Pierce＃77600)をとり、２ｍｌの水で注射調製した。
【００９３】
１ｍｌのペプチド溶液（すなわち、５ｍｇ）を１．２５ｍｌのＫＬＨ溶液（すなわち、１２．５ｍｇ）と混合した。吸引フードの下で、調製した２．２５ｍｌの２％グルタールアルデヒド溶液（２５％グルタールアルデヒド、Sigma＃G-5882）を当該混合物に即座に加えた。ＫＬＨ複合体の生成を避けるため、２％グルタールアルデヒド溶液は、１滴ずつ、混合物を攪拌しながら加えた。コンジュゲーション反応は、室温で２時間３０分インキュベートしながら行った。カップリング反応は、１０ｍｇ/ｍｌの最終濃度となるように、１００ｍｇ/ｍｌ水素化ホウ素ナトリウム溶液を加えて停止した。反応混合物を４℃で一晩インキュベートした。最後に、この溶液を、ｐＨ７．４のダルベッコ ＰＢＳ緩衝液で、４℃で一晩透析した。この溶液を最後に等分し、−８０℃で保存した。
【００９４】
実施例３：ペプチドによる免疫
ポリクローナル抗体の作製のために、ウサギ（ニュージーランド種の雌）を、実施例２に従って、ＫＬＨに結合したペプチドＣｙｓ−ＹＴＬＲＡＰＲＳＰＫＭＶＱＧＳＧ−ＮＨ2で免疫した。最初の注射用に、１．５ｍｌの完全フロイントアジュバント（Sigma＃F-5881）と共に、１．５ｍｌのＫＬＨ結合ペプチドのエマルションを調製し、１ｍｌの完全フロイントアジュバント（すなわち、２００μｇのペプチド）を各ウサギに皮内注射した。１ｍｌのＫＬＨ結合ペプチド（すなわち、２００μｇのペプチド）のエマルションを完全フロイントアジュバント（Sigma＃F-5881）と共に皮内注射することにより、２０日間離して２回の追加免疫を行った。第二の追加免疫の２０日後に、前の追加免疫と同じ方法、但し皮下注射で第三の追加免疫を行った。第三の追加免疫を行い、得られた抗体の力価を評価した２０日後に、ウサギの採血を行った。
【００９５】
特に、ＫＬＨに結合したペプチドＣ−ＹＴＬＲＡＰＲＳＰＫＭＶＱＧＳＧ−ＮＨ2（配列番号１６）の免疫によって得られる、番号＃０４６８０５及び０４６８３２によって特定されるウサギ由来のポリクローナル抗体、並びにＫＬＨに結合したペプチドＣ−ＹＴＬＲＡＰＲＳＰＫＭＶＱＧＳ−ＮＨ2（配列番号１０９）の免疫によって得られる、数＃Ｌ０１２３５によって特定されるウサギ由来のポリクローナル抗体は、本研究のその他として用いた。
【００９６】
実施例４：抗体の取得及び精製
精製した後、ウサギ血清を４℃、４５００ｒｐｍで３０分間遠心した。静置して分離後、当該血清を半分、１Ｍ Ｎａｃｌを含むｐＨ８．０の１．５Ｍグリセリン緩衝液で希釈した。
【００９７】
実施例４ａ：プロテインＡ−セファロース上でのＩｇＧ精製
ポリクローナル抗体の精製は、プロテインＡ−セファロースゲル（Amersham Biosciences＃17.1279.02）上でアフィニティクロマトグラフィーにより行った。黄色ブドウ球菌から抽出したプロテインＡをＩｇＧ分子のＦｃフラグメントと特異的に混合した。次いで、サブクラスを全て含むＩｇＧをｐＨ３．０で溶出した。
【００９８】
使用する全ての緩衝液は、気泡の生成を防ぐため、カラムに使用する前に、超音波洗浄機で１５分間、脱気した。
【００９９】
クロマトグラフィーカラムは、１２ｍｌのプロテインＡ−セファロースを使用して作った。ゲルカラムは、蒸留して脱気した水で４０分間、更に０．５Ｍ Ｎａｃｌを含むｐＨ７．４のダルベッコ ＰＢＳ緩衝液で４０分間、最後に１Ｍ ＮａＣｌを含むｐＨ８．０の１．５Ｍグリセリン緩衝液で、正しいベースラインが得られるまで平衡化した。
【０１００】
次に、１Ｍ ＮａＣｌを含むｐＨ８．０の１．５Ｍグリセリン緩衝液で半分希釈した１０ｍｌのウサギ血清を、０．５ｍｌ/分の流速でカラムに通過させた。アルブミンピークが現れた後、ＩｇＧ血清を、０．１Ｍ トリス−クエン酸ナトリウム緩衝液でｐＨ３．０に調整した０．１Ｍクエン酸溶液の方法で溶出した。ＩｇＧ溶出ピークを回収し、即座に、４℃で一晩、ｐＨ７．４のダルベッコ ＰＢＳ緩衝液中で透析した。
【０１０１】
プロテインＡによる精製後、ポリクローナル抗体の反応性を、プロＢＮＰ（１−１０８）、ＢＮＰ（１−７６）又はＢＮＰ（７７−１０８）を０．２５μｇ/ｍｌの吸着量で被覆した殻斗上でＥＬＩＳＡにより試験した。ウサギ＃０４６８０５由来のポリクローナル抗体について得られた結果を、図１に示す。ウサギ＃０４６８３２由来のポリクローナル抗体も同じ結果を与えた。ウサギ＃０４６８０５及び＃０４６８３２由来のポリクローナル抗体は、プロＢＮＰ（１−１０８）に対し、比較的特異的であった。しかしながら、我々は、高濃度において抗プロＢＮＰ（１−１０８）の反応性が低いことに気付くことができた。すなすち、ウサギ由来の単一特異的ポリクローナル抗体を作製し、実施例４．ｂで述べる方法に従い、ＢＮＰ−Ｋ3−ＮＨＳ−セファロース樹脂で除去することにより、無視できる反応性である。
【０１０２】
実施例４ｂ：ＢＮＰ−Ｋ3−ＮＭＳ−セファロース樹脂上でのＩｇＧの除去
当該操作の目的は、ＢＮＰ（７７−１０８）に関して観察される交差反応を排除することである。
【０１０３】
得られたポリクローナル抗体の交差反応は、ＢＮＰ（７７−１０８）分子のＮ−末端位に位置するので、排除するイムノグロブリンにＢＮＰ（７７−１０８）の当該領域を正しく提示することは重要である。当該目的のため、ＢＮＰ（７７−１０８）は、そのＣ−末端部によってＮＨＳ−セファロース樹脂への結合を促進するために、Ｃ−末端位を３つのリジン残基（ＢＮＰ−Ｋ3）で延長して合成した。
【０１０４】
ＢＮＰ−Ｋ3：Ｓ−Ｐ−Ｋ−Ｍ−Ｖ−Ｑ−Ｇ−Ｓ−Ｇ−Ｃ−Ｆ−Ｇ−Ｒ−Ｋ−Ｍ−Ｄ−Ｒ−Ｉ−Ｓ−Ｓ−Ｓ−Ｓ−Ｇ−Ｌ−Ｇ−Ｃ−Ｋ−Ｖ−Ｌ−Ｒ−Ｒ−Ｈ−Ｋ−Ｋ−Ｋ（配列番号１０４）は、実施例１で上述した、「Ｆｍｏｃ」（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル）化学を使ってパイオニアシンセサイザイーで行った。
【０１０５】
０．５Ｍ ＮａＣｌを１０ｍｇ/ｍｌの濃度で加えたｐＨ８．３の１００ｍＭ ＮａＨＣＯ3緩衝液を使って、５ｍｇのＢＮＰ−Ｋ3を溶解した。２ｍｌのＮＨＳ−セファロース樹脂（ＮＨＳ−活性化セファロース ４高速フロー、Amersham Biosciences ＃17.0906.01）を４℃、１０００ｒｐｍで３０秒間遠心した。樹脂を１５ｍｌの冷１ｍＭ ＨＣｌ溶液で洗浄した。ＨＣｌ溶液を遠心及び除去した後、樹脂をＢＮＰ−Ｋ3リガンドと１０ｍｇ/ｍｌで混合した。当該混合物を、ゆっくり攪拌しながら、室温で１時間インキュベートした。リガンド溶液を遠心及び除去した後、樹脂の非反応性基をｐＨ８．０の０．１Ｍ グリシン緩衝液５ｍｌでブロックした。当該混合物を、ゆっくり攪拌しながら、室温で１時間インキュベートした。ブロッキング緩衝液を遠心及び除去した後、０．５Ｍ ＮａＣｌを加えたｐＨ８．３の１００ｍＭ ＮａＨＣＯ3緩衝液５ｍｌで、樹脂を吸収し、当該緩衝液で４回洗浄した。最後の洗浄後、混合物をクロマトグラフィーカラムに装填した。
【０１０６】
クロマトグラフィーカラムを調製後、１０ｍｇのウサギ＃０４６８０５由来のＩｇＧ又はウサギ＃０４６８３２由来のＩｇＧを当該カラムに装填した。カラムに接続したペリスタポンプにより、４℃で一晩、ウサギ血清ＩｇＧを循環させることができた。次の日、ＩｇＧ溶液を回収した（ろ液）。ＢＮＰ−Ｋ3に結合したＩｇＧフラクションを、５Ｍ 尿素を含むｐＨ８．０の２０ｍＭトリス緩衝液溶出した（溶出液）。当該溶出液及びろ液は、除去の効果を確認するために試験した。図２及び３は、ウサギ＃０４６８０５及び＃０４６８３２由来の各ポリクローナル血清のろ液を用い、ＥＬＩＳＡにより行った試験結果を示す。図４及び５は、ウサギ＃０４６８０５及び＃０４６８３２由来の各ポリクローナル血清の溶出液を用い、ＥＬＩＳＡにより行った試験結果を示す。
【０１０７】
予想とおり、ウサギ＃０４６８０５及び＃０４６８３２由来のポリクローナル血清のろ液は、プロＢＮＰ（１−１０８）に特異的であった。すなわち、ＢＮＰ（１−７６）又はＢＮＰ（７７−１０８）では反応性が認められなかった。溶出液は、プロＢＮＰ（１−１０８）についてはかなりの反応性を有し、ＢＮＰ（７７−１０８）についても反応性を有していた。当該結果は、ＢＮＰ−Ｋ3−ＮＨＳ−セファロース樹脂に対するウサギポリクローナル血清の効果を確認するものである。
【０１０８】
ＢＮＰ（７７−１０８）は、Sigma（＃B-5900）から入手し、プロＢＮＰ（１−１０８）及びＢＮＰ（１−７６）は、ベクターｐＧＥＸ−２Ｔ（Amersham Pharmacia Biotech）にクローニングし、当業者によく知られた慣用的手段で大腸菌に導入した後に発現する組換え蛋白質の形で製造した。ベクターの起源はBerlex Biosciences(Richmond,CA,USA)社から提供を受け、その製造は、Yan et al.(PNAS,2000,vol.97,pp.8525-8529)によって記述されている。プロＢＮＰ（１−１０８）の濃度及びＢＮＰ（１−７６）の濃度は、比色蛋白質試験に関するＢｒａｄｆｏｒｄ法によって測定した（M.Bradford,Anal.Biochem.1976;72:248-54）。
【０１０９】
実施例５：ＢＮＰ（１−７６）及びＢＮＰ（７７−１０８）に関する、ウサギ＃０４６８０５及び＃Ｌ０１２３５由来の抗プロＢＮＰ（１−１０８）抗体の交差反応割合の決定
【０１１０】
材料：
１）固相：平底Maxisorpマイクロプレート、Nunc（Denmark）。
２）ＢＮＰ（７７−１０８）は、Sigma（＃B-5900）から入手し、プロＢＮＰ（１−１０８）及びＢＮＰ（１−７６）は、組換え蛋白質の形で製造した。当該蛋白質溶液の濃度は、比色分析蛋白質アッセイに関するＢｒａｄｆｏｒｄ法によって測定した（M.Bradford,Anal.Biochem.1976;72:248-54）。
３）使用したコンジュゲートは、ペルオキシダーゼ結合抗ウサギＩｇＧポリクローナル抗体（Sigma ＃A-9169）である。
４）飽和緩衝液：１％の牛胎児血清アルブミン（BSA,Sigma ＃A-7888）を含むｐＨ７．４のダルベッコＰＢＳ緩衝液。
５）希釈溶液：０．１％のＢＳＡ及び０．１％のツィーン２０を含むｐＨ７．４のダルベッコＰＢＳ緩衝液。
６）洗浄液：０．１％のツィーン２０を含むｐＨ７．４のダルベッコＰＢＳ緩衝液。
７）視覚化溶液：視覚化溶液は、
７ａ）基質溶液：０．３３％のＨ2Ｏ2を含む０．０１Ｍ クエン酸と０．０４Ｍ トリナトリウム・シトレートの最終ｐＨ５．６の溶液、及び
７ｂ）色原体：ＯＰＤ（オルト−フェニレンジアミン）錠で、１ＯＰＤ錠は、１０ｍｌの基質緩衝液に溶解している、
を含む。
８）停止溶液：４Ｎ Ｈ2ＳＯ4。
【０１１１】
プロトコール：
アッセイは、マイクロプレートの殻斗に固定された種々の蛋白質に対するポリクローナル抗体の免疫反応性を直接評価することにある。
【０１１２】
・ダルベッコ ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）で種々のコーティング溶液、すなわちＢＮＰ（７７−１０８）を０．２５μｇ/ｍｌ含む第一の溶液、プロＢＮＰ（１−１０８）を０．２５μｇ/ｍｌ含む第二の溶液、ＢＮＰ（１−７６）を０．２５μｇ/ｍｌ含む第三の溶液、及びＧＳＴ（バックグラウンドノイズ制御蛋白質）を０．２５μｇ/ｍｌ含む第四の溶液をまず調製した。
・当該溶液の各１００μｌをマイクロプレートのウェルに別々に入れた。
・このマイクロプレートを４℃で一晩インキュベートした。
・コーティング溶液を除いた後、マイクロプレートを、０．１％のツィーン２０を含むｐＨ７．４のダルべッコ ＰＢＳ緩衝液３００μｌで洗浄し、１％のＢＳＡを含むｐＨ７．４のダルべッコ ＰＢＳ緩衝液２５０μｌを添加して飽和させた。
・その後、マイクロプレートを３７℃で１時間インキュベートした。
・次いで、マイクロプレートを洗浄液で３回洗浄した。
・予め、ウサギ＃０４６８０５由来のポリクローナル血清については２及び１μｇ/ｍｌに、ウサギ＃Ｌ０１２３５由来のポリクローナル血清については１／２５００及び１／５０００に希釈したポリクローナル抗体溶液１００μｌを各殻斗に置いた。
・反応媒体を室温で２時間インキュベートした。
・次いで、マイクロプレートを３００μｌの洗浄液で３回洗浄した。
・１００μｌのペルオキシダーゼ結合抗ウサギＩｇＧポリクローナル抗体コンジュゲートを希釈緩衝液で１／８０００に希釈したマイクロプレートの各ウェルに加えた。
・反応媒体を室温で１時間インキュベートした。
・次いで、プレートを３００μｌの洗浄液で５回洗浄する。１００μｌの視覚化溶液を各殻斗に分注した。反応を黒っぽくなるまで、室温で２０分間放置した。
・次いで、５０μｌの停止溶液を各殻斗に分注した。
・反応を停止後、光学密度を４９０／６２０ｎｍで分光光度計で読んだ。
【０１１３】
抗プロＢＮＰ（１−１０８）抗体について、０．２５μｇ/ｍｌを吸着させたＢＮＰ（７７−１０８）、０．２５μｇ/ｍｌを吸着させたプロＢＮＰ（１−１０８）及び０．２５μｇ/ｍｌを吸着させたＧＳＴ上で試験し、ＢＮＰ（７７−１０８）抗体との交差反応の割合を次式：
【０１１４】
【数１】
【０１１５】
を使って計算した。
【０１１６】
抗プロＢＮＰ（１−１０８）抗体について、０．２５μｇ/ｍｌを吸着させたＢＮＰ（１−７６）、０．２５μｇ/ｍｌを吸着させたプロＢＮＰ（１−１０８）及び０．２５μｇ/ｍｌを吸着させたＧＳＴ上で試験し、ＢＮＰ（１−７６）抗体との交差反応の割合を次式：
【０１１７】
【数２】
【０１１８】
を使って計算した。
【０１１９】
【表１】
【０１２０】
結論：
上記血清ポリクローナル抗体の交差反応は、ＢＮＰ（１−７６）については２％未満であり、ＢＮＰ（７７−１０８）については５％未満であった。ＢＮＰ（７７−１０８）の交差反応性は、実施例４．ｂに記載した除去方法の手段により排除できた。しかしながら、当該ポリクローナル抗体は、実施例１９及び２０に記載のように、プロＢＮＰ（１−１０８）の免疫酵素測定法の条件、及び患者に通常見られるＢＮＰ（７７−１０８）濃度やＢＮＰ（１−７６）濃度では結果的に交差反応を示さずに、除去しない状態で使用できた。
【０１２１】
実施例６：ＢＮＰ−Ｋ3−ＮＨＳ−セファロース樹脂上で除去する前後の、ウサギ＃０４６８０５及び＃０４６８３２由来のポリクローナル血清によって認識されるエピトープの同定
ＮＰ−Ｋ3−ＮＨＳ−セファロース樹脂上で除去する前後の、ウサギ＃０４６８０５及び＃０４６８３２由来のポリクローナル血清は、当該ポリクローナル血清によって認識されるエピトープを同定するために、スポット法により試験した。Frankによって説明される当該方法（Tetrahedron,1992;48:9217-32）は、非常に多くの未特定配列のペプチドのニトロセルロース膜上での迅速合成が可能である。使用するプロトコールは、Molina et al.によって説明されている（Pet.Res.,1996;9:151-5）。
【０１２２】
アミノ化機能を含む直径約５ｍｍのスポットを１枚のシート上で作り、当該スポットは、合成ぺプチドのＣ−末端アミノ酸の支点として役立った。ペプチド鎖は、活性化Ｆｍｏｃアミノ酸の連続的な添加によって伸張できた。アミノ酸側鎖は、適当な化学基で保護した。全てのペプチドは、Ｎ−アセチル化したＮ−末端残基を用いて合成した。合成の最後には、側鎖はトリフルオロ酢酸の作用により脱保護した。当該処理は、ペプチド及びセルロース支持体との結合に影響を与えるものではなく、ペプチドの反応性は比色試験の手段により評価できた。
【０１２３】
膜上で合成した一連のペプチドは、プロＢＮＰ（１−１０８）の全体的配列を表す、３つのアミノ酸残基がシフトした３２のペンタデカペプチドから成っていた。
【０１２４】
【表２】
【０１２５】
０．１％ツィーン２０、５％ブロッキング緩衝液（Euromedex#SU-07-250）及び５％スクロースを加えたｐＨ７．０のＴＢＳ（トリス緩衝生理食塩水）緩衝液３０ｍｌで上記膜を飽和した後、１０μｇ/ｍｌに希釈したウサギポリクローナル血清２０ｍｌの反応性を試験した（３７℃で１時間３０分間、攪拌しながらインキュベートした後に試験した）。
【０１２６】
０．１％ツィーン２０を加えたｐＨ７．０のＴＢＳ緩衝液で洗浄した後、２０ｍｌのアルカリホスファターゼ結合抗ウサギＩｇＧコンジュゲート（Sigma＃A-8025）を室温で１時間、攪拌しながらインキュベートした。最後に、３０ｍｌの洗浄液で最終洗浄を行った後、３０ｍｌの基質溶液[０．１５Ｍ ＢＣＩＰ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート）１２０μｌ、１Ｍ ＭｇＣｌ２ １５０μｌ及び０．１Ｍ ＭＴＴ（チアゾイル・ブルー・テトラゾリウムブロミド）１８０μｌを含む、ｐＨ７．０のＣＢＳ（クエン酸緩衝生理食塩水）緩衝液３０ｍｌ］を添加することによって、当該スポットを視覚化した。
【０１２７】
上記膜をスキャンした後、膜のスポット強度を、画像処理ソフトウェアを用いて評価した（相対的強度単位で）。バックグラウンドノイズは、抗血清によって検出したスポットから計算した。除去前のウサギ＃０４６８０５由来のポリクローナル血清に関するエピトープ分析の結果を図６に示す。５つのペプチド（スポット２２〜２６）をポリクローナル血清によって検出し、これら５つのペプチドに共通の配列は、Ｒ76Ｓ77Ｐであった。
【０１２８】
しかしながら、ＲＡＰユニットをＲ76Ｓ77ＰユニットのＮ−末端位に加えると、反応性が顕著に増加した。ＢＮＰ−Ｋ3−ＮＨＳ−セファロース樹脂上での除去後のウサギ＃０４６８０５由来のポリクローナル血清に関するエピトープ分析の結果を、図７に示す。４つのペプチド（スポット２２〜２５）をポリクローナル血清によって検出し、これら５つのペプチドに共通の配列は、ＲＡＰＲ76Ｓ77Ｐであった。除去前のポリクローナル血清について観察されたものと異なり、Ｒ76Ｓ77Ｐユニットの反応性だけが観察されなかった（スポット２６）。
【０１２９】
このことは、ＢＮＰ−Ｋ3−ＮＨＳ−セファロース樹脂上での除去前では、ポリクローナル血清はＢＮＰ（７７−１０８）を検出しなかった、ことを説明している（心覚えに、Ｓ77Ｐユニットは、ＢＮＰ（７７−１０８）の配列の最初の２つのアミノ酸に対応していた）。結局、単一特異性を示すウサギ＃０４６８０５由来のポリクローナル血清によって認識されるエピトープは、ＲＡＰＲ76Ｓ77Ｐであった。
【０１３０】
実施例７：除去前後のウサギ＃０４６８０５及び＃０４６８３２由来のポリクローナル血清の最小エピトープの、アラニン（Ａｌａ）スキャン法による同定
ＮＰ−Ｋ3−ＮＨＳ−セファロース樹脂上で除去前後のウサギ＃０４６８０５及び＃０４６８３２由来のポリクローナル血清は、ポリクローナル血清によってプロＢＮＰ（１−１０８）のみを特異的に認識する、ヒンジペプチド中の最小エピトープを同定するために、（実施例６に記載の）スポット方法で試験した。ヒンジペプチドＹＴＬＲＡＰＲＳＰＫＭＶＱＧＳの配列を繰り返した１６つのペンタデカペプチドからなり、一つのアミノ酸がアラニン残基（アラニン・スキャニング又は「Ａｌａ−スキャン」）又はグリシン残基で順々に置換、この置換は、毎回、一つのアミノ酸残基ごとに右にシフトするような置換である、がなされている膜を合成した（表３−１、３−２）。ＢＮＰ−Ｋ3−ＮＨＳ−セファロース樹脂上で除去前後のウサギ＃０４６８０５及び＃０４６８３２由来のポリクローナル血清のＡｌａ−スキャン分析の結果を表３に示す。
