急性腎不全又は急性腎不全発症リスクのマーカーとしての尿中ＧＭ２活性化タンパク質
本発明は、タンパク質であるガングリオシドＧＭ２活性化タンパク質（ＧＭ２ＡＰ）を検出及び／又は定量することにより、個体における急性腎不全（ＡＲＦ）を発症するリスクを決定する方法、又はＡＲＦを決定する方法、及びＡＲＦの進行を予測する方法に関する。急性腎不全は、少なくとも１種の腎毒性物質の投与に起因することがあり、このとき、腎毒性物質は、例えばゲンタマイシンのようなアミノグリコシド系抗生物質であり得る。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質であるガングリオシドＧＭ２活性化タンパク質（ＧＭ２ＡＰ）を検出及び／又は定量することにより、個体における急性腎不全（ＡＲＦ）を発症するリスクを決定する方法、又はＡＲＦを決定する方法、及びＡＲＦの進行を予測する方法に関する。急性腎不全は、少なくとも１種の腎毒性物質の投与に起因することがあり、このとき、腎毒性物質は、例えばゲンタマイシンのようなアミノグリコシド系抗生物質であり得る。
【背景技術】
【０００２】
急性腎不全（ＡＲＦ）は、老廃物及び水の血液浄化、並びに電解質平衡を妨げるのに十分な、腎臓の排泄機能の急激な損失に起因する極めて重篤な状態である（Ｂｅｌｌｏｍｏ Ｒ、Ｋｅｌｌｕｍ ＪＡ及びＲｏｎｃｏ Ｃ．２００７、Ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ．３３：４０９〜１３）。ＡＲＦは、薬剤、化学毒、低酸素、泌尿手段の閉塞、感染などを含む多種多様な損傷原因によって引き起こされ得る（Ｂｉｎｓｗａｎｇｅｒ Ｕ．１９９７、Ｋｉｄｎｅｙ Ｂｌｏｏｄ Ｐｒｅｓｓ Ｒｅｓ．、２０：１６３）。ＡＲＦは、高い発生率及び死亡率に由来する、莫大な、ヒトへの社会経済的負担を引き起こす。入院のうちの１％近くがＡＲＦに関連すると推定され、入院患者のうちの約２〜７％が最終的にＡＲＦを発症する（Ｋｅｌｌｕｍ ＪＡ及びＨｏｓｔｅ ＥＡ．２００８、Ｓｃａｎｄ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｌａｂ Ｉｎｖｅｓｔ Ｓｕｐｐｌ．、２４１：６〜１１）。
【０００３】
ＡＲＦのより成功する臨床処置の重要な決定因子は、損傷がまだ可能な限り軽度なときの、極めて早期の診断であり、（可能な場合の）損傷回復の効力、治療的介入及び患者の転帰を大きく向上させる。したがって、より早期の且つより感度が高いバイオマーカーの同定は、明白な目標である。臨床診療では、ＡＲＦは、依然として、腎機能障害が測定可能な症状を生じたときに診断される。この診断は、典型的には、血液中のクレアチニン及び尿素のレベルの決定に依存する。これらの血清中濃度は、最も一般的には、ＧＦＲ（糸球体濾過量）が低下するにつれて上昇する。しかし、この段階では、ＡＲＦを処置するのが困難になる。したがって、現在の診断の傾向は、損傷が広がっていないときに、早い段階で生じる初期の病態生理学的事象を検出することを目指している（Ｖａｉｄｙａ ＶＳ、Ｆｅｒｇｕｓｏｎ ＭＡ及びＢｏｎｖｅｎｔｒｅ ＪＶ．２００８、Ｒｅｖ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｔｏｘｉｃｏｌ．、４８：４６３〜９３）。
【０００４】
中でも、尿細管細胞の破壊の結果として尿中に存在する特定の細胞酵素の測定は、尿細管損傷と共に進行するＡＲＦを早期に検出するための現在最も鋭敏な方法である。これらの酵素としては、Ｎ−アセチル−ベータ−Ｄ−グルコサミニダーゼ（ＮＡＧ）が挙げられるが、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＤＨＬ）、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）又はガンマ−グルタミルトランスペプチダーゼ（ＧＧＴ）などの他のものも含まれる。これらの酵素の大部分は、主に、安定性の問題及び尿中の他の成分による阻害のために、ＡＲＦの早期の且つ感度が高い尿中マーカーとして中程度の価値を有する（Ｖａｉｄｙａ ＶＳ、Ｆｅｒｇｕｓｏｎ ＭＡ及びＢｏｎｖｅｎｔｒｅ ＪＶ．、２００８、Ｒｅｖ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｔｏｘｉｃｏｌ．、４８：４６３〜９３）。日常の解析パラメータとしてはめったに使用されないが、明らかに、ＮＡＧは、腎障害の鋭敏なマーカーとして最も良く特徴付けられている。新しい尿中マーカーは、現在、ＡＲＦの極めて早期の診断及び予知のための検証が進んでいる段階にある。新しい尿中マーカーとしては、腎障害分子−１（ＫＩＭ−１）、好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（ＮＧＡＬ）、プラスミノーゲン活性化因子阻害因子−１（ＰＡＩ−１）、シスタチンＣ、インターロイキン１８、レチノール結合タンパク質（ＲＢＰ）などが挙げられる。
【０００５】
ＡＲＦに関するもう１つの重要な側面は、腎毒性の可能性がある特定の薬剤が、準毒性用量で、他の腎毒素に反応してＡＲＦにより罹患しやすくなるように、個体を罹患しやすくするか又は敏感にする作用である。薬剤（例えば、ゲンタマイシン）で治療される腎疾患の徴候を示していない患者が、同様に理論的に準毒性の療法の範囲内の別の腎毒性の可能性がある作用剤、例えば、別の薬剤、診断の対照、重金属などを同時に又は続いて投与される又は曝露されるという典型的な臨床的状況が存在する。その場合、潜在的な腎毒素での準毒性治療は、診断及び治療の観点から対処されるべきである、その隠れた性質のために、特別な重要性のある関連する臨床的状況を引き起こすであろう。
【０００６】
最近は、腎不全は、異なるパラメータを使用して診断される。例えば、急性腎不全の異なる段階を定める、急性腎不全（ＡＲＦ）の診断のための一致基準がある。この一致基準は、頭字語ＲＩＦＬＥと命名され（Ｒｉｃｃｉ Ｚ、Ｃｒｕｚ Ｄ及びＲｏｎｃｏ Ｃ．２００８、Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ．、７３：５３８〜４６）、血清クレアチニンの上昇、糸球体濾過量の低下及び尿流速の低下に基づいている。この基準を確立するためには、多数の試験を行うことが極めて重要である。血漿中のクレアチニンのレベルは、腎損傷のマーカーとして使用される。健常な腎臓は、クレアチニンを血液の外に取り出して尿中に入れ、体外に出す。腎臓が十分に働いていないときには、クレアチニンは血液中に蓄積するが、クレアチニンの値も変化し、食事による影響を受けることがある。腎不全を診断するための他のマーカーは、血液尿素窒素又はタンパク尿である。
【０００７】
ゲンタマイシンは、グラム陰性感染に対して世界中で広く使用されるアミノグリコシド系抗生物質である。ゲンタマイシンの治療有効性及び使用は、腎臓及び聴覚器官のレベルで主に生じる、その毒性によって厳しく限定される（Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｓａｌｇａｄｏ Ｃ、Ｌｏｐｅｚ−Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ ＦＪ及びＬｏｐｅｚ−Ｎｏｖｏａ ＪＭ．２００７、Ｔｏｘｉｃｏｌ Ａｐｐｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、２２３：８６〜９８）。ゲンタマイシンによって誘発される腎毒性は、１０〜２５％の治療課程において出現する（Ｌｅｅｈｅｙ ＤＪら、１９９３、Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．、４：８１〜９０）。この腎毒性は、尿細管損傷を主な特徴とするが（Ｎａｋａｋｕｋｉ Ｍら、１９９６、Ｃａｎ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、７４：１０４〜１１）、用量依存的な方法で、糸球体（Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｓａｌｇａｄｏ Ｃ、Ｌｏｐｅｚ−Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ ＦＪ及びＬｏｐｅｚ−Ｎｏｖｏａ ＪＭ．２００７、Ｔｏｘｉｃｏｌ Ａｐｐｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、２２３：８６〜９８）及び血管（Ｇｏｔｏ Ｔら、２００４、Ｖｉｒｃｈｏｗｓ Ａｒｃｈ．、４４４：３６２〜７４；Ｓｅｃｉｌｍｉｓ ＭＡ，ら、２００５、Ｎｅｐｈｒｏｎ Ｐｈｙｓｉｏｌ．、１００：１３〜２０）の変化が出現することもある（Ｈｉｓｈｉｄａ Ａら、１９９４、Ｒｅｎ Ｆａｉｌ．、１６：１０９〜１６）。
【０００８】
ガングリオシドＧＭ２活性化タンパク質（ＧＭ２ＡＰ）は、リソソーム酵素であるβ−ヘキソサミニダーゼＡの基質特異的補因子として働く小さな糖脂質輸送タンパク質である。この酵素はＧＭ２ＡＰと共に、ガングリオシドＧＭ２（スフィンゴ糖脂質を含むシアル酸）、及び末端Ｎ−アセチルヘキソサミンを含む他の分子の分解を触媒する。ＧＭ２ＡＰは、いくつかの肝臓毒の肝毒性の予測のためのマーカーとしてこれを使用して肝疾患と関連付けられているが（米国特許第７４６９１８５号）、腎疾患又は急性腎不全とは関連付けられていない。
【０００９】
急性腎不全又は腎障害において早期に発現されるいずれのバイオマーカーの使用も、任意の患者のこの障害を患うリスクを決定するための有用な手段であり得る。この手段は、可能性のある他の多くの用途の中でも、前記個体の健康が悪化するのを防ぐために、任意の個体に対する任意の薬剤の投与を改変するためにも使用することができる。
【発明の概要】
【００１０】
本発明は、タンパク質であるガングリオシドＧＭ２活性化タンパク質（ＧＭ２ＡＰ）を検出及び／又は定量することにより、個体における急性腎不全（ＡＲＦ）を発症するリスクを決定する方法、又はＡＲＦを決定する方法、及びＡＲＦの進行を予測する方法に関する。急性腎不全は、少なくとも１種の腎毒性物質の投与に起因することがあり、このとき、腎毒性物質は、例えばゲンタマイシンのようなアミノグリコシド系抗生物質であり得る。
【００１１】
本発明は、ゲンタマイシンによって誘発されるＡＲＦに対する素質はタンパク質ＧＭ２ＡＰの排泄の増加と相関するという証拠を提供する。実施例は、ゲンタマイシンによって誘発されるＡＲＦに対する素質の、可能性のある尿中バイオマーカーとしてのＧＭ２ＡＰの有用性をさらに強調する。
【００１２】
したがって、本発明は、ＡＲＦの検出及び、さらに、ＡＲＦを発症するリスクを決定する可能性を向上させるための手段を提供する。この提供の結果は、ＡＲＦの進行の予想、すなわち、該個体が、例えば、これに限定されないが、治療用物質で治療されたときの、或いは該個体が何らかの状態又は明らかな腎毒性作用を有する若しくは有さない作用剤に曝露されたときのＡＲＦの進行のモニタリングである。
【００１３】
行っている説明を補足するために且つ本発明の特徴をより良く理解するのを補助するために、いくつかの好ましい実施例に従って、以下のことを表している図面を、例示的且つ非限定的な性質で、含めている：
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】生理食塩水（０．９％ＮａＣｌ、ｎ＝１９）又はゲンタマイシン（５０又は１５０ｍｇ／ｋｇ／日、それぞれｎ＝４２及びｎ＝１５）で７日間処置したラットの生存率（Ａ）及び体重の段階的変化（Ｂ）を示している図である。データは、平均±標準誤差を表している。
【図２】腎機能の特徴付けを示している図である。生理食塩水（０．９％ＮａＣｌ、Ｃ）又はゲンタマイシン（５０又は１５０ｍｇ／ｋｇ／日、それぞれＧ−５０及びＧ−１５０）で７日間処置したラットの、（Ａ）血漿クレアチニン濃度、（Ｂ）血液尿素窒素（ＢＵＮ）、（Ｃ）タンパク質の１日の尿中排泄、及び（Ｄ）Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダーゼ（ＮＡＧ）の１日の尿中排泄。データは、平均±標準誤差を表している。対照：ｎｃｒｅａ＝４６、ｎＢＵＮ＝３８、ｎｐｒｏｔ＝２５、ｎＮＡＧ＝１２；５０ｍｇ／ｋｇ／日のゲンタマイシン：ｎｃｒｅａ＝５７、ｎＢＵＮ＝４９、ｎｐｒｏｔ＝２５、ｎＮＡＧ＝１１；及び１５０ｍｇ／ｋｇ／日のゲンタマイシン：ｎｃｒｅａ＝１８、ｎＢＵＮ＝４、ｎｐｒｏｔ＝７、ｎＮＡＧ＝７。黒丸ｐ＜０．０５対対照群；網掛け丸ｐ＜０．０５対Ｇ−５０群。
【図３】生理食塩水（対照）、ゲンタマイシン５０ｍｇ／ｋｇ／日（Ｇ−５０）及び１５０ｍｇ／ｋｇ／日（Ｇ−１５０）で処置をした７日後のラットの腎臓からの、ヘマトキシリン及びエオシンで染色した組織学的切片の代表的な画像（１００×）を示している図である。
【図４】組織の障害及び修復に関するマーカーの腎発現を示している図である。生理食塩水（０．９％ＮａＣｌ、Ｃ）又はゲンタマイシン（５０又は１５０ｍｇ／ｋｇ／日、それぞれＧ−５０及びＧ−１５０）で７日間処置したラットからの腎組織ホモジェネート中のプラスミノーゲン活性化因子阻害因子−１（ＰＡＩ−１）、腎障害分子−１（ＫＩＭ−１）及びビメンチンの腎臓レベルの代表的なウエスタンブロット画像である。試験は、各群から、無作為に選択した、３匹の動物（１〜３）からの試料で行った。
【図５】生理食塩水（０．９％ＮａＣｌ）又はゲンタマイシン（５０ｍｇ／ｋｇ／日）で７日間処置し、その直後に、単回の準毒性用量の硝酸ウラニル（ＵＮ、０．５ｍｇ／ｋｇ）又は生理食塩水を投与したラット（この図面の下方部分を参照されたい）における、血漿クレアチニン濃度（上方パネル）及び血液尿素窒素（ＢＵＮ）濃度（下方パネル）の段階的変化を示している図である。血漿クレアチニン及びＢＵＮは、この試験を通して、ＵＮ投与の６日後までモニタリングした。データは、１群あたり６匹の動物からの試料の平均±標準誤差を表している。黒丸ｐ＜０．０５対対照群；白丸ｐ＜０．０５対ＵＮ群；黒四角ｐ＜０．０５対Ｇ−５０群。
【図６】生理食塩水（０．９％ＮａＣｌ）又はゲンタマイシン（５０ｍｇ／ｋｇ／日、Ｇ−５０）で７日間処置し、その直後に、単回の準毒性用量の硝酸ウラニル（ＵＮ、０．５ｍｇ／ｋｇ、下方左パネルを参照されたい）又は生理食塩水を投与したラットにおける、タンパク質の尿中排泄の段階的変化（上方左パネル）を示している図である。中央及び右のパネルは、それぞれ、同じ動物のＮ−アセチル−グルコサミニダーゼ（ＮＡＧ）の尿中排泄及び１１日目（ＵＮ投与６日後）のクレアチニンクリアランスを示している。データは、条件あたり３〜９匹の動物の平均±標準誤差を表している。黒丸ｐ＜０．０５対ＵＮ群；ＡＵ：任意単位。
【図７】（ｉ）ゲンタマイシン（５０ｍｇ／ｋｇ／日）に加えて、ゲンタマイシンの第１の用量と共に投与される硝酸ウラニル（０．５ｍｇ／ｋｇ）の単回投与で処置したラット（黒丸）、及び（ｉｉ）ゲンタマイシン（５０ｍｇ／ｋｇ／日）で７日間処置したラットの血漿クレアチニン濃度の段階的変化を示している図である。７日目以後、さらに７日間処置を中止し、その後、単回用量の硝酸ウラニル（０．５ｍｇ／ｋｇ）を投与した（白丸、プロトコールを表すための下方パネルを参照されたい）。データは、１群あたり６匹の動物の平均±標準誤差を表している。
【図８】生理食塩水（０．９％ＮａＣｌ、対照）又はゲンタマイシン（５０ｍｇ／ｋｇ／日）で７日間処置したラットからの尿のタンパク質の代表的な２Ｄ−電気泳動を示している図である。試験は、各群の４匹の動物からの尿試料で（各試料を二重試験で）行った。
【図９】生理食塩水（０．９％ＮａＣｌ、対照）で７日間処置した４匹の無作為に選択したラット及び５０ｍｇ／ｋｇ／日のゲンタマイシンで同期間処置した４匹の無作為に選択したラットからの尿中のＧＭ２活性化タンパク質のレベルを示している図である。明白な腎不全の対照として、１５０ｍｇ／ｋｇ／日のゲンタマイシンで７日間処置したラットからの試料も示している。
【図１０】単回の硝酸ウラニルの腎毒性用量（５ｍｇ／ｋｇ、ＵＮ）で処置した４匹のラットから、１日目及び３日目の２回のシスプラチンの用量（１０ｍｇ／ｋｇ）で処置した４匹のラットから、又は生理食塩水で処置した（０．９％ＮａＣｌ、対照）４匹のラットからの尿中のＧＭ２活性化タンパク質のレベルでのウエスタンブロット画像を示している図である。尿は、処置開始の４日後に採取した。さらに、血漿クレアチニン濃度（Ｃｒｐｌ、ｍｇ／ｄＬ）の個々の値も示している。
【図１１】腎毒性のあるマーカーの腎毒性作用の段階的変化：ゲンタマイシン（１５０ｍｇ／ｋｇ／日）で７日間処置したラットにおける、血漿クレアチニン濃度、クレアチニンクリアランス、Ｎ−アセチル−グルコサミニダーゼ（ＮＡＧ）排泄、タンパク尿、並びに腎障害分子−１（ＫＩＭ−１）、プラスミノーゲン活性化因子阻害因子−１（ＰＡＩ−１）及びＧＭ２活性化タンパク質（ＧＭ２ＡＰ）の尿中レベルを示している図である。データは、６匹の動物からの試料の平均±標準誤差である。画像は、３匹の異なる動物からの試料で行われる試験の代表的なものである。
【図１２】未治療の８名のヒト及びゲンタマイシンで治療した８名のヒトからの尿中のＧＭ２活性化タンパク質（ＧＭ２ＡＰ）のレベルを示している図である。これらのヒトの性別、年齢、体重、血漿クレアチニン濃度、血漿尿素濃度、並びにクレアチニンクリアランスのＭＤＲＤ（ｍＬ／分）及びＣｏｃｋｒｏｆｔ−Ｇａｕｌｔ（ｍＬ／分）の推定も（わかる場合には）示している。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
ＧＭ２ＡＰの検出及び／又は定量によるＡＲＦの検出における上記で引用した改良は、例えば、血漿クレアチニン濃度、血液尿素窒素（ＢＵＮ）、タンパク質、例えばＮ−アセチル−ベータ−Ｄ−グルコサミニダーゼ（ＮＡＧ）などの尿排泄を決定することのように、背景技術で引用した方法から明らかである。この証拠については、実施例で示している。
【００１６】
さらに、本発明は、いくつかの予想外の又は驚くべき以下の作用を強調する：
一方では、尿の排泄は通常起こる必然の生理学的事実であるので、尿試料中でのＧＭ２ＡＰの検出は、患者にとってのさらなる利点を前提とする。この検出では、個体における侵襲性の試料採取を必要としない。
他方では、アミノグリコシド系抗生物質（ゲンタマイシン）の準毒性療法のラットへの投与は、第２の腎毒性物質、例えば硝酸ウラニルで処置した個体をＡＲＦに罹患しやすくし、この素質は、尿中のＧＭ２ＡＰの存在によって検出することができる。この事実は、これらの毒素に曝露したラットでは、プラセボを処置したラットに対して、血中のクレアチニン及び血液尿素窒素（ＢＵＮ）がより高濃度であること又は尿中タンパク質の排泄を確認して実証された。双方の化合物での共処置により、ゲンタマイシン及び硝酸ウラニルを連続した形態で投与するとき、及び双方の投与を休薬期間によって分離するときと同様に、血漿クレアチニン濃度の上昇が引き起こされることも本発明において実証している。
さらに、タンパク質ＧＭ２ＡＰは、個体の尿の試料において、ゲンタマイシンの毒性のある療法（本発明においてラットで用いる毒性用量は、１５０ｍｇ／ｋｇ／日である）を用いた治療の１日目から検出可能であるが、他の腎不全マーカー：クレアチニン、ＮＡＧ、タンパク尿、ＫＩＭ−１又はＰＡＩ−１は、同じ尿試料において、４日目に検出される。
【００１７】
したがって、本発明の第１の態様は、個体における、ＡＲＦを発症するリスクを決定するために、又はＡＲＦを決定するために有用なデータを用意する方法であって、
ａ．個体から生体試料を得るステップと、
ｂ．（ａ）で得られた試料において、配列番号１、又はその断片と少なくとも５０％同一なタンパク質を検出及び／又は定量するステップと
を含む方法に関する。
【００１８】
