抗−組織因子抗体を用いる腫瘍成長を抑制する方法
新脈管形成により特徴づけられる増殖性疾患、例えば癌、慢性関節リウマチ、乾癬、もしくは増殖性網膜症、または黄斑変性を処置するための組織因子拮抗物質の使用方法。外因性経路を介する血餅の急速防止が可能な組織因子拮抗物質は哺乳動物における腫瘍成長も抑制しうる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腫瘍細胞の成長を特異的に防止または抑制することにより癌を処置するための組織因子（ＴＦ）拮抗物質の使用方法に関する。本発明は、より特に、腫瘍の成長を抑制するのに充分な量での、例えば少なくとも１種のＴＦ蛋白質もしくはその断片に特異的な特異化された部分または変種を包含するＴＦに指向された抗体のようなＴＦ拮抗物質の使用によるそのような疾患の処置方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
組織因子（ＴＦ）
凝血はフィブリンの生成をもたらす段階的な順次反応である。凝固段階は２つの重複する経路よりなり、それらの両者とも止血に必要である。内因性経路は循環する血液中に存在する蛋白質因子を含んでなるが、外因性経路は組織因子（ＴＦ）を必要とし、それは脈管損傷に応答して種々の組織の細胞表面上で発生する（非特許文献１）。血液への露呈時に、ＴＦは不溶性フィブリン塊を生成する活性化段階の潜在的に爆発性である段階を作動させる。ＴＦは抗凝固剤療法の標的として研究されてきた。
【０００３】
ＴＦは因子ＶＩＩおよびＶＩＩａ用の受容体として機能しそしてそれにより脈管損傷に応答する凝固段階の外因性経路を始動させる単鎖の２６３アミノ酸膜糖蛋白質である。ＴＦは因子ＶＩＩａ用の受容体並びに共因子として作用するトランスメンブラン細胞表面受容体であり、細胞表面上に蛋白質分解活性ＴＦ：ＶＩＩａ複合体を生成する（非特許文献２）。止血の維持におけるその役割の他に、過剰のＴＦは病原性症状に関係していた。具体的には、ＴＦの合成および細胞表面発現は脈管疾患（非特許文献３）およびグラム−陰性敗血症ショック（非特許文献４）に関係していた。
ＴＦ拮抗物質
種々の抗−ＴＦ抗体が既知である。例えば、Ｃａｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ（非特許文献５）は不動化された因子ＶＩＩ上の親和クロマトグラフィーにより精製されたＴＦを用いるマウスの免疫処理により製造されたハイブリドーマ生成性モノクローナル抗体を開示している。Ｒｕｆ ｅｔ ａｌ（非特許文献６）はヒトＴＦに対するネズミモノクローナル抗体の抗凝固能力を同定した。ＲＦ上のＦＶＩＩ結合部位を標的とするモノクローナル抗体の能力はＴＦとの結合に関するＦＶＩＩと競合するそれらの能力およびＴＦが血漿と接触した時に急速に生成するＴＦ／ＶＩＩａ複合体の生成に依存する。そのような抗体はそれ故、血漿中のＴＦの比較的ゆっくりした抑制剤であった。１種のモノクローナル抗体であるＴＦ８−５Ｇ９はＴＦ／ＶＩＩａ複合体を抑制可能であり、血漿中で即時の抗凝固効果を与える。この抗体は特許文献１、特許文献２、および特許文献３に開示されている。Ｒｕｆ ｅｔ ａｌ（上記非特許文献２）は、ＴＦ／ＶＩＩａ複合体を不活性化する機構は、その生成を防止するよりむしろ、インビボでの凝固の妨害のための戦略を与えうることを示唆した。ＴＦと結合する因子ＶＩＩを抑制する他の抗体とは対照的に、ＴＦ８−５Ｇ９は受容体と結合する因子ＶＩＩまたは因子ＶＩＩａに対するかすかなそして間接的な効果だけを示す。ＴＦ８−５Ｇ９はナノモル結合定数を有するＴＦの細胞外領域と結合してＴＦ：Ｆ．ＶＩＩａ：Ｆ．Ｘ三元開始複合体の生成を遮断する（非特許文献７）。
【０００４】
抗−ＴＦモノクローナル抗体は様々な種においてＴＦ活性を抑制することが示されており（非特許文献８）そして抗−ＴＦ抗体の中和が敗血症のヒヒモデルにおける死亡を防止し（非特許文献９）そしてウサギにおけるエンドキシン誘発性ＤＩＣを緩和する（非特許文献１０）ことが示された。
【０００５】
特許文献４はＴＦ８−５Ｇ９抗体から誘導されたＣＤＲ−移植された抗−ＴＦ抗体を開
示している。他のヒトに適応されたまたはヒト抗−ＴＦ抗体は非特許文献１１、特許文献５、特許文献６および特許文献７に開示されている。
癌におけるＴＦの役割
組織因子は種々の悪性腫瘍および単離されたヒト腫瘍細胞系統上でも過剰発現され、腫瘍成長および生存におけるある役割を示唆する。ＴＦは正常な血管を内張りする健康な内皮細胞により製造されないが、腫瘍脈管中のこれらの細胞上で発現される。それは、２つの脈管形成、すなわち成長する動物および脈管形成における新血管の生成、正常および悪性腫瘍成体組織における現存動脈からの新毛細血管の発生、においてある役割を演ずるようである。ＴＦの抑制または標的化は従って、直接的にＴＦ介在細胞信号化または他の活性を抑制することによるＴＦ過剰発現性腫瘍細胞の生存に影響しうる有用な抗−腫瘍戦略でありうる。さらに、この方式は間接的に腫瘍内の内皮細胞を発現するＴＦの成長または機能を抑制することによる抗脈管形成機構により腫瘍成長を防止しうる。
ＴＦおよび脈管形成
脈管形成は新しい毛細血管を発生する工程であり、そして内皮細胞の活性化された増殖から生ずる。新脈管形成は厳しく調整され、そして胚成長、組織再構成、外傷治癒および黄体成長の周期的循環中にのみ起きる（非特許文献１２）。
【０００６】
腫瘍組織に栄養分および酸素を供給し、廃棄生成物を送り出しそして離れた部位への腫瘍細胞の転移のための導管として作用するためには、腫瘍成長および癌進行が脈管形成および新脈管形成、血管成長および伸長を必要とするというかなりの証拠が現在ある（非特許文献１３および非特許文献１４）。それにもかかわらず、組織および腫瘍脈管形成並びに新脈管形成はＴＮＦアルファ、ＶＥＧＦ、および組織因子を包含する細胞的に製造される因子の相互作用が介在する複雑な工程である。研究は、新血管形成の開始における２種の主な作用物質であるＶＥＧＦおよびＴＦ重複の上方調整（ｕｐｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）をもたらす経路を示している（非特許文献１５）。
【０００７】
内皮細胞は通常は体内の他のタイプの細胞よりはるかにゆっくり増殖する。しかしながら、これらの細胞の増殖速度が上方調整される場合には、病理学的な脈管形成が生じうる。病理学的な脈管形成は多くの疾患に関係する。例えば、心臓血管疾患、例えば血管腫、血管線維腫、脈管変形、アテローム硬化症、癒着および浮腫硬化症；並びに眼科疾患、例えば虹彩移植後の新脈管形成、新脈管性緑内障、糖尿病性網膜症、脈管形成性角膜疾患、黄斑変性、翼状片、網膜変性、水晶体後方線維増殖症、および顆粒性結膜炎が脈管形成に関連する。慢性炎症性疾患、例えば関節炎；皮膚疾患、例えば乾癬、毛細血管拡張症、化膿性肉芽腫、脂漏性皮膚炎、静脈潰瘍、ざ瘡、しゅさ（ざ瘡しゅさもしくは紅斑しゅさ）、いぼ（ゆうぜい）、湿疹、血管腫、リンパ管腫も脈管形成−依存性である。
【０００８】
硝子体液が毛細血液により浸潤される種々の眼科疾患のために、視力は損失または喪失されうる。糖尿病性網膜症は２つの形態、すなわち非増殖性または増殖性、の１つをとりうる。増殖性網膜症は異常な新しい脈管生成（新脈管形成）により特徴づけられ、それは硝子体表面上で成長するかまたは硝子体腔内に伸びる。進行した疾患では、新脈管膜が生じて、牽引網膜剥離をもたらしうる。硝子体出血が新脈管形成から生じうる。視力症状は変動する。硝子体内出血がある場合に突然の重篤な視力喪失が起きうる。増殖性網膜症を伴う視力の予後が重篤な網膜虚血、過度の新脈管形成、または過度の線維組織生成と関連する場合には、より多く監視される。黄斑変性も同様に２つの形態、すなわち乾燥および湿潤、をとる。それほど普遍的でない滲出性黄斑変性（湿潤形態）では、しばしば網膜内出血、網膜下流体、色素上皮剥離、および色素増加を伴う脈絡膜新脈管形成の網膜下網目構造の生成がある。実際に、この複雑さは後極における顕著な上昇した瘢痕を収縮させそして残す。両方の形態の年令−関連性黄斑変性はしばしば両側性でありそして黄斑領域内で結晶腔により進行する。脈管形成病因に関連する視力喪失の別の原因は虹彩の損傷である。虹彩を角に引っ張り上げる２つの最も普遍的な症状は、例えば糖尿病患者における新
脈管性緑内障におけるような膜の収縮または虹彩が角に引っ張り上げられるブドウ膜炎に伴われる中央網膜静脈閉塞もしくは炎症性沈殿である（非特許文献１６）。
【０００９】
炎症性疾患である慢性関節リウマチも不適切な脈管形成をもたらす。滑液腔内の脈管内皮細胞の成長は炎症性サイトカインにより活性化され、そして軟骨破壊および関節内のパンヌスによる置換をもたらす（非特許文献１７、非特許文献１８、非特許文献１９）。
【００１０】
乾癬は皮膚細胞の未調節増殖により引き起こされる。急速に成長する細胞は充分な血液供給を必要とし、そして異常な脈管形成が乾癬内で誘発される（非特許文献２０）。
【００１１】
特許文献８は、微小脈管内の転移細胞の長期付着を排してそれにより転移を抑制することによる転移の開始および進行を抑制するための抗−ＴＦ抗体の使用を開示しているが、定着した腫瘍細胞の成長に対する効果は開示していない。腫瘍脈管形成を調整する因子における複雑さ並びに腫瘍成長および外傷治癒の両者における受容体介在細胞成長としての組織因子の役割の不完全な理解を前提とすると、癌の発症または不適切な脈管形成活性により特徴づけられる他の疾患においてＴＦの遮断が重要なまたは追加の役割のいずれかを演じうることが可能である。
【特許文献１】米国特許第６，００１，９７８号明細書
【特許文献２】米国特許第５，２２３，４２７号明細書
【特許文献３】米国特許第５，１１０，７３０号明細書
【特許文献４】国際公開第９６／４０９２１号パンフレット
【特許文献５】欧州特許第１０６９１８５号明細書
【特許文献６】国際公開第０１／７０９８４号パンフレット
【特許文献７】国際公開第０３／０２９２９５号パンフレット
【特許文献８】国際公開第９４／０５３２８号パンフレット
【非特許文献１】Ｄａｖｉｅ ｅｔ ａｌ．著、１９９１、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３０：１０３６３
【非特許文献２】Ｒｕｆ ｅｔ ａｌ著、（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２６７：６３７５−６３８１
【非特許文献３】Ｗｉｌｃｏｘ ｅｔ ａｌ．著、１９８９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ、８６：２８３９
【非特許文献４】Ｗａｒｒ ｅｔ ａｌ．著、１９９０、Ｂｌｏｏｄ ７５：１４８１
【非特許文献５】Ｃａｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ著、１９８７、Ｂｌｏｏｄ ７０：４９０−４９３
【非特許文献６】Ｒｕｆ ｅｔ ａｌ著、１９９１、Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ ａｎｄ Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ ６６：５２９
【非特許文献７】Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ著、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７５：８７３−８９４ １９９８
【非特許文献８】Ｍｏｒｉｓｓｅｙ ｅｔ ａｌ．著、１９８８、Ｔｈｒｏｍｂ．Ｒｅｓ．５２：２４７−２６０
【非特許文献９】Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ著、Ｃｉｒｃ．Ｓｈｏｃｋ、３３：１２７（１９９１）
【非特許文献１０】Ｗａｒｒ ｅｔ ａｌ著、（１９９０）Ｂｌｏｏｄ ７５：１４８１
【非特許文献１１】Ｐｒｅｓｔａ ｅｔ ａｌ著、Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ ８５：３７９−３８９（２００１）
【非特許文献１２】Ｆｏｌｋｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｔｒａｎ著、Ｒｅｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｖａｓｃｕｌａｒ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｔｏ ｔｕｍｏｒ ｇｒｏｗｔｈ，Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｅｘｐ．Ｐａｔｈｏｌ．’１６，２０７−２４８（１９７６）
【非特許文献１３】Ｆｏｌｋｍａｎ ｅｔ ａｌ．著、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ２８５：１１８１−１１８６、１９７１
【非特許文献１４】Ｆｏｌｋｍａｎ ｅｔ ａｌ．著、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３３３：１７５７−１７６３、１９９５
【非特許文献１５】Ｃｈｅｎ Ｊ．ｅｔ ａｌ．著、（２００１）Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．８６−３３４−５
【非特許文献１６】Ｃｈ．９９．Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｍａｎｕａｌ １７ｔｈ Ｅｄ．１９９９
【非特許文献１７】Ｋｏｃｈ ＡＫ，Ｐｏｌｖｅｒｉｎｉ ＰＪ ａｎｄ Ｌｅｉｂｏｖｉｃｈ ＳＪ．著、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．２９，４７１−４７９（１９８６）
【非特許文献１８】Ｓｔｕｐａｃｋ ＤＧ，Ｓｔｏｒｇａｒｄ ＣＭ ａｎｄ Ｃｈｅｒｅｓｈ ＤＡ著、Ｂｒａｚ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｓ．，３２，５７８−５８１（１９９９）
【非特許文献１９】Ｋｏｃｈ ＡＫ著、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ，４１，９５１９６２（１９９８）
【非特許文献２０】Ｆｏｌｋｍａｎ Ｊ．著、Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｒｎａｔｏｌ．，５９，４０−４８（１９７２）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
従って、ヒトの癌または新脈管形成（ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）および脈管形成機構（ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ）に伴われる他の増殖性疾患の処置における主要または補助療法としてＴＦに対する抗体を使用しうるかどうかを理解することは有益であろう。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
発明の要旨
本発明は、哺乳動物のおける腫瘍の成長を抑制するための、ＴＦに対して指向された抗体、並びに少なくとも１種のＴＦ蛋白質もしくはその断片に関して特異的な特異化されたその部分または変種を包含するＴＦの拮抗物質を使用する方法に関する。そのようなＴＦ拮抗物質、例えば抗体はそれらがＴＦと結合する能力により組織、特に充実性腫瘍の成長に伴われる事象を防止する方法で作用しうる。
