心疾患抑制剤
【課題】本発明の目的は、安全であり毎日の投与も可能である上に優れた心疾患抑制効果を有する薬剤、および上記薬剤を収率よく高濃度で製造する方法を提供することにある。
【解決手段】本発明に係る心疾患抑制剤は、有効成分としてマンギフェリンを含有することを特徴とする。また、本発明の製造方法は、サラシア属植物に含まれるマンギフェリンを、アルコール水を用いて１５〜３０℃の温度で抽出することを特徴とする。
【解決手段】本発明に係る心疾患抑制剤は、有効成分としてマンギフェリンを含有することを特徴とする。また、本発明の製造方法は、サラシア属植物に含まれるマンギフェリンを、アルコール水を用いて１５〜３０℃の温度で抽出することを特徴とする。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、心疾患を抑制するための薬剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
悪性新生物、心疾患および脳血管疾患は三大成人病といわれ、常に死因の上位を占めている。これらのうち心疾患は、近年における肥満の増大と共にそのリスクが増しており問題となっている。即ち、肥満により全身に脂肪が付くとそれら脂肪組織にまで血液を送る必要が生じるため心臓に負担がかかり、心筋が肥大する。この肥大した心筋にも栄養と酸素が必要となるため、より一層心臓に負担がかかることになる。かかる肥大した心臓に過剰な負担が継続すると収縮不全や拡張不全が起こり、最悪の場合には悪性の不整脈や心不全に至る。
【０００３】
以上の状況下、心疾患を抑制するための薬剤については様々な研究がなされており、医療現場で実際に使用されている薬剤もある。例えば生理活性ペプチドであるアンジオテンシンは血圧上昇活性を有することから、アンジオテンシン変換酵素の阻害剤やアンジオテンシン受容体の拮抗薬が高血圧の治療剤として開発されている。しかしアンジオテンシンは生体内で重要な役割を担っており、その作用を強く阻害すれば当然に副作用の問題が起こる。現在利用されているこれら合成薬剤には常に副作用の問題が伴うので、副作用がより少ないと考えられる天然成分から目的薬剤を見出すことが好ましい。
【０００４】
天然成分から見出された心疾患の抑制効果を示す化合物は、例えば特許文献１と２に開示されている。これらの化合物は生薬であるトウヤクまたはカンゾウから抽出することができ、糖類にそれぞれグリチルレチン酸構造とピラノピラノン構造が結合した化学構造を有し、心疾患の前駆状態である心肥大を治療または予防できるとされている。
【０００５】
一方、ニシキギ科サラシア属の植物に含まれる成分は、糖尿病、肥満、高脂血症に対して有効であり（例えば、特許文献３〜特許文献５をご参照）、ぺルオキシソーム増殖因子活性受容体（ＰＰＡＲ）活性化作用を有する（特許文献６をご参照）ことも報告されている。
【０００６】
このうち、特許文献５には、「血糖値上昇抑制作用は、サラシア属植物に含まれる成分の一部が、糖質分解酵素であるα−グルコシダーゼ（α−Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ）に対する阻害作用を示すことによって発揮される」点に鑑み、α−グルコシダーゼ阻害活性をＩＣ５０値として評価する方法が開示されている。また、特許文献４には、特許文献５に記載のＩＣ５０値による血糖値上昇抑制評価法の代替手段として、キサントン配糖体であるマンギフェリンを測定する方法が提案されている。特許文献４の図２に示すように、マンギフェリン含量とＩＣ５０値とは、非常に高い相関関係を有している。従って、サラシア属植物中に微量しか存在せず検出が困難で再現性も低いα−グルコシダーゼ阻害活性成分を測定しなくても、サラシア属植物の各部位に一定レベルで含まれているマンギフェリン量を、マンギフェリン量と相関関係の高いＩＣ５０値を代用して測定することによって、血糖値上昇抑制作用を短時間で簡便に評価できると記載されている。
【０００７】
これらの特許文献３〜６では、サラシア属の植物に水やメタノールなどの有機溶媒を加えて加熱する加熱抽出法を用いて有効成分を抽出している。
【特許文献１】特開平１０−３３０２５６号公報
【特許文献２】特開平１０−３３０２６８号公報
【特許文献３】特開平１１−１１６９４６号公報
【特許文献４】特開２００２−２６７６５５号公報
【特許文献５】特開２００３−２４５０９５号公報
【特許文献６】特開２００５−２９５５９１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上述したように、心疾患は常に死亡原因の上位を占めるものであるため積極的な対策が必要である。特に、心疾患の発症に至る前に、常日頃から対策を講じて心疾患を予防的に抑制することが好ましい。しかしながら、高血圧症の治療薬などの合成薬剤は既に実用化されているものの、安全で毎日服用でき且つ有効な薬剤は少なかった。
【０００９】
例えば特許文献１と２には天然成分であり心肥大に効果があるとされている化合物の記載がある。しかし、これら特許文献の実施例では各化合物がコラーゲン生合成に関与するヒートショックタンパク質の１つの発現を抑制することが実証されているのみであり、心肥大はコラーゲン合成の異常亢進が関与する疾患の一例として例示されているに過ぎず、これら化合物が真に心肥大を抑制できるか否かは不明である。
【００１０】
また、特許文献３〜特許文献６には、サラシア属植物に含まれるマンギフェリンが糖尿病などの疾病に有効であることは開示または示唆されているが、マンギフェリンが心肥大抑制作用を有することは、何も教示しておらず、実証もしていない。
【００１１】
そこで、本発明が解決すべき課題は、安全であり毎日の投与も可能である上に優れた心疾患抑制効果を有する薬剤を提供することにある。
【００１２】
また、本発明が解決すべき他の課題は、上記薬剤を高収率且つ低コストで製造する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意研究を進めた。その結果、既にお茶として飲用されているサラシア属植物に含まれる化合物であるマンギフェリンが心疾患を有効に抑制できることを見出して本発明を完成した。
【００１４】
上記課題を解決することができた本発明の心疾患抑制剤はマンギフェリンを含有することを特徴とする。
【００１５】
本発明の心疾患抑制剤としては、マンギフェリンを含むサラシア属植物抽出物を含有するものが好ましい。サラシア属植物抽出物にはマンギフェリン以外の成分も含まれるが、例えばマンギフェリンを化学合成するよりも効率的に製造することができる。
【００１６】
また、本発明の心疾患抑制剤としては、マンギフェリンを含むサラシア属植物のアルコール水抽出物（アルコールと水との混合溶媒による抽出物）を含有するものが好ましい。後述する実施例の通り、サラシア属植物のアルコール水抽出物はマンギフェリンを高濃度で含み、且つ心疾患を直接抑制することができる。より好ましくは、アルコール水に対するアルコールの混合比率が４０容量％以上のアルコール水抽出物であり、最も好ましくは５０容量％エタノール水抽出物である。
【００１７】
本発明の心疾患抑制剤は、心肥大を抑制する目的で使用することができる。心肥大は心疾患の前駆状態であるので、心肥大を抑制することにより心疾患の発症を防止することができる。また、本発明の心疾患抑制剤が心肥大を直接抑制できることは、後述する実施例により実証されている。
【００１８】
また、上記課題を解決することができた本発明に係る心疾患抑制剤の製造方法は、サラシア属植物に含まれるマンギフェリンを、アルコール水を用いて１５〜３０℃の温度で抽出することを特徴とする。
【００１９】
上記方法に用いられるアルコール水は、アルコール水に対するアルコールの比率が４０容量％以上であることが好ましく、５０容量％エタノール水を用いることが最も好ましい。
【発明の効果】
【００２０】
本発明の心疾患抑制剤によれば、心疾患の前駆状態である心肥大を直接抑制することができ、また、心疾患の指標となるタンパク質等の産生を抑制できることから、特に心疾患を予防的に抑制できると考えられる。また、本発明の有効成分であるマンギフェリンは、お茶としても飲用されているサラシア属植物の含有成分であるので毒性は少なく、毎日飲用可能である。
【００２１】
従って本発明は、近年、肥満などによりそのリスクが増大している心疾患を、常に副作用の問題が伴う合成薬剤によらず抑制できるものとして非常に有用である。
【００２２】
また、本発明の製造方法によれば、従来のような加熱抽出法を行わなくても、サラシア属植物に含まれるマンギフェリンを高濃度に含む薬剤が高い収率で、しかも低コストで得られるため、薬剤間の薬効のバラツキが少ない高品質の心疾患抑制剤を提供できる点で、極めて有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
本発明の心疾患抑制剤は、マンギフェリンを有効成分として含有する。なお、本発明において「抑制」とは、発症した心疾患の症状を緩和するほか、その発症を予防的に防止することも含む。本発明の心疾患抑制剤は安全性が高く毎日でも服用できる上に、心疾患の前駆状態である心肥大を直接抑制できるので、特に心疾患の予防剤としての利用価値が高い。よって、いわゆる健康食品としての服用も可能である。
【００２４】
本発明に係る心疾患抑制剤の有効成分であるマンギフェリンは、Ｃ19Ｈ18Ｏ11の化学式を有し、下記の通りグルコースの１位にキサントン構造が結合した化学構造を有する。
【化１】
【００２５】
マンギフェリンは化学合成してもよいが、サラシア属植物の含有成分であるのでサラシア属植物から抽出すれば効率よく製造することができる。サラシア属植物はインドやスリランカ、東南アジアなどの亜熱帯地域に広く分布するニシキギ科の植物であり、例えばサラシア・レティキュラータ（Salacia reticulata）、サラシア・プリノイデス（S. prinoides）、サラシア・オブロンガ（S. oblonga）を挙げることができる。抽出部位としては根、幹、枝、葉などがあるが、マンギフェリンは根や枝葉からより効率的に抽出することができ、特に根から効率的に抽出できる。また、マンギフェリンはマンゴー（Mangifera indica、ウルシ科）の果実にも含まれており、その葉や樹脂からも抽出され得る。
【００２６】
抽出方法は、常法、すなわち、採取したサラシア属植物を粗切りして抽出溶媒に浸漬した後に濾過し、濾液を濃縮する方法を適用することができるが、後記する実施例に示すように、抽出溶媒としてアルコールと水の混合溶媒を用い、加熱せずに約１５〜３０℃の室温で抽出する抽出法（冷浸法）を用いれば、低コストで、サラシア属植物からの抽出物を収率良く、且つ、抽出物中のマンギフェリンを高濃度で得られることが判明した。
【００２７】
なお、前述した特許文献３〜特許文献６にも、サラシア属植物からマンギフェリンなどの成分を抽出する方法は記載されている。しかしながら、これらの特許文献には、いずれも、水やメタノールやアルコール水を加えて約８０〜９０℃に加熱して抽出する加熱抽出法が開示されているだけで、本発明のように加熱せずに室温で抽出する冷浸法は開示されていない。これまでは、代表的には、原料であるサラシア属植物に対して２〜２０倍量（質量比）の水を加えて約８０〜１００℃で約２〜４時間加熱抽出を行なってサラシア属植物由来のマンギフェリンを得ている（例えば、後記する表８のＮｏ．４６〜４８、表９のＮｏ．６１〜６３を参照）が、本発明者の詳細な実験結果によれば、
（ア）従来のような、抽出溶媒として水を用いた高温加熱抽出法では、サラシア属植物からの抽出物の収率が低く、マンギフェリンを高濃度に得ることができないこと、
（イ）抽出溶媒として、水の代わりにアルコール水（特に、４０〜７０容量％エタノール水、最も好ましくは５０容量％エタノール水）を用いると、抽出物を収率良く、高濃度のマンギフェリンが得られること、
（ウ）更に、アルコール水を用い、且つ、室温で抽出すると、高温で加熱したのと同程度またはそれ以上の抽出効率および高濃度マンギフェリンが得られること、
（エ）従って、加熱によるコストの上昇なども含めて総合的に勘案すれば、アルコール水を用いた冷浸法が最も優れていること、
が判明した。
【００２８】
