成長刺激タンパク質の使用
本発明は、個体における新たに発見された成長刺激タンパク質の阻害に関する。さらに、本発明は、前記成長刺激タンパク質の発現を下方調節し、又は前記タンパク質を不活性化することにより、個体において癌を予防若しくは治療し、又は癌の成長、浸潤、若しくは転移を予防若しくは治療し、又は他の過剰増殖性疾患を予防若しくは治療する方法に関する。さらに、本発明は、前記成長刺激タンパク質に基づいて、個体において癌又は他の過剰増殖性疾患を診断する方法に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、個体における新たに発見された成長刺激タンパク質の阻害に関する。さらに、本発明は、前記成長刺激タンパク質の発現を下方調節し、又は前記タンパク質を不活性化することにより、個体において癌を予防若しくは治療し、又は癌の成長、浸潤、若しくは転移を予防若しくは治療し、又は他の過剰増殖性疾患を予防若しくは治療する方法に関する。さらに、本発明は、前記成長刺激タンパク質に基づいて、個体において癌又は他の過剰増殖性疾患を診断する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明の背景を明らかにするための、本明細書で用いる刊行物及び他の材料、並びに、特に実施に関してさらなる詳細を提供するための事例は、参照により組み込まれる。
【０００３】
癌は、世界中の全ての地域社会を悩ませている深刻な疾患である。男性の２人に１人、女性の３人に１人が一生の間に何らかの形の癌を発症すると推定されている。また、２００５年の間にアメリカ合衆国のみにおいて５５万人超の人々が癌によって死亡するとも推定されている。癌とは、細胞の制御されていない成長、生存、及び浸潤に関連する複雑で非常に様々な一連の疾患についての一般的な用語である。１００を超える異なる型の癌、並びにそれぞれのサブタイプが存在するが、最近の研究によって、良性の細胞から癌細胞への形質転換に必要な限られた数の遺伝因子が明らかにされている（Ｚｈａｏら、２００４年）。通常、ヒト細胞の形質転換にはＲａｓ ＧＴＰアーゼの活性化、テロメラーゼの過剰発現、腫瘍抑制タンパク質ｐ５３及び網膜芽細胞腫タンパク質（Ｒｂ）の不活性化、並びにプロテインホスファターゼ２Ａ（ＰＰ２Ａ）の阻害が必要であるとされている（Ｚｈａｏら、２００４年）。これらの遺伝因子の機能を理解することで、異なる型の癌に広く適用可能となる癌治療の開発がなされ得ることは明らかである。
【０００４】
上述したように、ＰＰ２Ａ活性の阻害はヒトの初代細胞の形質転換の必要条件の１つであると同定されている（Ｚｈａｏら、２００４年）。ＰＰ２Ａは、触媒性サブユニット（ＰＰ２Ａｃ又はＣ）、足場サブユニット（ＰＲ６５又はＡ）、及び選択的な調節性Ｂサブユニットの１つからなる三量体のタンパク質複合体である（図１Ａ）（Ｊａｎｓｓｅｎｓ及びＧｏｒｉｓ、２００１年）。ＰＰ２Ａは、プロテインキナーゼ及び他のシグナル伝達タンパク質の調節性のｓｅｒ／ｔｈｒ残基を脱リン酸化することにより細胞の挙動を調節する。発癌性の転写因子ｃ−ＭｙｃはＰＰ２Ａの多くの基質の１つである。ｃ−Ｍｙｃのセリン６２のＰＰ２Ａ介在性の脱リン酸化によりプロテオソームによるタンパク質の分解が生じることが最近示された（Ｙｅｈら、２００４年）。重要なことには、ＰＰ２Ａを不活性化するウイルススモールｔ抗原は、ｃ−Ｍｙｃの安定化によりその発癌性を発揮する（Ｙｅｈら、２００４年）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ウイルス抗原を研究ツールとして用いることによって、ヒト細胞の形質転換のためのＰＰ２Ａの阻害の重要性が確証されているが、自然発生的に形質転換されたヒト癌細胞における、ＰＰ２Ａの阻害を生じさせる分子メカニズムは、現在のところ明らかにされていない。したがって、ＰＰ２Ａが形質転換を阻害するメカニズムを解明する確かな必要性がある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、成長刺激タンパク質の発見に基づいている。本発明の発明者は、タンパク質ＫＩＡＡ１５２４（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＩ３０５６５、配列番号１）がプロテインホスファターゼ２Ａ（ＰＰ２Ａ）の内因性阻害剤であること、並びにタンパク質ＫＩＡＡ１５２４が腫瘍の成長及び癌細胞の増殖に必要であること、並びにタンパク質ＫＩＡＡ１５２４が癌組織において上方調節されることを見出した。
【０００７】
したがって、一態様によれば、本発明はＫＩＡＡ１５２４を阻害する治療作用物質をスクリーニング及び同定する方法に関し、前記方法は、ａ）反応容器内に固定化された第一のタンパク質を提供するステップと、ｂ）前記容器に、候補作用物質及び標識された第二のタンパク質を同時に又は任意の順序で連続的に加えるステップと、ｃ）前記第一のタンパク質が前記第二のタンパク質に結合するかどうかを決定するステップと、ｄ）ステップｃ）における決定が否定的である場合に、前記候補作用物質を、ＫＩＡＡ１５２４を阻害する治療作用物質であると同定するステップとを含み、前記第一のタンパク質はＫＩＡＡ１５２４であり、前記第二のタンパク質はＰＰ２Ａ、そのサブユニット、及びｃ−Ｍｙｃからなる群から選択され、又はその逆である。
【０００８】
別の態様によれば、本発明は、特許請求の範囲に記載した低分子干渉ＲＮＡ及びペプチドなどの、ＫＩＡＡ１５２４を阻害する作用物質に関する。さらに、本発明はそのような作用物質を含む医薬組成物に関する。
【０００９】
さらなる態様によれば、本発明は医薬組成物を生産する方法、及びそのような方法によって生産された医薬組成物に関し、前記方法は、ＫＩＡＡ１５２４を阻害する作用物質を同定するステップと、前記作用物質を薬学的に許容できる任意の適切な賦形剤と混合するステップとを含む。
【００１０】
さらなる態様によれば、本発明は、特許請求の範囲に記載した医薬組成物を治療有効量投与することにより、ＫＩＡＡ１５２４の阻害が必要なヒト又は動物の患者においてＫＩＡＡ１５２４を阻害する方法に関する。
【００１１】
さらなる態様によれば、本発明は、癌及び他の過剰増殖性疾患からなる群から選択される疾患を治療、予防、及び／又は緩和するための医薬組成物を製造するための、ＫＩＡＡ１５２４を阻害する作用物質の使用に関する。
【００１２】
さらなる別の態様によれば、本発明は、癌に罹患している疑いのある哺乳動物において悪性転化の浸潤性を決定する方法に関し、前記方法は、ａ）前記哺乳動物から得られた、悪性細胞を含む疑いのある試料におけるＫＩＡＡ１５２４の発現レベルを評価するステップと、ｂ）ステップａ）の発現レベルを、非悪性の対照試料におけるＫＩＡＡ１５２４の発現レベルと比較するステップと、ｃ）前記試料におけるＫＩＡＡ１５２４の発現レベルが非悪性の対照試料におけるＫＩＡＡ１５２４の発現レベルよりも顕著に高い場合に、前記悪性転化を浸潤性であると決定するステップとを含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明は、ＫＩＡＡ１５２４を、ＰＰ２Ａと相互作用しその腫瘍抑制活性を阻害する成長刺激タンパク質として同定することに基づいている。したがって本発明は、新規な抗癌作用物質又は抗増殖作用物質の標的としてＫＩＡＡ１５２４を提供する。
【００１４】
ＫＩＡＡ１５２４を、ＰＰ２Ａタンパク質複合体の足場サブユニットであるＰＲ６５タンパク質との免疫共沈降、及びその後の質量分析によるペプチド配列決定に基づいて、ＰＰ２Ａ相互作用タンパク質として同定した。ＫＩＡＡ１５２４の、ＰＰ２Ａ複合体と相互作用する能力を、内因性ＰＲ６５タンパク質の免疫共沈降分析により、またＫＩＡＡ１５２４の欠失突然変異体を用いることにより明らかにした。加えて、ＫＩＡＡ１５２４に標的化した低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）オリゴによりＫＩＡＡ１５２４を減少させるとＰＰ２Ａのホスファターゼ活性が刺激されたことから、ＰＰ２Ａ阻害剤としてのＫＩＡＡ１５２４の機能的役割が明らかにされた。
【００１５】
さらに、免疫共沈降実験に基づいて、ＫＩＡＡ１５２４を、転写因子ｃ−Ｍｙｃと直接相互作用するタンパク質であると同定した。前記相互作用はｃ−Ｍｙｃタンパク質を安定化し、それによりその発癌性を高めることが示された。
【００１６】
例えば、ＫＩＡＡ１５２４のｓｉＲＮＡで細胞をトランスフェクトして、その後、細胞培養物及びインビボでのマウスモデルの両方における細胞増殖を決定することにより、癌細胞の挙動の調節におけるＫＩＡＡ１５２４の役割を研究した。ＫＩＡＡ１５２４が減少すると、細胞増殖が阻害され、細胞の足場非依存性の成長が阻害され、かつマウスにおける腫瘍形成が損なわれた。さらに、ＫＩＡＡ１５２４が頭頚部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）、結腸癌、及び乳癌などのヒトの悪性腫瘍において過剰発現することが見出された。特に、ＫＩＡＡ１５２４の過剰発現は、結腸癌及び乳癌の非浸潤性腫瘍よりも、結腸癌及び乳癌由来の浸潤性腫瘍で多く見られた。これらの結果、及び以下に開示する他の結果は、ＫＩＡＡ１５２４が癌細胞の成長を促進すること、したがってＫＩＡＡ１５２４が癌治療の標的となることを示している。
【００１７】
本発明は、ＫＩＡＡ１５２４を阻害する、ひいては癌、癌細胞の増殖、浸潤、転移、並びに他の過剰増殖性疾患、例えば乾癬、心筋肥大、及び良性腫瘍、例えば腺腫、過誤腫、及び軟骨腫の治療、予防、及び／又は緩和に有用な治療作用物質をスクリーニング及び同定する方法を目的とする。
【００１８】
本明細書を通して用いられるように、「ＫＩＡＡ１５２４を阻害すること」という表現は、ＫＩＡＡ１５２４の発現を下方調節すること、ＫＩＡＡ１５２４の活性を阻害すること、ＫＩＡＡ１５２４を不活性化すること、及びＰＰ２Ａ複合体又はｃ−ＭｙｃとのＫＩＡＡ１５２４の相互作用を阻害することを含む。阻害及び遮断という語は互換的に用いられる。
【００１９】
上記の方法は、ａ）反応容器内に固定化された第一のタンパク質を提供するステップと、ｂ）前記容器に、候補作用物質及び標識された第二のタンパク質を同時に又は任意の順序で連続的に加えるステップと、ｃ）前記第一のタンパク質が前記第二のタンパク質に結合するかどうかを決定するステップと、ｄ）ステップｃ）における決定が否定的であるが治療作用物質の不在下では肯定的である場合に、前記候補作用物質を、ＫＩＡＡ１５２４を阻害する治療作用物質であると同定するステップとを含む。この方法において、前記第一のタンパク質はＫＩＡＡ１５２４であり、前記第二のタンパク質はＰＰ２Ａ、そのサブユニット、すなわちＰＰ２Ａｃα若しくはβ、ＰＲ６５α若しくはβ、又は任意の選択的なＢサブユニット（Ｂ、Ｂ’、Ｂ”）、及びｃ−Ｍｙｃからなる群から選択され、又はその逆である。
【００２０】
マルチウェルプレートなどの反応容器への前記第一のタンパク質の固定化は、当技術分野で既知の任意の適切な方法によって行うことができる。そのような方法は当業者には明らかであり、当業者は、前記タンパク質の立体構造又は結合特性に影響を与えることなく前記タンパク質を固定化する方法についても充分に理解している。
【００２１】
当技術分野で既知の任意の適切な標識及び標識方法を、前記第二のタンパク質の標識に用いることができる。好ましくは、前記標識は蛍光標識であり、例えば、緑色蛍光タンパク質、又はテキサスレッドなどの化学蛍光標識である。前記標識はまた、ルシフェリンなどの基質とインキュベートすると光を発するホタルルシフェラーゼのようなタンパク質でもあり得る。加えて、前記標識は、３−アミノ−９−エチルカルバゾールなどの基質とインキュベートすると比色反応を生じる西洋ワサビペルオキシダーゼのような酵素でもあり得る。
【００２２】
候補作用物質の存在下で前記第一のタンパク質が前記第二のタンパク質に結合するかどうかについての決定は、用いる標識に応じて任意の適切な方法により行うことができる。例えば、蛍光標識を用いる場合、タンパク質の結合は、好ましくはレーザーである光源と、光又はレーザーによる励起に応じて蛍光標識から発せられる光を検出するセンサーとを含む光学機器によって決定することができる。例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ標識をその基質、例えば３−アミノ−９−エチルカルバゾールと組み合わせて用いる場合のような比色反応の場合、タンパク質の結合は、目的の波長領域における吸光度の変化により決定し得る。
【００２３】
当業者には、本方法がまたインキュベーション及び洗浄などの様々な追加のステップも含み得るということは明らかであろう。例えば、洗浄は、結合していない第二のタンパク質を除去するためにステップｂ）の後に必要であり得る。
【００２４】
本発明による一実施形態では、第一のタンパク質又は標的タンパク質を９６ウェル、３８４ウェル、又は任意の同等のマルチウェルのプレート上に固定化すること、及び、それを、例えば緑色蛍光タンパク質、テキサスレッド、又はルシフェラーゼタンパク質に融合した第二のタンパク質とインキュベートすることによる、タンパク質−タンパク質相互作用の阻害剤のハイスループットスクリーニングに、本方法を用いることができる。プレートリーダーを用いて、蛍光標識から発せられた光を測定し、相互作用の場合にはウェルからの光シグナルを検出する。このようなアッセイをペプチド及び小分子化合物のライブラリーと組み合わせることで、容器内の蛍光シグナルの損失により検出される、タンパク質相互作用を阻害する潜在的な薬物様分子の同定が可能になろう。
【００２５】
本発明はさらに医薬組成物を生産する方法を目的としており、前記方法は、ＫＩＡＡ１５２４を阻害する作用物質を同定すること、及び前記作用物質を薬学的に許容できる当業者に周知の任意の適切な賦形剤と混合することを含む。一実施形態では、前記同定は上述したスクリーニング方法及び同定方法を用いて行われる。
【００２６】
さらに、本発明は、本発明によって生産された医薬組成物を治療有効量投与することにより、ＫＩＡＡ１５２４の阻害が必要なヒト又は動物の患者においてＫＩＡＡ１５２４を阻害する方法を目的とする。
【００２７】
本方法はあらゆる癌の治療に有用となり得ると考えられる。しかし、本方法は、特定の組織に位置する癌、及び手術又は放射線照射によっては治療が困難又は不可能であろう癌の治療又は予防に特に適している。そのような癌の例としては、頭頚部扁平上皮癌、結腸癌、及び乳癌が挙げられる。
【００２８】
本方法はまた、ＫＩＡＡ１５２４が発現する過剰増殖性疾患の治療にも有用であり得ると考えられる。そのような疾患としては、乾癬、心筋肥大、並びに、腺腫、過誤腫、及び軟骨腫などの良性腫瘍が挙げられる。
【００２９】
本発明による方法は、単一の治療方法若しくは予防方法として、又は細胞毒性作用物質の投与、手術、放射線治療、免疫療法などの他の方法と組み合わせたアジュバント療法として達成され得る。
【００３０】
本発明による様々な実施形態によって同定され得る、及び／又は本発明による方法において有用な作用物質は、限定はしないが、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、及びリボザイム分子などのオリゴヌクレオチド、ペプチド、ペプチド模倣物、化合物、小分子、前記ＫＩＡＡ１５２４に対する抗体、並びにＫＩＡＡ１５２４のタンパク質立体構造に作用してそれを不活性化させるアプタマー（オリゴヌクレオチド）を含む。
【００３１】
好ましい実施形態によれば、前記作用物質はＫＩＡＡ１５２４の発現を下方調節する作用物質である。
【００３２】
好ましい一実施形態によれば、ＫＩＡＡ１５２４の下方調節は例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド、修飾されたヌクレオチド、異なる種類のヌクレオチドを組み合わせた配列を用いて、ＫＩＡＡ１５２４の合成を防止又は変更することにより可能である。アンチセンスオリゴヌクレオチドはＤＮＡ分子又はＲＮＡ分子であり得る。
【００３３】
ＫＩＡＡ１５２４のｍＲＮＡを切断するリボザイムもまた含まれる。リボザイム技術は例えば以下の刊行物に記載されている。「癌遺伝子標的の同定及び検証のためのリボザイム技術（Ｒｉｂｏｚｙｍｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ ｇｅｎｅ ｔａｒｇｅｔ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ）」、Ｌｉら、Ａｄｖ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００７年、９６：１０３−４３。また、低分子干渉ＲＮＡ分子（ｓｉＲＮＡ）も有用であろう。ｓｉＲＮＡの適用はここ数年、新たな治療の開発において重要なものとなってきている。Ｏ Ｈｅｉｄｅｎｒｅｉｃｈは、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗ、第１号、２００５年における論文「低分子干渉ＲＮＡからの治療法の構築（Ｆｏｒｇｉｎｇ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ｆｒｏｍ ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡｓ）」において、医薬品としての適用についての概説を示している。腫瘍及び癌、肉腫、高コレステロール血症、神経芽細胞腫、並びに実質型角膜ヘルペスの治療について、原理が特に示されている。
【００３４】
ｓｉＲＮＡの原理は文献に広く示されている。例として、米国特許公開第２００３／０１４３７３２号、第２００３／０１４８５０７号、第２００３／０１７５９５０号、第２００３／０１９０６３５号、第２００４／００１９００１号、第２００５／０００８６１７号、及び第２００５／００４３２６６号を挙げることができる。ｓｉＲＮＡの二本鎖分子はアンチセンス領域及びセンス鎖を含み、前記アンチセンス鎖は特定のタンパク質をコードするｍＲＮＡ配列における標的領域に相補的な配列を含み、センス鎖は前記アンチセンス鎖に相補的な配列を含む。したがって、ｓｉＲＮＡの二本鎖分子は２つの核酸断片の集合であり、一方の断片は前記ｓｉＲＮＡ分子のアンチセンス鎖を含み、第二の断片はそのセンス鎖を含む。センス鎖及びアンチセンス鎖は、ポリヌクレオチドリンカー又は非ヌクレオチドリンカーであり得るリンカー分子を介して共有結合し得る。アンチセンス鎖及びセンス鎖の長さは典型的には各々およそ１９から２１ヌクレオチドである。しかし、対応する従来の２１ｍｅｒの低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）よりも強力であると最近報告された（Ｋｉｍら、２００５年）、合成二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）のＤｉｃｅｒの基質である２５〜３０ヌクレオチド長の二本鎖もまた利用可能である。典型的には、アンチセンス鎖及びセンス鎖は両方とも、少しのヌクレオチド、典型的には２個のヌクレオチドの、３’末端の突出を有する。アンチセンスの５’末端は典型的にはリン酸基（Ｐ）である。末端のリン酸基（Ｐ）を有するｓｉＲＮＡの二本鎖は、一本鎖のアンチセンスよりも細胞内に投与することが容易である。細胞内において、活性なｓｉＲＮＡアンチセンス鎖が形成され、それが標的ｍＲＮＡの標的領域を認識する。このことから、ＲＩＳＣエンドヌクレアーゼ複合体（ＲＩＳＣは、ＲＮＡ誘導性サイレンシング複合体）により標的ＲＮＡが切断され、また、ＲＮＡ依存性のＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲＰ）によりさらなるＲＮＡが合成され、それによりＤＩＣＥＲが活性化しさらなるｓｉＲＮＡの二本鎖分子が生じ得、それによって応答が増幅される。
【００３５】
低分子干渉ＲＮＡに関する課題の１つは、対応するｍＲＮＡに対する強力なｓｉＲＮＡの同定である。不完全な相補性を有する遺伝子はｓｉＲＮＡによって間違えて下方調節されてしまい、それによりデータの解釈及び潜在的な毒性において問題が生じることに留意されたい。しかしこれは、設計アルゴリズムを用いて適切なｓｉＲＮＡを慎重に設計することにより部分的に対処し得る。これらのコンピュータプログラムは、ｓｉＲＮＡのサイレンシング効果を増強する特徴である、低いＧＣ含有量、内部反復の欠如、Ａ／Ｕに富んだ５末端、及び高い局所的な結合自由エネルギーを有する配列範囲を見出すための一連のルールを用いて、所与の標的配列をふるい出す。
【００３６】
本発明において有用な作用物質を同定するために、市販の及び市販されていないアルゴリズムを用いていくつかの異なるＫＩＡＡ１５２４のｓｉＲＮＡを設計した。この目的のために、ＫＩＡＡ１５２４の全長ｃＤＮＡ配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿０２０８９０）を、ｓｉＲＮＡアルゴリズムプログラム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｗｇ−ｂｉｏｔｅｃｈ．ｃｏｍ／ｈｔｍｌ／ｓ＿ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ＿ａｃｉｄｓ／ｓ＿ｓｉｒｎａ＿ｄｅｓｉｇｎ．ｓｈｔｍｌ）、及びＷｅｎｗｕ Ｃｕｉａ、Ｊｉａｎｃｈａｎｇ Ｎｉｎｇｂ、Ｕｌｈａｓ Ｐ．Ｎａｉｋａ、Ｍｅｌｉｎｄａ Ｋ．Ｄｕｎｃａｎａにより開発されたスタンドアロンプログラム（ＲＮＡｉ設計ツールであるＯｐｔｉＲＮＡｉ、「生物医学におけるコンピュータ手法及びプログラム（Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｇｒａｍｓ ｉｎ Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ）」（２００４年）７５、６７−７３）にロードした。さらに、アルゴリズムにより生成したｓｉＲＮＡ配列を次にゲノム規模でのＤＮＡ配列のアラインメント（ＢＬＡＳＴ）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ）を通してスクリーニングし、オフターゲット効果を有するｓｉＲＮＡを排除した。つまり、標的遺伝子（ＫＩＡＡ１５２４）よりも他の遺伝子とマッチしている配列領域をたとえ短くても有する全てのこれらのｓｉＲＮＡを、さらなる利用に非常に有益なものであると考えた。このアプローチにより、配列番号２から６で示される５つの潜在的なｓｉＲＮＡが同定された。
【００３７】
次に、得られたｓｉＲＮＡを異なる細胞系にトランスフェクトし、ｍＲＮＡを分解する及びＫＩＡＡ１５２４の翻訳をさらに減少させるそれらの能力を、ＫＩＡＡ１５２４に特異的な抗体でｓｉＲＮＡを処理した後のＫＩＡＡ１５２４タンパク質の量を測定することにより、タンパク質レベルで研究した。表１において、用いた最低濃度でＫＩＡＡ１５２４タンパク質の最も強い下方調節を示したｓｉＲＮＡ配列にアスタリスクで印を付した。
【００３８】
【表１】
【００３９】
したがって本発明は、配列番号２から６からなる群から選択されるＫＩＡＡ１５２４のｓｉＲＮＡ、及び医薬品としてのそれらの使用に関する。配列番号２及び４で示される好ましいｓｉＲＮＡ、並びに配列番号３及び６で示されるより好ましいｓｉＲＮＡが提供される。いくつかの適用では、前記ｓｉＲＮＡが２１〜２５ヌクレオチドより長くてもよく、又はｄｓＲＮＡのｄｉｃｅｒの基質である二本鎖でもよいことは明らかである。
【００４０】
オリゴヌクレオチド（アンチセンス、ｓｉＲＮＡ、又はリボザイム分子など）は、医薬品として用いる場合、標的細胞内に導入される。送達は、２つの基本的に異なる手段、１）オリゴヌクレオチドの外因性の送達、又は２）ＤＮＡ配列がベクター内に位置する場合の、オリゴヌクレオチドをコードするＤＮＡ配列の内因性の転写で達成され得る。
【００４１】
正常な、修飾されていないＲＮＡは、生細胞内に存在するリボヌクレアーゼ酵素により分解されるため、生理的条件下における安定性が低い。オリゴヌクレオチドを外因的に投与する場合、既知の方法によって分子を修飾し、化学分解及び酵素分解に対するその安定性を高めることが非常に望ましい。
【００４２】