【００１４】
別の面では、本発明は組織因子拮抗物質を脈管形成された組織の増加を抑制するのに充分な量で投与することを含んでなる該組織における増加により特徴づけられる疾患を処置する方法を提供する。
図面の簡単な記述
図１は、ヌードマウスの側腹部内に皮下移植されそしてｈＩｇに無関係にＣＮＴＯ８５９またはＨＢＳＳを１週１回０日目から始まって投与されたヒト乳癌細胞の腫瘍成長速度（容量変化）を示すグラフである。
【００１５】
図２は、ＣＮＴＯ８５９またはｈＩｇが１週１回１４日目から始まって投与されたマウス群に関する図１と同じ実験からのデータを示すグラフである。
【００１６】
図３は、対照動物、ＰＢＳまたは対照ヒトＩｇのいずれかで処置された動物、およびＣＮＴＯ８５９で処置された動物のいずれかからの腫瘍容量における変化を示すグラフである。
【００１７】
図４は、対照動物、ＰＢＳまたは対照ヒトＩｇのいずれかで処置された動物、およびＣＮＴＯ８５９で処置された動物のいずれかからの最終腫瘍容量の平均および標準偏差を表
わす棒グラフである。
【００１８】
図５は、腫瘍が移植された日と同じ日から始まるＰＢＳ、対照ＩｇまたはＣＮＴＯ８５９のいずれかで処置された動物における腫瘍出現率を示す。
【００１９】
図６は、ＰＢＳ、対照ヒトＩｇまたは種々の薬用量のＣＮＴＯ８５９のいずれかで処置された動物における容量により測定されたＭＤＡＭＢ２３１異種移植片の腫瘍進行を示す。ＣＮＴＯ８５９は全ての濃度において腫瘍成長を抑制することができた。腫瘍抑制は０．１ｍｇ／ｋｇにおける９０％（それぞれ、ｐ＝０．００１２および０．０１０６、ｔ−分布を用いるウィルコキソン（Ｗｉｌｃｏｘｏｎ）２−試料試験）からそれより高いいずれかの濃度における９５％までの範囲にわたった。
【００２０】
図７は、ＰＢＳ、対照ヒトＩｇまたは種々の薬用量のＣＮＴＯ８５９（０．１、１、５、１０および２０ｍｇ／ｋｇ）のいずれかで処置された動物からの最終腫瘍容量の分布を示す分布プロットである。
【００２１】
図８は、マウスに（乳房組織に）正常位移植されたヒト乳癌細胞ＭＤＡＭＢ２３１異種移植片を用いそしてマウスがＰＢＳ、対照ヒトＩｇ、ＣＮＴＯ８５９Ａｌａ／Ａｌａまたは種々の薬用量（０．０１、０．１および１ｍｇ／ｋｇ）のＣＮＴＯ８５９およびＣＮＴＯ８６０のいずれかで処置された実験に関する時間につれての腫瘍容量のグラフである。
【００２２】
図９は、０．１ｍｇ／ｋｇにおける対照並びにＣＮＴＯ８５９およびＣＮＴＯ８６０だけを示す、図８に示されたものと同じ実験からの群の４種の平均および標準偏差を示す。
【００２３】
図１０は、図８と同じ実験における各群からの個々の最終腫瘍容量および平均の各々のグラフ表示である。
【００２４】
図１１は、図８と同じ実験からの腫瘍出現データを示す。
【００２５】
図１２は、翌日から始まるＣＮＴＯ８５９で処置されたマウスに移植されたＢｘＰＣ−３ヒト膵臓腫瘍細胞の腫瘍成長速度（容量変化）を示すグラフである。腫瘍成長は４６．９％（ｐ＜０．００１２）抑制される。
【００２６】
図１３は、定着した腫瘍をＣＮＴＯ８５９で処置した場合のマウスに移植されたＢｘＰＣ−３ヒト膵臓腫瘍細胞の腫瘍成長速度（容量変化）を示すグラフである。腫瘍成長は３５％（ｐ＜０．０００１）抑制される。
【００２７】
図１４は、マウスにおいてマトリゲル（ＭＡＴＲＩＧＥＬ）内の管長さにより測定されたＰＡＮＣ−１ヒト膵臓腫瘍細胞誘発性脈管形成がヒト抗−ネズミＴＦ抗体（ＰＨＤ１２７）により８８％（ｐ＜０．０５）減じられることを示す棒グラフである。
発明の詳細な記述
本発明のＴＦ拮抗物質は腫瘍成長の抑制および防止において有用である。種々の形態の充実性原発性腫瘍を包含する多くの病状が本発明の方法におけるＴＦ拮抗物質を用いる処理により改善される。
腫瘍
種々の癌、例えば、頸癌、肛門癌および口腔癌、胃癌、結腸癌、膀胱癌、直腸癌、肝臓癌、膵臓癌、肺癌、乳癌、子宮頸癌、子宮体癌、卵巣癌、前立腺癌、睾丸癌、腎臓癌、脳／脳頭蓋癌（例えば、神経膠腫）、頭頸部癌、眼または眼球癌、咽門癌、皮膚黒色腫、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、ユーイング肉腫、カポジ肉腫、基底細胞カリノーマ（ｃａｒｉｎｏｍａ）および鱗状細胞カリノーマ、小細胞肺癌、繊毛癌、横紋筋肉腫、
血管肉腫、血管内皮腫、ヴィルムス腫瘍、神経芽腫、口／咽頭癌、食道癌、咽頭癌、腎臓癌およびリンパ腫をとりわけ包含する良性および悪性腫瘍の両者は本発明の抗−ＴＦ抗体を用いて処理することができる。
【００２８】
それ故、本発明は、乳癌、結直腸癌、腎細胞癌、膵臓癌、前立腺癌、鼻咽頭癌、悪性組織球増殖症、悪性のパラ新生物症候群／高カルシウム血症、充実性腫瘍、腺癌、肉腫、悪性黒色腫、血管腫、転移疾患などを包含するがそれらに限定されない、細胞、組織、器官、動物または患者における少なくとも１種の悪性疾患を緩和または処置する方法を提供する。そのような方法は、場合により、放射線療法剤、抗−脈管形成剤、化学療法剤、ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤、プロテソーム阻害剤などと、そのようなＴＦ拮抗物質の投与前の、同時のまたは後の投与により、組み合わせて使用することができる。
ＴＦ拮抗物質
ここで使用される用語「ＴＦ拮抗物質」は、ＴＦの活性を抑制または中和する物質をさす。そのような拮抗物質はこの効果を種々の方法で達成する。ＴＦ拮抗物質の１種は、ＴＦの効果を中和するのに充分な親和力および特異性を有するＴＦ蛋白質に結合するであろう。抗体および抗体断片（例えば、Ｆ（ａｂ）またはＦ（ａｂ’）２分子）はこの種類の分子に包含される。それ故、ここで使用される「抗体」は免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分をさす。ＴＦ拮抗物質の別の種類は、ＴＦ蛋白質、ムテイン、または有機分子、すなわち擬ペプチドであり、それらはＴＦ配位子と結合し、それによりＴＦの活性またはそれが分子内信号化を引き起こす能力を抑制するであろう。ＴＦ拮抗物質は、ＴＦ抗−腫瘍活性または抗−脈管形成活性を抑制する物質である限り、これらの種類のいずれであってもよい。ＴＦ拮抗物質は、ＴＦ抗体、改質されたＴＦ、アンチセンスＴＦおよびＴＦの部分ペプチドを包含する。
【００２９】
特に好ましい態様では、ＴＦ拮抗物質はネズミ、キメラ、ヒトに適応されたまたはヒトモノクローナル抗体もしくは以下の性質：ＴＦに対する因子ＶＩＩａを防止し、それにより凝固の進行を防止し、ＴＦ：ＦＶＩＩａ：ＦＸ複合体の生成を防止し、またはＴＦ信号化をその細胞内領域を介して防止する性質、の１つを有するその断片である。そのような抗体は当該技術で既知でありそして本発明の方法で使用することができる。ＴＦに対するネズミモノクローナル抗体は例えば米国特許第６，００１，９７８号明細書、米国特許第５，２２３，４２７号明細書、および第５，１１０，７３０号明細書中のように既知である。国際公開第９６／４０９２１号パンフレットは、マウス抗体ＴＦ８−５Ｇ９の可変領域からの相補決定領域（ＣＤＲ）がヒト抗体の可変領域中に移植されそしてヒト抗体の一定領域に結合されるＴＦ８−５Ｇ９抗体から誘導されるＣＤＲ−移植された抗−ＴＦ抗体を開示している。ＴＦ抗凝血剤および受容体介在活性を防止しうる他のヒトに適応された抗−ＴＦ抗体はＰｒｅｓｔａ ｅｔ ａｌ，Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ ８５：３７９−３８９（２００１）および欧州特許第１０６９１８５号明細書に開示されている。前記の参考文献の各々は引用することにより本出願の内容となる。
組成物およびそれらの使用
本発明に従えば腫瘍成長を抑制するために中和用の抗−ＴＦモノクローナル抗体を使用することができる。処置しようとする個体はいずれの哺乳動物であってもよく、そして好ましくはそのような処置を必要とするヒト患者である。モノクローナル抗体の投与量はその使用目的および投与方法に応じて変動するであろう。
【００３０】
本発明のＴＦ抗体は、成長が防止または停止されることが望まれる腫瘍組織内で効果をもたらす方法のいずれかの構成員により投与することができる。さらに、本発明の抗ＴＦ抗体は抗腫瘍効果を与えるために局部的に存在する必要はなく、従って、それらはＴＦを含有する身体部分または流体への到達が達成されるいずれの場所にでも投与することができる。悪性腫瘍組織の場合には、これらの方法は抗体を含有する調合物の直接適用を包含しうる。そのような方法は、液体組成物の静脈内投与、液体もしくは固体調合物の皮下も
しくは経皮投与、経口投与、局部投与、または間隙性もしくは相互作用性投与を包含する。
【００３１】
投与は経口的であってもまたは腫瘍もしくは組織内への局部注射によってでもよいが、一般的には、モノクローナル抗体は静脈内投与される。一般的には、投与量範囲は約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１２．０ｍｇ／ｋｇである。これは巨丸剤であってもよく、またはマイクロプロセッサーで調節され且つプログラム可能なポンプ装置により調節できる遅延もしくは連続的注入でありうる。
【００３２】
或いは、好ましくは該モノクローナル抗体の断片をコードするＤＮＡをハイブリドーマ細胞から単離されそして哺乳動物に投与することができる。ＤＮＡはそのままの形態で投与するかまたは組み換えべクタ−、例えば、バクシニアウイルス内に挿入して、患者の細胞内のＤＮＡの発現および抗体の分配を生ずる方法で投与することができる。
【００３３】
本発明の方法で使用されるモノクローナル抗体は、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１９８５に記載されているように、製薬学的組成物の確立された調合方法のいずれかにより調合することができる。投与の容易さのために、モノクローナル抗体は典型的には製薬学的に許容可能な担体と組み合わされるであろう。そのような担体は水、生理的食塩水、または油を包含する。
【００３４】
非経口的投与に適する調合物は、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤および調合物を意図する受容器の血液と等張性にさせる溶質を含有しうる水性および非水性殺菌性注射溶液、並びに懸濁化剤および濃稠化剤を含有しうる水性および非水性殺菌性注射懸濁液を包含する。従来の培地が活性成分およびその意図する使用と非相容性である場合を除いて、いずれの組成物中のその使用でも意図される。
【００３５】
調合物は単位服用量または複数回服用量容器、例えば、密封されたアンプルおよび瓶の中に存在することができ、そして使用直前に殺菌性液体、例えば、注射用の水の添加だけを必要とする凍結乾燥された状態で貯蔵することができる。
ＴＦ拮抗物質との組み合わせ
この方法は、本発明のＴＦ拮抗物質を抗−腫瘍効果またはインビボ脈管形成を抑制する化学療法剤を包含するがそれに限定されない別の機構を有する１種もしくはそれ以上の他の剤と組み合わせることができる。
【００３６】
さらに、ＴＦ抗体を１種もしくはそれ以上の抗−脈管形成剤と組み合わせることもできる。脈管形成は、円滑筋および内皮細胞の侵襲、泳動および増殖により特徴づけられる。αｖβ３インテグリン（ビトロネクチン受容体としても知られる）が腫瘍転移、充実性腫瘍成長（新形成）、オステオポローシス、パジェット病、悪性の体液高カルシウム血症、腫瘍脈管形成を包含する脈管形成、黄斑変性を包含する網膜症、慢性関節リウマチを包含する関節炎、歯周病、乾癬および円滑筋細胞泳動（例えば、再狭窄）を包含する種々の症状または疾患状態においてある役割を演ずることが知られている。
【００３７】
付着受容体αｖβ３インテグリンは、ビトロネクチン、フィブリノーゲン、フォン・ウィルブランド因子、ラミニン、スロンボスポンディン、および他の同様な配位子を結合する。それはヒヨコおよびヒトにおいて脈管形成性血管のマーカーとして同定され、そして脈管形成または新脈管形成において重要な役割を演ずる。αｖβ３の拮抗物質は、新脈管形成における細胞のアポプトシスを選択的に促進させることにより、この工程を抑制する。従って、αｖβ３拮抗物質は新脈管形成に付随するそのような症状を処置するための有用な治療標的であろう（Ｂｒｏｏｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．２６４，（１９９４），５６９−５７１）。さらに、腫瘍細胞侵襲は三段階方法：１）細胞外マ
トリックスに対する腫瘍細胞接触、２）マトリックスの蛋白質分解溶解、および３）溶解したバリアー内の細胞の移動により起きる。この方法は繰り返し行うことができ、そして元の腫瘍から離れた部位における転移をもたらしうる。αｖβ３インテグリンは腫瘍細胞侵襲並びに脈管形成においてある役割を演ずることが示された。
【００３８】
αｖβ３の拮抗物質および中和用の抗−ＴＦ抗体は両者とも腫瘍を標的にするが異なる機構により作用するため、抗−インテグリン抗体と抗−ＴＦ抗体との組み合わせは正常組織毒性がほとんどない特に有効な組み合わせを生ずるはずである。それ故、本発明の１つの態様では、インテグリン拮抗物質および抗−ＴＦ抗体の組み合わせをそのような処置を必要とする患者に投与することを含んでなる腫瘍の成長を抑制する方法が提供される。インテグリンまたはインテグリン副単位を選択的に結合する他の抗体、特にアルファＶ副単位を結合するもの、は米国特許第５，９８５，２７８号明細書および第６，１６０，０９９号明細書に開示されている。アルファＶベータ３とトリペプチドであるアルギニル−グリシル−アスパルテート（ＲＧＤ）を含有するその天然配位子との結合を抑制するＭａｂ類は米国特許第５，７６６，５９１号明細書および国際公開第００７８８１５号パンフレットに開示されている。アルファＶ−副単位を含有するインテグリンがビトロネクチン、フィブロネクチン、または他の配位子に結合するのを防止する他の抗体も脈管形成の防止において同様な有用性を有する。そのような抗体はＧＥＮ０９５またはＣＮＴＯ９５において知られておりそして国際公開第０２０１２５０１号パンフレットとして公開された出願継続中の出願に記載されている抗体を包含する。
【００３９】
本発明によると、例えばタリドミド（ｔｈａｌｉｄｏｍｉｄｅ）の如き他の既知の抗−脈管形成剤を抗−ＴＦ抗体と組み合わせて使用することもできる。
略語
ＡＴＣＣ−アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）
ＣＯ２−二酸化炭素
ＤＭＥＭ−ダルベッコ改質イーグル培地
ＥＤＴＡ−エチレンジアミン四酢酸
ＦＢＳ−胎牛血清
ＦＶＩＩａ−因子ＶＩＩａ（活性化されたＦＶＩＩ）
ＦＸ−因子Ｘ（不活性）
ＦＸａ−因子Ｘａ（活性化されたＦＸ）
ｈＩｇ−ヒトＩｇ
ＬＮＮ−２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１ｍＭ ピルビン酸ナトリウム、１ｍＭ 非必須ＡＡｓ
ＰＢＳ−燐酸塩緩衝食塩水
ＳＱ−皮下
ＩＶ−静脈内
ＩＰ−腹腔内
ＴＦ−組織因子
本発明を一般的に記載してきたが、本発明の態様は以下の実施例でさらに開示される。
【実施例】
【００４０】
実施例１
乳癌異種移植片における腫瘍成長の抑制
この実施例は、抗−組織因子ＩｇＧ抗体がヌードマウスに移植されたＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌異種移植片の腫瘍成長を抑制する能力を示す。
材料および方法 （５０匹の）チャールス・リバー・ラボラトリーズ（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）からの生後４−６週間の雌ヌードマウス（Ｃｒ