本発明において解釈される場合、「％同一」という用語は、２つのアミノ酸配列間の同一性の％を指す。この同一性の％は、２つの配列のアライメントの長さにわたり、その部位の全てのアミノ酸が同一である部位の数の総計である。
【００１９】
（ｂ）で検出及び／又は定量されるタンパク質は、配列番号１と少なくとも５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０又は９５％同一であり得る。
【００２０】
好ましい一実施形態において、（ｂ）で検出及び／又は定量されるタンパク質は、配列番号１と少なくとも７０％同一である。より好ましい一実施形態において、引用したタンパク質は配列番号１である。
【００２１】
本発明において解釈される場合、ＡＲＦという用語は、腎機能障害の任意の段階（又は重症度）にある急性腎不全を指し、又はＡＲＦという用語は急性腎障害も指す。ＡＲＦは、腎障害によって、又は原因が、例えば、遺伝的、免疫性、虚血性、若しくは任意の薬剤での治療であり得るが、これらに限定されない、任意の障害若しくは疾患によって引き起こされ得る。上述の腎障害又は任意の障害若しくは疾患は、例えば、これらに限定されないが、腎臓、前立腺、膀胱、尿管又は尿道における、外科的処置によっても引き起こされ得る。
【００２２】
該方法は、個体における、急性腎不全（ＡＲＦ）を発症するリスクを決定するために、又はＡＲＦを決定するために有用なデータを提供する。ＡＲＦを発症する最終段階のリスクはＡＲＦであり、したがって、該方法は、個体における双方の状態のＡＲＦに有用である。
【００２３】
アミノ酸配列の配列番号１は、Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ（ヒト）におけるタンパク質ＧＭ２ＡＰのアミノ酸配列、アクセス番号ＣＡＡ４３９９４である。
【００２４】
アミノ酸配列の配列番号１と少なくとも５０％の同一性を有するタンパク質（アミノ酸配列）は、アイソフォームであるか、又はいくつかの動物における配列番号１と相同なアミノ酸配列である。本発明の方法は、獣医学的目的のために適用することができる。この獣医学的目的は、例えば、これらに限定されないが、Ｅｑｕｕｓ ｃａｂａｌｌｕｓ、Ｂｏｓ ｔａｕｒｕｓ、Ｆｅｌｉｓ ｃａｔｕｓ又はＣａｎｉｓ ｌｕｐｕｓ ｆａｍｉｌｉａｒｉｓのような脊椎生物に適用することができる。脊椎生物は、魚の養殖における目的のために、魚種であってもよい。同一性の百分率は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）からのＢｌａｓｔｐによって選択された（表１を参照されたい）。
【表１】
【００２５】
アミノ酸配列の配列番号１と少なくとも５０％又は少なくとも７０％の同一性を有するいずれのタンパク質を指す場合も、又は配列番号１、若しくはその任意の断片を指す場合も、「本発明のタンパク質（１種又は複数）」という用語を以下で使用することにする。
【００２６】
本発明のタンパク質を検出及び／又は定量するために、前記タンパク質の１種又は複数の断片を検出することは、その断片はそのタンパク質のアミノ酸配列及び構造の構成要素であるので、十分である。
【００２７】
該方法のステップ（ｂ）は、本発明のタンパク質の検出及び定量、又はその検出若しくはその定量に関する。
【００２８】
本発明のタンパク質は、ヌクレオチド配列の発現の産物である。このヌクレオチド配列は、例えば、これらに限定されないが、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、又はその断片のような、任意のＲＮＡであってもよい。また、このヌクレオチド配列は、相補的なＤＮＡ（ｃＤＮＡ）又はその断片であってもよい。該ｃＤＮＡは、ｍＲＮＡと相補的なＤＮＡであるか、又はゲノム配列からのエキソンを含むがイントロンは含まないヌクレオチド配列、すなわち、コード配列でもある。遺伝子のゲノム配列及びそのｃＤＮＡの双方の転写は、同じｍＲＮＡをコードし、したがって、同じタンパク質をコードする。本発明において、タンパク質の代わりに又は同時に、任意のＲＮＡ若しくは任意のＤＮＡ、又はその断片を検出することも可能である。
【００２９】
他の好ましい一実施形態は、さらに、ステップ（ｂ）で得られたデータを標準値と比較して、任意の有意な偏差を見出すステップを含む、従来の方法に関する。本明細書中で使用される場合、「標準値」という用語は、例えば、ＡＲＦを発症していない個体から得られた生体試料において、本発明のタンパク質、又はその断片を検出及び／又は定量することに関するデータを指すが、これらに限定されない。
【００３０】
本明細書中で使用される場合、「有意な偏差」という用語は、単離された試料中にそのタンパク質が存在すること、又は単離された試料中で、健常な個体、すなわち、腎疾患の陰性対照からの試料に対して、本発明のタンパク質がより高濃度であることを指す。健常な個体は、１種又は複数の一般的な腎疾患マーカーのレベルの測定によって決定される。一般的なマーカーは、クレアチニン、血液尿素窒素又はタンパク尿であるが、これらに限定されない。
【００３１】
本発明の他の好ましい一実施形態において、該方法は、さらに、該有意な偏差を、該個体における、ＡＲＦを発症するリスクに、又はＡＲＦの発症に帰するステップを含む。したがって、この好ましい実施形態は、ＡＲＦを診断するため又は急性腎不全（ＡＲＦ）を発症するリスクを決定するための方法である。
【００３２】
生体試料は、生物の生理液及び／又は任意の細胞組織由来であってもよい、ヒト又は動物の身体などの生物から単離される試料である。
【００３３】
本明細書中で使用される場合、「ＡＲＦを発症するリスク」という用語は、ＡＲＦを患う又は発症する個体の素質を指す。したがって、該方法は、個体がＡＲＦを発症しているかどうか又は発症し得るかどうかを決定するために有用なデータを用意することに関する。実施例と共に、タンパク質ＧＭ２ＡＰ（配列番号１）は、ＡＲＦの極めて早期の段階で検出できることが実証され、これにより、ＡＲＦを発症するリスクとして、早期のＡＲＦの検出を可能にする。
【００３４】
本発明のさらに好ましい実施形態において、本発明のタンパク質、又はその断片は、例えば、これらに限定されないが、電気泳動、イムノアッセイ、クロマトグラフィー及び／又はマイクロアレイの技術などの方法によって検出及び／又は定量することができる。本発明のタンパク質の検出及び／又は定量は、従来技術の任意の組合せ又はその任意の組合せによって行うことができる。該タンパク質は、その存在又は欠如を評価して検出することができる。この検出は、任意のプローブ及び／又は任意の抗体による、該タンパク質の任意の断片の特異的な認識によって行うことができる。さらに、検出された本発明のタンパク質は、これらのデータを標準値と比較して任意の有意な偏差を見出すための基準としての役割を果たすように、定量することができる。この偏差は、急性腎不全を発症するリスク又はＡＲＦそれ自体であるとして解釈することができる。より好ましい一実施形態において、本発明のタンパク質、又はその断片は、電気泳動及び／又はイムノアッセイによって検出及び／又は定量することができる。
【００３５】
電気泳動は、電場の作用の結果として基質又は固体担体を通した、媒体（電気泳動緩衝液）中に溶解された高分子の運動又は移動に基づく分離の解析技術である。該分子の挙動は、その電気泳動移動度によって決まり、この移動度は、電荷、大きさ及び形によって決まる。使用される装置、担体及び条件に基づく、この技術の多数の変形が、分離を行うための物理化学において存在する。該電気泳動は、キャピラリー電気泳動、紙中での電気泳動、アガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点焦点化（焦点電気泳動）、又は２次元電気泳動を含むリストから選択される。
【００３６】
イムノアッセイは、生体液中の物質の濃度を、その抗原に対する抗体（単数）又は抗体（複数）の反応を使用して測定する生化学的な試験である。このアッセイは、抗体の、その抗原に対する特異的な結合を利用する。抗体又は抗原の量の検出は、多様な方法によって達成することができる。最も一般的なもののうちの１つは、抗原又は抗体のいずれかを標識することである。この標識は、酵素、放射性同位体（ラジオイムノアッセイ）、磁気標識（磁気イムノアッセイ）又は蛍光、及び凝集反応、比濁分析、濁度測定又はウエスタンブロットを含む他の技術も含み得るが、これらに限定されない。ヘテロジニアスイムノアッセイは、競合的であっても又は非競合的であってもよい。該イムノアッセイは、競合的であってもよい：その反応は、試料中の抗原の濃度に反比例することになる、又は非競合的であってもよい（「サンドイッチアッセイ」とも呼ばれる）：その結果は、抗原の濃度に正比例する。本発明において使用できるイムノアッセイ技術は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）である。
【００３７】
クロマトグラフィー技術によって、分子を、その電荷、大きさ又は分子量に基づいて、中でも、その極性又は酸化還元電位を通して、分離することができる。該クロマトグラフィー技術は、液体のクロマトグラフィー（分配クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、排除クロマトグラフィー、又はイオン交換クロマトグラフィー）、ガスクロマトグラフィー又は超臨界流体のクロマトグラフィーであってもよいが、これらに限定されない。
【００３８】
本発明のマイクロアレイ技術は、例えば、固体担体における、本発明のタンパク質を認識する分子の固定に基づいている。抗体マイクロアレイは、最も一般的なタンパク質マイクロアレイである。この場合、抗体は、タンパク質チップ（固体担体）上にスポット及び固定され、これらに限定されないが、生体試料、細胞溶解液、血清又は尿からのタンパク質を検出するための捕捉分子として使用される。本明細書中で使用される場合、「固体担体」という用語は、例えば、イオン交換樹脂又は吸着、ガラス、プラスチック、ラテックス、ナイロン、ゲル、セルロースのエステル、常磁性粒子又はこれらのうちのいくつかの組合せなどの多様な種類の物質を指すが、以前に言及されている物質に限定されない。
【００３９】
他の好ましい一実施形態では、本発明の方法のうち任意のもののステップ（ａ）からの生体試料は、体液である。該体液は、動物の身体から排泄又は分泌される液及び通常は排泄又は分泌されない液を含むこともある。該体液は、胎児を囲んでいる羊水、房水、血液、血漿、間質液、リンパ、母乳、粘液（鼻水及び痰を含む）、唾液、皮脂（皮膚油）、血清、汗、涙又は尿であってもよいが、これらに限定されない。本発明のタンパク質は、例えば、これらに限定されないが、細胞又は小胞のように、言及した体液中に存在する任意の生物学的区画中にあってもよい。より好ましい一実施形態において、該体液は尿である。
【００４０】
本発明のさらに好ましい一実施形態は、ＡＲＦを発症するリスク、又はＡＲＦが、少なくとも１種の腎毒性物質の投与又はそれに対する曝露に起因する場合の方法に関する。この腎毒性物質は、長期間にわたるものであっても又は単回の事象に限定されるものであってもよい投与又は曝露のレベルに起因し、且つ単一又は複数の化合物に起因してもよい、１種又は複数の腎臓の病変を引き起こし得る。曝露の状況は、不注意による過剰投与、偶発的な過剰投与、意図的な過剰投与、又は治療上必要なもの（投与）であってもよい。腎臓は、主要な排泄の器官であり、水溶性分子に対する恒常性を維持するので、能動的に特定の物質を濃縮することができる。一般に、近位尿細管及び遠位尿細管並びに尿路上皮は修復することができるが、糸球体及び髄質は著しく低級の修復機構を有し得る。
【００４１】
該腎毒性物質は、投与される場合には、医薬組成物（治療用物質）であってもよく、或いは、これらに限定されないが、ハロゲン化麻酔剤又は機能食品、又はビタミン補足物、若しくは栄養補足物に含まれる化合物であってもよい。該腎毒性物質は、個体が曝露される場合には、さらに、重金属、農薬又は抗菌剤などの化学物質であってもよいが、これらに限定されない。該農薬は、殺真菌剤、除草剤、殺虫剤、除藻剤、軟体動物駆除剤、ダニ駆除剤又は殺鼠剤であってもよいが、これらに限定されない。該殺虫剤は、殺菌剤、抗生物質、抗菌剤、抗ウイルス剤、抗真菌剤、抗原虫剤又は抗寄生虫剤であってもよいが、これらに限定されない。
【００４２】
本発明の任意の方法のさらに好ましい実施形態において、該腎毒性物質はアミノグリコシド系抗生物質である。アミノグリコシドは、例えば、細菌の３０Ｓ又は５０Ｓのリボゾームサブユニットに結合することによって、ペプチジル−ｔＲＮＡの移動を阻害して、さらにｍＲＮＡの誤読も引き起こし、細菌が増殖に不可欠なタンパク質を合成できないようにしておく働きをする。該アミノグリコシド抗生物質は、アミカシン、アルベカシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ネオマイシン、ネチルマイシン、パロモマイシン、ロドストレプトマイシン、ストレプトマイシン、トブラマイシン、アプラマイシン、スペクチノマイシン、ハイグロマイシンＢ、ベルダマイシン、アストロマイシン又はピューロマイシンであってもよいが、これらに限定されない。より好ましい一実施形態において、該アミノグリコシド系抗生物質はゲンタマイシンである。
【００４３】
ゲンタマイシンは、好気性グラム陰性菌の感染を治療するために一般的に使用される、広範囲に効能があるアミノグリコシド系抗生物質である。アミノグリコシドは、経口投与であまり吸収されないが、腎臓によって急激に排泄される。一方、アミノグリコシドは、外膜にあるポーリンチャネルを通して細菌細胞内に拡散し、次いで、細胞質を越えて輸送される。結果として、ゲンタマイシンは、細菌のタンパク質合成を妨げることによって作用するが、近位曲尿細管上に、特に、Ｓ１及びＳ２分節に、ＡＲＦに発展し得る、腎臓障害を引き起こすこともある。
【００４４】
本発明において実証するように、ＡＲＦは、同様に、同時又は連続の第２の腎毒性物質の投与に起因し得る。この第２の化合物は、硝酸ウラニルであり得る。実施例において引用しているように、（例えば、硝酸ウラニルのような）第２の腎毒性物質を準毒性用量で投与したときに腎毒性が生じるので、ゲンタマイシンを用いた準毒性療法は、個体がＡＲＦを発症しやすくなるようにさせる。この腎毒性は、ゲンタマイシンの単回投与直後に、硝酸ウラニルの単回投与を、生理食塩液の単回投与と比較して、追加するだけで実証される。この腎毒性作用は、血漿クレアチニン濃度、血液尿素窒素（ＢＵＮ）、全タンパク質又は特定のタンパク質（Ｎ−アセチル−グルコサミニダーゼ：ＮＡＧ）の尿中排泄、又はクレアチニンクリアランスを測定することによって実証される。
【００４５】
本発明において解釈される場合、「準毒性用量」という用語は、腎疾患の１種又は複数の一般的なマーカーのレベルが腎疾患の陰性対照のレベルに対して有意な偏差を示さないような方法で、個体において任意の療法で投与される１種又は複数の用量を指す。一般的なマーカーは、クレアチニン、血液尿素窒素又はタンパク尿であってもよいが、これらに限定されない。
【００４６】
双方の化合物（ゲンタマイシン及び硝酸ウラニル）で同時に個体を共処置することにより、双方の化合物を連続して投与するとき、双方の投与を休薬期間によって、例えば１週間、分離するときと同様に、血漿クレアチニン濃度の上昇が引き起こされることも本発明において実証している。
【００４７】
本発明のタンパク質は、抗腫瘍剤として他の腎毒性薬剤、例えば、これに限定されないが、シスプラチンで個体を治療したときに、尿中でも検出される。また、本発明のタンパク質は、個体を硝酸ウラニルのみで治療したときにも検出される。
【００４８】
シスプラチンは、精巣、卵巣、膀胱、皮膚、頭頸部、及び肺の腫瘍を治療するために一般的に使用される、広範囲に効能がある抗腫瘍剤である。シスプラチンは、細胞内に拡散して、細胞にとって致命的な、ＤＮＡのストランド間及びストランド間の架橋によって作用する。硝酸ウラニルは、重症の腎不全及び急性尿細管壊死を引き起こす腎毒性の高い作用剤である。他の標的臓器としては、肝臓、肺又は脳などが挙げられる。
【００４９】
本発明の方法の他の好ましい一実施形態において、本発明のタンパク質は、腎毒性物質の投与又はそれに対する曝露の開始から１２時間後に検出される。したがって、本発明のタンパク質は、急性腎不全の早期のマーカーとして、主に、限定されないが、ＡＲＦが少なくともアミノグリコシド系抗生物質ゲンタマイシンの投与に起因するときに、使用することができる。この場合、実施例で示すように、ゲンタマイシンをラットに１５０ｍｇ／ｋｇ／日で７日間投与したときに、血漿クレアチニン濃度、クレアチニンクリアランス、ＮＡＧ排泄、タンパク尿、並びに腎障害分子１（ＫＩＭ−１）及びプラスミノーゲン活性化因子阻害因子１（ＰＡＩ−１）の尿中レベルの段階的変化は、４日目から有意に増大したのに対し、該タンパク質である配列番号１は、毒性作用出現の少なくとも３日前に検出された。個体からの尿試料において、毒性作用の出現は、上記に引用したパラメータを測定することによって検出される。
【００５０】
他の好ましい一実施形態では、本発明のタンパク質は、腎毒性物質の投与又はそれに対する曝露の開始以後２４時間から検出され得る。実施例に示すように、ゲンタマイシン（１５０ｍｇ／ｋｇ／日）の投与の開始から最初の２４時間後に、該タンパク質は、ウエスタンブロットアッセイによって十分に明らかなレベルで検出される。
【００５１】
本発明の第２の態様は、少なくとも１種の腎毒性物質の投与又はそれに対する曝露に起因するＡＲＦの進行を予測する方法であって、該腎毒性物質に曝露された又は曝露されていない、配列番号１、又はその断片と少なくとも５０％同一なタンパク質の第１の濃度を決定するステップ、曝露された個体では引用したタンパク質の第１の濃度を決定した後に、又は曝露されていない個体では該腎毒性物質の投与又はそれに対する曝露の開始後に、（ａ）の個体から単離された体液において、本発明のタンパク質の第２の濃度を決定するステップを含む方法に関する。すなわち、腎毒性物質に曝露された個体からの試料において第１の濃度の決定を行う場合には、第２の濃度は第１の濃度の決定後に決定し、腎毒性物質に曝露されていない個体からの試料において第１の濃度の決定を行う場合には、第２の濃度は曝露していない個体における腎毒性物質の投与又は曝露の開始後に決定する。次いで、前記第２の濃度を前記第１の濃度と比較して、任意の有意な偏差を探す。有意な偏差は、前記第２の濃度を前記第１の濃度と比較したとき、又は何らかの有意な偏差を以前の濃度の決定と比較したときに、上昇又は低下した値という意味であってもよい。
【００５２】
本発明において、「進行の予想」という用語は、本明細書中で使用される場合、ＡＲＦの進行のモニタリングの結論、すなわち、この病変の進行についての告知を指す。
【００５３】
本発明の好ましい実施形態は、少なくとも１種の腎毒性物質の投与又はそれに対する曝露に起因するＡＲＦの進行を予測する方法に関し、このとき、前記タンパク質は配列番号１と少なくとも７０％同一である。より好ましい一実施形態において、前記タンパク質は配列番号１である。
【００５４】
ＡＲＦの進行を予測する方法の他の好ましい一実施形態において、該腎毒性物質はアミノグリコシド系抗生物質であり、より好ましい一実施形態において、該アミノグリコシド系抗生物質はゲンタマイシンである。
【００５５】
さらに好ましい実施形態は、該体液が尿である、ＡＲＦの進行を予測する任意の方法に関する。
【００５６】
急性腎不全（ＡＲＦ）を発症するリスクを決定するために、若しくはＡＲＦを決定するために有用なデータを用意する方法のいずれに関しても、又はＡＲＦの進行を予測する方法のいずれに関しても、「本発明の方法（１種又は複数）」という用語を使用することにする。
【００５７】
さらに好ましい一実施形態によると、本発明の方法の個体はヒトである。上記にもかかわらず、引用した方法は獣医学的目的において有用となり得るので、本発明の方法の個体は動物であってもよい。