インビボで外因的に投与されるヌクレオチドの修飾は当技術分野において広く記載されている。基本的に、ヌクレオチドの任意の部分、すなわちリボース糖、塩基、及び／又はヌクレオチド間のリン酸ジエステル鎖を修飾し得る。例えば、リボース単位から２’−ＯＨ基を除去して２’−デオキシリボースヌクレオチドとすると安定性が向上する。この基における他の修飾、すなわちアルキル基、アルケニル基、アリル基、アルコキシアルキル基、ハロ基、アミノ基、アジド基、又はスルフヒドリル基によるリボース２’−ＯＨ基の置換もまた先行文献に開示されている。リボース単位における他の修飾も実施し得、すなわちリボースの２’位と４’位との間にメチレン結合を含むロックされた核酸（ＬＮＡ）を、固有の安定性を高めるために採用し得る。
【００４３】
さらに、ヌクレオチド間のリン酸ジエステル結合を修飾して、例えば、１つ又は複数の酸素を硫黄、アミノ基、アルキル基、又はアルコキシ基で置換することができる。ヌクレオチド内の塩基もまた修飾し得る。
【００４４】
好ましくは、オリゴヌクレオチドは、リボース糖における１つ若しくは複数の２’−ヒロドキシル基の修飾、及び／又は１つ若しくは複数のヌクレオチド間のリン酸ジエステル結合における修飾、及び／又はリボース糖の２’位と４’位との間における１つ若しくは複数のロックされた核酸（ＬＮＡ）の修飾を含む。
【００４５】
特に、好ましい修飾は例えば、２’−デオキシ、２’−Ｏ−メチル、２’−ハロ、例えばフルオロ又は２’−メトキシエチルによる、１つ又は複数の２’−ＯＨ基の置換である。特に好ましいものは、いくつかのヌクレオチド間のリン酸ジエステル結合も修飾されている、例えばホスホロチオエート結合により置換されている、オリゴヌクレオチドである。
【００４６】
上述した修飾は非限定的な例にすぎないということに留意されたい。
【００４７】
好ましい一実施形態によれば、スクリーニングアッセイによって同定可能な、又は本発明による方法において有用な作用物質は、ＰＰ２Ａ複合体又は転写因子ｃ−Ｍｙｃとの前記ＫＩＡＡ１５２４の相互作用を阻害することにより腫瘍の成長及び増殖を予防又は阻害する。或いは、前記作用物質は、ＰＰ２Ａ又はｃ−ＭｙｃとのＫＩＡＡ１５２４の相互作用に依存しない、ＫＩＡＡ１５２４の成長及び増殖を増強する効果を阻害する。前記作用物質は、例えば、ペプチド、ペプチド模倣物、小分子、前記ＫＩＡＡ１５２４に対する抗体、又はＫＩＡＡ１５２４のタンパク質立体構造に作用してそれを不活性化させるアプタマー（オリゴヌクレオチド）であり得る。
【００４８】
ＰＲ６５の免疫共沈降実験の結果により、ＫＩＡＡ１５２４がＰＰ２Ａタンパク質複合体のＰＲ６５サブユニット及びＰＰ２Ａｃサブユニットの両方と相互作用することが示された。タンパク質−タンパク質相互作用に介在するＫＩＡＡ１５２４内の領域を同定するために、ＫＩＡＡ１５２４タンパク質の任意の領域が欠失することによりＰＰ２Ａとのその結びつきがなくなるかどうかを研究した。この目的のために、タンパク質をコードする配列のおよそ５０〜１００個のアミノ酸に対応する各欠失を有する、一連のＫＩＡＡ１５２４欠失構築物を生成し、ＨｅＬａ細胞に一過性にトランスフェクトした。１１個のＫＩＡＡ１５２４欠失体のうち、４６１〜５３３の間のアミノ酸を欠くＫＩＡＡ１５２４が、免疫共沈降実験で示されるＰＲ６５に対する結合の低下を反復実験において示した唯一の突然変異体であった。したがって、配列番号１のアミノ酸４６１からアミノ酸５３３までの領域は、癌の新規な治療法にとって特に重要な標的である。
【００４９】
したがって、特に好ましい実施形態によれば、作用物質は、アミノ酸４６１から５３３までの領域のＫＩＡＡ１５２４、又は、ＰＰ２Ａ複合体とＫＩＡＡ１５２４タンパク質との間の相互作用に関与するＫＩＡＡ１５２４上の任意の他の領域を不活性化する。前記作用物質は、例えば、ペプチド、ペプチド模倣物、小分子、前記ＫＩＡＡ１５２４に対する抗体、又はＫＩＡＡ１５２４のタンパク質立体構造に作用してそれを不活性化させるアプタマー（オリゴヌクレオチド）であり得る。
【００５０】
より具体的には、本発明は、配列番号１で示されるＫＩＡＡ１５２４のアミノ酸４６１〜５３３の領域のアミノ酸に対応する、３から６０個の任意の長さのアミノ酸、好ましくは３から３０個、好ましくは６から１８個、好ましくは６から１２個、又は好ましくは９から１２個のアミノ酸を含む遮断ペプチドを提供する。いくつかの適用において前記遮断ペプチドが６０個のアミノ酸よりも長くてもよいことは明らかである。本発明によるペプチドはＰＰ２Ａ複合体の構成要素に結合し、ＫＩＡＡ１５２４とＰＰ２Ａとの間の相互作用を阻害し、それによりＰＰ２Ａの腫瘍抑制活性を誘導し、かつ他方で、ＫＩＡＡ１５２４を阻害又は遮断する。本発明による他の実施形態では、前記遮断ペプチドは、配列番号７から３０からなる群から選択される少なくとも１つの、好ましくは１から２０個の、好ましくは１から１０個の、好ましくは２から６個の、好ましくは２から４個の、又は好ましくは３から４個の連続配列、及びその保存的な配列変異体を含む。
【００５１】
ＫＩＡＡ１５２４の減少が、ＰＰ２Ａ複合体とその基質であるｃ−Ｍｙｃとの機能的な相互作用に影響を与えるかどうかを研究するために、ＫＩＡＡ１５２４のｓｉＲＮＡをトランスフェクトした後のＨｅＬａ細胞抽出物においてｃ−Ｍｙｃの定常的な発現レベルを研究した。図３Ａに示すように、ｓｉＲＮＡ誘導性のＫＩＡＡ１５２４の減少により、ＨｅＬａ細胞におけるｃ−Ｍｙｃタンパク質の発現は下方調節されたが、一方、図３Ｂに示すように、ｃ−ＭｙｃのｍＲＮＡの発現は影響を受けなかった。これらの結果により、ＫＩＡＡ１５２４がｃ−Ｍｙｃタンパク質レベルを転写後に調節することが示された。ｃ−Ｍｙｃタンパク質レベルの減少がタンパク質の不安定化により生じるかどうかを研究するために、内因性ｃ−Ｍｙｃタンパク質の半減期に対するＫＩＡＡ１５２４の減少の影響をパルスチェイス分析により調べた。実験の項においてより詳細に記載するように、ＫＩＡＡ１５２４の減少はｃ−Ｍｙｃタンパク質の安定性を顕著に低下させ、つまりＫＩＡＡ１５２４がｃ−Ｍｙｃの安定性の重要な調節因子であることを示している。
【００５２】
細胞抽出物のｃ−Ｍｙｃ及びＫＩＡＡ１５２４の免疫共沈降により、これらのタンパク質の間の物理的関連が明らかにされた（図３Ｄ）。ＫＩＡＡ１５２４とｃ−Ｍｙｃとの間の相互作用をさらに解明するため、Ｆｌａｇタグ付けされた全長組換えＫＩＡＡ１５２４を昆虫細胞において産生し、ｃ−Ｍｙｃの組換えＧＳＴ融合アミノ末端部分（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿００２４５８の配列のアミノ酸１〜２６２）を用いた、インビトロでのタンパク質−タンパク質相互作用のアッセイを実施した。結果は、ＧＳＴ−ｃ−Ｍｙｃの１〜２６２はＫＩＡＡ１５２４と相互作用するが、一方、ＧＳＴ−Ｍｙｃの１〜１２０のサイズに対応する、ＧＳＴ−Ｍｙｃの１〜２６２のタンパク質分解断片はＫＩＡＡ１５２４と相互作用しないということを示した。したがって、ｃ−Ｍｙｃのドメイン１２０〜２６２はＫＩＡＡ１５２４へのｃ−Ｍｙｃの直接的な結合に介在すると予想される。前記ｃ−Ｍｙｃのドメイン１２０〜２６２は１４３個のアミノ酸を含み、配列番号３１で示されるアミノ酸１〜１４３に対応する。
【００５３】
したがって本発明は、ＫＩＡＡ１５２４とｃ−Ｍｙｃとの相互作用の阻害に有用な遮断ペプチドを提供する。特定の一実施形態では、配列番号３１で示されるアミノ酸１〜１４３に対応する、３から６０個の任意の長さのアミノ酸、好ましくは３から３０個、好ましくは６から１８個、好ましくは６から１２個、又は好ましくは９から１２個のアミノ酸を含み、ＫＩＡＡ１５２４を阻害する遮断ペプチドが提供される。前記結合によりＫＩＡＡ１５２４とｃ−Ｍｙｃとの間の相互作用が阻害され、それによりＫＩＡＡ１５２４が阻害又は遮断される。本発明による他の実施形態では、前記遮断ペプチドは、配列番号３２から７９からなる群から選択される少なくとも１つの、好ましくは１から２０個の、好ましくは１から１０個の、好ましくは２から６個の、好ましくは２から４個の、又は好ましくは３から４個の連続配列、及びその保存的な配列変異体を含む。
【００５４】
本発明によるペプチドの遮断能力を試験するために、前記ペプチドをＨｅＬａ癌細胞などの細胞に投与し、ペプチドの性質に応じて、ａ）ＰＰ２Ａに対するＫＩＡＡ１５２４の結合を防止するそれらの能力、又はｂ）ｃ−Ｍｙｃに対するＫＩＡＡ１５２４の結合を防止するそれらの能力のいずれかを、ＫＩＡＡ１５２４−ＰＰ２Ａ相互作用の免疫沈降分析などの任意の適切な方法によって、又はｃ−Ｍｙｃのセリン６２のリン酸化に特異的な抗体を用いた、細胞溶解物のウェスタンブロット分析によって検出する。前記結合を統計的に有意な程度に防止するペプチドを遮断ペプチドであると考える。
【００５５】
「保存的な配列変異体」という表現は、本明細書において、アミノ酸配列の修飾により生じる、本発明によるペプチドの結合特性を顕著に改変しない変異体を意味する。そのような修飾は当業者に明らかであり、それらは類似のアミノ酸によるアミノ酸の置換、並びにアミノ酸の欠失及び付加により生じるアミノ酸配列変異体を含む。９個超のアミノ酸、好ましくは１２個超、好ましくは１８個超、又は好ましくは３０個超のアミノ酸を含むペプチドなどの、本発明による、より長いペプチドに関して、本発明は、上述のポリペプチドと少なくとも９０％の同一性、又は少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性を有するものを含む。
【００５６】
医薬品として用いる場合、本発明による遮断ペプチドは、静脈内投与、腹腔内投与、及び髄腔内投与などの任意の適切な方法によって投与し得る。一実施形態では、遮断ペプチドは、当技術分野で既知の、細胞膜を越えて融合タンパク質を運ぶ細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）に融合される。そのような融合ペプチドは、例えば静脈内投与、腹腔内投与、及び髄腔内投与によって投与し得る。当業者には、そのような本発明による遮断ペプチド及び融合ペプチドを、技術が進歩するに従って、あらゆる他の適切な投与方法又は投与経路によって投与し得るということが自明であろう。
【００５７】
ＨＮＳＣＣ、結腸癌、及び乳癌などのヒト癌組織においてＫＩＡＡ１５２４が過剰発現しているという先の発見に加え、ＫＩＡＡ１５２４の発現レベルが腫瘍悪性度に相関するということを見出した。例えば、乳癌の悪性のサブタイプは、良性のサブタイプよりも統計上有意に多くのＫＩＡＡ１５２４を発現した。さらに、腫瘍悪性度が高い結腸癌は悪性度の低い結腸癌よりも統計上有意に多くのＫＩＡＡ１５２４を発現した。
【００５８】
本発明はまた、癌又は過剰増殖性疾患を診断する方法にも関し、その方法は、
ｉ）ＲＴ−ＰＣＲ又はハイブリダイゼーション技術によって、前記組織又は体液からＫＩＡＡ１５２４のｍＲＮＡの発現を決定し、或いは
ｉｉ）タンパク質ＫＩＡＡ１５２４を含むと予想される組織若しくは体液を、前記ＫＩＡＡ１５２４を認識する抗体にさらし、前記抗体を検出及び／若しくは定量し、又は前記組織若しくは体液をプロテオミクス技術による分析にかけることにより、組織又は体液におけるＫＩＡＡ１５２４タンパク質のレベルを検出又は定量することに基づく。
【００５９】
ハイブリダイゼーション技術には、例えばＤＮＡハイブリダイゼーション及びノーザンブロットが含まれる。抗体の検出又は定量は、標識結合免疫吸着アッセイ、ウェスタンブロット、及び免疫組織化学法などの標準的な免疫アッセイ手順によって実施することができる。
【００６０】
本発明はまた、ハイブリダイゼーション技術、又はＤＮＡ若しくはＲＮＡの配列決定、又はＲＮＡ若しくはＤＮＡのＲＴ−ＰＣＲ分析による、ＫＩＡＡ１５２４遺伝子における突然変異又は一塩基多型の検出又は定量に基づいて癌又は過剰増殖性疾患を診断する方法に関する。
【００６１】
診断は、ＫＩＡＡ１５２４のみによって、又は他のタンパク質若しくは遺伝子と組み合わせたＫＩＡＡ１５２４で実施し得る。
【００６２】
より具体的には、本発明は、癌に罹患している疑いのある哺乳動物において悪性転化の浸潤性を決定する方法に関し、前記方法は、ａ）前記哺乳動物から得られた、悪性細胞を含む疑いのある試料におけるＫＩＡＡ１５２４の発現レベルを評価するステップと、ｂ）ステップａ）の発現レベルを、非悪性の対照試料におけるＫＩＡＡ１５２４の発現レベルと比較するステップと、ｃ）前記試料におけるＫＩＡＡ１５２４の発現レベルが非悪性の対照試料におけるＫＩＡＡ１５２４の発現レベルよりも顕著に高い場合に、前記悪性転化を浸潤性であると決定するステップとを含む。好ましくは、前記試料におけるＫＩＡＡ１５２４の発現レベルは、前記対照試料よりも２倍超、好ましくは３倍超高い。
【００６３】
本発明による一実施形態では、上記の方法を用いて、ステップｃ）でＫＩＡＡ１５２４の発現レベルが非悪性の対照試料又は非浸潤性の悪性度Ｉ及びＩＩの試料におけるＫＩＡＡ１５２４の発現レベルよりも顕著に高い場合に、悪性転化の悪性度を悪性度ＩＩＩ又はＩＶと決定することにより、結腸癌などの癌に罹患している疑いのある哺乳動物において悪性転化の悪性度を決定する。さらに、本発明は、前記発現レベルが悪性度ＩＩ又は非悪性の対照試料よりも２倍超、好ましくは３倍超高い場合に、浸潤性で転移性の悪性度ＩＩＩ及びＩＶを非浸潤性で非転移性の悪性度ＩＩから区別する方法を提供する。
【００６４】
本発明によるさらなる実施形態では、上記の方法を用いて、ＫＩＡＡ１５２４の発現レベルが非悪性の対照試料よりも２倍超、好ましくは３倍超高い場合に、浸潤性の腺管癌（ＩＤＣ）、浸潤性の小葉癌（ＩＬＣ）、及び腺管面疱癌を伴うＩＤＣ（ＩＤＣ＋ＩＣＣ）などの浸潤性の腫瘍型の乳癌を粘液性癌から区別する。
【００６５】
本発明は以下の非限定的な実験の項によって明らかにされよう。
【実施例】
【００６６】
実験の項
結果
ＫＩＡＡ１５２４の同定
ＨＴ−１０８０細胞からＰＰ２Ａ相互作用タンパク質を同定するために、ＰＰ２Ａ複合体の足場サブユニットであるＴＡＰタグ付けされたＰＲ６５タンパク質を安定して過剰発現する細胞クローンを生成した（図１Ａ）。偽のトランスフェクションを行った対照又はＰＲ６５ＴＡＰ発現細胞の細胞質抽出物のＴＡＰ精製により、ＰＲ６５ＴＡＰと共精製するが対照細胞の最終溶出物には存在しない、いくつかのタンパク質が明らかになった（図１Ｂ）。その後、これらの推定ＰＲ６５相互作用タンパク質のいくつかを、質量分析によるペプチド配列決定により同定した。ＰＲ６５ＴＡＰ複合体から同定されるタンパク質には触媒性サブユニット（ＰＰ２Ａｃ）及びＰＰ２ＡのＢサブユニットの両方が含まれ、これによりアプローチが検証される（図１Ｂ）。加えて、ＫＩＡＡ１５２４を新規な推定ＰＰ２Ａ関連タンパク質であると同定することができた。ＫＩＡＡ１５２４は、いずれの細胞機能もこれまでに同定されていない、９０ｋＤＡの細胞質タンパク質である（図２）（Ｓｏｏ Ｈｏｏら、２００２年）。以下に示す結果により、ＫＩＡＡ１５２４は、癌において特異的に上方調節される、ＰＰ２Ａの内因性阻害剤であると同定される。
【００６７】
ＰＲ６５の免疫共沈降分析の結果により、内因性のＫＩＡＡ１５２４が内因性のＰＲ６５及びＰＰ２Ａｃと相互作用することが示される（図１Ｃ）。ＫＩＡＡ１５２４とＰＰ２Ａ複合体との間のタンパク質−タンパク質相互作用に介在するＫＩＡＡ１５２４の領域を同定するために、ＫＩＡＡ１５２４欠失突然変異体をコードする一連のｃＤＮＡ構築物を構築した。この目的のために、一連のＦｌａｇタグ付けされたＫＩＡＡ１５２４欠失構築物をＨｅＬａ細胞内に４８時間、一過性にトランスフェクトし、その後、抗Ｆｌａｇ抗体との免疫沈降を行った。ＫＩＡＡ１５２４突然変異体とＰＰ２Ａ複合体との間の相互作用を、ＰＲ６５サブユニットのウェスタンブロット分析により評価した。Ｆｌａｇ−ＫＩＡＡ１５２４野生型（ＫＩＡＡ１５２４ｗｔ）（図２Ａ）構築物の免疫沈降により、内因性のＰＲ６５タンパク質との明らかな相互作用が示された（図１Ｄ及び３Ａ）。相互作用は、低い（１５０ｍＭのＮａＣｌ）又は中程度（３００ｍＭのＮａＣｌ）の両方のストリンジェンシー条件下において生じた。しかし、４６１〜５３３の間のアミノ酸を欠いているＫＩＡＡ１５２４の突然変異体（ＫＩＡＡ１５２４ｍｕｔ）（図２Ａ）では、ＰＲ６５との相互作用が大きく減少した（図１Ｄ及び３Ａ）。ＫＩＡＡ１５２４ｍｕｔは、１１個の欠失突然変異体のうち、両方のストリンジェンシー条件下においてＰＲ６５に対する結合の低下を示した唯一の突然変異体であった。
【００６８】
次に、ＫＩＡＡ１５２４ｗｔ構築物又はＫＩＡＡ１５２４ｍｕｔ構築物のいずれかとＨＡ−ＰＰ２Ａｃを同時トランスフェクトした細胞の、ＰＰ２ＡｃとＫＩＡＡ１５２４との同時局在を研究した。図１Ｅに示すように、トランスフェクトした細胞の共焦点画像分析によりＰＰ２ＡｃとＫＩＡＡ１５２４ｗｔとの同時局在が明らかになったが、一方、ＰＰ２ＡｃとＫＩＡＡ１５２４ｍｕｔとでは同時局在は見られなかった（図１Ｅ）。ＰＰ２Ａの機能の調節におけるＫＩＡＡ１５２４の役割を研究するために、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）オリゴを用いてＨｅＬａ細胞におけるＫＩＡＡ１５２４の発現を阻害した。重要なことに、ｓｉＲＮＡによるＫＩＡＡ１５２４の発現の減少により、ＰＰ２Ａｃの免疫沈降物で測定されたように、ＰＰ２Ａのホスファターゼ活性が刺激された（図１Ｆ）。これらの結果を総合すると、ＫＩＡＡ１５２４が培養細胞においてＰＰ２Ａ複合体と相互作用し、その触媒活性を阻害するということが示される。さらに、データは、相互作用が中程度のイオン強度で安定であること、及びＫＩＡＡ１５２４のアミノ酸４６１〜５３３がＫＩＡＡ１５２４のＰＰ２Ａ相互作用ドメインを含むことを示す。
【００６９】
ＫＩＡＡ１５２４はｃ−Ｍｙｃタンパク質の安定性を高める
ＫＩＡＡ１５２４の特徴付けされていない細胞機能を明らかにするために、スクランブルｓｉＲＮＡ及びＫＩＡＡ１５２４のｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたＨｅＬａ細胞のゲノム規模での遺伝子発現プロフィールを７２時間後に比較した。注目すべきことに、Ｓｅｎｔｒｉｘ（登録商標）Ｈｕｍａｎ−６ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ＢｅａｄＣｈｉｐ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｉｎｃ．）内に含まれる遺伝子の少数の画分（２６０９１のうち７６）のみが、スクランブルｓｉＲＮＡをトランスフェクトした細胞及びＫＩＡＡ１５２４のｓｉＲＮＡをトランスフェクトした細胞の間で、再現性があり統計的に有意な（ｐ＜０．０５、データは示していない）発現レベルの違いを示した（図１Ｆ）。ＰＰ２Ａの活性は形質転換に関与する２つの転写因子、ｐ５３及びｃ−Ｍｙｃの活性を調節すると示されている。ＫＩＡＡ１５２４が減少した細胞の転写プロフィールに関してこれらの２つの転写因子を特徴付けるために、ＫＩＡＡ１５２４の減少に影響される７６個の遺伝子のリストを、ｐ５３及びｃ−Ｍｙｃについて発行された標的遺伝子のデータベースと比較した。ｐ５３標的遺伝子のデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｐ５３．ｂｉｉ．ａ−ｓｔａｒ．ｅｄｕ．ｓｇ／ａｂｏｕｔｐ５３／ｔａｒｇｅｔｇｅｎｅ／ｉｎｄｅｘ．ｐｈｐ）に基づくと、ＫＩＡＡ１５２４の減少に影響を受ける７６個の遺伝子のうち１つのみが、そのプロモーター内にｐ５３結合部位を有するか又はｐ５３に転写調節されると公表されている。しかし、ｃ−Ｍｙｃ標的遺伝子のデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｙｃ−ｃａｎｃｅｒ−ｇｅｎｅ．ｏｒｇ／ｓｉｔｅ／ｍｙｃＴａｒｇｅｔＤＢ．ａｓｐ）と比較すると、ＫＩＡＡ１５２４の減少に影響を受ける遺伝子の１６％（１２／７６）がそれらのプロモーター領域においてｃ−Ｍｙｃを結合することが見出された。これらの所見は、公表されている、ｃ−Ｍｙｃタンパク質の安定性を調節するＰＰ２Ａの役割と共に、ＫＩＡＡ１５２４がｃ−Ｍｙｃの機能を調節し得るということを示唆している。
【００７０】
上述したように、ウイルススモールｔ抗原は、ｃ−Ｍｙｃのセリン６２をＰＰ２Ａ介在性の脱リン酸化から保護することにより、ｃ−Ｍｙｃタンパク質を安定化させる。ＫＩＡＡ１５２４の減少がｃ−Ｍｙｃの発現を調節するかどうかを研究するために、ＫＩＡＡ１５２４のｓｉＲＮＡ又はスクランブルｓｉＲＮＡ（Ｓｃｒ．）でトランスフェクトした細胞で、ウェスタンブロットによりｃ−Ｍｙｃの定常的なタンパク質レベルを試験した。ＫＩＡＡ１５２４のｓｉＲＮＡでの処理によりｃ−Ｍｙｃタンパク質の発現が明らかに下方調節されたが、一方、ｃ−ＭｙｃのｍＲＮＡの発現レベルは同一の試料において変化しなかった（図４Ａ及び４Ｂ）。このことは、ＫＩＡＡ１５２４が転写後にｃ−Ｍｙｃタンパク質のレベルを調節することを意味する。実際、内因性のｃ−Ｍｙｃタンパク質の半減期に対するＫＩＡＡ１５２４の減少の影響を分析すると、スクランブルｓｉＲＮＡをトランスフェクトした細胞ではシクロヘキシミド処理（１００ｍｇ／ｍｌ）の１時間後におよそ４０％のｃ−Ｍｙｃタンパク質が細胞内に存在したのに対し、ＫＩＡＡ１５２４が減少するとｃ−Ｍｙｃタンパク質の安定性は顕著に低下した。
【００７１】
ＫＩＡＡ１５２４はｃ−Ｍｙｃ関連ＰＰ２Ａ活性を阻害する
上記の結果は、ＫＩＡＡ１５２４がＰＰ２Ａ複合体と相互作用し、ｃ−Ｍｙｃの安定性を高めることを示す。ＫＩＡＡ１５２４がｃ−Ｍｙｃ関連ＰＰ２Ａ活性を実際に阻害するかどうかを研究するために、スクランブルｓｉＲＮＡ及びＫＩＡＡ１５２４のｓｉＲＮＡをトランスフェクトした細胞のｃ−Ｍｙｃの免疫沈降物を、基質として６，８−ジフルオロ−４−メチルウンベリフェリルホスフェートを用いる（Ｐａｓｔｕｌａら、２００３年）、インビトロでのＰＰ２Ａアッセイにかけた。重要なことに、ｓｉＲＮＡによるＫＩＡＡ１５２４の減少により、ｃ−Ｍｙｃ免疫沈降物におけるＰＰ２Ａ活性が顕著に増加した（図４Ｃ）。興味深いことに、免疫沈降物の分析により、ＰＰ２Ａｃ及びｃ−Ｍｙｃが構成的に互いに複合していること、及びＫＩＡＡ１５２４の減少がｃ−Ｍｙｃ−ＰＰ２Ａｃの相互作用に影響を与えないことがさらに明らかになった（図４Ｄ）。総合すると、これらの結果は、ＫＩＡＡ１５２４がｃ−Ｍｙｃ−ＰＰ２Ａ複合体におけるＰＰ２Ａの活性を阻害し、ｃ−Ｍｙｃのタンパク質分解を防止することを示している。
【００７２】
細胞抽出物のｃ−Ｍｙｃ及びＫＩＡＡ１５２４の免疫共沈降により、これらのタンパク質の間の物理的関連が示されたが（図４Ｄ）、ＫＩＡＡ１５２４とｃ−Ｍｙｃとの間の相互作用が直接的なものであるかどうかは明らかにされていない。ｃ−ＭｙｃとのＫＩＡＡ１５２４の相互作用をさらに特徴付けるため、インビトロでのタンパク質−タンパク質相互作用アッセイにおいて、精製されたＦｌａｇ−ＫＩＡＡ１５２４タンパク質を、ｃ−Ｍｙｃの組換えＧＳＴ融合アミノ末端部分（アミノ酸１〜２６２）と共に用いた。Ｆｌａｇ抗体樹脂は組換えＦｌａｇ−ＫＩＡＡ１５２４とＧＳＴ−Ｍｙｃとを免疫共沈降させるが、一方、Ｆｌａｇ−ＫＩＡＡ１５２４はＧＳＴのみとは免疫共沈降しないということが見出され（図５Ａ）、このことは、ＫＩＡＡ１５２４がｃ−Ｍｙｃのアミノ末端に直接結合することを示している。興味深いことに、ＫＩＡＡ１５２４は、アミノ酸１〜１２０に対応するＧＳＴ−ｃ−Ｍｙｃ欠失体とは免疫共沈降しなかった（図５Ａ）。これらの結果は、ｃ−ＭｙｃのＫＩＡＡ１５２４相互作用ドメインがｃ−Ｍｙｃ上のアミノ酸１２０〜２６２の間にあることを示している（図５Ｂ）。
【００７３】
これらの実験を総合すると、ｃ−Ｍｙｃ関連ＰＰ２Ａ活性をＫＩＡＡ１５２４が阻害することの確かな生化学的証拠が得られる。さらに、ｃ−Ｍｙｃのアミノ末端に対するＫＩＡＡ１５２４の直接的な結合により、ｃ−Ｍｙｃ関連ＰＰ２Ａ活性に対するＫＩＡＡ１５２４の観察された選択性についての最もふさわしい説明が得られる。
【００７４】
ＫＩＡＡ１５２４は腫瘍の成長に必要である