表１は、後記する製造例２において、表５のＮｏ．９（本発明例）および表９のＮｏ．６２（従来例）の実験データを抜き出して対比したものである。表１より、本発明例のように５０容量％エタノール水を用いて室温で抽出すると、水を用いて加熱抽出を行う従来例に比べ、エキス収量で約１．７倍、マンギフェリン量で約３．３倍、キサントン類の含有量で約４．０９倍と、いずれも大幅に上昇することが明瞭に分かる。
【００２９】
【表１】
【００３０】
以下、サラシア属植物からマンギフェリンを抽出する工程を、順次説明する。
【００３１】
まず、サラシア属植物を粗切りする。サラシア属植物は細かく切断するほど抽出効率は高まるが手間がかかるので、粗切りの程度は適宜調整すればよい。
【００３２】
次に、粗切りしたサラシア属植物を抽出するが、特に、抽出溶媒および抽出温度は、高濃度のマンギフェリンを収率良く得るうえで極めて重要である。これらの抽出条件によって、抽出物の量（抽出性）やマンギフェリンの含有量（薬効）は大きく変化するからである。
【００３３】
抽出溶媒としては、通常、水；メタノールやエタノールなどのアルコール；水とアルコールの混合溶媒などが用いられ、抽出物は服用しなければならないことを考慮すれば、水またはエタノール水を用いることが良いといわれている。これに対し、本発明では、特に、水とアルコールの混合溶媒（アルコール水）を用いることが好ましい。後記する実施例に示すように、抽出温度が同じであっても、アルコールの含有率によって抽出物の量やマンギフェリンの含有量は変化し、アルコール水全体に占めるアルコールの割合（容量比）がおおむね、４０％以上になると、これらの値が上昇した。
【００３４】
抽出温度は、経済性を考慮すると、約１５〜３０℃の室温とすることが好ましい。室温で抽出を行なっても、高温加熱法と同程度またはそれ以上の効果が得られることが実験によって確認されたからである。
【００３５】
従って、抽出物の収率やマンギフェリン含有量、コストを総合的に勘案すれば、５０容量％エタノール水を用いて約１５〜３０℃の室温で抽出することが最も好ましい。
【００３６】
なお、抽出時間は、抽出条件に応じて適切に調整すれば良いが、おおむね、１〜１０日間程度抽出することが好ましい。
【００３７】
このようにして得られた抽出液はそのまま、或いは水で希釈して飲用してもよいが、製品の流通を考慮すれば濃縮することが好ましい。濃縮の条件も特に制限されないが、マンギフェリン等は高温で分解することも考えられるので、好ましくは５０℃以下で減圧濃縮する。
【００３８】
サラシア属植物抽出物は、さらにクロマトグラフィや再結晶などによりマンギフェリン濃度を高めるか或いはマンギフェリンを単離精製してもよい。しかし、サラシア属植物抽出物に含まれるその他の成分もマンギフェリンと同様の効果またはさらなる効果を示す可能性があるので、抽出物をそのまま用いてもよい。マンギフェリンを単離精製するのであれば、マンゴーの果実や葉、樹皮などを原料にして抽出することも勿論可能である。
【００３９】
本発明に係る心疾患抑制剤の剤形は特に問わない。例えば、サラシア属植物の抽出液や濃縮した抽出物を再度水に溶解した液剤としてもよく、また、濃縮した抽出物からなる粉末剤や錠剤としてもよい。注射剤とすることも考えられるが、毎日摂取する場合は経口投与剤が好適である。
【００４０】
本発明に係る心疾患抑制剤の投与量は、被投与者の症状や目的、性別、年齢などを考慮して適宜調整することができるが、通常は、マンギフェリン量で１回当たり２５〜１００ｇ／ｋｇ体重程度、その他の成分を含むサラシア属植物抽出物量で１回当たり２５〜１０００ｇ／ｋｇ体重程度とすることができる。なお、アルコール水の抽出物を用いれば、熱水抽出物に比べ、高濃度のマンギフェリンが得られるため、抽出物量をより少なくしても同様の効果が得られる。また、１日１回の投与でもよいが、１日当たり２〜４回程度投与してもよい。
【００４１】
本発明の心疾患抑制剤は、特に致死的な心疾患の前駆状態である心肥大を有効に抑制することができる上に、後述する実験結果の通り極めて安全である。よって本発明の心疾患抑制剤は、常に副作用が伴う合成医薬品とは異なり、いわゆる健康食品としての使用も可能である。
【実施例】
【００４２】
以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はもとより下記実施例により制限を受けるものではなく、前・後記の趣旨に適合し得る範囲で適当に変更を加えて実施することも可能であり、それらはいずれも本発明の技術的範囲に含まれる。
【００４３】
（製造例１）
インドのタミルナダ州で採取したサラシア・オブロンガの根、幹または枝葉２００ｇを粗切りし、２Ｌの３０容量％（以下、特に断らない限り単に「％」とする）、５０％もしくは８０％のエタノール水または１００％エタノールに浸漬し、２０〜２５℃で１週間静置した。次いで、根等を濾過により除去し、濾液を４５℃以下で減圧濃縮することによりサラシア・オブロンガ抽出物を得た。
【００４４】
また、同サラシア・オブロンガの根を粗切りし、２０倍量の水を加えて約３時間沸騰させつつ抽出する操作を２回繰り返し、各抽出液を合わせた後に４５℃以下で減圧濃縮することによりサラシア・オブロンガ抽出物を得た。
【００４５】
各抽出物について収率を求め、また、キサントン類とマンギフェリンの含有割合を測定した。それぞれの測定条件は以下の通りである。
【００４６】
（１）キサントン類の含有割合の測定条件
シグマ社製のマンギフェリン５ｍｇを精密に量り取り、５０ｍＬ容メスフラスコに入れ、８０％アセトン水を加えて５０ｍＬにメスアップした。５分間超音波処理して溶解した後、０．４５μｍメンブランフィルタで濾過した。得られた濾液５ｍＬを１０ｍＬ容メスフラスコに入れ、８０％アセトン水を加えて１０ｍＬにメスアップすることにより２倍希釈液を得た。同様の操作により１０倍希釈液を得た。以上により得られた０．０１質量％、０．００５質量％および０．００１質量％のマンギフェリンの８０％アセトン水溶液につき、３６４ｎｍにて吸光度を測定した。その結果から、吸光度とマンギフェリン濃度（質量％）とについて、下記式を導き出した。
Ｙ＝３１５．８５Ｘ＋０．０６３８
（式中、Ｙは３６４ｎｍの吸光度を示し、Ｘはマンギフェリン濃度（質量％）を示す）
【００４７】
別途、各抽出物の粉末５ｍｇを精密に量り取り、１０ｍＬ容メスフラスコに入れ、８０％アセトン水を加えて１０ｍＬにメスアップした。５分間超音波処理して溶解した後、０．４５μｍメンブランフィルタで濾過し、濾液の３６４ｎｍの吸光度を測定した。測定された吸光度を上記式に代入し、算出された濃度をキサントン量とした。なお、マンギフェリンが３６４ｎｍの光に吸収極大を示すのはキサントン骨格に由来するので、上記式からは、マンギフェリンに限られずキサントン骨格を有する化合物の量を算出することができる。
【００４８】
（２）マンギフェリン含有割合の測定条件
各抽出物の粉末１００ｍｇを精密に量り取り、２０ｍＬ容メスフラスコに入れ、約１５ｍＬの５０％メタノール水を加えて溶解した。超音波処理を１５分間行った後、５０％メタノール水を加えて２０ｍＬにメスアップした。次いで、得られた溶液を０．４５μｍメンブランフィルタで濾過し、ＨＰＬＣにより分析し、マンギフェリンピークの面積率によりマンギフェリンの含有割合を求めた。ＨＰＬＣの条件は以下の通りである。
カラム： ＧＬサイエンス社製 ＯＤＳ−３ ２５０ｍｍ×４．６ｍｍ ５μｍ
カラム温度： ４５℃
移動相： ２％酢酸：メタノール＝７０：３０の混合液
流量： １．０ｍＬ／分
検出波長： ３６５ｎｍＵＶ
標準物質：和光純薬製のマンギフェリンを約１００ｐｐｍで５０％メタノールに溶解
【００４９】
各サラシア・オブロンガ抽出物の用いた根等に対する収率、キサントン類の含有割合およびマンギフェリンの含有割合を表２に示す。なお、良好な結果が得られた５０％エタノールによるサラシア・オブロンガの根からの抽出では、普遍性を調べるために同様の実験を４回繰り返した。
【００５０】
【表２】
【００５１】
上記結果の通り、サラシア・オブロンガの根から５０％エタノール水を用いて、２０〜２５℃と比較的低温で抽出した場合には、熱水を用いた場合に比して、有効成分であるマンギフェリンやその他のキサントン類を６．６〜１１．８倍という効率で抽出できることが明らかとなった。なお、一般的に、現段階では野生のサラシア・オブロンガが用いられているが、抽出物の収率やマンギフェリン含有量などのばらつきが大きい。しかし本発明者らによりサラシア属植物の植栽研究は開始されており、将来的には高品質なサラシア属植物の安定的供給も可能になり得、さらに５０％エタノール水を用いる上記方法により高品質のサラシア属植物抽出物が提供できるようになる可能性がある。
【００５２】
（試験例１：心臓重量等の計測）
モナッシュ大学動物室（オーストラリア ビクトリア州）から購入した１３〜１５週齢の正常な雄性Ｚｕｃｋｅｒラット（以下、「ＺＬ」という）１０匹と遺伝的に肥満の雄性Ｚｕｃｋｅｒラット（以下、「ＺＤＦ」という）１０匹を、１２時間毎に明暗調整された２３±１℃の飼育室で飼育した。これら各ラットを５匹ずつ抽出物投与群と対照群の計４群に分けた。上記製造例１の熱水抽出物を濃度５質量％で５質量％アラビアゴム水溶液に溶解した。経口投与用ゾンデを用いて、７週間にわたり当該水溶液０．２ｍＬ／ｋｇ体重を１日１回ずつ抽出物投与群に投与した。対照群へは５質量％アラビアゴム水溶液を同量投与した。７週間後にラットを屠殺して心臓を迅速に摘出し、氷冷した生理食塩水で洗浄した後に表面に付着した水分を濾紙で除去し、心臓の重量（以下、「ＨＷ」という）を測定した。また、この摘出した全心臓から左心室のみを分離してその重量（以下、「ＬＶＷ」という）を測定した。さらに右頚骨の長さ（単位：ｃｍ、以下、「ＴＬ」という）も測定し、心肥大の評価に用いられる各重量と頚骨長さとの比、即ちＨＷ／ＴＬとＬＶＷ／ＴＬを算出した。結果を図１に示す。
【００５３】
図１の通り、正常なＺｕｃｋｅｒラットに比べ、肥満Ｚｕｃｋｅｒラットでは心臓重量と左心室重量が共に有意に重くなっており、心臓重量／頚骨長さと左心室重量／頚骨長さの値も有意に大きくなっている。しかし、サラシア属抽出物を投与したところ、これらの値は正常ラットと同等程度まで低減された。なお、正常ラットにサラシア属植物抽出物を投与した場合でも心臓重量等は多少の減少傾向は見られるが、統計的に有意なものではないことから、サラシア属植物抽出物は正常ラット群にはほとんど影響を与えないことが分かる。
【００５４】
（試験例２：心筋細胞の大きさの測定）
上記試験例１で得られた左心室の一部を６％ホルマリン液で数日間固定し、無水アルコールで脱水後パラフィンに包埋した。各切片をヘマトキンリン−エオジン染色した。左心室の生体成分の測定はイメージ分析機（カールツァイスビジョン社製、ＫＳ４００ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ、ドイツ国エーヒンク）で行った。１００個の心筋細胞を任意に選択し、大きさの分析に用いた。結果を図２に示す。また、各データはＡＮＯＶＡ社の１−ｆａｃｔｏｒ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｖａｒｉａｎｃｅで解析し、さらにＳｔｕｄｅｎｔ−Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓテストにより検定した。
【００５５】
図２ａと図２ｃを比較すれば明らかな通り、肥満Ｚｕｃｋｅｒラットでは正常Ｚｕｃｋｅｒラットに比べて左心室の心筋細胞が肥大している。図２ｅの通り、Ｓｔｕｄｅｎｔ−Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓテストで統計的処理をしても、肥満Ｚｕｃｋｅｒラットの心筋細胞の大きさは正常ラットに対して有意に大きい。しかし、肥満Ｚｕｃｋｅｒラットにサラシア属植物の熱水抽出物を投与した場合には、図２ｄの写真によっても明らかな通り小さくなっており、図２ｅの通り統計的にも対照群に比して有意に小さい。よって、本発明に係るサラシア属植物抽出物は肥満による心肥大を有意に抑制できることが実証された。
【００５６】
（試験例３：ラット左心室におけるＡＮＰ、ＢＮＰおよびＡＴ1の発現量の測定）