【０１３１】
【表３】
【０１３２】
【表４】
【０１３３】
ウサギ＃０４６８０５及び＃０４６８３２由来のポリクローナル血清によって認識されるエピトープの認識に不可欠であるアミノ酸は、Ｒ76Ｓ77Ｐであった。しかし、ＢＮＰ−Ｋ3−ＮＨＳ−セファロース樹脂上でのウサギ＃０４６８０５由来のポリクローナル血清の除去後では、Ｒ76Ｓ77Ｐユニットに加えて、ＲＡユニットが認識に寄与していた。除去前のウサギ＃０４６８３２由来のポリクローナル血清に関しては、プロリンＰ78のみが認識に寄与するが、ＢＮＰ−Ｋ3−ＮＨＳ−セファロース樹脂上でのウサギ＃０４６８３２由来のポリクローナル血清の除去後では、認識に寄与するユニットはＲ−ＰＲ76Ｓ77Ｐであった。これらの結果は、ウサギ＃０４６８０５及び＃０４６８３２由来のポリクローナル血清によるプロＢＮＰ（１−１０８）の特異的認識に必須の最小エピトープがＲＡＰＲ76Ｓ77Ｐである、ことを示している。
【０１３４】
実施例８：Ａｌａ−スキャン法によるウサギ＃Ｌ０１２３５由来のポリクローナル血清の最小エピトープの同定
最初（除去の必要がない）からプロＢＮＰ（１−１０８）に特異的な、ウサギ＃Ｌ０１２３５由来にポリクローナル血清は、ポリクローナル抗体によってプロＢＮＰ（１−１０８）のみを特異的に認識する、ヒンジ中の最小エピトープを同定するために、（実施例６に記載の）スポット法で試験した。使用した膜は、実施例７に記載したものである。ウサギ＃Ｌ０１２３５由来のポリクローナル血清のＡｌａ−スキャン分析の結果を表４に示す。
【０１３５】
【表５】
【０１３６】
ウサギ＃０４６８０５及び＃０４６８３２由来のポリクローナル血清に関し（実施例７）、これらの結果は、ウサギ＃Ｌ０１２３５由来のポリクローナル血清によるプロＢＮＰ（１−１０８）の特異的認識に必須の最小エピトーがＲＡＰＲ76Ｓ77Ｐである、ことを示している。
【０１３７】
実施例９：プロＢＮＰ（１−１０８）組換え蛋白質によるマウスの免疫
ＢＡＬＢ／ｃ（雌性６週齢）のマウスを、実施例４．ｂで述べた組換えプロＢＮＰ（１−１０８）で、当業者によく知られた慣用的技術により免疫した。最初の注射では、プロＢＮＰ（１−１０８）１ｍｌの完全フロイントアジュバント（Sigma＃F-5881）１ｍｌによるエマルションを調製し、このエマルションの３００μｌ（すなわち１００μｇの蛋白質）を各マウスに皮下注射した。２つの追加免疫は、プロＢＮＰ（１−１０８）（すなわち１００μｇの蛋白質）の不完全フロイントアジュバント（Sigma＃F-5506）によるエマルション３００μｌの腹腔内注射により、１５日間あけて行った。第二の追加免疫の１５日後、第三の追加免疫を先と同じ方法により、但し皮下注射によって行った。最後に、最終追加免疫の１５日後、スポット技術による免疫反応を分析するために、マウスから血液試料を採取した。マウス１２の免疫反応は、本研究のリマインダーに特に有益であることが判った。
【０１３８】
実施例１０：マウス１２由来のポリクローナル抗体によって認識される、プロＢＮＰ（１−１０８）配列のエピトープの同定
マウス１２由来のポリクローナル抗体によって認識される、プロＢＮＰ（１−１０８）配列のエピトープの同定に使用したスポット法は、実施例６に記載した。
【０１３９】
膜上で合成した一連のペプチドは、プロＢＮＰ（１−１０８）の配列全体を表している９４のペンタデカペプチドからなり、各ぺプチドは、１アミノ酸残基ずつシフトしている。マウス１２由来のポリクローナル血清の反応性は、１／５００に希釈し、実施例６に記載の膜上で試験した。膜をスキャン後、膜上のスポット強度（相対的強度ユニット）を、画像処理ソフトウェアにより評価した。抗血清によって検出したスポットから計算したバックグラウンドノイズは、相対的強度ユニットが３０であった。
【０１４０】
プロＢＮＰ（１−１０８）の配列のＮ−末端位に位置する３領域は、マウス１２由来の抗血清の抗体によって特に良好に認識された。この３領域とは、配列Ｈ1ＰＬＧＳＰＧＳＡＳＤＬＥＴＳ15（配列番号２３）（スポット１〜１２）、配列Ｌ17ＱＥＱＲＮＨＬＱＧＫ27（配列番号１２３）（スポット１７〜２７）及び配列Ｌ38ＥＰＬＱＥＳＰＲＰＴＧ49（配列番号１２４）（スポット３８〜４９）である。
【０１４１】
驚いたことに、マウス１２由来の抗血清は、ぺプチド配列がＲＡＰＲ76Ｓ77Ｐユニットを含むスポット、すなわちスポト６４〜６８を認識することができる抗体も含んでいた。スポットのペプチド配列を表５に記載する。
【０１４２】
【表６】
【０１４３】
【表７】
【０１４４】
モノクローナル抗体作製のために選んだマウス（５週齢ＢＡＬＢ／ｃ雌性）を、ＫＬＨ（keyhole limpet hemocyanin）に結合した配列番号１６ Ｃ−ＹＴＬＰＡＰＲＳＰＫＭＶＱＧＳＧ−ＮＨ2（Ｃ１３Ｐ３０）のペプチドで、次のプロトコールに従い免疫した。すなわち、完全フロイントアジュバントで２倍に希釈した１００μｇのＫＬＨ結合ペプチドで皮下注射した。４回の追加免疫を、不完全フロイントアジュバントで２倍に希釈したＫＬＨ結合ぺプチド１００μｇの皮下注射により、３週間あけて行った。
【０１４５】
リンパ球融合を実施する前の３日間、マウスを次のプロトコールに従い、超免疫した。滅菌ＰＢＳ緩衝液中にＫＬＨに結合したＣ−ＹＴＬＰＡＰＲＳＰＫＭＶＱＧＳＧ−ＮＨ2ペプチド１００μｇについて、イムノゲンの総用量を４回の注射に分注した。第一及び第二の注射は各々、総用量の１／１０に相当した。これらの注射は、種々の部位に、４５分間おきに皮下に行った。総用量の２／１０に相当する第三の注射は、第二の注射の４５分後に皮下に行った。第三の注射の３０分後、アナフィラシー・ショックを避けるために、プロメタジンの殺菌ＰＢＳの１ｍｇ/ｍｌ溶液（２．５％ フェネルガン、Laboratories Medeva Parma）１００μｌを腹腔内注射した。最後に、１５分後、総用量の６／１０に相当する最終注射を腹腔内に行った。
【０１４６】
リンパ球ハイブリダイゼーションは、Kohler and Milstein（Nature,1975;256:495-97）によって説明されている方法に従って実施した。予め非動化した１０％の牛胎児血清（Bio-Whittaker＃BE02701E）及び８−アザグアニン（Sigma＃A-8526）を添加したＬ−グルタミン、ペニシリン及びストレプトマイシン（Sigma＃G-6784）の混合物を補足したＲＰＭＩ １６４０倍地（Bio-Whittaker＃BE12-167F）で前もって培養した、マウスの脾臓から抽出したリンパ球細胞及びミエローマ細胞（Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８．６５３）を使って行った。
【０１４７】
牛胎児血清を添加せず、Ｌ−グルタミン、ペニシリン及びストレプトマイシン（Sigma＃G-6784）の混合物を補足したＲＰＭＩ １６４０倍地（Bio-Whittaker＃BE12-167F）で前もって培養したリンパ球細胞及びミエローマ細胞は、１ミエローマ細胞につき５リンパ球の割合で混合した。
【０１４８】
当該混合物を室温、９００ｒｐｍで７分間遠心し、細胞ペレットを再懸濁した後、１ｍｌのハイブリ−マックス（登録商標）ポリスチレングリコール（Sigma＃P-7777）を加えた。３７℃のウォーターバスで１分間インキュベートした後、当該細胞を室温、１０００ｒｐｍで１分３０秒間遠心した。最後に、３７℃のウォーターバスで２分間インキュベートした後、ペレットを再懸濁し、Ｌ−グルタミン、ペニシリン及びストレプトマイシン（Sigma＃G-6784）の混合物を補足したＲＰＭＩ １６４０倍地（Bio-Whittaker＃BE12-167F）であって、予め３７℃にしておいた倍地６ｍｌを５秒毎に１００μｌに速度で添加し、９ｍｌの同じ倍地全てを直ちに添加した。室温、９００ｒｐｍで１０分間遠心し、上清を除いた後、予め非動化した１０％の牛胎児血清（Bio-Whittaker＃BE02701E）及びＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン、Sigma＃H-0262）を添加したＬ−グルタミン、ペニシリン及びストレプトマイシン（Sigma＃G-6784）の混合物を補足したＲＰＭＩ １６４０倍地（Bio-Whittaker＃BE12-167F）で、１ウェル当り１２００００細胞となるように、１００μｌを分注するために、当該ペレットを溶解した。
【０１４９】
当該溶液を、予め、ネズミのマクロファージを播種した９６培養プレートのウェルに１００μｌ加えた。当該プレートをＣＯ2インキュベーターに置いた。リンパ球ハイブリダイゼーションの１５日後、融合プレートに存在するクローンの数を見積り、ハイブリドーマの割合の変化で表した。
【０１５０】
ハイブリドーマの選択は、プロＢＮＰ（１−１０８）、ＢＮＰ（１−７６）、ＢＮＰ（７７−１０８）及び配列ＲＡＰＲ76Ｓ77Ｐ（Ｃ１３Ｐ３０）を有するペプチドのＥＬＩＳＡによって行った。プロＢＮＰ（１−１０８）及び配列ＲＡＰＲ76Ｓ77Ｐを有するＣ１３Ｐ３０ペプチドを検出することができ、実質的にＢＮＰ（１−７６）及びＢＮＰ（７７−１０８）を認識することができない抗体を分泌するハイブリドーマのみを選択した。選択したハイブリドーマは、培養で維持し、希釈を制限することによってクローン化した。このようにしてクローン化したハイブリドーマは、腹水中でモノクローナル抗体の分泌のために用いることができた。
【０１５１】
上記の方法により、本発明者は、本発明に従う抗体の特徴を有するアイソタイプＩｇＧ1κのイムノグロブリンを分泌するネズミのハイブリドーマ、クローン３Ｄ４を作製した。当該ハイブリドーマは、２００３年７月３１日に、寄託番号ＣＮＣＭ Ｉ−３０７３として、ＣＮＣＭ（Collection Nationale de Cultures de Microorganismes［National Collection of Microorganism Cultures］,Pasteur Institute,25 rue du Docteur Roux,75 724 Paris,Cedex 15,France）に寄託した。
【０１５２】
実施例１２：ハイブリドーマ３Ｄ４によって分泌された抗体の特異性のＥＬＩＳＡによる確認
材料：
１）固相：平底Maxisorpマイクロプレート、Nunc（Denmark）。
２）ＢＮＰ（７７−１０８）は、Sigma（＃B-5900）から入手し、プロＢＮＰ（１−１０８）及びＢＮＰ（１−７６）は、組換え蛋白質の形で製造した。当該蛋白質溶液の濃度は、比色分析蛋白質アッセイに関するＢｒａｄｆｏｒｄ法によって測定した（M.Bradford,Anal.Biochem.1976;72:248-54）。
３）使用したコンジュゲートは、ペルオキシダーゼ結合抗ウサギＩｇＧポリクローナル抗体（Sigma＃A-9169）である。
４）飽和緩衝液：１％の牛胎児血清アルブミン（BSA,Sigma＃A-7888）を含むｐＨ７．４のダルベッコＰＢＳ緩衝液。
５）希釈溶液：０．１％のＢＳＡ及び０．１％のツィーン２０を含むｐＨ７．４のダルベッコＰＢＳ緩衝液。
６）洗浄液：０．１％のツィーン２０を含むｐＨ７．４のダルベッコＰＢＳ緩衝液。
７）視覚化溶液：視覚化溶液は、
７ａ）基質溶液：０．３３％のＨ2Ｏ2を含む０．０１Ｍ クエン酸と０．０４Ｍ トリナトリウム・シトレートの最終ｐＨ５．６の溶液、及び
７ｂ）色原体：ＯＰＤ（オルト−フェニレンジアミン）錠で、１ＯＰＤ錠は、１０ｍｌの基質緩衝液に溶解している、
を含む。
８）停止溶液：４Ｎ Ｈ2ＳＯ4。
【０１５３】
プロトコール：
アッセイは、マイクロプレートの殻斗に固定された種々の蛋白質に対するハイブリドーマ３Ｄ４の培養上清の免疫反応性を直接評価することにある。
【０１５４】
・ダルベッコ ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）で種々のコーティング溶液、すなわちＢＮＰ（７７−１０８）を１μｇ/ｍｌ含む第一の溶液、プロＢＮＰ（１−１０８）を１μｇ/ｍｌ含む第二の溶液及びＢＮＰ（１−７６）を１μｇ/ｍｌ含む第三の溶液を全てまず調製した。
・当該溶液の各１００μｌをマイクロプレートのウェルに別々に入れた。
・このマイクロプレートを４℃で一晩インキュベートした。
・コーティング溶液を除いた後、マイクロプレートを、０．１％のツィーン２０を含むｐＨ７．４のダルべッコ ＰＢＳ緩衝液で洗浄し、１％のＢＳＡを含むｐＨ７．４のダルべッコ ＰＢＳ緩衝液２５０μｌを添加して飽和させた。
・その後、マイクロプレートを３７℃で１時間インキュベートした。
・次いで、マイクロプレートを３００μｌの洗浄液で３回洗浄した。
・予め、１／２に希釈したハイブリドーマ３Ｄ４上清１００μｌを各殻斗に置いた。
・反応媒体を室温で２時間インキュベートした。
・次いで、マイクロプレートを３００μｌの洗浄液で３回洗浄した。
・１００μｌのペルオキシダーゼ結合抗ウサギＩｇＧポリクローナル抗体コンジュゲートを希釈緩衝液で１／２０００に希釈し、マイクロプレートの各ウェルに加えた。
・反応媒体を室温で１時間インキュベートした。
・次いで、プレートを３００μｌの洗浄液で５回洗浄する。１００μｌの視覚化溶液を各殻斗に分注した。反応を黒っぽくなるまで、室温（１８〜２４℃）で２０分間放置した。
・次いで、５０μｌの停止溶液を各殻斗に分注した。
・反応を停止後、光学密度を４９０／６２０ｎｍで分光光度計で読んだ。
【０１５５】
図８は、当該アッセイの結果を説明している。ハイブリドーマ３Ｄ４上清中に分泌された抗体は、プロＢＮＰ（１−１０８）及びＣ１３Ｐ３０免疫ペプチドのみを検出することができ、ＢＮＰ（１−７６）及びＢＮＰ（７７−１０８）には反応しなかった。この結果により、ＢＮＰ（１−７６）及びＢＮＰ（７７−１０８）を除き、ハイブリドーマ３Ｄ４によって分泌された抗体のプロＢＮＰ（１−１０８）に対する特異性を確認した。
【０１５６】
従って、本発明に従うハイブリドーマ３Ｄ４由来の抗体は、実質的にＢＮＰ（１−７６）及びＢＮＰ（７７−１０８）を除き、抗体のプロＢＮＰ（１−１０８）を特異的に認識する抗体であることが明白である。
【０１５７】
実施例１３：ハイブリドーマ３Ｄ４によって分泌された抗体の特異性のウェスタンブロッティングによる確認
材料：
１）一般的なＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動装置。
２）スタッキングゲル：５％アクリルアミド。
３）溶解ゲル：１６％アクリルアミド。
４）陽極緩衝液：０．２Ｍ トリス、ｐＨ８．９。
５）陰極緩衝液：０．１Ｍ トリス−トリシン；０．１％ＳＤＳ。
６）試料緩衝液：０．５Ｍ トリス、ｐＨ６．８；２５％グリセロール；２％ＳＤＳ；１４．４ｍＭ β−メルカプトエタノール；０．１％ブロモフェノールブルー。
７）電気泳動装置。
８）移動緩衝液；１９０ｍＭグリシン；２０％メタノール；０．０５％ＳＤＳ。
９）ＢＮＰ（７７−１０８）は、Sigma（＃B-5900）から入手し、プロＢＮＰ（１−１０８）、ＢＮＰ（１−７６）−ＧＳＴ及びＧＳＴ（ネガティブコントロール）は、組換え蛋白質の形で製造した。当該蛋白質溶液の濃度は、比色分析蛋白質アッセイに関するＢｒａｄｆｏｒｄ法によって測定した（M.Bradford,Anal.Biochem.1976;72:248-54）。
１０）コンジュゲートは、ペルオキシダーゼ結合ロバ抗マウスＩｇＧポリクローナル抗体（Jackson Immunoresearch＃715-035-150）を用いた。
１１）ウェスタンブロッティングの検出用のＥＣＬキット（Amersham Biosciences#RPN2106）。
【０１５８】
プロトコール：
当該アッセイの実施は、１６％アクリルアミドゲル中の種々の蛋白質の電気泳動的な移動、当該蛋白質のニトロセルロース膜への転写、そして最後にウェスタンブロッティング、の３つの主なステップを含む。
【０１５９】
・種々の溶液、すなわちプロＢＮＰ（７７−１０８）を１μｇ含む第一の溶液、ＧＳＴを１μｇ含む第二の溶液、ＢＮＰ（１−７６）−ＧＳＴを１μｇ含む第三の溶液、及びＢＮＰ（７７−１０８）を１μｇ含む第四の溶液、を同一の緩衝液で３５μｌの最終体積に調製した。
・各溶液を１００℃で５分間、ウォーターバス中でインキュベートし、次いでゲルのウェルに装填した。アクリルアミドゲル中の移動は、１２０Ｖの一定の電圧下で１時間３０分間行った。図９は、得られるアクリルアミドゲルの写真である。装填した蛋白質はクマズーブルーで染色した。
・移動後、ゲル中の蛋白質を１２０ｍＡで１時間、ニトロセルロース膜上に転写した。
・ニトロセルロース膜は、０．１％ツィーン２０入りのＰＢＳ緩衝液で洗浄し、室温で３０分間、０．１％ツィーン２０、２％スキムムルク入りのＰＢＳ緩衝液で飽和させた。
・０．１％ツィーン２０入りのＰＢＳ緩衝液で３回洗浄後、当該膜に５ｍｌのハイブリドーマ３Ｄ４上清を加えて、３７℃で１時間、揺り動かしながらインキュベーした。
・０．１％ツィーン２０入りのＰＢＳ緩衝液で３回洗浄後、当該膜に０．１％ツィーン２０、２％スキムムルク入りのＰＢＳ緩衝液で１／２０００に希釈した１０ｍｌのペルオキシダーゼ結合抗マウスＩｇＧコンジュゲートを加えて、室温で１時間、揺り動かしながらインキュベートした。
・０．１％ツィーン２０入りのＰＢＳ緩衝液で３回洗浄後、写真用フィルムに４曝す前に、当該膜をＥＣＬ視覚化剤に４分間浸漬した。
【０１６０】
得られたスキャンした写真画像である図１０に示したようにハイブリドーマ３Ｄ４上清中に分泌した抗体は、プロＢＮＰ（１−１０８）に対応するバンドのみを検出することができた。ＢＮＰ（１−７６）、ＢＮＰ（７７−１０８）及びＧＳＴは、ハイブリドーマ３Ｄ４の抗体によっては検出されなかった。当該結果により、ハイブリドーマ３Ｄ４によって分泌した抗体のプロＢＮＰ（１−１０８）に対する特異性も確認した。
【０１６１】
本発明に従うハイブリドーマ３Ｄ４由来の抗体が、実施的にＢＮＰ（１−７６）、ＢＮＰ（７７−１０８）を除き、プロＢＮＰ（１−１０８）を特異的に認識する抗体であることは明白である。
【０１６２】
実施例１４：ハイブリドーマ３Ｄ４によって分泌される抗体によって認識されるエピトーピのスポット法による同定
ハイブリドーマ３Ｄ４上清は、ハイブリドーマ３Ｄ４抗体によって認識されるエピトープを同定するために、スポット法（実施例６に記載）で試験した。得られた結果は、３Ｄ４抗体がＲＡＰＲ76Ｓ77Ｐユニットを含むペプチド配列を効率良く認識することを示した。
【０１６３】
当該結果は、プロＢＮＰ（１−１０８）に対する３Ｄ４抗体の特異性を確認する、ＥＬＩＳＡ（実施例１２）及びウェスタンブロッティング（実施例１３）で得られた結果と一致した。