癌細胞の挙動の調節におけるＫＩＡＡ１５２４の役割を研究するために、ＨｅＬａ細胞をＫＩＡＡ１５２４のｓｉＲＮＡでトランスフェクトし、細胞培養物及びインビボでのマウスモデルの両方において細胞増殖を研究した。次に、細胞増殖の調節におけるＫＩＡＡ１５２４の役割を、ＨｅＬａ細胞におけるチミジン組み込みアッセイによって分析した。スクランブルｓｉＲＮＡをトランスフェクトした細胞と比較して、ＫＩＡＡ１５２４の減少により、トランスフェクションの７２時間後の細胞増殖が顕著に阻害された（図６Ａ）。しかし、ＫＩＡＡ１５２４のｓｉＲＮＡのトランスフェクションは、細胞ＤＮＡ含有量のＦＡＣＳ分析においてサブＧ１画分を誘導せず（図６Ｂ）、またＰＡＲＰタンパク質の切断も誘導せず（図６Ｃ）、このことは、ＫＩＡＡ１５２４の減少がプログラム細胞死を誘導しないことを示している。
【００７５】
ＨｅＬａ細胞の腫瘍形成能に対するＫＩＡＡ１５２４の寄与を評価するために、単層上の高密度の増殖巣を形成するこれらの細胞の能力に対する、及び足場に依存せずに成長するそれらの能力に対する、ＫＩＡＡ１５２４の減少の影響を分析した。この目的のために、まず、トランスフェクションの１０日後にｓｉＲＮＡを１回トランスフェクトすることによりＫＩＡＡ１５２４の減少の効率を研究し、ＫＩＡＡ１５２４タンパク質の発現のおよそ５０％が１０日後にも依然として減少することを見出した。ＫＩＡＡ１５２４の減少により、トランスフェクションの１０日後のＨｅＬａ細胞の増殖巣の形成はなくなり（図６Ｄ）、また、細胞を寒天上に播種した１０日後に測定されたように、寒天上でのＨｅＬａ細胞の足場非依存性の成長が明らかに阻害された（図６Ｅ）。
【００７６】
インビボにおけるＫＩＡＡ１５２４の腫瘍形成の役割を評価するために、ＫＩＡＡ１５２４のｓｉＲＮＡ又はスクランブルｓｉＲＮＡで７２時間トランスフェクトしたＨｅＬａ細胞を無胸腺マウスに皮下投与し、触知可能な腫瘍のサイズを測定することにより腫瘍の成長を観察した。重要なことに、ｓｉＲＮＡによるＫＩＡＡ１５２４の減少により全ての腫瘍のサイズが減少し（図６Ｆ）、２７日目の腫瘍重量が顕著に阻害された（図６Ｇ）。
【００７７】
総合すると、これらのデータは、ＫＩＡＡ１５２４の発現が、形質転換された細胞の表現型の維持の新規なメカニズムであること、及びＫＩＡＡ１５２４がインビボで腫瘍の成長を促進することを示す。
【００７８】
ＫＩＡＡ１５２４はヒトの悪性腫瘍において過剰発現する
上記に示した結果により、ＫＩＡＡ１５２４がＰＰ２Ａ介在性のｃ−Ｍｙｃの分解を阻害し、癌細胞の成長及び増殖を促進することについての証拠が得られる。これらの特徴に基づいて、ＫＩＡＡ１５２４は癌治療のための新規な薬物標的となり得る。癌治療におけるタンパク質標的への期待を満たすためには、ＫＩＡＡ１５２４はヒト癌組織において過剰発現することが好ましい。本発明者による定量ＲＴ−ＰＣＲ分析によると、ＫＩＡＡ１５２４のｍＲＮＡは、骨髄、前立腺、睾丸、小脳、及び大脳以外の２１の非悪性試料の大部分において非常に低いレベル（β−アクチンのｍＲＮＡの発現レベルの１％未満）で発現した（図７Ａ）。非悪性細胞と悪性細胞との間でＫＩＡＡ１５２４のタンパク質レベルを比較するために、異なる細胞型の全細胞溶解物をＫＩＡＡ１５２４について免疫ブロットした。図７Ａと一致して、非常に低いレベルのＫＩＡＡ１５２４タンパク質がヒト表皮角化細胞（ＨＥＫ）、非腫瘍形成性ＭＥＦ、及び不死化ＮＩＨ３Ｔ３マウス線維芽細胞において検出された。しかし、ＫＩＡＡ１５２４タンパク質はＨｅＬａ細胞及びＨＴ−１０８０線維肉腫細胞の両方において高いレベルで発現し、このことは、ＫＩＡＡ１５２４の発現が細胞の腫瘍形成能と相関し得ることを示している。
【００７９】
さらに、ヒトの頭頚部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）におけるＫＩＡＡ１５２４の発現レベルを分析した。ＫＩＡＡ１５２４のｍＲＮＡのリアルタイムＰＣＲ分析により、対照として用いた正常なヒト表皮角化細胞と比較して、３６のＨＮＳＣＣ細胞系におけるＫＩＡＡ１５２４の統計的に有意な過剰発現が示された（図７Ｂ）。ＫＩＡＡ１５２４のｍＲＮＡはまた、ＨＮＳＣＣの腫瘍生検において、体の同一領域に由来する良性の対照組織よりも過剰発現した（図７Ｃ）。重要なことに、ＨＮＳＣＣ試料の免疫組織化学的染色により、周囲の間質細胞と比較して腫瘍細胞においてＫＩＡＡ１５２４がより高く発現することも確認された（図７Ｄ）。
【００８０】
最後に、ＨＮＳＣＣに由来する原発癌細胞系においてもＫＩＡＡ１５２４がｃ−Ｍｙｃタンパク質のレベルを調節するかどうかを研究するため、３つの異なるＨＮＳＣＣ細胞系をＫＩＡＡ１５２４のｓｉＲＮＡでトランスフェクトし、ウェスタンブロッティングによってｃ−Ｍｙｃの発現について分析した。図７Ｅに示すように、ＫＩＡＡ１５２４の減少により、調べた全ての細胞系においてｃ−Ｍｙｃタンパク質のレベルが明らかに下方調節された。重要なことに、ｃ−Ｍｙｃの免疫沈降物の分析の結果、ＫＩＡＡ１５２４の減少によりＨＮＳＣＣ細胞系におけるｃ−Ｍｙｃ関連ＰＰ２Ａホスファターゼ活性の上昇も生じることが明らかになった。
【００８１】
ＨＮＳＣＣ細胞の増殖の調節におけるＫＩＡＡ１５２４の役割を調べるために、ＵＴ−ＳＣＣ−７細胞系及びＵＴ−ＳＣＣ−９細胞系にＫＩＡＡ１５２４のｓｉＲＮＡのトランスフェクションを施し、これらの細胞系の高密度の増殖巣の形成を１０日間観察した。両方の細胞系において、ＫＩＡＡ１５２４の減少により増殖巣の形成が顕著に減少した。重要なことに、ＫＩＡＡ１５２４の減少により、トランスフェクションの２１日後の、軟寒天におけるＵＴ−ＳＣＣ−７細胞及びＵＴ−ＳＣＣ−９細胞の両方の足場非依存性の成長もまた顕著に減少した。ＨｅＬａ細胞において示されたＫＩＡＡ１５２４のｓｉＲＮＡの特異性と一致して、ＫＩＡＡ１５２４の２つの個別のｓｉＲＮＡにより軟寒天においてＵＴ−ＳＣＣ−９細胞が同様に阻害された。
【００８２】
最後に、ＵＴ−ＳＣＣ細胞のインビボでの腫瘍の成長に対するＫＩＡＡ１５２４の役割を評価するために、ＫＩＡＡ１５２４のｓｉＲＮＡ又はスクランブルｓｉＲＮＡでトランスフェクトしたＵＴ−ＳＣＣ−７細胞及びＵＴ−ＳＣＣ−９細胞の両方をＳＣＩＤマウスの背部に投与した。この作業において示される、悪性細胞の成長及び腫瘍の進行に対するＫＩＡＡ１５２４の重要性を示す全ての他のデータと一致して、ＫＩＡＡ１５２４のｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたＵＴ−ＳＣＣ−７細胞及びＵＴ−ＳＣＣ−９細胞を投与したマウスの、それぞれ５頭のうち３頭のみ、及び６頭のうち２頭のみが、実験の終了である６５日目に触知可能な腫瘍を発現した。さらに、ＫＩＡＡ１５２４のｓｉＲＮＡにより、スクランブルｓｉＲＮＡをトランスフェクトした細胞と比較して、両方のＵＴ−ＳＣＣ細胞で腫瘍の平均サイズが減少した。
【００８３】
上記の結果がＨＮＳＣＣに限定されていることを確認するために、４３個のヒト結腸癌試料及び正常な結腸由来の５つの対照試料で、ＫＩＡＡ１５２４の発現をＲＴ−ＰＣＲによって分析した。ＨＮＳＣＣのデータと一致して、ＫＩＡＡ１５２４のｍＲＮＡは、対照組織と比較して、ヒト結腸癌組織において顕著に過剰発現した（図８Ａ）。
【００８４】
さらに、結腸癌の腫瘍悪性度に対するＫＩＡＡ１５２４のｍＲＮＡの発現を比較したところ、ＫＩＡＡ１５２４の発現が、非浸潤性の悪性度ＩＩの腫瘍又は対照の結腸組織と比較して、浸潤性の悪性度ＩＩＩ及び悪性度ＩＶの腫瘍において顕著に高いということが明らかになった（図８Ｂ）。分析に用いた組織試料の腫瘍悪性度は、標準的な病理学的基準によってあらかじめ決定されている。
【００８５】
ＫＩＡＡ１５２４が過剰発現しているかどうかを研究するために、ＨＮＳＣＣ及び結腸癌に加えて、乳癌の試料においても、以前に特徴付けられた１５９個のヒト乳腺腫瘍及び正常な乳房の試料（Ｃｏｍｅら、２００６年）においてＫＩＡＡ１５２４の発現を評価した。重要なことに、ＫＩＡＡ１５２４が、正常な組織と比較して、ヒト乳腺腫瘍において顕著に過剰発現することが見出された（図９Ａ）。乳癌のサブタイプの間でＫＩＡＡ１５２４の発現を比較すると、ＫＩＡＡ１５２４の過剰発現は３つの浸潤性の乳腺癌のサブタイプの全て、すなわち浸潤性の腺管癌（ＩＤＣ）、浸潤性の小葉癌（ＩＬＣ）、及び腺管面疱癌を伴うＩＤＣ（ＩＤＣ＋ＩＣＣ）において見られた（図９Ｂ）。対照として、予後良好な乳腺腫瘍である粘液性癌が、浸潤性の腫瘍より統計的に低い、正常な乳房と同様のＫＩＡＡ１５２４のｍＲＮＡの発現を示した（図９Ｂ）。
【００８６】
総合すると、この結果により、ＫＩＡＡ１５２４が腫瘍の成長及び癌細胞の増殖を促進することが示され、ｃ−Ｍｙｃ関連ＰＰ２Ａ活性の抑制が、ＫＩＡＡ１５２４にその細胞効果を発揮させる分子メカニズムの少なくとも１つであることが強く示される。
【００８７】
材料及び方法
抗体
ＫＩＡＡ１５２４に対するウサギポリクローナル抗体が公表されている（Ｓｏｏ Ｈｏｏら、２００２年）（フロリダ大学のＣｈａｎ博士により提供していただいた）。ＰＰ２Ａｃ、ＰＲ６５、Ｆｌａｇ、ＨＡ、ＧＳＴ、ＰＡＲＰ、ｃ−Ｍｙｃ、及びアクチンに対する抗体を、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ｉｎｃ．から入手した。
【００８８】
プラスミド構築物
ＰＲ６５ＴＡＰタグベクターのＰＲ６５αをｐＲＣ／ＣＭＶ．ＨＡ ＰＲ６５ａ（スイス、バーゼル、Ｆｒｉｅｎｄｒｉｃｈ Ｍｉｅｓｃｈｅｒ−ＩｎｓｔｉｔｕｔのＢｒｉａｎ Ａ．Ｈｅｍｍｉｎｇｓ博士から譲っていただいた）からＰＣＲ増幅し、ＸｈｏＩ部位及びＢａｍＨＩ部位を用いてＴＡＰベクターであるＪＷ１６（Ｗｅｓｔｅｒｍａｒｃｋら、２００２年）内にクローニングした。Ｆｌａｇ−ＫＩＡＡ１５２４ｗｔ構築物を、公表されているＫＩＡＡ１５２４の全長ｃＤＮＡ（Ｓｏｏ Ｈｏｏら、２００２年）（フロリダ大学のＣｈａｎ博士により提供していただいた）からＰＣＲで構築した。Ｆｌａｇ−ＫＩＡＡ１５２４ｍｕｔのｃＤＮＡ構築物を、５−Ｔｔａａｔａｇａｇａａａｃｔｔｃａｇｔｃｔｇｇａａｔｇ（配列番号８０）及び５−Ｇｔｇｇｔａａａｇｇａｔｃａｇａｔｔｔｇｔｇａｔｇｔｇａｇａ（配列番号８１）のオリゴを用いてプラスミドＦｌａｇ−ＫＩＡＡ１５２４ｗｔからＰＣＲで構築した。その後、全てのクローンをＤＮＡの配列決定により検証した。
【００８９】
患者の試料
インフォームドコンセントの後、Ｔｕｒｋｕ大学中央病院において１９９０年から２００２年の間にＨＮＳＣＣから手術によって除去された腫瘍から、腫瘍試料を集めた。ＨＮＳＣＣの研究のために、正常な試料を口蓋垂軟口蓋咽頭形成術を受けている患者から集めた。試料は２９歳から８７歳までの男女から集めた。
【００９０】
結腸癌及び正常な結腸組織におけるＫＩＡＡ１５２４の発現を、結腸癌の４３個の試料（３１歳から９３歳までの男女）及び正常な結腸組織の５つの試料（３７歳から９１歳までの男女）を含むＴｉｓｓｕｅＳｃａｎリアルタイム結腸癌（ＨＣＲＴ１０１）ｃＤＮＡパネル（Ｏｒｉｇｅｎｅ）を用いることで調べた。２１の異なる正常なヒト組織から抽出された全ＲＮＡをＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、カナダ）から入手し、かつ、フィンランドのＴｕｒｋｕ大学のＫｌａｕｓ Ｅｌｅｎｉｕｓ教授から譲っていただいた。試料は１人の患者からのＲＮＡ抽出（小脳、大脳、心臓、肝臓、及び肺）又は２から８４人の患者のプールされたＲＮＡの抽出（副腎、骨髄、腎臓、胎盤、前立腺、唾液腺、骨格筋、脾臓、胸腺、甲状腺、気管、子宮、結腸、小腸、及び乳腺）のいずれかからなるものであった。
【００９１】
乳癌及び正常な乳腺組織におけるＫＩＡＡ１５２４の発現を、先に記載した組織試料（Ｃｏｍｅら、２００６年）を用いて調べた。
【００９２】
細胞培養
ヒトＳＣＣ細胞系を、頭頚部ＳＣＣの原発腫瘍（ＵＴ−ＳＣＣ−８）、再発腫瘍、又は転移（ＵＴ−ＳＣＣ−７、ＵＴ−ＳＣＣ−９）から確立した。６ｎｍｏｌ／ｌのグルタミン、非必須アミノ酸、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００ｍｇのストレプトマイシン、及び１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を補ったＤＭＥＭにおいて、ＳＣＣ細胞を培養した。正常なヒト表皮角化細胞を、ＳｉｎｇｌｅＱｕｏｔｓ（登録商標）（Ｃａｍｂｒｅｘ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、米国メリーランド州）を補ったケラチノサイト基礎培地（Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ）２（ＫＢＭ（登録商標）−２）において培養した。ＨＴ−１０８０、ＨｅＬａ、及びＨＫ２９３を含む全ての他の細胞系を、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００ｍｇのストレプトマイシン、及び１０％ＦＣＳを補ったＤＭＥＭにおいて培養した。
【００９３】
一過性トランスフェクション及びｓｉＲＮＡ処理
ＦｕＧｅｎｅ６トランスフェクション試薬（Ｒｏｃｈｅ）を製造者の指示に従って用いて、サブコンフルエントな細胞を一過性にトランスフェクトした。ｓｉＲＮＡ処理のために、細胞を８０％のコンフルエンスまで成長させ、培地を、何も補っていないＤＭＥＭで置き換えた。二本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチド（スクランブル：５’−ＵＡＡＣＡＡＵＧＡＧＡＧＣＡＣＧＧＣＴＴ−３’（配列番号８２）及び５’−ＣＣＵＡＣＡＵＣＣＣＧＡＵＣＧＡＵＧＡＵＧＴＴ−３’（配列番号８３）、ＫＩＡＡ１５２４：５’−ＣＵＧＵＧＧＵＵＧＵＧＵＵＵＧＣＡＣＵＴＴ−３’（配列番号８４）及び５’−ＡＣＣＡＵＵＧＡＵＡＵＣＣＵＵＡＧＡＡＴＴ−３’（配列番号６）、ＩＢＡ）をＯｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で調製し、細胞に加えた。４〜６時間のインキュベーションの後、培地を１０％ＦＣＳに平衡させ、ｓｉＲＮＡ処理を適切な長さの時間まで延長した。
【００９４】
ＲＮＡの単離及びｃＤＮＡの合成
ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造者の手順に従って用いて、培養細胞から全ＲＮＡを抽出した。臨床腫瘍試料から、酸性グアニジウム−チオシアネート−フェノール−クロロホルム法を用いてＲＮＡを抽出した。可能性のある汚染ＤＮＡを排除するため、ＲＮＡ試料を５単位のＤＮアーゼＩ（Ｒｏｃｈｅ）で処理した。鋳型としての１μｇの全ＲＮＡ、０．５μｇのランダムヘキサマー、及び２００単位のモロニーマウス白血病ウイルスＲＮアーゼＨマイナス逆転写酵素（どちらもＰｒｏｍｅｇａ、米国ウィスコンシン州Ｍａｄｉｓｏｎから入手）を２５μｌの全量に含む反応において、製造者の手順に従ってｃＤＮＡを合成した。
【００９５】
免疫蛍光
ＨＡ−ＰＰ２Ａｃ及びＦｌａｇ−ＫＩＡＡ１５２４のｃＤＮＡ構築物でのトランスフェクションの２４時間後に、ガラスカバースリップ上で培養したＨｅＬａ細胞を透過処理し、ＰＴＥＭＦ（１００ｍＭのＰｉｐｅｓ（ｐＨ６．８）、１０ｍＭのＥＧＴＡ、１ｍＭのＭｇＣｌ２、０．２％トリトンＸ−１００、及び４％ホルムアルデヒド）において１０分間固定した。ＰＢＳで３回洗浄した後、非特異的抗体の結合を、ＰＢＳにおける３％のＢＳＡで３０分間遮断した。その後カバースリップをＨＡ及びＦｌａｇタグ特異的抗体と、ＰＢＳにおける２％のＢＳＡ内で室温で１時間インキュベートした。３回洗浄した後、結合した抗体を、Ｃｙ３及びＣｙ２と結合した二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）と室温で１時間インキュベートすることで可視化した。ＰＢＳで３回洗浄した後、カバースリップを５０％グリセロール、ＰＢＳ、及び２％ｗ／ｖのＤＡＢＣＯ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）内に置いた。同時局在の分析のために、共焦点レーザー走査顕微鏡（ＬＳＭ５１０、Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ Ｉｎｃ．）を用いて画像を得た。
【００９６】
免疫沈降及びホスファターゼアッセイ
プロテインＧ−セファロースビーズを、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．５）、３００ｍＭのＮａＣｌ、０．２５ｍＭのＥＧＴＡ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．２５％ＮＰ−４０、プロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ）、１０ｍＭのｂ−グリセロリン酸、及び０．５ｍＭのＤＴＴ内において、ＰＲ６５、ＰＰ２Ａｃ、ｃ−Ｍｙｃ抗体、又は対照の免疫前血清と、４℃で２時間、回転機上で撹拌した。Ｆｌａｇ−ＫＩＡＡ１５２４突然変異体の免疫沈降を、Ｆｌａｇ抗体樹脂（Ｍ３、Ｓｉｇｍａ）を用いて実施した。その後、沈殿したビーズを細胞溶解物と混合し、４℃で一晩インキュベートした。その後、沈殿したビーズを、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．３％ＮＰ−４０、及び０．５ｍＭのＤＴＴで４回洗浄し、結合したタンパク質を、Ｔｒｕｅブロット二次抗体を用いてウェスタンブロッティングにより分析した。ホスファターゼアッセイのために、免疫複合体をビーズ上に保持し、等量のビーズを加えて、６，８−ジフルオロ−４−メチルウンベリフェリルホスフェート（ＤｉＦＭＵＰ）基質を有するタンパク質セリン／スレオニンホスファターゼアッセイキット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、米国オレゴン州Ｅｕｇｅｎｅ）を製造者の指示に従って用いてホスファターゼアッセイを行った。
【００９７】
ＫＩＡＡ１５２４とｃ−Ｍｙｃとの間の直接的な相互作用を研究するために、バキュロウイルスを用いてＦｌａｇ−ＫＩＡＡ１５２４を昆虫細胞において発現させ、以前に記載されているように（Ｎｏｒｄｌｕｎｄら、２００５年）、均質になるまでＦｌａｇ抗体樹脂（Ｍ３、Ｓｉｇｍａ）によってアフィニティー精製した。相互作用アッセイのために、Ｆｌａｇ−ＫＩＡＡ１５２４タンパク質を、低いｐＨ条件を用いてＦｌａｇ抗体ビーズから溶出した。このＫＩＡＡ１５２４タンパク質の純度及び量を、ＳＤＳ−ｐａｇｅゲル及びクマシー染色により各ステップにおいて分析した。ＫＩＡＡ１５２４調製物において、他の汚染タンパク質は同定されなかった。ＧＳＴタンパク質を細菌により産生し、標準的な手順に従ってアフィニティー精製し、ＧＳＴ−Ｍｙｃ１−２６２をＳａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｉｎｃ．から購入した。抗Ｆｌａｇ Ｍ３樹脂（Ｓｉｇｍａ）に固定化された１μｇのＦｌａｇ−ＫＩＡＡ１５２４を、等モル濃度の量の可溶性ＧＳＴ−ｃ−Ｍｙｃ及びＧＳＴタンパク質と、２０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．４）、０．２ｍＭのＥＤＴＡ、０．１ＭのＮａＣｌ、０．５ｍＭのＤＴＴ、及びコンプリートプロテアーゼインヒビター（Ｒｏｃｈｅ）を含む０．５ｍｌの緩衝液においてインキュベートすることにより、プルダウンアッセイを実施した。ＫＩＡＡ１５２４タンパク質調製物における昆虫のＰＰ２Ａの不在をホスファターゼアッセイによって管理した。抗Ｆｌａｇ Ｍ３樹脂を全ての実験における対照樹脂として用いた。結合したタンパク質を、０．２％ＮＰ−４０を補った結合緩衝液で洗浄し、続いて、試料緩衝液中で煮沸し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて分解し、ＧＳＴ及びＫＩＡＡ１５２４抗体と免疫ブロットした。
【００９８】
定量逆転写ＰＣＲ分析
ｃＤＮＡ試料の定量リアルタイム逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）分析を、Ｐｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓｓソフトウェア（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて設計した特異的プライマー及び蛍光プローブを用いて実施し、ＫＩＡＡ１５２４及びβ−アクチンのｍＲＮＡのレベルを特異的に定量した。プライマー及びプローブの配列を以下に示す。
【００９９】
ＫＩＡＡ１５２４：
プローブ：ａｔｔ ｇｃｔ ｃａｇ ｃａｔ ｃｇｃ ｔｇｔ ｃａａ ａｇａ ａｃｔ ｃａ（配列番号８５）
フォワード：ａａｇ ｃｔｃ ｔａｇ ｃｃｃ ｔｔｇ ｃａｃ ａｇｇ（配列番号８６）
リバース：ｇｔｃ ｃｇｔ ｇｃｃ ｔｃｔ ｇｔｔ ｔｃａ ｇｃ（配列番号８７）
【０１００】
β−アクチン
プローブ：ａｔｇ ｃｃｃ ｔｃｃ ｃｃｃ ａｔｇ ｃｃａ ｔｃｃ ｔｇｃ ｇｔ（配列番号８８）
フォワード：ｔｃａ ｃｃｃ ａｃａ ｃｔｇ ｔｇｃ ｃｃａ ｔｃｔ ａｃｇ ｃ（配列番号８９）
リバース：ｃａｇ ｃｇｇ ａａｃ ｃｇｃ ｔｃａ ｔｔｇ ｃｃａ ａｔｇ ｇ（配列番号９０）
【０１０１】
最終体積が２５μｌの、３００ｎＭのプライマー（Ｍｅｄｐｒｏｂｅ）、２００ｎＭの５’６−ＦＡＭ（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、１２．５μｌのＴａｑＭａｎユニバーサルＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、及び０．５μｌの鋳型ｃＤＮＡを含む溶液において、ＰＣＲを実施した。温度サイクルはＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７７００配列検出器（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で実施した。サイクルは５０℃で２分間及び９５℃で１０分で開始し、続いて９５℃で１５秒及び６０℃で１分を４０サイクル行った。特異的ＰＣＲ産物の蓄積を蛍光の増加としてリアルタイムで検出した。観察された蛍光をサイクル数に対してプロットして増幅プロットを生成し、ＣＴ値を決定、すなわち、蛍光シグナルが蛍光単位に対するＣＴ値０．０５を超えたサイクル数を決定した。ＣＴ値の各決定は２回ずつ行い、同じ試料で同時に２回行ったβ−アクチン発現の測定のＣＴ値で標準化した。２つの平行なＣＴ値の間の範囲は全ての測定において平均の５％未満であった。分析した遺伝子（標的遺伝子）の相対発現を、相対発現＝２−ΔＣＴという式（ここで、ΔＣＴ＝ＣＴ（標的遺伝子）−ＣＴ（β−アクチン））を用いて推定した。標的遺伝子の相対発現を１００倍して、ｍＲＮＡの量をβ−アクチンのｍＲＮＡの量のパーセンテージとして表した。
【０１０２】
軟寒天における成長、増殖巣形成、及びマウスにおける腫瘍形成
増殖巣形成アッセイ及び軟寒天における足場非依存性の成長のために、ＨｅＬａ細胞をトリプシン処理し、ｓｉＲＮＡ処理の４８時間後に１０ｃｍのプレートに細胞４×１０５個にして播種した。軟寒天アッセイを、文献に記載されているように１０％ＦＢＳを含む培地で実施した。９日間のインキュベーションの後、培養物を二重盲検で写真撮影した。生存しているコロニーの形の細胞を顕微鏡画像（倍率×５）で測定した。各画像で見られたコロニーの数及びサイズを、ＮＩＨ（ｈｔｔｐ：／／ｒｓｂ．ｉｎｆｏ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊ／）のＩｍａｇｅＪ １．３３ｕソフトウェアを用いて分析した。足場非依存性コロニーを２００〜１００００ピクセルの間の数に従って分類した。
【０１０３】
ＭＥＦにおける増殖巣形成アッセイのために、６ウェルプレートに、１ウェル当たり、レトロウイルスにより形質導入したＭＥＦの２００個又は５００個の細胞を、フィーダーである８．３×１０５個のＮＩＨ３Ｔ３細胞と共に播種した。細胞を１〜２週間成長させた。メタノール固定した細胞をギムザ染色した。感染細胞１００個当たりの増殖巣の数を計算した。
【０１０４】
