急性移植拒絶反応のためのバイオマーカー
移植対象においてＡＲの完全な臨床的顕在化が検出される前に、末梢血または移植生検組織において異なった量で発現する遺伝子に基づく、移植対象における急性拒絶（ＡＲ）の早期非侵襲性診断、ＡＲを発症する危険性のある移植対象におけるＡＲのモニタリング、移植対象におけるＡＲの予防、阻止、軽減もしくは処置、またはＡＲの予防、阻止、軽減もしくは処置の使用のための薬剤の同定のための方法を開示する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、移植者の移植組織または臓器状態をモニタリングする方法に関する。特に、本発明は、急性同種移植片拒絶反応の早期非侵襲性診断測定のための遺伝子発現分析の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
腎臓移植１年後の移植臓器の生着率は、シクロスポリンＡ（Ｎｅｏｒａｌ（登録商標））のような免疫抑制剤により約９０％であるが、急性および慢性拒絶反応の両方とも、移植片喪失の原因としてまだ重要な過程である。今日、生検しか急性拒絶反応発現を確認できないため、非侵襲方法による急性腎臓同種移植片拒絶反応の早期検出は、いまだ満たされていない医学的要求である。急性拒絶（ＡＲ）に関する現在の標準診断アッセイは、血清クレアチニン（ｓＣｒｅａ）の測定であるが、ｓＣｒｅａの上昇は腎臓移植片の約７０％が既に損傷を受けているときの遅い事象であり、そしてそれはあまり特異的ではなく、診断生検による最終確認を必要とする。
【０００３】
予測できる、感度の良い、信頼できる、および容易に測定できる非侵襲性急性拒絶バイオマーカーの必要性がある。このような援助は、例えば生検を減らし、それにより移植患者の生活の質を向上させるために、ＡＲ発現の早期検出による薬剤処置調節の最適化のために、そして最終的にはＡＲ事象の数および重症度と密接な相関関係を示す長期間移植臓器生着率の改善により、価値がある。
【発明の開示】
【０００４】
本発明は、ＡＲを発症している患者における、末梢血ならびに移植生検材料、例えば腎臓生検材料で発現量の異なる遺伝子の同定に関する。該遺伝子のサブセットの得られる遺伝子発現パターンは、ＡＲ発症の高い統計学的に有意な予測性を可能にする。例えば、生命維持的他家移植腎臓モデル（ＢＮからＬｅｗｉｓ）の、ＡＲ発症前の３、４および５日目および発症時の７日目のラットの血液において、ｍＲＮＡ転写物として同定された遺伝子を表１に示す。本明細書に記載の２８個の遺伝子のＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑまたはＧｅｎＢａｎｋ受入番号を表１に列挙し、そしてＮＣＢＩから検索できる。対応するＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋ／ＲｅｆＳｅｑ受入番号の下に示された配列は、引用により本明細書の一部とする。
【０００５】
加えて、タンパク質マーカー、例えば表４に記載のマーカーは、腎臓移植片がＡＲを有するおよび有さないラットの血清において同定されている。
【０００６】
本発明により同定される遺伝子は、移植対象におけるＡＲの早期診断のための予測バイオマーカーとして有用である。これらの遺伝子の任意の少なくとも１個の選択が、ＡＲの早期診断のための代用バイオマーカーとして利用できる。特に有用な態様において、これらの遺伝子の複数を選択し、そして同時にこれらのｍＲＮＡ発現を患者血液においてモニタリングし、様々な局面において使用するための発現プロフィールを提供できる。
【０００７】
よって、本発明は、急性移植拒絶反応に関する早期バイオマーカー、例えば明白な臨床的または組織学的顕在化前のＡＲに関するバイオマーカーとして、例えば表１に記載のとおりの遺伝子の使用を提供する。
【０００８】
さらなる態様において、遺伝子発現産物（タンパク質）のレベルは、限定はしないが、血漿、血清、リンパ液、尿、便および胆汁を含む様々な体液または生検組織においてモニタリングできる。この発現産物レベルは、ＡＲの早期診断のための代用マーカーとして使用でき、治療応答の指標を提供できる。例としては、例えば前駆Ｂ細胞コロニー促進因子（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ 受入番号ＮＭ＿００５７４６）のコードタンパク質または表４のタンパク質の少なくとも１個である。
【０００９】
ｍＲＮＡ発現レベルの検出方法は当分野で既知であり、限定はしないが、逆転写ＰＣＲ、リアルタイム定量ＰＣＲ、ノーザンブロットおよび他のハイブリダイゼーション法を含む。
【００１０】
よって、本発明は、表１に記載の遺伝子の発現産物（例えばコードタンパク質）および／または急性移植拒絶反応に関する早期バイオマーカー、例えば明白な臨床的または組織学的顕在化前のＡＲに関するバイオマーカーとしての、表４に記載のとおりのタンパク質の使用を提供する。
【００１１】
複数の記載の遺伝子から得られるｍＲＮＡ転写レベルの特に有用な検出方法は、オリゴヌクレオチドの秩序配列への標識ｍＲＮＡのハイブリダイゼーションを含む。このような方法は、複数のこれらの遺伝子の転写レベルを、遺伝子発現プロフィールまたはパターンを産生するために同時に決定できる。ＡＲを発症するリスクのある移植対象から得られる血液または生検試料由来の遺伝子発現プロフィールは、ＡＲを発症するリスクのない移植対象から得られるサンプル由来の遺伝子発現プロフィールと比較できる。
【００１２】
さらなる態様において、これらの遺伝子もしくはコードタンパク質の１個または複数の発現プロフィール測定が、ＡＲ抑制、例えば予防または処置のための薬剤の効力試験に関する、価値のある分子ツールを提供できる。移植患者が治療に暴露されている間、基準プロフィールが発現プロフィールから変化する。よって、本発明はまた、対象がＡＲ治療に応答する可能性を決定するための移植対象のスクリーニング方法、ＡＲ徴候を有する移植対象の処置に有用である薬剤の同定方法およびＡＲのための特定の薬剤処置の効力のモニタリング方法を提供する。
【００１３】
１つの態様において、本発明は、
ｉ）基準値として参照を使用して、異なる時間点で遺伝子に対応するｍＲＮＡ発現レベルを測定し；および／または
ｉｉ）基準値として参照を使用して、異なる時間点で遺伝子に対応するタンパク質発現レベルを測定し；そして
ｉｉｉ）変化倍率(fold change)および／または統計試験でフィルターをかけ、該発現レベルデータを分析すること
により、移植対象の末梢血でＡＲの発症前に異なった量で発現する少なくとも１個の遺伝子および／または１個のタンパク質の同定方法を提供する。
【００１４】
“異なった量で発現”なる用語は、所定の同種移植片遺伝子の発現レベルを示し、対応する基準発現レベルの量より実質的に多いまたは少ない量として定義する。
【００１５】
（ｉｉ）または（ｉｉｉ）における参照とは、ＡＲを発症しないことが既知の、例えば１つまたはそれ以上の対象であり得る。
【００１６】
さらなる局面において、本発明は、所定の体液または同種移植片組織サンプルにおける異なった量で発現される遺伝子の検出による、移植対象の、例えばインビトロでの早期ＡＲ診断方法を提供する。例えば、該方法は、
ａ）体液、例えば末梢血の少なくとも１個の遺伝子（臨床前ＡＲモデルから生じた遺伝子、例えば表１に特定されている遺伝子）に対応するｍＲＮＡ発現またはコードタンパク質レベルを基準値としてとり；
ｂ）定期的、例えば４週間ごとに、移植患者の体液、例えば末梢血の少なくとも１個の遺伝子に対応するｍＲＮＡ発現またはコードタンパク質レベルの検出し；
ｃ）１回目の値と２回目の値を比較することを含み得て、ここで２回目の値よりも低いまたは高い１回目の値が、移植対象がＡＲを発症することを予測する。
【００１７】
ＡＲの発症前またはＡＲの早期診断は、ＡＲの何らかの明白な臨床的もしくは組織学的顕在化前に、移植対象で検出することを意味する。
【００１８】
さらなる局面において、本発明は、ＡＲを発症するリスクのある移植対象において、ＡＲ阻害剤、例えば小分子、抗体もしくは他の治療剤または候補薬剤での、ＡＲのモニタリング、例えば予防、阻止、軽減または処置方法を提供する。本発明のマーカーの発現レベルに対する、薬剤、例えば薬剤化合物の影響をモニタリングすることは、基本的薬剤スクリーニングにおいて適用できるだけでなく、臨床試験でもまた適用できる。例えば、マーカー発現に影響する薬剤の有効性を、ＡＲ阻止のための処置を受けている移植対象の臨床試験においてモニタリングできる。