ｌ：ＮＵ／ＮＵ−ＣＤ１）を入手しそして実験前１０−１４日間にわたり気候順化させた。マウスをセントコル・インコーポレーテッド（Ｃｅｎｔｏｃｏｒ，Ｉｎｃ．）における動物施設内に研究動物の管理および使用に関する国立衛生機関指針に従い維持した。
【００４１】
ヒト乳癌細胞系統ＭＤＡＡ−ＭＢ−２３１はＡＴＣＣ（メリーランド州、ロックビル、カタログ＃ＨＴＢ−２６）から得られた。細胞を２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１０％ＦＢＳおよび１％ＬＮＮが補充されたＤＭＥＭ培地中で３７℃、５％ＣＯ２において培養した。細胞をトリプシン−ＥＤＴＡを用いて対数期成長において回収しそして殺菌性ＨＢＳＳ中で５×１０７個の細胞／ｍＬで再懸濁させた。
【００４２】
抗体：ＣＮＴＯ８５９、国際公開第９６／４０９２１号パンフレットに開示されたＣＤＲ移植されたＴＦ８−５Ｇ９抗体、株濃度３．７５ｍｇ／ｍＬ；ｈＩｇ、ＺＬＢ・バイオプラズマ（Ｂｉｏｐｌａｓｍａ）・ＡＧ、スイス、ベルン。殺菌性ＵＳＰ水中の株濃度３０ｍｇ／ｍＬ）。全ての試験製品は殺菌性ＨＢＳＳ中の２ｍｇ／ｍＬの操作濃度に設定された。全ての試験製品および対照は＜１．０ＥＵ／ｍｇのＬＡＬ値を有するであろう。
【００４３】
０日目に、マウスを５群のそれぞれに１群当たり１０匹のマウスで無作為に指定した。細胞をヌードマウスの側腹部内に５×１０６個のＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍細胞の濃度（０．２ｍＬの容量（０．１ｍＬのマトリゲル（Ｒ））と混合されたＨＢＳＳ中０．１ｍＬの細胞）で皮下移植した。マウスの群に表１に処方されている通りにして１週１回投与した。
【００４４】
【表１】
【００４５】
試験の０日目に、５０匹の試験マウスを５群にする（１０匹のマウス／群、表１に従う）。全ての動物に５×１０６個の細胞を含有する０．２ｍＬのＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞懸濁液（ＨＢＳＳ中細胞懸濁液とマトリゲル（Ｒ）との１：１混合物）を肋骨郭（ｒｉｂ
ｃａｇｅ）領域の右側に皮下移植した。０日目に、群１、２、および３内の全ての動物は１０ｍＬ／ｋｇの試験製品またはＨＢＳＳ（表１）の腹腔内注射を受けた。群４および５内の動物は１４日目または１００ｍｍ３の平均腫瘍寸法において１０ｍＬ／ｋｇの試験製品の腹腔内注射を受けた。最初の腹腔内注射後に、全ての動物は８０日目まで腹腔内服用量（５ｍＬ／ｋｇ）の試験製品または対照を毎週受ける。
【００４６】
最初の服用に関する２０ｍｇ／ｋｇおよびその後の服用に関する１０ｍｇ／ｋｇの服用量は最も近い以前の体重値を基準として計算された。動物は８０日目までまたは腫瘍が２，０００ｍｍ３の容量に達するまで毎週月曜日にＩＰ投与された。
【００４７】
動物体重および腫瘍容量は試験終了まで１週１回測定された。動物は０日目から始まって体重測定されたが、腫瘍容量は触診可能時にのみ記録された。腫瘍はカリパスを用いて三次元で測定されそして腫瘍容量は式Ｖ＝（Ｌ×Ｗ×Ｔ）／２［式中、Ｌ＝長さであり、Ｗ＝幅でありそしてＴ＝厚さである］に基づき計算された。
【００４８】
腫瘍が〜２０００ｍｍ３の平均容量に達した時に試験終了が予定され、動物の安寧性が危うくならなかった状態では試験を延長する選択肢もあった。終了時に、動物をＣＯ２窒息により安楽死させそして腫瘍を切除しそして重量測定した。個々の腫瘍を次に二分し、一方の半分はＯＣＴ中で急速冷凍しそして他方の半分は１０％ホルマリン中で固定した。血清試料を各動物から終了時に心臓穿刺により採取した。
【００４９】
結果 各処理群の成長速度を腫瘍容量（ｍｍ３）対時間（移植後日数）の関数としてプロットした（図１および２）。全ての群において１００％の取得率（ｔａｋｅ ｒａｔｅ）があった。０日目（図１）または１４日目（図２）におけるｈＩｇ対照を用いる動物の処置はＨＢＳＳ負対照と比べて腫瘍成長を有意に与えなかった（それぞれ、Ｐ＝０．７７９、Ｐ＝０．９７９）。
【００５０】
０日目にＣＮＴＯ８５９で処置した動物における腫瘍成長は６２％（Ｐ＜０．０００１）抑制された（図１）。ＣＮＴＯ８６９を用いる処置が１４日目に開始された場合には、平均腫瘍寸法が１００ｍｍ３であった時に、腫瘍成長率は４７％（Ｐ＜０．０００１）抑制された（図２）。
【００５１】
ＣＮＴＯ８５９の合計組み合わせ処置効果もｈＩｇ対照の合計処置効果と比べて有意であった（Ｐ＜０．０００１）。Ｐ＜０．００５として定義される日毎の有意性は一般的に１７日の処置後に得られた。
【００５２】
結果は、ＣＮＴＯ８５９が腫瘍成長速度を６２％まで抑制したことを示す。抗−ヒト組織因子ＩｇＧ抗体がヒト誘発腫瘍成長をインビボで抑制する能力を有することが初めて示された。ＣＮＴＯ８５９を用いる早期（０日目）および後期（１４日目）処置の両者とも腫瘍成長速度を有意に抑制した。
実施例２
正常位異種移植片モデルにおけるヒト乳癌に対する抗−ＴＦ抗体の効果
この実施例では、ＳＣＩＤ／ベージュマウスの乳房脂肪パッド内に注射されたヒト乳癌細胞系統ＭＤＡＭＢ２３１を用いる正常位腫瘍成長モデルを使用してＣＮＴＯ８５９の抗−腫瘍効果を試験した。さらに、抗−組織因子抗体の構造に対する変数：ヒト種同定ＣＮＴＯ８５９（ＩｇＧ４）およびＣＮＴＯ８６０（ＩｇＧ１）；並びにＣＮＴＯ８５９ａｌａ／ａｌａと表示されるＦｃＲ結合領域ＣＮＴＯ８５９の変更、の影響を比較した。
【００５３】
材料および方法 生後４週間の雌ＳＣＩＤ／ベージュマウス（Ｃ．Ｂ．−１７／ＩｃｒＣｒｌ−ｓｃｉｄ−ｂｇＢＲ）をチャールス・リバー・ラボラトリーズから入手しそして実験前１０−１４週間にわたり気候順化させた。マウスをフィルター・トップ・ケージ内で７−８匹／ケージで飼育されそしてオートクレーブにかけられた食料および細菌（０．１３ｍｇ／ｍＬのトリメトプリム（ｔｒｉｍｅｔｈｏｐｒｉｍ）／０．６６ｍｇ／ｍＬのスルファメトキセート（ｓｕｌｆａｍｅｔｈｏｘａｔｅ））を含有する酸性化された水を随時供給された。試験開始前５日間入れられた個別に番号がつけられた耳札により動物は同定された。入手先、性別、動物数、動物ＩＤ番号、群番号、処置、試験番号およびＩＡ
ＣＵＣ処方番号の標識が付けられたケージカードがケージに固定された。全ての動物試験はペンシルバニア州、ラドノルのセントコル・インコーポレーテッドにおいて動物試験場で研究室動物の管理および使用に関する国立衛生機関指針に従い行われた。
【００５４】
ヒト乳癌細胞系統ＭＤＡＭＢ２３１はセントコルの細胞貯蔵所から得られそして殺菌性であり且つマイコプラズマを含まないと推定された。細胞を１０％ＦＢＳおよび１％ＬＮＮが補充されたＤＭＥＭ培地中で３７℃、５％ＣＯ２において培養した。細胞をトリプシン−ＥＤＴＡを用いて対数期成長において回収しそして血清を含まないＨＢＳＳ中で５×１０７個の細胞／ｍＬで再懸濁させ、そして（Ｒｔ鼠径＃２／３）乳房脂肪パッド内に５０μＬの容量で移植された。
【００５５】
試験および対照抗体は以下の通りである：ＣＮＴＯ８５９、３．７５ｍｇ／ｍＬの株濃度；ＣＮＴＯ８５９、１０．２９ｍｇ／ｍＬの株；ＣＮＴＯ８６０、２．４ｍｇ／ｍＬの株；ＣＮＴＯ８５９Ａｌａ／Ａｌａ、Ｃ１０８１、１ｍｇ／ｍＬの株；ヒトＩｇ、ＺＬＢ・バイオプラズマ・ＡＧ、スイス、ベルン、３０ｍｇ／ｍＬの株濃度。
【００５６】
抗体を適当な濃度でＰＢＳ中に供給した。全ての対照および試験製品は＜１ＥＵ／ｍｇとなるまでエンドキシン試験しそして静脈内投与されるであろう。
【００５７】
動物を７−８匹のマウス／群に無作為分類した。０日目に２．５×１０６個のＭＤＡＭＢ２３１細胞を動物の乳房脂肪パッド内に５０μＬの容量で３０ｇ針を用いて注射した。静脈内抗体療法は３日目に開始された。３回の試験の各々に関する投与処方および濃度は、それぞれ、表２、３および４に詳細に記述される。
【００５８】
【表２】
【００５９】
【表３】
【００６０】
【表４】
【００６１】
１週１回８〜９週間にわたりマウスを体重測定しそして腫瘍容量を記録した。腫瘍容量は（Ｌ×Ｗ２）／２として計算された。試験は腫瘍細胞接種から約８〜９週間後に終了した。動物が終了点より前に急速な体重喪失、呼吸困難を経験するかまたは瀕死になった場合には、動物を試験コーディネーターにより安楽死させた。動物はＣＯ２窒息により安楽死されそして次に体重測定された。肺および腋窩リンパ節が外科的に除去され、冷たいＰＢＳ中ですすがれ、瓶詰めされ、重量測定されそして直ちにボワン溶液（Ｂｏｕｉｎ’ｓ
ｓｏｌｕｔｉｏｎ）中で固定された。原発性腫瘍が病歴分析用に切除され、重量測定されそして次にＢＺＴ溶液中で固定された。
【００６２】
主要な抗−腫瘍効果 腫瘍容量を試験中に１週１回監視しそして記録した。終了時に、原発性腫瘍がＣＯ２安楽死させたＳＣＩＤ／ベージュマウスから外科的に切除されそして重量測定された。腫瘍容量および最終質量が時間につれてプロットされた（図３および４）。動物がＣＮＴＯ８５９で処置された場合には、ＰＢＳまたは対照ヒトＩｇＧ処置動物と比べて腫瘍成長は９５％抑制された。（ｐ＝０．００３９およびｐ＝０．０１２６、両側パラメーターｔ試験、ｎ＝８）。
【００６３】
第二の試験では、服用量の影響を試験した。ＣＮＴＯ８５９は１週１回与えられる０．１ｍｇ／ｋｇ程度の低い服用量で腫瘍成長を抑制した。これは、０．１、１、５、１０または２０ｍｇ／ｋｇのいずれかのＣＮＴＯ８５９で処置された動物においてはＰＢＳおよびヒトＩｇ対照群と比べて腫瘍容量変化（図６）および個々の最終腫瘍重量（図７）として腫瘍進行における有意な減少があった。
【００６４】
３種の濃度におけるＣＮＴＯ８５９およびＣＮＴＯ８６０の間の比較試験では、我々の抗−組織因子抗体のＩｇＧ１変種が腫瘍成長だけでなく腫瘍出現の防止においても優れていたことが示された（図８−１１）。各群のそれぞれからの腫瘍容量は（図８に）時間につれての群内の平均腫瘍重量としてそして個々の最終重量として並びに平均（図１０）とした等々で示される。
【００６５】
腫瘍出現に対する効果 ＣＮＴＯ８５９療法は処置された動物の腫瘍出現における顕著な差も示した。第一の試験では、細胞は注射部位における小節の触診により観察されるように乳房脂肪パッド内に付着されそして接種されうるが、腫瘍が測定可能な寸法になる約３８日目までは測定するには小さすぎた。対照的に、ＰＢＳまたは対照ヒトＩｇ処置された動物においては測定可能な腫瘍が１７日目でから出現した。図５は、ＰＢＳ、対照ＩｇまたはＣＮＴＯ８５９のいずれかで処置された動物における腫瘍出現率を示す。この正常位ＭＤＡＭＢ２３１腫瘍成長モデルからの結果は、ＣＮＴＯ８５９が腫瘍出現、成長およ
び進行の非常に有効な抑制剤であることを示す。賦形剤対照またはＩｇ対照と比べて、ＣＮＴＯ８５９は腫瘍成長を９５％（ｐ＝０．００３９およびｐ＝０．０１２６、両側パラメーターｔ試験、ｎ＝８）そして腫瘍出現を８７．５％（ＰＢＳに対してｐ＝０．００１７および対照ヒトＩｇに対してｐ＝０．００８６、両側パラメーターｔ試験、ｎ＝８）減少させた。
【００６６】
ＣＮＴＯ８５９およびＣＮＴＯ８６０の間の比較試験では、０．１ｍｇ／ｋｇの薬用量を用いる場合には、ＣＮＴＯ８６０はＰＢＳおよびヒトＩｇ対照群と比べて最初の腫瘍出現を４４および３７日間遅らせることができた。同様に、ＣＮＴＯ８５９も最初の腫瘍出現を２３および１６日間遅らせることができた。さらに、試験の終了により、ＣＮＴＯ８６０群では動物の７０％以上がＣＮＴＯ８５９群における１５％と比べて腫瘍を含まなかった。ＰＢＳ、ヒトＩｇおよびＣＮＴＯ８５９ａｌａ／ａｌａ群における全ての動物は４４日目に腫瘍を有していた（図１１）。
【００６７】
まとめ ＣＮＴＯおよび２種の変種をこの異種移植片モデルを用いる順次実験において腫瘍成長および進行の防止における効果に関して比較した。第一の試験では、ＣＮＴＯ８５９は腫瘍移植後３日目から始めて１週１回２０ｍｇ／ｋｇの濃度で与えられた場合には腫瘍成長の防止において非常に効果的であり、ＰＢＳまたは対照Ｉｇ処置群（それぞれ、ｐ＝０．００３９およびｐ＝０．０１２６）のいずれかと比べて９５％成長抑制率を生じた。我々はＣＮＴＯ８５９で処置された動物における腫瘍出現においてＰＢＳまたは対照Ｉｇ処置群（それぞれ、ｐ＝０．００１７およびｐ＝０．００８６）のいずれかと比べて８７．５％の減少を観察した。
【００６８】
第二の試験では、ＣＮＴＯ８５９を０．１ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇの範囲にわたる順次薬用量で１週１回投与した。結果は、ＣＮＴＯ８５９を用いる抗−ＴＦモノクローナル抗体療法は、０．１ｍｇ／ｋｇの非常に低い服用量でも、腫瘍進行を遅らせる際に非常に有効であり、ＰＢＳまたは対照Ｉｇ処置群（それぞれ、ｐ＝０．００１２およびｐ＝０．０１０６、ｔ−分布を用いるウィルコキソン（Ｗｉｌｃｏｘｏｎ）二試料試験）のいずれかと比べて９０％を越える腫瘍抑制を生じた。１、５、１０および２０ｍｇ／ｋｇの薬用量は腫瘍成長を９５％以上有意に抑制した。
【００６９】
最後に、別の試験で、ＣＮＴＯ８５９の効果をＣＮＴＯ８６０、ＣＮＴＯ８５９のＩｇＧ１変種、およびＡＤＣＣ最小化変種であるＣＮＴＯ８５９ａｌａ／ａｌａに対して評価した。０．０１ｍｇ／ｋｇのＩｇＧ４またはＩｇＧ１治療抗体のいずれかの服用量はＰＢＳ、ヒトＩｇ対照またはＣＮＴＯ８５９Ａｌａ／Ａｌａと差はなかった。対照的に、１ｍｇ／ｋｇのＣＮＴＯ８５９またはＣＮＴＯ８６０のいずれかの服用量でも腫瘍成長を９５％以上抑制することができた。興味深いことに、０．１ｍｇ／ｋｇの服用量水準では、ＣＮＴＯ８６０がこの低服用量でも腫瘍成長を９５％以上抑制したがＣＮＴＯ８５９処置された腫瘍は療法からの除外の兆候を示し〜８５％だけの抑制を生じたことにより、ＣＮＴＯ８６０対ＣＮＴＯ８５９の効果は区別される。さらに、ＣＮＴＯ８６０は０．１ｍｇ／ｋｇで使用される場合には腫瘍進行の遅延において、多分追加のＡＤＣＣ活性のために、ＣＮＴＯ８５９より有効であった。
実施例３
膵臓腺癌異種移植片における腫瘍成長の抑制
この実施例では、我々はＳＣＩＤマウスの側腹部で成長した膵臓腺癌細胞系統ＢｘＰＣ−３の成長抑制に対する抗−組織因子抗体の効果を示す。ＣＮＴＯ８５９を、２０ｍｇ／ｋｇの最初の充填服用量後に１週１回１０ｍｇ／ｋｇで投与した。ＣＮＴＯ８５９を用いる療法が腫瘍移植から１日後に開始された群では、ＢｘＰＣ−３腫瘍の成長は４６．９％抑制された（ｐ＜０．００１）。処置が５０−１００ｍｍ３の平均腫瘍容量で開始された群では、腫瘍は穏やかに抑制されたが統計学的有意性は得られなかった（ｐ＝０．６２８
０）。
【００７０】
材料および方法 チャールス・リバー・ラボラトリーズ（ウィルミントン）からの生後６〜８週間の雌ＳＣＩＤマウスを入手しそして実験前１０−１４日間にわたり気候順化させた。マウスをフィルター・トップ・ケージ内で７−８匹／ケージで飼育されそしてオートクレーブにかけられた食料および細菌（０．１３ｍｇ／ｍＬのトリメトプリム／０．６６ｍｇ／ｍＬのスルファメトキセート）を含有する酸性化された水を随時供給された。試験開始前７日間入れられた個別に番号がつけられた耳札が動物を同定した。入手先、性別、動物数、動物ＩＤ番号、群番号、処置、試験番号およびＩＡＣＵＣ処方番号の標識が付けられたケージカードがケージに固定された。全ての動物試験はペンシルバニア州、ラドノルのセントコル・インコーポレーテッドにおいて動物試験場で研究室動物の管理および使用に関する国立衛生機関指針に従い行われた。
【００７１】