【００５８】
化合物に曝露された又はされていない、障害又は損傷を受けた細胞集団を、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏでアッセイすることもできる。例えば、新たに単離された腎細胞の細胞集団、特に、ラットの腎細胞。別のアッセイ形態では、ｉｎ ｖｉｖｏでの曝露は、生きている動物、例えば実験用ラットに対する腎毒性物質の投与によって達成されてもよい。
【００５９】
本発明の第３の態様は、ＡＲＦを発症するリスクを決定するため、又はＡＲＦを決定するため、又はＡＲＦの進行を予測するためのバイオマーカーとしての、配列番号１、又はその断片と少なくとも５０％同一なタンパク質の使用に関する。
【００６０】
このバイオマーカーは、ＡＲＦのリスク又は進行と、若しくは所与の処置に対する疾患のかかりやすさと関連する、又は個体におけるＡＲＦの存在とも関連する、タンパク質の発現又は状態における変化を示す。提案されたバイオマーカーの有効性が認められれば、それを使用して、疾患のリスク、個体における疾患の存在を診断することができるようになり、又は個体における疾患に合わせて治療を調整すること、例えば、薬剤治療又は投与療法の選択などができるようになる。ＡＲＦを患うリスクに直結する、該バイオマーカーの存在又は検出される量が治療によって変化する場合に、該バイオマーカーは、任意の腎毒性物質に対する任意の治療又は曝露を加減するためのレポーターとしての役割を果たす。
【００６１】
好ましい一実施形態は、前記タンパク質が、配列番号１、又はその断片と少なくとも７０％同一である場合の使用に関する。より好ましい一実施形態において、前記タンパク質は配列番号１である。
【００６２】
好ましい一実施形態は、ＡＲＦを発症するリスク、又はＡＲＦ、又はＡＲＦの進行が、少なくとも１種の腎毒性物質の投与に起因するものである、本発明のタンパク質の使用に関する。さらに好ましい実施形態において、該腎毒性物質はアミノグリコシド系抗生物質であり、例えば、該アミノグリコシド系抗生物質はゲンタマイシンである。
【００６３】
本発明のさらなる他の態様は、個体におけるＡＲＦを発症するリスクを決定するために、若しくはＡＲＦを決定する（ＡＲＦを診断する）ために、又は個体におけるＡＲＦの進行を予測するために有用なデータを用意するためのキットであって、本発明の任意の方法を行うための試薬を含むキットである。該試薬は、本発明のタンパク質の検出及び／又はその定量を可能にするものでなければならない。このキットは、検出溶液をさらに含んでいてもよい。
【００６４】
本発明の好ましい一実施形態は、上記のようなキットであり、このとき、該試薬は、少なくとも、配列番号１、又はその断片と少なくとも５０％同一なタンパク質を認識するための１種又は複数のプローブである。プローブは、本発明のタンパク質又はその任意の断片を検出、識別及び／又は定量するために、通常は（必須ではないが）標識されて使用される物質である。該プローブは、フルオロフォア、チオール反応性プローブ、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、ペプチン又は抗体であってもよいが、これらに限定されない。さらに、該プローブは、例えば、リソソーム酵素であるβ−ヘキソサミニダーゼＡ、及び／又はガングリオシドＧＭ２、若しくは末端Ｎ−アセチルヘキソサミンを含む他の分子のような、特異的分子結合であってもよい。ＧＭ２ＡＰは、リソソーム酵素であるβ−ヘキソサミニダーゼＡの基質特異的補因子として働く小さな糖脂質輸送タンパク質であるので、この酵素はプローブとしての役割を果たすことができ、β−ヘキソサミニダーゼＡは、ＧＭ２ＡＰと共に、ガングリオシドＧＭ２、及び末端Ｎ−アセチルヘキソサミンを含む他の分子の分解を触媒し、この理由のために、ＧＭ２、又は末端Ｎ−アセチルヘキソサミンを含む他の分子は、可能性があるプローブの基質として又はさらにプローブとして働き得る。
【００６５】
好ましい一実施形態は、配列番号１、又はその断片と少なくとも５０％同一な該タンパク質が、配列番号１と少なくとも７０％同一なタンパク質である、キットに関する。より好ましい一実施形態において、前記タンパク質は配列番号１である。
【００６６】
さらに好ましい一実施形態は、該プローブが固体担体に結合されている、キットに関する。この固体担体は、ゲル、例えば、アガロース又はポリアクリルアミドのゲルであることが好ましい。
【００６７】
より好ましい一実施形態において、該プローブは、本発明のタンパク質、又はその断片を認識するために使用される抗体である。該抗体は、モノクローナル又はポリクローナルであってもよい。さらにより好ましい一実施形態において、該抗体によって認識される該タンパク質からの断片は、配列番号２である。
【００６８】
他に定めがない限り、本明細書中で使用される技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者のうちの一人によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本発明の実施において、本明細書中に記載したものと同様又は同等の方法及び材料を使用することができる。本明細書及び特許請求の範囲の全体にわたり、「含む」という単語及びその変形は、他の技術的特徴、添加剤、成分、又はステップを排除することを意図するものではない。本発明のさらなる目的、利点及び特徴は、当業者には本明細書の検査を行うとすぐに明らかとなるであろうし、又は本発明の実施によってわかることもある。以下の実施例、図面及び配列表は、実例として提供されるものであって、本発明を限定することを意図するものではない。
【実施例】
【００６９】
以下の実施例は、下記に示すリスト中で請求する、ＧＭ２ＡＰの検出、並びにＡＲＦ、及び急性腎不全のリスクを検出するバイオマーカーとしてのその使用に関するいくつかのアッセイ及び操作条件についての、例示的且つ非限定的な性質の、説明を提供する。
【００７０】
実施例１．方法及び試薬。
１．１．動物及び試験のプロトコール。
【００７１】
ケージ飼育の、体重１９０〜２３０ｇの雌のＷｉｓｔａｒラットを、以下の試験群に分けた（図１）：（ｉ）対照：１日１回、生理食塩水（０．９％ＮａＣｌ）で７〜１３日間腹腔内に処置したラット、（ｉｉ）Ｇ−５０：５０ｍｇ／ｋｇ／日のゲンタマイシンで６日間処置したラット、（ｉｉｉ）Ｇ−５０−ＮＵ：５０ｍｇ／ｋｇ／日のゲンタマイシンで６日間処置し、７日目に０．５ｍｇ／ｋｇの硝酸ウラニルの単回腹腔内投与で処置したラット、（ｉｖ）ＮＵ：生理食塩水（０．９％ＮａＣｌ）で１日１回６日間腹腔内に処置し、７日目に０．５ｍｇ／ｋｇの硝酸ウラニルの単回腹腔内投与で処置したラット、（ｖ）Ｇ−５０＋ＮＵ：５０ｍｇ／ｋｇ／日のゲンタマイシンで６日間処置し、且つ１日目に０．５ｍｇ／ｋｇの硝酸ウラニルの単回腹腔内投与で処置したラット、（ｖｉ）Ｇ−５０−ｒ−ＮＵ：５０ｍｇ／ｋｇ／日のゲンタマイシンで６日間処置して、１週間処置のないままにし、次いで、０．５ｍｇ／ｋｇの硝酸ウラニルの単回腹腔内投与で処置したラット、（ｖｉｉ）Ｇ−１５０：１５０ｍｇ／ｋｇ／日のゲンタマイシンで６日間処置したラット。
【００７２】
全ての試験について、ラットは、温度及び湿度を調節した条件下の代謝ケージ中に個別に配置した。動物は、規則的な食事及び飲料水を自由に食べることができるようにさせた。異なる時に、２４時間の尿及び血液の試料を得た。尿は、混入及び蒸発を防止するために、１００μＬの０．１％アジ化ナトリウム及び１ｍｌの油を補った目盛をつけた容器中にそれぞれ採取した。続いて、尿を、１，１７５×ｇでの遠心分離によって透明にし、分注して−８０℃で保存した。血液は、尾部での小切開から採血し、ヘパリン処理したキャピラリー中に採取した。これらの血液を、１２，０００×ｇで直ちに遠心し、血漿を−８０℃で保存した。試験終了時に、ラットをペントバルビタールナトリウム（１０ｍｇ／ｋｇ）で麻酔した。腎臓を、腹大動脈を通してヘパリン処理した生理食塩水で潅流させて、直ちに解剖した。右腎と左腎の半分とを、液体窒素中での浸漬によって速やかに凍結させ、−８０℃で保存した。最終的に、これらをウエスタンブロット試験に使用した。こうした目的のために、ハンマーでの粉砕によって、微細な粉末が得られるまで、凍結組織を凍結条件下で均質化した。この粉末も、−８０℃で維持した。もう１つの半分の残された腎臓を、３．７％パラホルムアルデヒド中に４℃で１４〜１６時間浸漬した。その後、組織試料を、免疫組織化学試験用に処理した。
【００７３】
１．２．ｉｎ ｖｉｖｏでのゲンタマイシンの潅流。
ゲンタマイシンは、Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈによって好意的に提供された。硝酸ウラニルは、Ｓｉｇｍａから得た。他に指示がない場合、他の全ての試薬は、Ｓｉｇｍａから購入した。
【００７４】
ケージ飼育の、体重１９０〜２３０ｇの雌のＷｉｓｔａｒラットをペントバルビタールナトリウム（１０ｍｇ／ｋｇ）で麻酔した。右頸静脈及び膀胱にカテーテルを挿入した。１．５ｍＬのゲンタマイシン（１５０ｍｇ／ｋｇ）又は生理食塩水（０．９％ＮａＣｌ、対照として）の単回ボーラス投与を１．５ｍＬ中で頸静脈を通して３０分間潅流させた。その後、異なる各時点で、尿を採取した。尿を、（上記のように）遠心分離によって透明にし、後の使用のために−８０℃で維持した。
【００７５】
１．３．腎機能の特徴付け。
３２μＬの血漿及び尿を使用して、血漿及び尿のクレアチニン濃度及び血液尿素窒素（ＢＵＮ）を、自動解析システム（レフロトロン（Ｒｅｆｌｏｔｒｏｎ）（登録商標）、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｂａｒｃｅｌｏｎａ、Ｓｐａｉｎ）及び市販の反応性のストリップ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｂａｒｃｅｌｏｎａ、Ｓｐａｉｎ）によって決定した。この方法は、クレアチニンに対して０．５ｍｇ／ｄＬのより低い検出限界を有する。０．５ｍｇ／ｄＬ未満のクレアチニンの値を示す試料は、Ｊａｆｆｅの比色法（Ｈｅｒｖｅｙ、１９５３．Ｎａｔｕｒｅ、１７１：１１２５）によって接戦の再試験を行った。
【００７６】
クレアチニンクリアランス（Ｃｌｃｒ、ｍＬ／分）は、以下の式を使用して算出した：Ｃｌｃｒ＝ＵＦ×Ｃｕ／Ｃｐ、［式中、ＵＦは２４時間の尿流（ｍＬ／分で表される）であり、Ｃｕは尿中のクレアチニンの濃度であり、且つＣｐは血漿のクレアチニンの濃度である］。
【００７７】
尿中タンパク質濃度（ｍｇ／ｍＬ）は、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法（３９）によって測定した。１日のタンパク質排泄（ｍｇ／日）は、尿中タンパク質濃度と２４時間の尿流（ｍＬ／日）を乗算することによって得た。
【００７８】
尿中ＮＡＧ活性（任意単位、ＡＵ／ｍＬ）は、尿中ＮＡＧ濃度の推定値として、市販の酵素試験（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｂａｒｃｅｌｏｎａ、Ｓｐａｉｎ）によって製造業者の説明書に従って測定した。尿中ＮＡＧ活性は、尿中ＮＡＧ活性と２４時間の尿流（ｍＬ／日）を乗算することによって１日のＮＡＧ排泄（ＡＵ／日）に変換した。
【００７９】
１．４．抗ＧＭ２活性化タンパク質ポリクローナル血清の調製。
抗ＧＭ２ＡＰ血清の調製のために、架橋剤である４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸３−スルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルナトリウム塩（スルホ−ＳＭＣＣ）及びＮ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ、いずれもＳｉｇｍａ−Ａｌｄｈｒｉｃｈから）による、免疫原性タンパク質であるブルーキャリアー（ｂｌｕｅ ｃａｒｒｉｅｒ）（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）に対するコンジュゲート化を可能にするためにアミノ末端にシステインを加えた、ラット及びヒトのＧＭ２ＡＰ部分ペプチド配列である配列番号２に該当する合成の免疫原を、雌のニュージーランドホワイトウサギに注射した。フロイントアジュバント中の合成ペプチドを用いて、１、１４、３６及び５８日目に免疫化を行った。６３日目に、麻酔下でウサギを放血させた。この血清を、ＨｉＴｒａｐ ＴＭ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ ＨＰカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＡＢ；Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）に通して精製し、さらなる使用のために−２０℃で維持した。
【００８０】
１．５．免疫組織化学試験。
腎臓を、ｐ−ホルムアルデヒド中に４℃で一晩維持した。次いで、パラフィンブロックを作製し、５μｍの組織切片を切り分けて、ヘマトキシリン及びエオシンで染色した。Ｏｌｙｍｐｕｓ ＤＰ７０カラーデジタルカメラに連結したＯｌｙｍｐｕｓ ＢＸ５１顕微鏡下で写真を撮った。
【００８１】
１．６．ウエスタンブロッティング。
タンパク質抽出物を、１００ｍｇの組織ホモジェネート粉末から得て、均質化緩衝液（１４０ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ トリス−ＨＣＩ ｐＨ＝７．５、０．５Ｍ エチレンジアミン四酢酸−ＥＤＴＡ−、１０％ グリセロール、１％ イゲパル（Ｉｇｅｐａｌ） ＣＡ−６３０、１μｇ／ｍＬ アプロチニン、１μｇ／ｍＬ ロイペプチン、１μｇ／ｍＬ ペプスタチンＡ、１ｍＭ フッ化フェニルメチルスルホニル−ＰＭＳＦ−）中、４℃で組織ミキサー（Ｕｌｔｒａ−Ｔｕｒｒａｘ Ｔ８、ＩＫＡ（登録商標）−Ｗｅｒｗｅ）で腎臓を均質化することによって調製した。組織ホモジェネートを、２２，０００ｇで４℃で１５分間遠心分離した。上清を回収した。Ｌｏｗｒｙ法に基づく市販のキット（ＢｉｏＲａｄ）でタンパク質濃度を測定した。組織抽出物からの５０μｇの全タンパク質又は各試料からの２０μＬの透明にした尿を、１０〜１５％アクリルアミドゲル（Ｍｉｎｉ Ｐｒｏｔｅａｎ ＩＩ ｓｙｓｔｅｍ、ＢｉｏＲａｄ）中で電気泳動によって分離した。直ちに、タンパク質を、イモビロン−Ｐ（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ）メンブレン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に電気的に転写した。非特異的結合を防止するために膜をブロッキングした後に、ＫＩＭ−１（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、骨形成タンパク質−７（ＢＭＰ−７、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、プラスミノーゲン活性化因子阻害因子−１（ＰＡＩ−１ 、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ビメンチン（Ｄａｋｏ Ｄｅｎｍａｒｋ）及びＧＭ２活性化タンパク質（ＧＭ２ＡＰ、上記を参照されたい）に対する抗体で膜をプローブした。
【００８２】
１．７．尿プロテオミクス解析。
尿を、遠心力による濾過によってアミコンウルトラ（Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ）５Ｋカットオフカラム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を通して濃縮及び脱塩した。Ｂｒａｄｆｏｒｄ法によってタンパク質濃度を決定した。製造業者の説明書に従ってクリーン−アップ（Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ）キット（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて尿タンパク質を沈殿させた。各試料からの１００ｍｇのタンパク質を、７Ｍの尿素、２Ｍのチオ尿素、４％（ｗ／ｖ）のＣｈａｐｓ、０．５％の両性電解質ｐＨ４〜７又は４．５〜５．５、５０ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）及びブロモフェノールブルーに再水和させ、ＩＰＧｐｈｏｒ装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、長さ１８ｃｍの固定ｐＨ勾配（ＩＰＧ）ストリップ、ｐＨ４〜７又は４．５〜５．５（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｍａｄｒｉｄ、Ｓｐａｉｎ）を通して等電に集中させた（５００〜８，０００Ｖ）。ＩＰＧストリップを、１％（ｗ／ｖ）ＤＴＴを含む平衡化緩衝液［５０ｍＭトリス−ＨＣＩ ｐＨ＝８．８、６Ｍ尿素、３０％（ｖ／ｖ）グリセロール、２％（ｗ／ｖ）ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．０１％（ｗ／ｖ）ブロモフェノールブルー］中で１５分間、且つ２．５％（ｗ／ｖ）のヨードアセトアミドを含む平衡化緩衝液中でさらに１５分間予め平衡化した。次いで、ＩＰＧストリップを、長さ１８ｃｍの１２％アクリルアミドゲルに移して、ＳＥ ６００ Ｒｕｂｙ装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で電気泳動によって分離した。ゲルを、３０％エタノール、１０％酢酸中で一晩固定し、市販のキット（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて銀染色した。他に指示がない限り、全ての試薬はＳｉｇｍａからのものである。
【００８３】