【０１６４】
実施例１５：プロＢＮＰ（１−１０８）のラジオイムノアッセイ
材料：
１）固相：平底分裂型ウェル（cleavable-well）Maxisorpマイクロプレート、Nunc（Denmark）。
２）使用した捕獲抗体は、ウサギ＃０４６８０５由来の血清から得られた、非除去のポリクローナル抗体である。
３）使用したコンジュゲートは、Ｉ125（抗ＢＮ：−Ｉ125）で標識した抗ＢＮＰ（７７−１０８）抗体である。当該抗体は、シオノギ社のシオノリアＢＮＰキットのトレーサー抗体である。
４）飽和緩衝液：１％牛胎児血清（BSA,Sigma＃A-7888）を含むｐＨ７．４のダルベッコＰＢＳ緩衝液。
５）希釈緩衝液：０．１％ＢＳＡ及び０．１％ツィーン２０（Sigma＃P-1379）を含むｐＨ７．４のダルベッコＰＢＳ緩衝液。
６）洗浄緩衝液：０．１％ツィーン２０を含むｐＨ７．４のダルベッコＰＢＳ緩衝液。
７）プロＢＮＰ（１−１０８）スタンダード：組換え蛋白質の形の製造物。
【０１６５】
プロトコール：
使用したアッセイの原理は、平底分裂型ウェルマイクロプレートで行うサンドウィッチラジオイムノアッセイ法に基く。試料（又はプロＢＮＰ（１−１０８）のスタンダード）及びトレーサーを次々に加えるワンステップアッセイである。
【０１６６】
・コーティング溶液を、まず、ウサギ＃０４６８０５由来のポリクローナル抗体を用いて、ダルベッコ ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）で４０μｇ/ｍｌに希釈し、全て調製した。当該溶液の３００μｌをマイクロプレートの各ウェルに加えた。
・このマイクロプレートを４℃で一晩インキュベートした。
・コーティング溶液を除いた後、マイクロプレートを、０．１％のツィーン２０を含むｐＨ７．４のダルべッコ ＰＢＳ緩衝液３００μｌで洗浄し、１％のＢＳＡを含むｐＨ７．４のダルべッコ ＰＢＳ緩衝液３００μｌを添加して飽和させた。
・その後、マイクロプレートを３７℃で１時間インキュベートした。
・次いで、マイクロプレートを洗浄液（０．１％のツィーン２０を含むｐＨ７．４のダルべッコ ＰＢＳ緩衝液）で３回洗浄した。
・１００μｌのスタンダードプロＢＮＰ（１−１０８）溶液、血清又は血漿を各殻斗（cupule）に入れた。プロＢＮＰ（１−１０８）をもし必要ならば固相上に保持されている捕獲抗体に結合させた。
・２００μｌの用時調製抗ＢＮＰ−Ｉ１２５トレーサー溶液（シオノギ社のシオノリアＢＮＰキットから入手）を各ウェルに加えた。
・反応媒体を４℃で一晩（１８〜２２時間）インキュベートした。
・翌日、マイクロプレートを３００μｌの洗浄液で３回洗浄した。最終洗浄し、洗浄溶液を吸引した後、各殻斗を不特定のチューブに移した。
・各殻斗に存在し、結合トレーサー量と試料中に存在のプロＢＮＰ（１−１０８）の量に比例する放射活性をガンマカウターを使って測定した。
【０１６７】
図１１は、プロＢＮＰ（１−１０８）のスタンダードレンジを使って得た結果を示す。
【０１６８】
実施例１６：ヒト試料のアッセイ結果
建常人の１４試料及び心不全に苦しむ患者の１５試料を、実施例１５に記載の本発明に従うプロＢＮＰ（１−１０８）ＩＲＭＡアッセイ、及びロシュ社から販売され、エレクシー（登録商標）自動装置を使用するＢＮＰ（１−７６）アッセイの手段により試験した。血液試料は全て、ＥＤＴＡを含むチューブに入れた。
図１２は、本発明に従うプロＢＮＰ（１−１０８）ＩＲＭＡアッセイにより当該試料について行った試験のｃｐｍ（counts per minute）の結果を示す。心不全に苦しむ患者の試料から得られた結果は、建常人の試料から得られた結果よりも、著しく高かった。当該結果は、心不全に苦しむ患者の試料中の循環プロＢＮＰ（１−１０８）の存在を明らかにするものであり、血清プロＢＮＰ（１−１０８）が心不全の予測マーカーであるという最初の証明である。
図１３は、心不全に苦しむ患者の１４試料についての、本発明に従うプロＢＮＰ（１−１０８）ＩＲＭＡアッセイの手段によって測定したプロＢＮＰ（１−１０８）濃度（ｐｇ/ｍｌ）とエレクシー（登録商標）自動装置を使用するロシュ社のアッセイの手段によって測定したプロＢＮＰ（１−１０８）濃度（ｐｇ/ｍｌ）との相関関係を示す。観察できた相関関係は、相関係数Ｒ2が０．８５で、有意であった。
【０１６９】
実施例１７：ウサギ＃０４６８０５由来のポリクローナル抗体とビオチンとのカップリング
カップリング法は、ＩｇＧの第一アミンと反応してアミド結合をつくるビオチンのＮ−ヒドロキシコハク酸アミド（ＮＨＳ）を使用した。
【０１７０】
（＋）−ビオチン・Ｎ−スクシンイミジルエステル（Fluka＃14405）の１００ｍＭ溶液を、ビオチンをジメチルホルムアミドに溶解して調製した。ビオチン化は、ガラスフラスコ中で行った。除去していない、予め精製したウサギ＃０４６８０５由来のポリクローナル抗体の５００μｇを、１００ｍＭのビオチン溶液（ビオチン／抗体のモル比は５００）１７μｌと一緒にフラスコに入れた。反応はｐＨ７．４のダルベッコＰＢＳ緩衝液中で行った。反応混合物を室温で１時間３０分、攪拌しながらインキュベートした。冷却後、２Ｍ グリシン緩衝液を加えて、ビオチンを不活性化した。混合物を室温で１０時間、ゆっくり攪拌しながらインキュベートした。最後に、混合物をｐＨ７．４のダルベッコＰＢＳ緩衝液で４℃一晩透析した。翌日、ナトリウムアジド溶液を０．０２％の最終濃度で加えた。当該コンジュゲートを４℃で保存した。
【０１７１】
実施例１８：プロＢＮＰ（１−１０８）の酵素免疫試験
本発明に従う酵素免疫試験を設定した。
【０１７２】
材料：
１）固相：平底Maxisorpマイクロプレート、Nunc(Denmark)。
２）使用した捕獲抗体は、Strategic Biosolution社から市販のポリクローナル抗ＢＮＰ（１−１０８）抗体(#B9105RA00-A0)である。
３）使用したコンジュゲートは、実施例１７に記載の方法に従う、ビオチンに結合した、非除去のウサギ＃０４６８０５由来のポリクローナル抗体である。
４）ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼコンジュゲート（Amersham Pharmacia Biotech＃RPN1231V）。
５）飽和緩衝液：１％牛胎児血清（BSA,Sigma＃A-7888）を含むｐＨ７．４のダルベッコＰＢＳ緩衝液。
６）希釈溶液：０．１％ＢＳＡ及び０．１％ツィーン２０を含むｐＨ７．４のダルベッコＰＢＳ緩衝液。
７）洗浄緩衝液：０．１％ツィーン２０を含むｐＨ７．４のダルベッコＰＢＳ緩衝液。
８）プロＢＮＰ（１−１０８）スタンダード：組換え蛋白質。
９）視覚化溶液：視覚化溶液は、
９ａ）基質溶液：０．３３％のＨ2Ｏ2を含む０．０１Ｍ クエン酸と０．０４Ｍ トリナトリウム・シトレートの最終ｐＨ５．６の溶液、及び
９ｂ）色原体：ＯＰＤ（オルト−フェニレンジアミン）錠で、１ＯＰＤ錠は、１０ｍｌの基質緩衝液に溶解している、
を含む。
１０）停止溶液：４Ｎ Ｈ2ＳＯ4。
【０１７３】
プロトコール：
使用したアッセイの原理は、平底プレート中で行うサンドウィッチ型酵素免疫法に基く。まず、試料（又はスタンダード溶液）を捕獲抗体とインキュベートし、次いでインキュベーション及び洗浄後、検出抗体を添加する２ステップアッセイである。
【０１７４】
・コーティング溶液は、まず、ｐＨ７．４のダルベッコ ＰＢＳ緩衝液で１０μｇ/ｍｌに希釈した抗ＢＮＰ（７−１０８）ポリクローナル抗体で調製した。１００μｌの当該溶液をマクロプレートの各ウェルに入れた。
・このマイクロプレートを４℃で一晩インキュベートした。
・コーティング溶液を除いた後、マイクロプレートを、０．１％のツィーン２０を含むｐＨ７．４のダルべッコ ＰＢＳ緩衝液３００μｌで洗浄し、１％のＢＳＡを含むｐＨ７．４のダルべッコ ＰＢＳ緩衝液２５０μｌを添加して飽和させた。
・その後、マイクロプレートを３７℃で１時間インキュベートした。
・次いで、マイクロプレートを洗浄液で３回洗浄した。
・１００μｌのスタンダードプロＢＮＰ（１−１０８）溶液、血清又は血漿を各殻斗に入れた。プロＢＮＰ（１−１０８）がもし存在するならば、固相に保持されている捕獲抗体に結合させた。
・反応媒体を室温で２時間インキュベートした。
・次いで、マイクロプレートを３００μｌの洗浄液で５回洗浄した。
・ウサギ＃０４６８０５由来のビオチン化ポリクローナル抗体１００μｌ（６μｇ/ｍｌに濃縮）をマイクロプレートの各ウェルに加えた。
・反応媒体を室温で１時間３０分インキュベートした。
・次いで、プレートを３００μｌの洗浄液で５回洗浄した。１００μｌの視覚化溶液を各殻斗に分注した。反応は、室温（１８〜２４℃）で２０分間、黒っぽくなるまで放置した。
・次いで、５０μｌの停止溶液を各殻斗に分注した。
・反応を停止後、光学密度を４９０／６２０ｎｍで分光光度計で読んだ。
【０１７５】
図１４は、スタンダードプロＢＮＰ（１−１０８）レンジを用いて得た結果を示す。
【０１７６】
実施例１９：抗プロＢＮＰ（１−１０８）ポリクローナル抗体を共存させる、サンドウィッチ型のプロＢＮＰ（１−１０８）ＥＬＩＳＡアッセイを用いる、ＢＮＰ（１−７６）及びＢＮＰ（７７−１０８）に関する、非除去の、ウサギ＃０４６８０５由来のビオチン結合ポリクローナル抗体の交差反応の評価
ＢＮＰ（１−７６）及びＢＮＰ（７７−１０８）に関する、本発明に従う、非除去の、ビオチン化抗プロＢＮＰ（１−１０８）ポリクローナル抗体の交差反応は、実施例８に記載のプロＢＮＰ（１−１０８）ＥＬＩＳＡアッセイの手段により評価した。プロＢＮＰ（１−１０８）、ＢＮＰ（１−７６）及びＢＮＰ（７７−１０８）の５ｎｇ/ｍｌ〜１００ｎｇ/ｍｌの濃度レンジを調製し、実施例１８に記載のプロＢＮＰ（１−１０８）ＥＬＩＳＡアッセイの手段により試験した。
【０１７７】
濃度に対する４９０ｎｍにおける光学密度の変化の結果を、各蛋白質について図１５に示す。ＢＮＰ（１−７６）又はＢＮＰ（７７−１０８）については全く交差反応が認められなかった。すなわち、得られたシグナルは、如何なる濃度で試験しても、バックグラウンドと等価であった。患者に一般的に見られるＢＮＰ（１−７６）及びＢＮＰ（７７−１０８）の濃度（最高濃度では、１ｎｇ/ｍｌのオーダー）では、ウサギ＃０４６８０５由来のポリクローナル抗体は、交差反応を示さない非除去バージョンに使用することができた。
【０１７８】
実施例２０：抗ＮＴ−プロＢＮＰ（１−２９）ポリクローナル抗体を共存させる、サンドウィッチ型のプロＢＮＰ（１−１０８）ＥＬＩＳＡアッセイを用いる、ＢＮＰ（１−７６）及びＢＮＰ（７７−１０８）に関する、非除去の、ウサギ＃０４６８０５由来のビオチン結合ポリクローナル抗体の交差反応の評価
ＢＮＰ（１−７６）及びＢＮＰ（７７−１０８）に関する、非除去の、ビオチン化ポリクローナル抗体の交差反応を、実施例２０では、抗プロＢＮＰ（１−１０８）抗体を抗ＮＴ−プロＢＮＰ（１−２９）ポリクローナル抗体に換える以外は、実施例８に記載のプロトコール及び試薬を用いるプロＢＮＰ（１−１０８）ＥＬＩＳＡアッセイの手段により評価した。
【０１７９】
抗ＮＴ−プロＢＮＰ（１−２９）ポリクローナル抗体は、イムノゲンとして使用したペプチドがＫＬＨに結合したペプチドＮＴ−プロＢＮＰ（１−１０８）であった事実を除いて、実施例３に記載のプロトコールに従って作製した。プロＢＮＰ（１−１０８）、ＢＮＰ（１−７６）及びＢＮＰ（７７−１０８）の５ｎｇ/ｍｌ〜１００ｎｇ/ｍｌの濃度レンジを調製し、プロＢＮＰ（１−１０８）ＥＬＩＳＡアッセイの手段により試験した。
【０１８０】
濃度に対する４９０ｎｍにおける光学密度の変化の結果を、各蛋白質について図１６に示す。本発明に従うウサギ＃０４６８０５由来のポリクローナル抗体の交差反応は、ＢＮＰ（１−７６）又はＢＮＰ（７７−１０８）については全く認められなかった。すなわち、得られたシグナルは、如何なる濃度で試験しても、バックグラウンドと等価であった。患者に一般的に見られるＢＮＰ（１−７６）及びＢＮＰ（７７−１０８）の濃度（最高濃度では、１ｎｇ/ｍｌのオーダー）では、ウサギ＃０４６８０５由来のポリクローナル抗体は、交差反応を示さない非除去バージョンに使用することができた。
【図面の簡単な説明】
【０１８１】
【図１】図１は、プロテインＡ−セファロースで精製したウサギ＃０４６８０５由来のポリクローナル抗体の、マイクロプレート上に０．２５μｇ/ｍｌで吸着させたプロＢＮＰ（１−１０８）、ＢＮＰ（１−７６）フラグメント、ＢＮＰ（７７−１０８）又はＧＳＴ（glutathione-S-transferase、コントロール蛋白質として用いた）との反応性を示す。
【図２】図２は、ＢＮＰ−Ｋ3−ＮＨＳ−セファロース樹脂で除去した後に得たウサギ＃０４６８０５のろ液のポリクローナル抗体の反応性を示す。当該ポリクローナル抗体は、２〜２０μｇ/ｍｌのレンジの希釈形態で調製し、次いで０．２５μｇ/ｍｌの吸着量のプロＢＮＰ（１−１０８）、ＢＮＰ（１−７６）又はＢＮＰ（７７−１０８）ポリペプチドで被覆した殻斗上で試験した。
【図３】図３は、ＢＮＰ−Ｋ3−ＮＨＳ−セファロース樹脂で除去した後に得たウサギ＃０４６８３２のろ液のポリクローナル抗体の反応性を示す。当該ポリクローナル抗体は、５〜２０μｇ/ｍｌのレンジの希釈形態で調製し、次いで０．２５μｇ/ｍｌの吸着量のプロＢＮＰ（１−１０８）、ＢＮＰ（１−７６）又はＢＮＰ（７７−１０８）ポリペプチドで被覆した殻斗上で試験した。
【図４】図４は、ＢＮＰ−Ｋ3−ＮＨＳ−セファロース樹脂で除去した後に得たウサギ＃０４６８０５のポリクローナル血清の溶出液の反応性を示す。当該ポリクローナル抗体は、２〜２０μｇ/ｍｌのレンジの希釈形態で調製し、次いで０．２５μｇ/ｍｌの吸着量のプロＢＮＰ（１−１０８）、ＢＮＰ（１−７６）又はＢＮＰ（７７−１０８）ポリペプチドで被覆した殻斗上で試験した。
【図５】図５は、ＢＮＰ−Ｋ3−ＮＨＳ−セファロース樹脂で除去した後に得たウサギ＃０４６８３２のポリクローナル血清の溶出液の反応性を示す。当該ポリクローナル抗体は、５〜２０μｇ/ｍｌのレンジの希釈形態で調製し、次いで０．２５μｇ/ｍｌの吸着量のプロＢＮＰ（１−１０８）、ＢＮＰ（１−７６）又はＢＮＰ（７７−１０８）ポリペプチドで被覆した殻斗上で試験した。
【図６】図６は、スポット技術の手段による、除去前のウサギ０４６８０５由来のポリクローナル血清のエピトープ分析を表す（当該実施例では、ノイズのバックグラウンドは、３０．４±５．９３相対強度単位）。
【図７】図７は、スポット技術の手段による、ＢＮＰ−Ｋ3−ＮＨＳ−セファロース樹脂上での除去後のウサギ０４６８０５由来のポリクローナル血清のエピトープ分析を表す（当該実施例では、ノイズのバックグラウンドは、３１．３±６．３１相対強度単位）。
【図８】図８は、０．２５μｇ/ｍｌの吸着量のプロＢＮＰ（１−１０８）、ＢＮＰ（１−７６）、ＢＮＰ（７７−１０８）又はペプチドＹＴＬＲＡＰＲＳＰＫＭＶＱＧＳＧ（Ｃ１３Ｐ３０）で被覆した殻斗上で試験した、１／２に希釈したハイブリドーマ３Ｄ４の培養上清の反応性を表す。
【図９】図９は、各々の蛋白質が移動している（１レーン当たり、１μｇの蛋白質）、１６％アクリルアミドゲルの写真を示す。レーン１：分子量マーカー；レーン２：プロＢＮＰ（１−１０８）−ＧＳＴ；レーン３：ＧＳＴ（ネガティブコントロール蛋白質）；レーン４：ＢＮＰ（１−７６）−ＧＳＴ；レーン５：ＢＮＰ（７７−１０８）。
【図１０】図１０は、プロＢＮＰ（１−１０８）−ＧＳＴ（レーン２）、ＧＳＴ（ネガティブコントロール蛋白質）（レーン３）、ＢＮＰ（１−７６）−ＧＳＴ（レーン４）及びＢＮＰ（７７−１０８）（レーン５）をゲル（１ゲル当たり、１μｇの蛋白質）上に装填し、次いでニトロセルロース膜上に移す、３Ｄ４ハイブリドーマによって分泌された抗体を用いるウェスタンブロッティングアッセイの結果を示す。
【図１１】図１１は、プロＢＮＰ（１−１０８）ＩＲＭＡアッセイのスタンダードカーブを表す。
【図１２】図１２は、１４人の健常人からの試料及び心不全に苦しむ１５人の患者からの試料中のプロＢＮＰ（１−１０８）のＩＲＭＡアッセイの結果をｃｐｍ（counts per minute）で示す。
【図１３】図１３は、心不全に苦しむ１４人の患者からの試料について、本発明に従う免疫放射定量測定法の手段によって測定したプロＢＮＰ（１−１０８）（ｐｇ/ｍｌ）の濃度と、エレクシー(Ｅｌｅｃｓｙｓ)(登録商標)自動装置（ホフマン・ラロシュ社の登録商標）によるアッセイの手段によって測定したＢＮＰ（１−７６）（ｐｇ/ｍｌ）の濃度との関係を示す。
【図１４】図１４は、本発明に従うプロＢＮＰ（１−１０８）のＥＬＩＳＡＡアッセイのスタンダードカーブを表す。
【図１５】図１５は、プロＢＮＰ（１−１０８）ＥＬＩＳＡアッセイで、抗ＢＮＰ（７７−１０８）ポリクローナル抗体を共存させ、サンドウィッチに使用した、除去を行わず、ビオチンに結合させたウサギ＃０４６８０５のポリクローナル抗体のＢＮＰ（１−７６）及びＢＮＰ（７７−１０８）に関する交差反応の評価を表す。
【図１６】図１６は、プロＢＮＰ（１−１０８）ＥＬＩＳＡアッセイで、抗ＮＴ−プロＢＮＰ（１−２９）ポリクローナル抗体を共存させ、サンドウィッチに使用した、除去を行わず、ビオチンに結合させたウサギ＃０４６８０５のポリクローナル抗体のＢＮＰ（１−７６）及びＢＮＰ（７７−１０８）に関する交差反応の評価を表す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第一に、プロＢＮＰ（１−１０８）の配列ＲＡＰＲ76Ｓ77Ｐ（配列番号５）を特異的に認識し、ペプチドＢＮＰ（１−７６）又はペプチドＢＮＰ（７７−１０８）を実質的に認識せず、第二に、ヒト血清又は血漿の試料中の循環プロＢＮＰ（１−１０８）を特異的に認識する能力を有する、ことを特徴とする抗プロＢＮＰ（１−１０８）抗体。
【請求項２】
プロＢＮＰ（１−１０８）の配列Ｙ70ＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳＧ85（配列番号４）を特異的に認識する、請求項１記載の抗プロＢＮＰ（１−１０８）抗体。
【請求項３】
プロＢＮＰ（１−１０８）の配列Ｙ70ＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳ84（配列番号１０８）を特異的に認識する、請求項１記載の抗プロＢＮＰ（１−１０８）抗体。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項記載の抗プロＢＮＰ（１−１０８）抗体を取得するための方法であって、動物をプロＢＮＰ（１−１０８）分子全体で免疫し、次いで、ＢＮＰ（７７−１０８）ペプチド及び／又はＢＮＰ（１−７６）ペプチドを用いて、得られた抗血清を除去する前記方法。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれか１項記載の抗プロＢＮＰ（１−１０８）抗体を取得するための方法であって、
−下記式：
ａ1−Ｘ1−ＲＡＰＲＳＰ−Ｘ2−ａ2 （Ｉ）
［式中、