ヒトＢｘＰＣ−３膵臓腺癌細胞系統はＡＴＣＣ（メリーランド州、ロックビル、カタログ＃ＣＲＬ−１６８７）から得られた。それらはウイルスまたはマイコプラズマ汚染がないことが試験され、そしてセントコルズ・セル・バイオロジー・サービセス（Ｃｅｎｔｏｃｏｒ’ｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）により貯蔵された。細胞を１０％ＦＢＳおよび１％ＬＮＮが補充されたＤＭＥＭ培地中で３７℃、５％ＣＯ２において培養した。細胞をトリプシン−ＥＤＴＡを用いて対数期成長において回収しそして殺菌性ＨＢＳＳ中で１．５×１０７個の細胞／ｍＬで再懸濁させた。
【００７２】
セントコル，インコーポレーテッドで製造されたＣＮＴＯ８５９は３．７５ｍｇ／ｍＬの株濃度で使用され；ｈＩｇ、ＺＬＢ・バイオプラズマ・ＡＧ、スイス、ベルンは殺菌性ＵＳＰ水およびＰＢＳ，ｐＨ７．１、ギブコＢＲＬ中３０ｍｇ／ｍＬの株濃度で使用された試験品はすべて殺菌性ＨＢＳＳ中２ｍｇ／ｍＬの作業濃度に希釈された。
【００７３】
０日目に、マウスを５群のそれぞれに１群当たり１０匹のマウスで無作為に指定した。細胞をヌードマウスの側腹部内に３×１０６個のＢＸＰＣ−３腫瘍細胞の濃度で０．２ｍＬの容量でまたはＰＢＳ単独で（群１）皮下接種した。治療処方は表５に詳細に示されている。
【００７４】
１日目に、群１の動物は０．２ｍＬのＰＢＳ（腹腔内）を受容し、群２は２０ｍｇ／ｋｇのｈＩｇ対照抗体を受容し、そして群３は２０ｍｇ／ｋｇのＣＮＴＯ８５９抗体を受容した。抗体は引き続き７日毎に１回１０ｍｇ／ｋｇで投与された。ＰＢＳは７日毎に１回０．２ｍＬで与えられた。群４の動物は腫瘍が約５０ｍｍ３〜１００ｍｍ３に達した時に腹腔内投与される２０ｍｇ／ｋｇでそしてその後は７日毎に１回１０ｍｇ／ｋｇで投与されるＣＮＴＯ８５９を用いる処置を受けた。群５の動物は腫瘍寸法が約５０ｍｍ３〜１００ｍｍ３に達した時に腹腔内投与される２０ｍｇ／ｋｇでそしてその後は７日毎に１回１０ｍｇ／ｋｇで投与されるヒトＩｇを用いる処置を受けた。
【００７５】
【表５】
【００７６】
試験の終了時まで動物体重および腫瘍容量を１週１回監視した。動物は０日目から始まって体重測定されたが、腫瘍容量は触診可能になってからのみ記録された。腫瘍はカリパスを用いて三次元で測定されそして腫瘍容量は式Ｖ＝（Ｌ×Ｗ×Ｔ）／２［式中、Ｌ＝長さであり、Ｗ＝幅でありそしてＴ＝厚さである］に基づき計算された。
【００７７】
腫瘍が〜２０００ｍｍ３の平均容量に達した時に試験終了が予定され、動物の安寧性が危うくならなかった状態では試験を延長する選択肢もあった。終了時に、動物をＣＯ２窒息により安楽死させそして腫瘍を切除しそして重量測定した。個々の腫瘍を次に二分し、一方の半分はＯＣＴ中で急速冷凍しそして他方の半分は１０％ホルマリン中で固定した。血清試料を各動物から終了時に心臓穿刺により採取した。
【００７８】
結果 腫瘍容量（ｍｍ３）対時間（移植後日数）の関数としてプロットした各処理群の成長速度が示される（図１２）。１日目にｈＩｇで処置されたマウスに関しては２９日目に４０ｍｍ３の平均腫瘍容量に達した。しかしながら、ＣＮＴＯ８５９で処置されたマウスでは、平均腫瘍容量は３６日目まで〜４０ｍｍ３に達しなかった。
【００７９】
１日目におけるＣＮＴＯ８５９を用いる動物の処置は腫瘍成長の４６．９％抑制を生じた（Ｐ＜０．０００１）（図１２参照）。約５０−１００ｍｍ３における腫瘍の処置は２８％の穏やかであるが有意でない抑制を生じた（Ｐ＜０．６２８０）（図１３参照）。
【００８０】
１４日ＣＮＴＯ８５９−処置群では７匹のマウスのなかの２匹は腫瘍移植後１８日で死亡させなければならなかった。これらの動物の最終腫瘍容量は、それぞれ、１２９．９７ｍｍ３および４６１．１０ｍｍ３であった。１４日ｈＩｇ処置群では、８匹の動物が１８日目に７匹に減少した。これらの理由のために、試験の最後の処置工程は２５日目に終了した。
【００８１】
まとめ ＣＮＴＯ８５９は腫瘍成長率を４６．９％まで抑制した。我々の知識の限りでは、抗−ヒト組織因子抗体が膵臓腺癌の腫瘍成長を抑制する能力を有することが初めて示された。ＣＮＴＯ８５９を用いる早期処置はｈＩｇ対照抗体と比べて腫瘍成長率の有意な抑制（Ｐ＜０．０００１）を生じた。ＣＮＴＯ８５９を用いる後期処置は腫瘍成長率を２８％抑制したが統計学的に有意でなかった（Ｐ＝０．６２８０）。
実施例４
マトリゲル脈管形成モデルにおけるＰＡＮＣ−１膵臓腺癌により誘発される脈管形成の抑
制
この実施例では、我々はマトリゲル脈管形成モデルにおけるＰＡＮＣ−１膵臓腺癌により誘発される脈管形成の抑制における抗−ネズミ組織因子抗体の効果を示す。ネズミ組織因子に対する抗体は全長ｍＩｇＧ２ａ抗体に転化されたヒト抗体配列のファージライブラリーの指定された選択を用いて得られた。ＰＨＤ１２６およびＰＨＤ１２７と表示されるヒト抗−マウスＴＦ抗体は両者ともマウス組織因子の活性をＣＮＴＯ８５９およびその同族体のものと同じ機構により抑制する。具体的には、ＰＨＤ１２６およびＰＨＤ１２７はＦＸの競合抑制剤であり、そしてＴＦ、因子ＶＩＩａおよび酵素的に活性な因子Ｘａにより形成される三元複合体の生成を抑制する。両方の抗体はネズミＴＦにより促進される凝固を抑制しそしてネズミＴＦに関してヒトＴＦより選択的である。
【００８２】
材料および方法 チャールス・リバー・ラボラトリーズ（ウィルミントン）からの生後４〜６週間の雌ヌード（Ｎｕ／ＮｕＣＤ１）マウスが得られそして実験前１０−１４日間にわたり気候順化された。マウスはフィルター・トップ・プラスチック・ケージ内で（７匹／ケージ）飼育されそしてオートクレーブにかけられた食料および水を随時供給された。試験開始前少なくとも７日間入れられた番号がつけられた耳札または刺青が動物を個別に同定した。入手先、性別、動物数、動物ＩＤ番号、群番号、処置、試験番号およびＩＡＣＵＣ処方番号の標識が付けられたケージカードがケージに固定された。全ての動物試験はペンシルバニア州、ラドノルのセントコル・インコーポレーテッドにおいて動物試験場で行われた。
【００８３】
ヒト膵臓腺癌細胞系統ＰＡＮＣ−１はＡＴＣＣ（メリーランド州、ロックビル、カタログ＃ＣＲＬ−１６８７）から得られた。それらはウイルスまたはマイコプラズマ汚染がないと試験され、そしてセントコルズ・セル・バイオロジー・サービセスにより貯蔵された。
【００８４】
抗体の競合ＩｇＧ変種はセントコルで処理されそしてクローン化された：ＰＨＤ１２６株溶液は１．７ｍｇ／ｍｌであり、ＰＨＤ株溶液は０．６２ｍｇ／ｍＬであり、そして無関係な対照抗体ｃＶａＭは１０．０９ｍｇ／ＭＬであった。全ての抗体が試験されそしてＬＡＬ＜４ＥＵ／ｍｇを有していた。
【００８５】
ＰＡＮＣ−１細胞を対数期においてトリプシン処理により回収し、次に完全培地中で１回そしてＨＢＳＳ中で１回洗浄した。ＰＡＮＣ−１細胞（３．２×１０７個の細胞）を８．０ｍＬの氷冷殺菌性ＨＢＳＳ中に再懸濁させ、そして２４ｍＬの氷冷マトリゲル（ベクトン・ディクソン（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｓｏｎ））と混合した（最終濃度は１×１０６個の細胞であった）。マトリゲルの最終濃度は１０ｍｇ／ｍＬであった。
【００８６】
マウスを５群（７匹のマウス／群）に無作為分類した。マウスをケタミン（Ｋｅｔａｍｉｎｅ）／キシラジン（ｘｙｌａｚｉｎｅ）（９０／０１ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）で麻酔をかけそして体重測定した。マウスに２つの部位のそれぞれに０．５ｍｌのマトリゲルを腫瘍細胞懸濁液と共に注射した（群１〜４）。群５の動物にはマトリゲルだけを注射した。
【００８７】
注射部位は、各側面上で最終肋骨の後方約０．５インチ且つ背骨からの０．５インチの背側であった。注射部位における指押しがマトリゲル重合を促進しそしていずれかの起きうる漏出を防止する。麻酔薬の使用および冷たい物質の注射により、動物が意識を取り戻すまで体温は維持された。これらの条件下で、脈管形成因子はゆっくり放出され脈管形成の進行および新脈管形成を刺激する。血管によるゲル栓の侵襲は１２−４８時間内に起き、そして新脈管形成はマトリゲルの注射後７−１０日間まで続く。
【００８８】
動物に０．２ｃｃ（１０ｍｇ／ｋｇ）の各試験製品または１０ｍＬ／ｋｇの対照を腫瘍
／マトリゲル移植後１および５日目に注射した。
【００８９】
【表６】
【００９０】
全ての動物を１、５、および９日目（試験の終了時）に体重測定した。終了時にマトリゲル栓を切除しそして重量測定した。９日目に、全てのマウスをＣＯ２窒息により安楽死させた。動物を閉鎖容器（空の微小隔離ケージまたは密封プラスチックバッグ）内で腫瘍学研究所に移した。動物飼育場の外側では、動物は生物安全フード内で取り扱われた。作業が完了した時に、体は密封プラスチックバッグ内で動物飼育場冷凍機に戻された。栓を外科的に除去しそして盲検方式で重量測定した。栓を写真撮影しそして次にヘモグロビン含有量および管長さに関して処理した。
【００９１】
試験中のいずれかの時点で動物が瀕死状態（＞１５％の体重喪失、呼吸困難、運動失調，震顫など）になった場合には、ＰＩが通知されそして動物は安楽死されるであろう。体の処理はＰＩの自由裁量であった。
【００９２】
まとめ 管密度分析後に、ＰＨＤ１２６がＰＡＮＣ−１誘発性脈管形成を約６０％（統計学的に有意でない）抑制したがＰＨＤ１２７は脈管形成を対照抗体と比べて約８８％（ｐ＜０．０５）抑制したことを我々は見出した。
【００９３】
ＰＨＤ１２７は脈管形成を６６％までの率で（ｐ＜０．０５、一方向ＡＮＯＶＡ）抑制し、抗−組織因子抗体が脈管形成を抑制する能力を有することを示した。ＰＨＤ１２６を用いる処置も脈管形成を同じモデルにおいて約４５％抑制したが、結果は統計学的に有意でなかった（図１４）。
【００９４】
これらのデータは、増殖する細胞は宿主ＴＦが介在する宿主応答を生じて脈管形成をもたらし、従って腫瘍成長を許す条件を作成することを示している。
【図面の簡単な説明】
【００９５】
【図１】図１は、ヌードマウスの側腹部内に皮下移植されそしてｈＩｇに無関係にＣＮＴＯ８５９またはＨＢＳＳを１週１回０日目から始まって投与されたヒト乳癌細胞の腫瘍成長速度（容量変化）を示すグラフである。
【図２】図２は、ＣＮＴＯ８５９またはｈＩｇが１週１回１４日目から始まって投与されたマウス群に関する図１と同じ実験からのデータを示すグラフである。
【図３】図３は、対照動物、ＰＢＳまたは対照ヒトＩｇのいずれかで処置された動物、およびＣＮＴＯ８５９で処置された動物のいずれかからの腫瘍容量における変化を示すグラフである。
【図４】図４は、対照動物、ＰＢＳまたは対照ヒトＩｇのいずれかで処置された動物、およびＣＮＴＯ８５９で処置された動物のいずれかからの最終腫瘍容量の平均および標準偏差を表わす棒グラフである。
【図５】図５は、腫瘍が移植された日と同じ日から始まるＰＢＳ、対照ＩｇまたはＣＮＴＯ８５９のいずれかで処置された動物における腫瘍出現率を示す。
【図６】図６は、ＰＢＳ、対照ヒトＩｇまたは種々の薬用量のＣＮＴＯ８５９のいずれかで処置された動物における容量により測定されたＭＤＡＭＢ２３１異種移植片の腫瘍進行を示す。
【図７】図７は、ＰＢＳ、対照ヒトＩｇまたは種々の薬用量のＣＮＴＯ８５９（０．１、１、５、１０および２０ｍｇ／ｋｇ）のいずれかで処置された動物からの最終腫瘍容量の分布を示す分布プロットである。
【図８】図８は、マウスに（乳房組織に）正常位移植されたヒト乳癌細胞ＭＤＡＭＢ２３１異種移植片を用いそしてマウスがＰＢＳ、対照ヒトＩｇ、ＣＮＴＯ８５９Ａｌａ／Ａｌａまたは種々の薬用量（０．０１、０．１および１ｍｇ／ｋｇ）のＣＮＴＯ８５９およびＣＮＴＯ８６０のいずれかで処置された実験に関する時間につれての腫瘍容量のグラフである。
【図９】図９は、０．１ｍｇ／ｋｇにおける対照並びにＣＮＴＯ８５９およびＣＮＴＯ８６０だけを示す、図８に示されたものと同じ実験からの群の４種の平均および標準偏差を示す。
【図１０】図１０は、図８と同じ実験における各群からの個々の最終腫瘍容量および平均の各々のグラフ表示である。
【図１１】図１１は、図８と同じ実験からの腫瘍出現データを示す。
【図１２】図１２は、翌日から始まるＣＮＴＯ８５９で処置されたマウスに移植されたＢｘＰＣ−３ヒト膵臓腫瘍細胞の腫瘍成長速度（容量変化）を示すグラフである。
【図１３】図１３は、定着した腫瘍をＣＮＴＯ８５９で処置した場合のマウスに移植されたＢｘＰＣ−３ヒト膵臓腫瘍細胞の腫瘍成長速度（容量変化）を示すグラフである。
【図１４】図１４は、マウスにおいてマトリゲル（ＭＡＴＲＩＧＥＬ）内の管長さにより測定されたＰＡＮＣ−１ヒト膵臓腫瘍細胞誘発性脈管形成がヒト抗−ネズミＴＦ抗体（ＰＨＤ１２７）により８８％（ｐ＜０．０５）減じられることを示す棒グラフである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腫瘍細胞の成長を特異的に防止または抑制することにより癌を処置するための組織因子（ＴＦ）拮抗物質の使用方法に関する。本発明は、より特に、腫瘍の成長を抑制するのに充分な量での、例えば少なくとも１種のＴＦ蛋白質もしくはその断片に特異的な特異化された部分または変種を包含するＴＦに指向された抗体のようなＴＦ拮抗物質の使用によるそのような疾患の処置方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
組織因子（ＴＦ）
凝血はフィブリンの生成をもたらす段階的な順次反応である。凝固段階は２つの重複する経路よりなり、それらの両者とも止血に必要である。内因性経路は循環する血液中に存在する蛋白質因子を含んでなるが、外因性経路は組織因子（ＴＦ）を必要とし、それは脈管損傷に応答して種々の組織の細胞表面上で発生する（非特許文献１）。血液への露呈時に、ＴＦは不溶性フィブリン塊を生成する活性化段階の潜在的に爆発性である段階を作動させる。ＴＦは抗凝固剤療法の標的として研究されてきた。
【０００３】
ＴＦは因子ＶＩＩおよびＶＩＩａ用の受容体として機能しそしてそれにより脈管損傷に応答する凝固段階の外因性経路を始動させる単鎖の２６３アミノ酸膜糖蛋白質である。ＴＦは因子ＶＩＩａ用の受容体並びに共因子として作用するトランスメンブラン細胞表面受容体であり、細胞表面上に蛋白質分解活性ＴＦ：ＶＩＩａ複合体を生成する（非特許文献２）。止血の維持におけるその役割の他に、過剰のＴＦは病原性症状に関係していた。具体的には、ＴＦの合成および細胞表面発現は脈管疾患（非特許文献３）およびグラム−陰性敗血症ショック（非特許文献４）に関係していた。
ＴＦ拮抗物質
種々の抗−ＴＦ抗体が既知である。例えば、Ｃａｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ（非特許文献５）は不動化された因子ＶＩＩ上の親和クロマトグラフィーにより精製されたＴＦを用いるマウスの免疫処理により製造されたハイブリドーマ生成性モノクローナル抗体を開示している。Ｒｕｆ ｅｔ ａｌ（非特許文献６）はヒトＴＦに対するネズミモノクローナル抗体の抗凝固能力を同定した。ＲＦ上のＦＶＩＩ結合部位を標的とするモノクローナル抗体の能力はＴＦとの結合に関するＦＶＩＩと競合するそれらの能力およびＴＦが血漿と接触した時に急速に生成するＴＦ／ＶＩＩａ複合体の生成に依存する。そのような抗体はそれ故、血漿中のＴＦの比較的ゆっくりした抑制剤であった。１種のモノクローナル抗体であるＴＦ８−５Ｇ９はＴＦ／ＶＩＩａ複合体を抑制可能であり、血漿中で即時の抗凝固効果を与える。この抗体は特許文献１、特許文献２、および特許文献３に開示されている。Ｒｕｆ ｅｔ ａｌ（上記非特許文献２）は、ＴＦ／ＶＩＩａ複合体を不活性化する機構は、その生成を防止するよりむしろ、インビボでの凝固の妨害のための戦略を与えうることを示唆した。ＴＦと結合する因子ＶＩＩを抑制する他の抗体とは対照的に、ＴＦ８−５Ｇ９は受容体と結合する因子ＶＩＩまたは因子ＶＩＩａに対するかすかなそして間接的な効果だけを示す。ＴＦ８−５Ｇ９はナノモル結合定数を有するＴＦの細胞外領域と結合してＴＦ：Ｆ．ＶＩＩａ：Ｆ．Ｘ三元開始複合体の生成を遮断する（非特許文献７）。