可視化及び解析のために、染色したゲルをスキャンして（Ｉｍａｇｅ Ｓｃａｎｎｅｒ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｍａｄｒｉｄ、Ｓｐａｉｎ）、イメージマスター２Ｄプラチナ（Ｉｍａｇｅ Ｍａｓｔｅｒ ２Ｄ Ｐｌａｔｉｎｕｍ）６．０ソフトウェア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｍａｄｒｉｄ、Ｓｐａｉｎ）で処理及び統計学的解析を行った。以下のパラメータを用いてスポットの判別を行った：（ｉ）平滑係数：２；（ｉｉ）最小面積：５ピクセル；（ｉｉｉ）顕著性：１００。人為現象を排除するために、解析を視覚的に修正した。個々の各スポットについて、バックグラウンドを減算して、個々の強度体積を全強度体積（全スポット強度）によって標準化した。ゲル間の同じスポットを比較する場合には、示差的な発現とみなすために、最低２倍の強度の相違を設定した。（それぞれ）１Ｄ及び２Ｄの分離からの目的のバンド及びスポットをゲルから切断した。それぞれのゲル断片をアセトニトリル中で乾燥させ、これを真空ポンプで蒸発させて、ＮＨ４ＨＣＯ３に再懸濁した。２Ｄ−ＣＦ画分も真空蒸発させて、残留物をＮＨ４ＨＣＯ３に再懸濁した。したがって、１Ｄ、２Ｄ及び２Ｄ−ＣＦからの試料について、同一の処理をした。これらを、５０ｍＭのＮＨ４ＨＣＯ３中、５６℃で１０ｍＭのＤＴＴを用いて還元し、５０ｍＭのＮＨ４ＨＣＯ３中、ヨードアセトアミドでアルキル化した。次いで、このタンパク質を、ブタのトリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて４℃で３０分間ゲル中で消化させてペプチドにした。続いて、０．５％（ｖ／ｖ）のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）でペプチドを抽出した。この溶液を真空蒸発させて、ペプチドを０．１％（ｖ／ｖ）のギ酸に超音波処理下で溶解した。ペプチド含有溶液を、ａｎ１１００マイクロＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を備えたＬＣ−ＥＳＩ−ＱＵＡＤ−ＴＯＦ質量分光計ＱＳＴＡＲ ＸＬ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）内に注入した。大孔径１５０×０．３２ｍｍ（５μｍ）のスペルコ（Ｓｕｐｅｌｃｏ）カラム（Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ＢＩＯ）を７μＬ／分の流速で使用した。ＭＳ／ＭＳスペクトルを得た。タンパク質同定は、非重複性のタンパク質配列データベース（Ｓｗｉｓｓ Ｐｒｏｔ及びＮＣＢＩ）に対してＭＡＳＣＯＴソフトウェアを用いて行った。質量誤差範囲は５０ｐｐｍに、ＭＳ／ＭＳ誤差範囲は０．５Ｄａに、分類学的位置はラットに設定した。ＭＡＳＣＯＴ確率解析によって同定されるような、有意なヒットのみを考慮し、２０を超えるイオンスコアで適合する少なくとも１種のペプチドを、許容の閾値として設定した。ＬＣ−ＥＳＩ−ＱＵＡＤ−ＴＯＦ法により明確なタンパク質同定が得られないいくつかの場合には、又は（確認のために）無作為に選択したスポットでは、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｄａｄ ｄｅ Ｓａｌａｍａｎｃａ−ＣＳＩＣ（Ｓａｌａｍａｎｃａ、Ｓｐａｉｎ）のＣｅｎｔｒｏ ｄｅ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｃｉｏｎ ｄｅｌ ＣａｎｃｅｒのＰｒｏｔｅｏｍｉｃ Ｓｅｒｖｉｃｅによって、Ｕｌｔｒａｆｌｅｘ Ｉ ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分光計（Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ）を用いて、タンパク質を同定した。
【００８４】
ゲンタマイシン療法下ですでに２日又は３日の過程にある、ヒトの入院している個人からの尿試料を、Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｒｉｏ ｄｅ Ｓａｌａｍａｎｃａから得た。対照として、ゲンタマイシンを投与していない、年齢及び性別が適合した個人からの尿を使用した。
【００８５】
実施例２．結果。
ここで示す結果の主体は、以下を実証することを意図するものである。（ｉ）５０ｍｇ／ｋｇのゲンタマイシンを１日１回で６回投与する療法では、試験したいずれのパラメータによっても、いかなる腎損傷又は腎機能障害も誘発されない；（ｉｉ）これにもかかわらず、この準腎毒性療法は、第２の腎毒素の毒性の閾値を低下させることによって、ラットがＡＲＦを発症しやすくなるようにさせる；結果として、ゲンタマイシンによって罹患しやすくされたラットでは、準腎毒性用量のこの第２の腎毒素はＡＲＦの引き金となるが、未処置のラットではならない；（ｉｉｉ）（対照と比較した）Ｇ−５０動物からの尿についてのディファレンシャルプロテオミクスのアプローチを通して、この状態を検出する、尿中タンパク質（すなわち、ガングリオシドＧＭ２活性化タンパク質、ＧＭ２ＡＰ）を同定した；（ｉｖ）この新しい尿中バイオマーカーは、このこれまで隠されていた素因的状態の検出のためだけではなく、ゲンタマイシンによって誘発された急性腎損傷の極めて早期のマーカーとしても使用することができる。
【００８６】
２．１．腎毒性作用のないゲンタマイシン療法の選択。
予備試験において、ゲンタマイシンの腎毒性作用に対する用量の関係をＷｉｓｔａｒラットで段階的に調べた（データは示していない）。結果として、５０ｍｇ／ｋｇ／日を１日１回で６回投与した療法（Ｇ−５０）では、腎毒性の徴候は生じなかったが、１５０ｍｇ／ｋｇ／日を１日１回で６回投与する療法（Ｇ−１５０）では、本発明者らの全測定値の陽性対照として役割を果たす顕著な腎不全が引き起こされたことが結論づけられた。図１〜４は、生理食塩水を投与した対照ラット（Ｃ）と比較した、腎機能及び形態に対する、Ｇ−５０及びＧ−１５０の療法の作用の詳細な特徴付けを示している。これらの試験より、Ｇ−５０療法は、動物の一般的な健康状態に対する有害作用、並びに、（ｉ）臨床診療において使用されるパラメータ、及び（ｉｉ）より深く腎臓の状態を特徴付ける他のもの、によって測定されるような、特定の腎毒性の徴候を１つも及ぼさないことが明らかに実証される。
【００８７】
図１より、Ｇ−５０下の動物は、対照動物と同様な生存率及び体重の段階的変化を示すことが示唆され、毒性は有意でなかったことが示唆される。これに対して、Ｇ−１５０下の動物は、約５０％の死亡率、及び重篤な健康悪化を表す体重減少を示した。処置中止後（８日目以降）、いずれの群からの動物も死亡しなかった。
【００８８】
図２のデータより、対照ラットと比較して、Ｇ−５０ラットでは、ＧＦＲの状態に関連する臨床上使用されるパラメータ（すなわち、血漿クレアチニン濃度及びＢＵＮ濃度）が変化しなかったが、Ｇ−１５０群では、これらが著しく変化した（パネルＡ及びＢ）ことが示唆される。ゲンタマイシンによって誘発された腎障害の中で、タンパク尿は、主に尿細管由来であると考えられる（参考）。したがって、パネルＣより、Ｇ−５０動物は（対照のものと比較して）タンパク尿を示さないが、Ｇ−１５０動物は明白なタンパク尿を有することが示される。これは、極めて感度の高い尿細管障害のマーカー（参考）である、尿中ＮＡＧ排泄が、Ｇ−５０において変化せず、Ｇ−１５０において極めて増加している、パネルＤからのデータと合致している。これらのデータより、Ｇ−５０療法による腎機能の変化は認められないが、Ｇ−１５０処置の結果として明白な急性腎不全が生じることが示唆される。この後者は、これらの動物において認められる５０％死亡率及び健康悪化と合致している。
【００８９】
図３の画像は、Ｇ−１５０療法により、腎実質が、広範な尿細管壊死（パネルＣ）を主な特徴とする、集中的な損傷を負わされることを示している。しかし、Ｇ−５０群において、対照群と比較した、肉眼的な組織変化は検出されなかった。
【００９０】
さらに、腎組織ホモジェネートのウエスタンブロット解析（図４）により、Ｇ−１５０群において、ＰＡＩ−１、ＫＩＭ−１及びビメンチンのような、組織損傷及び修復に関連するマーカーの明らかな増加が示される。しかし、Ｇ−５０からの試料において、対照群からのものと比較した、これらのマーカーの増加は認められなかった。
【００９１】
図３で示した組織学的結果と合わせて、組織マーカー解析より、Ｇ−５０療法は腎臓に組織損傷を引き起こさないという考えが補強される。
２．２．ゲンタマイシンを用いた準毒性療法は急性腎不全の発症の素因となる。
【００９２】
この節における結果の主体は、準毒性Ｇ−５０療法により、可能性がある第２の腎毒素を投与したときに（未処置のラットに対する準毒性用量での場合）、ラットが急性腎損傷を発症しやすくなることを実証することを意図するものである。準毒性のゲンタマイシンによって誘発されるこの素質は、ゲンタマイシン治療中に生じ、治療中止後少なくともさらに１週間続く。
【００９３】
図５は、ラットに腎毒素である硝酸ウラニル（ＵＮ、０．５ｍｇ／ｋｇ）を投与したときに、そのクレアチニン及びＢＵＮの血漿濃度は、その前にゲンタマイシン（Ｇ−５０）を用いた準毒性療法を受けさせた場合のみに上昇することを示している。ゲンタマイシン（Ｇ−５０）、ＵＮ又は（対照として）生理食塩水のみを投与しているこれらのラットにおいて、これらのパラメータにおける変化は認められない。
【００９４】
さらに、ゲンタマイシンによって予め素因を与えられたラットのみが、タンパク尿（図６、左パネル）、増加したＮＡＧ排泄及び低下したクレアチニンクリアランス（図６、右パネル）を示す。これらのデータより、図５からの情報がさらに補強され、全体としてゲンタマイシンの素因的作用が支持される。
【００９５】
興味深いことに、ゲンタマイシンの素因的作用は、ゲンタマイシン中止直後のみではなく、その後の１週間も、且つさらにゲンタマイシン治療中にも有効である。これは、ラットにゲンタマイシンと並行して（黒丸）、又はゲンタマイシン中止１週間後に（白丸）ＵＮを投与した、図７のデータによって実証される。
【００９６】
２．３．ゲンタマイシンによって誘発される、急性腎不全に対する素質の尿中マーカーの、ディファレンシャルプロテオミクスを通した同定。
【００９７】
最先端の臨床的技術は、ゲンタマイシンの素因的作用を検出又は診断することができない。その理由は、そうした状態下で変化するパラメータがないからである。この状態を診断するために使用され得る、ゲンタマイシンのこの作用に関連する新しい尿中マーカーを見出す目的で、本発明者らは、対照及びＧ−５０の動物からの尿を用いて、ディファレンシャルプロテオミクスのアプローチを試みた。試験（図８）より、ＧＭ２ＡＰは、対照の尿中には存在せず、Ｇ−５０の尿中では高発現されていることが確認された。
【００９８】
２．４．ゲンタマイシンによって誘発される、急性腎不全に対する素質の尿中マーカーとしてのＧＭ２ＡＰの特徴付け及び検証。
ラット及びヒトのＧＭ２ＡＰに対して産生されたポリクローナル抗体によって、本発明者らは、対照及びＧ−５０の尿中でのこのタンパク質の示差的なレベルをさらに確認した（図９）。本発明者らの結果より、このタンパク質が、明白な腎不全を有するＧ−１５０ラットの尿中で上昇していることも実証される（図９、及び下記を、さらに詳細には図１１を参照されたい）。
【００９９】
２．５．他の腎毒性薬剤（ＵＮ及びシスプラチン）の後のＧＭ２ＡＰ。
図１０は、ＧＭ２ＡＰが、ＵＮ（上方パネル）及びシスプラチン（下方パネル）のような他の腎毒性物質によって負わされた明白な腎損傷の検出のためにも役立ち得ることを示している。血漿クレアチニン濃度によって実証されるように、ＵＮ又はシスプラチンのいずれかによってＡＲＦに罹患しているラットは、高レベルの尿中ＧＭ２ＡＰを示すが、対照ラットは、極めて少量の又は検出不可能な量のＧＭ２ＡＰマーカーを示すのを認めることができる。
【０１００】
上記の全てのデータから、本発明者らは、ＧＭ２ＡＰは以下を診断するために役立ち得ると結論づけることができる：１．準毒性のゲンタマイシンによって誘発されるＡＲＦに対する素質。これは、ＡＲＦの診断における突破口を構成するものである。その理由は、ゲンタマイシンで治療した患者が、無症状のままで、正常の条件ではいかなる腎作用も引き起こさないであろう他の作用剤への曝露によって急性腎損傷をより容易に発症しやすくなるようにさせ得る状態を我々は今や検出することができるようになる可能性があるからである。さらに、次に試験されるべきことは、ＡＲＦにおけるこの新規マーカーが、他の薬剤が準毒性用量で誘発する可能性がある潜在的な素因的作用を検出又は診断するのにも役立つかどうかである。
【０１０１】
２．６．急性腎不全（又は特定の型のＡＲＦ）の極めて早期のマーカーとしてのＧＭ２ＡＰの特徴付け及び検証。
ＧＭ２ＡＰがどのくらい早く腎損傷を検出するかを試験するために、Ｇ−１５０療法での処置による異なるマーカーの段階的変化についての一連の時間経過試験を行った。図１１において認められるように、クレアチニンクリアランス、血漿クレアチニン濃度及びＢＵＮ濃度、タンパク尿、及びＮＡＧ排泄などの臨床的パラメータは、ゲンタマイシン処置の開始４日後までに上昇した。さらに、ＫＩＭ−１及びＰＡＩ−１の尿中レベルも４日目までに上昇した。興味深いことに、ＧＭ２ＡＰの尿中レベルは、ゲンタマイシン開始後１日目と同じくらい早く上昇し始めた。
【０１０２】
これにより、ＧＭ２ＡＰは、ゲンタマイシンによって誘発された急性腎損傷の、且つおそらく一般の急性腎損傷の、極めて早期のマーカーとして、発展する可能性があることが明らかに示唆される。
【０１０３】
２．７．ゲンタマイシンで治療したヒトの尿中のＧＭ２ＡＰの特徴付け。
最後に、本発明者らは、ゲンタマイシンで治療した患者の尿中のＧＭ２ＡＰレベルが上昇しているかどうかを試験した。図１２は、ゲンタマイシン療法下の患者の人体計測のデータである血漿クレアチニン濃度及びＢＵＮ濃度、並びにＭＤＲＤ又はＣｏｃｋｒｏｆｔ−Ｇａｕｌｔ式によって推定されるＧＦＲ、並びに健常な未治療の対照からの人体計測のデータを示している。ゲンタマイシンで治療した、含まれている患者の腎機能は、正常状態の範囲内にある。しかし、実験動物において認められるのと同様に、ＧＭ２ＡＰの尿中レベルは、ウエスタンブロットによって決定されるように、ゲンタマイシンで治療した患者では明らかにより高い。これにより、ラットで収集した全てのデータと合わせて、ＧＭ２ＡＰの尿中レベルは、ヒトにおける急性腎損傷に対する素質の臨床的マーカーとして検証されるべきであることが示唆される。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質であるガングリオシドＧＭ２活性化タンパク質（ＧＭ２ＡＰ）を検出及び／又は定量することにより、個体における急性腎不全（ＡＲＦ）を発症するリスクを決定する方法、又はＡＲＦを決定する方法、及びＡＲＦの進行を予測する方法に関する。急性腎不全は、少なくとも１種の腎毒性物質の投与に起因することがあり、このとき、腎毒性物質は、例えばゲンタマイシンのようなアミノグリコシド系抗生物質であり得る。
【背景技術】
【０００２】
急性腎不全（ＡＲＦ）は、老廃物及び水の血液浄化、並びに電解質平衡を妨げるのに十分な、腎臓の排泄機能の急激な損失に起因する極めて重篤な状態である（Ｂｅｌｌｏｍｏ Ｒ、Ｋｅｌｌｕｍ ＪＡ及びＲｏｎｃｏ Ｃ．２００７、Ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ．３３：４０９〜１３）。ＡＲＦは、薬剤、化学毒、低酸素、泌尿手段の閉塞、感染などを含む多種多様な損傷原因によって引き起こされ得る（Ｂｉｎｓｗａｎｇｅｒ Ｕ．１９９７、Ｋｉｄｎｅｙ Ｂｌｏｏｄ Ｐｒｅｓｓ Ｒｅｓ．、２０：１６３）。ＡＲＦは、高い発生率及び死亡率に由来する、莫大な、ヒトへの社会経済的負担を引き起こす。入院のうちの１％近くがＡＲＦに関連すると推定され、入院患者のうちの約２〜７％が最終的にＡＲＦを発症する（Ｋｅｌｌｕｍ ＪＡ及びＨｏｓｔｅ ＥＡ．２００８、Ｓｃａｎｄ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｌａｂ Ｉｎｖｅｓｔ Ｓｕｐｐｌ．、２４１：６〜１１）。
【０００３】
ＡＲＦのより成功する臨床処置の重要な決定因子は、損傷がまだ可能な限り軽度なときの、極めて早期の診断であり、（可能な場合の）損傷回復の効力、治療的介入及び患者の転帰を大きく向上させる。したがって、より早期の且つより感度が高いバイオマーカーの同定は、明白な目標である。臨床診療では、ＡＲＦは、依然として、腎機能障害が測定可能な症状を生じたときに診断される。この診断は、典型的には、血液中のクレアチニン及び尿素のレベルの決定に依存する。これらの血清中濃度は、最も一般的には、ＧＦＲ（糸球体濾過量）が低下するにつれて上昇する。しかし、この段階では、ＡＲＦを処置するのが困難になる。したがって、現在の診断の傾向は、損傷が広がっていないときに、早い段階で生じる初期の病態生理学的事象を検出することを目指している（Ｖａｉｄｙａ ＶＳ、Ｆｅｒｇｕｓｏｎ ＭＡ及びＢｏｎｖｅｎｔｒｅ ＪＶ．２００８、Ｒｅｖ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｔｏｘｉｃｏｌ．、４８：４６３〜９３）。
【０００４】
中でも、尿細管細胞の破壊の結果として尿中に存在する特定の細胞酵素の測定は、尿細管損傷と共に進行するＡＲＦを早期に検出するための現在最も鋭敏な方法である。これらの酵素としては、Ｎ−アセチル−ベータ−Ｄ−グルコサミニダーゼ（ＮＡＧ）が挙げられるが、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＤＨＬ）、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）又はガンマ−グルタミルトランスペプチダーゼ（ＧＧＴ）などの他のものも含まれる。これらの酵素の大部分は、主に、安定性の問題及び尿中の他の成分による阻害のために、ＡＲＦの早期の且つ感度が高い尿中マーカーとして中程度の価値を有する（Ｖａｉｄｙａ ＶＳ、Ｆｅｒｇｕｓｏｎ ＭＡ及びＢｏｎｖｅｎｔｒｅ ＪＶ．、２００８、Ｒｅｖ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｔｏｘｉｃｏｌ．、４８：４６３〜９３）。日常の解析パラメータとしてはめったに使用されないが、明らかに、ＮＡＧは、腎障害の鋭敏なマーカーとして最も良く特徴付けられている。新しい尿中マーカーは、現在、ＡＲＦの極めて早期の診断及び予知のための検証が進んでいる段階にある。新しい尿中マーカーとしては、腎障害分子−１（ＫＩＭ−１）、好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（ＮＧＡＬ）、プラスミノーゲン活性化因子阻害因子−１（ＰＡＩ−１）、シスタチンＣ、インターロイキン１８、レチノール結合タンパク質（ＲＢＰ）などが挙げられる。
【０００５】
ＡＲＦに関するもう１つの重要な側面は、腎毒性の可能性がある特定の薬剤が、準毒性用量で、他の腎毒素に反応してＡＲＦにより罹患しやすくなるように、個体を罹患しやすくするか又は敏感にする作用である。薬剤（例えば、ゲンタマイシン）で治療される腎疾患の徴候を示していない患者が、同様に理論的に準毒性の療法の範囲内の別の腎毒性の可能性がある作用剤、例えば、別の薬剤、診断の対照、重金属などを同時に又は続いて投与される又は曝露されるという典型的な臨床的状況が存在する。その場合、潜在的な腎毒素での準毒性治療は、診断及び治療の観点から対処されるべきである、その隠れた性質のために、特別な重要性のある関連する臨床的状況を引き起こすであろう。
【０００６】
最近は、腎不全は、異なるパラメータを使用して診断される。例えば、急性腎不全の異なる段階を定める、急性腎不全（ＡＲＦ）の診断のための一致基準がある。この一致基準は、頭字語ＲＩＦＬＥと命名され（Ｒｉｃｃｉ Ｚ、Ｃｒｕｚ Ｄ及びＲｏｎｃｏ Ｃ．２００８、Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ．、７３：５３８〜４６）、血清クレアチニンの上昇、糸球体濾過量の低下及び尿流速の低下に基づいている。この基準を確立するためには、多数の試験を行うことが極めて重要である。血漿中のクレアチニンのレベルは、腎損傷のマーカーとして使用される。健常な腎臓は、クレアチニンを血液の外に取り出して尿中に入れ、体外に出す。腎臓が十分に働いていないときには、クレアチニンは血液中に蓄積するが、クレアチニンの値も変化し、食事による影響を受けることがある。腎不全を診断するための他のマーカーは、血液尿素窒素又はタンパク尿である。
【０００７】