ナトリウム利尿ペプチドであるＡＮＰ（Atrial natriuretic peptide）とＢＮＰ（Brain natriuretic peptide）は、ほとんど全ての心疾患の早期に起こる内分泌異常により血中に遊離するので心疾患のマーカーとなる。また、アンジオテンシンＩＩは、心筋と平滑筋細胞の生長を刺激して高血圧の病態進行に関与することから心疾患のマーカーとなる。そこで、ＡＮＰ、ＢＮＰおよびＡＴ1（アンジオテンシンＩＩサブタイプＡＴ1）の発現量に対するサラシア属植物抽出物の影響を調べた。
【００５７】
上記試験例１で得られた左心室の残りの部分からＴＲＩゾル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、オーストラリア）を用いて総ｍＲＮＡと総タンパク質を得た。得られた総ｍＲＮＡを３％アガロースゲルで電気泳動し、臭化エチジウムで染色し、既報（Abe Aら，Eur.J.Pharmacol.，436，pp.7-13（2002））に従ったＲＴ−ＰＣＲ法によりＡＮＰ、ＢＮＰおよびＡＴ1をコードするｍＲＮＡの発現量を、筋肉の収縮性タンパク質であるβアクチンのｍＲＮＡに対する相対量として求めた。また、電気泳動後のゲルの各バンドをＣＣＤカメラで撮影し、Ｉｍａｇｅ Ｊ １．２９Ｘ（ＮＩＨ、米国）で画像処理した。
【００５８】
また、左心室から得た総タンパク質に含まれるＡＴ1の量を、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法(Bradford MMら，Anal.Biochem.，72，pp. 284-254，（1976））により測定した。詳しくは、総タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０％ポリアクリルアミドゲル）で分離し、Ｄｕｎｎ−Ｃａｒｂｏｎａｔｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ緩衝液（１０ｍＭ炭酸水素ナトリウム、３ｍＭ炭酸ナトリウム、１５％メタノール、４℃）中でＰＶＤＦ膜（ポリフッ化ビニリデン膜）に転写した。次いで、５％スキムミルクを加えることにより反応を停止した。得られたＰＶＤＦ膜は０．２Ｍ ＮａＯＨで５分間処理した後に、抗ＡＴ1ウサギ一次抗体（１：４００に希釈、米国Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）と９０分間反応させた。次にワサビダイコン由来のパーオキシダーゼと結合した抗ウサギ二次ＡＴ1抗体（１：６０００に希釈、米国Ｐｒｏｍｅｇａ社製）で６０分間洗浄した後、結合した抗体を高感度蛍光キット（Ｌｕｍｉ−Ｌｉｇｈｔ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ、米国Ｒｏｃｈｅ社製）を用いて検出した。ＰＶＤＦ膜はＸ線フィルム（米国Ｋｏｄａｋ社製）に露出させ、ＳＲＸ−１０１ＡＸ線現像機（台湾Ｋｏｎｉｃａ社製）で現像した。結果の定量分析は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ａｎａｌｙｓｔ ｓｏｆｔｗａｖｅ（ｖｅｒｓｉｏｎ２．１．２、米国Ｂｉｏｒａｄ社製）でＸ線フィルム上をスキャンさせ、ＮＩＨ Ｉｍａｇｅ ｖｅｒｓｉｏｎ１．６２によりデンシトメトリーで行い、筋肉の収縮性タンパク質であるアクチンに対する蛍光強度の比を算出した。なお、ウエスタンプロットは既報（Zhou YTら，Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A.，95，pp.8898-8903（1998）；およびDavies GFら，J．Parmacol．Exp．Ther．，300，pp.72-77（2002））により行った。結果を図３に示す。
【００５９】
左心室におけるＡＮＰとＢＮＰの発現量に対するサラシア属植物の作用効果を図３に、左心室におけるＡＴ1の量の発現量に対するサラシア属植物の作用効果を図４に示す。
【００６０】
図３の通り、肥満ラットではＡＮＰとＢＮＰの両方の発現量が増大している。この結果につきＳｔｕｄｅｎｔ−Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓテストにより検定したところ、ｐ＜５％の危険率で有意であった。また、図４の通り、肥満ラットではＡＴ1のｍＲＮＡの発現量とＡＴ1自体の発現量が増大している。この結果につきＳｔｕｄｅｎｔ−Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓテストにより検定したところ、ｐ＜５％の危険率で有意であった。それに対してサラシア属植物抽出物を投与された肥満ラットでは、ＡＮＰとＢＮＰおよびＡＴ1の発現量が有意に低減されている。よってサラシア属植物抽出物は、心疾患のリスクを低減できることが証明された。
【００６１】
（試験例４：ラット心筋芽細胞におけるＡＮＰ、ＢＮＰおよびＡＴ1の発現量の測定）
心臓繊維芽細胞はアンジオテンシンＩＩによる刺激により活性化し、ＡＮＰやＢＮＰ、アンジオテンシンＩＩの生合成の亢進状態となり心肥大を引き起こすと考えられる。そこで、かかる状態を［3Ｈ］チミジンの取込量として評価し、サラシア属植物抽出物、マンギフェリン、およびアンジオテンシンＩＩの合成拮抗薬であるテルミサルタンの影響を試験した。
【００６２】
先ず、新生ラット胎児の心臓繊維芽細胞を既報（Watanabe Tら，Biochem．Biophys．Res．Commum．，311，pp.454-459（2003））に準じて得た。即ち、生後１〜３日のＳＤ系ラットの心室を約１ｍｍ3に切りとり、この組織を３７℃で１０分間一定に攪拌しつつトリプシン（０．１２５％，Ｇｉｂｃｏ Ｔ８００３）で消化分解した。その上清の２／７を集め、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。分離された細胞を集め、１０％ＦＢＳ（Ｈａｎｇｚｈｏｕ Ｓｉｊｉｇｉｎｇ、０５０４１６、中国Ｈａｎｇｚｈｏｕ）、２５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．４、シグマ社製、Ｈ４０３４）および抗生物質混合液（Ｈｙｃｌｏｎｅ、ＳＶ３００／０）が含まれているダルベッコ変法イーグル培地（１０００ｍｇ／Ｌのブドウ糖を含有。以下、「ＤＭＥＭ」という）に再懸濁した。繊維芽細胞は５％ＣＯ2ガスを充満させたチャンバー中３７℃で１時間培養した。さらに２４穴の培養皿に１×１０6個ずつ分注し、血清を添加せず１６〜１８時間培養した。
【００６３】
ラット心筋芽細胞であるＨ９ｃ２細胞（American Type Culture Collection，Manasas，米国ヴァージニア州）を、ダルベッコ変法イーグル培地（１０００ｍｇ／Ｌのブドウ糖を含有）に１０％のウシ胎児血清、４ｍＭ Ｌ−グルタミン、１質量％ペニシリンおよび１質量％ストレプトマイシンを含有する培地で培養した。２４穴の培養皿に１×１０6個の細胞を分注した。各細胞へ５０μｇ／ｍＬのサラシア属植物抽出物、２５μＭのマンギフェリン、または合成降圧剤であるテルミサルタン（１μＭ、ベーリンガー）を加え、１．５時間後にさらに５μＭのアジオテンシンＩＩを加えて刺激した。
【００６４】
別途、製造例１の熱水抽出物、マンギフェリンおよびアンジオテンシンＩＩ拮抗薬であるテルミサルタンをＤＭＳＯに溶解し、それぞれ熱水抽出物：５０μｇ／ｍｌ、マンギフェリン：２５μＭ（１０．５５μｇ／ｍＬ）、１μＭの濃度でテルミサルタンを繊維芽細胞の培養液に加えた。１．５時間後、１０％ＦＢＳと１μＣｉ／ｍｌの［3Ｈ］チミジン（Ｂｅｉｊｉｎｇ Ａｔｏｍ Ｈｉｇｈ−Ｔｅｃｈ Ｃｏ．Ｌｔｄ．、中国北京）およびアンジオテンシンＩＩ（１μｍ）を添加した。アンジオテンシンＩＩの添加から２４時間後に、冷却したＰＢＳ（Ｂｏｓｔｅｒ，ＡＲ００３０）により繊維芽細胞を３回洗浄した。当該繊維芽細胞を５％ＴＣＡと４℃で１時間反応させることによりＤＮＡを沈殿させ、得られた沈殿をＮａＯＨの０．１Ｎ無水エタノール溶液に溶解した。この溶液の放射活性を液体シンチレーションカウンターで求めた。また、上記試験例３と同様の方法によって、ＡＮＰをコードするｍＲＮＡの発現量をβアクチンのｍＲＮＡに対する相対量として求めた。ＡＮＰのｍＲＮＡの発現量の測定結果を図５Ａに、［3Ｈ］チミジンの取込量の測定結果を図５Ｂに示す。
【００６５】
図５の通り、アンジオテンシンＩＩにより心筋芽細胞を刺激すると、単なる生理食塩水を投与した場合に比してＡＮＰのｍＲＮＡの発現量が２倍以上となり、また、チミジン取り込み量が１．５倍近くとなり、ＡＮＰなどのタンパク質の発現量が増加するのが分かる。一方、サラシア属植物抽出物は心筋芽細胞のＡＮＰのｍＲＮＡの発現やチミジン取り込みを抑制し、心肥大を抑制している。マンギフェリンは、さらに少ない用量でチミジン取り込み等を抑制している。従って、本発明に係るマンギフェリンおよびサラシア属植物抽出物は、異常な心肥大を誘導するＡＮＰやＢＮＰなどの生理活性タンパク質の生合成亢進を抑制することができ、合成薬剤であるテルミサルタンに代わり得るものであることが証明された。
【００６６】
（試験例５：安全性試験）
製造例１で得られたサラシア・オブロンガの根の５０％エタノール水抽出物を、１日当たり１００ｍｇ／ｋｇ体重、３００ｍｇ／ｋｇ体重または９００ｍｇ／ｋｇ体重ずつ４週間にわたり、体重１２５ｇの雄性または雌性のＳＤラットへそれぞれ５匹ずつ経口投与した。４週間後、各ラットの摂餌量、摂水量、体重、心臓などの臓器重量、総タンパクなどの血中濃度を測定し、各群の平均値を求めた。比較のために、サラシア属植物抽出物を投与しない対照群についても同様の測定を行った。
【００６７】
その結果、サラシア属植物抽出物の投与群の各値は対照群に比べて全体的にいえば有意差のある異常値は認められなかった。但し、９００ｍｇ／日でサラシア属植物抽出物を投与した群において、４週間後に血中乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の有意な減少が見られた。ＬＤＨの血中濃度は炎症などにより増加するものであり、かえって減少する理由は明らかではないが、ＬＤＨは細胞内から血中へ逸脱するものであるので、サラシア属植物抽出物は細胞膜を安定化する作用があるのかもしれない。その他、平均赤血球色素濃度の有意な上昇が認められたが、特に問題にする程度ではなかった。
【００６８】
これら結果のうち、雄性ＳＤラットの体重と臓器重量の結果を表３に、雌性ＳＤラットの体重と臓器重量の結果を表４に示す。
【００６９】
【表３】
【００７０】
【表４】
【００７１】
以上の通り、本発明に係るサラシア属植物抽出物は、高投与量で継続的に投与してもほとんど問題がなかったことから、非常に安全な薬剤であることが証明された。
【００７２】
（製造例２）
本製造例では、抽出溶媒、抽出温度、およびサラシア属植物と抽出溶媒の混合比率（質量比）を様々に変化させて得られた種々のサラシア属植物からの抽出物について、前述した製造例１と同様にして抽出物（エキス）の収量（ｍｇ）、並びにキサントン類およびマンギフェリンの含有量（ｍｇ）を測定すると共に、後に詳しく説明するように、α−グルコシダーゼ阻害活性をＩＣ５０値によって評価した。
【００７３】
製造例２における抽出方法の詳細は、以下のとおりである。
【００７４】
ここでは、市販のサラシア・オブロンガ粉末（ロットＳ．Ｏ．０６０９１９Ｙ ８０メッシュ）を用いて、以下のようにして抽出溶媒および抽出温度を変えて実験を行なった。
【００７５】
（Ａ）室温での抽出実験
サラシア・オブロンガ粉末１０ｇに対し、５倍量、１０倍量、または２０倍量の５０％エタノール水を加え、室温（約２０℃）で１日静置する抽出操作を行ない、抽出液を得た。別途、上記と同様の抽出操作を行い、別の抽出液を得た。これらの抽出液を合わせて、減圧下、４５〜５０℃で溶媒を留去した後、凍結乾燥してサラシア・オブロンガ乾燥エキスを得た。
【００７６】
上記の抽出法では、抽出溶媒として５０％エタノールを用いて抽出を行なったが、５０％エタノールの代わりに、水、３０％エタノール、８０％エタノール、９５％エタノールを用い、上記と同様にして種々のサラシア・オブロンガ乾燥エキスを得た。
【００７７】
（Ｂ）５０℃での抽出法
サラシア・オブロンガ粉末１０ｇに対し、５倍量、１０倍量、または２０倍量の５０％エタノールを加え、５０℃で２時間還流しながら加熱抽出を行なった。別途、上記と同様の加熱抽出を行い、別の抽出液を得た。これらの抽出液を合わせた後は、前述した（Ａ）の抽出法と同様にしてサラシア・オブロンガ乾燥エキスを得た。