マウス実験のために、トランスフェクトした細胞３×１０６個を免疫不全マウスの脇腹に皮下投与した。その後、触診により３日ごとに腫瘍の形成を評価し、触知可能な腫瘍のサイズを精密機器によって測定した。実験は２８日目に終了した。マウスでの全ての実験は、動物管理の制度的なガイドラインに従って行い、フィンランドのＴｕｒｋｕ大学の動物実験審査委員会の許可を得たものである。
【０１０５】
ウェスタンブロット分析
ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動によるタンパク質の分離の後、タンパク質をＩｍｍｏｂｉｌｏ−Ｐ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、米国マサチューセッツ州Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ）に移した。一次抗体及び二次抗体とのインキュベーションの後、免疫ブロットしたタンパク質を高感度化学発光（ＥＣＬ、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって可視化した。
【０１０６】
免疫組織化学
ＫＩＡＡ１５２４の、パラフィン包埋した腫瘍切片及び対照の組織切片の免疫染色を、ＰＢＳに１：１００で希釈したｐ９０抗体（Ｓｏｏ Ｈｏｏら、２００２年）を用いて実施した。免疫染色は、ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）を組み合わせたアビジン−ビオチン−ペルオキシダーゼ複合体法（ＶｅｃｔａＳｔａｉｎ、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ、米国カリフォルニア州Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ）で行い、ヘマトキシリンで対比染色した。
【０１０７】
タンデムアフィニティー精製のための溶解物の調製
ＰＲ６５ＴＡＰタンパク質を安定して発現するＨＴ−１０８０細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、緩衝液Ａ（１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．９）、１０ｍＭのＫＣｌ、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、０．１ｍＭのＥＧＴＡ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、コンプリートプロテアーゼインヒビター、２０ｍＭのｂ−グリセロリン酸、２５ｍＭのＮａＦ、０．５ｍＭのＰＭＳＦ、及び０．５ｍＭのＤＴＴ）内に再懸濁した。細胞を氷上でインキュベートし、ボルテックスし、そしてその後３９００ｒｐｍで３分間遠心分離して細胞質溶解物を得た。次に、ＩｇＧ結合緩衝液（ＩＢＢ：１０ｍＭのＴｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．２％ＮＰ−４０、０．５ｍＭのＤＴＴ）として、同レベルのＮａＣｌとＮＰ−４０とを含むように抽出物を調整した。次に、調整した抽出物を、ＩＢＢで洗浄したＩｇＧセファロース４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を含むＰｏｌｙ−Ｐｒｅｐ（登録商標）クロマトグラフィーカラム（ＢｉｏＲａｄ）上に添加した。抽出物を４℃で４時間インキュベートし、その後１０ｍｌのＩＢＢで３回洗浄した。次に、ビーズをＴＥＶ切断緩衝液（ＴＣＢ：１０ｍＭのＴｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．３％ＮＰ−４０、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、及び０．５ｍＭのＤＴＴ）及び組換えタバコエッチウイルスプロテアーゼ（ＴＥＶ）において、４℃で一晩インキュベートした。カルモジュリンビーズ（Ｓｔａｒｔａｇｅｎｅ）を、Ｐｏｌｙ−Ｐｒｅｐ（登録商標）クロマトグラフィーカラムにおいてカルモジュリン結合緩衝液（ＣＢＢ：１０ｍＭのｂ−メルカプトエタノール、５０ｍＭのＴｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭの酢酸Ｍｇ、１ｍＭのイミダゾール、２ｍＭのＣａＣｌ２、及び０．２％ＮＰ−４０）で洗浄した。次に、ＴＥＶの溶出物をカラムから回収し、カルモジュリンビーズに結合するよう調整した（１ｍｌの各溶出物に対して、１ＭのＣａＣｌ２を４ｍｌ、及びＣＢＢを３ｍｌ）。調整した溶出物を４℃で２時間インキュベートし、その後１０ｍｌのＣＢＢで３回洗浄した。次に、カルモジュリンビーズに結合したタンパク質をカルモジュリン溶出緩衝液（ＣＥＢ：１０ｍＭのｂ−メルカプトエタノール、１０ｍＭのＴｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭの酢酸Ｍｇ、１ｍＭのイミダゾール、５ｍＭのＥＧＴＡ、及び０．２％ＮＰ−４０）で回収するか、又はＳＤＳローディングバッファー内で煮沸して回収した。
【０１０８】
質量分析によるタンパク質の同定
目的のタンパク質バンドをゲルから切り取り、還元し、アルキル化し、以前に記載されているようにトリプシンで一晩消化した。抽出されたペプチドを、ナノフローＨＰＬＣシステム（ＬＣ Ｐａｃｋｉｎｇｓ、米国カリフォルニア州Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ）と組み合わせた、ハイブリッドリニアイオントラップ機器（Ｑ−Ｔｒａｐ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、米国マサチューセッツ州Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ）で、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより特徴付けた。得られたペプチド断片のスペクトルを、包括的で非冗長なタンパク質データベースに対して、Ｍａｓｃｏｔを用いてサーチした。最低３つのマッチしたトリプシンペプチドが各タンパク質の同定に必要であり、必要であれば、手作業での検査により断片の正確なイオンの割り当てを確実にした。
【０１０９】
遺伝子発現分析
スクランブルｓｉＲＮＡ又はＫＩＡＡ１５２４のｓｉＲＮＡのいずれかでのトランスフェクションの７２時間後にＨｅＬａ細胞から抽出された全ＲＮＡを、Ｓｅｎｔｒｉｘ（登録商標）Ｈｕｍａｎ−６ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ＢｅａｄＣｈｉｐアレイ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｉｎｃ．）により、ゲノム規模での遺伝子発現プロフィールについて分析した。ｃＤＮＡの増幅、標識、及びハイブリダイゼーションは、製造者の指示及び標準的な手順に従って、フィンランドＤＮＡマイクロアレイセンター（バイオテクノロジーセンター、Ｔｕｒｋｕ大学及びＡｂｏ Ａｋａｄｅｍｉ大学、Ｔｕｒｋｕ、フィンランド）で行った。アレイから得られたデータを、フィンランド、ＴｕｒｋｕのＴｕｒｋｕ大学及びＡｂｏ Ａｋａｄｅｍｉ大学のバイオテクノロジーセンターに所在のバイオインフォマティクス中央施設で分析した。スクランブルｓｉＲＮＡをトランスフェクトした細胞と比較して、２つの実験の両方において発現レベルが少なくともｌｏｇ０．５変化するという基準に従って、発現がＫＩＡＡ１５２４の減少に応じて顕著に変化した７６個の遺伝子のリストをフィルターした。
【０１１０】
統計の方法
図６Ｇ、８Ａ、８Ｂ、９Ａ、及び９Ｂについては、統計的有意性はマンホイットニーのＵ検定によって決定し、統計分析を有する全ての他の実験については、統計分析はスチューデントｔ検定で行った。
【０１１１】
本発明の方法が、わずか一部のみが本明細書において開示されているにすぎない様々な実施形態の形に組み込まれ得ることは理解されよう。当業者には、他の実施形態が存在し、かつそれが本発明の趣旨に反しないことが明らかであろう。したがって、記載された実施形態は例示的なものであり、制限的であると解釈されるべきではない。
【０１１２】
（参考文献）
【図面の簡単な説明】
【０１１３】
【図１】ＫＩＡＡ１５２４がＰＰ２Ａの内因性阻害剤であることを示す図である。図１Ａ）は、ＰＲ６５足場、ＰＰ２Ａｃ触媒性サブユニット、及び調節性Ｂサブユニットを含む、ＰＰ２Ａ複合体の概略図を示す。ＴＡＰ精製に用いるＰＲ６５タンパク質のＴＡＰ融合体が示されている。図１Ｂ）ＨＴ−１０８０線維肉腫細胞からのＰＲ６５タンパク質複合体のＴＡＰの精製である。ＰＲ６５ＴＡＰ溶出物内のタンパク質を、質量分析によるペプチド配列決定によって同定した。図１Ｃ）ＨｅＬａ細胞の細胞質抽出物の、ＰＲ６５抗体との免疫共沈降分析により、内因性ＫＩＡＡ１５２４、ＰＲ６５、及びＰＰ２Ａｃタンパク質の間の相互作用が明らかになる。ＰＩは免疫前血清であり、インプットはインプット作用物質である。図１Ｄ）ＰＲ６５の結合を欠いたＫＩＡＡ１５２４タンパク質の突然変異体の、免疫共沈降分析による同定である。図１Ｅ）提示した発現構築物でトランスフェクトしたＨｅＬａ細胞を、ＫＩＡ１５２４−ＰＰ２Ａｃの同時局在について共焦点顕微鏡法で分析した。図１Ｆ）ｓｉＲＮＡ介在性の、ＨｅＬａ細胞におけるＫＩＡＡ１５２４タンパク質の発現の減少により、免疫沈降したＰＰ２Ａｃのセリン／スレオニンホスファターゼ活性が増大する。
【図２】ＫＩＡＡ１５２４タンパク質を示す図である。図２Ａ）ＫＩＡＡ１５２４タンパク質の予測上の構造により、いくつかの推定上のタンパク質−タンパク質相互作用ドメインが明らかになる。図１Ｄ及び１Ｅで分析されたＫＩＡＡ１５２４ｍｕｔタンパク質である。図２Ｂ）ＫＩＡＡ１５２４タンパク質のアミノ酸配列である（配列番号１）。
【図３】ＫＩＡＡ１５２４におけるＰＰ２Ａ相互作用ドメインの同定を示す図である。図３Ａ）ＫＩＡＡ１５２４欠失構築物と、ＨｅＬａ細胞溶解物の内因性ＰＲ６５との免疫共沈降。提示したＦｌａｇ−ＫＩＡＡ１５２４タンパク質とＰＰ２Ａ複合体との免疫共沈降を、ＰＲ６５抗体を用いた抗Ｆｌａｇ免疫沈降物のウェスタンブロッティングによって分析した。ＫＩＡＡ１５２４欠失体の免疫沈降効率をＫＩＡＡ１５２４のイムノブロッティングによって確認した。図３Ｂ）ＫＩＡＡ１５２４における推定上のＰＰ２Ａ介在性ドメインの同定。図３Ａにおける結果は、野生型ＫＩＡＡ１５２４はＰＰ２Ａ（ＲＰ６５）と相互作用する一方、４６１〜５３３のドメインが欠失しているＫＩＡＡ１５２４ではＰＰ２Ａとの相互作用が損なわれることを示す。したがって、ＫＩＡＡ１５２４のドメイン４６１〜５３３は、ＫＩＡＡ１５２４とＰＰ２Ａとの間の相互作用に介在すると予想される。
【図４】ＫＩＡＡ１５２４がｃ−Ｍｙｃ関連ＰＰ２Ａ活性及びｃ−Ｍｙｃの分解を阻害することを示す図である。図４Ａ）ＫＩＡＡ１５２４タンパク質のｓｉＲＮＡ誘導性の減少により、ＨｅＬａ細胞におけるｃ−Ｍｙｃタンパク質の発現が下方調節される。図４Ｂ）ＫＩＡＡ１５２４タンパク質のｓｉＲＮＡ誘導性の減少はｃ−ＭｙｃのｍＲＮＡの発現を阻害しない。図４Ｃ）ＫＩＡＡ１５２４タンパク質のｓｉＲＮＡ誘導性の減少は、ｃ−Ｍｙｃ免疫沈降物におけるＰＰ２Ａの活性を増強する。図４Ｄ）ＫＩＡＡ１５２４タンパク質はＰＰ２Ａｃタンパク質とｃ−Ｍｙｃタンパク質との間の相互作用を調節しない。スクランブルｓｉＲＮＡ又はＫＩＡＡ１５２４のｓｉＲＮＡのいずれかでトランスフェクトしたＨｅＬａ細胞を、ｃ−Ｍｙｃ特異的抗体との免疫共沈降分析にかけた。免疫沈降物におけるタンパク質をその後、提示した抗体によって研究した。
【図５】ｃ−ＭｙｃにおけるＫＩＡＡ１５２４相互作用ドメインの同定を示す図である。図５Ａ）固定化された組換えＦｌａｇ−ＫＩＡＡ１５２４タンパク質及び組換えＧＳＴタンパク質との、又はＧＳＴ−ｃ−Ｍｙｃ １−２６２タンパク質との、インビトロでの結合アッセイ。ＧＳＴ（上部）又はＫＩＡＡ１５２４（下部）での溶出物の免疫ブロット。インプットは、相互作用アッセイに用いたＧＳＴタンパク質である。同様の結果であった３回の個別の実験の代表的なブロットを示している。図５Ｂ）ｃ−Ｍｙｃ．ＫＩＡＡ１５２４上での、ＫＩＡＡ１５２４結合ドメインとしてのｃ−Ｍｙｃの１０５〜２６２の同定の概略図。
【図６】ＫＩＡＡ１５２４が癌細胞の成長に必要であることを示す図である。図６（Ａ）スクランブルｓｉＲＮＡ又はＫＩＡＡ１５２４のｓｉＲＮＡで７２時間トランスフェクトしたＨｅＬａ細胞の、細胞増殖のためのチミジンの組み込み。４回の実験の平均＋Ｓ．Ｄ．を示している。＊は、スチューデントｔ検定でｐ＜０．０５である。図６Ｂ）スクランブルｓｉＲＮＡ又はＫＩＡＡ１５２４のｓｉＲＮＡで７２時間トランスフェクトしたＨｅＬａ細胞の細胞周期の進行についての、ＤＮＡ量のフローサイトメトリー分析。結果は、同様の結果であった４回の反復実験の代表的な実験のものである。図６Ｃ）ＫＩＡＡ１５２４欠失体は、ＫＩＡＡ１５２４のｓｉＲＮＡのトランスフェクションの７２時間後のイムノブロッティングによって検出されたように、ＨｅＬａ細胞においてポリ（ＡＤＰリボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）の切断を誘導しない。全長の（１１０ｋＤ）及びカスパーゼで切断された形態のＰＡＲＰタンパク質の予想される分子量を右側に示す。図６Ｄ）スクランブルｓｉＲＮＡ又はＫＩＡＡ１５２４のｓｉＲＮＡでトランスフェクトしたＨｅＬａ細胞の単層上の高密度の増殖巣の形成。上は、代表的な光学顕微鏡画像である。下は、Ｉｍａｇｅ Ｊソフトウェアによる、再播種の１０日後の増殖巣の数の定量。４回の実験の平均＋Ｓ．Ｄ．を示している。＊は、スチューデントｔ検定でｐ＝０．００２である。図６Ｅ）ＫＩＡＡ１５２４タンパク質のｓｉＲＮＡ誘導性の減少により、寒天上でのＨｅＬａ細胞の足場非依存性の成長が阻害される。図６Ｆ）スクランブルｓｉＲＮＡ（Ｓｃｒ）又はＫＩＡＡ１５２４のｓｉＲＮＡでトランスフェクトしたＨｅＬａ細胞を、免疫不全マウスにおいて腫瘍の成長について分析した。各群につき６頭のマウスの腫瘍容積の平均＋ＳＤを示す。図６Ｇ）図６Ｆ）で示した実験と同様に行った個別の実験の２７日目の腫瘍の重量（ｍｇ）。＊は、マンホイットニーのＵ検定でｐ＝０．０３４である。
【図７】ＫＩＡＡ１５２４がヒトの頭頚部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）において過剰発現していることを示す図である。図７Ａ）ＫＩＡＡ１５２４のｍＲＮＡの発現を、正常な組織試料の定量ＲＴ−ＰＣＲ分析により定量した。ＫＩＡＡ１５２４の発現をβ−アクチンとの関連で示す。図７Ｂ）ＫＩＡＡ１５２４のｍＲＮＡの発現を、ＨＮＳＣＣ細胞系及びヒト表皮角化細胞（ＨＥＫ）で、ＴａｑｍａｎリアルタイムＰＣＲ分析によって研究した。図７Ｃ）ＫＩＡＡ１５２４のｍＲＮＡの発現をＨＮＳＣＣ腫瘍試料及び正常な組織の対照試料で、ＴａｑｍａｎリアルタイムＰＣＲ分析によって研究した。図７Ｄ）ＫＩＡＡ１５２４抗体を用いたＨＮＳＣＣ組織の免疫染色分析は、腫瘍細胞における細胞質ＫＩＡＡ１５２４の強い染色を示している（腫瘍細胞の小塊は矢印で示されている）。図７Ｅ）ＫＩＡＡ１５２４タンパク質のｓｉＲＮＡ誘導性の減少により、ＨＮＳＣＣ細胞系におけるｃ−Ｍｙｃタンパク質の発現が下方調節される。
【図８】ＫＩＡＡ１５２４がヒトの結腸癌において過剰発現していることを示す図である。図８Ａ）結腸癌組織及び非悪性の結腸組織（対照）におけるＫＩＡＡ１５２４のｍＲＮＡの発現の定量ＲＴ−ＰＣＲ分析。試料の発現の平均＋Ｓ．Ｄ．を示している。＊は、マンホイットニーのＵ検定でｐ＜０．０５である。図８Ｂ）ヒト結腸癌におけるＫＩＡＡ１５２４の発現レベルと腫瘍悪性度との間の関連性。悪性度ＩＩＩ〜ＩＶと悪性度ＩＩとの間（＊はマンホイットニーのＵ検定でｐ＜０．０００１）及び悪性度ＩＩＩ〜ＩＶと正常な試料との間（＊はマンホイットニーのＵ検定でｐ＝０．００１９）のＫＩＡＡ１５２４発現の統計的な違いを観察した。
【図９】ＫＩＡＡ１５２４がヒトの乳癌において過剰発現していることを示す図である。図９Ａ）正常な乳腺組織又は腫瘍乳腺組織におけるＫＩＡＡ１５２４の発現。図９Ｂ）ＫＩＡＡ１５２４の発現はヒトの乳腺腫瘍の型に依存する。２試料のウィルコクソン（マンホイットニー）の順位和検定を統計分析に用いた。＊は、正常な乳房と比較してｐ＜０．０５であり、＊＊は、粘液性腫瘍と比較してｐ＜０．００５である。ハウスキーピング遺伝子のβ−アクチンを標準化に用いた。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、個体における新たに発見された成長刺激タンパク質の阻害に関する。さらに、本発明は、前記成長刺激タンパク質の発現を下方調節し、又は前記タンパク質を不活性化することにより、個体において癌を予防若しくは治療し、又は癌の成長、浸潤、若しくは転移を予防若しくは治療し、又は他の過剰増殖性疾患を予防若しくは治療する方法に関する。さらに、本発明は、前記成長刺激タンパク質に基づいて、個体において癌又は他の過剰増殖性疾患を診断する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明の背景を明らかにするための、本明細書で用いる刊行物及び他の材料、並びに、特に実施に関してさらなる詳細を提供するための事例は、参照により組み込まれる。
【０００３】
癌は、世界中の全ての地域社会を悩ませている深刻な疾患である。男性の２人に１人、女性の３人に１人が一生の間に何らかの形の癌を発症すると推定されている。また、２００５年の間にアメリカ合衆国のみにおいて５５万人超の人々が癌によって死亡するとも推定されている。癌とは、細胞の制御されていない成長、生存、及び浸潤に関連する複雑で非常に様々な一連の疾患についての一般的な用語である。１００を超える異なる型の癌、並びにそれぞれのサブタイプが存在するが、最近の研究によって、良性の細胞から癌細胞への形質転換に必要な限られた数の遺伝因子が明らかにされている（Ｚｈａｏら、２００４年）。通常、ヒト細胞の形質転換にはＲａｓ ＧＴＰアーゼの活性化、テロメラーゼの過剰発現、腫瘍抑制タンパク質ｐ５３及び網膜芽細胞腫タンパク質（Ｒｂ）の不活性化、並びにプロテインホスファターゼ２Ａ（ＰＰ２Ａ）の阻害が必要であるとされている（Ｚｈａｏら、２００４年）。これらの遺伝因子の機能を理解することで、異なる型の癌に広く適用可能となる癌治療の開発がなされ得ることは明らかである。
【０００４】
上述したように、ＰＰ２Ａ活性の阻害はヒトの初代細胞の形質転換の必要条件の１つであると同定されている（Ｚｈａｏら、２００４年）。ＰＰ２Ａは、触媒性サブユニット（ＰＰ２Ａｃ又はＣ）、足場サブユニット（ＰＲ６５又はＡ）、及び選択的な調節性Ｂサブユニットの１つからなる三量体のタンパク質複合体である（図１Ａ）（Ｊａｎｓｓｅｎｓ及びＧｏｒｉｓ、２００１年）。ＰＰ２Ａは、プロテインキナーゼ及び他のシグナル伝達タンパク質の調節性のｓｅｒ／ｔｈｒ残基を脱リン酸化することにより細胞の挙動を調節する。発癌性の転写因子ｃ−ＭｙｃはＰＰ２Ａの多くの基質の１つである。ｃ−Ｍｙｃのセリン６２のＰＰ２Ａ介在性の脱リン酸化によりプロテオソームによるタンパク質の分解が生じることが最近示された（Ｙｅｈら、２００４年）。重要なことには、ＰＰ２Ａを不活性化するウイルススモールｔ抗原は、ｃ−Ｍｙｃの安定化によりその発癌性を発揮する（Ｙｅｈら、２００４年）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ウイルス抗原を研究ツールとして用いることによって、ヒト細胞の形質転換のためのＰＰ２Ａの阻害の重要性が確証されているが、自然発生的に形質転換されたヒト癌細胞における、ＰＰ２Ａの阻害を生じさせる分子メカニズムは、現在のところ明らかにされていない。したがって、ＰＰ２Ａが形質転換を阻害するメカニズムを解明する確かな必要性がある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、成長刺激タンパク質の発見に基づいている。本発明の発明者は、タンパク質ＫＩＡＡ１５２４（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＩ３０５６５、配列番号１）がプロテインホスファターゼ２Ａ（ＰＰ２Ａ）の内因性阻害剤であること、並びにタンパク質ＫＩＡＡ１５２４が腫瘍の成長及び癌細胞の増殖に必要であること、並びにタンパク質ＫＩＡＡ１５２４が癌組織において上方調節されることを見出した。
【０００７】
したがって、一態様によれば、本発明はＫＩＡＡ１５２４を阻害する治療作用物質をスクリーニング及び同定する方法に関し、前記方法は、ａ）反応容器内に固定化された第一のタンパク質を提供するステップと、ｂ）前記容器に、候補作用物質及び標識された第二のタンパク質を同時に又は任意の順序で連続的に加えるステップと、ｃ）前記第一のタンパク質が前記第二のタンパク質に結合するかどうかを決定するステップと、ｄ）ステップｃ）における決定が否定的である場合に、前記候補作用物質を、ＫＩＡＡ１５２４を阻害する治療作用物質であると同定するステップとを含み、前記第一のタンパク質はＫＩＡＡ１５２４であり、前記第二のタンパク質はＰＰ２Ａ、そのサブユニット、及びｃ−Ｍｙｃからなる群から選択され、又はその逆である。
【０００８】
別の態様によれば、本発明は、特許請求の範囲に記載した低分子干渉ＲＮＡ及びペプチドなどの、ＫＩＡＡ１５２４を阻害する作用物質に関する。さらに、本発明はそのような作用物質を含む医薬組成物に関する。
【０００９】
さらなる態様によれば、本発明は医薬組成物を生産する方法、及びそのような方法によって生産された医薬組成物に関し、前記方法は、ＫＩＡＡ１５２４を阻害する作用物質を同定するステップと、前記作用物質を薬学的に許容できる任意の適切な賦形剤と混合するステップとを含む。
【００１０】
さらなる態様によれば、本発明は、特許請求の範囲に記載した医薬組成物を治療有効量投与することにより、ＫＩＡＡ１５２４の阻害が必要なヒト又は動物の患者においてＫＩＡＡ１５２４を阻害する方法に関する。
【００１１】
さらなる態様によれば、本発明は、癌及び他の過剰増殖性疾患からなる群から選択される疾患を治療、予防、及び／又は緩和するための医薬組成物を製造するための、ＫＩＡＡ１５２４を阻害する作用物質の使用に関する。
【００１２】
さらなる別の態様によれば、本発明は、癌に罹患している疑いのある哺乳動物において悪性転化の浸潤性を決定する方法に関し、前記方法は、ａ）前記哺乳動物から得られた、悪性細胞を含む疑いのある試料におけるＫＩＡＡ１５２４の発現レベルを評価するステップと、ｂ）ステップａ）の発現レベルを、非悪性の対照試料におけるＫＩＡＡ１５２４の発現レベルと比較するステップと、ｃ）前記試料におけるＫＩＡＡ１５２４の発現レベルが非悪性の対照試料におけるＫＩＡＡ１５２４の発現レベルよりも顕著に高い場合に、前記悪性転化を浸潤性であると決定するステップとを含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明は、ＫＩＡＡ１５２４を、ＰＰ２Ａと相互作用しその腫瘍抑制活性を阻害する成長刺激タンパク質として同定することに基づいている。したがって本発明は、新規な抗癌作用物質又は抗増殖作用物質の標的としてＫＩＡＡ１５２４を提供する。
【００１４】
ＫＩＡＡ１５２４を、ＰＰ２Ａタンパク質複合体の足場サブユニットであるＰＲ６５タンパク質との免疫共沈降、及びその後の質量分析によるペプチド配列決定に基づいて、ＰＰ２Ａ相互作用タンパク質として同定した。ＫＩＡＡ１５２４の、ＰＰ２Ａ複合体と相互作用する能力を、内因性ＰＲ６５タンパク質の免疫共沈降分析により、またＫＩＡＡ１５２４の欠失突然変異体を用いることにより明らかにした。加えて、ＫＩＡＡ１５２４に標的化した低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）オリゴによりＫＩＡＡ１５２４を減少させるとＰＰ２Ａのホスファターゼ活性が刺激されたことから、ＰＰ２Ａ阻害剤としてのＫＩＡＡ１５２４の機能的役割が明らかにされた。
【００１５】
さらに、免疫共沈降実験に基づいて、ＫＩＡＡ１５２４を、転写因子ｃ−Ｍｙｃと直接相互作用するタンパク質であると同定した。前記相互作用はｃ−Ｍｙｃタンパク質を安定化し、それによりその発癌性を高めることが示された。