ゲンタマイシンは、グラム陰性感染に対して世界中で広く使用されるアミノグリコシド系抗生物質である。ゲンタマイシンの治療有効性及び使用は、腎臓及び聴覚器官のレベルで主に生じる、その毒性によって厳しく限定される（Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｓａｌｇａｄｏ Ｃ、Ｌｏｐｅｚ−Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ ＦＪ及びＬｏｐｅｚ−Ｎｏｖｏａ ＪＭ．２００７、Ｔｏｘｉｃｏｌ Ａｐｐｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、２２３：８６〜９８）。ゲンタマイシンによって誘発される腎毒性は、１０〜２５％の治療課程において出現する（Ｌｅｅｈｅｙ ＤＪら、１９９３、Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．、４：８１〜９０）。この腎毒性は、尿細管損傷を主な特徴とするが（Ｎａｋａｋｕｋｉ Ｍら、１９９６、Ｃａｎ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、７４：１０４〜１１）、用量依存的な方法で、糸球体（Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｓａｌｇａｄｏ Ｃ、Ｌｏｐｅｚ−Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ ＦＪ及びＬｏｐｅｚ−Ｎｏｖｏａ ＪＭ．２００７、Ｔｏｘｉｃｏｌ Ａｐｐｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、２２３：８６〜９８）及び血管（Ｇｏｔｏ Ｔら、２００４、Ｖｉｒｃｈｏｗｓ Ａｒｃｈ．、４４４：３６２〜７４；Ｓｅｃｉｌｍｉｓ ＭＡ，ら、２００５、Ｎｅｐｈｒｏｎ Ｐｈｙｓｉｏｌ．、１００：１３〜２０）の変化が出現することもある（Ｈｉｓｈｉｄａ Ａら、１９９４、Ｒｅｎ Ｆａｉｌ．、１６：１０９〜１６）。
【０００８】
ガングリオシドＧＭ２活性化タンパク質（ＧＭ２ＡＰ）は、リソソーム酵素であるβ−ヘキソサミニダーゼＡの基質特異的補因子として働く小さな糖脂質輸送タンパク質である。この酵素はＧＭ２ＡＰと共に、ガングリオシドＧＭ２（スフィンゴ糖脂質を含むシアル酸）、及び末端Ｎ−アセチルヘキソサミンを含む他の分子の分解を触媒する。ＧＭ２ＡＰは、いくつかの肝臓毒の肝毒性の予測のためのマーカーとしてこれを使用して肝疾患と関連付けられているが（米国特許第７４６９１８５号）、腎疾患又は急性腎不全とは関連付けられていない。
【０００９】
急性腎不全又は腎障害において早期に発現されるいずれのバイオマーカーの使用も、任意の患者のこの障害を患うリスクを決定するための有用な手段であり得る。この手段は、可能性のある他の多くの用途の中でも、前記個体の健康が悪化するのを防ぐために、任意の個体に対する任意の薬剤の投与を改変するためにも使用することができる。
【発明の概要】
【００１０】
本発明は、タンパク質であるガングリオシドＧＭ２活性化タンパク質（ＧＭ２ＡＰ）を検出及び／又は定量することにより、個体における急性腎不全（ＡＲＦ）を発症するリスクを決定する方法、又はＡＲＦを決定する方法、及びＡＲＦの進行を予測する方法に関する。急性腎不全は、少なくとも１種の腎毒性物質の投与に起因することがあり、このとき、腎毒性物質は、例えばゲンタマイシンのようなアミノグリコシド系抗生物質であり得る。
【００１１】
本発明は、ゲンタマイシンによって誘発されるＡＲＦに対する素質はタンパク質ＧＭ２ＡＰの排泄の増加と相関するという証拠を提供する。実施例は、ゲンタマイシンによって誘発されるＡＲＦに対する素質の、可能性のある尿中バイオマーカーとしてのＧＭ２ＡＰの有用性をさらに強調する。
【００１２】
したがって、本発明は、ＡＲＦの検出及び、さらに、ＡＲＦを発症するリスクを決定する可能性を向上させるための手段を提供する。この提供の結果は、ＡＲＦの進行の予想、すなわち、該個体が、例えば、これに限定されないが、治療用物質で治療されたときの、或いは該個体が何らかの状態又は明らかな腎毒性作用を有する若しくは有さない作用剤に曝露されたときのＡＲＦの進行のモニタリングである。
【００１３】
行っている説明を補足するために且つ本発明の特徴をより良く理解するのを補助するために、いくつかの好ましい実施例に従って、以下のことを表している図面を、例示的且つ非限定的な性質で、含めている：
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】生理食塩水（０．９％ＮａＣｌ、ｎ＝１９）又はゲンタマイシン（５０又は１５０ｍｇ／ｋｇ／日、それぞれｎ＝４２及びｎ＝１５）で７日間処置したラットの生存率（Ａ）及び体重の段階的変化（Ｂ）を示している図である。データは、平均±標準誤差を表している。
【図２】腎機能の特徴付けを示している図である。生理食塩水（０．９％ＮａＣｌ、Ｃ）又はゲンタマイシン（５０又は１５０ｍｇ／ｋｇ／日、それぞれＧ−５０及びＧ−１５０）で７日間処置したラットの、（Ａ）血漿クレアチニン濃度、（Ｂ）血液尿素窒素（ＢＵＮ）、（Ｃ）タンパク質の１日の尿中排泄、及び（Ｄ）Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダーゼ（ＮＡＧ）の１日の尿中排泄。データは、平均±標準誤差を表している。対照：ｎｃｒｅａ＝４６、ｎＢＵＮ＝３８、ｎｐｒｏｔ＝２５、ｎＮＡＧ＝１２；５０ｍｇ／ｋｇ／日のゲンタマイシン：ｎｃｒｅａ＝５７、ｎＢＵＮ＝４９、ｎｐｒｏｔ＝２５、ｎＮＡＧ＝１１；及び１５０ｍｇ／ｋｇ／日のゲンタマイシン：ｎｃｒｅａ＝１８、ｎＢＵＮ＝４、ｎｐｒｏｔ＝７、ｎＮＡＧ＝７。黒丸ｐ＜０．０５対対照群；網掛け丸ｐ＜０．０５対Ｇ−５０群。
【図３】生理食塩水（対照）、ゲンタマイシン５０ｍｇ／ｋｇ／日（Ｇ−５０）及び１５０ｍｇ／ｋｇ／日（Ｇ−１５０）で処置をした７日後のラットの腎臓からの、ヘマトキシリン及びエオシンで染色した組織学的切片の代表的な画像（１００×）を示している図である。
【図４】組織の障害及び修復に関するマーカーの腎発現を示している図である。生理食塩水（０．９％ＮａＣｌ、Ｃ）又はゲンタマイシン（５０又は１５０ｍｇ／ｋｇ／日、それぞれＧ−５０及びＧ−１５０）で７日間処置したラットからの腎組織ホモジェネート中のプラスミノーゲン活性化因子阻害因子−１（ＰＡＩ−１）、腎障害分子−１（ＫＩＭ−１）及びビメンチンの腎臓レベルの代表的なウエスタンブロット画像である。試験は、各群から、無作為に選択した、３匹の動物（１〜３）からの試料で行った。
【図５】生理食塩水（０．９％ＮａＣｌ）又はゲンタマイシン（５０ｍｇ／ｋｇ／日）で７日間処置し、その直後に、単回の準毒性用量の硝酸ウラニル（ＵＮ、０．５ｍｇ／ｋｇ）又は生理食塩水を投与したラット（この図面の下方部分を参照されたい）における、血漿クレアチニン濃度（上方パネル）及び血液尿素窒素（ＢＵＮ）濃度（下方パネル）の段階的変化を示している図である。血漿クレアチニン及びＢＵＮは、この試験を通して、ＵＮ投与の６日後までモニタリングした。データは、１群あたり６匹の動物からの試料の平均±標準誤差を表している。黒丸ｐ＜０．０５対対照群；白丸ｐ＜０．０５対ＵＮ群；黒四角ｐ＜０．０５対Ｇ−５０群。
【図６】生理食塩水（０．９％ＮａＣｌ）又はゲンタマイシン（５０ｍｇ／ｋｇ／日、Ｇ−５０）で７日間処置し、その直後に、単回の準毒性用量の硝酸ウラニル（ＵＮ、０．５ｍｇ／ｋｇ、下方左パネルを参照されたい）又は生理食塩水を投与したラットにおける、タンパク質の尿中排泄の段階的変化（上方左パネル）を示している図である。中央及び右のパネルは、それぞれ、同じ動物のＮ−アセチル−グルコサミニダーゼ（ＮＡＧ）の尿中排泄及び１１日目（ＵＮ投与６日後）のクレアチニンクリアランスを示している。データは、条件あたり３〜９匹の動物の平均±標準誤差を表している。黒丸ｐ＜０．０５対ＵＮ群；ＡＵ：任意単位。
【図７】（ｉ）ゲンタマイシン（５０ｍｇ／ｋｇ／日）に加えて、ゲンタマイシンの第１の用量と共に投与される硝酸ウラニル（０．５ｍｇ／ｋｇ）の単回投与で処置したラット（黒丸）、及び（ｉｉ）ゲンタマイシン（５０ｍｇ／ｋｇ／日）で７日間処置したラットの血漿クレアチニン濃度の段階的変化を示している図である。７日目以後、さらに７日間処置を中止し、その後、単回用量の硝酸ウラニル（０．５ｍｇ／ｋｇ）を投与した（白丸、プロトコールを表すための下方パネルを参照されたい）。データは、１群あたり６匹の動物の平均±標準誤差を表している。
【図８】生理食塩水（０．９％ＮａＣｌ、対照）又はゲンタマイシン（５０ｍｇ／ｋｇ／日）で７日間処置したラットからの尿のタンパク質の代表的な２Ｄ−電気泳動を示している図である。試験は、各群の４匹の動物からの尿試料で（各試料を二重試験で）行った。
【図９】生理食塩水（０．９％ＮａＣｌ、対照）で７日間処置した４匹の無作為に選択したラット及び５０ｍｇ／ｋｇ／日のゲンタマイシンで同期間処置した４匹の無作為に選択したラットからの尿中のＧＭ２活性化タンパク質のレベルを示している図である。明白な腎不全の対照として、１５０ｍｇ／ｋｇ／日のゲンタマイシンで７日間処置したラットからの試料も示している。
【図１０】単回の硝酸ウラニルの腎毒性用量（５ｍｇ／ｋｇ、ＵＮ）で処置した４匹のラットから、１日目及び３日目の２回のシスプラチンの用量（１０ｍｇ／ｋｇ）で処置した４匹のラットから、又は生理食塩水で処置した（０．９％ＮａＣｌ、対照）４匹のラットからの尿中のＧＭ２活性化タンパク質のレベルでのウエスタンブロット画像を示している図である。尿は、処置開始の４日後に採取した。さらに、血漿クレアチニン濃度（Ｃｒｐｌ、ｍｇ／ｄＬ）の個々の値も示している。
【図１１】腎毒性のあるマーカーの腎毒性作用の段階的変化：ゲンタマイシン（１５０ｍｇ／ｋｇ／日）で７日間処置したラットにおける、血漿クレアチニン濃度、クレアチニンクリアランス、Ｎ−アセチル−グルコサミニダーゼ（ＮＡＧ）排泄、タンパク尿、並びに腎障害分子−１（ＫＩＭ−１）、プラスミノーゲン活性化因子阻害因子−１（ＰＡＩ−１）及びＧＭ２活性化タンパク質（ＧＭ２ＡＰ）の尿中レベルを示している図である。データは、６匹の動物からの試料の平均±標準誤差である。画像は、３匹の異なる動物からの試料で行われる試験の代表的なものである。
【図１２】未治療の８名のヒト及びゲンタマイシンで治療した８名のヒトからの尿中のＧＭ２活性化タンパク質（ＧＭ２ＡＰ）のレベルを示している図である。これらのヒトの性別、年齢、体重、血漿クレアチニン濃度、血漿尿素濃度、並びにクレアチニンクリアランスのＭＤＲＤ（ｍＬ／分）及びＣｏｃｋｒｏｆｔ−Ｇａｕｌｔ（ｍＬ／分）の推定も（わかる場合には）示している。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
ＧＭ２ＡＰの検出及び／又は定量によるＡＲＦの検出における上記で引用した改良は、例えば、血漿クレアチニン濃度、血液尿素窒素（ＢＵＮ）、タンパク質、例えばＮ−アセチル−ベータ−Ｄ−グルコサミニダーゼ（ＮＡＧ）などの尿排泄を決定することのように、背景技術で引用した方法から明らかである。この証拠については、実施例で示している。
【００１６】
さらに、本発明は、いくつかの予想外の又は驚くべき以下の作用を強調する：
一方では、尿の排泄は通常起こる必然の生理学的事実であるので、尿試料中でのＧＭ２ＡＰの検出は、患者にとってのさらなる利点を前提とする。この検出では、個体における侵襲性の試料採取を必要としない。
他方では、アミノグリコシド系抗生物質（ゲンタマイシン）の準毒性療法のラットへの投与は、第２の腎毒性物質、例えば硝酸ウラニルで処置した個体をＡＲＦに罹患しやすくし、この素質は、尿中のＧＭ２ＡＰの存在によって検出することができる。この事実は、これらの毒素に曝露したラットでは、プラセボを処置したラットに対して、血中のクレアチニン及び血液尿素窒素（ＢＵＮ）がより高濃度であること又は尿中タンパク質の排泄を確認して実証された。双方の化合物での共処置により、ゲンタマイシン及び硝酸ウラニルを連続した形態で投与するとき、及び双方の投与を休薬期間によって分離するときと同様に、血漿クレアチニン濃度の上昇が引き起こされることも本発明において実証している。
さらに、タンパク質ＧＭ２ＡＰは、個体の尿の試料において、ゲンタマイシンの毒性のある療法（本発明においてラットで用いる毒性用量は、１５０ｍｇ／ｋｇ／日である）を用いた治療の１日目から検出可能であるが、他の腎不全マーカー：クレアチニン、ＮＡＧ、タンパク尿、ＫＩＭ−１又はＰＡＩ−１は、同じ尿試料において、４日目に検出される。
【００１７】
したがって、本発明の第１の態様は、個体における、ＡＲＦを発症するリスクを決定するために、又はＡＲＦを決定するために有用なデータを用意する方法であって、
ａ．個体から生体試料を得るステップと、
ｂ．（ａ）で得られた試料において、配列番号１、又はその断片と少なくとも５０％同一なタンパク質を検出及び／又は定量するステップと
を含む方法に関する。
【００１８】
本発明において解釈される場合、「％同一」という用語は、２つのアミノ酸配列間の同一性の％を指す。この同一性の％は、２つの配列のアライメントの長さにわたり、その部位の全てのアミノ酸が同一である部位の数の総計である。
【００１９】
（ｂ）で検出及び／又は定量されるタンパク質は、配列番号１と少なくとも５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０又は９５％同一であり得る。
【００２０】
好ましい一実施形態において、（ｂ）で検出及び／又は定量されるタンパク質は、配列番号１と少なくとも７０％同一である。より好ましい一実施形態において、引用したタンパク質は配列番号１である。
【００２１】
本発明において解釈される場合、ＡＲＦという用語は、腎機能障害の任意の段階（又は重症度）にある急性腎不全を指し、又はＡＲＦという用語は急性腎障害も指す。ＡＲＦは、腎障害によって、又は原因が、例えば、遺伝的、免疫性、虚血性、若しくは任意の薬剤での治療であり得るが、これらに限定されない、任意の障害若しくは疾患によって引き起こされ得る。上述の腎障害又は任意の障害若しくは疾患は、例えば、これらに限定されないが、腎臓、前立腺、膀胱、尿管又は尿道における、外科的処置によっても引き起こされ得る。
【００２２】
該方法は、個体における、急性腎不全（ＡＲＦ）を発症するリスクを決定するために、又はＡＲＦを決定するために有用なデータを提供する。ＡＲＦを発症する最終段階のリスクはＡＲＦであり、したがって、該方法は、個体における双方の状態のＡＲＦに有用である。
【００２３】
アミノ酸配列の配列番号１は、Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ（ヒト）におけるタンパク質ＧＭ２ＡＰのアミノ酸配列、アクセス番号ＣＡＡ４３９９４である。
【００２４】
アミノ酸配列の配列番号１と少なくとも５０％の同一性を有するタンパク質（アミノ酸配列）は、アイソフォームであるか、又はいくつかの動物における配列番号１と相同なアミノ酸配列である。本発明の方法は、獣医学的目的のために適用することができる。この獣医学的目的は、例えば、これらに限定されないが、Ｅｑｕｕｓ ｃａｂａｌｌｕｓ、Ｂｏｓ ｔａｕｒｕｓ、Ｆｅｌｉｓ ｃａｔｕｓ又はＣａｎｉｓ ｌｕｐｕｓ ｆａｍｉｌｉａｒｉｓのような脊椎生物に適用することができる。脊椎生物は、魚の養殖における目的のために、魚種であってもよい。同一性の百分率は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）からのＢｌａｓｔｐによって選択された（表１を参照されたい）。
【表１】
【００２５】
アミノ酸配列の配列番号１と少なくとも５０％又は少なくとも７０％の同一性を有するいずれのタンパク質を指す場合も、又は配列番号１、若しくはその任意の断片を指す場合も、「本発明のタンパク質（１種又は複数）」という用語を以下で使用することにする。
【００２６】
本発明のタンパク質を検出及び／又は定量するために、前記タンパク質の１種又は複数の断片を検出することは、その断片はそのタンパク質のアミノ酸配列及び構造の構成要素であるので、十分である。
【００２７】
該方法のステップ（ｂ）は、本発明のタンパク質の検出及び定量、又はその検出若しくはその定量に関する。
【００２８】
本発明のタンパク質は、ヌクレオチド配列の発現の産物である。このヌクレオチド配列は、例えば、これらに限定されないが、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、又はその断片のような、任意のＲＮＡであってもよい。また、このヌクレオチド配列は、相補的なＤＮＡ（ｃＤＮＡ）又はその断片であってもよい。該ｃＤＮＡは、ｍＲＮＡと相補的なＤＮＡであるか、又はゲノム配列からのエキソンを含むがイントロンは含まないヌクレオチド配列、すなわち、コード配列でもある。遺伝子のゲノム配列及びそのｃＤＮＡの双方の転写は、同じｍＲＮＡをコードし、したがって、同じタンパク質をコードする。本発明において、タンパク質の代わりに又は同時に、任意のＲＮＡ若しくは任意のＤＮＡ、又はその断片を検出することも可能である。
【００２９】
他の好ましい一実施形態は、さらに、ステップ（ｂ）で得られたデータを標準値と比較して、任意の有意な偏差を見出すステップを含む、従来の方法に関する。本明細書中で使用される場合、「標準値」という用語は、例えば、ＡＲＦを発症していない個体から得られた生体試料において、本発明のタンパク質、又はその断片を検出及び／又は定量することに関するデータを指すが、これらに限定されない。
【００３０】
本明細書中で使用される場合、「有意な偏差」という用語は、単離された試料中にそのタンパク質が存在すること、又は単離された試料中で、健常な個体、すなわち、腎疾患の陰性対照からの試料に対して、本発明のタンパク質がより高濃度であることを指す。健常な個体は、１種又は複数の一般的な腎疾患マーカーのレベルの測定によって決定される。一般的なマーカーは、クレアチニン、血液尿素窒素又はタンパク尿であるが、これらに限定されない。
【００３１】
本発明の他の好ましい一実施形態において、該方法は、さらに、該有意な偏差を、該個体における、ＡＲＦを発症するリスクに、又はＡＲＦの発症に帰するステップを含む。したがって、この好ましい実施形態は、ＡＲＦを診断するため又は急性腎不全（ＡＲＦ）を発症するリスクを決定するための方法である。
【００３２】
生体試料は、生物の生理液及び／又は任意の細胞組織由来であってもよい、ヒト又は動物の身体などの生物から単離される試料である。
【００３３】
本明細書中で使用される場合、「ＡＲＦを発症するリスク」という用語は、ＡＲＦを患う又は発症する個体の素質を指す。したがって、該方法は、個体がＡＲＦを発症しているかどうか又は発症し得るかどうかを決定するために有用なデータを用意することに関する。実施例と共に、タンパク質ＧＭ２ＡＰ（配列番号１）は、ＡＲＦの極めて早期の段階で検出できることが実証され、これにより、ＡＲＦを発症するリスクとして、早期のＡＲＦの検出を可能にする。
【００３４】
本発明のさらに好ましい実施形態において、本発明のタンパク質、又はその断片は、例えば、これらに限定されないが、電気泳動、イムノアッセイ、クロマトグラフィー及び／又はマイクロアレイの技術などの方法によって検出及び／又は定量することができる。本発明のタンパク質の検出及び／又は定量は、従来技術の任意の組合せ又はその任意の組合せによって行うことができる。該タンパク質は、その存在又は欠如を評価して検出することができる。この検出は、任意のプローブ及び／又は任意の抗体による、該タンパク質の任意の断片の特異的な認識によって行うことができる。さらに、検出された本発明のタンパク質は、これらのデータを標準値と比較して任意の有意な偏差を見出すための基準としての役割を果たすように、定量することができる。この偏差は、急性腎不全を発症するリスク又はＡＲＦそれ自体であるとして解釈することができる。より好ましい一実施形態において、本発明のタンパク質、又はその断片は、電気泳動及び／又はイムノアッセイによって検出及び／又は定量することができる。
【００３５】
電気泳動は、電場の作用の結果として基質又は固体担体を通した、媒体（電気泳動緩衝液）中に溶解された高分子の運動又は移動に基づく分離の解析技術である。該分子の挙動は、その電気泳動移動度によって決まり、この移動度は、電荷、大きさ及び形によって決まる。使用される装置、担体及び条件に基づく、この技術の多数の変形が、分離を行うための物理化学において存在する。該電気泳動は、キャピラリー電気泳動、紙中での電気泳動、アガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点焦点化（焦点電気泳動）、又は２次元電気泳動を含むリストから選択される。