【００７８】
上記の抽出法では、抽出溶媒として５０％エタノールを用いて抽出を行なったが、５０％エタノールの代わりに、水、３０％エタノール、８０％エタノール、９５％エタノールを用い、上記と同様にして種々のサラシア・オブロンガ乾燥エキスを得た。
【００７９】
（Ｃ）７５℃での抽出法
前記（Ｂ）の抽出法において、７５℃で２時間還流しながら加熱抽出を行なったこと以外は、前記（Ｂ）と同様に抽出を行い、種々のサラシア・オブロンガ乾燥エキスを得た。
【００８０】
（Ｄ）８０℃での抽出法
前記（Ｂ）の抽出法において、８０℃で２時間還流しながら加熱抽出を行なったこと以外は、前記（Ｂ）と同様に抽出を行い、種々のサラシア・オブロンガ乾燥エキスを得た。
【００８１】
（Ｅ）１００℃での抽出法
前記（Ｂ）の抽出法において、１００℃で２時間還流しながら加熱抽出を行なったこと以外は、前記（Ｂ）と同様に抽出を行い、種々のサラシア・オブロンガ乾燥エキスを得た。
【００８２】
上記（Ａ）〜（Ｅ）の抽出法によって得られた各抽出物について、製造例１と同様にして、抽出物の収量（エキス収量）、並びにキサントン類およびマンギフェリンの含有量を測定した。本製造例では、エキス収量については１００ｍｇ以上（すなわち、原料のサラシア・オブロンガ粉末１０ｇに対するエキス収率が１０％以上）を「合格」、マンギフェリン含有量については２５ｍｇ以上を「合格」、キサントン類の含有量については１００ｍｇ以上を「合格」とした。
【００８３】
更に、参考のため、上記の各抽出物について、以下のようにして、α−グルコシダーゼ阻害活性をＩＣ５０値によって評価した。
【００８４】
（３）α−グルコシダーゼ阻害活性の測定条件（ＩＣ５０値による評価方法）
まず、上記のようにして得られたサラシア・オブロンガ乾燥エキスに対し、表５〜９に示すように種々の抽出溶媒を所定の混合比率で混合した試料を用意した。
【００８５】
一方、ショ糖３７ｍＭおよび４％ＤＭＳＯを０．２ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に加えて確実に溶解させた溶液を調製した。この溶液１０００ｍＬに上記の試料を２０ｍｇ加え、測定用試料を得た。
【００８６】
一方、α−グリコシダーゼ（ＯＲＩＥＮＴＡＬ ＹＥＡＳＴ ＣＯ.，ＬＴＤ製）１ｍｇを０．２ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）１０ｍｇに溶解し、酵素液を得た。
【００８７】
上記の測定用試料および酵素液をそれぞれ、０．７ｍＬずつ採取し、充分混和して３７℃で３０分間インキュベートした後、水０．８ｍＬを加え、１００℃で２分間加熱して酵素反応を停止させた。
【００８８】
このようにして得られた反応液を冷却し、生成したグルコースの量をグルコース測定キット（グルコースＣＩＩテストワコー、和光純薬工業）を用いて測定し、ＩＣ５０値を算出した。本製造例では、ＩＣ５０値が４８．１５μｇ／ｍＬ以下のものを「合格」とした。
【００８９】
上記抽出方法（Ａ）〜（Ｅ）の結果を、それぞれ、表５〜表９に示す。これらの表には、各評価項目が合格のものに下線を付している。
【００９０】
更に、これらの表に「総合評価」の欄を設け、下記基準に従い、抽出効率および薬効の両方に優れているものに「◎」または「○」を付し、抽出効率および薬効のいずれかに劣るものに「×」を付した。すなわち、本製造例では、抽出効率を「エキス収量」で評価し、サラシア属植物由来の薬効を「マンギフェリン量」、「キサントン類量」、及び「ＩＣ５０値」の３つのパラメータで評価しているが、心肥大抑制作用を最も有効に評価し得るパラメータ（有効成分）は「マンギフェリン量」またはその上位概念である「キサントン類量」であるから、少なくとも、「エキス収量」、および「マンギフェリン量」または「キサントン類量」が上記の合格基準を満足するものを「総合評価：○」とした。具体的には、下記基準に従い、各実験例の抽出効率および薬効を総合評価した。
【００９１】
総合評価「◎」：エキス収量が合格で、且つ
マンギフェリン量、キサントン類量、ＩＣ５０値の全てが合格
総合評価「○」：エキス収量が合格で、且つ、
マンギフェリン量またはキサントン類量のいずれかが合格
（ＩＣ５０値は、合格・不合格のどちらでも可）
総合評価「×」：マンギフェリン量、キサントン類量のいずれかは合格だが
エキス収量は不合格、若しくは
エキス収量は合格だが、
マンギフェリン量、キサントン類量のいずれかは不合格
（ＩＣ５０値は合格・不合格のどちらでも可）、若しくは
マンギフェリン量、キサントン類量、エキス収量のすべてが不合格
【００９２】
【表５】
【００９３】
【表６】
【００９４】
【表７】
【００９５】
【表８】
【００９６】
【表９】
【００９７】
これらの表より、以下のように考察することができる。
このうち、表８のＮｏ．４６〜４８（抽出温度８０℃）および表９のＮｏ．６１〜６３（抽出温度１００℃）は、いずれも、従来の代表例であり、水を用いた８０℃以上の高温加熱抽出法の例である。
【００９８】
まず、抽出溶媒について検討すると、水よりも、水とエタノールの混合溶媒を用いた方が、抽出率も薬効も高くなった。
【００９９】
詳細には、水を用いた場合には、抽出温度にかかわらず、エキス収量がすべて低く、且つ、マンギフェリン量、キサントン類量、ＩＣ５０値で評価される薬効も、すべて、本製造例の合格基準を大幅に下回っており（表５のＮｏ．１〜３、表６のＮｏ．１６〜１８、表７のＮｏ．３１〜３３、表８のＮｏ．４６〜４８、表９のＮｏ．６１〜６３を参照）、抽出温度を１００℃に高めても、マンギフェリン量は最高で１４．１６ｍｇ、キサントン類量は最高で４１．３９ｍｇ（いずれも、表９のＮｏ．６３を参照）であり、合格基準（マンギフェリン量：２５ｍｇ以上、キサントン類量：１００ｍｇ以上）を大幅に下回った。
【０１００】
これに対し、抽出溶媒として、水とエタノールの混合溶媒を用いると、抽出温度にかかわらず、エキス収量および薬効は上昇した。特に、エタノールの含有率が５０％以上のエタノール水を用いれば、抽出物に対する抽出溶媒の混合比率にかかわらず、おおむね、これらの値は上昇し、とりわけ、５０％エタノール水を用い、８０℃で抽出を行なった表８のＮｏ．５４；５０％エタノール水を用い、１００℃で抽出を行なった表９のＮｏ．６８、６９；８０％エタノール水を用い、１００℃で抽出を行なった表９のＮｏ．７２は、総合評価が○であり、５０％エタノール水を用い、室温で抽出を行なった表５のＮｏ．９は総合評価が◎であった。
【０１０１】
加熱によるコストの上昇を考慮すれば、加熱抽出よりも、室温で抽出する冷浸法を用いた方が、コストを低く抑えられる。従って、抽出効率や薬効のみならず経済性をも考慮すれば、冷浸法を用いることが最も推奨される。
【０１０２】
特に、５０％以上のエタノール水を用いて室温で抽出すれば、表５のＮｏ．７〜９に示すように、サラシア属乾燥エキスに対する抽出溶媒の混合比率にかかわらず、マンギフェリン量は２０ｍｇ以上、キサントン類量は７０ｍｇ以上と総じて高くなり、エキス収量も７６０ｍｇ以上と高くなった。とりわけ、５０％エタノール水を用いた表５のＮｏ．９は、これらの評価項目のいずれもが本製造例の合格基準を満足し、極めて良好な特性を示した。
【０１０３】
なお、薬効に関し、マンギフェリン量と、キサントン類量またはＩＣ５０値との相関関係を見ると、マンギフェリン量とキサントン類量は、総じて、高い相関関係が認められたが、マンギフェリン量とＩＣ５０値の相関関係は低く、マンギフェリン量が多くてもＩＣ５０値が高い例もあり、バラツキが見られた。
【０１０４】
例えば、表５のＮｏ．１０、１３、１４；表６のＮｏ．２５、２６、２８、２９；表７のＮｏ．３７、４２；表８のＮｏ．５２、５８、５９；表９のＮｏ．６４〜６７、７３は、いずれも、マンギフェリン量は低いて悪いのにＩＣ５０値が低くて良好な例であり、一方、表５のＮｏ．１２；表９のＮｏ．７２は、マンギフェリン量は高くて良好なのにＩＣ５０値が高くて悪い例であり、良好な相関関係が認められなかった。
【０１０５】
従って、心疾患抑制剤の指標としては、サラシア属植物由来のマンギフェリンまたはキサントン類を用いることが有効であることが分かった。
【図面の簡単な説明】
【０１０６】
【図１】正常Ｚｕｃｋｅｒラット（ＺＬ）と肥満Ｚｕｃｋｅｒラット（ＺＤＦ）の対照群（Ｃｏｎ）とサラシア属植物抽出物投与群（ＳＯＥ）の、（ａ）心臓重量（ＨＷ）、（ｂ）心臓重量／頚骨長さ（ＨＷ／ＴＬ）、（ｃ）左心室重量（ＬＶＷ）、（ｄ）左心室重量／頚骨長さ（ＬＶＷ／ＴＬ）である。各図中、「＊」はＳｔｕｄｅｎｔ−Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓテストによりｐ＜５％の危険率で有意差がある場合を示す。
【図２】正常Ｚｕｃｋｅｒラット（ＺＬ）と肥満Ｚｕｃｋｅｒラット（ＺＤＦ）で、対照群（Ｃｏｎ）とサラシア属植物抽出物投与群（ＳＯＥ）における心細胞の大きさを比較するための写真と統計処理結果を示す図である。図中、（ａ）はＺＬの対照群の心細胞の写真、（ｂ）はＺＬのサラシア属植物抽出物投与群の心細胞の写真、（ｃ）はＺＤＦの対照群の心細胞の写真、（ｄ）はＺＤＦのサラシア属植物抽出物投与群の心細胞の写真、（ｅ）はこれら心細胞の大きさの統計処理結果を示す写真である。「＊」はＳｔｕｄｅｎｔ−Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓテストによりｐ＜５％の危険率で有意差がある場合を示す。
【図３】正常Ｚｕｃｋｅｒラット（ＺＬ）と肥満Ｚｕｃｋｅｒラット（ＺＤＦ）で、対照群（Ｃｏｎ）とサラシア属植物抽出物投与群（ＳＯＥ）におけるＡＮＰをコードするｍＲＮＡの発現量（Ａ）とＢＮＰのｍＲＮＡの発現量（Ｂ）を示す図である。図中、「＊」はＳｔｕｄｅｎｔ−Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓテストによりｐ＜５％の危険率で有意差がある場合を示す。
【図４】正常Ｚｕｃｋｅｒラット（ＺＬ）と肥満Ｚｕｃｋｅｒラット（ＺＤＦ）で、対照群（Ｃｏｎ）とサラシア属植物抽出物投与群（ＳＯＥ）におけるＡＴ1をコードするｍＲＮＡの発現量（ａ）とＡＴ1自体の発現量（ｂ）を示す図である。図中、「＊」はＳｔｕｄｅｎｔ−Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓテストによりｐ＜５％の危険率で有意差がある場合を示す。
【図５】アンジオテンシンＩＩで刺激した心臓繊維芽細胞において、サラシア属植物抽出物を投与した場合（ＳＯＥ）、マンギフェリンを投与した場合（ＭＡ）、およびテルミサルタンを投与した場合（Ｔｅｌ）におけるＡＮＰのｍＲＮＡの発現量（図５Ａ）とチミジンの取込量（図５Ｂ）を示す図である。比較のために、アンジオテンシンＩＩの代わりに生理食塩水を添加した場合（Ｓａｌｉｎｅ）の結果も合わせて示す。図中、「＊」はＳｔｕｄｅｎｔ−Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓテストによりｐ＜５％の危険率で有意差がある場合を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、心疾患を抑制するための薬剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
悪性新生物、心疾患および脳血管疾患は三大成人病といわれ、常に死因の上位を占めている。これらのうち心疾患は、近年における肥満の増大と共にそのリスクが増しており問題となっている。即ち、肥満により全身に脂肪が付くとそれら脂肪組織にまで血液を送る必要が生じるため心臓に負担がかかり、心筋が肥大する。この肥大した心筋にも栄養と酸素が必要となるため、より一層心臓に負担がかかることになる。かかる肥大した心臓に過剰な負担が継続すると収縮不全や拡張不全が起こり、最悪の場合には悪性の不整脈や心不全に至る。
【０００３】
以上の状況下、心疾患を抑制するための薬剤については様々な研究がなされており、医療現場で実際に使用されている薬剤もある。例えば生理活性ペプチドであるアンジオテンシンは血圧上昇活性を有することから、アンジオテンシン変換酵素の阻害剤やアンジオテンシン受容体の拮抗薬が高血圧の治療剤として開発されている。しかしアンジオテンシンは生体内で重要な役割を担っており、その作用を強く阻害すれば当然に副作用の問題が起こる。現在利用されているこれら合成薬剤には常に副作用の問題が伴うので、副作用がより少ないと考えられる天然成分から目的薬剤を見出すことが好ましい。