【００１９】
このような方法は、
ａ）薬剤の投与前に、移植対象から投与前サンプルを得、
ｂ）投与前サンプルにおける、少なくとも１個の遺伝子に対応するｍＲＮＡ発現またはコードタンパク質レベルを検出し、
ｃ）移植患者から１個またはそれ以上の投与後サンプルを得、
ｄ）投与後サンプル（複数を含む）における、少なくとも１個の遺伝子に対応するｍＲＮＡ発現またはコードタンパク質レベルを検出し、
ｅ）投与前サンプルにおける、少なくとも１個の遺伝子に対応するｍＲＮＡ発現またはコードタンパク質レベルと、投与後サンプル（複数を含む）における、少なくとも１個の遺伝子に対応するｍＲＮＡ発現またはコードタンパク質レベルを比較し、そして
ｆ）それにより薬剤を調整することを含む。
【００２０】
例えば、薬剤投与量の増加または減少が、少なくとも１個の遺伝子の発現レベルを検出されるよりも高いまたは低いレベルに変化するために望ましいことがある。上記方法において、薬剤はまた、単独でまたは組合せ治療において他の薬剤、好ましくは免疫抑制剤および／またはＡＲにおいて有効な薬剤と組み合わせて投与できる。
【００２１】
よって、ヒト体液、例えば末梢血または生検材料、例えばヒト腎臓プロトコール生検材料由来の遺伝子発現プロファイリングデータの取り込みが、ＡＲの処置およびそれに向かう進行の予防の両方を目的とする、臨床試験中の、患者の選択工程の向上に役立つであろう。
【００２２】
さらなる局面において、本発明はさらに、上記の少なくとも１個の遺伝子またはコードタンパク質のｍＲＮＡ発現レベルをモニタリングすることを含む、ＡＲ予防、阻止、軽減または処置に使用するための薬剤の同定方法を提供する。
【００２３】
さらなる局面において、本発明は、このような処置を必要とする移植対象に、少なくとも１種のＡＲ症状を改善することができる、例えば表１および／または４に記載のとおりの、１個またはそれ以上の遺伝子または遺伝子発現産物の、合成、発現または活性を調節する化合物を対象に投与することを含む、ＡＲ予防、阻止、軽減または処置法を提供する。
【００２４】
さらなる局面において、本発明は、移植対象におけるＡＲの例えば予防または処置用薬剤として使用するための、１個またはそれ以上の上記定義の、例えば表１および／または４に記載のとおりの遺伝子または遺伝子発現産物の、合成、発現または活性を調節する化合物、例えば小分子、抗体もしくは他の治療剤または候補薬剤を提供する。
【００２５】
さらなる局面において、本発明は、移植対象におけるＡＲの予防または処置のための、１個またはそれ以上の上記で、例えば表１および／または４において定義の遺伝子または遺伝子発現産物の、合成、発現または活性を調節する化合物、例えば小分子、抗体もしくは他の治療剤または候補薬剤の使用を提供する。
【００２６】
さらなる局面において、本発明は、移植対象におけるＡＲの予防または処置用医薬の製造のための、１個またはそれ以上の上記で、例えば表１および／または４において定義の遺伝子または遺伝子発現産物の、合成、発現または活性を調節する化合物、例えば小分子、抗体もしくは他の治療剤または候補薬剤の使用を提供する。
【００２７】
移植対象とは、ドナーから、好ましくは同種から組織または臓器、例えば腎臓、心臓、肺、心臓および肺の組合せ、肝臓、膵臓、腸（例えば、大腸、小腸、十二指腸）、神経組織、膵島、四肢を受け取った対象を意味する。
【００２８】
好ましくは１個またはそれ以上の遺伝子、例えば１セットの遺伝子を、本発明の方法で使用する。
【００２９】
既に言及したとおり、表１に記載の遺伝子のおよび／または、例えば表４に記載のとおりの遺伝子発現産物の少なくとも１個の任意の選択が使用できる。
【００３０】
遺伝子発現プロフィールは、例えばＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘマイクロアレイ技術を使用して生成できる。マイクロアレイは当分野で既知であり、そして遺伝子産物（例えばｍＲＮＡ、ポリペプチド、それらのフラグメントなど）と順に対応するプローブが、既知の位置に特異的にハイブリダイズまたは結合できる表面からなる。スキャナーにより検出されるハイブリダイゼーション強度データは、ＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘマイクロアレイＳｕｉｔｅ（ＭＡＳ５）ソフトウェアにより自動的に得られ、処理される。標的強度１５０を使用して、生データを発現レベルに対して標準化する。
【００３１】
少数の異なる遺伝子の遺伝子発現プロフィールを評価する別のかつ好ましい方法は、例えば標準のＴａｑＭａｎ（登録商標）遺伝子発現アッセイまたはＴａｑＭａｎ（登録商標）低密度アレイ−マイクロ流体カード（Applied Biosystems）のいずれかによるものである。ここで、定量データを小反応量におけるリアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより入手する。
【００３２】
細胞の転写状態は、当分野で既知の他の遺伝子発現技術により評価する。いくつかのこのような技術、例えば二重制限酵素消化とフェイジングプライマー（phasing primer）との組合せ方法（例えばEP-A1-0 534858）、または定義されたｍＲＮＡ末端に最も近い部分の制限フラグメントを選択する方法（例えばPrashar et al, Proc. Nat. Acad. Sci., 93, 659-663, 1996）は、電気泳動分析のために、限定された複雑さの制限フラグメントのプールを産生する。他の方法は、例えば各ｃＤＮＡを同定するために、各多数のｃＤＮＡにおいて十分な塩基（例えば２０−５０塩基）をシーケンシングすることにより、または定義されたｍＲＮＡ末端（例えばVelculescu, Science, 270, 484-487,1995）経路パターンに対する既知の位置で生じる、小タグ（例えば９−１０塩基）をシーケンシングすることにより、統計学的にｃＤＮＡプールをサンプリングする。
【００３３】
本発明の他の態様において、マーカーに対応するタンパク質を検出する。本発明のタンパク質を検出するための好ましい薬剤は、例えばタンパク質に結合能力のある抗体、好ましくは検出可能標識を有する抗体である。抗体はポリクローナル、または好ましくはモノクローナルであり得る。完全な抗体またはそれらのフラグメント（例えばＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２）を使用できる。“標識”なる用語は、抗体に検出可能な物質をカップリングすることによる抗体の直接標識、ならびに直接標識された別の試薬との反応性により抗体を間接標識することを包含することを意図する。様々な形式が、サンプルが、所定の抗体に結合するタンパク質を含むかどうかを決定するために使用できる。このような形式の例は、例えば酵素イムノアッセイ、ラジオイムノアッセイ、ウエスタンブロット分析およびＥＬＩＳＡを含む。
【００３４】
好ましい態様において、上記の方法の計算段階は、生物系モデルの形成および試験のための強力かつ便利な設備を提供するために、コンピューターシステムまたは１個またはそれ以上のネットワークコンピューターシステムで実行される。コンピューターシステムは、内部コンポーネントを含み、外部コンポーネントにリンクしている単一のハードウェアプラットフォームであり得る。コンピューターシステムの内部コンポーネントは、メインメモリーと相互接続した処理エレメントを含む。外部コンポーネントは、大量データ記憶装置を含む。このデータ記憶装置は、１個またはそれ以上のハードディスクであり得る。他の外部コンポーネントは、位置決め装置または他の図形入力装置と一体となった、モニターおよびキーボードであり得るユーザーインターフェース装置を含む。一般的に、コンピューターシステムはまた、他のローカルコンピューターシステム、遠隔コンピューターシステムまたは広域コミュニケーションネットワーク、例えばインターネットにリンクされている。このネットワークリンクは、コンピューターシステムが、データおよび処理作業の他のコンピューターシステムとの共有を可能にする。