【００３６】
イムノアッセイは、生体液中の物質の濃度を、その抗原に対する抗体（単数）又は抗体（複数）の反応を使用して測定する生化学的な試験である。このアッセイは、抗体の、その抗原に対する特異的な結合を利用する。抗体又は抗原の量の検出は、多様な方法によって達成することができる。最も一般的なもののうちの１つは、抗原又は抗体のいずれかを標識することである。この標識は、酵素、放射性同位体（ラジオイムノアッセイ）、磁気標識（磁気イムノアッセイ）又は蛍光、及び凝集反応、比濁分析、濁度測定又はウエスタンブロットを含む他の技術も含み得るが、これらに限定されない。ヘテロジニアスイムノアッセイは、競合的であっても又は非競合的であってもよい。該イムノアッセイは、競合的であってもよい：その反応は、試料中の抗原の濃度に反比例することになる、又は非競合的であってもよい（「サンドイッチアッセイ」とも呼ばれる）：その結果は、抗原の濃度に正比例する。本発明において使用できるイムノアッセイ技術は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）である。
【００３７】
クロマトグラフィー技術によって、分子を、その電荷、大きさ又は分子量に基づいて、中でも、その極性又は酸化還元電位を通して、分離することができる。該クロマトグラフィー技術は、液体のクロマトグラフィー（分配クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、排除クロマトグラフィー、又はイオン交換クロマトグラフィー）、ガスクロマトグラフィー又は超臨界流体のクロマトグラフィーであってもよいが、これらに限定されない。
【００３８】
本発明のマイクロアレイ技術は、例えば、固体担体における、本発明のタンパク質を認識する分子の固定に基づいている。抗体マイクロアレイは、最も一般的なタンパク質マイクロアレイである。この場合、抗体は、タンパク質チップ（固体担体）上にスポット及び固定され、これらに限定されないが、生体試料、細胞溶解液、血清又は尿からのタンパク質を検出するための捕捉分子として使用される。本明細書中で使用される場合、「固体担体」という用語は、例えば、イオン交換樹脂又は吸着、ガラス、プラスチック、ラテックス、ナイロン、ゲル、セルロースのエステル、常磁性粒子又はこれらのうちのいくつかの組合せなどの多様な種類の物質を指すが、以前に言及されている物質に限定されない。
【００３９】
他の好ましい一実施形態では、本発明の方法のうち任意のもののステップ（ａ）からの生体試料は、体液である。該体液は、動物の身体から排泄又は分泌される液及び通常は排泄又は分泌されない液を含むこともある。該体液は、胎児を囲んでいる羊水、房水、血液、血漿、間質液、リンパ、母乳、粘液（鼻水及び痰を含む）、唾液、皮脂（皮膚油）、血清、汗、涙又は尿であってもよいが、これらに限定されない。本発明のタンパク質は、例えば、これらに限定されないが、細胞又は小胞のように、言及した体液中に存在する任意の生物学的区画中にあってもよい。より好ましい一実施形態において、該体液は尿である。
【００４０】
本発明のさらに好ましい一実施形態は、ＡＲＦを発症するリスク、又はＡＲＦが、少なくとも１種の腎毒性物質の投与又はそれに対する曝露に起因する場合の方法に関する。この腎毒性物質は、長期間にわたるものであっても又は単回の事象に限定されるものであってもよい投与又は曝露のレベルに起因し、且つ単一又は複数の化合物に起因してもよい、１種又は複数の腎臓の病変を引き起こし得る。曝露の状況は、不注意による過剰投与、偶発的な過剰投与、意図的な過剰投与、又は治療上必要なもの（投与）であってもよい。腎臓は、主要な排泄の器官であり、水溶性分子に対する恒常性を維持するので、能動的に特定の物質を濃縮することができる。一般に、近位尿細管及び遠位尿細管並びに尿路上皮は修復することができるが、糸球体及び髄質は著しく低級の修復機構を有し得る。
【００４１】
該腎毒性物質は、投与される場合には、医薬組成物（治療用物質）であってもよく、或いは、これらに限定されないが、ハロゲン化麻酔剤又は機能食品、又はビタミン補足物、若しくは栄養補足物に含まれる化合物であってもよい。該腎毒性物質は、個体が曝露される場合には、さらに、重金属、農薬又は抗菌剤などの化学物質であってもよいが、これらに限定されない。該農薬は、殺真菌剤、除草剤、殺虫剤、除藻剤、軟体動物駆除剤、ダニ駆除剤又は殺鼠剤であってもよいが、これらに限定されない。該殺虫剤は、殺菌剤、抗生物質、抗菌剤、抗ウイルス剤、抗真菌剤、抗原虫剤又は抗寄生虫剤であってもよいが、これらに限定されない。
【００４２】
本発明の任意の方法のさらに好ましい実施形態において、該腎毒性物質はアミノグリコシド系抗生物質である。アミノグリコシドは、例えば、細菌の３０Ｓ又は５０Ｓのリボゾームサブユニットに結合することによって、ペプチジル−ｔＲＮＡの移動を阻害して、さらにｍＲＮＡの誤読も引き起こし、細菌が増殖に不可欠なタンパク質を合成できないようにしておく働きをする。該アミノグリコシド抗生物質は、アミカシン、アルベカシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ネオマイシン、ネチルマイシン、パロモマイシン、ロドストレプトマイシン、ストレプトマイシン、トブラマイシン、アプラマイシン、スペクチノマイシン、ハイグロマイシンＢ、ベルダマイシン、アストロマイシン又はピューロマイシンであってもよいが、これらに限定されない。より好ましい一実施形態において、該アミノグリコシド系抗生物質はゲンタマイシンである。
【００４３】
ゲンタマイシンは、好気性グラム陰性菌の感染を治療するために一般的に使用される、広範囲に効能があるアミノグリコシド系抗生物質である。アミノグリコシドは、経口投与であまり吸収されないが、腎臓によって急激に排泄される。一方、アミノグリコシドは、外膜にあるポーリンチャネルを通して細菌細胞内に拡散し、次いで、細胞質を越えて輸送される。結果として、ゲンタマイシンは、細菌のタンパク質合成を妨げることによって作用するが、近位曲尿細管上に、特に、Ｓ１及びＳ２分節に、ＡＲＦに発展し得る、腎臓障害を引き起こすこともある。
【００４４】
本発明において実証するように、ＡＲＦは、同様に、同時又は連続の第２の腎毒性物質の投与に起因し得る。この第２の化合物は、硝酸ウラニルであり得る。実施例において引用しているように、（例えば、硝酸ウラニルのような）第２の腎毒性物質を準毒性用量で投与したときに腎毒性が生じるので、ゲンタマイシンを用いた準毒性療法は、個体がＡＲＦを発症しやすくなるようにさせる。この腎毒性は、ゲンタマイシンの単回投与直後に、硝酸ウラニルの単回投与を、生理食塩液の単回投与と比較して、追加するだけで実証される。この腎毒性作用は、血漿クレアチニン濃度、血液尿素窒素（ＢＵＮ）、全タンパク質又は特定のタンパク質（Ｎ−アセチル−グルコサミニダーゼ：ＮＡＧ）の尿中排泄、又はクレアチニンクリアランスを測定することによって実証される。
【００４５】
本発明において解釈される場合、「準毒性用量」という用語は、腎疾患の１種又は複数の一般的なマーカーのレベルが腎疾患の陰性対照のレベルに対して有意な偏差を示さないような方法で、個体において任意の療法で投与される１種又は複数の用量を指す。一般的なマーカーは、クレアチニン、血液尿素窒素又はタンパク尿であってもよいが、これらに限定されない。
【００４６】
双方の化合物（ゲンタマイシン及び硝酸ウラニル）で同時に個体を共処置することにより、双方の化合物を連続して投与するとき、双方の投与を休薬期間によって、例えば１週間、分離するときと同様に、血漿クレアチニン濃度の上昇が引き起こされることも本発明において実証している。
【００４７】
本発明のタンパク質は、抗腫瘍剤として他の腎毒性薬剤、例えば、これに限定されないが、シスプラチンで個体を治療したときに、尿中でも検出される。また、本発明のタンパク質は、個体を硝酸ウラニルのみで治療したときにも検出される。
【００４８】
シスプラチンは、精巣、卵巣、膀胱、皮膚、頭頸部、及び肺の腫瘍を治療するために一般的に使用される、広範囲に効能がある抗腫瘍剤である。シスプラチンは、細胞内に拡散して、細胞にとって致命的な、ＤＮＡのストランド間及びストランド間の架橋によって作用する。硝酸ウラニルは、重症の腎不全及び急性尿細管壊死を引き起こす腎毒性の高い作用剤である。他の標的臓器としては、肝臓、肺又は脳などが挙げられる。
【００４９】
本発明の方法の他の好ましい一実施形態において、本発明のタンパク質は、腎毒性物質の投与又はそれに対する曝露の開始から１２時間後に検出される。したがって、本発明のタンパク質は、急性腎不全の早期のマーカーとして、主に、限定されないが、ＡＲＦが少なくともアミノグリコシド系抗生物質ゲンタマイシンの投与に起因するときに、使用することができる。この場合、実施例で示すように、ゲンタマイシンをラットに１５０ｍｇ／ｋｇ／日で７日間投与したときに、血漿クレアチニン濃度、クレアチニンクリアランス、ＮＡＧ排泄、タンパク尿、並びに腎障害分子１（ＫＩＭ−１）及びプラスミノーゲン活性化因子阻害因子１（ＰＡＩ−１）の尿中レベルの段階的変化は、４日目から有意に増大したのに対し、該タンパク質である配列番号１は、毒性作用出現の少なくとも３日前に検出された。個体からの尿試料において、毒性作用の出現は、上記に引用したパラメータを測定することによって検出される。
【００５０】
他の好ましい一実施形態では、本発明のタンパク質は、腎毒性物質の投与又はそれに対する曝露の開始以後２４時間から検出され得る。実施例に示すように、ゲンタマイシン（１５０ｍｇ／ｋｇ／日）の投与の開始から最初の２４時間後に、該タンパク質は、ウエスタンブロットアッセイによって十分に明らかなレベルで検出される。
【００５１】
本発明の第２の態様は、少なくとも１種の腎毒性物質の投与又はそれに対する曝露に起因するＡＲＦの進行を予測する方法であって、該腎毒性物質に曝露された又は曝露されていない、配列番号１、又はその断片と少なくとも５０％同一なタンパク質の第１の濃度を決定するステップ、曝露された個体では引用したタンパク質の第１の濃度を決定した後に、又は曝露されていない個体では該腎毒性物質の投与又はそれに対する曝露の開始後に、（ａ）の個体から単離された体液において、本発明のタンパク質の第２の濃度を決定するステップを含む方法に関する。すなわち、腎毒性物質に曝露された個体からの試料において第１の濃度の決定を行う場合には、第２の濃度は第１の濃度の決定後に決定し、腎毒性物質に曝露されていない個体からの試料において第１の濃度の決定を行う場合には、第２の濃度は曝露していない個体における腎毒性物質の投与又は曝露の開始後に決定する。次いで、前記第２の濃度を前記第１の濃度と比較して、任意の有意な偏差を探す。有意な偏差は、前記第２の濃度を前記第１の濃度と比較したとき、又は何らかの有意な偏差を以前の濃度の決定と比較したときに、上昇又は低下した値という意味であってもよい。
【００５２】
本発明において、「進行の予想」という用語は、本明細書中で使用される場合、ＡＲＦの進行のモニタリングの結論、すなわち、この病変の進行についての告知を指す。
【００５３】
本発明の好ましい実施形態は、少なくとも１種の腎毒性物質の投与又はそれに対する曝露に起因するＡＲＦの進行を予測する方法に関し、このとき、前記タンパク質は配列番号１と少なくとも７０％同一である。より好ましい一実施形態において、前記タンパク質は配列番号１である。
【００５４】
ＡＲＦの進行を予測する方法の他の好ましい一実施形態において、該腎毒性物質はアミノグリコシド系抗生物質であり、より好ましい一実施形態において、該アミノグリコシド系抗生物質はゲンタマイシンである。
【００５５】
さらに好ましい実施形態は、該体液が尿である、ＡＲＦの進行を予測する任意の方法に関する。
【００５６】
急性腎不全（ＡＲＦ）を発症するリスクを決定するために、若しくはＡＲＦを決定するために有用なデータを用意する方法のいずれに関しても、又はＡＲＦの進行を予測する方法のいずれに関しても、「本発明の方法（１種又は複数）」という用語を使用することにする。
【００５７】
さらに好ましい一実施形態によると、本発明の方法の個体はヒトである。上記にもかかわらず、引用した方法は獣医学的目的において有用となり得るので、本発明の方法の個体は動物であってもよい。
【００５８】
化合物に曝露された又はされていない、障害又は損傷を受けた細胞集団を、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏでアッセイすることもできる。例えば、新たに単離された腎細胞の細胞集団、特に、ラットの腎細胞。別のアッセイ形態では、ｉｎ ｖｉｖｏでの曝露は、生きている動物、例えば実験用ラットに対する腎毒性物質の投与によって達成されてもよい。
【００５９】
本発明の第３の態様は、ＡＲＦを発症するリスクを決定するため、又はＡＲＦを決定するため、又はＡＲＦの進行を予測するためのバイオマーカーとしての、配列番号１、又はその断片と少なくとも５０％同一なタンパク質の使用に関する。
【００６０】
このバイオマーカーは、ＡＲＦのリスク又は進行と、若しくは所与の処置に対する疾患のかかりやすさと関連する、又は個体におけるＡＲＦの存在とも関連する、タンパク質の発現又は状態における変化を示す。提案されたバイオマーカーの有効性が認められれば、それを使用して、疾患のリスク、個体における疾患の存在を診断することができるようになり、又は個体における疾患に合わせて治療を調整すること、例えば、薬剤治療又は投与療法の選択などができるようになる。ＡＲＦを患うリスクに直結する、該バイオマーカーの存在又は検出される量が治療によって変化する場合に、該バイオマーカーは、任意の腎毒性物質に対する任意の治療又は曝露を加減するためのレポーターとしての役割を果たす。
【００６１】
好ましい一実施形態は、前記タンパク質が、配列番号１、又はその断片と少なくとも７０％同一である場合の使用に関する。より好ましい一実施形態において、前記タンパク質は配列番号１である。
【００６２】
好ましい一実施形態は、ＡＲＦを発症するリスク、又はＡＲＦ、又はＡＲＦの進行が、少なくとも１種の腎毒性物質の投与に起因するものである、本発明のタンパク質の使用に関する。さらに好ましい実施形態において、該腎毒性物質はアミノグリコシド系抗生物質であり、例えば、該アミノグリコシド系抗生物質はゲンタマイシンである。
【００６３】
本発明のさらなる他の態様は、個体におけるＡＲＦを発症するリスクを決定するために、若しくはＡＲＦを決定する（ＡＲＦを診断する）ために、又は個体におけるＡＲＦの進行を予測するために有用なデータを用意するためのキットであって、本発明の任意の方法を行うための試薬を含むキットである。該試薬は、本発明のタンパク質の検出及び／又はその定量を可能にするものでなければならない。このキットは、検出溶液をさらに含んでいてもよい。
【００６４】
本発明の好ましい一実施形態は、上記のようなキットであり、このとき、該試薬は、少なくとも、配列番号１、又はその断片と少なくとも５０％同一なタンパク質を認識するための１種又は複数のプローブである。プローブは、本発明のタンパク質又はその任意の断片を検出、識別及び／又は定量するために、通常は（必須ではないが）標識されて使用される物質である。該プローブは、フルオロフォア、チオール反応性プローブ、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、ペプチン又は抗体であってもよいが、これらに限定されない。さらに、該プローブは、例えば、リソソーム酵素であるβ−ヘキソサミニダーゼＡ、及び／又はガングリオシドＧＭ２、若しくは末端Ｎ−アセチルヘキソサミンを含む他の分子のような、特異的分子結合であってもよい。ＧＭ２ＡＰは、リソソーム酵素であるβ−ヘキソサミニダーゼＡの基質特異的補因子として働く小さな糖脂質輸送タンパク質であるので、この酵素はプローブとしての役割を果たすことができ、β−ヘキソサミニダーゼＡは、ＧＭ２ＡＰと共に、ガングリオシドＧＭ２、及び末端Ｎ−アセチルヘキソサミンを含む他の分子の分解を触媒し、この理由のために、ＧＭ２、又は末端Ｎ−アセチルヘキソサミンを含む他の分子は、可能性があるプローブの基質として又はさらにプローブとして働き得る。
【００６５】
好ましい一実施形態は、配列番号１、又はその断片と少なくとも５０％同一な該タンパク質が、配列番号１と少なくとも７０％同一なタンパク質である、キットに関する。より好ましい一実施形態において、前記タンパク質は配列番号１である。
【００６６】
さらに好ましい一実施形態は、該プローブが固体担体に結合されている、キットに関する。この固体担体は、ゲル、例えば、アガロース又はポリアクリルアミドのゲルであることが好ましい。
【００６７】
より好ましい一実施形態において、該プローブは、本発明のタンパク質、又はその断片を認識するために使用される抗体である。該抗体は、モノクローナル又はポリクローナルであってもよい。さらにより好ましい一実施形態において、該抗体によって認識される該タンパク質からの断片は、配列番号２である。
【００６８】
他に定めがない限り、本明細書中で使用される技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者のうちの一人によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本発明の実施において、本明細書中に記載したものと同様又は同等の方法及び材料を使用することができる。本明細書及び特許請求の範囲の全体にわたり、「含む」という単語及びその変形は、他の技術的特徴、添加剤、成分、又はステップを排除することを意図するものではない。本発明のさらなる目的、利点及び特徴は、当業者には本明細書の検査を行うとすぐに明らかとなるであろうし、又は本発明の実施によってわかることもある。以下の実施例、図面及び配列表は、実例として提供されるものであって、本発明を限定することを意図するものではない。
【実施例】
【００６９】
以下の実施例は、下記に示すリスト中で請求する、ＧＭ２ＡＰの検出、並びにＡＲＦ、及び急性腎不全のリスクを検出するバイオマーカーとしてのその使用に関するいくつかのアッセイ及び操作条件についての、例示的且つ非限定的な性質の、説明を提供する。
【００７０】
実施例１．方法及び試薬。
１．１．動物及び試験のプロトコール。
【００７１】
ケージ飼育の、体重１９０〜２３０ｇの雌のＷｉｓｔａｒラットを、以下の試験群に分けた（図１）：（ｉ）対照：１日１回、生理食塩水（０．９％ＮａＣｌ）で７〜１３日間腹腔内に処置したラット、（ｉｉ）Ｇ−５０：５０ｍｇ／ｋｇ／日のゲンタマイシンで６日間処置したラット、（ｉｉｉ）Ｇ−５０−ＮＵ：５０ｍｇ／ｋｇ／日のゲンタマイシンで６日間処置し、７日目に０．５ｍｇ／ｋｇの硝酸ウラニルの単回腹腔内投与で処置したラット、（ｉｖ）ＮＵ：生理食塩水（０．９％ＮａＣｌ）で１日１回６日間腹腔内に処置し、７日目に０．５ｍｇ／ｋｇの硝酸ウラニルの単回腹腔内投与で処置したラット、（ｖ）Ｇ−５０＋ＮＵ：５０ｍｇ／ｋｇ／日のゲンタマイシンで６日間処置し、且つ１日目に０．５ｍｇ／ｋｇの硝酸ウラニルの単回腹腔内投与で処置したラット、（ｖｉ）Ｇ−５０−ｒ−ＮＵ：５０ｍｇ／ｋｇ／日のゲンタマイシンで６日間処置して、１週間処置のないままにし、次いで、０．５ｍｇ／ｋｇの硝酸ウラニルの単回腹腔内投与で処置したラット、（ｖｉｉ）Ｇ−１５０：１５０ｍｇ／ｋｇ／日のゲンタマイシンで６日間処置したラット。
【００７２】