【０００４】
天然成分から見出された心疾患の抑制効果を示す化合物は、例えば特許文献１と２に開示されている。これらの化合物は生薬であるトウヤクまたはカンゾウから抽出することができ、糖類にそれぞれグリチルレチン酸構造とピラノピラノン構造が結合した化学構造を有し、心疾患の前駆状態である心肥大を治療または予防できるとされている。
【０００５】
一方、ニシキギ科サラシア属の植物に含まれる成分は、糖尿病、肥満、高脂血症に対して有効であり（例えば、特許文献３〜特許文献５をご参照）、ぺルオキシソーム増殖因子活性受容体（ＰＰＡＲ）活性化作用を有する（特許文献６をご参照）ことも報告されている。
【０００６】
このうち、特許文献５には、「血糖値上昇抑制作用は、サラシア属植物に含まれる成分の一部が、糖質分解酵素であるα−グルコシダーゼ（α−Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ）に対する阻害作用を示すことによって発揮される」点に鑑み、α−グルコシダーゼ阻害活性をＩＣ５０値として評価する方法が開示されている。また、特許文献４には、特許文献５に記載のＩＣ５０値による血糖値上昇抑制評価法の代替手段として、キサントン配糖体であるマンギフェリンを測定する方法が提案されている。特許文献４の図２に示すように、マンギフェリン含量とＩＣ５０値とは、非常に高い相関関係を有している。従って、サラシア属植物中に微量しか存在せず検出が困難で再現性も低いα−グルコシダーゼ阻害活性成分を測定しなくても、サラシア属植物の各部位に一定レベルで含まれているマンギフェリン量を、マンギフェリン量と相関関係の高いＩＣ５０値を代用して測定することによって、血糖値上昇抑制作用を短時間で簡便に評価できると記載されている。
【０００７】
これらの特許文献３〜６では、サラシア属の植物に水やメタノールなどの有機溶媒を加えて加熱する加熱抽出法を用いて有効成分を抽出している。
【特許文献１】特開平１０−３３０２５６号公報
【特許文献２】特開平１０−３３０２６８号公報
【特許文献３】特開平１１−１１６９４６号公報
【特許文献４】特開２００２−２６７６５５号公報
【特許文献５】特開２００３−２４５０９５号公報
【特許文献６】特開２００５−２９５５９１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上述したように、心疾患は常に死亡原因の上位を占めるものであるため積極的な対策が必要である。特に、心疾患の発症に至る前に、常日頃から対策を講じて心疾患を予防的に抑制することが好ましい。しかしながら、高血圧症の治療薬などの合成薬剤は既に実用化されているものの、安全で毎日服用でき且つ有効な薬剤は少なかった。
【０００９】
例えば特許文献１と２には天然成分であり心肥大に効果があるとされている化合物の記載がある。しかし、これら特許文献の実施例では各化合物がコラーゲン生合成に関与するヒートショックタンパク質の１つの発現を抑制することが実証されているのみであり、心肥大はコラーゲン合成の異常亢進が関与する疾患の一例として例示されているに過ぎず、これら化合物が真に心肥大を抑制できるか否かは不明である。
【００１０】
また、特許文献３〜特許文献６には、サラシア属植物に含まれるマンギフェリンが糖尿病などの疾病に有効であることは開示または示唆されているが、マンギフェリンが心肥大抑制作用を有することは、何も教示しておらず、実証もしていない。
【００１１】
そこで、本発明が解決すべき課題は、安全であり毎日の投与も可能である上に優れた心疾患抑制効果を有する薬剤を提供することにある。
【００１２】
また、本発明が解決すべき他の課題は、上記薬剤を高収率且つ低コストで製造する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意研究を進めた。その結果、既にお茶として飲用されているサラシア属植物に含まれる化合物であるマンギフェリンが心疾患を有効に抑制できることを見出して本発明を完成した。
【００１４】
上記課題を解決することができた本発明の心疾患抑制剤はマンギフェリンを含有することを特徴とする。
【００１５】
本発明の心疾患抑制剤としては、マンギフェリンを含むサラシア属植物抽出物を含有するものが好ましい。サラシア属植物抽出物にはマンギフェリン以外の成分も含まれるが、例えばマンギフェリンを化学合成するよりも効率的に製造することができる。
【００１６】
また、本発明の心疾患抑制剤としては、マンギフェリンを含むサラシア属植物のアルコール水抽出物（アルコールと水との混合溶媒による抽出物）を含有するものが好ましい。後述する実施例の通り、サラシア属植物のアルコール水抽出物はマンギフェリンを高濃度で含み、且つ心疾患を直接抑制することができる。より好ましくは、アルコール水に対するアルコールの混合比率が４０容量％以上のアルコール水抽出物であり、最も好ましくは５０容量％エタノール水抽出物である。
【００１７】
本発明の心疾患抑制剤は、心肥大を抑制する目的で使用することができる。心肥大は心疾患の前駆状態であるので、心肥大を抑制することにより心疾患の発症を防止することができる。また、本発明の心疾患抑制剤が心肥大を直接抑制できることは、後述する実施例により実証されている。
【００１８】
また、上記課題を解決することができた本発明に係る心疾患抑制剤の製造方法は、サラシア属植物に含まれるマンギフェリンを、アルコール水を用いて１５〜３０℃の温度で抽出することを特徴とする。
【００１９】
上記方法に用いられるアルコール水は、アルコール水に対するアルコールの比率が４０容量％以上であることが好ましく、５０容量％エタノール水を用いることが最も好ましい。
【発明の効果】
【００２０】
本発明の心疾患抑制剤によれば、心疾患の前駆状態である心肥大を直接抑制することができ、また、心疾患の指標となるタンパク質等の産生を抑制できることから、特に心疾患を予防的に抑制できると考えられる。また、本発明の有効成分であるマンギフェリンは、お茶としても飲用されているサラシア属植物の含有成分であるので毒性は少なく、毎日飲用可能である。
【００２１】
従って本発明は、近年、肥満などによりそのリスクが増大している心疾患を、常に副作用の問題が伴う合成薬剤によらず抑制できるものとして非常に有用である。
【００２２】
また、本発明の製造方法によれば、従来のような加熱抽出法を行わなくても、サラシア属植物に含まれるマンギフェリンを高濃度に含む薬剤が高い収率で、しかも低コストで得られるため、薬剤間の薬効のバラツキが少ない高品質の心疾患抑制剤を提供できる点で、極めて有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
本発明の心疾患抑制剤は、マンギフェリンを有効成分として含有する。なお、本発明において「抑制」とは、発症した心疾患の症状を緩和するほか、その発症を予防的に防止することも含む。本発明の心疾患抑制剤は安全性が高く毎日でも服用できる上に、心疾患の前駆状態である心肥大を直接抑制できるので、特に心疾患の予防剤としての利用価値が高い。よって、いわゆる健康食品としての服用も可能である。
【００２４】
本発明に係る心疾患抑制剤の有効成分であるマンギフェリンは、Ｃ19Ｈ18Ｏ11の化学式を有し、下記の通りグルコースの１位にキサントン構造が結合した化学構造を有する。
【化１】
【００２５】
マンギフェリンは化学合成してもよいが、サラシア属植物の含有成分であるのでサラシア属植物から抽出すれば効率よく製造することができる。サラシア属植物はインドやスリランカ、東南アジアなどの亜熱帯地域に広く分布するニシキギ科の植物であり、例えばサラシア・レティキュラータ（Salacia reticulata）、サラシア・プリノイデス（S. prinoides）、サラシア・オブロンガ（S. oblonga）を挙げることができる。抽出部位としては根、幹、枝、葉などがあるが、マンギフェリンは根や枝葉からより効率的に抽出することができ、特に根から効率的に抽出できる。また、マンギフェリンはマンゴー（Mangifera indica、ウルシ科）の果実にも含まれており、その葉や樹脂からも抽出され得る。
【００２６】
抽出方法は、常法、すなわち、採取したサラシア属植物を粗切りして抽出溶媒に浸漬した後に濾過し、濾液を濃縮する方法を適用することができるが、後記する実施例に示すように、抽出溶媒としてアルコールと水の混合溶媒を用い、加熱せずに約１５〜３０℃の室温で抽出する抽出法（冷浸法）を用いれば、低コストで、サラシア属植物からの抽出物を収率良く、且つ、抽出物中のマンギフェリンを高濃度で得られることが判明した。
【００２７】
なお、前述した特許文献３〜特許文献６にも、サラシア属植物からマンギフェリンなどの成分を抽出する方法は記載されている。しかしながら、これらの特許文献には、いずれも、水やメタノールやアルコール水を加えて約８０〜９０℃に加熱して抽出する加熱抽出法が開示されているだけで、本発明のように加熱せずに室温で抽出する冷浸法は開示されていない。これまでは、代表的には、原料であるサラシア属植物に対して２〜２０倍量（質量比）の水を加えて約８０〜１００℃で約２〜４時間加熱抽出を行なってサラシア属植物由来のマンギフェリンを得ている（例えば、後記する表８のＮｏ．４６〜４８、表９のＮｏ．６１〜６３を参照）が、本発明者の詳細な実験結果によれば、
（ア）従来のような、抽出溶媒として水を用いた高温加熱抽出法では、サラシア属植物からの抽出物の収率が低く、マンギフェリンを高濃度に得ることができないこと、
（イ）抽出溶媒として、水の代わりにアルコール水（特に、４０〜７０容量％エタノール水、最も好ましくは５０容量％エタノール水）を用いると、抽出物を収率良く、高濃度のマンギフェリンが得られること、
（ウ）更に、アルコール水を用い、且つ、室温で抽出すると、高温で加熱したのと同程度またはそれ以上の抽出効率および高濃度マンギフェリンが得られること、
（エ）従って、加熱によるコストの上昇なども含めて総合的に勘案すれば、アルコール水を用いた冷浸法が最も優れていること、
が判明した。
【００２８】
表１は、後記する製造例２において、表５のＮｏ．９（本発明例）および表９のＮｏ．６２（従来例）の実験データを抜き出して対比したものである。表１より、本発明例のように５０容量％エタノール水を用いて室温で抽出すると、水を用いて加熱抽出を行う従来例に比べ、エキス収量で約１．７倍、マンギフェリン量で約３．３倍、キサントン類の含有量で約４．０９倍と、いずれも大幅に上昇することが明瞭に分かる。
【００２９】
【表１】
【００３０】
以下、サラシア属植物からマンギフェリンを抽出する工程を、順次説明する。
【００３１】
まず、サラシア属植物を粗切りする。サラシア属植物は細かく切断するほど抽出効率は高まるが手間がかかるので、粗切りの程度は適宜調整すればよい。
【００３２】
次に、粗切りしたサラシア属植物を抽出するが、特に、抽出溶媒および抽出温度は、高濃度のマンギフェリンを収率良く得るうえで極めて重要である。これらの抽出条件によって、抽出物の量（抽出性）やマンギフェリンの含有量（薬効）は大きく変化するからである。
【００３３】
抽出溶媒としては、通常、水；メタノールやエタノールなどのアルコール；水とアルコールの混合溶媒などが用いられ、抽出物は服用しなければならないことを考慮すれば、水またはエタノール水を用いることが良いといわれている。これに対し、本発明では、特に、水とアルコールの混合溶媒（アルコール水）を用いることが好ましい。後記する実施例に示すように、抽出温度が同じであっても、アルコールの含有率によって抽出物の量やマンギフェリンの含有量は変化し、アルコール水全体に占めるアルコールの割合（容量比）がおおむね、４０％以上になると、これらの値が上昇した。
【００３４】
抽出温度は、経済性を考慮すると、約１５〜３０℃の室温とすることが好ましい。室温で抽出を行なっても、高温加熱法と同程度またはそれ以上の効果が得られることが実験によって確認されたからである。
【００３５】
従って、抽出物の収率やマンギフェリン含有量、コストを総合的に勘案すれば、５０容量％エタノール水を用いて約１５〜３０℃の室温で抽出することが最も好ましい。
【００３６】