【０００４】
抗−ＴＦモノクローナル抗体は様々な種においてＴＦ活性を抑制することが示されており（非特許文献８）そして抗−ＴＦ抗体の中和が敗血症のヒヒモデルにおける死亡を防止し（非特許文献９）そしてウサギにおけるエンドキシン誘発性ＤＩＣを緩和する（非特許文献１０）ことが示された。
【０００５】
特許文献４はＴＦ８−５Ｇ９抗体から誘導されたＣＤＲ−移植された抗−ＴＦ抗体を開
示している。他のヒトに適応されたまたはヒト抗−ＴＦ抗体は非特許文献１１、特許文献５、特許文献６および特許文献７に開示されている。
癌におけるＴＦの役割
組織因子は種々の悪性腫瘍および単離されたヒト腫瘍細胞系統上でも過剰発現され、腫瘍成長および生存におけるある役割を示唆する。ＴＦは正常な血管を内張りする健康な内皮細胞により製造されないが、腫瘍脈管中のこれらの細胞上で発現される。それは、２つの脈管形成、すなわち成長する動物および脈管形成における新血管の生成、正常および悪性腫瘍成体組織における現存動脈からの新毛細血管の発生、においてある役割を演ずるようである。ＴＦの抑制または標的化は従って、直接的にＴＦ介在細胞信号化または他の活性を抑制することによるＴＦ過剰発現性腫瘍細胞の生存に影響しうる有用な抗−腫瘍戦略でありうる。さらに、この方式は間接的に腫瘍内の内皮細胞を発現するＴＦの成長または機能を抑制することによる抗脈管形成機構により腫瘍成長を防止しうる。
ＴＦおよび脈管形成
脈管形成は新しい毛細血管を発生する工程であり、そして内皮細胞の活性化された増殖から生ずる。新脈管形成は厳しく調整され、そして胚成長、組織再構成、外傷治癒および黄体成長の周期的循環中にのみ起きる（非特許文献１２）。
【０００６】
腫瘍組織に栄養分および酸素を供給し、廃棄生成物を送り出しそして離れた部位への腫瘍細胞の転移のための導管として作用するためには、腫瘍成長および癌進行が脈管形成および新脈管形成、血管成長および伸長を必要とするというかなりの証拠が現在ある（非特許文献１３および非特許文献１４）。それにもかかわらず、組織および腫瘍脈管形成並びに新脈管形成はＴＮＦアルファ、ＶＥＧＦ、および組織因子を包含する細胞的に製造される因子の相互作用が介在する複雑な工程である。研究は、新血管形成の開始における２種の主な作用物質であるＶＥＧＦおよびＴＦ重複の上方調整（ｕｐｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）をもたらす経路を示している（非特許文献１５）。
【０００７】
内皮細胞は通常は体内の他のタイプの細胞よりはるかにゆっくり増殖する。しかしながら、これらの細胞の増殖速度が上方調整される場合には、病理学的な脈管形成が生じうる。病理学的な脈管形成は多くの疾患に関係する。例えば、心臓血管疾患、例えば血管腫、血管線維腫、脈管変形、アテローム硬化症、癒着および浮腫硬化症；並びに眼科疾患、例えば虹彩移植後の新脈管形成、新脈管性緑内障、糖尿病性網膜症、脈管形成性角膜疾患、黄斑変性、翼状片、網膜変性、水晶体後方線維増殖症、および顆粒性結膜炎が脈管形成に関連する。慢性炎症性疾患、例えば関節炎；皮膚疾患、例えば乾癬、毛細血管拡張症、化膿性肉芽腫、脂漏性皮膚炎、静脈潰瘍、ざ瘡、しゅさ（ざ瘡しゅさもしくは紅斑しゅさ）、いぼ（ゆうぜい）、湿疹、血管腫、リンパ管腫も脈管形成−依存性である。
【０００８】
硝子体液が毛細血液により浸潤される種々の眼科疾患のために、視力は損失または喪失されうる。糖尿病性網膜症は２つの形態、すなわち非増殖性または増殖性、の１つをとりうる。増殖性網膜症は異常な新しい脈管生成（新脈管形成）により特徴づけられ、それは硝子体表面上で成長するかまたは硝子体腔内に伸びる。進行した疾患では、新脈管膜が生じて、牽引網膜剥離をもたらしうる。硝子体出血が新脈管形成から生じうる。視力症状は変動する。硝子体内出血がある場合に突然の重篤な視力喪失が起きうる。増殖性網膜症を伴う視力の予後が重篤な網膜虚血、過度の新脈管形成、または過度の線維組織生成と関連する場合には、より多く監視される。黄斑変性も同様に２つの形態、すなわち乾燥および湿潤、をとる。それほど普遍的でない滲出性黄斑変性（湿潤形態）では、しばしば網膜内出血、網膜下流体、色素上皮剥離、および色素増加を伴う脈絡膜新脈管形成の網膜下網目構造の生成がある。実際に、この複雑さは後極における顕著な上昇した瘢痕を収縮させそして残す。両方の形態の年令−関連性黄斑変性はしばしば両側性でありそして黄斑領域内で結晶腔により進行する。脈管形成病因に関連する視力喪失の別の原因は虹彩の損傷である。虹彩を角に引っ張り上げる２つの最も普遍的な症状は、例えば糖尿病患者における新
脈管性緑内障におけるような膜の収縮または虹彩が角に引っ張り上げられるブドウ膜炎に伴われる中央網膜静脈閉塞もしくは炎症性沈殿である（非特許文献１６）。
【０００９】
炎症性疾患である慢性関節リウマチも不適切な脈管形成をもたらす。滑液腔内の脈管内皮細胞の成長は炎症性サイトカインにより活性化され、そして軟骨破壊および関節内のパンヌスによる置換をもたらす（非特許文献１７、非特許文献１８、非特許文献１９）。
【００１０】
乾癬は皮膚細胞の未調節増殖により引き起こされる。急速に成長する細胞は充分な血液供給を必要とし、そして異常な脈管形成が乾癬内で誘発される（非特許文献２０）。
【００１１】
特許文献８は、微小脈管内の転移細胞の長期付着を排してそれにより転移を抑制することによる転移の開始および進行を抑制するための抗−ＴＦ抗体の使用を開示しているが、定着した腫瘍細胞の成長に対する効果は開示していない。腫瘍脈管形成を調整する因子における複雑さ並びに腫瘍成長および外傷治癒の両者における受容体介在細胞成長としての組織因子の役割の不完全な理解を前提とすると、癌の発症または不適切な脈管形成活性により特徴づけられる他の疾患においてＴＦの遮断が重要なまたは追加の役割のいずれかを演じうることが可能である。
【特許文献１】米国特許第６，００１，９７８号明細書
【特許文献２】米国特許第５，２２３，４２７号明細書
【特許文献３】米国特許第５，１１０，７３０号明細書
【特許文献４】国際公開第９６／４０９２１号パンフレット
【特許文献５】欧州特許第１０６９１８５号明細書
【特許文献６】国際公開第０１／７０９８４号パンフレット
【特許文献７】国際公開第０３／０２９２９５号パンフレット
【特許文献８】国際公開第９４／０５３２８号パンフレット
【非特許文献１】Ｄａｖｉｅ ｅｔ ａｌ．著、１９９１、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３０：１０３６３
【非特許文献２】Ｒｕｆ ｅｔ ａｌ著、（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２６７：６３７５−６３８１
【非特許文献３】Ｗｉｌｃｏｘ ｅｔ ａｌ．著、１９８９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ、８６：２８３９
【非特許文献４】Ｗａｒｒ ｅｔ ａｌ．著、１９９０、Ｂｌｏｏｄ ７５：１４８１
【非特許文献５】Ｃａｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ著、１９８７、Ｂｌｏｏｄ ７０：４９０−４９３
【非特許文献６】Ｒｕｆ ｅｔ ａｌ著、１９９１、Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ ａｎｄ Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ ６６：５２９
【非特許文献７】Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ著、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７５：８７３−８９４ １９９８
【非特許文献８】Ｍｏｒｉｓｓｅｙ ｅｔ ａｌ．著、１９８８、Ｔｈｒｏｍｂ．Ｒｅｓ．５２：２４７−２６０
【非特許文献９】Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ著、Ｃｉｒｃ．Ｓｈｏｃｋ、３３：１２７（１９９１）
【非特許文献１０】Ｗａｒｒ ｅｔ ａｌ著、（１９９０）Ｂｌｏｏｄ ７５：１４８１
【非特許文献１１】Ｐｒｅｓｔａ ｅｔ ａｌ著、Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ ８５：３７９−３８９（２００１）
【非特許文献１２】Ｆｏｌｋｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｔｒａｎ著、Ｒｅｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｖａｓｃｕｌａｒ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｔｏ ｔｕｍｏｒ ｇｒｏｗｔｈ，Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｅｘｐ．Ｐａｔｈｏｌ．’１６，２０７−２４８（１９７６）
【非特許文献１３】Ｆｏｌｋｍａｎ ｅｔ ａｌ．著、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ２８５：１１８１−１１８６、１９７１
【非特許文献１４】Ｆｏｌｋｍａｎ ｅｔ ａｌ．著、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３３３：１７５７−１７６３、１９９５
【非特許文献１５】Ｃｈｅｎ Ｊ．ｅｔ ａｌ．著、（２００１）Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．８６−３３４−５
【非特許文献１６】Ｃｈ．９９．Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｍａｎｕａｌ １７ｔｈ Ｅｄ．１９９９
【非特許文献１７】Ｋｏｃｈ ＡＫ，Ｐｏｌｖｅｒｉｎｉ ＰＪ ａｎｄ Ｌｅｉｂｏｖｉｃｈ ＳＪ．著、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．２９，４７１−４７９（１９８６）
【非特許文献１８】Ｓｔｕｐａｃｋ ＤＧ，Ｓｔｏｒｇａｒｄ ＣＭ ａｎｄ Ｃｈｅｒｅｓｈ ＤＡ著、Ｂｒａｚ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｓ．，３２，５７８−５８１（１９９９）
【非特許文献１９】Ｋｏｃｈ ＡＫ著、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ，４１，９５１９６２（１９９８）
【非特許文献２０】Ｆｏｌｋｍａｎ Ｊ．著、Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｒｎａｔｏｌ．，５９，４０−４８（１９７２）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
従って、ヒトの癌または新脈管形成（ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）および脈管形成機構（ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ）に伴われる他の増殖性疾患の処置における主要または補助療法としてＴＦに対する抗体を使用しうるかどうかを理解することは有益であろう。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
発明の要旨
本発明は、哺乳動物のおける腫瘍の成長を抑制するための、ＴＦに対して指向された抗体、並びに少なくとも１種のＴＦ蛋白質もしくはその断片に関して特異的な特異化されたその部分または変種を包含するＴＦの拮抗物質を使用する方法に関する。そのようなＴＦ拮抗物質、例えば抗体はそれらがＴＦと結合する能力により組織、特に充実性腫瘍の成長に伴われる事象を防止する方法で作用しうる。
【００１４】
別の面では、本発明は組織因子拮抗物質を脈管形成された組織の増加を抑制するのに充分な量で投与することを含んでなる該組織における増加により特徴づけられる疾患を処置する方法を提供する。
図面の簡単な記述
図１は、ヌードマウスの側腹部内に皮下移植されそしてｈＩｇに無関係にＣＮＴＯ８５９またはＨＢＳＳを１週１回０日目から始まって投与されたヒト乳癌細胞の腫瘍成長速度（容量変化）を示すグラフである。
【００１５】
図２は、ＣＮＴＯ８５９またはｈＩｇが１週１回１４日目から始まって投与されたマウス群に関する図１と同じ実験からのデータを示すグラフである。
【００１６】
図３は、対照動物、ＰＢＳまたは対照ヒトＩｇのいずれかで処置された動物、およびＣＮＴＯ８５９で処置された動物のいずれかからの腫瘍容量における変化を示すグラフである。
【００１７】
図４は、対照動物、ＰＢＳまたは対照ヒトＩｇのいずれかで処置された動物、およびＣＮＴＯ８５９で処置された動物のいずれかからの最終腫瘍容量の平均および標準偏差を表
わす棒グラフである。
【００１８】
図５は、腫瘍が移植された日と同じ日から始まるＰＢＳ、対照ＩｇまたはＣＮＴＯ８５９のいずれかで処置された動物における腫瘍出現率を示す。
【００１９】
図６は、ＰＢＳ、対照ヒトＩｇまたは種々の薬用量のＣＮＴＯ８５９のいずれかで処置された動物における容量により測定されたＭＤＡＭＢ２３１異種移植片の腫瘍進行を示す。ＣＮＴＯ８５９は全ての濃度において腫瘍成長を抑制することができた。腫瘍抑制は０．１ｍｇ／ｋｇにおける９０％（それぞれ、ｐ＝０．００１２および０．０１０６、ｔ−分布を用いるウィルコキソン（Ｗｉｌｃｏｘｏｎ）２−試料試験）からそれより高いいずれかの濃度における９５％までの範囲にわたった。
【００２０】
図７は、ＰＢＳ、対照ヒトＩｇまたは種々の薬用量のＣＮＴＯ８５９（０．１、１、５、１０および２０ｍｇ／ｋｇ）のいずれかで処置された動物からの最終腫瘍容量の分布を示す分布プロットである。
【００２１】
図８は、マウスに（乳房組織に）正常位移植されたヒト乳癌細胞ＭＤＡＭＢ２３１異種移植片を用いそしてマウスがＰＢＳ、対照ヒトＩｇ、ＣＮＴＯ８５９Ａｌａ／Ａｌａまたは種々の薬用量（０．０１、０．１および１ｍｇ／ｋｇ）のＣＮＴＯ８５９およびＣＮＴＯ８６０のいずれかで処置された実験に関する時間につれての腫瘍容量のグラフである。
【００２２】
図９は、０．１ｍｇ／ｋｇにおける対照並びにＣＮＴＯ８５９およびＣＮＴＯ８６０だけを示す、図８に示されたものと同じ実験からの群の４種の平均および標準偏差を示す。
【００２３】
図１０は、図８と同じ実験における各群からの個々の最終腫瘍容量および平均の各々のグラフ表示である。
【００２４】
図１１は、図８と同じ実験からの腫瘍出現データを示す。
【００２５】
図１２は、翌日から始まるＣＮＴＯ８５９で処置されたマウスに移植されたＢｘＰＣ−３ヒト膵臓腫瘍細胞の腫瘍成長速度（容量変化）を示すグラフである。腫瘍成長は４６．９％（ｐ＜０．００１２）抑制される。
【００２６】
図１３は、定着した腫瘍をＣＮＴＯ８５９で処置した場合のマウスに移植されたＢｘＰＣ−３ヒト膵臓腫瘍細胞の腫瘍成長速度（容量変化）を示すグラフである。腫瘍成長は３５％（ｐ＜０．０００１）抑制される。
【００２７】
図１４は、マウスにおいてマトリゲル（ＭＡＴＲＩＧＥＬ）内の管長さにより測定されたＰＡＮＣ−１ヒト膵臓腫瘍細胞誘発性脈管形成がヒト抗−ネズミＴＦ抗体（ＰＨＤ１２７）により８８％（ｐ＜０．０５）減じられることを示す棒グラフである。
発明の詳細な記述