全ての試験について、ラットは、温度及び湿度を調節した条件下の代謝ケージ中に個別に配置した。動物は、規則的な食事及び飲料水を自由に食べることができるようにさせた。異なる時に、２４時間の尿及び血液の試料を得た。尿は、混入及び蒸発を防止するために、１００μＬの０．１％アジ化ナトリウム及び１ｍｌの油を補った目盛をつけた容器中にそれぞれ採取した。続いて、尿を、１，１７５×ｇでの遠心分離によって透明にし、分注して−８０℃で保存した。血液は、尾部での小切開から採血し、ヘパリン処理したキャピラリー中に採取した。これらの血液を、１２，０００×ｇで直ちに遠心し、血漿を−８０℃で保存した。試験終了時に、ラットをペントバルビタールナトリウム（１０ｍｇ／ｋｇ）で麻酔した。腎臓を、腹大動脈を通してヘパリン処理した生理食塩水で潅流させて、直ちに解剖した。右腎と左腎の半分とを、液体窒素中での浸漬によって速やかに凍結させ、−８０℃で保存した。最終的に、これらをウエスタンブロット試験に使用した。こうした目的のために、ハンマーでの粉砕によって、微細な粉末が得られるまで、凍結組織を凍結条件下で均質化した。この粉末も、−８０℃で維持した。もう１つの半分の残された腎臓を、３．７％パラホルムアルデヒド中に４℃で１４〜１６時間浸漬した。その後、組織試料を、免疫組織化学試験用に処理した。
【００７３】
１．２．ｉｎ ｖｉｖｏでのゲンタマイシンの潅流。
ゲンタマイシンは、Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈによって好意的に提供された。硝酸ウラニルは、Ｓｉｇｍａから得た。他に指示がない場合、他の全ての試薬は、Ｓｉｇｍａから購入した。
【００７４】
ケージ飼育の、体重１９０〜２３０ｇの雌のＷｉｓｔａｒラットをペントバルビタールナトリウム（１０ｍｇ／ｋｇ）で麻酔した。右頸静脈及び膀胱にカテーテルを挿入した。１．５ｍＬのゲンタマイシン（１５０ｍｇ／ｋｇ）又は生理食塩水（０．９％ＮａＣｌ、対照として）の単回ボーラス投与を１．５ｍＬ中で頸静脈を通して３０分間潅流させた。その後、異なる各時点で、尿を採取した。尿を、（上記のように）遠心分離によって透明にし、後の使用のために−８０℃で維持した。
【００７５】
１．３．腎機能の特徴付け。
３２μＬの血漿及び尿を使用して、血漿及び尿のクレアチニン濃度及び血液尿素窒素（ＢＵＮ）を、自動解析システム（レフロトロン（Ｒｅｆｌｏｔｒｏｎ）（登録商標）、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｂａｒｃｅｌｏｎａ、Ｓｐａｉｎ）及び市販の反応性のストリップ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｂａｒｃｅｌｏｎａ、Ｓｐａｉｎ）によって決定した。この方法は、クレアチニンに対して０．５ｍｇ／ｄＬのより低い検出限界を有する。０．５ｍｇ／ｄＬ未満のクレアチニンの値を示す試料は、Ｊａｆｆｅの比色法（Ｈｅｒｖｅｙ、１９５３．Ｎａｔｕｒｅ、１７１：１１２５）によって接戦の再試験を行った。
【００７６】
クレアチニンクリアランス（Ｃｌｃｒ、ｍＬ／分）は、以下の式を使用して算出した：Ｃｌｃｒ＝ＵＦ×Ｃｕ／Ｃｐ、［式中、ＵＦは２４時間の尿流（ｍＬ／分で表される）であり、Ｃｕは尿中のクレアチニンの濃度であり、且つＣｐは血漿のクレアチニンの濃度である］。
【００７７】
尿中タンパク質濃度（ｍｇ／ｍＬ）は、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法（３９）によって測定した。１日のタンパク質排泄（ｍｇ／日）は、尿中タンパク質濃度と２４時間の尿流（ｍＬ／日）を乗算することによって得た。
【００７８】
尿中ＮＡＧ活性（任意単位、ＡＵ／ｍＬ）は、尿中ＮＡＧ濃度の推定値として、市販の酵素試験（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｂａｒｃｅｌｏｎａ、Ｓｐａｉｎ）によって製造業者の説明書に従って測定した。尿中ＮＡＧ活性は、尿中ＮＡＧ活性と２４時間の尿流（ｍＬ／日）を乗算することによって１日のＮＡＧ排泄（ＡＵ／日）に変換した。
【００７９】
１．４．抗ＧＭ２活性化タンパク質ポリクローナル血清の調製。
抗ＧＭ２ＡＰ血清の調製のために、架橋剤である４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸３−スルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルナトリウム塩（スルホ−ＳＭＣＣ）及びＮ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ、いずれもＳｉｇｍａ−Ａｌｄｈｒｉｃｈから）による、免疫原性タンパク質であるブルーキャリアー（ｂｌｕｅ ｃａｒｒｉｅｒ）（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）に対するコンジュゲート化を可能にするためにアミノ末端にシステインを加えた、ラット及びヒトのＧＭ２ＡＰ部分ペプチド配列である配列番号２に該当する合成の免疫原を、雌のニュージーランドホワイトウサギに注射した。フロイントアジュバント中の合成ペプチドを用いて、１、１４、３６及び５８日目に免疫化を行った。６３日目に、麻酔下でウサギを放血させた。この血清を、ＨｉＴｒａｐ ＴＭ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ ＨＰカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＡＢ；Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）に通して精製し、さらなる使用のために−２０℃で維持した。
【００８０】
１．５．免疫組織化学試験。
腎臓を、ｐ−ホルムアルデヒド中に４℃で一晩維持した。次いで、パラフィンブロックを作製し、５μｍの組織切片を切り分けて、ヘマトキシリン及びエオシンで染色した。Ｏｌｙｍｐｕｓ ＤＰ７０カラーデジタルカメラに連結したＯｌｙｍｐｕｓ ＢＸ５１顕微鏡下で写真を撮った。
【００８１】
１．６．ウエスタンブロッティング。
タンパク質抽出物を、１００ｍｇの組織ホモジェネート粉末から得て、均質化緩衝液（１４０ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ トリス−ＨＣＩ ｐＨ＝７．５、０．５Ｍ エチレンジアミン四酢酸−ＥＤＴＡ−、１０％ グリセロール、１％ イゲパル（Ｉｇｅｐａｌ） ＣＡ−６３０、１μｇ／ｍＬ アプロチニン、１μｇ／ｍＬ ロイペプチン、１μｇ／ｍＬ ペプスタチンＡ、１ｍＭ フッ化フェニルメチルスルホニル−ＰＭＳＦ−）中、４℃で組織ミキサー（Ｕｌｔｒａ−Ｔｕｒｒａｘ Ｔ８、ＩＫＡ（登録商標）−Ｗｅｒｗｅ）で腎臓を均質化することによって調製した。組織ホモジェネートを、２２，０００ｇで４℃で１５分間遠心分離した。上清を回収した。Ｌｏｗｒｙ法に基づく市販のキット（ＢｉｏＲａｄ）でタンパク質濃度を測定した。組織抽出物からの５０μｇの全タンパク質又は各試料からの２０μＬの透明にした尿を、１０〜１５％アクリルアミドゲル（Ｍｉｎｉ Ｐｒｏｔｅａｎ ＩＩ ｓｙｓｔｅｍ、ＢｉｏＲａｄ）中で電気泳動によって分離した。直ちに、タンパク質を、イモビロン−Ｐ（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ）メンブレン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に電気的に転写した。非特異的結合を防止するために膜をブロッキングした後に、ＫＩＭ−１（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、骨形成タンパク質−７（ＢＭＰ−７、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、プラスミノーゲン活性化因子阻害因子−１（ＰＡＩ−１ 、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ビメンチン（Ｄａｋｏ Ｄｅｎｍａｒｋ）及びＧＭ２活性化タンパク質（ＧＭ２ＡＰ、上記を参照されたい）に対する抗体で膜をプローブした。
【００８２】
１．７．尿プロテオミクス解析。
尿を、遠心力による濾過によってアミコンウルトラ（Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ）５Ｋカットオフカラム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を通して濃縮及び脱塩した。Ｂｒａｄｆｏｒｄ法によってタンパク質濃度を決定した。製造業者の説明書に従ってクリーン−アップ（Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ）キット（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて尿タンパク質を沈殿させた。各試料からの１００ｍｇのタンパク質を、７Ｍの尿素、２Ｍのチオ尿素、４％（ｗ／ｖ）のＣｈａｐｓ、０．５％の両性電解質ｐＨ４〜７又は４．５〜５．５、５０ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）及びブロモフェノールブルーに再水和させ、ＩＰＧｐｈｏｒ装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、長さ１８ｃｍの固定ｐＨ勾配（ＩＰＧ）ストリップ、ｐＨ４〜７又は４．５〜５．５（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｍａｄｒｉｄ、Ｓｐａｉｎ）を通して等電に集中させた（５００〜８，０００Ｖ）。ＩＰＧストリップを、１％（ｗ／ｖ）ＤＴＴを含む平衡化緩衝液［５０ｍＭトリス−ＨＣＩ ｐＨ＝８．８、６Ｍ尿素、３０％（ｖ／ｖ）グリセロール、２％（ｗ／ｖ）ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．０１％（ｗ／ｖ）ブロモフェノールブルー］中で１５分間、且つ２．５％（ｗ／ｖ）のヨードアセトアミドを含む平衡化緩衝液中でさらに１５分間予め平衡化した。次いで、ＩＰＧストリップを、長さ１８ｃｍの１２％アクリルアミドゲルに移して、ＳＥ ６００ Ｒｕｂｙ装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で電気泳動によって分離した。ゲルを、３０％エタノール、１０％酢酸中で一晩固定し、市販のキット（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて銀染色した。他に指示がない限り、全ての試薬はＳｉｇｍａからのものである。
【００８３】
可視化及び解析のために、染色したゲルをスキャンして（Ｉｍａｇｅ Ｓｃａｎｎｅｒ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｍａｄｒｉｄ、Ｓｐａｉｎ）、イメージマスター２Ｄプラチナ（Ｉｍａｇｅ Ｍａｓｔｅｒ ２Ｄ Ｐｌａｔｉｎｕｍ）６．０ソフトウェア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｍａｄｒｉｄ、Ｓｐａｉｎ）で処理及び統計学的解析を行った。以下のパラメータを用いてスポットの判別を行った：（ｉ）平滑係数：２；（ｉｉ）最小面積：５ピクセル；（ｉｉｉ）顕著性：１００。人為現象を排除するために、解析を視覚的に修正した。個々の各スポットについて、バックグラウンドを減算して、個々の強度体積を全強度体積（全スポット強度）によって標準化した。ゲル間の同じスポットを比較する場合には、示差的な発現とみなすために、最低２倍の強度の相違を設定した。（それぞれ）１Ｄ及び２Ｄの分離からの目的のバンド及びスポットをゲルから切断した。それぞれのゲル断片をアセトニトリル中で乾燥させ、これを真空ポンプで蒸発させて、ＮＨ４ＨＣＯ３に再懸濁した。２Ｄ−ＣＦ画分も真空蒸発させて、残留物をＮＨ４ＨＣＯ３に再懸濁した。したがって、１Ｄ、２Ｄ及び２Ｄ−ＣＦからの試料について、同一の処理をした。これらを、５０ｍＭのＮＨ４ＨＣＯ３中、５６℃で１０ｍＭのＤＴＴを用いて還元し、５０ｍＭのＮＨ４ＨＣＯ３中、ヨードアセトアミドでアルキル化した。次いで、このタンパク質を、ブタのトリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて４℃で３０分間ゲル中で消化させてペプチドにした。続いて、０．５％（ｖ／ｖ）のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）でペプチドを抽出した。この溶液を真空蒸発させて、ペプチドを０．１％（ｖ／ｖ）のギ酸に超音波処理下で溶解した。ペプチド含有溶液を、ａｎ１１００マイクロＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を備えたＬＣ−ＥＳＩ−ＱＵＡＤ−ＴＯＦ質量分光計ＱＳＴＡＲ ＸＬ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）内に注入した。大孔径１５０×０．３２ｍｍ（５μｍ）のスペルコ（Ｓｕｐｅｌｃｏ）カラム（Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ＢＩＯ）を７μＬ／分の流速で使用した。ＭＳ／ＭＳスペクトルを得た。タンパク質同定は、非重複性のタンパク質配列データベース（Ｓｗｉｓｓ Ｐｒｏｔ及びＮＣＢＩ）に対してＭＡＳＣＯＴソフトウェアを用いて行った。質量誤差範囲は５０ｐｐｍに、ＭＳ／ＭＳ誤差範囲は０．５Ｄａに、分類学的位置はラットに設定した。ＭＡＳＣＯＴ確率解析によって同定されるような、有意なヒットのみを考慮し、２０を超えるイオンスコアで適合する少なくとも１種のペプチドを、許容の閾値として設定した。ＬＣ−ＥＳＩ−ＱＵＡＤ−ＴＯＦ法により明確なタンパク質同定が得られないいくつかの場合には、又は（確認のために）無作為に選択したスポットでは、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｄａｄ ｄｅ Ｓａｌａｍａｎｃａ−ＣＳＩＣ（Ｓａｌａｍａｎｃａ、Ｓｐａｉｎ）のＣｅｎｔｒｏ ｄｅ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｃｉｏｎ ｄｅｌ ＣａｎｃｅｒのＰｒｏｔｅｏｍｉｃ Ｓｅｒｖｉｃｅによって、Ｕｌｔｒａｆｌｅｘ Ｉ ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分光計（Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ）を用いて、タンパク質を同定した。
【００８４】
ゲンタマイシン療法下ですでに２日又は３日の過程にある、ヒトの入院している個人からの尿試料を、Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｒｉｏ ｄｅ Ｓａｌａｍａｎｃａから得た。対照として、ゲンタマイシンを投与していない、年齢及び性別が適合した個人からの尿を使用した。
【００８５】
実施例２．結果。
ここで示す結果の主体は、以下を実証することを意図するものである。（ｉ）５０ｍｇ／ｋｇのゲンタマイシンを１日１回で６回投与する療法では、試験したいずれのパラメータによっても、いかなる腎損傷又は腎機能障害も誘発されない；（ｉｉ）これにもかかわらず、この準腎毒性療法は、第２の腎毒素の毒性の閾値を低下させることによって、ラットがＡＲＦを発症しやすくなるようにさせる；結果として、ゲンタマイシンによって罹患しやすくされたラットでは、準腎毒性用量のこの第２の腎毒素はＡＲＦの引き金となるが、未処置のラットではならない；（ｉｉｉ）（対照と比較した）Ｇ−５０動物からの尿についてのディファレンシャルプロテオミクスのアプローチを通して、この状態を検出する、尿中タンパク質（すなわち、ガングリオシドＧＭ２活性化タンパク質、ＧＭ２ＡＰ）を同定した；（ｉｖ）この新しい尿中バイオマーカーは、このこれまで隠されていた素因的状態の検出のためだけではなく、ゲンタマイシンによって誘発された急性腎損傷の極めて早期のマーカーとしても使用することができる。
【００８６】
２．１．腎毒性作用のないゲンタマイシン療法の選択。
予備試験において、ゲンタマイシンの腎毒性作用に対する用量の関係をＷｉｓｔａｒラットで段階的に調べた（データは示していない）。結果として、５０ｍｇ／ｋｇ／日を１日１回で６回投与した療法（Ｇ−５０）では、腎毒性の徴候は生じなかったが、１５０ｍｇ／ｋｇ／日を１日１回で６回投与する療法（Ｇ−１５０）では、本発明者らの全測定値の陽性対照として役割を果たす顕著な腎不全が引き起こされたことが結論づけられた。図１〜４は、生理食塩水を投与した対照ラット（Ｃ）と比較した、腎機能及び形態に対する、Ｇ−５０及びＧ−１５０の療法の作用の詳細な特徴付けを示している。これらの試験より、Ｇ−５０療法は、動物の一般的な健康状態に対する有害作用、並びに、（ｉ）臨床診療において使用されるパラメータ、及び（ｉｉ）より深く腎臓の状態を特徴付ける他のもの、によって測定されるような、特定の腎毒性の徴候を１つも及ぼさないことが明らかに実証される。
【００８７】
図１より、Ｇ−５０下の動物は、対照動物と同様な生存率及び体重の段階的変化を示すことが示唆され、毒性は有意でなかったことが示唆される。これに対して、Ｇ−１５０下の動物は、約５０％の死亡率、及び重篤な健康悪化を表す体重減少を示した。処置中止後（８日目以降）、いずれの群からの動物も死亡しなかった。
【００８８】
図２のデータより、対照ラットと比較して、Ｇ−５０ラットでは、ＧＦＲの状態に関連する臨床上使用されるパラメータ（すなわち、血漿クレアチニン濃度及びＢＵＮ濃度）が変化しなかったが、Ｇ−１５０群では、これらが著しく変化した（パネルＡ及びＢ）ことが示唆される。ゲンタマイシンによって誘発された腎障害の中で、タンパク尿は、主に尿細管由来であると考えられる（参考）。したがって、パネルＣより、Ｇ−５０動物は（対照のものと比較して）タンパク尿を示さないが、Ｇ−１５０動物は明白なタンパク尿を有することが示される。これは、極めて感度の高い尿細管障害のマーカー（参考）である、尿中ＮＡＧ排泄が、Ｇ−５０において変化せず、Ｇ−１５０において極めて増加している、パネルＤからのデータと合致している。これらのデータより、Ｇ−５０療法による腎機能の変化は認められないが、Ｇ−１５０処置の結果として明白な急性腎不全が生じることが示唆される。この後者は、これらの動物において認められる５０％死亡率及び健康悪化と合致している。
【００８９】
図３の画像は、Ｇ−１５０療法により、腎実質が、広範な尿細管壊死（パネルＣ）を主な特徴とする、集中的な損傷を負わされることを示している。しかし、Ｇ−５０群において、対照群と比較した、肉眼的な組織変化は検出されなかった。
【００９０】
さらに、腎組織ホモジェネートのウエスタンブロット解析（図４）により、Ｇ−１５０群において、ＰＡＩ−１、ＫＩＭ−１及びビメンチンのような、組織損傷及び修復に関連するマーカーの明らかな増加が示される。しかし、Ｇ−５０からの試料において、対照群からのものと比較した、これらのマーカーの増加は認められなかった。
【００９１】
図３で示した組織学的結果と合わせて、組織マーカー解析より、Ｇ−５０療法は腎臓に組織損傷を引き起こさないという考えが補強される。
２．２．ゲンタマイシンを用いた準毒性療法は急性腎不全の発症の素因となる。
【００９２】
この節における結果の主体は、準毒性Ｇ−５０療法により、可能性がある第２の腎毒素を投与したときに（未処置のラットに対する準毒性用量での場合）、ラットが急性腎損傷を発症しやすくなることを実証することを意図するものである。準毒性のゲンタマイシンによって誘発されるこの素質は、ゲンタマイシン治療中に生じ、治療中止後少なくともさらに１週間続く。
【００９３】