ａ1は、水素原子であるかあるいはチオール、アルコール、アミノキシ、第一アミンもしくは第二アミン官能基、アミノカルボキシル基、ビオチニル基及びアセチル基から選ばれる官能基又は化学基を表し、
Ｘ1は、０〜３のアミノ酸のペプチド配列であって、プロＢＮＰ（１−１０８）の天然配列に由来しても又は由来しなくてもよい配列を表し、
Ｘ2は、０〜７のアミノ酸のペプチド配列であって、プロＢＮＰ（１−１０８）の天然配列に由来しても由来しなくてもよい配列を表し、
ａ2は、ＯＨ官能基、ＮＨ2官能基又はアルコキシ基を表す。]
で表されるペプチド；
−下記式：
Ｘ−Ｙ70ＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳＧ85−Ｚ （ＩＩ）
［式中、Ｘは、水素原子であるか又はアセチル基もしくはプロＢＮＰ（１−１０８）の配列に属さない１〜３のアミノ酸を表し、そして、Ｚは、ＯＨ官能基又はプロＢＮＰ（１−１０８）の配列に属さない１〜３のアミノ酸を表す。］
で表されるペプチド；
−下記式：
Ｘ−Ｙ70ＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳ84−Ｚ （ＩＩＩ）
［式中、Ｘは、水素原子であるか又はアセチル基もしくはプロＢＮＰ（１−１０８）の配列に属さない１〜３のアミノ酸を表し、そして、Ｚは、ＯＨ官能基又はプロＢＮＰ（１−１０８）の配列に属さない１〜３のアミノ酸を表す。］
で表されるペプチド；
−アミノ酸Ｙ70、Ｔ71、Ｌ72、Ｋ79、Ｍ80、Ｖ81、Ｑ82、Ｇ83、Ｓ84及びＧ85の内の１以上のアミノ酸で置換された配列Ｘ−Ｙ70ＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳＧ85−Ｚ（ＩＩ）又は配列Ｘ−Ｙ70ＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳ84−Ｚ（ＩＩＩ）であって、Ｘが、水素原子であるか又はアセチル基もしくはプロＢＮＰ（１−１０８）の配列に属さない１〜３のアミノ酸を表し、そして、Ｚが、ＯＨ官能基又はプロＢＮＰ（１−１０８）の配列に属さない１〜３のアミノ酸であり得る配列に由来する配列を含むペプチド；
−配列Ｃ−Ｙ−Ｔ−Ｌ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ｋ−Ｍ−Ｖ−Ｑ−Ｇ−Ｓ−Ｇ（Ｃ１３Ｐ３０：配列番号１６）を有するペプチド；
−配列Ｃ−Ｙ−Ｔ−Ｌ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ｋ−Ｍ−Ｖ−Ｑ−Ｇ−Ｓ（ＣＮ３２：配列番号１０９）を有するペプチド；
から選ばれるペプチドで動物を免疫し、次いで、場合により、ＢＮＰ（７７−１０８）ペプチド及び／又はＢＮＰ（１−７６）ペプチドを用いて、得られた抗血清を除去する前記方法。
【請求項６】
請求項１〜３のいずれか１項記載の抗プロＢＮＰ（１−１０８）抗体を分泌するハイブリドーマを取得するための方法であって、
−下記式：
ａ1−Ｘ1−ＲＡＰＲＳＰ−Ｘ2−ａ2 （Ｉ）
［式中、
ａ1は、水素原子であるかあるいはチオール、アルコール、アミノキシ、第一アミンもしくは第二アミン官能基、アミノカルボキシル基、ビオチニル基及びアセチル基から選ばれる官能基又は化学基を表し、
Ｘ1は、０〜３のアミノ酸のペプチド配列であって、プロＢＮＰ（１−１０８）の天然配列に由来しても由来しなくてもよい配列を表し、
Ｘ2は、０〜７のアミノ酸のペプチド配列であって、プロＢＮＰ（１−１０８）の天然配列に由来しても由来しなくてもよい配列を表し、
ａ2は、ＯＨ官能基、ＮＨ2官能基又はアルコキシ基を表す。］
で表されるペプチド；
−下記式：
Ｘ−Ｙ70ＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳＧ85−Ｚ （ＩＩ）
［式中、Ｘは、水素原子であるか又はアセチル基もしくはプロＢＮＰ（１−１０８）の配列に属さない１〜３のアミノ酸を表し、そして、Ｚは、ＯＨ官能基又はプロＢＮＰ（１−１０８）の配列に属さない１〜３のアミノ酸を表す。］
で表されるペプチド；
−下記式：
Ｘ−Ｙ70ＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳ84−Ｚ （ＩＩＩ）
［式中、Ｘは、水素原子であるか又はアセチル基もしくはプロＢＮＰ（１−１０８）の配列に属さない１〜３のアミノ酸を表し、そして、Ｚは、ＯＨ官能基又はプロＢＮＰ（１−１０８）の配列に属さない１〜３のアミノ酸を表す。］
で表されるペプチド；
−アミノ酸Ｙ70、Ｔ71、Ｌ72、Ｋ79、Ｍ80、Ｖ81、Ｑ82、Ｇ83、Ｓ84及びＧ85の内の１以上のアミノ酸で置換された配列Ｘ−Ｙ70ＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳＧ85−Ｚ（ＩＩ）又は配列Ｘ−Ｙ70ＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳ84−Ｚ（ＩＩＩ）であって、Ｘが、水素原子であるか又はアセチル基もしくはプロＢＮＰ（１−１０８）の配列に属さない１〜３のアミノ酸を表し、そして、Ｚが、ＯＨ官能基又はプロＢＮＰ（１−１０８）の配列に属さない１〜３のアミノ酸であり得る配列に由来する配列を含むペプチド；
−配列Ｃ−Ｙ−Ｔ−Ｌ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ｋ−Ｍ−Ｖ−Ｑ−Ｇ−Ｓ−Ｇ（Ｃ１３Ｐ３０：配列番号１６）を有するペプチド；
−配列Ｃ−Ｙ−Ｔ−Ｌ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ｋ−Ｍ−Ｖ−Ｑ−Ｇ−Ｓ（ＣＮ３２：配列番号１０９）を有するペプチド；
から選ばれるペプチドで動物を免疫し、
イムノグロブリン分泌リンパ球を当該動物から採取し、そして、
当該リンパ球をミエローマ細胞と融合して、少なくとも一種のイムノグロブリン分泌ハイブリドーマを取得する前記方法。
【請求項７】
式（ＩＩ）の前記ペプチドが、配列Ｙ70ＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳＧ85（配列番号４）を有する、請求項５又は６記載の方法。
【請求項８】
式（ＩＩＩ）の前記ペプチドが、配列Ｙ70ＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳ84（配列番号１０８）を有する、請求項５又は６記載の方法。
【請求項９】
請求項６〜８のいずれか１項記載の方法によって製造されるハイブリドーマ。
【請求項１０】
請求項９記載のハイブリドーマによって分泌される抗プロＢＮＰ（１−１０８）モノクローナル抗体。
【請求項１１】
生物学的試料を請求項１〜３及び１０のいずれか１項記載の抗プロＢＮＰ（１−１０８）抗体と接触させること、及び当該試料中の前記抗プロＢＮＰ（１−１０８）を検出することを含む、ヒトの心不全のｉｎ ｖｉｔｒｏ診断方法。
【請求項１２】
ヒトの心不全のｉｎ ｖｉｔｒｏ診断方法であって、
ａ）生物学的試料を請求項１〜３及び１０のいずれか１項記載の抗プロＢＮＰ（１−１０８）抗体と接触させること、
ｂ）抗原抗体複合体の形成を可能にする条件下で、当該混合物をインキュベートすること、及び
ｃ）当該一次複合体中に存在する前記プロＢＮＰ（１−１０８）に特異的に結合することができる標識検出抗体、又は当該一次複合体中に存在する前記プロＢＮＰ（１−１０８）に対する抗体に結合することができる標識検出抗原を場合により使用して、形成された抗原抗体複合体を明らかにすること、
を含む前記方法。
【請求項１３】
前記明らかにされた抗原抗体複合体の量を、人の臨床症状と相関させるためのステップｄ）を更に含む、請求項１２記載の診断方法。
【請求項１４】
請求項１〜３及び１０のいずれか１項記載の少なくとも一つの抗体を含む、生物学的な試料中のプロＢＮＰ（１−１０８）を検出するためのキット。
【請求項１５】
請求項１４記載の生物学的な試料中のプロＢＮＰ（１−１０８）を検出するためのキットであって、
（ｉ）一つの容器には、請求項１〜３及び１０のいずれか１項記載の少なくとも一つの抗体を、
（ｉｉ）もう一つの容器には、
−下記式：
ａ1−Ｘ1−ＲＡＰＲＳＰ−Ｘ2−ａ2 （Ｉ）
［式中、
ａ1は、水素原子であるかあるいはチオール、アルコール、アミノキシ、第一アミンもしくは第二アミン官能基、アミノカルボキシル基、ビオチニル基及びアセチル基から選ばれる官能基又は化学基を表し、
Ｘ1は、０〜３のアミノ酸のペプチド配列であって、プロＢＮＰ（１−１０８）の天然配列に由来しても由来しなくてもよい配列を表し、
Ｘ2は、０〜７のアミノ酸のペプチド配列であって、プロＢＮＰ（１−１０８）の天然配列に由来しても由来しなくてもよい配列を表し、
ａ2は、ＯＨ官能基、ＮＨ2官能基又はアルコキシ基を表す。］
で表されるペプチド；
−下記式：
Ｘ−Ｙ70ＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳＧ85−Ｚ （ＩＩ）
［式中、Ｘは、水素原子であるか又はアセチル基もしくはプロＢＮＰ（１−１０８）の配列に属さない１〜３のアミノ酸を表し、そして、Ｚは、ＯＨ官能基又はプロＢＮＰ（１−１０８）の配列に属さない１〜３のアミノ酸を表す。］
で表されるペプチド；
−下記式：
Ｘ−Ｙ70ＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳ84−Ｚ （ＩＩＩ）
［式中、Ｘは、水素原子であるか又はアセチル基もしくはプロＢＮＰ（１−１０８）の配列に属さない１〜３のアミノ酸を表し、そして、Ｚは、ＯＨ官能基又はプロＢＮＰ（１−１０８）の配列に属さない１〜３のアミノ酸を表す。］
で表されるペプチド；
−アミノ酸Ｙ70、Ｔ71、Ｌ72、Ｋ79、Ｍ80、Ｖ81、Ｑ82、Ｇ83、Ｓ84及びＧ85の内の１以上のアミノ酸で置換された配列Ｘ−Ｙ70ＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳＧ85−Ｚ（ＩＩ）又は配列Ｘ−Ｙ70ＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳ84−Ｚ（ＩＩＩ）であって、Ｘが、水素原子であるか又はアセチル基もしくはプロＢＮＰ（１−１０８）の配列に属さない１〜３のアミノ酸を表し、そして、Ｚが、ＯＨ官能基又はプロＢＮＰ（１−１０８）の配列に属さない１〜３のアミノ酸であり得る配列に由来する配列を含むペプチド；
−配列Ｙ70ＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳＧ85（配列番号４）を有するペプチド；
−配列Ｙ70ＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳ84（配列番号１０９）を有するペプチド；
−配列Ｃ−Ｙ−Ｔ−Ｌ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ｋ−Ｍ−Ｖ−Ｑ−Ｇ−Ｓ−Ｇ（Ｃ１３Ｐ３０：配列番号１６）を有するペプチド；
−配列Ｃ−Ｙ−Ｔ−Ｌ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ｋ−Ｍ−Ｖ−Ｑ−Ｇ−Ｓ（ＣＮ３２：配列番号１０９）を有するペプチド；
から選ばれる少なくとも一つのペプチド
を含む前記キット。
【請求項１６】
下記式：
ａ1−Ｘ1−ＲＡＰＲＳＰ−Ｘ2−ａ2 （Ｉ）
［式中、
ａ1は、水素原子であるかあるいはチオール、アルコール、アミノキシ、第一アミンもしくは第二アミン官能基、アミノカルボキシル基、ビオチニル基及びアセチル基から選ばれる官能基又は化学基を表し、
Ｘ1は、０〜３のアミノ酸のペプチド配列であって、プロＢＮＰ（１−１０８）の天然配列に由来しても由来しなくてもよい配列を表し、
Ｘ2は、０〜７のアミノ酸のペプチド配列であって、プロＢＮＰ（１−１０８）の天然配列に由来しても由来しなくてもよい配列を表し、
ａ2は、ＯＨ官能基、ＮＨ2官能基又はアルコキシ基を表す。]
で表されるペプチド。
【請求項１７】
下記式：
Ｘ−Ｙ70ＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳＧ85−Ｚ （ＩＩ）
［式中、Ｘは、水素原子であるか又はアセチル基もしくはプロＢＮＰ（１−１０８）の配列に属さない１〜３のアミノ酸を表し、そして、Ｚは、ＯＨ官能基又はプロＢＮＰ（１−１０８）の配列に属さない１〜３のアミノ酸を表す。］
で表されるペプチド。
【請求項１８】
前記配列Ｙ70ＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳＧ85（配列番号４）を有する、請求項１７記載のペプチド。
【請求項１９】
下記式：
Ｘ−Ｙ70ＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳ84−Ｚ （ＩＩＩ）
［式中、Ｘは、水素原子であるか又はアセチル基もしくはプロＢＮＰ（１−１０８）の配列に属さない１〜３のアミノ酸を表し、そして、Ｚは、ＯＨ官能基又はプロＢＮＰ（１−１０８）の配列に属さない１〜３のアミノ酸を表す。］
で表されるペプチド。
【請求項２０】
前記配列Ｙ70ＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳ84−Ｚ（配列番号１０８）を有する、請求項１９記載のペプチド。
【請求項２１】
アミノ酸Ｙ70、Ｔ71、Ｌ72、Ｋ79、Ｍ80、Ｖ81、Ｑ82、Ｇ83、Ｓ84及びＧ85の内の１以上のアミノ酸で置換された配列Ｘ−Ｙ70ＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳＧ85−Ｚ（ＩＩ）又は配列Ｘ−Ｙ70ＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳ84−Ｚ（ＩＩＩ）であって、Ｘが、水素原子であるか又はアセチル基もしくはプロＢＮＰ（１−１０８）の配列に属さない１〜３のアミノ酸を表し、そして、Ｚが、ＯＨ官能基又はプロＢＮＰ（１−１０８）の配列に属さない１〜３のアミノ酸であり得る配列に由来する配列を含むペプチド。
【請求項２２】
以下の配列；
配列番号１６：Ｃ−Ｙ−Ｔ−Ｌ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ｋ−Ｍ−Ｖ−Ｑ−Ｇ−Ｓ−Ｇ（ペプチド Ｃ１３Ｐ３０）
配列番号１０９：Ｃ−Ｙ−Ｔ−Ｌ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ｋ−Ｍ−Ｖ−Ｑ−Ｇ−Ｓ（ペプチド ＣＮ３２）
配列番号６：Ｃ−Ｇ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ
配列番号７：アセチル−Ｃ−Ｇ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ
配列番号８：Ｃ−Ｇ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ｋ
配列番号９：アセチル−Ｃ−Ｇ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ｋ
配列番号１０：Ｃ−Ｇ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ｋ−Ｍ−Ｖ
配列番号１１：Ｃ−Ｇ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ｋ−Ｍ−Ｖ−Ｑ−Ｇ−Ｓ−Ｇ
配列番号１２：Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ｇ−Ｃ
配列番号１３：アセチル−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ｇ−Ｃ
配列番号１１０：Ｃ−Ｙ−Ｔ−Ｌ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ｋ
配列番号１１１：Ｃ−Ｙ−Ｔ−Ｌ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ｋ−Ｍ−Ｖ
配列番号１１２：Ｃ−Ｙ−Ｔ−Ｌ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ｋ−Ｍ−Ｖ−Ｑ
配列番号１１３：Ｃ−Ｙ−Ｔ−Ｌ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ｋ−Ｍ−Ｖ−Ｑ−Ｇ
配列番号１９：Ｃ−Ｙ−Ｔ−Ｌ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ｋ−Ｍ−Ｖ−Ｑ−Ｇ−Ｓ−βＡ
配列番号２０：Ｃ−Ｙ−Ｔ−Ｌ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ｋ−Ｍ−Ｖ−Ｑ−Ａ−Ｔ−βＡ
配列番号１１４：アセチル−Ｃ−Ｔ−Ｌ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ｋ−Ｍ−Ｖ−Ｑ
配列番号１１５：Ｃ−Ｔ−Ｌ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ｋ−Ｍ−Ｖ−Ｑ−Ｇ
配列番号１１６：Ｃ−Ｔ−Ｌ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ｋ−Ｍ−Ｖ−Ｑ−Ｇ−Ｓ
配列番号１１７：Ｃ−Ｔ−Ｌ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ｋ−Ｍ−Ｖ−Ｑ−Ｇ−Ｓ−Ｇ
配列番号１１８：Ｃ−Ｌ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ｋ−Ｍ−Ｖ
配列番号１１９：Ｃ−Ｌ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ｋ−Ｍ−Ｖ−Ｑ
配列番号１２０：Ｌ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ｋ−Ｍ−Ｖ−Ｑ−Ｃ
配列番号１２１：Ｃ−Ｌ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ｋ−Ｍ−Ｖ−Ｑ−Ｇ−Ｓ
配列番号１２２：Ｃ−Ｌ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ｋ−Ｍ−Ｖ−Ｑ−Ｇ−Ｓ−Ｇ
からなる群より選ばれる配列を有する、請求項１６記載のペプチド。
【請求項２３】