【００３５】
このシステムの操作中のメモリーにロードされるのは、当分野で一般的および本発明に専用である両方のいくつかのソフトウェアコンポーネントである。これらのソフトウェアコンポーネントは、集合的に本発明の方法により機能するためのコンピューターシステムをもたらす。これらのソフトウェアコンポーネントは、一般的に大容量または取り外し可能な媒体、例えばフロッピーディスクまたはＣＤ−ＲＯＭに保存される。ソフトウェアコンポーネントは、コンピューターシステムおよびそのネットワーク相互接続の処理を担うオペレーティングシステムを示す。好ましくは、本発明の方法は、方程式の記号入力および、使用されるアルゴリズムを含む処理の高レベルの特定化ができる、数学パッケージソフトウェア中にプログラミングされ、そしてそれにより、ユーザーが個々の方程式またはアルゴリズムを進行的にプログラミングする必要をなくす。
【００３６】
好ましい態様において、分析ソフトウェアコンポーネントは現に、互いに相互作用する別々のソフトウェアコンポーネントを含む。分析ソフトウェアは、システムの操作のために必要なすべてのデータを含むデータベースを示す。このようなデータは、限定はしないが、一般に前の実験の結果、ゲノムデータ、実験手順ならびにコスト、および当業者には明白である他の情報を含み得る。分析ソフトウェアは、本発明の分析方法を実行する１種またはそれ以上のプログラムを含むデータ整理および計算コンポーネントを含む。分析ソフトウェアはまた、ネットワーク試験モデルおよび、所望により、実験データのコントロールおよびインプットを備えたコンピューターシステムをユーザーに提供する、ユーザーインターフェースを含む。ユーザーインターフェースは、システムに仮説を特定させるために、ドラッグ・アンド・ドロップ・インターフェースを含み得る。ユーザーインターフェースはまた、大容量記憶コンポーネントから、取り外し可能な媒体から、またはネットワークを介して本システムと接続する異なるコンピューターシステムから実験データをローディングする手段を含む。
【００３７】
本発明はまた、本発明で述べる少なくとも１個のマーカー、例えばｍＲＮＡを含む、データベース作成法を提供する。例えば、ポリヌクレオチド配列は、データ処理システムがＡＲの早期診断を同定する遺伝子を標準化された表示するように、デジタル記憶媒体に保存する。データ処理システムは、異なる時間、例えば移植日および移植後に得られる２つの体液または組織サンプル間の遺伝子発現分析に有用である。単離ポリヌクレオチドをシーケンシングする。サンプルの配列は、相同性検索技術を使用して、データベースに存在する配列（複数も含む）と比較し得る。本発明の分析方法を実行するための、代わりのコンピューターシステムおよび方法は、当業者に明らかであり、添付の特許請求の範囲内に包含されることを意図する。
【実施例】
【００３８】
診断マーカーの同定のための臨床前ＡＲモデル
生命維持的ＢＮからＬｅｗｉｓ腎臓移植ラットモデル（７日目にＡＲ発症）におけるバイオマーカー試験に関して、１０匹の同種異系移植および１０匹の同種同系移植ラットのすべてに各々に免疫抑制レジメンなしで同時に移植し、異なる３つの時点（移植後３、４、５日）で終了する。加えて、非生命維持的同種同系移植対照を各６匹のラット、２グループで行った。約１３６０個のプローブ（血液、血清、尿、移植組織）を一斉にサンプル化する。移植組織および血液化学変化の測定をプロテオーム、トランスクリプトーム、およびメタボノミクス分析を組み合わせて一緒に適用する。
【００３９】
ＲＮＡ抽出：全血をＥＤＴＡ−ＥＴチューブ（Ｓａｒｓｔｅｄｔ）に回収し、２アリコート（２ｍｌ、０．２５ｍｌ）を、各々Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋非含有、同量のＰＢＳで満たした１５ｍｌ Ｆａｌｃｏｎまたは２ｍｌ エッペンドルフチューブに各々移す。混合後、同量のＮｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｌｙｓｉｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を加え、チューブをボルテックスし、−２０℃で保存する。全ＲＮＡを製造業者の指示にしたがって６１００ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ ＰｒｅｐＳｔａｔｉｏｎ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）により、血液溶解物から抽出する。腎臓皮質同種異系移植片サンプルをＲＮＡｌａｔｅｒ（Ａｍｂｉｏｎ）に回収し、一晩＋４℃、次いで−８０℃で保存する。最後に、組織をＦａｓｔＰｒｅｐ ＦＰ１２０（Ｓａｖａｎｔ）でホモジェナイズし、全ＲＮＡをＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して単離する。ＲＮＡの質をＡｇｉｌｅｎｔの２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ ｌａｂｃｈｉｐｓによりコントロールし、量を分光光度法で測定する。
【００４０】
遺伝子チップ分析：全体で、３種の移植（同種異系移植（ＢＮからＬｅｗｉｓ）、同種同系移植（ＬｅｗｉｓからＬｅｗｉｓ）ならびに非生命維持的同種同系移植（ＬｅｗｉｓからＬｅｗｉｓ））および３つの時点（生命維持的同種異系移植および同種同系移植操作後３、４、５日、非生命維持的同種同系移植後３、４日）を含む、末梢血由来の６０サンプルが、遺伝子チップ分析のための質および量（５−１０μｇ 全ＲＮＡ）基準に適合し、これは６個の血液ＲＮＡサンプルが最小グループサイズである合計８グループをもたらす。
【００４１】
ＲＮＡサンプルを、製造業者のプロトコールにしたがってＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標） Ｒａｔ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ２３０Ａで、処理し、標識化し、ハイブリダイズする。発現値をＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｓｕｉｔｅ（ＭＡＳ）バージョン５の統計的アルゴリズムにより計算する。ＭＡＳ５標準化データをＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ（登録商標）６．２（Ｓｉｌｉｃｏｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）により分析する。値を標準化し（チップあたり：定常値−１５０）、すべてのプローブセットを、生の値（８０以上）およびフラッグ（存在および境界）でふるいにかけ、１５９２３個のプローブセットの約半分を取り除く。すべてのサンプルを、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｑｕａｌｉｔｙ ｆｅａｔｕｒｅｓおよび条件クラスタリングを使用して質特性に関して確認する。
【００４２】
データを、対応するグループ（ｄ３同種移植片対ｄ３同種同系移植など）間の統計学的検定と組み合わせた対応するグループ（ｄ３同種移植片対ｄ３同種同系移植など−カットオフ：２倍）間の変化倍率の統計学的ふるいを使用して分析する。試験として、０．００５または０．００５のＰ値カットオフを使用するノンパラメトリックＷｉｌｃｏｘｏｎ−Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定および多試験補正（Benjamini and Hochberg False Discovery Rate）を使用する。有意に異なった量で発現する遺伝子の計算した変化倍率を、表２に記載する。
【００４３】