【００１６】
例えば、ＫＩＡＡ１５２４のｓｉＲＮＡで細胞をトランスフェクトして、その後、細胞培養物及びインビボでのマウスモデルの両方における細胞増殖を決定することにより、癌細胞の挙動の調節におけるＫＩＡＡ１５２４の役割を研究した。ＫＩＡＡ１５２４が減少すると、細胞増殖が阻害され、細胞の足場非依存性の成長が阻害され、かつマウスにおける腫瘍形成が損なわれた。さらに、ＫＩＡＡ１５２４が頭頚部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）、結腸癌、及び乳癌などのヒトの悪性腫瘍において過剰発現することが見出された。特に、ＫＩＡＡ１５２４の過剰発現は、結腸癌及び乳癌の非浸潤性腫瘍よりも、結腸癌及び乳癌由来の浸潤性腫瘍で多く見られた。これらの結果、及び以下に開示する他の結果は、ＫＩＡＡ１５２４が癌細胞の成長を促進すること、したがってＫＩＡＡ１５２４が癌治療の標的となることを示している。
【００１７】
本発明は、ＫＩＡＡ１５２４を阻害する、ひいては癌、癌細胞の増殖、浸潤、転移、並びに他の過剰増殖性疾患、例えば乾癬、心筋肥大、及び良性腫瘍、例えば腺腫、過誤腫、及び軟骨腫の治療、予防、及び／又は緩和に有用な治療作用物質をスクリーニング及び同定する方法を目的とする。
【００１８】
本明細書を通して用いられるように、「ＫＩＡＡ１５２４を阻害すること」という表現は、ＫＩＡＡ１５２４の発現を下方調節すること、ＫＩＡＡ１５２４の活性を阻害すること、ＫＩＡＡ１５２４を不活性化すること、及びＰＰ２Ａ複合体又はｃ−ＭｙｃとのＫＩＡＡ１５２４の相互作用を阻害することを含む。阻害及び遮断という語は互換的に用いられる。
【００１９】
上記の方法は、ａ）反応容器内に固定化された第一のタンパク質を提供するステップと、ｂ）前記容器に、候補作用物質及び標識された第二のタンパク質を同時に又は任意の順序で連続的に加えるステップと、ｃ）前記第一のタンパク質が前記第二のタンパク質に結合するかどうかを決定するステップと、ｄ）ステップｃ）における決定が否定的であるが治療作用物質の不在下では肯定的である場合に、前記候補作用物質を、ＫＩＡＡ１５２４を阻害する治療作用物質であると同定するステップとを含む。この方法において、前記第一のタンパク質はＫＩＡＡ１５２４であり、前記第二のタンパク質はＰＰ２Ａ、そのサブユニット、すなわちＰＰ２Ａｃα若しくはβ、ＰＲ６５α若しくはβ、又は任意の選択的なＢサブユニット（Ｂ、Ｂ’、Ｂ”）、及びｃ−Ｍｙｃからなる群から選択され、又はその逆である。
【００２０】
マルチウェルプレートなどの反応容器への前記第一のタンパク質の固定化は、当技術分野で既知の任意の適切な方法によって行うことができる。そのような方法は当業者には明らかであり、当業者は、前記タンパク質の立体構造又は結合特性に影響を与えることなく前記タンパク質を固定化する方法についても充分に理解している。
【００２１】
当技術分野で既知の任意の適切な標識及び標識方法を、前記第二のタンパク質の標識に用いることができる。好ましくは、前記標識は蛍光標識であり、例えば、緑色蛍光タンパク質、又はテキサスレッドなどの化学蛍光標識である。前記標識はまた、ルシフェリンなどの基質とインキュベートすると光を発するホタルルシフェラーゼのようなタンパク質でもあり得る。加えて、前記標識は、３−アミノ−９−エチルカルバゾールなどの基質とインキュベートすると比色反応を生じる西洋ワサビペルオキシダーゼのような酵素でもあり得る。
【００２２】
候補作用物質の存在下で前記第一のタンパク質が前記第二のタンパク質に結合するかどうかについての決定は、用いる標識に応じて任意の適切な方法により行うことができる。例えば、蛍光標識を用いる場合、タンパク質の結合は、好ましくはレーザーである光源と、光又はレーザーによる励起に応じて蛍光標識から発せられる光を検出するセンサーとを含む光学機器によって決定することができる。例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ標識をその基質、例えば３−アミノ−９−エチルカルバゾールと組み合わせて用いる場合のような比色反応の場合、タンパク質の結合は、目的の波長領域における吸光度の変化により決定し得る。
【００２３】
当業者には、本方法がまたインキュベーション及び洗浄などの様々な追加のステップも含み得るということは明らかであろう。例えば、洗浄は、結合していない第二のタンパク質を除去するためにステップｂ）の後に必要であり得る。
【００２４】
本発明による一実施形態では、第一のタンパク質又は標的タンパク質を９６ウェル、３８４ウェル、又は任意の同等のマルチウェルのプレート上に固定化すること、及び、それを、例えば緑色蛍光タンパク質、テキサスレッド、又はルシフェラーゼタンパク質に融合した第二のタンパク質とインキュベートすることによる、タンパク質−タンパク質相互作用の阻害剤のハイスループットスクリーニングに、本方法を用いることができる。プレートリーダーを用いて、蛍光標識から発せられた光を測定し、相互作用の場合にはウェルからの光シグナルを検出する。このようなアッセイをペプチド及び小分子化合物のライブラリーと組み合わせることで、容器内の蛍光シグナルの損失により検出される、タンパク質相互作用を阻害する潜在的な薬物様分子の同定が可能になろう。
【００２５】
本発明はさらに医薬組成物を生産する方法を目的としており、前記方法は、ＫＩＡＡ１５２４を阻害する作用物質を同定すること、及び前記作用物質を薬学的に許容できる当業者に周知の任意の適切な賦形剤と混合することを含む。一実施形態では、前記同定は上述したスクリーニング方法及び同定方法を用いて行われる。
【００２６】
さらに、本発明は、本発明によって生産された医薬組成物を治療有効量投与することにより、ＫＩＡＡ１５２４の阻害が必要なヒト又は動物の患者においてＫＩＡＡ１５２４を阻害する方法を目的とする。
【００２７】
本方法はあらゆる癌の治療に有用となり得ると考えられる。しかし、本方法は、特定の組織に位置する癌、及び手術又は放射線照射によっては治療が困難又は不可能であろう癌の治療又は予防に特に適している。そのような癌の例としては、頭頚部扁平上皮癌、結腸癌、及び乳癌が挙げられる。
【００２８】
本方法はまた、ＫＩＡＡ１５２４が発現する過剰増殖性疾患の治療にも有用であり得ると考えられる。そのような疾患としては、乾癬、心筋肥大、並びに、腺腫、過誤腫、及び軟骨腫などの良性腫瘍が挙げられる。
【００２９】
本発明による方法は、単一の治療方法若しくは予防方法として、又は細胞毒性作用物質の投与、手術、放射線治療、免疫療法などの他の方法と組み合わせたアジュバント療法として達成され得る。
【００３０】
本発明による様々な実施形態によって同定され得る、及び／又は本発明による方法において有用な作用物質は、限定はしないが、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、及びリボザイム分子などのオリゴヌクレオチド、ペプチド、ペプチド模倣物、化合物、小分子、前記ＫＩＡＡ１５２４に対する抗体、並びにＫＩＡＡ１５２４のタンパク質立体構造に作用してそれを不活性化させるアプタマー（オリゴヌクレオチド）を含む。
【００３１】
好ましい実施形態によれば、前記作用物質はＫＩＡＡ１５２４の発現を下方調節する作用物質である。
【００３２】
好ましい一実施形態によれば、ＫＩＡＡ１５２４の下方調節は例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド、修飾されたヌクレオチド、異なる種類のヌクレオチドを組み合わせた配列を用いて、ＫＩＡＡ１５２４の合成を防止又は変更することにより可能である。アンチセンスオリゴヌクレオチドはＤＮＡ分子又はＲＮＡ分子であり得る。
【００３３】
ＫＩＡＡ１５２４のｍＲＮＡを切断するリボザイムもまた含まれる。リボザイム技術は例えば以下の刊行物に記載されている。「癌遺伝子標的の同定及び検証のためのリボザイム技術（Ｒｉｂｏｚｙｍｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ ｇｅｎｅ ｔａｒｇｅｔ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ）」、Ｌｉら、Ａｄｖ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００７年、９６：１０３−４３。また、低分子干渉ＲＮＡ分子（ｓｉＲＮＡ）も有用であろう。ｓｉＲＮＡの適用はここ数年、新たな治療の開発において重要なものとなってきている。Ｏ Ｈｅｉｄｅｎｒｅｉｃｈは、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗ、第１号、２００５年における論文「低分子干渉ＲＮＡからの治療法の構築（Ｆｏｒｇｉｎｇ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ｆｒｏｍ ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡｓ）」において、医薬品としての適用についての概説を示している。腫瘍及び癌、肉腫、高コレステロール血症、神経芽細胞腫、並びに実質型角膜ヘルペスの治療について、原理が特に示されている。
【００３４】
ｓｉＲＮＡの原理は文献に広く示されている。例として、米国特許公開第２００３／０１４３７３２号、第２００３／０１４８５０７号、第２００３／０１７５９５０号、第２００３／０１９０６３５号、第２００４／００１９００１号、第２００５／０００８６１７号、及び第２００５／００４３２６６号を挙げることができる。ｓｉＲＮＡの二本鎖分子はアンチセンス領域及びセンス鎖を含み、前記アンチセンス鎖は特定のタンパク質をコードするｍＲＮＡ配列における標的領域に相補的な配列を含み、センス鎖は前記アンチセンス鎖に相補的な配列を含む。したがって、ｓｉＲＮＡの二本鎖分子は２つの核酸断片の集合であり、一方の断片は前記ｓｉＲＮＡ分子のアンチセンス鎖を含み、第二の断片はそのセンス鎖を含む。センス鎖及びアンチセンス鎖は、ポリヌクレオチドリンカー又は非ヌクレオチドリンカーであり得るリンカー分子を介して共有結合し得る。アンチセンス鎖及びセンス鎖の長さは典型的には各々およそ１９から２１ヌクレオチドである。しかし、対応する従来の２１ｍｅｒの低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）よりも強力であると最近報告された（Ｋｉｍら、２００５年）、合成二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）のＤｉｃｅｒの基質である２５〜３０ヌクレオチド長の二本鎖もまた利用可能である。典型的には、アンチセンス鎖及びセンス鎖は両方とも、少しのヌクレオチド、典型的には２個のヌクレオチドの、３’末端の突出を有する。アンチセンスの５’末端は典型的にはリン酸基（Ｐ）である。末端のリン酸基（Ｐ）を有するｓｉＲＮＡの二本鎖は、一本鎖のアンチセンスよりも細胞内に投与することが容易である。細胞内において、活性なｓｉＲＮＡアンチセンス鎖が形成され、それが標的ｍＲＮＡの標的領域を認識する。このことから、ＲＩＳＣエンドヌクレアーゼ複合体（ＲＩＳＣは、ＲＮＡ誘導性サイレンシング複合体）により標的ＲＮＡが切断され、また、ＲＮＡ依存性のＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲＰ）によりさらなるＲＮＡが合成され、それによりＤＩＣＥＲが活性化しさらなるｓｉＲＮＡの二本鎖分子が生じ得、それによって応答が増幅される。
【００３５】
低分子干渉ＲＮＡに関する課題の１つは、対応するｍＲＮＡに対する強力なｓｉＲＮＡの同定である。不完全な相補性を有する遺伝子はｓｉＲＮＡによって間違えて下方調節されてしまい、それによりデータの解釈及び潜在的な毒性において問題が生じることに留意されたい。しかしこれは、設計アルゴリズムを用いて適切なｓｉＲＮＡを慎重に設計することにより部分的に対処し得る。これらのコンピュータプログラムは、ｓｉＲＮＡのサイレンシング効果を増強する特徴である、低いＧＣ含有量、内部反復の欠如、Ａ／Ｕに富んだ５末端、及び高い局所的な結合自由エネルギーを有する配列範囲を見出すための一連のルールを用いて、所与の標的配列をふるい出す。
【００３６】
本発明において有用な作用物質を同定するために、市販の及び市販されていないアルゴリズムを用いていくつかの異なるＫＩＡＡ１５２４のｓｉＲＮＡを設計した。この目的のために、ＫＩＡＡ１５２４の全長ｃＤＮＡ配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿０２０８９０）を、ｓｉＲＮＡアルゴリズムプログラム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｗｇ−ｂｉｏｔｅｃｈ．ｃｏｍ／ｈｔｍｌ／ｓ＿ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ＿ａｃｉｄｓ／ｓ＿ｓｉｒｎａ＿ｄｅｓｉｇｎ．ｓｈｔｍｌ）、及びＷｅｎｗｕ Ｃｕｉａ、Ｊｉａｎｃｈａｎｇ Ｎｉｎｇｂ、Ｕｌｈａｓ Ｐ．Ｎａｉｋａ、Ｍｅｌｉｎｄａ Ｋ．Ｄｕｎｃａｎａにより開発されたスタンドアロンプログラム（ＲＮＡｉ設計ツールであるＯｐｔｉＲＮＡｉ、「生物医学におけるコンピュータ手法及びプログラム（Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｇｒａｍｓ ｉｎ Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ）」（２００４年）７５、６７−７３）にロードした。さらに、アルゴリズムにより生成したｓｉＲＮＡ配列を次にゲノム規模でのＤＮＡ配列のアラインメント（ＢＬＡＳＴ）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ）を通してスクリーニングし、オフターゲット効果を有するｓｉＲＮＡを排除した。つまり、標的遺伝子（ＫＩＡＡ１５２４）よりも他の遺伝子とマッチしている配列領域をたとえ短くても有する全てのこれらのｓｉＲＮＡを、さらなる利用に非常に有益なものであると考えた。このアプローチにより、配列番号２から６で示される５つの潜在的なｓｉＲＮＡが同定された。
【００３７】
次に、得られたｓｉＲＮＡを異なる細胞系にトランスフェクトし、ｍＲＮＡを分解する及びＫＩＡＡ１５２４の翻訳をさらに減少させるそれらの能力を、ＫＩＡＡ１５２４に特異的な抗体でｓｉＲＮＡを処理した後のＫＩＡＡ１５２４タンパク質の量を測定することにより、タンパク質レベルで研究した。表１において、用いた最低濃度でＫＩＡＡ１５２４タンパク質の最も強い下方調節を示したｓｉＲＮＡ配列にアスタリスクで印を付した。
【００３８】
【表１】
【００３９】
したがって本発明は、配列番号２から６からなる群から選択されるＫＩＡＡ１５２４のｓｉＲＮＡ、及び医薬品としてのそれらの使用に関する。配列番号２及び４で示される好ましいｓｉＲＮＡ、並びに配列番号３及び６で示されるより好ましいｓｉＲＮＡが提供される。いくつかの適用では、前記ｓｉＲＮＡが２１〜２５ヌクレオチドより長くてもよく、又はｄｓＲＮＡのｄｉｃｅｒの基質である二本鎖でもよいことは明らかである。
【００４０】
オリゴヌクレオチド（アンチセンス、ｓｉＲＮＡ、又はリボザイム分子など）は、医薬品として用いる場合、標的細胞内に導入される。送達は、２つの基本的に異なる手段、１）オリゴヌクレオチドの外因性の送達、又は２）ＤＮＡ配列がベクター内に位置する場合の、オリゴヌクレオチドをコードするＤＮＡ配列の内因性の転写で達成され得る。
【００４１】
正常な、修飾されていないＲＮＡは、生細胞内に存在するリボヌクレアーゼ酵素により分解されるため、生理的条件下における安定性が低い。オリゴヌクレオチドを外因的に投与する場合、既知の方法によって分子を修飾し、化学分解及び酵素分解に対するその安定性を高めることが非常に望ましい。
【００４２】
インビボで外因的に投与されるヌクレオチドの修飾は当技術分野において広く記載されている。基本的に、ヌクレオチドの任意の部分、すなわちリボース糖、塩基、及び／又はヌクレオチド間のリン酸ジエステル鎖を修飾し得る。例えば、リボース単位から２’−ＯＨ基を除去して２’−デオキシリボースヌクレオチドとすると安定性が向上する。この基における他の修飾、すなわちアルキル基、アルケニル基、アリル基、アルコキシアルキル基、ハロ基、アミノ基、アジド基、又はスルフヒドリル基によるリボース２’−ＯＨ基の置換もまた先行文献に開示されている。リボース単位における他の修飾も実施し得、すなわちリボースの２’位と４’位との間にメチレン結合を含むロックされた核酸（ＬＮＡ）を、固有の安定性を高めるために採用し得る。
【００４３】
さらに、ヌクレオチド間のリン酸ジエステル結合を修飾して、例えば、１つ又は複数の酸素を硫黄、アミノ基、アルキル基、又はアルコキシ基で置換することができる。ヌクレオチド内の塩基もまた修飾し得る。
【００４４】
好ましくは、オリゴヌクレオチドは、リボース糖における１つ若しくは複数の２’−ヒロドキシル基の修飾、及び／又は１つ若しくは複数のヌクレオチド間のリン酸ジエステル結合における修飾、及び／又はリボース糖の２’位と４’位との間における１つ若しくは複数のロックされた核酸（ＬＮＡ）の修飾を含む。
【００４５】
特に、好ましい修飾は例えば、２’−デオキシ、２’−Ｏ−メチル、２’−ハロ、例えばフルオロ又は２’−メトキシエチルによる、１つ又は複数の２’−ＯＨ基の置換である。特に好ましいものは、いくつかのヌクレオチド間のリン酸ジエステル結合も修飾されている、例えばホスホロチオエート結合により置換されている、オリゴヌクレオチドである。
【００４６】
上述した修飾は非限定的な例にすぎないということに留意されたい。
【００４７】
好ましい一実施形態によれば、スクリーニングアッセイによって同定可能な、又は本発明による方法において有用な作用物質は、ＰＰ２Ａ複合体又は転写因子ｃ−Ｍｙｃとの前記ＫＩＡＡ１５２４の相互作用を阻害することにより腫瘍の成長及び増殖を予防又は阻害する。或いは、前記作用物質は、ＰＰ２Ａ又はｃ−ＭｙｃとのＫＩＡＡ１５２４の相互作用に依存しない、ＫＩＡＡ１５２４の成長及び増殖を増強する効果を阻害する。前記作用物質は、例えば、ペプチド、ペプチド模倣物、小分子、前記ＫＩＡＡ１５２４に対する抗体、又はＫＩＡＡ１５２４のタンパク質立体構造に作用してそれを不活性化させるアプタマー（オリゴヌクレオチド）であり得る。
【００４８】
ＰＲ６５の免疫共沈降実験の結果により、ＫＩＡＡ１５２４がＰＰ２Ａタンパク質複合体のＰＲ６５サブユニット及びＰＰ２Ａｃサブユニットの両方と相互作用することが示された。タンパク質−タンパク質相互作用に介在するＫＩＡＡ１５２４内の領域を同定するために、ＫＩＡＡ１５２４タンパク質の任意の領域が欠失することによりＰＰ２Ａとのその結びつきがなくなるかどうかを研究した。この目的のために、タンパク質をコードする配列のおよそ５０〜１００個のアミノ酸に対応する各欠失を有する、一連のＫＩＡＡ１５２４欠失構築物を生成し、ＨｅＬａ細胞に一過性にトランスフェクトした。１１個のＫＩＡＡ１５２４欠失体のうち、４６１〜５３３の間のアミノ酸を欠くＫＩＡＡ１５２４が、免疫共沈降実験で示されるＰＲ６５に対する結合の低下を反復実験において示した唯一の突然変異体であった。したがって、配列番号１のアミノ酸４６１からアミノ酸５３３までの領域は、癌の新規な治療法にとって特に重要な標的である。
【００４９】
したがって、特に好ましい実施形態によれば、作用物質は、アミノ酸４６１から５３３までの領域のＫＩＡＡ１５２４、又は、ＰＰ２Ａ複合体とＫＩＡＡ１５２４タンパク質との間の相互作用に関与するＫＩＡＡ１５２４上の任意の他の領域を不活性化する。前記作用物質は、例えば、ペプチド、ペプチド模倣物、小分子、前記ＫＩＡＡ１５２４に対する抗体、又はＫＩＡＡ１５２４のタンパク質立体構造に作用してそれを不活性化させるアプタマー（オリゴヌクレオチド）であり得る。
【００５０】
より具体的には、本発明は、配列番号１で示されるＫＩＡＡ１５２４のアミノ酸４６１〜５３３の領域のアミノ酸に対応する、３から６０個の任意の長さのアミノ酸、好ましくは３から３０個、好ましくは６から１８個、好ましくは６から１２個、又は好ましくは９から１２個のアミノ酸を含む遮断ペプチドを提供する。いくつかの適用において前記遮断ペプチドが６０個のアミノ酸よりも長くてもよいことは明らかである。本発明によるペプチドはＰＰ２Ａ複合体の構成要素に結合し、ＫＩＡＡ１５２４とＰＰ２Ａとの間の相互作用を阻害し、それによりＰＰ２Ａの腫瘍抑制活性を誘導し、かつ他方で、ＫＩＡＡ１５２４を阻害又は遮断する。本発明による他の実施形態では、前記遮断ペプチドは、配列番号７から３０からなる群から選択される少なくとも１つの、好ましくは１から２０個の、好ましくは１から１０個の、好ましくは２から６個の、好ましくは２から４個の、又は好ましくは３から４個の連続配列、及びその保存的な配列変異体を含む。
【００５１】
ＫＩＡＡ１５２４の減少が、ＰＰ２Ａ複合体とその基質であるｃ−Ｍｙｃとの機能的な相互作用に影響を与えるかどうかを研究するために、ＫＩＡＡ１５２４のｓｉＲＮＡをトランスフェクトした後のＨｅＬａ細胞抽出物においてｃ−Ｍｙｃの定常的な発現レベルを研究した。図３Ａに示すように、ｓｉＲＮＡ誘導性のＫＩＡＡ１５２４の減少により、ＨｅＬａ細胞におけるｃ−Ｍｙｃタンパク質の発現は下方調節されたが、一方、図３Ｂに示すように、ｃ−ＭｙｃのｍＲＮＡの発現は影響を受けなかった。これらの結果により、ＫＩＡＡ１５２４がｃ−Ｍｙｃタンパク質レベルを転写後に調節することが示された。ｃ−Ｍｙｃタンパク質レベルの減少がタンパク質の不安定化により生じるかどうかを研究するために、内因性ｃ−Ｍｙｃタンパク質の半減期に対するＫＩＡＡ１５２４の減少の影響をパルスチェイス分析により調べた。実験の項においてより詳細に記載するように、ＫＩＡＡ１５２４の減少はｃ−Ｍｙｃタンパク質の安定性を顕著に低下させ、つまりＫＩＡＡ１５２４がｃ−Ｍｙｃの安定性の重要な調節因子であることを示している。
【００５２】
細胞抽出物のｃ−Ｍｙｃ及びＫＩＡＡ１５２４の免疫共沈降により、これらのタンパク質の間の物理的関連が明らかにされた（図３Ｄ）。ＫＩＡＡ１５２４とｃ−Ｍｙｃとの間の相互作用をさらに解明するため、Ｆｌａｇタグ付けされた全長組換えＫＩＡＡ１５２４を昆虫細胞において産生し、ｃ−Ｍｙｃの組換えＧＳＴ融合アミノ末端部分（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿００２４５８の配列のアミノ酸１〜２６２）を用いた、インビトロでのタンパク質−タンパク質相互作用のアッセイを実施した。結果は、ＧＳＴ−ｃ−Ｍｙｃの１〜２６２はＫＩＡＡ１５２４と相互作用するが、一方、ＧＳＴ−Ｍｙｃの１〜１２０のサイズに対応する、ＧＳＴ−Ｍｙｃの１〜２６２のタンパク質分解断片はＫＩＡＡ１５２４と相互作用しないということを示した。したがって、ｃ−Ｍｙｃのドメイン１２０〜２６２はＫＩＡＡ１５２４へのｃ−Ｍｙｃの直接的な結合に介在すると予想される。前記ｃ−Ｍｙｃのドメイン１２０〜２６２は１４３個のアミノ酸を含み、配列番号３１で示されるアミノ酸１〜１４３に対応する。
【００５３】
したがって本発明は、ＫＩＡＡ１５２４とｃ−Ｍｙｃとの相互作用の阻害に有用な遮断ペプチドを提供する。特定の一実施形態では、配列番号３１で示されるアミノ酸１〜１４３に対応する、３から６０個の任意の長さのアミノ酸、好ましくは３から３０個、好ましくは６から１８個、好ましくは６から１２個、又は好ましくは９から１２個のアミノ酸を含み、ＫＩＡＡ１５２４を阻害する遮断ペプチドが提供される。前記結合によりＫＩＡＡ１５２４とｃ−Ｍｙｃとの間の相互作用が阻害され、それによりＫＩＡＡ１５２４が阻害又は遮断される。本発明による他の実施形態では、前記遮断ペプチドは、配列番号３２から７９からなる群から選択される少なくとも１つの、好ましくは１から２０個の、好ましくは１から１０個の、好ましくは２から６個の、好ましくは２から４個の、又は好ましくは３から４個の連続配列、及びその保存的な配列変異体を含む。
【００５４】