前記ＢＮＰ（１−７６）ペプチド及び前記ＢＮＰ（７７−１０８）ペプチドを実質的に除き、プロＢＮＰ（１−１０８）の前記配列Ｙ70ＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳＧ85、前記配列Ｙ70ＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳ84及び／又は前記配列ＲＡＰＲ76Ｓ77Ｐを特異的に認識し、ヒト血清試料又は血漿試料中の循環プロＢＮＰ（１−１０８）を特異的に認識する能力を有する抗プロＢＮＰ（１−１０８）抗体を取得するための方法であって、動物を請求項１６〜２２のいずれか１項記載のペプチドで免疫し、場合により、前記ＢＮＰ（７７−１０８）ペプチド及び／又は前記ＢＮＰ（１−７６）ペプチドを用いて、得られた抗血清を除く前記方法。
【請求項２４】
前記ＢＮＰ（１−７６）ペプチド及び前記ＢＮＰ（７７−１０８）ペプチドを実質的に除き、プロＢＮＰ（１−１０８）の前記配列Ｙ70ＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳＧ85、前記配列Ｙ70ＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳ84及び／又は前記配列ＲＡＰＲ76Ｓ77Ｐを特異的に認識し、ヒト血清試料又は血漿試料中の循環プロＢＮＰ（１−１０８）を特異的に認識する能力を有する抗プロＢＮＰ（１−１０８）抗体を分泌するハイブリドーマを取得するための方法であって、動物を請求項１６〜２２のいずれか１項記載のペプチドで免疫し、イムノグロブリン分泌リンパ球を当該動物から採取し、そして、前記リンパ球をミエローマ細胞と融合し、少なくとも一種のイムノグロブリン分泌ハイブリドーマを取得する前記方法。
【請求項２５】
請求項２３記載の方法によって得られることを特徴とする、抗プロＢＮＰ（１−１０８）抗体。
【請求項２６】
プロＢＮＰ（１−１０８）の配列Ｙ70ＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳＧ85又は配列Ｙ70ＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳ84を特異的に認識する、請求項２５記載の抗プロＢＮＰ（１−１０８）抗体。
【請求項２７】
請求項２４記載の方法によって製造され得るハイブリドーマ。
【請求項２８】
請求項２７記載のハイブリドーマによって分泌される抗プロＢＮＰ（１−１０８）モノクローナル抗体。
【請求項２９】
ＣＮＣＭに番号ＣＮＣＭ Ｉ−３０７３で寄託されたハイブリドーマ３Ｄ４によって分泌される、請求項２８記載の抗プロＢＮＰ（１−１０８）モノクローナル抗体。
【請求項３０】
生物学的試料を請求項２５、２６、２８及び２９のいずれか１項記載の抗プロＢＮＰ（１−１０８）抗体と接触させること、及び当該試料中の前記プロＢＮＰ（１−１０８）を検出することを含む、ヒトの心不全のｉｎ ｖｉｔｒｏ診断方法。
【請求項３１】
ヒトの心不全のｉｎ ｖｉｔｒｏ診断方法であって、
ａ）生物学的試料を請求項２５、２６、２８及び２９のいずれか１項記載の抗プロＢＮＰ（１−１０８）抗体と接触させること、
ｂ）抗原抗体複合体の形成を可能にする条件下で、当該混合物をインキュベートすること、及び
ｃ）当該一次複合体中に存在する前記プロＢＮＰ（１−１０８）に特異的に結合することができる標識検出抗体、又は当該一次複合体中に存在する前記プロＢＮＰ（１−１０８）に対する抗体に結合することがでできる標識検出抗原を場合により使用して、形成された抗原抗体複合体を明らかにすること、
を含む前記方法。
【請求項３２】
明らかにされた抗原抗体複合体の量を人の臨床症状と相関させるためのステップｄ）を更に含む、請求項３１記載の診断方法。
【請求項３３】
請求項２５、２６、２８及び２９記載の少なくとも一つの抗体を含む、生物学的試料中のプロＢＮＰ（１−１０８）を検出するためのキット。
【請求項３４】
請求項１６〜２２のいずれか１項記載の少なくとも一つのペプチドをスタンダード及び／又はコントロールとして含む、生物学的試料中のプロＢＮＰ（１−１０８）を検出するためのキット。
【請求項３５】
生物学的な試料中のプロＢＮＰ（１−１０８）を検出するためのキットであって、
−一つの容器に、請求項２５、２６、２８及び２９記載の少なくとも一つの抗体を、
−もう一つの容器に、請求項１６〜２２のいずれか１項記載の少なくとも一つのペプチドを含む、生物学的試料中のプロＢＮＰ（１−１０８）を検出するための前記キット。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第一に、プロＢＮＰ（１−１０８）の配列ＲＡＰＲ７６Ｓ７７Ｐ（配列番号５）を特異的に認識し、ペプチドＢＮＰ（１−７６）又はペプチドＢＮＰ（７７−１０８）を実質的に認識せず、第二に、ヒト血清又は血漿の試料中の循環プロＢＮＰ（１−１０８）を特異的に認識する能力を有する、ことを特徴とする抗プロＢＮＰ（１−１０８）抗体。
【請求項２】
プロＢＮＰ（１−１０８）の配列Ｙ７０ＴＬＲＡＰＲ７６Ｓ７７ＰＫＭＶＱＧＳＧ８５（配列番号４）を特異的に認識する、請求項１記載の抗プロＢＮＰ（１−１０８）抗体。
【請求項３】
プロＢＮＰ（１−１０８）の配列Ｙ７０ＴＬＲＡＰＲ７６Ｓ７７ＰＫＭＶＱＧＳ８４（配列番号１０８）を特異的に認識する、請求項１記載の抗プロＢＮＰ（１−１０８）抗体。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項記載の抗プロＢＮＰ（１−１０８）抗体を取得するための方法であって、動物をプロＢＮＰ（１−１０８）分子全体で免疫し、次いで、ＢＮＰ（７７−１０８）ペプチド及び／又はＢＮＰ（１−７６）ペプチドを用いて、得られた抗血清を除去する前記方法。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれか１項記載の抗プロＢＮＰ（１−１０８）抗体を取得するための方法であって、
−下記式：
ａ１−Ｘ１−ＲＡＰＲＳＰ−Ｘ２−ａ２ （Ｉ）
［式中、
ａ１は、水素原子であるかあるいはチオール、アルコール、アミノキシ、第一アミンもしくは第二アミン官能基、アミノカルボキシル基、ビオチニル基及びアセチル基から選ばれる官能基又は化学基を表し、
Ｘ１は、０〜３のアミノ酸のペプチド配列であって、プロＢＮＰ（１−１０８）の天然配列に由来しても又は由来しなくてもよい配列を表し、
Ｘ２は、０〜７のアミノ酸のペプチド配列であって、プロＢＮＰ（１−１０８）の天然配列に由来しても由来しなくてもよい配列を表し、
ａ２は、ＯＨ官能基、ＮＨ２官能基又はアルコキシ基を表す。]
で表されるペプチド；
−下記式：
Ｘ−Ｙ７０ＴＬＲＡＰＲ７６Ｓ７７ＰＫＭＶＱＧＳＧ８５−Ｚ （ＩＩ）
［式中、Ｘは、水素原子であるか又はアセチル基もしくはプロＢＮＰ（１−１０８）の配列に属さない１〜３のアミノ酸を表し、そして、Ｚは、ＯＨ官能基又はプロＢＮＰ（１−１０８）の配列に属さない１〜３のアミノ酸を表す。］
で表されるペプチド；
−下記式：
Ｘ−Ｙ７０ＴＬＲＡＰＲ７６Ｓ７７ＰＫＭＶＱＧＳ８４−Ｚ （ＩＩＩ）
［式中、Ｘは、水素原子であるか又はアセチル基もしくはプロＢＮＰ（１−１０８）の配列に属さない１〜３のアミノ酸を表し、そして、Ｚは、ＯＨ官能基又はプロＢＮＰ（１−１０８）の配列に属さない１〜３のアミノ酸を表す。］
で表されるペプチド；
−アミノ酸Ｙ７０、Ｔ７１、Ｌ７２、Ｋ７９、Ｍ８０、Ｖ８１、Ｑ８２、Ｇ８３、Ｓ８４及びＧ８５の内の１以上のアミノ酸で置換された配列Ｘ−Ｙ７０ＴＬＲＡＰＲ７６Ｓ７７ＰＫＭＶＱＧＳＧ８５−Ｚ（ＩＩ）又は配列Ｘ−Ｙ７０ＴＬＲＡＰＲ７６Ｓ７７ＰＫＭＶＱＧＳ８４−Ｚ（ＩＩＩ）であって、Ｘが、水素原子であるか又はアセチル基もしくはプロＢＮＰ（１−１０８）の配列に属さない１〜３のアミノ酸を表し、そして、Ｚが、ＯＨ官能基又はプロＢＮＰ（１−１０８）の配列に属さない１〜３のアミノ酸であり得る配列に由来する配列を含むペプチド；
−配列Ｃ−Ｙ−Ｔ−Ｌ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ｋ−Ｍ−Ｖ−Ｑ−Ｇ−Ｓ−Ｇ（Ｃ１３Ｐ３０：配列番号１６）を有するペプチド；
−配列Ｃ−Ｙ−Ｔ−Ｌ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ｋ−Ｍ−Ｖ−Ｑ−Ｇ−Ｓ（ＣＮ３２：配列番号１０９）を有するペプチド；
から選ばれるペプチドで動物を免疫し、次いで、場合により、ＢＮＰ（７７−１０８）ペプチド及び／又はＢＮＰ（１−７６）ペプチドを用いて、得られた抗血清を除去する前記方法。
【請求項６】
請求項１〜３のいずれか１項記載の抗プロＢＮＰ（１−１０８）抗体を分泌するハイブリドーマを取得するための方法であって、
−下記式：
ａ１−Ｘ１−ＲＡＰＲＳＰ−Ｘ２−ａ２ （Ｉ）
［式中、
ａ１は、水素原子であるかあるいはチオール、アルコール、アミノキシ、第一アミンもしくは第二アミン官能基、アミノカルボキシル基、ビオチニル基及びアセチル基から選ばれる官能基又は化学基を表し、
Ｘ１は、０〜３のアミノ酸のペプチド配列であって、プロＢＮＰ（１−１０８）の天然配列に由来しても由来しなくてもよい配列を表し、
Ｘ２は、０〜７のアミノ酸のペプチド配列であって、プロＢＮＰ（１−１０８）の天然配列に由来しても由来しなくてもよい配列を表し、
ａ２は、ＯＨ官能基、ＮＨ２官能基又はアルコキシ基を表す。］
で表されるペプチド；
−下記式：
Ｘ−Ｙ７０ＴＬＲＡＰＲ７６Ｓ７７ＰＫＭＶＱＧＳＧ８５−Ｚ （ＩＩ）
［式中、Ｘは、水素原子であるか又はアセチル基もしくはプロＢＮＰ（１−１０８）の配列に属さない１〜３のアミノ酸を表し、そして、Ｚは、ＯＨ官能基又はプロＢＮＰ（１−１０８）の配列に属さない１〜３のアミノ酸を表す。］
で表されるペプチド；
−下記式：
Ｘ−Ｙ７０ＴＬＲＡＰＲ７６Ｓ７７ＰＫＭＶＱＧＳ８４−Ｚ （ＩＩＩ）
［式中、Ｘは、水素原子であるか又はアセチル基もしくはプロＢＮＰ（１−１０８）の配列に属さない１〜３のアミノ酸を表し、そして、Ｚは、ＯＨ官能基又はプロＢＮＰ（１−１０８）の配列に属さない１〜３のアミノ酸を表す。］
で表されるペプチド；
−アミノ酸Ｙ７０、Ｔ７１、Ｌ７２、Ｋ７９、Ｍ８０、Ｖ８１、Ｑ８２、Ｇ８３、Ｓ８４及びＧ８５の内の１以上のアミノ酸で置換された配列Ｘ−Ｙ７０ＴＬＲＡＰＲ７６Ｓ７７ＰＫＭＶＱＧＳＧ８５−Ｚ（ＩＩ）又は配列Ｘ−Ｙ７０ＴＬＲＡＰＲ７６Ｓ７７ＰＫＭＶＱＧＳ８４−Ｚ（ＩＩＩ）であって、Ｘが、水素原子であるか又はアセチル基もしくはプロＢＮＰ（１−１０８）の配列に属さない１〜３のアミノ酸を表し、そして、Ｚが、ＯＨ官能基又はプロＢＮＰ（１−１０８）の配列に属さない１〜３のアミノ酸であり得る配列に由来する配列を含むペプチド；
−配列Ｃ−Ｙ−Ｔ−Ｌ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ｋ−Ｍ−Ｖ−Ｑ−Ｇ−Ｓ−Ｇ（Ｃ１３Ｐ３０：配列番号１６）を有するペプチド；
−配列Ｃ−Ｙ−Ｔ−Ｌ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ｋ−Ｍ−Ｖ−Ｑ−Ｇ−Ｓ（ＣＮ３２：配列番号１０９）を有するペプチド；
から選ばれるペプチドで動物を免疫し、
イムノグロブリン分泌リンパ球を当該動物から採取し、そして、
当該リンパ球をミエローマ細胞と融合して、少なくとも一種のイムノグロブリン分泌ハイブリドーマを取得する前記方法。
【請求項７】
式（ＩＩ）の前記ペプチドが、配列Ｙ７０ＴＬＲＡＰＲ７６Ｓ７７ＰＫＭＶＱＧＳＧ８５（配列番号４）を有する、請求項５又は６記載の方法。
【請求項８】
式（ＩＩＩ）の前記ペプチドが、配列Ｙ７０ＴＬＲＡＰＲ７６Ｓ７７ＰＫＭＶＱＧＳ８４（配列番号１０８）を有する、請求項５又は６記載の方法。
【請求項９】
請求項６〜８のいずれか１項記載の方法によって製造されるハイブリドーマ。
【請求項１０】
請求項９記載のハイブリドーマによって分泌される抗プロＢＮＰ（１−１０８）モノクローナル抗体。
【請求項１１】
生物学的試料を請求項１〜３及び１０のいずれか１項記載の抗プロＢＮＰ（１−１０８）抗体と接触させること、及び当該試料中の前記抗プロＢＮＰ（１−１０８）を検出することを含む、ヒトの心不全の診断のためのｉｎ ｖｉｔｒｏ検定方法。
【請求項１２】
ヒトの心不全の診断のためのｉｎ ｖｉｔｒｏ検定方法であって、
ａ）生物学的試料を請求項１〜３及び１０のいずれか１項記載の抗プロＢＮＰ（１−１０８）抗体と接触させること、
ｂ）抗原抗体複合体の形成を可能にする条件下で、当該混合物をインキュベートすること、及び
ｃ）当該一次複合体中に存在する前記プロＢＮＰ（１−１０８）に特異的に結合することができる標識検出抗体、又は当該一次複合体中に存在する前記プロＢＮＰ（１−１０８）に対する抗体に結合することができる標識検出抗原を場合により使用して、形成された抗原抗体複合体を明らかにすること、
を含む前記方法。
【請求項１３】
前記明らかにされた抗原抗体複合体の量を、人の臨床症状と相関させるためのステップｄ）を更に含む、請求項１２記載の検定方法。
【請求項１４】
請求項１〜３及び１０のいずれか１項記載の少なくとも一つの抗体を含む、生物学的な試料中のプロＢＮＰ（１−１０８）を検出するためのキット。
【請求項１５】
請求項１４記載の生物学的な試料中のプロＢＮＰ（１−１０８）を検出するためのキットであって、
（ｉ）一つの容器には、請求項１〜３及び１０のいずれか１項記載の少なくとも一つの抗体を、
（ｉｉ）もう一つの容器には、
−下記式：
ａ１−Ｘ１−ＲＡＰＲＳＰ−Ｘ２−ａ２ （Ｉ）
［式中、
ａ１は、水素原子であるかあるいはチオール、アルコール、アミノキシ、第一アミンもしくは第二アミン官能基、アミノカルボキシル基、ビオチニル基及びアセチル基から選ばれる官能基又は化学基を表し、
Ｘ１は、０〜３のアミノ酸のペプチド配列であって、プロＢＮＰ（１−１０８）の天然配列に由来しても由来しなくてもよい配列を表し、
Ｘ２は、０〜７のアミノ酸のペプチド配列であって、プロＢＮＰ（１−１０８）の天然配列に由来しても由来しなくてもよい配列を表し、
ａ２は、ＯＨ官能基、ＮＨ２官能基又はアルコキシ基を表す。］
で表されるペプチド；
−下記式：
Ｘ−Ｙ７０ＴＬＲＡＰＲ７６Ｓ７７ＰＫＭＶＱＧＳＧ８５−Ｚ （ＩＩ）
［式中、Ｘは、水素原子であるか又はアセチル基もしくはプロＢＮＰ（１−１０８）の配列に属さない１〜３のアミノ酸を表し、そして、Ｚは、ＯＨ官能基又はプロＢＮＰ（１−１０８）の配列に属さない１〜３のアミノ酸を表す。］
で表されるペプチド；
−下記式：
Ｘ−Ｙ７０ＴＬＲＡＰＲ７６Ｓ７７ＰＫＭＶＱＧＳ８４−Ｚ （ＩＩＩ）
［式中、Ｘは、水素原子であるか又はアセチル基もしくはプロＢＮＰ（１−１０８）の配列に属さない１〜３のアミノ酸を表し、そして、Ｚは、ＯＨ官能基又はプロＢＮＰ（１−１０８）の配列に属さない１〜３のアミノ酸を表す。］
で表されるペプチド；
−アミノ酸Ｙ７０、Ｔ７１、Ｌ７２、Ｋ７９、Ｍ８０、Ｖ８１、Ｑ８２、Ｇ８３、Ｓ８４及びＧ８５の内の１以上のアミノ酸で置換された配列Ｘ−Ｙ７０ＴＬＲＡＰＲ７６Ｓ７７ＰＫＭＶＱＧＳＧ８５−Ｚ（ＩＩ）又は配列Ｘ−Ｙ７０ＴＬＲＡＰＲ７６Ｓ７７ＰＫＭＶＱＧＳ８４−Ｚ（ＩＩＩ）であって、Ｘが、水素原子であるか又はアセチル基もしくはプロＢＮＰ（１−１０８）の配列に属さない１〜３のアミノ酸を表し、そして、Ｚが、ＯＨ官能基又はプロＢＮＰ（１−１０８）の配列に属さない１〜３のアミノ酸であり得る配列に由来する配列を含むペプチド；
−配列Ｙ７０ＴＬＲＡＰＲ７６Ｓ７７ＰＫＭＶＱＧＳＧ８５（配列番号４）を有するペプチド；
−配列Ｙ７０ＴＬＲＡＰＲ７６Ｓ７７ＰＫＭＶＱＧＳ８４（配列番号１０８）を有するペプチド；
−配列Ｃ−Ｙ−Ｔ−Ｌ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ｋ−Ｍ−Ｖ−Ｑ−Ｇ−Ｓ−Ｇ（Ｃ１３Ｐ３０：配列番号１６）を有するペプチド；
−配列Ｃ−Ｙ−Ｔ−Ｌ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ｋ−Ｍ−Ｖ−Ｑ−Ｇ−Ｓ（ＣＮ３２：配列番号１０９）を有するペプチド；
から選ばれる少なくとも一つのペプチド
を含む前記キット。
【請求項１６】
下記式：
ａ１−Ｘ１−ＲＡＰＲＳＰ−Ｘ２−ａ２ （Ｉ）
［式中、
ａ１は、水素原子であるかあるいはチオール、アルコール、アミノキシ、第一アミンもしくは第二アミン官能基、アミノカルボキシル基、ビオチニル基及びアセチル基から選ばれる官能基又は化学基を表し、
Ｘ１は、０〜３のアミノ酸のペプチド配列であって、プロＢＮＰ（１−１０８）の天然配列に由来しても由来しなくてもよい配列を表し、
Ｘ２は、０〜７のアミノ酸のペプチド配列であって、プロＢＮＰ（１−１０８）の天然配列に由来しても由来しなくてもよい配列を表し、
ａ２は、ＯＨ官能基、ＮＨ２官能基又はアルコキシ基を表す。]
で表されるペプチド。
【請求項１７】
下記式：
Ｘ−Ｙ７０ＴＬＲＡＰＲ７６Ｓ７７ＰＫＭＶＱＧＳＧ８５−Ｚ （ＩＩ）
［式中、Ｘは、水素原子であるか又はアセチル基もしくはプロＢＮＰ（１−１０８）の配列に属さない１〜３のアミノ酸を表し、そして、Ｚは、ＯＨ官能基又はプロＢＮＰ（１−１０８）の配列に属さない１〜３のアミノ酸を表す。］
で表されるペプチド。
【請求項１８】
前記配列Ｙ７０ＴＬＲＡＰＲ７６Ｓ７７ＰＫＭＶＱＧＳＧ８５（配列番号４）を有する、請求項１７記載のペプチド。
【請求項１９】
下記式：
Ｘ−Ｙ７０ＴＬＲＡＰＲ７６Ｓ７７ＰＫＭＶＱＧＳ８４−Ｚ （ＩＩＩ）
［式中、Ｘは、水素原子であるか又はアセチル基もしくはプロＢＮＰ（１−１０８）の配列に属さない１〜３のアミノ酸を表し、そして、Ｚは、ＯＨ官能基又はプロＢＮＰ（１−１０８）の配列に属さない１〜３のアミノ酸を表す。］
で表されるペプチド。
【請求項２０】
前記配列Ｙ７０ＴＬＲＡＰＲ７６Ｓ７７ＰＫＭＶＱＧＳ８４−Ｚ（配列番号１０８）を有する、請求項１９記載のペプチド。
【請求項２１】
アミノ酸Ｙ７０、Ｔ７１、Ｌ７２、Ｋ７９、Ｍ８０、Ｖ８１、Ｑ８２、Ｇ８３、Ｓ８４及びＧ８５の内の１以上のアミノ酸で置換された配列Ｘ−Ｙ７０ＴＬＲＡＰＲ７６Ｓ７７ＰＫＭＶＱＧＳＧ８５−Ｚ（ＩＩ）又は配列Ｘ−Ｙ７０ＴＬＲＡＰＲ７６Ｓ７７ＰＫＭＶＱＧＳ８４−Ｚ（ＩＩＩ）であって、Ｘが、水素原子であるか又はアセチル基もしくはプロＢＮＰ（１−１０８）の配列に属さない１〜３のアミノ酸を表し、そして、Ｚが、ＯＨ官能基又はプロＢＮＰ（１−１０８）の配列に属さない１〜３のアミノ酸であり得る配列に由来する配列を含むペプチド。
【請求項２２】
以下の配列；
配列番号１６：Ｃ−Ｙ−Ｔ−Ｌ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ｋ−Ｍ−Ｖ−Ｑ−Ｇ−Ｓ−Ｇ（ペプチド Ｃ１３Ｐ３０）
配列番号１０９：Ｃ−Ｙ−Ｔ−Ｌ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ｋ−Ｍ−Ｖ−Ｑ−Ｇ−Ｓ（ペプチド ＣＮ３２）
配列番号６：Ｃ−Ｇ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ
配列番号７：アセチル−Ｃ−Ｇ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ
配列番号８：Ｃ−Ｇ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ｋ