ＴａｑＭａｎ確認：選択し同定された候補ＡＲマーカー遺伝子発現を、製造業者の標準プロトコールにしたがって、７９００ＨＴ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）での、市販ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ＡｓｓａｙｓおよびＵｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いる定量リアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより確認する。結果を表３に記載する。
【００４４】
トランスクリプトーム分析と同時に、１０匹の個々のラットの等量の血清を、二次元ゲル電気泳動法に使用する差次的発現のためのサンプルを提供するために集める。１０μｌの集めた血清を記載のとおりの３９０μｌのサンプルバッファーで希釈する(Rabilloud T, Electrophoresis 19 (1998), 758-60)。二次元電気泳動を記載のとおりに行う(Hoving et al., Electrophoresis 21 (2000), 2617-21)。５つのゲルの各サンプルを同時に流し、蛍光染色剤Ｓｙｐｒｏ Ｒｕｂｙ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）で染色する。染色したゲルを１６ビットのピクセルの深さのＴＩＦＦファイルとして、ＦＬＡ−３０００蛍光画像装置（Ｆｕｊｉ）でデジタル化する。画像解析をＰｒｏｇｅｎｅｓｉｓ（Ｎｏｎ−Ｌｉｎｅａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ）ソフトウェアパッケージで行う。スポット強度（スポット量、エリア全体の光学密度の積分）を標準化し、統計学的にスチューデントｔ検定を使用して比較する。同種異系移植動物と対応する同種同系移植対照間の有意な差異（ｔ検定でｐ＜０．０５、および＞２倍の量の差異）であるスポットをゲルから切り出し、含有タンパク質を、４７００ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用してＭＡＬＤＩ−ＭＳおよびＭＳ／ＭＳにより同定する。タンパク質同定は、Ｍａｓｃｏｔ（Ｍａｔｒｉｘ Ｓｃｉｅｎｃｅ）ソフトウェアを使用する、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔおよび／またはＧｅｎＢａｎｋデータベースでの実験的に得られたマススペクトルの適合に基づいている。
【００４５】
【表１】
【００４６】
【表２】
【００４７】
【表３】
【００４８】
【表４】
【００４９】
【表５】
【００５０】
【表６】
【００５１】
【表７】
【００５２】
【表８】
【００５３】
【表９】
【００５４】
ＢＮからＬｅｗｉｓ腎臓移植試験由来、同種異系および同種同系移植ラットの末梢血での定量ＴａｑＭａｎ実験を、市販ＴａｑＭａｎ登録商標遺伝子発現アッセイ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で既知の遺伝子について行う。相対定量を１８Ｓ ｒＲＮＡへの標準化により適用する。一般的に、得られたすべての値は、グループあたり６個のランダムに選択した血液サンプルの分析によるＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ遺伝子チップデータとよく一致し、そして４日目の３個の同種同系移植血液サンプルのすべての平均値と比較する。
【００５５】
【表１０】
１多数のイソ型の場合、各々のイソ型の見かけのｐＩを、任意に指定して示す；２Ｐ値（５日目のサンプル）、ｔ検定による；３５日目のサンプルで決定される値、同種異系移植片サンプルにおける正の値は上方制御、負の値は下方制御を示す、ｄｅ ｎｏｖｏは、１グループだけにおいて見いだされたスポットを示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、移植者の移植組織または臓器状態をモニタリングする方法に関する。特に、本発明は、急性同種移植片拒絶反応の早期非侵襲性診断測定のための遺伝子発現分析の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
腎臓移植１年後の移植臓器の生着率は、シクロスポリンＡ（Ｎｅｏｒａｌ（登録商標））のような免疫抑制剤により約９０％であるが、急性および慢性拒絶反応の両方とも、移植片喪失の原因としてまだ重要な過程である。今日、生検しか急性拒絶反応発現を確認できないため、非侵襲方法による急性腎臓同種移植片拒絶反応の早期検出は、いまだ満たされていない医学的要求である。急性拒絶（ＡＲ）に関する現在の標準診断アッセイは、血清クレアチニン（ｓＣｒｅａ）の測定であるが、ｓＣｒｅａの上昇は腎臓移植片の約７０％が既に損傷を受けているときの遅い事象であり、そしてそれはあまり特異的ではなく、診断生検による最終確認を必要とする。
【０００３】
予測できる、感度の良い、信頼できる、および容易に測定できる非侵襲性急性拒絶バイオマーカーの必要性がある。このような援助は、例えば生検を減らし、それにより移植患者の生活の質を向上させるために、ＡＲ発現の早期検出による薬剤処置調節の最適化のために、そして最終的にはＡＲ事象の数および重症度と密接な相関関係を示す長期間移植臓器生着率の改善により、価値がある。
【発明の開示】
【０００４】
本発明は、ＡＲを発症している患者における、末梢血ならびに移植生検材料、例えば腎臓生検材料で発現量の異なる遺伝子の同定に関する。該遺伝子のサブセットの得られる遺伝子発現パターンは、ＡＲ発症の高い統計学的に有意な予測性を可能にする。例えば、生命維持的他家移植腎臓モデル（ＢＮからＬｅｗｉｓ）の、ＡＲ発症前の３、４および５日目および発症時の７日目のラットの血液において、ｍＲＮＡ転写物として同定された遺伝子を表１に示す。本明細書に記載の２８個の遺伝子のＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑまたはＧｅｎＢａｎｋ受入番号を表１に列挙し、そしてＮＣＢＩから検索できる。対応するＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋ／ＲｅｆＳｅｑ受入番号の下に示された配列は、引用により本明細書の一部とする。
【０００５】
加えて、タンパク質マーカー、例えば表４に記載のマーカーは、腎臓移植片がＡＲを有するおよび有さないラットの血清において同定されている。
【０００６】
本発明により同定される遺伝子は、移植対象におけるＡＲの早期診断のための予測バイオマーカーとして有用である。これらの遺伝子の任意の少なくとも１個の選択が、ＡＲの早期診断のための代用バイオマーカーとして利用できる。特に有用な態様において、これらの遺伝子の複数を選択し、そして同時にこれらのｍＲＮＡ発現を患者血液においてモニタリングし、様々な局面において使用するための発現プロフィールを提供できる。
【０００７】
よって、本発明は、急性移植拒絶反応に関する早期バイオマーカー、例えば明白な臨床的または組織学的顕在化前のＡＲに関するバイオマーカーとして、例えば表１に記載のとおりの遺伝子の使用を提供する。
【０００８】
さらなる態様において、遺伝子発現産物（タンパク質）のレベルは、限定はしないが、血漿、血清、リンパ液、尿、便および胆汁を含む様々な体液または生検組織においてモニタリングできる。この発現産物レベルは、ＡＲの早期診断のための代用マーカーとして使用でき、治療応答の指標を提供できる。例としては、例えば前駆Ｂ細胞コロニー促進因子（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ 受入番号ＮＭ＿００５７４６）のコードタンパク質または表４のタンパク質の少なくとも１個である。
【０００９】
ｍＲＮＡ発現レベルの検出方法は当分野で既知であり、限定はしないが、逆転写ＰＣＲ、リアルタイム定量ＰＣＲ、ノーザンブロットおよび他のハイブリダイゼーション法を含む。
【００１０】
よって、本発明は、表１に記載の遺伝子の発現産物（例えばコードタンパク質）および／または急性移植拒絶反応に関する早期バイオマーカー、例えば明白な臨床的または組織学的顕在化前のＡＲに関するバイオマーカーとしての、表４に記載のとおりのタンパク質の使用を提供する。
【００１１】