なお、抽出時間は、抽出条件に応じて適切に調整すれば良いが、おおむね、１〜１０日間程度抽出することが好ましい。
【００３７】
このようにして得られた抽出液はそのまま、或いは水で希釈して飲用してもよいが、製品の流通を考慮すれば濃縮することが好ましい。濃縮の条件も特に制限されないが、マンギフェリン等は高温で分解することも考えられるので、好ましくは５０℃以下で減圧濃縮する。
【００３８】
サラシア属植物抽出物は、さらにクロマトグラフィや再結晶などによりマンギフェリン濃度を高めるか或いはマンギフェリンを単離精製してもよい。しかし、サラシア属植物抽出物に含まれるその他の成分もマンギフェリンと同様の効果またはさらなる効果を示す可能性があるので、抽出物をそのまま用いてもよい。マンギフェリンを単離精製するのであれば、マンゴーの果実や葉、樹皮などを原料にして抽出することも勿論可能である。
【００３９】
本発明に係る心疾患抑制剤の剤形は特に問わない。例えば、サラシア属植物の抽出液や濃縮した抽出物を再度水に溶解した液剤としてもよく、また、濃縮した抽出物からなる粉末剤や錠剤としてもよい。注射剤とすることも考えられるが、毎日摂取する場合は経口投与剤が好適である。
【００４０】
本発明に係る心疾患抑制剤の投与量は、被投与者の症状や目的、性別、年齢などを考慮して適宜調整することができるが、通常は、マンギフェリン量で１回当たり２５〜１００ｇ／ｋｇ体重程度、その他の成分を含むサラシア属植物抽出物量で１回当たり２５〜１０００ｇ／ｋｇ体重程度とすることができる。なお、アルコール水の抽出物を用いれば、熱水抽出物に比べ、高濃度のマンギフェリンが得られるため、抽出物量をより少なくしても同様の効果が得られる。また、１日１回の投与でもよいが、１日当たり２〜４回程度投与してもよい。
【００４１】
本発明の心疾患抑制剤は、特に致死的な心疾患の前駆状態である心肥大を有効に抑制することができる上に、後述する実験結果の通り極めて安全である。よって本発明の心疾患抑制剤は、常に副作用が伴う合成医薬品とは異なり、いわゆる健康食品としての使用も可能である。
【実施例】
【００４２】
以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はもとより下記実施例により制限を受けるものではなく、前・後記の趣旨に適合し得る範囲で適当に変更を加えて実施することも可能であり、それらはいずれも本発明の技術的範囲に含まれる。
【００４３】
（製造例１）
インドのタミルナダ州で採取したサラシア・オブロンガの根、幹または枝葉２００ｇを粗切りし、２Ｌの３０容量％（以下、特に断らない限り単に「％」とする）、５０％もしくは８０％のエタノール水または１００％エタノールに浸漬し、２０〜２５℃で１週間静置した。次いで、根等を濾過により除去し、濾液を４５℃以下で減圧濃縮することによりサラシア・オブロンガ抽出物を得た。
【００４４】
また、同サラシア・オブロンガの根を粗切りし、２０倍量の水を加えて約３時間沸騰させつつ抽出する操作を２回繰り返し、各抽出液を合わせた後に４５℃以下で減圧濃縮することによりサラシア・オブロンガ抽出物を得た。
【００４５】
各抽出物について収率を求め、また、キサントン類とマンギフェリンの含有割合を測定した。それぞれの測定条件は以下の通りである。
【００４６】
（１）キサントン類の含有割合の測定条件
シグマ社製のマンギフェリン５ｍｇを精密に量り取り、５０ｍＬ容メスフラスコに入れ、８０％アセトン水を加えて５０ｍＬにメスアップした。５分間超音波処理して溶解した後、０．４５μｍメンブランフィルタで濾過した。得られた濾液５ｍＬを１０ｍＬ容メスフラスコに入れ、８０％アセトン水を加えて１０ｍＬにメスアップすることにより２倍希釈液を得た。同様の操作により１０倍希釈液を得た。以上により得られた０．０１質量％、０．００５質量％および０．００１質量％のマンギフェリンの８０％アセトン水溶液につき、３６４ｎｍにて吸光度を測定した。その結果から、吸光度とマンギフェリン濃度（質量％）とについて、下記式を導き出した。
Ｙ＝３１５．８５Ｘ＋０．０６３８
（式中、Ｙは３６４ｎｍの吸光度を示し、Ｘはマンギフェリン濃度（質量％）を示す）
【００４７】
別途、各抽出物の粉末５ｍｇを精密に量り取り、１０ｍＬ容メスフラスコに入れ、８０％アセトン水を加えて１０ｍＬにメスアップした。５分間超音波処理して溶解した後、０．４５μｍメンブランフィルタで濾過し、濾液の３６４ｎｍの吸光度を測定した。測定された吸光度を上記式に代入し、算出された濃度をキサントン量とした。なお、マンギフェリンが３６４ｎｍの光に吸収極大を示すのはキサントン骨格に由来するので、上記式からは、マンギフェリンに限られずキサントン骨格を有する化合物の量を算出することができる。
【００４８】
（２）マンギフェリン含有割合の測定条件
各抽出物の粉末１００ｍｇを精密に量り取り、２０ｍＬ容メスフラスコに入れ、約１５ｍＬの５０％メタノール水を加えて溶解した。超音波処理を１５分間行った後、５０％メタノール水を加えて２０ｍＬにメスアップした。次いで、得られた溶液を０．４５μｍメンブランフィルタで濾過し、ＨＰＬＣにより分析し、マンギフェリンピークの面積率によりマンギフェリンの含有割合を求めた。ＨＰＬＣの条件は以下の通りである。
カラム： ＧＬサイエンス社製 ＯＤＳ−３ ２５０ｍｍ×４．６ｍｍ ５μｍ
カラム温度： ４５℃
移動相： ２％酢酸：メタノール＝７０：３０の混合液
流量： １．０ｍＬ／分
検出波長： ３６５ｎｍＵＶ
標準物質：和光純薬製のマンギフェリンを約１００ｐｐｍで５０％メタノールに溶解
【００４９】
各サラシア・オブロンガ抽出物の用いた根等に対する収率、キサントン類の含有割合およびマンギフェリンの含有割合を表２に示す。なお、良好な結果が得られた５０％エタノールによるサラシア・オブロンガの根からの抽出では、普遍性を調べるために同様の実験を４回繰り返した。
【００５０】
【表２】
【００５１】
上記結果の通り、サラシア・オブロンガの根から５０％エタノール水を用いて、２０〜２５℃と比較的低温で抽出した場合には、熱水を用いた場合に比して、有効成分であるマンギフェリンやその他のキサントン類を６．６〜１１．８倍という効率で抽出できることが明らかとなった。なお、一般的に、現段階では野生のサラシア・オブロンガが用いられているが、抽出物の収率やマンギフェリン含有量などのばらつきが大きい。しかし本発明者らによりサラシア属植物の植栽研究は開始されており、将来的には高品質なサラシア属植物の安定的供給も可能になり得、さらに５０％エタノール水を用いる上記方法により高品質のサラシア属植物抽出物が提供できるようになる可能性がある。
【００５２】
（試験例１：心臓重量等の計測）
モナッシュ大学動物室（オーストラリア ビクトリア州）から購入した１３〜１５週齢の正常な雄性Ｚｕｃｋｅｒラット（以下、「ＺＬ」という）１０匹と遺伝的に肥満の雄性Ｚｕｃｋｅｒラット（以下、「ＺＤＦ」という）１０匹を、１２時間毎に明暗調整された２３±１℃の飼育室で飼育した。これら各ラットを５匹ずつ抽出物投与群と対照群の計４群に分けた。上記製造例１の熱水抽出物を濃度５質量％で５質量％アラビアゴム水溶液に溶解した。経口投与用ゾンデを用いて、７週間にわたり当該水溶液０．２ｍＬ／ｋｇ体重を１日１回ずつ抽出物投与群に投与した。対照群へは５質量％アラビアゴム水溶液を同量投与した。７週間後にラットを屠殺して心臓を迅速に摘出し、氷冷した生理食塩水で洗浄した後に表面に付着した水分を濾紙で除去し、心臓の重量（以下、「ＨＷ」という）を測定した。また、この摘出した全心臓から左心室のみを分離してその重量（以下、「ＬＶＷ」という）を測定した。さらに右頚骨の長さ（単位：ｃｍ、以下、「ＴＬ」という）も測定し、心肥大の評価に用いられる各重量と頚骨長さとの比、即ちＨＷ／ＴＬとＬＶＷ／ＴＬを算出した。結果を図１に示す。
【００５３】
図１の通り、正常なＺｕｃｋｅｒラットに比べ、肥満Ｚｕｃｋｅｒラットでは心臓重量と左心室重量が共に有意に重くなっており、心臓重量／頚骨長さと左心室重量／頚骨長さの値も有意に大きくなっている。しかし、サラシア属抽出物を投与したところ、これらの値は正常ラットと同等程度まで低減された。なお、正常ラットにサラシア属植物抽出物を投与した場合でも心臓重量等は多少の減少傾向は見られるが、統計的に有意なものではないことから、サラシア属植物抽出物は正常ラット群にはほとんど影響を与えないことが分かる。
【００５４】
（試験例２：心筋細胞の大きさの測定）
上記試験例１で得られた左心室の一部を６％ホルマリン液で数日間固定し、無水アルコールで脱水後パラフィンに包埋した。各切片をヘマトキンリン−エオジン染色した。左心室の生体成分の測定はイメージ分析機（カールツァイスビジョン社製、ＫＳ４００ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ、ドイツ国エーヒンク）で行った。１００個の心筋細胞を任意に選択し、大きさの分析に用いた。結果を図２に示す。また、各データはＡＮＯＶＡ社の１−ｆａｃｔｏｒ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｖａｒｉａｎｃｅで解析し、さらにＳｔｕｄｅｎｔ−Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓテストにより検定した。
【００５５】
図２ａと図２ｃを比較すれば明らかな通り、肥満Ｚｕｃｋｅｒラットでは正常Ｚｕｃｋｅｒラットに比べて左心室の心筋細胞が肥大している。図２ｅの通り、Ｓｔｕｄｅｎｔ−Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓテストで統計的処理をしても、肥満Ｚｕｃｋｅｒラットの心筋細胞の大きさは正常ラットに対して有意に大きい。しかし、肥満Ｚｕｃｋｅｒラットにサラシア属植物の熱水抽出物を投与した場合には、図２ｄの写真によっても明らかな通り小さくなっており、図２ｅの通り統計的にも対照群に比して有意に小さい。よって、本発明に係るサラシア属植物抽出物は肥満による心肥大を有意に抑制できることが実証された。
【００５６】
（試験例３：ラット左心室におけるＡＮＰ、ＢＮＰおよびＡＴ1の発現量の測定）
ナトリウム利尿ペプチドであるＡＮＰ（Atrial natriuretic peptide）とＢＮＰ（Brain natriuretic peptide）は、ほとんど全ての心疾患の早期に起こる内分泌異常により血中に遊離するので心疾患のマーカーとなる。また、アンジオテンシンＩＩは、心筋と平滑筋細胞の生長を刺激して高血圧の病態進行に関与することから心疾患のマーカーとなる。そこで、ＡＮＰ、ＢＮＰおよびＡＴ1（アンジオテンシンＩＩサブタイプＡＴ1）の発現量に対するサラシア属植物抽出物の影響を調べた。
【００５７】
上記試験例１で得られた左心室の残りの部分からＴＲＩゾル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、オーストラリア）を用いて総ｍＲＮＡと総タンパク質を得た。得られた総ｍＲＮＡを３％アガロースゲルで電気泳動し、臭化エチジウムで染色し、既報（Abe Aら，Eur.J.Pharmacol.，436，pp.7-13（2002））に従ったＲＴ−ＰＣＲ法によりＡＮＰ、ＢＮＰおよびＡＴ1をコードするｍＲＮＡの発現量を、筋肉の収縮性タンパク質であるβアクチンのｍＲＮＡに対する相対量として求めた。また、電気泳動後のゲルの各バンドをＣＣＤカメラで撮影し、Ｉｍａｇｅ Ｊ １．２９Ｘ（ＮＩＨ、米国）で画像処理した。
【００５８】