本発明によるペプチドの遮断能力を試験するために、前記ペプチドをＨｅＬａ癌細胞などの細胞に投与し、ペプチドの性質に応じて、ａ）ＰＰ２Ａに対するＫＩＡＡ１５２４の結合を防止するそれらの能力、又はｂ）ｃ−Ｍｙｃに対するＫＩＡＡ１５２４の結合を防止するそれらの能力のいずれかを、ＫＩＡＡ１５２４−ＰＰ２Ａ相互作用の免疫沈降分析などの任意の適切な方法によって、又はｃ−Ｍｙｃのセリン６２のリン酸化に特異的な抗体を用いた、細胞溶解物のウェスタンブロット分析によって検出する。前記結合を統計的に有意な程度に防止するペプチドを遮断ペプチドであると考える。
【００５５】
「保存的な配列変異体」という表現は、本明細書において、アミノ酸配列の修飾により生じる、本発明によるペプチドの結合特性を顕著に改変しない変異体を意味する。そのような修飾は当業者に明らかであり、それらは類似のアミノ酸によるアミノ酸の置換、並びにアミノ酸の欠失及び付加により生じるアミノ酸配列変異体を含む。９個超のアミノ酸、好ましくは１２個超、好ましくは１８個超、又は好ましくは３０個超のアミノ酸を含むペプチドなどの、本発明による、より長いペプチドに関して、本発明は、上述のポリペプチドと少なくとも９０％の同一性、又は少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性を有するものを含む。
【００５６】
医薬品として用いる場合、本発明による遮断ペプチドは、静脈内投与、腹腔内投与、及び髄腔内投与などの任意の適切な方法によって投与し得る。一実施形態では、遮断ペプチドは、当技術分野で既知の、細胞膜を越えて融合タンパク質を運ぶ細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）に融合される。そのような融合ペプチドは、例えば静脈内投与、腹腔内投与、及び髄腔内投与によって投与し得る。当業者には、そのような本発明による遮断ペプチド及び融合ペプチドを、技術が進歩するに従って、あらゆる他の適切な投与方法又は投与経路によって投与し得るということが自明であろう。
【００５７】
ＨＮＳＣＣ、結腸癌、及び乳癌などのヒト癌組織においてＫＩＡＡ１５２４が過剰発現しているという先の発見に加え、ＫＩＡＡ１５２４の発現レベルが腫瘍悪性度に相関するということを見出した。例えば、乳癌の悪性のサブタイプは、良性のサブタイプよりも統計上有意に多くのＫＩＡＡ１５２４を発現した。さらに、腫瘍悪性度が高い結腸癌は悪性度の低い結腸癌よりも統計上有意に多くのＫＩＡＡ１５２４を発現した。
【００５８】
本発明はまた、癌又は過剰増殖性疾患を診断する方法にも関し、その方法は、
ｉ）ＲＴ−ＰＣＲ又はハイブリダイゼーション技術によって、前記組織又は体液からＫＩＡＡ１５２４のｍＲＮＡの発現を決定し、或いは
ｉｉ）タンパク質ＫＩＡＡ１５２４を含むと予想される組織若しくは体液を、前記ＫＩＡＡ１５２４を認識する抗体にさらし、前記抗体を検出及び／若しくは定量し、又は前記組織若しくは体液をプロテオミクス技術による分析にかけることにより、組織又は体液におけるＫＩＡＡ１５２４タンパク質のレベルを検出又は定量することに基づく。
【００５９】
ハイブリダイゼーション技術には、例えばＤＮＡハイブリダイゼーション及びノーザンブロットが含まれる。抗体の検出又は定量は、標識結合免疫吸着アッセイ、ウェスタンブロット、及び免疫組織化学法などの標準的な免疫アッセイ手順によって実施することができる。
【００６０】
本発明はまた、ハイブリダイゼーション技術、又はＤＮＡ若しくはＲＮＡの配列決定、又はＲＮＡ若しくはＤＮＡのＲＴ−ＰＣＲ分析による、ＫＩＡＡ１５２４遺伝子における突然変異又は一塩基多型の検出又は定量に基づいて癌又は過剰増殖性疾患を診断する方法に関する。
【００６１】
診断は、ＫＩＡＡ１５２４のみによって、又は他のタンパク質若しくは遺伝子と組み合わせたＫＩＡＡ１５２４で実施し得る。
【００６２】
より具体的には、本発明は、癌に罹患している疑いのある哺乳動物において悪性転化の浸潤性を決定する方法に関し、前記方法は、ａ）前記哺乳動物から得られた、悪性細胞を含む疑いのある試料におけるＫＩＡＡ１５２４の発現レベルを評価するステップと、ｂ）ステップａ）の発現レベルを、非悪性の対照試料におけるＫＩＡＡ１５２４の発現レベルと比較するステップと、ｃ）前記試料におけるＫＩＡＡ１５２４の発現レベルが非悪性の対照試料におけるＫＩＡＡ１５２４の発現レベルよりも顕著に高い場合に、前記悪性転化を浸潤性であると決定するステップとを含む。好ましくは、前記試料におけるＫＩＡＡ１５２４の発現レベルは、前記対照試料よりも２倍超、好ましくは３倍超高い。
【００６３】
本発明による一実施形態では、上記の方法を用いて、ステップｃ）でＫＩＡＡ１５２４の発現レベルが非悪性の対照試料又は非浸潤性の悪性度Ｉ及びＩＩの試料におけるＫＩＡＡ１５２４の発現レベルよりも顕著に高い場合に、悪性転化の悪性度を悪性度ＩＩＩ又はＩＶと決定することにより、結腸癌などの癌に罹患している疑いのある哺乳動物において悪性転化の悪性度を決定する。さらに、本発明は、前記発現レベルが悪性度ＩＩ又は非悪性の対照試料よりも２倍超、好ましくは３倍超高い場合に、浸潤性で転移性の悪性度ＩＩＩ及びＩＶを非浸潤性で非転移性の悪性度ＩＩから区別する方法を提供する。
【００６４】
本発明によるさらなる実施形態では、上記の方法を用いて、ＫＩＡＡ１５２４の発現レベルが非悪性の対照試料よりも２倍超、好ましくは３倍超高い場合に、浸潤性の腺管癌（ＩＤＣ）、浸潤性の小葉癌（ＩＬＣ）、及び腺管面疱癌を伴うＩＤＣ（ＩＤＣ＋ＩＣＣ）などの浸潤性の腫瘍型の乳癌を粘液性癌から区別する。
【００６５】
本発明は以下の非限定的な実験の項によって明らかにされよう。
【実施例】
【００６６】
実験の項
結果
ＫＩＡＡ１５２４の同定
ＨＴ−１０８０細胞からＰＰ２Ａ相互作用タンパク質を同定するために、ＰＰ２Ａ複合体の足場サブユニットであるＴＡＰタグ付けされたＰＲ６５タンパク質を安定して過剰発現する細胞クローンを生成した（図１Ａ）。偽のトランスフェクションを行った対照又はＰＲ６５ＴＡＰ発現細胞の細胞質抽出物のＴＡＰ精製により、ＰＲ６５ＴＡＰと共精製するが対照細胞の最終溶出物には存在しない、いくつかのタンパク質が明らかになった（図１Ｂ）。その後、これらの推定ＰＲ６５相互作用タンパク質のいくつかを、質量分析によるペプチド配列決定により同定した。ＰＲ６５ＴＡＰ複合体から同定されるタンパク質には触媒性サブユニット（ＰＰ２Ａｃ）及びＰＰ２ＡのＢサブユニットの両方が含まれ、これによりアプローチが検証される（図１Ｂ）。加えて、ＫＩＡＡ１５２４を新規な推定ＰＰ２Ａ関連タンパク質であると同定することができた。ＫＩＡＡ１５２４は、いずれの細胞機能もこれまでに同定されていない、９０ｋＤＡの細胞質タンパク質である（図２）（Ｓｏｏ Ｈｏｏら、２００２年）。以下に示す結果により、ＫＩＡＡ１５２４は、癌において特異的に上方調節される、ＰＰ２Ａの内因性阻害剤であると同定される。
【００６７】
ＰＲ６５の免疫共沈降分析の結果により、内因性のＫＩＡＡ１５２４が内因性のＰＲ６５及びＰＰ２Ａｃと相互作用することが示される（図１Ｃ）。ＫＩＡＡ１５２４とＰＰ２Ａ複合体との間のタンパク質−タンパク質相互作用に介在するＫＩＡＡ１５２４の領域を同定するために、ＫＩＡＡ１５２４欠失突然変異体をコードする一連のｃＤＮＡ構築物を構築した。この目的のために、一連のＦｌａｇタグ付けされたＫＩＡＡ１５２４欠失構築物をＨｅＬａ細胞内に４８時間、一過性にトランスフェクトし、その後、抗Ｆｌａｇ抗体との免疫沈降を行った。ＫＩＡＡ１５２４突然変異体とＰＰ２Ａ複合体との間の相互作用を、ＰＲ６５サブユニットのウェスタンブロット分析により評価した。Ｆｌａｇ−ＫＩＡＡ１５２４野生型（ＫＩＡＡ１５２４ｗｔ）（図２Ａ）構築物の免疫沈降により、内因性のＰＲ６５タンパク質との明らかな相互作用が示された（図１Ｄ及び３Ａ）。相互作用は、低い（１５０ｍＭのＮａＣｌ）又は中程度（３００ｍＭのＮａＣｌ）の両方のストリンジェンシー条件下において生じた。しかし、４６１〜５３３の間のアミノ酸を欠いているＫＩＡＡ１５２４の突然変異体（ＫＩＡＡ１５２４ｍｕｔ）（図２Ａ）では、ＰＲ６５との相互作用が大きく減少した（図１Ｄ及び３Ａ）。ＫＩＡＡ１５２４ｍｕｔは、１１個の欠失突然変異体のうち、両方のストリンジェンシー条件下においてＰＲ６５に対する結合の低下を示した唯一の突然変異体であった。
【００６８】
次に、ＫＩＡＡ１５２４ｗｔ構築物又はＫＩＡＡ１５２４ｍｕｔ構築物のいずれかとＨＡ−ＰＰ２Ａｃを同時トランスフェクトした細胞の、ＰＰ２ＡｃとＫＩＡＡ１５２４との同時局在を研究した。図１Ｅに示すように、トランスフェクトした細胞の共焦点画像分析によりＰＰ２ＡｃとＫＩＡＡ１５２４ｗｔとの同時局在が明らかになったが、一方、ＰＰ２ＡｃとＫＩＡＡ１５２４ｍｕｔとでは同時局在は見られなかった（図１Ｅ）。ＰＰ２Ａの機能の調節におけるＫＩＡＡ１５２４の役割を研究するために、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）オリゴを用いてＨｅＬａ細胞におけるＫＩＡＡ１５２４の発現を阻害した。重要なことに、ｓｉＲＮＡによるＫＩＡＡ１５２４の発現の減少により、ＰＰ２Ａｃの免疫沈降物で測定されたように、ＰＰ２Ａのホスファターゼ活性が刺激された（図１Ｆ）。これらの結果を総合すると、ＫＩＡＡ１５２４が培養細胞においてＰＰ２Ａ複合体と相互作用し、その触媒活性を阻害するということが示される。さらに、データは、相互作用が中程度のイオン強度で安定であること、及びＫＩＡＡ１５２４のアミノ酸４６１〜５３３がＫＩＡＡ１５２４のＰＰ２Ａ相互作用ドメインを含むことを示す。
【００６９】
ＫＩＡＡ１５２４はｃ−Ｍｙｃタンパク質の安定性を高める
ＫＩＡＡ１５２４の特徴付けされていない細胞機能を明らかにするために、スクランブルｓｉＲＮＡ及びＫＩＡＡ１５２４のｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたＨｅＬａ細胞のゲノム規模での遺伝子発現プロフィールを７２時間後に比較した。注目すべきことに、Ｓｅｎｔｒｉｘ（登録商標）Ｈｕｍａｎ−６ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ＢｅａｄＣｈｉｐ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｉｎｃ．）内に含まれる遺伝子の少数の画分（２６０９１のうち７６）のみが、スクランブルｓｉＲＮＡをトランスフェクトした細胞及びＫＩＡＡ１５２４のｓｉＲＮＡをトランスフェクトした細胞の間で、再現性があり統計的に有意な（ｐ＜０．０５、データは示していない）発現レベルの違いを示した（図１Ｆ）。ＰＰ２Ａの活性は形質転換に関与する２つの転写因子、ｐ５３及びｃ−Ｍｙｃの活性を調節すると示されている。ＫＩＡＡ１５２４が減少した細胞の転写プロフィールに関してこれらの２つの転写因子を特徴付けるために、ＫＩＡＡ１５２４の減少に影響される７６個の遺伝子のリストを、ｐ５３及びｃ−Ｍｙｃについて発行された標的遺伝子のデータベースと比較した。ｐ５３標的遺伝子のデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｐ５３．ｂｉｉ．ａ−ｓｔａｒ．ｅｄｕ．ｓｇ／ａｂｏｕｔｐ５３／ｔａｒｇｅｔｇｅｎｅ／ｉｎｄｅｘ．ｐｈｐ）に基づくと、ＫＩＡＡ１５２４の減少に影響を受ける７６個の遺伝子のうち１つのみが、そのプロモーター内にｐ５３結合部位を有するか又はｐ５３に転写調節されると公表されている。しかし、ｃ−Ｍｙｃ標的遺伝子のデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｙｃ−ｃａｎｃｅｒ−ｇｅｎｅ．ｏｒｇ／ｓｉｔｅ／ｍｙｃＴａｒｇｅｔＤＢ．ａｓｐ）と比較すると、ＫＩＡＡ１５２４の減少に影響を受ける遺伝子の１６％（１２／７６）がそれらのプロモーター領域においてｃ−Ｍｙｃを結合することが見出された。これらの所見は、公表されている、ｃ−Ｍｙｃタンパク質の安定性を調節するＰＰ２Ａの役割と共に、ＫＩＡＡ１５２４がｃ−Ｍｙｃの機能を調節し得るということを示唆している。
【００７０】
上述したように、ウイルススモールｔ抗原は、ｃ−Ｍｙｃのセリン６２をＰＰ２Ａ介在性の脱リン酸化から保護することにより、ｃ−Ｍｙｃタンパク質を安定化させる。ＫＩＡＡ１５２４の減少がｃ−Ｍｙｃの発現を調節するかどうかを研究するために、ＫＩＡＡ１５２４のｓｉＲＮＡ又はスクランブルｓｉＲＮＡ（Ｓｃｒ．）でトランスフェクトした細胞で、ウェスタンブロットによりｃ−Ｍｙｃの定常的なタンパク質レベルを試験した。ＫＩＡＡ１５２４のｓｉＲＮＡでの処理によりｃ−Ｍｙｃタンパク質の発現が明らかに下方調節されたが、一方、ｃ−ＭｙｃのｍＲＮＡの発現レベルは同一の試料において変化しなかった（図４Ａ及び４Ｂ）。このことは、ＫＩＡＡ１５２４が転写後にｃ−Ｍｙｃタンパク質のレベルを調節することを意味する。実際、内因性のｃ−Ｍｙｃタンパク質の半減期に対するＫＩＡＡ１５２４の減少の影響を分析すると、スクランブルｓｉＲＮＡをトランスフェクトした細胞ではシクロヘキシミド処理（１００ｍｇ／ｍｌ）の１時間後におよそ４０％のｃ−Ｍｙｃタンパク質が細胞内に存在したのに対し、ＫＩＡＡ１５２４が減少するとｃ−Ｍｙｃタンパク質の安定性は顕著に低下した。
【００７１】
ＫＩＡＡ１５２４はｃ−Ｍｙｃ関連ＰＰ２Ａ活性を阻害する
上記の結果は、ＫＩＡＡ１５２４がＰＰ２Ａ複合体と相互作用し、ｃ−Ｍｙｃの安定性を高めることを示す。ＫＩＡＡ１５２４がｃ−Ｍｙｃ関連ＰＰ２Ａ活性を実際に阻害するかどうかを研究するために、スクランブルｓｉＲＮＡ及びＫＩＡＡ１５２４のｓｉＲＮＡをトランスフェクトした細胞のｃ−Ｍｙｃの免疫沈降物を、基質として６，８−ジフルオロ−４−メチルウンベリフェリルホスフェートを用いる（Ｐａｓｔｕｌａら、２００３年）、インビトロでのＰＰ２Ａアッセイにかけた。重要なことに、ｓｉＲＮＡによるＫＩＡＡ１５２４の減少により、ｃ−Ｍｙｃ免疫沈降物におけるＰＰ２Ａ活性が顕著に増加した（図４Ｃ）。興味深いことに、免疫沈降物の分析により、ＰＰ２Ａｃ及びｃ−Ｍｙｃが構成的に互いに複合していること、及びＫＩＡＡ１５２４の減少がｃ−Ｍｙｃ−ＰＰ２Ａｃの相互作用に影響を与えないことがさらに明らかになった（図４Ｄ）。総合すると、これらの結果は、ＫＩＡＡ１５２４がｃ−Ｍｙｃ−ＰＰ２Ａ複合体におけるＰＰ２Ａの活性を阻害し、ｃ−Ｍｙｃのタンパク質分解を防止することを示している。
【００７２】
細胞抽出物のｃ−Ｍｙｃ及びＫＩＡＡ１５２４の免疫共沈降により、これらのタンパク質の間の物理的関連が示されたが（図４Ｄ）、ＫＩＡＡ１５２４とｃ−Ｍｙｃとの間の相互作用が直接的なものであるかどうかは明らかにされていない。ｃ−ＭｙｃとのＫＩＡＡ１５２４の相互作用をさらに特徴付けるため、インビトロでのタンパク質−タンパク質相互作用アッセイにおいて、精製されたＦｌａｇ−ＫＩＡＡ１５２４タンパク質を、ｃ−Ｍｙｃの組換えＧＳＴ融合アミノ末端部分（アミノ酸１〜２６２）と共に用いた。Ｆｌａｇ抗体樹脂は組換えＦｌａｇ−ＫＩＡＡ１５２４とＧＳＴ−Ｍｙｃとを免疫共沈降させるが、一方、Ｆｌａｇ−ＫＩＡＡ１５２４はＧＳＴのみとは免疫共沈降しないということが見出され（図５Ａ）、このことは、ＫＩＡＡ１５２４がｃ−Ｍｙｃのアミノ末端に直接結合することを示している。興味深いことに、ＫＩＡＡ１５２４は、アミノ酸１〜１２０に対応するＧＳＴ−ｃ−Ｍｙｃ欠失体とは免疫共沈降しなかった（図５Ａ）。これらの結果は、ｃ−ＭｙｃのＫＩＡＡ１５２４相互作用ドメインがｃ−Ｍｙｃ上のアミノ酸１２０〜２６２の間にあることを示している（図５Ｂ）。
【００７３】
これらの実験を総合すると、ｃ−Ｍｙｃ関連ＰＰ２Ａ活性をＫＩＡＡ１５２４が阻害することの確かな生化学的証拠が得られる。さらに、ｃ−Ｍｙｃのアミノ末端に対するＫＩＡＡ１５２４の直接的な結合により、ｃ−Ｍｙｃ関連ＰＰ２Ａ活性に対するＫＩＡＡ１５２４の観察された選択性についての最もふさわしい説明が得られる。
【００７４】
ＫＩＡＡ１５２４は腫瘍の成長に必要である
癌細胞の挙動の調節におけるＫＩＡＡ１５２４の役割を研究するために、ＨｅＬａ細胞をＫＩＡＡ１５２４のｓｉＲＮＡでトランスフェクトし、細胞培養物及びインビボでのマウスモデルの両方において細胞増殖を研究した。次に、細胞増殖の調節におけるＫＩＡＡ１５２４の役割を、ＨｅＬａ細胞におけるチミジン組み込みアッセイによって分析した。スクランブルｓｉＲＮＡをトランスフェクトした細胞と比較して、ＫＩＡＡ１５２４の減少により、トランスフェクションの７２時間後の細胞増殖が顕著に阻害された（図６Ａ）。しかし、ＫＩＡＡ１５２４のｓｉＲＮＡのトランスフェクションは、細胞ＤＮＡ含有量のＦＡＣＳ分析においてサブＧ１画分を誘導せず（図６Ｂ）、またＰＡＲＰタンパク質の切断も誘導せず（図６Ｃ）、このことは、ＫＩＡＡ１５２４の減少がプログラム細胞死を誘導しないことを示している。
【００７５】
ＨｅＬａ細胞の腫瘍形成能に対するＫＩＡＡ１５２４の寄与を評価するために、単層上の高密度の増殖巣を形成するこれらの細胞の能力に対する、及び足場に依存せずに成長するそれらの能力に対する、ＫＩＡＡ１５２４の減少の影響を分析した。この目的のために、まず、トランスフェクションの１０日後にｓｉＲＮＡを１回トランスフェクトすることによりＫＩＡＡ１５２４の減少の効率を研究し、ＫＩＡＡ１５２４タンパク質の発現のおよそ５０％が１０日後にも依然として減少することを見出した。ＫＩＡＡ１５２４の減少により、トランスフェクションの１０日後のＨｅＬａ細胞の増殖巣の形成はなくなり（図６Ｄ）、また、細胞を寒天上に播種した１０日後に測定されたように、寒天上でのＨｅＬａ細胞の足場非依存性の成長が明らかに阻害された（図６Ｅ）。
【００７６】
インビボにおけるＫＩＡＡ１５２４の腫瘍形成の役割を評価するために、ＫＩＡＡ１５２４のｓｉＲＮＡ又はスクランブルｓｉＲＮＡで７２時間トランスフェクトしたＨｅＬａ細胞を無胸腺マウスに皮下投与し、触知可能な腫瘍のサイズを測定することにより腫瘍の成長を観察した。重要なことに、ｓｉＲＮＡによるＫＩＡＡ１５２４の減少により全ての腫瘍のサイズが減少し（図６Ｆ）、２７日目の腫瘍重量が顕著に阻害された（図６Ｇ）。
【００７７】
総合すると、これらのデータは、ＫＩＡＡ１５２４の発現が、形質転換された細胞の表現型の維持の新規なメカニズムであること、及びＫＩＡＡ１５２４がインビボで腫瘍の成長を促進することを示す。
【００７８】
ＫＩＡＡ１５２４はヒトの悪性腫瘍において過剰発現する
上記に示した結果により、ＫＩＡＡ１５２４がＰＰ２Ａ介在性のｃ−Ｍｙｃの分解を阻害し、癌細胞の成長及び増殖を促進することについての証拠が得られる。これらの特徴に基づいて、ＫＩＡＡ１５２４は癌治療のための新規な薬物標的となり得る。癌治療におけるタンパク質標的への期待を満たすためには、ＫＩＡＡ１５２４はヒト癌組織において過剰発現することが好ましい。本発明者による定量ＲＴ−ＰＣＲ分析によると、ＫＩＡＡ１５２４のｍＲＮＡは、骨髄、前立腺、睾丸、小脳、及び大脳以外の２１の非悪性試料の大部分において非常に低いレベル（β−アクチンのｍＲＮＡの発現レベルの１％未満）で発現した（図７Ａ）。非悪性細胞と悪性細胞との間でＫＩＡＡ１５２４のタンパク質レベルを比較するために、異なる細胞型の全細胞溶解物をＫＩＡＡ１５２４について免疫ブロットした。図７Ａと一致して、非常に低いレベルのＫＩＡＡ１５２４タンパク質がヒト表皮角化細胞（ＨＥＫ）、非腫瘍形成性ＭＥＦ、及び不死化ＮＩＨ３Ｔ３マウス線維芽細胞において検出された。しかし、ＫＩＡＡ１５２４タンパク質はＨｅＬａ細胞及びＨＴ−１０８０線維肉腫細胞の両方において高いレベルで発現し、このことは、ＫＩＡＡ１５２４の発現が細胞の腫瘍形成能と相関し得ることを示している。
【００７９】
さらに、ヒトの頭頚部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）におけるＫＩＡＡ１５２４の発現レベルを分析した。ＫＩＡＡ１５２４のｍＲＮＡのリアルタイムＰＣＲ分析により、対照として用いた正常なヒト表皮角化細胞と比較して、３６のＨＮＳＣＣ細胞系におけるＫＩＡＡ１５２４の統計的に有意な過剰発現が示された（図７Ｂ）。ＫＩＡＡ１５２４のｍＲＮＡはまた、ＨＮＳＣＣの腫瘍生検において、体の同一領域に由来する良性の対照組織よりも過剰発現した（図７Ｃ）。重要なことに、ＨＮＳＣＣ試料の免疫組織化学的染色により、周囲の間質細胞と比較して腫瘍細胞においてＫＩＡＡ１５２４がより高く発現することも確認された（図７Ｄ）。
【００８０】
最後に、ＨＮＳＣＣに由来する原発癌細胞系においてもＫＩＡＡ１５２４がｃ−Ｍｙｃタンパク質のレベルを調節するかどうかを研究するため、３つの異なるＨＮＳＣＣ細胞系をＫＩＡＡ１５２４のｓｉＲＮＡでトランスフェクトし、ウェスタンブロッティングによってｃ−Ｍｙｃの発現について分析した。図７Ｅに示すように、ＫＩＡＡ１５２４の減少により、調べた全ての細胞系においてｃ−Ｍｙｃタンパク質のレベルが明らかに下方調節された。重要なことに、ｃ−Ｍｙｃの免疫沈降物の分析の結果、ＫＩＡＡ１５２４の減少によりＨＮＳＣＣ細胞系におけるｃ−Ｍｙｃ関連ＰＰ２Ａホスファターゼ活性の上昇も生じることが明らかになった。
【００８１】
ＨＮＳＣＣ細胞の増殖の調節におけるＫＩＡＡ１５２４の役割を調べるために、ＵＴ−ＳＣＣ−７細胞系及びＵＴ−ＳＣＣ−９細胞系にＫＩＡＡ１５２４のｓｉＲＮＡのトランスフェクションを施し、これらの細胞系の高密度の増殖巣の形成を１０日間観察した。両方の細胞系において、ＫＩＡＡ１５２４の減少により増殖巣の形成が顕著に減少した。重要なことに、ＫＩＡＡ１５２４の減少により、トランスフェクションの２１日後の、軟寒天におけるＵＴ−ＳＣＣ−７細胞及びＵＴ−ＳＣＣ−９細胞の両方の足場非依存性の成長もまた顕著に減少した。ＨｅＬａ細胞において示されたＫＩＡＡ１５２４のｓｉＲＮＡの特異性と一致して、ＫＩＡＡ１５２４の２つの個別のｓｉＲＮＡにより軟寒天においてＵＴ−ＳＣＣ−９細胞が同様に阻害された。
【００８２】
最後に、ＵＴ−ＳＣＣ細胞のインビボでの腫瘍の成長に対するＫＩＡＡ１５２４の役割を評価するために、ＫＩＡＡ１５２４のｓｉＲＮＡ又はスクランブルｓｉＲＮＡでトランスフェクトしたＵＴ−ＳＣＣ−７細胞及びＵＴ−ＳＣＣ−９細胞の両方をＳＣＩＤマウスの背部に投与した。この作業において示される、悪性細胞の成長及び腫瘍の進行に対するＫＩＡＡ１５２４の重要性を示す全ての他のデータと一致して、ＫＩＡＡ１５２４のｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたＵＴ−ＳＣＣ−７細胞及びＵＴ−ＳＣＣ−９細胞を投与したマウスの、それぞれ５頭のうち３頭のみ、及び６頭のうち２頭のみが、実験の終了である６５日目に触知可能な腫瘍を発現した。さらに、ＫＩＡＡ１５２４のｓｉＲＮＡにより、スクランブルｓｉＲＮＡをトランスフェクトした細胞と比較して、両方のＵＴ−ＳＣＣ細胞で腫瘍の平均サイズが減少した。
【００８３】
上記の結果がＨＮＳＣＣに限定されていることを確認するために、４３個のヒト結腸癌試料及び正常な結腸由来の５つの対照試料で、ＫＩＡＡ１５２４の発現をＲＴ−ＰＣＲによって分析した。ＨＮＳＣＣのデータと一致して、ＫＩＡＡ１５２４のｍＲＮＡは、対照組織と比較して、ヒト結腸癌組織において顕著に過剰発現した（図８Ａ）。
【００８４】
さらに、結腸癌の腫瘍悪性度に対するＫＩＡＡ１５２４のｍＲＮＡの発現を比較したところ、ＫＩＡＡ１５２４の発現が、非浸潤性の悪性度ＩＩの腫瘍又は対照の結腸組織と比較して、浸潤性の悪性度ＩＩＩ及び悪性度ＩＶの腫瘍において顕著に高いということが明らかになった（図８Ｂ）。分析に用いた組織試料の腫瘍悪性度は、標準的な病理学的基準によってあらかじめ決定されている。
【００８５】
ＫＩＡＡ１５２４が過剰発現しているかどうかを研究するために、ＨＮＳＣＣ及び結腸癌に加えて、乳癌の試料においても、以前に特徴付けられた１５９個のヒト乳腺腫瘍及び正常な乳房の試料（Ｃｏｍｅら、２００６年）においてＫＩＡＡ１５２４の発現を評価した。重要なことに、ＫＩＡＡ１５２４が、正常な組織と比較して、ヒト乳腺腫瘍において顕著に過剰発現することが見出された（図９Ａ）。乳癌のサブタイプの間でＫＩＡＡ１５２４の発現を比較すると、ＫＩＡＡ１５２４の過剰発現は３つの浸潤性の乳腺癌のサブタイプの全て、すなわち浸潤性の腺管癌（ＩＤＣ）、浸潤性の小葉癌（ＩＬＣ）、及び腺管面疱癌を伴うＩＤＣ（ＩＤＣ＋ＩＣＣ）において見られた（図９Ｂ）。対照として、予後良好な乳腺腫瘍である粘液性癌が、浸潤性の腫瘍より統計的に低い、正常な乳房と同様のＫＩＡＡ１５２４のｍＲＮＡの発現を示した（図９Ｂ）。