複数の記載の遺伝子から得られるｍＲＮＡ転写レベルの特に有用な検出方法は、オリゴヌクレオチドの秩序配列への標識ｍＲＮＡのハイブリダイゼーションを含む。このような方法は、複数のこれらの遺伝子の転写レベルを、遺伝子発現プロフィールまたはパターンを産生するために同時に決定できる。ＡＲを発症するリスクのある移植対象から得られる血液または生検試料由来の遺伝子発現プロフィールは、ＡＲを発症するリスクのない移植対象から得られるサンプル由来の遺伝子発現プロフィールと比較できる。
【００１２】
さらなる態様において、これらの遺伝子もしくはコードタンパク質の１個または複数の発現プロフィール測定が、ＡＲ抑制、例えば予防または処置のための薬剤の効力試験に関する、価値のある分子ツールを提供できる。移植患者が治療に暴露されている間、基準プロフィールが発現プロフィールから変化する。よって、本発明はまた、対象がＡＲ治療に応答する可能性を決定するための移植対象のスクリーニング方法、ＡＲ徴候を有する移植対象の処置に有用である薬剤の同定方法およびＡＲのための特定の薬剤処置の効力のモニタリング方法を提供する。
【００１３】
１つの態様において、本発明は、
ｉ）基準値として参照を使用して、異なる時間点で遺伝子に対応するｍＲＮＡ発現レベルを測定し；および／または
ｉｉ）基準値として参照を使用して、異なる時間点で遺伝子に対応するタンパク質発現レベルを測定し；そして
ｉｉｉ）変化倍率(fold change)および／または統計試験でフィルターをかけ、該発現レベルデータを分析すること
により、移植対象の末梢血でＡＲの発症前に異なった量で発現する少なくとも１個の遺伝子および／または１個のタンパク質の同定方法を提供する。
【００１４】
“異なった量で発現”なる用語は、所定の同種移植片遺伝子の発現レベルを示し、対応する基準発現レベルの量より実質的に多いまたは少ない量として定義する。
【００１５】
（ｉｉ）または（ｉｉｉ）における参照とは、ＡＲを発症しないことが既知の、例えば１つまたはそれ以上の対象であり得る。
【００１６】
さらなる局面において、本発明は、所定の体液または同種移植片組織サンプルにおける異なった量で発現される遺伝子の検出による、移植対象の、例えばインビトロでの早期ＡＲ診断方法を提供する。例えば、該方法は、
ａ）体液、例えば末梢血の少なくとも１個の遺伝子（臨床前ＡＲモデルから生じた遺伝子、例えば表１に特定されている遺伝子）に対応するｍＲＮＡ発現またはコードタンパク質レベルを基準値としてとり；
ｂ）定期的、例えば４週間ごとに、移植患者の体液、例えば末梢血の少なくとも１個の遺伝子に対応するｍＲＮＡ発現またはコードタンパク質レベルの検出し；
ｃ）１回目の値と２回目の値を比較することを含み得て、ここで２回目の値よりも低いまたは高い１回目の値が、移植対象がＡＲを発症することを予測する。
【００１７】
ＡＲの発症前またはＡＲの早期診断は、ＡＲの何らかの明白な臨床的もしくは組織学的顕在化前に、移植対象で検出することを意味する。
【００１８】
さらなる局面において、本発明は、ＡＲを発症するリスクのある移植対象において、ＡＲ阻害剤、例えば小分子、抗体もしくは他の治療剤または候補薬剤での、ＡＲのモニタリング、例えば予防、阻止、軽減または処置方法を提供する。本発明のマーカーの発現レベルに対する、薬剤、例えば薬剤化合物の影響をモニタリングすることは、基本的薬剤スクリーニングにおいて適用できるだけでなく、臨床試験でもまた適用できる。例えば、マーカー発現に影響する薬剤の有効性を、ＡＲ阻止のための処置を受けている移植対象の臨床試験においてモニタリングできる。
【００１９】
このような方法は、
ａ）薬剤の投与前に、移植対象から投与前サンプルを得、
ｂ）投与前サンプルにおける、少なくとも１個の遺伝子に対応するｍＲＮＡ発現またはコードタンパク質レベルを検出し、
ｃ）移植患者から１個またはそれ以上の投与後サンプルを得、
ｄ）投与後サンプル（複数を含む）における、少なくとも１個の遺伝子に対応するｍＲＮＡ発現またはコードタンパク質レベルを検出し、
ｅ）投与前サンプルにおける、少なくとも１個の遺伝子に対応するｍＲＮＡ発現またはコードタンパク質レベルと、投与後サンプル（複数を含む）における、少なくとも１個の遺伝子に対応するｍＲＮＡ発現またはコードタンパク質レベルを比較し、そして
ｆ）それにより薬剤を調整することを含む。
【００２０】
例えば、薬剤投与量の増加または減少が、少なくとも１個の遺伝子の発現レベルを検出されるよりも高いまたは低いレベルに変化するために望ましいことがある。上記方法において、薬剤はまた、単独でまたは組合せ治療において他の薬剤、好ましくは免疫抑制剤および／またはＡＲにおいて有効な薬剤と組み合わせて投与できる。
【００２１】
よって、ヒト体液、例えば末梢血または生検材料、例えばヒト腎臓プロトコール生検材料由来の遺伝子発現プロファイリングデータの取り込みが、ＡＲの処置およびそれに向かう進行の予防の両方を目的とする、臨床試験中の、患者の選択工程の向上に役立つであろう。
【００２２】
さらなる局面において、本発明はさらに、上記の少なくとも１個の遺伝子またはコードタンパク質のｍＲＮＡ発現レベルをモニタリングすることを含む、ＡＲ予防、阻止、軽減または処置に使用するための薬剤の同定方法を提供する。
【００２３】
さらなる局面において、本発明は、このような処置を必要とする移植対象に、少なくとも１種のＡＲ症状を改善することができる、例えば表１および／または４に記載のとおりの、１個またはそれ以上の遺伝子または遺伝子発現産物の、合成、発現または活性を調節する化合物を対象に投与することを含む、ＡＲ予防、阻止、軽減または処置法を提供する。
【００２４】
さらなる局面において、本発明は、移植対象におけるＡＲの例えば予防または処置用薬剤として使用するための、１個またはそれ以上の上記定義の、例えば表１および／または４に記載のとおりの遺伝子または遺伝子発現産物の、合成、発現または活性を調節する化合物、例えば小分子、抗体もしくは他の治療剤または候補薬剤を提供する。
【００２５】
さらなる局面において、本発明は、移植対象におけるＡＲの予防または処置のための、１個またはそれ以上の上記で、例えば表１および／または４において定義の遺伝子または遺伝子発現産物の、合成、発現または活性を調節する化合物、例えば小分子、抗体もしくは他の治療剤または候補薬剤の使用を提供する。
【００２６】
さらなる局面において、本発明は、移植対象におけるＡＲの予防または処置用医薬の製造のための、１個またはそれ以上の上記で、例えば表１および／または４において定義の遺伝子または遺伝子発現産物の、合成、発現または活性を調節する化合物、例えば小分子、抗体もしくは他の治療剤または候補薬剤の使用を提供する。
【００２７】
移植対象とは、ドナーから、好ましくは同種から組織または臓器、例えば腎臓、心臓、肺、心臓および肺の組合せ、肝臓、膵臓、腸（例えば、大腸、小腸、十二指腸）、神経組織、膵島、四肢を受け取った対象を意味する。
【００２８】
好ましくは１個またはそれ以上の遺伝子、例えば１セットの遺伝子を、本発明の方法で使用する。
【００２９】
既に言及したとおり、表１に記載の遺伝子のおよび／または、例えば表４に記載のとおりの遺伝子発現産物の少なくとも１個の任意の選択が使用できる。
【００３０】
遺伝子発現プロフィールは、例えばＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘマイクロアレイ技術を使用して生成できる。マイクロアレイは当分野で既知であり、そして遺伝子産物（例えばｍＲＮＡ、ポリペプチド、それらのフラグメントなど）と順に対応するプローブが、既知の位置に特異的にハイブリダイズまたは結合できる表面からなる。スキャナーにより検出されるハイブリダイゼーション強度データは、ＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘマイクロアレイＳｕｉｔｅ（ＭＡＳ５）ソフトウェアにより自動的に得られ、処理される。標的強度１５０を使用して、生データを発現レベルに対して標準化する。
【００３１】
少数の異なる遺伝子の遺伝子発現プロフィールを評価する別のかつ好ましい方法は、例えば標準のＴａｑＭａｎ（登録商標）遺伝子発現アッセイまたはＴａｑＭａｎ（登録商標）低密度アレイ−マイクロ流体カード（Applied Biosystems）のいずれかによるものである。ここで、定量データを小反応量におけるリアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより入手する。