また、左心室から得た総タンパク質に含まれるＡＴ1の量を、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法(Bradford MMら，Anal.Biochem.，72，pp. 284-254，（1976））により測定した。詳しくは、総タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０％ポリアクリルアミドゲル）で分離し、Ｄｕｎｎ−Ｃａｒｂｏｎａｔｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ緩衝液（１０ｍＭ炭酸水素ナトリウム、３ｍＭ炭酸ナトリウム、１５％メタノール、４℃）中でＰＶＤＦ膜（ポリフッ化ビニリデン膜）に転写した。次いで、５％スキムミルクを加えることにより反応を停止した。得られたＰＶＤＦ膜は０．２Ｍ ＮａＯＨで５分間処理した後に、抗ＡＴ1ウサギ一次抗体（１：４００に希釈、米国Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）と９０分間反応させた。次にワサビダイコン由来のパーオキシダーゼと結合した抗ウサギ二次ＡＴ1抗体（１：６０００に希釈、米国Ｐｒｏｍｅｇａ社製）で６０分間洗浄した後、結合した抗体を高感度蛍光キット（Ｌｕｍｉ−Ｌｉｇｈｔ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ、米国Ｒｏｃｈｅ社製）を用いて検出した。ＰＶＤＦ膜はＸ線フィルム（米国Ｋｏｄａｋ社製）に露出させ、ＳＲＸ−１０１ＡＸ線現像機（台湾Ｋｏｎｉｃａ社製）で現像した。結果の定量分析は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ａｎａｌｙｓｔ ｓｏｆｔｗａｖｅ（ｖｅｒｓｉｏｎ２．１．２、米国Ｂｉｏｒａｄ社製）でＸ線フィルム上をスキャンさせ、ＮＩＨ Ｉｍａｇｅ ｖｅｒｓｉｏｎ１．６２によりデンシトメトリーで行い、筋肉の収縮性タンパク質であるアクチンに対する蛍光強度の比を算出した。なお、ウエスタンプロットは既報（Zhou YTら，Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A.，95，pp.8898-8903（1998）；およびDavies GFら，J．Parmacol．Exp．Ther．，300，pp.72-77（2002））により行った。結果を図３に示す。
【００５９】
左心室におけるＡＮＰとＢＮＰの発現量に対するサラシア属植物の作用効果を図３に、左心室におけるＡＴ1の量の発現量に対するサラシア属植物の作用効果を図４に示す。
【００６０】
図３の通り、肥満ラットではＡＮＰとＢＮＰの両方の発現量が増大している。この結果につきＳｔｕｄｅｎｔ−Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓテストにより検定したところ、ｐ＜５％の危険率で有意であった。また、図４の通り、肥満ラットではＡＴ1のｍＲＮＡの発現量とＡＴ1自体の発現量が増大している。この結果につきＳｔｕｄｅｎｔ−Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓテストにより検定したところ、ｐ＜５％の危険率で有意であった。それに対してサラシア属植物抽出物を投与された肥満ラットでは、ＡＮＰとＢＮＰおよびＡＴ1の発現量が有意に低減されている。よってサラシア属植物抽出物は、心疾患のリスクを低減できることが証明された。
【００６１】
（試験例４：ラット心筋芽細胞におけるＡＮＰ、ＢＮＰおよびＡＴ1の発現量の測定）
心臓繊維芽細胞はアンジオテンシンＩＩによる刺激により活性化し、ＡＮＰやＢＮＰ、アンジオテンシンＩＩの生合成の亢進状態となり心肥大を引き起こすと考えられる。そこで、かかる状態を［3Ｈ］チミジンの取込量として評価し、サラシア属植物抽出物、マンギフェリン、およびアンジオテンシンＩＩの合成拮抗薬であるテルミサルタンの影響を試験した。
【００６２】
先ず、新生ラット胎児の心臓繊維芽細胞を既報（Watanabe Tら，Biochem．Biophys．Res．Commum．，311，pp.454-459（2003））に準じて得た。即ち、生後１〜３日のＳＤ系ラットの心室を約１ｍｍ3に切りとり、この組織を３７℃で１０分間一定に攪拌しつつトリプシン（０．１２５％，Ｇｉｂｃｏ Ｔ８００３）で消化分解した。その上清の２／７を集め、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。分離された細胞を集め、１０％ＦＢＳ（Ｈａｎｇｚｈｏｕ Ｓｉｊｉｇｉｎｇ、０５０４１６、中国Ｈａｎｇｚｈｏｕ）、２５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．４、シグマ社製、Ｈ４０３４）および抗生物質混合液（Ｈｙｃｌｏｎｅ、ＳＶ３００／０）が含まれているダルベッコ変法イーグル培地（１０００ｍｇ／Ｌのブドウ糖を含有。以下、「ＤＭＥＭ」という）に再懸濁した。繊維芽細胞は５％ＣＯ2ガスを充満させたチャンバー中３７℃で１時間培養した。さらに２４穴の培養皿に１×１０6個ずつ分注し、血清を添加せず１６〜１８時間培養した。
【００６３】
ラット心筋芽細胞であるＨ９ｃ２細胞（American Type Culture Collection，Manasas，米国ヴァージニア州）を、ダルベッコ変法イーグル培地（１０００ｍｇ／Ｌのブドウ糖を含有）に１０％のウシ胎児血清、４ｍＭ Ｌ−グルタミン、１質量％ペニシリンおよび１質量％ストレプトマイシンを含有する培地で培養した。２４穴の培養皿に１×１０6個の細胞を分注した。各細胞へ５０μｇ／ｍＬのサラシア属植物抽出物、２５μＭのマンギフェリン、または合成降圧剤であるテルミサルタン（１μＭ、ベーリンガー）を加え、１．５時間後にさらに５μＭのアジオテンシンＩＩを加えて刺激した。
【００６４】
別途、製造例１の熱水抽出物、マンギフェリンおよびアンジオテンシンＩＩ拮抗薬であるテルミサルタンをＤＭＳＯに溶解し、それぞれ熱水抽出物：５０μｇ／ｍｌ、マンギフェリン：２５μＭ（１０．５５μｇ／ｍＬ）、１μＭの濃度でテルミサルタンを繊維芽細胞の培養液に加えた。１．５時間後、１０％ＦＢＳと１μＣｉ／ｍｌの［3Ｈ］チミジン（Ｂｅｉｊｉｎｇ Ａｔｏｍ Ｈｉｇｈ−Ｔｅｃｈ Ｃｏ．Ｌｔｄ．、中国北京）およびアンジオテンシンＩＩ（１μｍ）を添加した。アンジオテンシンＩＩの添加から２４時間後に、冷却したＰＢＳ（Ｂｏｓｔｅｒ，ＡＲ００３０）により繊維芽細胞を３回洗浄した。当該繊維芽細胞を５％ＴＣＡと４℃で１時間反応させることによりＤＮＡを沈殿させ、得られた沈殿をＮａＯＨの０．１Ｎ無水エタノール溶液に溶解した。この溶液の放射活性を液体シンチレーションカウンターで求めた。また、上記試験例３と同様の方法によって、ＡＮＰをコードするｍＲＮＡの発現量をβアクチンのｍＲＮＡに対する相対量として求めた。ＡＮＰのｍＲＮＡの発現量の測定結果を図５Ａに、［3Ｈ］チミジンの取込量の測定結果を図５Ｂに示す。
【００６５】
図５の通り、アンジオテンシンＩＩにより心筋芽細胞を刺激すると、単なる生理食塩水を投与した場合に比してＡＮＰのｍＲＮＡの発現量が２倍以上となり、また、チミジン取り込み量が１．５倍近くとなり、ＡＮＰなどのタンパク質の発現量が増加するのが分かる。一方、サラシア属植物抽出物は心筋芽細胞のＡＮＰのｍＲＮＡの発現やチミジン取り込みを抑制し、心肥大を抑制している。マンギフェリンは、さらに少ない用量でチミジン取り込み等を抑制している。従って、本発明に係るマンギフェリンおよびサラシア属植物抽出物は、異常な心肥大を誘導するＡＮＰやＢＮＰなどの生理活性タンパク質の生合成亢進を抑制することができ、合成薬剤であるテルミサルタンに代わり得るものであることが証明された。
【００６６】
（試験例５：安全性試験）
製造例１で得られたサラシア・オブロンガの根の５０％エタノール水抽出物を、１日当たり１００ｍｇ／ｋｇ体重、３００ｍｇ／ｋｇ体重または９００ｍｇ／ｋｇ体重ずつ４週間にわたり、体重１２５ｇの雄性または雌性のＳＤラットへそれぞれ５匹ずつ経口投与した。４週間後、各ラットの摂餌量、摂水量、体重、心臓などの臓器重量、総タンパクなどの血中濃度を測定し、各群の平均値を求めた。比較のために、サラシア属植物抽出物を投与しない対照群についても同様の測定を行った。
【００６７】
その結果、サラシア属植物抽出物の投与群の各値は対照群に比べて全体的にいえば有意差のある異常値は認められなかった。但し、９００ｍｇ／日でサラシア属植物抽出物を投与した群において、４週間後に血中乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の有意な減少が見られた。ＬＤＨの血中濃度は炎症などにより増加するものであり、かえって減少する理由は明らかではないが、ＬＤＨは細胞内から血中へ逸脱するものであるので、サラシア属植物抽出物は細胞膜を安定化する作用があるのかもしれない。その他、平均赤血球色素濃度の有意な上昇が認められたが、特に問題にする程度ではなかった。
【００６８】
これら結果のうち、雄性ＳＤラットの体重と臓器重量の結果を表３に、雌性ＳＤラットの体重と臓器重量の結果を表４に示す。
【００６９】
【表３】
【００７０】
【表４】
【００７１】
以上の通り、本発明に係るサラシア属植物抽出物は、高投与量で継続的に投与してもほとんど問題がなかったことから、非常に安全な薬剤であることが証明された。
【００７２】
（製造例２）
本製造例では、抽出溶媒、抽出温度、およびサラシア属植物と抽出溶媒の混合比率（質量比）を様々に変化させて得られた種々のサラシア属植物からの抽出物について、前述した製造例１と同様にして抽出物（エキス）の収量（ｍｇ）、並びにキサントン類およびマンギフェリンの含有量（ｍｇ）を測定すると共に、後に詳しく説明するように、α−グルコシダーゼ阻害活性をＩＣ５０値によって評価した。
【００７３】
製造例２における抽出方法の詳細は、以下のとおりである。
【００７４】
ここでは、市販のサラシア・オブロンガ粉末（ロットＳ．Ｏ．０６０９１９Ｙ ８０メッシュ）を用いて、以下のようにして抽出溶媒および抽出温度を変えて実験を行なった。
【００７５】
（Ａ）室温での抽出実験
サラシア・オブロンガ粉末１０ｇに対し、５倍量、１０倍量、または２０倍量の５０％エタノール水を加え、室温（約２０℃）で１日静置する抽出操作を行ない、抽出液を得た。別途、上記と同様の抽出操作を行い、別の抽出液を得た。これらの抽出液を合わせて、減圧下、４５〜５０℃で溶媒を留去した後、凍結乾燥してサラシア・オブロンガ乾燥エキスを得た。
【００７６】
上記の抽出法では、抽出溶媒として５０％エタノールを用いて抽出を行なったが、５０％エタノールの代わりに、水、３０％エタノール、８０％エタノール、９５％エタノールを用い、上記と同様にして種々のサラシア・オブロンガ乾燥エキスを得た。
【００７７】
（Ｂ）５０℃での抽出法
サラシア・オブロンガ粉末１０ｇに対し、５倍量、１０倍量、または２０倍量の５０％エタノールを加え、５０℃で２時間還流しながら加熱抽出を行なった。別途、上記と同様の加熱抽出を行い、別の抽出液を得た。これらの抽出液を合わせた後は、前述した（Ａ）の抽出法と同様にしてサラシア・オブロンガ乾燥エキスを得た。
【００７８】
上記の抽出法では、抽出溶媒として５０％エタノールを用いて抽出を行なったが、５０％エタノールの代わりに、水、３０％エタノール、８０％エタノール、９５％エタノールを用い、上記と同様にして種々のサラシア・オブロンガ乾燥エキスを得た。
【００７９】
（Ｃ）７５℃での抽出法
前記（Ｂ）の抽出法において、７５℃で２時間還流しながら加熱抽出を行なったこと以外は、前記（Ｂ）と同様に抽出を行い、種々のサラシア・オブロンガ乾燥エキスを得た。
【００８０】
（Ｄ）８０℃での抽出法
前記（Ｂ）の抽出法において、８０℃で２時間還流しながら加熱抽出を行なったこと以外は、前記（Ｂ）と同様に抽出を行い、種々のサラシア・オブロンガ乾燥エキスを得た。
【００８１】
（Ｅ）１００℃での抽出法
前記（Ｂ）の抽出法において、１００℃で２時間還流しながら加熱抽出を行なったこと以外は、前記（Ｂ）と同様に抽出を行い、種々のサラシア・オブロンガ乾燥エキスを得た。
【００８２】
上記（Ａ）〜（Ｅ）の抽出法によって得られた各抽出物について、製造例１と同様にして、抽出物の収量（エキス収量）、並びにキサントン類およびマンギフェリンの含有量を測定した。本製造例では、エキス収量については１００ｍｇ以上（すなわち、原料のサラシア・オブロンガ粉末１０ｇに対するエキス収率が１０％以上）を「合格」、マンギフェリン含有量については２５ｍｇ以上を「合格」、キサントン類の含有量については１００ｍｇ以上を「合格」とした。
【００８３】
更に、参考のため、上記の各抽出物について、以下のようにして、α−グルコシダーゼ阻害活性をＩＣ５０値によって評価した。
【００８４】
（３）α−グルコシダーゼ阻害活性の測定条件（ＩＣ５０値による評価方法）
まず、上記のようにして得られたサラシア・オブロンガ乾燥エキスに対し、表５〜９に示すように種々の抽出溶媒を所定の混合比率で混合した試料を用意した。
【００８５】