本発明のＴＦ拮抗物質は腫瘍成長の抑制および防止において有用である。種々の形態の充実性原発性腫瘍を包含する多くの病状が本発明の方法におけるＴＦ拮抗物質を用いる処理により改善される。
腫瘍
種々の癌、例えば、頸癌、肛門癌および口腔癌、胃癌、結腸癌、膀胱癌、直腸癌、肝臓癌、膵臓癌、肺癌、乳癌、子宮頸癌、子宮体癌、卵巣癌、前立腺癌、睾丸癌、腎臓癌、脳／脳頭蓋癌（例えば、神経膠腫）、頭頸部癌、眼または眼球癌、咽門癌、皮膚黒色腫、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、ユーイング肉腫、カポジ肉腫、基底細胞カリノーマ（ｃａｒｉｎｏｍａ）および鱗状細胞カリノーマ、小細胞肺癌、繊毛癌、横紋筋肉腫、
血管肉腫、血管内皮腫、ヴィルムス腫瘍、神経芽腫、口／咽頭癌、食道癌、咽頭癌、腎臓癌およびリンパ腫をとりわけ包含する良性および悪性腫瘍の両者は本発明の抗−ＴＦ抗体を用いて処理することができる。
【００２８】
それ故、本発明は、乳癌、結直腸癌、腎細胞癌、膵臓癌、前立腺癌、鼻咽頭癌、悪性組織球増殖症、悪性のパラ新生物症候群／高カルシウム血症、充実性腫瘍、腺癌、肉腫、悪性黒色腫、血管腫、転移疾患などを包含するがそれらに限定されない、細胞、組織、器官、動物または患者における少なくとも１種の悪性疾患を緩和または処置する方法を提供する。そのような方法は、場合により、放射線療法剤、抗−脈管形成剤、化学療法剤、ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤、プロテソーム阻害剤などと、そのようなＴＦ拮抗物質の投与前の、同時のまたは後の投与により、組み合わせて使用することができる。
ＴＦ拮抗物質
ここで使用される用語「ＴＦ拮抗物質」は、ＴＦの活性を抑制または中和する物質をさす。そのような拮抗物質はこの効果を種々の方法で達成する。ＴＦ拮抗物質の１種は、ＴＦの効果を中和するのに充分な親和力および特異性を有するＴＦ蛋白質に結合するであろう。抗体および抗体断片（例えば、Ｆ（ａｂ）またはＦ（ａｂ’）２分子）はこの種類の分子に包含される。それ故、ここで使用される「抗体」は免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分をさす。ＴＦ拮抗物質の別の種類は、ＴＦ蛋白質、ムテイン、または有機分子、すなわち擬ペプチドであり、それらはＴＦ配位子と結合し、それによりＴＦの活性またはそれが分子内信号化を引き起こす能力を抑制するであろう。ＴＦ拮抗物質は、ＴＦ抗−腫瘍活性または抗−脈管形成活性を抑制する物質である限り、これらの種類のいずれであってもよい。ＴＦ拮抗物質は、ＴＦ抗体、改質されたＴＦ、アンチセンスＴＦおよびＴＦの部分ペプチドを包含する。
【００２９】
特に好ましい態様では、ＴＦ拮抗物質はネズミ、キメラ、ヒトに適応されたまたはヒトモノクローナル抗体もしくは以下の性質：ＴＦに対する因子ＶＩＩａを防止し、それにより凝固の進行を防止し、ＴＦ：ＦＶＩＩａ：ＦＸ複合体の生成を防止し、またはＴＦ信号化をその細胞内領域を介して防止する性質、の１つを有するその断片である。そのような抗体は当該技術で既知でありそして本発明の方法で使用することができる。ＴＦに対するネズミモノクローナル抗体は例えば米国特許第６，００１，９７８号明細書、米国特許第５，２２３，４２７号明細書、および第５，１１０，７３０号明細書中のように既知である。国際公開第９６／４０９２１号パンフレットは、マウス抗体ＴＦ８−５Ｇ９の可変領域からの相補決定領域（ＣＤＲ）がヒト抗体の可変領域中に移植されそしてヒト抗体の一定領域に結合されるＴＦ８−５Ｇ９抗体から誘導されるＣＤＲ−移植された抗−ＴＦ抗体を開示している。ＴＦ抗凝血剤および受容体介在活性を防止しうる他のヒトに適応された抗−ＴＦ抗体はＰｒｅｓｔａ ｅｔ ａｌ，Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ ８５：３７９−３８９（２００１）および欧州特許第１０６９１８５号明細書に開示されている。前記の参考文献の各々は引用することにより本出願の内容となる。
組成物およびそれらの使用
本発明に従えば腫瘍成長を抑制するために中和用の抗−ＴＦモノクローナル抗体を使用することができる。処置しようとする個体はいずれの哺乳動物であってもよく、そして好ましくはそのような処置を必要とするヒト患者である。モノクローナル抗体の投与量はその使用目的および投与方法に応じて変動するであろう。
【００３０】
本発明のＴＦ抗体は、成長が防止または停止されることが望まれる腫瘍組織内で効果をもたらす方法のいずれかの構成員により投与することができる。さらに、本発明の抗ＴＦ抗体は抗腫瘍効果を与えるために局部的に存在する必要はなく、従って、それらはＴＦを含有する身体部分または流体への到達が達成されるいずれの場所にでも投与することができる。悪性腫瘍組織の場合には、これらの方法は抗体を含有する調合物の直接適用を包含しうる。そのような方法は、液体組成物の静脈内投与、液体もしくは固体調合物の皮下も
しくは経皮投与、経口投与、局部投与、または間隙性もしくは相互作用性投与を包含する。
【００３１】
投与は経口的であってもまたは腫瘍もしくは組織内への局部注射によってでもよいが、一般的には、モノクローナル抗体は静脈内投与される。一般的には、投与量範囲は約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１２．０ｍｇ／ｋｇである。これは巨丸剤であってもよく、またはマイクロプロセッサーで調節され且つプログラム可能なポンプ装置により調節できる遅延もしくは連続的注入でありうる。
【００３２】
或いは、好ましくは該モノクローナル抗体の断片をコードするＤＮＡをハイブリドーマ細胞から単離されそして哺乳動物に投与することができる。ＤＮＡはそのままの形態で投与するかまたは組み換えべクタ−、例えば、バクシニアウイルス内に挿入して、患者の細胞内のＤＮＡの発現および抗体の分配を生ずる方法で投与することができる。
【００３３】
本発明の方法で使用されるモノクローナル抗体は、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１９８５に記載されているように、製薬学的組成物の確立された調合方法のいずれかにより調合することができる。投与の容易さのために、モノクローナル抗体は典型的には製薬学的に許容可能な担体と組み合わされるであろう。そのような担体は水、生理的食塩水、または油を包含する。
【００３４】
非経口的投与に適する調合物は、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤および調合物を意図する受容器の血液と等張性にさせる溶質を含有しうる水性および非水性殺菌性注射溶液、並びに懸濁化剤および濃稠化剤を含有しうる水性および非水性殺菌性注射懸濁液を包含する。従来の培地が活性成分およびその意図する使用と非相容性である場合を除いて、いずれの組成物中のその使用でも意図される。
【００３５】
調合物は単位服用量または複数回服用量容器、例えば、密封されたアンプルおよび瓶の中に存在することができ、そして使用直前に殺菌性液体、例えば、注射用の水の添加だけを必要とする凍結乾燥された状態で貯蔵することができる。
ＴＦ拮抗物質との組み合わせ
この方法は、本発明のＴＦ拮抗物質を抗−腫瘍効果またはインビボ脈管形成を抑制する化学療法剤を包含するがそれに限定されない別の機構を有する１種もしくはそれ以上の他の剤と組み合わせることができる。
【００３６】
さらに、ＴＦ抗体を１種もしくはそれ以上の抗−脈管形成剤と組み合わせることもできる。脈管形成は、円滑筋および内皮細胞の侵襲、泳動および増殖により特徴づけられる。αｖβ３インテグリン（ビトロネクチン受容体としても知られる）が腫瘍転移、充実性腫瘍成長（新形成）、オステオポローシス、パジェット病、悪性の体液高カルシウム血症、腫瘍脈管形成を包含する脈管形成、黄斑変性を包含する網膜症、慢性関節リウマチを包含する関節炎、歯周病、乾癬および円滑筋細胞泳動（例えば、再狭窄）を包含する種々の症状または疾患状態においてある役割を演ずることが知られている。
【００３７】
付着受容体αｖβ３インテグリンは、ビトロネクチン、フィブリノーゲン、フォン・ウィルブランド因子、ラミニン、スロンボスポンディン、および他の同様な配位子を結合する。それはヒヨコおよびヒトにおいて脈管形成性血管のマーカーとして同定され、そして脈管形成または新脈管形成において重要な役割を演ずる。αｖβ３の拮抗物質は、新脈管形成における細胞のアポプトシスを選択的に促進させることにより、この工程を抑制する。従って、αｖβ３拮抗物質は新脈管形成に付随するそのような症状を処置するための有用な治療標的であろう（Ｂｒｏｏｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．２６４，（１９９４），５６９−５７１）。さらに、腫瘍細胞侵襲は三段階方法：１）細胞外マ
トリックスに対する腫瘍細胞接触、２）マトリックスの蛋白質分解溶解、および３）溶解したバリアー内の細胞の移動により起きる。この方法は繰り返し行うことができ、そして元の腫瘍から離れた部位における転移をもたらしうる。αｖβ３インテグリンは腫瘍細胞侵襲並びに脈管形成においてある役割を演ずることが示された。
【００３８】
αｖβ３の拮抗物質および中和用の抗−ＴＦ抗体は両者とも腫瘍を標的にするが異なる機構により作用するため、抗−インテグリン抗体と抗−ＴＦ抗体との組み合わせは正常組織毒性がほとんどない特に有効な組み合わせを生ずるはずである。それ故、本発明の１つの態様では、インテグリン拮抗物質および抗−ＴＦ抗体の組み合わせをそのような処置を必要とする患者に投与することを含んでなる腫瘍の成長を抑制する方法が提供される。インテグリンまたはインテグリン副単位を選択的に結合する他の抗体、特にアルファＶ副単位を結合するもの、は米国特許第５，９８５，２７８号明細書および第６，１６０，０９９号明細書に開示されている。アルファＶベータ３とトリペプチドであるアルギニル−グリシル−アスパルテート（ＲＧＤ）を含有するその天然配位子との結合を抑制するＭａｂ類は米国特許第５，７６６，５９１号明細書および国際公開第００７８８１５号パンフレットに開示されている。アルファＶ−副単位を含有するインテグリンがビトロネクチン、フィブロネクチン、または他の配位子に結合するのを防止する他の抗体も脈管形成の防止において同様な有用性を有する。そのような抗体はＧＥＮ０９５またはＣＮＴＯ９５において知られておりそして国際公開第０２０１２５０１号パンフレットとして公開された出願継続中の出願に記載されている抗体を包含する。
【００３９】
本発明によると、例えばタリドミド（ｔｈａｌｉｄｏｍｉｄｅ）の如き他の既知の抗−脈管形成剤を抗−ＴＦ抗体と組み合わせて使用することもできる。
略語
ＡＴＣＣ−アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）
ＣＯ２−二酸化炭素
ＤＭＥＭ−ダルベッコ改質イーグル培地
ＥＤＴＡ−エチレンジアミン四酢酸
ＦＢＳ−胎牛血清
ＦＶＩＩａ−因子ＶＩＩａ（活性化されたＦＶＩＩ）
ＦＸ−因子Ｘ（不活性）
ＦＸａ−因子Ｘａ（活性化されたＦＸ）
ｈＩｇ−ヒトＩｇ
ＬＮＮ−２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１ｍＭ ピルビン酸ナトリウム、１ｍＭ 非必須ＡＡｓ
ＰＢＳ−燐酸塩緩衝食塩水
ＳＱ−皮下
ＩＶ−静脈内
ＩＰ−腹腔内
ＴＦ−組織因子
本発明を一般的に記載してきたが、本発明の態様は以下の実施例でさらに開示される。
【実施例】
【００４０】
実施例１
乳癌異種移植片における腫瘍成長の抑制
この実施例は、抗−組織因子ＩｇＧ抗体がヌードマウスに移植されたＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌異種移植片の腫瘍成長を抑制する能力を示す。
材料および方法 （５０匹の）チャールス・リバー・ラボラトリーズ（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）からの生後４−６週間の雌ヌードマウス（Ｃｒ
ｌ：ＮＵ／ＮＵ−ＣＤ１）を入手しそして実験前１０−１４日間にわたり気候順化させた。マウスをセントコル・インコーポレーテッド（Ｃｅｎｔｏｃｏｒ，Ｉｎｃ．）における動物施設内に研究動物の管理および使用に関する国立衛生機関指針に従い維持した。
【００４１】
ヒト乳癌細胞系統ＭＤＡＡ−ＭＢ−２３１はＡＴＣＣ（メリーランド州、ロックビル、カタログ＃ＨＴＢ−２６）から得られた。細胞を２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１０％ＦＢＳおよび１％ＬＮＮが補充されたＤＭＥＭ培地中で３７℃、５％ＣＯ２において培養した。細胞をトリプシン−ＥＤＴＡを用いて対数期成長において回収しそして殺菌性ＨＢＳＳ中で５×１０７個の細胞／ｍＬで再懸濁させた。
【００４２】
抗体：ＣＮＴＯ８５９、国際公開第９６／４０９２１号パンフレットに開示されたＣＤＲ移植されたＴＦ８−５Ｇ９抗体、株濃度３．７５ｍｇ／ｍＬ；ｈＩｇ、ＺＬＢ・バイオプラズマ（Ｂｉｏｐｌａｓｍａ）・ＡＧ、スイス、ベルン。殺菌性ＵＳＰ水中の株濃度３０ｍｇ／ｍＬ）。全ての試験製品は殺菌性ＨＢＳＳ中の２ｍｇ／ｍＬの操作濃度に設定された。全ての試験製品および対照は＜１．０ＥＵ／ｍｇのＬＡＬ値を有するであろう。
【００４３】
０日目に、マウスを５群のそれぞれに１群当たり１０匹のマウスで無作為に指定した。細胞をヌードマウスの側腹部内に５×１０６個のＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍細胞の濃度（０．２ｍＬの容量（０．１ｍＬのマトリゲル（Ｒ））と混合されたＨＢＳＳ中０．１ｍＬの細胞）で皮下移植した。マウスの群に表１に処方されている通りにして１週１回投与した。
【００４４】
【表１】
【００４５】
試験の０日目に、５０匹の試験マウスを５群にする（１０匹のマウス／群、表１に従う）。全ての動物に５×１０６個の細胞を含有する０．２ｍＬのＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞懸濁液（ＨＢＳＳ中細胞懸濁液とマトリゲル（Ｒ）との１：１混合物）を肋骨郭（ｒｉｂ
ｃａｇｅ）領域の右側に皮下移植した。０日目に、群１、２、および３内の全ての動物は１０ｍＬ／ｋｇの試験製品またはＨＢＳＳ（表１）の腹腔内注射を受けた。群４および５内の動物は１４日目または１００ｍｍ３の平均腫瘍寸法において１０ｍＬ／ｋｇの試験製品の腹腔内注射を受けた。最初の腹腔内注射後に、全ての動物は８０日目まで腹腔内服用量（５ｍＬ／ｋｇ）の試験製品または対照を毎週受ける。
【００４６】
最初の服用に関する２０ｍｇ／ｋｇおよびその後の服用に関する１０ｍｇ／ｋｇの服用量は最も近い以前の体重値を基準として計算された。動物は８０日目までまたは腫瘍が２，０００ｍｍ３の容量に達するまで毎週月曜日にＩＰ投与された。
【００４７】
動物体重および腫瘍容量は試験終了まで１週１回測定された。動物は０日目から始まって体重測定されたが、腫瘍容量は触診可能時にのみ記録された。腫瘍はカリパスを用いて三次元で測定されそして腫瘍容量は式Ｖ＝（Ｌ×Ｗ×Ｔ）／２［式中、Ｌ＝長さであり、Ｗ＝幅でありそしてＴ＝厚さである］に基づき計算された。
【００４８】
腫瘍が〜２０００ｍｍ３の平均容量に達した時に試験終了が予定され、動物の安寧性が危うくならなかった状態では試験を延長する選択肢もあった。終了時に、動物をＣＯ２窒息により安楽死させそして腫瘍を切除しそして重量測定した。個々の腫瘍を次に二分し、一方の半分はＯＣＴ中で急速冷凍しそして他方の半分は１０％ホルマリン中で固定した。血清試料を各動物から終了時に心臓穿刺により採取した。
【００４９】