配列番号９：アセチル−Ｃ−Ｇ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ｋ
配列番号１０：Ｃ−Ｇ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ｋ−Ｍ−Ｖ
配列番号１１：Ｃ−Ｇ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ｋ−Ｍ−Ｖ−Ｑ−Ｇ−Ｓ−Ｇ
配列番号１２：Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ｇ−Ｃ
配列番号１３：アセチル−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ｇ−Ｃ
配列番号１１０：Ｃ−Ｙ−Ｔ−Ｌ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ｋ
配列番号１１１：Ｃ−Ｙ−Ｔ−Ｌ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ｋ−Ｍ−Ｖ
配列番号１１２：Ｃ−Ｙ−Ｔ−Ｌ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ｋ−Ｍ−Ｖ−Ｑ
配列番号１１３：Ｃ−Ｙ−Ｔ−Ｌ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ｋ−Ｍ−Ｖ−Ｑ−Ｇ
配列番号１９：Ｃ−Ｙ−Ｔ−Ｌ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ｋ−Ｍ−Ｖ−Ｑ−Ｇ−Ｓ−βＡ
配列番号２０：Ｃ−Ｙ−Ｔ−Ｌ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ｋ−Ｍ−Ｖ−Ｑ−Ａ−Ｔ−βＡ
配列番号１１４：アセチル−Ｃ−Ｔ−Ｌ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ｋ−Ｍ−Ｖ−Ｑ
配列番号１１５：Ｃ−Ｔ−Ｌ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ｋ−Ｍ−Ｖ−Ｑ−Ｇ
配列番号１１６：Ｃ−Ｔ−Ｌ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ｋ−Ｍ−Ｖ−Ｑ−Ｇ−Ｓ
配列番号１１７：Ｃ−Ｔ−Ｌ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ｋ−Ｍ−Ｖ−Ｑ−Ｇ−Ｓ−Ｇ
配列番号１１８：Ｃ−Ｌ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ｋ−Ｍ−Ｖ
配列番号１１９：Ｃ−Ｌ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ｋ−Ｍ−Ｖ−Ｑ
配列番号１２０：Ｌ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ｋ−Ｍ−Ｖ−Ｑ−Ｃ
配列番号１２１：Ｃ−Ｌ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ｋ−Ｍ−Ｖ−Ｑ−Ｇ−Ｓ
配列番号１２２：Ｃ−Ｌ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ｋ−Ｍ−Ｖ−Ｑ−Ｇ−Ｓ−Ｇ
からなる群より選ばれる配列を有する、請求項１６記載のペプチド。
【請求項２３】
前記ＢＮＰ（１−７６）ペプチド及び前記ＢＮＰ（７７−１０８）ペプチドを実質的に除き、プロＢＮＰ（１−１０８）の前記配列Ｙ７０ＴＬＲＡＰＲ７６Ｓ７７ＰＫＭＶＱＧＳＧ８５、前記配列Ｙ７０ＴＬＲＡＰＲ７６Ｓ７７ＰＫＭＶＱＧＳ８４及び／又は前記配列ＲＡＰＲ７６Ｓ７７Ｐを特異的に認識し、ヒト血清試料又は血漿試料中の循環プロＢＮＰ（１−１０８）を特異的に認識する能力を有する抗プロＢＮＰ（１−１０８）抗体を取得するための方法であって、動物を請求項１６〜２２のいずれか１項記載のペプチドで免疫し、場合により、前記ＢＮＰ（７７−１０８）ペプチド及び／又は前記ＢＮＰ（１−７６）ペプチドを用いて、得られた抗血清を除く前記方法。
【請求項２４】
前記ＢＮＰ（１−７６）ペプチド及び前記ＢＮＰ（７７−１０８）ペプチドを実質的に除き、プロＢＮＰ（１−１０８）の前記配列Ｙ７０ＴＬＲＡＰＲ７６Ｓ７７ＰＫＭＶＱＧＳＧ８５、前記配列Ｙ７０ＴＬＲＡＰＲ７６Ｓ７７ＰＫＭＶＱＧＳ８４及び／又は前記配列ＲＡＰＲ７６Ｓ７７Ｐを特異的に認識し、ヒト血清試料又は血漿試料中の循環プロＢＮＰ（１−１０８）を特異的に認識する能力を有する抗プロＢＮＰ（１−１０８）抗体を分泌するハイブリドーマを取得するための方法であって、動物を請求項１６〜２２のいずれか１項記載のペプチドで免疫し、イムノグロブリン分泌リンパ球を当該動物から採取し、そして、前記リンパ球をミエローマ細胞と融合し、少なくとも一種のイムノグロブリン分泌ハイブリドーマを取得する前記方法。
【請求項２５】
請求項２３記載の方法によって得られることを特徴とする、抗プロＢＮＰ（１−１０８）抗体。
【請求項２６】
プロＢＮＰ（１−１０８）の配列Ｙ７０ＴＬＲＡＰＲ７６Ｓ７７ＰＫＭＶＱＧＳＧ８５又は配列Ｙ７０ＴＬＲＡＰＲ７６Ｓ７７ＰＫＭＶＱＧＳ８４を特異的に認識する、請求項２５記載の抗プロＢＮＰ（１−１０８）抗体。
【請求項２７】
請求項２４記載の方法によって製造され得るハイブリドーマ。
【請求項２８】
請求項２７記載のハイブリドーマによって分泌される抗プロＢＮＰ（１−１０８）モノクローナル抗体。
【請求項２９】
ＣＮＣＭに番号ＣＮＣＭ Ｉ−３０７３で寄託されたハイブリドーマ３Ｄ４によって分泌される、請求項２８記載の抗プロＢＮＰ（１−１０８）モノクローナル抗体。
【請求項３０】
生物学的試料を請求項２５、２６、２８及び２９のいずれか１項記載の抗プロＢＮＰ（１−１０８）抗体と接触させること、及び当該試料中の前記プロＢＮＰ（１−１０８）を検出することを含む、ヒトの心不全の診断のためのｉｎ ｖｉｔｒｏ検定方法。
【請求項３１】
ヒトの心不全の診断のためのｉｎ ｖｉｔｒｏ検定方法であって、
ａ）生物学的試料を請求項２５、２６、２８及び２９のいずれか１項記載の抗プロＢＮＰ（１−１０８）抗体と接触させること、
ｂ）抗原抗体複合体の形成を可能にする条件下で、当該混合物をインキュベートすること、及び
ｃ）当該一次複合体中に存在する前記プロＢＮＰ（１−１０８）に特異的に結合することができる標識検出抗体、又は当該一次複合体中に存在する前記プロＢＮＰ（１−１０８）に対する抗体に結合することがでできる標識検出抗原を場合により使用して、形成された抗原抗体複合体を明らかにすること、
を含む前記方法。
【請求項３２】
明らかにされた抗原抗体複合体の量を人の臨床症状と相関させるためのステップｄ）を更に含む、請求項３１記載の検定方法。
【請求項３３】
請求項２５、２６、２８及び２９記載の少なくとも一つの抗体を含む、生物学的試料中のプロＢＮＰ（１−１０８）を検出するためのキット。
【請求項３４】
請求項１６〜２２のいずれか１項記載の少なくとも一つのペプチドをスタンダード及び／又はコントロールとして含む、生物学的試料中のプロＢＮＰ（１−１０８）を検出するためのキット。
【請求項３５】
生物学的な試料中のプロＢＮＰ（１−１０８）を検出するためのキットであって、
−一つの容器に、請求項２５、２６、２８及び２９記載の少なくとも一つの抗体を、
−もう一つの容器に、請求項１６〜２２のいずれか１項記載の少なくとも一つのペプチドを含む、生物学的試料中のプロＢＮＰ（１−１０８）を検出するための前記キット。
【請求項１】
第一に、プロＢＮＰ（１−１０８）の配列ＲＡＰＲ76Ｓ77Ｐ（配列番号５）を特異的に認識し、ペプチドＢＮＰ（１−７６）又はペプチドＢＮＰ（７７−１０８）を実質的に認識せず、第二に、ヒト血清又は血漿の試料中の循環プロＢＮＰ（１−１０８）を特異的に認識する能力を有する、ことを特徴とする抗プロＢＮＰ（１−１０８）抗体。
【請求項２】
プロＢＮＰ（１−１０８）の配列Ｙ70ＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳＧ85（配列番号４）を特異的に認識する、請求項１記載の抗プロＢＮＰ（１−１０８）抗体。
【請求項３】
プロＢＮＰ（１−１０８）の配列Ｙ70ＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳ84（配列番号１０８）を特異的に認識する、請求項１記載の抗プロＢＮＰ（１−１０８）抗体。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項記載の抗プロＢＮＰ（１−１０８）抗体を取得するための方法であって、動物をプロＢＮＰ（１−１０８）分子全体で免疫し、次いで、ＢＮＰ（７７−１０８）ペプチド及び／又はＢＮＰ（１−７６）ペプチドを用いて、得られた抗血清を除去する前記方法。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれか１項記載の抗プロＢＮＰ（１−１０８）抗体を取得するための方法であって、
−下記式：
ａ1−Ｘ1−ＲＡＰＲＳＰ−Ｘ2−ａ2 （Ｉ）
［式中、
ａ1は、水素原子であるかあるいはチオール、アルコール、アミノキシ、第一アミンもしくは第二アミン官能基、アミノカルボキシル基、ビオチニル基及びアセチル基から選ばれる官能基又は化学基を表し、
Ｘ1は、０〜３のアミノ酸のペプチド配列であって、プロＢＮＰ（１−１０８）の天然配列に由来しても又は由来しなくてもよい配列を表し、
Ｘ2は、０〜７のアミノ酸のペプチド配列であって、プロＢＮＰ（１−１０８）の天然配列に由来しても由来しなくてもよい配列を表し、
ａ2は、ＯＨ官能基、ＮＨ2官能基又はアルコキシ基を表す。]
で表されるペプチド；
−下記式：
Ｘ−Ｙ70ＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳＧ85−Ｚ （ＩＩ）
［式中、Ｘは、水素原子であるか又はアセチル基もしくはプロＢＮＰ（１−１０８）の配列に属さない１〜３のアミノ酸を表し、そして、Ｚは、ＯＨ官能基又はプロＢＮＰ（１−１０８）の配列に属さない１〜３のアミノ酸を表す。］
で表されるペプチド；
−下記式：
Ｘ−Ｙ70ＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳ84−Ｚ （ＩＩＩ）
［式中、Ｘは、水素原子であるか又はアセチル基もしくはプロＢＮＰ（１−１０８）の配列に属さない１〜３のアミノ酸を表し、そして、Ｚは、ＯＨ官能基又はプロＢＮＰ（１−１０８）の配列に属さない１〜３のアミノ酸を表す。］
で表されるペプチド；
−アミノ酸Ｙ70、Ｔ71、Ｌ72、Ｋ79、Ｍ80、Ｖ81、Ｑ82、Ｇ83、Ｓ84及びＧ85の内の１以上のアミノ酸で置換された配列Ｘ−Ｙ70ＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳＧ85−Ｚ（ＩＩ）又は配列Ｘ−Ｙ70ＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳ84−Ｚ（ＩＩＩ）であって、Ｘが、水素原子であるか又はアセチル基もしくはプロＢＮＰ（１−１０８）の配列に属さない１〜３のアミノ酸を表し、そして、Ｚが、ＯＨ官能基又はプロＢＮＰ（１−１０８）の配列に属さない１〜３のアミノ酸であり得る配列に由来する配列を含むペプチド；
−配列Ｃ−Ｙ−Ｔ−Ｌ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ｋ−Ｍ−Ｖ−Ｑ−Ｇ−Ｓ−Ｇ（Ｃ１３Ｐ３０：配列番号１６）を有するペプチド；
−配列Ｃ−Ｙ−Ｔ−Ｌ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ｋ−Ｍ−Ｖ−Ｑ−Ｇ−Ｓ（ＣＮ３２：配列番号１０９）を有するペプチド；
から選ばれるペプチドで動物を免疫し、次いで、場合により、ＢＮＰ（７７−１０８）ペプチド及び／又はＢＮＰ（１−７６）ペプチドを用いて、得られた抗血清を除去する前記方法。
【請求項６】
請求項１〜３のいずれか１項記載の抗プロＢＮＰ（１−１０８）抗体を分泌するハイブリドーマを取得するための方法であって、
−下記式：
ａ1−Ｘ1−ＲＡＰＲＳＰ−Ｘ2−ａ2 （Ｉ）
［式中、
ａ1は、水素原子であるかあるいはチオール、アルコール、アミノキシ、第一アミンもしくは第二アミン官能基、アミノカルボキシル基、ビオチニル基及びアセチル基から選ばれる官能基又は化学基を表し、
Ｘ1は、０〜３のアミノ酸のペプチド配列であって、プロＢＮＰ（１−１０８）の天然配列に由来しても由来しなくてもよい配列を表し、
Ｘ2は、０〜７のアミノ酸のペプチド配列であって、プロＢＮＰ（１−１０８）の天然配列に由来しても由来しなくてもよい配列を表し、
ａ2は、ＯＨ官能基、ＮＨ2官能基又はアルコキシ基を表す。］
で表されるペプチド；
−下記式：
Ｘ−Ｙ70ＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳＧ85−Ｚ （ＩＩ）
［式中、Ｘは、水素原子であるか又はアセチル基もしくはプロＢＮＰ（１−１０８）の配列に属さない１〜３のアミノ酸を表し、そして、Ｚは、ＯＨ官能基又はプロＢＮＰ（１−１０８）の配列に属さない１〜３のアミノ酸を表す。］
で表されるペプチド；
−下記式：
Ｘ−Ｙ70ＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳ84−Ｚ （ＩＩＩ）
［式中、Ｘは、水素原子であるか又はアセチル基もしくはプロＢＮＰ（１−１０８）の配列に属さない１〜３のアミノ酸を表し、そして、Ｚは、ＯＨ官能基又はプロＢＮＰ（１−１０８）の配列に属さない１〜３のアミノ酸を表す。］
で表されるペプチド；
−アミノ酸Ｙ70、Ｔ71、Ｌ72、Ｋ79、Ｍ80、Ｖ81、Ｑ82、Ｇ83、Ｓ84及びＧ85の内の１以上のアミノ酸で置換された配列Ｘ−Ｙ70ＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳＧ85−Ｚ（ＩＩ）又は配列Ｘ−Ｙ70ＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳ84−Ｚ（ＩＩＩ）であって、Ｘが、水素原子であるか又はアセチル基もしくはプロＢＮＰ（１−１０８）の配列に属さない１〜３のアミノ酸を表し、そして、Ｚが、ＯＨ官能基又はプロＢＮＰ（１−１０８）の配列に属さない１〜３のアミノ酸であり得る配列に由来する配列を含むペプチド；
−配列Ｃ−Ｙ−Ｔ−Ｌ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ｋ−Ｍ−Ｖ−Ｑ−Ｇ−Ｓ−Ｇ（Ｃ１３Ｐ３０：配列番号１６）を有するペプチド；
−配列Ｃ−Ｙ−Ｔ−Ｌ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ｋ−Ｍ−Ｖ−Ｑ−Ｇ−Ｓ（ＣＮ３２：配列番号１０９）を有するペプチド；
から選ばれるペプチドで動物を免疫し、
イムノグロブリン分泌リンパ球を当該動物から採取し、そして、
当該リンパ球をミエローマ細胞と融合して、少なくとも一種のイムノグロブリン分泌ハイブリドーマを取得する前記方法。
【請求項７】
式（ＩＩ）の前記ペプチドが、配列Ｙ70ＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳＧ85（配列番号４）を有する、請求項５又は６記載の方法。
【請求項８】
式（ＩＩＩ）の前記ペプチドが、配列Ｙ70ＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳ84（配列番号１０８）を有する、請求項５又は６記載の方法。
【請求項９】
請求項６〜８のいずれか１項記載の方法によって製造されるハイブリドーマ。
【請求項１０】
請求項９記載のハイブリドーマによって分泌される抗プロＢＮＰ（１−１０８）モノクローナル抗体。
【請求項１１】
生物学的試料を請求項１〜３及び１０のいずれか１項記載の抗プロＢＮＰ（１−１０８）抗体と接触させること、及び当該試料中の前記抗プロＢＮＰ（１−１０８）を検出することを含む、ヒトの心不全のｉｎ ｖｉｔｒｏ診断方法。
【請求項１２】
ヒトの心不全のｉｎ ｖｉｔｒｏ診断方法であって、
ａ）生物学的試料を請求項１〜３及び１０のいずれか１項記載の抗プロＢＮＰ（１−１０８）抗体と接触させること、
ｂ）抗原抗体複合体の形成を可能にする条件下で、当該混合物をインキュベートすること、及び
ｃ）当該一次複合体中に存在する前記プロＢＮＰ（１−１０８）に特異的に結合することができる標識検出抗体、又は当該一次複合体中に存在する前記プロＢＮＰ（１−１０８）に対する抗体に結合することができる標識検出抗原を場合により使用して、形成された抗原抗体複合体を明らかにすること、
を含む前記方法。
【請求項１３】
前記明らかにされた抗原抗体複合体の量を、人の臨床症状と相関させるためのステップｄ）を更に含む、請求項１２記載の診断方法。
【請求項１４】
請求項１〜３及び１０のいずれか１項記載の少なくとも一つの抗体を含む、生物学的な試料中のプロＢＮＰ（１−１０８）を検出するためのキット。
【請求項１５】
請求項１４記載の生物学的な試料中のプロＢＮＰ（１−１０８）を検出するためのキットであって、
（ｉ）一つの容器には、請求項１〜３及び１０のいずれか１項記載の少なくとも一つの抗体を、
（ｉｉ）もう一つの容器には、
−下記式：
ａ1−Ｘ1−ＲＡＰＲＳＰ−Ｘ2−ａ2 （Ｉ）
［式中、
ａ1は、水素原子であるかあるいはチオール、アルコール、アミノキシ、第一アミンもしくは第二アミン官能基、アミノカルボキシル基、ビオチニル基及びアセチル基から選ばれる官能基又は化学基を表し、
Ｘ1は、０〜３のアミノ酸のペプチド配列であって、プロＢＮＰ（１−１０８）の天然配列に由来しても由来しなくてもよい配列を表し、
Ｘ2は、０〜７のアミノ酸のペプチド配列であって、プロＢＮＰ（１−１０８）の天然配列に由来しても由来しなくてもよい配列を表し、
ａ2は、ＯＨ官能基、ＮＨ2官能基又はアルコキシ基を表す。］
で表されるペプチド；
−下記式：
Ｘ−Ｙ70ＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳＧ85−Ｚ （ＩＩ）
［式中、Ｘは、水素原子であるか又はアセチル基もしくはプロＢＮＰ（１−１０８）の配列に属さない１〜３のアミノ酸を表し、そして、Ｚは、ＯＨ官能基又はプロＢＮＰ（１−１０８）の配列に属さない１〜３のアミノ酸を表す。］
で表されるペプチド；
−下記式：
Ｘ−Ｙ70ＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳ84−Ｚ （ＩＩＩ）
［式中、Ｘは、水素原子であるか又はアセチル基もしくはプロＢＮＰ（１−１０８）の配列に属さない１〜３のアミノ酸を表し、そして、Ｚは、ＯＨ官能基又はプロＢＮＰ（１−１０８）の配列に属さない１〜３のアミノ酸を表す。］
で表されるペプチド；