【００８６】
総合すると、この結果により、ＫＩＡＡ１５２４が腫瘍の成長及び癌細胞の増殖を促進することが示され、ｃ−Ｍｙｃ関連ＰＰ２Ａ活性の抑制が、ＫＩＡＡ１５２４にその細胞効果を発揮させる分子メカニズムの少なくとも１つであることが強く示される。
【００８７】
材料及び方法
抗体
ＫＩＡＡ１５２４に対するウサギポリクローナル抗体が公表されている（Ｓｏｏ Ｈｏｏら、２００２年）（フロリダ大学のＣｈａｎ博士により提供していただいた）。ＰＰ２Ａｃ、ＰＲ６５、Ｆｌａｇ、ＨＡ、ＧＳＴ、ＰＡＲＰ、ｃ−Ｍｙｃ、及びアクチンに対する抗体を、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ｉｎｃ．から入手した。
【００８８】
プラスミド構築物
ＰＲ６５ＴＡＰタグベクターのＰＲ６５αをｐＲＣ／ＣＭＶ．ＨＡ ＰＲ６５ａ（スイス、バーゼル、Ｆｒｉｅｎｄｒｉｃｈ Ｍｉｅｓｃｈｅｒ−ＩｎｓｔｉｔｕｔのＢｒｉａｎ Ａ．Ｈｅｍｍｉｎｇｓ博士から譲っていただいた）からＰＣＲ増幅し、ＸｈｏＩ部位及びＢａｍＨＩ部位を用いてＴＡＰベクターであるＪＷ１６（Ｗｅｓｔｅｒｍａｒｃｋら、２００２年）内にクローニングした。Ｆｌａｇ−ＫＩＡＡ１５２４ｗｔ構築物を、公表されているＫＩＡＡ１５２４の全長ｃＤＮＡ（Ｓｏｏ Ｈｏｏら、２００２年）（フロリダ大学のＣｈａｎ博士により提供していただいた）からＰＣＲで構築した。Ｆｌａｇ−ＫＩＡＡ１５２４ｍｕｔのｃＤＮＡ構築物を、５−Ｔｔａａｔａｇａｇａａａｃｔｔｃａｇｔｃｔｇｇａａｔｇ（配列番号８０）及び５−Ｇｔｇｇｔａａａｇｇａｔｃａｇａｔｔｔｇｔｇａｔｇｔｇａｇａ（配列番号８１）のオリゴを用いてプラスミドＦｌａｇ−ＫＩＡＡ１５２４ｗｔからＰＣＲで構築した。その後、全てのクローンをＤＮＡの配列決定により検証した。
【００８９】
患者の試料
インフォームドコンセントの後、Ｔｕｒｋｕ大学中央病院において１９９０年から２００２年の間にＨＮＳＣＣから手術によって除去された腫瘍から、腫瘍試料を集めた。ＨＮＳＣＣの研究のために、正常な試料を口蓋垂軟口蓋咽頭形成術を受けている患者から集めた。試料は２９歳から８７歳までの男女から集めた。
【００９０】
結腸癌及び正常な結腸組織におけるＫＩＡＡ１５２４の発現を、結腸癌の４３個の試料（３１歳から９３歳までの男女）及び正常な結腸組織の５つの試料（３７歳から９１歳までの男女）を含むＴｉｓｓｕｅＳｃａｎリアルタイム結腸癌（ＨＣＲＴ１０１）ｃＤＮＡパネル（Ｏｒｉｇｅｎｅ）を用いることで調べた。２１の異なる正常なヒト組織から抽出された全ＲＮＡをＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、カナダ）から入手し、かつ、フィンランドのＴｕｒｋｕ大学のＫｌａｕｓ Ｅｌｅｎｉｕｓ教授から譲っていただいた。試料は１人の患者からのＲＮＡ抽出（小脳、大脳、心臓、肝臓、及び肺）又は２から８４人の患者のプールされたＲＮＡの抽出（副腎、骨髄、腎臓、胎盤、前立腺、唾液腺、骨格筋、脾臓、胸腺、甲状腺、気管、子宮、結腸、小腸、及び乳腺）のいずれかからなるものであった。
【００９１】
乳癌及び正常な乳腺組織におけるＫＩＡＡ１５２４の発現を、先に記載した組織試料（Ｃｏｍｅら、２００６年）を用いて調べた。
【００９２】
細胞培養
ヒトＳＣＣ細胞系を、頭頚部ＳＣＣの原発腫瘍（ＵＴ−ＳＣＣ−８）、再発腫瘍、又は転移（ＵＴ−ＳＣＣ−７、ＵＴ−ＳＣＣ−９）から確立した。６ｎｍｏｌ／ｌのグルタミン、非必須アミノ酸、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００ｍｇのストレプトマイシン、及び１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を補ったＤＭＥＭにおいて、ＳＣＣ細胞を培養した。正常なヒト表皮角化細胞を、ＳｉｎｇｌｅＱｕｏｔｓ（登録商標）（Ｃａｍｂｒｅｘ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、米国メリーランド州）を補ったケラチノサイト基礎培地（Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ）２（ＫＢＭ（登録商標）−２）において培養した。ＨＴ−１０８０、ＨｅＬａ、及びＨＫ２９３を含む全ての他の細胞系を、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００ｍｇのストレプトマイシン、及び１０％ＦＣＳを補ったＤＭＥＭにおいて培養した。
【００９３】
一過性トランスフェクション及びｓｉＲＮＡ処理
ＦｕＧｅｎｅ６トランスフェクション試薬（Ｒｏｃｈｅ）を製造者の指示に従って用いて、サブコンフルエントな細胞を一過性にトランスフェクトした。ｓｉＲＮＡ処理のために、細胞を８０％のコンフルエンスまで成長させ、培地を、何も補っていないＤＭＥＭで置き換えた。二本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチド（スクランブル：５’−ＵＡＡＣＡＡＵＧＡＧＡＧＣＡＣＧＧＣＴＴ−３’（配列番号８２）及び５’−ＣＣＵＡＣＡＵＣＣＣＧＡＵＣＧＡＵＧＡＵＧＴＴ−３’（配列番号８３）、ＫＩＡＡ１５２４：５’−ＣＵＧＵＧＧＵＵＧＵＧＵＵＵＧＣＡＣＵＴＴ−３’（配列番号８４）及び５’−ＡＣＣＡＵＵＧＡＵＡＵＣＣＵＵＡＧＡＡＴＴ−３’（配列番号６）、ＩＢＡ）をＯｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で調製し、細胞に加えた。４〜６時間のインキュベーションの後、培地を１０％ＦＣＳに平衡させ、ｓｉＲＮＡ処理を適切な長さの時間まで延長した。
【００９４】
ＲＮＡの単離及びｃＤＮＡの合成
ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造者の手順に従って用いて、培養細胞から全ＲＮＡを抽出した。臨床腫瘍試料から、酸性グアニジウム−チオシアネート−フェノール−クロロホルム法を用いてＲＮＡを抽出した。可能性のある汚染ＤＮＡを排除するため、ＲＮＡ試料を５単位のＤＮアーゼＩ（Ｒｏｃｈｅ）で処理した。鋳型としての１μｇの全ＲＮＡ、０．５μｇのランダムヘキサマー、及び２００単位のモロニーマウス白血病ウイルスＲＮアーゼＨマイナス逆転写酵素（どちらもＰｒｏｍｅｇａ、米国ウィスコンシン州Ｍａｄｉｓｏｎから入手）を２５μｌの全量に含む反応において、製造者の手順に従ってｃＤＮＡを合成した。
【００９５】
免疫蛍光
ＨＡ−ＰＰ２Ａｃ及びＦｌａｇ−ＫＩＡＡ１５２４のｃＤＮＡ構築物でのトランスフェクションの２４時間後に、ガラスカバースリップ上で培養したＨｅＬａ細胞を透過処理し、ＰＴＥＭＦ（１００ｍＭのＰｉｐｅｓ（ｐＨ６．８）、１０ｍＭのＥＧＴＡ、１ｍＭのＭｇＣｌ２、０．２％トリトンＸ−１００、及び４％ホルムアルデヒド）において１０分間固定した。ＰＢＳで３回洗浄した後、非特異的抗体の結合を、ＰＢＳにおける３％のＢＳＡで３０分間遮断した。その後カバースリップをＨＡ及びＦｌａｇタグ特異的抗体と、ＰＢＳにおける２％のＢＳＡ内で室温で１時間インキュベートした。３回洗浄した後、結合した抗体を、Ｃｙ３及びＣｙ２と結合した二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）と室温で１時間インキュベートすることで可視化した。ＰＢＳで３回洗浄した後、カバースリップを５０％グリセロール、ＰＢＳ、及び２％ｗ／ｖのＤＡＢＣＯ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）内に置いた。同時局在の分析のために、共焦点レーザー走査顕微鏡（ＬＳＭ５１０、Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ Ｉｎｃ．）を用いて画像を得た。
【００９６】
免疫沈降及びホスファターゼアッセイ
プロテインＧ−セファロースビーズを、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．５）、３００ｍＭのＮａＣｌ、０．２５ｍＭのＥＧＴＡ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．２５％ＮＰ−４０、プロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ）、１０ｍＭのｂ−グリセロリン酸、及び０．５ｍＭのＤＴＴ内において、ＰＲ６５、ＰＰ２Ａｃ、ｃ−Ｍｙｃ抗体、又は対照の免疫前血清と、４℃で２時間、回転機上で撹拌した。Ｆｌａｇ−ＫＩＡＡ１５２４突然変異体の免疫沈降を、Ｆｌａｇ抗体樹脂（Ｍ３、Ｓｉｇｍａ）を用いて実施した。その後、沈殿したビーズを細胞溶解物と混合し、４℃で一晩インキュベートした。その後、沈殿したビーズを、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．３％ＮＰ−４０、及び０．５ｍＭのＤＴＴで４回洗浄し、結合したタンパク質を、Ｔｒｕｅブロット二次抗体を用いてウェスタンブロッティングにより分析した。ホスファターゼアッセイのために、免疫複合体をビーズ上に保持し、等量のビーズを加えて、６，８−ジフルオロ−４−メチルウンベリフェリルホスフェート（ＤｉＦＭＵＰ）基質を有するタンパク質セリン／スレオニンホスファターゼアッセイキット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、米国オレゴン州Ｅｕｇｅｎｅ）を製造者の指示に従って用いてホスファターゼアッセイを行った。
【００９７】
ＫＩＡＡ１５２４とｃ−Ｍｙｃとの間の直接的な相互作用を研究するために、バキュロウイルスを用いてＦｌａｇ−ＫＩＡＡ１５２４を昆虫細胞において発現させ、以前に記載されているように（Ｎｏｒｄｌｕｎｄら、２００５年）、均質になるまでＦｌａｇ抗体樹脂（Ｍ３、Ｓｉｇｍａ）によってアフィニティー精製した。相互作用アッセイのために、Ｆｌａｇ−ＫＩＡＡ１５２４タンパク質を、低いｐＨ条件を用いてＦｌａｇ抗体ビーズから溶出した。このＫＩＡＡ１５２４タンパク質の純度及び量を、ＳＤＳ−ｐａｇｅゲル及びクマシー染色により各ステップにおいて分析した。ＫＩＡＡ１５２４調製物において、他の汚染タンパク質は同定されなかった。ＧＳＴタンパク質を細菌により産生し、標準的な手順に従ってアフィニティー精製し、ＧＳＴ−Ｍｙｃ１−２６２をＳａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｉｎｃ．から購入した。抗Ｆｌａｇ Ｍ３樹脂（Ｓｉｇｍａ）に固定化された１μｇのＦｌａｇ−ＫＩＡＡ１５２４を、等モル濃度の量の可溶性ＧＳＴ−ｃ−Ｍｙｃ及びＧＳＴタンパク質と、２０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．４）、０．２ｍＭのＥＤＴＡ、０．１ＭのＮａＣｌ、０．５ｍＭのＤＴＴ、及びコンプリートプロテアーゼインヒビター（Ｒｏｃｈｅ）を含む０．５ｍｌの緩衝液においてインキュベートすることにより、プルダウンアッセイを実施した。ＫＩＡＡ１５２４タンパク質調製物における昆虫のＰＰ２Ａの不在をホスファターゼアッセイによって管理した。抗Ｆｌａｇ Ｍ３樹脂を全ての実験における対照樹脂として用いた。結合したタンパク質を、０．２％ＮＰ−４０を補った結合緩衝液で洗浄し、続いて、試料緩衝液中で煮沸し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて分解し、ＧＳＴ及びＫＩＡＡ１５２４抗体と免疫ブロットした。
【００９８】
定量逆転写ＰＣＲ分析
ｃＤＮＡ試料の定量リアルタイム逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）分析を、Ｐｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓｓソフトウェア（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて設計した特異的プライマー及び蛍光プローブを用いて実施し、ＫＩＡＡ１５２４及びβ−アクチンのｍＲＮＡのレベルを特異的に定量した。プライマー及びプローブの配列を以下に示す。
【００９９】
ＫＩＡＡ１５２４：
プローブ：ａｔｔ ｇｃｔ ｃａｇ ｃａｔ ｃｇｃ ｔｇｔ ｃａａ ａｇａ ａｃｔ ｃａ（配列番号８５）
フォワード：ａａｇ ｃｔｃ ｔａｇ ｃｃｃ ｔｔｇ ｃａｃ ａｇｇ（配列番号８６）
リバース：ｇｔｃ ｃｇｔ ｇｃｃ ｔｃｔ ｇｔｔ ｔｃａ ｇｃ（配列番号８７）
【０１００】
β−アクチン
プローブ：ａｔｇ ｃｃｃ ｔｃｃ ｃｃｃ ａｔｇ ｃｃａ ｔｃｃ ｔｇｃ ｇｔ（配列番号８８）
フォワード：ｔｃａ ｃｃｃ ａｃａ ｃｔｇ ｔｇｃ ｃｃａ ｔｃｔ ａｃｇ ｃ（配列番号８９）
リバース：ｃａｇ ｃｇｇ ａａｃ ｃｇｃ ｔｃａ ｔｔｇ ｃｃａ ａｔｇ ｇ（配列番号９０）
【０１０１】
最終体積が２５μｌの、３００ｎＭのプライマー（Ｍｅｄｐｒｏｂｅ）、２００ｎＭの５’６−ＦＡＭ（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、１２．５μｌのＴａｑＭａｎユニバーサルＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、及び０．５μｌの鋳型ｃＤＮＡを含む溶液において、ＰＣＲを実施した。温度サイクルはＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７７００配列検出器（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で実施した。サイクルは５０℃で２分間及び９５℃で１０分で開始し、続いて９５℃で１５秒及び６０℃で１分を４０サイクル行った。特異的ＰＣＲ産物の蓄積を蛍光の増加としてリアルタイムで検出した。観察された蛍光をサイクル数に対してプロットして増幅プロットを生成し、ＣＴ値を決定、すなわち、蛍光シグナルが蛍光単位に対するＣＴ値０．０５を超えたサイクル数を決定した。ＣＴ値の各決定は２回ずつ行い、同じ試料で同時に２回行ったβ−アクチン発現の測定のＣＴ値で標準化した。２つの平行なＣＴ値の間の範囲は全ての測定において平均の５％未満であった。分析した遺伝子（標的遺伝子）の相対発現を、相対発現＝２−ΔＣＴという式（ここで、ΔＣＴ＝ＣＴ（標的遺伝子）−ＣＴ（β−アクチン））を用いて推定した。標的遺伝子の相対発現を１００倍して、ｍＲＮＡの量をβ−アクチンのｍＲＮＡの量のパーセンテージとして表した。
【０１０２】
軟寒天における成長、増殖巣形成、及びマウスにおける腫瘍形成
増殖巣形成アッセイ及び軟寒天における足場非依存性の成長のために、ＨｅＬａ細胞をトリプシン処理し、ｓｉＲＮＡ処理の４８時間後に１０ｃｍのプレートに細胞４×１０５個にして播種した。軟寒天アッセイを、文献に記載されているように１０％ＦＢＳを含む培地で実施した。９日間のインキュベーションの後、培養物を二重盲検で写真撮影した。生存しているコロニーの形の細胞を顕微鏡画像（倍率×５）で測定した。各画像で見られたコロニーの数及びサイズを、ＮＩＨ（ｈｔｔｐ：／／ｒｓｂ．ｉｎｆｏ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊ／）のＩｍａｇｅＪ １．３３ｕソフトウェアを用いて分析した。足場非依存性コロニーを２００〜１００００ピクセルの間の数に従って分類した。
【０１０３】
ＭＥＦにおける増殖巣形成アッセイのために、６ウェルプレートに、１ウェル当たり、レトロウイルスにより形質導入したＭＥＦの２００個又は５００個の細胞を、フィーダーである８．３×１０５個のＮＩＨ３Ｔ３細胞と共に播種した。細胞を１〜２週間成長させた。メタノール固定した細胞をギムザ染色した。感染細胞１００個当たりの増殖巣の数を計算した。
【０１０４】
マウス実験のために、トランスフェクトした細胞３×１０６個を免疫不全マウスの脇腹に皮下投与した。その後、触診により３日ごとに腫瘍の形成を評価し、触知可能な腫瘍のサイズを精密機器によって測定した。実験は２８日目に終了した。マウスでの全ての実験は、動物管理の制度的なガイドラインに従って行い、フィンランドのＴｕｒｋｕ大学の動物実験審査委員会の許可を得たものである。
【０１０５】
ウェスタンブロット分析
ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動によるタンパク質の分離の後、タンパク質をＩｍｍｏｂｉｌｏ−Ｐ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、米国マサチューセッツ州Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ）に移した。一次抗体及び二次抗体とのインキュベーションの後、免疫ブロットしたタンパク質を高感度化学発光（ＥＣＬ、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって可視化した。
【０１０６】
免疫組織化学
ＫＩＡＡ１５２４の、パラフィン包埋した腫瘍切片及び対照の組織切片の免疫染色を、ＰＢＳに１：１００で希釈したｐ９０抗体（Ｓｏｏ Ｈｏｏら、２００２年）を用いて実施した。免疫染色は、ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）を組み合わせたアビジン−ビオチン−ペルオキシダーゼ複合体法（ＶｅｃｔａＳｔａｉｎ、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ、米国カリフォルニア州Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ）で行い、ヘマトキシリンで対比染色した。
【０１０７】
タンデムアフィニティー精製のための溶解物の調製
ＰＲ６５ＴＡＰタンパク質を安定して発現するＨＴ−１０８０細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、緩衝液Ａ（１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．９）、１０ｍＭのＫＣｌ、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、０．１ｍＭのＥＧＴＡ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、コンプリートプロテアーゼインヒビター、２０ｍＭのｂ−グリセロリン酸、２５ｍＭのＮａＦ、０．５ｍＭのＰＭＳＦ、及び０．５ｍＭのＤＴＴ）内に再懸濁した。細胞を氷上でインキュベートし、ボルテックスし、そしてその後３９００ｒｐｍで３分間遠心分離して細胞質溶解物を得た。次に、ＩｇＧ結合緩衝液（ＩＢＢ：１０ｍＭのＴｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．２％ＮＰ−４０、０．５ｍＭのＤＴＴ）として、同レベルのＮａＣｌとＮＰ−４０とを含むように抽出物を調整した。次に、調整した抽出物を、ＩＢＢで洗浄したＩｇＧセファロース４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を含むＰｏｌｙ−Ｐｒｅｐ（登録商標）クロマトグラフィーカラム（ＢｉｏＲａｄ）上に添加した。抽出物を４℃で４時間インキュベートし、その後１０ｍｌのＩＢＢで３回洗浄した。次に、ビーズをＴＥＶ切断緩衝液（ＴＣＢ：１０ｍＭのＴｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．３％ＮＰ−４０、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、及び０．５ｍＭのＤＴＴ）及び組換えタバコエッチウイルスプロテアーゼ（ＴＥＶ）において、４℃で一晩インキュベートした。カルモジュリンビーズ（Ｓｔａｒｔａｇｅｎｅ）を、Ｐｏｌｙ−Ｐｒｅｐ（登録商標）クロマトグラフィーカラムにおいてカルモジュリン結合緩衝液（ＣＢＢ：１０ｍＭのｂ−メルカプトエタノール、５０ｍＭのＴｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭの酢酸Ｍｇ、１ｍＭのイミダゾール、２ｍＭのＣａＣｌ２、及び０．２％ＮＰ−４０）で洗浄した。次に、ＴＥＶの溶出物をカラムから回収し、カルモジュリンビーズに結合するよう調整した（１ｍｌの各溶出物に対して、１ＭのＣａＣｌ２を４ｍｌ、及びＣＢＢを３ｍｌ）。調整した溶出物を４℃で２時間インキュベートし、その後１０ｍｌのＣＢＢで３回洗浄した。次に、カルモジュリンビーズに結合したタンパク質をカルモジュリン溶出緩衝液（ＣＥＢ：１０ｍＭのｂ−メルカプトエタノール、１０ｍＭのＴｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭの酢酸Ｍｇ、１ｍＭのイミダゾール、５ｍＭのＥＧＴＡ、及び０．２％ＮＰ−４０）で回収するか、又はＳＤＳローディングバッファー内で煮沸して回収した。
【０１０８】
質量分析によるタンパク質の同定
目的のタンパク質バンドをゲルから切り取り、還元し、アルキル化し、以前に記載されているようにトリプシンで一晩消化した。抽出されたペプチドを、ナノフローＨＰＬＣシステム（ＬＣ Ｐａｃｋｉｎｇｓ、米国カリフォルニア州Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ）と組み合わせた、ハイブリッドリニアイオントラップ機器（Ｑ−Ｔｒａｐ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、米国マサチューセッツ州Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ）で、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより特徴付けた。得られたペプチド断片のスペクトルを、包括的で非冗長なタンパク質データベースに対して、Ｍａｓｃｏｔを用いてサーチした。最低３つのマッチしたトリプシンペプチドが各タンパク質の同定に必要であり、必要であれば、手作業での検査により断片の正確なイオンの割り当てを確実にした。
【０１０９】
遺伝子発現分析
スクランブルｓｉＲＮＡ又はＫＩＡＡ１５２４のｓｉＲＮＡのいずれかでのトランスフェクションの７２時間後にＨｅＬａ細胞から抽出された全ＲＮＡを、Ｓｅｎｔｒｉｘ（登録商標）Ｈｕｍａｎ−６ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ＢｅａｄＣｈｉｐアレイ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｉｎｃ．）により、ゲノム規模での遺伝子発現プロフィールについて分析した。ｃＤＮＡの増幅、標識、及びハイブリダイゼーションは、製造者の指示及び標準的な手順に従って、フィンランドＤＮＡマイクロアレイセンター（バイオテクノロジーセンター、Ｔｕｒｋｕ大学及びＡｂｏ Ａｋａｄｅｍｉ大学、Ｔｕｒｋｕ、フィンランド）で行った。アレイから得られたデータを、フィンランド、ＴｕｒｋｕのＴｕｒｋｕ大学及びＡｂｏ Ａｋａｄｅｍｉ大学のバイオテクノロジーセンターに所在のバイオインフォマティクス中央施設で分析した。スクランブルｓｉＲＮＡをトランスフェクトした細胞と比較して、２つの実験の両方において発現レベルが少なくともｌｏｇ０．５変化するという基準に従って、発現がＫＩＡＡ１５２４の減少に応じて顕著に変化した７６個の遺伝子のリストをフィルターした。
【０１１０】
統計の方法
図６Ｇ、８Ａ、８Ｂ、９Ａ、及び９Ｂについては、統計的有意性はマンホイットニーのＵ検定によって決定し、統計分析を有する全ての他の実験については、統計分析はスチューデントｔ検定で行った。
【０１１１】
本発明の方法が、わずか一部のみが本明細書において開示されているにすぎない様々な実施形態の形に組み込まれ得ることは理解されよう。当業者には、他の実施形態が存在し、かつそれが本発明の趣旨に反しないことが明らかであろう。したがって、記載された実施形態は例示的なものであり、制限的であると解釈されるべきではない。
【０１１２】
（参考文献）
【図面の簡単な説明】
【０１１３】