【００３２】
細胞の転写状態は、当分野で既知の他の遺伝子発現技術により評価する。いくつかのこのような技術、例えば二重制限酵素消化とフェイジングプライマー（phasing primer）との組合せ方法（例えばEP-A1-0 534858）、または定義されたｍＲＮＡ末端に最も近い部分の制限フラグメントを選択する方法（例えばPrashar et al, Proc. Nat. Acad. Sci., 93, 659-663, 1996）は、電気泳動分析のために、限定された複雑さの制限フラグメントのプールを産生する。他の方法は、例えば各ｃＤＮＡを同定するために、各多数のｃＤＮＡにおいて十分な塩基（例えば２０−５０塩基）をシーケンシングすることにより、または定義されたｍＲＮＡ末端（例えばVelculescu, Science, 270, 484-487,1995）経路パターンに対する既知の位置で生じる、小タグ（例えば９−１０塩基）をシーケンシングすることにより、統計学的にｃＤＮＡプールをサンプリングする。
【００３３】
本発明の他の態様において、マーカーに対応するタンパク質を検出する。本発明のタンパク質を検出するための好ましい薬剤は、例えばタンパク質に結合能力のある抗体、好ましくは検出可能標識を有する抗体である。抗体はポリクローナル、または好ましくはモノクローナルであり得る。完全な抗体またはそれらのフラグメント（例えばＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２）を使用できる。“標識”なる用語は、抗体に検出可能な物質をカップリングすることによる抗体の直接標識、ならびに直接標識された別の試薬との反応性により抗体を間接標識することを包含することを意図する。様々な形式が、サンプルが、所定の抗体に結合するタンパク質を含むかどうかを決定するために使用できる。このような形式の例は、例えば酵素イムノアッセイ、ラジオイムノアッセイ、ウエスタンブロット分析およびＥＬＩＳＡを含む。
【００３４】
好ましい態様において、上記の方法の計算段階は、生物系モデルの形成および試験のための強力かつ便利な設備を提供するために、コンピューターシステムまたは１個またはそれ以上のネットワークコンピューターシステムで実行される。コンピューターシステムは、内部コンポーネントを含み、外部コンポーネントにリンクしている単一のハードウェアプラットフォームであり得る。コンピューターシステムの内部コンポーネントは、メインメモリーと相互接続した処理エレメントを含む。外部コンポーネントは、大量データ記憶装置を含む。このデータ記憶装置は、１個またはそれ以上のハードディスクであり得る。他の外部コンポーネントは、位置決め装置または他の図形入力装置と一体となった、モニターおよびキーボードであり得るユーザーインターフェース装置を含む。一般的に、コンピューターシステムはまた、他のローカルコンピューターシステム、遠隔コンピューターシステムまたは広域コミュニケーションネットワーク、例えばインターネットにリンクされている。このネットワークリンクは、コンピューターシステムが、データおよび処理作業の他のコンピューターシステムとの共有を可能にする。
【００３５】
このシステムの操作中のメモリーにロードされるのは、当分野で一般的および本発明に専用である両方のいくつかのソフトウェアコンポーネントである。これらのソフトウェアコンポーネントは、集合的に本発明の方法により機能するためのコンピューターシステムをもたらす。これらのソフトウェアコンポーネントは、一般的に大容量または取り外し可能な媒体、例えばフロッピーディスクまたはＣＤ−ＲＯＭに保存される。ソフトウェアコンポーネントは、コンピューターシステムおよびそのネットワーク相互接続の処理を担うオペレーティングシステムを示す。好ましくは、本発明の方法は、方程式の記号入力および、使用されるアルゴリズムを含む処理の高レベルの特定化ができる、数学パッケージソフトウェア中にプログラミングされ、そしてそれにより、ユーザーが個々の方程式またはアルゴリズムを進行的にプログラミングする必要をなくす。
【００３６】
好ましい態様において、分析ソフトウェアコンポーネントは現に、互いに相互作用する別々のソフトウェアコンポーネントを含む。分析ソフトウェアは、システムの操作のために必要なすべてのデータを含むデータベースを示す。このようなデータは、限定はしないが、一般に前の実験の結果、ゲノムデータ、実験手順ならびにコスト、および当業者には明白である他の情報を含み得る。分析ソフトウェアは、本発明の分析方法を実行する１種またはそれ以上のプログラムを含むデータ整理および計算コンポーネントを含む。分析ソフトウェアはまた、ネットワーク試験モデルおよび、所望により、実験データのコントロールおよびインプットを備えたコンピューターシステムをユーザーに提供する、ユーザーインターフェースを含む。ユーザーインターフェースは、システムに仮説を特定させるために、ドラッグ・アンド・ドロップ・インターフェースを含み得る。ユーザーインターフェースはまた、大容量記憶コンポーネントから、取り外し可能な媒体から、またはネットワークを介して本システムと接続する異なるコンピューターシステムから実験データをローディングする手段を含む。
【００３７】
本発明はまた、本発明で述べる少なくとも１個のマーカー、例えばｍＲＮＡを含む、データベース作成法を提供する。例えば、ポリヌクレオチド配列は、データ処理システムがＡＲの早期診断を同定する遺伝子を標準化された表示するように、デジタル記憶媒体に保存する。データ処理システムは、異なる時間、例えば移植日および移植後に得られる２つの体液または組織サンプル間の遺伝子発現分析に有用である。単離ポリヌクレオチドをシーケンシングする。サンプルの配列は、相同性検索技術を使用して、データベースに存在する配列（複数も含む）と比較し得る。本発明の分析方法を実行するための、代わりのコンピューターシステムおよび方法は、当業者に明らかであり、添付の特許請求の範囲内に包含されることを意図する。
【実施例】
【００３８】
診断マーカーの同定のための臨床前ＡＲモデル
生命維持的ＢＮからＬｅｗｉｓ腎臓移植ラットモデル（７日目にＡＲ発症）におけるバイオマーカー試験に関して、１０匹の同種異系移植および１０匹の同種同系移植ラットのすべてに各々に免疫抑制レジメンなしで同時に移植し、異なる３つの時点（移植後３、４、５日）で終了する。加えて、非生命維持的同種同系移植対照を各６匹のラット、２グループで行った。約１３６０個のプローブ（血液、血清、尿、移植組織）を一斉にサンプル化する。移植組織および血液化学変化の測定をプロテオーム、トランスクリプトーム、およびメタボノミクス分析を組み合わせて一緒に適用する。
【００３９】
ＲＮＡ抽出：全血をＥＤＴＡ−ＥＴチューブ（Ｓａｒｓｔｅｄｔ）に回収し、２アリコート（２ｍｌ、０．２５ｍｌ）を、各々Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋非含有、同量のＰＢＳで満たした１５ｍｌ Ｆａｌｃｏｎまたは２ｍｌ エッペンドルフチューブに各々移す。混合後、同量のＮｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｌｙｓｉｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を加え、チューブをボルテックスし、−２０℃で保存する。全ＲＮＡを製造業者の指示にしたがって６１００ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ ＰｒｅｐＳｔａｔｉｏｎ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）により、血液溶解物から抽出する。腎臓皮質同種異系移植片サンプルをＲＮＡｌａｔｅｒ（Ａｍｂｉｏｎ）に回収し、一晩＋４℃、次いで−８０℃で保存する。最後に、組織をＦａｓｔＰｒｅｐ ＦＰ１２０（Ｓａｖａｎｔ）でホモジェナイズし、全ＲＮＡをＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して単離する。ＲＮＡの質をＡｇｉｌｅｎｔの２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ ｌａｂｃｈｉｐｓによりコントロールし、量を分光光度法で測定する。