−アミノ酸Ｙ70、Ｔ71、Ｌ72、Ｋ79、Ｍ80、Ｖ81、Ｑ82、Ｇ83、Ｓ84及びＧ85の内の１以上のアミノ酸で置換された配列Ｘ−Ｙ70ＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳＧ85−Ｚ（ＩＩ）又は配列Ｘ−Ｙ70ＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳ84−Ｚ（ＩＩＩ）であって、Ｘが、水素原子であるか又はアセチル基もしくはプロＢＮＰ（１−１０８）の配列に属さない１〜３のアミノ酸を表し、そして、Ｚが、ＯＨ官能基又はプロＢＮＰ（１−１０８）の配列に属さない１〜３のアミノ酸であり得る配列に由来する配列を含むペプチド；
−配列Ｙ70ＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳＧ85（配列番号４）を有するペプチド；
−配列Ｙ70ＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳ84（配列番号１０９）を有するペプチド；
−配列Ｃ−Ｙ−Ｔ−Ｌ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ｋ−Ｍ−Ｖ−Ｑ−Ｇ−Ｓ−Ｇ（Ｃ１３Ｐ３０：配列番号１６）を有するペプチド；
−配列Ｃ−Ｙ−Ｔ−Ｌ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ｋ−Ｍ−Ｖ−Ｑ−Ｇ−Ｓ（ＣＮ３２：配列番号１０９）を有するペプチド；
から選ばれる少なくとも一つのペプチド
を含む前記キット。
【請求項１６】
下記式：
ａ1−Ｘ1−ＲＡＰＲＳＰ−Ｘ2−ａ2 （Ｉ）
［式中、
ａ1は、水素原子であるかあるいはチオール、アルコール、アミノキシ、第一アミンもしくは第二アミン官能基、アミノカルボキシル基、ビオチニル基及びアセチル基から選ばれる官能基又は化学基を表し、
Ｘ1は、０〜３のアミノ酸のペプチド配列であって、プロＢＮＰ（１−１０８）の天然配列に由来しても由来しなくてもよい配列を表し、
Ｘ2は、０〜７のアミノ酸のペプチド配列であって、プロＢＮＰ（１−１０８）の天然配列に由来しても由来しなくてもよい配列を表し、
ａ2は、ＯＨ官能基、ＮＨ2官能基又はアルコキシ基を表す。]
で表されるペプチド。
【請求項１７】
下記式：
Ｘ−Ｙ70ＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳＧ85−Ｚ （ＩＩ）
［式中、Ｘは、水素原子であるか又はアセチル基もしくはプロＢＮＰ（１−１０８）の配列に属さない１〜３のアミノ酸を表し、そして、Ｚは、ＯＨ官能基又はプロＢＮＰ（１−１０８）の配列に属さない１〜３のアミノ酸を表す。］
で表されるペプチド。
【請求項１８】
前記配列Ｙ70ＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳＧ85（配列番号４）を有する、請求項１７記載のペプチド。
【請求項１９】
下記式：
Ｘ−Ｙ70ＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳ84−Ｚ （ＩＩＩ）
［式中、Ｘは、水素原子であるか又はアセチル基もしくはプロＢＮＰ（１−１０８）の配列に属さない１〜３のアミノ酸を表し、そして、Ｚは、ＯＨ官能基又はプロＢＮＰ（１−１０８）の配列に属さない１〜３のアミノ酸を表す。］
で表されるペプチド。
【請求項２０】
前記配列Ｙ70ＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳ84−Ｚ（配列番号１０８）を有する、請求項１９記載のペプチド。
【請求項２１】
アミノ酸Ｙ70、Ｔ71、Ｌ72、Ｋ79、Ｍ80、Ｖ81、Ｑ82、Ｇ83、Ｓ84及びＧ85の内の１以上のアミノ酸で置換された配列Ｘ−Ｙ70ＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳＧ85−Ｚ（ＩＩ）又は配列Ｘ−Ｙ70ＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳ84−Ｚ（ＩＩＩ）であって、Ｘが、水素原子であるか又はアセチル基もしくはプロＢＮＰ（１−１０８）の配列に属さない１〜３のアミノ酸を表し、そして、Ｚが、ＯＨ官能基又はプロＢＮＰ（１−１０８）の配列に属さない１〜３のアミノ酸であり得る配列に由来する配列を含むペプチド。
【請求項２２】
以下の配列；
配列番号１６：Ｃ−Ｙ−Ｔ−Ｌ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ｋ−Ｍ−Ｖ−Ｑ−Ｇ−Ｓ−Ｇ（ペプチド Ｃ１３Ｐ３０）
配列番号１０９：Ｃ−Ｙ−Ｔ−Ｌ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ｋ−Ｍ−Ｖ−Ｑ−Ｇ−Ｓ（ペプチド ＣＮ３２）
配列番号６：Ｃ−Ｇ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ
配列番号７：アセチル−Ｃ−Ｇ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ
配列番号８：Ｃ−Ｇ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ｋ
配列番号９：アセチル−Ｃ−Ｇ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ｋ
配列番号１０：Ｃ−Ｇ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ｋ−Ｍ−Ｖ
配列番号１１：Ｃ−Ｇ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ｋ−Ｍ−Ｖ−Ｑ−Ｇ−Ｓ−Ｇ
配列番号１２：Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ｇ−Ｃ
配列番号１３：アセチル−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ｇ−Ｃ
配列番号１１０：Ｃ−Ｙ−Ｔ−Ｌ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ｋ
配列番号１１１：Ｃ−Ｙ−Ｔ−Ｌ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ｋ−Ｍ−Ｖ
配列番号１１２：Ｃ−Ｙ−Ｔ−Ｌ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ｋ−Ｍ−Ｖ−Ｑ
配列番号１１３：Ｃ−Ｙ−Ｔ−Ｌ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ｋ−Ｍ−Ｖ−Ｑ−Ｇ
配列番号１９：Ｃ−Ｙ−Ｔ−Ｌ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ｋ−Ｍ−Ｖ−Ｑ−Ｇ−Ｓ−βＡ
配列番号２０：Ｃ−Ｙ−Ｔ−Ｌ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ｋ−Ｍ−Ｖ−Ｑ−Ａ−Ｔ−βＡ
配列番号１１４：アセチル−Ｃ−Ｔ−Ｌ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ｋ−Ｍ−Ｖ−Ｑ
配列番号１１５：Ｃ−Ｔ−Ｌ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ｋ−Ｍ−Ｖ−Ｑ−Ｇ
配列番号１１６：Ｃ−Ｔ−Ｌ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ｋ−Ｍ−Ｖ−Ｑ−Ｇ−Ｓ
配列番号１１７：Ｃ−Ｔ−Ｌ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ｋ−Ｍ−Ｖ−Ｑ−Ｇ−Ｓ−Ｇ
配列番号１１８：Ｃ−Ｌ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ｋ−Ｍ−Ｖ
配列番号１１９：Ｃ−Ｌ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ｋ−Ｍ−Ｖ−Ｑ
配列番号１２０：Ｌ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ｋ−Ｍ−Ｖ−Ｑ−Ｃ
配列番号１２１：Ｃ−Ｌ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ｋ−Ｍ−Ｖ−Ｑ−Ｇ−Ｓ
配列番号１２２：Ｃ−Ｌ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ｋ−Ｍ−Ｖ−Ｑ−Ｇ−Ｓ−Ｇ
からなる群より選ばれる配列を有する、請求項１６記載のペプチド。
【請求項２３】
前記ＢＮＰ（１−７６）ペプチド及び前記ＢＮＰ（７７−１０８）ペプチドを実質的に除き、プロＢＮＰ（１−１０８）の前記配列Ｙ70ＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳＧ85、前記配列Ｙ70ＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳ84及び／又は前記配列ＲＡＰＲ76Ｓ77Ｐを特異的に認識し、ヒト血清試料又は血漿試料中の循環プロＢＮＰ（１−１０８）を特異的に認識する能力を有する抗プロＢＮＰ（１−１０８）抗体を取得するための方法であって、動物を請求項１６〜２２のいずれか１項記載のペプチドで免疫し、場合により、前記ＢＮＰ（７７−１０８）ペプチド及び／又は前記ＢＮＰ（１−７６）ペプチドを用いて、得られた抗血清を除く前記方法。
【請求項２４】
前記ＢＮＰ（１−７６）ペプチド及び前記ＢＮＰ（７７−１０８）ペプチドを実質的に除き、プロＢＮＰ（１−１０８）の前記配列Ｙ70ＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳＧ85、前記配列Ｙ70ＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳ84及び／又は前記配列ＲＡＰＲ76Ｓ77Ｐを特異的に認識し、ヒト血清試料又は血漿試料中の循環プロＢＮＰ（１−１０８）を特異的に認識する能力を有する抗プロＢＮＰ（１−１０８）抗体を分泌するハイブリドーマを取得するための方法であって、動物を請求項１６〜２２のいずれか１項記載のペプチドで免疫し、イムノグロブリン分泌リンパ球を当該動物から採取し、そして、前記リンパ球をミエローマ細胞と融合し、少なくとも一種のイムノグロブリン分泌ハイブリドーマを取得する前記方法。
【請求項２５】
請求項２３記載の方法によって得られることを特徴とする、抗プロＢＮＰ（１−１０８）抗体。
【請求項２６】
プロＢＮＰ（１−１０８）の配列Ｙ70ＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳＧ85又は配列Ｙ70ＴＬＲＡＰＲ76Ｓ77ＰＫＭＶＱＧＳ84を特異的に認識する、請求項２５記載の抗プロＢＮＰ（１−１０８）抗体。
【請求項２７】
請求項２４記載の方法によって製造され得るハイブリドーマ。
【請求項２８】
請求項２７記載のハイブリドーマによって分泌される抗プロＢＮＰ（１−１０８）モノクローナル抗体。
【請求項２９】
ＣＮＣＭに番号ＣＮＣＭ Ｉ−３０７３で寄託されたハイブリドーマ３Ｄ４によって分泌される、請求項２８記載の抗プロＢＮＰ（１−１０８）モノクローナル抗体。
【請求項３０】
生物学的試料を請求項２５、２６、２８及び２９のいずれか１項記載の抗プロＢＮＰ（１−１０８）抗体と接触させること、及び当該試料中の前記プロＢＮＰ（１−１０８）を検出することを含む、ヒトの心不全のｉｎ ｖｉｔｒｏ診断方法。
【請求項３１】
ヒトの心不全のｉｎ ｖｉｔｒｏ診断方法であって、
ａ）生物学的試料を請求項２５、２６、２８及び２９のいずれか１項記載の抗プロＢＮＰ（１−１０８）抗体と接触させること、
ｂ）抗原抗体複合体の形成を可能にする条件下で、当該混合物をインキュベートすること、及び
ｃ）当該一次複合体中に存在する前記プロＢＮＰ（１−１０８）に特異的に結合することができる標識検出抗体、又は当該一次複合体中に存在する前記プロＢＮＰ（１−１０８）に対する抗体に結合することがでできる標識検出抗原を場合により使用して、形成された抗原抗体複合体を明らかにすること、
を含む前記方法。
【請求項３２】
明らかにされた抗原抗体複合体の量を人の臨床症状と相関させるためのステップｄ）を更に含む、請求項３１記載の診断方法。
【請求項３３】
請求項２５、２６、２８及び２９記載の少なくとも一つの抗体を含む、生物学的試料中のプロＢＮＰ（１−１０８）を検出するためのキット。
【請求項３４】
請求項１６〜２２のいずれか１項記載の少なくとも一つのペプチドをスタンダード及び／又はコントロールとして含む、生物学的試料中のプロＢＮＰ（１−１０８）を検出するためのキット。
【請求項３５】
生物学的な試料中のプロＢＮＰ（１−１０８）を検出するためのキットであって、
−一つの容器に、請求項２５、２６、２８及び２９記載の少なくとも一つの抗体を、
−もう一つの容器に、請求項１６〜２２のいずれか１項記載の少なくとも一つのペプチドを含む、生物学的試料中のプロＢＮＰ（１−１０８）を検出するための前記キット。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第一に、プロＢＮＰ（１−１０８）の配列ＲＡＰＲ７６Ｓ７７Ｐ（配列番号５）を特異的に認識し、ペプチドＢＮＰ（１−７６）又はペプチドＢＮＰ（７７−１０８）を実質的に認識せず、第二に、ヒト血清又は血漿の試料中の循環プロＢＮＰ（１−１０８）を特異的に認識する能力を有する、ことを特徴とする抗プロＢＮＰ（１−１０８）抗体。
【請求項２】
プロＢＮＰ（１−１０８）の配列Ｙ７０ＴＬＲＡＰＲ７６Ｓ７７ＰＫＭＶＱＧＳＧ８５（配列番号４）を特異的に認識する、請求項１記載の抗プロＢＮＰ（１−１０８）抗体。
【請求項３】
プロＢＮＰ（１−１０８）の配列Ｙ７０ＴＬＲＡＰＲ７６Ｓ７７ＰＫＭＶＱＧＳ８４（配列番号１０８）を特異的に認識する、請求項１記載の抗プロＢＮＰ（１−１０８）抗体。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項記載の抗プロＢＮＰ（１−１０８）抗体を取得するための方法であって、動物をプロＢＮＰ（１−１０８）分子全体で免疫し、次いで、ＢＮＰ（７７−１０８）ペプチド及び／又はＢＮＰ（１−７６）ペプチドを用いて、得られた抗血清を除去する前記方法。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれか１項記載の抗プロＢＮＰ（１−１０８）抗体を取得するための方法であって、
−下記式：
ａ１−Ｘ１−ＲＡＰＲＳＰ−Ｘ２−ａ２ （Ｉ）
［式中、
ａ１は、水素原子であるかあるいはチオール、アルコール、アミノキシ、第一アミンもしくは第二アミン官能基、アミノカルボキシル基、ビオチニル基及びアセチル基から選ばれる官能基又は化学基を表し、
Ｘ１は、０〜３のアミノ酸のペプチド配列であって、プロＢＮＰ（１−１０８）の天然配列に由来しても又は由来しなくてもよい配列を表し、
Ｘ２は、０〜７のアミノ酸のペプチド配列であって、プロＢＮＰ（１−１０８）の天然配列に由来しても由来しなくてもよい配列を表し、
ａ２は、ＯＨ官能基、ＮＨ２官能基又はアルコキシ基を表す。]
で表されるペプチド；
−下記式：
Ｘ−Ｙ７０ＴＬＲＡＰＲ７６Ｓ７７ＰＫＭＶＱＧＳＧ８５−Ｚ （ＩＩ）
［式中、Ｘは、水素原子であるか又はアセチル基もしくはプロＢＮＰ（１−１０８）の配列に属さない１〜３のアミノ酸を表し、そして、Ｚは、ＯＨ官能基又はプロＢＮＰ（１−１０８）の配列に属さない１〜３のアミノ酸を表す。］
で表されるペプチド；
−下記式：
Ｘ−Ｙ７０ＴＬＲＡＰＲ７６Ｓ７７ＰＫＭＶＱＧＳ８４−Ｚ （ＩＩＩ）
［式中、Ｘは、水素原子であるか又はアセチル基もしくはプロＢＮＰ（１−１０８）の配列に属さない１〜３のアミノ酸を表し、そして、Ｚは、ＯＨ官能基又はプロＢＮＰ（１−１０８）の配列に属さない１〜３のアミノ酸を表す。］
で表されるペプチド；
−アミノ酸Ｙ７０、Ｔ７１、Ｌ７２、Ｋ７９、Ｍ８０、Ｖ８１、Ｑ８２、Ｇ８３、Ｓ８４及びＧ８５の内の１以上のアミノ酸で置換された配列Ｘ−Ｙ７０ＴＬＲＡＰＲ７６Ｓ７７ＰＫＭＶＱＧＳＧ８５−Ｚ（ＩＩ）又は配列Ｘ−Ｙ７０ＴＬＲＡＰＲ７６Ｓ７７ＰＫＭＶＱＧＳ８４−Ｚ（ＩＩＩ）であって、Ｘが、水素原子であるか又はアセチル基もしくはプロＢＮＰ（１−１０８）の配列に属さない１〜３のアミノ酸を表し、そして、Ｚが、ＯＨ官能基又はプロＢＮＰ（１−１０８）の配列に属さない１〜３のアミノ酸であり得る配列に由来する配列を含むペプチド；
−配列Ｃ−Ｙ−Ｔ−Ｌ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ｋ−Ｍ−Ｖ−Ｑ−Ｇ−Ｓ−Ｇ（Ｃ１３Ｐ３０：配列番号１６）を有するペプチド；
−配列Ｃ−Ｙ−Ｔ−Ｌ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ｋ−Ｍ−Ｖ−Ｑ−Ｇ−Ｓ（ＣＮ３２：配列番号１０９）を有するペプチド；
から選ばれるペプチドで動物を免疫し、次いで、場合により、ＢＮＰ（７７−１０８）ペプチド及び／又はＢＮＰ（１−７６）ペプチドを用いて、得られた抗血清を除去する前記方法。
【請求項６】
請求項１〜３のいずれか１項記載の抗プロＢＮＰ（１−１０８）抗体を分泌するハイブリドーマを取得するための方法であって、
−下記式：
ａ１−Ｘ１−ＲＡＰＲＳＰ−Ｘ２−ａ２ （Ｉ）
［式中、
ａ１は、水素原子であるかあるいはチオール、アルコール、アミノキシ、第一アミンもしくは第二アミン官能基、アミノカルボキシル基、ビオチニル基及びアセチル基から選ばれる官能基又は化学基を表し、
Ｘ１は、０〜３のアミノ酸のペプチド配列であって、プロＢＮＰ（１−１０８）の天然配列に由来しても由来しなくてもよい配列を表し、
Ｘ２は、０〜７のアミノ酸のペプチド配列であって、プロＢＮＰ（１−１０８）の天然配列に由来しても由来しなくてもよい配列を表し、
ａ２は、ＯＨ官能基、ＮＨ２官能基又はアルコキシ基を表す。］
で表されるペプチド；
−下記式：
Ｘ−Ｙ７０ＴＬＲＡＰＲ７６Ｓ７７ＰＫＭＶＱＧＳＧ８５−Ｚ （ＩＩ）
［式中、Ｘは、水素原子であるか又はアセチル基もしくはプロＢＮＰ（１−１０８）の配列に属さない１〜３のアミノ酸を表し、そして、Ｚは、ＯＨ官能基又はプロＢＮＰ（１−１０８）の配列に属さない１〜３のアミノ酸を表す。］
で表されるペプチド；
−下記式：
Ｘ−Ｙ７０ＴＬＲＡＰＲ７６Ｓ７７ＰＫＭＶＱＧＳ８４−Ｚ （ＩＩＩ）
［式中、Ｘは、水素原子であるか又はアセチル基もしくはプロＢＮＰ（１−１０８）の配列に属さない１〜３のアミノ酸を表し、そして、Ｚは、ＯＨ官能基又はプロＢＮＰ（１−１０８）の配列に属さない１〜３のアミノ酸を表す。］
で表されるペプチド；