一方、ショ糖３７ｍＭおよび４％ＤＭＳＯを０．２ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に加えて確実に溶解させた溶液を調製した。この溶液１０００ｍＬに上記の試料を２０ｍｇ加え、測定用試料を得た。
【００８６】
一方、α−グリコシダーゼ（ＯＲＩＥＮＴＡＬ ＹＥＡＳＴ ＣＯ.，ＬＴＤ製）１ｍｇを０．２ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）１０ｍｇに溶解し、酵素液を得た。
【００８７】
上記の測定用試料および酵素液をそれぞれ、０．７ｍＬずつ採取し、充分混和して３７℃で３０分間インキュベートした後、水０．８ｍＬを加え、１００℃で２分間加熱して酵素反応を停止させた。
【００８８】
このようにして得られた反応液を冷却し、生成したグルコースの量をグルコース測定キット（グルコースＣＩＩテストワコー、和光純薬工業）を用いて測定し、ＩＣ５０値を算出した。本製造例では、ＩＣ５０値が４８．１５μｇ／ｍＬ以下のものを「合格」とした。
【００８９】
上記抽出方法（Ａ）〜（Ｅ）の結果を、それぞれ、表５〜表９に示す。これらの表には、各評価項目が合格のものに下線を付している。
【００９０】
更に、これらの表に「総合評価」の欄を設け、下記基準に従い、抽出効率および薬効の両方に優れているものに「◎」または「○」を付し、抽出効率および薬効のいずれかに劣るものに「×」を付した。すなわち、本製造例では、抽出効率を「エキス収量」で評価し、サラシア属植物由来の薬効を「マンギフェリン量」、「キサントン類量」、及び「ＩＣ５０値」の３つのパラメータで評価しているが、心肥大抑制作用を最も有効に評価し得るパラメータ（有効成分）は「マンギフェリン量」またはその上位概念である「キサントン類量」であるから、少なくとも、「エキス収量」、および「マンギフェリン量」または「キサントン類量」が上記の合格基準を満足するものを「総合評価：○」とした。具体的には、下記基準に従い、各実験例の抽出効率および薬効を総合評価した。
【００９１】
総合評価「◎」：エキス収量が合格で、且つ
マンギフェリン量、キサントン類量、ＩＣ５０値の全てが合格
総合評価「○」：エキス収量が合格で、且つ、
マンギフェリン量またはキサントン類量のいずれかが合格
（ＩＣ５０値は、合格・不合格のどちらでも可）
総合評価「×」：マンギフェリン量、キサントン類量のいずれかは合格だが
エキス収量は不合格、若しくは
エキス収量は合格だが、
マンギフェリン量、キサントン類量のいずれかは不合格
（ＩＣ５０値は合格・不合格のどちらでも可）、若しくは
マンギフェリン量、キサントン類量、エキス収量のすべてが不合格
【００９２】
【表５】
【００９３】
【表６】
【００９４】
【表７】
【００９５】
【表８】
【００９６】
【表９】
【００９７】
これらの表より、以下のように考察することができる。
このうち、表８のＮｏ．４６〜４８（抽出温度８０℃）および表９のＮｏ．６１〜６３（抽出温度１００℃）は、いずれも、従来の代表例であり、水を用いた８０℃以上の高温加熱抽出法の例である。
【００９８】
まず、抽出溶媒について検討すると、水よりも、水とエタノールの混合溶媒を用いた方が、抽出率も薬効も高くなった。
【００９９】
詳細には、水を用いた場合には、抽出温度にかかわらず、エキス収量がすべて低く、且つ、マンギフェリン量、キサントン類量、ＩＣ５０値で評価される薬効も、すべて、本製造例の合格基準を大幅に下回っており（表５のＮｏ．１〜３、表６のＮｏ．１６〜１８、表７のＮｏ．３１〜３３、表８のＮｏ．４６〜４８、表９のＮｏ．６１〜６３を参照）、抽出温度を１００℃に高めても、マンギフェリン量は最高で１４．１６ｍｇ、キサントン類量は最高で４１．３９ｍｇ（いずれも、表９のＮｏ．６３を参照）であり、合格基準（マンギフェリン量：２５ｍｇ以上、キサントン類量：１００ｍｇ以上）を大幅に下回った。
【０１００】
これに対し、抽出溶媒として、水とエタノールの混合溶媒を用いると、抽出温度にかかわらず、エキス収量および薬効は上昇した。特に、エタノールの含有率が５０％以上のエタノール水を用いれば、抽出物に対する抽出溶媒の混合比率にかかわらず、おおむね、これらの値は上昇し、とりわけ、５０％エタノール水を用い、８０℃で抽出を行なった表８のＮｏ．５４；５０％エタノール水を用い、１００℃で抽出を行なった表９のＮｏ．６８、６９；８０％エタノール水を用い、１００℃で抽出を行なった表９のＮｏ．７２は、総合評価が○であり、５０％エタノール水を用い、室温で抽出を行なった表５のＮｏ．９は総合評価が◎であった。
【０１０１】
加熱によるコストの上昇を考慮すれば、加熱抽出よりも、室温で抽出する冷浸法を用いた方が、コストを低く抑えられる。従って、抽出効率や薬効のみならず経済性をも考慮すれば、冷浸法を用いることが最も推奨される。
【０１０２】
特に、５０％以上のエタノール水を用いて室温で抽出すれば、表５のＮｏ．７〜９に示すように、サラシア属乾燥エキスに対する抽出溶媒の混合比率にかかわらず、マンギフェリン量は２０ｍｇ以上、キサントン類量は７０ｍｇ以上と総じて高くなり、エキス収量も７６０ｍｇ以上と高くなった。とりわけ、５０％エタノール水を用いた表５のＮｏ．９は、これらの評価項目のいずれもが本製造例の合格基準を満足し、極めて良好な特性を示した。
【０１０３】
なお、薬効に関し、マンギフェリン量と、キサントン類量またはＩＣ５０値との相関関係を見ると、マンギフェリン量とキサントン類量は、総じて、高い相関関係が認められたが、マンギフェリン量とＩＣ５０値の相関関係は低く、マンギフェリン量が多くてもＩＣ５０値が高い例もあり、バラツキが見られた。
【０１０４】
例えば、表５のＮｏ．１０、１３、１４；表６のＮｏ．２５、２６、２８、２９；表７のＮｏ．３７、４２；表８のＮｏ．５２、５８、５９；表９のＮｏ．６４〜６７、７３は、いずれも、マンギフェリン量は低いて悪いのにＩＣ５０値が低くて良好な例であり、一方、表５のＮｏ．１２；表９のＮｏ．７２は、マンギフェリン量は高くて良好なのにＩＣ５０値が高くて悪い例であり、良好な相関関係が認められなかった。
【０１０５】
従って、心疾患抑制剤の指標としては、サラシア属植物由来のマンギフェリンまたはキサントン類を用いることが有効であることが分かった。
【図面の簡単な説明】
【０１０６】
【図１】正常Ｚｕｃｋｅｒラット（ＺＬ）と肥満Ｚｕｃｋｅｒラット（ＺＤＦ）の対照群（Ｃｏｎ）とサラシア属植物抽出物投与群（ＳＯＥ）の、（ａ）心臓重量（ＨＷ）、（ｂ）心臓重量／頚骨長さ（ＨＷ／ＴＬ）、（ｃ）左心室重量（ＬＶＷ）、（ｄ）左心室重量／頚骨長さ（ＬＶＷ／ＴＬ）である。各図中、「＊」はＳｔｕｄｅｎｔ−Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓテストによりｐ＜５％の危険率で有意差がある場合を示す。
【図２】正常Ｚｕｃｋｅｒラット（ＺＬ）と肥満Ｚｕｃｋｅｒラット（ＺＤＦ）で、対照群（Ｃｏｎ）とサラシア属植物抽出物投与群（ＳＯＥ）における心細胞の大きさを比較するための写真と統計処理結果を示す図である。図中、（ａ）はＺＬの対照群の心細胞の写真、（ｂ）はＺＬのサラシア属植物抽出物投与群の心細胞の写真、（ｃ）はＺＤＦの対照群の心細胞の写真、（ｄ）はＺＤＦのサラシア属植物抽出物投与群の心細胞の写真、（ｅ）はこれら心細胞の大きさの統計処理結果を示す写真である。「＊」はＳｔｕｄｅｎｔ−Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓテストによりｐ＜５％の危険率で有意差がある場合を示す。
【図３】正常Ｚｕｃｋｅｒラット（ＺＬ）と肥満Ｚｕｃｋｅｒラット（ＺＤＦ）で、対照群（Ｃｏｎ）とサラシア属植物抽出物投与群（ＳＯＥ）におけるＡＮＰをコードするｍＲＮＡの発現量（Ａ）とＢＮＰのｍＲＮＡの発現量（Ｂ）を示す図である。図中、「＊」はＳｔｕｄｅｎｔ−Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓテストによりｐ＜５％の危険率で有意差がある場合を示す。
【図４】正常Ｚｕｃｋｅｒラット（ＺＬ）と肥満Ｚｕｃｋｅｒラット（ＺＤＦ）で、対照群（Ｃｏｎ）とサラシア属植物抽出物投与群（ＳＯＥ）におけるＡＴ1をコードするｍＲＮＡの発現量（ａ）とＡＴ1自体の発現量（ｂ）を示す図である。図中、「＊」はＳｔｕｄｅｎｔ−Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓテストによりｐ＜５％の危険率で有意差がある場合を示す。
【図５】アンジオテンシンＩＩで刺激した心臓繊維芽細胞において、サラシア属植物抽出物を投与した場合（ＳＯＥ）、マンギフェリンを投与した場合（ＭＡ）、およびテルミサルタンを投与した場合（Ｔｅｌ）におけるＡＮＰのｍＲＮＡの発現量（図５Ａ）とチミジンの取込量（図５Ｂ）を示す図である。比較のために、アンジオテンシンＩＩの代わりに生理食塩水を添加した場合（Ｓａｌｉｎｅ）の結果も合わせて示す。図中、「＊」はＳｔｕｄｅｎｔ−Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓテストによりｐ＜５％の危険率で有意差がある場合を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
マンギフェリンを含有することを特徴とする心疾患抑制剤。
【請求項２】
サラシア属植物抽出物を含有する請求項１に記載の心疾患抑制剤。
【請求項３】
サラシア属植物のアルコール水抽出物を含有する請求項２に記載の心疾患抑制剤。
【請求項４】
前記アルコール水に対するアルコールの比率は４０容量％以上である請求項３に記載の心疾患抑制剤。
【請求項５】
心肥大を抑制するものである請求項１〜４の何れか１項に記載の心疾患抑制剤。
【請求項６】
請求項１〜５の何れか１項に記載の心疾患抑制剤を製造する方法であって、
サラシア属植物に含まれるマンギフェリンを、アルコール水を用いて１５〜３０℃の温度で抽出することを特徴とする心疾患抑制剤の製造方法。
【請求項７】
前記アルコール水に対するアルコールの比率は４０容量％以上である請求項６に記載の製造方法。
【請求項８】
５０容量％エタノール水を用いる請求項６または７に記載の製造方法。
【請求項１】
マンギフェリンを含有することを特徴とする心疾患抑制剤。
【請求項２】
サラシア属植物抽出物を含有する請求項１に記載の心疾患抑制剤。
【請求項３】
サラシア属植物のアルコール水抽出物を含有する請求項２に記載の心疾患抑制剤。
【請求項４】
前記アルコール水に対するアルコールの比率は４０容量％以上である請求項３に記載の心疾患抑制剤。
【請求項５】
心肥大を抑制するものである請求項１〜４の何れか１項に記載の心疾患抑制剤。
【請求項６】
請求項１〜５の何れか１項に記載の心疾患抑制剤を製造する方法であって、
サラシア属植物に含まれるマンギフェリンを、アルコール水を用いて１５〜３０℃の温度で抽出することを特徴とする心疾患抑制剤の製造方法。
【請求項７】
前記アルコール水に対するアルコールの比率は４０容量％以上である請求項６に記載の製造方法。
【請求項８】
５０容量％エタノール水を用いる請求項６または７に記載の製造方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２００９−１５４０（Ｐ２００９−１５４０Ａ）
【公開日】平成２１年１月８日（２００９．１．８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−２１４０６１（Ｐ２００７−２１４０６１）
【出願日】平成１９年８月２０日（２００７．８．２０）
【出願人】（５９８０９２２７０）有限会社 坂本薬草園 (11)
【出願人】（５９９０００２１２）香栄興業株式会社 (33)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年１月８日（２００９．１．８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年８月２０日（２００７．８．２０）
【出願人】（５９８０９２２７０）有限会社 坂本薬草園 (11)
【出願人】（５９９０００２１２）香栄興業株式会社 (33)
【Ｆターム（参考）】
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