【００４０】
遺伝子チップ分析：全体で、３種の移植（同種異系移植（ＢＮからＬｅｗｉｓ）、同種同系移植（ＬｅｗｉｓからＬｅｗｉｓ）ならびに非生命維持的同種同系移植（ＬｅｗｉｓからＬｅｗｉｓ））および３つの時点（生命維持的同種異系移植および同種同系移植操作後３、４、５日、非生命維持的同種同系移植後３、４日）を含む、末梢血由来の６０サンプルが、遺伝子チップ分析のための質および量（５−１０μｇ 全ＲＮＡ）基準に適合し、これは６個の血液ＲＮＡサンプルが最小グループサイズである合計８グループをもたらす。
【００４１】
ＲＮＡサンプルを、製造業者のプロトコールにしたがってＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標） Ｒａｔ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ２３０Ａで、処理し、標識化し、ハイブリダイズする。発現値をＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｓｕｉｔｅ（ＭＡＳ）バージョン５の統計的アルゴリズムにより計算する。ＭＡＳ５標準化データをＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ（登録商標）６．２（Ｓｉｌｉｃｏｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）により分析する。値を標準化し（チップあたり：定常値−１５０）、すべてのプローブセットを、生の値（８０以上）およびフラッグ（存在および境界）でふるいにかけ、１５９２３個のプローブセットの約半分を取り除く。すべてのサンプルを、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｑｕａｌｉｔｙ ｆｅａｔｕｒｅｓおよび条件クラスタリングを使用して質特性に関して確認する。
【００４２】
データを、対応するグループ（ｄ３同種移植片対ｄ３同種同系移植など）間の統計学的検定と組み合わせた対応するグループ（ｄ３同種移植片対ｄ３同種同系移植など−カットオフ：２倍）間の変化倍率の統計学的ふるいを使用して分析する。試験として、０．００５または０．００５のＰ値カットオフを使用するノンパラメトリックＷｉｌｃｏｘｏｎ−Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定および多試験補正（Benjamini and Hochberg False Discovery Rate）を使用する。有意に異なった量で発現する遺伝子の計算した変化倍率を、表２に記載する。
【００４３】
ＴａｑＭａｎ確認：選択し同定された候補ＡＲマーカー遺伝子発現を、製造業者の標準プロトコールにしたがって、７９００ＨＴ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）での、市販ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ＡｓｓａｙｓおよびＵｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いる定量リアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより確認する。結果を表３に記載する。
【００４４】
トランスクリプトーム分析と同時に、１０匹の個々のラットの等量の血清を、二次元ゲル電気泳動法に使用する差次的発現のためのサンプルを提供するために集める。１０μｌの集めた血清を記載のとおりの３９０μｌのサンプルバッファーで希釈する(Rabilloud T, Electrophoresis 19 (1998), 758-60)。二次元電気泳動を記載のとおりに行う(Hoving et al., Electrophoresis 21 (2000), 2617-21)。５つのゲルの各サンプルを同時に流し、蛍光染色剤Ｓｙｐｒｏ Ｒｕｂｙ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）で染色する。染色したゲルを１６ビットのピクセルの深さのＴＩＦＦファイルとして、ＦＬＡ−３０００蛍光画像装置（Ｆｕｊｉ）でデジタル化する。画像解析をＰｒｏｇｅｎｅｓｉｓ（Ｎｏｎ−Ｌｉｎｅａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ）ソフトウェアパッケージで行う。スポット強度（スポット量、エリア全体の光学密度の積分）を標準化し、統計学的にスチューデントｔ検定を使用して比較する。同種異系移植動物と対応する同種同系移植対照間の有意な差異（ｔ検定でｐ＜０．０５、および＞２倍の量の差異）であるスポットをゲルから切り出し、含有タンパク質を、４７００ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用してＭＡＬＤＩ−ＭＳおよびＭＳ／ＭＳにより同定する。タンパク質同定は、Ｍａｓｃｏｔ（Ｍａｔｒｉｘ Ｓｃｉｅｎｃｅ）ソフトウェアを使用する、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔおよび／またはＧｅｎＢａｎｋデータベースでの実験的に得られたマススペクトルの適合に基づいている。
【００４５】
【表１】
【００４６】
【表２】
【００４７】
【表３】
【００４８】
【表４】
【００４９】
【表５】
【００５０】
【表６】
【００５１】
【表７】
【００５２】
【表８】
【００５３】
【表９】
【００５４】
ＢＮからＬｅｗｉｓ腎臓移植試験由来、同種異系および同種同系移植ラットの末梢血での定量ＴａｑＭａｎ実験を、市販ＴａｑＭａｎ登録商標遺伝子発現アッセイ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で既知の遺伝子について行う。相対定量を１８Ｓ ｒＲＮＡへの標準化により適用する。一般的に、得られたすべての値は、グループあたり６個のランダムに選択した血液サンプルの分析によるＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ遺伝子チップデータとよく一致し、そして４日目の３個の同種同系移植血液サンプルのすべての平均値と比較する。
【００５５】
【表１０】
１多数のイソ型の場合、各々のイソ型の見かけのｐＩを、任意に指定して示す；２Ｐ値（５日目のサンプル）、ｔ検定による；３５日目のサンプルで決定される値、同種異系移植片サンプルにおける正の値は上方制御、負の値は下方制御を示す、ｄｅ ｎｏｖｏは、１グループだけにおいて見いだされたスポットを示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）体液、例えば末梢血の臨床前急性同種移植片拒絶反応（ＡＲ）モデルから得られる少なくとも１個の遺伝子に対応するｍＲＮＡ発現またはコードタンパク質レベルを基準値としてとり；
ｂ）定期的、例えば４週間ごとに、移植患者の体液、例えば末梢血の少なくとも１個の遺伝子に対応するｍＲＮＡ発現またはコードタンパク質レベルを検出し；
ｃ）１回目の値と２回目の値を比較することを含み、ここで２回目の値よりも低いまたは高い１回目の値が、移植対象がＡＲを発症することを予測する、
を含む、移植対象におけるＡＲの早期診断方法。
【請求項２】
ａ）薬剤の投与前に、移植対象から投与前サンプルを得、
ｂ）投与前サンプルにおける、臨床前ＡＲモデルから得られる少なくとも１個の遺伝子に対応するｍＲＮＡ発現またはコードタンパク質レベルを検出し、
ｃ）移植患者から１個またはそれ以上の投与後サンプルを得、
ｄ）投与後サンプル（複数を含む）における、少なくとも１個の遺伝子に対応するｍＲＮＡ発現またはコードタンパク質レベルを検出し、
ｅ）投与前サンプルにおける、少なくとも１個の遺伝子に対応するｍＲＮＡ発現レベルまたはコードタンパク質と、投与後サンプル（複数を含む）における、少なくとも１個の遺伝子に対応するｍＲＮＡ発現レベルまたはコードタンパク質を比較し、そして