図５は、ラットに腎毒素である硝酸ウラニル（ＵＮ、０．５ｍｇ／ｋｇ）を投与したときに、そのクレアチニン及びＢＵＮの血漿濃度は、その前にゲンタマイシン（Ｇ−５０）を用いた準毒性療法を受けさせた場合のみに上昇することを示している。ゲンタマイシン（Ｇ−５０）、ＵＮ又は（対照として）生理食塩水のみを投与しているこれらのラットにおいて、これらのパラメータにおける変化は認められない。
【００９４】
さらに、ゲンタマイシンによって予め素因を与えられたラットのみが、タンパク尿（図６、左パネル）、増加したＮＡＧ排泄及び低下したクレアチニンクリアランス（図６、右パネル）を示す。これらのデータより、図５からの情報がさらに補強され、全体としてゲンタマイシンの素因的作用が支持される。
【００９５】
興味深いことに、ゲンタマイシンの素因的作用は、ゲンタマイシン中止直後のみではなく、その後の１週間も、且つさらにゲンタマイシン治療中にも有効である。これは、ラットにゲンタマイシンと並行して（黒丸）、又はゲンタマイシン中止１週間後に（白丸）ＵＮを投与した、図７のデータによって実証される。
【００９６】
２．３．ゲンタマイシンによって誘発される、急性腎不全に対する素質の尿中マーカーの、ディファレンシャルプロテオミクスを通した同定。
【００９７】
最先端の臨床的技術は、ゲンタマイシンの素因的作用を検出又は診断することができない。その理由は、そうした状態下で変化するパラメータがないからである。この状態を診断するために使用され得る、ゲンタマイシンのこの作用に関連する新しい尿中マーカーを見出す目的で、本発明者らは、対照及びＧ−５０の動物からの尿を用いて、ディファレンシャルプロテオミクスのアプローチを試みた。試験（図８）より、ＧＭ２ＡＰは、対照の尿中には存在せず、Ｇ−５０の尿中では高発現されていることが確認された。
【００９８】
２．４．ゲンタマイシンによって誘発される、急性腎不全に対する素質の尿中マーカーとしてのＧＭ２ＡＰの特徴付け及び検証。
ラット及びヒトのＧＭ２ＡＰに対して産生されたポリクローナル抗体によって、本発明者らは、対照及びＧ−５０の尿中でのこのタンパク質の示差的なレベルをさらに確認した（図９）。本発明者らの結果より、このタンパク質が、明白な腎不全を有するＧ−１５０ラットの尿中で上昇していることも実証される（図９、及び下記を、さらに詳細には図１１を参照されたい）。
【００９９】
２．５．他の腎毒性薬剤（ＵＮ及びシスプラチン）の後のＧＭ２ＡＰ。
図１０は、ＧＭ２ＡＰが、ＵＮ（上方パネル）及びシスプラチン（下方パネル）のような他の腎毒性物質によって負わされた明白な腎損傷の検出のためにも役立ち得ることを示している。血漿クレアチニン濃度によって実証されるように、ＵＮ又はシスプラチンのいずれかによってＡＲＦに罹患しているラットは、高レベルの尿中ＧＭ２ＡＰを示すが、対照ラットは、極めて少量の又は検出不可能な量のＧＭ２ＡＰマーカーを示すのを認めることができる。
【０１００】
上記の全てのデータから、本発明者らは、ＧＭ２ＡＰは以下を診断するために役立ち得ると結論づけることができる：１．準毒性のゲンタマイシンによって誘発されるＡＲＦに対する素質。これは、ＡＲＦの診断における突破口を構成するものである。その理由は、ゲンタマイシンで治療した患者が、無症状のままで、正常の条件ではいかなる腎作用も引き起こさないであろう他の作用剤への曝露によって急性腎損傷をより容易に発症しやすくなるようにさせ得る状態を我々は今や検出することができるようになる可能性があるからである。さらに、次に試験されるべきことは、ＡＲＦにおけるこの新規マーカーが、他の薬剤が準毒性用量で誘発する可能性がある潜在的な素因的作用を検出又は診断するのにも役立つかどうかである。
【０１０１】
２．６．急性腎不全（又は特定の型のＡＲＦ）の極めて早期のマーカーとしてのＧＭ２ＡＰの特徴付け及び検証。
ＧＭ２ＡＰがどのくらい早く腎損傷を検出するかを試験するために、Ｇ−１５０療法での処置による異なるマーカーの段階的変化についての一連の時間経過試験を行った。図１１において認められるように、クレアチニンクリアランス、血漿クレアチニン濃度及びＢＵＮ濃度、タンパク尿、及びＮＡＧ排泄などの臨床的パラメータは、ゲンタマイシン処置の開始４日後までに上昇した。さらに、ＫＩＭ−１及びＰＡＩ−１の尿中レベルも４日目までに上昇した。興味深いことに、ＧＭ２ＡＰの尿中レベルは、ゲンタマイシン開始後１日目と同じくらい早く上昇し始めた。
【０１０２】
これにより、ＧＭ２ＡＰは、ゲンタマイシンによって誘発された急性腎損傷の、且つおそらく一般の急性腎損傷の、極めて早期のマーカーとして、発展する可能性があることが明らかに示唆される。
【０１０３】
２．７．ゲンタマイシンで治療したヒトの尿中のＧＭ２ＡＰの特徴付け。
最後に、本発明者らは、ゲンタマイシンで治療した患者の尿中のＧＭ２ＡＰレベルが上昇しているかどうかを試験した。図１２は、ゲンタマイシン療法下の患者の人体計測のデータである血漿クレアチニン濃度及びＢＵＮ濃度、並びにＭＤＲＤ又はＣｏｃｋｒｏｆｔ−Ｇａｕｌｔ式によって推定されるＧＦＲ、並びに健常な未治療の対照からの人体計測のデータを示している。ゲンタマイシンで治療した、含まれている患者の腎機能は、正常状態の範囲内にある。しかし、実験動物において認められるのと同様に、ＧＭ２ＡＰの尿中レベルは、ウエスタンブロットによって決定されるように、ゲンタマイシンで治療した患者では明らかにより高い。これにより、ラットで収集した全てのデータと合わせて、ＧＭ２ＡＰの尿中レベルは、ヒトにおける急性腎損傷に対する素質の臨床的マーカーとして検証されるべきであることが示唆される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体における急性腎不全（ＡＲＦ）を発症するリスクを決定するために、又はＡＲＦを決定するために有用なデータを用意する方法であって、
ａ．個体（対象）から生体試料を得るステップと、
ｂ．（ａ）で得られた試料において、配列番号１、又はその断片と少なくとも５０％同一なタンパク質を検出及び／又は定量するステップと
を含む方法。
【請求項２】
（ｂ）で検出及び／又は定量される前記タンパク質が配列番号１と少なくとも７０％同一である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
（ｂ）で検出及び／又は定量される前記タンパク質が配列番号１である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
（ｂ）で得られた前記データを標準値と比較して、任意の有意な偏差を見出すステップをさらに含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記有意な偏差を、前記個体におけるＡＲＦを発症するリスクに、又はＡＲＦの発症に帰するステップをさらに含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ステップ（ａ）からの前記生体試料が体液である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記体液が尿である、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記タンパク質が、電気泳動、イムノアッセイ、クロマトグラフィー及び／又はマイクロアレイの技術によって検出及び／又は定量される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
ＡＲＦを発症する前記リスク、又は前記ＡＲＦが、少なくとも１種の腎毒性物質の投与又はそれに対する曝露に起因するものである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記腎毒性物質がアミノグリコシド系抗生物質である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記アミノグリコシド系抗生物質がゲンタマイシンである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記タンパク質が、前記腎毒性物質の投与又はそれに対する曝露の開始の１２時間後から検出される、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記タンパク質が２４時間から検出される、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
少なくとも１種の腎毒性物質の投与又はそれに対する曝露に起因するＡＲＦの進行を予測する方法であって、
ａ．前記腎毒性物質に曝露された個体又は曝露されていない個体から単離された体液において、配列番号１、又はその断片と少なくとも５０％同一なタンパク質の第１の濃度を決定するステップと、
ｂ．曝露された個体では前記タンパク質の前記第１の濃度を決定した後に、曝露されていない個体では前記腎毒性物質の投与又はそれに対する曝露の開始後に、前記個体から単離された体液において、ステップ（ａ）からの前記タンパク質の第２の濃度を決定するステップと、
ｃ．前記第２の濃度を前記第１の濃度と比較して、任意の有意な偏差を見出すステップと
を含む方法。
【請求項１５】
前記タンパク質が配列番号１と少なくとも７０％同一である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記タンパク質が配列番号１である、請求項１４又は１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記腎毒性物質がアミノグリコシド系抗生物質である、請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記アミノグリコシド系抗生物質がゲンタマイシンである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記体液が尿である、請求項１４〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記個体がヒトである、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
ＡＲＦを発症するリスクを決定するため、又はＡＲＦを決定するため、又はＡＲＦの進行を予測するためのバイオマーカーとしての、配列番号１、又はその断片と少なくとも５０％同一なタンパク質の使用。
【請求項２２】
前記タンパク質が配列番号１と少なくとも７０％同一である、請求項２１に記載のタンパク質の使用。
【請求項２３】
前記タンパク質が配列番号１である、請求項２１又は２２に記載のタンパク質の使用。
【請求項２４】
ＡＲＦを発症する前記リスク、又は前記ＡＲＦ、又はＡＲＦの前記進行が、少なくとも１種の腎毒性物質の投与に起因するものである、請求項２１又は２３に記載のタンパク質の使用。
【請求項２５】
個体から単離された試料において、ＡＲＦを発症するリスクを決定するため、又はＡＲＦを決定するため、又はＡＲＦの進行を予測するために有用なデータを用意するためのキットであって、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の任意の方法を行うための試薬を含むキット。
【請求項２６】
前記試薬が、少なくとも、配列番号１、又はその断片と少なくとも５０％同一なタンパク質を認識するための１種又は複数のプローブである、請求項２５に記載のキット。
【請求項２７】
前記プローブが、配列番号１、又はその断片を認識する、請求項２６に記載のキット。
【請求項２８】
前記プローブが固体担体に結合されている、請求項２６又は２７に記載のキット。
【請求項２９】
前記プローブが、前記タンパク質、又はその断片を認識するために使用される抗体である、請求項２６〜２８のいずれか一項に記載のキット。
【請求項３０】
前記抗体によって認識されるタンパク質の前記断片が配列番号２である、請求項２９に記載のキット。
【請求項１】
個体における急性腎不全（ＡＲＦ）を発症するリスクを決定するために、又はＡＲＦを決定するために有用なデータを用意する方法であって、
ａ．個体（対象）から生体試料を得るステップと、
ｂ．（ａ）で得られた試料において、配列番号１、又はその断片と少なくとも５０％同一なタンパク質を検出及び／又は定量するステップと
を含む方法。
【請求項２】
（ｂ）で検出及び／又は定量される前記タンパク質が配列番号１と少なくとも７０％同一である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
（ｂ）で検出及び／又は定量される前記タンパク質が配列番号１である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
（ｂ）で得られた前記データを標準値と比較して、任意の有意な偏差を見出すステップをさらに含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記有意な偏差を、前記個体におけるＡＲＦを発症するリスクに、又はＡＲＦの発症に帰するステップをさらに含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ステップ（ａ）からの前記生体試料が体液である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記体液が尿である、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記タンパク質が、電気泳動、イムノアッセイ、クロマトグラフィー及び／又はマイクロアレイの技術によって検出及び／又は定量される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
ＡＲＦを発症する前記リスク、又は前記ＡＲＦが、少なくとも１種の腎毒性物質の投与又はそれに対する曝露に起因するものである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記腎毒性物質がアミノグリコシド系抗生物質である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記アミノグリコシド系抗生物質がゲンタマイシンである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記タンパク質が、前記腎毒性物質の投与又はそれに対する曝露の開始の１２時間後から検出される、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記タンパク質が２４時間から検出される、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
少なくとも１種の腎毒性物質の投与又はそれに対する曝露に起因するＡＲＦの進行を予測する方法であって、
ａ．前記腎毒性物質に曝露された個体又は曝露されていない個体から単離された体液において、配列番号１、又はその断片と少なくとも５０％同一なタンパク質の第１の濃度を決定するステップと、
ｂ．曝露された個体では前記タンパク質の前記第１の濃度を決定した後に、曝露されていない個体では前記腎毒性物質の投与又はそれに対する曝露の開始後に、前記個体から単離された体液において、ステップ（ａ）からの前記タンパク質の第２の濃度を決定するステップと、
ｃ．前記第２の濃度を前記第１の濃度と比較して、任意の有意な偏差を見出すステップと
を含む方法。
【請求項１５】
前記タンパク質が配列番号１と少なくとも７０％同一である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記タンパク質が配列番号１である、請求項１４又は１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記腎毒性物質がアミノグリコシド系抗生物質である、請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記アミノグリコシド系抗生物質がゲンタマイシンである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記体液が尿である、請求項１４〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記個体がヒトである、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
ＡＲＦを発症するリスクを決定するため、又はＡＲＦを決定するため、又はＡＲＦの進行を予測するためのバイオマーカーとしての、配列番号１、又はその断片と少なくとも５０％同一なタンパク質の使用。
【請求項２２】
前記タンパク質が配列番号１と少なくとも７０％同一である、請求項２１に記載のタンパク質の使用。
【請求項２３】
前記タンパク質が配列番号１である、請求項２１又は２２に記載のタンパク質の使用。
【請求項２４】
ＡＲＦを発症する前記リスク、又は前記ＡＲＦ、又はＡＲＦの前記進行が、少なくとも１種の腎毒性物質の投与に起因するものである、請求項２１又は２３に記載のタンパク質の使用。
【請求項２５】
個体から単離された試料において、ＡＲＦを発症するリスクを決定するため、又はＡＲＦを決定するため、又はＡＲＦの進行を予測するために有用なデータを用意するためのキットであって、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の任意の方法を行うための試薬を含むキット。
【請求項２６】
前記試薬が、少なくとも、配列番号１、又はその断片と少なくとも５０％同一なタンパク質を認識するための１種又は複数のプローブである、請求項２５に記載のキット。
【請求項２７】
前記プローブが、配列番号１、又はその断片を認識する、請求項２６に記載のキット。
【請求項２８】
前記プローブが固体担体に結合されている、請求項２６又は２７に記載のキット。
【請求項２９】
前記プローブが、前記タンパク質、又はその断片を認識するために使用される抗体である、請求項２６〜２８のいずれか一項に記載のキット。
【請求項３０】
前記抗体によって認識されるタンパク質の前記断片が配列番号２である、請求項２９に記載のキット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【公表番号】特表２０１２−５２８３００（Ｐ２０１２−５２８３００Ａ）
【公表日】平成２４年１１月１２日（２０１２．１１．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５１２２１２（Ｐ２０１２−５１２２１２）
【出願日】平成２１年５月２６日（２００９．５．２６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０５６３８１
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１３６０５９
【国際公開日】平成２２年１２月２日（２０１０．１２．２）
【出願人】（５０９０６７９５７）ウニベルシダド・デ・サラマンカ (3)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年１１月１２日（２０１２．１１．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年５月２６日（２００９．５．２６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０５６３８１
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１３６０５９
【国際公開日】平成２２年１２月２日（２０１０．１２．２）
【出願人】（５０９０６７９５７）ウニベルシダド・デ・サラマンカ (3)
【Ｆターム（参考）】
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