−アミノ酸Ｙ７０、Ｔ７１、Ｌ７２、Ｋ７９、Ｍ８０、Ｖ８１、Ｑ８２、Ｇ８３、Ｓ８４及びＧ８５の内の１以上のアミノ酸で置換された配列Ｘ−Ｙ７０ＴＬＲＡＰＲ７６Ｓ７７ＰＫＭＶＱＧＳＧ８５−Ｚ（ＩＩ）又は配列Ｘ−Ｙ７０ＴＬＲＡＰＲ７６Ｓ７７ＰＫＭＶＱＧＳ８４−Ｚ（ＩＩＩ）であって、Ｘが、水素原子であるか又はアセチル基もしくはプロＢＮＰ（１−１０８）の配列に属さない１〜３のアミノ酸を表し、そして、Ｚが、ＯＨ官能基又はプロＢＮＰ（１−１０８）の配列に属さない１〜３のアミノ酸であり得る配列に由来する配列を含むペプチド；
−配列Ｃ−Ｙ−Ｔ−Ｌ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ｋ−Ｍ−Ｖ−Ｑ−Ｇ−Ｓ−Ｇ（Ｃ１３Ｐ３０：配列番号１６）を有するペプチド；
−配列Ｃ−Ｙ−Ｔ−Ｌ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ｋ−Ｍ−Ｖ−Ｑ−Ｇ−Ｓ（ＣＮ３２：配列番号１０９）を有するペプチド；
から選ばれるペプチドで動物を免疫し、
イムノグロブリン分泌リンパ球を当該動物から採取し、そして、
当該リンパ球をミエローマ細胞と融合して、少なくとも一種のイムノグロブリン分泌ハイブリドーマを取得する前記方法。
【請求項７】
式（ＩＩ）の前記ペプチドが、配列Ｙ７０ＴＬＲＡＰＲ７６Ｓ７７ＰＫＭＶＱＧＳＧ８５（配列番号４）を有する、請求項５又は６記載の方法。
【請求項８】
式（ＩＩＩ）の前記ペプチドが、配列Ｙ７０ＴＬＲＡＰＲ７６Ｓ７７ＰＫＭＶＱＧＳ８４（配列番号１０８）を有する、請求項５又は６記載の方法。
【請求項９】
請求項６〜８のいずれか１項記載の方法によって製造されるハイブリドーマ。
【請求項１０】
請求項９記載のハイブリドーマによって分泌される抗プロＢＮＰ（１−１０８）モノクローナル抗体。
【請求項１１】
生物学的試料を請求項１〜３及び１０のいずれか１項記載の抗プロＢＮＰ（１−１０８）抗体と接触させること、及び当該試料中の前記抗プロＢＮＰ（１−１０８）を検出することを含む、ヒトの心不全の診断のためのｉｎ ｖｉｔｒｏ検定方法。
【請求項１２】
ヒトの心不全の診断のためのｉｎ ｖｉｔｒｏ検定方法であって、
ａ）生物学的試料を請求項１〜３及び１０のいずれか１項記載の抗プロＢＮＰ（１−１０８）抗体と接触させること、
ｂ）抗原抗体複合体の形成を可能にする条件下で、当該混合物をインキュベートすること、及び
ｃ）当該一次複合体中に存在する前記プロＢＮＰ（１−１０８）に特異的に結合することができる標識検出抗体、又は当該一次複合体中に存在する前記プロＢＮＰ（１−１０８）に対する抗体に結合することができる標識検出抗原を場合により使用して、形成された抗原抗体複合体を明らかにすること、
を含む前記方法。
【請求項１３】
前記明らかにされた抗原抗体複合体の量を、人の臨床症状と相関させるためのステップｄ）を更に含む、請求項１２記載の検定方法。
【請求項１４】
請求項１〜３及び１０のいずれか１項記載の少なくとも一つの抗体を含む、生物学的な試料中のプロＢＮＰ（１−１０８）を検出するためのキット。
【請求項１５】
請求項１４記載の生物学的な試料中のプロＢＮＰ（１−１０８）を検出するためのキットであって、
（ｉ）一つの容器には、請求項１〜３及び１０のいずれか１項記載の少なくとも一つの抗体を、
（ｉｉ）もう一つの容器には、
−下記式：
ａ１−Ｘ１−ＲＡＰＲＳＰ−Ｘ２−ａ２ （Ｉ）
［式中、
ａ１は、水素原子であるかあるいはチオール、アルコール、アミノキシ、第一アミンもしくは第二アミン官能基、アミノカルボキシル基、ビオチニル基及びアセチル基から選ばれる官能基又は化学基を表し、
Ｘ１は、０〜３のアミノ酸のペプチド配列であって、プロＢＮＰ（１−１０８）の天然配列に由来しても由来しなくてもよい配列を表し、
Ｘ２は、０〜７のアミノ酸のペプチド配列であって、プロＢＮＰ（１−１０８）の天然配列に由来しても由来しなくてもよい配列を表し、
ａ２は、ＯＨ官能基、ＮＨ２官能基又はアルコキシ基を表す。］
で表されるペプチド；
−下記式：
Ｘ−Ｙ７０ＴＬＲＡＰＲ７６Ｓ７７ＰＫＭＶＱＧＳＧ８５−Ｚ （ＩＩ）
［式中、Ｘは、水素原子であるか又はアセチル基もしくはプロＢＮＰ（１−１０８）の配列に属さない１〜３のアミノ酸を表し、そして、Ｚは、ＯＨ官能基又はプロＢＮＰ（１−１０８）の配列に属さない１〜３のアミノ酸を表す。］
で表されるペプチド；
−下記式：
Ｘ−Ｙ７０ＴＬＲＡＰＲ７６Ｓ７７ＰＫＭＶＱＧＳ８４−Ｚ （ＩＩＩ）
［式中、Ｘは、水素原子であるか又はアセチル基もしくはプロＢＮＰ（１−１０８）の配列に属さない１〜３のアミノ酸を表し、そして、Ｚは、ＯＨ官能基又はプロＢＮＰ（１−１０８）の配列に属さない１〜３のアミノ酸を表す。］
で表されるペプチド；
−アミノ酸Ｙ７０、Ｔ７１、Ｌ７２、Ｋ７９、Ｍ８０、Ｖ８１、Ｑ８２、Ｇ８３、Ｓ８４及びＧ８５の内の１以上のアミノ酸で置換された配列Ｘ−Ｙ７０ＴＬＲＡＰＲ７６Ｓ７７ＰＫＭＶＱＧＳＧ８５−Ｚ（ＩＩ）又は配列Ｘ−Ｙ７０ＴＬＲＡＰＲ７６Ｓ７７ＰＫＭＶＱＧＳ８４−Ｚ（ＩＩＩ）であって、Ｘが、水素原子であるか又はアセチル基もしくはプロＢＮＰ（１−１０８）の配列に属さない１〜３のアミノ酸を表し、そして、Ｚが、ＯＨ官能基又はプロＢＮＰ（１−１０８）の配列に属さない１〜３のアミノ酸であり得る配列に由来する配列を含むペプチド；
−配列Ｙ７０ＴＬＲＡＰＲ７６Ｓ７７ＰＫＭＶＱＧＳＧ８５（配列番号４）を有するペプチド；
−配列Ｙ７０ＴＬＲＡＰＲ７６Ｓ７７ＰＫＭＶＱＧＳ８４（配列番号１０８）を有するペプチド；
−配列Ｃ−Ｙ−Ｔ−Ｌ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ｋ−Ｍ−Ｖ−Ｑ−Ｇ−Ｓ−Ｇ（Ｃ１３Ｐ３０：配列番号１６）を有するペプチド；
−配列Ｃ−Ｙ−Ｔ−Ｌ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ｋ−Ｍ−Ｖ−Ｑ−Ｇ−Ｓ（ＣＮ３２：配列番号１０９）を有するペプチド；
から選ばれる少なくとも一つのペプチド
を含む前記キット。
【請求項１６】
下記式：
ａ１−Ｘ１−ＲＡＰＲＳＰ−Ｘ２−ａ２ （Ｉ）
［式中、
ａ１は、水素原子であるかあるいはチオール、アルコール、アミノキシ、第一アミンもしくは第二アミン官能基、アミノカルボキシル基、ビオチニル基及びアセチル基から選ばれる官能基又は化学基を表し、
Ｘ１は、０〜３のアミノ酸のペプチド配列であって、プロＢＮＰ（１−１０８）の天然配列に由来しても由来しなくてもよい配列を表し、
Ｘ２は、０〜７のアミノ酸のペプチド配列であって、プロＢＮＰ（１−１０８）の天然配列に由来しても由来しなくてもよい配列を表し、
ａ２は、ＯＨ官能基、ＮＨ２官能基又はアルコキシ基を表す。]
で表されるペプチド。
【請求項１７】
下記式：
Ｘ−Ｙ７０ＴＬＲＡＰＲ７６Ｓ７７ＰＫＭＶＱＧＳＧ８５−Ｚ （ＩＩ）
［式中、Ｘは、水素原子であるか又はアセチル基もしくはプロＢＮＰ（１−１０８）の配列に属さない１〜３のアミノ酸を表し、そして、Ｚは、ＯＨ官能基又はプロＢＮＰ（１−１０８）の配列に属さない１〜３のアミノ酸を表す。］
で表されるペプチド。
【請求項１８】
前記配列Ｙ７０ＴＬＲＡＰＲ７６Ｓ７７ＰＫＭＶＱＧＳＧ８５（配列番号４）を有する、請求項１７記載のペプチド。
【請求項１９】
下記式：
Ｘ−Ｙ７０ＴＬＲＡＰＲ７６Ｓ７７ＰＫＭＶＱＧＳ８４−Ｚ （ＩＩＩ）
［式中、Ｘは、水素原子であるか又はアセチル基もしくはプロＢＮＰ（１−１０８）の配列に属さない１〜３のアミノ酸を表し、そして、Ｚは、ＯＨ官能基又はプロＢＮＰ（１−１０８）の配列に属さない１〜３のアミノ酸を表す。］
で表されるペプチド。
【請求項２０】
前記配列Ｙ７０ＴＬＲＡＰＲ７６Ｓ７７ＰＫＭＶＱＧＳ８４−Ｚ（配列番号１０８）を有する、請求項１９記載のペプチド。
【請求項２１】
アミノ酸Ｙ７０、Ｔ７１、Ｌ７２、Ｋ７９、Ｍ８０、Ｖ８１、Ｑ８２、Ｇ８３、Ｓ８４及びＧ８５の内の１以上のアミノ酸で置換された配列Ｘ−Ｙ７０ＴＬＲＡＰＲ７６Ｓ７７ＰＫＭＶＱＧＳＧ８５−Ｚ（ＩＩ）又は配列Ｘ−Ｙ７０ＴＬＲＡＰＲ７６Ｓ７７ＰＫＭＶＱＧＳ８４−Ｚ（ＩＩＩ）であって、Ｘが、水素原子であるか又はアセチル基もしくはプロＢＮＰ（１−１０８）の配列に属さない１〜３のアミノ酸を表し、そして、Ｚが、ＯＨ官能基又はプロＢＮＰ（１−１０８）の配列に属さない１〜３のアミノ酸であり得る配列に由来する配列を含むペプチド。
【請求項２２】
以下の配列；
配列番号１６：Ｃ−Ｙ−Ｔ−Ｌ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ｋ−Ｍ−Ｖ−Ｑ−Ｇ−Ｓ−Ｇ（ペプチド Ｃ１３Ｐ３０）
配列番号１０９：Ｃ−Ｙ−Ｔ−Ｌ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ｋ−Ｍ−Ｖ−Ｑ−Ｇ−Ｓ（ペプチド ＣＮ３２）
配列番号６：Ｃ−Ｇ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ
配列番号７：アセチル−Ｃ−Ｇ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ
配列番号８：Ｃ−Ｇ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ｋ
配列番号９：アセチル−Ｃ−Ｇ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ｋ
配列番号１０：Ｃ−Ｇ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ｋ−Ｍ−Ｖ
配列番号１１：Ｃ−Ｇ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ｋ−Ｍ−Ｖ−Ｑ−Ｇ−Ｓ−Ｇ
配列番号１２：Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ｇ−Ｃ
配列番号１３：アセチル−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ｇ−Ｃ
配列番号１１０：Ｃ−Ｙ−Ｔ−Ｌ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ｋ
配列番号１１１：Ｃ−Ｙ−Ｔ−Ｌ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ｋ−Ｍ−Ｖ
配列番号１１２：Ｃ−Ｙ−Ｔ−Ｌ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ｋ−Ｍ−Ｖ−Ｑ
配列番号１１３：Ｃ−Ｙ−Ｔ−Ｌ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ｋ−Ｍ−Ｖ−Ｑ−Ｇ
配列番号１９：Ｃ−Ｙ−Ｔ−Ｌ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ｋ−Ｍ−Ｖ−Ｑ−Ｇ−Ｓ−βＡ
配列番号２０：Ｃ−Ｙ−Ｔ−Ｌ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ｋ−Ｍ−Ｖ−Ｑ−Ａ−Ｔ−βＡ
配列番号１１４：アセチル−Ｃ−Ｔ−Ｌ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ｋ−Ｍ−Ｖ−Ｑ
配列番号１１５：Ｃ−Ｔ−Ｌ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ｋ−Ｍ−Ｖ−Ｑ−Ｇ
配列番号１１６：Ｃ−Ｔ−Ｌ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ｋ−Ｍ−Ｖ−Ｑ−Ｇ−Ｓ
配列番号１１７：Ｃ−Ｔ−Ｌ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ｋ−Ｍ−Ｖ−Ｑ−Ｇ−Ｓ−Ｇ
配列番号１１８：Ｃ−Ｌ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ｋ−Ｍ−Ｖ
配列番号１１９：Ｃ−Ｌ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ｋ−Ｍ−Ｖ−Ｑ
配列番号１２０：Ｌ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ｋ−Ｍ−Ｖ−Ｑ−Ｃ
配列番号１２１：Ｃ−Ｌ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ｋ−Ｍ−Ｖ−Ｑ−Ｇ−Ｓ
配列番号１２２：Ｃ−Ｌ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ｋ−Ｍ−Ｖ−Ｑ−Ｇ−Ｓ−Ｇ
からなる群より選ばれる配列を有する、請求項１６記載のペプチド。
【請求項２３】
前記ＢＮＰ（１−７６）ペプチド及び前記ＢＮＰ（７７−１０８）ペプチドを実質的に除き、プロＢＮＰ（１−１０８）の前記配列Ｙ７０ＴＬＲＡＰＲ７６Ｓ７７ＰＫＭＶＱＧＳＧ８５、前記配列Ｙ７０ＴＬＲＡＰＲ７６Ｓ７７ＰＫＭＶＱＧＳ８４及び／又は前記配列ＲＡＰＲ７６Ｓ７７Ｐを特異的に認識し、ヒト血清試料又は血漿試料中の循環プロＢＮＰ（１−１０８）を特異的に認識する能力を有する抗プロＢＮＰ（１−１０８）抗体を取得するための方法であって、動物を請求項１６〜２２のいずれか１項記載のペプチドで免疫し、場合により、前記ＢＮＰ（７７−１０８）ペプチド及び／又は前記ＢＮＰ（１−７６）ペプチドを用いて、得られた抗血清を除く前記方法。
【請求項２４】
前記ＢＮＰ（１−７６）ペプチド及び前記ＢＮＰ（７７−１０８）ペプチドを実質的に除き、プロＢＮＰ（１−１０８）の前記配列Ｙ７０ＴＬＲＡＰＲ７６Ｓ７７ＰＫＭＶＱＧＳＧ８５、前記配列Ｙ７０ＴＬＲＡＰＲ７６Ｓ７７ＰＫＭＶＱＧＳ８４及び／又は前記配列ＲＡＰＲ７６Ｓ７７Ｐを特異的に認識し、ヒト血清試料又は血漿試料中の循環プロＢＮＰ（１−１０８）を特異的に認識する能力を有する抗プロＢＮＰ（１−１０８）抗体を分泌するハイブリドーマを取得するための方法であって、動物を請求項１６〜２２のいずれか１項記載のペプチドで免疫し、イムノグロブリン分泌リンパ球を当該動物から採取し、そして、前記リンパ球をミエローマ細胞と融合し、少なくとも一種のイムノグロブリン分泌ハイブリドーマを取得する前記方法。
【請求項２５】
請求項２３記載の方法によって得られることを特徴とする、抗プロＢＮＰ（１−１０８）抗体。
【請求項２６】
プロＢＮＰ（１−１０８）の配列Ｙ７０ＴＬＲＡＰＲ７６Ｓ７７ＰＫＭＶＱＧＳＧ８５又は配列Ｙ７０ＴＬＲＡＰＲ７６Ｓ７７ＰＫＭＶＱＧＳ８４を特異的に認識する、請求項２５記載の抗プロＢＮＰ（１−１０８）抗体。
【請求項２７】
請求項２４記載の方法によって製造され得るハイブリドーマ。
【請求項２８】
請求項２７記載のハイブリドーマによって分泌される抗プロＢＮＰ（１−１０８）モノクローナル抗体。
【請求項２９】
ＣＮＣＭに番号ＣＮＣＭ Ｉ−３０７３で寄託されたハイブリドーマ３Ｄ４によって分泌される、請求項２８記載の抗プロＢＮＰ（１−１０８）モノクローナル抗体。
【請求項３０】
生物学的試料を請求項２５、２６、２８及び２９のいずれか１項記載の抗プロＢＮＰ（１−１０８）抗体と接触させること、及び当該試料中の前記プロＢＮＰ（１−１０８）を検出することを含む、ヒトの心不全の診断のためのｉｎ ｖｉｔｒｏ検定方法。
【請求項３１】
ヒトの心不全の診断のためのｉｎ ｖｉｔｒｏ検定方法であって、
ａ）生物学的試料を請求項２５、２６、２８及び２９のいずれか１項記載の抗プロＢＮＰ（１−１０８）抗体と接触させること、
ｂ）抗原抗体複合体の形成を可能にする条件下で、当該混合物をインキュベートすること、及び
ｃ）当該一次複合体中に存在する前記プロＢＮＰ（１−１０８）に特異的に結合することができる標識検出抗体、又は当該一次複合体中に存在する前記プロＢＮＰ（１−１０８）に対する抗体に結合することがでできる標識検出抗原を場合により使用して、形成された抗原抗体複合体を明らかにすること、
を含む前記方法。
【請求項３２】
明らかにされた抗原抗体複合体の量を人の臨床症状と相関させるためのステップｄ）を更に含む、請求項３１記載の検定方法。
【請求項３３】
請求項２５、２６、２８及び２９記載の少なくとも一つの抗体を含む、生物学的試料中のプロＢＮＰ（１−１０８）を検出するためのキット。
【請求項３４】
請求項１６〜２２のいずれか１項記載の少なくとも一つのペプチドをスタンダード及び／又はコントロールとして含む、生物学的試料中のプロＢＮＰ（１−１０８）を検出するためのキット。
【請求項３５】
生物学的な試料中のプロＢＮＰ（１−１０８）を検出するためのキットであって、
−一つの容器に、請求項２５、２６、２８及び２９記載の少なくとも一つの抗体を、
−もう一つの容器に、請求項１６〜２２のいずれか１項記載の少なくとも一つのペプチドを含む、生物学的試料中のプロＢＮＰ（１−１０８）を検出するための前記キット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【公表番号】特表２００６−５１４６０９（Ｐ２００６−５１４６０９Ａ）
【公表日】平成１８年５月１１日（２００６．５．１１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−５２６９８５（Ｐ２００４−５２６９８５）
【出願日】平成１５年８月７日（２００３．８．７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＲ２００３／００２４８３
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０１４９５２
【国際公開日】平成１６年２月１９日（２００４．２．１９）
【出願人】（５０２０５６４００）バイオ−ラド パストゥール (2)
【出願人】（５０１０８９８６３）サントル ナシオナル ドゥ ラ ルシェルシェサイアンティフィク（セエヌエールエス） (173)
【出願人】（５０５０４５７１３）ユニベルシテ モンペリエ アン (2)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年５月１１日（２００６．５．１１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１５年８月７日（２００３．８．７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＲ２００３／００２４８３
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０１４９５２
【国際公開日】平成１６年２月１９日（２００４．２．１９）
【出願人】（５０２０５６４００）バイオ−ラド パストゥール (2)
【出願人】（５０１０８９８６３）サントル ナシオナル ドゥ ラ ルシェルシェサイアンティフィク（セエヌエールエス） (173)
【出願人】（５０５０４５７１３）ユニベルシテ モンペリエ アン (2)
【Ｆターム（参考）】
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