ｆ）それにより薬剤を調整すること
を含む、ＡＲを発症するリスクのある移植対象におけるＡＲをモニタリングする方法。
【請求項３】
臨床前ＡＲモデルから得られる１個またはそれ以上の遺伝子または遺伝子産物の合成、発現または活性を調節し、少なくとも１種のＡＲの症状を改善することができる化合物を対象に投与することを含む、このような処置を必要とする移植対象におけるＡＲ予防、阻止、軽減、または処置のための方法。
【請求項４】
例えば移植対象におけるＡＲの予防または処置のための医薬としての使用のための、臨床前ＡＲモデルから得られる１個またはそれ以上の遺伝子または遺伝子産物の合成、発現または活性を調節する化合物。
【請求項５】
移植対象におけるＡＲの予防または処置のための、臨床前ＡＲモデルから得られる１個またはそれ以上の遺伝子または遺伝子産物の合成、発現または活性を調節する化合物。
【請求項６】
移植対象におけるＡＲの予防または処置用医薬の製造のための、臨床前ＡＲモデルから得られる１個またはそれ以上の遺伝子または遺伝子産物の合成、発現または活性を調節する化合物の使用。
【請求項７】
急性移植拒絶反応に関する早期バイオマーカーとしての、表１に記載の遺伝子または遺伝子発現産物の使用。
【請求項８】
移植対象が腎臓、心臓、肝臓、肺または腸移植対象である、請求項１から６のいずれかに記載の方法、化合物または使用。
【請求項９】
遺伝子が表１に特定される遺伝子の群から選択される、請求項１から６のいずれかに記載の方法、化合物または使用。
【請求項１０】
遺伝子発現の発現レベルを遺伝子発現産物に対応するタンパク質の存在の検出により評価する、請求項１から６のいずれかに記載の方法、化合物または使用。
【請求項１１】
タンパク質に特異的に結合する試薬を使用してタンパク質の存在を検出する、請求項１から６のいずれかに記載の方法、化合物または使用。
【請求項１２】
１個またはそれ以上の遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルをノーザンブロット分析、逆転写ＰＣＲおよびリアルタイム定量ＰＣＲからなる群から選択される技術により検出する、請求項１から６のいずれかに記載の方法、化合物または使用。
【請求項１３】
遺伝子セットのｍＲＮＡ発現レベルを検出する、請求項１から６のいずれかに記載の方法、化合物または使用。
【請求項１４】
実質的に上記定義および上記記載の方法、化合物、遺伝子もしくは遺伝子発現産物または使用。
【請求項１】
ａ）体液、例えば末梢血の臨床前急性同種移植片拒絶反応（ＡＲ）モデルから得られる少なくとも１個の遺伝子に対応するｍＲＮＡ発現またはコードタンパク質レベルを基準値としてとり；
ｂ）定期的、例えば４週間ごとに、移植患者の体液、例えば末梢血の少なくとも１個の遺伝子に対応するｍＲＮＡ発現またはコードタンパク質レベルを検出し；
ｃ）１回目の値と２回目の値を比較することを含み、ここで２回目の値よりも低いまたは高い１回目の値が、移植対象がＡＲを発症することを予測する、
を含む、移植対象におけるＡＲの早期診断方法。
【請求項２】
ａ）薬剤の投与前に、移植対象から投与前サンプルを得、
ｂ）投与前サンプルにおける、臨床前ＡＲモデルから得られる少なくとも１個の遺伝子に対応するｍＲＮＡ発現またはコードタンパク質レベルを検出し、
ｃ）移植患者から１個またはそれ以上の投与後サンプルを得、
ｄ）投与後サンプル（複数を含む）における、少なくとも１個の遺伝子に対応するｍＲＮＡ発現またはコードタンパク質レベルを検出し、
ｅ）投与前サンプルにおける、少なくとも１個の遺伝子に対応するｍＲＮＡ発現レベルまたはコードタンパク質と、投与後サンプル（複数を含む）における、少なくとも１個の遺伝子に対応するｍＲＮＡ発現レベルまたはコードタンパク質を比較し、そして
ｆ）それにより薬剤を調整すること
を含む、ＡＲを発症するリスクのある移植対象におけるＡＲをモニタリングする方法。
【請求項３】
臨床前ＡＲモデルから得られる１個またはそれ以上の遺伝子または遺伝子産物の合成、発現または活性を調節し、少なくとも１種のＡＲの症状を改善することができる化合物を対象に投与することを含む、このような処置を必要とする移植対象におけるＡＲ予防、阻止、軽減、または処置のための方法。
【請求項４】
例えば移植対象におけるＡＲの予防または処置のための医薬としての使用のための、臨床前ＡＲモデルから得られる１個またはそれ以上の遺伝子または遺伝子産物の合成、発現または活性を調節する化合物。
【請求項５】
移植対象におけるＡＲの予防または処置のための、臨床前ＡＲモデルから得られる１個またはそれ以上の遺伝子または遺伝子産物の合成、発現または活性を調節する化合物。
【請求項６】
移植対象におけるＡＲの予防または処置用医薬の製造のための、臨床前ＡＲモデルから得られる１個またはそれ以上の遺伝子または遺伝子産物の合成、発現または活性を調節する化合物の使用。
【請求項７】
急性移植拒絶反応に関する早期バイオマーカーとしての、表１に記載の遺伝子または遺伝子発現産物の使用。
【請求項８】
移植対象が腎臓、心臓、肝臓、肺または腸移植対象である、請求項１から６のいずれかに記載の方法、化合物または使用。
【請求項９】
遺伝子が表１に特定される遺伝子の群から選択される、請求項１から６のいずれかに記載の方法、化合物または使用。
【請求項１０】
遺伝子発現の発現レベルを遺伝子発現産物に対応するタンパク質の存在の検出により評価する、請求項１から６のいずれかに記載の方法、化合物または使用。
【請求項１１】
タンパク質に特異的に結合する試薬を使用してタンパク質の存在を検出する、請求項１から６のいずれかに記載の方法、化合物または使用。
【請求項１２】
１個またはそれ以上の遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルをノーザンブロット分析、逆転写ＰＣＲおよびリアルタイム定量ＰＣＲからなる群から選択される技術により検出する、請求項１から６のいずれかに記載の方法、化合物または使用。
【請求項１３】
遺伝子セットのｍＲＮＡ発現レベルを検出する、請求項１から６のいずれかに記載の方法、化合物または使用。
【請求項１４】
実質的に上記定義および上記記載の方法、化合物、遺伝子もしくは遺伝子発現産物または使用。
【公表番号】特表２００８−５１２６４６（Ｐ２００８−５１２６４６Ａ）
【公表日】平成２０年４月２４日（２００８．４．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５２８７９０（Ｐ２００７−５２８７９０）
【出願日】平成１７年９月５日（２００５．９．５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００５／００９５２６
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０２７１９２
【国際公開日】平成１８年３月１６日（２００６．３．１６）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．フロッピー
【出願人】（５９７０１１４６３）ノバルティス アクチエンゲゼルシャフト (942)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年４月２４日（２００８．４．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年９月５日（２００５．９．５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００５／００９５２６
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０２７１９２
【国際公開日】平成１８年３月１６日（２００６．３．１６）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．フロッピー
【出願人】（５９７０１１４６３）ノバルティス アクチエンゲゼルシャフト (942)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]