【図１】ＫＩＡＡ１５２４がＰＰ２Ａの内因性阻害剤であることを示す図である。図１Ａ）は、ＰＲ６５足場、ＰＰ２Ａｃ触媒性サブユニット、及び調節性Ｂサブユニットを含む、ＰＰ２Ａ複合体の概略図を示す。ＴＡＰ精製に用いるＰＲ６５タンパク質のＴＡＰ融合体が示されている。図１Ｂ）ＨＴ−１０８０線維肉腫細胞からのＰＲ６５タンパク質複合体のＴＡＰの精製である。ＰＲ６５ＴＡＰ溶出物内のタンパク質を、質量分析によるペプチド配列決定によって同定した。図１Ｃ）ＨｅＬａ細胞の細胞質抽出物の、ＰＲ６５抗体との免疫共沈降分析により、内因性ＫＩＡＡ１５２４、ＰＲ６５、及びＰＰ２Ａｃタンパク質の間の相互作用が明らかになる。ＰＩは免疫前血清であり、インプットはインプット作用物質である。図１Ｄ）ＰＲ６５の結合を欠いたＫＩＡＡ１５２４タンパク質の突然変異体の、免疫共沈降分析による同定である。図１Ｅ）提示した発現構築物でトランスフェクトしたＨｅＬａ細胞を、ＫＩＡ１５２４−ＰＰ２Ａｃの同時局在について共焦点顕微鏡法で分析した。図１Ｆ）ｓｉＲＮＡ介在性の、ＨｅＬａ細胞におけるＫＩＡＡ１５２４タンパク質の発現の減少により、免疫沈降したＰＰ２Ａｃのセリン／スレオニンホスファターゼ活性が増大する。
【図２】ＫＩＡＡ１５２４タンパク質を示す図である。図２Ａ）ＫＩＡＡ１５２４タンパク質の予測上の構造により、いくつかの推定上のタンパク質−タンパク質相互作用ドメインが明らかになる。図１Ｄ及び１Ｅで分析されたＫＩＡＡ１５２４ｍｕｔタンパク質である。図２Ｂ）ＫＩＡＡ１５２４タンパク質のアミノ酸配列である（配列番号１）。
【図３】ＫＩＡＡ１５２４におけるＰＰ２Ａ相互作用ドメインの同定を示す図である。図３Ａ）ＫＩＡＡ１５２４欠失構築物と、ＨｅＬａ細胞溶解物の内因性ＰＲ６５との免疫共沈降。提示したＦｌａｇ−ＫＩＡＡ１５２４タンパク質とＰＰ２Ａ複合体との免疫共沈降を、ＰＲ６５抗体を用いた抗Ｆｌａｇ免疫沈降物のウェスタンブロッティングによって分析した。ＫＩＡＡ１５２４欠失体の免疫沈降効率をＫＩＡＡ１５２４のイムノブロッティングによって確認した。図３Ｂ）ＫＩＡＡ１５２４における推定上のＰＰ２Ａ介在性ドメインの同定。図３Ａにおける結果は、野生型ＫＩＡＡ１５２４はＰＰ２Ａ（ＲＰ６５）と相互作用する一方、４６１〜５３３のドメインが欠失しているＫＩＡＡ１５２４ではＰＰ２Ａとの相互作用が損なわれることを示す。したがって、ＫＩＡＡ１５２４のドメイン４６１〜５３３は、ＫＩＡＡ１５２４とＰＰ２Ａとの間の相互作用に介在すると予想される。
【図４】ＫＩＡＡ１５２４がｃ−Ｍｙｃ関連ＰＰ２Ａ活性及びｃ−Ｍｙｃの分解を阻害することを示す図である。図４Ａ）ＫＩＡＡ１５２４タンパク質のｓｉＲＮＡ誘導性の減少により、ＨｅＬａ細胞におけるｃ−Ｍｙｃタンパク質の発現が下方調節される。図４Ｂ）ＫＩＡＡ１５２４タンパク質のｓｉＲＮＡ誘導性の減少はｃ−ＭｙｃのｍＲＮＡの発現を阻害しない。図４Ｃ）ＫＩＡＡ１５２４タンパク質のｓｉＲＮＡ誘導性の減少は、ｃ−Ｍｙｃ免疫沈降物におけるＰＰ２Ａの活性を増強する。図４Ｄ）ＫＩＡＡ１５２４タンパク質はＰＰ２Ａｃタンパク質とｃ−Ｍｙｃタンパク質との間の相互作用を調節しない。スクランブルｓｉＲＮＡ又はＫＩＡＡ１５２４のｓｉＲＮＡのいずれかでトランスフェクトしたＨｅＬａ細胞を、ｃ−Ｍｙｃ特異的抗体との免疫共沈降分析にかけた。免疫沈降物におけるタンパク質をその後、提示した抗体によって研究した。
【図５】ｃ−ＭｙｃにおけるＫＩＡＡ１５２４相互作用ドメインの同定を示す図である。図５Ａ）固定化された組換えＦｌａｇ−ＫＩＡＡ１５２４タンパク質及び組換えＧＳＴタンパク質との、又はＧＳＴ−ｃ−Ｍｙｃ １−２６２タンパク質との、インビトロでの結合アッセイ。ＧＳＴ（上部）又はＫＩＡＡ１５２４（下部）での溶出物の免疫ブロット。インプットは、相互作用アッセイに用いたＧＳＴタンパク質である。同様の結果であった３回の個別の実験の代表的なブロットを示している。図５Ｂ）ｃ−Ｍｙｃ．ＫＩＡＡ１５２４上での、ＫＩＡＡ１５２４結合ドメインとしてのｃ−Ｍｙｃの１０５〜２６２の同定の概略図。
【図６】ＫＩＡＡ１５２４が癌細胞の成長に必要であることを示す図である。図６（Ａ）スクランブルｓｉＲＮＡ又はＫＩＡＡ１５２４のｓｉＲＮＡで７２時間トランスフェクトしたＨｅＬａ細胞の、細胞増殖のためのチミジンの組み込み。４回の実験の平均＋Ｓ．Ｄ．を示している。＊は、スチューデントｔ検定でｐ＜０．０５である。図６Ｂ）スクランブルｓｉＲＮＡ又はＫＩＡＡ１５２４のｓｉＲＮＡで７２時間トランスフェクトしたＨｅＬａ細胞の細胞周期の進行についての、ＤＮＡ量のフローサイトメトリー分析。結果は、同様の結果であった４回の反復実験の代表的な実験のものである。図６Ｃ）ＫＩＡＡ１５２４欠失体は、ＫＩＡＡ１５２４のｓｉＲＮＡのトランスフェクションの７２時間後のイムノブロッティングによって検出されたように、ＨｅＬａ細胞においてポリ（ＡＤＰリボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）の切断を誘導しない。全長の（１１０ｋＤ）及びカスパーゼで切断された形態のＰＡＲＰタンパク質の予想される分子量を右側に示す。図６Ｄ）スクランブルｓｉＲＮＡ又はＫＩＡＡ１５２４のｓｉＲＮＡでトランスフェクトしたＨｅＬａ細胞の単層上の高密度の増殖巣の形成。上は、代表的な光学顕微鏡画像である。下は、Ｉｍａｇｅ Ｊソフトウェアによる、再播種の１０日後の増殖巣の数の定量。４回の実験の平均＋Ｓ．Ｄ．を示している。＊は、スチューデントｔ検定でｐ＝０．００２である。図６Ｅ）ＫＩＡＡ１５２４タンパク質のｓｉＲＮＡ誘導性の減少により、寒天上でのＨｅＬａ細胞の足場非依存性の成長が阻害される。図６Ｆ）スクランブルｓｉＲＮＡ（Ｓｃｒ）又はＫＩＡＡ１５２４のｓｉＲＮＡでトランスフェクトしたＨｅＬａ細胞を、免疫不全マウスにおいて腫瘍の成長について分析した。各群につき６頭のマウスの腫瘍容積の平均＋ＳＤを示す。図６Ｇ）図６Ｆ）で示した実験と同様に行った個別の実験の２７日目の腫瘍の重量（ｍｇ）。＊は、マンホイットニーのＵ検定でｐ＝０．０３４である。
【図７】ＫＩＡＡ１５２４がヒトの頭頚部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）において過剰発現していることを示す図である。図７Ａ）ＫＩＡＡ１５２４のｍＲＮＡの発現を、正常な組織試料の定量ＲＴ−ＰＣＲ分析により定量した。ＫＩＡＡ１５２４の発現をβ−アクチンとの関連で示す。図７Ｂ）ＫＩＡＡ１５２４のｍＲＮＡの発現を、ＨＮＳＣＣ細胞系及びヒト表皮角化細胞（ＨＥＫ）で、ＴａｑｍａｎリアルタイムＰＣＲ分析によって研究した。図７Ｃ）ＫＩＡＡ１５２４のｍＲＮＡの発現をＨＮＳＣＣ腫瘍試料及び正常な組織の対照試料で、ＴａｑｍａｎリアルタイムＰＣＲ分析によって研究した。図７Ｄ）ＫＩＡＡ１５２４抗体を用いたＨＮＳＣＣ組織の免疫染色分析は、腫瘍細胞における細胞質ＫＩＡＡ１５２４の強い染色を示している（腫瘍細胞の小塊は矢印で示されている）。図７Ｅ）ＫＩＡＡ１５２４タンパク質のｓｉＲＮＡ誘導性の減少により、ＨＮＳＣＣ細胞系におけるｃ−Ｍｙｃタンパク質の発現が下方調節される。
【図８】ＫＩＡＡ１５２４がヒトの結腸癌において過剰発現していることを示す図である。図８Ａ）結腸癌組織及び非悪性の結腸組織（対照）におけるＫＩＡＡ１５２４のｍＲＮＡの発現の定量ＲＴ−ＰＣＲ分析。試料の発現の平均＋Ｓ．Ｄ．を示している。＊は、マンホイットニーのＵ検定でｐ＜０．０５である。図８Ｂ）ヒト結腸癌におけるＫＩＡＡ１５２４の発現レベルと腫瘍悪性度との間の関連性。悪性度ＩＩＩ〜ＩＶと悪性度ＩＩとの間（＊はマンホイットニーのＵ検定でｐ＜０．０００１）及び悪性度ＩＩＩ〜ＩＶと正常な試料との間（＊はマンホイットニーのＵ検定でｐ＝０．００１９）のＫＩＡＡ１５２４発現の統計的な違いを観察した。
【図９】ＫＩＡＡ１５２４がヒトの乳癌において過剰発現していることを示す図である。図９Ａ）正常な乳腺組織又は腫瘍乳腺組織におけるＫＩＡＡ１５２４の発現。図９Ｂ）ＫＩＡＡ１５２４の発現はヒトの乳腺腫瘍の型に依存する。２試料のウィルコクソン（マンホイットニー）の順位和検定を統計分析に用いた。＊は、正常な乳房と比較してｐ＜０．０５であり、＊＊は、粘液性腫瘍と比較してｐ＜０．００５である。ハウスキーピング遺伝子のβ−アクチンを標準化に用いた。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＫＩＡＡ１５２４を阻害する治療作用物質をスクリーニング及び同定する方法であって、
ａ）反応容器内に固定化された第一のタンパク質を提供するステップと、
ｂ）前記容器に、候補作用物質及び標識された第二のタンパク質を同時に又は任意の順序で連続的に加えるステップと、
ｃ）前記第一のタンパク質が前記第二のタンパク質に結合するかどうかを決定するステップと、
ｄ）ステップｃ）における決定が否定的である場合に、前記候補作用物質を、ＫＩＡＡ１５２４を阻害する治療作用物質であると同定するステップと
を含み、前記第一のタンパク質がＫＩＡＡ１５２４であり、前記第二のタンパク質がＰＰ２Ａ、そのサブユニット、及びｃ−Ｍｙｃからなる群から選択され、又はその逆である方法。
【請求項２】
前記第二のタンパク質が、蛍光標識、発光標識、及び比色標識からなる群から選択される標識で標識されている、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ステップｃ）がプレートリーダーにより実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
配列番号２から６からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含み、ＫＩＡＡ１５２４を阻害する低分子干渉ＲＮＡ。
【請求項５】
配列番号７から３０、３２から７９、及びその保存的な配列変異体からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含み、ＫＩＡＡ１５２４を阻害するペプチド。
【請求項６】
前記ペプチドが、配列番号３２から７９及びその保存的な配列変異体からなる群から選択される１から２０個の連続配列を含む、請求項５に記載のペプチド。
【請求項７】
前記ペプチドが、配列番号７から３０及びその保存的な配列変異体からなる群から選択される１から２０個の連続配列を含む、請求項５に記載のペプチド。
【請求項８】
医薬組成物を生産する方法であって、ＫＩＡＡ１５２４を阻害する作用物質を同定するステップと、前記作用物質を薬学的に許容できる任意の適切な賦形剤と混合するステップとを含む方法。
【請求項９】
前記同定が請求項１に記載の方法によって実施される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
請求項８に従って生産され、又は請求項４に記載のｓｉＲＮＡ若しくは請求項５から７までのいずれか一項に記載のペプチドを含む医薬組成物。
【請求項１１】
請求項１０に記載の医薬組成物を治療有効量投与することにより、ＫＩＡＡ１５２４の阻害が必要なヒト又は動物の患者においてＫＩＡＡ１５２４を阻害する方法。
【請求項１２】
前記患者が、癌及び他の過剰増殖性疾患からなる群から選択される疾患に罹患している、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記癌が、頭頚部扁平上皮癌、乳癌、及び結腸癌からなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記過剰増殖性疾患が、乾癬、心筋肥大、及び良性腫瘍からなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
癌及び他の過剰増殖性疾患からなる群から選択される疾患を治療、予防、及び／又は緩和するための医薬組成物を製造するための、ＫＩＡＡ１５２４を阻害する作用物質の使用。
【請求項１６】
前記癌が、頭頚部扁平上皮癌、乳癌、及び結腸癌からなる群から選択される、請求項１５に記載の使用。
【請求項１７】
前記過剰増殖性疾患が、乾癬、心筋肥大、及び良性腫瘍からなる群から選択される、請求項１５に記載の使用。
【請求項１８】
作用物質がアンチセンスオリゴヌクレオチド、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、又はリボザイムである、請求項１５に記載の使用。
【請求項１９】
前記ｓｉＲＮＡが配列番号２から６からなる群から選択される、請求項１８に記載の使用。
【請求項２０】
作用物質が、ＰＰ２Ａ複合体若しくは転写因子ｃ−Ｍｙｃとの前記ＫＩＡＡ１５２４タンパク質の相互作用を阻害することにより細胞の増殖及び成長を予防若しくは阻害し、又は前記作用物質が、ＰＰ２Ａ若しくはｃ−ＭｙｃとのＫＩＡＡ１５２４の相互作用に依存しない、ＫＩＡＡ１５２４の増殖及び成長の効果を阻害する、請求項１５に記載の使用。
【請求項２１】
作用物質がペプチド、小分子、抗体、又はアプタマーである、請求項１５に記載の使用。
【請求項２２】
前記ペプチドが、配列番号７から３０、３２から７９、及びその保存的な配列変異体からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含む、請求項２１に記載の使用。
【請求項２３】
前記ペプチドが、配列番号３２から７９及びその保存的な配列変異体からなる群から選択される１から２０個の連続配列を含む、請求項２２に記載の使用。
【請求項２４】
前記ペプチドが、配列番号７から３０及びその保存的な配列変異体からなる群から選択される１から２０個の連続配列を含む、請求項２２に記載のペプチド。
【請求項２５】
作用物質が、アミノ酸４６１から５３３までの領域のＫＩＡＡ１５２４、又は、ＰＰ２Ａ複合体とＫＩＡＡ１５２４タンパク質との間の相互作用に関与するＫＩＡＡ１５２４上の任意の他の領域を不活性化する、請求項１５に記載の使用。
【請求項２６】
癌に罹患している疑いのある哺乳動物において悪性転化の浸潤性を決定する方法であって、
ａ）前記哺乳動物から得られた、悪性細胞を含む疑いのある試料におけるＫＩＡＡ１５２４の発現レベルを評価するステップと、
ｂ）ステップａ）の発現レベルを、非悪性の対照試料におけるＫＩＡＡ１５２４の発現レベルと比較するステップと、
ｃ）前記試料におけるＫＩＡＡ１５２４の発現レベルが非悪性の対照試料におけるＫＩＡＡ１５２４の発現レベルよりも顕著に高い場合に、前記悪性転化を浸潤性であると決定するステップと
を含む方法。
【請求項２７】
前記試料におけるＫＩＡＡ１５２４の発現レベルが非悪性の対照試料又は非浸潤性の悪性度Ｉ及びＩＩの試料よりも２倍超高い場合に、前記悪性転化を悪性度ＩＩＩ又はＩＶと決定するステップをさらに含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記癌が結腸癌である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記試料におけるＫＩＡＡ１５２４の発現レベルが非悪性の対照試料よりも２倍超高い場合に、浸潤性の腺管癌（ＩＤＣ）、浸潤性の小葉癌（ＩＬＣ）、及び腺管面疱癌を伴うＩＤＣ（ＩＤＣ＋ＩＣＣ）からなる群から選択される浸潤性の腫瘍型を、非浸潤性の腫瘍型から区別するステップをさらに含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項１】
ＫＩＡＡ１５２４を阻害する治療作用物質をスクリーニング及び同定する方法であって、
ａ）反応容器内に固定化された第一のタンパク質を提供するステップと、
ｂ）前記容器に、候補作用物質及び標識された第二のタンパク質を同時に又は任意の順序で連続的に加えるステップと、
ｃ）前記第一のタンパク質が前記第二のタンパク質に結合するかどうかを決定するステップと、
ｄ）ステップｃ）における決定が否定的である場合に、前記候補作用物質を、ＫＩＡＡ１５２４を阻害する治療作用物質であると同定するステップと
を含み、前記第一のタンパク質がＫＩＡＡ１５２４であり、前記第二のタンパク質がＰＰ２Ａ、そのサブユニット、及びｃ−Ｍｙｃからなる群から選択され、又はその逆である方法。
【請求項２】
前記第二のタンパク質が、蛍光標識、発光標識、及び比色標識からなる群から選択される標識で標識されている、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ステップｃ）がプレートリーダーにより実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
配列番号２から６からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含み、ＫＩＡＡ１５２４を阻害する低分子干渉ＲＮＡ。
【請求項５】
配列番号７から３０、３２から７９、及びその保存的な配列変異体からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含み、ＫＩＡＡ１５２４を阻害するペプチド。
【請求項６】
前記ペプチドが、配列番号３２から７９及びその保存的な配列変異体からなる群から選択される１から２０個の連続配列を含む、請求項５に記載のペプチド。
【請求項７】
前記ペプチドが、配列番号７から３０及びその保存的な配列変異体からなる群から選択される１から２０個の連続配列を含む、請求項５に記載のペプチド。
【請求項８】
医薬組成物を生産する方法であって、ＫＩＡＡ１５２４を阻害する作用物質を同定するステップと、前記作用物質を薬学的に許容できる任意の適切な賦形剤と混合するステップとを含む方法。
【請求項９】
前記同定が請求項１に記載の方法によって実施される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
請求項８に従って生産され、又は請求項４に記載のｓｉＲＮＡ若しくは請求項５から７までのいずれか一項に記載のペプチドを含む医薬組成物。
【請求項１１】
請求項１０に記載の医薬組成物を治療有効量投与することにより、ＫＩＡＡ１５２４の阻害が必要なヒト又は動物の患者においてＫＩＡＡ１５２４を阻害する方法。
【請求項１２】
前記患者が、癌及び他の過剰増殖性疾患からなる群から選択される疾患に罹患している、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記癌が、頭頚部扁平上皮癌、乳癌、及び結腸癌からなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記過剰増殖性疾患が、乾癬、心筋肥大、及び良性腫瘍からなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
癌及び他の過剰増殖性疾患からなる群から選択される疾患を治療、予防、及び／又は緩和するための医薬組成物を製造するための、ＫＩＡＡ１５２４を阻害する作用物質の使用。
【請求項１６】
前記癌が、頭頚部扁平上皮癌、乳癌、及び結腸癌からなる群から選択される、請求項１５に記載の使用。
【請求項１７】
前記過剰増殖性疾患が、乾癬、心筋肥大、及び良性腫瘍からなる群から選択される、請求項１５に記載の使用。
【請求項１８】
作用物質がアンチセンスオリゴヌクレオチド、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、又はリボザイムである、請求項１５に記載の使用。
【請求項１９】
前記ｓｉＲＮＡが配列番号２から６からなる群から選択される、請求項１８に記載の使用。
【請求項２０】
作用物質が、ＰＰ２Ａ複合体若しくは転写因子ｃ−Ｍｙｃとの前記ＫＩＡＡ１５２４タンパク質の相互作用を阻害することにより細胞の増殖及び成長を予防若しくは阻害し、又は前記作用物質が、ＰＰ２Ａ若しくはｃ−ＭｙｃとのＫＩＡＡ１５２４の相互作用に依存しない、ＫＩＡＡ１５２４の増殖及び成長の効果を阻害する、請求項１５に記載の使用。
【請求項２１】
作用物質がペプチド、小分子、抗体、又はアプタマーである、請求項１５に記載の使用。
【請求項２２】
前記ペプチドが、配列番号７から３０、３２から７９、及びその保存的な配列変異体からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含む、請求項２１に記載の使用。
【請求項２３】
前記ペプチドが、配列番号３２から７９及びその保存的な配列変異体からなる群から選択される１から２０個の連続配列を含む、請求項２２に記載の使用。
【請求項２４】
前記ペプチドが、配列番号７から３０及びその保存的な配列変異体からなる群から選択される１から２０個の連続配列を含む、請求項２２に記載のペプチド。
【請求項２５】
作用物質が、アミノ酸４６１から５３３までの領域のＫＩＡＡ１５２４、又は、ＰＰ２Ａ複合体とＫＩＡＡ１５２４タンパク質との間の相互作用に関与するＫＩＡＡ１５２４上の任意の他の領域を不活性化する、請求項１５に記載の使用。
【請求項２６】
癌に罹患している疑いのある哺乳動物において悪性転化の浸潤性を決定する方法であって、
ａ）前記哺乳動物から得られた、悪性細胞を含む疑いのある試料におけるＫＩＡＡ１５２４の発現レベルを評価するステップと、
ｂ）ステップａ）の発現レベルを、非悪性の対照試料におけるＫＩＡＡ１５２４の発現レベルと比較するステップと、
ｃ）前記試料におけるＫＩＡＡ１５２４の発現レベルが非悪性の対照試料におけるＫＩＡＡ１５２４の発現レベルよりも顕著に高い場合に、前記悪性転化を浸潤性であると決定するステップと
を含む方法。
【請求項２７】
前記試料におけるＫＩＡＡ１５２４の発現レベルが非悪性の対照試料又は非浸潤性の悪性度Ｉ及びＩＩの試料よりも２倍超高い場合に、前記悪性転化を悪性度ＩＩＩ又はＩＶと決定するステップをさらに含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記癌が結腸癌である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記試料におけるＫＩＡＡ１５２４の発現レベルが非悪性の対照試料よりも２倍超高い場合に、浸潤性の腺管癌（ＩＤＣ）、浸潤性の小葉癌（ＩＬＣ）、及び腺管面疱癌を伴うＩＤＣ（ＩＤＣ＋ＩＣＣ）からなる群から選択される浸潤性の腫瘍型を、非浸潤性の腫瘍型から区別するステップをさらに含む、請求項２６に記載の方法。
【図５】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図６−１】
【図６−２】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図６−１】
【図６−２】
【図７】
【図８】
【図９】
【公表番号】特表２００９−５３０５９３（Ｐ２００９−５３０５９３Ａ）
【公表日】平成２１年８月２７日（２００９．８．２７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５５８８３９（Ｐ２００８−５５８８３９）
【出願日】平成１９年３月１４日（２００７．３．１４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＩ２００７／０５０１３７
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１０４８３５
【国際公開日】平成１９年９月２０日（２００７．９．２０）
【出願人】（５０８２７８４０２）
【出願人】（５０８２７８４１３）
【出願人】（５０８２７８４２４）
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年８月２７日（２００９．８．２７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年３月１４日（２００７．３．１４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＩ２００７／０５０１３７
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１０４８３５
【国際公開日】平成１９年９月２０日（２００７．９．２０）
【出願人】（５０８２７８４０２）
【出願人】（５０８２７８４１３）
【出願人】（５０８２７８４２４）
【Ｆターム（参考）】
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