結果 各処理群の成長速度を腫瘍容量（ｍｍ３）対時間（移植後日数）の関数としてプロットした（図１および２）。全ての群において１００％の取得率（ｔａｋｅ ｒａｔｅ）があった。０日目（図１）または１４日目（図２）におけるｈＩｇ対照を用いる動物の処置はＨＢＳＳ負対照と比べて腫瘍成長を有意に与えなかった（それぞれ、Ｐ＝０．７７９、Ｐ＝０．９７９）。
【００５０】
０日目にＣＮＴＯ８５９で処置した動物における腫瘍成長は６２％（Ｐ＜０．０００１）抑制された（図１）。ＣＮＴＯ８６９を用いる処置が１４日目に開始された場合には、平均腫瘍寸法が１００ｍｍ３であった時に、腫瘍成長率は４７％（Ｐ＜０．０００１）抑制された（図２）。
【００５１】
ＣＮＴＯ８５９の合計組み合わせ処置効果もｈＩｇ対照の合計処置効果と比べて有意であった（Ｐ＜０．０００１）。Ｐ＜０．００５として定義される日毎の有意性は一般的に１７日の処置後に得られた。
【００５２】
結果は、ＣＮＴＯ８５９が腫瘍成長速度を６２％まで抑制したことを示す。抗−ヒト組織因子ＩｇＧ抗体がヒト誘発腫瘍成長をインビボで抑制する能力を有することが初めて示された。ＣＮＴＯ８５９を用いる早期（０日目）および後期（１４日目）処置の両者とも腫瘍成長速度を有意に抑制した。
実施例２
正常位異種移植片モデルにおけるヒト乳癌に対する抗−ＴＦ抗体の効果
この実施例では、ＳＣＩＤ／ベージュマウスの乳房脂肪パッド内に注射されたヒト乳癌細胞系統ＭＤＡＭＢ２３１を用いる正常位腫瘍成長モデルを使用してＣＮＴＯ８５９の抗−腫瘍効果を試験した。さらに、抗−組織因子抗体の構造に対する変数：ヒト種同定ＣＮＴＯ８５９（ＩｇＧ４）およびＣＮＴＯ８６０（ＩｇＧ１）；並びにＣＮＴＯ８５９ａｌａ／ａｌａと表示されるＦｃＲ結合領域ＣＮＴＯ８５９の変更、の影響を比較した。
【００５３】
材料および方法 生後４週間の雌ＳＣＩＤ／ベージュマウス（Ｃ．Ｂ．−１７／ＩｃｒＣｒｌ−ｓｃｉｄ−ｂｇＢＲ）をチャールス・リバー・ラボラトリーズから入手しそして実験前１０−１４週間にわたり気候順化させた。マウスをフィルター・トップ・ケージ内で７−８匹／ケージで飼育されそしてオートクレーブにかけられた食料および細菌（０．１３ｍｇ／ｍＬのトリメトプリム（ｔｒｉｍｅｔｈｏｐｒｉｍ）／０．６６ｍｇ／ｍＬのスルファメトキセート（ｓｕｌｆａｍｅｔｈｏｘａｔｅ））を含有する酸性化された水を随時供給された。試験開始前５日間入れられた個別に番号がつけられた耳札により動物は同定された。入手先、性別、動物数、動物ＩＤ番号、群番号、処置、試験番号およびＩＡ
ＣＵＣ処方番号の標識が付けられたケージカードがケージに固定された。全ての動物試験はペンシルバニア州、ラドノルのセントコル・インコーポレーテッドにおいて動物試験場で研究室動物の管理および使用に関する国立衛生機関指針に従い行われた。
【００５４】
ヒト乳癌細胞系統ＭＤＡＭＢ２３１はセントコルの細胞貯蔵所から得られそして殺菌性であり且つマイコプラズマを含まないと推定された。細胞を１０％ＦＢＳおよび１％ＬＮＮが補充されたＤＭＥＭ培地中で３７℃、５％ＣＯ２において培養した。細胞をトリプシン−ＥＤＴＡを用いて対数期成長において回収しそして血清を含まないＨＢＳＳ中で５×１０７個の細胞／ｍＬで再懸濁させ、そして（Ｒｔ鼠径＃２／３）乳房脂肪パッド内に５０μＬの容量で移植された。
【００５５】
試験および対照抗体は以下の通りである：ＣＮＴＯ８５９、３．７５ｍｇ／ｍＬの株濃度；ＣＮＴＯ８５９、１０．２９ｍｇ／ｍＬの株；ＣＮＴＯ８６０、２．４ｍｇ／ｍＬの株；ＣＮＴＯ８５９Ａｌａ／Ａｌａ、Ｃ１０８１、１ｍｇ／ｍＬの株；ヒトＩｇ、ＺＬＢ・バイオプラズマ・ＡＧ、スイス、ベルン、３０ｍｇ／ｍＬの株濃度。
【００５６】
抗体を適当な濃度でＰＢＳ中に供給した。全ての対照および試験製品は＜１ＥＵ／ｍｇとなるまでエンドキシン試験しそして静脈内投与されるであろう。
【００５７】
動物を７−８匹のマウス／群に無作為分類した。０日目に２．５×１０６個のＭＤＡＭＢ２３１細胞を動物の乳房脂肪パッド内に５０μＬの容量で３０ｇ針を用いて注射した。静脈内抗体療法は３日目に開始された。３回の試験の各々に関する投与処方および濃度は、それぞれ、表２、３および４に詳細に記述される。
【００５８】
【表２】
【００５９】
【表３】
【００６０】
【表４】
【００６１】
１週１回８〜９週間にわたりマウスを体重測定しそして腫瘍容量を記録した。腫瘍容量は（Ｌ×Ｗ２）／２として計算された。試験は腫瘍細胞接種から約８〜９週間後に終了した。動物が終了点より前に急速な体重喪失、呼吸困難を経験するかまたは瀕死になった場合には、動物を試験コーディネーターにより安楽死させた。動物はＣＯ２窒息により安楽死されそして次に体重測定された。肺および腋窩リンパ節が外科的に除去され、冷たいＰＢＳ中ですすがれ、瓶詰めされ、重量測定されそして直ちにボワン溶液（Ｂｏｕｉｎ’ｓ
ｓｏｌｕｔｉｏｎ）中で固定された。原発性腫瘍が病歴分析用に切除され、重量測定されそして次にＢＺＴ溶液中で固定された。
【００６２】
主要な抗−腫瘍効果 腫瘍容量を試験中に１週１回監視しそして記録した。終了時に、原発性腫瘍がＣＯ２安楽死させたＳＣＩＤ／ベージュマウスから外科的に切除されそして重量測定された。腫瘍容量および最終質量が時間につれてプロットされた（図３および４）。動物がＣＮＴＯ８５９で処置された場合には、ＰＢＳまたは対照ヒトＩｇＧ処置動物と比べて腫瘍成長は９５％抑制された。（ｐ＝０．００３９およびｐ＝０．０１２６、両側パラメーターｔ試験、ｎ＝８）。
【００６３】
第二の試験では、服用量の影響を試験した。ＣＮＴＯ８５９は１週１回与えられる０．１ｍｇ／ｋｇ程度の低い服用量で腫瘍成長を抑制した。これは、０．１、１、５、１０または２０ｍｇ／ｋｇのいずれかのＣＮＴＯ８５９で処置された動物においてはＰＢＳおよびヒトＩｇ対照群と比べて腫瘍容量変化（図６）および個々の最終腫瘍重量（図７）として腫瘍進行における有意な減少があった。
【００６４】
３種の濃度におけるＣＮＴＯ８５９およびＣＮＴＯ８６０の間の比較試験では、我々の抗−組織因子抗体のＩｇＧ１変種が腫瘍成長だけでなく腫瘍出現の防止においても優れていたことが示された（図８−１１）。各群のそれぞれからの腫瘍容量は（図８に）時間につれての群内の平均腫瘍重量としてそして個々の最終重量として並びに平均（図１０）とした等々で示される。
【００６５】
腫瘍出現に対する効果 ＣＮＴＯ８５９療法は処置された動物の腫瘍出現における顕著な差も示した。第一の試験では、細胞は注射部位における小節の触診により観察されるように乳房脂肪パッド内に付着されそして接種されうるが、腫瘍が測定可能な寸法になる約３８日目までは測定するには小さすぎた。対照的に、ＰＢＳまたは対照ヒトＩｇ処置された動物においては測定可能な腫瘍が１７日目でから出現した。図５は、ＰＢＳ、対照ＩｇまたはＣＮＴＯ８５９のいずれかで処置された動物における腫瘍出現率を示す。この正常位ＭＤＡＭＢ２３１腫瘍成長モデルからの結果は、ＣＮＴＯ８５９が腫瘍出現、成長およ
び進行の非常に有効な抑制剤であることを示す。賦形剤対照またはＩｇ対照と比べて、ＣＮＴＯ８５９は腫瘍成長を９５％（ｐ＝０．００３９およびｐ＝０．０１２６、両側パラメーターｔ試験、ｎ＝８）そして腫瘍出現を８７．５％（ＰＢＳに対してｐ＝０．００１７および対照ヒトＩｇに対してｐ＝０．００８６、両側パラメーターｔ試験、ｎ＝８）減少させた。
【００６６】
ＣＮＴＯ８５９およびＣＮＴＯ８６０の間の比較試験では、０．１ｍｇ／ｋｇの薬用量を用いる場合には、ＣＮＴＯ８６０はＰＢＳおよびヒトＩｇ対照群と比べて最初の腫瘍出現を４４および３７日間遅らせることができた。同様に、ＣＮＴＯ８５９も最初の腫瘍出現を２３および１６日間遅らせることができた。さらに、試験の終了により、ＣＮＴＯ８６０群では動物の７０％以上がＣＮＴＯ８５９群における１５％と比べて腫瘍を含まなかった。ＰＢＳ、ヒトＩｇおよびＣＮＴＯ８５９ａｌａ／ａｌａ群における全ての動物は４４日目に腫瘍を有していた（図１１）。
【００６７】
まとめ ＣＮＴＯおよび２種の変種をこの異種移植片モデルを用いる順次実験において腫瘍成長および進行の防止における効果に関して比較した。第一の試験では、ＣＮＴＯ８５９は腫瘍移植後３日目から始めて１週１回２０ｍｇ／ｋｇの濃度で与えられた場合には腫瘍成長の防止において非常に効果的であり、ＰＢＳまたは対照Ｉｇ処置群（それぞれ、ｐ＝０．００３９およびｐ＝０．０１２６）のいずれかと比べて９５％成長抑制率を生じた。我々はＣＮＴＯ８５９で処置された動物における腫瘍出現においてＰＢＳまたは対照Ｉｇ処置群（それぞれ、ｐ＝０．００１７およびｐ＝０．００８６）のいずれかと比べて８７．５％の減少を観察した。
【００６８】
第二の試験では、ＣＮＴＯ８５９を０．１ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇの範囲にわたる順次薬用量で１週１回投与した。結果は、ＣＮＴＯ８５９を用いる抗−ＴＦモノクローナル抗体療法は、０．１ｍｇ／ｋｇの非常に低い服用量でも、腫瘍進行を遅らせる際に非常に有効であり、ＰＢＳまたは対照Ｉｇ処置群（それぞれ、ｐ＝０．００１２およびｐ＝０．０１０６、ｔ−分布を用いるウィルコキソン（Ｗｉｌｃｏｘｏｎ）二試料試験）のいずれかと比べて９０％を越える腫瘍抑制を生じた。１、５、１０および２０ｍｇ／ｋｇの薬用量は腫瘍成長を９５％以上有意に抑制した。
【００６９】
最後に、別の試験で、ＣＮＴＯ８５９の効果をＣＮＴＯ８６０、ＣＮＴＯ８５９のＩｇＧ１変種、およびＡＤＣＣ最小化変種であるＣＮＴＯ８５９ａｌａ／ａｌａに対して評価した。０．０１ｍｇ／ｋｇのＩｇＧ４またはＩｇＧ１治療抗体のいずれかの服用量はＰＢＳ、ヒトＩｇ対照またはＣＮＴＯ８５９Ａｌａ／Ａｌａと差はなかった。対照的に、１ｍｇ／ｋｇのＣＮＴＯ８５９またはＣＮＴＯ８６０のいずれかの服用量でも腫瘍成長を９５％以上抑制することができた。興味深いことに、０．１ｍｇ／ｋｇの服用量水準では、ＣＮＴＯ８６０がこの低服用量でも腫瘍成長を９５％以上抑制したがＣＮＴＯ８５９処置された腫瘍は療法からの除外の兆候を示し〜８５％だけの抑制を生じたことにより、ＣＮＴＯ８６０対ＣＮＴＯ８５９の効果は区別される。さらに、ＣＮＴＯ８６０は０．１ｍｇ／ｋｇで使用される場合には腫瘍進行の遅延において、多分追加のＡＤＣＣ活性のために、ＣＮＴＯ８５９より有効であった。
実施例３
膵臓腺癌異種移植片における腫瘍成長の抑制
この実施例では、我々はＳＣＩＤマウスの側腹部で成長した膵臓腺癌細胞系統ＢｘＰＣ−３の成長抑制に対する抗−組織因子抗体の効果を示す。ＣＮＴＯ８５９を、２０ｍｇ／ｋｇの最初の充填服用量後に１週１回１０ｍｇ／ｋｇで投与した。ＣＮＴＯ８５９を用いる療法が腫瘍移植から１日後に開始された群では、ＢｘＰＣ−３腫瘍の成長は４６．９％抑制された（ｐ＜０．００１）。処置が５０−１００ｍｍ３の平均腫瘍容量で開始された群では、腫瘍は穏やかに抑制されたが統計学的有意性は得られなかった（ｐ＝０．６２８
０）。
【００７０】
材料および方法 チャールス・リバー・ラボラトリーズ（ウィルミントン）からの生後６〜８週間の雌ＳＣＩＤマウスを入手しそして実験前１０−１４日間にわたり気候順化させた。マウスをフィルター・トップ・ケージ内で７−８匹／ケージで飼育されそしてオートクレーブにかけられた食料および細菌（０．１３ｍｇ／ｍＬのトリメトプリム／０．６６ｍｇ／ｍＬのスルファメトキセート）を含有する酸性化された水を随時供給された。試験開始前７日間入れられた個別に番号がつけられた耳札が動物を同定した。入手先、性別、動物数、動物ＩＤ番号、群番号、処置、試験番号およびＩＡＣＵＣ処方番号の標識が付けられたケージカードがケージに固定された。全ての動物試験はペンシルバニア州、ラドノルのセントコル・インコーポレーテッドにおいて動物試験場で研究室動物の管理および使用に関する国立衛生機関指針に従い行われた。
【００７１】
ヒトＢｘＰＣ−３膵臓腺癌細胞系統はＡＴＣＣ（メリーランド州、ロックビル、カタログ＃ＣＲＬ−１６８７）から得られた。それらはウイルスまたはマイコプラズマ汚染がないことが試験され、そしてセントコルズ・セル・バイオロジー・サービセス（Ｃｅｎｔｏｃｏｒ’ｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）により貯蔵された。細胞を１０％ＦＢＳおよび１％ＬＮＮが補充されたＤＭＥＭ培地中で３７℃、５％ＣＯ２において培養した。細胞をトリプシン−ＥＤＴＡを用いて対数期成長において回収しそして殺菌性ＨＢＳＳ中で１．５×１０７個の細胞／ｍＬで再懸濁させた。
【００７２】
セントコル，インコーポレーテッドで製造されたＣＮＴＯ８５９は３．７５ｍｇ／ｍＬの株濃度で使用され；ｈＩｇ、ＺＬＢ・バイオプラズマ・ＡＧ、スイス、ベルンは殺菌性ＵＳＰ水およびＰＢＳ，ｐＨ７．１、ギブコＢＲＬ中３０ｍｇ／ｍＬの株濃度で使用された試験品はすべて殺菌性ＨＢＳＳ中２ｍｇ／ｍＬの作業濃度に希釈された。
【００７３】
０日目に、マウスを５群のそれぞれに１群当たり１０匹のマウスで無作為に指定した。細胞をヌードマウスの側腹部内に３×１０６個のＢＸＰＣ−３腫瘍細胞の濃度で０．２ｍＬの容量でまたはＰＢＳ単独で（群１）皮下接種した。治療処方は表５に詳細に示されている。
【００７４】
１日目に、群１の動物は０．２ｍＬのＰＢＳ（腹腔内）を受容し、群２は２０ｍｇ／ｋｇのｈＩｇ対照抗体を受容し、そして群３は２０ｍｇ／ｋｇのＣＮＴＯ８５９抗体を受容した。抗体は引き続き７日毎に１回１０ｍｇ／ｋｇで投与された。ＰＢＳは７日毎に１回０．２ｍＬで与えられた。群４の動物は腫瘍が約５０ｍｍ３〜１００ｍｍ３に達した時に腹腔内投与される２０ｍｇ／ｋｇでそしてその後は７日毎に１回１０ｍｇ／ｋｇで投与されるＣＮＴＯ８５９を用いる処置を受けた。群５の動物は腫瘍寸法が約５０ｍｍ３〜１００ｍｍ３に達した時に腹腔内投与される２０ｍｇ／ｋｇでそしてその後は７日毎に１回１０ｍｇ／ｋｇで投与されるヒトＩｇを用いる処置を受けた。
【００７５】
【表５】
【００７６】
試験の終了時まで動物体重および腫瘍容量を１週１回監視した。動物は０日目から始まって体重測定されたが、腫瘍容量は触診可能になってからのみ記録された。腫瘍はカリパスを用いて三次元で測定されそして腫瘍容量は式Ｖ＝（Ｌ×Ｗ×Ｔ）／２［式中、Ｌ＝長さであり、Ｗ＝幅でありそしてＴ＝厚さである］に基づき計算された。
【００７７】
腫瘍が〜２０００ｍｍ３の平均容量に達した時に試験終了が予定され、動物の安寧性が危うくならなかった状態では試験を延長する選択肢もあった。終了時に、動物をＣＯ２窒息により安楽死させそして腫瘍を切除しそして重量測定した。個々の腫瘍を次に二分し、一方の半分はＯＣＴ中で急速冷凍しそして他方の半分は１０％ホルマリン中で固定した。血清試料を各動物から終了時に心臓穿刺により採取した。
【００７８】
結果 腫瘍容量（ｍｍ３）対時間（移植後日数）の関数としてプロットした各処理群の成長速度が示される（図１２）。１日目にｈＩｇで処置されたマウスに関しては２９日目に４０ｍｍ３の平均腫瘍容量に達した。しかしながら、ＣＮＴＯ８５９で処置されたマウスでは、平均腫瘍容量は３６日目まで〜４０ｍｍ３に達しなかった。
【００７９】
１日目におけるＣＮＴＯ８５９を用いる動物の処置は腫瘍成長の４６．９％抑制を生じた（Ｐ＜０．０００１）（図１２参照）。約５０−１００ｍｍ３における腫瘍の処置は２８％の穏やかであるが有意でない抑制を生じた（Ｐ＜０．６２８０）（図１３参照）。
【００８０】
１４日ＣＮＴＯ８５９−処置群では７匹のマウスのなかの２匹は腫瘍移植後１８日で死亡させなければならなかった。これらの動物の最終腫瘍容量は、それぞれ、１２９．９７ｍｍ３および４６１．１０ｍｍ３であった。１４日ｈＩｇ処置群では、８匹の動物が１８日目に７匹に減少した。これらの理由のために、試験の最後の処置工程は２５日目に終了した。
【００８１】
まとめ ＣＮＴＯ８５９は腫瘍成長率を４６．９％まで抑制した。我々の知識の限りでは、抗−ヒト組織因子抗体が膵臓腺癌の腫瘍成長を抑制する能力を有することが初めて示された。ＣＮＴＯ８５９を用いる早期処置はｈＩｇ対照抗体と比べて腫瘍成長率の有意な抑制（Ｐ＜０．０００１）を生じた。ＣＮＴＯ８５９を用いる後期処置は腫瘍成長率を２８％抑制したが統計学的に有意でなかった（Ｐ＝０．６２８０）。
実施例４
マトリゲル脈管形成モデルにおけるＰＡＮＣ−１膵臓腺癌により誘発される脈管形成の抑
制
この実施例では、我々はマトリゲル脈管形成モデルにおけるＰＡＮＣ−１膵臓腺癌により誘発される脈管形成の抑制における抗−ネズミ組織因子抗体の効果を示す。ネズミ組織因子に対する抗体は全長ｍＩｇＧ２ａ抗体に転化されたヒト抗体配列のファージライブラリーの指定された選択を用いて得られた。ＰＨＤ１２６およびＰＨＤ１２７と表示されるヒト抗−マウスＴＦ抗体は両者ともマウス組織因子の活性をＣＮＴＯ８５９およびその同族体のものと同じ機構により抑制する。具体的には、ＰＨＤ１２６およびＰＨＤ１２７はＦＸの競合抑制剤であり、そしてＴＦ、因子ＶＩＩａおよび酵素的に活性な因子Ｘａにより形成される三元複合体の生成を抑制する。両方の抗体はネズミＴＦにより促進される凝固を抑制しそしてネズミＴＦに関してヒトＴＦより選択的である。
【００８２】
材料および方法 チャールス・リバー・ラボラトリーズ（ウィルミントン）からの生後４〜６週間の雌ヌード（Ｎｕ／ＮｕＣＤ１）マウスが得られそして実験前１０−１４日間にわたり気候順化された。マウスはフィルター・トップ・プラスチック・ケージ内で（７匹／ケージ）飼育されそしてオートクレーブにかけられた食料および水を随時供給された。試験開始前少なくとも７日間入れられた番号がつけられた耳札または刺青が動物を個別に同定した。入手先、性別、動物数、動物ＩＤ番号、群番号、処置、試験番号およびＩＡＣＵＣ処方番号の標識が付けられたケージカードがケージに固定された。全ての動物試験はペンシルバニア州、ラドノルのセントコル・インコーポレーテッドにおいて動物試験場で行われた。
【００８３】
ヒト膵臓腺癌細胞系統ＰＡＮＣ−１はＡＴＣＣ（メリーランド州、ロックビル、カタログ＃ＣＲＬ−１６８７）から得られた。それらはウイルスまたはマイコプラズマ汚染がないと試験され、そしてセントコルズ・セル・バイオロジー・サービセスにより貯蔵された。
【００８４】
抗体の競合ＩｇＧ変種はセントコルで処理されそしてクローン化された：ＰＨＤ１２６株溶液は１．７ｍｇ／ｍｌであり、ＰＨＤ株溶液は０．６２ｍｇ／ｍＬであり、そして無関係な対照抗体ｃＶａＭは１０．０９ｍｇ／ＭＬであった。全ての抗体が試験されそしてＬＡＬ＜４ＥＵ／ｍｇを有していた。
【００８５】
ＰＡＮＣ−１細胞を対数期においてトリプシン処理により回収し、次に完全培地中で１回そしてＨＢＳＳ中で１回洗浄した。ＰＡＮＣ−１細胞（３．２×１０７個の細胞）を８．０ｍＬの氷冷殺菌性ＨＢＳＳ中に再懸濁させ、そして２４ｍＬの氷冷マトリゲル（ベクトン・ディクソン（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｓｏｎ））と混合した（最終濃度は１×１０６個の細胞であった）。マトリゲルの最終濃度は１０ｍｇ／ｍＬであった。
【００８６】
マウスを５群（７匹のマウス／群）に無作為分類した。マウスをケタミン（Ｋｅｔａｍｉｎｅ）／キシラジン（ｘｙｌａｚｉｎｅ）（９０／０１ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）で麻酔をかけそして体重測定した。マウスに２つの部位のそれぞれに０．５ｍｌのマトリゲルを腫瘍細胞懸濁液と共に注射した（群１〜４）。群５の動物にはマトリゲルだけを注射した。
【００８７】
注射部位は、各側面上で最終肋骨の後方約０．５インチ且つ背骨からの０．５インチの背側であった。注射部位における指押しがマトリゲル重合を促進しそしていずれかの起きうる漏出を防止する。麻酔薬の使用および冷たい物質の注射により、動物が意識を取り戻すまで体温は維持された。これらの条件下で、脈管形成因子はゆっくり放出され脈管形成の進行および新脈管形成を刺激する。血管によるゲル栓の侵襲は１２−４８時間内に起き、そして新脈管形成はマトリゲルの注射後７−１０日間まで続く。
【００８８】
動物に０．２ｃｃ（１０ｍｇ／ｋｇ）の各試験製品または１０ｍＬ／ｋｇの対照を腫瘍
／マトリゲル移植後１および５日目に注射した。
【００８９】
【表６】
【００９０】
全ての動物を１、５、および９日目（試験の終了時）に体重測定した。終了時にマトリゲル栓を切除しそして重量測定した。９日目に、全てのマウスをＣＯ２窒息により安楽死させた。動物を閉鎖容器（空の微小隔離ケージまたは密封プラスチックバッグ）内で腫瘍学研究所に移した。動物飼育場の外側では、動物は生物安全フード内で取り扱われた。作業が完了した時に、体は密封プラスチックバッグ内で動物飼育場冷凍機に戻された。栓を外科的に除去しそして盲検方式で重量測定した。栓を写真撮影しそして次にヘモグロビン含有量および管長さに関して処理した。
【００９１】
試験中のいずれかの時点で動物が瀕死状態（＞１５％の体重喪失、呼吸困難、運動失調，震顫など）になった場合には、ＰＩが通知されそして動物は安楽死されるであろう。体の処理はＰＩの自由裁量であった。
【００９２】
まとめ 管密度分析後に、ＰＨＤ１２６がＰＡＮＣ−１誘発性脈管形成を約６０％（統計学的に有意でない）抑制したがＰＨＤ１２７は脈管形成を対照抗体と比べて約８８％（ｐ＜０．０５）抑制したことを我々は見出した。
【００９３】
ＰＨＤ１２７は脈管形成を６６％までの率で（ｐ＜０．０５、一方向ＡＮＯＶＡ）抑制し、抗−組織因子抗体が脈管形成を抑制する能力を有することを示した。ＰＨＤ１２６を用いる処置も脈管形成を同じモデルにおいて約４５％抑制したが、結果は統計学的に有意でなかった（図１４）。
【００９４】
これらのデータは、増殖する細胞は宿主ＴＦが介在する宿主応答を生じて脈管形成をもたらし、従って腫瘍成長を許す条件を作成することを示している。
【図面の簡単な説明】
【００９５】
【図１】図１は、ヌードマウスの側腹部内に皮下移植されそしてｈＩｇに無関係にＣＮＴＯ８５９またはＨＢＳＳを１週１回０日目から始まって投与されたヒト乳癌細胞の腫瘍成長速度（容量変化）を示すグラフである。
【図２】図２は、ＣＮＴＯ８５９またはｈＩｇが１週１回１４日目から始まって投与されたマウス群に関する図１と同じ実験からのデータを示すグラフである。
【図３】図３は、対照動物、ＰＢＳまたは対照ヒトＩｇのいずれかで処置された動物、およびＣＮＴＯ８５９で処置された動物のいずれかからの腫瘍容量における変化を示すグラフである。
【図４】図４は、対照動物、ＰＢＳまたは対照ヒトＩｇのいずれかで処置された動物、およびＣＮＴＯ８５９で処置された動物のいずれかからの最終腫瘍容量の平均および標準偏差を表わす棒グラフである。
【図５】図５は、腫瘍が移植された日と同じ日から始まるＰＢＳ、対照ＩｇまたはＣＮＴＯ８５９のいずれかで処置された動物における腫瘍出現率を示す。
【図６】図６は、ＰＢＳ、対照ヒトＩｇまたは種々の薬用量のＣＮＴＯ８５９のいずれかで処置された動物における容量により測定されたＭＤＡＭＢ２３１異種移植片の腫瘍進行を示す。
【図７】図７は、ＰＢＳ、対照ヒトＩｇまたは種々の薬用量のＣＮＴＯ８５９（０．１、１、５、１０および２０ｍｇ／ｋｇ）のいずれかで処置された動物からの最終腫瘍容量の分布を示す分布プロットである。
【図８】図８は、マウスに（乳房組織に）正常位移植されたヒト乳癌細胞ＭＤＡＭＢ２３１異種移植片を用いそしてマウスがＰＢＳ、対照ヒトＩｇ、ＣＮＴＯ８５９Ａｌａ／Ａｌａまたは種々の薬用量（０．０１、０．１および１ｍｇ／ｋｇ）のＣＮＴＯ８５９およびＣＮＴＯ８６０のいずれかで処置された実験に関する時間につれての腫瘍容量のグラフである。
【図９】図９は、０．１ｍｇ／ｋｇにおける対照並びにＣＮＴＯ８５９およびＣＮＴＯ８６０だけを示す、図８に示されたものと同じ実験からの群の４種の平均および標準偏差を示す。
【図１０】図１０は、図８と同じ実験における各群からの個々の最終腫瘍容量および平均の各々のグラフ表示である。
【図１１】図１１は、図８と同じ実験からの腫瘍出現データを示す。
【図１２】図１２は、翌日から始まるＣＮＴＯ８５９で処置されたマウスに移植されたＢｘＰＣ−３ヒト膵臓腫瘍細胞の腫瘍成長速度（容量変化）を示すグラフである。
【図１３】図１３は、定着した腫瘍をＣＮＴＯ８５９で処置した場合のマウスに移植されたＢｘＰＣ−３ヒト膵臓腫瘍細胞の腫瘍成長速度（容量変化）を示すグラフである。
【図１４】図１４は、マウスにおいてマトリゲル（ＭＡＴＲＩＧＥＬ）内の管長さにより測定されたＰＡＮＣ−１ヒト膵臓腫瘍細胞誘発性脈管形成がヒト抗−ネズミＴＦ抗体（ＰＨＤ１２７）により８８％（ｐ＜０．０５）減じられることを示す棒グラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
処置を必要とする哺乳動物に組織因子拮抗物質を該哺乳動物における脈管化された組織の増加を抑制するのに有効な量で投与することを含んでなる、脈管化された組織における増加により特徴づけられる哺乳動物における疾患の処置方法。
【請求項２】
疾患が癌、網膜症、黄斑変性、慢性関節リウマチおよび乾癬よりなる群から選択される請求項１の方法。
【請求項３】
処置を必要とする哺乳動物に組織因子拮抗物質を該哺乳動物における腫瘍の成長を抑制するのに有効な量で投与することを含んでなる、処置を必要とする哺乳動物における腫瘍の成長の抑制方法。
【請求項４】
組織因子拮抗物質が組織因子モノクローナル抗体またはその断片である請求項３の方法。
【請求項５】
抗体断片がＦａｂ、Ｆａｂ’もしくはＦ（ａｂ’）２断片またはその誘導体である請求項４に記載の方法。
【請求項６】
抗体またはその断片が血漿中の組織因子である因子ＶＩＩａ：因子Ｘ複合体の生成を防止する請求項４に記載の方法。
【請求項７】
モノクローナル抗体または断片がヒト組織因子と結合するためのモノクローナル抗体ＴＦ８−５Ｇ９と競合する請求項４に記載の方法。
【請求項８】
モノクローナル抗体が静脈内投与される請求項４に記載の方法。
【請求項９】
モノクローナル抗体が０．０５ｍｇ／ｋｇ〜１２．０ｍｇ／ｋｇの体重の量で投与される請求項４に記載の方法。
【請求項１０】
モノクローナル抗体が巨丸剤服用量で投与され、引き続き該抗体の注入が行われる請求項４に記載の方法。
【請求項１１】
哺乳動物がヒト患者である請求項１または３に記載の方法。
【請求項１２】
腫瘍が乳癌または膵臓癌である請求項３の方法。
【請求項１３】
抗体が第二の抗脈管形成剤と組み合わせて投与される請求項１〜１２のいずれかの方法。
【請求項１４】
第二の抗脈管形成剤がアルファＶを含有する付着分子と特異的に結合しうるＭａｂである請求項１３の方法。
【請求項１５】
第二の抗脈管形成剤が脈管形成をもたらす細胞信号化経路に関係する他の標的に結合しうるかまたはそれを機能的に遮断しうるＭａｂである請求項１３の方法。
【請求項１６】
抗体が抗体療法、放射線療法、化学療法剤、プロテオソーム阻害剤、またはファルネシルトランスフェラーゼ剤と組み合わせて投与される請求項３〜１２のいずれかの方法。
【請求項１７】
癌、網膜症、黄斑変性、慢性関節リウマチまたは乾癬の処置のための脈管形成−抑制量の組織因子拮抗物質を含んでなる薬品の製造における組織因子拮抗物質の使用。
【請求項１８】
腫瘍の処置のための腫瘍成長を抑制するのに有効な量の組織因子拮抗物質を含んでなる薬品の製造における組織因子拮抗物質の使用。
【請求項１】
処置を必要とする哺乳動物に組織因子拮抗物質を該哺乳動物における脈管化された組織の増加を抑制するのに有効な量で投与することを含んでなる、脈管化された組織における増加により特徴づけられる哺乳動物における疾患の処置方法。
【請求項２】
疾患が癌、網膜症、黄斑変性、慢性関節リウマチおよび乾癬よりなる群から選択される請求項１の方法。
【請求項３】
処置を必要とする哺乳動物に組織因子拮抗物質を該哺乳動物における腫瘍の成長を抑制するのに有効な量で投与することを含んでなる、処置を必要とする哺乳動物における腫瘍の成長の抑制方法。
【請求項４】
組織因子拮抗物質が組織因子モノクローナル抗体またはその断片である請求項３の方法。
【請求項５】
抗体断片がＦａｂ、Ｆａｂ’もしくはＦ（ａｂ’）２断片またはその誘導体である請求項４に記載の方法。
【請求項６】
抗体またはその断片が血漿中の組織因子である因子ＶＩＩａ：因子Ｘ複合体の生成を防止する請求項４に記載の方法。
【請求項７】
モノクローナル抗体または断片がヒト組織因子と結合するためのモノクローナル抗体ＴＦ８−５Ｇ９と競合する請求項４に記載の方法。
【請求項８】
モノクローナル抗体が静脈内投与される請求項４に記載の方法。
【請求項９】
モノクローナル抗体が０．０５ｍｇ／ｋｇ〜１２．０ｍｇ／ｋｇの体重の量で投与される請求項４に記載の方法。
【請求項１０】
モノクローナル抗体が巨丸剤服用量で投与され、引き続き該抗体の注入が行われる請求項４に記載の方法。
【請求項１１】
哺乳動物がヒト患者である請求項１または３に記載の方法。
【請求項１２】
腫瘍が乳癌または膵臓癌である請求項３の方法。
【請求項１３】
抗体が第二の抗脈管形成剤と組み合わせて投与される請求項１〜１２のいずれかの方法。
【請求項１４】
第二の抗脈管形成剤がアルファＶを含有する付着分子と特異的に結合しうるＭａｂである請求項１３の方法。
【請求項１５】
第二の抗脈管形成剤が脈管形成をもたらす細胞信号化経路に関係する他の標的に結合しうるかまたはそれを機能的に遮断しうるＭａｂである請求項１３の方法。
【請求項１６】
抗体が抗体療法、放射線療法、化学療法剤、プロテオソーム阻害剤、またはファルネシルトランスフェラーゼ剤と組み合わせて投与される請求項３〜１２のいずれかの方法。
【請求項１７】
癌、網膜症、黄斑変性、慢性関節リウマチまたは乾癬の処置のための脈管形成−抑制量の組織因子拮抗物質を含んでなる薬品の製造における組織因子拮抗物質の使用。
【請求項１８】
腫瘍の処置のための腫瘍成長を抑制するのに有効な量の組織因子拮抗物質を含んでなる薬品の製造における組織因子拮抗物質の使用。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【公表番号】特表２００６−５２６６４１（Ｐ２００６−５２６６４１Ａ）
【公表日】平成１８年１１月２４日（２００６．１１．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５１４９８０（Ｐ２００６−５１４９８０）
【出願日】平成１６年５月２７日（２００４．５．２７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１６６６３
【国際公開番号】ＷＯ２００４／１１０３６３
【国際公開日】平成１６年１２月２３日（２００４．１２．２３）
【出願人】（５０３０５４１２２）セントカー・インコーポレーテツド (74)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年１１月２４日（２００６．１１．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年５月２７日（２００４．５．２７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１６６６３
【国際公開番号】ＷＯ２００４／１１０３６３
【国際公開日】平成１６年１２月２３日（２００４．１２．２３）
【出願人】（５０３０５４１２２）セントカー・インコーポレーテツド (74)
【Ｆターム（参考）】
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